(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアニオン性及びポリアニオン性に誘導された天然多糖類、又は誘導されていない天然多糖類を含む、アルカリホスファターゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アルカリホスファターゼを阻害するための、ポリアニオン性及びポリアニオン性に誘導された天然多糖類、又は誘導されていない天然多糖類の使用、並びにこれらの化合物を含有する口腔用製剤に関する。
【０００２】
歯科領域では、天然若しくは人工歯又は歯肉への細菌の接着により産生されるプラーク（歯石、結石）の形成、そしてう食、及び歯周症などの歯肉疾患の発症の促進という問題があることが多い。歯石は、歯の表面上の歯肉の縁において形成される沈着物を意味するものと理解されている。これらの沈着物は、無機材料、特にカルシウムヒドロゲンオキシアパタイト（hydrogenoxyapatite）（ＨＡＰ）、及び有機成分（上皮細胞、食物粒子、唾液の沈降物及び各種微生物など）の両方からなる。
【０００３】
この帯白色、帯黄色、又はときにしみのような歯石は、その外観のためばかりでなく、主には口腔粘膜を刺激し、歯肉炎並びに歯及び歯槽の疾患の発症を惹起するため、望ましくない。このような沈着物は、毎日のデンタルケアにより、またそれに付随する微少カルシウム除去（microdecalcification）によって予防される。更に、時々、歯科医に歯石を機械的に除去してもらうことも、通常必要である。
【０００４】
歯石形成を阻害するための安全かつ有効な薬剤は、ＨＡＰの形成を予防する、例えば、金属イオン封鎖剤及びキレート化剤として知られている、水溶性の分子脱水ポリホスファート（ヘキサメタホスファート、トリポリホスファート及びピロホスファートなど）である（米国特許第４，５１５，７２２号を参照）。しかし、経口適用すると、これらの化合物の効果は、口内及び喉領域に存在する唾液酵素により有意に低下してしまう（このようなホスファート化合物は、特にアルカリホスファターゼによって加水分解される）。
【０００５】
米国特許第５，０９４，８４４号では、アルカリホスファターゼの不活性化効果、つまり直鎖状の分子脱水ポリホスファートの加水分解を、アニオン性ポリビニルホスホナートを添加することによって、低下させることが提案されている。
【０００６】
本発明の目的は、アルカリホスファターゼの負の効果を低下させる更なる薬剤を提供することである。
【０００７】
驚くべきことに、ポリアニオン性及びポリアニオン性に誘導された天然多糖類、又は誘導されていない天然多糖類が、アルカリホスファターゼに対して阻害活性を有することが認められた。
【０００８】
したがって、本発明は、アルカリホスファターゼを阻害するための、ポリアニオン性及びポリアニオン性に誘導された天然多糖類、又は誘導されていない天然多糖類の使用に関する。
【０００９】
詳細には、本発明は、アルカリホスファターゼを阻害するための、ポリアニオン性及びポリアニオン性に誘導された天然多糖類の使用に関する。
【００１０】
使用するポリアニオン性及びポリアニオン性に誘導された天然多糖類は、好ましくは以下である：
−ムコ多糖類、及びその他のポリアニオン性天然多糖類（ヒアルロン酸又はカラゲナンなど）
−ポリアニオン性誘導体、例えば天然、非アニオン性多糖類（例えば、デキストラン、キサンタン、グルカンなど）のスルファート類、メチルカルボキシラート類、ホスファート類など。
【００１１】
ポリアニオン性に誘導された天然多糖類は、好ましくは、ホスファート基、ホスホナート基又はメチルホスホナート基を含有する化合物であり、以下のような化合物である：
−キチン誘導体、例えばスルホキチン、カルボキシメチルキチン、ホスホキチン、又は特に
−キトサン誘導体、例えばスルホキトサン、カルボキシメチルキトサン、又は格別に特にホスホキトサン。
【００１２】
本発明に用いるポリアニオン性及びポリアニオン性に誘導された天然多糖類は、好ましくは＞５０００の分子量を有する。
【００１３】
好ましいホスホキトサンは、詳細には、式（１）：
【００１４】
【化５】
0004064627.tif 000002
【００１５】
〔式中、
Ｒ1は、水素、又は式（１ａ）：
【００１６】
【化６】
0004064627.tif 000003
【００１７】
で示される基であり、
Ｒ2は、式（１ａ）の基であり、
Ｘ1及びＸ2は、互いに独立して、水素、Ｃ1−Ｃ5アルキル、又はアルカリイオン若しくはアンモニウムイオンであり、そして
ｎは、２０〜４０００である〕に対応するホスホノメチル化キトサンである。
【００１８】
非常に特に好ましいのは、式（２）：
【００１９】
【化７】
0004064627.tif 000004
【００２０】
〔式中、Ｘ1及びＸ2は、式（１）で定義したとおりである〕で示されるホスホノメチル化キトサンである。
【００２１】
最も興味深いのは、Ｘ1及びＸ2が、互いに独立してアルカリ金属であり、そしてｎが、２０〜１０００である、式（１）又は（２）の化合物である。
【００２２】
本発明により使用される誘導されていない天然多糖類は、好ましくはグルカンである。式（３）：
【００２３】
【化８】
0004064627.tif 000005
【００２４】
〔式中、ｎは、＞５×１０3〜１０×１０10、そして特に１０5〜１０8の範囲の平均分子量（ＭＷ）に対応する数である〕に対応するβ−１，３−グルカンを使用するのが好ましい。
【００２５】
本発明により使用されるポリアニオン性及びポリアニオン性に誘導された天然多糖類、及び誘導されていない天然多糖類、特に式（１）及び（２）のホスホノメチル化キトサン、並びに式（３）のβ−グルカンは、微生物、特に嫌気性微生物の固体表面、特に口内及び喉の領域における孔、間空、沈着物、歯嚢への接着を阻害し、このためこれらは、これらの微生物の負の効果、特にプラーク及び歯石の形成、又は歯のう食、臭い息（悪臭）、及び義歯への沈着を低下又は阻害することが認められた。
【００２６】
これらの化合物は、また固体表面から微生物を分離することもできる（脱着）。
【００２７】
これらの化合物は、Ｚｎ、Ｓｎ及びＭｎ、Ａｌ、Ｓｂ、Ｚｒ、Ｌａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｉｒ、Ｇｄの金属と錯体を形成して、更に例えば歯上での過剰感受性を脱感作することができる。
【００２８】
ホスホノメチル化キトサンの緩衝能は、口内のｐＨを安定化し、過酸を予防し、したがって歯のう食を予防する。
【００２９】
ポリビニルホスホナート、及び合成ポリマーの同様の誘導体とは反対に、式（１）及び（２）のホスホノメチル化キトサン、並びに式（３）のグルカンは、生体適合性であり、完全に生分解される化合物である。
【００３０】
これらの化合物の調製は、それ自体公知の方法でキトサンをホスホノメチル化することによって行われる。その調製に関する更なる詳細な記載は、ＥＰ−Ａ−０，７１３，８８２に認められる。
【００３１】
本発明は、そのもう一つの側面においては、
（ａ）少なくとも１の直鎖状の分子脱水（molecularly dehydrated）されたポリホスファート塩０．０１〜１０重量％、好ましくは２〜５重量％、及び
（ｂ）ポリアニオン性及びポリアニオン性に誘導された天然多糖０．０００１〜５重量％
を含む、口腔用組成物に関する。
【００３２】
本発明により使用されるポリホスファート塩（＝成分（ａ））、例えば、新規口腔用組成物中の細菌性プラーク形成に対する活性物質として有効であるヘキサメタホスファート、トリポリホスファート及びピロホスファート塩は、ナトリウム、カリウムなどの水溶性金属塩、又はアンモニウム塩、及びこれらの混合物である。これらの化合物は、米国特許第４，６２７，９７７及び４，８０６，３４０号から、細菌性プラークを予防する薬剤として知られている。
【００３３】
新規口腔用組成物中の成分（ａ）は、好ましくはヘキサメタホスファート、トリポリホスファート、ピロホスファート、又はこれらの化合物の混合物である。
【００３４】
ポリホスファートは、例えば２〜１２０のリン原子を含むことができ、本新規口腔用組成物に、組成物の総重量に基いて０．０１〜１０重量％、好ましくは２〜５重量％の量で使用される。
【００３５】
ピロホスファートは、好ましくはピロリン酸四カリウム及びピロリン酸四ナトリウムの混合物として使用する。
【００３６】
本新規組成物は、また抗菌活性物質、例えばフェノール誘導体、ジフェニル化合物、ベンジルアルコール、クロロヘキシジン、Ｃ12−Ｃ14アルキルベタイン、Ｃ8−Ｃ18脂肪酸アミドアルキルベタイン、両性界面活性剤、トリハロカルバニリド、第四級アンモニウム塩、そして非常に特に式（４）：
【００３７】
【化９】
0004064627.tif 000006
【００３８】
〔式中、
Ｙは、クロロ又はブロモであり、
Ｚは、ＳＯ2Ｈ、ＮＯ2、又はＣ1−Ｃ4アルキルであり、
ｒは、０〜３であり、
ｏは、０〜３であり、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０又は１であり、そして
ｎは、０又は１である〕で示される２−ヒドロキシジフェニルエーテルを含有することができる。
【００３９】
非常に特に好ましい化合物は、式（５）又は（６）：
【００４０】
【化１０】
0004064627.tif 000007
【００４１】
で示されるそれらである。
【００４２】
本新規口腔用組成物は、う食形成に有効なフッ素イオンを放出する化合物、例えば無機フッ化物塩（フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化アンモニウム又はフッ化カルシウムなど）、あるいは有機フッ化物塩（例えば、Olafluorの商品名で知られているフッ化アミン）もまた含むことができる。これらの化合物は、本新規組成物中、組成物の溶解性及び種類に応じて、０．００５〜３重量％の量で存在することができる。
【００４３】
本新規口腔用組成物は、好ましくは液状、例えばうがい薬（マウスウオッシュ）又は口内すすぎ液（マウスリンス）の形であり、本組成物は、好ましくは１：１〜２０：１、好ましくは２：１〜１０：１の、水及びアルコールの混合物である。
【００４４】
本新規口腔用組成物のｐＨは、４．５〜９、好ましくは５．５〜８である。
【００４５】
本新規口腔用組成物はまた、固形又はペースト状の形状、例えば歯磨粉、歯科用錠剤（tooth tablet）、ねり歯磨、歯磨用ゲル剤、歯磨用クリーム剤の形状であることもできる。このような固形又はペースト状の組成物は、通常は、経口的に許容しうる水不溶性の研磨剤を含有する。このような研磨剤の例としては、水不溶性メタホスファート、リン酸三カルシウム、脱水リン酸二カルシウム、ピロリン酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸ジルコニウム、ベントナイト、又はこれらの化合物の混合物が挙げられる。研磨剤は、通常は、固形又はペースト状組成物中、１０〜９０重量％、好ましくは１０〜７５重量％の量で存在する。
【００４６】
新規口腔用組成物は、更なる物質、例えば漂白剤、保存剤、シリコーン、クロロフィル化合物、細菌性プラークの予防のためのその他の薬剤、尿素、リン酸二アンモニウム、及びこれらの混合物もまた含有することができる。これらの補助剤は、本組成物の正の特性が影響を受けないような濃度で、本新規組成物に存在する。
【００４７】
更に、本新規組成物は、香料及び甘味料、例えばペパーミント油、ユーカリ油、マジョラム、シナモン、サッカリンなどを含有することができる。
【００４８】
本新規口腔用組成物は、糖衣錠、チューインガム又はその他の製品に、例えば暖かいガム状物質中で撹拌する、又はチューインガムの外表面を被覆することによって配合することができる。
【００４９】
本発明を、以下の実施例により説明する。
実施例１：アルカリホスファターゼの活性の測定
臨床化学的分析システム用の動力学的色試験を用いて、アルカリホスファターゼの活性を測定した（Olympus System Reagents 800, MIT Serice Inc.; San Diego CA）。通常使用する血液の替わりに、アルカリホスファターゼの源は、E. coliのアルカリホスファターゼ (Fluka, CH-9471 Buchs)の懸濁液２００μlを、２０mlの０．１mol/l  トリス−ＨＣｌ緩衝液、pH８．０にとり、３U/ml（Ｕ＝単位）に対応するアルカリホスファターゼの活性に調製した溶液とした（以降、溶液（Ａ）と記載する）。
【００５０】
測定溶液としては、ホスホノメチル化キトサン（＝Ｐ−キトサン)１００mgを、２０mlの０．１mol/lトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、更に０．１mol/lのトリス−ＨＣｌで希釈して、それぞれ２．５；０．５；０．１；０．０５；０．０２５；０．０１；０．００７５；０．００５及び０．００２５mg/mlとした（溶液Ｂ及びＣ）。
【００５１】
ホスホノメチル化キトサンのアルカリホスファターゼ活性に対する影響を測定するために、酵素溶液Ａ１００μlをそれぞれ溶液Ｂ又はＣ９００μlと混合した。臨床化学的プロトコールにしたがって、酵素の活性を、わずかに着色したｐ−ニトロフェニルホスファートを、強く着色したｐ−ニトロフェノールに分解するその能力により、分光光度法により測定した（表１を参照）。
【００５２】
【表１】
0004064627.tif 000008
【００５３】
これらの結果は、ホスホノメチル化されたキトサンは、アルカリホスファターゼの活性を有効に低下させることを示している。
【００５４】
実施例２：ねり歯磨の調製
0004064627.tif 000009
【００５５】
このねり歯磨きは、細菌性プラークに対して非常に有効である。
【００５６】
実施例３：うがい薬（マウスウオッシュ）の調製
0004064627.tif 000010
このうがい薬（マウスウオッシュ）は、細菌性プラークの予防に非常に適している。
【００５７】
実施例４：微生物の吸着及び脱着の測定
ａ．吸着
ＢＡプレート上に、細菌：S. mutans (ZIB6008); S. mitis (KL-stab.); S. anguinosus (ZIB6006)及びS. sanguis (ZIB6010)を嫌気的にプレートし、インキュベートした。コロニーそれぞれを、トッド−ヘウィット（Todd-Hewitt）ブロス中、約０．５ＯＤ660の密度になるまで増殖させて、保存溶液とした。
ヒドロキシアパタイトの粒状物（ＨＡ：Macro-Prep Ceramic Hydroxylapatite、８０μ、BioRad社）５０mgを滅菌Ｈ2Ｏ  １mlで１回、濾過により滅菌した吸着緩衝液（5mM  ＫＣＬ、１mMＣＣｌ2；０．１mM  ＭｇＣｌ2;１mM  Ｋ2ＨＰＯ4、pH７．２）（Berry & Siragusa (1997); Appl. Environ. Microbiol. 63, 4069-4074を参照）１mlで３回、洗浄した。細菌溶液２mlを遠心分離し（１０，０００rpm、５分間）、吸着緩衝液で２回洗浄し、次に異なる濃度の試験物質を含むか、又は試験物質を含まない吸着緩衝液１mlに再懸濁した。この溶液を吸着緩衝液１mlに懸濁したヒドロキシアパタイトの粒状物と合わせ、軽く振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートした。ＨＡ粒状物が沈降したら、上清を除去した。ＨＡ粒状物を０．５Ｎ  ＨＣｌ  １．６mlに溶解した。この溶液の光学密度（ＯＤ660）を測定し、それぞれの希釈系列について調製した試験物質を含有しない対照と関連させて配置した（対照：１００％吸着）。
【００５８】
ｂ．脱着
ＢＡプレート上に細菌：S. mutans (ZIB6008); S. mitis (KL-stab.); S. anguinosus (ZIB6006)及びS. sanguis (ZIB6010)を嫌気的にプレートし、インキュベートした。コロニーそれぞれを、トッド−ヘウィット（Todd-Hewitt）ブロス中、約０．５ＯＤ660の密度になるまで増殖させて、保存溶液とした。
ヒドロキシアパタイトの粒状物（ＨＡ：Macro-Prep Ceramic Hydroxylapatite、８０μ、BioRad社）５０mgを滅菌Ｈ2Ｏ  １mlで１回、濾過により滅菌した吸着緩衝液（5mM  ＫＣＬ、１mMＣＣｌ2；０．１mM  ＭｇＣｌ2;１mM  Ｋ2ＨＰＯ4、pH７．２）（Berry & Siragusa (1997); Appl. Environ. Microbiol. 63, 4069-4074を参照）１mlで３回、洗浄した。細菌溶液２mlを遠心分離し（１０，０００rpm、５分間）、吸着緩衝液で２回洗浄し、次に吸着緩衝液１mlに再懸濁した。この溶液を、吸着緩衝液１mlに懸濁したヒドロキシアパタイトの粒状物と合わせ、軽く振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートした。ＨＡ粒状物が沈降したら、上清を除去した。ＨＡの粒状物を吸着緩衝液で１回洗浄し、次に軽く振とうしながら、異なる濃度の試験物質を含有する吸着緩衝液１mlと共に、３７℃で３０分間インキュベートした。ＨＡの粒状物が沈降したら、上清を除去し、ＨＡ粒状物を０．５Ｎ  ＨＣｌ  １．６mlに溶解した。この溶液の光学密度（ＯＤ660）を測定し、それぞれの希釈系列について調製した試験物質を含有しない対照と関連させて配置した（対照：０％脱着）。
【００５９】
結果：
ａ．ホスホノメチル化キトサン
プラーク及び歯石形成に必須である微生物の接着のin vitroでの阻害
【００６０】
【表２】
0004064627.tif 000011
【００６１】
プラーク及び歯石形成に必須である接着微生物のin vitroでの脱着
【００６２】
【表３】
0004064627.tif 000012
【００６３】
ｂ．１．６−１，３−β−グルカン
プラーク及び歯石形成に必須である微生物の接着のin vitroでの阻害
【００６４】
【表４】
0004064627.tif 000013
【００６５】
プラーク及び歯石形成に必須である接着微生物のin vitroでの脱着
【００６６】
【表５】
0004064627.tif 000014
【００６７】
ｃ．Ｎ−ジカルボキシメチルキトサン
プラーク及び歯石形成に必須である微生物の接着のin vitroでの阻害
【００６８】
【表６】
0004064627.tif 000015