(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コプリヌス・ミカセウスCBS 816.95株から得られるか、またはコプリヌス・ミカセウスCBS 816.95株から生産可能である、アルカリ性条件下でセルロース分解活性を有する酵素製剤。
【請求項２】
前記酵素がエンドグルカナーゼである、請求項１に記載の酵素製剤。
【請求項３】
染色した織物の色濃度に局部的変化を与える方法であって、請求項１又は２に記載の酵素製剤を使って前記織物を処理することを含んで成る方法。
【請求項４】
紙パルプの水性懸濁液の排水を改善する方法であって、請求項１又は２に記載の酵素製剤を使って紙パルプを処理することを含んで成る方法。
【請求項５】
再生紙の脱インク方法であって、請求項１又は２に記載の酵素製剤を使って前記紙を処理することを含んで成る方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の酵素製剤の製造方法であって、コプリヌス・ミカセウス株を適当な栄養培地中で培養し、そして得られた培地から酵素組成物を回収することを含んで成る方法。
【請求項７】
布を処理する方法であって、請求項１又は２に記載の酵素製剤を使って前記布を処理することを含んで成る方法。
【請求項８】
洗剤組成物であって、請求項１又は２に記載の酵素製剤と、界面活性剤と、場合により金属イオン封鎖剤、無機塩類、追加の酵素、酵素活性化剤または促進剤、塩素捕捉剤または還元剤、漂白剤、漂白促進剤、可溶化剤、香料、酸化防止剤、顔料および水から成る群より選ばれた１または複数の成分とを含んで成る洗剤組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、アルカリ性セルロース分解活性を有する酵素製剤を含んで成る洗剤組成物、セルロース分解酵素製剤を使うことによる織物の処理方法、セルロース分解酵素製剤を使うことによる紙パルプの処理方法、コプリヌス科（Coprinaceae）およびボルビチウス科（Bolbitiaceae）に属する真菌から得られるまたは生産可能である酵素製剤、並びに例えば洗剤工業、繊維工業および紙パルプ工業における前記酵素製剤の利用に関する。
発明の背景
セルラーゼまたはセルロース分解酵素はセルロースの加水分解に関与する酵素である。天然のセルロースの加水分解には、３つの主な種類のセルラーゼ酵素、すなわちセロビオヒドロラーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、EC 3.2.1.91）、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ、EC 3.2.1.4）およびβ−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.21）が関与していることが知られている。
セルラーゼは、真菌、放線菌、粘液菌および真正細菌を包含する多数の微生物により合成され、更には植物によっても合成される。特に種々様々な特異性を有するエンドグルカナーゼが同定されている。
セルロース分解酵素の非常に重要な工業的用途は、例えば洗剤組成物または織物柔軟剤組成物中の成分としての、セルロース系繊維または織物の処理への利用、新織物のバイオポリッシュ（衣料仕上げ）への利用、およびセルロース含有織物（特にデニム）の「ストーンウオッシュ」様外観を得るための利用、並びにそのような処理のための幾つかの方法への利用が提案されている。例えば、GB-A-1368 599, EP-A-0 307 564およびEP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO 91/10732, WO 91/17244, PCT/DK95/000108およびPCT/DK95/00132を参照のこと。
セルロース分解酵素の別の重要な工業的用途は、例えば排水を改善するためのまたは再生紙の脱インキのための、紙パルプ処理への利用である。
特にエンドグルカナーゼ（EC番号3.2.1.4）は、言及した工業的用途への興味深いヒドロラーゼの群を構成する。エンドグルカナーゼはセルロースやセルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース）およびリケニン中の１，４−β−Ｄ−グリコシド結合、並びに混合β−１，３−グルカン、例えば穀物のβ−Ｄ−グルカンまたはキシログルカンおよびセルロース系部分を含む他の植物材料中のβ−１，４結合のエンド加水分解を触媒する。正式名称はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカン４−クルカノヒドロラーゼであるが、本明細書中では略式名称エンドグルカナーゼを使用する。
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第１巻，169〜196頁を参照されたい。
真菌エンドグルカナーゼは多数の刊行物に記載されており、それらとしては特に、例えばフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachi atum）、アスペルギルス・アクレータス（Aspergillus aculeatus）、ネオカリマスチクス・パトリシアルム（Neocallimastix patriciarum）のような種に由来するもの、およびピロマイセス（Piromyces）、フミコーラ（Humicola）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ゲオトリカム（Geotricum）、ペニシリウム（Penicillium）、イルペクス（Irpex）属の種に由来するものが挙げられる。
コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）由来のセルラーゼは、例えば、Mardi Research Journal, 21(2), 1993, 179〜186頁；Mycological Research（1991）, 95, P.9, 1077〜81頁；およびEuropean Journal of Biochemistry（1988）, 174(4), 724〜732頁中に開示されている。更に、分類学における最新の発展によれば、コプリヌス・マクロリズス（Coprinus macrorhizus）とコプリヌス・フィメタリウス（Coprinus fimetarius）はコプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）の同義語であると見なすことができる。
セルラーゼ、好ましくはエンドグルカナーゼ活性が望ましい用途に用いることのできる新規セルラーゼ酵素製剤を提供する必要性が常に存在している。
本発明の目的は、好ましくはアルカリ性条件下で実質的なセルロース分解活性を有し、且つ紙パルプ加工、織物処理、洗濯工程および／または動物飼料において改善された性能を有する新規酵素製剤；好ましくは組換え技術により生産可能であるかまたは生産されると期待される新規セラーゼ、より好ましくはエンドグルカナーゼを提供することである。
発明の要約
驚くべきことに、コプリヌス節コプリヌス（Coprinus sect. Coprinus）と称するコプリナス属の節ではないコプリヌス科（Coprinaceae）およびボルビチウス科（Bolbitiaceae）の部分に属する種が、実質的セルロース分解活性、特にエンドグルカナーゼ活性を有する酵素製剤を生産することができるということを発見した。
より詳しくは、第一の観点では、本発明は、担子菌類（Basidiomycetous）のコプリヌス科（Coprinaceae）およびボルビチウス科（Bolbitiaceae）から選ばれた真菌から得られるかまたは生産可能であるアルカリ性条件下で実質的なセルロース分解活性を有する酵素製剤と界面活性剤とを含んで成る洗剤組成物に関する。
第二の観点では、本発明は、担子菌類のコプリヌス科（Coprinaceae）およびボルビチウス科（Bolbitiaceae）より選ばれた真菌から得られるかまたは生産可能である酵素製剤を使って織物を処理することによる、染色した織物の色濃度に局部的変化を与える方法に関する。
第三の観点では、本発明は、担子菌類のコプリヌス科（Coprinaceae）およびボルビチウス科（Bolbitiaceae）より選ばれた真菌から得られるかまたは生産可能であるアルカリ性条件下で実質的なセルロース分解活性を有する酵素製剤を使って紙パルプを処理することによる、紙パルプの水性懸濁液の排水を改善する方法および再生紙の脱インク方法に関する。
更なる観点では、本発明は、担子菌類のコプリヌス科（Coprinaceae）およびボルビチウス科（Bolbitiaceae）より選ばれた真菌であって、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）種に属さないことを条件とする真菌；好ましくはサチレラ（Psathyrella）属、ポダキシス（Podaxis）属、パネオルス（Paneolus）属、コプリヌス（Coprinus）属およびボルビチウス（Bolbititus）属に属する株の群より選ばれた真菌；より好ましくはコプリヌス属のコプリヌス節ヘメロビ（Coprinus sect. Hemerobi）、コプリヌス節セツロシ（Coprinus sect. Setulosi）、コプリヌス節ベスチティ（Coprinus sect. Vestiti）およびコプリヌス節ミカセイ（Coprinus sect. Micacei）の亜節に属する株の群より選ばれた真菌；特にコプリヌス・ミカセウス（Coprinus micaceus）、コプリヌス・ドメスチクス（Coprinus domesticus）、コプリヌス・エフェメルス（Coprinus ephemerus）、コプリヌス・ディスセミナタス（Coprinus disseminatus）、コプリヌス・ラディアンス（Coprinus radians）、コプリヌス・ピカセウス（Coprinus picaceus）、コプリヌス・フリセイ（Coprinus frisei）、コプリヌス・サブインパティエンス（Coprinus subimpatiens）、サチレラ・カンドレーナ（Psathyrella candolleana）、サチレラ・プロナ（Psathyrella prona）、パネオルス・セミオバツス（Panaeolus semiovatus）、ポダキシス・ピスチラリス（Podaxis pistillaris）およびボルビチウス・アレウリアタス（Bolbitius aleuriatus）の種に属する株の群より選ばれた真菌、から得られるかまたは生産可能である新規セルロース分解酵素製剤に関する。
更に、本発明の酵素製剤は、セルラーゼ、特にアルカリ性エンドグルカナーゼを必要とする任意の工業工程、例えばデニムのストーンウオッシュのように染色した織物の色濃度に局部的変化を与えるために、紙パルプの水性懸濁液の排水を改善するために、再生紙の脱インクのために、洗剤組成物においておよび織物柔軟剤において、有益であり得る。
発明の詳細な説明
特にアルカリ性条件下で実質的なセルロース分解活性を有する酵素を生産することができる真菌源の一次スクリーニングでは、真菌源（例えば土壌から得たもの）についてのスクリーニングは土壌希釈により、固形のChapek & Hetchinson培地上への土壌微粉、小粒子または植物の根による直接接種により行うことができ、そしてペトリ皿に入れた常用の固形培地上への単離培養物の接種により種を同定することができる。次いで、濾紙上での真菌増殖の目視検査または非晶質セルロースを含む固形培地上での透明帯の形成により、セルロース分解活性の存在を定性的に評価することができる。更に、寒天−非晶質酸膨潤セルロース上での28℃で７〜10日間の培養、pH9.5-10での0.1％AZCL-HE-セルロース（オーストラリア国Megazyme社より）を含む寒天中へのブロックの据付けと40℃での1/2〜２日間のインキュベーション、およびブロックの周りにできる青色の輪を観察することによるセルロース分解活性の目視検出により、アルカリ性条件下でのセルラーゼ活性の存在を評価することができる。
コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）IFO 30116株およびポダキシス・ピスチラリス（Podaxis pistillaris）ATCC 38868株は共に、本特許出願の優先権日には関連寄託機関の目録に発表されている商業的に入手可能な株であると思われる。
コプリヌス・ミカセウス（Coprinus micaceus）株は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定により、1995年12月19日に、CBS（Centraalbureau voor Schimmelcultures）, P.O. Box 273, NL-3740 AG Baarn; the Netherlandsに寄託番号CBS 816.95のもとに寄託された。
コプリヌス・ドメスチクス（Coprinus domesticus）株は、ブダペスト条約に従って、1995年12月19日に、CBS（Centraalbureau voor Schimmelcultures）, P.O. Box 273, NL-3740 AG Baarn, the Netherlandsに寄託番号CBS 817.95のもとに寄託された。
コプリヌス・エフェメルス（Coprinus ephemerus）株は、ブダペスト条約に従って、1995年12月19日に、CBS（Centraalbureau voor Schimmelcultures）, P.O. Box 273, NL-3740 AG Baarn, the Netherlandsに寄託番号CBS 821.95のもとに寄託された。
コプリヌス・ラディアンス（Coprinus radians）株は、ブダペスト条約に従って、1995年12月19日に、CBS（Centraalbureau voor Schimmelcultures）, P.O. Box 273, NL-3740 AG Baarn, the Netherlandsに寄託番号CBS 818.95のもとに寄託された。
ボルビチウス・アレウリアタス（Bolbitius aleuriatus）株は、ブダペスト条約に従って、1995年12月19日に、CBSに寄託番号CBS 820.95のもとに寄託された。
パネオルス・セミオバツス（Panaeolus semiovatus）株は、ブダペスト条約に従って、1995年12月19日に、CBS（Centraalbureau voor Schimmelcultures）, P.O. Box 273, NL-3740 AG Baarn, the Netherlandsに寄託番号CBS 819.95のもとに寄託された。
サチレラ・プロナ（Psathyrella prona）株は、ブダペスト条約に従って、1995年12月19日に、CBS（Centraalbureau voor Schimmelcultures）, P.O. Box 273, NL-3740 AG Baarn, the Netherlandsに寄託番号CBS 822.95のもとに寄託された。
サチレラ・カンドレーナ（Psathyrella candolleana）株は、ブダペスト条約に従って、1995年８月16日に、CBS（Centraalbureau voor Schimmelcultures）, P.O. Box 273, NL-3740 AG Baarn, the Netherlandsに寄託番号CBS 628.95のもとに寄託された。
酵素
本明細書中、「セルロース分解活性」という用語は、セルロースをグルコース、セロビオース、トリオースおよび他のセローオリゴ糖に分解するかまたはキシログルカン、リケニンおよびβ−グルカンのようなセルロース誘導体を分解する酵素の能力を指して言う。この能力は下記に明記する条件下でカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ゲルまたはAZCL−HE−セルロース中での透明帯の形成により決定することができる。
本明細書中、「酵素」という語は、成熟タンパク質またはそれの前駆体形に加えて本質的に全長酵素の活性を有するそれの機能的断片を含むものと解釈される。更に、「酵素」という用語は前記酵素の相同体を含むものである。そのような相同体は、親酵素、即ち親のセルラーゼのアミノ酸配列と少なくとも60％の一致度を示すアミノ酸配列を含んで成る。一致度は常法により決定することができ、例えばAltshul他，Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986並びにHenikoffおよびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992を参照のこと。簡単に言えば、ギャップの挿入ペナルティー10、ギャップの延長ペナルティー１およびHenikoff & Henikoff（前掲）の「ブロサム62」得点行列を使って整列の評点を最適にするように２つのアミノ酸配列を整列させる。
あるいは、酵素の相同体は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドプローブと下記条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるものであってもよい：５×ＳＳＣ中での予備浸漬、20％ホルムアミド、５×デンハーツ溶液、50mMリン酸ナトリウム，pH6.8および50μgの超音波処理した変性子ウシ胸腺ＤＮＡを含む溶液中での約40℃で１時間の予備ハイブリダイゼーション、次いで100μＭのＡＴＰが補足された同溶液中での約40℃で18時間のハイブリダイゼーション、次いで約45℃の温度で0.4×ＳＳＣ中での洗浄。
それらの条件下でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子は、標準的な検出方法（例えばサザンブロット法）を使って検出される。
本発明の酵素の相同体は１もしくは複数のアミノ酸の置換、削除または付加を有してもよい。それらの変更は好ましくは重要でない性質のもの、すなわち、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意な影響を与えない保存性アミノ酸置換；小規模の削除、典型的には１〜30アミノ酸の削除；小規模のアミノまたはカルボキシル末端伸長、例えば１つのアミノ末端メチオニン残基、約20〜25残基までの小型リンカーペプチド、または精製を容易にする小規模の伸長、例えばポリヒスチジン領域、抗原性エピトープまたは結合ドメインである。一般にFord他，Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991を参照のこと。保存性置換の例は塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えばグルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）および小型アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）のグループ内である。
当業者には、そのような置換が酵素分子の機能に重要な領域の外側で行われそしてまだ活性酵素を生じ得ることは明白であろう。本発明の酵素の活性に不可欠であり、従って置換を受けないのが好ましいアミノ酸は、当業界で既知の手順、例えば部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発（CunninghamおよびWells, Science 244, 1081-1085, 1989）に従って同定することができる。後者の技術では、分子内のあらゆる残基のところに変異を導入し、得られた変異分子をセルロース分解活性について試験して、該分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。核磁気共鳴法、結晶学または光親和性標識法のような技術により決定されるような結晶構造の分析によって、リガンド−レセプター相互作用部位も決定することができる。例えば、de Vos他，Science 255:306-312, 1992；Smith他，J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992；Wlodaver他，FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照のこと。
相同体は対立遺伝子変異体、すなわち突然変異から生じる遺伝子の別形態、または変異遺伝子によりコードされる改変酵素であって、本発明の酵素と実質的に同じ活性を有するものであることができる。よって、変異はサイレント（コードされる酵素に変化なし）であることができ、または変更されたアミノ酸配列を有する酵素をコードすることもできる。
酵素の相同体は、問題の種の細胞のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製し、そして例えばSambrook他，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989により記載されたような標準技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを使うことによって、またはSambrook他（前掲）により記載されたような特異的プライマーを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、該相同体の全部または一部をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることにより、単離することができる。
本発明の酵素は、単離された形、すなわち土壌、多分デンマークの森林の土というそれの本来の環境とは異なる状態で提供される。好ましい形態では、単離された酵素は他のタンパク質、特に真菌起源の他の酵素を本質的に含まない。本発明の酵素製剤は、例えば、真菌から単離することができる。
一態様では、本発明の酵素製剤は、担子菌類のコプリヌス科（Coprinaceae）およびボルビチウス科（Bolbitiaceae）より選ばれた真菌であって、ただしコプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）種に属さないことを条件とした真菌の上清から得ることができる。好ましい態様では、前記真菌はサチレラ（Psathyrella）属；ポダキシス（Podaxis）属；パネオルス（Paneolus）属；コプリナス（Coprinus）属、特にコプリヌス属のコプリヌス節ヘメロビ（Coprinus sect. Hemerobi）、コプリヌス節セツロシ（Coprinus sect. Setulosi）、コプリヌス節ベスチティ（Coprinus sect. Vestiti）およびコプリヌス節ミカセイ（Coprinus sect. Micacei）の亜節；並びにボルビチウス（Bolbititus）属に属する株の群から選ばれる。
特に好ましい態様では、本発明の酵素製剤は、コプリヌス・ミカセウス（Coprinus micaceus）、コプリヌス・ドメスチクス（Coprinus domesticus）、コプリヌス・エフェメルス（Coprinus ephemerus）、コプリヌス・ディスセミナタス（Coprinus disseminatus）、コプリヌス・ラディアンス（Coprinus radians）、コプリヌス・ピカセウス（Coprinus picaceus）、コプリヌス・フリセイ（Coprinus frisei）、コプリヌス・サブインパティエンス（Coprinus subimpatiens）、サチレラ・カンドレーナ（Psathyrella candolleana）、サチレラ・プロナ（Psathyrella prona）、パネオルス・セミオバツス（Panaeolus semiovatus）、ポダキシス・ピスチラリス（Podaxis pistillaris）およびボルビチウス・アレウリアタス（Bolbitius aleuriatus）の種に属する株の群から選ばれた真菌により；特に、コプリヌス・ミカセウス（Coprinus micaceus）CBS 816.95株；コプリヌス・ドメスチクス（Coprinus domesticus）CBS 817.95株；コプリヌス・エフェメルス（Coprinus ephemerus）CBS 821.95株；コプリヌス・ラディアンス（Coprinus radians）CBS 818.95株；ポダキシス・ピスチラリス（Podaxis pistillaris）ATCC 38868株；ボルビチウス・アレウリアタス（Bolbitius aleuriatus）CBS 820.95株；パネオルス・セミオバツス（Panaeolus semiovatus）（＝Ｐ．fimiputris）CBS 819.95株；サチレラ・プロナ（Psathyrella prona）CBS 822.95株；およびサチレラ・カンドレーナ（Psathyrella candolleana）CBS 628.95株により、生産されるかまたは生産可能である。
本発明の酵素製剤は実質的なセルロース分解活性を有し、すなわち該活性は言及されたセルロース分解活性のいずれであってもよい。好ましくは、セルロース分解活性はエンドグルカナーゼ活性である。
本発明の酵素製剤は、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、アラビナナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼ、エンドグルカナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびトランスグルタミナーゼから成る群より選ばれた１または複数の酵素を更に含んで成ることができる。
該酵素製剤は当業界で既知の手法を使ってアッセイすることができる。例えば、本発明の酵素製剤は約７より上の、より好ましくは約８より上の、特に約９より上の最適ｐＨを有する。
好ましくは、本発明の酵素製剤は直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウムおよびα−スルホ−脂肪酸エステルの存在下で安定である。
本発明の酵素製剤は、コプリヌス・ミカセウス（Coprinus micaceus）CBS 816.95、コプリヌス・ドメスチクス（Coprinus domesticus）CBS 817.95、コプリヌス・エフェメルス（Coprinus ephemerus）CBS 821.95、コプリヌス・ラディアンス（Coprinus radians）CBS 818.95、ポダキシス・ピスチラリス（Podaxis pistillaris）ATCC 38868、ボルビチウス・アレウリアタス（Bolbitius aleuriatus）CBS 820.95、パネオルス・セミオバツス（Panaeolus semiovatus）（＝Ｐ．fimiputris）CBS 819.95、サチレラ・プロナ（Psathyrella prona）CBS 822.95およびサチレラ・カンドレーナ（Psathyrella candolleana）CBS 628.95から成る群より選ばれた株を適当な栄養培地中で培養し、そして得られた培地から酵素製剤を回収することにより、通常の手法で調製することができる。
酵素製剤を高度に精製された形、すなわちSDS-PAGEにより測定した時に純度90％以上、より好ましくは純度95％以上、最も好ましくは純度99％以上の形で提供することが好ましいだろう。
本発明の酵素製剤の活性酵素成分は組換えＤＮＡ技術により生産せしめることができると思われる。エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードする本発明のＤＮＡ配列は、適当なベクター中で、それぞれコプリヌス・ミカセウス（Coprinus micaceus）CBS 816.95；コプリヌス・ドメスチクス（Coprinus domesticus）CBS 817,95；コプリヌス・エフェメルス（Coprinus ephemerus）CBS 821.95；コプリヌス・ラディアンス（Coprinus radians）CBS 818.95；ポダキシス・ピスチラリス（Podaxis pistillaris）ATCC 38868；ボルビチウス・アレウリアタス（Bolbitius aleuriatus）CBS 820.95；パネオルス・セミオバツス（Panaeolus semiovatus）（＝Ｐ．fimiputris）CBS 819.95；サチレラ・プロナ（Psathyrella prona）CBS 822.95；またはサチレラ・カンドレーナ（Psathyrella candolleana）CBS 628.95からのＤＮＡライブラリーをクローニングし、前記ベクターを用いて適当な酵母宿主細胞を形質転換せしめ、前記ＤＮＡライブラリー中のクローンによりコードされる着目の酵素を発現させるのに適当な条件下で前記宿主細胞を培養し、そのようなクローンにより生産された酵素の任意のセルラーゼ活性またはエンドグルカナーゼ活性を測定することにより陽性クローンについてスクリーニングし、そしてそのようなクローンから酵素をコードするＤＮＡを単離することを含んで成る、一般的な方法により単離することができる。一般的方法はWO 94/14953の中に更に開示されている。
該酵素をコードするＤＮＡ配列は、例えば、問題の真菌株のcDNAライブラリーをスクリーニングし、そして適当な酵素活性（即ちエンドグルカナーゼ活性）を発現するクローンについて選択することにより、単離することができる。次いで、標準手順により前記クローンから適当なＤＮＡ配列を単離することができる。
他の微生物から相同酵素をコードするＤＮＡ配列、すなわち類似のＤＮＡ配列が得られると期待される。例えば、該ＤＮＡ配列は、別の真菌、例えばアスペルギルス（Aspergillus）種の株、特にＡ．アクレータス（A. aculeatus）もしくはＡ．ニガー（A. niger）の株、トリコデルマ（Trichoderma）種の株、特にＴ．リーセイ（T. reesei）、Ｔ．ビリデ（T. viride）、Ｔ．ロンギブラキアタム（T. longibrachiatum）、Ｔ．ハージアナム（T. harzianum）もしくはＴ．コニンジィ（T. koningii）、フザリウム（Fusarium）種の株、特にＦ．オキシスポルム（T. oxysporum）、またはフミコラ（Humicola）種の株、或いはネオカリマスチクス（Neocallimastix）種、ピロマイセス（Piromyces）種、ペニシリウム（Penicillium）種、アガリカス（Agaricus）種またはファネロケータ（Phanerochaete）種の株、のｃＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングすることにより得ることができる。
或いは、本発明のエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡは、周知の手順に従って、便利には適当な入手源、例えば上述した生物のいずれかから、ＤＮＡ配列に基づいて調製した合成オリゴヌクレオチドプローブを使って単離することができる。
次いで該ＤＮＡ配列を組換え発現ベクターに挿入することができる。これは便利には組換えＤＮＡ操作にかけることのできる任意のベクターであることができ、ベクターの選択はそれを導入しようとする宿主細胞にしばしば依存するだろう。よって、ベクターは自己複製ベクター、すなわちその複製が染色体の複製から独立している染色体外存在物として存在するベクター、例えばプラスミドであることができる。あるいは、ベクターは宿主細胞中に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
ベクター中、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ配列は適当なプロモーターおよびターミネーター配列に作用可能に連結されるだろう。プロモーターは特定の宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であることができ、宿主細胞に対して相同または非相同のいずれのタンパク質をコードする遺伝子からも誘導することができる。エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネーターをそれぞれ連結させ、そしてそれらを適当なベクター中に挿入するのに使う手法は、当業者に周知である（例えば、Sambrook他，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989参照）。
該酵素をコードするＤＮＡ配列により形質転換される宿主細胞は、好ましくは真核細胞、特に真菌細胞、例えば酵母または糸状菌細胞である。特に、該細胞はアスペルギルス種またはトリコデルマ種、最も好ましくはアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に属し得る。真菌細胞は、それ自体既知である方法で、プロトプラスト形成と該プロトプラストの形質転換に続いて細胞壁の再生を含む方法により形質転換せしめることができる。宿主微生物としてのアスペルギルスの使用はEP 238 023（Novo Nordisk A/S）に記載されている。宿主細胞は酵母細胞、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）種、特にサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）もしくはサッカロミセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）の株、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）種、特にシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ハンゼヌラ（Hansenula）種、ピキア（Pichia）種、ヤロウィア（Yarrowia）種、例えばヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、またはクルイベロミセス（Kluyveromyces）種、例えばクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）の株であることができる。
該酵素をコードするＤＮＡ配列により形質転換された適当な宿主細胞を、該酵素の生産を許容する条件下で培養し、そして生成した酵素を培養物から回収することにより、酵素を生産することができると期待される。
形質転換した宿主細胞を培養するのに使う培地は、問題の宿主細胞を増殖させるのに適当な任意の常用培地であることができる。発現されたセルラーゼ（エンドグルカナーゼ）を便利には培地中に分泌せしめ、そして遠心分離または濾過により該培地から細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩を使って培地のタンパク様成分を沈澱させ、次いでイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のようなクロマトグラフィー手法により精製することを含む周知の手順により、培地から回収することができる。
更に他の観点では、本発明は、上述したようなエンドグルカナーゼ活性を示す酵素が濃縮されている酵素製剤によるセルロースまたはセルロース系材料の処理に関する。
例えば、本発明の酵素製剤は植物細胞壁含有材料の分解または改質に有用であり、前記製剤は上述したようなエンドグルカナーゼ活性を有する酵素が濃縮されている。そのような酵素製剤の例は、多数の酵素活性を含んで成る製剤、特に複数の植物細胞壁分解酵素を含んで成る酵素製剤、例えばペクチネックス（Pectinex）▲Ｒ▼、ペクチネックス−ウルトラＳＰ（Pectinex Ultra SP）▲Ｒ▼、セルクラスト（Celluclast）またはセルザイム（Celluzyme）（いずれもNovo Nordisk A/Sから入手可能）を含んで成る酵素製剤である。本明細書中、「濃縮された（enriched）」という語は、酵素製剤のエンドグルカナーゼ活性が増加されていること、例えば少なくとも約1.1の濃縮倍率で増加されていることを示すものである。
本発明の酵素製剤は、洗剤組成物において、織物柔軟剤組成物において、織物加工に、染色したセルロース系織物のストーンウオッシュ外観を提供するために、紙パルプの処理に、または後述する他の用途に、有用であろう。
用途
洗剤組成物
本発明の好ましい態様によれば、本明細書に記載の酵素製剤は洗剤組成物の一成分である。そのような場合、それは無粉塵性顆粒、安定化された液体または保護された酵素製剤の形で洗剤組成物中に含めることができる。無粉塵性顆粒は、例えば米国特許第4,106,991号と同第4,661,452号（共にNovo Industri A/S）に開示されたようにして製造することができ、そして場合により既知の方法でコーティングすることができる。蝋状コーティング材料の例は、1000〜20000の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を含みそして15〜80エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−、ジ−およびトリグリセリドである。流動床技術による使用に適当な皮膜形成コーティング材料の例は英国特許第1483591号に与えられている。液体酵素製剤は、例えば、確立された方法に従って、プロピレングリコールのようなポリオール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することにより安定化することができる。他の酵素安定剤は当業界で公知である。保護された酵素はヨーロッパ特許第238,216号に開示された方法に従って調製することができる。
本発明の洗剤組成物は任意の便利な形態、例えば粉末、顆粒、ペーストまたは液体であることができる。液体洗剤は、典型的には水70％までと有機溶剤０〜30％を含有する水性であってもよく、または非水性であってもよい。
洗剤組成物は１または複数の界面活性剤を含んで成り、その各々がアニオン性、非イオン性、カチオン性または両イオン性であることができる。洗剤は一般に、０〜50％のアニオン性界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、α−オレインスルホネート（AOS）、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）（AS）、アルコールエトキシスルフェート（AEOSまたはAES）、第二級アルカンスルホネート（SAS）、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−もしくはアルケニル−コハク酸、または石鹸を含むだろう。それは０〜40％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート（AEOまたはAE）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、またはポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えばWO 92/06154中に記載されたような）を含有してもよい。
洗剤組成物は、１または複数の別の酵素、例えばアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、およびオキシダーゼ、例えばラッカーゼを更に含んでもよい。
洗剤は１〜65％の洗剤ビルダーまたは錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロ三酢酸（NTA）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTMPA）、アルキル−もしくはアルケニル−コハク酸、可溶性シリケートまたは積層シリケート（例えばHoechstからのSKS-6）を含んでもよい。洗剤はビルダー無添加（unbuilt）であってもよく、即ち洗剤ビルダーを本質的に含まなくてもよい。
洗剤は１または複数のポリマーを含んでもよい。ポリマーの例はカルボキシメチルセルロース（CMC）、ポリ（ビニルピロリドン）（PVP）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ（ビニルアルコール）（PVA）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、およびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーである。
洗剤は漂白系を含んでもよい。前記漂白系は、過酸を形成する漂白促進剤〔例えばテトラアセチルエチレンジアミン（TAED）またはノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）〕と組み合わせることができるH2O2源（例えば過ホウ酸塩または過炭酸塩）を含んで成ることができる。あるいは、漂白系が例えばアミド、イミドまたはスルホン型のペルオキシ酸を含んで成ってもよい。
本発明の洗剤組成物の酵素は、常用の安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸またはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステルを使って安定化することができ、該組成物は例えばWO 92/19709およびWO 92/19708に記載されたようにして配合することができる。
洗剤は他の常用の洗剤成分、例えば織物コンディショナー（クレーを含む）、起泡増進剤、泡止め剤、防錆剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、色素、殺菌剤、蛍光増白剤、または香料を含んでもよい。
ｐＨ（使用濃度の水溶液中で測定した時の）は通常は中性またはアルカリ性、例えば７〜11の範囲であろう。
本発明の範囲内の洗剤組成物の特定形態としては下記のものが挙げられる：
0004064456.tif 000003
0004064456.tif 000004
0004064456.tif 000005
0004064456.tif 000006
0004064456.tif 000007
0004064456.tif 000008
0004064456.tif 000009
0004064456.tif 000010
0004064456.tif 000011
0004064456.tif 000012
0004064456.tif 000013
0004064456.tif 000014
13）直鎖アルキルベンゼンスルホネートの全部または一部が（Ｃ12〜Ｃ18）アルキルスルフェートにより置き換えられている、１）〜12）に記載の洗剤組成物。
0004064456.tif 000015
0004064456.tif 000016
16）追加の成分としてまたは明記してある漂白系の代替物として、安定化されたまたはカプセル化された過酸を含有する、１）〜15）に記載の洗剤組成物。
17）過ホウ酸塩が過炭酸塩に置き換えられている、１），３），７），９）および12）に記載の洗剤組成物。
18）マンガン触媒を更に含有する、１），３），７），９），12），14）および15）に記載の洗剤組成物。マンガン触媒は、例えば“Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching”, Nature, 369, 637-639, 1994に記載の化合物の１つであることができる。
19）液体非イオン性界面活性剤（例えば直鎖アルコキシル化第一級アルコール）、ビルダー系（例えばホスフェート）、酵素およびアルカリを含んで成る非水性液体洗剤として製剤化された洗剤組成物。この洗剤はアニオン性界面活性剤および／または漂白系を含んでもよい。
本明細書中に記載されるセルラーゼ製剤は、洗剤に汎用される濃度で配合することができる。本発明の洗剤組成物では、セルラーゼ0.00001〜１mg（純粋な酵素タンパク質として計算）／ｌ洗液に相当する量でセルラーゼを添加することができると現在のところ期待される。
パルプおよび紙用途
製紙パルプ工業において、本発明の酵素製剤を例えば次のように有益に用いることができる：
−  剥皮（debarking）に：酵素製剤での前処理は、機械ドラム中で樹皮を剥ぐ前に形成層を分解するので、有益な省エネルギーをもたらし得る。
−  解繊（defibration）に：セルロース系繊維を含む材料を洗練または叩解前に酵素製剤で処理すると、繊維間表面でのセルロースの加水分解作用のためにエネルギー消費量の削減をもたらし得る。当該酵素製剤の使用は既知の酵素の使用に比べて改善された省エネルギーをもたらし得る。何故なら、本発明の酵素組成物は繊維壁の中に浸透する高い能力を有すると思われるからである。
−  繊維の改質、即ちより深く浸透する酵素を必要とする繊維壁を越えた部分的加水分解が必要である場合の繊維性質の改善に（例えば粗繊維をより柔軟にするために）。繊維の深部処理は今まで高収率パルプ、例えばメカニカルパルプまたは再生紙の混合物に可能でなかった。これは、繊維壁の微細孔マトリックスの物理的制限のために酵素分子の通過を妨害するという繊維壁構造の性質によるものであった。当該酵素組成物は繊維壁の中に浸透することができると期待される。
−  排水の改善に。製紙パルプの排水能力は、パルプを加水分解酵素、例えばセルラーゼで処理することにより改善することができる。当該酵素製剤の使用はより効果的であり、例えば繊維間と製紙機の金網中の中空スペースを塞ぐことによって排水速度を制限する微細画分（繊維破片から成る）中の強度に水和されたミクロフィブリル束をより高度に緩めることができる。パルプをセルラーゼ処理にかけると、カナダ標準ろ水度（ＣＳＦ）が増加し、ショッパー・リグラー（Schopper-Riegler）排水指数が減少する。例えば米国特許第4,923,565号；TAPPI T227, SCAN C19:65.enceを参照のこと。
−  繊維間接着に。加水分解酵素は繊維間接着を改善するために製紙パルプの製造に用いられる。該酵素は繊維表面から不純物、例えばセルロースの破片を洗い落とし、繊維壁への結合に使われるセルロースの暴露面積を増やし、かくして繊維対繊維の水素結合能を改善する。この工程は除角（dehornification）とも呼ばれる。セルラーゼ含有酵素製剤を使って製造された紙や板は、改善された強度または減少された秤量、より滑らかな表面、および改善された印刷適性を有し得る。それらの改善は、改変/誘導型酵素の浸透性の改善の結果であると思われる。
−  酵素的脱インクに。セルラーゼのような加水分解酵素を使うことによるパルプ化の最中またはパルプ化と同時の再生紙の部分的加水分解は、インク粒子の除去と凝集を促進することが知られている。酵素製剤の使用は、繊維壁の繊維マトリックス中への酵素分子のより深い浸透のために表面構造からのより効果的なインクの離脱を与え、かくして表面を柔らかくしインク粒子が効果的に離脱されるようにすることができる。繊維から生じるインク粒子に付着して見つかるセルロース系断片を効果的に加水分解するために、離脱したインク粒子の凝集も改善される。
リグノセルロースパルプの処理は、例えばWO 91/14819, WO 91/14822, WO 92/17573およびWO 91/18688中に記載されたように実施することができる。
繊維用途
別の態様では、本発明は、バイオポリッシュ工程における本発明の酵素製剤の利用に関する。バイオポリッシュは布の湿潤性を損なうことなく風合いと外観の点で布品質を改善する糸表面の特殊処理である。バイオポリッシュの最も重要な効果は、毛羽およびピリングの減少、光沢/艶の増加、織物の風合いの改善、耐久的な軟らかさの増加および吸水性の変化により特徴づけることができる。バイオポリッシュは通常編布または織布の製造の湿式加工において行われる。湿式加工は例えば糊抜き、精錬、漂白、洗浄、乾燥／なせん、および仕上げといった段階を含んで成る。それらの各段階の間に、繊維はより大きいまたは小さい機械作用にかけられる。一般に、繊維が編まれまたは織られた後、織物が糊抜き工程に入り、次いで精錬段階等に進む。糊抜きは織物から糊剤を除去する行為である。製織または機械製織の前に、たて糸はしばしばそれらの引張り強度を高めるために糊剤のデンプンまたはデンプン誘導体でコーティングされる。製織後、均一且つ耐洗浄成果を得るために、織物を更に加工する前に糊剤コーティングを除去しなければならない。バイオポリッシュの効果を得るためには、セルロース分解作用と機械作用の組合せが必要とされることは知られている。セルラーゼ処理を通常の柔軟剤処理と組み合わせると「超柔軟性（super-softness）」が得られることも知られている。セルロース系繊維のバイオポリッシュへの当該酵素製剤の利用は有利であり、例えばより完全なバイオポリッシュを達成することができる。バイオポリッシュは例えばWO93/20278に記載された方法を使うことにより得ることができる。
ストーンウオッシュ
デニムまたはそのような布から作ったジーンズを軽石の存在下で洗浄して布の所望の位置の色を明るくすることによるか、または布を酵素的に（特にセルロース分解酵素で）処理することにより、染色した布、特にデニム布またはジーンズにおいて「ストーンウオッシュ」外観（色の局部的な磨耗）を提供することが知られている。本明細書中に記載の酵素製剤での処理は、米国特許第4,832,864号に開示されるように単独で、伝統的な方法で必要とされるよりも少量の軽石と一緒に、またはWO 95/09225に開示されるようにパーライトと一緒に、実施することができる。
セルロース分解活性の測定
セルロース分解酵素はＣＭＣを加水分解し、それによってインキュベーション混合物の粘度を増加させる。結果として生じる粘度の減少を振動粘度計（例えばフランス国Sofraser社からのMIVI 3000）により測定することができる。S-CEVUの点から測定されるセルロース分解活性は後述のアッセイに従って決定することができる：
S-CEVUアッセイは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液の粘度を減少させる試料の能力を測定することにより、試料中に存在する触媒活性の量を定量するものである。このアッセイは、40℃；pH7.5；0.1Ｍリン酸緩衝液；時間30分；ＣＭＣ基質（カルボキシメチルセルロースHercules 7 LFD）の粘度を減少させるのに比較酵素標準を使う；酵素濃度約0.15 S-CEVU／ml。
更に１ Savi U（単位）は１分あたり１μモルのグルコース当量を生成することのできる酵素の量として定義される。
本発明を下記の非限定例により更に説明する。
実施例１
コプリヌス・ミカセウス（Bull.：Fr.）からの酵素製剤のエンドグルカナーゼ活性の測定
株：
コプリヌス・ミカセウス（Coprinus micaceus）（Bull.：Fr.）Fr., Section Micacei Fr.。1995年12月19日にCBS 816.95として寄託。
コプリヌス・ミカセウスCBS 816.95株はコペンハーゲンの植物園から単離した。
単離した株を、セルロース（Solcaflocセルロース繊維、Avicelまたはそれらの組合せ）を添加した常用のジャガイモ・ブドウ糖寒天上で増殖させた。
エンドグルカナーゼ活性は、Azur架橋HEC blue顆粒を使って通常の平板アッセイ法により決定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：良好な活性（＋＋）
pH9.5：良好な活性（＋＋）
洗剤の存在下でのエンドグルカナーゼ活性：
0.05％を平板に添加した同様な平板アッセイにより、汎用洗剤直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）の存在下でのエンドグルカナーゼ活性を測定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：中程度の活性（＋）
pH9.5：良好な活性（＋＋）
温度に依存したエンドグルカナーゼ活性：
50℃で１時間加熱した後でエンドグルカナーゼ活性を測定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：良好な活性（＋＋）
pH9.5：良好な活性（＋＋）
更に、液体醗酵で、すなわち100mlの振盪フラスコ中で、26℃にてセルロース（Solcaflocセルロース繊維、Avicelまたはそれらの組合せ）を添加した常用のジャガイモ・ブドウ糖培地上で150rpmで攪拌しながら、株を培養した。
実施例２
セルロース系繊維を含む布の糸からはみ出た表面フィブリルおよび繊維の除去として測定される、コプリヌス・ミカセウスからのセルラーゼの効能
装置：Terg-o-tometer
液量：100ml
攪拌：竪形攪拌器を使って150運動／分
すすぎ時間：水道水中で10分
洗浄温度：40℃
洗液：0.05Ｍリン酸塩緩衝液，pH7.0
洗浄時間：30分；２反復
布：綿100％の古くなった黒のスワッチ（布見本）２枚  ５×６cm
乾燥：タンブル乾燥
セルラーゼ：コプリヌス・ミカセウス（Coprinus micaceus）, CBS 816.95
評価：
糸からはみ出た表面フィブリルおよび繊維がセルラーゼにより取り除かれると、黒布の表面はより黒く且つ毛羽がなく見える。３人の試験審査員団が互いに比較してスワッチを位置付けた。それらに「最もきたない」スワッチに対しての１から「最もきれい」なスワッチに対しての18までの数字を与えた。10より大きい値を有するスワッチは非常に改善された表面外観を有する。７より大きい値を有するスワッチは明らかに目に見える改善された表面外観を有する。
２つの異なる用量を試験し、ブラインド試料と比較した。試験審査員団により与えられた平均点数を下記に示す：
0004064456.tif 000017
この結果は、コプリヌス・ミカセウス（Coprinus micaceus）セルラーゼが良好な色の明澄化を与えることを示す。
実施例３
コプリヌス・ドメスチクス（Bolt.：Fr.）Fr.からのセルラーゼ調製物中のエンドグルカナーゼ活性の測定
株：コプリヌス・ドメスチクス（Coprinus domesticus）（Bolt.：Fr.）S.F. Gray, Section Micacei Fr.。1995年12月19日にCBS 817.95として寄託。
コプリヌス・ドメスチクスCBS 817.95株はKrenkerup Hareskovという名称のデンマークのブナ林から単離した。
単離した株を、セルロース（Solcaflocセルロース繊維、Avicelまたはそれらの組合せ）を添加した常用のジャガイモ・ブドウ糖寒天上で増殖させた。
エンドグルカナーゼ活性は、Azur架橋HEC blue顆粒を使って通常の平板アッセイ法により決定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：非常に高い活性（＋＋＋）
pH9.5：良好な活性（＋＋）
洗剤の存在下でのエンドグルカナーゼ活性：
0.05％を平板に添加した同様な平板アッセイにより、汎用洗剤直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）の存在下でのエンドグルカナーゼ活性を測定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：中程度の活性（＋）
pH9.5：中程度の活性（＋）
温度に依存したエンドグルカナーゼ活性：
50℃で１時間加熱した後でエンドグルカナーゼ活性を測定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：中程度の活性（＋）
pH9.5：中程度の活性（＋）
更に、液体醗酵で、すなわち100mlの振盪フラスコ中で、26℃にてセルロース（Solcaflocセルロース繊維、Avicelまたはそれらの組合せ）を添加した常用のジャガイモ・ブドウ糖培地上で150rpmで攪拌しながら、株を培養した。
実施例４
セルロース系繊維を含む布の糸からはみ出た表面フィブリルおよび繊維の除去として測定される、コプリヌス・ドメスチクスからのセルラーゼの効能
コプリヌス・ドメスチクスCBS 817.95からのセルラーゼを使って実施例２に記載の試験を実施した。
異なる２用量を試験し、ブラインド試料と比較した。試験審査員団により与えられた平均点数を下記に示す：
0004064456.tif 000018
この結果は、コプリヌス・ドメスチクス（Coprinus domesticus）セルラーゼが良好な色の明澄化を与えることを示す。
実施例５
コプリヌス・エフェメルス（Bull.：Fr.）Fr.からのセルラーゼ製剤中のエンドグルカナーゼ活性の測定
株：
コプリヌス・エフェメルス（Coprinus ephemerus）（Bull.：Fr.）S.F. Gray, Section Setulosi Lange。1995年12月19日にCBS 821.95として寄託した。
コプリヌスー・エフェメルスCBS 821.95株はGrib Skovという名称のデンマークの落葉樹林から単離した。
単離した株を、セルロース（Solcaflocセルロース繊維、Avicelまたはそれらの組合せ）を添加した常用のジャガイモ・ブドウ糖寒天上で増殖させた。
エンドグルカナーゼ活性は、Azur架橋HEC blue顆粒を使って通常の平板アッセイ法により決定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：良好な活性（＋＋）
pH9.5：良好な活性（＋＋）。
洗剤の存在下でのエンドグルカナーゼ活性：
0.05％を平板に添加した同様な平板アッセイにより、汎用洗剤直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）の存在下でのエンドグルカナーゼ活性を測定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：中程度の活性（＋）
pH9.5：中程度の活性（＋）
更に、Ｃ．エフェメルスにより生産された酵素製剤はAzur架橋キシログルカン基質に対しても良好な活性（＋＋）を有することがわかった。
実施例６
コプリヌス・ディスセミナタス（Pers.：Fr.）S.F. Grayからのセルラーゼ調製物中のエンドグルカナーゼ活性の測定
株：
コプリヌス・ディスセミナタス（Coprinus disseminatus）（Pers.：Fr.）S.F. Gray, Section Setulosi Lange。
コプリヌス・ディスセミナタス株はデンマークの落葉樹林から単離され、ブナの腐った切り株上で成育する。
多胞子接種により株を単離し、そして単離した株を、セルロース（Solcaflocセルロース繊維、Avicelまたはそれらの組合せ）を添加した常用のジャガイモ・ブドウ糖寒天上で増殖させた。
エンドグルカナーゼ活性は、Azur架橋HEC blue顆粒を使って通常の平板アッセイ法により決定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：無活性
pH9.5：中程度の活性（＋）。
実施例７
コプリナス・ラディアンス（Desm.：Fr.）Fr.からのセルラーゼ製剤中のエンドグルカナーゼ活性の測定
株：
コプリナス・ラディアンス（Coprinus radians）（Desm.：Fr.）Fr.。1995年12月19日にCBS 818.95として寄託した。
単離した株を小麦ブラン上で増殖させた。
エンドグルカナーゼ活性は、Azur架橋HEC blue顆粒を使って通常の平板アッセイ法により決定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：非常に高い活性（＋＋＋）
pH9.5：良好な活性（＋＋）。
洗剤の存在下でのエンドグルカナーゼ活性：
0.05％を平板に添加した同様な平板アッセイにより、汎用洗剤直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）の存在下でのエンドグルカナーゼ活性を測定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：中程度の活性（＋）
pH9.5：中程度の活性（＋）
更に、Ｃ．ラディアンスにより生産された酵素製剤はAzur架橋キシログルカン基質に対して非常に高い活性（＋＋）を有することがわかった。
実施例８
Ｃ．ピカセウス、Ｃ．フリセイおよびＣ．サブインパティエンスからのセルラーゼ製剤中のエンドグルカナーゼ活性の測定
株：
コプリヌス・ピカセウス（Coprinus picaceus）、Section Coprinus Fr.；
コプリヌス・フリセイ（Coprinus frisei）、Section Coprinus；
コプリヌス・サブインパティエンス（Coprinus subimpatiens）
それらの株を、セルロース（Solcaflocセルロース繊維、Avicelまたはそれらの組合せ）を添加した常用のジャガイモ・ブドウ糖寒天上で増殖させた。
エンドグルカナーゼ活性は、Azur架橋HEC blue顆粒を使って通常の平板アッセイ法により決定した。３つの種の全てについて次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：良好な活性（＋＋）
pH9.5：中程度の活性（＋）。
実施例９
サチレラ・カンドレーナからのセルラーゼ製剤中のエンドグルカナーゼ活性の測定
株：
コプリヌス科、サチレラ・カンドレーナ（Psathyrella candolleana）。1995年にCBS 628.95として寄託。
この株を小麦ブラン上で増殖させた。
エンドグルカナーゼ活性は、Azur架橋HEC blue顆粒を使って通常の平板アッセイ法により決定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：良好な活性（＋＋）
pH9.5：中程度の活性（＋）。
実施例10
サチレラ・プロナからのセルラーゼ製剤中のエンドグルカナーゼ活性の測定
株：
コプリヌス科、サチレラ・プロナ（Psathyrella prona）。1995年12月19日にCBS 822.95として寄託。
この株はGribという名のデンマーク樹林から単離した。
単離した株を小麦ブラン上で増殖させた。
エンドグルカナーゼ活性は、Azur架橋HEC blue顆粒を使って通常の平板アッセイ法により決定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：非常に高い活性（＋＋＋）
pH9.5：非常に高い活性（＋＋＋）。
実施例11
パネオルス・セミオバツス（＝Ｐ．フィミプトリス）からのセルラーゼ製剤中のエンドグルカナーゼ活性の測定
株：
コプリヌス科、パネオルス・セミオバツス（Panaeolus semiovatus）〔＝Ｐ．フィミプトリス（P. fimiputris）〕。1995年12月19日にCBS 819.95として寄託。
アイスランドでこの株の子実体を収集し、後で多胞子接種により単離し、そしてジャガイモ・ブドウ糖寒天平板上で増殖させた。小麦ブランに移した後、酵素活性が検出可能であった。
エンドグルカナーゼ活性は、Azur架橋HEC blue顆粒を使って通常の平板アッセイ法により決定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：非常に高い活性（＋＋＋）
pH9.5：中程度の活性（＋）。
更に、パネオルス・セミオバツスにより生産された酵素製剤はAzur架橋キシログルカン基質に対しても非常に高い活性（＋＋＋）を有することがわかった。
パネオルス・スフィンクトリナス（Panaeolus sphinctrinus）をパネオルス・セミオバツスについて記載したのと同様にして処理した。
上記と同様にしてパネオルス・スフィンクトリナスのエンドグルカナーゼ活性を測定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：良好な活性（＋＋）
pH9.5：無活性。
実施例12
ポダキシス・ピスチラリスからのセルラーゼ製剤中のエンドグルカナーゼ活性の測定
株：
コプリヌス科、ポダキシス・ピスチラリス（Podaxis pistillaris）。ATCC 38868として寄託。
この株は子実体から多胞子接種により単離した。単離した株を小麦ブラン上で増殖させた。
エンドグルカナーゼ活性は、Azur架橋HEC blue顆粒を使って通常の平板アッセイ法により決定した。次の結果が得られた：
pH3：良好な活性（＋＋）
pH7：中程度の活性（＋）
pH9.5：無活性。
実施例13
ボルビチウス・アレウリアタス（＝Ｂ．レチクラタス）からのセルラーゼ製剤中のエンドグルカナーゼ活性の測定
株：
ボルビチウス科、ボルビチウス・アレウリアタス（Bolbitius aleuriatus）〔Ｂ．レチクラタス（B. reticulatus）と同義〕。1995年12月19日にCBS 820.95として寄託。
ボルビチウス・アレウリアタスCBS 820.95株はスウェーデンのヘルシンボルグに近い原野から単離した。
単離した株を、セルロース（Solcaflocセルロース繊維、Avicelまたはそれらの組合せ）を添加した常用のジャガイモ・ブドウ糖寒天上で増殖させた。
エンドグルカナーゼ活性は、Azur架橋HEC blue顆粒を使って通常の平板アッセイ法により決定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：非常に高い活性（＋＋＋）
pH9.5：良好な活性（＋＋）。
洗剤の存在下でのエンドグルカナーゼ活性：
0.05％を平板に添加した同様な平板アッセイにより、汎用洗剤直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）の存在下でのエンドグルカナーゼ活性を測定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：中程度の活性（＋）
pH9.5：中程度の活性（＋）
温度に依存したエンドグルカナーゼ活性：
50℃で１時間加熱した後でエンドグルカナーゼ活性を測定した。次の結果が得られた：
pH3：無活性
pH7：良好な活性（＋＋）
pH9.5：良好な活性（＋＋）。
更に、液体醗酵で、すなわち100mlの振盪フラスコ中で、26℃にてセルロース（Solcaflocセルロース繊維、Avicelまたはそれらの組合せ）を添加した常用のジャガイモ・ブドウ糖培地上で150rpmで攪拌しながら、株を培養した。
実施例14
セルロース系繊維を含む布の糸からはみ出た表面フィブリルおよび繊維の除去として測定される、ボルビチウス・アレウリアタスからのセルラーゼの効能
装置：Terg-o-tometer
液量：100ml
攪拌：竪形攪拌器を使って150運動／分
すすぎ時間：水道水中で５分
洗浄温度：40℃
洗液：0.05Ｍリン酸塩緩衝液，pH7.0
洗浄時間：30分；２反復
繊維：綿100％の古くなった黒のスワッチ（布見本）２枚  ５×６cm
乾燥：タンブル乾燥
セルラーゼ：ボルビチウス・アレウリアタス，CBS 820.95
評価：
光の規約反射率をDatacolor Elrepho Remission分光光度計により測定した。糸からはみ出た表面フィブリルおよび繊維がセルラーゼにより取り除かれると、黒布の表面はより黒く見え、そして低いＬ値が得られる。
異なる２用量を試験し、ブラインド試料と比較した。
0004064456.tif 000019
この結果は、ボルビチウス・アレウリアタスのセルラーゼが良好な色の明澄化を与えることを示す。
実施例15
非晶質セルロースに対するアルカリ性セルラーゼ活性の測定
材料と方法：
基質の調製：20グラムの酸膨潤AVICEL▲Ｒ▼原液（１か月間貯蔵することができる製剤について下記参照のこと）を5000rpmで20分間遠心し、上清を流し、沈降物を30mlの緩衝液に再懸濁した。次いでこの懸濁液を5000rpmで20分間遠心し、上清を流し、沈降物を総量30ｇになるように緩衝液に再懸濁した。これは10g AVICEL／ｌの基質濃度に相当する。
緩衝液：pH8.5の0.1ＭバルビタールまたはpH10.0の0.1Ｍグリシン。
酵素溶液：酵素をpH8.5またはpH10.0で0.2〜1 S-CEVU／mlの活性に希釈した。
試薬：２％NaOH，PHBAH試薬：1.5gのｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドと5.0gの酒石酸ナトリウムを100mlの２％NaOHに溶かした。
基質、緩衝液および酵素溶液を4.00g／ｌの最終基質濃度になるように混合した。
酸膨潤セルロースの調製：
材料：
5g Avicel▲Ｒ▼（Art. 2331 Merck）
150ml  85％オルトリン酸（Art. 573 Merck）
400ml  アセトン（Art. 14 Merck）
1.3ｌ  脱イオン水（Milli Q）
１ｌ  ガラスビーカー
１ｌ  ガラス濾過用漏斗
２ｌ  吸引フラスコ
Ultra Turrax Homogenizer
手順：
アセトンとリン酸を氷上で冷却した。5gのAvicel▲Ｒ▼を水で湿らせ、次いで150mlの氷冷85％オルトリン酸を加え、混合物を弱く攪拌しながら氷浴中に１時間置いた。100mlの氷冷アセトンを攪拌しながら添加し、次いで該混合物をガラス濾過用漏斗に移し、次いで３×100mlの氷冷アセトンで洗浄し、各回洗浄後に吸引乾燥した。濾過ケークを２×500mlの水で洗浄し、各回洗浄後に吸引してできるだけ乾燥させた。濾過ケークを総容量300mlに再懸濁し、そして均質性まで混合した（Ultra Turrax Homogenizerを使って）。得られた生成物を冷蔵庫に保存した。
基質／緩衝液溶液を40℃で５分間予熱した。次いで酵素溶液を添加し、得られた溶液を５秒間渦動混合した後、40℃で20分間インキュベーションした。500μｌの２％NaOH溶液を添加することにより反応を停止させ、次いで５秒間渦動混合した。試料を5000rpmで20分間遠心した。試験管から1000μｌの上清を新しい試験管に移し、そこに500μｌのPHBAH試薬を加え、次いで10分間煮沸した。試験管を氷水中で冷却した。
分光光度計上で410nmで試料の吸光度を測定した。
標準グルコース曲線：
300mg／ｌを含む原液をそれぞれ5，10，15および25mg／ｌに希釈した。希釈した標準試料1000μｌを500μｌのPHBAH試薬と混合し、そして他の試料と同様に試験した（上記参照）。
定義：
１ Savi U（単位）は、１分あたり１μモルのグルコース当量を生成することができる酵素の量として定義される。
活性の測定：
標準曲線を使って、還元グルコース当量の放出を計算した。
結果を下表に示す。
培養液上清の活性をS-CEVU／mlで測定した。
0004064456.tif 000020
実施例16
セルロース系繊維を含む布の糸からはみ出た表面フィブリルおよび繊維の除去として測定される、コプリヌス・シネレウスからのセルラーゼの効能
装置：Terg-o-tometer
液量：100ml
攪拌：竪形攪拌器を使って150運動／分
すすぎ時間：水道水中で10分
洗浄温度:40℃
水の硬度：1mM CaCl2
洗液：Ｉ）高アニオン／非イオン比を有するＵＳ型粉末洗剤1.0g／ｌ，pH10.0
II）高非イオン／アニオン比を有するマイルド液体着色洗剤2.0g／ｌ，pH10.0
洗浄時間：Ｉ）12分；７反復
II）30分；５反復
布：綿100％の古くなった黒のスワッチ（布見本）３枚  ５×６cm
乾燥：タンブル乾燥
セルラーゼ：コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus），IFO 30116
評価：
糸からはみ出た表面フィブリルおよび繊維がセルラーゼにより取り除かれると、黒布の表面はより黒く見え且つ毛羽がなく見える。試験審査員団が互いに比較してスワッチを位置付けした。それらに「最もきたない」スワッチに対しての１から「最もきれい」なスワッチに対しての14までの数字を与えた。10より大きい値を有するスワッチは非常に改善された表面外観を有する。４より大きい値を有するスワッチは明らかに目に見える改善された表面外観を有する。
２つの異なる用量を試験し、ブラインド試料と比較した。２種類の洗剤について異なる反復回数と洗浄時間を使って別々の実験を実施したので、その試験間でそのまま効能を比較することはできない。
0004064456.tif 000021
このデータは、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）セルラーゼが２種類の試験した洗剤基剤において良好な色の明澄化を与えることを示す。