(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体をソヤサポゲノールＢへ変換するネオコスモスポラ属に属する微生物を、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を含む培地で培養し、次いでその培養物からソヤサポゲノールＢを採取することを含んでなる、ソヤサポゲノールＢの製造法。
【請求項２】
ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体をソヤサポゲノールＢへ変換するユーペニシリウム属に属する微生物を、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を含む培地で培養し、次いでその培養物よりソヤサポゲノールＢを採取することを含んでなる、ソヤサポゲノールＢの製造法。
【請求項３】
ネオコスモスポラ属に属する微生物が、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ（Neocosmospora vasinfecta var. vasinfecta）である、請求項１に記載の製造法。
【請求項４】
ユーペニシリウム属に属する微生物が、ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム（Eupenicillium brefeldianum）である、請求項２に記載の製造法。
【請求項５】
ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・PF1225株（Neocosmospora vasinfecta var. vasinfecta PF1225）（FERM BP- 7475）である、請求項１に記載の製造法。
【請求項６】
ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・PF1226株（Eupenicillium brefeldianum PF1226）（FERM BP- 7476）である、請求項２に記載の製造法。
【請求項７】
ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体をソヤサポゲノールＢへ変換するネオコスモスポラ属に属する微生物を培養することによって得られた培養物と接触させ、次いでその培養物からソヤサポゲノールＢを採取することを含んでなる、ソヤサポゲノールＢの製造法。
【請求項８】
ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体をソヤサポゲノールＢへ変換するユーペニシリウム属に属する微生物を培養することによって得られた培養物と接触させ、次いでその培養物からソヤサポゲノールＢを採取することを含んでなる、ソヤサポゲノールＢの製造法。
【請求項９】
ネオコスモスポラ属に属する微生物が、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ（Neocosmospora vasinfecta var. vasinfecta）である、請求項７に記載の製造法。
【請求項１０】
ユーペニシリウム属に属する微生物が、ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム（Eupenicillium brefeldianum）である、請求項８に記載の製造法。
【請求項１１】
ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・PF1225株（Neocosmospora vasinfecta var. vasinfecta PF1225）（FERM BP- 7475）である、請求項７に記載の製造法。
【請求項１２】
ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・PF1226株(Eupenicillium brefeldianum PF1226）（FERM BP-7476）である、請求項８に記載の製造法。
【請求項１３】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM BP-7475のもと寄託されたネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・PF1225株（Neocosmospora vasinfecta var. vasinfecta PF1225）。
【請求項１４】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM BP-7476のもと寄託されたユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・PF1226株(Eupenicillium brefeldianum PF1226）。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は微生物の培養物を用いたソヤサポゲノールＢの製造法、並びにネオコスモスポラ属に属する新菌株およびユーペニシリウム属に属する新菌株に関する。
関連技術
ソヤサポゲノールＢ（ｓｏｙａｓａｐｏｇｅｎｏｌ．Ｂ）はマメ科植物中に含まれるサポニンのアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）の一つであり、最初に大豆種子（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ  ＭＥＲＲＩＬＬ，ｓｅｅｄｓ）から単離、構造決定された（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２４：１２１−１２９，１９７６、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３０：２２９４−２２９７３，１９８２）。ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体（ソヤサポニン等）には、抗酸化作用、肝障害発症抑制作用、血清脂質改善作用、血小板凝集抑制作用、抗補体活性等の生理活性が報告されており、腎炎、リューマチ、全身性紅斑性狼瘡等の免疫疾患、自己免疫疾患あるいは血栓症等の予防および治療薬としての可能性が示されている（化学と生物２１：２２４−２３２，１９８３、特開昭６１−３７７４９）。また、ソヤサポゲノールＢに関しては、抗補体活性、血小板凝集抑制作用、ヒト大腸癌およびヒト卵巣癌由来の細胞に対して増殖抑制作用が報告されている（特開昭６１−３７７４９、特開平１０−２３４３９６）。
ソヤサポゲノールＢは、例えば大豆種子に含有されるソヤサポニンＩ〜Ｖの糖鎖を化学的に加水分解することにより得られるが、この場合酸加水分解等の条件下でかなりの副生成物が生じるため効率的な製造法ではない。また、大豆由来の粗抽出物を化学的な加水分解法の原料に用いた場合、この粗抽出物はソヤサポニンＩ〜Ｖ以外にソヤサポニンＡ１〜Ａ６等も含有しているため、ソヤサポゲノールＢとは異なるアグリコンも同時に生成し、精製操作が煩雑になるなどの問題がある。
一方、微生物によるソヤサポゲノールＢの製造法としては、ストレプトミセス属（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２：１２８７−１２９３，１９８４）およびペニシリウム属（特開平１０−２３４３９６）による方法が知られている。しかしながらこれらの微生物によるソヤサポゲノールＢの生産性は低く実用的ではない。また、アスペルギルス属に属する菌が生産する酵素（グルクロニダーゼ）あるいはこの酵素を含む培養物を用いてグルクロナイドサポニン類を加水分解し、グルクロン酸を還元末端とする酸性オリゴ糖を製造する時に、副生成物としてソヤサポゲノールＢが生成することが報告されている（特公平７−３２７１４）。しかしこの方法は酸性オリゴ糖の製造法であり、ソヤサポゲノールＢの定性的な確認が記載されているにすぎない。
ソヤサポゲノールＢは上記のように種々の生理活性を有しており、医薬品あるいは健康食品としての利用、あるいは更に有用性を向上させた誘導体の原料としての利用が考えられる。そのため、より効率的で安価なソヤサポゲノールＢの製造法の開発が望まれている。
発明の概要
本発明はソヤサポゲノールＢの効率的な製造法の提供をその目的とする。
本発明はまた、配糖体をソヤサポゲノールＢに効率的に変換できる新規微生物の提供をその目的とする。
本発明者らは今般、大豆サポニンのようなソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を選択的に加水分解してソヤサポゲノールＢに効率良く変換する微生物を見出した。そして、これらの微生物がネオコスモスポラ属およびユーペニシリウム属に属する新菌株であることを見出した。
本発明によるソヤサポゲノールＢの製造法は、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体をソヤサポゲノールＢへ変換するネオコスモスポラ属に属する微生物を、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を含む培地で培養し、次いでその培養物からソヤサポゲノールＢを採取することを含んでなるものである。
本発明によるソヤサポゲノールＢの製造法は、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体をソヤサポゲノールＢへ変換するユーペニシリウム属に属する微生物を、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を含む培地で培養し、次いでその培養物よりソヤサポゲノールＢを採取することを含んでなるものである。
本発明によるソヤサポゲノールＢの製造法はまた、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体をソヤサポゲノールＢへ変換するネオコスモスポラ属に属する微生物を培養することによって得られた培養物と接触させ、次いでその培養物からソヤサポゲノールＢを採取することを含んでなるものである。
本発明によるソヤサポゲノールＢの製造法はまた、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体をソヤサポゲノールＢへ変換するユーペニシリウム属に属する微生物を培養することによって得られた培養物と接触させ、次いでその培養物からソヤサポゲノールＢを採取することを含んでなるものである。
本発明による新菌株は、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ｖａｒ．ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ＰＦ１２２５）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７５）およびその変異株である。
本発明による新菌株はまた、ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｆｅｌｄｉａｎｕｍ  ＰＦ１２２６）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７６）およびその変異株である。
ネオコスモスポラ属に属する微生物は、好ましくはネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ｖａｒ．ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）、より好ましくはネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ・ＰＦ１２２５株（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ｖａｒ．ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ＰＦ１２２５）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７５）であることができる。
ユーペニシリウム属に属する微生物は、好ましくはユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｆｅｌｄｉａｎｕｍ）、より好ましくはユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム・ＰＦ１２２６株（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｆｅｌｄｉａｎｕｍ  ＰＦ１２２６）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７６）であることができる。
発明の具体的説明
１．ＰＦ１２２５株の菌学的性状
（１）コロニーの性状
オートミール寒天培地上で生育良く、２５℃、１４日間の培養でコロニーの直径は８５ｍｍ以上に達する。淡茶灰色、羊毛状、平坦なコロニーとなり、中央に暗橙色の子のう殻を豊富に形成する。裏面は灰茶色となる。
ツアペック酵母エキス寒天培地上で生育良く、２５℃、１４日間の培養でコロニーの直径は８０ｍｍに達する。淡茶色、羊毛状、放射状のしわのあるコロニーとなり、子のう殻を菌糸中に形成する。裏面は黄土色となる。
３７℃の培養では、どの培地上でも生育は抑制的で子のう殻を形成しない。
（２）形態的性状
子のう殻は表在性、孔口を有し、球形〜卵形、大きさ３００〜４５０×２５０〜３５０μｍである。殻壁は膜質、１０〜２５μｍの多角形の細胞からなる。子のうは８胞子性、円筒形、短柄を有し、子のう胞子は１列に配列し、大きさ７５〜１００×１０〜１２μｍ、成熟すると消失する。子のう胞子は球形〜亜球形もしくは俵形、表面には微細なしわ状の構造を有し、大きさ１０〜１２×８〜１０μｍである。
フィアライドは菌糸より垂直に生じ、大きさ２５〜５０×２．５〜３μｍである。分生子は楕円形〜円筒形、直線状もしくは多少カーブし、滑面、大きさ５〜１２．５×２．５〜３μｍ、粘塊状に生じる。
以上の菌学的性状より、ＰＦ１２２５株を、子のう菌亜門核菌綱ネオコスモスポラ・バシンフェクタ・バラエティー・バシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ｖａｒ．ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）に属する糸状菌と同定した。同定のための参考文献として「Ａ  ＲＥＶＩＳＩＯＮ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＧＥＮＵＳ  ＮＥＯＣＯＳＭＯＳＰＯＲＡ（Ｐ．Ｆ．ＣＡＮＮＯＮ，Ｄ．Ｌ．ＨＡＷＫＳＷＯＲＴＨ：Ｔｒａｎｓ．Ｂｒ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．８２（４）：６７３−６８８，１９８４）」を用いた。
ＰＦ１２２５菌株は２０００年３月１３日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７５である。
２．ＰＦ１２２６株の菌学的性状
（１）コロニーの性状
ツアペック酵母エキス寒天培地上で生育良く、２５℃、１４日間の培養でコロニーの直径は８５ｍｍ以上に達する。淡灰茶色、ベルベット状、放射状のしわのあるコロニーとなる。子のう果を疎らに形成する。裏面は黄土色となる。
麦芽エキス寒天培地上で生育良く、２５℃、１４日間の培養でコロニーの直径は８０ｍｍに達する。白色〜淡茶色、ベルベット状〜羊毛状、平坦なコロニーとなる。子のう果をほとんど形成しない。裏面は黄橙色となる。
オートミール寒天培地上で生育良く、２５℃、１４日間の培養でコロニーの直径は８５ｍｍ以上に達する。淡茶色、ベルベット状、平坦なコロニーとなる。子のう果を豊富に形成し、無色透明の水滴を生じる。裏面は茶橙色となる。
３７℃の培養では、どの培地上でも生育は抑制的である。
（２）形態的性状
子のう果は表在性、閉鎖型、球形〜亜球形、大きさ１００〜３００μｍである。殻壁は膜質、１０〜２５μｍの多角形の細胞からなる。子のうは８胞子性、楕円形から洋なし形、単生、大きさ１０〜１２．５×７．５〜１０μｍ、成熟すると消失する。子のう胞子は球形〜亜球形、表面には微細な刺状突起を有し、大きさ２．５〜３×２〜２．５μｍである。
分生子柄は、気生菌糸より生じ、滑面、大きさ２５〜１５０×２〜２．５μｍである。ペニシリは、単輪生となる。フィアライドはペン先型、７．５〜１２．５×２〜２．５μｍ、３〜６本の輪生体となる。分生子は球形〜楕円形、滑面、大きさ２〜２．５μｍ、連鎖状に生じる。
以上の菌学的性状より、ＰＦ１２２６株を、子のう菌亜門不整子のう菌綱ユーペニシリウム・ブレフェルディアヌム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｆｅｌｄｉａｎｕｍ）に属する糸状菌と同定した。同定のための参考文献として「Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＵＭ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｔａｔｅｓ  Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｎｄ  Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ（ＪＯＨＮ  Ｉ．ＰＩＴＴ：ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ，１９７９）」を用いた。
ＰＦ１２２６菌株は２０００年３月１３日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７６である。
ＰＦ１２２５株およびＰＦ１２２６株は他の微生物に見られるようにその性状が変化し易い。例えば、ＰＦ１２２５株およびＰＦ１２２６株に由来する突然変異株（自然発生または誘発性）、形質接合体または遺伝子組換え体であっても、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体の加水分解によりソヤサポゲノールＢを産生するものはすべて本発明によるソヤサポゲノールＢの製造法に使用できる。
３．ＰＦ１２２５株およびＰＦ１２２６株の培養
本発明による製造法では、ネオコスモスポラ属に属する微生物、例えば、ＰＦ１２２５株、あるいはユーペニシリウム属に属する微生物、例えば、ＰＦ１２２６株を、通常の微生物が利用し得る栄養物を含有する培地にソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を含有する物質を添加して培養することができる。
ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体としては、主にマメ科の植物体に含有されているソヤサポニンＩ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ（ｓｏｙａｓａｐｏｎｉｎ  Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ）、アズキサポニンＩＩ，Ｖ（ａｚｕｋｉｓａｐｏｎｉｎ  ＩＩ，Ｖ）、アストラガロシドＶＩＩＩ（ａｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅ  ＶＩＩＩ）、ソフォラフラボシドＩ（ｓｏｐｈｏｒａｆｌａｖｏｓｉｄｅ  Ｉ）等が知られており、これらを培地中に直接添加することが可能である。より実用的な方法としては、これらを含有するマメ科の植物、例えば、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ  ＭＥＲＲＩＬＬ）、赤小豆（Ｖｉｇｎａ  ａｎｇｕｌａｒｉｓ（ＷＩＬＬＤ．）ＯＨＷＩ  ｅｔ  ＯＨＡＳＨＩ）、黄耆（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ  ＢＵＮＧＥ）、苦参（Ｓｏｐｈｏｒａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ  ＡＩＴＯＮ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）等から熱水、アルコールまたは含水アルコールで抽出される物質を添加する方法、あるいはこれらの抽出物から常法により目的物以外の夾雑物を適当に除去して、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体の含有量を高めた物質を添加する方法等がある。ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体を含有した物質の例としては、大豆あるいは脱脂大豆（大豆粕）から熱水、アルコールまたは含水アルコールで抽出される物質、より好ましくは常法によりタンパク質、糖質、脂質等の夾雑物を除去した物質が挙げられる。
栄養源としては、従来カビの培養に利用されている公知のものが使用できる。例えば、炭素源としては、グルコース、スクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動植物油等を使用し得る。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等を使用し得る。その他必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することは有効である。また、菌の発育を助け、ソヤサポゲノールＢをアグリコンとする配糖体からソヤサポゲノールＢへの微生物変換を促進するような有機物及び無機物を適当に添加することができる。
培養法としては、好気的条件での培養法、特に振盪培養法が最も適している。培養に適当な温度は２５〜３０℃であるが、多くの場合２６℃付近で培養する。ソヤサポゲノールＢの生産は、培地や培養条件によって異なるが、静置培養、振盪培養、タンク培養のいずれにおいても、通常２〜１４日間でその蓄積が最高に達する。培養物中のソヤサポゲノールＢの蓄積が最高になった時に培養を停止し、培養物から目的物質を単離、精製する。
４．ソヤサポゲノールＢの精製
このようにして生産されたソヤサポゲノールＢは、その性状に従って培養物から単離、精製することができる。即ち、有機溶媒を用いた溶媒抽出法、吸着剤を用いた吸脱着法、ゲル濾過剤を用いた分子分配法、沈殿法あるいは再結晶化法等を単独もしくは適宜組み合わせることにより精製できる。例えば、ソヤサポゲノールＢを含む培養物から酢酸エチルにより抽出して有機溶媒層を減圧濃縮する。この濃縮物をシリカゲルカラムに吸着した後、クロロホルム−メタノール、ヘキサン−酢酸エチル又はヘキサン−アセトンの混合溶媒系でクロマトグラフィーを行う。更に、必要に応じてセファデックスＬＨ−２０（ファルマシアファインケミカルズ社製）等のゲル濾過剤に供してソヤサポゲノールＢを精製することができる。また、ソヤサポゲノールＢは酢酸エチルあるいはメタノール等の有機溶媒中で結晶化が可能である。
実  施  例
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。すなわち、微生物変換に用いる菌株およびソヤサポゲノールＢの性状に基づきソヤサポゲノールＢの製造法を種々改変することができるが、そのような方法も本発明による製造法の範囲内である。
実施例１：ＰＦ１２２５株によるソヤサポゲノールＢの製造
種培地として、澱粉２．０％、グルコース１．０％、ポリペプトン０．５％、小麦胚芽０．６％、酵母エキス０．３％、大豆粕０．２％および炭酸カルシウム０．２％の組成からなる培地（殺菌前ｐＨ  ７．０）を用いた。
また、生産培地としては、麦芽エキス４．０％、酵母エキス２．０％、リン酸二水素カリウム０．２％、硫酸アンモニウム０．２％、硫酸マグネシウム（７水和物）０．０３％、塩化カルシウム（２水和物）０．０３％に、大豆サポニン（小城製薬社製）１．０％を添加した培地を用いた。
前記の種培地（２０ｍｌ）を分注した１００ｍｌ容三角フラスコを１２０℃で１５分間殺菌し、これにＰＦ１２２５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７５）の斜面寒天培養の１白金耳を植菌後、２５℃で２日間振盪培養した。次いで、生産培地（１００ｍｌ）を分注した５００ｍｌ容三角フラスコを１２０℃で１５分間殺菌し、これに上記種培養液を２ｍｌずつ植菌し、２５℃で４日間振盪培養した。
得られた培養物（３００ｍｌ）を酢酸エチル（３００ｍｌ）で抽出し、酢酸エチル層を減圧濃縮すると油状物質（７５０ｍｇ）が得られた。これをシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−３００、和光純薬社製、７０ｇ）に供し、ヘキサン−アセトン（３：１）で溶出した後、単一の物質を含む画分をそれぞれ集めて濃縮乾固すると、ソヤサポゲノールＢ（１５０ｍｇ）とソヤサポゲノールＡ（８ｍｇ）が得られた。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ：ＭＥＲＣＫ  １．０５７１５．、展開系：ヘキサン−アセトン（２：１））
ソヤサポゲノールＢ：Ｒｆ  ０．３８
ソヤサポゲノールＡ：Ｒｆ  ０．２８
実施例２：ＰＦ１２２６株によるソヤサポゲノールＢの製造
実施例１の種培地（２０ｍｌ）を分注した１００ｍｌ容三角フラスコを１２０℃で１５分間殺菌し、これにＰＦ１２２６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７６）の斜面寒天培養の１白金耳を植菌後、２５℃で２日間振盪培養した。次いで、生産培地（１００ｍｌ）を分注した５００ｍｌ容三角フラスコを１２０℃で１５分間殺菌し、これに上記種培養液を２ｍｌずつ植菌し、２５℃で４日間振とう培養した。
得られた培養物（３００ｍｌ）を酢酸エチル（３００ｍｌ）で抽出し、酢酸エチル層を減圧濃縮すると油状物質（７００ｍｇ）が得られた。これをシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−３００、和光純薬社製、７０ｇ）に供し、ヘキサン−アセトン（３：１）で溶出した後、単一の物質を含む画分をそれぞれ集めて濃縮乾固すると、ソヤサポゲノールＢ（１２０ｍｇ）とソヤサポゲノールＡ（６ｍｇ）が得られた。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ：ＭＥＲＣＫ  １．０５７１５．、展開系：ヘキサン−アセトン（２：１））
ソヤサポゲノールＢ：Ｒｆ  ０．３８
ソヤサポゲノールＡ：Ｒｆ  ０．２８
ソヤサポゲノールＢの同定
実施例１および実施例２において得られたソヤサポゲノールＢの物理化学的性状および各種スペクトルデータは標品のソヤサポゲノールＢと一致した。本発明で得られたソヤサポゲノールＢの重クロロホルム中での１３Ｃ  ＮＭＲデータ（化学シフトｐｐｍ、多重度、帰属の順）は以下の通りである。帰属に用いたナンバリングは下記化学式に示した。
３８．４（ｔ，Ｃ−１），２７．６（ｔ，Ｃ−２），８０．８（ｄ，Ｃ−３），４２．７（ｓ，Ｃ−４），５５．８（ｄ，Ｃ−５），１８．４（ｔ，Ｃ−６），３３．１（ｔ，Ｃ−７），３９．７（ｓ，Ｃ−８），４７．７（ｄ，Ｃ−９），３６．６（ｓ，Ｃ−１０），２３．７（ｔ，Ｃ−１１），１２２．３（ｄ，Ｃ−１２），１４３．９（ｓ，Ｃ−１３），４２．０（ｓ，Ｃ−１４），２５．９（ｔ，Ｃ−１５），２８．２（ｔ，Ｃ−１６），３７．４（ｓ，Ｃ−１７），４４．７（ｄ，Ｃ−１８），４６．１（ｔ，Ｃ−１９），３０．５（ｓ，Ｃ−２０），４１．４（ｔ，Ｃ−２１），７６．６（ｄ，Ｃ−２２），２２．４（ｑ，Ｃ−２３），６４．５（ｔ，Ｃ−２４），１６．１（ｑ，Ｃ−２５），１６．８（ｑ，Ｃ−２６），２５．４（ｑ，Ｃ−２７），２０．０（ｑ，ｃ−２８），３２．８（ｑ，Ｃ−２９），２８．２（ｑ，Ｃ−３０）
0004169977.tif 000002