(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネの種子由来のカルスと根由来のカルスとにおいてセルラーゼ活性を測定し、比較することを含み、前記種子由来のカルスのセルラーゼ活性が前記根由来のカルスのセルラーゼ活性よりも低いことにより前記種子由来のカルスの再分化能が高いと評価することを特徴とする、前記種子由来のカルスの再分化能を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【００００】
【発明の属する技術分野】
遺伝子組み換え植物の作成にあたって、カルスの再分化能力の判別手法に関する。
【０００１】
【従来の技術】
近年、遺伝子組み換え技術が進歩し、遺伝子組み換えによる研究が各分野で行われている。植物体における遺伝子組み換えは、遺伝子導入を行ったカルスを植物体に戻すことで実施されることがほとんどである。
このカルスは、植物組織からホルモン処理によって得られる増殖能力の高い細胞である。カルスは植物体からむき出しになった裸の状態に近いため、外部からの遺伝子導入が容易である。そして、遺伝子導入されたカルスを植物体に戻すことにより遺伝子組み換え植物ができあがるわけであるが、全てのカルス細胞が植物体に戻り易いわけではなく、どのカルス細胞が植物体に戻り易い（再分化能力が高い）かを見分けられれば、遺伝子組み換え植物を作成し易いか否かが判別できる。
従来は、どのカルスがより再分化能力を有しているかを見分けられないため、試行錯誤の上実験を行い、遺伝子組み換え植物の作成が甚だ非効率であった。
従って、効率の良い実験手法の開発が待たれていたところである。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子組み換え植物を作成するにあたって、再分化能力が高いカルスの判別手法を開発することを課題とする。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、鋭意努力した結果カルスの酵素活性を分析し、特にセルラーゼの酵素活性に着目することで解決できることを見出した。
すなわち、本発明は、
（１）カルスの酵素活性を測定することによってカルスの再分化能を評価する方法、
（２）カルスのセルラーゼ活性を測定することを特徴とする遺伝子組み換え植物の作成方法
に関する。
【０００４】
【発明の実施の形態】
遺伝子導入を行ったカルスを植物体に戻す際の、植物の形態形成に関わる要因として細胞壁に着目し、細胞壁を分解する酵素の酵素活性を測定した。
細胞壁を分解する酵素としては、キシログルカナーゼ、パキマナーゼ、β-グルカナーゼ、セルラーゼ、アラビノキシラナーゼ等がある。検体として、種子から誘導したカルスと根から誘導したカルスのこれらの酵素活性を測定したところ、図１に示すように、種子からのカルスのセルラーゼ活性が０となり、根からのカルスに比し特異的な酵素活性の数値となった。そして、種子からのカルスが再分化能力を有する（再分化効率２０％）のに対して、根からのカルスは再分化能力を有していない（再分化効率２％以下）。すなわち、セルラーゼ活性の検出されない方が、再分化能力を有することが判明した。
【０００５】
言い換えれば、セルラーゼ活性の有無を測定した後、セルラーゼ活性のないカルスを用いて遺伝子を導入し、そのカルスを植物体に戻せば、効率的に遺伝子組み換え植物を作成することができることを見出した。
なお、実施例ではカルスＡとして種子を用いているが、種子以外の例えば葉についても、同様の結果が得られることが判明している。
本発明を更に詳細に説明するために、実施例を記載するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０００６】
【実施例】
以下の手順でカルスを培養し、再分化能力を測定した。
▲１▼  稲種子及び根をカルス誘導培地（表１、ＣＩＭ）に植え付けて、暗所２８℃において２週間培養した。
▲２▼  稲種子及び根の表面にでてきたカルス塊をピンセットではずし同じ培地に植え換えて、同条件で２週間培養した。
▲３▼  大きくなったカルス塊１ｇを５００mlのバッフル付きフラスコに培養液（表１、ＣＳＭ）１００mlを入れ、８５RPM、２８℃、１２時間日長（光強度３０００Lx以下）で液体振盪培養を行った。１週間毎に植え換えた。
▲４▼  植え換え時に直径1mmのふるいにかけて、下に落ちてきたカルスを０.１mmのふるいで受け止めた粒径のものを新しい培地（表１、ＣＳＭ）に植えた。
▲５▼  酵素の分析は培地に植え付けて１週間の培養後に行った。全ての粒径のカルスを0.1mmのふるいで回収した。
▲６▼  このカルスの一部を固体再分化培地及び液体再分化培地に植え付けた。
固体培地（表３）の場合は、３０００Lxで１６時間日長で２ヶ月静置培養した。
【０００７】
液体培地（表４、表５）の場合は、３０００Lxで１６時間日長で１２０rpmの振盪培養を行った。１００mlの三角フラスコに入れた２０mlの初期誘導培地に２００mgのカルスを植え付けた。２週間後に交換培地（４０ml）に入れ替え、更に３週間培養を行った。
▲７▼  植物体の再分化率を測定した。
【０００８】
【表１】
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【０００９】
【表２】
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【００１０】
【表３】
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【００１１】
【表４】
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【００１２】
【表５】
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【００１３】
その結果、稲種子のカルス（カルスＡ）を植え付けた再分化培地では、２０％の再分化率を示したが、稲の根のカルス（カルスＢ）では、２％以下の再分化率であった。
一方、酵素の分析は下記の方法により、実施した。
【００１４】
１．酵素抽出方法
▲１▼  １週継代後の培養液を０４５μmのセルロースアセテート膜で濾過。
▲２▼  ３００ｍｌの濾過液のｐＨを１Ｎのアンモニア水でｐＨ調整し７.０へ。これ以降の操作は４℃で。
▲３▼  固形の硫酸アンモニウム（１００μmのメッシュで漉したパウダー）を培養濾液１リッター当たり４３６ｇ（７０％飽和濃度）徐々に加えた。
▲４▼  ｐＨを１Ｎのアンモニア水でｐＨ調整し７.０へ。氷にこの培養濾液を浮かべ、１６時間放置。
▲５▼  ４℃、５０００ｇ、１５分遠心分離して、硫酸アンモニウム沈殿物を集めた。
▲６▼  沈殿物を透析用緩衝液（下記成分表）３mlに溶かし、１６時間透析。
▲７▼  限外濾過膜（アミコンＹＭ-１０）で透析物を１ml以下に濃縮。
▲８▼  この濃縮物を活性測定のために使用した。
【００１５】
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【００１６】
２．酵素活性測定方法
キャノンマニングのセミミクロ粘度計（Ｎｏ.１００）を恒温水槽に入れ、３５℃の条件で測定を行った。表３の基質０.５４mlを粘度計に入れ、１０分プレインキュベーション。抽出液を０.０６ml添加し、攪拌し、反応開始。１５分後反応溶液の落下速度を測定した。この時抽出液は、希釈して各サンプル間の蛋白量を一定に揃えておいた。
式１を用いて、コントロール（抽出液の代わりに酵素の入っていない緩衝液を用いた）落下時間に対して、酵素による落下時間の減少（粘度低下）で活性を表した。
【００１７】
式１  粘度低下＝１−（１５分後の落下時間÷コントロールの落下時間）
それぞれの落下時間から水だけ入れた時の落下時間（６０秒）はあらかじめ引いておいた。
なお、酵素活性量の単位は、抽出液０.０６mlを用いて、１５分の反応後に粘度低下が１となった時、酵素活性量を１ユニットと定義する。
【００１８】
【表６】
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【００１９】
その結果、図１のようになり、カルスＡのセルラーゼが０.０となり、カルスＢの０.１５と比して、顕著な相違が示された。
以上の結果から、セルラーゼ活性が０のカルスＡが再分化能が高いことが判明した。すなわち、セルラーゼ活性が０に近い程、再分化能が優れていることを解明することができた。
【００２０】
【発明の効果】
本発明により、再分化能力（カルス細胞の植物体への戻り易さ）を評価する手法が確立されたので、再分化能力の高い細胞を見分けて実験することができ、遺伝子組み換え植物の作出効率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素活性分析を示す図である。
【図１】
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