(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イグサ品種「ひのみどり」を、「ひのみどり」と、「岡山３号」、「いそなみ」、「岡山みどり」、「せとなみ」、「筑後みどり」、「ふくなみ」、「あさなぎ」、「きよなみ」、「しらぬい」、「くまがわ」、または「さざなみ」との中から識別するための方法であって、該方法は、
各種イグサのゲノムＤＮＡを鋳型に塩基配列５’−ＣＣＣＧＡＡＧＣＧＡ−３’からなるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅ＤＮＡ産物を得る工程；および
該増幅ＤＮＡ産物を電気泳動する工程；
を包含し、ここで該電気泳動において、該「ひのみどり」が特異的にバンドを消失しており、該特異的なバンドは、サイズマーカーλＨｉｎｄＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた場合、３ｋｂｐのサイズのバンドに相当する、方法。
【請求項２】
イグサ品種「ひのみどり」を、「ひのみどり」と、「岡山３号」、「いそなみ」、「岡山みどり」、「せとなみ」、「筑後みどり」、「ふくなみ」、「あさなぎ」、「きよなみ」、「しらぬい」、「くまがわ」、または「さざなみ」との中から識別するためのプライマーであって、
塩基配列５’−ＣＣＣＧＡＡＧＣＧＡ−３’
からなるプライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、最も優良な品質を有し、産業価値の高いイグサ品種「ひのみどり」と他の品種とを識別することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
イグサは、イグサ科に属する工芸作物であり、畳表、花筵、ござ、編み笠、草履などに用いられる。イグサは、日本を始め、韓国、中国、台湾などで栽培されている。以下に説明するように、イグサには種々の栽培品種が存在する。なお、本明細書においては、イグサ品種の名称を括弧（「  」）内に示して表している（例えば、「ひのみどり」）。
【０００３】
従来、イグサの品種特性は草丈、茎の太さ、茎の色、着花の頻度、先端枯れの頻度など産業上の品質に関わる特徴で表されてきた。しかし、これらの特性は量的形質であって、生育環境の変化に応じてそれらの形質も変化するため、一定の栽培環境における品種の特徴を説明することはできても、確実に品種を識別するマーカーとしては利用できなかった。このため、いったん入手経路が不確実になると、どの品種であるのか断定することは困難であった。その結果、いくつかの品種が混ざって製品の均一性が失われたり、あるいは優良品種の盗難、不法栽培を防止・規制することができなかった。
【０００４】
近年、分子生物学的技術によってイグサ品種識別のための分子遺伝マーカーの探索が行われてきた。しかし、イグサのゲノム研究がほとんど進んでいないこともあり、品種識別マーカーは全く見つかっていなかった。このため、イグサの品種を識別することは極めて困難であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、ゲノムＤＮＡの中で品種特異的に存在するか、または存在しないＤＮＡ断片を特定し、イグサの品種を識別するための手段を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、各種イグサのゲノムＤＮＡを鋳型に、ある種のランダムプライマーを用いて、そのプライマー間のゲノム領域をＰＣＲ増幅させて安定的に検出されるＤＮＡ断片のうちに、「ひのみどり」で特異的に消失するＤＮＡ断片があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、「ひのみどり」を識別する方法を提供する。この方法は、各種イグサのゲノムを鋳型に塩基配列５’−ＣＣＣＧＡＡＧＣＧＡ−３’からなるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅ＤＮＡ産物を得る工程、および該増幅ＤＮＡ産物を電気泳動する工程を包含する。上記電気泳動において、上記「ひのみどり」が特異的にバンドを消失している。
【０００８】
１つの実施形態では、上記の特異的なバンドは、サイズマーカーλＨｉｎｄＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの３．２５ｋｂｐと２．８５ｋｂｐとの間の位置で消失している。
【０００９】
１つの実施形態では、上記特異的なバンドは、サイズマーカーλＨｉｎｄＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた場合、３ｋｂｐのサイズのバンドに相当する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、ゲノムＤＮＡの中で「ひのみどり」に対して特異的に存在しないＤＮＡ断片を特定し、本品種を正確に識別するための手段を提供する。より詳細には、本発明は、各種イグサのゲノムＤＮＡを鋳型に、ある種のランダムプライマーを用いて、そのプライマー間のゲノム領域をＰＣＲ増幅させて安定的に検出されるＤＮＡ断片のうち、特定のＤＮＡ断片が「ひのみどり」で特異的に消失することにより、「ひのみどり」を識別する方法を提供する。
【００１１】
本発明の方法は、各種イグサのゲノムＤＮＡを鋳型に塩基配列５’−ＣＣＣＧＡＡＧＣＧＡ−３’からなるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅ＤＮＡ産物を得る工程；および該増幅ＤＮＡ産物を電気泳動する工程を包含する。
【００１２】
イグサの主要な栽培品種としては、「ひのみどり」以外に、「岡山３号」、「いそなみ」、「岡山みどり」、「せとなみ」、「筑後みどり」、「ふくなみ」、「あさなぎ」、「きよなみ」、「しらぬい」、「くまがわ」、および「さざなみ」が挙げられる。
【００１３】
イグサのゲノムＤＮＡは、当業者に慣用の手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙなどの実験書に記載される方法）を用いて調製することができる。これらイグサ品種のゲノムＤＮＡは、生育時期に関わらず、枯れていない、健康な茎から調製され得る。このような植物組織からのＤＮＡの抽出においては、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）を抽出バッファーとして使用する方法（ＣＴＡＢ法とも称する）が好適に使用され得る。このようなプロトコルとしては、例えば、ＲｏｇｅｒｓｏｙおよびＢｅｎｄｉｃｈ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ａ６：１−１０（１９８８）；および植物バイオテクノロジー実験マニュアル  クローニングとシークエンス、第２５２〜２５６頁、１９８９年６月１５日発行、株式会社農村文化社出版に記載のようなプロトコルが挙げられる。
【００１４】
本発明の方法においては、塩基配列５’−ＣＣＣＧＡＡＧＣＧＡ−３’からなるプライマーが使用され得る。本プライマーは、上記配列情報を元に、当業者に周知の手順に従って化学合成によって作製され得る。例えば、上記プライマーは、例えば、ＰＥ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのような製造会社より入手可能なポリヌクレオチド合成機を用いて、製造業者によって提供される仕様書に従って合成され得る。しかし、標記の配列を有する断片であれば、市販のプライマーもまた利用できる。
【００１５】
本発明の方法においては、通常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実施され得る。より詳細には、ＰＣＲは、例えば、Ｓａｉｋｉら、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９に記載のようにして実施され得る。このようなＰＣＲは、通常のＰＣＲ自動化機器（例えば、ＰＥ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより市販され得る）を製造業者によって提供される仕様書に従って使用することにより、好都合に実施され得る。ＰＣＲで使用される個々の添加成分およびその添加量は、上記プライマーを使用すること以外は、当業者によって適宜設定され得る。すなわち、適切な溶媒（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、核酸増幅反応で通常使用され得るいずれもの緩衝液（市販による入手可能なキット中の緩衝液を含む）、ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシヌクレオチドが、この反応において添加され得る。ＤＮＡポリメラーゼは、市販により入手可能な、または当業者に調製可能な任意のＤＮＡポリメラーゼであり得る。好ましくは、Ｔａｑポリメラーゼが使用され得る。デオキシヌクレオチドは、各デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰとも称される：デオキシシトシン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシアデニン三リン酸、およびデオキシチミジン三リン酸を含む）であり得、通常、ＤＮＡ合成の直接の前駆物質として使用され得る物質である。ＰＣＲの熱変性、アニーリング、および伸長の条件は、用いるプライマーの長さおよび組成、ポリメラーゼの酵素性質などを考慮して、反応温度および反応時間が当業者によって適宜設定され得る。非特異的なバンドの生成を避けるためには、ストリンジェントな条件を設定することが好ましい。ＰＣＲは、好ましくは、下記の実施例と実質的に同等の条件下で実施され得る。
【００１６】
次いで、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ産物は、電気泳動によってバンドとして検出され得る。このような電気泳動は、ＤＮＡのバンドの検出に使用され得る電気泳動が使用され得る（例えば、アガロースゲル電気泳動）。このような電気泳動は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどの実験書に記載される方法によって行なわれ、本方法は当業者に周知である。増幅されたＰＣＲ産物は、当業者に周知の適切なサイズマーカーと一緒にゲルに載せられ、適切な条件下で泳動され得る。本発明の方法においては、好ましくは、ＤＮＡサイズマーカーλＨｉｎｄＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩが使用され得る。この電気泳動は、好ましくは、下記の実施例と実質的に同等の条件下で実施され得る。
【００１７】
このような工程を包含する本発明の方法によれば、「ひのみどり」以外のイグサ栽培品種には存在するが、「ひのみどり」において特異的に消失するバンドが検出される。このバンドは、サイズマーカーλＨｉｎｄＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いた場合、３．２５ｋｂと２．８５ｋｂｐのバンドの間の位置で消失し得る。用いたサイズマーカーよりバンドの大きさを推定することができる。従って、このバンドは３ｋｂｐと推定される。ここで、３ｋｂｐ、とは厳密な値ではなく、０．１ｋｂｐ前後の変動が、電気泳動の条件に依存し得る。
【００１８】
本発明の方法によれば、ゲノムＤＮＡ情報において品種間の差異を反映するので、イグサの生育環境に影響されることなく、最も優良な品質を有し産業価値の高い品種である「ひのみどり」を、他の主要栽培品種から識別することができる。また、本発明の方法は、簡単に再現性の高い結果が得られるため、「ひのみどり」を識別する際に誤認の可能性が低く、正確な品種判定ができる。
【００１９】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されない。本実施例で使用した材料、試薬、装置などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。使用され得る試薬は、工業的に利用可能な等級の試薬である。
【００２０】
【実施例】
イグサ主要栽培品種において、最も優良な品質を有し産業価値の高い「ひのみどり」を他の品種から識別した。本実施例で使用したイグサ栽培品種は、以下の通りである：「ひのみどり」、「岡山３号」、「いそなみ」、「岡山みどり」、「せとなみ」、「筑後みどり」、「ふくなみ」、「あさなぎ」、「きよなみ」、「しらぬい」、「くまがわ」、および「さざなみ」。これら栽培品種は、熊本県農業研究センターい業研究所の遺伝資源より入手した。
【００２１】
（イグサのゲノムＤＮＡの調製）
イグサのゲノムＤＮＡは、植物バイオテクノロジー実験マニュアル  クローニングとシークエンス、第２５２〜２５６頁、１９８９年６月１５日発行、株式会社農村文化社出版に記載のＣＴＡＢバッファーを用いるゲノムＤＮＡの調製法に基づいて調製した。ゲノムＤＮＡは、枯れていない健康な茎から調製した。簡潔には、以下の通りである。各品種において、枯れていない健康な茎５ｇを液体窒素下で細かく粉砕し、破砕組織を得た。この破砕した組織を、２×ＣＴＡＢ液（２％ＣＴＡＢ；０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０；２０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１．４Ｍ  ＮａＣｌ；１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）５ｍｌと共にビーカー中で混合した。これを５５℃で１０分静置した。これに５ｍｌクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１；ｖ／ｖ）添加した。室温で３０分間ゆっくり振盪した。次いで、２８００ｒｐｍ、１５分、室温で遠心分離した。この上層に５ｍｌクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１；ｖ／ｖ）を添加し、これを室温で１０分間ゆっくりと振盪した。次いで、２８００ｒｐｍ、１５分、室温で遠心分離し、上清を得た。一方、先の遠心分離の下層に５ｍｌの１×ＣＴＡＢ液（上記２×ＣＴＡＢ液２倍希釈液）を添加し、これを室温で１０分間ゆっくりと振盪し、この上清もまた得た。これらの上清に、１／１０容１０％ＣＴＡＢ液（１０％ＣＴＡＢ；０．７Ｍ  ＮａＣｌ）を添加し、混和した。さらにこれに１％ＣＴＡＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む等容のバッファーを添加し、３０分間室温で混和した。２８００ｒｐｍ、室温で１５分間遠心分離した。この沈殿物に５ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌ−ＴＥ（１Ｍ  ＮａＣｌ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、５５℃とし、沈殿物が溶解した後、さらに５ｍｌイソプロピルアルコールを添加した。次いで、２８００ｒｐｍ、室温で１５分間遠心分離し、沈殿物に５ｍｌのエタノールを添加し、２８００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離した。この沈殿物を、エタノールを除去した後、３ｍｌのＴＥを添加し、５５℃とした。沈殿物が溶解した後、０．３ｍｌの１０×ＲＮａｓｅ液（１０μｇ／ｍｌＲＮａｓｅ  Ａ）を添加し、５５℃で３０分間おいた。次いで、使用するまで−２０℃下で小分けして保存した。
【００２２】
（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅）
反応に使用した耐熱性ポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（寶酒造製）であった。反応液の組成（１μｌあたりの濃度で示す）は、上述のように調製した、試験される各品種のイグサ由来のゲノムＤＮＡ（０．８ｎｇ）、５’−ＣＣＣＧＡＡＧＣＧＡ−３’のヌクレオチド配列を有するプライマー（０．２ｐｍｏｌ）、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）（各０．２ｍｍｏｌ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０２５ｕｎｉｔ）であった。バッファーは、上記のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含むキットに備え付けのバッファーを使用した。
【００２３】
ＰＣＲは、１サイクルが熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（４０℃、２分）、および伸長反応（７２℃、３分）からなった。これを４５サイクル行った。
【００２４】
（電気泳動法によるゲノムＤＮＡ断片の分画）
エチジウムブロマイドを含む１．２％アガロースゲルのウェル部に、上記で得られたＰＣＲ反応液１０μｌをのせた。次いで、１００Ｖで３〜４時間泳動した。
【００２５】
アガロースは、ＴＡＥ緩衝液に溶解して調製した。なお、電気泳動用緩衝液としてＴＡＥ緩衝液を使用した。ここで、ＤＮＡサイズマーカーとしては、λＨｉｎｄＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用した。
【００２６】
泳動終了後、ＤＮＡ断片の電気泳動パターンは、紫外線照射下でポラロイドカメラを用いて撮影した。
【００２７】
電気泳動パターンを図１に示す。本図において、レーン１は、「岡山３号」、２は、「ひのみどり」、３は、「いそなみ」、４は、「岡山みどり」、５は、「せとなみ」、６は、「筑後みどり」、７は、「ふくなみ」、８は、「あさなぎ」、９は、「きよなみ」、１０は、「しらぬい」、１１は、「くまがわ」、そして１２は、「さざなみ」のバンドを示す。両側のレーンは、λＨｉｎｄＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの分子量マーカーを示す。分子量マーカーにおいて示されたバンドは、上から順に、４．４０ｋｂｐ、３．７３ｋｂｐ、３．２５ｋｂｐ、２．８５ｋｂｐ、２．１５ｋｂｐ、１．９０ｋｂｐを表す。レーン２の「ひのみどり」には、レーン１および３〜１２において上から２番目に見られるバンドが存在しなかった。このバンドの位置は、サイズマーカーλＨｉｎｄＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの３．２５ｋｂｐと２．８５ｋｂｐとの間である。本電気泳動パターンから、他の品種には存在し得るが「ひのみどり」で特異的に消失するＤＮＡ断片は、約３．０ｋｂｐであることが示唆される。
【００２８】
【発明の効果】
従って、本発明により、最も優良な品質を有し、そして産業価値の高い「ひのみどり」を識別するための手段が提供される。
【００２９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例により得られたイグサ主要栽培品種の電気泳動パターンを示す電気泳動写真である。
【図１】
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