(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定条件のＰＣＲに供されることにより酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより、実質的にラクトバチルス属細菌以外の生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないプライマーセットであって、
配列番号１における塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマーと、
配列番号２における塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマーと
からなるプライマーセット。
【請求項２】
（ｉ）被験食品に含まれるＤＮＡを抽出する工程と、
（ｉｉ）このＤＮＡを鋳型として請求項１に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程と、
（ｉｉｉ） ＤＮＡ増幅の有無を検出する工程と
を含む細菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主に酸性食品の細菌汚染検査に用いられるPCRプライマーセット及びそのプライマーセットを用いた細菌の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌は乳糖やブドウ糖を分解して乳酸をつくる細菌の総称であり、ヨーグルトや発酵乳等の食品の製造に活用されている。その乳酸菌の中で、自然界のあらゆるところに生息するグラム陽性通性嫌気性細菌の一部の細菌群は、加工食品等に汚染し、風味の劣化や食品収納密閉容器の膨化等を引き起こす原因菌として知られている（J. Appl. Bacteriol. 34:541-545(1971), Dakin J. C. and J. Y. Radwell; Lactobacilli causing spoilage of acetic acid preserves.; Int. J. Food Microbiol. 64:355-360(2001), Lyhs U., H. Korkeala H., P. Vandamme, and J. Bjorkroth; Lactobacillus alimentarius: a specific spoilage organism in marinated herring.）。
【０００３】
マヨネーズや食酢のような低ｐＨ食品では、含有される酢酸の静菌作用により、一般的な汚染菌の増殖による食品腐敗は制御されている。しかし、このような酢酸等による低ｐＨ環境下においても増殖可能で、食品の腐敗、汚染原因となる乳酸菌（酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌）が存在する。低ｐＨ食品製造事業所等で危機管理の対象菌となっている代表的な酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌としては、具体的にはラクトバチルスフラクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバチルスブレビス（L. brevis）、ラクトバチルスブチェネリ（L. buchneri）、ラクトバチルスプランタラム（L. plantarum）、ラクトバチルスパラカゼイ（L. paracasei）の５菌種が挙げられる（「食品の腐敗変敗防止対策ハンドブック」、株式会社サイエンスフォーラム発行）。これらの酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌は、いずれもラクトバチラレス（Lactobacillales）目; ラクトバチラセ（Lactobacillaceae）科に属する。
【０００４】
これら酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌群を迅速かつ精度よく検出することは、低ｐH食品の製品や製造工程における品質管理手法を開発する上で非常に重要である。
【０００５】
従来主に、Lactobacilli MRA Broth［Difco Laboratories Inc. (BD Difco)］寒天培地のようなラクトバチルス属細菌を選択的に培養できる培地を用いることにより低ｐＨ食品の乳酸菌汚染の有無が判定されている。しかし、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌はいずれも増殖速度が遅いため、この方法では、細菌が視覚的に確認可能なコロニーにまで増殖するのに通常３〜５日間の培養時間を要し、即ち汚染状況の把握に長時間を要するという問題がある。
【０００６】
そこで、迅速な細菌検出方法としてPCRを行うことが考えられる。乳酸菌をPCR法で検出するためのプライマーとしては、特許文献１、２又は３に記載のプライマーが知られている。しかし、これらは特定の乳酸菌の16SrRNA遺伝子に由来するＤＮＡを認識できるプライマーであり、低pH食品の汚染菌として問題となる酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の有無を一度に検出できるものではない。
【０００７】
一方、広範囲な細菌を一度に検出できるプライマーとして非特許文献１又は２に記載されたプライマーが知られている。しかし、これらはいずれも細菌一般、グラム陽性菌又はグラム陰性菌のように極めて広範囲の細菌種を対象としているため、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌に汚染されているか否かの判断には用い難い。しかもこれらのプライマーは植物のクロロプラストのＤＮＡも認識するため、食品の検査には使用し難い（本明細書の表１参照）。
【０００８】
【特許文献１】
特開平07-289295号公報（段落0029、0031等）
【０００９】
【特許文献２】
特開平11-151097号公報（段落0060、配列１〜21等）
【００１０】
【特許文献３】
特開2003-255号公報（請求項１、請求項２、段落0055等）
【００１１】
【非特許文献１】
J. Dent. Res. 78:850-856（1999）Rupf, S., K. Merte, and K. Eschrich；Qu    antification of  bacteria in oral samples by competitive polymerase     chain reaction. （第851頁等）
【００１２】
【非特許文献２】
J. Clin. Microbiol. 37:464-466(1999),Klausegger, A., M. Hell, A. Berger, K. Zinober, S. Baier, N. Jones, W. Sperl, and B. Kofler； Gram type-specific broad-range PCR amplification for rapid detection of 62 pathogenic bacteria. （第464〜465頁等）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できるPCR用プライマーセット及び酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できる方法を提供することを主目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の16SrRNA遺伝子の塩基配列を確認し、また公共のDNAデータベースに収録されているその他の細菌の16SrRNA遺伝子、細菌以外の原生生物の16SrRNA遺伝子、食品中に含まれる植物又は動物のミトコンドリアの16SrRNA遺伝子、植物のクロロプラストの16SrRNA遺伝子を確認し、さらにこれらの遺伝子のアラインメント解析を行うことにより、以下の知見を得た。
▲１▼  酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌は、特徴的な塩基配列として、16SrRNAをコードするDNA（16SrDNA）分子中に配列番号３の塩基配列（5'-CTTGAGTGCAGAAGAGGAC-3'）及び配列番号４の塩基配列(5'-GAGGGTTTCCGCCCTTCA-3')を有する。この配列は、酢酸耐性乳酸菌群及びこれに類縁のラクトバチルス属に属する一部細菌の16SrRNAに特異的な塩基配列であり、ラクトバチルス属細菌以外の細菌、その他の原生生物、植物、動物等には実質的に存在しない。従って、配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を有するDNAの２本鎖を認識して増幅できるPCRプライマーセットを用いることにより、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を検出でき、さらにラクトバチルス属細菌中の酢酸耐性乳酸菌群の類縁細菌を特異的に検出できる。
▲２▼  配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を有するDNAを認識して増幅できるプライマーセットとしては、配列番号１の塩基配列(5'- CTTGAGTGCAGAAGAGGAC-3')からなるプライマーと他のプライマーとのセット、配列番号２の塩基配列(5'-TGAAGTGCGGAAACCCTC-3')からなるプライマーと他のプライマーとのセット、好ましくは、配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基配列からなるプライマーとのセットが挙げられる。
【００１５】
配列番号１の塩基配列からなるプライマーは、配列番号３に相補的な配列部分にハイブリダイズでき、配列番号２の塩基配列からなるプライマーは、配列番号４の配列部分にハイブリダイズできるものである。
【００１６】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下のプライマーセット、プライマー及び細菌の検出方法を提供する。
【００１７】
項１．  所定条件のPCRに供されることにより酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の16SrRNA遺伝子を検出可能に増幅するが、同じ条件のPCRに供されることにより、実質的にラクトバチルス属細菌以外の生物の16SrRNA遺伝子を検出可能に増幅しないプライマーセット。
【００１８】
項２．  細菌のDNA分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むDNAを特異的に検出可能に増幅するプライマーセット。
【００１９】
項３．  所定条件のPCRに供されることにより、実質的に、細菌のDNA分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むDNAを検出可能に増幅するが、同じ条件のPCRに供されることにより、実質的に、分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含まないDNAを検出可能に増幅しないプライマーセット。
【００２０】
項４．  以下の(1)又は(2)のプライマーと(3)又は(4)のプライマーとからなるプライマーセット。
(1)  配列番号１における塩基番号10〜19の塩基配列、塩基番号９〜19の塩基配列、塩基番号８〜19の塩基配列、塩基番号７〜19の塩基配列、塩基番号６〜19の塩基配列、塩基番号５〜19の塩基配列、塩基番号４〜19の塩基配列、塩基番号３〜19の塩基配列、塩基番号２〜19の塩基配列、又は、塩基番号１〜19の塩基配列からなるプライマー。
(2)  配列番号１における塩基番号10〜19の塩基配列、塩基番号９〜19の塩基配列、塩基番号８〜19の塩基配列、塩基番号７〜19の塩基配列、塩基番号６〜19の塩基配列、塩基番号５〜19の塩基配列、塩基番号４〜19の塩基配列、塩基番号３〜19の塩基配列、塩基番号２〜19の塩基配列、又は、塩基番号１〜19の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー。
(3)  配列番号２における塩基番号９〜18の塩基配列、塩基番号８〜18の塩基配列、塩基番号７〜18の塩基配列、塩基番号６〜18の塩基配列、塩基番号５〜18の塩基配列、塩基番号４〜18の塩基配列、塩基番号３〜18の塩基配列、塩基番号２〜18の塩基配列、又は、塩基番号１〜18の塩基配列からなるプライマー。
(4)  配列番号２における塩基番号９〜18の塩基配列、塩基番号８〜18の塩基配列、塩基番号７〜18の塩基配列、塩基番号６〜18の塩基配列、塩基番号５〜18の塩基配列、塩基番号４〜18の塩基配列、塩基番号３〜18の塩基配列、塩基番号２〜18の塩基配列、又は、塩基番号１〜18の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー。
【００２１】
項５．  以下の(1)又は(2)のプライマー。
(1)  配列番号１における塩基番号10〜19の塩基配列、塩基番号９〜19の塩基配列、塩基番号８〜19の塩基配列、塩基番号７〜19の塩基配列、塩基番号６〜19の塩基配列、塩基番号５〜19の塩基配列、塩基番号４〜19の塩基配列、塩基番号３〜19の塩基配列、塩基番号２〜19の塩基配列、又は、塩基番号１〜19の塩基配列からなるプライマー。
(2)  配列番号１における塩基番号10〜19の塩基配列、塩基番号９〜19の塩基配列、塩基番号８〜19の塩基配列、塩基番号７〜19の塩基配列、塩基番号６〜19の塩基配列、塩基番号５〜19の塩基配列、塩基番号４〜19の塩基配列、塩基番号３〜19の塩基配列、塩基番号２〜19の塩基配列、又は、塩基番号１〜19の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー。
【００２２】
項６．  以下の(3)又は(4)のプライマー。
【００２３】
(3)  配列番号２における塩基番号９〜18の塩基配列、塩基番号８〜18の塩基配列、塩基番号７〜18の塩基配列、塩基番号６〜18の塩基配列、塩基番号５〜18の塩基配列、塩基番号４〜18の塩基配列、塩基番号３〜18の塩基配列、塩基番号２〜18の塩基配列、又は、塩基番号１〜18の塩基配列からなるプライマー。
(4)  配列番号２における塩基番号９〜18の塩基配列、塩基番号８〜18の塩基配列、塩基番号７〜18の塩基配列、塩基番号６〜18の塩基配列、塩基番号５〜18の塩基配列、塩基番号４〜18の塩基配列、塩基番号３〜18の塩基配列、塩基番号２〜18の塩基配列、又は、塩基番号１〜18の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー。
【００２４】
項７．  (i)被験食品に含まれるDNAを抽出する工程と、(ii)このDNAを鋳型として項１から４のいずれかに記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、
(iii)  DNA増幅の有無を検出する工程と
を含む細菌の検出方法。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
(I)プライマー・プライマーセット
本発明のプライマーセットは、所定条件のPCRに供されることにより酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の16SrRNA遺伝子（16SrRNAをコードするDNA）を検出可能に増幅するが、同じ条件のPCRに供されることにより、実質的にラクトバチルス属細菌以外の生物の16SrRNA遺伝子を検出可能に増幅しないプライマーセットである。
【００２６】
本発明において、「16SrRNA遺伝子を検出可能に増幅する」とは、16SrRNA遺伝子の全配列又はその部分配列を、何らかの手段で検出可能な程度までPCRにより増幅することを意味する。
【００２７】
本発明において、「酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌」とは、ラクトバチルスフラクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバチルスブレビス（L. brevis）、ラクトバチルスブチェネリ（L. buchneri）、ラクトバチルスプランタラム（L. plantarum）及びラクトバチルスパラカゼイ（L. paracasei）をいう。
【００２８】
本発明のプライマーセットは、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の他に、酢酸耐性乳酸菌群に類縁のラクトバチルス属細菌の全て又は一部を検出可能に増幅するものであってもよい。
【００２９】
「酢酸耐性乳酸菌群に類縁の細菌」とは、酢酸耐性乳酸菌群と同様にラクトバチルス属に属し、酢酸耐性乳酸菌群に分子系統樹上極めて近く、酢酸耐性乳酸菌群と同様に低ｐH下での増殖が可能で、場合によっては低ｐHの食品において、酢酸耐性乳酸菌群と同様に食品の腐敗、汚染の原因となる可能性を有する菌である。
【００３０】
また、実質的にラクトバチルス属細菌以外の生物の16SrRNA遺伝子を検出可能に増幅しないことには、ラクトバチルス属細菌以外の全ての生物の16SrRNA遺伝子を検出可能に増幅しない場合だけでなく、例外的にラクトバチルス属細菌以外の数種の生物の16SrRNA遺伝子を検出可能に増幅する場合も含まれる。
【００３１】
前記の所定条件は通常PCRにおいて採用される条件であればよいが、例えば、変性を85〜99℃程度で30秒間〜15分間程度まで、アニーリングを50〜68℃程度で5秒間〜1分間程度行い、DNA伸長を68〜75℃程度で10秒間〜1分間程度行い、反応液中のMgイオン濃度を1〜4mM程度とする条件が挙げられる。
【００３２】
ラクトバチルス属細菌の中の酢酸耐性乳酸菌及びその類縁細菌の16SrRNA遺伝子には、そのDNA分子中に配列番号３の塩基配列（5'-CTTGAGTGCAGAAGAGGAC-3'）及び配列番号４の塩基配列(5'-GAGGGTTTCCGCCCTTCA-3')が特異的に含まれている。特に酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の16SrRNA遺伝子には、そのDNA分子中に上記２配列が含まれている。従って、本発明のプライマーセットは、換言すれば、配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むDNAを特異的に検出可能に増幅するものといえる。
【００３３】
また上記２配列は、ラクトバチルス属細菌以外の生物種には、実質的に見出されない。従って、本発明のプライマーセットは、所定条件のPCRに供されることにより、実質的に、１分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むDNAを検出可能に増幅するが、同じ条件のPCRに供されることにより、実質的に、１分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含まないDNAを検出可能に増幅しないプライマーセットと表現することもできる。
【００３４】
前述したように、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌は、主に低pH食品を汚染して風味の低下や食品の密閉包装容器の膨張等を引き起こす点で問題になっている危機管理の対象細菌群である。従って、これらの酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を一度に必ず検出でき、しかも、ラクトバチルス属細菌以外の細菌、細菌以外の原生生物、食品に含まれる植物及び動物の各16SrRNA遺伝子を実質的に検出しない本発明のプライマーセットは、上記の危機管理対象菌群を精度よく検出できる、優れたプライマーセットである。
プライマーセットの具体例
本発明におけるプライマーの塩基配列には、その塩基配列及びその塩基配列において１〜３個程度の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列が含まれる。
【００３５】
本発明のプライマーとしては、代表的には、以下の(1)若しくは(2)のプライマー、又は、(3)若しくは(4)のプライマーが挙げられる。(1)及び(2)のプライマーは、前述した配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列を認識できるプライマーであり、(3)及び(4)のプライマーは、前述した配列番号４の塩基配列を認識できるプライマーである。
(1)  配列番号１(5'- CTTGAGTGCAGAAGAGGAC-3')における塩基番号10〜19の塩基配列、塩基番号９〜19の塩基配列、塩基番号８〜19の塩基配列、塩基番号７〜19の塩基配列、塩基番号６〜19の塩基配列、塩基番号５〜19の塩基配列、塩基番号４〜19の塩基配列、塩基番号３〜19の塩基配列、塩基番号２〜19の塩基配列、又は、塩基番号１〜19の塩基配列からなるプライマー。
(2)  配列番号１における塩基番号10〜19の塩基配列、塩基番号９〜19の塩基配列、塩基番号８〜19の塩基配列、塩基番号７〜19の塩基配列、塩基番号６〜19の塩基配列、塩基番号５〜19の塩基配列、塩基番号４〜19の塩基配列、塩基番号３〜19の塩基配列、塩基番号２〜19の塩基配列、又は、塩基番号１〜19の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー。
【００３６】
(2)のプライマーは、前記列記したいずれかの塩基配列の5'末端側に任意の塩基配列を有し、全体として最大30塩基までの長さのDNAからなるものである。(2)のプライマーにおいて、5'末端側に付加されて存在することがある前記任意の塩基配列は、１〜６個程度の塩基からなることが好ましい。この任意の塩基配列は付加されていないのが最も好ましい。
【００３７】
(1)又は(2)のプライマーの中では、塩基番号３〜19の塩基配列からなるプライマー、塩基番号２〜19の塩基配列からなるプライマー、若しくは、塩基番号１〜19の塩基配列からなるプライマー、又は、これらの塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーが好ましく、塩基番号１〜19の塩基配列からなるプライマーがより好ましい。
(3)  配列番号２(5'-TGAAGTGCGGAAACCCTC-3')における塩基番号９〜18の塩基配列、塩基番号８〜18の塩基配列、塩基番号７〜18の塩基配列、塩基番号６〜18の塩基配列、塩基番号５〜18の塩基配列、塩基番号４〜18の塩基配列、塩基番号３〜18の塩基配列、塩基番号２〜18の塩基配列、又は、塩基番号１〜18の塩基配列からなるプライマー。
(4)  配列番号２における塩基番号９〜18の塩基配列、塩基番号８〜18の塩基配列、塩基番号７〜18の塩基配列、塩基番号６〜18の塩基配列、塩基番号５〜18の塩基配列、塩基番号４〜18の塩基配列、塩基番号３〜18の塩基配列、塩基番号２〜18の塩基配列、又は、塩基番号１〜18の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー。
【００３８】
(4)のプライマーは、前記列記したいずれかの塩基配列の5'末端側に任意の塩基配列を有し、全体として最大30塩基までの長さのDNAからなるものである。(4)のプライマーにおいて、5'末端側に付加されて存在することがある前記任意の塩基配列は、１〜６個程度が好ましい。この任意の塩基配列は付加されていないのが最も好ましい。
【００３９】
(3)又は(4)のプライマーの中では、塩基番号３〜18の塩基配列からなるプライマー、塩基番号２〜18の塩基配列からなるプライマー、若しくは、塩基番号１〜18の塩基配列からなるプライマー、又は、これらの塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーが好ましく、塩基番号１〜18の塩基配列からなるプライマーがより好ましい。
【００４０】
本発明のプライマーセットとしては、代表的には(1)又は(2)のプライマーと(3)又は(4)のプライマーとの組み合わせが挙げられる。
【００４１】
(1)又は(2)のプライマーと(3)又は(4)のプライマーとの組み合わせは、特に限定されずどのような組み合わせであってもよいが、配列番号１の塩基番号１〜19の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基番号１〜18の塩基配列からなるプライマーとの組み合わせが最も好ましい。
製造方法
本発明のプライマーセットの各プライマーは、その塩基配列に基づき常法に従って合成することができる。また、プライマー合成メーカー（例えばサワディーテクノロジー社）から購入することもできる。
(II)細菌の検出方法
基本的構成
本発明の細菌の検出方法は、(i)被験食品に含まれるDNAを抽出する工程と、(ii)このDNAを鋳型として上記説明した本発明のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、(iii)  DNA増幅の有無を検出する工程と
を含む方法である。
対象食品
本発明方法の対象となる被験食品は、酢酸耐性乳酸菌に汚染し得る食品である限り特に限定されない。被験食品には加工食品の他にその原材料も含まれる。特に、酢酸耐性乳酸菌の増殖が問題となる食品が対象として好適である。このような食品として、例えば、マヨネーズ、ケチャップ、ドレッシング、醤油、つゆ、ウスターソース、中濃ソース、みりん、ウインナーソーセージ、ロングライフ牛乳等及びこれらの原材料が挙げられる。
【００４２】
DNA抽出工程
本発明においては、食品から分離培養した細菌からDNAを抽出してもよいが、食品から直接DNAを抽出することもできる。
【００４３】
被験食品からのDNAの調製方法は公知の方法を採用すればよい。例えば、被験食品に市販の界面活性剤を加え、８０〜１００℃程度で１〜１５分間程度加熱した後、冷却し、次いで遠心分離して上清を採取することによりDNAを含有する試料を調製することができる。被験食品から調製されたDNA含有試料には、食品に細菌が含まれている場合には細菌16SｒRNA遺伝子が含まれており、その他各種RNA、DNA及びタンパク質等が含まれる。従って、この試料を常法に従って精製してDNAを含む画分を得てもよい。
【００４４】
死菌がPCRの結果に影響を与えると考えられる場合や、得られる菌数が少なすぎるために十分量のDNAを得ることができないが酢酸耐性乳酸菌の検出感度を高めたい場合には、例えば以下の方法でDNAを抽出すればよい。先ず、MRA培養液（日水製薬）のようなラクトバチルス属細菌の選択培地を塩酸等でpH6.0程度に調整し、この選択培地で被験食品を２０〜３０℃程度で培養する。培養時間は、被験食品中に存在する細菌数によっても異なるが、通常１２〜３６時間程度とすればよい。培養液を50〜300×g程度で遠心分離し、得られる上清をさらに、2000〜14000×g程度で遠心分離する。被験食品に細菌が含まれていれば、得られる沈殿には通常細菌が含まれる。この沈殿を10%キレックス液［10%(W/V)キレックス（バイオラッド社）、10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、pH 8.0］200μL中に懸濁後、ヒートブロックを用いて100℃前後で５分間程度加熱することにより溶解し、細菌溶解物を2000〜14000×g程度で遠心分離した上清を採取することによりDNA含有試料を調製することができる。
【００４５】
食品の種類によっても異なるが、食品１ｇ当たり10〜20cfu程度の酢酸耐性乳酸菌が含まれていれば、被験食品を上記のようにして24時間程度培養することにより、PCRにより酢酸耐性乳酸菌由来のDNAを検出できる。
【００４６】
食品１ｇ当たりに含まれる酢酸耐性乳酸菌の数が10cfu未満の場合の検査等で、さらに、検出感度を高くしたい場合は、被験食品量を増やしたり、培養時間を延長させたりすればよい。
【００４７】
PCR工程
PCRを行うにあたっては、上記説明した本発明のプライマーセットを用いる。具体的には、(1)又は(2)のプライマーと(3)又は(4)のプライマーとのセット、特に、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとのセットを用いることが好ましい。
【００４８】
PCR条件は特に限定されず、PCR装置毎に最適条件を定めればよいが、例えば、リアルタイムPCR装置の場合、以下の条件が挙げられる。
反応液：例えば、PCR反応用のキットであるTakara Ex TaqTM R-PCR Version （Takara Bio社、Otsu、Japan）のようなリアルタイムPCR専用のPCR反応液を用いる。
PCRサイクル条件：
・２本鎖DNAの熱変性：９５℃で５秒間
・プライマーの一本鎖DNAへのアニーリング：６６℃で１０秒間
・DNA伸長：７２℃で２０秒間
この反応を通常３０〜３５サイクル程度行うことにより、目的DNAを検出可能な程度に増幅することができる。
【００４９】
PCR装置としては、ブロックタイプ、リアルタイムPCRタイプ等の市販の装置を使用できる。迅速にDNAを増幅するためにはキャピラリータイプのリアルタイムPCR装置を用いることが好ましい。
【００５０】
DNA増幅の確認工程
DNA増幅の有無の確認は、通常、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、サイバーグリーンIなどで核酸染色することにより行える。また、リアルタイムPCR装置を用いてPCRを行う場合は、その装置の検出システムにより自動的に短時間でDNA増幅の有無が確認される。例えば、PCR反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合では、サイバーグリーンIが二本鎖DNAに結合したときに発する蛍光値から増幅産物量をサイクル毎にモニター可能であり、さらに、PCR後に融解曲線分析を行うことによりPCR増幅産物が目的の増幅産物であるかどうかを確認できる。判断が困難な場合は、増幅産物の大きさをアガロースゲル電気泳動により確認すればよい。
【００５１】
PCRによりPCR産物が検出される場合は、酢酸耐性乳酸菌が被験食品に存在していたと判定できる。またPCR産物が検出されない場合は、酢酸耐性乳酸菌は被験食品に存在していなかったと判定できる。酢酸耐性乳酸菌が存在する場合は、アガロースゲル電気泳動により、203塩基対程度の大きさのバンドが検出される。
【００５２】
被験食品の酢酸耐性乳酸菌による汚染の有無をさらに精度よく判定する必要がある場合には、PCR増幅断片が酢酸耐性乳酸菌の16S rRNA遺伝子に由来するものであることを確認することがより好ましい。
【００５３】
確認方法としては、例えばPCR増幅断片を制限酵素で処理して得られるDNA断片について制限断片長多型解析を行う方法が挙げられる。この際使用する制限酵素はPCR増幅断片を切断し制限断片長多型を示し得るものであれば特に限定されない。制限酵素は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できるが、２種以上を組み合わせて使用することが望ましい。制限断片長多型は、例えば、アガロース電気泳動やサザンブロット法により検出することができる。
【００５４】
また、PCR増幅断片の塩基配列を常法により決定し、その塩基配列を公共のDNAデータベースの塩基配列と比較することによっても、PCR増幅断片が酢酸耐性乳酸菌の16S rRNA遺伝子に由来するものであることを確認することができる。
【００５５】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び試験例を示して詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５６】
実施例１（酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の標準菌株に対する検出感度の確認）
Lactobacillus casei JCM 1134T株及びLactobacillus fructivorans JCM 1117T株をそれぞれMRS液体培地（pH6.0）を用いて培養した。各菌株の培養液からPUREGENE DNA Isolation Kit （Gentra社、Minneapolis、USA）を用いて、DNA溶液を調整した。各菌株のDNA量を測定し、各菌株のゲノムの分子量を3.0Mbpと概算してゲノムのコピー数を２コピー／μL程度、２０コピー／μL程度、２×１０2コピー／μL程度、２×１０3コピー／μL程度及び２×１０4コピー／μL程度にした被験DNA溶液をそれぞれ調整した。
【００５７】
一方、配列番号１及び配列番号２の各DNAプライマーをDNA合成機を用いて合成した。上記各被験DNA溶液１μLをPCR反応用のキットであるTakara Ex TaqTM R-PCR Version （Takara Bio社、Otsu、Japan）の説明書に従って調整して総量20μLのPCR反応液を調整した。すなわち、2μLの10×R-PCR Buffer(Mg2+free)、0.16μLの250mM Mg2+Solution for R-PCR、0.4μLのdNTP Mixture(各10mM)、0.2μL のTaKara EX TaqTM R-PCR(5units/μL)、0.8μLの0.125% SYBRTM GreenI (Fmc Bioproducts社、Rockland、USA)、1.0μLのDNAプライマー液（配列番号１のDNAプライマー及び配列番号２のDNAプライマーを各々5μM含有）及び16.44μLの蒸留水を含む19μLの調整液に、被験DNA溶液１μLを加えて20μLにしたPCR反応液を調整した。
【００５８】
PCRはロシュ・ダイアグノスティックス社のLightCyclerを用いて次のように行った。すなわち、初期変性を95℃で１分間行った後、95℃で5秒間、66℃で10秒間、及び72℃で20秒間、蛍光測定（PCRによる増幅産物の測定）を1サイクルとし、これを35サイクル行い、続いて増幅産物の融解曲線分析のために、97℃で0秒、60℃で10秒後、0.2℃/秒の速度で97℃まで昇温させると同時に連続的に蛍光測定により各温度に対する増幅産物の二本鎖DNA量を測定し、最後に40℃まで降温させた。
【００５９】
PCR終了後、融解曲線解析を同PCR装置上のソフトウェアで行い、増幅産物のTm値を求めることで特異的な増幅産物の有無を判定した。さらに、Mupidミニゲル泳動槽（ADVANCE社）を用いて1.8%アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認することにより、増幅産物の有無を確認した。
【００６０】
PCR後の反応液を電気泳動した後のゲルを図１に示す。レーン１〜５はLactobacillus fructivorans JCM 1117T株を示し、図１のレーン６〜１０はLactobacillus casei JCM 1134Tを示す。レーンMはDNA分子量マーカーを、レーンBはネガティブコントロールを示す。
【００６１】
図１の結果から、配列番号１のDNAプライマーと配列番号２のDNAプライマーとをセットで使用することにより、反応液中に2〜20コピー程度のゲノムDNAが存在すれば前記のPCR条件でLactobacillus fructivorans JCM 1117T株やLactobacillus casei JCM 1134T株DNAを検出できることが確認された。
【００６２】
Lactobacillus brevis JCM 1059T株、Lactobacillus buchneri JCM 1115T株、Lactobacillus plantarum  JCM 1149T株及びLactobacillus paracasei JCM 8130T株について同様にしてゲノムDNAコピー数を変化させてPCRを行ったところ、いずれの菌種のDNAにおいても、2〜20コピー程度のゲノムDNAが存在すれば、同様に検出できることが確認された。
【００６３】
実施例２（酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の標準菌株に対する反応性の確認）
実施例１と同様にしてLactobacillus fructivorans JCM 1117T株、Lactobacillus casei JCM 1134T株、Lactobacillus brevis JCM 1059T株、Lactobacillus buchneri JCM 1115T株、Lactobacillus plantarum  JCM 1149T株及びLactobacillus paracasei JCM 8130T株のDNA溶液を調整し、ゲノムのコピー数が２×１０4コピー／μL程度の被験DNA溶液をそれぞれ調整した。
【００６４】
これらの各菌株のDNAに対する配列番号１のDNAプライマーと配列番号２のDNAプライマーとのプライマーセットの反応性を調べるために、上記の各被験DNA溶液１μLに対する同DNAプライマーセットを用いたPCRを実施例１と同様にして実施した。PCR増幅産物の有無を、実施例１と同様にしてアガロースゲルによる電気泳動で確認した。
【００６５】
PCR後の反応液を電気泳動した後のゲルを図２に示す。図２のレ−ン１〜６はそれぞれLactobacillus casei JCM 1134T株、Lactobacillus fructivorans JCM 1117T株、 Lactobacillus brevis JCM 1059T株、Lactobacillus buchneri JCM 1115T株、Lactobacillus plantarum  JCM 1149T株及びLactobacillus paracasei JCM 8130T株を示す。図２から、配列番号１のDNAプライマーと配列番号２のDNAプライマーとをセットで使用することにより、上記乳酸菌（酢酸耐性乳酸菌とその類縁菌１種）６種を検出できることが確認された。
【００６６】
実施例３（酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌以外の細菌及びその他の生物由来DNAとの反応性の確認）
以下の表１に示す各細菌株及び各真菌株をそれぞれに適合する培地を用いて培養し、実施例１と同様にしてDNA溶液を調整した。各DNA溶液のDNA量を測定し、各細菌株DNAは濃度５pg/μL程度にした被験DNA溶液を調整し、各真菌株DNAは濃度1ng/μLにした被験DNA溶液を調整した。また、市販の小麦粉、トウモロコシ、ジャガイモ、ナタネ、及びダイズからDNeasy Plant Mini Kit(キアゲン社)を用いてそれぞれの植物DNAを抽出した。各DNA溶液のDNA量を測定し、小麦DNAは濃度8ng/μL程度にした被験DNA溶液を調整し、トウモロコシ、ジャガイモ、ナタネ及びダイズのDNAは濃度3ng/μL程度にした被験DNA溶液をそれぞれ調整した。また、ヒトMCF-7細胞（大日本製薬社）からDNeasy Tissue Mini Kit(キアゲン社)を用いてヒトDNAを抽出した。DNA溶液のDNA量を測定し、濃度3ng/μL程度にした被験DNA溶液を調整した。ウシ及びニワトリの精製DNAはCeMines社から購入し、サケの精製DNAはBD Bioscience Clontech社から購入した。各DNA溶液のDNA量を測定し、ウシ及びニワトリDNAは濃度3ng/μL程度にした被験DNA溶液を調整し、サケDNAは濃度1ng/μL程度にした被験DNA溶液を調整した。
【００６７】
これらの各生物のDNAに対する配列番号１のDNAプライマーと配列番号２のDNAプライマーとのプライマーセット（LA1-203）の反応性を調べるために、上記の各被験DNA溶液１μLに対する同DNAプライマーセットを用いたPCRを実施例１と同様にして実施した。PCR増幅産物の有無を、実施例１と同様にしてアガロースゲルによる電気泳動で確認した。
【００６８】
また、配列番号１及び２のプライマーセット（LA1-203）に代えて前述した非特許文献１に記載の細菌一般を検出できるプライマーセット(prbac)を用いて同様にしてPCRを行った。但し、PCRは次の反応条件に置換して実施した。すなわち、初期変性を95℃で１分間行った後、95℃で5秒間、59℃で10秒間、及び72℃で20秒間、蛍光測定（PCRによる増幅産物の測定）を1サイクルとし、これを30サイクル行った。
【００６９】
これらのPCRの結果を次の表１及び表２に示す。表中＋は電気泳動によりバンドが検出されたことを示し、マイナスはバンドが検出されなかったことを示す。
【００７０】
【表１】
0004117475.tif 000002
【００７１】
【表２】
0004117475.tif 000003
【００７２】
表１及び表２に示す結果から、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとのセットを用いたPCRにより、酢酸耐性乳酸菌５種（Lactobacillus fructivorans JCM 1117T、 Lactobacillus brevis JCM 1059T、Lactobacillus buchneri JCM 1115T、Lactobacillus plantarum  JCM 1149T及びLactobacillus paracasei JCM 8130T株）及びその類縁のLactobacillus属に属する一部細菌の16S rRNA遺伝子に由来するDNA断片を特異的に増幅できることが判明した。
【００７３】
これに対して、公知のプライマーセットであるprbacを用いた場合は、広く細菌が検出され、さらに植物から抽出されたDNAが検出された。なお、塩基配列解析の結果、植物由来のDNAからprbacによって増幅されたPCR増幅産物はクロロプラストの１６SｒRNAをコードするDNA断片であることが確認された。
【００７４】
図３は各種細菌の16S rRNA遺伝子配列に基づいて作成された分子系統樹であり、配列番号１及び配列番号２の各DNAプライマーを用いたPCRにおいて検出された各菌株を＋で示している。
【００７５】
図３から、配列番号１及び配列番号２のDNAプライマーセットを用いてPCRを行うことで、16S rRNA遺伝子配列に基づいて作成された分子系統分類上においても一群の菌群に分類可能な主要５種の酢酸耐性乳酸菌群とこれに類縁の菌群とを特異的に検出できたことがわかる。
【００７６】
実施例４（食品中の酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌16SrRNA遺伝子の検出）
一般生菌に汚染されていないことを予め確認済みの市販のマヨネーズ及び食酢に、代表的な酢酸耐性乳酸菌であるLactobacillus fructivorans JCM 1117T株を指標菌として、それぞれの食品１ｇあたり１０〜２０ｃｆｕ程度となるように添加したもの及び、無添加のものを調整した。それぞれ食品重量の９倍量のMRS液体培地（pH6.0）を加え、ストマッカーを用いて無菌的に攪拌混合した。
【００７７】
これらの食品希釈混合液10mLを15mL容の培養管に移して密栓後、３０℃で２０時間〜２８時間、静置培養した。PCRで使用するDNA溶液の調整のために、０時間、２０時間、２４時間及び２８時間後の培養液を1.3mLづつ採取した。
【００７８】
採取した培養液を１００×ｇで１分間遠心した後の上清をさらに１３，０００×ｇで５分間遠心して沈殿を得た。この沈殿を洗浄するために0.5mLのTE緩衝液（10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、pH 8.0）に懸濁後、１３，０００×ｇで５分間遠心して沈殿を得た。この沈殿に10%キレックス液［10%(W/V)キレックス（バイオラッド社）、10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、pH 8.0］200μLを加えて沈殿を懸濁後、ヒートブロックを用いて９９℃で５分間加熱し、１３，０００×ｇで３分間遠心した上清を採取した。上清中にはDNAが含まれており、PCRに使用するDNA溶液とした。
【００７９】
得られたDNA溶液1μLを試料とし、実施例１に記載されたと同様の方法でPCRを行い、PCR増幅産物の有無を確認した。アガロースゲルによる電気泳動パターンを図４に示す。
【００８０】
図４の(A)は市販マヨネーズの場合の電気泳動パターンであり、図４の(B)は市販食酢である場合の電気泳動パターンである。また、図(A)、(B)ともに、レーン１、２、３及び４は、細菌を添加せずに食品の培養時間を０、20、24及び28時間にしたサンプルである。またレーン５、６、７及び８は、食品に細菌を添加した後DNAを抽出する前の培養時間を０、20、24及び28時間にしたサンプルである。
【００８１】
図４の（Ａ）に示すように、市販マヨネーズ１ｇあたり１０〜２０ｃｆｕ程度のLactobacillus fructivorans JCM 1117T株の指標菌が存在する場合、DNA抽出前の食品培養時間を２４時間以上にすれば、前記PCRによってその細菌DNAを検出できることがわかる。また、図４の（Ｂ）に示すように、市販食酢１ｇあたり１０〜２０ｃｆｕ程度のLactobacillus fructivorans JCM 1117T株の指標菌が存在する場合、DNA抽出前の食品培養時間を２４時間以上にすれば、前記PCRによってその細菌DNAを検出できることがわかる。
【００８２】
【発明の効果】
本発明により、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できるPCR用のプライマー及び酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できる方法が提供された。
【００８３】
さらにいえば、本発明のプライマーセットを用いたPCRを行うことにより、酢酸耐性乳酸菌を一括して検出できる。具体的には、酸性食品の腐敗において問題となるLactobacillus fructivorans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus paracaseiの食品等への混入の有無を従来の寒天培養法よりもより迅速に検査することができる。
【００８４】
従って、本発明のプライマーセットは、汚染頻度が比較的低い食品を対象にした細菌検査の一次スクリーニングに好適に使用できる。すなわち、本発明のプライマーセットを用いた一次スクリーニングにより細菌が検出された場合には、食品の製造工程や製品に対する適切な措置をより迅速に執ることが出来る。また、必要に応じて、PCR増幅産物の塩基配列解析の実施や二次スクリーニングとして特定乳酸菌に特異的なプライマーセットを用いてPCRを行うことにより、菌種を同定することもできる。
【００８５】
また、従来の細菌一般を広く検出できるプライマーを使用する場合は、目的細菌以外の混入生物のDNAや食品由来のDNAまで検出されるが、本発明のプライマーを用いることにより、酢酸耐性乳酸菌を検出できるとともに、ラクトバチルス属細菌以外の混入生物由来のDNAや食品由来のDNAを実質的に検出せず、即ち高精度の検出が行える。
【００８６】
特に、本発明のプライマーは食品である植物や動物のDNAを検出しないため、食品から細菌を分離培養した上でそのDNAを抽出する必要がなく、食品から直接DNAを抽出するだけで、又は食品をおよそ２４時間培養した培養液からDNAを抽出するだけで、そのDNAをPCRに供することができる。それにより、検査時間を大幅に短縮することができる。
【００８７】
【配列表】
0004117475.tif 000004
0004117475.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】  酢酸耐性乳酸菌の検出感度を示す図である。
【図２】  配列番号１及び２のプライマーセットにより乳酸菌6種を検出できたことを示す図である。
【図３】  細菌16S rRNA 遺伝子配列に基づいた分子系統樹及び、配列番号１及び２のプライマーセットにより検出可能な細菌群を示す図である。
【図４】  被験食品の培養時間と酢酸耐性乳酸菌の検出の有無との関係を示す図である。（Ａ）は市販マヨネーズ、（Ｂ）は市販食酢の結果を示す。
【図１】
0004117475.tif 000006
【図２】
0004117475.tif 000007
【図３】
0004117475.tif 000008
【図４】
0004117475.tif 000009