(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物を、還元糖／全糖比（％）が３０〜９０％である糖化デンプンを含む培地を用いて培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法。
【請求項２】
糖化デンプンが、デンプンまたは可溶性デンプンを糖化酵素で処理して得られる糖化デンプンである請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物を、（ａ）デンプンまたは可溶性デンプンおよび（ｂ）糖化酵素を含む培地を用いて培養し、該培地に含まれるデンプンまたは可溶性デンプンから糖化酵素によって生成される還元糖／全糖比（％）が３０〜９０％である糖化デンプンを培地炭素源として用いて、モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物により高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を生成させ、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法。
【請求項４】
デンプンまたは可溶性デンプンを含む培地を用いて、モルティエレラ（Mortierella）属微生物を主たる微生物とし、アスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物を副たる微生物として混合培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法。
【請求項５】
アスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物が、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)またはアスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)である請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物が、モルティエレラ属モルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物である請求項１〜５に記載の製造方法。
【請求項７】
モルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）またはモルティエレラ・アリアセア（Mortierella alliacea）である請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
高度不飽和脂肪酸が、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ミード酸、６，９−オクタデカジエン酸および８，１１−エイコサジエン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸である請求項１〜７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高度不飽和脂肪酸生産能を有するモルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物（以下、モルティエレラ属微生物という。）を、糖化デンプンを培地炭素源として培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本明細書において、不飽和脂肪酸とは炭素鎖に二重結合が１個以上ある脂肪酸をいい、またこの中で炭素数が１８以上でかつ二重結合が２個以上の脂肪酸を一般に「高度不飽和脂肪酸」という。高度不飽和脂肪酸としては、例えば、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ミード酸、６、９−オクタデカジエン酸、８、１１−エイコサジエン酸等を挙げることができる。モルティエレラ属微生物によって作られる高度不飽和脂肪酸は、その大部分がトリグリセリドの構成脂肪酸として生成され、これ以外にジグリセリド、モノグリセリド、遊離脂肪酸、リン脂質などの様々な脂質を構成する脂肪酸としても生成される。本明細書における高度不飽和脂肪酸含有脂質とは、これら様々な高度不飽和脂肪酸含有脂質の混合物であり、アラキドン酸生成量とは、これら様々な脂質の構成脂肪酸として存在するアラキドン酸の量を遊離脂肪酸量に換算した値である。また、デンプンをアミラーゼ等の糖化酵素で処理して得られるオリゴグルコースおよびグルコースの混合物を「糖化デンプン」とし、糖化デンプンを調製するために用いるアミラーゼなどの糖質分解酵素を「糖化酵素」、デンプンを当該酵素で処理することを「糖化処理」とする。糖化処理によるデンプンの分解度を「糖化度」といい、糖化度は糖化デンプンの還元糖／全糖（％）で表され、例えば、還元糖／全糖が５０％であることは糖化デンプン中のα-グルカンの平均鎖長が２であることを示している。
【０００３】
アラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸は、特に乳児の発育に必要な成分として、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）とともに栄養学的見地から注目されている。Lantingらは生後３週間以上母乳で育てた乳児と育児用粉乳で育てた乳児を９歳まで追跡調査し、行動面などから脳神経の小さな障害の発生率を検討した結果、育児粉乳で育った子供の脳障害発生率は母乳で育った子供の２倍であると報告した（ＬＡＮＣＥＴ、ｖｏｌ．３４４、１３１９−１３２２（１９９４））。この結果は、母乳には存在するが育児用粉乳にはほとんど存在しないＤＨＡやアラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸が乳児の脳の発達に関係するためとされている。この他にも、高度不飽和脂肪酸が新生児の脳および網膜の発達に関係しているとする結果が相ついで報告されるようになり（Carlson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1073-1077 (1993)）、未熟児および新生児における栄養学的観点からこれら高度不飽和脂肪酸の重要性が注目されている。
【０００４】
高度不飽和脂肪酸は動物界に広く分布しており、例えばアラキドン酸は動物の副腎腺や肝臓から抽出した脂質から分離されている。しかしながら、これらの動物臓器中の高度不飽和脂肪酸の含量は少ないため、動物臓器からの高度不飽和脂肪酸の抽出・分離は、高度不飽和脂肪酸を大量に供給するには十分な方法とはいえなかった。そのため、種々の微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を得る方法が開発されてきた。中でもモルティエレラ属微生物は、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸等の高度不飽和脂肪酸含有脂質を生産する微生物として知られており、この微生物を用いた発酵法による高度不飽和脂肪酸含有脂質を製造する方法が開発されている（特開昭６３−４４８９１、特開昭６３−１２２９０、特開昭６３−１４６９６、特開昭６３−１４６９７）。さらに、モルティエレラ属微生物のΔ１２不飽和化酵素活性が低下または欠失している変異株を用いてミード酸を製造する方法も知られている（特開平５−９１８８８）。また、モルティエレラ属微生物に変異処理を施して得られる、Δ５不飽和化酵素活性が低下または欠失している変異株を用いて、ジホモ−γ−リノレン酸を製造する方法も知られている（特開平５−９１８８７）。
【０００５】
モルティエレラ属微生物がデンプン資化能を有することは既に知られいているが、その資化能はグルコース資化能には及ばないため、グルコースが培地炭素源として広く用いられてきた(Shinmen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 31:11-16 (1989)、Aki et al., JAOCS 78:599-604 (2001))。モルティエレラ属微生物のデンプン資化能に着目した結果、分泌されているデンプン分解酵素が単離精製され、かかるデンプン分解酵素がα−グルコシダーゼであることが報告されている(田中ら, 農芸化学会要旨集  1999年3月)。しかし、α−グルコシダーゼはα−グルカンの非還元末端からグルコース単位を切り出していく分解様式をもつエキソ型アミラーゼであり、デンプンに代表される高分子量α−グルカンを分解する活性が低く、数個のグルコースからなるオリゴグルコースを分解する活性が高い。このことが、モルティエレラ属微生物のデンプン資化能がグルコース資化能に劣る原因の１つであると考えられる。一方、グルコースを炭素源として用いる場合、培地中の高濃度グルコースによる浸透圧の上昇が、モルティエレラ属微生物の菌体増殖および高度不飽和脂肪酸含有脂質の生産性に悪影響を引き起こすため、低濃度グルコースで培養して、資化されたグルコースを補うために培養中にグルコースを逐次添加する方法（流加培養法）が広く用いられている（Shinmen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 31:11-16 (1989)）。また、高濃度のグルコースに耐性を有するモルティエレラ属微生物を用いて、高度不飽和脂肪酸含有脂質を生産する試み（国際公開番号：WO98/39468）も行われている。
【０００６】
培地炭素源は培地の原材料費の大部分を占めており、これをグルコースよりも安価な原料に変更することができれば、高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造経費の削減がはかれる。グルコースの原料であるデンプンを培地炭素源として用いれば、原材料費削減がはかれるが、モルティエレラ属微生物が生産するα−グルコシダーゼは上記のごとくデンプンを分解する活性が低く、従ってデンプンを十分資化することができない。また、グルコースを高濃度に含有する培地は浸透圧が高くなり、モルティエレラ属微生物の増殖遅延、高度不飽和脂肪酸含有脂質の生産性低下および菌形態の変化などの原因となるため、培養中に逐次グルコースを添加せずに培養開始時からグルコースを高濃度で含有させる回分培養法で、安価に高度不飽和脂肪酸含有脂質を製造することは困難である。この問題を解決する手段として、培養中に逐次グルコースを添加する流加培養法が用いられるが、流加培養法はグルコースを逐次添加するための追加の装置を必要とするだけでなく、培養工程における作業回数や作業時間を増加させるので、高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造コストを増加させる。また、グルコースはデンプンを種々のアミラーゼで酵素分解して製造されるが、酵素処理後にグルコースを単離・精製する必要があり、酵素処理および単離・精製のコストがグルコースをデンプンよりも高価なものにしている。
【０００７】
デンプンあるいは可溶性デンプンを培地炭素源として利用した高度不飽和脂肪酸含有脂質の生産について報告されているが(Shinmen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 31:11-16 (1989)、Aki et al., JAOCS 78:599-604 (2001))、高度不飽和脂肪酸含有脂質の生産量は、培地中の糖質あたりで同量のグルコースを炭素源とした場合に比べて低く、これはデンプンあるいは可溶性デンプンが完全に資化されていないためである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、グルコースよりも安価で、培地の浸透圧上昇には寄与せず、かつモルティエレラ属微生物が資化できる培地炭素源を用いた従来よりも安価な高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
モルティエレラ属微生物が生産するα−グルコシダーゼは、上記の如くデンプンを分解する活性が低い。デンプンを培地炭素源として用いるためには、モルティエレラ属微生物が生産するα−グルコシダーゼが分解しやすい糖化デンプンにまでデンプンを分解する必要があった。しかし、デンプンをグルコースにまで完全に分解すると単糖の増加による浸透圧の上昇を引き起こし、上記のような高度不飽和脂肪酸含有脂質の生産に様々な悪影響を及ぼす。そこで、デンプンを糖化処理する糖質分解酵素および当該酵素による糖化処理の条件を選択することによって、糖化デンプン中のオリゴグルコースの平均鎖長を、モルティエレラ属微生物が生産するα−グルコシダーゼが分解しやすい適切な長さに制御することを本発明者らは着想した。そして、本発明者らは、デンプンを各種糖質分解酵素によって様々な条件で糖化処理して得られた糖化デンプンを培地炭素源として、モルティエレラ属微生物を培養して得られた菌体から抽出した高度不飽和脂肪酸含有脂質の生産性を、培地炭素源として同量のデンプンまたはグルコースを用いて回分培養した場合、および培地炭素源として同量のグルコースを添加して流加培養した場合の該生産性と比較した。その結果、糖化デンプンを炭素源とした培養では、デンプンまたはグルコースを培地炭素源とした回分培養よりも高い生産性を示し、グルコースを培地炭素源として流加培養した場合と同等の生産性を示すことを発見し、さらに検討を行って本発明を完成した。
【００１０】
本発明はすなわち、
（１）  モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物を、糖化デンプンを含む培地を用いて培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法、
（２）  糖化デンプンが、デンプンまたは可溶性デンプンを糖化酵素で処理して得られる糖化デンプンである前記（１）に記載の製造方法、
（３）  モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物を、（ａ）デンプンまたは可溶性デンプンおよび（ｂ）糖化酵素を含む培地を用いて培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法、
（４）  デンプンまたは可溶性デンプンを含む培地を用いて、モルティエレラ（Mortierella）属微生物と糖化酵素生産能を有する微生物とを混合培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法、
（５）  糖化酵素生産能を有する微生物が、アスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物である前記（４）記載の製造方法、
（６）  アスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物が、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)またはアスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)である前記（５）記載の製造方法、
に関する。
【００１１】
また、本発明は、
（７）  モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物が、モルティエレラ属モルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物である前記（１）〜（６）に記載の製造方法、
（８）  モルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）またはモルティエレラ・アリアセア（Mortierella alliacea）である前記（７）記載の製造方法、
（９）  高度不飽和脂肪酸が、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ミード酸、６，９−オクタデカジエン酸および８，１１−エイコサジエン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸である前記（１）〜（８）に記載の製造方法、
に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において使用する微生物は、高度不飽和脂肪酸含有脂質を産生することができるモルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物であれば、どのような微生物でもよい。このような微生物としては、例えばMYCOTAXON，Vol．XLIV，No.2，pp．257-265（1992）に記載されている菌株を使用することができ、具体的にはモルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等のモルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物や、モルティエレラ・イザベリナ（Mortierella isabellina）CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、モルティエレラ・ナナ（Mortierella nana）IFO8190、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィナセア（Mortierella vinacea）CBS236.82等のマイクロムコール亜属（subgenus Micromucor）に属する微生物を挙げることができる。
【００１３】
これらの菌株はいずれも、大阪市の財団法人醗酵研究所（ＩＦＯ）、および米国American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、およびオランダCentraalbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）からなんら制限なく入手することができる。また、本発明者らが土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号）を使用することもできる。これらタイプカルチャーに属する菌株、あるいは自然界から分離した菌株をそのまま用いることができる。また、本発明で用いる上記微生物としては、モルティエレラ属微生物（野生株）の変異株または遺伝子組換え株であってもよい。中でも、野生株と同じ培養条件で培養した時に、元の野生株が産生する高度不飽和脂肪酸脂質の量と比べて、脂質中の特定のまたは全部の高度不飽和脂肪酸含量が多くなるか、もしくは総脂質量が多くなる、あるいはその両方を達成できる変異株ないし遺伝子組換え株が好ましい。脂質中の特定の高度不飽和脂肪酸含量が多くなる変異株として、例えば、Δ１２不飽和化酵素活性の欠失したモルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６１（微工研条寄第３５９０号、ＦＥＲＭ ＢＰ−３５９０）や、Δ５不飽和化酵素活性の欠失したモルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６０（微工研条寄第３５８９号、ＦＥＲＭ ＢＰ−３５８９）を挙げることができる。また、高濃度のグルコースに耐性を有するモルティエレラSAM2197（FERM BP-6261）を用いることもできる。
【００１４】
本発明にかかる高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法としては、（ｉ）上述のモルティエレラ属微生物を、糖化デンプンを含む培地を用いて培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取するか、（ii）上述のモルティエレラ属微生物を、（ａ）デンプンまたは可溶性デンプンおよび（ｂ）糖化酵素を含む培地を用いて培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取するか、または（iii）デンプンまたは可溶性デンプンを含む培地を用いて、上述のモルティエレラ属微生物と糖化酵素生産能を有する微生物（以下、糖化酵素生産微生物という。）とを混合培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取するという３つの態様が挙げられる。下記にそれぞれの態様について分けて説明する。
【００１５】
本発明の第一の態様として、上述のモルティエレラ属微生物を、糖化デンプンを含む培地を用いて培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取することを特長とする高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法について述べる。このように、デンプンを予め糖化処理して得られた糖化デンプンを培地炭素源として用いることによって、モルティエレラ属微生物に資化されやすく、かつ培地の浸透圧上昇を抑制して対炭素源あたりの高度不飽和脂肪酸含有脂質の収率を増加させることできるという利点がある。
本態様におけるモルティエレラ属微生物の単一培養は、培地炭素源として糖化デンプンを使用すること以外は、常法に従って行えばよい。例えば、上記モルティエレラ属微生物の胞子、菌糸または予め培養して得られた前培養液を、液体培地または固体培地に接種し培養するという方法が挙げられる。
【００１６】
かかる態様における微生物培養用培地は、培地炭素源として糖化デンプンを含んでいれば特に限定されない。中でも、培地炭素源として用いる糖化デンプンは、培養するモルティエレラ属微生物が生産するα−グルコシダーゼが最も分解しやすい糖化度、すなわち糖化デンプン中のオリゴグルコースの平均鎖長にすることが望ましい。具体的には、浸透圧の上昇とモルティエレラ属微生物が資化できる糖化デンプン中のオリゴグルコースの鎖長を考慮して、還元糖／全糖比、つまり糖化度が約２０〜９０％程度、好ましくは約３０〜９０％程度の糖化デンプンを用いることが好適である。
【００１７】
前記糖化デンプンは、デンプンまたは可溶性デンプンを糖化酵素で処理して得ることができ、さらに糖化酵素の選択および当該酵素による糖化処理の条件を設定することにより、上記所望の糖化度の糖化デンプンを得ることができる。糖化酵素としては、デンプンなどを分解できる糖質分解酵素であれば特に限定されないが、ランダムな分解様式をもつα−アミラーゼ等のエンド型アミラーゼ、またはデンプン分子の末端からマルトース単位で切り出すβ−アミラーゼ等のエキソ型アミラーゼが好ましい。また、異なる作用機序の糖化酵素を組み合わせて用いてもよい。糖化処理に用いる糖化酵素は、当該糖化酵素を生産する微生物を培養し、その培養液から公知の方法で該酵素を得ることができる。また、市販されている糖化酵素を用いてもよい。市販の糖化酵素としては、アミラーゼＡＤ「アマノ」１（天野エンザイム株式会社製）などのα−アミラーゼ、またはプルラナーゼ「アマノ」３（天野エンザイム株式会社製）などのプルラナーゼ等が挙げられる。また、前記糖化デンプンは、デンプンまたは可溶性デンプンを酸で分解するなど他の公知の方法で得ることもできる。デンプンまたは可溶性デンプンを酸で分解して糖化デンプンを得る酸分解法としては、シュウ酸を用いる処理が好適な例として挙げられる。さらに、前記糖化デンプンとしては、市販されている糖化デンプンを用いてもよい。市販の糖化デンプンとしては、フジシラップＣ−７５Ｓ、フジシラップＣ−７５、ＨＭＴＰ−７５またはＡ−７５（いずれも加藤化学社製）等が挙げられる。これら市販の糖化デンプンは、各々糖化度が異なるので、本発明に実施に好適な糖化デンプンを選ぶことができる。
【００１８】
本態様で用いる微生物培養用培地には、糖化デンプンを補う副原料として、例えばグルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、糖蜜、グリセロール、マンニトールまたはクエン酸等の一般に使用されている培地炭素源を含んでいてもよい。また、培地窒素源として、例えば大豆粉、大豆フレーク、脱脂大豆粉、食用大豆タンパク、大豆ペプチド、きな粉、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティプリカーもしくは尿素等の有機窒素源、または硝酸アンモニウムもしくは硫酸アンモニウム等の無機窒素源が、本態様で用いる微生物培養用培地に含まれていてもよい。中でも、培地窒素源としては、脱脂大豆に熱変性を施したものが好ましく、特に脱脂大豆を約７０〜９０℃で熱処理しさらにエタノール可溶成分を除去したものがより好ましい。
【００１９】
さらに、本態様で用いる微生物培養用培地には、リン酸、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、および／またはカルシウムからなる無機塩類や、鉄、銅、亜鉛、マンガン、ニッケル、コバルト等の金属イオンやビタミン等が、微量栄養源として含まれていてもよい。中でも、リン酸、カリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる１以上の無機塩類が含まれていることが好ましい。
また、本態様で用いる微生物培養用培地には、高度不飽和脂肪酸の収率を増加せしめるために、高度不飽和脂肪酸の前駆体として、例えば、ヘキサデカンもしくはオクタデカンのごとき炭化水素；オレイン酸もしくはリノール酸のごとき脂肪酸またはその塩、トリアシルグリセロール、または、例えばエチルエステル、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルのごとき脂肪酸エステル；オリーブ油、大豆油、なたね油、綿実油若しくはヤシ油のごとき油脂類が、含まれていてもよい。前記化合物は１種類のみが単独で含まれていてもよいし、２種類以上が組み合わされて含まれていてもよい。
【００２０】
上記の炭素源、窒素源、その他の培地成分は、培養開始前の培地および／または培養中の培地に添加することができる。これらの培地成分は一度に添加することもでき、または連続的に、若しくは複数回に分けて経時的に添加することもできる。これらの培地成分は、各々単独でまたは予め混合して、殺菌したのち添加することができ、その殺菌方法、添加順序は特に制限されない。好ましくは、炭素源と窒素源は別々に殺菌するのが望ましく、塩類は対数増殖終了までに、より好ましくは対数増殖中期より前に添加するのが望ましい。リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン濃度に影響を与えない他の培地成分については、モルティエレラ属微生物の生育を阻害しない濃度であれば、その添加時期は特に制限されない。
【００２１】
実用上、一般に炭素源の総添加量は約０．１〜４０重量％程度、好ましくは約１〜２５重量％程度、窒素源の総添加量は約０．０１〜１０重量％程度、好ましくは約０．１〜１０重量％程度の濃度とするのが望ましく、より好ましくは初発の炭素源添加量を約１〜１２重量％程度、初発の窒素源添加量を約０．１〜８重量％程度として、培養途中で炭素源および窒素源を添加することもできる。また、上述の高度不飽和脂肪酸の前駆体の添加量は、培地に対して約０．００１〜１０％程度、好ましくは約０．５〜１０％程度である。
【００２２】
培養条件も特に限定されず、常法に従えばよい。例えば、培養温度は約５〜４０℃程度、好ましくは約２０〜３０℃程度である。また、約２０〜３０℃程度にてモルティエレラ属微生物を増殖せしめた後、約５〜２０℃程度にて培養を続けて高度不飽和脂肪酸を生産せしめることもできる。また、培地ｐＨは、約４〜１０程度、好ましくは約５〜８程度である。培養方法としては、例えば通気撹袢培養、振とう培養、または静置培養等が挙げられる。培養は通常約２〜２０日間程度行う。このように培養して、モルティエレラ属微生物内に高度不飽和脂肪酸を含有する脂質が生成蓄積される。本発明においては、液体培地による通気撹拌培養が好ましい。
【００２３】
ついで、以上のようにして得られる培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取する。前記「培養物」としては、例えば、培養によって脂質を製造する途中の培養液若しくはその殺菌した培養液、または培養終了後の培養液若しくはその殺菌した培養液、またはそれぞれから集菌した培養菌体若しくはその乾燥物等が挙げられる。このような培養物から、高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取する方法としては、公知の方法を用いてよい。例えば、培養菌体から次の方法により目的とする脂質の採取を行うことができる。
【００２４】
培養終了後、培養液より遠心分離および／または濾過等の常用の固液分離手段により培養菌体を得る。培養菌体は、好ましくは、水洗、破砕、乾燥する。乾燥は、凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。乾燥菌体は、好ましくは窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒としては、例えば、エーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いることができる。また、メタノールと石油エーテルの交互抽出やクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。なかでも、ヘキサンを用いて抽出することが好ましい。抽出物から減圧下で有機溶剤を留去することにより、高濃度の高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を得ることができる。また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて抽出を行うこともできる。この場合にはメタノール、エタノール等の水に対して相溶性の溶媒、またはこれらと水および／または他の溶媒とからなる水に対して相溶性の混合溶媒を使用する。その他の手順は上記と同様である。
【００２５】
次に、本発明の第二の態様として、上述のモルティエレラ属微生物を、（ａ）デンプンまたは可溶性デンプンおよび（ｂ）糖化酵素を含む培地を用いて培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法について述べる。本態様においては、培地に含まれるデンプンまたは可溶性デンプンから糖化酵素によって生成される糖化デンプンを培地炭素源として用いる。すなわち、本態様においてはデンプンの糖化処理とモルティエレラ属微生物の培養を同時に行う。より具体的には、デンプンまたは可溶性デンプンを炭素源とする培地に糖化酵素を添加してデンプンまたは可溶性デンプンをモルティエレラ属微生物が生産するα−グルコシダーゼが分解しやすい糖化デンプンに変換し、該糖化デンプンから生成するグルコースをモルティエレラ属微生物が資化して高度不飽和脂肪酸含有脂質を製造する方法である。
【００２６】
本態様で用いるデンプンとしては特に限定されないが、具体的には、例えば、米デンプン、カンショデンプン、馬鈴薯デンプン、タピオカデンプン、小麦デンプンもしくはコーンスターチ、またはそれらの化工澱粉やα化澱粉などが挙げられる。デンプンのうち熱湯に溶けるものを、可溶性デンプンと言う。
本態様で用いる糖化酵素としては、糖化処理に用いる酵素であれば何でも用いることができ、具体的には、上記第一の態様と同様に糖化酵素生産微生物から調製した糖化酵素および市販の糖化酵素を用いることができる。本態様で用いる糖化酵素としては、第一の態様と同様に、ランダムな分解様式をもつα−アミラーゼ等のエンド型アミラーゼ、およびデンプン分子の末端からマルトース単位で切り出すβ−アミラーゼ等が好適であるが、デンプンを非還元末端から逐次分解してグルコースを産生するグルコアミラーゼ等のエキソ型アミラーゼも用いることができる。グルコアミラーゼによって生成したグルコースは直ちにモルティエレラ属微生物によって資化されるので、培地の浸透圧上昇による悪影響が起こらないからである。
【００２７】
本態様は、糖化デンプンの代わりに、（ａ）デンプンまたは可溶性デンプンおよび（ｂ）糖化酵素を微生物培養培地成分として用いる以外は、上記第一の態様と全く同様である。なお、本態様における微生物培養培地成分には、上述した糖化デンプンが含まれていてもよい。
【００２８】
次に、本発明の第三の態様として、デンプンまたは可溶性デンプンを含む培地を用いて、上述のモルティエレラ属微生物と糖化酵素生産微生物とを混合培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を採取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法について述べる。本態様においては、培地に含まれるデンプンまたは可溶性デンプンから糖化酵素生産微生物が生産する糖化酵素によって生成される糖化デンプンを培地炭素源として用いる。すなわち、本態様は、デンプンまたは可溶性デンプンを培地炭素源とした培地において、モルティエレラ属微生物と同時に、上記糖化処理に用いる糖化酵素生産微生物とを混合培養することによって糖化デンプンを生成せしめ、該糖化デンプンからモルティエレラ属微生物が高度不飽和脂肪酸含有脂質を製造する方法である。
【００２９】
本態様においては、モルティエレラ属微生物を主たる微生物として培養し、糖化酵素生産微生物を副たる微生物として培養する。前記糖化酵素生産微生物としては、糖化酵素を分泌する微生物であれば全て使用することができるが、例えば、アスペルギスル(Aspergillus)属、リゾプス(Rhizopus)属やトリコデルマ(Trichoderma)属に属する糸状菌、バシルス(Bacillus)属、マイクロバクテリウム(Microbacterium)属やクレブシエラ(Klebsiella)属に属する細菌を挙げることができる。なかでも、糖化酵素生産微生物としては、α−アミラーゼを生産するアスペルギルス属に属する微生物が好ましく、特にアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)もしくはアスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)がより好ましい。また、上記グルコアミラーゼを分泌する微生物も副たる微生物として好適に用いることができる。グルコアミラーゼ分泌微生物としては、アスペルギルス属微生物およびリゾプス属微生物等を挙げることができる。なお、糖化酵素生産能が付与されたモルティエレラ属微生物の変異株または遺伝子組変え株を単一培養することによって、糖化酵素生産微生物との混合培養と同様の効果を得ることができる。
【００３０】
本態様は、糖化デンプンの代わりに、デンプンまたは可溶性デンプンを微生物培養培地成分として用い、モルティエレラ属微生物を単一培養する代わりに、モルティエレラ属微生物と糖化酵素生産微生物とを混合培養する以外は、上記第一の態様と全く同様である。なお、本態様における微生物培養培地成分には、上述した糖化デンプンが含まれていてもよい。この場合、糖化デンプの糖化度、すなわち、還元糖／全糖比は、約０〜８０％程度、好ましくは約０〜７０％程度であることが好ましい。また、モルティエレラ属微生物と糖化酵素生産微生物とを混合培養する際は、両微生物を同時に培養し始めてもよいし、予め一方の微生物をある程度培養した後、他方の微生物を添加して、混合培養してもよい。
【００３１】
以上のような方法により得られる高度不飽和脂肪酸を含有する脂質は、動物用飼料や食品などの種々の用途に使用することができる。ここで、前記脂質には、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ミード酸、６，９−オクタデカジエン酸および８，１１−エイコサジエン酸から成る群から選択される１以上の高度不飽和脂肪酸が含まれていることが好ましい。かかる高度不飽和脂肪酸の分離精製は、常法により、溶媒抽出、脱溶媒の後、脱酸、脱色、脱臭、脱ガム処理、あるいは冷却分離などにより行なうことができる。好ましくは、国際公開番号：ＷＯ９８／３９４６８に記載の方法等が挙げられる。
【００３２】
【実施例】
以下実施例に従って、発明の詳細を述べるが、本発明はこれに限定されないことは言うまでもない。なお、培地中の成分組成は、すべて重量％で示す。
〔実施例１〕
アラキドン酸生産菌としてモルティエレラ属SAM2197（FERM  BP-6261）を用いた。
表１の培地１−Ａ，１−Ｂ，１−Ｃ各々５Ｌを１０Ｌ容培養槽に調製し、予めフラスコ培養で調製した前培養液を接種して培養した。培地１−Ａのアミラーゼ処理デンプンは、デンプンにα−アミラーゼ（和光純薬株式会社製  製品コード番号011-16881）を加えて３７℃で３０分インキュベートしたものを用いた。還元糖はソモギー・ネルソン(Somogyi-Nelson)法で、全糖はフェノール硫酸(Pohenol-H2SO4)法で測定した。測定の結果、培地１−Ａのアミラーゼ処理デンプンの還元糖／全糖比は３８％、培地１−Ｂの可溶性デンプンの還元糖／全糖比は０％であった。
7日間の通気攪拌培養の結果、培地１−Ａでは４．２ｇ／Ｌ、培地１−Ｂでは１．２ｇ／Ｌ、培地１−Ｃでは４．３ｇ／Ｌのアラキドン酸生成量が各々の培地で得られた。なお、アラキドン酸生成量は次のようにして算出した。すなわち、培養液を濾紙でろ過して菌体ケーキを回収し、菌体を１０５℃で乾燥した後、秤量した。乾燥後の秤量値を濾過に供した培養液量で除して、乾燥菌体濃度を求めた。乾燥菌体片約20 mgをネジ口試験管に精秤し、これに塩酸メタノール2 mLおよびジクロロメタン1 mLを添加して、５０℃で３時間反応させた。反応の後、ヘキサンを添加して脂肪酸メチルエステルを抽出し、回収したヘキサン層を減圧濃縮した。得られた脂肪酸メチルエステルを所定量のアセトニトリルに溶解して、ガスクロマトグラフィーで分画し、ピーク面積から各脂肪酸メチルエステルを定量した。定量結果を菌体片精秤値で除して、乾燥菌体あたりの各脂肪酸含量を求めた。得られた各脂肪酸含量に乾燥菌体濃度を乗じて各脂肪酸生成量を求めた。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
上表から明らかなように、可溶性デンプンを用いた培地では、アラキドン酸生成量が低かったが、デンプンをアミラーゼで処理した糖化デンプンを用いることによって、グルコース培地と同等の、高いアラキドン酸生成量が得られた。
【００３５】
〔実施例２〕
アラキドン酸生産菌としてモルティエレラ属SAM2197（FERM  BP-6261）を用いた。可溶性デンプン24％、酵母エキス1.5％の培地50mLを500mLフラスコに調製した。培地50mLにモルティエレラ属SAM2197の胞子を1×105個接種し、アスペルスギスル・オリゼ(Aspergillus oryzae)の胞子懸濁液を種々の量、接種して、160rpm、28℃で7日間培養した。また、比較のためにグルコース12％、酵母エキス1.5%の培地を上記と同様に調製し、モルティエレラ属SAM2197（FERM  BP-6261）を接種して培養した。培養5日目にグルコース12%を添加し、160rpm、28℃で7日間培養した。培養の結果、表２に示すように、アスペルギルス・オリゼの胞子懸濁液接種量が0.1mLの時にアラキドン酸生成量が0.56g/Lで最大になり、これはモルティエレラの単一培養で可溶性デンプンを用いた場合（0.3ｇ/L）の2倍近い値となり、かつ単一培養でグルコースを炭素源として用いた場合と同等の生成量であった。アスペルギルスの胞子接種量が1mLになると、アラキドン酸生成量は低下したが、これはアスペルギスルの増殖の影響により、モルティエレラの増殖が抑制される場合があり得ることが示唆され、モルティエレラ属微生物と糖化酵素生産微生物の混合培養の際には、前者を主たる微生物として培養することが好ましいことがわかった。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
〔実施例３〕
アラキドン酸生産菌としてモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）CBS754.68を用いた。表３に示す種々の糖を4.5％、酵母エキスを1％含む培地50mLを500mL容フラスコに調製し、1×103個の胞子を接種して培養した。28℃、100rpmで5日間培養した。糖化デンプン(2), (7)および(8)の糖化処理方法としては、デンプンにα−アミラーゼおよびプルラナーゼを加えて37℃で30分間インキュベートしたものを用いた。なお、α−アミラーゼとしてアミラーゼＡＤ「アマノ」１（天野エンザイム株式会社製）を、また、プルラナーゼとしてプルラナーゼ「アマノ」３（天野エンザイム株式会社製）を用いた。
培養の結果、表３に示す通りのアラキドン酸生成量が得られ、上述したような糖化度の好ましい範囲が存在することが示された。
【００３８】
【表３】
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炭素源の詳細
（１）松谷化学製、スタビローズＫ
（２）デンプンをα−アミラーゼおよびプルラナーゼで糖化処理したもの
（３）加藤化学製、フジシラップC-75S
（４）加藤化学製、フジシラップC-75
（５）加藤化学製、HMTP-75(M-70)
（６）加藤化学製、A-75
（７）デンプンをα−アミラーゼおよびプルラナーゼで糖化処理したもの
（８）デンプンをα−アミラーゼおよびプルラナーゼで糖化処理したもの
【００３９】
〔実施例４〕
アラキドン酸生産菌としてモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）CBS754.68を用いた。酵母エキスおよびグルコースを栄養源とする培地で種培養を行い、50L容培養槽に調製した本培養の培地に接種した。本培養の培地組成は、表４に示す４−Ａ，４−Ｂ，４−Ｃの3通りの糖組成で実施し、糖以外の共通の培地組成は、大豆粉4％、大豆油0.1％、KH2PO4 0.3%、Na2SO4 0.1%、CaCl2・2H2O 0.05%、MgCl2・6H2O 0.05%で培養した。尚、使用した糖化デンプンの還元糖／全糖比は30％であった。
10日間の培養を行った結果、培地４−Ａでは13.5ｇ/L、４−Ｂでは7g/L、４−Ｃでは13.3ｇ/Lのアラキドン酸生成量が各々得られた。この結果より、糖化デンプンを用いることによって、高濃度グルコースによる増殖阻害の回避と、流加回数低減による培養コストの低減が可能になる。
【００４０】
【表４】
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【００４１】
〔実施例５〕
ミード酸生産菌としてモルティエレラ・アルピナSAM1861（微工研条寄第3590号、FERM BP-3590）を、ジホモ−γ−リノレン酸生産菌としてモルティエレラ・アルピナSAM1860（微工研条寄第3589号、FERM BP-3589）を用いた。表５に示す３種類の培地50mLを500mL容フラスコに調製し、1×103個の胞子を接種して培養を開始した。24℃、100rpmの条件で7日間培養を行った。
【００４２】
【表５】
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【００４３】
可溶性デンプンを用いた培養では、ミード酸生産、ジホモ−γ−リノレン酸生産ともに低い生産量であったが、糖化デンプンを用いることによってグルコース培地と同等の高い生成量が得られた。
【００４４】
【発明の効果】
本発明において、モルティエレラ属微生物を培養する際に、培地炭素源として従来用いられていたグルコースよりも安価なデンプン等を用いるため、培地の原材料費を削減することができ、ひいては、高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造経費の削減が図れる。また、培地炭素源として糖化デンプンを用いることにより、培地の浸透圧上昇を抑制して対炭素源あたりの高度不飽和脂肪酸含有脂質の収率を増加させることできる。このように浸透圧の上昇を抑制することができるため、本発明では、培地炭素源としてグルコースを用いる場合とは異なり、必ずしも流加培養法を行う必要はなくなり、培養工程における設備、作業回数や作業時間を省略でき、ひいては、高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造コストを削減することができる。