(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞増殖防止用薬剤であって、Ｇ２８．５及びＣＤ４０Ｌから選択されるＣＤ４０レセプターバインダーを含む薬剤。
【請求項２】
上皮細胞系における癌の治療のための薬剤であって、Ｇ２８．５及びＣＤ４０Ｌから選択されるＣＤ４０レセプターバインダーを含む薬剤。
【請求項３】
新生上皮細胞の抗腫瘍薬物性アポトーシスに対する感受性を高めるための薬剤であって、Ｇ２８．５及びＣＤ４０Ｌから選択されるＣＤ４０レセプターバインダーを含む薬剤。
【請求項４】
抗腫瘍薬をさらに含む、請求項２に記載の薬剤。
【請求項５】
Ｇ２８．５及びＣＤ４０Ｌから選択されるＣＤ４０レセプターバインダーを動物（但し、ヒトを除く）の患者に投与することを含む、上皮細胞増殖を防止する方法。
【請求項６】
Ｇ２８．５及びＣＤ４０Ｌから選択されるＣＤレセプターバインダーを動物（但し、ヒトを除く）の患者に投与することを含む、動物における上皮細胞癌を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、主に癌の治療に関し、より詳細には上皮細胞系における癌の治療に関するが、本発明は、その最も広い態様においては、一般的に上皮細胞増殖の防止に関する。
上皮細胞系における癌を、アポトーシスを誘発することを意図する抗腫瘍薬を用いて治療することは公知である。このような薬剤には、サイトカイン及び成長因子、例えば、トランスフォーミング成長因子β1（ＴＧＦ−β1）、抗Ｆａｓ及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）並びに他の抗腫瘍薬、例えば、インタ−フェロンγ（ＩＦＮ−γ）、シスプラチン、マイトマイシンＣ、シクロホスファミド、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ビンクリシチン、エトポシド、５−フルオロウラシル、メトトレキセート及び照射剤などがある。しかしながら、上皮細胞系における癌の治療のため及び／又は既存の抗腫瘍薬の効果を高めるための他の薬剤が引続き必要とされている。
本発明の第一の態様によれば、上皮細胞増殖防止用薬剤の製造又は上皮細胞系における癌の治療のための、ＣＤ４０レセプターバインダーの使用が提供される。
本発明の第二の態様によれば、新生上皮細胞の抗腫瘍薬物性アポトーシスに対する感受性を高めるための薬剤製造における、ＣＤ４０レセプターバインダーの使用が提供される。
本発明の第三の態様によれば、上皮細胞増殖防止又は上皮細胞系における癌の治療のための、ＣＤ４０レセプターバインダーとＣＤ４０インデューサとの組み合わせの使用が提供される。
本発明の第四の態様によれば、上皮細胞系における癌の治療のための、ＣＤ４０レセプターバインダーと抗腫瘍薬との組み合わせの使用が提供される。
本発明の第五の態様によれば、ＣＤ４０レセプターバインダーをヒト又は動物の患者に投与することを含む、上皮細胞増殖を防止する方法が提供される。
本発明の第六の態様によれば、ＣＤ４０レセプターバインダーをヒト又は動物の患者に投与することを含む、ヒト又は動物における上皮細胞癌を治療する方法が提供される。
好ましくは、このような投与は、少なくとも一種の抗腫瘍薬及び／又はＣＤ４０インデューサの投与といっしょに行う。
抗腫瘍薬は、サイトカイン及び成長因子、例えば、トランスフォーミング成長因子β1（ＴＧＦ−β1）、抗Ｆａｓ及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）並びに他の抗腫瘍薬、例えば、インタ−フェロンγ（ＩＦＮ−γ）、シスプラチン、マイトマイシンＣ、シクロホスファミド、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ビンクリシチン、エトポシド、５−フルオロウラシル、メトトレキセート及び照射剤から選択できる。このような抗腫瘍薬は、通常個々の薬剤について推奨されているのと同じ投与量で投与される。
ＣＤ４０インデューサは、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、又は他の公知ＣＤ４０発現のインデューサであってよい。このようなＣＤ４０インデューサは、通常個々のインデューサについて推奨されているのと同じ投与量で投与される。
ＣＤ４０は、神経成長因子レセプター／腫瘍壊死因子レセプター（ＮＧＦ−Ｒ／ＴＮＦ−Ｒ）系統群に属する５０キロダルトンの１型糖タンパク質であり、Ｂリンパ球の表面上で発現する（Ｎｏｅｌｌｅ等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１３、４３１〜４３３、１９９２；及びＳｍｉｔｈ等、Ｃｅｌｌ、７６、９５９〜９６２、１９９４参照）。アポトーシスするかアポトーシスさせられる傾向のある正常Ｂ細胞及び新生Ｂ細胞について、ＣＤ４０のライゲーションにより、Ｂｃｌ−２発現のアップレギュレーションが部分的に介在する強力なレスキュー（生存）シグナルが提供される（Ｌｉｕ等、Ｎａｔｕｒｅ、３４２、９２９〜９３１、１９８９参照）。この効果は、最初リガンド擬態モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて示され、より最近では、組み換えリガンド（ＣＤ４０Ｌ）により確認された（Ｎｏｅｌｌｅ等、前出参照）。
ＣＤ４０とＢｃｌ−２の両方の発現は、正常基底上皮細胞、及び卵巣、鼻咽頭、肺及び胸部の癌を含む多数の種々の癌において生じる（Ｙｏｕｎｇ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４３、７８６〜７９４、１９８９；及びＨｏｃｋｅｎｂｅｒｙ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、６９６１〜６９６５、１９９１参照）ことも知られている。これらの研究は、ＣＤ４０経路が癌において活性なことがあること、及び生じたＢｃｌ−２の発現が、これらの腫瘍が通常の癌の化学療法に使用される細胞障害薬により誘発されるものなどのアポトティック細胞死を生じないように保護することがあることを示唆している（Ｄｉｖｅ等、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ、３、４１７〜４２７、１９９２参照）。さらに、ＣＤ４０及びＢｃｌ−２の発現が重層鱗状上皮の増殖性基底コンパートメントに制限されることは、この経路が、正常成長の制御及び上皮分化のアポトティックプロセスの制御に役割を果たす可能性のあることを示している。
上記のことからして、Ｂ細胞における研究とは対照的に、正常又は新生源の上皮細胞におけるＣＤ４０の刺激により、成長が阻止され、抗腫瘍薬性アポトーシスに対する感受性が高まることを見出したことは、驚くべきことであった。
ＣＤ４０バインダーとしては、例えば、リガンド擬態モノクローナル抗体、例えばＧ２８．５（米国メリーランド州ロックビルにあるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるハイブリドーマ（取得番号ＨＢ−９１１０）、Ｓ２Ｃ６（Ｐａｕｌｉｅ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、２０、２３〜２８、１９８５に開示されている）及び天然又は構築型ＣＤ４０リガンド（一例としてＣＤ４０Ｌがある）を使用することができる。ＣＤ４０Ｌは、Ｔ細胞レセプターを介しての活性化後にＴ細胞上で誘発できる、ＴＮＦに相同性を有する３９キロダルトンのII型細胞膜内タンパク質である（Ｃｌａｒｋ及びＬｅｄｂｅｔｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３６７、４２５〜４２８、１９９４参照）。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ対は、標的細胞における細胞活性化及びアポトーシスの制御に関与するＴＮＦ−Ｒ／ＴＮＦ系統群に基づく相互作用するレセプター−リガンド分子の拡大系統群の一部分である（Ｓｍｉｔｈ等、前出）。
ＣＤ４０バインダーは、静脈内、皮下若しくは腹腔内注射又は注入することによるか、精製形態又は人間化した形態において腫瘍部に直接注射することにより、投与できる。ＣＤ４０の投与量は、モノクローナル抗体であるかＣＤ４０Ｌであるかによって異なるが、μｇ〜ｍｇの範囲である。
ＣＤ４０バインダーとともに使用される薬学的に許容されるキャリア（希釈剤、賦形剤等）は、これらの種類の薬物についての公知のキャリアのいずれかから選択でき、とりわけ投与形態に依存する。例えば、注射性組成物を製造するには、キャリアを、ヒト血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水等の単純な製剤から、細胞培養液等のより複雑な溶液までを選択できる。
本発明を、以下の実施例及び添付図面を参照しながらより詳細に説明する。
第１図は、抗ＣＤ４０ｍＡｂＧ２８．５による４８時間処理が卵巣癌細胞株Ａ２７８０の成長に及ぼす影響を示すチャートであり、ここに示されているデータは、３つの独立した実験で得た３重反復測定値の平均であり、非処理対照に対する生存減少率（％）で表わしてあり、
第２図は、Ａ２７８０ＣＰ細胞株をＩＦＮ−γ１５０単位／ｍｌとともに２４時間予備インキュベーションすると、Ｇ２８．５ｍＡｂ  ２μｇ／ｍｌの存在下での細胞成長が２６％減少することを示すチャートであり、
第３図は、ＥＪ膀胱癌細胞株の細胞成長に対するＧ２８．５ｍＡｂの時間と濃度の影響を示すチャートであり、
第４図は、Ｒａｔ−１／ＣＤ４０トランスフェクタント（Ｃ１．８）の成長に対する抗ＣＤ４０ｍＡｂの影響を示すチャートであり、
第５図は、卵巣癌細胞株Ａ２７８０におけるＧ２８．５ｍＡｂと５μＭシスプラチンとの組み合わせによる細胞障害作用の増強を示すチャートであり、ここでは、細胞障害作用は、４８時間ＭＴＴアッセイで測定したものであり、データは、３つの独立した実験で得た３重反復測定値の平均であり、非処理対照に対する生存減少率（％）で表わしてあり、
第６図は、Ｇ２８．５ｍＡｂ  ２μｇ／ｍｌとともに４８時間インキュベーションすることによるＥＪ膀胱癌細胞株におけるシスプラチン性細胞障害作用の増強を示すチャートであり、
第７図は、種々の濃度のシスプラチンについて、Ｒａｔ−１／ＣＤ４０Ｃ１．８細胞をＧ２８．５ｍＡｂ  １μｇ／ｍｌとともにインキュベーションした場合の効果を示すチャートであり、データは、３つの独立した実験で得た３重反復測定値の平均であり、
第８図は、卵巣癌細胞株Ａ２７８０の成長に対するＣＤ４０Ｌによる４８時間処理の影響を示すチャートであり、データは、３つの独立した実験で得た３重反復測定値の平均であり、非処理対照に対する生存減少率（％）で表わしてあり、
第９図は、ＥＪ膀胱腺癌細胞株の細胞成長に対するＣＤ４０Ｌの時間と濃度の影響を示すチャートであり、
第１０図は、Ｒａｔ−１／ＣＤ４０トランスフェクタント（Ｃ１．８）の成長に対するＣＤ４０Ｌの影響を示すチャートであり、
第１１図は、ＣＤ４０Ｌ  １００単位／ｍｌとともに４８時間インキュベーションすることによるＥＪ膀胱癌細胞株におけるシスプラチン誘発細胞障害作用の増強を示すチャートである。
実施例１
細胞培養
ヒト卵巣癌細胞株Ａ２７８０とそのシスプラチン耐性誘導体２７８０ＣＰ（Ｍａｓｕｄａ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５０、１８６３〜１８６６、１９９０）、ＥＪ膀胱癌細胞株（受託番号：８５０６１１０８、英国Ｐｏｒｔｏｎ  ＤｏｗｎにあるＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）及びＲａｔ−１線維芽細胞（Ｌａｎｉａ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１０１、２１７〜２３２、１９８０）を、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清、英国Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ  ＴｈａｎｅにあるＩＣＮ  Ｆｌｏｗ製）、２ｍＭグルタミン、並びに抗生物質、ペニシリン（１０００単位／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）（英国のＤｏｒｓｅｔ  ＰｏｏｌｅにあるＳｉｇｍａ社製）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（スコットランドのＰａｉｓｌｅｙにあるＧＩＢＣＯＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に、５％ＣＯ2中３７℃で、連続的に維持した。
ＣＤ４０を発現するＲａｔ−１線維芽細胞を、適当な薬剤耐性プラスミド、ｐＵＣＬＴＲネオを１０：１で用いた（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．、８、１４０３〜１４１０、１９８９に記載の操作後）ＣＤ４０発現ベクターのエレクトロポレーションにより生成させた。ＣＤ４０発現Ｒａｔ−１細胞の安定なトランスフェクタントを、ゲネチシンＧ４１８抗生物質に長時間暴露した後単離した。このとき、薬剤耐性細胞の個々のコロニーを収穫し、個々のコロニーとして別々に培養した。このようなトランスフェクタントの試料は、ブダペスト条約に基づき、英国Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４０ＪＧ  ＳａｌｉｓｂｕｒｙにあるＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈに、１９９５年１１月１０日に寄託した（取得番号９５１１１０１００）ものである。
上記細胞株におけるＣＤ４０の発現は、抗ＣＤ４０抗体を用いたＦＡＣＳ分析により確認された。簡単に述べると、細胞を、トリプシン消化後に収穫し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、Ｇ２８．５ｍＡｂ  ０．５μｇ／ｍｌに再懸濁した。４℃で１時間インキュベーションした後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（英国のＰｏｏｌｅ、ＤｏｒｓｅｔにあるＳｉｇｍａ社製）の１：５０希釈溶液に再懸濁した。４℃でさらに３０分間インキュベーションした後、細胞を洗浄し、最後に１％パラホルムアルデヒドに再懸濁してから、標準ＦＡＣＳ分析した。
細胞の処理及び細胞成長についてのアッセイ
細胞増殖の阻害を、Ｍｏｓｓａｍａｎの比色分析（Ｍｏｓｓｍａｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｓ．、６５、５５〜６３、１９８３参照）を用いて評価した。簡単に述べると、細胞を９６ウエルプレートで一晩平板培養して正常細胞周期とした。次に、種々の濃度のＧ２８．５ｍＡｂを添加し、細胞成長に及ぼすそれらの影響を、適当な時間（４８時間、７２時間及び９６時間）をおいた後に、Ｓｉｇｍａ社製５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ（３−（４，４−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）のＰＢＳ溶液２０μｌを添加して評価した。細胞を、さらに３７℃で５時間インキュベーションし、形成されたホルマザン結晶をＤＭＳＯに溶解し、光学濃度（ＯＤ）をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎにより５５０ｎｍで記録した。さらなる一連の実験では、細胞を、種々のシスプラチン濃度で、Ｇ２８．５ｍＡｂを添加又は無添加で、２時間処理した。次に、細胞を、ＰＢＳ、及びＧ２８．５ｍＡｂ含有の新鮮な培地２００μｌで２回洗浄した。４８時間後、細胞成長を、上記したＭＴＴアッセイを用いて評価した。
抗ＣＤ４０ｍＡｂの癌細胞成長に及ぼす影響
Ａ２７８０、２７８０ＣＰ及びＥＪ癌細胞株の細胞成長に対する抗ＣＤ４０ｍＡｂＧ２８．５の影響だけでなく、これらの細胞成長に対するＣＤ４０Ｒａｔ−１トランスフェクタント（Ｒａｔ−１／ＣＤ４０Ｃ１．８）の影響についても調査した。Ｇ２８．５ｍＡｂは、最適濃度１０μｇ／ｍｌで、４８時間処理後、卵巣Ａ２７８０細胞株の生存を、対照に対して、２９％減少させた（第１図）。
シスプラチン耐性２７８０ＣＰ細胞株を、同様の条件下で、Ｇ２８．５ｍＡｂにより処理したとき、何の影響も観察されなかった。これは、この細胞株におけるＣＤ４０の発現レベルが低いためと思われた。しかしながら、２７８０ＣＰ細胞株を、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）１５０Ｕ／ｍｌで２４時間処理し、続いてＧ２８．５  １０μｇ／ｍｌでインキュベーションしたところ、生存が約２２％減少し、これはＩＦＮγによるＣＤ４０の誘発と一致していた（第２図）。ＣＤ４０活性の同様な効果は、ＥＪ膀胱癌細胞株についても観察された（第３図）。ＥＪ細胞株に対するＧ２８．５ｍＡｂの影響は、時間と濃度の両方に依存し、Ｇ２８．５  ２μｇ／ｍｌで９６時間処理したときに最大の効果が得られ、生存が２７％減少した（第３図）。
形質移入ＣＤ４０発現Ｒａｔ−１線維芽細胞を用いて、ＣＤ４０効果の特異性を調査した。第４図に示すように、Ｇ２８．４ｍＡｂによるＣＤ４０の刺激によって、細胞成長が阻害された。検討したトランスフェクタント（クローン８個）において、Ｇ２８．５ｍＡｂ  ２μｇ／ｍｌとともに４８時間インキュベーションすると、細胞成長が２２％減少する（第４図）。
ＣＤ４０活性化によるシスプラチン誘発細胞死滅の強化
上記細胞株をＧ２８．５ｍＡｂで処理することにより、シスプラチン等の抗癌剤の細胞障害効果が強化された。Ａ２７８０細胞株において、Ｇ２８．５ｍＡｂ  １０μｇ／ｍｌに暴露することにより、５μＭシスプラチンの細胞死滅効果が、統計的に有意な効果である、４６％から６１％に増加した（第５図）。同様な結果が、Ｇ２８．５ｍＡｂ  ２μｇ／ｍｌの存在下で５μＭシスプラチンにより処理したＥＪ株についても得られた（第６図）。
また、Ｒａｔ−１／ＣＤ４０Ｃ１．８のＧ２８．５ｍＡｂ  １μｇ／ｍｌによる処理によっても、シスプラチンの細胞障害効果が強化され、ＩＣ５０値が６μＭ（＋／−０．９）から４．２μＭ（＋／−０．３）にシフトした。これは、薬剤感受性が１．６〜１．８倍増加したことを表す（第７図）。親の未形質移入Ｒａｔ−１細胞では何ら効果が見られなかった。
実施例２
細胞培養
上記実施例１に記載した細胞培養法を利用した。
細胞の処理及び細胞成長についてのアッセイ
細胞増殖の阻害を、Ｍｏｓｓａｍａｎの比色分析（Ｍｏｓｓｍａｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｓ．、６５、５５〜６３、１９８３参照）を用いて評価した。簡単に述べると、細胞を９６ウエルプレートで一晩平板培養して正常細胞周期とした。次に、種々の濃度のＣＤ４０Ｌ〔構築可溶型ＣＤ４０結合リガンド（米国ワシントン州シアトル  ユニバシティストリート５１にあるＩｍｍｕｎｅｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）を添加し、細胞成長に及ぼすそれらの影響を、適当な時間（４８時間、７２時間及び９６時間）をおいた後に、Ｓｉｇｍａ社製５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ（３−（４，４−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）のＰＢＳ溶液２０μｌを添加して評価した。細胞を、さらに３７℃で５時間インキュベーションし、形成されたホルマザン結晶をＤＭＳＯに溶解し、光学濃度（ＯＤ）をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎにより５５０ｎｍで記録した。さらなる一連の実験では、細胞を、種々のシスプラチン濃度で、ＣＤ４０Ｌを添加又は無添加で、２時間処理した。次に、細胞を、ＰＢＳ、及びＣＤ４０Ｌ含有の新鮮な培地２００μｌで２回洗浄した。４８時間後、細胞成長を、上記したＭＴＴアッセイを用いて評価した。
癌細胞成長に対するＣＤ４０Ｌの影響
Ａ２７８０、２７８０ＣＰ及びＥＪ癌細胞株だけでなく、ＣＤ４０Ｒａｔ−１トランスフェクタント（Ｒａｔ−１／ＣＤ４０Ｃ１．８）の細胞成長に対するＣＤ４０Ｌの影響についても調査した。ＣＤ４０Ｌ  １００単位／ｍｌにより、４８時間処理後、卵巣Ａ２７８０細胞株の生存を、対照に対して、３６％減少させた（第８図）。ＥＪ細胞株に対するＣＤ４０Ｌの影響は、時間と濃度の両方に依存し、ＣＤ４０Ｌ  １００単位／ｍｌで９６時間処理したときに最大の効果が得られ、生存が４３％減少した（第９図）。
形質移入ＣＤ４０発現Ｒａｔ−１線維芽細胞を用いて、ＣＤ４０効果の特異性を調査した。第１０図に示すように、ＣＤ４０ＬによるＣＤ４０の刺激によって、細胞成長が阻害された。検討したトランスフェクタント（クローン８個）において、ＣＤ４０Ｌ  １００単位／ｍｌとともに４８時間インキュベーションすると、生存が２８％減少した（第１０図）。
ＣＤ４０活性化によるシスプラチン誘発細胞死滅の強化
ＥＪ癌細胞株を、ＣＤ４０Ｌ  １００単位／ｍｌの存在下で７．５μＭシスプラチンにより処理することにより、細胞死滅が増強された（第１１図）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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