(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合ブロスまたは部分的に精製したプロセスストリームからエキノカンジン核塩結晶を形成する方法であって、該方法は、以下の順序の工程：
エキノカンジン核またはそのアモルファス塩、アルデヒド不純物および溶媒を含む溶液を提供する工程；
該溶液を、ナノ濾過プロセスによって濃縮し、濃縮物を形成する工程；
該アルデヒド不純物と選択的に相互作用する誘導体化剤を添加する工程；
該濃縮物のｐＨを、４．０未満に調整する工程；
酸または金属塩を添加する工程；および
該濃縮物を冷却し、エキノカンジン核塩結晶を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
工程（ｖｉｉ）結晶化を開始させるための種結晶を添加する工程、をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エキノカンジン核が、以下の構造：
【化１】
0004063497.tif 000007
によって表される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記誘導体化剤が亜硫酸水素ナトリウムであり、前記酸が塩化水素であり、そして前記アルデヒド不純物が以下の構造：
【化２】
0004063497.tif 000008
で表される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記金属塩が複数の部分に分けて添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の部分が、異なる温度で添加される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
エキノカンジンＢ核の塩酸塩の結晶であって、以下の工程：
エキノカンジンＢ核またはそのアモルファス塩、アルデヒド不純物および溶媒を含む溶液を提供する工程；
該溶液を、ナノ濾過プロセスによって濃縮し、濃縮物を形成する工程；
亜硫酸水素ナトリウムを添加する工程；
該濃縮物のｐＨを、４．０未満に調整する工程；
塩化金属塩を添加する工程；および
該濃縮物を冷却する工程、
により調製される、エキノカンジンＢ核の塩酸塩の結晶。
【請求項８】
前記塩化金属塩が、約２２℃と２８℃との間で添加される第１の部分、約２０℃と１５℃との間で添加される第２の部分、および約１２℃と８℃との間で添加される第３の部分、を包含する３つの部分に分けて添加される、請求項７に記載の塩酸塩結晶。
【請求項９】
前記第１の部分が、前記第２の部分または第３の部分のいずれかの重量にして約２倍の塩化金属塩を含む、請求項８に記載の塩酸塩結晶。
【請求項１０】
以下の式で表されるシクロペプチド（ＣＰ）エキノカンジンＢ核の塩形態結晶、およびその薬学的に受容可能な溶媒和物または水和物であって：
ＣＰ−ＮＨ３＋Ａ−、（ＣＰ−ＮＨ３＋）２Ａ−２、または（ＣＰ−ＮＨ３＋Ｍ＋）Ａ−２
ここで、ＣＰ−ＮＨ３＋は、以下の構造：
【化３】
0004063497.tif 000009
で表され、
Ａ−は、クロリド、ブロミド、ヨーダイド、ジハイドロゲンホスフェート、ハイドロゲンスルフェート、ハイドロゲンオキサレート、ハイドロゲンタートレート、ベンゾエート、メタンスルホネート、またはｐ−トルエンスルホネートであり；
Ｍ＋は、アンモニウム、リチウム、ナトリウム、カリウムまたはテトラアルキルアンモニウムであり；
Ａ−２は、スルフェート、オキサレート、ハイドロゲンホスフェート、タートレートまたはフマレートである、
シクロペプチド（ＣＰ）エキノカンジンＢ核の塩形態結晶、およびその薬学的に受容可能な溶媒和物または水和物。
【請求項１１】
以下の式で表されるシクロペプチド（ＣＰ）エキノカンジン核の内部塩形態結晶、およびその薬学的に受容可能な溶媒和物または水和物であって：
（ＣＰ−ＮＨ３＋Ａ−）（Ｍ＋Ａ−）または（（ＣＰ−ＮＨ３＋）２Ａ−２）（Ｍ＋２Ａ−２）
ここで、ＣＰ−ＮＨ３＋は、以下の構造：
【化４】
0004063497.tif 000010
で表され、
Ａ−は、クロリド、ブロミド、ヨーダイド、ジハイドロゲンホスフェート、ハイドロゲンスルフェート、ハイドロゲンオキサレート、ハイドロゲンタートレート、ベンゾエート、メタンスルホネート、またはｐ−トルエンスルホネートであり；
Ｍ＋は、アンモニウム、リチウム、ナトリウム、カリウムまたはテトラアルキルアンモニウムであり；
Ａ−２は、スルフェート、オキサレート、ハイドロゲンホスフェート、タートレートまたはフマレートであり；
Ｍ＋２は、カルシウムまたはマグネシウムである、
シクロペプチド（ＣＰ）エキノカンジン核の内部塩形態結晶、およびその薬学的に受容可能な溶媒和物または水和物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、エキノカンジン核（ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ  ｎｕｃｌｅｕｓ）の塩結晶、特にエキノカンジンＢ（Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ  Ｂ）核の塩結晶の形成およびアニオン交換プロセスに関する。
【０００２】
（発明の背景）
エキノカンジン環状ペプチドは、天然の抗真菌産物である。エキノカンジン環状ペプチドのファミリーには、エキノカンジンＢ（ＥＣＢ）、エキノカンジンＣ、アクレアシン（Ａｃｕｌｅａｃｉｎ）Ａγ、ムルンドカンジン（Ｍｕｌｕｎｄｏｃａｎｄｉｎ）、スポリオファンジン（Ｓｐｏｒｉｏｆｕｎｇｉｎ）Ａ、ニューモカンジン（Ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ）Ａ0、ＷＦ１１８９９Ａ、およびニューモカンジンＢ0のような天然産物が含まれる。これらは、代表的には、種々の微生物を培養することにより産生される。例えば、エキノカンジンＢは、真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｎｉｄｕｌａｎｓの発酵により産生される。
【０００３】
より活性な物質の探索において、天然産物は種々の方法で改変されている。最も一般的な方法の１つは、天然産物上のＮ−アシル側鎖の置換による半合成誘導体の生成である。例えば、米国特許第４，２９３，４８９号；同第４，３２０，０５２号；同第５，１６６，１３５号；および同第５，５４１，１６０号；ならびにＥＰ３５９５２９；ＥＰ４４８３５３；ＥＰ４４７１８６；ＥＰ４６２５３１；およびＥＰ５６１６３９は、種々の程度の抗真菌活性を有する種々のＮ−アシル誘導体化エキノカンジン化合物を記載する。
【０００４】
このＮ−アシル誘導体は、天然産物を脱アシル化し、続いて異なるアシル基で再アシル化することによって生成される。脱アシル化は、代表的には酵素（例えば、デアシラーゼ酵素）によって達成される。このデアシラーゼ酵素は、微生物Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｕｔａｈｅｎｓｉｓ種またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種から得られ得る（例えば、米国特許第４，２９３，４８２号および同第４，３０４，７１６号；ならびにＥＰ４６０，８８２を参照のこと）。脱アシル化化合物は、代表的には、対応する天然産物の核といわれる（例えば、エキノカンジンＢの脱アシル化生成物は、エキノカンジンＢ核（ＥＣＢＮ）といわれる）。あいにく、アシル化生成物および非アシル化化合物の両方は、それらの限定された溶解度およびアモルファス状態のため、精製することが困難である。さらに、遊離アミノ化合物（例えば、ＥＣＢＮ）は、一般的に不安定で、開環に供される。
【０００５】
結晶の物質は、それらのアモルファスの対応物よりも、一般的に精製が容易であることは、当該分野において周知である。従って、環状ペプチド化合物を、それらの結晶状態で生成し、最適な純度を得ることが望ましい。最終薬学的生成物の効力は、最終生成物を作製するために使用される中間体の純度に依存するので、製造プロセスの任意の段階における純度の向上は、非常に望ましい。理想的には、混入物は、製造プロセスにおける可能な限り初期の段階で除去される。従って、次のアミノ置換基の付加の前に、遊離アミノ基を含む環状ペプチド化合物の精製を単純化かつ向上させるプロセスの必要性が存在する。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、混合ブロスまたは部分的に精製されたプロセスストリームから、エキノカンジン核塩形態の結晶を形成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程による：（ｉ）エキノカンジン核またはそのアモルファス塩、アルデヒド不純物および溶媒を含む溶液を、ナノ濾過プロセスによって濃縮し、濃縮物を形成する工程；（ｉｉ）アルデヒド誘導体化剤を加える工程；（ｉｉｉ）ｐＨを、４．０未満（好ましくは、約２．０と約３．０との間）の値に調整する工程；（ｉｖ）酸または金属塩を加える工程；および（ｖ）濃縮物を濃縮し、工程（ｉｖ）で加えた酸または金属塩のアニオンに対応するアニオンを有するエキノカンジン核を結晶化させる工程。結晶化を開始させるために、種結晶が必要に応じて加えられ得る。
【０００７】
本発明の別の実施形態においては、エキノカンジンアンモニウム塩（その単純な誘導体を含む）のアニオンを交換するためのプロセス、および種々の形態のエキノカンジン核塩結晶が提供される。
【０００８】
（定義）
「エキノカンジン化合物」とは、以下の一般構造：
【０００９】
【化５】
0004063497.tif 000002
を有する化合物（その任意の単純な誘導体を含む）およびそれらの薬学的に受容可能な塩、エステル、水和物または溶媒和物をいい、ここでＲは、水素または−Ｃ（Ｏ）Ｒ’であり、ここでＲ’は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、またはヘテロアリール基であり；Ｒ1は、−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ2は、−Ｈ、−ＮＨ2または−ＣＨ3であり；Ｒ3は、−Ｈ、−ＣＨ3、−ＣＨ3ＣＯＮＨ2または−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2であり；Ｒ4は、−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｒ5は、−ＯＨ、−ＯＳＯ3Ｈ、または−ＯＰＯ2ＨＲaであり、ここでＲaは、ヒドロキシ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、フェニル、フェノキシ、ｐ−ハロフェニル、ｐ−ハロフェノキシ、ｐ−ニトロフェニル、ｐ−ニトロフェノキシ、ベンジル、ベンジロキシ、ｐ−ハロベンジル、ｐ−ハロベンジロキシ、ｐ−ニトロベンジル、またはｐ−ニトロベンジロキシであり；Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、または−ＯＳＯ3Ｈであり；Ｒ7は、−Ｈまたは−ＣＨ3である。特定の不斉中心は示されていないが、上記に示される構造Ｉの、種々のエナンチオマー（ｅｎａｎｔｏｍｅｒｉｃ）形態もまた、エキノカンジンの意味に含まれる。「エキノカンジン核」とは、Ｒが水素である脱アシル化されたエキノカンジン化合物をいう。「ＥＣＢＮ」とは、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５がヒドロキシル基、Ｒ２、Ｒ３およびＲ７がメチル基；そしてＲおよびＲ６が水素である、エキノカンジンＢ核をいう。
【００１０】
「アルキル」とは、他に示されない限り、１〜３０個の炭素原子を含む、一般式ＣnＨ2n+1の炭化水素ラジカルをいう。アルカンラジカルは、直鎖状（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、分枝状（例えば、イソプロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチルなど）、環式（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、シクロヘキシルなど）、または多環式（例えば、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、スピロ［２．２］ペンタンなど）であり得る。アルカンラジカルは、置換されていても置換されていなくてもよい。同様に、アルコキシ基またはアルカノエートのアルキル部分は、上記と同様の定義を有する。
【００１１】
「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、非環式炭化水素をいう。アルケンラジカルは、直鎖状、分枝状、環式、または多環式であり得る。アルケンラジカルは、置換されていても置換されていなくてもよい。
【００１２】
「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む非環式炭化水素をいう。アルキンラジカルは、直鎖状でも分枝状でもよい。アルキンラジカルは、置換されていても置換されていなくてもよい。
【００１３】
「アリール」とは、単環系（例えば、フェニル）または縮合環系（例えば、ナフタレン、アントラセン、フェナントレンなど）を有する芳香族部分をいう。アリール基は、置換されていても置換されていなくてもよい。
【００１４】
「ヘテロアリール」とは、芳香族環系内に少なくとも１つのヘテロ原子を含む芳香族部分（例えば、ピロール、ピリジン、インドール、チオフェン、フラン、ベンゾフラン、イミダゾール、ピリミジン、プリン、ベンズイミダゾール、キノリンなど）をいう。芳香族部分は、単環系または縮合環系を構成し得る。ヘテロアリール基は、置換されていても置換されていなくてもよい。
【００１５】
有機化学の分野、特に有機生化学の分野においては、化合物のかなりの置換が許容され、また有用でさえあることが広く理解されている。本発明においては、例えば、用語アルキル基は、典型的なアルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、イソオクチル、ドデシル、ステアリルなど）である置換基を考慮する。この用語は、特に、当該分野において一般的なアルキル上の置環基（例えば、ヒドロキシ、ハロゲン、アルコキシ、カルボニル、ケト、エステル、カルバメートなど）を想定かつ考慮し、そして非置換アルキル部分を含む。しかし、置換基は、この化合物の薬学的特性に悪影響を与えないように、または医薬の使用を不利に妨害しないように選択されるべきである。上記で定義された任意の基に対する適切な置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノ、４級アンモニウム塩、アミノアルコキシ、ヒドロキシアルキルアミノ、アミノアルキルチオ、カルバミル、カルボニル、カルボキシ、グリコリル、グリシル、ヒドラジノ、グアニル、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００１６】
「溶媒和物」とは、１つ以上の溶質分子（例えば、化合物Ｉ）と、１つ以上の溶媒分子（例えば、水、エタノールなど）とで構成される凝集体を意味する。
【００１７】
「適切な溶媒」とは、反応物を十分に可溶化して、所望のアニオン交換または塩形成に影響を与える媒体を提供する、進行中の反応に対して不活性な任意の溶媒、または溶媒の混合物をいう。
【００１８】
「混合ブロス（ｍｉｘｅｄ  ｂｒｏｔｈ）」とは、精製することなく、発酵ブロスが直接脱アシル化酵素で処理されて、脱アシル化生成物（例えば、ＥＣＢＮ）を生成する転化混合物をいう。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載される環状ペプチドの粗混合物は、当該分野において記載されるような公知の微生物の発酵により調製され得る。次の脱アシル化は、代表的には、当該分野において記載される公知の物質および手順によって、デアシラーゼ酵素を用いて酵素的に行われる。
【００２０】
例えば、Ｒ1およびＲ4が各々、ヒドロキシであり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ7が各々、メチルである環状ペプチドＩ（すなわち、Ａ−３０９１２Ａに対応する環式核）は、米国特許第４，２９３，４８２号に詳述される手順を用いて調製され得る。Ｒ1がヒドロキシであり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ7が各々メチルであり、そしてＲ4が水素である環状ペプチドＩＩ（ａ）（すなわち、Ａ−３０９１２Ｂに対応する環式核）は、米国特許第４，２９９，７６３号に詳述される手順を用いて調製され得る。アクレアシンは、米国特許第３，９７８，２１０号に詳述される手順を用いて調製され得る。Ｒ3がＣＨ2Ｃ（Ｏ）ＮＨ2であり、Ｒ7がメチルであり、Ｒ2が水素であり、そしてＲ1およびＲ4がヒドロキシである環状ペプチドＩは、米国特許第５，１９８，４２１号に詳述される手順を用いて調製され得る。
【００２１】
発酵ブロスおよび混合ブロスは、多数の関連する副生成物を含み、これらは所望の環状ペプチド生成物から分離することが非常に困難である。逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＬＣ）は、過去に合理的な成功とともに使用されていた；しかし、高純度の化合物の必要性は、さらにより改良された精製方法を必要とする。
【００２２】
混合ブロス溶液または発酵プロセスから単離された生成物は、一般的に、粒子を除去するために予備濾過（ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ）される。予備濾過は、任意の数の当該分野において公知の手段によって達成され得、これらの手段としては、重力濾過、セラミックフィルター（これは、ＣｅｌｉｔｅTM濾過助材を含んでも含まなくてもよい）を通す減圧濾過などが挙げられる。発酵ブロス中の固体はまた、遠心分離し、続いて固体から液体をデカントすることにより除去され得る。混合ブロスからの濃縮物とは、発酵混合ブロスの濾過または遠心分離から直接得られる濃縮物をいう。
【００２３】
濾過した溶液が、さらに精製を必要とする場合、濃縮した溶液は、任意の結晶化試行の前に分取液体クロマトグラフィーを用いて分離され得る。クロマトグラフィー分離から生じたこれらの濃縮物は、部分的に精製されたプロセスストリームからの溶液の例として役立ち、そして「洗練された（ｐｏｌｉｓｈｅｄ）濃縮物」といわれる。
【００２４】
当該分野において周知の任意のクロマトグラフ方法は、生成物の所望の分離を提供するために使用され得る。好ましいクロマトグラフ方法は、酸性溶出スキームを有する逆相媒体の使用を利用する。好ましくは、溶出剤は、酢酸を含有する。例えば、この物質は、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  エキノカンジン  Ｃｙｃｌｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．」と題された、Ｋｒｏｅｆｆら（１９９８年１２月９日出願）に記載されるクロマトグラフ方法を用いて精製され得る。この精製方法は、混合物を、疎水性逆相クロマトグラフ媒体に吸着させる工程、および水中の０．１体積％酢酸〜１０．０体積％酢酸、好ましくは０．５％（ｐＨ＝５．５）〜４．０％（ｐＨ＝２．５）酢酸にわたる範囲の、連続的なほぼ線形の酢酸勾配で溶出する工程を包含する。
【００２５】
ＥＣＢＮ塩を結晶化させるために、混合ブロスまたはクロマトグラフプロセスから収集した分離からの溶液を、まず濃縮させる。従来、この溶液は、蒸発方法（例えば、蒸留）によって濃縮された。しかし、出願人らは、ナノ濾過システムが、より効率的かつ高品質の濃縮物を提供することを見出した。このプロセスは、約４００分子量の逆浸透圧膜上の環状ペプチド核の２００倍濃度の希釈（約１ｇ／リットル）溶液を含む。この膜は、環状ペプチド核を保持するが、より低分子量の不純物が通過するのを可能にする。ナノ濾過方法は、従来の蒸発方法を越えるいくつかの利点（例えば、高い効力、この核を凍結乾燥する必要性の排除、短いサイクルタイム、および濃縮の間の分解生成物の有意な減少）を提供する。蒸留と異なり、ナノ濾過は、有意な分解なく、約１８％と２２％との間の重量％を有する濃縮物を生成することを可能にする。
【００２６】
他の関連する不純物に加え、エキノカンジンＢの発酵ブロスは、以下の化学構造（Ｉａ）を有する、種々のレベルのトリペプチドアルデヒド（Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈ）副生成物を含む。このトリペプチドアルデヒド副生成物は、酵素的脱アシル化プロセスの間に、エキノカンジンＢと同様に脱アシル化を受け、対応する脱アシル化トリペプチドアルデヒド（Ｉｂ）を形成する。
【００２７】
【化６】
0004063497.tif 000003
ここで、Ｒは、Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）Ｃ9Ｈ19（Ｉａ−発酵副生成物）または水素（Ｉｂ−混合ブロスからの脱アシル化副生成物）である。
【００２８】
驚くべきことに、脱アシルトリペプチド−アルデヒドの保持時間は、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＬＣ）において、最適化溶出条件下でさえ、ＥＣＢＮと非常に類似しており、従って、所望のＥＣＢＮから脱アシルトリペプチド−アルデヒド（Ｉｂ）を分離することを非常に困難にする。ナノ濾過プロセスはまた、脱アシルトリペプチド−アルデヒドを十分に除去しない。ここでトリペプチド不純物が、ＥＣＢＮ塩の結晶化する能力に影響を与えるということが示された。いかなる１つの理論にも拘束されることを望まないが、トリペプチド不純物（Ｉｂ）は、ＥＣＢ核と、溶液中で弱い複合体を形成し、この複合体がＥＣＢ核結晶化の速度を減少させるか、そうでなければ阻害するように作用して、従って低い生成物回収に寄与していると考えられる。結果として、トリペプチド副生成物は、好ましくは結晶ＥＣＢＮの単離の前に除去されるか、または改変される。
【００２９】
トリペプチド−アルデヒド副生成物は、結晶化の前に誘導体化剤とアルデヒドを反応させることにより、ＥＣＢＮ濃度を改変され得る。その誘導体化剤は、アルデヒドと選択的に相互作用し、従ってアルデヒドとＥＣＢＮとの間のいかなる相互作用も減少させるか、または除去する。「誘導体化剤」とは、トリペプチド副生成物のアルデヒド官能基と相互作用（すなわち、反応または複合体化）し得、疎水性の十分異なる中間体を生成して、所望のＥＣＢＮ塩からトリペプチド中間体を分離することを可能にする試薬をいう。例えば、アルデヒドの溶解性が増加され、その結果ＥＣＢＮ塩は、溶液から選択的に結晶化して、溶液中にアルデヒドを残す。適切な誘導体化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびセミカルバジド塩酸塩が挙げられる。アルデヒド不純物の１当量に当たり少なくとも１当量の誘導体化剤が、添加される。好ましくは、小過剰の誘導体化剤が添加される（すなわち、約１．２当量）。
【００３０】
濃縮溶液のｐＨを４．０未満、好ましくは約４．０と２．０との間、より好ましくは約３．５と約２．５との間に調整するために、有機酸または無機酸が、この濃縮物に添加される。最適なｐＨ（すなわち、プロトン化の程度）は、アミン官能基の局所的な化学的環境に依存する。換言すると、ｐＨは、アンモニウム塩の形成に好都合であるように調整される。ＥＣＢＮ塩は、所望のアニオンを含む酸または金属塩を添加し、次いでこの混合物をゆっくりと冷却して結晶化を開始させることにより、酸性濃縮物から結晶化され得る。酸／金属塩は、分けて添加される。その部分は、等量でか、または異なる量で添加され得る。部分ずつの添加は、結晶成長プロセスを制御するようである。代表的には、第１の部分は、第２または第３の部分のほぼ２倍の量を含む。好ましくは、金属塩は、異なる温度で部分ずつ添加される。例えば、金属塩の第１の部分は、約２２℃と２８℃との間で添加され、第２の部分は約２０℃と１５℃との間で添加され、そして第３の部分は約８℃と１２℃との間で添加される。温度を２８℃から約１０℃に下げることにより、ＥＣＢＮ塩の溶解性を低下させ、従ってＥＣＢＮ塩の結晶化を補助するが；１０℃より低く温度をさらに下げることは、ＥＣＢＮ塩の溶解性に有意に影響しないようである。濃縮物に加えられる酸／金属塩の量を増大させることは、豊富なアニオン源提供するだけでなく、ＥＣＢＮ塩の溶解性を低下させると考えられる。濃縮物に添加される酸／金属塩の総量は、一般的には濃縮物の約１４重量％と１６重量％との間である。好ましくは、種結晶を結晶化プロセスの開始を補助するために添加する。
【００３１】
シクロペプチドがエキノカンジンＢの核である場合、酢酸塩は非晶質固体である。出願人らは、非晶質アンモニウムシクロペプチド塩のアニオンが、代替のアニオン源（酸または金属塩）の存在下で容易に交換されて、結晶性塩を形成し得るということを発見した。例えば、ＥＣＢＮを含むＨＰＬＣ分割部分は、溶出液が酢酸であるので代表的にはアンモニウムアセテート塩の形態である。アニオン交換は、結晶化の前の任意の工程で、代替のアニオン源として作用する適切な酸／金属塩を添加することにより達成され得る。ＥＣＢＮについては、好ましいアニオン源は、ＨＣｌ／塩化ナトリウムである。
【００３２】
要約すると、ＥＣＢＮ塩の形成は、以下の工程：（ｉ）ＥＣＢＮまたはその非晶質塩およびアルデヒド不純物を含む溶液を、ナノ濾過プロセスを使用して濃縮する工程；（ｉｉ）アルデヒド不純物と相互作用する誘導体化剤（好ましくは亜硫酸水素ナトリウム）を添加する工程；（ｉｉｉ）ｐＨを４．０未満に調整する工程；（ｉｖ）酸または金属塩（好ましくはＮａＣｌ）を添加する工程；および（ｖ）この混合物を冷却してＥＣＢＮ塩の結晶化を開始させる工程、を包含する。ＥＣＢＮ塩の種結晶は、必要に応じて結晶化の開始を補助するために添加され得る。好ましくは、塩化ナトリウムは、３つの部分で添加される（第１の部分は約２２℃と２８℃との間で添加され；第２の部分は約１５℃と２０℃との間で添加され；そして第３の部分は約８℃と１２℃との間で添加される）。さらに、第１の部分は、好ましくは第２または第３の部分のほぼ２倍の量の塩化ナトリウムを含む。
【００３３】
単離されたＥＣＢＮ塩のアニオンは、シクロペプチドアンモニウム塩を、所望のアニオンを含有する酸塩（または金属塩）と適切な溶媒中でスラリー化して、このスラリーを加熱して反応物を溶解させ、次いでこの溶液を冷却して所望の結晶性塩を形成することにより交換され得る。
【００３４】
結晶形は、いくつかの利点（例えば、混合発酵ブロス（ｂｒｏｔｈ）および／またはプロセスストリーム（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｔｒｅａｍ）からのシクロペプチドの容易な単離、中間体の改善された精製、改善された貯蔵寿命、ならびに最終アシル化生成物の増加した収率）を提供する。これらの利点の各々が実現される程度は、特定の塩形態およびこの塩が生成されるプロセスに依存し得る。
【００３５】
結晶性塩は、種々の結晶形（例えば、単一の塩および内部塩（ｉｎｎｅｒ−ｓａｌｔ）の形態、溶媒和形態および／または水和物形態など）で単離され得る。簡単なプロトン化アンモニウム塩は、ＣＰ−ＮＨ3+Ａ-、（ＣＰ−ＮＨ3+）2Ａ-2、および（ＣＰ−ＮＨ3+Ｍ+）Ａ-2のような一酸付加塩または二酸付加塩の形態であり得、ここでＣＰ−ＮＨ3+は、プロトン化１級アミノ基を含むシクロペプチド（例えば、ＥＣＢＮ）を示し、Ａは、一価または二価のアニオン、そしてＭ+は、一価の金属である。適切な一価のアニオンとしては、クロリド、ブロミド、ヨーダイド、ジハイドロゲンホスフェート、ハイドロゲンスルフェート、ハイドロゲンオキサレート、ハイドロゲンタートレート、ベンゾエート、メタンスルホネート、およびｐ−トルエンスルホネートが挙げられる。適切な二価のアニオンとしては、スルフェート、オキサレート、ハイドロゲンホスフェート、タートレートおよびフマレートが挙げられる。適切な金属カチオンとしては、アンモニウム、リチウム、ナトリウム、カリウムおよびテトラアルキルアンモニウムが挙げられる。
【００３６】
内部塩形態は、（ＣＰ−ＮＨ3+Ａ-）（Ｍ+Ａ-）および（（ＣＰ−ＮＨ3+）2Ａ-2）（Ｍ+2Ａ-2）のような式により示され得、ここでＭ+2は、二価の金属である。適切な二価の金属としては、カルシウムおよびマグネシウムが挙げられる。
【００３７】
上記で議論された基本的な塩の形態に加えて、塩は溶媒和物として単離され得る。溶媒和形態の例は、以下の化学式を有する形態を含む：（ＣＰ−ＮＨ3+Ａ-）（Ｈ2Ｏ）a（Ｓ）b（ここでＳは、有機溶媒であり、下付き文字ａおよびｂは、溶媒和化学量論を表す。適切な溶媒和物の溶媒としては、メタノール、エタノール、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランおよびトルエンが挙げられる。
【００３８】
非溶媒和形態および溶媒和形態は、多形を示す。例えば、結晶形は、結晶化の条件に依存し得る。たとえ化学量論が同じであっても、異なる物理的および化学的特性を有する、異なる３次元固相結晶構造が存在し得る。
【００３９】
以下は例示的な実施例として提供され、そして他のシクロペプチドアンモニウム塩が、以下に記載の手順を使用して精製され得るかまたは生成され得るということが当業者に理解される。本明細書中に引用される全ての参考文献は、参考として本明細書中に援用される。
【００４０】
（実施例）
以下の調製において使用される材料は、他に記載されなければ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から入手可能である。以下の省略形が使用される：ＡＣＮ−アセトニトリル；ＴＦＡ−トリフルオロ酢酸；およびＴＲＳ−全関連物質（すなわち不純物）。
【００４１】
（サンプルの分析的特徴付け）
ＥＣＢＮ濾液サンプルの量および品質を以下の分析方法を使用して評価した。
【００４２】
ホスフェート系：ＺｏｒｂｏｘTMＳＢ  Ｃ−１８、３．５ミクロン粒子カラム（０．４６ｃｍ内径×１５ｃｍ）を、１．０％リン酸／ＡＣＮ移動相を用いて１．５ｍｌ／分の流速で溶出した。このカラムを３０℃で使用して溶出液を２１０ｎｍでモニターした。このカラムを１％ＡＣＮ中で平衡化し、そしてサンプル注入後、９分間にわたって５〜６１．０％ＡＣＮの範囲の勾配を使用して、ＥＣＢＮを溶出した。溶出後、このカラムを５０％ＡＣＮで洗浄して、任意の高度に保持される成分を溶出した。
【００４３】
ホスフェート／オクタンスルホン酸（ＯＳＡ系）：この系は、移動相が３０ｍＭのＯＳＡおよび０．２％のリン酸を含むことを除いて、上記で議論されたホスフェート系と同様である。このカラムを１０％ＡＣＮで平衡化する。サンプルを注入した後に、ＥＣＢＮの溶出を、９分間にわたる１０〜２８％ＡＣＮの範囲の勾配を用いて達成する。次いで、このカラムを５０％ＡＣＮで洗浄して、高度に保持される成分を溶出する。カラム流速および検出器波長は、上記の通りにしたが、カラム温度を５０℃にした。この系は、Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈトリペプチド−アルデヒド成分を定量するために特に有用である。
【００４４】
ＴＦＡ系：ＶｙｄａｃTMＣ−１８、３．５ミクロンカラム（０．４６×２５ｃｍ）を、アッセイのために使用した。移動相は０．１％のＴＦＡを含み、そして溶出を、２０分間にわたって０〜１０％の線形ＡＣＮ勾配を使用して達成し、次いで５０％のカラム洗浄を行った。カラム流速、温度、および検出器波長は、上記のホスフェート系と同じであった。
【００４５】
（一般的手順）
（ナノ濾過プロセス）
約３％の酢酸および５％のアセトニトリルを含む水中に溶解された約３０ＫｇのＥＣＢＮを含む１０，０００リットルの樹脂溶出液を、６００ｆｔ2のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｎａｎｏｍａｘ  ５０膜を備えたナノ濾過系に充填した。このナノ濾過系を、６００ｐｓｉｇ、１５℃、および約５０〜２００ｌｐｍの再循環流速で操作する。この溶液を約３００リットルに１〜３時間にわたって濃縮する。ｐＨを濃ＨＣｌで２．７と３．０との間に調整する。この系を、約１０００リットルの水を用いてダイアフィルトレーションする（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅｄ）（すなわち、全体積を大まかに３００リットルに一定に保ちながら、（例えば、膜を通る濾液の流速と同じ速度で水を加える）水で洗浄する）。洗浄の後、この溶液を最終体積１００〜１５０リットル（２００〜３００ｇ／リットル）に濃縮する。次いでこれを結晶化工程に直接使用する。
【００４６】
（実施例１）
実施例１は、濃縮物中のトリペプチド−アルデヒド不純物の結晶化プロセスおよび複合体化を例示する。
【００４７】
上記の一般的なプロセスを使用してナノ濾過された種々の製造ロットからの水性ＥＣＢ核濃縮（Ｎｕｃｌｅｕｓ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）溶液を特徴とするアッセイのサンプルを秤量した。（後処理については表Ｉを参照のこと）。幾つかの場合、亜硫酸水素ナトリウムを添加し、そしてこの混合物をナトリウム亜硫酸水素ナトリウムが溶解するまで攪拌した。全ての場合において、生じた溶液のｐＨを、塩酸の希釈溶液（約１０重量％）滴下することにより、３．２〜２．９に調整した。生じたｐＨを調整された溶液に、計算された量の塩化ナトリウムを添加し、そしてこの混合物を固体が溶解するまで攪拌した。生じた溶液をメカニカルスターラーを備えた１００ｍｌのジャケット付き結晶化器（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｒ）に移した。一定の量の結晶性ＥＣＢ核種結晶（６９０ｍｇ）を攪拌溶液に加えた。この生じた種スラリーを２５℃で約２４時間攪拌した。第２の量の塩化ナトリウムを添加した。攪拌されるスラリーの温度を１７℃に調整し、そして内容物を約２４時間攪拌した。最後に、第３の量の塩化ナトリウムを添加した。攪拌されるスラリーの温度を１０℃に調整し、そして内容物を約２４時間攪拌した。ＥＣＢ核結晶スラリーから生じた固体を、吸引濾過により単離した。この結晶性湿性ケーキ生成物を、塩化ナトリウムの水溶液（約１０ｍｌ、１４重量％）で洗浄し、プル乾燥（ｐｕｌｌｅｄ  ｄｒｙ）した。この結晶を７５％相対湿度チャンバー中で一晩乾燥させた。単離された生成物を秤量し、そして表ＩＩ中に記録されるように有効性についてアッセイした（ここで*は、不十分な乾燥に起因して有効性が低いことを示す）。
【００４８】
【表１】
0004063497.tif 000004
【００４９】
【表２】
0004063497.tif 000005
（実施例２）
実施例２は、非晶質ＥＣＢＮアセテートアンモニウム塩の、種々の結晶性塩ヘの変換を例示する。
【００５０】
所定の量のＥＣＢＮアンモニウムアセテート塩（５．０ｇ、８８．４％有効性、４．１５％ＴＲＳ）を、５０ｍｌのエルレンマイヤーねじぶた式フラスコ中に入れた。次いで酸塩の水溶液を加えた（表ＩＩＩ、ここで1ＴＲＳは、全関連物質（例えば、不純物）であり；そして2ＫＦは、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒアッセイである）。生じたスラリーを攪拌して固体を溶解させた。少量の種結晶を加え、そしてフラスコを密閉した。このフラスコを−２５℃に維持された回転式（ｏｒｂｉｔａｌ）振盪浴中に置き、そして５日間の間浸透し、この際に沈殿が形成した。沈殿の４／５の部分を吸引濾過により単離した。単離された湿性ケーキを二つのフラクションに分割した：（Ａ）湿性ケーキフラクション；および（Ｂ）半乾燥フラクション。この湿性ケーキフラクションを、密閉バイアルに保存した。
【００５１】
この半乾燥フラクションをアセトニトリル水溶液（体積で９５：５、２ｍｌ）で洗浄した。洗浄したケーキを周囲温度で乾燥し、そして１５分間（ＡＣＮ臭が消散するのに十分な時間）加圧した。自由流動性（ｆｒｅｅ  ｆｌｏｗｉｎｇ）半乾燥湿性ケーキ粉末を密閉バイアル中に貯蔵した。
【００５２】
単離された半乾燥ケーキを、イオンクロマトグラフィーによりアニオンおよびカチオンについて分析した。有効性および不純物（ＴＲＳ）を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により決定した。
【００５３】
【表３】
0004063497.tif 000006
各サンプルについて単離された湿性ケーキを、偏光下で顕微鏡で調べ、そして結晶性物質に典型的な複屈折挙動を示した。さらに、顕微鏡写真は結晶形を提示した。全ての単離された物質は、Ｘ線粉末回折法（ＸＲＰＤ）により分析された場合に、結晶性物質の存在に一致する明確な回折パターンを示した。
【００５４】
（実施例３）
実施例３は、蒸留（方法Ａ）を介して濃縮されたＥＣＢＮの品質を、ナノ濾過（方法Ｂ）により濃縮されたＥＣＢＮの品質と比較する。
【００５５】
（方法Ａ）
カラム溶出（「主流」と呼ばれる、約１０，０００Ｌ）からの合わせたフラクションを、部分的に蒸留装置に移した。揮発性の成分（アセトニトリル、酢酸および水を含む）を、減圧蒸留により部分的に除去する。代表的な蒸留温度は４０℃と４５℃との間である。濃縮物の全体積が約２００Ｌになるまで主流を蒸留装置に移し、蒸留を続けた。代表的な蒸留時間は、２４〜３６時間である。
【００５６】
（方法Ｂ）
カラム溶出物（約１０，０００Ｌ）からの合わせたフラクションを、加圧下でナノ濾過装置を通して再循環させる。再循環操作の間、アセトニトリル、水、および酢酸の大部分を除去する。他の不純物（カルシウム塩およびマグネシウム塩を含む）もまた除去される。除去された物質は、「浸透液」といわれるプロセスストリーム（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｔｒｅａｍ）に溶解する。残留した物質を含む濃縮された部分は、「残分」といわれる。再循環操作を残分の体積が約５００Ｌになるまで続ける。
【００５７】
塩化ナトリウム（１０ｋｇ）、塩酸（残分のｐＨを３．０に調整するため）および水（２６００Ｌ）をこの残分に添加する。この残分混合物をナノ濾過装置を通して残分の体積が約２００Ｌになるまで再循環させる。代表的なナノ濾過時間は約９時間である。
【００５８】
（観察）
ナノ濾過（方法Ｂ）により調製されたＥＣＢ核濃縮物溶液は、蒸留（方法Ａ）により調製された溶液より良好な品質である。ＥＣＢ核物質のＨＰＬＣクロマトグラムは、存在する不純物の型および量が、方法Ａにより調製された蒸留された物質と比較して、方法Ｂにより調製されたナノ濾過された物質においてより少ないか、または存在しないということを示した。例えば、クロマトグラムは、熱分解に関連する不純物がナノ濾過により調製された濃縮物より、蒸留により調製された濃縮物において有意に多いということを示す。８つの蒸留濃縮物における平均分解不純物レベルは、６．５％であった（中間＝７．９％、範囲＝４．８２％〜１１．１％）。一方、１８のナノ濾過濃縮物における平均分解不純物レベルは、３．２％であった（中間＝４．７％、範囲＝０．４２〜８．９５％）。
【００５９】
ナノ濾過により調製されたＥＣＢ核濃縮物溶液からの結晶性ＥＣＢ核の回収率は、代表的に蒸留により調製された濃縮溶液からの回収率より多い。８つの蒸留濃縮溶液からの結晶性ＥＣＢ核の平均回収率は、２５．６％であった（中間２５．８％、範囲＝４．０％〜４７．６％）。対照的に、１８のナノ濾過された濃縮物からの結晶性ＥＣＢ核の平均回収率は、６０．６％（中間＝５１．０％、範囲＝２３．３％〜７８．７％）。