(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラムL−１３７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３１７）の菌体とニゲロースを有効成分として含むＩＬ−１２産生誘導組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する菌またはその処理物とたとえば、ニゲロースまたはニゲロオリゴ糖類などの３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類を有効成分として含むインターロイキン１２（以下、ＩＬ−１２と略記する。）産生誘導組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー細胞刺激因子、細胞障害性リンパ球成熟因子などとも呼ばれ、Ｂ細胞、単球、マクロファージから産生される分子量約７０，０００の糖蛋白質である。その生物活性としては、静止期のＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのインターフェロンγ産生の誘導、ＮＫ細胞活性の亢進、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の誘導、静止期Ｔ細胞のレクチン刺激による細胞増殖能の充進、ナイーブＴ細胞からＴＨ−１細胞への分化の促進などが知られており、生体の免疫系に深く関与している物質である。
また、アレルギーや自己免疫疾患の発症機序の１つに、ＴＨ−１の活性がＴＨ−２の活性に比して低下した場合が有ると考えられており、ナイーブＴ細胞からのＴＨ−１細胞への分化促進、ＴＨ−１細胞の活性化を促進する作用を有するＩＬ−１２は、アレルギーや自己免疫疾患の発症を抑制する効果があると期待されている。
一方、従来から、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む糖類がいくつか知られている。例えば、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む多糖として、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の菌糸中に含有されるニゲラン、そのニゲランの部分酸加水分解等によって得られるα−Ｄ−グルコピラノース（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノース（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノース（１→３）−Ｄ−グルコース（以下、ニゲランテトラサッカライドと称する）をはじめとする様々な３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有するオリゴ糖、さらには、上記のニゲランの加水分解によっても得ることが可能であり、また、蜂蜜、麹汁、ビール等にも含有される、ニゲロースと称される３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコース（図解糖質便覧、７０頁）などである。
【０００３】
本発明者らは、これら３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類が、抗原受容体を介する刺激により活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球の活性をさらに上昇させ、また、菌体成分またはレクチンを認識する受容体を介する刺激により、抗原非特異的に活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球の活性をさらに上昇させることを見出し、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄグルコースを構成単位として含む糖類を有効成分として含有する免疫賦活剤の発明を完成し、既に特許出願をした（特開平９−５２８３４号）。
その後本発明者らは、乳酸菌の１種であるラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus  plantarum）Ｌ−１３７株の菌体がＴリンパ球共刺激作用を示すこと、また該菌体が抗原受容体を介する刺激により活性化されたＴリンパ球の活性をさらに上昇させ、抗原受容体以外の経路により抗原非特異的に活性化されたＴリンパ球の活性をも上昇させることを突き止めた。これらＴリンパ球の活性化に伴い、Ｔリンパ球のインターフェロン−γの産生が増強される一方、Ｂリンパ球への抗原受容体を介する刺激および抗原受容体以外の経路による活性化は抑制される事実も判明した。これとは別に該菌体がマクロファージのＩＬ−１２の産生を選択的に促進する作用を有していることも判明した。
【０００４】
すなわち、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体は、抗原受容体を介するＴリンパ球の活性化を上昇させることにより、生体内で常時起こっている微生物および腫瘍細胞に対する排除反応を高め、特にインターフェロン−γの産生を増強することから、ウイルスや腫瘍に対する防御能を高める。しかし、単独ではリンパ球はほとんど活性化しないことから、生体にとって好ましくない免疫応答を誘導せず、また、Ｂリンパ球の抗原受容体を介する活性化や抗原非特異的な活性化を抑制することにより、免疫賦活に伴い予測されるＢリンパ球のポリクロナールな活性化により誘導される自己免疫疾患等は増悪させない。
またラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体は、腫瘍細胞障害性を有するナチュラルキラー細胞を活性化するサイトカインであるＩＬ−１２のマクロファージからの産生を高める結果、腫瘍に対する防御能を特に高めるとともに、後天性免疫不全症候群（AIDS）の発症予防にも有用である。しかし腫瘍壊死因子αの産生は軽度にしか上昇させないため、通常のマクロファージの活性化剤により上昇する腫瘍壊死因子αにより引き起こされる、発熱、体重減少などの副作用を誘導しない。
これらの知見を基に、本発明者らは、ラクトバチルス属に属する菌またはその処理物を含む免疫賦活剤の発明を成し遂げ、既に特願平８−２８９３３３号として特許出願した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前述のとおり、本発明者らはラクトバチルス属に属する菌体にＩＬ−１２産生誘導促進効果の存することを見出したが、その効果は該菌単独では必ずしも充分なものではなく、より早く、より強力にその効果を発揮させる手段が他にないものかと鋭意研究を重ねてきた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そして、本発明者らはラクトバチルス属に属する菌体と併用することにより相乗効果を発揮させるような物質がないか種々検討を行ったところ、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位とする糖類、特にニゲロースが顕著な相乗効果を示すことを知見し、その知見に基づいて更に研究を重ねて本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３１７）の菌体とニゲロースを有効成分として含むＩＬ−１２産生誘導組成物である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられる菌は、ラクトバチルス属に属し、Ｂ細胞、単球、マクロファージのＩＬ−１２の産生を誘導、促進する作用を有するものであればどのような菌でもよい。
菌のマクロファージのＩＬ−１２産生促進作用は、たとえばマウス腹腔マクロファージを組織培養プレートで培養し、ラクトバチルス属に属する菌を添加し、一定期間培養して培地中のＩＬ−１２濃度をエンザイムイムノアッセイで測定することにより容易に判定することができる。
本発明に用いられるラクトバチルス属に属する菌の代表的なものとしてラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を挙げることができるが、この菌は工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年１１月３０日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３１７，微工研  菌寄第１５３１７号として寄託されており、その菌学的性質は特開平９−１６３９７７号に詳しく記載されている。さらにこの菌については、Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 73, No.3, 193-197(1992)及び Vol. 80, No.2, 124-130(1995)にも報告されている。
本発明に用いられるラクトバチルス属に属する菌は、天然培地、合成培地、半合成培地などの培地に培養することにより大量に得ることができる。
【０００８】
培地としては、窒素源および炭素源を含有するものが用いられる。窒素源としては、たとえば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等であり、炭素源としては、たとえば、グルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、水アメ、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等が用いられる。
このほか、無機質として、たとえば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン更に各種ビタミン類その他を添加することができる。
培養温度は２５〜４０℃、好ましくは２７〜３５℃であり、培養時間は１２〜４８時間程度であり、通気振盪してもよい。
培地のｐＨは３〜６、好ましくは４〜６である。培養終了後菌体を採取し蒸留水を加え、遠心分離などの手段により上清を除き、必要によりその操作を繰り返し、遠心分離や濾過等により菌体を採取する。
採取された菌体は生菌のまま、またはたとえば加熱、紫外線照射、ホルマリン処理などにより不活性化して投与に適した剤型にすることもできる。分離された生菌体、死菌体はさらに摩砕や破砕処理をし、得られた処理物を必要により加熱滅菌、無菌濾過し、濾液を凍結乾燥して製品とすることもできる。
菌体の処理物にはたとえば、上記摩砕物、破砕物、それらからの抽出液、凍結乾燥品が含まれる。
また、本発明に用いられる乳酸菌の一種、ラクトバチルス・プランタラム  Ｌ−１３７株は、元々発酵食品であるブロングイスダから分離されたものであり、食品、たとえば果菜類、穀類から選択された少なくとも１種または、果菜類や穀類を発酵可能な形態に処理したもの、たとえば切断物、粉砕物、摩砕物、搾汁、搾汁濃縮物を本発明において用いられる菌により発酵させた菌を含む発酵物をそのまま用いることができる。
【０００９】
本発明に用いられる他の有効成分は、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類であり、その具体例としては、前記したニゲロース、ニゲランテトラサッカライド、ニゲロトリオースなどのニゲロオリゴ糖が挙げられ、これらは単独または２種以上を併用して用いてもよい。
本発明の組成物における菌体またはその処理物と糖類の使用比率は重量比で１：１〜４００、好ましくは１：５〜１００である。本発明の組成物は、必要に応じて、さらに種々の添加剤、例えば、医薬の担体、賦形剤、ビタミン、アミノ酸、ミネラル、食物繊維、他の糖類、甘味料、香料、牛乳、脱脂粉乳などの乳成分を加えてもよい。
このようにして得られた本発明の組成物は、免疫力を高めまたは調節する食品や医薬剤としても利用可能である。用いる食品あるいは、食品成分、医薬担体または賦形剤は特に限定するものではなく、当該組成物の具体的用途に応じて当業者が適宜選択できる。また本発明の組成物の形態も特に限定するものではなく、具体的用途に応じて種々の固体や液体の形態とすることができる。本発明の組成物は、医薬として用いる場合、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの経口投与、あるいは注射剤などの非経口投与が考えられるが、経口投与の場合、本発明の菌体またはその処理物を１ｍｇ〜５ｇ、好ましくは４ｍｇ〜４ｇおよび本発明の糖類を４ｍｇ〜４０ｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１０ｇ含む製剤を、また注射剤の場合は、菌体またはその処理物を０．１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜５００ｍｇ、糖類を２ｍｇ〜２０ｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１０ｇ含む注射液を、成人１日当たり１〜数回に分けて投与することにより、副作用を伴うことなく所期の目的を達することができる。
本発明の組成物を食品として用いる場合、調味料、畜肉加工品、水産加工品、農産加工品、ステープル、調味食品、調味済食品、デザート類、乳油製品、菓子、スナック菓子等の形態で提供することも可能である。
本発明のＩＬ−１２産生誘導組成物は、たとえば、ウイルス、バクテリヤ等の微生物による感染症や各種悪性腫瘍などの予防・治療や免疫力調整に有効である。
【００１０】
【実施例】
以下に参考例、実施例および試験例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
参考例１
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥菌体の製造方法
乳酸菌培養培地であるＧＹＰ培地のグルコースの代わりにスターチを加えた培地２００ｍｌにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして１重量％接種し、３２℃で２４時間前培養を行った。ついで、６ＬのＧＹＰ培地に前述の培養液をスターターとして１重量％接種し、３２℃にて２４時間静地培養した。培養後、５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離し、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、５０００ｒｐｍで３５分遠心分離したのち、上清を除き菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散し、７０℃で１０分間殺菌した。これを凍結乾燥し、乾燥菌体を７.０７ｇ得た。
【００１１】
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調製法
水を除く上記各成分に純水５００ｇを加えて撹拌し、１０分間超音波処理をして懸濁溶解させ、さらに水を加えて全量を１０００ｇにした後、６５℃で１０分間殺菌して清涼飲料水を得た。
【００１２】
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調製法
上記各成分の粉末を各配合量均一に混合し、造粒破砕後乾燥して顆粒剤を得た。
【００１３】
実施例３
錠剤の処方ならびに調製法
実施例２で得られた顆粒剤９９ｇにステアリン酸カルシウム１ｇを混合し、打錠機で圧縮整形して９００ｍｇの錠剤を得た。得られた錠剤は１錠当たり、ニゲロースを約１８０ｍｇ、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体を約９ｍｇ含有する。
実施例４
注射剤の処方ならびに調製法
ニゲロース５０ｇ、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥菌体０.２ｇを精製水１０００ｍｌに懸濁させ、超音波処理した後、凍結乾燥した。この凍結乾燥物を５００本のバイアル瓶に分注して注射剤を得た。この注射剤１バイアルには凍結乾燥物１００.４ｍｇが含まれており、２ｍｌの生理食塩水に容易に懸濁溶解した。
【００１４】
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調製法
上記各成分の配合量を均一に混合し、ゼラチンカプセルに充填した。カプセル１個当たり、ニゲロースを２５０ｍｇ、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体を３０ｍｇ含有する。
【００１５】
試験例１
マウス腹腔マクロファージのＩＬ−１２産生誘導に対するラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とニゲロースの相乗効果
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、１６週齢）の腹腔内に無菌的にＲＰＭＩ  １６４０培地を注入し、腹部をよく揉んだ後、注入したＲＰＭＩ  １６４０培地を回収し腹腔細胞浮遊液を得た。腹腔細胞浮遊液の細胞数とそれに含まれるマクロファージの割合を自動血球計測装置で測定した後、マクロファージとして１×１０6／ｍｌの細胞数にＲＰＭＩ  １６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。３７℃の５％炭酸ガス培養器内に２時間放置し、腹腔マクロファージを各穴に付着させ、２時間後にＲＰＭＩ  １６４０培地で洗浄後、ＲＰＭＩ  １６４０培地を１穴当たり１００μｌ加えた。
これにＲＰＭＩ  １６４０培地（対照）あるいはラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を０.４あるいは４μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ  １６４０培地に溶解した液をそれぞれ１穴当たり５０μｌ加えた。さらに、ＲＰＭＩ１６４０培地（対照）あるいはニゲロースを１２８、６４０あるいは３２００μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ  １６４０培地に溶解した液を１穴当たり５０μｌ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で１５時間培養し、培養後の培養上清のＩＬ−１２をエンザイムイムノアッセイで測定した。
【００１６】
エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスＩＬ−１２ IgG2a 抗体（Genzyme 社製）をホウ酸緩衝液で６μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え３７℃で１日間放置しラット抗マウスＩＬ−１２ IgG2a 抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。培養上清を１穴当たり５０μｌ加え室温で９０分間放置し、培養上清のＩＬ−１２をプレートに付着したラット抗マウスＩＬ−１２ IgG2a 抗体と結合させた。洗浄後ラット抗マウスＩＬ−１２ IgG2a 抗体（Genzyme 社製）を加え、プレートに結合させたＩＬ−１２に結合させた。洗浄後ペルオキシダーゼで標識した抗ラットIgG1抗体を加え、プレートに結合させたラット抗マウスＩＬ−１２ IgG1 抗体に結合させた。洗浄後、過酸化水素０.００６％とオルトフェニレンジアミン０.１％を含有するリン酸緩衝液を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を１.５Ｎ硫酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４９２ｎｍを測定し、リコンビナントマウスＩＬ−１２で作成した標準曲線から、培養上清中のＩＬ−１２の濃度を求めた。〔表１〕にその結果を示す。
【００１７】
【表１】
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〔表１〕から明らかなごとくラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体は単独でもマクロファージからのＩＬ−１２の産生を誘導したが、ニゲロース単独ではその作用はなかった。しかし、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体にニゲロースを添加すると、ＩＬ−１２の産生がラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体単独にくらべ大幅に上昇し、ＩＬ−１２産生誘導におけるラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とニゲロースの相乗効果が検証された。
【００１８】
試験例２
血中ＩＬ−１２の上昇に対するラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とニゲロースの相乗効果
２１週齢、雌性のＤＢＡ／２マウス（１群５匹）に連続して４日間毎日、（１）生理食塩水０.４５ｍｌ、（２）ニゲロースを１００ｍｇ／ｍｌの濃度に生理食塩水で調製した溶液０.３ｍｌ、（３）ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を１ｍｇ／ｍｌの濃度に生理食塩水で調製した溶液０.１５ｍｌ、および（４）ニゲロースを１００ｍｇ／ｍｌの濃度に生理食塩水で調製した溶液０.３ｍｌとラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を１ｍｇ／ｍｌの濃度に生理食塩水で調製した溶液０.１５ｍｌをそれぞ腹腔内投与した。４日目の投与の４時間後にマウスの眼底静脈から採血し、血漿を分離し、ＩＬ−１２をエンザイムイムノアッセイで測定した。結果を〔表２〕に示す。
【００１９】
【表２】
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〔表２〕から明らかなごとく、ニゲロース単独使用では有意な血漿ＩＬ−１２の上昇は認められなかったが、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体単独使用では有意な血漿ＩＬ−１２の上昇がみられ、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とニゲロースを併用すると、血漿ＩＬ−１２が顕著に上昇し、血中ＩＬ−１２上昇におけるラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とニゲロースの相乗効果が検証された。
【００２０】
【発明の効果】
本発明においては、単独投与では有意なＩＬ−１２産生誘導活性を示さない３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類を、ラクトバチルス属に属する菌体またはその処理物と併用して投与することにより、ＩＬ−１２産生誘導活性に対する顕著な相乗効果が奏される。