(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ａ２４分子結合モチーフを有する配列表の配列番号１から配列番号１７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドを含む医薬。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドを含む癌ワクチン。
【請求項４】
肺癌または腎癌の治療に用いる請求項２または３に記載の医薬または癌ワクチン。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドを含む細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドを使用することを特徴とする生体外での細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項７】
請求項１のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項８】
請求項１のペプチドをコードするポリヌクレオチドをその一部に含むポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号７６７から配列番号７７４のいずれか１に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項９】
ペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチドである、請求項８に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含有する組換えベクター。
【請求項１１】
組換えベクターが発現組換えベクターである請求項１０に記載の組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１に記載のペプチドまたは請求項８から９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドがコードするペプチドの製造方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項１５】
請求項１に記載のペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２４と相互作用して少なくともＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチドの認識を増強する化合物、および／または請求項７から９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物の同定方法であって、請求項１に記載のペプチド、請求項７から９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖、請求項１０または１１に記載の組換えベクター、請求項１２に記載の形質転換体、または請求項１４に記載の抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とする方法であって、請求項１に記載のペプチドをパルスした抗原提示細胞によるＣＴＬの誘導および／または該抗原提示細胞のＣＴＬによる認識を、ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生量を指標にして測定する実験系を用い、この系に被検物質である化合物を加えることにより、ＣＴＬによる請求項１に記載のペプチドの認識を増強する化合物を選別する同定方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のペプチド、請求項７から９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖、請求項１０または１１に記載の組換えベクター、請求項１２に記載の形質転換体、および請求項１４に記載の抗体のうちの少なくとも１つを含有することを特徴とする癌治療に用いる医薬組成物。
【請求項１７】
請求項７から９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法であって、腫瘍細胞株を用いて、対象核酸について、相応するｍＲＮＡの発現についてノザンブロッテイング法でおこなう方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な腫瘍抗原に関し、さらに詳しくは腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ペプチドに対する抗体、該ペプチドあるいは該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖と相互作用を有する化合物、該ペプチドからなる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、これらの１種以上を含む医薬組成物、該ペプチドの製造方法、該ペプチドまたは該ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用を有する化合物の同定方法、該ペプチドを用いる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、該ペプチドまたは該ペプチドをコードしているポリヌクレオチドの測定方法、並びに該同定方法若しくは該測定方法に使用する試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体における癌の排除には免疫系、特に細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）が重要な役割を果たしている。癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞の浸潤が認められている（Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．，１２６：２００〜２０５，１９９０）。この腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の標的分子（腫瘍抗原）は、メラノーマにおいて初めて発見された。腫瘍細胞内で生成された腫瘍抗原は、細胞内で分解されて８乃至１１個のアミノ酸からなるペプチド（腫瘍抗原ペプチド）になり、主要組織適合性抗原であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡと腫瘍抗原ペプチドとからなる複合体を認識して腫瘍細胞を傷害する。すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡ拘束性に腫瘍細胞を認識する。
【０００３】
ＨＬＡは細胞膜抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。ＨＬＡはクラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原に大別されるが、細胞傷害性Ｔ細胞により抗原ペプチドと共に認識されるＨＬＡはクラスＩ抗原である。ＨＬＡクラスＩ抗原はさらにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ等に分類され、ヒトでは有核細胞がそれぞれ異なった量のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃを有している。また、その遺伝子は多型性に富むことが報告されている。例えば、ＨＬＡ−ＡにはＡ１、Ａ２、Ａ２４、およびＡ２６等の、ＨＬＡ−ＢにはＢ８、Ｂ２７、およびＢ４６等の、ＨＬＡ−ＣにはＣｗ３やＣｗ６等の多型が存在する。そのため、それぞれのヒトが有するＨＬＡの型は必ずしも同一ではない。また、細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡクラスＩ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識するとき、ＨＬＡの型をも認識する。その上、ＨＬＡに結合可能な抗原ペプチドには、ＨＬＡの型（ｔｙｐｅ）ごとにその配列にモチーフ（規則的配列）があることが知られている。
【０００４】
近年、細胞傷害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原をコードする多くの遺伝子が、ヒトの癌細胞のｃＤＮＡから同定されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３〜１６４７，１９９１）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：１１８５〜１１９２，１９９６）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：４９９４〜５００４，１９９９）。例えば、ＨＥＲ／ｎｅｕ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：４３２〜４３６，１９９５）、変異ｃｄｋ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：１２８１〜１２８４，１９９５）、そして変異ＣＡＳＰ−８（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６：７８５〜７９３，１９９７）等がその例としてあげられるが、これらは増殖性細胞および悪性形質転換体中に含まれる。
【０００５】
また、腫瘍拒絶抗原遺伝子、およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）を含む特異免疫に関与する分子が、過去１０年において、メラノーマ、食道癌、およびその他の癌で同定されてきており、進行癌または転移性癌においてペプチドによる特異的免疫療法が検討されてきている。
【０００６】
現在欧米では、腫瘍抗原ペプチド投与することにより癌患者の体内の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法の開発がなされており、メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。例えば、メラノーマ抗原ｇｐ１００ペプチドをメラノーマ患者に皮下投与し、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を静脈注射投与することにより、４２％の患者で腫瘍の縮小が認められている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４：３２１，１９９８）。このように腫瘍抗原は、ワクチンとして利用することにより、有効な癌治療効果を期待できる。
【０００７】
しかしながら、同定されている腫瘍抗原はメラノーマ由来のものが多く、発病頻度の高い上皮性の癌や腺癌由来の腫瘍抗原についての報告は少ない。また、癌の多様性を考えると、全ての癌細胞において同一の腫瘍抗原が同程度発現されているとは考えられない。もちろん、単一の腫瘍抗原を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法によっても、該腫瘍抗原を有する癌の治療効果は得られる。しかし、癌の治療において特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を惹起し、かつ癌の多様性に対応して高い治療効果を得るためには、癌の多様性に応じた数多くの新たな腫瘍抗原を発見し利用することが重要である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、腺癌、および上皮性の癌、例えば大腸癌や肺癌の患者の特異的免疫療法に有用な、細胞傷害性Ｔ細胞に認識される新規な腫瘍抗原を見い出して提供することである。
【０００９】
具体的には少なくともＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチドを提供することである。さらに詳しくは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ペプチドに対する抗体、該ペプチドあるいは該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖と相互作用を有する化合物、該ペプチドからなる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、これらの１種以上を含む医薬組成物、該ペプチドの製造方法、該ペプチドまたは該ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用を有する化合物の同定方法、該ペプチドを用いる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、該ペプチドまたは該ペプチドをコードしているポリヌクレオチドの測定方法、並びに該同定方法若しくは該測定方法に使用する試薬キットを提供することである。
【００１０】
【課題解決のための手段】
本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２４と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＧＫ−ＣＴＬ）を、肺癌患者由来の腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｕｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）（ＴＩＬ）から樹立し、この腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に認識され得る腫瘍抗原をコードする遺伝子を、遺伝子発現クローニング法を用いて、ヒト肺腺癌細胞株１１−１８（ＨＬＡ−Ａ２４０２／０２０１）のｃＤＮＡライブラリーから単離・同定し、さらに、得られた遺伝子にコードされる腫瘍抗原に基づいて、該腫瘍抗原のエピトープを有するペプチドを見い出して、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、
（１）配列表の配列番号１から配列番号７６６のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列表の配列番号１から配列番号７６６のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドからなる医薬、
（３）配列表の配列番号１から配列番号７６６のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する癌ワクチン、
（４）肺癌または腎癌の治療に用いる前記（２）または（３）の医薬または癌ワクチン、
（５）配列表の配列番号１から配列番号７６６のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、
（６）配列表の配列番号１から配列番号７６６のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、
（７）配列表の配列番号１から配列番号７６６のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、
（８）配列表の配列番号１から配列番号７６６のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号７６７から配列番号７７４のいずれか１に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖、
（９）配列番号７６７から配列番号７７４のいずれか１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ポリヌクレオチドまたはその相補鎖、
（１０）前記（７）から（９）のいずれかのポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、
（１１）前記（７）から（１０）のいずれかのポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含有する組換えベクター、
（１２）組換えベクターが発現組換えベクターである前記（１１）の組換えベクター、
（１３）前記（１１）または（１２）の組換えベクターを導入されてなる形質転換体、
（１４）前記（１２）の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程を含む、前記（１）のペプチドの製造方法、
（１５）前記（１）のペプチドを免疫学的に認識する抗体、
（１６）前記（１）のペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２４と相互作用して少なくともＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチドの認識を増強する化合物、および／または前記（７）から（１０）のいずれかのポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物の同定方法であって、前記（１）のペプチド、前記（７）から（１０）のいずれかのポリヌクレオチドまたはその相補鎖、前記（１１）若しくは（１２）の組換えベクター、前記（１３）の形質転換体、または前記（１５）の抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とする方法、
（１７）前記（１６）の方法により得られる化合物、
（１８）前記（１）のペプチドの少なくとも１つに対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物、または前記（７）から（１０）のいずれかのポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物、
（１９）前記（１）のペプチド、前記（７）から（１０）のいずれかのポリヌクレオチドまたはその相補鎖、前記（１１）または（１２）の組換えベクター、前記（１３）の形質転換体、前記（１５）の抗体、および前記（１７）または（１８）の化合物のうちの少なくとも１つを含有することを特徴とする癌治療に用いる医薬組成物、
（２０）前記（１）のペプチドまたは前記（７）から（１０）のいずれかのポリヌクレオチドを定量的あるいは定性的に測定する方法、
（２１）前記（１６）または（２０）の方法に使用する試薬キットであって、前記（１）のペプチド、前記（７）から（１０）のいずれかのポリヌクレオチド、前記（１１）若しくは（１２）の組換えベクター、前記（１３）の形質転換体、または前記（１５）の抗体を少なくとも１つ以上含んでなる試薬キット、
からなる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
（腫瘍抗原遺伝子の同定）
本発明者らは、日本人の多数においてみられるＨＬＡ−Ａ分子の型であるＨＬＡ−Ａ２４と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を、既報（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：４９９４〜５００４，１９９９）に記載の方法で、肺癌患者由来の腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｕｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）（ＴＩＬ）から樹立した。以下、この細胞をＧＫ−ＣＴＬと呼ぶ。このＧＫ−ＣＴＬに認識され得る腫瘍抗原をコードする遺伝子を、遺伝子発現クローニング法を用いて、ヒト肺癌細胞株である１１−１８細胞（ＨＬＡ−Ａ２４０２／０２０１）のｃＤＮＡライブラリーから単離・同定した。さらに、得られた遺伝子にコードされる腫瘍抗原に基づいて、該腫瘍抗原のエピトープを有するペプチドを見い出した。
【００１３】
本明細書においてペプチドとは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む物質を意味し、蛋白質、ポリペプチド、オリゴペプチド等を包含する。以降、アミノ酸配列を表記する場合、１文字にて表記する場合と３文字にて表記する場合がある。
【００１４】
また、腫瘍抗原とは腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得る、腫瘍細胞が有する蛋白質、ポリペプチド、またはペプチドを意味する。また腫瘍抗原ペプチドとは、該腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるペプチドであり、ＨＬＡ分子と結合して細胞表面上に提示されることにより細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るペプチドを意味する。さらに、腫瘍抗原が有する腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るアミノ酸配列の部位を腫瘍抗原エピトープ（腫瘍抗原決定基）という。
【００１５】
ここで、「認識する（ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ）」とは、認識するものが、認識される対象を他のものと見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬと略称することもある）が腫瘍細胞あるいは腫瘍抗原ペプチドを認識するとは、ＣＴＬがＨＬＡにより提示された腫瘍抗原ペプチドにＴ細胞受容体を介して結合することを意味する。「活性化する」とは、ある活性若しくは作用を有するものまたは状態を、さらに増強するまたは作動させることを意味する。特に、本明細書において、ＣＴＬが活性化するとは、ＣＴＬがＨＬＡにより提示された抗原を認識することにより、例えばＩＦＮ−γを産生すること、あるいはＣＴＬが認識した標的細胞に対し細胞傷害性を示すことを意味する。「誘導する」とは、ある活性若しくは作用をほとんど持たないものまたは状態から、該活性若しくは該作用を発生させることを意味する。特に、本明細書において、抗原特異的なＣＴＬを誘導するとは、インビトロあるいはインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識するＣＴＬを分化および／または増殖させることを意味する。また、本明細書において細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤とは、ある抗原を特異的に認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が存在しないあるいは非常に低い割合でしか存在しない状態から、該抗原を認識する細胞傷害性Ｔ細胞が非常に多い割合で存在するような状態へと変化させる作用を示す薬剤を意味する。
【００１６】
（腫瘍抗原遺伝子の単離・同定）
本発明に係る腫瘍抗原をコードする遺伝子の単離・同定は、後述する実施例に詳細に示したように、１１−１８細胞のｃＤＮＡとＨＬＡ−Ａ２４０２ｃＤＮＡとをＣＯＳ−７細胞に共遺伝子導入し、該導入遺伝子が発現された細胞のうち、ＧＫ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進するものを選択することにより行った。その結果、ＧＫ−ＣＴＬによりＨＬＡ−Ａ２４拘束性に認識される遺伝子産物をコードする７種類のｃＤＮＡクローン、すなわちクローン５、クローン１１４、クローン５０、クローン８３、クローン１１１、クローン９６、およびクローン１２２が得られた。
【００１７】
得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列をダイデオキシヌクレオチドシークエンシング法により決定した。また、クローン１１４については、その塩基配列と部分的に相同性を有するクローン１９−５−１１４が得られた。これらの塩基配列を配列表の配列番号７６７〜７７４に記載した（下記の表１を参照）。これらの塩基配列について、ＧｅｎＢａｎｋ等の既存のデータベースに対して相同性検索を行ったところ、下記に示すような遺伝子と相同性はあるものの、これらは新規な塩基配列を有するｃＤＮＡであった。見い出された相同性の高いヒト由来遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸配列は開示されているものの、これらが腫瘍抗原をコードしているという報告はない。
【００１８】
クローン５の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：Ｙ１７１５１、ＡＦ１０４９４３、ＡＦ０８５６９２、ＡＦ０８５６９０、ＡＦ００９６７０、ＮＭ＿００３７８６）に登録されたＭＲＰ３遺伝子（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）のものと高い相同性が認められた。ＭＲＰ３遺伝子は、ＡＢＣ（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇｃａｓｓｅｔｔｅ）トランスポーターに属し、その機能として多剤耐性への関与が報告されている。
【００１９】
クローン１１４の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＡＦ１３１８４６として登録されている機能未知の遺伝子であるクローン２５０２８と部分的に相同性が認められた。クローン１１４は３６４８ｂｐの塩基からなり、その３′側の塩基配列はＡＦ１３１８４６の塩基配列の第１９７番目〜１６７６番目と相同であるが、その他の塩基配列には相同性はない。また、クローン１９−５−１１４の塩基配列第１８５番目以降は、クローン１１４の塩基配列第２８６１番目以降と、またＡＦ１３１８４６の塩基配列第９０７番目〜１６７６番目と相同であるが、第１〜第１８４番目はこれらと相同性は認められない。したがって、クローン１１４とクローン１９−５−１１４とは選択的スプライシング変異体（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ）または同一ファミリーの別遺伝子であると考えられる。
【００２０】
クローン５０の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＡＫ０００３９３）に登録されている機能未知の遺伝子であるＫＩＡＡ４１８４（ヒトｃＤＮＡ  ＦＬＪ２０３８６ｆｉｓ）のものと高い相同性が認められた。しかしクローン５０には多型や変異のある可能性がある。
【００２１】
クローン８３の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＡＢ０２４７４５として登録されている機能未知の遺伝子であるＦｅ６５Ｌ２と相同性が認められた。クローン８３は４２００ｂｐの塩基よりなり、塩基配列第１５８番目〜第５６６番目が、ＡＢ０２４７４５の塩基配列第１番目〜第４０９番目と相同であるが他の塩基配列には相同性は認められなかった。
【００２２】
クローン１１１の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＡＦ０９３２５０、ＡＪ１３０８９４として登録されている機能未知の遺伝子であるｐ３８ＩＰ（ｐ３８  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）のものと相同性が認められた。クローン１１１は２９５２ｂｐの塩基よりなり、塩基配列第８番目〜第５７９番目が、ＡＪ１３０８９４の塩基配列第３８番目〜第８５４番目と相同であるが他の塩基配列には相同性は認められなかった。
【００２３】
クローン９６の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＮＭ＿００６５２７、Ｚ７１１８８）に登録されたＨＢＰ遺伝子（Ｈａｉｒｐｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈｉｓｔｏｎｅ）のものと相同であった。ＨＢＰ遺伝子は、ＲＮＡ結合蛋白質としてヒストンｍＲＮＡ前駆体のプロセシングへの関与が報告されているが、腫瘍抗原としての報告はなされていない。
【００２４】
クローン１２２は、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：ＮＭ＿００６００７、ＡＦ０６２３４７、ＡＦ０６２３４６）に登録された機能未知のＺＦＮ２１６遺伝子（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２１６）の新規選択的スプライシング変異体（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ）である。クローン１２２は２００４ｂｐの塩基よりなり、塩基配列第２３２番目〜第２００４番目は、ＮＭ＿００６００７の塩基配列第６５３番目〜２４２５番目と同一であるが、５′末端側の塩基配列が異なる。
【００２５】
以下、クローン５、クローン１１４、クローン１９−５−１１４、クローン５０、クローン８３、クローン１１１、クローン９６、およびクローン１２２を、それぞれ遺伝子１、遺伝子２、遺伝子３、遺伝子４、遺伝子５、遺伝子６、遺伝子７、および遺伝子８と称することもある。また遺伝子１〜８の遺伝子産物をそれぞれ遺伝子産物１〜８と呼ぶ。
【００２６】
これら８つの遺伝子は腫瘍抗原をコードする遺伝子であり、上記のように細胞で発現させると、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬにより認識され、該ＣＴＬを活性化できる。これら各遺伝子がコードするアミノ酸配列を、各遺伝子毎にフレーム１（ＦＬ１）、フレーム２（ＦＬ２）、およびフレーム３（ＦＬ３）の全読み取り枠について推定した。その結果得られた５個以上のアミノ酸からなるペプチドを、ＦＬ１、ＦＬ２、およびＦＬ３についてそれぞれ、クローン５は配列表の配列番号１８〜２４、配列番号２５〜７９、および配列番号８０〜１１７；クローン１１４は配列表の配列番号１１８〜１７５、配列番号１７６〜２３２、および配列番号２３３〜２８９；クローン１９−５−１１４は配列表の配列番号２９０〜３０４、配列番号３０５〜３２１、および配列番号３２２〜３３２；クローン５０は配列表の配列番号３３３〜３４４、配列番号３４５〜３５０、および配列番号３５１〜３６５；クローン８３は配列表の配列番号３６６〜４０６、配列番号４０７〜４３７、および配列番号４３８〜４７９；クローン１１１は配列表の配列番号４８０〜５２９、配列番号５３０〜５７２、および配列番号５７３〜６１１；クローン９６は配列表の配列番号６１２〜６３１、配列番号６３２〜６６３、および配列番号６６４〜６７５；並びにクローン１２２は配列表の配列番号６７６〜７０２、配列番号７０３〜７３２、および配列番号７３３〜７６６；に記載した。
【００２７】
（腫瘍抗原ペプチドの同定）
腫瘍抗原をコードする上記遺伝子から腫瘍抗原ペプチドを得るために、上記遺伝子１〜８がコードするアミノ酸配列、並びに上記遺伝子と高い相同性を有するＭＲＰ３、ＨＢＰ、およびＺＦＮの遺伝子産物のアミノ酸配列に基づいてペプチドを合成した。ＨＬＡに結合可能な腫瘍抗原ペプチドには、ＨＬＡの各型に応じて、そのアミノ酸配列にモチーフ（規則的配列）があることが知られている。そこで、ＨＬＡ−Ａ２４に結合し得るペプチドについて、既報〔Ｋａｗａｎｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３５５０−３５５８（２０００）〕〔Ｉｂｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４４：２３３−２４１（１９９６）〕に記載の方法により、９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのペプチドを設計し合成した。
【００２８】
合成した各ペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４０２を遺伝子導入したＣ１Ｒ細胞にパルスし、この細胞とＧＫ−ＣＴＬとを共に培養して該ＧＫ−ＣＴＬから産生されるＩＦＮ−γを測定し、これを指標にしてＧＫ−ＣＴＬにより認識されるペプチドの選択を行った。合成したペプチドのうち、１７種類のペプチド（配列表の配列番号１〜１７）（表１）が、ＧＫ−ＣＴＬにより認識され、ＧＫ−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進した。ＧＫ−ＣＴＬによって認識される上記１７種類のペプチドのうち、ＭＲＰ３由来の４種類、クローン１１４由来の１種類、クローン１９−５−１１４由来の１種類、クローン５０由来の２種類のペプチドについて、ＣＴＬ活性化作用の用量依存性を検討したところ、いずれも用量依存的にＧＫ−ＣＴＬにより認識され、該ＧＫ−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進した。また、ＭＲＰ３由来の４種類、クローン１１４由来の２種類、クローン５０由来の２種類、クローン８３由来の２種類、クローン１１１由来の１種類、クローン９６由来の１種類のペプチドについて、癌患者から得た末梢血単核細胞からＣＴＬを誘導し得るかを検討したところ、これらのペプチドはいずれも癌患者から得た末梢血単核細胞から、標的細胞を認識してＩＦＮ−γの産生を促進し且つ該標的細胞を傷害することが可能なＣＴＬをインビトロで誘導した。すなわち、本発明において、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性にＣＴＬを誘導および／または活性化することのできる１７種類の腫瘍抗原ペプチドを得ることができた。さらに、ＭＲＰ３由来のペプチドで誘導された上記ＣＴＬによる標的細胞の認識が、該標的細胞のＭＲＰ３発現に関連することを見い出し、上記ＣＴＬは該ＣＴＬの誘導に用いたペプチドを特異的に認識することにより、該ペプチドを発現する腫瘍細胞を傷害することを確認した。
【００２９】
【表１】
0004097178.tif 000002
【００３０】
（ペプチド）
本発明に係るペプチドは、ヒト肺癌細胞株１１−１８から得られた上記遺伝子１〜８のいずれか１がコードするペプチドであり、好ましくは配列表の配列番号１〜７６６、さらに好ましくは配列表の配列番号１〜１７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。これらのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原特異的なＣＴＬに認識されるので、該ＣＴＬを誘導および／または活性化する腫瘍抗原として使用できる。また、これらのペプチドは、腫瘍抗原エピトープを特定して腫瘍抗原ペプチドを得るための材料として使用できる。例えば、これらのペプチドのアミノ酸配列に基づいて、例えばＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフに適合するものを設計し、該設計されたペプチドからＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬに認識されるものを選択することにより得られる。当該ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４と結合して抗原提示細胞表面上に提示され、かつＣＴＬにより認識される腫瘍抗原エピトープとしての性質を有するものであればよく、少なくとも約５個以上、好ましくは約７個以上、さらに好ましくは９個乃至１０個のアミノ酸残基からなるペプチドである。特に好ましくは、配列表の配列番号１〜１７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００３１】
配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、クローン５のＦＬ１にコードされるペプチドであり、配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに含まれている。配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、クローン１１４のＦＬ２にコードされるペプチドであり、配列表の配列番号２３０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに含まれている。配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、クローン１９−５−１１４のＦＬ３にコードされるペプチドであり、配列表の配列番号３２２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに含まれている。配列表の配列番号７または配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドはそれぞれ、クローン５０のＦＬ１またはＦＬ２にコードされるペプチドであり、配列表の配列番号３４４または配列番号３４７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに含まれている。配列表の配列番号９または配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドはクローン８３のＦＬ２にコードされるペプチドであり、配列表の配列番号４２７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに含まれている。配列表の配列番号１１または配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、クローン８３のＦＬ３にコードされるペプチドであり、配列表の配列番号４４７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに含まれている。配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドはクローン１１１のＦＬ３にコードされるペプチドであり、配列表の配列番号６０６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに含まれている。配列表の配列番号１４または配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、クローン９６のＦＬ３にコードされるペプチドであり、配列表の配列番号６６８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに含まれている。配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドはクローン１２２のＦＬ３にコードされるペプチドであり、配列表の配列番号７３７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに含まれている。したがって、配列表の配列番号１８、配列番号２３０、配列番号３２２、配列番号３４４、配列番号３４７、配列番号４２７、配列番号４４７、配列番号６０６、配列番号６６８、または配列番号７３７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドも、腫瘍抗原としてＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬにより認識されるので、該ＣＴＬの誘導および／または活性化のために好ましく使用できる。また、配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、公知遺伝子ＺＦＮ２１６の遺伝子産物由来のペプチドであるが、このペプチドがＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬに認識される腫瘍抗原ペプチドであるという報告はない。
【００３２】
上記ペプチドは、ＣＴＬを誘導および／または活性化するために、単独で使用してもよいし、２つ以上を組み合わせて使用してもよい。腫瘍抗原を認識して活性化されるＣＴＬは、複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であると考えられる。例えば、上記ＧＫ−ＣＴＬから限界希釈法によって得られた複数のＧＫ−ＣＴＬサブラインは、上記７種類のｃＤＮＡクローンをそれぞれ発現させたＣＯＳ−７細胞を認識する程度が異なっていた（実施例３および表２を参照）。このように、ＣＴＬは種々の抗原を認識する複数の細胞集団であることから、好ましくは上記ペプチドを２つ以上組み合わせて用いることが推奨される。
【００３３】
また、このように特定されたペプチドに１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入等の変異を導入したものであって、少なくともＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬにより認識されるペプチドも本発明の範囲に包含される。欠失、置換、付加、または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９：６６６，１９８３）を利用できる。このような変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、活性、または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基若しくはカルボキシル基等を修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
【００３４】
（ポリヌクレオチド）
本発明に係るポリヌクレオチドは、ヒト肺癌細胞株１１−１８より得られた上記遺伝子１〜８であって、配列表の配列番号７６７〜７７４のいずれか１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。配列表の配列番号７６７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは配列表の配列番号１８〜２４（ＦＬ１）、配列番号２５〜７９（ＦＬ２）、および配列番号８０〜１１７（ＦＬ３）のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしている。配列表の配列番号７６８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは配列表の配列番号１１８〜１７５（ＦＬ１）、配列番号１７６〜２３２（ＦＬ２）、および配列番号２３３〜２８９（ＦＬ３）のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしている。配列表の配列番号７６９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは配列表の配列番号２９０〜３０４（ＦＬ１）、配列番号３０５〜３２１（ＦＬ２）、および配列番号３２２〜３３２（ＦＬ３）のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしている。配列表の配列番号７７０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは配列表の配列番号３３３〜３４４（ＦＬ１）、配列番号３４５〜３５０（ＦＬ２）、および配列番号３５１〜３６５（ＦＬ３）のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしている。配列表の配列番号７７１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは配列表の配列番号３６６〜４０６（ＦＬ１）、配列番号４０７〜４３７（ＦＬ２）、および配列番号４３８〜４７９（ＦＬ３）のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしている。配列表の配列番号７７２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは配列表の配列番号４８０〜５２９（ＦＬ１）、配列番号５３０〜５７２（ＦＬ２）、および配列番号５７３〜６１１（ＦＬ３）のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしている。配列表の配列番号７７３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは配列表の配列番号６１２〜６３１（ＦＬ１）、配列番号６３２〜６６３（ＦＬ２）、および配列番号６６４〜６７５（ＦＬ３）のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしている。配列表の配列番号７７４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは配列表の配列番号６７６〜７０２（ＦＬ１）、配列番号７０３〜７３２（ＦＬ２）、および配列番号７３３〜７６６（ＦＬ３）のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしている。
【００３５】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１〜７６６のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、好ましくは配列番号１〜１７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチドをコードするものおよびその相補鎖であってもよい。さらに、本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るペプチドの腫瘍抗原エピトープをコードする領域に対応する少なくとも約１５個以上、好ましくは約２１〜３０個以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドおよびその相補鎖であってもよい。この有用なポリヌクレオチドの選択および塩基配列の決定は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して、発現させたペプチドのＣＴＬによる認識および／またはＣＴＬ誘導能の確認を行うことにより可能である。
【００３６】
さらに、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。ポリヌクレオチド分子としてＤＮＡ分子を代表例にとると、「ＤＮＡ分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子」は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）等に記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることを表す。
【００３７】
上記ポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ａ２４を有する細胞で発現させたときに、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原特異的なＣＴＬを誘導することおよび／または該ＣＴＬにより認識されることができる。また、該ポリヌクレオチドは、その３′末端にポリ（Ａ）構造を有しているが、ポリ（Ａ）の数は腫瘍抗原として作用するアミノ酸のコード部位に影響するものではなく、該ポリヌクレオチドの有するポリ（Ａ）の数は特に限定されるものではない。
【００３８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、いずれも本発明に係るペプチドの製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸としての試薬・標準品としても利用できる。
【００３９】
（組換えベクター）
上記ポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより、組換えベクターが得られる。用いるベクターＤＮＡは、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等をあげることができる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等を用いることができる。
【００４０】
組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等、とを構成要素とし、これらを自体公知の方法により組み合わせて作製される。前記ベクターＤＮＡに本発明に係るポリヌクレオチドを組み込む方法は、自体公知の方法を適用し得る。例えば、適当な制限酵素を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的のポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターを得ることができる。
【００４１】
（形質転換体）
上記ポリヌクレオチドが組み込まれたベクターＤＮＡを、自体公知の宿主、例えば大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、または動物細胞等に自体公知の方法で導入することにより形質転換体が得られる。遺伝子の導入を行う場合、より好ましい系としては遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法があげられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を用いることができる。ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９）等に記載されている標準的な方法により行うことができる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等を例示できる。
【００４２】
（ペプチドの製造）
上記形質転換体に導入するベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、本発明に係るペプチドを提供可能である。上記ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターＤＮＡを導入した形質転換体は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件で培養される。培養は、形質転換体により発現される本発明に係るペプチドの作用、特に少なくともＣＴＬを誘導および／または活性化する作用あるいは宿主中または宿主外に産生された該ペプチドまたはペプチド量を指標にして行ってもよいし、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養若しくはバッチ培養を行ってもよい。
【００４３】
本発明に係るペプチドは、通常のペプチド化学において知られる方法でも製造できる。例えば、ペプチド合成（丸善）１９７５年、“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６”が例示されるが、無論既知の方法が広く利用可能である。
【００４４】
本発明に係るペプチドの回収は、該ペプチドのＣＴＬによる認識を指標にして、例えば該ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生量を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、若しくはアフィニティクロマトグラフィー等の方法を組み合わせて、または硫安やアルコール等を用いて溶解度差に基づく分画手段によって精製回収できる。より好ましくは、本発明に係るペプチドのアミノ酸配列の情報に基づいて該アミノ酸配列に特異的な抗体を作製し、得られたポリクローナル抗体またはモノクロ−ナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。
【００４５】
（抗体）
本発明に係る抗体は、上記ペプチドを抗原として用いて作製する。抗原は上記ペプチド自体でもまたはその断片でもよく、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８個乃至１０個のアミノ酸で構成される。上記ペプチドに特異的な抗体を作製するためには、該ペプチドに固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが好ましい。このアミノ酸配列は、必ずしも該ペプチドのアミノ酸配列と相同である必要はなく、該ペプチドの立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、免疫学的に該ペプチドを結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定される。
【００４６】
抗体を産生するためには、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、本発明に係るペプチドを、アジュバントの存在または非存在下で単独または担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。
【００４７】
ポリクローナル抗体は、上記免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得される。好ましい手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。
【００４８】
モノクロ−ナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、上記ペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
【００４９】
かくして得られた、上記ペプチドを認識し結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該ペプチドの精製用抗体、試薬、または標識マーカー等として利用できる。
【００５０】
（スクリーニング）
上記ペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、上記組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、またはこれらを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数を組み合わせることにより、ＣＴＬによる該ペプチドの認識を増強し得る物質の同定に有効な手段を提供する。同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築できる。例えば、実施例に示したように、腫瘍抗原ペプチドをパルスした抗原提示細胞によるＣＴＬの誘導および／または該抗原提示細胞のＣＴＬによる認識を、ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生量を指標にして測定する実験系を用い、ここに被検物質を加えることにより、ＣＴＬによる本発明に係るペプチドの認識を増強する物質を選別できる。この実験系は同定方法の１つを説明するものであり、本発明に係る同定方法はこれに限定されない。
【００５１】
本発明は、上記同定方法によって得られた化合物も対象とする。該化合物は、本発明に係るペプチド、例えば配列表の配列番号１〜７６６のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、好ましくは配列表の配列番号１〜１７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、および／またはＨＬＡ−Ａ２４と相互作用してＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬによる該ペプチドの認識を増強する化合物であり得る。また、本発明に係るポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物等も本発明の範囲に包含される。かくして選別された化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。
【００５２】
（医薬組成物）
本発明に係るペプチドは、腫瘍抗原として、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に抗原特異的なＣＴＬを誘導および／または活性化するために使用できる。すなわち、上記ペプチドを使用することを特徴とするＣＴＬの誘導方法並びに上記ペプチドを含有するＣＴＬの誘導剤も、本発明の範囲に包含される。
【００５３】
また、本発明に係るペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、本発明に係る組換えベクター、該組換えベクターを導入した細胞、該ペプチドを免疫学的に認識する抗体、該ペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２４と相互作用してＣＴＬによる該ペプチドの認識を増強する化合物、または該ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物を、単独または複数組み合わせて利用することにより、これらのうち少なくとも１つを含有する医薬組成物を提供できる。ＨＬＡ−Ａ亜領域の多型の１つであるＨＬＡ−Ａ２４対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）は、日本人の人口の約６０％（多くは、その９５％の遺伝型がＡ２４０２である）、コーカサス人の２０％、アフリカ人の１２％でみられることから、本発明に係る医薬組成物は、多数の患者においてその効果を期待できる。
【００５４】
さらに、本発明に係るペプチド、例えばＭＲＰ３のｍＲＮＡは、肺癌細胞株、卵巣癌細胞株、および腎癌細胞株（肺癌細胞株：１１−１８、ＱＧ５６、ＳＱ−１、ＲＥＲＦ−ＬＣＭ、ＳＬＣ１−Ｓｑ、ＬＣ６５Ａ、ＲＥＲＦ−ＬＣＡ１、ＬＫ７９、ＰＣ−９、および１−８７；卵巣癌細胞株：ＫＯＣ−３Ｓ、ＫＯＣ−５Ｃ、ＫＯＣ−７Ｃ、ＴＹＫ−ｎｕ、ＲＭＵＧ−Ｓ、ＲＭＧ−１、ＴＯＣ−２、ＭＣＡＳ、ＲＴＳＧ、およびＲＫＮ；腎癌細胞株：ＰＣ９３、ＲＣ３０−１４、ＰＣ３、ＶＭＲＣ−ＲＣＷ、ＴＵＨＲ−４ＴＫＢ、ＴＵＨＲ−１０ＴＫＢ、ＲＣＣ−１０ＲＧＢ、およびＬＮＣａｐ）等で発現している。また、肺癌、腎癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、および口腔癌の各患者由来の種々組織においてもＭＲＰ３の発現が認められた。従って、上記医薬組成物は癌の治療、例えば肺癌、腎癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、および口腔癌等の治療において有用である。
【００５５】
具体的には、例えば本発明に係るペプチドからなる医薬、さらに本発明に係るペプチドを含有する医薬組成物は、いわゆる癌ワクチンとして使用できる。このとき、細胞性免疫の賦活のために、本発明に係るペプチドは適当なアジュバントの存在または非存在下で、単独で用いるかまたは担体に結合して用いる。担体は、それ自体が人体に対して有害作用をおこさなければ特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。剤形は、自体公知のペプチドを製剤化する手段を応用して適宜選択できる。その投与量は、ＣＴＬによる当該ペプチドの認識の程度により変化するが、一般的には活性本体として０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日乃至数ヶ月に１回投与する。
【００５６】
または、患者の末梢血より単核細胞画分を採取し、本発明に係るペプチドと共に培養し、ＣＴＬが誘導および／または活性化された該単核細胞画分を患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果を得られる。培養するときの単核細胞濃度、本発明に係るペプチドの濃度等の培養条件は、簡単な実験により決定できる。また、培養時、インターロイキン−２等のリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。
【００５７】
癌ワクチンとして本発明に係るペプチドを使用する場合、１つのペプチドのみでも癌ワクチンとして有効であるが、複数の種類の上記ペプチドを組み合わせて使用することもできる。癌患者のＣＴＬは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であるため、１種類のペプチドを癌ワクチンとして使用するより複数を組み合わせて癌ワクチンとして使用する方が、より高い効果が得られるときがある。
さらに、本発明に係るペプチド、例えばＭＲＰ３の腫瘍細胞株における発現が、一般的に知られている抗癌剤、例えばドキソルビシンやシスプラチン等によって増加することが報告されていることから（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３２：９４−６５７，１９９６）（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎＣａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ：９８−１０７，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ，１９９６）〔Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ），９２：１２９５−１３０２，２０００〕、本発明に係るペプチド、医薬組成物、または癌ワクチンを、これら抗癌剤と共に用いたときに、癌に対する高い防止および／または治療効果が得られることがあることは容易に想到できる。
【００５８】
本発明に係るペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、癌の、例えば肺癌、腎癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、および口腔癌等の遺伝子治療のために有用である。これらポリヌクレオチドをベクターに担持させ、直接体内に導入する方法またはヒトから細胞を採取したのち体外で導入する方法があるが、いずれも利用できる。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等が知られているが、レトロウイルス系が推奨される。無論これらウイルスは複製欠陥性である。その投与量は、ＣＴＬによる該ポリヌクレオチドがコードするペプチドの認識の程度により変化するが、一般的には本発明に係る腫瘍抗原ペプチドをコードするＤＮＡ含量として０．１μｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μｇ〜５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日乃至数ヶ月に１回投与する。
【００５９】
（診断のための測定方法および試薬）
本発明に係るペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、並びに該ペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能である。また本発明は、これらのうちの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体等それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【００６０】
本発明に係るペプチドの発現または活性に関連した疾患の診断手段は、例えば当該ペプチドをコードしているポリヌクレオチドとの相互作用や反応性を利用して、相応する核酸の存在量を決定すること、および／または当該ペプチドについて個体中の生体内分布を決定すること、および／または当該ペプチドの存在、個体由来の試料中の存在量を決定することによって行われる。すなわち、本発明に係るペプチドまたはこれらをコードしている核酸を診断マーカーとして定性的にあるいは定量的に測定する。試料中の当該ペプチドまたはこれらをコードしている核酸の定量的または定性的な測定法は当業者に周知の方法を利用できる。このような測定法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析および酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）等がある。また、核酸は、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレベルでの検出および定量ができる。
【００６１】
測定される試料として、個体由来の細胞、例えば血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等を例示できる。また、測定される核酸は、上記各試料から自体公知の核酸調製法により得られる。核酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲ若しくはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。また、正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を検出できる。増幅ＤＮＡを標識した上記ペプチドをコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。
【００６２】
上記測定により本発明に係るペプチドおよび該ペプチドをコードするＤＮＡの変異、減少、増加を検出することにより、当該ペプチドが関連する疾患、例えば、肺癌、腎癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、および口腔癌等の診断が可能になる。
【００６３】
【実施例】
以下に実施例をあげて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
（ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬの樹立）
ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球株（ＣＴＬ）は、肺癌患者（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ａ０２０６）の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から、文献に記載の方法に準じて樹立した（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８１：４５９〜４６６，１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：４９９７〜５００４，１９９９）。まず、肺癌患者から得たＴＩＬを１００Ｕ／ｍｌの組換えヒト・インターロイキン−２（ＩＬ−２）を添加して５０日以上長期培養した。培養７日毎にこれらＩＬ−２活性化ＴＩＬの一部を採取し、種々の腫瘍細胞または正常細胞と共に培養して、ＩＦＮ‐γ産生の測定により、そのＣＴＬ活性を検定した（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：４９９７〜５００４，１９９９）。ＩＦＮ‐γの測定は、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）により行った。
【００６４】
得られたＣＴＬ（以下、ＧＫ−ＣＴＬと呼ぶ）は図１に示すように、ＨＬＡ−Ａ２４０２＋１１−１８肺癌細胞株、Ｓｑ−１肺癌細胞、およびＰＣ９肺癌細胞を認識して、ＩＦＮ−γを産生した。しかし、ＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞、ＣＯＳ−７細胞、およびＶＡ−１３細胞を認識しなかった。このことから、ＧＫ−ＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬであることが確認された。
【００６５】
なお、上記腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の遺伝子型は、既報（Ｃａｎｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４８：１４７〜１５２，１９９９）に記載されている。また上記患者のＨＬＡクラスＩの抗原型は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて従来の血清学的方法で決定した。さらに、ＨＬＡ−Ａ２／Ａ２４サブタイプは、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ法とＤＮＡ配列決定法（ダイデオキシヌクレオチドシークエンシング法）によって決定した。
【００６６】
【実施例２】
（腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡクローンの単離・同定）
実施例１で得たＧＫ−ＣＴＬにより認識されるヒト肺癌細胞株１１−１８の腫瘍抗原をコードする遺伝子は、既知の方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：４９９７〜５００４，１９９９）に準拠して単離・同定した。まず、１１−１８細胞のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをｃＤＮＡに転換してＳａｌＩアダプターにライゲーションし、発現ベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した。また、ＨＬＡ−Ａ２４０２のｃＤＮＡを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得、真核細胞発現ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローン化した。
【００６７】
１１−１８細胞から得られた上記ｃＤＮＡクローンは１００クローンずつプールし、各ウエル毎にプールしたｃＤＮＡの２００ｎｇと、ＨＬＡ−Ａ２４０２のｃＤＮＡの２００ｎｇとを、１００μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１：２００混液中で３０分間混合した。この混合物の５０μｌをＣＯＳ−７細胞（１×１０５）に加え、６時間インキュベーションして共遺伝子導入した。次いで１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて２日間培養し、ＧＫ−ＣＴＬ（２×１０４）を各ウエルに添加した。さらに１８時間インキュベーションした後に、上清の１００μｌを採り、産生されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定し、ｃＤＮＡライブラリーのプールをスクリーニングした。このとき、ネガティブコントロールとして遺伝子を導入していないＣＯＳ−７細胞を標的細胞としてＧＫ−ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を検討し、産生されたＩＦＮ−γの値をバックグランドとして各測定値から減算した。
【００６８】
その結果、ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進した上記１１−１８細胞ｃＤＮＡライブラリーのプールについて再現性を確認し、次いで当該再現性が確認されたｃＤＮＡプールから個別にクローンを取り出し、上記同様にスクリーニングを行って、ＣＴＬに認識される独立プール由来のクローンを選別した。さらに、得られたクローンの用量依存性を上記同様の方法で確認し、最終的に８種類のクローン、すなわちクローン５、クローン１１４、クローン５０、クローン８３、クローン１１１、クローン９６、クローン１２２、クローン１９−５−１１４を得た。これら８種類のｃＤＮＡクローンは、それぞれＨＬＡ−Ａ２４０２ｃＤＮＡと共にＣＯＳ−７細胞に共遺伝子導入したときは、用量依存的にＧＫ−ＣＴＬにより認識されてＩＦＮ−γ産生を促進した。しかし、これらのｃＤＮＡクローンをＨＬＡ−Ａ２６０２ｃＤＮＡと共に共遺伝子導入したときには、ＧＫ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生の促進は観察されなかった。クローン５、クローン１１４、クローン５０、クローン８３、クローン１１１、クローン９６、およびクローン１２２について、それぞれ図２〜図８に示す。このことから、得られたｃＤＮＡクローンがＨＬＡ−Ａ２４拘束性にＧＫ−ＣＴＬにより認識され得る腫瘍抗原をコードしていることが確認された。一方、発現ベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−２のみを各型のＨＬＡと共に共遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞では、ＧＫ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生は促進されなかった（図示せず）。
【００６９】
得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列の決定は、ＤＮＡシークエンシングキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３７７ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して、ダイデオキシヌクレオチドシークエンシング法により行った。さらに、得られた各塩基配列（配列表の配列番号７６７〜７７４）から、各遺伝子がコードするアミノ酸配列をフレーム１、フレーム２、フレーム３の読み取り枠について推定した。また、クローン１９−５−１１４は、シークエンシングの結果、クローン１１４の選択的スプライシング変異体であることが判明した。
【００７０】
【実施例３】
（ＧＫ−ＣＴＬサブラインの樹立）
ＧＫ−ＣＴＬサブラインは、ＧＫ−ＣＴＬ親株から、限界希釈培養（０．３、０．５、１、２および４細胞／ウエル）によって樹立した〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３，４９９７〜５００４、１９９９〕。これらのサブラインは、上記遺伝子の各１００ｎｇ／ウエルとＨＬＡ−Ａ２４０２ｃＤＮＡの１００ｎｇ／ウエルとを共遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞または腫瘍細胞と細胞比１：１で培養し、そのＩＦＮ−γ産生量を指標にして選択したものである。これらサブラインのうち、４種類のＣＴＬサブラインがクローン５（ＭＲＰ３）、３種類のＣＴＬサブラインがクローン５０、５種類のＣＴＬサブラインがクローン８３、３種類のＣＴＬサブラインがクローン９６（ＨＢＰ）、３種類のＣＴＬサブラインがクローン１１１、１種類のＣＴＬサブラインがクローン１１４、および２種類のＣＴＬサブラインがクローン１２２（ＺＦＮ）を発現したＣＯＳ−７細胞に対して反応性を示した（表２）。すなわち、ＣＴＬサブラインにより、認識する腫瘍抗原ペプチドが異なることが判明した。このことから、ＧＫ−ＣＴＬ、すなわち癌患者のＣＴＬは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることが示唆された。
【００７１】
【表２】
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【００７２】
【実施例４】
（腫瘍抗原ペプチドの調製およびそのＣＴＬ誘導活性）
実施例２で単離・同定した腫瘍抗原をコードする８種類の遺伝子から腫瘍抗原ペプチドを得るために、まずＨＬＡ−Ａ２４に結合し得るモチーフ（規則的配列）に基づいて、既報〔Ｋａｗａｎｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３５５０−３５５８（２０００）〕〔Ｉｂｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４４：２３３−２４１（１９９６）〕に記載の方法により、上記遺伝子１〜８がコードするアミノ酸配列、並びに当該遺伝子と高い相同性を有するＭＲＰ３、ＨＢＰ、およびＺＦＮの遺伝子産物のアミノ酸配列から、それぞれ異なる９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのペプチドを設計し、合計７２種類のペプチド（７０％以上の純度）を自体公知の方法で合成した。３１種類はクローン５（表３）、１０種類はクローン１１４（表４）、１種類はクローン１９−５−１１４（表４のペプチド１１４−３−５４）、６種類はクローン５０（表５）、１１種類はクローン８３（表６）、２種類はクローン１１１（表７）、７種類はクローン９６（表８）、３種類はクローン１２２（表９）、１種類はＺＦＮ遺伝子（表９のペプチド１２２−２０）がコードするアミノ酸配列から設計したペプチドである。
【００７３】
【表３】
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【００７４】
【表４】
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【００７５】
【表５】
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【００７６】
【表６】
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【００７７】
【表７】
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【００７８】
【表８】
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【００７９】
【表９】
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【００８０】
上記合成した各ペプチド（終濃度１０μＭ）を、ＨＬＡ−Ａ２４０２を遺伝子導入したＣ１Ｒ細胞（以下、Ｃ１Ｒ／Ａ２４０２細胞と呼ぶ）と、５％ＣＯ２−９５％Ａｉｒにて３７℃で２時間インキュベーションし、当該各ペプチドを細胞表面上に発現したＨＬＡ−Ａ２４０２に結合させた。このように各ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞を標的細胞（Ｔ）として用いた。また、ＧＫ−ＣＴＬをエフェクター細胞（Ｅ）として用いた。標的細胞１×１０４個とエフェクター細胞２×１０４個とを混合し（Ｅ／Ｔ比＝２）、１８時間インキュべーションした。インキュベーション後の上清の１００μｌを回収してＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γを測定した。ペプチドをパルスしていないＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞に対するＣＴＬのＩＦＮ−γ産生をバックグランドとして、各測定値から減算した。その結果、上記表１に示す１７種類のペプチドがそれぞれＧＫ−ＣＴＬに認識され、ＧＫ−ＣＴＬのＩＦＮ‐γ産生を促進した。結果を図９〜図１５に示した。
【００８１】
さらに、ＧＫ−ＣＴＬによって認識される上記１７種類のペプチドのうち、クローン５由来の４種類（ペプチド５−５０３、５−６９２、５−７６５、および５−１２９３）、クローン１１４由来の１種類（ペプチド１１４−１−２７５）、クローン１９−５−１１４由来の１種類（ペプチド１１４−３−５４）、クローン５０由来の２種類（ペプチド５０−１−７６７および５０−２−３８３）について、用量依存性を検討したところ、いずれも用量依存的にＧＫ−ＣＴＬに認識され、ＧＫ−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進した（図１６〜２３）。
【００８２】
【実施例５】
（ペプチドによる癌患者末梢血単核細胞からのＣＴＬ誘導）
実施例４で得た腫瘍抗原ペプチドのうち、クローン５０由来の２種類（ペプチド５０−１−７６７および５０−２−３８３）、クローン８３由来の２種類（ペプチド８３−３−２９７および８３−３−３０１）、クローン９６由来の１種類（ペプチド９６−３−３８０）、クローン１１１由来の１種類（ペプチド１１１−３−８１５）、クローン１１４由来の１種類（ペプチド１１４−１−２７５）、並びにクローン１９−５−１１４由来の１種類（ペプチド１１４−３−５４）について、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのインビトロでのＣＴＬ誘導能を、ＩＦＮ−γ産生を指標にして検討した。ＰＢＭＣは、６人のＨＬＡ−Ａ２４陽性の肺癌患者並びに６人の健常人の末梢血からそれぞれ常法通り調製した。まず、ＰＢＭＣの１×１０５個を９６ウエルＵ底型マイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエルに加え、１０μｇ／ｍｌの上記各ペプチドと共に２００μｌの培養培地中でインキュベーションした。培地は４５％ＲＰＭＩ−１６４０、４５％ＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌのヒト・インターロイキン−２、および０．１μＭ  ＭＥＭノンエッセンシャル・アミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）からなるものを用いた。培養３日目毎に半量の培地を除き、対応する各ペプチドを含む上記組成の培地と交換した。このように培地交換によるペプチド刺激を５回行い、最終刺激を行った翌日に細胞を回収して洗浄した後に標的細胞と反応させ、上清に産生されるＩＦＮ−γ量を実施例４と同様に測定した。標的細胞としては、１１−１８肺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２４＋）または対応する各ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞を用いた。このとき、ＱＧ５６細胞（ＨＬＡ−Ａ２４−）またはＨＩＶペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞に対するＣＴＬのＩＦＮ−γ産生をバックグランドとして、１１−１８肺癌細胞または各ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞を標的細胞として用いたときに得られた測定値から減算した。また、エプスタイン・バ−・ウイルス（ＥＢＶ）由来のＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフに適合するペプチドを陽性コントロールとして使用した。
【００８３】
その結果を図２４から図２６に示した。図２４は、エフェクター細胞としてペプチド刺激した肺癌患者由来のＰＢＭＣを用い、標的細胞として対応する各ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞を用いた結果を示す。図２５は、エフェクター細胞としてペプチド刺激した肺癌患者由来のＰＢＭＣを用い、標的細胞として１１−１８肺癌細胞を用いた結果を示す。図２６は、エフェクター細胞としてペプチド刺激した健常人由来のＰＢＭＣを用い、標的細胞として対応する各ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞を用いた結果を示す。図中、各バーは６人の肺癌患者または健常人から得たＰＢＭＣについての結果にそれぞれ対応する。
【００８４】
図２４および図２５に示したように、上記８種類のペプチドとそれぞれインキュベーションした肺癌患者由来のＰＢＭＣは、刺激に用いた各ペプチドと同じペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞、または１１−１８肺癌細胞を認識して、ＩＦＮ−γの産生を促進した。すなわち、上記８種類のペプチドは、肺癌患者のＰＢＭＣから、これらペプチドを認識してＩＦＮ−γ産生を促進するＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬをインビトロで誘導できた。一方、図２６に示したように、健常人から得たＰＢＭＣにおいては、ペプチド１１４−１−２７５を例外として、刺激に用いた各ペプチドと同じペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞と反応させても、ＩＦＮ−γ産生の促進はみられないか、またはその程度が低かった。なお、癌患者によって、各ペプチドによるＣＴＬ誘導の程度に個体差があるのは、ＣＴＬが既に前駆体の段階で、複数の抗原を認識する細胞の集団であるためと考えられる。
【００８５】
また、ペプチドで５回刺激した肺癌患者由来の上記ＰＢＭＣを、さらにペプチド非存在下且つＩＬ−２（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）存在下で１ヶ月間培養した後、得られた細胞の１１−１８肺癌細胞に対する細胞傷害性を、Ｅ／Ｔ比２．５：１〜２０：１における標準的な６時間の５１Ｃｒ遊離試験で測定し、得られた結果を％特異的溶解で表した（図２７）。同時にＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞であるＱＧ５６肺癌細胞に対する細胞傷害性を測定した。
【００８６】
その結果、上記でペプチド刺激された肺癌患者由来のＰＢＭＣは、Ｅ／Ｔ比に依存してＨＬＡ−Ａ２４＋腫瘍細胞である１１−１８肺癌細胞を認識し、細胞傷害性を示した。しかし、ＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞であるＱＧ５６細胞に対しては細胞傷害性は示さなかった。代表的な例を図２７に示す。すなわち、上記８種類のペプチドは、肺癌患者のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に腫瘍細胞を認識して細胞傷害性を示すＣＴＬを誘導した。
【００８７】
【実施例６】
実施例４で得た腫瘍抗原ペプチドのうち、ＭＲＰ３由来の４種類のペプチド（ＭＲＰ３−５０３、ＭＲＰ３−６９２、ＭＲＰ３−７６５およびＭＲＰ３−１２９３）について、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのインビトロでのＣＴＬ誘導能を、ＩＦＮ−γ産生を指標にして検討した。ＰＢＭＣは、いずれもＨＬＡ−Ａ２４陽性の、肺癌患者３人、腎癌患者４人、および大腸癌患者２人、並びに健常人３人の末梢血からそれぞれ常法通り調製した。得られたＰＢＭＣと上記ペプチド各１０μＭとを実施例５と同様に培養し、ペプチド刺激を４回行った。最終刺激を行った翌日に細胞を回収して洗浄した後に標的細胞と反応させ、上清に産生されるＩＦＮ−γ量を実施例４と同様に測定した。標的細胞としては、Ｓｑ−１肺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２４＋）または対応する各ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞を用いた。このとき、ＱＧ５６細胞（ＨＬＡ−Ａ２４−）またはペプチドをパルスしていないＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞に対するＣＴＬのＩＦＮ−γ産生をバックグランドとして、Ｓｑ−１肺癌細胞または各ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞を標的細胞として用いたときに得られた測定値から減算した。また、エプスタイン・バ−・ウイルス（ＥＢＶ）由来のＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフに適合するペプチドを陽性コントロールとして、ＨＩＶ由来のペプチドを陰性コントロールとして使用した。その結果を図２８および図２９に示した。
【００８８】
図２８は、肺癌患者由来のＰＢＭＣについての結果を代表例として示したものである。図２８のＡから明らかなように、ＭＲＰ３由来の４種類のペプチドとそれぞれインキュベーションした該ＰＢＭＣは、Ｓｑ−１肺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２４＋）または刺激に用いた各ペプチドと同じペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞を認識してＩＦＮ−γ産生を促進した。すなわち、上記４種類のペプチドは、これらペプチドを認識してＩＦＮ−γ産生を促進するＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを、肺癌患者のＰＢＭＣからインビトロで誘導できた。さらに、該誘導されたＣＴＬについて、ペプチド認識の特異性を検討した結果、図２８のＢに示したように、各ペプチドにより誘導されたＣＴＬは、刺激に用いた各ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞を認識してＩＦＮ−γ産生を促進したが、他のペプチドをパルスした細胞の認識およびＩＦＮ−γ産生量は低かった。すなわち、各ペプチドにより誘導されたＣＴＬは、該誘導に用いたペプチドを特異的に認識することが判明した。
【００８９】
また、図２９に示したように、上記４種類の各ペプチドにより刺激された肺癌患者３人、腎癌患者４人、および大腸癌患者２人から得たＰＢＭＣは、刺激に用いた各ペプチドと同じペプチドをパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞および／またはＳｑ−１肺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２４＋）を認識してＩＦＮ−γ産生を促進した（図２９のＡおよびＢ）。一方、健常人から得たＰＢＭＣにおいては、これらのペプチドで刺激しても、上記標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生量は低かった。すなわち、上記４種類のペプチドはこれらペプチドを認識してＩＦＮ−γ産生を促進するＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを、肺癌患者、腎癌患者、および大腸癌患者のＰＢＭＣからインビトロで誘導できた。
【００９０】
また、ペプチドで４回刺激した癌患者由来の上記ＰＢＭＣを、放射線照射した後に対応するペプチドをパルスした自己ＰＢＭＣを抗原提示細胞として用いてさらに培養した。該培養の３日目および７日目に、抗原提示細胞非存在下でペプチドにより刺激し、さらにＩＬ−２のみで培養した。細胞を培養２８〜４２日目に回収してエフェクター細胞として用い、標的細胞としてＨＬＡ−Ａ２４＋腫瘍細胞であるＳｑ−１肺癌細胞若しくは１１−８肺癌細胞または刺激に用いたペプチドと同じペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４＋ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞を使用して、標的細胞に対する細胞傷害性を、実施例５と同様に測定し、得られた結果を％特異的溶解で表した（図３０）。同時にＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞であるＱＧ５６肺癌細胞に対する細胞傷害性を測定した。
【００９１】
その結果、上記ペプチドで刺激された癌患者由来のＰＢＭＣは、Ｅ／Ｔ比に依存して上記各標的細胞を認識し、細胞傷害性を示した。しかし、ＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞であるＱＧ５６細胞に対しては細胞傷害性は示さなかった。代表的な例を図３０のＡおよびＢに示す。すなわち、上記ＭＲＰ３由来の４種類のペプチドは、肺癌患者、腎癌患者、または大腸癌患者のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に腫瘍細胞を認識して細胞傷害性を示すＣＴＬを誘導した。また、図３０のＢから分かるように、ＭＲＰ３−５０３で誘導したＣＴＬは、ＭＲＰ３−５０３をパルスした細胞を認識するが、ＭＲＰ３−７６５をパルスした細胞は認識せず、逆にＭＲＰ３−７６５で誘導したＣＴＬは、ＭＲＰ３−７６５をパルスした細胞を認識するが、ＭＲＰ３−５０３をパルスした細胞は認識しないことから、上記ペプチドにより誘導されたＣＴＬは、該誘導に用いたペプチド特異的を特異的に認識することが確認された。
【００９２】
さらに、上記ＣＴＬによる腫瘍細胞の認識は、該腫瘍細胞のＭＲＰ３発現に関連していることを確認した。すなわち、上記ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４＋であってＭＲＰ３を発現しているＳｑ−１肺癌細胞とＴＵＨＲ−１０ＴＫＢ腎癌細胞を認識してＩＦＮ−γ産生を促進したが、ＨＬＡ−Ａ２４＋であってＭＲＰ３の発現が低いＣａｋｉ−１腎癌細胞、ＨＬＡ−Ａ２４−であってＭＲＰ３の発現が低いＫＵＲ−１１腎癌細胞、およびＨＬＡ−Ａ２４−であってＭＲＰ３を発現しているＱＧ５６肺癌細胞に対する認識の程度およびＩＦＮ−γ産生量が低かった。その結果を、肺癌患者由来のＰＢＭＣからＭＲＰ３由来のペプチドにより誘導されたＣＴＬを例として図３１のＡに示した。さらに、本来ＭＲＰ３の発現が低いＣａｋｉ−１腎癌細胞にＭＲＰ３−６９２をパルスすると、図３１のＢに示したように、ＭＲＰ３−６９２の刺激で誘導されたＣＴＬに認識されることを見い出した。一方、ＨＩＶペプチドでパルスしたＣａｋｉ−１腎癌細胞は、ＭＲＰ３−６９２の刺激で誘導されたＣＴＬに認識されなかった。
【００９３】
また、各種腫瘍細胞株を用いてそのＭＲＰ３  ｍＲＮＡの発現をノザンブロッティングにより検討したところ、検討した肺癌細胞株、卵巣癌細胞株、および腎癌細胞株各１０種類のうち、腎癌細胞株２種類を除く全てで、ＭＲＰ３の発現が確認された（肺癌細胞株：１１−１８、ＱＧ５６、ＳＱ−１、ＲＥＲＦ−ＬＣＭ、ＳＬＣ１−Ｓｑ、ＬＣ６５Ａ、ＲＥＲＦ−ＬＣＡ１、ＬＫ７９、ＰＣ−９、および１−８７；卵巣癌細胞株：ＫＯＣ−３Ｓ、ＫＯＣ−５Ｃ、ＫＯＣ−７Ｃ、ＴＹＫ−ｎｕ、ＲＭＵＧ−Ｓ、ＲＭＧ−１、ＴＯＣ−２、ＭＣＡＳ、ＲＴＳＧ、およびＲＫＮ；腎癌細胞株：ＰＣ９３、ＲＣ３０−１４、ＰＣ３、ＶＭＲＣ−ＲＣＷ、ＴＵＨＲ−４ＴＫＢ、ＴＵＨＲ−１０ＴＫＢ、ＲＣＣ−１０ＲＧＢ、およびＬＮＣａｐ）。一方、非腫瘍性細胞株であるＣＯＳ−７細胞、ＶＡ１３細胞、および２９３Ｔ細胞や、ＥＢＶ形質転換細胞であるＳＳ−ＥＢＢ細胞では、ＭＲＰ３の発現は低かった。また、肺癌、腎癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、および口腔癌の各患者由来の種々組織においてもＭＲＰ３の発現が認められた。このことから、上記ＭＲＰ３由来のペプチドは、上記検討において用いた１１−１８肺癌細胞やＳｑ−１肺癌細胞だけでなく、ＭＲＰ３を発現している様々な腫瘍細胞に対してＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性を示すＣＴＬを誘導できると考えられる。すなわち、ＭＲＰ３由来のペプチドは、種々の癌、例えば肺癌、腎癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、および口腔癌等の防止および／または治療に有用である。
【００９４】
【発明の効果】
本発明により、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化せしめることができ、上皮性癌および腺癌等の、例えば肺癌等の特異的免疫療法が可能になる。ＨＬＡ−Ａ２４対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）は、日本人の人口の約６０％（多くは、その９５％の遺伝型がＡ２４０２である）、コーカサス人の２０％、アフリカ人の１２％でみられる。従って、本発明は、癌治療において多大な貢献を期待し得る。また、本発明は、上皮性癌および腺癌等の、Ｔ細胞による認識に関する分子の基礎的研究にも多大に寄与するものである。
【００９５】
【配列表フリーテキスト】
配列表の配列番号  １：腫瘍抗原として作用する設計されたペプチド。
配列表の配列番号  ２：腫瘍抗原として作用する設計されたペプチド。
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【００９６】
【配列表】
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【００９７】
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＧＫ−ＣＴＬ（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ａ０２０６）が、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に腫瘍細胞を認識してＩＦＮ−γを産生することを示す図である。
【図２】  ヒト肺癌細胞株１１−１８から得た腫瘍抗原遺伝子であるクローン５（ＭＲＰ３）がコードする腫瘍抗原が、ＧＫ−ＣＴＬにＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性かつ用量依存的に認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図３】  ヒト肺癌細胞株１１−１８から得た腫瘍抗原遺伝子であるクローン１１４がコードする腫瘍抗原が、ＧＫ−ＣＴＬにＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性かつ用量依存的に認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図４】  ヒト肺癌細胞株１１−１８から得た腫瘍抗原遺伝子であるクローン５０がコードする腫瘍抗原が、ＧＫ−ＣＴＬにＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性かつ用量依存的に認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図５】  ヒト肺癌細胞株１１−１８から得た腫瘍抗原遺伝子であるクローン８３がコードする腫瘍抗原が、ＧＫ−ＣＴＬにＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性かつ用量依存的に認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図６】  ヒト肺癌細胞株１１−１８から得た腫瘍抗原遺伝子であるクローン１１１がコードする腫瘍抗原が、ＧＫ−ＣＴＬにＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性かつ用量依存的に認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図７】  ヒト肺癌細胞株１１−１８から得た腫瘍抗原遺伝子であるクローン９６がコードする腫瘍抗原が、ＧＫ−ＣＴＬにＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性かつ用量依存的に認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図８】  ヒト肺癌細胞株１１−１８から得た腫瘍抗原遺伝子であるクローン１２２がコードする腫瘍抗原が、ＧＫ−ＣＴＬにＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性かつ用量依存的に認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図９】  腫瘍抗原遺伝子であるクローン５（ＭＲＰ３）の遺伝子産物由来の腫瘍抗原ペプチドが、ＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図１０】  腫瘍抗原遺伝子であるクローン１１４またはクローン１９−５−１１４の遺伝子産物由来の腫瘍抗原ペプチドが、ＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図１１】  腫瘍抗原遺伝子であるクローン５０の遺伝子産物由来の腫瘍抗原ペプチドが、ＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図１２】  腫瘍抗原遺伝子であるクローン８３の遺伝子産物由来の腫瘍抗原ペプチドが、ＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図１３】  腫瘍抗原遺伝子であるクローン１１１の遺伝子産物由来の腫瘍抗原ペプチドが、ＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図１４】  腫瘍抗原遺伝子であるクローン９６（ＨＢＰ）の遺伝子産物由来の腫瘍抗原ペプチドが、ＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図１５】  腫瘍抗原遺伝子であるクローン１２２（ＺＦＮ）の遺伝子産物由来の腫瘍抗原ペプチドが、ＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図１６】  腫瘍抗原ペプチド５−５０３（ＭＲＰ３−５０３）が、ペプチド用量依存的にＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図１７】  腫瘍抗原ペプチド５−６９２（ＭＲＰ３−６９２）が、ペプチド用量依存的にＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図１８】  腫瘍抗原ペプチド５−７６５（ＭＲＰ３−７６５）が、ペプチド用量依存的にＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図１９】  腫瘍抗原ペプチド５−１２９３（ＭＲＰ３−１２９３）が、ペプチド用量依存的にＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図２０】  腫瘍抗原ペプチド１１４−１−２７５が、ペプチド用量依存的にＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図２１】  腫瘍抗原ペプチド１１４−３−５４が、ペプチド用量依存的にＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図２２】  腫瘍抗原ペプチド５０−１−７６７が、ペプチド用量依存的にＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図２３】  腫瘍抗原ペプチド５０−２−３８３が、ペプチド用量依存的にＧＫ−ＣＴＬに認識され、そのＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図２４】  腫瘍抗原ペプチドとインキュベーションした肺癌患者由来のＰＢＭＣが、対応する各ペプチドをパルスした細胞を認識してＩＦＮ−γ産生を促進することを示した図である。
【図２５】    腫瘍抗原ペプチドとインキュベーションした肺癌患者由来のＰＢＭＣが、１１−１８肺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２４＋）を認識してＩＦＮ−γ産生を促進することを示した図である。
【図２６】  腫瘍抗原ペプチドとインキュベーションした健常人由来のＰＢＭＣをエフェクター細胞とし、対応する各ペプチドをパルスした細胞を標的細胞として反応させたときのＩＦＮ−γ産生量を示した図である。
【図２７】  腫瘍抗原ペプチドが、肺癌患者由来のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得ることを示す図である。図中、実線は１１−１８肺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２４＋）に対する細胞傷害性を、破線はＱＧ５６肺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２４−）に対する細胞傷害性を示した。
【図２８】  腫瘍抗原ペプチド（ＭＲＰ３−５０３、ＭＲＰ３−６９２、ＭＲＰ３−７６５、またはＭＲＰ３−１２９３）とインキュベーションした肺癌患者由来のＰＢＭＣが、Ｓｑ−１肺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２４＋）または対応する各ペプチドをパルスした細胞を認識してＩＦＮ−γ産生を促進すること（Ａ図）、および該ペプチドとインキュベーションしたＰＢＭＣが、該ペプチドを特異的に認識してＩＦＮ−γ産生を促進すること（Ｂ図）を示す図である。
【図２９】  腫瘍抗原ペプチド（ＭＲＰ３−５０３、ＭＲＰ３−６９２、ＭＲＰ３−７６５、またはＭＲＰ３−１２９３）により刺激された、肺癌患者３人、腎癌患者４人、および大腸癌患者２人から得たＰＢＭＣが、刺激に用いた各ペプチドと同じペプチドをパルスした細胞（Ａ図）および／またはＳｑ−１肺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２４＋）（Ｂ図）を認識してＩＦＮ−γ産生を促進することを示す図である。
【図３０】  腫瘍抗原ペプチド（ＭＲＰ３−５０３、ＭＲＰ３−６９２、ＭＲＰ３−７６５、またはＭＲＰ３−１２９３）が、肺癌患者または腎癌患者のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得ることを、Ｓｑ−１肺癌細胞および／または１１−１８肺癌細胞（Ａ図）、あるいはＭＲＰ３−５０３若しくはＭＲＰ３−７６５をパルスした細胞（Ｂ図）に対する細胞傷害性を例として示す図である。Ａ図において、ＱＧ５６肺癌細胞（ＨＬＡ−Ａ２４−）は陰性対照である。Ｂ図において、ＨＩＶは陰性対照であるペプチドを、７６５および５０３はそれぞれのペプチドをパルスした細胞を意味し、ペプチドなしは、ペプチドをパルスしていない細胞を意味する。
【図３１】  腫瘍抗原ペプチド（ＭＲＰ３−６９２、ＭＲＰ３−７６５、またはＭＲＰ３−１２９３）の刺激で肺癌患者由来のＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬによる腫瘍細胞の認識が、該腫瘍細胞のＭＲＰ３発現に関連していることを示す図である（Ａ図）。Ｂ図は、本来ＭＲＰ３の発現が低いＣａｋｉ−１腎癌細胞にＭＲＰ３−６９２をパルスすると、ＭＲＰ３−６９２の刺激で誘導されたＣＴＬにより認識されることを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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