(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌を発酵培地中で培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌は、エシェリヒア属細菌のアスパルトキナーゼIIIをコードし、該アスパルトキナーゼIIIのリジンによるフィードバック阻害を解除する変異をコーディング領域内に有する遺伝子を含有するＤＮＡであって、該変異がアスパルトキナーゼIIIの318番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ323番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、325番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に置換させかつ347番目のバリン残基をメチオニン残基に置換させる変異、323番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ347番目のバリン残基をメチオニン残基に置換させる変異、325番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に置換させかつ345番目のセリン残基をロイシン残基に置換する変異、250番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、346番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させかつ374番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に置換させる変異、250番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させかつ364番目のスレオニン残基をメチオニン残基に置換させる変異、202番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に置換させかつ321番目のセリン残基をプロリン残基に置換させる変異、または283番目のアルギニン残基をセリン残基に置換させかつ333番目のアラニン残基をスレオニン残基に置換させかつ338番目のセリン残基をスレオニン残基に置換させかつ346番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ414番目のアスパラギン残基をセリン残基に置換させる変異であるＤＮＡが、エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに接続されて得られる組換えＤＮＡを有し、かつ、前記Ｌ−アミノ酸はＬ−リジンまたはＬ−スレオニンであることを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法、この製造法に用いるＤＮＡ及び微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
発酵法によりＬ−リジンを製造する場合、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。Ｌ−リジンを生産する人工変異株は数多く知られており、その多くはアミノエチルシステイン（ＡＥＣ）耐性変異株であり、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、またはエシェリヒア属に属している。また、組換えＤＮＡを使用した形質転換体を用いる（米国特許第4278765号）等、アミノ酸の生産を増加させる種々の技術が開示されている。
【０００３】
例えば、エシェリヒア属においては、特開昭56-18596号公報、米国特許第4346,170号およびApplied Microbiology and Biotechnology 15, 227 (1982)においてジヒドロジピコリン酸合成酵素（以下、「ＤＤＰＳ」と略すことがある）を増強する事による、Ｌ−リジンの製造法が示されている。
【０００４】
ところで、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（ＤＤＰＳ）は、アスパルトセミアルデヒドとピルビン酸を脱水縮合させ、ジヒドロジピコリン酸を合成する酵素であり、この反応はアスパラギン酸系アミノ酸の生合成において、Ｌ−リジン生合成系への分岐の入口となっている。エシェリヒア属細菌においてはアスパルトキナーゼとともにＬ−リジン生合成の重要な調節部位を担っている事が知られている。
【０００５】
ＤＤＰＳはE. coli（エシェリヒア・コリ）ではdapAという遺伝子にコードされている。このdapAはすでにクローニングされており、塩基配列も決定されている（Richaud,F. et al. J. Bacteriol. 297 (1986)）。
【０００６】
一方、アスパルトキナーゼ（以下、「ＡＫ」と略すことがある）は、アスパラギン酸をβホスホアスパラギン酸に変える反応を触媒する酵素であり、アスパラギン酸系のアミノ酸の生合成系の主な調節酵素となっている。E. coliのＡＫは３種あり（ＡＫI, ＡＫII,ＡＫIII）、うち２つはホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下、「ＨＤ」と略すことがある）との複合酵素である。複合酵素の内のひとつはthrA遺伝子にコードされるＡＫI−ＨＤIであり、もう一方はmetLM遺伝子にコードされるＡＫII−ＨＤIIである。ＡＫIはスレオニンとイソロイシンによる協奏的抑制及びスレオニンによる阻害を受け、ＡＫIIはメチオニンによる抑制を受ける。
【０００７】
これらに対し、ＡＫIIIのみは単機能酵素であり、lysCと名付けられた遺伝子の産物であって、Ｌ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。菌体内でのこれらの活性の割合は、ＡＫI:ＡＫII:ＡＫIII＝約５:１:４となっている。
【０００８】
E. coli のlysC はすでにクローニングされており、塩基配列も決定されている（Cassan,M., Parsot,C., Cohen,G.N., and Patte,J.C., J.Biol.Chem. 261, 1052 (1986)）。
【０００９】
リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するdapAとリジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するlysCを有するE. coliを用いてＬ−リジンを製造する方法は国際公開パンフレットWO95/16042に開示されている。
【００１０】
発酵法によりＬ−スレオニンを製造する場合、微生物としては自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。Ｌ−スレオニンを生産する人工変異株は数多く知られており、その多くはα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸に耐性があり、エシェリヒア属、セラチア属、またはブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属に属している。エシェリヒア属においては特開昭55-131397号公報、特開昭59-31691号公報、特開昭56-15696号公報、および特表平3-501682号公報でスレオニンオペロンを含有した組換えプラスミドにより形質転換された菌株によるL-スレオニンを製造する方法が示されている。
【００１１】
また、リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するlysCを有するE. coliを用いてＬ−スレオニンを製造する方法は国際公開パンフレットWO94/11517に開示されている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリヒア属細菌由来のＡＫIIIを取得し、従来よりもさらに改良された発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリヒア属細菌由来のＡＫIIIをコードするＤＮＡを取得することに成功した。尚、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたE. coli由来のＡＫIIIをコードするＤＮＡを本明細書において変異型lysCあるいは変異型ＡＫIII遺伝子とよぶことがある。
【００１４】
なお、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたE. coli由来のＤＤＰＳをコードするＤＮＡを本明細書において変異型dapAあるいは変異型ＤＤＰＳ遺伝子とよぶことがある。
【００１５】
さらに本願発明者らは、変異型lysCを細胞内に有するエシェリヒア属細菌を創製した。そして同エシェリヒア属細菌を好適な培地で培養することにより、該培養物中にＬ−リジンまたはＬ−スレオニンを著量生産蓄積させ得ることを見出した。
【００１６】
すなわち本願発明は、エシェリヒア属細菌のアスパルトキナーゼIIIをコードし、該アスパルトキナーゼIIIのリジンによるフィードバック阻害を解除する変異をコーディング領域内に有する遺伝子を含有するＤＮＡであって、該変異がアスパルトキナーゼIIIの318番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、325番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ347番目のバリン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ347番目のバリン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、325番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ345番目のセリン残基を別のアミノ酸残基に置換する変異、323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ358番目のセリン残基を別のアミノ酸残基に置換する変異、344番目のスレオニン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、250番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、346番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ374番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、250番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ364番目のスレオニン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、202番目のアスパラギン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ321番目のセリン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、283番目のアルギニン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ333番目のアラニン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ338番目のセリン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ346番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ414番目のアスパラギン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、318番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ321番目のセリン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ328番目のバリン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ349番目のバリン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ405番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異であるものである。
【００１７】
好ましくは、エシェリヒア属細菌のアスパルトキナーゼIIIをコードし、該アスパルトキナーゼIIIのリジンによるフィードバック阻害を解除する変異をコーディング領域内に有する遺伝子を含有するＤＮＡであって、該変異がアスパルトキナーゼIIIの318番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ323番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、325番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に置換させかつ347番目のバリン残基をメチオニン残基に置換させる変異、323番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ347番目のバリン残基をメチオニン残基に置換させる変異、325番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に置換させかつ345番目のセリン残基をロイシン残基に置換する変異、323番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ358番目のセリン残基をロイシン残基に置換する変異、344番目のスレオニン残基をメチオニン残基に置換させる変異、250番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、346番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させかつ374番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に置換させる変異、250番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させかつ364番目のスレオニン残基をメチオニン残基に置換させる変異、202番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に置換させかつ321番目のセリン残基をプロリン残基に置換させる変異、283番目のアルギニン残基をセリン残基に置換させかつ333番目のアラニン残基をスレオニン残基に置換させかつ338番目のセリン残基をスレオニン残基に置換させかつ346番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ414番目のアスパラギン残基をセリン残基に置換させる変異、318番目のメチオニン残基をリジン残基に置換させかつ321番目のセリン残基をプロリン残基に置換させかつ328番目のバリン残基をフェニルアラニン残基に置換させかつ349番目のバリン残基をグリシン残基に置換させかつ405番目のグルタミン酸残基をバリン残基に置換させる変異であるものである。
【００１８】
本願発明は、前記ＤＮＡが、エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに接続されて得られる組換えＤＮＡ、前記ＤＮＡを有するエシェリヒア属に属する微生物である。
【００１９】
本願発明は、前記微生物であってＬ−アミノ酸生産能を有するものを発酵培地中で培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法である。
【００２０】
尚、本明細書において、ＤＤＰＳ又はＡＫIIIをコードするＤＮＡ、あるいはこれらにプロモーターを含むＤＮＡを、「ＤＤＰＳ遺伝子」又は「ＡＫIII遺伝子」ということがある。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異酵素を単に「変型型酵素」、これをコードするＤＮＡあるいはこれにプロモーターを含むＤＮＡを「変異型遺伝子」ということがある。さらに、「Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される」とは、実質的に阻害が解除されていればよいことを意味し、完全に解除されている必要はない。
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】
＜１＞本発明の変異型アスパルトキナーゼ（ＡＫIII）をコードするＤＮＡ
本発明の変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡは、野生型ＡＫIIIをコードするＤＮＡにおいて、コードされるＡＫIIIのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものである。ＡＫIIIとしては、エシェリヒア属細菌由来のもの、特にE. coli由来のＡＫIIIが挙げられる。また、ＡＫIIIのＬ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異としては、配列表の配列番号１に記載されるＡＫIIIのアミノ酸配列中、ＡＫIIIのＮ−末端から
ア)318番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはイソロイシン残基に置換させかつ323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはアスパラギン酸残基に置換させる変異、
イ)325番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはフェニルアラニン残基に置換させかつ347番目のバリン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはメチオニン残基に置換させる変異、
ウ)323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはアスパラギン酸残基に置換させかつ347番目のバリン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはメチオニン残基に置換させる変異、
エ)325番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはフェニルアラニン残基に置換させかつ345番目のセリン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはロイシン残基に置換する変異、
オ)323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはアスパラギン酸残基に置換させかつ358番目のセリン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはロイシン残基に置換する変異、
カ)344番目のスレオニン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはメチオニン残基に置換させる変異、
キ)250番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好ましくはリジン残基に置換させる変異、
ク)346番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好ましくはリジン残基に置換させかつ374番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはフェニルアラニン残基に置換させる変異、
ケ)250番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好ましくはリジン残基に置換させかつ364番目のスレオニン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはメチオニン残基に置換させる変異、
コ)202番目のアスパラギン酸残基を別のアミノ酸残基、好ましくはグリシン残基に置換させかつ321番目のセリン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはプロリン残基に置換させる変異、
サ)283番目のアルギニン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはセリン残基に置換させかつ333番目のアラニン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはスレオニン残基に置換させかつ338番目のセリン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはスレオニン残基に置換させかつ346番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好ましくはアスパラギン酸残基に置換させかつ414番目のアスパラギン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはセリン残基に置換させる変異、
シ)318番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはリジン残基に置換させかつ321番目のセリン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはプロリン残基に置換させかつ328番目のバリン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはフェニルアラニン残基に置換させかつ349番目のバリン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはグリシン残基に置換させかつ405番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好ましくはバリン残基に置換させる変異
が挙げられる。
【００２３】
野生型ＡＫIIIをコードするＤＮＡとしては、特に制限されないが、エシェリヒア属細菌、例えばE. coli由来のＡＫIIIをコードするＤＮＡが挙げられ、具体的には配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、さらには配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号584〜1930で表される配列が挙げられる。尚、E. coliのＡＫIIIは、lysC遺伝子にコードされている。
【００２４】
これらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、本発明の変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡである。尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型ＡＫIIIのアミノ酸配列がわずかに相異するものがある。このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも本発明の変異型ＡＫIII遺伝子に含まれる。
【００２５】
例えば、後記実施例１で得られた野生型lysC遺伝子の塩基配列（配列番号１）は、既に発表されている E. coli K-12 JC411株のlysCの配列（Cassan,M., Parsot,C., Cohen,G.N., and Patte,J.C., J.Biol.Chem. 261, 1052 (1986)）と６ヶ所相違しており、そのうち２ヶ所でコードされるアミノ酸残基が異なっている（JC411株のlysCは、配列番号１に示すlysCのアミノ酸配列中、Ｎ−末端から５８番目のグリシン残基がシステイン残基に、401番目のグリシン残基がアラニン残基に置き換わっている）。このE. coli K-12 JC411株のlysCと同一の配列を有するlysCであっても、上記ア)〜シ)のいずれかの変異を導入すれば、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するlysCが得られることが予想される。
【００２６】
リジンによるフィードバック阻害が解除された変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡを取得する方法は以下の通りである。まず、野生型ＡＫIII遺伝子又は他の変異を有するＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合するベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで変異型ＡＫIIIを発現するように至ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子を保持している。また、野生型ＡＫIII遺伝子又は他の変異を有するＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡを、宿主に適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで変異型ＡＫIIIを発現するように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異型遺伝子を保持している。あるいは、野生型酵素を生産する微生物を変異処理し、変異型酵素を生産する変異株を創成した後、該変異株から変異型遺伝子を取得してもよい。
【００２７】
ＤＮＡを直接変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒドロキシルアミンは、シトシンをＮ4−ヒドロキシシトシンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。
【００２８】
上記野生型ＡＫIII遺伝子あるいは他の変異を有するＡＫIII遺伝子を含有するDNAの供与菌としては、エシェリヒア属に属する微生物であればいかなるものを用いてもかまわない。具体的にはF.C.Neidhardtらの著書（Neidhardt,F.C. et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., pp1208, table 1）にあげられるものが利用できる。たとえば、E.coli JM109株や、MC1061株などがあげられる。
【００２９】
（１）野生型ＡＫIII遺伝子の取得
以下に、ＡＫIII遺伝子を含有するDNAの調製例について述べる。まず、野生型のlysCをもつE. coli例えばMC1061株を培養して培養物を得る。上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良いが、集菌の際の効率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが好ましい。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスィープリカーまたは大豆もしくは小麦の浸出液等の１種類以上の窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添加した物が用いられる。なお、培地の初発ｐＨは、6〜8に調製するのが適当である。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で4〜24時間、通気攪拌深部培養、振盪培養または静置培養等により行う。
【００３０】
このようにして得られた培養物を、例えば3,000 r.p.m.で5分間遠心分離してE. coli MC1061株の菌体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta. 72, 619, (1963)）、K.S.Kirbyの方法（Biochem.J. 64, 405, (1956)）等の方法により染色体DNAを得ることができる。
【００３１】
こうして得られた染色体ＤＮＡからＡＫIII遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度1〜10unit/mlで様々な時間（1分〜2時間）染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。
【００３２】
ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDNAに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素 Sau3AＩと同一末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHＩを、温度30℃以上、酵素濃度1〜100unit/mlの条件下で1時間以上、好ましくは1〜3時間、ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と開裂切断されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度4〜１16℃、酵素濃度1〜100unit/mlの条件下で1時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
【００３３】
得られた組換えＤＮＡを用いて、エシェリヒア属の微生物、例えば大腸菌K-12株、好ましくはＡＫI、II、III全欠損株、例えばE. coli GT3株（E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）等から入手できる）等を形質転換して染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。この形質転換は D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326, (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A., J.Mol.Biol. 53,159(1970)）等により行うことができる。
【００３４】
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中から、ＡＫIII活性が増大した株あるいはＡＫIII遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株より ＡＫIII 遺伝子の組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。例えば、ＡＫ完全欠損変異株を宿主に用いた場合は、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチニオンおよびジアミノピメリン酸を含有しない培地上で、またはホモセリンおよびジアミノピメリン酸を含有しない培地上で生育可能となった形質転換株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。  候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液を調製してＡＫIII活性を確認する。ＡＫIIIの酵素活性測定法は、E.R.Stadtmanらの方法（Stadtman,E.R., Cohen,G.N., LeBras,G., and Robichon-Szulmajster,H., J.Biol.Chem. 236, 2033 (1961)）により行うことができる。
【００３５】
そして、上記菌株より、ＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡがベクターＤＮＡに挿入された組換えＤＮＡを、例えば P.Guerryらの方法（J.Bacteriol. 116, 1064, (1973)）、D.B.Clewellの方法（J.Bacteriol. 110, 667, (1972)）などにより単離することができる。
【００３６】
野生型ＡＫIII遺伝子の取得は、染色体上にＡＫIII遺伝子を有する株から、斎藤、三浦の方法等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction; White,T.J. et al Trends Genet. 5, 185 (1989)）により、ＡＫIII遺伝子を増幅することによっても行える。増幅反応に用いるＤＮＡプライマーは、ＡＫIII 遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重鎖の両3'末端に相補するものを用いる。ＡＫIII遺伝子の一部領域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片をプライマーとして全領域を含むＤＮＡ断片を染色体ＤＮＡライブラリーよりスクリーニングする必要がある。ＡＫIII遺伝子の全領域を増幅した場合には、増幅されたＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のＤＮＡ断片を抽出することによって ＡＫIII 遺伝子を含有するＤＮＡ断片を回収できる。
【００３７】
ＤＮＡプライマーとしては、例えばE. coliにおいて既知となっている配列（Cassan,M., Parsot,C., Cohen,G.N., and Patte,J.C., J.Biol.Chem. 261, 1052 (1986)）を基にして適宜作成できるが、lysC遺伝子をコードする1347塩基からなる領域を増幅できるプライマーが適当であり、例えば配列番号２および３に示した２種のプライマーが適当である。プライマーＤＮＡの合成は、ホスホアミダイド法（Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981)）等の常法により、市販のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380B等）を用いて合成することができる。また、PCR反応は、市販のＰＣＲ反応装置（宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型等）を使用し、TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造（株）より供給されている）を用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００３８】
ＰＣＲ法により増幅されたＡＫIII遺伝子は、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導入することによって、ＡＫIII遺伝子への変異の導入などの操作がしやすくなる。用いられるベクターＤＮＡと形質転換法、さらに ＡＫIII遺伝子の存在の確認方法は上述した方法と同じである。
【００３９】
（２）ＡＫIII遺伝子への変異の導入
上記のようにして得られたＡＫIII遺伝子に、アミノ酸残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法としては、リコンビナントＰＣＲ法（Higuchi,R., 61, in PCR Technology (Erlich,H.A. Eds., Stockton press (1989)）、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J., Methods in Enzymology 154, 350 (1987); Kunkel,T.A. et.al., Methods in Enzymology 154, 367 (1987)）などがある。これらの方法を用いると、目的部位に目的の変異を起こすことができる。
また、目的遺伝子を化学合成する方法によれば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導入することができる。
【００４０】
さらに、染色体もしくはプラスミド上のＡＫIII遺伝子を直接ヒドロキシルアミンで処理する方法（Hashimoto,T. and Sekiguchi,M., J.Bacteriol. 159, 1039 (1984)）がある。また、ＡＫIII遺伝子を保有するエシェリヒア属細菌を紫外線照射する方法またはN−メチル−N'−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸などの化学薬剤処理による方法を用いてもよい。これらの方法によれば、ランダムに変異を導入できる。
【００４１】
変異型ＡＫIII遺伝子の選択方法としては、まず変異処理したＡＫIII遺伝子を含有する組換えＤＮＡをＡＫ完全欠損株、例えば E. coli GT3株に形質転換する。次に著量のＬ−リジンを含む最少培地、例えばM9で形質転換株を培養する。野生型のＡＫIII遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保持する株は、唯一のＡＫがＬ−リジンにより阻害されるために、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、及びジアミノピメリン酸(DAP)の合成が出来なくなり生育が抑えられる。これに対しＬ−リジンによる阻害の解除された変異型ＡＫIII遺伝子を含有する組換えＤＮＡ保持株は、著量のＬ−リジンが添加された最少培地上での生育が可能になるはずである。この現象を利用し、生育が、Ｌ−リジンあるいはＬ−リジンのアナログであるＳ−２−アミノエチル・システイン（AEC）に耐性となっている株、すなわち阻害の解除された変異型ＡＫIII遺伝子を含有する組換えＤＮＡ保持株を選択することができる。
【００４２】
こうして得られた該変異型遺伝子を、組換えＤＮＡとして適当な微生物（宿主）に導入し、発現させることによりフィードバック阻害が解除されたＡＫIIIを保有する微生物を取得できる。
【００４３】
宿主としては、エシェリヒア属に属する微生物が好ましく、例えば大腸菌（E. coli）が挙げられる。
【００４４】
また、組換えＤＮＡから変異ＡＫIII遺伝子断片を取り出し、他のベクターに挿入したものを使用してもよい。本発明において用いることのできることのできるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤＮＡが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターやトランスポゾンのベクターも利用できる。
【００４５】
さらに、変異型ＡＫIII遺伝子の発現を効率的に実施するために、変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡの上流に、lac、trp、PL等の微生物内で働く他のプロモーターを連結してもよく、ＡＫIII遺伝子に含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅して用いてもよい。
【００４６】
また、上記のように、変異型遺伝子を自律複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主に保持させてもよいが、変異型遺伝子を、トランスダクション、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M., Bio/Technol. 1, 417 (1983)）、Muファージ（特開平2-109985）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab. (1972)）を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
【００４７】
＜３＞本発明によるＬ−アミノ酸の製造
上記のようにして得られる変異型ＡＫIII遺伝子を導入することによって形質転換されたエシェリヒア属細菌を、好適な培地中で培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造することができる。
【００４８】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたＡＫを保持するエシェリヒア属細菌としては、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するＡＫIIIをコードするＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれて形質転換されたエシェリヒア属細菌、または該ＤＮＡとエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡが細胞内に導入されることによって形質転換されたエシェリヒア属細菌が挙げられる。さらに、エシェリヒア属細菌細胞を変異処理することにより、変異型ＡＫIIIを産生するようになったエシェリヒア属細菌変異株であってもよい。
【００４９】
形質転換の宿主として用いるエシェリヒア属細菌としては、その細胞内で変異型ＡＫIII遺伝子のプロモーター又はこれらの遺伝子を発現させるための他のプロモーターが機能し、さらに変異型ＡＫIII遺伝子をプラスミド上に染色体外ＤＮＡとして導入する場合には、導入するのに用いるベクターＤＮＡの複製起点が細胞内で機能して複製可能なものであれば利用できる。
本発明による変異型遺伝子を保持する微生物の培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
【００５０】
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトールなどのアルコール類、またはフマール酸、クエン酸もしくはコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００５１】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
【００５２】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、Ｌ−イソロイシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００５３】
培養は、好気的条件下で16〜72時間実施するのがよく、培養温度は25℃〜45℃に、培養中pHは5〜8に制御する。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００５４】
発酵液からのＬ−アミノ酸の採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００５５】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
【００５６】
【実施例１】
変異型ＡＫIII遺伝子の取得（１）
＜１＞野生型ＡＫIII遺伝子のクローニング
E. coliのＡＫIII遺伝子（lysC）の塩基配列は既に報告されており（Cassan,M., Parsot,C., Cohen,G.N., and Patte,J.C., J.Biol.Chem. 261,1052 (1986)）、オープンリーディングフレーム(ORF)は1347塩基対よりなり、449アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることがわかっている。この遺伝子にはオペレーターが存在しＬ−リジンによる抑制を受けるため、このオペレーター領域を除くために、SD配列とORFのみを含む領域を、ＰＣＲ法を用いて増幅し、クローニングすることにした。
【００５７】
E.coli K-12 MC1061株の全ゲノムＤＮＡを斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta. 72, 619 (1963)）により調製し、配列番号２および３に示す配列を有する２種のプライマーを作製し、これらを用いてH.A.Erlichらの方法（PCR Technology, Stockton press (1989)）に従ってＰＣＲ反応を行い、ＡＫIII遺伝子の増幅を行った。得られたＤＮＡをBamHIとAseIで消化した後、平滑末端にし、低コピーベクターpMW119のSmaI部位に挿入してpMLYSC2を構築した。このSmaI部位はベクター内に存在するlacZプロモーターの下流側に位置しており、pMW119のSmaI部位にＤＮＡ断片を挿入して得られる組換えＤＮＡをE. coliに導入すると、lacZプロモーター制御による転写により、挿入されたＤＮＡ断片が転写される（図１）。
【００５８】
＜２＞変異型ＡＫIII遺伝子のクローニング
国際公開パンフレットWO94/11517及びWO95/16042に記載されている変異型ＡＫIII遺伝子を持つプラスミドpLYSC1*80、pLYSC1*117、pLYSC1*126をEcoRIとHindIIIで消化して変異型ＡＫIII遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、この断片をpMW119のEcoRI-HindIII部位に挿入してそれぞれpMLYSC2*80、pMLYSC2*117、pMLYSC2*126と名付けたプラスミドをそれぞれ構築した。
【００５９】
なお、プラスミドpLYSC1*80は国際公開パンフレットWO94/11517の記載に従って、pLLC*80から調製可能である。pLLC*80がE. coli HB101株に導入されて得られる株はAJ12750と命名されて1992年９月１日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５  茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されて、受託番号FERM P-13136が付与されている。同株は1993年11月４日付でブタペスト条約に基づく国際寄託に移管されており、新たに受託番号FERM BP-4462が付与されている。pLYSC1*117、pLYSC1*126は寄託されていないが、それぞれの変異点が国際公開パンフレットWO94/11517に開示されているのでpLYSC1*80を出発材料として容易に調製できる。
【００６０】
＜３＞新規変異型ＡＫIII遺伝子の選択条件の検討
pMLYSC1をＡＫ完全欠損株E. coli GT3(thrA1016b, metLM1005, lysC1004)に導入して得られる形質転換株をGT3/pMLYSC2と命名した。同様にしてGT3/pMLYSC2*80、GT3/pMLYSC2*117、GT3/pMLYSC2*126を得た。GT3/pMLYSC2株は野生型のlysCを含むプラスミドを保持し、同プラスミド上のlysCにコードされるＡＫIIIが唯一のＡＫである。最少培地において著量のＬ−リジン存在下では唯一のＡＫである野生型ＡＫIIIがＬ−リジンにより阻害されるために、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、及びジアミノピメリン酸(DAP)の合成ができなくなり生育が抑えられた。Ｌ−リジンによる阻害が解除された変異型lysCを有するプラスミド保持株は著量のＬ−リジンが添加された最少培地上での生育が可能になると予想し、生育がＬ−リジン耐性となっている株を選択することによってＬ−リジンによる阻害の解除された変異型lysCを含有するプラスミドを保持する株を選択することにした。GT3/pMLYSC2株、GT3/pMLYSC2*80株、GT3/pMLYSC2*117株、GT3/pMLYSC2*126株をそれぞれ種々の濃度のＬ−リジンを含有する最少寒天平板培地上で培養を行い、生育阻止濃度を調べ変異型lysCを含有するプラスミド保持株の選択条件の検討を行った。各種濃度でＬ−リジンを含む最少寒天平板培地での形質転換体の生育を表１に示す。尚、表中の＋は形質転換株が生育したことを示し、±はやや生育したことを示し、−は生育しなかったことを示す
【００６１】
【表１】
0004088982.tif 000002
【００６２】
野生型lysCを持つGT3/pMLYSC2株ではＬ−リジンが0.2Mの添加区で生育が完全に抑えられた。また、従来より知られている変異型lysCを持つGT3/pMLYSC2*80株、GT3/pMLYSC2*117株、GT3/pMLYSC2*126株でも0.4MのＬ−リジン添加区で生育がほぼ抑制された。この結果よりＬ−リジンが0.4Mの添加区において選択を行うことによりこれまでに知られている変異型lysCよりもさらに阻害解除度の高い変異型が取得できる可能性が示唆された。なお、この生育阻害はホモセリン及びジアミノピメリン酸の同時添加により消去されることを確認した。
【００６３】
変異導入実験にはpMLYSC2を用い、最少寒天培地M9にＬ−リジン0.4Mを添加したものを、変異型lysCを含有するプラスミド保持株の選択に用いた。以下、実施例１においてこの培地を選択培地という。
【００６４】
＜４＞ＡＫIII遺伝子の変異処理と変異型ＡＫIII遺伝子の取得
pMLYSC1プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを直接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理法に加え、変異に多様性を与えるため、即ちヒドロキシルアミンによるシトシンからチミンへの変異以外の変異を期待して、ＰＣＲ変異処理法の２種の方法を用いた。
【００６５】
2μgのpMLYSC2を 0.4M ヒドロキシルアミン中（0.1M KH2PO4-1mM EDTA (pH6.0) 100μl、1M ヒドロキシルアミン-1mM EDTA (pH6.0) 80μl、DNA 2μg、水を加えて計200μlとする）で 、75℃の条件下で、１〜４時間処理した。処理後のＤＮＡをガラスパウダーで精製後、ＡＫ完全欠損株E. coli GT3株に導入し、完全培地（ L-broth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast extract, 0.5％ NaCl, 50mg/L Ampicillin, 1.5％ agar）に撒きコロニーを形成させた。これを選択培地にレプリカし、選択培地上に生育可能な株を選択し候補株とした。
【００６６】
ＰＣＲ法によるランダム変異処理はC.Cadwellらの方法（Cadwell,C. and G.F.Joyce, PCR Methods Applic. 2, 28, (1982)）に従って行った。すなわちpMLYSC2とM13ユニバーサルプライマーを用いて上記の方法によりlysC断片を増幅した。この断片をEcoRIとHindIIIで消化した後、pMW119のEcoRI-HindIII部位に挿入してＡＫ完全欠損株E. coli GT3に導入し、完全培地（ L-broth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast extract, 0.5％ NaCl, 50mg/L Ampicillin, 1.5％ agar）に撒きコロニーを形成させた。これを選択培地にレプリカし、選択培地上に生育可能な株を選択し候補株とした。
【００６７】
上記で得られた候補株、すなわち、ヒドロキシルアミンによる変異処理由来の44株、ＰＣＲ法によるランダム変異処理由来の3株、合計47株よりプラスミドを回収して変異型lysCの塩基配列を決定し、変異点を同定した。塩基配列の決定はDNAシークエンサーABI Model 373A（ABI社製）を使用して、常法に従い行なった。その結果、ヒドロキシルアミンによる変異処理由来から4種類（No.1, No.6, No.14, No.21）、ＰＣＲ法によるランダム変異処理由来から3種類（No.28, No.29, No.30）の新規変異点を持つ変異型ＡＫIIIを取得することができた（表２）。
【００６８】
【表２】
0004088982.tif 000003
【００６９】
これら7種類のプラスミド（pMLYSC2*Y1, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, MLYSC2*Y28, pMLYSC2*Y29, pMLYSC2*Y30）をＡＫ完全欠損株であるGT3に導入し、各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、ＡＫIIIの酵素活性を測定した。無細胞抽出液及びＡＫIII酵素活性の測定は、E.R.Stadtmanらの方法（Stadtman,E.R., Cohen,G.N., LeBras,G., and Robichon-Szulmajster,H., J.Biol.Chem. 236, 2033 (1961)）に従った。また、ＡＫIIIの酵素活性を測定する際、酵素反応液中に種々の濃度のＬ−リジンを加え、Ｌ−リジンによる阻害の度合を調べ、結果を表３に示した。 尚、阻害解除度はＬ−リジン非存在下でのＡＫ活性に対するＬ−リジン0.4M存在下でのＡＫ残存活性の割合を示している。
【００７０】
【表３】
0004088982.tif 000004
【００７１】
この結果が示すように、今回用いた選択方法により、これまでに知られている代表的な変異型ＡＫIII（pMLYSC2*80及びpMLYSC2*117にコードされている変異型ＡＫIII）よりもＬ−リジンに対する阻害解除度が優れた変異型ＡＫIIIを取得することができた。また総蛋白当りの比活性は、菌体の生育状況や試料の調製に影響されるが、いずれもほとんどが野生型及びこれまでの変異型と同等であり、変異導入による活性低下の問題はほとんどなかった。このことより、ＡＫIIIの活性中心とＬ−リジンによる調節部位がそれぞれ独立していることが予想された。
【００７２】
【実施例２】
変異型ＡＫIII遺伝子の取得（２）
358番目のSerをLeuに変異させたlysC遺伝子はLA PCR in vitro Mutagenesis Kit（宝酒造株式会社製）を用いて部位特異的変異を導入することで作製した。この際、国際公開パンフレットWO94/11517及びWO95/16042に記載のpLYSC1を鋳型として、配列表番号４に記載のプライマーを変異導入用のプライマーとして用いた。PCR増幅断片の両端をEcoRIとHindIIIで切断し、pUC19のEcoRIとHindIIIで切断した断片と接続したものをpLYSC358Lとした。345番目のSerをIleまたはValに変異させた変異型ＡＫIII遺伝子は上記と同様の方法で、但しプライマーとして配列表番号５または配列表番号６を用いて作製した。pUC19をEcoRIとHindIIIで切断した断片と接続したものを各々pLYSC345I、pLYSC345Vとした。
【００７３】
また国際公開パンフレットWO94/11517及びWO95/16042記載のpLYSC1*48, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLYSC1*150, pLYSC1*158のEcoRIとHindIIIで切り出されるlysCを含む方の断片をpUC19のEcoRI-HindIII切断部位に挿入したものを作製し、各々pLYSC2*48, pLYSC2*117, pLYSC2*126, pLYSC2*150, pLYSC2*158と命名した。国際公開パンフレットWO94/11517及びWO95/16042には、pLYSC1の構造、pLYSC1*48, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLYSC1*150, pLYSC1*158の変異点の位置が開示されているので、上記プラスミドpLYSC1*80からこれらプラスミドを調製することができる。
【００７４】
次に、このようにして得られた1塩基変異型lysCの変異点群の中央付近に存在するSspI切断部位と、pUC19上のlysC下流側に存在するSspI切断部位を用いて、2種類の変異を合わせもつ変異型lysC遺伝子を作製した。すなわち、pLYSC2*48のlysC遺伝子上流領域を含むSspI断片とpLYSC2*158のlysC下流領域を含むSspI断片を結合してpU2547Mを、pLYSC2*126のlysC上流領域を含むSspI断片とpLYSC2*158のlysC下流領域を含むSspI断片を結合してpU2347Mを、pLYSC2*48のlysC上流領域を含むSspI断片とpLYSC2*117のlysC下流領域を含むSspI断片を結合してpU2545Lを、pLYSC2*126のlysC上流領域を含むSspI断片とpLYSC358LのlysC下流領域を含むSspI断片を結合してpU2358Lを、pLYSC2*126のlysC上流領域を含むSspI断片とpLYSC345VのlysC下流領域を含むSspI断片を結合してpU2345Vを、pLYSC2*126のlysC上流領域を含むSspI断片とpLYSC345IのlysC下流領域を含むSsp断片を結合してpU2345Iを、各々作製した。また、pLYSC2*150とpLYSC2*126の変異点は共にSspI切断部位よりも上流に位置するため、この2点の変異を合わせ持つ2塩基変異型lysCの作製は以下のようにして行った。まずpLYSC2*126を鋳型とし、配列表番号７に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、上述のキットを用いて2点の変異を持つDNA断片を増幅した。次に、得られたDNA断片の両端をEcoRIとHindIIIで切断し、pUC19のEcoRIとHindIIIで切断した断片と接続した。このようにして得られたものをpU1823Dとした。
【００７５】
以上のようにして得られた2塩基変異型lysC遺伝子産物（ＡＫIII）のLysに対する阻害解除度を実施例１に記載したように測定した。その結果、どの2塩基変異型ＡＫIIIの阻害解除度もそれを構成する1塩基変異型ＡＫIIIの阻害解除度よりも向上していた（表４）。なお、pLYSC358L、pLYSC345I、pLYSC345V上にある変異型lysCは新規変異型遺伝子である。各々の遺伝子産物はリジンによるフィードバック阻害が解除されているが、他の変異と組み合わさることによってその阻害解除度はさらに向上する。すなわち、2塩基変異型ＡＫIII構築のための中間体としても有用である。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
【実施例３】
変異型ＤＤＰＳ及び変異型ＡＫIII遺伝子を導入した株によるＬ−リジンの発酵生産（１）
変異型ＤＤＰＳ遺伝子と変異型ＡＫIII遺伝子のＬ−リジン生産に対する効果は国際公開パンフレットWO95/16042に記載されている。これをさらに改良するために、実施例１で得られた変異型ＡＫIII遺伝子を変異型ＤＤＰＳ遺伝子と共存させる事とした。
【００７８】
国際公開パンフレットWO95/16042に記載されている変異型ＤＤＰＳ遺伝子を持つプラスミドRSF24PがE. coli JM109株に導入されて得られる株はAJ12395と命名されて1993年10月28日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５  茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されて、受託番号FERM P-13935が付与されている。同株は1994年11月１日付でブタペスト条約に基づく国際寄託に移管されており、新たに受託番号FERM BP-4858が付与されている。
【００７９】
変異型ＡＫIII遺伝子を含むプラスミドpMLYSC2*Y1, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, MLYSC2*Y28, pMLYSC2*Y29, pMLYSC2*Y30及びpU2547M, pU2347M, pU2545L, pU2358L, pU2345V, pU2345I, pU1823Dから選ばれる一つと、変異型ＤＤＰＳ遺伝子を有するプラスミドRSF24Pから、変異型ＡＫIII遺伝子と変異型ＤＤＰＳ遺伝子を有するプラスミドRSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30及びRSFD2547M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2345I, RSFD1823Dを図２の様にして作製した。
【００８０】
尚、対照として国際公開パンフレットWO95/16042に記載されているプラスミドRSFD80を用いた。プラスミドRSFD80がE. coli JM109株に導入されて得られる株はAJ12396と命名されて1993年10月28日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５  茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されて、受託番号FERM P-13936が付与されている。同株は1994年11月１日付でブタペスト条約に基づく国際寄託に移管されており、新たに受託番号FERM BP-4859が付与されている。
【００８１】
上記により作製したRSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30及びRSFD2547M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2345I, RSFD1823Dを常法にしたがいB-399株に導入し、各々Ｌ−リジン生産株を得た。以上の菌株についてのＬ−リジン生産性について評価を行なった。コントロールとして、B-399/RSFD80についてもＬ−リジン生産性の評価を行った。なお、B-399株の入手方法は際公開パンフレットWO95/16042に記載されている。
【００８２】
培養は、国際公開パンフレットWO95/16042に記載されている方法と同様のＬ−リジン生産培地を用い、培養時間48時間、温度37℃の条件下、攪拌114〜116rpmで行った。結果を表５に示した。
【００８３】
【表５】
0004088982.tif 000006
【００８４】
【実施例４】
変異型ＤＤＰＳ及び変異型ＡＫIII遺伝子を導入した株によるＬ−リジンの発酵生産（２）
エシェリヒア属細菌に変異型ＤＤＰＳ遺伝子と、変異型ＡＫIII遺伝子を保持させて、Ｌ−リジンの生産性が改善できることが実施例３で確認された。この効果が、宿主を変更した場合にも維持されるかどうかを実験した。
【００８５】
宿主には、E. coli W3110(tyrA)株を用いた。W3110(tyrA)株は欧州特許公開92年488424号公報にその詳しい記載がある。欧州特許公開92年488424号公報には、W3110(tyrA)株にプラスミドを導入して形成される株が多く記載されている。例えば、プラスミドpHATermを導入して得られる株は、E. coli W3110(tyrA)/pHATerm株と命名され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５  茨城県つくば市東１丁目１番３号）に1991年11月18日付でブタペスト条約に基づき国際寄託されており、寄託番号FERM BP-3653が付与されている。このE. coli W3110(tyrA)/pHATerm株からプラスミドpHATermを脱落させることによってもW3110(tyrA)株を取得することができる。プラスミドの脱落は常法によって行うことができる。
【００８５】
前記のようにして得られたW3110(tyrA)株に、実施例３で得られた変異型ＤＤＰＳ及び変異型ＡＫIII遺伝子をともに含有するプラスミドRSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30及びRSFD2547M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2345I, RSFD1823Dを導入し,実施例３と同様にＬ−リジン生産性について評価を行なった。コントロールとして、W3110(tyrA)株にRSFD80を常法に従い導入し、W3110(tyrA)/RSFD80を得、この菌株についてもＬ−リジン生産性の評価を行った。結果を表６に示した。
【００８６】
【表６】
0004088982.tif 000007
【００８７】
【実施例５】
変異型ＡＫIII遺伝子を導入した株によるＬ−スレオニンの発酵生産
E. coliスレオニン生産菌としては B-3996株が現在知られている内で最も高い生産能を持っている。そこで、変異型ＡＫIIIを評価するに当たり、B-3996株を宿主に用いることとした。B-3996株はUSP5,175,107 に記載される株で、Reserch   Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breedingに、登録番号BKIIM B-3996のもとに寄託されている。また、評価する変異型ＡＫIII遺伝子としては実施例４においてＬ−リジンの生産性の良かった変異型の中から3種類（RSFDY6, RSFD2547M, RSFD1823Dの変異型ＡＫIII遺伝子）を選び実験に供した。まず、変異型ＡＫIII遺伝子の発現量を増すため、pMLYSC2*Y6上にあった変異型ＡＫIII遺伝子をpUC19（宝酒造社製）のlacZプロモーター下流につなぎかえた。こうして作成された新規プラスミドをpLLC*Y6命名した（図３）。pU2547MとpU1823Dについては、元々pUC19（宝酒造社製）のlacZプロモーター下流に変異型ＡＫIII遺伝子が位置しているのでそのまま用いた。
【００８８】
これらプラスミドを常法にしたがいB-3996株に導入、評価を行なった。培養は、国際公開パンフレットWO94/11517に記載されている方法により行った。
【００８９】
B-3996株にpLLC*Y6, pU2547M, pU1823Dを形質転換したものそれぞれについて、リジン 1g/L 添加、無添加の２通りの条件で培養を行なった。コントロールとしては宿主 B-3996株のみのものと、国際公開パンフレットWO94/11517に記載されているB-3996/pLLC*80をおいた。
【００９０】
結果を表７に示す。表７中のリジン感受性とは、（リジン添加時の対消費糖収率）／（リジン無添加時の対消費糖収率）である。リジン添加培養時にみられる対消費糖収率の低下はB-3996株では無添加区に対し約0.74、B-3996/pLLC*80においては約0.90である。今回新たに取得した変異型ＡＫIII遺伝子はそれぞれ、スレオニンの生産性及びリジン感受性においても若干の優位性を示していた。
【００９１】
【表７】
0004088982.tif 000008
【００９２】
【発明の効果】
本発明により、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリヒア属細菌由来の変異型ＡＫIII遺伝子が得られた。この遺伝子をエシェリヒア属細菌に導入することにより、従来よりもさらに改良されたＬ−アミノ酸生産菌を得ることができた。このＬ−アミノ酸生産菌を用いることによって、従来より優れた発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供することができる。
【００９３】
【配列表】
0004088982.tif 000009
0004088982.tif 000010
0004088982.tif 000011
0004088982.tif 000012
0004088982.tif 000013
0004088982.tif 000014
【００９４】
配列番号：２
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG                                                 20
【００９５】
配列番号：３
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
GAATTCCTTT GCGAGCAG                                                   18
【００９６】
配列番号：４
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
GAGGTCAGAC CGGTGGTATC AAGGGTTAAT GC                                   32
【００９７】
配列番号：５
配列の長さ：51
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
GGTATCAAGG GTTAATGCCA CGCTCACTTC GATCGTGGTG ATTAAGTCTA C              51
【００９８】
配列番号：６
配列の長さ：51
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
GGTATCAAGG GTTAATGCCA CGCTCACTTC AACCGTGGTG ATTAAGTCTA C 51
【００９９】
配列番号：７
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
TGCAGTATAT TCAGGCTGTG CAAAGTGAGC                                      30
【図面の簡単な説明】
【図１】  pMLYSC2の製造工程を示す図
【図２】  RSFDシリーズのプラスミドの製造工程を示す図
【図３】  pLLC*Y6の製造工程を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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