(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性有機溶媒を用いて得られるパイナップル抽出物を有効物質として含有することを特徴とする抗アレルギー剤。
【請求項２】
パイナップル抽出物が、パイナップル搾汁粕より得られる抽出物である請求項１記載の抗アレルギー剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、パイナップル抽出物を有効物質として含有する抗アレルギー剤及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、気管支喘息、花粉症やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の患者が増大し、大きな社会問題になっている。何らかのアレルギーを持つ人は今や５人に１人までになっており、国民病とまで言われている。アレルギー疾患の発症のメカニズムは、肥満細胞に結合したIgE抗体がアレルゲン（抗原）と結合すると、ヒスタミンなどのケミカルメディエーターが放出され、くしゃみ、鼻水、目のかゆみといったアレルギー症状を引き起こすと考えられている。このため、肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制活性を有する成分は、抗アレルギー剤としての効果が期待できる。そして、医療の現場では、種々のアレルギー性疾患の予防・治療に有用な抗アレルギー剤の開発が強く求められている。従来知られている抗アレルギー剤としては、クロモグリク酸ナトリウム、フマル酸ケトチフェン、トシル酸スプラタスト等の化学合成品や、ヨモギ抽出物や甜茶抽出物（特開平０６−１９２１１４）等が知られているが、パイナップルを原料とする抗アレルギー剤は知られていない。前記の既存抗アレルギー剤は、副作用も含め安全性の問題点や、有効性が不十分である等、それぞれ、一長一短があり、必ずしも、理想的な抗アレルギー剤とは言えず、それ故に現在も、各方面で抗アレルギー剤の研究開発が続けられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、食糧資源を原料とし、安全で且つ有効な新規の抗アレルギー剤及びその製造方法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、前記課題を達成するために、肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制活性を指標とし、又、食糧資源を原料とし、抗アレルギー物資を鋭意探索した。その結果、パイナップルに抗アレルギー活性成分が含まれること、及び抗アレルギー活性を有する画分は、パイナップル搾汁粕に多く含まれること、又、活性成分は親水性有機溶媒により効率的に抽出できることを知見し、本発明を完成した。即ち、本発明は、パイナップル抽出物を有効物質して含有することを特徴とする抗アレルギー剤及び該抗アレルギー剤を含有する医薬品、飲食品、化粧品を提供するものである。又、その製造方法は、原料としてパイナップル、特に好ましくはパイナップル搾汁粕を用い、抽出溶媒として親水性有機溶媒、特に好ましくは５０〜１００％エタノールを用いることからなっている。
なお、本願において使用する「親水性有機溶媒」の用語は、次の通り定義する。「親水性有機溶媒とは、２０℃において、水に対する溶解度が５％以上である有機溶媒と定義する。」
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
先ず、本発明の抗アレルギー剤及び該抗アレルギー剤を含有する医薬品、飲食品、化粧品について説明する。
【０００６】
抗アレルギー剤：  本発明の抗アレルギー剤は、パイナップル抽出物を有効物質として含有することを特徴とする。パイナップル抽出物としては、特に、パイナップル搾汁粕抽出物は、有効性が高く望ましい。この場合、パイナップル搾汁粕としては、パイナップルの植物体全体の他、果実、果皮等の任意の部位を搾汁したもの等が用いられる。パイナップル抽出物は、そのままでも抗アレルギー剤として使用できるが、顆粒状・粉末状・錠剤状あるいはブロック状などに成形したものが好ましい。その際、本抗アレルギー剤には、パイナップル抽出物以外に、例えば固形担体、液体担体、油性担体、防腐・殺菌剤、香料、呈味剤、着色料、等が配合されていても良い。なお、本抗アレルギー剤には、パイナップル抽出物に加えてそれ以外のパイナップルの成分、例えば、果汁等が含まれていてもよく、パイナップル搾汁粕そのものを用いることもできる。本発明の抗アレルギー剤は、パイナップル抽出物又はパイナップル搾汁粕抽出物を有効物質とする。実施例に示すように、本発明の抗アレルギー剤は、肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制活性を示す。したがって、本発明の抗アレルギー剤は、種々のアレルギー性疾患の予防剤又は治療剤、抗炎症剤あるいはヒスタミン遊離抑制剤として有用である。アレルギー性疾患とは、例えば、花粉、ダニやハウスダストなどにより発症するアレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、牛乳・卵などの特定の食物に対して起こる食物アレルギー、アレルギー性気管支喘息、炎症等である。本発明の抗アレルギー剤は、抗アレルギー活性、抗炎症活性あるいは抗ヒスタミン活性を有する医薬品、飲食品又は化粧品等として、そのままであるいはこれらの製品に添加して使用できる。
【０００７】
医薬品：  本発明の抗アレルギー剤は、パイナップル抽出物又はパイナップル搾汁粕抽出物をそのまま、若しくはこれを公知の医薬用担体と共に製剤化することにより医薬品として使用できる。本発明の抗アレルギー剤は、例えば、錠剤、顆粒剤、粉剤、シロップ剤等の経口剤や、坐剤、外用剤等の非経口剤として製剤化できる。医薬用担体としては、特に制限はなく、例えば、固形担体（デンプン、乳糖、カルボキシメチルセルロース等）、液体担体（蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール、プロピレングリコール等）、油性担体（各種の動植物油、白色ワセリン、パラフィン等）が挙げられる。上記医薬品は、人及び人以外の動物（ペット、家畜）用として使用できる。上記医薬の投与量は、それを使用する患者等の症状、性別、年齢に応じて適宜設定すればよい。
【０００８】
飲食品：  本発明の抗アレルギー剤は飲食品に添加することにより、その飲食品に、上記の活性を付与することができ、健康食品、健康志向食品、特定保健用食品、機能性食品等に利用できる。添加されるべき飲食品は特に限定されないが、肉製品、加工野菜、惣菜類、乳製品、菓子、パン、清涼飲料、果実飲料、酒類等が挙げられる。食品に対する本発明の抗アレルギー剤の配合率も特に限定されない。また、本発明の抗アレルギー剤とその他の食品素材を混合して、顆粒状・粉末状・錠剤状あるいはブロック状などに成形し、食品素材や健康食品等としてもよい。その他の食品素材とは、例えば、糖類、食用たんぱく質、アルコール、ビタミン、増粘多糖類、アミノ酸、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等である。
【０００９】
化粧品：  本発明の抗アレルギー剤は、化粧品に添加し、その化粧品に抗アレルギー活性、抗炎症活性あるいはヒスタミン遊離抑制活性を付与することができる。化粧品の種類は、特に限定されないが、例えば、化粧水、化粧クリーム、乳液、ファンデーション、口紅、整髪料、ヘアトニック、育毛料、歯磨き、洗口料、シャンプー、リンス等に利用できる。その際の、化粧品原料としては、植物油等の油脂類、ラノリンやミツロウ等のロウ類、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、種々の界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物・動物抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、保存剤等、通常の化粧品原料として使用されているものを適宜配合することができる。
【００１０】
次に、本発明の抗アレルギー剤の製造方法について詳述する。
本発明の抗アレルギー剤の製造方法は、抽出原料としてパイナップルを用い、抽出溶媒として親水性有機溶媒を用いることからなる。抽出原料のパイナップルは、パイナップル植物体全体の他、果実、果皮等の任意の部位であってもよい。特に好ましいのは、抗アレルギー活性を有する成分（以下「抗アレルギー活性成分」）を多く含むパイナップル搾汁粕である。この場合、搾汁の対象は、パイナップルの植物体全体の他、果実、果皮等の任意の部位であってもよい。原料パイナップルの品種は特に限定されず、一般に流通している生食用、加工用の品種が使用可能である。原料パイナップルが水分を多く含んでいる場合、作業性を良くするため乾燥した後に使用するのが望ましい。具体的には、例えば、５０〜１５０℃にて１〜２４時間乾燥し、水分含量を低減することが好ましい。また、抽出効率を高めるため、原料パイナップルは、細かくすりつぶしてから用いるのが好ましい。手段は特に限定されず、乳鉢による方法、ワーリングブレンダー、ホモジナイザー等の粉砕機器による方法等が挙げられる。原料パイナップルは１６メッシュ以下となるように粉砕することが好ましい。
【００１１】
抽出に用いる溶剤は、抗アレルギー活性成分を抽出可能なものであれば、使用できるが、その中でも親水性有機溶媒を主として含有する溶媒、即ち、親水性有機溶媒、親水性有機溶媒と水の混合溶媒又は親水性有機溶媒と他の有機溶媒の混合溶媒（３種類以上を混合しても良い）が好ましい。親水性有機溶媒の具体例としては、例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、ジエチルエーテル、クロロホルム等が挙げられる。作業性や安全性等の面からは、エタノールが特に、好ましい。エタノールに水を混合させて利用する場合は、有効成分の抽出効率の点からエタノールの濃度が５０％（ｖ／ｖ）以上であることが特に好ましい。抽出に際しての原料パイナップルと溶媒との混合率は特に限定されず、原料パイナップル１に対して溶剤１〜５０重量倍、特に抽出操作、効率の点で５〜３０重量倍であることが好ましい。抽出温度は５℃〜室温・常圧下での溶剤の沸点の範囲とするのが便利であり、加熱・還流してもよい。抽出時間は、加熱温度等の条件にもよるが、１分以上であれば可能である。しかし、一般的な設備を前提とすれば、好ましくは１０分〜１ヶ月行う。
【００１２】
なお、有機溶媒を含む溶剤での抽出の前に、原料パイナップルを水や熱水で洗浄することにより、水に可溶の夾雑物を除くことができる。この場合、水洗浄後の粕を回収し、それを溶剤抽出に供する。抽出工程により、抗アレルギー活性成分が溶剤中に溶出する。有機溶媒、特にエタノール、アセトン、酢酸エチルを含む溶剤により抗アレルギー活性成分が効率的に抽出されることから、該成分は、パイナップルの上記溶剤可溶成分中に特に多く存在していると考えられる。抽出効率向上のため、抽出工程は複数回繰り返すことが好ましい。抽出後は吸引濾過等を行ってパイナップル抽出物を含む溶剤を回収する。以上により溶液状のパイナップル抽出物が得られる。なお、必要により、得られた画分を合成吸着剤やイオン交換樹脂等によって更に精製してもよい。
【００１３】
得られたパイナップル抽出物は、溶剤を含んだ状態のものやその濃縮物、抽出物から溶剤を除去した乾燥物等、いかなる状態でも、抗アレルギー剤として使用できる。ただし、保存性、有機溶媒の安全性の点で、パイナップル抽出物は乾燥物の状態にするのが好ましい。
溶剤抽出や樹脂による精製操作の各段階で得られる画分の抗アレルギー活性は、肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制活性を指標として測定すればよい。測定法を実験例２に記載した。
【００１４】
【実施例】
以下に、本発明をさらに具体的に説明するため、以下に実施例を挙げて説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実験例１（パイナップル抽出物の調製）
（１）パイナップル果肉６０ｇをミキサーにて粉砕し、果汁を除去して得たパイナップル粕を、６０ｍｌの水で２回洗浄した。次いで、洗浄粕を凍結乾燥後粉砕し、得られた乾燥パイナップル粕０．９２ｇに対し１３．７ｍｌのエタノールを加え、室温で２０時間抽出することを２回繰り返した。得られた抽出液を濾過した後に、濾液を減圧下で濃縮乾燥し、パイナップル抽出物１９９．１ｍｇを得た（パイナップル抽出物１）。
（２）上記（１）と同様にして得られた洗浄粕の凍結乾燥粉砕物０．９２ｇに対し２７．５ｍｌの水を加え、６０℃で加熱・還流しながら水洗浄を行ない、夾雑物を洗浄除去した。次いで、洗浄粕を回収し、２７．５ｍｌのエタノールを加え、室温で２０時間抽出した。得られた抽出液を濾過した後に、濾液を減圧下で濃縮し、パイナップル抽出物２１．１ｍｇを得た（パイナップル抽出物２）。
（３）パイナップルジュース粕１２ｇに水６０ｍｌを加えてミキサーにて粉砕し、水層を除去して得たパイナップル粕を、６０ｍｌの水で1回洗浄した。次いで、洗浄粕を凍結乾燥後粉砕し、得られた乾燥パイナップル粕１．１６ｇに対し１７．３ｍｌのエタノールを加え、室温で２０時間抽出することを２回繰り返した。得られた抽出液を濾過した後に、濾液を減圧下で濃縮乾燥し、パイナップル抽出物４５．１ｍｇを得た（パイナップル抽出物３）。
【００１６】
（４）上記（３）と同様にして得られた洗浄粕の凍結乾燥粉砕物１．１６ｇに対し３５ｍｌの水を加え、６０℃で加熱・還流しながら水洗浄を行ない、夾雑物を除去した。次いで、洗浄粕を回収し、３５ｍｌのエタノールを加え、室温で２０時間抽出した。得られた抽出液を濾過した後に、濾液を減圧下で濃縮し、パイナップル抽出物１７．４ｍｇを得た（パイナップル抽出物４）。
（５）パイナップル果皮３０ｇに水６０ｍｌを加えてミキサーにて粉砕し、水層を除去して得たパイナップル粕を、６０ｍｌの水で1回洗浄した。次いで、洗浄粕を凍結乾燥後粉砕し、得られた乾燥パイナップル粕１．８１ｇに対し１８．２ｍｌのエタノールを加え、室温で２０時間抽出することを２回繰り返した。得られた抽出液を濾過した後に、濾液を減圧下で濃縮乾燥し、パイナップル抽出物９９．４ｍｇを得た（パイナップル抽出物５）。
（６）上記（３）と同様にして得られた洗浄粕の凍結乾燥粉砕物１．８１ｇに対し２７ｍｌの水を加え６０℃で加熱・還流しながら水洗浄を行ない、夾雑物を除去した。次いで、洗浄粕を回収し、２７ｍｌのエタノールを加え、室温で２０時間抽出した。得られた抽出液を濾過した後に、濾液を減圧下で濃縮し、パイナップル抽出物５０ｍｇを得た（パイナップル抽出物６）。
【００１７】
実験例２（抗アレルギー活性の測定）
実験例１で得られたパイナップル抽出物１〜６について、抗アレルギー活性を確認するため、ラット肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制活性の測定を、以下の方法により行い、その測定結果を表1に示した。表1の結果から明らかなように、パイナップル抽出物はヒスタミン遊離抑制活性を示した。
測定法：  ラットを放血致死後直ちに腹腔よりヘパリン含有肥満細胞用緩衝液（組成：0.150 M NaCl、3.7 mM KCl、3.0 mM Na2HPO4、3.5 mM KH2PO4、0.9 mM CaCl2、5.6 mM D-glucose、0.1% (w/v) gelatin、pH6.8）を用いて細胞を採取した（大内和雄  編集：生物薬科学実験講座12 炎症とアレルギーII、廣川書店、1993、p.372）。細胞を洗浄後、トルイジンブルーで染色される細胞が２．０×１０5個／ｍｌ となるよう上記肥満細胞用緩衝液を加え、細胞浮遊液とした。一方、実験例1で得た各パイナップル抽出物を、１％ジメチルスルホキシドに溶解し、０．３ 〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の試料溶液とした。
【００１８】
次に、試料溶液２０μlに細胞溶液８０μlを加えて３７℃１０分間インキュベートした。次いで、ヒスタミンの脱顆粒誘発剤としてコンパウンド４８／８０（５μｇ／ｍｌ）を２０μl 加え、１０分インキュベートした（このときパイナップル抽出物の終濃度は０．０５〜１．６７ｍｇ／ｍｌ）。その後いったん氷冷して遠心分離（４，５００×ｇ、５分、４回）し、上清中に遊離されたヒスタミンを、重炭酸塩存在下4-N,N-dimethylamino-azobenzene-4'-isothiocyanateにより色素標識後、高速液体クロマトグラフィーにより測定した(Kinoshita, E. and Saito, M の方法; Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(8), 1488-1491, 1998)。
ヒスタミン遊離抑制活性は、測定されたヒスタミン値から下記の計算式（A）を用いて算出した。
ヒスタミン遊離抑制率（％）＝（１−(S −B)/(C −B)）×１００  ・・・（A）
B：誘発剤を加えない対照の細胞から遊離されるヒスタミン量
C：誘発剤を加えたときに細胞から遊離されるヒスタミン量
S：被験試料を共存させて誘発剤を加えたときに細胞から遊離されるヒスタミン量
【００１９】
【表１】
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【００２０】
実験例３（抽出溶媒の検討１）
パイナップルジュース粕１００ｇに水６００ｍｌを加えてミキサーにて粉砕し、水層を除去して得たパイナップル粕に、６００ｍｌの水を加え、６０℃で加熱・還流しながら水洗浄を行ない、夾雑物を除去した。次いで、洗浄粕を凍結乾燥後粉砕し、粉砕物１ｇに溶剤としてヘキサン、酢酸エチル、アセトン、７５％アセトン、エタノール、７５％エタノールを各々３０ｍｌ加え、室温で２０時間抽出することを２回繰り返した。また、粉砕物１ｇに水３０ｍｌを加え、沸騰水浴上２時間にて抽出した。得られた抽出液を濾過した後に、濾液を減圧下で濃縮乾燥し、パイナップル抽出物を得た。これらの抽出物について、実験例２の方法によりヒスタミン遊離抑制活性を測定した。抽出物の重量を表２、測定結果を表３に示した。これらの結果から、抽出溶媒としては、抗アレルギー活性の点からは、酢酸エチル、アセトン、７５％アセトン、エタノール、７５％エタノールなどの親水性有機溶媒含有溶媒が望ましく、抽出物収量や、安全性も加味すれば、エタノールや７５％エタノールが特に優れていることがことが判った。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
【表３】
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【００２３】
実験例４（抽出溶媒の検討２）
パイナップルジュース粕５０ｇに水２５０ｍｌを加え、６０℃で加熱・還流しながら水洗浄を行ない、夾雑物を除去した。次いで、洗浄粕を回収し、５ｇずつに分け、溶剤として１０％〜９０％エタノール、及びエタノールを各々３０ｍｌ加え、室温で２０時間抽出した。得られた抽出液を濾過した後に、濾液を減圧下で濃縮乾燥し、パイナップル抽出物を得た。これらの抽出物について、実験例２の方法によりヒスタミン遊離抑制活性を測定した。抽出物の重量を表４、測定結果を表５に示した。これらの結果から、抽出溶媒として、５０〜１００％エタノールが、抗アレルギー活性が強く且つ抽出物収量も良好で、特に好ましいことが判った。
【００２４】
【表４】
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【００２５】
【表５】
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【００２６】
実験例５：毒性試験
実験例１で得たパイナップル抽出物について、引用文献（大内和雄  編集：生物薬科学実験講座12 炎症とアレルギーII、廣川書店、1993、p.372）に記載の方法で細胞毒性試験を行った。即ち、まず、実験例２（１）と同様に調製した細胞浮遊液（全細胞数３〜６×１０6個／ｍｌ）８０μｌに、試料溶液２０μｌを加え、３７℃で培養した。培養開始から、０，１０，２０分後に各１０μｌずつ取り出し、予め用意しておいた２０μｌの０．４％トリパンブルー液に加えた。青色色素で染まる細胞を死細胞と判定し、血球計算盤を用いて、顕微鏡下で細胞数を測定し、各時間における全細胞数及び生存細胞数を測定した。その結果、細胞毒性は見られなかった。
なお、パイナップル果実の場合は、言うまでも無く食品として認められているものであって、毒性、特に急性毒性を示す可能性は無く、従って、それから得られるパイナップル果実粕抽出物は、急性毒性の可能性は無いと思われる。
【００２７】
実施例１（抗アレルギー剤の製造）
パイナップルジュース粕１００ｋｇに水６００リットルを加え、摩砕した後、固液分離し、粕を回収した。次いで、この水洗粕に水６００リットルを加え、６０℃で２時間加熱還流した後、濾過し、水洗粕を回収した。この水洗粕を６０％エタノール６００リットルにて、６０℃で２時間抽出し、得られた抽出液を減圧濃縮し、濃縮液５リットルを得た。
これを凍結乾燥し、パイナップル粕抽出物（粉末）４４０ｇを得た。本抽出物を実施例２の方法によりヒスタミン遊離抑制活性を測定したところ、濃度５００μｇ／ｍｌにおいて抑制率７２．１％であり、本抽出物が抗アレルギー剤として利用できることが確認された。
【００２８】
実施例２（医薬品への使用）
実施例１で得られたパイナップル抽出物１００ｇに、乳糖１００ｇ及びステアリン酸マグネシウム５ｇを加え混合し、この混合物を、常法により、単発式打錠機にて打錠し、直径１０ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤タイプの医薬品を１９０ｇを製造した。
【００２９】
実施例３（食品への使用）
実施例１で得られたパイナップル抽出物（２．４ｇ）に砂糖（４７０ｇ）、水飴（４９７．６ｇ）、香料（１０ｇ）、水（２０ｇ）を加え、混合し、常法により、キャンデー（一粒5g）を９５０ｇ製造した。
実施例４（飲料への使用）
実施例１で得られたパイナップル抽出物（１０ｇ）に濃縮温州みかん果汁（５０ｇ）、果糖ブドウ糖液糖（１１０ｇ）、クエン酸（２ｇ）、Ｌ−アスコルビン酸（０.２ｇ）、水を加え、常法により処理し、オレンジジュースを１０００ｇ製造した。
【００３０】
実施例５（化粧品への使用）
実施例１で得られたパイナップル抽出物（０．５ｇ）にグリセリン（５.０ｇ）、プロピレングリコール（４.０ｇ）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（２．０ｇ）、エタノール（１０.０ｇ）、香料（０.１ｇ）、精製水を加え、常法により処理し、化粧水を１００ｇ製造した。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の新規抗アレルギー剤は、優れた抗アレルギー活性を示し、各種アレルギー疾患の予防剤・治療剤、抗炎症剤あるいはヒスタミン遊離抑制剤として利用できる。また、本発明の抗アレルギー剤は、食糧原料に由来し、安全性が高く、医薬品のみならず、飲食品、化粧品にも利用できる。又、本発明の製造方法は、該新規抗アレルギー剤を製造するための具体的方法を提供するものである。なお、原料のパイナップル粕は、パイナップルの加工工場で大量に発生する未利用の副産物であって、安価な原料であり経済性に優れ、又、製造の際、環境にも優しい。以上を要するに、本発明により、安全且つ有効で特長有る新規の抗アレルギー剤を提供することができる。