(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾された左および右Ｔ−ＤＮＡボーダーのみを有するＴ−ＤＮＡを含むＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターであって、
修飾された右Ｔ−ＤＮＡボーダーが、右ボーダー外側領域により外側で隣接された右ボーダーコア配列からなる右Ｔ−ＤＮＡボーダーであり、そして
修飾された左Ｔ−ＤＮＡボーダーが、
（ｉ）左ボーダーコア配列、または
（ii）左ボーダーコア配列と左ボーダー内側領域
からなる左Ｔ−ＤＮＡボーダーである
ことを特徴とする、Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクター。
【請求項２】
修飾された左Ｔ−ＤＮＡボーダーが、ノパリン型Ｔ−ＤＮＡ左ボーダーとオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ左ボーダーを含有する左Ｔ−ＤＮＡボーダーの反復からなる左Ｔ−ＤＮＡボーダーである、請求項１記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクター。
【請求項３】
修飾左Ｔ−ＤＮＡボーダーが、オクトピン型左ボーダーに隣接しその下流または上流にあるノパリン型左ボーダーを含有する左Ｔ−ＤＮＡボーダーの反復からなる左Ｔ−ＤＮＡボーダーである、請求項２記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクター。
【請求項４】
修飾左Ｔ−ＤＮＡボーダーが、左ボーダーコア配列の下流で組換え部位をさらに含み、そして、修飾右Ｔ−ＤＮＡボーダーが、右ボーダーコア配列の上流で組換え部位をさらに含み、該組換え部位が反復として構成されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクター。
【請求項５】
さらに、右ボーダー外側領域の上流でかつ修飾右Ｔ−ＤＮＡボーダーの組換え部位の下流で請求項１〜３いずれか１項記載の修飾左Ｔ−ＤＮＡボーダーの第２のコピーを含む、請求項４記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクター。
【請求項６】
修飾左Ｔ−ＤＮＡボーダーの第２のコピーが、修飾右Ｔ−ＤＮＡボーダーの右ボーダー外側領域に隣接している、請求項５記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクター。
【請求項７】
さらに、修飾左Ｔ−ＤＮＡボーダーの左ボーダーコア配列の下流の組換え部位の下流に位置するリコンビナーゼ遺伝子を含む、請求項４記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクター。
【請求項８】
リコンビナーゼ遺伝子が、修飾左Ｔ−ＤＮＡボーダーの組換え部位の反復に隣接しており、さらに該組換え部位に隣接した該リコンビナーゼ遺伝子の下流に位置する請求項１〜３いずれか１項記載の修飾左Ｔ−ＤＮＡボーダーの第２のコピーを含む、請求項７記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクター。
【請求項９】
さらに、修飾左Ｔ−ＤＮＡボーダーの第２のコピーの左ボーダーコア配列の下流および上流に反復として構成されたさらなる組換え部位を含む、請求項８記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクター。
【請求項１０】
各々、反復として構成された組換え部位が直列反復として構成された部位特異的組換え部位か、または逆反復として構成されたトランスポゾンボーダー配列のいずれかとして定義され；リコンビナーゼ遺伝子が部位特異的リコンビナーゼかまたはトランスポザーゼ遺伝子のいずれかとして定義される、請求項４〜９のいずれか１項記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項で定義された修飾された左および右Ｔ−ＤＮＡボーダーのみを含む、遺伝子治療の目的のアグロリスティック形質転換のためのアグロバクテリウム媒介形質転換のためのベクターであって、該ベクターが、アグロリスティック形質転換または遺伝子治療に使用されるバイナリー形質転換ベクター、スーパーバイナリー形質転換ベクター、同時組み込み形質転換ベクター、Ｒｉ−由来の形質転換ベクターおよびＴ−ＤＮＡ担持ベクターから選択される、ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターを用いる植物、酵母、カビまたは糸状菌のアグロバクテリウム媒介形質転換からなるトランスジェニック植物、酵母、カビまたは糸状菌を得る方法。
【請求項１３】
トランスジェニック植物、酵母、カビまたは糸状菌を得る方法であって、請求項４〜６のいずれか１項で定義されるＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターでの植物、酵母、カビまたは糸状菌のアグロバクテリウム媒介形質転換に、該ベクターから生じる可能性のある組み込まれたベクターバックボーン配列から得られた形質転換細胞を修復するためにリコンビナーゼまたはトランスポザーゼの供給を組み合わせてなる方法。
【請求項１４】
トランスジェニック植物、酵母、カビまたは糸状菌を得る方法であって、請求項７〜９のいずれか１項で定義されるＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターを用いる植物、酵母、カビまたは糸状菌のアグロバクテリウム媒介形質転換からなる、ベクターから生じる可能性のある組み込まれたベクターバックボーン配列から得られた該形質転換細胞を修復するための方法。
【請求項１５】
さらに、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼの供給を組み合わせてなる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
アグロバクテリウム媒介形質転換細胞におけるベクターバックボーン配列の組み込みを防御する方法であって、Ｔ−ＤＮＡニッキング複合体内に含まれるＶｉｒＤ１および／またはＶｉｒＤ２タンパク質の産生を増加させることにより、請求項１〜１１のいずれか１項記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターを含む、Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクターの左ボーダーコア配列でニッキング効率を増強することを含む方法。
【請求項１７】
アグロバクテリウムのゲノムまたは染色体外実体にｖｉｒＤ遺伝子座の追加のコピーを組み込むことを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ｖｉｒＤ遺伝子座の追加のコピーが、オクトピン型ｖｉｒＤ遺伝子座またはノパリン型ｖｉｒＤ遺伝子座から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
さらに請求項１６〜１８のいずれか１項記載の方法を用いて、Ｔ−ＤＮＡニッキング複合体内に含まれるＶｉｒＤ１および／またはＶｉｒＤ２タンパク質の産生を増加させることを含む、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか１項記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターを用いる、真核細胞のアグロリスティック基盤の形質転換の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか１項記載のＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターのいずれかの使用を含む、遺伝子治療方法であって、ヒトのための遺伝子治療方法を除く、方法。
【請求項２２】
請求項１〜１１のいずれか１項で定義されるいずれかのＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターを含有する、組換え宿主細胞。
【請求項２３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスであると同定される、請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１２〜２０のいずれか１項記載のアグロバクテリウム媒介形質転換法により得ることができるトランスジェニック植物細胞または植物、その一部、またはその子孫。
【請求項２５】
請求項１２〜２０のいずれか１項記載のアグロバクテリウム媒介形質転換法により得ることができる、トランスジェニック酵母、カビまたは糸状菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は分子生物学の分野に関する。より具体的には本発明は外来のＤＮＡの真核細胞のゲノム、例えば植物細胞への組み込みの方法について記載する。本発明の特性は、左Ｔ−ＤＮＡボーダーを通る読み合わせが著明に低下し、および／または組み込まれたベクターバックボーンＤＮＡを容易に除去できるように、アグロバクテリウム的に転移されたＴ−ＤＮＡを隣接するボーダー反復を設計することに在る。従って、Ｔ−ＤＮＡのみを含有するトランスジェニック真核細胞を得る頻度が増す。
【０００２】
（発明の背景）
人類が遊牧生活から定住生活に移って以来、「古典的な」交雑育種により改良された植物変種が得られている。さらに近年では科学者が交雑の間の遺伝物質の挙動を解明し始め、植物の育種家は交雑の子孫の所定の遺伝的特色の分布を予測するメンデルの法則に含まれる知識から利を得ることができ、依然そうしている。植物分子生物学の出現で植物の育種家はかなり精密さを増して新規キメラ遺伝子を植物ゲノムに挿入することができる。今日では、植物の遺伝的形質転換を媒介するためにアグロリスティック、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、遺伝子直接転移およびＤＮＡコーティングした粒子を用いるボンバードメントなど種々の技術を利用できる。好ましい、広く用いられている植物形質転換系では土壌細菌アグロバクテリウム（ZupanおよびZambryski(1995)、Gelvin(1998a)、Gheysenら(1998))を使用する。今日、アグロバクテリウムは植物の形質転換に使用するのみならず、酵母、カビおよび糸状菌の形質転換にも使用されている(Bundockら(1995)、de Grootら(1998)、Goukaら(1999)、国際公開公報第９８／４５４５５号）。さらに、Ｔ−ＤＮＡ産生の構成要素およびアグロバクテリウムの転移メカニズムは哺乳動物細胞の核へのＤＮＡの移入に有用であることが示されており、遺伝子治療におけるこれらの構成要素の使用に展望が開かれた(Ziemienowiczら(1999))。アグロバクテリウムはＴ−ＤＮＡに位置するいずれかのＤＮＡを真核細胞核へ移す。このＴ−ＤＮＡは野生型Ｔｉ−（アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の場合）またはＲｉ−プラスミド（Ａ．リゾゲネスの場合）の一部である。野生型Ｔ−ＤＮＡは植物ゲノムに組み込まれた後、Ａ．ツメファシエンスまたはＡ．リゾゲネスの場合、各々クラウンゴール腫瘍または毛状根症候群を引き起こす遺伝子を担持する。ｖｉｒ遺伝子（有毒遺伝子）もまた野生型Ｔｉ−またはＲｉ−プラスミドに位置し、これは植物フェノール類により活性化される。ｖｉｒ遺伝子の産生物はＴ−ＤＮＡの真核細胞ゲノムへの転移に寄与する。形質転換目的では、Ｔ−ＤＮＡを無毒化（すなわち全ての疾患原因となる遺伝子を除去する）し、ｖｉｒ遺伝子はヘルパープラスミドのトランス（（複数の）異種性遺伝子を取り囲むＴ−ＤＮＡは次いで第２のバイナリー植物形質転換ベクターに位置する）か、または同時組み込み植物形質転換ベクターの場合シスのいずれかで供給される。２個のＴ−ＤＮＡ  ２２塩基対（オクトピンＴｉプラスミドの場合）または２５塩基対（ノパリンＴｉプラスミドの場合）の右ボーダー（ＲＢ）および左ボーダー（ＬＢ）を構成する不完全なボーダーコア配列間に目的の異種性遺伝子をクローニングし、これはＴ−ＤＮＡプロセシングを指示するのに必要なシスエレメントのみである。ＲＢおよびＬＢのボーダーコア配列は不完全な反復として構成される。
【０００３】
ＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２タンパク質は各ボーダー反復のボトム鎖の第３および第４塩基間で一本鎖ニックを作る（Yanofskyら(1986)）。ＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２のレベル増加によりアグロバクテリウム内のＴ−ＤＮＡ複合体の産生が増強され、その結果、植物形質転換効率が上昇する（Wangら(1990)）。
【０００４】
何年もの間、反復間のＤＮＡ、すなわちＴ−ＤＮＡのみが真核細胞に転移し、Ｔ−ＤＮＡの外側のベクターＤＮＡは転移しないと考えられていた。しかしながら、近年、トランスジェニック植物のＤＮＡインサートのより詳細な特徴づけにより、ベクターバックボーン配列もまた非常に高頻度で植物ゲノムに組み込まれることが示されている（Martineauら(1994)、RamanathanおよびVeluthambi(1995)、Clusterら(1996)、van der Graaffら(1996)、Kononovら(1997)、Wenckら(1997)、Woltersら(1998)）。
【０００５】
本発明の著者は以前にベクター配列の組み込み頻度が植物種または用いる形質転換法により影響されないことを見出した。これはベクターバックボーン配列の転移がＬＢを通り過ぎた読み合わせの結果であり、その過程はアグロバクテリウム細胞内で生じており、恐らくこれらの細胞内の因子により決定されるという見解に合致する。しかしながら、他の研究者による根形質転換により得られるアラビドプシス（Arabidopsis）形質転換体の３３％で、および真空浸透により得られる形質転換体の６２％まで、ベクターバックボーンが組み込まれるとう報告に注目すべきである（Wenckら(1997)）。これは用いられる形質転換法がベクターバックボーンの組み込みの頻度に影響する別の因子であり得ることを意味している。ベクターバックボーン配列の組み込みはペチュニア（Petunia）（VirtsおよびGelvin(1985)、Clusterら(1996)）、アラビドプシス（Arabidopsis)(Van der Graaffら(1996）、Wenckら(1997)、タバコ（RamanathanおよびVeluthambi(1995))、Kononovら(1997）、Wenckら(1997)）およびジャガイモ（Woltersら(1998)）などの多くの植物種で生じることが報告されている。ベクターバックボーンの組み込みは明らかに植物形質転換に用いたアグロバクテリウム株の型とは独立している（Kononvら(1997)）。
【０００６】
発明者らは以前に、特異的ＰＣＲ反応およびＤＮＡゲルブロット分析を用いてベクターバックボーン配列の存在に関して異なるシリーズの形質転換体を分析した。２つの異なる植物種において、すなわちアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）根および葉形質転換体並びにニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）プロトプラストおよび葉形質転換体において３つの異なる形質転換法を評価した。最終的にレプリコン型、ＣｏｌＥ１およびｐＶＳ１レプリコンの影響を評価した。結果は形質転換に使用した植物種も外植体の型、レプリコン型または選択もベクター配列の組み込みを生じる頻度に大きく影響することはなかった。従来はＴ−ＤＮＡに属さないベクターＤＮＡのこの転移は左ボーダーでの読み合わせの結果であり、これはＴ−ＤＮＡ転移の正常な終止を妨害すると仮定されていた。または、ＤＮＡ転移は左ボーダーで出発し、右ボーダーに向かって進み得る（RamanathanおよびVeluthambi(1995); van der Graaffら(1996)）。しかしながら前記のトランスジェニク植物では、多くが左ボーダーに結合したベクターバックボーン配列および、右Ｔ−ＤＮＡボーダーとのベクター接合を含有することが観察された。ＤＮＡゲルブロットはこれらの植物のほとんどで、完全なベクター配列が組み込まれていることを示している。従って、完全なベクターバックボーン配列の植物ゲノムにおける組み込みは右ボーダーで開始される接合転移、続いて読み合わせと称する左および右ボーダーでの連続複製の結果である。このモデルは左ボーダーがＤＮＡ転移の開始部位としてはあまり認識されなく、右ボーダーはＤＮＡ転移の終止部位としては効率よく認識されないことを意味している。これらの観察は、Ｔ−ＤＮＡ形質転換の促進において右ボーダー領域が左ボーダー領域よりも本質的により活性であることを示す以前の研究結果に準じている（JenおよびChilton(1986、a,b), Caplanら(1985)）。利用できる全てのデータより、Ｔ鎖形成は左ボーダー領域よりも右ボーダー領域でより高頻度で出発すると結論づけることができる。
【０００７】
将来、アグロバクテリウム媒介の形質転換の結果、ベクターバックボーンの組み込みを防御するか、または修復することが最も重要になろう。第１に、監督機関は、一般の市場に放出されるトランスジェニック植物はベクターバックボーン配列を含まないことを要求する。かかるバックボーン配列は細菌性複製起点、細菌性抗生物質抵抗性遺伝子および可能な多くのその他の（外来）遺伝子を担持している可能性がある。また植物バイオテクノロジーに関係するこのような潜在する危険性に徐々に気付いてきている消費者によっても同じ厳しい懸念があげられる。第２に科学的な観点からも、植物のゲノムにベクターバックボーンが組み込まれているのは望ましくない。かかる配列は導入遺伝子発現に影響し得る（Iglesiasら(1997)、MatzkeおよびMatzke(1998)、Jakowitschら(1999))。ベクターバックボーンの組み込みはまたＴ−ＤＮＡタグ化実験に影響を及ぼす可能性が高い。タグは予期していたものよりかなり長く（Martineauら(1994)）、ベクターバックボーンの組み込みはまた、Ｔ−ＤＮＡタグ化アラビドプシス植物では多くの割合でＴ−ＤＮＡが変異表現型と同時分離されないという事実を説明することもできる（Errampaliら(1991)、Feldmann(1991)、Konczら(1992)、Van Lijsebettensら(1991))。
【０００８】
偶発的なベクターバックボーンの組み込み現象はすでに早くも１９８２年にOomsらにより遭遇されているが、これは１９９５年になってまず第１の解決としてRamanathanおよびVeluthambi(1995)により：「．．．左ボーダーに隣接して『転移停止』シグナル調整を有する新規バイナリーベクターを構築できる」ことが示唆された。それ以来、研究者はベクターバックボーン組み込みのメカニズムを理解しようとしてきた。可能な理由がWenckら(1997)により論じられた：「．．．効率の悪いニッキングは有毒タンパク質、主にＶｉｒＤ２が低量であるためであろう」。しかしながら、極最近、Hansonら(1999)によりＴ−ＤＮＡボーダーで読み合わせを防御する方法が開示された（国際公開公報第９９／０１５６３号）。これらの方法はボーダーの外側の配列を含むことに基づく。これらの配列は毒性化合物をコードする遺伝子またはＤＮＡ結合タンパク質と相互作用できる配列またはＧ＋Ｃヌクレオチドに富む配列のいずれかである。国際公開公報第９９／０１５６３号およびHansonら(1999)に記載された方法の主要な欠点はゲノムにＴ−ＤＮＡ領域以上の領域を担持する植物形質転換体の再生が防御されることである。かかる方法は全形質転換効率を損なう、すなわち所定の形質転換実験から得られる形質転換体の数が少なくなると考えられる。まさにHansonら(1999)によりタバコ形質転換効率が３０％も低下することが報告された。それにもかかわらず、Hansonら(1999)は彼らの研究を「トランスジェニック体から非Ｔ−ＤＮＡ配列を排除するため」の有用な手段として報告している。
【０００９】
本発明は望ましくないベクターバックボーンの組み込みの技術的な問題に対する解決について記載し、既存の方法に対する利点を提供する。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明はＴ−ＤＮＡボーダーで隣接しているＴ−ＤＮＡを含む、形質転換ベクターについて記載する。Ｔ−ＤＮＡベクターは真核細胞の遺伝子形質転換がＴ−ＤＮＡでのみ可能であり、ベクターバックボーン配列では不可能であるように修飾されているという特徴を有する。これはベクターバックボーン配列の真核細胞のゲノムへの転移を防御することによるか、または真核細胞のゲノムに転移したベクターバックボーン配列を修復することにより達成される。該修飾Ｔ−ＤＡＮベクターにより、少なくともＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２を含むニッキング複合体による左ボーダーの効率のよいプロセシングが可能になるか、または転移したベクターバックボーン配列の切除が可能になる。
【００１１】
本発明の第１の態様は右ボーダーの外側の領域により隣接する単一の右ボーダーコア配列を含む、Ｔ−ＤＮＡ右ボーダーの修飾および／または：
ａ）１０〜１００塩基対の長さの、好ましくは２０〜１００塩基対の天然の左ボーダー外側領域および内側のＴ−ＤＮＡ左ボーダー隣接領域により隣接した単一の左ボーダーコア配列であって、これはＡおよびＴ残基の数に富み、ＡＴ残基のパーセンテージが６０〜８５％であるのが好ましく、６４〜８０％であるのがより好ましく、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８または７９％が最も好ましく、ただし該内側のＴ−ＤＮＡ左ボーダー隣接領域が天然のオクトピン型左ボーダー内側領域ではない場合である、または
ｂ）天然の左ボーダー内側領域によってのみ隣接した単一の左ボーダーコア配列；または
ｃ）単一の左ボーダーコア配列；または
ｄ）天然の左ボーダー外側領域によってのみ隣接したいくつかの左ボーダーコア配列の縦列反復であって、好ましくは２〜３個の左ボーダーコア配列を含有するが、高コピー数の左ボーダーコアの不完全な反復を排除していない縦列反復を有し、該縦列反復の該反復左ボーダーコア配列は３つの読み枠および両方向で停止コドンを選択的に担持する少なくとも１０〜２０塩基対の配列により分けられている；または
ｅ）完全なオクトピン型左ボーダー領域に隣接してその下流もしくは上流の完全なノパリン型左ボーダー領域；
として設計された左Ｔ−ＤＮＡボーダーの倍増などの修飾を含む最適化Ｔ−ＤＮＡベクターからなる。
【００１２】
本発明の別の態様は、組み込まれたベクターバックボーン配列の形質転換後の除去を可能にする、Ｔ−ＤＮＡボーダーコア反復の外側に追加のＤＮＡ配列を有する最適化Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクターからなる。該追加のＤＮＡ配列はＴ−ＤＮＡボーダー領域またはその一部に倍増などの修飾を行い：
ｆ）左ボーダーコア配列の下流および右ボーダーコア配列の上流を反復するように構成された組換え部位；または
ｇ）単一の右ボーダー外側領域の上流、および好ましくはそれに隣接して位置する左ボーダー領域の第２のコピーおよび該第２の左ボーダー領域のコア配列の上流の該組換え部位を付加することによりさらに修飾された（ｆ）の該ＤＮＡ配列；または
ｈ）好ましくは、存在する場合、左ボーダーの外側領域に隣接し、およびその下流に左ボーダーコア配列の下流の該組替え部位の下流にリコンビナーゼ遺伝子を有する（ｆ）の該組換え部位；または
ｉ）左ボーダー領域の下流に位置するＤＮＡ配列であって、該ＤＮＡ配列は（ｈ）で定義される組換え部位の反復により隣接したリコンビナーゼ遺伝子を含んでなり、さらに該リコンビナーゼの下流に左ボーダー領域の第２のコーピーを含む、；または
ｊ）第２の左ボーダーコア配列の下流および単一の右ボーダーコア配列の上流に反復として構成された追加の組換え部位を有する（ｉ）のＤＮＡ配列；
を含む、。
【００１３】
該修飾（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）のいずれかでは、該組換え部位は左および／または右ボーダーコア配列に隣接して、並びにその下流および／または上流に位置し、３つの読み枠で両方向の停止コドンを選択的に担持する少なくとも１０〜２０塩基対の長さの配列により左および／または右ボーダーコア配列から分けられている。
【００１４】
該修飾（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）のいずれかでは、該組換え部位は、直列反復として配列された部位特異的組換え部位または逆反復として配列されたトランスポゾンボーダー配列のいずれかであり、該リコンビナーゼ遺伝子は各々部位特異的リコンビナーゼ遺伝子かまたはトランスポザーゼ遺伝子のいずれかである。
【００１５】
本発明の別の態様は（ａ）〜（ｊ）で定義される該修飾のいずれかが適用されるか、または組み合わせて適用される形質転換ベクターを含む。これらの形質転換ベクターはアグロバクテリウム媒介の形質転換に用いられるベクターを含んでなり、オクトピン型バイナリー形質転換ベクター、ノパリン型バイナリー形質転換ベクター、同時組み込み型形質転換ベクター、スーパー・バイナリー型形質転換ベクター、Ｒｉ誘導形質転換ベクターおよびアグロリスティック形質転換または遺伝子治療で使用されるベクターを担持するＴ−ＤＮＡなどがある。
【００１６】
本発明は該修飾（ａ）〜（ｊ）のいずれかを含む該最適化形質転換ベクターを用いてベクターバックボーン配列の転移を防御することによりＴ−ＤＮＡのみで形質転換されたトランスジェニック真核細胞を得る方法を含む、。
【００１７】
さらに本発明は部位特異的リコンビナーゼもしくはトランスポザーゼの供給と組み合わせた（ｆ）もしくは（ｇ）の該ＤＮＡ配列、または実際には部位特異的リコンビナーゼもしくはトランスポザーゼの供給と組み合わせた（ｈ）、（ｉ）もしくは（ｊ）の該ＤＮＡ配列を含有する該最適化形質転換ベクターを用いてベクターバックボーン配列を含有する該形質転換された細胞の修復を可能にすることによりＴ−ＤＮＡのみで形質転換されたトランスジェニック真核細胞を得る方法を包含する。修復とはＴ−ＤＮＡ形質転換事象を廃することなく該ベクターに由来し得る形質転換ベクターバックボーン配列を除去することを意味する。
【００１８】
本発明の方法に従っておよび／または本発明の方法を意味して修飾された形質転換ベクターで植物、酵母、カビまたは糸状菌を形質転換することによりベクターバックボーン配列を含まないトランスジェニック植物、酵母、カビまたは糸状菌を得る方法もまた本発明の一部である。
【００１９】
本発明はさらに、アグロバクテリウムによる、少なくともＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２を含むニッキング複合体の産生を増加させる方法を包含する。該ニッキング複合体成分は、アグロバクテリウム株に含まれ、保持されている染色体および／または染色体外ＤＮＡ単位に少なくとも１つの余分なコピーが組み込まれているｖｉｒＤオペロン（オクトピン型またはノパリン型）によりコードされる。Ｔ−ＤＮＡ左ボーダーの読み合わせを低下させるために、該方法を単独でまたは修飾Ｔ−ＤＮＡボーダーを含有する形質転換ベクターと組み合わせて適用することができる。
【００２０】
さらに本発明は、いずれかのその他の方法および／またはベクターバックボーン配列の組み込みを防御または修復するために適用されるＴ−ＤＮＡベクター修飾でベクターバックボーン配列の組み込みを防御または修復するための、方法のいずれかの組み合わせおよび／または本発明のＴ−ＤＮＡベクター修飾を包含する。
【００２１】
本発明に従って修飾された該形質転換ベクターを含有する細菌、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスのような宿主もまた本発明に寄与する。
【００２２】
ベクターバックボーン配列の組み込みを修復するための本発明の部位特異的組換え系もしくはトランスポゾン媒介組換え系と、同一物またはいずれかその他の目的で用いられるいずれかその他の部位特異的組換え系もしくはトランスポゾン媒介組換え系とのいずれかの組み合わせもまた本発明に包含される。
【００２３】
前記するベクターで定義される変更に従って修飾されたＴ−ＤＮＡベクターを用いるアグロリスティック基盤の真核細胞の形質転換のための方法もまた本発明に含まれる。
【００２４】
前記するベクターで定義される変更に従って修飾されたＴ−ＤＮＡベクターを用いる遺伝子治療のための方法もまた本発明に含まれる。
【００２５】
前記で定義されるアグロバクテリウム媒介形質転換法により得られるトランスジェニック植物細胞または植物、かかる植物の一部、またはその子孫もまた本発明の構成要素である。
【００２６】
前記で定義されるアグロバクテリウム媒介形質転換法により得られるトランスジェニック酵母、カビまたは糸状菌もまた本発明の構成要素である。
【００２７】
前記のおよびその他の目的、本明細書の後記で明らかになる本発明の利点および特徴、本発明の本質は以下の本発明の好ましい態様の詳細な説明および添付の請求の範囲を参考にすることにより、より明確に理解されよう。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
植物、酵母、カビまたは糸状菌のアグロバクテリウム媒介形質転換またはアグロリスティック形質転換はＴ−ＤＮＡと称する形質転換ベクター配列の一部の核への転移および該真核細胞のゲノムにおける該Ｔ−ＤＮＡの組み込みに基づく。
【００２９】
「アグロバクテリウム」とはアグロバクテリア科の一員、より好ましくはアグロバクテリウムまたはリゾバクテリウム、最も好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスを意味する。「Ｔ−ＤＮＡ」または転移ＤＮＡとはＴ−ＤＮＡにより隣接した形質転換ベクターの一部を意味し、これはアグロバクテリウムｖｉｒ遺伝子の活性化の後Ｔ−ＤＮＡボーダーでニックが入り、一本鎖ＤＮＡとして真核細胞の核に転移する。Ｔ−ＤＮＡ鎖の産生は二本鎖分子で部位特異的ニックにより開始されるＤＮＡプロセシング事象の結果である。相関するＤＮＡプロセシング反応のファミリーは異なる真核細胞系に存在する。各々の場合、基質は超らせん環状ＤＮＡ分子であり、ニッキングタンパク質は短い配列を認識し、保存部位（保存ニック部位の位置およびニックの３’に位置するコンセンサス領域）で切断し、ニックの入った鎖の５’末端に共有結合する。このファミリーに属するＤＮＡプロセシング系には、真核細胞でのＴ−ＤＮＡ形成およびアグロバクテリウムによる真核細胞へのＴ−ＤＮＡの転移に加えて、（１）接合ＤＮＡ複製の開始およびそれに続くグラム陰性細菌のプラスミドの転移、（２）φＸ１７４−関連ファージのローリングサークル複製の間のプラス鎖合成の開始、並びに（３）グラム陽性細菌の特定のプラスミドにおけるローリングサークル複製の開始（WatersおよびGuiney(1993)）などがある。ＤＮＡプロセシング事象はオリゴタンパク質レラクソソーム複合体により触媒される。この複合体のタンパク質の１つであるレラキサーゼは部位および鎖特異的ＤＮＡ切断を触媒する重要な酵素である（PansegrauおよびLanka(1996)）。プラスミドの接合転移の場合、レラキサーゼはＤＮＡの５’末端に共有結合して転移し、ＤＮＡの単一のコピーの転移に必要な第２のニックを作ることはできない。少なくともレラキサーゼ二量体が単一のＤＮＡコピーの転移に必要であると考えられている（PansegrauおよびLanka(1996)）。
【００３０】
アグロバクテリウムの場合、最低限２つのタンパク質が、ニッキングおよびそれに続くＴ−ＤＮＡ転移に必要である。これらのレラクソソームタンパク質はＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２である。ＶｉｒＤ１は配列特異性のないＩ型トポイソメラーゼである（GhaiおよびDas(1989)）。また配列相同性に基づいても、ＶｉｒＤ２タンパク質はアグロバクテリウムのレラキサーゼであり、ニッキングエンドヌクレアーゼとして作用する（Pansegrauら(1994)）。ニッキング過程ではＶｉｒＤ２は右ボーダーのプロセシングされたＴ−ＤＮＡの両５’末端および左ボーダーのＴ−ＤＮＡプラスミドの残りに共有結合する（Durrenbergerら(1989)、YoungおよびNester(1988)）。Ｔ−ＤＮＡ左および右ボーダーの双方はＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２によって認識される。ＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２間およびＶｉｒＤ２タンパク質間の強い相互作用が示され、Ｔ−ＤＮＡ鎖置換（ＤＮＡ複製による）はＶｉｒＤ２−ＶｉｒＤ２相互作用に依存して第２のニックを作ることにより終止することが示唆された。これは少なくともＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２を含む別個のレラクソソーム複合体が２つのＴ−ＤＮＡボーダーの各々のプロセシングに関与し得ることを意味しいている（Relicら(1998)）。
【００３１】
「Ｔ−ＤＮＡボーダー」、「Ｔ−ＤＮＡボーダー領域」または「ボーダー領域」とは「右ボーダー」とも称する右Ｔ−ＤＮＡボーダー（ＲＢ）、または「左ボーダー」とも称する左Ｔ−ＤＮＡボーダー（ＬＢ）のいずれかを意味する。かかるボーダーには、ボーダーを隣接するＴ−ＤＮＡの一部であるボーダー内側領域および／またはボーダーを隣接するベクターバックボーンの一部であるボーダー外側領域により隣接するコア配列が含まれる。コア配列はオクトピン型ベクターの場合２２塩基対、ノパリン型ベクターの場合２５塩基対からなる。右ボーダー領域および左ボーダー領域のコア配列は不完全な反復形態を成す。ボーダーコア配列は少なくともＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２からなるアグロバクテリウムニッキング複合体による認識およびプロセシングに欠くことができない。Ｔ−ＤＮＡを隣接するコア配列は該Ｔ−ＤＮＡの転移を促進するのに十分である。しかしながら、該コア配列により単独で隣接する該Ｔ−ＤＮＡを担持する形質転換ベクターを用いる形質転換の効率は悪い。ボーダーの内側および外側領域はＴ−ＤＮＡ転移の効率を変調することが知られている（Wangら(1987)）。Ｔ−ＤＮＡ転移を増強する１つのエレメントが特徴づけされ、右ボーダー外側領域に存在し、オーバードライブと称される（Peraltaら(1986)、van Haarenら(1987)）。コア配列は以下のとおりである（ｉｎｎ：Ｔ−ＤＮＡ配列の一部；ｏｕｔ：ベクターバックボーン配列の一部；コア配列は太字および下線付き太字で示す；Gielenら(1984,1999)）：
【００３２】
【表１】
0004080746.tif 000002
【００３３】
「完全なボーダー領域」とはボーダーコア配列並びにボーダーの内側および外側の双方を含む、天然発生Ｔ−ＤＮＡボーダーを意味する。
【００３４】
「Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクター」または「Ｔ−ＤＮＡベクター」とは各々少なくとも右および左ボーダーコア配列からなる右および左Ｔ−ＤＮＡボーダーに隣接し、いずれかの真核細胞の形質転換に用いられるＴ−ＤＮＡ配列を含むいずれかのベクターを意味する。
【００３５】
「ベクターバックボーン配列」または「（複数の）ベクターバックボーン配列」とはＴ−ＤＮＡボーダーの外側、より具体的にはボーダーコア不完全反復のニッキング部位の外側に在るベクターを含むＴ−ＤＮＡの全ＤＮＡを意味する。「ベクター」とは細菌培養、例えば大腸菌（Escherichia coli）培養またはアグロバクテリウム培養において安定して保持される形質転換ベクターまたはＴ−ＤＮＡベクターを意味する。
【００３６】
本発明は真核細胞のゲノムにおけるベクターバックボーンの組み込みが最小化されるか、もしくは組み込まれないように、または真核細胞に組み込まれたベクターバックボーン配列の修復が可能であるように最適化されたＴ−ＤＮＡベクターの構築物を包含する。次いで該ベクター、それらのいずれかの誘導体または本発明のいずれかの修飾もしくはいずれかの修飾の組み合わせを利用するいずれかのベクターを、２つのボーダー反復間での目的のＤＮＡ配列のクローニングのため、および例えば農作物用植物、酵母または菌類の例えば形質転換、および例えば遺伝子治療など続いて適用するための出発物質として使用できる。
【００３７】
「最適化Ｔ−ＤＮＡベクター」とは真核細胞のゲノムへのベクターバックボーン配列の転移を低減するかもしくは廃するか、または真核細胞のゲノムに転移したベクターバックボーン配列を修復できように設計されたＴ−ＤＮＡベクターを意味する。
【００３８】
本発明の枠内で実施される分析（実施例１〜３）では、ベクターバックボーン転移の頻度を、天然オクトピン配列の前後関係においてボーダー反復を有するＴ−ＤＮＡで、およびボーダー配列の内側のボーダー領域のないＴ−ＤＮＡベクターで形質転換されたトランスジェニック植物において比較した。実質的には、内側のボーダー反復配列を有さないＴ−ＤＮＡベクターを用いた一連の形質転換植物では、完全な内側および外側のボーダー領域を用いた一連の形質転換植物よりも、より多くのベクターバックボーンの組み込みが見出された。さらに多くのトランスジェニック植物が左Ｔ−ＤＮＡボーダーに結合したベクターバックボーン配列および右Ｔ−ＤＮＡボーダーとのベクター接合を含むことが観察された（実施例２参照）。ＤＮＡゲルブロット分析により、たいていのこれらの植物では完全なベクター配列が組み込まれていることが示された（実施例３参照）。さらに、完全なベクターバクボーン配列の組み込み頻度はボーダー内側領域の存在または不在に影響されなかった。これらのデータは右ボーダー内側領域がたいてい左Ｔ−ＤＮＡボーダーでの有効なニッキングに重要な決定基を含有しないことを示唆している。この結果はさらにＲＢ内側領域の欠失が植物形質転換の効率に影響しないことを示す、Shawら(1984)により早期に得られた結果により実証される。従って、左Ｔ−ＤＮＡボーダーでの有効なニッキングのための決定基はＬＢそのものに在る可能性が最も高い。完全なベクターバックボーン配列の植物ゲノムへの組み込みは、右ボーダーで接合転移を開始し、続いて左および右ボーダーでコピーを続ける、所謂読み合わせの結果である。ベクターバックボーン転移はまたＤＮＡ転移の出発点としてＬＢを認識し、ＲＢでＬＢまでコピーを続ける結果でも在り得る（van der Graaffら(1996)）。従ってＬＢコア反復で有効なニッキングに関与するＬＢエレメントを同定することが重要である。このように、例えば左ボーダー領域内側領域および／または外側領域の部分的または完全な欠失を、ＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２に対するその親和性および認識を増強する状況で左ボーダーコア反復に入れることができる。これに関して驚くべき観察が実施例２および３に記載される実験で用いられた形質転換ベクターの左（および右）ボーダー配列の分析から得られる。図１では、天然のボーダー内側領域の前後関係を含むか、または含まない双方の形質転換ベクターに関してＬＢおよびＲＢコア反復の周囲（含まれない）の１００塩基対の広がりでのＡおよびＴ残基のパーセンテージが描かれている。天然の内側領域（図１のＫ  Ｔ−ＤＮＡベクター）のＬＢ隣接の１００塩基対のＡＴ残基のパーセンテージが、天然の内側領域が欠失しているベクター（図１のＨｓｂ  Ｔ−ＤＮＡベクター）のＬＢ隣接の１００塩基対のＡＴ残基のパーセンテージよりもかなり高い、すなわち各々５６％に比して６４％という事実からなる観察が顕著である。前記したように、Ｋ  Ｔ−ＤＮＡベクターで植物を形質転換した場合に比して、Ｈｓｂ  Ｔ−ＤＮＡベクターで植物を形質転換した場合、ＬＢ読み合わせおよび部分的ベクターバックボーン転移を生じる頻度がより高くなる。機械論的には、このＡＴ残基のパーセンテージが低いこと���少なくともＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２を含むＬＢ結合レラクソソームのニッキング活性を減じる可能性がある。同時に、Ｔ−ＤＮＡ置換に影響するＤＮＡ複製の機構は比較的高い頻度で、ニックを実現する前にＬＢからレラクソソームを置換することができる。ＬＢでの読み合わせ頻度の増加はかかる過程の結果であろう。従って、ＬＢおよびＴ−ＤＮＡの一部に隣接する１０〜１００塩基対（または好ましくは２０〜１００塩基対）のＡＴ残基のパーセンテージはＬＢコア反復でのニッキング効率を決定するＬＢの候補要素である。ニッキング効率を十分に高くするために、該ＬＢ隣接領域のＡＴ残基のパーセンテージを十分に高くする、すなわち少なくとも約６０〜８５％、より好ましくは少なくとも約６４〜８０％にすべきである。Ｔ−ＤＮＡ  ＲＢコア反復の外側の隣接の１００塩基対はＴ−ＤＮＡ  ＬＢコア反復の内側の隣接の１００塩基対と類似のＡＴ残基パーセンテージを有する、すなわち各々５６％に比して５８％である（図１参照）が、ＲＢでの正確で高い効率のプロセシングは問題ない。これはＲＢ外側領域に存在するオーバードライブ配列の正の影響による可能性が最も高い（Peraltaら(1986)、van Haarenら(1987)）。レラクソソーム複合体に対するタンパク質補助物質がオーバードライブ配列に結合し、ＲＢニッキングを増強することは除外できない。これはまたかかる補助タンパク質が同定された細菌間での接合プラスミド転移の状況に類似している（WatersおよびGuiney(1993)）。また、現在まだ同定されていない補助タンパク質がＬＢの効率のよいプロセシングに関与していることも除外できない。
【００３９】
前記したベクターバックボーン転移を防御するための第１の修飾Ｔ−ＤＮＡベクター構築物はＡおよびＴ残基に富む内側Ｔ−ＤＮＡ  ＬＢ隣接領域を含む。しかしながらかかる研究法は全てのＴ−ＤＮＡ構築物には現実的ではない。従って、図２では多くのさらなる最適化Ｔ−ＤＮＡベクター構築物が図式的に描かれている。図２の第１の構築物を用いる植物形質転換の結果は本発明に包含される（実施例１〜３参照）。その他の構築物は最適化Ｔ−ＤＮＡベクターを得るためのいくつかの研究法の基礎となる。最適化は、ＬＢニッキングの効率を上げ、真核細胞のゲノムへのベクターバックボーンの組み込みが高度に最小化されるか全く欠如する結果に至ることを目標とする左ボーダーの設計の修飾に在る。該最適化Ｔ−ＤＮＡベクター構築物では、ＲＢ領域が一定である、すなわち右ボーダー外側領域を含む、が、右ボーダー内側領域は欠失している。該右ボーダー領域は２５塩基対ＲＢコア配列およびｐＴｉＡｃｈ５に由来する右ボーダー外側領域の上流１４６塩基対を含有する（Gielenら(1984)）。この外側領域はオーバードライブ配列を含有する。天然の前後関係、すなわち右ボーダー内側領域を含む、右ボーダー領域を同様に本発明で使用することができる。しかしながらボーダー内側領域が除去されている右ボーダーは、明確な機能を有さず、Ｔ−ＤＮＡの一部である「外来の」ＤＮＡの植物への転移はさらに限定されているという利点を有する。さらに前記では、ＲＢ内側領域の欠如はＬＢプロセシングの効率に影響する可能性は非常に低いことを論じた。例示した最適化Ｔ−ＤＮＡベクターのＬＢ領域は一般にオクトピン型Ｔｉプラスミドに由来し、全て天然の左ボーダーコア配列を含有する。ノパリン型Ｔ−ＤＮＡボーダーは通常Ｔｉプラスミド、例えばｐＴｉＣ５８に由来する（Gielenら(1999)）。本発明の最適化Ｔ−ＤＮＡベクターの実例に用いられるボーダー領域の実例についてより詳細には図２および実施例４に記載する。
【００４０】
本発明の第１の態様は図２に例示する、右ボーダーの外側の領域に隣接する単一の右ボーダーコア配列を含む、Ｔ−ＤＮＡ右ボーダーの修飾および／または：
ａ）１０〜１００塩基対の長さの、好ましくは２０〜１００塩基対の天然の左ボーダー外側領域および内側のＴ−ＤＮＡ左ボーダー隣接領域に隣接した単一の左ボーダーコア配列であって、これはＡおよびＴ残基の数に富み、ＡＴ残基のパーセンテージが６０〜８５％であるのが好ましく、６４〜８０％であるのがより好ましく、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８または７９％が最も好ましく、ただし該内側のＴ−ＤＮＡ左ボーダー隣接領域が天然のオクトピン型左ボーダー内側領域ではない場合である、または
ｂ）天然の左ボーダー内側領域にのみ隣接した単一の左ボーダーコア配列；または
ｃ）単一の左ボーダーコア配列；または
ｄ）天然の左ボーダー外側領域にのみ隣接したいくつかの左ボーダーコア配列の縦列反復であって、好ましくは２〜３個の左ボーダーコア配列を含有するが、高コピー数の左ボーダーコアの不完全な反復を排除していない縦列反復を有し、該縦列反復の該反復左ボーダーコア配列は３つの読み枠および両方向で停止コドンを選択的に担持する少なくとも１０〜２０塩基対の配列により分けられている；または
ｅ）完全なオクトピン型左ボーダー領域に隣接してその下流もしくは上流の完全なノパリン型左ボーダー領域；
として設計された左Ｔ−ＤＮＡボーダーの倍増などの修飾を含む最適化Ｔ−ＤＮＡベクターからなる。
【００４１】
一般に使用される形質転換ベクターにＬＢコア配列で有効なニッキングを表示する修飾左ボーダー領域の組み込みはＬＢ読み合わせを防御する。ＬＢコア配列の縦列配置の、または完全左ボーダーの別の利点は偶発的な読み合わせまたは該ＬＢコア配列または完全ＬＢ領域の第１のコピーで開始するＤＮＡ転移が該縦列の該ＬＢコア配列または完全ＬＢ領域の隣接コピーで終止するという事実に在る。本発明に含まれる双方の場合に、ベクターバックボーン配列の転移頻度および真核細胞ゲノムの該配列の組み込みは低減する。
【００４２】
「下流」および「上流」とはいずれか他の配列の各々５’および３’に位置するいずれかの配列を意味する。参考として、ＲＢのその５’末端で出発し、ＬＢのその３’末端で終止するＴ−ＤＮＡ鎖を取り上げる。
【００４３】
左ボーダー内側および／または外側領域がベクターバックボーンの組み込みを避けるのに必要であるかどうかが解れば、さらなるＴ−ＤＮＡ転移ベクターの最適化が考慮される。該内側および／または外側ボーダー領域の（複数の）特異的配列がＴ−ＤＮＡ転移の終止の決定に重要であることを決定するために該内側および／または外側領域のいくつかの欠失誘導体を作ることができる。一度この／これらの配列が解れば、それをＬＢ反復の周囲のより多くのコピーに含めることができ、より有効なニッキングを得るに至る。Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクターおよび該さらに修飾された左ボーダーを含有する該ベクターをさらに最適化することができる、かかる左ボーダーもまた本発明の対象である。
【００４４】
本発明はまたバイナリー形質転換ベクター、スーパーバイナリー形質転換ベクター、同時組み込み形質転換ベクター、Ｒｉ誘導形質転換ベクターを含む、いずれかのＴ−ＤＮＡベクターにおける、およびアグロリスティック形質転換または遺伝子治療に用いられるＴ−ＤＮＡ担持ベクターにおける該修飾左ボーダーのいずれかの組み込みを含む。
【００４５】
「バイナリー形質転換ベクター」とは：
ａ）形質転換すべき真核細胞に少なくとも１個の目的のおよび／または少なくとも１個の選択マーカー活性を含む、Ｔ−ＤＮＡ領域；並びに
ｂ）大腸菌およびアグロバクテリウムに少なくとも複製活性の起点および大腸菌およびアグロバクテリウムにおける選択マーカーを含む、ベクターバックボーン領域；
を含む、Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクターを意味する。
【００４６】
または、アグロバクテリウムにおけるバイナリー形質転換ベクターの複製は別個のヘルパープラスミドの存在に依存する。バイナリーベクターｐＧｒｅｅｎおよびヘルパープラスミドｐＳｏｕｐは、例えばHellensら、Plant Mol.Biol.42、819-832(2000)に記載されるか、またはインターネットサイト  http://www.pgreen.ac.ukで利用できるような系の実例である。
【００４７】
バイナリー形質転換ベクターのＴ−ＤＮＡボーダーをオクトピン型またはノパリン型Ｔｉプラスミドまたは双方から誘導できる。バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡのみがヘルパープラスミドと組み合わせて真核細胞に転移される。
【００４８】
「ヘルパープラスミド」とは安定してアグロバクテリウムに保持され、少なくともＴ−ＤＮＡの転移を可能にするのに必要なｖｉｒ遺伝子セットを担持するプラスミドを意味する。該ｖｉｒ遺伝子セットをオクトピン型またはノパリン型のいずれかのＴｉプラスミドからまたは双方から誘導できる。
【００４９】
「スーパーバイナリー形質転換ベクター」とはさらにベクターバックボーン領域に猛毒性アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡ２８１株（欧州特許第０６０４６６２号、欧州特許第０６８７７３０号）のＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒ領域を担持するバイナリー形質転換ベクターを意味する。スーパーバイナリー形質転換ベクターはヘルパープラスミドと組み合わせて使用される。
【００５０】
「同時組み込み形質転換ベクター」とは少なくとも：
ａ）少なくとも１個の目的の遺伝子および／または植物において活性な少なくとも１個の選択マーカーを含む、Ｔ−ＤＮＡ領域；および
ｂ）少なくとも大腸菌およびアグロバクテリウムにおいて活性な複製起点、および大腸菌およびアグロバクテリウムにおける選択マーカーを含む、ベクターバックボーン領域；
を含む、Ｔ−ＤＮＡベクターを意味する。
【００５１】
Ｔ−ＤＮＡボーダーおよび該Ｔ−ＤＮＡベクターの該ｖｉｒ遺伝子セットをオクトピン型またはノパリン型のいずれかのＴｉプラスミドまたは双方から誘導できる。
【００５２】
「Ｒｉ由来植物形質転換ベクター」とはＴ−ＤＮＡボーダーがＴｉプラスミドおよび必要なｖｉｒ遺伝子セットを担持する「ヘルパー」Ｒｉプラスミドとの接合に用いられるバイナリー形質転換ベクターに由来する該バイナリー形質転換ベクターを意味する。
【００５３】
「アグロリスティック」、「アグロリスティック形質転換」または「アグロリスティック転移」とは本明細書ではアグロバクテリウム媒介の形質転換およびバイオリスティックなＤＮＡ転移の特徴を組み合わせた形質転換方法を意味する。このように、標的プラスミドを含有するＴ−ＤＮＡはＶｉｒＥ２を含むまたは含まないＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２の植物産生を可能にするＤＮＡ／ＲＮＡと同時に分配される（HansenおよびChilton(1996); Hansenら(1997)；国際公開公報第９７／１２０４６号）。
【００５４】
真核細胞ゲノムのベクターバックボーン配列の転移および組み込みを先導する２つの可能なメカニズムが認識されている。第１のメカニズムでは、Ｔ−ＤＮＡ転移は合理的に右Ｔ−ＤＮＡボーダーで出発するが、続いて左Ｔ−ＤＮＡボーダーで停止せず、ベクターバックボーン配列のコピーが続く。このメカニズムは左ボーダー読み合わせとして知られている。第２のメカニズムではＤＮＡ転移が不合理に左Ｔ−ＤＮＡボーダーで開始し、再度左Ｔ−ＤＮＡボーダーに至るまでコピーが続く。どのメカニズムで行われても、トランスジェニック植物の分析によりそれらの多くがそのゲノムに組み込まれた完全なベクターバックボーン配列を有することが示されている。本発明はさらにリコンビナーゼおよび組換え部位に関与する組換えによりベクターバックボーン配列を含有する形質転換細胞を修復するための研究法についてさらに記載する。
【００５５】
「修復」とは本明細書ではＴ−ＤＮＡ組み込み事象を廃することなく形質転換ベクターバックボーン配列を除去することを意味する。トランスジェニック個体から非Ｔ−ＤＮＡ配列を排除するための別の手段はHansonら(1999)に記載されている。しかしながらこの手段は困難で、本発明で記載する修復方法とは関連しない。前記するように、Hansonら(1999)または国際公開公報第９９／０１５６３号の方法による非Ｔ−ＤＮＡ配列の排除は形質転換効率を減じるという欠点を有する（Hansonら(1999)）。
【００５６】
従って、本発明の別の態様では、不合理に組み込まれたベクターバックボーン配列を除去するための方法として、組換え事象により形質転換された細胞を修復する。結果的に形質転換された細胞はゲノムにＴ−ＤＮＡを保持する形質転換細胞が得られる。Hansonら(1999)または国際公開公報第９９／０１５６３号の方法と対照的に、本発明の修復法は、以前不合理に組み込まれたベクターバックボーン配列を担持したトランスジェニック細胞を含有するＴ−ＤＮＡを救済する。従って形質転換効率はほとんど影響を受けない。
【００５７】
「組換え事象」とは部位特異的組換え事象またはトランスポゾン「ジャンピング」により行われる組換え事象のいずれかを意味する。
「リコンビナーゼ」とは部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼのいずれかを意味する。
「組換え部位」とは部位特異的組換え部位またはトランスポゾンボーダー配列のいずれかを意味する。
【００５８】
「部位特異的組換え事象」とは一般的に３つの要素からなる系により触媒される事象を意味する：１対のＤＮＡ配列（部位特異的組換え配列または部位）および特異的酵素（部位特異的リコンビナーゼ）。部位特異的リコンビナーゼは２つの部位特異的組換え配列間のみで部位特異的組換え配列の配向に依存して組換え反応を触媒する。部位特異的組換え配列が互いに相対して反対の方向に配向する場合、部位特異的リコンビナーゼの存在下、２つの部位特異的組換え部位間に介在する配列は逆転する（すなわち逆方向反復）。部位特異的組換え配列が互いに相対して同一の方向に配向する場合（すなわち直列反復）、次いでいずれかの介在配列は部位特異的リコンビナーゼと相互作用したときに欠失する。従って、部位特異的組換え配列が真核細胞ゲノムに組み込まれたベクターバックボーン配列の両末端で直列反復として存在する場合、該配列のかかる組み込みは続いて部位特異的組換え配列と対応する部位特異的リコンビナーゼとの相互作用により除去され得る。
【００５９】
使用できる多くの異なる部位特異性リコンビナーゼ系には、非限定例としてはバクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ、大腸菌のＰｉｎリコンビナーゼ、シゲラ（Shigella）のＰｉｎＢ、ＰｉｎＤおよびＰｉｎＦ、並びにジゴサッカロミセス・ルークシー（Zygosaccharomyces rouxii）のＲ／ＲＳ系などがある。リコンビナーゼは一般的にインテグラーゼ、レソルバーゼまたはフリッパーゼである。また二重特異的リコンビナーゼを二重特異的リコンビナーゼに対応する２つの異なる部位特異的リコンビナーゼ部位の直列または非直列反復と組み合わせて使用することができる（国際公開公報第９９／２５８４０号）。好ましい部位特異的リコンビナーゼ系はバクテリオファージＰ１  Ｃｒｅ／ｌｏｘおよび酵母ＦＬＰ／ＦＲＴおよびＺ．ルークシーＲ／ＲＳ系である。これらの系でリコンビナーゼ（各々Ｃｒｅ、ＦＬＰまたはＲ）はその各々の部位特異的組替え配列（各々ｌｏｘ、ＦＲＴ、ＲＳ）と相互作用して介在配列を逆転または切除する。これらの２つの系の部位特異的組換え配列は比較的短い（ｌｏｘで３４塩基対およびＦＲＴで４７塩基対）。これらの系のいくつかは既に植物例えばタバコ（Daleら(1990)Onouchiら(19919、Sugitaら(2000))およびArabidopsis（Osbornら(1995)、Onouchiら(1995)）で高い効率で使用されている。部位特異的組換え系は相同的組換え（例えば米国特許第５５２７６９５号）を調節する方法、標的挿入、遺伝子スタッキング等の方法（国際公開公報第９９／２５８２１号）および複合Ｔ−ＤＮＡ組み込みパターンの解析方法または選択マーカーの切除方法（国際公開公報第９９／２３２０２号）などの植物分子生物学における多くの適用がある。これらの適用において、部位特異的組換え部位は典型的にはＴ−ＤＮＡとしてまたは相同的組換えにより真核細胞ゲノムに組み込まれたＤＮＡの一部であり、従ってベクターバックボーン配列には存在しない。
【００６０】
部位特異的組換え配列は切除または逆転されるＤＮＡの末端に結合しなければならないが、部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子はその他の場所に位置し得る。例えば、リコンビナーゼ遺伝子はすでに真核細胞のＤＮＡに存在し得るか、または後ほど、直接細胞に、交雑また交差受粉のいずれかで導入されたＤＮＡフラグメントにより提供され得る。または、例えばマイクロインジェクションまたは粒子ボンバードメントにより実質的に精製されたリコンビナーゼタンパク質を直接真核細胞に導入できる。典型的には、真核細胞における部位特異的リコンビナーゼの発現を可能にする制御配列に部位特異的リコンビナーゼコーディング領域を機能的に結合させる。
【００６１】
本発明の一部として、部位特異的組換え部位を、Ｔ−ＤＮＡの外側に在るが、該Ｔ−ＤＮＡベクターに由来する可能性のある転移したベクターバックボーン配列またはその一部が部位特異的リコンビナーゼの作用により形質転換後に切除され得るようにＴ−ＤＮＡベクターに導入する。
【００６２】
「トランスポゾンジャンピングにより生じる組換え事象」または「トランスポゾン媒介組換え」とは３つの要素からなる系により触媒される組換えを意味する：一対のＤＮＡ配列（トランスポゾンボーダー配列）および特異的酵素（トランスポザーゼ）。トランスポザーゼは逆反復として配置された２つのトランスポゾンボーダー配列間でのみ組換え反応を触媒する。
【００６３】
非限定例としてはＤｓ／Ａｃ系、Ｓｐｍ系およびＭｕ系などの多くの異なるトランスポゾン／トランスポナーゼ系を使用できる。これらの系はトウモロコシに由来するが、少なくともＤｓ／ＡｓおよびＳｐｍ系はその他の植物においてもまた機能することが示されている（Fedoroffら(1993)、Schlappiら(1993)Van Sluysら(1987)）。各々１１塩基対および１３塩基対ボーダー配列により示されるＤｓ−およびＳｐｍ型トランスポゾンが好ましい。
【００６４】
トランスポゾンボーダー配列は切除されるＤＮＡの末端に結合しなければならないが、トランスポゾンをコードする遺伝子は別の場所に位置し得る。例えば、リコンビナーゼ遺伝子はすでに真核細胞のＤＮＡに存在し得るか、または後ほど細胞に直接導入、交雑、または交雑受粉のいずれかにより導入されたＤＮＡフラグメントにより提供され得る。または、例えばマイクロインジェクションまたは粒子ボンバードメントにより実質的に純粋なトランスポゾンタンパク質を直接細胞に導入できる。
【００６５】
本発明の一部として、トランスポゾンボーダー配列を、それらがＴ−ＤＮＡの外側に在り、ベクターバックボーンまたはその一部を、トランスポザーゼの作用により移動できるトランスポゾン様単位に形質転換するようにＴ−ＤＮＡベクターに導入する。従って本発明ではトランスポゾンとしてベクターバックボーンまたはその一部を宿主のゲノムの別の位置に再度組み込み、Ｔ−ＤＮＡのみを含有する形質転換された宿主およびベクターバックボーンまたはその一部を含有する形質転換された宿主を分けるために、トランスポザーゼが作用できる宿主の子孫の分離が必要であろう。
【００６６】
本発明の別の態様は、組み込まれたベクターバックボーン配列の形質転換後の除去を可能にする、図３に例示するＴ−ＤＮＡボーダーコア反復の外側にさらなるＤＮＡ配列を有する最適化Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクターからなる。さらなるこのＤＮＡ配列はＴ−ＤＮＡボーダー領域またはその一部に倍増などの修飾を行い：
ｆ）左ボーダーコア配列の下流および右ボーダーコア配列の上流を反復するように構成された組換え部位；または
ｇ）単一の右ボーダー外側領域の上流、および好ましくはそれに隣接して位置する左ボーダー領域の第２のコピーおよび該第２の左ボーダー領域のコア配列の上流の該組換え部位を付加することによりさらに修飾された（ｆ）の該ＤＮＡ配列；または
ｈ）好ましくは、存在する場合、左ボーダーの外側領域に隣接し、およびその下流に左ボーダーコア配列の下流の該組替え部位の下流にリコンビナーゼ遺伝子を有する（ｆ）の該組換え部位；または
ｉ）左ボーダー領域の下流に位置するＤＮＡ配列であって、該ＤＮＡ配列は（ｈ）で定義される組換え部位の反復により隣接したリコンビナーゼ遺伝子を含んでなり、さらに該リコンビナーゼの下流に左ボーダー領域の第２のコーピーを含む、；または
ｊ）第２の左ボーダーコア配列の下流および単一の右ボーダーコア配列の上流に反復として構成されたさらなる組換え部位を有する（ｉ）のＤＮＡ配列；
を含む、。
【００６７】
該修飾（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）のいずれかでは、該組換え部位は左および／または右ボーダーコア配列に隣接して、並びにその下流および／または上流に位置し、３つの読み枠で両方向の停止コドンを選択的に担持する少なくとも１０〜２０塩基対の長さの配列により左および／または右ボーダーコア配列から分けられている。
【００６８】
該修飾（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）のいずれかでは、該組換え部位は、直列反復として配列された部位特異的組換え部位または逆反復として配列されたトランスポゾンボーダー配列のいずれかであり、該リコンビナーゼ遺伝子は各々部位特異的リコンビナーゼ遺伝子かまたはトランスポザーゼ遺伝子のいずれかである。
【００６９】
該Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクターにおいて該修飾（ｆ）または（ｇ）が、Ｔ−ＤＮＡボーダー領域またはその一部の、倍増などの単一の修飾として考えられるのは明らかである。
【００７０】
左ボーダー読み合わせを防御する（国際公開公報第９９／０１５６３号）かまたは非Ｔ−ＤＮＡ配列を排除する（Hansonら(1999)）ためのＴ−ＤＮＡ左ボーダーコア反復の下流のさらなるＤＮＡ配列の導入について記載されており、これらの配列はベクターバックボーン配列が組み込まれた形質転換体の成長を防御する。該修飾（ｆ）に加えて、Ｔ−ＤＮＡベクターの該修飾（ｇ）は第１のＬＢコア配列での読み合わせを第２のＬＢコア配列で停止できる利点を有し、従ってＴ−ＤＮＡフラグメントの重複が防御される。続いて挿入されたベクターバックボーン配列が適当なリコンビナーゼの作用により実質的に除去される。該修飾（ｆ）に加えて、該修飾（ｈ）はＴ−ＤＮＡベクターに左ボーダーコア配列の下流でリコンビナーゼ遺伝子配列を導入し、それにより該修飾Ｔ−ＤＮＡボーダーに導入された組換え部位で該Ｔ−ＤＮＡベクターに由来する可能性のある組み込まれたベクターバックボーン配列を解析できる。このように、国際公開公報第９９／０１５６３号とは対照的に、修復後、すなわち該Ｔ−ＤＮＡボーダーに導入された組換え部位に隣接したベクターバックボーン配列の除去後、組み込まれたベクターバックボーン配列を有する形質転換体を救済できる。同時にリコンビナーゼ遺伝子は切除される。
【００７１】
該修飾（ｉ）はさらに左ボーダー領域の設計を変化させる、すなわち左ボーダー領域のさらなるコピーが加えられる。しかしながら双方のコピーは、ベクターバックボーン組み込みを防御するための最初の研究法で前記されるように縦列には配置されないが、リコンビナーゼ遺伝子により分離され、ボーダーコア配列はより広範なボーダーの前後関係において生じる。従って、該修飾（ｉ）は、単一のＬＢ領域がＬＢコア配列の縦列配列を含む、前記されるＴ−ＤＮＡベクター構築物の修飾として考えられる。左Ｔ−ＤＮＡボーダー領域の第２のコピーの存在は第１のボーダーコア配列で出発するかまたは読み合わせする不合理なＤＮＡ転移を第２のボーダーコア配列で停止することができる。従って、ベクターバックボーン配列の一部のみが真核細胞の核に転移する。このベクターバックボーン領域が組換え部位に隣接しているので、リコンビナーゼの作用によリ容易にそれを除去できる。しかしながら左ボーダーコア配列の第２のコピーで出発するかまたは読み合わせする不合理なＤＮＡ転移は依然生じ得る。
【００７２】
従って、該修飾（ｊ）はさらに左ボーダーコア配列の第２のコピーの下流および単一の右ボーダー領域の上流に１対の組換え部位を加える。組み込まれたベクターバックボーン配列を、再度組換え部位におけるリコンビナーゼの作用により容易に除去できる。左ボーダーコア配列の第２のコピーの不合理なＤＮＡ転移の場合、リコンビナーゼはＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターバックボーンにより供給されない。従って、それはどこかから、例えばすでにそのゲノムにリコンビナーゼ遺伝子を含有する植物との有性交雑により供給されなければならない。
【００７３】
該修飾（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）のいずれかはまたＴ−ＤＮＡとは独立して、すなわち物理的にＴ−ＤＮＡに結合していない真核細胞のゲノムに組み込まれたベクターバックボーン配列からトランスジェニック細胞を修復するのにも適用される。
【００７４】
さらに本発明は（ｆ）または（ｇ）の該ＤＮＡ配列を含有する該Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクターをリコンビナーゼの供給と組み合わせて使用する方法か、または該ベクターバックボーン配列のバックボーン配列を含有する形質転換された細胞をリコンビナーゼの供給と選択的に組み合わせて修復するために該ＤＮＡ配列（ｈ）（ｉ）または（ｊ）を含むが該Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクターを使用する方法からなる。
【００７５】
続いて組換えを生じることができた形質転換された宿主の子孫を分離することにより、組換えを可能にするために宿主ゲノムに導入した部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼを除去できる。該子孫の分離はまたＴ−ＤＮＡのみを含有する形質転換された宿主およびベクターバックボーン配列またはその一部のみを含有する形質転換された宿主を分ける方法でもある。
【００７６】
本発明はさらにバイナリー形質転換ベクター、スーパーバイナリー形質転換ベクター、同時組み込み形質転換ベクター、Ｒｉ誘導形質転換ベクターを含んでいるいずれかのＴ−ＤＮＡベクターにおける、およびアグロリスティック形質転換または遺伝子治療に用いられるＴ−ＤＮＡ担持ベクターにおけるいずれかのさらなるＤＮＡ配列組み込みからなる。
【００７７】
本発明の１つの態様では、そのゲノムにリコンビナーゼ遺伝子を含有する植物との有性交雑により、組換え部位で隣接したベクターバックボーン配列を含有するトランスジェニック植物にリコンビナーゼ遺伝子を供給する。該リコンビナーゼを構成または誘導プロモーターのいずれかに機能的に結合させることができる。また宿主細胞も対応するＲＮＡポリメラーゼを活性形態で含む、場合、リコンビナーゼ遺伝子を単一のサブユニットバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター、例えばＴ７またはＴ３特異的プロモーターの調節下に置くことができる。リコンビナーゼを発現するためのさらに別の方法は、宿主細胞が転写因子と共に適当な方法で供給される場合、トランス活性下転写因子例えばＧＡＬ４もしくは誘導体（米国特許第５８０１０２７号、国際公開公報第９７／３０１６４号、国際公開公報第９８／５９０６２号）またはＬａｃレプレッサー（欧州特許第０８２３４８０号）により奮起する上流活性化配列をリコンビナーゼオープン・リーディング・フレームと機能的に結合させることからなる。
【００７８】
本発明の別の態様では、リコンビナーゼ遺伝子は形質転換ベクターバックボーンで供給され、該リコンビナーゼ遺伝子のプロモーターは好ましくは誘導プロモーターである。かかるプロモーターは当該分野で公知であり、例えば熱ショック応答プロモーター、糖質コルチコイド誘導プロモーターまたは別の化学物質により誘導されるプロモーター（例えば欧州特許第０３３２１０４号および国際公開公報第９０／０８８２６号に記載されるように）などがある。
【００７９】
好ましい態様では、細菌宿主におけるリコンビナーゼ遺伝子の発現は該リコンビナーゼ遺伝子のコーディング領域に（１つまたは複数の）イントロン配列が含まれることにより妨げられる。
【００８０】
当業界ではアグロバクテリウムにおけるＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２のレベル上昇により植物形質転換のレベルが高くなることが知られている（Wangら(1990)）。ＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２はまた、該真核細胞をキメラｖｉｒＤ１および／またはｖｉｒＤ２遺伝子（国際公開公報第９７／１２０４６号）で形質転換する手段により真核細胞に分配される外来性ＤＮＡの組み込みを改善する方法においても組み込まれた。しかしながらそれはＶｉｒＤ１および／またはＶｉｒＤ２の産生増加がベクターバックボーン配列の組み込みを防御できることは今まで示されてはいなかった。
【００８１】
従って、本発明の別の態様では、少なくともエンドヌクレアーゼＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２を含むＴ−ＤＮＡニッキング複合体の産生を増加させることによりＴ−ＤＮＡベクターの左ボーダーコア配列でニッキング効率を増強させることによりベクターバックボーン配列の組み込みを防御する。
【００８２】
本発明の好ましい態様では、オクトピン型ｖｉｒＤ遺伝子座のさらなるコピーがアグロバクテリウムのゲノムおよび／またはヘルパープラスミドおよび／またはバイナリー形質転換ベクターおよび／またはスーパーバイナリー形質転換ベクターおよび／または同時組み込み形質転換ベクターおよび／またはＲｉ由来植物形質転換ベクターのいずれかに組み込まれる。本発明の別の態様では、ノパリン型ｖｉｒＤ遺伝子座のさらなるコピーを、記載するように供給できる。
【００８３】
従って本発明は形質転換ベクターバックボーン配列の組み込みを防御するかまたは修復し：
１）左Ｔ−ＤＮＡボーダー領域で、読み合わせが防御されるかもしくは停止するかまたはこのボーダーで出発するＤＮＡ−転移が防御されるかもしくは停止するように（ａ）〜（ｅ）の修飾がなされたいずれかのＴ−ＤＮＡベクター；
２）組換えの手段によりトランスジェニック細胞のゲノムに組み込まれた形質転換ゲクターバックボーン配列を解析できるいずれかの（ｆ）〜（ｊ）のＴ−ＤＮＡベクター；または
３）Ｔ−ＤＮＡボーダーニッキング複合体の最低限の構成成分としてＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２のレベルを上昇させるためのアグロバクテリウムのｖｉｒＤ遺伝子座の少なくとも１つの余分なコピー；
を用いる３つの方法を提示する。
【００８４】
これらのいずれかの方法またはその一部を単独で、または２つを組み合わせて、またはそれら３つを全て組み合わせて用いることができるということは当業者には明白である。かかる組み合わせのいくつかを反映するＴ−ＤＮＡベクター設計の実例は図３に示す。
【００８５】
発明の方法（１）または（２）と発明の方法（３）との好ましい組み合わせはＬＢコア配列の縦列配置を含有する修飾ＬＢ領域またはＬＢ領域の複数のコピーを含有し、およびアグロバクテリウムによりＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２の産生が増加した修飾ＬＢ領域を担持する形質転換ベクターからなる。ＬＢコア配列の縦列またはＬＢ領域の複数のコピーが通常形質転換に用いられるアグロバクテリウム株で利用できるＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２タンパク質を規定することは全く予想できることである。結果的に、これらのタンパク質はもはや単一のＲＢコア配列でニックを確立するために利用することはできない。
【００８６】
従って本発明の別の態様は、別個にまたはいずれかの組み合わせで形質転換ベクターバックボーンの組み込みを防御または修復するための、該方法のいずれかおよび／またはＴ−ＤＮＡベクター修飾の使用からなる。好ましい組み合わせはアグロバクテリウムにより産生されるＶｉｒＤタンパク質のレベル増強によりＬＢコア配列の複数のコピーまたはＬＢ領域の複数のコピーをつなぎ止めるＴ−ＤＮＡベクターに作用することが可能になる組み合わせである。
【００８７】
ベクターバックボーンの組み込みを防御するかまたは修復するための該方法のいずれかおよび／またはＴ−ＤＮＡベクター修飾をベクターバックボーンの組み込みを防御するかまたは修復するためのいずれか別の方法と組み合わせることができる。かかる方法およびＴ−ＤＮＡベクター修飾には左ボーダーの下流の遺伝子またはＤＮＡ配列の付加、例えば国際公開公報第９９／０１５６３号に記載されるものなどがある。かかる遺伝子／ＤＮＡ配列には細胞毒性化合物をコードする遺伝子、アンチセンスハウスキーピング遺伝子、左ボーダー領域の後ろのＤＮＡの巻き戻しを妨げる配列、例えばＧＣ含量の高い配列またはＤＮＡ結合タンパク質と相互作用するｖｉｒボックス配列などがある。
【００８８】
従って、本発明の別の態様は、形質転換ベクターバックボーン配列の組み込みを防御または修復するための本発明のいずれかの方法および／またはＴ−ＤＮＡベクター修飾を、形質転換ベクターバックボーン配列の組み込みを防御または修復するための本発明のいずれか別の方法および／またはＴ−ＤＮＡベクター修飾と組み合わせて使用することからなる。
【００８９】
形質転換ベクターバックボーン配列の組み込みを防御または修復するための本発明のいずれかの方法および／またはＴ−ＤＮＡベクター修飾を、例えば植物において活性な選択マーカーを切除するためのいずれかの組換え系を使用するかまたは組み込むいずれか別の方法および／またはＴ−ＤＮＡベクター修飾と組み合わせることができるのは当業者にはさらに明白であろう。該修復方法を実際に、例えばベクターバックボーン配列が隣接するのと同一のまたは異なる組換え部位を有する例示する選択マーカーを隣接することによる選択マーカーの切除と組み合わせることができる。該修復方法では、ベクターバックボーン配列をまた２つの異なる部位特異的組換え部位に隣接することもでき、使用する部位特異的組換え部位に対応する特異性で二重特異性リコンビナーゼにより修復を実施できる。
【００９０】
従って本発明のさらなる態様は、形質転換ベクターバックボーン配列の組み込みを修復するための本発明の方法および／またはＴ−ＤＮＡベクター修飾を、ベクターバックボーン配列の組み込みを修復する以外の目的で何れかの組換え系を使用するかまたは組み込む方法および／またはＴ−ＤＮＡベクター修復と組み合わせて使用することからなる。
【００９１】
本発明の別の態様は、相互に異なる部位特異的組換え部位のいずれかの対を付加することによりＴ−ＤＮＡボーダーの修飾を意味する組み込まれた形質転換ベクターバックボーン配列を修復し、少なくとも使用した部位特異的組換え部位に対応する特異性を有する少なくとも二重特異性リコンビナーゼと組み合わせて使用することからなる。
【００９２】
本発明の別の態様では、本発明によるいずれかの該Ｔ−ＤＮＡベクター構築物をアグロバクテリウム株に起動させる。得られた株もまた本発明を構成する。
【００９３】
本発明のさらに別の態様では、本発明によるいずれかの該Ｔ−ＤＮＡベクターをアグロバクテリウム媒介またはアグロリスティック形質転換において使用し、かかる形質転換方法は当業者に公知である。本発明による該Ｔ−ＤＮＡベクターを用いて、異なる単子葉および双子葉植物種、非限定例としては例えばアラビドプシス、タバコ、ペチュニア、トマト、ジャガイモ、豆、米および小麦の根、プロトプラスト、葉等からなるいくつかの植物組織を形質転換できる。より一般的には好ましくは農業、木の栽培、園芸における目的の植物種に属するか、または医薬品、生化学製品、抗生物質、または香料の製造に適用される植物種に属するいずれかの単子葉または双子葉植物種でよい。かかる植物には穀物、根植物、油産生植物、木材産生植物、農業用植物、果実産生植物、かいばまたはまぐさ豆果、コンパニオン・プランツまたは園芸植物などがある。かかる植物にはさらにアプリコット、アーティチョーク、アスパラガス、リンゴ、バナナ、大麦、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、カノーラ、ニンジン、カッサバ、カリフラワー、セロリ、チェリー、チコリ、マリファナ、綿、米松、モミ（アビエス(Abies)およびピセア(Picea)種）、亜麻、ニンニク、ブドウ、ケール、レンズマメ、トウモロコシ、オーク、カラスムギ、脂肪種子ナタネ、オクラ、タマネギ、西洋ナシ、トウガラシ、ポプラ、ライ麦、モロコシ、大豆、カボチャ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリなどがある。
【００９４】
本発明による該Ｔ−ＤＮＡベクターをフラワー・ディップ形質転換法（CloughおよびBent(1998)）と、または植物茎頂形質転換法（in planta apical shoot transformation procedure）（国際公開公報第９９／１４３４８号）と組み合わせて使用することもできる。本発明による該Ｔ−ＤＮＡベクターを用いて酵母、カビなどのその他の真核細胞および糸状菌並びにそれに由来する分生子、菌糸またはプロトプラストを形質転換できる。該その他の真核細胞のアグロバクテリウム媒介形質転換は当業者に公知である（例えば国際公開公報第９８／４５４５５号）。本発明のいずれかのＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターのアグロバクテリウム媒介転移またはアグロリスティック転移により形質転換された真核細胞の重要な特徴はＴ−ＤＮＡ配列の組換え頻度に大きく影響せずにベクターバックボーン配列の組換え頻度を著明に低下させることである。
【００９５】
本発明の好ましい態様は本発明のいずれかのＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターアグロバクテリウム媒介転移またはアグロリスティック転移のいずれかの方法により得られるトランスジェニック植物からなる。本発明のいずれかのＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターのアグロバクテリウム媒介転移またはアグロスティック転移のいずれかの方法の後、いずれかの方法により得られるまたは再生されるトランスジェニック植物もまた含まれる。かかる植物はゲノムにＴ−ＤＮＡを含有するがベクターバックボーン配列は含有しないという特徴を有する。さらに該トランスジェニック植物の子孫およびそれに由来する、すなわち該トランスジェニック植物細胞に由来する細胞、プロトプラスト、カルス、組織、器官、種子、果実、花粉、卵細胞、接合子、接合子胚または体細胞胚が含まれる。
【００９６】
遺伝子治療において本発明によるＴ−ＤＮＡ担持ベクターを用いるための可能性を以下のように説明できる。ＶｉｒＤ２−ｓｓＤＮＡ−ＶｉｒＥ２からなるインビトロで再構成された複合体はｓｓＤＮＡを無傷で哺乳動物核に転移させることができると記載されている（Ziemienowiczら(1999)）。
【００９７】
ＶｉｒＤ２はｓｓＤＮＡの５’末端に共有結合（Durrenbergerら(1989)、YoungおよびNester(1988)）し、２つの核局在配列（ＮＬＳ）の手段により、ｓｓＤＮＡを植物細胞核に対して標的化する（Narasimhuluら(1996)、Rossiら(1993)、Shurvintonら(1992)）ので、ヌクレオチド鎖分解に対してｓｓＤＮＡを保護する。さらにＶｉｒＤ２は宿主ゲノムにおけるＴ−ＤＮＡの効率的な組み込みに重要な「オメガ」ドメインを含有する（Narasimhuluら(1996)、Mysoreら(1998)、Tinlandら(1995)）。ＶｉｒＤ２のＮＬＳはヒトＨｅＬａ細胞、ドロソフィラ胚およびキセノパス卵母細胞などの動物細胞において活性であることが示されている（Guralnickら(1996)、Ziemienowiczら(1999)）。ＶｉｒＤ１は哺乳動物細胞の細胞質に局在したままであるが、ＶｉｒＤ２が関与するピギーバックメカニズムを介して核に移入できる（Ziemienowiczら(1999)）。
【００９８】
ＶｉｒＥ２は内ヌクレオチド結合分解に対してｓｓＤＮＡを保護し、Ｔ−ＤＮＡの完全性を保護する（Gelvin(1998b)、Rossiら(1996)）。ＶｉｒＥ２タンパク質はさらにＴ−ＤＮＡを植物核に対して標的化するのに活発に関与する（Gelbvin(1998b)）。ＶｉｒＥ２のＮＬＳは植物特異性であるが、ＶｉｒＥ２  ＮＬＳ内の単一のアミノ酸の位置変更によりこれらの修飾タンパク質が動物細胞の核に対して標的化される（Guralnickら(1996)）。ＶｉｒＥ２タンパク質はそれ自体で互いに相互作用するが、ＶｉｒＥ１のＶｉｒＥ２との相互作用がより強力であり、ＶｉｒＥ１はＶｉｒＥ２の自己相互作用を阻止する。アグロバクテリウム細胞では、ＶｉｒＥ１はＶｉｒＥ２の凝集を阻止する。従ってＶｉｒＥ１はＶｉｒＥ２のシャペロンとして機能するようである（Dengら(1999)）。
【００９９】
Ziemienowiczら(1999)に示されるように、これらのＶｉｒタンパク質の特徴によりＶｉｒタンパク質を遺伝子治療実験の適用に関して理想的な候補物質にする。遺伝子治療における主要な問題の１つは実際に核分解および核取り込みなどの細胞内バリヤを通過するＤＮＡ分配の困難である。
【０１００】
ウイルスベクターは適当な宿主においてＤＮＡ配列を発現させる遺伝子治療において科学者が使用する主要な媒体の１つである。レトロウイルスベクター（ＨＩＶおよびＭＭＬＶを含む）は組換えＤＮＡ諮問委員会（国立衛生研究所（ＮＩＨ）の部門）により承認された遺伝子治療プロトコルの６３％で用いられているが、一方アデノウイルスベクターはかかるプロトコルの１６％で使用されている。その他のウイルスベクターにはＡＡＶ、ＨＳＶおよびワクシニアに基づくものなどがある。ウイルスベクターは遺伝子治療において絶えず新しく開発されている分野である。
【０１０１】
アグロバクテリウムタンパク質ＶｉｒＤ１、ＶｉｒＤ２およびＶｉｒＥ２（および実際にはＶｉｒＥ１）の遺伝子を動物細胞において発現できるような方法で（すなわち適合したコドン使用および適当な制御配列を含む）、好ましくは一過性で、好ましくは宿主のゲノムに該ｖｉｒ遺伝子が組み込まれないように、ウイルスベクターに組み込む。遺伝子治療目的で、目的の遺伝子を含有するＴ−ＤＮＡが同一のウイルスベクターに存在するか、または別個のウイルスベクターもしくは別の型のウイルスベクターに同時に分配される場合、次いで該Ｔ−ＤＮＡを効率よく動物細胞の核のゲノムに転移できる。しかしながら、かかる遺伝子治療計画の承認のための厳格な要件はＴ−ＤＮＡだけが核に転移し、いずれかその他の外来ＤＮＡは核に転移しないということである。Ｔ−ＤＮＡに属しないＤＮＡ配列の転移を防御するかまたは修復するための本発明のいずれかの修飾は、目的のＤＮＡを分配および転移させるためのアグロバクテリウムタンパク質の使用などの遺伝子治療計画の許容性を増すために非常に価値の在るものであろう。従って、本発明のいずれかの修飾または修飾の組み合わせに従って修飾されたベクターを担持し、遺伝子治療目的で使用されるＴ−ＤＮＡは本発明に包含される。
【０１０２】
本発明による、およびＬＢで効率の高いニッキングが得られる修飾ＬＢを含む、Ｔ−ＤＮＡベクターを、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、キャリヤ媒介分配および衝撃ＤＮＡ注射などのその他の遺伝子治療技術において使用できる、例えばＶｉｒＤ２−ｓｓ−Ｔ−ＤＮＡ−ＶｉｒＥ２複合体の供給源として利用できることは当業者に明白である。例えばＶｉｒＤ２タンパク質を認識する抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーの手段により、例えばアセトシリンゴン誘導アグロバクテリウム培養または少なくともＶｉｒＤ１、ＶｉｒＤ２およびＶｉｒＥ２タンパク質を発現する大腸菌の培養から該複合体を増やすことができる。
【０１０３】
本発明についてここで一般的に記載し、以下の実施例を参考にすることによりより明確に理解できようが、この実施例は単に本発明の特定の態様および具体例を説明する目的で含まれるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書にて言及する全ての参考文献の内容は参照として本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
【実施例】
実施例１
Ａ．タリアナ（A.thaliana）（Ｌ．）ヘイン（Heynh）およびニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）（Ｌ．）の形質転換
プラスミドｐＫ２Ｌ６１０（「Ｋ」Ｔ−ＤＮＡベクター；Ｄｅ  Ｂｕｃｋら（１９９８））、ｐＳｉｎｇｌｅ  ｇｕｓ（「Ｋｓｂ１」Ｔ−ＤＮＡベクター；以下参照）およびｐＨＳＢ６１０（「Ｈｓｂ」Ｔ−ＤＮＡベクター；Ｄｅ  Ｂｕｃｋら（１９９９））を植物形質転換に使用した。ベクターｐＳｉｎｇｌｅ  ｇｕｓ（「Ｋｓｂ１」）はベクターｐＨＳＢ６１０（「Ｈｓｂ」）に類似しているが、ｐＨＳＢ６１０（「Ｈｓｂ」）のＰｎｏｓ−ｈｐｔ−３’ｎｏｓフラグメントをｐＳｉｎｇｌｅ  ｇｕｓ（「Ｋｓｂ１」）のＰｎｏｓ−ｈｐｔｌｌ−３’ｎｏｓカセットと交換する。植物形質転換の選択マーカーとしてＫおよびＫｓｂ１ベクターはネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ｎｐｔｌｌ）を含有し、Ｈｓｂベクターはヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）を含有する。アグロバクテリウム媒介アラビドプシス根形質転換法に従ってＡ．タリアナをプラスミドＫおよびＨｓｂで同時形質転換した（De Buckら(1999)、Valvekensら(1988)）。アグロバクテリウム媒介アラビドプシス葉ディスク形質転換法に従ってタバコ（Ｎ．タバクム：N.tabacum）をプラスミドＫｓｂで形質転換した（Horschら(1985)）。トランスジェニック植物を適当な植物ホルモンおよび適当な選択物質を含有する培地で再生した。シリーズ１では、ＫおよびＨｓｂ  Ｔ−ＤＮＡベクターで同時形質転換した１８個のトランスジェニックＡ．タリアナ植物が得られた。シリーズ２では、Ｋｓｂ  Ｔ−ＤＮＡで形質転換した３６個のＮ．タバクム植物が得られた。別のシリーズでは、Ｋｓｂ  Ｔ−ＤＮＡベクターで形質転換した２６個のＮ．タバクム植物が得られた。
【０１０５】
実施例２
ＰＣＲにより評価されるベクターバックボーン配列の組み込み
ＰＣＲ分析ではＤＮＡをJonesら(1985)に記載されるようにＮ．タバクムの葉の素材から、およびDe Neveら(1997)に従ってＡ．タリアナから単離した。ベクター配列の組み込みに関してトランスジェニック植物をスクリーニングするために、異なるＰＣＲ反応を実施した。１ｘＴａｑポリメラーゼインキュベーションバッファー中、ＤＮＡ（１００ng）を各プライマー５００ngと共にインキュベートした（Roche Diagnostics、Brussels、ベルギー）。Ｔａｑポリメラーゼ２と２分の１単位を最終容量１００μLに添加した。ＰＣＲの前にサンプルを９４℃で５分間加熱した。９４℃で１時間変性した。５７℃で２分間アニーリングを生じ、伸長反応は７２℃で５分間であり、その間３０サイクル行った。ベクターバックボーンの少なくとも１００塩基対（表１および２の「ＲＢ１００」および「ＬＢ１００」）または少なくとも１０００塩基対（表１および２の「ＬＢ１０００」および「ＲＢ１０００」）の存在が既知の大きさの診断用ＰＣＲフラグメントになるようにプライマーの組み合わせを選択した。増幅されたＰＣＲ産生物が依然植物組織に存在する夾雑アグロバクテリウム細胞に由来しないことを確認するために、各々のＤＮＡに関して染色体Ａ．ツメファシエンス遺伝子ｐｉｃＡに特異的な２つのプライマーでＰＣＲ反応を実施した（Yusibovら(1994)）。
【０１０６】
シリーズ１Ａ．タリアナ植物はＫおよびＨｓｂ  Ｔ−ＤＮＡベクターで同時形質転換された１８個のトランスジェニック植物を含有する。Ｋベクターは天然のオクトピン前後関係において各々１５０塩基対および２５５（ＲＢ）〜３００（ＬＢ）塩基対の内側および外側領域を有するボーダーを含有する。Ｈｓｂベクターは外側領域のみを含有する。ベクターバックボーン配列の組み込みに関するスクリーニングにより、ＫおよびＨｓｂ  Ｔ−ＤＮＡからのベクター配列がトランスジェニック植物の各々３３％（６／１８）および６１％（１１／１８）で見出されたことが示された。１個の形質転換体においてのみベクター配列がＴ−ＤＮＡに結合しなかった。ＨｓｂのＲＢ領域（６／１８）およびＫプラスミドのＲＢ領域（４／１８）に結合したベクターの頻度においては主要な差異は認められなかった（表１参照）。しかしながらＫ  Ｔ−ＤＮＡよりもＨｓｂ  Ｔ−ＤＮＡ（１１／１８）のＬＢ領域により多くのベクターが組み込まれた。全ケースで、組み込まれたＴ−ＤＮＡはＲＢでベクター配列を含有し、ＬＢでもベクター配列が検出された。
【０１０７】
シリーズ２タバコ植物は３６個のＫｓｂベクターで形質転換されたトランスジェニック植物を含有する。このベクターはまた内側領域を有さないＲＢおよびＬＢを含有し、従ってＨｓｂベクターに匹敵する。分析された形質転換体の５３％（１９／３６）（表２参照）でベクター配列が見出された；これらはＬＢ（８／１９）のみ、右Ｔ−ＤＮＡ末端（１／１９）のみ、または双方の末端（１０／１９）に結合した。
【０１０８】
Ｋｓｂ  Ｔ−ＤＮＡを含有するタバコ形質転換体の別のシリーズでは（データは示していない）、形質転換体の８１％（２１／２６）はＬＢに、６１％（１６／２６）はＲＢに結合したベクター配列を含有した（データは示していない）。しかしながら驚くべきことに、ＲＢバックボーン配列を含有するこれらの１６個の形質転換体のうち、１５個は組み込まれたＬＢベクター配列をも含有する（データは示していない）。
【０１０９】
まとめると、内側ボーダー配列を有さないＴ−ＤＮＡベクターが用いられた３つの異なるシリーズの形質転換体では、形質転換体の５０％以上がベクターバックボーンＤＮＡを含有した。右Ｔ−ＤＮＡ末端にのみ結合するベクターＤＮＡを含有する形質転換体は極わずかであった。一般に、右ボーダーに結合したベクターＤＮＡが存在する場合、左Ｔ−ＤＮＡ末端に結合したベクターＤＮＡをも検出できた。これはとりわけ効率の悪いニッキングによる左ボーダー反復での読み合わせがベクターバックボーン配列の組み込みに寄与することを意味している。内側ボーダー領域の欠失、ベクターが由来した元来のＴｉプラスミドに存在する１片のＴ−ＤＮＡがＬＢ反復の効率の悪いニッキングを引き起こし、これによりＬＢを通過する読み合わせおよび下流に位置するベクター配列の転移に至る。これに一致して、HorschおよびKlee(1986)は２５塩基対の反復のみを含有するプラスミドの植物への転移の全体の率は、より大きなＴｉ由来のボーダーフラグメントほど高くないことを観察し、これはボーダー反復を取り囲む別の配列が転移においてある役割を果たしていることを示唆している。しかしながらこれらの著者は該ベクターを使用するトランスジェニック植物におけるベクターバックボーン配列の組み込みの可能性の疑問には取り組まなかった。
【０１１０】
実施例３
ＤＮＡゲルブロッティングにより評価されるベクターバックボーン配列の組み込み
本質的にはManiatisら(1982)に従って、およそ０．６μgのゲノムＤＮＡでＤＮＡゲルブロット分析を実施した。用いた制限部位（Ｋｐｎｌ−Ｓａｃｌ）を図５Ａに示す。ＫｐｎｌおよびＳａｃｌで制限した後、プローブとしてＫプラスミドのベクター配列を使用した。ハイブリダイゼーションおよび検出には各々非放射活性「ジーン・イメージ」ランダムプライム・ラベリングモジュールおよび「ジーン・イメージ」ＣＤＰスター・検出モジュール（Amersham、Aylesburg、英国）を使用した。
【０１１１】
実施例２で概要を示すように、ＲＢおよびＬＢ双方の領域の１つまたは双方のプラスミドの少なくとも１０００塩基対のベクターバックボーンフラグメントへの結合をシリーズ１の異なる形質転換体で観察した（表１参照）。完全なバイナリーＴ−ＤＮＡプラスミド（Ｔ−ＤＮＡ＋ベクターバックボーン配列）がこれらの形質転換のゲノムに組み込まれているかどうかを決定するために、プローブとしてＫベクター配列を用いてＤＮＡゲルブロット分析を実施した。ベクター配列全体が存在する場合、ＫｐｎｌおよびＳａｃｌでゲノムＤＮＡを制限することにより、Ｋのおよそ８４６７塩基対（図５Ｂの矢印１）およびＨｓｂのおよそ７０６６塩基対（図５Ｂの矢印２）のフラグメントが検出されるはずである。図３Ｂに示すＤＮＡゲルブロット分析により、分析された１１個の植物のうち１０個で、ベクターバックボーン配列全体が植物ゲノムに組み込まれたことが示される。レーン１、２および５のサンプルは記載した実験以外の実験からの植物に由来する。これらの結果により、完全なベクター配列がしばしば植物ゲノムに組み込まれることが示唆される。
【０１１２】
実施例４
修飾された左ボーダーを有する最適化Ｔ−ＤＮＡベクターの構築
図２に示す型の修飾がなされた最適化バイナリーＴ−ＤＮＡベクターの実例を以下のように構築した。
【０１１３】
この実施例では、この実施例に記載される全ての最適化バイナリーＴ−ＤＮＡベクターはｐＴＨＷ１３６に由来する。バイナリーベクターｐＴＨＷ１３６は不完全な反復を形成するオクトピン型右および左ボーダーコア配列を含有し、各々ｐＴｉ１５９５５から生じたオクトピン型ボーダー外側領域により隣接している（ＲＢ外側領域の場合２２４塩基対、およびＬＢ外側領域の場合２６８塩基対）。ｐＴＨＷ１３６のＴ−ＤＮＡにはＧＵＳイントロン発現カセット（イントロン３５Ｓターミネーターにより割り込まれた３５ＳプロモーターＧＵＳオープン・リーディング・フレーム）およびｎｐｔｌｌ選択マーカー遺伝子（ｎｏｓプロモーター−ｎｐｔｌｌオープン・リーディング・フレーム−ｏｃｓターミネーター）が位置する。
【０１１４】
図２で示す型のバイナリーＴ−ＤＮＡベクターの実例を作るために、ＸｂａｌおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することによりｐＴＨＷ１３６からＧＵＳイントロン発現カセットを除去し、続いて張り出しをクレノウポリメラーゼで埋め、得られたブラント末端を再度ライゲーションした。この方法により得られたベクターをさらにｐ０１３０と称する。
【０１１５】
次の工程では、ＢａｍＨＩで消化することによりｎｐｔｌｌ選択マーカー遺伝子をｐ０１３０から除去し、続いて適合するベクターの張り出しを再度ライゲーションした。この方法により生じたバイナリーＴ−ＤＮＡベクターをｐＣＤＶＩＢと称した。このようにベクターｐＣＤＶＩＢはボーダー外側領域に隣接するコア配列に広がるオクトピン型ＬＢ領域を含有し、従って、図２に示すＢ型の構築物である。図２に示すＥ型の構築物を作るために、２個の長いオリゴヌクレオチド、ｐｒｍＣＤＶＩＢ１ＦおよびｐｒｍＣＤＶＩＢ１Ｒを以下の配列で設計した：
【０１１６】
【表２】
0004080746.tif 000003
【０１１７】
太字および二重下線部はＮｃｏＩ部位の一部、イタリックおよび一重下線部は左ボーダーコア配列、３’末端Ｇ残基はＢａｍＨＩ部位の一部であり；並びに
【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
太字および二重下線部はＢａｍＨＩ部位の一部、イタリックおよび一重下線部は左ボーダーコア配列、３’末端Ｃ残基はＮｃｏＩ部位の一部である。
【０１２０】
オリゴヌクレオチドｐｒｍＣＤＶＩＢ１ＦおよびｐｒｍＣＤＶＩＢ１Ｒは８０ヌクレオチド離れて相補的であり、アニーリングの後その５’（ｐｒｍＣＤＶＩＢ１Ｆに相対して）で５’ＮｃｏＩ張り出し（「ＣＡＴＧ」）およびその３’（ｐｒｍＣＤＶＩＢ１Ｆに相対して）５’ＢａｍＨＩ張り出し（「ＧＡＴＣ」）を有するｄｓＤＮＡフラグメントを生じる。該ｄｓＤＮＡフラグメントはさらにｐｒｍＣＤＶＩＢ１Ｆの１２〜３３および４６〜６７ヌクレオチドに対応する２個のオクトピン型ＬＢコア配列の縦列を含有する。双方のＬＢコア配列はｐＴｉ１５９５５の天然のＬＢから生じた別の６塩基対により上流および下流に広がり、ｐＴｉＡｃｈ５でも同様である（Gielenら(1984)）。従ってＬＢコア配列の縦列での反復は１２塩基対により分けられる。縦列に配置されたＬＢコア配列を有する該ｄｓＤＮＡフラグメントをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐ０１３０のＬＢコア配列の上流で隣接して挿入し、ｐＣＤＶＢ１を生じた。このようにｐＣＤＶＩＢ１はＬＢ外側領域に広がるオクトピン型左ボーダー領域および３個の縦列に配置されたＬＢコア配列を含有する。
【０１２１】
図２に示すＡ型の構築物を作るために、２個の長いオリゴヌクレオチドｐｒｍＣＤＶＩＢ２ＦおよびｐｒｍＣＤＶＩＢ２Ｒを以下の配列で設計した：
【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
太字および二重下線部はＮｃｏＩ部位の一部、３’末端Ｇ残基はＢａｍＨＩ部位の一部であり；並びに
【０１２４】
【表５】
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【０１２５】
太字および二重下線部はＢａｍＨＩ部位の一部、３’末端Ｃ残基はＮｃｏＩ部位の一部である。
【０１２６】
オリゴヌクレオチドｐｒｍＣＤＶＩＢ２ＦおよびｐｒｍＣＤＶＩＢ２Ｒは１１２ヌクレオチド離れて相補的であり、アニーリングの後その５’（ｐｒｍＣＤＶＩＢ１Ｆに相対して）で５’ＮｃｏＩ張り出し（「ＣＡＴＧ」）およびその３’（ｐｒｍＣＤＶＩＢ１Ｆに相対して）５’ＢａｍＨＩ張り出し（「ＧＡＴＣ」）を有するｄｓＤＮＡフラグメントを生じる。該ｄｓＤＮＡフラグメントはさらにｐＴｉ１５９５５の１１２塩基対の内側領域を含有する。このフラグメントをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐ０１３０のＬＢコア配列の上流で隣接して挿入し、ｐＣＤＶＩＢ２を生じた。このようにＰＣＤＶＩＢ２はＬＢ外側および内側領域に埋め込まれたＬＢコア配列に広がるオクトピン型ＬＢ領域を含有する。
【０１２７】
別のＴ−ＤＮＡベクター構築物を図２で示すＥ型およびＦ型構築物の特徴を組み合わせた修飾ＬＢで作った。完全なノパリン型ＬＢ領域がバイナリーＴ−ＤＮＡベクターｐＰＺＰ２００の３３１塩基対のＢｃｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして得られた。このフラグメントはｐＴｉＣ５８から生じたノパリン型ＬＢ外側領域、ＬＢコア配列およびＬＢ内側領域にわたる（Gielenら(1999)）。該ノパリン型ＬＢ領域をＢａｍＨＩ（ｐｒｍＣＤＶＩＢ２Ｆに相対して、ＬＢコア配列縦列の３’に位置する）およびＥｃｏＲＩで消化したｐＣＤＶＩＢ２のオクトピン型ＬＢ領域（縦列反復するオクトピン型ＬＢコア配列）の上流で隣接して挿入し、ｐＣＤＶＩＢ３を生じた。このようにｐＣＤＶＩＢ３は３個の縦列に配置されたコア配列を有する完全なオクトピン型ＬＢ領域のコピーおよび完全なノパリン型ＬＢ領域のコピーにわたるＬＢ領域を含有する。
【０１２８】
全ての記載した修飾ＬＢ領域を有するＴ−ＤＮＡベクターの実例、すなわちｐＣＤＶＩＢ、ｐＣＤＶＩＢ１、ｐＣＤＶＩＢ２およびｐＣＤＶＩＢ３を目的の（複数の）遺伝子および／または（複数の）選択マーカー遺伝子を該Ｔ−ＤＮＡベクターのＲＢおよびＬＢの間に挿入するための出発点として提供する。
【０１２９】
ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーター（Ｐｎｏｓ−ｎｐｔｌｌ−３’ｏｃｓ）の調節下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔｌｌ）選択マーカー遺伝子および３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモーター（Ｐ３５Ｓ−ｇｕｓ−３’ｎｏｓ）の調節下のβ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）発現カセットを該Ｔ−ＤＮＡベクターのＲＢおよびＬＢ間に挿入した。
【０１３０】
ｎｐｔｌｌ−ｇｕｓカセットはＥｃｏＲＩ−ＡｇｅＩフラグメントとしてｐＸＤ６１０プラスミドに由来した（De Looseら(1995)）。このフラグメントをｐＣＤＶＩＢ；ｐＣＤＶＩＢ１；ｐＣＤＶＩＢ２およびｐＣＤＶＩＢ３のＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。適合する付着末端を得るために、オープンなＡｇｅＩ−およびＳａｌＩ−部位間の２個のアダプターオリゴヌクレオチドを以下の配列と共に使用した：
【０１３１】
【表６】
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【０１３２】
太字はＡｇｅＩ部位の一部、３’およびＧ残基はＳａｌＩ部位の一部であり、並びに
【０１３３】
【表７】
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【０１３４】
下線部はＳａｌＩの一部、Ａ残基はＡｇｅＩ部位の一部である。
【０１３５】
オリゴヌクレオチドＮａｐｏｄ３およびＮａｐｏｄ４は８ヌクレオチド離れて相補的であり、アニーリングの後その５’（Ｎａｐｏｄ３に相対して）で５’ＡｇｅＩ張り出し（「ＣＣＧＧ」）およびその３’（Ｎａｐｏｄ３に相対して）ＳａｌＩ張り出し（「ＴＣＧＡ」）を有するｄｓＤＮＡフラグメントを生じる。得られたベクターをｐＣＤＶＩＢ＋ｇｕｓｎｐｔ、ｐＣＤＶＩＢ１＋ｇｕｓｎｐｔ、ｐＣＤＶＩＢ２＋ｇｕｓｎｐｔ、ｐＣＤＶＩＢ３＋ｇｕｓｎｐｔと称する。
【０１３６】
実施例５
組み込まれた組換え部位を有する最適化Ｔ−ＤＮＡベクターの構築
図３に示す型の最適化バイナリーＴ−ＤＮＡベクターの実例を以下のように構築する。この実施例では最適化バイナリーＴ−ＤＮＡベクターはｐＣＤＶＩＢに由来する（実施例４参照）。
【０１３７】
組換え部位を導入するための１つの方法は：
１．ＲＢの上流およびＬＢの下流のベクタードメインのＰＣＲ増幅のためのプライマー対の設計。該ドメインはＲＢの上流（例えばｐＣＤＶＩＢベクターバックボーン内に含まれるｐＶＳ１レプリコンのＮａｒＩ部位）およびＬＢの下流（例えばｐＣＤＶＩＢベクターバックボーン内に含まれるＳｍ／Ｓｐ抵抗性マーカーのＢｃｌＩ部位）の独特の制限部位を包含する。ＲＢまたはＬＢに位置するかまたは近接するＰＣＲプライマーを、これらが５’独特な制限部位、続いて右方向（ＦＲＴ部位の場合、Ｔ−ＤＮＡボーダーの外側のダイレクト反復として）で組換え部位（例えばＦＲＴ部位）、および続いてボーダー外側領域の一部を含有するように設計する。得られたＰＣＲ産生物を続いて適当な酵素で消化する。
【０１３８】
２．アニーリングの後ＲＢまたはＬＢコア配列のいずれかにわたり、ボーダーに近接して位置し、ＲＢコア配列の下流の独特の制限部位に相補的な第２の張り出しを有する（例えばｐＣＤＶＩＢのＳｃａｌ）かまたはＬＢコア配列の上流の独特な制限部位に相補的である（例えばｐＣＤＶＩＢのＮｃｏｌ）（１）のプライマーの５’独特の制限部位に相補的な１つの張り出しを有するｄｓＤＮＡ分子を生じる相補的オリゴヌクレオチド対（実施例４に類似）の設計。
【０１３９】
３．（ａ）ＮａｒＩ（ｐＶＳレプリコンで）およびＳｃａＩ（ＲＢコア配列の下流）を有するｐＣＤＶＩＢの消化、続いて１）得られたベクターと２）欠失ｐＣＤＶＩＢフラグメントを含み、組換え部位を導入した消化ＰＣＲ産生物並びに３）アニーリングしたオリゴヌクレオチドに基づき、およびＲＢコア配列を再導入したｄｓＤＮＡの３分子ライゲーション；
【０１４０】
（ｂ）最終的にＢｃｌＩ（Ｓｍ／Ｓｐ抵抗性マーカー）およびＮｃｏＩ（ＬＢコア配列の上流）を有する（３ａ）で得られたベクターの設計、続いて１）得られたベクターと２）欠失ｐＣＤＶＩＢフラグメントを含み、組換え部位を導入した消化ＰＣＲ産生物並びに３）アニーリングしたオリゴヌクレオチドに基づき、およびＬＢコア配列を再導入したｄｓＤＮＡの３分子ライゲーション；
からなる。
【０１４１】
記載した、再導入された組換え部位を有するＴ−ＤＮＡベクターの実例は該Ｔ−ＤＮＡベクターのＲＢおよびＬＢ間で目的の（複数の）遺伝子および／または（複数の）選択マーカー遺伝子を挿入するための出発点を提供する。
【０１４２】
実施例６
誘導されたアグロバクテリウム培養を用いたベクターバクボーン転移頻度の予測
培養培地に対して１００μＭの濃度でアセトシリンゴンを添加することによりｓｓＴ−ＤＮＡ鎖の産生に関していずれかのＴ−ＤＮＡベクターを含有するアグロバクテリウム株を誘導できる（Durrenbergerら(1989)）。ｓｓＴ−ＤＮＡ鎖の産生を以下の方法のいずれか１つを用いて分析できる（図式的な概要に関しては添付の図面を参照）。
【０１４３】
１．全ＤＮＡを所定のＴ−ＤＮＡベクターを含有するアグロバクテリウム細胞から単離する。異なるアグロバクテリウム株から単離したこのＤＮＡ約５μgの重複非変性サザンブロット（Tinlandら(1995)）を２つの異なるプローブ：１つはＴ−ＤＮＡの一部であるＤＮＡ配列を認識し、１つは左ボーダーを隣接するベクターバックボーンの一部であるＤＮＡ配列を認識するプローブにハイブリダイズする。左ボーダーが高効率を有するようにプロセシングされているＴ−ＤＮＡベクターの場合、ベクターバックボーン配列を認識するプローブのハイブリダイゼーションシグナルは欠如するか、または大きく低減する。しかしながらＴ−ＤＮＡを認識するプローブのハイブリダイゼーションシグナルは変わらない。
【０１４４】
２．全ＤＮＡを所定のＴ−ＤＮＡベクターを含有するアグロバクテリウム細胞から単離する。１つは左ボーダーでまたはそのすぐ近くでＴ−ＤＮＡを切断する制限酵素で、もう１つはＴ−ＤＮＡ配列内で切断する制限酵素で消化した、等量の全ＤＮＡを含有する２つの異なる消化物を用意する。しかしながらｓｓＴ−ＤＮＡ鎖は無傷のままである。特異的プライマー対を定量ＰＣＲで使用して左ボーダーの下流のＴ−ＤＮＡボーン配列およびベクターボーン配列を増幅する。また、左ボーダーが高効率を有するようにプロセシングされているＴ−ＤＮＡベクターの場合、ベクターバックボーン増幅産生物は得られないかまたは非常に少ない。しかしながらＴ−ＤＮＡ特異的増幅産生物の量は変わらない。
【０１４５】
双方の型の分析では、異なるＴ−ＤＮＡベクターの左ボーダーのすぐ下流でさらなるＧＦＰ（緑蛍光タンパク質）発現カセットをクローン化する。このカセットは左ボーダーの下流によく知られた「ベクターバックボーン」配列を提供する。ＧＵＳ発現カセットをＴ−ＤＮＡ特異的標的として使用する。双方の発現カセットは各々ＧＦＰおよびＧＵＳコーディング領域にイントロンを含有し、アグロバクテリウムにおける双方のマーカーの発現を防御する。
【０１４６】
図６では双方の実験準備を図式的に描く。黒い実線の上はＴ−ＤＮＡベクターを示し、ハイブリダイゼーション実験法は実線の下に示し、定量ＰＣＲ研究法を示す。
【０１４７】
実施例７
植物細胞へのベクターバックボーン転移配列の初期分析
実施例６に概要を示し、左ボーダーの下流でさらなるＧＦＰ発現カセットを含有する構築物を、植物細胞へのベクターバックボーン転移を評価するための一過性発現アッセイにおいて使用する。この目的のために、アラビドプシス根フラグメントを本発明に従って修飾したＴ−ＤＮＡベクターを含有するアグロバクテリウムで形質転換する（De Buckら(1999)、Valvekensら(1988)）。同時培養の３日後、根を、最初にＧＦＰの一過性発現に関して評価し、続いてＧＵＳの一過性発現に関して評価する。左ボーダーが高効率を有するようにプロセシングされているＴ−ＤＮＡベクターの場合、ＧＦＰ発現のレベルは低いかまたはゼロである。しかしながらＧＵＳ活性のレベルは変わらない。
【０１４８】
または、一過性に蓄積されたＧＦＰおよびＧＵＳ転写物のレベルを検出および定量するためにＰＣＲに次いで逆転写の手順を続ける（Narasihuluら(1996)）。また、左ボーダーが高効率を有するようにプロセシングされているＴ−ＤＮＡベクターの場合、ＧＦＰ特異的増幅産生物は得られないかまたは非常に少ない。しかしながらＧＵＳ特異的増幅産生物の量は変わらない。
【０１４９】
実施例８
ベクターバックボーン配列が組み込まれた形質転換植物の修復
植物（例えばアラビドプシス）をＦＲＴ組換え部位を含有する実施例５のＴ−ＤＮＡベクターの実例で形質転換する（実施例１参照）。再生した植物を実施例２〜３または６〜７に記載した方法のいずれかに従ってベクターバックボーンの組み込みに関して試験し、そのゲノムにＴ−ＤＮＡおよびベクターバックボーンを含有するトランスジェニック植物を選択する。
【０１５０】
開花時に、選択したトランスジェニック植物の１セットを、ＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼを構成的に発現する別のトランスジェニク植物に由来する花粉で交雑受粉させ、一方選択したトランスジェニック植物の第２のセットを野生型植物に由来する花粉で交雑受粉させる。種子を収集し、選択物質を含有する培地に播種する。双方の交雑で生存した植物（Ｔ−ＤＮＡの選択マーカーによる）を再度Ｔ−ＤＮＡの存在およびベクターバックボーンの存在に関して分析する。ＦＬＰを発現する親が関与し、Ｔ−ＤＮＡを含有する交雑の子孫の大部分では、ベクターバックボーン配列が除去されている。野生型の親が関与し、Ｔ−ＤＮＡを含有する交雑の子孫では、ベクターバックボーン配列が依然存在する。
【０１５１】
実施例９
ｖｉｒＤ遺伝子座のクローニングおよびベクターバックボーン転移に及ぼす遺伝子座の余分なコピーの影響
オクトピン型およびノパリン型ｖｉｒＤ遺伝子座の配列は公知である（各々Yanofskyら(1986)、Jayaswalら(1987)；およびWangら(1990)）。完全なｖｉｒＤ遺伝子座のＰＣＲ増幅を可能にする特異的プライマーを設計する。これらの遺伝子座を続いてＰ１５ａレプリコン（ChangおよびCohen(1987)）およびｐＡｌｔｅｒに由来するテトラサイクリン抵抗性マーカー（Promega）を担持するプラスミドにサブクローニングする。続いてプラスミドをＴ−ＤＮＡベクターを含有するアグロバクテリウムに移動させる。実施例２、３、５または６に記載の方法に従って、該アグロバクテリウム株によるベクターバックボーン配列の転移を分析する。
【０１５２】
実施例１０
左ボーダーでの転移の開始頻度の決定
植物を図２に記載するＴ−ＤＮＡベクターで形質転換する。全ＤＮＡを準備し、３つのプライマーセットを合成して異なるＰＣＲ反応を実施する。第１のプライマーセットは左ボーダー反復に隣接するＴ−ＤＮＡ内側フラグメントを増幅する（ＰＣＲフラグメント１）。第２のプライマーセットはＴ−ＤＮＡ左ボーダー領域にわたるＴ−ＤＮＡ／ベクターフラグメントおよび左ボーダー反復に隣接するベクター領域を増幅する（ＰＣＲフラグメント２）。最後に、第３のプライマーセットは左ボーダー反復に隣接するベクターフラグメントを増幅する（ＰＣＲフラグメント３）。ベクター転移が左ボーダーでの読み合わせの結果であるのかまたは左ボーダーでの開始の結果であるのかに依存して、異なるＰＣＲフラグメントが増幅される。ＰＣＲフラグメント１のみが存在する場合、Ｔ−ＤＮＡ転移は右ボーダーで出発し、左ボーダーで停止し、ベクターＤＮＡは転移しなかった。ＰＣＲフラグメント１、２および３が存在する場合、Ｔ−ＤＮＡ転移は右ボーダーで出発するが、左ボーダーで停止しなかった。ＰＣＲフラグメント１および３が存在するが、フラグメント２は存在しない場合、右ボーダーからのＴ−ＤＮＡ転移とは独立して、ベクター転移は左ボーダーで出発した。このようにおよそ５０個の形質転換体に関してこれらの異なるＰＣＲ反応を実施し、左ボーダーでの読み合わせ頻度および左ボーダー反復での開始頻度を得る。読み合わせおよびベクター転移の開始の頻度を異なる前後関係で左ボーダー反復を有する異なるＴ−ＤＮＡベクターに関して決定する。
【０１５３】
表１
ＫおよびＨｓｂ  Ｔ−ＤＮＡベクターで同時形質転換したトランスジェニック植物Ａ．タリアナのＴ−ＤＮＡのＬＢおよびＲＢに結合するベクター配列の存在（＋）または不在（−）
【０１５４】
【表８】
0004080746.tif 000009
【０１５５】
表２
Ｋｓｂ  Ｔ−ＤＮＡベクターで形質転換したトランスジェニック植物Ｎ．タバクムのＴ−ＤＮＡのＬＢおよびＲＢに結合するベクター配列の存在（＋）または不在（−）
【０１５６】
【表９】
0004080746.tif 000010
【０１５７】
【表１０】
0004080746.tif 000011
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【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１〜３に記載および使用のＫおよびＨｓｂ  Ｔ−ＤＮＡベクターの左および右ボーダーコア不完全反復の周囲（含まれない）の１００塩基対のブロックあたりのＡ−およびＴ−残基（ベクターを示す水平線の上および下に示す）のパーセンテージを図式的に示す。
【図２】  ボーダー内側領域を欠く右ボーダーと共に修飾された左ボーダーでのニッキング効率を評価するために設計されたＴ−ＤＮＡ構築物を図式的に示す。Ｇｕｓ：β−グルクロニダーゼコーディング配列；ｎｐｔｌｌ：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩコーディング配列；３’ｏｃｓ：オクトピンシンターゼ遺伝子の３’ターミネーター；Ｐｎｏｓ：ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター；３’ｎｏｓ：ノパリンシンターゼ遺伝子の３’ターミネーター；Ｐ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルスの構成性３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター。
【図３】  真核細胞のゲノムに組み込まれたベクターバックボーン配列を修復できるように設計されたＴ−ＤＮＡ構築物を図式的に示す。ＬＢ：左ボーダー；ＲＢ：右ボーダー。
【図４】  本発明による修飾の組み合わせを特色とするＴ−ＤＮＡ構築物の実例を図式的に示す。ＬＢ：左ボーダー；ＲＢ：右ボーダー；ｍｏｄＬＢ：修飾された左ボーダー（可能な修飾に関しては図２参照）。
【図５】  （Ａ）ＤＮＡゲルブロット分析で使用した消化物およびプローブを図式的に示す（比例的に拡大して描いてはいない）。各々の植物ゲノムＤＮＡサンプルおよび陽性対照として用いられたプラスミドをＫｐｎｌおよびＳａｃｌで消化し、双方をＬＢおよびＲＢの外側でベクターバックボーンを切断した。プローブとして、斜線入りのバーで示すＫプラスミドのベクター配列をＫｐｎｌおよびＳａｃｌでの制限の後に使用した。
（Ｂ）ＤＮＡゲルブロット分析。少なくとも１０００塩基対のベクターバックボーンがトランスジェニック植物のＰＣＲ分析により見出されるＴ−ＤＮＡベクターを各レーンの上部に示す。Ｋプラスミド（Ｋ１およびＫ２はＴ−ＤＮＡで異なる構造遺伝子を担持するが、なお同一である）の全ベクターバックボーン配列が組み込まれた場合には、８４７６塩基対のフラグメント（矢印１）が観察され、一方Ｈｓｂプラスミドの全ベクターバックボーン配列が組み込まれた場合には、７０６６塩基対のフラグメント（矢印２）が検出される。ＫおよびＨｓｂ  Ｔ−ＤＮＡプラスミドについては実施例１に記載される。
レーン１、２および５のゲノムＤＮＡサンプルは記載した以外の実験からの植物に由来する。
レーンＣ：形質転換されていないＡ．タリアナ（A.thaliana）のゲノムＤＮＡ。
プラスミドレーン：ＫｐｎｌおよびＳａｃｌで消化された、示されたプラスミドの純粋なＤＮＡを含有する。
【図６】  実施例６の実験準備を図式的に描く。黒い実線の上はＴ−ＤＮＡベクターを示し、ハイブリダイゼーション実験法は実線の下に示し、定量ＰＣＲ研究法を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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