(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするヘキシュロースリン酸イソメラーゼが発現可能な形態で導入された細胞。
【請求項４】
請求項３記載の細胞を培地で培養し、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼを培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりヘキシュロースリン酸イソメラーゼを採取することを特徴とするヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼをコードするＤＮＡ及びヘキシュロースリン酸イソメラーゼを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
メチロトローフ細菌のＣ１代謝には、リブロースモノリン酸経路が知られている。この経路は、リブロース ５−リン酸によるホルムアルデヒドの固定に始まり、フルクトース ６−リン酸の開裂、リブロース ５−リン酸の再生の３つの段階により構成されている。リブロースモノリン酸経路は、いくつかの代謝系と共役した経路であり、この経路に関与する各酵素の遺伝子構造に興味が持たれていたが、本経路に関する報告は少なく、遺伝子的な解析もほとんどなされていない。
【０００３】
リブロースモノリン酸経路の初発反応を触媒する３−ヘキシュロース−６−リン酸シンターゼ（3-hexulose-6-phosphate synthase、以下「ＨＰＳ」ともいう。）については、グラム陰性の偏性メタノール資化菌であるメチロモナス  アミノファシエンス（Methylomonas aminofaciens）において既に精製され、これをコードする遺伝子がクローニングされ、一次構造が報告されている（Yanase, H. et al., FEMS Microbiol. Lett., 135, 201-205 (1996)）。
【０００４】
ところで、目的化合物分子上の特異的な位置が、安定同位元素炭素13（13C）で標識されている生化学物質は、生物代謝経路の研究に役立つ。更に近年、代謝産物の生体内での様子を、炭素13-NMRの技術を用いて調べる事は、いろいろな病気の診断や日々の健康診断において、大変重要な手法になってきている。その様な新しい技術には、ある目的の位置を炭素13で標識した化合物が、安価に提供できる事が必要であり、また望まれていた。
【０００５】
本発明者らは、メタノール資化菌のホルムアルデヒド固定経路を利用し、炭素13標識のメタノールから、［1-13C］Ｄ−グルコース ６−リン酸の調製方法を確立していたが、目的化合物の合成収率はあまり高くなかった（Biosci.Biotech.Biochem.57,308-312 (1993)）。
【０００６】
そこで、目的産物のみを効率よく生産させる系が望まれていた。そのような系の一つとして、標識ホルムアルデヒドとリブロース ５−リン酸を用い、標識Ｄ−フルクトース ６−リン酸を合成する一連の各酵素を調製し、これらを用いた反応系で、効率よい目的標識化合物の調製を行うという方法が考えられる。その反応の最初の酵素であるＨＰＳは、上述したようにメチロモナス  アミノファシエンスではその遺伝子が単離され、構造も明らかとなっている。しかし、その次の段階の反応を触媒する酵素であるヘキシュロースリン酸イソメラーゼ（hexulose-phosphate isomerase、以下「ＨＰＩ」ともいう。あるいは、本酵素は、phospho-3-hexuloisomerase、ホスホ−３−ヘキシュロイソメラーゼ、（ＰＨＩ）ともいう。）は、部分的に精製されていたに過ぎず、そのアミノ酸配列も遺伝子構造も知られていない。さらに、グラム陽性の通性メタノール資化菌であるマイコバクテリウム属細菌では、ＨＰＳ及びＨＰＩのいずれの酵素についてもアミノ酸配列及び遺伝子構造は報告されていない。
【０００７】
この様な状況下では、効率よい目的標識化合物の調製系の確立の為には、ＨＰＩをコードする遺伝子を単離し、それを用いて効率よくＨＰＩを製造する方法が望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記観点からなされたものであり、ＨＰＩをコードするＤＮＡ及び該ＤＮＡの利用法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グラム陽性の通性メタノール資化菌であるマイコバクテリウムガストリ（Mycobacterium gastri）における、リブロースモノホスフェート経路、特にＨＰＳ及びその遺伝子について研究をしていたところ、偶然に、この株のＨＰＩをコードする遺伝子を発見し、本発明に至った。
すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである。
（Ａ）配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１０】
前記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１１】
また、本発明は、前記ＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするヘキシュロースリン酸イソメラーゼが発現可能な形態で導入された細胞を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、前記細胞を培地で培養し、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼを培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりヘキシュロースリン酸イソメラーゼを採取することを特徴とするヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造法を提供する。
【００１３】
尚、本発明において、「ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性」とは、３−ヘキシュロース ６−リン酸とフルクトース ６−リン酸との間の異性化反応を触媒する活性をいう。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について、詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、後記実施例に示すように、マイコバクテリウム  ガストリ染色体ＤＮＡから次のようにして取得したものである。
まず、マイコバクテリウム  ガストリ MB19株から、ＨＰＳを精製する。ＨＰＳは、MB19株の無細胞抽出液から、DEAE−セファロースカラムクロマトグラフィー、フェニルセファロースカラムクロマトグラフィー、DEAE−セファロースカラムクロマトグラフィーにより、SDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製することができる。各精製工程において、ＨＰＳ活性は、Methods in Enzymology Vol.188，397-401 (1990年)に記載の方法にて測定することができる。
【００１６】
次に、精製ＨＰＳの部分アミノ酸配列を決定し、得られるアミノ酸配列情報を基に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）用のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、マイコバクテリウム  ガストリ MB19株より調製したゲノムDNAを鋳型とするＰＣＲを行う。ゲノムDNAは、Saitoらの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)に記載）により取得することができる。ゲノム調製に用いる菌体を得るための培養は、メタノールを炭素源とし、さらに1%のグリシンを添加した培地を用いると、菌体量が多く取れ、溶菌操作が容易となる。また、溶菌酵素としては、リゾチームのみでは十分な溶菌に至らないが、Ｎ−アセチルムラミダーゼ(N-acethylmuramidase) SGを用いると効果的である。
【００１７】
プライマーとして、配列表の配列番号８及び配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いると、上記ＰＣＲによって約400bpのDNA断片が得られる。
【００１８】
次に、上記のようにしてＰＣＲにより増幅されるDNA断片をDNAプローブに用いて、マイコバクテリウム  ガストリ MB19株ゲノムＤＮＡのPstI切断断片ライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローンを取得する。
【００１９】
上記のようにして得られた約4.1kbの長さのクローン断片のうち、約3kbについて塩基配列を決定した結果を配列表配列番号12に示す。この領域内には３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。各ＯＲＦがコードするアミノ酸配列を、５’末端側から順に、配列番号13〜15に示す。これらのうち、２番目のＯＲＦ（ORF-2）は、ＨＰＳの部分アミノ酸配列と完全に一致したことから、ＨＰＳをコードする遺伝子（以下、「ｈｐｓ」ともいう）であることが示された。一方、一番目のＯＲＦ（ORF-1）は、このＯＲＦを発現させて得られるタンパク質の活性を調べることによって、ＨＰＩをコードする遺伝子（以下、「ｈｐｉ」ともいう）、すなわち本発明のＤＮＡであることが確認された。
【００２０】
上記のように、本発明のＤＮＡは、ＨＰＳの精製及びｈｐｓの単離に付随して偶然取得されたものであるが、本発明のＤＮＡの取得は、ORF-1がＨＰＩをコードしているのではないかとの着想に基づき、ORF-1を発現させ、発現産物の活性を確認することによりなされたものである。ORF-1がコードするアミノ酸配列について、既知の種々のデータベース検索を行ったが、機能が良く知られたポリペプチドとの高い相関は見い出せなかった。
【００２１】
尚、本発明のＤＮＡの単離に用いたマイコバクテリウム  ガストリはグラム陽性の通性メタノール資化菌であり、すでにｈｐｓが単離されているメチロモナスアミノファシエンスはグラム陰性の偏性メタノール資化菌であって、両者は分類学的には全く異なる。
【００２２】
本発明のＤＮＡは、上記のようにして取得されたものであるが、本発明によりその塩基配列及びコードするアミノ酸配列が明らかとなったので、これらの塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、マイコバクテリウム属細菌、例えばマイコバクテリウム  ガストリ MB19株のゲノムＤＮＡライブラリーから取得することができる。また、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとし、マイコバクテリウム属細菌のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行うことによっても、本発明のＤＮＡは得られる。
【００２３】
ゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1.21(1989)に記載されている。
【００２４】
後記実施例で得られた、本発明のＤＮＡを含み、かつ、トリプトファンオペロンプロモーターの制御下でＨＰＩを発現するプラスミドpT-HPIS-1を含むエシェリヒア  コリ（Escherichia coli） JM1O9/pT-HPIS-1は、プライベートナンバーAJ13363が付与され、平成９年８月４日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ  Ｐ−１６３６３の受託番号で寄託され、平成１０年１月１６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２５の受託番号で寄託されている。
【００２５】
本発明のＤＮＡは、コードされるＨＰＩの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＨＰＩをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なる。それは、イソロイシンとバリンのように、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、蛋白質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。具体的には、前記「数個」は、より好ましくは２から１０個である。
【００２６】
上記のようなＨＰＩと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ＨＰＩをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びＨＰＩをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００２７】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、ｈｐｉを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００２８】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のＨＰＩ活性を調べることにより、ＨＰＩと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するＨＰＩをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号12に記載の塩基配列のうち、塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＨＰＩ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、ＨＰＩと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。
【００２９】
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎＨＰＩ活性を前記の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００３０】
＜２＞ヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造
上記の本発明のＤＮＡを、適当な宿主−ベクター系を用いて発現させることにより、ＨＰＩを製造することができる。
ｈｐｉ遺伝子を発現させるための宿主としては、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）をはじめとする種々の真核細胞、動物細胞、植物細胞が挙げられるが、これらの中では原核細胞、特にエシェリヒア  コリが好ましい。
【００３１】
上記の宿主にｈｐｉ遺伝子を導入するためのベクターとしては、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。これらのベクターにｈｐｉ遺伝子を連結して得られる組換えベクターで上記宿主を形質転換することによって、ｈｐｉ遺伝子を導入することができる。また、ｈｐｉ遺伝子を、トランスダクション、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)）を用いた方法で宿主のゲノムに組み込んでもよい。
【００３２】
また、ｈｐｉ遺伝子の発現を効率的に実施するために、ＨＰＩをコードするＤＮＡ配列の上流に、宿主細胞内で働くｌａｃ、ｔｒｐ、ＰL等のプロモーターを連結してもよい。ベクターとして、プロモーターを含むベクターを用いると、ｈｐｉ遺伝子と、ベクター及びプロモーターとの連結を一度に行うことができる。このようなベクターとしては、ｔｒｐプロモーターを含むpT13sNco（J. Biochem. 104, 30-34 (1988)に記載）が挙げられる。
【００３３】
形質転換は、例えば、エシェリヒア  コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（ Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970) ）や、バチルス  ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1,153(1977) ）を用いることができる。あるいは、バチルス  ズブチリス、放線菌類および酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen.,Genet.,168.111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75 1929(1978)）も応用できる。これらの方法は、宿主として用いる細胞に応じて適宜選択すればよい。
【００３４】
ｈｐｉ遺伝子としては、発現した時にＨＰＩ活性を有するものであればすべて含まれるが、好ましくは、配列表の配列番号13記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む遺伝子、又は配列表の配列番号12記載の塩基配列のうち塩基番号６０８〜１２０４で表される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、前述のように、コードされるＨＰＩの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＨＰＩをコードするＤＮＡを含むものであってもよい。
【００３５】
上記のようにしてｈｐｉ遺伝子を導入された細胞を培地で培養し、ＨＰＩを培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりＨＰＩを採取することにより、ＨＰＩを製造することができる。培養に用いる培地は、用いる宿主に応じて適宜選択すればよい。宿主としてエシェリヒア  コリを用い、ｈｐｉをｔｒｐプロモーターで発現させる場合には、M9−カザミノ酸−グルコース培地が好ましい。培養は、37℃で行い、培養開始後数時間後に、ｔｒｐプロモーターの誘導剤であるインドールアクリル酸（IAA）を終濃度25μg/mlになるよう添加し、更に培養を続けると、菌体内にＨＰＩが蓄積する。また、適当な分泌系を用いてＨＰＩを細胞外に分泌生産させる場合には、ＨＰＩは培地中に蓄積する。
【００３６】
上記のようにして製造されるＨＰＩは、必要に応じて、菌体抽出液又は培地からイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、溶媒沈殿等、通常の酵素の精製法を用いて精製することができる。
【００３７】
本発明により得られるＨＰＩは、炭素13標識のメタノールから、［1-13C］Ｄ−グルコース ６−リン酸を調製するのに利用することができる。この［1-13C］Ｄ−グルコース ６−リン酸の調製は、例えば次のようにして行うことができる。メタノール資化酵母キャンヂタ  ボイヂニーより調製したアルコールオキシダーゼを用いてメタノールをホルムアルデヒドに酸化する。得られたホルムアルデヒドはＨＰＳの作用で、リブロース ５−リン酸とアルドール縮合してアラビノ−３−ヘキシュロース ６−リン酸を生成させる。この場合、リブロース ５−リン酸は不安定であるので、同じ反応系内でリボース ５−リン酸よりホスホリボイソメラーゼの作用でリブロース ５−リン酸に異性化し、ＨＰＳ反応に供する。上記反応で生成したアラビノ−３−ヘキシュロース ６−リン酸はＨＰＩの作用で、フルクトース ６−リン酸に変換され、更に、これはグルコース ６−リン酸イソメラーゼの作用で、グルコース ６−リン酸に変換される。一般に、メタノール資化性細菌のＨＰＩ含量は、ＨＰＳに比べて著しく低いため、ＨＰＩを上記反応に利用することは困難であったが、本発明によりｈｐｉが単離され、効率よくＨＰＩを製造する方法が提供されたので、上記反応を実用化することが可能となった。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００３９】
【実施例１】
マイコバクテリウム  ガストリ MB19株のｈｐｉ遺伝子のクローニング及びＨＰＩの発現
＜１＞３−ヘキシュロース−６−リン酸シンターゼの精製
マイコバクテリウム  ガストリ MB19株を、炭素源がメタノールのみの基本培地〔組成：1%(v/v)メタノール，0.2% NaNO3，0.2%（NH4)2SO4，0.2% K2HPO4，0.1% KH2PO4，0.02% MgS04・7H20，0.02% 酵母エキス，0.2%(v/v)ビタミン溶液（40mgパントテン酸カルシウム塩，20mgイノシトール，40mg ニコチン酸，20mg p-アミノ安息香酸塩，40mg ピリドキシン塩酸塩，0.2mg ビオチン，40mgチアミン塩酸塩を蒸留水100mlに溶解したもの），1%(v/v)微量金属塩溶液（0.2g CaCl2・2H2O，0.2g MnS04・7H20，0.2g ZnS04・7H20，0.02g CuS04・5H20，0.1g FeS04・7H20，0.05g Na2MoO4・2H20，0.25g H3B03，0.05g KIを蒸留水100mlに溶解したもの）〕にて30℃、24時間、10リッター（L）ジャー培養装置で培養を行い、その培養液10Lから集菌（6500×g にて連続遠心）し、湿菌体80gを得た。
【００４０】
上記菌体を、濃度が10%(w/v)になるように緩衝液Ａ（10mM Tris-HCl(pH8.2)，1mM ジチオスレイトール，5mM 塩化マグネシウム，0.15mM フェニルメチルスルフォニルフルオライド）に懸濁した。次に、その懸濁液中の菌体を、180Wの強度にて超音波破砕し、それを120,000×gにて60分、超遠心分離した後、その上清画分を無細胞抽出液として得た。これを緩衝液Ａで平衡化したDEAE−セファロースイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。この条件で、目的のＨＰＳ蛋白質は、前記カラムに吸着した。そこで、このカラムに対して、高いTris-HCl濃度を含む緩衝液（100mM Tris-HCl(pH8.2)、1mM ジチオスレイトール、5mM 塩化マグネシウム、0.15mM フェニルメチルスルフォニルフルオライド）を用いて、緩衝剤の濃度勾配をかけることで目的ＨＰＳ蛋白質を溶出し、酵素活性画分を回収した結果、約19倍に精製されたＨＰＳ標品を得ることができた。
【００４１】
次に、上記ＨＰＳ標品を、3M NaCl，1mMジチオスレイトール，5mM 塩化マグネシウム，0.15mM フェニルメチルスルフォニルフルオライドを含む10mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）（緩衝液Ｂ）に対して透析し、同緩衝液で平衡化したフェニルセファロースカラムによる疎水クロマトグラフィーに供した。この条件で、ＨＰＳは吸着した。次に、エチレングリコールを含む緩衝液（50% エチレングリコール、1mM ジチオスレイトール、5mM 塩化マグネシウム、0.15mM フェニルメチルスルフォニルフルオライド、10mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.0））を用いて、このカラムに対して、濃度勾配をかけることでタンパク質を溶出し、ＨＰＳ活性を示す画分を集めた。この段階でＨＰＳを31倍に精製できた。
【００４２】
更に、標品の純度を上げる為に、再度、前記と同様の平衡化、溶出条件にて、DEAE−セファロースカラムに供することで、ＨＰＳを収率47%、比活性42倍で、SDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製することができた。
【００４３】
なお、各精製工程において、ＨＰＳ活性は、基本的には Methods in Enzymology Vol.188，397-401 (1990年)に記載の方法にて測定した。具体的な方法は以下の通りである。酵素反応キュベットの中に、0.5Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）0.05ml，50mM 塩化マグネシウム 0.05ml，50mM リボース ５−リン酸 0.05ml，100U/ml ホスホリボイソメラーゼ（シグマ社製）0.05ml，水 0.15mlを入れ、そこへ活性測定の標品を0.05ml添加し、混合した。これを30℃で２分間、プレインキュベーションした後、10mM ホルムアルデヒドを 0.1ml加え、酵素反応を開始した。30℃で5分間の反応後、0.1mlの0.5M HClをその反応液へ添加することで、反応を停止した。そして、その反応溶液を20倍に希釈したものへ、Nash 試薬（Biochem. J., 55, 416 (1953)に記載）を2ml添加し、溶液中のホルムアルデヒドの減少の程度を測定した。なお、対照実験としては、上記のリボース ５−リン酸の代わりに水を加えた反応系を用いた。
【００４４】
＜２＞ｈｐｓ遺伝子のクローニング
上記のようにして得られた精製ＨＰＳをプロテインシーケンサーにかけ、Ｎ末端配列を30残基決定した（MKLQVAIDLLSTEAALELAGKVAEYVDIIE(配列番号１)）。また、リジルエンドベプチダーゼで精製ＨＰＳを処理し、その分解ペプチド断片産物を逆相HPLCにて分画し、各々を上記同様にプロテインシーケンサーにより解析することで、ＨＰＳの内部アミノ酸配列を決定した（VAEYVDIIELGTPLIK(配列番号２)、IVFADMK(配列番号３)、ATRAQEVRALGAK(配列番号４)、FVEMHAGLDEQAK(配列番号５)、ARVPFSVAGGVK(配列番号６)、VATIPAVQK(配列番号７)）。
【００４５】
これらのアミノ酸配列情報を基に、ｈｐｓ遺伝子をＰＣＲにより増幅するためのＮ末端プライマーとして、配列番号８に記載の塩基配列（5'-ATGAARYTICARGTNGCIATHGA-3'）を有するオリゴヌクレオチドを、 そして内部プライマーとして配列番号９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（5'-CCNGCRTGCATYTCNACRAA‐3'）を化学合成した。これらをプライマーとして用い、マイコバクテリウム  ガストリ MB19株より調製したゲノムDNAを鋳型とするＰＣＲを行い、約400bpのDNA断片を得た。鋳型に用いたゲノムDNAの取得は、Saitoらの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)に記載）を参考に行った。培養は、菌体量が多く取れるエタノールを炭素源とした基本培地で行ったが、そのままでは溶菌操作に苦労するということが判明した為、培養液に1%のグリシンを添加した。更に、リゾチームのみでは、十分な溶菌に至らなかったので、種々の可溶化酵素を検討したところ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ(N-acethylmuramidase) SGが効果的であったので、これを用いた。またＰＣＲは、宝酒造（株）製のEX Taq-DNA polymeraseを用い、95℃：１分、55℃：１分、72℃：１分という条件の反応を２５回行った。
【００４６】
こうして、上記のようにして得られたDNA断片を、改めてDNAプローブに用いて、各種制限酵素処理を行ったマイコバクテリウム  ガストリ MB19株ゲノムDNAに対してジェノミックサザン解析を行ったところ、このプローブは、ゲノムDNAをPstI処理することによって切り出される約4.1kb の大きさのDNA断片とハイブリダイズすることが判った。そこで、この結果を基に、pUC118をベクターとして、これにPstIで切断したマイコバクテリウム  ガストリ MB19株ゲノムDNA断片を連結して作製したゲノムライブラリーに対して、先のDNAプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローンを取得した。そしてこのクローンより約7.2kbpのプラスミドを得た。このプラスミドをpUHM1と命名した。
【００４７】
＜３＞ｈｐｓ遺伝子の塩基配列決定
次に、プラスミドpUHM1上の挿入DNA断片のDNA塩基配列を約3kb決定した。結果を配列表の配列番号12に示す。その結果、この領域内には３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。各ＯＲＦがコードするアミノ酸配列を、５’末端側から順に、配列番号13〜15に示す。
【００４８】
２番目のＯＲＦ（ORF-2）がコードするタンパク質は、207アミノ酸残基からなるもので、これより求めた分子量は21000であった。この値は、精製ＨＰＳのサブユニットより求めた分子量24000とほぼ一致した。また、ORF-2によってコードされるアミノ酸配列（配列番号14）は、精製した蛋白質から得られた７種のアミノ酸配列（Ｎ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列）と完全に一致し、これがＨＰＳをコードしている遺伝子（ｈｐｓ）であることが示された。
【００４９】
一方、このｈｐｓ上流のＯＲＦ（ORF-1）のアミノ酸配列を、Blast（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを用いて既知の種々のデータベースに対して検索したところ、機能が良く知られたポリペプチドとの高い相関は見い出せなかった。
【００５０】
＜４＞ORF‐1の発現
上記で得られたｈｐｓの上流にあるORF‐1を強制発現させ、コードされるタンパク質の活性を調べることを試みた。２種のオリゴヌクレオチド、5'-CGAAATCGATAAAAATGACGCAAGCCGCAGAAGCCGACGGCG-3'（配列番号１０）及び(5'-AATTCCAGCTCTAGACAAGGCGGTACGGCG-3'（配列番号１１）を合成し、これらをプライマーとし、プラスミドpUHM1を鋳型としてＰＣＲを行い、ORF-1を含み、その上流末端がClaI部位、そして、下流末端がXbaIであるDNA断片（A）を調製した。
【００５１】
一方、上記DNA断片（A）を発現させるための高発現用プラスミドとして、トリプトファンプロモーターを有するpT13sNco（J. Biochem. 104, 30-34 (1988)に記載）を用いた。pT13sNcoを制限酵素ClaI及びXbaIにて切断し、得られる大きいDNA断片（B）を調製した。これに、上記のDNA断片（A）をT4 DNAリガーゼにて連結することで、ORF-1の発現プラスミドpT-HPIS-1を構築した。
【００５２】
このpT-HPIS-1を用いてエシェリヒア  コリ JM1O9株を常法により形質転換し、形質転換体JM109/pT-HPIS-1を得た。一方、DNA断片（A）を含まないプラスミドで形質転換した対照株としては、pT13sNcoのベクター部分である pTTNcoを保持するエシェリヒア  コリ JM109株（JM109/pTTNco）を用いた。
【００５３】
これらの形質転換体を、M9−カザミノ酸−グルコース培地で、37℃にて振盪培養し、約２時間後に、トリプトファンプロモーターからの転写の誘導剤であるインドールアクリル酸（IAA）を終濃度25μg/mlになるよう添加し、更に培養を４時間続け、その後、培養液1.5mlを集菌した。この菌体へ、0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）を 0.5ml添加し、懸濁した。次に、菌体を超音波破砕後、遠心分離（15000rpm×５分）し、可溶性画分を酵素標品とした。
【００５４】
上記酵素標品について、ＨＰＩ活性の測定を行った。活性測定法は、ホルムアルデヒドの同化を、最終的にグルコース−６−リン酸脱水素酵素による酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還元化を測定するという方法をとった。
【００５５】
具体的には、反応液〔20mMリン酸カリウム（pH7.5），1mM塩化マグネシウム，1mM リボース ５−リン酸、0.8mM NADP+（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸），3U/ml ホスホリボイソメラーゼ（シグマ社製）、3.5U/ml ホスホグルコイソメラーゼ（ベーリンガー社製），3.5U/ml グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ベーリンガー社製）、3U/ml ＨＰＳを、0.9mlずつ分光光度計用のキュベット（標品用と対照用）に入れ、その後、各々のキュベットに菌体可溶性画分を0.05mlづつ加え、混合した。30℃で２分間保温後、対照用のキュベットには水0.05mlを、標品用のキュベットには0.1Mホルムアルデヒドを0.05ml加えることで反応を開始し、NADP+の還元に伴う340nm波長光の吸光度上昇を指標にＨＰＩ活性を測定した。尚、この活性測定に用いたＨＰＳは、FEMS microbiology letter 135,201-205 (1996)に記載された公知の方法で、メチロモナス  アミノファシエンス 77a株由来のｈｐｓ遺伝子をエシェリヒア  コリに組み込んだ株を用いて量産化したＨＰＳを、Agric.Biol.Chem.,41,1133-1140 (1997)に記載の公知の方法にて精製したものを用いた。
【００５６】
その結果、対照株（JM109/pTTNco）から得られた細胞抽出液を用いた場合は、ＨＰＩ酵素活性は全く示さなかったが、JMIO9/pT-HPIS-1の抽出液を用いた場合は、明らかなＨＰＩ酵素活性を偶然にも検出できた。このことから、ORF-1は、ＨＰＩをコードする遺伝子であることが示された。
【００５７】
上記のように取得されたマイコバクテリウム  ガストリ MB19株のｈｐｉ遺伝子と、メチロモナス  アミノファシエンス 77a株から上記と同様にしてクローニングされたｈｐｉ遺伝子について、コードされるＨＰＩのアミノ酸を比較したところ、相同性が認められた。全く同一のアミノ酸における相同性は約30%、類似するアミノ酸も含めた相同性は約69%であった。
【００５８】
【実施例２】
バチルス  ズブチリス 168株のｈｐｉ遺伝子の同定
＜１＞ＨＰＳアミノ酸配列のデータベース検索
上記の実施例１のごとく取得したマイコバクテリウム  ガストリ MB19株のＨＰＩのアミノ酸配列について、既存のアミノ酸配列のデータバンクに対して、機能未知なＯＲＦも含めて相同性検索を行った。なお、この検索は、データバンクはSWISS-PROT Rel.34を用い、Genetyx-Mac（ソフトウエア開発株式会社）の検索システムにて行った。その結果、マイコバクテリウム  ガストリ MB19株のｈｐｉ遺伝子のアミノ酸配列と高度に相同性のあるものは、バチルス  ズブチリス 168株の機能未知遺伝子であるyckF（配列番号16）であった。
【００５９】
マイコバクテリウム  ガストリ MB19株のＨＰＩのアミノ酸配列とバチルス  ズブチリス 168株のyckFがコードするアミノ酸配列（配列番号17）を比較したところ、全く同一のアミノ酸における相同性は約３５％、類似するアミノ酸も含めた相同性は約７６％であった。このように、本来、メタノールなどのＣ１化合物の資化とは無関係なバチルス  ズブチリスに、ＨＰＩと相同性の高いタンパク質をコードする遺伝子が存在していたことは予想外であった。そこで、このyckFがＨＰＩ活性を保持しているかどうかを調べるために、yckF遺伝子をバチルス  ズブチリスより単離し、これを発現ベクターに組み込み、得られた組換えベクターをエシェリヒア  コリ細胞中へ導入し、細胞粗抽出液中のＨＰＩ活性を測定した。
【００６０】
＜２＞バチルス  ズブチリスのyckF遺伝子のクローニング
既に、バチルス  ズブチリスの全ゲノム塩基配列は決定されているため（Nature, Vol.390, pp249, 1997）、その塩基配列情報を基に、yckFを含むDNA断片をPCRにて増幅した。用いたDNAプライマーは、Ｎ末端側の上流に制限酵素ClaI切断部位を有するプライマーとして、配列番号18に記載の塩基配列(5'-AAGCATCGATAAAATGAAAACGACTGAATACGTAGCGGAA-3') を有するオリゴヌクレオチドを、そしてＣ末端側の下流に制限酵素BamHI切断部位を有するプライマーとして配列番号19に記載の塩基配列(5'-ATCTTGGATCCGGTTGTGTGATGTTATTCAAGGTTTGCG-3') を有するオリゴヌクレオチドを化学合成した。これをプライマーとしてバチルス  ズブチリス 168株より調製したゲノムDNAを鋳型とするPCRを行い、約550bpの大きさの増幅されたDNA断片を得た。なお、鋳型に用いたゲノムDNAの取得は、Saito らの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)に記載）を参考に行った。またＰＣＲは、宝酒造（株）製のLA-Taq酵素を用い、94℃、90秒の熱処理後、98℃：10秒、58℃：20秒、70℃：60秒という条件の反応を２８回行い、その後、70℃、3分間の反応を行った。
【００６１】
上記のようにして得られたDNA断片を、フェノール処理、アルコール沈澱等で精製した後、適当な酵素反応用の緩衝液に溶解し、制限酵素ClaI及びBamHIを添加し、37℃にて１時間処理した。そして、この反応液を0.8%アガロースのゲル電気泳動に供し、両端に各々、ClaI、BamHI切断端をもつDNA断片を分離した。その後、このアガロースゲルより目的のDNA断片を精製し、yckFを含むDNA断片を得た。
【００６２】
＜２＞バチルス  ズブチリスのyckF遺伝子の発現及び酵素活性の確認
上記のようにして得られたyckF遺伝子を発現させるため為の高発現用プラスミドとして、実施例１と同じく、トリプトファンプロモーターを有するpT13sNcoを用いた。pT13sNcoを制限酵素ClaI及びBamHIにて切断し、得られる大きいDNA断片を調製した。これに、上記のyckFを含むDNA断片をT4-DNAリガーゼにて連結することで、yckFの発現プラスミドpT-Bsb-yckF1を構築した。
【００６３】
このpT-Bsb-yckFを用いて、エシェリヒア  コリ JM109株を常法により形質転換し、形質転換体JM109/ pT-Bsb-yckF1を得た。尚、JM109/ pT-Bsb-yckF1は、プライベートナンバーAJ13441が付与され、平成１０年５月８日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３４５が付与されている。
【００６４】
一方、yckFを含むDNA断片を含まないプラスミドで形質転換した対照株としては、pT13sNcoのベクター部分であるpTTNcoを保持するエシェリヒア  コリ JM109株(JM109/pTTNco)を用いた。
【００６５】
これらの形質転換体を、M9-カザミノ酸-グルコース培地で、37℃にて振盪培養し、約２時間後に、トリプトファンプロモーターからの転写の誘導剤であるインドールアクリル酸を終濃度25μg/ml になるよう添加し、更に培養を８時間続けた。その後、培養液を集菌し、実施例１と同様にして、菌体の可溶性画分を調製した後、HPI活性を測定した。
【００６６】
その結果、対照株(JM109/pTTNco)から得られた細胞抽出液を用いた場合は、ＨＰＩ酵素活性は見られなかったが、JM109/pT-Bsb-yckF1の抽出液を用いた場合には、明らかなＨＰＩ活性を検出した。このことから、バチルス  ズブチリス 168株中の機能未知ＯＲＦであるyckF（配列番号16）は、ＨＰＩをコードするものであることが、はじめて明らかになった。また、バチルス  ズブチリスはメタノール等のＣ１化合物を資化することができないため、ｈｐｉ遺伝子を有するとは考えられていなかったが、該遺伝子を有することが明らかとなった。
【００６７】
【発明の効果】
本発明方法によれば、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼをコードするＤＮＡが得られ、該酵素を効率よく生産することが可能となり、ひいては、医療や生化学的基礎研究に重要で必要となる標識化合物を大量に安価に提供できることになる。
【００６８】
【配列表】
0004122580.tif 000002
【００７０】
0004122580.tif 000003
【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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Leu Gln
【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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