(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
防腐剤、抗菌剤、または殺菌剤としての使用のための、液体、クリーム、ローション、またはジェルの形態のハロパーオキシダーゼ組成物であって、１ｍｌ当たり０．１３ｐｍｏｌから１００ｐｍｏｌのミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）および１ｍｌ当たり０．８ｐｍｏｌから１００ｐｍｏｌの好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）よりなる群から選択されるハロパーオキシダーゼを含み、該組成物は、望ましい微生物を消失させることなく病原性微生物の増殖を選択的に阻止し、ここで該望ましい微生物は、健康な宿主の体表面中または上に共生レベルで通常存在する細菌をいい、
製薬的に受容可能な液体担体中１ｍｌ当たり１０ｎｍｏｌから１５０μｍｏｌの塩化物または臭化物；および
１ｍｌ当たり１ｎｍｏｌから１０μｍｏｌの過酸化水素、またはヒトまたは動物宿主に投与するとき１分間当たり１ｐｍｏｌから１００ｎｍｏｌの過酸化物を生成するに有効な過酸化物生成オキシダーゼ
を更に含み、
該ハロパーオキシダーゼが、病原性微生物に選択的に結合し、塩化物または臭化物を酸化し、そして過酸化物の不均化を高めて一重項分子酸素を形成し得る、ハロパーオキシダーゼ組成物。
【請求項２】
塩化物または臭化物対過酸化物の比が、前記組成物の使用の部位において０．１から４０，０００の範囲に維持される、請求項１に記載のハロパーオキシダーゼ組成物。
【請求項３】
前記ハロパーオキシダーゼが、ＭＰＯであり、前記塩化物または臭化物が塩化物であり、そして前記塩化物対過酸化物の比が、前記組成物の使用の部位において１から４０，０００の範囲内に維持される、請求項２に記載のハロパーオキシダーゼ組成物。
【請求項４】
前記ハロパーオキシダーゼが、ＥＰＯであり、前記塩化物または臭化物が臭化物であり、そして前記臭化物対過酸化物の比が、前記組成物の使用の部位において１から１，０００の範囲内に維持される、請求項２に記載のハロパーオキシダーゼ組成物。
【請求項５】
第１の病原性微生物および第２の望ましい微生物を含む媒体中で該第１の病原性微生物の増殖を選択的に阻止する方法において使用され、ここで、該第２の望ましい微生物は、健康な宿主の体表面中または上に共生レベルで通常存在する細菌をいい、ここで該第１の病原性微生物は、該第２の望ましい微生物より大きな結合ハロパーオキシダーゼ対遊離ハロパーオキシダーゼの比を有し、該方法は、過酸化物および塩化物または臭化物と接触するとき該第１の病原性微生物に選択的に結合し、そして該第１の病原性微生物の増殖を阻止するが該第２の望ましい微生物を消失させるには無効な、１ｍｌ当たり０．１３ｐｍｏｌから１００ｐｍｏｌのミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）および１ｍｌ当たり０．８ｐｍｏｌから１００ｐｍｏｌの好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）よりなる群から選択されるハロパーオキシダーゼを該媒体に導入することを含む、請求項１から４のいずれかに記載のハロパーオキシダーゼ組成物。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載の組成物を含浸した吸収性材料を含む、創傷用包帯組成物。
【請求項７】
前記媒体への導入用である、請求項５に記載のハロパーオキシダーゼ組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本願発明は感染を治療しそして叢［フローラ（flora）］組成を制御する方法およびそのための組成物に関するものである。更に詳細には、本願発明はハロパーオキシダーゼ殺微生物活性を使用する防腐方法および組成物に関するものである。
発明の背景
歴史的背景：
酸化防腐剤および消毒剤の使用は18世紀後期にまで遡って興味ある発展をしてきている。ハイポハライトおよび過酸化物防腐剤と本願発明の関連性のため、これらの歴史を簡略化して示す。1788年に、フランスの化学者ベルトレー（Berthollet）は水性アルカリおよび塩素から製造された溶液の消毒および漂白特性を記載し、そして1792年にカリウムに基づく組成物製剤、オウ  ド  ジャベル（eau de Javel）が消毒剤として市販された。1820年に、ラバラーク（Labarraque）は水性炭酸ナトリウムおよび塩素から溶液を製造した。このリカー  ド  ラバラーク（liqueur de Labarraque）は消毒剤および防臭剤特性のため良く知られていた。1846年に、ゼンメルバイス（Semmelweis）は石灰の塩化物、次亜塩素酸カルシウム溶液を使用して産床敗血症の蔓延を首尾良く制御し、そして1881年にコッホ（Koch）は次亜塩素酸塩の殺菌作用に関する彼の結果を報告した。
1818年に、テナード（Thenard）は、希釈酸を二酸化バリウムと反応させて過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を合成し、比較的不安定なＨ2Ｏ2の３〜４％溶液を得た。Ｈ2Ｏ2の消毒剤特性は19世紀半ばまでに認められた。「その適用は水および牛乳を安全にするためや、下水の消毒用に提唱されてきた；これは医薬、外科、歯科、調髪等で適用されてきた。」（Heinemann、1913年、J.A.M.A.60:1603〜1606）。しかし乍ら、この防腐能力は次亜塩素酸塩と比較して比較的乏しい。
染料の防腐作用も知られておりそして第一次世界大戦前および中に使用された。1900年に、ラーブ（Raab）は染料アクリジンが光の存在下でのみ生存する細胞（即ち、ゾウリムシ）を殺害したことを報告し（Z.Biol.39:524以下、そして1905年にヨードルバウアー（Jodlbauer）とフォン  タッペイナー（von Tappeiner）は細菌の染料感受性光殺害にはＯ2が必要であることを報告した（Deut.Arch.Klin.Med.82:520〜546）。染料感受性のＯ2依存性光酸化および光酸素付加活性は通常光力学活性と称される（Blum、1941年、Photodynamic Action and Diseases Caused by Light、Reinhold、ニューヨーク）。フラビンやブリリアントグリーンのような染料は、血清媒体中で比較的高い希釈で使用したときでも、防腐剤として有効であった。残念なことに、それらの抗微生物作用に加えて、これらの染料は宿主の損傷、即ち白血球破壊ももたらす（Fleming、1919年、Brit.J.Surg.7:99〜129）。
防腐作用分野における研究は第一次世界大戦で加速された。この期間中に、前記した次亜塩素酸塩に基づく防腐剤の能力（AndrewesおよびOrton、1904年、Zentrabl.Bakteriol.（Orig.A.）35:811〜816）が確固として確立され、そしてユーゾル（Eusol）（Smith等、1915年、Brit.Med.J.2:129〜136）およびダーキンス（Dakin′s）溶液（Dakin、1915年、Brit.Med.J.2:318〜320）のような製剤が最初に好まれた石炭酸およびヨウ素防腐剤に取って代わった。
アレキサンダー  フレミングの1919年の「膿創における化学的および生理的防腐剤の作用」と題したハンタリアン（Hunterian）講義は今日まで関係のある消毒法の主題の優れた解説を提供している。フレミングは創傷の治療に関して２つの考え方の流儀を記載した：（１）「感染に対する身体の自然防護能力を助ける努力」に向けた生理学的流儀、および（２）化学剤によって創傷微生物を殺害する努力に向けた防腐的流儀。
生理学的流儀は、感染に対して最も大きい防護が生理学的能力：（１）血液および体液防護メカニズム並びに（２）食細胞白血球を助けることによって得られると主張している。白血球は壁に集まりそして創傷の空洞に移り、最終的には膿の細胞要素を形成することが知られていた。フレミングは「新鮮な膿」の食細胞白血球は有効な抗微生物効果を発揮するが、「新鮮でない膿」（即ち、非開放フルンケルの膿）並びに加熱処理または防腐剤処理した「新鮮な膿」は微生物殺害能力を欠いていることに言及した。
防腐剤処理の非特異的性質：
防腐に対する化学的試みの基本的な問題点は化学的防腐剤が非特異的に作用することである。「消毒は、反応剤が細菌に対してだけでなく細菌が見い出される媒体に対しても作用する化学反応である。」（Dakin、1915年、Brit.Med.J.2:809〜810）。防腐剤溶液は生物を水性媒体中に懸濁するときに最大の微生物殺害をもたらすが、殺菌作用は血清液または血液中に存在する有機物との競合反応によって非常に低下する。
防腐剤は、通常の免疫生理学的防禦メカニズムと非特異的に反応しそしてそれを阻害する。殺菌濃度の防腐剤は食細胞白血球の抗微生物機能を阻害する。「白血球は細菌よりも化学的防腐剤の作用に対して一層感受性が高く、そしてこれを考慮すると、これら防腐剤のいずれも、先ず組織それ自体を破壊することなくしては、組織中に浸透して細菌を殺害する力を有していないように思われる。膿の自然防腐能力は一掃されるが、微生物は完全には破壊されず、そして残っている微生物は新たな膿細胞が移動してきて微生物を抑止できるときまで阻止されることなく増殖可能である。防腐剤の殺白血球能力を考えると、或る種の防腐剤は創傷の洗浄に適当であるが他の防腐剤は適当でないことを我々に示している。それ故、我々が創傷を洗浄するために防腐剤溶液を所望する場合、我々はその抗白血球能力を急速に失いそしてその防腐作用を非常に迅速に発揮する防腐剤を選択すべきである。そうすると、我々は創傷にあまり損傷を与えることなく該液体の洗浄効果を有することになる。ユーゾルおよびダーキンス溶液の１つの大きな利点はそれらが２，３分で活性の化学剤としては消滅しそして白血球に対して持続的な悪い影響を何も有していないことである（Fleming、1919年）。
作用メカニズム：
初期の研究者の多くは次亜塩素酸塩の殺微生物作用は次亜塩素酸の自己プロトロシス生成物として遊離する発生期酸素に依存しており、そして遊離した酸素は細胞原形質中の不飽和成分と結合して殺害を行うと考えていた。この見解は今世紀の初めにダーキンによって正当性を疑われた。「次亜塩素酸の防腐作用が酸素の遊離によるものであることは繰返し述べられてきた。私はこの陳述を支持する証拠を何も見い出すことができなかった。」彼は続けて更に直接的な塩素化メカニズムを提案した。「次亜塩素酸および次亜塩素酸塩が細菌または他の起源の有機物に作用するとき、タンパク質の（ＮＨ）基の幾つかが（ＮＣl）基に変換されるように思われる。」このようにして形成されクロラミン−Ｉの群に属する生成物が元の次亜塩素酸塩と殆ど同じ防腐作用を有していると考えられ、そして次亜塩素酸塩の防腐作用は、酸素の遊離を伴う分解によるよりはむしろこれらクロラミンの形成によって調節される可能性が多いように思われる」（Dakin、1915年）。更に、「塩素以外の供給源からの酸素は、当量の発生期酸素を生成するのに理論的に必要な量の塩素と同程度には容易に細菌を殺害しない」ことが知られていた（MercerおよびSomers、1957年、Adv.Food.Res.7:129〜160）。
現在まで持続している、塩素の直接的殺微生物作用に関するダーキンの見解も問題が多い。「塩素の殺菌作用を説明するために提唱された他の仮説に対しても実験的根拠がない。これら仮説は、細菌のタンパク質が塩素によって沈殿し；細胞膜が塩素によって変化して細胞内容物の拡散を可能にし；そして細胞膜が塩素によって機械的に崩壊するとの示唆を含んでいる」（MercerおよびSomers、1957年）。細菌と塩素の結合はｐＨ6.5では顕著に低く、そしてｐＨを8.2まで上げることによって２倍になる（Friberg、1956年、Acta Pathol.Microbiol.Scand.38:135〜144）。他方、次亜塩素酸塩の殺菌および殺ウイルス能力は酸性、即ちｐＨの低下によって上昇する（Butterfield等、1943年、Publ.Health Reports 58:1837〜1866:FribergおよびHammarstrom、1956年、Acta Pathol.Microbiol.Scand.38:127〜134）。このため、塩素の結合は塩素依存性の殺害と反比例する。
有機クロラミン製剤、例えばクロラミン−Ｔも防腐剤として役立つが、逆説的に言えば、これらクロラミンの殺微生物作用（microbicidal action）は全てまたは大部分、クロラミンの加水分解で形成される次亜塩素酸に起因すると結論される（Leech、1923年、J.Am.Pharm.Assoc.12:592〜602）。クロラミンの殺菌作用（bactericidal action）は「全てまたは部分的に、加水分解およびイオン化平衡に従って形成される次亜塩素酸によるものと思われる」（Marks等、1945年、J.Bacteriol.49:299〜305）。クロラミンのより緩慢な加水分解によってもたらされるより大きい安定性が殺菌作用を緩慢にする。
次亜塩素酸塩は0.2から2.0ppmの濃度（即ち、１ml当たり4から40ｎmol）で殺菌作用を発揮する。このような「痕跡量」の濃度による高い能力は、殺微生物作用が１つまたは複数の必須酵素の阻害に起因することを強く示唆している（Green、1941年、Adv.Enzymol.1:177〜198）。次亜塩素酸は種々のスルフヒドリル酵素を阻害しそしてグルコース代謝の阻害は細菌の殺害と比例するという証拠が提示されている（Knox等、1948年、J.Bacteriol.55:451〜458）。
Ｈ2Ｏ2の作用メカニズムに関する文献は幾らか不完全である。しかし乍ら、全体的に一致していることは「Ｈ2Ｏ2はその高い酸化−還元能にも拘わらず分子酸素と同様に緩慢な酸化剤であり、そして事実、この物質に起因する多数の酸化は、注意深く検討すると、触媒量のＦｅ++またはＣｕ++の付加によって生じる遊離基の形成によるものであることが見い出されている」ということである（Guzman−Barron等、1952年、Arch.Biochem Biophys.41:188〜202）。この見解は幾つかの研究の一致する結論を表わしている（Yoshpe−PurerおよびEylan、1968年、Health Lab.Sci.5:233〜238;Miller、1969年、J.Bacteriol.98:949〜955）。
種々の染料も防腐剤として使用されてきた。光力学作用は、染料（1Ｄye）、即ち、一重項（singlet）増感剤分子が光子を吸収しそしてその一重項励起状態（1Ｄye*）になるように促進されるときに生じる。1Ｄye*が光子を放出して1Ｄyeの基底状態に戻る場合、蛍光現象が光力学作用なしに観察される。光力学的増感剤として使用するためには、1Ｄye*は項間交差（ＩＳＣ）を行って、即ちスピン多重度が変化して染料の準安定的な三重項励起状態（3Ｄye*）を比較的高い量子収量で生じさせなければならない（Gollnick、1968年、Advan.Photochem.6:1〜122）。
1Ｄye---hν--->1Ｄye*---IＳＣ--->3Ｄye*      （1）
増感剤は近紫外部から、近赤外部を含めて可視部全体までの範囲の光を吸収する。この吸収が「染料」の色特性の原因である。染料の励起に必要な光の波長（即ち、光子のエネルギー）は染料の吸収スペクトルによって特定される。
3Ｄye*状態は比較的寿命が長いので、その状態で他の分子と反応することができる。光力学反応は3Ｄye*の活性に依存して２つの主要なクラスに分けることができる（SchenckおよびKoch、1960年、Z.Electrochem.64:170〜177）。
タイプ１の反応では、励起された三重項（triplet）増感剤はもう１つの分子による直接的な酸化還元転移を受ける。タイプ１の反応の増感剤は典型的には容易に酸化されるかまたは還元される。
3Ｄye*＋1ＳubＨ--->2Ｄye＋2Ｓub・      （2）
式（2）において、三重項増感剤は１価の酸化剤として作用し、そしてその二重項状態（2Ｄye）に還元され、そして一重項基質（1ＳubＨ）は二重項（doublet）の遊離基2Ｓub・状態に酸化される。同様な様式で、還元性の3Ｄye*をラジカル還元剤として作用させることができる。反応（2）の生成物2Ｄyeは基底状態のＯ2、三重項ジラジカル分子（3Ｏ2）と反応させて二重項のヒドロジオキシル酸ラジカル（2・Ｏ2Ｈ）またはその抱合体塩基である過酸化アニオン（2・Ｏ2-）を生成させ、そして一重項基底状態の染料を発生させることができる:
2Ｄye＋3Ｏ2--->1Ｄye＋2・Ｏ2Ｈ（または2・Ｏ2-）      （3）
中性から酸性条件下では、酸素還元によるこれら生成物は二重項−二重項（即ち、ラジカル−ラジカル）が消滅してＨ2Ｏ2が生成される：
2・Ｏ2Ｈ＋2・Ｏ2-＋Ｈ+--->1Ｈ2Ｏ2＋1Ｏ2      （4）
該反応が直接的な消滅によるものである場合、スピン恒存は維持されるので、このことにより一重項分子酸素（1Ｏ2）を生成させることもできる（Khan、1970年、Science 168:476〜477）。
タイプIIの反応では、励起した三重項増感剤は三重項（基底状態）3Ｏ2と相互に直接作用する。反応は3Ｄye*から3Ｏ2への励起エネルギーのスピン平衡移動を伴い、生成物として基底状態の1Ｄyeおよび一重項分子酸素（1Ｏ2）を生成する（Kautsky、1939年、Trans.Faraday Soc.35:216〜219）：
3Ｄye*＋3Ｏ2--1ＤyeＯ2-->1Ｄye＋1Ｏ2      （5）
反応（5）は非常に迅速でありそして最も普通のタイプIIの経路である。しかし乍ら、3Ｄye*が十分に還元性である場合、Ｏ2への直接的な１価電子の移動が生起することがある：
3Ｄye*＋3Ｏ2--1ＤyeＯ2-->2Ｄye+＋2・Ｏ2-      （6）
ラジカルの消滅によって反応（4）で記載したようにＨ2Ｏ2を生成するように進むことができる。これらの反応経路を考慮して、反応（5）の方が反応（6）より２桁以上好ましいと考えられる（KascheおよびLindqvist、1965年、Photochem.Photobiol.4:923〜933）。
染料による微生物の殺害は3Ｄye*自体またはそのタイプＩおよびタイプIIの反応生成物、即ち2・Ｏ2-、Ｈ2Ｏ2、そして特に1Ｏ2と微生物のタンパク質、核酸、不飽和脂肪等との反応に起因するものであろう（SpikesおよびLiving ston、1969年、Adv.Rad.Biol.3:29〜121）。
範囲の広い求電子酸化剤、1Ｏ2は触媒活性に必須のアミノ酸を破壊することによって酵素を阻害することができる。1Ｏ2とトリプトファン、ヒスチジンおよびメチオニンとの反応の速度定数（ｋr、Ｍ-1秒-1）は2*107から9*107までの範囲である（MathesonおよびLee、1979年、Photochem.Photobiol.29:879〜881;KraljicおよびSharpatyi、1978年、Photochem.Photobiol.28:583〜586）。標的微生物に極めて近接して発生する場合、「痕跡」量の1Ｏ2で微生物の代謝に必要な酵素を有効に阻害することができよう。不飽和脂肪、核酸および他の電子稠密な生物学的分子も1Ｏ2と反応性である。このような必須の細胞成分の二原子酸素付加も殺微生物作用で役割を果たすことがあろう。
継続している問題点：
以下の本質的な問題点を上記材料から引き出すことができる。第１に、能力の高い化学的防腐剤は典型的には酸化剤、例えばＨＯＣｌである。これらの酸化剤や酸素付加剤は「痕跡」量で殺微生物作用を有し、そして多分代謝に必須の酵素を阻害することによってそれらの効果を発揮する（Green、1941年）。
第２に、このような防腐剤の抗微生物能力はそれらの非特異的な反応性により損なわれる。損傷は標的微生物に限定されない。フレミングが指摘したように、一般的に宿主細胞は防腐剤の毒性作用に対して微生物より感受性が高い。
理想的な防腐剤は、宿主細胞には最小の毒性しか有さないで、真菌を含む広範囲の病原性微生物に対して有効な反応性を発揮するであろう。創傷の治療に関する生理学的流儀の原則を維持すると、防腐剤は感染に対する身体の自然防禦能力を助けるかまたは増大させるであろう。
範囲は限定されるが、これらの要件は或る種の抗生物質によって充足される。抗生物質の選択的殺菌作用は、タンパク質合成、核酸複製および細胞壁の存在またはその組成に関して原核生物細胞と真核生物細胞間の差異に基づいている。抗生物質は、事実上、宿主の真核細胞には毒性でなく、或る種の細菌、即ち原核生物に選択的に毒性である。しかし乍ら、抗生物質の広範囲な作用は宿主の正常叢［正常フローラ（normal flora）］を形成する細菌に対して有害な影響を有することがある。正常叢の細菌は病原性生物の増殖に対して障壁として作用し、そしてこのため、抗生物質による正常叢の破壊はより多くの病原性細菌が増殖する機会を提供する。抗生物質に関連した偽膜性大腸炎は、抗生物質による正常叢を破壊した後の、病原体、即ち、クロストリジウム  ジフィシレおよびまれには黄色ブドウ球菌の増殖過剰によってもたらされる。
更に、酵母および真菌は真核微生物であり、そしてこのため、本質的に抗生物質によって影響を受けない。従って、酵母の増殖過剰および感染は細菌感染の抗生物質治療によることがある。
抗生物質はまた直接的な毒性の影響を示すことがある。これらの有害な影響は宿主細胞および組織に対する医薬品の直接的作用、例えば抗生物質の腎毒性から生じることがある。
前述のことから容易に明らかであるように、広範囲の病原性微生物に対して反応性を有するが宿主細胞および正常叢には最小の活性しか示さない新規で改良された防腐剤が長い間待望されている。
発明の要約
ハロパーオキシダーゼを使用して、標的微生物の環境下で、標的微生物と選択的に結合させ、そして過酸化物およびハライドの存在下で、望ましい微生物を消失させないでまたは宿主細胞のような他の媒体成分を顕著には損傷させないで、標的微生物の増殖を阻害できることが今発見された。ハロパーオキシダーゼの新たに発見された選択的結合特性により、病原性微生物のような標的微生物が正常叢のメンバーのような望ましい微生物よりハロパーオキシダーゼに対して大きい結合能力を有するとき、標的微生物はハロパーオキシダーゼと選択的に結合するが望ましい微生物はハロパーオキシダーゼと殆どまたは全く結合しない。過酸化物およびハライドの存在下で、ハロパーオキシダーゼと結合した標的はハライドの酸化を触媒しそして標的微生物の表面で一重項分子酸素への過酸化物の不均化を促進して、標的細胞の選択的な殺害を生じさせるが、望ましい微生物または生理学的媒体に対する付随的な損傷は最小である。
ハロパーオキシダーゼ結合の選択的な性質は、本発明の方法や組成物を使用して細菌または真菌感染と闘う際に正常叢または宿主細胞をあまり傷つけることなく非常に有効であるように設計できるので、ヒトまたは動物対象の治療的または予防的防腐剤治療において本発明の方法および組成物を非常に有用にしている。
本発明の方法および組成物で使用するのに適切なハロパーオキシダーゼにはミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ラクトパーオキシダーゼ（ＬＰＯ）およびクロロパーオキシダーゼ（ＣＰＯ）が含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の一重項分子酸素（1Ｏ2）経路およびハロゲン化−過酸化（実質上の一重項分子酸素）経路による微生物殺害を示す概略図である。
図２は、ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）によるジチオナイト還元マイナス酸化（Ｒ−Ｏ）差異スペクトルである。
図３は、好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）によるジチオナイト還元マイナス酸化（Ｒ−Ｏ）差異スペクトルである。
図４は、ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）に暴露する前（スペクトルＡ）および後（スペクトルＢ）の黄色ブドウ球菌によるジチオナイト還元マイナス酸化（Ｒ−Ｏ）差異スペクトルを示す。
図５は、細菌に暴露しそして遠心して細菌を除去した後の溶液（遊離ＭＰＯ）中に残っているＭＰＯによるジチオナイトＲ−Ｏ差異スペクトルを示す。
図６Ａは、ＭＰＯ依存性ルミノール酸化対使用したＭＰＯ濃度から得られる、20秒当たりメガ光子で表わした化学発光（ＣＬ）のプロットである。図６Ｂは、図６Ａに示したデータの範囲を限定した再プロットであり、その際ｘとｙ軸は図６Ａと逆になっている。
図７は、実施例６に詳細に記載されているＭＰＯの結合データのプロットを示す。図７Ａは、微生物黄色ブドウ球菌（図７の“＊”で示される）および連鎖球菌種（ビリダンス、図７の“ｏ”で示される）の別個のインキュベーションに関する反応容量（１ml）当たりピコモルで表わした結合対遊離ＭＰＯのプロットである。図７Ｂは、図７Ａのデータを微生物当たりキロ分子（103個の分子）で表わしたＭＰＯ濃度のプロットである。図７Ｃは、図７Ｂのデータのスキャッチャードプロットであり、その際結合対遊離ＭＰＯの比は黄色ブドウ球菌懸濁液（“＊”で示される）または連鎖球菌種（ビリダンス）懸濁液（“ｏ”で示される）の１ml反応容量中の微生物当たりのキロ分子として表わした結合ＭＰＯに対してプロットしている。
図８は、実施例７に詳細に記載されているＣＰＯの結合データのプロットを示す。図８Ａは、微生物当たりのキロ分子（103個の分子）で表わした結合対遊離ＣＰＯのプロットである。図８Ｂは、図８Ａのデータのスキャッチャードプロットであり、その際結合対遊離ＣＰＯの比は黄色ブドウ球菌懸濁液（“＊”で示される）または連鎖球菌種（ビリダンス）懸濁液（“ｏ”で示される）の１ml反応容量中の微生物当たりのキロ分子として表わした結合ＣＰＯに対してプロットしている。
図９は、実施例８に詳細に記載されているＥＰＯの結合データのプロットを示す。図９Ａは、微生物当たりのキロ分子（103個の分子）で表わした結合対遊離ＣＰＯのプロットである。図９Ｂは、図９Ａのデータのスキャッチャードプロットであり、その際結合対遊離ＥＰＯの比は黄色ブドウ球菌懸濁液（“＊”で示される）または連鎖球菌種（ビリダンス）懸濁液（“ｏ”で示される）の１ml反応容量中の微生物当たりのキロ分子として表わした結合ＥＰＯに対してプロットしている。
図１０は、実施例８に詳細に記載されているＬＰＯの結合データのプロットを示す。図１０Ａは、微生物当たりのキロ分子（103個の分子）で表わした結合対遊離ＬＰＯのプロットである。図１０Ｂは、図１０Ａのデータのスキャッチャードプロットであり、その際結合対遊離ＬＰＯの比は黄色ブドウ球菌懸濁液（“＊”で示される）または連鎖球菌種（ビリダンス）懸濁液（“ｏ”で示される）の１ml反応容量中の微生物当たりのキロ分子として表わした結合ＬＰＯに対してプロットしている。
発明の詳細な説明
本願発明は、標的微生物に選択的に結合して殺害するためにハロパーオキシダーゼを使用する方法および組成物に広範に向けられているものであり、その際標的微生物環境下で望ましい微生物は消失させないかまたは宿主細胞のような媒体成分は殆ど損傷させない。
１つの特に好ましい実施態様では、本願方法および組成物は防腐剤として使用される。真菌を含む広範囲の病原性微生物に対する有効な反応性および宿主細胞に対する最小の毒性に加えて、理想的な防腐剤は宿主生物の正常叢も選択的に保持しなければならない。１つの特徴において、本願発明は、病原性微生物に選択的な親和性を有する二原子酸素付加酵素系の使用に基づく防腐剤系を提供する。本発明の防腐剤系は化学的防腐剤能を有しているが、関連した宿主組織を破壊または正常叢を崩壊させない；即ち、防腐作用は選択的でありそして標的微生物に限定される。本発明は理想的な防腐剤系に関して上記した基準を充足するものである。
酸化剤および酸素付加剤の発生：
ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）や好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）のようなハロパーオキシダーゼ（ＸＰＯｓ）は、適当なハライド補因子（Ｘ-）およびＨ2Ｏ2が基質として与えられるとき、天然系で殺微生物活性を示すことが知られている（Klebanoff、1968年、J.Bacteriol.95:2131〜2138）。しかし乍ら、ハロパーオキシダーゼ結合の選択的性質並びに治療、研究および産業的適用におけるこれらの系の有用性はこれまで認識されていなかった。
第１次反応：
ＸＰＯが触媒する反応の第１次段階はＨ2Ｏ2によるＸ-の酸化に係わるものである：
Ｈ2Ｏ2＋Ｘ-＋Ｈ+--（ＸＰＯ）--->ＨＯＸ＋Ｈ2Ｏ      （7）
この反応はネルンスチアン（Nernstian）の関係式として最も良く理解されている：
0004063317.tif 000002
式中、Ｅは観測された電位（ボルト）であり、Ｅ0は標準電位（ボルト）であり、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度であり、ｎは移動したグラム当量当たりの電子数であり、Ｆはファラデーであり、Inは還元反応剤対酸化反応剤（［酸化］／［還元］）の濃度比の自然対数であり、そしてIn［H+］はプロトン（水素イオン）濃度の自然対数である。式（7）で記載される反応は２つの別個の半分ずつの反応：Ｈ2Ｏ2からＨ2Ｏへの還元、
0004063317.tif 000003
およびＸ-からＨＯＸへの酸化、
0004063317.tif 000004
と考えることができる。
Ｈ2Ｏ2でＸ-を酸化するために組合わされた反応は正味の電位△Ｅ、即ち
0004063317.tif 000005
によって行われる。熱力学的には、電位の正味の変化は反応の自由エネルギーの変化（△Ｇ）として記載することができる：
0004063317.tif 000006
自由エネルギーの変化は下記式による電位の変化に関係がある：
△G＝−nF△E      （13）
酵素は特定の化学反応の速度を大いに高めることができるが、反応の△Ｇには影響を与えない。酵素は熱力学的に可能な反応の機械論的経路を提供する。本願発明において、ハロパーオキシダーゼは、Ｈ2Ｏ2を使用してより一層反応性の酸化剤、即ちハイポハライト（ＨＯＸ）および酸素付加剤、即ち一重項分子酸素（1Ｏ2）を発生させるメカニズムを提供する。表１のデータは、ハイポハライトを生成するハライドのＨ2Ｏ2酸化が熱力学的に好ましい、即ちエネルギー発生性であることを示している。エネルギー発生性はハロゲンの電気陰性度に反比例することに注意されたい。
0004063317.tif 000007
値はPourbaix、1966年、水溶液中の電気化学的平衡図表集、Pergamon Press、644頁のデータから計算した。
第２次反応：
共に一重項の反応剤、ＨＯＸとＨ2Ｏ2の反応は一重項の表面を介して進行して、全て一重項の生成物である1Ｏ2、Ｘ-およびＨ2Ｏを生成する（KashaおよびKhan、1970年、Ann.N.Y.Acad.Sci.171:5〜23）;即ち、
0004063317.tif 000008
この反応の正味の電位は次の関係式で示される：
0004063317.tif 000009
表２は、Ｈ2Ｏ2によるＨＯＣｌまたはＨＯＢｒの酸化が1Ｏ2の発生に十分以上のエネルギー発生性を有することを示している。ＨＯＸがＨＯＩであるとき、反応は中性付近からアルカリ性ｐＨの範囲においてだけ十分エネルギー発生性である。
0004063317.tif 000010
この第２次反応における1Ｏ2の発生は22.6kcal mol-1のエネルギー吸収性である。△Ｇaの値は調整したエネルギー発生性を表わす;即ち、△Ｇ2＋22.56＝△Ｇaである。値はPourbaix（1966年）のデータから計算した。
全体の正味の反応、即ち、反応（7）と（14）の合計:
２Ｈ2Ｏ2--（ＸＰＯ）-->２Ｈ2Ｏ＋1Ｏ2      （16）
はＨ2Ｏ2の不均化であり、表３のデータで示されるように1Ｏ2とともに−27.8kcal mol-1の△Ｇが生成する。
0004063317.tif 000011
この第２次反応における1Ｏ2の発生は22.6kcal mol-1のエネルギー吸収性である。△Ｇnaの値は調整したエネルギー発生性を表わす；即ち、△Ｇn＋22.56＝△Ｇnaである。値はPourbaix（1966年）のデータから計算した。
ＸＰＯは反応調整に有利な酸化還元非対称を導入することによってＨ2Ｏ2の不均化を触媒する。Ｘ-のＨ2Ｏ2酸化は温和なエネルギー発生性であり、ＨＯＸを生成する。Ｈ2Ｏ2によるＨＯＸ酸化は非常にエネルギー発生性であり、1Ｏ2を生成する。換言すれば、Ｃl-とＨＯＣｌのＨ2Ｏ2酸化は共に熱力学的に好ましい。ＸＰＯがミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）であるとき、Ｘ-はＣｌ-、Ｂｒ-であり、そして程度は限定されるがＩ-であることができる。ＸＰＯが好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）またはラクトパーオキシダーゼであるとき、Ｘ-はＢｒ-であり、そして一定の程度でＩ-であることができる。
本発明の１つの特徴は、過酸化物およびハライドの存在下、第１の微生物に選択的に結合して該微生物の増殖を阻止するのに有効であるが媒体から第２の微生物を消失させるには有効でない量のハロパーオキシダーゼを媒体中に導入することによって、媒体から第２の望ましい微生物を消失させることなく媒体中の第１の標的微生物の増殖を選択的に阻止する方法を提供する。媒体中の標的微生物の増殖を選択的に阻止する能力は、制御された濃度値の本発明のパーオキシダーゼが微生物に種々の程度にそして種々の親和性で選択的に結合するという発見に起因する。標的微生物が、上記で詳細に記載したように、望ましい微生物より大きいハロパーオキシダーゼ結合能を有するとき、媒体に対してハロパーオキシダーゼを飽和に満たない量で準備すると、標的微生物の表面へのハロパーオキシダーゼの選択的結合が生じ、望ましい微生物の表面へのハロパーオキシダーゼの結合は最小であるかまたは全く生じない。過酸化物とハライドの存在下で、標的と結合したハロパーオキシダーゼはハライドの酸化を触媒し、そして標的微生物の表面で過酸化物から一重項分子酸素への不均化を促進する。一重項分子酸素の寿命は比較的短くそしてその拡散能は比例して限定されるので、これも上記で詳細に記載したように、標的微生物表面での一重項分子酸素の生成は標的微生物の選択的殺害を生じさせ、望ましい微生物または媒体の他の生理学的成分の付随的損傷は最小である。
本発明のもう１つの特徴に従って、本発明のハロパーオキシダーゼは、宿主細胞に対する付随的損傷が最小で病原性微生物に選択的に結合しそしてそれらを殺害するために、ヒトまたは動物対象の治療的または予防的処置で防腐剤として使用することができる。それ故、本発明は更に、過酸化物およびハライドの存在下で防腐剤的に有効であるが宿主の正常な細胞を顕著に損傷するには無効な量のハロパーオキシダーゼを宿主に投与することによってヒトまたは動物宿主を治療する方法を提供する。好ましくは、使用されるハロパーオキシダーゼの性質および量は宿主の正常叢を消失させるには無効であるように調節される。
本願発明に有用なハロパーオキシダーゼはハライド：過酸化水素の酸化還元酵素として定義され（例えばthe International Union of Biochmistryに基づくEC No.1.11.1.7およびEC No.1.11.1.10）、その際ハライドは電子供与体または還元剤でありそして過酸化物は電子受容体または酸化剤である。過酸化水素から一重項分子酸素のハライド依存性発生を触媒する任意のハロパーオキシダーゼを本願発明で使用することができる。本願明細書で示されるように、適当なハロパーオキシダーゼにはミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ラクトパーオキシダーゼ（ＬＰＯ）、クロロパーオキシダーゼ（ＣＰＯ）およびそれらの誘導体が含まれ、現在好ましいハロパーオキシダーゼはミエロパーオキシダーゼおよび好酸性パーオキシダーゼである。本願明細書で使用される「それらの誘導体」は一般的に、化学的にまたは機能的に修正したＭＰＯ、ＥＰＯ、ＣＰＯおよびＬＰＯを意味し、これらは本願明細書で記載するように、標的微生物または特定の真核細胞タイプに特異的に結合できそして過酸化物の不均化を高めるハロパーオキシダーゼ活性を保持して適当なハライドの存在下で重項分子酸素を形成する。有用な誘導体の例には、標的微生物または癌細胞のような標的細胞の表面で抗原、受容体部位または他の顕著な特徴を特異的に認識しそしてそれらに選択的に結合できる抗体、抗体フラグメント、レクチンまたは他の標的部分と抱合しているハロパーオキシダーゼが含まれる。誘導体化されていないＣＰＯおよびＬＰＯの微生物結合が比較的非特異的であるため、これらのハロパーオキシダーゼは好ましくは、標的微生物との結合特異性および／または親和性を高めるように誘導した後に本発明の実施に使用する。
本発明のハロパーオキシダーゼ組成物の防腐剤活性は、上記したように、ハイポハライトを形成させる過酸化物とハライドの反応および一重項分子酸素を形成させる過酸化物とハイポハライトの反応に係わっているので、本発明の組成物の活性は感染部位での適当な過酸化物とハライドの存在に依存している。或る状況下では、過酸化物（例えば、過酸化水素）は、例えば、天然に生起する叢の活性により感染部位に存在することがあり、そして十分な量の塩化物が生理学的環境中に存在することがあり変換反応の補因子として作用する。これらの状況下では、治療される対象に過酸化物またはハライドを追加して投与する必要はない。他の状況下では、過酸化水素および／またはハライドを感染部位に追加的に提供する必要があると思われる。従って、本発明の組成物は更に、所望の場合、過酸化物またはインビボ（in vivo）で過酸化物を生成できる物質およびハライドからなることができる。
本発明の方法および組成物に有用な過酸化物には式：
Ｒ−ＯＯＨ
（式中、Ｒは水素または１から３個の炭素原子を有する短鎖アルキル基である）の過酸化水素およびアルキルヒドロパーオキサイドが含まれる。酸化剤活性は一般的に、Ｒ鎖の長さが増すにつれて低下し、それは次のとおりである：
Ｒ＝Ｈ>>ＣＨ3>ＣＨ3ＣＨ2>ＣＨ3（ＣＨ2）2
本発明の組成物で使用するのに現在好ましい過酸化物は過酸化水素である。過酸化水素はまた、インビボで過酸化水素を生成できる物質を防腐剤組成物に含めることによって感染部位で利用可能にすることもできる。この目的で特に有用な物質には、例えばグルコースオキシダーゼやガラクトースオキシダーゼのようなオキシダーゼが含まれる。
過酸化水素を本発明組成物に直接含めるとき、使用される量は好ましくは、最大の防腐剤活性を提供するがヒトまたは動物対象の細胞および組織の損傷は最小とするように設計される。従って、局所的または口内投与用の液体組成物に含めるとき、本発明組成物は１mlの液体組成物当たり約１ｎmolから約10μmolまでの過酸化水素、更に好ましくは１mlの液体組成物当たり約５ｎmolから約５μmolまでの過酸化水素、そして最も好ましくは１mlの液体組成物当たり約10ｎmolから約１μmolまでの過酸化水素からなることができる。インビボで過酸化水素を生成できる物質、例えばオキシダーゼは感染部位に存在する過酸化水素の量を力学的に制御するのに特に有用である。このような物質は組成物の防腐剤活性を最大にし、一方治療すべき対象の組織の損傷は最小にする。従って、使用すべきこのような物質の量は該物質の性質および望まれる治療効果に非常に依存するが、微生物感染の部位で利用可能なハライドのタイプおよび濃度に依存して、好ましくは１分当たり液体１ml当たり約１ｐmolから約100ｎmolまでの一定状態値をもたらし得る量である。
本発明の方法および組成物に使用するのに好適なハライドは臭化物または塩化物であることができる。特定の適用で使用されるハライドの使用、選択および量は種々の因子、例えば防腐剤組成物に使用されるハロパーオキシダーゼ、所望の治療効果、過酸化物の利用可能性および他の因子に依存する。ハロパーオキシダーゼがＭＰＯまたはＣＰＯであるとき、ハライドは臭化物または塩化物であることができる。塩化物は殆どの生理学的媒体中にハライド補因子として制限がないほど十分な値で存在しているので、塩化物の外部供給源は一般的には必要でなく、その結果使用するのに現在最も好ましいハライドは塩化物である。塩化物の外部供給源を所望する場合、使用される塩化物の量は、生理学的条件に近づけるため、好ましくは溶液１ml当たり約10μmolの塩化物から約150μmolの塩化物までの範囲内である。ハロパーオキシダーゼがＥＰＯまたはＬＰＯであるとき、塩化物は補因子として比較的無効であり、従って好ましいハライドは臭化物である。局所または口内投与用の液体組成物中に含めるとき、本発明の組成物は液体組成物１ml当たり約１ｎmolから約20μmolまでの臭化物、更に好ましくは液体組成物１ml当たり約10ｎmolから約10μmolまでの臭化物、最も好ましくは液体組成物１ml当たり約100ｎmolから約１μmolまでの臭化物からなることができる。本発明の全身送達用の液体組成物および他の投与形態の組成物は好ましくは実質的に当量のハライドを治療すべき微生物感染部位に提供する。
下記の実施例１０に詳細に記載するように、ハライド対過酸化物の比は有効な殺微生物環境の形成における重要な考慮事項である。従って、上記したように微生物攻撃位置でのハライドと過酸化物の有効値を確保することに加えて、最適な殺微生物活性をもたらすハライド：過酸化物比で本発明の方法を実施することが好ましい。例えば、ハロパーオキシダーゼがＭＰＯでありそしてハライドがＣｌ-であるとき、Ｃｌ-対過酸化物の比は殺微生物活性の環境下で好ましくは約１から約40,000まで、更に好ましくは約50から約40.000まで、そして最も好ましくは約200から約40,000までの範囲内に維持する。ハライドがＢｒ-であるとき、Br-対過酸化物の比は殺微生物活性の環境下で好ましくは約0.1から約4,000まで、更に好ましくは約0.5から約2,000まで、そして最も好ましくは約１から約1,000までの範囲内に維持する。
防腐剤適用で使用するとき、本発明の方法および組成物は、好ましくは正常叢への損傷が最小で、病原性微生物による広範囲の感染を治療するために使用することができる。本願明細書で使用するとき、「病原性微生物」は宿主中に通常存在していないかまたは宿主中に病原的程度にまで過剰に集まった病原性細菌または真菌を含むように意図されている。宿主の病原体感染を生じさせる微生物は良く知られている（Principles and Practice of Infectious Diseases、第３版、1990年、G.Mandell等編、Churchill Livingstone Inc.、ニューヨーク参照）。かくして、本発明の方法および組成物は、感染部位に本発明の組成物を送達できるようにする任意の条件と関連させて病原性微生物による感染治療または予防に使用することができ、これらには表面若しくは外科的創傷、火傷または他の顕著な表皮障害、例えば中毒性表皮壊死、膀胱炎および尿道炎のような尿路感染、外陰部膣炎および子宮頚管炎のような膣炎、歯肉炎、外耳炎、アクネ、外部真菌感染、上気道感染、胃腸管感染、亜急性細菌性心内膜炎並びに他の細菌若しくは真菌感染の治療が含まれるがこれらに限定されず、これら感染に対して本発明の組成物を効果的に送達することができる。本発明を実施して選択的に殺すことができる代表的な病原性微生物には化膿性連鎖球菌、ストレプトコッカス  アガラクチエ、黄色ブドー球菌、緑膿菌、大腸菌および他の大腸菌型細菌、カンジダ  アールビカンス、並びに他の感染性細菌および真菌が含まれるがこれらに限定されない。微生物感染の治療に使用される特定のハロパーオキシダーゼは好ましくは治療すべき病原性微生物の結合特性に基づいて選択される。一般的に、病原性微生物が細菌であるとき、好ましいハロパーオキシダーゼはしばしばミエロパーオキシダーゼである。以下で更に説明されるように、カンジダ  アルビカンスおよび他の真菌に対しては好酸性パーオキシダーゼの親和性がより大きいため、通常はＥＰＱがこれら微生物による感染の治療に好ましいハロパーオキシダーゼであろう。
本願明細書で使用するとき、用語「正常叢［正常フローラ（normal flora）］」は健康な宿主の体表面中または上に共生値で通常存在する細菌を意味する。正常叢には、例えばヒト対象の口、腸または膣内細菌の乳酸系統群、例えば口内の連鎖球菌（ビリダンス）並びに母乳栄養乳児の腸、外生殖器、前尿道および膣内の乳酸桿菌種（例えば、チシアー桿菌およびデーデルライン桿菌）が含まれる。宿主の正常叢を構成する微生物は良く知られている（例えば、上述のPrnciples and Practice of Infectious Diseases、ニューヨーク、34〜36および161頁参照）。本発明のハロパーオキシダーゼは正常叢に優先して多くの病原性細菌および真咲菌と選択的に結合することが見い出されている。宿主は好ましくは、宿主の正常叢を消失させるには無効な量のハロパーオキシダーゼで治療される。正常な叢集団が病原性微生物の過剰集団のためかまたは他の理由により抑圧されているような或る種の状況下では、正常叢の増殖を更に刺激することが望ましいことがある。従って、本発明の実施に関連して宿主の正常叢の再転移増殖を促進するのに有効な量の正常叢を用いて宿主を更に治療することができる。
本発明の防腐剤組成物は一般的には、過酸化物およびハライドの存在下で病原性微生物の増殖を阻止するのに有効な量のハロパーオキシダーゼと共に製薬的に受容可能な担体とからなる。担体がハロパーオキシダーゼの選択的結合能力または酵素活性を顕著に妨げない限り、一般的には任意の製薬的に受容可能な担体を本目的のために使用することができる。
該防腐剤組成物は任意の効果的な製薬的に受容可能な形態でヒトおよび動物対象を含む温血動物に、例えば、局所、洗浄法、経口、坐剤、非経口または注入可能な投与形態で、例えば局所、口内若しくは鼻スプレーとしてまたは活性のハロパーオキシダーゼを微生物感染部位に送達するのに有効な他の任意の方法で投与することができる。投与経路は好ましくは防腐剤組成物と感染微生物が直接接触するように設計される。
局所投与用には、製薬的に受容可能な担体は液体、クリーム、ローションまたはゲルの形態をとることができ、そして更に有機溶媒、乳化剤、ゲル化剤、加湿剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤化剤、保存剤、時間放出剤および少量の湿潤剤、分離剤、染料、香料並びに局所投与用の製薬組成物に通常使用される他の成分からなることができる。本発明の組成物は吸収性材料、例えば縫合糸、包帯およびガーゼ中に含浸させるかまたは固体相材料、例えば繊維、ジッパーおよびカテーテルの表面上に被覆させて該組成物を微生物感染部位に送達させることができる。このタイプの他の送達系は当該技術分野の熟練者に容易に明白であろう。
注射用に設計される組成物は製薬的に受容可能な無菌の水性若しくは非水性溶液、懸濁液またはエマルジョンからなることができる。適当な非水性担体、希釈剤、溶媒または媒体の例にはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。このような組成物は保存剤、湿潤化剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントからなることもできる。それらは、例えば、細菌保持フィルターによるろ過によって、または組成物中に滅菌剤を導入することによって滅菌することができる。それらはまた、投与する前に無菌の水、生理食塩水または他の注射可能な媒体中に溶解させるかまたは懸濁させることができる無菌の固体組成物の形態で製造することもできる。
経口または局所投与用の固形の投与形態にはカプセル、錠剤、ピル、坐剤、粉末および顆粒が含まれる。固形の投与形態では、該組成物はスクロース、ラクトースまたは殿粉のような少なくとも１つの不活性希釈剤と混合することができ、そして滑沢剤、緩衝化剤、腸溶剤外皮および当該技術分野の熟練者に周知の他の成分から更になることができる。
本発明組成物中のハロパーオキシダーゼの実際の投与値は、特定のハロパーオキシダーゼおよび投与方法で所望の治療または予防的応答を得るのに有効な量のハロパーオキシダーゼを感染部位で得られるように変化させることができる。従って、選択される投与値は感染の性質および部位、所望の治療応答、投与経路、所望の治療期間および他の因子に依存する。一般的には、ハロパーオキシダーゼがミエロパーオキシダーゼであるとき、局所または口内投与用の液体の投与形態は、液体組成物１ml当たり約0.01ピコモル（ｐmol）から約500ｐmolまでのミエロパーオキシダーゼ、更に好ましくは液体組成物１ml当たり約0.1ｐmolから約50ｐmolまでのミエロパーオキシダーゼ、そして最も好ましくは液体組成物１ml当たり約0.5ｐmolから約５ｐmolまでのミエロパーオキシダーゼからなる。同様な投与量の他のハロパーオキシダーゼを使用することができる。
前述のことは、下記の代表的な実施例に関連して更によく理解することができる。これらの実施例は説明のために示したものであって限定するためのものではない。
実施例
実施例１
Ｈ2Ｏ2対ＨＯＣｌの殺微生物活性、赤血球の影響
材料：以下で更に詳細に記載する細菌はトリプチカーゼ（trypticase）大豆ブイヨン（ＴＢＳ）中35℃で15〜16時間増殖させた。以下で更に詳細に記載する酵母はサボラウド（Sabouraud）のデキストロース寒天（ＳＤＡ）中35℃で16時間増殖させた。培養物を3,000rpmで15分間遠心し、そして上清液を取り除いた。ペレットを集めそして0.85％の無菌の標準生理食塩液（ＮＳ）で２回洗浄した。洗浄した微生物を再懸濁し、そして540nmの波長で0.1の吸収、すなわち、１ml当たり約107個の細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）および１ml当たり約106個の酵母ＣＦＵになるようにＮＳで希釈した。
３％のＨ2Ｏ2ストック溶液（0.88Ｍ）を使用して必要なＨ2Ｏ2希釈物を調製した。Ｈ2Ｏ2の濃度は43.6Ｍ-1cm-1の240nm吸光係数または1.0Ｍ-1cm-1の300nm吸光係数を使用して紫外線吸収で確認した。5.25％のＨＯＣlストック溶液（0.7Ｍ）を使用して必要なＨＯＣｌ希釈物を調製した。
血液は健康なヒトのボランティアから静脈穿刺によって集めた。リチウムヘパリンを抗凝血剤として使用した。全血液を1,500rpmで15分間遠心し、そしてバフィコートを血漿と一緒に吸引して赤血球（ＲＢＣ）を回収した。赤血球をＮＳに再懸濁し、そして遠心、吸引および再懸濁を繰り返した。次いで、残っている白血球を除くために赤血球懸濁液は無菌の木綿ガーゼを通過させた。遠心および吸引を再度繰返し、そしてペッレットを50mlのＮＳに再度懸濁させた。血球計で細一胞を計数し、そして懸濁液は１ml当たり108個のＲＢＣに調整した。ヘモグロビン濃度はドラブキンス（Drabkins）技術で測定した（J.B.Henry、1984年、Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods、第17版、580〜585頁、W.B.Saunders Co.）。
方法論：無菌技術を使用して、100μlの微生物懸濁液と100μlのＮＳまたは100μlのＲＢＣ懸濁液を12×75mmのポリスチレン管に加えた。Ｈ2Ｏ2またはＨＯＣlの種々の希釈物を加えて反応を開始させた；ＮＳを加えて最終容量を１mlに調整した。反応は23℃で30分間行わさせた。混合して細胞成分を再び懸濁させた後、100μlの反応懸濁液を900μlのＮＳに加え、そして10-3まで連続的に（10n）希釈した。次いで、「ガラス  ホッキー  スティック（glass hockey stick）」技術を使用して、100μlの各希釈物を予め標識した寒天プレート上に均一に広げて乾燥させた。細菌にはトリプチカーゼ大豆寒天（ＴＳＡ）を使用し、そして酵母にはサボラウドデキストロース寒天（ＳＤＡ）を使用した。次いで、プレートは読み取るまで35℃で約24から約48時間インキュベートした。コロニーを計数し、そしてＣＦＵ／試験は計数されたコロニー数を10（最初の希釈ファクター）倍して得て、そしてこの値にプレート希釈ファクターを掛けた。
表４および５は、３種の細菌および１種の酵母、カンジダ  アルビカンスに対するＨ2Ｏ2（表４）とＨＯＣl（表５）の殺害研究の結果を示す。２つの細菌、緑膿菌と大腸菌はグラム陰性細菌であり；黄色ブドウ球菌はグラム陽性球菌である。これらの微生物はタイプが多様であるため、そしてそれらが全て共通して感染性病理学に関係があるので選択した。これらの実験はまた、Ｈ2Ｏ2およびＨＯＣｌの防腐作用に対する赤血球（ＲＢＣ）の阻害影響を定量するために構築した。ＲＢＣは、Ｈ2Ｏ2を不均化して3Ｏ2とＨ2Ｏを生成する酵素、カタラーゼを含有している。ＲＢＣはまた、1Ｏ2およびＨＯＣｌと反応し得る多数の基質も含有しているので、防腐作用を競合的に阻害する。
0004063317.tif 000012
表４の集めたデータは、ＲＢＣの存在下または不存在下で微生物殺害に必要なＨ2Ｏ2の量を示す。例えば、ＲＢＣの不存在下では２*106個の緑膿菌の100％殺害には79μmolのＨ2Ｏ2が必要であり、そして7.9μmolのＨ2Ｏ2は２*106個の緑膿菌を99.8％殺害した。これは殺害される各緑膿菌１ml当たり約４ｐmolまたは２*1012個の分子のＨ2Ｏ2に等いい。107個のＲＢＣ／mlの存在下では、２*106個の緑膿菌を殺害するには790μmolのＨ2Ｏ2、即ち、２*1014個のＨ2Ｏ2分子／殺害緑膿菌が必要であった。殺害の100倍阻止は細菌当たり約５個のＲＢＣの存在によって行われることに注意されたい。上清液およびペレット  フラクションの両方にヘモグロビンが共に存在していないことに基づいて、ＲＢＣは790μmolのＨ2Ｏ2／mlで完全に破壊されそして79μmol／mlで80％破壊された。ＲＢＣの存在下では、80％のＲＢＣ破壊が行われたＨ2Ｏ2濃度でさえ緑膿菌は全く殺害されないことに注意されたい。同様な結果が標的微生物として大腸菌を用いて得られた。
ＲＢＣの阻害効果は標的微生物として黄色ブドウ球菌を用いると更に一層劇的である。ＲＢＣの不存在下ではＨ2Ｏ2に対して僅かにより感受性である、即ち、約９*1011個のＨ2Ｏ2分子／殺害黄色ブドウ球菌であるが、ＲＢＣは殺害に対して非常に大きい阻止効果を発揮する。ＲＢＣを含有する懸濁液中では殺害される黄色ブドウ球菌当たり約４*104個のＨ2Ｏ2分子／mlが必要である。107個のＲＢＣ／mlの存在は黄色ブドウ球菌殺害を400倍阻害した。グラム陰性微生物で見られるように、ＲＢＣの存在下では、存在するＲＢＣの60％を破壊した濃度、79μmol／１mlのＨ2Ｏ2の濃度では黄色ブドウ球菌を全く殺害しない。
カンジダ  アルビカンスはＨ2Ｏ2の作用に対して例外的に抵抗する。ＲＢＣの不存在下または存在下で殺害されるカンジダ  アルビカンス当たり1015個より多いＨ2Ｏ2分子が必要であった。
0004063317.tif 000013
表５の集めたデータは、ＲＢＣの存在下または不存在下で微生物殺害に必要なＨＯＣｌの量を示す。ＨＯＣｌは非常に有効な防腐剤である。ＲＢＣの不存在下で殺害される緑膿菌当たり106個のＨＯＣｌ分子が必要である。ＲＢＣの不存在下ではＨＯＣｌは緑膿菌の殺害にＨ2Ｏ2より100万倍有効であることに注意されたい。しかし乍ら、その能力はＲＢＣの存在下では極度に損なわれる。ＲＢＣの存在下では、殺害される緑膿菌当たり1012個のＨＯＣｌ分子が必要である。細菌当たり約５個のＲＢＣの比率で、赤血球は緑膿菌の殺害に必要なＨＯＣｌの量に関して100万倍の阻止を発揮する。630ｎmolのＨＯＣｌ／mlでＲＢＣを完全に溶解するが、殺微生物作用には影響が無いことに注意されたい。
大腸菌と黄色ブドウ球菌は共にＨＯＣｌに対する感受性に関して同様な感受性パターンを示す、即ち、ＲＢＣの不存在下では約109個の分子／殺害細菌でありＲＢＣの存在下では1012個の分子／殺害細菌である。かくして、ＲＢＣはＨＯＣｌの作用に対して1000倍の阻止を発揮し、そして63ｎmol／ｍｌでは総計107個のＲＢＣを溶解するにも拘わらず有効な殺微生物作用はない。
カンジダ  アルビカンスはＨＯＣｌに感受性である。殺害される微生物当たり1011個のＨＯＣｌ分子／mlが必要である。かくにＨ2Ｏ2と比較して、ＨＯＣｌはカンジダ  アルビカンスの殺害に１万倍有効である。ＨＯＣｌの殺微生物作用はＲＢＣの存在によって100倍阻害され、そして細菌で観察するとき63ｎmolのＨＯＣｌ／mlでは、存在する総計107個のＲＢＣを溶解するにも拘わらず、カンジダ  アルビカンスの殺害には全く有効でなかった。
これらのデータはＨ2Ｏ2とＨＯＣlの防腐作用の量を測定するものであり、それ故、本発明のハロパーオキシダーゼの防腐活性を比較するための参照データとして役立つ。これらの結果は上記したダーキン、フレミングおよびノックス（Knox）の観察および結論と一致している。第１に、ＨＯＣｌは有効な防腐剤である。ノックス等（1948年）はＨＯＣｌが0.2から2.0ppmまでの範囲の濃度、即ち４〜40ｎmol／mlのＨＯＣｌで効果的に微生物を殺害すると報告した。表５のデータはこの範囲の活性と定量的に一致している。第２に、微生物はＨ2Ｏ2およびＨＯＣｌの作用に対して宿主細胞、例えばＲＢＣより感受性が低い。宿主組織を損傷する可能性は、防腐剤の治療的有効性を評価するときに考慮しなければならない。
実施例２
ミエロパーオキシダーゼおよび好酸性パーオキシダーゼの殺微生物作用
細胞不含ミエロパーオキシダーゼは酸化性ハライド、即ち、Ｉ-、Ｂｒ-およびＣｌ-並びにＨ2Ｏ2と組み合わせると殺微生物作用を発揮することが知られている（Klebanoff、1968年）。ハライドがＩ-であるとき、ヨード化が観察される。ハライドとしてＢｒ-またはＣｌ-を用いると、ＨＯＢｒおよびＨＯＣｌが生成し、そしてこれらの有効な酸化剤は微生物基質と直接反応するかまたは反応（14）に記載したようにして追加的なＨ2Ｏ2と反応させて1Ｏ2を生成させることができる（Allen、1975年、Bioch.Biophys.Res.Com.63:675〜683および684〜691）。行われる反応経路は大部分、Ｈ2Ｏ2の利用可能性によって決定される。反応（7）に従うと、ＨＯＣｌの発生速度：
ｄＨＯＣｌ／ｄｔ＝k［Ｈ2Ｏ2］1      （17）
はＨ2Ｏ2の濃度と一次関数的に正比例するが、反応（16）に従うと、1Ｏ2の生成速度：
ｄ1Ｏ2／ｄｔ＝k［Ｈ2Ｏ2］2      （18）
はＨ2Ｏ2濃度の二乗に依存する；即ち、反応はＨ2Ｏ2の濃度に関して二次関数的である。このため、Ｈ2Ｏ2が10分の１に減少するとＨＯＣｌの利用可能性は10分の１に減少するが、Ｈ2Ｏ2が同じく10分の１に減少しすると1Ｏ2の生成は100分の１に減少する。Ｈ2Ｏ2を制限するとき、微生物基質の直接的ハロゲン化、例えばクロラミン形成が有利である。しかし乍ら、適当なＨ2Ｏ2を利用できる場合、1Ｏ2の発生が有利である。
クロラミン形成は微生物基質の最終的な二原子酸素付加（dioxygenation）に介在することがある。酸性ｐＨはＨＯＣｌを生成するクロラミン解離に好都合であり、そして酸性ｐＨはまた微生物の殺害にも好都合である。かくしてＨＯＣｌ、クロラミンまたは塩素化された微生物基質の他の幾つかの可能な形態がＨ2Ｏ2と反応して事実上または実際上二原子酸素付加剤として役立つ1Ｏ2で二原子酸素付加された微生物を生成させることができる。塩素化および臭素化した有機化合物とＨ2Ｏ2との反応は二原子酸素付加された生成物、即ち1Ｏ2反応により得られるものと同一のジオキセタン（dioxetane）を生成する（Kopecky、1982年、in Chemical and Biological Generation of Excited States、AdamおよびCilento編集、85〜114頁、Academic Press）。
1Ｏ2の微生物殺害作用はこれまで染料感作光殺害反応に関連して考慮されてきた。1Ｏ2は一重項基質のパイ（π）結合電子と反応可能性の求電子試薬である。生じた求電子性の二原子酸素付加は非常にエネルギー発生性であり、スピンが認められる、即ち機械論的に好ましい（Allen等、1972年、Biochm.Biophys.Res.Commun.47:679;Allen、1986年、Meth.Enzymol.133:449〜493）。ハロパーオキシダーゼの1Ｏ2発生メカニズムの図式的描写は図１に示す。1Ｏ2による微生物の殺害は十中八、九、膜の完全性の酸化的破壊、代謝機能に必要な酵素の酸化的阻害および／または再生に必要な核酸の酸化的分解に関係している。
過酸化物の存在下または不存在下におけるミエロパーオキシダーゼおよび好酸性パーオキシダーゼの殺微生物活性は次のようにして測定した。グルコースおよびグルコースオキシダーゼが存在するとき、それらを過酸化水素の供給源として使用した。
材料：細菌および酵母は実施例１に記載したようにして調製した。グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）はシグマ  ケミカル  カンパニー（Sigma Chemical Co.）から購入し、そしてＤ−グルコースの無菌ストック溶液（１mg／ml）はＮＳ中で調製した。ＧＯＸは450nmで11.3mＭ-1cm-1のＦＡＤ（フラビン  アデニン  ジヌクレオチド、Whitby、1953年、Biochem.J.54:437〜442）吸光係数を使用して吸収分光法で定量した。各ＧＯＸは２つのＦＡＤを含有しているので、ＧＯＸの定量には450nmで22.8mＭ-1cm-1の吸光係数を使用した。ＧＯＸはまた、供給者（Sigma Chemical Co.）が記載したようにして、過剰の西洋ワサビパーオキシダーゼの存在下でオルト−ジアニシジンのミリモル酸化単位としても定量した。１単位は、試験で使用したものと同じ条件下で１分当たり１μmolのグルコースを過酸化物に酸化するＧＯＸの量である。
ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）および好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）はブタの白血球から抽出しそしてクロマトグラフィーで精製した。ハロパーオキシダーゼの量は、還元剤としてジチオナイトを使用して還元マイナス酸化（Ｒ−Ｏ）差異分光法で評価した。ＭＰＯのラインハイツツァール（reinheitszahl）（ＲＺ、純度数）、即ち430nm対280nmの吸収比（Ａ430/280）は0.7であり、概ね90％の純度を示していた。ＭＰＯのＲ−Ｏ差異スペクトルは図２に示す；475nmでの50mＭ-1cm-1のＲ−Ｏ差異吸収係数をＭＰＯの定量に使用した。ＥＰＯのＲ−Ｏ差異スペクトルは図３に示す。ＥＰＯ定量用のＲ−Ｏ差異吸光係数は、450nmでの56mＭ-1cm-1であった。ＥＰＯのＲＺ、即ちＡ412/280は0.7であり、概ね70％の純度を示していた。分光光度計測定はＤＷ2000 ＵＶ−可視分光光度計（SLM Instruments Co.）で実施した。
方法論：ハロパーオキシダーゼおよび過酸化水素または次亜塩素酸塩を添加する代わりに過酸化物の供給源としてグルコースとＧＯＸを加えた以外は実施例１の方法に従った。この実施例においては、100μlの微生物懸濁液、100μlのハロパーオキシダーゼ、100μlのグルコースおよび600μlのＮＳを12×75mm管に加えた。100μlのＧＯＸを加えて反応を開始させた。23℃で30分間反応させた。希釈、プレーティングおよびコロニー計数は実施例１に記載したようにした。
表６および７は実施例１で既に試験した３種の細菌と１種の酵母のＭＰＯおよびＥＰＯ殺害の結果を示す。この実施例では、微生物は更に10倍に希釈した。Ｈ2Ｏ2発生用に100ｐmolのグルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）を使用し、そして管当たりのグルコースの最終濃度は0.1mg／ml、即ち、0.56μmol／mlであった。Ｈ2Ｏ2発生は一次関数的にグルコース利用可能性に比例し、この系で発生するＨ2Ｏ2の総量は0.56μmolに制限される。表４のデータで示されるように、この濃度のＨ2Ｏ2だけでは微生物を直接殺害するには不十分である。ＭＰＯおよびＥＰＯの殺微生物活性は表６および７に示すように、ＧＯＸ供給系の存在下および不存在下で試験した。
0004063317.tif 000014
微生物（100μl）、ＭＰＯ（100μl）およびグルコース（100μl、１mg／ml）プラスまたはマイナスＧＯＸ（100ｐmol、即ち100μl中約１m Ｍ−単位）をＮＳに加えて最終容量を1.0mlとした。
0004063317.tif 000015
微生物（100μl）、ＭＰＯ（100μl）およびグルコース（100μl、１mg／ml）プラスまたはマイナスＧＯＸ（100ｐmol、即ち100μl中約１mＭ−単位）をＮＳに加えて最終容量を1.0mlとした。
ＭＰＯおよび特にＥＰＯは塩基性であり、即ち陽イオン性（プラスに荷電した）タンパク質であり、そして或る種の陽イオン性タンパク質は明白に証明される酸化還元酵素作用の不存在下で殺微生物作用を発揮する。しかし乍ら、本願の試験条件下では、0.7から500ｐmol／mlの濃度範囲ではＭＰＯまたはＥＰＯのいずれも直接的な過酸化物依存性の殺微生物作用は本質的に全く示さなかった。同様に、100ｐmol／mlの濃度のＧＯＸ、即ち、試験条件下で約１mＭのｏ−ジアニシジン酸化単位活性はＸＰＯの不存在下では検出可能な殺微生物作用を発揮しなかった。これはＧＯＸによる0.1mg（0.56μmol）のグルコースの0.56μmolＨ2Ｏ2への総変換では殺微生物作用には不十分であったろうから、予期されることである。１ミリリットル当たりピコモルの濃度のＭＰＯかまたはＥＰＯのいずれかに対して同じ量のＧＯＸを添加すると、試験される全ての微生物に対して有力な殺微生物作用をもたらす。ＭＰＯおよびＥＰＯのデータも、以下で更に詳細に記載する殺害特異性を示すように思われる。
実施例３
過酸化物の殺微生物作用に与えるミエロパーオキシダーゼの効果
材料：細菌および酵母は実施例１に記載したようにして調製した。ＭＰＯは実施例２に記載したようにして調製した。
方法論：実施例１の方法に一般的的に従ったが、その際100μlの微生物懸濁液、100μlのＭＰＯ（10ｐmol）、および800μlの酢酸緩衝液（Ａc Ｂ）、ｐＨ６中、指示された濃度のＨ2Ｏ2を12×75mm管に加えた。Ｈ2Ｏ2を加えて反応を開始させた。反応は100μmolのＣｌ-の存在下（表８Ａ）またはハライドの不存在下若しくは10μmolのＢｒ-の存在下（表８Ｂ）で実施した。23℃で30分間反応させた。希釈、プレーティングおよびコロニー計数は実施例１に記載したようにした。
0004063317.tif 000016
微生物（100μl）、ＭＰＯ（100μl）および指示された量のＨ2Ｏ2をＮＳに加えて最終容量を1.0mlとした。
0004063317.tif 000017
表８Ａおよび８Ｂのデータは、ハライド補因子としてそれぞれ100μmolのＣｌ-と10μmolのＢｒ-を使用してＨ2Ｏ2の殺微生物作用に与えるＭＰＯの潜在的影響を示すものである。10ｐmol／mlの濃度では、ＭＰＯは106個の標的微生物のＭＰＯ：Ｃｌ-（またはＢｒ-）：Ｈ2Ｏ2依存性殺害に関して速度制限的でない。このＭＰＯ量では、殺微生物動力学におけるＸＰＯに関して本質的にゼロ桁の条件を提供し、このため、ハライドが制限的でなくそしてハライド：過酸化物比が阻害的でない（以下で十分に記載する）場合、殺害はＨ2Ｏ2の利用可能性に比例する。Ｈ2Ｏ2の殺微生物作用に与えるＭＰＯの触媒的影響は上記したのと同じ細菌および酵母を使用して試験した。
ＭＰＯとハライドの濃度は一定に保ち、そしてＨ2Ｏ2の濃度は広範囲に変化させた。表８Ａのデータにおいて、ＭＰＯの不存在下でのＨ2Ｏ2の殺害活性はＲＢＣの不存在下での直接的なＨ2Ｏ2の殺害活性と比肩できるものであることに注意されたい。表４の集めたデータを参照のこと。両試験では殺害される細菌当たり約1012個のＨ2Ｏ2分子が必要であり、そしてＨ2Ｏ2は700μmol／mlの濃度、即ち2.4％のＨ2Ｏ2であってもカンジダ  アルビカンスの殺害においては無効であった。表８Ｂのデータは更に、臭化物がＭＰＯの殺微生物作用のハライドとして作用し得ることを確立している。本質的に、ハライドの不存在下ではＭＰＯ−Ｈ2Ｏ2系を使用しても殺害は観察されなかった。
Ｈ2Ｏ2の不存在下では、ＭＰＯは試験した微生物を殺害しなかったが、ＭＰＯはＨ2Ｏ2の殺微生物能力を数倍増加させた。例えばμmol／mlの範囲の比較的高い濃度では、ハライド濃度が比例的に増加しない限り、Ｈ2Ｏ2はＸＰＯの触媒活性を阻害することができる。高濃度のＨ2Ｏ2でのＭＰＯ−依存性のカンジダ  アルビカンス殺害阻害はＣｌ-：Ｈ2Ｏ2比の非常な低下から生じる。細菌で観察可能な影響がないことはこれらの細菌に関するＨ2Ｏ2のＭＰＯ非依存性殺害活性の方がはるかにより大きいことの結果であると思われる；即ち、殺害はＭＰＯ阻害にも拘わらず生じる。黄色ブドウ球菌殺害阻害が2.8および14μmolの過酸化物で観察されることに注意のこと。ＭＰＯはハライドの濃度を上昇させるかまたはｐＨを低下させることによってＨ2Ｏ2の作用から保護することができる。しかし乍ら、添加するＨ2Ｏ2濃度を低下させるかまたは、比較的低いがＨ2Ｏ2の利用可能性を動力学的に維持するＨ2Ｏ2発生体系を導入することの方が多分一層適切であろう。塩化物／過酸化物の比はハロパーオキシダーゼの安定性および機能的な触媒活性に関して重要な因子である。塩化物／過酸化物比が好ましくは約50以上に維持される限り、広範囲の過酸化物濃度を使用することができる。例えば、塩化物濃度が100μmol／ml、即ち、生理学的血漿濃度に概ね等しい場合には、過酸化物濃度は２μmol／ml未満、好ましくは１μmol／ml未満に維持されよう。
ピコモル量のＭＰＯはＨ2Ｏ2の殺微生物作用を１万倍以上上昇させる。10ｐmolのＭＰＯでは、試験細菌に関係なく殺害細菌当たり約108個のＨ2Ｏ2分子が必要である。これは0.01ppmのＨ2Ｏ2濃度に相当する。このより低い範囲の過酸化物濃度は塩化物／過酸化物または臭化物／過酸化物の比を最適に調整することによってなお更に低くすることができよう。このことにより、ＭＰＯが触媒するＨ2Ｏ2の殺害作用はＨＯＣｌで報告されたもの、即ち、0.2から2.0ppm（Knox等、1948年）より優れている。表５においてＨＯＣｌを使用する際の分子／殺害微生物の比が大腸菌および黄色ブドウ球菌では約109であったが、緑膿菌では約106であったことを思い出されたい。例外はあるが、濃度または分子／微生物基準が等しいとき、ＭＰＯが触媒するＨ2Ｏ2の殺微生物作用はＨＯＣｌより大きい。
表４、８Ａおよび８Ｂのデータで示されるように、カンジダ  アルビカンスはＨ2Ｏ2の直接的作用に対しては非常に耐性であるが、Ｃｌ-またはＢｒ-の存在下で10ｐmolのＭＰＯを導入すると、この酵母に関するＨ2Ｏ2の殺害活性が10万倍以上増加する。カンジダ  アルビカンスに関するＭＰＯ−依存性Ｈ2Ｏ2殺害は約５*109の分子／酵母比で行われる。ＭＰＯ系の酵母殺害能力は細菌で観察される能力より小さいが、該殺害系は慣用の防腐剤または抗生物質と比較して法外に有力である。表５と８のデータの比較に基づいて、ＭＰＯが触媒するＨ2Ｏ2−依存性のカンジダ  アルビカンス殺害はＨＯＣｌを使用して観察されたものより大きい。
実施例４
ＭＰＯ−ＧＯＸの殺微生物作用に与える赤血球の影響
材料：細菌および酵母は実施例1に記載したようにして調製した。ＭＰＯ、ＧＯＸおよびＲＢＣ懸濁液は、グルコースを10倍高い濃度、即ち10mg／mlのストックグルコースを使用した以外は実施例２に記載したようにして調製した。
方法論：実施例２の方法に従ったが、その際100μlの微生物懸濁液、100μlのＭＰＯ、100μlのグルコース（１ｍｇ／100μl）、プラスまたはマイナス100μlのＲＢＣ懸濁液および0.9mlの容量にするのに十分なＮＳを12×75mm管に加えた。100μlのＧＯＸ（100ｐmol／mol；約１mＭのｏ−ジアニシジン酸化単位）を添加して反応を開始させた。23℃で30分間反応を行わせた。希釈、プレーティングおよびコロニー計数は実施例１に記載したようにした。
表９のデータで更にもう１度、Ｈ2Ｏ2発生系としてグルコース：ＧＯＸを組み合わせたＭＰＯの潜在的殺微生物活性を示す。実施例４の方法の最初の部分は、グルコース濃度を10倍高くした点でのみ実施例２（表６のデータ）に記載した方法と異なっていた。Ｈ2Ｏ2発生用に100ｐmolのＧＯＸを使用し、管当たりのグルコースの最終濃度は1.0mg／ml、即ち、5.6μmol／mlであった。それ故、この系によって発生するＨ2Ｏ2の総量は5.6μmolに制限される。表４のデータに基づいて、ＲＢＣの不存在下での直接的殺微生物作用にはこの量のＨ2Ｏ2で十分であるが、ＲＢＣが存在すると十分ではない。
この実施例はＭＰＯの殺微生物作用に与えるＲＢＣの影響を評価するために設計した。ＲＢＣ：細菌比は約２であり、そしてＲＢＣ：酵母比は約40であった。これらの比は表４および５に集めた実験と同じ大きさの範囲内である。細胞の大きさの差異に従って、赤血球塊は微生物塊より数倍大きい。
0004063317.tif 000018
微生物（100μｌ）、ＭＰＯ（100μl）、グルコース（100μl、10mg／ml）、ＧＯＸ（100ｐmol、即ち100μl中約１mＭ−単位）プラスまたはマイナス107個のＲＢＣ（100μl）をＮＳに加えて最終容量を1.0mlとした。
表９に示されるように、ＭＰＯ−ＧＯＸ系の殺微生物能力はＲＢＣの存在によって阻害されるが、その阻害影響は比較的小さい。約６μmolの量のＨ2Ｏ2は検出可能な殺微生物作用を示すはずであるが、ＲＢＣの不存在下では殺真菌作用を示さずそしてＲＢＣの存在下では検出可能な殺菌または殺真菌作用を示さなかった。表９のデータは、ＭＰＯ−ＧＯＸ系がＲＢＣの存在下であっても潜在的殺微生物作用を行うことを示している。ＭＰＯを約１ｐmol／mlより大きい濃度で使用したとき、上記ＭＰＯ−ＧＯＸ系は溶血を生じさせた。しかし乍ら、ｐmol／ml未満の範囲のＭＰＯ濃度では、溶血活性を伴わないで殺菌作用が観察される。この後者の観察は、それがＭＰＯの破壊活性に関する選択性を示唆している点できわめて重要である；即ち、最適の条件下で、細菌を選択的に殺害することができ、宿主細胞に対する付随的な損傷は最小である。
実施例５
微生物に対するＭＰＯ結合のスペクトル分析
1Ｏ2は防腐剤として幾つかの利点を提供する。これは、重要なアミノ酸、不飽和脂肪および核酸と反応し得る広範囲で、しかも比較的選択的な求電子性酸素付加剤である。1Ｏ2とトリプトファン、ヒスチジンおよびメチオニンとの反応の反応速度定数（kr、Ｍ-1秒-1）はそれぞれ３*107（MathesonおよびLee、1979年、Photochem.Photobiol.29:879〜881）、8.8*107および２*107（KraljicおよびSharpatyi、1978年、、Photochem.Photobiol.28:583〜586）である。これら必須アミノ酸は必要なタンパク質構造成分でありそして典型的には酵素触媒メカニズムに関与している。このため、「痕跡」濃度の1Ｏ2は代謝機能に必要な多数の酵素を反応的に阻害することがあろう（Green、1941年）。
スピン多重度の変化、即ち項間交差が1Ｏ2から3Ｏ2への緩和に必要である。ウィグナー（Wigner）のスピン恒存規則に従って、準安定性はスピン状態における何らかの変化に関連した低い蓋然性に起因する。このため、酸素の1Ｏ2励起状態は準安定状態であり、μ秒領域の水性反応性寿命を有する（MerkelおよびKearns、1972年、J.Am.Chem.Soc.94:1029〜1030）。かくして、1Ｏ2の求電子特性による機械論的制限に加えて、1Ｏ2の反応性もその寿命で支配される一時的な領域に制限される。「水性溶液中での1Ｏ2の寿命はμ秒領域であることが分かっており、その期間中に少なくとも1,000オングストロームの平均放射距離に拡散することができる。かくして、発生部位から離れた位置で反応することができる。」（LindigおよびRodgers、1981年、Photochem.Photobiol.33:627〜634）。
この反応性に関する時間関門制限は、損傷量を発生器酵素、ＸＰＯの接近に関連させることによって、1Ｏ2の酸化的損傷の範囲および程度に対して生物学的に必要な限定を負わせている。換言すれば、三次元的空間における反応は反応剤の第４次元的のもの、即ち1Ｏ2の寿命によって制限される。ＸＰＯが微生物の表面に結合する場合、ＸＰＯ位置から約1000オングストローム（0.1μmまたは100nm）の半径での酸化的損傷量は微生物の何らかの成分を本質的に破壊するのに十分であろう。細菌の直径は約0.5から1.0μmまでの範囲であり、そして膜およびペプチドグリカン領域は典型的には50nm未満の厚さである。かくして、微生物膜の重要な成分並びに細胞質の必須酵素および核酸は表面に結合したＸＰＯによって発生される1Ｏ2に感受性である。
ＸＰＯが標的微生物に密接に接近する場合、この反応量の制限は微生物に対する酸素付加損傷を制限するように作用する。更に、ＸＰＯと微生物の結合が真核細胞に比べて選択的である場合には、殺微生物作用は居合わせる宿主細胞の損傷、例えば溶血が最も少ないように行うことができよう。
ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）および特に好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）は陽イオン性のグリコプロテインである。ＸＰＯは共に多数のレシチン、例えばコンカナバリンＡとも結合する。このため、これらのＸＰＯは静電的負荷、レシチン結合を介して、または或る種の他のメカニズムによって微生物と結合することができよう。本願明細書で示されるように、標的微生物に対する結合が十分選択的である場合、ＸＰＯ系の容量限定酸素付加活性の防腐能力は十分に具現化されよう。
材料：細菌はトリプチカーゼ大豆ブイヨン（ＴＳＢ）中35℃で約16時間増殖させた。次いで、培養物を遠心（3,000rpmで15分間）し、そして上清液を除去した。ペレットを集め、そして無菌の0.85％の通常生理食塩液（ＮＳ）で２回洗浄した。洗浄した微生物は約109個の細菌／mlの密度に再懸濁した。最終の量測定は血球計計数によった。ＭＰＯは実施例２に記載したようにして調製した。
方法論：ＭＰＯの種々の希釈物を2.1*109個の黄色ブドウ球菌の懸濁液に加えた；最終容量は１mlであった。懸濁液は静かに30分間混合し、次いで2,000rpmで10分間遠心した。上清液を取り出して、遊離ＭＰＯの定量用に保管した。ペレットを５等容量のＮＳ中で再懸濁して洗浄した。傾斜テーブル上で約10分間完全に混合した後、細菌を再び遠心した。上清液は廃棄し、そしてペレットをＮＳを用いて再懸濁して元の容量とした。
Ｒ−Ｏ差異分光学的測定は実施例２に記載したものを次のように修正した。比較的稠密な黄色ブドウ球菌懸濁液は、475nmで50mＭ-1cm-1のＲ−Ｏ差異吸光係数に基づくＭＰＯの定量に関して、シグナル対ノイズの問題をもたらした。この問題は449および500nmでのＲ−Ｏ差異吸収を平均化することによって解決された。次いで、この平均を475mmでのＲ−Ｏ差異吸収から差し引いた。475nmでの調整したＲ−Ｏ差異吸収は、50mＭ-1cm-1の吸光係数を使用して、ＭＰＯ濃度を計算するために使用した。
図４はＭＰＯへの暴露前後の黄色ブドウ球菌、即ち結合ＭＰＯのジチオナイト還元マイナス酸化（Ｒ−Ｏ）差異スペクトルを表わす。図５は細菌を遠心除去した後に溶液中に残っているＭＰＯ、即ち遊離ＭＰＯのＲ−Ｏスペクトルを表わす。約20ｐmolのＭＰＯが2.1*109個の黄色ブドウ球菌と結合し、一方1,560ｐmolのＭＰＯが１ml容量の溶液中に残っていた。このため、ＭＰＯの結合：遊離比は0.013であり、細菌当たり約5,700分子のＭＰＯが結合していた。この最初のＭＰＯ濃度の連続２n希釈によって、ｎがそれぞれ１および２であるとき、0.020および0.018のＭＰＯ結合：遊離比が得られた。同様に、細菌当たりの結合ＭＰＯ分子の数は、ｎがそれぞれ１および２であるとき、4,100および1,700であった。
残念なことに、シグナル：ノイズ比はより大きいＭＰＯ希釈では非常に小さかった。かくして、結合ＭＰＯの直接的な分光学的測定は比較的親和性の低い範囲の結合に限られる。感度がこのように限定されるにも拘わらず、これらの分光学的測定はＭＰＯと細菌の結合の直接的証明を提供する。事実、十分な数の細菌と適当なＭＰＯが組合わされる場合、細菌に対するＭＰＯの結合は肉眼で視覚的に観察することができる。
実施例６
微生物に対するＭＰＯ結合のスキャッチャード分析
スキャッチャード法は結合親和性を分析するための図表的方法として頻繁に使用される（Robard、1981年、Ligand Assay、LanganおよびClapp編集、45〜101頁、Masson Publ.、ニューヨーク参照）。微生物に対するＸＰＯ結合の動力学：
遊離ＸＰＯ＋微生物部位  ＜＝＝＝＞  微生物−ＸＰＯ      （19）
は集団作用関係に従って表わすことができ：
0004063317.tif 000019
そしてそれ故：
0004063317.tif 000020
かくして、結合対遊離ＭＰＯ比は微生物当たりの部位数に親和性定数Ｋaffを掛けた一次関数である。
材料：緑膿菌、大腸菌、ネズミチフス菌および黄色ブドウ球菌は実施例１に記載したようにして調製した。連鎖球菌種および乳酸桿菌種は、各群の増殖を支持するためにそれぞれトッド−ヘビット（Todd−Hewitt）およびＭＲＳ培地を使用した以外は、実施例１に記載したようにして調製した。カンジダ  アルビカンスおよびクリプトコッカス  ネオホルマンスは、サボラウド  デキストロース  寒天培地を使用した以外は同様な方法で調製した。ＲＢＣは上記実施例１に記載したようにして調製した。細菌および酵母は血球計計数によって定量した。ＭＰＯは実施例２に記載したようにして調製しそして定量した。
方法論：ＭＰＯの連続1.5nまたは２n希釈物を調製しそして微生物と組み合わせた。ＭＰＯ濃度を変化させ、そして微生物数は一定に保った。約105から106個の細菌または酵母細胞を１試験当たりで使用した。微生物調製物の１容量をＭＰＯ希釈物またはＮＳの１容量に加えた。懸濁液を混合しそして23℃で30分間インキュベートした。次いで、懸濁液はエッペンドルフ  モデル（Eppendorf Model）5414高速遠心機で15,000rpmで５分間遠心した。上清液を傾瀉し、そして試験用に貯蔵した。ペレットを再懸濁しそして当量のＮＳで洗浄した。再懸濁したペレットを再度遠心しそして洗浄上清液は棄てた。ペレットを再懸濁して１容量、即ち元の容量の微生物調製物とした。
各ＭＰＯ希釈物のＭＰＯ活性はハライドとしてＢr-、酸化剤としてＨ2Ｏ2、そして化学発光源基質としてルミノールを使用し、1989年10月5日に提出された係属中の米国特許出願番号第417,276号に記載されているようにして、ＭＰＯの生成物発光として測定した。各ＭＰＯ希釈物の100μl分別物を試験した。各試料を12×75mmの試験管に加えた。発光はＬＢ950ルミノメーター（Berthold Instruments、ビルトバード、ドイツ）で測定した。２つの注入器を使用した。最初の注入器は300μlの150μＭ（45nmol）のルミノールを、５μmolのＢr-を含有する50mＭの酢酸塩緩衝液（Ａc Ｂ）、ｐＨ５中に注入した。300μlの16.7mＭ（５μmol）のＨ2Ｏ2を第２の注入器から注入した後に20秒の測定を行った。
遊離および微生物と結合したＭＰＯの活性は、管当たり100μlの試験上清液、即ち遊離ＭＰＯまたは100μlのＭＰＯ−微生物懸濁液、即ち結合ＭＰＯを加えた以外は同じ方法論を使用して測定した。この方法論によって、遊離ＭＰＯは結合ＭＰＯに関して２の因数で希釈する。これは、遊離ＭＰＯ測定の有効範囲を広げるためになされた。それ故、遊離ＭＰＯ測定の活性値は、スキャッチャード分析に使用する前に２の因数を掛けた。
ＸＰＯ活性を定量する蛍光の感度の大きいので、この感度は、結合親和性のスキャッチャード分析に必要なｐmolおよびｐmol未満の量の遊離および微生物結合ＭＰＯを測定するのに理想的に適するものとなる。このような分析の第１段階は、測定されたＣＬ活性をＭＰＯ分子の量に等しくする標準曲線を構築することである。
図６はメガ光子／20秒、即ち106光子／20秒対試験したＭＰＯのｐmol量として表わした化学蛍光（ＣＬ）のプロットである。ＭＰＯ対ＣＬの関係は０から10ｐmolの範囲のＭＰＯ濃度では、ｘおよびｙ軸を図６Ａと逆にした図６Ｂのこの範囲のプロットで示されるとおり、本質的に直線的である。回帰分析によって次式が得られる：
ＣＬ光子/20秒＝k*［ＭＰＯpmol］p      （22）
式中、ｋは定数でありそして上つき文字ｐはＭＰＯに関する反応次数である。式の実際の値は：
ＣＬメガ光子／20秒＝3.35*［ＭＰＯpmol］1.15      （23）
またはその逆の表現：
ＭＰＯpmol＝0.702*［ＣＬメガ光子/20秒］0.811      （24）
は10個の別個の標準範囲の測定を平均して決定した。決定係数、即ちｒ2は0.987である。ＭＰＯのｐmol値はＲ−Ｏ差異分光学による最初の定量に基づいており、そして評価は連続２n希釈に基づいている。ポリスチレン管中での希釈は管結合による幾らかの損失に関連しており、これは比較的高い希釈物で特に明白である。このことにより、反応次数の評価は僅かに不均斉である。かくして、1.15のｐ値は最初の次数より僅かに大きい。
図７Ａは、試験当たりそれぞれ7.5*108個の黄色ブドウ球菌および2.4*108個のビリダンス連鎖球菌を使用して、黄色ブドウ球菌およびビリダンス連鎖球菌に結合したＭＰＯ対遊離ＭＰＯをプロットしたものである。微生物結合対遊離ＭＰＯの関係は次のように記載される：
遊離ＭＰＯpmol＝k*［結合ＭＰＯpmol］p      （25）
約10ｐmolのＭＰＯ／mlの遊離濃度で、7.5*108個の黄色ブドウ球菌に結合したＭＰＯ量は約２ｐmolに限定され、そして2.4*108個のビリダンス連鎖球菌当たりの結合ＭＰＯ量は約１ｐmolである。
微生物の近飽和のＭＰＯ結合能力は、ＭＰＯ結合量を微生物当たりの分子で表わすことによって評価することができる。例えば、結合ＭＰＯのモル量、即ち黄色ブドウ球菌では２*10-12molにアボガドロ数、即ち６*1023を掛け、そしてこの積、即ち結合ＭＰＯ分子を微生物数、7.5*108で割って商、即ち黄色ブドウ球菌当たり2,400個の結合ＭＰＯ分子を得る。
図７Ｂは微生物当たりの分子として表わした結合対遊離ＭＰＯをプロットしたものである。
これらのデータのスキャッチャードプロットは図７Ｃに示し、その際黄色ブドウ球菌のデータのポイントは“＊”で記し、そしてビリダンス連鎖球菌は“ｏ”で記す。等式（19）から（21）までを考慮して上記で展開したように、結合／遊離ＭＰＯ比と結合ＭＰＯ濃度間には直線関係がある。この直線の傾斜の絶対値は親和性定数、Ｋaffの値である。図７Ｃでは、結合ＭＰＯは反応容量当たり微生物当たり総結合部位、即ち結合ＭＰＯ／微生物／mlで表わされる。かくして、ｘ−インターセプトは微生物当たりのＭＰＯ結合部位数に近く、そしてｙ−インターセプトは外挿した最大結合／遊離比、即ちＫaffに微生物当たりの結合ＭＰＯ部位数を掛けた積である。
２つの比較的明確な直線的関係が黄色ブドウ球菌データのプロットによって示される。微生物当たり結合ＭＰＯ分子が０から1,000の範囲で、その関係は比較的直線的、即ちｒ2＝0.83であり、次の関数で記載することができる：
ＭＰＯ−黄色ブドウ球菌＝−0.012128*［部位］＋14.647      （28）
それ故、Ｋaffは概ね1.213*10-2であり、Ｋaff*微生物部位］は14.647であり、そして総結合能力は微生物当たり1,208ＭＰＯである。黄色ブドウ球菌のプロットはまた、比較的親和性の低い第２のクラスの結合部位の存在も示している。微生物当たり結合ＭＰＯ分子が1,000から3,000の範囲で、この低い親和性結合は次の関数で定義され、その際ｒ2＝0.65である：
ＭＰＯ−黄色ブドウ球菌＝-0.000491*［部位］＋1.433      （29）
この第２のクラスの結合物のＫaff、4.907*10-4は親和性の高い結合部位で計算されたものより25倍小さいが、微生物当たりのＭＰＯ結合部位数はより多く、概ね2,900／微生物であることに注意されたい。
プロットからはあまり明白でないが、ビリダンス連鎖球菌のデータはまた少なくとも２つの異なるタイプの結合の存在も示している。微生物当たり結合ＭＰＯ分子が０から1,500の範囲で、その関係は概ね直線状、即ちｒ2＝0.66であり、次の等式で定義される：
ＭＰＯ−連鎖球菌（ビリダンス）＝-0.000255*［部位］＋0.406      （30）
このＫaff、2.551*10-4は黄色ブドウ球菌の親和性の高い」結合部位より非常に小さいことに注意されたい。これらの親和性の低いＭＰＯ結合部位はビリダンス連鎖球菌当たり概ね1,600存在する。データの生プロットから上記で推論したように、２種の微生物に対するＭＰＯの結合能力は微生物当たりの総結合部位数に関して比肩し得るものである。プロットは全く同様な微生物当たり約2,000分子であることに注意されたい。スキャッチャード分析で計算したＢ／Ｆ、Ｋaffおよび部位／微生物の値は次表１０に記載する。同様にして、数種のグラム陰性およびグラム陽性細菌、真菌性酵母およびヒト赤血球をＭＰＯ結合能力に関して試験した。これらのスキャッチャード分析の結果も表１０に示す。
0004063317.tif 000021
上清液およびペレットのＭＰＯ含量は、同時に実施したＭＰＯ標準を使用して蛍光測定法によって測定した。範囲は細胞当たりＭＰＯ分子の比で表わす。ＭＰＯ濃度当たり約108から109個の細胞を試験した。Ｂ／Ｆは結合対遊離ＭＰＯの比である；即ち、Ｂは細胞当たり結合したＭＰＯ分子の数であり、そしてＦは遊離のＭＰＯ分子の数である。Ｋaffは親和性または会合定数であり、そして部位／微生物は細胞当たりのＭＰＯ結合部位の数である。
表１０に示した結果から分かるように：
（1）ＭＰＯは試験した病原性細菌の全てに結合する。
（2）口内および中咽頭の正常叢の主要成分、即ち連鎖球菌種（ビリダンス）並びに膣の乳酸桿菌種（デーデルライン桿菌）である乳酸産生細菌は試験した細菌のうちで最も低いＫaff値を有している。
（3）細菌と比較して、酵母はより小さいＫaff値を有しているが、酵母の大きさがより大きいことに一致して、酵母は微生物当たりの結合部位がより多い。
（4）ヒト赤血球に対するＭＰＯの結合は本質的に検出されなかった。即ち、Ｂ／Ｆは0.2未満であり、ｒ2は0.1未満であった。
このため、ＸＰＯが触媒する微生物殺害の接近要件はＭＰＯでは充足される。ＭＰＯはグラム陰性およびグラム陽性の病原性微生物に対しては高い親和性を、そして正常叢、即ちビリデンス連鎖球菌およびデーデルライン乳酸桿菌のＯ2Ｈ2産生菌には比較的低い親和性を示す。病原体および正常叢を含有する環境下では、ＭＰＯの利用可能性を制限するとＭＰＯの結合は病原体に効果的に限定される。かくして、殺微生物作用は存在する病原性微生物に選択的に限定することができ、そして正常叢の生存性を保持することができる。競合する病原体の存在下では、ＭＰＯは病原性微生物への選択的結合およびそれらの殺害によってＬＡＢ叢と相乗的に作用するであろう。
実施例７
微生物に対するクロロパーオキシダーゼ結合のスキャッチャード分析
材料：細菌、酵母および赤血球は実施例６に記載したようにして調製した。真菌性クロロパーオキシダーゼ（ＣＰＯ）はシグマ  ケミカル  カンパニーから購入した。クロロパーオキシダーゼは最初に、還元剤としてジチオナイトを使用して還元マイナス酸化（Ｒ−Ｏ）差異分光学で定量した。ＣＰＯの400nm対280nmの吸光度（Ａ400/280）比は0.8であった。ＣＰＯの定量には450nmでの56mＭ-1cm-1のＲ−Ｏ差異吸光係数を使用した。ＣＰＯ酸素付加活性に関するルミノール依存性の蛍光アッセイも各微生物結合アッセイで行った。
方法論：プロトコールは、ＣＰＯをＸＰＯとして使用した以外は実施例６に記載したものと同じであった。
ＣＰＯ対ＣＬの標準測定は各結合研究で行い、そしてこれらのデータは化学蛍光データをＣＰＯ分子に変換するために使用した。方法論は図６のＭＰＯ標準化測定に記載したようにした。
図８Ａは、反応容量当たり微生物当たりの非結合ＣＰＯ分子に対してプロットした黄色ブドウ球菌および連鎖球菌種（ビリダンス）当たりの結合ＣＰＯ分子を示す。図７ＢのＭＰＯ結合データと対照的に、連鎖球菌種（ビリダンス）は黄色ブドウ球菌より強くＣＰＯに結合する。しかし乍ら、どちらの微生物もＭＰＯと同じ位効果的にはＣＰＯと結合しない。
これらのデータのスキャッチャードプロットは図８Ｂに示す。同様な結合範囲で、縦座標の大きさ、即ち、Ｂ／Ｆ＝Ｋaff*［部位／微生物］は図７ＣのＭＰＯスキャッチャードプロットで記載したものより100倍小さい。連鎖球菌種（ビリダンス）に対するＣＰＯの結合能力は黄色ブドウ球菌に対するより比較的大きいが、両微生物に対するＣＰＯの結合能力はＭＰＯの結合能力に比較して小さい。
ＭＰＯで記載したものと同様な方法で、同じ範囲の細菌、酵母並びに赤血球はそのＣＰＯ結合能力をスキャッチャード法で分析した。結果をまとめて表１１に示す。
0004063317.tif 000022
上清液およびペレットのＣＰＯ含量は同時に実施したＣＰＯ標準を使用して蛍光測定法で測定した。条件は表１０の凡例に記載したものと同じであった。
実施例８
微生物に結合する好酸性パーオキシダーゼおよびラクトパーオキシダーゼのスキャッチャード分析
材料：細菌、酵母および赤血球は実施例６に記載したようにして調製した。好細菌パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）は実施例２に記載したようにしてブタ白血球から抽出しそして精製した。ラクトパーオキシダーゼ（ＬＰＯ）はシグマ  ケミカルカンパニーから購入した。ＥＰＯおよびＬＰＯは、還元剤としてジチオナイトを使用して還元マイナス酸化（Ｒ−Ｏ）差異分光学で定量した。ＥＰＯの412nm対280nmの吸光度（Ａ412/280）比は0.7であり、そしてＬＰＯの412nm対280nmの吸光度（Ａ412/280）比は0.7であった。ＥＰＯの定量には450nmでの56nmＭ-1cm-1のＲ−Ｏ差異吸光係数を、そしてＬＰＯの定量には438nmでの56mＭ-1cm-1のＲ−Ｏ差異吸光係数を使用した。ＥＰＯおよびＬＰＯ酸素付加活性に関するルミノール依存性化学蛍光アッセイも各微生物結合アッセイで実施した。
方法論：プロトコールは、ＥＰＯおよびＬＰＯをＸＰＯＳとして使用した以外は実施例６に記載したものと同じであった。
ＭＰＯおよびＥＰＯの結合データを熟読すると、それらの微生物結合能力に関してハロパーオキシダーゼを区別できる差異が強調される。結合データの相互比較を整合させるため、図９Ａは反応容量当たり微生物当たりの非結合ＥＰＯ分子に対してプロットした黄色ブドウ球菌および連鎖球菌種（ビリダンス）当たりの結合ＥＰＯ分子を示す。連鎖球菌種（ビリダンス）と黄色ブドウ球菌に対するＥＰＯの結合は低い範囲のＥＰＯ濃度では類似しているが、黄色ブドウ球菌当たりの結合部位はより少ないように思われる。試験した濃度範囲内で、ＥＰＯはＭＰＯに関して上記で観察されたどの微生物に対してよりも効果的に結合する。
これらのデータのスキャッチャードプロットは図９Ｂに示す。同様な結合範囲で、縱座標の大きさ、即ち、Ｂ／Ｆ＝Ｋaff*［部位／微生物］は図７ＣのＭＰＯスキャッチャードプロットで記載したものと同一である。連鎖球菌種（ビリダンス）に対するＣＰＯの結合能力はＭＰＯの結合能力より相対的に大きい。しかし乍ら、黄色ブドウ球菌に対する結合能力はＭＰＯと同様である。全体的に、ＥＰＯの結合能力はＣＰＯよりＭＰＯに一層良く類似している。
ＭＰＯおよびＣＰＯに関して上記したようにして、同じ範囲の細菌、酵母並びに赤血球のＥＰＯ結合能力をスキャッチャード法で分析した。結果をまとめて表１２に示す。
0004063317.tif 000023
上清液およびペレットのＥＰＯ含量は同時に実施したＥＰＯ標準を使用して蛍光測定法で測定した。条件は表１０の凡例に記載したものと同じであった。
表１０と表１２のデータを比較すると、個々の微生物、例えば連鎖球菌種（ビリダンス）に関してＥＰＯ−結合能力はＭＰＯ−結合能力と異なっているが、両ハロパーオキシダーゼは共に一般的に試験した細菌に関しては大きな同様な結合能力を有していることが示される。潜在的に重要なことは、試験した真菌、即ち、カンジダ  アルビカンスおよびクリプトコッカス  ネオホルマンスに対してＥＰＯが一層大きい結合能力を有することである。
図１０Ａは、反応容量当たり微生物当たりの非結合ＬＰＯ分子に対してプロットした黄色ブドウ球菌および連鎖球菌種（ビリダンス）当たりの結合ＬＰＯ分子を示す。連鎖球菌種（ビリダンス）と黄色ブドウ球菌に対するＬＰＯの結合能力はＥＰＯおよびＭＰＯで観察されたものより小さいが、ＣＰＯで観察されたものよりはるかに大きい。
これらのデータのスキャッチャードプロットは図１０Ｂに示す。ビリダンス連鎖球菌と黄色ブドウ球菌に対するＥＰＯの結合能力は類似しており、そしてＭＰＯおよびＥＰＯと比較すると相対的に小さい。ＬＰＯ−結合能力の調査は、ハロパーオキシダーゼの結合分析で上記で使用した同じ範囲の細菌、酵母および赤血球を使用して実施した。結果をまとめて表１３に示す。
0004063317.tif 000024
上清液およびペレットのＬＰＯ含量は同時に実施したＬＰＯ標準を使用して蛍光測定法で測定した。条件は表１０の凡例に記載したものと同じであった。
表１０、１１、１２および１３のデータの相互比較によって、ＬＰＯの結合能力は一般的にＭＰＯおよびＥＰＯの結合能力より小さいが、ＣＰＯより大きいことが示される。ＭＰＯとＥＰＯに関して上記で認められたように、ＬＰＯはグラム陰性細菌および酵母に対して相対的により大きい結合能力を示す傾向がある。
実施例９
乳酸産生細菌：ハロパーオキシダーゼの相乗作用
ヒトの正常叢には乳酸産生細菌属の幾つかのメンバーが含まれている。同様に、この属の幾つかの他のメンバーが発酵産業、例えばチーズ生産に使用される。これらのグラム陽性細菌は、プロトポルフィンを合成できないことが特徴である。グラム陽性菌に呼吸性のシトクロムが無い結果、酸化還元代謝はフラビン酵素で触媒されて、代謝産生物として乳酸、そして多くの場合にＨ2Ｏ2を産生する。
これらの乳酸産生細菌（ＬＡＢ）の多くは必須的にヒトおよび関連動物に固有である。連鎖球菌のビリダンス群のメンバー、即ち、連鎖球菌ミチス、サリバリウス等は口、中咽頭、および程度はより少ないが、上気道の鼻咽頭部に固有のものである。ビリダンス連鎖球菌も膣や糞便中に一般的に見られる。ＬＡＢの乳酸桿菌のメンバーも口中で一般的に見られる。この群の他のメンバー、即ちチシアー桿菌（ビフィズス菌）およびデーデルライン乳酸桿菌は母乳栄養乳児および妊娠期間中の膣に固有のものである。
『天然の２つまたはそれ以上の微生物種（または、ついでに言えば、巨大生物）が親密な関係で増殖する場合にはいつも、各々お互いに作用し；そして微生物が宿主生物上で増殖する場合には、宿主は相互作用によって何らかの方法で影響を受ける：「許容だけでは生物学的にそして統計的に不可能である」（Lucas、1949年）』（Rosebury、1962年、Microorganisms Indigenous To Man、McGraw−Hill、ニューヨーク）。ＬＡＢのメンバーが病原性微生物と競合して宿主を保護するように作用することは期待されない。「ヒトの固有の微生物叢と外因性病原体の相互作用は50年以上もの間散在的な研究および継続的な調査の対象であった。しかし乍ら、拮抗的相互作用が感染に抵抗するヒトの能力を高めることができることは最近証明されただけである」（Sanders、1969年、J.Infect.Dis.129:698〜707）。この見解の有効性は、抗生物質の投与後の重複感染の現象によって示される（Weinstein、1947年、Amer.J.Med.Sci.214:56〜63;McCurdyおよびNeter、1952年、Pediatrics 9:572〜576）。
インビトロで肺炎球菌とビリダンス連鎖桿菌が髄膜炎菌や他のグラム陰性細菌を殺害する能力は1915年にコールブルック（Colebrook）によって最初に報告された（Lancet、1915年11月20日、1136〜1138）。彼の技術は、１滴の連鎖球菌（肺炎球菌）培養物を置き、そしてそれを寒天プレートを横切って細く流すことである；この流れの跡を乾燥させた跡、彼は元の連鎖球菌と垂直方向に１滴のグラム陰性培養物を流すことによって上記方法を繰り返した。彼は、２つの流れが交差した場所でのグラム陰性培養物の阻止を観察した。更に、彼は、殺害の程度が２つの培養物のプレーティングを隔てる時間間隔に比例することに注目した。「髄膜炎菌流をプレーティングする前に肺炎球菌の増殖を良好に開始させることによって、髄膜炎菌の増殖を２つの流れが出会う場所だけでなく、その点のどちらかの側のほぼ１センチメーター離れた場所でも総合的に点検した。」コールブルックは、グラム陰性細菌懸濁液の濃度が非常に増加すると微生物の激しい増殖が生じることも見い出した。「明らかに、その後、肺炎球菌は培地から髄膜炎菌の増殖に必須のものを奪わなかったし、また他のどんな方法でも肺炎球菌は培地をそのような生物に不適当なものとはしなかった」（Colebrook,1915年）。ビリダンス連鎖球菌による酸およびＨ2Ｏ2の発生はミロード（M′leod）およびゴードン（Gordon）によって1922年に証明された（Biochem.J.16:499）。連鎖球菌による髄膜炎菌阻止に必要な時間間隔は多分連鎖球菌が発生するＨ2Ｏ2の蓄積に関係がある。
潜在的な病原体の増殖抑制における連鎖球菌のインビボでの重要性も抗生物質治療後の重複感染の現象によって暗示される。「連鎖球菌のビリダンス群のメンバー、即ち殆どの人間の中咽頭叢の有力な株は小腸のグラム陰性細菌、即ちペニシリンの大量投与で治療した後にこの部位で通常過剰に増殖する生物の増殖を阻止することができる。抗生物質の大量投与によるこれら連鎖球菌の抑制（または消失）がそれらの阻止作用を抑制（または消失）し、そしてそれまで阻止されていた（または新たに導入された）細菌の増殖を可能にすることが提言された」（Sprunt等、1971年、J.Infect.Dis.123:1〜10）。
表１０のデータで示されるように、ＸＰＯ結合は微生物特異性である。更に、結合親和性は細菌の乳酸属の正常叢のメンバーでは比較的に貧弱である。結合の選択性は、1Ｏ2反応性の寿命制限と一緒になって、低濃度のＭＰＯの存在で生き延びるメカニズムを有するＨ2Ｏ2産生ＬＡＢをもたらす。更に、このような状態は実際に、拮抗的な微生物の競合において固有のＬＡＢが優位となるのに好ましい。混合細菌環境、例えば、黄色ブドウ球菌と連鎖球菌種（ビリダンス）中にＭＰＯを導入するとＭＰＯの黄色ブドウ球菌への選択的結合が生じる。従って、連鎖球菌種（ビリダンス）の代謝産生物であるＨ2Ｏ2は黄色ブドウ球菌結合ＭＰＯの基質として作用し、有効な活性を有するが反応寿命が限られている微生物反応剤、例えば、ＨＯＣｌおよび特に1Ｏ2を産生する。実施例６に記載したように、このようなＭＰＯが触媒する殺微生物作用は黄色ブドウ球菌に対して比較的に選択的であろう。
赤血球の不存在下および存在下での黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌およびカンジダ  アルビカンスのＭＰＯ依存性殺害に与えるビリダンス連鎖球菌の相乗的影響を次のとおり示す。
材料：細菌、酵母およびＲＢＣは実施例１に記載したようにして調製しそして定量した。ＭＰＯは実施例２に記載したようにして調製しそして定量した。
方法：100μlの標的微生物懸濁液（約106個の微生物）、100μlの連鎖球菌種（ビリダンス）懸濁液（約５*107個の連鎖球菌）、100μlのＭＰＯ（濃度を変化させた）、100μlのグルコース（１mg）、500μlのＮＳおよび、指示された場合、100μlの赤血球懸濁液（107個のＲＢＣ）かまたはＮＳのいずれかを各管に加えて１mlの最終容量とした。内容物を静かに混合し、そして管を23℃で30分間インキュベートした。微生物殺害は、連鎖球菌のより小さいコロニーを十分に顕在化させるためにコロニーを２〜３日間増殖させた以外は上記実施例１に記載したようにして、寒天プレート希釈によって測定した。
（1）赤血球の不存在下での黄色ブドウ球菌の殺害。表１４のデータは黄色ブドウ球菌の連鎖球菌依存性殺害に与えるＭＰＯの影響を示すものである。
0004063317.tif 000025
連鎖球菌はＭＰＯの不存在下では黄色ブドウ球菌を阻止しない。30分の期間中に3.7ｐmolのＭＰＯを添加すると連鎖球菌には何の影響も与えないで黄色ブドウ球菌数を73％減少させ、そして33ｐmolのＭＰＯの添加は連鎖球菌を殺さないで黄色ブドウ球菌を全滅させた。100ｐmolのＭＰＯ添加は黄色ブドウ球菌の全滅をもたらしそして連鎖球菌数を１桁低下させた。
表１０のデータは黄色ブドウ球菌のＭＰＯ−結合能力が連鎖球菌より30倍以上であることを示している。表１４のデータは２*1012個のＭＰＯ分子で106個の黄色ブドウ球菌の50％以上が殺され、そして２*1013個のＭＰＯ分子では、ビリダンス連鎖球菌は比較的に生かしておいて、106個の黄色ブドウ球菌を100％殺害する。このＭＰＯの範囲は総計約106から107個のＭＰＯ分子／黄色ブドウ球菌および104から105個のＭＰＯ分子／連鎖球菌と等しい。黄色ブドウ球菌に関するＭＰＯの高い結合能力、即ちＢ／Ｆ＝14.6に基づいて、利用可能なＭＰＯの極く大部分が黄色ブドウ球菌に結合する。更に、連鎖球菌種（ビリダンス）に関する低い結合能力、即ちＢ／Ｆ＝0.4によって、残っているＭＰＯの小部分しか連鎖球菌に結合しないことが確実である。黄色ブドウ球菌の殺害に必要な濃度より非常に高い濃度である100ｐmolのＭＰＯでは、連鎖球菌には不十分であった。
黄色ブドウ球菌を完全に殺害するＭＰＯ濃度が、連鎖球菌種（ビリダンス）に対しては最小の損傷しか与えない。これにより、ＭＰＯの導入は、拮抗的微生物競合において黄色ブドウ球菌およびＭＰＯ結合能力の高い他の微生物より連鎖球菌種（ビリダンス）を優位にするのに好ましい。
（2）赤血球の存在下での黄色ブドウ球菌の殺害。表１４は、試験した種々の濃度のＭＰＯの存在下連鎖球菌種（ビリダンス）依存性の黄色ブドウ球菌の殺害に与える107個のＲＢＣの影響を更に記録するものである。3.7ｐmolのＭＰＯでは殺害は全く観察されなかったが、33.3ｐmolのＭＰＯは黄色ブドウ球菌数を50％以上減少させた。100ｐmolのＭＰＯを加えると黄色ブドウ球菌数は95％減少し、即ち８*104のＣＦＵになった。この濃度のＭＰＯは連鎖球菌も減少させたが消失させはしなかった。
ＲＢＣに対する同時的または付随的損傷は溶血の程度、即ち上清液／ペレットのヘモグロビン比およびヘモグロビン破壊、即ち最終／初期ヘモグロビン比を測定して評価した。反応系に107個のＲＢＣを加えると黄色ブドウ球菌殺害の少々の、即ち約３倍の阻止をもたらす。ＲＢＣの添加はまた、比較的高いＭＰＯ濃度と関連した連鎖球菌種（ビリダンス）殺害も阻止する。赤血球はカタラーゼを含有するので、黄色ブドウ球菌と連鎖球菌種（ビリダンス）殺害の両方の阻害は大部分、ＲＢＣカタラーゼによるＨ2Ｏ2の競合的消費に起因すると思われる。表１０に示されるように、赤血球はＭＰＯに対して本質的に結合能力を有していない。これは有効な黄色ブドウ球菌殺害と一緒に溶血作用の欠如が観察されたことと致する。連鎖球菌−ＭＰＯ系の殺微生物作用は随伴するＲＢＣの損傷は生じさせず、そしてこのため、ＲＢＣは競合的基質として作用しない。これらの観察は、溶血作用が殺微生物作用に必要な濃度よりはるかに低いＨ2Ｏ2およびＨＯＣｌ濃度で観察された実施例１に示した観察とは全く対照的である。
連鎖球菌−ＭＰＯ系の赤血球阻害は直接的（ＭＰＯ−依存性）Ｈ2Ｏ2およびＨＯＣｌ殺害で観察されたものと比較して非常に小さい。表４および５のデータは、同じ量のＲＢＣがＨ2Ｏ2−依存性およびＨＯＣｌ−依存性の黄色ブドウ球菌殺害の両方で約1000倍阻止したことを示している。
ＲＢＣの存在下で溶血作用を有さないで黄色ブドウ球菌を選択的に殺害することはＭＰＯの選択的防腐作用に関して反応性接近の概念を強力に支持している；即ち、標的微生物に対するＭＰＯの選択的結合は標的の損傷を最大にし、そしてＨ2Ｏ2を発生する正常叢および宿主細胞に対する損傷を最小にする。ＭＰＯの選択的殺微生物作用は防腐法に対する生理学的に健常な試みの根拠を提供する。ダーキン、フレミングおよびその他の者によってこれまでに記載されたように、宿主細胞は化学的防腐剤の損傷作用に対して微生物より感受性が高い。本願発明は、（1）有力で広範囲の病原体を殺害でき、（2）正常叢は生存させそして正常叢に対して選択的でさえあり、そして（3）宿主細胞には非毒性であって宿主の免疫応答を妨げない比較的に微生物選択的なハロパーオキシダーゼ防腐剤系である。
（3）赤血球の不存在下での大腸菌の殺害。
表１４のデータは、連鎖球菌依存性の大腸菌殺害に与えるＭＰＯの影響を更に示すものである。各反応で、概ね２*106個の大腸菌および５*107個の連鎖球菌種（ビリダンス）を指示された量のＭＰＯと共に23℃で30分間インキュベートした。連鎖球菌はＭＰＯの不存在下では大腸菌を殺害しなかった。むしろ、大腸菌は総合的にはＭＰＯの不存在下では連鎖球菌の増殖を阻止した。3.7ｐmolのＭＰＯの添加は大腸菌を99％以上殺害する。この濃度のＭＰＯはまた大腸菌コロニーの消失に比例して連鎖球菌コロニーの出現も生じさせる。11.1ｐmolのＭＰＯは連鎖球菌は比較的に生存させ乍ら総体的に大腸菌の殺害をもたらすが、100ｐmolのＭＰＯでは連鎖球菌数は100分の１に減少した。
大腸菌は、表１０に記載したように、少数の高親和性のＭＰＯ結合部位と多数の比較的に低い親和性のＭＰＯ部位を有する。大腸菌の総ＭＰＯ結合能力は連鎖球菌より大きいが、黄色ブドウ球菌について上記したものより小さい。しかし乍ら、連鎖球菌−ＭＰＯの組合せは連鎖球菌より大腸菌に対して大きい殺害能力を発揮する。２*106個の大腸菌の99％以上の殺害が２*1012個のＭＰＯ分子、即ち、約106個のＭＰＯ分子／大腸菌によって行われた。相対的な殺害能力の上昇はＨＯＣｌおよび1Ｏ2のようなＭＰＯにより発生した反応剤に対して大腸菌がより感受性が高いことを示していると思われる。
大腸菌のＭＰＯ結合能力がより小さいことは連鎖球菌の結合に利用可能な残存ＭＰＯがより多くなると解釈される。従って、大腸菌の存在下での連鎖球菌殺害に与える100ｐmolのＭＰＯの影響は黄色ブドウ球菌の存在下で連鎖球菌殺害に与える影響より大きい。
（4）赤血球の存在下での大腸菌殺害。ＭＰＯの存在下でのビリダンス連鎖球菌依存性の大腸菌殺害に与える107個のＲＢＣの影響も表１４に示す。3.7ｐmolのＭＰＯを加えると、大腸菌コロニーを50％減少させそして連鎖球菌コロニーを出現させた。11.1ｐmolのＭＰＯでは、連鎖球菌には何らの悪い影響を与えることなく、大腸菌数は99％以上消失させ、即ち１*104のＣＦＵになる。大腸菌の完全な殺害および連鎖球菌の僅かな減少が100ｐmolのＭＰＯで行われた。
黄色ブドウ球菌で上記で観察されたように、反応系に107個のＲＢＣを加えると小さい、約３倍の大腸菌殺害阻止がもたらされる。添加されたＲＢＣはまた、比較的に高いＭＰＯ濃度に関連した連鎖球菌殺害も阻止する。表１４に記載されるように、全体的な大腸菌殺害をもたらすＭＰＯ量は溶血作用をもたらさなかった。ＲＢＣの存在下での黄色ブドウ球菌殺害に関して上記で観察されたように、少量のＭＰＯを混合微生物懸濁液に導入すると大腸菌の選択的且つ総合的破壊を生じさせ、非病原性連鎖球菌の優位性に選択的に助力し、そして随伴する赤血球への障害は生じさせない。
（5）赤血球の不存在下および存在下での緑膿菌の殺害。
試験した全ての微生物のうちで、緑膿菌がＭＰＯの殺微生物作用に対して最も感受性である。表１４のデータはＲＢＣの不存在下で0.4ｐmolのＭＰＯを使用して99％以上の殺害、およびＲＢＣの存在下で1.2ｐmolのＭＰＯを使用して85％の殺害を示すものである。溶血的損傷は試験したＭＰＯ濃度のいずれでも観察されなかった。
この殺害研究の結果は表１０の結合データと一致する。緑膿菌は少数の極端に高い親和性のＭＰＯ結合部位および多数の高親和性の結合部位を有する。緑膿菌の全体的なＭＰＯ結合能力は試験した他の微生物より大きい。
（6）赤血球の不存在下および存在下でのカンジダ  アルビカンスの殺害。
カンジダ  アルビカンスはＭＰＯ−依存性の殺微生物作用に対して感受性である。表１４に示されるように、1.2ｐmolのＭＰＯはＲＢＣの不存在下で97％の殺害をもたらす。しかし乍ら、殺害はＲＢＣの存在によって非常に損なわれる。ＲＢＣの存在下溶血作用の徴候なしに概ね同一の殺害活性を得るためには100ｐmolのＭＰＯが必要である。
ＭＰＯ−依存性のカンジダ  アルビカンス殺害結果は表１０に示されるＭＰＯ−カンジダ  アルビカンス結合の結果と一致する。カンジダ  アルビカンス、即ち真核性酵母は試験した細菌と比べて相対的に大きい。各酵母は約104個のＭＰＯ結合部位を有しているが、これらの部位は比較的に親和性が低い。カンジダ  アルビカンスの全体的なＭＰＯ結合能力は連鎖球菌種（ビリダンス）やＲＢＣより大きい。ＭＰＯにビリダンス連鎖球菌を加えると効果的にカンジダを殺害する。赤血球のカンジダ殺害阻止は多分、ＲＢＣカタラーゼが比較的に小さいＭＰＯ結合親和性と一緒になってビリダンス連鎖球菌性Ｈ2Ｏ2を破壊することを反映している。
カンジダ  アルビカンスは正常叢と病原体の間の灰色領域にある。これは典型的に存在し、そして正常叢の小部分を占める。カンジダは、特に、実際上カンジダの過剰増殖および重複感染を選択する原核細胞特異性抗生物質の使用に関係がある免疫を損傷された宿主で問題となる。表１４のデータは、カンジダを殺害しそして酵母の過剰増殖を抑制するためにＭＰＯと組み合わせたビリダンス連鎖球菌の相乗作用を示すものである。
（7）化膿連鎖球菌（Ａ群）およびストレプトコッカス  アガラクチエ（Ｂ群）の直接的なＭＰＯ殺害。
材料：全て連鎖球菌属のメンバーである細菌をトッド-ヘビット  ブイヨン（ＴＨＢ）中で一夜増殖させた。ＲＢＣおよびＭＰＯは実施例１および２に記載したようにして調製しそして定量した。
方法：100μlの標的微生物懸濁液（約106個の微生物）、100μlのＭＰＯ（濃度を変化させた）、100μlのグルコース（１mg）、600μlのＮＳおよび、指示される場合、赤血球懸濁液（107個のＲＢＣ）かまたはＮＳかのいずれか100μlを各管に加えて１mlの最終容量とした。この内容物を静かに混合し、そして管は23℃で30分間インキュベートした。微生物殺害は、コロニーを血液寒天上にプレーティングしそして小コロニーを十分に発育させそして溶血パターンを得るために２日間増殖させた以外は上記実施例１に記載したようにして寒天プレート希釈によって測定した。
連鎖球菌属の全てではないが多数のメンバーは代謝産生物としてＨ2Ｏ2を発生する。表１０に示された結果は、連鎖球菌属のメンバーもＭＰＯ結合能力に関しては異なっていることを示している。これらの観察はＭＰＯ殺害に対する感受性に差異がある可能性を示唆する。表１５に示される結果はこの可能性を実証している。
0004063317.tif 000026
ＭＰＯは連鎖球菌種（ビリダンス）、化膿連鎖球菌（Ａ群）およびストレプトコッカス  アガラクチエ（Ｂ群）を直接殺害するが、糞便連鎖球菌（Ｄ群）の直接的殺害はもたらさない。ＲＢＣの存在はＭＰＯの殺微生物作用を減少させるが溶血作用は最小であった。
ＭＰＯ殺害に関して、化膿連鎖球菌（Ａ群）はＲＢＣの不存在下でストレプトコッカス  アガラクチエ（Ｂ群）および連鎖球菌種（ビリダンス）より一層感受性である。この順序は表１０に示したＭＰＯ結合親和性および能力と一致する。この結合−殺害の関係はＲＢＣの存在によって歪められる。ＲＢＣはＭＰＯとは結合しないが、Ｈ2Ｏ2を破壊できるカタラーゼを含有している。微生物殺害に差異のある阻止は、種々の連鎖球菌によるＨ2Ｏ2発生の種々の速度に比例した一定量のＲＢＣカタラーゼの作用を反映していると思われる。
糞便連鎖球菌（Ｄ群）は、アルファ型またはベータ型の溶血性ではなくそして代謝産生物としてＨ2Ｏ2を放出しない試験群の唯一のメンバーである。かくして、最も高いＭＰＯ結合親和性および能力を有しているにも拘わらず、糞便連鎖球菌はＨ2Ｏ2の外部供給源の不存在下ではＭＰＯの作用から保護される。
これらの観察はＬＡＢ属の病原性メンバーの直接的ＭＰＯ殺害を実証しており、そしてＡ群および／またはＢ群の連鎖球菌コロニー形成または感染を消失させるＭＰＯの治療的な有用性を証明している。
（8）赤血球の不存在下および存在下でのビリダンス連鎖球菌−クロロパーオキシダーゼの相乗的殺微生物作用。
材料：細菌、酵母およびＲＢＣは上記したようにして調製しそして定量した。ＣＰＯはシグマ  ケミカル  カンパニーから購入しそして実施例７に記載したようにして調製した。
方法：方法論は、ＣＰＯが使用したハロパーオキシダーゼであった以外は上記したとおりであった。
ＣＰＯはハロパーオキシダーゼ作用の比較分析用のデータを提供するためにＭＰＯの代わりに使用した。ビリダンス連鎖球菌と組み合わせたＣＰＯの殺微生物能力は上記した３種の細菌と１種の酵母を使用して試験し、そしてその結果は表１６に示す。
0004063317.tif 000027
ＲＢＣの不存在下で、ビリダンス連鎖球菌はビリダンス連鎖球菌−ＭＰＯ系で上記で得られた結果と比肩できるＣＰＯ−依存性殺菌活性を発揮するが、ＭＰＯ系とは異なって、ＣＰＯ系はカンジダ  アルビカンスは効果的には殺害しなかった。ＭＰＯとＣＰＯは共に、ハライド酸化および1Ｏ2生成に関して比肩し得る活性を有しているが、表１０および１１のＭＰＯとＣＰＯの結合データを比較するとＭＰＯの微生物結合能力の方が非常に大きいことを示している。
ＭＰＯとＣＰＯのＨＯＣｌおよび1Ｏ2発生は共に殺微生物効果をもたらすが、ＣＰＯ系は付随的な損傷が最小である選択的殺害に必要な高度の特異性を欠いている。カンジダは試験したどの濃度でもＣＰＯによって殺害されない。溶血作用の形態の付随的な損傷は10ｐmolの上記のＣＰＯ／mlで観察される。
実施例１０
ハロパーオキシダーゼの殺微生物作用に対する塩化物／Ｈ2Ｏ2および臭化物／Ｈ2Ｏ2比の最適範囲
材料：カンジダ  アルビカンスは実施例１０に記載したようにして調製しそして定量した。ＥＰＯおよびＭＰＯは実施例２に記載したようにして調製した。
方法：方法論は、ＥＰＯとＭＰＯを共に使用しそして両ハライド、即ちＣｌ-およびＢｒ-並びにＨ2Ｏ2の濃度を変えた以外は実施例３で上記したとおりであった。
実施例３で上記で考察したように、ハライド／Ｈ2Ｏ2比はハロパーオキシダーゼの安定性および機能に関して重要な要素である。非常に低い比では、Ｈ2Ｏ2はハロパーオキシダーゼの機能を阻害することができ、そして非常に高い比率では、ハライドは触媒作用を競合的に阻害することができる。
表１７は、Ｃｌ-／Ｈ2Ｏ2比をカンジダ  アルビカンスのＭＰＯおよびＣＰＯ依存性殺害に関連づけているデータを表わす。カンジダはＨ2Ｏ2の直接的作用に対して耐性であるので、標的微生物として選択した。データはカンジダ  アルビカンス  ＣＦＵとして示す。Ｃｌ-／Ｈ2Ｏ2比を以下に示し、そして殺害パーセントはこの比の下に示す。
0004063317.tif 000028
ハロパーオキシダーゼとしてＭＰＯを用いると、殺カンジダ作用は１から40,000のＣｌ-／Ｈ2Ｏ2比で検出され、そして本質的に完全な殺害は200から40,000の範囲で観察された。ハライド／Ｈ2Ｏ2比は効果的な殺微生物環境の形成における重要な考慮事項である。低いＨ2Ｏ2濃度では、Ｃｌ-が体液の遍在成分であるので、相対的に高い比が本質的に保証される。正常な対象（ヒト）では、血漿のＣｌ-値は98〜107μmol／mlの範囲であり；脳脊髄液の値は119〜131μmol／mlの範囲であり；唾液の値は7〜43μmol／mlの範囲であり、そして汗の値は4〜60μmol／mlの範囲である。刺激された胃の分泌は460〜1,040μmol／mlの範囲であり、そして尿排泄は80,000〜270,000μmol／日の範囲である（Geigy Scientific Tables、第８版、1981年、Ciba-Geigy Ltd.、バーゼル、スイス）。５μmol／ml未満のＨ2Ｏ2を含有する体液を得るのは困難であるので、酵素の大部分の防腐的および選択的抗微生物適用では、利用可能なＨ2Ｏ2の濃度は５μmol／ml未満、好ましくは0.5μmol／ml未満、そして最も好ましくは0.05μmol／ml未満に維持すべきである。
ハロパーオキシダーゼとしてＥＰＯを用いると、殺カンジダ作用は試験した０から40,000の範囲内のＣｌ-／Ｈ2Ｏ2比では有効でなかった。上記したように、塩化物はＥＰＯ殺微生物作用のハライド補因子として相対的に無効である。
表１８のデータは、Ｂｒ-／Ｈ2Ｏ2比をＭＰＯおよびＥＰＯ依存性のカンジダ  アルビカンス殺害に関連づけるものである。データは表１７で上記したようにして示す。
0004063317.tif 000029
ハロパーオキシダーゼとしてＭＰＯを用いると、殺カンジダ作用は２から4,000のＢｒ-／Ｈ2Ｏ2比では検出されず、そして本質的に完全な殺害は20から400の範囲で観察された。ハロパーオキシダーゼとしてＥＰＯを使用すると、殺害は0.2から4,000の範囲のＢｒ-／Ｈ2Ｏ2比で観察され、そして本質的に完全な殺害は２から４００の範囲で得られた。ＭＰＯに比較してＥＰＯの殺カンジダの有効性の上昇は、表１０および１３に示されるこれらハロパーオキシダーゼのカンジダ  アルビカンスに対する相対的な結合親和性と一致する。
正常なヒト対象では、血漿のＢｒ-値は0.049〜0.93μmol／mlの範囲であり；脳脊髄液の値は0.018〜0.048μmol／mlの範囲であり；唾液の値は0.003〜0.013μmol／mlの範囲であり、そして汗の値は0.002〜0.006μmol／mlの範囲である。Ｂｒ-は胃壁細胞によってＣｌ-に優先して分泌され、そして尿排泄は20〜84μmol／日の範囲である（Geigy Scientific Tables、第８版、1981年、Ciba-Geigy Ltd.、バーゼル、スイス）。体液中で利用可能なＢｒ-の濃度は典型的には５ｎmol／mlから90ｎmol／mlの範囲である。それ故、Ｂｒ-の補給がなければ、ＥＰＯまたはＬＰＯのような臭素要求性のハロパーオキシダーゼの大部分の防腐的または選択的抗微生物適用では、利用可能なＨ2Ｏ2の濃度は0.01μmol／ml未満、好ましくは0.001μmol／ml未満に維持すべきである。
臭素は癲癇の治療に治療的に使用される。この治療的範囲は９〜18μmol／mlであり、16μmol／mlを超えると毒性があると報告されている（Cecil′s Textbook of Medicine、第18版、1988年、W.B.Saunders Co.、フィラデルフィア）。それ故、毒性を有さないで体液のＢｒ-濃度を10倍から100倍高めることは可能である。これにより、ＥＰＯまたはＬＰＯが選択されるハロパーオキシダーゼである場合、Ｂｒ-を毒性範囲未満の濃度にまで処方に加えることができ、そしてＨ2Ｏ2濃度は最適範囲内のＢｒ-／Ｈ2Ｏ2比を維持するように比例して高めることができる。
実施例１１
ＭＰＯの殺菌作用に与える高濃度の競合的基質の影響
有効な殺微生物作用と組合わされた微生物選択性結合特性は、媒体成分に対する付随的損傷および微生物叢の選択的制御が最小で微生物を殺害するハロパーオキシダーゼの使用を示唆している。これらの可能性を完全に具現化するためには、ハロパーオキシダーゼは競合的基質で満たされた媒体中で微生物を効果的に殺害しなければならない。次の実験はミエロパーオキシダーゼの殺菌活性に与える複雑な媒体の影響を試験するために行った。
材料および方法：材料および方法は、反応媒体が標準濃度の１/2希釈のシミラック（Similac）（登録商標）乳児処方（Ross Laboratories、Abbott Laboratoriesの部門）を含有していた以外は実施例３に記載したとおりであった。
表１９のデータは、１／２標準濃度のシミラック（登録商標）の存在下で大腸菌および黄色ブドウ球菌に与える種々の濃度のＨ2Ｏ2のＭＰＯ−依存性殺菌作用を示す。種々の濃度のＨ2Ｏ2によるＭＰＯ−依存性殺微生物作用は上記実施例３に記載されており、そして表８Ａのデータで示されている。
シミラック（登録商標）はタンパク質、脂肪、炭水化物およびビタミンの複合懸濁液である。試験に使用した濃度では、媒体各１mlは10ｐmolのＭＰＯおよび指示された量のＨ2Ｏ2に加えて7.5mgのタンパク質、18mgの脂肪（このうち、4.4mgはりノール酸である）、36mgの炭水化物および30μgのアスコルビン酸（ビタミンＣ）を含有していた。比較的高濃度の競合的基質、例えばリノール酸、および還元剤、例えばアスコルビン酸はＭＰＯの殺微生物作用の大きな阻止をもたらすが、この阻止にも拘わらず、残存するＭＰＯの殺微生物能力は有効なままである。表１９のデータは、0.6μmol／ml未満のＨ2Ｏ2でも殺菌作用が完全であることを示している。
0004063317.tif 000030
シミラック（登録商標）は１／２標準濃度で使用した。試験懸濁液の各１mlは7.5mgのタンパク質、18mgの脂肪（このうち、4.4mgはリノール酸である）、36mgの炭水化物および30μgのアスコルビン酸を含有していた。
微生物に結合するハロパーオキシダーゼは複雑な媒体を滅菌するために比較的低い濃度で使用することができる。同様に、実施例６から９に記載したように微生物に特異的に結合しそして殺害するハロパーオキシダーゼの特性は、叢組成の選択的制御におけるハロパーオキシダーゼの潜在的な役割を示唆している。これらのハロパーオキシダーゼは医薬療法のみならず発酵法の制御に適用することができる。
本発明の防腐剤方法および組成物の種々の修正および改変は、前述したことから当該技術分野の熟練者に明白であろう。このような任意の修正および改変は、先行技術によって排除されない限り、下記の請求の範囲内であるように意図するものである。
【図１】
0004063317.tif 000031
【図２】
0004063317.tif 000032
【図３】
0004063317.tif 000033
【図４】
0004063317.tif 000034
【図５】
0004063317.tif 000035
【図６Ａ】
0004063317.tif 000036
【図６Ｂ】
0004063317.tif 000037
【図７Ａ】
0004063317.tif 000038
【図７Ｂ】
0004063317.tif 000039
【図７Ｃ】
0004063317.tif 000040
【図８Ａ】
0004063317.tif 000041
【図８Ｂ】
0004063317.tif 000042
【図９Ａ】
0004063317.tif 000043
【図９Ｂ】
0004063317.tif 000044
【図１０Ａ】
0004063317.tif 000045
【図１０Ｂ】
0004063317.tif 000046