(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質と、該融合タンパク質をコードし、かつリガンドが結合したDNAとが、該アダプタータンパク質と該リガンドとの結合を介して連結されている、タンパク質−DNA連結分子であって、アダプタータンパク質が、ビオチン結合タンパク質であり、リガンドがビオチンである連結分子。
【請求項２】
被標的タンパク質がｃDNAの翻訳産物である請求項１記載の連結分子。
【請求項３】
タンパク質−ＤＮＡ連結分子に、さらに標識物質が結合してなる請求項１または２に記載の連結分子。
【請求項４】
被標的タンパク質がｃＤＮＡライブラリーの翻訳産物よりなる、請求項１から３の何れかに記載のタンパク質−ＤＮＡ連結分子からなるライブラリー。
【請求項５】
少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質であるビオチン結合タンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドであるビオチンが結合したＤＮＡを、無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することを特徴とする、請求項１から３何れかに記載のタンパク質−ＤＮＡ連結分子の製造方法。
【請求項６】
少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質であるビオチン結合タンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドであるビオチンが結合したＤＮＡのライブラリーを、該ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡが、一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することを特徴とする、請求項１から３何れかに記載のタンパク質−ＤＮＡ連結分子の製造方法。
【請求項７】
タンパク質の合成がマイクロカプセル内で行われる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質であるビオチン結合タンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドであるビオチンが結合したＤＮＡのライブラリーが、ｃＤＮＡライブラリーである請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質であるビオチン結合タンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドであるビオチンが結合したＤＮＡのライブラリーを、該ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡが、一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成し、合成されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーを、混合して回収した後に、該ライブラリーから所望の性質を有する連結分子を選択することを含む、タンパク質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質−ＤＮＡ連結分子及びそれを用いるタンパク質の機能解析方法に関する。本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子は、タンパク質の進化分子工学やゲノムの機能解析における、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用解析等の試験管内選択に応用される。
【０００２】
【従来技術】
タンパク質の進化分子工学は、医薬・環境分野等への応用、タンパク質の起源・進化の問題、分子間相互作用の解析等生命科学の基礎研究において重要な役割を果たすことが期待されている（根本, 土居, 柳川, 1998, 生化学, 70, 1251-1261）。また、生物の全ゲノム塩基配列情報を基礎として、全ゲノム機能解明を目指すゲノム生物学（統合化生物学）の確立は、２１世紀の生命科学の大きな命題となっている。このゲノム機能解析には、タンパク質、核酸、その他の生体分子と相互作用する未知のタンパク質を、種々の生物や組織由来のｃＤＮＡライブラリーの中から効率的に選び出すことが必要である。
【０００３】
進化分子工学やゲノム機能解析において、タンパク質の試験管内選択の応用が期待されている。タンパク質の試験管内選択を実現するためには、タンパク質（表現型）とそれをコードする核酸（遺伝子型）とを連結しておく必要がある。
【０００４】
タンパク質（表現型）とその遺伝情報を担う核酸（遺伝子型）とを連結させる、従来公知の方法として、ファージ・ディスプレイ法（Smith,  G. P., 1985, Science, 228, 1315-1317）、リボゾーム・ディスプレイ法（Hanes, J. and Pluckthun, A. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4937-4942）、試験管内ウイルス法（Nemoto, N. et al., 1997, FEBS Lett., 414, 405-408; Roberts, R. W. and Szostak, J. W., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297-12302）等がある。現在広く用いられているファージ・ディスプレイ法は、（１）大腸菌の形質転換という過程が必要であり培養に時間がかかる、（２）集団のサイズが小さくなる、（３）大腸菌にとって有害なタンパク質や、大腸菌内で分解されるタンパク質、さらに大腸菌の膜を透過出来ないタンパク質は提示できない、等の問題点がある。
【０００５】
一方、リボゾーム・ディスプレイ法や試験管内ウイルス（In vitro virus）法は、すべての過程を試験管内で行うため上記の制約を回避できる。しかしながら、これらの方法では、タンパク質と連結させる遺伝子型がｍＲＮＡであるため分解されやすく、また、タンパク質の終止コドンを除いた遺伝子ライブラリーを用いる等の必要があるので、ｃＤＮＡライブラリー等をそのまま提示できないという欠点がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ファージ・ディスプレイ法の長所は遺伝子型が安定なＤＮＡであることであり、その短所は生きた細胞を用いる必要があることである。他方、リボゾーム・ディスプレイ法及び試験管内ウイルス法の長所は細胞を必要としない試験管内での方法であることであり、その短所は遺伝子型がｍＲＮＡであり、かつその終止コドンを除く必要があることである。したがって、遺伝子型が安定なＤＮＡを用いて、それが終止コドンを含むものでも試験管内でタンパク質−ＤＮＡ連結分子を製造する方法の開発が望まれていた。
【０００７】
一方、多様な生物の全遺伝子機能を核酸−核酸相互作用に基づいて迅速かつ効率的に解析するための技術として、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイがある（Gerhold, D. G. et al., 1999, TIBS, 168-173）。ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイは、スライドガラス、シリコン、プラスチックス等の基板に、多数のＤＮＡ分子を整列させたもので、遺伝子の発現や変異、多型性等の同時解析に非常に有用であり、実用化されている。また、ＤＮＡチップと同様にタンパク質をチップ上に固定したタンパク質チップがある。タンパク質チップは、ゲノム機能解析においてタンパク質−タンパク質相互作用やタンパク質−核酸相互作用を高い効率で調べるのに有用であるが、タンパク質の固定化や安定化に問題があり、まだ実用化の段階に達していない。
【０００８】
タンパク質−タンパク質相互作用や、タンパク質−核酸相互作用をする物質を試験管内で選択するためには、基本的に、ある１つの選ばれた特定の標的分子（タンパク質、核酸、糖質・脂質、その他どの様な化合物でもよい）と相互作用するタンパク質（これを「被標的タンパク質（candidate protein）」と呼ぶことがある）を１つのライブラリーから選択することが必要である。しかし、標的分子を１つの分子に限らずに、沢山の標的分子からなる第１のライブラリーを用意し、その中の何れかの分子と相互作用する被標的タンパク質を第２のライブラリーから選択すれば、１度に多くの分子間相互作用を知ることができる。ゲノム機能解析のように、非常に膨大な数の遺伝子やタンパク質の間の相互作用を調べる必要がある場合には、このようなライブラリー対ライブラリーの選択法が非常に有用である。最近、細胞内（in vivo）でライブラリー対ライブラリーの選択を行う方法がいくつか提案されているが（Rudert, F. et al., 1998, FEBS Lett., 440, 135-140; Pelletier, J.N. et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17, 683-690）、試験管内（in vitro）でタンパク質のライブラリー対ライブラリーの選択を行う方法は開発されていない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、被標的タンパク質とその遺伝情報を担うＤＮＡとが安定に連結した「タンパク質−ＤＮＡ連結分子」を試験管内で構築すべく鋭意検討した。その結果、本発明者らは、被標的タンパク質（表現型）とこれをコードするＤＮＡ（遺伝子型）とを、被標的タンパク質に融合したアダプタータンパク質とそのＤＮＡに結合させたリガンドとの結合を介して連結できることを見出した。また、本発明者らは、かくして構築されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子が、タンパク質の相互作用の解析、タンパク質の高速な試験管内進化実験等に利用可能であることを見出した。さらに、本発明者らは、標識物質で標識したタンパク質−核酸連結分子を含むタンパク質−核酸連結分子のライブラリーを用い、ライブラリー対ライブラリーの選択を行うことができることを見出した。このようなスクリーニングから得られる知見を基に、タンパク質や核酸の相互作用ネットワークのデータベースを構築すれば、医薬品の開発に有用な情報を提供することが可能となる。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明の第１の態様によれば、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質と、該融合タンパク質をコードし、かつリガンドが結合したＤＮＡとが、該アダプタータンパク質と該リガンドとの結合を介して連結されている、タンパク質−ＤＮＡ連結分子が提供される。
【００１１】
好ましくは、被標的タンパク質はｃＤＮＡの翻訳産物である。
好ましくは、アダプタータンパク質は、ビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及び抗体からなる群から選ばれる。
好ましくは、アダプタータンパク質はビオチン結合タンパク質であり、リガンドはビオチンである。
好ましくは、ビオチン結合タンパク質は、アビジン又はストレプトアビジンである。
好ましくは、タンパク質−ＤＮＡ連結分子に、さらに標識物質が結合してなる。
【００１２】
本発明の第２の態様によれば、被標的タンパク質がｃＤＮＡの翻訳産物である上記した本発明によるタンパク質−ＤＮＡ連結分子からなるライブラリーが提供される。
本発明の第３の態様によれば、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡを、無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することを特徴とする、本発明によるタンパク質−ＤＮＡ連結分子の製造方法が提供される。
【００１３】
本発明の第４の態様によれば、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡのライブラリーを、該ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡが、一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することを特徴とする、本発明によるタンパク質−ＤＮＡ連結分子の製造方法が提供される。
【００１４】
好ましくは、タンパク質の合成はマイクロカプセル内で行われる。
好ましくは、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡのライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーである。
【００１５】
本発明の第５の態様によれば、本発明の方法により製造されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーから所望の性質を有する連結分子を選択することを含む、タンパク質のスクリーニング方法が提供される。
本発明の第６の態様によれば、本発明の方法により製造されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーから所望の性質を有する連結分子を選択し、更に連結分子中の被標的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を誘発させ、所望の性質が更に改変された被標的タンパク質を含有する連結分子を選択することを特徴とする、タンパク質の機能改変方法が提供される。
【００１６】
本発明の第７の態様によれば、（ａ）第１の標識物質で標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーである第１のライブラリーと、第１の標識物質とは異なる第２の標識物質で標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーである第２のライブラリーとを混合する工程；
（ｂ）第１のライブラリー中のタンパク質−連結分子と第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子との複合体を、第１及び第２の標識物質の標識に基づいて選択する工程；及び
（ｃ）上記工程（ｂ）で選択された第１及び第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子の複合体が有する核酸部分を解読して複合体を形成するタンパク質を同定する工程：
を含む、相互作用を有するタンパク質の機能解析方法が提供される。
【００１７】
好ましくは、第１のライブラリーを標識するための第１の標識はビーズであり、第１及び第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子の複合体の選択は、セルソーター又は光ピンセットで行う。
好ましくは、第１の標識物質で標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーである第１のライブラリーは、固相上に一種類ずつ固定化されている。
【００１８】
好ましくは、タンパク質−核酸連結分子は、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質と、該融合タンパク質をコードし、かつリガンドが結合したＤＮＡとが、該アダプタータンパク質と該リガンドとの結合を介して連結されている、タンパク質−ＤＮＡ連結分子である。
好ましくは、タンパク質−核酸連結分子は、被標的タンパク質のＣ末端と該タンパク質をコードする核酸の３’末端とが核酸誘導体を介して結合されているものである。
好ましくは、タンパク質−核酸連結分子は、ファージ表面に提示される被標的タンパク質をコードするＤＮＡをファージ粒子内に包み込んだものである。
好ましくは、タンパク質−核酸連結分子は、被標的タンパク質と、該タンパク質をコードする核酸とがリボゾームを介して結合されているものである。
【００１９】
【発明の実施の形態】
（１）本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子
先ず、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子について説明する。
本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子は、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質と、該融合タンパク質をコードし、かつリガンドが結合したＤＮＡとが、該アダプタータンパク質と該リガンドとの結合を介して連結されることによって構成されている。
【００２０】
融合タンパク質を構成する「被標的タンパク質（candidate protein）」とは、機能解析、機能改変等の対象となるタンパク質を意味する。この被標的タンパク質は、天然タンパク質又はその変異体、及び人工タンパク質又はその変異体の何れでもよい。天然タンパク質としては、種々の生物の器官、組織又は細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーから転写翻訳される多様性を有するタンパク質のライブラリーを含むものである。人工タンパク質としては、天然タンパク質の全てもしくは部分配列を組み合わせた配列、又はランダムなアミノ酸配列を含むものである。
【００２１】
「アダプタータンパク質」とは、ある分子（リガンド）と特異的に結合する能力を有するタンパク質を意味し、これらの中には、結合タンパク質、受容体を構成する受容体タンパク質、抗体等も含まれる。
「リガンド」とは、アダプタータンパク質に特異的に結合する分子を意味する。
アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合蛋白質／ビオチン、マルトース結合蛋白質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、DNA結合タンパク質／DNA、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ATP結合タンパク質／ATP、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール等の各種受容体タンパク質／そのリガンド等が挙げられる。
【００２２】
これらの中で、アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）等が好ましく、特に、ストレプトアビジン／ビオチンが最も好ましい。
これらの結合タンパク質は、それ自体既知のものであり、該タンパク質をコードするＤＮＡは既にクローニングされている。
【００２３】
「融合タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、被標的タンパク質をコードするＤＮＡ領域とアダプタータンパク質をコードするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである。本発明で用いる融合タンパク質をコードするＤＮＡにおいては、通常、その一方の末端にリガンドが結合している。該ＤＮＡの末端に結合したリガンドと該ＤＮＡにより発現される融合タンパク質中のアダプタータンパク質部分との結合を介して、融合タンパク質とＤＮＡとが物理的に連結される。
【００２４】
（２）本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子の製造方法
上記した本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子は、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡを、無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することにより製造できる。好ましくは、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡのライブラリーを、該ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡが、一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することにより製造される。
【００２５】
すなわち、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子の製造方法は、（ｉ）試験管内でＤＮＡからタンパク質を合成するために無細胞転写翻訳系を用いること、（ii）無細胞転写翻訳系に加えるＤＮＡとそこから合成されるタンパク質とが自然に連結できるように、被標的タンパク質にはアダプタータンパク質を融合させるとともに、転写翻訳されるＤＮＡにはリガンドを結合させておくこと、そして（iii）ＤＮＡを１種類もしくは１分子ずつマイクロチューブ等の試験管、マイクロプレートのウェル、またはカプセル等の中に隔離した状態でタンパク質合成を行わせ、合成された融合タンパク質とそれをコードするＤＮＡとをアダプタータンパク質とリガンドとの結合を介して連結させるという、３つの特徴を有している。
【００２６】
本発明において、「転写翻訳開始領域」とは、ＤＮＡ上に存在し、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳を可能とするようなあらゆる塩基配列を有するＤＮＡセグメントを指す。具体的には、プロモーター、エンハンサー、コザック配列、シャイン・ダルガーノ配列等を含むＤＮＡセグメントが挙げられる。
【００２７】
「被標的タンパク質をコードするＤＮＡ領域」とは、前記した被標的タンパク質をコードするＤＮＡを意味し、このＤＮＡ領域が、融合タンパク質を構成する被標的タンパク質に翻訳される。多様性を有する諸種のタンパク質の全部またはその一部に翻訳されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡのライブラリーは、主にタンパク質コード領域の塩基配列が互いに異なっている１種類以上のＤＮＡからなる。このような被標的タンパク質をコードする領域の多様性を実現する１つの方法として、天然タンパク質をコードする塩基配列の一部又は全部をランダム配列で置き換える方法(Doi, N. et al., 1997, FEBS Lett., 402, 177-180; Doi, N. et al., 1998, FEBS Lett., 427, 51-54) 及びモジュールや二次構造単位のような単位領域を組み合わせる方法(Tsuji, T. et al., 1999, J. Mol. Biol., 286, 1581-1596)が挙げられる。
【００２８】
「アダプタータンパク質をコードするＤＮＡ領域」とは、前記したアダプタータンパク質をコードするＤＮＡを意味し、このＤＮＡ領域が、融合タンパク質を構成するアダプタータンパク質に翻訳される。
上記した転写翻訳開始領域、被標的タンパク質をコードするＤＮＡ領域及びアダプタータンパク質をコードするＤＮＡ領域を、これらタンパク質をコードする領域の５’側に転写翻訳開始領域がくるように結合し、更に、そのＤＮＡの何れかの末端にリガンドを結合することによって、転写翻訳させるＤＮＡのライブラリーを調製することができる。
【００２９】
ＤＮＡの末端へのリガンドの結合は、例えば、好ましくは、ＤＮＡの３’末端側からのＤＮＡ鎖の伸長のために用いるプライマーの５’末端側にリガンドが結合したプライマーを調製し、該プライマーを用いるＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)法により行うことができる。例えば、リガンドがビオチンの場合は、ＰＣＲ法で該ＤＮＡを増幅する際、ビオチンが予め結合しているプライマーを用いて行うことにより、容易にＤＮＡの末端にビオチンを導入することができる。
【００３０】
ビオチンが予め結合しているプライマーを得るには、プライマーをＤＮＡ合成機で合成する際にその最後の段階でビオチンホスホアミダイドを用いて反応させればよい。各種ヌクレオチドのビオチンホスホアミダイドは、グレン・リサーチ社等にて市販されている。リガンドがペプチド、脂質、糖等の場合は、上記プライマーを合成する際に、ヌクレオチドの５’末端に、炭素数３〜６の炭化水素基を介して保護されたアミノ基を持つホスホアミダイド（アルキルホスホアミダイドリンカー）を反応させた後、アミノ基を脱保護し、所望のリガンドのサクシニル誘導体を化学結合させる。リガンドがニッケル等の金属イオンの場合は、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬を、必要な場合スペーサーを介してプライマーの末端に結合させ、結合後、金属イオンを配位させることができる。
【００３１】
上記したＤＮＡ末端へのリガンドの結合方法は、それ自体既知の当業者によく知られた方法であり、容易に行うことができる。
かくして調製されたＤＮＡのライブラリーを用い、該ＤＮＡが一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離された無細胞転写翻訳系で該ＤＮＡを発現させてタンパク質合成が行われる。
【００３２】
ここで、「無細胞転写翻訳系」とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そこにＤＮＡを加えることによってそのＤＮＡがコードしているタンパク質が合成されるようなあらゆる系を指す。無細胞転写翻訳系の具体例としては、真核細胞及びバクテリア細胞又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられ、特に好ましい具体例としては、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽、大腸菌からの抽出液（大腸菌Ｓ３０抽出液）に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。
【００３３】
ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡが一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離するための方法としては、マイクロチューブ等の試験管、マイクロプレートまたはカプセル等を利用する方法が挙げられる。例えば、ＤＮＡのライブラリーが、１個ずつクローニングされカタログ化されているｃＤＮＡライブラリー等の場合、それぞれのＤＮＡはあらかじめ１種類ずつ分離されているので、それぞれ別々にマイクロチューブやマイクロプレートのウェル中の無細胞転写翻訳系に加えればよい。
【００３４】
ＤＮＡのライブラリーが、化学合成されたランダム配列等のように、混合物として調製される場合、その混合物をプラスミド等のベクターにクローニングし、大腸菌等の細胞の中で１種類ずつ隔離し、それぞれのＤＮＡを細胞から抽出してくる方法がある。また、細胞を使わずに試験管内でＤＮＡを隔離する方法として、ＤＮＡの混合物をＤＮＡ１分子の隔離が可能になるまで希釈し、それぞれのＤＮＡ１分子を取り出し、ＰＣＲ法により増幅することも可能である（Ohuchi, S. et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4339-4346）。これらのＤＮＡをそれぞれ別々にマイクロチューブやマイクロプレートのウェル中の無細胞転写翻訳系に加えることができる。
【００３５】
さらに別の方法として、マイクロカプセルを利用してＤＮＡを隔離する方法もある。具体的には、ＤＮＡのライブラリーを加えた無細胞転写翻訳系の水相を、油相に加え撹拌することによって形成される逆相ミセル（水／油型エマルジョン；water-in-oil emulsion）がある。逆相ミセルの作成及び逆相ミセル中での無細胞転写翻訳は、Tawfik, D.S. and Griffith, A.D., 1998, Nat. Biotechnol., 16, 652-656; Nametkin, S.N., Kolosov, M.I. et al., 1992, FEBS Lett., 309, 330-332; 国際公開WO 99/02671号公報に記載の方法に準じ行うことができる。
【００３６】
逆相ミセル（water-in-oil emulsion）の作成法は非常に多くの方法が知られているが、本発明で用いる方法には、ミセルが安定であること、そして転写翻訳反応を阻害しないことという条件が求められる。この条件は、用いる油に１種もしくはそれ以上の界面活性剤を加えてミセルを安定化することにより達成できる。これらの界面活性剤はエマルジョン化試薬と呼ばれ、水相と油相とが分離してしまわないようにするものである。用いられる油（オイル）としては、light white mineral oilが好ましく、特にプロテアーゼやヌクレアーゼを含まない純度の高いものが望ましい。用いられる界面活性剤としては、sorbitan monooleate（例えばSpan-80）、polyoxyethylenesorbitan monooleate（例えばTween-80）等の非イオン系界面活性剤、コール酸ナトリウムやタウロコール酸ナトリウム等のアニオン性界面活性剤が挙げられる。エマルジョン作製は、それ自体既知の通常用いられる撹拌装置を用いて行うことができる。特に簡便には、マグネチックスターラー、ホモジナイザー、超音波等が利用可能である。攪拌装置の回転数は毎分500回転から2000回転程度が望ましい。攪拌時の温度はエマルジョン作製時に転写翻訳の反応が進まないように４℃以下で行うのが望ましい。
【００３７】
また、別のマイクロカプセルの具体例として、例えば、天然のリン脂質や人工の合成両親媒性分子で形成されるリポソーム等を用いることができる(Chakrabarti, A.C., Breaker, R.R. et al., 1994, J. Mol. Evol., 39(6), 555-559)。
【００３８】
（３）本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーからの所望の性質を有する連結分子の選択（タンパク質のスクリーニング方法）、並びにそれを利用したタンパク質の機能改変方法
本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子を用いる試験管内選択を行う前に、あらかじめ無細胞転写翻訳系由来のタンパク質、その他の夾雑物から、タンパク質−ＤＮＡ連結分子を分離及び精製しておくことが好ましい。精製の具体例として、エピトープペプチド、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質等をコードするＤＮＡ領域を、前記した転写翻訳されるべきＤＮＡに導入し、前記の通り発現させ、該タンパク質と親和性を有する物質とのアフィニティーを利用して精製することができる。
【００３９】
必要に応じて、精製・回収されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーは、試験管内選択に利用することができる。
即ち、得られるタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーを、目的とする生物活性により選択し、選択された連結分子のＤＮＡを、例えばＰＣＲ法により増幅して、塩基配列を解析することにより、タンパク質−ＤＮＡ連結分子中のタンパク質の配列を容易に知ることができる。
【００４０】
また、タンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリー中から所望の性質を有するタンパク質−ＤＮＡ連結分子を目的とする生物活性により選択し、さらにタンパク質−ＤＮＡ連結分子中のＤＮＡを増幅するに際し、該被標的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を誘発させ、所望の性質がさらに改良された被標的タンパク質を含有するタンパク質−ＤＮＡ連結分子を選択することができる。変異の誘発は、既に確立しているError-prone PCR (Leung, D.W. et al., 1989, J. Methods Cell. Mol. Biol., 1, 11-15)やSexual PCR (Stemmer, W.P.C., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10747-10751)を用いて容易に行うことができる。
【００４１】
ここで、「所望の性質を有するタンパク質」とは、所望の標的分子に結合するタンパク質、所望の化学反応を触媒するタンパク質、上記したタンパク質の結合能、触媒能、基質特異性、熱安定性及び環境条件が改変されたタンパク質等をいう。
【００４２】
目的とする生物活性により被標的タンパク質を選択する方法としては、標的分子との結合能を指標にして選択する方法と、触媒活性を指標にして選択する方法が挙げられる。これら結合能または触媒活性を指標として、例えば、親和性樹脂吸着法、免疫沈降法、電気泳動法、クロマトグラフィー法、フローサイトメトリー法等を利用して所望の性質を有する被標的タンパク質を選択することができる。より具体的には、タンパク質、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、糖質、脂質等の標的分子を、予めマイクロプレートやビーズ等の固相に結合させておき、これに上記で構築されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子を加え、適当な温度条件で、一定時間反応させた後に洗浄し、標的分子に結合した連結分子を解析する方法が挙げられる。この方法は、既に確立しているEnzyme Linked Immunosorbent Assay (ＥＬＩＳＡ) (Crowther, J.R., 1995, Method in Molecular Biology, Vol. 42, Humana Press Inc.)に準じて行うことができる。
【００４３】
触媒活性を指標として被標的タンパク質（酵素タンパク質）を選択する際、例えば、次の２つの方法を用いることができる。その１つは触媒抗体の場合のように、所望の触媒反応の遷移状態アナログを固定化した樹脂に結合するタンパク質を選択する方法である（Tramontano, A. et al., 1986, Science, 234, 1566-1570）。もう１つはＲＮＡ酵素（リボザイム）の場合のように、触媒活性による分子の結合・切断によって、タンパク質−ＤＮＡ連結分子が樹脂に結合・解離されるように工夫する方法である（Gold, L. et al., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763-797）。前者の選択法は酵素活性のターンオーバーを増やすことが難しいのに対して、後者の選択法は、リボザイムの多くの成功例が示しているように、結合ではなく最初から触媒活性で選択する方法であり、後者の方法が有効である。
【００４４】
また、触媒抗体が抗体構造によって制限されることも、天然酵素ほどの活性をもつものが得られていない理由の１つである。本発明では、リボザイム型の選択法が利用可能であり、タンパク質の構造の選択範囲も抗体に限らず自由なので、従来の触媒抗体を越えた新規触媒タンパク質の創出に大きく寄与することが期待できる。
【００４５】
また、本発明では、細胞を使わない試験管内での選択が可能であるため、細胞が生育できないような温度・圧力・有機溶媒中等の過酷な環境条件で働く酵素の創出にも利用できる。リボゾーム・ディスプレイや試験管内ウイルス等の従来法では遺伝子としてｍＲＮＡを使用するのに対して、本発明の連結分子においては安定なＤＮＡを使用しているので、このような場合にも有利である。
【００４６】
このような方法により選択された連結分子に含有されるＤＮＡを、上記の通り、例えば、ＰＣＲ法により増幅し、クローニングしたＤＮＡの塩基配列を決定することによって、選択されたタンパク質のアミノ酸配列を知ることができる。ＰＣＲ法によるタンパク質−ＤＮＡ連結分子中のＤＮＡの増幅には、タンパク質コード領域の前後の非コード領域（ＵＴＲ）に共通に含まれるＤＮＡに相補的なプライマーを用いればよい。
【００４７】
上記の通り、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子は、酵素活性の検出、タンパク質−タンパク質相互作用の解析、タンパク質−核酸相互作用の解析、タンパク質の修飾の解析等の生化学的機能を解析して、遺伝子の機能を解析することにより、治療・診断あるいは産業上の問題を解決するためにタンパク質の利用が考えられるようなあらゆる分野に応用可能である。既存のタンパク質の改良ばかりでなく、新しい機能を有するタンパク質の創出にも役立つ。
【００４８】
（４）タンパク質−核酸連結分子を利用したライブラリー対ライブラリーのスクリーニング
蛍光性物質等で標識された本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子を含むタンパク質−核酸連結分子を利用すると、１種類の標的分子に対するライブラリーのスクリーニングだけでなく、ライブラリー対ライブラリーのスクリーニングも可能になる。
【００４９】
即ち、本発明によれば、（ａ）第１の標識物質で標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーである第１のライブラリーと、第１の標識物質とは異なる第２の標識物質で標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーである第２のライブラリーとを混合する工程；
（ｂ）第１のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子と第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子との複合体を、第１及び第２の標識物質の標識に基づいて選択する工程；及び
（ｃ）上記工程（ｂ）で選択された第１及び第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子の複合体が有する核酸部分を解読して複合体を形成するタンパク質を同定する工程：
を含む、相互作用を有するタンパク質の機能解析方法が提供される。
【００５０】
本発明で用いることができる標識物質の具体例としては、蛍光性物質、放射性物質、非放射性標識物質等が挙げられる。蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、NBD系列等の蛍光色素や、緑色蛍光タンパク質（GFP）等の蛍光性タンパク質がある。また、放射性物質として、32Ｐ、35Ｓ等の放射性同位元素等が挙げられる。その他、非放射性標識物質としては、糖類、脂質類、色素、ビーズ、ナノビーズ等、タンパク質またはＤＮＡと結合可能な化合物であれば如何なるものでもよい。
【００５１】
前記タンパク質−ＤＮＡ連結分子を標識する最も簡単な方法は、ＤＮＡのライブラリーをあらかじめ標識しておくことである。例えば、フルオレセイン等の蛍光色素で標識したプライマーとリガンドが結合したプライマーを用いて、ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、ＤＮＡライブラリーを調製する方法が挙げられる。この方法は、従来のファージ・ディスプレイ法、リボゾーム・ディスプレイ法、試験管内ウィルス法等で構築される「タンパク質と核酸が連結した分子」を標識化するよりもはるかに容易であり、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子の大きな利点の１つである。
【００５２】
本発明においては、本明細書中上記した本発明によるタンパク質−ＤＮＡ連結分子の他に、ファージ・ディスプレイ法、リボゾーム・ディスプレイ法、試験管内ウィルス法、その他の方法で製造されるタンパク質−核酸連結分子を標識物質で標識化して用いることができる。本発明によるタンパク質−ＤＮＡ連結分子を含むこれら全てのタンパク質−核酸連結分子は、基本的に、転写翻訳開始領域とタンパク質コード領域を含む核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を調製し、それを細胞または無細胞転写翻訳系に加えてタンパク質を合成させ、何らかの方法で核酸と合成されたタンパク質とを連結させた構造を有する。したがって、連結分子を標識化するためには、この製造過程の何れかの段階で、核酸部分、タンパク質部分、またはタンパク質−核酸連結分子に含まれるそれ以外の部分に、検出のための標識物質を結合させる必要がある。標識化されたタンパク質−核酸連結分子はさまざまな方法でライブラリー対ライブラリーの試験管内選択に利用できる。
【００５３】
ここで言う「タンパク質コード領域」とは、前記した被標的タンパク質をコードするＤＮＡ領域を含む転写翻訳されるべきＤＮＡ領域を意味する。また、「転写翻訳領域」、「無細胞転写翻訳系」、「標識物質」等は前記した意味を有する。
タンパク質（表現型）とその遺伝情報を担う核酸（遺伝子型）とを連結させたタンパク質−核酸連結分子の調製方法として上記したファージ・ディスプレイ法（Smith, G. P., 1985, Science, 228, 1315-1317）、リボゾーム・ディスプレイ法（Hanes, J. and Pluckthun, A., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4937-4942）、及び試験管内ウイルス法（Nemoto, N. et al., 1997, FEBS Lett., 414, 405-408; Roberts, R.W. and Szostak, J.W., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297-12302; 国際公開WO98/16636号公報）はそれ自体既知の方法である。
【００５４】
即ち、ファージ・ディスプレイ法は、大腸菌に感染して増殖するファージを利用する方法である。ファージ粒子はファージを構成する外被蛋白質がそれ自身をコードするＤＮＡを包み込む形態をしている。ＤＮＡライブラリーを外被蛋白質遺伝子に挿入することにより、ファージ粒子の表面にペプチドが提示されたファージライブラリーを作成できる。提示されたペプチドと標的分子との相互作用に基づいて選択したファージを増幅し、そのＤＮＡを調べることにより、選択されたペプチドの配列を知ることができる。
【００５５】
リボゾーム・ディスプレイ法と試験管内ウイルス法は、無細胞翻訳系で合成されたタンパク質とそれをコードするｍＲＮＡを連結する方法である。リボゾーム・ディスプレイ法では、終止コドンを除いたｍＲＮＡを用いて翻訳されたタンパク質をリボゾーム上にトラップさせ、この結果生じるタンパク質−リボゾームｍＲＮＡ複合体をタンパク質−核酸連結分子として利用することができる。
【００５６】
一方、試験管内ウイルス法では、同じく終止コドンを除いたｍＲＮＡの３’末端にＤＮＡスペーサーと核酸誘導体、例えばピューロマイシンとを結合し、それを鋳型として無細胞転写翻訳を行うことで、タンパク質とｍＲＮＡが核酸誘導体を介して共有結合した単純な分子である「試験管内ウィルス」を構築することができる。これらのタンパク質−ｍＲＮＡ連結分子は試験管内選択後、逆転写ＰＣＲ法により遺伝子を増幅し解読することができる。
【００５７】
この試験管内ウイルス法で用いられる核酸誘導体としては、ピューロマイシン(Puromycin)、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド(3'-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside; PANS-アミノ酸)、例えば、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸が利用できる。また、３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基がアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオチド(3'-aminoacyladenosine aminonucleoside; AANS-アミノ酸)、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸が利用できる(Harris, R.J., Hanlon, J.E. and Symuns, R.H., 1971, Biochem. Biophys. Acta., 240, 244-262)。これらの中で、ピューロマイシンを利用するのが最も好ましい。
【００５８】
タンパク質−核酸連結分子の標識化は、具体的には、例えば次の通り行うことができる。
まず、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子の標識は、前記した通り、ＤＮＡをＰＣＲ法で増幅するとき、プライマーに標識物質、例えばフルオレセイン等の蛍光色素やビーズ等を結合したものを用いて行えばよい。この標識プライマーを用いて増幅したＤＮＡを鋳型に用い、無細胞転写翻訳を行えば、蛍光性物質やビーズ等で標識されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子が得られる。
【００５９】
また、ＤＮＡをＰＣＲ法で増幅するとき、蛍光性物質が結合したり、放射性物質で標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸を用いれば、蛍光性物質や放射性物質で標識されたＤＮＡを作成できる。これらの標識されたＤＮＡを用いて無細胞転写翻訳を行えば、蛍光性物質や放射性物質等で標識されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子を作成できる。アダプタータンパク質に対する蛍光抗体を作製して、アダプタータンパク質部分に結合させても、タンパク質−ＤＮＡ連結分子を蛍光標識することができる。蛍光性物質が結合したり、放射性物質で標識されたアミノ酸や、それから誘導されるアミノアシル-ｔＲＮＡ を用いて無細胞転写翻訳を行えば、合成されるタンパク質−ＤＮＡ連結分子のタンパク質部が蛍光性物質や放射性物質で標識される。
【００６０】
ファージ・ディスプレイ法においてファージを標識化するには、蛍光性タンパク質、例えばＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）の遺伝子をファージの外被タンパク質遺伝子に挿入して、発現させる方法がある。また、外被タンパク質の蛍光抗体を外被タンパク質に結合させて、ファージを蛍光標識させてもよい。
【００６１】
リボゾーム・ディスプレイ法において、タンパク質−ｍＲＮＡ複合体を標識化するには、あらかじめｍＲＮＡを標識する方法がある。例えば、蛍光性物質やビーズ等をキャップ構造の中の核酸塩基やリボース部分に蛍光またはビーズ等を化学結合させた標識化キャップ構造を作製し、これを転写の段階で加えれば、ｍＲＮＡが蛍光性物質やビーズ等で標識される。また、蛍光性物質が結合したり、放射性物質、例えば32Ｐで標識されたリボヌクレオチド三リン酸を用いて転写すれば、蛍光性物質や放射性物質で標識されたｍＲＮＡを作成できる。これらのｍＲＮＡを用いて無細胞転写翻訳を行えば、ｍＲＮＡ−リボゾームタンパク質複合体が標識される。また、ｍＲＮＡやリボゾームＲＮＡの核酸部を核酸染色性の蛍光色素（たとえばSYPRO Orange）等で、染色して蛍光標識させる方法もある。さらに、発現、提示するタンパク質を既知タンパク質との融合タンパク質として発現するように予め遺伝子に組み込み、該既知タンパク質に対する蛍光抗体を調製し、これをｍＲＮＡ−リボゾームタンパク質複合体のタンパク質部に結合させれば、ｍＲＮＡ−リボゾームタンパク質複合体を蛍光標識できる。また、蛍光性物質が結合したり、放射性物質、例えば32Ｓ−メチオニンで標識されたアミノ酸や、それから誘導されるアミノアシル-ｔＲＮＡ を用いて無細胞転写翻訳を行えば、合成されるタンパク質が蛍光性物質や放射性物質で標識され、その結果タンパク質−ｍＲＮＡ連結分子が標識される。
【００６２】
試験管内ウィルス法で調製されるタンパク質−核酸連結分子の標識化は次の通り行うことができる。
試験管内ウイルスは上記の通り、ｍＲＮＡ−スペーサー−核酸誘導体−タンパク質から構成される。標識物質、例えば、蛍光性物質またはビーズ等をキャップ構造の中の核酸塩基やリボース部分に化学結合させた蛍光またはビーズ標識キャップ構造をつくり、これを転写の段階で加えれば、ｍＲＮＡが蛍光またはビーズ等で標識される。また、蛍光性物質が結合したり、放射性物質で標識されたリボヌクレオチド三リン酸を用いて転写を行えば、蛍光性物質や放射性物質で標識されたｍＲＮＡを作成できる。
【００６３】
これらの標識されたｍＲＮＡを用いて無細胞転写翻訳を行うと、試験管内ウイルスであるｍＲＮＡ−スペーサー−核酸誘導体−タンパク質のｍＲＮＡ部分が標識される。予めスペーサーの特定部分やピューロマイシン及びその誘導体の核酸塩基部分に蛍光性物質やビーズ等を化学的に結合させ、その結果、試験管内ウイルスを標識化することもできる。また、ｍＲＮＡ部分を核酸染色性の蛍光色素（たとえばSYPRO Orange）等で、染色して蛍光標識させる方法もある。
【００６４】
さらに、発現、提示するタンパク質部を既知タンパク質との融合タンパク質として発現するように予め遺伝子に組み込み、該既知タンパク質に対する蛍光抗体やビーズ結合抗体を調製し、ｍＲＮＡ−スペーサー−核酸誘導体−タンパク質におけるタンパク質部分に特異的に結合させれば、試験管内ウイルスが蛍光またはビーズで標識される。また、蛍光性物質が結合したり、放射性物質で標識されたアミノ酸や、それから誘導されるアミノアシル-ｔＲＮＡ を用いて無細胞転写翻訳を行えば、合成される試験管内ウイルスのタンパク質部分が蛍光性物質や放射性物質で標識される。
【００６５】
かくして標識されたタンパク質−核酸連結分子は、必要に応じて精製した後、ライブラリー対ライブラリーのスクリーニングに用いて、タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−核酸相互作用を解析することができる。
即ち、前記の通り、第１のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子と第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子との複合体を、第１及び第２の標識物質の標識に基づいて選択し、上記工程で選択された第１及び第２のライブラリー中のタンパク質−核酸連結分子の複合体が有する核酸部分を解読して複合体を形成するタンパク質を同定することによって、２つの異なるライブラリーの間に存在する全てのタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用を同時に選択でき、複合体を形成するタンパク質を解析、同定することができる。
【００６６】
ここで、複合体を形成しているタンパク質−核酸連結分子の選択は、それぞれの標識物質の標識に基づき、例えば、親和性樹脂吸着法、免疫沈降法、ポリアクリルアミドゲル及びアガロースゲル電気泳動法、クロマトグラフィー法、フローサイトメトリー法、蛍光及び放射能スキャナー法、シンチレーションカウント法、蛍光相関分光法、蛍光偏向解消法等を利用して行うことができる。かくして選択された連結分子の複合体が含有する核酸をＰＣＲ法等により増幅し、塩基配列を解読することにより選択されたタンパク質を解析、同定することができる。
【００６７】
本発明においては、一方のライブラリーがビーズで標識されたものを用いることが好ましい。即ち、第１のライブラリーであるビーズで標識された連結分子のライブラリーと、第２のライブラリーであるビーズとは異なる標識物質で標識された連結分子のライブラリーとを混合し、ビーズとビーズとは異なる標識物質で標識されている連結分子の複合体をセルソーターまたは光ピンセットを用いて分離し、連結分子の複合体が有する核酸部をそれぞれ増幅、解読することによって、２つの異なるライブラリーの間に存在する全てのタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用を有するタンパク質を同時に、選択、解析、同定することができる。
【００６８】
本発明においては、第１のライブラリーをビーズで標識し、第２のライブラリーを蛍光標識したものを用いることがより好ましい。即ち、第１のライブラリーであるタンパク質−核酸連結分子をビーズで標識し、第２のライブラリーであるタンパク質−核酸連結分子を蛍光標識する。両者を混合し、蛍光を発するビーズをセルソーター等を用いて分離し、そこにあるタンパク質−核酸連結分子の核酸を増幅、解読することによって、２つの異なるライブラリーの間に存在する全てのタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用を有するタンパク質を同時に選択、解析、同定することができる。
【００６９】
図５に、ビーズで標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリー対蛍光性物質で標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーの間に存在するタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用を有するタンパク質を同時に選択、解析、同定する方法を示す。両者のライブラリーを混合し、蛍光を発するビーズをセルソーターや光ピンセットを用いて分離し、そこにあるタンパク質−核酸連結分子の核酸を増幅、解読することによって、２つの異なるライブラリーの間に存在する全てのタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−核酸相互作用を同時に選択、解析することができる。
【００７０】
更に好ましい方法として、蛍光性物質等で標識されたタンパク質−核酸連結分子と、マイクロアレイやチップ技術を組み合わせて、ライブラリー対ライブラリーのスクリーニングを行う方法が挙げられる。
具体的には、タンパク質−核酸連結分子の第１ライブラリーを、一種類ずつ固相、例えばマイクロアレイまたはチップ上に固定化しておき、第２のライブラリーである蛍光標識されたタンパク質−核酸連結分子のライブラリーを添加し、非特異的に吸着する分子を洗い流す。特異的に吸着したタンパク質−核酸連結分子の蛍光を検出することによって、第１のライブラリー中のどのタンパク質−核酸連結分子に吸着したかが分かる。一方、そこに吸着しているタンパク質−核酸連結分子の核酸部を増幅し、解読することによって、第２のライブラリーのどの分子が吸着したかが分かる。結果的に、２つの異なるライブラリーの間に存在する全てのタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−核酸相互作用を同時に選択、解析することが可能となる。
【００７１】
なお、本明細書における、核酸の単離・調製、核酸の連結、核酸の合成、ＰＣＲ、プラスミドの構築、無細胞系での翻訳等の遺伝子操作技術は、特に明記しない限り、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法またはそれに準じた方法により行うことができる。
【００７２】
（５）本発明の応用
本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子を利用したタンパク質の進化分子工学では、タンパク質を進化させるために必要なすべての過程を試験管内で行うことができるのでライブラリーのサイズや配列に制限がなく、また、遺伝子型としてＤＮＡを利用しているので安定であり、生きた細胞を用いないので、ｃＤＮＡライブラリーの提示への障害もない。また、リボゾーム・ディスプレイ法や試験管内ウイルス法で必要とされる逆転写やスペーサーの結合等の過程も必要なく、あるサイクルで釣り上げたＤＮＡをそのまま次のサイクルの鋳型として使用できるので、従来法に比べきわめて簡便かつ高速な（High Throughput）試験管内タンパク質進化を実現することが可能となる。
【００７３】
タンパク質の高速進化により全く新しいタンパク質が創製できるようになれば、環境汚染物質の分解酵素のような新規酵素触媒、分子センサー、新しいリガンドやヒト化抗体のような治療・診断薬等、医療・環境分野、生化学・細胞生物学等多くの分野の進歩に寄与することが期待できる。また、現在ゲノム解析計画の進展に伴い大量の遺伝子情報が蓄積しているが、シグナル伝達、転写制御、発生分化等高次の生命現象を研究するためには、各遺伝子の機能と同時に、それらの遺伝子間の相互作用（ネットワーク）を解析する必要がある。本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子を用いれば、ある遺伝子（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質またはそのタンパク質の代謝産物）が相互作用している未知のタンパク質をｃＤＮＡライブラリーの中から、試験管内で手軽に効率よくスクリーニングする、ゲノムの機能解析が可能になる。したがって、本発明は、医療・環境問題や、物質・エネルギー生産等、２１世紀の生命科学全般に大きく貢献することが期待できる。
【００７４】
更に、現在ゲノム解析計画の進展に伴い大量の遺伝子情報が蓄積しているが、シグナル伝達、転写制御、発生分化等高次の生命現象を研究するためには、各遺伝子の機能と同時に、それらの遺伝子間の相互作用（ネットワーク）を解析する必要がある。本発明の標識されたタンパク質−核酸連結分子を用いるライブラリー対ライブラリーの選択法を利用すれば、ある遺伝子（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質またはそのタンパク質の代謝産物）が相互作用している未知のタンパク質をｃＤＮＡライブラリーの中から、試験管内で容易にかつ効率よくスクリーニングすることができる。この様に本発明を用いることにより、効率のよいゲノム機能解析が可能になる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例は本発明の一例を示すものに過ぎず、本発明の範囲は以下の実施例により何ら制限されるものでない。本発明の精神から離れることなく、以下の実施例に変更、改変又は改良を加えて本発明を実施できることは当業者には自明である。
【００７５】
【実施例】
実施例１：ストレプトアビジン−ビオチンを介して結合したタンパク質−ＤＮＡ連結分子の構築
タンパク質とそれをコードするＤＮＡとを連結するために、ストレプトアビジン−ビオチン複合体を利用した。すなわち、被標的タンパク質をストレプトアビジンとの融合タンパク質として合成させ、ビオチンで標識したＤＮＡと連結させた。この「タンパク質−ＤＮＡ連結分子」を利用した試験管内選択が可能であることを確認するために、10アミノ酸残基のランダムペプチドライブラリーを作製し、その中からNi（ニッケル）キレート樹脂（Ni-NTA樹脂）に結合するペプチドの濃縮を行った。
【００７６】
図１は、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子を利用したタンパク質の試験管内選択の概念図である。まず、あるアダプタータンパク質（図１のＡ、例えばアビジン）とそれに結合するリガンド（図１のＢ、例えばビオチン）を用意する。次に、スクリーニングしようとするＤＮＡライブラリーにリガンドを結合し、無細胞転写翻訳系に加える。また、あらかじめライブラリーのタンパク質がアダプタータンパク質との融合タンパク質として合成されるようにＤＮＡを構築しておく。無細胞転写翻訳系で合成されたタンパク質は、アダプタータンパク質とリガンドとの結合を介して、そのタンパク質をコードするＤＮＡと連結する。完成したタンパク質−ＤＮＡ連結分子を回収・混合し、標的物質に結合するタンパク質を、例えば親和性樹脂等への吸着を利用してスクリーニングする。さらに、樹脂に吸着したタンパク質−ＤＮＡ連結分子のＤＮＡは、ＰＣＲ法により増幅され、解読される。
【００７７】
実験材料
放線菌ストレプトミセス・アビジニー（Streptomyces avidinii）は理化学研究所より購入した。オリゴＤＮＡはエスペックオリゴサービスで合成された。大腸菌、プラスミド、各種酵素・試薬等は次の通り市販のものを用いた。
【００７８】
大腸菌JM109、プラスミドpUC18及びpUC19（東洋紡）、pET20b（Novagen）、大腸菌S30抽出液（プロメガ）；制限酵素NdeI、NheI、XbaI（NEB）、BamHI 、EcoRI及びHindIII（東洋紡）；Ligation High及びRNaseインヒビター（東洋紡）、T7 RNAポリメラーゼ（プロメガ）、Ex Taq ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）；Wizard PCR Preps（プロメガ）、RecoChip（宝酒造）、Ni-NTA樹脂（QIAGEN）、ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI）。
遺伝子工学の基本操作（クローニング、大腸菌の形質転換及び培養、プラスミドの回収等）は、サンブルック等のモレキュラー・クローニング（Molecular Cloning, Sambrook et al. (1989) CSH Press）に従った。
【００７９】
ライブラリーの構築
ストレプトアビジン遺伝子を、放線菌Streptomyces avidiniiゲノムを鋳型として、ストレプトアビジン遺伝子の上流及び下流に相補的なプライマー（配列番号１及び２）を用いてＰＣＲで増幅し、BamHI 及び EcoRIで消化し、pUC18のBamHI-EcoRI部位にクローニングし、pUC-STA を得た。これを鋳型として、ストレプトアビジン遺伝子の５’側にＴ７タグを付加するためのプライマー（配列番号３）及びストレプトアビジン遺伝子下流に相補的なプライマー（配列番号４）を用いてＰＣＲを行い、５’側にＴ７タグ配列をもつストレプトアビジン遺伝子を得た。さらに、この上流にＴ７プロモーターを含む非コード領域（５’-ＵＴＲ）を付加するために、pET20bを鋳型として、５’-ＵＴＲの上流及び下流に相補的なプライマー（配列番号５及び６）を用いてＰＣＲ増幅した断片をNdeI及びNheIで消化し、NheI-HindIII処理したＴ７タグ−ストレプトアビジン遺伝子と共に、pUC19のNdeI-HindIII 部位にクローニングし、pT7-STAを得た。
【００８０】
これを鋳型として、Ｔ７プロモーターの上流に相補的なプライマー（配列番号７）及びストレプトアビジン遺伝子の３’側にランダム配列（ＮＮＹ；Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ，Ｙ＝Ａ，Ｇの等モル混合物）及び３’-ＵＴＲを付加し、ＤＮＡの３’ 側をビオチン化するためのプライマー（配列番号８）を用いてＰＣＲを行い、３’末端にランダム配列をもつストレプトアビジン遺伝子ライブラリーを得た（STA-Random；図２）。同様に、pT7-STA を鋳型として、Ｔ７プロモーターの上流に相補的なプライマー（配列番号７）及びストレプトアビジン遺伝子の３’側にヒスチジン（His）タグ及び３’-ＵＴＲを付加し、ＤＮＡの３’ 側をビオチン化するためのプライマー（配列番号９）を用いてＰＣＲを行った。かくして３’側にHisタグ及びビオチンのついたストレプトアビジン遺伝子を作製した（STA-His; 図２）。
【００８１】
図２は、実施例１で使用したＤＮＡライブラリーの模式図である。ストレプトアビジン（STA）遺伝子の５’側には１１アミノ酸残基のＴ７タグ（MASMTGGQQMG）をコードする塩基配列が付加されている。Ｔ７タグはストレプトアビジンの発現量と溶解度を上げることが知られている（Gallizia, A. et al., 1998, Protein Expr. Purif., 14, 192-196）。また、Ｔ７タグを認識する抗体カラムを利用してタンパク質−ＤＮＡ連結分子を精製することもできる。遺伝子の３’側には10アミノ酸残基のランダム配列（STA-Random）、又はHisタグをコードする塩基配列が付加されている（STA-His）。これらの遺伝子はＴ７プロモーター支配下で転写される。ＤＮＡの３’ 側にはビオチンが結合している。これらをWizard PCR Prepsにより精製し、His タグ付き遺伝子を希釈してランダム遺伝子ライブラリーに加えることにより、最終的なＤＮＡライブラリーを得た。
【００８２】
無細胞転写翻訳
無細胞転写翻訳系として大腸菌S30抽出液にT7 RNAポリメラーゼを添加した系を用いた。この系におけるタンパク質の発現及びタンパク質−ＤＮＡ連結分子の生成を確認するために、STA-His ＤＮＡまたはその５’側をＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で蛍光標識したものを上記の系に加え、合成反応を行った。図３に示すように、フルオレセイン−ビオチン連結化合物を反応液に添加・結合させたSTA-Hisタンパク質（レーン１、２）、ＦＩＴＣで標識されたＤＮＡ（レーン２、３）、及びＦＩＴＣとビオチンで標識されたＤＮＡと STA-Hisタンパク質との連結分子（レーン３）が蛍光イメージアナライザーにより検出された。
以上の結果から、蛍光性物質で標識されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子が構築されることが明らかとなった。
【００８３】
試験管内選択
ＤＮＡを１分子ずつ隔離するために、逆相ミセル（水／油型エマルジョン）を用いた（Tawfik, D.S. and  Griffiths, A.D., 1998, Nat. Biotechnol., 16, 652-656）。まず、上記のＤＮＡライブラリー 1 nM を氷上で 50 μl の大腸菌S30抽出液に加えた。油相として、1mlのlight white mineral oil（シグマ社製）に4.5%のSpan-80（sorbitan monooleate、シグマ社製）、0.5%の Tween-80 (polyoxyethylene-sorbitan monooleate、シグマ社製）加えたものを用いた。
上記溶液を、４℃で 1 mlの油相（Span-80 4.5％、Tween-80 0.5%を含む）に加え、マグネチックスターラーで1150ｒｐｍの速度で撹拌し、水／油型エマルジョン（water-in-oil emulsion）を形成させた。
この系を４℃から 25 ℃に移し１時間反応させることにより、各ミセルの中でタンパク質が合成され、それ自身をコードするＤＮＡと結合する。反応終了後、エーテル処理により水層をオイル層から分離し、「タンパク質−ＤＮＡ連結分子」のライブラリーを回収した。この溶液をNi-NTA 樹脂と１時間混合し、樹脂に吸着させ、洗浄バッファー（0.1M NaH2PO4、10mM Tris-HCl、2M NaCl 、1% Tween-20、20mMイミダゾール、2.25M 塩酸グアニジン、20mMメルカプトエタノール）で５回洗浄した。
【００８４】
濃縮の確認
上記の操作でNi-NTA樹脂に吸着しやすいHisタグ付き遺伝子（STA-His；図２）が、濃縮されることを確認するために、吸着・洗浄した樹脂の一部を鋳型として、Ｔ７プロモーターの上流に相補的なプライマー（配列番号７）及びＤＮＡの３’側をＦＩＴＣ標識するための３’-ＵＴＲに相補的な蛍光プライマー（配列番号 10 ）を用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをBamHIで消化した。図２に示すように、BamHIはSTA-His遺伝子のみを切断し、ランダムライブラリー（STA-Random）は切断しないので、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、蛍光イメージアナライザーでスキャンすることによって切断された蛍光ＤＮＡの割合を定量化できる。
【００８５】
図４に示すように、STA-His遺伝子は試験管内選択により約10倍濃縮されることが分かった。すなわち、図４は、タンパク質−ＤＮＡ連結分子を利用した試験管内選択の結果、ランダム配列のライブラリー（STA-Random）からHisタグ配列（STA-His）が濃縮されたことを示す図である。（Ａ）試験管内選択を行う前のSTA-HisとSTA-Randomとの比率は、１：10（レーン１）、１：100（レーン２）及び１：1000（レーン３）である。（Ｂ）試験管内選択によってSTA-His の割合は約10倍増加した。以上の結果から、タンパク質−ＤＮＡ連結分子の構築及びそれを利用した試験管内選択が可能であることが分かった。
【００８６】
【発明の効果】
本発明により、遺伝子型が安定なＤＮＡを用いて、それが終止コドンを含むものでも試験管内でタンパク質−ＤＮＡ連結分子を製造する方法が提供されることになった。また、本発明により、ゲノム機能解析のように非常に膨大な数の遺伝子やタンパク質の間の相互作用を調べるのに有用な試験管内（in vitro）でタンパク質のライブラリー対ライブラリーの選択を行う方法が提供されることになった。
【００８７】
【配列表】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【００９６】
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【００９７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のタンパク質−ＤＮＡ連結分子、その構築方法、連結分子の選択等の概略を示す図である。
【図２】図２は、３’側にランダム配列をもつストレプトアビジン遺伝子ライブラリー（STA-Random）及び３’側にヒスチジン（His）タグのついたストレプトアビジン遺伝子（STA-His）を表す。
【図３】図３は、STA-His ＤＮＡ（ＤＮＡ１）、ＦＩＴＣで蛍光標識したSTA-His ＤＮＡ（ＤＮＡ２）ならびにビオチンで標識するとともにＦＩＴＣで蛍光標識したSTA-His ＤＮＡ（ＤＮＡ３）を無細胞転写翻訳系に加えて得られる、STA-Hisタンパク質（レーン１及び２）、ＦＩＴＣで標識されたＤＮＡ（レーン２及び３）及びＦＩＴＣとビオチンで標識されたＤＮＡとSTA-Hisタンパク質との連結分子（レーン３）の説明図とＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図４】図４は、STA-Random遺伝子及びSTA-His遺伝子のポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図５】図５は、本発明のタンパク質機能解析方法の概略を示す図である。ビーズで標識されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリー対蛍光性物質で標識されたタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーの間に存在するタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−核酸相互作用を同時に解析する方法を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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