(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号3のアミノ配列の402位のグルタミン酸残基がリジン残基に置換された配列を含むFMO2タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
a)配列番号1のヌクレオチド配列の2001位〜2056位のヌクレオチド配列、
b)配列番号1のヌクレオチド配列の2405位〜2542位のヌクレオチド配列、
c)配列番号1のヌクレオチド配列の10026位〜10214位のヌクレオチド配列、
d)配列番号1のヌクレオチド配列の13341位〜13503位のヌクレオチド配列、
e)配列番号1のヌクレオチド配列の16036位〜16178位のヌクレオチド配列、
f)配列番号1のヌクレオチド配列の20558位〜20757位のヌクレオチド配列、
g)配列番号1のヌクレオチド配列の21972位〜22327位のヌクレオチド配列、
h)24431位のグアニンがアデニンに置換された配列番号1の24411位〜24483位のヌクレオチド配列、
i)配列番号1のヌクレオチド配列の25487位〜25899位のヌクレオチド配列、
j)24431位のグアニンがアデニンに置換された配列番号1のヌクレオチド配列、
k)1266位のグアニンがアデニンに置換された配列番号2のヌクレオチド配列、
から選択される配列を含んでなり、402位のグルタミン酸残基がリジンに置換された配列番号3のアミノ酸配列からなるFMO2タンパク質の変異体をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
402位のグルタミン酸残基がリジン残基に置換された配列番号3の配列からなるポリペプチドをコードする配列、又は、請求項１若しくは２に記載の配列に相補的な配列から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号7〜10のいずれかから選択される配列からなるプライマー。
【請求項５】
配列番号11〜14のいずれかから選択される配列からなるプローブ。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項７】
402位のグルタミン酸残基がリジン残基に置換された配列番号3のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含み、適当な宿主細胞でのヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクター。
【請求項９】
上記宿主細胞における上記配列の発現及び／又は分泌を可能とする構成要素を含む請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
自己複製可能ベクターである、請求項８又は９に記載のベクター。
【請求項１１】
染色体組込みベクターである、請求項８又は９に記載のベクター。
【請求項１２】
ウイルスベクターである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
アデノウイルス、AAV、レトロウイルス、ポックスウイルス、又はヘルペスウイルスに基づき構築される、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項１５】
原核細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
真核細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載の細胞を有するヒト以外の動物。
【請求項１８】
請求項６又は７のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法であって、
請求項１４〜１６のいずれかの細胞を培養し、上記細胞によって産生されたタンパク質を回収する方法。
【請求項１９】
変異FMO2活性に直接又は間接的に関与する生成物のインヴィトロでの選択における、請求項１４〜１６のいずれかに記載の細胞、又は請求項１７に記載の動物の使用。
【請求項２０】
変異FMO2と相互作用する生成物のインヴィトロでの選択における、請求項１４〜１６のいずれかに記載の細胞、又は請求項１７の動物の使用。
【請求項２１】
患者における若年性緑内障の素因を検出する方法であり、
上記患者から採取した生物学的サンプルについて、上記遺伝子に関連する核酸配列の全て又は一部の解析を行うことで、FMO2遺伝子における配列番号1の24431位のグアニンのアデニンへの変異の存在を確認し、
少なくとも１つの上記変異の存在が、上記患者の若年性緑内障の素因の存在の指標となる方法。
【請求項２２】
解析される上記核酸配列がゲノムDNA、cDNA、又はmRNAである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記解析はハイブリダイゼーションによって実行される請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
対応する天然の非変異配列との比較により上記変異の存在を検出する請求項２１〜２３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
対立遺伝子に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて上記ハイブリダイゼーションを行う、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
上記解析は、配列決定によって実行される請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２７】
上記解析は電気泳動による分離、SSCP、又はDGGEによって実行される請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２８】
変異の検出に先立って、変異FMO2遺伝子の核酸配列の全て又は一部を増幅する、請求項２１〜２７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
上記増幅は、PCRによって、又はNASBA、TAS、LCR、ERA、CPR、又はSDAのいずれかから選択される方法によって実行される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
上記増幅の実行のために選択されるプライマーが、請求項4に記載のプライマーから選択される、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
生物学的サンプルにおいてFMO2遺伝子における配列番号1の24431位のグアニンのアデニンへの置換を検出及び／又は同定するための試薬であって、
キャプチャープローブ及び／又は検出プローブを含み、これらプローブの少なくとも一方は請求項５に記載の配列を含む試薬。
【発明の詳細な説明】
本発明は、特にヒトフラビンモノオキシゲナーゼ2(hFMO2)、および別のヒトFMOファミリー酵素、すなわちhFMOx、ならびにそれらのヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、該ヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクター、およびこれらベクターで形質転換された細胞、ならびに該ポリペプチドを調製する方法に関する。本発明はまた、化合物を選択する方法、およびFMOに関連した病状および／または欠乏症の疾病素因を診断する方法、ならびにヒトで同定されている該化合物(それぞれGeneBank配列M64082、M83772、Z11737およびL37080)を含んでなる医薬組成物を包含する。
フラビンモノオキシゲナーゼ(FMO)(Lawton et al., 1994)は、特に窒素、硫黄リンまたはセレニウム原子などの求核ヘテロ原子を有する多くの外因性有機化合物（生体異物）（この生体異物が薬剤であれ、農薬であれ、また他の毒性の可能性がある物質であれ）のNADHに依存する酸化を触媒するミクロソーム酵素のファミリーをなす(Ziegler D.M., 1988; Ziegler D.M., 1993)。システアミンは、現在唯一公知の内生するFMO基質である。
FMOは多重遺伝子ファミリーを示し、種々の形態のFMO発現は、検討中の組織および種の双方に依存する。
FMOは種々のタイプの組織、特に肝臓、肺および腎臓で局在することが確認されている。
これまでに、参照種、すなわちウサギにおいてFMOの５つのイソ型が確認されている。これらの相同性は50〜60%である。ヒトではこれらのうち４つのイソ型、すなわちFMO1、FMO3、FMO4およびFMO5が確認されている（それぞれ、GeneBank配列M64082、M83772、Z11737およびL37080)。哺乳類の種のうち、オーソロガスFMO間の相同性は80%より大きい。他のイソ型ではそうは言えないまでも、FMO2がヒトに存在すると仮定することは理に適っている。
FMOは小胞体と会合しており、生体異物をより極性の高い物質へと変換することができるモノオキシゲナーゼにより生体異物化合物を解毒することに関与し、この変換はその排出に先立つ予備工程である。またFMOは、環境中に存在する種々の有毒化合物および／または発癌性化合物の代謝の活性化に関与するものと考えられる。
FMOの反応のメカニズムは詳細に記載されている(Poulsen, L.L. et al., 1995)。他の総ての既知オキシダーゼまたはモノオキシゲナーゼと比較して、FMOは酸化可能な基質の不在下で、NADP(H)と酸素依存性酵素の安定な中間生成物、すなわち4α-ヒドロペルオキシフラビンを生成するという独特の特性を有する。触媒作用のエネルギーはその潜在基質との接触前のFMO酵素にすでに存在しているので、基質が適切であるかどうかは他種の酵素の場合ほど厳密でなくともよい。このFMOの特異的な特徴が、広範な基質（例えば、第三および第二アルキルアミン類およびアリールアミン類、多くのヒドラジン類、チオカルバミド類、チオアミド類、硫化物類、二硫化物類ならびにチオール類を含む）がFMOにより許容されることの理由である。
薬剤の活性化合物である多くの分子がN酸化またはS酸化のいずれかに関するFMOの基質であることが認識されており(gasser, 1996)、これらの分子は特に、抗鬱薬、神経弛緩薬、抗潰瘍薬、血管拡張神経薬および抗高血圧薬を含む。
FMO基質には活性の低い誘導体へと酸化されるものもあるが、多くの求核化合物は排出されるよりもむしろ、より反応性のある、かつ／または有毒である可能性があるの中間生成物へと代謝され、このような生成物は細胞内の高分子と共有結合することによって、または他のメカニズムによって毒性応答を引き起こし得る。例えば、主にメルカプトピリミジン類およびチオカルバミド類がFMO活性により活性化され得る(Hines et al., 1994)。さらに厳密には、アクロレインのグルタチオン結合に関与する腎毒性が腎臓のFMOが介在するその代謝に関連していることが証明されており；FMOは硫黄酸化物を形成し、これは次いで細胞傷害性アクロレインの形態において塩基性培地で触媒される排出反応により放出される(Park, S.B. et al., 1992)。このようにFMOは、化学物質毒性の最初の工程および生体異物化合物の解毒の双方において重要な役割を果たし得る。
前記のように、現在臨床試験の段階にある、そうでなければ広く処方されている多くの薬剤には窒素、硫黄、リンまたは他種の求核官能基が含まれている。しかしながら、ヒトにおける薬剤および外生化学化合物の酸化代謝におけるFMOの役割は十分には理解されていない。
Cashman et al. (1996)は最近、シメチジンおよびS-ニコチンのin vivoでの生理代謝におけるFMO酵素の寄与についての研究を行った。それらの結果の大部分は成人肝臓のFMO3活性がシメチジンおよびS-ニコチンの酸素化にあずかり、この酸素化が立体特異的であることを確かにするものである。さらに筆者らは、実験小動物におけるシメチジンおよびS-ニコチンの主要な代謝物の立体化学がヒトで観察されたものとは異なることを実証し、そして種によりFMOの種々のイソ型が優勢となり得ることを示唆し、このことはヒトの薬剤を合成および開発するプログラムのための実験動物の選択に関しておそらく重要な結果を有する。
FMO1はヒトにおいて腎臓では発現するが肝臓では発現しないことが知られている。FMO2は、試験した哺乳類種の総てで主に肺で発現する。ヒトにおいて、FMO3は肝臓から単離され、そこではそれは成人において優勢であった。FMO3は、メチオニンのスルホキシ化、ならびにシメチジンおよびS-ニコチンの立体特異的酸素化に関与する主要なイソ型である。FMO3は、研究されたほとんどの動物種の肝臓に認められるFMO1酵素により示されたものより大きな基質特異性を示す。FMO4は少ないイソ型であり、その機能および基質特異性はよく知られていない。それはヒト肝臓に存在し、また脳でも発現し、そこでそれはイミプラミンのような抗鬱薬の酸化に関与するものと考えられる。FMO5はヒト肝臓においてFMO3よりも低い程度で発現する。薬剤の代謝に関与する酵素としてのその見かけ上の効力の欠如は、それが生理学上の機能に関与している可能性のあることを示唆するしている。
従って、組織および／または種によって異なるFMOイソ型の発現プロフィールは、おそらく組織間でおよび／または種間で見られるFMO活性における差異に寄与する重要な因子を構成している。このように、FMOの種々の形態は、生体異物化合物への曝露に対する組織および／または種の応答における違いに対して重要な影響力を持つ可能性がある。これは、組織および／または種間で認められる生体異物化合物に対する応答における、またこれらの化合物の毒性における違いが、重要な程度で、FMOによるこれら基質の代謝に関与する活性および特異性におけるバリエーションに関連しているためである。FMOの発現における遺伝因子および組織特異性はこれらのバリエーションにおける重要な因子である。
遺伝因子に関しては、例えば、白人イギリス人被験者の1%に存在し、呼気、汗または尿における強い魚の腐敗臭で示される症状のトリメチルアミン尿症は、肝臓のFMOの機能における遺伝的起源の欠損と関連することが報告されている。
従って現在のところ、前記した理由のため、FMOの新たなイソ型、ならびにそれらに関与し、それらの基質および／またはそれらの組織発現プロフィールに関して特異性を示し、薬剤代謝物のような生体異物、または例えば農薬など環境中に存在する外生物質の代謝に関与し、そうでなければ生理作用に関与すると考えられる遺伝子の多形性を同定する重要な必要性が存在する。正確にはこれが本発明の目的である。
ヒトFMOファミリーのいくつかの遺伝子は、中期染色体のin situハイブリダイゼーションにより、第1染色体のlq23-25領域上に位置決定されている。
このような候補領域がひとたび定義されると、必要とされている遺伝子が位置する間隔にわたるゲノム断片を得る手段を持つ必要がある。この工程は物理的地図の作成、すなわちクローン化され、調整された断片セットで領域をカバーすることを通じて行う。現在、CEPH/Genethonにより統合されたヒトゲノム地図のおかげで、およそ80%のゲノムが、その染色体上の位置が、遺伝学的に調整された多形性のマーカーによって決定されたBACへサブクローニングされたYACクローンによりカバーされている(Chumakov et al., 1995)。物理遺伝学的地図により、特に注目する領域の徹底的な配列決定を用いることによる相当な長さの時間を節約することが可能となる。
このように本発明によれば、前記した遺伝子座lq24-25上でBAC 123H04Mを位置決定した後、それが担持する挿入配列がhFMO3の3'部分およびhFMO1の5'部分、ならびにhFMO2の完全な配列およびFMOファミリーのメンバーである別の新たな遺伝子のそれ、すなわちhFMOxを含むということが立証される。
さらに、5'標識ライブラリーを使用する結果として、前記のように同定された候補遺伝子の発現を変更することが可能になり、その候補配列の１つとハイブリダイズする標識の同定により、この配列はｃＤＮＡライブラリーから誘導されているので、考慮中の組織における問題の配列のｍＲＮＡの存在、ひいては発現を示す。
このような理由により、本発明は特に、その配列、すなわち配列番号1が図2に部分的に示されており、図1で示されている配列番号3の配列を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
本発明はまた、その配列、すなわち配列番号4が図10に部分的に示されており、配列番号6の配列を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
これら２つのヌクレオチド配列は、新規なヒト・フラビンモノオキシゲナーゼ(FMO)ファミリーの酵素、すなわちそれぞれhFMO2およびhFMOxをコードする２つの遺伝子のものである。このことは、同定された配列とこれまでに知られているFMO配列とを比較することにより立証され、研究された２つの配列とFMOのそれとの間の非常に強固な構造一致、第１の配列と既知のFMO2、特にマカクFMO2（マカクFMO2: GeneBank配列U59453）との間の非常に強固な一致、ならびに第２の配列が、ヒトにおいてすでに挙げられているいずれかのFMOとは十分には一致していないことによりこのように結論づけることができる。
本発明のhFMO2ヌクレオチド配列においては、FMOファミリーの既知の遺伝子のエキソン構造は完全にカバーされている。本発明のポリヌクレオチドの9個のエキソンの各々の配列（図3）は、それに対応するマカクFMO2のメッセンジャーＲＮＡ配列（図4）と95%〜98%の様々な程度でのＤＮＡ一致を示す。この２つのヌクレオチド配列間の発散、ならびにペプチド配列に対するそれらの有意性は図5に示されている。本発明の配列番号1のポリヌクレオチド配列は、配列番号3（図1）の配列を有する535個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードしており、推定されるメッセンジャーＲＮＡである配列番号2の配列、ならびにヒトタンパク質のポリペプチド配列はマカクFMO2のそれと97%の一致を示し（図6および7）、これにより本発明のポリペプチドをヒトFMO2であると同定することができる。図1に示されているような配列番号3の配列番号を有するポリペプチドはまた、他の哺乳類のフラビンモノオキシゲナーゼ2と高い程度の一致を示し、フラビンモノオキシゲナーゼファミリーの他のタンパク質との一致の程度はより低い。
前記のように、hFMOxに相当する配列、すなわちゲノム配列（配列番号4）、メッセンジャーＲＮＡ配列（配列番号5）およびペプチド配列（配列番号6）と既知のFMOの配列との間に十分な一致がないことにより、hFMOxは新規なFMOのイソ型であるという結論を引き出すことができた。
従って本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に関するものであり、このＤＮＡはFMO、特にhFMO2およびhFMOxのゲノムＤＮＡ、相補ＤＮＡまたは合成ＤＮＡ、ならびにこれ対応するタンパク質であってよい。
さらに本発明は、該ヌクレオチド配列を含むクローニングベクターおよび／または発現ベクター、これらのベクターで形質転換した細胞または該細胞を含む動物、ならびに該ポリペプチドを組換えポリペプチドの形態で調製する方法に関する。
本発明はまた、FMO活性を調整することができる化合物を選択する方法を包含する。
本発明はまた、FMO関連疾患に対する疾病素因を診断する方法、ならびにこれらの疾患を治療および／または予防することを意図した医薬組成物に関する。
このような疾患の第１の例は原発性開放隅角緑内障(POAG)であり得る。このように、一方で、Sunden et al., (1996)、ならびに発明者ら(Belmouden et al., 1996)は、他の遺伝子配列のうち、若年性POAG(J-POAG)の発症に関連するlq23-25におけるFMOファミリーの既知配列を担持する染色体領域GLCIAを同定した。他方、緑内障の病因におけるモノオキシゲナーゼの可能性ある役割がこれまでに示唆されている(Schwartzman et al., 1987)。このように、角膜におけるNa+、K+、ATPアーゼ活性を阻害することにより、酸化反応代謝物が角膜の透明度および眼の体液分泌の調節に寄与し得ることが示唆されており、角膜の不透明性および高眼圧が緑内障を診断するための２つの主要な基準となることに気付くはずである。
かくして、発明者らは、本発明のhFMO2ポリペプチドのエキソン8において、J-POAGで損傷を受けている多くのメンバーのそこにおける存在に関して研究された家族ー内で遺伝子型の分離を示す異型接合の部位を同定した。
適切に選択した集団中に存在し、BAC 123H04M挿入配列により、またはより一般的にはFMO配列により担持されているものに対応する配列中に位置する多形性を探すことにより、特にFMOの改変に関連した病状または疾患に関与する突然変異を同定することができるであろう。
種々のFMOイソ型は、その形質転換をそれらが触媒する基質によるよりも、それらの発現の組織特異性による方が互いに区別しにくいように思われる。これまでに指摘したように、FMOは肝臓、肺、腎臓および脳で発現することが示されている。
FMOの機能欠損の病理学上の影響としては、それが発現する組織の酸化ストレスに耐える能力を低下させることとなる。
さらに一般的には、酸化代謝におけるそれらの役割およびそれらの解毒作用の結果、FMOが、証明されている、または解明過程にある退化的または有害ないずれの病状、特にプログラムされた細胞死が起こることが示されている病状、および中枢神経系の退化的疾病に関与し得る。
一般には、FMO作用に関連する病状は「FMO関連疾患」という名称で分類されている。
例として記載し得るFMO関連疾患には、それらの疾患に限定されるものではないが、
FMO基質である薬剤のより活性の低い誘導体の形態への酸化、これは該薬剤の効力が低下することを意味する；
代謝形態で活性がある薬剤を代謝させないようにすること；該薬剤の効力を低下させること；
植物アルカロイドなどの食物中に自然に存在する外生物質、または殺虫剤や除草剤など環境中に存在する有毒物質をはじめとする毒性および／または発癌性生体異物を代謝させないようにすること；
薬剤の、より反応性があると考えられる中間生成物の形態への代謝、これは副作用の可能性を伴う過剰投与を意味する；
薬剤または他の外生物質を含む生体異物の、毒性を持つ可能性がある中間生成物形態への代謝；および／または
FMOが関与する生理作用の改変；特にFMO作用の改変は緑内障の総合的症状に関与する可能性がある
がある。
「FMO」とは、公知のヒトFMOのいずれも、すなわちFMO1、FMO3、FMO4およびFMO5を、または本特許出願に新たに記載されるヒトFMO、すなわちFMO2またはFMOxをいうと理解されよう。
これらの疾患のうちいくつかは多遺伝子起源を有してもよいが、その総てに、１以上のFMOに対する改変がその疾患の発症または悪化に寄与していることが当てはまる。
ヌクレオチド配列
本発明は第１に、
a)ヒトFMO2またはFMOxタンパク質およびそれらタンパク質の変異体をコードする配列、
b)少なくとも10塩基を有するこれらタンパク質の断片をコードする配列、
c)ヒトFMO2またはFMOxゲノム配列およびそれらの対立遺伝子、
d)配列(a)および(c)と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%の一致を示す配列、
e)少なくとも10塩基を有する配列(c)または(d)の断片、
f)(a)〜(e)の配列とハイブリダイズする配列
から選択されることを特徴とする単離ヌクレオチド配列に関する。
本発明は、それらの自然の染色体環境、すなわちそれらの自然状態におけるゲノムヌクレオチド配列に関するものではないと理解されるべきであり、本発明は単離された、すなわち、例えば複製(ｃＤＮＡ)をマーキングすることにより直接的または間接的に抽出された配列に関するものであって、それらの環境は少なくとも部分的に修飾されている。
従って本発明が関与する配列は、部分的に修飾された、または自然状態でそれらを持つ配列とは少なくとも部分的に異なる配列により担持されているゲノムＤＮＡとまさに同じｃＤＮＡであってよい。
これらの配列はまた、「非天然」であると記載することもできる。
「核酸配列」とは、修飾または修飾されていないヌクレオチドの正確な配列を示す天然、単離または合成ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片と理解され、この配列により核酸の断片、セグメントまたは領域を定義することが可能となる。
「対立遺伝子」とは、ヒトに存在する多形性に相当する変異した天然配列をいい、特にFMO関連疾患の発症をもたらし得るものと理解される。
「タンパク質変異体」とは、ヒトに存在し、特にアミノ酸残基の先端切断、置換、欠失および／または付加に相当する変異タンパク質の総て、ならびにこれもやはり「タンパク質変異体」と呼ばれる人工変異体をいうものと理解される。この場合、これら変異体はFMO関連疾患の発症に部分的に関連する。
本発明によれば、核酸配列断片は特に、タンパク質ドメインをコードし、そうでなければ検出、同定または増幅法におけるプローブとして、またはプライマーとして使用される。これらの断片は少なくとも10塩基のサイズであり、20塩基、好ましくは30塩基を含む断片とすれば好ましい。
本発明によれば、相同とは単に統計的なものであり、それは、それらのヌクレオチドの少なくとも80%、好ましくは90%を共通して持つ配列を意味するものである。
(f)配列に関する限り、ハイブリダイゼーション条件は、本発明によれば少なくとも95%の一致を確実なものとする。
さらに明示すれば、本発明は
a)配列番号3の配列または配列番号6の配列のアミノ酸を含んでなるポリペプチドをコードする配列、
b)配列番号1もしくは2の核酸配列、すなわち図2および1に示された核酸配列、または配列番号4もしくは5の核酸配列、すなわち図10に示された核酸配列、またはこれに対応するポリペプチドをコードする核酸配列、
c)少なくとも10塩基を含む(a)または(b)の配列の断片、
d)配列(a)、(b)または(c)と比較したとき、少なくとも１つの点突然変異を含む配列、
e)配列(a)、(b)、(c)または(d)に相補的な配列
から選択されるヌクレオチド配列に関する。
図1は配列番号3の配列を示し、図2はFMO2の配列番号1の配列を部分的に示し、一方、図10は、いずれの目に見えるFMO疾患も呈していない個体由来のゲノム上で配列決定した場合の、FMOxの配列番号4の配列を部分的に示している。
hFMO2遺伝子の構造は図3で確認される。
FMOxの配列番号4の配列は、図10に部分的に示されている。
(a)、(b)、(c)、(d)および(e)について明示した注解に関する限り、前記の注解が当てはまる。
本発明はまた、これらの配列の断片、特にFMOタンパク質の活性の総てまたは一部を保持したポリペプチドをコードする配列に関する。
これらの配列のうちいくつかは特に図3を参照することにより同定してもよく、それはhFMO2の編成の全体像を提供するものである。
これらの部分配列は以下に示すような多くの適用に、特にFMOタイプの、または異なるタイプのタンパク質構築体を作製するためだけでなく、例えばFMO様タンパク質を作製するためにも使用できる。
記載されている配列が一般に正常な配列であったとしても、本発明はまた、少なくとも１つの点突然変異、好ましくはその分子の10%を超えない程度の突然変異を含む程度に変異した配列に関する。
好ましくは本発明は、点突然変異がサイレントである、すなわち正常配列に比べ、コードされたアミノ酸配列において変異をもたらす変異型ヌクレオチド配列に関する。なおさらに好ましくは、これらの突然変異は、FMOタンパク質、または特に触媒部位、調節部位または補因子結合部位に相当する領域における相当するこれらタンパク質の断片の構造をなすアミノ酸に関するものであり、この突然変異はまた、輸送および標的化に関与する配列にも関し、それらはまた、特にシステインを欠失していてもよく、一方では荷電に関するかまたは疎水性に関するタンパク質の特性を変化されることも明らかになっている。
本発明はまた、ヒトFMO遺伝子のプロモーターおよび／または調節配列に生じ得る突然変異に関し、その突然変異は例えばの発現に対して、特にはそれが発現するレベルに対して効果を発揮し得る。
一般には、本発明は正常型FMOタンパク質と変異型FMOタンパク質の双方、ならびにそれらの断片およびそれに対応するＤＮＡおよびＲＮＡ配列に関する。
特に診断のために注目され得るヌクレオチド断片のうち、FMO遺伝子のゲノムイントロン配列、例えばイントロンとエキソンの間の連結配列も記載すべきであろう。
本発明は、以下の実施例で定義されるように、少なくとも突然変異G.1263mac.Aを含んでなることを特徴とする本発明のヌクレオチド配列を包含する。
本発明はまた、少なくとも10塩基を含有することを特徴とする本発明のヌクレオチド配列、ならびに特に対立遺伝子に特異的なプライマーとして使用できるヌクレオチド配列を包含する。
本発明はまた、特に核酸プライマーとして使用でき、好ましくは配列が配列番号7、配列番号8、配列番号9および配列番号10の配列から選択されることを特徴とする本発明のヌクレオチド配列を包含する。
本発明はさらに、特に対立遺伝子に特異的なプローブとして使用でき、好ましくは配列が配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14の配列から選択されることを特徴とする本発明のヌクレオチド配列に関する。
本発明はまた、配列がFMOドメインの１つをコードすることを特徴とする本発明のヌクレオチド配列に関する。
本発明のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、特に配列番号3または配列番号6の配列を有するポリペプチドも本質的に本発明に属する。
本記載においては、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドという用語は互換的である。
本発明は、前記ヌクレオチド配列から推定可能な、またPCR法などの増幅法を使用することによりこれら配列の検出が可能な総てのプライマーに関する。
本発明はまた、非天然ヌクレオチドを含み得るヌクレオチド配列、特に硫黄含有ヌクレオチド、またはαもしくはβ構造を有するヌクレオチドに関する。
最後に本発明は本質的に、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列の双方、ならびにそれらとハイブリダイズする配列、およびそれに対応する二本鎖ＤＮＡ分子に関する。
特に記載すべき注目のヌクレオチド配列はアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち標的配列とのハイブリダイゼーションによりその構造が確実なものとなり、それに対応する生成物の発現が阻害されるオリゴヌクレオチドである。対応する生成物の発現の調節に関与するタンパク質と相互作用することにより、その発現の阻害または活性化のいずれかを誘導するセンスオリゴヌクレオチドを記載する必要もある。
以下に記載するように、いくつかの適用のためには、タンパク質／ＤＮＡ／化学化合物、構築体の混合、特に例えばインターカレート剤の使用を考える必要があると思われ、このような化合物が本発明の配列を含有する場合には、本特許により包含されると理解すべきである。
タンパク質およびポリペプチド
本発明はまた、前記の配列に相当し、かつ、非天然形態で存在するペプチド、すなわちそれらの自然環境下では使用されないが天然の供給源からの精製によって得られたか、そうでなければ以下に記載するような遺伝子組換えによって得られたタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに関する。
本発明はまた、化学合成によって得られ、かつ、非天然アミノ酸を含み得る同ポリペプチドまたはタンパク質に関する。
本発明は、このようにグリコシル化形態および非グリコシル化形態の双方で得られ、かつ、天然の三次元構造を有していても、また有していなくともよい組換えタンパク質に関する。
ベクターおよび細胞
本発明はまた、前記のようなヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターに関する。
これらのクローニングおよび発現ベクターは、宿主細胞内でその配列を確実に発現させる構成要素、特にはその細胞内で有効なプロモーター配列および調節配列を含み得る。
問題のベクターは自己複製ベクターであってもよいし、そうでなければその配列が宿主細胞の染色体に確実に組み込まれることが意図されたベクターであってもよい。
宿主細胞により原核細胞または真核細胞である自己複製系の場合、好ましくはプラスミド系またはウイルス系が使用され、ウイルスベクターは特にアデノウイルス(Perricaudet et al., 1992)、レトロウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルス(Epstein et al., 1992)であってよい。当業者ならばこれらウイルスの各々について使用できる技術をよく知っている。
このように、相補する細胞内で培養した欠陥ウイルスをベクターとして使用し、それにより感染性のあるウイルスベクターの増殖の危険性を回避されることが知られている。
宿主細胞の染色体へ配列を組み込むことが望ましい場合は、組換えが確実に起こるよう、ヌクレオチド配列の各々の末端に、組み込まれる宿主細胞由来の１以上の配列を配置する必要がある。この場合に使用される方法も先行技術に広く記載されている。例えば、プラスミドまたはウイルス系が使用でき、これらウイルスの例としてレトロウイルス(Temin 1986)またはAAV、すなわちアデノ随伴ウイルス(Carter 1993)がある。
本発明はまた、前記のベクターで形質転換した原核または真核細胞に関し、この形質転換は天然型または変異型FMOタンパク質、またはそうでなければ例えばそのドメインの１つを確実に発現するものである。
本発明の形質転換細胞を含むことを特徴とする動物も本発明に属する。
さらに本発明は、本発明のポリペプチドを生産する方法であって、本発明の細胞を培養し、そこで産生されるタンパク質を回収することを特徴とする方法を包含する。
前記で指摘したように、本発明はまた、このようにして形質転換した細胞を培養し、次いで発現したポリペプチドを回収することにより得られるポリペプチドに関し、その回収は細胞内、またはベクターが、例えばリーダー配列によってポリペプチドが確実に分泌するよう設計されている場合には細胞外の培地中で達成でき、そのタンパク質はプレタンパク質またはプレプロタンパク質の形態で発現する。ポリペプチドの分泌を可能にする構造は、原核細胞系および真核細胞系の双方に関して公知である。本発明の記載の範囲内で、FMOポリペプチドのいくつかは分泌または膜挿入のためのそれら固有の系を含んでもよい。
好ましくは本発明は、配列が少なくとも１つの突然変異を含むポリペプチド配列から選択されることを特徴とする、本発明のタンパク質の変異形態に特異的なポリペプチドに関する。
これらのポリペプチドを生産するために使用できる、記載すべき細胞としては、細菌細胞(Olins and Lee, 1993)はもちろんのこと、酵母細胞(Buckholz, 1993)、ならびに動物細胞、特には培養哺乳類細胞(Edwards and Aruffo, 1993)、例えばバキュロウイルスを利用する方法(Luckow, 1993)を使用できる昆虫細胞もある。
このようにして得られた細胞を用いて天然型または変異型FMOポリペプチドの双方、およびこれらポリペプチドの断片、特に問題の種々のドメインに対応するポリペプチドを調製することができる。
本発明はまた、好ましくは本発明のポリペプチドに対して向けられるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を包含し、これら抗体は、ヒトまたは動物の器官と本発明のポリペプチドからなる免疫原物質、特に本発明の組換えまたは合成ポリペプチドとの免疫反応によって得られることを特徴とし、この免疫原物質は好ましくは、前記の方法に従って得られる変異型タンパク質に特異的なポリペプチドからなると考えられ、該ポリペプチドの配列は少なくとも１つの突然変異を含むポリペプチド配列から選択される。
本発明はまた、特に画像形成用の標識抗体であることを特徴とする、本発明の抗体に関する。
標識され、特に変異型タンパク質の総てまたは一部に対応するこれらモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、例えば、細菌サンプルについてin vivoまたはex vivoにおける画像形成剤として使用できる（例えば、PETスキャンタイプの画像形成で検出可能な分子と結合させた抗体を用いる画像形成)。
細胞モデル
前記のような形質転換細胞はまた、FMOとそれらの相手、すなわちFMO活性に直接的または間接的に関与する化学化合物およびタンパク質化合物との間の相互作用を研究するため、またFMOが正常型FMOであるか変異型FMOであるかによって関与する種々の相互作用を研究するためのモデルとしても使用できる。しかしながら、特にそれは、アゴニスト、特に酵素アクチベーター、またはアンタゴニスト、特に酵素インヒビターとしての正常型または変異型FMOと相互作用する生成物を選択するために使用できる。
従って、これらの遺伝子の特性のもう１つの適用の可能性は、化合物、特にこれらFMOと反応するタンパク質化合物を同定できるということである。これらの化合物はインヒビターまたはアクチベーター、例えば基質または補因子のいずれかであり得る。それらの同定することで、正常型タンパク質または変異型タンパク質との相互作用に従い、それらの使用が可能となる。特に、正常型FMOと変異型FMOに対して異なる作用を持つ薬剤を単離使用とすることができる。
また、正常型または変異型FMOによる生体異物、薬剤または他の化合物の代謝を研究するためにこれらの細胞モデルを使用することも可能である。このことは、ある化合物の毒性効力の確認に関して、毒性の低いまたは活性の高い化合物の選択、開発に関して、または注目する化合物を代謝する能力を増強した改良FMOの選択、開発に関してなすことができる。
この種の細胞モデルは遺伝子工学の技術を用いて構築できる。使用が望まれる細胞種により、その正常型またはその変異型での問題の遺伝子の、それが自己複製ベクターであれ組み込みベクターであれ発現ベクターへのクローニングの問題があり、このベクターは問題の細胞中で遺伝子を発現するための総ての構成要素を含有するか、または後者は問題の配列を発現するための総ての構成要素を有している。
この結果として、正常型または変異型FMOタンパク質を発現し、同時に種々の生成物のFMOタンパク質もしくはそれらの変異体との相互作用を試験するための、または正常型もしくは変異型FMO遺伝子の産物と相互作用可能な化合物、特に合成化学生成物を試験するためのモデル原核または真核細胞が得られる。
特に、問題の生成物は、アゴニスト活性を有する薬剤と同程度に十分アンタゴニスト活性を有する薬剤であり得る。
医薬組成物の試験を目的とした細胞モデルの使用は公知であり、もう一度この種のモデルを詳細に記載する必要はない。しかしながら、使用される技術のうち記載してよいものとしては、ファージディスプレー(Allen et al., 1995)およびツーハイブリッド法(Luban and Goff., 1995)がある。
これらのモデルはin vitroタイプ、例えば通常培養、あるいはまた単離器官の形態での培養ヒト細胞ものであってよい。
本発明はまた、ヒト起源の正常型または変異型FMOに対応する表現型を発現する動物、特にマウスなどの生物に関する。この場合も、これらの動物はある医薬製剤の効力を試験するための動物モデルとして使用できる。
本発明はまた、前記細胞モデルを使用することによって得られる生成物に関する。
診断方法
前記したように、本発明は、より詳細には、患者におけるFMO関連疾患の疾病素因の診断方法に関し、この方法は、遺伝子に対応する核酸配列の総てまたは一部を解析することにより、FMOをコードする少なくとも１つの配列における突然変異の存在の検出のために、患者から採取した生物学的サンプルを使用し、このような突然変異の少なくとも１つ存在することが、FMO関連疾患に対する患者の疾病素因の指標となることを特徴とする。
本発明ではhFMO2およびhFMOxに関してのみ詳細に記載するが、診断方法および治療目的の組成物は双方とも、前記のFMOおよびFMO1、FMO3、FMO4およびFMO5に関連することを明確にすることが重要である。これは、一般にFMOは、生体異物の代謝および、例えば生体異物および前記のFMO関連疾患のような、それらに付随する疾患に関与するからである。
研究された突然変異のうち、より明確に記載すべきものは、G.1263mac.A.変異（図6に示す）である。
解析された核酸配列とは、同等にゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡであってよい。
一方、前記したように、検出され得るFMO関連疾患は、前記の生体異物代謝に関連する、またはFMOの生物学的機能に関連する病状として、より明確に理解され、FMO異常に関連する可能性のある他の疾患もまた存在するであろう。
本発明に基づく診断手段により、単独で取られた患者における陽性および示差診断の達成が可能となるが、それらはむしろ、リスクのある、特に家族性症例歴を有する患者における前症候性診断を達せいするために価値があり、また、出生前診断を想定することもできる。
さらに、特異的な突然変異の検出により、特に疾患の強度および予想される発症時期に関して、予後診断を行うことが可能になるであろう。
もちろん、天然の遺伝子と比較して、遺伝子における突然変異を検出するには、非常に多くの方法がある。これらの方法は、本質的には２つの広いカテゴリーに分類され得る；第１タイプの方法は、変異した配列を、それに対応する天然の非変異配列と比較することにより突然変異の存在を検出するものであり、第２のタイプの方法は、例えば突然変異の存在による誤対合を検出することにより、突然変異の存在を間接的に検出するものである。
この２つの場合では、一般に、突然変異の検出に先立ち、FMOに相当する配列の総てまたは一部を増幅する方法が好ましく、これらの増幅方法は、いわゆるPCRまたはPCRの準ずる方法により達成される。PCRに準ずるとは、直接的または間接的な核酸配列の再生産を利用するか、または標識系が増幅された総ての方法をいうものと理解され；もちろん、これらの技術は十分公知であり；一般にそれらはポリメラーゼを用いるDNAの増幅を含み；元のサンプルがRNAである場合には、まず、逆転写を行うことが賢明である。現在、この増幅を達成するための非常に多くの方法、例えばNASBAと称される「核酸配列に基づく増幅」(Compton 1991)、TAS「転写に基づく増幅系」(Guatelli et al., 1990)、LCR「リガーゼ連鎖反応」(Landegren et al., 1988)、「エンド・ラン増幅」(ERA)、「環状プローブ反応」(CPR)およびSDA「ストランド置換増幅」(Walker et al., 1992)があり、これらは当業者に十分公知である。
表1は、G.1263mac.A.変異に関連する注目する配列の増幅に使用できるプライマー配列を示している。
生物学的サンプル中の、FMO遺伝子の突然変異の検出および／または同定に使用される試薬は、少なくともこれらプローブのうちの１つが、本発明の前記の配列を含有する、いわゆるキャプチャープローブおよび／またはいわゆる検出プローブを含んでなる。
点突然変異の検索
一般的な方法では、注目する配列のPCRによる増幅の後に、いくつかの検出方法が実施可能であるか、または必要に応じて適応可能である。例として以下を記載し得る：
1)配列決定：数人の被験者由来の配列の比較および／または１被験者におけるヘテロ接合性の位置決定。
2)「一本鎖ヌクレオチドプライマー伸長」(Syvanen et al., 1990)。この方法によりG.1263mac.A変異を検出するために使用可能なプライマーの例は、表2に示されている。
3)RFLP「制限断片長多型」。RFLPによりG.1263mac.A変異を検出するために使用可能な制限酵素の例は表3に示されている。
4)「一本鎖構造多型」(SSCP)の検索
5)誤対合領域の切断（S1ヌクレアーゼによる酵素的切断、ピペリジンまたはオスミウムテトロオキシドなどのような種々の化合物による化学的切断）に基づく方法
6)電気泳動によるヘテロ二本鎖の検出
7)ハイリブリダイゼーションにおける対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの使用に基づく方法：
「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」(ASO)(Stoneking et al., 1991)。ASOによるG.1263mac.A変異の検出に使用可能なプローブの例は表4に示されている。
8)OLA「2色オリゴヌクレオチド連結アッセイ」法(Samiotaki et al., 1994)
9)ARMS「増幅不応性突然変異系」法またはASA「対立遺伝子特異的増幅」法、またはPASA「特異的対立遺伝子のPCR増幅」法(Wu et al., 1989)
このリストは網羅的なものではなく、その他の十分公知な方法も用いてよい。
変異、例えば欠失型の検索
ゲノムプローブ、ｃＤＮＡプローブ、オリゴヌクレオチドプローブまたはリボプローブを用いるハイブリダイゼーション技術に基づく、十分公知な他の方法を、この種の変異の検索のために使用してもよい。
従って、患者におけるFMO関連疾患の疾病素因を診断するための本発明の方法は、ハイブリダイゼーションにより分析が行われ、そのハイブリダイゼーションは、好ましくは対立遺伝子に特異的な、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて行われること、または相当する天然の非変異配列との比較により突然変異の存在が検出されること、または分析が配列決定、もしくは電気泳動による分離、より具体的にはSSCPもしくはDGGEにより行われること、または分析がタンパク質の先端切断の検出を目的とする方法論を用いて行われることを特徴とし、本発明の一部をなす。
また、患者におけるFMO関連疾患の疾病素因を診断するための本発明の方法は、突然変異の検出に先立って、FMO遺伝子の核酸配列の総てまたは一部を増幅し、その増幅は好ましくはPCRもしくはPCRに準ずる方法により行われ、かつ、増幅を行うために選択されるプライマーは、好ましくは本発明のプライマーから選択されることを特徴とし、本発明の一部を成す。
また、生物学的サンプル中のFMO遺伝子の突然変異を検出および／または同定するための試薬は、いわゆるキャプチャープローブおよび／またはいわゆる検出プローブを含んでなり、これらのプローブのうちの少なくとも１つが、本発明の配列または本発明の抗体を含有することを特徴とし、本発明の一部を成す。
遺伝子産物の検出に基づく方法
FMO遺伝子の突然変異は、この遺伝子の産物の種々の修飾にあずかる可能性があり、これらの修飾は、診断上のアプローチとして使用できる。このように、抗原性における修飾により、特異的抗体の開発が可能となる。正常型タンパク質もしくは変異体を認識するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体の使用に基づくRIA法またはELISA法などのいくつかの十分公知の方法の存在により、これら修飾は総て、診断上のアプローチを目的に使用することができる。
最後に、患者から採取した生物学的サンプル中のFMOの酵素活性を測定することにより、患者におけるFMO関連疾患に対する疾病素因を診断することも可能である。このように、内部または外部標準と比較した場合、この（これらの）活性の測定により、前記の疾患の１つに対する疾病素因を示すことができる。
治療用組成物
本発明はまた、FMO関連疾患の治療または予防上の治療処置に関する。
FMO活性に直接的または間接的に関与し、かつ前記の細胞モデルを用いることにより誘導した化合物を使用できる。
特に、正常型または変異型FMOと、特にアゴニストまたはアンタゴニストとして相互作用し得る化合物を使用できる。
本発明はまた、有効成分としてFMO活性を調整できる化合物を含んでなる治療用組成物に関し：これらの化合物は、特に前記したようにプロFMO活性を有する化合物であってもよいし、または抗FMO活性を有する化合物であってもよい。
一般に、「プロFMO活性」を有する化合物とは、FMO活性が低い傾向にある抗FMO化合物とは対照的に、FMO活性を誘導する化合物として理解される。これらの活性タイプの実際の作用は、発現させる酵素の種、すなわち正常型か異常型かに依存する。
正常型FMO酵素に対する活性と変異型FMO酵素に対する活性とが異なる、治療用組成物を使用することが好ましい。
第１に、置換治療薬、すなわち有効成分としてプロFMO活性を有する化合物を含んでなることを特徴とする治療用組成物を想定することができ；これらの化合物は、特に前記のポリペプチドの総てもしくは一部、またはこれら同ポリペプチドを発現するためのベクター、またはさらに再びプロFMO活性もしくはFMO様活性を有するか、またはFMOの産生を誘導する化学的もしくは生物学的化合物であり得る。
有効成分が抗FMO活性、特に抗FMO変異体作用を有する治療用組成物を使用することもできる。この場合、この治療薬は抑制型治療薬である。化合物は、例えば該酵素と相互作用する化合物、特にタンパク質化合物であってよく、特にそれら抗体が変異型タンパク質を認識する場合には、抗FMO抗体であってよい。この化合物はまた、抗FMO活性を有する化学生成物、特に変異型FMOのアンタゴニストであってもよい。
使用可能な多くの医薬組成物のうち、より明確に記載すべきものは、正常型または変異型FMO遺伝子と相互作用するアンチセンス配列、そうでなければこれら遺伝子の発現の調節に作用するセンス配列であり、これらの生成物はFMOにより誘導される発現産物の下流で相互作用し得る。
FMO、特に変異型FMOsを阻害する、および／または対応するリガンドを阻害するモノクローナル抗体、および／またはFMO活性により誘導され、それゆえにプロもしくは抗活性を有し得る生成物も記載すべきであろう。
in vivoにおいて、特に前記のベクターを用いる遺伝子治療による、タンパク質またはそれらの断片の発現を想定することもできる。
遺伝子治療に関して、前記の遺伝子またはｃＤＮＡの「裸の」配列の使用を考えることもでき、この技術は、特にVical社により開発されており、これらの条件下でウイルスベクターの助けなく、特定の組織でタンパク質を発現させ得ることが証明された。
さらに遺伝子治療に関しては、これもまた当技術の水準で公知であるように(Danos et al., 1993)、ex vivoで形質転換し、次いでそれ自体かまたはは類器官種の系の中かのいずれかに再移植することができる細胞の使用を想定することもできる。また、定義された細胞種の標的化、細胞への透過、または核への輸送を容易にする薬剤の使用を想定することもできる。
このように、本発明はまた、有効成分として、FMO活性、好ましくはFMO2および／またはFMOx活性を調整できる少なくとも１種の化合物を含んでなることを特徴とする治療用組成物に関する。
本発明はまた、有効成分として、FMOならびに好ましくはFMO2および／もしくはFMOxと相互作用し得る少なくとも１種の化合物を含んでなることを特徴とする治療用組成物、または正常型FMOと異常型FMOに対して異なる活性を示すことを特徴とする本発明の治療用組成物を包含する。
本発明はまた、有効成分として、プロFMO活性を有する化合物を含んでなることを特徴とする本発明の治療用組成物を包含し、その化合物は好ましくは以下の化合物；
a)本発明のタンパク質またはポリペプチド、
b)本発明の発現ベクター
c)FMOの発現を誘導するセンス配列であることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列
より選択される。
本発明はさらに、有効成分として本発明の抗FMO活性を有する化合物を含んでなることを特徴とする本発明の治療用組成物に関し；有効成分は好ましくは以下の化合物：
a)本発明の抗FMO抗体、
b)本発明の発現ベクター、
c)FMOの発現を阻害するアンチセンス配列であることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列、
d)FMOの発現を阻害するセンス配列であることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列
より選択される。
本発明はまた、有効成分がFMOと相互作用する可溶性配列であることを特徴とする、本発明の治療用組成物に関する。
本発明はまた、FMO作用に関連する疾患の治療および／または予防を意図した薬剤の製造のための、有効成分、好ましくはFMO、FMO2および／またはFMOxを調整、またはこれらと相互作用し得る少なくとも１種の本発明生成物の使用に関する。
もう１つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたは細胞を使用することを特徴とする、有機化合物または無機化合物の生分解または生合成法に関する。
このように、FMO活性を有する本発明のポリペプチドは、有利なことに、例えばZieglerにより記載されたように(Ziegler et al., 1993)、FMOの基質である化合物、特に本明細書に記載したような化合物を、酸化反応によって生分解するために使用することもできるし、またはFMOの基質である該化合物から、注目する化合物を生合成するために、特に薬剤、食品添加物、殺虫剤もしくは除草剤の生合成のために使用することもできる。
注目する化合物を合成する方法は、本発明のポリペプチドまたは細胞を使用することを特徴とし、これももちろん本発明の一部をなす。このように、本発明のポリペプチドまたは細胞は、有利なことに、in vitroにおける注目の化合物の存在し得る代謝の測定、ならびにそれらの毒性および／またはそれらの活性を含め、得られる可能性のある代謝物の分析に使用することができる。得られた結果により、化合物の確認が可能なるし、あるいはそれがFMO基質となるよう、またならないように、あるいは形成される代謝物が異なるように再処方することも可能になる。
前記生合成法により得ることができる生成物もまた、本発明の一部をなす。
最後に、本発明は、FMOの基質である生体異物化合物の解毒のための、本発明のポリペプチドまたは細胞の使用を包含する。これら生体異物化合物は、殺虫剤もしくは除草剤として環境中に存在する可能性があり、天然には特殊なアルカロイドとして植物中に存在し、あるいは医薬組成物に相当し得る。
以下、添付図面を参照しながら、実施例により本発明の他の特徴および利点を明らかにする。
図1：マカクFMO2のヒト相同体であるhFMO2の、推定配列配列番号3に相当するポリペプチド配列
図2：マカクFMO2のヒト相同体であるhFMO2をコードする遺伝子の、配列番号1の配列に部分的に相当するヌクレオチド配列
既知のフラビンモノオキシゲナーゼファミリー遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの相同性を考慮に入れると、これらの遺伝子は、同じエキソン／イントロン構造を共有する：
エキソン1：非翻訳、サイズおよび配列は多様、
エキソン2：コード領域の開始部、アミノ酸1〜44をコードする、
エキソン3：アミノ酸45〜107、
エキソン4：アミノ酸108〜161、
エキソン5：アミノ酸162〜209、
エキソン6：アミノ酸210〜275、
エキソン7：アミノ酸276〜394、
エキソン8：アミノ酸395〜419、
エキソン9：アミノ酸420〜535、コード領域の終結部であり、かつ3'非翻訳領域
イントロンは、サイズおよび複雑性において多様である。
発明者らはまず、その断片がこの相同体の総てのエキソンを含む、BAC 123H04M由来の３つの断片の配列を単離した。
断片1：エキソン1および2を含有、
断片2：エキソン3を含有、
断片3：エキソン4〜9を含有。
次ぎに、２つのイントロンの配列を完させた：
図3：
図3A：マカクFMO2のヒト相同体であるhFMO2をコードする遺伝子のエキソン／イントロン構造の説明。
エキソンが開始および終了する位置は、配列番号1および2のヌクレオチド配列上に示されている。
図3B：hFMOxをコードする遺伝子のエキソン／イントロン構造の説明。
エキソンが開始および終了する位置は、配列番号4および5のヌクレオチド配列上に示されている。
図4：図2に示したようなマカクFMO2遺伝子とそのヒト相同体間の間の相同性。
5'非翻訳領域は、図2に示したように、マカク配列由来のものとはわずかに異なる。
図5：ヒトhFMO2ｍＲＮＡ配列が、相同なマカク配列と比較して異なるという位置の概要；タンパク質配列に対する変異の影響
図6：マカクFMO2のｍＲＮＡ配列と、そのヒト相同体との間の相同性。
G.1263mac.A変異の位置は、垂直な矢印で示してある。
図7：マカクFMO2のペプチド配列、そのヒト相同体との間の相同性。
図8：研究した家族における、G.1263mac.A多型の分離の解析。
疾患により分離されるヘテロ接合部位を検出するために、被験者3、4および7〜14のゲノムＤＮＡをPCRにより増幅し、得られた断片の配列を解析した。
黒い印は、若年性POAGを患う被験者を示す。線印は遺伝子型が違う被検者を示す。被験者11および12は双生児である。
G/G＝マカクFMO2ｍＲＮＡの1263位と相同な位置における塩基のホモ接合性。
G/A＝マカクFMO2ｍＲＮＡの1263位と相同な位置における塩基のヘテロ接合性。
図9：蛍光in-situハイブリダイゼーションにより決定されたBAC123H04Mの染色体位置。
(A)特異的なシグナルが双方の第１染色体で認められた。写真(B)は、これら２つの第１染色体の一方のみを表す。(c)では、この染色体のRバンドのみが認められるが、これにより、123H04Mプローブがバンド1q23上に位置することが証明される。
図10：ヒトhFMMOxのイソ型をコードする遺伝子の、配列番号4の配列に部分的に相当するヌクレオチド配列。
この遺伝子は、BAC 123H04M上に存在するフラビンモノオキシゲナーゼメッセンジャーＲＮＡと75%のＤＮＡ一致、および70%のアミノ酸一致を示す。この予備図面では、遺伝子は４つの断片で表してある。
断片1：エキソン2をコードする（最初のコーディングエキソン）、
断片2：エキソン3、
断片3：エキソン4〜8、
断片4：エキソン9。
実施例
BAC 123H04Mの単離
予め、第１染色体上に置かれた候補領域に相当するBAC（”bacterial artifical chromosome”細菌人工染色体）を、新規なFMOをコードする遺伝子を同定するために単離した。完全なヒトゲノムを覆うBACライブラリーを、CEPHファミリーの被験者No.8445に由来する、ヒトリンパ芽球細胞株のＤＮＡから調製した。この細胞株を高分子ＤＮＡ源として用いた。このＤＮＡを部分的に制限酵素BamH1で切断し、次いでプラスミドpBeloBacIIのBamH1部位にクローン化した。得られたクローンをプールし、前記に記載したYAC（”yeast artificial chromosome”酵母人工染色体）ライブラリーのスクリーニング(Chumakov et al., 1992)のための三次元解析法を用いてスクリーニングした。得られた三次元プールを、DIS3423(WI-10286)マーカーでフランクしたプライマーを用いるPCRによりスクリーニングした。このSTS（”sequence tagged site”配列タグ付き部位）を予め候補領域中に置いた。個のようにして、BAC 123H04Mの1クローンを単離した。
制限酵素NotIでの切断に続き、このBACにより担持される挿入部位のサイズを、交番電界(CHEF)（0.5×TAE緩衝液中、11℃、100°の角度で、9ボルト/cmにて4時間）における電気泳動分離後、0.8%アガロースゲル中で決定した。これによりBAC 123H04Mが180kbの挿入配列を担持することが証明された。
蛍光in-situハイブリダイゼーション(FISH)によるBAC 123H04Mの染色体位置の決定
候補領域lq23-q25におけるBACの染色体位置を、Cherif et al., 1990により記載された方法を用いて、中期染色体に対し蛍光in-situハイブリダイゼーション(FISH)を行うことにより確認した。さらに厳密には、BAC 123H04Mは第１染色体のバンドlq23に位置することがわかった(図9)。
BAC 123H04M挿入部の配列
BAC 123H04M挿入部の配列決定を行うため、音波処理したこのBACのＤＮＡから、３つの別個のサブクローンライブラリーを調製した。
一晩インキュベーションした後、3リットルの培養物から得た細胞を標準的な技術に従い、アルカリ溶解により処理した。得られた産物を塩化セシウム勾配で遠心分離した後、52μgのBAC 123H04M ＤＮＡを精製した。7μgのDNAを3つの異なる条件下で音波処理をし、そのサイズが1〜9kbの範囲にわたって一様に分布する断片を得た。得られた断片を、50μlの容量で、4デオキシ三リン酸(100μM)の存在下、70℃で20分間、2単位のVentポリメラーゼで処理した。この工程から得られた平滑末端断片を、1%の低融点アガロースゲルにおける電気泳動（60ボルトで3時間）により分離した。サイズにより分類されたこれら断片を切り出し、得られたバンドをアガラーゼで処理した。クロロホルムで抽出し、次いでMicrocon 100カラムで透析した後、溶解したＤＮＡを100ng/μlの濃度に調整した。連結反応は一晩のインキュベーションを要し、これは、断片化したBAC 123H04M ＤＮＡ100ngを、酵素での消化により線状化し、次いでアルカリ性ホスファターゼで処理した20ngのベクターＤＮＡと接触させることにより行った。この反応を40単位のT4 ＤＮＡリガーゼ(Epicentre)/μlの存在下、最終容量10μlにて行った。次いでこの連結産物を用いて、エレクトロポレーションにより、XL-Blue株（多重コピープラスミド用）またはD10HB株(BAC由来のサブクローン用)のいずれかを形質転換した。Lacz-であり、かつ、抗生物質耐性であるクローンは、保存用および配列決定用として個別にマイクロプレートに再採取した。
この結果：
2〜3kbのサイズの断片のプラスミドpuc18のSmaI部位への挿入から得られた864個のサブクローン；
1.5〜2kbのサイズの断片のプラスミドBluescriptSKのBamHI部位（平滑としたもの）への挿入に相当する1728個のサブクローン；
修飾されたBACベクターのPmlI部位へ挿入された、4〜7kbのサイズの断片を担持する288個のサブクローン
が得られた。
これらのサブクローンの挿入配列をPCRにより増幅し、これは一晩インキュベートし、挿入配列でフランクしたベクタープライマーを用いる細菌培養物に対して行った。これらの挿入部の末端配列（各末端につき平均500塩基）を、ABIプライム配列決定解析パッケージ(ABI prism DNA Sequencing analysis package)（2.1.2版）を装備したABI377シーケンサーにおける自動化蛍光配列決定により決定した。
サブBAC由来の配列断片は、R.StadenのGap4パッケージ(Bonfield et al., 1995)を用いて採集した。このパッケージにより、配列断片から完全な配列が再構築できるようになる。種々の断片を整列させることから推定される配列が、共通配列である。
最後に、指向される配列技術（系統的プライマー増幅）を用いて、配列を完成させ、次いでにコンティグを連結した。
配列の解析
存在し得るBAC 123H04Mのエキソンは、公開タンパク質、核酸およびEST（発現配列タグ）データベースで相同性の検索を行うことにより、位置決定した。
データベース：
主な公開データベースの部分的改訂版を使用した。用いたタンパク質データベースは、Genpept（自動化Genbank翻訳、NCBI; Benson et al., 1996）；Swissprot(George et al., 1996)；およびPIR/NBRF(Bairoch et al., 1996)データベースを重複なく合わせたもので構成されている。重複は”nrdb”パッケージ（公開ドメイン、NCBI; Benson et al., 1996）を用いて排除した。次いで内部反復を”xnu”パッケージ（公開ドメイン、NCBI; Benson et al., 1996）で遮断した。得られたデータベース、設計NRPU（非重複固有タンパク質(nin-redundant protein unique)）を、タンパク質の相同性検索の参照として用いた。このデータベースで見つけ出された相同性により、少なくとも既知タンパク質（コーディングエキソン）と関連する、タンパク質断片をコードしている可能性がある領域の位置決定が可能となった。用いたESTデータベースは、Genbank（NCBI; Benson et al., 1996)の”gbest”区分(1-9)からなる。これには公開転写断片が総て含まれている。
このデータベースを用いて見つけ出された相同性により、（メッセンジャーＲＮＡ上に存在する）転写される可能性のある領域の位置決定が可能となった。
用いた核酸のデータベース（EST以外）は、GenbankおよびEMBL(Rodriguez-Tome et al., 1996)の他の総ての区分を含み、その重複は前記のように排除した。
パッケージ：
総てのBLASTパッケージ（公開ドメイン、Altschul et al., 1990）を、配列およびタンパク質または核酸データベース間の相同性検索に用いた。有意性の限界は、試験領域の長さと複雑性、ならびに参照データベースのサイズに依存する。それらを調整し、各解析に適合させた。
常染色体優性方式（遺伝子座GLCIA）で伝達される疾患である、若年性緑内障、J-POAGの発症と関連する表現型多型についてのFMO関連遺伝子多型の同定
多型性／突然変異の検出
1)DNAの抽出
細胞溶解、タンパク質消化、有機分配、最後にアルコール沈殿に従い、末梢静脈血からＤＮＡを抽出する。
末梢静脈穿刺により、血液(20ml)をEDTAを含む試験管に採る。
それを同容量の再蒸留水で希釈する。10分後、この細胞を1600gで10分間の遠心分離により回収する。この操作を繰り返す。
白色細胞を20mlのCLS緩衝液（10mM Tris, pH7.6, 5mM MgCl2, 0.32Mスクロース，1%（v/v）Ttiton X-100）の存在下で溶解させる。この細胞核を1600gで10分間の遠心分離により回収する。この操作を繰り返す。
この細胞核をRSB緩衝液（10mM Tris, pH8, 10mM NaCl, 10mM EDTA）中で一度洗浄する。ペレットを2mMのRSB緩衝液に再懸濁させ、これにラウリル硫酸ナトリウム(1%)とプロテナーゼK(200mg/ml)を添加する。この混合液を、規則的に振盪しながら、55℃で少なくとも3時間インキュベートする。
次いで得られたＤＮＡ溶液を、50mMTris, pH8, バッファーで平衡化した1容量のフェノールで抽出する。この操作を繰り返し、1容量のクロロホルム／イソアミルアルコール(24:1 v/v)での抽出にて終了する。
1容量のイソプロパノールでＤＮＡを沈殿させ、エタノール(70%)ですすぎ、乾燥させて、最後に1mMのTE緩衝液（10mM Tris, pH8, 0.5mM EDTA）中に再懸濁させる。260nmでの吸収を測定し、50μg/mlのＤＮＡが1単位の吸収に相当すると考えることより、ＤＮＡ濃度を求める。次いで、このＤＮＡ濃度を200μg/mlに調整する。
2)ゲノムＤＮＡの増幅
コンピューター解析により推定されるように、BAC 123H04M由来エキソン配列のゲノム増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを、OSPパッケージ(Hillier et al., 1991)を用いて決定した。
これら総てのプライマーは、特に増幅により標的化される塩基の上流に、増幅した断片の配列決定を可能にすることを意図した共通のオリゴヌクレオチドテール（上流プライマーについてはPU、下流プライマーについてはRP; 配列は表5に示される）を含む。
オリゴヌクレオチドプライマーをはホスホルアミダイト法を用いてGENSET UFPS 24.1シンセサイザーで合成した。
推定される各エキソン配列を、以下の条件下でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅させた：
最終容量                                      50μl
ゲノムＤＮＡ                                  100ng
MgCl2                                         2mM
（各）dNTP                                    200μM
（各）プライマー                              7.5pmol
AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ(Perkin)         1単位
*PCR緩衝液            1x
*：（10x=0.1M Tris HCl, pH8.3, 0.5M KCl）
増幅は、Perkin Elmer 9600または加熱用の蓋を有するMJ Research PTC200サーモサイクラーで行う。94℃で10分間加熱後、35サイクル行う。各サイクルは：94℃で30秒、55℃で1分、72℃で30秒で構成される。72℃で7分間にて最終セグメントの伸長により増幅が終了する。
得られた増幅産物の量は、インターカレート剤ピコグリーン(Picogreen)（分子プローブ）を用い、96-ウェルマイクロプレート上での蛍光測定法により求める。
3)多型性／突然変異の検出
配列
PCRゲノム増幅の産物を、ABIで標識した蛍光プライマー、フルオロクロム（Joe, Fam, Rox,およびTamra）およびサーモシーケナーゼＤＮＡポリメラーゼ(Thermosequanase DNA polymerase)(Amersham)を用い、自動化ABI 377シーケンサーで配列決定した。
この反応は、標準的な温度サイクル条件：
8サイクル：変性：94℃で5秒、ハイブリダイゼーション：10秒；伸長：72℃で30秒、次いで
13サイクル：変性：94℃で5秒；伸長：72℃で30秒
の下、Perkin Elmer 9600サーモサイクラーにて96-ウェルマイクロプレート中で行う。
１回の配列決定反応につき6単位のサーモシーケナーゼと5〜25ngの増幅産物を用いた。
一度増幅サイクルが完了したら、その配列決定する反応生成物をエタノールで沈殿させ、ホルムアルデヒドを含有する充填緩衝液に再懸濁し、変性させ、次いで4%アクリルアミドゲル上に置く；電気泳動（3000ボルトで2時間30分）は、ABIコレクションおよび解析ソフトウェア（ABIプライムＤＮＡ配列決定解析ソフトウェア,2.1.2版）を備えたABI 377シーケンサーで実施する。
配列解析
J-POAGは常染色体優性疾患であるため、若年性緑内障を患う患者のヘテロ接合部位の存在を検出する目的で、得られた配列データを解析した。関連のある各被験者由来のゲノムＤＮＡの２本の鎖の配列を比較した後、ヘテロ接合部位を確認した。ヘテロ接合部位が、その家族に関連のない対照には一般に存在しないが、１つのおよび同一の家族のメンバーの母集団には存在する場合、それはFMO関連疾患の発症の原因となる突然変異候補として選択される。
結果
研究された総てのBAC 123H04M由来の増幅断片のうち１つが、図8に示した系統図における若年性緑内障の発症により分離するヘテロ接合部位を示している。
総ての患者は同一家族に由来するにもかかわらず、このヘテロ接合部位(G/A)は、3人のホモ接合健常者(G/G)には存在しないが、J-POAGを患う7人の患者には存在する。さらに同様に、99人の関連のない対照は、この部位に関してホモ接合(G/G)であり、このことは一般母集団におけるA対立遺伝子の頻度が0.005未満であることを示している。
この部位は本発明のhFMO2タンパク質をコードする遺伝子のエキソン8に含まれており；記載の突然変異はhFMO2のアミノ酸配列の402位で、グルタミン酸をリジンへ転換するものである（図1）。
驚くべきことに、一般母集団における各対立遺伝子の頻度についての異なる仮定に関するこれまでのデータを統合したロドスコア(lod scores)の算出により、記載のヘテロ接合(G/A)がJ-POAGと関連するという100を超えるもの〜1の確率が示されること（表6）に気付く。その解析が単一の家族に関していたという事実により、この確率は有意である。
このヘテロ接合部位を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であったプライマーは、表1に記載されている。
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配列リスト
配列番号1
配列番号2
配列番号3
配列番号4
配列番号5
配列番号6
配列番号7
配列番号8
配列番号9
配列番号10
配列番号11
配列番号12
配列番号13
配列番号14
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配列表
(1)GENERAL INFORMATION:
(i)APPLICANT:
(A)NAME: GENSET
(B)STREET: 24 RUE ROYALE
(C)CITY: PARIS
(E)COUNTRY: FRANCE
(F)POSTAL CODE (ZIP): 75008
(ii)TITLE OF INVENTION:
(iii)NUMBER OF SEQUENCES: 14
(iv)COMPUTER READABLE FORM:
(A)MEDIUM TYPE: Floppy disk
(B)COMPUTER: IBM PC compatible
(C)OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D)SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(vi)PRIOR APPLICATION DATA:
(A)APPLICATION NUMBER: FR 9615032
(B)FILING DATE: 06-AUG-1996
(2)  配列番号: 1:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 26016塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 二本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA (genomic)
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 1:
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(2)  配列番号: 2:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 1731塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: cDNA
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 2:
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(2)  配列番号: 3:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 535アミノ酸
(B)配列の型: アミノ酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: ペプチド
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 3:
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(2)  配列番号: 4:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 25464塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 二本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: DNA (genomic)
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 4:
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(2)  配列番号: 5:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 1605塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: cDNA
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 5:
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(2)  配列番号: 6:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 532アミノ酸
(B)配列の型: アミノ酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: ペプチド
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 6:
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(2)  配列番号: 7:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 21塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: 他の核酸
(A)DESCRIPTION: /desc=”oligonucleotide”
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 7:
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(2)  配列番号: 8:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 25塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: 他の核酸
(A)DESCRIPTION: /desc=”oligonucleotide”
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 8:
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(2)  配列番号: 9:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 23塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: 他の核酸
(A)DESCRIPTION: /desc=”oligonucleotide”
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 9:
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(2)  配列番号: 10:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 23塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: 他の核酸
(A)DESCRIPTION: /desc=”oligonucleotide”
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 10:
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(2)  配列番号: 11:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 16塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: 他の核酸
(A)DESCRIPTION: /desc=”oligonucleotide”
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 11:
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(2)  配列番号: 12:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 16塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: 他の核酸
(A)DESCRIPTION: /desc=”oligonucleotide”
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 12:
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(2)  配列番号: 13:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 16塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: 他の核酸
(A)DESCRIPTION: /desc=”oligonucleotide”
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 13:
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(2)  配列番号: 14:
(i)特徴:
(A)配列の長さ: 16塩基対
(B)配列の型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: 他の核酸
(A)DESCRIPTION: /desc=”oligonucleotide”
(xi)配列の内容: SEQ ID NO: 14:
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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