(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）〜（３）を含む、コーンの低温エタノール分画法における第ＩＩ＋ＩＩＩ画分であるヒト血漿原料からヒトマンノース結合レクチンを精製する方法。
（１）上記ヒト血漿原料とポリエチレングリコールを接触させる工程、
（２）続いてヒトマンノース結合レクチンと親和性を有する物質を担体に固定化した固定相を用いるアフィニティークロマトグラフィーを行う工程、
（３）さらに続いてヘパリンクロマトグラフィーを行う工程。
【請求項２】
ヒトマンノース結合レクチンと親和性を有する物質がマンノースまたはマンナンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリエチレングリコール濃度が、２〜５ｗ／ｖ％である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ポリエチレングリコールの平均分子量が６００〜６０００である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ポリエチレングリコールとの接触が０〜１０℃で行われることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
以下の工程（１）〜（３）を含む、コーンの低温エタノール分画法における第ＩＩ＋ＩＩＩ画分であるヒト血漿原料からのヒトマンノース結合レクチン含有組成物の製造方法。
（１）上記ヒト血漿原料とポリエチレングリコールを接触させる工程、
（２）続いてヒトマンノース結合レクチンと親和性を有する物質を担体に固定化した固定相を用いるアフィニティークロマトグラフィーを行う工程、
（３）さらに続いてヘパリンクロマトグラフィーを行う工程。
【請求項７】
ヒトマンノース結合レクチンと親和性を有する物質がマンノースまたはマンナンである、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
ポリエチレングリコール濃度が、２〜５ｗ／ｖ％である、請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項９】
ポリエチレングリコールの平均分子量が６００〜６０００である、請求項６〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
ポリエチレングリコールとの接触が０〜１０℃で行われることを特徴とする、請求項６〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
ヒト血漿原料に対して回収率が６０％以上である、請求項６〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
ヒトマンノース結合レクチンの純度が９０％以上である、請求項６〜１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
ヒトマンノース結合レクチンが高次ホモオリゴマー構造を保持した状態であることを特徴とする、請求項６〜１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項６〜１３のいずれかに記載の製造方法により製造されるヒトマンノース結合レクチン含有組成物。
【請求項１５】
ヒトマンノース結合レクチンが請求項１〜５に記載の方法により精製されたヒトマンノース結合レクチンであり、該ヒトマンノース結合レクチンの純度が９０％以上である、ヒトマンノース結合レクチン含有組成物。
【請求項１６】
ヒトマンノース結合レクチンが高次ホモオリゴマー構造を保持した状態であることを特徴とする、請求項１５記載のヒトマンノース結合レクチン含有組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、ヒトの血漿中に存在する、ヒトマンノース結合レクチン（以下、単にマンノース結合レクチン（ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎ）と呼び、ＭＢＬと記載する。マンナン結合レクチン、マンナン結合プロテインとも呼ばれる）を、ヒト血漿から精製する方法に関する。また、本発明は、ヒト血漿からのＭＢＬ含有組成物の製造方法およびその製造方法により製造されるＭＢＬ含有組成物に関する。また、本発明は、ＭＢＬの新たな用途に関する。
背景技術
ＭＢＬは、主に肝臓で生合成されるタンパク質であり、コレクチンと呼ばれるファミリーに属する。またＭＢＬは、システインに富んだＮ末端領域、コラーゲン様領域、ネック領域およびカルシウム要求性の糖認識領域からなる分子量約３１ｋＤａのサブユニットが、ネック領域およびコラーゲン領域によりトリプルヘリックス構造をとって三量体となり、さらにその三量体を基本単位とした二〜六量体のホモオリゴマー構造となって、全体として２００〜６００ｋＤａの分子量を持つ状態（以下、単に「ホモオリゴマー構造」という。）で存在していることが知られている〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，２２８７−２２９４，１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７，１０２９−１０３５，１９９５、およびＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３７５，１５９−１６１，１９９５〕。
ＭＢＬは、主に免疫機能における補体系に作用することが知られている。すなわち、これまで補体系の活性化経路としては、免疫グロブリンを異物の認識分子とし、補体第一成分が活性化されるいわゆる古典的経路と、細菌などの異物に補体第三成分が直接結合する第二経路が知られていたが、近年になって、ＭＢＬがマンノースやＮ−アセチルグルコサミンなどの微生物表面の糖鎖を特異的に認識して補体の活性化を起こす、レクチン経路と呼ばれる第三の補体活性化経路の存在が見いだされた。このレクチン経路は、抗原を認識して記憶するいわゆる獲得性免疫を持たない無脊椎動物を含め、普遍的に存在する自然免疫の一つであり、その中でも重要な位置を占める生体防御機能であると考えられている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，７４５１−７４５４，１９８７およびＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８４，１８２１−１８２９，１９８９〕。ＭＢＬは血清中で補体活性化成分であるＭＡＳＰ（ＭＢＬ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）などと複合体を形成して補体活性化することが知られている。ＭＢＬがウイルスや細菌などの表面の糖鎖にあるマンノースやＮ−グルコサミンを認識してそれらと結合することが起点となり、ＭＡＳＰとの複合体の形成下に補体経路を活性化させ、ウイルスや細菌などの殺傷を引き起こす。
また、同様にＭＢＬがウイルスや細菌などに結合することが起点となり、食細胞がそれらを貧食すること、すなわちＭＢＬはオプソニン作用を有していることが知られている。
食細胞が細菌などへの貧食作用を起こさず易感染性を呈しているＭＢＬ欠損患者に対して、ＭＢＬを補充する治療を行ったところ、易感染性が改善されたとの報告もある〔Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４８，１１６−１２３，１９９８〕。
さらに、ＭＢＬがインフルエンザの感染を抑制するとの報告〔Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９７，３８５−３９２，１９９９〕、ＨＩＶの感染を抑制するとの報告〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９，１８５−１９６，１９８９〕、がん増殖を抑制するとの報告〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９６，３７１−３７５，１９９９〕などがこれまでに行われている。
発明の開示
ＭＢＬの精製方法としては、これまでにヒト血漿から精製する方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１９，３２９−３３２，１９９６〕、ヒト血清から精製する方法〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９４，９３７−９４７，１９８３〕などが知られている。しかし、これらの方法は、マンナンまたはマンノース固定化アガロース（セファロース４Ｂ、ファルマシアバイオテク社）クロマトグラフィーを複数回行わなくてはならないことなどにより、ＭＢＬの回収率は高くはない。さらに、これらの方法は、目的とするＭＢＬのみを精製する方法でしかなく、限りのある貴重なヒト血漿から、数多くの有用な血漿蛋白成分を無駄なく分取する工程の一部であるべき、血漿蛋白製剤原料としてのＭＢＬの精製方法として好ましくない。また、コーンの低温エタノール分画法によって得られる第ＩＩ＋ＩＩＩ画分からイムノグロブリンを抽出した残渣を原料として、ＭＢＬを工業レベルで精製する方法も報告されている〔ＰＣＴ／ＷＯ９９／６４４５３〕。しかし、この技術では、マンナンなどを固定化していないアガロース（セファロースＣＬ４Ｂ、ファルマシアバイオテク社）を用いたアフィニティークロマトグラフィー処理工程の前処理として、不溶物を除去するための複数回の通常ろ過工程およびデリピドフィルターを用いたろ過工程が必要とされており、精製方法として煩雑であるほか、そのための設備も必要となる。さらに、アフィニティークロマトグラフィー処理工程から最終精製物までの回収率も、４３％という低い数値にすぎないことが記載されている。一般に、アフィニティークロマトグラフィーに付すための溶液が不溶物を含んでいると、不溶物によりカラムが目詰まりを起こしたり、カラム中の担体と分取目的物との接触を不溶物が妨げることによりクロマトグラフィーの分離性能が低下することがある。そのため、アフィニティークロマトグラフィーに付すための溶液が不純物を含まず澄明であることが、アフィニティークロマトグラフィーの性能を十分に発揮させるために重要であると考えられるが、上記のいずれの技術でも、そのような中間原料を簡便な方法で得ることができない。
また、上述のように、ＭＢＬはホモオリゴマー構造の状態で存在していることが知られているが、その中でも約４５０ｋＤａ（五量体）以上の高次なホモオリゴマー構造（以下、単に「高次ホモオリゴマー構造」という。）の状態で存在しているＭＢＬは、約２７０ｋＤａ（三量体）の状態で存在しているＭＢＬに比べ、補体活性化作用が強いとの報告もある〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４４，２２８７−２２９４，１９９０およびＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７７，４１４−４１９，１９９５〕。従って、ＭＢＬの精製は、高次ホモオリゴマー構造を分解させることのない条件で行うことが好ましい。
従って、本発明は、ＭＢＬの有する高次ホモオリゴマー構造を分解させることなく、また限りのある貴重なヒト血漿から、他の有用な血漿蛋白成分の分取に何ら影響を与えることなく、また遊離の状態で、ＭＢＬを高純度かつ高回収率で得る精製方法およびかかるＭＢＬを高純度で含有するＭＢＬ含有組成物のヒト血漿原料からの回収率のよい製造方法を提供すること、および、アフィニティークロマトグラフィー処理などに適したＭＢＬの精製用原料およびＭＢＬ含有組成物の製造用原料として有用な、ＭＢＬ含有溶液を提供すること、および、ＭＢＬを高純度で含み、ＭＢＬが高次ホモオリゴマー構造を保持している臨床上有用なＭＢＬ含有組成物を提供することを目的とする。
発明者らは、ヒト血漿の分画を出発原料として、ポリエチレングリコールと接触させる工程を少なくとも１回行うことにより得られるＭＢＬ含有溶液が、その後のアフィニティークロマトグラフィー処理に適していることを見出した。ポリエチレングリコールと接触させる工程を少なくとも１回行うことにより得られるＭＢＬ含有溶液は、澄明な溶液であって、アフィニティークロマトグラフィーの性能を十分に発揮させることができ、かつ、ヒト血漿中のＭＢＬを回収率よく含んでおり、ＭＢＬの精製用原料またはＭＢＬ含有組成物の製造用原料として有用である。また、この澄明な溶液に対してアフィニティークロマトグラフィー処理工程を行うことにより、好ましくは、さらに続いてヘパリンクロマトグラフィー処理工程を行うことにより、ヒト血漿に含まれるＭＢＬを、高次ホモオリゴマー構造を保持した状態で、高純度かつ高回収率で精製することが可能であることを見出した。さらに、本発明の精製方法または製造方法により、ＭＢＬを９０％以上の純度で含み、ＭＢＬが高次ホモオリゴマー構造を保持している臨床上有用なＭＢＬ含有組成物を得ることができることを見出し、本発明を完成させた。
また、サイトメガロウイルスは、臓器移植時やＡＩＤＳ発症時など、免疫抑制や免疫不全の環境下に感染あるいは再活性化すると、感染症状として網膜炎、脳炎、肺炎などを引き起こし、患者を失明や死に至らしめることが知られており、Ｂ型肝炎ウイルスは、急性肝炎から劇症肝炎となって患者を死に至らしめたり、慢性肝炎から肝硬変や肝癌を発症させることが知られている。本発明者らは、ＭＢＬが、サイトメガロウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスの感染の予防剤または治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（３３）からなる。
（１）ポリエチレングリコールと接触させる工程を含む、ヒト血漿原料からＭＢＬを精製する方法、
（２）ポリエチレングリコールと接触させる工程に続いてアフィニティークロマトグラフィーを行う工程を含む、上記（１）記載の方法、
（３）さらに続いてヘパリンクロマトグラフィーを行う工程を含む、上記（２）記載の方法、
（４）ポリエチレングリコール濃度が、２〜５ｗ／ｖ％である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５）ポリエチレングリコールの平均分子量が６００〜６０００である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法、
（６）ポリエチレングリコールとの接触が０〜１０℃で行われることを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法、
（７）ヒト血漿原料が、コーンの低温エタノール分画法における第ＩＩ＋ＩＩＩ画分である、上記（１）記載の方法、
（８）ポリエチレングリコールと接触させる工程を含む、ヒト血漿原料からのＭＢＬ含有組成物の製造方法、
（９）ポリエチレングリコール濃度が、２〜５ｗ／ｖ％である、上記（８）記載の製造方法、
（１０）ポリエチレングリコールの平均分子量が６００〜６０００である、上記（８）または（９）に記載の製造方法、
（１１）ポリエチレングリコールとの接触が０〜１０℃で行われることを特徴とする、上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の製造方法、
（１２）上記（８）〜（１１）のいずれかに記載の製造方法によって得られるＭＢＬ含有組成物であって、澄明な溶液であることを特徴とするＭＢＬ含有組成物、
（１３）ポリエチレングリコールと接触させる工程に続いてアフィニティークロマトグラフィーを行う工程を含む、ヒト血漿原料からのＭＢＬ含有組成物の製造方法、
（１４）さらに続いてヘパリンクロマトグラフィーを行う工程を含む、上記（１３）記載の製造方法、
（１５）ヒト血漿原料が、コーンの低温エタノール分画法における第ＩＩ＋ＩＩＩ画分である、上記（８）または（１３）に記載の製造方法、
（１６）ヒト血漿原料に対して回収率が６０％以上である、上記（８）または（１３）に記載の製造方法、
（１７）ＭＢＬの純度が９０％以上である、上記（８）または（１３）に記載の製造方法、
（１８）ＭＢＬが高次ホモオリゴマー構造を保持した状態であることを特徴とする、上記（８）または（１３）に記載の製造方法、
（１９）上記（１３）〜（１８）のいずれかに記載の製造方法により製造されるＭＢＬ含有組成物、
（２０）ＭＢＬの純度が９０％以上である、上記（１２）または（１９）に記載のＭＢＬ含有組成物、
（２１）ＭＢＬが高次ホモオリゴマー構造を保持した状態であることを特徴とする、上記（１２）または（１９）に記載のＭＢＬ含有組成物、
（２２）ＭＢＬの純度が９０％以上である、ＭＢＬ含有組成物、
（２３）ＭＢＬが高次ホモオリゴマー構造を保持した状態であることを特徴とする、上記（２２）記載のＭＢＬ含有組成物、
（２４）ＭＢＬを有効成分として含有する、サイトメガロウイルス感染症の予防または治療剤、
（２５）ＭＢＬを有効成分として含有する、Ｂ型肝炎ウイルス感染症の予防または治療剤、
（２６）ＭＢＬと製薬上許容されうる添加剤を含む、サイトメガロウイルス感染症の予防または治療のための医薬組成物、
（２７）ＭＢＬと製薬上許容されうる添加剤を含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染症の予防または治療のための医薬組成物、
（２８）サイトメガロウイルス感染症の予防または治療剤の製造のためのＭＢＬの使用、
（２９）Ｂ型肝炎ウイルス感染症の予防または治療剤の製造のためのＭＢＬの使用、
（３０）患者の血漿中ＭＢＬ濃度が医薬上有効な濃度となる量のＭＢＬを患者に投与することを含む、サイトメガロウイルス感染症の予防または治療方法。
（３１）患者の血漿中ＭＢＬ濃度が医薬上有効な濃度となる量のＭＢＬを患者に投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染症の予防または治療方法。
（３２）上記（２６）に記載のサイトメガロウイルス感染症の予防または治療のための医薬組成物をサイトメガロウイルス感染症の予防または治療に使用しうるか、または使用すべきであることを記載した書類を含む商業パッケージ、
（３３）上記（２７）に記載のＢ型肝炎ウイルス感染症の予防または治療のための医薬組成物をＢ型肝炎ウイルス感染症の予防または治療に使用しうるか、または使用すべきであることを記載した書類を含む商業パッケージ。
発明の詳細な説明
本発明のＭＢＬを精製する方法に使用されるヒト血漿原料としては、ヒト血漿に由来するものであって、ＭＢＬを含有する画分であれば、特に限定されるものではない。具体的には、ヒト血漿そのもの、ヒト血清、コーンの低温エタノール分画法〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６８，４５９−４７５，１９４６〕により得られる、第Ｉ上清画分、第Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ画分、第ＩＩ＋ＩＩＩ画分、第ＩＩ画分、第ＩＩＩ画分、または、ポリエチレングリコール分画法により得られる７ｗ／ｖ％処理時での沈殿画分などが例示される。このうちＭＢＬが多く存在するという理由からコーンの低温エタノール分画法における第ＩＩ＋ＩＩＩ画分を用いることが好ましい。また、ヒト血漿の無駄のない利用という面からは、有用な血漿タンパク成分であるイムノグロブリンを抽出した後のヒト血漿を原料として用いることが好ましい。具体的には、第ＩＩ＋ＩＩＩ画分からイムノグロブリンを抽出した後の抽出残渣を用いることが挙げられる。
コーンの低温エタノール分画法における第ＩＩ＋ＩＩＩ画分は、通常の方法により得ることができ、例えば上述の文献等に従って得ることができる。第ＩＩ＋ＩＩＩ画分からイムノグロブリンを抽出した画分は、例えば次の方法により得ることができる。０〜５℃において、まず第ＩＩ＋ＩＩＩ画分に、その重量の５〜１５倍量の水を加えて懸濁し、塩酸などでｐＨ５．０〜６．０に調整し、１〜５時間攪拌し、遠心分離により上清画分（イムノグロブリンを含む画分）と抽出残渣（ＭＢＬを含む画分）に分離して、抽出残渣を採取する。
本発明のＭＢＬを精製する方法は、少なくともポリエチレングリコールと接触させる工程（１）を含み、得られた澄明な溶液にアフィニティークロマトグラフィー処理を行う工程（２）を含み、好ましくは、さらに続いてヘパリンクロマトグラフィー処理を行う工程（３）を含む。また、本発明においては（１）、（２）、（３）の工程を、この順に１回ずつ行うことによって効率よく高純度なＭＢＬ含有組成物を得ることができる。
（１）ポリエチレングリコールと接触させる工程
本工程は、ＭＢＬを含有するヒト血漿画分をポリエチレングリコールと接触させて、その上清画分を採取することにより、ＭＢＬの精製用原料またはＭＢＬ含有組成物の製造用原料として有用な澄明な溶液を得るための工程である。
上記の方法等により得られたヒト血漿原料について、まず、適当な溶媒を加えて懸濁、攪拌してＭＢＬを抽出することが好ましい。この懸濁液にポリエチレングリコールを接触させ、上清画分と沈殿画分とに分離し、澄明な上清画分（以下工程（１）により得た上清画分を「ＭＢＬ抽出液」という。）を採取する。
ヒト血漿原料からＭＢＬを抽出するための溶媒としては、生理食塩水、等張化リン酸緩衝液（ＰＢＳ）などが例示される。溶媒の使用量としては、ヒト血漿原料の重量の５〜１５倍、好ましくは８〜１２倍が挙げられる。抽出時のｐＨ条件はｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５に調節される。イオン強度は８０〜３００ｍＥｑ／Ｌが例示される。温度は０〜１０℃、好ましくは０〜５℃である。
この懸濁液に添加するポリエチレングリコールは、６００〜６０００の平均分子量を有するものが挙げられる。具体的には、ポリエチレングリコール６００（平均分子量６００）、ポリエチレングリコール１５００（平均分子量１５００）、ポリエチレングリコール４０００（平均分子量４０００）、ポリエチレングリコール６０００（平均分子量６０００）などが例示される。好ましくはポリエチレングリコール４０００が用いられる。ポリエチレングリコール濃度は２〜５ｗ／ｖ％が例示され、より好ましくは３〜４ｗ／ｖ％が挙げられる（当該濃度が２ｗ／ｖ％未満では澄明なＭＢＬ抽出液を得ることができず、逆に５ｗ／ｖ％を超えるとＭＢＬ抽出液中のＭＢＬ含有率が低下する。なお、溶液の澄明性は、日本薬局方通則に従い、内径１５ｍｍの無色の試験管に３０ｍｍの液層を入れた状態で、白色の背景を用いて肉眼で判断する）。ポリエチレングリコール接触時のｐＨ条件は、ｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５が例示される。これは、必要に応じてポリエチレングリコール添加後の懸濁液に塩基または酸（無機塩基または無機酸など、好ましくは水酸化ナトリウムまたは塩酸）を添加することにより調節することができる。イオン強度は８０〜３００ｍＥｑ／Ｌが例示される。ポリエチレングリコールと接触させる時間は、ポリエチレングリコールにより不溶物が沈殿する範囲であれば特に限定されないが、好ましくは３〜２０時間である。
ポリエチレングリコールとの接触処理後に、遠心分離またはフィルタープレスなどの方法を用いて、上清画分と沈殿画分とを分離し、上清画分を採取する。遠心分離を行う場合は１０００〜１００００ｇで１０〜６０分間の条件下で遠心分離を行った後に、フィルターろ過により上清画分を採取する。フィルターとしては孔径０．２２〜０．４５μｍのメンブレンフィルター（Ｓａｒｔｏｃｏｎ、ザルトリウス社；ミリパック、プロスタック、ともにミリポア社など）を用いる。また、この際にプレフィルターを組み合わせて用いてもよい。プレフィルターとしてはプレフィルター−ＡＰ（ミリポア社）、Ｚｅｔａ−ｐｌｕｓ３０ＬＡ（Ｃｕｎｏ社）などが例示される。
（２）アフィニティークロマトグラフィー処理を行う工程
本工程は、ＭＢＬとの特異的な親和性を有する担体を用いて他の夾雑タンパクとＭＢＬを分離することにより、ＭＢＬを高純度かつ高濃度な状態で得るための工程である。
アフィニティークロマトグラフィーの固定相は、ＭＢＬと親和性を有するものであれば特に限定されない。例えば、マンノースまたはマンナンを担体（例えばセルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリビニル、シリカ、ガラスなど）に固定化したものが挙げられる。具体的には、マンノースを、リガンド固定化担体（ＡＦ−アミノトヨパール６５０Ｍ，東ソー社；活性化エポキシセファロース６Ｂ、アマシャムファルマシア社）に固定化させたものや、マンナン固定化アガロース（マンナン・アガロース、シグマ社）などが例示される。好ましくはマンナン固定化アガロースを用いる。
工程（１）で得られたＭＢＬ抽出液にカルシウム塩を添加し、固定相を充填したカラムに展開してＭＢＬをカラムに吸着させた後、適当な溶液でカラムを洗浄して夾雑タンパクを溶出させ、続いてカルシウム塩とキレートを形成することが可能なキレート化剤を含む溶液を用いて、吸着したＭＢＬを溶出・回収する。吸着・洗浄用の溶液中に含まれるカルシウム塩としては塩化カルシウムなどが例示される。この際のｐＨ条件としてはｐＨ７．０〜９．０が例示され、吸着・洗浄用の溶液の溶媒として例えばイミダゾール緩衝液などが挙げられる。また、塩類、例えば、塩化ナトリウムなどを含んでいてもよい。吸着・洗浄用の溶液中のカルシウム塩の添加濃度としては０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌが例示され、他に含んでいてもよい塩類の添加濃度としては０．５〜２ｍｏｌ／Ｌが例示される。吸着したＭＢＬを溶出するための溶液中に含まれる、カルシウム塩とキレートを形成することが可能なキレート化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸、クエン酸などが例示される。キレート化剤の添加濃度としては０．００１〜０．０１ｍｏｌ／Ｌが例示される。溶出用溶液の溶媒、ｐＨ、塩類、その添加濃度などは、塩類としてカルシウム塩を含まないことを除き、吸着・洗浄用の溶液と同一の条件である。
（３）ヘパリンクロマトグラフィー処理を行う工程
本工程は、ヘパリン固定化担体を用いてＭＢＬを吸着後、吸着したＭＢＬを溶出させることにより、夾雑タンパクを除去し、ＭＢＬを精製する工程である。
工程（２）で得たＭＢＬ溶液につき、必要に応じて、限外ろ過などにより濃縮および溶媒交換を行い、濃縮液を調製する。限外ろ過は分画分子量１０〜１００ｋＤａの限外ろ過膜を用いて行う方法が挙げられる。
この濃縮液を、ヘパリン固定化担体を充填したカラムに展開してＭＢＬを吸着・洗浄後に、吸着したＭＢＬを溶出・回収してＭＢＬ含有組成物を得る。ヘパリン固定化担体はヘパリンを担体（例えばセルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリビニル、シリカ、ガラスなど）に固定化したものである。具体的には、ヘパリン固定化アガロース（ヘパリンセファロース、アマシャムファルマシア社；ヘパリンアクチゲル、ステロジェン社；アフィゲルヘパリン、バイオラッド社）、ヘパリン固定化ポリビニル（ヘパリントヨパール６５０Ｍ、東ソー社）などが例示される。吸着・洗浄用の溶液としては、０〜０．１ｍｏｌ／Ｌの塩類を含む溶液を用いる。塩類としては例えば塩化ナトリウムなどが例示される。吸着・洗浄用の溶液の溶媒としてはリン酸緩衝液などが例示される。ｐＨ条件はｐＨ６．０〜８．０が例示され、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５が挙げられる。また、エチレンジアミン四酢酸などを含んでいてもよい。ＭＢＬ溶出用の溶液としては、０．１５〜０．３ｍｏｌ／Ｌの塩類を含む溶液を用いる。塩類の種類、溶媒の種類、ｐＨ条件などは吸着・洗浄用の溶液と条件は同一である。
好ましくは、得られたＭＢＬ含有組成物について、限外ろ過などにより濃縮および透析などを行う。限外ろ過は例えば分画分子量１０〜１００ｋＤａの限外ろ過膜を用いて行う方法が挙げられる。透析は例えば生理食塩水などに対して行う方法が例示される。
また、本発明のＭＢＬ溶液のＭＢＬ純度を上げる目的で、必要に応じて、ＭＢＬを精製する方法として公知であるものをさらに実施してもよい。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどが挙げられる。あるいは、上述した本発明の各工程を（１）、（３）、（２）、（３）の順で行うことなどが例示される。
本発明のＭＢＬ含有組成物の製造方法は、上記のＭＢＬを精製する方法に準じて、上記のヒト血漿原料を原料として行うことができる。
本発明において、回収率は、ヒト血漿原料中のＭＢＬ量、精製工程または製造工程で得られるＭＢＬ量を測定して求める。ＭＢＬ含有量は、次のＥＬＩＳＡ法により好適に求めることができる。
ＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体は例えば以下のようにして作製することができる。真核細胞および大腸菌で組換えタンパク質として発現させた２種類の抗原を用いる。具体的には、抗原は全長ＭＢＬ、およびコラーゲン様領域のＣ末端側６アミノ酸分（グリシン−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙは任意のアミノ酸）の繰り返し２回分）を含み、以降ネック領域、糖認識領域を含む部分ＭＢＬを、それぞれ真核細胞および大腸菌で発現させたものを用いる。発現ベクターへ組み込む遺伝子は、いずれの場合もヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを用いてＰＣＲにより増幅を行う。
真核細胞での発現は例えば以下のようにして行うことができる。Ｎ末端の開始コドンの前に制限酵素Ｎｏｔ  Ｉの切断サイトを付加したプライマー５’−ＡＡＧＣＧ  ＧＣＣＧＣ  ＡＴＧＴＣ  ＣＣＴＧＴ  ＴＴＣＣＡ  ＴＣＡＣＴ  Ｃ−３’（配列表配列番号１）およびＣ末端の終止コドンの後に制限酵素Ｘｂａ  Ｉ切断サイトを付加したプライマー５’−ＣＣＴＣＴ  ＡＧＡＴＣ  ＡＧＡＴＡ  ＧＧＧＡＡ  ＣＴＣＡＣ  ＡＧＡＣ−３’（配列表配列番号２）を用いて変性９４℃１分、アニール５５℃１分、伸長７２℃２分を３０サイクルのプログラムにて断片の増幅を行う。増幅した断片および発現ベクターｐＮＯＷ１（特開平１１−２０６３７８号公報を参照）をそれぞれ制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉで切断し、精製した後、ライゲーションを行いＭＢＬ発現ベクターとする。得られたＭＢＬ発現ベクターはＤＯＴＡＰ（ロッシュ社製）によりＣＨＯ細胞にトランスフェクションしＭＢＬ発現細胞とする。ＭＢＬは細胞外に分泌されてくるので、細胞培養液をアフィニティーカラムであるマンナン・アガロース（シグマ社製）にて精製を行う。
一方、大腸菌での発現は例えば以下のようにして行うことができる（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２（７），１３２６−１３３１，１９９８を参照）。Ｎ末端側のプライマーとしてコラーゲン様領域のＣ末端側６アミノ酸をコードする塩基から始まる配列とその配列の前に制限酵素Ｘｈｏ  Ｉ切断サイトを付加したプライマー５’−ＧＧＧＣＴ  ＣＧＡＧＧ  ＧＡＧＡＣ  ＣＣＴＧＧ  ＡＡＡＡＡ  ＧＴＣＣＧ−３’（配列表配列番号３）およびＣ末端の終止コドンの後に制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ切断サイトを付加したプライマー５’−ＧＧＧＧＡ  ＡＴＴＣＴ  ＣＡＧＡＴ  ＡＧＧＧＡ  ＡＣＴＣＡ  ＣＡＧＡＣ−３’（配列表配列番号４）を用いて変性９２℃１分、アニール５５℃１分、伸長７２℃２分を３５サイクルのプログラムにて断片の増幅を行う。増幅した断片および発現ベクターｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）をそれぞれ制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉで切断し、精製した後、ライゲーションを行い部分ＭＢＬ発現ベクターとする。このベクターは発現遺伝子のＣ末端側に６個のヒスチジンが付加される発現ベクターである。得られた部分ＭＢＬ発現ベクターは大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルにトランスフォーメーションし、発現誘導の後、大腸菌を回収後、６Ｍ尿素を含むＴＢＳ／Ｃａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＣａＣｌ２）にて可溶化し、アフィニティーカラムであるニッケル−ニトリロ三酢酸アガロース（キアゲン社製）にて精製を行った。得られた精製画分は透析によりＴＢＳ／Ｃａの溶液としその後、真核細胞での発現系と同様にアフィニティーカラムであるマンナン・アガロース（シグマ社製）にて精製を行う。
以上のようにして得られた２種類のＭＢＬ（全長ＭＢＬおよび部分ＭＢＬ）を用いて、例えば以下のように抗血清を作成する。フロイントの完全アジュバントとの乳濁液とし、それぞれウサギ（ニュージーランドホワイト）１羽当たり０．２ｍｇ（容量１ｍｌ）を皮下２０カ所程度に分けて注入する。以後、２週間間隔で、３回同様にして免疫を行う。ただし、２回目以降はフロイントの完全アジュバントのかわりにフロイントの不完全アジュバントを用い、免疫量も１羽当たり０．１ｍｇ（容量１ｍｌ）とする。追加免疫３回目が終了した１週間後少量採血を行い、抗体価を測定し、抗体価が上がっているものに関して、大量採血をおこない、抗血清とする。得られた抗血清はプロテインＧカラム（アマシャムファルマシア社製）などにてＩｇＧ抗体を精製する。部分ＭＢＬに対する抗体はＥＬＩＳＡ法において１次抗体として用いるためビオチン化を行う。ビオチン化は、例えばＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ  ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（ピアス社製）を用いて行うことができる。
ＭＢＬ量は、抗ＭＢＬ抗体（全長ＭＢＬに対する抗体）、ビオチン化抗ＭＢＬ／ＣＲＤ抗体（部分ＭＢＬに対する抗体をビオチン化したもの）、およびアビジンビオチン結合ペルオキシダーゼを用いてＥＬＩＳＡ法により、例えば以下のように測定することができる。抗ＭＢＬ抗体を終濃度１μｇ／ｍＬとなるよう０．５ｍｇ／ｍＬアジ化ナトリウム含有０．０１５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム、０．０３５ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）を用いて希釈し、この液を９６穴マイクロプレートに１００μＬ／ウェル加えて一晩放置する。その後、ウェル内の液を吸引除去し、２．５ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン溶液を３００μＬ／ウェル加えて一晩放置し、ＴＣ緩衝液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５ｗ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．０１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．４）を３００μＬ／ウェルずつ満たした後、吸引除去を行ってこの操作を３回繰り返し、抗ＭＢＬ抗体固定プレートを作製する。別の試験管を用いて検体をＴＣ緩衝液で適当な濃度になるように希釈し、抗ＭＢＬ各固定化マイクロプレートに１００μＬ／ウェル添加して室温で１時間放置する。その後、ウェル内の液を吸引除去し、ＴＣ緩衝液を３００μＬ／ウェルずつ満たした後、吸引除去を行ってこの操作を５回繰り返して洗浄を行う。続いてＴＣ緩衝液にて１μｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン化抗ＭＢＬ／ＣＲＤ抗体溶液１００μＬを各ウェルに加え、室温下で１時間静置後、前述と同様の洗浄操作を５回行う。次いで、ＴＣ緩衝液で希釈したアビジンビオチン結合ペルオキシダーゼ溶液（ＶＥＣＴＡＳＴＡＴＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ、フナコシ）を１００μＬ／ウェル加え、室温下で１時間放置した後５回の洗浄を行い、基質液（ＯＰＤ溶液、住友ベークライト製ペルオキシダーゼ検出試薬）を１００μＬ／ウェル添加して遮光した室温下で一定時間静置して発色させた後、反応停止液（１ｍｏｌ／Ｌ硫酸）を１００μＬ／ウェル加え、各ウェルの４９２ｎｍ吸光度をプレートリーダーで測定する。測定した吸光度から標準品の検量線を作成し、被験物質のＭＢＬ含有量を求めることができる。
本発明のＭＢＬ含有組成物について、ＭＢＬの純度は９０％以上である。ここで本発明において純度は、ＨＰＬＣゲルろ過またはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求める。ＨＰＬＣゲルろ過によるＭＢＬの検出は、分光光度計により光路長１０ｍｍにおける波長２８０ｎｍの吸光度を測定して求める。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ法）はそのバンドをデンシトメーターを用いて測定することにより求める。また、未分画のヒト血漿から工程（１）、（２）、（３）をこの順に各１回行った場合の回収率は、６０％以上である。なお、アフィニティークロマトグラフィー処理工程の出発原料である、ポリエチレングリコール処理後のＭＢＬ抽出液から工程（２）、（３）をこの順に各１回行った場合の回収率は、７０％以上である。
本発明のＭＢＬ含有組成物に含まれるＭＢＬは、ＭＢＬモノマーやその三量体を実質的に含まない、５４０ｋＤａ以上の高次ホモオリゴマー構造を保持しているものを含むなどの性状を有する。これらの性状はＨＰＬＣゲルろ過法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析などにより確認することができる。
本発明の製造方法により得られるＭＢＬ含有組成物に含有されるＭＢＬは遊離の状態である。ここに遊離の状態とは、ＭＢＬがＭＡＳＰとの複合体を形成していないことをいう。これはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認することができる。具体的には、以下のようにして確認する。ＭＡＳＰには、分子量の異なるＭＡＳＰ１、ＭＡＳＰ２が知られており、ＭＡＳＰ１が存在する場合、還元条件で６０ｋＤａ、非還元条件で１００ｋＤａの位置にＭＡＳＰ１のバンドが確認されなければならず、ＭＡＳＰ２が存在する場合、還元条件で５２ｋＤａ、非還元条件で７６ｋＤａの位置にＭＡＳＰ２のバンドが確認されなければならない。本発明の製造方法により得られるＭＢＬ含有組成物からは、これらのバンドおよびこれらにＭＢＬの分子量を合わせた分子量のバンドが確認されないことより、遊離しているＭＢＬのみが存在していることが確認できる。ゆえに、タンパク質として単一のＭＢＬが得られることにより、ＭＢＬ自身が有する各種活性をＭＡＳＰの影響を考えずに調査することが可能である。
なお、本発明の精製または製造工程において、加熱処理や、有機溶剤ならびに界面活性剤を用いるＳＤ処理、ナノフィルトレーション法など、通常のウイルス不活化処理を行って、ＭＢＬ含有組成物のウイルスを不活化することも可能である。
本発明者らは、ヒト血漿をコーンの低温エタノール分画法に従って分画し、各画分中におけるＭＢＬの存在量を測定した。その結果、第ＩＩ＋ＩＩＩ画分中にほぼ全量のＭＢＬが存在することを確認した。さらに、第ＩＩ＋ＩＩＩ画分よりイムノグロブリンを抽出したところ、ＭＢＬは、従来は廃棄されていた抽出後の残渣にほぼすべて存在していることを確認した。
イムノグロブリンを抽出した残渣には、脂質と結合したタンパクが夾雑物として多く含まれている。従って従来は、イムノグロブリンを抽出した残渣から常法によってＭＢＬを抽出してもそれらの脂質タンパクを十分に除去することはできず、抽出液に濁りが生じるため、ＰＣＴ／ＷＯ９９／６４４５３公報に記載のように、デリビドフィルターなどを用いた度重なるろ過処理などを行うことが必要となり、その処理を行うことなくそのまま抽出液をアフィニティークロマトグラフィー処理に付してＭＢＬを精製することは困難であった。本発明では、ＭＢＬをヒト血漿、特に、ヒト血漿からイムノグロブリンを抽出した残渣から、アフィニティークロマトグラフィー処理などに適したＭＢＬの精製用またはＭＢＬ含有組成物の製造用の中間原料として有用な澄明な溶液を、回収率を低下させることなく得ることができる。本発明では、イムノグロブリンを抽出した後のヒト血漿原料からの、工程（１）の処理によるＭＢＬの精製度は７倍以上、回収率は９０％以上である。精製度は、（精製溶液中のＭＢＬ量／精製溶液の光路長１０ｍｍにおける波長２８０ｎｍの吸光度）／（精製前溶液中のＭＢＬ量／精製前溶液の光路長１０ｍｍにおける波長２８０ｎｍの吸光度）の式により求める。
ＭＢＬとマンノースあるいはマンナンの親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたＭＢＬ溶液におけるＭＢＬの精製度は、好ましい条件下では工程（１）により得たＭＢＬ抽出液に対して７００倍以上である。通常、アフィニティークロマトグラフィー処理により得たＭＢＬ溶液は、ゲルろ過クロマトグラフィーあるいはイオン交換クロマトグラフィーなどによってさらに精製されるか、あるいはアフィニティークロマトグラフィーを再度繰り返すことによって精製されるが、本発明では、例えば工程（３）の固定化ヘパリンカラムを用いることにより、回収率を低下させることなく、高純度のＭＢＬを回収することが可能である。本発明の工程（３）の方法では、工程（２）により得られたＭＢＬ溶液におけるＭＢＬに対して、ＭＢＬの精製度は３倍以上、回収率は８０％以上である。
本発明のＭＢＬ含有組成物は、塩化ナトリウムなどの塩類、公知の安定化剤、例えば、ヒト血清アルブミンなどを含んでいてもよい。
本発明者らは、また、ＭＢＬがサイトメガロウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスによる感染症の予防または治療に有用であることを見出した。
ＭＢＬを上記の予防または治療に用いる場合は、それ自体を、あるいは適宜の製薬上許容される添加剤（例えば等張化剤（例えば、マンニトール、ソルビトール、ショ糖、ブドウ糖などの糖類、塩化ナトリウムなどの塩類）および／または安定化剤（例えば血清アルブミンなど）など）と混合した組成物として、適当な溶媒（例えば、注射用水、生理食塩水など）で希釈し、筋注、静注、点滴など注射剤の形態で投与することができる。上記製剤は液状製剤あるいは凍結乾燥製剤などとすることができ、製剤中にはＭＢＬを有効量配合する。
本発明のサイトメガロウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスによる感染症の予防または治療剤は、ヒトに適用することができる。
当該ＭＢＬの投与量は、投与ルート、患者の症状、体重あるいは年齢等によっても異なり、投与目的に応じて適宜設定することができる。サイトメガロウイルスあるいはＢ型肝炎ウイルスによる感染症の予防または治療のためには、例えば、患者の血漿中ＭＢＬ濃度が、ヒトの標準的な血漿中ＭＢＬ濃度（１〜２μｇ／ｍＬ）と同等、あるいは症状に応じて５倍から１０倍となるよう、必要に応じ一日１回〜複数回の静注点滴を、症状に応じた期間、投与する。
実施例
以下に本発明のＭＢＬ精製方法を参考例、実施例、実験例により詳細に説明するが、本発明はこれらの記載によって何ら限定的に解釈されるべきものではない。
参考例：ＭＢＬ抽出原料の調製
−３〜−２℃の条件下で、プールされたヒトの血漿６０Ｌを出発物質として、これに２ｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウムを加えてｐＨ７．２に調整し、続いてエタノールを終濃度８ｖｏｌ％となるように加えて混和した。遠心分離により上清画分と沈殿画分とに分離し、上清画分６５Ｌを採取した。
−６℃の条件下で、上清画分６５Ｌに１０ｍｏｌ／Ｌの酢酸を加えてｐＨ６．８に調整し、続いてエタノールを終濃度２１ｖｏｌ％となるように加えて混和した。ろ過（フィルタープレス）により上清画分と沈殿画分（コーンの第ＩＩ＋ＩＩＩ画分）とに分離し、沈殿画分３ｋｇを採取した。
０〜５℃の条件下で沈殿画分３ｋｇに３０Ｌの水を加えて懸濁し、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩酸を加えてｐＨ５．２５に調整した後、１時間から２時間抽出した。得られた抽出液は、遠心分離により上清画分（イムノグロブリンを含む画分）と抽出残渣（ＭＢＬを含む画分）とに分離し、抽出残渣２ｋｇを採取した。
実施例１：澄明なＭＢＬ抽出液の製造
４℃の条件下で、参考例により得られた抽出残渣２ｋｇに、２０Ｌの生理食塩液を加え、６５時間懸濁した。５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムを加えてｐＨ７．０に調整した後、再度３時間撹拌した。続いて、この懸濁液にポリエチレングリコール４０００（日本薬局方マクロゴール４０００、日本油脂社）を終濃度４ｗ／ｖ％となるよう加えた後、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムまたは１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を加えてｐＨ７．０に調整し、０〜５℃の条件下で１２時間放置した。続いて、４６００ｇ×３０分の条件で遠心分離を行った後に、プレフィルターＡＰ（ミリポア社）と０．４５μｍメンブレンフィルター（ミリパック、ミリポア社）を用いて上清をろ過することにより、上清画分（ＭＢＬ抽出液）と沈殿画分（抽出残渣）とに分離し、澄明な上清画分（溶液量２０Ｌ、ＭＢＬ含有量１４ｍｇ／Ｌ）を採取した。
実施例２−１：ＭＢＬ含有組成物の製造−アフィニティーカラム（マンナン固定化カラム）による精製
実施例１で得られた上清画分２０Ｌに塩化ナトリウム、１ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム溶液および１ｍｏｌ／Ｌイミダゾール溶液（ｐＨ７．８）をそれぞれ終濃度１ｍｏｌ／Ｌ、０．０２ｍｏｌ／Ｌおよび０．０１ｍｏｌ／Ｌとなるよう加え、ｐＨ７．８に調整した。この液全量をあらかじめ１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムと０．０２ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムを含む０．０１ｍｏｌ／Ｌイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．８）５００ｍＬで平衡化したマンナン固定化担体（マンナン・アガロース、シグマ社）５０ｍＬを充填したカラムに注入した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムと０．０２ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムを含む０．０１ｍｏｌ／Ｌイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．８）７５０ｍＬにてカラムを洗浄し、続いて１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムと０．００５ｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．８）２５０ｍＬを用いてＭＢＬ画分を展開し、ＭＢＬ溶液２５０ｍＬを回収した。
実施例２−２：ＭＢＬ含有組成物の製造−ヘパリン固定化カラムによる精製
実施例２−１で得られた２５０ｍＬのＭＢＬ溶液につき、分画分子量１０ｋＤａの限外ろ過膜（ペリコン２・バイオマックス１０、ミリポア社）を用いて濃縮および溶媒交換を行い、溶媒系を０．００１ｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸を含む０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に置換し、濃縮液５０ｍＬを調製した。この濃縮液をあらかじめ０．００１ｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸を含む０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３００ｍＬで平衡化したヘパリン固定化担体（ヘパリントヨパール６５０Ｍ、東ソー社）３０ｍＬを充填したカラムに注入した後、０．００１ｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸を含む０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍＬおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムと０．００１ｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸を含む０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍＬにてカラムを洗浄し、続いて０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムと０．００１ｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸を含む０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍＬを用いてＭＢＬを展開し、精製ＭＢＬ組成物を得た。また、得られた組成物は、分画分子量１０ｋＤａの限外ろ過膜（セントリプレップ１０、ミリポア社）を用いて濃縮および透析（生理食塩液に対して）を行い、ＭＢＬ溶液を調製した。（溶液量１５ｍＬ、総ＭＢＬ含有量３６ｍｇ）
実験例１−１：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＭＢＬの分析と純度測定
Ｌａｅｍｍｌｉ法に準じ、１０％−２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品社）を用いて還元処理および非還元処理の条件で、実施例２−２におけるヘパリン固定化カラムからの精製ＭＢＬ組成物および市販のＭＢＬ（バイオジェネシス社）に対して分析を実施した。生理食塩液で希釈調整した検体を還元用サンプル緩衝液Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ−ＢＭＥ  Ｓｅｐｒａｓｏｌ（第一化学薬品社）あるいは非還元用サンプル緩衝液Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ  Ｓｅｐｒａｓｏｌ（第一化学薬品社）と等量比で混合し、５分間加熱処理を行った。この液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのウェルに一定量チャージし、１８ｍＡで２時間電気泳動した。その後、クイックＣＢＢ染色キット（和光純薬社）によりゲルを染色後、蒸留水で脱色した。なお、分子量マーカーとしてＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｓｔａｎｄａｒｄ，ｂｒｏａｄ  ｒａｎｇｅ（バイオラッド社）もしくは低分子量マーカー（アマシャムファルマシア社）を用いた。ゲルの写真を図１に示す。分析の結果、本発明による精製ＭＢＬ組成物に含まれるタンパクは、還元下では分子量約３０ｋＤａの位置にほぼ単一のバンドとして認められ、非還元下では１００ｋＤａ以上の高分子に存在することが観察されたことから、ホモオリゴマー構造を保持しているＭＢＬであることが確認された。また、デンシトメーターをもちいてバンドの濃淡を測定することにより純度を求めたところ、ＭＢＬの純度は９０％以上であった。
実験例１−２
実験用ゲルとして４％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品社）および分子量マーカーとしてＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｓｔａｎｄａｒｄ，ｈｉｇｈ  ｒａｎｇｅ（バイオラッド社）を使用した他は、実験例１−１で行った非還元処理と同一の条件で、実施例２−２におけるヘパリン固定化カラムからのＭＢＬ含有組成物に対して分析を行った。ゲルの写真を図２に示す。各バンドの分子量を分子量マーカーの分子量およびウェルの下端からの移動距離から作製した検量線を用いて算出した結果、本願発明によるＭＢＬ含有組成物に含まれるタンパクは、非還元条件下において、小さなものでも約２６４ｋＤａ（ホモオリゴマー三量体に相当）の分子量を有していた。また、約５４５ｋＤａ（ホモオリゴマー六量体に相当）および約６１０ｋＤａ（ホモオリゴマー七量体にほぼ相当）の分子量を有するバンドが強く発色していたことから、高次ホモオリゴマー構造を保持しているＭＢＬを含んでいることが確認された。
実験例２：ウェスタンブロッティングによるＭＢＬの分析
実験例１−１の方法に準じて検体の電気泳動を行った後、ゲルをブロッティング緩衝液（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、２０ｖｏｌ％メタノール）に浸漬した。別にメタノールおよび同緩衝液で平衡化したＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオライド）膜（ミリポア社）にゲルを載せ、ろ紙およびパットでこれを挟んだ後、１８０ｍＡで９０分から１２０分電気泳動し、ゲル上のタンパクをＰＶＤＦ膜に転写した。その後、転写後の膜をブロッキング溶液（ブロックエース、大日本製薬社）に一定時間浸した後、ＴＣ緩衝液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５ｗ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社）含有０．０１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。続いて、洗浄後のＰＶＤＦ膜を２μｇ／ｍＬの抗ＭＢＬウサギ抗体（上述の方法で作成したもの）に浸し、室温下で１時間振とうした後、ＴＣ緩衝液で５回洗浄し、５０００倍希釈したペルオキダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）に浸して室温下で１時間反応させた。続いて、反応後のＰＶＤＦ膜をＴＣ緩衝液で５回洗浄し、基質液（ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン  テトラヒドロクロライド）溶液、フナコシ社）に一定時間浸して発色させ、適当な発色強度が得られた時点でＰＶＤＦ膜をＲＯ（逆浸透）水により洗浄し、発色反応を停止させた。ゲルの写真を図３に示す。分析の結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同位置のバンドが強い反応性を示したことから、本発明による精製ＭＢＬ組成物には、ＭＢＬがホモオリゴマー構造を保持している状態で、高純度で含まれていることが確認された。
実験例３：ＨＰＬＣゲルろ過によるＭＢＬの純度測定
実施例２−２における透析後のＭＢＬ溶液５０μＬを、ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（東ソー社）を装着した高速液体クロマトグラフ（Ｓｙｓｔｅｍ  ＧＯＬＤ、Ｂｅｃｋｍａｎ社）にアプライし、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有０．０５ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７）を移動相として、流速０．５ｍＬ／分で展開を行った。ＭＢＬの検出は、２８０ｎｍの吸光度を分光光度計を用いて測定することにより行った。結果を図４に示す。分析の結果、本発明による精製ＭＢＬ組成物に含まれるＭＢＬの純度は９８％以上であった。また、別途、ＩｇＧの凝集物を調製しそれを同様にＨＰＬＣゲルろ過に付してＭＢＬの場合と比べたところ、ＭＢＬのピークは、ＩｇＧの凝集物の展開位置とほぼ同じであった。ＩｇＧ凝集物は２００ｋＤａ以上の分子量を有するものであり、これと展開位置が同じであることから、ＭＢＬがホモオリゴマー構造を保持していることが確認された。
実験例４：ＭＢＬの補体活性化能の測定
補体活性化能は、受動溶血反応を利用し、ＭＢＬとの結合が確認されているマンナンを表面に固定化したヒツジ赤血球にＭＢＬを反応させ、これにモルモット補体を加えることで惹起される溶血反応により検出した。
０．２５ｍｇの塩化マンガン六水和物を含有する生理食塩液０．５ｍＬと４０μｇのマンナンを含有する生理食塩液溶液０．５ｍＬを混合した後、これにヒツジ血液（緬羊保存血液、日本バイオテスト研究所）を遠心分離して得た沈澱を生理食塩液で懸濁して調製した赤血球浮遊液（１×１０９個／ｍＬ）１ｍＬを混合し、室温で１０分間反応させた。反応液に、氷冷した０．１％のゼラチン、２ｍＭの塩化カルシウム、０．５ｍＭの塩化マグネシウムを含む５ｍＭのベロナール緩衝液（ｐＨ７．４、以下ＧＶＢと呼ぶ）を１．５ｍＬ添加して反応を停止させた後、遠心分離してマンナン固定化赤血球（沈殿画分）を得た。得られたマンナン固定化赤血球をＧＶＢで洗浄し、ＧＶＢ１ｍＬあたりの赤血球が１０９個となるように懸濁した。
この懸濁液０．１ｍＬあたり、分光光度計における光路長１０ｍｍでの波長２８０ｎｍの吸光度が０．０００００１〜０．００１となる量のＭＢＬを含有するよう、実施例２−２における透析後のＭＢＬ溶液を加えたＧＶＢ溶液あるいはＧＶＢのみを４００μＬ混合し、室温で１５分間緩やかに振とうした後、氷冷したＧＶＢで洗浄し、赤血球数をＧＶＢで１ｍＬあたり１０９個になるように再懸濁した。続いて、この懸濁液０．１ｍＬに、あらかじめマンナン固定化担体（マンナン・アガロース、シグマ社）と一定時間反応させたモルモット血清（乾燥補体、極東製薬工業社）の１００倍希釈液（希釈溶媒はＧＶＢ）を１．５ｍＬ加えて混和し、３７℃で１時間反応させた。反応後、遠心分離を行い、上清の５４１ｎｍにおける吸光度を測定して反応液の溶血度を求めた。一方、対照として、マンナン固定化処理を行わない、すなわち、塩化マンガン六水和物およびマンナンで処理しない赤血球を用いて同様な試験を実施し、溶血度を求めた。
溶血度は、モルモット血清の代わりに蒸留水を添加混和した液の５４１ｎｍにおける吸光度（１００％（Ａ５４１））を１００％とし、以下の式から溶血度を算出した。
溶血度（％）＝（各濃度のＭＢＬ添加時のＡ５４１−ＭＢＬ無添加時のＡ５４１）×１００／（（１００％（Ａ５４１））−ＭＢＬ無添加時のＡ５４１）
結果を図５に示す。本発明による精製ＭＢＬ組成物は、優れた補体活性化能を有することが確認された。
実験例５：コーンの低温エタノール分画法におけるＭＢＬの挙動
上述のＭＢＬ測定法を用いて、ヒト血漿をコーンの低温エタノール分画法に従って分画した場合のＭＢＬの挙動を表１および表２に示す。ＭＢＬは第ＩＩ＋ＩＩＩ画分からイムノグロブリンを抽出した残渣にほぼすべて含まれることが判明した。
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実験例６：各精製工程におけるＭＢＬの精製度および未分画ヒト血漿からの回収率
実施例１、実施例２−１、実施例２−２によって得られた各ＭＢＬ溶液のＭＢＬ精製度を表３に示す。精製度の計算には上述の式を用いる。また、未分画ヒト血漿中のＭＢＬ量を基準とした場合の、各ＭＢＬ溶液中のＭＢＬ回収率（％）を、併せて表３に示す。
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実験例７：ポリエチレングリコール接触工程におけるポリエチレングリコール濃度の影響
ポリエチレングリコール接触工程におけるポリエチレングリコール４０００の濃度を０〜５ｗ／ｖ％とした場合におけるＭＢＬ抽出液の外観およびＭＢＬの回収率を図６および表４に示す。ポリエチレングリコール濃度が２〜５ｗ／ｖ％、好ましくは３〜４ｗ／ｖ％であれば、澄明かつ回収率の高いＭＢＬ抽出液を得られることが判明した。
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実験例８：Ｎ末端アミノ酸配列分析
本発明の精製方法によるＭＢＬのＮ末端アミノ酸配列分析を、プロテインシークエンサー（島津製作所）を用いて行った。プロテインシークエンサー（ＰＰＳＱ−１０、ＬＣ−１０ＡＳポンプ、ＳＰＤ−１０Ａ検出器、Ｃ−Ｒ７Ａデータ処理システム及びＣＴＯ−１０Ａカラムオーブンを併設）を用いて、そのプロトコールに従って２ｍｇ／ｍＬのＭＢＬ溶液（実施例２−２におけるヘパリン溶出画分）の６μｇ相当を分析した。測定は１０サイクル行い、得られたクロマトグラムから各サイクルのアミノ酸残基を同定した。なお、分析に用いた試薬類は、和光純薬工業製「島津プロテインシークエンサー用」を使用した。本発明の精製ＭＢＬ検体につき、Ｎ末端から１０番目までのアミノ酸配列を調べた結果、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓであった（Ｘａａは同定不能）（配列表配列番号５）。一方、ＦＡＳＴＡ  Ｓｅｒａｃｈ  Ｒｅｓｕｌｔ（アミノ酸配列データベース、京都大学化学研究所バイオインフォマティクスセンター）を検索した結果、登録されていたＭＢＬのＮ末端アミノ酸配列はＧｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列表配列番号６）であった。
実験例９：ＭＢＬのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染阻害活性の測定
ＭＢＬのＣＭＶ感染阻害活性の測定は、ＣＭＶ感染細胞の細胞間感染阻害作用により評価した。２４ウェルプレートに、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ、ハイクローン社）を含むイーグルＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）を用いてＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１７１、大日本製薬）をウェルあたり５万個／０．５ｍＬの密度で加え、３日間培養して細胞をコンフルエントの状態にした。その後、培養上清を吸引除去し、５％ＦＣＳを含むイーグルＭＥＭ培地で希釈したＣＭＶ（５０ＰＦＵ／０．５ｍＬ）を各ウェルに加え、一晩培養して感染細胞を作製した。
次いで、各ウェルの培養上清を吸引除去した後、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）をウェルあたり１ｍＬ加えて吸引除去し、この操作を２回繰り返すことによってウェル内を洗浄した後、０〜１００μｇ／ｍＬのＭＢＬ（実施例２−２におけるＭＢＬ最終精製物）、０．４％アガロース（シグマ社Ｔｙｐｅ  Ｉ、Ｌｏｗ  ＥＥＯアガロース）及び、２．５％ＦＣＳを含むイーグルＭＥＭ培地各溶液もしくは同液にそれぞれ補体溶液（極東製薬「乾燥補体」を注射用水にてバイアル１ｍＬで溶解した液）を１０％加えたものを各ウェルあたり１ｍＬ重層し、３７℃で１週間培養した。１週間培養したプレートの１部は重層したアガロースを剥がした後０．５％クリスタルバイオレット染色液を１ｍＬ／ウェル加えて３７℃、２時間培養し、細胞染色を行なって形成されたプラークの大きさを顕微鏡観察した。また、他のプレートは感染細胞を継代するため、重層したアガロースを剥がした後、ＰＢＳをウェルあたり１ｍＬ加えて吸引除去してウェルを洗浄後、０．２５％トリプシンＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯ社）をウェルあたり０．１ｍＬ加えてウェルから細胞を剥し、さらに５％ＦＣＳを含むイーグルＭＥＭ培地を０．１ｍＬ／ウェル加えて懸濁し、同培地を用いて適当に希釈した。別に１０％ＦＣＳを含むイーグルＭＥＭ培地を用いてＭＲＣ−５をウェルあたり２０万個／２ｍＬの密度で加え、３日間培養して細胞をコンフルエントの状態にした６ウェルプレートを作製し、前述と同様に洗浄したウェル内に、希釈した細胞懸濁液０．１ｍＬ／ウェル加えて３７℃、１時間培養した。その後、０．６％アガロース及び５％ＦＣＳを含むイーグルＭＥＭ培地２ｍＬを重層し、３７℃で１週間培養後、アガロースを剥し、０．５％クリスタルバイオレット染色液で各ウェルを染色して形成されたプラーク数を測定した。
その結果、一週間培養した時点で検出されたプラークの大きさを比較したところ、補体存在下、ＭＢＬを４μｇ／ｍＬ以上の濃度で含む系では、ＭＢＬを含まない系に比べ形成するプラークの大きさが縮小していることが確認された。結果を図７に示す。また、これらの細胞を継代しさらに一週間培養した時点で検出されたプラークの数を比較したところ、補体存在下、ＭＢＬの濃度に依存して、形成するプラーク数が減少することが確認された。結果を図８に示す。
実験例１０：ＭＢＬのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する結合能の測定
ＭＢＬのＨＢＶに対する結合能の測定は、ＨＢｓＡｇへのＭＢＬの結合能により評価した。抗ＨＢｓＡｇ抗体測定キット（商品名「エルジアオートＡｎｔｉ−ＨＢｓ」、国際試薬）に含まれるＨＢｓＡｇ固定化マイクロウェルに、０．００〜０．２５μｇ／ｍＬのＭＢＬ溶液（実施例２−２におけるＭＢＬ最終精製物）を０．１ｍＬ／ウェル加えて室温下で１時間放置してＭＢＬを結合させた。次いで、ウェル内の液を吸引除去し、０．００５ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム及び０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ−ＴＣ）をウェルあたり０．３ｍＬずつ満たして吸引除去を行い、この操作を５回繰り返すことによってウェル内を洗浄した。続いて、ＴＢＳ−ＴＣにて１００００倍に希釈した抗ＭＢＬウサギ抗体（扶桑薬品）溶液０．１ｍＬを各ウェルに加えて室温下で１時間放置後、前述と同様の洗浄操作を行った後、ＴＢＳ−ＴＣにて１００００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）溶液０．１ｍＬを各ウェルに加え、室温下で１時間放置後、前述と同様の洗浄操作を行った。続いて基質液（ＯＰＤ溶液（ｏ−フェニルジアミン溶液）、住友ベークライト製ペルオキシダーゼ検出試薬）を１００μＬ／ウェル加え、遮光した室温下で数分間放置後、反応停止液として１ｍｏｌ／Ｌの硫酸を１００μＬ／ウェル加えた。
各ウェルの波長４９２ｎｍの吸光度をプレートリーダー（大日本製薬、Ｖｉｅｎｔｏ）で測定したところ、ＭＢＬは用量依存的にＨＢｓＡｇに結合することが確認された。結果を図９に示す。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１：全長ＭＢＬを真核細胞で発現させるためのプライマー。
配列番号２：全長ＭＢＬを真核細胞で発現させるためのプライマー。
配列番号３：部分ＭＢＬを大腸菌で発現させるためのプライマー。
配列番号４：部分ＭＢＬを大腸菌で発現させるためのプライマー。
配列番号５：本発明の精製ＭＢＬのＮ末端から１０番目のアミノ酸までのアミノ酸配列。Ｘａａは確定されていないアミノ酸を示す。
産業上の利用可能性
本発明では、ヒト血漿原料から、ポリエチレングリコールと接触させる処理を少なくとも１回行うことにより、その後のアフィニティークロマトグラフィー処理などに適した、ＭＢＬの精製用またはＭＢＬ含有組成物の製造用原料として有用な、ヒト血漿原料中のＭＢＬを高い割合で回収した澄明なＭＢＬ溶液を製造することができる。ポリエチレングリコールと接触させる工程に続いて、アフィニティークロマトグラフィー処理工程、さらに続いてヘパリンクロマトグラフィー処理工程を行うことにより、高純度かつ高回収率でＭＢＬ含有組成物を得ることができる。ヒト血漿原料から、ポリエチレングリコールと接触させる工程、アフィニティークロマトグラフィー処理工程、ヘパリンクロマトグラフィー処理工程をこの順に各１回行うのみで、ＭＢＬ含有組成物を高回収率かつ高純度に製造または精製できるため、精製または製造工程が少なく、設備を多く必要としないことから、ヒト血漿中ＭＢＬを原料として、工業的規模で精製する方法または製造する方法として好適である。また、本発明の製造方法によれば、高次オリゴマー構造を保持しているＭＢＬを含む臨床上有用なＭＢＬ含有組成物を製造することができる。さらに本発明のＭＢＬの精製方法または製造方法によれば、従来は廃棄されていた、コーンの低温エタノール分画法に従って得られる第ＩＩ＋ＩＩＩ画分よりイムノグロブリンを抽出した残渣を出発原料とすることができる。また、ＭＢＬは、サイトメガロウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスによる感染症の予防または治療に有用である。
本出願は、日本で出願された特願２００１−２６４９１５を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実験例１−１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
レーン１：サイズマーカー
レーン２：ヘパリンカラムからの溶出液（還元）
レーン３：ＭＢＬ（バイオジェネシス社）（還元）
レーン４：ヘパリンカラムからの溶出液（非還元）
レーン５：ＭＢＬ（バイオジェネシス社）（非還元）
図２は、実験例１−２におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
レーン１：サイズマーカー
レーン２：ヘパリンカラムからの溶出液（非還元）
図３は、実験例２におけるウェスタンブロッティングの結果を示す。
レーン１：サイズマーカー
レーン２：ヘパリンカラムからの溶出液（還元）
レーン３：ＭＢＬ（バイオジェネシス社）（還元）
レーン４：ヘパリンカラムからの溶出液（非還元）
レーン５：ＭＢＬ（バイオジェネシス社）（非還元）
図４は、実験例３におけるゲルろ過クロマトの結果を示すチャートである。
図５は、実験例４における補体活性化能の測定結果を示すグラフである。
図６は、実験例７において、ポリエチレングリコール４０００の濃度が０ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％である場合のＭＢＬ抽出液の外観を示す。
試験管１：残渣を生理食塩水で懸濁し、ｐＨ７．０に調製した液
試験管２：ポリエチレングリコール４０００を０ｗ／ｖ％含有した抽出液
試験管３：ポリエチレングリコール４０００を１ｗ／ｖ％含有した抽出液
試験管４：ポリエチレングリコール４０００を２ｗ／ｖ％含有した抽出液
試験管５：ポリエチレングリコール４０００を３ｗ／ｖ％含有した抽出液
試験管６：ポリエチレングリコール４０００を４ｗ／ｖ％含有した抽出液
試験管７：ポリエチレングリコール４０００を５ｗ／ｖ％含有した抽出液
図７は、実験例９において、感染細胞を１週間培養した時点で検出されたサイトメガロウイルスが形成するプラークを示す。
図８は、実験例９におけるサイトメガロウイルスが形成するプラーク数の測定結果を示すグラフである。
図９は、実験例１０におけるＨＢｓＡｇ結合能の測定結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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