(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）の化合物のコンビナトリアル・ライブラリを調製する方法であって、
0004059303.tif 000032
次の工程を含む前記方法。
0004059303.tif 000033
（式中、
Ｙは、Ｈであり；
Ｘは、以下の基のいずれかであり；
0004059303.tif 000034
ｎは、２〜１２であり；
Ｒ１は基質からのプロテアーゼの認識要素であり、及びＲ２はプロテアーゼと作用する基であり；
Ｒ１及びＲ２は、独立に可変であり；且つ
Ｒ２’は、Ｒ２の中間体である。）
【請求項２】
Ｘが-(CH2)n-であり、ｎが４であり、請求項１記載の方法。
【請求項３】
開裂反応[2]の試薬がトリフルオロ酢酸（TFA）である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
側鎖保護基によってＹ基を最初に保護する予備工程を更に含み、
前記側鎖保護基が除去されて、アシル化[1]を可能とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
側鎖官能基保護基がFmocである、請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
イントロダクション
特定の障害(disorder)に関連する分子ターゲットの同定について、医化学的研究は、該障害の進行を防止する具体的経路中に介在する医薬分子に向けられている。良く効く、選択的な薬剤についての途のりは、多くの段階を経て進行する。例えば、異常プロテアーゼに直面した場合、最初に該プロテアーゼを単離しかつ精製する。その後、活性についてのアッセイを確立し、タンパク分解作用を示す分子を開発し、体系的に精製して、所望の効き目及び選択性を有する薬剤カンジデート(drug candidate)を得る。この経路は、時間がかかり、かつ費用が高く、従って、薬剤開発の全工程の一部の進行速度を上げる手段が商業的に非常に魅力的なものである。
従来の単一の連続技術と比較して多くの分子の同時製造(parallel preparation)のための方法である組合せ化学技術(combinatorial chemistry techniques)は、薬剤様分子(drug-like molecule)の設計及び開発において主要な役割を果たす潜在的可能性を有する。共に係属中の英国特許出願第9608457.9号明細書には、タンパク分解酵素の阻害剤の開発を促進するための手段として開発された組合せライブラリ技術(combinatorial library technology)が記載されている。プロテアーゼは、内部消滅蛍光に基づくタンパク分解活性のアッセイを迅速に提供する、潜在的プロテアーゼ基質の大きなアドレス性ライブラリ(a large addressablelibrary)についてスクリーニングされる。感受性のアッセイの確立に伴い、阻害剤の設計に使用可能な、多量の基質構造−活性データが収集される。（英国特許出願第9608457.5号明細書は本件明細書に含まれるものとする。）
プロテアーゼ阻害剤として先に開発された、又は現在開発されている分子の大部分、即ち実際上多くの他の薬剤クラスは、単純な一般式（１）
0004059303.tif 000002
により表すことができる。
（１）などの分子の製造について２つの基本的アプローチが利用可能である。従来は、液相ベースの連続化学を利用して、単一分子を得ていた。近年、これらの連続溶液化学(serial solution chemistry)は、迅速に１０代〜１００代の分子を提供する、同時組合せ法(parallel combinatorial method)に開発され始めている（Ｒ１及び／又はＲ２が変動する）。また、最近の３０年間では、固相化学の好都合な方法が開発されている。固相法は、数千の分子を迅速に生成する潜在的可能性を有する。しかしながら、一般式（１）において同時にＲ１及びＲ２の両方が異なるクラスについての容易さは、Ｒ１及びＲ２の具体的な性質及び機能に依存する。例えば、Ｒ１及びＲ２が、一般的なクラスの‘ペプチド’を提供する標準アミノ酸構造であるとき、個相法は、比較的容易に組み合わせライブラリフォーマット(combinatorial library format)において単一のペプチド又は数千／数百万のペプチドを提供するために十分に進歩している。
一般に、プロテアーゼ阻害剤は、基質からの認識要素（即ちＲ１）を用いて設計され、かつ、プロテアーゼと作用してタンパク分解活性を阻害する化学成分（即ちＲ２）と結合されることが多い。
英国特許出願第9608457.9号明細書の組合せプロテアーゼ阻害剤ライブラリアッセイ技術により、Ｒ１の可撓性組合せ変形物が存在する分子（１）の同時製造の例が提供される。組合せライブラリからの、（１）の選択された特に有効な例は、その後、連続的変形成分Ｒ２について個々に、プロテアーゼ阻害剤としての作用をアッセイしなければならない。
現在利用可能な固相技術は、単一の存在物としての単純な連続方法においてでさえ、（１）の主要クラスにおける、Ｒ１及びＲ２の両方の可撓性組合せ変形物は当然、組合せライブラリが十分に開発されていない。従って、（１）の多くのクラスにわたる数百又は数千の化合物の迅速な製造を可能にする固相組合せライブラリ法が、潜在的に、薬剤カンジデートの開発における物理化学的／構造活性プロフィールのために非常に魅力的である。また、そのような方法論により、英国特許出願第9608457.9号明細書に記載されたライブラリから誘導されたＲ１基質データの有効な阻害剤への変換の進行速度が高まり、その方法は、溶液ベースの技術を用いる現在の消費時間のものである。
構造（１）の分子への一般的固相組合せ経路が、プロテアーゼ阻害剤の開発に制限されないことが当業者には容易に分かるであろう。全てのタイプの相互作用、例えばタイプ（１）の分子が活性を示すレセプターアゴニスト、アンタゴニストが、組合せ方法において開発され得る。この点で、一般的構造（１）の多くのクラスにおいてＲ１及びＲ２の可撓性変形を可能にし、かつ、多くの分子の同時製造を導く組合せアプローチを可能にする新規な固相方法論が記載される。
背景化学−現在の問題
固相ベースの合成では、化学的に反応性のユニット（リンカー）で機能化された架橋ポリマー（樹脂支持体）を利用する。最終的に望まれる化合物の第一中間体からの官能基（カルボン酸、アミン、ヒドロキシル、スルフィドリル(sulphydryl)等）を、可逆的に及び共有結合的に、リンカーを介して樹脂に結合させる。その後、この新規な樹脂結合中間体の最終化合物への経時的な化学的変換を行う。各段階で、過剰な及び使用済みの試薬を、成長樹脂結合生成物から、単純なろ過及び洗浄（これは、溶液ベースの合成と比較して好都合な合成を提供する最優先因子(overriding factor)である）により除去する。最終段階として、十分に集めた生成物を、リンカー及び生成物の官能基間の共有結合の開裂により、固体支持体から放出する。
今までのところ、ペプチドにより、製造される一般式（１）の化合物の大部分が提供されている。従来の固相ペプチド合成では、Ｃ−末端残基のＣαカルボキシルが共有結合するリンカー誘導体化樹脂が使用される。所望の配列が、連続的に構築される（各段階で個々の要素を使用して、単一の最終生成物を提供するか、又は各段階で要素の混合物を使用して、最終生成物の混合物又は‘ライブラリ’を提供する）。その後、生成物を、Ｃ−末端残基−リンカー結合の開裂により、溶液中に放出する。これにより、遊離Ｃ−末端カルボン酸が提供される。代替のＣ−末端機能性を得るために、異なるリンカーが開発された。しかしながら、今日までに記載された実質的に全てのリンカーが、最終生成物中に存在する官能基（カルボン酸、アミン、ヒドロキシル、スルフィドリル等）を放出する。従って、（１）の多くのクラスがそうであるように、所望の化合物が上記機能性の１つを欠く場合には、明らかな問題が生じる。例えば、一般式（２）のペプチジルアクリロキシメチルケトン、良く効くクラスの阻害剤のシステイニルプロテアーゼDer p I、家庭ダストマイト(dust mite)の主要アレルゲンは、一般的クラス（１）の一員であるが、リンカーが中間体を樹脂に結合させることが可能である明らかな官能基を含まない。従って、現在の固相技術では、単一の個々の化合物は当然、類似の定義したライブラリのような一般的構造（２）の良く効く薬剤カンジデートを製造することが不可能である。
0004059303.tif 000003
Ｒ１＝Ｎα−置換アミノ酸又はアルキル又はアリール
Ｒ２＝天然の又は非天然のアミノ酸側鎖
Ｙ又はＺ＝Ｈ、アルキル、アリール、ハロゲン、アルコキシ等
共に係属中のＰＣＴ出願PCT/GB96/01707号明細書には、システイニルプロテアーゼDer p I阻害剤（２）及びそれらの製造方法がより詳細に記載されている。（ここで、PCT/GB96/01707号明細書は、本件明細書に含まれるものとする。）
新規な固相ベースの溶液
ｉ）方法
（１）中に常に存在する唯一の官能的要素は、第二級アミド基（３）である。従って、一般式（１）の初期中間体を、保存された(conserved)第二級アミド基を介して樹脂支持体に結合させることにより、任意のクラスの（１）への独特な経路が提供される。所望の化合物のその後の固相収集に次いで、リンカー及びその時点で第三級のアミド間の共有結合が開裂して、保存された第二級アミド（３）が再生される。以下の図式１を参照されたい。最終第二級アミド生成物を生じる経時的な化学的変換の間、２つの選択が可能である。
0004059303.tif 000004
0004059303.tif 000005
カップリング反応（新規な化学成分の添加により最終生成物の一部が提供される）を、単一の建築用ブロックを用いて行い、単一の最終生成物を生じさせることができる。あるいはまた、各カップリング段階を化学的混合物を用いて行い、Ｒ１及びＲ２の両方が変更された最終生成物の組合せライブラリを提供することができる。この後者の経路により、全薬剤発見プログラムにおいて利用可能な薬剤様分子の数及び範囲が非常に幅広いものとなる。
ｉｉ）化学
最近１０年間に記載された固相合成の大多数では、塩基により除去されたＮα−保護と共に、アシドリシス開裂(acidolytic cleavage)により除去される側鎖官能基保護が利用される。従って、幅広い範囲の商業的に入手可能な建築用ブロックは、この図式をベースとしている。固相法合成における最終合成段階として一般的な方法は、生成物−リンカー開裂に伴う側鎖保護の付随物除去である。従って、文献に記載された多くのリンカーは、アシドリシス処理により生成物から開裂される。リンカーの更に好ましい特徴は、幅広い範囲の試薬により容易に誘導体化（即ち、図式１におけるR1-CO-の付加）する能力である。従って、図式１について理想的なリンカーは、上記特性の全てを有するべきである。しかしながら、今日まで、そのようなリンカーは知られていない。
文献に記載されたアシドリシス処理の際にアミドを生じる、多くの主鎖アミド保護基が存在する。Johnson, Quibell及びSheppardは、図式２に概要される主鎖アミド保護システムの開発を記載した。
0004059303.tif 000006
このシステム（それ自身にリンカーなし）は、合成の間にペプチド（Ｃ−末端残基−リンカー成分(基(moiety)）を介して樹脂に予め結合されたもの）の主鎖アミドを保護するように設計された。ペプチド構築の完成後、基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によるペプチド−リンカー開裂及び側鎖脱保護を伴って最終段階で除去された。2−メトキシ(R3＝CH3）基よりむしろ２−ヒドロキシル（Ｒ３＝Ｈ）の使用により、その後のアシル化が、アシル変換メカニズムを介して、幅広い範囲の試薬を用いて行い得ることが分かった。対照的に、２−メトキシ誘導体化システムは、アシル変換反応の影響を受けず、かつ、非常に制限された適応性を有することが分かった。
Baranyのグループは、近年、図式３に示す主鎖アミドリンカーを報告した。
0004059303.tif 000007
このリンカーは、アシル化の間のアシル変換オプションを含まず、従って、一般的な適応性を有さない。
本発明により、図式２及び３に記載された要素の組合せが提供され、図式４に示した主鎖アミドリンカーシステムが導かれる。これは、商業的に入手可能な試薬の広範な主要部と適合性のシステムを作り出す主鎖アミドリンカーの正確な化学的特性と共に、アシル変換要素（即ち−ＯＹ＝２−ヒドロキシル成分）を含む。図式４に概要したリンカーにより、図式１に記載した一般的なゴールに達するのに必要な化学が提供され、これは、同時に変化可能なＲ１及びＲ２の両方を有する、一般式（１）を有する、異なるクラスの薬剤様分子の多くのライブラリの可撓性組合せ製造である。
0004059303.tif 000008
（ここで、Ｘは、
0004059303.tif 000009
Ｙは、Ｈ又はＦｍｏｃ等の側鎖官能基保護成分であり；Ｒ２1は、その後に所望のＲ２に化学的に変換される中間型のＲ２であり；かつ、ｎは、２〜１２、好ましくは４である。）
本発明により、第１の態様において、一般式（１）R1-CO-NH-R2の化合物の製造方法において使用するための、以下の一般式（Ａ）の中間体化合物が提供される。
0004059303.tif 000010
（式中、リンカー成分は、以下の一般式（Ｂ）を有する。
0004059303.tif 000011
0004059303.tif 000012
（ここで、Ｘは、
0004059303.tif 000013
Ｙは、水素又はＦｍｏｃ等の側鎖官能基保護成分であり；Ｒ２1は、その後に所望のＲ２に化学的に変換される中間型のＲ２であり；ｎは、２〜１２、好ましくは４である。））
第２の態様において、本発明により、以下の一般式（Ｃ）の中間体化合物が提供される。
0004059303.tif 000014
（式中、リンカー成分は、以下の一般式（Ｂ）を有する。
0004059303.tif 000015
（ここで、Ｘは、
0004059303.tif 000016
Ｙは、Ｈ又はＦｍｏｃ等の側鎖官能基保護成分であり；ｎは、２〜１２、好ましくは４である。））
また、本発明により、以下の一般式（Ｄ）（Ｄ1）を有する、上記中間体化合物のアシル誘導体が提供される。
0004059303.tif 000017
0004059303.tif 000018
また、本発明により、上記中間体化合物の製造方法において使用するための、以下の一般式（Ｅ）の化合物が提供される。
0004059303.tif 000019
また、本発明により、化合物（Ｅ）の製造方法において使用するための、以下の一般式（Ｆ）又は（Ｇ）の化合物が提供される。
0004059303.tif 000020
0004059303.tif 000021
本発明によれば、以下の工程を含む、上記中間体化合物を使用する、一般式（１）の化合物の製造方法が提供される。
0004059303.tif 000022
更に、本発明により、以下の工程を含む、一般式（Ｅ）の化合物の製造方法が提供される。
0004059303.tif 000023
また、本発明により、上記方法の生成物である化合物が提供される。
また、本発明により、Ｒ１及びＲ２の両方が変化可能な一般式（１）の化合物の組合せライブラリの製造方法における、本発明の化合物の使用が提供される。
好ましくは、式（Ｂ）、（Ｅ）及び（Ｇ）の化合物において、Ｙ＝Ｈであり、Ｘ＝（ＣＨ2）n（式中、ｎ＝４）である。
新規な技術の使用例
リンカーの製造
本発明のリンカー成分についての製造方法の第１の例を以下に記載する。
0004059303.tif 000024
本発明のリンカー成分についての製造方法の第２の例を以下に記載する。
0004059303.tif 000025
（Ｉ）2,4-ジヒドロキシベンズアルデヒド(mw.138.1, 50g, 0.36mol)及び噴霧乾燥した弗化カリウム(mw.58.1, 41.8g, 0.72mol)を、無水アセトニトリル(750mL)中において２０分間６０℃で強力に攪拌し、メチル-5-ブロモバレレート(mw.195.1, 140.4g, 0.72mol)を一部に添加し、その混合物を５時間穏やかに還流させた。反応物を室温に冷却し、溶剤を減圧下で除去し；残留物を水(500mL)及びエチルアセテート(250mL)間で区分けし、その水溶液をエチルアセテート(2×150mL)で２回より多く洗浄し、かつ組合せ有機物を、水でバックウォッシュ(back-wash)し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、蒸発させて乾燥物にした。得られた赤色オイルを、メチル-t-ブチルエーテル(150mL)中に溶解し、ヘプタン(100mL)を添加し、生成物をオフホワイト(off-white)固体として結晶化させた(mw252.3, 37.3g, 0.148mol, 41％収率)；1H NMR(CDCl3)δ11.44(1H, s), 9.69(1H, s), 7.41(1H, d, J=8.6Hz), 6.51(1H, dd, J=8.6, 2.2Hz), 6.39(1H, d, J=2.2Hz), 4.02(2H, t, J=5.8Hz), 3.66(3H, s), 2.44(2H, t, J=7.0Hz), 1.83(4H, m);IR(フィルム)1735cm-1;mp. 62-65℃;ESMS m/z 253(M++1);HPLC rt. 15.4分, 10-90％B（A中）,A=0.1％水性TFA, B=10％A（MeCN中），直線勾配25分，1.5mL/分，カラム=ビダックタンパク(Vydac protein)C4, 4.6×250mm, 5μ粒径。
（ＩＩ）工程（Ｉ）の生成物
5-(4-ホルミル-3-ヒドロキシフェノキシ)ペンタン酸メチルエステル(mw.252.3, 37g, 0.147mol)をＴＨＦ(1200mL)中に溶解し、室温で強力に攪拌した。この溶液に、水(600mL)に溶解した水酸化リチウム(mw.41.96, 18.5g 0.441mol)を添加し、混合物を４時間攪拌した。溶剤を減圧下で還元し、得られた油性残留物を水(200mL)で希釈し、メチル-t-ブチルエーテル(2×500mL)で２回洗浄し、濃縮されたＨＣｌで酸性化して慎重にｐＨ２とし（強力攪拌）、かつ、エチルアセテート(4×300mL)を用いて抽出した。組合せエチルアセテートを無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、蒸発させて乾燥物とし、白色固体として生成物を得た(mw.238.2, 32.1g, 0.135mol, 92％収率);1H NMR(CDCl3)δ11.26(2H, br.s), 9.69(1H,s), 7.41(1H, d, J=8.6Hz), 6.51(1H, dd, J=8.6, 2.2Hz), 6.40(1H, d, J=2.2Hz), 4,02(2H, t, J=5.9Hz), 2.44(2H, t, J=7.0Hz), 1.84(4H, m);IR(フィルム)1697, 1626cm-1;mp.88.6-89.1℃;ESMS m/z 239(M++1);HPLC rt. 14.3分, 10-90％B（A中）,A=0.1％水性TFA, B=10％A（MeCN中），直線勾配25分, 1.5mL/分，カラム=ビダックタンパク(Vydac protein)C4, 4.6×250mm, 5μ粒径。
ペプチジルアクリロキシメチルケトンの組合せライブラリ
図式５は、システイニルプロテアーゼDer p Iの潜在的阻害剤としてのペプチジルアクリロキシメチルケトンのライブラリの製造についての新規な固相組合せ技術の潜在的使用を説明するものである。
0004059303.tif 000026
ここで、Ｒ＝アリール、アルキルであり、Ｒ１’、Ｒ２’＝天然又は非天然のアミノ酸側鎖であり、Ｚ、Ｙ＝Ｈ、アルキル、ハロゲン等である。
現在、上記図式に潜在的に使用可能である、約２００の商業的に入手可能な、Fmoc-NH-CHR1'-COOH建築用ブロックが存在する。これらの大部分は、誘導体化して、図式５の第一樹脂結合中間体を生成可能であった。従って、潜在的に、Ｒ／Ｙ／Ｚの実際上制限のない組合せと共に、2001＝40000R1'/R2'変化体が存在する。２−ヒドロキシアシル変換メカニズムについてでさえ、数種の組合せは、妨げの原因となり、実用的でない。しかしながら、８０％より多く、即ち＞32000は、図式４で定義した新規なシステムを用いて容易に利用できるであろう。単に現在記載されているのみの主鎖アミドリンカーシステム（図式３）の制限された適応性を本件明細書の明確に記載する。図式４（本発明）と比較して、図式３（従来技術）は、ほんの約１０％、即ち許容可能なＲ１’／Ｒ２’の全組み合わせの4000が実用的機能性を有するであろう。
実施例
化合物のライブラリを、本発明の新規な固相組合せ化学を用いて合成した。
実施例１
一般式（Ｈ）の化合物のライブラリ。
0004059303.tif 000027
（式中、R2は、
0004059303.tif 000028
又は他の第一級アミン基から選択され、Ｒ1は、組合せ的に変化可能である。）
これらのライブラリは、プロテアーゼ阻害剤の発見に有用であり、例えば、それらは、アスパルチルプロテアーゼ阻害剤の発見に有用である。
実施例２
以下の一般式（Ｊ）の化合物を含むスタチン(statine)のライブラリ。
0004059303.tif 000029
（式中、Ｒ1又はＲ4の一方又はその両方は、組合せ的に変化可能である。）
実施例３
前駆体成分からのＮ−末端保護基の除去により形成された中間体であり、不安定であり、従って、自動的に環化する、以下の一般式（Ｋ）のジケトピペリジン化合物のライブラリ。
0004059303.tif 000030
（式中、Ｒ1及び／又はＲ2は、組合せ的に変化可能であり、Ｒ3は、アルキル又はアリル脱離基である。）これらの化合物（Ｊ）は開裂して、一般式（Ｌ）の環状化合物を形成可能である。
実施例４
以下の一般式（Ｍ）の化合物のライブラリ。
0004059303.tif 000031
（これは、環化し、開裂して、ＡＡ1〜ＡＡ4が各々組合せ的に変化可能である一般式（Ｎ）の環状化合物を提供することができる。）プロリンのＣαが反応の際に容易にはエピマー化し得えず、従って、環状生成物のキラル整合性が保持されることが、化合物（Ｍ）のクラスに特に都合が良い。
従って、本発明の更なる態様によれば、式（Ｈ）、（Ｊ）、（Ｋ）及び（Ｍ）の化合物自体及びそれぞれのライブラリ（主鎖リンカーに結合しているか又は開裂型にある）が、式（Ｌ）及び（Ｎ）の化合物自体及びそれぞれのライブラリと共に提供される。