(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９〜２７から選ばれる１つ以上の配列を有するSulfolobus solfataricus KM1(FERM BP-4626)株から得られる、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα−１，４結合をα−１，α−１結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼであって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が７４０００〜７６０００であり、且つ、下記の理化学的性質を有する上記酵素：
（１）至適ｐＨ：５．０〜６．０
（２）至適温度：６０〜８０℃
（３）安定ｐＨ：４．０〜１０．０
（４）温度安定性：８５℃で６時間の処理により９１％以上残存
（５）等電点電気泳動法による等電点：６．１
（６）反応阻害：５ｍＭ  ＣｕＳＯ4で１００％阻害される。
【請求項２】
配列番号３０〜４４から選ばれる１つ以上の配列を有するSulfolobus acidocaldarius ATCC33909株から得られる、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα−１，４結合をα−１，α−１結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼであって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が７４０００〜７６０００であり、且つ、下記の理化学的性質を有する上記酵素：
（１）至適ｐＨ：４．５〜５．５
（２〉至適温度：７０〜８０℃
（３）安定ｐＨ：４．０〜１０．０
（４）温度安定性：８０℃で６時間の処理により９０％以上残存
（５）等電点電気泳動法による等電点：５．６
（６）反応阻害：５ｍＭ  ＣｕＳＯ4で１００％阻害される。
【請求項３】
配列番号９〜２７から選ばれる１つ以上の配列を有するSulfolobus solfataricus KM1(FERM BP-4626)株から得られる、すべてのグルコース残基がα−１，４結合であるマルトオリゴ糖を基質とし、その還元末端のα−１，４結合をα−１，α−１結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼであって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が７４０００〜７６０００であり、且つ、下記の理化学的性質を有する上記酵素：
（１）至適ｐＨ：５．０〜６．０
（２）至適温度：６０〜８０℃
（３）安定ｐＨ：４．０〜１０．０
（４）温度安定性：８５℃で６時間の処理により９１％以上残存
（５）等電点電気泳動法による等電点：６．１
（６）反応阻害：５ｍＭ  ＣｕＳＯ4で１００％阻害される。
【請求項４】
配列番号３０〜４４から選ばれる１つ以上の配列を有するSulfolobus acidocaldarius ATCC33909株から得られる、すべてのグルコース残基がα−１，４結合であるマルトオリゴ糖を基質とし、その還元末端のα−１，４結合をα−１，α−１結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼであって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が７４０００〜７６０００であり、且つ、下記の理化学的性質を有する上記酵素：
（１）至適ｐＨ：４．５〜５．５
（２〉至適温度：７０〜８０℃
（３）安定ｐＨ：４．０〜１０．０
（４）温度安定性：８０℃で６時間の処理により９０％以上残存
（５）等電点電気泳動法による等電点：５．６
（６）反応阻害：５ｍＭ  ＣｕＳＯ4で１００％阻害される。
【請求項５】
請求項１または３に記載のトランスフェラーゼ産生能を有するSulfolobus solfataricus KM1(FERM BP-4626)株細菌を培地に培養し、培養物より、マルトオリゴ糖を基質としてトレハロースオリゴ糖を生成する活性を指標とする活性測定法に基づいて、該トランスフェラーゼを単離精製することを特徴とする請求項１または３に記載のトランスフェラーゼの製造法。
【請求項６】
請求項２または４に記載のトランスフェラーゼ産生能を有するSulfolobus acidocaldarius ATCC33909株細菌を培地に培養し、培養物より、マルトオリゴ糖を基質としてトレハロースオリゴ糖を生成する活性を指標とする活性測定法に基づいて、該トランスフェラーゼを単離精製することを特徴とする請求項２または４に記載のトランスフェラーゼの製造法。
【請求項７】
請求項１、２、３または４に記載の酵素を用い、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質として作用させ、少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα−１，α−１結合で、該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα−１，４結合である糖を製造することを特徴とする末端の２糖がα−１，α−１結合である糖の製造法。
【請求項８】
マルトオリゴ糖各単独またはそれらの混合物を基質として用いる、請求項７に記載の製造法。
【請求項９】
トレハロースオリゴ糖を製造する、請求項８に記載の製造法。
【請求項１０】
トレハロースオリゴ糖がグルコシルトレハロースまたはマルトオリゴシルトレハロースである、請求項９に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｉ−新規トランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いたオリゴ糖の製造法、並びに該酵素の遺伝子及びその利用、II−新規アミラーゼ、その製造法及び該酵素を用いたα，α−トレハロースの製造法、並びに該酵素の遺伝子及びその利用に関するものである。
より詳しくは、
Ｉ−本発明は、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質として、その還元末端のα−１，４結合をα−１，α−１結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼとその製造法に関し、詳しくは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目の古細菌、例えばＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ属等の細菌の産生する上記酵素に関するものである。
また、本発明は、上記の新規酵素を用いたトレハロースオリゴ糖等の新規な製造法に関し、更に詳しくは、原料としてマルトオリゴ糖等を用いた効率的で、かつ高収率な、例えば、グルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロースなどのトレハロースオリゴ糖の製造法に関する。
また、本発明は上記の新規トランフェラーゼをコードするＤＮＡ断片及びこのＤＮＡ断片の遺伝子工学的な利用に関する。
II−本発明は、少なくとも還元末端から３つ以上の糖がグルコース単位で構成される３糖以上の糖を基質とし、還元末端から加水分解して主に単糖及び／又は２糖を遊離する活性を有する新規アミラーゼとその製造法に関する。詳しくは、本発明は、少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα−１，α−１結合で、該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、２つ目と３つ目のグルコース間のα−１，４結合を加水分解し、α，α−トレハロースを遊離する主要な活性を有する新規アミラーゼ及びその製造法に関する。該酵素は更に基質の分子鎖中のα−１，４結合をエンド型で加水分解する活性を合わせて有する新規なアミラーゼであって、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する細菌によって産生されうる新規な酵素である。本酵素はデンプン糖工業、繊維工業、食品工業等の産業において有用である。
また、本発明は、上記新規アミラーゼと、上記新規トランスフェラーゼとを組み合わせて作用させることを特徴とするα，α−トレハロースの製造法に関する。詳しくは、デンプン、デンプン分解物、或いはマルトオリゴ糖各単独又はマルトオリゴ糖の混合物を原料として用い、また酵素として本発明の新規トランスフェラーゼとアミラーゼとを用いて高収率でα，α−トレハロースを製造する方法に関する。
また、本発明は上記の新規アミラーゼをコードするＤＮＡ断片及びこのＤＮＡ断片の遺伝子工学的な利用に関する。
背景技術
Ｉ．酵素トランスフェラーゼの背景技術
デンプン、及びマルトオリゴ糖等のデンプン分解物に作用する糖転移酵素については、今までに様々なグルコシルトランスフェラーゼ、及びサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）などが見出されている（生物化学実験法２５、澱粉・関連糖質酵素実験法、学会出版センター刊、及びＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．１（１９９２）３９−４４など参照）。これらの酵素はグルコシル基をα−１，２、α−１，３、α−１，４、α−１，６位に転移する酵素であるが、α−１，α−１位に転移するような酵素は未だに知られていない。α−１，α−１結合に作用する酵素としては、トレハロース分解酵素であるトレハラーゼがあるが、あくまでトレハロースを唯一の基質とする分解酵素であり、その平衡及び反応速度は分解反応側に偏っている。
ところで近年、オリゴ糖には保湿性、保形性、粘性、褐変防止等の理化学的特性、及び低カロリー性、抗う食性、ビフィズス活性等の生理活性があることが見出されており、それに伴いマルトオリゴ糖、分岐オリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖等のオリゴ糖が開発されてきた（甘味料（１９８９年版）メディカルリサーチ社刊、月刊フードケミカル（１９９３年２月号）２１−２９など参照）。
オリゴ糖のうち、還元末端の存在しないオリゴ糖に関しては、還元性を持たないショ糖を骨格とした、フラクトシルトランスフェラーゼにより生産されるフラクトオリゴ糖等がある。またマルトオリゴ糖等のデンプン分解物で、還元末端を持たないオリゴ糖としては、前記ＣＧＴａｓｅにより生産されるサイクロデキストリン、α，β−トレハロース（ネオトレハロース）、及び化学合成により還元末端に水素添加したオリゴ糖還元物（オリゴ糖アルコール）等がある。これらの還元末端の存在しないオリゴ糖には、従来の水飴、マルトオリゴ糖にはない、様々な物理化学的特性及び生理活性がある。よって、マルトオリゴ糖においてその還元末端側がα−１，α−１結合を有しているオリゴ糖についてもこのオリゴ糖が還元末端を有さないことから、上記の還元末端を有さないオリゴ糖が持つような物理化学的特性及び生理活性を有することが期待されうる。
ところで、上記したような還元末端側がα−１，α−１結合を有しているマルトオリゴ糖は、α，α−トレハロースにグルコース又はマルトオリゴ糖が結合したトレハロースオリゴ糖であると考えることができる。よって、このようなトレハロースオリゴ糖は、還元末端を有さないオリゴ糖が有する物理化学特性及び生理活性に加えて、更にα，α−トレハロースに見られる様な特徴的な活性（例えば、特表昭６３−５００５６２号参照）も有することが期待されうる。
トレハロースオリゴ糖に関しては、自然界では酵母内に痕跡量認められるという報告（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７（７），１２２０−１２２１（１９９３））があるがこれのみであり、また酵素による合成も報告（１９９４年度日本農芸化学大会、講演要旨集、２４７）されてはいるが、その方法は原料として高価なトレハロースを用いるものであり、安価な供給は期待できていないのが現状である。
ところで、Ｌａｍａらは古細菌の一種であるＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＴ−４株（ＤＳＭ  ５８３３株）の菌体抽出液中に耐熱性のデンプン分解活性があることを見出している（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｆｏｒｕｍ．Ｅｕｒ．８，４，２−１（１９９１））。彼らは更に、この活性は、デンプンからトレハロース及びグルコースを生成する活性であるとも報告している。しかしながら上記の報告にはグルコシルトレハロース、マルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖の存在については全く触れられていない。更に上記の菌株以外の古細菌についての検討も全くなされていない。
また、トレハロースオリゴ糖の効率のよい生産のためには、この新規トランスフェラーゼの効率のよい入手法の確立が必要であるといえる。
従って、トレハロースオリゴ糖の大量生産のためには、この新規トランスフェラーゼの更なる大量取得が望まれる。そのためには、これら酵素の遺伝子を取得し、遺伝子工学的にそれを生産することが好ましい。さらに、遺伝子を取得出来れば、蛋白工学の技術を用いて、耐熱性、耐ｐＨ性の向上、反応速度が増大された酵素を得ることも期待出来る。しかしながら、このような酵素についての遺伝子クローニングに関する報告は未だなされていない。
本発明は、マルトオリゴ糖等の糖から、代表的にはグルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖を生成する反応の触媒作用を有する新規なトランスフェラーゼと、その製造法、並びに該酵素を用いてマルトオリゴ糖等の原料から効率的、かつ高収率で、代表的には、グルコシルトレハロース、マルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖を製造する新規な方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、古細菌のトレハロース生成活性について鋭意検討した結果、Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属し、詳しくはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ属等に属する広い範囲の古細菌の菌体抽出液が、マルトトリオースを基質としてグルコシルトレハロースを生成することを見出した。この際、デンプンを基質としたＬａｍａらによる活性測定法ではトレハロースとグルコースの生成は確認されたものの、グルコシルトレハロースなどのトレハロースオリゴ糖の生成の確認は非常に困難であることがわかった。また、古細菌の菌体抽出液の精製過程においてＬａｍａらが見出したトレハロースの生成活性は消失されてしまうことも知見し、総じてこのような活性を有する酵素自体の精製及び特定化は実質上不可能であることがわかった。
このような状況下にあって本発明者らは更に研究を重ね、マルトオリゴ糖（例えばマルトトリオース）を基質とし、トレハロースオリゴ糖（例えばグルコシルトレハロース）を生成する活性を指標とする新しい活性測定法を思考するに至り、この測定法を実施したところトレハロースオリゴ糖（例えばグルコシルトレハロース）の検出が容易に可能であることを見出し、更に種々の菌株に関してこの活性を有する酵素の精製を試みたところ、驚くべきことにこうして得られた酵素は、還元末端から３つ以上のグルコース残基がα−１，４結合であるマルトトリオース以上の糖に作用して還元末端のグルコース残基をα−１，α−１に転移させ、グルコシルトレハロースなどのトレハロースオリゴ糖を生産する能力を有する全く新規なトランスフェラーゼであることを知見した。なお、マルトオリゴ糖等の還元末端のグルコース残基がα−１，α−１に転移したトレハロースオリゴ糖の存在は1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲにより確認した（実施例Ｉ−１、７及び８参照）。
本発明者らは、更に、このような新規酵素を用いることよりマルトオリゴ糖等の糖から、大量に、例えば、グルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖を生産することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明者らは、更に、このような新規酵素の遺伝子を単離し、この遺伝子を利用して組換え新規トランフェラーゼを遺伝子工学的に生産する手法を、今般、確立した。
II．酵素アミラーゼの背景技術
アミラーゼはデンプンを加水分解する酵素の総称であり、その中でα−アミラーゼはα−１，４グルコシド結合をエンド様式で加水分解する活性を持つ酵素である。α−アミラーゼは生物界に広く存在し、ほ乳類においては、消化酵素として、唾液、膵液中に認められる。植物においては、麦芽等に多く認められる。また微生物界においても広く分布しており、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属するかび、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌の産生するα−アミラーゼ等が産業上使用されている（アミラーゼ、中村道徳監修、学会出版センター刊、１９８６年）。
これらのα−アミラーゼは産業上様々な用途で使用されており、例えば、デンプン糖工業においてはデンプンの液化工程で、また繊維工業では糊抜き工程等で広く用いられており、工業的に大変重要な酵素である。「酵素応用の知識」（小巻利章、幸書房刊、１９８６年）によれば、デンプンの液化工程で重要なこととして、１）デンプン分子をできるだけ完全に溶かすこと、２）液化生成物が次の糖化工程の目的に対して好都合であること、３）液化生成物が老化しない条件であること、４）経済的見地からできるだけ高濃度（３０〜３５％）で実施することなどが挙げられている。デンプンの液化工程は例えば、連続恒温液化法、ジェットクッカー法などで実施され、通常α−アミラーゼ含有の、高濃度デンプン乳液を瞬間的に高温（８５〜１１０℃前後）にまで上げ、デンプンが糊化、膨潤しはじめると同時に、α−アミラーゼを作用させて液化している。すなわち、デンプンの液化工程では酵素が作用できるようにデンプンを膨潤させるだけの十分な温度を必要としている。このような分野で使用しうる酵素としては、例えば、上述のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する麹菌やＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌の産生する耐熱性α−アミラーゼが挙げられる。これらの酵素の耐熱性を更に向上させるために、カルシウムを添加する必要がある場合もある。もしデンプンの液化工程で膨潤し、開裂しかけたデンプンミセルがα−アミラーゼの作用を受けずに、ひとたび温度が低下すると、デンプンは再び集まり、α−アミラーゼで液化されにくい新しいミセル（難溶性デンプン）を作ってしまう。その結果、生じた糖液は混濁し、難濾過性となるという問題が知られている。このような事態を防止するために、液化度（ＤＥ＝Dextrose Equivalent）をある程度高める方法がとられている。しかし酵素法マルトースの製造工程のように、収率を高く維持するためになるべくこのＤＥを低く（すなわち糖鎖の重合度を高く）保つ必要がある場合もある。従って、デンプンの液化工程後、次工程で酵素を更に作用させる場合、高温を維持したまま作用させうる耐熱性酵素を用いるならば、デンプン濃度が高い場合でも、これを用いて難溶性デンプンを生成させることなく反応を進めることが可能であり、また同時に、微生物汚染の危険も低減させうるために工程管理、衛生管理の面からも有利であるといえる。また、酵素を反復使用するために、固定化してバイオリアクターとして利用する場合には、酵素が高い安定性、特に耐熱性を有することが重要であるといわれている。すなわち、固定化のために比較的高温にさらされることがあるが、耐熱性が低いものでは固定化操作中に失活してしまう恐れがあるからである。以上のことから耐熱性の高い酵素は、例えばデンプンの液化工程などの場合を含め各種の産業において非常に有利に用いることができ、かつ、望まれていると言えよう。
また、近年アミラーゼを含み耐熱性酵素の取得に関しては好熱性、高度好熱性細菌のスクリーニングが広く行われている。その中にはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ目、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する古細菌も対象となっており、α−アミラーゼを産生するとの報告がある（Applied and Environmental Microbiology，１９８５−１９９１（１９９０）；特開平６−６２８６９など）。またＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する古細菌もその対象になっており、耐熱性酵素の単離が報告されている。ここにおいて、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する古細菌とは、分類学上、高度高熱性（温度：５５℃〜８８℃の範囲で生育）、好酸性（ｐＨ：１〜６の範囲で生育）、好気性、硫黄細菌（球菌（不規則）：直径０．６〜２μｍ）として定義される古細菌をいう。よって、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する古細菌がアミラーゼを産生しうるならばこのアミラーゼも耐熱性を有することが期待される。Ｌａｍａらは古細菌の一種であるＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＴ−４株（ＤＳＭ  ５８３３株）の菌体抽出液に耐熱性のデンプン分解活性があることを見出している（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｆｏｒｕｍ．Ｅｕｒ．８，４，２−１（１９９１））。この文献ではこの活性は、デンプンからα，α−トレハロース及びグルコースを生成する活性であると報告している。しかしながらこの活性物質については部分精製しかしておらず、活性本体についての特定はしていない。また活性の酵素学的諸性質についても全く解明していない。本発明者らの研究によれば（詳細は後述する）、Ｌａｍａらがデンプンに作用させた上記菌株由来の活性物質は複数の酵素の混合体であり、これを用いて得られた最終生成物がα，α−トレハロースとグルコースであったのである。
ところで、α−アミラーゼには初期にヨウ素デンプン反応を減少させるという、すなわち、α−１，４グルカンをエンド型に加水分解する活性（液化活性）がある。この液化型アミラーゼにも反応機構上様々な様式がある。すなわち、エンド型で加水分解する活性としては共通しているが、マルトオリゴ糖の分解パターンについて調べてみると、それぞれ特徴があることが知られている。例えば、非還元末端側から特定の位置を認識して加水分解するもの、還元末端側から特定の位置を認識して加水分解するものがあり、また、分解された主生成物がグルコースであるもの、或いはマルトース又はマルトオリゴ糖であるものなどがある。具体的には、すい臓由来のα−アミラーゼは還元末端から２つ目、或いは３つ目のα−１，４結合を加水分解する（澱粉・関連糖質酵素実験法、中村道徳・貝沼圭二、学会出版センター刊、１９８９年）。また、枯草菌由来のα−アミラーゼは非還元末端から６つ目あるいは還元末端から３つ目のα−１，４結合を加水分解する（酵素応用の知識、小巻利章、幸書房刊、１９８６年）。このようなα−アミラーゼの反応様式の差異は、各酵素の構造に起因するといわれており、これらの現象の解釈についてはサブサイト理論が提唱されている。また転移活性、縮合活性を持つものや、更にはサイクロデキストリンを生成するような特殊なα−アミラーゼも存在することが認められている。
一方、α，α−トレハロースは、２分子のグルコースがその還元性基どうしでα−１，α−１結合したものであり、自然界の多くの生物、植物、微生物に存在し、生体膜の凍結や乾燥からの細胞保護や、昆虫のエネルギー源等、多くの働きを持つことが知られている。近年、このα，α−トレハロースはタンパク質の凍結や乾燥に対する安定化剤として、医薬品、化粧品、食品等の分野で検討されている（特公平５−８１２３２、特開昭６３−５００５６２など）。しかしながら現在までのところ安価な大量生産法が確立していないためか、実際に利用されている例はほとんどない。
従来のα，α−トレハロースの製造法としては、例えば、酵母抽出による方法（特開平５−９１８９０、特開平４−３６０６９２など）、酵母による菌体内生産による方法（特開平５−２９２９８６、ヨーロッパ特許０４５１８９６など）、スクレロチウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）属、或いはリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属に属する微生物による生産法（特開平３−１３００８４）等が試みられている。ただし、これらの方法では菌体内生産であるために、菌体破砕、夾雑物の除去の為の多段階の精製工程を必要としている。また、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３３，Ｎｏ．２，１９０，１９６９，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ）、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属に属する微生物（特開昭５０−１５４４８５）、グルタミン酸生産菌（フランス特許２６７１０９９、特開平５−２１１８８２など）を用いた発酵法による菌体外生産の検討もなされている。更にまた、α，α−トレハロースの生合成酵素遺伝子による生産の検討も試みられている（ＰＣＴ特許９３−１７０９３）。これらの方法はいずれもグルコース等の糖源を用い、かつＡＴＰ、ＵＴＰをエネルギーとして必要とする代謝系を利用するものである。よって、培養液からのα，α−トレハロースの繁雑な精製工程を必要としている。また更に、トレハロースホスホリラーゼを用いた方法（特公昭６３−６０９９８）、トレハラーゼを用いた方法（特開平７−５１０６３）等の酵素法による生産の検討も試みられているが、酵素の大量生産、酵素の安定性等の問題がある。以上のような従来の方法はいずれも低収量、精製工程の煩雑さ、低生産量、酵素調製の煩雑さ等の問題があり、未だに工業化しうる方法は確立されておらず、よって、より効率の良いα，α−トレハロースの製造法の確立が強く望まれているのが現状である。
α，α−トレハロースは上述のように自然界に広く見出され、古細菌にもその存在が確認されている（Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０，２１５．１９８８）。具体的には、前述したように、Ｌａｍａらは古細菌の一種であるＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＴ−４株（ＤＳＭ  ５８３３株）の菌体抽出液に耐熱性のデンプン分解活性があることを見出しており、その生成物中にα，α−トレハロースの存在を確認している（前掲Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｆｏｒｕｍ．Ｅｕｒ．８，４，２−１（１９９１））。この文献ではこの活性はデンプンからα，α−トレハロース及びグルコースを生成する活性であると報告はしていても、実際には０．３３％可溶性デンプンを基質とした場合の例を挙げているのみで、その際生成したα，α−トレハロースの量は極僅かなものであり、しかもα，α−トレハロース：グルコースの生成比は１：２であった。従って大量のグルコースを副生するためにその分離を必要とし、α，α−トレハロースの大量生産法としての目的を達成しうるものでは全くなかったのである。
本発明者等は、前述したように、Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属する古細菌が、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα−１，４結合をα−１，α−１結合に転移させる作用を有するトランスフェラーゼを産生することを見出し、更にこの酵素を用いた、マルトオリゴ糖からのグルコシルトレハロース、マルトオリゴシルトレハロースなどのトレハロースオリゴ糖の製造法を発明した。なお、トレハロースオリゴ糖とは、還元末端側にα−１，α−１結合を有しているマルトオリゴ糖をいう。
また一方、従来知られている各種酵素のうちで、マルトオリゴ糖の還元末端がα−１，α−１結合となったトレハロースオリゴ糖を、そのα−１，α−１結合のとなりのα−１，４結合の位置で特異的に加水分解して収率よくα，α−トレハロースを遊離する作用を有する酵素に関しては、本発明者らの知る限りでは、そのような報告は全くない。すなわち、トレハロースオリゴ糖の還元末端側の２つ目と３つ目のグルコース間のα−１，４結合を特異的に加水分解してα，α−トレハロースを遊離することは従来のアミラーゼでは不可能であった。よって、デンプン又はデンプン分解物分子鎖中のα−１，４結合を加水分解する活性を有すると共に、上記したようなα，α−トレハロース生成反応を触媒しうるアミラーゼを開発し得たならば、α，α−トレハロースの大量生産上益することは多大であろう。
また、α，α−トレハロースの大量生産のためには、この新規アミラーゼの大量取得が望まれる。そのためには、これら酵素の遺伝子を取得し、遺伝子工学的にそれを生産することが好ましい。さらに、遺伝子を取得出来れば、蛋白工学の技術を用いて、耐熱性、耐ｐＨ性の向上、反応速度が増大された酵素を得ることも期待出来る。
本発明は、デンプン又はデンプン分解物分子鎖中のα−１，４結合をエンド型で加水分解する活性を有すると共に、マルトオリゴ糖の還元末端がα−１，α−１結合となったトレハロースオリゴ糖の還元末端側の２つ目と３つ目のグルコース間のα−１，４結合を特異的に加水分解してα，α−トレハロースを遊離する反応を触媒しうる新規なアミラーゼを提供すること、及び該酵素を製造する方法を提供すること、並びに該酵素を用いてデンプン、デンプン分解物、或いはマルトオリゴ糖等の安価な原料から効果的、かつ高収率で、α，α−トレハロースを製造する新規な方法を提供することを目的とする。
本発明者らは古細菌のデンプン分解活性について鋭意検討した結果、Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属し、詳しくはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する広い範囲の古細菌の菌体抽出液が、耐熱性のデンプン分解活性を有することを見出した。その際デンプンの分解によって生成する糖は、Ｌａｍａらの文献記載におけるのと同様に、主にグルコースとα，α−トレハロースであることを確認した。そこで、更に種々の菌株抽出液についてデンプン分解活性の性質を調べてみたところ、これらの菌株が産生する酵素が、デンプン分解活性やα，α−トレハロース生成活性などの酵素活性の点から液化アミラーゼ、グルコアミラーゼ等のエンド型、エキソ型の各種アミラーゼ、及びトランスフェラーゼなどにより構成されている酵素混合体であることを発見した。しかもその酵素活性は、これらの複数の酵素による活性の相乗作用によるものであることがわかった。更に、個々の酵素を精製しようとした場合、ヨウ素デンプン反応による青色の減少を指標としたＬａｍａらによる活性測定法では感度および定量性が低いためか、総じてこの様な酵素活性を有する酵素の精製は収率の点で低く、しかも操作が非常に困難であることがわかった。また本発明者らの詳細な検討によれば、Ｌａｍａらの文献記載の部分精製方法では、蛋白質レベルでは全く精製、単離がなされていないことがわかった。
このような状況下にあって本発明者らは更に研究を重ね、トレハロースオリゴ糖（例えばマルトトリオシルトレハロース）を基質とし、α，α−トレハロースを遊離する活性を指標とする新しい活性測定法を思考するに至り、この測定法を実施したところ、アミラーゼ活性の検出が容易に可能であることを見出し、更に種々の菌株に関してこの活性を有する酵素の精製を試みたところ、最終的にアミラーゼの単離精製に成功するに至った。また、単離精製されたアミラーゼに関して酵素学的な諸性質を調べてみたところ、驚くべきことにこうして得られた酵素は、デンプンまたはデンプン分解物をエンド型で加水分解する活性を有する他に、デンプン分解物またはマルトオリゴ糖などを還元末端側から加水分解して単糖及び／又は２糖を生成する活性を有し、特に還元末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα−１，α−１結合で、該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα−１，４結合である３糖以上の糖（例えばトレハロースオリゴ糖）との反応性が、それぞれ対応するマルトオリゴ糖と比較して高く、このような３糖以上の糖を基質とし、還元末端側から２つ目と３つ目のグルコース間のα−１，４結合を加水分解してα，α−トレハロースを遊離する活性を合わせて有するという、全く新規な作用機作を有する酵素であることを知見した。
本発明者らは、更に、このような新規酵素の遺伝子を単離し、この遺伝子を利用して組換え新規アミラーゼを遺伝子工学的に生産する手法を、今般、確立した。
発明の開示
Ｉ．新規トランスフェラーゼ
本発明は、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα−１，４結合をα−１，α−１結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼ（以下、本発明の新規トランスフェラーゼ、或いは単に本発明の酵素又は本酵素とも称する）を提供するものである。
本発明は、また、他面において、すべてのグルコース残基がα−１，４結合であるマルトオリゴ糖を基質とし、その還元末端のα−１，４結合をα−１，α−１結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼを提供するものである。
本発明は、更に、このような作用をするトランスフェラーゼ産生能を有する細菌を培地に培養し、培養物より、マルトオリゴ糖を基質としトレハロースオリゴ糖を生成する活性を指標とする活性測定法に基づいて、該トランスフェラーゼを単離精製することを特徴とする本発明の新規トランスフェラーゼの製造法を提供するものである。
本発明は、更にまた、本発明の酵素を用い、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質として作用させ、少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα−１，α−１結合で、該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα−１，４結合である糖を製造することを特徴とする末端の２糖がα−１，α−１結合である糖の製造法を提供するものである。
本発明はまた更に、本発明の酵素を用い、マルトオリゴ糖各単独又はそれらの混合物を基質として作用させることを特徴とするトレハロースオリゴ糖の製造法を提供するものである。
また、本発明は新規トランスフェラーゼ遺伝子の提供をその目的としている。
また、本発明は前記遺伝子を用いた組換え新規トランスフェラーゼおよびその製造法の提供を目的としている。
さらに本発明は、組換え新規トランスフェラーゼを用いた効率的なグルコシルトレハロース、マルトグルコシルトレハロースなどのトレハロースオリゴ糖の製造法の提供をその目的としている。
よって、本発明によるＤＮＡ断片は、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα-１，４結合である三糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα-１，４結合をα-１，α-１結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼをコードする遺伝子を含んでなるもの、である。
また、本発明による組換え新規トランスフェラーゼは、上記ＤＮＡ断片の発現産物である。
さらに、本発明による組換え新規トランスフェラーゼの製造法は、
前記遺伝子で形質転換された宿主細胞を培養し、その培養物中に前記組換え新規トランスフェラーゼを生成させ、これを採取することを含んでなるもの、である。
II．新規アミラーゼ
本発明は、少なくとも還元末端から３つ以上の糖がグルコース単位で構成される３糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して主に単糖及び／又は２糖を遊離する活性を有する新規アミラーゼを提供するものである。
また、本発明は、他面において、少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα−１，α−１結合で、該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、２つ目と３つ目のグルコース間のα−１，４結合を加水分解し、α，α−トレハロースを遊離する主要な活性を有する新規アミラーゼを提供するものである。
また、更に、本発明は、別の面において、上記したような活性を有すると共に、基質の分子鎖中のα−１，４結合をエンド型で加水分解する活性を合わせ有する新規アミラーゼを提供するものである。
本発明は、更に、上記したような本発明のアミラーゼを産生する能力を有する細菌を培地に培養し、培養物より、トレハロースオリゴ糖を基質としてα，α−トレハロースを生成する活性を指標とする活性測定法に基づいて、該アミラーゼを単離精製することを特徴とする該アミラーゼの製造法を提供するものである。
本発明者らは、上記したような本発明のアミラーゼと、前述した本発明のトランスフェラーゼとを、デンプン、デンプン分解物、及びマルトオリゴ糖等の糖質原料に組み合わせて作用させたところ効率的に、かつ高収率でα，α−トレハロースが生成することを知見した。
よって、本発明は、更にまた、上記したような本発明のアミラーゼとトランスフェラーゼとを組み合わせて用いることを特徴とするα，α−トレハロースの製造法を提供するものである。
また、本発明は新規アミラーゼ、およびその遺伝子の提供をその目的としている。
また、本発明は前記遺伝子を用いた組換え新規アミラーゼおよびその製造法の提供をその目的としている。
さらに本発明は、組換え新規アミラーゼを用いたα，α-トレハロースの製造法の提供をその目的としている。
従って、本発明によるアミラーゼ遺伝子は、
（１）糖鎖中のα-１，４グルコシド結合をエンド型で加水分解する活性、
（２）少なくとも還元末端から３つ以上の糖がグルコース単位で構成され、かつその結合がα-１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して主に単糖および／または２糖を遊離する活性、および
（３）少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα-１，α-１結合であり、かつ該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα-１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、２つ目と３つ目のグルコース間のα-１，４結合を加水分解し、α，α-トレハロースを遊離する主要な活性を有する新規アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなるもの、である。
また、本発明による組換え新規アミラーゼは上記遺伝子の発現産物である。
更に本発明によるα，α-トレハロースの製造法は、
上記組換え新規アミラーゼ、および
少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα-１，４結合である三糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα-１，４結合をα-１，α-１結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼとを、
少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα-１，４結合である３糖以上の糖と接触させる工程を含んでなるもの、である。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例Ｉ−１で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の菌体抽出液による生成物のTSK-gel Amide-80 HPLCによる分析結果を示すグラフである。
図２は、実施例Ｉ−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素トランスフェラーゼの温度安定性を示すグラフである。
図３は、実施例Ｉ−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素トランスフェラーゼのｐＨ安定性を示すグラフである。
図４は、実施例Ｉ−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素トランスフェラーゼの各温度における反応性を示すグラフである。
図５は、実施例Ｉ−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素トランスフェラーゼの反応至適ｐＨを示すグラフである。
図６は、実施例Ｉ−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素トランスフェラーゼによる、マルトトリオースからの反応生成物のパターンを示すグラフである。
図７は、実施例Ｉ−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素トランスフェラーゼによる、マルトテトラオースからの反応生成物のパターンを示すグラフである。
図８は、実施例Ｉ−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素トランスフェラーゼによる、マルトペンタオースからの反応生成物のパターンを示すグラフである。
図９は、実施例Ｉ−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素トランスフェラーゼによる、マルトオリゴ糖混合物からの反応生成物のAMINEX HPX-42A HPLCによる分析結果を示すグラフである。
図１０は、実施例II−１で得たSulfolobus solfataricus KM1株の粗酵素液を作用させたマルトトリオシルトレハロースからの反応生成物のTSK-gel Amide-80 HPLCによる分析結果を示すグラフである。
図１１は、実施例II−１で得たSulfolobus solfataricus KM1株の粗酵素液を作用させた可溶性デンプンからの反応生成物のAMINEX HPX-42A HPLCによる分析結果を示すグラフである。
図１２は、実施例II−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素アミラーゼの温度安定性を示すグラフである。
図１３は、実施例II−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素アミラーゼのｐＨ安定性を示すグラフである。
図１４は、実施例II−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素アミラーゼの各反応温度における反応性を示すグラフである。
図１５は、実施例II−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素アミラーゼの反応至適ｐＨを示すグラフである。
図１６は、実施例II−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素アミラーゼの各種基質に対する反応性を示すグラフである。
図１７は、実施例II−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素アミラーゼを作用させたマルトペンタオース、アミロースＤＰ−１７、可溶性デンプンからの反応性生物のAMINEX HPX-42A HPLCによる分析結果を示すグラフである。
図１８は、実施例II−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素アミラーゼを作用させたマルトトリオシルトレハロースからの反応性生物のTSK-gel Amide-80 HPLCによる分析結果を示すグラフである。
図１９は、実施例II−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素アミラーゼを作用させたマルトペンタオシルトレハロースからの反応生成物のTSK-gel Amide-80 HPLCによる分析結果を示すグラフである。
図２０は、実施例II−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素アミラーゼを可溶性デンプンに作用させたときのヨウ素発色の消失及びデンプン加水分解率の経時変化を示すグラフである。
図２１は、実施例II−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素アミラーゼを作用させた放射活性ラベル化したマルトペンタオースからの反応生成物の放射活性の経時変化を示すグラフである。
図２２は、実施例II−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素アミラーゼを作用させた放射活性ラベル化したマルトトリオシルトレハロースからの反応生成物の放射活性の経時変化を示すグラフである。
図２３は、ブタ膵臓由来のα−アミラーゼの各種基質に対する反応性を示すグラフである。
図２４は、ブタ膵臓由来のα−アミラーゼを作用させたマルトペンタオシルトレハロースからの反応生成物のTSK-gel Amide-80 HPLCによる分析結果を示すグラフである。
図２５は、実施例II−２で得たSulfolobus solfataricus KM1株由来の本酵素アミラーゼ及びトランスフェラーゼを作用させた可溶性デンプンからの反応生成物のAMINEX HPX-42A HPLCによる分析結果を示すグラフである。
図２６は、実施例Ｉ−１２で得られたＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の新規トランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＫＴ１、ｐＫＴ１１およびｐＫＴ２１の挿入断片の制限酵素地図を示した図である。
図２７は、ｐＫＴ２２プラスミドの構築方法を示した図である。
図２８は、マルトトリオースに組換え新規トランフェラーゼを作用させたときの生成物のTSK-gel Amide-80 HPLCによる分析結果を示した図である。
図２９は、実施例Ｉ−１６で得られたＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株由来の新規トランスフェラーゼ遺伝子を含むｐ０９Ｔ１の挿入断片の制限酵素地図を示した図である。
図３０は、ｐ０９Ｔ１プラスミドの構築方法を示した図である。
図３１は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株とＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株由来の新規トランスフェラーゼのアミノ酸配列の相同性を示した図である。
図３２は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株とＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株由来の新規トランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列の相同性を示した図である。
図３３は、マルトオリゴ糖混合物に組換え新規トランスフェラーゼを作用させたときの生成物のAMINEX HPX-42A HPLCによる分析結果を示した図である。
図３４は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の新規アミラーゼ遺伝子を含むｐＫＡ１の挿入断片の制限酵素地図を示した図である。
図３５は、ｐＫＡ２の制限酵素地図を示した図である。
図３６は、（Ａ）は本発明による組換え新規アミラーゼをマルトトリオシルトレハロースに作用させたときの生成物の分析結果を示した図であり、また（Ｂ）は本発明による組換え新規アミラーゼを可溶性デンプンに作用させたときの生成物の分析結果を示した図である。
図３７は、本発明による組換え新規アミラーゼを可溶性デンプンに作用させたときのヨウ素発色の消失と、デンプン加水分解率の経時的変化を示すグラフである。
図３８は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株由来の新規アミラーゼ遺伝子を含むｐ０９Ａ１の挿入断片の制限酵素地図である。
図３９は、ｐ０９Ａ２よりｐ０９Ａ１の作成方法を示した図である。
図４０は、Sulfolobus acidocaldarius ＡＴＣＣ３３９０９株，Sulfolobus solfataricus ＫＭ１株由来の新規アミラーゼのアミノ酸配列について相同性を比較した図である。
図４１は、Sulfolobus acidocaldarius ＡＴＣＣ３３９０９株，Sulfolobus solfataricus ＫＭ１株由来の新規アミラーゼ遺伝子の塩基配列について相同性を比較した図である。
図４２は、１０％可溶性デンプンに実施例II−１９の組換え新規アミラーゼおよび実施例Ｉ−２０の組換え新規トランスフェラーゼを作用させたときの生成物の分析結果を示した図である。
発明を実施するための最良な形態
微生物の寄託
本発明者らにより自然界から実質的に純粋な形で分離した後述の新菌株ＫＭ１株は、平成６年（１９９４）４月１日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６２６の番号のもとに工業技術院生命工学技術研究所に寄託されている。
本発明による新規トランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＫＴ２２（後記する実施例Ｉ−１４参照）で形質転換された大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＫＴ２２は、平成６年（１９９４年）１０月２１日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ-４８４３の番号のもとに、またプラスミドｐ０９Ｔ１（後記する実施例Ｉ−１６参照）で形質転換された大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐ０９Ｔ１は平成７年（１９９５年）５月９日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０９３の番号のもとに工業技術院生命工学技術研究所に寄託されている。
また、本発明による新規アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＫＡ２（後記する実施例II−１９参照）で形質転換された大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＫＡ２は、平成６年（１９９４年）１０月３１日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ-４８５７の番号のもとに、またプラスミドｐ０９Ａ１（後記する実施例II−２２参照）で形質転換された大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐ０９Ａ１は平成７年（１９９５年）５月９日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０９２の番号のもとに工業技術院生命工学技術研究所に寄託されている。
Ｉ．新規トランスフェラーゼ
本発明の新規トランスフェラーゼを産生する微生物
本発明において利用されうる古細菌としては、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ３５０９１（ＤＳＭ  １６１６）株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５８３３株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株（本発明者らにより自然界から実質的に純粋な形で分離した後述の新菌株）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３９０９（ＤＳＭ  ６３９）株、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ  １６５１株等を挙げることができる。
本発明の新規トランスフェラーゼを産生する微生物は、このように、分類学上Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ及びＡｃｉｄｉａｎｕｓ属が属するＳｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属するかなり広い範囲の古細菌に及ぶと考えられる。ここにおいて、Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目とは、分類学上、高度好酸性好熱性、好気性、硫黄細菌（球菌）として定義される古細菌である。Ａｃｉｄｉａｎｕｓ属に属する上記のＡｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ  １６５１株は以前はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ  １６５１株として分類されていた菌であり、また、上記のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５８３３株は以前はＣａｌｄａｒｉｅｌｌａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌａと命名されていた菌である。よって、このような事実から、上記の古細菌に遺伝学的に或いは分類学的に近縁であり、かつ同種の酵素を産生しうる菌はすべて本発明において使用できることは言うまでもない。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株
上記において例示した微生物の中で、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株は本発明者らが群馬県の温泉から分離した菌株であって、次の様な性質を示すものである。
（１）形態的性質
菌の形、大きさ：球菌（不規則）  直径０．６〜２μｍ
（２）生育最適条件
ｐＨ：３〜５．５の範囲で生育し、最適生育ｐＨは３．５〜４．５
温度：５５℃〜８５℃の範囲で生育し、最適生育温度は７５℃〜８０℃
硫黄を代謝できる
（３）好気性、嫌気性の区別：好気性
以上の性質から、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３（１９８９）に従い菌株の同定を行った結果、本菌株はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓに属する菌株であり、従って本菌株をＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株と命名した。
上記の菌株の培養にあたっては、培地は液体でも固体でもよく、通常は液体培地を用いた振とう培養又は通気撹拌培養が行なわれる。このように、培地は生育に適するものであれば特に限定されず、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）発行Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｅｓ  １８版（１９９２）及びＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）発行Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ５版（１９９３）に記載のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  Ｍｅｄｉｕｍ等を好ましく用いることができる。更に糖源としてデンプン、マルトオリゴ糖等を加えてもよい。また、培養条件も上記の生育可能な温度及びｐＨのもとであれば特に限定されない。
本発明の新規トランスフェラーゼを産生する微生物の培養
本発明の新規トランスフェラーゼ産生のための培養条件は、該トランスフェラーゼを産生しうる範囲内で適宜選択すればよい。液体振とう培養又は通気撹拌培養の場合は各微生物が生育するｐＨ、培養温度で、２日〜７日間の培養が適当である。培地としては、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）発行Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｅｓ  １８版（１９９２）及びＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）発行Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ５版（１９９３）に記載のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  Ｍｅｄｉｕｍ等を好ましく用いることができる。更に糖源としてデンプン、マルトオリゴ糖等を加えてもよい。
本発明の新規トランスフェラーゼの精製
上記微生物の産生する本発明の新規トランスフェラーゼの抽出は、まず上記のような培養方法により得られた培養物から公知の方法、例えば遠心分離により菌体を得て、これを適切な緩衝液中に懸濁し、凍結融解、超音波処理、磨砕等により菌体を破砕し、遠心分離またはろ過により該トランスフェラーゼを含有する菌体抽出物を得る。
この菌体抽出物に存在する本発明の新規トランスフェラーゼの精製には、公知の分離、精製法を適当に組み合わせて行うことができる。例えば、塩沈澱及び溶媒沈澱のような溶解性を利用する方法、透析、限外ろ過、ゲルろ過及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、更に等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法等が挙げられる。これらの具体的な例は、後述の実施例Ｉ−２〜Ｉ−５に示すとおりである。最終的にネイティブポリアクリルアミドゲル、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル或いは等電点電気泳動にて単一バンドを示す酵素を精製酵素として得る。
上記したような各種の精製過程において分離された酵素或いは酵素含有物の活性測定に関しては、Ｌａｍａらの方法における活性測定法ではデンプンを基質として行っており、それによれば、トレハロースとグルコースの生成は確認できるものの、トレハロースオリゴ糖の生成は全く検出できず、また、この方法では精製途中においてトレハロース生成活性さえも消失して確認できなくなるという大きな問題があり、酵素活性本体の精製、特定化は実質上不可能であった。ところが、本発明者らにより、マルトオリゴ糖（例えばマルトトリオース）を基質とし、トレハロースオリゴ糖（例えばグルコシルトレハロース）を生成する活性を指標とする新しい活性測定法を採用したところ、初めて目的とする酵素の単離精製が可能となり、ようやくにして、本発明の新規トランスフェラーゼ活性本体の精製及び特定化を実現し得たのである。
本発明の新規トランスフェラーゼの諸性質
本発明の酵素例として、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５８３３株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３９０９株、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ  １６５１株の微生物がそれぞれ産生したトランスフェラーゼについてそれらの酵素学的な諸性質を下記の第１表にまとめて示す。なお、表中のデータは、実施例Ｉ−６及び７に示した具体例に基づくものである。
0004033897.tif 000002
註１：経時変化
マルトトリオースを基質として用いた場合、主反応であるグルコシルトレハロースの生成とともに、副反応としてマルトース及びグルコースが等モル生成された。
マルトテトラオース以上の重合度ｎを持つ糖では、主反応として、還元末端のグルコース単位がα−１，α−１結合した糖が生成され、同様に副反応として等モルずつの重合度（ｎ−１）糖及びグルコースが生成された。
註２：酵素作用／酵素反応様式
還元末端がα−１，４結合でグルコースが３つ結合したマルトトリオース以上の糖の還元末端の糖を、転移によりα−１，α−１で結合させる活性を有する酵素と考えられる。また基質濃度が低い場合、及び長時間反応させた場合等においては、副反応、即ち、グルコースポリマーからグルコースを遊離する活性も有する。この詳細は、実施例Ｉ−７の具体例において示す通りである。
以上、本酵素の諸性質を述べたが、酵素作用／酵素反応様式のところで述べたように、本酵素の活性は、還元末端がα−１，４結合でグルコースが３つ結合したマルトトリオース以上の糖の還元末端の糖を、転移によりα−１，α−１で結合させるという活性であり、これは全く新規な酵素活性である。但し、以下の実施例において明らかなように、このような酵素活性以外の本酵素の諸性質に関しては、菌株の属或いは種の違いにより若干の差違がある。
グルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖の製造
本発明は、本酵素を用い、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質として作用させ、少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα−１，α−１結合で、該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα−１，４結合である糖を製造することを特徴とする末端の２糖がα−１，α−１結合である糖の製造法を提供するものであるが、該本発明の製造法を、最も典型的な具体例、即ち、グルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖の製造法でもって以下説明する。
本発明におけるグルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖の製造法は、古細菌が産生する本酵素によって、マルトオリゴ糖等の糖から、典型的には、マルトオリゴ糖各単独又はそれらの混合物から、グルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖を製造するものである。従って、古細菌が産生する本酵素がマルトオリゴ糖等の糖に作用可能な様態である限り、本酵素トランスフェラーゼとマルトオリゴ糖等の糖との接触の様態は特に限定されない。具体的には、一般的に、古細菌の菌体或いは菌体破砕物から粗酵素を得、次いで各種精製工程で得られた精製酵素、或いは各種精製手段を経て単離精製された酵素を直接マルトオリゴ糖等の糖に作用させればよい。或いは、上記酵素を常法に準じて担体に固定化し、固定化した酵素としてマルトオリゴ糖等の糖に接触させてもよい。なお、古細菌の複数種から得た二つ以上の本酵素を共存させて、マルトオリゴ糖等の糖と接触させてもよい。
上記の本発明の製造法において代表的な基質原料であるマルトオリゴ糖の混合物は、例えばデンプンをエンド型アミラーゼ、枝切り酵素などによる分解或いは酸分解に処し、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα−１，４結合であるように適宜分解することにより製造し得る。その際エンド型アミラーゼとしては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属等のバクテリア、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等のかび、麦芽等の植物由来の酵素等が利用できる。また枝切り酵素については、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属等バクテリア由来のプルラナーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のイソアミラーゼ等が利用できる。更にこれらの酵素を組み合わせても利用できる。
マルトオリゴ糖等の糖の使用濃度は、用いる糖が溶解されうる範囲であれば、本酵素の比活性、反応温度等を考慮して適宜選択すればよい。０．５〜７０％の範囲とするのが一般的であり、好ましくは５〜４０％の範囲である。糖と酵素との反応における反応温度及びｐＨ条件は、本酵素トランスフェラーゼの最適条件下で行うことが好ましい。よって、５０〜８５℃程度、ｐＨ３．５〜６．５程度の条件下で行うのが一般的であり、好ましくは６０〜８０℃、ｐＨ４．５〜６．０の範囲である。
生成されたグルコシルトレハロース或いはマルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖を含む反応液は、公知の方法に従い精製することができる。例えば、得られた反応液をイオン交換樹脂により脱塩し、活性炭、イオン交換樹脂（HSO3型）又は陽イオン交換樹脂（Ca型）等を分離剤とするクロマトグラフィーによって目的の糖画分を分離し、又は更に続いて濃縮し、結晶化することにより、高純度のトレハロースオリゴ糖を得ることができる。
新規トランスフェラーゼをコードする遺伝子
本発明によれば、更に上記の新規トランフェラーゼをコードする遺伝子が提供される。
本発明による新規トランスフェラーゼをコードしている遺伝子を含んでなるＤＮＡ断片としては、例えば図２６または図２９に示される制限酵素地図で表されるＤＮＡ断片が挙げられる。
このＤＮＡ断片は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属する古細菌から得ることが出来、好ましくはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する古細菌、より好ましくは後記するＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、またはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株から単離することが出来る。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、およびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株からのその好ましい単離法については、後記する実施例において詳細に説明されている。
このＤＮＡ断片を取得可能と思われる起源の具体例としては、さらにＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５３５４株、ＤＳＭ５８３３株、ＡＴＣＣ３５０９１株、ＡＴＣＣ３５０９２株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ４９４２６株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ  ＤＳＭ５３８９、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ１６５１株等を挙げることができる。これらの古細菌が、本発明によるＤＮＡ断片の起源となりうることは、後記する実施例Ｉ−１７のハイブリダイゼーション試験において、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の新規トランスフェラーゼ遺伝子が、これら古細菌の染色体ＤＮＡとハイブリッドを形成すること、さらには、上記したように酵素自体の性質も酷似していることを示していることからも明らかである。更にこの実施例の結果は、本発明による新規トランスフェラーゼ遺伝子が、Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属する古細菌に特異的に高度に保存されていることを示しているといえる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明による新規トランスフェラーゼをコードしている遺伝子の好ましい具体例として、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ断片が提供される。さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の好ましい具体例としては、配列番号１に示される塩基配列の３３５番から２５１８番までの塩基配列が挙げられる。配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の好ましい具体例としては、配列番号３に示される塩基配列の８１６番から２８５５番までの塩基配列が挙げられる。
一般に、タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は、いわゆるコドン表を参照して容易に定まる。よって配列番号２または４に示されるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を適宜選択することが可能である。従って、本発明において「配列番号２に示されるアミノ酸をコードするＤＮＡ配列」とは、配列番号１に示される塩基配列の３３５番から２５１８番の配列を有するもの、およびその縮重関係にあるコドンが使用されている以外は同一の塩基配列を有しかつ配列番号２に示されるアミノ酸をコードする塩基配列をも意味するものとする。また「配列番号４に示されるアミノ酸をコードするＤＮＡ配列」とは、配列番号３に示される塩基配列の８１６番から２８５５番の配列を有するもの、およびその縮重関係にあるコドンが使用されている以外は同一の塩基配列を有しかつ配列番号４に示されるアミノ酸をコードする塩基配列をも意味するものとする。
さらに、後記するように本発明による新規トランスフェラーゼには、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列の等価配列をも包含するものである。従って、本発明によるＤＮＡ断片には、さらにこの等価配列をコードする塩基配列も包含される。
なお、配列番号１または３に示される塩基配列と相同性を有する配列の存在について、塩基配列データバンク（ＥＭＢＬ）を通じて、配列解析ソフトジェネティックス（ソフトウエア開発）を用いて調べた結果、そのような配列は存在しないことを本発明者らは確認している。
本発明による配列番号１に示される塩基配列の３３５番から２５１８番の配列を有するＤＮＡ断片、および配列番号３に示される塩基配列の８１６番から２５１８番の配列を有するＤＮＡ断片は塩基配列が定まっていることから、そのＤＮＡ断片を取得する一つの手段は核酸合成の手法に従って製造することである。
またこの配列は、前記したＳｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属する古細菌、好ましくはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、またはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株から遺伝子工学的な手法を用いて得ることが出来る。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））などに記載の手法で好ましく行うことができる。具体的な方法は、後記する実施例に詳細に説明されている。
組換え新規トランスフェラーゼ
上記の通り、新規トランフェラーゼの遺伝子が提供されたことから、本発明によれば、この遺伝子の発現産物である組換え新規トランフェラーゼが提供される。
本発明による組換え新規トランスフェラーゼの好ましい具体例としては、図２６または図２９に示される制限酵素地図で表されるＤＮＡ断片の発現産物が挙げられる。
更に、好ましい具体例としては、配列表の配列番号２または４に示されるアミノ酸配列またはその等価配列を含んでなるポリペプチドが挙げられる。ここで、「その等価配列」とは、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、いくつかのアミノ酸の挿入、置換または欠失、若しくは両末端への付加がなされたものであって、かつその新規トランスフェラーゼ作用を依然として保持するものをいうものとする。その等価配列における新規トランスフェラーゼ作用の保持とは、その作用を利用した実際の使用態様において、配列番号２または４に示される配列を全て有するポリペプチドと、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいうものとする。このような「等価配列」は具体的に実施例Ｉ−１８においてＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、およびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株の２株の間で新規トランスフェラーゼのアミノ酸配列の相同性がギャップを考慮して計算した場合４９％であっても同一の活性が保持されていることからも、配列番号２および４に示される配列を参照すれば、当業者であれば格別の困難性なしに選択し、製造可能であることは明らかである。
後記する実施例Ｉ−１７において明らかにされているように、配列番号１および３に示される配列を有するＤＮＡ断片が、このＤＮＡ断片の起源であるＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、およびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株以外の他の菌株由来のＤＮＡ断片とハイブリッドを形成している。一方、上記したように、これらの菌株から性質の酷似した新規トランスフェラーゼの存在を今般確認した。また後記する実施例Ｉ−１８において明かにされるように、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株とＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株の２株の間で、新規トランスフェラーゼのアミノ酸配列の相同性はギャップを考慮して計算した場合４９％である。従って、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列とある程度の相同性ある配列において、新規トランスフェラーゼ活性が保持されうることは当業者に明らかであるといえる。
なお、配列番号２および４に示されるアミノ酸配列と相同性を有する配列の存在について、アミノ酸配列データバンク（Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ、およびＮＢＲＦ-ＰＦＢ）を通じて、配列解析ソフトジェネティックス（ソフトウエア開発）を用いて調べた結果、そのような配列は存在しないことを本発明者らは確認している。
新規トランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現
本発明による新規トランスフェラーゼをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特に発現ベクター、の形態として宿主細胞の形質転換を行えば、宿主細胞において本発明による組換え新規トランスフェラーゼを産生させることができる。
従って、本発明によれば、さらに本発明による新規トランスフェラーゼをコードする遺伝子を含んだＤＮＡ分子、特に発現ベクター、が提供される。このＤＮＡ分子は、ベクター分子に本発明による新規トランスフェラーゼをコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることが出来る。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。
この本発明によるＤＮＡ分子の作成は前掲のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌに記載の方法に準じて行うことができる。
本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＢＲ，ｐＵＣ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＣｐ系のベクターが挙げられる。
このプラスミドは形質転換体の選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性マーカー、栄養要求マーカー遺伝子を使用することができる。
さらに、本発明による発現ベクターとしてのＤＮＡ分子は、新規トランスフェラーゼ遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号、翻訳調節信号などを有しているのが好ましい。
プロモーターとしては、挿入断片に含まれる宿主中でも機能することができるプロモーターはもちろんのこと、大腸菌においてはラクトースオペロン（ｌａｃ）、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）等のプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ）、ガラクトース遺伝子（ＧＡＬ）、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＰＤ）等のプロモーターが好ましく用いることができるものとして挙げられる。
ここで、配列番号１に示される塩基配列の１番から２５７８番までの塩基配列および配列番号３に示される塩基配列の１番から３４６７番までの塩基配列は、上記の発現に必要な配列を含んでいると思われることから、この配列をそのまま利用するのも好ましい。
また、宿主細胞が枯草菌、酵母の場合には、分泌型ベクターを使用して、菌体外に組換え新規トランスフェラーゼ酵素を分泌することも有利である。
宿主細胞としては、大腸菌の他に、枯草菌、酵母、高等真核生物を用いることができる。枯草菌としては例えばＢａｃｉｌｕｓ属に属する微生物を用いることが好ましい。該属には、タンパク質を多く菌体外へ分泌する株が存在することが知られている。従って、分泌型ベクターを用いることにより、培養液中に多量の組換え新規アミラーゼを分泌させることが出来る。さらに培養上清からの精製も容易となるので好ましい。また、該属には菌体外にプロテアーゼをほとんど分泌しない株も知られており、このような株を用いることにより、本発明による組換え新規アミラーゼを効率よく生産することが出来るので好ましい。また、宿主細胞としてグルコアミラーゼを産生しない生物を選択すると、菌体抽出液、または簡単な精製を行った粗酵素の状態で本発明による組換え新規トランスフェラーゼを得て、それをそのまま後記するトレハロースオリゴ糖の製造に用いることができるので、極めて有利である。
前記した形質転換体の産生する組換え新規トランスフェラーゼは、次のようにして得ることが出来る。まず上記の宿主細胞を適切な条件下で培養し、得られた培養物から公知の方法、例えば遠心分離により菌体を得て、これを適切な緩衝液中に懸濁し、凍結融解、超音波処理、磨砕等により菌体を破砕し、遠心分離またはろ過により組換え新規トランスフェラーゼを含有する菌体抽出物を得る。
この菌体抽出物に存在する組換え新規トランスフェラーゼの精製には、公知の分離、精製法を適当に組み合わせて行うことができる。例えば、熱処理のような耐熱性の差を利用する方法、塩沈澱および溶媒沈澱のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外ろ過、ゲルろ過およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、更に等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法等が挙げられる。この組換え新規トランスフェラーゼは耐熱性を有するため、熱処理により宿主のタンパク質を変性させることにより、これを沈殿として除去できるため、精製を非常に簡単に行うことができる。
組換え新規トランフェラーゼを用いたトレハロースオリゴ糖の製造
更に本発明によれば、上記の組換え新規トランスフェラーゼを用いた、グルコシルトレハロースおよびマルトオリゴシルトレハロース等のいわゆるトレハロースオリゴ糖の製造法が提供される。
すなわち、本発明による方法は、少なくとも還元末端側の三糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα-１，α-１結合で、該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα-１，４結合であるトレハロースオリゴ糖の製造法であって、上記組換え新規トランスフェラーゼを、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα-１，４結合である三糖以上の糖と接触させることを含んでなる。
少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα-１，４結合である三糖以上の糖は特に限定されないが、デンプン、デンプン分解物、マルトオリゴ糖等が挙げられる。ここでデンプン分解物としては、デンプンをエンド型アミラーゼ、枝切り酵素などによる分解または酸分解に付し、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα-１，４結合であるように適宜分解することにより製造されたものが挙げられる。ここで用いられるエンド型アミラーゼとしては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属等のバクテリア、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等のかび、麦芽等の植物由来の酵素等が利用できる。また枝切り酵素としては、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属等バクテリア由来のプルラナーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のイソアミラーゼ等が利用できる。更にこれらの酵素を組み合わせて利用することも可能である。
本発明による組換え新規トランスフェラーゼと、少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα-１，４結合である三糖以上の糖との接触態様およびその条件は、組換え新規トランスフェラーゼが該糖に作用可能な様態である限り特に限定されない。溶液中で接触させる場合の好ましい態様を示せば次の通りである。すなわち、マルトオリゴ糖等の糖の使用濃度は、用いる糖が溶解されうる範囲であれば、本酵素の比活性、反応温度等を考慮して適宜選択してよいが、０．５〜７０％の範囲とするのが一般的であり、好ましくは５〜４０％の範囲である。糖と酵素との反応における反応温度およびｐＨ条件は、組換え新規トランスフェラーゼの最適条件下で行うことが好ましい。よって、５０〜８５℃程度、ｐＨ３．５〜６．５程度の条件下で行うのが一般的であり、好ましくは６０〜８０℃、ｐＨ４．５〜６．０の範囲である。
また、組換え新規トランスフェラーゼの精製の程度も適宜選択することができ、形質転換体の菌体破砕物から粗酵素のまま用いることもでき、また、各種精製工程で得られた精製酵素として利用してもよい。さらには各種精製手段を経て単離精製された酵素として用いてもよい。
さらに酵素は、常法に準じて担体に固定化し、固定化した状態で、糖と接触させてもよい。
生成したグルコシルトレハロース、マルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖は、反応液を公知の方法に従い精製することにより得ることが出来る。例えば、得られた反応液をイオン交換樹脂により脱塩し、活性炭、イオン交換樹脂（ＨＳＯ３型）又は陽イオン交換樹脂（Ｃａ型）等を分離剤とするクロマトグラフィーによって目的の糖画分を分離し、又は更に続いて濃縮し、結晶化することにより、高純度のトレハロースオリゴ糖を得ることができる
II．新規アミラーゼ
本発明の新規アミラーゼを産生する微生物
本発明において利用されうる古細菌としては、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株（本発明者らにより自然界から実質的に純粋な形で分離した前述の新菌株）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５８３３株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３９０９（ＤＳＭ  ６３９）株等を挙げることができる。
本発明の新規アミラーゼを産生する微生物は、このように、分類学上Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属するかなり広い範囲の古細菌に及ぶと考えられる。ここにおいて、Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目とは、分類学上、高度好熱性（温度：５５℃〜８８℃の範囲で生育）、好酸性（ｐＨ：１〜６の範囲で生育）、好気性、硫黄細菌（球菌（不規則）：直径０．６〜２μｍ）として定義される古細菌である。上記のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５８３３株は以前はＣａｌｄａｒｉｅｌｌａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌａと命名されていた菌である。よって、このような事実から、上記の古細菌に遺伝学的に或いは分類学的に近縁であり、かつ同種の酵素を産生しうる菌、及び該菌の菌株を各種変異剤によって処理して得られる変異株はすべて本発明において使用できることは言うまでもない。
上記において例示した微生物の中で、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株は本発明者らが群馬県の温泉から分離した菌株であって、その性質、培養法並びに寄託に関しては、前述において詳しく説明したとおりのものである。
本発明の新規アミラーゼを産生する微生物の培養
本発明の新規アミラーゼ産生のための培養条件は、該アミラーゼを産生しうる範囲内で適宜選択すればよい。液体振とう培養又は通気撹拌培養の場合は各微生物が生育するｐＨ、培養温度で、２日〜７日間の培養が適当である。培地としては、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）発行  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｅｓ  １８版（１９９２）及びＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）発行Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ５版（１９９３）に記載のものを好ましく用いることができる。更に糖源としてデンプン、マルトオリゴ糖等を加えてもよい。
本発明の新規アミラーゼの精製
上記微生物の産生する本発明の新規アミラーゼの抽出は、まず上記のような培養方法により得られた培養物から公知の方法、例えば、遠心分離により菌体を得て、これを適切な緩衝液中に懸濁し、凍結融解、超音波処理、磨砕等により菌体を破砕し、遠心分離又はろ過により該アミラーゼを含有する菌体抽出物を得る。
この菌体抽出物に存在する本発明の新規アミラーゼの精製には、公知の分離、精製法を適当に組み合わせて行うことができる。例えば、塩沈澱及び溶媒沈澱のような溶解性を利用する方法、透析、限外ろ過、ゲルろ過、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、更に等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法等が挙げられる。これらの具体的な例は、後述の実施例II−２〜II−４に示すとおりである。最終的にネイティブポリアクリルアミドゲル、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル或いは等電点電気泳動にて単一バンドを示す酵素を精製酵素として得る。
上記したような各種の精製過程において分離された酵素或いは酵素含有物の活性測定に関しては、Ｌａｍａらの方法における活性測定法ではデンプンを基質として行っており、それによれば、各種アミラーゼが複数存在している状態ではデンプンの分解が検出できるものの、それらのアミラーゼがそれぞれ分離された状態では検出感度、定量性が共に低く、また、この方法では精製途中においてデンプン分解活性はほとんど消失して確認できなくなるという大きな問題があり、酵素活性本体の精製、特定化は実質上不可能であった。ところが、本発明者らにより、トレハロースオリゴ糖（例えばマルトトリオシルトレハロース）を基質とし、α，α−トレハロースとマルトオリゴ糖（例えばマルトトリオース）に分解する活性を指標とする新しい活性測定法を採用したところ、非常に特異性、検出感度、及び定量性が高く、初めて目的とする酵素の単離精製が可能となり、ようやくにして、本発明の新規アミラーゼ活性本体の精製及び特定化を実現し得たのである。
本発明の新規アミラーゼの諸性質
本発明の酵素例として、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５８３３株、及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３９０９（ＤＳＭ  ６３９）株の古細菌がそれぞれ産生した新規アミラーゼについてそれらの酵素学的な諸性質を下記の第２表にまとめて示す。なお、表中のデータは、実施例II−５に示した具体例に基づくものである。
0004033897.tif 000003
註１：経時変化
可溶性デンプンを基質として用いた場合、反応初期にヨウ素デンプン反応が速やかに消失し、引き続き、マルトース、グルコースを主成分として若干量のマルトトリオース、マルトテトラオースを生成するように分解した。
註２：酵素作用／酵素反応様式
本酵素はデンプン、デンプン分解物、及びマルトオリゴ糖を基質とした場合、加水分解反応により主にグルコース、マルトースを生成し、少量のマルトトリオース、マルトテトラオースを生成する。本活性の作用機作についてはこれらの基質に対してエンド型に作用するアミラーゼ活性と共にその還元末端側から主に単糖、２糖を生成する活性を有する。
特に、還元末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα−１，α−１結合で、該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα−１，４結合である３糖以上の糖（例えばトレハロースオリゴ糖）との反応性が高く、これを基質とした場合、還元末端側から２つ目と３つ目のグルコース間のα−１，４結合を加水分解して反応の初期に特異的にα，α−トレハロースを遊離する活性を有する。
よって、本酵素は新規なアミラーゼであると考えられる。この詳細は、実施例II−５の具体的な例において示す通りである。
以上、本酵素の諸性質を述べたが、第２表及び後述の実施例から明らかなように、酵素活性以外の本酵素の諸性質に関しては、菌株の属或いは種の違いにより若干の差異があるのが認められる。
α，α−トレハロースの製造において用いられるトランスフェラーゼ
本発明のα，α−トレハロースの製造法において使用するトランスフェラーゼとしては、前述のＩ．新規トランフェラーゼの項において詳説した本発明のトランフェラーゼを用いることができる。具体的には、例えばＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ３５０９１（ＤＳＭ  １６１６）株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５８３３株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３９０９（ＤＳＭ  ６３９）株、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ  １６５１株等が産生するトランスフェラーゼを挙げることができる。
上記トランスフェラーゼは、例えば、後述する実施例Ｉ−２〜Ｉ−５に示す方法に従って製造することができる。こうして得られたトランスフェラーゼは後述の実施例Ｉ−６において示すような諸性質を有するものである。
α，α−トレハロースの製造
本発明は、本発明の新規アミラーゼとトランスフェラーゼとを用いて、α，α−トレハロースを製造する方法を提供するものであるが、該本発明の製造法を、最も典型的な具体例、即ち、デンプン、デンプン分解物、及びマルトオリゴ糖等の糖原料から、α，α−トレハロースを製造する方法でもって以下説明する。なお、デンプン等に上記の２つの酵素が作用する機構は、多分、以下の通りであると考えられる。すなわち、デンプン、デンプン分解物、或いはマルトオリゴ糖に本発明の新規アミラーゼがそのエンド型活性により、まず作用してこのものをアミロース又はマルトオリゴ糖に分解し、続いて、トランスフェラーゼの作用によって該アミロース又はマルトオリゴ糖の還元末端のα−１，４結合をα−１，α−１結合に転位させ、更に、再び新規アミラーゼが作用してα，α−トレハロースと、重合度を２つ減じたアミロース又はマルトオリゴ糖を生成し、こうして生じたアミロース又はマルトオリゴ糖に上記の反応が繰り返されて、延いては、高収率でα，α−トレハロースが生成されるようになるのではないかと考えられる。
このような作用機構は、還元末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα−１，α−１結合で、該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα−１，４結合である３糖以上の糖（例えばトレハロースオリゴ糖）に対する反応性が、それぞれ対応するマルトオリゴ糖との反応性に比較して高く、上記の３糖以上の糖の還元末端側の２つ目と３つ目のグルコース間のα−１，４結合を特異的に加水分解してα，α−トレハロースを遊離するという、本発明の新規アミラーゼの特異的な反応様式に起因するものと考えられる。
本発明者らの知る限りでは、従来知られているアミラーゼで、マルトオリゴ糖の還元末端がα−１，α−１結合となったマルトオリゴシルトレハロースを、そのα−１，α−１結合のとなりのα−１，４結合の位置で特異的に加水分解し、収率よくα，α−トレハロースを遊離する活性を有するものはなく、従ってα，α−トレハロースを高い収率で生成することはほとんど不可能であった。
本発明におけるα，α−トレハロースの製造法は、古細菌が産生する本発明のアミラーゼ（本酵素）がデンプン、デンプン分解物、及びマルトオリゴ糖等の糖に作用可能な様態である限り、該アミラーゼ、及びトランスフェラーゼとデンプン、デンプン分解物、及びマルトオリゴ糖等の糖との接触の様態は特に限定されない。具体的には、一般的に、古細菌の菌体或いは菌体破砕物から粗酵素を得、次いで各種精製工程で得られた精製酵素、或いは各種精製手段を経て単離精製された酵素を直接デンプン、デンプン分解物、或いはマルトオリゴ糖等の糖に作用させればよい。或いは、そのようにして得た酵素を担体に固定化し、固定化された酵素としてデンプン、デンプン分解物、或いはマルトオリゴ糖等の糖に接触させてもよい。なお古細菌の複数種から得た二つ以上の本酵素を共存させて、デンプン、デンプン分解物、或いはマルトオリゴ糖等の糖と接触させてもよい。
本発明のα，α−トレハロースの製造法において、上記アミラーゼ、及びトランスフェラーゼの使用量については、いずれも最適範囲内で使用されるべきである。即ち、過剰のアミラーゼは、還元末端がトランスフェラーゼにより作用を受けていないデンプン、デンプン分解物、或いはマルトオリゴ糖に作用してグルコース、マルトースを生成するようになり、一方、過剰のトランスフェラーゼは、同酵素によって生成したマルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖を副反応により分解し、グルコースを生成するようになるからである。
具体的には、アミラーゼ及びトランスフェラーゼの基質に対する濃度は、それぞれ１．５Ｕ／ml及び０．１Ｕ／ml以上、好ましくはそれぞれ１．５Ｕ／ml及び１．０Ｕ／ml以上、更に好ましくはそれぞれ１５Ｕ／ml及び１．０Ｕ／ml以上であり、また、アミラーゼ対トランスフェラーゼの濃度比は１００〜０．０７５、好ましくは４０〜３である。
デンプン、デンプン分解物、及びマルトオリゴ糖等の糖の使用濃度は、用いる糖が溶解されうる範囲であれば、用いる酵素の比活性、反応温度等を考慮して適宜選択すればよい。０．５〜７０％の範囲とするのが一般的であり、好ましくは５〜４０％の範囲である。糖と酵素との反応における反応温度及びｐＨ条件は、アミラーゼ、及びトランスフェラーゼの最適条件で行うことが好ましい。よって、５０〜８５℃程度、ｐＨ３．５〜８程度の条件下で行うのが一般的であり、好ましくは６０〜７５℃、ｐＨ４．５〜６．０の範囲である。
また、用いる糖原料が高重合度のデンプン、デンプン分解物等の場合は、補助的に他のエンド型液化アミラーゼを併用することにより、α，α−トレハロースの生成を促進させることができる。更にプルラナーゼ、イソアミラーゼ等の枝切り酵素を用いることもできる。この場合のエンド型アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ等については、古細菌が産生する酵素である必要はない。よって、特に限定されないが、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属等のバクテリア、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等のかび、麦芽等の植物由来のアミラーゼが利用できる。また枝切り酵素については、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属等バクテリア由来のプルラナーゼ（耐熱性のプルラナーゼを含む）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のイソアミラーゼ等が利用できる。更にこれらの酵素どうしを組み合わせても利用できる。
ただし、過剰量のアミラーゼの添加はトランスフェラーゼによって利用されないグルコース、マルトースを生成する可能性がある。また、枝切り酵素においても同様に、過剰量の添加は１，６結合の切断による基質の溶解度の低下を引き起こし、利用されない高粘度の不溶物質（アミロース）を生じるようになる。よって、用いるアミラーゼ及び枝切り酵素等の量は、過剰のグルコース、マルトース、或いは不溶性物質を生成させないように注意して調節する必要がある。例えば、枝切り酵素に関しては、その使用濃度は、本発明のアミラーゼの比活性、反応温度等を考慮し、かつ不溶性物質を生成させない範囲で適宜選択する必要がある。具体的には、４０℃にて１ｈｒ処理する場合は、基質に対して０．０１〜１００Ｕ／ｍｌの範囲とするのが一般的であり、好ましくは０．１〜２５Ｕ／ｍｌの範囲である。（枝切り酵素の活性の定義については実施例II−６，１３及び１４参照。）枝切り酵素を用いる場合は、α，α−トレハロースの生成反応の前に予め基質を枝切り酵素にて前処理する方法、又はα，α−トレハロースの生成反応に際していずれかの段階でアミラーゼ及びトランスフェラーゼと共存させて用いる方法などいずれであってもよい。なお、その際枝切り酵素はいずれかの段階で１回以上組み合わせて用いるのが好ましく、特に初期の段階で１回以上組み合わせて用いるのが好ましい。なお、耐熱性枝切り酵素を用いる場合はα，α−トレハロース生成反応に際していずれかの段階、或いは初期の段階において、１回添加するのみで同様の効果が得られる。
生成されたα，α−トレハロースを含む反応液は、公知の方法に従い精製することができる。例えば、得られた反応液をイオン交換樹脂により脱塩し、活性炭、イオン交換樹脂（HSO ３型）、又は陽イオン交換樹脂（Ca型）等を分離剤とするクロマトグラフィーによって目的の糖画分を分離し、又は更に続いて濃縮し、結晶化することにより、高純度のα，α−トレハロースを得ることができる。
新規アミラーゼをコードする遺伝子
本発明によれば更に上記の新規アミラーゼをコードする遺伝子が提供される。
本発明による新規アミラーゼをコードしている遺伝子を含むＤＮＡ断片の具体例としては、図３４または図３８に示される制限酵素地図で表されるＤＮＡ断片が挙げられる。
このＤＮＡ断片は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属する古細菌から得ることが出来、好ましくはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する古細菌、より好ましくは後記するＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、またはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株から単離することが出来る。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、およびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株からのその好ましい単離法については、後記する実施例において詳細に説明されている。
このＤＮＡ断片を取得可能と思われる起源の具体例としては、さらにＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ５３５４株、ＤＳＭ５８３３株、ＡＴＣＣ３５０９１株、ＡＴＣＣ３５０９２株  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ４９４２６株  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ  ＤＳＭ５３８９株  Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ１６５１株等を挙げることができる。これらの古細菌が、本発明によるＤＮＡ断片の起源となりうることは、後記する実施例II−２４のハイブリダイゼーション試験において、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株  およびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株由来の新規アミラーゼ遺伝子が、これら古細菌の染色体ＤＮＡとハイブリッドを形成すること、さらには、上記したように酵素自体の性質も酷似していることを示していることからも明らかである。更にこの実施例の結果は、本発明による新規アミラーゼ遺伝子が、Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属する古細菌に特異的に高度に保存されていることを示しているといえる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明による新規アミラーゼをコードしている遺伝子の好ましい具体例として、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ断片が提供される。さらに、配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の好ましい具体例としては、配列番号５に示される塩基配列の６４２番から２３１５番までの塩基配列が、また配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の好ましい具体例として配列番号７に示される塩基配列の１１７６番から２８４３番が挙げられる。
一般に、タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は、いわゆるコドン表を参照して容易に定まる。よって配列番号６または８に示されるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を適宜選択することが可能である。従って、本発明において「配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列」とは、配列番号５に示される塩基配列の６４２番から２３１５番の配列を有するもの、およびその縮重関係にあるコドンが使用されている以外は同一の塩基配列を有しかつ配列番号６に示されるアミノ酸をコードする塩基配列をも意味するものとする。また「配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列」とは、配列番号７に示される塩基配列の１１７６番から２８４３番の配列を有するもの、およびその縮重関係にあるコドンが使用されている以外は同一の塩基配列を有しかつ配列番号８に示されるアミノ酸をコードする塩基配列をも意味するものとする。
さらに、後記するように本発明による新規アミラーゼには、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列の等価配列をも包含するものである。従って、本発明によるＤＮＡ断片には、さらにこの等価配列をコードする塩基配列も包含される。
そしてさらに、本発明による新規アミラーゼには、配列番号６に示されるアミノ酸配列のＮ末端に更にＭｅｔが付加した配列が包含される。よって、本発明による新規アミラーゼを含むＤＮＡ断片には、配列番号５に示される塩基配列の６３９番から２３１５番の配列を有するものが包含される。
なお、配列番号５および７に示される塩基配列と相同性を有する配列の存在について、塩基配列データバンク（ＥＭＢＬ）を通じて、配列解析ソフトジェネティックス（ソフトウエア開発）を用いて調べた結果、そのような配列は存在しないことを本発明者らは確認している。
本発明による配列番号５に示される塩基配列の６３９番または６４２番から２３１５番の配列を有するＤＮＡ断片、または配列番号７に示される塩基配列の１１７６番から２８４３番の配列を有するＤＮＡ断片は塩基配列が定まっていることから、そのＤＮＡ断片を取得する一つの手段は核酸合成の手法に従って製造することである。
またこの配列は、前記したＳｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属する古細菌、好ましくはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、またはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株から遺伝子工学的な手法を用いて得ることが出来る。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））などに記載の手法で好ましく行うことができる。具体的な方法は、後記する実施例に詳細に説明されている。
組換え新規アミラーゼ
上記の通り、新規アミラーゼの遺伝子が提供されたことから、本発明によれば、この遺伝子の発現産物である組換え新規アミラーゼが提供される。
本発明による組換え新規アミラーゼの好ましい具体例としては、図３４または図３８に示される制限酵素地図で表されるＤＮＡ断片の発現産物が挙げられる。
更に、好ましい具体例としては、配列表の配列番号６または８に示されるアミノ酸配列またはその等価配列を含んでなるポリペプチドが挙げられる。ここで、「その等価配列」とは、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列において、いくつかのアミノ酸の挿入、置換、または欠失、若しくは両末端への付加がなされたものであって、かつその上記した新規アミラーゼ活性を依然として保持するものをいうものとする。その等価配列における新規アミラーゼ活性の保持とは、その活性を利用した実際の使用態様において、配列番号６または８に示される配列を全て有するポリペプチドと、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいうものとする。このような「等価配列」は具体的に実施例II−２３においてＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株とＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株の２株の間で、新規アミラーゼの相同性がアミノ酸配列レベルでギャップを考慮して計算した場合５９％であっても、同一の活性が保持されていることからも、配列番号６または８に示される配列を参照すれば、当業者であれば格別の困難性なしに選択し、製造可能であることは明らかである。
さらに、本発明の別の態様によれば、この配列番号６に示されるアミノ酸配列のＮ末端にＭｅｔが更に付加されたアミノ酸配列が更に提供される。本発明による新規アミラーゼはその天然型において配列番号６に示される配列を有していた。しかしながら、後記するように単離されたその遺伝子情報から、その配列を利用して遺伝子組換えの手法により新規アミラーゼを得た場合、配列番号６のアミノ酸配列のＮ末端に更にＭｅｔが付加したものが得られることがわかる。更にこの配列が新規アミラーゼ活性を有することは明らかであり、よって、このＭｅｔが付加したアミノ酸配列も本願発明に包含される。
後記する実施例II−２４において明らかにされているように、配列番号７に示される１３９３番から２１１６番までの配列を有するＤＮＡ断片が、このＤＮＡ断片の起源であるＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株またはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株以外の他の菌株由来のＤＮＡ断片とハイブリッドを形成している。一方、上記したように、これらの菌株から性質の酷似した新規アミラーゼの存在を今般確認した。また後記する実施例II−２３において明らかにされるように、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株とＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株の２株の間で、新規アミラーゼのアミノ酸配列の相同性はギャップを考慮して計算した場合５９％である。従って、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列とある程度の相同性ある配列において、新規アミラーゼ活性が保持されうることは当業者に明らかであるといえる。
なお、配列番号６および８に示されるアミノ酸配列と相同性を有する配列の存在について、アミノ酸配列データバンク（Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ、およびＮＢＲＦ-ＰＦＢ）を通じて、配列解析ソフトジェネティックス（ソフトウエア開発）を用いて調べた結果、そのような配列は存在しないことを本発明者らは確認している。
新規アミラーゼをコードする遺伝子の発現
本発明による新規アミラーゼをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特に発現ベクター、の形態として宿主細胞の形質転換を行えば、宿主細胞において本発明による新規アミラーゼを産生させることができる。
従って、本発明によれば、さらに本発明による新規アミラーゼをコードする遺伝子を含んだＤＮＡ分子、特に発現ベクター、が提供される。このＤＮＡ分子は、ベクター分子に本発明による新規アミラーゼをコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることが出来る。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。
この本発明によるＤＮＡ分子の作成は前掲のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌに記載の方法に準じて行うことができる。
本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＢＲ、ｐＵＣ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＣｐ系のベクターが挙げられる。
このプラスミドは形質転換体の選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性マーカー、栄養要求マーカー遺伝子を使用することができる。
さらに、本発明による発現ベクターとしてのＤＮＡ分子は、新規アミラーゼ遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号、翻訳調節信号などを有しているのが好ましい。
プロモーターとしては、挿入断片に含まれる宿主中でも機能するこどができるプロモーターはもちろんのこと、大腸菌においてはラクトースオペロン（ｌａｃ）、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）等のプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ）、ガラクトース遺伝子（ＧＡＬ）、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＰＤ）等のプロモーターが好ましく用いることができるものとして挙げられる。
ここで、配列番号５に示される塩基配列の１番から２６９１番までの塩基配列および配列番号７に示される塩基配列の１番から３６００番までの塩基配列は大腸菌において新規アミラーゼを効率よく発現させる。よって、この配列番号５および７に示される塩基配列は、少なくとも大腸菌における発現に必要な配列を含んでいると思われることから、この配列をそのまま利用するのも好ましい。
また、宿主細胞が枯草菌、酵母の場合には、分泌型ベクターを使用して、菌体外に新規アミラーゼを分泌することも有利である。
宿主細胞としては、大腸菌の他に、枯草菌、酵母、高等真核生物を用いることができる。枯草菌としては例えばＢａｃｉｌｕｓ属に属する微生物を用いることが好ましい。該属には、タンパク質を多く菌体外へ分泌する株が存在することが知られている。従って、分泌型ベクターを用いることにより、培養液中に多量の組換え新規アミラーゼを分泌させることが出来る。さらに培養上清からの精製も容易となるので好ましい。また、該属には菌体外にプロテアーゼをほとんど分泌しない株も知られており、このような株を用いることにより、本発明による組換え新規アミラーゼを効率よく生産することが出来るので好ましい。また、宿主細胞としてグルコアミラーゼを産生しない生物を選択すると、菌体抽出液、または簡単な精製を行った粗酵素の状態で本発明による組換え新規アミラーゼを得て、それをそのまま後記するα，α-トレハロースの製造に用いることができるので、極めて有利である。
前記した形質転換体の産生する組換え新規アミラーゼは、次のようにして得ることが出来る。まず上記の宿主細胞を適切な条件下で培養し、得られた培養物から公知の方法、例えば遠心分離により菌体を得て、これを適切な緩衝液中に懸濁し、凍結融解、超音波処理、磨砕等により菌体を破砕し、遠心分離またはろ過により組換え新規アミラーゼを含有する菌体抽出物を得る。
この菌体抽出物に存在する組換え新規アミラーゼの精製には、公知の分離、精製法を適当に組み合わせて行うことができる。例えば、熱処理のような耐熱性の差を利用する方法、塩沈澱および溶媒沈澱のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外ろ過、ゲルろ過およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、更に等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法等が挙げられる。この組換え新規アミラーゼは耐熱性を有するため、熱処理により宿主のタンパク質を変性させることにより、これを沈澱として除去できるため、精製を非常に簡単に行うことができる。
組換え体を用いたα，α-トレハロースの製造
本発明によれば、上記の組換え新規アミラーゼと、前記した組換え新規トランスフェラーゼを用いた、α，α-トレハロースの製造法が提供される。
α，α-トレハロースの製造法の好ましい態様によれば、本発明による組換え新規アミラーゼと、組換え新規トランスフェラーゼは同時にデンプン、デンプン分解物、マルトオリゴ糖等の糖と、混合され、接触されてよい。また、組換え新規トランフェラーゼ及び組換え新規アミラーゼのいずれか一方を天然由来の酵素に置き換えることも好ましい。
デンプン、デンプン分解物、マルトオリゴ糖等の糖の使用濃度は、用いる糖が溶解されうる範囲であれば、本酵素の比活性、反応温度等を考慮して適宜選択されて良いが、０．５〜７０％の範囲とするのが一般的であり、好ましくは５〜４０％の範囲である。糖と酵素との反応における反応温度及びｐＨ条件は本発明による組換え新規アミラーゼ、および組換え新規トランスフェラーゼの最適条件で行うことが好ましい。よって５０〜８５℃程度、ｐＨ３．５〜８程度が一般的であり、好ましくは６０〜７５℃、ｐＨ４．５〜６．０の範囲である。
また高重合度のデンプン、デンプン分解物等の糖においては、補助的にエンド型液化アミラーゼ、枝切り酵素を用いることによりα，α-トレハロースの生成を促進させることができる。このようなエンド型液化アミラーゼとしては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属等のバクテリア、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等のかび、麦芽等の植物由来の酵素等が利用できる。また枝切り酵素については例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属等バクテリア由来のプルラナーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のイソアミラーゼ等が利用できる。更にこれらの酵素を組み合わせて使用することも可能である。
ただし、過剰量のエンド型液化アミラーゼの添加は新規トランスフェラーゼによって利用されないグルコース、マルトースを生成する。またプルラナーゼにおいても同様に過剰量の添加はα-１，６結合の切断による基質の溶解度の低下を引き起こし利用されない高粘度の不溶物を生じる。よってこの際に用いるエンド型液化アミラーゼおよびプルラナーゼの量は過剰のグルコース、マルトース、または不溶物を生成しないよう調節されるのが好ましい。
また、プルラナーゼを用いる場合は、基質をあらかじめプルラナーゼにて前処理する方法、またはα，α-トレハロースの生成反応に際していずれかの段階で組換え新規アミラーゼおよび新規トランスフェラーゼとを共存させて用いる方法のいずれであってもよい。
生成されたα，α-トレハロースは、反応液を公知の方法に従い精製することによって得ることが出来る。例えば、得られた反応液をイオン交換樹脂により脱塩し、活性炭、イオン交換樹脂（ＨＳＯ３型）、または陽イオン交換樹脂（Ｃａ型）等を分離剤とするクロマトグラフィーによって目的の糖画分を分離し、または更に続いて濃縮し、結晶化させることにより、高純度のα，α-トレハロースを得ることができる。
以下に、具体的な実施例を示し、本発明をより詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に制限されないことは言うまでもない。
実施例Ｉ−１ 古細菌のグルコシルトレハロース生成活性
下記の第３表に示す菌株についてグルコシルトレハロース生成活性を調べた。方法としては、各菌株の培養菌体を超音波破砕処理、遠心分離を行い、その上清に基質であるマルトトリオースを最終的に１０％となるように加え、６０℃で２４時間反応後、１００℃で５分間加熱処理して反応を停止させた後、生成したグルコシルトレハロースを、以下に示す条件のＨＰＬＣ分析法により測定した。
カラム：  TOSOH TSK-gel Amide-80（4.6×250mm）
溶媒  ：  ７５％アセトニトリル
流速  ：  １．０ml/min
温度  ：  室温
検出器：  示差屈折計
酵素活性は、マルトトリオースを１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースに変換する酵素活性を１ユニットとして示した。但し、第３表においては菌体ｇ当りの活性として示した。
そのＨＰＬＣチャートは図１（Ｂ）に示す通りである。図に示すように、主反応物はＨＰＬＣチャート上ではアノマーのない一本のピークとして、未反応基質よりやや遅れて現れた。なお、この主生成物をTSK-gel amide-80 HPLC columnにて分取し、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲにより解析の結果、グルコシルトレハロースであることを確認した。化学式は以下の通りである。
0004033897.tif 000004
その結果、Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属する菌株の細胞抽出液はグルコシルトレハロース生成活性、即ち、本酵素トランスフェラーゼ活性を有することがわかった。
0004033897.tif 000005
実施例Ｉ−２ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の本酵素トランスフェラーゼの精製
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株を、２ｇ／リットルの可溶性デンプン及び２ｇ／リットルの酵母エキスを含むＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）発行Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｅｓ  １８版（１９９２）に記載の培地番号１３０４の培地で７５℃、３日間培養した。遠心分離により集菌し、−８０℃にて保存した。菌体の収率は３．３ｇ／リットルであった。
上記のようにして得られた菌体２００ｇを５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）４００ｍｌに懸濁し、０℃で１５分間、超音波破砕処理により溶菌し、次に遠心分離を行い上清溶液を得た。これに硫安を６０％飽和となるように加えた。
遠心分離して得られた沈澱を１Ｍの硫安、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、同緩衝液にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S  ８００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次に６００ｍｌの１Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配で標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次いで同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel DEAE-TOYOPEARL 650S ３００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、引き続き９００ｍｌの０Ｍ〜０．３Ｍ食塩の線状勾配で標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き０．１５Ｍの食塩、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次に脱塩濃縮液をゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg）に載せ、同緩衝液にて標的トランスフェラーゼを溶出した。活性画分をを限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次に脱塩濃縮液に１Ｍとなるよう硫安を溶解し、同緩衝液にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-5PW HPLC）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで３０ｍｌの１Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配で標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）にて洗浄、脱塩した。
次に同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel DEAE 5PW HPLC）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで３０ｍｌの０Ｍ〜０．３Ｍ食塩の線状勾配で標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮した。
最終的にネイティブポリアクリルアミドゲル、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、及び等電点電気泳動にて単一バンドを示す精製酵素を得た。
なお、活性測定は、実施例Ｉ−１と同様に行った。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第４表に示す。
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実施例Ｉ−３ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ５８３３株由来の本酵素トランスフェラーゼの精製
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ５８３３株を、２ｇ／リットルの可溶性デンプン及び２ｇ／リットルの酵母エキスを含むＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）発行Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｅｓ  １８版（１９９２）に記載の培地番号１３０４の培地で７５℃、３日間培養した。遠心分離により集菌し、−８０℃にて保存した。菌体の収率は１．７ｇ／リットルであった。
上記のようにして得られた菌体５６ｇを５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌに懸濁し、０℃で１５分間、超音波破砕処理により溶菌し、次に遠心分離を行い上清溶液を得た。
次に上清溶液に１Ｍとなるよう硫安を溶解し、１Ｍの硫安、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S ２００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで６００ｍｌの１Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配で標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄、脱塩した。
次に同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel DEAE-TOYOPEARL 650S ３００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで９００ｍｌの０Ｍ〜０．３Ｍ食塩の線状勾配で標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次に脱塩濃縮液に１Ｍとなるよう硫安を溶解し、同緩衝液にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S ２００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで６００ｍｌの１Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配で標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き０．１５Ｍの食塩、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次に脱塩濃縮液をゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg）に載せ、同緩衝液にて標的トランスフェラーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き２５ｍＭ  ビス-トリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．７）にて透析した。
次に同緩衝液にて平衡化したクロマトフォーカシング（カラム：ファルマシアMono P HR/5/20）に通した。サンプルを注入後、直ちに１０％ポリバッファー７４ＨＣｌ（ｐＨ５．０ファルマシア社製）にて標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き２５ｍＭ  ビス-トリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．７）にて透析した。
さらに同様の条件にてクロマトフォーカシングを行い、標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
最終的にネイティブポリアクリルアミドゲル、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、及び等電点電気泳動にて単一バンドを示す精製酵素を得た。
なお、活性測定は、実施例Ｉ−１と同様に行った。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第５表に示す。
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実施例Ｉ−４ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３９０９株由来の本酵素トランスフェラーゼの精製
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３９０９株を、２ｇ／リットルの可溶性デンプン及び２ｇ／リットルの酵母エキスを含むＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）発行  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｅｓ  １８版（１９９２）に記載の培地番号１３０４の培地（ｐＨ３．０）で７５℃、３日間培養した。遠心分離により集菌し、−８０℃にて保存した。菌体の収率は２．９ｇ／リットルであった。
上記のようにして得られた菌体９２．５ｇを５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２００ｍｌに懸濁し、０℃で１５分間、超音波破砕処理により溶菌し、次いで遠心分離を行い上清溶液を得た。
次に上清溶液に１Ｍとなるよう硫安を溶解し、１Ｍの硫安、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S ４００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで６００ｍｌの１Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配で標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄、脱塩した。
次に同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel DEAE-TOYOPEARL 650S ３００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで９００ｍｌの０Ｍ〜０．３Ｍ食塩の線状勾配で標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外憾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次に脱塩濃縮液に１Ｍとなるよう硫安を溶解し、同緩衝液にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S ２００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで６００ｍｌの１Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配で標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き０．１５Ｍの食塩、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次に脱塩濃縮液をゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg）に載せ、同緩衝液にて標的トランスフェラーゼを溶出した。活性画分をを限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き２５ｍＭ  ビス-トリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．７）にて透析した。
次に同緩衝液にて平衡化したクロマトフォーカシング（カラム：ファルマシアMono P HR/5/20）に通した。サンプルを注入後、直ちに１０％ポリバッファー７４ＨＣｌ（ｐＨ５．０  ファルマシア社製）にて標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き２５ｍＭ  ビス-トリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．７）にて透析した。
さらに同様の条件にてクロマトフォーカシングを行い、標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
最終的にネイティブポリアクリルアミドゲル、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、及び等電点電気泳動にて単一バンドを示す精製酵素を得た。
なお、活性測定は、実施例Ｉ−１と同様に行った。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第６表に示す。
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実施例Ｉ−５ Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ  １６５１株由来の本酵素トランスフェラーゼの精製
Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ  １６５１株を、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）発行Ｃａｔａｌｏｇｕｅｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ５版（１９９３）に記載の培地番号１５０の培地で７０℃、３日間培養した。遠心分離により集菌し、−８０℃にて保存した。菌体の収率は０．６ｇ／リットルであった。
上記のようにして得られた菌体１２ｇを５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１２０ｍｌに懸濁し、０℃で１５分間、超音波破砕処理により溶菌し、次いで遠心分離を行い上清溶液を得た。
次に上清溶液に１Ｍとなるよう硫安を溶解し、１Ｍの硫安、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S ２００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで６００ｍｌの１Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配で標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄、脱塩した。
次に同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel DEAE-TOYOPEARL 650S ３００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで９００ｍｌの０Ｍ〜０．３Ｍ食塩の線状勾配で標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き０．１５Ｍの食塩、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次に脱塩濃縮液をゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg）に載せ、同緩衝液にて標的トランスフェラーゼを溶出した。活性画分をを限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き２５ｍＭ  ビス-トリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．７）にて透析した。
次に同緩衝液にて平衡化したクロマトフォーカシング（カラム：ファルマシアMono P HR5/20）に通した。サンプルを注入後、直ちに１０％ポリバッファー７４ＨＣｌ（ｐＨ５．０  ファルマシア社製）にて標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
最終的にネイティブポリアクリルアミドゲル、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、及び等電点電気泳動にて単一バンドを示す精製酵素を得た。
なお、活性測定は、実施例Ｉ−１と同様に行った。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第７表に示す。
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実施例Ｉ−６ 本酵素トランスフェラーゼの諸性質の検討
実施例Ｉ−２で得られた精製酵素の酵素学的諸性質を測定した。
（１）分子量
ネイティブな状態での精製酵素の分子量測定は、ゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg）により行った。マーカータンパク質として分子量２００，０００；９７，４００；６８，０００；４３，０００；２９，０００；１８，４００；１４，３００のものを用いた。
その結果、該トランスフェラーゼの分子量は５４，０００であった。
ゲル濃度６％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量測定を行った。マーカータンパク質として分子量２００，０００；１１６，３００；９７，４００；６６，３００；５５，４００；３６，５００；３１，０００；２１，５００；１４，４００のものを用いた。
その結果、該トランスフェラーゼの分子量は７６，０００であった。
ゲル濾過クロマトグラフィーとＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量の測定値に相違が見られたが、これは多分、ゲル濾過カラムの充填剤とタンパク質との間に何らかの相互作用が働くためではないかと考えられる。よって、ゲル濾過による分子量の値は本酵素のネイティブな状態での分子量を示しているとは必ずしもいえない。
（２）等電点
アガロースゲル等電点電気泳動の結果、等電点は６．１であった。
（３）安定性
得られた精製酵素の各温度、各ｐＨにおける安定性を、それぞれ図２、図３に示す。測定は、ｐＨ３〜５の間はグリシン塩酸系緩衝液を、ｐＨ４〜６の間は酢酸ナトリウム系緩衝液を、ｐＨ５〜８の間は燐酸ナトリウム系緩衝液を、ｐＨ８〜９の間はトリス塩酸系緩衝液を、ｐＨ９〜１０の間は炭酸水素ナトリウム系緩衝液を、ｐＨ１１〜１３の間はＫＣｌ−ＮａＯＨ系緩衝液をそれぞれ用いた。
本酵素は８５℃で６時間の処理で安定であり、またｐＨ４．０〜１０．０の室温６時間の処理で安定であった。
（４）反応性
得られた精製酵素の各温度、各ｐＨにおける反応性を、それぞれ図４、図５に示す。測定は、ｐＨ３〜５の間はグリシン塩酸系緩衝液（□）を、ｐＨ４〜５．５の間は酢酸ナトリウム系緩衝液（●）を、ｐＨ５〜７．５の間は燐酸ナトリウム系緩衝液（△）を、ｐＨ８〜９の間はトリス塩酸系緩衝液（◇）をそれぞれ用いた。本酵素は６０〜８０℃付近に反応最適温度、ｐＨ５．０〜６．０付近に反応最適ｐＨを有する。
（５）各種活性化剤、阻害剤の影響
実施例Ｉ−１のグルコシルトレハロース生成活性の測定法において以下の第８表に示す物質を基質と共に添加し、それぞれの場合の活性測定を実施例Ｉ−１と同様に行い、活性化又は阻害の有無を調べた。その結果、銅イオン、ＳＤＳにて阻害を受けることがわかった。糖関連酵素ではカルシウムイオンによって活性化される場合が多く認められるが、本酵素ではカルシウムイオンによっては活性化されない。
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（６）基質特異性
本精製酵素を以下の第９表に示す基質に作用させて、α−１，α−１転移体の生成の有無を調べた。なお、活性測定は実施例Ｉ−１と同様に行った。
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その結果、本精製酵素に関しては、マルトトリオース、（Ｇ３）〜マルトヘプタオース（Ｇ７）からトレハロースオリゴ糖の生成が確認された。また、α−１，６結合を還元末端から１つ目〜４つ目、又は２つ目に有するイソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、パノースに対してはいずれも反応しなかった。
なお、実施例Ｉ−３〜Ｉ−５で得たＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓＤＳＭ  ５８３３株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３９０９株、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ  １６５１株由来の各精製酵素についても同様の方法により酵素学的性質を調べ、その結果を前記した第１表に示した。
実施例Ｉ−７ マルトオリゴ糖からのグルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロースの製造
基質を１００ｍＭのマルトトリオース（Ｇ３）〜マルトヘプタオース（Ｇ７）とし、実施例Ｉ−２で得られた精製酵素１３．５Units/ml（マルトトリオースを基質として作用させたときの酵素活性）をそれぞれ作用させ、対応するα−１，α−１転移体を生成させた。各生成物の分析法は実施例Ｉ−１の方法により行い、その収率及び酵素活性を調べた。なお、第１０表中での酵素活性は、各マルトオリゴ糖を１時間に１μmolの対応するα−１，α−１転移体に変換する酵素活性を１ユニットとして示した。結果は以下の第１０表に示した通りである。
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表の結果より、基質はＧ５の時、最も活性が高く、Ｇ３のおよそ８倍を示した。また、収率はＧ３の場合４４．６％であるが、Ｇ４以上では６３．５〜７３．１％であった。
また、Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５を基質として得られた反応生成物の組成を調べたところその結果は、それぞれ図６〜８に示した通りであった。
すなわち、マルトトリオースを基質として用いた場合、主反応であるグルコシルトレハロースの生成とともに、副反応として等モルずつのマルトース及びグルコースが生成された。
マルトテトラオース以上の重合度ｎを持つ糖を基質として用いた場合では、主反応としてまず還元末端のグルコース単位がα−１，α−１結合した重合度ｎの糖が生成され、同様に副反応として等モルずつの重合度（ｎ−１）糖及びグルコースが生成された。さらにこれらの糖の反応が進むと、二次的に、重合度（ｎ−１）糖から同様の反応が進んだ（なお、図７、８において３糖又は４糖と示した糖にはそれぞれ、未反応のマルトトリオース又はマルトテトラオースと、二次的に同様の反応が進み、その末端がα−１，α−１結合した糖が含まれている）。また、重合度（ｎ＋１）以上の糖、すなわち分子間の転移体の生成は認められなかった。なお、副反応である加水分解は鎖長がＧ４以上になると少なくなることが認められた。
これらの主反応物の例として、基質Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５からの主生成物である３糖、４糖、及び５糖をTSK-gel amide-80 HPLC columnにて分取し、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲにより解析を行った。その結果、いずれも還元末端のグルコース残基１個がα−１，α−１で結合した構造を示し、それぞれグルコシルトレハロース（α−Ｄ−マルトシル  α−Ｄ−グルコピラノシド）、マルトシルトレハロース（α−Ｄ−マルトトリオシル  α−Ｄ−グルコピラノシド）、及びマルトトリオシルトレハロース（α−Ｄ−マルトテトラオシル  α−Ｄ−グルコピラノシド）であることを確認した。これらの化学式はそれぞれ以下の通りである。
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以上の結果から、本発明の酵素はグルコースがα−１，４で結合したマルトトリオース以上のグルコースポリマーの還元末端を、転移によりα−１，α−１で結合させる活性を有する酵素であると結論される。また、副反応として、糖転移酵素によく観察されるように、水分子を受容体として加水分解反応し、還元末端側の結合１個を切断してグルコース１分子を遊離することもわかった。
実施例Ｉ−８ マルトオリゴ糖混合物からのグルコシルトレハロース、マルトオリゴシルトレハロースの製造
実施例Ｉ−２で得られた精製酵素１０Units/mlを用い、基質を可溶性デンプン（ナカライテスク社製、特級品）のα−アミラーゼ分解物（ヨウ素デンプン反応を示さずオリゴ糖にまで分解されたもの：なおここにおいて用いられたα−アミラーゼは、Sigma社製のA-0273  アスペルギルス・オリゼ由来のもの）とし、グルコシルトレハロース及び各種のマルトオリゴシルトレハロースの製造を試みた。反応液は以下に示す条件下のＨＰＬＣ分析法により分析を行った。
カラム：  BIORAD AMINEX HPX-42A（7.8×300mm）
溶媒  ：  水
流速  ：  ０．６ml/min
温度  ：  ８５℃
検出器：  示差屈折計
図９にそのＨＰＬＣによる分析チャートを示した（A）。なお対照として、本酵素トランスフェラーゼを添加しない場合のＨＰＬＣチャートを示した（B）。その結果、反応生成物のオリゴ糖類は還元末端がα−１，α−１に転移されるため、対照のアミラーゼのみによる生成物よりも各々保持時間が短いオリゴ糖類を生じた。これらの反応物の例として、実施例Ｉ−７の場合と同様に３糖、４糖、及び５糖をそれぞれ分取し、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲにより解析を行ったところ、いずれも還元末端のグルコース残基１個がα−１，α−１で結合した構造を示し、それぞれグルコシルトレハロース（α−Ｄ−マルトシル  α−Ｄ−グルコピラノシド）、マルトシルトレハロース（α−Ｄ−マルトトリオシル  α−Ｄ−グルコピラノシド）、及びマルトトリオシルトレハロース（α−Ｄ−マルトテトラオシル  α−Ｄ−グルコピラノシド）であることを確認した。これらの化学式はそれぞれ以下の通りである。
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以下の実施例II−１〜II−１４（比較例II−１〜II−２及び参考例II−１〜II−４を含む）において用いた下記の試薬或いは原料は、いずれも下記の製造元から入手したものである。
α，α−トレハロース：Sigma社製
可溶性デンプン：ナカライテスク社製、特級品
Klebsiella pneumoniae由来プルラナーゼ：和光純薬製、165-15651
パインデックス＃１及びパインデックス＃３：松谷化学製
マルトース（Ｇ２）：和光純薬製
マルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）、マルトヘプタオース（Ｇ７）、及びアミロース  ＤＰ−１７：林原バイオケミカル製
アミロペクチン：ナカライテスク社製、特級品
イソマルトース：和光純薬製
イソマルトトリオース：和光純薬製
イソマルトテトラオース：生化学工業製
イソマルトペンタオース：生化学工業製
パノース：東京化成工業製
実施例II−１ 古細菌のトレハロースオリゴ糖分解活性、及びデンプン液化活性の測定
下記の第１１表に示す菌株について活性を調べた。方法としては各菌株の培養菌体を超音波破砕処理、遠心分離を行い、その上清を粗酵素液として、これに基質であるマルトトリオシルトレハロースを最終的に１０ｍＭとなるように加え、６０℃、ｐＨ５．５（５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液）で反応後、１００℃で５分間加熱処理して反応を停止させた後、生成したα，α−トレハロースを、以下に示す条件のＨＰＬＣ分析法により測定した。
カラム：  TOSOH TSK-gel Amide-80（4.6×250mm）
溶媒  ：  ７２．５％アセトニトリル
流速  ：  １．０ml/min
温度  ：  室温
検出器：  示差屈折計
トレハロースオリゴ糖分解活性は、マルトトリオシルトレハロースから１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する酵素活性を１Unitとして示した。但し、第１１表においては菌体ｇ当りの活性として示した。また、マルトトリオシルトレハロースの調製は、５０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．５）を含む１０％マルトペンタオースにＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼを１０Units/mlとなるように添加して６０℃で２４ｈｒ反応させた後、上記条件のTSK-gel Amide-80 HPLC columnにより分取することによって行った。なお、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を１Unitと定義する。
そのＨＰＬＣチャートは図１０に示す通りである。図に示すように、ＨＰＬＣチャート上ではアノマーのないα，α−トレハロースと同一の保持時間を示すピークと、マルトトリオースと同一の保持時間を示すピークが現れた。なお、はじめの生成物をTSK-gel amide-80 HPLC columnにて分取し、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲにより解析の結果、α，α−トレハロースであることを確認した。
また、上記と同じ粗酵素液（上清）を用いて、２％可溶性デンプンを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）０．５mlに該上清を適宜希釈して０．５ml加え、６０℃にて反応を行った。経時的にサンプリングを行い、このサンプルに２倍量の１Ｎ塩酸を加えて反応を停止した。次いで２／３倍量の０．０１％ヨウ素を含む０．１％ヨウ化カリウム溶液を加え、更に１．８倍量の水を加えた。最後に６２０ｎｍの吸光を測定し、その経時変化から活性を測定した。
反応後生成する糖の分析は、１００℃で５分間処理して反応を停止させた後、以下に示す条件下ＨＰＬＣ分析法により測定した。
カラム：  BIO-RAD AMINEX HPX-42A（7.8×300mm）
溶媒  ：  水
流速  ：  ０．６ml/min
温度  ：  ８５℃
検出器：  示差屈折計
デンプン分解活性は、デンプン-ヨウ素複合体の青紫色による６２０ｎｍの吸光を１０分に１０％減少させる酵素量を１Unitと定義した。但し、第１１表においては菌体ｇ当たりの活性として示した。
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Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の粗酵素液による反応生成物のAMINEX HPX-42A HPLCによる分析結果は図１１に示す通りであった。
以上の結果、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する菌株の細胞抽出液はトレハロースオリゴ糖を分解し、α，α−トレハロースを遊離する活性及び、デンプンを加水分解して主に単糖及び２糖を遊離する活性を有することがわかった。
実施例II−２ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の本酵素アミラーゼの精製
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株を、２ｇ／リットルの可溶性デンプン及び２ｇ／リットルの酵母エキスを含むＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）発行  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｅｓ  １８版（１９９２）に記載の培地番号１３０４の培地で７５℃、３日間培養した。遠心分離により集菌し、−８０℃にて保存した。菌体の収率は３．３ｇ／リットルであった。
上記のようにして得られた菌体２００ｇを５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）４００ｍｌに懸濁し、０℃で１５分間、超音波破砕処理により溶菌し、次いで遠心分離を行い上清溶液を得た。これに硫安を６０％飽和となるように加えた。
遠心分離して得られた沈澱を１Ｍの硫安、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、同緩衝液にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S  ８００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次に６００ｍｌの１Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配で標的アミラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄、脱塩した。
次に同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel DEAE-TOYOPEARL 650S ３００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、引き続き９００ｍｌの０Ｍ〜０．３Ｍ食塩の線状勾配で標的アミラーゼを溶離した。活性画分を限外漉過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き０．１５Ｍの食塩、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次に脱塩濃縮液をゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg）に載せ、同緩衝液にて標的アミラーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き２５ｍＭビス−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．３）にて洗浄、脱塩した。
次にこの脱塩濃縮液を、同緩衝液にて平衡化したクロマトフォーカシング（カラム：Pharmacia Mono P HR5／20）に載せ、１０％Polybuffer 74（Pharmacia製、塩酸にてｐＨ４．０に調製したもの）で標的アミラーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）にて洗浄、脱塩した。
次にこの脱塩濃縮液に４分の１量のサンプルバッファー（６２．５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０１２５％ブロモフェノールブルー）を加え、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（装置：BIO-RADプレップセル  モデル491）にて標的アミラーゼを溶離した。活性画分を分取し限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
最終的にネイティブポリアクリルアミドゲル、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、及び等電点電気泳動にて単一バンドを示す精製酵素を得た。
なお、この精製における活性測定には、基質としてマルトトリオシルトレハロースを用い、その他の方法は実施例II−１において示したTSK-gel Amide-80のＨＰＬＣ分析法と同様にして行った。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第１２表に示す。
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実施例II−３ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ５８３３株由来の本酵素アミラーゼの精製
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ５８３３株を、２ｇ／リットルの可溶性デンプン及び２ｇ／リットルの酵母エキスを含むＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）発行Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｅｓ  １８版（１９９２）に記載の培地番号１３０４の培地で７５℃、３日間培養した。遠心分離により集菌し、−８０℃にて保存した。菌体の収率は１．２ｇ／リットルであった。
上記のようにして得られた菌体２５ｇを５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）５０ｍｌに懸濁し、０℃で１５分間、超音波破砕処理により溶菌し、次いで遠心分離を行い上清溶液を得た。
この上清溶液に硫安を１Ｍとなるように加え、１Ｍの硫安、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S １００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで３００ｍｌの１Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配で標的アミラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄、脱塩した。
次に同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel DEAE-TOYOPEARL 650S １００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで３００ｍｌの０Ｍ〜０．３Ｍ食塩の線状勾配で標的アミラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き０．１５Ｍの食塩、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次に脱塩濃縮液をゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Phamacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg）に載せ、同緩衝液にて標的アミラーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き２５ｍＭビス−トリス−イミノジ酢酸緩衝液（ｐＨ７．１）にて洗浄、脱塩した。
次にこの脱塩濃縮液を同緩衝液にて平衡化したクロマトフォーカシング（カラム：Pharmacia Mono P HR5/20）に載せ、１０％Polybuffer 74（Pharmacia製、イミノジ酢酸にてｐＨ４．０に調製したもの）で標的アミラーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き２５ｍＭビス−トリス−イミノジ酢酸緩衝液（ｐＨ７．１）にて洗浄、脱塩した。
次にこの脱塩濃縮液を、同緩衝液にて平衡化したクロマトフォーカシング（カラム：Phamacia Mono P HR5/20）に載せ、１０％Polybuffer 74（Pharmacia製、イミノジ酢酸にてｐＨ４．０に調製したもの）で標的アミラーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き０．１５Ｍの食塩、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次に脱塩濃縮液をゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：TSK-gel G3000SW HPLC）に載せ、同緩衝液にて標的アミラーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
最終的にネイティブポリアクリルアミドゲル、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、及び等電点電気泳動にて単一バンドを示す精製酵素を得た。
なお、この精製における活性測定には、基質としてマルトトリオシルトレハロースを用い、その他の方法は実施例II−１において示したTSK-gel Amide-80のＨＰＬＣ分析法と同様にして行った。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第１３表に示す。
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実施例II−４ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株由来の本酵素アミラーゼの精製
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株を、２ｇ／リットルの可溶性デンプン及び２ｇ／リットルの酵母エキスを含むＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）発行  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｅｓ  １８版（１９９２）に記載の培地番号１３０４の培地で７５℃、３日間培養した。遠心分離により集菌し、−８０℃にて保存した。菌体の収率は２．７ｇ／リットルであった。
上記のようにして得られた菌体２５ｇを５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）５０ｍｌに懸濁し、０℃で１５分間、超音波破砕処理により溶菌し、次いで遠心分離を行い上清溶液を得た。
この上清溶液に硫安を１Ｍとなるように加え、１Ｍの硫安、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S １００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで３００ｍｌの１Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配で標的アミラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄、脱塩した。
次に同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel DEAE-TOYOPEARL 650S １００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで３００ｍｌの０Ｍ〜０．３Ｍ食塩の線状勾配で標的アミラゼーを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き０．１５Ｍの食塩、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次に脱塩濃縮液をゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg）に載せ、同緩衝液にて標的アミラーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
次に脱塩濃縮液に１Ｍとなるよう硫安を溶解し、同緩衝液にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-5PW HPLC）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次に３０ｍｌの１Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配で標的アミラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き２５ｍＭビス−トリス−イミノジ酢酸緩衝液（ｐＨ７．１）にて洗浄、脱塩した。
次にこの脱塩濃縮液を、同緩衝液にて平衡化したクロマトフォーカシング（カラム：Pharmacia Mono P HR5/20）に載せ、１０％Polybuffer 74（Pharmacia製、イミノジ酢酸にてｐＨ４．０に調製したもの）で標的アミラーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄、脱塩した。
最終的にネイティブポリアクリルアミドゲル、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、及び等電点電気泳動にて単一バンドを示す精製酵素を得た。
なお、この精製における活性測定には、基質としてマルトトリオシルトレハロースを用い、その他の方法は実施例II−１において示したTSK-gel Amide-80のＨＰＬＣ分析法と同様にして行った。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第１４表に示す。
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実施例II−５ 本酵素アミラーゼの諸性質の検討
実施例II−２で得られた精製酵素の酵素学的諸性質を測定した。
（１）分子量
ゲル濃度６％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量測定を行った。マーカータンパク質として分子量２００，０００；１１６，３００；９７，４００；６６，３００；５５，４００；３６，５００；３１，０００；２１，５００；１４，４００のものを用いた。
その結果、該アミラーゼの分子量は６１，０００であった。
（２）等電点
アガロースゲル等電点電気泳動の結果、等電点は４．８であった。
（３）安定性
得られた精製酵素の各温度、各ｐＨにおける安定性を、それぞれ図１２、図１３に示す。酵素活性の測定は、実施例II−１においてマルトトリオシルトレハロースを用いた測定法に準じて行ない、ｐＨ３〜５の間はグリシン塩酸系緩衝液を、ｐＨ４〜６の間は酢酸ナトリウム系緩衝液を、ｐＨ５〜８の間は燐酸ナトリウム系緩衝液を、ｐＨ８〜９の間はトリス塩酸系緩衝液を、ｐＨ９〜１０の間は炭酸水素ナトリウム系緩衝液を、ｐＨ１１〜１３．５の間はＫＣｌ−ＮａＯＨ系緩衝液をそれぞれ用いた。
本酵素は８５℃で６時間の処理で安定であり、またｐＨ３．５〜１０．０の室温６時間の処理で安定であった。
（４）反応性
得られた精製酵素の各温度、各ｐＨにおける反応性を、それぞれ図１４、図１５に示す。酵素活性の測定は、実施例II−１においてマルトトリオシルトレハロースを用いた測定法に準じて行ない、ｐＨ２〜４の間はクエン酸ナトリウム系緩衝液（□）を、ｐＨ４〜５．５の間は酢酸ナトリウム系緩衝液（●）を、ｐＨ５〜７．５の間は燐酸ナトリウム系緩衝液（△）を、ｐＨ８〜９の間はトリス塩酸系緩衝液（◇）をそれぞれ用いた。
本酵素は７０〜８５℃付近に反応最適温度、ｐＨ４．５〜５．５付近に反応最適ｐＨを有する。
（５）各種活性化剤、阻害剤の影響
実施例II−１のマルトトリオシルトレハロース分解活性測定法において以下の第１５表に示す物質を基質と共に添加し、それぞれの場合の活性測定を実施例II−１と同様に行い、活性化又は阻害の有無を調べた。その結果、銅イオン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）によって阻害を受けることがわかった。但し、ＳＤＳによる阻害については透析、限外濾過などの方法でＳＤＳを除去することにより、酵素活性が回復した。糖関連酵素ではカルシウムイオンによって活性化される場合が多く認められるが、本酵素ではカルシウムイオンによっては活性化されない。
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（６）基質特異性
本精製酵素２５．０Units/ml（マルトトリオシルトレハロースを基質として作用させたときの酵素活性）を以下の第１６表に示す１０ｍＭの基質（アミロペクチン、可溶性デンプンについては２．８％）に作用させ、分解性及び分解生成物の分析を行った。各種マルトオリゴ糖、アミロース  ＤＰ−１７、アミロペクチン、可溶性デンプン、各種イソマルトオリゴ糖、及びパノースについては単糖＋２糖の生成活性を指標として、また、各種トレハロースオリゴ糖、アミロース  ＤＰ−１７α−１，α−１転移体（アミロース  ＤＰ−１７の還元末端側の、１つ目と２つ目のグルコース残基間の結合がα−１，α−１であるオリゴ糖）についてはα，α−トレハロースの生成活性を指標として、マルトース及びα，α−トレハロースについてはグルコースの生成活性を指標として実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLCによる分析法で分析を行った。
なお、第１６表中での酵素活性は、各々単糖及び２糖を１時間に１μｍｏｌ遊離する酵素活性を１Unitとして示した。
結果は以下の第１６表及び図１６〜１９に示した通りである。
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註：グルコシルトレハロース、マルトシルトレハロース、マルトテトラオシルトレハロース、マルトペンタオシルトレハロース及びアミロースDP-17，α-1，α-1転移体は、いずれも実施例II−１におけるマルトトリオシルトレハロースの調製法に準じて製造したものである。
マルトペンタオース、アミロース  ＤＰ−１７、可溶性デンプンからの反応生成物のAMINEX HPX-42A HPLCによる分析結果は、それぞれ図１７のＡ、Ｂ、Ｃに、また、マルトトリオシルトレハロース、マルトペンタオシルトレハロースからの反応生成物のTSK-gel Amide-80 HPLCによる分析結果は、それぞれ図１８、図１９に示す。
その結果、本精製酵素に関しては、還元末端側のグルコース残基がα−１，α−１結合したマルトトリオシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖に、極めてよく作用し、α，α−トレハロースと重合度が２つ減少した対応するマルトオリゴ糖を生成することが確認された。またマルトース（Ｇ２）〜マルトヘプタオース（Ｇ７）、アミロース、可溶性デンプンからは、主としてグルコース又はマルトースを遊離することが確認された。しかしながらα−１，α−１結合であるα，α−トレハロースに反応せず、また、すべての結合がα−１，６結合であるイソマルトース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース及びイソマルトペンタオース、又は、α−１，６結合を還元末端から２つ目に有するパノースに対しても反応しなかった。
（７）エンド型アミラーゼ活性
本精製酵素２００Units/ml（マルトトリオシルトレハロースを基質として作用させたときの酵素活性）による、可溶性デンプンに作用させた時のヨウ素発色の消失、及び単糖及び２糖の生成量から求めたデンプン加水分解率の経時変化を、実施例II−１に示したデンプン分解活性測定法、及びAMINEX HPX-42A HPLCによる分析法により分析を行った。
その結果、図２０に示した様に、本精製酵素に関してはヨウ素反応呈色度が５０％消失した時点での加水分解率は３．７％と低く、従ってエンド型アミラーゼの性質を示すことが確認された。
（８）作用機作の検討
ウリジンジホスホグルコース［グルコース-6-3H］、及びマルトテトラオースにグリコーゲンシンターゼ（ウサギ骨格筋由来、Sigma社製G-2259）を作用させ、非還元末端のグルコース残基を3Ｈで放射能ラベル化したマルトペンタオースを合成させ、分取精製した。次にこの放射能ラベル化した１０ｍＭのマルトペンタオースを基質とし、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼ１０Units/ml（マルトトリオースを基質として作用させたときの酵素活性）を添加し、６０℃、３ｈｒ作用させ、非還元末端のグルコース残基を3Ｈで放射能ラベル化したマルトトリオシルトレハロースを合成させ、分取精製した。（なお、この生成物にグルコアミラーゼ（Rhizopus由来、生化学工業製）を作用させ、グルコースとα，α−トレハロースに完全に分解させた。これらを薄層クロマトグラフィーにて分取し、それぞれ液体シンチレーションカウンターで放射能を測定したところ、α，α−トレハロース画分に放射活性は見られず、グルコース画分に放射活性が認められ、よって、非還元末端のグルコース残基が放射能ラベル化されていることを確認した。）
以上のように調製した非還元末端のグルコース残基を3Ｈで放射能ラベル化したマルトペンタオース、及び非還元末端のグルコース残基を3Ｈで放射能ラベル化したマルトトリオシルトレハロースを基質として、これらに実施例II−２で得られた精製酵素をそれぞれ５０Units/ml及び５Units/ml作用させ、反応前、及び６０℃、０．５、１及び３時間後にサンプリングを行った。この反応物を薄層クロマトグラフィー（Kieselgel 60メルク社製、溶媒：ブタノール−エタノール−水＝５：５：３）で展開した。得られた各糖に相当するところを分取し、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。その結果をそれぞれ図２１、及び図２２に示す。図２１、２２より明らかなように、マルトペンタオースを基質とした場合、加水分解産物であるグルコース、マルトース画分には放射活性は見られず、マルトテトラオース、マルトトリオース画分に放射活性が認められた。またマルトトリオシルトレハロースを基質とした場合、加水分解産物であるα，α−トレハロース画分には放射活性は見られず、マルトトリオース画分に放射活性が認められた。
よって、本精製酵素の作用機作はエンド型に作用するアミラーゼ活性と共に、還元末端側から主に単糖、２糖を生成する活性を有するものであることがわかった。
なお、実施例II−３、４で得たＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ５８３３株、及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株由来の各精製酵素にういても同様の方法により酵素学的諸性質を調べ、その結果を前記した第２表に示した。
比較例II−１ 膵臓α−アミラーゼによる各種オリゴ糖の分解性と分解生成物の分析
ブタ膵臓由来α−アミラーゼは、マルトオリゴ糖を還元末端から２糖または３糖単位で加水分解することが知られている（澱粉・関連糖質酵素実験法P135、中村道徳、貝沼圭二、学会出版センター）。そこで、本発明の新規アミラーゼの比較例としてブタ膵臓由来α−アミラーゼ（Sigma社製、A-6255）１Units/ml（デンプンを基質として、ｐＨ６．９、２０℃において３分間に１ｍｇのマルトースに相当する還元糖を生成する酵素量を１Unitとする）を以下の第１７表に示す１０ｍＭの基質にpH6.9、20℃にて作用させ、分解性及び分解生成物の分析を行った。酵素活性は２糖＋３糖の生成活性を指標として、実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLC分析法で分析を行った。
なお、第１７表中での酵素活性は、各オリゴ糖を１時間に１μｍｏｌ遊離する酵素活性を１Unitとして示した。
結果は以下の第１７表及び図２３、２４に示した通りである。
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註：グルコシルトレハロース、マルトシルトレハロース、マルトテトラオシルトレハロース及びマルトペンタオシルトレハロースは、いずれも実施例II−１におけるマルトトリオシルトレハロースの調製法に準じて製造したものである。
マルトペンタオシルトレハロースからの反応生成物のTSK-gel Amide-80 HPLCによる分析結果を図２４に示す。
その結果、膵臓アミラーゼはマルトテトラオース（Ｇ４）〜マルトヘプタオース（Ｇ７）からマルトースあるいはマルトトリオースと重合度が２つまたは３つ減少した対応するマルトオリゴ糖を生成するが、還元末端側のグルコース残基がα−１，α−１結合したグルコシルトレハロース、マルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖からはα，α−トレハロースを遊離しない上、反応性が低いことが確認された。
実施例II−６ 可溶性デンプン、及び各種デンプン分解物からのα，α−トレハロースの製造
実施例II−２で得られた本精製酵素１５０Units/ml、及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼ１０Units/mlを用い、基質を、可溶性デンプン（ナカライテスク社製、特級品）；デンプン分解物として、Klebsiella pneumoniae由来のプルラナーゼ（和光純薬製）２５Units/mlで４０℃、１ｈｒの条件の下で予めα−１，６結合を分解しておいた可溶性デンプン；また別のデンプン分解物として、Bacillus amylolichefaciens由来のα-アミラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）１２．５Units/mlで３０℃、２．５ｈｒの条件の下で予め部分分解しておいた可溶性デンプン；パインデックス＃１；パインデックス＃３（ともに松谷化学製）；Ｇ３〜Ｇ７マルトオリゴ糖各単独；及びアミロースＤＰ−１７（いずれも林原バイオケミカル製）として、それぞれ最終濃度１０％、６０℃、ｐＨ５．５の条件下で約１００ｈｒ反応させ、用いた酵素の相乗作用を利用したα，α−トレハロースの製造を試みた。
反応液は基質を可溶性デンプンとした場合を例として、実施例II−１に示したAMINEX HPX42A HPLC分析法による分析を行った。
また、未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLC分析法による分析を行い、生成したα，α−トレハロースの収率を調べた。
なお、本発明の新規アミラーゼの活性は、実施例II−１と同様に、マルトトリオシルトレハロースから１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する酵素活性を１Unitとして示した。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
プルラナーゼの活性は，プルランを基質としてｐＨ６．０、３０℃で１分間に１μｍｏｌのマルトトリオースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
その結果は以下の第１８表に示した。
0004033897.tif 000022
可溶性デンプンからの反応生成物のAMINEX HPX42A HPLCによる分析結果は図２５に示す。
その結果、可溶性デンプンを基質とした場合、３７．０％の収率にてα，α−トレハロースを生成した。また各種デンプン分解物ではプルラナーゼにてα−１，６結合を加水分解した可溶性デンプンを基質とした場合、６２．１％、全ての結合がα−１，４結合である各種マルトオリゴ糖、及びアミロース  ＤＰ−１７ではそれぞれ３６．４〜６７．１％、及び８３．５％であった。これらの結果は、α−１，４結合の直鎖が長い基質を用いるほど最終製品のα，α−トレハロースの収率が高いことを示している。
実施例II−７ 可溶性デンプンからの各種酵素濃度におけるα，α−トレハロースの製造
実施例II−２で得られた本精製酵素、及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼを用い、基質を、Klebsiella pneumoniae由来のプルラナーゼ（和光純薬製）２５Units/mlで４０℃、１ｈｒの条件下で前処理した可溶性デンプンとし、該基質（最終濃度１０％）に第１９表に示した濃度の酵素をそれぞれ添加して６０℃、ｐＨ５．５にて約１００ｈｒ反応させて、これら酵素の相乗作用を利用したα，α−トレハロースの製造を試みた。反応液は未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLC分析法により分析を行い、生成したα，α−トレハロースの収率を調べた。
なお、本発明の新規アミラーゼの活性は、実施例II−１と同様に、マルトトリオシルトレハロースから１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する酵素活性を１Unitとして示した。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
プルラナーゼの活性は，プルランを基質としてｐＨ６．０、３０℃で１分間に１μｍｏｌのマルトトリオースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
その結果は以下の第１９表に示した。
0004033897.tif 000023
表の結果より、α，α−トレハロースの収率は、トランスフェラーゼ２０Units/ml、アミラーゼ１５０Units/mlのとき最大となり、６５．１％に達したことがわかる。
比較例II−２ 他の生物起源のアミラーゼを用いたα，α−トレハロースの製造
本発明の新規アミラーゼの比較として、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis及びAspergillusoryzae由来のアミラーゼ（それぞれ、生化学工業製100200、Sigma製A-3403、及びA-0273：いずれも６０℃にて活性を有する）を用い、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼとの併用において、基質をKlebsiella pneumoniae由来のプルラナーゼ（和光純薬製）２５Units/mlで４０℃、１ｈｒの条件下で前処理した可溶性デンプン（最終濃度１０％）として、該基質に、第２０表に示した濃度の酵素をそれぞれ添加し、６０℃、ｐＨ５．５にて約１００ｈｒ反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα，α−トレハロースの製造を試みた。反応液は未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLC分析法により分析を行い、生成したα，α−トレハロースの収率を調べた。
なお、アミラーゼの酵素活性は、実施例II−１と同様の条件にて反応させて、デンプン-ヨウ素複合体の青紫色による６２０ｎｍの吸光を１０分間に１０％減少させる酵素量を１Unitとして示した。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
プルラナーゼの活性は，プルランを基質としてｐＨ６．０、３０℃で１分間に１μｍｏｌのマルトトリオースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
その結果は以下の第２０表に示した。
0004033897.tif 000024
表の結果より、他の生物起源のアミラーゼを用いても、α，α−トレハロースを生成することはできるが、いずれも収率は、本発明の新規酵素を用いた場合よりも低いことがわかった。
実施例II−８ アミロース  ＤＰ−１７からの各種酵素濃度におけるα，α−トレハロースの製造
実施例II−２で得られた本精製酵素、及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼを用い、基質を、アミロース  ＤＰ−１７（林原バイオケミカル製）（最終濃度１０％）として、該基質に、第２１表に示した濃度の酵素をそれぞれ添加し、６０℃、ｐＨ５．５にて約１００ｈｒ反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα，α−トレハロースの製造を試みた。反応液は未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLC分析法により分析を行い、生成したα，α−トレハロースの収率を調べた。
なお、本発明の新規アミラーゼ活性は、実施例II−１と同様に、マルトトリオシルトレハロースから１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する酵素活性を１Unitとして示した。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
その結果は以下の第２１表に示した。
0004033897.tif 000025
表の結果より、直鎖状のα−１，４結合からなるアミロース  ＤＰ−１７を基質とした場合にはα，α−トレハロースの収率は、トランスフェラーゼ１０Units/ml、アミラーゼ１５０Units/mlのとき最大となり、８３．４％に達したことがわかる。
実施例II−９ 各種可溶性デンプン濃度におけるα，α−トレハロースの製造
実施例II−２で得られた本精製酵素、及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼを用い、基質を可溶性デンプンとし、該基質の最終濃度５％、１０％、２０％、及び３０％のものに、第２２表に示した濃度の酵素をそれぞれ添加し、６０℃、ｐＨ５．５にて約１００ｈｒ反応させ、これらの酵素の相乗作用を利用したα，α−トレハロースの製造を試みた。この際、反応途中、０ｈｒから９６ｈｒの間、０ｈｒも含めて１２ｈｒ毎に合計９回、５Units/mlとなるようプルラナーゼ（Klebsiella pneumoniae由来品、和光純薬製）を添加し、４０℃、１ｈｒの条件下で処理した。
反応液は未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLC分析法により分析を行い、生成したα，α−トレハロースの収率を調べた。
なお、本発明の新規アミラーゼの活性は、実施例II−１と同様に、マルトトリオシルトレハロースから１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する酵素活性を１Unitとして示した。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
プルラナーゼの活性は，プルランを基質としてｐＨ６．０、３０℃で１分間に１μｍｏｌのマルトトリオースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
その結果は以下の第２２表に示した。
0004033897.tif 000026
表の結果より、基質の可溶性デンプンの濃度を５〜３０％と変化させた場合でも、アミラーゼ及びトランスフェラーゼ濃度を最適条件の下で使用することにより、α，α−トレハロースの収率を、いずれも７０％以上とすることができることがわかる。
実施例II−１０ 各種プルラナーゼ処理を含む可溶性デンプンからのα，α−トレハロースの製造
実施例II−２で得られた本精製酵素、及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼを用い、基質を、可溶性デンプン（最終濃度１０％）として、該基質に第２３表に示した濃度の酵素をそれぞれ添加し、６０℃、ｐＨ５．５にて約１２０ｈｒ反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα，α−トレハロースの製造を試みた。この際、反応途中２４ｈｒ後に１回（ａ）、４８ｈｒ後に１回（ｂ）、７２ｈｒ後に１回（ｃ）、９６ｈｒ後に１回（ｄ）、２４ｈｒから９６ｈｒの間、２４ｈｒ毎に合計４回（ｅ）、０ｈｒから９６ｈｒの間、０ｈｒも含めて１２ｈｒ毎に合計９回（ｆ）、及び０ｈｒから１２ｈｒの反応初期段階に、０ｈｒも含めて３ｈｒ毎に合計５回、その後は２４ｈｒから９６ｈｒの間、１２ｈｒ毎に合計７回（ｇ）の条件の下で表中に示した濃度となるようにプルラナーゼ（Klebsiella pneumoniae由来品）を添加し、いずれの場合にも添加後４０℃、１ｈｒの条件の下でプルラナーゼ処理をした。
反応液は未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLC分析法により分析を行い、生成したα，α−トレハロースの収率を調べた。
なお、本発明の新規アミラーゼの活性は、実施例II−１と同様に、マルトトリオシルトレハロースから１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する酵素活性を１Unitとして示した。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
プルラナーゼの活性は，プルランを基質としてｐＨ６．０、３０℃で１分間に１μｍｏｌのマルトトリオースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
その結果は以下の第２３表に示した。
0004033897.tif 000027
表の結果より、反応途中にプルラナーゼ処理を導入することにより収率を向上させることができ、しかも、複数回にわたって該処理をする方法、或いは反応初期段階で複数回にわたって該処理をする方法において、α，α−トレハロースの収率を一段と向上させることができることがわかった。トランスフェラーゼ１０Units/ml、アミラーゼ１５０Units/ml、プルラナーゼ処理方法（ｇ）、プルラナーゼ５Units/mlの条件下でα，α−トレハロースの収率は最大となり、８０．９％に達した。
実施例II−１１ 各種アミロース  ＤＰ−１７濃度及び各種反応温度におけるα，α−トレハロースの製造
実施例II−２で得られた本精製酵素、及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼを、それぞれ３２０Units／g−基質、及び２０Units／g−基質となるように添加し、基質をアミロースＤＰ−１７として、第２４及び２５表に示した基質濃度及び反応温度において、それぞれ約１００ｈｒ反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα，α−トレハロースの製造を試みた。
反応液は未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLC分析法により分析を行い、生成したα，α−トレハロースの収率及び反応速度を調べた。
なお、本発明の新規アミラーゼの活性は、実施例II−１と同様に、マルトトリオシルトレハロースから１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する酵素活性を１Unitとして示した。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
その結果は以下の第２４及び２５表に示した。
なお、第２４表中の反応速度は、１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する速度を１Unitとして示した。
0004033897.tif 000028
0004033897.tif 000029
表の結果より、反応温度を４０〜８０℃に上げると温度依存的に反応速度は増加することがわかった。また、低温（４０〜５０℃）では基質濃度を高濃度（３０〜４０％）とすると不溶化し、収率が著しく低下するが、高温にすると基質が溶解し、収率も高く維持できた。収率は７５．１％に達した。
本実施例の結果から、耐熱性の高い本発明のアミラーゼを用いることにより、高温、高濃度仕込を可能とし、経済的にも、ハンドリングの容易さの観点からも有利なα，α−トレハロースの製造法を提供し得ることが理解される。
実施例II−１２ 各種可溶性デンプン濃度及び各種反応温度における、耐熱性プルラナーゼを用いたα，α−トレハロースの製造
実施例II−２で得られた本精製酵素、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼ、及び市販耐熱性プルラナーゼ（デブランチングエンザイム  アマノ（Bacillus sp.由来品、天野製薬社製）；なお、疎水クロマトグラフィーTOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650Sにより、混在するグルコアミラーゼ活性及びα−アミラーゼ活性を除去した）を、それぞれ１２８０Units／g−基質、８０Units／g−基質、及び３２Units／mlとなるように添加し、基質を可溶性デンプンとして、第２６及び２７表に示した基質濃度及び反応温度において、それぞれ約１００ｈｒ反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα，α−トレハロースの製造を試みた。
反応液は未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLC分析法により分析を行い、生成したα，α−トレハロースの収率及び反応速度を調べた。
なお、本発明の新規アミラーゼの活性は、実施例II−１と同様に、マルトトリオシルトレハロースから１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する酵素活性を１Unitとして示した。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
プルラナーゼの活性はプルランを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１分間に１μｍｏｌのマルトトリオースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
その結果は以下の第２６及び２７表に示した。
なお、第２６表中の反応速度は、１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する速度を１Unitとして示した。
0004033897.tif 000030
0004033897.tif 000031
なお、耐熱性プルラナーゼを添加しない以外は基質濃度１０％、反応温度６０℃において、上記の条件下で反応させたところ、反応収率は３５．０％であった。
表の結果より、耐熱性プルラナーゼは反応にあたり一度添加するのみで収率向上効果が得られ、反応温度を４０〜６０℃に上げると温度依存的に反応速度は増加することがわかった。また、低温（４０〜５０℃）では基質濃度を高濃度（２０〜３０％）とすると不溶化し、収率が著しく低下するが、高温（６０℃）にすると基質が溶解し、収率も高く維持できた。収率は、７４．１％に達した。
実施例II−１３ イソアミラーゼ処理を含む可溶性デンプンからのα，α−トレハロースの製造
実施例II−２で得られた本精製酵素、及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼを用い、基質を可溶性デンプン（最終濃度１０％）として、該基質にそれぞれ１２８０Units／g−基質、及び８０Units／g−基質となるように添加し、６０℃、ｐＨ５．０にて約１００ｈｒ反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα，α−トレハロースの製造を試みた。この際、０ｈｒから１２ｈｒの反応初期段階に、０ｈｒも含めて３ｈｒ毎に合計５回、その後は２４ｈｒから９６ｈｒの間、２４ｈｒ毎に合計３回の条件の下でイソアミラーゼ（Pseudomanas amyloderamosa由来品、生化学工業）を第２８表に示した濃度となるように添加し、いずれの場合にも添加後４０℃、１ｈｒの条件の下でイソアミラーゼ処理をした。
反応液は未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLC分析法により分析を行い、生成したα，α−トレハロースの収率を調べた。
なお、本発明の新規アミラーゼの活性は、実施例II−１と同様に、マルトトリオシルトレハロースから１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する酵素活性を１Unitとして示した。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
イソアミラーゼの活性は、１％可溶性モチゴメデンプン０．５ｍｌに０．５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ３．５を０．１ｍｌ、酵素液０．１ｍｌを混合して４０℃で反応させ、アミロース−ヨウ素複合体の青紫色による６１０ｎｍの吸光度を１cm幅のセルで測定し（澱粉、関連糖質酵素実験法、中村道徳、貝沼圭二、学会出版センター刊、１９８９年）、１時間に０．１増加させる酵素量を１Unitと定義した。
そ結果は以下の第２８表に示した。
0004033897.tif 000032
表の結果より、プルラナーゼ（Klebsiella pneumoniae由来品）の場合と同様に、反応途中にイソアミラーゼ処理を導入することにより収率を向上させることができ、α，α−トレハロースの収率は、７５．７％に達した。
実施例II−１４ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来枝切り酵素処理を含む可溶性デンプンからのα，α−トレハロースの製造
実施例II−２で得られた本精製酵素、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼ、及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株の枝切り酵素（参考例II−３の方法に準じて菌体抽出液より分離精製したもの）を、それぞれ１２８０Units／g−基質、８０Units／g−基質、及び下表中に示す濃度となるように添加し、基質を可溶性デンプン（最終濃度１０％）として、６０℃、ｐＨ５．５として、約１００ｈｒ反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα，α−トレハロースの製造を試みた。
反応液は未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLC分析法により分析を行い、生成したα，α−トレハロースの収率を調べた。
なお、本発明の新規アミラーゼの活性は、実施例II−１と同様に、マルトトリオシルトレハロースから１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する酵素活性を１Unitとして示した。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製枝切り酵素の活性は、１％可溶性モチゴメデンプン０．５ｍｌに０．５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０を０．１ｍｌ、酵素液０．１ｍｌを混合して６０℃で反応させ、アミロース−ヨウ素複合体の青紫色による６１０ｎｍの吸光度を１cm幅のセルで測定し、１時間に０．１増加させる酵素量を１Unitと定義した。
その結果は以下の第２９表に示した。
0004033897.tif 000033
表の結果より、耐熱性プルラナーゼ（デブランチングエンザイム  アマノ、Bacillus sp.由来品）の場合と同様に、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の枝切り酵素は反応にあたり一度添加するのみで収率を向上させることができ、α，α−トレハロースの収率は、６９．８％に達した。
参考例II−１ 各種アミロース  ＤＰ−１７濃度及び各種反応温度におけるトランスフェラーゼによる転移オリゴ糖の製造
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼを、２０Units／g−基質となるように添加し、基質をアミロースＤＰ−１７として、第３０及び３１表に示した基質濃度及び反応温度において、それぞれ約１００ｈｒ反応させ、還元末端側のグルコース残基がα−１，α−１結合した対応のトレハロースオリゴ糖を生成させた。
生成した還元末端側のグルコース残基がα−１，α−１結合した対応のトレハロースオリゴ糖は、ジニトロサリチル酸法（澱粉・関連糖質酵素実験法、中村道徳・貝沼圭二、学会出版センター刊、１９８９年）によりその還元末端量を測定し、その減少量より収率及び反応速度を調べた。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてｐＨ５．５、６０℃で１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を１Unitとして示した。
その結果は以下の第３０及び３１表に示した。
なお、第３０表中の反応速度は、１時間に１μｍｏｌのα，α−トレハロースを遊離する速度を１Unitとして示した。
0004033897.tif 000034
0004033897.tif 000035
表の結果より、反応温度を４０〜８０℃に上げると温度依存的に反応速度は増加することがわかった。また、低温（４０〜５０℃）では基質濃度を高濃度（特に４０％）とすると不溶化し、収率が著しく低下するが、高温にすると基質が溶解し、収率も高く維持できた。モル収率は７６．６％に達した。
参考例II−２ アミロース  ＤＰ−１７の水に対する溶解度の測定
アミロース  ＤＰ−１７を５、１０、２０、３０、４０％（w/vol）溶液となるように加熱溶解した後、３５、４０、５０、６０、７０、８０℃の高温槽に入れ、経時的にサンプリングし、生じた不溶物を濾過して得られた上清溶液中のアミロース  ＤＰ−１７濃度を求め、平衡となった濃度を飽和点として溶解度を求めた。
その結果は以下の第３２表に示した。
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参考例II−３ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来枝切り酵素の精製
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株を、２ｇ／リットルの可溶姓デンプン及び２ｇ／リットルの酵母エキスを含むＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）発行Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｅｓ  １８版（１９９２）に記載の培地番号１３０４の培地で７５℃、３日間培養した。遠心分離により集菌し、−８０℃にて保存した。菌体の収率は３．３ｇ／リットルであった。
上記のようにして得られた菌体８２ｇを５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）４００ｍｌに懸濁させ、０℃で１５分間、超音波破砕処理により溶菌し、次いで遠心分離を行い上清溶液を得た。
この上清溶液に硫安を１Ｍとなるように加え、１Ｍの硫安、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S ８００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、素通り画分中に標的枝切り酵素を回収した。上清溶液中に含まれているアミラーゼ、トランスフェラーゼ、及びグルコアミラーゼはカラム充填剤Phenyl-TOYOPEARL 650Sに保持、吸着されるので、標的枝切り酵素とは分離された。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄し、脱塩した。
次いで同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel DATE-TOYOPEARL 650S ３００ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、引き続き９００ｍｌの０Ｍ〜０．３Ｍ食塩の線状勾配で標的枝切り酵素を溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、次いで０．１５Ｍの食塩、５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて洗浄し、脱塩した。
この脱塩濃縮液をゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg）に載せ、同緩衝液にて標的枝切り酵素を溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き２５ｍＭビス−トリス−イミノジ酢酸緩衝液（ｐＨ７．１）にて洗浄し、脱塩した。
この脱塩濃縮液を同緩衝液にて平衡化したクロマトフォーカシング（カラム：Pharmacia Mono P HR5/20）に載せ、１０％ Polybuffer 74（Pharmacia製、イミノジ酢酸にてｐＨ４．０に調整したもの）で標的枝切り酵素を溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、引き続き１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄し、脱塩した。
この脱塩濃縮液を同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel DATE 5PW HPLC）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで３０ｍｌの０Ｍ〜０．３Ｍ食塩の線状勾配で標的枝切り酵素を溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、標的枝切り酵素の部分精製品（液状品）を得た。
なお、上記の精製法における標的枝切り酵素の検出は、基質として５％可溶性デンプンを用い、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製アミラーゼ及び精製トランスフェラーゼのそれぞれ２Unis／ml及び３２Units／mlを被検液と共に添加し、ｐＨ５．５、６０℃にて反応させ、被検液の無添加の場合との比較においてα，α−トレハロース生成量が増加する活性を指標として行った。
上記の精製法によって得られたＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の部分精製枝切り酵素の活性は、１％可溶性モチゴメデンプン０．５ｍｌに０．５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０を０．１ｍｌ、酵素液０．１ｍｌを混合して６０℃で反応させ、アミロース−ヨウ素複合体の青紫色による６１０ｎｍの吸光度を１cm幅のセルで測定し、１時間に０．１増加させる酵素量を１Unitと定義した。
以上の精製操作により部分精製された枝切り酵素の比活性は４９５Units／mgであった。
参考例II−４ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来枝切り酵素の諸性質の検討
参考例II−３で得られた部分精製枝切り酵素の酵素学的諸性質を測定した。
（１）作用及び基質特異性
以下の第３３表に示す基質及び各活性測定法を用いて、各基質に対する反応性及び作用を調べた。
ジニトロサリチル酸法（澱粉・関連糖質酵素実験法、中村道徳・貝沼圭二、学会出版センター刊、１９８９年）は、α−１，６結合の加水分解反応による還元末端量の増加を定量する方法である。
ヨウ素呈色法は参考例II−３と同様に行い、α−１，６結合の加水分解反応による直鎖状アミロースの増加を、アミロース−ヨウ素複合体の青紫色による６１０ｎｍの吸光度増加によって定量する方法である。
液体クロマトグラフィーによる分解生成物の分析（ＨＰＬＣ法）は、実施例II−１に示したBio-Rad AMINEX HPX-42A ＨＰＬＣ分析法により行い、生じるオリゴ糖を調べた。
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上記の結果から明らかなように、本枝切り酵素は、１）プルラン及び各種デンプンより、還元末端を生じさせ、２）各種デンプンのヨウ素量色度を増加させ、また、３）プルランよりマルトトリオースを生じさせうる。更にまた、４）実施例II−１４に示したように、可溶性デンプンを基質として用い、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の精製アミラーゼ及び精製トランスフェラーゼと共に反応させた場合、本枝切り酵素を添加しない場合に比べて著しくα，α−トレハロース生成量を増加させる。よって、これらの事実から本酵素はデンプンやプルランのα−１，６結合を加水分解することが理解される。
（２）安定性
得られた部分精製酵素の各温度での３時間処理における安定性を第３４表に示す。
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本酵素は６０℃で３時間の処理で７３．３％の残存活性があった。
（３）反応性
得られた部分精製酵素の各ｐＨ及び各温度における反応性を、それぞれ第３５及び３６表に示す。測定は、ｐＨ３〜５の間はグリシン塩酸系緩衝液を、ｐＨ４〜５．５の間は酢酸ナトリウム系緩衝液を、ｐＨ５〜７．５の間は燐酸ナトリウム系緩衝液をそれぞれ用いた。
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本酵素は６０〜６５℃付近に反応最適温度、ｐＨ４．０〜５．５付近に反応最適ｐＨを有する。
（４）等電点
クロマトフォーカーシングにより分離された枝切り酵素画分のｐＨ測定の結果、等電点は４．４であった。
（５）各種活性化剤及び阻害剤の影響
以下の第３７表に示す物質を基質と共に添加し、それぞれの場合の活性測定を参考例II−３と同様に行い、活性化又は阻害の有無を調べた。その結果、銅イオンにより阻害を受けることがわかった。糖関連酵素ではカルシウムイオンによって活性化される場合が多く認められるが、本酵素はカルシウムイオンによっては活性化されない。
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実施例Ｉ−９ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の新規トランスフェラーゼの部分アミノ酸配列の決定
実施例Ｉ−２で得られた精製酵素の部分アミノ酸配列の決定は岩松（生化学  ６３、１３９（１９９１））らの方法により行った。すなわち、精製された新規トランスフェラーゼを、泳動用緩衝液（１０％グリセロール、２．５％ＳＤＳ、２％２-メルカプトエタノール、６２ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８））に懸濁し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、当該酵素をゲルよりポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）膜（ＰｒｏＢｌｏｔ、（アプライド、バイオシステムズ社））に、エレクトロブロッティング（ザルトブロットＩＩｓ型（ザルトリウス社））を１６０ｍＡで１時間行った。
転写後、当該酵素の転写された部分の膜を切りとり、約３００μ１還元用緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）、０．３％ＥＤＴＡ、２％アセトニトリル）に浸し、これに１ｍｇのジチオスレイトールを加え、アルゴン下で６０℃／約１時間の還元を行った。これに２．４ｍｇモノヨード酢酸を０．５Ｎ水酸化ナトリウム液１０μｌに溶かしたものを加え、遮光下で２０分間撹拌した。ＰＶＤＦ膜を取り出し、２％アセトニトリルで十分洗浄した後、０．１％ＳＤＳ中で５分間撹拌した。次に、ＰＶＤＦ膜を水で軽く洗浄後、０．５％ポリビニルピロリドン−４０、１００ｍＭ酢酸に浸し３０分放置した。この後ＰＶＤＦ膜を水で軽く洗浄し、約１ｍｍ四方に切断した。これを消化用緩衝液（８％アセトニトリル、９０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０））に浸し、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉ（和光純薬社）を１ｐｍｏｌ加え、室温で１５時間消化した。この消化物をＣ８カラム（日本ミリポアリミテッド社、μ-Ｂｏｎｄａｓｈｅｒｅ  ５Ｃ８、３００Ａ、２．１ｘ１５０ｍｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより分離し、１０数種のペプチド断片を得た。ペプチドの溶出溶媒としては、Ａ溶媒（０．０５％トリフルオロ酢酸）、Ｂ溶媒（０．０２％トリフルオロ酢酸を含む２-プロパノール／アセトニトリル  ７：３）を用い、Ｂ溶媒に関し２〜５０％の直線濃度勾配で０．２５ｍｌ／分の流速で４０分間溶出させた。得られたペプチド断片について、気相ペプチドシーケンサー（アプライド  バイオシステム社  モデル４７０型）を用いた自動エドマン分解法によりアミノ酸配列を決定した。
またＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉで消化されたペプチド断片を更にＡｓｐ-Ｎにより２次消化し、得られたペプチド断片について上記の条件で同様に分離しアミノ酸配列を決定した。
その結果、部分アミノ酸配列は下記の通りであった。
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実施例Ｉ−１０ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株染色体ＤＮＡの調製
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株の菌体は実施例Ｉ−２の方法に従って得た。
この菌体の１ｇに２５％スクロース、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌを加え懸濁し、室温にて３０分放置した。これに１０％  ＳＤＳ  ０．５ｍｌ、及び１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（和光純薬社製）０．２ｍｌを加え、５０℃で２時間放置した。次にこの溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、水相をとりこれをエタノール沈殿させた。沈殿してきたＤＮＡを滅菌したガラス棒で巻きとり、これを７０％エタノールで洗浄した後、減圧乾燥した。最終的に１．５ｍｇの染色体ＤＮＡが得られた。
実施例Ｉ−１１ 部分アミノ酸配列に基づくＤＮＡプローブの作成およびＰＣＲ法によるプローブの確認
実施例Ｉ−９により決定されたＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来新規トランスフェラーゼの部分アミノ酸配列の情報をもとにオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーをＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステムズ社製モデル３８１）によって作成した。その配列は下記の通りであった。
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このＤＮＡプライマーを各々１００ｐｍｏｌおよび実施例Ｉ−１０で調製されたＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株の染色体ＤＮＡ１００ｎｇを用いてＰＣＲ法を実施した。ＰＣＲ装置はパーキンエルマー社製、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステムモデル９６００を用い、１サイクルを９４℃で３０秒、５０℃で１分および７２℃で２分で行い、サイクル数３０回および総液量１００μｌで実施した。
得られた反応液１０μ１を１％アガロース電気泳動により分析した。その結果約１．２ｋｂの長さを持つＤＮＡ断片が特異的に増幅された。
このＰＣＲ産物の末端を平滑化し、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃII部位にサブクローニングした。このプラスミドの挿入断片のＤＮＡ配列をアプライド・バイオシステムズ社製、ＤＮＡシークエンサ／ＧＥＮＥＳＣＡＮ  モデル３７３Ａを用いて決定した。その結果、実施例Ｉ−９で得られたアミノ酸配列に相当するＤＮＡ配列が見いだされた。
実施例Ｉ−１２ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来新規トランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
実施例Ｉ−１０で調製されたＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株の染色体ＤＮＡ１００μｇを制限酵素Ｓａｕ３Ａｌで部分消化した。反応液をスクロース密度勾配を用いて超遠心で５〜１０ｋｂのＤＮＡ断片を分離精製した。一方、プラスミドベクターｐＵＣ１１８をＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼにより末端を脱リン酸化したものと、上記５〜１０ｋｂの長さを持つＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株の染色体ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結（ライゲーション）した。この挿入断片を含むｐＵＣ１１８プラスミドベクターを含んだ混合液を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９細胞を形質転換した。これを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート培地に蒔きコロニーを形成させ、ＤＮＡライブラリーを作成した。
このＤＮＡライブラリーにおける新規トランスフェラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドのスクリーニングは、ＰＣＲ法により以下のように行った。
まず、コロニーをかき取りＴＥ緩衝液に懸濁した。これを１００℃にて５分間処理し菌体を破砕し、実施例Ｉ−１１に記載の方法でＰＣＲ法を実施した。
次いで得られたＰＣＲ反応液１０μｌを１％アガロース電気泳動により分析し、約１．２ｋｂの長さを持つＤＮＡ断片が増幅されてくるクローンを陽性クローンとした。
その結果、６００個の形質転換体から１個の陽性クローンを得た。そこから抽出されたプラスミドを解析したところ約８ｋｂの挿入断片を有していた。このプラスミドを「ｐＫＴ１」と称した。
更に挿入断片を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し、上記の方法と同様にＰＣＲ法を実施して、挿入断片を縮小化した。その結果約３．８ｋｂおよび約４．５ｋｂの挿入断片を有するプラスミドを保持する形質転換体を得た。これらのプラスミドをそれぞれ「ｐＫＴ２１」、「ｐＫＴ１１」と称した。
これらのプラスミドの挿入断片の制限酵素地図は図２６に示される通りであった。
なお、以上の実施例で使用された制限酵素としては、全て市販品（宝酒造株式会社より購入）を利用した。
実施例Ｉ−１３ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来新規トランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列の決定
実施例Ｉ−１２で得られたプラスミドｐＫＴ１１、ｐＫＴ２１中の挿入断片の共通部分のＤＮＡ塩基配列を決定した。
まず、このプラスミドＤＮＡを宝酒造社製、キロシークエンス用デレーションキットを用いて、デレーションプラスミドを作成した。次いでこのプラスミドの挿入断片のＤＮＡ配列をパーキンエルマージャパン社製、ＰＲＩＳＭ，Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｄｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット、Ｔａｑ  Ｄｙｅ  ＤｅｏｘｙTM  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔおよびアプライド  バイオシステムズ社製、ＤＮＡシークエンサ／ＧＥＮＥＳＣＡＮ  モデル３７３Ａを用いて決定した。
共通配列中のＳｐｈＩ−ｐＫＴ２１の末端間（図２６のＡ，Ｂ間）の塩基配列およびそこから推定されるアミノ酸配列は配列番号１および２に示される通りであった。
このアミノ酸配列中に実施例Ｉ−９で得られた部分アミノ酸配列に相当する配列が全て認められた。このアミノ酸配列は長さが７２８個で、推定分子量８２ｋＤａのタンパク質をコードしているものと考えられた。この分子量はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来新規トランスフェラーゼの精製酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけることによって得られた分子量の値にほぼ一致した。
実施例Ｉ−１４ 形質転換体における新規トランスフェラーゼの発現
実施例Ｉ−１２で得られたｐＫＴ２１についてＳｐｈＩおよびＸｂａＩで切断し、同酵素で切断したｐＵＣ１１９（宝酒造社製）に連結したものをｐＫＴ２２とした。図２７にその手段を示した。ｐＫＴ２２に挿入された新規トランスフェラーゼ遺伝子を含む断片中、マルチクローニングサイトを除く塩基配列は、配列番号１の塩基番号１〜２５７８の配列であった。
このプラスミドを含む形質転換体の新規トランスフェラーゼ活性を次のように調べた。まず、形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃で、１晩培養した。遠心分離により集菌し、−８０℃にて保存した。菌体の収率は１０ｇ／リットルであった。
上記のようにして得られた菌体１０ｇを５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）４０ｍｌに懸濁し、０℃で３分間、超音波破砕処理により溶菌し、次いで遠心分離を行い上清溶液を得た。これを７５℃で３０分間熱処理し、再度遠心を行い、限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮して、粗酵素液（６Unit/ml）として、基質であるマルトトリオースを最終的に１０％となるように加えた。ｐＨ５．５（５０ｍＭ  酢酸ナトリウム）で、６０℃で２４時間反応させた後、１００℃で５分間加熱処理して反応を停止させた。生成したグルコシルトレハロースを実施例Ｉ−１におけるのと同様のＨＰＬＣ分析法により測定した。
ＨＰＬＣ分析の結果は図２８に示される通りであった。主反応物はＨＰＬＣチャート上ではアノマーのない一本のピークとして、未反応基質よりやや遅れて現れた。また、この主生成物をTSK-gel amide-80 HPLC columnにて分取し、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲにより解析の結果、グルコシルトレハロースであることを確認した。
この結果、形質転換体はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の新規トランスフェラーゼ活性を有することがわかった。またＪＭ１０９にｐＵＣ１１９のみを入れた形質転換体からは新規トランスフェラーゼ活性は検出されなかった。
実施例Ｉ−１５ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３９０９株由来の新規トランスフェラーゼの部分アミノ酸配列の決定
実施例Ｉ−４で得られた新規トランスフェラーゼの部分アミノ酸配列の決定は実施例Ｉ−９に記載される方法に従って行った。以下に決定された部分アミノ酸配列を示す。
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実施例Ｉ−１６ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株由来の新規トランスフェラーゼのクローニング
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株の染色体ＤＮＡは実施例Ｉ−４の方法に従って得た菌体より実施例Ｉ−１０の方法に従って得た。上記染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化した後、ＥＭＢＬ３  ＢａｍＨＩ切断アーム（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結（ライゲーション）した。パッケージングはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製  ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ  Ｇｏｌｄを用いて行った。上記ライブラリーを大腸菌ＬＥ３９２に３７℃１５分間感染させた後、ＮＺＹ寒天プレート培地に播種し、３７℃で約８から１２時間程度培養して、プラークを形成させた。約２時間、４℃で保存した後、ナイロンメンブレン（アマシャム社製，Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋）へＤＮＡを吸着させた。２ｘＳＳＰＥで軽く洗浄した後、８０℃で２時間ベーキングを行った。プローブは実施例Ｉ−１４で得られたｐＫＴ２２のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片（配列番号１の８２４番より２５７８番へ対応する）を用い、アマシャム社製  メガプライムＤＮＡ標識システムを用いて32ｐで標識した。
ハイブリダイセーションの条件は６ｘＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳで６０℃オーバーナイトでおこなった。洗浄は２ｘＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳで、室温１０分、２回行った。
約５０００クローンからスクリーニングを開始して８個の陽性クローンを得た。このクローンより約７．６ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片を得て、これをｐＵＣ１１８の上記サイトへ挿入した。このプラスミドを「ｐ０９Ｔ３」と称する。さらに上記クローンの挿入断片をＳａｕ３ＡＩで部分消化し、得られた約６．７ｋｂｐの断片をｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩサイトへ挿入した。このプラスミドを「ｐ０９Ｔ２」と称する。このプラスミドより約３．８ｋｂｐのＸｂａＩ断片についてｐＵＣ１１８の上記サイトへ挿入した。このプラスミドを「ｐ０９Ｔ１」と称する。このプラスミドの挿入断片の制限酵素地図を図２９に示す。またその作成方法を図３０に示す。上記ｐ０９Ｔ１について新規トランスフェラーゼをコードしている領域を中心に実施例Ｉ−１３の方法に従って塩基配列の決定を行った。決定された塩基配列およびそこさら推定されるアミノ酸配列は配列番号３および４に示される通りである。このアミノ酸配列中に実施例Ｉ−１５で得られた部分アミノ酸配列に相当する配列が全て認められた。このアミノ酸配列は長さが６８０個で、推定分子量８０．１ｋＤａのタンパク質をコードしているものと考えられた。この分子量はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３９０９株由来新規トランスフェラーゼの精製酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけることによって得られた分子量の値にほぼ一致した。またプラスミドｐ０９Ｔ１を含む形質転換体について実施例Ｉ−１４の方法に従って新規トランスフェラーゼ活性を確認した。
実施例Ｉ−１７ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来の新規トランスフェラーゼ遺伝子と他の生物種の染色体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション試験
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５８３３株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ  ＤＳＭ  ５３８９株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを実施例Ｉ−１０に準じた方法で得て、これを制限酵素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
この消化物を１％アガロースゲル電気泳動にて分離し、アマシャムジャパン社製、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎにサザンプロッティングした。このメンブレンに実施例Ｉ−１２で得られたｐＫＴ２１の約２．６ｋｂｐのＳｐｈＩ、ＸｂａＩ断片（配列番号１に示される配列に対応、図２６におけるＡ〜Ｂ間の範囲に対応）を、ベーリンガーマンハイム社製、ＤＩＧシステムキットによって標識し、これを用いてハイブリダイゼーションを行った。
条件はハイブリダイゼーション：５ｘＳＳＣ、４０℃、２時間、洗浄：２ｘＳＳＣ（０．１％ＳＤＳを含む）、４０℃、５分、２回  ０．１ｘＳＳＣ（０．１％ＳＤＳを含む）、４０℃、５分、２回であった。
その結果、ＳｐｈＩ、ＸｂａＩ断片は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５８３３株については約５．９ｋｂｐの断片と、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ  ＤＳＭ  ５３８９株については約５．０ｋｂｐおよび約０．８ｋｂｐの断片とそれぞれハイブリッドを形成した。一方、ネガティブコントロールであるＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株については、ハイブリッドの形成は観察されなかった。
さらにＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、ＤＳＭ５３５４株、ＤＳＭ５８３３株、ＡＴＣＣ３５０９１株，ＡＴＣＣ３５０９２株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株、ＡＴＣＣ４９４２６株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ  ＤＳＭ５３８９株、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ１６５１株  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを実施例Ｉ−１０方法に準じて得、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＶで消化した。
この消化物を１％アガロースゲル電気泳動にて分離し、アマシャムジャパン社、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋にプロッティングした。このメンブレンに配列番号１の１８８０番より２２５７番の領域（３７８ｂｐ）をＰＣＲにて増幅し、実施例Ｉ−１６の方法に従って32Ｐで標識し、これを用いてハイブリダイゼーションを行った。
条件はハイブリダイゼーション：６ｘＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳで６０℃、オーバーナイトで、洗浄：２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで室温、１０分、２回行った。
その結果、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、ＤＳＭ５３５４株、ＤＳＭ５８３３株、ＡＴＣＣ３５０９１株，ＡＴＣＣ３５０９２株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株、ＡＴＣＣ４９４２６株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ  ＤＳＭ５３８９株、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ１６５１株について、それぞれ約４．４ｋｂｐ、３．７ｋｂＰ、３．７ｋｂｐ、０．８ｋｂｐ、３．９ｋｂｐ、０．８ｋｂｐ、０．８ｋｂｐ、４．４ｋｂｐ、２．１ｋｂｐの部位でハイブリッドを形成することが判明した。一方ＪＭ１０９のゲノムＤＮＡについては結合が観察されなかった。
また配列番号１、２、３および４の範囲に含まれるアミノ酸配列、塩基配列と相同性を有する配列が存在しないことを、アミノ酸配列データーバンク（Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ、及びＮＢＲＦ−ＰＤＢ）、塩基配列データーバンク（ＥＭＢＬ）から、配列解析ソフト  ジェネティックス（ソフトウエアー開発）を用いて確認した。よってこの新規トランスフェラーゼ遺伝子はＳｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属する古細菌に特異的に高度に保存されていることがわかった。
実施例Ｉ−１８ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株  および  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｉｄａｒｉｕｓｕ  ＡＴＣＣ３３９０９株由来の新規トランスフェラーゼの塩基配列、アミノ酸配列の比較
配列番号２のＫＭ１株由来の新規トランスフェラーゼのアミノ酸配列と配列番号４のＡＴＣＣ３３９０９株由来の新規トランスフェラのアミノ酸配列とを、また配列番号１のＫＭ１株由来の新規トランスフェラーゼの塩基配列と配列番号３のＡＴＣＣ３３９０９株由来の新規トランスフニラーゼの塩基配列とを配列解析ソフト，ジェネティックス（ソフトウエアー開発）を用いてギャップを考慮した解析を行った。アミノ酸配列についての結果を図３１に、塩基配列についての結果を図３２に示した。それぞれの図中上段にＡＴＣＣ３３９０９株の配列を、下段にＫＭ１株の配列を示し、中段の（＊）は両者で一致する配列を、また（．）は両者で性質の似たアミノ酸配列であることを示す。相同性はアミノ酸配列レベルで４９％、塩基配列レベルで５７％であった。
実施例Ｉ−１９ 形質転換体由来組換え新規トランスフェラーゼを用いたマルトオリゴ糖混合物からのトレハロースオリゴ糖の製造
可溶性デンプン（ナカライテスク社製、特級品）のα−アミラーゼ分解物であってヨウ素デンプン反応を示さずオリゴ糖にまで分解されたもの（α−アミラーゼは、Sigma社製のA-0273アスペルギルス・オリゼ由来のものを用いた）を基質とした。
実施例Ｉ−１４で得た粗酵素液、および上記基質を用いて、実施例Ｉ−１４の反応条件に従いグルコシルトレハロースおよび各種のマルトオリゴシルトレハロースの製造を試みた。反応液の分析は以下に示す条件のＨＰＬＣ分析法により行った。
カラム：  BIORAD AMINEX HPX-42A（7.8×300mm）
溶媒  ：  水
流速  ：  ０．６ml/min
温度  ：  ８５℃
検出器：  示差屈折計
図３３（A）にＨＰＬＣによる分析の結果を（B）に組換え新規トランスフェラーゼを添加しない場合のＨＰＬＣ分析の結果を示した。その結果、反応生成物のオリゴ糖類は対照のアミラーゼのみによる生成物よりも各々保持時間が短かった。また、基質マルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）およびマルトペンタオース（Ｇ５）（いずれも林原バイオケミカル社製）からの主生成物である３糖、４糖および５糖をTSK-gel amide-80 HPLC collumnにて分取し、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲにより解析を行った。その結果、いずれも還元末端のグルコース残基１個がα-１，α-１で結合した構造を示し、それぞれグルコシルトレハロース（α-Ｄ-マルトシル  α-Ｄ-グルコピラノシド）、マルトシルトレハロース（α-Ｄ-マルトトリオシル  α-Ｄ-グルコピラノシド）およびマルトトリオシルトレハロース（α-Ｄ-マルトテトラオシル  α-Ｄ-グルコピラノシド）であることが確認された。
実施例Ｉ−２０ 形質転換体由来組換え新規トランスフェラーゼを用いたグルコシルトレハロースおよびマルトオリゴシルトレハロースの製造
基質を１００ｍＭのマルトトリオース（Ｇ３）〜マルトヘプタオース（Ｇ７）（いずれも林原バイオケミカル社製）とし、実施例Ｉ−１４で得られた粗酵素液を凍結乾燥した後、５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）に懸濁し、濃縮酵素とした。この濃縮酵素１２．７Unit/ml（マルトトリオースを基質として作用させたときの酵素活性）をそれぞれの基質に作用させ、対応するα-１，α-１転移体を生成させた。各生成物の分析法は実施例Ｉ−１の方法に従って行い、その収率および酵素活性を調べた。結果は第３８表に示される通りであった。なお、第３８表中での酵素活性は、マルトオリゴ糖を１時間に１μｍｏｌの対応するα-１，α-１転移体に変換する酵素活性を１Unitとして示した。
0004033897.tif 000045
実施例II−１５ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓＫＭ１株由来の新規アミラーゼの部分アミノ酸配列の決定
実施例II−２で得られた精製酵素の部分アミノ酸配列の決定は岩松ら（生化学６３、１３９（１９９１））の方法により、またＮ末端アミノ酸配列の決定はMatsudaira T（J.Biol.Chem.262,10035-10038（1987））の方法により行った。
まず精製された新規アミラーゼを、泳動用緩衝液（１０％グリセロール、２．５％ＳＤＳ、２％２−メルカプトエタノール、６２ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８））に懸濁し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、当該酵素をゲルよりポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）膜（ＰｒｏＢｌｏｔ、アプライドバイオシステムズ社製）に、１６０ｍＡで１時間エレクトロブロッティング（ザルトブロットＩＩｓ型、ザルトリウス社製）することにより転写を行った。
転写した後、当該酵素の転写された部分の膜を切りとり、約３００μｌ還元用緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）、０．３％  ＥＤＴＡ、２％アセトニトリル）に浸し、これに１ｍｇのジチオスレイトールを加え、アルゴン下で６０℃／約１時間の還元を行った。これに２．４ｍｇモノヨード酢酸を０．５Ｎ水酸化ナトリウム液１０μｌに溶かしたものを加え、遮光下で２０分間攪拌した。ＰＶＤＦ膜を取り出し、２％アセトニトリルで十分洗浄した後、０．１％ＳＤＳ中で５分間攪拌した。次いで、ＰＶＤＦ膜を水で軽く洗浄した後、０．５％ポリビニルピロリドン−４０を含む１００ｍＭ酢酸に浸し３０分間放置した。この後ＰＶＤＦ膜を水で軽く洗浄し、約１ｍｍ四方に切断した。Ｎ末端アミノ酸配列についてはこの切断した膜を直接気相シークエンサーで分析した。部分アミノ酸配列についてはこの切断した膜を消化用緩衝液（８％アセトニトリル、９０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０））に浸し、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉ（和光純薬工業社製）を１ｐｍｏｌ加え、室温で１５時間かけて消化した。この消化物をＣ８カラム（日本ミリポアリミテッド社製、μ−Ｂｏｎｄａｓｈｅｒｅ  ５Ｃ８、３００Ａ、２．１X １５０ｍｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより分離し、１０数種のペプチド断片を得た。ペプチドの溶出溶媒としては、Ａ溶媒（０．０５％トリフルオロ酢酸）およびＢ溶媒（０．０２％トリフルオロ酢酸を含む２−プロパノール／アセトニトリル  ７：３）を用い、溶出はＢ溶媒に関し２〜５０％の直線濃度勾配で０．２５ｍｌ／分の流速で４０分間溶出させることにより行った。得られたペプチド断片についてのアミノ酸配列の決定は、気相ペプチドシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製、モデル４７０型）を用いた自動エドマン分解法により行った。
決定されたＮ末端アミノ酸配列および部分アミノ酸配列は下記の通りであった。
0004033897.tif 000046
実施例II−１６ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株染色体ＤＮＡの調製
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株を、２ｇ／リットルの可溶性デンプンおよび２ｇ／リットルの酵母エキスを含むＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）発行  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｐｈａｇｅｓ  １８版，１９９２に記載の培地番号１３０４の培地で、７５℃で３日間培養した。遠心分離により集菌し、−８０℃にて保存した。菌体の収率は３．３ｇ／リットルであった。
この菌体１ｇに２５％スクロース、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１ｍＭＥＤＴＡおよび１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌを加えて懸濁し、室温にて３０分間放置した。これに１０％ＳＤＳ０．５ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（和光純薬工業社製）０．２ｍｌを加え、３７℃で２時間放置した。次にこの溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させた。沈澱したＤＮＡを滅菌したガラス棒で巻きとり、これを７０％エタノールで洗浄した後、減圧乾燥した。最終的に１．５ｍｇの染色体ＤＮＡが得られた。
実施例II−１７ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来新規アミラーゼ遺伝子の活性染色法による発現クローニング
実施例II−１６で調製されたＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株の染色体ＤＮＡ  １００μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した。反応液をショ糖密度勾配遠心分離法を用いて分画し、５〜１０ｋｂのＤＮＡ断片を分離精製した。一方プラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒造社製）をＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼにより末端を脱リン酸化し精製したものと、上記５〜１０ｋｂの染色体ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結（ライゲーション）した。この挿入断片を含んだｐＵＣ１１８プラスミドベクターを含んだ混合液を用いて、大腸菌ＪＭ１０９細胞（宝酒造社製）を形質転換した。これを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート培地に播種しコロニーを形成させて、ＤＮＡライブラリーを作成した。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来新規アミラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを有する形質転換体のスクリーニングは活性染色法により行った。
まず、得られた形質転換体を濾紙にレプリカし、ＬＢ寒天培地上にてコロニーを形成させ、この濾紙を１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（生化学工業社製）、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）溶液に浸し３０分間放置した。次いで１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶液に３０分間浸して、溶菌させ、６０℃で１時間熱処理して、宿主由来の酵素を失活させた。この処理した濾紙を０．２％可溶性デンプンを含む寒天プレートにのせて６０℃にて一晩反応を行った。反応させたプレートをヨウ素の蒸気下に置いてデンプンを発色させ、ハローを形成したコロニーを陽性クローンとした。その結果、６０００個の形質転換体から５個の陽性クローンを得た。そこからプラスミドを抽出したところ最も挿入断片の短いものは約４．３ｋｂの挿入断片を有していた。
そこでこの挿入断片を更に制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、更に上記の方法と同様にして、挿入断片を縮小化した。その結果３．５ｋｂの挿入断片を有するプラスミドを保持する形質転換体を得た。このプラスミドを「ｐＫＡ１」と称した。
このプラスミドの挿入断片の制限酵素地図は図３４に示される通りであった。
実施例II−１８ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来新規アミラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列の決定
実施例II−１７で得られたプラスミドｐＫＡ１中の挿入断片の（後記するｐＫＡ２に対応する領域の）ＤＮＡ塩基配列を決定した。
まず、このプラスミドＤＮＡを宝酒造社製、キロシークエンス用デレーションキットを用いて、デレーションプラスミドを作成した。次いでこのプラスミドの挿入断片のＤＮＡ配列をパーキンエルマージャパン社製、ＰＲＩＳＭ，Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｄｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット、Ｔａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙTM  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ  およびアプライド  バイオシステムズ社製、ＤＮＡシークエンサ／ＧＥＮＥＳＣＡＮ  モデル３７３Ａを用いて決定した。
塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列は配列番号５および６に示される通りであった。
このアミノ酸配列中に実施例II−１５で得られた部分アミノ酸配列全てが認められた。このアミノ酸配列は長さが５５８個で、推定分子量６４．４ｋＤａのタンパク質をコードしているものと考えられた。この分子量はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来アミラーゼの精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の測定値６１．０ｋＤａにほぼ一致した。
実施例II−１９ 形質転換体における組換え新規アミラーゼの発現
実施例II−１７で得られたｐＫＡ１について制限酵素ＰｓｔＩで部分消化したものをｐＫＡ２とした。図３５はその制限酵素地図を示したものである。ｐＫＡ２を含む形質転換体の活性は次のようにして調べた。まず上記形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃で一晩培養した。遠心分離により集菌した菌体を１ｇあたり４ｍｌのｐＨ５．５（５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液）へ懸濁し、超音波破砕処理および遠心分離を行ない、その上清を７０℃で１時間熱処理し、宿主のアミラーゼを失活させた。遠心分離により沈澱物を除去し、限外濾過膜（分子量カット１３，０００）で濃縮したものを粗酵素液として、以下の実験に用いた。
（１）基質特異性
前記粗酵素液３５．２Units/ml（ここで１Unitとは、マルトトリオシルトレハロースを基質として作用させたときの酵素活性で、反応条件は実施例II−１に従い、１時間にマルトトリオシルトレハロースからα，α-トレハロースを１μｍｏｌ生成する活性として定義した）を、以下の第３９表に示す１０ｍＭの基質（アミロペクチン、可溶性デンプンについては３．０％）に作用させ、分解性及び分解生成物の分析を行った。各種マルトオリゴ糖、アミロースＤＰ−１７、アミロペクチン、可溶性デンプン、各種イソマルトオリゴ糖、及びパノースについては単糖＋２糖の生成活性を指標として、また、各種トレハロースオリゴ糖、アミロースＤＰ−１７α−１，α−１転移体（アミロースＤＰ−１７の還元末端側の、１つ目と２つ目のグルコース残基間の結合がα−１，α−１であるオリゴ糖）についてはα，α−トレハロースの生成活性を指標として、マルトース及びα，α−トレハロースについてはグルコースの生成活性を指標として実施例II−１に示したTSK-gel Amide-80 HPLCによる分析法で分析を行った。
なお、表中での酵素活性は、各々単糖及び２糖を１時間に１μｍｏｌ遊離する酵素活性を１Unitとして示した。
結果は以下の第３９表に示される通りであった。
0004033897.tif 000047
マルトトリオシルトレハロースからの反応生成物の実施例II−１の条件に従って行ったTSK-gel Amide-80 HPLCによる分析結果は図３６（Ａ）に示される通りであった。また、可溶性デンプンからの反応生成物を、以下の条件で行ったAMINX HPX-42A HPLCによる分析結果は図３６（Ｂ）に示される通りであった。
カラム：AMINEX HPX-42A（7.8 X 300mm）
溶媒  ：水
流速  ：０．６ml/min
温度  ：８５℃
検出器：示差屈折計
以上の結果より、本酵素に関しては還元末端側のグルコース残基がα−１，α−１結合したマルトトリオシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖に、極めてよく作用し、α，α−トレハロースと重合度が２つ減少した対応するマルトオリゴ糖を生成することが確認された。またマルトース（Ｇ２）〜マルトペンタオース（Ｇ５）、アミロース、可溶性デンプンからは、主としてグルコースまたはマルトースを遊離することが確認された。しかしながらα，α−トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、およびパノースに対してはいずれも反応しなかった。
（２）エンド型アミラーゼ活性
前記粗酵素液１５０Unit/ml（活性単位は上記（１）と同様）を可溶性デンプンに作用させた。実施例II−１に示したデンプン分解活性測定法と同様の条件でヨウ素発色の消失を測定し、また上記（１）に示した基質特異性を決定する際の条件のＨＰＬＣ分析法の条件に従って単糖、および２糖の生成量を測定した。これらからデンプン加水分解率を求めた。
その経時変化は図３７に示される通りであった。図から、ヨウ素反応呈色度が５０％消失した時点でのデンプンの加水分解率は４．５％と低く、従って本粗酵素はエンド型アミラーゼの性質を示すことが確認された。
（３）作用機作の検討
ウリジンジホスホグルコース［グルコース-６-３Ｈ］、およびマルトテトラオースにグリコーゲンシンターゼ（ウサギ骨格筋由来、Sigma社製G-2259）を作用させ、非還元末端のグルコース残基を３Ｈで放射能ラベルしたマルトペンタオースを合成し、これを分取精製した。
次にこの放射能ラベルした１０ｍＭのマルトペンタオースを基質とし、前記実施例Ｉ−２０で得られた組換え新規トランスフェラーゼ（１０Unit/ml：活性単位は実施例Ｉ−１に従った）を添加し、６０℃、３時間作用させ、非還元末端のグルコース残基を３Ｈで放射能ラベルしたマルトトリオシルトレハロースを合成し、これを分取精製した。なお、この生成物にグルコアミラーゼ（Rhizopus由来、生化学工業社製）を作用させ、グルコースとα，α−トレハロースに完全に分解した。これらを薄相クロマトグラフィーにて分取しそれぞれ液体シンチレーションカウンターで放射能を測定したところ、α，α−トレハロース画分に放射活性は見られず、グルコース画分に放射活性が回収され、非還元末端のグルコース残基が放射能ラベルされている事を確認した。
以上のように調製した、非還元末端のグルコース残基が３Ｈで放射能ラベルされたマルトペンタオース、および非還元末端のグルコース残基が３Ｈで放射能ラベルされたマルトトリオシルトレハロースを基質として、これに上記粗酵素液をそれぞれ３０Units/ml及び１０Units/ml作用させた。反応前、および６０℃、３時間後に反応物をサンプリングした。この反応物を薄相クロマトグラフィー（Kieselgel 60メルク社製、溶媒；ブタノール：エタノール：水＝５：５：３）で展開した。得られた各糖に相当するところを分取し液体シンチレーションカウンターで放射能を測定したところ、マルトペンタオースを基質とした場合、加水分解産物であるグルコース、マルトース画分には放射活性は見られず、マルトテトラオース、マルトトリオース画分に放射活性が回収された。またマルトトリオシルトレハロースを基質とした場合、加水分解産物であるα，α−トレハロース画分には放射活性は見られず、マルトトリオース画分に放射活性が回収された。
以上の結果より、本組換え新規アミラーゼの作用機作はエンド型に作用するアミラーゼ活性と共に、還元末端側から主に単糖、２糖を生成する活性を有することが確認された。
なお、以上の実施例で用いた試薬の入手先は、それぞれα，α−トレハロース：Sigma社、マルトース（Ｇ２）：和光純薬社、マルトトリオース〜マルトペンタオース（Ｇ３〜Ｇ５）：林原バイオケミカル社、アミロースＤＰ１７：林原バイオケミカル社、イソマルトース：和光純薬社、イソマルトトリオース：和光純薬社、イソマルトテトラオース：生化学工業社、イソマルトペンタオース：生化学工業社、パノース：東京化成社、アミロペクチン：ナカライテスク社である。
実施例II−２０ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株由来新規アミラーゼの部分アミノ酸配列の決定
実施例II−４で得た精製酵素の部分アミノ酸配列の決定は実施例II−１５に記載される方法に従って行った。部分アミノ酸配列は下記の通りであった。
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実施例II−２１ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株  新規アミラーゼ  部分アミノ酸配列に基づくＤＮＡプローブの作成
実施例II−２０により決定された部分アミノ酸配列の情報を基にオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーをＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステムズ社モデル３８１）によって作成した。その配列は下記の通りであった。
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このプライマーを各々１００ｐｍｏｌおよび実施例II−４の方法に従って得た菌体より実施例II−１６の方法に従って調製されたＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株の染色体ＤＮＡ約１００ｎｇを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ装置はパーキンエルマー社製Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲシステム  モデル９６００を用い、１サイクル９４℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃３０秒で行いサイクル数３０回および総液量１００μｌで実施した。約８３０ｂｐの増幅断片をｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へサブクローニングした。このプラスミドの挿入断片の塩基配列を決定したところ実施例II−２０で得られたアミノ酸配列に相当する配列が見いだされた。
実施例II−２２ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株由来新規アミラーゼ遺伝子のクローニング
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株の染色体ＤＮＡは実施例II−４の方法に従って得た菌体より、実施例II−１６の方法に従って得た。上記染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した後，ＥＭＢＬ３  ＢａｍＨＩ切断アーム（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結（ライゲーション）した。パッケージングはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製，ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ  Ｇｏｌｄを用いて行った。上記ライブラリーを大腸菌ＬＥ３９２に３７℃１５分感染させた後、ＮＺＹ寒天プレート培地に播種し、３７℃で約８から１２時間程度培養して、プラークを形成させた。約２時間、４℃で保存した後、ナイロンメンブレン（アマシャム社製、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋）へＤＮＡを吸着させた。２ｘＳＳＰＥで軽く洗浄した後８０℃２時間ベーキングを行った。プローブは実施例II−２１のＰＣＲ断片を用い、アマシャム社製  メガプライムＤＮＡ標識システムを用いて32Ｐで標識した。
ハイブリダイセーションの条件は６ｘＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳで６５℃オーバーナイトで行った。洗浄は２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで、室温１０分、２回行った。
約８０００クローンからスクリーニングを開始して１７個の陽性クローンを得た。このクローンより約５．４ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片を得て、これをｐＵＣ１１８の上記サイトへ挿入した。得られたプラミドをｐ０９Ａ２と命名した。このプラスミドＤＮＡをさらに制限酵素ＳａｃＩで消化したものをｐ０９Ａ１とする。ｐ０９Ａ１の挿入断片の制限酵素地図を図３８に、またｐ０９Ａ１の作成方法を図３９に記す。上記ｐ０９Ａ１についてＰｈａｒｍａｃｉａ社製，ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｄｅｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてデレーションプラスミドを作成した。実施例II−１８の方法に従って新規アミラーゼの構造遺伝子の領域を中心にＤＮＡ配列を決定した。これらのＤＮＡ配列およびそこから推定されるアミノ酸配列は配列番号７および配列番号８にそれぞれ示される通りであった。
このアミノ酸配列中に実施例II−２０で得られた部分アミノ酸配列に相当する配列が全て認められた。このアミノ酸配列は長さが５５６個で、推定分子量６４．４ｋＤａのタンパク質をコードしているものと考えられた。この分子量はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株由来新規アミラーゼの精製酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけることによって得られた分子量の値にほぼ一致した。またプラスミドｐ０９Ａ１を含む形質転換体について実施例II−１９の方法に従って新規アミラーゼ活性を確認した。
実施例II−２３ ＫＭ１株とＡＴＣＣ３３９０９株の上記酵素のアミノ酸配列、塩基配列の相同性について
配列番号６のＫＭ１株由来の新規アミラーゼのアミノ酸配列と、配列番号８のＡＴＣＣ３３９０９株由来の新規アミラーゼのアミノ酸配列とを、また配列番号５のＫＭ１株由来の新規アミラーゼの塩基配列と、配列番号７のＡＴＣＣ３３９０９株由来の新規アミラーゼの塩基配列とを、配列解析ソフト、ジェネティックス（ソフトウエアー開発）を用いてギャップを考慮してそれぞれ解析した。アミノ酸配列についての結果を図４０に、塩基配列についての結果を図４１に示す。それぞれの図中下段にＫＭ１株の配列を、上段にＡＴＣＣ３３９０９株の配列結果を示し、中段の（＊）は両者で一致する配列をまた中段の（．）は両者で性質の似たアミノ酸を示す。相同性はアミノ酸レベルで約５９％、塩基配列レベルで６４％であった。
実施例II−２４ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株  および  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓＡＴＣＣ３３９０９株由来新規アミラーゼ遺伝子の他の生物種の染色体ＤＮＡとのハイプリダイゼーション試験
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ５８３３株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ  ＤＳＭ  ５３８９株、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ  １６５１株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを実施例II−１６の方法に準じて制限酵素Ｈｉｎｄ  IIIで消化した。
この消化物を１％アガロースゲル電気泳動にて分離し、アマシャムジャパン社製、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎにサザンブロッティングした。このメンブレンにプラスミドｐＫＡ１の約１．９ｋｂｐのＰｓｔＩ断片（配列番号５の１番から１８４５番までの配列に対応する）をベーリンガーマンハイム社製、ＤＩＧシステムキットによって標識し、これを用いてハイブリダイゼーションを行った。
条件はハイブリダイゼーション：５ｘＳＳＣ、４０℃、３時間、洗浄：２ｘＳＳＣ（０．１％ＳＤＳを含む）、４０℃、５分、２回  ０．１ｘＳＳＣ（０．１％ＳＤＳを含む）、４０℃、５分、２回であった。
その結果、ＰｓｔＩ断片は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５８３３株については約１３．０ｋｂｐの断片と、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ  ＤＳＭ  ５３８９株については約９．８ｋｂｐの断片と、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ  １６５１株については約１．９ｋｂｐの断片とハイブリッドを形成した。一方、ネガティブコントロールであるＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株については、ハイブリッドの形成は観察されなかった。
またＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、ＤＳＭ５３５４株、ＤＳＭ５８３３株、ＡＴＣＣ３５０９１株、ＡＴＣＣ３５０９２株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株、ＡＴＣＣ４９４２６株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ  ＤＳＭ５３８９株、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ１６５１株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを実施例II−１６の方法に従って得、制限酵素ＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＥｃｏＲＶで消化した。この消化物を１％アガロースゲル電気泳動にて分離し、アマシャム社製、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋にサザンブロッティングした。このメンブレンに配列番号７番の１３９３番より２１２１番の領域（実施例II−２２で得られたｐ０９Ａ１より制限酵素ＥｃｏＴ22ＩとＥｃｏＲＶで消化し、ゲルから回収した）をプローブとして実施例II−２２の方法に従い32Ｐによって標識し、これを用いてハイブリダイゼーションを行った。条件はハイブリダイゼーション６ｘＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、６０℃でオーバーナイトで行った。洗浄は２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで室温１０分、２回行った。その結果Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株、ＤＳＭ５３５４株、ＤＳＭ５８３３株、ＡＴＣＣ３５０９１株、ＡＴＣＣ３５０９２株  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ３３９０９株、ＡＴＣＣ４９４２６株  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ  ＤＳＭ５３８９株  Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ  ＤＳＭ１６５１株の染色体ＤＮＡはそれぞれ約３．６ｋｂｐ，１．０ｋｂｐ，０．９ｋｂｐ、０．９ｋｂｐ、１．０ｋｂｐ、０．９ｋｂｐ、０．９ｋｂｐ、１．４ｋｂｐ、０．９ｋｂｐの部位でハイブリッドを形成した。一方Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡとはハイブリッドを形成しなかった。また配列番号５、６、７、および８の範囲内に含まれるアミノ酸配列、塩基配列と相同性を有する配列が存在しないことをアミノ酸データーバンク（Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ，及びＮＢＲＦ−ＰＤＢ）、塩基配列データーパンク（ＥＭＢＬ）から、配列解析ソフト、ジェネティックス（ソフトウエアー開発）を用いて確認した。よってこの新規アミラーゼ遺伝子はＳｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属する古細菌に特異的に高度に保存されていることがわかった。
実施例III−１ 組換え新規アミラーゼおよび組換え新規トランスフェラーゼを用いたα，α−トレハロースの製造
実施例II−１９で得られた粗精製組換え新規アミラーゼおよび実施例Ｉ−２０で得られた濃縮組換え新規トランスフェラーゼ並びに１０％可溶性デンプン（ナカライテスク社製、特級品）を用い、プルラナーゼを補助的に添加して、α，α−トレハロースの製造を試みた。反応は以下のように行った。
まず１０％可溶性デンプンを０．５〜５０Unit/mlのプルラナーゼ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来：和光純薬社製）で、４０℃で１時間処理した後、上記組換え新規トランスフェラーゼ（１０Unit/ml）と、上記組換え新規アミラーゼ（１５０Unit/ml）とを添加し、ｐＨ５．５、６０℃で１００時間反応させた。次いで反応液を１００℃で５分間加熱処理して反応を停止し、未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解した。その後、実施例II−１に示す条件のＨＰＬＣ分析法により測定した。
TSK-gel Amide-80 HPLCによる分析結果は図４２に示される通りであった。
ここで、組換え新規アミラーゼの酵素活性は１時間に１μｍｏｌのα，α-トレハロースをマルトトリオシルトレハロースから遊離する活性を１Unitとして示した。組換え新規トランスフェラーゼの酵素活性はマルトトリオースを１時間に１μｍｏｌのグルコシルトレハロースに変換する活性を１Unitとして示した。プルラナーゼの酵素活性の定義は、ｐＨ６．０、３０℃で１分間にプルランから１μmolのマルトトリオースを生成する酵素量を１Unitとして示した。
プルラナーゼの添加量５０Unit/mlの際α，α-トレハロースの収率は６７％であった。この値は、組換え新規アミラーゼが、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＫＭ１株由来精製新規アミラーゼを上記条件で作用させた場合とほぼ同様の収率を与えることを示している。
産業上の利用可能性
本発明の新規な精製法に基づく酵素製造法により得られるマルトオリゴ糖等の糖に作用してグルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロースなどのトレハロースオリゴ糖等を生成する能力を有する新規トランスフェラーゼを用いることにより、マルトオリゴ糖等の原料を用いて効率的で、かつ高収率にグルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロースなどのトレハロースオリゴ糖等を製造する新規な方法を提供することができる。
本発明の新規アミラーゼを、本発明の新規トランスフェラーゼと組み合わせて用いることにより、デンプン、デンプン分解物、及びマルトオリゴ糖等の糖質原料から効率的に、かつ高収率にα，α−トレハロースを製造する新規な方法を提供することができる。
配  列  表
配列番号：１
配列の長さ：２５７８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic ＤＮＡ
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000050
0004033897.tif 000051
0004033897.tif 000052
0004033897.tif 000053
0004033897.tif 000054
0004033897.tif 000055
0004033897.tif 000056
配列番号：２
配列の長さ：７２８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000057
0004033897.tif 000058
0004033897.tif 000059
0004033897.tif 000060
配列番号：３
配列の長さ：３４６７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic ＤＮＡ
起源
生物：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ  ３３９０９株
配列
0004033897.tif 000061
0004033897.tif 000062
0004033897.tif 000063
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0004033897.tif 000065
0004033897.tif 000066
0004033897.tif 000067
配列番号：４
配列の長さ：６８０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ  ３３９０９株
配列
0004033897.tif 000068
0004033897.tif 000069
0004033897.tif 000070
0004033897.tif 000071
配列番号：５
配列の長さ：２６９１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic ＤＮＡ
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000072
0004033897.tif 000073
0004033897.tif 000074
0004033897.tif 000075
0004033897.tif 000076
0004033897.tif 000077
配列番号：６
配列の長さ：５５８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000078
0004033897.tif 000079
0004033897.tif 000080
配列番号：７
配列の長さ：３６００
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic ＤＮＡ
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000081
0004033897.tif 000082
0004033897.tif 000083
0004033897.tif 000084
0004033897.tif 000085
0004033897.tif 000086
0004033897.tif 000087
配列番号：８
配列の長さ：５５６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000088
0004033897.tif 000089
0004033897.tif 000090
0004033897.tif 000091
配列番号：９
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000092
配列番号：１０
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000093
配列番号：１１
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000094
配列番号：１２
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000095
配列番号：１３
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000096
配列番号：１４
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000097
配列番号：１５
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000098
配列番号：１６
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000099
配列番号：１７
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000100
配列番号：１８
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000101
配列番号：１９
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000102
配列番号：２０
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000103
配列番号：２１
配列の長さ：４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000104
配列番号：２２
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000105
配列番号：２３
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000106
配列番号：２４
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000107
配列番号：２５
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000108
配列番号：２６
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000109
配列番号：２７
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000110
配列番号：２８
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0004033897.tif 000111
配列番号：２９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0004033897.tif 000112
配列番号：３０
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000113
配列番号：３１
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000114
配列番号：３２
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000115
配列番号：３３
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000116
配列番号：３４
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000117
配列番号：３５
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000118
配列番号：３６
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000119
配列番号：３７
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000120
配列番号：３８
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000121
配列番号：３９
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000122
配列番号：４０
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000123
配列番号：４１
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000124
配列番号：４２
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000125
配列番号：４３
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000126
配列番号：４４
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000127
配列番号：４５
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：Ｎ端フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000128
配列番号：４６
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000129
配列番号：４７
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000130
配列番号：４８
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物：Sulfolobus solfataricus
株名：ＫＭ１
配列
0004033897.tif 000131
配列番号：４９
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000132
配列番号：５０
配列の長さ：１７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000133
配列番号：５１
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000134
配列番号：５２
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000135
配列番号：５３
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000136
配列番号：５４
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000137
配列番号：５５
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000138
配列番号：５６
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：Sulfolobus acidocaldarius
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
配列
0004033897.tif 000139
配列番号：５７
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0004033897.tif 000140
配列番号：５８
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0004033897.tif 000141
【図１Ａ】
0004033897.tif 000142
【図１Ｂ】
0004033897.tif 000143
【図２】
0004033897.tif 000144
【図３】
0004033897.tif 000145
【図４】
0004033897.tif 000146
【図５】
0004033897.tif 000147
【図６】
0004033897.tif 000148
【図７】
0004033897.tif 000149
【図８】
0004033897.tif 000150
【図９Ａ】
0004033897.tif 000151
【図９Ｂ】
0004033897.tif 000152
【図１０】
0004033897.tif 000153
【図１１】
0004033897.tif 000154
【図１２】
0004033897.tif 000155
【図１３】
0004033897.tif 000156
【図１４】
0004033897.tif 000157
【図１５】
0004033897.tif 000158
【図１６】
0004033897.tif 000159
【図１７Ａ】
0004033897.tif 000160
【図１７Ｂ】
0004033897.tif 000161
【図１７Ｃ】
0004033897.tif 000162
【図１８】
0004033897.tif 000163
【図１９】
0004033897.tif 000164
【図２０】
0004033897.tif 000165
【図２１】
0004033897.tif 000166
【図２２】
0004033897.tif 000167
【図２３】
0004033897.tif 000168
【図２４】
0004033897.tif 000169
【図２５】
0004033897.tif 000170
【図２６】
0004033897.tif 000171
【図２７】
0004033897.tif 000172
【図２８Ａ】
0004033897.tif 000173
【図２８Ｂ】
0004033897.tif 000174
【図２９】
0004033897.tif 000175
【図３０】
0004033897.tif 000176
【図３１】
0004033897.tif 000177
【図３２Ａ】
0004033897.tif 000178
【図３２Ｂ】
0004033897.tif 000179
【図３３Ａ】
0004033897.tif 000180
【図３３Ｂ】
0004033897.tif 000181
【図３４】
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【図３５】
0004033897.tif 000183
【図３６Ａ】
0004033897.tif 000184
【図３６Ｂ】
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【図３７】
0004033897.tif 000186
【図３８】
0004033897.tif 000187
【図３９】
0004033897.tif 000188
【図４０】
0004033897.tif 000189
【図４１Ａ】
0004033897.tif 000190
【図４１Ｂ】
0004033897.tif 000191
【図４２】
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