(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
装置の部品１種またはそれ以上がフィルムまたは膜で構成され、該部品１種またはそれ以上が、ＣＯ２緩衝培地を細胞増殖チャンバー中で用いることが可能である程度に、および／または増殖中その代謝のために細胞に酸素が行き渡る程度にガス透過性であることを特徴とする装置であって、その装置は次のものを含む：
ａ）複数の微小チャネル部品を支持する基板であって、各微小チャネル部品は細胞増殖チャンバー、それに液体試料を導入する導入チャネルおよびそれから液体試料を除去するための排出チャネルを有する；
ｂ）該基板上に配置されたカバープレートであって、該カバープレートは該チャンバーおよび接続チャネルを形成するように該部品の上に拡がっている；および
ｃ）増殖させるべき細胞の懸濁液。
【請求項２】
細胞付着および細胞増殖のために該細胞増殖チャンバーに組込まれた手段を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
該カバープレートが該チャネルへの進入路として複数の開口部を有する、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
該部品１個またはそれ以上がプラスチック材料から製造されている請求項１から３までのいずれかに記載の装置。
【請求項５】
該基板がディスクの中心近くに配置され、輪状の試料リザーバーに接続された試料導入口を提供するように微細加工された回転可能なディスクをなしており、および該微小チャネル部品が該ディスク上に放射状に配置され、その各導入チャネルは該リザーバーから試料を受けるように接続されている請求項１から４までのいずれかに記載の装置。
【請求項６】
該カバープレートがガス透過性プラスチック材料から加工されている請求項１から５までのいずれかに記載の装置。
【請求項７】
該プラスチック材料がシリコンポリマー、ポリウレタンまたはポリテトラフルオロエチレンである、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
細胞付着および細胞増殖のための該手段が、細胞付着および細胞増殖が可能となるために、該細胞増殖チャンバー表面の少なくとも一部の化学的または物理的修飾によって導入される請求項２から７までのいずれかに記載の装置。
【請求項９】
細胞付着および細胞増殖のための該手段が、マイナス荷電表面を含む、請求項２から８までのいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
細胞付着および細胞増殖のための該手段が、ポリリジン、コラーゲンおよび／またはフィブロネクチンの表面コーティングを含む、請求項２から９までのいずれかに記載の装置。
【請求項１１】
細胞付着および細胞増殖のための手段が該細胞増殖チャンバー内に配置された微小担体ビーズ１個またはそれ以上を含み、各該微小担体ビーズが細胞付着および細胞増殖を提供する請求項２から１０までのいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
細胞増殖チャンバーがさらに細胞増殖チャンバーの基部に配置して柱状物に成形された突起成形構造を有する請求項１から１１までのいずれかに記載の装置。
【請求項１３】
該導入チャネルの断面積が該排出チャネルの断面積より大きい請求項１から１２までのいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
該排出チャネルの断面積が該導入チャネルの断面積の０．９９倍と０．０１倍との間である請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
該微小チャネル部品の少なくとも一部がおのおのさらに細胞成分に関する検定を行うための検定チャンバー１個またはそれ以上を有し、該細胞増殖チャンバーと該排出チャネルの間を線状に接続する請求項１から１４までのいずれかに記載の装置。
【請求項１６】
単数または複数の検定チャンバーまたはチャンバーが単数または複数の中間チャネルによって相互におよび該細胞増殖チャンバーに次の順序：すなわち導入チャネル、細胞増殖チャンバー、中間チャネル１、検定チャンバー１、中間チャネル２（要すれば）、検定チャンバー２（要すれば）、・・・、排出チャネル、で接続し、および各チャネルの断面積が導入チャネルから排出チャネルに向けて順次減少する請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
単数または複数の中間チャネルおよび排出チャネルの断面積が直前（上流）のチャネルの断面積の０．９９倍と０．０１倍との間である請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
該検定チャンバー１個またはそれ以上の内部表面上または表面層内に 発光物質を含む層が提供される請求項１５から１７までのいずれかに記載の装置。
【請求項１９】
発光物質を含む層がそれに結合した結合成分を有し、該結合成分がビオチン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、抗体、レクチン、ホルモン受容体、核酸プローブ、およびＤＮＡ結合蛋白質から選択される特異的結合ペアの構成員である請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
請求項１から１９までのいずれかに記載の装置を使用して被験物質が細胞の活性または物理的パラメータに及ぼす効果を測定する方法であって、この方法は次を含む：
ａ）細胞に及ぼす効果を測定すべき被験物質の試料１種またはそれ以上を該細胞が該被験物質との接触を起こす条件下に提供する；
ｂ）被験物質が該細胞に及ぼす効果を、光学的検出法を用いて測定する。
【請求項２１】
該細胞が付着している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
被験物質導入の前に装置内の表面で細胞を培養、付着させる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
続いて工程
ｃ）検定試薬１個またはそれ以上を添加し、該試薬を該装置内の反応チャンバー１個またはそれ以上に分散させる；
を提供する、請求項２０から２２までのいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
該検定試薬の少なくとも１種が螢光標識、化学発光標識、生物発光標識、酵素標識および放射能標識から選択された検出可能な標識で標識されている請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１から１９までに記載の装置を使用して細胞の被分析物を測定する方法であって、この方法は以下を含む：
ａ）細胞を増殖させる；
ｂ）検定試薬１種またはそれ以上を添加し、該試薬を該装置内のチャンバー１個またはそれ以上に分散させる；
ｃ）細胞の被分析物を光学的方法によって測定する。
【請求項２６】
該検定試薬の少なくとも１種が螢光標識、化学発光標識、生物発光標識、酵素標識および放射能標識から選択された検出可能な標識で標識されている請求項２５の方法。
【請求項２７】
該細胞が付着している、請求項２５から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
細胞に基づく検定に関連する細胞を増殖させるための、請求項１から１９までのいずれかに記載の装置の使用。
【請求項２９】
該細胞が付着している、請求項２８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は細胞に基づく検定法に関する。殊に本発明は細胞増殖および細胞に基づく検定を行うための微細加工した装置ならびにこの検定を行う方法に関する。
【０００２】
最近、コンビナトリアル化学合成および遺伝子科学の両技術によって加速されて新規で有望な標的薬剤および有望な治療用化合物としての新規薬剤候補を発見するため増大するますます多数な化合物のスクリーニングに向けた高処理量検索法に焦点が当てられている。この一次検索法は高処理量スクリーニングおよび３８４穴、８６４穴、１５３６穴またはそれ以上の小型化されたウェルを持つマイクロタイターウェルプレート形式を利用する検定法の小型化の開発に向けられてきた。小型化検定法では一次検定では処理量水準を１日当り１０万テスト以上とすることが可能である。この処理量水準では一次検索は１日当りの「ヒット数」１００〜１０００が得られることを期待しうる。これら薬剤になりうると推測される化合物をその化合物の生物学的適合性について検討するためにはさらに精密な検索法に付すことおよび種々の検定法でテストすることが必要である。このような検定には生物学的利用可能性、代謝および毒性学を含み、これらは主として培養された細胞系統を使用して実施される。一次スクリーニングで使用される検定と比較して、２次スクリーニングの検定は検定法の機構および得られる情報の双方について複雑性の水準が高く、条件が厳しい。
【０００３】
当技術分野では薬剤リード候補作製率の増加および候補薬剤に関する生物学的データの作製の両方を処理することのできる２次スクリーニング検定法に対する必要性が存在する。それに加えて情報量の多い結果を得る検定法の開発には薬剤開発のスクリーニング段階の間にリード薬剤の特性決定の水準を高める可能性がある。
小型化生物分析に使用するために適する微細加工した装置は以前に発表されている。例えば、WO96/15450号は微小チャネルで結合され、ガラスのカバープレートで閉じられた室の集合を有するエッチングしたガラス構造からなる装置を開示している。Wilding らは例えばＰＣＲによってＤＮＡを増幅するメソスケールの装置を開示しているWO93/22058号にチャネルで結合されたチャンバー多数から構成される装置を記載している。WO93/22055号およびWO93/22053号は生物学的液体中の細胞を捕捉および／または溶解するための入口を持つか、または特異的に被分析物を結合するための結合成分を含むメソスケールの流動系から構成される液体の細胞含有試料を分析する装置に関する。ここでは被分析物は試料中の細胞または試料中の細胞集団の中にある細胞内成分であってもよい。前記各装置は細胞または分析直前に装置に導入された細胞に存在する細胞の被分析物の測定または検出に関するが、これらは細胞培養または細胞増殖での使用については記載されておらず、またテストする薬剤に対する細胞の応答を研究するための使用についても記載はない。さらにその上、それらは付着培養細胞の使用については記載されておらず、またそれを可能とするものでもない。
【０００４】
培養細胞の長期間生存を支持する環境を、装置内で培養された細胞を利用する手段と組合せて、提供することができる装置に対する必要性が存在する。これは第二次薬剤スクリーニングまたはその他の研究のために利用されるものである。
【０００５】
側面の一つでは、本発明は液体培地中で細胞増殖および細胞に基づく検定を行うように微細加工した装置を提供する。この装置には次のものを含む：
イ）複数の微細チャネル部品を支持する基板であって、各微細チャネル部品は細胞増殖チャンバー、それに液体試料を添加する導入チャネル、およびそれから液体試料を除去するための排出チャネルを含む；
ロ）基板上に置かれたカバープレートであって、該カバープレートは該チャンバーおよび結合チャネルを形成するように該部分の上に拡がっており；該カバープレートには複数の開口部があって、該チャネルへの進入路を提供する；
ハ）該細胞増殖チャンバーに組込まれた細胞付着および細胞増殖のための手段。
【０００６】
本発明の第二の側面では前記に定義した装置の使用によって細胞の活性または物理的パラメータに及ぼす被験物質の効果を研究する方法が提供されるが、その方法には次を含む：
イ）液体培地中の細胞懸濁液を提供する；
ロ）該細胞を該装置に導入し、該細胞を該装置の細胞増殖チャンバー１個またはそれ以上へと輸送する；
ハ）細胞に及ぼす効果を測定すべき被験物質の試料１種またはそれ以上を細胞が該物質との接触を起こすような条件下に提供する；
ニ）光学的検出法を用いて該被験物質が該細胞に及ぼす影響を測定する。
【０００７】
被験物質の効果を研究する方法には被験物質の導入前に装置内の表面に付着する細胞を培養する段階を含むものが好ましい。段階ハ）に続いて検定試薬１種またはそれ以上を加えて装置内の反応チャンバー１個またはそれ以上に分散させることも好ましい。
【０００８】
本発明の別の側面においては細胞の被分析物を前記定義の装置を使用して測定する方法が提供されるが、その方法には次を含む：
イ）測定すべき被分析物を含む細胞の液体培地中懸濁液を提供する；
ロ）細胞を装置に導入し、装置にある細胞増殖チャンバー１個またはそれ以上に細胞を輸送する；
ハ）細胞を増殖させる；
ニ）検定試薬１種またはそれ以上を提供し、試薬を該装置内にあるチャンバー１個またはそれ以上に分布させる；
ホ）細胞の被分析物を光学的手段で測定する。
【０００９】
本発明が良く理解されるように、単なる例示としておよび添付する図面を参照して、数種の態様を以下に詳記する。図面を簡単に説明すれば次の通りである：
図１ａは細胞増殖および細胞に基づく検定を行うために微細加工された装置の各微小チャネル部品の設計図を表す；
図１ｂは細胞増殖および細胞に基づく検定を本発明に従って行うための検定部品を複数含む、微細加工されたディスクの断面図である；
図２は微小担体ビーズの表面に増殖された細胞を用いるために微細加工された装置について、各検定部品の別な形状を表す。および
図３は微細加工された装置の各検定部品についてさらに別な形状を表し、そこでは細胞増殖チャンバー内での細胞の通行を防止または妨害するための手段が提供される。
【００１０】
図１ｂに関連して、本発明の装置はディスクの中心近くに配置され、輪状の試料リザーバー（９）に結合し、翻って放射状に分布する微小チャネル検定部品（６）の複数に結合している試料導入口（無記載）を提供するように微細加工された回転可能なディスク（１８）を含むが、該微小チャネル部品は、細胞増殖チャンバー、試料導入チャネル、および液体を除去するための排出チャネル、および閉鎖されたチャンバーおよび結合チャネルが形成されるように該ディスク上に配置されるカバープレートを含む。各微小チャネル部品は一端では中心の試料リザーバー（９）に結合し、反対側の一端では共通の廃液チャネル（１０）に結合している。
【００１１】
微細加工された装置での放射状に分布した微小チャネル検定部品（６）の各々（図１ａに示す）には次を含む：左端でリザーバー（９）に結合する試料導入チャネル（１）、細胞増殖を行うための細胞増殖チャンバー（２）、これがチャネル（４）を経て検定チャンバー（３）に結合し、さらにこれが排出チャネル（５）を経て廃液チャネル（１０）に右端で結合する。
【００１２】
本発明の別の形式においては、図２に示すように微小担体ビーズ（１７）の表面で増殖する細胞による装置の使用が可能になるように微小チャネル部品（６）を修飾してある。そこで各微小チャネル部品（６）は左端で試料リザーバー（９）に結合する試料導入チャネル（８）、細胞増殖チャンバー（７）、これがチャネル（１６）を経て検定チャンバー（１１）に接続し、排出チャネル（１２）を経て共通の廃液チャネル（１０）に導く。
【００１３】
本発明装置の別の態様である図３では、細胞増殖チャンバー（２）は一方では液体の通過を可能にしつつ導入チャネル（１）を経て細胞増殖チャンバー（２）に到る細胞の流動または通過に対するバリアーを形成するような柱（１５）を形成するように細胞増殖チャンバーの基礎部分の上に設置された、突き出た成形構造が提供されていてもよい。これらの構造は該装置中を移動する液体中の懸濁液として行われる細胞の通過を可能にするには狭すぎるが、細胞増殖チャンバー（１４）の表面で増殖する細胞がバリアーと次の細胞質分裂との間の細胞過程の伸張によってバリアーを通して移動するには十分な大きさである構造間の間隙を提供するように選択された寸法である。細胞増殖チャンバー内に形成された、突き出た柱（１５）の間の間隙の適当な寸法は、捕捉されるべく選択された細胞の型および細胞の大きさに依存して５μmと５０μmとの間である。
【００１４】
好ましくは図３に示す各微小チャネル部品（６）はさらに細胞成分が関与する検定を行うための検定チャンバーを１個またはそれ以上含み、該細胞増殖チャンバー（２）および該排出チャネル（５）との間を線状に結合している。
【００１５】
ディスク（１８）は１片または２片からなる成型構造であって、所望なら透明なプラスチックまたはポリマー材料で別々の型で形成され、これを組立てて所定の位置にこの装置に液体を負荷し，廃液を排出する開口部を持つ閉鎖構造を提供するのが適当である。最も単純な型ではこの装置は相補的部品２個として製造され、各部品の一方または双方が成型構造を持ち、互いに結合する時には固いディスク本体内に一連の相互に結合された微小チャネル部品を形成する。あるいは微小チャネル部品は微細加工法によって成型してもよいが、微小チャネル部品を形成する微小チャネルおよびチャンバーはディスクの表面に微細加工され、さらに例えばプラスチックフィルムなどのカバープレートでチャネルおよびチャンバーを封入するように表面に付着させる。
【００１６】
代謝のために酸素を得る手段を持つ培養細胞を得、およびＣＯ2緩衝培地の使用を可能にするために、装置の部品１種またはそれ以上はガス透過性のプラスチック、フィルム、ポリマー、または膜から構成してもよい。ガス透過性のプラスチック、フィルム、ポリマ−または膜はたとえばポリジメチルシロキサンのようなシリコンポリマーまたはポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレンまたはその他のガス透過性プラスチック材料から製造するのが適当である。これに加えて、好ましくは閉鎖構造の開口部を封鎖するための手段（図示せず）が提供され、これは使用の間に液体の蒸発を防ぐためであるが、この手段で細胞増殖培地へのガス交換を妨害せずに開口部を封鎖する。封鎖は別なガス透過性材料の層を用いて全装置を通して、またはその余のガス透過性材料を局所的雰囲気に暴露させたまま非透過性材料を開口部にのみ局所的に適用して達成することもできる。
【００１７】
細胞増殖チャンバーおよび微小チャネルを形成するための適当なプラスチックまたはポリマー材料は好ましくは疎水性を持つものから選択される。このプラスチックまたはポリマーの表面は、例えば細胞増殖、 細胞付着、および共有結合または非共有結合による生物分子との適合性、などの所望の性質を持つように表面の性質を化学的または物理的手段によってさらに選択的に修飾することができる。好適なプラスチックはポリスチレンおよびポリカーボネートから選択される。
【００１８】
あるいは、細胞増殖チャンバーおよび微小チャネルは親水性を持つように選択されたプラスチックまたはポリマー材料で構成してもよい。このプラスチックまたはポリマーの表面は所望の性質を与えるためにチャンバーおよび／または微小チャネル内に疎水性の局所部分を作成するように表面の性質を変えるために化学的または物理的な手段によってさらに選択的に修飾できる。この方法で、例えば疎水性のバリアーまたは弁を提供して装置内での液体の流動を制御してもよい。好適なプラスチックは荷電表面を持つポリマーから選択されるが、化学的にまたはイオンプラスマで処理したポリスチレン、ポリカーボネートまたはその他の堅い透明なポリマーが適当である。
【００１９】
微小チャネル部品（６）はディスク（１８）周囲に放射状に配置し、共通の中心部分に結合させる。チャネル１、４、５、８、１２および１６の寸法はチャネルに沿った細胞の動きに適するものである。適当なものではチャネルとチャンバーがたとえば正方形、矩形、円形、台形および三角形のようないずれの断面型のものであってもよい。細胞増殖チャンバー（２）の寸法は１００ μm２ と１００００００μm２ との間、 好ましくは１０００ μm２ と１００００００ μm２ との間、最も好ましくは１００００μm２ と１００００００ μm２ との 間の床面積を与えるものが適当である。細胞増殖チャンバーのプラスチックまたはポリマー表面は細胞の付着および／または増殖が可能なように選択的に処理または修飾してもよい。好ましくはこの処理には表面に強いＵＶ光を照射してポリマー表面を修飾するか、あるいは知られている技術を用いて高電圧プラズマ放電（Amstein, C,F, and Hartmann, P.A., J. Clin. Microbiol., 2, 1, 46-54 (1975) 参照）を行うがこれは細胞の増殖および付着、および（要すれば）検定目的のために適当なマイナス荷電表面を作製するためである。細胞増殖チャンバーの表面にさらに、たとえばポリリジン、コラーゲン、フィブロネクチン、などのコーティングを施して細胞の付着をさらに改善してもよい。
【００２０】
前記のように本発明の好適な側面では細胞成分に関する検定を行うために微小チャネル部品（６）の各々にはさらに細胞増殖チャンバー（２）と排出チャネル（５）との間に線状に配置された検定チャンバー（３）を設置する。検定チャンバーは研究対象である培養細胞に由来するものであってもよい可溶性被分析物の収集および／または捕捉を可能にするために細胞増殖チャンバー（２）の容積に応じた寸法とする。検定チャンバー（３）の容積は細胞増殖チャンバー（２）の容積の２倍から１０分の１倍の間であるのが適当である。細胞増殖チャンバーと検定チャンバーを結合するチャネル（４）は疎水性壁面および細胞増殖チャンバーの上流にあるチャネル（１）よりも小さい断面積を持つことに特徴があるのが有利である。チャネル（４）は導入チャネル（１）の面積の０．９９倍と０．０１倍との間の断面積を持つのが適当である。排出チャネル（５）は疎水性壁面を持ち、チャネル（４）の面積の０．９９倍と０．０１倍との間の断面積を持つことに特徴があるのが適当である。このように、微小チャネル部品中の液体流動は一定の遠心力を適用して一定の断面積を持つチャネル内で液体に流動を起こさせることによって制御できる。この力は液体を小さい断面積の別の結合チャネル内を流動させるには不十分であって、これが微小チャネル部品の所望の位置で液体流動を停止させる効果を持つ。
【００２１】
液体流動を制御する別法では、チャネル（１）およびチャネル（４）が同じ断面積を持つように構築されるが種々な程度にチャネルの疎水性を与える化学的または物理的手段によって各チャネルの表面を選択的に修飾してもよい。例えば、細胞増殖チャンバー（２）の下流にあるチャネル（４）は、細胞増殖チャンバーの上流にあるチャネル（１）よりも疎水性を高くする。この方法によって、このチャネルに液体の流動を起こすに十分な一定の力をチャネル（１）中の液体に加えることは液体が高疎水性の第二チャネル（４）への進入を起こすには不十分であろうが、これは微小チャネル部品中の所望の位置で液体流動を停止させる効果を有する。チャネル表面の疎水性を選択的に修飾するための適当な手段には一定の面積をイオン化または電磁的照射またはマスクを通したイオンプラスマに暴露するか、または疎水性物質を施用するか、またはスクリーンプリンティングによってインクを用いるか、または局部的施用の他の方法を含む。
【００２２】
前記装置内の液体流動を制御する方法は微小チャネル部品内にある結合したチャンバーおよびチャネル中の液体流動に所望の制御を与えるために単独または必要ならば組合わせて使用してもよい。組み合わせて使用する態様では、この方法は順次に使用してもよい。例えば、断面積の変化に続けて疎水性を変化させれば、逐次的な２点での液体流動の制御を与える。これとは別に、本方法はチャネルの断面積の変化に同じチャネルの疎水性の変化を伴わせるように同時的態様で使用してもよい。その組合せで単一の手段を用いては達成できない程度の制御を液体流動に与えるために使用される。
【００２３】
検定チャンバーの内部表面は目的の被分析物を特異的に結合できるリガンドの１種またはそれ以上を共有結合または非共有結合で表面に結合することによってそのリガンドでコーティングしてもよい。この目的のために適当なリガンドの例には次のものを含む：ビオチン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、抗体、レクチン、ホルモン受容体、核酸プローブ、ＤＮＡ結合プロテイン、その他。
【００２４】
この装置および方法は細胞の増殖および細胞の完全性または生存能力を損なわない技術である非侵襲的技術を使用して例えば細胞代謝、細胞生存力、レポータ遺伝子の発現などの細胞活性、細胞パラメータの検出および生化学的過程を検出および測定するために使用できる。これとは別に、この装置はたとえばペプチドホルモン、二次メッセンジャーのような細胞から放出され、さもなければ分泌される細胞由来産物の検出および測定に使用してもよい。図３に示す装置の使用によって、この装置は例えば、化学誘引物質をバリアーの一方の側に置き、細胞をバリアーの反対側に置いてバリアーを透過して化学誘引物質に向けて移動する走化性を観察するなど化学的または物理的刺激に応答しての細胞移動の研究が可能になる。
【００２５】
本発明は標準的組織培養用のプラスチック容器上に培養できるいかなる細胞型も使用できる。このような細胞型には種（たとえばヒト、囓歯類、サル）、組織源（たとえば脳、肝臓、肺臓、心臓、腎臓、皮膚、筋肉など）、および細胞型（たとえば上皮、内皮）に関する認識された起源から誘導された正常なおよび形質転換された全ての細胞を含む。これに加えて、組換え遺伝子を遺伝子移入した細胞も本発明を使用して培養してもよい。広範な細胞型の培養に適用可能な確立したプロトコルが存在する。（例えば Freshney, R.I.著「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique」、第２版、Alan R. Liss 社、1987 年参照）。このようなプロトコルは細胞増殖および特異的細胞機能の発現を可能にするために特別のコーティングおよび選択的培地の使用を必要とするかも知れない。これらプロトコルはいずれもこの発明の装置で使用することを排除するものではない。
【００２６】
装置の寸法はある程度その用途に支配されることとなる。すなわち装置は真核生物細胞の使用に適合する寸法となろう。これは細胞の移動を可能とするように設計されたチャネルについて下限を与え、各検定に存在する細胞の数に従って細胞封入部の寸法または増殖部分の寸法を決定することになる。付着培養物として増殖している平均的な哺乳類細胞は〜３００ μm2 の面積を持ち；非付着細胞および付着していない付着細胞は〜１０ μm の球状直径を有する。従って装置内の細胞移動のチャネルに２０〜３０ μm またはそれ以上のオーダーの寸法を持たせると思われる。細胞保持部分の寸法は検定を行うために必要な細胞数に依存するものである（この数は感度と統計学的要件の双方から決められる）。典型的な検定には最低５００〜１０００個の細胞が必要となり、これのため付着細胞については１５００００〜３０００００ μm2 の構造、すなわち、直径〜４００〜６００μm の円形「ウェル」が必要となろうことが予測される。
【００２７】
本発明の微小チャネルの構造は好ましくは液体培地中の細胞懸濁液を試料リザーバーに試料導入口から添加し、続いて遠心力によりディスクの周辺に外向に細胞懸濁液の移動を起こすに十分な速度で適当な手段でディスク（１８）を回転させて細胞増殖チャンバー内に同時的接種ができるように選択される。液体の運動で細胞懸濁液を各導入微小チャネル（１、８）に沿って細胞増殖チャンバー（２、７）に向かって分布させる。ディスクの回転速度は液体が流動して細胞増殖チャンバー（２、７）を満たすに十分であるが、液体が細胞増殖チャンバーの反対側にある直径の小さい限定されたチャネル（４、１６）に入るには不十分な遠心力を提供するように選択される。
【００２８】
回転を停止すると、懸濁液中の細胞は重力によって細胞増殖チャンバー（２、７）の底部に沈降し、存在するなら処理済の表面に付着させる。チャネルの中に残留する細胞は無処理の疎水性表面には付着できず、懸濁液中に残留する。細胞の付着が起きるように選択した適当な時間の後に、装置を以前よりも高速で回転して液体および付着していない細胞をすべてディスクの周辺に向けて移動させてディスクの周囲に設置された廃液チャネル （１０）に入れる。チャネルから非付着細胞が消えた後に微小チャネル部品を満たすために用いた最初の速度まで回転を落とし、新鮮な細胞培養培地を試料リザーバーに入れる。ディスクをもう一度回転させ、遠心力により細胞培養培地を流して微小チャネルおよび細胞増殖チャンバーを前記のようにして満たす。この操作で細胞増殖および細胞に基づく検定に適する新鮮な培養培地で細胞増殖チャンバー表面に播種された付着細胞を覆う。
【００２９】
図２の装置では、ビーズ （１７）は細胞の付着および増殖のために比較的小さな容積の液体中に大きな表面積を提供する。本明細書に記載する装置では、ビーズ（１７）は二つの機能を果たす；第一に細胞の付着および増殖のための表面を提供してディスク内に細胞増殖に適合する表面を提供する必要性を除いて構築に使用する材料の範囲を拡大すること；および第二に細胞のための大きな物理的担体を提供して装置内で細胞の接近を防ぐようなチャネルの設計を容易にする。好適な態様では、各部品は細胞増殖チャンバー（２、７）および分析チャンバー（３、１１）および廃液チャンバー（１０）を含み、これらはディスクのほぼ中心から放射状に配置されてディスクの中心にある共通の入口に連結している。
【００３０】
細胞試料を装置に添加し、その付着および後続する細胞増殖の後、検定用の試薬および試料は試料導入口を経て試料リザーバー（９）に入れる。全ての微小チャネル部品に加える試薬は細胞を接種するために前記のように、すなわち全ての微小チャネル、細胞増殖チャンバーおよび検定チャンバーに試薬が分布するように中央の入口に試薬の溶液を加え、ディスクを回転して導入する。特定ウェルへの特定試料の添加は少量の液体を個々の液滴として中心のウェルに直接滴加して達成できる。この中心のウェルは導入チャネルの開口部に隣接しており、この導入チャネルから試料が入るべき細胞増殖チャンバーに導かれる。これは、例えばピエゾ電気分配装置（図示せず）を用いて達成してもよいのであるが、この場合には液体の小滴がおのおのディスク表面に衝突し、遠心力によって隣接する導入チャネル（１、８）に輸送され、また細胞増殖チャンバー（２、７）内の液体と混合するような滴加頻度およびディスクの回転速度の適当な組合せにおいて、装置からの液体の小滴の分配はディスクの回転速度と同期している。
【００３１】
別法として、液体を個々の液滴として固定ディスク（１８）の疎水性表面上に滴加し、ディスクの回転を用いて適当な導入チャネル、従って細胞増殖チャンバーにこの液滴を移動させる。これらの手段により、試薬および試料は全て検定を行うために所望の順序と割合で細胞チャンバーに添加してもよい。
【００３２】
検定の液体操作が終了後、結果検定を測定するために、典型的には螢光、化学発光またはその他の標識基が発するシグナルを測定することによって検出操作を行うことが必要になる。図１ｂに示す装置は検定シグナルの検出を可能にする手段２種を内蔵する。第一に検定シグナルを細胞増殖チャンバーの原位置で測定できる。このようなシグナルは細胞内レポータ遺伝子産物、たとえばＧＦＰの螢光の測定によって代表される。
【００３３】
あるいは細胞由来の産物または被分析物を例えば、測定の妨害を避けるために装置内で培養される細胞の不在下での免疫化学的またはその他の特異的な結合検定法などによって測定することが望ましいこともある。この場合、この装置にはディスク周縁に設置され、細胞増殖チャンバー（２、７）に結合させて第二のチャンバー、すなわち検定チャンバー（３、１１）が提供される。この検定チャンバーは狭いチャネル（５、１２）によって縁辺の廃液チャネル（１０）に結合しているが、このチャネルは検定チャンバーと細胞増殖チャンバーとを結合するもの（４、１６）よりも直径が小さい。各チャンバー間の直径の差分は制御された回転と遠心力の条件下に、前記のように細胞増殖チャンバーから検定チャンバーへの液体の移動を可能にする。例えば、この操作によって被分析物は細胞増殖チャンバーから検定チャンバーに移動し、ここで被分析物は検定チャンバーの壁に付着したリガンドによって親和性による捕捉を受ける。それ故、この操作は細胞から放出または分泌された細胞由来被分析物を細胞の環境から離して移動させ、被分析物に結合する特異的結合相手によってこの被分析物を検定チャンバー内に固定し、続いて試薬の添加と処理を可能にして被分析物の検出が行えるようにする手段を提供する。
【００３４】
所望なら、本装置を用いる検定法で使用する試薬の少なくとも１種は共有結合または非共有結合による付着により検出可能な標識で標識してもよい。検出可能な適当な標識は螢光標識、化学発光標識、生物発光標識、酵素標識および放射能標識から選択してもよい。本発明の方法に従って試薬に目印をつけるために適当な螢光標識は、これに限定するものではないがフルオレッセイン、ロダミン、シアニン色素、クマリン、および BODIPY 群の螢光色素を含む螢光色素の一般的カテゴリーから選択できる。生物発光による検出可能な標識の例はたとえばグリーンフルオレッセントプロテイン（ＧＦＰ）およびエクオリンのような螢光レポータ蛋白質の中に見出されるべきものである。他種の検出可能なシグナルを与える標識には螢光エネルギー移動標識がある。
【００３５】
検定完了後、シグナルの測定は検定に用いた標識化合物または標識基に適する手段で行えばよいが、典型的には光学的手段である。例えば、細胞または螢光標識された検定試薬から発射された発光はＣＣＤカメラを導入した撮像装置を用いてまたは螢光光度計を用いて本発明の微細加工された装置で検出してもよい。発射された螢光の検出はディスクが透明な材料で構築されていればディスク（１８）本体を通して、あるいはディスク本体に作られた透明材料製の窓を通して行ってもよい。
【００３６】
非放射能検出の別法として、本発明の装置はシンチレーションプロキシミティー技術を利用する放射能検出に関連して使用してもよい。例えば、発光剤含有ビーズを本装置に導入してもよい。あるいは本発明の微細加工された装置の細胞増殖チャンバー（２、７）および／または検定チャンバー（３、１１）の内面に発光剤含有層を作成してもよい。本装置の発光ビーズまたは発光表面を有する部分は好ましくは光学的に透明であって、その材料が至適効率で所与の波長の光を透過するようにする。この発光剤含有部分は発光剤を含有するたとえばランタニド金属含有化合物による発光ガラスまたは発光物質が導入された、たとえばポリスチレンまたはポリビニルトルエンのようなプラスチック材料のような、いかなる透明材料でできていてもよい。
【００３７】
適切な発光物質は、たとえばｐ−テルフェニル、ｐ−カテルフェニル、およびそれらの誘導体のような芳香族炭化水素および、例えば２−（４−ｔ−ブチルフェニル）−５−（４−ビフェニリル）−１，３，４−オキサジアゾールおよび２，５−ジフェニルオキサゾールなどのオキサゾールおよび１，３，４−オキサジアゾールの誘導体を含むことができる。たとえば１，４−ビス（５−フェニル−２−オキサゾリル）ベンゼンまたは９，１０−ジフェニルアントラセンのような波長移動剤を混入してもよい。
【００３８】
たとえば特異的結合ペアの一員のような結合基を本検定操作中で使用した細胞に由来する被分析物が特異的に結合するようにビーズまたは発光剤層の表面に固定化してもよい。本発明で有用な特異的結合ペアの適当なものにはビオチン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、抗体、レクチン、ホルモン受容体、核酸プローブ、ＤＮＡ結合蛋白質、その他を含む。特異的結合ペアのいずれの側の構成員でも特異的結合ペアの相補的構成員と結合させるために付着し固定化してもよいことは理解されるものである。
【００３９】
検定試薬を標識するために用いうる典型的な放射性同位元素には生化学で通常使用されるたとえば［3Ｈ］、［125Ｉ］、［35Ｓ］、［33Ｐ］を含むが、その他の同位元素の使用を排除するものではない。シンチレーションプロキシミティーに基づく検出法はよく知られている（例えば米国特許第4,568,649号、 Bertoglio-Matte, J. 参照）。検出には同時にまたは迅速に継続して組合せて測定されるべき検定を可能にする多数な全ての様式を利用することがある。この他に適当な撮像形式は本装置を利用する放射能および非放射能検定の双方に適当な検出手段を提供するであろう。
【００４０】
使用法によっては、ある検定部分が余分になることもある；すなわち装置の全部分がすべて毎回使われるものではない。どの型の検定を行う必要があり、装置内の液体流動を決定するためにどの適当な制御手段を選択するかは利用者が決定することになると予測される。従って、その構造は必要とする検定の操作およびプロトコルの範囲に液体流動の様々な複雑さを適合させるものとする。例えば、ＧＦＰに関連するレポータ遺伝子の検出では螢光の測定を可能にする単純なウェル構造が必要となろう。対照的に細胞から分泌された被分析物の測定、例えば免疫検定によるサイトカインの測定または細胞溶解後の細胞ｍＲＮＡの測定のためには被分析物を分析する前に、分泌された被分析物から細胞を分離するためにさらに複雑な構造が必要となろう。
【００４１】
本発明を次の実施例を参照してさらに説明する。
実施例１
プラスチックのフラスコ中でダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％ウシ血清およびＬ−グルタミンを添加し、ＨｅＬａ細胞の保存培養物を標準的な組織培養条件下に培養した。トリプシン化して細胞を収集し、得られた懸濁液を遠心分離で濃縮して細胞密度１０7 細胞/mLを得た。細胞懸濁液の適量（１μL）を射出成型により製造した図１に示す微細加工された構造物の表面にある深さ５０ μm、幅１００ μmの内部チャネルを持つ開口部に添加した。
【００４２】
この細胞懸濁液をディスクの導入チャネルに沿って深さ５０ μm および直径 ５００ μm の円形の細胞増殖チャンバーに移動させ、細胞を付着、増殖させた。組織培養インキュベータ（３７℃/９５％ＲＨ）中で４８時間インキュベーション後、細胞を細胞密度、形態学および生存能力について検査した。位相差顕微鏡術による検査によって微細構造中で増殖している細胞集団は元の保存株から増殖され、標準的組織培養プラスチック容器中に維持された対照培養物と同じ密度と形態学を有することが示された。次に細胞を装置内の細胞から増殖培地を除き、細胞を燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗い、細胞増殖チャンバー内に螢光検定試薬の溶液を添加し、市販の検査キット（LIVE/DEAD Viability Kit, Molecular Probes社、オレゴン州、L-3224）を用いて生存能力について検査した。続いて螢光顕微鏡術で検査すると、微細加工された構造物中で増殖している細胞は生存能力＞９５％を維持しており、標準的な組織培養条件下に増殖している対照細胞と同様であった。
【００４３】
実施例２
深さ５０ μm、幅１００μm の放射状内部チャネルを多数持つ図１に示す型を持ち、射出成形によって製造し、微細加工されたプラスチックディスクの表面を５００ＷのＵＶランプで２０ cm の距離から３０分間金属マスクを通して照射することによってマスクによって決定された領域の表面にのみＵＶ光が当たるようにして選択的に修飾した。
【００４４】
プラスチックのフラスコ中で、ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％ウシ血清とＬ−グルタミンとを添加し、ＨｅＬａ細胞の原培養物を標準的な組織培養条件下に培養した。トリプシン化により細胞を収集し、得られた懸濁液を遠心分離で濃縮して密度１０7 細胞/mLの細胞を得た。細胞懸濁液の適量（１μL）を装置の表面にある開口部に添加し、軸を中心にディスクを回転（１０００ rpmで３０秒間）させて細胞をチャネルに沿って移動させた。組織培養インキュベータ（３７℃/９５％ＲＨ）中で１８時間インキュベーション後、細胞を位相差顕微鏡術によって検査した。細胞はディスクの予めＵＶ光に露光しておいた部分で優先的に増殖し、他の部分では細胞が少なく、付着もよくないことが観察された。ディスクを次に１０００rpmで３０秒間回転し、細胞を再検査した。回転後、ＵＶ露光部分の細胞はプラスチック表面に付着したままで形態学的に対照細胞と同一のままであったが；対照的に非露光表面上の細胞は回転するディスクにより発生した遠心力によって完全に除去されたことが観察された。
【００４５】
実施例３
前記のように増殖させ収集したＨｅＬａ細胞を実施例２の装置の種々な寸法に成形された柱を持つ微小チャネルに導入し、そのチャネル内の細胞運動に対するバリアーとして作用するチャネル内に分散させた。懸濁液細胞をチャネルに導入し、装置を１８時間インキュベーションして細胞を沈降し、増殖させた。後続する検査により、柱の間の間隙が１０×６０ μm またはそれ以上であれば、チャネル内では細胞は自由にバリアーを超えて移動することを観察されることが判明した。対照的に柱の間の間隙が１０×２０ μm またはそれ以下であれば、懸濁液の流動性液体による輸送では細胞がバリアーを超えて移動することは妨げられた。しかし、続いてインキュベーションし、増殖させると細胞はゆっくりと変形してこのバリアーを越えて移動することが観察された。このバリアー構造が化学的または物理的刺激に応答しての細胞の運動または移動の研究に有用でありうることが証明された。
【００４６】
実施例４
カルレチクリン−ＧＦＰ融合蛋白質を安定に発現するように遺伝子移入されたＨｅＬａ細胞を図１に示す型に成形された装置の直径６００ μmおよび１０００μm、深さ１００ μm の複数の円形チャンバーに接続する幅１００ μm、深さ１００ μm の支持チャネルに導入した。細胞を組織培養インキュベー タ中で１８時間インキュベーションし、共焦点螢光顕微鏡術で検査した。微細加工された構造物中で増殖する細胞は通常の組織培養条件下で増殖する対照細胞と同じ水準のＧＦＰ発現を示した。
【００４７】
実施例５
実施例１に記載のようにしてＨｅＬａ細胞を増殖させ、微細加工したディスクに導入した。１８時間インキュベーションした後、細胞から増殖培地を除去し、０〜０．２mg/mL（w/v）の範囲で種々な濃度の膜浸透化剤ジギトニンを含む培地に置換し、細胞をジギトニン存在下に１０分間インキュベーションした。その後、実施例１に記載のように細胞の生存能力を測定した。結果はマイクロタイタープレート検定によって同一用量範囲のジギトニンに接触させた細胞と等価であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  図１ａは細胞増殖および細胞に基づく検定を行うために微細加工された装置の各微小チャネル部品の設計図を表す；
【図１ｂ】  図１ｂは細胞増殖および細胞に基づく検定を本発明に従って行うための検定部品を複数含む、微細加工されたディスクの断面図である；
【図２】  図２は微小担体ビーズの表面に増殖された細胞を用いるために微細加工された装置について、各検定部品の別な形状を表す。および
【図３】  図３は微細加工された装置の各検定部品についてさらに別な形状を表し、そこでは細胞増殖チャンバー内での細胞の通行を防止または妨害するための手段が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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