(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
0004169782.tif 000005
（式中、Ｒ1はＣＨ2、ＣＨＦまたはＣＦ2であり、そしてＲ2はＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3である）を有する化合物。
【請求項２】
５個のフッ素原子を含む請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
哺乳動物に導入されて、そして、組織を含有する哺乳動物の部分を画像化することを含む哺乳動物の組織低酸素症の検出方法に使用される請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
上記検出技術がＰＥＴまたはＭＲＩである請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
化合物がＦ18を含み、そして哺乳動物において組織低酸素症を検出する方法がＰＥＴを用いて哺乳動物の一部を画像化することを含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
化合物がＦ19を含み、そして哺乳動物において組織低酸素症を検出する方法がＭＲＩを用いて哺乳動物の一部を画像化することを含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項７】
哺乳動物に導入されて、そして請求項１記載の化合物に特異的な標識モノクローナル抗体を投与して組織を含有する哺乳動物の部分を画像化することを含む哺乳動物の組織低酸素症の検出方法に使用される請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
上記画像化技術がＰＥＴまたはＳＰＥＣＴである請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
上記標識がポジトロンまたはガンマ線放出同位体である請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
上記画像化技術がＭＲＩである請求項７に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般的に、還元的代謝で活性化されたとき低酸素細胞と結合するニトロ芳香族化合物のクラスに関するものである。この還元的代謝および結合は細胞の酸素濃度の減少に伴って増加するので、これらの化合物は低酸素症の指標として使用できるようになる。本願発明は新規ニトロ芳香族化合物、該新規ニトロ芳香族化合物とタンパク質を含む免疫原性抱合体並びに本発明の新規ニトロ芳香族化合物、該化合物のタンパク質抱合体、該化合物の還元的副生成物および哺乳動物の低酸素細胞と本発明の化合物間で形成される付加物に特異的なモノクローナル抗体を提供する。本発明は更に、組織中の低酸素値の検出方法に向けたものである。検出は、ニトロ芳香族薬品に結合した特異的な同位体に係わる画像化技術のような方法を使用して直接検出するかまたは免疫組織学的アッセイでモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用して間接的に検出することができる。更に尚、本願発明は本発明の方法を実施するためのキットに向けたものである。
発明の背景
腫瘍学における最も重要な目的の１つは治療抵抗性細胞の同定および排除であり、低酸素細胞はこのタイプの細胞の最も良く知られた例である。ケネディ（Kennedy）等、Biochem. Pharm. 1980年、29、１; モウルダー（Moulder）等、Int. J. Radioat. Oncol. Biol. Phys. 1984年、10、695; アダムス（Adams）、Cancer、1981年、48、696。低酸素細胞は正常な組織ではまれにしか見られず、そして一般的には或る種の腫瘍、血管症または発作後に関連してしか見られない。
或る種の腫瘍が肥大すると、機能性血管および毛細血管の不適切な網目構造のため、組織はしばしばその酸素や栄養供給より大きく成長する。酸素や栄養を奪われた細胞は最終的には死亡するが、任意の一定の時間に腫瘍は生存可能な低酸素細胞を産生することがある。生存してはいるが、これらの低酸素細胞は血管から離れているため酸素濃度が非常に低い。
分子酸素の値は病気の診断および予後において重要な意味を有している。放射線腫瘍学では、例えば、固形腫瘍の低酸素細胞は放射線および或る形態の化学療法による殺害に対して非常に抵抗性である。化学療法剤を患者に投与したとき、化学療法剤は機能性血管および毛細血管から標的細胞に運ばれる。低酸素組織は十分に機能する血管供給網目構造を欠いているので、化学療法薬品は決して低酸素細胞に到達することはできない。その代わり、介在細胞が薬品を捕集する。その結果、低酸素細胞は生き残りそして腫瘍の再発が可能になる。ケネディ等、上述。
組織低酸素症はまた、特に新生物の放射線療法の有効性も妨害する。放射線治療は、酸素が優れた放射線増感体であるので、酸素含有細胞を破壊するのに最も有効である。低酸素細胞の存在は、酸素濃度が低いためイオン化放射線を癌細胞の殺害で相対的に無効とするので、上記治療を妨げる。それ故、低酸素細胞は一層放射線療法に耐えて生き残ると思われ、そして結局腫瘍の再発につながる。動物の腫瘍で放射線応答を限定する際の低酸素細胞の重要性は良く知られている。アダムス、上述; モウルダー等、上述; チャップマン（Chapman）等、「腫瘍固体群における低酸素クロノゲニック細胞のフラクション（The Fraction of Hypoxic Clonogenic Cells in Tumor Populations）」、腫瘍の放射線抵抗性の生物学的基礎と臨床的意味（Biological Bases and Clinical Implications of Tumor Radioresistance）61、G. H. フレッチャー（Fletcher）、C. ネビル（Nevil）およびH. R. ウィザーズ（Withers）、編集、1983年。研究によって、上記の抵抗性細胞は動物の腫瘍を上首尾に殺害する放射線や化学療法剤の能力に大いに影響を与えることが明らかにされている。その後の重要な研究はヒト腫瘍で同様な問題を示している。低酸素細胞の同定に関する動物試験の進歩にも拘わらず、ヒトで達成された成功は限られている。この不一致の１つの理由は、腫瘍の増殖と他の宿主関連因子における差異に関係があると思われるが、加えて、十分に精密な分析での組織酸素の評価に適する正確な方法が存在していなかったことである。
静脈の酸素圧は一般的には約35トルであり、この酸素値はほぼ十分な放射線感受性を提供する。酸素値が35トル未満に低下すると、放射線抵抗性は徐々に増加し、約3.5トルで最大抵抗性の半分になり、そして約0.35トルで完全に抵抗性となる。それ故、正常組織で通常見られるよりはるかに低い酸素値を測定することが必要である。現在の技術はこの必要性を充足しない。現在の技術を使用して測定される酸素分圧はしばしば、非常に多数の隣接細胞の平均値をもたらす。これは、２，３の細胞直径の範囲で細胞酸素の重要な変化が生起する可能性があることを固形腫瘍の組織学的評価が示唆しているので、検出や診断にとって重大な障害である。ウルタサン（Urtasun）等、Br. J. Cancer、1986年、54、453。
ニトロ複素環式薬品が酸素指標として広範に研究されてきた。このクラスの化合物は細胞レベルで分析される能力を有しておりそして上記した低い酸素分圧をモニターするのに十分な感度を提供できることが知られている。この技術はニトロ芳香族薬品を問題の組織に投与することに係わるものである。この薬品は、組織の酸素分圧の低下に伴って実質的に増加する速度で生物還元的代謝を受ける。この生物還元的代謝の結果は、化学的に結合して優先的に細胞タンパク質と付加物を形成する反応性の薬品生成物が形成されるということである。これらの化合物と細胞の巨大分子との代謝的結合は酸素によって阻止されるので、これらの化合物は正常で健康で酸素に富む組織に優先して低酸素細胞と結合する。この優先的な代謝的結合または付加物形成によって低酸素症の程度の測定が提供される。コッホ（Koch）等、Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys.、1984年、10、1327。
ミソニダゾール（misonidazole）、ＭＩＳＯ3−メトキシ−1−（2−ニトロイミダゾール−1−イル）−2−プロパノールおよびその或る種の誘導体は、哺乳動物組織の低酸素症の指標として広範に研究されてきた。チャップマン等、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.、1989年、16、911; テーラー（Tayler）等、Cancer Res.、1978年、38、2745; バルゲーズ（Varghese）等、Cancer Res.、1980年、40、2165。本出願で結合と呼称する、或る種のミソニダゾール誘導体が細胞巨大分子と付加物を形成する能力は、極々の検出方法の基礎となっている。
例えば、Ｈ3またはＣ14標識ミソニダゾールはインビトロおよびインビボで使用されており、結合は液体シンチレーション計数またはオートラジオグラフィーによって分析されている。チャップマン、1984年、上述; ウルタサン、1986年、上述; フランコ（Franko）等、Cancer Res.、1987年、47、5367。ミソニダゾールのモノフッ素化誘導体は、インビボでの結合薬品を画像化するためにポジトロン放出同位体Ｆ18を使用している。ラッセイ（Rasey）等、Radiat. Res.、1987年、111、292。ミソニダゾールのヘキサフッ素化誘導体は、核磁気共鳴分光器（ＮＭＲまたはＭＲＩ）技術によって直接（放射性同位体なしに）アッセイされている。ラレイ（Raleigh）等、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.、1984年、10、1337。この同じ誘導体のポリクローナル抗体は薬品付加物の免疫組織化学的同定を可能にしている。ラレイ等、Br. J. Cancer、1987年、56、395。もう１つのアゾマイシン誘導体、アゾマイシンアラビノシド中にヨウ素同位体が導入され、検出に関する放射線学技術が可能になった。パーリアメント（Parliament）等、Br. J. Cancer、1992年、65、90。
低酸素症を検出する蛍光免疫組織化学アッセイは文献に記載されている。ラレイ等、1987年、上述。上記アッセイで使用される免疫原性抱合体の調製方法は、1992年２月４日付でラレイ等に付与された米国特許第5,086,068号（「ラレイ特許」）に広範に開示されている。ラレイ特許は、既知のフッ素化ミソニダゾール誘導体と免疫原性担体タンパク質、ヘモシアニンを含む免疫原性抱合体の調製方法を記載している。得られた抱合体を使用してミソニダゾール誘導体に特異的なウサギポリクローナル抗体を生じさせている。蛍光免疫組織化学試験によって、これらのポリクローナル抗体が球形の低酸素（中心）領域（腫瘍と一層密接に関係のある幾つかの特性を有する組織培養物中の細胞の多細胞凝集物）および腫瘍切片の同領域と、放射性薬品単独を使用して、即ちポリクローナル抗体なしでのオートラジオグラフィー試験によって明らかになったパターンに類似したパターンで結合したことが示された。この方法で使用されたミソニダゾール誘導体はＮＭＲ試験に関連して上記したヘキサフッ素化2−ニトロイミダゾール（ＣＣＩ−103Ｆ）、即ち１−（2−ヒドロキシ−3−ヘキサフルオロイソプロポキシプロピル）−2−ニトロイミダゾールであった。
免疫応答を引き出すために小さい抗原を大きい担体タンパク質と抱合させるラレイ特許の技術は、抗体産生の中心的な基礎であり、そして当該技術分野で周知である。当該技術分野の熟練者はまた、ニトロ芳香族を化学的または生化学的還元で活性化して細胞巨大分子と付加物を形成させなければならないことも理解するであろう。更に、ラレイ特許および論文（Raleigh等、1987年、上述）に記載された方法を使用してモノクローナル抗体を産生させることは可能でなかった。
上記の生物還元性薬品アッセイでは、たとえ放射線応答を予測するために酸素分圧が必要な値であったとしても（例えば、放射線療法）、酸素分圧は直接的には測定されない。むしろ、このアッセイは付加物形成、酸素によって阻止される生化学的プロセスを測定する。これらの方法を使用して得られたデータは酸素による阻止程度が組織によってかなり変化することを示している。フランコ等、1987年上述。更に、酸素の完全な不存在下の付加物形成の最高速度も、酸素による最大阻止パーセントと同様に、組織によって非常に変動する。コッホ、レドックス法による薬品の選択的活性化（Selective Activation of Drug by Redox Processes）、プレナムプレス（Plenum Press）、237〜247頁、アダムス等、編集、ニューヨーク、1990年。これらの制限を示すもう１つは、ニトロ芳香族の生物還元的形成が酸素値の変化の相対的な示唆だけは提供するが、酸素の変化に加えて付加物形成に影響を与える幾つかの因子、非酸素依存性因子があるので、酸素分圧の絶対的な測定を提供するには不適切であるということである。更に、ニトロ芳香族薬品の選択が非酸素依存性因子に関連した変動性に影響を与える。
大部分の研究はミソニダゾールおよびその或る種の誘導体に焦点を当てている。
しかし乍ら、ミソニダゾールは試験した幾つかの薬品のうちで、付加物形成における非酸素依存性の変動の影響を最も受け易い。コッホ、選択的活性化、上述。他の問題は現存の薬品の種々の物理化学的特性に関係があり、それらは全て付加物形成で非酸素依存性の変動に影響を与えることがある。例えば、上記したヘキサフッ素化ミソニダゾール誘導体は高度の不溶性を有していた。
放射化学トレーサーは組織低酸素症を検出する感度の良い方法を提供するが、これらの技術に関連した生物障害および費用が重要な欠点である。このような標識薬品の投与に関連した、依然として組織生検を必要とする放射能の量は動物試験でかなり問題となり、そして30ミリキューリーの三重水素化薬品が典型的に使用されるヒトでは更により大きい問題となる。ウルタサン等、1986年、上述。Ｃ14は法外に高価であり、そして受容できない放射線暴露を引き起こす。放射性トレーサーの使用は、放射性組織および体液の取扱いに関連した厳格な要件のため、一般的には受け入れられない。放射性トレーサーの使用には実際的な限界もある。例えば、組織切片のオートラジオグラフィー分析に必要な遅延（しばしば数週間）は、治療決定に必要な迅速分析の非常に深刻な障害である。更に、或る種のミソニダゾール誘導体に関連した毒性の問題の結果として薬品は比較的低濃度で投与され、そのため検出感度が低下した。
ラレイ特許はポリクローナル抗体を産生するのに有用な免疫原性抱合体を開示しているが、この特許の教示を使用して得られたデータは、検出技術で問題のある変動的な結果をもたらしている。更に、ラレイ特許の方法に従って実施された別個の実験法では、特許請求されたようなミソニダゾール誘導体とタンパク質間の高度の抱合体は再現されなかった。
哺乳動物組織の酸素値を安全且つ一致してアッセイできる現在利用可能な方法はない。放射能に関連して付随する危険なしに、より安全でより予測可能な酸素検出方法の需要が長い間痛感されている。本願発明はなかんずくこの需要に向けたものである。
発明の要約
本発明は新規ニトロ芳香族化合物、新規ニトロ芳香族化合物とタンパク質を含む免疫原性抱合体並びに本発明の新規ニトロ芳香族化合物、該化合物のタンパク質抱合体、該化合物の還元的副生成物および哺乳動物の低酸素細胞と本発明の化合物間で形成される付加物に特異的なモノクローナル抗体を提供する。新規化合物のタンパク質抱合体、還元的副生成物および哺乳動物の低酸素細胞と本発明の化合物間で形成される付加物は、本出願では一般的に組成物と呼称することができる。本発明の新規化合物および組成物並びに本発明に従う方法は組織低酸素症を検出する高感度で正確な方法の基礎を提供する。
本発明の化合物は、該化合物を以前の化合物より安全で且つより予測性のある酸素指標にする独特の特性を有している。親化合物2−ニトロイミダゾール、エタニダゾール、Ｎ−（2−ヒドロキシエチル）−2（2−ニトロ−1Ｈ−イミダゾール−1−イル）アセタミドの構造は、付加物形成においてミソニダゾールより非酸素依存性変動の影響を受け難いことが示されている。
高い溶解度を維持している、５個のフッ素を含有する本発明の好ましい実施態様が今提供された。非常に好ましい実施態様は、本出願でＥＦ5と呼称する2（2−ニトロ−1Ｈ−イミダゾール−1−イル）−Ｎ−（2,2,3,3,3−ペンタフルオロプロピル）アセタミドである。現在使用されているミソニダゾール誘導体を超えるもこの高い溶解度によってより高濃度の薬品の投与が可能になり、検出感度の上昇が得られ、現在の方法で毒性は観察されていない。
更に、特異的な薬品−タンパク質の抱合体の製剤は、細胞の生物還元的代謝で産生されるこのような抱合体に対するモノクローナル抗体の形成を可能にした。世界的な努力にも拘わらず、モノクローナル抗体はニトロ芳香族薬品付加物に対してはこれまで作られておらず、そして臨床アッセイではこのようなモノクローナル抗体の信頼性があり且つ一貫した供給源を有することが必須である。Ｈ3やＣ14のような放射性トレーサーの使用に関連した生物障害のため、モノクローナル抗体が開発されると技術は著しく進歩する。
ＥＦ5の全体的な可溶性とは対照的に、そのハロゲン化された側鎖は疎水性である。本発明の化合物のこの特徴は、側鎖の疎水性が、より高い親水性の誘導体の場合より大きい割合で薬品−タンパク質抱合体と低酸素細胞タンパク質間の巨大付加物を形成させるので、検出効率を改善する。フッ素数が比較的多いとこの原子のアッセイが高まり、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）にはＦ19が好ましく、そしてポジトロン放出トモグラフィー（ＰＥＴ）にはＦ18が好ましい。これらの競合特性は本発明の化合物に特有であり、そして本発明の新規性および有用性を高める。
更に、本願化合物の側鎖は非常に非生理学的であり、これが本願化合物の抗原性特徴に寄与しているものと考えられる。本発明のモノクローナル抗体は本発明の新規なニトロ芳香族化合物、該化合物のタンパク質抱合体、該化合物の還元的副生成物および哺乳動物の低酸素細胞と本発明の化合物間で形成された付加物に対して非常に特異的である。この特異性によってこれらの抗体が当該技術分野で現在使用されているポリクローナル抗体より優れた検知器となる。上記で示したように、臨床アッセイには同一の抗体の一貫した供給源が必要である。本発明の新規化合物は、組織低酸素症を検出するための高感度で、万能でそして一層正確な方法を提供する。
かくして、本願発明はミソニダゾールと核構造が類似しているが新規側鎖を有する新規クラスの化合物を提供し、この新規側鎖によってこれら化合物が一層はるかに予測性のある酸素指標となりそして免疫組織化学アッセイや他のアッセイが一層はるかに扱い易くなる。本発明の新規化合物および組成物並びに対応する方法論は哺乳動物の腫瘍の低酸素症の程度を測定する技術を提供し、これは以前には達成されなかった正確さと感度を有している。これらの新規化合物および組成物は標準的な核薬品方法を使用して、当該技術分野で以前には観察されなかった一貫性をもって、低酸素症を検出することができる。これらの新規化合物はまた免疫学アッセイの基礎も提供する。
本発明の新規クラスの化合物は免疫原性プロセスを刺激することができるハロゲン化２−ニトロイミダゾール誘導体であり、そして本発明の化合物、該化合物のタンパク質抱合体、還元的副生成物および哺乳動物の低酸素細胞と本発明の化合物間で形成された付加物に特異的なモノクローナル抗体の産生を可能にする。本願発明の化合物は下記で表わす一般構造を有している：
0004169782.tif 000002
式中、Ｒ1はＣＨ2、ＣＨＸまたはＣＸ2（式中、Ｘはハロゲン原子である）のいずれかであることができる。Ｒ2置換基は１から６個の炭素を含有し、そして好ましくは約６個までのハロゲン原子を有するアルキル基である。好ましいハロゲン原子はフッ素である。好ましい実施態様によれば、本発明の化合物は約５個のフッ素原子を有しており、Ｒ1はＣＨ2であり、そしてＲ2はＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3である。本発明は更に、タンパク質と結合した本発明の新規化合物を含む組成物を提供する。これらの薬品−タンパク質抱合体は、本発明の化合物、該化合物の還元的副生成物、タンパク質抱合体および組織タンパク質と本発明の化合物間で形成された付加物に対して非常に特異的なモノクローナル抗体の産生を可能にする免疫応答を誘発することができる。特許請求した化合物および組成物に対するモノクローナル抗体の特異性は高感度で、正確で且つ精密な免疫組織化学アッセイに基づく低酸素症検出の基礎を提供する。本発明の好ましい実施態様では、タンパク質担体はアルブミン、ボーマンバークインヒビターまたはリゾチームであることができる。もう１つの好ましい実施態様では、タンパク質はリゾチームであり、Ｒ1はＣＨ2でありそしてＲ2はＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3である。更に好ましい実施態様では、タンパク質はボーマンバークインヒビター（ＢＢＩ）であり、Ｒ1はＣＨ2でありそしてＲ2はＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3である。
本発明は更に、新規薬品化合物の製薬製剤に向けられている。好ましい実施態様によれば、本発明の化合物は製薬的に許容可能な希釈剤に溶解させるかまたは分散させる。好ましい希釈剤は非発熱性の生理学的食塩水である。
本発明はまた、タンパク質担体と結合しそして希釈剤中に溶解または分散された本発明の新規薬品化合物を含む免疫原性抱合体の製剤に向けられている。
本発明のもう１つの特徴では、本発明の化合物、該化合物のタンパク質抱合体、還元的副生成物および哺乳動物低酸素細胞と本発明の化合物間で形成された付加物に特異的なモノクローナル抗体が提供される。タンパク抱合体、還元的副生成物および哺乳動物の低酸素細胞と本発明の化合物間で形成された付加物は一般的には組成物と呼称する。本発明の好ましい実施態様では、モノクローナル抗体は、ハロゲン原子がフッ素である本発明の化合物および組成物に特異的である。本発明の更に好ましい実施態様では、モノクローナル抗体は約５個のフッ素原子を有する化合物および組成物に特異的である。尚一層好ましい実施態様では、モノクローナル抗体はＲ1がＣＨ2である本発明の化合物および組成物に特異的である。もう１つの好ましい実施態様では、本発明のモノクローナル抗体はＲ2がＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3である本発明の化合物および組成物に特異的である。更に一層好ましい実施態様では、モノクローナル抗体はＲ1がＣＨ2でありそしてＲ2がＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3である化合物および組成物に特異的である。モノクローナル抗体の調製方法も提供する。認められるように、本発明のモノクローナル抗体は新規化合物自体であるかまたはタンパク質と結合した化合物のいずれかに対するものであることができる。
本発明の更なる特徴では、組織低酸素症のアッセイ方法を提供する。組織試料は免疫組織化学技術または画像化技術を使用してアッセイされる。画像化技術は非侵入的分析に使用することができる。画像化方法は、免疫組織化学アッセイによらないで、そして好ましくはモノクローナル抗体を使用しないで本発明の新規化合物を使用して低酸素細胞を検出することを含む。哺乳動物に、上記したような適当な製薬担体または希釈剤中に溶解または分散させた本発明の化合物を投与する。この化合物を哺乳動物から排出させ、そしてその後問題の組織を含有する哺乳動物の１部を非侵入的、例えば磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）またはポジトロン放出トモグラフィー（ＰＥＴ）によって分析する。化合物の１部は低酸素細胞と結合または会合して体内に残っている。ＭＲＩの場合には、フッ素の慣用の非放射性（Ｆ19）同位体を使用する。ＰＥＴの場合には、本発明の化合物を先ずポジトロン放出同位体Ｆ18と組み合わせなければならない。
本発明のもう１つの好ましい実施態様では、アッセイ方法は免疫化学法を使用する。これらの方法は一般的には、本発明の化合物を上記のようにして哺乳動物に投与し、組織試料を取得し、そして組織試料を検出系と関係のある本発明のモノクローナル抗体と接触させて試料細胞と本発明の化合物間で形成された付加物の存在を検出することを含む。ｍＡｂは付加物に特異的である。即ち、ｍＡｂは組織タンパク質と予め投与した化合物間で形成された付加物に特異的である。組織低酸素症の程度は細胞と抗体の相互作用の値を、例えばエンザイム結合イムノソルバントアッセイ（エリザ法、ＥＬＩＳＡ）、微量透析、免疫組織化学染色または他の免疫学的プロトコールを使用することによって定量して決定する。
本発明の尚もう１つの実施態様では、薬品−低酸素細胞付加物がインシトゥで検出されることが必要である。本発明の化合物は哺乳動物に投与され、そして非結合組織から排出させられる。付加物に特異的な標識ｍＡｂ、即ち組織タンパク質と予め投与した薬品間で形成される付加物に特異的なｍＡｂを投与する。抗体はラジオグラフィーまたは核薬品アッセイに適する同位体で標識し、そして低酸素組織により形成された付加物と結合させる。この実施態様の利点は抗体を組織の非侵入アッセイで使用できることであり、その際構造が比較的固定されている２−ニトロイミダゾール薬品の標識より抗体の標識の方が融通性がある。
新規化合物または組成物を含む診断用途に有用なキットも本願発明の範囲内である。これらのキットには免疫学的試薬と一緒に本発明の薬品製剤、特に本発明のモノクローナル抗体が含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１は、酸素濃度の低下に伴って実質的に増加する態様で細胞と結合する本発明の化合物を示すものである。結合は本発明の特別の化合物、ＥＦ5の放射性形態を使用して検出した。図面の記号は次のように定義する: 円形は低酸素細胞を表わし、四角形は中間値の酸素（約３トル）を含有する細胞を表わし、そして三角形はより高い値の酸素（15トル）を含有する細胞を表わす。各記号において、中黒記号はトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿性付加物、そして中抜き記号はＴＣＡ可溶性付加物に対するものである。この実験の細胞は9Ｌグリオーム（神経膠原病）細胞であった。
図２は、幾つかの抗原に対する本発明のｍＡｂの特異性を図示するものである。本発明のｍＡｂは、他の同様なニトロ芳香族薬品よりＥＦ5に対する反応性が少なくとも10倍高い。図面の記号は次のように定義する: 中黒円形記号はＥＦ5を表わし、中抜き円形記号はエタニダゾール（ＥＴＡＮ）を表わし、中抜き三角形はＭＩＳＯを表わし、中黒四角形はＣＣＩ−103Ｆを表わし、十字はＮＰ−6（2,4−ジニトロ−1Ｈ−ピロール−2−エタノール）を表わし、そして中抜き四角形はジメチルミソニダゾール、3−メトキシ−1−［2−ニトロ−4,5−ジメチルイミダゾール−1−イル］−2−プロパノール（ＤＭＭ）である。
図３は、ＢＢＩと付加した本発明の化合物、ＥＦ5に対する、幾つかの異なる形態の本発明のｍＡｂの特異性を図示するものである。ｍＡｂは、２つの異なるカップリング化学を使用して化学的に修飾して蛍光部分、アミノメチルクマリン酢酸（ＡＭＣＡ）を付加させた。蛍光染料はｍＡｂの活性に影響を与えないで本発明のｍＡｂに抱合することができる。図面の記号は次のように定義する: 中抜き円形は検出部分、ＡＭＣＡの不存在下でのモノクローナル抗体の特異性を表わし、中黒三角形は染料とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド基（ＮＨＳＤスルホＨi）のカップリングを表わし、これはその後問題のタンパク質の第一アミンと反応する、中黒四角形は、反応基がピリジルｄｌチオプロピオンアミド（ＨＰＤＰhi）である同様な方法を表わし、これは問題のタンパク質の遊離チオール基と反応する。チオールを穏やかな放射化学還元法（実施例１参照）を使用して発生させて抗体のジスルフィド残基の小部分を還元させた。
図４は、エリザ法に基づく技術を使用して、本発明のｍＡｂとＥＭＴ−6マウス細胞から誘導したタンパク質との結合を示すものである。細胞は種々の酸素添加値で本発明の化合物と共にインキュベートし、その後細胞を集め、そして全細胞タンパク質調製物を作成した。好気性細胞から得たタンパク質は反応せず、中程度に低い酸素値、15トルでインキュベートした細胞から得たタンパク質は僅かに反応性であり、一方非常に低い酸素値でインキュベートした細胞から得たタンパク質は非常に反応性であった。中黒三角形はＥＦ5と10％の酸素を含有する細胞との相対的反応性を表わし、中抜き円形は嫌気性環境（窒素）中でのエタニダゾールの相対的反応性を表わし、中黒四角形はＥＦ5と１％の酸素を含有する細胞との相対的反応性を表わし、そして中黒円形は嫌気性環境（窒素）中でのＥＦ5の相対的反応性を表わす。
図５〜７は、本発明の化合物で処理し、その後本発明のｍＡｂで染色した種々の細胞および組織の免疫組織化学染色を示すものである。図５および６では、本発明のｍＡｂは修飾されておらずそして第２の抗体（蛍光染料フルオレセインで標識したヤギ抗マウスＩgＧ1）を使用して反応を監視した。図５は、組織培養細胞、9Ｌラットグリオームが低酸素下で本発明の化合物と共にインキュベートしたとき好気性条件下よりはるかに濃厚に染色されたことを示している。図６は、マウスＥＭＴ6細胞の多細胞球形培養物が本発明の化合物と共にインキュベートされたが、同一の結果を示している。この系では、低酸素症は外部細胞による代謝性酸素減少によって作られ、内部環状部分は低酸素生存細胞に、そして内部コアは無酸素、壊死細胞になる。外部の非染色バンドは生存している酸素化細胞を表わす。図７は、インビボ低酸素細胞は腫瘍標本の生検後に同様な方法で分析することができることを示している。この場合には、ＥＦ5を腫瘍のある生存動物に投与した。腫瘍生検から得た組織切片は、蛍光染料（ＡＭＣＡ）を添加して修飾した本発明のｍＡｂで染色した。濃厚に染色されている明るい青色部分は本発明の化合物の結合が高い領域を示す。
好適態様の詳細な記述
固形腫瘍中の低酸素症細胞は照射（上記のモルダー（Moulder）の文献参照）およびある種の形態の化学療法（上記のケネディ（Kennedy）の文献参照）による処置耐性と関連性がある。この影響のために、低酸素症細胞を同定するための方法に関する腫瘍学的要望が多く存在する。前記のことを鑑みると、動物またはヒトの腫瘍中の低酸素症細胞の存在を検定できることが非常に望まれる。しかしながら、哺乳動物組織中で酸素水準を安全に且つ一定して検定できる方法は今までに得られていない。特許が請求されている本発明の化合物および方法は当技術におけるこの要望に応えるものである。
本発明は免疫組織化学検定および像形成技術の両者を使用して予期可能な酸素指示薬である新規な種類の２−ニトロイミダゾール誘導体を提供するものであり、該化合物は構造：
0004169782.tif 000003
式中、Ｒ1はＣＨ2、ＣＨＸ、またはＣＸ2であり、ここでＸはハロゲン原子であり、そしてＲ2は約６個までのハロゲン原子を有するＣ1〜Ｃ6アルキルであるを有する。
本発明の化合物は、正常で健康な酸化された組織上の低酸素症細胞に関するそれらの劇的な特異性のために、酸素水準の検出において非常に有用である。本発明の他の局面は、該新規化合物および蛋白質を含んでなる免疫原性の共役物、並びに本発明の新規化合物、それらの蛋白質共役物、還元性副生物、および哺乳動物の組織蛋白質と本発明の化合物との間で生成する付加物に関して特異的なモノクローナル抗体を提供する。組織の低酸素症を検出する方法も提供される。
低酸素症細胞および好気性細胞を本発明の化合物の存在下で培養する時には、本発明のモノクローナル抗体が選択的に低酸素症細胞とたくさん結合する。図１、５−７を参照のこと。この優先的結合が哺乳動物において組織の低酸素症を検定する方法の基礎となる。
本発明の化合物は出発物質および基本的条件に依存する種々の反応条件を用いて合成することができる。例えば、ＰＥＴ同位体−含有誘導体の製造にはＦ18部分の急速付加並びに１０３分間というＦ18の短い半減期によるその直後の精製および使用が必要である。
一般的には、本発明の化合物は下記の反応条件下で合成される。反応は無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中でアルゴン下で且つクロロ蟻酸イソ−ブチルおよびＮ−メチルモルホリンの存在下で実施することができる。出発物質は２−（２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）アセトアミドのアルコール誘導体であってよい。アセトアミドはカルボニル基の位置でアルカリ性加水分解を受けて、２−（２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）の酸誘導体を生成する。その後、酸中間生成物のカルボニル基の位置でハロゲン化されたアルキルアミンの親核性置換を行って、ハロゲン化されたニトロイミダゾールアセトアミドを生成する。
或いは、出発物質が２−ニトロイミダゾール酸誘導体であってもよく、その場合には塩基性加水分解の必要性はない。酸誘導体は次に酸のカルボニル基の位置でハロゲン化されたアルキルアミンとの親核性置換を受けて、ハロゲン化されたニトロイミダゾールアセトアミドを生成する。他の合成方法は当技術の専門家には明らかであろう。
反応は反応スラリーを生成するかもしれず、そこから生成物を回収しなければならない。試料を回収する方法は当技術で既知である濾過または分離技術を包含する。そのような方法には真空濾過、分離抽出、または蒸留が包含されるが、それらに限定されるものではない。好適な方法は空気または液体を用いる濾過であるが、他の方法は当技術の専門家には明らかであろう。
不純物または他の反応中間生成物もしくは副生物を分離するために濾過固体は有機溶媒を用いる洗浄をさらに必要とする。有機溶媒にはエーテル、メタノール、エタノール、酢酸エチル、またはヘキサン類が包含されるが、それらに限定されるものではない。エーテルが好ましい溶媒であるが、他の型の溶媒は当技術の専門家には明らかであろう。有機溶媒は当技術で既知である方法を使用して蒸発させるべきである。蒸発方法は室温において、真空吸引によりまたは潜熱の使用により、実施することができる。蒸発方法はこれらの技術に限定されるものではなく、そして他の技術は当技術の専門家には明らかであろう。
反応生成物を次に当技術で既知である精製技術を用いて精製する。これらの技術にはカラムクロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、再結晶化、またはゲルクロマトグラフィーが包含されるが、それらに限定されるものではない。クロマトグラフィー精製方法を使用する時には、勾配溶離が好ましい。有機溶媒の組み合わせにはメタノール、アセトニトリル、ヘキサン類、四塩化炭素、および酢酸エチルが包含されるが、それらに限定されるものではない。他の精製方法は当技術の専門家には明らかであろう。
ある種の態様では、該化合物および組成物のハロゲン原子は弗素である。より好適な態様では、本発明の化合物および組成物は約６個までの弗素原子を有する。他の好適態様に従うと、Ｒ1はＣＨ2である。他の好適態様では、Ｒ2は炭素数が約１〜６のアルキル基であり、そして約６個までのハロゲン原子、好適には弗素を有する。本発明のより好適な態様では、Ｒ1はＣＨ2でありそしてＲ2はＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3である。この化合物は本出願全体にわたりＥＦ５と称される。
本発明はさらに本発明の化合物と適当な担体蛋白質との間で製造される薬品−蛋白質共役物にも関するものであり、これらの組成物はこの出願全体にわたり抗原と称される。当技術で既知である技術を用いて製造される抗原は活性ｍＡｂを生成しないため、予備工程が実質的に変更された。
先行技術は抗原−生成反応をｐＨ４〜７の間で実施できると述べている。これらの条件では充分な数の薬品−蛋白質共役物が生成できないことを今見いだした。中性またはそれより高いｐＨ、好ましくは中性付近において抗原−生成反応を行うことが非常に好ましい。これらの条件下では、薬品−蛋白質共役物はなおさら有効である。
担体蛋白質がシステインスルフヒドリル基（ＰＳＨ）を含有する時には、共役方法もはるかに有効である。残念なことに、ほとんどの蛋白質のシステイン残基はａ）数が少なかったり（例えば、ヘモシアニン）、ｂ）入手できなかったり（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ）、または、ｃ）還元されたニトロ芳香族を結合しないシスチン二量体として酸化される。数種の蛋白質のシスチン二量体は放射化学連鎖反応により非常に効率的に還元することができるが（コッフ（Koch)およびラレイー（Raleigh）、Arch. Biochem. Biophys.、１９９１、２８７、７５）、生じた改質蛋白質はおそらくは分子間の二硫化物架橋の生成のためにしばしば不溶性となる。シスチン−含有蛋白質を同時に還元および安定化させうる過剰量の例えばジチオトレイトールまたはメルカプトエタノールの如き試薬の添加により蛋白質システインを還元することができず、その理由は付加物は過剰の低分子量チオールを優先的に生成するからである。従って、高いシスチン含有量を有し且つ放射化学還元時に沈澱からの相対的自由度を有する蛋白質を同定することが一般的である。ボーマンバークインヒビターである大豆からのトリプシン／キモトリプシンインヒビター（ボーマンバークインヒビター（ＢＢＩ）−７個のシスチン架橋、分子量７８００）はこの観点からすると最適に近い特性を有することが見いだされており、そして平均して８個までのシステイン残基の還元が可能であった。ＥＦ５−ＢＢＩ共役物が次に第二の放射化学還元段階で製造された。
酸素は上記のコッフおよびラレイーの文献、Arch. Biochem. Biophys.にすでに記載されている技術を用いて溶液から除かれる。フランコ（Franko）他の文献、「癌研究における最近の成果（Recent Results in Cancer Res.）、９５」、カルチャー・オブ・セルラー・スフェロイズ（Culture of Cellular Spheroids）、６２（フェルラグ（Verlag）１９８４）中に記載されているテフロンから放出された酸素を除くための特別に構成されたセラミックが封入された回転棒を備えたガラス容器を漏出防止アルミニウム室の中に入れ、そして酸素−含有空気を多くの気体交換器を用いて窒素により置換した。
適当な蛋白質担体にはアルブミン（ＡＬＢ）、リゾチーム（ＬＹＺ）およびボーマンバークインヒビター（ＢＢＩ）が包含されるが、それらに限定されるものではない。免疫原性共役物のより好適な態様では、薬品はＥＦ５でありそして蛋白質はＢＢＩまたはＬＹＺである。
本発明は本発明の化合物、それらの蛋白質共役物、還元性副生物、並びに哺乳動物の組織蛋白質と本発明の化合物との間で製造される付加物に関して高度に特異的なモノクローナル抗体にも関するものである。上記方法に従い製造される薬品−蛋白質共役物を使用して抗体生成を誘発する。本発明の薬品−蛋白質共役物を試験管内で蛋白質担体と結合させそして哺乳動物に投与する時には、本発明の化合物、それらの蛋白質共役物、還元性副生物、および哺乳動物の低酸素症細胞と本発明の化合物との間で製造される付加物に特異的なモノクローナル抗体を高めることができる。モノクローナル抗体の製造は当技術では既知である。特に、ナウフ（Knauf）他の文献、Cancer Immunol. Immunotherapy、１９８６、２１、２１７−２２５に記載されているように変更されたコーラー（Kohler）およびミルステイン（Milstein）方法、コーラー他、ネーチャー（Nature）、１９７５、２５６、４９５の文献を参照のこと。
一般的には、薬品−蛋白質共役物組成物を使用して一般的技術を用いてハツカネズミを免疫処置する。一般的には上記のナウフの文献を参照のこと。宿主に、免疫応答を誘発する抗原として作用する本発明の薬品−蛋白質共役物を注射する。適当な培養期間後に、血液を宿主から採取しそして分析する。宿主の血清が抗原に対して強い活性を示したと見いだされた時に、動物を殺害しそしてその脾臓細胞を使用してハイブリドーマ・クローンを製造した。
そのような抗体を高めるための既知の方法がある。すなわち、宿主の脾臓を除去しそして当技術で既知である技術を用いて免疫細胞を適当な骨髄腫細胞と縮合させてハイブリドーマを製造する。上記のコーラー他の文献を参照のこと。そのようなハイブリドーマは哺乳動物に投与された特定の薬品−蛋白質共役物の薬品に関して特異的なモノクローン抗体を製造することができる。上記のコーラー他の文献を参照のこと。本発明の好適態様では、ハイブリドーマ・クローンを条件付けして血清を含まない培地中で成長させる。血清を含まない培地中でのこの成長能力により、抗体の容易な精製および発蛍光団、ビオチン、または酵素としての検出成分の容易な添加が可能となる。
特殊な培地調合物を用いて、ＥＬＫ−２細胞をゆっくり適用して血清水準を低下させることにより、該細胞を条件付けして血清を含まない培地中で成長させた。タウピエル（Taupier）およびロード（Lord）に対して１９８９年に発行された米国特許第４，８１６，４０１号を参照のこと。
本発明の薬品化合物は、正常な健康な酸化された組織上の低酸素症細胞に関するそれらの劇的な特異性のために、酸素水準の検出において非常に有用である。低酸素症細胞および好気性細胞を新規な化合物の存在下で培養する時には、本発明のモノクローナル抗体は選択的に低酸素症細胞と結合する。この優先的結合が哺乳動物において組織を検定する方法の基礎となる。
本発明の目的用には、哺乳動物には、齧歯目、例えばハツカネズミ；ロゴモルファ（Logomorpha）目、例えば兎；より特に、猫および犬を含む食肉目；さらに特に偶蹄目、牛および豚；並びに馬を含む奇数指目；並びに最も特に霊長目、セボイド目（Ceboids）およびサイモイド目（Simoids）（猿）および類人目（ヒトおよび無尾猿）が包含されるが、それらに限定されるものではない。好適な哺乳動物はヒトである。
哺乳動物の組織中で組織の低酸素症を検出する方法には非侵襲性の像形成技術および免疫組織化学法が包含されるが、それらに限定されるものではない。像形成技術には単一光子放出コンピューター処理断層写真（ＳＰＥＣＴ）、ＰＥＴ、および一般的には磁気共鳴像形成法（ＭＲＩ）と称される核磁気共鳴像形成法が包含されるが、それらに限定されるものではない。一般的には、像形成技術は哺乳動物の体外から検出可能なマーカー原子を有する化合物の投与を含む。本発明の化合物を薬学的に許容可能な希釈剤、例えば非発熱性の生理食塩水の中に溶解または分散させ、哺乳動物に投与し、代謝されない化合物を除くための時間をかけ、そして組織の低酸素症をマーカー原子の検出体を用いて検定する。
本発明の好適態様では、該化合物は少なくとも５個の弗素原子を有する。本発明のより好適な態様では、Ｒ1はＣＨ2である。さらに好適な態様では、Ｒ2はＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3である。さらに好適な態様では、Ｒ1がＣＨ2であり且つＲ2がＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3であり、化合物ＥＦ５を化成する。ＰＥＴを用いると好適な同位体はＦ18であり、ＭＲＩを用いると好適な同位体はＦ19である。
本発明の他の好適な態様では、検出技術はモノクローナル抗体および免疫組織化学法を利用する。これらの技術には、免疫ブロット法もしくはウェスタンブロット法、エリザ法、サンドイッチ検定法、蛍光法、ビオチン法または副抗体を用いるもしくは用いない酵素標識法が包含されるが、それらに限定されるものではない。一般的には、免疫組織化学法は染色された寒冷切断された組織試料を包含する。哺乳動物に、薬学的に許容される希釈剤中に分散または溶解された本発明の化合物を注射する。該化合物は低酸素症細胞の組織蛋白質と選択的に結合して付加物を生成する。腫瘍組織の試料が得られそして本発明のモノクローナル抗体を既知の免疫組織学技術と共に用いて検定する。付加物の側鎖に対する抗体の結合度が腫瘍組織中の低酸素症の程度の測定値を与える。図５−７を参照のこと。本発明の好適態様では、本発明のモノクローナル抗体をパラホルムアルデヒド中に固定された細胞または組織切片と共に使用することができる。図６および７を参照のこと。
分析用の組織試料を得る方法には当技術で既知の外科的および非外科的技術が包含される。外科的方法には生検、例えば微細針吸引、芯生検、拡張法および掻爬が包含されるが、それらに限定されるものではない。
診断器具も本発明の範囲内である。そのような器具は組織の低酸素症を迅速に検出しうるモノクローナル抗体を含んでおり、且つ本発明の化合物、本発明の化合物と組織蛋白質との間で製造された付加物に対する個別のまたは混合されたモノクローナル抗体を含んでいる。好適には、検定用の測定試料として使用される製造された蛋白質付加物の標準も含まれる。
本発明の好適な局面を下記の実施例において論じる。本発明をある種のこの好適態様に従い特別に記載するが、本発明は請求の範囲によってのみ限定されるものである。
実施例１
ＥＦ５の合成
出発物質として２−（２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）酢酸を使用して、ＥＦ５、すなわち２（２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）アセトアミドを合成した。酸のカルボニル基の位置におけるハロゲン化されたアルキルアミン（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピルアミン塩酸塩）の親核性置換を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中でアルゴン下でクロロ蟻酸イソブチルおよびＮ−メチルモルホリンの存在下で行った。再蒸留されたＮ−メチルモルホリン（１２８μｌ、１．１７ミリモル）を無水ＴＨＦ（２０ｃｃ）中に溶解された２−（２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）酢酸（２００ｍｇ、１．１７ミリモル）にアルゴン下で０℃において加え、それから１０分後に新しいクロロ蟻酸イソ−ブチル（１６７μｌ、１．２８７ミリモル）を加えた。０℃における３０分後に、２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピルアミン塩酸塩（２３７ｍｇ、１．２８７ミリモル）および再蒸留されたＮ−メチルモルホリン（１４２μｌ、１．２８７ミリモル）の無水ＴＨＦ（２ｃｃ）中の予め製造された溶液をクリーム状溶液に加え、そして混合物を室温において３時間撹拌した。次に反応混合物を濾過し、固体残渣をエーテルで洗浄し、そして一緒にした有機溶媒を蒸発させて薄黄色の固体を与えた。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、３％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3）による精製で２（２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）アセトアミドを白色結晶性固体として与え、それを
ＥｔＯＡｃ／ヘキサン類から再結晶化させた。融点１３６−１３７℃。
実施例２
抗原製造
酸素を含まない環境中での蛋白質担体に対するＥＦ５の照射−誘発性共有結合により、抗原を製造した。上記のコッフおよびラレイー、１９９１の文献中にすでに記載されている技術を用いて酸素を溶液から除去した。上記のフランコ他、１９８４の文献に記載のテフロンから放出された酸素を除去するための特別に構成されたセラミックが封入された回転棒を備えたガラス容器を漏出防止アルミニウム室の中に入れ、そして酸素を含有する空気を一連の気体交換器を用いて窒素により置換した。酸素除去用の時間をコッフに対して１９９１年に発行された米国特許第５，０３０，０３６号で論じられているようなポーラログラフ酸素検出器を用いて測定し、室内で使用されたものと同様な幾何学的形態の窒素を流した容器の中に封入した。室を酸素除去工程中に撹拌板（ウィートン・バイオスター４）の上に置き、該工程は４−５Ｈｚの撹拌速度において約３時間かかった。抗原生成は多段階方法で行われ、各段階はＥＦ５の不存在下における蛋白質二硫化の放射化学還元、次のＥＦ５の添加およびその後のＥＦ５と還元された蛋白質との間の付加物生成の放射化学誘発からなる。全ての照射は嫌気性条件下で行われ、その理由は痕跡量の酸素でさえ必須反応を抑制するからである。低酸素溶液をシェファード照射器（マーク１、モデル３０）の中で毎分約１０Ｇｙの投与量速度で室温において照射した。
実質的に中性のｐＨにおいてのみ高い効率の付加物生成が得られた。２５−１００ｍＭの蟻酸アンモニウムおよび５−１０ｍＭの燐酸塩を含有するｐＨ７．５の溶液中でＥＦ５を蛋白質に対して還元的に結合させた。蟻酸塩は希望する還元反応を妨害しうる照射からの酸化ラジカルを、これも還元性である二酸化炭素アニオン基に転化するために作用する。各々が相対的に大きいモル留分のシスチンを含有する数種の蛋白質が考えられた：アルブミン（ＡＬＢ）、分子量６７０００、１７個のシスチン架橋結合；リゾチーム（ＬＹＺ）、分子量１４０００、４個のシスチン架橋結合；ボーマンバークインヒビター（ＢＢＩ）、分子量７８００、７個のシスチン架橋結合およびＲＮＡａｓｅ、分子量１４０００、４個のシスチン架橋結合。好適な蛋白質はＢＢＩであることが見いだされた。
典型的なサイクルは、蛋白質（２ｍｇ／ｃｃ、５０ｍＭの蟻酸アンモニウム中、２．５ｍＭの燐酸カリウム）を脱酸素化し、充分な投与量で低酸素下で照射することにより蛋白質シスチン架橋結合を還元してシスチン残基の約５０％（典型的には２０−５０Ｇｙ）を還元し、室を解放しそしてＥＦ５（１５０マイクロモル）を加え、第二の脱酸素化し、その後に充分な照射投与量で薬品（８５０Ｇｙ）を還元し、そして精製／蛋白質濃縮段階（５０００Ｇにおける分子フィルター−セントリコン２を用いる遠心）で終了する段階を包含する。初期蛋白質の全体的回収率は３０−５０％であった。少量の放射活性ＥＦ５（ニトロイミダゾールの２位置でＣ14−標識が付けられている、特異的活性７０マイクロキュリー／ｍｇ）を含有せしめて結合された薬品の痕跡量の留分（蛋白質−含有溶液中の放射活性の初期特異的活性からセントリコン濾液の特異的活性を引算する）を保った。
３−５回のサイクル後に、最終的蛋白質濃度を測定した（ピアースＢＣＡ検定）。少量の蛋白質を５％ＴＣＡを用いて沈澱させ、次に塩基中に溶解させることにより、付加物の特異的活性を測定した。上記の方法に従い、３−４個のリゾチーム分子、１−３個のＢＢＩ分子、および０．２−０．５個のアルブミン分子当たり約１個の共役物が生じた。
実施例３
モノクローナル抗体の製造
２匹のＣ５７Ｂｒ／ｃｄＪ×ＳＪＬ／Ｂｒ（Ｈ−２ｋ）ハツカネズミに、等量の完全フロイントアジュバントで乳化させた０．０５ｃｃの抗原を２個の部位のそれぞれに筋肉内注射することにより（３００μｇの蛋白質／ｃｃ、抗原共役物対蛋白質は０．５：１であった）、モノクローナル抗体を製造した。不完全フロイントアジュバント中の０．１ｍｌ抗原の追加免疫注射を２カ月後に腹腔内投与した。追加免疫注射から３週間後に、血液試料を採取し、自然に凝集させ、そして血清を除去し且つエリザ検定法を用いて試験した。
血清をエリザ検定技術を用いてそれがニトロイミダゾール化合物と反応する能力に関して同定した。蛋白質またはＥＦ５−共役蛋白質をエリザ板の９６−ウェル（５０ｎｇ／ウェル）に自然に接着させ、そして追加の結合部位をその後にブロット−ツイーン（BLOTTO-Tween）R（５％の無脂肪牛乳、０．２％のツイーン−２０）を用いて３７℃において６０分間にわたり阻止した。抗血清希釈物を加え、そして３７℃において４５分間培養し、未結合抗体をＰＢＳ中の０．０２％ツイーン−２０で３回そしてＰＢＳで２回洗浄することにより除去した。各ウェルにＰＢＳ中で希釈された０．１ｃｃのビオチニル化された馬の抗−ハツカネズミＩｇＧＬを加え、そして３７℃において４５分間培養し、次に上記の如く洗浄した。０．１％ツイーン−２０を含有するＰＢＳ中で希釈されたアビジン−ビオチン・ペルオキシダーゼ複合体（ベクタステインＡＢＣ試薬）を加え、そして３７℃において４５分間培養した。ウェルを次に上記の通り５回洗浄した。各ウェルに次に０．０５ｃｃのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ基質（５０ｍＭのクエン酸塩／燐酸塩緩衝液、ｐＨ４．５、０．０１５％の過酸化水素中の０．０５ｍｇ／ｃｃのＯＰＤ［ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩］）を接種した。室温において５−３０分間にわたり発色させ、次に０．０５ｃｃの４Ｎ Ｈ2ＳＯ4を加えることにより反応を停止させた。最後に、光学的密度を４９０ｎｍにおいて記録した。
免疫処置性蛋白質（ＢＢＩ）または他の蛋白質（ＡＬＢ、ＬＹＺ）のいずれにせよ共役したＥＦ５とその抗血清が反応したハツカネズミを選択した。このハツカネズミに追加のＥＦ５−蛋白質共役物（８０μｇ）の腹腔内注射を、殺害および脾臓除去の４日前、３日前、２日前および１日前に行った。注入はハーウェル（Harwell）他の文献、J. Immunol. Methods、１９８４、６６、５９に記載されている如くして行った。使用されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、血清を含まない培地／５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中で３５％で製造されたシグマ＃Ｐ７７７７であった。全ての細胞および試薬を注入前に３７℃に暖めた。注入後に、細胞をローラー瓶の中で２日間塊状培養した。細胞を次に遠心し、１０ｃｃの凍結培地（４０％の胎牛血清〜Ｓおよび１０％のＤＭＳＯを有する培養培地）の中に再懸濁させ、そして１個の瓶当たり１ｃｃで凍結した。
１個の注入瓶を次に解凍し、そして５個のそれぞれの９６ーウェル・マイクロリットルの板中で１０％ＦＢＳ、ＨＡＴ−含有培養培地（１．３６ｍｇ／ｃｃのハイポキサンチン、０．０３８ｍｇ／ｃｃのアミノプテリン、０．０１７６ｍｇ／ｃｃのチミジン）の中で培養して、１個のウェル当たり２０００個の照射されたハツカネズミの腹腔細胞を支持細胞として用いて、融合細胞用に選択した。ウェルを、上記のエリザ検定法並びに抗原としてＢＢＩおよびＢＢＩ−ＦＳＥ共役物を用いて特異的な抗体−生成細胞に関してスクリーニングした。６個のハイブリドーマをこれらの２種の抗原の分化を基にして選択し、そしてさらに追加抗原のパネルに対してスクリーニングした。これらの中の１個、すなわちＥＬＫ−２−４，３，４（ＥＬＫ−２）を、蛋白質−ＥＦ５共役物に対するその強い選択的反応および完全細胞蛋白質調合物を含む試験した他の抗原に対する非反応性を基にして、選択した。表１（列１）および図２−４を参照のこと。
0004169782.tif 000004
ＥＬＫ−２と指定された最も分化に関して特異的なクローンからのＭＡｂを次に同定した。ＥＬＫ−２からのＭＡｂは親の２−ニトロイミダゾールと強く反応したが、他のニトロ複素環との反応性はほとんど見られなかった。例えば、エタニダゾールに関しては１０００倍高い濃度においても測定可能な反応性は観察されず、ここでエタニダゾールはＥＦ５と側鎖上の弗素の不存在の点だけ異なっていた（図２を参照のこと）。
リゾチームに付加された本発明の化合物を用いて免疫処置された他のハツカネズミを同様な方法で処置した。表１は、それぞれがＥＦ５付加物のないものと比較している多種の蛋白質に対する種々のクローンの応答を記述している。クローンの初期スクリーンはアルブミン−ＥＦ５に対する正の応答を基にして行われたが、負の応答はアルブミン単独に対して行われた。１６個の試験したクローンの中で、ほとんど全ての応答見込みが交互の抗原に対して見られたが、２個のクローンすなわち＃４３および＃５１だけはＥＦ５で培養された低酸素症細胞からの完全細胞蛋白質調合物に対して強い分化に関して正の応答を示した。表１は多種の試験抗原の重要性を示しており、最も重要なものは完全細胞蛋白質消化物であり、そして記載されている技術は希望する抗原に対して高度に特異的にｍＡｂ−生成性ハイブリドーマを確実に生成できることを示している。
実施例４
規定された酸素条件下での組織培養における細胞に対するＥＦ５の結合
細胞を約半年の基準で凍結原料から解凍し、そして試験を定常的に行って培養物がマイコプラズマおよび他の不純物を含んでいないことを確認した。細胞を、１２．５容量／容量％の胎牛血清および抗化物質（全ての培養溶液はＧＩＢＣＯ製）を含有するイーグルの最少必須培地を用いて１週間に２回の移転により指数増殖期において培養した（３７℃、９５％の空気＋５％の二酸化炭素、１００％相対湿度）。実験の１日前に、細胞をトリプシン処理し、そしてガラスペトリ皿（皿の中心部分に制限された約２００，０００個の細胞）の上で板培養し、その後、前記の如く３７℃において一夜培養した。コッフの文献、Radiat. Res.、１９８４、９７、４３４を参照のこと。
次に皿を培養器から取り出し、０℃に冷却し、そしてそれらの培地を薬品−含有培地と、最初はすすぎ液（１ｍｌ）として交換し、それは簡単に吸引され、そして次に実験用に使用される実際の培地（１ｍｌ）として交換した。皿をマニホルドと連結された漏出防止アルミニウム室の中に入れ、それらを一連の気体交換で脱酸素化し、それには約３０分を要した。皿の中心部分に対する細胞の制限および少量の培地の使用により、非常に急速な気体および液体相の平衡化が可能となり、酸素濃度の調節が可能となった。上記のコッフの文献、１９８４を参照のこと。脱酸素化後に、室を３７℃で培養した。酸素の微量勾配または起きうる栄養分／代謝物の大勾配を防止するために、室を静かに振った（１Ｈｚ、２．５ｃｍストローク）。上記のコッフ、１９８４の文献の規定された実験条件下での培養後の放射活性ニトロ複素環の結合を検定するために、室を培養器から取り出しそして開き（直後の再酸素化を可能にする）、そして皿を氷上で冷却した。放射活性培地を取り出した。ヘペス（ＨＥＰＥＳ）で緩衝されたアールの均衡塩溶液（ＥＢＳＳ）を用いて２回すすぎ、その後、新たな培地を加え、そして皿を３７℃において１５分間培養した。ＥＢＳＳ中でさらにすすぎ、その後、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＥＢＳＳの中で０．０５％トリプシン（シグマ’４０Ｘ’の４０：１希釈物）を用いて細胞を取り出した。等量の血清−含有培地を加えてトリプシンを停止し、そして細胞懸濁液の一部を計測した。
細胞を１０分間にわたる１０００ｒｐｍにおける遠心により濃縮し、その後、氷上の２００μｌのＥＢＳＳの中に再懸濁させ、そして次に１００マイクロリットルの１Ｍ氷冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の添加により細胞を破壊した。ＴＣＡ沈澱を２５００ｒｐｍにおける２０分間の遠心により濃縮した。ＴＣＡ上澄み液を貯蔵し、そしてペレットを０．２ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨ中に溶解させ、その後、酢酸を用いて中和した。透明なＴＣＡ上澄み液および溶解されたペレットをシンチレーション流体と共に瓶に加え、そしてベックマン液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）の中で計測して、酸可溶性および酸沈澱性の数を分離した。上記の方法は、放射活性感知器を低酸素症において低温（４℃）でまたは空気中において３７℃で培養した時の加えられる放射活性の背景水準を生ずる。細胞数、薬品濃度および特異的活性、並びにＬＳＣ効率が全て既知であるため、付加物の絶対的加入は３７℃における１時間の培養当たりの１個の細胞に関するピコモルとして計算することができる。
図１から、中間的な酸素水準（〜３トル−四角）における細胞より低酸素症細胞（丸）の方が結合がたくさん起きることおよび比較的高水準の酸素（１５トル−三角）を含有する細胞に関してはほとんど結合がみられないことがわかる。各場合とも、黒い記号はＴＣＡ沈澱性付加物に関し、そして白い記号はＴＣＡ可溶性付加物に関する。この実験における細胞は９Ｌネズミの神経膠腫細胞であった。
実施例５
エリザ技術を用いるｍＡｂの特異性の試験
図２はＥＬＫ−２と指定された抗体は本発明の化合物であるＥＦ５だけを認識することを示しており、種々の他のニトロ芳香族は抗体に対して少なくとも１００倍ほど小さい反応性を示す。化合物は下記の記号により表されている：黒い円丸はＥＦ５を表し、白い丸はＥＴＡＮを表し、白い三角はＭＩＳＯを表し、黒い四角はＣＣＩ−１０３Ｆを表し、交叉記号はＮＰ−６を表し、そして白い四角はＤＭＭを表す。
図３は、２種の結合用化学物質を用いる本発明のモノクローナル抗体に対するＡＭＣＡ蛍光部分の付加がその目標抗原であるＥＦ５−ＢＢＩ共役物に関するその高い特異性を減少させなかったことを示している。ＡＭＣＡ分子をピアースから入手可能な標準的蛋白質改質器具を用いて加え、それはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド基（ＮＨＳＤスルホ・上にある黒い三角）に対する染料の結合を含んでおり、それを次に当該蛋白質の第１級アミンと反応させ、または反応基がピリジルジチオプロピオンアミド（ＨＰＤＰ・上にある黒い四角）であるような同様な方法を行うと、それは当該蛋白質上で遊離チオール基と反応する。チオールを穏やかな放射化学還元方法（実施例１）で発生させ、少量の抗体の二硫化物残基を還元させた。
図４は、臨床検定実施方法の例を表している。この場合、低酸素下でＥＦ５で処置された細胞を標準的蛋白質抽出技術を用いて均質化した。生じた蛋白質調合物を実施例３に関して以上で記載されている９６ウェル・エリザ板に加え、そしてエリザＡ競合技術を用いて分析した。低酸素症細胞からの蛋白質は中間的酸素濃度において培養された細胞からのものよりはるかに反応性が大きいこと、並びに好気性細胞からの蛋白質が非−反応性であることがわかる。白い三角は１０％の酸素を含有する細胞とのＥＦ５の相対的反応性を表しており、白い丸は嫌気性環境（窒素）中のエタニダゾールの相対的反応性を表しており、黒い四角は１％の酸素を含有する細胞とのＥＦ５の相対的反応性を表しており、そして黒い丸は嫌気性環境（窒素）中のＥＦ５の相対的反応性を表している。
実施例６
像形成技術（図５−７）
低酸素症細胞を含有せしめたかまたはそれを予期した種々の細胞および組織を本発明の化合物であるＥＦ５と共に培養し、そして次に本発明のｍＡｂであるＥＬＫ−２を用いて染色した。抗体の結合を二種の方法のうちの一方法において可視化した。最初に、ＥＬＫ−２抗体の同位体（ハツカネズミのＩｇＧＬ）を認識する蛍光標識の付いた第二抗体（ジャクソン研究所）を使用する。次に、上記の如きＡＭＣＡの添加により自動蛍光化ＥＬＫ−２を使用する。
図５は、顕微鏡写真で暗色領域により表されている空気の存在下対顕微鏡写真で明色領域により表されている窒素の存在下における０．５ｍＭのＥＦ５で処置された９Ｌ神経膠腫細胞に対する抗体の結合を比較している。薬品の露光、抗生物質および写真は図面の両半分中で全て同一であった。培養中の酸素濃度だけを変えた。細胞を顕微鏡スライドに接触させ、次にそれらを空気乾燥し、そしてトリトンＸ−１００の０．１％溶液に対して露呈し、その後、すすいで洗剤を除去した。スライドを４℃においてＥＬＫ−２抗体で一夜処理し、そしてＰＢＳ中で数分聞すすいだ。それらを次に蛍光−標識が付けられた山羊の抗−ハツカネズミＩｇＧｌで染色し、すすいで未結合の第二抗体を除去し、そして蛍光顕微鏡を用いて観察した。
図６は、スピナーフラスコ中で成長する完全球状物を０．５ｍＭのＥＦ５を用いて４時間培養した同様な実験の結果を示す。球状物を取り出し、洗浄し、ＯＣＴ化合物の中に埋め、そしてドライアイス上で凍結させた。クリオスタット切片（１０ミクロンの厚さ）を切断し、ポリ−Ｌ−リシンでコーテイングされたガラススライド上に置き、そしてその切片を１％パラホルムアルデヒド中で１０分間にわたり固定した。すすいだ後に、阻止性抗血清（２％の正常な山羊の血清）を加え、そして室温で３０分間培養した。スライドを４℃においてＥＬＫ−２で一夜処置し、そして次に３回洗浄し、次に上記の如く蛍光−標識が付けられた第二抗体で処置した。スライドを次に洗浄し、そして蛍光顕微鏡を用いて観察した。顕微鏡写真は、球状物の外縁が完全には染色されていないが染色強度は低酸素症になると予期される球状物内部の細胞に関して劇的に増加することを示している。
図７は、実際に腫瘍を有する動物を用いた他の実施例を表している。ＥＭＴ６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃハツカネズミに１．２２ｃｃの２ｍＭのＥＦ５を腹腔内注射した。１４時間後に、ハツカネズミを殺害し、腫瘍を取り出し、ＯＣＴ化合物の中に埋め、そしてドライアイス上で凍結させた。約２０ミクロンの厚さのクリオスタット切片を切断し、そしてその切片を球状物の切片に関して上記の如く処理したが、唯一の抗体、すなわち上記および図４に記載されているようなＡＭＣＡ共役結合されたＥＬＫ−２を使用した。ＡＭＣＡ染料を紫外線刺激を用いて青色に発行させる。顕微鏡写真の明るい部分は低酸素症細胞を含有すると予期されるものである。ここに示されそして記載されているもの以外の本発明の種々の改変は以上の記述から当技術の専門家には明白であろう。そのような改変も請求の範囲内に入るとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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