(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、イサチン除去活性を有する酵素をコードする単離ＤＮＡ断片。
【請求項２】
イサチン除去活性を有する酵素をコードする単離ＤＮＡ断片であって、前記酵素が配列番号２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする単離ＤＮＡ断片。
【請求項３】
請求の範囲第１または２項記載のＤＮＡ断片を含む発現ベクター。
【請求項４】
請求の範囲第１または２項記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
適切な宿主微生物内でインジゴを産生する方法であって、前記宿主微生物中に、イサチン除去酵素をコードするＤＮＡ断片を導入する工程、および該微生物をインドキシルの蓄積を促進する条件下で培養する工程を含み、前記イサチン除去酵素をコードするＤＮＡ断片が、配列番号１の配列からなるＤＮＡ断片であることを特徴とする方法。
【請求項６】
前記イサチン除去酵素をコードするＤＮＡ断片が、前記微生物の染色体内に組み込まれていることを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項７】
前記イサチン除去酵素をコードするＤＮＡ断片が、適切な条件下で該ＤＮＡ断片中に含まれる遺伝子の発現を導くことができる一つ以上の染色体外因子内に含まれていることを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項８】
前記適切な宿主微生物が、インジゴをグルコースから産生するのに必要とされる内因性または外因性ＤＮＡを含み、
前記内因性または外因性ＤＮＡが、インドールをインドキシルに転化できるオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片、および、インドールの産生および蓄積を促進するように修飾されたトリプトファンオペロンをコードするＤＮＡ断片またはトリプトファンをインドールに転化できる酵素をコードするＤＮＡ断片の少なくとも一方からなる群より選択される
ことを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項９】
前記イサチン除去酵素をコードするＤＮＡ断片、インドールをインドキシルに転化できるオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片、および、インドールの産生および蓄積を促進するように修飾されたトリプトファンオペロンをコードするＤＮＡ断片またはトリプトファンをインドールに転化できる酵素をコードするＤＮＡ断片の少なくとも一方が、前記微生物の染色体内に組み込まれていることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１０】
前記イサチン除去酵素をコードするＤＮＡ断片、インドールをインドキシルに転化できるオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片、および、インドールの産生および蓄積を促進するように修飾されたトリプトファンオペロンをコードするＤＮＡ断片またはトリプトファンをインドールに転化できる酵素をコードするＤＮＡ断片の少なくとも一方が、適切な条件下で該ＤＮＡ内に含まれる遺伝子の発現を導くことのできる一つ以上の染色体外因子内に含まれていることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１１】
前記オキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片が、芳香族ジオキシゲナーゼまたは芳香族モノオキシゲナーゼをコードすることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１２】
前記インドールの産生および蓄積を促進するように修飾されたトリプトファンオペロンをコードするＤＮＡ断片が、インドールを蓄積できるトリプトファンシンターゼ突然変異を含むことを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１３】
前記トリプトファンシンターゼ突然変異がｔｒｐＢ３８２であることを特徴とする請求の範囲第12項記載の方法。
【請求項１４】
前記適切な宿主微生物が、トリプトファンからインジゴを産生するのに必要とされる内因性または外因性ＤＮＡを含み、
前記内因性または外因性ＤＮＡが、トリプトファンをインドールに転化できる酵素をコードする
ことを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項１５】
前記内因性または外因性ＤＮＡが、トリプトファナーゼ酵素をコードすることを特徴とする請求の範囲第14項記載の方法。
【請求項１６】
前記内因性または外因性ＤＮＡが、前記微生物の染色体内に組み込まれていることを特徴とする請求の範囲第14項記載の方法。
【請求項１７】
前記内因性または外因性ＤＮＡが、適切な条件で該ＤＮＡ内に含まれる遺伝子の発現を導くことのできる一つ以上の染色体外因子内に含まれていることを特徴とする請求の範囲第14項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、微生物から染料、特にインジゴを生合成により産生することに関するものである。インドールおよびトリプトファン（両者ともインジゴの前駆体）の生合成的産生が以前に記載されているが、本発明は、インジゴの合成における抑制化合物であるイサチンがそれにより減少した、または発酵培養液から除去された、商業的に実行可能性のある効率的な生合成的産生系を提供する。インジゴの産生中に抑制化合物を除去することにより、所望の最終生成物であるインジゴの産生が向上するおよび／またはそのように産生したインジゴの特性が改良される。さらに、本発明により、生合成的なインジゴ産生の副生成物である赤染料のインジルビンの産生を防ぐかまたは減少させる。
発明の背景
青染料であるインジゴは、人間に知られた最も古い染料の内の一つである。その織物染料としての用途は、少なくとも紀元前2000年まで遡る。1800年代後半まで、インジゴまたはインジゴチンは主に、アフリカ、アジア、東インドおよび南アメリカに広く分布する、インジゴフェラ（Indigifera）属の植物から得られていた。1800年代に産業革命がヨーロッパおよび北アメリカ中に広がるにつれ、この染料の鮮やかな青色の需要により、ヨーロッパと極東との間の貿易の主要品目の内の一つとして青色染料が発展した。1883年に、アルフレッド・フォン・バイエル（Alfred von Baeyer）がインジゴの化学式Ｃ16Ｈ10Ｎ2Ｏ2を同定した。1887年には、インジゴの最初の商業的な化学的製造方法が開発された。この方法は、今日まで使用されており、苛性ソーダおよびソーダミド（sodamido）の混合物中にナトリウムフェニルグリシネートを溶融させて、インドキシルを製造することを含んでいる。この方法の最終生成物であるインドキシルは、空気に曝されると、自発的にインジゴに酸化された。
インジゴを製造する現在の商業的な化学的工程により、毒性のある廃棄物が大量に製造されてしまう。毒性のある副生成物を製造せずにインジゴを製造できる方法が望まれていることは明らかである。毒性の副生成物がそれほど製造されない方法の一つに、微生物によるインジゴの生合成がある。
エンスレイ（Ensley）等［（1983）Science 222:167-169］は、土壌細菌スードモナスプチダ（Pseudomonas putida）から単離された伝染性プラスミドからのＤＮＡ断片により、この断片を収容するプラスミドで安定に形質転換された大腸菌が、インドールまたはトリプトファンの存在下でインジゴを合成できることを発見した。エンスレイ等は、媒質の補助物質として添加されたかまたはトリプトファンの酵素的な異化作用の結果として産生されたインドールは、スードモナスプチダＤＮＡ断片によりコード化された、以前に同定された多成分酵素であるナフタレンジオキシゲナーゼ（ＮＤＯ）によって、シス−インドール−２，３−ジヒドロジオールおよびインドキシルに転化されると仮定した。次いで、このように産生されたインドキシルを空気に曝すことによりインジゴに酸化した。エンスレイ等により記載されたジオキシゲナーゼは、ここにさらに記載するように、インジゴの産生に有用な好ましいオキシゲナーゼである。
ＮＤＯは、芳香族炭化水素であるナフタレンの（＋）−シス−（１Ｒ，２Ｓ）−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロナフタレンへの酸化を触発することが以前に知られている［Ensley等（1982）J.Bacteriol. 149:948-954］。ここに引用する米国特許第4,520,103号には、ＮＤＯのような芳香族ジオキシゲナーゼ酵素による、インドールからのインジゴの微生物産生が記載されている。ＮＤＯ酵素は多数の成分からなる：レダクターゼポリペプチド（Ｒｄ、約37,000ダルトン（37ｋＤ）の分子量）；鉄−硫黄フェレドキシン（ferredoxin）ポリペプチド（Ｆｄ、約13ｋＤの分子量）；および末端オキシゲナーゼ鉄−硫黄タンパク質（ＩＳＰ）。ＩＳＰ自体は、α2β2サブユニット構造（おおよそのサブユニット分子量：α、55ｋＤ；β、21ｋＤ）を有する四つのサブユニットからなる。ＩＳＰは、ナフタレンと結合し、そして、ＮＡＤＨ、Ｒｄ、Ｆｄおよび酸素の存在下においては、ナフタレンをシス−ナフタレン−ジヒドロジオールに酸化することが知られている。Ｆｄは、このナフタレン酸化触媒作用においては律速ポリペプチドであると考えられている（様々なＮＤＯサブユニットおよびインジゴ生合成の目的のためにそれらを改良する方法の徹底的な議論に関して、ここに引用する米国特許第5,173,425号を参照のこと）。
さらに、ＮＤＯ以外の芳香族ジオキシゲナーゼもまたインジゴの生合成による産生に有用であるかもしれない。例えば、トルエンを分解できる、スードモナス（P.mendocina）からの芳香族ジオキシゲナーゼのようなトルエンモノオキシゲナーゼ（ＴＭＯ）もまた、培地にインドールが補われたときにインジゴを産生できた。詳細に関しては、ここに引用する米国特許第5,017,495号を参照のこと。原則として、ヒドロキシ成分をインドールの３位置に導入して、インドキシルを形成できるどのような酵素も、インジゴの生合成による産生に使用する候補である。
微生物は、芳香族アミノ酸であるＬ−トリプトファンを含む、20の必須アミノ酸の産生に関する生合成経路を含有することが長い間知られている。芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）の新規合成は、コリスミ酸を形成するときに共通の経路を共有する。コリスミ酸の合成後、三つの芳香族アミノ酸の各々に関する特定の経路を用いてそれらの合成を完了する。
コリスミ酸からのトリプトファンの細菌生合成（特に大腸菌において）は、トリプトファン（trp）オペロンの制御下にある。調節領域およびいくつかの構造遺伝子からなる、（trp）オペロンは、その複雑で協調した調節システムのために、広く研究されてきた。大腸菌trpオペロンの調節および構造の構築が、オペロンの構造遺伝子によりコード化された触媒活性とともに、ここに引用するPCT/US93/09433の図１に示されている。PCT/US93/09433には、Ｌ−セリンと協同した、インドール−３’−グリセロール−ホスフェート（ＩｎＧＰ）のＬ−トリプトファンへの転化に特に関係するといった点で、インドールの細胞内産生の改良が記載されている。この反応は、マルチサブユニット酵素であるトリプトファンシンターゼにより触発される。反応の最中に、インドールが中間体として産生される。しかしながら、インドールは、化学量論的様式でＬ−セリンと非常に急速に結合して、Ｌ−トリプトファンを産生する。したがって、このＩｎＧＰとＬ−セリンのトリプトファンへの転化の結果として、遊離したインドールは全く産生されない。
しかしながら、ヤノフスキー（Yanofsky）等［（1958）Biochim.Biophys.Acta. 28:640-641］は、インドールを蓄積したトリプトファンシンターゼ突然変異体を同定した。しかしながら、この特別なトリプトファンシンターゼ突然変異体はトリプトファンシンターゼのβサブユニットに関する遺伝子暗号における一つのヌクレオチド塩基対が変化したことにより生じたので、この突然変異体には野生型表現型への自発的逆突然変異が施された。
PCT/US93/09433には、高レベルの細胞内インドールを産生できる安定なトリプトファンシンターゼ突然変異体を産生する方法が記載されている。このようなインドールを蓄積するトリプトファンシンターゼ突然変異体がＮＤＯのような芳香族ジオキシゲナーゼ酵素を発現する場合、蓄積されたインドールはインドキシルに転化されるかもしれず、このインドキシルは次いで酸素分子によりインジゴに酸化され得る。このように、組換えＤＮＡ技術の商業的適用によって、連続的にインドールを産生できる修飾trpオペロンおよびインドールをインドキシルに同時に転化できるオキシゲナーゼ酵素の過剰発現により、インジゴをグルコースのような再生可能な原料から産生することができる。
振とうフラスコの研究において、本出願人は、インドールからのインジゴの合成の最中に、低レベルの他の化合物または副生成物が培養上澄み中に蓄積することを断定した。これらの副生成物の一つであるイサチン（インドール２，３−ジオン）が、産生菌株内のオキシゲナーゼ（すなわち、ＮＤＯ）活性を抑制し、その結果として、全体的なインジゴの産生を減少させることが分かった。したがって、イサチンは望ましくない。副生成物のイサチン以外にも、イサチンから誘導される赤色染料物質であるインジルビンは、この生合成的なインジゴ産生工程の最中に産生されるかもしれない。副生成物であるイサチンは産生菌株の産生能を減少させると考えられているが、副生成物であるインジルビンは、インジルビンにより汚染された微生物的に産生されたインジゴにより染められた布の赤味がかったものとして表現された、微生物的に産生されたインジゴに望ましくない染色特徴を与えるものと考えられている。
一種類以上のこれら副生成物の振とうフラスコ内の産生により、この産生菌株の産生能が減少するおよび／またはそれから産生されたインジゴに望ましくない特徴が生じるので、本発明の目的は、イサチンの蓄積を減少させる、または微生物細胞内のインジゴの生合成の副生成物として形成されたようなイサチンを除去することにある。イサチンを除去することにより、発酵槽内のインジゴの全体的な産生を潜在的に向上させ、インジルビンの蓄積を減少させるまたは妨げる。ここに詳述されているような、イサチンの蓄積を減少させるまたはそのようなイサチンを除去するある方法は、イサチン除去活性を有する酵素をコード化する遺伝子の、単離、クローニング、塩基配列決定およびイサチン産生宿主菌株内の発現に関している。好ましくは、その酵素は、イサチンを分解できる酵素であるイサチンヒドロラーゼであるが、イサチンを除去またはその形成を抑制するいかなる方法も本発明により考えられる。したがって、本発明の別の形態は、限定するものではないが、イサチンをイサチンヒドロラーゼのようなイサチン除去酵素に接触させることによるイサチンの酵素的転化、適切な温度およびｐＨでのイサチンの一般的に塩基により触発された化学的転化を含む手段により、またはイサチンの炭素または適切な樹脂への吸着により、蓄積を減少させるかまたは蓄積したイサチンを除去することにより、生合成インジゴの製造を向上させる。本発明のこれらの形態を以下に記載する。
用語の定義
以下の用語は、別記しない限り、ここに定義したものとして理解するものとする。このような定義は、引用なくして、当業者に知られているこれらの用語に関連する意味を包含する。
生合成インドールの蓄積を確保するのに有用なトリプトファン経路遺伝子としては、コリスミ酸からのＬ−トリプトファンの生合成を指示できる酵素的経路をコード化する精製ＤＮＡ分子として微生物から単離された、trpオペロンが挙げられる（A.J.Pittard（1987）Biosythesis of Aromatic Amino Acids in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, F.C.Neidhardt,ed., American Society for Microbiology, Publisher, 368-394頁）。インドールの蓄積は、一種類以上の経路構成因子および／または調節領域を修飾することにより可能になる。次いで、この修飾trpオペロンを、微生物、植物組織培養系または他の適切な発現系のような適切な宿主中に導入してもよい。「インドールの蓄積」という用語はかならずしも、インドールが実際に細胞内に蓄積することを意味するものではない。代わりに、この用語は、インドールへの炭素のフラックスが増加しており、インドールが、Ｌ−トリプトファンの形成以外のインドキシルの形成のような細胞内触媒反応のための基質として利用できるように形成されていることを意味する。本発明の文脈において、「蓄積した」インドールは、インドールからインドキシルへの転化において、芳香族ジオキシゲナーゼＮＤＯのようなオキシゲナーゼ、またはＴＭＯのような芳香族モノオキシゲナーゼにより消費されても、あるいは、所望の最終産生物がインドールまたはその誘導体のうちの一つである場合のように、実際に細胞内または細胞外で蓄積してもよい。
適切な宿主微生物または宿主細胞は、微生物インドールおよび／またはインジゴの産生に有用な自律性単細胞微生物であり、真核微生物および原核微生物の両方を含む。このような宿主微生物は、グルコースから、またはトリプトファンからの生転化物（bioconversion）として、インドール、インドキシルおよび／またはインジゴの産生に必要とされる、内因性または外因性いずれかの全てのＤＮＡを含有している。有用な真核生物としては、酵母および菌類のような微生物または植物が挙げられる。本発明に有用な真核生物の例としては、以下に限定されるものではないが、大腸菌、シュードモナスプチダおよびネズミチフス菌のような細菌が挙げられる。
インドールからインジゴへの生合成転化は、酸素分子または空気により媒介されるインジゴへのインドキシル酸化を含むことを意味する。
ここに用いているようなＤＮＡ断片は、調節および／または構造遺伝子情報をコード化し得る。本発明に有用なＤＮＡ断片はまた、提供された配列に相補的な配列をコード化する核酸分子；ストリンジェント条件下で、提供された核酸分子とハイブリダイズする核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）；または遺伝暗号の縮重に関してであるが、提供された分子またはそれらの相補鎖とハイブリダイズする核酸分子を含んでいる。「ストリンジェント」ハイブリダイゼーション条件は、非相補的またはミス対合の一本鎖核酸からの二本鎖核酸ハイブリッドの形成を最小にする条件である。さらに、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの存在または不在、核酸分子のヌクレオチド組成等を含む、ハイブリダイゼーション反応の様々な成分により影響を受けるかもしれない。本発明に有用な核酸分子は、天然由来または合成由来のいずれであってもよい。
「外因性」ＤＮＡ断片は、形質転換、形質移入、形質導入、接合、エレクトロポレーション等のような工程により、宿主微生物中に導入されるＤＮＡ断片である。さらに、「外因性」ＤＮＡ断片が挿入されている宿主細胞はそれ自体、同一または類似の配列をコード化する分子を天然に収容してもよいという可能性がある。例えば、本発明において大腸菌を宿主菌株として用いる場合、通常、宿主は天然に、染色体上に、trpオペロンの発現を可能にする条件下でコリスミ酸からのＬ−トリプトファンの合成を指示できるtrpオペロンを含むことが認識されている。このような分子は、「外因性」ＤＮＡ分子と称される。
安定に形質転換された微生物は、導入された分子が増殖培養において維持され、複製され、分離されるように導入される一種類以上のＤＮＡ断片を有する微生物である。安定な形質転換は、多数または単一の染色体組込みのためであっても、あるいはプラスミドベクターのような染色体外因子によるものであってもよい。プラスミドベクターは、特定のＤＮＡ断片によりコード化されたポリペプチドの発現を指向できる。発現は、構成によるものであっても、またはここに記載されているように修飾されたtrpオペロンの構造遺伝子のような特定のポリペプチドをコード化する機能的に関連したＤＮＡ断片を高レベルで転写できる誘導性（または抑制性）プロモータにより調節されていてもよい。
ここで用いられているような「イサチン除去酵素」は、イサチンの抑制、除去、不活化、分解、加水分解または結合（封鎖）を生じる活性を含む、イサチン酸またはイサチンの他の誘導体を形成するあらゆる酵素である。本発明に有用な好ましいイサチン除去酵素は、ここにシュードモナスプチダ（ＷＷ２）から単離されたヒドロラーゼのようなイサチンヒドロラーゼである。
インドール、インドキシルおよび／またはインジゴの微生物産生に必要な酵素の発現に用いられる厳密な機構にもかかわらず、このような発現は典型的に、組換え遺伝因子の宿主細胞中への転移により媒介されるまたはもたらされると考えられている。ここに定義した遺伝因子は、関連酵素（すなわち、イサチンヒドロラーゼ、トリプトファンシンターゼ、ＮＤＯ等）を発現するまたはその発現を調節するタンパク質、特に酵素、アポタンパクまたはアンチセンスＲＮＡのような生成物に関する発現性暗号配列を有する核酸（一般的にＤＮＡまたはＲＮＡ）を含んでいる。発現されたタンパク質は、酵素として機能し、酵素活性を抑制または抑制解除したり、または酵素の発現を制御することができる。これらの発現性配列をコード化する組換えＤＮＡは、染色体性（例えば、相同組換えにより宿主細胞染色体中に組み込まれる）または染色体外性（例えば、一種類以上のプラスミド、コスミドおよび標的形質転換をもたらすことのできる他のベクターにより運搬される）のいずれであっても差し支えない。本発明による宿主細胞を形質転換するのに用いられた組換えＤＮＡの例としては、構造遺伝子および転写因子に加えて、タンパク質、アポタンパクまたはアンチセンスＲＮＡの暗号配列の発現または抑制解除を制御するように機能する、プロモータ、抑制体およびエンハンサを含む発現制御配列を包含するものである。例えば、このような制御配列を野生型宿主細胞中に挿入して、宿主細胞ゲノム内ですでにコード化された選択された遺伝子の過剰発現を促進しても、あるいは、それらを用いて、染色体外でコード化された酵素の合成を制御しても差し支えない。
組換えＤＮＡを、限定するものではないが、プラスミド、コスミド、ファージ、酵母人工染色体または遺伝因子の宿主細胞中への転移を媒介する他のベクターを含むいかなる手段により宿主細胞中に導入されても差し支えない。これらのベクターは、ベクターおよびベクターにより運搬される遺伝因子の複製を制御するシス作用性制御因子とともに、起点（origin）または複製（replication）を含んでいても差し支えない。選択性マーカーは、遺伝因子が導入される宿主細胞の同定において役立つベクター上に存在しても差し支えない。そのような選択性マーカーの例としては、テトラサイクリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンまたはネオマイシンのような特定の抗生物質に対する抵抗を与える遺伝子が挙げられる。
遺伝因子を宿主細胞中に導入する手段では、本発明による遺伝因子が挿入された染色体外多重コピープラスミドベクターを用いる。遺伝因子の宿主細胞中へのプラスミドで運ばれた導入は、制限酵素によるプラスミドベクターの初期開裂、それに続いて本発明による標的酵素種に関してコード化する遺伝因子およびプラスミドの連結を含む。連結した組換えプラスミドの再環状化（recircularization）の際に、プラスミド転移（例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション等）に関する感染（例えば、λファージ内のパッケージング）または他の機構を用いて、プラスミドを宿主細胞中に転移させる。遺伝因子の宿主細胞内への挿入に適したプラスミドは当業者によく知られている。
発明の概要
本発明のある形態は、イサチンを除去する酵素活性を有する微生物（イサチン除去酵素と称する）の単離、並びに好ましいイサチン除去酵素であるイサチンヒドロラーゼをコード化する遺伝子のクローニングおよび塩基配列決定である。
本発明の別の形態は、インドール、インドキシルおよび／またはインジゴを産生できる宿主菌株中にイサチン除去酵素活性をコード化するＤＮＡ分子を取り込むことである。このＤＮＡ分子は好ましくは、真核または原核宿主細胞の染色体内に安定に形質転換、形質移入または組込みされる。有用な宿主細胞は、たとえば、ストレプトミセス属、エシェリキア属、バチルス属、シュードモナス属、サッカロミセス属、アスペルギルス属等を含む、細菌、酵母または菌類であってよい。真核宿主大腸菌は、好ましい宿主微生物のうちの一つである。
本発明のＤＮＡ分子を含む、生物学的作用性プラスミドまたはウイルスＤＮＡベクターは、本発明の別の形態を示す。ある実施の形態において、大腸菌のような原核または真核宿主細胞は、そのような生物学的作用性ベクターにより安定に形質転換または形質移入される。
本発明の他の形態は、適切な宿主微生物内でインジゴを生合成する方法であって、この宿主細胞中に、イサチン除去酵素活性をコード化するＤＮＡ断片を導入し、インドキシルのインジゴへの転化の際に、イサチン除去酵素活性が、産生されるいかなるイサチン副生成物をも除去するようにインドキシルの蓄積を促進する条件下で微生物を培養する各工程からなる方法を含んでいる。適切な宿主微生物の例としては、以下に限定されるものではないが、トリプトファンオペロン（または修飾trpオペロン）および／またはオキシナーゼ活性を発現する（内因的または外因的のいずれかで）宿主微生物が挙げられ、この宿主微生物は、イサチンヒドロラーゼをコード化するＤＮＡ分子により安定に形質転換または形質移入される。このような微生物は、トリプトファンオペロン（または修飾trpオペロン）、インドール酸化活性（インドキシルを形成することのできる）およびイサチンヒドロラーゼの発現を促進する条件下で培養される。
特に、選択された宿主微生物内でインジゴを生合成する改良方法であって、宿主微生物が、以下の酵素活性：
（i）  トリプトファナーゼ活性（トリプトファンをインドールに転化できる）または
（ii）  インドールをインドキシルに転化できるオキシゲナーゼ活性
の一つ以上をコード化する一種類以上のＤＮＡ断片を導入することによりさらに修飾させられるとすると、インジゴの産生中に蓄積されるいかなるイサチンをも除去できるイサチン除去酵素活性をコード化するＤＮＡ断片を宿主微生物中に導入し、
そのようなＤＮＡ断片によりコード化されるポリペプチドの発現を、そのようなポリペプチドの発現により、インドールを蓄積し、インドールをインドキシルに転化し、イサチンを除去できるように促進する条件下で修飾微生物を培養する各工程からなる方法をクレームする。そのような修飾微生物により、インジゴに酸化される、インドキシルを産生することができ、次いで、そのように産生されたインジゴを、当業者に知られた手段により回収することができる。
本発明のさらなる別の実施の形態は、副生成物であるイサチンおよび／またはインジルビンの産生が、化学的または酵素的な抑制／不活化または炭素のような化合物による吸着を含む、いかなる方法により抑制または除去される、インジゴを産生する改良方法からなる。
【図面の簡単な説明】
図１は、シュードモナスプチダ菌株ＷＷ２からのイサチンヒドロラーゼ遺伝子をクローニングするのに用いた方法論を示している。
図２は、シュードモナスプチダ菌株ＷＷ２からのイサチンヒドロラーゼ遺伝子をサブクローニングするのに用いた方法論を示している。
図３ａ−ｃは、イサチンヒドロラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）および演繹されたアミノ酸配列（配列番号２）、並びに５’および３’の非翻訳配列（配列番号１のそれぞれ1-144ｂｐおよび924-1006ｂｐ）およびクローニングベクターのポリリンカー配列を示している。
図４は、イサチンヒドロラーゼ（ＩＨ）およびトリプトファナーゼ（ｔｎａＡ）の遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ−ＩＨ−Ｈの構築を示している。
図５は、ｌａｃプロモーターと同一方向にあるイサチンヒドロラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＬ−ＩＨ−ＳＩの構築を示している。
図６は、中間体プラスミドであるプラスミドｐＡＫ１の構築を示している。
図７は、ｌａｃプロモーターと同一方向にあるイサチンヒドロラーゼ遺伝子およびトリプトファナーゼ（ｔｎａＡ）遺伝子を含むプラスミドｐＣＬ−ＩＳＴＩの構築を示している。
図８は、ｌａｃプロモーターと同一方向にあるイサチンヒドロラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＬ−ＩＨＡの構築を示している。
図９は、染料にインジルビンを転化することによる、インジゴ染めデニムの漂白への効果を示している。
発明の詳細な説明
現在利用できる生合成によるインジゴ産生方法では、それぞれＴＭＯまたはＮＤＯのような芳香族モノまたはジオキシゲナーゼ、あるいはS.Hart, K.R.KochおよびD.R.Woods［（1992）「Identification of indigo-related pigments produced by Escherichia coli containing a cloned Rhodococcus gene」J.Gen.Microbiology 138:211-216］により記載されているように、ロードコッカス属（Rhodococcus）からのオキシダーゼのような他のオキシゲナーゼ酵素を用いたインドールのインジゴへの生転化を用いているかもしれない。これらの方法では、このような系においては細胞内でインドールが蓄積しないので、培地にインドールを加える必要がある。しかしながら、培地に加えられたインドールは、微生物にとって毒性であるかもしれない。インドールが培地内に存在する場合、大腸菌の増殖が抑制されるかもしれない。Bang等［（1983）Biotechnology and Bioengineering 25:999-1011］により、振とうフラスコ内の最小培地で増殖させられる大腸菌に外因性インドールを加えることの影響が記載された。0.025％間での濃度では細菌の増殖が遅くなったが、細胞は長時間に亘るインドールの存在に順応したことが分かった。しかしながら、0.03％のインドールでは、増殖が厳しく制限され、順応は全く確認されず、インドール濃度が0.04％より大きいと、増殖が完全に不可能となった。さらに、前出のBang等は、インドールが0.2ｇ／Ｌを越える濃度で加えられたときに、Ｌ−トリプトファン合成が抑制されたことを発見した。
培地にインドールを補うことによる、インジゴ合成の固有の制限を避けるために、内因性インドール生合成を行える系を開発した。そのような系の一つでは、インドールの産生および蓄積を促進するように修飾された、trpオペロン（以後「修飾trpオペロン」と称する）のＤＮＡ配列をコード化する外因性ＤＮＡ分子を、オキシゲナーゼ（すなわち、ＮＤＯ）活性をすでに発現できる組換え宿主微生物中に移入することを用いてもよい。そのような系により、グルコースまたは他の炭素供給源からインジゴを産生することができる。必要に応じて、そのような系は、細胞内にインドールが蓄積するのを避けるような様式で、外因的に産生されたインドールをインドキシルに効率的に転化する。この系は、PCT/US93/09433に詳細に記載されている。本発明のイサチン除去方法と組み合わせたそのような系は、ここに記載する、インジゴを産生する改良方法の好ましい実施の形態である。
一般的に、PCT/US93/09433に示されているように、trpＢ遺伝子内、特にtrpB遺伝子内の位置382（trpB382と称される）でのある点突然変異により、trpBの安定な突然変異体が形成された。このような突然変異により、宿主細胞内でのインドールフラックスが向上し、このような突然変異体は、イサチン除去活性と組み合わせてここに記載するようなインジゴの産生にとって好ましい。さらに、ＮＤＯのような芳香族ジオキシゲナーゼとともに、これらのトリプトファンシンターゼ突然変異体の発現により、インドールが細胞内で産生され、インドールがインドキシルに転化された。このインドキシルは、自発的にインジゴに酸化される。
本発明の好ましい実施の形態は、微生物のインジゴ産生中の望ましくない副生成物であるイサチンおよび／またはインジルビンの産生を除去または減少させる必要があるという問題に対処することにより、この従来の研究の教示に基づいている。インジゴの生合成的産生の拡大を試みている最中に本出願人が遭遇したこの問題を克服するために開発した酵素的方法、化学的方法または吸着方法に関する詳細が以下に記載されている。
Ｉ．    イサチンの形成に対する酵素的手法
シュードモナスプチダ菌株ＷＷ２からのイサチンヒドロラーゼ遺伝子のクローニング
インドールからインジゴを合成する最中に、低レベルの他の化合物が培養上澄み中に蓄積する。これらの副生成物のうちの一つであるイサチン（インドール２，３−ジオン）は産生菌株内のＮＤＯ活性を抑制し、その結果、全体的なインジゴの収率が減少することが分かった。さらに、イサチンは、微生物インジゴにより染められた材料に赤味がかった色を与えるかもしれない赤色染料である、インジルビンの前駆体である。したがって、イサチンの蓄積を減少させるまたは除去する方法を探した。したがって、イサチンを分解できる酵素を探し始めた。栄養性選択機構を用いて、数多くの土壌試料をスクリーニングして、イサチンを分解する能力を示す微生物を同定した。ゼラチン加水分解およびホスホリパーゼＣアッセイである、バイオログ（登録商標）ＧＣ−ＦＡＭＥからなる分類研究により、その微生物がシュードモナスプチダであることが示された。したがって、その微生物をシュードモナスプチダ菌株ＷＷ２と称した。酵素活性を、イサチンをイサチン酸に加水分解する加水分解反応として認定した。したがって、その酵素を「イサチンヒドロラーゼ」と称した。
イサチンヒドロラーゼをコード化する遺伝子をクローニングするために（図２および３参照）、全ＤＮＡをシュードモナスプチダ菌株ＷＷ２から調製し、Ｓａｕ３Ａ制限エンドヌクレアーゼにより部分的に消化した。次いで、部分的に消化したＤＮＡを0.7％のアガロースゲル中12時間に亘り100ｍＶで電気泳動させた。エチジウムブロミドにより染色した後、蛍光によりＤＮＡを可視化し、１ｋｂから10ｋｂまでの範囲に亘るＤＮＡ断片を含有するゲル切片を切除した。このＤＮＡを電気溶離によりゲル切片から溶離し、さらにフェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿およびＴＥ緩衝液中での再懸濁により精製した。
次いで、単離したＤＮＡ断片を、以前にＢａｍＨＩによる消化により線状化し、子ウシ腸内アルカリ性ホスファターゼにより脱リンされた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ファーマシアバイオテックより市販されている；カタログ番号27-50007-01）に連結した。連結後、５μｌの連結混合物を用いて、コンピテント大腸菌Sure Cell（登録商標）（ストラタジーンから得られる、カタログ番号200238）を形質転換した。形質転換の外殖後、この混合物を２ＹＴ培地により１：１に希釈し、50μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬアガープレート上に平板培養した。
このプレートの37℃での一晩の定温培養後、数千の形質転換体が観察された。プレートの表面に10ｍｇ／ｍｌのライソザイムおよび25ｍＭのＥＤＴＡの溶液を吹き付け、室温で20分間に亘り定温培養することによりコロニーを溶解させた。次いで、これらのプレートに、10ｍｌの50ｍＭ  トリス／ＨＣｌ  ｐＨ7.5中の3.5ｍｇの５，７−ジメチルイサチンからなる溶液内で20分間に亘り予め染色したニトロセルロース膜を重ね合わせた。一時間の定温培養期間後、ニトロセルロース膜をプレートから持ち上げ、オレンジ色の背景上の白色の透明区域について検査した。このような透明区域は、イサチン加水分解活性の存在を示す。
このスクリーンにより、6.3ｋｂのクローニングされた挿入物とともにプラスミドを含有する陽性形質転換体が産生された（図１）。このプラスミドをｐＴｒｃ−ＩＨと称した。ｐＴｒｃ−ＩＨから6.3ｋｂの挿入物のセグメントを欠失させることにより、イサチンヒドロラーゼ遺伝子のサブクローニングを行った。ｐＴｒｃ−ＨＩのＳａｌＩによる消化により、三つの断片（1.6ｋｂ、2.6ｋｂ、および6.3ｋｂ）が得られた。これにより、クローニングされた挿入物が最低二つの内部ＳａｌＩ部位を含むことが示された。クローニングベクターは、ポリリンカー領域に一つのＳａｌＩ部位を含んでいる。ｐＴｒｃ−ＩＨの6.3ｋｂのＳａｌＩ断片を単離し、再連結し、コンピテント大腸菌Sure Cell（ストラタジーン、カタログ番号200238）中に形質転換したときに、イサチンヒドロラーゼ活性が再度観察された。この新しいプラスミドは、ｐＴｒｃ−ＩＨ＃２と称され、約2.3ｋｂのクローニングされた断片上にＩＨ遺伝子を含んでいた（図１）。
ｐＴｒｃ−ＩＨ＃２の制限遺伝地図作製により、一方の端部から約400塩基対に位置するクローニング断片に独特なＸｈｏＩ制限部位が存在することが明らかになった。このことによりさらに、イサチンヒドロラーゼ含有断片をサブクローニングすることができた（図２参照）。ｐＴｒｃ−ＩＨ＃２をＸｈｏＩにより消化し、続いてＴ４  ＤＮＡポリメラーゼにより張り出し部（overhang）を充填した（ブラント末端を形成する）。次いで、線状化されたプラスミドをＳａｌＩにより消化した。これにより、アガロースゲルから精製し、以前にＳｍａＩおよびＳａｌＩにより消化したベクターｐＵＣ１８に連結した1.9ｋｂのブラント−ＳａｌＩ断片が産生された。充填されたＸｈｏＩ張り出し部をＳｍａＩに連結することにより、ＸｈｏＩ部位を再度形成する。大腸菌菌株ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ33876）をこの連結混合物により形質転換し、上述したスクリーンを用いてイサチンヒドロラーゼ活性を有する形質転換体を同定した。陽性形質転換体から単離したプラスミドが、1.9ｋｂのＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片上にイサチンヒドロラーゼ遺伝子を含むことが確認された；このプラスミドをｐＵＣ１８−ＩＨと称した（図２）。さらなる実験により、ｐＵＣ１８−ＩＨを含有する菌株内のイサチンヒドロラーゼ活性がＩＰＴＧにより誘導可能であることが示され、ｐＵＣ１８−ＩＨ内のイサチンヒドロラーゼ遺伝子の転写方向がｌａｃプロモーターと同一であることを示唆した。
イサチンヒドロラーゼ遺伝子をさらに以下のようにサブクローニングした（図２参照）。ｐＵＣ１８−ＩＨ内の1.9ｋｂのクローニングされた断片の部分的なＤＮＡ塩基配列決定および制限遺伝地図作製により、この断片に特有であり、その中心に近いＢｂｓＩ制限部位が存在することが示された。クローニングされたＤＮＡの約１ｋｂを、ｐＵＣ１８−ＩＨをＢｂｓＩにより消化し、アガロースゲル上で断片を分離し、大きい（3.6ｋｂ）断片を単離することにより欠失することができた。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにより末端を充填した後、この断片を連結により再度環状にした。次いで、この連結混合物を、大腸菌菌株ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ33876）の形質転換およびイサチンヒドロラーゼ活性のスクリーニングに用いた。陽性クローンにより、新しいプラスミドが産生された。このプラスミドは、ｐＵＣ−ＩＨと称され（図２）、約900塩基対の断片内に機能性イサチンヒドロラーゼ遺伝子を含有することが分かった。
イサチンヒドロラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列    ｐＵＣベクター（ＡＴＣＣ37253）に使用するように設計された市販のｌａｃおよび逆プライマーを用いて、ｐＵＣ−ＩＨ内のクローニングされた挿入物全体の塩基配列を決定した。この挿入物の完全なヌクレオチド配列が図３に示されている（配列番号１）。塩基配列の決定された領域内の一本の読み取り枠（配列番号１のｂｐ145からｂｐ923までの780ｂｐ）を、ジェネティクスコンピュータグループインクからの塩基配列分析ソフトウェアを用いて同定した。この読み取り枠のヌクレオチド配列に基づくイサチンヒドロラーゼの予測分子量（32,886）は、ゲル浸透クロマトグラフィーおよび天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定されたイサチンヒドロラーゼタンパク質の予測サイズ（30,000-40,000）と一致した。続いて精製したイサチンヒドロラーゼのＮ末端アミノ酸配列決定により、ＭＴＳＩＫＬＬＡＥＳＬＬＫの配列（配列番号３）が得られた。この配列は、一本の読み取り枠のヌクレオチド配列から誘導されたＮ末端アミノ酸配列と一致する。これらの分析により、この読み取り枠には、144塩基対５’（非翻訳）および82塩基対３’（非翻訳）が隣接することが示される。
インジゴ産生菌株内で使用する、イサチンヒドロラーゼ遺伝子および大腸菌Ｋ−１２トリプトファナーゼ遺伝子を含有する補助プラスミドの構築    イサチンの濃度が、細胞抽出物として発酵物に供給される場合、または酵素がプラスミドから発現される場合のいずれかで、イサチンヒドロラーゼの存在するトリプトファンのインジゴへの生体形質転換発酵において減少することが分かっている。トリプトファンをインドールに転化し、大腸菌Ｋ−１２から誘導される酵素であるトリプトファナーゼが、ｔｎａＡ遺伝子を収容するプラスミドから過剰発現された場合、振とうフラスコ内のインジゴ産生の速度に別の利点が観察された。したがって、イサチンヒドロラーゼ遺伝子およびトリプトファナーゼ遺伝子を単一の低コピー数プラスミド上で組み合わせて、これらの利点を達成した。このプラスミドの構築を以下に記載する。
プラスミドｐＵＣ−ＩＨの構築中に、イサチンヒドロラーゼ遺伝子の３’末端での独特なＳａｌＩ制限部位を破壊した。イサチンヒドロラーゼ遺伝子をｐＵＣ−ＩＨから都合よくサブクローニングするために、ｐＵＣ−ＩＨをＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ＳａｌＩ部位（適切な方向で）中に大腸菌Ｋ−１２トリプトファナーゼ（ｔｎａＡ）遺伝子（ｐＵＳｔｎａから、図４）を含有する3.2ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片をクローニングすることにより、ＳａｌＩ部位をイサチンヒドロラーゼ遺伝子の３’末端で再度形成した［DeeleyおよびYanofsky（1981）「Nucleotide sequence of the structural gene for tryptophanase of Escherichia coli K-12」J.Batriol. 147:787-796］。この3.2ｋｂの断片は、クローニングしたｔｎａＡ遺伝子の一方の端部に有用なポリリンカー配列を有しているという理由のみで選択した。この新しいプラスミド構築物をｐＵＣ−ＩＨ−Ｈと称した（図４）。この新しい中間体を構築することにより、イサチンヒドロラーゼ遺伝子を、約１ｋｂのＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片上のｐＵＣ−ＩＨ−Ｈから都合よく除去できた。
この断片を、低コピー数ベクターｐＣＬ１９２０の独特のＳａｌＩ部位中に両方向でクローニングした［C.G.LernerおよびM.Inouye（1990）Nucleic Acid Research 18:4631］。ｌａｃプロモーターと同一方向にあるイサチンヒドロラーゼ遺伝子およびイサチンヒドロラーゼ遺伝子の３’末端の独特なＳａｌＩ部位を有する所望のプラスミド（図５）を単離し、ｐＣＬ−ＩＨ−Ｓ１と称した。
クローニングした大腸菌Ｋ−１２トリプトファーゼ（ｔｎａＡ）遺伝子を以下のようにｐＣＬ−ＩＨ−Ｓ１に加えた：ｐＭＢ２１９０からのカナマイシン抵抗性遺伝子を含有する1.3ｋｂのＥｃｏＲＩ断片［A.Darzins, B.Frantz, R.I.Vannags, A.M.Chakrabarty（1986）Gene 42:293-302］をプラスミドｐＳＵｔｎａ内のクローニングされたｔｎａＡ遺伝子の一方の端部の独特のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。プラスミドｐＭＤ６［M.C.DeeleyおよびC.Yanofsky（1981）J.Bacteriol.147:787-796］からの3.2ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（ｔｎａＡを含有する）をプラスミドｐＳＵ１８［B.Bartolome, Y.Jubete, E.Marinez, F.de la Cruz（1991）Gene 102:75-78］中にサブクローニングすることにより、プラスミドｐＳＵｔｎａを構築した。ｔｎａＡに隣接する追加のＳａｌＩ部位を導入するために、カナマイシン抵抗性遺伝子およびｐＭＢ２１９０からの二つの側部多数クローニング部位を含有する1.3ｋｂのＥｃｏＲＩ断片［部分的なプラスミド地図が図８に示されている；A.Darzins, B.Frantz, R.I.Vanags, A.M.Chakrabarty（1986）Gene 42:293-302］を、プラスミドｐＳＵｔｎａ内のクローニングされたｔｎａＡに対して３’である独特のＥｃｏＲＩ部位に導入した。得られたプラスミドをｐＡＫ１と称した。
ｔｎａＡ遺伝子を3.2ｋｂのＳａｌＩ断片としてｐＡＫ１から切除することができた。この断片をｐＣＬ−ＩＨ−Ｓ１の独特のＳａｌＩ部位中に挿入した（図７参照）。挿入物の予測した二つの方向の内の、転写方向がイサチンヒドロラーゼに関して同一であるものを単離し、ｐＣＬ−ＩＳＴ１と称した（図７）。
産生微生物の構築    産生微生物を生成するために、適合性プラスミド９１１−ＩＳＰ［Ensley等（1987）「Expression and complementation of naphthalene dioxygenase activity in Escherichia coli」in Microbial Metabolism and the Carbon Cycle, S.R.Hagdorn, R.S.Hanson and D.A.Kunz, eds., Harwood Academic Publisher, New York, 437-455頁］およびｐＣＬ−ＩＳＴ１（図７）を、塩化カルシウム処理によりコンピテントにされたＦＭ５細胞を用いた標準的な弊質転換方法により、産生宿主ＦＭ５［Burnette等（1998）「Direct expression of Bordella pertussin toxin subunits to high levels in Escherichia coli」Bio/technology 6:699-706］中に導入した。両方のプラスミドを含有する形質転換体を、それぞれ、プラスミド９１１−ＩＳＰおよびｐＣＬ−ＩＳＴ１により与えられたアンピシリンおよびスペクチノマイシンに対する耐性により同定した。ＦＭ５宿主内のこれらのプラスミドの存在は、全プラスミドＤＮＡの単離および制限酵素分析により確認した。
産生宿主菌株ＦＭ５が以前に記載されており［Burnette等（1988）「Direct expression of Bordella pertussin toxin subunits to high levels in Escherichia coli」Bio/technology 6:699-706］、産生プラスミド９１１−ＩＳＰおよび宿主ＦＭ５／９１１−ＩＳＰも記載されている［Ensley等（1987）「Expression and complementation of naphthalene dioxygenase activity in Escherichia coli」in Microbial Metabolism and the Carbon Cycle, S.R.Hagdorn, R.S.HansonおよびD.A.Kunz, eds., Harwood Academic Publishers, New York, 437-455頁］。トリプトファナーゼ（ｔｎａＡ）をコード化するクローニングされた大腸菌Ｋ−１２ｔｎａ断片（3.2ｋｂ）が記載されており［DeeleyおよびYanofsky（1981）「Nucleotide sequence of the structural gene for tryptophanase of Escherichia coli K-12」J.Bacteriol. 147:787-796］、ベクターｐＣＬ１９２０も記載されている［C.G.LernerおよびM.Inouye（1990）「Low copy number plasmid for regulated low-level expression of cloned genes in Escherichia coli with blue/white insert screening capability」Nucleic Acid Research 18:4631］。インジゴ産生菌株（ＦＭ５／９１１−ＩＳＰ、ｐＣＬ−ＩＳＴ１）中に導入される唯一の新しいＤＮＡは、中間体プラスミド構築物から移った少量の塩基配列決定されたポリリンカーＤＮＡとともに挿入されたイサチンヒドロラーゼ遺伝子（図８参照）およびトリプトファナーゼに関するｔｎａＤＮＡ暗号を含有する１ｋｂのＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片を有するｐＣＬ１９２０である。
インジゴ発酵中に副生成物として産生されるイサチンを除去するために、イサチンヒドロラーゼ遺伝子を、多くの異なる形態で適用することができる。本出願人は、遺伝子産生物であるイサチンヒドロラーゼを、トリプトファンのインジゴへの生転化（生転化法）および単一宿主微生物によるトリプトファンまたはインドールの中間体合成によるこの微生物内でグルコースからのインジゴの産生（単一宿主または直接法）に使用することを検討する。イサチンヒドロラーゼ遺伝子の耐性は、それ自体でいくつかの形態を取ることができる：この遺伝子は、宿主の染色体上に配置されたとき、染色体外で自律的に複製するＤＮＡ因子上に供給されたとき、または細胞中に導入され、発酵の期間中に維持されたＤＮＡの他の形態にあるときに効果的である。遺伝子発現の調節は、構造的であっても、または適切なプロモーターにより調節されてもよい。
染色体により含まれる場合、ヒドロラーゼ遺伝子は、ＮＤＯ（米国特許第4,520,103号および米国特許第5,173,425号）、ＴＭＯ（米国特許第5,017,495号）またはロードコッカスからのオキシダーゼにより例証されているようなオキシダーゼのようなオキシゲナーゼと協力して機能する［S.Hart, K.R.KochおよびD.R.Woods（1992）「Identification of indigo-related pigments produced by Escherichia coli containing a cloned Rhodococcus gene」J.Gen.Microbiology 138:211-216］。直接的または間接的のいずれかでインドキシルを提供できる単一成分であるモノオキシゲナーゼもまた、イサチンヒドロラーゼとともに適用する候補である。これらのオキシゲナーゼ／オキシダーゼまたはそれらの成分を、宿主の染色体上にコード化するか、または染色体外因子上に導入することができる。酸化酵素の遺伝子は、構造的に発現しても、または適切なプロモーターにより調節しても差し支えない。イサチンヒドロラーゼ遺伝子は、酸化酵素をコード化する遺伝子と同一のＤＮＡ因子上にあっても差し支えない。全ての活性に関する遺伝子の発現を、独立して調節しても、または協力して調節してもよい。
直接的方法、すなわち、単一宿主法において、イサチンヒドロラーゼ遺伝子は、外因的調節下にあるか、またはフィードバック抑制を除去するおよび／または遺伝子を過剰発現させる遺伝子操作した突然変異体により人工的に調節できる芳香族アミノ酸経路の遺伝子とともに共発現されることが予測されている。これには、適切な遺伝子がそれより構成プロモーターからまたは調節プロモーターから発現される多コピー数プラスミド上にコード化されることにより増幅される芳香族アミノ酸経路遺伝子が含まれる。全ての遺伝子は、異なるプロモーターまたはプロモーターのいかなる組合せにより調節されていても差し支えない。
芳香族アミノ酸経路遺伝子もまた単に染色体上に位置していても、またはプラスミドから作用する、染色体によりコード化された芳香族アミノ酸経路遺伝子のいかなる組合せがあっても差し支えない。
ＤＮＡの単離および精製、制限酵素によるＤＮＡの開裂、組換えプラスミドの構築、ＤＮＡの微生物中への導入、および部位定方向突然変異を含む、本発明に用いられる一般的な組換えＤＮＡ技術が、Manniatis等のMolecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1982）およびCurrent Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel等, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience（1987）を含む多くの出版物に記載されている。
II．  イサチン除去に対する他の手法
発酵において非抑制性化合物への化学的転化または吸着を実施する方法が、当業者に知られている。これらには、限定するものではないが、以下のものが含まれる。
処理のための無細胞培養液の除去    無細胞培養液は、直交流形濾過膜または遠心分離のような分離装置により発酵槽から除去することができる。次いで、無細胞培養液を、実施例１または２に示されている手段により処理しても差し支えない。この培養液を、熱交換ループを用いて加熱して、必要であれば冷却しても差し支えない。ｐＨを制御するための塩基をこのループに加えて、アルカリ度を増大させても差し支えない。本発明のある実施の形態において、ｐＨを少なくとも約11まで増加させて（適切な塩基を加えることにより）、温度を約50-70℃まで上昇させることにより発酵培養液を処理することによって、イサチン副生成物を除去する。この処理を、培養液のオレンジ色が薄い黄色に変化するのに十分な期間に亘り（12時間未満、好ましくは約２−５時間未満）行ってもよい。あるいは、この培養液を活性炭または別の吸着体に通過させて、イサチンを除去しても差し支えない［Freeman等（1993）「In situ product removal as a tool for bioprocessing」Bio/technology 11:1007-1012］。
吸着体の生転化物質への直接的な添加    生転化物質に吸着体を加えて、イサチンを吸着しても差し支えない。活性炭または別の種類の吸着体を培養液に加えて、発酵後にインジゴから分離しても差し支えない。
一般的な塩基触媒作用によるイサチンの加水分解    発酵物に、イサチンを加水分解するための一般的な塩基触媒として機能する高温のホスフェートを加えることにより、イサチンの濃度を低下させても差し支えない。一般的な塩基触媒作用が、実施例４に示されている。
実        験
実施例１
系からイサチンを除去することにより、インジゴの産生量が増大する。
熱および高ｐＨの処理による、インジゴ形成の抑制の緩和
トリプトファンをインジゴに転化できる菌株［ＦＭ５（９１１−ＩＳＰ，ｐＣＬ−ＩＳＰ＃１４）］について、二種類の発酵を行った。一方にはトリプトファンを供給して、インジゴが産生されたが、対照タンクにはトリプトファンを供給せず、全くインジゴは産生されなかった。発酵を行って20時間後に、各々のタンクから培養液を採集し、遠心分離して、インジゴおよび細胞を除去した。上澄み液に10ｇ／Ｌまでグルコースを加えた。さらなる対照に関して、10ｇ／Ｌのグルコースおよび±５ｍＭのイサチンとともに、ｐＨ7.0での200ｍＭのＫ+リン酸塩を含有する緩衝液試料を調製した。各々の培養液および各々の緩衝液のアリコートに、45％のＫＯＨを加えて、ｐＨを約11.0まで上昇させた。これらの溶液を加熱板上に配置して、イサチン溶液のオレンジ色が薄い黄色に変化するまで（約２−５時間）約50-70℃で加熱した。この色の変化は、以前のスペクトルの実験において測定されているように、イサチンが化学式１に示したようにイサチン酸に加水分解されることを示している。この時点で、全ての試料を冷却し、85％のリン酸でｐＨを7.0に調節した。
0004080533.tif 000002
トリプトファンを供給しなかった発酵槽から21時間後に細胞を採集し、遠心分離した。高細胞密度で10ｇ／Ｌのグルコース緩衝液を有するｐＨ7.0の200ｍＭのＫ+ホスフェート中に再懸濁させた後、最終的なＡ660が２となる細胞の等しいアリコートを、それぞれ、250ｍＬのバッフル付きフラスコ内に含まれた、ｐＨおよび熱により処理した25ｍＬの緩衝液および培養液中に配置した（二重に行った）。フラスコを30分間に亘り振とうし、このときに、最初のインジゴ測定を行い（10部以上のＤＭＦ中に１部の培養物を溶解させ、Ａ660を測定した）、インドールを250ｍ／Ｌの濃度まで加えた。１時間後に、インジゴの産生量をＡ610で分光光度的に測定し、１時間当たりの、乾燥細胞１ｇ当たりのインジゴのｇとして表した。その結果（実験は二重に行った）が、インジゴの産生量について処理培養液と未処理培養液を比較している、表１に記録されている。
0004080533.tif 000003
これら結果は、イサチンまたはインジゴ産生生転化物からの培養液がさらにインジゴの産生量を減少させ得ることを示している。イサチンをイサチン酸に加水分解する培養液または緩衝液の処理により、そのような抑制が除かれる。
実施例２
活性炭で生転化物からの使用済培養液を処理することによるインジゴ産生量の増加
実施例１のように、生転化物から培養液を採集した。活性炭を用いて培養液の一つのアリコートを処理した。処理しなかった培養液のアリコートを対照とした。実施例１のように測定した、インジゴ産生速度が表２に示されている。これらの結果は、実験を二重に行ったものとして示されている。
0004080533.tif 000004
これらのデータは、炭素で処理することにより、インジゴ産生の抑制が除かれることを示している。抑制の除去は、活性炭によるイサチンの除去に寄与するものであると考えられた。
実施例３
イサチンは精製ＮＤＯによるレドックスサイクラーである
組換えＮＤＯを、発表されている方法［HaiglerおよびGibson（1990）「Purification and properties of NADH-ferredoxinnap reductase, a component of naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. Strain NCIB 9816」J.Bacteriol. 172:457-464 ; EnsleyおよびGibson（1983）「Naphthalene dioxygenase: purification and properties of a terminal oxygenase component」J.Bacteriol. 155:505-511; HaiglerおよびGibson（1990）「Purification and properties offerredoxinnap, a component of naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. Strain NCIB 9816」J.Bacteriol. 172:465-468］により、フェレドキシンレダクターゼ（Ｒｄ）、フェレドキシン（Ｆｄ）および末端オキシゲナーゼ）ＩＳＰ）を過剰発現する大腸菌菌株から精製した。ＮＤＯオペロンを、ｐｈｏＡプロモーター下に配置した。使用するまで、精製した成分を−80℃で貯蔵した。イサチンの存在下において340ｎｍでＮＡＤＨ酸化をスペクトルでモニタすることにより、イサチンをフェレドキシンレダクターゼおよびフェレドキシンのための電子受容体とデモンストレーションした。アッセイは、以下のように行った：0.97ｍｌの50ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ7.5、100ｕＭのＮＡＤＨ、レドックス酵素成分およびイサチン。いくつかの実験において、ＮＤＯ基質（Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−１−ナフタレン［（Ｒ）−ＴＨＮ］の存在下でＮＡＤＨも測定した。イサチンまたは基質の不在下においては、全くＮＡＤＨの酸化は観察されなかった。スペクトルをモニタすることにより測定したように、どのアッセイにおいても、イサチンにより濃度が変化しなかった。以下の表３に結果が要約されている。
0004080533.tif 000005
これらの結果は明らかに、イサチンがＮＡＤＨの酸化を媒介していることを示している。イサチンはいかなる化学変化も経験しないので、ＲｄおよびＦｄ成分によるレドックスサイクラーとして機能する。
実施例４
一般的な塩基により触発されたイサチンの加水分解のデモンストレーション
一般的な塩基の触媒作用によるイサチンの加水分解が、いくつかの異なる濃度のＫＰＯ4緩衝液ｐＨ７および37℃で示された。それぞれ、302および368ｎｍでのイサチンの消失およびイサチン酸の出現をモニタすることにより、加水分解をスペクトルで追跡した。イサチンの出発濃度は250ｕＭであった。以下の表は、速度を要約しており、速度の緩衝液濃度への依存性を示している。この表はまた、全てｐＨ７および37℃での、多くの他の陰イオンおよび緩衝液に関するイサチンの加水分解の速度を示している。速度は、半減期（ｔ1/2）として表されている。表４は、緩衝液中のイサチンの加水分解速度を要約するものである。
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実施例５
イサチンヒドロラーゼを産生する微生物の単離
イサチンヒドロラーゼ産生微生物を、インディアナ州テレホウトのクレオソートプラントで採集した土壌試料から単離した。単離は、１ｇの土壌試料および唯一の炭素源およびエネルギー源としての1.7ｍＭのインドールを含有する最小塩培地［Stanier等（1957）J.Cell Comp.Phys. 49:25］を用いて集積プロトコルにより行った。液体集積培養物の三連続の継代後、微生物を、唯一の炭素源としてのインドールとともに1.5％最小塩培地である寒天平板上で液体培養物を平板培養し、続いて、ＬＡ平板上で増殖しているコロニーを平板培養し、最後に、インドールを含有する1.5％最小塩培地平板に、ＬＡ平板からの一つのコロニーより由来の細胞を線条接種することにより精製した。集積および精製は、30℃で行った。単一のコロニーより由来し、インドールを有する元の最小塩培地内で培養された全細胞は、イサチンヒドロラーゼ活性を示した。このアッセイが実施例６に記載されている。このコロニーを菌株ＷＷ２と称した。
実施例６
実施例５において単離した微生物の全細胞（ＷＷ２）のイサチンヒドロラーゼ活性のデモンストレーション
1.7ｍＭのインドールを含有する最小塩培地内で増殖した細胞を遠心分離した。細胞の沈殿をＯＤ600が２となるまで50ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5中に再懸濁させた。細胞サスペンションのアリコートに、200μＭの濃度までイサチンを加えた。30秒未満でオレンジ色が消えた。遠心分離により、この試料から細胞を除去し、上澄みのスペクトルを記録した。このスペクトルは、真正のイサチン酸と同一であった。ＨＰＬＣ分析により、生成物の同一性を確認した。
実施例７
ＷＷ２の無細胞アッセイにおけるイサチンヒドロラーゼ活性および見かけの天然分子サイズのデモンストレーション
実施例５において単離し、1.7ｍＭのインドールを含有するＬＢ培地中または1.7ｍＭのインドールを含有する最小塩培地中のいずれかで増殖した微生物の、50ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5中の１：４細胞ホモジネートを、細胞をフランス受圧器内で粉砕することにより調製した。ホモジネートを直接的にアッセイしたか、またはホモジネートの100,000ｇの遠心分離後に上澄みおよび沈殿をアッセイした。全ホモジネートおよび高速上澄み中において、イサチンヒドロラーゼ活性が見られた。高速沈殿物においては、５％未満の活性が検出された。細胞を豊富または最小培地中で増殖させた場合に、等しい活性が検出された。インドールが存在しない豊富培地中で増殖した細胞は20分の１の活性を有し、インドールが酵素活性を誘発することを示した。
見かけの天然分子サイズを以下のように測定した。上記からの粗製ホモジネートを50ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ7.5中の０から500ｍＭのＮａＣｌグラジエントによりＤＥＡＥセルロース上で分画した。酵素活性が約175ｍＭのＮａＣｌで溶離したが、この一つの工程の最中に酵素活性の85％が失われた。集積され、透析された分画をさらに、30％から40％のＮＨ4ＳＯ4沈殿により分画した。元の活性の約10％に活性が損失した。試料のＴＳＫ  Ｑイオン交換クロマトグラフィーによるさらなる処理により、同一の緩衝液中の０から500ｍＭのＮａＣｌグラジエントによる溶離で元の活性の1.4％が得られた。この残りの活性を最終的にセファロースＳ−１００ゲル濾過カラムに施した。約30から40,000Ｄａの見かけの分子量に対応する酵素活性が溶離した。上述した工程を、分光光学的酵素アッセイによりモニタした。50ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ7.5中において、イサチンの消失またはイサチン酸の発生のいずれかが、それぞれ、302ｎｍまたは368ｎｍでモニタできた。展開したゲルに、実施例１４に記載する５，７−ジメチルイサチン中に予め浸漬したニトロセルロース膜を重ねることにより、7.5％の天然アクリルアミドゲル上に活性を検出することができた。桃色の膜に白色点が表れたことにより、酵素を位置付けた。この桃色は、20分間に亘り3.5ｍｇ／10ｍｌの50ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ7.5、５，７−ジメチルイサチン溶液とともに膜を定温培養することにより与えられている。
実施例８
イサチンヒドロラーゼを産生する、ＷＷ２からの抽出物による生転化物からの使用済培養液の処理によるインジゴ産生量の増加
培養液を実施例１のように採集した。細胞を、フランス受圧器および100,000ｇでの遠心分離により破壊することにより調製した、菌株ＷＷ２からの細胞質ゾル細胞抽出物を培養液および大腸菌宿主細胞に加え、インドールを添加する前に１時間に亘り接触させた。インジゴの産生速度を測定した。これが表５に示されている。
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これらデータは、イサチンをイサチン酸に転化できる酵素による処理で、インジゴの産生の抑制が除かれることを示している。
実施例９
シュードモナスプチダＷＷ２からの細胞質ゾル抽出物の存在下でトリプトファンをインジゴに生転化する最中のイサチン濃度の減少のデモンストレーション
シュードモナスプチダ菌株ＷＷ２の細胞を、インドールを加えた最小塩培地内の10Ｌの発酵槽中で増殖させた。ＯＤ600が４の細胞が得られた。細胞を収穫し、フランス受圧器および10,000ｇでの遠心分離を用いて１：１のサスペンションとして細胞を破壊することにより抽出物を調製した。16時間後に、この抽出物を4.5時間に亘り30分間隔で50ｍＬのアリコートでＦＭ５／９１１−ＩＳＰ、ｐＣＬ−ＩＳＰ＃１４によるトリプトファンのインジゴへの生転化物に加えた。１時間以内に、イサチンの濃度が0.4ｍＭから0.06ｍＭに降下した。同一の間隔で、対照タンク内のイサチンの濃度は0.95ｍＭに上昇した。イサチンのレベルは、ＮＤＯ活性に対して抑制的であることが知られている。加水分解産生物であるイサチン酸は、実験タンク内で0.16ｍＭから1.64ｍＭまで上昇し、一方で対照タンクにおいては、その濃度は0.5ｍＭを越えることはなかった。この実験により、イサチンヒドロラーゼが、発酵中に培養液内のイサチンのレベルを著しく減少させ得ることが示された。この実験はまた、発酵が終了した時点でのイサチンとイサチン酸との合計が７ｍＭより大きく、一方で対照タンクにおいてはこの合計が２ｍＭ未満であったので、イサチンヒドロラーゼがない状態においては、イサチンが他の産生物に転化されるかもしれないことを示唆している。この発見は、イサチンヒドロラーゼが存在しない発酵においてインジルビンが高レベルで観察されたことと一致している。インジルビンは、イサチンとインジゴの前駆体であるインドキシルとの反応から形成することができる。
実施例１０
ＷＷ２と称する微生物の分類
実施例５において単離した微生物をＧＣ−ＦＡＭＥおよびバイオログ（登録商標）により分類した。これらの方法は、それぞれ、この微生物がシュードモナスマージナリス（marginalis）またはシュードモナスプチダＡ１型であることを示した。ホスホリパーゼＣ活性に関するアッセイ［R.M.Berka, G.L.GrayおよびM.L.Vasil（1981）「Studies of phospholipase C（heat-labile homolysin in Pseudomonas aeruginosa）」Infection and Immunity 34:1071-1074］およびゼラチン液化活性［R.N.Krieg, ed.,（1984）Berey's Manual of Systematic Bacteriology, vol.1（J.G.Holt, series ed.）, Williams and Wilkins, Baltimore, 163-165頁］は、その種がシュードモナスプチダであることを示している。ＧＣ−ＦＡＭＥおよびバイオログ試験は、マイローブイノテックラボラトリーズインク（Mirobe Inotech Laboratories, Inc.）により行われた。したがって、ＷＷ２の新しい呼び名は、シュードモナスプチダＷＷ２である。
実施例１１
イサチンヒドロラーゼ活性を含有するＤＮＡ断片の単離
全ＤＮＡを、HarwoodおよびCuttingの方法［（1990）Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley, New York, 140-145頁］により実施例５に記載した微生物から単離した。続いての全てのＤＮＡ操作は、Sambrook等［（1989）Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Springs Harbor Laboratory］に見られる標準的なプロトコルにより、またはキットの製造業者により指示されたように行った。37℃で１時間に亘りＤＮＡ10μｇ当たり0.25ユニットのＳａｕ３Ａ制限エンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ）を用いて、ＤＮＡを部分的に消化した。消化したＤＮＡをアガロースゲル上で分画し、１から10ｋｂまでの断片を電気溶離により単離した。ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（ファーマシア、カタログ番号27-5007）を用いて、プラスミドライブラリーを構築した。連結混合物を、コンピテントSure Cell（ストラタジーン、カタログ番号200238）中に形質転換し、これを続いて、１ｍｌ当たり50μｇのカルベニシリン、および50μｇのインドール、並びに１ｍＭのＩＰＴＧを含有する40の、15ｃｍ２ＹＴ平板上で平板培養した。37℃で一晩増殖させた後、10ｍｇ／ｍＬのライソザイムおよび25ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液を軽く吹き付け、室温で20分間に亘り定温培養することにより、コロニーを溶解した。次いで、部分的に溶解した細胞に、50ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5および２ｍＭの５，７−ジメチルイサチン（５，７−ジメチルイサチンは、エタノール中で作成した20ｍＭの原液から加えられた）中に20から30分間に亘り含浸したニトロセルロースフィルタを重ね合わせた。陽性のクローンを、桃色の背景において脱色した点として確認した。3,000のうち合計で三つのクローンを確認した。採取したコロニーを、中実のＬＢ平板上での二回のコロニー精製により精製した。以下の実施例１２に記載するようにイサチンヒドロラーゼ活性をデモンストレーションした後、クローニングしたＤＮＡの制限分析により、サイズが約6.8ｋｂであることが示された。サブクローニングにより、2.3ｋｂの断片と、実施例１２に記載する全細胞アッセイにおいてアッセイしたときにイサチンヒドロラーゼ活性を示す１ｋｂの断片とが得られた。その後、１ｋｂの断片の完全なヌクレオチド配列を決定した。これが図３に示されている（配列番号１）。このアミノ酸配列を、配列番号２に示したように演繹した。
実施例１２
微生物をクローニングする大腸菌内のイサチンヒドロラーゼ活性のデモンストレーション
実施例１１で確認した陽性クローンの全細胞を、培地がカルベニシリンを含有するＬＢであることを除いて、実施例６と同様にイサチンヒドロラーゼ活性についてアッセイした。ＩＰＴＧは、全長断片または2.3ｋｂ断片を含有する細胞を導入する必要がなかった。このことは、これらの単離したＤＮＡ断片が内因性プロモーターを含有したことを示している。しかしながら、サブクローニングした１ｋｂの断片には、最大活性を発現するためにＩＰＴＧが必要であった。
実施例１３
プラスミドｐＣＬ−ＩＳＴ１の構築
図７に示すように、このプラスミドを、プラスミドｐＡＫ１をＳａｌＩにより消化し、ｔｎａＡ構造遺伝子を含有する3.2ｋｂの断片を単離し、アガロースゲルの電気泳動を行い、この断片を、ＳａｌＩにより線状化した後のプラスミドｐＣＬ−ＩＨ−Ｓ１中に連結することにより構築した。
実施例１４
プラスミドｐＣＬ−ＩＨＡの構築
図８に示すように、このプラスミドを、プラスミドｐＴｒｃ−ＩＨ＃２、ｐＭＢ２１９０およびｐＣＬ１９２０から二工程で構築した。プラスミドｐＭＢ２１９０［Darzins等（1986）Gene 42:293-302］およびｐＴｒｃ−ＩＨ＃２をＥｃｏＲＩにより消化し、続いて、連結および形質転換を行うことにより、プラスミドｐＴｒｃ−ＩＨ＃２−ｋａｎを担持する、アンピシリンおよびカナマイシンに対して抵抗性を有するコロニーを単離することができた。このクローニング工程により、イサチンヒドロラーゼ遺伝子を含有するｐＴｒｃ−ＩＨ＃２−ｋａｎから2.5ｋｂのＳａｌＩ断片を単離することができた。次いで、この断片をｐＣＬ１９２０ベクターの特異的なＳａｌＩ部位にクローニングして、産生物の一つとしてｐＣＬ−ＩＨＡを産生した。
実施例１５
イサチンヒドロラーゼ遺伝子を収容する2.3ｋｂ断片を含有する菌株からの培養液の発酵によるインジゴ産生の抑制の欠如
産生宿主の形質転換
大腸菌菌株の形質転換を、Manniatis等のMolecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 250頁（1982）に記載されたように、細胞をコンピテントにするＣａＣｌ2方法を使用することにより行った。
インジゴを産生する生転化をＦＭ５（９１１−ＩＳＰ）およびＦＭ５（９１１−ＩＳＰ，ｐＣＬ−ＩＨＡ）について行った（図８）。この第一の菌株は、イサチンヒドロラーゼに関する遺伝子を含有しない対照菌株であり、第二の菌株は、イサチンヒドロラーゼ遺伝子を収容する2.3ｋｂのＤＮＡ断片を含有していた。培養液および細胞を各々の発酵物から採集し、培養液に実施例１のようにグルコースを補給した。次いで、これらの細胞を、グルコースを補給した培養液中、または実施例１のインジゴ振とうフラスコアッセイ用の緩衝液中のいずれかに再懸濁させた。これらの結果が表６に示されている。
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緩衝液と培養液とを比較するデータは、イサチンヒドロラーゼを収容する菌株からの培養液はインジゴ産生に対して抑制的ではなく、イサチンヒドロラーゼを含まない菌株からの培養液は抑制的であることを示している。
実施例１６
イサチンヒドロラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列
実施例１１において単離した１ｋｂの断片のＤＮＡ配列を、チェインターミネーター法［Sanger等（1977）Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74:5463-5467］を改良した方法により決定した。780ｂｐからなる読み取り枠（ＯＲＦ）を同定した。それぞれ、144ｂｐの５’−非翻訳ＤＮＡおよび82ｂｐの３’−非翻訳ＤＮＡがあり、クローニングされたＤＮＡに関して合計で1006ｂｐとなった。配列データが図３（配列番号１）に示されている。
実施例１７
イサチンヒドロラーゼの精製
１ｋｂのＤＮＡ断片によりコード化された酵素を部分的に精製した。これは、枠内の６つのヒスチジンコドンを実施例１４に記載したＯＲＦの５’末端に接合することにより１ｋｂの断片を修飾し、ＩＰＴＧ誘発条件下でこの構築物により形質転換された細胞を増殖させることによって行った。細胞を50ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5中に、一部が細胞ペレットであり、一部が緩衝液である状態に懸濁させ、フランス受圧器内で破壊した。さらにホモジネートを等量の同一の緩衝液により希釈し、100,000ｇで遠心分離した。製造業者の推奨にしたがってＮｉ−ＮＴＡ樹脂カラム（カリフォルニア州、QIAGEN,Inc.,）に高速上澄みを通過させた。酵素活性がカラムに結合した。精製を、Ａ280が0.04吸光度単位未満に低下するまで、カラムをｐＨ6.0での50ｍＭのＮａホスフェート、300ｍＭのＮａＣｌ、10％のグリセロール（洗浄緩衝液）により洗浄することにより行った。次いで、このカラムを50ｍＭの洗浄緩衝液中の０−0.5Ｍのグラジエントのイミダゾールにより溶離した。イサチン加水分解により検出された、酵素活性を含有する分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ［U.K.Laemmli（1970）Nature 277:680-685］上で電気泳動させた。銀染色ゲルにより、33,000Ｄａで主要帯域が示され、ほとんどの純粋な分画内では他の成分は微量しか示されなかった。これらの結果は、実施例７に記載した天然微生物からのタンパク質の分子量測定と一致している。この場合、ゲル浸透クロマトグラフィーにより、イサチンヒドロラーゼ活性を示すタンパク質に関して30から40ｋＤａの推測が得られた。これらの結果を組み合わせると、イサチンヒドロラーゼは天然状態で単量体であることが言える。
実施例１８
インジゴ発酵におけるイサチンヒドロラーゼによるインジルビンレベルの減少のデモンストレーション
14Ｌの発酵槽内の発酵を、イサチンヒドロラーゼの遺伝子を含有するインジゴ産生菌株またはこの遺伝子を含まないインジゴ産生菌株のいずれかについて通常のように行った。試料を発酵時間の関数として採集し、以下のように分析した：１ｍｌの発酵培養液を15分間に亘り12,000ｇで遠心分離し、上澄みを除去し、ペレットをＴＨＦ／ＤＭＳＯ（１／１；１ｍｌ）中で１分間に亘り渦流で再懸濁させた。この混合物を12,000ｇで再度遠心分離した。実施例２０に記載するように、ＨＰＬＣ分析にこの上澄みを用いた。
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同一の方法により、多数の発酵槽についてさらに終点分析（約48時間、発酵の通常の終了）を行った。これらの結果が以下の表に報告されている。
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結論：  これらの実験は、イサチンヒドロラーゼ遺伝子をインジゴ産生菌株に加えることにより、インジルビンのレベルが二分の一以下に減少することを示している。
実施例１９
大腸菌発酵工程からのインジゴで染めたデニム内のイサチンヒドロラーゼによるインジルビンレベルの減少のデモンストレーション
インジゴ染めデニムのインジルビンレベルは、染色された布の赤い色合いおよび「さらした風合い（bleached out）」のファッションルックを達成するインジゴ染めデニムの漂白に対する抵抗性と関連する。以下の実験は、イサチンヒドロラーゼのある場合よりもない場合のほうが、大腸菌発酵工程からのインジゴで染めたデニム内のインジルビンのレベルが大きいことを示している。デニム試料内のインジルビンのレベルを以下のように測定した：２グラムのデニムをソックスレー装置内の150ｍｌのエタノールにより1.5時間に亘り抽出した。抽出物を回転蒸発器内で完全に乾燥させ、実施例２０によるＨＰＬＣ分析のために１ｍｌのＴＨＦ：ＤＭＳＯ溶剤中に入れた。
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これらの結果は、インジルビンレベルが、より低いレベルのインジルビンを含有するインジゴで染めたデニムのほうが低いことを示している。相関関係は線形ではなく、この関係を制御する要因は完全には理解されていない。追加の質的な観察結果（染色工業における熟練者による）は、量的な観察結果と一致している。
実施例２０
インジゴ染めデニムのさらした風合いへのインジルビンの影響のデモンストレーション
インジゴでデニムを染める典型的な方法
１．  布の水和（予備染め条件）
Ａ．  ９インチ×15インチ（サンプル）のブルデニムを切断（染色浴当たり二枚）
Ｂ．  熱い水道水に一晩浸漬（最小１時間）
２．  染色浴調製
Ａ．  60ｇの20％ペーストを用いて原料混合物を調製。加熱板上で撹拌しながら以下を加える：
74.9ｇのＤＩ  Ｈ２Ｏ
23.0ｇの50％ＮａＯＨ
60.0gの20％インジゴペースト（５％のＮａＯＨ含む）
約70℃まで加熱する
8.16ｇの亜二チオ酸ナトリウムを加える
溶解するまで撹拌し、熱から除去する
Ｂ．  バランス溶液の調製（染色を行う容器を用いる）
4,383ｇの脱イオン水
25.3ｇの50％のＮａＯＨ
15.4ｇの亜二チオ酸ナトリウム
138.4ｇの原料混合物を加える
撹拌して混合し、次いで、混合を停止する
３．  染色工程
Ａ．  水に浸漬したサンプルを洗濯型水絞り機の間に押し込んで過剰の水を除去し、染色前に全てのサンプルの含水量を均一にする。
Ｂ．  サンプルを以下のプロトコルにしたがって浸漬する。サンプルを20秒間に亘り染色浴中に浸漬し、布を水絞り機に通過させることにより過剰の染色浴の液体を除去し、浸漬している間にロイコインジゴをインジゴに酸化させるために約３分間に亘り周囲空気に布を露出する（スカイングskying）。
（浸漬１から５までの初めと終わりを分および秒で示す浸漬スケジュールの表；水絞りおよびスカイングを浸漬の間に行う）
浸漬１    0:30 - 0:50
浸漬２    4:00 - 4:20
浸漬３    7:30 - 7:50
浸漬４   11:00 -11:20
浸漬５   14:30 -14:50
最後の浸漬の後に、水絞り機を通過させ、５分間に亘りスカイングを行う。
Ｃ．  冷水中に浸漬し、続いて熱水中に浸漬することにより濯ぐ。布に水絞り機を通過させ、乾燥させる。
Ｄ．  必要であれば、各々のサンプルを15枚の３インチ×３インチの正方形に切断する。
次亜塩素酸ナトリウムによりインジゴ染めサンプルを漂白（ファッションルックとするのに用いる漂白条件をシミュレートする）
漂白工程
Ａ．  漂白浴の調製
１Ｌの脱イオン水に対して2.6ｇの次亜塩素酸ナトリウム（次亜塩素酸塩は5.25％の原料溶液から加える）
50℃まで加熱
Ｂ．  浴の容量
布対漂白溶液の比率が１：50以下（10Ｌの漂白溶液当たり200ｇの乾燥布）
（適切な実施例において特定したように漂白を行う）
Ｃ．  添加時間
15枚の小さなサンプルを３枚の５つの群に分ける。最低で５分間に亘り脱イオン水中に予め濡らす。これらのうちの４つの群を漂白溶液に入れる。30、20、10および５分間の漂白時間のために、０、10、20および25分後に添加する。
Ｄ．  冷却および洗浄
サンプルを取り出して冷水中に入れる。
急いで濯いで、約２Ｌの10ｇ／Ｌの亜硫酸水素ナトリウムに入れる。
水で濯いで、約２Ｌの10ｇ／Ｌの漂白剤を含まないタイドを加える。
完全に濯ぐ。
サンプルを完全に乾燥させる。
Ｅ．  ハンターラボカラーメーターのＬ値の読み取り
インジルビンを10ｍｇおよび70ｍｇインジルビン／インジゴのｇで市販の化学的インジゴペーストに加えた。「添加された」染料をよく混合して、デニムの布をこの実施例２０に記載された染色および漂白プロトコルにしたがって染めた。色値を以下のように読み取った。これらのデータをプロットしたグラフが図９に示されている。
次亜塩素酸ナトリウムによるインジゴ染めデニムの漂白効率の評価
漂白効果をハンターラボカラーメーター（Hunter Associates Laboratory, Inc., Reston, Virginia）によりＬ値として測定した。Ｌ値は試料の「明度」を示すものであり、０が黒を示し、100が純粋な白を示す。それらの結果は、デルタＬ値で表されている。
ＨＰＬＣによるインジルビン濃度の測定
方法は以下のとおりである：カラム、250×4.6ｍｍ、ＲＰ−１８、５μｍ；254ｎｍで検出；使用した溶剤系、溶剤Ａ−90％水、10％アセトニトリル、２ｇ／Ｌテトラブチルアンモニウムブロミド、溶剤Ｂ−90％アセトニトリル、10％水、２ｇ／Ｌテトラブチルアンモニウムブロミド。
グラジエントプログラム：
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この系におけるインジルビンの保持時間は31.8分であり、インジゴは27.5分で溶離する。
図９のデータは、インジルビンが高レベルのときに、漂白が抑制されることを示している。その差は30分で小さく思われるけれども、当業者は、インジルビンを含むまたは含まないインジゴで染めた布を見れば、その差が著しいものであると認識する。インジルビンを含まないサンプルおよび10ｍｇのインジルビンが加えられたサンプルは仕様を満たしたが、インジルビンを70ｍｇ含むサンプルは仕様を満たさなかった。
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３】
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【図３ｆ】
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【図９】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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