(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カカオ豆の圧搾物及び／またはカカオ豆の外皮にヘキサンを加えて抽出後の抽出残渣を更に熱水抽出した抽出残渣物に、０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で抽出して得られる抽出液を、酢酸でｐＨ５．０に調整後、得られた沈殿物を水に溶解し、透析後乾燥して得られる抽出物を有効成分とすることを特徴とする癌転移抑制剤。
【請求項２】
カカオ豆の圧搾物及び／またはカカオ豆の外皮にヘキサンを加えて抽出後の抽出残渣を更に熱水抽出した抽出残渣物に、０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で抽出して得られる抽出液を、酢酸でｐＨ５．０に調整後、得られた濾液にエタノールを加えて得られた沈殿物を水に溶解し、透析後乾燥して得られる抽出物を有効成分とすることを特徴とする癌転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カカオ豆の圧搾物及び／またはカカオ豆の外皮にヘキサンを加えて抽出後の抽出残渣を更に熱水抽出した抽出残渣物に、０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で抽出して得られる抽出液を、酢酸でｐＨ５．０に調整後、得られた沈殿物を水に溶解し、透析後乾燥して得られる抽出物を有効成分とする癌転移抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌、虚血性心疾患、腎不全等の疾患は、生体内で生じるラジカルが関与することが解明され、強いラジカル消去作用を持つ植物ポリフェノールには、これらの疾病に対する予防効果があることが明らかにされつつある。例えば、茶や赤ワインに含まれているポリフェノールには、発癌抑制作用があることが既に知られている。
【０００３】
チョコレートやココア等の原料として使用されているカカオ豆にもポリフェノールが含まれており、このポリフェノールを有効成分とする先行技術としては、特開平９−２２４６０６号公報にカカオ豆からエタノールで抽出して得られる発癌予防物質を含有する健康飲食品が開示されている。
【０００４】
しかしながら、カカオ豆等のポリフェノールによる予防効果は、癌の発生を抑制する発癌予防を目的としたものであり、既に生じた癌細胞の転移を抑制することにより癌が拡大、進行するのを防ぐものではなく、既に癌に罹患した患者を対象とするものではない。
【０００５】
また、特開平３−２０５４０２号公報及び特開平４−１３６８４号公報には、松かさ、茶、草みづき、三豆根等から得られる新規なリグニン配糖体が癌遺伝子の発現を特異的に抑制することが記載されており、癌治療剤としての用途が開示さている。詳しくは、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）遺伝子を導入したマウス乳癌細胞において、ＭＭＴＶ遺伝子の発現がクロマチンタンパク質における脱ポリＡＤＰ−リボース反応が引き金になって起こるところから、この反応に関与するポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼを上記リグニン配糖体で阻害することによって、癌遺伝子の発現を抑制し癌治療剤として使用するものである。
【０００６】
しかしながら、松かさ、茶、草みづき、三豆根等から得られるリグニン配糖体によるポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼ阻害は、癌遺伝子の発現の段階を抑制するものであって、癌転移を抑制するものではなく、また、松かさや茶等を原料として熱水、エタノール、アセトン等の溶媒で処理した抽出残渣物をアルカリ抽出、エタノール沈殿、ゲル濾過により調製されるので、原料を得ることが困難であったり、リグニン配糖体の含量が低い等の問題点があった。
【０００７】
その他、癌の治療法としては、一般に外科的治療、放射線療法、化学療法（薬剤投与）等が実施されている。これらの中で化学療法は、従来から直接癌細胞を死滅させる薬剤を投与する治療法が広く適用されており、この化学療法に使用する抗癌剤に関する提案も多い。しかしながら、抗癌剤による治療では、抗癌剤が癌細胞のみならず正常細胞にも作用するため、副作用が非常に強いという欠点がある。さらに、抗癌剤は毒性が強いために、高用量や長期の反復投与に限界があり、化学療法による従来の治療法では癌の転移、再発の抑制や延命等の点で十分な効果が期待できないのが現状である。
【０００８】
したがって、癌治療において、癌転移を阻止し、長期投与が可能で、かつ優れた治療効果を有する薬剤や治療法の期待は大きい。
【０００９】
癌の転移の分子メカニズムは以下の過程を経ると考えられている。（１）転移能をもった癌細胞が腫瘍塊の中から離脱し、（２）間質組織の中を移動し、（３）血管の基底膜へ接着する。（４）接着した癌細胞は基底膜を分解、破壊し、さらに血管内腔へ侵入する。（浸潤という）（５）さらに、癌細胞は血管内を移動して標的臓器の血管内皮細胞に選択的に接着する。（６）接着した癌細胞は、その血管の基底膜を分解し、破壊し、さらに標的臓器内へ移動する。（７）そして、新しい環境下で生着、増殖し、さらに新たな転移巣を形成する（日本臨床５３巻７号、１５７１〜１５７７頁［１９９５年］）。
【００１０】
したがって、癌転移を抑制するためには上記したいずれかの過程を抑制すればよく、癌の治療法の一つとして重要である。これまでに知られている癌転移抑制物質としては、▲１▼血管新生阻害物質（アンジオスタチン、インターフェロンα、トロンボスポンジン、血小板第４因子、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリサルフェート等）▲２▼細胞接着阻害物質（ＲＧＤＳ関連ペプチド、ＹＩＧＳＲ関連ペプチド、ＳＣＭキチン、ノジリマイシン、ツニカマイシン等）▲３▼血小板凝集阻害物質（シカプロスト、インドメタシン、アンチスタシン等）▲４▼シグナル伝達阻害物質及び運動能制御物質（カルボキシアミド−トリアゾール、ＭＤＬ−２７０３２、べラパミル、ジルチアゼム等）▲５▼細胞外マトリックス分解酵素阻害物質（バチマスタット、ＦＯＹ−３０５、レチノイド、インターフェロンβ等）▲６▼免疫療法剤（ＣＧＰ−１９８３５Ａ、ＢＣＧ、ＯＫ−４３２等）等が報告されている（ファルマシア３１巻１０号、１１３２〜１１３７頁［１９９５年］）が、この癌の転移抑制を目的とした薬物は一部の癌のみを対象（インターフェロン−αはカポジ肉腫、スラミンは前立腺癌[癌化学療法ハンドブック第３版、古江尚ら、９５〜９６頁、（株）メディカル・サイエンス・インターナショナル]）として臨床応用が認められているのが現状である。
【００１１】
また、最近、癌細胞の転移を阻害する薬物がいくつか臨床治験段階にあがってきている。そのひとつに、癌細胞の浸潤過程において重要となる細胞外マトリックス分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼを阻害することで転移を抑制するマリマスタットがある（ファルマシア３４巻１０号、９９５〜９９７頁[１９９８]）。しかしながら、この薬剤には、重篤ではないが関節痛、筋肉痛や消化器系の副作用が認められている。
【００１２】
さらに、癌転移抑制においては、先に示したように血管新生阻害も重要であり、最近では腫瘍細胞中に見出された内在性の血管新生抑制因子であるプラスミノーゲンやコラーゲンの断片化ペプチドであるアンジオスタチンやエンドスタチンが注目されている（化学と生物３７巻５号、３０６〜３１１頁[１９９９]）。
【００１３】
さらにまた、研究段階のものとして、癌転移抑制剤としてフィブロネクチン分子のペプチド誘導体があるが、浸潤を抑制するのにかなり高濃度を必要としている。
【００１４】
このように、従来技術においては、癌転移抑制剤として十分な作用を有し、かつ十分な安全性を有する物質は見出されておらず、また臨床において用いられている薬剤は少ない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、副作用がなく安全であり、優れた癌転移抑制効果を有する癌転移抑制剤及びこれを含有する飲食品を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、カカオ豆及び／またはカカオ豆の外皮からアルカリ性水溶液で抽出して得られる抽出物、或いはカカオ豆及び／またはカカオ豆の外皮に水または有機溶剤を加えて抽出した後の抽出残渣物から、アルカリ性水溶液で抽出して得られる抽出物であれば、副作用がなく安全であり、優れた癌転移抑制効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち本発明は、カカオ豆及び／またはカカオ豆の外皮からアルカリ性水溶液で抽出して得られる癌転移抑制剤及びこれを含有する飲食品である。
【００１８】
また、好ましい態様として、上記抽出物をｐＨが４〜６の弱酸性の範囲にして得られる沈殿物、或いは上記抽出物からｐＨが４〜６の弱酸性の範囲にして得られる沈殿物を除去せしめた後、該抽出物に有機溶剤を添加して生成する沈殿物を有効成分とすることで、極めて効果的に癌の転移を抑制することができる。
【００１９】
したがって、本発明の有効成分は、先行技術として特開平９−２４６０６号公報に記載されているカカオ豆のエタノール可溶性の抽出成分とは異なるものである。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の有効成分であるカカオ豆及び／またはカカオ豆の外皮からアルカリ性水溶液で抽出して得られる抽出物は、アオギリ科の小高木であるカカオ（Theobroma Cacao L．）の豆の胚乳（カカオニブ）及び／またはその外皮（カカオハスク）を原料として、これにアルカリ性水溶液、例えば０．１〜１Ｎの水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等で１〜１５時間抽出する。
【００２１】
或いは、カカオ豆またはカカオ豆外皮を最初に水や熱水またはエタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、ヘキサン等の有機溶剤、もしくはこれらの混合溶媒で抽出し、その抽出残渣より上記のアルカリ性水溶液によって抽出してもよい。なお、最初の水、熱水または有機溶剤の抽出処理は、別種の溶剤で繰り返し抽出することも可能である。
【００２２】
さらに、本発明においては、好ましくは上記アルカリ性水溶液抽出物を酢酸、塩酸等によってｐＨを４〜６の弱酸性の範囲に調整し、約３０分から一昼夜静置後に得られる沈殿物を有効成分として用いると効果的である。また、弱酸性の範囲に調整しても溶解している成分に対しては、有機溶剤を添加して４時間から一昼夜静置して生じる沈殿を使用することも可能である。この場合に使用する有機溶剤としては、アルコール類、アセトン類、或いはこれらの含水物を使用することができるが、好ましくは５０％以上の濃度になるようにエタノールを添加することが最適である。
【００２３】
なお、本発明においては、原料としてカカオ豆またはカカオ豆の外皮いずれかを必要に応じて選択して使用してもよいが、それらを適宜混合して使用することも可能である。
【００２４】
本発明のカカオ豆及び／またはその外皮のアルカリ抽出物を有効成分とする癌転移抑制剤は、癌の転移抑制作用を有するので、各種癌、例えば、悪性黒色腫、子宮癌、食道癌、皮膚癌、胃癌、肺癌、小腸・大腸癌、膵臓癌、乳癌、膀胱癌、絨毛性腫瘍、リンパ肉腫、白血病等の悪性腫瘍の転移抑制剤として使用することができる。
【００２５】
また、本発明の癌転移抑制剤は、ヒトを含む哺乳動物（ヒト、ウマ、イヌ、ウシ、ブタ等）等に対して投与することが可能であり、その有効成分の投与量としては、患者の年齢、体重及び処理すべき病状の重度や治療に対する反応、投与方法及び投与回数により変わりうるが、例えば、経口投与の場合には、通常０．３〜３０ｍｇ／ｋｇ体重程度を１日１回または数回にわたって投与する。０．３ｍｇ／ｋｇより低い濃度の使用では、効果が不十分である場合がある。
【００２６】
さらに、本発明の癌転移抑制剤は、上記本発明の有効成分と製薬上許容されるキャリア等の製剤用の添加剤とを混合して医薬製剤の形で、経口的、非経口的（経静脈的、経直腸的等）に投与することができる。その剤型としては、錠剤、カプセル剤、散剤、坐剤、液剤、直腸軟膏、注射剤等が例示されるが、必ずしもこれらの剤型に限るものでない。
【００２７】
本発明における有効成分の上記医薬製剤中の含有量としては、その形態並びに容量等により一概に規定することは困難であるが、好ましくは１〜９０重量％である。
【００２８】
本発明で使用するカカオ豆またはカカオ豆の外皮は、天然物で豊富にあり、また簡単に採取することができることから、本発明の癌転移抑制剤は、マリマスタットのように合成する工程が複雑であったり、アンジオスタチン、エンドスタチンのような遺伝子組み換え操作が必要になることはなく、生産における手間とコストがかからず安価に製造することができ実用的である。さらに、カカオ豆またはその外皮は食品として使用されているものであり、本発明の有効成分は毒性がなく安全である。
【００２９】
以下に、本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３０】
【実施例】
〔実施例１〕カカオ豆とカカオ豆の外皮からの癌転移抑制剤の調製
カカオ豆（カカオニブ）の圧搾物（カカオマス）またはカカオ豆の外皮（カカオハスク）各３００ｇにヘキサン２．５ｌを加えて、一昼夜攪拌後濾過した。その残渣にヘキサン２．５ｌを加えて再度一昼夜攪拌した。それを濾過し、脱脂物をそれぞれ１３３ｇ、２７０ｇ得た。その脱脂物各２５ｇに熱水２５０ｍｌを加え１ｈｒ煮沸した。それを遠心分離（１０，０００ｇ×２０ｍｉｎ）し、残渣を同様に熱水で抽出した。得られた熱水抽出残渣に０．３Ｎの水酸化ナトリウム溶液２５０ｍｌを加え、一昼夜抽出した。それを遠心分離（１０，０００ｇ×２０ｍｉｎ）し、得られた抽出液を酢酸でｐＨ５．０に調整し、４℃で一昼夜静置した。それを遠心分離（１０，０００ｇ×２０ｍｉｎ）し、得られた沈殿を水に溶解し、一昼夜透析後凍結乾燥し、カカオ豆及びカカオ豆の外皮由来の抽出物であるカカオマスＰ１画分、カカオハスクＰ１画分をそれぞれ１．４ｇ、０．８ｇ得た。また、上記酢酸でｐＨ５．０に調整し、４℃で一昼夜静置後遠心分離を行った濾液については、同量のエタノールを加え、４℃で一昼夜静置した。これを遠心分離（１０，０００ｇ×２０ｍｉｎ）し、得られた沈殿を水に溶解し、透析及び凍結乾燥し、カカオ豆及びカカオ豆の外皮由来の抽出物であるカカオマスＰ２画分、カカオハスクＰ２画分をそれぞれ０．６１ｇ、０．７４ｇ得た。
【００３１】
〔実施例２〕癌浸潤抑制効果試験
１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養維持しているヒト膵癌細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ−２（高浸潤能を示す）をトリプシン−ＥＤＴＡで回収し、洗浄後、１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、浸潤能測定系に供した。
【００３２】
浸潤能測定は二重構造の９６穴ケモタキシスチャンバーを用いた。ポアサイズ８μｍのポリカーボネートフィルターにヒト血漿由来フィブロネクチンをコートし風乾後、さらに細胞外マトリックスの構成成分からなるマトリゲルを重層した。ケモタキシスチャンバーの下層には１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地を注入し、その上に先のポリカーボネートフィルターを装着して、約２時間、３７℃でフィブロネクチンを膨潤させた。その後、上層に１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁したＭＩＡ ＰａＣａ−２を細胞数１×１０５播種し、マトリゲル上で均一となるようにケモタキシスチャンバーを軽く振った。カカオマスＰ１、Ｐ２画分またはカカオハスクＰ１、Ｐ２画分をＦＣＳを含まないＤＭＥＭ培地で６０℃、１５分間加温し、溶解後、各最終濃度となるように上層の細胞に添加した。そのケモタキシスチャンバーを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュべートした。
【００３３】
ポリカーボネートフィルター下面に浸潤した細胞はメタノールで固定し、ヘマトキシリン‐エオジン染色後、顕微鏡下で細胞数を計測した。浸潤細胞数は倍率４００倍で１０視野を計測し、１視野あたりの平均細胞数で表した。
【００３４】
図１にカカオマスＰ１画分のＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞浸潤能抑制効果を示した。カカオマスＰ１画分は濃度依存的に抑制し、３０μｇ／ｍｌで有意な抑制効果が見られた。図２にカカオマスＰ２画分の結果を示した。カカオマスＰ１画分より効果は弱いが、濃度依存的に抑制し、１００μg/mlで有意な抑制効果を示した。図３にカカオハスクＰ１画分の結果を示した。カカオマスＰ１画分同様に、濃度依存的に抑制し、３０μg/mlで有意な抑制効果があった。図４にカカオハスクＰ２画分の結果を示した。カカオハスクＰ１画分より効果は弱いが、濃度依存的に抑制し、１００μｇ／ｍｌで有意な抑制効果を示した。
【００３５】
〔実施例３〕錠剤
0004124952.tif 000002
【００３６】
（１）から（４）までを均一に混合した後に、（５）を添加してさらに混合し、その混合末を打錠して、１錠２００ｍｇの錠剤とした。この錠剤は、必要に応じて、通常用いられる胃溶性フィルムコーティング剤（例えば、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート）または食用性着色剤でコーティングすることも可能である。
【００３７】
〔実施例４〕カプセル剤
（１）実施例１のカカオハスクＰ１画分          １０００ｇ
（２）乳糖                                      ９６０ｇ
（３）ステアリン酸マグネシウム                    ４０ｇ
【００３８】
上記成分を均一に混合し、その混合粉末をハードゼラチンカプセルに２００ｍｇずつ充填した。
【００３９】
〔実施例５〕注射剤
（１）実施例１のカカオハスクＰ１画分            １００ｍｇ
（２）ブドウ糖                                  １００ｍｇ
（３）注射用水                              全量で１０ｍｌ
【００４０】
（１）と（２）を（３）に溶解した液をメンブランフィルターで濾過後、再び除菌濾過を行い、その濾過液を無菌的にバイアルに分注し、窒素ガスを充填し密封して静脈内注射剤とした。
【００４１】
〔実施例６〕シロップ剤
（１）実施例１のカカオハスクＰ１画分              ５０ｇ
（２）単シロップ                                １００ｍｌ
（３）精製水                              全量で３００ｍｌ
【００４２】
（１）を（３）で完全に溶解し、（２）を加えて混合し、シロップ剤とした。
【００４３】
〔実施例７〕坐剤
（１）実施例１のカカオハスクＰ１画分                ２ｇ
（２）ウイテプゾール                            ２００ｇ
【００４４】
（２）を１２０℃、３０分加熱し、室温で５０〜６０℃まで冷却し、これに（１）を加えて十分に混和して均一とし、坐剤型に注入、放冷、固化して１００個の坐剤とした。
【００４５】
〔実施例８〕錠剤
0004124952.tif 000003
【００４６】
実施例３と同様に調製し、錠剤とした。
【００４７】
〔実施例９〕カプセル剤
（１）実施例１のカカオハスクＰ２画分          １０００ｇ
（２）乳糖                                      ９６０ｇ
（３）ステアリン酸マグネシウム                    ４０ｇ
【００４８】
実施例４と同様に調製し、カプセル剤とした。
【００４９】
〔実施例１０〕チューインガム
ガムベース５００ｇ、砂糖１．２ｋｇ、水飴２００ｇ、軟化剤２０ｇ、色素２０ｇ、酸味料２０ｇ、香料２０ｇ、及び実施例１のカカオハスクＰ１画分２０ｇを練り合わせ、常法によりチューインガムを製造した。テクスチャー、風味ともに良好で、癌転移抑制用として日常的に摂取し得るチューインガムであった。
【００５０】
〔実施例１１〕チョコレート
カカオマス３．５ｋｇ、カカオバター１．５ｋｇ、全脂粉乳０．４ｋｇ、砂糖４．５ｋｇ、及び実施例１のカカオハスクＰ１画分０．１ｋｇを混合機に入れ、３８〜４３℃で３０分混合後、リファイナーに移し、３５〜３６℃で粒子が４０μ以下になるように均一に微細化した。次いでコンチングマシンに移して、約６０℃に加温しながら４０時間攪拌混和し、コンチング終了直前に乳化剤としてレシチン５０ｇと若干の香料を加えて均質化した後、２７〜３２℃でテンパリングを行なった。これを所定のモールドに入れ、冷却固化させてチョコレートを製造した。風味が良好で、癌転移抑制用として日常的に摂取し得るチョコレートであった。
【００５１】
〔実施例１２〕キャラメル
砂糖１５０ｇ、水飴１５０ｇ、練乳６０ｇ、小麦粉１８．８ｇを混合し１２０℃まで煮詰めて後、実施例１の方法で得られたカカオハスクＰ２画分２．０ｇ、バター２．２ｇ、カカオバター１．６ｇ、椰子油２．２ｇ、香料１ｇを加えて攪拌後、冷却、成形してキャラメルを製造した。口溶け、風味ともに良好で、癌転移抑制用として日常的に摂取し得るキャラメルであった。
【００５２】
〔実施例１３〕ウーロン茶
定法により製造したウーロン茶１リットルに実施例１で得られたカカオマスＰ２画分１ｇを添加し、癌転移抑制用のウーロン茶飲料を製造した。風味が良好で、癌転移抑制用として日常的に摂取し得るウーロン茶飲料であった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明の有効成分であるカカオ豆及び／またはカカオ豆の外皮からアルカリ性水溶液で抽出して得られる抽出物は、副作用がなく安全であり、優れた癌浸潤抑制効果を有するので、癌転移抑制剤として各種癌の転移予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の癌転移抑制剤であるカカオマスＰ１画分による癌浸潤抑制効果を示したグラフである。
【図２】本発明の癌転移抑制剤であるカカオマスＰ２画分による癌浸潤抑制効果を示したグラフである。
【図３】本発明の癌転移抑制剤であるカカオハスクＰ１画分による癌浸潤抑制効果を示したグラフである。
【図４】本発明の癌転移抑制剤であるカカオハスクＰ２画分による癌浸潤抑制効果を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
0004124952.tif 000007