(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレイ中の少なくとも１種のサンプルを分析する方法において
（ａ）前記アレイ中の少なくとも１種のサンプルと他のサンプルとの間の相対的位置のイメージを記録する工程、
（ｂ）ｉｎ  ｓｉｔｕで、前記少なくとも１種のサンプルに単数の試薬または一連の試薬を適用するために前記記録したイメージを利用する工程、
（ｃ）前記少なくとも１種のサンプルの、単数または複数の試薬に対する反応または当該試薬との反応について分析する工程、
からなる方法。
【請求項２】
サンプルはタンパク質、ペプチド、糖、脂質、核酸分子、糖タンパク質を含む複合バイオ分子、ならびにそれらの混合物からなる群より選択されるバイオ分子である請求項１記載の方法。
【請求項３】
バイオ分子はクロマトグラフィーで分離されサンプルのアレイを形成する請求項２記載の方法。
【請求項４】
クロマトグラフィーは電気泳動である請求項３記載の方法。
【請求項５】
電気泳動はポリアクリルアミドゲル中で実施される請求項４記載の方法。
【請求項６】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動は一次元で行われる請求項５記載の方法。
【請求項７】
一次元電気泳動は、等電点電気泳動、ネイティブなポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動からなる群より選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動は二次元で行われる請求項３記載の方法。
【請求項９】
第一次元は等電点電気泳動により、第二次元はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により実施する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
バイオ分子は電気泳動によって分離され、固体支持体上に移送される請求項４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
固体支持体は、ポリビニリデンジフルオリド、ニトロセルロース、ナイロン、テフロン、ジテックス、ポリプロピレン、ＰＴＥＥおよび１種または２種以上の官能基を有するそれらの誘導体化型からなる群より選択される請求項10記載の方法。
【請求項１２】
固体支持体上に移送されたバイオ分子は、染料、蛍光基または金属との会合または第三のバイオ分子、染料、蛍光基または金属とカップリングされた第二のバイオ分子との会合により可視化される請求項10または11記載の方法。
【請求項１３】
前記アレイはイメージの記録を補助するために平面内に配置される請求項１〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
イメージは電子工学的にまたはデジタル的に記録される請求項１〜13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
サンプルの可視化が可能なように染色または照明されたサンプルの走査からイメージを発生させて、単数または複数の試薬の適用は単数または複数の試薬が化学プリンターにより所望のサンプルを放出する化学プリンター適用システムを用いて行われる請求項13または14記載の方法。
【請求項１６】
アレイ中の同一サンプルまたは多数の異種サンプルの一連の操作を実施できるように、工程（ａ）および（ｂ）をくり返す、請求項１〜15のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
一連の操作は同一の試薬、同一セットの試薬、または多数の異なる試薬で実施する請求項16記載の方法。
【請求項１８】
分析は、液体クロマトグラフィー、光電気、光化学、レーザー、放射化学またはマススペクトル分析による請求項１〜17のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
サンプルから得られた反応生成物が直接分析に供される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アレイ中の少なくとも１種のサンプルを分析するための装置において、
（ａ）前記アレイ中の少なくとも１種のサンプルと他のサンプルとの間の相対的位置のイメージを記録する手段；
（ｂ）ｉｎ  ｓｉｔｕで、前記少なくとも１種のサンプルに単数の試薬または一連の試薬を適用する手段；
（ｃ）前記少なくとも１種のサンプルの、単数または複数の試薬に対する反応または当該試薬との反応を分析する手段；および
（ｄ）手段（ａ）によって決定されたアレイ中の前記少なくとも１種のサンプルと他のサンプルとの間の相対的位置により、前記少なくとも１種のサンプルに手段（ｂ）によって試薬を適用する手段（ｂ）の制御手段
を包含する装置。
【請求項２１】
装置はさらに手段（ｃ）によって得られた分析結果を記録するための手段を包含する請求項20記載の装置。
【請求項２２】
手段（ａ）は、スキャナー、光検出器、荷電カップリング装置からなる群より選択される請求項20または21記載の装置。
【請求項２３】
手段（ｂ）はサンプルに１種または２種以上の試薬を適用するために採用される化学プリンターである請求項20〜22のいずれかに記載の装置。
【請求項２４】
手段（ｂ）は試薬送達および抽出装置であって、
当該試薬送達および抽出装置は：
液体源；
液体制御手段；
アレイ中のサンプルに液体を送達し、アレイ上のサンプルに適用された液体を採取するための液体送達および採取装置；
アレイ中のサンプルからの反応生成物を保持できる抽出装置；
液体源から液体送達および採取装置への液体の移動を制御するための、及び、サンプルから液体送達および採取装置を介しての抽出装置への液体の移動を制御するための制御装置；を包含し、
この場合、使用時には、サンプルから反応生成物を産生できる液体が、制御装置の作用によって、液体源から、液体送達及び採取装置へ液体制御手段を介してアレイのサンプルに適用され、
しかも、サンプルに適用された液体の一部は制御装置の作用により液体送達および採取装置を通って抽出装置に集まる、
請求項20〜22のいずれかに記載の装置。
【請求項２５】
液体制御手段は三方バルブである請求項24記載の装置。
【請求項２６】
制御装置は液体送達および採取装置のための第一の制御装置と、抽出装置のための第二の制御装置からなる請求項24記載の装置。
【請求項２７】
第一および第二の制御装置はピエゾ電気制御装置である請求項26記載の装置。
【請求項２８】
液体はサンプルと反応して抽出装置によって保持できる検出可能な生成物を産生できる試薬である請求項24記載の装置。
【請求項２９】
抽出装置はクロマトグラフィーパッキングのカートリッジである請求項24記載の装置。
【請求項３０】
手段（ｃ）は液体クロマトグラフ、光電気検出器、光化学検出器、レーザー検出器、放射化学検出器およびマススペクトロメーターからなる群より選択される請求項20〜29のいずれかに記載の装置。
【請求項３１】
手段（ｄ）は、（ｂ）を制御するようにプログラムされたコンピューターとする請求項20〜30のいずれかに記載の装置。
【請求項３２】
アレイが、半固体または実質的に固体の支持体上にある請求項20〜31のいずれかに記載の装置。
【請求項３３】
分析されるサンプルは約100mm2未満、好ましくは約50mm2未満、さらに好ましくは約１〜10のmm2の面積を有する請求項32記載の装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はサンプルのアレイ中の１種または２種以上のサンプル好ましくはバイオ分子を分析する方法およびこれらの方法を実施するための装置に関する。
背景技術
実験室技術および実務の改良は、絶え間なく数の増加する新しいバイオ分子の発見を招来してきた。新しいタンパク質の精製および検出方法は、たとえば多くの、多分新しいタンパク質の検出を可能にしてきた。多数の既知のバイオ分子により、新しく発見された分子が、既知の分子とどの程度類似するかまたは相違するかを決定するため、新しく発見された分子の分子比較を実施する必要がある。タンパク質の決定的な分析を行うためには、たとえば、アミノ酸配列情報を得ることが必要である。残念ながら、このような分析の現在の方法および装置は遅く同時に１個または数個のサンプルしか分析できない。現在では、与えられたタンパク質の分析を実施するためには、実質的に純粋な単離された形態でタンパク質を得ることが必要である。サンプルのアレイからの１個の所望のサンプルを分析できるか、または多重のサンプルを分析できる方法および装置が必要である。
本発明は、これらのタイプの分析を実施するのに適当な改良された方法および装置を開発することが可能であることを実際に示したものである。
発明の開示
本発明は一般的に、サンプルのアレイ中の少なくとも１種のサンプルを、そのアレイ中の他のサンプルとの間の相対的位置のイメージを記録し、その記録されたイメージを利用してｉｎ  ｓｉｔｕで少なくとも１種のサンプルの分析を可能にすることにより分析する方法に関する。
第一の態様においては、本発明は、アレイ中の少なくとも１種のサンプルを分析する方法であって、
（ａ）前記アレイ中の少なくとも１種のサンプルと他のサンプルとの間の相対的位置のイメージを記録する工程、
（ｂ）ｉｎ  ｓｉｔｕで、前記少なくとも１種のサンプルに単数の試薬または一連の試薬を適用するために前記記録したイメージを利用する工程、
（ｃ）前記少なくとも１種のサンプルの、単数または複数の試薬に対する反応または当該試薬との反応について分析する工程、
を包含する方法である。
好ましい形態においては、サンプルは、タンパク質、ペプチド、糖、脂質、核酸分子、糖タンパク質を包含する複合バイオ分子、ならびにそれらの混合物からなる群より選択されるバイオ分子である。バイオ分子は好ましくは、クロマトグラフィーにより分離され、サンプルのアレイを形成する。クロマトグラフィーは好ましくは電気泳動であり、さらに好ましくは電気泳動はポリアクリルアミドゲル中で実施される。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、等電点電気泳動、ネイティブなポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を包含し、一次元において実施することができる。また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、最初の次元を等電点電気泳動、第二の次元をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で行う二次元において実施することもできる。
好ましくは、電気泳動によって分離されたバイオ分子は半固体または固体支持体に移送される。固体支持体は、ポリビニリデンジフルオリド、ニトロセルロース、ナイロン、テフロン、ジテックス、ポリプロピレン、ＰＴＥＥおよび１または２以上の官能基を有するそれらの誘導型で作られた膜とすることができる。
好ましくは、半固体または固体支持体に移送されたバイオ分子は、染料、蛍光基もしくは金属と会合させて、または第三のバイオ分子、染料、蛍光基もしくは金属とカップリングさせた第二のバイオ分子と会合させることによって可視化される。サンプルのアレイは好ましくは、イメージの記録を補助するために一平面にある。
本発明の好ましい実施態様においては、イメージは、サンプルの可視化を可能にするために染色または照射したサンプルの走査によって発生させ、試薬（単数または複数）の適用は「インク-ジェット」をベースとした化学プリンター、または試薬（単数または複数）を化学プリンターにより所望のサンプルに放出する類似の適用システムを用いて実施される。
マニュピレート（操作）されるアレイは、イメージが得られたアレイである必要はないことを理解すべきである。たとえば、サンプルの多くの同一のアレイを作成し、イメージを得るために１つのアレイを用いることは可能であるが、多くの同一のアレイの１または２以上を使用して、マニュピレーション（操作）を行うこともできる。たとえば、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ  ＰＡＧＥ）によるタンパク質の分離においては、１つの分離ゲルを２以上の支持体にブロットしてもよく、また多くの同一の分離を実施して、それぞれを支持体に移送し、同一のアレイを形成させてもよい。
分析は、本技術で周知の任意の方法によることができる。適当な例には、液体クロマトグラフ、光電、光化学、レーザー、放射化学およびマススペクトル分析の使用が包含される。サンプルは与えられた反応生成物について直接分析することができる。また、試薬がアレイ中の１つのサンプルに適用され処理サンプルの１つに到達した場合には、サンプルのアレイを分析することが可能であり、反応生成物の検出は処理サンプルの１つに由来するものとして帰属される。
イメージは、電子工学的またはデジタルイメージとしての記録を含めて任意の適当な手段で記録することができる。一つの好ましい形態では、イメージはサンプルを可視化することを可能にするため染色または照明されたサンプルの走査によって発生させ、試薬（単数または複数）の適用は化学プリンターにより所望のサンプルに試薬（単数または複数）を放出する化学プリンター適用システムを用いて実施する。
工程（ａ）および（ｂ）は、同一サンプルまたはアレイ中の多数の異なるサンプルの一連のマニュピレーションを実施できるように反復（くり返す）または循環させることが可能であると理解すべきである。多くのマニュピレーションは、同一の試薬、同じセットの試薬または多数の異なる試薬によることができる。
分析は好ましくは液体クロマトグラフィー、光電、光化学、レーザー、放射化学、およびマススペクトル分析による。サンプルは直接、与えられた反応生成物について分析できる。
アレイ中のサンプルのイメージを発生させるためには、通常、それらは何らかの様式で同定することが必要である。サンプルの可視化マーカーによる標識は、荷電カップリング装置（ＣＣＤ）でサンプルの位置の可視化を可能にする方法の一例である。ついで標識したサンプルの走査によってデジタルとして記録し、たとえばコンピューター内に保存する。イメージがたとえばデジタルの形態で記録されたならば、イメージは電子工学的に維持されているのでアレイ上にサンプルの可視化を維持しておく必要はない。サンプルの位置がＸ/Ｙグリッド上に記録されれば、これはサンプルの位置を電子工学的またはデジタル的にアクセスする一方法である。コンピューターはまた、工程（ｂ）における試薬のマニュピレートすべきサンプルの位置への適用を制御する。サンプルへ送達される化学剤の量は、白黒印刷のための灰色のスケールと同様に調節されることになる。すべてのサンプルの位置はグリッド上のそれらの座標から知られ、サンプルがなお可視化されているかどうかには無関係に更なるマニュピレーションが可能である。
本発明は、とくにタンパク質ブロットのようなアレイ上の、１または２以上のサンプルの多重分析にとくに適している。この方法は、たとえば二次元ゲル電気泳動によって分離されたタンパク質およびタンパク質に由来するペプチドのＮ-およびＣ-末端の定量に適用できる。この方法は多重サンプルの抗体または抗原アッセイ等に使用することが可能であり、本方法は初期の反応の結果に基づいて異なる以後の工程を可能にすることに留意すべきである。
好ましい一形態においては、本発明は、サンプル中の分子と検出可能な反応を生じるように固体支持体上に吸着されたサンプルに化学試薬をスプレーする化学プリンターの開発に関する。サンプルの分子の化学的誘導体の分析は、レーザー脱着イオン化によることができるが、それはなお、支持体上に吸着されている。さらに、レーザー脱着技術は、正確にサンプルの異なる領域を目標にすることができるので、化学の各サイクル後に同一サンプルの異なる部分を分析することが可能である。
本発明での使用に適当な化学印刷システムには、DNA Diagnosticsにおける微小分配液体のピエゾ電気のドロップ-オン-デマンドインク-ジェット印刷技術またはCombion, Inc.の「ケム-ジェット」と呼ばれる合成方法の使用が包含される。DNA Diagnosticsのドロップ-オン-デマンド液体分配を探究するには、八液体プリンターがNational Institute of Standards and Technology（USA）により資金を提供されてGenosensor Technology Development（GTD）プロジェクトの部分として開発された。現在までの研究は、固体支持体上へのオリゴヌクレオチドマイクロスポットの「印刷」に集中されてきた。California Institute of Technologyで開発された「ケム-ジェット」技術では、試薬含有液体の小容量を、インク-ジェットプリンターがページ上の小ドットに縁をつけるように固体基質の特異的なスポットまたは位置に縁づけをする。この方法でヌクレオチドが修飾された場合、一つまたは他の構築ブロックの小セットで各位置に繰り返し戻ることにより、短いＤＮＡ鎖（オリゴヌクレオチド）の巨大な二次元ライブラリーが組立られる。
ＧＴＤおよび「ケム-ジェット」はアナライザーというよりむしろセンサー／合成装置である。したがって、本発明はインク-ジェットアセンブリー技術の新規な応用を包含する。
多くの異なる化学が、支持体上のサンプルに対しｉｎ  ｓｉｔｕでとくにタンパク質に対しマイクロプレパラティブな固定化ｐＨ勾配等電点クロマトグラフィーの最近の開発を参考に実施できることを理解すべきである。実験室的な例には、可視化タンパク質スポットの酵素消化、染色されたタンパク質スポットに付着したオリゴ糖の酵素的および化学的放出、ならびに抗体／抗原反応が包含される。このような分析は化学プリンターにより継続的に実施できることを理解すべきである。化学的プリンターの更なる応用には二次元電気泳動によって分離された全タンパク質に対する大規模なエドマン化学およびＣ-末端化学がある。
プリンターには他の多くの置換が可能である。すなわち、
ｉ）エドマン化学のサイクルに続いて単一（または少数の）タンパク質のエンドペプチダーゼ消化後のペプチドの分析。化学の各サイクルから放出されたアミノ酸は、レーザー脱着ＴＯＳ-ＭＳをタンパク質を同定するバイオインフォーマティクスアプローチと組合わせて使用して分析される。
ii）他のマクロ分子、たとえば薄層クロマトグラフィーまたは他の支持体上で分離された炭水化物と脂質の複合体。
iii）エドマン化学の最初のサイクルを印刷したのち、アミノ酸の不存在下に検出されるブロックされたタンパク質については、ついで支持体はエンドプロテイナーゼにより印刷される。消化後、支持体をついで特定の配列モチーフに特異的な末端基ブロック試薬の「印刷」に付す。たとえばエンドプロテイナーゼＡsp-Ｎ消化およびエドマン化学の１サイクル（または「印刷」）後に、支持体をＮ-末端Ｐroをもつペプチドのみを残しすべてのα-アミノ基をブロックするo-フタルアルデヒド（ＯＰＡ）で印刷される。別法として、トリプシン消化、エドマン化学の１サイクルおよびＯＰＡの印刷後、その方法はモチーフＬys/Ａrg-Ｘaa-Ｐroに特異的である。これらのブロックされていないペプチドは上記（ｉ）によって分析できる。
第二の態様においては、本発明は、本発明の第一の態様を実施するための装置から構成される。
アレイ中の少なくとも１種のサンプルを分析するための装置は以下の装置を包含する。すなわち、
（ａ）前記アレイ中の少なくとも１種のサンプルと他のサンプルとの間の相対的位置のイメージを記録する手段；
（ｂ）ｉｎ  ｓｉｔｕで、前記少なくとも１種のサンプルに単数の試薬または一連の試薬を適用する手段；
（ｃ）前記少なくとも１種のサンプルの、単数または複数の試薬に対する反応または当該試薬との反応を分析する手段；および
（ｄ）手段（ａ）によって決定されたアレイ中の前記少なくとも１種のサンプルと他のサンプルとの間の相対的位置により、前記少なくとも１種のサンプルに手段（ｂ）によって試薬を適用する手段（ｂ）の制御手段、
を包含する装置。
装置はさらに、手段（ｃ）によって得られた分析結果を記録する手段を包含してもよい。
好ましくは、手段（ａ）は、スキャナー、光検出器、荷電カップリング装置からなる群より選択される。
手段（ｂ）は、サンプルに１種または２種以上の試薬を適用するために採用される化学プリンターであってもよい。別法として、手段（ｂ）は、試薬送達および抽出装置であって、
当該試薬送達および抽出装置は：
液体源；
液体制御手段；
アレイ中のサンプルに液体を送達し、アレイ上のサンプルに適用された液体を採取するための液体送達および採取装置；
アレイ中のサンプルからの反応生成物を保持できる抽出装置；
液体源から液体送達および採取装置への液体の移動を制御するための、及び、サンプルから液体送達および採取装置を介しての抽出装置への液体の移動を制御するための制御装置；を包含し、
この場合、使用時には、サンプルから反応生成物を産生できる液体が、制御装置の作用によって、液体源から、液体送達及び採取装置へ液体制御手段を介してアレイのサンプルに適用され、
しかも、サンプルに適用された液体の一部は制御装置の作用により液体送達および採取装置を通って抽出装置に集められる。
抽出装置は本発明では必ずしも必要ではないが、処理サンプルのある種の分析が要求する場合には有用である。たとえば、抽出装置はサンプルを電気スプレーマススペクトロメーターに導入するのにとくに適している。抽出装置は、しかしながら、サンプルをＭＡＬＤＩ-ＴＯＦへ導入するのには、この装置が、塩に著しく耐容性であるので必ずしも必要ではない。
好ましくは、液体制御手段は三方バルブである。
好ましくは、制御装置は液体送達および採取装置（サンプリング装置）のための第一の制御装置と、抽出装置のための第二の制御装置から構成される。さらに好ましくは、第一および第二の制御装置はピエゾ電気制御装置である。
液体は好ましくはサンプルと反応して抽出装置によって保持できる検出可能な生成物を産生できる試薬である。抽出装置は好ましくはクロマトグラフィーパッキングのカートリッジである。
好ましい形態においては、手段（ｃ）は液体クロマトグラフ、光電気検出器、光化学検出器、レーザー検出器、放射化学検出器およびマススペクトロメーターからなる群より選択される。手段（ｄ）は手段（ｂ）を制御するようにプログラムされたコンピューターとすることができる。
サンプルのアレイは好ましくは半固体または実質的に固体の支持体上にある。本発明の一つの利点は、きわめて小さなサンプルが処理され分析されることである。本発明の装置は約100mm2未満、好ましくは約50mm2未満、さらに好ましくは約1〜10のmm2の面積をもつサンプルの分析にとくに適している。しかしながらさらに小さいサンプルも、本発明で分析できることに留意すべきである。
本明細書を通じて、とくに他の指示がない限り、「からなる」またはその変化として「構成される」もしくは「構成する」の語は、述べられた要素の全体もしくは各個または要素群の全体もしくは各個を包含することを意味するものと理解すべきであるが、他の要素の全体もしくは各個または要素群の全体もしくは各個を排除するものではない。
本発明がさらに明瞭に理解されるため、以下の実施例および添付の図面を参照しながら好ましい形態について説明する。
【図面の簡単な説明】
図１は、アレイの成分またはサンプルに関する情報を得る方法を示す本発明の好ましい実施態様の模式的な表示であり、アレイ中の少なくとも１個の成分またはサンプルの位置のイメージを取得または記録し、少なくとも１個の成分またはサンプルのｉｎ  ｓｉｔｕでのマニュピレーションを可能にするように記録されたイメージを使用する方法を示す。
図２は、アレイの成分またはサンプルの少なくとも１個の成分またはサンプルのイメージング、マニピュレーティングおよび分析のための本発明の第二の態様による装置の好ましい実施態様の模式的な表示である。
図３ａはポリビニリデンジフルオリド膜に移送されたタンパク質混合物のアミドブロック染色二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ-ＰＡＧＥ）分離の形態でのアレイのイメージを示す模式的な表示である。
図３ｂは、ピクセル座標を与えられたサンプルに所望のマニュピレーションを指示するための座標に変換した図３ａに示したアレイの処理したデジタルイメージの模式的な表示である。挿入図は３種の選ばれたタンパク質とそれらの座標を強調するものである。
図３ｃは、図３ｂに示す選択されたタンパク質サンプルの座標により指示される試薬分配装置の模式的な表示である。
図３ｄは、レーザー脱着マススペクトロメーターのレーザー光線と「並列」である座標によって指示される処理タンパク質サンプルの模式的な表示である。脱着生成物はマススペクトロメーターにより検出し、データ管理システムによって解釈された。
図４ａは、337nm窒素レーザーを用いてＰＶＤＦ膜から直接脱着されたヒトα1-アンチトリプシンペプチドのＭＡＬＤＩ-ＴＯＦマススペクトルを示す。
図４ｂは、337nm窒素レーザーを用いてＰＶＤＦ膜から直接脱着されたペプチド1641.86m/zの詳細な同位元素分割を示す。
図４ｃは、337nm窒素レーザーを用いてＰＶＤＦ膜から直接脱着されたペプチド2090.09m/zの詳細な同位元素分割を示す。
図５ａは、抽出溶液試薬をアレイ上のサンプルに送達する機構の模式的な表示である。
図５ｂは、アレイからピアゾ電気装置を用いて液体サンプルを摘出する機構の模式的な表示である。
図５ｃは、逆相パッキング支持体上に濃縮されたサンプルをピエゾ電気装置を用いて洗浄する機構の模式的な表示である。
図５ｄは、逆相パッキング支持体上に濃縮されたサンプルをピエゾ電気装置を用いて溶出する機構の模式的な表示である。
図６ａは、ピエゾ電気装置を用いた逆相パッキング支持体の洗浄液からのサンプルを示すＭＡＬＤＩ-ＴＯＦマススペクトルである。
図６ｂは、ピエゾ電気装置を用いた逆相パッキング支持体からの最初の溶出液を示すＭＡＬＤＩ-ＴＯＦマススペクトルである。
図６ｃは、ピエゾ電気装置を用いた逆相パッキング支持体から溶出された大腸菌タンパク質外膜プロテインＡからのペプチドのサンプル液を示すＭＡＬＤＩ-ＴＯＦマススペクトルである。
本発明を実施する方式
図面を参照すれば、図１は、本発明の方法の一実施態様の模式的表示を示す。システムは、アレイ100、イメージ取得システム200、イメージ分析システム300、コンピューター400、x, y, z調整可能なプラットフォーム500、複数個の化学分配制御ユニット600、複数個の分配ヘッドおよび貯蔵部700、アナライザー制御ユニット800、アナライザー900およびデータ解析ステーション910からなる。
アレイ100はx, y, z調製可能テーブルまたはアーム500の上または下に配置され、イメージ200デジタルイメージとしてコンピューター400に取得され、移送される。このイメージは、イメージ解析システム300によって解釈され、ここでアレイの各成分の座標が真のx, y, z軸を反映する値に変換される。別法としてコンピューター400に保存されたイメージは解釈することなく使用され、アレイ100内の一つの特定の成分は分配ヘッド（噴出装置）700を有するx, y, z調製可能テーブルまたはアーム500の移動に使用される。分配ヘッド700は、コンピューター400の制御下にありアレイ100中の選択されたサンプル上に試薬を分配する化学分配ユニット600の制御下に置かれる。処理が完了した場合にはアレイ100内の処理成分の座標はアナライザー900を有するx, y, z調製可能テーブルまたはアーム500の移動に使用される。アナライザー900は、オペレーターによって選択された場合にはコンピューター400を介して処理選択サンプル100を分析する分析制御ユニット800の制御下にある。分析からのデータをついでイメージ分析システムからアレイ中の各サンプルの翻訳された座標に相関するデータ解析および管理システム910によって収集される。
本発明の方法および装置の一実施態様においては、x, y, z調製可能プラットフォーム、化学分配制御ユニット、分配ヘッドおよび貯蔵部、アナライザーは、図２に示すようにすべてコンピューターの制御下にある。アレイ102はプラットフォーム502に固定される。アレイ102のイメージはデジタルカメラ502によって取得される。アレイ102はカメラのフラッシュまたは外部タングステンランプ206によって照明される。イメージはカメラ202からコンピューター402に移送される。イメージは処理して、「クリック-オン-ア-スポット」ソフトウエアに移入する。この処理はイメージピクセル座標をロボット座標に翻訳する。ついで「クリック-オン-ア-スポット」ソフトウエアを使用して、アレイ中の選択されたサンプルに対してx, y, z移動可能なバー508を介して分配装置702を駆動する。分配装置702のｚ移動は分配装置支持ユニット506を介して行われる。試薬は、試薬貯蔵部から、分配装置702に直接連結している化学分配制御ユニット602のコンピューター制御402を介して分配される。処理アレイ108はついでアナライザーたとえばレーザー脱着マススペクトロメーター802のx, yプラットフォーム806上に配置される。x, yロボット座標を用いてアナライザーx, yプラットフォーム806を駆動させ、処理サンプルをレーザー光線804と直接平行して位置させるために使用する。処理の生成物はついでアナライザー902で検出する。
アレイの分析例は図３ａ〜３ｄに示す。図３ａに示したアレイはポリビニリデン膜102に移送したタンパク質混合物の二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動分離である。膜を配置し、イメージをデジタルイメージとして走査および捕獲することにより取得した。イメージをコンピューターに移し、ピクセル座標に翻訳した（図３ｂ）。これにより、アレイのイメージはイメージピクセル座標104をロボット座標106に変換することにより得られた。アレイ中に配置されたタンパク質サンプルが選択され、選択されたサンプルの座標は試薬分配装置704を選択されたタンパク質サンプルに駆動するために使用されて、そこで試薬が分配される。アレイ108上の処理サンプルはついでアナライザー802に移動させ、示した例はマトリックス補助レーザー脱着イオン化−飛翔時間（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ）マススペクトロメーターである。処理サンプルは、マススペクトロメーター802のx, yテーブル806を駆動する同じトロボット座標を用いレーザー光線と平行に配置する。処置サンプルの脱着生成物はマススペクトロメーター902で検出してデータ管理システム912において変換する。
２Ｄ-ＰＡＧＥによって分離したヒト血清タンパク質のポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜脱着トリプシン処理生成物の例は図４ａに示す。処置には試薬〜3-4μlの消化緩衝液（0.025μg/μlのPromegaのトリプシン；１％（v/v）還元Triton  X-100；10％（v/v）ＭeＣＮ；5ｍＭ  Tris, ｐＨ8.0）の適用を包含した。処理は加湿条件下に37℃で３時間放置した。試薬緩衝液〜3-4μl抽出緩衝液（70％（v/v）ＭeＣＮ；0.1％（v/v）ＴＦＡ）をＰＶＤＦ上、ペプチドサンプルに適用することによりペプチドを抽出した。抽出緩衝液が乾燥する前に、さらに抽出緩衝液のアリコートを適用する。これを４〜５回繰り返す。最後に、〜3-4μlの試薬マトリックス溶液、50％（v/v）ＭeＣＮ；0.1％（v/v）ＴＦＡ中α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸マトリックスを適用し、風乾させた。処理ＰＶＤＦ膜ペプチドサンプルを、両面接着テープを用いてＭＡＬＤＩ-ＭＯＦサンプルステージに付着させた。ペプチドは337nm窒素レーザーおよび遅延した抽出様式の反射を用いて脱着させた。データの質はそれぞれ図４ｂおよび４ｃに示す２つのペプチドの同位元素分割、1041.66m/zおよび2090.09m/zによって表す。
試薬の適用のための試薬送達ならびに試薬の適用および処理サンプルからの反応生成物のサンプリングのための抽出装置の例は図５ａに示す。試薬、たとえば抽出溶液714は三方バルブ716を通し、アレイ108上のサンプルにピエゾ電気装置710を介して送達される。この操作は十分なサンプルが処理されるまで反復することができる。処理サンプル110からの生成物はついで三方バルブを逆相クロマトグラフィーパッキングのカートリッジ718に例に示すように付着する第二のピエゾ電気装置712と平行にスイッチすることによりアレイから除去する（図５ｂ）。ピエゾ電気装置は移動する内部部分をもたないので、サンプルは活性化装置712によって摘出され、一方装置710はＺ-領域によりサンプル110に低下される。逆相パッキング718へのサンプル導入後、その上に反応生成物は分析のために結合され、装置710と逆相パッキング718は、適当な溶媒の入口714を介しての送達を可能にする三方バルブ716をスイッチすることにより洗浄した（図５ｃ）。洗浄のために装置を活性化する必要はない。これはバルブ714に付着した加圧容器から行われるからである。別法として、洗浄は両装置を活性化することによって進行させることができる。サンプルは最終的に、装置712を活性化することによって、バルブ入口714に付着した適当な溶媒を導入することにより逆相パッキング718から溶出する（図５ｄ）。また、加圧下の適当な溶媒を導入することにより、サンプルを逆相パッキング718から溶出させることもできる。ついで、溶出した生成物を、その同定を可能にするある種の適当な手段によって検出される。
本発明はとくに、化学試薬および／またはタンパク質（たとえば、酵素および抗体）の微小滴を基質上に固定化または吸着されるタンパク質または他のマクロ分子に分配するための「インク-ジェット」もしくは他の印刷方法の使用に関する。本発明はまた一つの好ましい形態では化学プリンターによる適用後の化学／酵素反応に続いてマクロ分子の誘導体を検出／分析する方法としてマススペクトロメトリーの使用に関する。
一実施例においてはこの方法はタンパク質分析の一連の工程に関し、次のように行われる。
ｉ）分析すべきタンパク質をクロマトグラフィー技術たとえばポリアクリルアミド電気泳動を用いて分離する。
タンパク質はそのまま可視化するか、または支持体上に移して、タンパク質パターンがＣＣＤカメラを用いて検出され、デジタル化イメージを得ることができるように可視化される。タンパク質のスポットは、染料、化学ルミネッセンスまたは放射標識および蛍光誘導体の導入を含めた様々の方法で可視化できることを理解すべきである。
ii）タンパク質パターンのイメージを、個々のタンパク質スポット／バンドが注釈できるソフトパッケージに負荷する。イメージまたはイメージのサブセットをついで、所望の反応の種類に応じてインクの代わりに適当な化学剤を含有するインク-ジェット印刷技術を用いて、最初の可視化支持体上に印刷する。化学反応が２種またはそれ以上の試薬の同時送達を要求する場合、もしイメージが１種または２種以上の色を記録するかまたはそれに帰属されたならば青色および黄色のカートリッジ中での化学剤の生成物からのスポット上の反応で緑色に着色した１個のスポットを生じる。この場合、スポットはそれらの直接的な環境で誘導され、その化学反応の生成物はその環境に止まることを直接みることができる。
iii）個々の化学反応からの生成物は、タンパク質スポットに向けられた技術を用いて分析されねばならない。プリンターの生成物は各種のクロマトグラフィー技術たとえば毛細管電気泳動、液体クロマトグラフィーおよび電気スプレーマススペクトロスコピーを用いて分析できることは、タンパク質分析の分野における経験者には明らかであるが、これらの技術は分析の前に印刷された生成物の液体抽出を要求する。液体抽出の別法にレーザー脱着イオン化−飛翔時間（ＬＤＩ-ＴＯＦ）マススペクトロスコピーの使用がある。ＬＤＩ-ＴＯＦマススペクトロスコピーは化学／酵素反応の生成物の両者（たとえば、エドマン化学からの修飾アミノ酸またはエンドグリコシダーゼ消化からのオリゴ糖）または反応後の残った基質（たとえば、エドマン化学後の短化タンパク質またはＮ-連結糖の放出後の糖タンパク質）を検出することができる。分析は、支持体がＬＤＩ-ＴＯＦに移送されて、ついでレーザーが最初の支持体のデジタル化イメージを用いて各スポットに導かれた場合、ｉｎ  ｓｉｔｕで行うことができる。必要に応じて、タンパク質のパターンを分析前に適当なマトリックスで印刷できる。これは被検物質のイオン化を助け、これはＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ  ＭＳ，マトリックス補助レーザー脱着イオン化-飛翔時間マススペクトロスコピーと呼ばれる。
iv）分析がさらに化学のサイクルを要求する場合には、第二の化学のために膜を調製し、再度、印刷することができる。これはエドマンのシクエネーターに相当するが、同時に多数のタンパク質の配列の決定を可能にする。
プリンターは、ソフトウエアがある種のタンパク質スポットを選択できる場合には、Corel Drawのようなドローイングプログラムにきわめて類似の制御を受けるコンピューターである。これらの方法は多くの実験室でルーチンであり、頻繁に使用されることから、パッケージはしかしながら、数種のプログラムされた方法を、還元およびアルキル化、エンドロテイナーゼ消化、エンドグリコシダーゼ消化およびエドマン化学についてもっている。
エドマン化学の例は染色タンパク質に対して高感度で実施できることが知られているが、加熱した、無水の、酸素を含まない環境で行われなければならない。この場合、プリンターはしたがって、このような環境に封入される必要がある。４色のインク-ジェット技術は試薬の正確な混合を可能にする。エドマン化学に必要な４種の試薬はＲ１（ヘプタンまたはアセトニトリル中フェニルイソチオシアナートまたはイソチオシアナート）；Ｒ２（カップリング塩基）；Ｓ１（酢酸エチル）およびＲ３（トリフルオロ酢酸）である。Ｎ-末端アミノ酸の切断後、支持体をレーザー脱着マススペクトロメーターに移動し、ここで放出された修飾Ｎ-末端アミノ酸が検出される。膜は化学プリンターに戻し、真空マニホールド上Ｓ１で洗浄して残った放出された修飾アミノ酸の過剰を除去し、第二ラウンドの化学を開始する。放出されるアミノ酸を産生しなかったそれらの（ブロックされた）タンパク質については、エドマン化学の第二サイクルの代わりにたとえばＬys-Ｃによる切断に付してペプチドを産生させた。この方法によれば、自動化できる分析の体系を開発することが可能である。
レーザー脱着技術はプリンターのように、ｉｎ  ｓｉｔｕで平行した分析を可能にすることから好ましい。残ったタンパク質は、質量が定量される特定のタンパク質を同定するラダー配列決定アプローチを用いマス分析に付すことができることに留意すべきである。場合により液体抽出を用いる必要がある。液体抽出機構は正しいスポットから生成物を抽出するため、イメージによっても駆動される。
要約すれば、本発明は分子の「化学」イメージを最初にイメージを得るために用いた同じ支持体上に分子の「化学」イメージを印刷する考え方を使用する。
（ｉ）検討すべき分子のイメージを、１つの、サブセットのまたはすべての分子上の選択的化学の全種を印刷するための鋳型として使用する。したがって、色「インク-ジェット」プリンターと同様に、化学プリンターは分子へ移動し化学を印刷する１つまたは数種の異なる化学剤のカートリッジを維持するか、または支持体がカートリッジ（単数または複数）に移動できる。
（ii）「印刷された」分子の誘導体または反応生成物はなお支持体上に吸着されている間に分析できる。レーザー脱着イオン化技術およびマススペクトロメーターは、誘導体または反応生成物を同定するための検出器として使用できる。エドマン化学によって検討されたタンパク質の場合には、アミノ酸の量を定量すること、したがって測定されるタンパク質の量を測定することも可能である。
この態様は、誘導体が最初に支持体から液体に抽出され、ついで同定される必要はないことから、「乾燥」分析と呼ばれていた。しかしながら、一部の誘導体で「乾燥」分析に適当でないときは、適当な収集システムまたは一連の試験管への液体抽出を使用する可能性も残されている。
（iii）支持体上に吸着されるタンパク質は最初に、たとえば染料、蛍光発色団または放射標識を用いることにより最初に可視化される（オリジナル支持体と呼ばれる）。オリジナル支持体をついで走査してデジタル化イメージを得て、これをソフトウエアパッケージに移入し、そこでデジタル化スポットまたはサンプルの位置がマニュプレートされる。たとえば、デジタル化スポットまたはサンプルの「色」をコンピューターイメージ上に帰属することにより、色「インク-ジェット」技術は分離カートリッジからの試薬の正確な混合とオリジナル支持体上へのこれらの試薬の以後の印刷を可能にする。化学プリンターの使用の例は、酵素基質カートリッジが黄色のカートリッジで置換され、反応からの生成物を検出するインディケーターは青色カートリッジ中にある特定の酵素の同定である。したがって、化学プリンターがオリジナル支持体上に緑色のスポットを印刷することを指示した場合は、任意の基質反応が特異的なインディケーターにより検出されることになる（たとえば、メチルチアゾリルブルーは紫色のフォルマザン染料を産生する）。全過程をたとえば、新しい基質を導入する赤色および青色のカートリッジを用いて紫色を印刷することによって反復することができる。
本発明の方法は、自動化制御および大規模な適用にとくに適している。
多くの改変および／または修飾が、特定の実施態様に示したように、本発明の精神および広く記載された範囲から逸脱することなく可能なことは、本技術分野における熟練者には自明の通りである。したがって、以上の記載は、すべての点で例示として考慮すべきであり、限定を意味するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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