(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合組織型ヒト肥満細胞に特異的に発現する細胞表面抗原と特異的に反応し、融合細胞クローンａｈＭＣ５Ｃ１２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７０）によって産生されることを特徴とする抗体。
【請求項２】
新生の哺乳動物（ヒトを除く）にヒト臍帯血細胞を注射してこの細胞の全抗原に対し抗体産生誘導能を失わせたあと、結合組織型ヒト肥満細胞を注射して免疫感作し、この免疫感作した哺乳動物から得られる抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合して融合細胞を作製し、この融合細胞の中から結合組織型ヒト肥満細胞と結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することにより請求項１記載の抗体を得る抗体の製法。
【請求項３】
（１）繊維芽細胞上に発現される肥満細胞の分化・増殖に関与する因子とインターロイキン−６との存在下で臍帯血単核球を培養することにより、ヒト肥満細胞のうちのトリプターゼ陽性細胞を作製し、これを更にヒト皮膚組織から得た初代培養繊維芽細胞と共生培養することにより、トリプターゼ及びキマーゼの両者陽性細胞である結合組織型ヒト肥満細胞を作製する第１工程と、
（２）新生の哺乳動物（ヒトを除く）にヒト臍帯血細胞を注射してこの細胞の全抗原に対し抗体産生誘導能を失わせたあと、第１工程で作製した結合組織型ヒト肥満細胞を注射して免疫感作し、この免疫感作した哺乳動物から得られる抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合して融合細胞を作製する第２工程と、
（３）第２工程で作製した融合細胞の中から結合組織型ヒト肥満細胞と結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することにより、結合組織型ヒト肥満細胞と結合する抗体を得る第３工程と
を含むことを特徴とする抗体の製法。
【請求項４】
融合細胞クローンａｈＭＣ５Ｃ１２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７０）であり、請求項１の抗体を産生することを特徴とする融合細胞。
【請求項５】
新生の哺乳動物（ヒトを除く）にヒト臍帯血細胞を注射してこの細胞の全抗原に対し抗体産生誘導能を失わせたあと、結合組織型ヒト肥満細胞を注射して免疫感作し、この免疫感作した哺乳動物から得られる抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合して融合細胞を作製し、この融合細胞の中から結合組織型ヒト肥満細胞と結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養することにより、請求項４記載の融合細胞を得る融合細胞の製法。
【請求項６】
結合組織型ヒト肥満細胞の細胞表面に特異的に発現し、請求項１記載の抗体によって特異的に認識される抗原蛋白質。
【請求項７】
分子量が９０ｋＤ乃至１１０ｋＤであり、末梢血中の血球表面には存在しない請求項６記載の抗原蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗体及びその製法、この抗体を産生する融合細胞及びその製法、並びにこの抗体に認識される抗原蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
気管支喘息やスギ花粉症などのアレルギー性疾患は、まず抗原に特異的なＩｇＥの産生の誘導が起こり、この誘導されたＩｇＥに活性化された肥満細胞や好塩基球からヒスタミン・好酸球遊走因子（ＥＣＦ−Ａ）やロイコトリエン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、トロンボキサンなどの各種のメディエーターが産生、遊離されることによってアレルギー性炎症が誘発される。
【０００３】
特に組織内においては肥満細胞がこれらケミカルメディエーターを放出することによって、アレルギー性病変の形成に重要な役割を担っている。
肥満細胞は体内のあらゆる組織の血管周囲に存在し、中でも、表皮直下、気道、消化管粘膜などに数多く分布するが、これら肥満細胞はその分布する組織によって表現型に違いがあり、マウスにおいては、存在部位、大きさ、染色性、含有する化学伝達物質などにより、結合組織型肥満細胞（ＣＴＭＣ：ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ）と粘膜型肥満細胞（ＭＭＣ：ｍｕｃｏｓａｌ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ）に分けられる。ヒトの場合にはＭＭＣとＣＴＭＣというような明確な区別はないが、肥満細胞中の顆粒に含まれる蛋白分解酵素の組成により、トリプターゼ陽性細胞（以下ＭＣ−Ｔという）とトリプターゼ及びキマーゼの両者陽性細胞（以下ＭＣ−ＴＣという）に分けられる。ＭＣ−Ｔは肺や消化管粘膜組織に分布するのに対し、ＭＣ−ＴＣは皮膚組織に分布する。
【０００４】
ヒト肥満細胞は他の血液細胞と異なり、多能性幹細胞として骨髄をでて、末梢の環境に至り、肺又は皮膚の繊維芽細胞への接着の後、ＭＣ−Ｔ又はＭＣ−ＴＣとなる。ヒト肥満細胞の分化・増殖に関する研究はマウスほどには進んでいなかったが、これはヒト肥満細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養法が確立しなかったことによる。ヒト骨髄細胞をＩＬ−３存在下で培養しても、最終的に誘導されるのは主に好塩基球であって、肥満細胞は得られなかったが、１９８９年にＦｕｒｉｔｓｕらは、臍帯血単核球をマウス繊維芽細胞と共生培養することによりヒト肥満細胞の培養に成功した。ついで、繊維芽細胞上に発現される肥満細胞の分化・増殖に関与する因子（ステム・セル・ファクター（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）、以下ＳＣＦという）が明らかにされ、そのｃＤＮＡがクローニングされると、ＳＣＦによりヒト骨髄や末梢血の単核球あるいは胎児肝細胞からの肥満細胞培養が可能となった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
アレルギー性炎症症状の形成過程を明らかにし、適切な治療方法を提供するためには、組織ごとに異なるこれらの肥満細胞を純粋な形で取り出し、その性状を明らかにすることが必要である。
【０００６】
従来、これら組織特異的な肥満細胞を得るためには、各組織より酵素的処理によって肥満細胞を分離していたが、この方法では採取できる細胞数に限りがあるうえ、組織特異的な肥満細胞のみを精製することが技術的に困難であった。
現在では各種の分化した細胞について、細胞培養により大量に増殖させ、また、細胞特異的な細胞表面抗原が明らかにされていることから、このような抗原に対する抗体を用いて均一な細胞を精製する技術が確立されている。しかし、肥満細胞特に皮膚組織に分布する結合組織型肥満細胞（ＭＣ−ＴＣ）については未だ特異的な細胞表面抗原、あるいはこれを認識する抗体は得られていない。
【０００７】
本発明の目的は、ＭＣ−ＴＣと特異的に反応する抗体及びその製法、この抗体を産生する融合細胞及びその製法、並びに、この抗体に認識される抗原蛋白質を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
上記課題を解決するため、本発明の第１である抗体は、結合組織型ヒト肥満細胞に特異的に発現する細胞表面抗原と特異的に反応し、融合細胞クローンａｈＭＣ５Ｃ１２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７０）によって産生されることを特徴とする。かかる抗体を用いれば、従来困難であったＭＣ−ＴＣを組織中から容易に選択することができ、アレルギー反応における肥満細胞の役割の解明に資することができるほか、フローサイトメトリーに応用することにより、組織中の肥満細胞の分布、量的変化、形態的異常を容易に捉えることができ、ひいてはアレルギー性疾患の診断、病態の把握、治療方針の確立、治療への応用が可能になるという効果が得られる。
【０００９】
この抗体は、例えば、▲１▼繊維芽細胞上に発現される肥満細胞の分化・増殖に関与する因子とインターロイキン−６との存在下で臍帯血単核球を培養することにより、ヒト肥満細胞のうちのトリプターゼ陽性細胞を作製し、これを更にヒト皮膚組織から得た初代培養繊維芽細胞と共生培養することにより、トリプターゼ及びキマーゼの両者陽性細胞である結合組織型ヒト肥満細胞を作製する第１工程、▲２▼新生の哺乳動物（ヒトを除く）にヒト臍帯血細胞を注射してこの細胞の全抗原に対し抗体産生誘導能を失わせたあと、第１工程で作製した結合組織型ヒト肥満細胞を注射して免疫感作し、この免疫感作した哺乳動物から得られる抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合して融合細胞を作製する第２工程、▲３▼第２工程で作製した融合細胞の中から結合組織型ヒト肥満細胞と結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することにより、結合組織型ヒト肥満細胞と結合する抗体を得る第３工程を経ることにより、得ることができる。
【００１０】
本発明の第２である融合細胞は、融合細胞クローンａｈＭＣ５Ｃ１２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７０）であり、上述の抗体を産生することを特徴とする。この融合細胞は、例えば、新生の哺乳動物（ヒトを除く）にヒト臍帯血細胞を注射してこの細胞の全抗原に対し抗体産生誘導能を失わせたあと、結合組織型ヒト肥満細胞を注射して免疫感作し、この免疫感作した哺乳動物から得られる抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合して融合細胞を作製し、この融合細胞の中から結合組織型ヒト肥満細胞と特異的に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養することにより、得ることができる。
【００１１】
本発明の第３である抗原蛋白質は、結合組織型ヒト肥満細胞の細胞表面に特異的に発現し、本発明の第１の抗体によって特異的に認識されることを特徴とする。例えば、この抗原蛋白質は、分子量が９０ｋＤ乃至１１０ｋＤであり、末梢血中の血球表面には存在しない。かかる抗原蛋白質によれば、ヒト肥満細胞と特異的に反応する新たな抗体を得ることが可能になり、また、種々のアレルギー性疾患との係わりを把握することが可能になる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
［結合組織型ヒト肥満細胞と特異的に反応する抗体、及び、その抗体を産生する融合細胞］
Ａ．抗原（結合組織型ヒト肥満細胞の培養）
ヒト皮膚組織に存在する肥満細胞はその顆粒中にトリプターゼとキマーゼを含むＭＣ−ＴＣであるが、ＭＣ−ＴＣは最も分化の進んだ結合組織型の細胞と考えられ、肥満細胞を研究するために必須の細胞である。近年、繊維芽細胞が産生する肥満細胞の増殖因子としてＳＣＦが発見され、培養系でヒト肥満細胞の分化過程が調べられるようになった。本発明者らは末梢血中の幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）をＳＣＦの存在下で培養し、培養ヒト肥満細胞を得たが、この方法で得られる肥満細胞は、顆粒中にトリプターゼのみを含み、キマーゼを含まないＴ型肥満細胞つまりＭＣ−Ｔがほとんどであった。しかし、このＭＣ−Ｔをヒト皮膚組織の初代培養繊維芽細胞と共生培養することによってＭＣ−ＴＣへ分化させることに成功した（第４６回日本アレルギー学会総会（１９９６年１１月１日、栃木）、アレルギー第４５巻第１００５頁）。
【００１３】
Ｂ．抗体の作製
分化したＭＣ−ＴＣに特異的な抗体を得るには、例えば免疫寛容法を用いることが挙げられる。すなわち、生後４日目のラット乳児に、ヒト臍帯血由来の培養２週間細胞を腹腔内注射して、この細胞の全抗原に対し抗体産生誘導能を失わしめる。そして１．５カ月経過後にＭＣ−ＴＣを腹腔内注射して免疫感作し、さらに２週間毎に免疫を繰り返した後、脾細胞を取り出し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知の方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、ＭＣ−ＴＣに結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによってモノクローナル抗体を得ることができる。なお、精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ等の公知の方法を用いればよい。
【００１４】
あるいは、遺伝子工学的な方法を用いて上記抗体を得てもよい。例えば、免疫した動物から脾細胞を採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作成したあと、ＭＣ−ＴＣと反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を得てもよい。
［上記抗体によって認識される抗原蛋白質］
ＭＣ−ＴＣ抗原蛋白質は、上記で得た抗体を用いて得ることができる。例えば、ＭＣ−ＴＣより細胞を破砕後、膜分画を超遠心分離した後、キャピラリー電気泳動、ウエスタンブロットにより抗原を精製することにより得ることができる。
【００１５】
【実施例】
［実施例１］臍帯血単核球の培養
ヘパリン処理した臍帯血をフィコール・ハイパック液（比重１．０７７、シグマ社）に重層して３００×ｇで３０分間室温で遠心して単核球を分離し、１０％のＦＢＳ（ギブコ社）、５０μＭの２−メルカプトエタノール、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）に懸濁した。懸濁液の単核球数濃度を５×１０6 ／ｍｌに調製して、コラーゲンコートした１０ｃｍ培養シャーレ（イワキガラス）に蒔き、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）とＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）を加えて２週間培養し、好中球系細胞、リンパ球、マクロファージ、好塩基球や肥満細胞の前駆細胞を含む２週間培養細胞を得た。
【００１６】
［実施例２］ＭＣ−ＴＣの培養
上記で得られた臍帯血単核球をＳＣＦ１００ｎｇ／ｍｌとＩＬ−６  ５０ｎｇ／ｍｌの存在下で６週間培養し、ヒト肥満細胞が過半数を占めたところで、すなわち１０6 個のオーダーのヒト肥満細胞が得られたところで、ヒトの繊維芽細胞の初代培養細胞との共生培養を行った。すなわち、ヒトの皮膚由来もしくは肺由来の繊維芽細胞の単層培養にこのヒト肥満細胞を移し、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦの存在下で２カ月間培養した。
【００１７】
共生培養前後の肥満細胞について、キマーゼ陽性の肥満細胞の割合と、トリプターゼ濃度を測定した。その結果を図１に示す。この図１において、共生培養前の肥満細胞すなわちＳＣＦとＩＬ−６の存在下で１０〜１６週間培養したヒト肥満細胞（図１のグラフの左端）ではキマーゼ陽性の肥満細胞の割合、トリプターゼ濃度ともにわずかしか認められなかった。これに対して皮膚繊維芽細胞と６〜８週間の共生培養後（図１のグラフの中央）及び肺繊維芽細胞との共生培養後（図１のグラフの右端）のヒト肥満細胞ではともに明らかな増加が認められ、特に皮膚繊維芽細胞と共生培養したヒト肥満細胞の場合に著しい増加が認められた。
【００１８】
ＳＣＦとＩＬ−６の存在下で１５週間培養した肥満細胞と、６週間の培養の後皮膚繊維芽細胞と共に２ヶ月間培養した肥満細胞について、トリプターゼに対する抗体及びキマーゼに対する抗体を用いて細胞を染色したところ、トリプターゼに対する染色ではどちらの細胞も全体に染色が認められたのに対し、キマーゼに対する染色では、繊維芽細胞と共生培養した細胞では殆どの細胞に染色が認められたのに対し、共生培養を行わなかった細胞では一部にしか染色が認められなかった。この結果、共生培養によってＭＣ−ＴがＭＣ−ＴＣに分化していることが判明した。
【００１９】
以上のように、結合組織型ヒト肥満細胞であるＭＣ−ＴＣは、臍帯血単核球をＳＣＦ、ＩＬ−６の存在下で培養後、さらにヒト皮膚繊維芽細胞の初代細胞と共生培養を行うことにより得られることが判明した。
［実施例３］免疫と抗体の産生
１）マウスの免疫
生後４日目のラット乳児に、上記実施例１で得た臍帯血の２週間培養細胞（１０6 ｃｅｌｌ／０．１ｍｌ）を腹腔内注射して、免疫学習中のラットにこの細胞の全抗原に対する抗体産生誘導能を失わしめた。１．５ヶ月後に上記実施例２で得たＭＣ−ＴＣ（１０6ｃｅｌｌ／０．１０ｍｌ）を、コンプリートアジュバントと共に腹腔内注射して感作免疫した。さらに、以後２週間ごとに２回、同細胞を単独で腹腔内注射した。最終免疫後、４日目に脾臓を取り出し、以下に示すように細胞融合を行った。
【００２０】
２）抗肥満細胞表面抗原抗体を産生する融合細胞の選択と取得
摘出したラットの脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞とを１０：１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５００を融合促進剤として細胞融合を行った。融合後の細胞は脾臓細胞当り５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞濃度となるように１０％ウシ血清を含むＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウエルのマイクロタイタープレート（ヌンク社）に１ウエル当たり２００μｌずつ分注した。
【００２１】
融合細胞はＣＯ2インキュベータ（５％ＣＯ2、３７℃）中で培養し、ＨＡＴ培地で培地交換を行い増殖させて、脾臓細胞と骨髄腫細胞からなる融合細胞のスクリーニングを行った。ついでＨＡＴ培地中で順化し、さらに１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）ＩｓｃｏｖｅのＩＭＤＭ培地で順化した。
【００２２】
融合細胞培養上清中の抗体は、マストサイトーマの皮膚病巣より分離したＭＣ−ＴＣを抗原に用い、これと反応する抗体を産生するクローンを、蛍光抗体法により選別し、ａｈＭＣ５Ｃ１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０７０）と名付けた。得られたクローンの細胞はそれぞれ１０％のＤＭＳＯを含む９０％ウシ血清中に懸濁させ、液体窒素中に保存した。
【００２３】
３）モノクローナル抗体の採取
クローンの産生する抗肥満細胞表面抗原モノクローナル抗体は、ａｈＭＣ５Ｃ１２をヌードマウスの腹腔内で増殖させ、その腹水から精製した。
［実施例４］抗体の特異性の確認
１）染色による特異性の確認
▲１▼ＭＣ−ＴＣのスメアをカルノア（Ｃａｒｎｏｙ）固定液で固定して、上記実施例３で得たクローンａｈＭＣ５Ｃ１２の培養上清を添加して３７℃で４０分間反応後水洗し、ＦＩＴＣ標識抗ラットイムノグロブリン（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）で４０分反応後、ＰＢＳで洗浄し、エバンスブルーで対比染色したところ、上記スメアに染色が認められた。コントロールとして、上記培養上清の代わりにＰＢＳを用いたところ、上記スメアに染色は認められなかった。
【００２４】
▲２▼臍帯血単核球のスメアをカルノア固定液で固定して、上記実施例３で得たクローンａｈＭＣ５Ｃ１２の培養上清を添加して同様にして処理したところ、染色される細胞は認められなかった。このスメアには好塩基球が全量２×１０4個のうち０．４％含まれるが、この結果はエピトープがＩｇＥレセプターではないことを示唆している。
【００２５】
▲３▼臍帯血単核球をＳＣＦ、ＩＬ−６の存在下で３週間及び６週間培養した後、上記と同様にして処理したところ、いずれにおいても染色される細胞は認められなかった。３週間培養後の細胞構成は、平均すると下記表１の構成割合であった。したがって、本抗体は下記表１の細胞のいずれとも反応しないことが示唆された。また、６週間培養後の細胞構成は下記表２の構成であり、このため本抗体は幼弱なヒト肥満細胞とは反応しないことが示され、また、エピトープはＳＣＦが結合するｃ−キットレセプター（ｃ−ｋｉｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ではないことが示唆され、更に、このヒト肥満細胞（ＭＣ−Ｔ）はトリプターゼを含むので本抗体はトリプターゼとも反応しないことが示唆された。また、後述するように、抗原の分子量が９０〜１１０ｋＤであるので、分子量３０ｋＤのキマーゼとも本抗体は反応しないと考えられる。
【００２６】
【表１】
0004117054.tif 000002
【００２７】
【表２】
0004117054.tif 000003
【００２８】
▲４▼正常ヒト末梢血のスメア標本を作製し、上記と同様にして処理したところ、末梢血中のいずれの細胞にも染色は認められなかった。
▲５▼ヒト正常皮膚組織の凍結切片を材料として、本抗体を用いて染色し、トルイジンブルーによる染色結果と比較したところ、メタクロマジーのため紫色に染色される顆粒を持つ細胞が蛍光抗体法によって染色された。このことから、本抗体はＴＣ型肥満細胞を特異的に認識していることが示された。
【００２９】
上記「１」〜「５」より、本抗体はＩｇＥレセプター、ｃ−キットレセプター、トリプターゼ及びキマーゼと反応する抗体ではなく、結合組織型のヒト肥満細胞であるＭＣ−ＴＣを識別する抗体であることが示された。また、この抗体によって識別されるＭＣ−ＴＣ上に発現する抗原は正常ヒト末梢血中の血球表面には存在しないことが示された。
【００３０】
２）フローサイトメトリーによる特異性の確認
ＭＣ−ＴＣに対して、ハイブリドーマａｈＭＣ５Ｃ１２をヌードマウスの腹腔に播種して得た腹水（抗体）を１／５０量添加し、対照として正常ラット血清を１／５０量添加した。抗体及び正常ラット血清を添加した細胞は氷冷しながら１時間攪拌して反応させた後、１０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を捨て、１％のＢＳＡを加えたＰＢＳで懸濁し、再度遠心した後、０．８ｍｌの１％ＢＳＡ加ＰＢＳに懸濁し、ＦＩＴＣ標識抗ラットイムノグロブリン（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）（ヤギ）を加えて２５℃で２０分間反応させた。反応後、８００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除き、１％ＢＳＡ加ＰＢＳで３回洗浄した後ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社）で分析した。
【００３１】
その結果を図２（ａ）及び（ｂ）に示す。図２（ａ）の横軸は細胞のサイズ、縦軸は細胞表面の凹凸を示すスケールで、肥満細胞は大型で且つ顆粒を含むため、図中主たる細胞であり、リンパ球とは異なり、７角形の枠内に分布すると考えられる。
【００３２】
枠内の細胞について蛍光強度を横軸にした分布を示したのが図２（ｂ）で、図示しない蛍光抗体法の写真でも明らかであったように肥満細胞の中でも抗体によって強く染色される細胞と弱く染色される細胞が幅をもっており、ＦＡＣＳでも強度３〜５００まで幅広い分布を示している。これはおそらく細胞の分化の度合いによって抗原の発現量が変化しているためと思われる。また、本抗体を反応させることにより、細胞の分布のピークが移動し、本抗体がＴＣ型肥満細胞の細胞表面に存在する抗原と反応していることが示された。
【００３３】
このように細胞は固定せず生きたまま染色していることから、抗体は細胞表面に出ている抗原と反応していると考えられ、抗原は肥満細胞の分化（ＭＣ−Ｔ→ＭＣ−ＴＣ、もしくは粘膜型→結合組織型）に応じて細胞表面に発現する分化マーカーと考えられる。
【００３４】
３）ウェスタンブロッティングによる特異性の確認と対応抗原の分子量
陽性細胞（ＭＣ−ＴＣ）を２−ＭＥ加ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと等量混合し、１００℃、５分間煮沸して細胞溶解液とし、これを抗原とした。この抗原を用いてＬａｅｍｍｌｉの方法によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。なお、２−ＭＥ加ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーの組成を下記表３に示す。
【００３５】
【表３】
0004117054.tif 000004
【００３６】
電気泳動は濃縮ゲル４．５％、分離ゲル１２．５％で行い、通常の手順に従って分離した後、ニトロセルロースメンブレンフィルターに転写して、一次抗体（ハイブリドーマａｈＭＣ５Ｃ１２をヌードマウスの腹腔に播種して得た腹水（本抗体という）、又は、正常ラット血清）を反応させ、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリンを用い、ジアミノベンチジンを基質として特異バンドの検出を行った。同様に、ヒト臍帯血の２週間培養細胞（陰性細胞）を抗原としてウエスタンブロッティングを行った。
【００３７】
結果は図３に示すとおりで、陽性細胞であるＭＣ−ＴＣを用いて一次抗体として本抗体を反応させた場合には分子量約１００ｋＤ（９０ｋＤ〜１１０ｋＤ）にバンドが確認されたが、陰性細胞を抗原とした場合及び一次抗体として正常ラット血清を用いた場合にはバンドは検出されなかった。このことから、本抗体がＭＣ−ＴＣに特異的に発現する抗原と特異的に反応することが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  共生培養前後の肥満細胞についてキマーゼ陽性の肥満細胞の割合とトリプターゼ濃度を測定した結果を表すグラフである。
【図２】  フローサイトメトリーの結果を表すグラフである。
【図３】  ウエスタンブロッティングの結果を表すグラフである。
【図１】
0004117054.tif 000005
【図２】
0004117054.tif 000006
【図３】
0004117054.tif 000007