(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジジベオサイド（zizybeoside）IIを指標とする製剤中のタイソウの確認方法。
【請求項２】
製剤中に含まれるジジベオサイド（zizybeoside）IIを定量することによって、タイソウ含有製剤の品質を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ジジベオサイド（zizybeoside）IIを指標とする製剤中のタイソウの確認方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タイソウ（大棗）は、ナツメの果実であり、緩下剤、利尿剤、強壮剤などに用いられている。このタイソウはｃＡＭＰ（cyclic ＡＭＰ，adenosine 3',5'-cyclic monophosphate）を含有し、これを指標成分とする分析方法が知られている（非特許文献１及び２参照）。
【０００３】
しかしながら、ｃＡＭＰは普通に生薬に存在する成分であるため、タイソウを他の生薬成分とともに製剤に配合した場合、ｃＡＭＰを指標として製剤中のタイソウを確認・定量することができなかった。
【０００４】
【非特許文献１】
J.C.Cyong, et al; Cyclic Adenosine Monophosphate in Fruits of Zizyphus Jujuba; Phytochemistry, 1980, 19, 2747.
【非特許文献２】
原田 正敏 編集「繁用生薬の成分定量」廣川書店、１９８９年、ｐ．２５９
【非特許文献３】
Nobuyuki Okamura, et al; Studies on the Constituents of Zizyphi Fructus. V. Structures of Glycosides of Benzyl Alcohol, Vomifoliol and Naringenin; Chem. Pharm. Bull; 29(12), 3507-14, 1981.
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、タイソウのみに含まれる特有成分を探索し、これを指標とする分析方法の開発が求められていた。
【０００６】
本発明は、製剤中に配合されたタイソウの確認・定量方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはタイソウを含有する製剤とタイソウを含有しない製剤のＬＣ分析チャートを比較し、タイソウ含有製剤に特有のピークが存在することを見出した。そして、そのピークがタイソウに微量含有されているジジベオサイサイド（zizybeoside）IIのものであることを確認した。
【０００８】
かかる知見をもとに完成した本発明の態様の１つは、ジジベオサイド（zizybeoside）IIを指標とする製剤中のタイソウの確認方法である。
【０００９】
本発明の他の態様は、製剤中に含まれるジジベオサイド（zizybeoside）IIを定量することによって、タイソウ含有製剤の品質を判定する方法である。
【００１０】
本発明に用いられる「ジジベオサイド（zizybeoside）II」は、タイソウ原生薬等にごくわずかに含有されていることが確認されている（非特許文献３参照）。
ジジベオサイドIIは微量成分であるので、その確認・定量には、ＬＣ／ＭＳを用いるのが好ましい。
【００１１】
本発明に用いられる「タイソウ」とは、タイソウ原生薬の他、ジジベオサイド（zizybeoside）IIを含有するようにタイソウ原生薬から抽出されたタイソウ軟エキスなどが該当する。
【００１２】
本発明における「製剤」とは、ドリンク剤等の内服液剤の他、顆粒剤、散剤、錠剤等の内服固形製剤が該当し、食品もこれに含まれる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
例えば、タイソウ軟エキスを含む数種の生薬成分を配合した製剤において、予めタイソウ軟エキスの抜き試料について妨害がないことを確認しておけば、ジジベオサイドIIを指標とするタイソウの確認試験を行うことができる。そうすることによって、原料としてのエキスの状態から製造直後、長年月を経た製品に至るまで、経時的なタイソウ含有製剤の品質評価を行うことができる。
【００１４】
また、高感度で特異性の高いＬＣ／ＭＳを用いることにより、複雑な前処理を省略して簡便かつ迅速にジジベオサイドIIの確認・定量を行うことができる。
【００１５】
【実施例】
以下に実験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
（実験例）
【００１６】
［試料］
ジジベオサイド（zizybeoside）II：タイソウ原生薬より単離したもの。構造式を以下に示す。
【００１７】
【化１】
0004042598.tif 000002
【００１８】
タイソウ軟エキス：水製エキス，エキス１ｇは原生薬３．３ｇに相当する。
【００１９】
［分析機器］
ＨＰＬＣ：ナノスペース（資生堂）
質量分析計（ＭＳ）：SCIEX API III plus( PE SCIEX )
（使用ソフト）測定：Tune 2.5,RAD 2.6
解析：Mac Spec 3.3,Mac Quan 1.3 ( PE SCIEX )
【００２０】
［試薬］
プレカラム：CAPCELL PAK C18 UG 120  2.0φ× 10 mm（資生堂）
分析カラム：CAPCELL PAK C18 UG 120  2.0φ×150 mm（資生堂）
ギ酸：特級（和光純薬）
ギ酸アンモニウム：特級（和光純薬）
メタノール：特級（国産化学）
【００２１】
［実験１］ジジベオサイドIIのＬＣ／ＭＳ測定条件の設定
（１）ジジベオサイド（zizybeoside）II単離品について、ＬＣ／ＭＳ測定条件の検討を行った。設定したジジベオサイドIIのＬＣ／ＭＳ測定条件を下表１に示す。
【００２２】
【表１】
0004042598.tif 000003
【００２３】
設定したＬＣ／ＭＳ測定条件でのジジベオサイドII単離品の検出限界及び定量性の確認を行った。ジジベオサイドII濃度0.025〜10μg/mLの試料溶液（移動相溶液）を調製し、表１に示したＬＣ／ＭＳ測定条件で分析を行い、Ｓ／Ｎ比から検出限界を、試料溶液濃度とピーク面積から最小二乗法により直線性を評価した。
【００２４】
（２）結果及び考察
移動相に水／メタノール／ギ酸系を用いて、ジジベオサイドIIのＬＣ／ＭＳスキャン分析を行った結果、プロトン化分子［Ｍ＋Ｈ］+であるm/z595のイオンは非常に小さく、m/z612［Ｍ＋18］+のイオンが非常に大きく観察された。
【００２５】
そこで、移動層にギ酸アンモニウムを添加し、ジジベオサイドIIを積極的に［Ｍ＋ＮＨ4］+の形にしてm/z612を検出することとした。検出感度を確認しながら、添加するギ酸アンモニウム濃度を0.1％に決定した。
【００２６】
m/z612［Ｍ＋ＮＨ4］+をプリカーサーイオンとしてプロダクトイオンスキャンを行ったところ（図１参照）、各フラグメントイオンはすべて構造に帰属可能であった（図２参照）。検出感度及び選択性を高めるために、m/z612［Ｍ＋ＮＨ4］+とプロダクトイオンスペクトルのベースピークであるm/z325をＳＲＭ（selected reaction monitoring）モードでのモニターイオンとして設定し、最終的に表１に示したＬＣ／ＭＳ測定条件を設定した。設定した条件でのジジベオサイドII単離品のＳＲＭクロマトグラムを図３に示す。
【００２７】
表１の条件でジジベオサイドIIの検出感度を確認した結果、検出限界はＨＰＬＣへの絶対注入量0.2ngであることがわかった。また、試料溶液濃度0.025〜10μg/mLの範囲で、濃度（Ｘ）とピーク面積（Ｙ）の間に相関係数0.995以上の良好な直線関係が得られた（表２参照）。
【００２８】
【表２】
0004042598.tif 000004
【００２９】
［実験２］タイソウ軟エキスの分析
（１）タイソウ軟エキス中のジジベオサイドIIのピーク確認及び含量評価を行った。エキス中では、他の夾雑成分の影響により単離品と比較してイオン化効率が変化する可能性があるため、単離品の試料溶液濃度（Ｘ）とピーク面積（Ｙ）との相関性及びエキスに単離品を添加した添加試料溶液の濃度（Ｘ）とピーク面積（Ｙ）との相関性を比較し、直線の傾きからイオン化効率に差があるかを確認した。
【００３０】
その結果を踏まえて、エキス中のジジベオサイドII含量は、標準添加法により算出し、日間差の確認も行った。エキス中でのジジベオサイドIIのイオン化効率の確認及び含量評価に用いた試料溶液の調製法は、下の通りである。ＬＣ／ＭＳ測定条件は表１に示した通りである。
【００３１】
【化２】
0004042598.tif 000005
【００３２】
（２）結果及び考察
製造ロットの異なる２つのタイソウ軟エキスの分析結果を図４に示す。何れもジジベオサイドIIのピークが良好に確認できた。
【００３３】
ジジベオサイドII単離品とエキス中でのイオン化効率を比較した結果を下表３に示す。
【００３４】
【表３】
0004042598.tif 000006
【００３５】
表３から明らかなように、両方とも良好な直線関係を示しており、定量性のあることは確認できたが、単離品と添加試料溶液では日によって傾きに差が認められた。このことから、エキス中のジジベオサイドII含量を算出するには、標準添加法を用いる。標準添加法により求めたタイソウ軟エキス中のジジベオサイドII含量も表３に掲載した。
【００３６】
製造ロットの異なる２種のタイソウ軟エキス中のジジベオサイドII含量は、約0.01％と非常に微量ではあるが、ほぼ同程度の含量であると考えられる。同一ロットについて日間差を確認したところ、得られるデータはほぼ同等であり、本法によりタイソウ軟エキス中のジジベオサイドIIの含量測定が可能であることを確認した。
【００３７】
［実験３］製剤中のジジベオサイドIIの分析
（１）検出、特異性及び安定性の確認
▲１▼  下表４に掲載したタイソウ軟エキス配合の製剤Ａ及び製剤Ｂ並びにタイソウ未配合の製剤Ｃを用いて、ドリンク剤中のジジベオサイドIIの検出、特異性及び安定性の確認を行った。標準溶液にはジジベオサイドII単離品0.1μg/mL溶液を、試料溶液には各製剤を移動相で２倍に希釈したものを用いた。ＬＣ／ＭＳ測定条件は表１に示した通りである。
【００３８】
【表４】
0004042598.tif 000007
【００３９】
▲２▼  結果及び考察
製剤Ａ、製剤Ｂ及び製剤Ｃ分析時のＳＲＭクロマトグラムを図５に示す。図５のクロマトグラムから明らかなように、タイソウ軟エキス配合の２製剤では、保持時間約７分にジジべオサイドIIのピークが明瞭に認められるが、タイソウ未配号の製剤Ｃでは、ジジベオサイドIIの溶出位置にピークが認められなかった。ジジベオサイドIIを指標にタイソウの有無が容易に確認できると考えられる。
【００４０】
また、製剤Ｂの２つのサンプル（Ｂ−１、Ｂ−２）は、室温で長期間（Ｂ−１は６年４月、Ｂ−２は３年１０月）保存した後のものであるが、ジジベオサイドIIのピークは良好に確認された。さらにサンプルＢ−２を６５℃で２週間保存したサンプル（Ｂ−３）を同様に分析した結果、こちらも問題なくピークが確認でき、保存前とほぼ同等のピーク強度であったことから、製剤中のジジベオサイドIIの安定性に問題はなく、タイソウの確認試験の指標成分として適当であると判断した。
【００４１】
（２）定量性の確認
▲１▼  製剤中のジジベオサイドIIに関してもエキスの場合と同様の操作を行いイオン化効率に差があるかを確認した。その結果を踏まえて、製剤についても標準添加法によりジジベオサイドII含量を測定した。サンプルには製剤Ａ及びＢを用い、日間差の確認も行った。試料溶液調製法は、下の通りであり、ＬＣ／ＭＳ測定条件は表１に示した通りである。
【００４２】
【化３】
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【００４３】
▲２▼  結果及び考察
ジジベオサイドII単離品とドリンク剤中でのイオン化効率を比較した結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】
0004042598.tif 000009
【００４５】
表５からも明らかなように、製剤でも良好な直線関係を示しており、定量性のあることは確認できたが、やはり単離品と添加試料溶液では傾きに差が認められたことから、製剤中のジジベオサイドII含量を算出する場合にも、標準添加法を用いることとした。標準添加法により求めた各製剤中のジジベオサイドII含量も併せて表５に示した。
【００４６】
各製剤中のジジベオサイドII含量は、タイソウ軟エキスの配合量により異なるが、エキス中の含量に換算すると約0.007〜0.01％という結果であった。非常に微量ではあるが、エキス中のジジベオサイドII含量とほぼ同等であり妥当な結果であると判断した。製剤についても同じ製造ロットのものについて日間差を確認したところ、得られるデータはほぼ同等であり、本法により製剤中のジジベオサイドIIの含量測定が可能であることを確認した。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、確認不可生薬であるタイソウについて、特有成分であるジジベオサイドIIを指標に、高感度で特異性の高いＬＣ／ＭＳを用いて、製剤における簡便なタイソウ確認試験の方法を確立した。
【００４８】
また、本発明は、検出限界が数百ｐｇ以下と高感度であり、試料溶液濃度0.025〜10μg/mLの範囲でも定量可能である。
【００４９】
本発明を用いて、タイソウ軟エキス及び該軟エキス配合製剤の分析を行った結果、何れもジジベオサイドIIを良好に確認することができ、特異性及び安定性にも問題はなかった。
【００５０】
更に、標準添加法を用いることにより、エキス中及び製剤中のジジベオサイドIIの含量測定も可能であった。
【００５１】
以上のことから、ＬＣ／ＭＳを用いることにより、簡便で種々の製剤で適用できるジジベオサイドIIを指標成分とするタイソウの確認試験法を提供することが可能となった。
【００５２】
【図面の簡単な説明】
【図１】  ジジベオサイドIIのプロダクトイオンスペクトルを示すグラフである。
【図２】  ジジベオサイドIIのＣＡＤ( collision-activated dissociation )フラグメンテーションを示す。
【図３】  ジジベオサイドII単離品のＳＲＭクロマトグラムを示すグラフである。
【図４】  タイソウ軟エキス中のジジベオサイドIIのＳＲＭクロマトグラムを示すグラフである。
【図５】  製剤中のジジベオサイドIIのＳＲＭクロマトグラムを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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