(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織、骨、軟骨又は皮膚組織の再生増加を目的とする組成物であって、
骨芽細胞、軟骨細胞、ケラチノサイト、又は線維芽細胞の細胞増殖を活性する作用を有する生物活性物質を含んでなり、
該生物活性物質が、
ａ）真珠層を、粒度が２００μｍ未満の粉末にし、
ｂ）これを、水性溶媒と緊密に接触させ、
ｃ）接触時間の終了時に、不溶性画分を分離して、水性画分を回収し、
ｄ）前記水性画分の溶媒を濃縮し、無機成分を本質的に含まない前記生物活性物質からなる、前記真珠層の可溶性又は水中で輸送可能な画分を回収することを含んでなることを特徴とする製造方法によって得られて成るものである、組成物。
【請求項２】
組織、骨、軟骨又は皮膚組織の再生増加を目的とする組成物であって、
真珠層から得ることができ、かつ、水溶性であり、細胞毒性がなく、並びに、
アルカリホスファターゼ活性及び骨芽細胞によるＩ型コラーゲン合成を増加する作用を有するＢＭＰｓ類の非繊維状骨誘導タンパク質を含んでなる、組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組成物を含んでなる、組織、骨、軟骨又は皮膚組成の再生増加を目的とする、医薬組成物。
【請求項４】
生体適合性の固形支持体をさらに含んでなる、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
経皮投与に適切な賦形剤を含んでなる、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物を含んでなる、組織、骨、軟骨又は皮膚組織の再生増加を目的とする、医薬品。
【請求項７】
請求項１又は請求項２に記載の組成物を含んでなる、組織、骨、軟骨又は皮膚組織の再生増加を目的とする、医薬品。
【請求項８】
関節症、多発性関節炎、骨粗鬆症、退行性老化、腫瘍病変、外傷後病変、又は偽関節及び疼痛ジストロフィーから選択される疾患の治療に使用される、請求項６又は７に記載の医薬品。
【請求項９】
老化防止を目的とする組成物であって、
骨芽細胞、軟骨細胞、ケラチノサイト、又は線維芽細胞の細胞増殖を活性する作用を有する生物活性物質を含んでなり、
該生物活性物質が、
ａ）真珠層を、粒度が２００μｍ未満の粉末にし、
ｂ）これを、水性溶媒と緊密に接触させ、
ｃ）接触時間の終了後に、不溶性画分を分離して、水性画分を回収し、
ｄ）前記水性画分の溶媒を濃縮し、無機成分を本質的に含まない前記生物活性物質からなる、前記真珠層の可溶性又は水中で輸送可能な画分を回収することを含んでなることを特徴とする製造方法によって得られて成るものである、組成物。
【請求項１０】
老化防止を目的とする組成物であって、
真珠層から得ることができ、かつ、水溶性であり、細胞毒性がなく、並びに、
アルカリホスファターゼ活性及び骨芽細胞によるＩ型コラーゲン合成を増加する作用を有するＢＭＰｓ類の非繊維状骨誘導タンパク質を含んでなる組成物。
【請求項１１】
請求項１又は請求項２に記載の組成物を含んでなる、細胞培地。
【発明の詳細な説明】
本発明は、真珠層(nacre)から生物活性物質の製造法、およびこの方法で得ることができる精製した生成物の使用に関する。
これらの生成物は、特に骨、特に上顎顔面手術、または軟骨の退行性病変の治療並びに皮膚科学に有用である。
真珠層は、特に整形外科または上顎顔面手術における骨代替および／または再生、および歯科移植物の製造のための材料として提案されてきた。
更に、真珠層は、イン・ビトロで骨細胞に骨誘導および骨形成作用を離れて及ぼすことも示されている(Lopez等、Tissue and Cell，24，667-679，1992)。
従って、真珠層に存在する生物活性物質を単離できることが望まれていた。
真珠層またはアラゴナイトコンチリファー(chonchylifer)は、生物起源の鉱物化した形成体であることが知られており、これは、総質量の約１．７％の繊維状および非繊維状物質の有機マトリックス（Taylor等、Suppl．3，pp．125+29plates，1969）とアラゴナイトの形態で結晶化した炭酸カルシウムとからなっている。従って、真珠層の構造は骨の構造と類似しており、有機マトリックスとヒドロキシアパタイトの形態のリン酸カルシウムからなっている無機相とを含んでなる。対照的に、真珠層の有機マトリックスの約５０％は可溶性である。
著者らは、骨のマトリックスの不溶性画分から骨の形成に活性を有するタンパク質ＢＭＰｓ（または骨形態形成タンパク質(Bone Morphogenetic Proteins)）の抽出を報告した(rist等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，76:1828-1832，1979)。この方法は酸性脱塩を伴い、目的とする生成物の変性の危険性を含んでいる。
真珠層は主体適合材料として長期間示唆されてきたが、ＢＭＰｓに類似のタンパク質は明示されていない。
本出願人は、今般、特に変性段階を含まないため、一組の特に有益な生物学的特性を有する物質を分離することができる方法を見出だした。
これが、本発明が、真珠層から生物活性物質の製造法であって、下記ａ）〜ｄ）によりなることを特徴とする、方法に関する理由である。
ａ）真珠層を粉末状にして、粒度が約２００μｍ未満（すなわち、通常は５０〜１５０μｍ）として、
ｂ）これを、場合によっては塩を補足した水性溶媒と緊密に接触させ、
ｃ）接触時間の終了後に、不溶性画分を分離して、水性画分を回収し、
ｄ）水性画分の溶媒を濃縮して、真珠層の可溶性または水中で輸送可能な画分であって、無機成分を本質的に含まない生物活性物質からなるものを回収する。
この方法は、用いやすく、かつ約４℃〜３０℃の温度で好ましく行なわれるものであり、室温で良好な結果が得られる。
使用した真珠層は、軟体動物、特にPinctada maximaのようなカキの殻から得ることができる。他のカルサイト分が多い殻成分を含まない未処理真珠層を用い、出発材料は白色真珠層が好ましく、さもないと、顔料を除去する段階を設けなければならない。
これは容易に入手できる原料であり、これを使用しても天然の固体数に負の影響を与えることはなく、実際に、これらのカキまたは他の真珠層を有する軟体動物のほとんどは養殖されている。
更に、追加の利点は、原料が真珠を生産したカキ殻から得ることができることから得られ、実際に、真珠貝は、連続してせいぜい３個の真珠を生産した後は、優れた品質（等級Ａ）の厚い層状の真珠層を有していても、生産プールから除かれる。従って、本発明は、真珠養殖の真珠層下流を用いる特別な機会を提供する。
真珠層は、前もって除染を行なうことなく用いることができる。大規模（水８００リットル／日）に濾過を行なう二枚貝から得られる真珠層かた抽出される精製した生物学的画分は、ヒトで活性を有する病原性物質を含まず、これが短期および長期間に亙り無害であることが現在主要な最重要課題である移植可能な生体適合材料の条件の本質的部分を構成している。この最重要課題は、例えば骨の手術において凍結乾燥した骨を使用することによって起こることがある重大な病状を回避することが重要であることが証明している。
この方法の態様の一つでは、真珠層を５０〜１００μｍの粒度にまで減少させる。
もう一つの態様では、真珠層を粒度が１５〜５０μｍの粒末状にして、結晶性単位の粒度に近づけることによって効率を向上させることができる。
いずれの場合にも、一回限りの粉砕処理では、出発材料のコンシステンシーに適さないので、最初に粗砕を行なった後に磨砕を行なう。
段階b)の溶媒は、純粋な二回蒸留を行なったまたは発熱性物質を含まない水、または特にＮａＣｌまたはグアニジン塩酸塩から選択される塩を補足した水から選択することができる。
本発明は、実際に、真珠層の生物活性に関与する物質が親水性であるかまたは水中で輸送可能、特に水溶性であり、かつ生産コストを制限する微粉砕した真珠層を処理する条件で最初の分別段階のような早期に抽出することができる。
上記の方法によって直接得ることができる生成物は、特に骨芽細胞、軟骨細胞、ケラチノサイトおよび線維芽細胞の細胞増殖を刺激する生物活性を有するタンパク質の混合物を含んでなる。これらのタンパク質は、繊維状であってもまたは繊維状でなくともよい。本発明は、この方法で得られた生成物に関するだけでなく、完全な可溶性生成物から分別によって精製した各種物質にも関する。
本発明は、特にＢＭＰ／ＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子）類に関連した先祖タンパク質に類似することがあるタンパク質を含んでなる。
更に詳細には、本発明は、真珠層から得ることができ、かつ下記の特性を有する１個以上の非繊維状骨誘導タンパク質に関する。
水溶性であるか、または水中で輸送可能であり、
細胞毒性がなく、
アルカリホスファターゼ活性および骨芽細胞によるＩ型コラーゲン合成を増加する。
本発明は、この型のタンパク質をコードするヌクレオチド配列にも関する。従って、別の供給源から、またはイン・ビボ合成により、単離組織または器官により、または培養細胞によって得られるこの型のタンパク質も、化学合成または遺伝子工学によって得られる生成物と同様に本発明に包含されることを理解すべきである。
生物活性生成物は、段階d)で透析および／または凍結乾燥によって濃縮することができる。
本発明の方法の変更態様では、段階d)の後に、エタノールによる沈澱を行ない、生物活性を有するサブ画分を構成する残渣を回収し、溶液中に残る生成物は、もう一つの生物活性を有するサブ画分を構成する。
段階b)は、特に真珠層粉末を機械攪拌下で水性溶媒に懸濁することによって行なうことができ、４℃で２４時間処理を行なうことができるが、時間および温度は、出発粒子の粒度などによって当業者が適合させることができる。
もう一つの態様では、段階b)は、固定した真珠層粉末中を溶媒を加圧下で通過させることによって行なわれる。この固定は、例えばＨＰＬＣ型のカラムを、場合によっては溶媒の拡散を良好にしおよび真珠層の圧縮を回避する増量剤との混合物として用いて行なう。
本発明によって得られる各種生成物は、組織、特に骨、軟骨または皮膚組織の再生を増加することを目的とする移植片または医薬品として有用である。
下記のような多くの応用分野がある。
各種組織：
骨格組織：骨、軟骨、靭帯、歯、セメント質、象牙質など、
皮膚および皮下組織、
その他、
各種病理学的状況：
退行性老化、外傷性、腫瘍性、審美的および身体障害、
関節症、多発性関節炎などのリマウチ性感染症、
整形外科感染症（外傷学および矯正用）、
カルシウム代謝病理学、
皮膚または皮膚美容感染症、
その他。
本発明による生成物は、特に外科、介入放射線学、または任意の他の治療技術に用いることができる。
一般的にまたは局部的に、即時作用効果を目的としまたは遅延作用効果を目的として、様々な様式の適用を考えることができる。
本発明による生成物およびタンパク質は、医薬組成物に配合することができる。これらは、溶液、懸濁液、凍結乾燥生成物、粉末、ゲル、ペースト、接着剤、粘着性、非粘着性コーティング、ギブス包帯などの様々な形態とすることができる。
それらは、例えば下記の場合に用いることもできる。
イメージング下での介入
局部的骨修復（物質の損失）または拡散骨修復（無機質脱落）、脊椎における四肢（圧縮骨、海綿骨）、顔面および頭蓋の偏平骨、胸部骨格など。
軟骨修復、例えば関節症または外傷性の損傷などの後の椎間円板および関節表面。
骨格組織の各種病変の治療
上記の総ての場合において、通常の手術、
骨芽細胞または線維芽細胞の刺激によるイン・ビトロでの上記骨移植片の製造（骨誘導）。
皮膚病変の治療
局所適用による、
外科介入による（注射、移植片など）による、
皮膚移植片のイン・ビトロでの生産の後。
培養中のヒト骨形成細胞（骨芽細胞）の表現型発現の刺激および維持を補助するための骨細胞の自家移植の場合。これらの自己由来の骨芽細胞は、自家移植片の形態で再移植することを目的とする。
カルシウム代謝の制御を目的とする「経口」使用。
有利な態様によれば、組成物は生体適合性の固形支持体も含み、これは生物活性を有する生成物を定義された量で加えることによってドープされる。この組成物は、増量剤材料として用いて、外傷性、審美的または病理学的質性の骨物質の損失および／または欠落の場合に骨格を修復することができる。
もう一つの態様によれば、組成物は経皮投与に好適な賦形剤を含む。これは、瘢痕形成および皮膚再生を誘発することができる。
本発明は、各種の生物活性タンパク質画分を標的とする抗体の産生にも関し、これらの抗体は、放射能、蛍光、発色試薬または酵素で標識することができる。
本発明は、標識または未標識プローブの産生に関する。
もう一つの態様によれば、本発明は、上記の抗体およびプローブを含む診断キットに関する。
本発明による生成物およびタンパク質は、特に老化の影響を防止することを目的とする化粧組成物に配合することができる。
最後に、本発明は、水溶性物質および細胞培養添加剤としての真珠層から抽出することができるタンパク質、並びにそれらを含む培地の使用を含んでなる。
例Ｉ  抽出
不規則な断片状のPinctada maxima真珠層（EVM Develppement社、SARL，5，rue Capron，75018，パリ、シレ、38348098500019から入手）を流水で洗浄した後、蒸留水で３回洗浄する。これらの断片を微粉状にし、粉度を５０〜１００μｍとする。得られた粉末をγ線で除染し、予め脱塩を行なうことなく、２回蒸留した純水または発熱性物質を含まない水または２５ｇ／ｌ強度のＮａＣｌ溶液またはグアニジン塩酸塩（ｐＨ７．４）の水溶液を用いて、４℃で２４時間機械攪拌により抽出する。真空濾過の後に可溶性画分を得て、凍結乾燥によって濃縮した後、直径が４０ｍｍであり細孔度が１２，０００〜１４，０００ダルトンの膜を用いて水に対して透析する。得られた画分の一部を直接凍結乾燥する。他の部分は、エタノールで沈澱を行なう（４℃、２４時間）。
行なった一連の操作を、下記の図にまとめる。
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タンパク質およびペプチドの分画化、および分析
未処理画分のＵＶ吸収スペクトルおよびクロマトグラフィー分析では、これらの画分は本質的にタンパク質またはペプチド性のものであることを示している。
有機マトリックスの各種成分への分画化の主要段階では、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と電気泳動の通常の技術を組み合わせて用いている。サイズ排除（ＳＥＣ）、イオン交換（ＩＥＸ）、疎水性相互作用（ＨＩＣ）、ヒドロキシアパタイト（ＨＰＨＴ）、およびアフィニティークロマトグラフィー（ＡＦＣ）は、最もよく用いられるＨＰＬＣ法である。これらの方法は、タンパク質やペプチドを変性させず、従って生物活性の損傷を引き起こさないと考えられる。
タンパク質の分析のための電気泳動法は、高ｐＨでのキャピラリー・ゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、分析的電気泳動および調製用電気泳動である。これら総ての電気泳動法は、高分解能を有し、変性を起こさない。
実施例２  イン・ビトロでの生物学的試験
実験用の生物学的材料
ヒト骨芽細胞、軟骨芽細胞、線維芽細胞、およびケラチノサイトの培養。異なる性別および様々な年齢（小児−成人−高齢者）の個人からの最初の実験用の細胞。
用いた評価基準
1）細胞毒性、細胞の増殖および移動を、生細胞のＮＡＤＰＨレダクターゼによるテトラゾリウム塩（黄色）のホルマザン塩（青紫色）への転換に基づく比色法であるＭＴＴ試験を用いて評価する。
2）コンフルエンスに維持され、存在量および／またはアルカリホスファターゼ活性の増加によって評価される骨芽細胞の活性の刺激。
3）骨芽細胞によるＩ型、軟骨細胞によるII型、および線維芽細胞によるIII型のコラーゲンの合成。ペプチド細胞外マトリックスの成分であるこれらのコラーゲンは、これらの細胞型の活性の指示薬である。
4）軟骨細胞によって分泌される非ペプチド性の細胞外マトリックスの成分であるコンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸の合成。
5）骨芽細胞によって合成された細胞外有機マトリックス上でのカルシウム固定（原子吸光法により評価）。
6）ケラチノサイトによるＰＴＨｒｐの合成。
一例としては、下記のものが挙げられる。
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実施例３  イン・ビボ  用いた評価基準
画分の活性の例示  骨形態発生タンパク質（ＢＭＰｓ）の生物活性の特性決定に用いられるSAMPATH試験（SAMPATH等、１９９０年）をモデルとして選択する。
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皮膚再生に対する活性の例示  動物（ラット、ウサギ）で誘発される傷（傷痕、火傷など）に局所適用することによる
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