(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主にある一の腫瘍を処置するための薬学的組成物であって、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する一つの作用薬を含み、前記作用薬はサイクリンＧ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的でありかつサイクリンＧ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに結合して、サイクリンＧ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドまたは少なくとも１５ヌクレオチドのその断片を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
請求の範囲第１項記載の薬学的組成物であって、ここで前記薬学的組成物が前記宿主の腫瘍細胞を形質導入するために適切な形態のアンチセンスポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
【請求項３】
請求の範囲第２項記載の薬学的組成物であって、ここで前記アンチセンスポリヌクレオチドが発現伝導体としてレトロウイルス伝導体内に含まれる、薬学的組成物。
【請求項４】
サイクリンＧ１タンパク質を阻害する作用薬をコードするポリヌクレオチドを含む発現伝導体を含む、宿主における腫瘍を処置するため、または宿主における再狭窄を予防または処置するための薬学的組成物であって、ここで前記作用薬は、サイクリンＧ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的でありかつサイクリンＧ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに結合して、サイクリンＧ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を妨げるアンチセンスポリヌクレオチドまたは少なくとも１５ヌクレオチドのその断片を含む、薬学的組成物。
【請求項５】
請求の範囲第４項記載の薬学的組成物であって、ここで前記発現伝導体がウイルスベクターである薬学的組成物。
【請求項６】
請求の範囲第５項記載の薬学的組成物であって、ここで前記ベクターがレトロウイルスベクターである、薬学的組成物。
【請求項７】
前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求の範囲第５項に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
宿主の再狭窄を予防または処置するための薬学的組成物であって、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する作用薬を含み、ここでサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドに相補的でありかつサイクリンＧ１タンパク質に結合して、サイクリンＧ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドまたは少なくとも１５ヌクレオチドのその断片を含む、薬学的組成物。
【請求項９】
前記薬学的組成物は、前記宿主の細胞を形質導入するために適切な形態のアンチセンスポリヌクレオチドを含む、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
請求の範囲第９項記載の薬学的組成物であって、ここでアンチセンスポリヌクレオチドは、発現伝達体としてのレトロウイルスベクター内に含まれている、薬学的組成物。
【請求項１１】
前記サイクリンＧ１を阻害する作用薬は、侵襲性血管処置の部位において活性である、請求の範囲第８項記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記侵襲性血管処置は血管形成である、請求の範囲第１１項記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記侵襲性血管処置は血管移植である、請求の範囲第１１項記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記サイクリンＧ１を阻害する作用薬は、血管損傷部位で活性である、請求の範囲第８項記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
この発明は、１９９５年１１月１日に受理された出願連続番号第０８／５５１，４８６号を部分継承するものであり、その内容はここで引用例としてとり込まれている。
この発明は、腫瘍にあるサイクリンＧ１の発現に関する。より詳細には、この発明は：（ｉ）腫瘍細胞にあるサイクリンＧ１タンパク質を阻害することによる骨原性肉腫あるいはユーイング肉腫などの腫瘍の処置、（ii）侵襲性血管処置あるいは血管損傷の部位で細胞内のサイクリンＧ１タンパク質を阻害することによる再狭窄の予防、（iii）サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドで細胞を形質導入することによるそのような細胞の不死化、（iv）レトロウイルス形質導入あるいは感染の前あるいは同時にサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドで細胞を形質導入することにより、細胞をレトロウイルスベクターによる感染あるいは形質導入により受容的にすること、および（ｖ）細胞内でサイクリンＧ１タンパク質の発現水準を決定することによる癌を検出する薬剤に関する。この発明はまた発現伝達体、望ましくはレトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターに関し、それらはサイクリンＧ１タンパク質を認識するアンチセンスポリヌクレオチド、および抗体あるいは断片もしくはそれらの誘導体などのサイクリンＧ１タンパク質を阻害する薬剤をコード化するポリヌクレオチドを含み、またサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む発現伝達体に関する。
発明の背景
サイクリンとして知られる新しいクラスのタンパク質をコード化する遺伝子は、新しいクラスのプロトオンコジーンとして同定され、またサイクリン依存性キナーゼ（つまりＣｄｋ）阻害剤が腫瘍サプレッサーとして同定され、これにより細胞形質転換および腫瘍形成の分子メカニズムを細胞周期制御を支配する酵素学と結合した（ホール、他、細胞生物学の最新の見解、３巻、１７６−１８４ページ（１９９１）；ハンター、他、細胞、５５巻、１０７１−１０７４ページ（１９９１）；ハンター、他、細胞、７９巻、５７３−５８２ページ（１９９４）；エレッジ、他、細胞生物学の最新の見解、６巻、８７４−８７８ページ（１９９４）；ピーター、他、細胞、７９巻、１８１−１８４ページ（１９９４））。特異的サイクリンの連続発現および特異的Ｃｄｋ複合体の基本的機能が定義され、（ウー、他、腫瘍学インターナショナルジャーナル、３巻、８５９−８６７ページ（１９９３）；パインズ、他、新生物学者、２巻、３８９−４０１ページ（１９９０）；パインズ、細胞成長および分化、２巻、３０５−３１０ページ（１９９１）；リード、細胞生物学年次報告、８巻、５２９−５６１ページ（１９９２）；シャー、細胞、７９巻、５５１−５５５ページ（１９９４））、これによりＤＮＡ複製、転写、修復、遺伝子不安定性およびアポトーシスの根本的メカニズムへの直接的結合を提供する。（ドゥルソ、他、サイエンス、２５０巻、７８６−７９１ページ（１９９０）；ウー、他、オンコジーン、９巻、２０８９−２０９６ページ（１９９４）；ロイ、細胞、７９巻、１０９３−１１０１ページ（１９９４）；マイクランツ、他、全米科学アカデミー紀要、９１巻、３７４４−３７５８ページ（１９９４年））。万能Ｃｄｋ阻害剤ｐ２１／ＷＡＦ１／ＣＩＰ１（ジオン、他、ネイチャー、３６６巻、７０１−７０４ページ（１９９３）；ハーパー、他、細胞分子生物学、６巻、３８７−４００ページ（１９９５））、およびサイクリンＧ１（ウー、他、腫瘍学レポート、１巻、７０５−７１１ページ（１９９４））は、ＤＮＡ修復およびもしくはアポトーシスの開始において野生型ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質により誘導される（エル−デーリー、他、細胞、７５巻、８１７−８２５ページ（１９９３年）；エル−デーリー、他、癌研究、５４巻、１１６９−１１７４ページ（１９９４））。かくして臨界細胞周期チェックポイントを調節する分子成分は、Ｒｂおよびｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子がしばしば不活性化される小児骨癌を含む細胞増殖疾患の処置において潜在的な治療介入のための戦略目標を表す（ハンセン、他、全米科学アカデミー紀要、８２巻、６２１６−６２２０ページ（１９８５）；トグチダ、他、ネイチャー、３３８巻、１５６−１５８ページ（１９８９）；トグチダ、他、癌研究、４８巻、３９３９−３９４３ページ（１９８８）；ディラー、他、分子細胞生物学、１０巻、５７７２−５７８１ページ（１９９０））。これまでの研究は、ＭＧ−６３骨肉腫細胞におけるｐ２１／ＷＡＦ１／ＣＩＰ１のｐ５３独立誘導（ウー、他、腫瘍学レポート、２巻、２２７−２３１ページ（１９９５））と同じように、サイクリン発現およびＣｄｋ活性化の進行性プロファイルを特徴づけている（ウー、１９９３；カルボナロ−ホール、他、オンコジーン、８巻、１６４９−１６５９ページ（１９９３）；ホール、他、オンコジーン、８巻、１３７７−１３８４ページ（１９９３）；ウイリアムズ、他、生物化学ジャーナル、２６８巻、８８７１−８８７０ページ（１９９３）；オルバース、他、生物化学ジャーナル、２６８巻、２２８２５−２２８２９ページ（１９９３））。更に、サイクリンＤ１に指向されたアンチセンスオリゴヌクレオチド戦略は、これらの骨肉腫細胞における細胞周期の進行を効果的に阻害する。
転移性癌は、それが乏しい成果しかあげていないので遺伝子治療の重要な標的である。例えば直腸癌は、合衆国で肺癌に次ぐ二番目の癌死亡因となっており、この後乳癌、膵臓癌へと続く（シルバーバーグ、他、癌臨床実習、４０巻、９−２６ページ（１９９０）。これらの癌の内、膵臓癌が最悪の予後を有する。転移性膵臓癌を持つ患者の正中生存率は、３乃至６ケ月であり、事実上すべての患者は、１年以内で死亡する（メリック、他、北米胃腸病臨床学、１９巻、９３５−９６２ページ（１９９０））。患者の約４０％は、診断の際肝臓あるいは腹腔のいずれかあるいは両方への転移性疾病を有するであろう。転移性疾病のためのある化学療法は、いろいろな形態のある処置にも拘らず効果が見られない。従って転移性疾患への代替的アプローチが望まれる。
ここで前記のウー、他（腫瘍学レポート、１巻、７０５−７１１ページ（１９９４））は、ヒトサイクリンＧ１タンパク質のための推論されたアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列を開示する。ウー、他はまた、正常な二倍体ヒト線維芽細胞よりも、骨肉腫細胞およびユーイング肉腫細胞内に、より高い水準のサイクリンＧ１発現が発見されたことを開示する。ウー、他は、ヒト骨肉腫細胞内でのサイクリンＧ１タンパク質の過発現が、癌への潜在的関連を提供すると述べてはいるけれども、ウー、他は、癌細胞内でサイクリンＧ１タンパク質の機能に介入あるいはそれを阻害することによる癌の処置を開示していない。
発明の要約
癌細胞におけるサイクリンＧ１タンパク質の機能に介入し、あるいは発現を阻害する薬剤を投与することにより、そのような癌細胞の増殖およびもしくは生存を阻害し、防止し、あるいは破壊できることを出願人は発見した。かくして、この発明は、望ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドをサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドに、あるいは抗体をサイクリンＧ１タンパク質に投与することを通じて、サイクリンＧ１タンパク質を阻害することによる腫瘍（望ましくは、癌性腫瘍）の処置に向けられる。
加えて、この発明は、（ｉ）侵襲性血管処置あるいは血管損傷部位で細胞内のサイクリンＧ１タンパク質を阻害することによる再狭窄の予防、（ii）サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドで細胞を形質導入することによる細胞の不死化、（iii）細胞をレトロウイルスベクターを用いる形質導入あるいは感染に対しより受容的にするために、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを用いる細胞の形質導入、および、（iv）サイクリンＧ１タンパク質およびもしくはそのようなタンパク質をコード化するポリヌクレオチドの検出を伴う癌検定、に向けられる。
この発明はまた、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する薬剤をコード化するポリヌクレオチドを含む発現伝達体、およびサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む発現伝達体に向けられる。このような発現伝達体は、必ずしもそれに限定されないが、レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターを含む。
【図面の簡単な説明】
この発明はこれから図面と関連して説明され、ここで
図１は、ヒトサイクリンＧ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
図２は、β−ガラクトシダーゼ、あるいは１ａｃＺ遺伝子を含むレトロウイルスベクターでのＭＧ−６３骨原性肉腫細胞の形質導入に続くその細胞の染色を示す。
図３は、単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を含むレトロウイルスベクターで形質導入されたＭＧ−６３細胞、およびそのようなベクターで形質導入されなかった細胞の混合物における密集の度合のグラフである。
図４は、レトロウイルスベクターＧ１ａＤ１ＳｖＮａ、Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、Ｇ１ｐ２１ＳｖＮａおよびＧ１ＸＳｖＮａの図式である。
図５は、Ｇ１ＸＳｖＮａ、Ｇ１ａＤ１ＳｖＮａ、Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、あるいはＧ１ｐ２１ＳｖＮａで形質導入されたＭＧ−６３細胞の培養における細胞総数のグラフである。
図６は、Ｇ１ＸＳｖＮａ、Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、あるいはＧ１ａＤ１ＳｖＮａで形質導入されたＭＧ−６３細胞におけるｐ２９サイクリンＧ１タンパク質の発現のウエスタンブロットある。
図７は、Ｇ１ＸＳｖＮａ、Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、Ｇ１ａＤ１ＳｖＮａ、あるいはＧ１ｐ２１ＳｖＮａでＭＧ−６３細胞の形質導入７２時間後の顕微鏡検査によるその細胞の形態学的外観を示す。
図８は、Ｇ１ＸＳｖＮａ、Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、Ｇ１ａＤ１ＳｖＮａあるいはＧ１ｐ２１ＳｖＮａで形質導入されたＭＧ−６３細胞の培養におけるアポトーシス細胞の検出を示す。
図９Ａは、アンチセンスサイクリン  Ｇ１を運ぶレトロウイルスベクター（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）でのＶＸ２癌細胞の形質導入４８時間後のＰＩ染色核を、対照（Ｇ１ＸＳｖＮａ）ベクターのそれと比較したＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）分析を示す。
図９Ｂは、アンチセンスサイクリンＧ１を運ぶレトロウイルスベクター（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）でＭＧ−６３骨肉腫細胞の形質導入４８時間後のＰＩ染色核を、対照（Ｇ１ＸＳｖＮａ）ベクターのそれと比較したＦＡＣＳ分析を示す。
図１０：形質導入ＶＸ２未分化癌細胞内でアンチセンスサイクリンＧ１および野生型ｐ５３を運ぶレトロウイルスベクターの細胞分裂抑制作用。細胞密度は、Ｇ４１８選択前、レトロウイルスベクター形質導入後に、連続間隔を置いてＶＸ２細胞の細胞培養内で細胞計数により測定された。
図１１：Ｇ４１８選択後に、アンチセンスサイクリンＧ１（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）、野生型ｐ５３（Ｇ１ｐ５３ＳｖＮａ）を運ぶレトロウイルスベクター、あるいは対照（Ｇ１ＸＳｖＮａ）ベクターで形質導入１０日後のＶＸ２細胞の形態学的外観。
図１２：アンチセンスサイクリンＧ１を運ぶ腫瘍内注入レトロウイルスベクターに続くヌードマウスにおけるＶＸ２腫瘍増殖の阻害。縦軸にプロットされた腫瘍サイズの増加割合は、横軸にプロットされた時間（日数）の関数として表される。
図１３Ａ：アンチセンスサイクリンＧ１を運ぶレトロウイルスベクター（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）、あるいは対照ベクター（Ｇ１ＸＳｖＮａ）で処置１週後の代表的ＶＸ２腫瘍保持マウスの肉眼で見える外観。
図１３Ｂ：アンチセンスサイクリンＧ１を運ぶレトロウイルスベクター（Ｇ１ａＧ７ＳｖＮａ）、あるいは対照ベクター（Ｇ１ＸＳｖＮａ）での処置１週のホルマリン固定腫瘍切開部のヘマトキシリン−エオシン染色。倍率４０倍。
図１４は、ＭＮＮＧ／ＨＯＳ細胞を注射され、レトロウイルスベクターＧ１ＳＸｖＮａ、あるいはＧ１ａＧ１ＳｖＮａの注射が続けられたマウスの腫瘍サイズのグラフである。腫瘍の量は、レトロウイルスベクターの注射の０，４，６，８，１０および１２日後で測定される。
図１５：（Ａ）Ｇ１ｎＢｇＳｖＮａベクターでの形質導入に続く核標的β−ガラクトシダーゼを発現する大動脈平滑筋細胞（青い核を持つ細胞）；（Ｂ）形質導入大動脈ＳＭＣ内でのアンチセンスサイクリンＧ１および野生型ｐ５３の細胞分裂抑制および細胞致死作用。細胞密度は対照ベクター（Ｇ１ＸＳｖＮａ）と同じくアンチセンスＧ１（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）および野生型ｐ５３（Ｇ１ｐ５３ＳｖＮａ）を運ぶレトロウイルスベクターで形質導入後、連続間隔で収穫された大動脈ＳＭＣの培養での直接細胞計数により測定された；（Ｃ）レトロウイルスベクター（各グループ  ｎ＝３）で形質導入された後の培養大動脈ＳＭＣへの3Ｈ−チミジンとり込み。放射能は、ウエル当りｄｐｍとして表現される。その結果は、算術平均±１標準偏差で表される；
図１６：対照およびアンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクター（Ａ＝Ｇ１ＸＳｖＮａ対照ベクター；Ｂ−Ｄ＝Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）で形質導入２４時間後に、顕微鏡検査で観察された大動脈ＳＭＣの形態学的外観。アンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクター形質移入後血管ＳＭＣにおけるアポトーシスの検出；（Ｅ）Ｇ１ＸＳｖＮａ対照ベクター形質導入細胞、（Ｆ）Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａアンチセンスサイクリンＧ１ベクター形質導入細胞。濃い染色アポトーシス体は合胞体細胞内および外の両方で認められる；
図１７：アンチセンスサイクリンＧ１ベクター形質導入大動脈ＳＭＣでの細胞致死「バイスタンダー」作用。アンチセンスサイクリンＧ１ベクターで前もって形質導入されたＳＭＣ培養に覆われた時に、非形質導入蛍光標識大動脈ＳＭＣの多細胞性合胞体への取り込み。ＡおよびＢ、低倍率；ＣおよびＤ、高倍率；ＡおよびＣ、位相差；ＢおよびＤ、紫外線。蛍光標識を含む細胞を取り込む代表的な多核合胞体は、矢印で同定される。（Ｅ）レトロウイルスベクター：Ｇ１ＸＳｖＮａ、対照ベクター；Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、アンチセンスＧ１遺伝子を運ぶベクター；Ｇ１ｐ５３ＳｖＮａ、野生型ｐ５３を運ぶベクターで形質導入された血管ＳＭＣでの時間にわたる合胞体形成の定量化：
図１８：（Ａ）細胞を欠いている１ｍｍのトラックを創り出すために、２００μｌピペットチップでこすりとられた大動脈ＳＭＣの高密度培養、（Ｂ）こすりとりおよび剥離細胞除去のための洗浄直後の「創傷」端部の外観、（Ｃ）トラックの端部に沿って核標的βガラクトシダーゼを発現する大動脈ＳＭＣ、（Ｄ）損傷２４時間後トラックへのＧ１ＸＳｖＮａ対照ベクター形質導入大動脈ＳＭＣの増殖および移動、（Ｅ）標識された合胞体形成を持つＧ１ａＧ１ＳｖＮａベクター形質導入大動脈ＳＭＣにおけるアポトーシスおよび縮重の変化、および
図１９：ラット頸動脈損傷の再狭窄モデルにおけるアンチセンスサイクリンＧ１ベクターの効率の検査。中膜のエラスチン層が、ヴァーヘフ染色により（Ａ−Ｄで）同定される。増殖平滑筋細胞（赤黄色染色細胞）よりなる新内膜は、シリス赤色染色により同定される。ＡおよびＣ＝未処置動脈セグメント；ＢおよびＤ＝アンチセンスサイクリンＧ１ベクター処置動脈セグメント。ＥおよびＦ＝高倍率のそれぞれ未処置動脈セグメントおよびａＧ１処置動脈セグメント：Ｇ＝未処置（ＮＴ）、対照（ＧＩＸ）およびアンチセンスサイクリンＧ１（ａＧ１）処置の各動脈セグメントの新内膜の中膜に対する比率の分析が、縦棒軸で表される。
発明の詳細な説明
この発明の一つの見地に従って、宿主にある腫瘍を処置する方法が提供される。この方法は、宿主あるいは腫瘍に対してサイクリンＧ１タンパク質を阻害する一つの薬剤を投与することを含む。この薬剤は腫瘍細胞内のサイクリンＧ１タンパク質を阻害するのに有効な量で投与される。
ここで使用される「腫瘍を処置する」という用語は、腫瘍細胞の阻害、予防、あるいは破壊が提供されることを意味する。
ここで使用される「サイクリンＧ１タンパク質を阻害する」という用語は、薬剤が、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの発現を阻害し、あるいは予防しあるいはサイクリンＧ１タンパク質の機能を阻害しあるいは予防することを意味する。
採用されるサイクリンＧ１タンパク質を阻害する薬剤は、必ずしもそれに限定されないが、（サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチド断片もしくは配列を含む）ポリヌクレオチド、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの発現を予防するために結合するサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドに結合するポリヌクレオチド、また例えばサイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体あるいは断片もしくはそれらの誘導体などのサイクリンＧ１タンパク質に対する拮抗薬、またサイクリン依存性キナーゼ阻害体を含む。
一つの実施例において、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する薬剤は、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドと結合するポリヌクレオチドであり、またとりわけサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドである。ヌクレオチドｃＤＮＡ（図１）およびヒトサイクリンＧ１タンパク質の推定アミノ酸配列は、ウー、他、腫瘍学レポート、１巻、７０５−７１１（１９９４）に記載され、それはここで引用例としてとり込まれている。
ここで使用されている「ポリヌクレオチド」という用語は、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、またリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む。その用語は、更に一本および二本鎖ＤＮＡ、同じく一本および二本鎖ＲＮＡを含む。この用語はまたメチル化あるいはキャップ（異化遺伝子活性化タンパク）ポリヌクレオチドなどの修飾ポリヌクレオチドを含む。
一般にサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドは、少なくとも１５個のヌクレオチド、望ましくは少なくとも１８個のヌクレオチド、またより望ましくは１８個から２０個のヌクレオチドを含む。一つの実施例において、アンチセンスポリヌクレオチドは、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの全長に対し相補的である。
一つの実施例において、アンチセンスポリヌクレオチドは、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、かくしてそれと結合あるいは雑種形成することができ、これによりこのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害する。も一つの実施例において、アンチセンスポリヌクレオチドは、サイクリンＧ１タンパク質をコード化する一本鎖あるいは二本鎖ＤＮＡに相補的であり、かくしてそれと結合あるいは雑種形成することができ、これによりそのようなＤＮＡのｍＲＮＡへの翻訳を予防し、あるいはそのようなＤＮＡの複製を阻害する。アンチセンスポリヌクレオチドは、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するＤＮＡあるいはｍＲＮＡのいずれかの一部に結合するが、望ましくは、そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡあるいはｍＲＮＡの５′末端で結合する。
も一つの実施例において、アンチセンスポリヌクレオチドは、サイクリンＧ１をコード化するｍＲＮＡの切断を促進するリボザイムである。ここで使用されるように、「リボザイム」という用語は、標的ｍＲＮＡの特異的配列に基礎を置く認識が一度達成されると、標的ｍＲＮＡ分子の触媒による切断を促進する二次構造を形成するいずれかの一本鎖のポリヌクレオチドを意味する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の技術に従って、例えば自動オリゴヌクレオチド合成機などにより合成される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、次いで宿主の腫瘍細胞でサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの発現を阻害するのに有効な量で、宿主に投与される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約０．１μＭから約１０μＭ、望ましくは約１μＭから約５μＭの量で投与される。宿主は動物宿主、とりわけヒトおよび非ヒト霊長類宿主を含む哺乳類宿主である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に許容可能薬理担体、例えば生理食塩水などと併用して宿主に全身投与される。選択肢として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポソーム内に含有され、これは許容可能薬理担体と併用して宿主に全身投与される。このような全身投与は、例えば静脈内、動脈内、あるいは腹腔内投与によるものである。選択肢として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、直接腫瘍に投与される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによる劣化に対し、オリゴヌクレオチドを安定化させるため、およびもしくは腫瘍細胞に侵入するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を高めるために修飾される。このような修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１個のリン酸ジエステル結合を、ヌクレアーゼによる劣化に対し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定化向上を提供し、およびもしくは腫瘍細胞に侵入するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を高める構造に置換することにより達成される。このような置換は、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル、メチルホスホネート結合などのアルキルもしくはアリルホスホネート結合、短鎖アルキルあるいはシクロアルキル構造もしくは短鎖ヘテロ原子あるいは複素環式構造、例えばＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2、およびＯ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ2、同じくモルホリン構造を含む。このような修飾の例は、１９９３年３月１８日公開されたＰＣＴ出願番号第ＷＯ９３／０５１８２号および１９９１年７月２３日発行された合衆国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。アルキルあるいはアリルホスホネート結合の例は、同じく合衆国特許番号第４，４６９，８６３号および４，５１１，７１３号に記載されている。選択肢として、アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、アミノ酸；ジペプチド模擬品；蔗糖；蔗糖二リン酸塩；神経伝達物質；ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、デキストラン、ポリ無水マレイン酸、シクロデキストリン、でんぷん、あるいはポリエチレンイミンなどの親水性ポリマーの成分と接合される。このような成分の例は、１９９４年１月２０日公開されたＰＣＴ出願番号第ＷＯ９４／０１４４８号に記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾するのに使用される成分の更なる例は、必ずしもそれに限定されないが、アルキルあるいはアリルリン酸塩、カルバミン酸塩、硫酸塩、および（チオ）ホルムアセタールを含む。
前記の修飾は、当業者に公知の手段によりアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成の間に、アンチセンスオリゴヌクレオチドに対し行われる。望ましい実施例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが直接あるいはリポソームに投与される時、アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１個のホスホロチオエートあるいはホスホロジチオエートリンカー成分を含み、それらは当業者に公知の技術により合成の間にアンチセンスオリゴヌクレオチドのバックボーンに付着される。
も一つの実施例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドで、宿主の形質導入腫瘍細胞により宿主に投与される。
サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドは、腫瘍細胞内に形質導入される適切な発現伝達体内に含まれる。このような発現伝達体は、必ずしもそれに限定されないが、プラスミド、真核ベクター、原核ベクター（例えば細菌ベクターなど）、およびウイルスベクターを含む。
一つの実施例において、ベクターはウイルスベクターである。使用されるウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスベクター（レトロウイルスベクターなど）、およびＤＮＡウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ関連性ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクター）を含む。ベクターを構築するのにＲＮＡウイルスベクターが使用される時、アンチセンスポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドはＲＮＡの形態にある。ベクターを構築するのにＤＮＡウイルスベクターが使用される時は、アンチセンスポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドはＤＮＡの形態にある。
一つの実施例において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。使用されるレトロウイルスベクターの例は、必ずしもそれに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、および下記のレトロウイルスから誘導されるベクター、すなわちラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血症ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスを含む。ベクターは一般に複製不能レトロウイルス粒子である。
レトロウイルスベクターは、レトロウイルス媒介遺伝子の真核細胞への移転を媒介する薬剤として有用である。レトロウイルスベクターは、一般にウイルスの構築遺伝子をコード化する多数の配列が欠失し、対象となる遺伝子により置換されるように構築される。しばしば構築遺伝子（すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）は、従来公知の遺伝子工学技術を用いてレトロウイルスバックボーンから除去される。これは適切な制限エンドヌクレアーゼで、あるいはある場合にはＢａｌ  ３１エキソヌクレアーゼを用いる消化を含み、パッケージングシグナルの適切な部分を含む断片を生成する。
これらの新しい遺伝子は、プロウイルスバックボーンにいくつかの一般的な方法でとり込まれてきた。もっとも直接的な構築は、レトロウイルスの構築遺伝子が単一遺伝子により置換され、それは次いで長末端反復（ＬＴＲ）内のウイルス調節配列の制御の下で転写される。レトロウイルスベクターは、更に１個以上の遺伝子を標的細胞に導入できるように構築されてきた。通常このようなベクターで、１個の遺伝子は、ウイルスＬＴＲの調節制御の下にあり、一方第二の遺伝子は、スプライスメッセージと離れて発現されるかもしくはそれ自身の内部プロモーターの調節下にある。選択肢として、２個の遺伝子は内部リポソームエントリー部位の使用により単一プロモーターから発現される。
ウイルスバックボーンのウイルス成分を最小化することに努力が向けられてきたが、それは主としてパッケージング細胞内でベクターとパッケージング欠陥ヘルパーウイルスとの間の組換えの機会を減少する努力であった。パッケージング欠陥ヘルパーウイルスはベクター自身から欠失されてきたレトロウイルスの構築遺伝子を提供するのに必要である。
使用されるレトロウイルスベクターの例はレトロウイルスから誘導されるレトロウイルスプラスミドベクターから生成されるレトロウイルスベクターを含み、必ずしもそれに限定されないが、ミラー、他、バイオテクニク、７巻、９８０−９９０ページ（１９８９）、およびミラー、他、ヒト遺伝子治療、１巻、５−１４ページ（１９９０）に記載されたものなどのモロニーマウス白血病ウイルスベクターを含む。
望ましい実施例において、レトロウイルスプラスミドベクターは少なくとも４個のクローニング、あるいは制限酵素認識部位を含み、ここで少なくとも２個の部位は１０，０００塩基対で１回以下の真核遺伝子の平均出現頻度を持つ。すなわち制限産物は少なくとも１０，０００塩基対の平均ＤＮＡサイズを有する。望ましいクローニング部位はＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩよりなるグループから選択される。望ましい実施例において、レトロウイルスプラスミドベクターはこれらクローニング部位のそれぞれを含む。このようなベクターは更に１９９４年１１月１７日に受理された合衆国特許出願連続番号第０８／３４０，８０５号、および１９９１年７月２５日公開されたＰＣＴ出願番号第ＷＯ９１／１０７２８号に記載されており、それらの全体が引用例としてここにとり込まれている。
このようなクローニング部位を含むレトロウイルスプラスミドベクターが使用される時、レトロウイルスベクターに位置するＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩよりなるグループから選択された少なくとも２個のクローニング部位と適合する少なくとも２個のクローニング部位を含むシャトルクローニングベクターが更に提供される。シャトルクローニングベクターは更にシャトルクローニングベクターからレトロウイルスベクターに移すことのできる少なくとも１個の望ましい遺伝子を含む。
シャトルクローニングベクターは、基本「バックボーン」ベクターあるいは断片から構築され、後者にはクローニングあるいは制限酵素認識部位を含む１個もしくはそれ以上のリンカーが結合される。クローニング部位に含まれるものは前に記載の適合性クローニング部位あるいは相補的クローニング部位である。シャトルベクターの制限部位に対応する末端を持つ遺伝子およびもしくはプロモーターは、従来既知の技術を通じてシャトルベクターに結合される。
シャトルクローニングベクターは、原核システムにあるＤＮＡ配列を増幅するために使用できる。シャトルクローニングベクターは、原核システムおよびとりわけ細菌で一般に使用されるプラスミドから用意できる。かくして、例えばシャトルクローニングベクターは、ｐＢＲ３２２；ｐＵＣ１８；等などのプラスミドから誘導される。
レトロウイルスプラスミドベクターは、１個もしくはそれ以上のプロモーターを含む。使用される適切なプロモーターは、必ずしもそれに限定されないが、ミラー、他、バイオテクニク、７巻、９号、９８０−９９０（１９８９）に記載されているレトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、あるいはいずれか他のプロモーター（例えば必ずしもそれに限定されないが、ヒストン、ｐｏｌＩＩＩ、およびβアクチンプロモーターを含む原核細胞プロモーターなどの細胞プロモーター）を含む。使用される他のウイルスプロモーターは、必ずしもそれに限定されないが、アデノウイルスプロモーター、ＴＫプロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択は、ここに含まれる教訓から当業者にとっては明らかである。
レトロウイルスプラスミドベクターは、次いで生産者細胞系を形成するためにパッケージング細胞系を形質導入するために使用される。形質移入されるパッケージング細胞の例は、必ずしもそれに限定されないが、ミラー、ヒト遺伝子治療、１巻、５−１４ページ（１９９０）に記載されているＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２、およびＤＡＮ細胞系を含む。サイクロンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスプラスミドベクターは、従来公知のいずれかの手段を通じてパッケージング細胞を形質導入する。このような手段は必ずしもそれに限定されないが電気穿孔法、リポソームの使用、およびリン酸カルシウム沈殿を含む。
パッケージング細胞はかくして生産者細胞となり、それはサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドを含む。このようなレトロウイルスベクターは、次いで腫瘍細胞に形質導入され、これにより形質導入腫瘍細胞は、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドを生産することになる。
レトロウイルスベクターは、腫瘍細胞にあるサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの発現の阻害を通じて、腫瘍細胞の増殖を阻害し、予防し、あるいは破壊するのに有効である量で宿主に投与される。そのような投与は前に記載の全身投与により、あるいは腫瘍にレトロウイルスベクターの直接注射によるものである。一般にレトロウイルスベクターは、少なくとも１×１０5ｃｆｕ／ｍｌの量で投与され、またそのような量は、一般に１×１０9ｃｆｕ／ｍｌを越えることはない。望ましくはレトロウイルスベクターは、約１×１０6ｃｆｕ／ｍｌから約１×１０8ｃｆｕ／ｍｌの量で投与される。投与されるべき正確な用量は、患者の年齢、および性、ならびに処置される腫瘍のサイズおよび発病度を含む各種の因子に依存する。
レトロウイルスベクターは、更に薬理許容担体、例えば食塩水、硫酸プロタミン（ニュージャージー、チェリーヒル、エルキンズ−シン，インコーポレイテッド）など、水、水性緩衝液、例えばリン酸緩衝液およびトリス緩衝液、あるいはポリブレン（ミズーリ、セントルイス、シグマ・ケミカル）などと併用して投与される。適切な薬理担体の選択は、ここに含まれる教訓から当業者にとって明らかであると見做される。
も一つの選択肢において、レトロウイルス生産者細胞は、前に記載の通りパッケージング細胞系から誘導されたものなどであり、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドを含むが、このレトロウイルス生産者細胞が宿主に投与される。このような生産者細胞は、一つの実施例において、腫瘍にごく近接した点で全身（例えば静脈内あるいは動脈内）投与され、あるいは生産者細胞は直接腫瘍に投与される。生産者細胞系は、次いでサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドに相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターを生体内で生産し、これによりそのようなレトロウイルスベクターは、次いで腫瘍細胞を形質転換する。
も一つの実施例において、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する薬剤は、サイクリンＧ１タンパク質に結合しそれを阻害するサイクリンＧ１タンパク質に対する拮抗薬である。サイクリンＧ１タンパク質への拮抗薬の例は、必ずしもそれに限定されないが、サイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体あるいは断片もしくはそれらの誘導体、および例えばサイクリンＧ１タンパク質に結合しその機能を阻害するサイクリン依存性キナーゼ阻害剤などの小分子を含む。
一つの実施例において、拮抗薬は、サイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体あるいは断片もしくはそれらの誘導体である。「断片あるいはそれらの誘導体」という用語は、未修飾抗体に関してアミノ酸残基の欠失およびもしくは置換を有し、しかもなおこのような断片あるいは誘導体が、サイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体を意味する。このような抗体は、モノクローナルあるいはポリクローナル抗体である。一つの実施例においておいて、抗体は一本鎖抗体である。
望ましくは、抗体は、その抗体あるいは断片もしくはそれらの誘導体が腫瘍細胞に入るように宿主に投与される。望ましい実施例において、サイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体あるいは断片もしくはこれらの誘導体は、サイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体あるいは断片もしくはこれらの誘導体をコード化するポリヌクレオチドで宿主の腫瘍細胞を形質導入することにより、宿主に投与される。ポリヌクレオチドは前に記載したもののような適切な発現伝達体に含まれる。一つの実施例において、ポリヌクレオチドは、前に記載したレトロウイルスベクターであるレトロウイルスベクターに包含される。
サイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体あるいは断片もしくはこれらの誘導体をコード化するポリヌクレオチドを含むベクターは、宿主にある腫瘍細胞内のサイクリンＧ１タンパク質の機能を阻害するのに有効な量で宿主に投与される。レトロウイルスベクターが使用される時、このようなレトロウイルスベクターは約１×１０6ｃｆｕ／ｍｌから約１×１０8ｃｆｕ／ｍｌの量で投与される。このようなベクターは（例えば静脈内、動脈内あるいは腹腔内投与などにより）全身投与され、あるいは選択肢として、ベクターは直接腫瘍に投与される。ベクターは次いで腫瘍細胞を形質導入し、これによりサイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体あるいは断片もしくはこれらの誘導体は腫瘍細胞内で発現される。このような抗体あるいは断片もしくはこれらの誘導体は、腫瘍細胞にあるサイクリンＧ１タンパク質と結合し、これにより腫瘍細胞内のサイクリンＧ１タンパク質の機能を阻害する。
サイクリンＧ１タンパク質の阻害を通じてこの発明に従って処置される腫瘍は、非悪性、同じく悪性、あるいは癌腫瘍を含む。処置される癌性腫瘍は、必ずしもそれに限定されないが、サイクリンＧ１が発現される骨原性肉腫およびユーイング肉腫または新生物形成疾患であり、例えば膠芽腫、神経芽腫、乳癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含む）、線維肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、肝細胞癌などの肝臓癌、および腺癌を含む。
サイクリンＧ１が阻害される前記の処置は、更に腫瘍の他の処置、例えば（ｉ）放射線；（ii）化学療法；あるいは（iii）例えばウイルスチミジンキナーゼ遺伝子などの負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドでの腫瘍の形質導入、続けて例えば負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドで形質導入された細胞を殺すガンシクロビルなどの相互作用薬の投与、などを併用して使用することができる。
一つの実施例において、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する薬剤が、前に記載の方法の一つに従って宿主に投与される。薬剤を含有するいずれかの腫瘍細胞の増殖は阻害され、予防され、あるいは破壊されるであろう。加えて、腫瘍細胞は負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチド、あるいは「自殺」遺伝子で形質導入される。負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドは、前に記載したもののような発現ベクターに含有される。一度腫瘍細胞が負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドで形質導入されると、相互作用薬が宿主に投与され、これにより相互作用薬は腫瘍細胞の増殖を阻害し、予防しあるいは破壊するために負の選択マーカーと相互作用する。
使用される負の選択マーカーは、必ずしもそれに限定されないが、単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘−帯状痘疹ウイルスチミジンキナーゼなどのチミジンキナーゼ；およびシトシンデアミナーゼを含む。
一つの実施例において、負の選択マーカーは、単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘−帯状庖疹ウイルスチミジンキナーゼよりなるグループから選択されたウイルスチミジンキナーゼである。このようなウイルスチミジンキナーゼが使用される時、相互作用薬あるいは化学療法薬は、望ましくはヌクレオシド類似体、例えばガンシクロビル、アシクロビル、および１−２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）よりなるグループから選択されたものである。このような相互作用薬は、基質としてのウイルスチミジンキナーゼにより効果的に利用され、またこのような相互作用薬は、かくしてウイルスチミジンキナーゼを発現し腫瘍細胞のＤＮＡに致死的に組み込まれ、かくして腫瘍細胞の死亡を生み出す。
も一つの実施例において、負の選択マーカーは、シトシンデアミナーゼである。シトシンデアミナーゼが負の選択マーカーである時、望ましい相互作用薬は、５−フルオロシトシンである。シトシンデアミナーゼは、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換し、後者はきわめて細胞毒性が高い。かくして、シトシンデアミナーゼ遺伝子を発現する腫瘍細胞は、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに転換し死滅する。
相互作用薬は形質導入腫瘍細胞の増殖を阻害し、予防し、あるいは破壊するのに有効な量で投与される。例えば、相互作用薬は患者に対する全体の毒性に依存して体重キログラム当り５ｍｇ乃至１０ｍｇの量で投与される。相互作用薬は望ましくは全身に、例えば静脈内投与により、非経口投与により、腹腔内投与により、あるいは筋肉内投与により投与される。
負の選択マーカーを含む前に記載したもののような発現伝達体が腫瘍細胞に投与される時、「バイスタンダー作用」が生じる、すなわち負の選択マーカーをコード化する核酸配列でもともと形質導入されなかった腫瘍細胞は、相互作用薬の投与で殺される。出願人は何らかの理論的類推に限定する意図はないが、形質導入腫瘍細胞は、相互作用薬に対し細胞外で作用するか、もしくは次いで相互作用薬の作用を受け易くなる隣接した非形質転換腫瘍細胞により取り上げられる拡散可能形態の負の選択マーカーを生産している。負の選択マーカーおよび相互作用薬の一つもしくは双方が、腫瘍細胞との間で伝達しあうことも可能である。
サイクリンＧ１タンパク質を阻害する薬剤は、また血管形成、動脈移植などの血管新生移植あるいは冠状動脈バイパス手術などの侵襲性血管処置後の血管再狭窄を予防する。かくしてこの発明のも一つの見地に従って、宿主に対し、あるいは侵襲性血管処置あるいは血管損傷の部位に、サイクリンＧ１タンパク質を阻害することより成る再狭窄を予防する薬剤が提供される。薬剤は、宿主の再狭窄を予防するのに有効な量で投与される。薬剤は侵襲性血管処置中あるいは処置後に投与される。ここで使用される「侵襲性血管処置」という用語は、必ずしもそれに限定されないが、動脈および静脈を含む一部の血管系の修復、除去、置換およびもしくは再方向付け（すなわちバイパスあるいはシャント）を含むいずれかの処置を意味する。このような処置は、必ずしもそれに限定されないが、血管形成、動脈移植などの血管新生移植、血液凝集の除去、大動脈あるいは静脈の部分除去、および冠状動脈バイパス手術などの処置を含む。
使用されるサイクリンＧ１タンパク質を阻害する薬剤は、必ずしもそれに限定されないが前に記載のものを含む。望ましくは、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する薬剤は、前に記載したサイクリンＧ１タンパク質をコード化する少なくとも１部のポリヌクレオチドに相補的であり、従ってそれと結合しあるいは雑種形成できるアンチセンスポリヌクレオチドである。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前に記載した長さを持ち再狭窄を予防するのに有効な量で投与される。この量は前に記載した通りである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血管内投与され、また侵襲性血管処置あるいは血管損傷の部位に直接投与される。
望ましい実施例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、侵襲性血管処置あるいは血管損傷の部位でサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドを用いて、血管細胞を形質導入することにより宿主に投与される。このようなアンチセンスポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドは、前に記載した適切な発現伝達体に含有され、それは侵襲性血管処置あるいは血管損傷の部位の細胞に形質導入される。一つの実施例において、発現伝達体は、前に記載したもののようなウイルスベクターである。一つの実施例において、ウイルスベクターは、前に記載した通りのレトロウイルスベクターである。
レトロウイルスベクターが使用される時、このようなレトロウイルスベクターは前に記載した量で投与され、また血管内に投与される。一つの実施例において、レトロウイルスベクターは、侵襲性血管処置あるいは血管損傷の部位に投与される。ベクターは侵襲性血管処置あるいは血管損傷の部位にある血管細胞を形質導入し、これによりアンチセンスオリゴヌクレオチドがそのような細胞内で生産され、これによりそのような細胞内のサイクリンＧ１をコード化するポリヌクレオチドの発現を制限し、かくしてそのような細胞の増殖を防止することにより再狭窄を予防する。
も一つの実施例において、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する薬剤は、前に記載の通りサイクリンＧ１タンパク質と結合し、それを阻害するサイクリンＧ１タンパク質に対する拮抗薬であり、また一つの実施例では、サイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体あるいは断片もしくはこれらの誘導体である。
抗体あるいは断片もしくはこれらの誘導体が侵襲性血管処置あるいは血管損傷の部位の細胞に入るように、抗体は宿主に投与される。望ましくは、サイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体あるいは断片もしくはこれらの誘導体は、侵襲性血管処置あるいは血管損傷の部位での細胞を、サイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体あるいは断片もしくはこれらの誘導体をコード化するポリヌクレオチドで形質導入することにより投与される。ポリヌクレオチドは、前に記載のもののような適切な発現伝達体に包含される。一つの実施例において、発現ベクターは、前に記載のようなレトロウイルスベクターであり、それは前に記載したような量で投与される。このようなベクターは、前に記載したように血管内に投与され、また侵襲性血管処置あるいは血管損傷の部位に直接投与される。
この方法は再狭窄の予防、および必ずしもそれに限定されないが心臓血管形成、動脈移植および冠状動脈バイパス手術を含む各種の侵襲性血管処置に続く血管損傷の予防あるいは処置に適用することができる。この方法はまた必ずしもそれに限定されないが、大腿動脈、頸動脈あるいは腎動脈、とりわけ腎透析フィステルと関連した腎動脈の損傷を含む血管損傷の予防および処置に適用される。
この発明のも一つの見地に従って、非腫瘍細胞をサイクリンＧ１タンパク質あるいは誘導体もしくはこれらの類似体をコード化するポリヌクレオチドで形質導入することを含む非腫瘍細胞を不死化する方法が提供される。ここで使用される「誘導体もしくはこれらの類似体」という用語は、タンパク質が天然のサイクリンＧ１タンパク質配列と関連してアミノ酸残基の欠失およびもしくは置換を有するタンパク質であり、しかもなお天然あるいは未修飾のサイクリンＧ１タンパク質としての同じ生物学的性質を保持するタンパク質であることを意味する。この発明のこの見地の範囲は、いずれかの理論的類推に限定される意図はないけれども、出願人は、非腫瘍細胞におけるサイクリンＧ１タンパク質の過発現が、続く細胞周期事象に応答する能力を保持し細胞の形質転換を生じるウイルスオンコジーンの使用を避ける細胞不死化および永久細胞系に貢献することを発見した。
サイクリンＧ１タンパク質あるいは断片もしくはこれらの誘導体をコード化するポリヌクレオチドは、前に記載された通り適切な発現伝達体に包含される。一つの実施例において、発現伝達体は、前に記載されたようにレトロウイルスベクターである。
この発明のこの見地に従って形質導入される非腫瘍細胞は、必ずしもそれに限定されないが、線維芽細胞、肝細胞、筋細胞、上皮細胞および内皮細胞を含む。
更にこの発明のも一つの見地に従って、細胞の形質導入をレトロウイルスベクターで高める方法が提供される。この方法は細胞をサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む一次発現伝達体で形質導入することを含む。一次発現伝達体は、レトロウイルスベクターではない。細胞はまた、望ましくは治療薬をコード化するポリヌクレオチドを含む二次発現伝達体で形質導入される。二次発現伝達体はレトロウイルスベクターである。この方法は、細胞を生体内あるいは生体外もしくは試験管内で形質導入するのに使用することができる。
一次発現伝達体はレトロウイルスベクターではないいずれかの発現伝達体である。このような発現伝達体は、必ずしもそれに限定されないが、プラスミドベクター、真核ベクター、原核ベクター（例えば細菌ベクターなど）および必ずしもそれに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連性ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターを含むレトロウイルスベクター以外のウイルスベクターである。
望ましい実施例において、一次発現伝達体はアデノウイルスベクターである。この実施例はいずれかの理論的類推に限定されるものではないけれども、サイクリンＧ１タンパク質は、細胞活性化が生じる時にごく初期のＧ１相に誘導される。サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターでの細胞の形質導入は、細胞内でサイクリンＧ１タンパク質の一過性過発現を提供し、これにより細胞を活性化し、また治療薬をコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの細胞内への組み込みの増加を可能にする。このような処置は、低い複製指標および低い形質導入効率を持つ細胞へのレトロウイルスベクターの導入に特に適用できる。
使用されるアデノウイルスベクターは、一つの実施例において、基本的に完全アデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターである（シェンク、他、微生物免疫学の最新の論題、１１１（３）：１−３９（１９８４））。選択肢として、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの少なくとも一部が欠失している修飾アデノウイルスベクターである。
望ましい実施例において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルス５′ＩＴＲ；アデノウイルス３′ＩＴＲ；アデノウイルス包膜シグナル；サイクリンＧ１タンパク質をコード化するＤＮＡ配列；およびサイクリンＧ１タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を制御するプロモーターを含む。ベクターは少なくとも大多数のアデノウイルスＥ１およびＥ３  ＤＮＡ配列を欠いており、しかしＥ２およびＥ４  ＤＮＡ配列ならびにアデノウイルス主要後期プロモーターにより促進されるアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡ配列のすべてを欠いていない。
一つの実施例において、ベクターは更にＥ２およびＥ４  ＤＮＡ配列よりなるグループから選択される少なくとも１個のＤＮＡ配列の少なくとも一部を欠いている。
も一つの実施例において、ベクターはアデノウイルスＥ１およびＥ３  ＤＮＡ配列の少なくとも多数を欠いており、またＥ２およびＥ４  ＤＮＡの他の一部を欠いている。
更にも一つの実施例において、７２キロダルトン結合タンパク質をコード化するＥ２ａ領域の遺伝子は、突然変異され３２℃で活性である温度感受性タンパク質を生産し、この温度でウイルス粒子が生産される。この温度感受性突然変異体は、エンシンジャー、他、ウイルス学ジャーナル、１０：３２８−３３９（１９７２）：ファン・デル・フリート、他、ウイルス学ジャーナル、１５：３４８−３５４（１９７５）、およびフリーフェルド、他、ウイルス学ジャーナル、１２４：３８０−３８９（１９８３）に記載されている。
このようなベクターは、望ましい実施例において、標準技術に従ってシャトルプラスミドを構築することによりまず構築され、このシャトルプラスミドは５′末端で開始し、「臨界左端要素」を含有し、これはアデノウイルス５′ＩＴＲ、アデノウイルス包膜シグナル、およびＥ１ａエンハンサー配列；プロモーター（アデノウイルスプロモーターあるいは外部プロモーターであるもの）；多重クローニング部位（前に記載した通りのもの）；ポリＡシグナル；およびアデノウイルスゲノムのセグメントに対応するＤＮＡセグメントを含む。ベクターは更に三部分リーダー配列を含有する。アデノウイルスゲノムに対応するＤＮＡセグメントは、修飾あるいは突然変異アデノウイルスを用いる相同的組換えの基質として役立ち、また各配列は、例えばゲノムの３３２９塩基対から６２４６塩基対までより短いアデノウイルス５ゲノムのセグメントを取り囲む。プラスミドは更に選択マーカーおよび複製起点を含む。複製起点は細菌複製起点である。このようなシャトルプラスミドの代表的な例はｐＡｖＳ６を含み、これは１９９４年１０月２７日公開された公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２３５８２号および１９９５年４月１３日公開されたＷＯ９５／０９６５４号に記載されている。サイクリンＧ１タンパク質をコード化するＤＮＡ配列は、次いで多重クローニング部位に挿入されプラスミドベクターを生産する。
この構築物は、次いでアデノウイルスベクターを生産するために使用される。相同的組換えは、少なくとも多数のＥ１およびＥ３アデノウイルスＤＮＡ配列が欠失している修飾あるいは突然変異アデノウイルスで実行される。このような相同的組換えは、リン酸カルシウム沈殿により２９３細胞などのヘルパー細胞系へのプラスミドベクターおよび修飾アデノウイルスの同時形質移入を通じて実施される。このような相同的組換えに際し、組換えアデノウイルスベクターが形成され、それはＮｏｔＩ部位および相同的組換え断片の間のシャトルプラスミドから誘導されたＤＮＡ配列、および相同的組換え断片および３′ＩＴＲの間のＥ１およびＥ３欠失アデノウイルスから誘導されたＤＮＡを含む。
一つの実施例において、相同的組換え断片は、アデノウイルス５（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５）ゲノムのヌクレオチド３３２９から６２４６でオーバーラップする。
このように相同的組換えを通じて、アデノウイルス５′ＩＴＲ、アデノウイルス包膜シグナル；Ｅ１ａエンハンサー配列；プロモーター；サイクリンＧ１タンパク質をコード化するＤＮＡ配列；ポリＡシグナル；Ｅ１およびＥ３アデノウイルスＤＮＡ配列の少なくとも大部分を欠いているアデノウイルスＤＮＡ；およびアデノウイルス３′ＩＴＲを含むベクターが形成される。このベクターは更に三部分リーダー配列を含む。ベクターは次いで２９３ヘルパー細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）などのヘルパー細胞系に形質移入され、この細胞系はＥ１ａおよびＥ１ｂＤＮＡ配列を含み、それはウイルス複製に必要なものであり、またアデノウイルス粒子を生成する。形質移入は電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、微量注入、あるいはプロテオリポソームを通じて行われる。
前に記載のベクターは、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するＤＮＡ配列のクローニングベクターへの挿入を促進するために多重クローニング部位を含む。一般に多重クローニング部位は「稀有」制限酵素部位；すなわち１０，０００塩基対毎に約１個から１００，０００塩基対毎に約１個までの頻度で真核遺伝子内に見出される部位を含む。適切なベクターは、かくして多重クローニング部位の適切な制限部位で標準技術によりクローニングベクターを切断し、次いでサイクリンＧ１タンパク質をコード化するＤＮＡ配列をクローニングベクターに結合することにより形成される。
サイクリンＧ１タンパク質をコード化するＤＮＡ配列は、前に記載されたものから選択される適切なプロモーターの制御下にあり、あるいはＤＮＡはそれ自身の天然プロモーターの制御下にある。
一つの実施例において、アデノウイルスはここに含まれる教訓と併用してケットナー、他、全米科学アカデミー紀要、９１巻、６１８６−６１９０ページ（１９９４）に記載された方法に従って、アデノウイルスゲノムを含む酵母人工染色体（すなわちＹＡＣ）を用いることにより構築される。この実施例において、アデノウイルス酵母人工染色体は、アデノウイルスＤＮＡおよびアデノウイルス左および右ゲノム末端のセグメントを運ぶ酵母人工染色体プラスミドベクターの間で生体内相同的組換えにより生産される。サイクリンＧ１タンパク質をコード化するＤＮＡ配列は、次いでアデノウイルスＤＮＡにクローンされる。修飾アデノウイルスゲノムは、次いで前に記載のアデノウイルスベクター粒子を生成するために使用されるために、アデノウイルス酵母人工染色体から切除される。
二次発現伝達体であるレトロウイルスベクターは、前に記載した通りである。このようなレトロウイルスベクターは、治療薬をコード化するポリヌクレオチドを含む。「治療薬」という用語は一般的な意味で使用され、治療剤、予防剤、および置換剤を含む。
レトロウイルスプラスミドベクターに含有される治療薬をコード化するポリヌクレオチドは、必ずしもそれに限定されないが、ＴＮＦ−αなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子をコード化するポリヌクレオチド；インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γなどのインターフェロンをコード化する遺伝子；ＩＬ−１，ＩＬ−１β、およびインターロイキン２−１４をコード化する遺伝子；ＧＭ−ＣＳＦをコード化する遺伝子；アデノシンデアミナーゼ、つまりＡＤＡをコード化する遺伝子；細胞増殖因子、つまりリンパ球の増殖因子であるリンホカインなどをコード化する遺伝子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）、およびケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）をコード化する遺伝子；可溶ＣＤ４をコード化する遺伝子；因子ＶＩＩＩ；因子ＩＸ；チトクロームｂ；グルコセレブロシダーゼ；Ｔ細胞レセプター；ＬＤＬレセプター、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＣ、ＡｐｏＡＩ、およびコレステロール輸送および代謝に含まれる他の遺伝子；アルファ−１アンチトリプシン（α１ＡＴ）遺伝子；インスリン遺伝子；ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子；ＣＦＴＲ遺伝子；ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子などの負の選択マーカーあるいは「自殺」遺伝子、例えば単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、サイトメガロウイルスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、および水痘−帯状痘疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子；抗体の抗原結合領域のためのＦｃレセプター、ウイルス複製を阻害するアンチセンス配列、例えばＢ型肝炎あるいは非Ａ非Ｂ型ウイルス肝炎などの複製を阻害するアンチセンス配列など；アンチセンスｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチド；また必ずしもそれに限定されないが、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（Ｍｎ−ＳＯＤ）、カタラーゼ、銅−亜鉛−スーパーオキシドジスムターゼ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＥＣ−ＳＯＤ）、およびグルタチオン還元酵素などの抗酸化剤；組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）；尿プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼ）；ヒルジン；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子；酸化窒素シンセターゼ；血管作用性ペプチド；血管形成ペプチド；ドーパミン遺伝子；ジストロフィン遺伝子；β−グロビン遺伝子；α−グロビン遺伝子；ＨｂＡ遺伝子；ｒａｓ，ｓｒｃおよびｂｃ１遺伝子などのプロトオンコジーン；ｐ５３およびＲｂなどの腫瘍サプレッサー遺伝子；ＬＤＬレセプター；乳癌、卵巣癌、胃癌、および子宮内膜癌を処置するヘレグリン−αタンパク質遺伝子；Ｔ細胞抗原レセプターのβ鎖内に含有されるエピトープに特異的なモノクローナル抗体；多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子；リボザイムをコード化するポリヌクレオチド；アンチセンスポリヌクレオチド；アンギオテンシン変換酵素、血管平滑筋カルシウムチャネル、アドレナリン作用性レセプターの拮抗阻害剤として作用する分泌ペプチドをコード化する遺伝子；および中枢神経系内でアミロイドプラークを分解する酵素をコード化するポリヌクレオチド、を含む。
治療薬をコード化するポリヌクレオチドは、適切なプロモーターの制御下にある。使用される適切なプロモーターは、必ずしもそれに限定されないが、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ヒストンプロモーター；ｐｏｌＩＩＩプロモーター、β−アクチンプロモーター；ＭＭＴＶプロモーターなどの誘導プロモーター；メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アデノウイルスプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；Ｂ１９パルボウイルスプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純性ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲｓ；ヒト成長ホルモンプロモーター、およびＭｘＩＦＮ誘導プロモーターを含む。このプロモーターは、更に治療薬をコード化するポリヌクレオチドを制御する天然プロモーターでもあり得る。しかしこの発明の範囲が、特異的な外部遺伝子あるいはプロモーターにより制限されるべきものでないことは理解されねばならない。
望ましくはアデノウイルスベクターであり、サイクリンＧ１タンパク質あるいはその類似誘導体をコード化するＤＮＡ配列を含む一次発現伝達体、および治療薬をコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターは、生体内あるいは試験管内で細胞を形質導入する。
一つの実施例において、細胞を二次発現伝達体（すなわちレトロウイルスベクター）で形質導入する前に、細胞は一次発現伝達体、それも望ましくはアデノウイルスベクターで形質導入される。も一つの実施例において細胞は一次発現伝達体および二次発現伝達体で同時に形質導入される。
生体内で投与される時、アデノウイルスベクターは、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを持つ望ましい細胞を形質導入するのに有効な量で投与される。アデノウイルスベクターは、例えば静脈内、動脈内、あるいは腹腔内投与によるなど全身投与される。選択肢として、アデノウイルスベクターは、直接非全身的注射により望ましい組織器官、あるいは細胞塊、例えば腫瘍などに投与される。一般に、アデノウイルスベクターは約１から約１０までの感染多重度で投与される。
レトロウイルスベクターは、生体内で動物宿主に動物内で治療作用を生産するのに有効な量で投与される。
動物はヒトおよび非ヒト霊長類を含む哺乳類である。レトロウイルスベクターは、例えば静脈内あるいは動脈内もしくは腹腔内で全身に、あるいは望ましい組織、器官あるいは細胞塊例えば腫瘍などへの直接非全身的注射により投与される。
レトロウイルスベクターは、動物に治療効果を生産するのに有効な量で動物に投与される。一般に、レトロウイルスベクターは、少なくとも１×１０5ｃｆｕ／ｍｌの量で投与され、また一般にそのような量は、１×１０9ｃｆｕ／ｍｌを越えない。望ましくはレトロウイルスベクターは、約１×１０6ｃｆｕ／ｍｌから約１×１０8ｃｆｕ／ｍｌまでの量で投与される。投与される正確な用量は、患者の年齢、身長、重量、および性、処置される疾患、およびこれらの発病度を含む各種の因子に依存する。
レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクター各自は、例えば生理食塩水などの薬理許容担体内で患者に投与される。他の薬理担体は、必ずしもそれに限定されないが、鉱油、アラム、およびリポソームのような脂質小嚢を含む。適切な薬理担体の選択は、ここに含まれる教訓から当業者の範囲にあるものと見做される。
一つの実施例において、レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターで生体内で形質導入される真核細胞は、真核性ヒト細胞である。治療薬をコード化する遺伝子は、例えば治療遺伝子あるいは標識遺伝子などの臨床的有用性を持ついずれかの遺伝子であることができる。望ましくは、一次ヒト細胞は血球である。ここで使用される「血球」という用語は、あらゆる形態の有核血球同じくその先駆体および前駆体を含むことを意味する。
血球により運ばれる遺伝子は、血球の治療作用を直接高めるいずれかの遺伝子であり得る。血球により運ばれる遺伝子は、血友病の治療に有用な凝固因子（例えば因子ＶＩＩＩあるいは因子ＩＸ）をコード化する遺伝子などのそれが通常は持たない治療作用を血球に発揮させるいずれかの遺伝子であり得る。遺伝子は治療作用を持つ１個もしくはそれ以上の製品をコード化できる。適切な遺伝子の例は、サイトカインをコード化するもの、例えばＴＮＦ、インターロイキン（インターロイキン１−１２）、インターフェロン（α、β、γ−インターフェロン）、Ｔ細胞レセプタータンパク質および抗体に結合するＦｃレセプターを含む。
レトロウイルスベクターは、必ずしもそれに限定されないが、アデノシンデアミナーゼ欠損、鎌状赤血球貧血、サラセミア、血友病、糖尿病、α−アンチトリプシン欠損、アルツハイマー病などの脳疾患、および増殖疾患などの他の病気、ならびに例えばコレステロールが代謝されるような変化により生じる心臓疾患および免疫系の欠損を含む。
一つの実施例において、レトロウイルスベクターは、例えばウイルスチミジンキナーゼ、より詳細には、単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子などの負の選択マーカーを含む。このようなレトロウイルスベクターは、前に記載したアデノウイルスベクターと併用して生体内でヒト患者の腫瘍細胞に（とりわけ癌細胞に）投与される。アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターは、次いで腫瘍細胞を形質導入する。レトロウイルスベクターが腫瘍細胞を形質導入した後に、患者はガンシクロビルあるいはアシクロビルなどの相互作用薬を与えられ、この相互作用薬は負の選択マーカーを含むレトロウイルスベクターで形質導入されたすべての複製細胞（すなわち腫瘍細胞）を殺すために負の選択マーカーにより発現されるタンパク質と相互作用する。
前に記載されたアデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターは、更に遺伝子治療処置の有効性を決定するために動物モデルに投与される。例えばサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターおよび治療薬をコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターは、同じ種の動物に投与される。レトロウイルスベクターは、異なった量で動物に投与される。動物における遺伝子治療処置の有効性を決定することから、ヒト患者に投与されるレトロウイルスベクターの有効量を決定することができる。
も一つの実施例において、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含むアデノウイルスベクターは、治療薬をコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターを生成するレトロウイルス生産者細胞と併用して患者に生体内で投与される。
このような実施例は、例えば肝腫瘍、骨腫瘍、および肺腫瘍などの（悪性および非悪性腫瘍を含む）腫瘍の処置に特に適用される。例えば、生産者細胞は、負の選択マーカーを含むレトロウイルスプラスミドベクターを含む。アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターは次いで腫瘍に投与され、これにより生産者細胞は負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクター粒子を生成する。アデノウイルスベクターおよびレトロウイルス生産者細胞により生成するレトロウイルスベクター粒子は腫瘍細胞を形質導入し、これにより腫瘍細胞は負の選択マーカーを生産する。相互作用薬の患者への投与に際し、形質導入腫瘍細胞は殺される。
選択肢として、アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターは、試験管内で真核細胞を形質導入し、これにより真核細胞は、治療薬の試験管内での生産のために試験管内で培養され、あるいは選択肢として、形質導入真核細胞は、遺伝子治療処置の一部として宿主に投与され、これにより形質導入真核細胞は宿主内で生体内で治療薬を発現する。
前に述べた通り、この発明の前記の方法は、（サイクリンＧ１タンパク質を阻害することにより腫瘍を処置することが望まれる時は）サイクリンＧ１タンパク質を阻害する薬剤をコード化するポリヌクレオチドか、あるいは（細胞系を不死化しあるいは細胞のレトロウイルス形質導入を高めることが望まれる時は）サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドのいずれかを含む適切な発現伝達体の使用を通じて達成される。かくしてこの発明のも一つの見地に従って、一つの実施例でサイクリンＧ１タンパク質を阻害する薬剤である薬剤をコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。このような薬剤は、例えばサイクリンＧ１タンパク質を認識するアンチセンスポリヌクレオチドあるいは抗体もしくは断片あるいはこれらの誘導体、あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤など前に記載のものを含む。も一つの実施例において、ポリヌクレオチドはサイクリンＧ１タンパク質をコード化する。
発現伝達体は前に記載のものから選択され、また望ましくは前に記載の通りＲＮＡウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターを含むウイルスベクターである。
一つの実施例において、ウイルスベクターはＲＮＡウイルスベクターであり、また望ましくは前に記載のものなどのレトロウイルスベクターである。も一つの実施例において、ウイルスベクターはＤＮＡウイルスベクターであり、また望ましくは前に記載のものなどのアデノウイルスベクターである。
この発明の更なる見地に従って、サイクリンＧ１タンパク質の増加した発現の検出により癌を検出する一つの方法が提供され、そのような増加した発現は正常な非癌性細胞と比較して、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの増加した量の検出により、あるいはサイクリンＧ１タンパク質の増加した量の検出により検出される。この方法は（ｉ）サイクリンＧ１タンパク質およびもしくは（ii）サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチド、と結合する薬剤に細胞を接触させることを含む。サイクリンＧ１タンパク質およびもしくはサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドへの薬剤の結合が次いで決定される。
サイクリンＧ１タンパク質は細胞内で発現され、またサイクリンＧ１タンパク質の増加した発現を検定するために、サイクリンＧ１タンパク質およびもしくはサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドと結合する薬剤に接触する前に検定内で薬剤の結合を可能にするために適切な処置が採用される。このような処置は必ずしもそれに限定されないが、検定に先立つ細胞の組織サンプルの固定を含む。
この見地で使用される薬剤は必ずしもそれに限定されないが、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドに雑種形成するポリヌクレオチド（例えばＤＮＡあるいはＲＮＡプローブ）、およびサイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体あるいは断片もしくはこれらの誘導体を含む。
一つの実施例において、薬剤は、サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドに雑種形成するポリヌクレオチドである。
も一つの実施例において、薬剤は、サイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体あるいは断片もしくはこれらの誘導体である。このような抗体は必ずしもそれに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および一本鎖抗体である。
癌のある種の性質は、細胞内で発現されるサイクリンＧ１タンパク質に結合する量、あるいは細胞内で存在するサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドに結合する量の分析を通じて決定される。正常細胞で観察されたものと比較したサイクリンＧ１タンパク質と、あるいはサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドとの薬剤の結合の上昇量の決定は、癌細胞の存在を暗示するものとなる。この方法に従って決定される癌は、骨原性肉腫およびユーイング肉腫、ならびに前に記載したものなどのサイクリンＧ１が発現される他の新生物形成疾患を含む。
サイクリンＧ１タンパク質あるいはサイクリンＧ１タンパク質を発現するポリヌクレオチドとの薬剤の結合の決定は、当業者に既知の各種検定方法により決定される。このような検定は必ずしもそれに限定されないが、直接および間接サンドイッチ検定、比色検定およびエリザ検定を含む。
前記の検定において、サイクリンＧ１タンパク質あるいはサイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドと結合する薬剤、あるいは間接サンドイッチ検定が使用される時に薬剤と結合する結合剤は、検出可能標識あるいはマーカーに連結される。このような標識あるいはマーカーは、必ずしもそれに限定されないが、例えばヨード、コバルトあるいはトリチウムの放射性同位元素；酵素；蛍光色素；吸収色素；化学ルミネセンス物質；スピン標識；ビオチン；ヘマトキシリン；当業者に既知の染色粒子あるいはいずれか他の標識物質を含む。
一つの実施例において、癌細胞であると思われる固定細胞が、サイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体と接触される。結合抗体の検出は、抗体と結合するビオチン−ストレプトアビジン複合体などのビオチン−アビジン複合体を使用する間接サンドイッチ検定により決定される。アビジンは、例えばアルカリ性ホスファターゼなどの酵素と結合する。サンプルは、染色反応製品を製造する酵素の基質と接触される。染色反応製品の発展を測定することにより、細胞サンプルにあるサイクリンＧ１タンパク質の量が決定され、これにより癌の存在およびもしくはそれの範囲ならびに発病度を決定することができる。
実施例
この発明はここで以下の実施例と関連して説明されるが、しかしこの発明の範囲は、それにより限定されることを意図するものではない。
実施例１
材料および方法
アンチセンスサイクリンＧ１、アンチセンスサイクリンＤ１、およびｐ２１／ＷＡＦ１／ＣＩＰ１発現構築物のクローニング
ヒトサイクリンＧ１の完全コード化領域（図１）（ウー、他、腫瘍学リポート、１巻、７０５−７１１ページ（１９９４））、サイクリンＤ１（ジオン、他、細胞、６５巻、６９１−６９９ページ（１９９１））および終結コドンを含むｐ２１／ＷＡＦ１／ＣＩＰ１（ハーパー、他、分子細胞生物学、６巻、３８７−４００ページ（１９９５）；エル−ディーリー、他、細胞、７５巻、８１７−８２５ページ（１９９３））は、プライマー指向ＲＴ−ＰＣＲ増幅により用意された。アンチセンスサイクリンＧ１（ａＧ１）発現構築物を創り出すために、未翻訳領域の−６５塩基対を含む５８６塩基対Ｎ末端断片が、ヒトＷＩ−３８線維芽細胞（メリーランド、ロックビル、ＡＴＣＣ）ｃＤＮＡライブラリーからまず最初に分離されたＣＹＣＧ１からＸｂａＩ／ＨｐａＩを用いる二重消化により放出され、次いで平滑連結によりＥｃｏＲＶ部位でｐｃＤＮＡ３ベクター（カリフォルニア、サンディエゴ、インバイトロゲン）にクローンされた。サイクリンＤ１（アンチセンス配向、ａＤ１）の６０５Ｎ−末端領域およびＷＡＦ１／ＣＩＰ１（ｐ２１）の４９５塩基対完全コード化領域は、それぞれＮｄｅＩ／ＮｃｏＩおよびＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩでの消化により放出され、ＥｃｏＲＶ部位でｐｃＤＮＡ３ベクターへの平滑末端クローニングが続いた。各構築物の構造は、修飾ジデオキシ鎖終結法（ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカルズ）を用いて、手動ＤＮＡ配列分析により確認された。
細胞周期制御遺伝子を持つレトロウイルスベクターの構築（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、Ｇ１ａＤ１ＳｖＮａ、およびＧ１ｐ２１ＳｖＮａ：レトロウイルスベクター源、ｐＧ１ＸＳｖＮａ；挿入源、ｐｃＤＮＡ３ａＧ１、ｐｃＤＮＡ３ａＤ１、ｐｃＤＮＡ３ｐ２１）
各レトロウイルスベクターを創り出すために、ｐＧ１ＸＳｖＮａ（メリーランド、ゲイザーズバーグ、ジェネティック・セラピー，インコーポレイテッド）はＮｏｔＩで消化され、５′リン酸塩は仔ウシ腸アルカリホスファターゼの処置により除去され、また生成する断片は次いでゲル精製（アガロース１％）され、切除され、また電気溶離された。ｐＧ１ＸＳｖＮａは、ｐＧ１から誘導されたレトロウイルスプラスミドベクターであり（１９９１年７月２５日公開されたＰＣＴ出願番号第ＷＯ９１／１０７２８で説明されている）、それはレトロウイルス５′ＬＴＲ、レトロウイルス３′ＬＴＲ、多重クローニング領域およびＳＶ４０プロモーターの制御下でのネオマイシン耐性遺伝子を含んでいる。ｐＧ１ＸＳｖＮａは、更に１９９５年４月１３日公開されたＰＣＴ出願番号第ＷＯ９５／０９６５４で説明されている。この処置は、再連結あるいは再環状化できないＤＮＡの５８５６塩基対長断片を生成した。ａＧ１、ａＤ１およびｐ２１挿入断片を分離するために、各プラスミドＤＮＡｓはそれぞれ、ａＧ１にはＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩでおよびａＤ１およびｐ２１にはＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで二重消化された。これら消化物は１％アガロースゲルに分解され、ａＧ１の５９７塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ断片、ａＤ１の６３２塩基対ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ断片、およびｐ２１の５２２塩基対ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ断片を産出した。これらのバンドは次いでアガロースゲルから切除され、電気溶離された。各挿入片のＮｏｔＩ末端、は消化ｐＧ１ＸＳｖＮａベクターのＮｏｔＩ末端に連結され、また１％アガロースゲル上で分離され、ａＧ１、ａＤ１およびｐ２１それぞれに対し６４５３、６４８８、および６３７８塩基対長断片を産出した。各断片は次いでクレノウ断片で平滑末端を生成するために処置され、また次いで対象となる各自の遺伝子を含む閉鎖プラスミドＤＮＡを生成するために連結された。成功したクローニングおよび挿入配向が制限分析により決定された。ＢｓｔＥＩＩおよびＮｏｔＩでの消化により生成される予期されたＤＮＡ断片は、ａＧ１、ａＤ１およびｐ２１挿入片それぞれに対し９２０、９５５および８４５塩基対であり、またベクターＤＮＡにとっては±５５００塩基対であった。
レトロウイルスベクター上澄みおよび生産者細胞系
βガラクトシダーゼおよびＨＳｔｋ発現ベクターが高力価ＰＡ３１７パッケージング細胞クローン（力価：βガラクトシダーゼおよびＨＳｔｋベクターそれぞれに対し１．３×１０6および４．９×１０6Ｇ４１８rコロニー形成単位、ｃｆｕ／ｍｌ）としてジェネティック・セラピー、インコーポレイテッド（メリーランド、ゲイザーズバーグ）の好意により同社より提供された。細胞周期制御酵素ｃＤＮＡｓを運ぶ３種の実験用レトロウイルスプラスミドベクターは、ＰＡ３１７細胞にパッケージされ（ミラー、他、分子細胞生物学、６巻、２８９５−２９０２ページ（１９８６））、貯留ベクター上澄みとして試験された（ベクター力価：それぞれ１×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）。ベクターは以下の各ベクターに含まれるプロモーターの桁およびそれに含まれるコード化領域を示すために、Ｇ１ＢｇＳｖＮａ、Ｇ１ＴＫ１ＳｖＮａ．７、Ｇ１ｐ２１ＳｖＮａ、Ｇ１ａＤ１ＳｖＮａおよびＧ１ａＧ１ＳｖＮａとして引用される（Ｇ１ベクター、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）配列；Ｂｇ、βガラクトシダーゼあるいはｌａｃＺ遺伝子；ＨＳｔｋ、単純性ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子；ａＧ１、アンチセンスヒトサイクリンＧ１；ａＤ１、アンチセンスサイクリンＤ１；ｐ２１、Ｃｄｋ阻害剤ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１遺伝子；Ｓｖ、ＳＶ４０初期領域エンハンサー／プロモーター；およびＮａ．７、ｎｅｏr遺伝子、クローン７）。レトロウイルスベクターＧ１ＴＫ１ＳｖＮａ７は、更に１９９５年４月１３日公開されたＰＣＴ出願番号第ＷＯ９５／０９６５４号に記載されている。レトロウイルスベクターＧ１ＢｇＳｖＮａは、プラスミドｐＧ１ＢｇＳｖＮａから生成された。ｐＧ１ＢｇＳｖＮａはｐＳｖＮａ（ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９５／０９６５４号）およびｐＧ１Ｂｇ（ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９１／１０７２８号）をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより構築された。ＳＶ４０プロモーターおよびネオマイシン耐性遺伝子を含有するｐＳｖＮａのＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＧ１Ｂｇに連結されｐＧ１ＢｇＳｖＮａを形成した。
ＳＶ４０プロモーター駆動ｎｅｏr遺伝子のみを含有するベクター源、Ｇ１ＸＳｖＮａは、遺伝子形質導入およびＧ４１８選択の作用のための対照として使用された。
細胞、細胞培養条件およびｌａｃＺ、細胞周期制御遺伝子、およびＨＳｔｋベクターでの細胞の形質導入
ヒト骨原性肉腫（ＭＧ−６３、ＡＴＣＣ番号  ＣＲＬ１４２７）細胞および一次正常二倍体ヒト線維芽細胞（肝起源のもの）は、６ウエル平板のそれぞれで２．５×１０4細胞の平板培養密度で、１０％ＦＢＳで補充されたＤＭＥＭ（Ｄ１０）で培養された。一晩の付着後、細胞はポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下で２時間それぞれのレトロウイルスベクター１ｍｌに露出され、その後１ｍｌの新鮮Ｄ１０が各ウエルに加えられた。ｌａｃＺベクターでの形質導入４８時間後に、遺伝子移転効率がＸ−ｇａｌ染色および顕微鏡検査でｌａｃＺ正細胞の割合を決定することにより測定された。
ＨＳｔｋベクター形質導入ＭＧ−６３細胞におけるガンシクロビル（ＧＣＶ）細胞障害作用／バイスタンダー作用
初期用量応答研究は、ＭＧ−６３細胞の感受性および形質導入細胞を選択するのに使用されるＧ４１８の最適濃度を決定した。Ｇ４１８の選択に際して、変化した割合のＨＳｔｋ形質導入および非形質導入ＭＧ−６３細胞（平板培養密度２．５×１０4細胞）が、６ウエル平板のそれぞれで１０日間２０μｇＧＣＶ／ｍｌＤ１０に露出された。従ってＨＳｔｋ形質導入ＭＧ−６３におけるＧＣＶのバイスタンダー作用は、１０日培養の各ウエルにおける細胞密集の度合を決定することにより測定された。ＧＣＶ処置のバイスタンダー作用は、ＨＳｔｋ形質導入ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５８）のそれと比較された。
キメラレトロウイルスベクターを運ぶＭＧ−６３細胞における細胞増殖、タンパク質発現、およびアポトーシスの評価
細胞周期修飾物質を運ぶレトロウイルスベクターの細胞分裂抑制作用を評価するために、細胞周期修飾物質を発現する対照ベクターあるいはベクター類で形質導入された細胞は、形質導入後連続間隔（０、２４、４８、７２、１４４および１９２時間）で各培養の成育可能細胞数を計数することによりその増殖能力を評価された。タンパク質発現のウエスタン分析がヒトサイクリンＧ１のＣ末端１８アミノ酸を認識するポリクローナル抗ペプチド抗体（ウー、他、１９９４）を用いて、これまでに記載（ウイリアムズ、他、生物学化学ジャーナル、２６８巻、８８７１−８８８０ページ（１９９３）；ウー、他、腫瘍学レポート、２巻、２２７−２３１ページ（１９９５））された通り実行された。ＭＧ−６３細胞でアポトーシスの導入におけるアンチセンスＧ１、アンチセンスＤ−１、およびｐ２１発現の比較効率を分析するために、細胞は初期にアポトーシス（細胞収縮、細胞溶解、核フラグメント化、およびクロマチン凝縮）と関連した形態変化の顕微鏡検査により検討された。アポトーシス細胞の相対数が更に確認され、アポプターグ・プラス原位置アポトーシス検出キット（メリーランド、ゲイザーズバーグ、オンカー）を用いて定量され、このキットはエンドヌクレアーゼ媒介ＤＮＡフラグメント化により生成される発生期３′−ＯＨ  ＤＮＡ末端を特異的に検出する。ａＧ１、ａＤ１、およびｐ２１挿入片を運ぶレトロウイルスベクター、ならびに対照ベクターの間の差異の有意性は分散分析により決定された。
結果
レトロウイルスベクターを用いる遺伝子治療の標的としてのヒト骨原性肉腫
初期の研究は、Ｇ１ＢｇＳｖＮａレトロウイルスベクター構築物を用いて、ヒト骨肉腫細胞の形質導入効率を特徴付けることを目標とした。レトロウイルスベクターの明白な形質導入効率は、２０−３０％の形質導入効率が観察された正常な二倍体線維芽細胞と比較して、形質転換ＭＧ−６３細胞では、８０−９０％に近付く相対的に高いものであった。図２は、ｌａｃＺベクターでの形質導入に続くβ−ガラクトシダーゼ染色ＭＧ−６３細胞を示している。次に単純性ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳｔｋ）遺伝子で形質導入された細胞を非形質導入細胞と混合し、続く２０μｇ／ｍｌガンシクロビル露出による潜在的「バイスタンダー」細胞致死作用が検討された。図３は、ＧＣＶ（２０μｇ／ｍｌ）の存在下で１０日間培養されたＨＳｔｋ＋およびＨＳｔｋ−ＭＧ−６３細胞の混合物における密集の度合（％）を示すグラフである。ＨＳｔｋ−細胞１００％を含む非形質導入培養物は、７５％の密集を示した。これに反して、１０％ＨＳｔｋ＋／９０％ＨＳｔｋ−および３０％ＨＳｔｋ＋／７０％ＨＳｔｋ−細胞を含む培養物は、１５％の密集を示したに過ぎず、一方５０％ＨＳｔｋ＋／５０％ＨＳｔｋ−細胞を含む培養物は、１０％の密集を達成し、また５０％以上のＨＳｔｋ＋細胞培養培養物は１０％＞の密集を達成した。生存曲線の非線形性は、ＭＧ−６３細胞の混合培養物でＧＣＶの有意バイスタンダー作用を示している。レトロウイルスベクターの高い形質導入効率およびＨＳｔｋ＋／ＧＣＶ処置に対する際だったバイスタンダー作用の発生はいずれも、レトロウイルスベクターを使用するヒト骨原性肉腫に対する遺伝子治療の実現可能性を実証するものとなる。
培養ヒト骨原性肉腫細胞におけるアンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクターの細胞分裂抑制作用および細胞致死作用
実験的レトロウイルスベクター構築物の構造が図４で図式で示され、３個の細胞周期制御タンパク質のそれぞれの遺伝子の下流に位置するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏr）遺伝子の配置を含み、このタンパク質の内２個は、アンチセンス配向で設計された切形断片である。アンチセンスサイクリンＧ１、アンチセンスサイクリンＤ１、およびｐ２１発現ベクターの転写物の予期サイズは、それぞれ３４２１、３４５６、および３３４６塩基対である。試験ベクターのそれぞれを持つＭＧ−６３細胞の形質導入（図５）は、ｎｅｏr遺伝子のみを発現する対照ベクターを含む形質導入培養物と比較した時、形質導入２４乃至１６８時間後で観察された成育可能細胞数の著しい減少を明らかにした。細胞密度は、アンチセンスサイクリンＧ（Ｇ１ａＧ１）、アンチセンスサイクリンＤ１（Ｇ１ａＤ１）、およびｐ２１（Ｇ１ｐ２１）を運ぶレトロウイルスベクター、ならびに対照ベクターＧ１ＸＳｖＮａ（Ｇ１Ｘ）での形質導入後連続間隔でＭＧ−６３細胞の培養物で細胞計数により測定される。
図６で示されるように、ｐ２９サイクリンＧ１タンパク質の比較発現がウエスタンブロッティングで分析され、アンチセンスＧ１ベクターを運ぶＭＧ−６３細胞で著しく減少することが発見された。
アンチセンスノックアウトサイクリンＧ１はヒト骨原性肉腫細胞にアポトーシスを誘導する
ＭＧ−６３細胞の形態学的外観が、アンチセンスサイクリンＧ１、アンチセンスサイクリンＤ１、ｐ２１阻害剤を運ぶレトロウイルスベクターおよび対照ベクター構築物の形質導入７２時間後に顕微鏡検査により観察された（図７）。アンチセンスサイクリンＧ１、同じくアンチセンスサイクリンＤ１およびｐ２１構築物を含むベクターで形質導入された培養で観察された細胞密度の著しい減少（図５参照）に加えて、これら細胞周期制御要素のそれぞれで形質導入された細胞内に細胞収縮、核セグメント化、クロマチン凝縮、および核フラグメント化を含むアポトーシス変化の形態学的証拠が認められた（アーレンズ、他、実験病理学国際評論、３２巻、２２３−２５４ページ（１９９１）、ワイリー、他、細胞学国際評論、６８巻、２５１−３０６ページ（１９８０））。細胞死滅のメカニズムを更に調査するために、分子／免疫細胞化学アプローチ（アーレンズ、他、アメリカ病理学ジャーナル、１３６巻、５９３−６０８ページ（１９９０）；ガブリエリ、他、細胞生物学ジャーナル、１１９巻、４９３−５０１ページ（１９９２））がアポトーシスを特徴付けるエンドヌクレアーゼ媒介ＤＮＡ切断フラグメントを検出するために使用された（バーシュ、他、生化学細胞生物学、６８巻、１０７１−１０７４ページ（１９９０）；コンプトン、癌転移、１１巻、１０５−１１９ページ（１９９２））。図８は、アンチセンスサイクリンＧ１、アンチセンスサイクリンＤ１、およびｐ２１構築物を含むキメラベクターを運ぶ培養内でＤＮＡフラグメント化の免疫細胞化学分析によるアポトーシス細胞の検出を示す。細胞周期制御ベクターで形質導入された培養のそれぞれへのアポトーシスの導入は、対照ベクターで形質導入された培養物（平均出現率＝３．６±４．１％、ｎ＝６）と比較した時きわめて有意（アンチセンスサイクリンＧ１、平均出現率＝３８．８±５．０％、ｎ＝６、ｐ＜０．００１；アンチセンスサイクリンＤ１、平均出現率＝３７．４±２４．４％、ｎ＝６、ｐ＜０．０１；およびｐ２１、平均出現率＝３７．５±８．２％、ｎ＝６；ｐ＜０．００１）であると決定された。これらの結果は、これらレトロウイルス媒介細胞周期遮断の観察された細胞致死作用がアポトーシスから生じることを確証する。
転移性骨原性肉腫は、それが不変的に致命的な結果と関連しているので、実験的遺伝子治療の標的となる。肉腫のこの型は局所的に再発し、外科手術で接近可能な部位である他の骨あるいは肺に転移する傾向がある。事実最近の研究は、攻撃的転移切開を受けた患者で、生存期間の増加があることを報告している（ダムロン、他、腫瘍学、９巻、３２７−３４０ページ（１９９５））。特異的細胞周期制御酵素あるいはＨＳｔｋを運ぶ治療ベクターの安全性および有効性は、生産者細胞あるいはベクター上澄みの転移性病巣への腫瘍内注射、それに続くアポトーシス、細胞溶解および組織構造的細胞分化の証拠のための転移切開および組織構造検査により評価することができた。現在の研究は、正常な二倍体線維芽細胞と比較して、前記のレトロウイルスベクターに対して、ＭＧ−６３骨肉腫細胞の相対的に高い形質導入効率を明らかにする。興味深いことに、これらの細胞の明らかな形質導入効率（８０−９０％）は、非同期型培養物にあるＳ期（合成期）の細胞の割合よりもはるかに大きい（カルボナロ−ホール、他、腫瘍学、８巻、１６４９−１６５９ページ（１９９３））。非形質導入ＭＧ−６３細胞はＨＳｔｋ＋形質導入細胞と混合された時ガンシクロビルの有意な「バイスタンダー」細胞致死作用を示し、それはレトロウイルス形質導入感受性と共に転移性疾病の臨床管理において発展する遺伝子治療アプローチの実現可能性を肯定する。
これまでの研究はＭＧ−６３骨肉腫細胞におけるサイクリン発現の正確な配列を特徴付け（ウー、他、腫瘍学国際ジャーナル、３巻、８５９−８６７ページ（１９９３）；カルバナロ−ホール、１９９３；ホール、他、腫瘍学、８巻、１３７７−１３８４ページ（１９９３）；ウイリアムズ、他、生物学化学ジャーナル、２６８巻、８８７１−８８８０ページ、（１９９３））、抗増殖剤ラパマイシンにより明らかにされた新規なＣｄｋ−関連細胞周期遮断点の一時的局在化を可能にした（オルバース、他、生物学化学ジャーナル、２６８巻、２２８２５−２２８２９ページ（１９９３））。レトロウイルスベクターについてのこの研究の結果は、貫通性アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いるこれまでの研究の結果を確認する（ウー、１９９３）；すなわちサイクリンＤ１遺伝子座に指向されるアンチセンス戦略は骨肉腫細胞増殖を効果的に阻害する。実験的構築物（すなわちａＧ１，ａＤ１、およびｐ２１）のそれぞれで形質導入された細胞で観察される細胞死滅のメカニズムはアポトーシスであると定義され、それは生体内治療効果に関してかなり重要なものとなる。
サイクリンＧ１の生理的機能およびその治療能力は特に関心が持たれ、ここで候補プロトオンコジーン（ＣＹＣＧ１）がヒト骨肉腫の癌病原と初めて結合された（ウー、１９９４）。更に最近の研究は、ｐ２１などのサイクリンＧ１がｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質の転写標的であることを示唆している（岡本、他、ＥＭＢＯ  Ｊ、１３巻、４８１６−４８２２（１９９４））。しかしサイクリンＧ１が、ｐ５３媒介経路でサイクリン依存性キナーゼの阻害サブユニットとして腫瘍形成を防止するために反直観的に機能するであろうという初期の仮説は、サイクリンＧ１の強制的な過発現が正常細胞系あるいは新形成細胞系のいずれかで細胞サイクリンを捕捉するのに失敗したという実験により割引かれることとなった（岡本、１９９４）。それに反して、本研究は、サイクリンＧ１が骨肉腫細胞の生存およびもしくは増殖にとって必須であるという最初の実例を示している。これらの新しいデータは、サイクリンＧ１が細胞活性化およびもしくは「受容能」（ウー、１９９４）を伴うものであり、またアンチセンス構築物によるサイクリンＧ１発現の遮断が、深い細胞致死作用ならびに細胞分裂抑制作用を及ぼすという概念を支持するものとなる。
実施例２
材料および方法
レトロウイルスベクター上澄みおよび生産者細胞系
βガラクトシダーゼおよびｐ５３発現ベクターが、高力価ＰＡ３１７パッケージング細胞クローン（力価：βガラクトシダーゼおよびｐ５３ベクターそれぞれが１．３×１０6および２×１０6コロニー形成単位、ｃｆｕ／ｍｌ）としてジェネティック・セラピー、インコーポレイテッド（メリーランド、ゲイザーズバーグ）の好意で提供された。アンチセンスサイクリンＧ１ｃＤＮＡを運ぶ実験ベクターは、ＰＡ３１７細胞にパッケージされ、高力価クローン（ベクター力価：それぞれ１×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）に成長した。ベクターは、以下の各ベクターに含有されるプロモーターの順位およびコード化領域を示すために、Ｇ１ＢｇＳｖＮａ、Ｇ１ｐ５３ＳｖＮａ．７、およびＧ１ａＧ１ＳｖＮａとして引用される（Ｇ１ベクター、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）配列；Ｂｇ、βガラクトシダーゼあるいはｌａｃＺ遺伝子；ｐ５３、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子；ａＧ１、アンチセンスヒトサイクリンＧ１；Ｓｖ、ＳＶ４０初期領域エンハンサー／プロモーター；およびＮａ、ｎｅｏr遺伝子）。ＳＶ４０プロモーター駆動ｎｅｏr遺伝子のみを含有するベクター源、Ｇ１ＸＳｖＮａは、遺伝子形質導入およびＧ４１８選択の作用のための対照として使用された。
ベクターＧ１ｐ５３ＳｖＮａ．７はＧ１ＸＳｖＮａおよびプラスミドｐｐ５３から構築された。プラスミドｐｐ５３はファーマジェニックス（ニュージャージー、アレンデール）から得られたｐＢＳＫ−ＳＮ３から構築され、それは野生型ｐ５３読み枠、ならびにビーブルースクリプトＳＫ（カリフォルニア、ラホーラ、ストラータジェン）のＸｂａＩ部位にクローンされた５′および３′未翻訳領域を含む１．８キロベースＸｂａＩ断片を含有する。ｐＢＳＫ−ＳＮ３は、ＳｍａＩで消化され、ＮｃｏＩで部分消化され、ｐ５３読み枠を含有する１，３２２塩基対断片を生成した。この断片はゲル精製され、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位の間のβガラクトシダーゼに代って（１９９１年７月２５日公開された公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９１／１０７２８に記載されているように）プラスミドｐＢｇに連結され、プラスミドｐｐ５３を生成した。
プラスミドｐＧ１ＸＳｖＮａは、ＳｎａＢＩおよびＮｏｔＩで消化された。ＳｎａＢＩおよびＮｏｔＩ部位はプラスミドのポリリンカー領域に位置を占める。この消化は５，８４８塩基対の長さを持つ断片を生成した。断片の末端は仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処置された。
プラスミドｐｐ５３はＮｏｔＩおよびＳｍａＩで消化された。この消化は、２，０８１塩基対断片および１，４００塩基対断片を生成した。１，４００塩基対断片は、ｐ５３遺伝子を含有していた。この断片は分離され、ゲル精製された。
ｐＧ１ＸＳｖＮａから得られた５，８４８塩基対断片、およびｐｐ５３から得られた１，４００塩基対断片は、各自が粘着性／平滑末端を有していたが、連結されてｐＧ１ｐ５３ＳｖＮａを形成した。生成するプラスミドは、いくつかの診断制限分析により同定され確認された。プラスミドｐＧ１ｐ５３ＳｖＮａは、次いでＰＡ３１７細胞にパッケージされ、レトロウイルスベクターＧ１ｐ５３ＳｖＮａ．７を生成した。
ｌａｃＺ、アンチセンスサイクリンＧ１およびｐ５３ベクターを用いる細胞、細胞培養条件および細胞形質導入
ラビット未分化癌（ＶＸ２）細胞および他の一次および樹立細胞系が、１０％ＦＢＳで補充されたＤＭＥＭ（Ｄ１０）で６個のウエル平板のそれぞれに２．５×１０4細胞の平板密度で培養された。一晩付着後、細胞は２時間ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下で１ｍｌの各レトロウイルスベクターに露出され、その後１ｍｌの新鮮Ｄ１０が各ウエルに加えられた。ｌａｃＺベクターで形質導入４８時間後、遺伝子移転効率がＸ−ｇａｌ染色および顕微鏡検査でｌａｃＺ正細胞の割合を決定することにより測定された。
細胞周期制御遺伝子を運ぶレトロウイルスで形質導入されたＶＸ２における細胞増殖および細胞周期速度の評価
細胞周期修飾物質を運ぶレトロウイルスベクターの細胞分裂抑制作用を評価するために、対照ベクター、あるいはアンチセンスサイクリンＧ１もしくはｐ５３遺伝子を発現するベクターで形質導入された細胞は、形質導入後連続間隔で各培養内の生存可能細胞数を計数することにより、その増殖能を評価された。ＶＸ２（癌）ならびにＭＧ−６３（肉腫）細胞の細胞周期速度に対する細胞周期修飾物質の作用がＦＡＣＳ分析により試験された。Ｇ４１８の存在下で形質導入ＶＸ２細胞の生存はどの範囲までアンチセンスサイクリンＧ１が形質導入細胞に対し細胞致死性であるかを決定するために評価された。
細胞周期修飾物質を運ぶレトロウイルスベクターを用いる生体内遺伝子治療のための先天性胸腺欠損ヌードマウスにおける腫瘍モデルの発展
未分化癌（ＶＸ２）腫瘍が、ＶＸ２細胞の皮下移植によりヌードマウス内で成功裡に増殖した。これらの腫瘍は、３週間で急速に増殖し、腫瘍量および形態の変化のために手術上接近可能となる。要約すると、ＶＸ２腫瘍は、１×１０7ＶＸ２細胞の皮下注射により先天性胸腺欠損ヌードマウスで５週にわたり増殖した。腫瘍がサイズで１００mm3に到達した時、１００μｌの濃縮レトロウイルスベクター上澄み（アンチセンスサイクリンＧ１遺伝子を運ぶＧ１ａＧ１ＳｖＮａ、あるいはベクター力価１×１０8ｃｆｕ／ｍｌのｎｅｏr遺伝子のみを運ぶＧ１ＸＳｖＮａ対照ベクター）が、２週間毎日メトフェン麻酔の下で腫瘍内に注射された。腫瘍量は、毎週ベルニーカリパスを用いて測定され、腫瘍量の百分率変化が推定された。アンチセンスサイクリンＧ１ベクター処置腫瘍と対照ベクター処置腫瘍の間の差の有意性は、スチューデントｔ検定を用いて検定された。更にホルマリン固定腫瘍は、組織学的試験のためにヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された。
結果
広範囲の細胞系が、細胞周期修飾物質を運ぶレトロウイルスベクターに対する感受性を検定された。このような検定の結果は下記の表Ｉで示される。
表Ｉ
癌および非癌細胞でのアンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクターの生体内形質導入効率および細胞分裂抑制作用
0004117367.tif 000002
検定された細胞の内、４個の結腸癌細胞（ＨＴ−２９、ＫＭ１２Ｃ４Ａ、ＫＭ１２ＣおよびＫＭ１２ＳＭ）、ユーイング肉腫（ＥＷ−１）、Ｃ６神経膠腫、２個の膵臓癌（ＢｘＰｃ３、Ｍｉａｐａｃａ）および２個の骨肉腫（ＭＧ−６３、ＭｎｎｇＨＯＳ）の増殖が、アンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクターにより阻害された。ＨＴ２９、ＢｘＰｃ３、およびＫＭ１２ＳＭ細胞もまた、野生型ｐ５３に感受性であった。非癌細胞系の中で、細胞性塞栓が、アンチセンスサイクリンＧ１およびｐ５３により胚ラット大動脈平滑筋細胞およびヒト皮膚ならびにケロイド線維芽細胞に誘導されたが、正常ヒト支質、ヒト肝臓誘導線維芽細胞、あるいはヒト内皮細胞には導入されなかった。
ＦＡＣＳ分析が、アンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクターの肉腫および癌腫瘍細胞の細胞周期速度への作用を調査するために使用された。アンチセンスサイクリンＧ１を運ぶレトロウイルスベクターで形質導入されたＶＸ２未分化癌細胞は、ＦＡＣＳ分析に際して細胞周期速度の深い変更を示し、核フラグメント化を暗示する頂点の広がり、およびＳ期における細胞の減少を表示した（図９Ａ）。これに対比して、アンチセンスサイクリンＧ１ベクターで形質導入されたＭＧ−６３細胞のＦＡＣＳ分析は、Ｇ１期における細胞の蓄積、およびＳ期における細胞数の著しい減少を示し、これらの形質導入細胞における細胞性塞栓のメカニズムが、Ｇ１期細胞周期遮断を伴うことを示唆している（図９Ｂ）。
変更された細胞周期速度と同時に、アンチセンスサイクリンＧ１ならびにｐ５３ベクターは、対照ベクター処置細胞と比較して、１４４時間にわたりＶＸ２癌細胞の増殖を阻害した（図１０）。Ｇ４１８での形質導入細胞の選択に際して、ＶＸ２細胞の５％のみが除去され（図１１）、これはアンチセンスサイクリンＧ１および野生型ｐ５３を運ぶ大多数の細胞が、恐らくアポトーシスを経由して細胞死滅を受けたことを示していた。これらのデータは、アンチセンスサイクリンＧ１が上皮源の癌で抗腫瘍活性を示す最初の試験管内実例を示している。
図１２は、対照ベクターを受け入れたマウス内でのＶＸ２腫瘍増殖と比較した時、アンチセンスサイクリンＧ１（Ｇ１ａＧ１）を運ぶレトロウイルスベクターの腫瘍内注射によるヌードマウスにおけるＶＸ２腫瘍増殖の阻害を示す（Ｇ１Ｘ；７日でｐ＜０．０５；１１日でｐ＜．００１；また２１日でｐ＜０．０５；ｎ＝３マウス／各グループ毎）。アンチセンスサイクリンＧ１ベクターで処置した５匹のマウスの１匹では、腫瘍サイズの１２％の減少が処置１週後に認められた。対照的に、対照ベクターで処置されたマウスでは腫瘍増殖は阻止されなかった。
アンチセンスサイクリンＧ１ベクターで処置されたマウスは対照マウスよりも総体的により小さい腫瘍を示した。図１３Ａは、代表的なアンチセンスサイクリンＧ１対対照ベクター処置マウスを示し、一方図１３Ｂは２１日（処置完了１週後）に収穫されたホルマリン固定およびＨ＆Ｅ染色ＶＸ２腫瘍切開部の組織病理学的特徴を示す。対照ベクターで処置した腫瘍切開部は退生紡錘型細胞および数多くの有糸分裂像を持つ増加した細胞密度の領域を示した。これとは対照的に、アンチセンスサイクリンＧ１ベクターで処置された腫瘍切開部は、有糸分裂像が少なく、顕著な単核細胞浸潤を持つ減少した細胞密度の領域を示した。しかしアンチセンスサイクリンＧ１ベクターを受け入れる腫瘍切開部に残渣腫瘍細胞が認められ、これは腫瘍細胞集団が効果的に形質導入されなかったことを示していた。総合すれば、アンチセンスサイクリンＧ１を発現するレトロウイルスベクターは、この未分化癌腫瘍モデルで生体内で抗腫瘍作用を示しているように見える。
議論
癌は遺伝子治療の主要な標的であり、何故なら癌患者、とりわけ転移性疾病を持つ人々は、しばしば処置選択の自由を殆どあるいは全然持たず、また実験的治療に選ばれるのにふさわしいからである。レトロウイルスベクター送達システムが、承認された１０６件のヒト実験の７６件で使用された。このベクターシステムは、複製不全マウスレトロウイルスを利用し、これまでの所は生体外および生体内でその使用は何ら主要な副作用を生じていない。
他の遺伝子治療戦略は、サイトカイン、ＭＨＣクラス１あるいはＢ７遺伝子を発現する形質導入放射線照射腫瘍細胞を含む腫瘍ワクチンの注射による免疫応答の向上、２）腫瘍サプレッサー遺伝子の発現強化、３）アンチセンスベクターによるプロトオンコジーン過発現のノックアウト、および４）増殖因子レセプター遺伝子の発現強化を含む。ここ数年では、各種細胞周期制御遺伝子の過発現あるいは増幅は、各種悪性疾患で報告されてきており、それはこれら過発現遺伝子のアンチセンスノックアウトが細胞増殖の制御を再確立し、細胞性塞栓を誘導し、腫瘍増殖を阻害し腫瘍の重荷を減少するために使用できたことを示していた。
これらの概念は出芽酵母ビール酵母菌の初期研究から生じ、ここで増殖および分化を調節する細胞外シグナルはスタート（ＳＴＡＲＴ）と名付けられたａＧ１制御点の調節を経由して作用し（ハートウエル、サイエンス、１８３巻、４６−５１ページ（１９７４）；クロス、他、細胞生物学年次報告、５巻、３４１−３９５ページ（１９８９））、この制御点は培養における動物細胞で観察されたＧ１制限点（Ｒ点）と大ざっぱに類似する（パーディー、サイエンス、２４６巻、６０３−６０８ページ（１９８９））。従ってＣｄｋサブユニット（Ｃｄｃ２８）に関連してビール酵母菌にあるＧ１サイクリン（Ｃ１ｎｓ）が細胞にとってスタートを通過する必要があるという発見は、Ｇ１特異的サイクリンが哺乳類Ｓ期促進因子の上流成分として確かに機能するという仮説に導いた（ドラエッタ、生物化学科学動向、１５巻、３７８−３８３ページ（１９９０）；リード、遺伝学における動向、７巻、９５−９９ページ（１９９１））。Ｃ１ｎ欠損酵母細胞を救助するのに役立ち得る遺伝子のためのヒトｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ヒトＧ１サイクリンの３個の新規なファミリーの同定および分子クローニングに導いた（サイクリンＣ、Ｄ、およびＥ：ルー、他、細胞、６６巻、１１９７−１２０６ページ（１９９１）；コッフ、他、細胞、６６巻、１２１７−１２２８ページ（１９９１）；ジーオン、他、細胞、６５巻、６９１−６９９ページ（１９９１）；シャー、細胞、７３巻、１０５９−１０６５ページ（１９９３））。続く研究はＰＲＡＤ１／サイクリンＤ１遺伝子を染色体１１ｑ１３に位置付けたが、これはサイクリンＤ１を、Ｂ細胞新生物内で転座し過発現するＢＣＬ−１オンコジーンとして（ローゼンバーグ、他、全米科学アカデミー紀要、８８巻、９６３８ページ（１９９１）；ウイザース、他、分子細胞生物学、１１巻、４８４６ページ（１９９１））、また扁平上皮細胞癌、乳癌、食道癌、および膀胱癌で増幅され過発現される１１ｑ１３オンコジーンとして（ラミー、他、腫瘍学、６巻、４３９ページ（１９９１）；ジーアン、他、癌研究、５２巻、２９８０ページ（１９９２）；本倉、他、遺伝学発展の最新の見解、３巻、５ページ（１９９３））関係している。サイクリンＥの遺伝子増幅、増加発現、および変更代謝もまたヒト癌細胞で観察された（バックレー、他、オンコジーン、８巻、２１２７ページ（１９９３）；ケイヨマルシ、他、癌研究、５４巻、３８０ページ（１９９４））。もっと最近では、骨肉腫細胞のサブセットで著しく過発現されたＧ１サイクリンであるヒトＧ型サイクリンが分離された（ウー、他、１９９４）。総合すれば、これらの発見は、シグナル形質導入経路を細胞周期の酵素構造で正常に連結するＧ１サイクリンの構造性、異所性、あるいは規制解除発現（ハンターおよびパインズ、細胞、６６巻、１０７１−１０７４ページ（１９９１）；シャー、（１９９３））は、新生物形成形質転換および腫瘍形成に重要な役割を果し（ハンターおよびパインズ、細胞、７９巻、５７３−５８２ページ（１９９４））、また癌および過度増殖性疾患への新規な遺伝子治療アプローチの発展のための戦略的照合点として使用することができた。
この研究では、癌への潜在的遺伝子治療アプローチとしてアンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクター上澄みの安全性および効率が検定された。さまざまな種類の癌細胞が、野生型ｐ５３よりもアンチセンスノックアウトサイクリンＧ１に感受性を示した。いくつかの非癌性細胞の増殖も、アンチセンスサイクリンＧ１ベクターにより阻害され、同じように非悪性線維増殖性疾患の処理に対するその潜在的有用性を示唆している。従って各種の細胞型が細胞周期修飾物質に対する差別的感受性を示した。アンチセンスサイクリンＧ１ベクターは、Ｓ期における細胞減少により実証されるように、ＤＮＡ合成の減少という正味の効果で癌性および肉腫性腫瘍細胞両方の細胞周期速度に深い影響を有していた。これらのデータは、これらの形質導入細胞における細胞性塞栓のメカニズムがＧ１期細胞周期遮断を伴うことを示唆する。Ｇ４１８での形質導入細胞の選択に際し、ＶＸ２細胞の５％のみが除去されたが、これはアンチセンスサイクリンＧ１および野生型ｐ５３を運ぶ大多数の細胞が恐らくはアポトーシスを通じて細胞死滅を受けたことを示していた。
最後に、生体内腫瘍増殖は濃縮アンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクター上澄みの連続腫瘍内注射により劇的に阻害された。これとは逆に、腫瘍細胞は対照ベクターで処置されたマウスでは阻止されなかった。処置中止１週後の組織学的検査は、対照ベクター処置腫瘍において退生紡錘型細胞および数多くの有糸分裂像を持つ増加細胞密度の領域を示した。これとは逆にアンチセンスサイクリンＧ１ベクターで処置された腫瘍の切開部は、有糸分裂像の少ない減少細胞密度の領域および顕著な単核細胞浸潤を示した。総合すれば、これらの発見は未分化癌のモデルでアンチセンスサイクリンＧ１を発現するレトロウイルスベクターの生体内抗腫瘍活性の最初の実例を表している。
実施例３
先天性胸腺欠損ヌードマウスにおけるアンチセンスサイクリンＧ１を運ぶレトロウイルスベクターによる生体内腫瘍増殖の阻害
骨肉腫腫瘍は、１×１０7ＭＮＮＧ／ＨＯＳ細胞の皮下注射で先天性胸腺欠損ヌードマウス内で２週にわたり増殖した。腫瘍が１００mm3のサイズに到達した時、１００μｌの濃縮レトロウイルスベクター上澄み（ｎｅｏr遺伝子のみを運ぶＧ１ＸＳｖＮａ対照ベクター、あるいはアンチセンスサイクリンＧ１遺伝子を運ぶＧ１ａＧ１ＳｖＮａ：ベクター力価：それぞれ１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）が１０日間毎日腫瘍内に注射された。
腫瘍量は、ベクター注射０、４、６、８、１０、および１２日後の間隔で測定された。図１４は、前記間隔のそれぞれでの腫瘍量を示している。図１４で示されるように、アンチセンスサイクリンＧ１ベクター処置マウスは、対照ベクター処置マウスよりも腫瘍が少ない。
アンチセンスサイクリンＧ１遺伝子を運ぶレトロウイルスベクター（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）あるいは対照ベクター（Ｇ１ＸＳｖＮａ）による処置の後、２日間ホルマリン固定ＭＮＮＧ／ＨＯＳ腫瘍切開部のヘマトキシリンおよびエオシン染色は、減少した有糸分裂指数（アンチセンスサイクリンＧ１処置腫瘍１％対対照ベクター腫瘍３．５％）、および増加した支質形成を示す。
ＭＮＮＧ／ＨＯＳ腫瘍から得られたＰＩ染色核のＦＡＣＳ分析は、アンチセンスサイクリンＧ１ベクター処置腫瘍における異数体細胞数（２％）で対照ベクター処置腫瘍におけるそれ（４５％）と比較して劇的な減少を示した。更に、アンチセンスサイクリンＧ１ベクター処置腫瘍からの細胞の二倍体集団は、Ｇ１期で細胞の７７％累積対Ｇ１ＸＳｖＮａ対照ベクター処置腫瘍での４９％を示し、またＳ期における細胞数の有意の減少（１５％対２５％）を示し、これは形質導入腫瘍における細胞性塞栓のメカニズムがＧ１期細胞周期遮断を伴っていたことを示唆している。
実施例４
材料および方法
レトロウイルスベクター、ベクター上澄みおよび生産者細胞系
ヒトサイクリンＧ１をコード化するｃＤＮＡ配列（アクセッション＃Ｘ７７７９４）はウー、他、１９９４でもともと記載されているものである。アンチセンスサイクリンＧ１ｃＤＮＡを運ぶ実験ベクター（ウー、他、１９９４）は、ＰＡ３１７細胞にパッケージされ高力価クローンに成育された（それぞれベクター力価：１×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）。β−ガラクトシダーゼおよびｐ５３発現ベクターは、ジェネティック・セラピー・インコーポレイテッド（メリーランド、ゲイザーズバーグ）の好意により高力価ＰＡ３１７パッケージング細胞クローンとして提供された（力価：β−ガラクトシダーゼおよびｐ５３ベクターそれぞれに対し５×１０5および２×１０6コロニー形成単位、ｃｆｕ／ｍｌ）。ベクターは以下の各ベクターに含まれるプロモーターの順およびコード化領域を示すために、Ｇ１ｎＢｇＳｖＮａ（１９９５年７月２０日公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／１９４２７および１９９６年７月２５日公開されたＷＯ９６／２２２１２）、Ｇ１ｐ５３ＳｖＮａ．７、およびＧ１ａＧ１ＳｖＮａとして引用される（Ｇ１、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）配列；Ｂｇ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子；ｐ５３、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子；ａＧ１、アンチセンスヒトサイクリンＧ１；Ｓｖ、ＳＶ４０初期領域エンハンサー／プロモーター；およびＮａ、ｎｅｏr遺伝子）。レトロウイルスベクター上澄みは、低速遠心分離により更に１×１０8ｃｆｕ／ｍｌの力価に濃縮された。ＳＶ４０プロモーター駆動ｎｅｏr遺伝子のみを含むベクターバックボーンＧ１ＸＳｖＮａが、形質導入およびＧ４１８選択の作用の対照として使用された。
レトロウイルスベクターでの細胞、細胞培養条件、および形質導入
ラット動脈平滑筋（Ａ１０）細胞がＡＴＣＣ（Ｃａｔ＃ＣＲＬ１４７６）から得られ、ウエル当り２．５×１０4の平板密度で、ウシ胎仔血清１０％で補充されたＤＭＥＭ（ＦＢＳ；Ｄ１０）で単層として保持された。一晩付着後、細胞は２時間ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下で各レトロウイルスベクター１ｍｌに露出され、周期的に振動させ、その後新鮮Ｄ１０が１ｍｌ各ウエルに加えられた。β−ガラクトシダーゼベクターで形質導入４８時間後、遺伝子移転効率がラル、他、組織細胞化学ジャーナル、４２巻、９５３−９５６ページ（１９９４）に記載されたＸ−ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）染色への露出に際してβ−ガラクトシダーゼ正細胞の割合の決定および顕微鏡検査による視覚化により測定された。
細胞増殖、ＤＮＡ合成、サイクリンＧ１タンパク質発現およびアポトーシスの分析
細胞周期修飾物質を運ぶレトロウイルスベクターの細胞分裂抑制作用を評価するために、アンチセンスサイクリンＧ１（あるいはｐ５３）遺伝子を発現する対照ベクター、あるいはベクター群で形質導入されたＳＭＣは、形質導入後連続間隔で各培養内の生存可能細胞数を計数化することにより、その増殖性能を評価された。示された値は三倍の平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。ＤＮＡ合成に対する細胞周期修飾物質の作用は、ゴードン、他、全米科学アカデミー紀要、９３巻、２１７４−２１７９ページ（１９９６）に記載されているように、３Ｈ−チミジンのＤＮＡへのとり込みによりモニターされた。要約すると、アンチセンスサイクリンＧ１、あるいは対照レトロウイルスベクターでの形質導入２４時間後、細胞培養物は、２時間3Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウエル；比重６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ；ニューイングランド・ニュークレア）に露出された。細胞は次いで氷上に置かれ、冷却リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２度すすぎ洗いされ、次いで氷冷５％トリクロール酢酸（ＴＣＡ）で３回すすぎ洗いされた。最後のＴＣＡリンス水が除去され、ＴＣＡ沈殿物質は１Ｍ水酸化ナトリウム０．２ｍｌで可溶化され、等量の１Ｍ酢酸での中和が続けられた。細胞高分子への3Ｈチミジンのとり込みは、液体シンチレーション計数化により測定され、ｄｐｍ／ウエルの放射能単位で表現された。未処置およびベクター処置グループの差の有意性は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）により決定された。
サイクリン発現のウエスタンブロット分析は、ウー、他、腫瘍学国際ジャーナル、３巻、８５９−８６７ページ（１９９３）およびコルトン、医学における統計、９９ページ、リトルブラウン・アンド・カンパニー（１９７４）に記載された通り、ヒトサイクリンＧ１のＣ末端１８アミノ酸を認識するポリクローナル抗ペプチド抗体（ウー、他、１９９４）を用いて実施された。形質導入細胞培養物におけるアポトーシスの発生は、アポプターグ・プラス原位置検出キット（オンカー）で評価され、これはジオキシゲニン標識ヌクレオチドの酵素（末端デオキシヌクレオチジルトランスファーゼ；ＴｄＴ）追加を利用するエンドヌクレアーゼ媒介ＤＮＡフラグメント化により生成された発生期３′−ＯＨ  ＤＮＡ末端を検出し、修飾ＤＮＡ断片の免疫細胞化学的検出がこれに続く（スコッツコ、他、癌研究、５５巻、５４９３−５４９８ページ（１９９５））。
血管再狭窄のラット頸動脈損傷モデルにおけるアンチセンスサイクリンＧ１遺伝子のレトロウイルス媒介移転
全身麻酔（ケタミン、１０ｍｇ／Ｋｇ；ロンパン、５ｍｇ／Ｋｇ）の下で、ＵＳＣインスティチューション・アニマル・ケア・アンド・ユース・コミッティー（ＩＡＣＵＣ）、２Ｆインティマックス動脈塞栓切除カテーテル（カリフォルニア、ラグーナヒルズ、アプライド・メディカル・リソーシズ・コーポレイション）がウィスターラット（それぞれ４００−５００ｇｍの重量）の頸動脈の内皮を裸出するために使用された。カテーテルは遠位に連結された外頸動脈に挿入され、また総頸動脈に進められた。バルーンは１０μｌの量に注気され、３回総頸動脈の長さに沿って進められた。バルーン損傷の後、塞栓切除カテーテルは除去され、内頸動脈は分岐に対して丁度遠位に一時的に連結された。損傷セグメントの遠位半分は同様に一時的に連結され、次いでレトロウイルスベクターに１５分露出された。動物の各グループは、１００μｌの濃縮高力価アンチセンスサイクリンＧ１ベクター（ｎ＝７）あるいはｎｅｏr遺伝子のみを運ぶ対照ベクター（ｎ＝４）の注入を受け、その後ラットは回復を許され、普通のマウス／ラット飼料および水を適宜与えられた。無痛覚のために、動物は手術７２時間後まで１２時間毎にバプレネックス、０．２ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．が与えられた。ラットは過用量のベントバルビタールナトリウム（１２０ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）により血管障害導入２週後に犠牲にされ、損傷および非損傷対側性頸動脈双方のホルマリン固定切開部が、ヘマトキシリン−エオシン、シリス赤色ヴァーヘフエラスチン染料で染色された。組織構造切開部は、顕微鏡検査で試験され、また新内膜対中膜表面領域の外形計測評価が、デジタル化システムを用いて行われた。血管障害に続く内膜過形成の範囲は、新内膜の中膜に対する比率として発現される。非処置およびベクター処置血管の新内膜の中膜に対する比率の間の差異の有意性が一対のｔ検定で決定された（コルトン、１９７４）。
結果
細胞周期制御遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターでの大動脈ＳＭＣの形質導入
核標的β−ガラクトシダーゼベクター（Ｇ１ｎＢｇＳｖＮａ）を用いるラット（Ａ１０）大動脈ＳＭＣの明らかな形質導入効率は、約４５％であった（図１５Ａ）が、これはマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞に類似しており、また形質導入効率がそれぞれ２０％および３０％で観察された正常ヒト線維芽細胞あるいは、癌痕誘導（ケロイド）線維芽細胞よりもいくらか大きかった。アンチセンスサイクリンＧ１（ａＧ１）を運ぶベクターでの大動脈ＳＭＣの形質導入は、空白（対照）ベクターを含む形質導入培養物と比較すると、形質導入２４乃至１４４時間後に観察される生存可能細胞数が著しい減少を示した（図１５Ｂ）。ウエスタンブロット分析は、対照ベクターと比較した時に、アンチセンスサイクリンＧ１で形質導入された大動脈ＳＭＣでサイクリンＧ１タンパク質発現の下降調節を確認した（図示されていない）。Ａ１０細胞の増殖は、更にセンス配向におけるｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子のレトロウイルス媒介過発現により阻害された。アンチセンスサイクリンＧ１およびｐ５３ベクター双方は、3Ｈチミジンの取り込みにより決定されたように、細胞周期の進行を阻害した（ａＧ１およびｐ５３のいずれに対してもｐ＜．００１、図１５Ｃ）。
アンチセンスサイクリンＧ１は大動脈ＳＭＣの縮重、多細胞合胞体形成、およびアポトーシスを誘導する
図１６で示される顕微鏡写真は、対照およびアンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクターで、形質導入２４時間後に顕微鏡で観察された大動脈ＳＭＣの形態学的外観を示している。１６Ａで示されるように、対照ベクターで形質導入された細胞は、有意の形態学的変化を示さなかった。これとは逆に、アンチセンスサイクリンＧ１を運ぶベクターで形質導入された培養物では、明白な縮重変化、多核合胞体形成の増加、および細胞溶解と関連して細胞密度の著しい減少が観察された（図１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄ）。合胞体に含まれる細胞の割合は、β−ガラクトシダーゼの形質導入および発現により決定された形質導入効率を著しく上回っていた。合胞体形成は、３個の異なった高力価クローンから誘導されるアンチセンスサイクリンＧ１ベクター、またある程度はｐ５３ベクターで形質導入されたＡ１０培養物で発生したが、対照（Ｇ１ＸＳｖＮａ）あるいはβ−ガラクトシダーゼベクターからは発生しなかった。更に細胞死滅のメカニズムを調査するために、アポトーシスの特徴であるエンドヌクレアーゼ媒介ＤＮＡ切断断片を検出するための分子および免疫細胞化学アプローチが採用された。図１６Ｅおよび１６Ｆに示されるように、対照ベクターで形質導入された細胞ではアポトーシスの証拠は観察されなかった（図１６Ｅ）。しかしアンチセンスサイクリンＧ１ベクター形質導入培養物では、数多くのアポトーシス細胞が観察された（図１６Ｆ）。これらの結果は、Ａ１０大動脈ＳＭＣにおけるアンチセンスサイクリンＧ１ベクターの細胞致死作用が、部分的にアポトーシス、細胞縮重、および異常な合胞体形成から生じることを示している。
アンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクターで形質導入された大動脈ＳＭＣ培養物における細胞致死「バイスタンダー」作用の証拠
非形質導入細胞がアンチセンスサイクリンＧ１形質導入培養物で見出される多細胞合胞体にとり込まれたことを確認するために、我々は非形質導入Ａ１０細胞に蛍光マーカーを与え、かつ標識細胞をベクター上澄みの洗い落としの２時間後既に形質導入された培養物上に置いた。非形質導入蛍光標識Ａ１０平滑筋細胞の多核合胞体への明らかなとり込みは、これらの標識細胞が、これまでに形質導入されたＡ１０培養物に置かれた時に明らかであった（図１７Ａおよび１７Ｂ、低倍率；１７Ｃおよび１７Ｄ、高倍率；１７Ａおよび１７Ｃ、位相差；１７Ｂおよび１７Ｄ、紫外線）。蛍光標識を含む細胞をとり込む代表的な多核合胞体は、矢印で同定される。非形質導入蛍光標識大動脈ＳＭＣとの同時培養２４時間後、かなりの数の多核合胞体も蛍光染色で標識され、これは形質導入および非形質導入細胞の間の細胞融合が発生したことを示していた。この発見は、単純性ヘルペスチミジンキナーゼ／ガンシクロビルシステムにより誘導され、また敏感な細胞に存在するギャップ結合により媒介される古典的「バイスタンダー作用」から区別できる新規な細胞致死性「バイスタンダー作用」の追加の証拠を提供する。
細胞融合の現象が時間の経過で続き（図１７Ｅ）、これは、対照ベクター（Ｇ１ＸＳｖＮａ；ｐ＜．００１）で形質導入された細胞と比較した時、アンチセンスサイクリンＧ１ベクター（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）で形質導入された大動脈ＳＭＣで４−８時間にわたり増加した合胞体の数の著しい増加を明らかにした。かなりの程度の合胞体形成が、更に野生型ｐ５３ベクター（Ｇ１ｐ５３ＳｖＮａ）で形質導入された細胞で認められ、このベクターは、更にＡ１０細胞内に標識された細胞性塞栓を生産した。しかし、ｐ５３形質導入で観察された合胞体の数は８、１２、および２４時間でａＧ１形質導入細胞で観察されたものよりも著しく少なかった（Ｐ＜．００１）。
アンチセンスサイクリンＧ１ベクターは試験管内「組織」損傷モデルで大動脈平滑筋細胞の増殖および移動を阻害する。
細胞増殖の接触阻害を示すＡ１０  ＳＭＣの高密度（密集）単層培養物は、７日間にわたる特有の「創傷治癒」応答を示す一連の細胞／組織障害に沿って増殖するために刺激することができる。図１８Ａは、細胞を欠いている１mmの通路を創り出すために、２００μｌピペットチップでこすり取られた大動脈ＳＭＣの高密度培養物を示す。図１８Ｂは、剥離細胞除去するためこすり取り洗浄された直後の「創傷」縁部の外観を示す。図１８Ｃで示されるように、核標的β−ガラクトシダーゼベクターでの（ｔ＝２４時間での）細胞培養物の連続形質導入は、活性化ＳＭＣ増殖の領域である「創傷」の縁部で最大であった。図１８Ｄは、損傷ｔ＝２４時間後での創傷通路への大動脈ＳＭＣの増殖および移動を示す。これとは逆に、アポトーシスおよび他の縮重的変化が、アンチセンスサイクリンＧ１ベクターで形質導入されたＳＭＣで観察された（図１８Ｅ）。これらの退化的変化は、対照あるいはβ−ガラクトシダーゼベクターのいずれかでは観察されなかった多細胞合胞体形成により著しく特徴付けられた。更に創傷通路への細胞増殖および明らかな細胞移動は、アンチセンスサイクリンＧ１形質導入細胞培養物で著しく減少し、対照ベクター処置培養物（約３日）と比較して創傷通路の閉鎖の遅れ（約７日）により立証された。
高力価アンチセンスサイクリンＧ１ベクター上澄みの注入による生体内新内膜形成の阻害
これまでの研究は、１０4−１０6粒子／ｍｌのウイルス力価を持つレトロウイルスベクターによる組換えマーカー遺伝子の動脈壁への直接移転を示し（ネイベル、他、サイエンス、２４９巻、１２８５−１２８８ページ（１９９０））、また数多くの研究が、他の方法により血管再狭窄の動物モデルに送達される細胞分裂抑制遺伝子治療の効果を提示した。この研究では、高力価レトロウイルスベクター上澄み（ウイルス力価：１×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）が生成され、高度に濃縮されたレトロウイルスベクターにより、再狭窄のラット頸動脈損傷モデルに送達されたアンチセンスサイクリンＧ１の効力が検定された。バルーン損傷未処置動脈から得られた染色切開部の組織試験は、血管ＳＭＣを増殖することによる内膜の侵襲で立証されるように、２週でかなりの新内膜形成を示した（図１９Ａおよび１９Ｃ）。これとは逆に、高力価アンチセンスサイクリンＧ１ベクター上澄みで処置された損傷動脈セグメントは、新内膜形成で著しい減少を示した（図１９Ｂおよび１９Ｄ）。外形計測分析は、未処置動脈セグメント（Ｉ：Ｍ比率１．１±０．４；ｐ＜．００１；図１９Ｇ）と比較して、アンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクターで処置された損傷頸動脈（Ｉ：Ｍ比率０．４±標準偏差０．４）で新内膜形成の著しい阻害を確認した。対照研究では、ｎｅｏr遺伝子のみを含む高力価ベクター（Ｉ：Ｍ比率１．５±０．２）と比較して、非処置動脈セグメント（Ｉ：Ｍ比率１．３±標準偏差０．５）での新内膜形成の範囲の間に差異は見られなかった。
議論
内膜過形成の病因に関連する同定増殖因子およびもしくは増殖因子レセプターの分子遮断にもとづく臨床試験は、細胞分裂抑制血管治療に有効な媒介物であることがこれまで証明されていない（ファクソン、他、アメリカンカレッジ心臓学ジャーナル、２５巻、３６２−３６９ページ（１９９５））。従って多くの増殖調節分子により分配される細胞内信号送付カスケードを標的とするアプローチは、より戦略的になることが示唆されてきた（ギボンズ、他、サイエンス、２７２巻、６８９−６９３ページ（１９９６））。従ってＳＭＣ増殖および新内膜形成を阻害する新規な遺伝子治療アプローチは、最近細胞周期制御のメカニズムに焦点をあててきた。実際、細胞周期調節遺伝子に対するアンチセンスアプローチは、バイパス手術（マン、他、全米科学アカデミー紀要、９２巻、４５０２−４５０６ページ（１９９５））およびバルーン血管形成の双方に続く損傷形成の動物モデルにおいて、新内膜過形成を制限するのに著しく有効であることが示されてきている。アンチセンスＣｄｋ２キナーゼあるいはＣｄｋ２キナーゼの単一管腔内送達は新内膜過形成に著しい障害をもたらした（森下、他、全米科学アカデミー紀要、９０巻、８４７４−８４７８ページ（１９９３）；森下、他、臨床研究ジャーナル、９３巻、１４５８−１４６４ページ（１９９４）；阿部、生化学生物物理学研究通信、１９８巻、１６−２４ページ（１９９４））。Ｒｂの非リン酸化可能構造活性形態を運ぶアデノウイルスベクターもまた、バルーン血管形成に続くＳＭＣ増殖および新内膜形成を阻害することが報告された（チャン、他、サイエンス、２６７巻、５１８−５２２ページ（１９９５））。数多くの細胞周期調節遺伝子の協同導入がこの転写因子により調節されるので、Ｅ２Ｆに指向された分子戦略もまた開発された。Ｅ２Ｆ  ｃｉｓエレメント配列を含むオリゴヌクレオチドは、細胞内でＥ２Ｆと結合し、生体内で新内膜損傷形成を阻害する「デコイ（おとり）」として機能する（森下、他、全米科学アカデミー紀要、９２巻、５８５５−５８５９ページ、（１９９５））。更に細胞周期制御酵素の阻害にもとづく細胞分裂抑制遺伝子の概念のための支援が、以下に記載される最近の発見により提供される。すなわち細胞分裂／周期酵素の活性化を阻害するラパマイシン（オルバース、他、ニューヨーク科学アカデミー年報、６９６巻、５４−６２ページ（１９９３）；オルバース、他、生物化学ジャーナル、２６８巻、２２８２５−２２８２９ページ（１９９３）；ジャヤラーマン、他、生物化学ジャーナル、３４巻、２５３８５−２５３８８ページ（１９９３））は、更にラットおよびブタモデル双方の血管損傷形成を阻害する（グレゴリー、他、移植、５９巻、６５５−６６１ページ（１９９５）；マークス、他、循環研究、７６巻、４１２−４１７ページ（１９９５））。
サイクリンＧ１はサイクリンの所謂Ｇ１ファミリーの一員であり、それは細胞周期のＧ１期の間サイクリン依存性タンパク質と協同して作用する（ウー、他、国際腫瘍学ジャーナル、３巻、８５９−８６７ページ（１９９３）；シャー、細胞、７９巻、５５１−５５５ページ（１９９４））。初期Ｇ１に誘導されまた細胞活性化の分子メカニズムに参加しているものと疑われているが（ウー、他、腫瘍学レポート、１巻、７０５−７１１ページ（１９９４））、サイクリンＧ１はｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の転写標的であるように見える（岡本、他、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３巻、４８１６−４８２２ページ（１９９４））。サイクリンＧ１過発現はまず癌と結合され（ウー、他、１９９４）、より最近では、アンチセンスＣＹＣＧ１を運ぶレトロウイルスベクターによるサイクリンＧ１発現の下降調節が、ヒト骨肉腫（ＭＧ−６３）細胞の増殖および生存を阻害することが報告された（スコッツコ、他、１９９５）。
この実施例において、Ａ１０ラット大動脈平滑筋細胞の増殖で、アンチセンスサイクリンＧ１構築物を運ぶレトロウイルスベクターの作用が試験された。センス配向において、ｐ５３遺伝子と同じくアンチセンスＧ１遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターは、２−６日培養で形質導入Ａ１０細胞の生存および増殖を阻害した。細胞性塞栓は、対照ベクターで形質導入されたものと比較して、アンチセンスサイクリンＧ１で形質導入された血管ＳＭＣでのサイクリンＧ１のＤＮＡ合成および下降調節と関連した。形質導入ＳＭＣの形態学的試験は、細胞溶解、巨大合胞体形成、および細胞収縮により立証される明らかなアポトーシスの変化；核フラグメント化、アンチセンスサイクリンＧ１ベクター、およびｐ５３ベクター形質導入Ａ１０細胞の双方で観察されたクロマチン濃縮を明らかにした。しかし多核合胞体数は、アンチセンスサイクリンＧ１で処置された細胞培養物で著しく高く発見された。際立った「バイスタンダー」作用は、定量細胞融合検定および非形質導入の蛍光標識により決定されたように、アンチセンスサイクリンＧ１ベクターで形質導入されたＡ１０細胞で認められた。これらの発見は、アンチセンスサイクリンＧ１ベクターが、ＭｏＭｕＬＶ包膜タンパク質の融合誘導性に関連したメカニズムを多分増加することにより、細胞融合および合胞体形成を促進する「融合促進因子」、多分プロテアーゼあるいはグリコシラーゼを誘導する、ということを示している（ジョーンズ、他、ウイルス学ジャーナル、６７巻、６７−７４ページ（１９９３））。
再狭窄のための細胞分裂抑制遺伝子治療は、追加の治療結果の徴候を示し、ここでは細胞周期調節遺伝子は血管細胞のアポトーシスを誘発すると報告されている（ギボンズ、他、１９９６；レアード、他、循環、９３巻、５２９−５３６ページ（１９９６）。骨肉腫細胞（スコッツコ、他、１９９５）で見られるように、有糸分裂活性化ＳＭＣにおいて、サイクリンＧ１遮断の細胞毒性は、少なくとも一部はアポトーシス経路の活性化に起因する（図１６Ｆ）。更に、ある状況下での細胞周期の阻止の導入は、更にＳＭＣ移動および細胞外基質生産を阻害するようにみえる（ビロー、他、全米科学アカデミー紀要、９０巻、６５４−６５８ページ（１９９３））。試験管内「組織損傷」モデルにおいて、アンチセンスサイクリンＧ１ベクターで形質導入されたＡ１０細胞の増殖および移動双方が、細胞損傷の領域で阻害された（図１８Ｅ）。際立った細胞毒性、細胞周期遮断、および多細胞合胞体形成を総合すれば、これらの発見は、サイクリンＧ１が増殖性疾患の処理における治療介入に関して戦略的中心を表す概念を更に支持するように導く。
一度潜在的治療遺伝子が同定されると、遺伝子移転ベクターを適切な生理学的部位に効果的に送達する攻撃が残る。バルーン血管形成の場合には、内皮内層の裸出および近隣ＳＭＣの分裂促進活性化の双方は、レトロウイルスベクターで送達される治療遺伝子が分裂促進活性細胞で優先的に発現されるので、レトロウイルスベクター送達のための有利な条件が提供される。本研究においては、非常に高力価の上澄み（１０8ｃｆｕ／ｍｌ）が、血管ＳＭＣの形質導入効率、従って再狭窄の実験モデルにおけるレトロウイルスベクターの効力を高めるために生成された。実際に、胚Ａ１０ＳＭＣでのレトロウイルスベクター媒介遺伝子送達の試験管内研究は、再狭窄の生理学に特に関連し、というのは胚および新内膜ＳＭＣが分裂促進シグナルに対し同様の応答を示すことを多くの報告が示しているからである（シュワルツ、他、血管平滑筋細胞、シュワルツ、他編、８１−１３９ページ、ニューヨーク、アカデミック  プレス、インコーポレイテッド（１９９５））。ラット頸動脈再狭窄損傷モデルでの本研究は、このアプローチの効力を示している：高濃縮（１０8ｃｆｕ／ｍｌ）アンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクター上澄みの注入で処理されたバルーン損傷頸動脈の切開部は、新内膜で著しい減少を示した。総合すれば、これらのデータは、血管再狭窄と闘うための新規な遺伝子治療戦略の開発で、サイクリンＧ１のみを運び、あるいはｐ５３、もしくは今や古典的な単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／ＧＣＶアプローチなどを併用するレトロウイルスベクターの有用性を支持する。
この明細書で引用されたすべての特許の開示、公開情報（公開特許出願を含む）、データベース・アクセッション番号および保管所アクセッション番号は、あたかもこれら各個別特許、公開情報、データベースアクセッション番号、および保管所番号が引用例としてとり込まれるべきであると個別に指示されたかのように同じ範囲でその全体が引用例としてここに特異的にとり込まれる。
しかしこの発明の範囲は、前に記載の特異的な実施例に幸限定されるべきではない。この発明は特別に記載されたもの以外にも実施することができ、かつしかも以下の発明の範囲内にある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図６】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７】
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【図１７Ｅ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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