(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟成長ホルモン（GH）に少なくとも９５％の同一性を有する第１のポリペプチドと、これが融合した血清アルブミンの少なくともアミノ酸１〜３８７を含む血清アルブミンに少なくとも９５％の同一性を有する第２のポリペプチドを含んでなるポリペプチドであって、in vivoでｈＧＨ活性を有しかつ第２のポリペプチドに融合していないときの第１のポリペプチドと比べて高い安定性を有するポリペプチド。
【請求項２】
成熟成長ホルモン（GH）に少なくとも９９％の同一性を有する第１のポリペプチドと、これが融合した血清アルブミンの少なくともアミノ酸１〜３８７を含む血清アルブミンに少なくとも９９％の同一性を有する第２のポリペプチドを含んでなるポリペプチドであって、in vivoでｈＧＨ活性を有しかつ第２のポリペプチドに融合していないときの第１のポリペプチドと比べて高い安定性を有するポリペプチド。
【請求項３】
前記第１のポリペプチドが成熟GHの欠失変異体である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記第２のポリペプチドが血清アルブミンの欠失変異体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
第１のポリペプチドが成熟GHである、請求項１、２または４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
第２のポリペプチドが成熟血清アルブミンである、請求項１、２、３および５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
アルブミンおよび／または成長ホルモンがヒト由来のものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドがヒト血清アルブミンの成熟型とヒト成長ホルモンの成熟型の融合体を含んでなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドのN-末端が前記第１のポリペプチドを含み、C-末端が前記第２のポリペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドのN-末端が第２のポリペプチドを含み、C-末端が第１のポリペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドのいずれかの末端に付加される追加のアミノ酸をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ポリペプチドが第１と第２のポリペプチドの間にリンカーペプチドを有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んでなる培地。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞。
【請求項１６】
宿主細胞が動物宿主細胞、酵母宿主細胞、または細菌宿主細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
酵母宿主細胞がS.cerevisiaeである、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
ポリペプチドが宿主細胞から分泌される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞を含んでなる培地。
【請求項２０】
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し、ポリペプチドを精製することを含む、ポリペプチドを得る方法。
【請求項２１】
請求項１３または１９に記載の培地からのポリペプチドを精製することを含む、ポリペプチドを得る方法。
【請求項２２】
成長ホルモンで治療可能な症状を有する患者を治療するための医薬処方物であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の、または請求項２０または２１の方法によって製造されたポリペプチドおよび医薬上許容可能なキャリヤーを含んでなる医薬処方物。
【請求項２３】
動物の成長速度、または低脂肪肉対脂肪肉の比率を正常を上回って増加するための組成物であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の、または請求項２０または２１の方法によって製造されたポリペプチドおよび許容可能なキャリヤーを含んでなる組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のまたは請求項２０または２１の方法によって製造されたポリペプチドの、成長ホルモンで治療可能な症状を有する患者を治療するための医薬剤の製造における使用。
【請求項２５】
ヒト以外の動物の成長速度、または低脂肪肉対脂肪肉の比率を正常を上回って増加する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の、または請求項２０または２１の方法によって製造されたポリペプチドの有効量を動物に投与することを含む方法。
【請求項２６】
成長ホルモンの産生法であって、請求項１４に記載のポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させ、これによってコードされたポリペプチドが、成長ホルモンである第１のポリペプチドと第２のポリペプチドの間に、宿主に存在する酵素、または任意の他の酵素によって、または化学的に開裂可能である部位を有することを特徴とする、方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、組換え融合タンパク質、成長ホルモン（ＧＨ）、血清アルブミン、および酵母でのタンパク質の生産に関する。
背景および先行技術
５８５個のアミノ酸のタンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、血清の浸透圧のかなりの部分に関与しており、内因性および外因性リガンドのキャリヤーとしても機能する。現在、臨床的に用いられるＨＳＡは、ヒト血液から抽出によって生産される。微生物における組換えＨＡ（ｒＨＡ）の生産は、欧州特許第３３０，４５１号明細書および欧州特許第３６１，９９１号明細書に開示されている。
キャリヤー分子としてのアルブミンの役割およびその不活性性は、ポリペプチドの安定剤および輸送体として使用するのに望ましい特性である。他のタンパク質を安定化するための融合タンパク質の１成分としてのアルブミンの使用は、ＷＯ９３／１５１９９号明細書、ＷＯ９３／１５２００号明細書、および欧州特許第４１３，６２２号明細書に開示されている。ポリペプチドに対する融合体のためのＮ−末端断片の使用も、開示されている（欧州特許第３９９，６６６号明細書）。前記ポリペプチドに対する融合は、遺伝子操作を行ない、ＨＳＡをコードするＤＮＡまたはその断片を前記ポリペプチドをコードするＤＮＡに結合させることによって行なわれる。次に、適当な宿主を融合ヌクレオチド配列で形質転換またはトランスフェクションし、適当なプラスミド上に融合ポリペプチドを発現するように整備する。Nomura et al.（１９９５年）は、S.cerevisiaeにおいてヒトアポリポタンパク質ＥをＨＳＡまたはＨＳＡの断片との融合タンパク質として、分泌を指示するＨＳＡプレ配列を用いて発現することを試みた。全長ＨＳＡに対する融合は、媒質へのタンパク質の低水準の分泌を生じるが（最大収率６．３ｍｇ／リットル）、ＨＳＡ（１〜１９８）またはＨＳＡ（１〜３９０）に対する融合は媒質への分泌を生じなかった。
ヒト成長ホルモン（Strobl and Thomas,1994参照）は、内部で二つのジスルフィド結合により架橋された１９１アミノ酸の単一のポリペプチドからなる。ｈＧＨリセプタ−の二つの分子は、ｈＧＨの各分子を結合してシグナルトランスダクションを促進する（Cunningham et al,1991;de Vos et al,1992）。ｈＧＨ分子のＣ−末端は、最初のリセプタ−分子への結合に関与するが、Ｎ−末端がリセプタ−結合に関与する程度は知られていない。そのホルモンは、視床下部の制御下で前脳下垂体から分泌され、体内で広範囲の成長−促進効果に関与している。臨床的には、ｈＧＨは脳下垂体低下萎縮、小児の慢性腎不全、骨折および火傷の治療に用いられる。治療用途のｈＧＨの最近の生産方法は、ヒト脳下垂体、欧州特許第１２７，３０５号公報（Genentech）に開示されているような大腸菌での組換発現または哺乳類細胞培養での組換発現（Zeisel et al,1992）によるものである。
さらに、ｈＧＨは酵母で細胞内に発現され（Tokunaga et al,1985）、この生物は欧州特許第６０，０５７号公報（Genentech）に開示されたような代替えの生産手段を提供することができる。Tsiomenkoら（１９９４年）は、酵母からのｈＧＨの分泌中に酵母ＭＦα−１プレプロリーダー配列の役割を報告した。そのリーダー配列のプレー部分のｈＧＨ遺伝子への結合は、ペリプラズムおよび空胞（vacuole）中でのｈＧＨ蓄積を生じるが、プロ−部分のｈＧＨへの結合は、細胞内に局在する非−グリコシル化前駆体の発現を生じる。リーダー配列の両部分がｈＧＨ遺伝子に結合している場合のみ、ｈＧＨは培地中に分泌された。他の分泌シグナル（プレ−配列）も、酵母−由来プロ配列が使用されない限り効果的でなく、このようなプロ配列が用いられたことは、酵母でのｈＧＨの有効な分泌に重大であることを示唆した。
ヒトにおいて、ｈＧＨは律動的に血中に分泌され、循環において半減期は２０分未満である（Haffner et al.，１９９４年）。ホルモンの排除は主として肝臓および腎臓での代謝によって行なわれ、小児よりは成人で一層速やかである（Kearns et al.，１９９１年）。ｈＧＨ欠損症の治療は、一般的に６〜２４か月間継続し、その間にｈＧＨを週に３回筋肉内にまたは毎日皮下に投与する。この分子の半減期が短いため、このように頻繁な投与法を必要とするのである。
Poznansky et al.（１９８８年）は、ブタ成長ホルモンの半減期を、ブタまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との接合（conjugation）により約１８０ｋＤの比較的大きな接合体（conjugates）を形成することによって増加させた。架橋試薬グルタルアルデヒドを用いて化学反応を行なうと、成長ホルモン６分子と複合体形成したアルブミン２分子を平均して生じた。生成する１８０ｋＤの接合体は、ラットの循環において、未接合成長ホルモンの５分と比較して、２〜３時間の伸長した半減期を有することが分かった。活性分析では、接合体はイン・ビトロでは完全でありかつ可能に増加した活性を保持したが、イン・ビボでは不活性であることが示された。
発明の概要
本発明は、アルブミンの分子またはその変異体または断片の成長ホルモンの分子またはその変異体または断片への融合によって形成されるタンパク質であって、非融合成長ホルモンと比較して循環半減期が増加した融合タンパク質に関する。便宜上、ヒトアルブミン（ＨＡ）およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を指すことにするが、他の脊椎動物のアルブミンおよび成長ホルモンも包含される。好ましくは、融合タンパク質は、ＨＡまたはその変異体または断片をＮ−末端部分として、ｈＧＨまたはその変異体または断片をＣ−末端部分として含んでなり、レセプター結合に対するあらゆる可能な悪影響を最小限にするものである。あるいは、ＨＡまたはその変異体または断片をＣ−末端部分として、ｈＧＨまたはその変異体または断片をＮ−末端部分として含んでなる融合タンパク質も、シグナル形質導入も可能である。一般的に、ポリペプチドは、１個のＨＡ由来の領域と１個のＧＨ由来の領域だけを有する。
また、本発明の融合タンパク質は、２個の融合部分の間にリンカーペプチドを含み、これら２個の部分の間を物理的に一層大きく分離させることにより、ｈＧＨ部分の利用可能性を最大にしてｈＧＨレセプターに結合させることができる。リンカーペプチドはアミノ酸からなり、柔軟または一層堅くなるようにすることができる。
リンカー配列は、プロテアーゼによりまたは化学的に開裂して、成長ホルモン関連部分を生成することができる。好ましくは、プロテアーゼは、宿主によって自然に産生されるもの、例えばS.cerevisiaeプロテアーゼkex2または同等なプロテアーゼである。従って、本発明のもう一つの局面は、適当な宿主で本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、開裂可能なリンカーを開裂してＧＨ型化合物を生成させ、宿主培養物からＧＨ型化合物を更に純粋な形態で回収することによる、成長ホルモン、またはその変異体または断片の製造法を提供する。
本発明者らは、本発明のポリペプチドは、ｈＧＨよりも溶液中で有意に安定であることを見出だした。後者は、溶液で４℃で１月以上保管すると、速やかに不活性化する。現在市販されているｈＧＨは、凍結乾燥粉末として発売されている。
融合ポリペプチドは、酵母、細菌のような微生物、ヒト細胞ラインまたは酵母からの分泌により組換え分子として産生されるのが好適である。ポリペプチドは、宿主から分泌されるのが好ましい。本発明者らは、ｈＧＨコード配列をＨＡコード配列の５′末端または３′末端に融合することによって、酵母由来のプロ配列を必要とすることなく酵母から融合タンパク質を分泌することが可能であることを見出だした。酵母由来のプロ配列が酵母でのｈＧＨの効率的分泌に必要であることを他の研究者らが見出だしているので、これは予想外のことである。例えば、Hiramitsu et al.（１９９０年、１９９１年）は、Mucor pusillusレンニンプレ−プロリーダーにおけるプロ配列のＮ−末端部分が重要であることを見出だした。ＭＦα−１シグナルを用いる他の著者らは、ｈＧＨを分泌するときには、常にＭＦα−１プロ配列を包含した。プロ配列は、分子内シャペロン（chaperone）として作用することによって、ｈＧＨの折畳みに有用であると考えられた。本発明は、ＨＡまたはＨＡの断片が同様な機能を行なうことができることを示す。
従って、本発明の特定の態様は、酵母での分泌を指示するのに有効なシグナル配列、特に酵母由来のシグナル配列（特に、酵母宿主に相同なもの）をコードするＤＮＡ構築物と、本発明の第一の局面の融合分子とを含んでなり、シグナルおよび成熟ポリペプチドの間には酵母由来のプロ配列はないことを特徴とするものである。
Saccharomyces cerevisiaeインベルターゼシグナルは、酵母由来のシグナルの好ましい例である。
Poznansky et al.（１９８８年）によって調製した種類の接合体であって、別々に調製したポリペプチドを化学的架橋によって結合するものは、考慮しない。
アルブミンまたはｈＧＨは、それぞれ正常なＨＳＡ／ｒＨＡ（以後「ＨＡ」と表す）またはｈＧＨの変異体であることができる。「変異体」とは、保存的または非保存的な挿入、欠失および置換であって、そのような変化がアルブミンの腫張性（oncotic）の、有用なリガンド結合および非免疫原性特性、またはｈＧＨの場合には、その非免疫原性およびｈＧＨレセプターと結合して活性化する能力の１つまたは２つ以上を実質的に変更させない変化等が挙げられる。特に、ヒトアルブミンの天然に存在する多型変異体（polymorphic variants）およびヒトアルブミンの断片、例えば欧州特許第３２２，０９４号明細書に開示されている断片（すなわち、ＨＡ（１−ｎ）であって、ｎが３６９〜４１９であるもの）など等が挙げられる。アルブミンまたは成長ホルモンは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳類、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリまたはサケ由来のものでよい。融合体のアルブミンとＧＨ部分は、異なる動物由来のものでよい。
「保存的置換」とは、Ｇｌｙ，Ａｌａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ；およびＰｈｅ，Ｔｙｒ等の群内での交換を意味する。変異体は、当該技術分野で通常であるような欠失および挿入を斟酌すれば、通常は、この変異体と同じ長さでありかつ正常なＨＡまたはｈＧＨの任意の他の長さよりそれに対する同一性が高い正常なＨＡまたはｈＧＨの長さと少なくとも７５％（好ましくは、少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％）の配列同一性を有する。一般的に言えば、ＨＡ変異体は、少なくとも１００アミノ酸の長さであり、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸の長さである。ＨＡ変異体は、ＨＡの少なくとも１個の全ドメイン、例えばドメイン１（１〜１９４）、２（１９５〜３８７）、３（３８８〜５８５）、１＋２（１〜３８７）、２＋３（１９５〜５８５）、または１＋３（１〜１９４，＋３８８〜５８５）からなりまたはを含んでなることができる。それぞれのドメインは、それ自身２個の相同性サブドメイン、すなわち１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１、および５１２〜５８５から構成されており、残基Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１９９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａｌ３１５、およびＧｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１を含んでなる柔軟なインター−サブドメインリンカー領域を有する。好ましくは、融合のＨＡ部分は、ＨＡの少なくとも１個のサブドメインまたはドメイン、またはその保存修飾を含んでなる。融合がサブドメインに基づく場合には、隣接リンカーの幾つかまたは総てを用いてｈＧＨ部分に結合するのが好ましい。ｈＧＨ変異体はＧＨ活性を有し、一般的には少なくとも１０個のアミノ酸（幾人かの著者らは４個の残基だけで活性を見出だしているが）、好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０、１００、１５０、１８０または１９１個のアミノ酸の長さを有し、好ましくは両方の内部ジスルフィド結合に対してそのシステインを保持している。
本発明の融合分子は、一般的には分子量が１００ｋＤ未満であり、例えば９０ｋＤまたは７０ｋＤ未満である。従って、それらは、イン・ビボで不活性なPoznansky et al.の１８０ｋＤの接合体（前記引用）よりずっと小さい。それらは、一般に分子量が少なくとも２０ｋＤであり、通常は少なくとも３０ｋＤまたは５０ｋＤとなる。ほとんどは、分子量範囲６０〜９０ｋＤに収まる。
本発明の第二の主要な局面は、本発明の融合タンパク質を発現するように形質転換した酵母を提供する。
形質転換した宿主細胞自身の他に、本発明は、これらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に均質な）培養物、または栄養培地でのモノクローナル培養物から誘導される培養物も意図する。特に、ポリペプチドを分泌するときには、培地はポリペプチドを細胞と共に、または細胞が濾過または遠心分離によって除去されているときには細胞なしで含む。
細菌（例えば、E.coliおよびBacillus subtilis）、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactisおよびPichia pastoris）、糸状菌（filamentous fungi）（例えば、Aspergillus）、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞などの多くの発現系が、知られている。
所望なタンパク質は、通常の方法で、例えば宿主染色体中にまたは遊離プラスミド上で挿入されたコード配列から産生される。
酵母を、通常の方法のいずれか、例えばエレクトロポレーションで所望なタンパク質についてのコード配列で形質転換する。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換の方法は、Becker & Guarente（1990）Methods Enzymol.194,182に開示されている。
良好に形質転換した細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞は、周知の方法によって同定することができる。例えば、発現構築物の導入によって得られる細胞を成長させて、所望なポリペプチドを産生させることができる。細胞を回収してリーシスを行ない、Southern（1975）J.Mol.Biol.98,503またはBerent et al.（1985）Biotech 3,208に記載の方法を用いて、それらのＤＮＡ含量をＤＮＡの存在について検討することができる。あるいは、上清中のタンパク質の存在を、抗体を用いて検出することもできる。
有用な酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６等が挙げられ、通常はStratagene Cloning Systems、La Jolla、カリフォルニア９２０３７、米国から入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組込み型プラスミド（Yeast Integrating plasmids（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択可能マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母動原体プラスミド（Yeast Centromere plasmids（ＹＣＰｓ）である。
様々な方法が、相補的粘着末端を介してＤＮＡをベクターに作動可能に連結する目的で開発された。例えば、相補的ホモポリマートラクト（homopolymer tracts）をＤＮＡ部分（segment）に加えてベクターＤＮＡに挿入させることができる。次に、ベクターおよびＤＮＡ部分を、相補的ホモポリマー性テール間の水素結合によって接合して、組換えＤＮＡ分子を形成する。
１または２個以上の制限部位を有する合成リンカーは、ＤＮＡ部分をベクターに接合する代替法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化によって生成したＤＮＡ部分を、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはE.coli ＤＮＡポリメラーゼＩの酵素であって、３′−５′−エキソヌクレオリーシス活性で３′−一本鎖突出末端を除去し、凹んだ３′−末端に重合活性を満たす酵素で処理する。
従って、これらの活性を組み合わせることによって、平滑末端ＤＮＡ部分が得られる。次に、平滑末端部分を、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのような平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒することができる酵素の存在下で大モル過剰量のリンカー分子とインキュベーションする。従って、反応の生成物は、それらの末端にポリマー性リンカー配列を有するＤＮＡ部分である。次に、これらのＤＮＡ部分を適当な制限酵素で開裂し、ＤＮＡ部分のものに適合する末端を生成する酵素で開裂した発現ベクターに連結する。
各種の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する合成リンカーは、International Biotechnologies Inc、ニューヘブン、ＣＮ、米国などの多数の供給元から発売されている。
例えば、ＨＡ変異体を調製しようとするときに、本発明によるＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Saiki et al.（1988）Science 239,487-491によって開示されたポリメラーゼ連鎖反応を用いることである。この方法では、酵素的に増幅されるＤＮＡに、２個の特異的なオリゴヌクレオチドプライマーであって、それ自身、増幅したＤＮＡに取り込まれるものが隣接している。前記の特異的プライマーは、当該技術分野で知られている方法を用いて発現ベクターへのクローニングに用いることができる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことができる。
融合タンパク質を発現する宿主として本発明の実施に有用であると思われる酵母の典型的な属は、Pichia（Hansenula）、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Torulopsis、Torulaspora、Schizosaccharomyces、Citeromyces、Pachysolen、Debaromyces、Metschunikowia、Rhodosporidium、Leucosporidium、Botryoascus、Sporidiobolus、Endomycopsisなどである。好ましい属は、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、Pichia、およびTorulasporaからなる群から選択されるものである。Saccharomyces spp.の例は、S.cerevisiae、S.italicus、およびS.rouxiiである。Kluyveromyces spp.の例は、K.fragilis、K.lactisおよびK.marxianusである。好適なTorulaspora種は、T.delbrueckiiである。Pichia（Hansenula）spp.の例は、P.angusta（以前は、H.polymorpha）、P.anomala（以前は、H.anomala）、およびP.pastorisである。
S.cerevisiaeの形質転換の方法は、一般的には欧州特許第２５１，７４４号明細書、欧州特許第２５８，０６７号明細書、およびＷＯ９０／０１０６３号明細書に教示があり、前記特許明細書の内容は、その開示の部として本明細書に引用される。
S.cerivisiaeの好適なプロモーターとしては、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣ１、ＰＨＯ５、ＴＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α−交配因子フェロモン（α-mating factor pheromone）、ａ−交配因子フェロモンに対する遺伝子に関連するもの、ＰＲＢ１プロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤ１プロモーター、および５′制御領域の部分と他のプロモーターの５′制御領域の部分または上流活性部位とのハイブリッドなどのハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８，０６７号明細書のプロモーター）等が挙げられる。
Schizosaccharomyces pombeに用いられる好都合な調節可能プロモーターは、Maundrell（1990）J.Biol.Chem.265,10857-10864に記載のｎｍｔ遺伝子からのチアミン抑制可能プロモーター、およびHoffman & Winston（1990）Genetics 124,807-816に記載のグルコース抑制可能ｆｂｐ１遺伝子プロモーターである。
外来遺伝子の発現のためにPichiaを形質転換する方法は、例えばCregg et al（１９９３年）およびPhilipsの各種特許明細書（例えば、米国特許第４，８５７，４６７号明細書、前記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）に教示されており、Pichia発現キットはInvitrogen BV、リーク、オランダ、およびInvitrogen Corp.、サンディエゴ、カリフォルニアから発売されている。好適なプロモーターとしては、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２等が挙げられる。
Gleeson et al.（1986）J.Gen.Microbiol.,132,3459-3465には、Hansenulaベクターおよび形質転換に関する情報、好適なプロモーターがＭＯＸ１およびＦＭＤ１であることが含まれており、欧州特許第３６１９９１号公報、Fleer et al.（１９９１年）およびRhone-Poulenc Rorerからの公表物には、Kluyveromyces spp.における外来タンパク質の発現法、好適なプロモーターがＰＧＫ１であることが教示されている。
転写終止シグナルは、好ましくは転写終止およびポリアデニル化の適正なシグナルを含む真核遺伝子の３′フランキング配列である。好適な３′フランキング配列は、例えば用いられる発現調節配列に自然に連結した遺伝子配列であることができ、すなわちプロモーターに相当することができる。あるいは、それらは異なっていてもよく、その場合にはS.cerevisiae ＡＤＨ１遺伝子の終止シグナルが好ましい。
所望な融合タンパク質は、選択された酵母で有効な任意のリーダーであることができる分泌リーダー配列で最初に発現することができる。S.cerevisiaeで有用なリーダーとしては、交配因子αポリペプチド（ＭＦα−１）からのものおよびＥＰ−Ａ−３８７，３１９号明細書のハイブリッドリーダー等が挙げられる。これらのリーダー（またはシグナル）は酵母によって開裂された後、成熟アルブミンが周囲の培地に放出される。更に、このようなリーダーとしては、ＪＰ６２−０９６０８６号明細書（９１／０３６５１６号として特許付与）に開示されたS.cerevisiaeインベルターゼ（ＳＵＣ２）、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）、ＭＦα−１のプレ−配列、β−グルカナーゼ（ＢＧＬ２）、およびキラー毒素；S.diastaticusグルコアミラーゼII；S.carlsbergensis α−ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）；K.lactisキラー毒素；およびCandidaグルコアミラーゼ由来のもの等が挙げられる。
本発明の融合タンパク質またはその処方物は、非経口（例えば、皮下または筋肉内）注射または静脈内注入など任意の通常の方法によって投与することができる。治療は、一定時間に単回投与または複数回投与からなることができる。
本発明の融合タンパク質は単独で投与することが可能であるが、これを１または２種類以上の受容可能なキャリヤーと共に医薬処方物として提供するのが好ましい。（１または複数の）キャリヤーは、融合タンパク質と適合性でありかつそれを受入する者にとって有害でないという意味において「受容可能」でなければならない。典型的には、滅菌されかつ発熱性物質を含まない水または塩水（saline）である。処方物は、非免疫原性であるべきであり、アジュバントを含むワクチン型処方物は企図しない。
処方物は、単位投与量形態で好都合に提供することができ、製薬業界で周知の任意の方法によって調製することができる。このような方法としては、融合タンパク質を１または２種類以上の補助成分を構成するキャリヤーと合同させる段階が含まれる。一般に、処方物は、活性成分と液体キャリヤーまたは微細に分割した固形キャリヤー、または両者と均一かつ緊密に合同させた後、必要ならば、生成物を成形することによって調製される。
非経口投与に好適な処方物としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および所期の受容者の血液と等張にする溶質を含むことができる水性および非水性滅菌注射溶液、および懸濁剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性懸濁液が挙げられる。処方物は、単位投与量または複数投与量容器、例えば密封したアンプルおよび瓶に入れて提供することができ、使用直前に滅菌した液体キャリヤー、例えば注射用の水を加えるだけで済む凍結乾燥（lyophilised）条件で保管することができる。即席注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末から調製することができる。
好ましい単位投与処方物は、活性成分の１日投与量または単位、１日区分投与量またはそれらの適当な画分を含むものである。
本発明の融合タンパク質は、成長ホルモンが指摘される任意の症状、例えば単離成長ホルモン欠損症（isolated growth hormone deficiency）、（例えば、白血病または脳腫瘍の治療における）頭部照射の後の汎下垂体機能低下症、ターナー症候群、ダウン症候群、子宮内成長遅延、特発性成長欠損症、慢性腎不全、軟骨形成不全症、女性不妊症、および各種の異化作用障害の治療に用いることができる。それらは、ウシ、ヒツジ、ヤギ、およびブタのような家畜の成長の刺激および／または低脂肪肉割合の増加に用いることもできる。
融合タンパク質は、インシュリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）と共に投与することができる。
投与量は、ｈＧＨの効力に対する融合タンパク質の効力に基づいて、天然のｈＧＨと比較して融合タンパク質の伸長した血清半減期を考慮して計算することができる。成長ホルモンは、典型的には０．３〜３０．０ＩＵ／ｋｇ／週、例えば０．９〜１２．０ＩＵ／ｋｇ／週を３〜７回の小分け投与量として１年間以上投与される。全長ＧＨに融合した全長ＨＡからなる融合タンパク質では、単位の点から見ると等価投与量の薬剤重量は大きくなるが、投与頻度は減少させ、例えば１週間に２回、１週間に１回以下にすることができる。
本発明の好ましい例を、実施例によりおよび添付図面に関して説明する。
第１図は、成熟ｈＧＨをコードするヒト成長ホルモンｃＤＮＡ配列を表し、
第２図は、ｐＨＧＨ１の制限酵素マップを示し、
第３図は、ｐＢＳＴ（＋）の制限酵素マップ、およびポリリンカーのＤＮＡ配列を示し、
第４図は、ｐＨＧＨ１２の構築を示し、
第５図は、ｐＨＧＨ１６の構築を示し、
第６図は、ＨＳＡ  ｃＤＮＡ配列、更に詳細には成熟タンパク質をコードする領域を示し、
第７図は、ｐＨＧＨ１４の構築を示し、
第８図は、ｐＨＧＨ３８の構築を示し、
第９図は、ｐＨＧＨ３１の構築を示し、
第１０図は、ｐＨＧＨ５８またはｐＨＧＨ５９（実施例７）の構築を示し、
第１１図は、スペーサーを有する融合体を構築する模式図（実施例７）であり、
第１２図は、ラットでの静脈内注射の後にｈＧＨと比較した125Ｉを標識したｒＨＡ−ｈＧＨのクリアランスを示す薬物動態の検討の結果を示す。データは、各群２匹のラットからのものであり、総放射能、およびＴＣＡによって沈澱することができた放射能、すなわち遊離125Ｉとしてよりはむしろタンパク質と結合したもの等が挙げられる。ｈＧＨのクリアランス半減期の計算値は、ｒＨＡ−ｈＧＨ融合タンパク質について約６０分であるのと比較して、約６分であった。実施例３を参照されたい。
●  ｈＧＨ（総カウント）
■  ｈＧＨ（ＴＣＡで沈澱したカウント）
▼  ｒＨＡ−ｈＧＨ（総カウント）
▲  ｒＨＡ−ｈＧＨ（ＴＣＡで沈澱したカウント）
発明の詳細な説明
総ての標準的組換えＤＮＡ手順は、特に断らない限りSambrook et al.（1989）に記載された通りである。ＨＳＡをコードするＤＮＡ配列は、欧州特許第２０１，２３９号明細書に開示されたｃＤＮＡから誘導した。
実施例１：  ｈＧＨ  ｃＤＮＡのクローニング
ｈＧＨ  ｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅によりヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリー（目録番号ＨＬ１０９７ｖ、Clontech Laboratories,Inc.）から得た。ｈＧＨ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に好適な２個のオリゴヌクレオチド、ＨＧＨ１およびＨＧＨ２は、Applied Biosystems 380B Oligonucleotide Synthesiserを用いて合成した。
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ＨＧＨ１およびＨＧＨ２は、ｈＧＨ  ｃＤＮＡ配列（第１図、Martial et al.,1979）の同等な部分とはそれぞれ２および３個のヌクレオチドだけ異なり、ＰＣＲ増幅の後、ＥｃｏＲＩ部位がｃＤＮＡの５′末端に導入され、ＢａｍＨＩ部位がｃＤＮＡの３′末端に導入されるようにした。更に、ＨＧＨ２はｈＧＨ配列の直ぐ下流にＨｉｎｄIII部位を含んでいた。
Perkin-Elmer-Cetus Thermal Cycler 9600およびPerkin-Elmer-Cetus PCRキットを用いるＰＣＲ増幅は、下記のようにしてｃＤＮＡライブラリーのファージ粒子から単離した一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて行なった：１０μｌのファージ粒子を、１０μｌファージ溶解緩衝液（２８０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ／ＴＥ緩衝液）を加え、５５℃で１５分間の後８５℃で１５分間インキュベーションすることによって溶解した。氷上で１分間インキュベーションした後、ファージ破片を１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離することによってペレット化した。ＰＣＲ混合物は、このＤＮＡ鋳型６μｌ、それぞれのプライマー０．１μＭ、およびそれぞれのデオキシリボヌクレオチド２００μＭを含んでいた。ＰＣＲは３０サイクルで行ない、変性を９４℃で３０秒間、アニーリングを６５℃で３０秒間、および伸長（extending）を７２℃で３０秒間行ない、伸長時間をサイクル当たり１秒間増加した。ゲル電気泳動により反応を分析したところ、予想した大きさ（５８９塩基対）の単一生成物を示した。
ＰＣＲ生成物を、Wizard PCR Preps DNA Purification System（Promega Corp）を用いて精製した後、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片をゲル電気泳動で更に精製した後、生成物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消化したｐＵＣ１９（GIBCO BRL）にクローニングし、ｐＨＧＨ１（第２図）を得た。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII領域のＤＮＡ配列決定では、ＰＣＲ生成物の配列は、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位がそれぞれ導入された５′および３′末端を除き、ｈＧＨ配列（Martial et al.,1979）と同一であった。
実施例２：  ｈＧＨ  ｃＤＮＡの発現
ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ（＋）（Stratagene）のポリリンカー配列を、２個の７５−マー（mer）オリゴヌクレオチドのアニーリングによって形成したオリゴヌクレオチドリンカーをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII部位の間に挿入することによって置換し、ｐＢＳＴ（＋）（第３図）を形成した。新たなポリリンカーは、ユニークＮｏｔＩ部位を含んでいた（ポリリンカーの領域における全配列を第３図に示す）。
ＰＲＢ１プロモーター、ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドリーダー配列をコードするＤＮＡ、ＨＳＡをコードするＤＮＡ、およびＡＤＨ１ターミネーターを含んでなるｐＡＹＥ３０９のＮｏｔＩ  ＨＳＡ発現カセット（欧州特許第４３１，８８０号明細書）を、ｐＢＳＴ（＋）に移して、ｐＨＡ１を形成した（第４図）。ＨＳＡコード配列を、ＨｉｎｄIIIで消化した後、再連結することによってこのプラスミドから除去して、ｐＨＡ２を形成した（第４図）。
実施例１に記載のｈＧＨ  ｃＤＮＡのクローニングにより、プロ−ｈＧＨ配列および成熟ｈＧＨ配列の最初の８塩基対（ｂｐ）を欠いているｈＧＨコード領域が提供された。酵母からｈＧＨの分泌のための発現プラスミドを構築するため、酵母プロモーター、シグナルペプチド、およびｈＧＨ配列の最初の８ｂｐを、下記のようにしてクローニングしたｈＧＨ配列の５′末端に結合した。
ｐＨＡ１からのＨｉｎｄIII−ＳｆａＮＩ断片を、２個の合成オリゴヌクレオチドＨＧＨ３およびＨＧＨ４を介してｐＨＧＨ１からのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片の５′末端に結合した。
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このようにして形成したＨｉｎｄIII断片を、ＨｉｎｄIIIで消化したｐＨＡ２にクローニングしてｐＨＧＨ２を作成し（第４図）、ｈＧＨ  ｃＤＮＡがＰＲＢ１プロモーターおよびＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列（ＷＯ９０／０１０６３号明細書）の下流に位置するようにした。ｈＧＨ  ｃＤＮＡの下流にＡＤＨ１ターミネーターを含むｐＨＧＨ２に含まれたＮｏｔＩ発現カセットを、ＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５にクローニングし（Sleep et al.,1990）、ｐＨＧＨ１２（第４図）を作成した。このプラスミドは、複製機能を提供するための全２μｍプラスミドおよび形質転換体の選択のためのＬＥＵ２遺伝子を含んでいた。
ｐＨＧＨ１２を、形質転換によってS.cerevisiae ＤＢ１（Sleep et al.,1990）に導入し、個々の形質転換体を１０ｍｌのＹＥＰＤ（１％ｗ／ｖ酵母エキス、２％ｗ／ｖペプトン、２％ｗ／ｖデキストロース）中で３０℃で３日間成長させた。細胞を遠心分離した後、上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって検査し、予想した大きさでありかつウェスタンブロットで抗−ｈＧＨ抗血清（Sigma、poole、英国）によって認識されるタンパク質を含むことを見出だした。
実施例３：  ＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質のクローニングおよび発現
ＨＳＡ  ｃＤＮＡをｈＧＨ  ｃＤＮＡの５′末端に融合するため、ｐＨＡ１  ＨｉｎｄIII−Ｂｓｕ３６Ｉ断片（ＨＳＡ  ｃＤＮＡのほとんどを含む）を、２個のオリゴヌクレオチドＨＧＨ７およびＨＧＨ８を介してｐＨＧＨ１  ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片（ｈＧＨ  ｃＤＮＡのほとんどを含む）に結合した。
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このようにして形成したＨｉｎｄIII断片をＨｉｎｄIIIで消化したｐＨＡ２にクローニングしてｐＨＧＨ１０（第５図）を作成し、このプラスミドのＮｏｔＩ発現カセットをＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５にクローニングしてｐＨＧＨ１６を作成した（第５図）。
ｐＨＧＨ１６を用いてS.cerevisiae ＤＢ１を形質転換し、培養物の上清を実施例２と同様にして分析した。分子量がＨＡとｈＧＨとの合わせた質量に相当する約８８ｋＤの主バンドが観察された。抗−ＨＳＡおよび抗−ｈＧＨ抗血清（Sigma）を用いるウェスタンブロットにより、融合タンパク質の２個の構成部分の存在を確かめた。
融合タンパク質を、カチオン交換クロマトグラフィーの後、アニオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーによって培養物上清から精製した。アミノ酸配列決定によるタンパク質のＮ−末端の分析により、予想したアルブミン配列の存在を確認した。
イン・ビトロ成長ホルモン活性分析（Ealey et al.,1995）では、融合タンパク質が完全なｈＧＨ活性を有するが、効力はｈＧＨ標準品と比較して減少することが示された。本質的に欧州薬局方（１９８７年、モノグラフ５５６）に記載されている方法で行なった下垂体切除ラット体重増進モデルでは、（前記のイン・ビトロ分析法に基づいた）同じ単位数の活性を毎日投与すると、融合分子はｈＧＨより効力が高かった。融合タンパク質を４日ごとに１回投与した実験では、ｈＧＨの毎日投与と同様な全般的成長応答を示した。125Ｉ−標識タンパク質をラットに投与した薬物動態実験では、ｈＧＨに比較して融合タンパク質の循環半減期が約１０倍増加することを示した（第１２図）。
S.cerevisiaeインベルターゼ（ＳＵＣ２）リーダー配列をコードするＤＮＡがハイブリッドリーダーに対する配列に取って代わり、コードされたリーダーおよびＨＳＡ配列との接合が下記の通りになるようにした。
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S.celevisiac ＤＢ１への導入の際、このプラスミドは、ｐＨＧＨ１６で得たのと同じ水準での融合タンパク質の発現および分泌を指示した。融合タンパク質のＮ−末端の分析を行なったところ、成熟タンパク質からリーダー配列が精確かつ効率的に開裂することが示された。
実施例４：  ｈＧＨ−ＨＳＡ融合タンパク質のクローニングおよび発現
ｈＧＨ  ｃＤＮＡをＨＳＡ  ｃＤＮＡの５′末端に融合するため（第６図）、ＨＳＡ  ｃＤＮＡを、最初に部位特異的突然変異誘発によって変更して、コード領域の５′末端附近にＥｃｏＮＩ部位を導入した。これは、ｐＨＡ１および合成オリゴヌクレオチドＬＥＵ４から調製した一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いてKunkel et al.（1987）の方法によって行なった。
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このオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発により、ＨＳＡ  ｃＤＮＡのコード配列がＬｙｓ４からＬｅｕ４に変化した（Ｋ４Ｌ）。しかしながら、この変化は、ｐＨＧＨ２  ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を突然変異したｐＨＡ１のＥｃｏＮＩ−ＮｏｔＩ断片に、２個のオリゴヌクレオチドＨＧＨ５およびＨＧＨ６を介して連結することによって、ｈＧＨ  ｃＤＮＡが次に５′末端で結合するときに修復された。
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このようにして形成されたＮｏｔＩ断片を、ＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５にクローニングして、ｐＨＧＨ１４（第７図）を作成した。ｐＨＧＨ１４を用いてS.cerevisiae ＤＢ１を形質転換し、培養物の上清を実施例２と同様にして分析した。分子量がｈＧＨとＨＡとの合わせた質量に相当する約８８ｋＤの主バンドが観察された。抗−ＨＳＡおよび抗−ｈＧＨ抗血清を用いるウェスタンブロット法により、融合タンパク質の２個の構成部分の存在を確かめた。
融合タンパク質を、カチオン交換クロマトグラフィーの後、アニオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーによって培養物上清から精製した。アミノ酸配列決定によるタンパク質のＮ−末端の分析により、予想したｈＧＨ配列の存在を確認した。
イン・ビトロ検討では、融合タンパク質がｈＧＨ活性を保持したが、効力は、実施例３に記載したように、Ｎ−末端部分としての全長ＨＡ（１〜５８５）およびＣ−末端部分としてのｈＧＨを含んでなる融合タンパク質より有為に低かった。
実施例５：  ＳＡのドメインに対するｈＧＨ融合体の発現のためのプラスミドの構築
ｈＧＨ分子をＨＡの最初の２個のドメイン（残基１〜３８７）に融合した融合ポリペプチドを作成した。ｈＧＨのＮ−末端への融合は、ＨＡのドメイン１および２に対するコード配列のほとんどを含むｐＨＡ１  ＨｉｎｄIII−ＳａｐＩ断片をオリゴヌクレオチドＨＧＨ１１およびＨＧＨ１２を介してｐＨＧＨ１  ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片に結合することによって行なった。
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このようにして形成したＨｉｎｄIII断片をＨｉｎｄIIIで消化したｐＨＡ２にクローニングしてｐＨＧＨ３７（第８図）を作成し、このプラスミドのＮｏｔＩ発現カセットをＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５にクローニングした。生成するプラスミドｐＨＧＨ３８（第８図）は、S.cerevisiae ＤＢ１に形質転換するとき、融合ポリペプチドの上清中への分泌を指示することが見出だされた発現カセットを含んでいた。抗−ＨＳＡおよび抗−ｈＧＨ抗血清を用いるウェスタンブロット法により、融合タンパク質の２個の成分部分の存在を確認した。
融合タンパク質を、カチオン交換クロマトグラフィーの後にゲル浸透クロマトグラフィーによって培養物上清から精製した。精製したタンパク質を用いるイン・ビボでの検討では、循環半減期はｈＧＨのものより長く、実施例３に記載したように、Ｎ−末端部分としての全長ＨＡ（１〜５８５）およびＣ−末端部分としてのｈＧＨを含んでなる融合タンパク質のものと同様であることが示された。イン・ビトロの検討では、融合タンパク質はｈＧＨ活性を保持したことを示した。
前記に詳細に説明したのと同様の方法を用いて、Ｎ−末端部分としてＨＡの最初のドメイン（残基１〜１９４）およびＣ−末端部分としてｈＧＨを含んでなる融合タンパク質をクローニングし、S.cerevisiae ＤＢ１で発現した。抗−ＨＳＡおよび抗−ｈＧＨ抗血清を用いる培養上清のウェスタンブロット法により、融合タンパク質の２個の成分部分の存在を確認した。
実施例６：  ＨＳＡとｈＧＨの間に開裂部位を導入することによるｈＧＨの発現
Ｋｅｘ２プロテアーゼによって認識されるペプチド配列をＨＡ−ｈＧＨ融合タンパク質の間に導入することにより、ｈＧＨが分泌される。Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ａｒｇをコードする配列を、２個のオリゴヌクレオチドＨＧＨ１４およびＨＧＨ１５を用いて導入した。
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これらを用いて、ｐＨＡ１  ＨｉｎｄIII−Ｂｓｕ３６１断片をｐＨＧＨ１ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片に結合し、これを次にＨｉｎｄIIIで消化したｐＨＡ２にクローニングして、ｐＨＧＨ２５（第９図）を作成した。このプラスミドのＮｏｔＩ発現カセットを、ＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５にクローニングしてｐＨＧＨ３１（第９図）を作成した。
ｐＨＧＨ３１で形質転換したS.cerevisiae ＤＢ１は、培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定したところ、２個の主要な物質種（species）を分泌することが分かった。この２個の物質種の分子量は、（完全長）ＨＡに相当する約６６ｋＤおよび（完全長）ｈＧＨに相当する２２ｋＤであり、Ｋｅｘ２プロテアーゼまたは同等な活性を有するものによる融合タンパク質のイン・ビボ開裂を示していた。抗−ＨＳＡおよび抗−ｈＧＨ抗血清を用いるウェスタンブロット法により、２個の別個の物質種の存在が確認された。ｈＧＨ部分のＮ−末端配列分析により、ＨＡ部分からの精確かつ効率的な開裂が確認された。
ｈＧＨ部分を、アニオン交換クロマトグラフィーの後にゲル浸透クロマトグラフィーによって培養上清から精製した。精製したｈＧＨを用いるイン・ビトロ検討では、タンパク質は活性であり、かつ完全な効力を有することを示していた。
同じ方法を用いて、ＨＡの最初のドメイン（残基１〜１９４）またはＨＡの最初の２個のドメイン（残基１〜３８７）に続いてＫｅｘ２ｐプロテアーゼによって認識される配列、続いてｈＧＨ  ｃＤＮＡを含んでなる融合タンパク質をS.cerevisiae ＤＢ１でクローニングして、発現させた。抗−ＨＳＡおよび抗−ｈＧＨ抗血清を用いる培養上清のウェスタンブロットにより、２個の異なる物質種の存在が確認された。
実施例７：  柔軟なリンカー配列を用いるＨＳＡのｈＧＨへの融合
［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］n（式中、ｎは２または３である）の繰返し単位を含んでなる柔軟なリンカーを、オリゴヌクレオチドＨＧＨ１６、ＨＧＨ１７、ＨＧＨ１８およびＨＧＨ１９のクローニングによってＨＳＡとｈＧＨの融合タンパク質の間に導入した。
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ＨＧＨ１６とＨＧＨ１７のアニーリングでは、ｎ＝２となり、ＨＧＨ１９に対してアニーリングしたＨＧＨ１８では、ｎ＝３となった。アニーリングの後、二本鎖オリゴヌクレオチドを、ｐＨＧＨ１から単離したＥｃｏＲＩ−Ｂｓｕ３６Ｉ断片でＢｓｕ３６Ｉで消化したｐＨＧ１０にクローニングして、ｐＨＧＨ５６（ｎ＝２）およびｐＨＧＨ５７（ｎ＝３）を作成した（第１０図）。これらのプラスミドからのＮｏｔＩ発現カセットをＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５にクローニングして、それぞれｐＨＧＨ５８およびｐＨＧＨ５９を作成した。
ｐＨＧＨ５６およびｐＨＧＨ５７を作成するためのオリゴヌクレオチドのクローニングにより、第１１図に示されるようにＢａｍＨＩ部位がリンカー配列に導入された。従って、ｐＨＧＨ５６からのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片をｐＨＧＨ５７からのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片に結合することにより（ｎ＝１とする）、またはｐＨＧＨ５７からのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片をｐＨＧＨ５６からのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片と結合することにより（ｎ＝２とする）、リンカー配列（但し、ｎ＝１およびｎ＝４）を構築することが可能であった。これらの断片のｐＨＡ２（実施例２に記載）のＨｉｎｄIII部位へのクローニングにより、ｐＨＧＨ６０（ｎ＝１）およびｐＨＧＨ６１（ｎ＝４）を生成した（第１１図を参照されたい）。ｐＨＧＨ６０およびｐＨＧＨ６１からのＮｏｔＩ発現カセットをＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５にクローニングして、それぞれｐＨＧＨ６２およびｐＨＧＨ６３を作成した。
S.cerevisiaeのｐＨＧＨ５８、ｐＨＧＨ５９、ｐＨＧＨ６２およびｐＨＧＨ６３での形質転換の結果、融合ポリペプチドを上清に分泌する形質転換体を得た。
抗−ＨＳＡおよび抗−ｈＧＨ抗血清を用いるウェスタンブロットにより、融合タンパク質の２個の成分部分の存在が確認された。
融合タンパク質を、カチオン交換クロマトグラフィーの後にアニオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーによって培養上清から精製した。アミノ酸配列決定によるタンパク質のＮ−末端の分析により、予想したアルブミン配列の存在が確認された。精製したタンパク質を、エレクトロスプレーマススペクトル分析法（electrospray mass spectrometry）により分析したところ、予想したように、実施例３に記載のＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質と比較して３１５Ｄ（ｎ＝１）、６３０Ｄ（ｎ＝２）、９４５Ｄ（ｎ＝３）および１２６０Ｄ（ｎ＝４）の質量の増加が確認された。精製したタンパク質は、イン・ビトロで活性であることが分かった。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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