(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（１）〜（５）に示す理化学的性質を有するα−ケト酸還元酵素。
（１）作用
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、α−ケト酸を還元し、（Ｒ）−α−ヒドロキシ酸を生成する。
（２）基質特異性
（ａ）還元反応の補酵素として還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。
（ｂ）２−クロロフェニルグリオキシル酸を還元して、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成する。
（ｃ）２−クロロフェニルグリオキシル酸に対して還元活性を有するが、２−クロロマンデル酸のいずれの光学異性体に対しても実質的に脱水素活性を有しない。
（３）至適ｐＨ
ｐＨ ５．０−５．５。
（４）至適温度
４５−５５℃。
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム −ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約３５，０００。ゲルろ過による分子量が約６３，０００。
【請求項２】
ロイコノストック属に属する微生物によって産生される請求項１に記載のα−ケト酸還元酵素。
【請求項３】
ロイコノストック属に属する微生物が、ロイコノストック・メセンテロイデスである請求項２に記載のα−ケト酸還元酵素。
【請求項４】
ロイコノストック・メセンテロイデスに属する微生物が、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum ）である請求項３に記載のα−ケト酸還元酵素。
【請求項５】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のα−ケト酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、３０以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項５に記載されたポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
【請求項８】
更に、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、請求項７に記載された組換えベクター。
【請求項９】
脱水素酵素がギ酸脱水素酵素である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
ギ酸脱水素酵素がマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）に由来する請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
脱水素酵素がグルコース脱水素酵素である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１２】
グルコース脱水素酵素がバシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）に由来する請求項１１に記載の組換えベクター。
【請求項１３】
請求項５に記載されたいずれかのポリヌクレオチド、または請求項７に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項６に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１５】
ロイコノストック属に属し、請求項１に記載の酵素、または請求項６に記載のタンパク質を産生する微生物を培養する工程を含む、請求項１に記載の酵素、または請求項６に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１６】
ロイコノストック属に属する微生物が、ロイコノストック・メセンテロイデスである請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
ロイコノストック・メセンテロイデスに属する微生物が、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum）である請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
請求項１または請求項２に記載のα−ケト酸還元酵素、請求項６に記載のタンパク質、該酵素またはタンパク質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物、をα−ケト酸に作用させ、生成する光学活性α−ヒドロキシ酸を回収する工程を含む光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【請求項１９】
α−ケト酸が式(I)で示されるフェニルグリオキシル酸誘導体であり、生成する式(II)で表される光学活性なマンデル酸誘導体を回収する工程を含む、請求項１８に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【化１】
式(I)
0004154182.tif 000029
（式中Xは水素原子またはアルカリあるいはアルカリ土類金属を表し、Rはオルト位、メタ位またはパラ位が一個または複数個置換されていることを意味し、置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、アルコキシ基またはチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、またはフェノキシ基を表す）
【化２】
式(II)
0004154182.tif 000030
（式中XとRは、それぞれ式(I)のXとRと同じ置換基を表す）
【請求項２０】
フェニルグリオキシル酸誘導体が、オルト位が置換されたフェニルグリオキシル酸誘導体である請求項１９に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【請求項２１】
オルト位がハロゲン原子に置換されたフェニルグリオキシル酸誘導体である請求項２０に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【請求項２２】
フェニルグリオキシル酸誘導体が、メタ位が置換されたフェニルグリオキシル酸誘導体である請求項１９に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【請求項２３】
メタ位がハロゲン原子に置換されたフェニルグリオキシル酸誘導体である請求項２２に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【請求項２４】
α−ケト酸が、２−クロロフェニルグリオキシル酸であり、光学活性α−ヒドロキシ酸が（Ｒ）−２−クロロマンデル酸である請求項１８に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【請求項２５】
微生物が、請求項１３に記載の形質転換体である請求項１８に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【請求項２６】
更に、付加的に酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換する工程を含むことを特徴とする請求項１８に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【請求項２７】
酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として脱水素反応を触媒する酵素の作用によって酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換する請求項２６に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【請求項２８】
酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として脱水素反応を触媒する酵素が、ギ酸脱水素酵素および／またはグルコース脱水素酵素である、請求項２７に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性の新規なα−ケト酸還元酵素に関する。また、本発明は、該酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を発現する組換え体を用いた光学活性なα−ヒドロキシ酸、特に（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素は高い触媒機能をもつだけでなく、基質特異性、反応特異性とともに、立体特異性を示す。酵素の立体特異性は、いくつかの例外はあるものの、ほとんど絶対的といえる。
近年における研究の精密化に伴い、医薬品、農薬、飼料、香料などの分野で光学活性体を扱うことの重要性が増している。これは光学異性体が生理活性をまったく異にする場合があるため、光学異性体を特異的に得るための技術は重要である。たとえば対掌体の一方のみが有効な生理活性を示す場合、両者の共存によって、もう一方の異性体が単に活性を持たないという問題のみならず、有効な対掌体に対して競合阻害をもたらす。その結果、ラセミ体の生物活性が有効な対掌体に対して1／2以下に激減してしまうこともある。従って、光学的に純粋な対掌体をいかにして入手（合成または分割）するかは、産業上重要な課題となっている。
【０００３】
この課題に対して、ラセミ体を合成した上で、それを効果的に光学分割する手法が広く用いられている。しかし合成後の分割による手法では、常に目的としない対掌体を副生成物として合成することになるので、原料の有効利用という点では問題を残す。たとえ回収された副生成物を原料として再生するとしても、常に一定量の副生成物の合成を繰り返すことには変わりは無い。したがって、副生成物や多量の廃液を生じない酵素法による光学分割が注目されている。酵素法による光学分割は、酵素の特異性を利用して、必要な対掌体を特異的に生成させる方法である。不要な対掌体の合成を低く抑えることができるので、光学的な純度に優れた生成物を容易に得ることができる。また、原料の有効利用の点でも有利である。
【０００４】
さて、光学活性α−ヒドロキシ酸には医薬や農薬の合成用中間体として有用な光学活性マンデル酸等が含まれる。ベンゼン環に置換基を有する光学活性マンデル酸を製造する方法として、以下のような方法が知られている。
・ラセミ体の分別結晶による光学分割法（特開2001-72644）
・クロマトグラフィーによる光学分割法（Journal of Chromatography. (1983), 282, 83-8）
・ニトリラーゼを用いる方法（特開平4-99496、特開平6-237789）
・ラセミ体の一方を酸化することにより光学活性体を得る方法（特開平6-165695）
・ヒドロキシルニトリルリアーゼを用いる方法（特開 2001-354616）
【０００５】
ニトリラーゼを用いる方法は、原料としてマンデロニトリル誘導体を必要とする。マンデロニトリル誘導体の合成には、青酸ソーダが必要である。
ヒドロキシニトリルリアーゼを用いる方法は原料として、ベンズアルデヒドと青酸を原料とする。青酸は毒性を有するので、取扱いに注意しなければならない。
【０００６】
これまでに、ベンゼン環に置換基を有しないフェニルグリオキシル酸を微生物によって不斉還元し、光学活性なマンデル酸を得る方法は知られている（特開昭57-198096、特開昭57-198097、特開昭63-32492、特開平6-7179など）。
ベンゼン環に置換基を有するマンデル酸においても、酵素的な反応によって光学活性体を得ることができれば有用である。しかし、現在までに、工業的な規模で実施可能な、酵素的な手法は知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、酵素的な手法によってベンゼン環に置換基を有する光学活性α−ヒドロキシ酸を製造するための方法を提供することである。
【０００８】
また、本発明は、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと省略する）を補酵素として、α−ケト酸を還元して、高い光学純度のα−ヒドロキシ酸を生成する新規な酵素の提供を課題とする。更に本発明は、目的とする性状を備えた該酵素をコードするＤＮＡを単離し、組換え体として得ることを課題とする。加えて、組換え体による光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法の提供をも課題とするものである。
【０００９】
【問題を解決するための手段】
本発明者らは、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム(Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum)が、立体選択的に２−クロロフェニルグリオキシル酸を還元して（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成することを明らかにした。この反応は、高い反応収率と高い立体選択性を有していた。
次に本発明者らは、本菌株の無細胞抽出液から、２−クロロフェニルグリオキシル酸を還元する酵素を電気泳動的に単一のバンドになるまで精製し、その諸性質を明らかにした。その結果、本酵素が様々なα−ケト酸を還元する新規なα−ケト酸還元酵素であることを見出した。本酵素は還元反応において２−クロロフェニルグリオキシル酸を還元して高い収率で高い光学純度の（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成した。更に本発明者らは、本酵素をコードするＤＮＡを単離し、本酵素を高発現する形質転換体を得た。そして得られた形質転換体が、光学活性α−ヒドロキシ酸の酵素的な製造方法に有用であることを確認し、本発明を完成した。
【００１０】
既に述べたように、ベンゼン環に置換基を有しないフェニルグリオキシル酸を微生物によって不斉還元し、光学活性なマンデル酸を得る方法は公知である。しかし、ベンゼン環に置換基を有するフェニルグリオキシル酸を基質として、同じ微生物が同様の反応を触媒することは一般に考えにくい。置換基の立体障害、基質化合物や生成物の菌に対する毒性、更には基質が有する置換基による電子的効果の違いなどから、同様の反応は期待できないと考えられる。
後に述べる実施例においても明らかにしているように、たとえば置換基を持たないフェニルグリオキシル酸誘導体に作用することができるキャンディダ・ファマータ IFO 0856（特開平6-7179）は、式(I)の化合物である２−クロロフェニルグリオキシル酸には作用しなかった。この化合物は、フェニルグリオキシル酸誘導体を構成するベンゼン環のオルト位にCl置換を有する構造からなる化合物である。従って、本発明らが得た知見は、非常に意外なことであった。更に驚くべきことに、微生物が生成する光学活性マンデル酸の光学純度は非常に高く、実用に際し問題の無いレベルであった。
【００１１】
従来、ＮＡＤＨ依存的にα−ケト酸還元活性を有する酵素に関しては、D-乳酸脱水素酵素(D-LDH)、D-α-ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素（D-HicDH）、D-マンデル酸脱水素酵素(D-ManDH)が乳酸菌などから高度に精製され、その諸性質が明らかにされている(Enzyme Microb.Technol. , 14 , 28-35(1992)、Appl.Environ.Microbiol. , 68 , 2 , 947-951(2002))。しかし、いずれもα−ケト酸に対応するα−ヒドロキシ酸に対して脱水素活性を有しており、本発明のα−ケト酸還元酵素とは明らかに性質が異なる。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下のα−ケト酸還元酵素、この酵素をコードするＤＮＡ、この酵素の製造方法、および用途に関する。あるいは本発明は、以下のα−ヒドロキシ酸の製造方法に関する。
〔１〕次の（１）および（２）に示す理化学的性質を有するα−ケト酸還元酵素。
（１）作用
ＮＡＤＨを補酵素として、α−ケト酸を還元し、（Ｒ）−α−ヒドロキシ酸を生成する。
（２）基質特異性
（ａ）還元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。
（ｂ）２−クロロフェニルグリオキシル酸を還元して、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成する。
（ｃ）２−クロロフェニルグリオキシル酸に対して還元活性を有するが、２−クロロマンデル酸のいずれの光学異性体に対しても実質的に脱水素活性を有しない。
〔２〕更に付加的に、次の（３）、（４）、および（５）に示す理化学的性質を有する〔１〕に記載のα−ケト酸還元酵素。
（３）至適ｐＨ
ｐＨ ５．０−５．５。
（４）至適温度
４５−５５℃。
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム −ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約３５，０００。ゲルろ過による分子量が約６３，０００。
〔３〕ロイコノストック属に属する微生物によって産生される〔１〕に記載のα−ケト酸還元酵素。
〔４〕ロイコノストック属に属する微生物が、ロイコノストック・メセンテロイデスである〔３〕に記載のα−ケト酸還元酵素。
〔５〕ロイコノストック・メセンテロイデスに属する微生物が、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム(Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum)である〔４〕に記載のα−ケト酸還元酵素。
〔６〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のα−ケト酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と５０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
〔７〕〔６〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質。
〔８〕〔６〕に記載されたポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
〔９〕更に、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、〔８〕に記載された組換えベクター。
〔１０〕脱水素酵素がギ酸脱水素酵素である、〔９〕に記載のベクター。
〔１１〕ギ酸脱水素酵素がマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）に由来する〔１０〕に記載のベクター。
〔１２〕脱水素酵素がグルコース脱水素酵素である、〔９〕に記載のベクター。
〔１３〕グルコース脱水素酵素がバシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）に由来する〔１２〕に記載の組換えベクター。
〔１４〕〔６〕に記載されたいずれかのポリヌクレオチド、または〔８〕に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
〔１５〕〔１４〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔７〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔１６〕ロイコノストック属に属し、〔１〕に記載の酵素、または〔７〕に記載のタンパク質を産生する微生物を培養する工程を含む、〔１〕に記載の酵素、または〔７〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔１７〕ロイコノストック属に属する微生物が、ロイコノストック・メセンテロイデスである〔１６〕に記載の製造方法。
〔１８〕ロイコノストック・メセンテロイデスに属する微生物が、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum）である〔１７〕に記載の製造方法。
〔１９〕〔１〕または〔２〕に記載のα−ケト酸還元酵素、〔７〕に記載のタンパク質、該酵素またはタンパク質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物、をα−ケト酸に作用させ、生成する光学活性α−ヒドロキシ酸を回収する工程を含む光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
〔２０〕α−ケト酸が式(I)で示されるフェニルグリオキシル酸誘導体であり、生成する式(II)で表される光学活性なマンデル酸誘導体を回収する工程を含む、〔１９〕に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【化３】
式(I)
0004154182.tif 000002
（式中Xは水素原子またはアルカリあるいはアルカリ土類金属を表し、Rはオルト位、メタ位またはパラ位が一個または複数個置換されていることを意味し、置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、アルコキシ基またはチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、またはフェノキシ基を表す）
【化４】
式(II)
0004154182.tif 000003
（式中XとRは、それぞれ式(I)のXとRと同じ置換基を表す）
〔２１〕フェニルグリオキシル酸誘導体が、オルト位が置換されたフェニルグリオキシル酸誘導体である〔２０〕に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
〔２２〕オルト位がハロゲン原子に置換されたフェニルグリオキシル酸誘導体である〔２１〕に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
〔２３〕フェニルグリオキシル酸誘導体が、メタ位が置換されたフェニルグリオキシル酸誘導体である〔２０〕に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法
〔２４〕メタ位がハロゲン原子に置換されたフェニルグリオキシル酸誘導体である〔２３〕に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法
〔２５〕α−ケト酸が、２−クロロフェニルグリオキシル酸であり、光学活性α−ヒドロキシ酸が（Ｒ）−２−クロロマンデル酸である〔１９〕に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
〔２６〕微生物が、〔１４〕に記載の形質転換体である〔１９〕に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
〔２７〕更に、付加的に酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と省略する）をＮＡＤＨに変換する工程を含むことを特徴とする〔１９〕に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
〔２８〕ＮＡＤ＋を補酵素として脱水素反応を触媒する酵素の作用によってＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換する〔２７〕に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
〔２９〕ＮＡＤ＋を補酵素として脱水素反応を触媒する酵素が、ギ酸脱水素酵素および／またはグルコース脱水素酵素である、〔２８〕に記載の光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のα−ケト酸還元酵素は、以下の理化学的性状（１）、および（２）を有する。
（１）作用
ＮＡＤＨを補酵素として、α−ケト酸を還元し、（Ｒ）−α−ヒドロキシ酸を生成する。
（２）基質特異性
（ａ）還元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。
（ｂ）２−クロロフェニルグリオキシル酸を還元して、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成する。
（ｃ）２−クロロフェニルグリオキシル酸に対して還元活性を有するが、２−クロロマンデル酸のいずれの光学異性体に対しても実質的に脱水素活性を有しない。
【００１４】
本発明のα−ケト酸還元酵素は、好ましくは更に付加的に、次の（３）−（５）に示す理化学的性質を有する。
（３）至適ｐＨ
ｐＨ ５．０−５．５。
（４）至適温度
４５−５５℃。
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム −ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）により約３５，０００。ゲルろ過による分子量が約６３，０００。
【００１５】
本発明のα−ケト酸還元酵素は、たとえばロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムから得ることができる。この微生物に由来するα−ケト酸還元酵素は、補酵素として還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと省略する）を実質的に利用することができない。しかし、ＮＡＤＰＨの利用性に関わらず、前記物理学化学的性状（１）および（２）を有する酵素は、本発明に含まれる。あるいは好ましくは更に付加的に前記性状（３）−（５）を有する酵素は、本発明に含まれる。
【００１６】
本発明において、２−クロロマンデル酸に対する脱水素活性は、次のようにして確認することができる。
２−クロロマンデル酸に対する脱水素活性測定法:
５０mM トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．５）、２．５mM ＮＡＤ＋、１mM ２−クロロマンデル酸及び酵素を合む反応液中３０℃で反応させ、ＮＡＤＨの生成にともなう３４０ nmの吸光度の増大を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの生成を触媒する酵素量とした。
【００１７】
一方本発明において、あるタンパク質が２−クロロマンデル酸のいずれの光学異性体に対しても脱水素活性を実質的に有しないことは、２−クロロフェニルグリオキシル酸の還元を１００とした相対活性で表した場合、２−クロロマンデル酸のいずれの光学異性体に対する脱水素活性も２０％以下であることによって確認することができる。
【００１８】
また、あるタンパク質がＮＡＤＰＨを実質的に利用できないことは、ＮＡＤＨ依存的に２−クロロフェニルグリオキシル酸を還元した際の活性を１００とした相対活性で表した場合、ＮＡＤＰＨ依存的に２−クロロフェニルグリオキシル酸を還元する活性が２０％以下であることによって確認することができる。
【００１９】
本発明において、ＮＡＤＰＨ依存的な２−クロロフェニルグリオキシル酸の還元活性は、次のようにして確認することができる。
ＮＡＤＰＨ依存的な２−クロロフェニルグリオキシル酸の還元活性測定法:
５０mM 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．５）、０．２mM ＮＡＤＰＨ、１mM ２−クロロフェニルグリオキシル酸及び酵素を合む反応液中３０℃で反応させ、ＮＡＤＰＨの減少にともなう３４０ nmの吸光度の減少を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量とした。
【００２０】
あるいは本発明における好ましいα−ケト酸還元酵素は、補酵素としてＮＡＤＨを利用しうること、α−ヒドロキシ酸に対して脱水素活性を実質的に有しないこと、また、ＮＡＤＨを補酵素として２−クロロフェニルグリオキシル酸を還元し、９９％ｅｅ以上の（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成することによって特徴付けることもできる。
【００２１】
上記のような理化学的性状を持つα−ケト酸還元酵素は、たとえばエンテロコッカス属、ラクトバシラス属、ロイコノストック属の乳酸菌の培養物より精製することができる。エンテロコッカス属としては、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、ラクトバシラス属としては、ラクトバシラス・フルクティボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバシラス・ヒルガルディ（Lactobacillus hilgardii）、ロイコノストック属乳酸菌としては、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum ）などが特に本発明によるα−ケト酸還元酵素の産生能に優れる。本発明のα−ケト酸還元酵素を得るために利用することができるロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムとしては、ＡＴＣＣ １７０７２、ＮＲＩＣ １０８５などが挙げられる。
【００２２】
上記微生物は、ＭＲＳ培地等の乳酸菌の培養に用いられる一般的な培地で培養される。十分に増殖させた後に菌体を回収し、２−メルカプトエタノールやフェニルメタンフルホニルフルオリド等の還元剤やプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製することができる。たとえば、フェニル−セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチル−セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトを用いた吸着クロマトグラフィー等を経て電気泳動的に単一バンドにまで精製することができる。
【００２３】
本発明は、α−ケト酸還元酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。本発明において、ポリヌクレオチドは、DNAやRNA等の天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であることもできる。また本発明のポリヌクレオチドは、DNA-RNAのキメラ分子であることもできる。本発明のα−ケト酸還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明によるα−ケト酸還元酵素の好ましい態様を構成する。
【００２４】
本発明のα−ケト酸還元酵素をコードするポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記理化学的性質（１）−（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者であれば、配列番号：１記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
【００２５】
また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性質（１）−（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【００２６】
さらに、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、より好ましくは７０%以上のホモロジーを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明における望ましいタンパク質は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と８０％以上、あるいは８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、たとえば９８％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなる。タンパク質のホモロジー検索は、たとえばSWISS-PROT, PIRなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドを含む。単離されたポリヌクレオチドとは、天然に存在するポリヌクレオチドとは異なる形態で存在するポリヌクレオチドを言う。たとえば、ベクターや他の生物のゲノムにインテグレートされたポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドに含まれる。あるいは、cDNA、PCR産物、あるいは制限酵素の切断断片として得られた本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。あるいは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部として利用されたポリヌクレオチドも、単離されたポリヌクレオチドに含まれる。
【００２８】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてSWISS-PROTを対象にBLASTプログラムを用いてホモロジー検索を行った。その結果、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）が産生するケトパント酸還元酵素(EC 1.1.1.169)が、既知のタンパク質の中で高いホモロジーを示した。しかしケトパント酸還元酵素は、ＮＡＤＰＨ依存的にケトパント酸を還元する酵素であり、本発明のα−ケト酸還元酵素とは異なる性質を持つタンパク質であった。
また、このタンパク質に対するホモロジーは、Identityで６７／１４８（４５％）、Positiveで９５／１４８（６３％）であった。部分的な一致のみであったため、Genetyx-win（ソフトウェア開発株式会社製）ソフトのMaximum Matchingプログラムを用いて計算（J.Biochem. , 92 , 1173-1177(1984)）した結果、両者のホモロジーは４６％であった。本発明の５０％以上のホモロジーとは、例えば、Maximum Matchingプログラムを用いた相同性の値を表す。
【００２９】
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。本発明はまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。
本発明のα−ケト酸還元酵素のホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、たとえば１００以下、通常５０以下、好ましくは３０以下、より好ましくは１５以下、更に好ましくは１０以下、あるいは５以下のアミノ酸残基の変異は許容される。一般に蛋白質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。
【００３０】
例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。
【００３１】
本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等とは、当該タンパク質が前記（１）−（２）に示した酵素化学的性状を有することを意味する。当業者であれば、配列番号：１記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりα−ケト酸還元酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そのα−ケト酸還元酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載のα−ケト酸還元酵素のホモログを得ることが可能である。
【００３２】
さらに、本発明のα−ケト酸還元酵素のホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは７０％以上のホモロジーを有するタンパク質をいう。タンパク質のホモロジー検索は、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、各種のアミノ酸配列データベースやDNAデータベースを対象にして行うことができる。データベースには、たとえばSWISS-PROT、PIRなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを用いることができる。これらのデータベースは、いずれもインターネットを通じて利用することができる。
【００３３】
本発明においてα−ケト酸還元酵素、あるいはそのホモログは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な活性を有する限り、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また本発明のα−ケト酸還元酵素、あるいはそのホモログは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な活性を有する限り、断片であってもよい
【００３４】
本発明のα−ケト酸還元酵素活性を有するタンパク質は、実質的に純粋なタンパク質とすることができる。本発明において、実質的に純粋なタンパク質とは、他の生物学的な分子を実質的に含まないことを言う。より具体的には、実質的に純粋なタンパク質とは、乾燥重量で、通常７５％以上、あるいは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の純度を有する。タンパク質の純度を決定する方法は公知である。具体的には、各種カラムクロマトグラフィー、あるいはＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動分析によって、タンパク質の純度を知ることができる。
【００３５】
本発明のα−ケト酸還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。
たとえば配列番号：１に記載の塩基配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡを得ることができる。
【００３６】
さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００３７】
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、ＲＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）などにより本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得られたＤＮＡが含まれる。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、たとえば以下に示す群から選択された属に属する微生物から上記のような方法によって得ることができる。これらの属に属する微生物は、いずれも前記式(I)で示されるフェニルグリオキシル酸誘導体を基質として、(R)-マンデル酸誘導体を生成する。
キャンディダ（Candida）属、
クリプトコッカス（Cryptococcus）属、
ハンゼヌラ（Hansenula）属、
オガタエア（Ogataea）属、
ピキア（Pichia）属、
ロドスポリディウム（Rhodosporidium）属、
ロドトルラ（Rhodotorula）属、
サッカロマイセス（Saccharomyces）属、
トリコスポロン（Trichosporon）属、
ヤマダジマ（Yamadazyma）属、
ロドコッカス（Rhodococcus）属、
アミコラトプシス（Amycolatopsis）属、
アルカリゲネス（Alcaligenes）属、
アルスロバクター（Arthrobacter）属、
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、
コマモナス（Comamonas）属、
コリネバクテリウム（Corynebactrium）属、
エンテロバクター（Enterobacter）属、
エンテロコッカス（Enterococcus）属、
ラクトバシラス（Lactobacillus）属、
ロイコノストック（Leuconostoc）属、
ミクロバテリウム（Microbacterium）属、
ミクロコッカス（Micrococcus）属、
プロテウス（Proteus）属、および
シュードモナス（Pseudomonas）属
【００３９】
より具体的には、上記の群から選択された属に属する微生物として、以下の微生物を示すことができる。これらの微生物は、いずれも高い光学純度で(R)-マンデル酸誘導体を生成しうる。
キャンディダ・エルノビー（Candida ernobii）、
キャンディダ・グロペンギエセリ（Candida gropengiesseri）、
キャンディダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）、
キャンディダ・サケ（Candida sake）、
キャンディダ・シェハタエ（Candida shehatae）、
キャンディダ・シルバティカ（Candida silvatica）、
クリプトコッカス・フラバス（Cryptococcus flavus）、
クリプトコッカス・フミコラス（Cryptococcus humicolus）、
クリプトコッカス・マルセランス（Cryptococcus marcerans）、
ハンセヌラ・ベッキー（Hansenula beckii）、
ハンセヌラ・カナデンシス（Hansenula canadensis）、
ハンセヌラ・グルコジマ（Hansenula glucozyma）、
オガタエア・ピニ（Ogataea pini）、
ピキア・カルソニー（Pichia carsonii）、
ピキア・ファビアニー（Pichia fabianii）、
ピキア・ハプロフィラ（Pichia haplophila）、
ピキア・サブペリクローサ（Pichia subpelliculosa）、
ロドスポリディウム・ダクリオディウム（Rhodosporidium dacryodium）、
ロドスポリディウム・ディオボバタム（Rhodosporidium diobovatum）、
ロドスポリディウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、
ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、
ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta）、
ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、
サッカロマイセス・シェレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、
トリコスポロン・ブラシカエ（Trichosporon brassicae）、
トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、
ヤマダジマ・キャスティラエ（Yamadazyma castillae）、
ヤマダジマ・ナカザワエ・バラエティ・アキタエンシス（Yamadazyma nakazawae var. akitaensis）、
ヤマダジマ・スコリティ（Yamadazyma scolyti）、
ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、
ロドコッカス・ファシアンス（Rhodococcus fascians）、
ロドコッカス・オブエンシス（Rhodococcus obuensis）、
ロドコッカス・ロドクロス（Rhodococcus rhodochrous）、
アミコラトプシス・オリエンタリス・サブスピーシーズ・オリエンタリス（Amycolatopsis orientalis subsp. orientalis）、
アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）、
アルスロバクター・プロトフォルミアエ（Arthrobacter protophormiae）、
ブレビバクテリウム・ヨーディナム（Brevibacterium iodinum）、
コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、
エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、
エンテロコッカス・カセリフラバス（Enterococcus casseliflavus）、
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、
エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、
ラクトバシラス・ビリデッセンス（Lactobacillus viridescens）、
ラクトバシラス・マリ（Lactobacillus mali）、
ラクトバシラス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、
ラクトバシラス・フルクティボランス（Lactobacillus fructivorans）、
ラクトバシラス・ヒルガルディ（Lactobacillus hilgardii）、
ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum）、
ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、
プロテウス・バルガリス（Proteus vulgaris）、および
シュードモナス・ジミヌタ（Pseudomonas diminuta）
【００４０】
これらの微生物は、様々な寄託機関から細胞株として入手することができる。細胞の寄託機関としては、たとえば以下に示すような機関を示すことができる。あるいは、当業者であれば様々な試料から、必要な微生物を分離することもできる。
IFO：  財団法人発酵研究所
DSM：  Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
ATCC：  American Type Culture Collection
JCM：  理化学研究所微生物系統保存施設
IAM：  東京大学応用微生物研究所
NRIC：  東京農業大学
【００４１】
このようにして単離された、本発明によるα−ケト酸還元酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、α−ケト酸還元酵素発現ベクターが提供される。
また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のα−ケト酸還元酵素を組換え体から得ることができる。
【００４２】
本発明においてα−ケト酸還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、α−ケト酸還元酵素を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、α−ケト酸還元酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス(Rhodococcus)属
ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００４３】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤＨを電子供与体とするα−ケト酸還元酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００４４】
そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
【００４５】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ PＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のｐＳＥ４２０（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターｐＳＥ４２０Ｄ（特開2000-189170に記載）が好適に利用できる。
【００４６】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミラーゼ)などが利用できる。
【００４７】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００４８】
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００４９】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００５０】
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００５１】
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００５２】
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である (J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
【００５３】
ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997) ）。
【００５４】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５５】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５６】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５７】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ(Zygosaccharomyces rouxii)由来のpSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。
【００５８】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・アンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ)、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、 PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。
【００５９】
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平 08-173170）。
【００６０】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
【００６１】
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。
【００６２】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００６３】
本発明は、前記本発明のα−ケト酸還元酵素、該酵素活性を有するタンパク質、該酵素または該タンパク質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物、をα−ケト酸に作用させ、生成する光学活性α−ヒドロキシ酸を回収するか工程を含む光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法に関する。本発明において使用するα−ケト酸還元酵素または、該酵素活性を有するタンパク質の生産能を有する微生物は、α−ケト酸還元酵素生産能を有するロイコノストック属に属するすべての菌株、突然変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換株を含む。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物やその処理物を、基質であるα−ケト酸を含む反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されない。
【００６４】
本発明におけるα−ケト酸還元酵素産生能を有する微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００６５】
これら微生物は、醗酵学の分野で公知の情報に従って培養することができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培地は、液体培地または固体培地を使用することができる。
【００６６】
具体的には、炭素源として、次に示すような一般的な炭素源より、使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
0004154182.tif 000004
【００６７】
0004154182.tif 000005
【００６８】
アミノ酸類：            炭化水素類：
グリシン、              ノルマルパラフィンなど
グルタミン、
アスパラギンなど
【００６９】
窒素源としては、次に示すような一般的な窒素源の中から、使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
有機窒素化合物：
肉エキス、        ペプトン、        酵母エキス、
大豆加水分解物、  ミルクカゼイン、  カザミノ酸、
各種アミノ酸、    コーンスティープリカー、
その他の動物、植物、微生物の加水分解物など、
【００７０】
無機窒素化合物：
アンモニア、      硝酸アンモニウム、    硫酸アンモニウム、
塩化ナトリウムなどのアンモニウム塩、
硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素など
【００７１】
また、微生物のα−ケト酸還元酵素産生能を高めるために、誘導物質を用いることができる。誘導物質としては、目的とする光学活性なα−ヒドロキシ酸酸誘導体、もしくはα−ケト酸酸誘導体を、使用する微生物に応じて使用することができる。
【００７２】
さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等より適宜一種または二種以上を選択して使用することができる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を培養液中に添加してもよい。
【００７３】
培養は前記培地成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。
【００７４】
培養条件は、微生物の種類、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、該菌株が増殖し、フェニルグリオキシル酸誘導体からマンデル酸誘導体への変換能力を有しうる条件であれば特に制限はない。
【００７５】
通常は、培養開始時のpHを4から10、好ましくは6から8に調節し、15から70℃、好ましくは25から40℃の温度条件下で培養することが望ましい。培養時間はフェニルグリオキシル酸誘導体からマンデル酸誘導体への変換能力を有する菌体が得ることができれば特に制限はなく、通常は1日から7日、このましくは1日から3日培養する。
【００７６】
また、かかる微生物菌体の処理物としては、例えば、上記微生物の凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体自己消化物、菌体抽出物、菌体磨砕物、菌体の超音波処理物などがあげられ、さらに菌体抽出物から公知の方法を組み合わせて精製取得した酵素も用いることができる。このとき、酵素は精製酵素であっても部分精製酵素であってもよい。
【００７７】
また、本発明の微生物菌体あるいは菌体処理物は、たとえばポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（κ-カラギーナンゲル法など）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法、イオン交換樹脂法などの公知方法により固定化して使用することもできる。
【００７８】
本発明における酵素または微生物による不斉還元方法は、微生物を酵素が誘導される適切な前記培養条件において培養を行い、得られた培養液、あるいは培養液から採取した菌体や該菌体処理物に反応基質を加えて、不斉還元反応を行なうことができる。また、前記培養条件と同じpH、温度範囲で、1日から7日間、培養と並行しても行うことができる。
【００７９】
反応条件としては、たとえば以下の条件を示すことができる。
pH 4.0から9.0、好ましくはpH 5.0から8.0、
温度15から50℃、好ましくは25から40℃、
反応時間は、4時間から7日間接触させる
一般に、微生物の培養と不斉還元反応とは、別に行った方が良好な結果を期待できる。
【００８０】
また後者の反応においては、還元エネルギー源として、糖類、アルコール類、あるいは糖アルコール類などの存在下で不斉還元反応を行うことにより、さらに効率的な反応が期待できる。糖類としては、グルコース、フルクトース、シュクロース等を用いることができる。アルコール類としては、エタノール、イソプロパノール、グリセロール等が利用できる。またソルビトールなどを糖アルコール類として示すことができる。還元エネルギーのために添加する化合物は、反応基質であるα−ケト酸の量に応じて添加することができる。
【００８１】
還元エネルギー源の消費に伴って、反応液のpHに変化が見られる場合には、適当な酸、アルカリを用いてpHを一定範囲に調節することで、さらに良好な反応性を維持して、反応を行なうことも可能である。
【００８２】
本発明において生菌体を使用した場合、反応液中に界面活性剤を添加しておけば反応時間の短縮をはかることができ好ましい。この目的に用いられる界面活性剤としては、生菌体の細胞壁の透過性をあげるものであれば特に制限はなく、臭化セチルピリミジウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、トリトンX-100、パライソオクチルフェニルエーテル、トゥイーン80、スパン60等があげられ、反応液に対して、0.0001〜1％程度使用することが好ましい。
【００８３】
また、反応液中に有機溶媒を添加することによっても、同様の効果を得ることができる。この目的に用いられる界面活性剤としては、生菌体の細胞壁の透過性をあげるものであれば特に制限はなく、トルエン、キシレンなどの有機溶媒があげられ、反応液に対して、0.0001〜1％程度使用することが好ましい。
【００８４】
また、反応液に添加せずとも、菌体を集菌後、界面活性剤および有機溶媒を含む水もしくはバッファーで前処理することにより、細胞壁の透過性を上げた菌体を用いてもよい。
【００８５】
本発明の不斉還元反応においては、好気的条件下では通常副生成物が多くなることもある。この場合には、嫌気的、あるいは酸素の制限条件下で反応を行うことにより、高い収率を期待できる。具体的には、たとえば窒素を液中もしくは気相中に通じて反応させることにより、収率の向上を期待できる。
【００８６】
本発明による光学活性なα−ヒドロキシ酸の製造方法におけるα−ケト酸として、たとえば下記式(I)で表されるフェニルグリオキシル酸誘導体を基質として用いることができる。
【００８７】
【化５】
式(I)
0004154182.tif 000006
【００８８】
（式中Xは水素原子またはアルカリあるいはアルカリ土類金属を表し、Rはオルト位、メタ位またはパラ位が一個または複数個置換されていることを意味し、置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、アルコキシ基またはチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、またはフェノキシ基を表す）。
【００８９】
置換基の具体例としては、臭素原子、塩素原子、フッ素原子、ヨウ素原子などのハロゲン原子、炭素数が１〜３個の分枝していてもよい低級アルキル基、またメトキシ基、エトキシ基などのアルコキシ基、チオメチル基などのチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、またはフェノキシ基などがあげられる。これら置換基が複数導入されていてもよく、さらにメチレンジオキシ、エチレンジオキシ、トリメチレンジオキシ基などの低級アルキレンジオキシ基のように環を形成することもできる。
【００９０】
式(I)の化合物が金属塩を表す場合、すなわちXが表す金属原子としては、ナトリウム、カリウムなどの一価金属、カルシウム、マグネシウムなどの二価金属などがあげられる。
【００９１】
本発明において、式(I)の化合物として、たとえば２−クロロフェニルグリオキシル酸（オルト位のRとしてCl）や、２−ブロモフェニルグリオキシル酸などの２−ハロフェニルグリオキシル酸化合物を用いることができる。
【００９２】
また、３−クロロフェニルグリオキシル酸（メタ位のRとしてCl）や、３−ブロモフェニルグリオキシル酸などの３−ハロフェニルグリオキシル酸化合物を用いることができる。
【００９３】
また、これら化合物のハロゲンの代わりに水酸基（RとしてOH）、アルキル基（Rとしてメチル、エチル）などで置換された化合物を用いることができる。
【００９４】
これらの基質化合物は、公知の方法によって製造することができる。たとえば実施例に示した２−クロロフェニルグリオキシル酸は、２−クロロベンゾイルクロライドを出発原料として、２−クロロフェニルオキソアセトニトリルを経て合成することができる(Bull. Soc. Chim. Fr. 850, 851 (1959))。
【００９５】
本発明による光学活性なα−ヒドロキシ酸の製造方法におけるα−ケト酸と、生成物であるα−ヒドロキシ酸の具体的な化合物の例を以下に示す。
フェニルグリオキシル酸：（Ｒ）−マンデル酸
２−ケトイソ吉草酸：（Ｒ）−２−ヒドロキシイソ吉草酸
２−ケトイソカプロン酸：（Ｒ）−２−ヒドロキシイソカプロン酸
３−クロロフェニルグリオキシル酸：（Ｒ）−３−クロロマンデル酸
ケトパント酸：（Ｒ）−パント酸
トリメチルピルビン酸：（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３，３−ジメチル酪酸
２−クロロフェニルグリオキシル酸：（Ｒ）−２−クロロマンデル酸
【００９６】
本発明における反応基質であるα−ケト酸は、目的とする生成物を効率的に生成できるように、適切な濃度で用いることができる。α−ケト酸は、水系溶媒における溶解性が高いことから、反応を阻害しない範囲で、高い濃度で用いることができる。α−ケト酸の反応液中における濃度として、たとえば０．１から５０%w/v、好ましくは１から２０%w/vを示すことができる。α−ケト酸は、一括（バッチ法）、分割添加（フェドバッチ法）あるいは連続添加（フィード法）等の任意の方法で添加することができる。
【００９７】
本発明における「光学活性α−ヒドロキシ酸」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含まれるα−ヒドロキシ酸を言う。本発明において、好ましい光学活性α−ヒドロキシ酸は、通常５０％ee以上、好ましくは８０％ee以上、より好ましくは９０％ee以上、更に好ましくは９５％ee以上の光学純度（enantiomeric excess; ee）を有する。光学活性α−ヒドロキシ酸の光学純度は、たとえば光学分割カラムなどを用いて確認することができる。本発明の「光学異性体」は、一般的に「光学活性体」および「鏡像異性体」と呼ばれる場合もある。
【００９８】
上記還元反応に付随してＮＡＤＨから生成するＮＡＤ＋の、ＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤ＋還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤ＋還元能は、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。たとえば、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてＮＡＤＨの再生を行うことができる。これらのＮＡＤＨ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるα−ヒドロキシ酸の製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいはＮＡＤＨの交換が可能な膜を介して接触させることができる。
【００９９】
また、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換した微生物の生菌体を前記α−ヒドロキシ酸の製造方法に利用する場合には、ＮＡＤＨ再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡＤＨ再生活性の高い微生物を用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＨ再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、ＮＡＤＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明のＮＡＤＨ依存性α−ケト酸還元酵素をコードするＤＮＡと同時に宿主に導入することによって、より効率的なＮＡＤＨ再生酵素とＮＡＤＨ依存性α−ケト酸還元酵素の発現、還元反応を行うことも可能である。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、両方、もしくは、片方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
【０１００】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【０１０１】
例えば、ＮＡＤＨ再生用酵素として、マイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）に由来するギ酸脱水素酵素、バシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）に由来するグルコース脱水素酵素が利用可能であり、具体的には、α-ケト酸還元酵素とギ酸脱水素酵素の遺伝子を導入した組換えベクターであるpSF-LMK1、α-ケト酸還元酵素とグルコース脱水素酵素の遺伝子を導入した組換えベクターであるpSG-LMK1、などが好適に利用される。
【０１０２】
本発明の酵素を用いた還元反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系、もしくは水に溶解する有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシドなどとの混合系により行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【０１０３】
本発明の反応は、反応温度４−６０℃、好ましくは１５−３７℃、ｐＨ３−１１、好ましくはｐＨ５−９、基質濃度０．０１−５０%、好ましくは０．１−２０%、さらに好ましくは０．１−１０％で行うことができる。反応系には必要に応じて補酵素ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＨが０．００１mM−１００mM、好ましくは、０．０１−１０mM添加できる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
【０１０４】
ＮＡＤＨの再生のために、たとえば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどが反応系に添加される。これらの化合物は、基質α−ケト酸に対してモル比で０．１−２０、好ましくは１−５倍過剰に添加することができる。一方、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素などの、ＮＡＤＨ再生用の酵素は、本発明のＮＡＤＨ依存性α−ケト酸還元酵素に比較して酵素活性で０．１−１００倍、好ましくは０．５−２０倍程度添加することができる。
【０１０５】
かくして、本発明の反応により、フェニルグリオキシル酸誘導体は不斉還元され光学活性なマンデル酸誘導体が生成する。生成した光学活性マンデル酸誘導体は、常法に従って容易に単離することができる。たとえば、反応液から遠心分離によって、菌体などの不溶性物質を除去した後、反応液の pH を適当な鉱酸、たとえば硫酸や塩酸によって低下、好ましくは1 程度に調整し、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、ヘキサン、ベンゼン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャルブチルエステル、ジエチルエーテル、などで抽出後、これを減圧濃縮することにより、光学活性マンデル酸誘導体を結晶として、採取することができる。
【０１０６】
さらに反応生成物の純度を上げるには、このものを少量のアセトンに溶解し、ヘキサン−アセトン混合溶剤で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なうことで高度に精製することができる。また、ベンゼン、トルエンあるいはヘキサン、酢酸エチル混合溶媒中に加熱溶解後冷却し、再結晶することで容易に他の不純物と分離することができる。
【０１０７】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
また、表中菌株の株名の示す保存機関は以下のとおりである。
IFO：  財団法人発酵研究所
DSM：  Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
ATCC：  American Type Culture Collection
JCM：  理化学研究所微生物系統保存施設
IAM：  東京大学応用微生物研究所
NRIC：  東京農業大学
【０１０８】
［実施例１］（基質２−クロロフェニルグリオキシル酸の合成）
２−クロロベンゾイルクロライド 17.5g（0.1mol）、シアン化銅（I） 11.65g（0.13mol）、アセトニトリル 8mLをトルエン 15mL中で３時間還流した後、室温まで冷却後、不溶物をろ別し、残渣をトルエンで洗浄した。得られたろ液を減圧条件下、溶媒留去し、残留物を蒸留し、２−クロロフェニルオキソアセトニトリルを12.3g得た（収率 75%）。
得られた２−クロロフェニルオキソアセトニトリル 16.5g（0.1mol）を濃塩酸 110mL中、室温にて5日間反応後、1100mLの水を加え、エーテルにて抽出し、エーテル層を減圧条件下、溶媒留去し、残留物を四塩化炭素中で再結晶することで、白色結晶を16.6g得た。
本化合物は、1H-NMR、MS、IRの各スペクトル分析により、式(III)に示す２−クロロフェニルグリオキシル酸であることを確認した（収率90%）。
【０１０９】
【化６】
式(III)
0004154182.tif 000007
【０１１０】
［実施例２］（酵母のスクリーニング）
酵母エキス 3g/L、麦芽エキス 3g/L、グルコース 20g/L、ポリペプトン 5g/Lからなる液体培地（pH 6.0）を、18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表１に示す菌株を一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養した。
【０１１１】
得られた培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌体に、10mg ２−クロロフェニルグリオキシル酸および 10mgグルコースを含む 100mMリン酸バッファー（pH 7.0） 1mLを加え、30℃、48時間振とう反応した。
【０１１２】
反応液より遠心分離によって除菌し、得られた上清中に含まれる２−クロロマンデル酸は、C18逆相カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより定量した。カラム温度を40℃とした、和光純薬株式会社製 C18逆相カラム（Wakosil II 5C18 HG 4.6mm x 250mm）を用い、50mMリン酸バッファー（pH 2.5）：アセトニトリル ＝ 3：1 の溶離液を流速 1mL/min で通じ、254nmにおけるUV吸収を検出することで定量した。
【０１１３】
また、反応液から２−クロロマンデル酸を酢酸エチルで抽出し、脱溶媒した後、光学分割カラムを用いた液体クロマトグラフィーによりその光学純度を測定した。光学分割カラムは、ダイセル化学工業株式会社製キラルセル OJ-H（CHIRALCEL OJ-H 4.6mm x 150mm）を用い、n-ヘキサン：イソプロパノール：トリフルオロ酢酸 ＝ 85：15：0.1 の溶離液を流速1.5mL/minで通じ、254nmにおけるUV吸収を検出することで測定を行った。
分析結果を表１に示す。その結果、光学活性な(R)-２−クロロマンデル酸が生成していることが確認できた。
【０１１４】
【表１】
0004154182.tif 000008
【０１１５】
［実施例３］（バクテリア、放線菌のスクリーニング）
ブイヨン培地（日水製薬株式会社製）を、18mmφ試験管に 4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表２に示す菌株を一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養した。
得られた培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌体に、10mg ２−クロロフェニルグリオキシル酸および10mgグルコースを含む100mMリン酸バッファー（pH 7.0）1mLを加え、30℃、48時間振とう反応した。
反応液より遠心分離によって除菌し、得られた上清中に含まれる２−クロロマンデル酸は、実施例２にしたがって定量および光学純度の測定を行なった。
分析結果を表２に示す。その結果、光学活性な(R)-２−クロロマンデル酸が生成していることが確認できた。
【０１１６】
【表２】
0004154182.tif 000009
【０１１７】
［実施例４］（乳酸菌のスクリーニング）
MRS培地（Lactobacilli MRS broth、Difco Laboratories製）を、18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表３に示す菌株を一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養した。
得られた培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌体に、10mg ２−クロロフェニルグリオキシル酸および10mgグルコースを含む100mMリン酸バッファー（pH 7.0） 1mLを加え、30℃、48時間振とう反応した。
反応液より遠心分離によって除菌し、得られた上清中に含まれる２−クロロマンデル酸は、実施例２にしたがって定量および光学純度の測定を行なった。
分析結果を表３に示す。その結果、光学活性な(R)-２−クロロマンデル酸が生成していることが確認できた。
【０１１８】
【表３】
0004154182.tif 000010
【０１１９】
［実施例５］（(S)体を生成する乳酸菌のスクリーニング）
MRS培地（Lactobacilli MRS broth、Difco Laboratories製）を、18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表４に示す菌株を一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養した。
【０１２０】
得られた培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌体に、10mg２−クロロフェニルグリオキシル酸および10mgグルコースを含む100mMリン酸バッファー（pH 7.0）1mLを加え、30℃、48時間振とう反応した。
反応液より遠心分離によって除菌し、得られた上清中に含まれる２−クロロマンデル酸は、実施例２にしたがって定量および光学純度の測定を行なった。
分析結果を表４に示す。その結果、光学活性な(S)-２−クロロマンデル酸が生成していることが確認できた。
【０１２１】
【表４】
0004154182.tif 000011
【０１２２】
［比較例］
酵母エキス 3g/L、麦芽エキス 3g/L、グルコース 20g/L、ポリペプトン 5g/Lからなる液体培地（pH 6.0）を、18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、特許03146641（特開平6-7179）記載のキャンディダ・ファマータ IFO 0856株を一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養した。
得られた培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌体に、10mg２−クロロフェニルグリオキシル酸および10mgグルコースを含む100mMリン酸バッファー（pH 7.0）1mLを加え、30℃、48時間振とう反応した。
反応液より遠心分離によって除菌し、得られた上清中に含まれる２−クロロマンデル酸を、実施例２にしたがって定量した。
その結果、２−クロロマンデル酸は検出できなかった。
【０１２３】
［実施例６］（基質３−クロロフェニルグリオキシル酸の合成）
３−クロロベンゾイルクロライド 43.8g（0.1mol）、シアン化銅（I） 29.1g（0.13mol）、アセトニトリル 20mLをトルエン 37mL中で３時間還流した後、室温まで冷却後、不溶物をろ別し、残渣をトルエンで洗浄した。得られたろ液を減圧条件下、溶媒留去し、残留物を蒸留し、３−クロロフェニルオキソアセトニトリルを28g得た（収率 68％）。
得られた３−クロロフェニルオキソアセトニトリル 15g（0.1mol）を濃塩酸 110mL中、室温にて5日間反応後、1100mLの水を加え、エーテルにて抽出し、エーテル層を減圧条件下、溶媒留去し、残留物を四塩化炭素中で再結晶することで、白色結晶を15.1g得た。
本化合物は、1H-NMR、MS、IRの各スペクトル分析により、式(III)に示す３−クロロフェニルグリオキシル酸であることを確認した（収率90%）。
【０１２４】
［実施例７］（バクテリアのスクリーニング２）
ブイヨン培地（日水製薬株式会社製）を、18mmφ試験管に 4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表５に示す菌株を一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養した。
【０１２５】
得られた培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌体に、10mg３−クロロフェニルグリオキシル酸および10mgグルコースを含む100mMリン酸バッファー（pH 7.0）1mLを加え、30℃、48時間振とう反応した。
【０１２６】
反応液より遠心分離によって除菌し、得られた上清中に含まれる３−クロロマンデル酸は、C18逆相カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより定量した。カラム温度を40℃とした、和光純薬株式会社製 C18逆相カラム（Wakosil II 5C18 HG 4.6mm x 250mm）を用い、50mMリン酸バッファー（pH 2.5）：アセトニトリル ＝ 3：1 の溶離液を流速 1mL/min で通じ、254nmにおけるUV吸収を検出することで定量した。
【０１２７】
また、反応液から３−クロロマンデル酸を酢酸エチルで抽出し、脱溶媒した後、光学分割カラムを用いた液体クロマトグラフィーによりその光学純度を測定した。光学分割カラムは、ダイセル化学工業株式会社製キラルセル OJ-H（CHIRALCEL OJ-H 4.6mm x 150mm）を用い、n-ヘキサン：イソプロパノール：トリフルオロ酢酸 ＝ 85：15：0.1 の溶離液を流速1.5mL/minで通じ、254nmにおけるUV吸収を検出することで測定を行った。
分析結果を表５に示す。その結果、光学活性な(R)-３−クロロマンデル酸が生成していることが確認できた。
【０１２８】
【表５】
0004154182.tif 000012
【０１２９】
［実施例８］（乳酸菌のスクリーニング２）
MRS培地（Lactobacilli MRS broth、Difco Laboratories製）を、18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表５に示す菌株を一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養した。
得られた培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌体に、10mg ３−クロロフェニルグリオキシル酸および10mgグルコースを含む100mMリン酸バッファー（pH 7.0） 1mLを加え、30℃、48時間振とう反応した。
反応液より遠心分離によって除菌し、得られた上清中に含まれる３−クロロマンデル酸は、実施例７にしたがって定量および光学純度の測定を行なった。
分析結果を表６に示す。その結果、光学活性な(R)-３−クロロマンデル酸が生成していることが確認できた。
【０１３０】
【表６】
0004154182.tif 000013
【０１３１】
［実施例９］（α−ケト酸還元酵素の精製）
ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムＡＴＣＣ １７０７２株を１．２ＬのMRS培地（Lactobacilli MRS broth、Difco Laboratories製）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体を５０mM トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、０．０２％ ２−メルカプトエタノール及び２mM フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）で澱懸し、ビードビーター（Biospec社製） により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、遠心分離により除核酸した上清を得た。その上清に硫安を３０％飽和になるまで添加し、３０％硫安を含む標準緩衝液（１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、０．０１％２−メルカプトエタノール、１０％ グリセロール）で平衡化したフェニル−セファロースＨＰ（２．６cm×１０cm）に添加し、硫安濃度を３０％−０％の勾配溶出を行った。ＮＡＤＨ依存性２−クロロフェニルグリオキシル酸還元活性は、勾配溶出部分に観察され、溶出したピーク部分を回収し、限外濾過により濃縮した。
【０１３２】
濃縮した酵素液を標準緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ（０．５cm× ５cm）に添加し、０−０．５Ｍ塩化ナトリウムの勾配溶出を行った。溶出した活性画分を回収し、限外濾過により濃縮酵素液を得た。
濃縮酵素液を０．０１％２−メルカプトエタノール、１０％グリセロールを含む５mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）に透析した後、同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（０．５cm×１０cm）に添加し、５−３５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）の濃度勾配溶出を行った。溶出した活性画分の内、最も比活性が高かった画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果、単一バンドであった（図１）。
精製酵素の比活性は３，８１０ U／mgであった。精製の要約を表７に示す。
【０１３３】
【表７】
表７ 精製の要約
0004154182.tif 000014
【０１３４】
［実施例１０］（α−ケト酸還元酵素の分子量測定）
実施例９で得られた酵素のサブユニットの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めた結果、約３５，０００であった。また、スーパーデックスＧ２００のゲルろ過カラムを用いて分子量を測定したところ、約６３，０００であった。
【０１３５】
［実施例１１］（α−ケト酸還元酵素の至適ｐＨ）
リン酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ブリットン・ロビンソンの広域緩衝液を用いてｐＨを変化させて、実施例９で得られた酵素の２−クロロフェニルグリオキシル酸の還元活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図２に示した。反応の至適ｐＨは５．０−５．５であった。
【０１３６】
［実施例１２］（α−ケト酸還元酵素の至適温度）
実施例９で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけを変化させて、２−クロロフェニルグリオキシル酸の還元活性を測定し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図３に示した。最大活性の８０％以上を示したのは４５−５５℃であった。
【０１３７】
［実施例１３］（α−ケト酸還元酵素のｐH安定性）
実施例９で得られた酵素をブリットン・ロビンソンの広域緩衝液中で、２５℃、３０分間インキュベートし、残存する２−クロロフェニルグリオキシル酸の還元活性を測定した。未処理の活性を１００とした残存活性で表し、図４に示した。その結果、ｐＨ５−１０．５で８０％以上の残存活性を示した。
【０１３８】
［実施例１４］（α−ケト酸還元酵素の温度安定性）
実施例９で得られた酵素をリン酸カリウム緩衝液ｐH８．０中で、温度を変化させ、１０分間インキュベートし、残存する２−クロロフェニルグリオキシル酸の還元活性を測定した。未処理の活性を１００とした残存活性で表し、図５に示した。その結果、５０℃まで８０％以上の残存活性を示した。
【０１３９】
［実施例１５］（α−ケト酸還元酵素の基質特異性）
実施例９で得られた酵素を種々のα−ケト酸、ケトン、ケトール等と反応させ、その還元反応の活性を２−クロロフェニルグリオキシル酸の還元を１００とした相対活性で表し、表８に示した。
【０１４０】
【表８】
表８ α−ケト酸還元酵素の基質特異性
0004154182.tif 000015
【０１４１】
［実施例１６］（α−ケト酸還元酵素を用いた（Ｒ）−２−クロロマンデル酸の合成）
２００mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）、１００mM ＮＡＤＨ、１Ｕ α−ケト酸還元酵素、５０mM ２−クロロフェニルグリオキシル酸を含む反応液中で、２５℃で終夜反応させた。生成した２−クロロマンデル酸は、実施例２にしたがって定量および光学純度の測定を行なった。その結果、本発明によって生成した２−クロロマンデル酸は、９９％ｅｅ以上のＲ体であった。また、反応収率は１００％であった。
【０１４２】
［実施例１７］（α−ケト酸還元酵素の部分アミノ酸配列）
実施例９で得られた酵素を用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列を解析した。アミノ酸配列を配列番号：３に示した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルより、α−ケト酸還元酵素を含むゲル断片を切り出し、2回洗浄後、リジルエンドペプチダーゼを用いて、35℃で終夜イン・ゲル・ダイジェションを行った。消化したペプチドを逆相ＨＰＬＣ (東ソー製TSK gel ODS-80-Ts、 ２.０mm × ２５０mm) を用い、０．１％ トリフルオロ酢酸中でアセトニトリルのグラジエント溶出によりペプチドを分離し、分取した。
【０１４３】
分取したペプチドピーク２種を lep_71、lep_72とし、プロテインシーケンサー（Hewlett Packard G1005A Protein Sequencer System） によりアミノ酸配列の解析を行った。lep_71とlep_72のアミノ酸配列を配列番号：４、および配列番号：５で示した。
配列番号：３ /N末端アミノ酸配列
Met-Lys-Ile-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Arg-Leu
配列番号：４ /lep_71
Leu-Gly-Val-Met-Leu-Gln-Ala-Gly-Gly-His配列番号：５ /lep_72
Thr-Glu-Ile-Asp-Phe-Leu-Asn-Gly-Tyr-Phe
【０１４４】
［実施例１８］（ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムからの染色体ＤＮＡの精製）
ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムＡＴＣＣ １７０７２株をＭＲＳ培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体ＤＮＡの精製は、J.Dairy Sci. , 75 , 1186-1191(1992)に記載の方法により行った。
【０１４５】
［実施例１９］（α−ケト酸還元酵素遺伝子のコア領域のクローニング）
N末端、lep_71、lep_72のアミノ酸配列を元にそれぞれセンスプライマー、アンチセンスプライマーを合成した。それぞれの塩基配列を配列番号：６ (LmKAR-N4) 、配列番号：７ (LmKAR-71B)、配列番号：８（LmKAR-71D）、配列番号：９（LmKAR-72B）、および配列番号：１０（LmKAR-72D）に示した。
配列番号：６ /LmKAR-N4
CTGAAGCTTATGAARATHGCHATHGCNGG
配列番号：７ /LmKAR-71B
CAGAAGCTTTGDCCDCCDGCYTGYARCATNAC
配列番号：８ /LmKAR-71D
CTGAAGCTTGGYGTHATGYTDCARGCHGGNGG
配列番号：９ /LmKAR-72B
GTCAAGCTTTADCCRTTYARRAARTCDATYTC
配列番号：１０ /LmKAR-72D
CTGAAGCTTACHGARATYGAYTTYYTDAAYGG
【０１４６】
5種類のプライマーから4種類の組み合わせ、すなわち、LmKAR-N4とLmKAR-71B、LmKAR-N4とLmKAR-72B、LmKAR-71DとLmKAR-72B、LmKAR-72DとLmKAR-71Bとし、プライマー各５０pmol、dNTP１０nmol、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム由来染色体ＤＮＡ５０ng、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝液 (宝酒造製)、Ｅｘ−Ｔａｑ ２Ｕ (宝酒造製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒） 、アニール（５０℃、３０秒）、伸長（７０℃、４０秒）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。
ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、LmKAR-N4とLmKAR-71B、および、LmKAR-71DとLmKAR-72B、の組み合わせで８００bpあたりに特異的と思われるバンドが検出できた。得られた2種類のＤＮＡ断片を、それぞれフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収し、HindIIIで制限酵素消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Sephaglas BandPrep Kit(ファルマシア製)により精製した。
【０１４７】
得られたＤＮＡ断片を、HindIIIで消化したpUC18（宝酒造製）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム、以下、ＬＢ培地と略す）プレート上で生育させ、Blue/Whiteセレクション法により選別されたいくつかの白色のコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Flexi-Prep (ファルマシア製) によりプラスミドを精製し、LmKAR-N4とLmKAR-72Bの組み合わせで増幅したDNA断片を含むプラスミドをpLMK1、LmKAR-71DとLmKAR-72Bの組み合わせで増幅したDNA断片を含むプラスミドをpLMK2とした。
【０１４８】
精製したプラスミドを用いて、挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS ready Reaction Kit (パーキンエルマー製)を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡシーケンサーABI PRISMTM３１０(パーキンエルマー製)により行った。決定されたコア領域の塩基配列を配列番号：１１として示した。
【０１４９】
［実施例２０］（α−ケト酸還元酵素遺伝子のコア領域周辺の塩基配列の解析）ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム由来染色体ＤＮＡを制限酵素PstI、HaeIIで消化し、T4リガーゼを用いて１６℃で終夜セルフ・ライゲーション反応により、各断片を環化させた。次に、プライマーLMK-IPU(配列番号：１２)およびLMK-IPD(配列番号：１３)を各１００pmol、環化ＤＮＡを２５ng、ＬＡ−Ｔａｑ用緩衝液 (宝酒造製)、ＬＡ−Ｔａｑ ２Ｕ (宝酒造製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒） 、アニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、１０分）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、PstI、HaeIIで消化した鋳型ＤＮＡに対応して、約２５００bp、４０００bpのＤＮＡ断片が検出できた。このDNA断片をSephaglas BandPrep Kit(ファルマシア製)により精製し、塩基配列をLMK-IPU、LMK-IPDを用いて解析した。その結果、α−ケト酸還元酵素遺伝子のＯＲＦ配列を決定することができた。決定したDNA配列は配列番号：１に、予想されるアミノ酸配列を配列番号：２に示す。ＯＲＦ検索は、Genetyx-win（ソフトウェア開発株式会社製）ソフトを用いて行った。
【０１５０】
配列番号：１２ /LMK-IPU
TCACTTGCCGGCATAACTGG
配列番号：１３ /LMK-IPD
GTCACAAGGCATTAAAGTTGACG
【０１５１】
［実施例２１］（α−ケト酸還元酵素遺伝子のクローニング）
α−ケト酸還元酵素の構造遺伝子配列を元にＯＲＦのみをクローニングするためのプライマーLmKAR-N5（配列番号：１４）、LmKAR-C（配列番号：１５）を合成した。プライマーを各５０pmol、dNTP１０nmol、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム由来染色体ＤＮＡ５０ng、Pfu Turbo-DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu Turbo-DNA polymerase ３．７５Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、２分３０秒）、アニール（５５℃、１分）、伸長（７２℃、１分）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。配列番号：１４ /LmKAR-N5
GTCGAATTCTATCATGAAAATTGCAATTGCAGGATTTGGTGCAC配列番号：１５ /LmKAR-C
GATAAGCTTACTAGTATTAAATTTCAAAGTTTTCTTGCTGTTTTGCTAATTTAACACG
【０１５２】
得られたＤＮＡ断片を、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素EcoRI、HindIIIで2重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Sephaglas BandPrep
Kit(ファルマシア製)により精製した。
得られたＤＮＡ断片を、EcoRI、HindIIIで2重消化したpSE420D（Invitrogen製のプラスミドベクターpSE420のマルチクローニングサイトを改変したプラスミド、特開2000-189170）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。
形質転換株をアンピシリンを含むＬＢ培地で生育させ、挿入断片の塩基配列を解析した。目的とするα−ケト酸還元酵素遺伝子を持つプラスミドをpSE-LMK1とした。プラスミド構築の過程を図６に示した。
【０１５３】
［実施例２２］（α−ケト酸還元酵素の大腸菌による生産）
α−ケト酸還元酵素を発現するプラスミドpSE-LMK1で形質転換された大腸菌JM109株をアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌した後、０．０２％ ２−メルカプトエタノール、２mM ＰＭＳＦ、１０％グリセリンを含む５０mM トリス−塩酸緩衝液（pH８．５）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）を用いて３分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収した。また該遺伝子を含まないプラスミドpSE420Dを持つ大腸菌をＬＢ培地で終夜培養し、０．１mM ＩＰＴＧ添加後さらに４時間培養した菌体を、同様に破砕して２−クロロフェニルグリオキシル酸に対する還元活性を測定した。結果を表９に示す。
【０１５４】
【表９】
表９ プラスミド有無の比較
0004154182.tif 000016
【０１５５】
［実施例２３］（α−ケト酸還元酵素遺伝子とマイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSF-LMK1の構築）
マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を発現するプラスミドpSFR426(EP1211316)をNcoI、EcoRIの2つの制限酵素で二重消化し、マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を調製した。得られたＤＮＡ断片を、NcoI、EcoRIで2重消化したpSE420DとTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。形質転換株をアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Qiagen Tip-500 (QIAGEN製) によりプラスミドを精製し、マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子DNA断片を含むプラスミドをpSE-MF26とした。プラスミド構築の過程を図７に示した。
pSE-MF26をEcoRI、HindIIIの2つの制限酵素で二重消化し、pSE-LMK1から同酵素で切り出したα−ケト酸還元酵素遺伝子を含むDNA断片とTakara Ligation Kitを用いてライゲーションし、ギ酸脱水素酵素とα−ケト酸還元酵素を同時に発現可能なプラスミドであるpSF-LMK1を得た。プラスミド構築の過程を図８に示した。
【０１５６】
［実施例２４］（α−ケト酸還元酵素とギ酸脱水素酵素の大腸菌による同時発現）
pSF-LMK1で形質転換された大腸菌JM109株をアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに4時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌した後、０．０２％ ２−メルカプトエタノール、２mM ＰＭＳＦ、１０％グリセリンを含む５０mM トリス−塩酸緩衝液（pH８．５）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）を用いて３分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収し、２−クロロフェニルグリオキシル酸に対する還元活性とギ酸脱水素活性を測定した。ギ酸脱水素酵素活性の測定は、１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２．５mM ＮＡＤ＋、１００mM ギ酸および酵素を含む反応液中で３０℃で行った。1Uは、上記反応条件において1分間に1μmolのNADH生成を触媒する酵素量とした。その結果、大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性は、２−クロロフェニルグリオキシル酸還元活性が６２０ U/mg-protein、ギ酸脱水素酵素活性が０．２４０ U/mg-proteinであった。
【０１５７】
［実施例２５］（pSF-LMK1で形質転換した大腸菌HB101による（Ｒ）−２−クロロマンデル酸の製造）
pSF-LMK1で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌した後、２７０mM ２−クロロフェニルグリオキシル酸、５４０mM ギ酸ナトリウムを含む５００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）１０mLに懸濁し、終夜３０℃で振とう反応を行った。反応後、生成した２−クロロマンデル酸の光学純度と、反応液中の２−クロロマンデル酸と２−クロロフェニルグリオキシル酸を実施例２と同様にして分析した。その結果、生成した（Ｒ）−２−クロロマンデル酸の光学純度は９９％ｅｅ以上で、反応収率は１００％であった。
【０１５８】
［実施例２６］（α−ケト酸還元酵素遺伝子と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSG-LMK1の構築）
枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドpSE-BSG3（特開 2000-3745931）をEcoRI、HindIIIの2つの制限酵素で二重消化し、pSE-LMK1から同酵素で切り出したα−ケト酸還元酵素遺伝子を含むDNA断片とTakara Ligation Kitを用いてライゲーションし、グルコース脱水素酵素とα−ケト酸還元酵素を同時に発現可能なプラスミドであるpSG-LMK1を得た。プラスミド構築の過程を図９に示した。
【０１５９】
［実施例２７］（α−ケト酸還元酵素とグルコース脱水素酵素の大腸菌による同時発現）
pSG-LMK1で形質転換された大腸菌JM109株をアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１mM ＩＰＴＧを加え、さらに4時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌した後、０．５M NaCl、０．０２％ ２−メルカプトエタノール、２mM PMSF、１０％グリセリンを含む５０mM リン酸カリウム緩衝液（pH６．５）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）を用いて３分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収し、２−クロロフェニルグリオキシル酸に対する還元活性とグルコース脱水素活性を測定した。グルコース脱水素酵素活性の測定は、１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２．５mM NAD＋、１００mM グルコースおよび酵素を含む反応液中で３０℃で行った。1Uは、上記反応条件において1分間に1μmolのNADH生成を触媒する酵素量とした。その結果、大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性は、２−クロロフェニルグリオキシル酸還元活性が８００ U/mg-protein、グルコース脱水素酵素活性が５．８７ U/mg-proteinであった。
【０１６０】
［実施例２８］（pSG-LMK1で形質転換した大腸菌HB101による（Ｒ）−２−クロロマンデル酸の製造）
pSG-LMK1で形質転換された大腸菌HB101株をアンピシリンを含む２０mLの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１mM IPTGを加え、さらに４時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌した後、２７０mM ２−クロロフェニルグリオキシル酸、３２４mM グルコースを含む５００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）１０mLに懸濁し、終夜３０℃で振とう反応を行った。反応後、生成した２−クロロマンデル酸の光学純度と、反応液中の２−クロロマンデル酸と２−クロロフェニルグリオキシル酸を実施例２と同様にして分析した。その結果、生成した（Ｒ）−２−クロロマンデル酸の光学純度は９９％ｅｅ以上で、反応収率は７０％であった。
【０１６１】
【発明の効果】
本発明により、微生物を用いた不斉還元反応によって、光学活性α−ヒドロキシ酸を効率的に製造することができる。本発明の方法は、高い収率を期待できるので、工業的にも有利である。本発明によって製造される光学活性α−ヒドロキシ酸には、光学分割剤として、また光学活性な医薬や農薬の合成原料として有用な光学活性マンデル酸誘導体が含まれる。より具体的には、光学活性なマンデル酸誘導体は、抗血小板剤、抗肥満薬の合成中間体、優先晶析等において利用されている。
また、光学活性α−ヒドロキシ酸などの生産に有用な、ＮＡＤＨ依存性のα−ケト酸還元酵素が提供された。本酵素を利用することにより、２−クロロフェニルグリオキシル酸から光学純度の高い（Ｒ）−２−クロロマンデル酸の効率的な生産方法が提供された。
【０１６２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる泳動像を示す図写真である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は実施例１で得られた酵素を示す。矢印で示したバンドが、酵素に相当するバンドである。
【図２】実施例９で得られた酵素の２−クロロフェニルグリオキシル酸還元活性のｐＨ依存性を示す図である。図中、縦軸は最大活性を１００とする相対的な酵素活性(%)、横軸がｐＨを示す。
【図３】実施例９で得られた酵素の２−クロロフェニルグリオキシル酸還元活性の温度依存性を示す図である。図中、縦軸は最大活性を１００とする相対的な酵素活性(%)、横軸が温度(℃)を示す。
【図４】実施例９で得られた酵素の２−クロロフェニルグリオキシル酸還元活性のｐＨ安定性を示す図である。図中、縦軸は最大活性を１００とする相対的な酵素活性(%)、横軸がｐＨを示す。
【図５】実施例９で得られた酵素の２−クロロフェニルグリオキシル酸還元活性の温度安定性を示す図である。図中、縦軸は最大活性を１００とする相対的な酵素活性(%)、横軸が温度(℃)を示す。
【図６】ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム由来のα−ケト酸還元酵素遺伝子を導入したプラスミド(pSE-LMK1)の構築図。プラスミドのマップ中で、P(trc)はｔｒｃプロモーターを、T(rrnB)はrrnBT1T2ターミネーターを、ampはアンピシリン抵抗性を示すβ−ラクターゼ遺伝子を、oriはプラスミドの複製起源を、ropはROP−protein遺伝子を、laqIqはラクトースリプレッサーを表す。pSE-LMK1中のLmKARはロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム由来のα−ケト酸還元酵素遺伝子を表す。。
【図７】マイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を導入したプラスミド(pSE-MCF26)の構築図。プラスミドのマップ中で、P(trc)はｔｒｃプロモーターを、T(rrnB)はrrnBT1T2ターミネーターを、ampはアンピシリン抵抗性を示すβ−ラクターゼ遺伝子を、oriはプラスミドの複製起源を、ropはROP−protein遺伝子を、laqIqはラクトースリプレッサーを、McFDHはマイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を表す。。
【図８】ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム由来のα−ケト酸還元酵素遺伝子とマイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を導入したプラスミド(pSF-LMK1)の構築図。プラスミドのマップ中で、P(trc)はｔｒｃプロモーターを、T(rrnB)はrrnBT1T2ターミネーターを、ampはアンピシリン抵抗性を示すβ−ラクターゼ遺伝子を、oriはプラスミドの複製起源を、ropはROP−protein遺伝子を、laqIqはラクトースリプレッサーを、McFDHはマイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を、LmKARはロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム由来のα−ケト酸還元酵素遺伝子を表す。
【図９】ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム由来のα−ケト酸還元酵素遺伝子と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を導入したプラスミド(pSG-LMK1)の構築図。プラスミドのマップ中で、P(trc)はｔｒｃプロモーターを、T(rrnB)はrrnBT1T2ターミネーターを、ampはアンピシリン抵抗性を示すβ−ラクターゼ遺伝子を、oriはプラスミドの複製起源を、ropはROP−protein遺伝子を、laqIqはラクトースリプレッサーを、BsGlcDHは枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を、LmKARはロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム由来のα−ケト酸還元酵素遺伝子を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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