(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのパルボウイルス特異的ＶＰ１及び／又はＶＰ２エピトープをコードする、プラズミドに含まれる核酸分子及び製薬学的に適した担体を含む、続くパルボウイルス感染においてパルボウイルスにより誘導される疾病から予防接種された動物を保護する抗パルボウイルスワクチンであり、前記プラズミドが哺乳動物において機能し、前記パルボウイルスがイヌ科の動物、ネコ科の動物、イタチ科の動物、イヌ、ネコまたはイタチに感染できる、前記抗パルボウイルスワクチン。
【請求項２】
少なくとも１つの前記パルボウイルス特異的ＶＰ１及び／又はＶＰ２エピトープが、T細胞エピトープである請求項１に記載の抗パルボウイルスワクチン。
【請求項３】
少なくとも１つの前記パルボウイルス特異的ＶＰ１及び／又はＶＰ２エピトープが、B細胞エピトープである請求項１または２に記載の抗パルボウイルスワクチン。
【請求項４】
前記核酸分子がDNA分子またはRNA分子である請求項１から３のいずれか１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。
【請求項５】
前記核酸分子がパルボウイルスVP１及び／またはVP２核酸キャプシドタンパク質をコードする請求項１から４のいずれか１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。
【請求項６】
前記核酸分子が完全なVP１オープンリーディングフレームを含有する請求項５に記載の抗パルボウイルスワクチン。
【請求項７】
前記ワクチンが少なくとも１つの付加的な抗原を含有するかまたは前記プラズミドが少なくとも１つの付加的な抗原をコードする請求項１から６のいずれか１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。
【請求項８】
前記付加的な抗原が免疫原である請求項７に記載の抗パルボウイルスワクチン。
【請求項９】
少なくとも１つのT細胞エピトープをコードする前記核酸分子が、以下の一般化した核酸配列にコードされるエピトープ群から選択される請求項２から８のいずれか１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。
0004117027.tif 000011
配列中、Nはいずれの塩基でもよく、Rはプリンを示し、Yはピリミジンを示し、及びHはA、C、またはTを示す。
【請求項１０】
核酸配列にコードされる前記エピトープが以下の配列である請求項９に記載の抗パルボウイルスワクチン。
0004117027.tif 000012
【請求項１１】
少なくとも１つのB細胞エピトープをコードする前記核酸分子が、以下の一般化した核酸配列によりコードされたエピトープ群から選択される請求項３から１０のいずれか１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。
0004117027.tif 000013
配列中、Nはいずれの塩基でもよく、Rはプリンを示し、Yはピリミジンを示し、SはGまたはCを示し、かつMはCまたはAを示す。
【請求項１２】
核酸配列によりコードされた前記エピトープが以下の配列である請求項１１に記載の抗パルボウイルスワクチン。
0004117027.tif 000014
【請求項１３】
Ｔ細胞及びＢ細胞エピトープの両方をコードする核酸混合物を含む請求項１から１２のいずれか１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。
【請求項１４】
アジュバントを更に含有する請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗パルボウイルスワクチン。
【請求項１５】
前記アジュバントがメチル化されていないCpGモチーフを含むDNA分子である請求項１４に記載の抗パルボウイルスワクチン。
【請求項１６】
メチル化されていないCpGモチーフを含む前記DNA分子が
0004117027.tif 000015
である請求項１５に記載の抗パルボウイルスワクチン。
【請求項１７】
前記DNA分子がホスホロチオエート変性バックボーンを含有する請求項１５または１６に記載の抗パルボウイルスワクチン。
【請求項１８】
イヌ科、ネコ科、またはイタチ科の動物における予防接種のための請求項１から１７のいずれか１項に記載のワクチンの作製に請求項１から１７のいずれか１項に記載の核酸分子を使用する方法。
【請求項１９】
前記イヌ科、ネコ科またはイタチ科の動物が、イヌ、ネコまたはミンクである請求項１８に記載の使用方法。
【請求項２０】
前記ワクチンが下記の経路の１つにより投与される請求項１８または１９に記載の使用方法；針及び注射器による筋内投与、バイオジェクター2000（登録商標）による筋内投与、針及び注射器による鼻腔内投与、粒子打ち込みによる鼻腔内投与、乱切による鼻腔内投与、静脈内または腹腔内投与。
【請求項２１】
ワクチンの単一投与により免疫化が達成される請求項１８または１９に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
本発明の一般的な技術分野は、パルボウイルス感染から動物を保護するための動物への核酸予防接種の方法である。本発明は、特に、パルボウイルスDNAの調製及び使用並びに毒性パルボウイルスにより発病する疾病から動物を保護する免疫反応を誘導するためのイヌ、ネコ及びミンクへのパルボウイルスDNAの投与に関する。核酸免疫原は、細菌プラズミドに含有されたパルボウイルスゲノムの抗原性部分を含有するようにデザインされている。これらのプラズミドは、トランスフェクションにより宿主細胞に導入された時に、所望のパルボウイルス遺伝子生成物を生成する。パルボウイルス免疫原発現プラズミドを導入した宿主細胞は、宿主の免疫系が保護的免疫反応を生じる抗原性タンパク質の流れを生成する。
パルボウイルスは、単鎖DNAを含有するタンパク質キャプシドからなる小さいDNAウイルスに非常に類似した一族である。パルボウイルスは様々な哺乳類種に多様な疾病を引き起こす。ネコ科パンルコペニア  ウイルス（feline panleukopenia virus）、ミンク  エンターリチス  ウイルス（mink enteritis virus）及びイヌ科パルボウイルスは、ネコ科パルボウイルス  サブグループの宿主に関する変異体であり、98％以上のDNA類似性を有している（マルティン（Martyn）ら、J.Gen.Virol.71（1990）2747-2753）。イヌ科パルボウイルスは、全てのイヌ科動物において比較的新しい病原体であり、高致死率胃腸炎の世界的な流行の原因となる作因として始めて1970年代後半に発見された。このウイルスは、ネコ科パルボウイルスの宿主に関する変種であると推測された。ネコ科及びイヌ科のパルボウイルスの核酸配列を比較すると、31塩基の変化が確認され、たった9つのアミノ酸が変化しただけであると分かった（マルティンら、1990）。これらのアミノ酸の6つの変化は、主要キャプシド遺伝子であるVP1及びVP2にあった。イヌ科特異的抗原性エピトープは、ネコ科パンルコペニア  ウイルスと1つ異なると決定された。さらに遺伝子マッピングにより、近年イヌ科パルボウイルスの発生時が確認され、ネコ科パルボウイルスから発生したという推測を確かなものとし、現在単離されている系におけるウイルスの継続的な進化を示している（トルイェン（Truyen）ら、J. of Virology 69（8）（1995）、4702-4710）。
2つの核酸キャプシドタンパク質、VP1及びVP2は同じRNAから発現し、VP2はVP1のオープンリーディングフレームのイン-フレームATGコドンから得られる。VP2はVP1より約10倍高いレベルで発現されており、内部の出発コドンはより効率的に翻訳装置により認識されることを示している（トゥリソら、J. of Gen. Virol. 72（1991）、2445-2456）。エピトープマッピング実験は、全ての抗原性エピトープは、VP2内で中和抗体を生成していることを立証した（トゥリソら、1991、前記参照.）。これらはVP2の最初の16のアミノ酸を含んでいる（ランゲヴェルドら、J. of Virology 68（7）（1994）4506-4513；カサル（Casal）ら、J. of Virology 69（11）（1995）、7274-7277）。
免疫化は、ヒト及び動物を感染性疾病の発生源から保護する一次的機構を与える。安全性を考慮して、生きた、弱毒化した試薬から離れた最近のワクチンのデザインの流行、「ワクチン破壊」による不完全に弱毒化したもの、復帰したもの、または免疫抑制患者において増幅するものは、ワクチンの持続及び効力における減少を伴っているようにも見える。溶解試薬、クローンされたタンパク質またはペプチドの組み換え体の使用は、多量の投与量及びアジュバントの存在を必要とする。しかし、そのようなアジュバントの長期に渡る影響は広く調査されておらず、最近になって、それらはネコの肉腫を誘導するワクチン中の原因となる作因として包含されるようになった（ヘンドリック（hendrick）ら、J. Am. Vet. Med. Assoc. 205（1994）、1425-1429）。更に、投与された抗原の細胞外での位置は、免疫系にこれらの抗原をいれる方法及びそれらの自然発生する感染に対する保護を発生させるための適性についての疑問を投げかける。
最近のイヌ科パルボウイルスのための免疫試験は限界にきている（シャルツ（Schultz）、R.D.（1994）、新規発見疾病の制御への挑戦：イヌ科パルボウイルスワクチン、IBC国際シンポジュウム、10月27-28、108）。弱ったまたは殺された生物によるワクチンは、免疫を発生させるために繰り返し与える必要があり、循環している母親から受けた抗体力価に対抗できる免疫化は通常起こらない。この問題は、保護不可能なレベルまで減少させて、「無防備な窓（window of vulnerability）」にまで導びく間に、ワクチンを不活性化する母親から受けた抗体によって倍加される（ポロック（Pollock）及びカルミカエル（Carmichael）、J. Am. Vet. Med. Assoc. 130（1982）、37-42）。イヌ科パルボウイルスのクローニングは、2つの明確なワクチン法の開発に導いた。1つ目は、哺乳類のウイルス（baculovirus）の発現系に完全なVP2配列を導入することである。生成されたタンパク質は収集され、有効にイヌを免疫化するのに用いられる（トゥリソ（Turiso）ら、J. of Virology 66（5）（1992）、2748-2753）。第二の方法は、イヌを免疫化するのに用いられるペプチドエピトープのサブクローニングまたは合成を含んでいる。これらのペプチドは、VP2のアミノ末端配列を使用し（カサル（Casal）ら、1995、前記参照.）、有効なイヌの免疫化を行っている。これらの方法を用いて開発されたワクチンはミンク  エンテリティス  ウイルスや他の非常に類似したパルボウイルスの宿主に関する変異体でも試された。組み換えタンパク質またはペプチドの投与により、商業的に問題であるミンクの疾病に対する保護免疫が得られた（ランゲヴェル（Langeveld）ら、Vaccine 31（11）（1995）、1033-1037）。
ネコ科パンレウコペニアのための修飾された生きたウイルスのワクチンは、成ネコを保護するには効果的であるが、子宮内の子ネコの胎児に生まれつきの障害を与えてしまうため、妊娠可能な成体のメスネコの予防接種には適当ではない。修飾された生きたウイルスのワクチンでは大きな制限があるため、研究者らは、感染生物からの遺伝子発現抗原をin vivoで細胞に導入する可能性を広げることを試みた（ドネリー（Donnelly）ら、J. Imm. Meth. 176（1994）、145-152；ファイナン（Fynan）ら、Int. J. Immunopharmac. 17（2）（1995）、79-83；ウェレン（Whalen）ら（1995）、ヘパチチスB表面抗原のDNAを介した免疫化；DNAワクチンにおける免疫反応の活性化及び同調化、ニューヨーク：ニューヨーク科学アカデミーを参照）。上記の免疫化の機構は、典型的なアジュバントの必要性を迂回しつつ、弱った生物から与えられる付随の危険性なしにウイルス性遺伝子発現の経路を模倣する。哺乳類プロモーターを持つ「裸の」プラズミドDNAの筋内投与が、筋肉細胞に吸収され発現されるDNAを発生させる（ウォルフ（Wolff）ら、Science 247（1990）1465-1468）という思いがけない発見は、核酸予防接種の新規分野の画期的な発展に導いた。最初の研究に続いて、プラズミドDNAの筋内投与に影響を与える条件が更に特定され広げられた（ウォルフ（Wolff）ら、Biotechniques 11（1991）、474-485）。転移の効率は比較的低く、１-5％の範囲内にあり、その効率は、プラズミドDNAの投与後に筋肉変性を誘導することによって40倍にまで増加させることができる（ヴィタデロ（Vitadello）ら、Hum.Gene.Ther.5（1994）、11-18；ダンコ（Danko）及びウォルフ、Vaccine 12（16）（1994）、1499-1502）；ディビス（Davis）ら、Hum.Gene.Ther.4（1993）、733-740）。最も一般的に使用されている２つの筋肉性（myonecrotic）作因は、局所的な麻酔性ブピビカイン（bupivicaine）、及びカルティオ毒（cardiotoxin）（ダンコ（Danko）及びウォルフ、1994、前記参照.；デイヴィス（Davis）ら、1993、前記参照）である。例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びリボゾームを含む多くの他の技術は、遺伝子を筋肉に転移するために使用されている。しかし、外来DNAの転移及び発現における輸送機構において、裸のDNAの直接投与が一番効率的であるようである（ディビス（Davis）ら、1993、前記参照）。
筋内注射に加えて、幾つかの投与経路が探求されている。これらの経路の共通点は、標的細胞に核酸を挿入するために作因またはベクターを必要としない点である。静脈内、腹腔内、皮内、鼻腔内及び半継続的なDNAプラズミドの注射の全てが、インフルエンザ  ウイルス  ヘマグルチニン（HA）に対してニワトリを免疫化した（パルドール（Pardoll）及びベッカークレッグ（Beckerkleg）、Immunity 3（1995）、165-169参照）。興味深いことに、これらの研究は、DNAによる粘膜（鼻腔内）免疫は、IgA反応を起こさず、むしろ筋内注射に見られるように、IgG反応を起こすことを示している。更に、金の微粒子に覆われたDNAの打ち込みによる皮内免疫は、他の方法よりも100から1000倍低いDNA濃度でも、他の遺伝子転移方法と同様の効果があることが示された。同じような実験が、皮内及び静脈内経路によりネズミ及びウサギを免疫化することを示した（ラズ（Raz）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91（1994）、9519-9523）。方法の単純さを強調することで、ラズ及びその同僚は、プラスチックのツベルクリンPPDトィンのDNA被覆及び皮膚の乱切によりバイオリスチックな打ち込み（biolistic bombardment）と同様な結果が得られる、組織打ち込み及び皮内免疫のために必要な、高価で場合によっては扱いにくい器具の使用を迂回できる可能性があることを示唆している。DNA免疫は、ウシ、ブタ、及びヒト以外の霊長類を含む数種の哺乳類において、主に筋内経路を介して試みられ、多くの成功を収めている。
DNA発現構築物の筋内注射の後に起こる免疫反応の性質は、免疫系の体液性及び細胞性の防護の両方に関連していると報告されている。レポーターDNA構築物が注射されると、それらは成熟した筋原繊維内に含有されると思われる。これは、筋肉再生成がプラズミド発現の効果を増加するように思われる証拠により支持されている。抗原の導入は、筋細胞によるMHCクラスＩの発生、骨髄由来抗原提供細胞（APCs）による筋細胞からの抗原吸収、または筋肉を介して移動するAPCsの直接DNAトランスフェクションにより起こるのであろうと考えられている（パルドール（Pardol）及びベッカーレッグ（Beckerleg）、1995、前記参照；ウァレン（Whalen）ら、1995、前記参照.参照）。2つの理由から、筋細胞の単純な抗原提供は、これらの現象の全てを担っているとは思われない。一つ目は、副-増幅（co-stimulatory）信号B7及びB7-2が欠けたときの抗原提供は抗原に対する耐性を起こすという成長体の証拠である（チェン（chen）及びナバビ（Nabavi）、Immunity 1（1994）、147-154）。二つ目は、筋肉ではMHCクラスＩ発現が非常に低いレベルにあると報告されていることである（カルパチ（Karpati）ら、Ann.Neurol.23（1988）、64-72）。従って、抗原提供は、抗原を取り除くかまたは転移された遺伝子の直接的な取得及び発現を介して抗原を得るプロフェッショナルAPCsにより行われる可能性が高いと考えられる（パラドール及びベッカーレッグ、1995、前記参照.；ウァレンら、1995、前記参照.）。ネズミにおけるバイオリスチックな（biolistic）粒子打ち込みによる実験は、後者のアプローチを好ましいものとすると考えられる。ネズミは耳介に打ち込みを受け、打ち込みを受けた5分後にその耳が手術的に摘出された。これらのネズミは、免疫反応を形成する能力を保持しており、その反応は、打ち込みのみによって誘導されたものと定量的に相違しなかった。明らかに、高率で動き回る細胞集団がこれらのネズミの免疫反応の出発及び移動に関与しているようである。この細胞として、樹状突起細胞が挙げられた（フィナンら、1995、前記参照.）。明らかに、粒子打ち込みにより誘導された免疫反応の特徴は、筋内注射により得られる反応からは微妙に異なっており、筋内注射ではIgG1が大部分であるが、皮内注射においてはIgG2が主成分であった。この違いの第一の理由は、1ヶ月を超える期間抗原を発現し続ける筋内免疫の筋細胞（パラドール及びベッカーレッグ、1995、前記参照.）にあると思われる。この継続的な発現は、免疫昏睡と呼ばれるものを引き起こす（ウェイレンら、1995、前記参照.）。この症状に見られる実験的な現象は、筋肉発現の継続的な上昇（boost）である。しばしば、単一の注射により得られる力価は4から8週間、またはそれ以上の週を超える期間上昇することがある。古典的な上昇反応は、第一回目の注射の後に、6ヶ月以上DNA注射が続けられた時にも観察された。奇妙なことに、上昇抗体力価の期間中に起こるDNA上昇注射は、何の影響も及ぼさないか、または抗原に対する反応を減少させる（デイヴィスら、「プラズミドDNAを有するHBVに対する組織的及び粘膜の免疫の導入」、核酸ワクチン国際会議、2月5-7、1996、ベセスダ、メリーランド、アメリカ）。
測定可能な免疫反応を生成する能力は、予防接種のために優先される（priori）能力ではない。むしろ免疫反応は、感染、進入,及び疾病から宿主を保護する適当な成分を含有していなければならない。従って、攻撃の研究での感染に対する保護が、唯一の最もの確信の持てるワクチン効率の証拠であることは事実である。DNAを基にしたワクチンは、致死的なインフルエンザウイルスの攻撃からニワトリを（ロビンソン（Robinson）ら、Vaccine 9（1993）、957-960）かつミクロプラズマ（Mycoplasma pulmonis）感染からネズミを（ライ（Lai）ら、DNA and Cell Biology 14（7）（1995）、643-651）保護することができる。更に、DNA免疫により、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルスの継続的な感染の構築に対してネズミを保護することができる（マーティン（Martins）ら、J. of Virology 69（4）（1995）、2574-2582）。
核酸予防接種に関して、本発明に関連する従来技術は、以下の記事にまとめられている。核酸予防接種に関して、ドンネリーら、1994、前記参照.、フィナンら、1995、前記参照.、ウァレンら、1995、前記参照.、及びパルボウイルス予防接種に関して、トゥリソら、前記参照,及びカサルら、1995、前記参照.。
例示された上記従来技術は、核酸予防接種に対するネズミの免疫反応のみを試験している。従来技術で知られているように、ネコ、イヌ及びミンク等の動物間の（taxonomic）相違により、ネズミから得られた実験結果をこれらの動物に適用することはできない。一方、イヌ科、ネコ科及びイタチ科の動物のパルボウイルス感染に対する適当なワクチンが従来技術に無いため、本発明の根底にある技術的な課題はそれらのワクチンを提供することにある。前記ワクチンは、パルボウイルス感染の潜在的な命を脅かす効果から、特に、イヌ、ネコ及びミンクを効果的に保護しなければならない。上記の技術的問題は、請求項で特徴付けられる態様の提供により解決することができる。
従って、本発明は、少なくとも１つのパルボウイルス特異的エピトープをコードする核酸分子及び製薬学的に適した担体を含む抗パルボウイルスワクチンに関する。
驚くべきことに、本発明により、少なくとも１つのパルボウイルス特異的エピトープをコードする「裸」のDNAを用いた免疫化は、続くパルボウイルス感染においてパルボウイルスにより誘導される疾病から予防接種された動物を保護する免疫反応を生じることが分かった。
本発明の抗パルボウイルスワクチンの好ましい態様においては、少なくとも１つの前記パルボウイルス特異的エピトープが、Ｔ細胞エピトープである。
当業者は、本発明の技術知識を用いて保護的ワクチンをデザインする場合、本発明のワクチンに使用されるＴ細胞エピトープのみをコードする核酸配列を含むワクチンを考案することが可能である。
同様に、当業者は、本発明による核酸ワクチンのために使用するＢ細胞エピトープのみをコードするDNAを含むワクチンを考案することが可能である。従って、更なる好ましい態様においては、抗パルボウイルスワクチンは少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含有する。代わりに、少なくとも１つの前記Ｂ細胞エピトープをコードする核酸は、少なくとも１つのＴ細胞をコードする核酸と共に前記ワクチンに含有されることが可能である。T細胞及びB細胞エピトープは、同じまたは異なるDNA分子にコードされることができる。
本発明による抗パルボウイルスワクチンの更に好ましい態様においては、前記核酸分子がDNA分子またはRNA分子である。「DNA分子」という用語はここでは最も広い意味で用いられ、例えばcDNA分子、遺伝子DNA、合成及び半合成DNA分子を含む。同様に、「RNA分子」という用語は、ここでは最も広い範囲の意味で使用される。
本発明の抗パルボウイルスワクチンの更に好ましい態様においては、前記核酸分子はパルボウイルスVP1及び／またはVP2核酸キャプシドタンパク質をコードする。
パルボウイルス遺伝子は、長さ約5000塩基対であり、約4つのオープンリーディングフレームを含有する。これらのオープンリーディングフレームの２つは、パルボウイルスの主要キャプシドタンパク質VP1及びVP2をコードする。VP2は、VP1内に含有され、全てのしかし小さいVP1遺伝子の5’末端またはVP1タンパク質のアミノ末端を含有している。VP1のみが有する配列は、T細胞反応の増幅に関与しているエピトープをコードしていることが知られている。VP1及びVP2で共通する配列は、抗体反応を増幅する少なくとも1つのエピトープをコードする。パルボウイルスの自然感染は、感染から1週間以内に顕著な保護反応を生じる。全VP1遺伝子またはVP1（及びVP2）内のエピトープの発現は、細胞性及び体液性防護の両方または免疫系を介する保護免疫を生じる。
従って、当業者は、パルボウイルスT細胞エピトープの代表としてVP1エピトープをコードする配列、またはパルボウイルスB細胞エピトープの代表としてVP2エピトープをコードする核酸配列またはその両方の組み合わせを含む、ネコ科、イヌ科及びイタチ科の動物を免疫化するためのワクチン調製のために含有する核酸配列を使用することができる。
本発明のワクチンの特に好ましい態様としては、前記核酸分子が完全なVP1オープンリーディングフレーム、例えば、VP1核酸キャプシドタンパク質をコードするリーディングフレームを含有する。ネコ科パルボウイルスの場合、オープンリーディングフレームの完全な長さは2169塩基対である。好ましくは、前記orfは適切な外来プロモーターの制御下で発現される。
本発明のワクチンの更に好ましい態様は、前記エピトープがパルボウイルス遺伝子から誘導されたものであり、前記パルボウイルスはイヌ科、ネコ科またはイタチ科の動物、及び、好ましくは、イヌ、ネコまたはミンクに感染できる。イヌ科、ネコ科またはイタチ科の動物に感染するパルボウイルス遺伝子が全体的に非常に類似していることから、イヌ科、ネコ科またはイタチ科の動物から誘導された核酸により誘導されるワクチンは、前記以外の動物群の免疫化を行うのに使用することができる。
本発明のワクチンの更に好ましい態様においては、少なくとも1つのパルボウイルス特異的エピトープをコードする前記核酸分子は、発現ベクターに含有されており、前記発現ベクターが哺乳類細胞で機能する。
当業者にとっては、本発明を行うために適当な様々な発現ベクターを得ることが可能である。従って、本発明のワクチンの開発を始める基盤となる下記の実施例において列挙されたベクターは、いずれの場合においても本発明を限定するものではない。更に適するベクターは、インヴィトロゲン（Invitrogen）、ヴィカル（Vical）、及びアグラセタス（Agracetus）を含む商社から入手可能であり、当業者によって簡単に製造することができる。
本発明の更なる好ましい態様は、少なくとも1つの付加的な抗原を、前記ワクチンが含有するかまたは前記発現ベクターがコードする、抗パルボウイルスワクチンに関連している。
前記付加的抗原は、パルボウイルス特異的エピトープ免疫反応を増強する機能を果たすことができる。この事において、前記付加的抗原は担体タンパク質の機能を有する。代わりに、異なる病原体に対して異なる抗原は免疫反応を誘導し、よって、多価ワクチンを生ずる機能を果たすこともできる。更に、付加的抗原は両方の機能を果たすことも可能である。
少なくとも1つの付加的な抗原と同様に、少なくとも1つのパルボウイルス特異的エピトープをコードするベクターを作る多くの方法がある。従って、例えば、付加的な抗原をコードする核酸は、少なくとも1つのパルボウイルス特異的エピトープをコードする核酸配列にクローンすることができる。もし、前記パルボウイルス特異的エピトープをコードする前記核酸配列内に適する制限酵素部位がないならば、制限酵素部位を従来法により形成することができる。逆に、前記少なくとも1つのパルボウイルス特異的エピトープをコードする核酸配列を前記少なくとも1つの付加的な抗原をコードするDNA配列にクローンすることもできる。得られたポリペプチドは、融合タンパク質でもよい。代わりに、少なくとも1つのパルボウイルス特異的エピトープ及び少なくとも1つの付加的な抗原が、別々のタンパク質系（proteinuceous）物体として発現されてもよい。
前段の記載から明らかなように、本発明の特に好ましい態様は、前記付加的抗原が免疫原であるワクチンに関連している。
担体分子として効果的であるとされた上記のような免疫原の例は、肝炎B-表面抗原、及び好ましくはヒト肝炎B-表面抗原プレS2タンパク質である。
本発明の更に特に好ましい態様は、組み換え体pGT36VP1を含むワクチンに関する。前記ベクターは完全なVP1オープンリーディングフレームを表す核酸分子を含む。前記ベクター構成の詳細は実施例2に記載されている。
本発明のワクチンの更に特に好ましい態様においては、少なくとも1つのT細胞エピトープをコードする前記核酸分子が、以下の一般化した核酸配列にコードされるエピトープ群から選択される。
0004117027.tif 000002
配列中、Nはいずれの塩基でもよく、Rはプリンを示し、Yはピリミジンを示し、及びHはA、CまたはTを示し、
好ましくは、エピトープが下記の核酸配列によりコードされる。
0004117027.tif 000003
本発明のワクチンの更に特に態様においては、少なくとも1つのB細胞エピトープをコードする前記核酸分子が、以下の一般化した核酸配列によりコードされたエピトープ群から選択される。
0004117027.tif 000004
配列中、Nはいずれの塩基でもよく、Rはプリンを示し、Yはピリミジンを示し、SはGまたはCを及びMはCまたはAを示し、
好ましくは、エピトープが核酸配列によりコードされる。
0004117027.tif 000005
更に好ましい態様においては、本発明のワクチンはT細胞及びB細胞エピトープの両方をコードする核酸の混合物を含む。
本発明のこの態様の例は、前記少なくとも1つのB細胞及びT細胞エピトープをコードする核酸分子が、前述のいずれかの異なる発現ベクターに含有される場合である。
本発明の抗パルボウイルスワクチンの更なる好ましい態様は、前記ワクチンにアジュバントを更に含有する。
免疫化のためのアジュバントは従来技術においてよく知られており、当業者によって、ワクチンの製剤のための前記態様で説明された核酸配列と組み合わせることができる。
本発明の特に好ましい態様は、前記アジュバントがメチル化されていないCpGモチーフを含むDNA分子を含有するワクチンに関する。
DNAはそれぞれ個々の特徴を形成する遺伝情報を含むことが知られてきた。細胞の青写真（blueprint）であるこの役割に加えて、アーサー  クリエグ博士（Dr.Athur Krieg）は、最近、潜在的免疫活性化を起こすCpGモチーフと呼ばれる短鎖DNAを発見した（Nature（1995）、Vol 374、546）。CpGモチーフを有するDNA（「CpG DNA」）は簡単に安価で合成することができ、免疫系を選択的に活性化するために使用することができる。ワクチン効果の増加を含むCpG DNAを介した免疫活性化のための治療的な応用は、ガン細胞の破壊、及び感染の保護または治療のための免疫系を助ける。DNAは自然組織体の一部であり、免疫系を増強するために現在使用されている薬より安全である（米国特許出願番号08/386,063；08/461,036；08/462,799参照）。
本発明は、DNAに基づくワクチン用のアジュバントとして作用するCpGを含有するオリゴヌクレオチドとワクチン用のプラズミドDNAの使用を、初めて組み合わせた。
このワクチンの優れた免疫性質は、下記の実施例において説明されている。
特に好ましいのは、メチル化されていないCpGモチーフを含む前記DNA分子が、
0004117027.tif 000006
である抗パルボウイルスワクチンである。
本発明の抗パルボウイルスワクチンの更に特に好ましい態様においては、前記DNA分子がホスホロチオエート（phosphorothioate）変性バックボーンを含むメチル化されていないCpGモチーフを含有する。
ホスホロチオエート変性は、メチル化されていないCpGモチーフのアジュバント容量を更に強化することが明らかなため、特に有利である（クリエグら、前記参照.）。
本発明のワクチンにより、ワクチンが1度しか与えられない場合にも、効果的な免疫を得ることが可能である。
更に、本発明は、例えば、パルボウイルス疾患に対するイヌ科、ネコ科またはイタチ科の動物の免疫化のためのワクチンを調製するための、種々の態様で特定された核酸またはメチル化されていないCpGモチーフのようなアジュバントまたはそれらの組み合わせのいずれかのような本発明のワクチンの成分の使用と同様に、イヌ科、ネコ科及びイタチ科の動物の予防接種ための本発明の抗パルボウイルスワクチンの使用、必要のある動物に本発明のワクチンを適した分量で投与することによりイヌ科、ネコ科及びイタチ科の動物に予防接種する方法に関する。
好ましくは、前記イヌ科、ネコ科またはイタチ科の動物が、イヌ、ネコまたはミンクである。当業者（ここでは獣医）は適用するべき分量及び投与経路について熟知している。更に、最初及びそれに続く予防接種の好適な時間間隔と同様に、ワクチンの適用回数も公知である。
特に好ましい態様においては、本発明のワクチンは、ワクチンが1回与えられるだけで十分な免疫を誘導する予防接種方法のために使用される（単一投与量免疫（single dose immunization））。
本発明のワクチンは、好ましくは、以下の経路の1つにより投与される；針及び注射器による筋内投与、バイオジェクター2000▲Ｒ▼による筋内投与、針及び注射器による鼻腔内投与、粒子打ち込みによる鼻腔内投与、乱切による鼻腔内投与、静脈内または腹腔内投与。
実施例で本発明を例示する。
実施例１：イヌ科パルボウイルスサブグループの抗原的エピトープの合成
合成デオキシリボ核酸オリゴヌクレオチドが、以下の配列
0004117027.tif 000007
及び相補的鎖の
0004117027.tif 000008
により生成された。
上記配列は、アニーリングした時に、EcoR I及びXho I制限酵素部位に結合する末端及びVP1のT細胞エピトープ、PKIFINLAKKKKAG、をコードする適当なリーディングフレームを含有している。プレS2領域の大部分を削除する工程において、これらのオリゴヌクレオチドは、pCMV-S2S中のヒト肝炎B表面抗原のプレS2領域にあるEco R1及びXho Iサイトにライゲートする（ミッチェル（Michel）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92（1995）、5307-5311）。得られた構築物はpCMVS-VP1eと名づけられた。この構築物のCMVプロモーターから生成されたRNA転写物は、内部出発コドン（AUG）を持つオープンリーディングフレームを含んでいる。第一のAUGが使用された時、VP1エピトープ、S2領域の一部分及び全てのS領域は単一のタンパク質として生成される。内部AUGはSタンパク質のみを生成する。同様にして、下記の配列を持つデオキシリボ核酸オリゴヌクレオチド
0004117027.tif 000009
及びVP2から、ペプチドエピトープSDGAVQPDGGQPAVRをコードする相補的鎖
0004117027.tif 000010
がVP1エピトープと同じ方法により、pCMV-S2Sにクローンされた。得られたプラズミドはpCMVS-VP2eと名づけられた。これらのエピトープをコードする両方のDNA配列は合成配列であり、自然発生パルボウイルスからのDNA配列を表してはいない。
実施例２：イヌ科パルボウイルスVP1-VP2遺伝子のクローニング及びパルボウイルス遺伝子発現プラズミドの構築
イヌ科パルボウイルスVP1（VP1及びVP2）をコードする領域の全てが、ポリメラーゼ鎖反応増幅により、CPVタイプ2aを含有する組織培養上清からクローンされた。プライマーは、VP1のオープンリーディングフレームのすぐ外側に配置され、Not I（下流）及びBamH I（上流）制限酵素部位を含みかつ以下の配列を有する。
5’末端または上流プライマーとして、cgg gat ccG AGA CGA CTT GGA TTA AGG TA、3’末端または下流プライマーとしてgtg cgg ccg CTA GTT GAT ATG TAA TAA AC。
PCR生成物はNot I及びBamH Iにより順番に切断され、同様に切断された細菌発現pGT36とセンス方向でライゲートされた（コンリー（Conry）ら、Cancer Gene Therapy 2（1）（1995）33-38）。VP1（及びVP2）の方向及び配列は、全VP1挿入部をDNA配列分析することにより確認された。このクローンされたDNAはpGT36VP1と呼ばれる。
実施例３：培養細胞におけるクローンパルボウイルスVP1-VP2の発現
ネズミ繊維芽細胞（NIH 3T3）にpGT36VP1クローンが導入された。イヌ科パルボウイルスに対するイヌ科抗血清を用いる免疫蛍光アッセイにより、免疫活性イヌ科パルボウイルスタンパク質の存在について細胞を試験した。染色のパターンはイヌ科パルボウイルスで感染された細胞では確認することができず、陰性（pGT36DNA無し）コントロールは染色されていなかった。これによって、pGT36VP1クローンは抗パルボウイルス抗体により確認されるタンパク質生成物を生成していることが示された。
実施例４：パルボウイルス（エピトープ）核酸ワクチンによるイヌの免疫化
3匹の11週目の高齢子犬が150μg pCMVS-VP1e及び100μgの合成ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、TCCATGACGTTCCTGATGCT（ISO）により、右の大腿四頭筋筋肉から免疫化され、3匹の11週目の高齢子犬は150μgのpCMVS-VP2e及び100μg ISOで免疫化され、3匹の11週目の高齢子犬は150μgのpCMVS-VP1e、150μgのpCMVS-VP2e及び100μgのISOで免疫化された。子犬は3週間後に同じ投与量で免疫強化され、担体タンパク質、肝炎B表面抗原、及びイヌ科パルボウイルスエピトープに対する抗体力価の変化が観察された。pCMVS-VP1e及びpCMVS-VP2eを投与された動物及びpCMVS-VP2e群においては、顕著な抗体反応が肝炎およびイヌ科パルボウイルスの両方において見られた。pCMVS-VP1eはT細胞エピトープを示すため、イヌ科パルボウイルスに対する抗体反応は予測されなかった。この予測は実験的に確認された。反応は、pCMVS-VP1eプラスpCMVS-VP2eにおいて最大であり、これは多価ワクチンがより効果的であることを示している。
実施例５：パルボウイルスVP1及びVP2遺伝子を発現する核酸による動物の免疫化
（a）pGT36VP1により免疫化された3匹のBalb-cネズミの1匹は、プラズミド1μgによる粒子打ち込みの1週間の後に、免疫化されており、特に、イヌ科パルボウイルスに対する抗体反応を示した。
（b）抗イヌ科パルボウイルス抗体力価の無い3匹の幼いビークル犬（約6ヶ月）を、150μgのpGT36VP1及び100μg ISOにより、右の大腿四頭筋筋肉から免疫化した。顕著な抗イヌ科パルボウイルス抗体反応が、１匹では2週間で構築され始め、3匹の動物において少なくとも3週間増加を続けた。対照ビーグルとしてベクターDNA及びISOを投与したものは、抗体力価に変化はなかった。
（c）抗イヌ科パルボウイルス抗体力価を有さない6匹の幼犬を400μgのpGT36VP1で、右の大腿四頭筋筋肉から免疫化した。これらのイヌのうち、3匹には、更に免疫増強アジュバントとして400μgの大腸菌由来DNAをpGT36VP1と共に投与した。6匹全てが抗パルボウイルス抗体反応を免疫化の2週間以内に示し、3から5週間目で保護可能な力価を明らかに超えた力価に達した。免疫増強DNAを受けた3匹は、CpG免疫増幅強化を示す高い抗体力価に、他のイヌよりもより早くより達した。
実施例６：核酸ワクチン発現パルボウイルスVP1及びVP2による免疫化されたイヌのイヌ科パルボウイルス感染の攻撃からの保護
（a）実施例5において免疫化された3匹のビーグル犬は、パルボウイルスワクチン投与において鼻腔内経路を介して使用された標準3価の量のイヌ科パルボウイルスで試験された。いずれのイヌもパルボウイルスに関連した病状は見られず、これは疾病からの保護を示している。2匹のイヌはわずかな抗イヌ科パルボウイルス抗体反応の増加を示し、便からのパルボウイルスの流出は無く、予備投与の傾向と一致しており、これは感染からの完全な保護を示している。対照ビーグルは投与後、抗イヌ科パルボウイルス抗体反応の顕著な増加を伴うパルボウイルス疾患の症状を示した。
（b）抗イヌ科パルボウイルス抗体力価を有さない4匹の幼犬を、筋内投与を介して200、400、600及び800μgのプラズミドpGT36VP1で免疫化した。全てのイヌが抗イヌパルボウイルス抗体を1週間以内に生じ、2週間以内に保護力価のピークに達した。陰性コントロールとして生理食塩水を投与したイヌは、抗イヌ科パルボウイルス抗体を発生しなかった。600μgのプラズミドDNAを注射されたイヌは、他のイヌに比べて長く抗体力価を保持した。全てのイヌに、最初の投与から16週後、同じ分量の同じ調製物を再度投与した。陰性コントロール及び200μg以外の全てのイヌは、既往症抗体反応を示した。陰性コントロール以外の200μg投与を含めた全てのイヌは、保護を発生することが知られている再注射の後、血清中和抗体力価を示した。全てのイヌは、最初の注射の24週間後に、免疫化していない犬において発病の原因になると知られている3種の単離ウイルスを含む毒性街上ウイルスを注射された。pGT36VP1核酸ワクチンで免疫化された全てのイヌは、感染及び疾病から保護された。陰性対照犬はイヌ科パルボウイルスの典型的な臨床的疾病を発病し、ウイルスを便に排出した。この実験は、最初の及び効果を高める次の注射で与えた200μgから800μgプラズミドの範囲にあるpGT36VP1の投与量が、抗体力価の生成を刺激し、毒性の攻撃に対する保護を形成することを示した。
（c）抗イヌ科パルボウイルス抗体力価を持たない3匹の幼犬に150μgのpGT36VP1プラスCpGsを含有するように合成されたオリゴヌクレオチドDNA150μgを注射した。全てのイヌが抗イヌ科パルボウイルス抗体を形成し、毒性ウイルスの攻撃から保護された。この実験により、免疫化が免疫刺激性オリゴヌクレオチドにより増幅された時、低い分量のpGT36VP1による免疫化が保護免疫を与えることが示された。
（d）抗イヌ科パルボウイルス抗体力価を有さない6匹の幼犬に、単一分量200から800μgのpGT36VP1を注射した。全てのイヌが始めに抗イヌ科パルボウイルス抗体力価を形成し、免疫化の12週間後、それは検出不可能なレベルまで減少した。効果を高める次の免疫化を投与しないで、全てのイヌは毒性ウイルスによる攻撃を受けたが、いずれのイヌも感染または病気にはならなかった。この実験は、保護免疫がpGT36VP1の単一投与後に達成され、この保護は測定可能な抗イヌ科パルボウイルス抗体の存在には依存していないことが示された。この結果から、細胞免疫が長期生存免疫記憶T細胞に授与されたと解釈することができる。
これらの研究は、ネコ科パルボウイルスサブグループから選択されたDNA配列が動物発現プラズミドに挿入された時に、培養細胞及び動物内で細胞に導入することが可能であることを示した。更に、我々のDNA発現プラズミドは動物内で抗体反応を呼び出し、毒性ウイルス攻撃に対する保護に導くことが示された。