(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鼻内投与に適合したワクチン組成物であって、抗原と、キトサンの有効アジュバント量とを含んでなり、抗原がインフルエンザウイルス抗原ではない、組成物。
【請求項２】
抗原が、病原体由来のタンパク質、組換えタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖類、リポ多糖類、またはポリヌクレオチドである、請求の範囲第１項に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
抗原が全細胞またはウイルスである、請求の範囲第１項に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
抗原が、抗原をコードするＤＮＡとして提供される、請求の範囲第１項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
抗原が、百日咳菌（Bordetella pertussis）抗原、髄膜炎菌抗原、破傷風菌抗原、ジフテリア抗原、肺炎球菌抗原、結核抗原、またはＲＳＶ抗原である、請求の範囲第１項または第２項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
抗原が、耐性を誘導するために送達されるものである、請求の範囲第１項または第２項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
抗原が精製された形態で存在する、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
キトサンの濃度が０．０２〜１０％の範囲にある、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
キトサンの濃度が０．１〜５％の範囲にある、請求の範囲第８項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
キトサンの濃度が０．２５〜２％の範囲にある、請求の範囲第９項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
キトサンが水溶性である、請求の範囲第１〜１０項のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
キトサンが、４０％を上回る脱アセチル化の程度までの脱アセチル化によってキチンから生成される、請求の範囲第１〜１１項のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
脱アセチル化の程度が５０％〜９０％である、請求の範囲第１２項に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
脱アセチル化の程度が７０％〜９５％である、請求の範囲第１２項に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
キトサンの分子量が１０ｋＤ〜５００ｋＤである、請求の範囲第１〜１４項のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
キトサンの分子量が５０ｋＤ〜３００ｋＤである、請求の範囲第１５項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
キトサンの分子量が１００ｋＤ〜３００ｋＤである、請求の範囲第１６項に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
組成物のｐＨが５．５〜６．５の範囲にある、請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
ｐＨがｐＨ６である、請求の範囲第１８項に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
乾燥粉末として、またはミクロスフェアの形態で処方される、請求の範囲第１〜１９項のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
請求の範囲第１〜２０項のいずれか１項に記載のワクチン組成物と組合わせて組成物を鼻内送達するのに適した投与装置を含んでなる医薬製品。
【請求項２２】
投与装置がエアゾール送達装置である、請求の範囲第２１項に記載の医薬製品。
【請求項２３】
適当な抗原を請求の範囲第１〜２０項のいずれか１項に記載のキトサンの有効アジュバント量と共に含んでなるワクチン組成物をヒト以外の宿主に鼻内投与することを含む、疾患の感染に対して宿主を免疫する方法。
【請求項２４】
ヒト以外の哺乳動物に、抗原と、請求の範囲第１〜２０項のいずれか１項に記載のワクチン組成物を鼻内投与することによって、防護的ＩｇＡ粘膜免疫応答およびＩｇＧ全身性応答を増強する方法。
【請求項２５】
抗原と、請求の範囲第１〜２０項のいずれか１項に記載のキトサンとを共投与することを含む、ヒト以外の哺乳動物に鼻内投与した抗原の免疫応答を高める方法であって、抗原がインフルエンザウイルス抗原ではない、方法。
【請求項２６】
鼻内投与した抗原の免疫原性を高めるための鼻内アジュバント組成物の製造のための、請求の範囲第１〜２０項のいずれか１項に記載のキトサンの使用であって、抗原がインフルエンザウイルス抗原ではない、使用。
【請求項２７】
防護的ＩｇＡ粘膜免疫応答およびＩｇＧ全身性免疫応答を増強するための鼻内組成物の製造のための、抗原およびキトサンの有効アジュバント量の使用であって、抗原がインフルエンザウイルス抗原ではない、使用。
【請求項２８】
疾患の感染に対して宿主を免疫するための鼻内組成物の製造のための、抗原およびキトサンの有効アジュバント量の使用であって、抗原がインフルエンザウイルス抗原ではない、使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、鼻内投与用のワクチン組成物であって、１または２以上の抗原および有効なアジュバントを含んでなる組成物に関する。本発明は、哺乳動物にこれらの組成物を投与することにより哺乳動物を疾患に対して免疫する方法、鼻内投与した抗原の免疫原性を増強する方法、および特定の疾患に対して哺乳動物を免疫する鼻内投与用のワクチン組成物の製造のための抗原のアジュバントと組合わせた使用にも関する。
ワクチンは、細菌またはウイルスなどの特定の微生物に対する活性免疫を誘導することによる感染症に対する抵抗を高める目的で患者に投与される抗原物質の製剤である。
ワクチンは、単一でもまたは混合成分ワクチンであってもよく、様々な形態で提供される。例えば、流行性インフルエンザワクチンは、不活性化した全ウイルス、破砕したウイルス（スプリットワクチン）、または抗原性タンパク質の精製した製剤からなっている。
ワクチンは、典型的には注射により非経口的に投与される。従来の非経口免疫法は、多くの欠点を有することが知られている。例えば、多くの個体は注射に対する自然な恐怖感を持っており、その結果精神的不快感を経験することがある。更に、多くの個体は注射を肉体的に苦痛なものと感じている。また、非経口ワクチン接種（筋肉内、皮下など）は、（例えば、感染により）以前に局部的暴露がなかった場合には、局部的抗体産生を誘導する有効な手段ではない。
従って、有効な局部的（local）および／または局所的（topical）投与法が望まれる。
幾つかの疾患の場合には、粘膜免疫系を刺激することが有利である。これを行うには、ワクチンを粘膜表面に局所適用しなければならない。従って、場合によっては（例えば、上気道（respiratory tract）の感染症の場合には）、気道の局部粘膜免疫系を更に効果的に刺激するのが有利となる。
従って、粘膜ワクチンを開発するための多くの試みが行われてきた。しかしながら、一つの欠点は、不活性化ワクチンは、粘膜投与したときに、余り免疫原性でないことが多いことである。この問題点を解決するため、経口または鼻内投与されるワクチンの免疫原性を向上させる他の方法は、アジュバント（下記参照）の使用、各種ミクロスフェアへのワクチンのカプセル封入、および弱毒化した生株の使用を含んでいた。
ある種のアジュバントは、ワクチン抗原と共投与したときに、免疫応答を刺激することによってワクチン組成物の有効性を更に高めることが示されている（例えば、Hibberd et al., Ann. Intern. Med., 110, 955 (1989)）。有効であることが示されているアジュバントの例としては、インターフェロンアルファ、Klebsiella pneumoniae、糖タンパク質、およびインターロイキン−２が挙げられる。
キトサンは、キチンまたはポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの誘導体であって、かなりの割合のＮ−アセチル基が加水分解によって外されたものである。
欧州特許出願第４６０，０２０号明細書には、粘膜吸収増強剤としてキトサンを含んでいる医薬処方が開示されている。ワクチン組成物に投与されたときにキトサンがアジュバント効果を提供することができることは、開示も示唆もされていない。
意外なことには、本発明者らは、キトサンは、鼻内共投与すると、抗原の免疫応答を増強し、従ってアジュバント効果をを提供することを見出だした。
従って、本発明の第一の局面では、鼻内投与に適したワクチン組成物であって、抗原と、キトサンの有効アジュバント量とを含んでなる組成物（以後、「本発明の組成物と呼ぶ）が提供される。
「有効アジュバント量」という用語は、当業者によって十分に理解されるであろうし、鼻内投与した抗原に対する免疫応答を刺激することができるキトサンの量、すなわち、鼻内洗浄液中のＩｇＡ濃度によって測定した鼻内投与した抗原組成物の免疫応答を増加させる量を包含する。ＩｇＡ濃度の有効増加量は、アジュバントを含まない同じ抗原組成物と比較して５％超過、好ましくは２５％以超過、特に５０％超過を包含するのが好適である。
本発明の組成物におけるキトサンの好ましい濃度は、０．０２〜１０％の範囲であり、更に好ましくは０．１〜５％であり、特に０．２５〜２％である。
本発明者らは、鼻内組成物において特定のキトサン誘導体と共に抗原を投与することによって、免疫（例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡ）応答を得ることができることを見出だした。本発明者らは、抗原を含む鼻内ワクチン組成物にキトサンを配合すると、良好な全身的および局部的免疫応答が得られることも見出だした。特に、本発明者らは、本発明の組成物を鼻内投与すると、防御的ＩｇＡ粘膜（mucosal）免疫応答およびＩｇＧ全身性（systemic）免疫応答を両方とも増強することを見出だした。
従って、本発明は、抗原とキトサンの有効アジュバント量とを含んでなるワクチン組成物を哺乳動物に鼻内投与することによる防護的ＩｇＡ粘膜免疫応答およびＩｇＧ全身的免疫応答を増強する方法も提供する。
抗原は、細胞壁タンパク質または多糖類のサブユニットとして、または（例えば、トランスフェクションによる）ＤＮＡの導入の後に細胞中で抗原を生成するＤＮＡとして提供することができる。厳密にいえば、ＤＮＡはそれ自身は「抗原」ではないが、抗原をコードするので、本明細書では抗原と呼ぶ。
抗原は、精製したまたは未精製の形態で提供することもできる。しかしながら、抗原を精製した形態で提供するのが好ましい。
本発明は、病原体由来のタンパク質、組換えタンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、リポ多糖類、およびＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）などの抗原に適用することができる。
下記の抗原のリストは、例示のために提供したものであり、排他的であることを意味しない。インフルエンザウイルス抗原（例えば、血球凝集素およびノイラミニダーゼ抗原）百日咳菌（Bordetella pertussis）抗原（例えば、百日咳毒素、線維状血球凝集素、ペルタクチン（pertactin））、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Helicobacter pylori抗原、狂犬病抗原、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）抗原、髄膜炎菌抗原（例えば、血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５のカプセル状多糖類）、破傷風菌抗原（例えば、破傷風トキソイド）、ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド）、肺炎球菌（例えば、Streptococcus pneumoniae３型のカプセル状多糖類）、結核抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原（例えば、ＧＰ−１２０、ＧＰ−１６０）、コレラ抗原（例えば、コレラ毒素Ｂサブユニット）、ブドウ球菌抗原（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）、シゲラ抗原（例えば、シゲラ多糖類）、水疱性口内炎ウイルス抗原（例えば、水庖性口内炎ウイルス糖タンパク質）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、肝炎抗原（例えば、Ａ型（ＨＡＶ）、Ｂ型（ＨＢＶ）、Ｃ型（ＨＣＶ）、Ｄ型（ＨＤＶ）およびＧ型（ＨＧＶ）肝炎ウイルス抗原）、呼吸シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）抗原、単純庖疹抗原、またはそれらの組合わせ（例えば、ジフテリア、百日咳および破傷風の組合わせ（ＤＰＴ））。適当な抗原としては、網膜抗原のような耐性を誘導する目的で送達されるものも挙げられる。
好ましい抗原としては、Bordetella pertussis抗原、髄膜炎菌抗原、破傷風抗原、ジフテリア抗原、肺炎球菌抗原、結核抗原、およびＲＳＶ抗原等が挙げられる。
本発明のもう一つの局面によれば、抗原はインフルエンザウイルス抗原でないのが好ましい。
キトサンは水溶性であるのが好ましく、キチンから４０％を上回る程度の脱アセチル化により、好ましくは５０〜９０％、更に好ましくは７０％〜９５％の脱アセチル化によって有利に製造することができる。
挙げることができる特定の脱アセチル化したキトサンとしては、Protan Biopolymer A/S、ドラーメン、ノルウェーから入手できる「Sea Cure+」キトサングルタメート等が挙げられる。
キトサンの分子量は、１０ｋＤ〜５００ｋＤ、好ましくは５０ｋＤ〜３００ｋＤ、更に好ましくは１００ｋＤ〜３００ｋＤであることができる。
本発明による組成物は、例えば下記の試験で記載されているような疾患に対する宿主の免疫化に用いることができる。
本発明のもう一つの局面によれば、疾患の感染に対して宿主を免疫化する方法であって、宿主に抗原を上記に定義したキトサンの有効アジュバント量と共に含んでなるワクチン組成物を鼻内投与することを含んでなる方法が提供される。
更に本発明のもう一つの局面によれば、鼻内投与した抗原の免疫応答を高める方法であって、上記抗原と上記に定義したキトサンとを共投与することを含んでなる方法が提供される。
本発明による鼻内用組成物は、エアゾール、点滴または吸入剤として投与するために液体または乾燥粉末として処方することができる。
本発明による組成物は、乾燥粉末として、またはミクロスフェアの形態で処方するのが好ましい。
鼻用点滴として投与する組成物は、このような組成物に通常含まれる種類の１または２以上の補形剤、例えば保存剤、粘度調節剤、緊張度（tonicity）調節剤、緩衝剤などを含むことができる。
キトサンが水性媒質に可溶性のままにし、抗原が酸性が強すぎるｐＨによって悪影響を受けないないようにするため、鼻内投与用溶液のｐＨは５．５〜６．５の範囲であるのが好ましく、ｐＨが約６であるのが最も好ましい。
本発明は、精製した表面抗原とキトサンとの鼻用組成物を投与する手段も提供する。投与装置は、例えばエアゾール投与装置の形態をとることができ、また単回投与量だけまたは複数回の投与量を投与するように整えることができる。
ワクチンは、患者の防御的免疫応答を刺激するのに有効な量で患者に投与される。例えば、ワクチンは、１または２以上の投与量で、各投与量がそれぞれのウイルスまたは菌株から調製したタンパク質または多糖類を１〜２５０μｇ、更に好ましくは２〜５０μｇ含むものをヒトに投与することができる。例えば、血球凝集素およびノイラミニダーゼ製剤は、３種類のウイルス株、例えば２×インフルエンザＡおよび１×インフルエンザＢから調製される場合に、投与されるウイルスタンパク質の総投与量は１５〜１５０μｇの範囲とすることができる。
Bordetella pertussis抗原を用いる場合には、ＦＨＡ、百日咳毒素（トキソイド）またはペルタクチン（pertactin）として個々にまたは組合わせて投与される細菌タンパク質の総投与量は、５〜１５０μｇの範囲とすることができる。
本発明を下記の実施例によって説明するが、これに限定されるものではない。記載される検討は、粘膜ワクチン接種のアジュバントとして用いられるキトサンは、多数の抗原に対する全身性および粘膜体液性応答のいずれをも高める可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
第１図は、インフルエンザの精製表面抗原（ＰＳＡ）で免疫したマウスにおける血清ＩｇＧ抗−血球凝集素応答を示している。各棒線は、４匹のマウスの相乗平均価（geometric mean titre）を示している。誤差の棒線は平均の１標準誤差を表す。カットオフ値は、検出下限の５０である。
第２図は、精製表面抗原（ＰＳＡ）で免疫したマウスにおける鼻におけるＩｇＡ抗血球凝集素応答を示している。第１図と同様に、それぞれの棒線は、４尾（匹）のマウスの相乗平均力価（titre）を表し、誤差の棒線は１標準誤差または平均を表している。
第３ａおよび３ｂ図は、ＥＬＩＳＰＯＴを用いる精製表面抗原（ＰＳＡ）で免疫したマウスの鼻および肺の抗ヘマグルチニン分泌細胞の測定を示す。第３ａ図は対数目盛を用いているが、第３ｂ図では線形目盛を用いている。
第４ａ、４ｂおよび４ｃ図は、それぞれＦＨＡで免疫したマウスでの抗−Bordetella pertussis線維状ヘマグルチニン（抗−ＦＨＡ）血清ＩｇＧ応答、肺洗浄液（lung lavage）中の抗−ＦＨＡ分泌ＩｇＡ応答、および鼻洗浄液中の抗−ＦＨＡ分泌ＩｇＡ応答を示す。
第５ａ、５ｂおよび５ｃ図は、それぞれＦＨＡおよびＰＴで免疫したマウスでの、坑−ＦＨＡおよび抗−Pertussis毒素（トキソイド；抗−ＰＴ）血清ＩｇＧ応答、肺洗浄液分泌ＩｇＡ応答、および鼻洗浄液分泌ＩｇＡ応答を示す。
実施例１
インフルエンザＢ精製表面抗原／キトサングルタメート組成物の調製
１Ａ．  中粘度脱アセチル化キチンが約１１％の残存Ｎ−アセチル基を有する１％キトサングルタメートの溶液を、キトサングルタメートを０．８％塩化ナトリウムに溶解することによって調製した。用いたキトサングルタメートの等級は、Protan Biopolymer A/S、ドラメン、ノルウェーから発売されている「Sea Cure+210」であった。
１Ｂ．  Evans Medical Limited、スペック（speke）、マージサイド、英国から「Fluvirin」の商標で発売されているインフルエンザＡおよびインフルエンザＢタンパク質の両者を含むインフルエンザ精製表面抗原（ＰＳＡ）をリン酸緩衝塩水中で調合して、タンパク質濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。ＰＳＡはほとんど完全にスパイクタンパク質（spike protein）血球凝集素（ＨＡ）からなっているが、幾らかのノイラミニダーゼを含んでいる。
１Ｃ．  キトサングルタメート溶液とＰＳＡ溶液との１：１混合物を調製して、０．５％キトサングルタメート（１１％アセチル化）、０．８％ＮａＣｌ、０．０５％ＰＳＡ、および溶液ｐＨを６とするリン酸緩衝液を含む鼻内ワクチン組成物を得た。
１Ｄ．  同じ濃度のＰＳＡを含むがキトサングルタメートは含まない、および同濃度のキトサングルタメートは含むがＰＳＡは含まない対照溶液も、調製した。更に、既知のアジュバントAlhydrogel（水酸化アルミニウム）に吸着させた同濃度のＰＳＡを含んでなる組成物も調製した。ＰＳＡは、Alhydrogelに４０℃で一晩吸着させた。
実施例２
マウス免疫研究
２Ａ．  実施例１に記載の方法で調製した４種類の組成物を、１２尾の成熟した（６〜８周齢）雌BALB/cマウスの群に下記のようにして投与した。
群１：  ２０μｌ（鼻孔当たり１０μｌ）ＰＳＡ／キトサン溶液を鼻内（intranasally）投与。ＰＳＡ投与量＝１０μｇ。
群２：  ２０μｌＰＳＡを鼻内投与（総ＰＳＡ投与量＝１０μｇ）。
群３：  ２００μｌＰＳＡ／Alhydrogelを皮下（subcutaneously）投与（ＰＳＡ投与量＝１０μｇ）。群４：  ２０μｌキトサン溶液を鼻内投与。
群５：  ２０μｌＰＳＡ（鼻孔当たり１０μｌ）を３日間毎日投与。（本研究に用いた４尾のマウスの群）。
２Ｂ．  免疫化の手続きは、マウスを３日間連続毎日投与して免疫した群５を除き、１か月の間隔をおいて３回行った。免疫化および試料採取法を、第１表に示す。
0004063876.tif 000002
免疫化および試料採取法
各試料採取点において、各群からの４尾のマウスを心臓穿刺によって定期に採血し、頭部を取り除いて、鼻通路を１ｍｌＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミンで洗浄した。群５は４尾のマウスだけであったので、血液は最初の２回の試料採取では尾穿刺によって得て、鼻洗浄は３回目の試料採取時にだけ行った。
抗体分析
総ての分析において、全インフルエンザワクチン（ＷＩＶ）を抗原として用いた。ＷＩＶは約５０％ＨＡに過ぎないが、これらの分析は、主として抗−ＨＡ抗体を測定しているものと思われた。この推定は、ＷＩＶの代わりにＰＳＡ（１００％ＨＡ）を用いて、幾つかの分析を繰り返すことによって確かめた。結果は、いずれの抗原でも同様であった。ＨＡに特異的な血清ＩｇＧおよび鼻ＩｇＡ抗体は、エンザイム・リンクト・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。バックグラウンドを補正した後、個々の光学密度（ＯＤ）希釈曲線をプロットし、力価値を測定した。力価は、ＯＤの読みが０．２となる血清の希釈度、またはＯＤの読みが０．１となる鼻洗浄の希釈度として測定した。
第三の試料で鼻洗浄液の採取と同様に、リンパ球を鼻腔の粘膜および肺から単離して、局部免疫応答をＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。
結果
１．  血清抗−ＨＡ血清応答
精製表面抗原（第１図および第２表）：
予想されたように、良好な血清応答が、ＰＳＡ＋Alhydrogelによる皮下（ＳＩＣ）免疫によって誘導された。試験を行った総ての動物では第一の免疫化の後に血清変換し、幾何平均力価（ＧＭＴ）は良好であった。応答は各追加免疫の後に増加し、３回目の投与の後のＧＭＴは極めて高かった（約８００，０００）。対照的に、鼻内投与したＰＳＡだけに対する血清応答は不十分であり、４尾のマウスの２尾だけが１回目の投与の後に血清変換し、試験を行ったマウスのいずれも２回目の投与の後にも血清ＨＡ抗体を持たず（これらは最初の免疫化の後に試験したものとは異なるマウスである）、試験を行った総ての動物は３回目の投与の後には血清変換したが、ＧＭＴはＰＳＴ＋Alhydrogelを一回投与した動物より低かった。キトサンは鼻内投与したＰＳＡの血清応答を高め、３回目のワクチン接種の後には、ＰＳＡ＋キトサンを投与したマウスの抗体応答は、ＰＳＡだけを鼻内投与（Ｉ／Ｎ）したマウスの３６０倍大きかった。ＰＳＡ＋キトサンマウスにおける血清応答の大きさは、ＳＩＣ免疫したマウスのものと極めて類似しており、実際に、いずれの試料採取時での２つの群のＧＭＴには統計的差異はなかった（Studentのｔ検定、ｐ＞０．０１）。
数尾のマウスをＰＳＡのみを連日で３回鼻内投与して免疫して、この方法が月１回の方法より有利かどうかを検討した。この群の総てのマウスは、最初の投与から２１日後には検出可能な血清抗体を有し、この時点でのＧＭＴは、ＰＳＡを１回鼻内投与したマウスでのものより大きく、セロポジティブなマウスの数は検討の経過中に減少したが、ＧＭＴは減少しなかった（この群では、各時点で同じマウスから試料採取した）。最終的な時点で、月毎の方法でのマウスのＧＭＴの大きさの程度は、日毎の方法でのマウスより大きかった。
0004063876.tif 000003
２．  鼻内洗浄液ＩｇＡ抗−ＨＡ応答
精製表面抗原（第２図および第３表）：
皮下投与したＰＳＡ＋Alhydrogelは、鼻ＩｇＡ応答の誘導は極めて不十分であり、本発明者らの以前の知見および他の研究者らの知見と一致している。ＰＳＡだけを鼻内投与したものも、応答する動物の数に関しては皮下免疫化より僅かに良好であったが、やはり不十分な粘膜免疫原であった。キトサンを添加すると、この応答は１回目の投与の後には低かったが、ＩｇＡ応答は著しく高められ、ＨＡ特異的ＩｇＡが４尾のマウスのうち３尾に検出することができた。ＩｇＡ応答は、２回目の免疫化によってこれらのマウスで著しく高められた。最後の免疫化の効果はわずかであり、実際に平均特異的ＩｇＡ濃度は若干減少した。
0004063876.tif 000004
キトサンのみに対する応答
キトサンだけで免疫した対照マウスからの血清および鼻内洗浄液は、総ての分析において陰性であった。
鼻および肺組織における局所抗−ＨＡ抗体分泌細胞応答（ＡＳＣ）
３回目の試料採取の時点で、リンパ球を４尾のマウスの群の鼻内粘膜および肺実質組織から単離した。個々のマウスからのリンパ球をプールして、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗インフルエンザ（anti-flu）抗体を分泌する細胞についてＥＬＩＳＰＯＴを用いて分析した。結果を、第３ａおよび３ｂ図に示す。
ＨＡ特異抗体を分泌するＢ細胞は、総ての群の鼻および肺組織で検出可能であった。ＰＳＡ＋キトサン群にはこれらの細胞が極めて多数であり、これは結果を線形目盛上にプロットするときには極めて明らかである（第３ｂ図）。皮下で免疫したマウスを除く総ての場合において、ＩｇＡ抗体分泌細胞（ＡＳＣ）が鼻腔では支配的であり、ＩｇＧまたはＩｇＭが肺で支配的であった。応答の大きさは、ＰＳＡ＋キトサンマウスの肺および鼻では同程度である。
実施例３
Bordetella pertussis繊維状血球凝集素／キトサングルタメート組成物の調製
３Ａ．  １％（１０ｍｇ／ｍｌ）キトサングルタメート（ＣＳＮ）の溶液を、上記実施例１に記載した方法で調製した。
３Ｂ．  National Institute for Biological Sciences、サウス・ミムス、ポッタース・バー、ロンドン、英国から入手したBordetella pertussis繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）をリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中で調製し、タンパク質濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。
３Ｃ．  ＣＳＮ溶液とＦＮＡ溶液との１：１混合物を調製して、０．５％ＣＳＮ、０．５ｍｇ／ｍｌＦＨＡ、０．８％塩化ナトリウムおよびリン酸緩衝液、ｐＨ６．０を含む鼻内ワクチンを得た。
３Ｄ．  同濃度のＦＨＡを含むがＣＳＮは含まない鼻内ワクチン接種用の対照溶液も調製した。更に、既知のアジュバントAlhydrogel（水酸化アルミニウム）に吸着したＦＨＡ約０．１ｍｇ／ｍｌを含む混合物も調製した。ＦＨＡは、混合物を室温で３０分間攪拌することによってAlhydrogelに吸着した。
マウス免疫化研究
３Ｅ  上記の方法（３Ｃおよび３Ｄの節）で調製した３種類の組成物を、下記のような１３尾の成熟雄Balb/cマウスの群に投与した。
群１：  ２０μｌ（鼻孔当たり１０μｌ）のＦＨＡ溶液を鼻内投与。（ＦＨＡ投与量＝１０μｇ）。
群２：  ２０μｌ（鼻孔当たり１０μｌ）のＦＨＡ／ＣＳＮ溶液を鼻内投与。（ＦＨＡ投与量＝１０μｇ、およびキトサン＝１００μｇ）。
群３：  ５０μｌＦＨＡ／Alhydrogel混合物を皮下投与。（ＦＨＡ投与量＝５μｇ、およびAlhydrogel＝０．２５ｍｇ）。
免疫化および試料採取法
３Ｄ  免疫化の手続きは、１か月の間隔で３回行った。免疫化および試料採取法を、第４図に示す。
３Ｅ  試料採取点１および２におけるそれぞれの群からの４尾のマウス、および試料採取点３における各群からの５尾のマウスを心臓穿刺によって定期に採血した。血液試料を採取した後、ペントバルビトンナトリウムの静脈内過剰投与によって動物を殺し、鼻通路および肺をそれぞれ１％ウシ血清アルブミンを含む１ｍｌＰＢＳで洗浄した。
0004063876.tif 000005
抗体分析
３Ｆ  血清試料中の抗−ＦＨＡ  ＩｇＧ抗体および鼻洗浄および肺洗浄試料中の抗−ＦＨＡ分泌ＩｇＡ抗体をエンザイム・リンクト・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。個々の動物において異なる組成物によって誘導される抗体応答を比較するため、ある値を、試験試料の分析の際の標準曲線を作成するのに用いた対照ポジティブ血清および対照ポジティブ肺洗浄試料に割り当てた。対照ポジティブ血清および対照ポジティブ肺洗浄液は、それぞれ１０６ＩｇＧ当量単位（Eq. unit）／ｍｌおよび１０４ＩｇＡ当量単位／ｍｌの値を得た。
結果
３Ｇ  血清ＩｇＧ濃度（第５表および第４ａ図）は、鼻内投与したＦＨＡ／キトサン組成物は、２２日、４３日および７０日の応答の安定増加を誘導したことを示している。対照的に、鼻内投与したＦＨＡ溶液も７０日目までに幾らかの応答を誘導したが、これはＦＨＡ／キトサン溶液によって生成される相当する応答の５分の１に過ぎなかった。期待したように、皮下投与したＦＨＡ／Alhydrogel組成物は高い二次応答を誘導した（４３日目）。この応答は、ＦＨＡ／キトサンの鼻用組成物によって生成される相当する応答の７倍程であった。しかしながら、皮下投与に対する応答は７０日までに減少し、これはＦＨＡ／キトサン鼻用組成物についての相当する値の３倍程にすぎなかった。
３Ｈ  肺洗浄液における分泌ＩｇＡ濃度（第５表、第４ｂ図）は、ＦＨＡ／キトサン鼻用組成物は、鼻内投与したＦＨＡ溶液または皮下投与したＦＨＡ／Alhydrogel組成物によって生成される応答と比較して４３日目および７０日目に最大の応答を誘導したことを明らかに示している。４３日目には、応答は、それぞれ鼻用ＦＨＡ溶液および皮下用ＦＨＡ／Alhydrogel組成物によって誘導される応答の１００および２５０倍程であった。
３Ｉ  鼻内洗浄液中の分泌ＩｇＡ濃度（第５表および第４ｃ図）も、ＥＨＡ／キトサン鼻用組成物は４３日目および７０日目の応答に安定な増加を誘導したことを示している。対照的に、皮下投与では、応答は全く生じず、鼻内ＦＨＡ溶液では７０日目に幾らかの応答を生じたが、これはＦＨＡ／キトサン鼻用組成物によって生成される応答の３分の１に過ぎなかった。
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実施例４
Bordetella pertussis線維状血球凝集素／百日咳毒素（トキソイド）／キトサングルタメート組成物の調製
４Ａ  ２％（２０ｍｇ／ｍｌ）キトサングルタメート（ＣＳＮ）の溶液を、２００ｍｇのキトサンを１０ｍｌの水に溶解して調製した。
４Ｂ  CAMR、サリスバリー、ウィルトシャー、英国から入手したBordetella pertussis繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）を、Aquacide IIカラムを用いて濃縮し、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中で調合して、タンパク質濃度を２６７μｇ／ｍｌとした。IRIS、シエナ、イタリアから入手した百日咳毒素（ＰＴ）の非毒性突然変異体をAquacide IIカラムを用いて濃縮し、０．５Ｍ塩化ナトリウム中で調合して、最終濃度を２６７μｇ／ｍｌとした。これらの２種類の抗原溶液の等容ずつを混合して、それぞれの抗原を１３３μｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度で含む溶液を得た。
４Ｃ  ２％ＣＳＮ溶液およびＦＨＡ／ＰＴ溶液の１：３混合物を調製して、０．５％ＣＳＮ、約１００μｇ／ｍｌＦＨＡ、１００μｇ／ｍｌＰＴ、０．８％塩化ナトリウム、およびリン酸緩衝液を含む鼻内ワクチンを得た。
４Ｄ  同じ濃度のＦＨＡおよびＰＴを含むが、ＣＳＮは含まない鼻内ワクチン接種用の対照溶液を調製した。０．５％ＣＳＮを含むが、ＦＨＡもＰＴも含まない鼻内ワクチン接種用のネガティブコントロール溶液も、２％ＣＳＮ溶液１部を０．００１４Ｍ塩化カリウムおよび０．３１８５Ｍ塩化ナトリウムを含むＰＢＳ３部で希釈することによって調製した。また、約１０μｇ／ｍｌＦＨＡおよび１０μｇ／ｍｌＰＴを既知のアジュバントAlhydrogel（２００〜ｇ／ｍｌ）に吸着したものを含む混合物を調製した。抗原は、混合物を室温で３０分間攪拌してAlhydrogelに吸着した。
マウス免疫化研究
４Ｅ  上記の方法（第３Ｃおよび３Ｄの節）で調製した４種類の組成物を、下記のような１０尾の成熟した雌Balb/cマウスの群に投与した。
群１：  ２０μｌ（鼻孔当たり１０μｌ）のＦＨＡ／ＰＴ／ＣＳＮ溶液を鼻内投与。（ＦＨＡの投与量＝２μｇ、ＰＴ投与量＝２μｇ、キトサン投与量＝１００μｇ）。
群２：  ２０μｌ（鼻孔当たり１０μｌ）のＰＴ／ＦＨＡ溶液を鼻内投与。（ＦＨＡの投与量＝１０μｇ、ＰＴ投与量＝２μｇ）。
群３：  ２０μｌ（鼻孔当たり１０μｌ）のＣＳＮ溶液を鼻内投与。（ＣＳＮの投与量＝１００〜ｇ）。
群４：  ２００μｌのＦＨＡ／ＰＴ／Alhydrogel混合物を腹腔内（intraperitoneally）投与。（ＦＨＡの投与量＝２μｇ、ＰＴの投与量＝２μｇ、Alhydrogel＝４０μｇ）。
免疫化および試料採取法
４Ｄ  免疫化の手続きは１か月の間隔で２回行った。免疫化および試料採取法を、第６表に示す。
４Ｅ  試料採取点１および２におけるそれぞれの群からの５尾のマウスを心臓穿刺によって定期に採血した。血液試料を収集した後、動物をペントバルビトンナトリウムを静脈内過剰投与によって殺し、鼻通路および肺をそれぞれ１％ウシ血清アルブミンを含む１ｍｌＰＢＳで洗浄した。
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抗体分析
４Ｆ  血清試料中の抗−ＦＨＡ  ＩｇＧ、抗−ＰＴ  ＩｇＧ抗体、および鼻内洗浄液および肺洗浄試料中の抗−ＦＨＡ分泌ＩｇＡ、抗−ＰＴ分泌ＩｇＡ抗体を、エンザイム・リンクト・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。試験試料を試料緩衝液で適当に希釈して４種類の異なる濃度とし、それぞれの抗体に対して２回分析した。滴定曲線を作成し、ｙ−軸値をバックグラウンド値の２．５倍に固定して、それぞれの試料に対する内挿値をKineticalc programme KC3を用いて計算した。次いで、各試料についての相乗平均タイトレーション（ＧＭＴ）を、内挿値の逆数を計算することによって得た。
結果
４Ｇ  抗−ＦＨＡおよび抗−ＰＴ血清ＩｇＧ抗体のＧＭＴ値（第７、８表および第５ａ図）は、鼻内投与したＦＨＡ／ＰＴ／キトサン組成物（群１）は、一次全身性（systemic）応答およびかなり増強された二次応答を誘導することを示している。対照的に、鼻内投与したＦＨＡ／ＰＴ溶液（群２）も、幾らかの一次全身性応答と増強された二次応答を誘導した。しかしながら、群１によって生成したＦＨＡおよびＰＴの両者に対する二次応答は、群２によって生じた相当する応答の約５倍高かった。
４Ｈ  期待したように、腹腔内投与したＦＨＡ／ＰＴ溶液（群４）は、ＦＨＡおよびＰＴに対する高い一次および二次応答を誘導した（第７、８表および第５Ａ図）。しかしながら、ＦＨＡおよびＰＴに対する二次応答は、それぞれ一次応答の約３０および１０倍高かった。ネガティブコントロール群の血清試料（群３）は、抗−ＦＨＡおよび抗−ＰＴ  ＩｇＧ抗体（第７および８表）の両者に対してネガティブであることがわかった。
４Ｉ  肺洗浄における分泌ＩｇＡ抗体のＧＭＴ値（第７、８表および第５ｂ図）は、鼻内組成物ＦＨＡ／ＰＴ／キトサン（群１）およびＦＨＡ／ＰＴ（群２）はいずれもＦＨＡおよびＰＴに対して二次応答を誘導したが、いずれの抗原も一次応答は生じないことを明らかに示している。群１および群２によって生成されたＰＴに対する二次応答は同様であったが、群１によって生成されたＦＨＡに対するこの応答は、群２によって生成されたＦＨＡに対する応答の約１５倍高かった。
４Ｊ  鼻内洗浄液中の分泌ＩｇＡ抗体のＧＭＴ値（第７、８表および第５ｃ図）も、群１および群２の鼻内組成物はいずれも両抗原に対する二次応答を誘導したが、ＰＴだけが小さな一次応答を生じることを示している。群１によって生じたＦＨＡに対する二次応答は、群２によって生じたもののほぼ１５倍高かったが、群１によって生じたＰＴに対する相当する応答は群２によって生じた応答の２倍に過ぎなかった。
４Ｋ  キトサン対照群（群３）からの肺洗浄および鼻洗浄試料は、抗−ＦＨＡおよび抗−ＰＴ  ＩｇＡ抗体の両者に対してネガティブであることがわかった（第７および８表）。腹腔内投与したＦＨＡ／ＰＴ／Alhydrogel（群４）も、肺洗浄または鼻洗浄液中のいずれの抗原に対しても粘膜応答（ＩｇＡ抗体）を生じなかった。
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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