(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、又はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）とコレステロールを包含する脂質を含む脂質二分子膜、水性区画及びディフェンシンを含むリポソームであって、該ディフェンシンが、インドリシジンとマゲイニンとＨＮＰ−１とＨＮＰ−２とＨＮＰ−３とからなる一群から選ばれ、上記水性区画内または上記脂質二分子膜に含まれており、リポソームの二分子膜構造を破壊することが抑制されている中和されたディフェンシンであるリポソーム。
【請求項２】
上記リポソームが、マルチラメラである請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
その水性区画内に溶質が取り込まれており、各水性区画内の溶質の濃度が同じである請求項２に記載のマルチラメラリポソーム。
【請求項４】
上記ディフェンシンが、リポソームの脂質二分子膜内に含まれている請求項１に記載のリポソーム。
【請求項５】
上記ディフェンシンが、リポソームの水性区画内に含まれている請求項１に記載のリポソーム。
【請求項６】
上記ディフェンシンが、インドリシジンであり、上記脂質が、ＰＯＰＣを含む請求項１に記載のリポソーム。
【請求項７】
少なくとも０．５モルパーセントのインドリシジンを含む請求項６に記載のリポソーム。
【請求項８】
上記ディフェンシンが、インドリシジンであり、上記脂質が、ＤＳＰＣとコレステロールを含む請求項１に記載のリポソーム。
【請求項９】
少なくとも０．５モルパーセントのインドリシジンを含む請求項８に記載のリポソーム。
【請求項１０】
上記ディフェンシンが、インドリシジンであり、上記脂質が、ＤＯＰＣを含む請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１１】
少なくとも０．５モルパーセントのインドリシジンを含む請求項１０に記載のリポソーム。
【請求項１２】
上記リポソームが、クエン酸水溶液である放出抑制緩衝水溶液を含む請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
上記リポソームが、ヘッドグループ修飾脂質を含み、該ヘッドグループに、ポリエチレングリコール、ポリアルキルエーテル、ガングリオシド又は有機ジカルボン酸が結合しており、該ヘッドグループが、リン酸基、硫酸基およびアミノ基からなる群から選ばれる、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１４】
上記脂質二分子膜が、１，２−ジパルミトイル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロパンを含む請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１５】
上記リポソームの最外層脂質二分子膜に存在する１，２−ジパルミトイル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロパンの５０％よりも多くが、該最外層脂質二分子膜の内側の単分子膜に存在する請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１６】
上記最外層脂質二分子膜の１，２−ジパルミトイル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロパンの濃度が、少なくとも５モルパーセントである請求項１４に記載のリポソーム。
【請求項１７】
更に、別の生理活性剤を含む請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１８】
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、又はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）とコレステロールを包含する脂質を含む脂質二分子膜、及びディフェンシンを含む脱水リポソームであって、該ディフェンシンが、インドリシジンとマゲイニンとＨＮＰ−１とＨＮＰ−２とＨＮＰ−３とからなる一群から選ばれ、上記水性区画内または上記脂質二分子膜に含まれており、リポソームの二分子膜構造を破壊することが抑制されている中和されたディフェンシンである脱水リポソーム。
【請求項１９】
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、又はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）とコレステロールを包含する脂質を含む脂質二分子膜、水性区画及びディフェンシンを含むリポソーム、並びに薬理学的に許容され得る担体を含む医薬組成物であって、該ディフェンシンが、インドリシジンとマゲイニンとＨＮＰ−１とＨＮＰ−２とＨＮＰ−３とからなる一群から選ばれ、上記水性区画内または上記脂質二分子膜に含まれており、リポソームの二分子膜構造を破壊することが抑制されている中和されたディフェンシンである医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の医薬組成物の抗感染有効量を含む、動物における感染を治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項２１】
上記感染が、ディフェンシンに敏感に反応する真菌によるものであり、該真菌が、クリプトコッカス属又はアスペルギルス属である請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
上記動物が、免疫の低下した動物である請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
上記感染が、クリプトコッカス属による真菌感染を含み、上記動物が、免疫の低下したヒトである請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
上記感染が、アスペルギルス属による真菌感染を含み、上記動物が、免疫の低下したヒトである請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ディフェンシンに反応する癌にかかった動物を治療するための組成物であって、請求項１９に記載の医薬組成物の抗癌有効量を含み、ディフェンシンに反応する癌が、白血病又はリンパ腫である医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本研究は、一部、国立衛生研究所からＮｏ．ＡＩ３１６９６−０１の補助を受けて行ったものである。従って、本発明に対しては、合衆国政府が、ある権利を有している。
本出願は、リポソームディフェンシン（defensin）製剤及びその治療用途に関するものである。ディフェンシンは、動物の宿主防御系の蛋白質成分である。それらは、動物において、異常又は老化細胞の他に侵入微生物及び寄生菌を破壊することに関与する特殊細胞中に見出されている。グラム陽性及びグラム陰性菌の両方、真菌並びに寄生菌は、ディフェンシンの作用を受ける（例えば、T. Ganz等、Med. Microbiol Immunol. １８１，９９（１９９２）参照）。また、ディフェンシンは、ウイルスを不活性化する。この点について、Daher等（J. Virol. ６０（３），１０６８（１９８６））は、ヒトディフェンシンが、１型及び２型単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水疱性口内炎ウイルス、インフルエンザウイルスなどの外被ウイルスを不活性化したと報告した。Ganz等（Eur. J. Haematol. ４４，１（１９９０））は、いくつかのディフェンシンが、培養中の哺乳動物細胞を殺したとを報告している。Lichtenstein等（Blood ６８（６），１４０７（１９８６））は、ヒトディフェンシンが、マウス及びヒトのリンパ腫細胞を溶解することができたと報告した。ウサギディフェンシンも、マウスリンパ腫に対して細胞毒性を示した。更に、Charp等（Biochem. Pharmacol. ３７（５），９５１（１９８８））は、ヒトディフェンシン（ＨＮＰ−１、ＨＮＰ−２及びＨＮＰ−３）が、蛋白キナーゼＣ活性を抑制したと報告した。
ディフェンシンは、ヒト、ウシ、ウサギ、モルモット、ラットなどの哺乳動物で見出されている。代表的な哺乳動物ディフェンシンは、アミノ酸数が約２９〜３４で、６個のシステイン残基の保存（conseved）パターンを有する陽イオン両親媒性蛋白質である。しかし、哺乳動物の細胞質顆粒で見出されているディフェンシンが、全てこの基本パターンに合致しているわけではない。例えば、インドリシジン（Indolicidin）は、細胞毒性があり、トリプトファンを多く含み、アミノ酸数が１３の、ウシ好中球由来のディフェンシンである（M. Selsted等、J. Biol. Chem. ２６７（７），４２９２（１９９２）参照）。同グループ（M. Selsted等、J. Biol. Chem. ２６８（９），６６４１（１９９３）は、６個の保存システイン残基を有し、サイズ及び構造は若干異なるが、基本型の哺乳動物ディフェンシンと同様の細胞毒活性を有する陽イオン両親媒性蛋白質系のβ−ディフェンシンを単離したことを報告した。当初カエルから得られた蛋白質であるマゲイニン（Magainin）も、哺乳動物のディフェンシンと同様である（例えば、米国特許第４，９６２，２７７号及び米国特許第５，０４５，５３１号参照）。ディフェンシンは、昆虫でも見出されている（J. Hoffman及びC. Hetru、Immunology Today １３（１０），４１１（１９８７）参照）。
好中球、好酸球、マクロファージ、キラーリンパ球などの食細胞は、ディフェンシン含有細胞質顆粒を有しており、好中球は、特に豊富なディフェンシン源である。細胞質顆粒は、食作用小胞体（endocytic vesicle）と融合して、ディフェンシンを、侵入微生物などのような細胞内に取り込まれる物質と接触させる（J. Gabay等、J. Exp. Med. １６４，１４０７（１９８６）；W. Rice等、Blood ７０（３），７５７（１９８７）参照）。
ディフェンシンは、それらの標的の外部リン脂質膜と結合し、浸透可能にすることにより、細胞の浸透圧バランスを乱す（例えば、Ganz等、Med. Microbiol. Immunol. １８１，９９（１９９２）；Ganz等、Eur. J. Haematol. ４４，１（１９９０）；Kagan等、ＰＮＡＳ  ８７，２１０（１９９０）；Lichtenstein等、J. Immunol. １４０，２６８６（１９８８）；Lichtenstein等、Blood ６８（６），１４０７（１９８６）参照）。この浸透可能化（Permeabilization）は、本来、自然に、細胞死を引き起こすのに十分であっても、十分でなくてもよい。標的細胞代謝活性、さらにはディフェンシン作用も、必要とされ得る。
動物において、ディフェンシンの十分な治療能を達成するには、これらの蛋白質が活性な形でそれらの標的に到達するが、動物の正常な細胞に対する付随損傷を避けるようにして、これらの蛋白質を投与しなければならない。これは、ディフェンシンをリポソーム内に取り込むことにより、達成することができる。
リポソームは、内部水性容積（internal aqueous volume）を取り囲む両親媒性脂質分子の一つ又はそれ以上の二分子膜（bilayer）からなる自己集合構造体である。脂質二分子膜を構成する両親媒性脂質分子は、一つ又は二つの非極性（疎水性）アシル鎖と共有結合で結合している極性（親水性）ヘッドグループ領域を含んでいる。疎水性アシル鎖と水性媒体との間のエネルギー的に好ましくない接触によって、極性ヘッドグループが水性媒体に向かって配向し、一方、アシル鎖が二分子膜の内部に向かって再配向するように、脂質分子が再配列される。最終結果は、アシル鎖が、水性媒体と接触することから有効に遮蔽されている、エネルギー的に安定な構造体である。リポソームは、種々の方法により製造することができる（検討のためには、例えば、M. J. Ostro編、「リポソーム、生物物理学から治療まで」、３９−７２頁、Marcel Dekker（１９８７）のCullis等を参照のこと）。Banghamの方法（J. Mol. Biol. １３，２３８−２５２（１９６５））によれば、通常のマルチラメラ小胞（multilamellar vesicle、ＭＬＶ）が作られる。Lenk等（米国特許第４，５２２，８０３号（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８３／０３３８３（１０／１３／８３））、米国特許第５，０３０，４５３号、米国特許第５，１６９，６３７号）、Fountain等（米国特許第４，５８８，５７８号（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８５／００７５１（０２／２８／８５））及びCullis等（米国特許第４，９７５，２８２号（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０００４３（０１／１５／８７））には、実質的に同じ層間溶質分布を有するマルチラメラリポソームの製造方法が開示されている。
ユニラメラ小胞（unilamellar vesicle）は、音波破砕（PaPhadjopoulos等、Biochem. Biophys. Acta. １３５，６２４（１９６８）参照）又は押出（Cullis等、米国特許第５，００８，０５０号（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８６／００２３８（０１／１６／８６）及びLoughrey等、米国特許第５，０５９，４２１号（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／００２８９（０１／１０／８９）参照）によりＭＬＶから製造することができる。Janoff等（米国特許第４，７２１，６１２号（ＰＣＴ公開番号８５／０４５７８（１０／２４／８５））及びBolcsak等（米国特許第５，１００，６６２号）には、安定性の高いリポソームを製造するのに、ステロールを使用することが記載されている。これらの開示は、リポソーム製造に関する技術の状態を示すために、ここに参照のために記載した。
リポソームには、受動的に、即ち、水溶性生理活性剤の場合は、リポソームを形成する媒体内にその分子を可溶化することにより、あるいはリポソームを作るリポソーム溶液に脂質溶解性生理活性剤を添加することにより、生理活性剤を装填することができる。イオン化し得る生理活性剤は、積極的に、例えば、リポソーム膜を横切る方向に電気化学ポテンシャル勾配を形成し、その後、リポソームの外側の媒体にその生理活性剤を添加することにより、リポソームに装填することもできる（Bally等、米国特許第５，０７７，０５６号参照、その内容は、ここに参照のために記載した。）。
リポソーム内に取り込まれた薬剤は、毒性を低くするか、効能を高めるか、あるいはその両方によって、治療指数を高めることができる。更に、リポソームは、循環における他の微粒子物質と同様に、洞様毛細血管を有する組織内の細網内皮系の食細胞によって取り込まれ、それにより、細胞内感染の部位に向けられることが多い。
出願人は、ディフェンシン及び放出抑制脂質を含み、そのディフェンシンが中和されたディフェンシン、即ちリポソームからの放出が抑制されたディフェンシンであるリポソームを、ここに提供する。米国特許第５，０３２，５７４号には、配列が変更されているが、保存哺乳動物ディフェンシン配列に基づいている抗菌性蛋白質を含むリポソームが開示されている。
発明の要旨
この出願は、脂質二分子膜、水性区画（aqueous compartment）及びディフェンシンを含み、そのディフェンシンが中和されたディフェンシンであるリポソームを提供する。リポソームは、ユニラメラでも、マルチラメラでもよいが、マルチラメラであることが好ましい。より好ましくは、リポソームは、その水性区画内に溶質が取り込まれており、各水性区画内の溶質の濃度が実質的に同じであるマルチラメラリポソーム、即ち、実質的に同じ層間溶質分布を有しているマルチラメラ小胞である。ディフェンシンは、リポソームの脂質二分子膜内及び／又はリポソームの水性区画内に含まれることができる。ディフェンシンは、任意の殺菌性及び／又は殺腫瘍性動物宿主防御系蛋白質、例えば、基本型の哺乳動物ディフェンシン、β−ディフェンシン、インドリシジン、マゲイニン又は昆虫ディフェンシンであることができる。現在、好ましいディフェンシンは、インドリシジンである。
この発明のリポソームは、放出抑制脂質を含むことができる。現在、好ましい放出抑制脂質は、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）及びジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）にコレステロールを加えたものがあり、コレステロールに対するＤＳＰＣの比（モル／モル）は、約３：２であることが好ましい。従って、本発明の現在好ましい実施態様では、ディフェンシンがインドリシジンであり、リポソームは、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ又はＤＳＰＣとコレステロールを含む放出抑制脂質を含む。インドリシジン／ＰＯＰＣリポソームは、代表的には少なくとも約０．５モルパーセントのインドリシジンと、高々約９９．５モルパーセントのＰＯＰＣ、好ましくは約５モルパーセントのインドリシジンと約９５モルパーセントのＰＯＰＣを含む。インドリシジン／（ＰＳＰＣ＋コレステロール）リポソームは、代表的には少なくとも約０．５モルパーセントのインドリシジンと、高々約９９．５モルパーセントのＰＳＰＣ＋コレステロール、好ましくは約２０モルパーセントのインドリシジンと約８０モルパーセントのＰＳＰＣ＋コレステロールを含む。インドリシジン／ＤＯＰＣリポソームは、代表的には少なくとも約５モルパーセントのインドリシジンと、高々約９５モルパーセントのＤＯＰＣを含む。
ここで提供されるリポソームは、更に、放出抑制緩衝水溶液、ヘッドグループ変性脂質及びその他の生理活性剤を含んでもよい。リポソームの最外層脂質二分子膜に存在するイオン化し得る脂質の約５０％よりも多くが、最外層脂質二分子膜の内側の単分子膜（monolayer）に存在していることが好ましい。代表的には、イオン化し得る脂質は、その脂質の少なくとも約５モルパーセントを脂質二分子膜内に含んでおり、望ましくは約１０モルパーセントである。本発明の現在好ましい実施態様では、イオン化し得る脂質は、ＤＰＤＡＰ（１，２−ジパルミトイル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロパン）を含んでいる。
また、本発明によれば、ディフェンシンを含み、そのディフェンシンが中和されたディフェンシンである脱水リポソームも提供される。更に、薬理学的に許容され得る担体並びに脂質二分子膜、水性区画及びディフェンシンを含み、そのディフェンシンが中和されたディフェンシンであるリポソームを含む医薬組成物が提供される。
ディフェンシン、例えばインドリシジンに敏感に反応する生物による感染を治療又は予防するために、抗感染有効量のこの医薬組成物を動物に投与してもよい。好ましい治療被験体は哺乳動物であり、特にヒト、例えばＨＩＶなどのウイルスにより、又は化学療法により、あるいは臓器移植のために、免疫系が易感染性となっているヒトである。クリプトコッカス又はアスペルギルス真菌による感染などのような、ディフェンシンに敏感に反応する真菌による感染は、本発明のリポソームによって治療することができる。従って、本発明の現在好ましい実施態様は、治療される動物は、免疫の低下したヒトであり、感染は、クリプトコッカス属又はアスペルギルス属による真菌感染を含むものである。
ディフェンシンに反応する癌、例えば白血病やリンパ腫を治療するために、ここに提供される抗癌有効量の医薬組成物を動物に投与することができる。
更に、細胞質顆粒における蛋白質媒介殺菌性及び／又は殺腫瘍性細胞毒活性の欠乏を特徴とする特異顆粒欠乏症候群（Specific Granule Deficiency Syndrome）などの疾患の動物を治療する方法において、ここに提供される細胞毒有効量の医薬組成物を動物に投与することからなる方法がここに提供される。この方法は、このような症候群に苦しみ、微生物にも感染している動物を治療するのに、特に有用であろう。
【図面の簡単な説明】
第１図  インドリシジン水溶液の直角光散乱
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、ｐＨ７．５の緩衝液に、インドリシジンを種々の濃度で溶解した。サンプルを蛍光キュベットに入れ、５００ｎｍの波長（励起波長）での光の散乱を、９０度の角度で、蛍光光度計にて測定した。緩衝液のみ（インドリシジンなし）では、相対光散乱は０．４×１０6であった。縦軸は、相対散乱強度の尺度であり、横軸は、インドリシジン濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。
第２図  インドリシジン水溶液の蛍光
インドリシジンを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、ｐＨが７．５の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した。励起波長を２８５ｎｍに設定し、発光波長を３２５ｎｍから４５０ｎｍまで走査した。発光曲線の下側の面積（縦軸）を、インドリシジン濃度（μｇ／ｍｌ）（横軸）に対してプロットした。図中、挿入図は、インドリシジン濃度が約0.5μｇ／ｍｌよりも低いところでの傾向を示す。その勾配を示す点線は、大きい方の図にも示されている。３つの勾配が異なっていることは、明白である。低濃度と高濃度との間で、スリット幅を変更した。中間濃度は、適当な正規化を確かめるために、両方のスリット幅で試験した。
第３図  ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣ含有リポソームにおけるインドリシジンの保持
ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン）、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ（コレステロール）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）及びＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームを、後述のようにして形成し、それらの中にインドリシジンを取り込んだ。初めにリポソームに取り込まれ、４８時間後にその中に残っていたインドリシジンのパーセンテージを求め（後述の方法により）、それぞれのリポソーム生成物について示した。
第４図  ＤＯＰＥ含有リポソームにおけるインドリシジンの保持
インドリシジン含有リポソームを、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と共に、後述のようにして形成した。最初及び連続洗浄後の両方について、リポソーム内のインドリシジン濃度が説明されている。
第５図  ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ含有リポソームにおけるインドリシジンの保持
インドリシジン含有リポソームを、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）＋コレステロールと共に、後述のようにして形成した。上澄みのインドリシジン濃度、従って当初取り込まれ、その後、リポソームから漏洩したインドリシジンの濃度を、後述の方法に従って求めた。上澄みのインドリシジン濃度（ｍＭ）を、第１、第２、第３、第４、第５及び第６洗浄後について示す。
第６図  遊離及びリポソームインドリシジンの蛍光
ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ及びＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（３：２）マルチラメラ小胞（ＭＬＶ）を、細孔サイズが０．１ミクロンの２枚重ね合わせフィルターから５０℃で押し出した。得られたリポソームサンプルの一部を、最終脂質濃度が０．１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、０．５μｇのインドリシジンが存在する場合と存在しない場合について、蛍光発光プロファイルをとった。発光波長は、３２５ｎｍから４５０ｎｍまで走査され、励起波長は、２８５ｎｍに設定された。Ａ：緩衝溶液中のインドリシジン；Ｂ：インドリシジン／ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌリポソーム；Ｃ：インドリシジン／ＤＯＰＣリポソーム；Ｄ：インドリシジン／ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌリポソーム；Ｅ：インドリシジン／ＰＯＰＣリポソーム
第７図  リポソームインドリシジン系のオーダーパラメーター（order Parameter）
縦軸は、１モルパーセントの濃度でスピンラベル（spin label）、１−パルミトイル−２（１２ドキシルステアロイル）ホスファチジルコリンを用い、インドリシジン濃度（モルパーセント、横軸）を高めた際の種々のリポソーム系のオーダーパラメーターに及ぼすインドリシジン添加の影響を示す。白四角：ＤＰＰＣリポソーム；白三角：ＤＳＰＣリポソーム；白丸：ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（３：２）リポソーム；星印：ＤＨＰＣリポソーム；黒四角：ＰＯＰＣリポソーム；黒三角：ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＴＡＰ（ジオレオイルトリメチルアミノプロパン）（５：４：１）リポソーム；黒丸：ＰＯＰＣ／ＤＯＴＡＰ（９：１）リポソーム；黒棒：ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＤＡＢ（ジメチルアミノジオクタデシルアンモニウムブロマイド）リポソーム
第８図  ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣ含有リポソーム内のインドリシジンの溶血活性
遊離（取り込まれていない）の形及びリポソーム製剤の一部としての両方のインドリシジンを、赤血球（ＲＢＣ）でインキュベートした。溶解した赤血球のパーセンテージを後述のようにして測定し、インドリシジン濃度の関数として示す（白四角：遊離インドリシジン；白三角：インドリシジン／ＰＯＰＣリポソーム；白丸：インドリシジン／ＤＰＰＣリポソーム；黒四角：インドリシジン／ＤＰＰＣ嵌合−融合リポソーム）。
第９図  溶血活性に及ぼすＰＯＰＣ含有リポソーム内のインドリシジン濃度変更の影響
インドリシジン／ＰＯＰＣリポソームを、後述のようにして調製した。インドリシジン含有小胞（遊離インドリシジンと共に）を、ＲＢＣでインキュベートし、溶解した数を求めた（下記の方法に従って）。
インドリシジンによって生じたＲＢＣ溶血のパーセンテージを、ＲＢＣサンプル中のインドリシジン濃度（ｍｇ／ｍｌ）の関数として示す（黒四角：遊離インドリシジン；黒三角：ＰＯＰＣリポソーム内に３．８モルパーセントのインドリシジン；星印：２．５モルパーセントのインドリシジン；黒丸：１．８モルパーセントのインドリシジン；黒四角：１．０モルパーセントのインドリシジン；黒三角：０．４モルパーセントのインドリシジン）。
第１０図  ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソーム内のインドリシジンの溶血活性
後述のようにして、４．８モルパーセントのインドリシジンを有するインドリシジン含有ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームを調製した。このリポソームを、ＲＢＣでインキュベートした。溶解した数を後述のようにして求め、ＲＢＣサンプル内のインドリシジン濃度を変えて測定したＲＢＣ溶血のパーセントとして示す（黒丸：ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソーム内に４．８モルパーセントのインドリシジン；黒四角：遊離インドリシジン）。
第１１図  赤血球溶血に及ぼす他の脂質の影響
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ及びＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＤＡＢリポソームを調製し、溶血測定に使用して、ＲＢＣ溶血に及ぼす上記脂質の影響を測定した。その結果を、ＲＢＣサンプルの脂質濃度を種々変更して生ずる溶血パーセント（０及び１００パーセント溶血コントロールに対して相対的な）として示す。
第１２図  インドリシジン／ＤＯＰＥリポソームの溶血活性
インドリシジン／ＤＯＰＥリポソームを調製し、溶血測定に使用した。その結果を、脂質濃度を種々変更して生ずる溶血パーセント（０及び１００パーセント溶血コントロールに対して相対的な）として示す。
第１４図  リポソームインドリシジン対遊離インドリシジン細胞毒性
濃度（μｇ／ｍｌ）を高めた際の遊離インドリシジン、インドリシジンを含まないリポソーム、及びインドリシジン濃度（μｇ／ｍｌ）（横軸）を高めた際のリポソームインドリシジンによるＣＨＯ／Ｋ１細胞の生体外成長の特異的抑制を、標準チミジン取り込み測定法により測定した（ｃｐｍ×１０3、縦軸）。
第１３図  マウスのアスペルギルス感染に対する遊離及びリポソームインドリシジンの治療効力
各Ｂａｌｂ／ｃマウスに２×１０7個のアスペルギルスフミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）胞子を感染させ、次いで、ＰＢＳ緩衝液、遊離インドリシジン、リポソームインドリシジンのいずれかを注射した。１５日間にわたって、この動物の生存を監視した。生存率（縦軸）を、日数（横軸）に対してプロットした。
発明の詳細な説明
この発明は、脂質二分子膜、水性区画及びディフェンシンを含み、そのディフェンシンが中和されたディフェンシンであるリポソームを提供する。ディフェンシンは、特殊化された（specialized）動物宿主防御系細胞で見出されるか、あるいはそれによって分泌される殺菌性及び／又は殺腫瘍性の細胞毒性蛋白質、ポリペプチド又はペプチドである。これらの蛋白質は、癌性などの異常又は老化宿主細胞の他に、細菌、真菌及び寄生菌などの感染性生体に対して細胞毒性であることができ、外被ウイルスを不活性化することが分かっている。これらの蛋白質は、ヒト、ウシ、モルモット、ウサギ、ラットなどの哺乳動物で見出されている。それらは、カエル、昆虫、鮫などの非哺乳動物からも得られている。
“基本型哺乳動物ディフェンシン”は、哺乳動物食細胞の細胞質顆粒で見出されている可変的に陽イオン性の蛋白質である。これらのディフェンシンは、代表的には、アミノ酸数が約２９〜３４で、６個のシステイン残基の保存パターンを有し、両親媒性である。基本型哺乳動物ディフェンシンは、ウサギ、ラット及びモルモットの好中球蛋白質の他に、ヒトの好中球蛋白質１、２及び３（ＨＮＰ−１、ＨＮＰ−２及びＨＮＰ−３）を含むものである。
非哺乳動物由来のものの他に、他の哺乳動物ディフェンシンを初めとして、その他のディフェンシンも、この基本型パターンとは配列及び／又は構造が異なるが、同様な細胞毒活性を有している。例えば、β−ディフェンシンは、基本型哺乳動物ディフェンシンと同様の一連の細胞毒活性を持つことができ、ウシ好中球から得ることもできるが、コンセンサスアミノ酸配列及び三次元構造が異なる。インドリシジンは、ウシ好中球からも単離することができる、アミノ酸数が１３で、殺菌性、殺腫瘍性の細胞毒性蛋白質である。インドリシジンは、基本型哺乳動物ディフェンシンに匹敵する細胞毒活性を有しているが、それらよりも小さく、それらの６個の保存システインを欠いている。昆虫ディフェンシンは、基本型哺乳動物ディフェンシンとはサイズ及び三次元構造が異なるが、陽イオン性でもあり、６個の保存システインのパターンを持っており、高度に両親媒性であって、細胞毒性がある。マゲイニンは、当初、カエルから得られた、陽イオン性で、両親媒性の殺菌性宿主防御系蛋白質である。更に、ディフェンシンは、鮫でも見出されている。
従って、ここで用いられる“ディフェンシン”という用語は、感染、異常又は老化細胞に対する動物の宿主防御系の一成分であり、動物の宿主防御系の細胞で見出されることができるか、あるいはそれによって分泌されることができる殺菌性及び／又は殺腫瘍性の蛋白質、ペプチド又はポリペプチドを意味する。“ディフェンシン”としては、“基本型哺乳動物ディフェンシン”、β−ディフェンシン、インドリシジン、マゲイニン、昆虫ディフェンシン及びその他の動物宿主防御系蛋白質、例えば鮫由来のものなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。“ディフェンシン”という用語は、動物細胞から単離されるか、あるいは合成的に製造された蛋白質を含み、親蛋白質の細胞毒活性を実質的に保持しているが、一つ又はそれ以上のアミノ酸を挿入又は置換することによってその配列が変更されている変異体をも含むものである。現在、本発明のリポソーム製剤で使用する好ましいディフェンシンは、インドリシジンである。
“中和された”ディフェンシンとは、リポソームと結合し、一つ又はそれ以上の小胞成分によってリポソームの二分子膜構造を破壊することが抑制されているディフェンシンである。“中和された”という用語は、リポソームの水性区画内に含まれているディフェンシン、あるいはリポソームの脂質二分子膜に含まれているディフェンシンを意味する。一般に、中和されたディフェンシンは、実質的にリポソームから漏洩せず、その細胞毒活性を保持する。即ち、標的にさらされたとき、標的の二分子膜構造を破壊することができる。ディフェンシンは、脂質二分子膜との相互作用を抑制することによって中和されていることが好ましい。例えば、二分子膜を硬くしててディフェンシンが入り込むのを抑制することにより、あるいはディフェンシンが一般に二分子膜内に入り込まないように、水性区画内でディフェンシンを凝集させることにより、ディフェンシン−二分子膜相互作用を抑制する小胞成分が、ディフェンシンを中和することができる。一方、脂質二分子膜にディフェンシンを安定に挿入することによって、ディフェンシンを中和することができる。小胞成分は、例えば、蛋白質の疎水性部分と好ましいファンデルワールス型相互作用を形成することにより、二分子膜内部に蛋白質のためのスペースを作ることにより、あるいはディフェンシンと好ましい静電気相互作用を形成することにより、ディフェンシンを安定に挿入させることができる。好ましいディフェンシン−二分子膜相互作用により、二分子膜の構造に対する乱れが最小になる。例えば、二分子膜へディフェンシンを添加することによって、二分子膜を乱しながら、二分子膜のオーダーパラメーターの変化を測定して、二分子膜構造の変化を測定することができる。オーダーパラメーターは、当業者に周知の方法で測定できるものであり、二分子膜を構成する脂質の炭素−炭素結合の配向が、二分子膜−水性環境界面に対する垂線に関してどの程度であるかを測定するものである（例えば、「生体膜の構造」（P. Yeagle編）、CRC Press, Inc., Boca Raton（1992）、２２２〜２２３頁のS. Gruner、「非ラメラ脂質相」参照、その内容は、ここに参照のために記載した。）。二分子膜構造に対する乱れは、この関係を低下させると期待することができる。ディフェンシンとの好ましい相互作用をもたらす好ましい放出抑制脂質は、オーダーパラメーターの変化が最も少なく、二分子膜構造に対する乱れが最も少ないものである。
リポソームは、内部水性容積を取り囲む一つ又はそれ以上の二分子膜からなる自己集合構造体である。脂質二分子膜は、それぞれが、内部又は外部水性相に隣接した極性（親水性）ヘッドグループを有する両親媒性脂質分子の二つの向かい合った単分子膜と、二分子膜内部に配列された非極性（疎水性）アシル鎖とからなる。ヘッドグループは、リン酸塩、硫酸塩、アミノ又はその他の適当な極性部分であることができるが、リン酸塩基が好ましい。アシル鎖は、代表的には、１４〜２４炭素原子の長さであり、一つ又はそれ以上の二重結合を有していてもよい。即ち、アシル鎖は、飽和でも不飽和でもよい。安定な脂質二分子膜を形成すると、アシル鎖と周囲の水性環境との相互作用から生ずる疎水性効果、アシル鎖の立体パッキング制限（steric packing constraint）、二分子膜と水性環境との界面における吸引、反発相互作用、二分子膜の曲げ弾性等が、エネルギー的にバランスする。
リポソームは、一つの脂質二分子膜を持つことができる。即ち、リポソームは、ユニラメラ二分子膜でもマルチ二分子膜でもよい。即ち、リポソームは、マルチラメラ（ＭＬＶ）であることができる。ユニラメラ小胞は、スモールユニラメラ小胞（small unilamellar vesicle、ＳＵＶ）でも、リポソームの平均直径が約５０ｎｍよりも大きいラージユニラメラ小胞（large unilamellar vesicle、ＬＵＶ）でもよい。
ＭＬＶは、脂質を有機溶剤に溶解し、溶剤を蒸発させ、次いで、得られた脂質フィルムに水性媒体を加えることによって、調製することができる（Bangham、J. Mol. Biol. １３，２３８（１９６５）参照）。Cullis等（米国特許第４，９７５，２８２号）、Lenk等（米国特許第４，５２２，８０３号、米国特許第５，０３０，４５３号、米国特許第５，１６９，６３７号）及びFountain等（米国特許第４，５８８，５７８号）は、リポソームが、その水性区画内に取り込まれた溶質を含み、各区画内の溶質濃度が実質的に等しい、即ち、リポソームが、実質的に等しい層間溶質分布を有しているマルチラメラリポソームの製造方法を開示している。
ユニラメラ小胞は、音波破砕（Paphadjopoulos等、Biochem. Biophys. Acta. １３５，６２４（１９６８）参照）又は加圧下でのフィルターからの押出（Cullis等、米国特許第５，００８，０５０号及びLoughrey等、米国特許第５，０５９，４２１号参照）によりＭＬＶから製造することができる。これらの開示は、リポソーム製造に関する技術の状態を示すために、ここに参照のために記載した。
本発明のリポソームは、ユニラメラであっても、マルチラメラであってもよいが、マルチラメラであることが好ましい。多重脂質二分子膜は、リポソームからのディフェンシン放出に対して、より多数の障壁を提供する。マルチラメラリポソームは、通常のＭＬＶ、即ち、Bangham等（J. Mol. Biol. １３，２３８（１９６５））の方法（両親媒性脂質を有機溶剤に溶解し、溶剤を蒸発させ、次いで、乾燥脂質を水性媒体で再水和する）と同様の方法で製造されたＭＬＶであることができる。このようなＭＬＶは、更に処理されることができる。例えば、一つ又はそれ以上の有機溶剤（例えば、エタノール、メタノール及びクロロホルム）中で、インドリシジンとＰＯＰＣの混合物を調製し、有機溶剤を蒸発させ、次いで、乾燥脂質を水性緩衝液で水和することにより、ＰＯＰＣ、インドリシジン含有リポソームを調製することができる。得られたリポソームは、通常のＭＬＶであり、Cullis等（米国特許第５，００８，０５０号）及びLoughrey等（米国特許第５，０５９，４２１号）の方法により、所定の細孔サイズ（例えば、５ミクロン）のフィルターから押し出して、そのラメラリティー（lamellarity）を低下させ、そのサイズを均一化することができる。しかし、本発明のマルチラメラリポソームは、その水性区画内に取り込まれた溶質を含み、各水性区画内の溶質濃度が実質的に等しい、即ち、マルチラメラリポソームが、実質的に等しい層間溶質分布を有していることが好ましい。例えば、ＤＳＰＣ及びコレステロールと共にリポソームを調製し、通常のＭＬＶよりも浸透圧的に安定にすることができる。
本発明のリポソームは、更に、放出抑制脂質、即ち、リポソームからのディフェンシンの放出を抑制する脂質を含むことができる。“放出抑制脂質”は、一般に、脂質二分子膜内に入り込むことができず、それによって、一般に、二分子膜構造を破壊しないようにして、ディフェンシン−二分子膜相互作用を抑制する脂質であることができる。このような脂質は、例えば、ディフェンシンの帯電した基と静電反発を起こすヘッドグループへの帯電により、また、膜を硬くすることにより、あるいは、二分子膜内部の疎水性アシル鎖と好ましく相互に作用する疎水性ディフェンシン領域の能力を制限することにより、ディフェンシン−二分子膜相互作用を抑制することができる。本発明の放出抑制脂質は、ディフェンシン−二分子膜相互作用を抑制する脂質であることが好ましい。現在、好ましいこのような放出抑制脂質は、ＤＳＰＣ＋コレステロールを含み、コレステロールに対するＤＳＰＣのモル比が３：２であることが望ましい。一方、放出抑制脂質は、二分子膜内のディフェンシンと好ましく相互に作用することができる脂質でもよい。放出抑制脂質は、疎水性アシル鎖とディフェンシンの疎水性領域との間の好ましいファンデルワールス型相互作用により、ディフェンシンと相互に作用することもできる。放出抑制脂質は、ディフェンシンと共有結合を形成することもできる。ディフェンシンの疎水性部分が二分子膜内に残っている状態で、帯電した脂質ヘッドグループと帯電したディフェンシンの間に、静電相互作用を形成することができる。このような“好ましい”相互作用によって、二分子膜構造の乱れが最少となり、ディフェンシン放出のポテンシャルを最小にする。放出抑制脂質は、ディフェンシンの疎水性領域を二分子膜内部に挿入するための好ましい立体状態を設定することもできる。更に、放出抑制脂質は、ディフェンシンが二分子膜内で細孔を形成しないように、ディフェンシンの疎水性領域を二分子膜に挿入することができる。ディフェンシンと好ましく相互作用する現在好ましい放出抑制脂質は、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）又はジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である。
従って、この発明の一実施態様では、ディフェンシンは、インドリシジンを含み、放出抑制脂質は、ＰＯＰＣを含む。代表的には、インドリシジン／ＰＯＰＣリポソームは、少なくとも約０．５モルパーセントのインドリシジンと、高々約９９．５モルパーセントのＰＯＰＣを含む。リポソームは、約５モルパーセントのインドリシジンと、約９５モルパーセントのＰＯＰＣを含むのが望ましい。この発明の他の実施態様では、ディフェンシンは、インドリシジンを含み、放出抑制脂質は、ＤＯＰＣを含む。代表的には、リポソームは、少なくとも約０．５モルパーセントのインドリシジンと、高々約９９．５モルパーセントのＤＯＰＣを含む。ここで用いられる場合、脂質又は蛋白質の“モルパーセント”は、存在する合計モル数で脂質又は蛋白質のモル数を割ったもの意味する（即ち、Ａのモル数＝（Ａ）／（Ａ＋Ｂ））。
この発明の現在好ましい実施態様では、ディフェンシンは、インドリシジンを含み、放出抑制脂質は、ＤＳＰＣ＋コレステロールを含む。ＤＳＰＣとコレステロールは、ＤＳＰＣ：コレステロールモル比が約３：２となるように存在することが好ましい。代表的には、リポソームは、少なくとも約０．５モルパーセントのインドリシジンと、高々約９９．５モルパーセントのＤＳＰＣとコレステロールを含み、約２０モルパーセントのインドリシジンと、約８０モルパーセントのＤＳＰＣ＋コレステロールを含むのが望ましい。
ここに提供されるリポソームは、更に、放出抑制緩衝液を含むことができる。ここで用いられる場合、“放出抑制緩衝液”とは、リポソームに取り込まれたディフェンシンの放出を抑制するか防止する水溶液のことである。このような緩衝液は、蛋白質が脂質二分子膜を破壊するのを抑制することによって、好ましくは、二分子膜とのディフェンシンの相互作用を抑制することによって、ディフェンシンの放出を抑制する。得られた凝集物が一般に脂質二分子膜に入り込まないように、ディフェンシン分子を互いに相互作用させるか、あるいは架橋させることにより、ディフェンシン−二分子膜相互作用を抑制してもよい。種々のディフェンシン分子と陰イオンが静電相互作用を形成するように、ディフェンシンを陰イオン、好ましくはポリアニオン水溶液に入れることにより、ディフェンシンに錯体を作らせることができる。例えば、インドリシジンを５０ｍＭクエン酸溶液に入れることにより、インドリシジンを錯体として沈殿させることができる。インドリシジン上の正電荷（分子当たり合計５つ）とクエン酸塩上の負電荷（ｐＨ７において、分子当たり合計３つ）との間の静電対生成により、沈殿を促進することができ、蛋白質分子の架橋を示す。架橋し、沈殿したディフェンシンは、小胞を調製する脂質に錯体の水性懸濁液を添加することにより、取り込むことができる。ディフェンシン又はポリアニオンを含むが、両方は含まず、取り込まれなかった物質に対しては透過することができるが、取り込まれた物質に対しては透過できないように、小胞を形成することにより、リポソームにディフェンシン錯体を取り込むこともできる。取り込まれなかった透過し得る物質が、リポソームを取り囲む外部環境に入ると、透過し得る物質が小胞の内部に移動し、静電相互作用によってディフェンシン凝集が生ずるにつれて、小胞内で沈殿ができる。
ここに提供されるリポソームディフェンシンは、更に第二の生理活性剤、即ちディフェンシンに追加して生理活性剤を含んでもよい。ここで用いる“生理活性剤”とは、動物、例えばヒトにおいて、生理活性を有する任意の化合物又は組成物を示す。生理活性剤としては、抗ウイルス性化合物、抗菌性化合物、抗真菌性化合物、抗寄生菌性化合物、代謝拮抗性化合物、抗緑内症性化合物、抗炎症性化合物、抗腫瘍性化合物、ステロール、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、免疫グロブリン、免疫調節剤、染料、トキシン、酵素、ホルモン、神経伝達物質、糖ペプチド、放射性標識、放射線不透性化合物、蛍光化合物、細胞受容体蛋白質、細胞受容体リガンド、散瞳性化合物、気管支拡張剤、局所麻酔薬、成長促進剤、再生剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。この第二の生理活性剤は、追加のディフェンシンであってもよい。
ここで提供されるリポソームは、更にヘッドグループ修飾脂質を含むことができる。リポソームは、固定及び循環マクロファージからなる細網内皮系（ＲＥＳ）によって、動物の体から排除される。ＲＥＳ排除を回避することによって、より長時間、リポソームを循環させたままにしておくことができ、このことは、目的とする血清濃度を達成するのに、より少ない薬剤を投与すればよいことを意味する。循環時間が長くなれば、リポソームが、ＲＥＳを含まない組織を標的にすることもできる。動物に投与した場合、リポソームの表面は、血清蛋白質で被覆されるようになる。ＲＥＳによる排除速度は、このような蛋白質被覆の程度及びレベルに関係することができる。従って、血清蛋白質の結合が一般に抑制されるように、リポソームの外表面を修飾することによって、排除を抑制することができる。これは、蛋白質結合を促進することができる負の表面電荷を最少にするか、遮蔽することにより、あるいは、そうでなければ、血清蛋白質の結合に対して立体障害を与えることにより、達成することができる。
有効な表面修飾、即ち、ＲＥＳ取り込みを抑制することになるリポソーム外表面に対する変更は、ヘッドグループ修飾脂質をリポソーム二分子膜へ入れることにより、達成することができる。ここで用いられる“ヘッドグループ修飾脂質”とは、動物の循環系における小胞の薬物動力学的挙動を変えるように、リポソームへの血清蛋白質の結合を抑制することができる化学部分、例えばポリエチレングリコール、ポリアルキルエーテル、ガングリオシド、有機ジカルボン酸などをヘッドグループへ結合することにより、その極性ヘッドグループを誘導体化した（derivatize）両親媒性脂質のことである（例えば、Blume等、Biochim. Biophys. Acta. １１４９，１８０（１９９３）；Gabizon等、Pharm. Res. １０（５），７０３（１９９３）；Park等、Biochim. Biophys. Acta. １１０８，２５７（１９９２）；Woodle等、米国特許第５，０１３，５５６号、Allen等、米国特許第４，８３７，０２８号及び米国特許第４，９２０，０１６号（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０４９２４（０７／１４／８８））参照、それらの開示の内容は、ここに参照のために記載した。）。本発明によって提供されるリポソームは、更にこのようなヘッドグループ修飾脂質を含むことができる。リポソームに取り込まれるヘッドグループ修飾脂質の量は、当業者によく知られているか、あるいは必要以上の実験を行わなくても当業者が決めることのできる範囲内の多数の要因によって決まる。これらの要因としては、脂質の種類及びヘッドグループ修飾の種類、リポソームの種類及びサイズ並びにリポソームディフェンシン製剤の目的とする治療用途などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。代表的には、リポソーム内のヘッドグループ修飾脂質の濃度は、少なくとも約５モルパーセントであり、約１０モルパーセントが望ましい。
本発明のリポソームの脂質二分子膜は、イオン化し得る脂質を含むことができる。イオン化し得る脂質を適当なｐＨの環境に入れると、一つ又はそれ以上の正又は負の電荷を帯びるであろう。リポソームに取り込まれた蛋白質と、同じ種類の電荷を帯びたリポソームの脂質成分との間の相互作用により、その蛋白質と脂質との間に、静電反発を引き起こす結果となる。このような静電反発は、リポソームからの蛋白質の放出を抑制することができる。ディフェンシンは、一般に陽イオン蛋白質である。従って、イオン化し得る陽イオン脂質が、リポソーム二分子膜に含まれると、ディフェンシンとの間に静電反発を引き起こすことができ、それによって、リポソームからのディフェンシンの放出を抑制することができる。脂質二分子膜に取り込まれるイオン化し得る脂質の量は、ディフェンシン−二分子膜相互作用を防ぎ、それによってディフェンシン放出を抑制することができ、他の点では、リポソーム製剤、安定性及び用途と両立する量であれば、任意の量でよい。この量は、当業者によく知られているか、あるいは必要以上の実験を行わなくても当業者が決めることのできる範囲内の、本発明に与えられた多数の要因によって決まる。これらの要因としては、脂質の種類及び１分子当たりの電荷量、使用されるディフェンシン及びリポソームの種類などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。代表的には、リポソーム二分子膜に取り込まれるイオン化し得る脂質の量は、二分子膜内の脂質の約５モルパーセントであり、約１０モルパーセントが望ましい。
リポソームの最も外側の脂質二分子膜に存在するイオン化し得る脂質の約５０パーセントよりも多くが、最も外側の脂質二分子膜の内側の単分子膜に存在していることが好ましい。脂質二分子膜は、両親媒性脂質分子の二つの向かい合った単分子膜、内側及び外側の単分子膜からなる。リポソームの最も外側の脂質二分子膜は、その外側の単分子膜がリポソームを取り囲む外部環境に接している脂質二分子膜である。イオン化し得る脂質が、脂質二分子膜の内側の単分子膜に蓄積すると、二分子膜で囲まれる水性区画に取り込まれたイオン化し得る蛋白質との間の静電反発力が最大となり、一方、帯電脂質が外部環境にさらされることが最少となるであろう。イオン化し得る脂質は、Hope等（米国特許第５，２０４，１１２号（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０７５３０（１２／１７／８７））及び米国特許第５，２５２，２６３号）の方法に従って、二分子膜を横切る方向に電気化学ポテンシャル勾配、例えばプロトン勾配を与えることにより、脂質二分子膜の内側の単分子膜に蓄積させることができる。現在、本発明のリポソームに取り込まれるイオン化し得る脂質は、ＤＰＤＡＰ（１，２−ジパルミトイル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロパンであることが好ましい。
本発明は、更に、ディフェンシンを含み、そのディフェンシンが中和されたディフェンシンである脱水リポソームを提供する。リポソームを脱水すると、長期間にわたって小胞を貯蔵することが可能となる。これらは、必要に際し、再構成することができる。標準的な凍結乾燥装置又はその同等装置を用いて、凍結することにより、リポソームを脱水することができる。凍結乾燥は、Schneider等（米国特許第４，２２９，３６０号）及びJanoff等（米国特許第４，８８０，６３５号（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８６／０１１０３（０２／２７／８６）、それらの内容は、ここに参照のために記載した。）に記載された方法に従って、一種又はそれ以上の保護糖をリポソーム生成物に混合した後、行うのが好ましい。凍結せずに脱水を行い、十分な水がリポソーム生成物に残されたままにして、脱水−再水和工程を通じてのリポソーム二分子膜の実質的な部分の完全性を維持するのであれば、保護糖を省略することができる。
更に、本発明は、薬理学的に許容され得る担体並びに脂質二分子膜、水性区画及びディフェンシンを含み、そのディフェンシンが、中和されたディフェンシンであるリポソームを含む医薬組成物を提供する。ここで用いられる“薬理学的に許容され得る担体”とは、動物への生理活性剤の投与に関連しての使用を意図する標準的な担体、希釈剤、賦形剤などのどれでもを意味する。このような担体は、当該技術分野ではよく知られており、一般に、用いられる特定の薬剤、目的とする投与経路などの多数の要因に関連して選択され、それらは当業者によりよく理解されているものであり、当業者が決めることのできる範囲内のものである。適当な担体としては、生理食塩水、緩衝水溶液などのような塩溶液を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。この医薬組成物は、当業者によく知られている理由で、更に、防腐剤、酸化防止剤などの補助剤を含むことができる。医薬組成物は、抗感染有効量又は抗腫瘍有効量の医薬組成物を含むことができる単位投与量の形で提供されることができる。
ここで提供される医薬組成物は、動物、例えば哺乳動物、好ましくはヒト、最も好ましくは、ＨＩＶなどのウイルスにより、又は化学療法により、あるいは臓器移植のために、免疫系が易感染性となっているヒトにおける感染を治療するか、あるいは予防する方法に用いることができる。これらの方法は、抗感染有効量の使用医薬組成物を動物に投与することからなる。感染は、ウイルス、細菌、真菌、寄生菌、あるいはディフェンシンに敏感に反応するその他の種類の微生物感染であってもよい。種々の抗感染剤に対する感染生体の応答性は、当業者によく知られている容易に利用できる方法、例えば微生物感度テストにより求めることができる。
動物におけるクリプトコッカス及びアスペルギルス感染などのような、ディフェンシンに敏感に反応する真菌感染は、現在、本発明の方法による治療の好ましい対象である。従って、本発明の現在好ましい実施態様では、ここに提供されるリポソームディフェンシンで、免疫の低下したヒトのクリプトコッカス感染又はアスペルギルス感染が治療される。
ディフェンシンの作用は、一般に、種特異性でも、細胞種類特異性でもない。即ち、ある動物から得たディフェンシンは、他の動物においても活性であり、他の動物の細胞の細胞溶解を引き起こすことができる。ある特定のディフェンシンは、種々の微生物及び細胞種類に対して活性であることもでき、一般に、特定の細胞に対する作用に限定されない。従って、本発明の実施においては、種々の微生物感染又は癌について、本来、ある種類の動物から得られたディフェンシンを、他の種類の動物に投与することを考えている。例えば、ウシ好中球由来のインドリシジンを、ヒトの治療に用いることができる。
医薬組成物を動物に投与する方法としては、静脈内、動脈内、眼内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、膣内、皮下、直腸内及び局所投与が挙げられる。ある特定の医薬組成物について選ばれる投与の様式は、当業者によく知られているか、あるいは必要以上の実験を行わなくても当業者が決めることのできる範囲内の多数の要因によって決まるであろう。これらの要因としては、治療対象及びその年齢、大きさ、全身状態、投与される活性剤、治療される病気、疾患、状態などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。現在、好ましい投与経路には、静脈内投与が含まれる。“抗感染有効量”の医薬組成物とは、ディフェンシンに敏感に反応する感染の定着、成長若しくは拡散を抑制又は防止するのに有効な任意の量の医薬組成物を意味する。代表的には、ここに提供される医薬組成物の抗感染有効量は、その組成物を投与する動物の体重１ｋｇ当たりリポソームディフェンシン１ｍｇ〜約１０００ｍｇを含む量であり、望ましくは、医薬組成物の抗感染有効量は、体重１ｋｇ当たりリポソームディフェンシン約１０ｍｇ〜約２０ｏｍｇを含む。この範囲内で、特定の動物に投与される医薬組成物の量、即ち投与量は、当業者によく知られているか、あるいは必要以上の実験を行わなくても当業者が決めることのできる範囲内の多数の要因によって決まるであろう。これらの要因としては、微生物感染の種類及びその進行段階、治療対象及びその年齢、大きさ、全身状態、医薬組成物の好ましい投与経路などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の病気、疾患又は示された状態のために投与される医薬組成物の特定の量は、当業者によく知られている方法、例えば、投与量変更試験（dose ranging trial）よって決定してもよい。
ここでは、更に、動物、例えば哺乳動物、好ましくは白血病やリンパ腫などの、ディフェンシンに対して応答性のある癌で苦しんでいるヒトを治療する方法が提供される。この方法は、抗癌有効量のここに提供される医薬組成物を動物に投与することからなる。本発明の目的のためには、“抗癌有効量”の医薬組成物とは、動物における腫瘍の定着、成長若しくは転移を抑制するのに有効な任意の量の医薬組成物を意味する。代表的には、医薬組成物の抗癌有効量は、その組成物を投与する動物の体重１ｋｇ当たりリポソームディフェンシン１ｍｇ〜約１０００ｍｇを含む量であり、望ましくは、医薬組成物の抗癌有効量は、体重１ｋｇ当たりリポソームディフェンシン約１０ｍｇ〜約２００ｍｇを含む。この範囲内で、特定の動物に投与される医薬組成物の量、即ち投与量は、当業者によく知られているか、あるいは必要以上の実験を行わなくても当業者が決めることのできる範囲内の多数の要因によって決まるであろう。これらの要因としては、微生物感染の種類及びその進行段階、治療対象及びその年齢、大きさ、全身状態、医薬組成物の好ましい投与経路などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の病気、疾患又は示された状態のために投与される医薬組成物の特定の量は、当業者によく知られている方法、例えば、投与量変更試験よって決定してもよい。
以下、実施例により本発明を説明するが、これらの実施例が、その後に続く請求範囲で規定された本発明を、単に説明するだけのものであることは、当業者が容易に理解できるところであろう。
実施例
実施例１
インドリシジンの光散乱
１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に、種々の濃度でインドリシジンを溶解した。サンプルを蛍光キュベットに入れ、５００ｎｍの励起波長での光散乱を、９０度の角度で、蛍光光度計にて測定した。
これらの結果（第１図参照）から、インドリシジンは、３０μｇ／ｍｌ以上の濃度で、溶液内で自己会合することがわかる。このような自己会合は、インドリシジンの非極性領域が水分子にさらされるのを最少にとどめることができるので好ましい。
実施例２
インドリシジン水溶液の蛍光
ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）にインドリシジンを溶解した。励起波長を２８５ｎｍに設定し、発光波長を３２５ｎｍから４５０ｎｍまで走査した。発光曲線の下側の面積を、インドリシジン濃度に対してプロットした（第２図参照）。低濃度と高濃度との間で、スリット幅を変更した。中間濃度は、適当な正規化を確かめるために、両方のスリット幅で試験した。
これらの結果から、水溶液中のインドリシジンの蛍光は、０．５μｇ／ｍｌまでは、インドリシジン濃度と共に直線的に増加したが、０．５μｇ／ｍｌと５０μｇ／ｍｌの間の濃度では、急な勾配に変わったことがわかる。５０μｇ／ｍｌを越えると、勾配が緩やかになった。これらの偏位は、インドリシジン濃度が変わると、インドリシジン分子の分子間自己会合が変化することを反映している。
実施例３
インドリシジン／ＰＯＰＣユニラメラリポソームの調製
インドリシジン／ＰＯＰＣ溶液（１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン；インドリシジン：ＰＯＰＣ＝０．０８５：１（ｗ／ｗ））を、回転蒸発器で乾燥し、次いで、マルチラメラリポソームの懸濁液を形成するように、緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で再水和した。次いで、１００ｎｍの細孔を有するフィルターからリポソームを押し出して、大ユニラメラ小胞（ＬＵＶ；Cullis等、米国特許第５，００８，０５０号及びLoughrey等、米国特許第５，０５９，４２１号参照、それらの内容は、ここに参照のために記載した。）を製造した。
実施例４
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌマルチラメラリポソームの調製
インドリシジン（エタノール中に６６ｍｇ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、クロロホルム中に５６ｍｇ）及びコレステロール（Ｃｈｏｌ、クロロホルム中に１９ｍｇ）を混合し、次いで、３ｍｌの緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を添加した。得られた混合物を、丸底フラスコ内で、ほぼ乾燥させた。次いで、マルチラメラリポソーム（ＭＬＶ）の懸濁液を形成するように、乾燥リポソームをメタノールと１ｍｌの水で再水和した。ＭＬＶ懸濁液を真空回転蒸発器に載せ、十分な真空状態で４５℃で乾燥して、ペーストにした。次いで、サンプルを冷却し、１０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液を添加した。得られた溶液を３０ｍｌのチューブに移し、振り混ぜた（vortexed）。この生成物を遠心分離し、１２，０００ｇで１０分間回転させた。リポソームは、ペレット化した。ペレット上の上澄みを取り除き、新しい緩衝液と置き換えた。遠心分離によるこの洗浄を更に４回繰り返して、実質的に等しい層間溶質分布を有するマルチラメラリポソームからなり、合計容積が１．７ｍｌとなるように再懸濁された最終ペレットが得られた。
実施例５
ホスファチジルコリン含有リポソームにおけるインドリシジンの保持
インドリシジンと、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌのいずれかを含むリポソームを、インドリシジン１ｍｌ当たり１３〜２８μｇ有するインドリシジン／緩衝液及び１．５〜２．５ｍＭの濃度の脂質溶液を用いて調製した。脂質溶液を回転蒸発器で乾燥し、マルチラメラ小胞（ＭＬＶ）の分散液を形成するように、インドリシジン溶液をこの乾燥脂質に添加した。次いで、実質的に等しい層間溶質分布を有するマルチラメラリポソームを製造するように、これらのＭＬＶを凍結融解サイクル（Cullis等、米国特許第４，９７５，２８２号参照、その内容は、ここに参照のために記載した。）に７回かけた。取り込まれなかったインドリシジンをリポソーム生成物から取り除き、サンプルをエタノールに溶解し、ＵＶ分光計で２８０ｎｍにおける吸光度を読みとることにより、最初及び最後のインドリシジン濃度を測定した。
これらのデータ（第３図参照）から、ＰＯＰＣ含有リポソームが、４８時間後に最高のパーセンテージのインドリシジンを保持し（初めに取り込まれた量の約９５％）、ＤＰＰＣ含有リポソームは、それよりも少ない（約７５％）量を、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌは約５５％、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌは約２０〜３０％を保持したことがわかる。
実施例６
ＤＯＰＥ含有リポソームにおけるインドリシジンの保持
インドリシジン（６ｍｇ）を１ｍｌのエタノールに溶解した。これを、２０ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＥ原液と混合して次の４つのサンプルを作成した。Ｉ：２ｍｇＤＯＰＥ／１ｍｇインドリシジン；ＩＩ：２ｍｇＤＯＰＥ／３ｍｇインドリシジン；ＩＩＩ：２ｍｇＤＯＰＥ／６ｍｇインドリシジン；ＩＶ：２ｍｇＤＯＰＥ／０ｍｇインドリシジン。これらのサンプルを、３０℃で回転蒸発により乾燥し、次いで、マルチラメラリポソームを形成するように、１ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液で再水和した。石英キュベット内で、一部（２５μｌ）を２５μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液及び９５０μｌのエタノールと混合した。リポソームサンプルをエタノールに溶解し、２８０ｎｍにおける吸光度を読みとることにより、最初のインドリシジン濃度及び連続洗浄後に残っている濃度を測定した。標準リン酸塩測定法（Chen等、Anal. Chem. ２８、１９５６（１９５６）参照）により、脂質濃度を求めた。
これらのデータ（第４図参照）から、ＤＯＰＥ含有リポソーム中のインドリシジンのモルパーセントが、洗浄によって増加し、最終生成物では約５０モルパーセントに達したことがわかる。
実施例７
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームの漏洩に及ぼすインドリシジンの影響
ＤＳＰＣ（６０ｍｇ）及びコレステロール（２０ｍｇ）の溶液を、回転蒸発により乾燥し、次いで、０．５ｍＭのプローブＣＡＴ１（ヨウ化４−トリメチルアンモニウム−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）を含む緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ）２ｍｌで、そのプローブを含むマルチラメラリポソームの懸濁液を作成するように、乾燥脂質を再水和した。次いで、これらの小胞の懸濁液を、６５℃で１１０分間加熱した。サンプルを、ＨＥＰＥＳ緩衝液で４回洗浄し、最終容積が２ｍｌとなるように、緩衝液に再懸濁した。インドリシジン（２０ｍｇ／ｍｌ）の原液も、ＨＥＰＥＳ緩衝液で調製した。種々の量のこの溶液（下記表１参照）を、リポソーム生成物の一部（１００μｌ）と混合し、次いで、緩衝液を加えて最終容積を０．２ｍｌまでとした。サンプルをマイクロ遠心分離機にかけ遠心脱水し、上澄み液をＥＳＲチューブに移した。室温（２３℃）でスペクトルをとり、上澄み液サンプル中のプローブの濃度を求めた（Perkins等、Biochim. Biophys. Acta. ９４３、１０３（１９８８）参照）。
データ（下記表１参照）は、上澄み液中に認められるプローブのパーセント、及びそれにより、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームからの漏洩パーセントを示す。これらの結果から、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソーム中のインドリシジンの濃度が高くなっても、プローブの漏洩は著しく増大しなかった。
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実施例８
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＤＡＢリポソームからの漏洩に及ぼすインドリシジンの影響
ＤＳＰＣ（５１．６ｍｇ）、コレステロール（２０．２ｍｇ）及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ、８．２３ｍｇ）の溶液を、丸底フラスコ内で乾燥した。マルチラメラリポソームの懸濁液を作成するように、０．５ｍＭのプローブＣＡＴ１を含む緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で、脂質を再水和した。懸濁液を、６５℃で１０分間加熱し、次いで、１０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液で２回洗浄し、ＣＡＴ１を含むＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＤＡＢマルチラメラリポソームからなる最終ペレットを得て、最終容積が２ｍｌとなるように、緩衝液に再懸濁した。標準リン酸塩測定法（Chen等、Anal. Chem. ２８、１９５６（１９５６）参照）を実施して、残留脂質の量（３４．１２ｍｇ）を求めた。ＨＥＰＥＳ緩衝液の２０ｍｇ／ｍｌインドリシジン原液も調製した。
種々の量のこの溶液（下記表２参照）を、リポソーム懸濁液の一部（１００μｌ）と混合し、ＨＥＰＥＳ緩衝液でサンプルの最終容積を０．２ｍｌまでとした。これらのサンプルを遠心分離し、上澄み液の一部をＥＳＲスペクトル測定（２３℃）用に採取して、プローブ漏洩を測定した。最もインドリシジン濃度が高い２つのサンプルには、少量のブロードニング剤（broadening agent）を加えた。その結果を表２に示す。
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実施例９
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ含有又はＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ含有リポソームへのインドリシジンの取り込み
ＤＳＰＣとコレステロールか、あるいはＰＯＰＣとコレステロールのどちらかと、インドリシジンとを、０．１、０．２、０．４及び０．６のインドリシジン：脂質（ｗ／ｗ）比で混合し、その混合物を有機溶剤に溶解し、その溶剤を蒸発させた後、マルチラメラリポソームを形成するように、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で乾燥脂質を水和することにより、リポソームを作成した。リポソーム生成物をカラムに通して、取り込まれなかったインドリシジンを除去した。リポソーム生成物をエタノールに溶解し、２８０ｎｍでの吸光度を読みとり、インドリシジン濃度を求めた。標準リン酸塩測定法（Chen等、Anal. Chem. ２８、１９５６（１９５６）参照）により、脂質濃度を求めた。そのデータを下記の表３に示す。
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実施例１０
遊離及びリポソームインドリシジンの蛍光
ＰＯＰＣ、ＰＯＰＣ／コレステロール（３：２）及びＤＰＰＣ／コレステロール（３：２）（それぞれ脂質４０ｍｇ）の乾燥生成物を、マルチラメラリポソームを形成するように、８ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で水和して、リポソームを調製した。次いで、これらのＭＬＶを、０．１μｍの細孔を有する２枚重ねのポリカーボネートフィルターから５０℃で押し出した。各サンプルの一部を、０．１ｍｇ／ｍｌの脂質濃度に希釈し、蛍光スペクトルをとった。最終インドリシジン濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるように、リポソームサンプルにインドリシジンを加えた後でも、蛍光プロファイルをとった。散乱を補正するために、インドリシジンを加えないリポソームについて得たスペクトル値を、
インドリシジンを加えた後で得たスペクトルから引いた。緩衝液中の遊離インドリシジンの蛍光図形も得た。励起波長を２８５ｎｍに設定し、発光図形を３２５ｎｍから４５０ｎｍまで走査した。
これらの結果（第６図参照）から、インドリシジンは、ＤＰＰＣ（飽和）二分子膜（Ｃ）よりもＰＯＰＣ（不飽和）二分子膜（Ｅ）に対する親和性の方が大きい（遊離及びＤＰＰＣ会合インドリシジンの相対蛍光間の差よりも、遊離（Ａ）及びＰＯＰＣ会合インドリシジンの相対蛍光間の差の方が大きい）ことがわかる。コレステロール（膜を硬くする）をＰＯＰＣ（Ｄ）とＤＰＰＣ（Ｂ）の両方に添加すると、インドリシジンのこれらの系に対する親和性が低下する。蛍光の増加及び発光図形のブルーシフト（blue-shift）は、インドリシジンが、検討した他のどの系の場合よりも、二分子膜に深く結合していることを示している。
実施例１１
オーダーパラメーター
二分子膜の配列（ordering）に及ぼすインドリシジンの影響を調べるために、オーダーパラメーターの検討を行った。種々のモルパーセントのインドリシジン及び１モルパーセントのスピンラベル、１−パルミトイル−２（１２ドキシルステアロイル）ホスファチジルコリンを含むインドリシジン含有ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（３：２）、ＤＨＰＣ（ジヘキサデシルホスファチジルコリン）、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＴＡＰ（ジオレオイルトリメチルアミノプロパン）（５：４：１）、ＰＯＰＣ／ＤＯＴＡＰ及びＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド）リポソームを調製した。インドリシジン（２０ｍｇ／ｍｌ）の原液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液で調製した。インドリシジンとリポソームとを、インドリシジンに対する脂質のモル比を種々変更して混合した。ＤＰＰＣ（９９ｍｇ）、ＤＳＰＣ（９９ｍｇ）、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（７４ｍｇ／２４ｍｇ）、ＰＯＰＣ／ＤＯＴＡＰ（９０ｍｇ／１０ｍｇ）、ＰＯＰＣ（９９ｍｇ）、ＰＯＰＣ／ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌ（６２ｍｇ／１１ｍｇ／２５ｍｇ）及びＤＨＰＣ（９９ｍｇ）を、溶液を形成するように、有機溶剤中で１ｍｇのスピンラベルと混合した。得られた溶液を、丸底フラスコ内で乾燥し、乾燥脂質を、リポソーム（ＭＬＶ）を形成するように、２．５ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液で再水和した。得られたリポソームサンプルを、クリオ（cryo）チューブに移し、凍結融解サイクル（Cullis等、米国特許第４，９７５，２８２号参照）を５回行った。リポソームを、インドリシジン原液の一部と混合して、種々のモルパーセントのインドリシジンを有するリポソームを得た。次いで、得られたリポソームインドリシジン製剤を、それらの相転移温度よりも高い温度で加熱した。ＥＳＲスペクトルを、２３℃（室温）でとった。これらのデータを、種々のリポソームインドリシジン系のオーダーパラメーターを求めるのに使用した（第７図参照）。
実施例１２
リポソーム二分子膜の内側の単分子膜への正帯電脂質の取り込み
ＨＥＰＥＳ緩衝液（５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）及び５００ｍＭクエン酸緩衝液を調製した。これらの緩衝液を用いて、２９０ｍＯｓＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）及び２９０ｍＯｓＭクエン酸（ｐＨ５．３）緩衝液を調製した。
次の脂質を用いて、６つの脂質系を調製した。Ｉ：ＰＯＰＣ−９０モル％／ステアリルアミン（ＳＡ）−１０モル％（ｐＨ５．３）、ＰＯＰＣ９６．２３ｍｇ、ＳＡ３．７９ｍｇ；ＩＩ：ＰＯＰＣ−９０モル％／ステアリルアミン（ＳＡ）−１０モル％（ｐＨ７．３）、ＩＩＩ：ＤＳＰＣ−５０モル％／Ｃｈｏｌ−４０モル％／ＳＡ−１０モル％（ｐＨ５．３）、ＤＳＰＣ６８．５５ｍｇ、Ｃｈｏｌ２６．８４ｍｇ、ＳＡ４．６８ｍｇ；ＩＶ：ＤＳＰＣ−５０モル％／Ｃｈｏｌ−４０モル％／ＳＡ−１０モル％（ｐＨ７．３）；Ｖ：ＤＳＰＣ−６０モル％／コレステロール−４０モル％（ｐＨ７．３）；ＶＩ：ＰＯＰＣ（ｐＨ７．３）。これらの脂質を含む溶液を乾燥し、乾燥脂質を、示されているようにして、マルチラメラリポソームを形成するように、２９０ｍＯｓＭ緩衝液の一つに再懸濁する。次いで、これらのリポソームを、フィルターを通し、次のようにして押し出す（Cullis等、米国特許第５，００８，０５０号及びLoughrey等、米国特許第５，０５９，４２１号参照、それらの内容は、ここに参照のために記載した。）。ＰＯＰＣ：室温で５回、フィルター細孔サイズ＝２００ｎｍ；ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ：８００ｎｍフィルターを通して３回（６５℃）、次いで、２００ｎｍフィルターを通して５回（６５℃）。
等容積（２５０μｌ）のｐＨ５．３のリポソーム生成物（ｐＨ５．３のクエン酸緩衝液中で乾燥脂質を水和することにより形成されたリポソーム）とｐＨ１１．９２のＨＥＰＥＳ緩衝液を、最終ｐＨが約７．３となるように混合した。これらのリポソームは、外部水性環境に対して相対的に酸性の内部水性区画を含んでおり、それらの二分子膜を横切る方向にｐＨ勾配を有している。ｐＨ７．３の緩衝液中で形成されたリポソーム生成物を、等容積（２５０μｌ）の同じｐＨ７．３の緩衝液と混合したが、膜内外ｐＨ勾配はなかった。
一般に、帯電脂質は、二分子膜を横切る方向に設けられたｐＨ勾配に応じて、二分子膜の単分子膜の一方に蓄積することができる。従って、帯電脂質は、内側の単分子膜と外側の単分子膜との間で、不均一に分布することができる。即ち、二分子膜内に不整分布を持つことができる（Hope等、米国特許第５，２０４，１１２号及び米国特許第５，２５２，２６３号参照、それらの内容は、ここに参照のために記載した。）。内部水性区画が外部水性環境に対して相対的に酸性であり、二分子膜内の脂質のｐＫａよりも低いｐＨを有している場合、ステアリルアミン（ＳＡ）などの脂質は、一般に、二分子膜を横切る方向に設けられたｐＨ勾配に応じて、二分子膜の内側の単分子膜に蓄積することができる。
ｐＨ５．３及びｐＨ７．３のリポソームサンプルを振り混ぜ、次いで、室温でインキュベートした（ＰＯＰＣ含有リポソーム：１０分；ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ含有リポソーム：１時間）。各サンプルの一部を少量取り除いて、脂質濃度を測定するために標準リン酸塩測定法（Chen等、Anal. Chem. ２８、１９５６（１９５６）参照）で使用するのに別にしておいた。次に、２００μｌの１％ポリアスパラギン酸溶液を各チューブに加え、１０分間放置した後、５５０ｎｍにおける吸光度を記録した。
これらの結果を表４（下記参照）に示す。対照値に対する相対的な吸光度の低下は、帯電脂質（ステアリルアミン）が二分子膜の内側の単分子膜に蓄積することを示す。これらの結果から、ＰＯＰＣリポソームについては、リポソーム内部が外部に対して相対的に酸性である二分子膜を横切る方向のｐＨ勾配に応じて、ステアリルアミンが、内側の単分子膜に蓄積することを示す。ステアリルアミンが、外側の単分子膜から内側の単分子膜へ、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ二分子膜を通って移行するには、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ二分子膜が硬いため、より長い時間がかかる。
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実施例１３
正帯電リポソームへのインドリシジンの取り込み
ＤＳＰＣ３．５９ｍｇ、コレステロール１．５４ｍｇ及びＤＤＡＢ０．６３１ｍｇを、１００ｍｌの丸底フラスコ内で有機溶剤に溶解することにより、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＤＡＢ（ＤＳＰＣ５０モルパーセント、コレステロール４０モルパーセント，ＤＤＡＢ１０モルパーセント）を調製した。このフラスコにＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を加え、サンプルを回転乾燥して、有機溶剤を除去した。更に、５ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液をフラスコに加え、次いで、それを６５℃で加熱した。４ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液を更に加えて、サンプルを２０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み液をデカントして、保存した。ペレットは、更に４回再洗浄した。最終ペレットを、最終容積が１ｍｌとなるように、ＨＥＰＥＳ緩衝液中に再懸濁した。インドリシジン濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度分光写真法により求めた。
実施例１４
インドリシジン／ホスファチジルコリン含有リポソームの溶血活性
凍結融解サイクルを用いずに、上記の方法に従って、また嵌合−融合（interdigitation-fusion）（ＩＦ）小胞の場合は、Janoff等（米国特許出願番号０７／９６１，２７７及び０８／０６６，５３９、それぞれ、１９９２年１０月１４日及び１９９３年３月２４日出願、それらの内容は、ここに参照のために記載した。）に記載されている方法で、インドリシジン含有ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣリポソームを調製した。赤血球（ＲＢＣ）サンプルをこれらのリポソームと混合し、生じた溶血の程度を測定した。
用いた溶血測定法は、ＲＢＣサンプルの上澄み液中のヘモグロビン濃度を測定するものであり、上澄み液に放出されたヘモグロビンの濃度は、リポソームディフェンシンによって引き起こされた赤血球膜の損傷を示すものである。溶血測定法では、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ヒトの赤血球、ポリスチレンチューブ及びＵＶ分光計で使用するように設計された使い捨てのキュベットを使用した。約３ｍｌの濃縮赤血球を１５ｍｌのチューブに入れ、それに１０ｍｌのＰＢＳを添加した。ＲＢＣを懸濁させ、その懸濁液を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレット上の上澄み液を捨て、更にＰＢＳを加えた。この洗浄工程を、上澄み液がほぼ透明になるまで繰り返した。２ｍｌの最終ＲＢＣペレットを、４８ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。得られたＲＢＣ懸濁液を、一組の試験管に分け（試験管当たりＲＢＣ懸濁液０．５ｍｌ）、それに、追加の緩衝液及びＰＯＰＣ／インドリシジン又はＤＰＰＣ／インドリシジンリポソームを加えた。試験管に蓋をして、振り混ぜた後、３７℃の培養器内の撹拌器上で２０時間インキュベートした。このインキュベーション後、試験管を、低速（＜３０００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離した。各試験管からの上澄み液の一部（０．２ｍｌ）を、１．０ｍｌの水を加えたキュベットに入れた。５５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、上澄み液中のヘモグロビン濃度を求めた。ヘモグロビン濃度は、対照に対する相対的な溶血パーセントとして与えられる。０パーセント溶血対照は、ＲＢＣとＨＥＰＥＳ緩衝液（インドリシジン含有リポソームを懸濁させた懸濁液と同じ組成）からなり、１００パーセント溶血対照は、ＲＢＣと蒸留水からなるものであった。
第８図は、遊離インドリシジン（白四角）、ＰＯＰＣ／インドリシジンリポソーム（白三角）、ＤＰＰＣ／インドリシジンリポソーム（白丸）、ＤＰＰＣ／インドリシジン嵌合−融合（ＩＦ）リポソーム（黒四角）によって引き起こされる溶血のパーセントを示す。これらのデータから、リポソームに取り込まれると、インドリシジンの溶血活性が低下すること、即ち、遊離の形のディフェンシンに比較して、溶血のパーセントが低下することがわかる。
実施例１５
インドリシジン濃度の変更によるＰＯＰＣ／インドリシジンリポソームの溶血活性
ＰＯＰＣ／有機溶剤溶液を乾燥し、マルチラメラリポソームを形成するように、インドリシジン含有緩衝液でその溶液を再水和することにより、種々のインドリシジン濃度（モルパーセント）のＰＯＰＣ／インドリシジンリポソームを調製した。次いで、リポソームサンプルをクリオチューブに移し、凍結融解（Cullis等、米国特許第４，９７５，２８２号参照、その内容は、ここに参照のために記載した。）を５回行い、実質的に等しい層間溶質分布を有するマルチラメラ小胞を製造した。
標準リン酸塩測定法（Chen等、Anal. Chem. ２８、１９５６（１９５６）参照）により、最初及び最終の脂質濃度を求めた。第９図は、遊離インドリシジン（黒四角）及び試験した種々のインドリシジン／ＰＯＰＣリポソーム製剤（インドリシジン３．８モル％：黒三角；２．５モル％：星印；１．８モル％：黒丸；１．０モル％：黒四角；及び０．４モル％：黒三角）によって引き起こされたＲＢＣ溶血のパーセンテージを示す。
実施例１６
インドリシジン／ＤＰＰＣ（インドリシジン８．２７モルパーセント）の溶血活性
５００μｌのＤＰＰＣ小ユニラメラ小胞（ＳＵＶ）に、ゲルを形成するように６０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度で、エタノール（３６１μｌ）を加えた。次いで、インドリシジンと共に、１．２ｍｌのＤＰＰＣＳＵＶ生成物を、振り混ぜながら更に添加した。混合物を加熱、冷却した後、５回洗浄した。最初及び最後のサンプルにおける脂質濃度を、標準リン酸塩測定法（上記参照）により求めた。最初及び最後のサンプルにおけるインドリシジン濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度により求めた。
溶血測定は、前述のようにして行った（実施例１４参照）。これらの結果（表５参照）から、ＲＢＣサンプルにおけるインドリシジン（ＤＰＰＣ含有リポソーム内に８．２７モル％）濃度（ｍｇ／ｍｌ）が高くなると、溶血の程度が大きくなることがわかる。
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実施例１７
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／インドリシジンリポソームの溶血活性
ＤＳＰＣ１１．８５ｍｇ、コレステロール３．８７ｍｇ及びインドリシジン２０ｍｇを丸底フラスコ内で有機溶剤に溶解し、次いで、その溶液を回転蒸発で乾燥することにより、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／インドリシジンリポソーム（最終インドリシジン濃度＝４．８モルパーセントインドリシジン）を調製した。４ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で脂質を再水和し、得られたリポソーム懸濁液を遠心分離チューブに移した。フラスコを緩衝液で洗浄し、次いで、緩衝液を遠心分離チューブに加えた。これらのリポソームを、ＨＥＰＥＳ緩衝液で５回洗浄し、最終ペレットを、３ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁させた。２ｍｇのインドリシジンを１ｍｌのＨＥＰＥＳに溶解して、遊離（取り込まれなかった）インドリシジン対照を調製した。
最初及び最後のインドリシジン濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度により測定した。最初及び最終の脂質濃度は、標準リン酸塩測定法（Chen等、Anal. Chem. ２８、１９５６（１９５６）参照）により求めた。溶血測定にはリポソームを用い、測定は、前述の方法（実施例１４参照）に従って行った。データ（第１０図及び表６参照）は、遊離インドリシジン（黒四角）により引き起こされた溶血のパーセンテージ及びＲＢＣサンプルにおける種々のインドリシジン濃度で、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／インドリシジンリポソーム製剤により引き起こされた（黒丸）溶血パーセントとして示される。
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実施例１８
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソーム（インドリシジンを含まず）の溶血活性
脂質をクロロホルムに溶解し、次いで、単相（monophase）を形成するように、クロロホルム１容量当たりメタノール２容量を用いて、メタノールを添加することにより（Fountain等、米国特許第４，５８８，５７８号参照）、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ及びＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＤＡＢリポソームを調製した。ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を０．５ｍｌずつ別々に２回添加し、各添加後、かき混ぜた。このサンプルを、室温、次いで６０℃で回転蒸発させて、溶剤を除去した。実質的に等しい層間溶質分布を有するマルチラメラリポソームを形成するように、乾燥サンプルをＨＥＰＥＳ緩衝液で再水和して、最終容積を４ｍｌとした。これらのリポソームをＲＢＣ懸濁液と混合し、上記方法（実施例１０参照）に従って溶血測定を行い、脂質の溶血性を測定した。これらのデータ（第１１図及び下記表７参照）は、生成物中にインドリシジンを含まずに、種々の脂質濃度で引き起こされる溶血のパーセントを示す。
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実施例１９
インドリシジン／ＤＯＰＥリポソームの溶血活性
インドリシジン／ＤＯＰＥ有機溶剤溶液を、丸底フラスコ内で、回転蒸発により乾燥して、ＤＯＰＥ／インドリシジンリポソームを調製した。乾燥脂質を、２ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁させた。２ｍｇのインドリシジンを１ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解して、遊離（取り込まれなかった）インドリシジン対照を調製した。脂質濃度を、リン酸塩測定法（Chen等、Anal. Chem. ２８、１９５６（１９５６）参照）により求め、インドリシジン濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより求めた。これらのデータ（第１２図及び下記表８参照）から、一般に、リポソーム及び遊離型インドリシジンの両方とも、インドリシジン濃度が高くなるにつれて、溶血が増加したこと、また、ＲＢＣサンプルでのほぼ同じ濃度では、ＤＯＰＥリポソームに取り込まれたインドリシジンは、取り込まれなかったインドリシジンとほぼ同じパーセントの溶血を引き起こしたことがわかる。
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実施例２０
生体外リポソームインドリシジン毒性
１ｍｇのインドリシジンをメタノールに溶解し、得られた溶液をＰＯＰＣ（１１．７ｍｇ）クロロホルム溶液（インドリシジン：脂質比が０．８５：１）と混合して、リポソームを調製した。回転蒸発器を用いて、真空下で有機溶剤を除去した。乾燥脂質／インドリシジン混合物を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で水和した。エクストルーダー（ライペックス（Lipex）社、バンクーバー、カナダ）を用い、二枚重ねの０．１μｍニュークレオポア（Nucleopore）フィルターを通して１０回押し出した。
チミジン取り込み測定法を用いて、遊離インドリシジン、空の（インドリシジンを含まない）リポソーム又はリポソームインドリシジンによるＣＨＯ／Ｋ１細胞の生体外成長の特異的抑制を測定した。ＣＨＯ／Ｋ１細胞（２０，０００個／ウエル）を、９６ウエルの平底マイクロタイタープレートの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地にプレートし、調湿雰囲気で、５％ＣＯ2にて、３７℃に保った。この細胞を、種々の濃度の空のリポソーム、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、遊離インドリシジン、リポソームインドリシジンのいずれかにさらし、３７℃で４時間培養した。種々のインドリシジン製剤で処理された細胞を、０．５μＣｉ／ウエルの［3Ｈ］チミジン（比活性５０ｃｉ／ｍｍｏｌ）（ＩＣＮバイオメディカル（Biomedical）社、ＵＳＡ）と共に、更に８時間脈動させた。ブランデル（Brandel）Ｍ−９６ハーベスター（ブランデル（Brandel）社、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて、９３４ＡＨフィルターペーパーに細胞を集菌した。脂質シンチレーション計数により、［3Ｈ］チミジン取り込みを測定した。
これらの結果（第１４図参照）から、使用した全てのインドリシジン濃度において、リポソームインドリシジンは、遊離のインドリシジンよりも高度に細胞を成長させた。即ち、リポソームインドリシジンは、遊離のインドリシジンよりも毒性が低かった。
実施例２１
生体内毒性
５匹の雄Ｂａｌｂ／ｃマウスからなる４グループの各マウス（２０〜２２ｇ）に、種々の量（０．７５〜１２ｍｇ／ｋｇ）の遊離インドリシジン及び種々の量（２０〜１２０ｍｇ／ｋｇ）のリポソームインドリシジンを含む、発熱物質を含まない０．２ｍｌの食塩水を、尾静脈から注射した。マウスには、食塩水及び空のリポソームも注射した。これらのマウスの急性毒性を観察し、テスト母集団の５０％に対しての致死量である、インドリシジンのＬＤ50量を求めた。
これらの結果（下記表９参照）から、遊離インドリシジンのＬＤ50は３ｍｇ／ｋｇであったが、リポソームインドリシジンのそれは８０ｍｇ／ｋｇであったことがわかる。
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実施例２２
マウスにおけるアスペルギルスフミガタス（Aspergillus fumigatus）感染の治療
雄のＢａｌｂ／ｃマウスに、それぞれ２×１０7個のアスペルギルスフミガタス胞子を尾静脈から注射した。６時間後、マウスをランダムに１０匹ずつ５群に分けた。一つのグループは、２ｍｇ／ｋｇの遊離インドリシジンで治療し、第二のグループは、２ｍｇ／ｋｇのリポソームインドリシジンで治療し、第三のグループには、４０ｍｇ／ｋｇのリポソームインドリシジンを投与し、第四のグループは、空のリポソームで治療し、第五のグループは、０．２ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で治療した。１５日間にわたって、動物の生存を監視した。
これらの結果（第１３図参照）から、アスペルギルスフミガタス胞子に感染し、緩衝液か又は空のリポソームを投与したマウスは、ほぼ同じ生存率を示したことがわかる。遊離インドリシジン（２ｍｇ／ｋｇ）を投与すると、生存時間がわずかに長くなった。同じインドリシジン濃度では、リポソームインドリシジンの方が、生存時間が更に長くなった。４０ｍｇ／ｋｇのインドリシジンを投与したマウスの３０％は、治療期間の終わりまで生きていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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