(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸の存在または不在の検出方法であって、該方法は、次の工程：
ａ）表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）−活性標識及び試料中に存在する任意の標的との間で、標的結合分子種を介して、第一の複合体を形成し；
ｂ）該第一の複合体がＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に結合されるか、または標識を含み該第一の複合体から直接に誘導される第二の複合体が、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に結合される検出試料を調製し；並びに
ｃ）該検出試料についてＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得て分析することにより、該検出試料中の第一または第二の複合体（及びその結果としてもとの試料中の標的）の存在または不在を検出する、
を含んでなり、ここにおいて以下の特徴：
ｉ）検出に先行して、単量体または多量体ポリアミンの該検出試料への導入；
ｉｉ）標的結合分子種は、標的の少なくとも一部に対して選択的ハイブリッド形成が可能である核酸プローブまたはプライマーであり、標的および標的結合分子種は、検出に先行して、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に対する化学吸着を促進または容易にすべく修飾される；
ｉｉｉ）ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識中の化学吸着官能基の包含、
の一つ以上が使用されることを特徴とする試料中の標的核酸の存在または不在の検出方法。
【請求項２】
第一の複合体に存在する標識の検出試料中の濃度、または第二の複合体の標的結合分子種に含まれる核酸の濃度が、リットル当たり１０-10モルを越えない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的結合分子種が、標的の少なくとも一部に対して選択的ハイブリッド形成が可能である核酸プローブまたはプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標識及び標的結合分子種を含む第二の複合体が検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも特徴（ｉ）が使用される請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
特徴（ｉ）及び（ｉｉ）が一緒に使用される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識がローダミン色素またはアゾ色素のいずれかである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該標的が、天然に生じるＤＮＡ若しくはＲＮＡである、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面が、銀コロイド粒子の凝集物を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
特徴（ｉ）が使用され、該ポリアミンが短鎖脂肪族ポリアミンである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
該ポリアミンがスペルミンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
特徴（ｉｉ）が使用され、かつ該標的又は標的結合分子種の修飾が、少なくとも一部として、核酸の全体的負電荷を減少させることにより、そのＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面への化学吸着を容易にする請求項１から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
特徴（ｉｉ）が使用され、該標的又は標的結合分子種の修飾が、ルイス塩基を含む１個以上の官能基の該核酸への取り込みにより達成される、請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
１個以上のアミノ基が、該核酸へ取り込まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
特徴（ｉｉ）が使用され、該標的又は標的結合分子種の修飾が、その中性類似体への変換により達成される、請求項１から１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
該中性類似体が、１個以上のホスホラミドヌクレオチド間結合を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
特徴（ｉｉｉ）が使用され、化学吸着性官能基がルイス塩基でもある、請求項１から１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
該官能基が、トリアゾール基を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該官能基が、ベンゾトリアゾール基を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該標識が、アゾベンゾトリアゾールである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
標的結合分子種を介して、表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）−活性標識に結合された標的核酸を含むＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性複合体であって、該標識がＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に結合され、該複合体が以下の特徴：
ｉ）単量体または多量体ポリアミン；
ｉｉ）ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に対する化学吸着を促進または容易にすべく、ルイス塩基を含む１個以上の官能基を取り込んでいるか、または中性の核酸である、標的または標的結合分子種に含まれる核酸；
ｉｉｉ）ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識中のルイス塩基である化学吸着官能基、
の一つ以上を取り入れてなるＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性複合体。
【請求項２２】
核酸を含み、表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）−活性標識に結合された結合分子種を含むＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性複合体であって、該標識がＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に結合され、該複合体が単量体または多量体ポリアミンを取り入れてなるＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性複合体。
【請求項２３】
核酸を含み、表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）−活性標識に結合された結合分子種を含むＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性複合体であって、該標識がＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に結合され、該複合体がＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識中のルイス塩基である化学吸着官能基を取り入れてなるＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性複合体。
【請求項２４】
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識がローダミン色素またはアゾ色素のいずれかである、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２５】
該標識が、アゾベンゾトリアゾールである、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２６】
請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法の実施における使用のため、あるいは請求項２１から２５のいずれか１項に記載の表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）−活性複合体形成のためのキットであって、核酸を含む結合分子種に結合し、ルイス塩基である化学吸着官能基を取り込んでいるＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識を有してなるキット。
【請求項２７】
更にＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
該ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識がアゾ色素である、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
該標識がアゾベンゼントリアゾールである、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
さらに単量体または多量体のポリアミンを含む、請求項２６から２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
ａ）３−メトキシ−４−（５’−アゾベンゾトリアゾリル）−フェニルアミン；
ｂ）３，５−ジメトキシ−４−（５’−アゾベンゾトリアゾリル）−フェニルアミン；及び
ｃ）４−（５’−アゾベンゾトリアゾリル）−１−アミノナフタレン
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法において使用するためのアゾベンゾトリアゾール。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この発明は、試料中の標的核酸の存在または不在の検出、及び配列の分析方法に関するものである。このような方法は、ヌクレオチド及びヌクレオシド並びにそれらの類似体等の核酸単位を標的とするためにも適用されうる。本発明は、このような方法に使用するための化学的複合体、該方法の実施に使用するための試薬キット、及び該方法において有用な幾つかの新規化合物にも関するものである。
発明の背景
核酸の検出
ＤＮＡ及びＲＮＡまたはそれらの構成ヌクレオチド等の核酸の存在を、定性的または定量的に検出することが必要である多くの状況が存在する。このような状況の例は、医学的診断（例えば、細菌及びウイルスのような感染物質の検出、先天性または後天性遺伝子疾患の診断及び組織型の確立等）、犯罪捜査及び父系紛争における法的試験並びに当然のことながらヒト及び動物遺伝子のより一般的配列決定の試みを含む。
核酸及び核酸単位の検出についての技術は既に知られている。利用可能な方法は、例えば次の方法を含む：
ａ）蛍光分光測定−これは高感度が達成されなければならない場合には極めて骨が折れる技術である。生物学的アッセイにおいて、その使用は分析対象物の自己蛍光性のために複雑となる傾向がある。
ｂ）放射標識−これも高水準の技術的熟練を要するが、蛍光分光測定よりも敏感ではない傾向がある。これは、放射性物質の取り扱いに関わる明らかな危険に患わされる。
ｃ）化学発光−この技術は比較的に迅速に行い得て、自己蛍光性及び毒性物質を扱う必要性の問題を回避しうるが、残念ながら感度が比較的低く、また技術的にまだ骨の折れるものである。
多くの既知の技術に共通する不都合は、大量の標的分析対象物の必要性、即ちそれらの比較的低い感度である。上述の状況において、しばしば標的は十分に高濃度で利用可能では全くない。結果として利用可能な標的物質は、その存在が正確に検出され得るためには増幅されなければならない。
また、核酸増幅についての技術が知られている。最も一般的なものは、周知の“ポリメラーゼ連鎖反応”（“ＰＣＲ”）である。別法として、標的核酸は、プラスミド、ファージ等の生物学的ベクター中にクローン化され、これは次いで（典型的には細菌である）宿主細胞に挿入される。該宿主が複製を許容され、そして所望のベクターが適当な時間経過後に宿主細胞から“収穫”される。
明らかに、増幅の必要性は検出方法をより複雑にし、また経費がかかり、時間を消費し、かつ誤差および標的物質の汚染の可能性を増大させる。
従って、比較的低い標的濃度に対して感度を有し、また非増幅試料に対して好ましくは直接に実施可能である核酸検出法が必要とされる。本発明が焦点を当てるのはこの必要性である。
表面増強ラマン散乱
発明は、“表面増強ラマン散乱”（ＳＥＲＳ）の原理及びＳＥＲＲＳ（表面増強共鳴ラマン散乱）として知られるその原理の改良に基づく技術を提供する。これらの原理は既に知られ、また充分に記述されており、種々の標的材料の検出及び分析において以前に使用されている。
略述すれば、ラマンスペクトルは分析対象物への入射光が分析対象物の電子の励起により散乱されるために生じる。“ラマン”散乱は、励起電子がもと来たところとは別のエネルギーレベルに復帰する場合に起こり、このことは散乱光の波変化を生じ、入射光の周波数よりもより高い及びより低い周波数の両方において一連のスペクトル線を生じる。散乱光は、入射光に対して直角方向に検出されうる。
通常のラマン線は比較的弱く、従ってラマン分光法は化学分析において使用するためには、他の利用可能な検出方法に比べてあまりにも低感度である。ラマン分光法は、（やはり入射光に対して直角に検出される）広範囲の蛍光輻射バンドがより弱いラマン輻射を圧倒する傾向がある蛍光性物質についても成功していない。
しかしながら、“表面増強”ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に基づくラマン分光法の改良形態は、より高感度であることが示され、従ってより一般的に有用である。そのスペクトルが記録される分析対象物は、粗面化した金属表面と密接に関連させられる。これは検出感度の大きな増大をもたらし、該効果が顕著であるほど、分析対象物は“活性”表面により近接する（至適位置は表面付近の第一の分子層、即ち表面の約２０ｎｍ以内にある）。
この表面増強の理論は未だに完全には理解されていないが、分析対象物のより高い原子価電子が、金属表面の穴の電子プール（“プラズモン”として知られる）と関連するものと考えられる。入射光が分析対象物の電子を励起させた場合に、該効果が、分析対象物を取り巻く電子雲よりもかなり大きいプラズモンに移され、これがしばしば１０6以上の係数をもって、出力信号を増強する作用を有する。蛍光も消光され、よりきれいなラマンスペクトルを与え、蛍光染料を検出可能な分析対象物とすることを可能とする。一般的に、信号増強は通常のラマン分光法を使用するよりも広範囲の分析対象物が使用可能となるよう分析可能であることを意味する。更に、増強は分析対象分子を励起させるために、より少出力の光源を必要とすることを意味する。
感度の更なる増大は、分析対象物（この場合は通常興味ある標的に結合される色素）の共鳴周波数にて操作することにより得られ得る。色素の吸収最大値に同調させたコヒーレント光源の使用は、感度の１０3−１０5倍の増大を与える。これは、“共鳴ラマン分散”分光法と称される。
表面増強効果及び共鳴効果が結合され、“表面増強共鳴ラマン散乱”またはＳＥＲＲＳが与えられると、感度及び強健さにおける結果的増大は、相加的なもの以上となる。更に、感度は、ＳＥＲＳのみの場合と同様に、表面に対する分析対象の配向角度に臨界的に依存するものではないように考えられる。ＳＥＲＲＳ信号は、夾雑及び背景からより容易に識別され、かつ局所的な条件（例えば、分析が溶液中で行われる場合にはイオン強度またはｐＨ）により変化し難い。従って、ＳＥＲＲＳは驚くべき感度の検出技術であり；多くの場合において蛍光分光法に比べて優れているとは言えない場合にも少なくとも同程度に良好である（例えば、C Rodger et al., J. Chem. Soc. Dalton Trans.（1996）,pp791-799）。
ＳＥＲＲＳは、蛍光分光法で必要とされるような予めの分離を要せずに、数種の分析対象物を選択的に検出するために使用することができる（C H Munro et al., Analyst, April 1995, 120, pp993-1003）。
ＳＥＲＳ及びＳＥＲＲＳに関連する先行技術
ＳＥＲＳ及びＳＥＲＲＳは、種々の分子種の検出に既に使用されてきている。関連する先行技術書類は以下を含む：
Appl. Spectroscopy（1993）, 47, pp80-84（J C Rubin et al.）
ＳＥＲＳ−活性真鍮表面の調製及びベンゾトリアゾールのＳＥＲＳ検出
J. Raman Spectroscopy（1994）, 25, pp899-901（H Wilson et al.）
銀コロイド表面に沈着させたベンゾトリアゾールのＳＥＲＳ検出
J. Phys. Chem.（1995）, 99, pp879-885（C H Munro et al.）
アゾ色素、ソルベントイエロー１４の検出のためのＳＥＲＲＳの使用及び関連する機構の説明
Analyst, April 1995, 120, pp993-1003（C H Munro et al.）
酸性モノアゾ色素のＳＥＲＲＳ検出
J. Raman Spectroscopy（1991）, 22, pp771-775（J Clarkson et al.）
銀コロイド表面における有機分子種のＳＥＲＳ検出に対する溶媒効果
US-4,674,878（Vo-Dinh）
ＳＥＲＳ基材の調製方法及び種々の有機化合物（核酸ではないが）についてのスペクトル例。ナノグラム及びサブナノグラムにおける検出感度が報告されている。
US-5,400,136（Vo-Dinh）
ＳＥＲＳ−活性表面のための特殊被覆。実施例において、比較的に高出力レーザーが光源として使用され、かなり低水準の感度が示唆される。また、標的分析対象として核酸は引用されていない。
Anal. Chem. （1990）, 62, p2437-2441（J M Bello et al.）
ＳＥＲＳスペクトルを得るためのファイバー状光学センサーの使用。種々の有機化合物について〜１０-7Ｍより低くない検出限界が引用される。
Appl. Spectroscopy（1995）, 49. No. 6, pp780-784（K Kneipp et al.）
ＳＥＲＲＳを使用する比較的低濃度（〜１０−１４Ｍ）の色素ローダミン６Ｇの検出。この色素はラマン標識核酸とは異なる様式でこの色素と相互作用するであろうことは記憶されるべきである。
ＤＮＡ及びＲＮＡの検出のためのＳＥＲＳ及びＳＥＲＲＳの使用についても触れられている。しかしながら、検出された濃度は比較的に高かった。このことは、先行技術の方法が、非増幅試料を検出するためには十分に感度を持たないことを示唆している。
下記の書類は、核酸検出のためのＳＥ（Ｒ）ＲＳの使用に関連する：
J. Raman Spectroscopy（1991）, 22, pp729-742（T M Cotton et al）
これは、生物学的系におけるＳＥＲＳ及びＳＥＲＲＳ分光法の応用の外観を提供する。ＤＮＡの検出が引用され、可能性ある問題点が検討されている。ＤＮＡ分析において達成される検出感度については示されていない。
US-5,306,403（Vo-Dinh）
これは、色素を用いて標識し、得られた複合体をＳＥＲＳ−活性表面に吸着されることによるＤＮＡの検出を提案している。しかしながら、先行するＤＮＡ増幅無しに使用するために充分な感度をもった技術の実施可能な開示がない。ほとんどの実施例は色素−ＤＮＡ複合体（これは、後に説明するようにＳＥＲＳ条件下で大きく異なる挙動を示すであろう）よりむしろ、単離された色素の検出に関連し、これらの例においては評価された溶液中の最小色素濃度は０．０５ｍｇ／ｍｌであり、これは多分〜１０7及び１０11分子の間の検出に等しいであろう。唯一の実施例が、アミノアクリジンにより標識された（極めて短い）オリゴヌクレオチドの検出について示され、この例には濃度のデータが全く示されていない。
Anal. Chem. （1994）, 66, pp3379-3383（Vo-Dinh et al）
この論文は、ＳＥＲＳを用いるＤＮＡの検出を報告しているが、比較的高濃度のみであった（１０-9Ｍまたはそれ以上；正確な計算を行うことは不可能であるが、示された例において標的〜１０5分子未満が検出されていることはないであろう）。論文の結論において、これらの検出水準、及びＰＣＲの使用の参照は、開示される技術が非増幅ＤＮＡ試料の検出のためには未だに不充分であることを示している。
US-5,266,498, US-5,376,556及びUS-5,445,972（Tarcha et al）
これらは、ＳＥＲＳを使用して分析対象物に媒介されるリガンド結合事象を観測することによる分析対象物の検出が記述している。“捕捉試薬”標的分析対象に特異的なＳＥＲＳ−標識結合要素をＳＥＲＳ−活性表面に結合させることにより調製される。試験試料中における、特異的結合要素の分析対象物に対する結合は、捕捉試薬についてＳＥＲＳスペクトルにおける検出可能な変化を生じる。可能性ある分析対象物としてヌクレオチド配列に簡単に触れられているが、これらの書類はこれについて実施例を示しておらず、また特に非増幅ヌクレオチド試料についていかにして適切な感度が達成されるかの説明もない。
J. Mo;ecular Structure（1896）, 145, pp173-179（K Kneipp et al）
銀ゾル上でのＤＮＡのＳＥＲＳ検出。実験におけるＤＮＡ濃度は、〜μｇ  ｍｌ-1であり；ナノグラム量のＤＮＡの検出についても触れられている。
Studia Biophysica（1989）, 130, pp45-50（J Flemming et al）
再び、銀コロイド上のＤＮＡの〜μｇ  ｍｌ-1の濃度におけるＳＥＲＳ検出。
Anal. Chem. （1990）, 62, pp1958-1963（F Ni et al）
ＲＮＡ塩基を比較的高濃度（〜１０-4Ｍ）において検出するためのＳＥＲＳ分光法とフロー・インジェクション分析の組合せの可能性を評価する。
Anal. Chem. （1991）, 63,pp437-442（R Sheng et al）
ナノモル量の核酸塩基を検出するためのＳＥＲＳとの組合せにおける逆相高速液体クロマトグラフィーの使用。感度の限界が、それらの克服の可能性ある方法として検討される。
J. Molecular Structure（1991）, 244, pp183-192（K Kneipp et al）
ＤＮＡ及びＲＮＡを含む種々の核酸の〜１０μｇ  ｍｌ-1より低くない濃度におけるＳＥＲＳ検出。
Appl. Spectroscopy（1994）, 48, pp951-955（K Kneipp et al）
銀または金コロイド粒子に吸着されるＤＮＡ塩基アデニンの近赤外ＳＥＲＳ検出。検出された最も低い塩基濃度は１０-7Ｍである。
如かして、以前の実験には共通して比較的大量の核酸分析対象物を使用していたという事実がある。何れも、非増幅核酸試料の検出（即ち、試料中におそらく１−１００分子の検出）を可能とするに充分高い感度を未だ示していない。
ＳＥＲＳ及びＳＥＲＲＳが、非増幅核酸の検出における使用について決して提案されなかったことは、少なくとも一部として、適切な感度を達成することが明らかに困難であることによる。これらの困難性は、一部には核酸に特異的な問題によるもので、この問題は従ってより一般的なＳＥ（Ｒ）ＲＳの文献においては指摘されない。
従って、核酸または核酸単位の検出を研究する当業者は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ分光法が正に標的増幅無しに必要な感度及び強健性を欠くものと考えるであろう。極めて低濃度の標的について使用するために好適な別の検出方法の必要性が残されており、このことが本発明が提供するものである。
発明の記述
第１の側面
第１の側面に従えば、本発明は試料中の標的核酸または核酸単位の存在の検出方法を提供するもので、該方法は、（任意の適切な順にて）次の工程：
ａ）ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識及び試料中に存在する任意の標的との間で、場合により核酸または核酸単位を含む標的結合分子種を介して、第一の複合体を形成し；
ｂ）該第一の複合体、または標識及び標的結合分子種を含み該第一の複合体から直接に誘導される第二の複合体が、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に結合される検出試料を調製し；並びに
ｃ）該検出試料についてＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得て分析することにより、該検出試料中の第一または第二の複合体（及びその結果としてもとの試料中の標的）の存在を検出する、
を含んでなり、ここにおいて該検出試料中の第一の複合体に存在する標的、または第二の複合体の標的結合分子種に含まれる核酸若しくは単位の濃度が、リットル当たり、１０-10Ｍを越えない。
標的、標識、第一の標的−標識複合体、標的結合分子種、第二の複合体、及びＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面は、下記により特定的に定義される。検出試料中の濃度は、実際に調査される試料中の濃度を指し、即ち、液相調査の場合にはＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルが直接に取られる試料、または固相調査の場合にはスペクトルを得るためにＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に塗布される試料である。
明らかに実際的制限に影響されるが、本発明が検出のために使用される核酸／核酸単位濃度の下限はない。例えば、関連する核酸または核酸単位の１００コピー未満、例えば５０未満、あるいはおそらく２０未満または１０コピー未満、特には５コピー未満を含む検出試料を使用して有用に実施されるであろう。確かに、ピコモル（リットル当たり１０-10〜１０-12モル）またはフェムトモル（リットル当たり１０-13〜１０-15モル）またはそれ以下、多分より低い、おそらくアットモル（リットル当たり１０-16〜１０-18モル）濃度、あるいは更に低い検出が予想される。
該方法は、当然に同じ工程を実施して検出試料中の関連する第一または第二の複合体の不在を検出することにより、試料中の標的の不在を確立するためにも使用されうる。
上記に説明したように、ＳＥＲＳ及びＳＥＲＲＳの何れも、過去においてこのような低濃度、即ち標的物質の非増幅試料を代表するような濃度における核酸の検出のために使用されたことがない。本発明は、慣用のＳＥ（Ｒ）ＲＳ技術の感度を大幅に増大させることによりこのような検出を可能とし、如かして核酸及びそれらの構成単位を検出するための全く新規な改良された方法を提供し、該方法は既存の検出法よりもより迅速にかつ安価で、しかも技術を要さずに実施され得るであろう。
増大される感度は、本発明において、下記の手法にて達成されるであろう。それは、第一または第二の複合体を、いずれもＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得るために使用されるＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面により近く近接されることを補助する３種の修正する特徴の内の少なくとも１種、好ましくはそれ以上の使用を含む。
第２の側面
如かして本発明のより好ましい第２の側面は、試料中の標的核酸または核酸単位の存在または不在の検出方法を提供するもので、該方法は、（任意の適切な順にて）次の工程：
ａ）ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識及び試料中に存在する任意の標的との間で、場合により核酸または核酸単位を含む標的結合分子種を介して、第一の複合体を形成し；
ｂ）該第一の複合体、または標識及び標的結合分子種を含み該第一の複合体から直接に誘導される第二の複合体が、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に結合される検出試料を調製し；並びに
ｃ）該検出試料についてＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得て分析することにより、該検出試料中の第一または第二の複合体（及びその結果としてもとの試料中の標的）の存在を検出する、
を含んでなり、ここにおいて以下の特徴：
ｉ）検出に先行して、単量体または多量体ポリアミンの該検出試料への導入；
ii）検出に先行して、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に対する化学吸着を促進または容易にすべく、標的及び／または標的結合分子種に含まれる核酸若しくは核酸単位の修飾；
iii）ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識中の化学吸着官能器の包含、
の一つ以上が使用される。
この方法についても、第一の複合体に存在する標識の検出試料中の濃度、または第二の複合体の標的結合分子種に含まれる核酸若しくは単位の濃度は、好ましくはリットル当たり１０-10モルを越えない。
この方法は、既存のＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出法の感度を向上する修飾法の少なくとも一つ、（好ましくは一つ以上、より好ましくは３種全て）を使用し、如かしてある場合においては非増幅標的の極めて低濃度を検出するために使用することを可能とする。
特徴（ｉ）−（iii）のそれぞれの感度向上における効果は少なくとも相加的であるものと考えられ、共に使用される２以上の特徴は検出感度に相乗効果を持ちうる。各特徴は、発明の定義において使用される用語の説明に続いて、下記により詳細に記述される。
ＳＥ（Ｒ）ＲＳの意味
第一に、ＳＥ（Ｒ）ＲＳは、表面増強ラマン散乱または表面増強共鳴ラマン散乱のいずれかを意味する。本発明の方法は、基本的原理（ラマン−活性表面とのラマン−活性標識の結合）がそれぞれの場合で同じであるため、分光法の何れの形態をも含みうる。標識の共鳴周波数における操作が増大した感度を与えるため、好ましくは、本発明の方法は、ＳＥＲＳよりむしろＳＥＲＲＳを含み、この場合ラマンスペクトルを生成するために使用される光源は、使用される標識の最大吸収周波数に同調させたコヒーレント光源（例えば、レーザー）である。（この周波数は、標識のＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面並びに標的及び／または標的結合分子種との結合により僅かにシフトし得ることに注意されたいが、当業者は光源をこれに適応させることが充分できるであろう。光源は標識の吸収最大近傍の周波数、または標識の吸収スペクトルの第２のピークまたはその近傍の周波数に同調されうることにも注意されたい。）
本発明の方法において、標識の共鳴周波数に同調されることが好ましいものと考えられるが、別法としてＳＥＲＲＳは、活性表面のプラズモンの共鳴周波数において操作することも含む。
標的及び試料の形態
本発明の方法は、標的核酸または核酸単位の定量的または定性的検出のため、及び試料中の標的の存在に加えて不在の検出に使用され得る。それらは、幾つかの選択された標的ヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の存在を検出することにより、核酸配列決定のための方法全体の一部分を形成してもよい。
標的核酸は、天然に産生するＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ若しくは他の核酸類似体であってよい。それはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。この書類において内容が別途必要としない限り、“ヌクレオチド”なる用語はデオキシリボ−またはリボ−ヌクレオチドのいずれか、またはその類似体を指すために使用され；“オリゴヌクレオチド”は、２〜１００塩基単位の間のヌクレオチド配列を；並びに“ポリヌクレオチド”は、５０塩基単位以上のヌクレオチド配列を指すために使用される。
標的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、実質的に単鎖または二重鎖であってよい。検出に先行して、最初の標的は、制限酵素のよる消化または核酸ポリメラーゼによる複製等の分子生物学的操作に付してよく、如かして修飾が導入されてもよいことは認識されるであろう。
標的は、“単位”であってよく、これはヌクレオチド若しくはヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチド若しくはヌクレオシド、またはヌクレオチド若しくはヌクレオシド類似体、または個々の核塩基を意味する。標的の選択は、検出方法が最終的に使用される目的に依存し、例えば細胞中の細菌またはウイルスの存在の検出のためには、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡが最も好適な標的であろう。
試料は、標的が見い出されるであろう任意の適当な調製物であってよい。医学的診断技術の場合には、例えば試料は、血液（血漿及び血小板分画を含む）、髄液、粘液、痰、精液、便または尿を含む。特に好適な試料は、例えば２０−１０００μｌの血液、または１−１０ｍｌの口中洗浄液を含む。試料は、食料品、飲料、汚染が疑われる水等々を含んでよい。この一覧は明らかに徹底的なものではない。
試料は典型的には標的を単離するために前処理され、引き続くＳＥ（Ｒ）ＲＳ分析のために適当なものとされる。試料を種々の型に前よりするための、多くの方法及びキットが利用可能である。
検出試料は、固体、溶液または懸濁液または気体等の適当な形態であってよく、好適にはそのＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルの記録を可能とするべく調製される。検出試料は、任意の適当なｐＨ、典型的には酸性のｐＨであり得る。
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識
該標識は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性の、即ち適切に照射された場合にＳＥＲＳまたはＳＥＲＲＳスペクトルを生じることができる任意の適当な物質でありうる。またそれは、下記のようにして標的と直接にまたは標的結合分子種を介してのいずれかにより、第一の複合体を形成し得るものでなければならない。
ある場合には、特にＳＥＲＳ分光法を使用する場合に標的自体、または標的結合分子種が、それ自体のラマンスペクトルを生じ得るＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識として作用することが可能である。
多くのＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識は、既に知られておりｍＳＥ（Ｒ）ＲＳ文献に引用されている。それらはＳＥ（Ｒ）ＲＳを使用して比較的容易に検出されうる発色団及び／または蛍光団を含む分子種を包含する。
適当なＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性分子種の例は、５−（及び６−）カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオロセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン等のフルオレセイン色素；５−（及び６−）カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、６−カルボキシローダミンＸ等のローダミン色素；メチル、ニトロシル、スルホニル及びアミノフタロシアニン等のフタロシアニン類；C H Munro et al, Analyst（1995）, 120, p993に一覧されるようなアゾ色素類；アゾメチン類；シアニン類及びメチル、ニトロ、スルファノ及びアミノ誘導体等のキサンチン類；並びにスクシニルフルオレセイン類等を含む。これらの各々は、任意の慣用方法により置換されて、多くの有用な標識を与えることができる。いずれかの与えられた場合において、標識の選択は、標識の共鳴周波数、存在する他の分子種、標識の利用可能性、等々の因子に依存するであろう。
最も好ましいものは、下記に発明の特徴（iii）との関連において記述される化学吸着官能基を含む標識である。
更に、好ましいＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識は、標的（または適当な標的結合分子種）及びＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面の両者に対しての容易な結合を可能とする適当な官能基を有するものである。該標識は、標的または標的結合分子種に対して干渉し得るような基を含むべきでないことは明らかである。
標識が、標的結合分子種を介して標的に結合する場合には、標識は好ましくは予め調製された標識−結合分子種複合体の形態にて使用される。標識が標的結合分子種と複合体形成され得る方法が下記に略述される。
標的結合分子種
典型的には、本発明の方法を実施するに際して、標的を、標的結合分子種を介してＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識に結合することが必要であろう。これは、少なくとも標的の少なくとも一部に対して実質的に相補的である核酸または核酸単位の形態であるか、またはそれを含み、換言すれば標的結合分子種は、典型的には標的に特異的な核酸プローブまたはプライマーの形態である。（“実質的に相補的”とは、核酸または単位が標的に対して選択的ハイブリッド形成が可能であることを意味する。）標的結合分子種に対して結合されるＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識の、引き続いての検出は、それが結合される、または結合されていた任意の標的の存在（または不在）に関する情報を与える。
第一の標的−標識複合体
第一の複合体は、上記したように一般的には標的の少なくとも一部と、次いでＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識と結合される標的結合分子種との特異的結合を含む。標的−標識結合の主な要件は、該２種の分子種の複合体を形成してＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルによる標識の検出が、実効において結合される標的の検出に同等であるようにすることである。
標識と標的との間、あるいは適用される場合において標識と標的結合分子種との間の結合は、結合の任意の好適な形態を含んでよい。例えば蛍光分光法等から、色素及び他の標識を核酸及び／または核酸単位に結合するための多くの方法が知られている。幾つかは、基本的標識構造の化学的修飾を含む。当業者は、考慮している特定の標識、標的及び標的結合分子種について、適当なものを選択することを困難としないであろう。結合は、直接的に、例えば共有結合またはキレート結合を介していてもよい。更に好ましくは、離間的連結基を介して間接的であり−適当な連結基は既知であり、これらは（以下に説明される様に）標識を、該標識とＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面との間の重大な相互作用の干渉し得るであろう結合される核酸及び核酸単位から離間させることを助ける。例えば、ＤＮＡ結合蛋白質は、この意味において“連結基”として機能し得る。
標識は、３’−末端または中間位置（例えば塩基または背骨となる糖基に対して）への結合も可能ではあるが、好ましくは関連する核酸または核酸単位の５’−末端に結合される。
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識が核酸または核酸単位に対して結合され得る２種類の方法は、例えば：
１．核酸（または単位）が、通常は５’−端部において親核性の第一アミノ基を伴って合成される。脱保護の後に、それが標識上の適当な反応性部位（例えば、活性エステル部位）と反応に付される。通常、クロマトグラフィーを用いた精製により、所望の生成物を生じる。（例えば、J Goodchild, Bioconjugate Chem. （1990）, 1, pp165-187参照）
２．標識が、リン官能化を受けうる化学基（通常アルコール）を伴って合成される。次いで、活性リン化合物が、核酸または核酸単位との反応に付される。この反応は、例えば、M J Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach（1984）, IRL Press Oxfordに詳述されるように、幾つかの型の標準的化学を使用して行われ得る。
好適な結合の更なる例は、P Theisen et al, Tetrahedron Letters（1992）, 33, No.35, pp5033-5036; J M Prober et al, Science（1987）, 233, pp336-341; D B Shealy et al, Anal. Chem. （1995）, 67,pp247-251;及びC Mackellar et al, Nuc. Acids Res. （1992）, 20, pp3411-3417に示されている連結基を介したものを含む。
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識が核酸または核酸単位に結合されるであろう方法の更なる例は、下記の典型的な既知方法である。核酸の５’標識が例示されるが、３’末端及び／または内部部位の本質的に同様な修飾が同様に実行可能である。
修飾染料
0004071278.tif 000002
（P Theisen et alの前出文献参照）
カップリング染料（カップリングはその場で行われる）
0004071278.tif 000003
（Ｘ＝第一アミンによる攻撃について適切な基；例えば、イソチオシアネートまたはＮ−スクシンアミド；Ｙは、その誘導された形態）
修飾された核塩基を有するカップリング染料
0004071278.tif 000004
（Ｘ、Ｙ＝上記の通り；Ｂ＝核酸または核酸単位中の任意の塩基。核酸または単位が標的結合分子種である場合、生成物は次いで検出されるべき標的に結合するために好適な標識ポリヌクレオチドの合成においてモノマーとして使用される。）
（J M Prober et al、前出文献参照）
第二の複合体
“第二の複合体”は、第一の標的−標識複合体から直接に誘導され、如かしてその存在は第一の複合体の形成に依存する。第二の複合体の検出は、元の標識が存在しない場合にも標的の検出に（定性的及び好ましくは定量的の両者に）対応する。第二の複合体は、なおも検出可能なＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを生じるようにＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識を含む。
第二の複合体は、例えば元の標的の全てまたその部分を第一の標的−標識複合体から切断除去することによっても形成されうる。第二の複合体が分子種の付加または除去により第一ものから直接に誘導されうる他の同様な状況も存在し、唯一の要求は、検出試料中の第二の複合体の存在が、元の試料中の第一の複合体の存在を反映することである。
検出時において、第一及び第二の“複合体類”は、それらの構成分子種間に共有結合等の直接結合を含む必要はない。同様に予想されるのは、例えば標的または標的結合分子種が単に標識に伴われる状況、即ちそれがなおも検出試料中に存在し、かつその存在がなおも存在する他の分子種の相互作用に影響し、従って、ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルに影響しうるが、しかしながらそれは、例えば標識−含有複合体から切断されている状況である。
分子種の結合順序
標的、標識（使用される場合には標的結合分子種を伴う）及びＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面の組合せの順序は、本発明の方法のおいては臨界的なものではない。好ましくは、第一または第二の複合体が形成され、次いで活性表面に添加される。別法として、第一の工程は、標的結合分子種との反応による標的の存在（または不在）の確認であり、これは次いで適当なＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識及び表面の添加により検出されうる。
標的が、標識及び必要に応じて標的結合分子種の添加に先立って、適当な表面（例えば、導波上の被覆の形態において）との接触に付される状況も予見することが可能である。
それぞれの場合において、結果は標識−含有複合体が活性表面の電子プールに連結するか、あるいは理想的には可能な限り近接して位置する系でなければならない。以下に記述する特徴（ｉ）−（iii）の全ては、複合体と表面との間の近接性を至適化することを助け、従って感度を増大する。
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面は、通常金属性の、ラマン効果を増強する任意の適当な表面であってよく、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ文献から多くが既知である。それは例えば、エッチングされたか、あるいは他の手段で粗面化された金属表面、金属ゾルまたは更に好ましくは金属コロイド粒子の凝集物であってよい。銀、金または銅表面、特には銀が本発明において使用するためにことに好ましく、再度述べるが凝集コロイド表面が最良のＳＥ（Ｒ）ＲＳ効果を与えるものと考えられる。
表面は裸の金属であってよく、あるいは金属表面に金属酸化物層を有してもよい。それは、吸着容量を増大させるためにクエン酸塩、またはポリリジン若しくはポリフェノール等の適当なポリマーの有機被覆を有していてもよい。
表面がコロイド状である場合には、コロイド粒子は均一、かつ所望の大きさ及び形であり、自己凝集に対して可能な限り安定である様に、好ましくは制御された様式にて凝集される。このような非凝集コロイドの調製方法は既知である。それらは、例えばクエン酸塩等の還元剤を用いる金属塩（例えば、硝酸銀）の還元を含み、安定な微小結晶懸濁物が形成される（P C Lee & D Meisel, J. Phys. Chem. （1982）, 86, p3391参照）。この“貯留”懸濁物は、次いで使用の直前に凝集される。適当な凝集剤は、酸（例えばＨＮＯ3、またはアスコルビン酸）、ポリアミン（例えば、ポリリジン、スペルミン、スペルミジン、１，４−ジアミノピペラジン、ジエチレントリアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、トリエチレンテトラアミン及びテトラエチレンペンタアミン等）、及びＣｌ-、Ｉ-、Ｎａ+またはＭｇ2+等の無機活性化イオン等を含む。処理に亘っての制御を増大させるために、使用される全ての器具は、細心の注意で清浄を保ち、試薬は高級でなければならない。凝集したコロイドは沈殿について比較的不安定であるため、それらは理想的には検出試料中のその場にて形成され、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−スペクトルは、その直後（好ましくは凝集から１５分以内）に得られる。
理想的には、スペルミンまたはスペルミジン等の材料が、凝集工程の制御を補助するために導入される−特徴（ｉ）の下の検討参照。凝集は、表面が検出試料の他の分子種に導入されるのと同時、または直後に行われ得る。
コロイド粒子は、好ましくは性質において単一分散物であり、またＳＥ（Ｒ）ＲＳ効果を生じる限りいかなる大きさでもあり得て、一般的には金属の種類に依存するが、直径で４−５０ｎｍ、好ましくは２５−３６ｎｍであろう。
好ましくは、該表面は、形状において実質的に六角形であり約２０−３６ｎｍの最大直径の銀コロイド粒子を有してなる。
標識−含有複合体と表面との結合
標識−含有複合体（即ち第一または第二の複合体）の、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面との“結合”は、典型的には該複合体の表面への化学吸着によるか、または該複合体の表面上への、直接的または連結基を介してのいずれかによる化学結合（共有的、キレート形成等）によるであろう。該結合は、通常は表面または表面被覆（例えばポリアミン被覆の遊離のアミノ基等）に引きつけられる荷電極性基（例えば、ＮＨ3+またはＣＯ2-等）の標識上の適当な官能基を介している。結合の型は、明らかに与えられたその場合の表面の性質及び標識に依存するであろうが、異なった官能基が、例えば負の荷電を有するもの等、正の荷電を有する表面に引きつけられるであろう。
複合体を活性表面に結合し得る適当な基は、窒素、酸素、硫黄及びリン供与体等の複合体形成基；キレート基；架橋リガンド及びポリマー形成リガンド等を含み、これらの例は下記を含む：
0004071278.tif 000005
該表面及び標識−含有複合体の間の結合を至適化する好ましい方法は、下記の特徴（ｉ）−（iii）との関連において記述される。
特徴（ｉ）−（iii）
本発明の方法の特徴（ｉ）−（iii）に立ち返れば、これら３種類全てはＳＥＲ（Ｒ）Ｓ表面及び標識−含有複合体の間の可能な最良の接触を容易にすることにより、該方法の感度を増大するように設計された。それぞれの特徴は、このことをわずかづつ異なった方法にて達成することを助け、あるものは更なる優位点を提供する。
これらの特徴及び感度に対するそれらの効果の確認は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳを核酸及び核酸単位に適用すること、並びに従来遭遇していた感度の欠如の問題点のより良い理解を導いた。感度の高いＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出を達成するためには、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識がＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に対して少なくとも約２０ｎｍ以内、即ち第一分子層内に接近可能でなければならない。一般的にはより近く接近するほどにより良好であり；ラマンシグナルの増強は、ｒを表面と標識との間の距離として、１／ｒ2に比例する。分子生物学にて典型的に使用される大きさ（長さにおいて少なくとも８塩基）の核酸標的または標的結合分子種に、標識が結合する場合に、２つの因子が標識−表面近接性、従って検出感度を妨害する：（ａ）核酸は、標識よりもかなり大きく、標識−表面相互作用を立体的に妨害する；（ｂ）核酸は、各ヌクレオチド残基上に負の電荷をもった多価陰イオンであり；従ってそれは典型的に使用されるＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面（特にコロイド）と結合する傾向のある還元剤等の負に荷電する分子種により静電気的に拒絶され、このことも標識が表面に近接することを妨害する。
従って、標識を該表面に対して充分に近接させるためには、最初に核酸を通常可能であるよりも表面に近接させる必要がある。
特徴（ｉ）−（iii）はこれらの障害を克服し、より良好な標識−表面相互作用を促進するために有効であるものと考えられる。特徴（ｉ）は、本発明の方法において使用するために特に好ましいが、理想的にはそれは特徴（ii）及び（iii）の一つ以上と組み合わされる。
各特徴を順に取り上げる：
（ｉ）ポリアミンの導入
最初に“ポリアミン”は、分子当たりに１個を越えるアミノ基を有するアミンを意味する。この用語は、モノマー性及びポリマー性のポリアミンを両者共に包含し；ポリマー性ポリアミンの場合には、モノマー当たりまたはポリマーの反復単位当たり１アミノ基を越えなければならない。
ポリアミンの導入は、本発明の方法の感度を大きく向上することが見い出された。このことは、ポリアミンの、標的核酸または核酸単位（及び／または使用される任意の標的結合分子種）に伴われる正味の負の電荷のいくらかと“平衡する”能力に少なくとも部分的によっているものと考えられ；“イオン対”が、ポリアミン及び核酸（単位）の間に形成されるものと考えられる。またポリアミンは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面上で大きい正の電荷を有するリガンド（それは正に高濃度の遊離のアミノ基を含む）として作用するものと考えられ、これが第一または第二の複合体が該表面に近接することを容易にするか、または付着を良好にすることができると考えられる。このことは、如かして感度及び強健性を増大させる。
驚くべきことに、ある種のポリアミンは、該表面が金属コロイドの場合に更なる優位点を与えることが見い出され；それらはコロイド凝集の制御を補助し、それを、より均一で時間的に安定した生成物を生じる制御された様式にて進行させる。再度述べると、このことは、充分な凝集が必要とされる金属粒子の電荷を減少させるポリアミンの能力によるであろう。スペルミン及びスペルミジン、特にはスペルミンは、コロイド凝集に対してことに良好な効果を有し、本発明において使用するために極めて好ましい。
核酸標的の場合のように、高水準の感度が要求される場合には、多くの従来技術よりも活性表面の質がより重要となり、例えばコロイド表面については、凝集したコロイド粒子が至適で（かつ均一の）大きさ及び形状を持たなくてはならない。スペルミ（ジ）ン等のポリアミンの使用は、このことの達成を助ける。
先行技術は、ポリリジン（１アミノ基のみを反復単位当たりに含むポリマー性アミン）のＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面の被覆としての使用を記述し、陰イオン性ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性染料の電荷を変更している（例えば、C H Munro et al, J. Phys. Chem.,前出文献）。しかしながら、ポリリジンは核酸−標識−表面相互作用を、本発明によるポリアミン類のように促進することがなく；特には核酸電荷を同じように変更することはできない。先行技術は、スペルミンまたはスペルミジン等のポリアミン類が、コロイド形成における補助、及び標識−含有複合体に対する活性表面の親和性の増大の両者について有用であろうことの認識を欠く。それらがこれを成し得ることの発見は、新規であり、かつ予期しないものである。
ポリアミンの二重性機能故に、それは、好ましくは検出試料においてコロイド性ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面（例えば、前述した微小結晶性溶液）の前駆体に対して導入され；如かして該ポリアミンは、コロイド凝集を促進し、同時に存在する核酸または核酸単位の負の電荷を修飾する。過剰のポリアミンは、表面上の被覆として残り、標識−含有複合体がより容易に接近して結合可能となる。
より一般的な意味において、ポリアミンはＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得る前に、それの標的及び／または標的結合分子種との相互作用が許容される時点において導入されなければならない。例えば、それは標識及び結合分子種を標的物質を含む試料中に導入する以前に、標識−結合分子種複合体に添加されてよい。別法として、それは標識（及び場合により結合分子種）の導入に先行し、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面よりも後に、標的試料に添加されてもよい。表面が一旦他の試薬と結合されると、結果としては表面から、その上に存在するであろう被覆を介し、更にポリアミン被覆を介して、検出されるべき標識−含有複合体までの結合の“鎖”となる。
好ましくはポリアミンは、短鎖の脂肪族性ポリアミン、例えばスペルミン、スペルミジン、１，４−ジアミノピペラジン、ジエチレントリアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、トリエチレンテトラアミン及びテトラエチレンペンタアミン等（構造式は下記参照）であり；スペルミン及びスペルミジン、特に反復単位当たりに４個のＮＨ4基を伴うスペルミンは、本発明における使用について最も好ましい。ポリアミンは、例えば塩酸塩等の酸塩の形態で導入されることが好ましい。上述した様に、それはＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面がコロイド上である場合に最も有用である。
0004071278.tif 000006
添加されるポリアミンの量は、好ましくは表面にポリアミンの単一層被覆を得るために必要な量の１００〜１０００倍程度である。コロイド上の表面の場合には、これはコロイド粒子の大きさを参照して計算される。
（ii）標的または標的結合分子種の修飾
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に対する化学吸着を促進し、あるいは容易にするための、標的または標的結合分子種（それ自体核酸または核酸単位を含む）の修飾は、標識−含有複合体及び表面の間の相互作用の安定化を助け、かつ本発明の方法の感度及び強健性を増大する。
該修飾は、少なくとも一部として、核酸または核酸単位の全体的負電荷を減少させることにより化学吸着を容易にするであろう。理想的には、該修飾は両方の効果、即ち化学吸着の促進または容易化、及び正味の負電荷の減少を達成するようなものである。
修飾は、多くの方法により行われ得て、最も好ましくは１種以上の適当な官能基を核酸（単位）に導入するか、あるいは中性の類似体（下記参照）を使用することのいずれかである。核酸がそれに要求されるように効果的にハイブリッド形成することを損なうほどに過剰修飾しないように注意しなければならないが、所望により全体としてのより大きい効果を与えるために２種類の修飾法を組み合わせてもよい。好ましくは修飾は、本発明の方法において特徴（ｉ）によるポリアミンの使用と組み合わされる。これは、核酸プローブまたはプライマー等の標的結合分子種に対して都合良く行われる。
官能基の取り込み
好適な官能基は、核酸に対して容易に付加できるチオール及びアミン類等のルイス塩基を含む。最も好ましい官能基は、付加的な陽イオン部位（使用される試験条件下で）を提供しうるもので、例えばアミノ、好ましくは第一アミノ基を含むものである。アミノ基は、この技術で周知のように核酸（単位）に対して５’及び３’末端ヒドロキシル基を含めて種々の一においてスペーサアームを介して結合され得る。それらは、同様に知られているように、核塩基、特にはチミジンまたはウリジンのＣ５位置に結合され得る。
核酸（単位）に結合可能な５’及び３’アミノ修飾基の特定の例は、ｎが１より大きい整数であるアルキルアミノ基Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）n−、及びｎが１より大きい整数であるアミノ−エチレングリコールＨ2Ｎ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−を含む。チミジンまたはウリジン修飾基の特定の例は、例えば、ｎが１より大きい整数である−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＮＨ2である。
アミノ−修飾チミジンの更なる例は、５−（３−アミノプロプ−１−イン−１−イル）−２’−デオキシウリジン：
0004071278.tif 000007
（合成については、K A Cruickshank et al, Tetrahedron Letts. （1988）,29, pp5221-5224参照）
更に有用なアミノ修飾法は、チミジン若しくはウリジンのＣ５位置から、または核酸（単位）の他の適当な位置からのポリアミノリンカーの調製であろう。これは、例えば既知化合物５−（３−アクリリル）チミジンから出発して、スペルミン等のポリアミンと反応させ、ジシクロヘキシルカルボジアミド（ＤＣＣ）等のペプチドカップリング剤を使用してアミド結合を形成する１工程にて達成されうる：
0004071278.tif 000008
修飾は、核酸（単位）の塩基において都合良く行われる。それは１以上の位置にて起こり得て、可能な修飾の程度は化学的及び立体化学的可能性に依存する。道理上、より高い水準の修飾は、一般的には本発明の方法においてより高い検出感度を与える。
中性類似体
ヌクレオチド間ホスホジエステル結合の１個以上（または全て）が電気的に中性の残基に置換された核酸の中性類似体は、この技術で周知であり、本発明においても特に標的結合分子種として有用である。
天然型の核酸においては、骨格は、一つの（デオキシ）リボース糖リングの３’炭素、同じ（デオキシ）リボース残基の４’及び５’炭素、５’炭素に結合する酸素、この酸素に結合するリン、並びにリンと５’方向に引き続く（デオキシ）リボースリングの３’炭素の両者に結合する酸素からなる残基間の６個の原子の反復をもっている。中性核酸類似体において、この残基間の６個の原子反復の基調は通常維持される。最も普通には、（デオキシ）リボースリングの使用は保持され、従って通常、原子の内の２個は（デオキシ）リボースリングの３’及び４’からなるが、結合の残る４個の原子のそれぞれまたは全てまたはいずれかの組合せは他の原子または官能基により置換されてもよい。これらの電気的に中正なヌクレオチド間結合の幾つかの例は下記の表１に示されている。
他の中性核酸類似体の幾つかは、リング間原子に加えて骨格の（デオキシ）リボースリングが、他の原子または官能基に置換された場合において既知である。これらは、限定されるものではないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オルニチンペプチド核酸及びモルホリンカルバメートを含む（構造式は下記表１参照）。
0004071278.tif 000009
0004071278.tif 000010
式の例（上付き文字の引用文献は、表１自体と同じ）は、下記を含む。
0004071278.tif 000011
表１の引用文献
１．オリゴヌクレオチド及び類似体についてのプロトコール、S Agraqal編，Hamana Press, 1993
２．A DE Mesmaeker, R Haner, P Martin and H E Moser, Acc. Chem. Res. （1995）, 28, pp366-374
３．J F Milligan, M D Matteucci and J C Martin, J. Med. Chem. （1993）, 36, pp1923-1937
４．M Egholm, O Buchardt, P E Nielsen and R H Berg, J. Am. Chem. Soc. （1992）, 114, p1895
５．E Lioy and H Kessler, Liebigs Ann. （1996）, pp201-204
６．S Chaturvedi, T Horn and R L Letsinger, Nuclei Acids Res. （1996）, 24, pp2318-2323
修飾核酸の調製のための中性ヌクレオチド間結合の使用は、一般にホスホジエステラーゼ及びアルカリホスファターゼによる核酸分解に対する抵抗性を付与すること、及びそれらが生体内的治療に使用される場合においては細胞膜通過のために親油性を増大させることを意図している。しかしながら、非天然のヌクレオチド間結合の使用は、修飾核酸と天然型の配列の相補体との間に形成される二重鎖の熱安定性を低下させることがしばしば見い出されている。この理由のため、酵素的分解を阻害し、その一方で残るヌクレオチド間結合は二重鎖安定性を維持すべく使用されるホスホジエステル基とするために、修飾された天然ヌクレオチド間結合は３’及び／または５’末端のみに、しばしば挿入される。
しかしながら、中性ヌクレオチド間結合の幾つかは、不安低下させないことが見い出されている。これらはある種のアミド、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン及びチオホルムアセタール結合を含む。これらの結合により調製された核酸は、天然型のＤＮＡ及びＲＮＡ間と同程度かあるいはより高い安定性をもってＲＮＡに結合して二重鎖を形成する（表１に続く引用文献２参照）。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、やはりＤＮＡに結合して、対応するＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも安定なハイブリッドを形成する。
ＳＥ（Ｒ）ＲＳプローブ、即ち本発明により検出される標識と結合された標的結合分子種は、適当に標識された核酸から調製され得て、該核酸は（ｉ）天然型ホスホジエステルヌクレオチド間結合を、合成された中性ヌクレオチド間結合との組合た混合物を使用するか、あるいはＰＮＡを含む合成中性ヌクレオチド間結合を完全に使用して調製される。このような修飾核酸は、対応する天然型のＤＮＡまたはＲＮＡ配列よりも酸性が弱いものと予想され、また、従ってＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に対して増大した親和性を示すであろう。
ＳＥ（Ｒ）ＲＳプローブとして特に有用なものは、ホスホラミドヌクレオチド間結合を使用して調製されたものである。特に可能性ある有用性をもったものは、ホスホジエステル基の（Ｏ-）官能基をＮＲ2に置換してホスホラミデートを形成する結合である。従って、各々の修飾された結合は、中性であるのみならず、正の電荷をも持ちうる。Chaturvediら（表１の引用文献６）は、ホスホラミデートアミノ官能基に加えてヌクレオチド間結合残基当たりに一つの脂肪族アミノ基を持った、Ｎ−（ジメチルアミノプロピル）ホスホラミデートを調製することにより、この概念を拡張した。
（iii）標識上の化学吸着官能基
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識は、好ましくはＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に対する化学吸着を促進するであろう官能基を取り入れる。このような基の選択は、表面の性質（例えば、その電荷、酸化物または他の層の存在または不在）及びいずれかの表面被覆またはそれの結合する他の分子種（クエン酸塩還元剤等）の性質に依存し、また標識の性質に依存する。最も有用な表面については、官能基は好ましくはルイス塩基を含む。理想的にはそれは使用される表面に活発に引きつけられる。
チアゾール基：
0004071278.tif 000012
は、窒素原子の孤立電子対に富み、金属コロイド等のＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に対して特に親和性を有している。従って、この基の標識への取り込みは、該標識の表面への近接、ひいては表面増強効果、最終的には検出感度を更に増加させ得るため特に好ましい。
該標識は、好ましくはベンゾトリアゾール基、特にＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面が銀−または銅−基材である場合には：高度の共役性（特に脱プロトン化された場合）を有する、
0004071278.tif 000013
を含み、従って、標識の共鳴に依存するＳＥＲＲＳ検出に特に耐える。
ベンゾトリアゾール誘導体、例えば
0004071278.tif 000014
は、容易に入手可能であり、存在する標識（例えばアゾ染料等）とカップリング反応し得て、適当に修飾された標識を与える。ある種のこうした修飾標識は、新規化合物であるものと考えられ、本発明の側面を形成する（特に、下記の第７の側面参照）。
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識のための他の適当な化学吸着官能基は、カリクセリン及びメルカプトベンゾトリアゾール類を含む。
本発明において使用するための好適な標識は、典型的にはアゾ基質をベンゾトリアゾール誘導体と結合させることにより形成されるアゾベンゾトリアゾールを含む。アゾベンゾトリアゾールの例は、９−（カルボキシエチル）−３−ヒドロキシ−６−オキソ−６Ｈ−ベンゾトリアゾール並びにベンゾトリアゾールに結合される置換安息香酸及びナフトイン酸アゾ誘導体を含む。
好適な標識は式に包含される：
0004071278.tif 000015
式中、Ｒ1−Ｒ6は、適当な基（水素を含む）を表し、その例は当業者に周知であるが、好ましくは式の右側に一覧にしたものである。Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺも、式の右側に定義される。このような化合物の更に好ましい部分集合は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ6が独立して水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、６−員環芳香族環、ハロゲン、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ3Ｈ、ＰＯ4、−ＳＨ、−ＰＯ、−ＮＲ7及びＲ8から選択され；Ｒ5がＲ1と同様であるかまたは代わってＮＨ2若しくはｎが１〜６の整数である−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ等の官能化された−ＣＯＯＨであり；並びにＲ7及びＲ8が独立して水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル（直鎖または分枝鎖）及び不飽和環状アルキル環式基から選択されるものである。
このような標識の最も好ましい形態は、Ｒ1及びＲ2が共に水素であり、Ｒ3及びＲ4が独立して水素及びメチルから選択され、Ｒ5が−ＣＯＯＨまたはアミノであり、Ｒ6が水素であるものである。更になお好ましいものは下記実施例２にて引用されるものである。
実際的考慮
発明の第１及び第２の側面の他の特徴は全く慣用的である。例えば、標的及び所望により標識−含有複合体の固定化、単離及び／または操作；並びに得られたＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルの使用及び解釈（特にそれが配列決定法全体の一部分として使用される場合）等は、当業者に周知の実施法に従って、全て実施され得る。
検出感度を最大にするために、使用者は適切な特徴、即ち標識、標識の修飾、適切である場合には標識結合分子種、核酸修飾、ポリアミン、光源等々、並びに特にはＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面を選択しなければならず、これらは所定の使用の全ての状況で可能な最も効果的な様式にて相互作用するものであることにも注意しなければならない。この選択は試薬、条件及び他のパラメーターの試行錯誤による調整過程が一部にあるであろうが、この書類に含まれる指針を利用する限り、平均的な当業者の能力の範囲内に充分にあるであろう。
標識及び光源の注意深い選択は、（ＳＥＲＲＳを使用して）識別的なラマンスペクトルの手段と共に数種の標的の高度に選択的な検出を、予めの分離を必要とせずに可能とし得る。多分、２０種までの異なるＳＥＲＲＳ−活性標識が、理想的には下記の型の均質アッセイにおいてこの方法で分離可能であった。
均質及び非均質アッセイ
検出試料は、固体、液体または気体の形態であってよい。本発明の方法は、均質形態によって都合良く実施され、即ち、全ての必要とされる試薬が検出試料に同時に、または実質的にそのように添加され、結果は何れの段階においても更に試薬を添加することを必要とせず、また引き続いていずれかの試験成分を他の成分から分離することを必要とせずに得られる。
均質アッセイは、反応容器がアッセイの間のどの時点においても開かれる必要がないため、それらが汚染される傾向が少なく、また同様にそれら自体が外部環境を汚染する恐れも少ないという優位点を有する。本発明のように増幅を伴わない核酸または核酸単位の直接検出は、増幅に基づくアッセイにおいて起こりがちな、先行するアッセイの生成物による汚染が生じる傾向はない。そうではあるが、本発明の方法において要求される高い感度は、それらが均質系にて行われることを望ましいものとする。
均質核酸アッセイの既知の例は、傾向分光法に基づく場合が多い。本発明は、同様な形式のアッセイを実施するために、より単純でかつ費用がかからないＳＥ（Ｒ）ＲＳ分光法を使用することを可能とするものである。
本発明に従った均質アッセイ法は、消光波検出器を使用して都合良く実施され得、発明に衣装するための好適な光源については下記参照。
ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得る
一旦、標識−含有第一または第二の複合体が形成された後には、ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得る方法は、慣用方法である。本発明は、既存のＳＥ（Ｒ）ＲＳ技術についての化学的な修飾にかかるものであり、即ち、非増幅核酸−塩基標的の検出において使用するために実行可能となるような、標的または標的結合分子種、標識及びＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面の修飾にかかる。
しかしながら例示としては、以下が分光学的測定に適用されるであろう。
光源
典型的には、発明の方法は可視スペクトルの周波数をもったレーザーからの入射光を使用して実施されるであろう（選択される正確な周波数は、それぞれの場合の標識、表面及び標的に依存し、可視スペクトルの赤領域の周波数が全般的にはより良好な表面増強効果を生じるであろう）。しかしながら、他の周波数、例えば紫外または近赤外領域が使用されるであろう状況もあり得る−後述の配列決定法の検討参照。
適当な周波数及び出力をもって適切な光源を選択、または必要に応じて同調させることは、特に利用可能なＳＥ（Ｒ）ＲＳ文献を参照すれば、当業者の能力の範囲内に充分にある。ＳＥＲＲＳを使用して高感度の検出を達成するために、標識の最大吸光（後述の通り）、または表面プラズモンの最大吸光の、またはそれに近接する周波数をもったコヒーレント光源が必要である。低感度が必要であれば、光源はコヒーレントあるいは高強度である必要はなく、ランプ類が適切な励起光を選択するためにモノクロメーター用回折格子若しくはプリズムと組み合わせて使用されてよく；この場合は標識またはプラズモンの共鳴周波数にて操作する必要はない。
光源は、電極等の活性表面上において直接的に；またはＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性コロイド懸濁物を通して照射して；またはＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面により被覆された導波器を介して消光により、標識を励起させるために使用することができる。
光は、光源から活性表面に対して、鏡の反射により導くことができ、またレンズを通してより高密度の光束を与えるために焦点を合わせることができる。ＳＥ（Ｒ）ＲＳ分析について好適な装置は、励起光ビームに対して９０°の信号検出をもった蛍光顕微鏡である。共焦点光学系をもった蛍光顕微鏡も適当である。顕微鏡光学系の使用は、極めて小さい面積及び体積の分析を可能とする。
光は、別法として光源から活性表面に対して導波器を介して導くことができる。このことは、試料の位置に関して柔軟性を与え；該導波器は活性表面上に走査され得、またＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性コロイド懸濁物中に浸漬されうる。導波器は、マイクロタイタープレートのウエル中の溶液相において行われる分析に使用するために特に適当である。該導波器は、ロボットアームに保持され、多くの試料の高い処理能力でのスクリーニングのために、各ウエルに順次預けられる。
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面により被覆された導波器も、その表面に結合する分析対象物を検出するために選択的に使用され得る。原理は次の通りである。光は内部の全反射により導波器に沿って進む。しかしながら、導波器の外部表面に近接して結合する分子は、光の電場によってなおも励起される（“消光”）。この励起により生じるＳＥ（Ｒ）ＲＳ放射等の放射は、導波器を通り、その出力端部にて検出されうる。
このようにして検出されるＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルは、表面分子が他の分子種に結合される場合には影響を受ける。如かしてそれは、対の内の一方が、試料中の他方の片割れを捕捉するために導波器表面に被覆されて、標的核酸とその相補的標的結合分子種等の、親和性ペアの結合の存在を明らかにし得る。当然に、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識は、ペアの２種の片割れの内の少なくとも一方に必要である。好ましくは“遊離の”片割れが標識され、如かしてＳＥ（Ｒ）ＲＳ−信号が、その分子種が導波器表面上の相補的分子種により“捕捉”された場合にのみ検出される。導波器表面に結合した分子のみが問われるので、特異的な結合の事象は、未反応試薬の洗浄除去の必要無しに均質に検出されうる。
幾つかの文献は、光学ファイバーを被覆してそれらが特異的に分析対象物を吸着し、次いでＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出を可能とする適当な方法を開示している。ＵＳ４，３９５，３１２（McCreery et al）は、ラマンプローブにより検出されうる発色団の電気化学的生成を開示している。ＵＳ４，５７３，７６１（McLachlan）は、特別に設計された集中角を有するラマン分光法に有用な、独立した伝送用及び回収用光ファイバーを有してなるファイバー光学プローブを開示している。ＵＳ４，７８１，４５８（Angel et al）は、ＳＥＲＳ−活性金属が薄く被覆され、更に一側面には該金属上に選択的吸着物質が被覆される光学ファイバープローブ、または“オプトロード（optrode）”を開示している。ＵＳ４，８３４，４９７（Angel et al）は、ガソリン等の特定の物質用に設計されたファイバー−光学的流体検出器も開示している。ＵＳ５，３２７，２１１（Carron and Mullen）は、ＳＥＲＳ検出を可能とする所望の分子と選択的に複合体形成または分割する化学層により被覆された光ファイバーまたはファイバー−光学的プローブの製造方法を開示している。
検出器
ＳＥ（Ｒ）ＲＳにおいて主要な測定は、散乱光の強度及び輻射の波長である。入射光の角度及び検出器の位置の何れも、重要ではない。平らな表面に関しては、入射レーザービームは、６０°の角度をもって表面を叩くように位置し、入射光に対して９０°または１８０°のいずれかで検出される。コロイド状懸濁物では、検出は入射光に対して任意の角度可能であるが、９０°がしばしば採用される。
ラマンシグナルの強度は、励起ビームからの背景強度に対して測定され、このため大きいストークスシフトを伴ったラマン分析対象物の使用が有利である。背景は、主としてレイリー散乱光及び屈折性反射であるが、これらは高効率の光ファイバーを使用することにより選択的に除かれうる。
波長選択的鏡、散乱高検出のためのホログラフ性光学要素、及びファイバー−光学的導波器等を含む幾つかの器具は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳシグナルを集めるために好適である。ＳＥ（Ｒ）ＲＳシグナルの強度は、単独で配置されるか、またはシグナルの直列的増幅のために直列に配置される電子結合素子（ＣＣＤ）、シリコーンフォトダイオード、または光増幅管を使用して測定され得る。光子計数電子機器が、高感度検出に使用され得る。検出器の選択は、特定のアッセイを行うために要求される検出感度に大きく依存する。
本発明の方法は、波長範囲に亘って全ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得るか、あるいはピークを選択してそのピークの波長のみを走査するか（即ちラマン“造影”）のいずれかを含み得る。
データ処理装置
ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得、及び／または分析する装置は、コンピュータ等のデータ処理装置を先ず含んでいる。
ラマンシグナルは、一連の種々の強度の離散したスペクトル線からなる。線の周波数及び相対強度は、検出される標識に特異的であり、従って、ラマンシグナルは標識の“指紋”となる。ＳＥ（Ｒ）ＲＳ分析装置が混合物から１種類の標識を選択的に検出するために使用される場合には、同定を目的として全体の“指紋”スペクトルを検出する必要がある。しかしながら、検出器が、それぞれ固有のスペクトル線をもった１種または数種の標識の検出を定量化するために使用される場合には、選択されたスペクトル線周波数におけるシグナル強度を検出することのみが必要となる。
一旦ＳＥ（Ｒ）ＲＳシグナルが適当な検出器に捕捉されれば、その周波数及び強度データは、典型的には分析用コンピュータに転送される。指紋ラマンスペクトルが、検出されたラマン活性化合物の同定のために参照スペクトルと比較されるか、あるいは測定周波数の信号強度が、検出されたラマン活性化合物の量を計算するために使用されるか、いずれかが行われる。
装置
発明の実施に使用される商業的ＳＥ（Ｒ）ＲＳ分析装置は、以下の構成部分からなるであろう：レーザー光源、光をＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性表面に運ぶ適当な光学系、分析のための試料を設置するためのステージ、ラマン信号を受けるための光学系、ラマン信号をある周波数における一連の強度に変換するための検出器、及び波長／強度データを解釈し、分析出力を提供するためのデータ処理装置。
光源、光学系、検出器及び処理装置は既に言及した。試料を設置するためのステージは、以下の固体支持体の１種以上に適応するように設計される：顕微鏡スライドまたはシリコンウエハース若しくはチップ等の他の平板状表面、マイクロタイタープレート若しくは高密度配列マイクロウエルプレート、または膜。
アッセイは、固体支持体上にて行われ、該支持体は分析のためのＳＥ（Ｒ）ＲＳ読取り装置に挿入される。別法としてアッセイは、別個の容器にて行われ、次いでアッセイ成分が、分析装置に挿入される固体支持体に移送されることにより行われ得る。固体支持体の、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ分析装置ステージヘ、及びそれからの移動のためのロボット技術の使用は、試料の自動的操作及び分析によって、操作者の顕著な投入を伴わずに、高い処理能力のシステムの開発を可能とするであろう。
第３および第４の側面−複合体
第３の側面に従えば、本発明は、場合により核酸または核酸単位を含む標的結合分子種を介してＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識に結合される、標的核酸または核酸単位を含むＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性複合体を提供し、該標識はＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に結合され、また該複合体は１種以上、好ましくは３種全ての上述した特徴（ｉ）−（iii）を取り入れる。
第４の側面に従えば、本発明は、核酸または核酸単位を含み、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識に結合される結合分子種を含んでなるＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性複合体を提供し、該標識はＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に結合され、また該複合体は１種以上、好ましくは３種全ての上述した特徴（ｉ）−（iii）を取り入れる。
このような複合体は、当然に本発明の第１および第２の側面に従う方法において有用である。第４の側面において、結合分子種は典型的には、最終的に検出されるべき他の核酸または核酸単位の少なくとも一部に実質的に相補的なプローブまたはプライマーであろう。このような複合体は、例えば試料中の固定化された標的と反応に付され、次いで未結合複合体は、残る標識−含有複合体が元の試料中の標的の存在を示すように洗浄除去される。
これらの複合体の構成分子種の相互の結合は、会合によるか、または共有若しくはキレート結合等の直接若しくは間接（連結基を介して）的な化学結合であってよい。
特徴（ｉ）の“取り込み”は、ポリアミンが、例えば、標的若しくは結合分子種、及び／またはＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面の被覆の全てまたは一部と電荷平衡イオン対の形態で、該複合体と結合されることを意味する。
第５の側面−配列決定
本発明は、第５の側面に従えば、少なくとも１個の標的ヌクレオチドまたは該酸のヌクレオチド配列を検出するための第１および第２の側面の方法の使用を含む核酸配列決定方法を提供する。配列決定方法における他の工程は、全く慣用方法であってよく；当業者は、全ての配列についての結論に達するために、本発明の第１および第２の側面の方法からのデータを容易に使用し得るであろう。この方法において、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識は関連する標的ヌクレオチドまたは配列と、標的に実質的に相補的な核酸プライマー配列の形態またはｄＮＴＰ若しくはｄｄＮＴＰ（（ジ）デオキシヌクレオチド三リン酸塩基）の形態で標的結合分子種を介して、複合体形成されてよい。
一般に知られた核酸配列決定のための非放射活性プロトコールは、２種類の主な系に基づいている：
ａ）異なる染料により標識された４種の同等なプライマーを“サンガー”型の鎖停止反応に付し、貯留し、ゲル電気泳動により分離する。蛍光をレーザー及びＣＣＤを用いてゲル中に検出する。
ｂ）サンガー反応における各ジデオキシ停止塩基を異なる染料にて標識し、全ての反応を単一容器中にて行わせる。過剰の染料停止試薬の除去後、標識生成物をゲル電気泳動にて分離し、レーザーにて調べる。
幾つかの染料は、使用されるものから充分に離れた励起最大値を持つので、単一のレーザー線を用いて達成しうる感度を制限する、ある範囲の励起及び輻射波長を、染料の間を識別するために使用した。加えて、充分な量の配列決定テンプレートが、通常は先行する増幅を必要として不便と費用とを生じるような信頼できる情報を得るために必要とされる。従って、本発明の方法の配列決定技術における使用は、顕著な優位点を提供する。
本発明を使用して上記反応スキームの両者が可能である。他の検出スキームは、配列伸長生成物のナイロンまたはニトロセルロース膜上の直接ブロッティング、またはゲル電気泳動からの生成物の、膜の移動ロールへの溶出であろう。次いで、生成物は、ポリアミン（例えばスペルミン）、及び引き続くコロイドの吸収と、全フィルターのＳＥ（Ｒ）ＲＳ分光法により検出されうる。本発明の配列決定における使用により得られる二つの主な進歩は：第一には各染料がレーザー線に極めて近接した励起最大を有しうるので全てが同じようによく励起され、第二には、発明方法の高い感度が、ゲノムからの直接的配列決定の可能性をもって、より少量の出発テンプレートの使用を可能とすることである。
発明の第５の側面に従った尤もと思われる配列決定フォーマットは：
ａ．テンプレート（または可能性としてゲノム）の単離。
ｂ．異なった標識プライマー及びｄｄＮＴＰターミネータをそれぞれ用いた４種の並行する反応を用い、鎖停止配列決定を行う。
ｃ．４種の反応物を貯留。
ｄ．反応生成物をポリアクリルアミド／尿素ゲルにて分離。
ｅ．ゲルをナイロン上にブロットする。
ｆ．該膜にスペルミンを染み込ませる。
ｇ．該膜に分散銀コロイドを染み込ませる。
ｈ．ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得る。
ｉ．処理された像から配列を再構成する。
別の配列決定スキームは、サザンブロッティングの類似法であろう。４種のターミネータ反応物は、標識無しで操作される。電気泳動（テンプレート毎に４つのレーン）の後に、生成物が膜に移され、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識を持った相補的プローブとハイブリッド形成される。ＳＥ（Ｒ）ＲＳシグナルは、スペクトルを得る前にスペルミン及びコロイドに浸漬することにより現像される。このような反応における処理能力は、複数反応を実行し、プローブを一時に一つの反応の組のみを“見る”為に使用することにより改善されうる。種々のプローブを用いたハイブリッド形成は、順次的または同時的（コンピュータソフトウエアによる洗練されたデータ解読に頼って）に行われ得る。プローブは、プライミング部位近傍であるが、配列決定領域の内部である。
本発明による配列決定方法は、多重性も含んでよい（後述の実施例９参照）。
紫外領域における配列決定
慣用の核酸配列決定技術（“サンガー”法に基づく）の更なる欠点は、（ｉ）各塩基について一つづつ、四つの独立した配列決定反応を走らせる必要性、及び（ii）結果を高分解能の電気泳動を使用して分析する必要性を含む。
これらの課題の幾つかに向けられた現在研究されている技術は、緩衝溶液の線形の流れの中の固体支持体につながれ、制御された条件下で３’−５’エキソヌクレアーゼにより処理される核酸の単一分子を必要とする。各ヌクレオチドは核酸から順次切断され、適当な検出器を過ぎて流れる。
この点において、本発明による検出方法は、個々のヌクレオチドの存在を検出するために使用され得て、如かして元の核酸についての配列の一覧を与える。この場合、ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルは、理想的には紫外範囲の入射光、及び適当なＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性を有する表面を使用して得られるであろう。このような技術には幾つかの優位点がある。第一には、４種のヌクレオチドのそれぞれは類似したＵＶスペクトル（約２６０ｎｍに一つの極大）を有し、従って、それぞれはこの周波数を中心とした単一のレーザー線により最大に励起されるであろう。ラマン分光法では普通であるが、４種のヌクレオチドは、容易に区別可能なラマンスペクトルを有することも期待される。最後にはヌクレオチドのＵＶ消光係数が極めて高く、それらをＳＥ（Ｒ）ＲＳを用いて正に検出可能としている。
生物学的試料の分析のためにＵＶ範囲におけるラマン共鳴分光法を使用する可能性については、T M Cotton et al, J. Raman Spectroscopy（1991）, 22, pp729-742により簡単に言及されている。ＵＶに基づく技術は、別個のＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識を使用するよりも、ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルの手段により直接的に核酸または核酸単位を検出するために使用されるであろう。標的核酸（単位）または適当な標的結合分子種は、この場合にはＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識としても機能するであろう。
第６の側面−キット
第６の側面に従えば、本発明は第１、第２または第５の側面による方法の実施において使用するため、あるいは第３または第４の側面による複合体を形成するためのキットを提供する。このようなキットは、少なくともＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識またはこのような標識の調製手段を含み、好ましくはＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面またはこのような表面の調製手段を含む。標識は、該表面または表面調製に使用される試薬に、既に結合されているか、あるいはさもなければ会合していてよい。該標識は、興味ある標的と反応するように設計されたオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡプローブ等の標的結合分子種と更に結合されるか、または別法として結合されてもよい。該キットは、適当である場合に、本発明の第４の側面による表面−標識−結合分子種を含んでよい。
標識は、好ましくは本発明の特徴（iii）に従って修飾される。存在する任意の標的結合分子種は、好ましくは特徴（ii）に従って修飾される。特徴（ｉ）によれば、該キットは好ましくはＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得るに先立って検出試料中に導入するためのポリアミンを含む。
ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面の調製手段は、例えば、（銀コロイド調製用に）クエン酸、硝酸銀、アスコルビン酸、蒸留水及びスペルミン等の試薬を含みうる。
本発明によるキットは、標的または標識−含有複合体が固体支持体に固定化されうる手段として捕捉物質を含んでもよい。適当な捕捉物質は、固体支持体に結合されるか、または特異的に結合され得るオリゴヌクレオチド（即ち、標的結合分子種）であろう。このような支持体は、例えば、マイクロタイタープレート、常磁性ビーズまたは沈降可能なビーズの表面であり得る。
該キットは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ分析のための粗製の標的−含有試料調製用の試薬及び／または他の材料（例えば、フィルター、シリンジ、カラム等々）も含んでよい。それは、標的核酸または核酸単位及び／または他の試薬の操作において使用するための酵素等の試薬を含んでもよい。このような酵素はこの分野で周知であり、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ及び他の高性能核酸ポリメラーゼを含む。
最後に、該キットは光源、検出器、データ処理装置等々のＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルを得る際に使用する為の装置を含んでもよい。それは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面により、また場合により該表面に結合された標的結合分子種によって被覆された導波器を含んでもよい。
第７の側面−新規化合物
最後に第７の側面に従えば、本発明は他の側面におけるＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性標識として有用な下記の新規アゾベンゾトリアゾール類を提供する：
ａ）３−メトキシ−４−（５’−アゾベンゾトリアゾリル）−フェニルアミン；
ｂ）３，５−ジメトキシ−４−（５’−アゾベンゾトリアゾリル）−フェニルアミン；
及び
ｃ）４−（５’−アゾベンゾトリアゾリル）−１−アミノナフタレン。
本発明方法の感度
実験は、本発明の第１および第２の側面による方法が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等の標的核酸のサブ−フェムトモル（１０-15Ｍ）量の検出が可能であることを示し、標的の先行する増幅は必要ではない。１７−１８塩基の、単一の染料で標識された標的分子を使用し、固相においては１〜１００（ほぼ確かに５０未満）の標的分子の存在が信頼性を持って検出され；また液相において１〜１０分子が検出された（下記実施例５、７及び８も参照）。
本発明の第５の側面による配列決定方法は、一般に慣用の配列決定技術で必要とされるよりも少量の必要なテンプレート配列を使用して実施することができ、典型的には約１００フェムトモル未満のテンプレートで十分であり、多分アットモル（１０-18Ｍ）量の程度またはそれ未満でも可能であろう。
本発明の方法の高感度は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面に極めて近接するように近づく標識−含有ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性複合体の能力によるもので、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ効果のために必要な２０ｎｍよりかなり小さい５オングストロームの程度の表面−標識間分離が本発明の方法を使用して可能である。
本発明の用途
本発明の用途は、先の記述から明らかであり、医学的症状の予測及び検出、法的試験、ヒト及び動物遺伝子の配列決定並びに保証札付き製品の同定を含み、“札”は、標的核酸または核酸単位を有する。遺伝子マーカーの検出に関わる他の技術、及び如かして本発明が有用であろう他の技術は、食料品及び家畜の飼育における明確な特色の検出並びに移植試料の適合を可能とするＨＬＡ特異性の検出を含む。明らかに本発明の側面は、標的核酸または核酸単位の低濃度に加えて高濃度を検出するためにも使用され得る。
本発明による検出方法は、既存の生化学技術の全ての範囲のおいて改善のために使用され得る。配列決定（本発明の第５の側面に関連して記述した）は、明白な例である。その他は以下に略述される。
Ａ）後天性または先天性の遺伝子疾患は、生物ゲノムのＤＮＡ配列がある決定的な点にて天然型配列から変化した場合に生じる。この変化の分析は、現在では、ＰＣＲまたは他の増幅に基づく技術により増幅されたＤＮＡを分析するために、配列決定、ＳＳＣＰ及びＤＧＧＥを使用して行われている。ＡＲＭＳ（EP-B-O,332,435）の使用は、配列依存的様式でＰＣＲ生成物を生成させるために有用で、これは増幅断片の配列を引き続いて分析する必要を取り除く。ゲノムＤＮＡから直鎖伸長生成物を生成させるためにＡＲＭＳを使用し、引き続いて伸長物を本発明の方法を使用して検出することによる遺伝子疾患の直接分析法は、遺伝子分析を迅速化するであろう。ＰＣＲ増幅を避けることは、ＰＣＲ生成物の交差夾雑の危険性も取り除くであろう。配列変異の検出のためのＡＲＭＳの使用は、疾患状態に伴われる変異に限定されるものではなく、個体の遺伝子的識別において有用な潜在的変異である単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）の検出にも適用されうる。
Ｂ）可変数縦列反復（ＶＮＴＲ）分析は、個人毎の遺伝子的変化に基づく個人の同定手段である。ゲノムＤＮＡは、制限酵素により処理されてＤＮＡ断片を生じ、そのいくらかは可変的長さの縦列反復配列を含む。これらの断片は電気泳動により分離され、ゲルがアルカリにより変性される。次いでＤＮＡは膜に移され、反復配列に相補的な標識された単鎖オリゴヌクレオチドプローブが、該ＤＮＡにハイブリッドされる。プローブを厳密条件の洗浄に付した後、標識を介して検出される。例えば、酵素アルカリホスファターゼにより標識されたプローブは、適当なホスホリル化基質からの化学発光の生成により検出され、また放射標識プローブは、オートラジオグラフィーにより検出される。プローブが検出されれば、それがはぎ取られ、他のＶＮＴＲを検出するために次のプローブがハイブリッド形成に付される。通常、個人当たりに３〜５種類のプローブ操作が行われ、それぞれのプローブ操作が１日仕事である。酵素結合検出及びオートラジオグラフィーは、多重的検出に助力しないためプローブは多量的ではなく、また蛍光プローブ操作は、入力ＤＮＡの量が少ないこと及びハイブリダイゼーション膜の高い自己蛍光性のために充分な感度を持たない。全てのプローブ操作が同時的に実施できれば、操作者の時間を低減することにおいて有利であろう。本発明の方法は、自己蛍光の背景の問題無しに、それらの固有のラマン振動“指紋”により、数個のプローブの多重的検出を可能とする。
Ｃ）多重的蛍光の困難性は、蛍光・インサイチュ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による細胞遺伝学分析の分野においても見られる。ほとんどの有機性蛍光物質の広範囲の蛍光のために、蛍光に重複を生じない５種以上の明白な蛍光物質を選択することは困難であり、従って、多くの細胞遺伝学研究室では、染色体プローブを標識するためにわずか２または３種の蛍光物質を使用しており、多重的検出が制限される。一つの解決法は、異なる染色体領域を着色する為に蛍光物質の変化させた混合物を使用することであり、分離フィルターを用いて各色を順次検出し、各々の異なった標識領域を同定するために、得られた像をコンピュータ合成することである。この技術は、高価な映像装置及び分析装置を必要とし、従って比較的少数の研究室で使用されている。異なった着色剤が、異なったＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性プローブへのハイブリッド形成による“指紋形成”することを可能とする、ラマンスペクトルの離散スペクトル線を使用することは遊離であろう。このような技術の更なる優位点は、ラマンシグナルが自己消光せず、従って標識着色剤が染色体表面に、蛍光剤にて可能であるよりも高密度で詰め込まれ得て、対応する信号を生じることである。
Ｄ）標識されたジデオキシ鎖ターミネータが、配列依存的な態様でプライマーの３’末端に取り込まれることによる小配列決定法は、本発明の方法による取り込み塩基の検出にて、直接にゲノム上で行われてよい。
Ｅ）細胞周期の種々の段階にある組織において発現される遺伝子の、ｍＲＮＡ検出による分析は、遺伝子機能の追跡の有用な手段である。現在はｍＲＮＡ濃度は、困難な技術であるＲＴ−ＰＣＲにより定量されている。本発明を使用するｍＲＮＡの直接定量は、組織中の多くの遺伝子の迅速かつ同時的追跡を可能とし、それらの機能の洞察を導く。このことは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性染料により標識されたプローブのｍＲＮＡの利用可能な領域とのハイブリッド形成、次いでポリチミジン配列を用いる該ハイブリッド生成物の固相上への捕捉、及び引き続く該染料からのＳＥ（Ｒ）ＲＳシグナルの強度測定によるｍＲＮＡ濃度の定量によって達成されうるであろう。
Ｆ）本発明の更なる用途は、ｍＲＮＡのどの領域がアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリッド可能であるかを検出することである。ｍＲＮＡは、その方法が満足できるものではないが、コンピュータモデルにより予測しうる相当の二次構造を有している。ｍＲＮＡの僅かにいくらかの領域のみが、単鎖であり、かつアンチセンスオリゴヌクレオチドとの結合に利用できる傾向にある。これらの結合部位を迅速に同定することができることは、“アンチ遺伝子”技術を開発している会社には相当に価値のあることである。一つの可能な方法は、ｎがオリゴヌクレオチドプローブの長さである４n個の要素を持った列（４n個の可能なオリゴヌクレオチドｎ−量体があり得る）上にて、固体支持体にｍＲＮＡを結合させることである。４n個の異なるプローブが調製され、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性染料により標識され、次いでそれぞれが個々に、ｍＲＮＡのスポットに添加され、次いで厳密条件の洗浄に付される。ｍＲＮＡにハイブリッドしたこれらの標識プローブは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ分光法により検出され、ｍＲＮＡ配列に対する関係が、分子のどの領域がプローブに対して利用可能であるかが明らかにされる。一旦調製されれば、得られたＳＥ（Ｒ）ＲＳプローブのライブラリーは、任意の所望のｍＲＮＡ標的についても使用されうる。別法として、４n個のプローブオリゴマーは、個の技術で周知のようにオリゴヌクレオチド列上に塗布され、ｍＲＮＡを添加して厳密条件下での洗浄に付され得る。該列の特定の領域に対するｍＲＮＡの結合は、ｍＲＮＡのポリ−Ａテイルに結合するＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性染料により標識されたポリチミジンプローブを添加し、ＳＥ（Ｒ）ＲＳを検出することにより検出されうる。分析完了後、ｍＲＮＡは、リボヌクレアーゼまたはアルカリを用いた処理によって除去され、該列は再使用可能となる。
Ｇ）本発明との組合せにおけるオリゴヌクレオチド列の使用は、ＳＮＰ及び有害な変異の両者ともについてのゲノタイプの分析にも拡張されうる。これは増幅核酸を使用して、または直接に非増幅核酸材料を使用して行われ得る。ゲノムの特定の領域に対する多数の捕捉プローブが列の調製のために使用され得て、理論的には個人の遺伝子的変異に関するかなりの量の情報が１回の実験で収集され得、ヒトを固有に同定することを可能とする（ＳＮＰによる）と共に、現在及び将来の疾患状態への臨床的に有用な洞察を与える。
図面の簡単な記述
本発明は実施例及び添付する例示的図面を参照して更に詳細に記述されるであろう：
図１及び２は、本発明による方法において標識として有用なベンゾトリアゾールモノアゾ染料の調製のための二者択一の反応スキームを示す（実施例２）；
図３−６は、本発明による方法において標識として有用な修飾アゾ染料についてのＳＥＲＲＳスペクトルである（実施例３）；
図７及び８は、溶液中の染料標識修飾オリゴヌクレオチドについての、本発明による方法にて得たれたＳＥＲＲＳスペクトルである（実施例５）；
図９−１５は、ナイロン膜上の染料標識非修飾オリゴヌクレオチドについて得たＳＥＲＲＳスペクトルである（実施例６）；
並びに
図１６−２２は、ナイロン膜上の染料標識修飾オリゴヌクレオチドについて、本発明に従って得たＳＥＲＲＳスペクトルである（実施例７）。
詳細な記述
実施例１ ベンゾトリアゾールアゾ染料の調製−一般的方法
本発明における標識として使用するために好適なベンゾトリアゾールアゾ染料は、以下の一般的手法の従って調製されうる。
工程１：ジアゾ化
５−アミノベンゾトリアゾール（１．０ｇ、７．６３ｍｍｏｌ）をＨＣｌ（５ｍｌ、５０％ｖ／ｖ）に溶解し、０℃にて亜硝酸ナトリウム（０．５７８ｇ、１．１当量、５ｍｌの水中）を滴下添加することによりジアゾ化した。過剰量の亜硝酸ナトリウムをヨウ素デンプン紙を用いて検出した。暗青色は、ジアゾニウム塩の形成を示す。
工程２：カップリング反応
ジアゾニウム塩とカップリングされるべき所望のカップリング試薬（１当量）を、酢酸ナトリウム緩衝溶液（５ｍｌ、ｐＨ６．０）及びアセトンまたはジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）のいずれかに溶解した。ジアゾニウム溶液を緩衝化カップリング剤に滴下添加した。該溶液を室温にて１時間撹拌した。
実施例２ ベンゾトリアゾールアゾ染料−特定の例
Ａ）４-（５’-アゾベンゾトリアゾリル）-フェニルアミン
アニリン（１当量）を酢酸ナトリウム緩衝溶液（１．０Ｍ、５ｍｌ、ｐＨ６．０）及びアセトン（５ｍｌ）に溶解した。ジアゾ化されたアミノベンゾトリアゾールを、この溶液に０℃にて撹拌しつつ１時間で滴下添加した。生成した固体を濾過により単離し、飽和ＫＣｌ（３ｘ５０ｍｌ）にて洗浄して黄色残渣を得た。（０．８９２ｇ、３．７４ｍｍｏｌ、８４％）、Ｒｆ［ジクロロメタン／メタノール（Ａ）９／１］０．３７；δH（ＤＭＳＯ−ｄ６）４．１０（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）７．１４−８．２５（７Ｈ，ｍ，ａｒ）１２．７３（２Ｈ，ｂｒ  ｓ，ＮＨ2）；λmax（ＭｅＯＨ）３６０ｎｍ。
Ｂ）３−メトキシ−４-（５’-アゾベンゾトリアゾリル）−フェニルアミン
アニシジン（１当量）を酢酸ナトリウム緩衝溶液（１．０Ｍ、５ｍｌ、ｐＨ６．０）及びアセトン（５ｍｌ）に溶解した。ジアゾ化したアミノベンゾトリアゾールをこの溶液に、０℃にて撹拌しつつ１時間で滴下添加した。生成した固体を濾過により単離し、飽和ＫＣｌ（３ｘ５０ｍｌ）にて洗浄した。残渣をエタノール／水（８：２）から再結晶し、赤色結晶（０．４５８ｇ、１．９４ｍｍｏｌ、７３％）を得た。Ｒｆ（Ａ）０．４２；δH（ＤＭＳＯ−ｄ６）３．９６（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ3）６．４６（１Ｈ，ｓ，ａｒ）６．６０−６．６３（２Ｈ，ｄ，ａｒ）６．６３−７．６８（２Ｈ，ｂｒ  ｓ，ＮＨ2）７．６６−７．６８（１Ｈ，ｄ，ａｒ）７．９６−８．０２（２Ｈ，ｄｄ，ａｒ）８．１８（１Ｈ，ｓ，ａｒ）；λmax（ＭｅＯＨ）４０９ｎｍ。
Ｃ）３，５−ジメトキシ−４-（５’-アゾベンゾトリアゾリル）−フェニルアミン
３，５−ジメトキシアニリン（１当量）を酢酸ナトリウム緩衝溶液（１．０Ｍ、５ｍｌ、ｐＨ６．０）及びアセトン（５ｍｌ）に溶解した。ジアゾ化したアミノベンゾトリアゾールをこの溶液に、０℃にて撹拌しつつ１時間で滴下添加した。生成した固体を濾過により単離し、飽和ＫＣｌ（３ｘ５０ｍｌ）にて洗浄した。残渣をメタノールから再結晶し、橙色結晶（０．７６８ｇ、２．５８ｍｍｏｌ、６７％）を得た。Ｒｆ（Ａ）０．３７；δH（ＤＭＳＯ−ｄ６）３．３６（６Ｈ，ｓ，２ｘＯＣＨ3）３．８７（２Ｈ，ｓ，ａｒ）７．８１（３Ｈ，ｍ，ＮＨ2＋ａｒ）１１．９９（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）；λmax（ＭｅＯＨ）３９５ｎｍ；ＦＡＢ  ｍｓ  ｍ／ｚ２９９．１２５６［Ｃ14Ｈ14Ｏ2Ｎ6（Ｍ＋１）＜０．１ｐｐｍ］。
Ｄ）４−（５’−アゾベンゾトリアゾリル）−１−アミノナフタレン
１−アミノナフタレン（１当量）を酢酸ナトリウム緩衝溶液（１．０Ｍ、５ｍｌ、ｐＨ６．０）及びアセトン（５ｍｌ）に溶解した。ジアゾ化したアミノベンゾトリアゾールをこの溶液に、０℃にて撹拌しつつ１時間で滴下添加した。生成した固体を濾過により単離し、飽和ＫＣｌ（３ｘ５０ｍｌ）にて洗浄した。残渣を水から再結晶し、スミレ色結晶（０．６４５ｇ、２．２４ｍｍｏｌ、２９％）を得た。Ｒｆ（Ａ）０．３５；δH（ＤＭＳＯ−ｄ６）３．３６（６Ｈ，ｓ，２ｘＯＣＨ3）３．８７（２Ｈ，ｓ，ａｒ）６．０８（２Ｈ，ｓ，ａｒ）７．８１（３Ｈ，ｍ，ＮＨ2＋ａｒ）１１．９９（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）；λmax（ＭｅＯＨ）４６９ｎｍ。
ベンゾトリアゾールモノアゾ染料の他の合成スキーム
最初に、本発明において標識として使用するために好適なベンゾトリアゾールモノアゾ染料の調製のために、図１に概略を示したスキームを試みた。しかしながら、芳香族環のベンゾトリアゾールに対するカップリングが極めて困難な反応であることが証明された。４−位の活性は、アミド結合の存在により大きく減少された。該反応は３種の異なる芳香族環を使用して試みられた。残念ながら、何れも達成困難であることが示された。
図２に示される代替経路は、アゾ染料の調製及び使用においてより成功裏にあることが示された。
実施例３ 修飾（ベンゾトリアゾール）アゾ染料のＳＥＲＲＳスペクトル
図３−６は、それぞれ実施例２にて調製された修飾アゾ染料Ａ−Ｄについて得たＳＥＲＲＳスペクトルである。
これらは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性銀コロイド表面を捜し出す傾向がある化学吸着性のベンゾトリアゾール基を含む染料である。このような染料は本発明における標識として有用である。
スペクトルを得る条件は次の通りである。ＳＥＲＲＳ−活性表面は、下記実施例５のようにしてコロイド／水混合物（１：１、１ｍｌ）の形態で調製されたクエン酸還元銀コロイドである。これに、問題の染料を含むメタノール溶液（１０μｌ、約１０-5Ｍ）、次いでスペルミン（２０μｌ、８ｘ１０-4Ｍ）を添加した。スペクトルは、実施例５に記述されている装置を使用して得た。レーザーについてのλmaxは、５１４．５ｎｍ；染料についてのλmax値は、〜３９４ｎｍ（図３）、４０９ｎｍ（図４）、４４４ｎｍ（図５）及び４６８ｎｍ（図６）であった。
実施例４ ベンゾトリアゾールモノアゾ染料の核酸への結合
一般的方法
ベンゾトリアゾールモノアゾ染料の合成後、第一アミンがジメチルホルムアミド基により保護され、如かしてベンゾトリアゾール第二アミンのモノメトキシトリチル基による選択的保護を可能とする。塩基処理によるホルムアミド基の除去後、該遊離のアミンは無水コハク酸とのカップリングによりカルボキシル酸を生じる。次いで酸は第一アミン及び保護アルコールを有するメチレンリンカーとカップリングされる。保護基の選択的除去後、アルコールはホスフィチル化され、如かして慣用的固相合成の実施を可能とするモノマーを生じる。
別法として、上記スキームにおいて生成された酸は、適当な活性エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール）に変換され、核酸の５’−末端親核性第一アミンとカップリングされてよい。（J Goodchild,前出文献参照）
特定の例
前述したベンゾトリアゾールモノアゾ染料は、この提案された結合方法についての出発材料として機能することができる。
工程１
染料（１当量）を、無水ピリジンに溶解し、添加されるピリジン及びジメチルホルムアミジンジメチルアセタール（３当量）に撹拌しつつ溶解する前に、無水ピリジン中で共蒸発させた。４０℃にて２時間撹拌後、溶媒を除去し、残渣を酢酸エチルに溶解させた。飽和ＫＣｌ（ｘ３）による洗浄及びＮａ2ＳＯ4による乾燥後、生成物を、ジクロロメタン中のメタノールにて溶出する湿式フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。
工程２
工程１の生成物（１当量）を、無水ピリジン及び添加されるジメチルアミノピリジン（０．１当量）に溶解する前に、無水ピリジン（ｘ３）と共に共蒸発させた。モノメトキシトリチルクロライド（１．２当量）を２時間で小分けに添加し、該混合物をメタノールの添加に先立って４時間撹拌し、溶媒を減圧除去した。残渣をメタノール性アンモニアに溶解し、１６時間撹拌した。溶媒の除去後、残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和ＫＣｌ（ｘ３）により洗浄し、及びＮａ2ＳＯ4により乾燥させた。生成物を、ジクロロメタン中のメタノールにて溶出する湿式フラッシュカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミンにより予め平衡化されたシリカ）により精製した。
工程３
工程２の生成物（１当量）を、無水ピリジン及び徐々に添加される無水コハク酸（１．２当量）に溶解する前に、無水ピリジン（ｘ３）から共蒸発させた。２時間撹拌後、メタノールを添加し、溶媒を減圧除去した。残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和ＫＣｌ（ｘ３）により洗浄し、及びＮａ2ＳＯ4により乾燥させた。生成物を、ジクロロメタン中のメタノールにて溶出する湿式フラッシュカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミンにより予め平衡化されたシリカ）か、あるいは適当な溶媒からの再結晶のいずれかにより精製した。
工程４
アミノヘキサノール（１当量）を、無水ピリジン及び撹拌しつつ添加されるジメチルアミノピリジン（０．１当量）に溶解した。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロライド（１．２当量）を徐々に添加し、該混合物を１６時間撹拌した後、メタノールを添加し、溶媒を減圧除去した。残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和ＫＣｌ（ｘ３）により洗浄し、及びＮａ2ＳＯ4により乾燥させた。生成物を、ジクロロメタン中のメタノールにて溶出する湿式フラッシュカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミンにより予め平衡化されたシリカ）により精製した。
工程５
工程３にて生成された生成物（１当量）を無水ジクロロメタン及び添加されるトリエチルアミン（３当量）に溶解した。工程４からの生成物にもＴＯＰＰｉｐＵ（２−（２−オキソ−１（２Ｈ）−ピリジル）−１，１，３，３−ビスペンタメチレンウロニウムテトラフルオロボレート）（１．１当量）を添加し、混合物を１８時間撹拌した。溶媒除去後、残渣を無水テトラヒドロフラン中のテトラブチルアンモニウムフルオライド（３当量）により更に６時間処理した。メタノール及びダウアーレジン（Ｐｙ）（１０当量）を添加し、１時間撹拌後に該混合物を濾過した。溶媒除去後、残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和ＫＣｌ（ｘ３）により洗浄し、及びＮａ2ＳＯ4により乾燥させた。生成物を、ジクロロメタン中のメタノールにて溶出する湿式フラッシュカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミンにより予め平衡化されたシリカ）により精製した。
工程６
工程５からの生成物（１当量）を、無水テトラヒドロフランに溶解する前に、無水テトラヒドロフランを用いて３回共蒸発させた。無水ジイソプロピルエチルアミン（４当量）をアルゴン下で撹拌しつつ添加した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（１．１当量）を滴下添加し、該混合物を２時間撹拌した。酢酸エチルを添加し、有機層を飽和ＫＣｌにて洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して油状物を得、これを１００％酢酸エチルにて溶出する湿式フラッシュカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミンにより、予め平衡化されたシリカ）により精製した。
工程３Ａ
工程３の生成物（１当量）を無水ジクロロメタンに溶解し、トリエチルアミン（３当量）を添加した。ペンタフルオロフェノール（１当量）及びＴＯＰＰｉｐＵ（１．１当量）も添加し、混合物を１８時間撹拌した。溶媒除去後、生成物を１００％酢酸エチルにて溶出する湿式フラッシュカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミンにより予め平衡化されたシリカ）により精製した。
次いで、工程６及び工程３Ａの化合物は、先に引用した方法を使用して核酸にカップリングされうる。
実施例５ 溶液中の染料−標識修飾オリゴヌクレオチドの検出
この実施例は、特徴（ｉ）に従って感度を上昇させるためにスペルミンが使用され、特徴（ii）に従って標的オリゴヌクレオチドが修飾される本発明による方法が例示される。
修飾オリゴヌクレオチドに結合された場合の使用されるＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性染料の検出可能性は、染料が、同じオリゴヌクレオチドに結合されるが、５-（３−アミノプロピル-１-イン-１-イル）-２'-デオキシウリジン残基に置換する非修飾チミジン塩基を用いた場合に観察されるよりも顕著に大きいことが見い出された。このことは、修飾アミノ基が標識ＤＮＡとＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性コロイド表面との間の相互作用を安定化し、染料がより容易の表面の残基に接近することを可能とし、これによってその検出を容易にすることを示している。
方法
硝酸銀（９９．９９９９％；Johnson Matthey）、クエン酸三ナトリウム及びスペルミン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）は、全て分析級である。２’−デオキシチミジンに代えて５-（３-アミノプロピル-１-イン-１-イル）-２'-デオキシウリジン残基を６個取り入れた１７−塩基のＤＮＡオリゴヌクレオチドは、サザンプトン大学のオズウェルＤＮＡユニットから購入した。５’−末端は、“ＨＥＸ”（P.E. Applied Biosystemsの商標）として商業的に入手可能な置換フルオレセイン染料である２，５，１’，３’，７’，９’−ヘキサクロロ−５−カルボキシフルオレセインにより置換され、該染料の結合は標準的ホスホラミダイト化学である（M H Caruthers, Science（1985）, 239, pp281-285）。
クエン酸還元銀コロイドは、下記の様に変更されたP C Lee及びD Meiselの前出文献の方法に従って調製された。全てのガラス器具は、使用前に王水（ＨＣｌ、ＨＮＯ3（３＋１ｖ／ｖ））を用いた処理、次いで石鹸溶液中での穏やかなこすり、及び蒸留水での充分な濯ぎにより厳密に清浄化した。硝酸銀試料（９０ｍｇ）を、蒸留水（５００ｍｌ、４５℃）に懸濁し、撹拌しつつ沸騰まで急速に加熱した。沸騰が始まったら直ちにクエン酸ナトリウム水溶液（１．０％、１０ｍｌ）を急速に添加し、加熱を弱め、溶液の穏やかな沸騰を撹拌しつつ９０分間維持し、その後最終体積を蒸留水にて５００ｍｌに調整した。ＳＥＲＲＳ試験のために、このコロイドの溶液（５０％ｖ／ｖ）を蒸留水中に調製した。
標識オリゴマー（１ｘ１０-8Ｍ）を含む溶液を蒸留水にて調製した。スペルミン塩酸塩の水溶液（８ｘ１０-4Ｍ、２０μｌ）を、オリゴマー（２０μｌ）と混合し、この混合物を銀コロイド溶液（１ｍｌ）の分別量に添加した。このコロイド懸濁液の分別量（４００μｌ）を、ＳＥＲＲＳ試験のためにマイクロタイタープレートに移した。
ＳＥＲＲＳスペクトルは、励起源として２５ｍＷのアルゴンイオンレーザー（５１４．５ｎｍ、１ｍＷ）を使用し、レニシャウ２０００スペクトロメーター（Renishaw Ltd, Gloucestershire）及び顕微鏡を使用して記録した。この装置は検出器として冷却された荷電結合素子を使用する。それぞれ１０秒の蓄積を１０回記録し、合わせて最終的ＳＥＲＲＳスペクトルを生成した。対照スペクトルは、ＤＮＡの存在を伴わない上記成分の懸濁物を試験することにより得た。
結果及び検討
共有的に結合された染料は、５４０ｎｍに吸収スペクトルに最大を有し、また約５６５ｎｍにに輻射スペクトルの最大を有する。
標識オリゴマーからの表面増強ラマン共鳴散乱を、５１４．５ｎｍの励起により試験した。この波長における励起は、吸収スペクトルにおける最大とおよそ一致し、また吸収バンドを生じる遷移からの顕著な共鳴増強が存在する。
試験された分別量は、染料標識オリゴヌクレオチドを、約２ｘ１０-10Ｍの濃度で含み、１０００キロカウントｓ-1の程度の強いＳＥＲＲＳシグナルが染料から観測された。スペクトルが図７に示されている。
強いＳＥＲＲＳシグナルは、４９５μｌの蒸留水に添加された５μｌのコロイド懸濁物の分別量からも得られ、これは約１ｘ１０-11Ｍに対応する。図８は得られたスペクトルを示す。
（比較）例６ ナイロン膜上の染料標識オリゴヌクレオチドの検出
この実験は、固相における非修飾オリゴヌクレオチドの検出を例示する。この発明の特徴（ｉ）−（iii）の何れもが感度向上のため使用されなかった。結果は、特徴（ｉ）及び（ii）の両者ともに使用された実施例７のものと比較されうる。
方法
クエン酸還元銀コロイドは、実施例５と同様にして調製された。４種類の共通２'-デオキシオリゴヌクレオシドを含むＨＥＸ標識プライマーは、サザンプトン大学のオズウェルＤＮＡユニットから購入した。ＳＥＲＲＳによる測定のために、ＨＥＸ標識オリゴヌクレオチドを含む溶液（１ｘ１０-8Ｍ）を、蒸留水中にて調製した。この溶液の希釈物は、染料標識オリゴヌクレオチドが１ｘ１０-9Ｍ〜１ｘ１０-18Ｍの範囲の濃度を含む溶液を生じるように蒸留水中にて調製された。
染料標識オリゴヌクレオチドの濃度範囲（１ｘ１０-8Ｍ〜１ｘ１０-18Ｍ）のものを２ｘ１μｌの体積でＨｙｂｏｎｄ−Ｎ（アマシャム）上にブロッティングした。該オリゴヌクレオチドは、ナイロン膜に対し、３６６ｎｍにて４５秒間照射を行うことにより共有的に結合した。
ＳＥＲＲＳを得るために、ポリ（Ｌ−リジン）（０．０１％、２ｘ５μｌ）を膜に添加し、２分間静置した。次いでクエン酸還元銀コロイド（２ｘ５μｌ）を膜に添加し、オリゴマーを含む領域を試験した。ＳＥＲＲＳは、上記実施例に記述したレニシャウの系を使用した。取得時間は、それぞれの場合で５秒間であった。
対照スペクトルは、ＤＮＡを含まないナイロン膜の領域を上記と同様の様式にて試験することにより得た。
結果及び検討
先行技術方法と同様に、膜を、銀コロイドに先行して本発明において好適な型のポリアミンとは異なるポリ（Ｌ−リジン）にて処理した。
ｘｙｚステージに載置され、ｘ及びｙ調節を使用してレーザービーム中に位置させたコロイド被覆膜を、ＳＥＲＲＳシグナルが実際にＨＥＸ標識からのものとなるまで走査した。ハイボンド膜の対照スペクトルを、各々の陽性スペクトルの後に得た。
得られたスペクトルを図９−１５に示す。オリゴヌクレオチド濃度は、１ｘ１０-8Ｍ（図９）；１ｘ１０-10Ｍ（図１０）；１ｘ１０-11Ｍ（図１１）；１ｘ１０-12Ｍ（図１２）；１ｘ１０-13Ｍ（図１３）；１ｘ１０-15Ｍ（図１４）及び１ｘ１０-16Ｍ（図１５）である。
陽性の結果は負荷濃度１ｘ１０-16Ｍに低下するまで得られているが、ピークの位置及びそれらの相対強度は異なるように見えた。このことは、ＨＥＸ標識が銀コロイドの表面に吸着する際に異なった配置を取っていることが原因である。我々は、単層被覆の濃度を充分に下回っており、この結果は予期されないものである。
１ｘ１０-16Ｍの図は、標識オリゴヌクレオチドの約６０分子に対応しており、僅かに半分のオリゴヌクレオチドにより飽和された膜がそれぞれの場合に試験された。
実施例７ ナイロン膜上の染料標識修飾オリゴヌクレオチドの検出
この実験においては、標的オリゴヌクレオチドが検出感度上昇のために修飾される。スペルミンが、感度を更に上昇させるために使用された。より低い濃度の標的が、実施例６において可能であったよりも信頼性を持って検出された。
方法
クエン酸還元銀コロイドは、前述のようにして調製された。２’−デオキシチミジンに代えて５-（３−アミノプロピル-１-イン-１-イル）-２'-デオキシウリジン残基を含む１７−塩基ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、サザンプトン大学のオズウェルＤＮＡユニットから購入し、５’−末端をＨＥＸにより標識した。ＳＥＲＲＳによる測定のために、ＨＥＸ標識オリゴヌクレオチドを含む溶液（１ｘ１０-8Ｍ）を、蒸留水中にて調製した。この溶液の希釈物は、染料標識オリゴヌクレオチドが１ｘ１０-9Ｍ〜１ｘ１０-18Ｍの範囲の濃度を含む溶液を生じるように蒸留水中にて調製された。
染料標識オリゴヌクレオチドの濃度範囲（１ｘ１０-8Ｍ〜１ｘ１０-18Ｍ）のものを、２ｘ１μｌの体積でＨｙｂｏｎｄ−Ｎ（アマシャム）上にブロッティングした。該オリゴヌクレオチドは、ナイロン膜に対し、３６６ｎｍにて４５秒間照射を行うことにより共有的に結合した。
ＳＥＲＲＳを得るために、スペルミン塩酸塩（８ｘ１０-4Ｍ、２ｘ５μｌ）を膜に添加した。次いでクエン酸還元銀コロイド（２ｘ５μｌ）を直ちに膜に添加し、オリゴヌクレオチドを含む領域を試験した。ＳＥＲＲＳは、上記実施例に記述したレニシャウの系を使用した。取得時間は、それぞれの場合で５秒間であった。
対照スペクトルは、ＤＮＡを含まないナイロン膜の領域を上記と同様の様式にて試験することにより得た。
結果及び検討
染料標識オリゴヌクレオチドのコロイド表面への吸着、及び強いＳＥＲＲＳシグナルのために要求される安定なコロイド凝集の形成を促進するために、銀コロイドに先行して膜をスペルミン塩酸塩にて処理した。
ｘｙｚステージに載置され、ｘ及びｙ調節を使用してレーザービーム中に位置させたコロイド被覆膜を、散乱輻射が妥当なＳＥＲＲＳシグナルを示すまで走査した。ＳＥＲＲＳシグナルが実際にＨＥＸ標識からのものであることを確認するために、ハイボンド膜の対照スペクトルを、各々の陽性スペクトルの後に得た。
得られたスペクトルを図１６−２２に示す。オリゴヌクレオチド濃度は、１ｘ１０-7Ｍ（図１６）；１ｘ１０-8Ｍ（図１７）；１ｘ１０-9Ｍ（図１８）；１ｘ１０-13Ｍ（図１９）；１ｘ１０-14Ｍ（図２０）；１ｘ１０-15Ｍ（図２１）及び１ｘ１０-17Ｍ（図２２）である。
陽性の結果は濃度１ｘ１０-17Ｍに低下するまで得られているが、これは染料標識オリゴヌクレオチドの約６分子に対応している（僅かに半分のオリゴヌクレオチドにより飽和された膜がそれぞれの場合に試験された）。スペクトル的な質も、実施例６よりも顕著な改善を示す。１ｘ１０-8Ｍの濃度を負荷された膜について得られたスペクトルは、実施例６において得たものと同じであるが、しかしながらこの濃度を一旦超えると、スペクトルが変化する。相対的強度及びピーク位置は、１ｘ１０-9Ｍから１ｘ１０-17Ｍまでの各スペクトルと同様に維持され、このことはＨＥＸに矛盾しない検出を示している。
この方法は、実施例６よりも検出の低い限界まで下ったスペクトルの質の改善を与え、如かして極めて少量の核酸の正確かつ信頼性ある分析を容易にする。
実施例８ 修飾オリゴヌクレオチドの検出感度
実施例５及び７に基づいて、次の計算が、本発明の方法を使用して検出され得る標的分子の実際の個数について行われた。
溶液相（実施例５）
試験された標識オリゴマーの分別量は、約２００ｘ１０-15モルの染料（ＨＥＸ）標識修飾オリゴマーを含んでいた。１０００キロカウントｓ-1の程度の強いＳＥＲＲＳシグナルが、染料から観測された。強いシグナルは、４９５μｌの蒸留水に添加されたコロイド懸濁物の５μｌの分別量からも得られ、この溶液は約１０ｘ１０-15モルのオリゴマーに対応していた。
これらのモル数の分子数への転換は、下記の数字を与える：
２００ｘ１０-15モルは１．２ｘ１０11分子に等しい。
１０ｘ１０-15モルは２ｘｌ０9分子に等しい。
任意の時点においてレーザービームにより実際に試験された溶液の体積（３．９３ｘ１０-16ｍ3、３９３フェムトリットル）を考慮すると、下記の仮定的数が計算される：
２００ｘ１０-15モルは検出される平均９４．５分子に等しい。
１０ｘ１０-15モルは検出される平均４．７分子に等しい。
固相（実施例７）
１ｘ１０-8Ｍの濃度を使用して固相にて得られるスペクトルは、同じ濃度について溶液相にて得られるものに等しい。この濃度より後では、スペクトルはより多くのピークを持つものに変化する。このことは、染料が凝集コロイドの表面に相対的にある配置を取ることを強いられる為であると考えられる。この研究と、ポリ（Ｌ−リジン）を使用して行われたものとの主な差異は、引き続くスペクトルが１ｘ１０-17Ｍの濃度に至るまでピーク位置及び相対強度においてほとんど同じであることである。この濃度は、調査される面積中の約６分子に相当する。
実施例７において使用されたスペルミンは、ポリ（Ｌ−リジン）（実施例６にて使用）よりも大きい程度で凝集コロイドの大きさ調整するものと思われる。このことは、スペルミンを使用した場合にスペクトルのより大きい再現性を与えるものと考えられる。
実施例９ アッセイ及び配列決定技術の態様例
以下の態様例は、本発明の方法が、アッセイ及び配列決定技術においてどの様に使用され、多くの場合において既存の技術を改良するかを例示する。それぞれの場合において、ＤＮＡ及びＲＮＡが標的核酸として述べられるが、他の核酸の型も同じかまたは類似する方法で処理され得る。
サザンブロッティング
１．常法によりＤＮＡの調製、制限消化物、電気泳動及びブロットを調製。
２．染料−標識オリゴヌクレオチドプローブ（または複数プローブ）とハイブリッド形成；プローブはアミノプロパルギルまたは他の手段にて電荷を修飾されていてもよい。
３．予め決定された至適厳密度にて洗浄（リン酸塩にて洗浄して塩素の持ち越しを最少とする）。
４．スペルミンに浸漬
５．還元銀コロイドに浸漬。
６．全てのフィルターに亘ってスペクトルを得る。
７．データの分析にソフトウエアを使用し、種々の染料からの混合スペクトルを解読。
感染性疾患の検出
１．好ましい方法により細胞を溶解−標的がＤＮＡの場合、変性工程を含む。
２．ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性染料標識プローブ（類）を、選択する標的（ＲＮＡまたはＤＮＡ）とハイブリッド。
３．多くの方法の一つ、例えば、プローブ標的と同じ鎖上のオリゴマーのビオチン捕捉によるハイブリッド材料の捕捉。
４．過剰のプローブ及び標的の洗浄除去。
５．スペルミン、次いでコロイドの添加。
６．スペクトルの収集
７．最終的に、種または属は、プローブの選択及び数種の染料のスペクトルの解読により識別される。
（プローブハイブリッド形成と引き続く捕捉に代えて、ゲノムの変化については、伸長、放出及び捕捉に基づく様式も可能である。）
ゲノム変化
１．変性ゲノム標的の調製（アルカリ煮沸が良好）
２．染料標識プライマーの３’−末端における合致または非合致部分とのハイブリッド形成。
３．伸長（または３’の一致状況に依存して起こらず）
４．新たに伸長された材料を、加熱若しくはアルカリ変性または鎖転移により放出）
５．放出された鎖を、固定化されたかまたは固定化されうるオリゴマーにて捕捉。
６．過剰の非取り込みプライマーの洗浄除去（捕捉表面において、消滅波検出が行われた場合には必要ではないであろう）。
７．スペルミン及びコロイドを用いて、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ効果を展開。
８，通常にスペクトルを得る。
配列決定
様式Ａ
１．テンプレート（またはゲノム）の調製。
２．配列決定プライマーをハイブリッド（それぞれ異なる染料がプライマーに結合した４種の並行する試験管）。
３．ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びｄｄＮＴＰを用いて鎖停止反応の実施。
４．４種全ての反応物をプールし、ゲル上で分離。
５．膜に転送−ブロッティングまたは移動膜上への溶出。
６．スペルミン及びコロイドに浸漬。
７．ＳＥ（Ｒ）ＲＳスペクトルの収集及び配列の再組立。
様式Ｂ
１．テンプレート（またはゲノム）の調製。
２．非標識プライマーのアニール化。
３．ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びｄｄＮＴＰを用いて鎖停止反応の実施。
４．生成物の配列決定ゲル上での分離；上記のように転送及び展開。
様式Ｃ
１．プライマー上またはｄｄＮＴＰ上に標識を持たない鎖停止配列決定反応の実施（停止塩基当たりに１本の試験管）。
２．生成物のポリアクリルアミドゲル上での分離（テンプレート当たりに４個のウエル）。
３．膜の試験のための、伸長生成物の内部部分、好ましくはプライマー自体に極めて近接した部分に相補的な染料標識オリゴマーの使用。
４．ハイブリッド形成及び洗浄後、スペルミン、コロイド及び分光法を用いてＳＥＲＲＳシグナルを展開。
配列決定生成物が膜に移送される上記方法に加えて、ゲルプレートの一方または他方が粗面化したＳＥ（Ｒ）ＲＳ−活性表面を有してなる場合には、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ−染料標識物質をゲル中にて直接に検出することが可能である。しかしながら、これに磯つかの未解決の課題が伴われ；概評面が至適感受性をもつ検出の為に完全に好適ではないこともあり；核酸上の正味の電荷を中和するためにスペルミンが使用されず；また、標識標的分子の僅かに小部分が銀表面に近接し得る。
様式Ａの変法は、処理能力改善のための多重化を用いる。染料−標識プライマー類の幅を持つものは、異なるゲノム領域の配列決定に使用されるであろう。このため工程２において、各試験管は、異なる領域を配列決定するべく設計された２種以上（５または１０までの）異なった標識を持つプライマーを有しうる。各々１０種までの異なった染料を持った４つの別個の反応を操作し（合計で４０種の染料）、４本の試験管の内容物をプールし、前述のように分離及び解読し得る。ＳＥ（Ｒ）ＲＳ分光法の大きな柔軟性及び利用可能な識別できるスペクトルを持った染料の夥しい品揃いの為、４０種の好適な着色剤は入手可能であり、複雑ではあるが得られたシグナルの解読は達成可能であろう。
この多重性の優位性を採ると、配列決定作業の処理能力は大きく向上させ得る。配列決定反応の標的を一つの特定の領域に限定する理由はなく、十分利用可能なテンプレートの調製方法があれば、それらは広範囲に分散させ得る。
【図１】
0004071278.tif 000016
【図２】
0004071278.tif 000017
【図３】
0004071278.tif 000018
【図４】
0004071278.tif 000019
【図５】
0004071278.tif 000020
【図６】
0004071278.tif 000021
【図７】
0004071278.tif 000022
【図８】
0004071278.tif 000023
【図９】
0004071278.tif 000024
【図１０】
0004071278.tif 000025
【図１１】
0004071278.tif 000026
【図１２】
0004071278.tif 000027
【図１３】
0004071278.tif 000028
【図１４】
0004071278.tif 000029
【図１５】
0004071278.tif 000030
【図１６】
0004071278.tif 000031
【図１７】
0004071278.tif 000032
【図１８】
0004071278.tif 000033
【図１９】
0004071278.tif 000034
【図２０】
0004071278.tif 000035
【図２１】
0004071278.tif 000036
【図２２】
0004071278.tif 000037