(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）、（Ｈ2Ｎ−Ｘ1−Ｔｈｒ−Ｘ2−ＣＯ）n−Ｒ  （１）
（式中、Ｘ1とＸ2は互いに異なる基であって、Ｌ型配置またはＤ型配置のチロシンおよびアルギニンのアミノ酸残基を示し、スレオニンの水酸基群とアルギニンのグアニジン部分は、水酸基とグアニジン成分をそれぞれ保護するために、ペプチド化学で通常用いられている化合物によって保護することができ、ｎは、２、３または４を示し、Ｒはそれぞれ二量体、三量体、四量体のペプチドを形成可能な基を示す）の生物学的有効量のペプチド、および少なくとも一つの薬学的に許容され得る不活性成分、を含む医薬組成物。
【請求項２】
ｎが４である、請求の範囲第１項に記載の医薬組成物。
【請求項３】
式（１）の化合物の各アミノ酸がＬ型配置またはＤ型配置を有している、請求の範囲第１項または第２項に記載の医薬組成物。
【請求項４】
Ｒが式（Ｌｙｓ）2−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨのテトラペプチドである、請求の範囲第２項または第３項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Ｘ1がＡｒｇである、請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
Ｘ2がＴｙｒである、請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
Ｘ1がＡｒｇ（Ｐｍｃ）である、請求の範囲第１項から第４項および第６項のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
Ｘ2がＴｙｒ（ＯｔＢｕ）である、請求の範囲第１項から第５項および第７項のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
式（１）の化合物中、スレオニン水酸基が、第３級ブチル基によって保護されている、請求の範囲第１項から第８項のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、免疫グロブリンとその受容体の間の相互作用を阻害することが可能なペプチドからなる医薬組成物に関する。
免疫グロブリン（Ｉｇ）類とそれに関連した細胞表面に位置している受容体との間の相互作用があり、その相互作用が受容体によって認識される免疫グロブリンのアイソタイプに依存する一連の種々の反応を引き起こすことが知られている。例えば、マクロファージ上の、免疫グロブリンＧに関連した受容体ＦｃｇＲに対する免疫グロブリンＧの結合は、エンドサイトーシス、抗原抗体複合体のリソソーム分解およびプロスタグランジン類、ロイコトリエン、酸素中間体、中性プロテアーゼのような強力な炎症メデイエーターの分泌をもたらす（Ｕｎｋｅｌｅｓｓら、１９８１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１、５９７−６１１）。
また、抗体抗原特異性とは無関係に、Ｆｃと称される不変部分によって、免疫グロブリンはそれと関係する受容体と相互に作用することも、知られている（Ｆｒｉｄｍａｎら、１９９２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｗ．１２５、４９−７６）。
免疫グロブリン／受容体の相互作用を阻害することが可能な合成化合物は、まだ入手されていない。遺伝子工学技術によって組換え産物として得られた、ｓＦｃＲと称される可溶形態の天然受容体のみ、この重要な相互作用の阻害剤として実際に作用させることが可能である（Ｓａｕｔｅｓら、１９９４、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ、６６２、１９７−２０７）。
従って、免疫グロブリン類の過剰生産の影響を調節することが重要であり、免疫グロブリン／受容体認識によって生じる影響が細胞周期に対しネガティブであるようなそれらのすべての場合に、免疫グロブリンと受容体の間における相互作用の阻害は重要な治療法であることは明白である。
例えば、標準の化学療法に抵抗性があるため不治の腫瘍疾患である多発性骨髄腫において、実験データにより、Ｆｃに対する可溶性受容体の投与に基づくフランキング免疫療法が腫瘍細胞増殖および免疫グロブリンの分泌を減じることが示された（Ｈｏｏｖｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５、２４１−２４７）。
同様に、後天性免疫不全（ＡＩＤＳ）おいては、それぞれの細胞受容体と相互作用し、ウイルス感染性を増加する抗体が患者の血清中に生じる（Ｈｏｍｓｙら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４、１３５７−１３６０）。従って、免疫グロブリンと相互作用する受容体を阻害することが可能な分子の投与に基づく治療は、ＨＩＶウイルス感染性に対する注目すべき治療上の重要性がある。
さらに、慢性関節リウマチのような炎症由来の疾病においては、その病理上の状態をもたらす事象として、免疫グロブリンとそれに対応する細胞受容体との相互作用があり（ＦｅａｒｏｎおよびＷｏｎｇ、１９８３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１，２４３）、そして前症例では、免疫グロブリン／受容体を阻害することが可能な分子の投与に基づく治療は、顕著な治療上の恩恵を与えることができる。
Ｅクラスの場合には、アレルギー反応さえ、免疫グロブリンとそれに対応する細胞受容体との相互作用により引き起こされる。
広範な治療適用範囲および病理厳格性が提供されるため、免疫グロブリンとそれに関連する受容体の間の相互作用を阻害することが可能な合成化合物に対する大きな需要があり、合成化合物であるために生物由来の汚染がなく、低価格である。
ここで、これらの特性が、式（１）、
（Ｈ2Ｎ−Ｘ1−Ｔｈｒ−Ｘ2−ＣＯ）n−Ｒ      （１）
（式中、Ｘ1とＸ2は互いに異なる基であって、Ｌ型配置またはＤ型配置のチロシンおよびアルギニンのアミノ酸残基を示し、スレオニンの水酸基群とアルギニンのグアニジン部分は、通常ペプチド化学で用いられている水酸基とグアニジン部分をそれぞれ保護する化合物によって保護することができ、ｎは２、３または４を示し、Ｒはそれぞれ二量体、三量体、四量体のペプチドを生成することが可能な基を示す）のペプチドによって得られることを見出した。
これらの化合物の製法は、同一出願人名の１９９６年６月１９日付け欧州特許出願番号９６２０１７０６．７に記載されている。前記出願は、未だ公開されていないが、その化合物の免疫グロブリンリガンドとしての特性が記載されている。
したがって、本発明の第一の目的は、式（１）
（Ｈ2Ｎ−Ｘ1−Ｔｈｒ−Ｘ2−ＣＯ）n−Ｒ      （１）
（式中、Ｘ1とＸ2は互いに異なる残基であって、Ｌ型配置またはＤ型配置のチロシンおよびアルギニンのアミノ酸残基を示し、スレオニンの水酸基とアルギニンのグアニジン部分は、通常ペプチド化学で用いられている水酸基とグアニジン部分をそれぞれ保護する化合物によって保護することができ、ｎは２、３または４を示し、Ｒはそれぞれ二量体、三量体、四量体のペプチドを生成することが可能な基を示す）のペプチドの生物学的に有効な量、および少なくとも一つの薬学的に許容され得る不活性成分を含む、医薬組成物を提供することである。好ましくはｎは４である。
式（１）の化合物の各アミノ酸は、Ｌ型配置またはＤ型配置を有することができる。
本発明の明細書および特許請求の範囲において、「二量体」「三量体」および「四量体」の用語はそれぞれ２、３および４つのＨ2Ｎ−Ｘ1−Ｔｈｒ−Ｘ2−ＣＯ−配列から構成されるペプチドを意味する。配列中、Ｘ1およびＸ2は前述の意味を有する。
二量体（ｎ＝２）を形成するのに適切な基の代表的な例は、リジン残基である。三量体（ｎ＝３）を形成するのに適切な基の代表的な例は、式Ｌｙｓ−Ｌｙｓで表されるリジン−リジンのジペプチドである。四量体（ｎ＝４）を形成するのに適切な基の代表的な例は、式Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（εＬｙｓ）で表される分枝したトリペプチド、および式Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（εＬｙｓ）で表される分枝したテトラペプチドである。
式（１）の四量体の代表的な例は、次式（ＩＡ）
（Ｈ2Ｎ−Ｘ1−Ｔｈｒ−Ｘ2−ＣＯ）4−（Ｌｙｓ）2−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ      （ＩＡ）
（式中、Ｘ1とＸ2は前述した意味を示し、スレオニンとチロシンの水酸基およびアルギニンのグアニジン部分は、通常ペプチド化学で用いられている水酸基とグアニジン部分をそれぞれ保護する化合物によって保護することができる）である。
水酸基を保護するのに有効な多数の保護基が文献に報告されている（Ｇｒａｎｔ  Ｇ．Ａ．「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ａ  ｕｓｅｒ’ｓ  ｇｕｉｄｅ」Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎ．Ｙ．、１９９２）。
前記保護基の代表的な例は、第３級ブチル（ｔＢｕ）（Ｌａ  Ｊｏｉｅ  Ｇ．、Ｃｒｉｖｉｃｉ  Ａ、Ａｄａｍｓｏｎ  Ｊ．Ｇ．、「Ｓｙｎｔｈｅｓｙｓ」５７１−５７２（１９９０））、およびベンジル基（Ｙｏｊｉｍａ「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ」４４：８０５−８１９（１９８８））である。
アルギニンのグアニジン部分を保護ために有用な多数の基も、また、文献によって公知である（Ｇｒａｎｔ  Ｇ．Ａ．「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ａ  ｕｓｅｒ’ｓ  ｇｕｉｄｅ」Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎ．Ｙ．、１９９２）。
前記保護基の代標的な例は、２、２、５、７、８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル（Ｐｍｃ）および４−メトキシ−２、３、６−トリメチルベンゼン（Ｍｔｒ）である（ＲａｍａｇｅおよびＧｒｅｅｎ「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」、２８、２２８７（１９８７）とＦｕｊｉｉｎｏら「Ｃｈｅｍ．Ｔｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２９、２８２５（１９８１））。
式（ＩＡ）の化合物の特異的な例は、
（Ｈ2Ｎ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌ−Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）−Ｌ−Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）−ＣＯ）4−（Ｌｙｓ）2−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ    （Ｐ−ＰＡＭ）、
（Ｈ2Ｎ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ｔｙｒ−ＣＯ）4（Ｌｙｓ）2−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ    （Ｌ−ＰＡＭ）、
（Ｈ2Ｎ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｔｙｒ−ＣＯ）4−（Ｌｙｓ）2−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ      （Ｄ−ＰＡＭ）である。
下記に詳細を記述したように、式（１）のペプチドの生物活性を、免疫グロブリンと受容体（Ｉｇ−ＦｃＲ）の間の結合の阻害、およびヒトＩｇＧにより誘導体化したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）とＵ９３７細胞の間のロゼット形成阻害によりアッセイした。その結果、式（１）の化合物はＩｇ受容体上においてＩｇと同様の相互作用を生じ、前記相互作用は用量依存性であった。さらに、生体内で、受動皮膚アナフィラキシー分析によって式（１）の化合物の生物活性を評価したところ、抗アレルギー化合物の研究用動物モデルが提示された。
マウスの急性毒性試験では、式（Ｉ）の化合物は、経口投与または静脈内投与のいずれも十分に許容する。
本発明よる医薬組成物を用いた治療によって作用があると思われる病理上の状態の代表的な例は、免疫グロブリンとその受容体との間の相互作用を阻害することが有用であるか必要であるという場合である。これらの病理上の状態の代表的な例は、慢性関節リウマチ、およびアレルギー反応である。
本発明による医薬組成物は、好ましくは、少なくとも式（１）の化合物の一つの有効量と、薬学的に許容され得る少なくとも一つの不活性成分から成る、適切に剤型に調製される。
適切な剤型の例としては、経口投与用の錠剤、カプセル、コーテイングした錠剤、顆粒剤、溶液およびシロップ、および局所投与のための軟膏、医療パッチ、並びに、直腸投与のための坐薬、または注射用、アエロゾル投与用、眼科投与用の滅菌した溶液がある。
さらに、剤型には、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、緩衝液、浸透圧調整用の塩類、乳化剤、甘味料、着色剤、着香剤等の他の常用成分を含むことができる。
特別の治療が必要な場合には、本発明の医薬組成物は、他の薬学的に活性な成分を含むことが可能であり、随伴性投与が治療上有用となる。
本発明の医薬組成物における式（１）のペプチドの量は、例えば、治療すべき疾病の型、重症度、患者の体重、剤型、選択した投与手段、毎日の投与回数および選択した式（１）のペプチドの有効性のような、既知の要因に依存して大幅に変更することができる。
一般的に、本発明の医薬組成物における式（１）のペプチドの量は、１日当たり１〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１日当たり２〜５０ｍｇ／ｋｇの投与レベルが確実である。
本発明の医薬組成物の剤型は、混合、顆粒化、圧縮、溶解、滅菌等より成る、薬化学者に既知の技術によって調製することができる。
Ｐ−ＰＡＭペプチド、Ｌ−ＰＡＭペプチドおよびＤ−ＰＡＭペプチドの場合、ヒト免疫グロブリンまたはヒト免疫グロブリンＡと、それらに対応する受容体ＦｃγおよびＦｃαとの間の相互作用を阻害する能力を評価した。
この目的のため、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ＩｇＧおよびＩｇＡと、Ｕ９３７ヒト細胞系の形質膜上のそれらの受容体との間の結合の，阻害アッセイを開発した。
ＥＣＡＣＣ（カタログ番号８７０１０８０２）によって提供されたＵ９３７細胞系（Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｃ．およびＮｉｌｓｓｏｎ  Ｋ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１７、５６５、１９７６）は、ｈｙｓｔｉｃｙｔｉｃなリンパ腫に由来し、ｈｙｓｔｏｉｃｙｔｉｃな起源の細胞により、単核細胞様の特性が多く発現されている、数少ないヒト細胞系のうちの１つである。そのために、ＩｇとＦｃ受容体（ＦｃＲ）との間の相互作用に関する研究において、この細胞系が広く使用されている（ＭｃＣｏｏｌ  Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５、１９７５−１９８０、１９８５、Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ  Ｇ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２、１００９−１０１９、１９８５、およびＢｕｒｔｏｎＤ．Ｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５、１１７５−１１８１、１９８８）。
ＩｇＧ受容体のＦｃｇＲＩおよびＦｃｇＲＩＩ（Ｌｏｏｎｅｙ  Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３６、１６４１、１９８６）、およびＩｇＡ受容体のＦｃα（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ  Ｒ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７１、５９７−６１３、１９９０）が、この細胞系において構成的に発現している。
アッセイを組み立てる第一段階は、Ｕ９３７細胞からの形質膜の調製であった。この試料は、均質化をＤｏｕｎｃｅ装置で行った事、引き続き形質膜画分の精製をショ糖密度勾配で行った事以外は、制御された細胞均質化に基づいて、Ｈｕｂｂａｒｄ  Ａ．Ｌ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、９６、２１７−２２９、１９８３）の手順に従って得た。
細胞は、提供者の条件に従って培養した後に、回収し、遠心分離し（１０分間、４℃、１００×ｇ）、冷却Ｄ−ＰＢＳで３回洗浄した後、再度遠心分離した。得られた細胞ペレット（１．５ｇ）を秤量し、４ｍｌの０．２５ＭのＳＴＭ［（ＴＭ（ｐＨ８の５ｍＭ  トリス塩酸、０．５ｍＭ  の塩化マグネシウム）中に０．２５Ｍショ糖］中に懸濁した。
その懸濁液を４℃で１０分間置いた。
細胞の破壊を顕微鏡で確認しながら、Ｄｏｕｎｃｅ中で細胞を均質化し［乳棒Ａ（大型の乳棒）で４０パッセージ、および乳棒Ｂ（小型の乳棒）で同回数］、遠心分離して（４℃、１０分間、２８０×ｇ）無損傷の細胞、核および細胞砕片を除去した。
上澄を回収後、初期容量の１／２のＳＴＭにペレットを再懸濁し、次いでＤｏｕｎｃｅ装置において乳棒Ａの１０パッセージで処理した。懸濁液を遠心分離した（４℃、１０分間、２８０×ｇ）。上澄を回収し、上記ステップで得られたものといっしょに貯蔵した。その上澄の貯蔵物を遠心分離した（１０分間、４℃、１５００×ｇ）。
得られたペレットを０．２５ＭのＳＴＭに再懸濁し、２ＭのＳＴＭ（ＴＭ中２Ｍショ糖）を添加してその溶液密度を１．１８ｇｒ／ｃｍ3に調整した。得られた溶液において０．２５ＭのＳＴＭの層が形成し、その後超遠心分離機にかけた（１時間、４℃、７８０００×ｇ）。
２つのショ糖勾配相間の境界面から、形質膜画分を回収した。
競合アッセイの組み立ての第２相は、ヒトＩｇビオチン標識であった（ｌｇＧ，Ｓｉｇｍａ  カタログ番号１−４５０６、およびＩｇＡ（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号１−０６６３）。１５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した２ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリン溶液０．５ｍｌを、Ｈ2Ｏ／ＥｔＯＨ１：１に溶解した６ｍｇ／ｍｌのビオチン溶液（Ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏｃａｐｒｏａｔｅ  Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｍｉｄｅ  Ｅｓｔｅｒ  Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｂ−２６６３）０．５ｍｌと混合した。得られた溶液を撹拌しながら、室温で１５時間インキュベートした。過剰のビオチンをｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析をする事により、後に除去した。
Ｉｇ／Ｆｃ結合阻害のアッセイを行うため、ビオチン化したＩｇと形質膜試料に存在する受容体との間の直線的な結合アッセイによって、条件をセットアップした。
ＥＬＩＳＡ定量用のマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ  カタログ番号３９１２）を、ＰＢＳ中で、０．１〜１０μｇ／ｍｌ（形質膜試料中の全タンパク質を参照して）の間で濃度を変えたＵ９３７細胞由来の形質膜により、１ウエル当たり１００μｌで、４℃、１５時間処理した。そのプレートをＰＢＳで５回洗浄し、各ウエルに対し、３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ａ−９４１８）を含むＰＢＳ溶液１８０μｌを添加して、非特異的部位を飽和した。
室温で１時間３０分間おいた後、そのプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％）で５回洗浄し、ＢＳＡを０．５％含むＰＢＳに溶解した、０．０２〜２μｇ／ｍｌの間で濃度を変化させたビオチン化したＩｇを含む溶液１００μｌで、各ウェルを満たした。
３７℃で１時間３０分インキューベーションした後、ペルオキシダーゼにより誘導体化したストレプトアビジン溶液を（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｓ−５５１２）、ＢＳＡを０．５％含むＰＢＳで１：１０００に希釈し、１ウエル当たり１００μｌ添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後、そのプレートをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ｐＨ５のリン酸緩衝液中に溶解した２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ａ−９９４１）１００μｌ、および０．０１２％の過酸化水素で各ウエルを満たした。
約３０分間後に、プレートリーダ（Ｍｅｒｃｋ，Ｍｏｄ．Ｍｉｏｓ）を用いて、各ウエルの４０５ｎｍにおける吸光度を検出した。その結果を表１に示す。
0004071830.tif 000002
表１に報告されたデータは、ＩｇＧとＩｇＡの両者が、形質膜試料中に存在する受容体に、容量依存的な様式で結合する事を示している。
Ｉｇ／Ｆｃ結合の阻害アッセイは、１０μｇ／ｍｌの濃度でプレート上に固定化し、０．４μｇ／ｍｌの濃度でビオチン化した、Ｕ９３７形質膜を用いて行った。
両者のＩｇＧを、本発明のペプチド（Ｌ−ＰＡＭ、Ｄ−ＰＡＭおよびＰ−ＰＡＭ）及び２つのコントロール、すなわちＬ配置（ＣＯＮ−Ｌと称する）およびＤ配置（ＣＯＮ−Ｌと称する）のＡｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒと、１〜５００μｇ／ｍｌの間の濃度でインキューベートした（表２）。一方、ＩｇＡについては、Ｌ−ＰＡＭ，Ｐ−ＰＡＭおよびＣＯＮ−Ｌペプチドと類似した条件で、阻害アッセイを実施した（表３）。
0004071830.tif 000003
Ｂ／Ｂｏは、ＯＤに関して、競合物の存在下で得られた値を、競合物の非存在下で得られた値で割る事により計算した、阻害パーセンテージを表している。
0004071830.tif 000004
Ｂ／Ｂｏの意味は、上記に述べた通りである。
表２および３で報告されたデータは、Ｌ−ＰＡＭ、Ｄ−ＰＡＭおよびＰ−ＰＡＭが、用量依存的な様式により、ＩｇＧと同じレベルの相互作用を生じることを示している。コントロール（ＢＳＡ）及び２つのペプチドＣＯＮ−ＬおよびＣＯＮ−Ｄは共に、この相互作用を阻害することが不可能であるので、この阻害作用は特異的である。
同様に、Ｌ−ＰＡＭおよびＰ−ＰＡＭのペプチドは、ＩｇＡ−ＦｃＲの相互作用を特異的に阻害するが、一方、ＢＳＡおよびＣＯＮ−Ｌは共に、同じ効果を生じることができない。
さらに、本発明の化合物により生じる、ヒトＩｇＧで誘導体化したＳＲＢＣとＵ９３７細胞との間のロゼット形成に対する阻害の型を評価した。
ヒトＩｇＧで誘導体化したヒツジ赤血球細胞（３ＲＢＣ）と、Ｕ９３７細胞（前述のように調製した）との間のロゼット形成アッセイを用いて、Ｌ−ＰＡＭペプチドおよびＤ−ＰＡＭペプチドについて試験を行った。
ロゼット形成アッセイは、Ｌｕｎｄ  Ｊ．ら（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９，１１５−１１９，１９９５）の手順に従い、下記のように変更して行われてきた。
タンニン化したＳＲＢＣ（タンニン酸で前処理したＳＲＢＣ、Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｒ−８１２８）およびヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号１−４５０６）を用い、提供者のプロトコールに従って、誘導体化されたＳＲＢＣを調製した。誘導体化の最後に、ＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｄ−５５２７）中に０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ａ−９４１８）を含む溶液に、ＩｇＧ−ＳＲＢＣを再懸濁した。
１ｍｌ当たり７．５×１０5個の細胞密度の培養液から得られた２．５×１０5個のＵ９３７を、８０×ｇで５分間遠心分離し、５０μｌの０．１％ＤＰＢＳ−ＢＳＡに再懸濁し、２．５×１０7個のＳＲＢＣ−ＩｇＧを含む５０μｌの０．１％ＤＰＢＳ−ＢＳＡと共にインキュベートした。Ｕ９３７／ＳＲＢＣ−ＩｇＧの比率は、１：１００で使用した。
２５℃で３０分間おいた後、ロゼットを、より特異的には、表面上において４又はそれ以上の結合したＳＲＢＣを有しているＵ９３７を計測した。これらの条件では、平均して、処理したＵ９３７のうち４５％がロゼットを形成していることが確認された。
上記の条件で、Ｌ−ＰＡＭ，Ｄ−ＰＡＭ，ＣＯＮ−ＬおよびＣＯＮ−Ｄのペプチドを使用して、ロゼット形成の阻害アッセイを実施した。さらに、阻害のポジテイブコントロールとしてｌｇＧを、ネガティブコントロールとして誘導体化されていないＳＲＢＣを用いて、コントロールアッセイを行った。
分析の結果を表４に示す。その結果は、ＩｇＧにおいて得られたように、本発明のペプチドＬ−ＰＡＭおよびペプチドＤ−ＰＡＭは、誘導体化されたＳＲＢＣＩｇＧとＵ９３７膜上の関連する受容体との間の、ロゼット形成を阻害することができることを表している。コントロールＳＲＢＣと、ＣＯＮ−ＬおよびＣＯＮ−Ｄペプチドの双方は、この相互作用を阻害することができないので、この阻害は特異的である。
0004071830.tif 000005
アフィニティカラムを調製して、生物学的な液体より免疫グロブリンＥを精製する能力を試験する事により、式（１）のペプチドとクラスＥ免疫グロブリンとの間の相互作用を最初に試験した。この目的のため、ペプチド（１）（５ｍｇ）を５ｍｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０に溶解し、１．２ｇの活性化されたＣＨ−セファロース樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  カタログ番号１７−０４９０−０１）へ添加した。ＣＨ−セファロース樹脂は、アフィニティクロマトグラフィー担体であり、ペプチドとタンパク質の直接的なカップリングのために予め活性化した。その懸濁液を２４時間混合し、異なった時間での反応混合物のサンプリングしてその後にＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行う事により、カップリング効率をモニターした。２４時間の後に、当初のペプチドの約９０％が樹脂に共有結合していた。誘導体化した樹脂を、５０ｍｌのｐＨ９．０の１Ｍトリスで洗浄し、１００×６．６ｍｍのＩ．Ｄ．サイズのガラスカラムに充填した。クラスＥイムノグロブリンを精製するために、カラムを２５ｍＭのＢＩＳ−ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ６．５で、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化させ、２８０ｎｍにおいて溶出液をモニタリングした。
その後、卵白アルブミンに対するＩｇＥを含む腹水１ｍｌをカラムに搭載し、非結合物質を流出した後、溶出緩衝液を０．１Ｍの酢酸に変更した。この処理により脱着された物質を回収し、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動分析によって分析した。電気泳動の分析によって明らかにされたように、カラムは腹水のイムノグロブリン画分を保持することができたが、アルブミンは保持されずカラム空隙容量に溶出した。
Ｌ型配置またはＤ配置アミノ酸のいずれかで調製した、式（１）の化合物の精製能力は、使用したアフィニティクロマトグラフィー担体の型とは無関係だった。実際に、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  ｓｕｐｐｏｒｔ（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ３０Ｎ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）およびＡｆｆｉ−ｇｅｌ（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）のような他の担体で、同様の結果が得られた。
クラスＥ免疫グロブリンに結合するという式（１）のペプチドの能力を、ＥＬＩＳＡ検出によって更に確認した。この目的のため、ＥＬＩＳＡ検出（Ｆａｌｃｏｎ  カタログ番号３９１２）において、マイクロプレート上に式（１）のペプチドを固定することによって、式（１）のペプチド−ＩｇＥに特異的なビオチン化抗原の直線的結合アッセイを実施した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ  Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ａ−９４１８）と結合させた後、式（１）のペプチドをｐＨ８．５の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム中に５０μｇ／ｍｌの濃度で、１ウエル当たり１００μｌプレートし、４℃で１５時間おいた。ＰＢＳでプレートを５回洗浄し、３％の粉乳を含んでいる溶液を１８０μｌずつ各ウエルに添加することによって、非特異的な部位を飽和した。室温で１時間３０分おいた後、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％）でプレートを５回洗浄し、卵白アルブミン抗原に特異的なＩｇＥを、１０μｇ／ｍｌの濃度で含む腹水の、０．５％粉乳を含有するＰＢＳ溶液１００μｌで、各ウエルを満たした。３７℃で１時間３０分インキュベーションした後、０．５％粉乳を含有するＰＢＳ中における、１〜３０μｇ／ｍｌの間で変わる濃度のビオチン化卵白アルブミン溶液を、１ウエル当たり１００μｌ添加した。
３７℃で１時間３０分インキュベーションした後、０．５％粉乳含有ＰＢＳで希釈した、ペルオキシダーゼ誘導体ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｓ−５５１２）の溶液を添加した（１００μｌ／ウエル）。
３７℃で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ−Ｔで５回プレートを洗浄し、ｐＨ５のクエン酸燐酸緩衝液に溶解した、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン）酸溶液（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ａ−９９４１）１００ｍｌと、０．０１２％の過酸化水素で各ウエルを満たした。
約３０分後に、プレートリーダー（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｏｄ．Ｍｉｏｓ）によって各ウエルの吸光度を検出した。その結果を表５に示す。そのようにして得られたデータは、特異的かつ用量依存的な様式で、ＰＡＭペプチドが免疫グロブリンＥに結合していることを示している。
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さらに、本発明のペプチドの、インビボにおける抗アレルギー活性を評価した。卵白アルブミン抗原に特異的なＩｇＥと全免疫グロブリン量４ｍｇ／ｍｌをあわせて含むラット腹水を、ＰＢＳで希釈調整したものを、ＣＤ種のオスのラットに皮内経路で注射した。
動物の剃った背中に、５０μｌの容量を皮内注射した。
この方法では、腹水ＩｇＥは抹消のマストセルのＦｃεＲに結合可能であり、それらを過敏化した。
２４時間後に、卵白アルブミン１ｍｇと１ｍｌのＰＢＳに２％の濃度で溶解したエバンズブルー（Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ）染料とを、静脈経路で注射した。
１５分後に、ラットの背中の皮膚上に着色された領域が存在することを確認した。その着色された領域の範囲と色彩強度は、腹水とともに注射した抗原特異的なＩｇＥの量に比例している。
注射されたＩｇＥに結合する抗原によって、青色着色損傷が与えられ、皮内注射の部位に脱顆粒とメディエイターの遊離が検出された。結果的に、局所的な血管透過性の増加および血管からの染料漏れが観察された。
ネガティブのコントロールとして、青色着色損傷の形成を生じない皮内注射（腹水を含まないＰＢＳを５０μｌ）を行った。
阻害アッセイについては、全免疫グロブリン−ペプチド中におけるＬ−ＰＡＭペプチドおよびＤ−ＰＡＭペプチドのモル比が、１：２０，１：２００，１：２０００，１：２０．０００，１：２００．０００、すなわち、２６ｎｇ，２６０ｎｇ，２．６ｎｇ，２６ｎｇ，２６０ｎｇ，２６００ｎｇに相当するＬ−ＰＡＭペプチドおよびＤ−ＰＡＭペプチドと、ＩｇＥを含み、適切に希釈された腹水をインキュベートした。
２つのペプチドに対して個別の実験を実施した。
ＣＤ１ラットに、腹水とペプチドの混合物５０μｌを、様々な濃度で皮内注射した。
ポジティブなコントロールとして、ペプチドを含まない腹水を５０μｌ注射した。
２４時間後に、上記のように、エバンズブルー染料とともに抗原を注射した。
１５分後に、背中の皮膚上の青色着色損傷の強度と範囲を確認した。その結果、それは注射されたペプチドの量に比例し、最高濃度のペプチドにおいては完全に消失した。
Ｌ−ＰＡＭペプチドおよびＤ−ＰＡＭペプチドで得られたこの結果を、表６に示す。これらの結果は、炎症性反応の完全な消失に至るまで、両ペプチドはＩｇＥ−受容体の相互作用を、用量依存的な様式により阻害することができることを示している。
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