(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学指示薬を含有する水溶性ゲル又はプラスチックに、凍結組織切片を接触させることにより該化学指示薬を発色させることにより、凍結組織切片に存在する物質の分布を視覚化することを特徴とする視覚化方法。
【請求項２】
化学イオンプルーブを含有する水溶性ゲル又はプラスチックに、凍結組織切片を接触させることにより該化学イオンプルーブを発色させて凍結組織切片に存在するイオンの分布を視覚化することを特徴とするイオン分布の視覚化方法。
【請求項３】
前記水溶性ゲル又はプラスチックが、膜状の形態を有することを特徴とする請求項１または２記載の視覚化方法。
【請求項４】
前記凍結組織切片が、人間または動物の皮膚であることを特徴とする請求項１、２または３記載の視覚化方法。
【請求項５】
前記化学指示薬または化学イオンプルーブが蛍光化合物であり、蛍光により発色させて視覚化することを特徴とする請求項１、２，３または４記載の視覚化方法。
【請求項６】
前記化学イオンプルーブが水素イオン濃度に対応して異なる色彩に発色する化合物であり、可視光により凍結組織切片のｐHを視覚化することを特徴とする請求項２記載のイオン分布の視覚化方法。
【請求項７】
前記凍結組織切片が、実質的に乾燥させないものであることを特徴とする請求項１、２，３，４，５または６記載の視覚化方法。
【請求項８】
溶媒と、概溶媒に溶解する高分子とからなるゲルに、化学イオンプルーブを含有し、該ゲル中の溶媒が８０〜９９．５質量％であり、該高分子が０．５〜２０質量％であり、該ゲルの厚さが１０〜５０μmであることを特徴とする化学イオンプルーブ担持型イオン分布視覚用薄膜ゲル。
【請求項９】
ＮＯ若しくは脂質指示薬を含有する水溶性ゲル又はプラスチックに、凍結組織切片を接触させることにより該指示薬を発色させて凍結組織切片に存在するＮＯ若しくは脂質の分布を視覚化することを特徴とするＮＯ若しくは脂質分布の視覚化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、皮膚組織中に存在するイオンなどの物質の分布状態を化学指示薬により観察するための有用な方法に関する。さらに詳しくは、簡便かつ安価な手段により、凍結組織中のイオンの分布などを視覚化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
表皮バリア機能の恒常性維持におけるイオンの役割を明らかにする目的で、人の皮膚中に存在するカルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、水素イオンなどの皮膚における分布を調べることが研究されている。
【０００３】
これらのイオンの役割が明らかになれば、表皮バリア機能の恒常性維持を目的とする皮膚外用剤が期待される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の方法は、ＳＩＭＳ（secondary ion masss pectroscopy、二次イオン質量分析）、ＰＩＸＥ（ particle  induced  X−ray  Emission、荷電粒子励起X線発光分光分析）、Ｘ線マイクロアナライザーなどで調べる方法であり、技術的に簡単な方法とは言えず、高価な装置が必要であった。
【０００５】
また、凍結乾燥した皮膚の組織を真空乾燥して分析しなければならず、真空乾燥の際に、細胞が収縮してダメージを受けたり、イオンが本来の存在個所から移動したりする可能性があり、必ずしも正確な分布を知ることが出来ない場合があった。
【０００６】
さらに、比較的大きな組織切片は、従来の方法に用いる機器による観察が困難であるなどの欠点があった。
【０００７】
本発明は、上記の従来の分析方法の欠点に鑑みてなされた発明であり、皮膚の組織中に存在するイオンの分布状態を正確に視覚化して観察する新規な方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は下記の通りである。
【０００９】
１．化学指示薬を含有する水溶性ゲル又はプラスチックに、凍結組織切片を接触させることにより該化学指示薬を発色させることにより、凍結組織切片に存在する物質の分布を視覚化することを特徴とする視覚化方法。
【００１０】
２．化学イオンプルーブを含有する水溶性ゲル又はプラスチックに、凍結組織切片を接触させることにより該化学イオンプルーブを発色させて凍結組織切片に存在するイオンの分布を視覚化することを特徴とするイオン分布の視覚化方法。
【００１１】
３．前記水溶性ゲル又はプラスチックが、膜状の形態を有することを特徴とする前記の視覚化方法。
【００１２】
４．前記凍結組織切片が、人間または動物の皮膚であることを特徴とする前記の視覚化方法。
【００１３】
５．前記化学指示薬または化学イオンプルーブが蛍光化合物であり、蛍光により発色させて視覚化することを特徴とする前記の視覚化方法。
【００１４】
６．前記化学イオンプルーブが水素イオン濃度に対応して異なる色彩に発色する化合物であり、可視光により凍結組織切片のｐHを視覚化することを特徴とする前記のイオン分布の視覚化方法。
【００１５】
７．前記凍結組織切片が、実質的に乾燥させないものであることを特徴とする前記の視覚化方法。
【００１６】
８．溶媒と、概溶媒に溶解する高分子とからなるゲルに、化学イオンプルーブを含有し、該ゲル中の溶媒が８０〜９９．５質量％であり、該高分子が０．５〜２０質量％であり、該ゲルの厚さが１０〜５０μmであることを特徴とする化学イオンプルーブ担持型イオン分布視覚用薄膜ゲル。
【００１７】
９．ＮＯ若しくは脂質指示薬を含有する水溶性ゲル又はプラスチックに、凍結組織切片を接触させることにより該指示薬を発色させて凍結組織切片に存在するＮＯ若しくは脂質の分布を視覚化することを特徴とするＮＯ若しくは脂質分布の視覚化方法。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の構成について詳述する。
【００１９】
本発明の方法に供される凍結組織切片とは、イオン分布を知るために視覚化する対象となるサンプルを意味し、本発明の方法によって含有するイオンを視覚化できる対象であれば限定されない。
【００２０】
例えば、人若しくは動物の皮膚組織、筋肉などの組織、その他の器官の組織（例えば、脳や内臓のスライス）、植物などの組織が挙げられる。人の皮膚の場合は、化粧料などの皮膚外用剤や外部ストレスなどによる影響、表皮バリア機能の恒常性維持におけるイオンの役割を検討する場合に、特に有効である。
【００２１】
また、近年アルツハイマー病に関係あるとされる脳内のアルミニウムイオンの分布を動物実験により容易に視覚化することができる。
【００２２】
本発明においてイオン分布とは、組織中の活性酸素、細胞膜電位などの分布も含む概念である。
また、本発明は、イオン分布のみならず、ＮＯ若しくは脂質のように、生態組織中での固定化が困難なため、従来の方法では分布状態の観察が困難な化合物の視覚化方法も含まれる。
本発明のさらに広い概念は、化学指示薬により視覚化できる物質の分布を視覚化する方法である。
【００２３】
組織切片の凍結方法は限定されず常法により凍結することが出来る。本発明の方法においては、従来の方法において必要とされた凍結後の乾燥を実質的に必要とせず、乾燥工程のおける組織の損傷及びイオン分布の移動を阻止することができ、組織中に本来位置する正確な分布を視覚できる。
【００２４】
本発明の好ましい態様として、人の皮膚を測定サンプルにする場合、いかなる部位の皮膚でもかまわない。角質層、表皮、新皮を含む皮膚表面の垂直断片のイオン分布を観察する場合は、解剖鋏等で皮膚断片を１ｍｍ×１ｍｍ程度の大きさに切り取り、常法に従い凍結して、皮膚中のイオン分布を固定化した後、凍結した組織切片をクリオスタットなどのスライサーを用いて、５〜１０μm程度の厚さにスライスした切片が凍結組織切片として本発明の方法に供される。この切片は蛍光顕微鏡等の顕微鏡によってイオン分布を観察する場合に特に好ましい。
【００２５】
上記のように調製された凍結組織切片は、化学イオンプルーブを含有した水溶性高分子のゲル若しくはプラスチックに接触させる。化学イオンプルーブを含有する水溶性ゲル又はプラスチックは膜状の形態が好ましく、さらに好ましくは薄膜である。好ましい態様として、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリサッカライドなどの水溶性高分子を用いて、これらの水溶液を平坦なガラスの上に滴下し放置することにより、本発明に用いる水溶性高分子のゲルの薄膜が得られる。また、薄膜状のゲル又はフィルムを形成させる際に高分子をさらに架橋させることも可能である。モノマー溶液を平坦なガラスの上に滴下させそこで重合させて薄膜状ゲルやフィルムを調製しても良い。なお、プラスチック材料としては親水性高分子若しくは疎水性高分子を使用できるが、用いる化学イオンプルーブと親和性があり、膜成型性が良好なプラスチック材料が望ましい。
【００２６】
本発明の好ましい水溶性ゲルであるポリサッカライドの薄膜は、好ましくは、２質量％程度のポリサッカライドと９８質量％程度の水とから構成される。薄膜状水溶性ゲルにおける高分子と水との好ましい構成比は用いる高分子により適宜決定される。
【００２７】
上記水溶性ゲルの薄膜中に、化学イオンプルーブが含有されるが、高分子が３次元的に絡み合うため、ゲル中の水が流動することにより化学イオンプルーブが本来位置する場所から移動することを防止でき、正確なイオンの分布が観察できる。
【００２８】
上記ゲル又はフィルムの中若しくは表面に存在する化学イオンプルーブは、観察する組織切片中に含まれるイオンなどの化学物質に対して反応する化学指示薬（インディケーター）であり、主に、特定の波長で発色する蛍光化学物質が使用される。水素イオンの分布を視覚化する場合は、水素イオン濃度に応じて可視光にて変色する化学物資でも良い。なお、膜中の化学イオンプルーブの含有濃度は限定されず、膜及び化学イオンプルーブの種類によって適宜決定されるが、膜に対して１０μｇ／ｍｌ程度が好ましい。
【００２９】
本発明に用いる化学イオンプルーブとは対象サンプル中に含まれるイオン等の化学物質を一定条件下で呈色して検出できる化合物であり、いかなる化学指示薬も使用できる。公知の化学インディケーターを用いることが出来る。
例えば、特開平２−２８５４２公報に開示されているカルシウム検出用のイオンプルーブなども使用出来る。化学イオンプルーブの市販品は米国オレゴン州のモルキュラプルーブ社（Molecular Probes, Inc.）から購入できる。
【００３０】
具体的な化合物は同社の「Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals by Richard P.Haugland ；Sixth Edition」に記載されている。具体的には、例えば、カルシウムインディケーターとしてCalcium Green 1, Fura 2, Indo-1, Quin-2, Rhod-2, Oregon Green, Fluo-3,；マグネシウムインディケーターとしてMagnesium Green, Magunesium Orange, Mag-Fura, Mag-indo-1,；亜鉛インディケーターとしてNewport Green, TSQ,；鉄インディケーターとしてPhen Green；水素イオン（ｐＨ）インディケーターとしてSNAFL, HPTS, BCECF, Fluorescein, Carboxyfluorescein；ナトリウム、カリウムインディケーターとして SBFI, SBFO, PBFI, CD222, Sodium Green；塩素イオンインディケーターとしてSPQ, MQAE, MQAA, MEQ, ABQ, Lucigeninが挙げられる。また、活性酸素インディケーターとしてLuminol, H2DCFDA；細胞膜電位インディケーターとして、ANEP dye, JC-1が挙げられる。さらに、イオン分布以外の化学物質を視覚化する方法においては、ＮＯインディケーターとして、Griess Reagent, 2,3-Diaminonaphyhalene； 脂質インディケーターとしてBODIPY, DPH, DAUDAなどが挙げられるが、これらの具体例のみに限定されない。
【００３１】
上記の化学イオンプルーブを含有する水溶性ゲルを調製する好ましい一つの方法としては、最初に、約５〜２０質量％のポリアクリルアミド若しくはポリビニルアルコール水溶液、又は、約０．０５〜２質量％のポリサッカライド水溶液に、化学イオンプルーブを、必要に応じて加温しながら攪拌して溶解させる。次に、この水溶液を平坦なガラス上に滴下させ放置して膜状の水溶性ゲルが得られる。放置にあったては必要に応じて４０〜５０℃に加温する。アガロースゲルを用いる場合においても同様に薄膜を調製出来る。また、プラスチックフィルムを利用する場合もこれを溶解する溶媒を用い同様にして膜を調製することが出来る。なお、化学イオンプルーブを含まない膜の表面に、化学イオンプルーブの溶液を塗布することも可能である。得られた膜は必要に応じ適宜適当な大きさに切断して凍結組織切片を接触させる。通常は、膜の上に凍結組織切片を載せて、これを蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、コンフォーカルマイクロスコープ、マルチフォトンレーザースキャニングマイクロスコープなどによりイオンの分布を観察する。
【００３２】
なお、ＮＯ若しくは脂質などの化学物質の分布を視覚化する方法も、上記と同様に行なうことが出来る。
【００３３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。本発明はこれらの実施例のみに限定されない。
【００３４】
「化学イオンプルーブ及び水溶性ゲル」
化学イオンプルーブとして、カルシウムグリーン１、マグネシウムグリーン、PBFI（カリウムインディケーター）、ソジウムグリーン（ナトリウムインディケーター）を、モレキュラ−プロ−ブ社から購入し使用した。ブロモクレゾールグリーンは和光純薬工業株式会社から購入した。水溶性ゲルを構成するアガロース（寒天）はシグマ社から購入した。
【００３５】
「皮膚サンプルの調整」
皮膚サンプルはインフォームドコンセントを与えた健常男性の前腕内側から、解剖鋏（Ｄｉｎｅｒ Ｓｐｅｚｉａｌ；ＣＨＲ Ｄｉｅｎｅｒ社）によりカットして得た。無処理の皮膚、およびテープストリッピングを３０分経過した時点で皮膚切片を生検（バイオプシ）した。結果の再現性を確認するため、同じ部位から最低３つのサンプルを採取した。テープストリッピングはセロテープ（登録商標：ニチバン）により２０回行なった。この段階で角層のほとんどが除去されているが、少しは残存している。採取したサンプルは液体窒素で冷却したイソペンタンの中で急速凍結した。その後、観察するまで−８０℃で保存した。
【００３６】
「イオンの視覚化による観察」
アガロース粉末（Ｔｙｐｅ Ｉ―Ｂ：シグマ社）を、ホットプレート上のビーカーを用い９０℃の水に溶解した。最終濃度２質量％のアガロース水溶液に化学イオンプルーブをホットプレート上で５０℃に加温しながら溶解した。これを５０μｍの厚さにスライドグラスの上に広げ、薄膜を得た。カルシウムの視覚化による観察には最終濃度１０μg/mlのカルシウムグリーン１を上記ゲル膜作製時に混ぜた。マグネシウム観察の場合には最終濃度１０μg/mlのマグネシウムグリーンと0.2mMのEGTA〔（エチレングリコールビス(２-アミノ-エチルエーテル)-N,N,N'N'-テトラセチックアシド）をゲル膜に混ぜた。カリウムの視覚化による観察の場合には最終濃度１０μg/mlのPBFIをゲル膜に混ぜた。ナトリウムの視覚化による観察の場合には最終濃度１０μg/mlのソジウムグリーンを混ぜた。pHの観察の場合には0.01％のブロモクレゾールグリーンのエタノール溶液２０ｍｌをゲル膜表面に塗布した。凍結したサンプルを10μｍの厚さで切り、切片を各種インディケーターを含むゲル膜の上に乗せ、２時間以内に写真撮影を行なった。明瞭な像を得るには12時間以内に写真撮影をする必要がある。今回の視覚化にはオリンパス光学工業株式会社の蛍光顕微鏡システム（ＡＨ３−ＲＦＣ）を用いた。カルシウム、マグネシウム、ナトリウムの視覚化による観察時には546nmの励起光を用いた。カリウム観察時には334、365nmの励起光を用いた。pH観察は通常の光学顕微鏡にて行なった。今回の実験では共通した傾向を探索するため、最低５つのサンプルについて各イオンの分布を視覚化し観察した。
【００３７】
「結果及び検討」
カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムの各イオンの皮膚中分布を図１に示した。これらは代表的な傾向を示した像である。図はすべてヒト皮膚の断面図で、上が皮膚表面に相当する。図１，２，４では各々のイオンの濃度が高い部分ほど白く、濃度が低いほど黒くなっている。皮膚の最も表面に角質層が集積した層が形成されている。その下に表皮と呼ばれるケラチノサイトという細胞からなる層がある。表皮は表面から順に、顆粒層、有棘層、基底層と呼ばれる。さらにその下にコラーゲンゲルに繊維芽細胞が点在する真皮があり、その奥が皮下脂肪層である。上記実施例は角質層から真皮の上層までを観察した。図１Ａは、正常皮膚中のカルシウムイオンの分布を視覚化している。白い矢印で示している、白く見える帯状の部分は角質層と表皮顆粒層の境界であり、カルシウムイオンが特にこの領域に多く分布していることを示している。図１Ｂは、正常皮膚中のマグネシウムイオンの分布を視覚化している。カルシウムと同じく角質層と表皮の境界付近に高い濃度分布が認められる。図１Ｃは、正常皮膚中のカリウムイオンの分布を視覚化している。カルシウムやマグネシウムとは逆に角質層、表皮境界で濃度が低く（黒い矢印）、その下の部分は表皮有棘層で高い濃度を示している。図１Ｄは、正常皮膚中のナトリウム分布を視覚化したものであるが、図１のＡ、Ｂ、Ｃに見られるような顕著な濃度分布は見られず、表皮全体にほぼ均一な分布を示している。図１Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｆは、それぞれ上記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの正常皮膚において、テープストリッピング後の各イオンの分布状態を視覚化したものである。カルシウムイオン、マグネシウムイオン、カリウムイオンの分布はいずれも消失していることが視覚化されている。ナトリウムイオンについては分布状態に顕著な変化がないことを視覚化している。図２Ａ及びＢは、正常皮膚において、50mMのEDTA溶液を用いてカルシウムインディケーター及び／又はマグネシウムインディケーターを用いた実験を繰り返した結果を示している。図１Ａ及びＢで視覚化されたカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの分布がＥＤＴＡにより消失していることを示している。図３Ａは正常皮膚中のpＨの分布を示しており、図３Ｂはテープストリッピング後のｐＨの分布を示している。いずれも角質層、表皮上層でより酸性（pH4.0-4.5は黄緑色）であった。表皮深部と真皮では中性に近くなり（pH5.6以上は青緑色）、テープストリッピングによるｐＨ分布の顕著な変化は認められなかった。図４のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、テープストリッピング後の表皮有棘層の高倍率観察像を示したものであり、図４Ａはカルシウム、図４Ｂはマグネシウム、図４Ｃはカリウム、図４Ｄはナトリウムイオンの分布を視覚化したものである。カルシウム（図４Ａ）、ナトリウム (図４Ｄ)は、いずれも明瞭なパターンが観察され、いずれのイオンも細胞核周辺の濃度が低かった。一方、マグネシウムはテープストリッピング後、細胞核での濃度が高い傾向にあることが分かるが（図４Ｂ）、カリウムは明瞭な分布パターンを示さなかった（図４Ｃ）。
【００３８】
以上の実施例の結果をまとめると、本発明の方法により、正常な皮膚ではカルシウムは顆粒層に分布するが（図１Ａ）、テープストリッピングして３０分後この分布は消える（図１Ｅ）ことが視覚化できた。マグネシウムも同様の傾向を示すことを本発明の視覚化方法により分かった（図１Ｂ及びＦ）。カリウムは有棘層で濃度が高く、顆粒層で低い濃度になり（図１Ｃ）、この分布もテープストリッピングによって消える（図１Ｇ）ということが本発明の視覚化方法により分かった。ナトリウムは表皮全体で均一な分布を示し（図１Ｄ）。これはテープストリッピングの影響を受けないという知見が本発明の視覚化方法により得られた。これらの結果の妥当性を確認するため、50mMのEDTA溶液を用いてカルシウムインディケーター、マグネシウムインディケーターを用いた実験を繰り返した（図２Ａ及びＢ）。EDTAは表皮中で認められた蛍光をほとんど消滅させ、この結果は図１で示した像が各イオンによるものであることを示している。図３では、本発明の方法により、正常皮膚、テープストリッピング後の皮膚のpＨ分布について視覚化できた。図４では、本発明の方法により、テープストリッピング後の表皮有棘層におけるカルシウムイオン、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオンの分布を視覚化できた。
【００３９】
【発明の効果】
本発明によれば、極めて簡易な方法で、真空乾燥を必要とせず、皮膚などの組織中に存在するイオンの分布状態を正確に視覚化して観察する新規な方法を提供出来る。本発明の方法は、凍結した組織中のイオンの分布をサンプルに対して特別な処理を必要とせずに極めて簡便に視覚化できる新規有用な方法である。
【００４０】
本発明の方法により、皮膚中のイオンの分布状態を正確に把握できれば、皮膚外用剤などの研究開発に極めて有用な知見を得ることができる。例えば、ヒト表皮中のカルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、水素イオンの分布を、化学指示薬を含むゲルにイオンを染ませることによって視覚化し、そしてこれらイオン分布に対する皮膚バリアの損傷の影響について知見を得ることが可能となる。
【００４１】
本発明の方法は、例えば、化粧料の官能的効果を皮膚中イオンの分布状態の変化により評価する方法に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】テープストリッピング前後の表皮の各イオン分布（Ａ及びＥ：カルシウムイオン、Ｂ及びＦ：マグネシウムイオン、Ｃ及びＧ：カリウムイオン、Ｄ及びＨ：ナトリウムイオン）を表す顕微鏡写真図である。
【図２】ＥＤＴＡを使用した場合にカルシウムイオンプルーブ（Ａ）及びマグネシウムイオンプルーブ（Ｂ）により視覚化された表皮を表す顕微鏡写真図である。
【図３】皮膚のｐＨを表す顕微鏡写真図である（Ａ：正常皮膚、Ｂ：テープストリッピング後）。
【図４】表皮有棘層の高倍率観察像を表す顕微鏡写真図である（Ａ：カルシウムイオン、Ｂ：マグネシウムイオン、Ｃ：カリウムイオン、Ｄ：ナトリウムイオン）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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