(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）又は（２）の塩基配列及び（３）又は（４）の塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（１）配列番号１の塩基配列
（２）下記いずれかのタンパク質をコードする塩基配列
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつその発現によりブラシノステロイドの合成を促すタンパク質
（３）配列番号３の５１〜１６２５位の塩基配列
（４）下記いずれかのタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつその発現によりブラシノステロイドの合成を促すタンパク質
【請求項２】
プロモーター及び請求項１に記載のポリヌクレオチドを有し、該塩基配列のいずれもが該プロモーターに対して順方向に連結されているポリヌクレオチド。
【請求項３】
プロモーター及び請求項１に記載のポリヌクレオチド又はそれらの部分配列を有し、該塩基配列の少なくとも一方又はそれらの部分配列の少なくとも一方が該プロモーターに対して逆方向に連結されているポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有するプラスミド。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された植物。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドにより植物を形質転換し、該遺伝子又は該ポリヌクレオチドを発現させるか又はその発現を抑制することにより、該植物の葉の大きさを変化させる方法。
【請求項７】
請求項２又は３に記載の遺伝子又はポリヌクレオチドにより形質転換された植物に前記プロモーターに応じた刺激を与えることにより、該植物の葉の大きさを変化させる方法。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の方法で葉の大きさが変化した植物。
【請求項９】
（ａ）又は（ｂ）のタンパク質及び（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質から成るタンパク質の混合物又は複合物。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつその発現によりブラシノステロイドの合成を促すタンパク質
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつその発現によりブラシノステロイドの合成を促すタンパク質
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ブラシノステロイド合成に関与する遺伝子に関し、より詳細には、遺伝子ROT3 (= CYP90C1、配列番号３の５１〜１６２５位)と共同してブラシノステロイドの最終合成ステップを司る新規な遺伝子（CYP90D1、配列番号１）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ブラシノステロイドは、植物界に広く分布し、極低濃度で細胞伸張や細胞分裂などの生理作用を示す植物ホルモンであり、４０種以上の類縁体の総称である。
植物におけるブラシノステロイドの作用は極めて強く、さまざまな農業適応用の価値の高さが指摘され、関連特許も多数公開されている（例：特開平５−２２２０９０、特開平６−９８６４８、特開平６−３４０６８９、特開平８−５９４０８、特開平８−８１３１０、特開平８−１１３５０３、特開平９−９７など）。
【０００３】
ブラシノステロイドの生合成に関する研究も精力的に行われており、その合成経路についても解明が進んでおり（例えば、細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ１０「植物ホルモンのシグナル伝達」p180-189秀潤社（1998.8） 藤岡ら「ブラシノステロイドの生合成と情報伝達」）、ブラシノステロイドの植物体内での合成系はシトクロムP450型蛋白質が司ることが示されている。
発明者らは、既にシロイヌナズナにおいて、シトクロムP450ファミリーに属するROTUNDIFOLIA3（ＲＯＴ３）遺伝子を特定し（Gene & Development 12:2381-2391(1998)）、このＲＯＴ３の発現を制御することにより葉や花の形状を変化させることができることを示した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 96, pp. 9433-9437 (1999)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、ブラシノステロイドの合成に関与するシトクロムp450型タンパク質をコードする核酸分子等が特定されているが（特表2000-508524）、これまで知られていた合成系の核酸分子の働きは、ブラシノステロイド合成系の比較的初期段階を司るものであったため、その作用を器官特異的にあるいは量的に調節できるような形で利用することは困難であった。更に、ブラシノステロイドの合成の最終的な合成ステップを司る最も重要な合成酵素蛋白質とそれをコードする核酸分子については不明であった。ここで最終的ステップとはcasteroneからブラシノイド（brassinoide、化１）を合成するステップである（ブラシノステロイドの全合成系については図１に示す。）。
【化１】
0004064184.tif 000002
【０００５】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明者らは、既に見出していた遺伝子ROT3 (= CYP90C1、配列番号３の５１〜１６２５位、ACCESSION No.AB008097)について相同性検索を行い、５１％相同の塩基配列を見出し、この配列を検討した結果、この配列が、植物体のサイズの制御など生理作用を有するブラシノステロイドの合成ステップを司る因子をコードする新規な遺伝子（CYP90D1、配列番号１）であることを見出した。更に、発明者らは、この遺伝子CYP90D1が遺伝子ROT3 (= CYP90C1)と共同してブラシノステロイドの最終合成ステップを司っているということを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明では、生理活性を実際に示すブラシノステロイド合成系を、これらROT3 (= CYP90C1)及びCYP90D1により制御することを可能とする点で、従来法とは一線を画す。
【０００６】
即ち、単独のROT3 (= CYP90C1)を植物体全体で発現させると葉及び花器官でのみ効果を発揮し、しかも縦軸方向のみに効果を及ぼすことが判明している。花器官とは葉が変形したものであり、遺伝子による形態制御の形態に共通性がある。
しかし、ROT3 (= CYP90C1)をCYP90D1と組みあわせると、植物体全体に作用する。これらROT3 (= CYP90C1)及びCYP90D1の核酸分子及びこれのコードするタンパク質を人為的に操作することで、花や葉の形状を意図したとおりに同時に変形させることも、また植物体の背丈や葉の形状をほとんど変えることなく、花の形状のみを変えることもできる。
【０００７】
即ち、本発明は、（１）又は（２）の塩基配列及び（３）又は（４）の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
（１）配列番号１の塩基配列
（２）下記いずれかのタンパク質をコードする塩基配列
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつその発現によりブラシノステロイドの合成を促すタンパク質
（３）配列番号３の５１〜１６２５位の塩基配列
（４）下記いずれかのタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつその発現によりブラシノステロイドの合成を促すタンパク質
【０００８】
また本発明は、i)プロモーター及び上記のポリヌクレオチドを有し、該塩基配列のいずれもが該プロモーターに対して順方向に連結されているポリヌクレオチド、又はii)プロモーター及び上記のポリヌクレオチド又はそれらの部分配列を有し、該塩基配列の少なくとも一方又はそれらの部分配列の少なくとも一方が該プロモーターに対して逆方向に連結されているポリヌクレオチドである。
ここで用いるプロモーターとしては、詳細は後述するが、カリフラワーモザイクウィルスの 35S プロモーター・熱ショックプロモーター・化学物質誘導性プロモーター等が挙げられる。またプロモータ及び上記遺伝子の結合方法に特に制限は無く、通常の遺伝子工学的手法に従って適宜行うことができる。
【０００９】
更に本発明は、上記のいずれかのポリヌクレオチドを含有するプラスミドであり、上記のいずれかのポリヌクレオチドにより形質転換された植物である。
更に、本発明は、このポリヌクレオチドを含有するプラスミドである。ここで用いるプラスミドとして、ＴｉプラスミドのｐＢＩ−１２１プラスミド等のバイナリーベクターが挙げられる。
また、本発明の適用できる植物は、種子植物全般である。
このような植物を形質転換するには、通常の遺伝子工学的手法を用いて、本発明のポリヌクレオチドを上記プラスミドに挿入し、上記植物を形質転換することができる。
【００１０】
また、本発明は、上記のポリヌクレオチドにより植物を形質転換し、該ポリヌクレオチドを発現させるか又はその発現を抑制することにより、該植物の葉の大きさを変化させる方法であり、更に、上記のいずれかの遺伝子又はポリヌクレオチドにより形質転換された植物に前記プロモーターに応じた刺激を与えることにより、該植物の葉の大きさを変化させる方法であり、これらのいずれかの方法で葉の大きさが変化した植物である。
【００１１】
本発明は、また、以下（ａ）又は（ｂ）のタンパク質及び（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質から成るタンパク質の混合物又は複合物である。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつその発現によりブラシノステロイドの合成を促すタンパク質
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつその発現によりブラシノステロイドの合成を促すタンパク質
【００１２】
CYP90D1及びROT3 (= CYP90C1)の核酸分子及びこれのコードするタンパク質は、以下のような操作により、人為的に操作することができる。
(1)人為的に操作可能なプロモータにCYP90D1（配列番号１）及びROT3 (= CYP90C1、配列番号３の５１〜１６２５位)の核酸分子を結合させたものを、適宜Ｔｉプラスミド等の公知手段を用いて、植物に導入し、外的刺激をプロモータに与え、これら遺伝子の発現をコントロールする。ここで使用できるプロモーターの例として以下のものが挙げられる。
・35Sプロモータ（構成的に発現できる。）
・熱ショックプロモータ（温度依存的に発現できる。）
・Dex誘導性プロモータ（デキサメタゾンを投与することで発現をコントロールできる。）
・ペチュニアCHS-Aプロモータ（花弁の着色する性質の植物においては花弁特異的発現、シロイヌナズナなどでは花弁特異的発現をしないが、糖を投与することで茎葉で発現できる。）
等が挙げられるが、その他、植物の分野で公知の使用可能なプロモータを用いてもよい。
【００１３】
(2)ROT3あるいはCYP90D1の機能を抑える方法：
アンチセンスＲＮＡ法（本来の向きと正反対に遺伝子領域を読むように改変した遺伝子を導入する方法）やＲＮＡｉ法（遺伝子領域の一部を正逆タンデムにつないだものをつくり、これをまとめて読むように改変した遺伝子を導入する方法）により、特定の遺伝子の機能を抑えることができる。本発明において、この方法により遺伝子発現を抑えることができる。いずれの場合も、標的となる遺伝子配列（CYP90D1（配列番号１）及びROT3 (= CYP90C1、配列番号３の５１〜１６２５位)）が分かっているため、ねらい打ちができる。
【００１４】
(3)組み合わせる方法：
古典遺伝学的に、それぞれ遺伝子（CYP90D1（配列番号１）及びROT3 (= CYP90C1、配列番号３の５１〜１６２５位)）の改変株を作っておき、それらの間で掛け合わせによって作る方法と、直接遺伝子導入をまとめて行なう方法とが可能です。
(4)前駆体発酵方法：
ブラシノステロイド合成系のうち、これまで知られてきた遺伝子の少なくとも一部の遺伝子では、酵母菌で発現させたときに、実際に酵素活性を示した、という成功例がある。このような方法により、ROT3及びCYP90D1の組み合わせ、又はそれぞれを酵母菌など真核細胞で発現させておいて、そこに前駆体を与えることでカスタステロンあるいはブラシノライド（最終産物で、かつ活性物質）を人工合成する。
【００１５】
【発明の効果】
従来の、植物に顕著な生理作用を有するステロイド化合物の合成ステップ制御に関する発明は、いくつか実用面で問題点を有していた。
即ち、従来解明されていたブラシノステロイド合成系の制御因子は、合成系の早期ステップに関するものであったため、例えばその合成系をトランスジェニック植物において強発現させると、植物体全体が徒長し、大型化する。これは特殊な用途以外には、実際には利用価値がなかった。逆にその合成系をトランスジェニック植物系を使ってストップさせると、植物体全体が著しく小型化し、これも特殊な用途以外には、実際には利用価値がなかった。即ち、従来法によって植物体全体が変化してしまうこと、しかもその変化が価値の低いものであることが問題である。実際に応用的に利用価値のあるトランスジェニック植物とは、例えば花卉園芸上では花だけが大きい、あるいは葉のみが小さいものであり、蔬菜改良についていえば、葉のみが大きい、といったものである。そのためには、従来法に関しては、特殊な発現調節システム等を組み合わせないかぎり解決が困難であった。しかし、本発明の示すように、ROT3 (= CYP90C1)とCYP90D1を共同して用いることにより、特定の器官のみ特定の方向（特に、縦方向）へのサイズの制御や植物体全体のサイズの制御も可能になった。
【００１６】
また、本発明において、ROT3 (= CYP90C1)及びCYP90D1が共同して最終ステップを支配していることを解明した。そのため、ブラシノステロイドの化学合成系として利用した様々な工業的利用が可能になる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
製造例１
ROT3の機能抑制には、ROT3遺伝子の機能欠損型変異体rot3-1（Tsuge et al. Development 122: 1589-1600 (1996)に報告した株）を用いた。これを常法により無菌は種の後、23度恒明条件で培養した。
【００１８】
製造例２
一方、ROT3及びCYP90D1の両方の機能抑制には、まずROT3homolog (CYP90D1)を特異的に増幅するプライマーセット
ROT3h-cDNA-for:5'-GTTAAAACACTAATGGACAC-3'（配列番号５）
ROT3h-cDNA-rev:5'-TGATTTATATTCTTTTGATCC-3'（配列番号６）
によりCYP90D1のcDNA（配列番号１）をシロイヌナズナから単離した。一方、汎用ベクターpBI121にハイグロマイシン耐性遺伝子を選択マーカーを加え、更にその中のGUSタンパクコード領域を取り除き、そこに前述のCYP90D1（配列番号１）のクローンを、本来と逆向きにCauliflower mosaic Virus 35Sプロモーターで読まれるように組み込んだ。これをアグロバクター(C58C1 Rif-resistant)に導入し、常法に従い培養懸濁液を用いて、in planta法によりシロイヌナズナrot3-1変異体に導入した。その形質転換体をハイグロマイシンで選抜の上、自家受粉により導入遺伝子がホモに入っている個体を作出した。常法により無菌は種の後、23度恒明条件で培養した。
【００１９】
実施例１
シロイズナズナの野生株（Ｗｓ−２）、製造例１の株（ROT3の機能抑制）及び製造例２で作製した株（ROT3及びCYP90D1の機能抑制）を同条件で栽培した葉の形状を図２に示す。
ROT3（図２−２）の機能抑制したものは、野生株（図２−１）と比べ葉が縦方向にのみ縮まっているのに対し、ROT3及びCYP90D1の両方の機能抑制したもの（図２−３及び４）は、これらに比べ顕著に葉が縮まっている。即ち、ROT3とCYP90D1とは共同してブラシノステロイドの合成を司る遺伝子であることが分かる。
【００２０】
実施例２
製造例２で作製したROT3及びCYO90D1の機能不全の株を、種子から無菌培養した。培地は2%(w/v)のスクロース入りMS培地（0.2% ゲルライトで固化）を使い、常法により無菌は種の後、23度恒明条件で培養した。
一方、ブラシノステロイド合成系中間体（６−Ｄ−ＣＴ：6-Deoxocathasterone、６−Ｄ−ＴＥ：6-Deoxoteasterone、６−Ｄ−３ＤＴ：3-Dehydro-6-deoxoteasterone、６−Ｄ−ＴＹ：6-Deoxotyphasterol、６−Ｄ−ＣＳ：6-Deoxocastasterone、ＣＴ：Cathasterone、ＴＥ：Teasterone、３ＤＴ：3-Dehydroteasterone、ＴＹ：Typhasterol、ＣＳ：Castasterone）及びブラシノライド（ＢＬ）（ＢＬは和光純薬より購入（富士化学工業製）、その他のブラシノステロイドは理研・藤岡昭三博士及び上越教育大・高津戸秀博士より分与された。）のそれぞれの水溶液（濃度０．１μＭ／ｌ）を用意した。
【００２１】
これらの水溶液に上記植物（ROT3及びCYO90D1の機能不全の株）が水没するようにして、ゆっくりと振盪培養した。葉柄の処理の場合は、植物を無菌的に取り出し、メスにより葉柄を切り出して、同様の処理を行った。それらの葉の写真を図３に示す。
図３より、ROT3及びCYO90D1の両遺伝子の機能欠失体に対し、ブラシノステロイド各誘導中間体は効果を示さないが、最終生産物であるブラシノライド（ＢＬ）を与えたものは葉が大きく、顕著な効果を示した。即ち、ブラシノステロイドの合成ステップの最終生成物であるブラシノライドの合成をROT3とCYP90D1とが共同で支配していることがわかる。
【００２２】
実施例３
シロイヌナズナの野生株（Ｗｓ−２）、製造例１で作製した株（ROT3の機能抑制、rot3-1とrot3-5）及び製造例２で作製した株（ROT3及びCYP90D1の機能抑制、rot3/CYP90D1）における各ブラシノステロイドの量を測定した。この量は、植物体のロゼット時期に地上部を刈り取り、凍結乾燥の後、ＨＰＬＣ及びＧＣ−ＭＳを用いて測定した。その結果を表１に示す。
【表１】
0004064184.tif 000003
注：表中（−）で示したところは、測定限界(0.001ng/g)以下であったことを示す。
ROT3を抑制したものは（rot3-1及びrot3-5）、ブラシノライドの生成を顕著に抑制し、その結果それ以前のブラシノステロイド（特に、Castasterone）の生成量が上昇していることがわかる。しかし、ROT3の抑制によりブラシノライドの生成を完全に止めるに至っていない。即ち、rot3はそれのみではブラシノライドの生成を完全に制御しているわけではないことも同時に示されている。
一方、ROT3及びCYP90D1の機能抑制したものについては、ブラシノステロイドの合成系のなかでブラシノライド（brassinolide）の量が極端に減少しており、ROT3及びCYP90D1の両者の機能を抑制すると、castasteroneからブラシノライド（brassinolide）への合成が完全に抑制されることがわかる。即ち、ROT3とCYP90D1とが共存することによって初めてブラシノライドの生成を完全に制御していることが示されている。
【００２３】
【配列表】
0004064184.tif 000004
0004064184.tif 000005
0004064184.tif 000006
0004064184.tif 000007
0004064184.tif 000008
【００２４】
0004064184.tif 000009
0004064184.tif 000010
0004064184.tif 000011
0004064184.tif 000012
0004064184.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】ブラシノステロイドの全合成系を示す図である。
【図２】シロイズナズナの野生株（Ｗｓ−２）（Ｎｏ．１）、製造例１の株（ROT3の機能抑制）（Ｎｏ．２）、及び製造例２で作製した株（ROT3及びCYP90D1の機能抑制）（Ｎｏ．３及び４）を同条件で栽培した葉の形状を示す図である。Ｎｏ．３は効果がやや弱い株、Ｎｏ．４は効果が強く出た株である。
【図３】ROT3及びCYO90D1の機能不全の株にブラシノステロイド合成系中間体及びブラシノライドを投与した後の葉の形状を示す図である。Ｃｏｎｔｒｏｌ：何も投与しない、６−Ｄ−ＣＴ：6-Deoxocathasteroneを投与（以下同じ。）、６−Ｄ−ＴＥ：6-Deoxoteasterone、６−Ｄ−３ＤＴ：3-Dehydro-6-deoxoteasterone、６−Ｄ−ＴＹ：6-Deoxotyphasterol、６−Ｄ−ＣＳ：6-Deoxocastasterone、ＣＴ：Cathasterone、ＴＥ：Teasterone、３ＤＴ：3-Dehydroteasterone、ＴＹ：Typhasterol、ＣＳ：Castasterone、ＢＬ：Brassinolide
【図１】
0004064184.tif 000014
【図２】
0004064184.tif 000015
【図３】
0004064184.tif 000016