(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳又は脳脊髄液に由来する検体中のミントを、脳卒中、脳梗塞、及びアルツハイマー病から選択された何れかの神経変性疾患の診断のために、検出、同定又は定量する、ミントの７０ｋＤａ断片に対する抗体を含んでなるミント検出剤。
【請求項２】
ミントが、ミント１又は２である請求項１に記載のミント検出剤。
【請求項３】
神経変性疾患が、アルツハイマー病である請求項１又は２に記載のミント検出剤。
【請求項４】
抗体が、モノクローナル抗体である請求項１〜３の何れかに記載のミント検出剤。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の検出剤を含んでなる、ミント測定用ＥＬＩＳＡシステム。
【請求項６】
ミントの７０ｋＤａ断片に対する抗体を用いて、脳又は脳脊髄液に由来する検体中のミントの、検出、同定又は定量を行って、脳卒中、脳梗塞、及びアルツハイマー病から選択された何れかの神経変性疾患の検出をする方法。
【請求項７】
ミントが、ミント１又は２である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗体が、モノクローナル抗体である請求項６〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
ＥＬＩＳＡ法による請求項６〜８の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、体液又は組織中のミントを検出、同定又は定量することからなる神経性疾患、好ましくは痴呆症、アルツハイマー病などの診断剤、診断マーカーとしてのミント又はそれに対する抗体の使用、及び、検体中のミントを検出、同定又は定量する方法に関する。
本発明はアルツハイマー病をはじめとする痴呆性疾患の診断に利用できる診断剤、検査法に関するもので、この検査法により測定される神経伝達に必須のシナプス小胞輸送蛋白（Ｍｉｎｔｓ）の濃度および活性は神経活動の指標として広く利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病は神経変性を伴う痴呆性疾患である。家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）以外はその原因が不明であるため診断治療法は確立していない。アルツハイマー脳の病理学的検討から、アルツハイマー病にみられる活性物質の変化があるが、現在ではこれらを指標として診断の一助としているに過ぎない。その例として、痴呆脳・老化脳にみられる神経伝達物質の変化や、老人班（senile plaque；ＳＰ）やアルツハイマー原線維変化（neurofibrillary tangle；ＮＦＴ）形成に関わる活性物質の測定がなされている。
【０００３】
痴呆脳・老化脳にみられる神経伝達物質の変化としては、例えば、アセチルコリン（Acetylcholine（Ａｃｈ））量の減少、コリンアセチル転移酵素（choline acetyltransferase（ＣＡＴ））活性の減少、アセチルコリンエステラーゼ（acetylcholine esterase（ＡｃｈＥ））活性の減少、アセチルコリン合成酵素（Ａｃｈ  synthetase）量の減少、アセチルコリン受容体（Ａｃｈ  receptor）量の減少などが知られている。また、ソマトスタチン（Somatostatin）や神経ペプチドＹ（Neuropeptide  Ｙ）などの神経ペプチド、ノルアドレナリン（Noradrenaline）、ドーパミン（Dopamine）、セレトニン（Serotonin（５ＨＴ））、５−ヒドロキシインドールアミノ酸（5-hydrooxyindoraminoacid（５ＨＩＡＡ））などの神経伝達物質の量の変化を調べることも知られている。
【０００４】
これら神経伝達物質はおもに脳脊髄液（cerebrospinal fluid；ＣＳＦ）で測定されるが、その変化は正常脳や他の痴呆性疾患の脳でも見られアルツハイマー型痴呆との関連性については未だ確立されておらず、アルツハイマー型痴呆であることを特定するための診断法としての診断的価値は少ないと思われる。
【０００５】
アルツハイマー病の神経病理学的変化の主なものとしては、神経原線維変化（Neurofibrillary tangle；ＮＦＴ）と老人班（Senile plaque；ＳＰ）が挙げられる。
アルツハイマー神経原線維変化（Neurofibrillary tangle；ＮＦＴ）は特異なねじれを有するフィラメント（Paired Helical Filament（ＰＨＦ））が主成分であり、このＰＨＦは微小管結合蛋白質（microtuble associate proteins（ＭＡＰｓ））の一種であるタウ蛋白（τ蛋白質）の異常リン酸化で生成される。
老人班（ＳＰ）は、アミロイド物質が細胞外に蓄積したものであり、その主な構成成分としてβアミロイド前駆体蛋白質（β−Amyloid Precursor protein（βＡＰＰ））から生成されるＡβ／Ａ４Ａｍｙｌｏｉｄ（Ａβ）などがある。
【０００６】
一方、アルツハイマー病の神経病理学的変化で注目されているβアミロイド（Ａβ）生成沈着機構の解明により、これに関わる多くの活性分子が明らかとなってきた。これらには、Ａβの前駆体であるβアミロイド前駆タンパク（β−amyloid precursor protein；βＡＰＰ）や、その切断酵素であるセクレターゼ（secretase）、その選別蛋白質（sorting protein）の可能性があるプレセニリン（presenirin；ＰＳ）があげられる。これらの異常は遺伝的アルツハイマー病の原因であることはすでに報告されているが、これら遺伝的アルツハイマー病の頻度は全アルツハイマー病の５％以下であり、その大部分を占める孤発性アルツハイマー病の原因は未だ不明である。Ａβがアルツハイマー病の主因を説明する最も重要な分子である限り、この生成沈着に関わる新たな分子の存在確認とその制御機構の解明は是非必要な作業であるといわざるを得ない。
全アルツハイマー病患者の数％は家族性である。その原因遺伝子としてこれまで同定されているのはβＡＰＰ、プレセニリン１および２（ＰＳ−１、ＰＳ−２）の３種である。
また、Ａβのキャリアー蛋白質（carrier蛋白質）であるアポリポ蛋白質Ｅ（Apolipoprotein  Ｅ（ＡＰＯＥ））のある種の対立遺伝子産物（ＡＰＯＥ４）もアミロイド物質の沈着の危険因子であるとされている。
このような家族性アルツハイマー病の遺伝的背景をまとめると次の表１のようになる。
【０００７】
0004064569.tif 000002
【０００８】
家族性アルツハイマー病に関与すると考えられている種々の遺伝子が解明されてきているが、アルツハイマー病患者の９０％以上を占める孤発例では遺伝的要因が明らかではないため生前の診断は困難であり、これらは大部分の孤発性アルツハイマー病の診断マーカーとなるものではない。
【０００９】
さらにこれらの分子（βＡＰＰ、ＰＳ、ｓｅｃｒｅｔａｓｅ、ＡｐｏＥなど）は脳神経細胞のみならず非神経細胞すなわち他臓器の体細胞でも産生しているため、これらの異常が神経特有の変性疾患であるアルツハイマー病の病態を完全には説明しえず、当然診断マーカーとしての期待は出来ない。従って、神経特有の分子であり、かつＡβとの関わりを持つ新たな分子に診断マーカーとしての可能性を期待しなければならない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は神経に特有でかつＡβ生成にからみ、かつ神経伝達機構にも関与する分子マーカーを利用してすべてのアルツハイマー痴呆症の新たな診断法を提供するものである。即ち、本発明は神経性疾患、特にアルツハイマー病の新規な診断マーカーを提供するものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、体液又は組織中のミントを検出、同定又は定量することからなる神経性疾患の診断剤、当該診断剤を含有してなる神経性疾患を診断するためのキットに関する。また、本発明は、神経性疾患を判定するための体液又は組織中のミントの検出、同定又は定量に用いるための判定用組成物、当該組成物を含有してなる神経性疾患を判定、診断するためのキットに関する。
本発明は、神経性疾患、例えば痴呆症、アルツハイマー病などの診断マーカーとしてのミント又はそれに対する抗体の使用に関する。
さらに、本発明は、検体中のミントを検出、同定又は定量する方法に関する。
【００１２】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、神経に特有でかつ神経伝達機構の根幹をなすシナプス伝達に必須の小胞輸送蛋白に注目した。発明者の一人である岡本らは小胞輸送蛋白であるマンク１８（Ｍｕｎｃ１８）に特異的に結合し、シナプス小胞（synaptic vesicle）のエクソサイトーシス（exocytosis）に関与する新規小胞輸送蛋白マンク１８関連蛋白質（Munc18-interacting proteins）であるミント（Ｍｉｎｔｓ）をクローニングした(M.Okamoto., et al., J. Biol. Chem., 272(50),31459-31464,1997 ; Eur. J. Cell Biol., 77, 161-165, 1998)。
ミント（Ｍｉｎｔｓ）は、少なくともミント１（Ｍｉｎｔ１）からミント３（Ｍｉｎｔ３）からなるファミリーを形成し、ミント１と２は神経に特異的に発現する小胞輸送蛋白である。その後の研究により、ミントはＰＴＢドメインとふたつのＰＤＺドメイン（ＰＤＺａドメイン及びＰＤＺｂドメイン）という蛋白間の相互作用に重要な働きを持つ二つの基本機能構造（モジュール）を持つことが判明した。この２種のモジュールを一つの蛋白が持つのは現在の所このミントのみであり、この点からもミントの神経伝達機能における特異性が示唆されている(M.Okamoto., et al., J. Biol. Chem., 272(50),31459-31464,1997)。
【００１３】
ミントは他に例をみない特徴的なドメイン構造をしている。ミント１及び２のＮ−末端側半分には二つのプロリンリッチな領域が存在し、マンク１８結合ドメイン（ＭＩＤ）が保存されている以外には相同性が極めて低いが、Ｃ−末端側半分には共通して１つのＰＴＢドメインと２つのＰＤＺドメインが存在し、相同性は極めて高い。一方ミント１は、前シナプス終末蛋白であるＣＡＳＫ及びベリ（ｖｅｌｉ）と複合体を形成し、神経細胞膜蛋白であるニューレキシン（neurexin）などと相互作用し、シナプス形成に関与していると考えられている。この機構は生物進化上極めてよく保存されていることが明らかにされている。実際、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ではＣＡＳＫ、ベリ（ｖｅｌｉ）、ミント１の各ホモログであるリン（ＬＩＮ）−２，７，１０が複合体を形成して細胞分化制御をすることが明らかにされている。これらのことより、ヒトでも同様の蛋白相互作用が行われていると考えられる。
【００１４】
さらにミント１はβＡＰＰと結合することが明らかとなった（J P. Borg, et al., Mol. Cell. Biol., 16, 6229-6241, 1996）。ミント１はそのＰＴＢドメインを介してβＡＰＰのＣ末端のＹＥＮＰＴＹ配列と特異的に結合する。
ミント１とβＡＰＰの結合は、Ａβ生成を制御し、ミント１の異常は神経伝達機能不全を引き起こすと同時にＡβ生成を増強する。一方、βＡＰＰのエンドサイトーシス（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）には、βＡＰＰのＣ末端のＹＥＮＰＴＹ配列が必要であり、Ａβはその後β／γセクレターゼによって細胞内で産生される。すなわち、Ａβの生成にはＹＥＮＰＴＹ配列が必要であり、ミント１はこのＡβ生成の機構を制御していると考えられる。
【００１５】
ミントのもつこのような機能を次のようにして確認した。
まず、抗ミント１ポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学で、マウスの脳のミント１の局在を検討した（図１参照）。電子顕微鏡による微細構造の検討では、ミント１は前シナプス神経終末に存在するシナプス小胞とそのアクティブゾーン（active zone）に限局していることが示された（図２参照）。さらにラットの細胞株ＰＣ１２細胞を神栄養因子（ＮＧＦ）により、神経細胞に分化させ、培養ディシュ上でシナプス結合を形成させ、その時の内在性ミント１の局在を蛍光抗体法により観察した結果、ミント１は前シナプス終末に限局していた。以上のことより、ミント１がシナプス小胞輸送蛋白であることが示された。
さらに、ミント分子中の各ドメインの機能を解析するために、種々の欠失変異体を遺伝子工学的手法により作成し、培養細胞に導入発現させた。この結果ミントが細胞内で小胞に結合するためにはＰＤＺドメインが必須であることが明らかとなった（図５参照）。一方、ミントがβＡＰＰに結合するのはＰＴＢドメインを介してである。
【００１６】
生体内で実際にミントがβＡＰＰと結合していることを確認するためにヒト細胞株ＨＥＫ２９３細胞のミント１／βＡＰＰ強制発現細胞においてβＡＰＰとミント１の局在を共焦点レーザー顕微鏡を用いた二重標識間接蛍光抗体法で検討した（図４参照）。その結果、ミント１とβＡＰＰは一致して局在することが明らかとなり、細胞内でミント１はβＡＰＰと結合していることが示された。
従って、ミント１はＰＤＺドメインを介してβＡＰＰを輸送する小胞の動きを制御し、その過程でＰＴＢドメインを介してβＡＰＰと結合し、最終的にＡβの産生にいたる蛋白質代謝分解経路をも調節するものと考えられる。
【００１７】
つぎに、マウスの脳虚血モデルを用いてミント１の発現を検討した（図３参照）。この結果ミント１の発現は脳虚血により変動することが明らかとなった。このことは神経伝達物質の放出時にミント１がシナプス伝達機能を果たしていることを示す。また、マウスの脳をホモジュネートし、その抽出液からウエスタンブロッティング（Western blotting）によりミント１の同定を試みたところ、ミント１はマウス脳に存在しており、他臓器には存在しないことが明らかとなった。さらに、脳虚血を加えた脳ではミント１蛋白量が虚血負荷後経時的に変動することが明らかとなった（図３及び図６参照）。
【００１８】
家族性、孤発性を問わずアルツハイマー病にいたる異常はβＡＰＰの代謝分解異常である。βＡＰＰと強固に結合しその機能を制御するミントは同時にシナプス伝達をも制御すると考えられる。以上のことから、Ａβの蓄積がみられるアルツハイマー病の初期にはミントの異常による神経障害がみられると考えられる。このことはミント１の測定が神経変性疾患としてまた痴呆性疾患としてのアルツハイマー病の診断に適していることを示している。特に、これらの疾患の初期症状の診断に適したものということができる。
従来からアルツハイマー病の診断をめざして多数の神経物質が用いられてきたが、いずれもアルツハイマー病にのみ関連するものではなく、各器官に点在する神経物質の量の増減を測定し、この結果からアルツハイマー病である可能性をみるというものであった。しかしながら、本発明のミントの測定は、Ａβの生成に直接関連し、かつ脳に局在する蛋白質を測定するものであることから、アルツハイマー病などの神経性疾患の発病の状況を直接知ることができるものである。
【００１９】
本発明は、小胞輸送蛋白ミント、好ましくはミント１及び／又はミント２を検出、同定又は定量することにより神経性疾患、例えば痴呆症、アルツハイマー病などを診断することができることを見い出したものである。
本発明の小胞輸送蛋白ミントを検出、同定又は定量する方法としては、例えば抗ミント抗体を使用することができる。抗ミント抗体はミント又はミントの部分配列からなる蛋白質で感作させた動物から得ることができる。例えば、ラットのミントをウサギに感作させることにより、ウサギ抗ラットミント抗体を得ることができる。
抗原として使用されるミントの部分配列としては、ミント１又はミント２のＮ−末端部分、Ｃ−末端部分、ＰＴＢドメイン、ＰＤＺドメイン、およびβ−アミロイド前駆体蛋白質（βＡＰＰ）の側からはミントとの結合部分であるＹＥＮＰＴＹ配列などを用いることができる。
【００２０】
使用される抗体としては、抗ヒト抗体が好ましいが、ミント１をはじめとするこれらの蛋白の免疫原性は種間で極めて交差性が高く、異種生物の抗体を使用してもヒトミントの測定をすることができる。また、異種生物の抗体を必要に応じてキメラ型やヒト型などに変性させて使用することもできる。
抗体はポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であってもよい。本発明者らは、ラットミントに対するウサギポリクローナル抗体を製造し、これを本発明の方法とした。
【００２１】
本発明の診断剤における小胞輸送蛋白ミントの検出、同定又は定量のための手段としては、抗原−抗体反応による通常の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosolubent assay）法などを用いることができる。また、βＡＰＰ抗体を用いた免疫沈降法との組み合わせて、ミント蛋白の定量とβＡＰＰ結合能の両者を測定することもできる。
【００２２】
また、本発明における検体としては、各種の体液や組織を用いることができるが、痴呆症などの診断において通常使用されている脳脊髄液（ＣＳＦ）を使用するのが好ましい。
本発明のミント蛋白測定ＥＬＩＳＡシステムは生体試料の正常及び異常ミント蛋白量、活性、ＰＴＢ、ＰＤＺドメイン活性、βＡＰＰ結合能などが測定でき、シナプス機能の分子マーカーとして使用することが出来る。特に、βＡＰＰ結合能の測定からはアルツハイマー病発症の予知診断を下すことが出来る。
【００２３】
【実施例】
次に具体例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１（ミントの存在部位）
ラットの各器官からノーザンブロット解析によりミント１の発現分布を検討した。
ミント１、２、３にそれぞれ特異的なＮ−末端側領域を含むＤＮＡ断片をプローブとして使用するために、ラジオアイソトープで標識し、脳、心臓、肺、脾臓、肝臓、腎臓、筋、精巣の各臓器より抽出したｍＲＮＡをプロットしたフィルターに対してハイブリダイゼーションを行った。
この結果からミント１はラット脳に存在しており、他臓器には存在しないことが明らかとなった。
【００２５】
実施例２（ミント１の脳内での局在）
抗ミント１ポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学でマウス脳のミント１の局在を検討した。
マウスを経心的に４％パラフォルムアルデヒドを含む固定液で潅流固定後、脳を摘出し、ビブラトームを用いて脳切片を作成した。その後脳切片をミント１に対する免疫組織化学に供した。即ち、脳切片をラビットポリクローナル抗ラットミント１抗体を含むリン酸緩衝液(2000倍希釈)にて12時間反応させ（第一反応）、洗浄後ビオチン標識ヤギ抗ラビットIgG（第二反応）、次いでアビヂン／ビオチン／ペルオキシダーゼ複合体と反応させた。ミント１の可視化はＤＡＢ反応により行い、光学顕微鏡観察に供した。一部の脳切片はその後オスミウム固定、ウラン染色、脱水、エポン包埋を経て超薄切片とし、電子顕微鏡観察に供した。結果を図面に代る写真により図１（ａ）及び（ｂ）に示す。
また、さらに他の脳切片においては第一反応後に金コロイド標識のヤギ抗ラビットIgGを用いて第二反応を施行し、その後銀染色（silver enhancement）をして可視化した後に電子顕微鏡観察に供した。結果を図面に代る写真により図２Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤとして示す。
光学顕微鏡による検討結果では、ミント１は海馬への興奮性伝導路と苔状線維に多量に局在していた。以上のことより、ミント１が側頭葉海馬という記憶中枢に豊富に含まれていることが示された（図１参照）。
電子顕微鏡による微細構造の検討結果では、ミント１は前シナプスボタンのシナプス小胞とアクティブゾーン（active zone）に限局していた。以上のことより、ミント１がシナプス小胞輸送蛋白であることが示された。（図２参照）
【００２６】
実施例３（抗ミント１ポリクローナル抗体の製造）
ラットミント１のＮ−末端側に存在するマンク１８結合ドメインを含むミント１に特異的な領域とＧＳＴの融合蛋白質を大腸菌内で製造し、これをアフィニティーカラムにて精製して抗原として用いた。
この抗原蛋白質をウサギに投与することにより感作し、抗体を含む血清を得た。この抗体のミント１に対する特異性はリコンビナントミント１、ＧＳＴ融合蛋白質、ＧＳＴのウエスタンブロットで確認した。
【００２７】
実施例４（脳虚血によるミント１の発現の変動）
マウスの脳虚血モデルを用いた検討ではミント１の発現は脳虚血により変動することが明かになった。
マウスの両側総頚動脈の15分間結紮による一過性前脳虚血を作成した。血流再開後１，３，５日目にマウスを経心的に４％パラフォルムアルデヒドを含む固定液で潅流固定後、脳を摘出した。その後、実施例２と同様にしてビブラトームを用いて脳切片を作成し、ミント１に対する免疫組織化学に供した。光学顕微鏡による結果を、図面に代る写真として図３ａ〜ｆに示す。図３のａ〜ｃはミント１の１日目、３日目及び５日目をそれぞれ示し、図３のｄ〜ｆはマンク１８の１日目、３日目及び５日目をそれぞれ示す。
ミント１は虚血負荷後１日目では苔状線維で免疫反応性が低下し、３日目では逆にコントロールよりも増強していた（図３ａ〜ｃ参照）。
このことによりミント１蛋白量が虚血負荷後経時的に変動することが明かとなり、また神経伝達物質の放出時にミント１が機能していることを示す。
【００２８】
実施例５（ミント１のβＡＰＰとの結合能）
ＨＥＫ２９３細胞のミント１／βＡＰＰ強制発現細胞においてミント１とβＡＰＰの局在を共焦点レーザー顕微鏡を用いた二重標識間接蛍光抗体法で行った。結果を図４に図面に代る写真として示す。図４の左上はＦＩＴＣ標識され緑色に蛍光を発色するミント１の局在を、右上はＣｙ３標識され赤色に蛍光を発色するβＡＰＰの局在を、左下は両者の蛍光が一致した時に黄色に発色するミント１／βＡＰＰの局在を示す。即ち図４の左上はミント１単独、右上はβＡＰＰ単独、左下はミント１とβＡＰＰの結合体を示す。
その結果、Ｍｉｎｔ１とβＡＰＰは細胞内局在が一致することが明らかとなり、細胞内でＭｉｎｔ１はβＡＰＰと結合していることが示された（図４参照）。
【００２９】
実施例６（ミント１の各ドメインの小胞輸送機構に対する役割）
ＰＣＲ法と標準的な遺伝子工学組みかえＤＮＡ作製手法により、ミントの各ドメインとＥＧＦＰ（enhanced green fluorescence protein）の融合蛋白質を作製し、ヒト細胞株Ａ４３１細胞の中で発現させた。その結果を図面に代る写真として図５に示す。図５の上段はＥＧＦＰ単独の場合を、中段はＥＧＦＰとミント３のＰＴＢドメインとの融合蛋白質の場合を、下段はＥＧＦＰとミント３のＰＤＺドメインを含む融合蛋白質の場合をそれぞれ示す。この結果、ＰＤＺドメインを含む融合蛋白質のみがゴルジ装置と小胞上に分布した。
【００３０】
実施例７（脳におけるミント１蛋白の半定量的測定）
マウス脳（全脳又は海馬）をホモジュネートし、その抽出液から免疫ブロッティング法（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）によりミント１の同定を試みた。
正常および虚血脳（一過性虚血後１、３、７日後）から抽出した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により泳動したあとニトロセルロース膜に転写し、抗ミント１抗体を用いて同定した。結果を図面に代る写真として、図６Ａ及びＢに示す。図６Ａのレーン１は正常脳の海馬を示し、レーン２は虚血後１日目の海馬を示し、レーン３は虚血後３日目の海馬を示し、レーン４は虚血後５日目の海馬を示し、レーン５はレーン１と同じである。図６Ｂのレーン１は正常脳の大脳皮質を示し、レーン２は虚血後１日目の大脳皮質を示し、レーン３は虚血後３日目の大脳皮質を示し、レーン４は虚血後５日目の大脳皮質を示し、レーン５はレーン１と同じである。
各レーンの上段のブロットは約１４０ｋＤａの全長のミント１蛋白を、下段の約７０ｋＤａのブロットはそのミント１蛋白が切断された一断片蛋白質を示している。この結果より、ミント１は海馬（Ａ）大脳皮質（Ｂ）に豊富に存在していることがわかる。また、海馬では虚血後３日目にミント蛋白およびその断片蛋白の発現産生量が増加しているが、断片蛋白の増加が正常蛋白の増加より顕著であることから、ミント１の産生代謝量が虚血により亢進することが示された。一方、大脳皮質ではミント１の産生量は虚血後も大きくは変化しない。以上のことから、虚血後の神経障害が大きい海馬での神経伝達物質放出時にミント１産生量が変動すると考られた。
【００３１】
【発明の効果】
本発明はアルツハイマー病をはじめとする痴呆性疾患の診断に利用できる診断剤、検査法に関するもので、この検査法により測定される神経伝達に必須のシナプス小胞輸送蛋白ミント（Ｍｉｎｔｓ）の濃度および活性は神経活動の指標として広く利用できる。本発明の方法は、ヒト由来の微量試料を用いて簡便に利用でき、且つ神経機能を特異的に測定できる痴呆の診断法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マウスにおけるミント１の脳内局在を示す免疫組織化学の結果を示す図面に代る写真である。
【図２】図２は、ミント１の微細局在を示す図面に代る電子顕微鏡写真である。
【図３】図３は、脳虚血後のミント１の変動を示す免疫組織化学の結果を示す図面に代る写真である。
【図４】図４は、ＨＥＫ２９３細胞におけるミント１とβＡＰＰの局在の一致を示す図面に代る共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図５】図５は、ミントのＰＤＺドメインがミントが小胞に結合するために必須であることを示す図面に代る写真である。
【図６】図６は、正常および虚血後のミント１の半定量的測定結果を示す免疫ブロットの結果を示す図面に代る写真である。
【図１】
0004064569.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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