(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程からなる正常白血球の分類計数と幼若白血球の分類計数を行う方法：
（１）幼若白血球を生きた状態に保持し、その他の白血球に損傷を与える溶血剤で血液学的試料を処理する；
（２）損傷を与えた前記白血球を、損傷を受けた細胞を染色できる蛍光色素で染色する；そして
（３）上記の工程で処理した血球の少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定し、その強度差によって幼若白血球及び正常白血球を検出し、全白血球数を計数し、幼若白血球を分類計数する。
【請求項２】
さらに正常白血球を少なくとも３つに分類計数する請求項１記載の方法。
【請求項３】
溶血剤が以下の成分：
（１）幼若白血球の細胞質及び細胞膜を固定化するためのポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤；
（２）血球の細胞膜に損傷を与え縮小化するための可溶化剤；
（３）幼若白血球の細胞質及び細胞膜を固定化するためのアミノ酸；および
（４）液のｐＨを5.0〜9.0、浸透圧を150〜600 mOsm/kgにする緩衝液、
を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光色素が以下の群から選ばれる請求項１〜３のいずれかに記載の方法：
（１）以下の式（Ｉ）の化合物：
【化１】
0004042925.tif 000008
（式中、Ｒ1は水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2及びＲ3は水素原子、低級アルキル基又は炭素数１〜６の低級アルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アセチル、プロピオニル基又は低級アルキル基；Ｒ5は水素原子、１〜３個の水酸基、ハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基で置換された炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ-はハロゲンイオン、ハロゲン化ホウ素イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、又はメチル硫酸イオンであり、前記低級アルキル基が炭素数１〜６の直鎖又は分枝のアルキル基である）；
（２）エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド；
（３）エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３。
【請求項５】
蛍光色素が以下の色素Ａ、色素Ｂまたは色素Ｃから選択される請求項４記載の方法。
【化２】
0004042925.tif 000009
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フローサイトメトリによる白血球の分類計数法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査の分野において、白血球の分類計数を行うことは、疾患の診断を行う上で極めて有用な情報を得ることができる。通常、正常な末梢血液中の白血球には、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、好中球の５つが存在するのみである。しかしながら、例えば種々の血液疾患では、骨髄球、骨髄芽球等の幼若白血球が出現してくる。これらの幼若白血球の出現を検出することは、疾患を診断する上で極めて重要である。
【０００３】
従来、この目的には、血液の塗抹標本を作製し適当な染色を施した後に顕微鏡で観察しながら分類計数することが一般的であった。一方、近年、フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動白血球分類計数装置が提供されている。しかしながら、これらの装置は正常な白血球を高精度に分類計数することができるが、上述の幼若白血球を確実に検出し分類することはできなかった。
【０００４】
近年、ＲＦ／ＤＣ測定原理を用いて幼若白血球の出現を高精度で検出する試薬及び方法が提供されている（特開平６−２７３４１３号）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記公報の方法は、特定の条件下では、正常白血球よりも幼若白血球の方が破壊されにくいという性質を利用して電気的に測定を行うものである。また、散乱光情報によって測定できることも示唆されている。しかし、この方法は、幼若白血球の検出のみを目的としており、幼若白血球の検出において優れた性能を有するが、幼若白血球の測定と同時に正常な白血球を分類計数することはできない。正常な白血球を分類計数するには、別途他の方法で行う必要がある。
【０００６】
特開平６−２０７９４２号には、白血球に標識物質が通過するだけの損傷を与えて血液を分析する方法が開示されているが、この方法は正常白血球にも幼若白血球にも同様の損傷を与えて分析する方法であり、幼若白血球と正常白血球の分離が必ずしも良くない。また、この方法で処理された幼若白血球は、標識物質として使用される色素に対して透過性であり、幼若白血球に損傷を与えない方法を開示してはいない。
【０００７】
本発明は、高精度で幼若白血球を測定すると同時に、正常白血球の分類並びに白血球計数を行うことができる方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の工程：
（１）幼若白血球を生きた状態に保持し、その他の白血球に損傷を与える溶血剤で血液学的試料を処理する；
（２）損傷を与えた前記白血球を、損傷を受けた細胞を染色できる蛍光色素で染色する；そして
（３）上記の工程で処理した血球の少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定し、その強度差によって白血球を分類計数する、
からなる幼若白血球の分類計数法を提供する。
【０００９】
本発明でいう白血球の損傷とは、通常、生きた白血球の細胞膜を通過しない色素の細胞膜透過を可能とする操作である。本発明では、正常白血球は損傷し、色素の透過を可能とし、一方幼若白血球は損傷せずに、つまり色素透過性のない状態にする。
【００１０】
通常の白血球細胞は、細胞内に不要の物質（例えば色素）を排除する物質排除機能を有している。
【００１１】
一方、特定の組成の溶血剤を細胞に作用させた場合、作用機序は明確ではないが、特定の細胞（例えば、正常白血球）の細胞膜脂質構成成分の一部を抽出（引き抜く）することにより、細胞膜に特定の物質が通過できるだけの細孔をあける。この結果、特定の細胞内に色素分子が入り込み染色することができる。一方、幼若白血球は、色素の透過を可能にするだけの細孔があけられないために（この状態を本発明中では生きた状態という）、色素で染色されない。なお、本発明でいう幼若白血球とは、通常骨髄に存在し、末梢血液に存在しない未成熟な細胞を指す。例えば、芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球をさす。前骨髄球、骨髄球、後骨髄球については、まとめて幼若顆粒球とすることもある。さらには、芽球以前の分化段階の細胞である、骨髄系幹細胞（CFU-GEMN）、好中球・マクロファージコロニー形成細胞（CFU-GM）、好酸球コロニー形成細胞（CFU-EOS）等の白血球系の造血前駆細胞も本発明の幼若白血球の範囲に含む。幼若白血球が染色されず、その他の白血球が染色されるようにするには下記の溶血剤と血液学的試料を混合することによって得られる。本発明でいう血液学的試料とは、主に末梢血液をさすが、この他にも、骨髄液、アフェレーシス等によって回収された血液成分を含む試料、又は腹腔液、尿試料等の白血球成分を含む生体試料も好適な試料である。
【００１２】
本発明で使用できる溶血剤としては、界面活性剤を含む水溶液が用いられ、さらには以下の構造式を有するポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤を含むものが好適に用いられる。特開平６−２７３４１３号に記載の溶血剤が好適である。前記公報に記載の溶血剤は、（１）幼若白血球の細胞質及び細胞膜を固定化するためのポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤；（２）血球の細胞膜に損傷を与え縮小化するための可溶化剤；（３）幼若白血球の細胞質及び細胞膜を固定化するためのアミノ酸；および（４）液のｐＨを5.0〜9.0、浸透圧を150〜600 mOsm/kgにする緩衝液、電気伝導度を6.0〜9.0 mS/cmにする緩衝液を含む。本発明では、光学的に測定を行うため、電気伝導度の影響はほとんどなく、従って電気伝導度については上記の範囲に限定されない。
【００１３】
前記ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤は、以下の構造式を有するものが使用できる：
【化２】
0004042925.tif 000002
【００１４】
特に、ポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルが好適である。
【００１５】
ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤の濃度については、使用するものによって異なるが、前述のポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテルでは、0.1〜2.0 g/l（好ましくは0.5〜1.5 g/l）、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルでは、1〜9 g/l（好ましくは3〜7 g/l）、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルでは、5〜50 g/l（好ましくは15〜35 g/l）の範囲で使用できる。ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤は、疎水性基の炭素数が同じであれば、ｎの数が小さくなるほど細胞を損傷する力が強く、ｎが大きくなるほど弱くなる。また、ｎの数が同じであれば、疎水性基の炭素数が小さくなるにつれて細胞を損傷する力が強くなる。その点を考慮し、上記の値を目安にして、必要な界面活性剤濃度は実験により簡単に求めることができる。
【００１６】
また、前記可溶化剤は以下のものから選ぶことができる：
【化３】
0004042925.tif 000003
【００１７】
可溶化剤の好ましい濃度は、サルコシン酸誘導体あるいはその塩では、0.2〜2.0 g/l、コール酸誘導体では、0.1〜0.5 g/l、メチルグルカンアミドでは、1.0〜8.0 g/lである。具体的には、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウロイルメチルβ−アラニンナトリウム、ラウロイルサルコシン、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、ＭＥＧＡ８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ９（ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ１０（デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）等が好適に使用できる。その他に、ｎ−オクチルβ−グルコシド、シュークロースモノカプレートやＮ−ホルミルメチルロイシルアラニン等が使用でき、その好ましい濃度は、0.01〜50.0 g/lである。
【００１８】
また、アミノ酸は、タンパク質を構成するアミノ酸を使用でき、グルタミン酸、バリンや、特にメチオニン、シスチン及びシステイン等のような含硫アミノ酸が好適であり、メチオニンが最も好適である。使用量は、1〜50 g/lの範囲で使用でき、グルタミン酸の場合は8〜12 g/lが好適であり、メチオニンの場合には、16〜24 g/lが好適である。
【００１９】
緩衝液は、ＨＥＰＥＳ等のＧｏｏｄ緩衝液やリン酸緩衝液等に水酸化ナトリウム等のｐＨ調整剤を加え、必要があれば、塩化ナトリウムのような浸透圧調整剤をさらに加え、ｐＨを5.0〜9.0、浸透圧を150〜600 mOsm/kgとするのが好ましい。
【００２０】
本発明で使用される色素は、損傷を与えた細胞又は幼若白血球のうちいずれか一方を染色できればよいが、好ましくは損傷を与えた細胞を染色できる色素である。損傷を与えた細胞を染色するための色素とは、生細胞に対する透過性が低い色素である。一般に生細胞は、細胞膜によって細胞外と区別されており、細胞膜は細胞が必要としない物質を透過させないように、物質選択的である。例えば、細胞膜透過性の低い色素の例としては、トリパンブルーが挙げられる。これらの色素は一般的に酸性官能基、例えばカルボキシル基、硫酸基等を有する酸性色素である。これらの色素は生細胞を染色せずに、細胞膜に損傷を受けた細胞を染色することができる。しかしながら、酸性色素は血小板等の白血球以外の成分を染色する傾向にあるため本発明に使用するには好適でない。本発明の目的を達成するには、白血球に特異的に存在する成分を染色する方が好適である。この染色対象としては、細胞核、特にＤＮＡに対して特異性を有する色素あるいはＲＮＡに特異性を有する色素が特に好適である。この目的には、いくつかのカチオン性色素が好適である。
【００２１】
一般的にカチオン性色素は、生きた細胞の細胞膜を通過し、細胞内構成成分を染色する。しかしながら、特定のカチオン性色素（例えば、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド等）は、生細胞を透過せず、損傷細胞のみを染色することがよく知られている。本発明の目的に使用できる色素は特に限定されるものではないが、具体例としては、先のエチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド、さらにモレキュラープローブ社より販売されているエチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 5th Edition 1992-1994: MOLECULAR PROBES, INC. 1992 に記載）等に加え、さらに、光源としてＨｅ−Ｎｅ、赤色半導体レーザを使用する場合に好適な色素として、以下の構造式（Ｉ）で示される色素が使用できることを見いだした：
【化４】
0004042925.tif 000004
（式中、Ｒ1は水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2及びＲ3は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基又は低級アルキル基；Ｒ5は水素原子、置換されていてもよい低級アルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基で置換された炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ-はアニオンである）。
【００２２】
式（Ｉ）のＲ1における低級アルキル基とは、炭素数１〜６の直鎖又は分枝のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒ−ブチル、ペンチル、ヘキシル基が挙げられ、中でもメチル基、エチル基が好ましい。
【００２３】
Ｒ2及びＲ3における低級アルキル基は上記と同様であり、低級アルコキシ基としては、炭素数１〜６のアルコキシを意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ等が挙げられ、中でもメトキシ基、エトキシ基が好ましい。なお，Ｒ2及びＲ3は水素原子であることがより好ましい。
【００２４】
Ｒ4におけるアシル基とは、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ましく、例えば、アセチル、プロピオニル等が挙げられ、中でもアセチル基が好ましい。また、低級アルキル基は上記と同様である。
【００２５】
Ｒ5における低級アルキル基は上記と同様であり、置換されていてもよい低級アルキル基とは、１〜３個の水酸基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）等で置換されていてもよい低級アルキル基を意味し、中でも１個の水酸基で置換されたメチル基、エチル基が好ましい。
【００２６】
Ｚにおける低級アルキル基とは上記と同様であり、Ｚとしては硫黄原子であることが好ましい。
【００２７】
Ｘ-におけるアニオンは、ハロゲンイオン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化ホウ素イオン（ＢＦ4-、ＢＣｌ4-、ＢＢｒ4-等）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環にハロゲンあるいはハロゲンをもつアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられる。中でも、臭素イオン又はＢＦ4-が好ましい。
【００２８】
上記式（Ｉ）の色素の具体的な例としては、以下の色素Ａ、色素Ｂおよび色素Ｃが好適である。これらの色素Ａ、色素Ｂ、色素Ｃについては、特開平９−１０４６８３号に詳細な合成方法が記載されている。
【化５】
0004042925.tif 000005
【００２９】
合成方法の一例を挙げると、式（Ｉ）においてｎ＝１の化合物は、例えば、式（II）
【化６】
0004042925.tif 000006
で表される化合物と、Ｎ，Ｎ−ジ置換ホルムアミジンとを反応させ、その生成物に式（III）
【化７】
0004042925.tif 000007
で表されるキノリン誘導体を反応させ、次いで、ホウフッ化ナトリウムと処理することにより得ることができる。
【００３０】
また、式（Ｉ）の化合物のうち、ｎ＝２の化合物は、上記反応で、Ｎ，Ｎ−ジ置換ホルムアミジンを用いる代わりに、例えば、マロンアルデヒド  ビス（フェニルイミン）塩を反応させることによって得ることができる。
【００３１】
また、前述のMOLECULAR PROBES, INC.のハンドブックにも幾つかの色素が記載されている。上述の色素は例示であって、これによって本発明が制限されるものではない。
【００３２】
測定用試料の作製には、上述の溶血剤と色素を含む溶液と血液試料を混合するだけでよい。あるいは、色素をエチレングリコール等の水溶性有機溶媒に溶解しておき、使用時に溶血剤と混合してもよい。このようにすることによって、色素の保存安定性を高めることができる。色素濃度は、使用する色素に応じて適宜決定でき、当業者は容易に実験的に求めることができる。例えば、エチジウムブロマイドの場合、0.01〜100 ppm、好ましくは0.1〜30 ppmが使用できる。
【００３３】
また、血液試料と、色素を含む溶血剤溶液との混合比は、１：１０〜１：１０００、反応温度は２０〜４０℃、反応時間５秒〜５分間で好適に実施できる。反応温度が高いときは反応時間を短くすることが望ましい。
【００３４】
作製した試料を測定するには、例えば図１に示すような構造のフローサイトメータが使用できる。市販のフローサイトメータ（例えば、ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトンディッキンソン社）が使用でき、特に改良の必要はない。光源は、使用する蛍光色素の励起波長に合わせて適宜選択することができる。
【００３５】
散乱光の検出は、前方散乱光（低角または高角）でも側方散乱光でも構わない。
【００３６】
本発明を以下の実施例によって説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。
【００３７】
【実施例】
実施例１
測定用試薬：
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル            24.0g/l
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム                   1.5g/l
ＤＬ−メチオニン                                      20.0g/l
ＨＥＰＥＳ                                            12.0g/l
１Ｎ−ＮａＯＨ                                         0.3g/l
ＮａＣｌ                                               4.0g/l
色素Ａ                                                 3.0mg/l
【００３８】
上述の試薬１ｍｌと血液３３μｌを混合し、１０秒後にフローサイトメータで側方散乱光、赤蛍光を測定した（光源：赤色半導体レーザー、波長：６３３ｎｍ）。
【００３９】
得られた結果を図２（Ａ〜Ｃ）に示す。Ａは正常な血液の測定結果、Ｂは幼若顆粒球の出現している血液、Ｃは幼若顆粒球、芽球の出現している検体の測定結果を示す。図中、Ｌｙｍｐｈはリンパ球、Ｍｏｎｏは単球、Ｇｒａｎは顆粒球、ＩＧは幼若顆粒球、Ｂｌａｓｔは芽球を示す。
【００４０】
図２のＡでは、白血球がリンパ球、単球、顆粒球に３分画されている。Ｂでは、正常の３分画に加えて、幼若顆粒球が分画される。Ｃでは、正常の３分画に加えて、幼若顆粒球と芽球が分画される。
【００４１】
次に、本発明の測定法による測定結果と従来法による測定結果を比較して相関分析を求めた。従来法は多項目自動血球分析装置（ＳＥ−９０００、東亜医用電子株式会社）で測定した。
【００４２】
得られた結果を図３（Ａ〜Ｄ）に示す。リンパ球（Ａ）、単球（Ｂ）および顆粒球（Ｃ）の割合、ならびに白血球の総数（ＷＢＣ：図３ではＤで示す）のいずれにおいても従来法と本発明の方法の結果に良好な相関が得られた。なお、ＳＥ−９０００の顆粒球は、ＮＥＵＴ（好中球）＋ＥＯ（好酸球）＋ＢＡ（好塩基球）で求めた。
【００４３】
実施例２
実施例１と同じ試薬を用いて、Ｇ−ＣＳＦ投与後の造血前駆細胞の出現した検体をフローサイトメータで側方散乱光と赤蛍光を測定した。結果を図４に示す。幼若白血球の領域である蛍光強度の低い領域に細胞集団が認められた。
【００４４】
また、造血前駆細胞がＣＤ３４陽性である性質を利用して、造血前駆細胞を分離して測定を行った。まず、血液成分分析装置により単核球に富む試料を調製し、次に、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（Becton Dickinson Immunocytometry System Co., Ltd.社製）を結合させた磁気ビーズ（DynabeadsTM; DYNALとして市販されている）と反応させ、次いで磁気細胞分離器（IsolexTM; Baxter Co., Ltd.）を用いてＣＤ３４陽性の造血前駆細胞を分離した。次に、酵素（キモパパイン）処理を行ってＣＤ３４陽性細胞を磁気ビーズから分離した。
【００４５】
このようにして調製した試料を同じ試薬を用いて、フローサイトメータで側方散乱光と赤蛍光を測定した。結果を図５に示す。同様に幼若白血球の領域である蛍光強度の低い領域に細胞集団が認められた。
【００４６】
【発明の効果】
本発明によれば、溶血剤による処理に加え、さらに損傷細胞を染色できる色素で染色し、散乱光と蛍光とを組み合わせて測定することにより、従来法では不可能であった正常白血球の分類計数と幼若白血球の分類計数が同時に可能になり、ならびに白血球数計数が一つの系で可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法に使用できるフローサイトメータの概略図を示す。
【図２】本発明の方法を用いて測定した結果を示す。Ａは正常な血液の測定血液、Ｂは幼若顆粒球の出現している血液、Ｃは幼若顆粒球、芽球の出現している検体の測定結果である。
【図３】本発明の測定法による測定結果と従来法による測定結果を比較して相関分析結果を示す。
【図４】Ｇ−ＣＳＦ投与後の造血前駆細胞の出現した検体を本発明の方法を用いて測定した結果を示す。
【図５】ＣＤ３４陽性の造血前駆細胞を分離した後、本発明の方法を用いて測定した結果を示す。
【図１】
0004042925.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
0004042925.tif 000013
【図５】
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