(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物及び酵素をキャピラリーに導入する前及び後に、それぞれ、泳動液とは異なる第１のサンドイッチ溶液及び第２のサンドイッチ溶液を前記キャピラリーに導入し、前記第１のサンドイッチ溶液及び前記第２のサンドイッチ溶液で、前記分析対象物及び前記酵素を挟む工程と、
前記分析対象物と前記酵素とをそれぞれ異なる速度で電気泳動により移動させ、前記分析対象物と前記酵素とが混合する場所で酵素反応を起こさせ、生成物を得る工程と、次いで、
電気泳動により移動してきた生成物を検知する工程と、
を含み、
前記泳動液には、前記酵素反応を阻害する物質が含まれており、前記第１のサンドイッチ溶液と、前記第２のサンドイッチ溶液とには、前記酵素反応を阻害する物質が含まれていないことを特徴とする分析方法。
【請求項２】
前記分析対象物が、燐酸リボフラビンナトリウムを含有し、かつ、前記生成物がリボフラビンを含有する請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記分析対象物が、硝酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸アミド、および無水カフェインから選ばれる少なくとも１種を含有する請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記酵素がアルカリホスファターゼを含有する請求項１、２又は３に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ドリンク剤成分を分析する方法に関し、より詳しくは、インキャピラリー酵素反応法によるドリンク剤配合水溶性ビタミン類を分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ビタミンは、少量だが生物に必要不可欠な栄養素で、欠乏すれば病気を引き起こすことが知られている。近年はその不足を補うために、ドリンク剤、錠剤及びシロップ剤などの剤型をとったマルチビタミン剤が広く使用されている。したがって製薬分野ではより迅速、簡便かつ確実性のあるビタミン分析法の開発が望まれている。数ある分離分析法の中で、高い理論段数、分離能を有するキャピラリー電気泳動法（ＣＥ）は、短時間で複数成分を一斉分析する能力に長けている。これまでにもこのような特長を生かして、ビタミン類の分析にＣＥを用いた例が数多く報告されており、主に水系バッファーを泳動液に用いるキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ：Capillary zone electrophoresis）やミセルを擬似固定相として用いるミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ：Micellar electrokinetic chromatography）が利用されてきた。
【０００３】
水溶性ビタミン類の１つであるリボフラビン（ＲＦ，ビタミンＢ２）は、生体内で酸化還元反応に関与しており、２種のフラビン補酵素、すなわちフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ、リン酸リボフラビン）とフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の構成成分として自然界に存在する。またNielsenらは、市販のリン酸リボフラビンナトリウムにはいくつかのリボフラビンリン酸エステル類（ＦＭＮｓ）が混在しており、その組成比は一定ではないことを示した。リボフラビン類を定量する方法としてこれまで、微生物学的手法，蛍光法，分光光度法，電気化学的手法，光化学的手法などが知られている。リボフラビンの定量にはその標準品の入手が必要であるが、リン酸リボフラビンナトリウムは、リボフラビンに比較して溶解性が大きいことから医薬品ドリンク剤に主に配合されてきたにもかかわらず、その純品の入手は不可能であるといわれている。
【０００４】
このため、酵素を用いてＦＭＮｓを完全にリボフラビンに変換してから、トータルリボフラビン量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：High performance liquid chromatography）にて評価する方法が幾つか試みられてきた。その中でもホスファターゼを酵素に用いて変換を行う手法は、反応の迅速性及び正確性の面から有用性が高いといえる。Ｌａｍらは、アルカリホスファターゼを用いて酵素変換を行い、リン酸リボフラビンナトリウムを含めた４種の水溶性ビタミンをＨＰＬＣにて同時分析した。さらに、大曽根らは小麦胚芽由来の酸ホスファターゼを用いても同様に変換が可能であることを示し、医薬品製剤分析に応用した。また大和らは固定化した酸ホスファターゼをプレカラムリアクターとして用いることにより、オンラインでの酵素変換−分離分析を可能にし、操作の自動化を達成した。
【０００５】
一般に酵素は高額で、少量のみしか手に入らない場合が多い。その点ＣＥでの分析ではごく微量の試料のみを必要とするため、酵素マイクロリアクターとしての有用性も注目されている。近年酵素活性測定のために、ＣＥを用いたインキャピラリー酵素反応（In-capillary enzyme reaction）法に関する報告がいくつかなされている（「キャピラリー電気泳動を用いた酵素で触媒されたミクロ反応：定量的研究」、D. S. Zhao F.A. Gomez, Chromatographia Vol. 44, No. 9/10, May 1997, 514-520; Toshiro Watanabe et al., Electrophoresis 1998, 19, 2331-2337；特表平８−５０１３９２)。インキャピラリー酵素反応では、まず基質と酵素の溶液を別々に注入した後、電気泳動を開始し、それぞれ異なる速度で移動する２つの溶質が混じりあう場所で反応を起こさせ、続けて、移動してきた反応生成物を分析するというものである。基質と酵素の混合、反応、分離、検出までを市販装置を用いてオンラインで行うこの手法は、簡便な操作でなおかつ分析に必要な試料容量をｍＬからｎＬレベルにまで減らすことができる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、インキャピラリー酵素反応法による分析方法に関する。本発明の第１の側面では、ドリンク剤中のリン酸リボフラビンナトリウムの分析に、初めてインキャピラリー酵素反応法を試みたことに特徴がある。これにより、ドリンク剤成分を簡易に分析することができる。また、分析対象物に複数のドリンク剤成分が含まれていても、容易に分離することができる。
【０００７】
本発明の第２の側面では、第１のサンドイッチ溶液及び第２のサンドイッチ溶液で、ドリンク剤成分及び酵素を挟むことに特徴がある。泳動液に酵素反応を阻害する物質が含まれている場合には、第１のサンドイッチ溶液と、第２のサンドイッチ溶液とには、前記酵素反応を阻害する物質が含まれていないようにすることで、泳動液で酵素反応を阻害しないようにすることができる。
【０００８】
本発明は、より具体的には以下のようなものを提供する。
【０００９】
（１）  ドリンク剤成分と酵素とを別々に、泳動液を含むキャピラリーに導入する工程と、前記ドリンク剤成分と前記酵素とをそれぞれ異なる速度で電気泳動により移動させ、前記ドリンク剤成分と前記酵素とが混合する場所で酵素反応を起こさせ、生成物を得る工程と、次いで、電気泳動により移動してきた生成物を検知する工程と、を有することを特徴とする、ドリンク剤成分の分析方法。
【００１０】
（２）  前記ドリンク剤成分が、燐酸リボフラビンナトリウムを含有し、かつ、前記生成物がリボフラビンを含有する上記に記載のドリンク剤成分の分析方法。
【００１１】
（３）  前記ドリンク剤成分と共に、更に、硝酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸アミド、および無水カフェインから選ばれる少なくとも１種をキャピラリーに導入する上記に記載のドリンク剤成分の分析方法。
【００１２】
（４）  前記ドリンク剤成分及び前記酵素を前記キャピラリーに導入する前及び後に、それぞれ、第１のサンドイッチ溶液及び第２のサンドイッチ溶液を前記キャピラリーに導入し、前記第１のサンドイッチ溶液及び前記第２のサンドイッチ溶液で、前記ドリンク剤成分及び前記酵素を挟む上記に記載のドリンク剤成分の分析方法。
【００１３】
（５）  第１のサンドイッチ溶液と、分析対象物と、酵素と、第２のサンドイッチ溶液とを、泳動液を含むキャピラリーに導入する工程と、前記分析対象物と前記酵素とをそれぞれ異なる速度で電気泳動により移動させ、前記分析対象物と前記酵素とが混合する場所で酵素反応を起こさせ、生成物を得る工程と、次いで、電気泳動により移動してきた生成物を検知する工程と、を含むことを特徴とする分析方法。
【００１４】
（６）  前記泳動液には、前記酵素反応を阻害する物質が含まれており、前記第１のサンドイッチ溶液と、前記第２のサンドイッチ溶液とには、前記酵素反応を阻害する物質が含まれていない上記に記載の分析方法。
【００１５】
（７）  前記分析対象物が、燐酸リボフラビンナトリウムを含有し、かつ、前記生成物がリボフラビンを含有する上記に記載の分析方法。
【００１６】
（８）  前記分析対象物が、硝酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸アミド、および無水カフェインから選ばれる少なくとも１種を含有する上記に記載のドリンク剤成分の分析方法。
【００１７】
（９）  前記酵素がアルカリホスファターゼを含有する上記に記載の分析方法。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳しく説明する。本発明は、インキャピラリー酵素反応法による分析方法に関する。"キャピラリー"とは毛細管のことをいい、インキャピラリー酵素反応法は、このキャピラリーである直径100μm以下の細い管、例えば、直径５０μｍの細い管の両端に高電圧をかけることにより、溶液中の各種イオンや有機酸等の荷電粒子が分離・移動する原理を応用した極めて分解能が高い分析方法である。
【００１９】
本発明のインキャピラリー酵素反応法は、ドリンク剤成分又は分析対象物と酵素の移動度がそれぞれ異なることを利用する。電気泳動において、速く移動するゾーン、（例えば、酵素ゾーン）が遅く移動するゾーン、（例えば、ドリンク剤成分又は分析対象物ゾーン）を追い越すことを利用して、両者が混合した際に反応を起こさせる。即ち、ドリンク剤成分又は分析対象物と、酵素とで、電気泳動の移動度を比較し、電気泳動で遅く移動する方、例えば、ドリンク剤成分または分析対象物を先にキャピラリーに導入し、電気泳動で速く移動する方、例えば、酵素を後にキャピラリーに導入することが好ましい。ドリンク剤成分又は分析対象物と酵素とを導入する際には、間隔が空いてもよいが、間隔が空かなくてもよい。間隔が空かない方が好ましい。
【００２０】
本発明の第１の側面では、ドリンク剤成分と酵素とを別々に、泳動液を含むキャピラリーに導入する工程と、前記ドリンク剤成分と前記酵素とをそれぞれ異なる速度で電気泳動により移動させ、前記ドリンク剤成分と前記酵素とが混合する場所で酵素反応を起こさせ、生成物を得る工程と、次いで、電気泳動により移動してきた生成物を検知する工程と、を有することを特徴とする、ドリンク剤成分の分析方法が提供される。
【００２１】
ドリンク剤成分の例示として、構造式を下記に示す。ドリンク剤成分としては、例えば、燐酸リボフラビンナトリウム、リボフラビン、硝酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸アミド、および無水カフェインが挙げられる。
【００２２】
【化１】
0004097465.tif 000002
【００２３】
酵素はドリンク剤成分又は分析対象物中の基質と反応するものが選ばれる。例えば、基質が燐酸リボフラビンナトリウムの場合には、アルカリホスファターゼが好ましく用いられる。酸ホスファターゼに比較して比活性が高く、アルカリ性に最適ｐＨを持つからである。従来、インキャピラリー酵素反応法では、酵素活性に着目されてきたが、この場合必ずしも基質の反応が１００％完結する必要はなかった。しかしながらリン酸リボフラビンナトリウムの分析の場合には、ＦＭＮｓを完全にリボフラビンに変換することが好ましい。
【００２４】
ドリンク剤成分又は分析対象物には、酵素と反応する成分と、酵素と反応しない成分とが同時に含まれていてもよい。あるいは、酵素と反応する成分のみが含まれていてもよい。
【００２５】
キャピラリー中には、泳動液が含まれる。泳動液としては、通常、インキャピラリー酵素反応法に用いられるものを用いればよい。泳動液にはラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含有することが好ましい。ラウリル硫酸ナトリウムの濃度が上昇するにつれて、エレクトロフェログラムのピークの移動時間が長くなり、分離が容易になる。
【００２６】
キャピラリー中には、充填剤が含まれていてもよい。充填剤が含まれない場合は、例えば、フューズドシリカが用いられる。
【００２７】
本発明には、電気泳動により移動してきた生成物を検知する工程が含まれる。検知手段は限定されるものではなく、公知の検知手段が好ましく用いられる。例えば、フォトダイオードアレイ検出器を用いることができる。生成物に限られず、未反応のドリンク剤成分又は分析対象物と、未反応の酵素等までも検出される場合がある。
【００２８】
本発明の第２の側面では、いわゆるサンドイッチ法が用いられる。本発明の第１の側面と共通する要素については、説明を省略する。
【００２９】
本発明の第２の側面では、第１のサンドイッチ溶液と、分析対象物と、酵素と、第２のサンドイッチ溶液とを、泳動液を含むキャピラリーに導入する工程と、前記分析対象物と前記酵素とをそれぞれ異なる速度で電気泳動により移動させ、前記分析対象物と前記酵素とが混合する場所で酵素反応を起こさせ、生成物を得る工程と、次いで、電気泳動により移動してきた生成物を検知する工程と、を含む。
【００３０】
本発明の第２の側面では、分析対象物及び酵素が第１のサンドイッチ溶液及び第２のサンドイッチ溶液の間に挟まれる。第１のサンドイッチ溶液と、第２のサンドイッチ溶液とは、同じ組成の溶液を用いてもよいし、異なった組成の溶液を用いてもよい。泳動液に、前記酵素反応を阻害する物質が含まれている場合には、サンドイッチ法が特に好ましく用いられる。この場合には、前記第１のサンドイッチ溶液と、前記第２のサンドイッチ溶液とには、前記酵素反応を阻害する物質が含まれていないことが好ましい。このようなサンドイッチ溶液により、酵素反応の阻害を抑制することができるからである。
【００３１】
分析対象物及び酵素の導入順序は、本発明の第１の側面と同様に、分析対象物と酵素とで電気泳動の移動度を比較し、電気泳動で遅く移動する方、例えば、分析対象物を先にキャピラリーに導入し、電気泳動で速く移動する方、例えば、酵素を後にキャピラリーに導入することが好ましい。
【００３２】
【実施例】
[装置]
フォトダイオードアレイ検出器（検出波長：２７０ｎｍ）を接続したキャピラリー電気泳動装置（AgilentＣＥ，アジレントテクノロジー，Waldbronn，Germany）を用いた。キャピラリー温度は３７℃、印加電圧は１２ｋＶ，試料注入はすべて加圧注入法（３．４５ｋＰａ）を採った。フューズドシリカキャピラリー（５０μｍＩ．Ｄ．；３７５μｍＯ．Ｄ．；有効長４０ｃｍ；全長４８．５ｃｍ）はアジレントテクノロジー製のものを用い、検出感度向上のためバブルセルキャピラリーを用いた。キャピラリー洗浄法は、毎日分析開始時に１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ（１００ｋＰａ×１５分間）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ（１００ｋＰａ×１５分間）、水（１００ｋＰａ×１５分間）及び泳動液（１００ｋＰａ×１５分間）の順で行った。また、毎分析前に１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ（１００ｋＰａ×３分間）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ（１００ｋＰａ×２分間）、水（１００ｋＰａ×５分間）、及び泳動液（１００ｋＰａ×５分間）の順でコンディショニングを行った。すべてのデータはChemStation software（アジレントテクノロジー）にて、解析を行った。
【００３３】
[試薬及び試液]
リン酸リボフラビンナトリウム（市販ＦＭＮ）及び硝酸チアミンはエフ・ホフマン−ラ・ロシュ（F.Hoffmann‐La Roche Ltd．）（スイス、ベーゼル、Basel，Switzerland）より購入した。リボフラビン標準品、硝酸チアミン標準品、塩酸ピリドキシン標準品、ニコチン酸アミド標準品及びカフェイン標準品は公定書協会（Tokyo,Japan）よりそれぞれ購入した。
【００３４】
ウシ腸粘膜由来アルカリホスファターゼ（E.C.3.1.3.2）（Type VII-Lアフイニテイー精製品）及び小麦胚芽由来酸ホスファターゼ（E.C.3.1.3.2）（TypeI）はSigｍa（St.Louis，MO,USA）より購入した。
【００３５】
没食子酸一水和物、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），１‐デカンスルホン酸ナトリウム、ホウ酸及び四ホウ酸ナトリウム十水和物（ホウ砂）は和光純薬（Osaka，Japan）製のものを用いた。すべての試薬は特級を用いた。リン酸リボフラビンナトリウム溶液及びアルカリホスファターゼ溶液は、それぞれ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス−１９５ｍｍｏｌ／Ｌグリシン緩衝液に溶解して得た。泳動液、即ち、泳動液は、あらかじめ５０ｍｍｏｌ／Ｌホウ砂溶液と２００ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸溶液を混合しｐＨを８．０に調整した緩衝液にＳＤＳを１３５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶かして製造した。調製した泳動液は０．４５μｍ水系メンブランフイルターにてろ過後使用した。
【００３６】
[比較例１：オフライン酵素反応法]
リン酸リボフラビンナトリウム水溶液（５０μｇ／ｍＬ）２ｍＬにトリスーグリシン緩衝液もしくは１３５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＳＤＳを含んだトリスーグリシン緩衝液を５ｍＬ加え、さらにアルカリホスファターゼ溶液（５０単位／ｍＬ）１ｍＬを加え、３７℃で１０分間インキュベーションを行った。その後水を加え１０ｍＬとし、試料溶液とした。加圧注入法（３．４５ｋＰａ×５秒間）で、キャピラリー電気泳動装置に供し、上記記載の泳動液を用いてｎ＝５で試験を行った。なお変換率は、クロマトグラム中に検出されるリボフラビン及びＦＭＮｓのピーク面積の総和に占めるリボフラビンのピーク面積値の百分率で表した。
【００３７】
[実施例１、２、比較例２：インキャピラリー酵素反応法]
インキャピラリー酵素反応法の概略を図１に示す。フューズドシリカキャピラリー１０（内径５０μｍ、有効長４０ｃｍ）に泳動液１２を充填した。リン酸リボフラビンナトリウム（ＦＭＮ）を含む試料溶液１４とアルカリホスファターゼを含む酵素溶液１６を、続けて加圧注入法（３．４５１ｋＰａ×５秒間）で注入した（図１（Ａ）及び図１（Ｂ）を参照のこと）。この際、反応ゾーン１８が形成される。リン酸リボフラビンナトリウム（ＦＭＮ）を含む試料溶液１４と酵素溶液１６とをそれぞれ異なる速度で電気泳動により移動させ、前記試料溶液１４と酵素溶液１６とが混合する場所で酵素反応を起こさせた。即ち、印加電圧１ｋＶで混合時間を３分間とった後、上記記載の泳動液を用いて、印加電圧１２ｋＶで電気泳動を行った。電気泳動において、温度は３７℃であり、検出波長は２７０ｎｍ、泳動液は、５０ｍｍｏｌ／Ｌのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中に１３５ｍｍｏｌ／Ｌのラウリル硫酸ナトリウムを含有した溶液を用いた。
【００３８】
その結果のエレクトロフェログラムを図２（Ｂ）に示す。ピーク１は未反応のリン酸リボフラビンナトリウムを意味し、ピーク２は生成物のリボフラビンを意味する。変換率は８６．７％であった。
【００３９】
比較例２では、実施例１と同様な条件でエレクトロフェログラムを得た。ただし、酵素溶液の代わりに、トリスーグリシン緩衝液を注入した。結果を図２（Ａ）に示す。未反応のリン酸リボフラビンナトリウム、ピーク１が観察され、生成物のリボフラビン、即ち、ピーク２はほとんど観察されなかった。
【００４０】
実施例２では、実施例１と同様な条件でエレクトロフェログラムを得た。ただし、酵素溶液を先に注入し、次いで、試料溶液を注入し、実施例１とでは注入順序を入れ替えた。
【００４１】
結果を図２（Ｃ）に示す。ピーク１は未反応のリン酸リボフラビンナトリウムを意味し、ピーク２は生成物のリボフラビンを意味する。このように実施例２でもリボフラビンへの変換が起こったのは、酵素溶液と試料溶液を連続的に注入した段階で、ある程度の混合が起こっていることを示している。変換率は７５．２％であった。
【００４２】
[実施例３：インキャピラリー酵素反応法、サンドイッチ注入法]
サンドイッチ注入法の概略を図３に示す。まずサンドイッチ溶液１１ａ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））を２０秒間注入し、その後試料溶液１４、１０μｇ／ｍＬのリボフラビンナトリウムを５秒間、次いで、酵素溶液１６、１５〜５００単位／ｍＬのアルカリホスファターゼ溶液を１０秒間、圧力注入し、最後にサンドイッチ溶液１１ｂ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））を２０秒間注入した。すなわち、用いる酵素溶液の濃度を変化させた。印加電圧１ｋＶで１０分間混合するようにした後、上記記載の泳動液を用いて１２ｋＶで電気泳動を行った。変換率の計算は比較例１のオフライン酵素反応法と同様な方法で行った。結果を図４（Ｂ）に示す。
【００４３】
[実施例４：インキャピラリー酵素反応法、通常法]
実施例３と同様に試験を行った。ただし、サンドイッチ溶液１１ａ、１１ｂを用いなかったことのみが実施例３と異なる。結果を図４（Ａ）に示す。
【００４４】
図４（Ａ）及び図４（Ｂ）、並びに、図５に示すように、実施例３も実施例４も酵素量を増やしていくとともにリボフラビンへの変換が進んでいくが、そのいずれのポイントでもサンドイッチ注入法のほうが高い変換率を示すことがわかった。そして５００単位／ｍＬのアルカリホスファターゼを用いたときノーマル注入法ではＦＭＮｓの未変換部分が認められるのに対して、サンドイッチ注入法では完全変換を達成した。
【００４５】
[実施例５：インキャピラリー酵素反応法、サンドイッチ注入法]
完全変換を達成した条件、即ち、実施例３における、５００単位／ｍＬのアルカリホスファターゼを用いた条件において、５μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲でリン酸リボフラビンナトリウムのリボフラビンへの変換の直線性を最小二乗法に基づき計算した。その結果、リン酸リボフラビンナトリウムの濃度と生成リボフラビンのピーク面積比との間に、ほぼ原点を通る回帰式Ｙ＝０．１２９６Ｘ−０．０２９３及び相関係数ｒ＝０．９９９９の直線関係を得た。
【００４６】
[実施例６：サンドイッチ注入法の有効性試験]
サンドイッチ注入法によるインキャピラリー酵素反応法により、市販ドリンク剤中のリン酸リボフラビンナトリウム定量法への適用の可能性を検討した。その際、同時に配合される水溶性ビタミン類及び無水カフェインも併せて分析することを試みた。実施例３、即ち、インキャピラリー酵素反応法のサンドイッチ注入法と同様な条件で反応を行った。内標準物質として塩酸フェニレフリンを用い、設定した条件に従って、標準溶液、試料溶液及び各成分抜き試料（実施例７に記載されている通りである。）を用いて特異性を確認した。
【００４７】
代表的な結果を図６に示す。ＩＳは内標準物質を意味し、数字は前出の化１中に番号で示されている化合物を意味する。図６（Ｃ）では、１０００単位／ｍｌのアルカリホスファターゼ溶液が販売されているビタミン強化ドリンクのアッセイの完全な変換のために用いられた。
【００４８】
各成分及び内標準物質の移動時間には妨害となるピークは認められなかった。また、酵素反応前（図６（Ｂ））では確認されたＦＭＮｓのピークが、酵素反応後（図６（Ｃ））には消失し、代わりにリボフラビンのピークが生成する様子が製剤試料溶液においても確認できた。
【００４９】
標準溶液及び試料溶液の安定性を確認したところ、遮光容器中で室温２５時間まではピーク面積の低下は見られず、安定性は確保できることを確かめた。
【００５０】
Ｓ／Ｎ＝３より求めた検出限界を表１に示す。表１に示すように、各成分定量濃度の５０〜１５０％の範囲の標準溶液で直線性を確認したところ、全ての成分についてほぼ原点を通り、かつ相関係数０．９９９以上の良好な直線が得られた。
【００５１】
プラセボ試料に，定量濃度の８０、１００、１２０％になるように各成分標準溶液を添加し（ｎ＝３）、回収率及び精度を確認した。その結果、表１に示すように、回収率は９９．３〜１０１．８％と良好な値が得られた。また、精度に関しても、０．１〜２．５％ＲＳＤであり良好な結果であるといえる。結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
0004097465.tif 000003
【００５３】
[実施例７：市販製剤の定量]
市販製剤の定量では、製剤２ｍＬを正確にとり、溶液の安定化のために没食子酸一水和物を最終濃度４μｇ／ｍＬとなるように加え、内標準溶液２ｍＬを正確に加え、トリスーグリシン緩衝液を加えて１０ｍＬとし、孔径０．４５μｍ水系メンブランフイルターでろ過し、ろ液を試料溶液とした。標準品（リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸アミド、及びカフェイン）のそれぞれ対応量を正確に量り、没食子酸一水和物を試料溶液と同様に加え、内標準溶液２ｍＬを正確に加え、トリスーグリシン緩衝液を加えて１０ｍＬとし、孔径０．４５μｍ水系メンブランフイルターでろ過し、ろ液を標準溶液とした。内標準溶液は塩酸フェニレフリン２０ｍｇを水に溶かし、１００ｍＬとしたものを用いた。
【００５４】
[比較例３：ＨＰＬＣによる製剤分析法.]
リン酸リボフラビンナトリウムは、大曽根らの方法（K. Ozone et al., Jpn. J. Toxicol. Environ. Health 41(1995)358)を基に小麦胚芽由来の酸ホスファターゼを用いてリボフラビンへの変換を行った後、ＨＰＬＣ分析を行った。その際塩酸ピリドキシン、ニコチン酸アミド及び無水カフェインの３成分も同時に定量した。硝酸チアミンは日本薬局方第１４改正の方法を基にＨＰＬＣ分析を行った。
【００５５】
実施例７では、市販製剤中の成分の定量をインキャピラリー酵素反応法で行った。これに対して、比較例３では、市販製剤中の成分の定量をＨＰＬＣ法で行い、両者を比較した。なお、ＨＰＬＣ法ではＦＭＮからリボフラビンへの変換は酸ホスファターゼを用いてオフラインで行い、その後ＨＰＬＣ分析を行った。その際硝酸チアミン以外の３成分も同時に分析した。硝酸チアミンは単独でＨＰＬＣにより分析した。その結果、いずれの成分の定量値も同等な値が得られ、インキャピラリー酵素反応法の妥当性を示した。一方精度の面ではＨＰＬＣ法に比較して若干の見劣りがする結果であった。結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
0004097465.tif 000004
【００５７】
【発明の効果】
本発明の第１の側面では、分析対象物がドリンク剤成分に限定されており、これにより、ドリンク剤成分を簡易に一斉定量分析することができる。分析対象物に複数のドリンク剤成分が含まれていても、容易に分離することができる。
【００５８】
本発明の第２の側面では、第１のサンドイッチ溶液及び第２のサンドイッチ溶液で、分析対象物、例えば、ドリンク剤成分及び酵素を挟むことにより、分析対象物と酵素との反応が促進される。泳動液に酵素反応を阻害する物質が含まれている場合には、第１のサンドイッチ溶液と、第２のサンドイッチ溶液とには、前記酵素反応を阻害する物質が含まれていないようにすることで、泳動液で酵素反応を阻害しないようにすることができる。ＨＰＬＣ法との比較においては精度の面で若干の見劣りがしたものの、操作の簡便さ、迅速性、市販装置の改造なく適用できるという汎用性の面で有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】  通常法のインキャピラリー酵素反応法の概略の断面図を示す。図１（Ａ）は、試料溶液１４を注入した直後の断面を示す。図１（Ｂ）は、更に酵素溶液１６を注入した直後の断面を示す。図１（Ｃ）は、酵素溶液１６が生成物１５より先行している状態の断面を示す。
【図２】  インキャピラリー酵素反応法における、基質と酵素の注入順序の影響を示すエレクトロフェログラムを示す。図２（Ａ）は、酵素溶液の代わりに、トリスーグリシン溶液が注入されている場合のエレクトロフェログラム、即ち、比較例２の結果を示す。図２（Ｂ）は、試料溶液を注入し、次いで、酵素溶液を注入した場合のエレクトロフェログラム、即ち、実施例１の結果を示す。図２（Ｃ）は、酵素溶液を注入し、次いで、試料溶液を注入した場合のエレクトロフェログラム、即ち、実施例２の結果を示す。
【図３】  サンドイッチ注入法のインキャピラリー酵素反応法の概略の断面図を示す。図３（Ａ）は、サンドイッチ溶液１１ａを注入した直後の断面図である。図３（Ｂ）は、試料溶液１４を注入した直後の断面図である。図３（Ｃ）は、更に酵素溶液１６を注入した直後の断面図である。図３（Ｄ）は、サンドイッチ溶液１１ｂを注入した直後の断面図である。図３（Ｅ）は、酵素溶液１６が生成物１５より先行している状態の断面図である。
【図４】  酵素、即ち、アルカリホスファターゼの注入量を変化させたときのインキャピラリー酵素反応法のエレクトロフェログラムを示す図である。図４（Ａ）は、通常法、実施例４の結果を示す図であり、図４（Ｂ）はサンドイッチ注入法、実施例３の結果を示す図である。
【図５】  通常法でインキャピラリー酵素反応法を行った実施例４と、サンドイッチ注入法でインキャピラリー酵素反応法を行った実施例３とに関し、リン酸リボフラビンナトリウムからリボフラビンへの変換率の比較を示すグラフである。
【図６】  販売されているビタミン強化ドリンクのアッセイの典型的なエレクトロフェログラムである。図６（Ａ）は標準溶液である。図６（Ｂ）は、サンプル溶液が、酵素溶液の代わりにトリス−グリシン緩衝液で処理されたサンドイッチ注入型インキャピラリー酵素反応法である。図６（Ｃ）は、サンドイッチ注入型インキャピラリー酵素反応法で酵素と処理されたサンプル溶液である。
【符号の説明】
１０・・・キャピラリー
１１ａ、１１ｂ・・・サンドイッチ溶液
１２・・・緩衝液
１４・・・試料溶液
１５・・・生成物
１６・・・酵素溶液
１８・・・反応ゾーン
１９・・・進行方向
【図１】
0004097465.tif 000005
【図２】
0004097465.tif 000006
【図３】
0004097465.tif 000007
【図４】
0004097465.tif 000008
【図５】
0004097465.tif 000009
【図６】
0004097465.tif 000010