(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に示される塩基配列（ただし、ＴはＵでもよい)から成るオリゴヌクレオチドであるフォワード側プライマーと、配列表の配列番号４に示される塩基配列（ただし、ＴはＵでもよい)から成るオリゴヌクレオチドであるリバース側プライマーと、配列表の配列番号６に示される塩基配列（ただし、ＴはＵでもよい)から成るオリゴヌクレオチドに、リポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されており、前記リポーター蛍光色素は、該リポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものであるプローブとを用い、被検試料中の測定すべきクリプトスポリジウム・パルブム遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定することから成る、被検試料中のクリプトスポリジウム・パルブム遺伝子の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるクリプトスポリジウム・パルブム遺伝子の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クリプトスポリジウムは胞子虫類のコクシジウム目に属する原虫で、ヒトに感染すると激しい水様下痢、胃けいれん、腹痛などの症状を引き起こす。ヒトに感染するのはクリプトスポリジウム・パルブム(Cryptosporidium parvum)で、オーシストを経口的に摂取すると小腸粘膜に寄生し、ここで増殖することにより上記のような症状を呈する。クリプトスポリジウムオーシストは固い殻で覆われているため、耐塩素性が強く、上水道に混入した場合、長時間生存することが可能である。このため、上水道を原因とするクリプトスポリジウム症の集団感染が近年注目を集めている。感染例としては９３年米国ウィスコンシン州ミルウォーキー市での４０万人以上の集団感染をはじめ、日本でも９６年６月に埼玉県越生町で約９０００人の水系感染の発生が報告されている。このような背景をもとに、９６年９月３０日に厚生省より暫定対策指針及び暫定的な試験方法が発表され、それに伴って様々な試験方法の検討がなされている。
【０００３】
暫定的な試験方法は、
(1)  セルロースフィルターを用いて試験水をろ過濃縮する、
(2)  アセトンでフィルターを溶解した後、ショ糖浮遊法によりオーシストを回収及び夾雑物を除去する、
(3)  間接蛍光抗体染色によりオーシストを染色後、蛍光顕微鏡にて計数する、という手順で行う。この方法は、多くの時間と煩雑な操作を必要とし、またオーシスト計数には熟練した手技が要求される。
【０００４】
また、クリプトスポリジウム・パルブムの18SリボソームＲＮＡ(ｒＲＮＡ）遺伝子をＰＣＲで検出することも提案されている(Rochelle, P.A. et al., Proc. AWWA. Water. Qual. Technol. Conf., No. 1995 Pt2 1637-1661)。しかしながら、従来のＰＣＲを用いたこの方法では、ＰＣＲ後にゲル電気泳動を行なってバンドを検出する必要があるので、手間がかかり、多数の検体について検査を行なうには不向きである。また、この方法では、検体中のクリプトスポリジウム・パルブムのオーシスト数を測定することができない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、特別な手技を必要とすることなく簡便に実施することができ、かつ、検体中のクリプトスポリジウム・パルブムの検出のみならず定量も可能な、クリプトスポリジウム・パルブムの高感度な測定方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
最近、リポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されたプローブの存在下にＰＣＲを行い、標的核酸の増幅に伴ってリアルタイムに増加する蛍光強度を測定することにより、検体中の標的核酸の測定を行なう技術(本明細書において「リアルタイム検出ＰＣＲ法」という）が開発され、そのためのキットも市販されている。本願発明者らは、このリアルタイム検出ＰＣＲ法をクリプトスポリジウム・パルブムの測定に利用できないかと考えた。しかしながら、用いるプライマー及びプローブの設定いかんによっては、測定の感度及び／又は再現性について必ずしも満足できない。そこで、鋭意研究の結果、特定のプライマー及びプローブを用いることによりリアルタイム検出ＰＣＲ法を用いて非常に高感度に、高い再現性をもってクリプトスポリジウム・パルブムの遺伝子を正確に定量することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号２に示される塩基配列（ただし、ＴはＵでもよい)から成るオリゴヌクレオチドである第１のフォワード側プライマーと、配列表の配列番号４に示される塩基配列（ただし、ＴはＵでもよい)から成るオリゴヌクレオチドである第１のリバース側プライマーと、配列表の配列番号６に示される塩基配列（ただし、ＴはＵでもよい)から成るオリゴヌクレオチドに、リポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されており、前記リポーター蛍光色素は、該リポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものである第１のプローブとを用い、被検試料中の測定すべきクリプトスポリジウム・パルブム遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定することから成る、被検試料中のクリプトスポリジウム・パルブム遺伝子の測定方法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる第１のフォワード側プライマーは、配列表の配列番号２で示される２２塩基から成る塩基配列（ただし、ＴはＵでもよい)から成るオリゴヌクレオチドである。なお、配列番号２で示される塩基配列は、クリプトスポリジウム・パルブムの18S rRNA遺伝子の第７１２番目のヌクレオチド（以下、「７１２ｎｔ」のように記載）〜７３３ｎｔに相当するものである。なお、クリプトスポリジウム・パルブムの18S rRNA遺伝子の全塩基配列は公知であり、塩基配列のデータベースであるBio-Database Genetyx-CD（ソフトウェア開発株式会社の解析ソフトであるGenetyx-Macの付属のＣＤ）にファイルネーム「Crypt. paruvum1507」で登録されている。
【００１０】
本発明で用いられる第１のリバース側プライマーは、配列表の配列番号４で示される２１塩基から成る塩基配列（ただし、ＴはＵでもよい)から成るオリゴヌクレオチドである。なお、配列番号４で示される塩基配列は、クリプトスポリジウム・パルブムの18S rRNA遺伝子の９７１ｎｔ〜９９１ｎｔにハイブリダイズするものである。
【００１１】
本発明で用いられる第１のプローブは、オリゴヌクレオチドに後述するリポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素が結合したものである。該プローブのオリゴヌクレオチド部分は、配列表の配列番号６で示される２４塩基から成る塩基配列（ただし、ＴはＵでもよい)から成るオリゴヌクレオチドである。なお、配列番号６で示される塩基配列は、クリプトスポリジウム・パルブムの18S rRNA遺伝子の９２２ｎｔ〜９４５ｎｔにハイブリダイズするものである。
【００１２】
前記リポーター蛍光色素は、該リポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものである。リポーター蛍光色素としては、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のようなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、容易に入手可能である。リポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好ましくは５’末端）にリポーター蛍光色素が、他端にクエンチャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNoble et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びIyer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254に記載されている。
【００１３】
第２のフォワード側プライマーは、配列表の配列番号８で示される２１塩基から成る塩基配列（ただし、ＴはＵでもよい)から成るオリゴヌクレオチドである。なお、配列番号８で示される塩基配列は、クリプトスポリジウム・パルブムの18S rRNA遺伝子の９７１ｎｔ〜９９１ｎｔに相当するものである。
【００１４】
第２のリバース側プライマーは、配列表の配列番号１０で示される２１塩基から成る塩基配列（ただし、ＴはＵでもよい)から成るオリゴヌクレオチドである。なお、配列番号１０で示される塩基配列は、クリプトスポリジウム・パルブムの18S rRNA遺伝子の１２０４ｎｔ〜１２２４ｎｔにハイブリダイズするものである。
【００１５】
第２のプローブは、オリゴヌクレオチドに上記したリポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素が結合したものである。該プローブのオリゴヌクレオチド部分は、配列表の配列番号１２で示される２７塩基から成る塩基配列（ただし、ＴはＵでもよい)から成るオリゴヌクレオチドである。なお、配列番号１２で示される塩基配列は、クリプトスポリジウム・パルブムの18S rRNA遺伝子の１１３３ｎｔ〜１１５９ｎｔにハイブリダイズするものである。なお、第２のプローブに結合される蛍光色素については第１のプローブについて説明した通りである。
【００１６】
本発明の方法では、上記第１のフォワード側プライマーと、上記第１のリバース側プライマーと、上記第１のプローブとを用い、被検試料中の測定すべきクリプトスポリジウム・パルブムの18S rRNA遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定する。このリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及びキットも市販されているので、このような市販の装置及びキットを用いて行なうことができる。
【００１７】
反応は、被検クリプトスポリジウム・パルブムの18S rRNA遺伝子、上記フォワード側プライマー、リバース側プライマー及び上記プローブ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、dATP, dGTP, dCTP, dTTPを含む溶液を調製して行なう。dTTPに代えて、dUTPを用い、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を加えることにより、前回のＰＣＲ産物からの混入ＤＮＡを分解することができるので好ましい。反応の具体的な条件は下記実施例に詳述されている。なお、被検試料としては、クリプトスポリジウム・パルブムを含有する疑いのあるいずれのものであってもよく、例えば水道水、河川水、地下水、各種食品、各種飲料等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。クリプトスポリジウム・パルブムのＤＮＡの調製は、クリプトスポリジウム・パルブムのオーシストをアルカリ処理又はプロテイナーゼＫのようなタンパク分解酵素で処理することにより行なうことができ、具体的な方法が下記実施例に記載されている。
【００１８】
反応では、まず、クリプトスポリジウム・パルブムの18S rRNA遺伝子を鋳型としてＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。増幅ＤＮＡは、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズする。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プローブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とする伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解される。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド部分に結合されているリポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素とがバラバラになり、クエンチャー蛍光色素に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されていたリポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一方、被検試料中にクリプトスポリジウム・パルブムの18S rRNA遺伝子が存在しない場合には、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡにハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによって加水分解されることもない。このため、リポーター蛍光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍光強度を測定することにより、被検試料中のクリプトスポリジウム・パルブムの18S rRNA遺伝子を検出することが可能である。
【００１９】
本発明の方法では、蛍光強度をリアルタイムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣＲ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そして、被検試料中のクリプトスポリジウム・パルブム遺伝子の量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイクルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるか（この時のサイクル数を本明細書では「Ｃｔ値」という)を調べることにより、被検試料中のクリプトスポリジウム・パルブムの定量測定を行なうことができる。すなわち、被検試料中のオーシスト数の常用対数を横軸に、上記Ｃｔ値を縦軸にとると、測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成しておけば、Ｃｔ値を調べることにより被検試料中のクリプトスポリジウム・パルブム遺伝子の量を定量測定することができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＰＣＲのように、ＰＣＲ後に電気泳動を行なって増幅を調べる操作が不要であり、非常に簡便である。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
(1)  プライマーの合成
下記表１に示すプライマー及びプローブを化学合成した。プローブに結合した蛍光色素は上記したＦＡＭ及びＴＡＭＲＡであった。なお、プライマーの化学合成はAmersham Pharmacia Biotech社、プローブの化学合成(蛍光色素の結合を含む）はPE Applied Biosystems社に依頼して行った。
【００２２】
【表１】
0004033569.tif 000002
【００２３】
なお、プローブを構成するオリゴヌクレオチドの５'末端にはＦＡＭ、３'末端にはＴＡＭＲＡを結合した。
【００２４】
(2)  被検試料の調製
ショ糖浮遊法にて精製されたウシ糞便由来のクリプトスポリジウム・パルブムのオーシストを約２％の重クロム酸カリウム溶液中に４８５０００個／ｍｌ含む浮遊液２ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、２５００ｒｐｍ、１０分遠心し、上澄を除去することにより重クロム酸カリウムを除去した。滅菌精製水を加えて遠心する操作を２〜３回繰り返すことにより、オーシストを洗浄した。沈渣に滅菌精製水を５００μｌ加え、浮遊させた。０．２Ｍ  ＮａＯＨを５００μｌ加え（終濃度０．１Ｍ)  、６０℃水浴で１晩アルカリ処理後のサンプル３９０μｌに０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4を５００μｌ加え、中和した。得られた溶液５００μｌを市販の遠心ろ過チューブに入れ、１１０００ｒｐｍで濃縮ポケット内の液量が約20μｌになるまで室温で遠心し、遠心チューブのろ液を捨てた。１×ＴＥバッファーを５００μｌの目盛りまで加え、１１０００ｒｐｍで濃縮ポケット内の液量が約20μｌになるまで室温で遠心し、遠心チューブのろ液を捨てた。１×ＴＥを５００μｌの目盛りまで加え、再度遠心した。これを３回繰り返し洗浄（Ｂｕｆｆｅｒ交換）濃縮ポケットに集められた濃縮液をマイクロピペットで回収した。得られた濃縮液を１００倍〜２５６００倍まで２倍段階希釈し、被検試料とした。
【００２５】
(3)  リアルタイム検出ＰＣＲ
上記のように調製した被検試料及び(1)で作製したプライマー及びプローブを用い、市販のリアルタイム検出ＰＣＲ用試薬キット(TaqMan PCR Reagent Kit(商品名）、PE Applied Biosystems社製)及び装置(ABI PRISM 7700 （商品名）、PE Applied Biosystems社製)を用いてリアルタイム検出ＰＣＲを行なった。なお、プライマー及びプローブとしては、CR-2F、CR-2R、CRP-P5のセット(以下、「第１セット」ということがある)又はcrp-4F、crp-4R、CRP-P3のセット(以下、「第２セット」ということがある)を用いた。なお、仕込んだ反応溶液の組成を下記表２に示す。
【００２６】
【表２】
0004033569.tif 000003
※1：dNTP…dATP、dCTP、dGTP、dUTP
※2：ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ
※3:耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
【００２７】
ＰＣＲ反応は、いずれの場合も変性工程９５℃、１５秒、アニーリング工程５０℃、１５秒、伸長工程６０℃、１分で行ない、４０サイクル行なった。反応開始後、蛍光強度をリアルタイムで自動測定することによりＣｔ値を自動測定した。なお、増幅が正しく起きるか否かを調べるために、上記市販のキットに添付されているヒトβ―アクチン遺伝子並びにそのためのプライマー及びプローブを用い、キットに添付されている指示書に従ってコントロール実験を行なった。
【００２８】
(4)  結果
結果を図１及び図２に示す。図１は第１セットについての結果を、図２は第２セットについての結果を示す。図１及び図２は、横軸にオーシスト数（常用対数スケール)、縦軸にＣｔ値をとったものである。いずれのセットを用いた場合でも勾配を有する直線関係が成立しており、本発明の方法によりオーシストの定量が可能であることが明らかになった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、特別な手技を必要とすることなく簡便に実施することができ、かつ、検体中のクリプトスポリジウム・パルブムの検出のみならず定量も可能な、クリプトスポリジウム・パルブムの高感度な測定方法が提供された。本発明によれば、クリプトスポリジウム・パルブムを簡便かつ高感度に検出又は定量できるので、本発明は水道水や河川水、地下水等の水や各種食品、飲料等の品質検査に大いに貢献するものと期待される。
【００３０】
【配列表】
0004033569.tif 000004
【００３１】
0004033569.tif 000005
【００３２】
0004033569.tif 000006
【００３３】
0004033569.tif 000007
【００３４】
0004033569.tif 000008
【００３５】
0004033569.tif 000009
【００３６】
0004033569.tif 000010
【００３７】
0004033569.tif 000011
【００３８】
0004033569.tif 000012
【００３９】
0004033569.tif 000013
【００４０】
0004033569.tif 000014
【００４１】
0004033569.tif 000015
【００４２】
0004033569.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において測定された、プライマー及びプローブの第１セットを用いた場合のクリプトスポリジウム・パルブムのオーシスト数（常用対数スケール）と、Ｃｔ値との関係を示す図である。
【図２】本発明の実施例において測定された、プライマー及びプローブの第２セットを用いた場合のクリプトスポリジウム・パルブムのオーシスト数（常用対数スケール）と、Ｃｔ値との関係を示す図である。
【図１】
0004033569.tif 000017
【図２】
0004033569.tif 000018