(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
TAG-72と結合するネズミ抗体から得られるTAG-72と特異的に結合するヒト型化抗体またはTAG-72と特異的に結合するヒト型化抗体断片であってFab、Fab'、F(ab')2及びFvから選択されるものにおいて、該ヒト型化抗体が、
（１）配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６のいずれかに記載のアミノ酸配列又はATCC CRL-12209により発現されるヒト型化CC49抗体のヒト型化重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのNEWMに移植されたヒト型化重鎖領域、及び
（２）配列番号：９に記載のアミノ酸配列またはATCC CRL-12209により発現されるヒト型化CC49抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのREIに移植されたヒト型化軽鎖可変領域、
を有することを特徴とするヒト型化抗体またはヒト型化抗体断片。
【請求項２】
前記ヒト型化抗体がATCC CRL-12209により発現されるヒト型化CC49抗体と同一である、請求項１に記載のヒト型化抗体またはヒト型化抗体断片。
【請求項３】
前記ヒト型化抗体がATCC CRL-12209により発現される請求項２に記載のヒト型化抗体またはヒト型化抗体断片。
【請求項４】
前記ヒト型化抗体断片が、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６のいずれかに記載の少なくとも１つのNEWMに移植されたヒト型化重鎖可変配列又は少なくとも１つのREIに移植された配列番号：９に記載のヒト型化軽鎖可変配列を有するか、あるいは前記ヒト型化重鎖可変配列および前記ヒト型化軽鎖可変配列の両方を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒト型化抗体断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト型化抗体またはヒト型化抗体断片が発現され得ることを特徴とする核酸。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト型化抗体またはヒト型化抗体断片が発現され得ることを特徴とするベクター。
【請求項７】
前記ベクターが裸核酸セグメント、担体結合核酸セグメント、核タンパク質、プラスミド、ウイルス、ウイロイドまたは転位性遺伝因子である請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
癌のin vitro検出に適した組成物であって、診断的有効量の請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト型化抗体またはヒト型化抗体断片を含んで成ることを特徴とする組成物。
【請求項９】
前記ヒト型化抗体またはヒト型化抗体断片が、直接または間接的に、検出可能標識に会合または結合される請求項８に記載の組成物であって、癌の検出に適している組成物。
【請求項１０】
検出可能標識が放射性核種または酵素である請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
TAG-72発現性癌細胞のin vitro免疫検出方法であって、請求項８〜10のいずれか１項に記載の組成物を癌細胞に接触させることにより実施する方法。
【請求項１２】
組成物のヒト型化抗体またはヒト型化抗体断片が固体支持体に結合される請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
癌のin vitro検出のための、活性成分として請求項８〜10のいずれか１項に記載の組成物を、その使用のための使用説明書と一緒に含入することを特徴とする市販パッケージであって、組成物が前記使用前に再構築されるパッケージ。
【請求項１４】
癌のin vitro検出のための請求項８〜10のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
癌のin vitro検出のための請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト型化抗体またはヒト型化抗体断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、各種ヒト腫瘍細胞により発現されたヒト汎癌抗原である腫瘍関連糖蛋白であるTAG-72に特異的に結合するヒト型化モノクローナル抗体及びその断片又は誘導体である。より具体的には、本発明はマウスモノクローナル抗体CC49又はTAG-72に特異的に結合するその他のマウス抗体に由来するヒト型化モノクローナル抗体及びその断片又は誘導体である。本発明は更にこの様なTAG-72に特異的なヒト型化モノクローナル抗体、この様なヒト型化モノクローナル抗体を含む医薬用及び診断用組成体を製造する方法、並びに癌の治療又は診断へのその利用方法に関する。
【０００２】
発明の背景
腫瘍細胞により発現された抗原の同定、及びこの様な抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体の調製は当分野に公知である。抗腫瘍モノクローナル抗体は、治療薬及び診断薬としての応用の可能性を有している。この様なモノクローナル抗体は、それらが腫瘍抗原に特異的に結合し、それにより腫瘍細胞又は分析体中の腫瘍抗原の存在を検出できることから、診断薬として大きな可能性を有している。例えば、当分野では腫瘍抗原に結合するモノクローナル抗体は、これらモノクローナル抗体の標識体を利用したin vitro及びin vivo での腫瘍細胞又は腫瘍の画像化によく利用されている。
【０００３】
更に、腫瘍抗原に結合するモノクローナル抗体は治療薬としての応用も良く知られている。モノクローナル抗体そのもののを治療薬として、又はモノクローナル抗体が作用成分、例えば薬物、サイトカイン、細胞毒素等、に直接又は間接的に結合した標識体として利用することは良く知られている。
【０００４】
実質的には、モノクローナル抗体が作用成分に結合している場合、モノクローナル抗体は狙い付け成分として機能し、還元すればそれは所望の標的、例えばモノクローナル抗体が結合する抗原を発現している腫瘍に対し、所望する作用成分（典型的には治療活性を有する）を向けさせる。これに対し、モノクローナル抗体そのものが治療作用物質として機能する場合には、抗体は狙い付け成分、即ちそれが抗原を発現する細胞に特異的に結合し、更に治療活性を伝達する作用体の両方として機能し、典型的には腫瘍細胞を融解する。この様な作用体の機能−例えば抗体依存性細胞障害性（ADCC）及び補体依存型細傷害性（CDC ）等が含まれる−は、一般に文献中にFc部と呼ばれる抗体分子の一部により発揮されている。
【０００５】
各種モノクローナル抗体が開発されている特異的腫瘍抗原の１つは、腫瘍関連糖蛋白TAG-72である。TAG-72はLS174T腫瘍細胞株（米国標準組織コレクション（American Type Tissue Collection)(ATCC)番号CL188 ）、細胞株180 （ATCC番号CL187 ）の変異体、結腸腺癌株の様な各種ヒト腫瘍細胞の表面に発現している。様々な研究グループがTAG-72に対するモノクローナル抗体の生成を報告している。
【０００６】
例えばMuraroら、Cancer Res.,48:4588-4596(1988); Johnson ら、Cancer Res., 46:850-857(1986): Molinolo ら, Cancer Res., 50: 1291-1298 (1990); Thor ら、Cancer Res., 46:3118-3127(1986); Schlom らのEP 394277 （国立ガン研究所に譲渡）及びJeffrey Schlomらの米国特許第5,512,443 号を参照せよ。好適に利用可能なTAG-72に対する特異的抗体にはCC49(ATCC 番号HB9459）、CC83(ATCC 番号HB9453）、CC46(ATCC 番号HB9458）、CC92(ATCC 番号HB9454）、CC30(ATCC 番号HB9457）、CC11(ATCC 番号HB9455）及びCC15(ATCC 番号HB9460）がある。
【０００７】
その一例であるCD49はIgG1イソタイプのマウスモノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体は第一世代の抗体B72.3 を用いて精製されたTAG-72でマウスを免疫して調整された第２世代モノクローナル抗体である。Colcher ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78;3199-3203(1981) 。CC49はTAG-72に特異的に結合し、B72.3 より高い親和性を持つ。Murao ら、Cancer Res., 48:4588-1596(1988) 。このモノクローナル抗体はヒト結腸腺癌異種移植体に効果的に狙い付けし、良好な効率でこれら異種移植体の増殖を低下させると報告されている。Milinoloら、Cancer Res.,50:1291-1298(1996); Colcher ら、J.Natl.Cancer Inst., 82:1191-1197(1990) 。また、放射線標識されたCC49は、進行中の複数の臨床試験に於いて優れた腫瘍局在性を有していると報告されている。
【０００８】
しかし、マウス抗体はヒト用治療薬として応用性を持つものの、それらは幾つかの点で不利益を持っている。具体的にはヒトに於いてはマウス抗体は異種起源であることから、それらは免疫原性であろう。その結果中和抗体反応をもたらすが（ヒト抗マウス抗体（HAMA）反応）、抗体を繰り返し投与することを望まれる場合、例えば慢性あるいは再発性の疾患状況では特に問題である。さらに、それらはマウス定常ドメインを含むことから、ヒトへの作用機能は有さないだろう。
【０００９】
この様な問題を排除し又は軽減するために、キメラ抗体が開示されている。キメラ抗体は２種類、典型的には２つの異なる種の抗体の部分を含む。一般には、これら抗体はヒト定常領域と他種の可変領域、典型的にはマウスの可変領域を含む。例えば幾つかのマウス／ヒトキメラ抗体は、親マウスの結合特性、及びヒト定常に関連した作用機能を有すると報告されている。Cabililyらの米国特許第4,816,567 号、Shoemaker らの米国特許第4,978,745 号、Beavers らの特許第4,975,369 号及びBossらの米国特許第4,816,397 号を参照せよ。
【００１０】
一般に、これらキメラ抗体は既存のマウスハイブリドーマより抽出されたDNA からのゲノム遺伝子ライブラリーを調製し、構築される。Hishimura ら、Cancer Res.,47:999(1987)。次にライブラリーを正しい抗体断片再配置パターンを持つ重鎖及び軽鎖の両方に由来する可変領域についてスクリーニングする。あるいは、cDNAライブラリーをハイブリドーマより抽出されたRNA から調製、スクリーニングし、又はポリメラーゼチェインリアクションを用い可変領域を得る。次にクロン化された可変領域遺伝子を、クローン化された適当な重鎖又は軽鎖ヒト定常領域遺伝子のカッセトを含む発現ベクター内に接続した。
【００１１】
更に、TAG-72に特異的に結合するCC49及びCC83に由来するキメラマウス−ヒト抗体の製造が報告されている。本件に関しては、Mezes らのEPO0,965,997（The Dow Chemical Company）を参照せよ。この様なキメラCC49抗体の一つは、ATCC番号HB9884として寄託された細胞株により製造される(Budapest)。
【００１２】
更に、Morrisonらは複数の抗腫瘍キメラモノクローナル抗体の調製を、腫瘍学の重要な進展、組換え体キメラモノクローナル抗体（Important Advances in Oncology, Recombinat Chimeric Monoclonal Antibodies ）、pp.3-18 （S.A.Rosenberg 編集、1990）（J.B.Lippincott, Philadelphia）に報告している。転移性結腸直腸癌患者に於けるキメラcMAB-17-A を用いた臨床試験の結果は、この抗体がそれが由来した元のマウスモノクローナル抗体に比べ６倍長い循環時間を持ち、免疫原性を大きく低下させることを示している。Loguglloら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86-4420-4224（1989）：Meredithら、J.Nucl.Med., 32:1162-1168(1991) 。
【００１３】
しかし、この様なキメラモノクローナル抗体は典型的には免疫原性が低くいものの、それでもそれらが抗体反応を惹起する可能性を持つマウス可変配列を含むことから、ヒトに於いては潜在的に免疫原性を有している。即ち、これらキメラ抗体を患者に投与した場合に、これらが抗イディオタイプ反応を惹起する可能性がある。Saleh ら、Cancer Immunol. Immunother., 32:185-190(1990) 。
【００１４】
例えばcB72.3（γ4 ）を結腸直腸癌患者に投与すると、これら患者の62% が抗-V- 域反応を含むヒト抗マウス抗体（HAMA）反応を起こした。このことは、血清より排除される抗体が増え（Saleh ら、Cancer Immunol. Immunother., 32:180-190(1990))、また強いアレルギー反応が起こることもあることから（LoBuglioら、Hybridoma,Hybridoma,5:5117-5123(1986) ）、繰り返し行われる抗腫瘍抗体投与がHAMAにより無効になる可能性がり、不利益である。
【００１５】
数多くの臨床上有益な遺伝的変異体がMAbCC49 から開発されている。これらにはcCC49 、C H 2 ドメイン欠失cCC49 （Slavin-Chiorini ら、Int.J.Cancer,53:97-103（1993) ）及び短鎖Fv（sFv ）（Milenic ら、Cancer Res., 51:6365-6371(1991):Sawyerら、Protein Eng., 7:1401-1405(1994))が含まれる。これら分子はマウスやアカゲザルでは無傷のIgG に比べると迅速に血漿及び全身から排除されることから、患者でのHAMA反応は比較的低いだろう。Slavin-Chiorini ら、(1993 ）（上記）；Mulenic ら、(1991)（上記）。
【００１６】
更に、cCC49 由来の新規単鎖免疫グロブリン（SCIg）分子が報告されており、単一遺伝子構築対にコードされている。他のSCIg-IL-2 は遺伝的にSCIg△CH1 のFcRYO 域のカルボキシル末端に結合したヒトインターロイキン-2（IL-2）分子を持っている（Kashimirl ら、Oric.XVI Intl. Cancer Cong., 1:183-187-(1994))のに対し、この様な分子であるCC49sFv のSCIg△C H 1 はヒトγ1Fc 域に結合している（Shu ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7915-7999(1993) ）が、その。両SCIgs は  抗原結合及び抗体の細胞性細胞融解活性に関しcCC49 と同等である。SCIg-IL-2 のなかにもIL-2の生物学的活性は保持されている。
【００１７】
キメラ及びマウス抗体に関する免疫学上の危惧を軽減する手段として、”ヒト型化”抗体の作製も知られている。理想的には”ヒト型化”によって、本質的には元の分子の抗原結合特性を完全に保持し、ヒトに於いて非免疫的である抗体が得られる。元の抗体の抗原結合特性を全て保存するには、その結合部位の構造が”ヒト型化”版の中に真実再現されている必要がある。
【００１８】
これは、(a) 重要なヒトフレームワークの残基をの残し、あるいは残さずに非ヒトＣＤＲｓをヒトフレームワークに移す（Jones ら、Nature、321:522(1986) ：Verhoeyen ら、Science 、239:1539（1988）か；又は(b）非ヒト型可変ドメイン全体（リガンド結合特性を保存する）を移植すると同時に、露出した残基を賢く置換しそれらのヒト様表面で覆うことにより（抗原性を低下させる）（Padlan, Molec.Immunol.,28;489(1991))、非ヒト抗体の結合部位をヒトのフレームワーク上に移植することで達成できるだろう。
【００１９】
本質的には、CDR 移植によるヒト型化は、CDRsだけをヒト断片及び定常域に移植することを含む。理論的には、これにより実質的に免疫原性を排除する（アロタイプまたはイディオタイプの違いは存在するが）。Jones ら、Nature, 321:522-525(1986);Verhoeyeら、Science, 239: 1534-1536(1988):Riechmann ら、Nature, 332:323-327(1988) 。この様な技術は幾つかの例では有効であるが、CDR 移植が望む結果をもたらさないこともある。むしろ、抗原結合活性を保存するためには、元の抗体のフレームワークの一部の残基が必要であるだろう。Riechmann ら、Nature, 332:323-327(1988); Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86;10023-10029; Tepestら、Biol.Technology, 9:266-271(1991); Coら、Nature、321 ：501-502(1991）。
【００２０】
上記論じた様に、元の抗体の抗原結合特性を保存するためには、ヒト型化分子の中にその結合部位の構造が真に再現されなければならない。Ｘ線結晶学的研究より、幾つかの近隣のフレームワーク残基も抗原結合に関わることが判明しているが、一次的には抗体の結合部位はCDR 残基から構築されている。Amitら、Science,233:747-753 986); Clomanら、Nature、326:358-363(1987）；Sheriff ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84:8075-8079(1987); Padianら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:5938-5942(1989); Fischmannら、J.Biol.Chem, 266;12915-12920(1991); Tulip ら、J. Molec.Biol., 227:122-148(1992) 。CDR ループの構造は周囲のフレームワーク構造から強い影響を受けることが知られている。Chothia ら、J.Molec.Biol.,96:901-917(1987 ）；Chothia ら、Nature、342:877-883(1989）；Tramomontenoら、J.Molec.Biol.215：175-182 （1990）。
【００２１】
可変軽鎖（V L ）と可変重鎖（V H ) の相対的な配置には僅かではあるが明瞭な違いがあること(Colman ら、Nature, 326:358-363(1987))、そしてその差が明らかにドメイン間の接触に関与する残基の変異によること（Padlanら、Molec.Immunol., 31:169-217(1994)) が報告されている。
【００２２】
更に、側鎖容積の変化が関係する内部残基の変異の持つ効果を対象とした構造研究は、生じた局所的な変形に伴い側鎖の位置がシフトし、それが分子内部の遠位部分に伝達されることを示した。このことは、ヒト型化の最中に可変ドメイン内及びこれらドメイン間のインターフェイス内の内部残基が、又は少なくとも内部容積は維持されることを示している；異なる物理特性（例えば大きさ、電荷、又は疎水性等）を持つ残基で内部残基を置換すると、抗原結合部位の構造構想に大きな変化をもたらすだろう。
【００２３】
保存する必要のあるフレームワーク残基を特定する一つの方法はコンピューターモデリングである。あるいは、重要なフレームワーク残基は、既知抗体の結合部位こうぞうと比較することで特定できるかもしれない（Padlan. Molec. Immun.31(3):169-217(1994)) 。
【００２４】
抗原結合に影響を与える可能性のある残基は７つのグループに分類できる。第１のグループは、結合部位表面に配置され、従って抗原と直接接することができる残基を含む。これには、アミノ末端残基及びCDRsに隣接するものが含まれる。第２のグループにはCDRsまたは反対側の鎖に接することでCDR の構造または相対的な並びを変えることができる残基が含まれる。第３のグループは、可変ドメインの構造の保全性に影響する、埋没側鎖を持つアミノ酸を含む。通常、これらグループの残基は、採用した番号付けシステムによれば同一位置（前記）に見つかる。Kabat ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Pub.No.91-3242(5th ed., 1991)(U.S.Dept. Health & Human Services, Bethesda, MD) 及びジーンバンクを参照せよ。
【００２５】
しかし、ヒトに於ける免疫原性が低いと考えられることからヒト型化抗原が望まれる一方で、その作製は予想不可能である。例えば抗体の配列の修飾は抗原結合親和性の実質または全てを失わせ、あるいは結合特異性を失わせることがある。あるいは、”ヒト型化抗体”は、配列の修飾にも関わらずヒトに於いても免疫原性を保持するこもあるだろう。
換言すれば、所望の抗原に対する新規ヒト型化抗体に関しては、当分やに於いて強い需要がまだある。より具体的には、当分野に於いては、免疫治療薬及び免疫診断薬としての可能性より、TAG-72に特異的なヒト型化抗体に対する需要がある。
【００２６】
発明の目的
この目的に向け、本発明の目的はヒトTAG-72に特異的であるヒト型化抗体を提供することである。
より具体的には、本発明の目的はTAG-72に対するマウス抗体由来の、特にTAG-72に結合する特異的マウス抗体に由来するヒト型化抗体を提供することである。  さらに、本発明の目的は、TAG-72に特異的であるヒト型化抗体を含む医薬品組成体を提供することである。本発明のより具体的目的は、TAG-72に特異的に結合するマウス抗体のCC49に由来するヒト型化抗体を含む医薬品組成体を提供することである。
【００２７】
本発明の別の具体的目的は、TAG-72を発現している癌、特にヒト結腸癌の治療に適したTAG-72に対するヒト型化抗体を用いる方法を提供することである。
本発明の別の目的は、TAG-72に特異的に結合するヒト型化抗体を含む、癌細胞を検出するための免疫診断的組成体を提供することであり、好ましくは抗体が標識された又は未標識の形状にあるCC49に由来するものである。本発明の別の目的は、TAG-72に特異的に結合する、標識された又は未標識の形状にあるヒト型化抗体を含む組成体を用いた癌の免疫診断法を提供することである。
【００２８】
本発明の更に別の目的は、TAG-72に対するヒトか抗体またはその断片をコードする核酸配列を提供することである。本発明のより具体的な別の目的は、TAG-72に特異的に結合するマウス抗体であるCC49由来のヒト型化抗体をコードする核酸配列を提供することである。本発明の別の目的は、TAG-72に対するヒト型化抗体、特にTAG-72に特異的に結合するマウス抗体であるCC49に由来するヒト型化抗体を発現しているであろうベクターを提供することである。
【００２９】
発明の詳細な説明
発明を既述する前に、本開示に用いられる特定用語の定義を以下に記す：
抗体−本用語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ及び免疫グロブリンに属する（モノクローナル抗体が好ましい）に属する単鎖、２本鎖、及び多鎖蛋白及び糖蛋白を意味する；さらにこれら免疫グロブリンの合成あるいは遺伝子工学による変異種も含む。”抗体断片”にはFab 、Fab'、F(ab')2 及びFv断片、並びに所望標的の単一エピトープまたは複数エピトープに対し特異性を有する抗体のいずれかの部分が含まれる。
【００３０】
ヒト型化抗体−本用語は、元の抗体の抗原結合特性を保持又は実質保持しながら、ヒトに於ける免疫原性を持たない非ヒト抗体、典型的にはマウスに由来する抗体を意味する。これは(a) 非ヒトCDRsだけをヒトフレームワーク及び重要なフレームワーク残基を保持した、又は保持していない定常域上に移し、または(b) 非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基を置換しそれらをヒト様部分で”覆う”ことにより達成されるだろう。この様な方法は本発明の実施に有用であり、Jones ら,Morrison ら、Proc.NatL Acad.Sci.USA,81;6851-6855(1984); Morrison とOi、Adv.Immunol.,44:65-92(1988) ；Verhoeyeら、Science 、239:1534-1536(1988）；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3):160-217(1994) に開示された方法を含む。
【００３１】
相補性決定領域又はCDR −ここで使用するCDR という用語は、Kabat ら(1991)により描かれた天然の免疫グロブリン結合部位の天然Fv域の結合親和性及び特異性を共に規定するアミノ酸配列を意味する。
フレームワーク領域−FRという用語は、CDRs間に組み込まれたアミノ酸配列を意味する。抗体のこれら部分は抗原結合に適した方向にCDRsを固定するのに機能する。本発明の抗体及び抗体断片では、そのFRs のアミノ酸配列が完全にヒト天然型を維持しているか、あるいはその結合親和性及び／又は結合特異性を維持又は増加するのに必要なアミノ酸配列への特定修飾を含むかに関わらず、軽鎖可変域のフレームワーク領域はヒトラムダ軽鎖FRs 及びヒトカッパサブグループＩ、II及びIII 軽鎖FRs を含むグループより選択される。
【００３２】
定常域−エフェクター機能を含む抗体分子の部分。本発明では、マウス定常域はヒト定常域で置換される。対象となるキメラまたはヒト型化抗体の定常域はヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖定常域は５つのイソタイプのいずれかより選択できる；アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマまたはミューである。更に、各種サブクラスの重鎖（重鎖のIgG サブクラスの様な）は異なるエフェクター機能を担当しており、従って所望の重鎖定常域を選択することで、所望のエフェクター機能を持つキメラ抗体を産することができる。
好ましい定常域はガンマ１（IgG1）、ガンマ３(IgG3 ）及びガンマ４（IgG4）である。より好ましいものはガンマ１(IgG1 ）イソタイプの定常域である。軽鎖定常域はカッパまたはラムダ型であり、好ましくはカッパ型である。
【００３３】
キメラ抗体−これは２種類の抗体、典型的には異なる種の抗体に由来する配列を含む抗体である。最も典型的なキメラ抗体は、ヒト及びマウス抗体断片を含む、一般にはヒト定常域とマウス可変域を含む。
ほ乳動物−その子供に乳腺から分泌される乳により栄養を提供する動物で、好ましくは温血動物、さらに好ましくはヒトである。
免疫原性−レシピエントに投与された時に免疫反応（ヒトまたは細胞）を惹起する標的化蛋白または治療成分の能力。本発明は主題のヒト型化抗体またはその断片の免疫原性に関係する。
低免疫原性ヒト型化抗体−本用語は親抗体に比し低い免疫原性を有するヒト型化抗体を意味する。
【００３４】
親抗体の結合特性を実質保持するヒト型化抗体−本用語は、そのヒト型化抗体の製造に利用される親抗体により認識される抗原に、特異的に結合できる能力を保持したヒト型化抗体を意味する。好ましくは、ヒト型化抗体は親抗体、例えばCC49と同一または実質同一の抗原結合親和性及び結合力を持つヒト型化抗体である。好ましくは、抗体の親和性は少なくとも親抗体の約10％である。より好ましくは、親和性は少なくとも約25％、即ち親抗体の親和性に比べ２倍以下である。最も好ましくは、親和性は少なくとも親抗体の約50％である。抗原結合親和性のアッセイ方法は当分野既知であり、半最大結合アッセイ法、競合アッセイ法、スキャッチャード分析を含む。好適な抗原結合アッセイ法は本明細書に既述される。
【００３５】
最も広範な実施態様では、本発明は各種ヒトの癌、特にヒト結腸癌に発現している汎癌抗原であるTAG-72に特異的に結合するヒト型化抗体を目的としている。これらヒト型化抗体は、TAG-72に対する良好な結合親和性を有する抗体に由来することが好ましい；B72.3(Thorら,Cancer Res., 46:31 18-3127'1986); Johnsonら, Cancer Res., 46:850-857(1986)), ATCC番号HB18108 として寄託；CC49(ATCC 番号HB9459）、CC83(ATCC 番号HB9453）、CC46(ATCC 番号HB9458）、CC92(ATCC 番号HB9454）、CC30(ATCC 番号HB9457）、CC11(ATCC 番号HB9455）及びCC15(ATCC 番号HB9460）；又はそのキメラ（Mezes ら、The Dow Chemical CompanyのEPO0,465,997を参照）。
【００３６】
最も好ましくは、この様なヒト型化抗体はヒト結腸癌異種移植体を効果的に標的化し、良好な効率で異種移植体の増殖を減じることが報告されているCC49に由来する。Molinoloら、Cancer Res., 50;1291-1298(1980); Colcherら、J.Natl.Cancer Inst.,82:1191-1197(1990)。
上記の如く、ヒト型化抗体はマウス及びキメラ抗体に比べ優位性、例えばヒトでの免疫原性の低下、を発揮する。これは、この様なヒト型化抗体をin vivo に投与した場合、例えば癌治療またはガン診断、例えば腫瘍イメージングした時にHAMA反応の惹起を減じ、そして排除も可能なことから有益である。
【００３７】
しかし、既述の如く、ヒト型化は一部の例においては抗原結合に悪影響を及ぼす。好ましくは、本発明のTAG-72に特異的に結合するヒト型化抗体は、親のマウス抗体、例えばB72.3 、CC49、CC46、CC30、CC11、CC15、C83 又はその他の親抗体の持つTAG-72抗原結合親和性の少なくとも約10％、より好ましくは少なくとも約25％、そして最も好ましくは少なくとも約50％を有するだろう。最も好ましくは、本発明のTAG-72に特異的に結合するヒト型化抗体は、CC49又はキメラCC49抗体のTAG-72抗原結合親和性の少なくとも約10％、より好ましくは少なくとも約25％、そして最も好ましくは少なくとも約50％を有するだろう。
【００３８】
好ましくは、本発明のヒト型化抗体はCC49と同一のエピトープに結合するだろう。この様な抗体は、TAG-72またはTAG-72発現癌細胞に対するCC49の結合と競合するそれらの能力に基づき同定できる。
一般に、問題のヒト型化抗体は、TAG-72に結合する抗体、好ましくはCC49の可変重鎖及び可変軽鎖配列をコードする核酸配列を得て、該可変重鎖及び可変軽鎖配列中のCDRsを特定し、このCDR 核酸配列をヒトフレームワーク核酸配列に移すことで作製される。
【００３９】
好ましくは、選択されたヒトフレームワークは、in vivo 投与に好適である、即ち免疫原性を持たないと予想されるものである。これは、例えばこれら抗体のin  vivo利用による予備実験、及びアミノ酸配列の類似性に関する研究から決定できる。後者の方法では、ヒト型化される抗体、例えばCC49のフレームワーク域のアミノ酸配列を既知ヒトフレームワーク域と比較し、CDR 移植に用いられるヒトフレームワークは、親抗体、例えばTAG-72と結合するマウス抗体のフレームワークに最も似た配列と大きさを持つものから選択される。様々なヒトフレームワーク域が分離されており、その配列は文献中に報告されている。
【００４０】
Kabat ら（上記）参照。これにより、親抗体（例えばマウス）のCDR が選択されたヒトフレームワーク上に移植されたCDR 移植”ヒト型化”抗体は、親抗体の結合構造、従って結合親和性も有意に保持することになるだろう。この様な研究の結果として、REI 及びNEWN抗体のFRs は、CC49のCDRsに有意な程度の抗原結合親和性を保持させると考えられるアミノ酸配列を持つことが特定された。既述の如く、好ましくは選択されたヒトフレームワーク域は、in vivo 投与に好適であり、即ち免疫原性がないことが期待されるものである。そのアミノ酸配列によれば、REI 及びNEWMヒトフレームワーク域は実質的に非免疫原性であると推測される。
【００４１】
免疫グロブリンをコードする核酸配列をクローニングする方法は当分野公知である。幾つかの方法は一般に、クローン化する免疫グロブリン配列を、適当なプライマーを用い、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）により増幅することを含む。免疫グロブリンの核酸配列、特にマウス可変重鎖及び可変軽鎖の配列の増幅に好適なプライマーは文献に報告されている。これら免疫グロブリン配列をクローン化した後、それらについて当分野公知の方法により配列決定する。これは可変重鎖及び可変軽鎖配列、さらに具体的にはCDRs及びFRs の構築するその部分を特定するのに役立だろう。これは既知方法により実施できる。
【００４２】
ヒト型化されるクローン化抗体配列のCDRs及びFRs を特定した後、CDRsをコードするアミノ酸配列を特定し（核酸配列及び遺伝子コードから演繹し、従来の抗体配列との比較により）、対応する核酸配列を選択したヒトFR1 に移植する。これは適当なプライマーとリンカーを用い実施できるだろう。所望する核酸配列の結合に好適なプライマー及びリンカーの選択方法は通常技術の範囲であり、Bossらの米国特許第4,816,397 号及びWinterらの米国特許第5,225,539 号に開示されている。
【００４３】
CDRsを選択されたヒトFRs 上に移植された後、次に得られた”ヒト型化”可変重鎖及び重鎖軽鎖配列を発現し、TAG-72に結合するヒト型化Fvまたはヒト型化抗体を産生する。典型的には、ヒト型化可変重及び可変軽配列をヒト定常ドメイン配列との融合蛋白として発現され、その結果TAG-72と結合する無傷の抗体が得られる。しかし、可変重及び軽配列は定常配列の無い状態でも発現でき、TAG-72と結合するヒト型化Fvを産することができることから、これは必要ない。
【００４４】
しかし、得られるTAG-72に結合するヒト型化抗体が補体依存性細胞傷害性（CDC ）及び抗原依存性細胞傷害性（ADCC）といったヒトエフェクター機能を持つことから、ヒト定常配列をヒト型化可変域に融合することが強く望まれる。本発明のヒト型化抗-TAG-72 抗体は更にHAMA反応のリスクを大きく下げるという別の利点によってもこれらエフェクター機能活性を支持できる。
【００４５】
既知配列の一部をコードするDNA を合成する方法は当分野公知である。これら方法を用いて、主題のヒト型化V L 及びV H 配列をコードするDNA 配列が合成され、次に組換え抗体の発現に好適なベクターシステムにて発現される。これは、ヒト定常ドメイン配列との融合蛋白として発現され、機能的（抗原結合性）抗体の産生に関係するヒト型化V L 及びV H 配列に関し提供される何れかのベクターにて実施されるだろう。組換え抗体、特にヒト型化抗体の発現に好適な発現ベクター及び宿主細胞は当分野公知である。
【００４６】
以下の参照は、本発明の実施に利用可能な組換え免疫グロブリンの発現に好適は代表的方法及びベクターである。Weidleら,Gene,51:21-29(1987); Doral ら, J.Immunol., 13(12):4232-4241(1987); De Waeleら, Eur.J. Biochem., 176:287-295(1988); Colcher ら,Cancer Res., 49:1738-1745(1989); Woodら、J.Immunol.,145(a):3011-3016(1990):Bulensら, Eur.J.Bioche,., 195:235-242(1991);Beggingtonら, Biol.Technology, 10:169(1992): King ら, Biochem.J. 281:317-323(1992); Pageら, Biol.Technology, 9:64(1991); King ら, Biochem. J., 290:723-729(1993); Chaudaryら, Nature 329:394-397(1989);
【００４７】
Jones ら, Nature, 321:522-525(1986); MorisonとOi,Adv.Immunol.44;65-92(19889; Benhar ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:12051-12055(1994); Singer ら, J.Immunol., 150;2844-2857(1993); Cootoら, Hybridoma, 13(3):214-219(1994); Queen ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86;10029-10033(1989):Caronら, Cancer Res.,32:6761-6767(1992); Cotomaら、J.Immunol.Meth., 152:89-109(1992) 。ベクターは、例えば裸の核酸断片、担体に結合した核酸断片、核蛋白、プラスミド、ウイルス、ビロイド又はトランスポーザブルエレメントである。
【００４８】
機能的免疫グロブリンを発現できることが知られている宿主細胞には、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO ）細胞の様な哺乳動物細胞；COS 細胞、NSO 及びSP2/0 細胞の様なミエローマ細胞；大腸菌の様な細菌；サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の様な酵母細胞；及びその他宿主細胞が含まれる。その内CHO 細胞は多くの研究者に、免疫グロブリンを効果的は発現し分泌する能力を与えるために利用されている。NSO 細胞は本発明に於いて利用される宿主細胞の好適なタイプの一つである。
【００４９】
実質的には、ヒト型化抗体の組換え体発現は、２つの一般的方法により実施される。第１の方法では、選択された定常域と随意融合し重及び軽可変配列の両方を発現するために提供される単一のベクターに宿主細胞はトランスフェクトされる。第２の方法では、宿主細胞はそれぞれが異なる可変鎖（即ち可変重鎖又は可変軽鎖）をコードする２種類のベクターにトランスフェクトされる；各可変鎖をコードするベクターは選択された定常域に融合された可変鎖域の発現に随意共される。
【００５０】
ヒト定常ドメイン配列は当分野公知であり、文献に報告されている。好適なヒト定常配列にはカッパ及びラムダ定常軽鎖配列を含む。好適なヒト重定常配列は、ヒトガンマ１、ヒトガンマ２、ヒトガンマ３、ヒトガンマ４、及び変化した効果、または機能、例えばin vivo 半減期が延長された、あるいはFcレセプター結合が低下した変異体を含む。
【００５１】
発現後、得られたヒト型化抗体の抗原結合親和性は既知方法、例えばスキャッチャード分析によりアッセイされる。特に好適な実施態様では、ヒト型化された抗体の抗原結合親和性は親抗体、例えばCC49の少なくとも25％、即ち未変性またはキメラCC49の２倍以下である。最も好ましくは、ヒト型化抗体の親和性は親抗体、例えばCC49の少なくとも約50％である。
【００５２】
幾つかの例では、CDRsを（TAG-72に結合する抗体より）選択したヒトフレームワーク域上に移植し作られたヒト型化抗体は、TAG-72に対する所望の親和性を有するヒト型化抗体を提供するだろう。しかし、抗原結合を促進するためには、選択されたヒトフレームワークの特定の残基をさらに修飾することが必要、あるいは望ましいだろう。これは、幾つかのフレームワーク残基は抗原結合に必須であり、または少なくとも影響すると信じられているからである。好ましくは、結合部位構造を維持し、又は影響する親（例えばマウス）抗体のフレームワーク残基は保持されるだろう。
【００５３】
これら残基は親抗体またはFab 断片のＸ線結晶図より特定でき、これにより抗原結合部位の立体構造が特定できる。又、抗原結合に関与するフレームワーク残基は、従来報告のヒト型化マウス抗体配列に基づき特性することもできるだろる。換言すればこれは、これらフレームワーク残基又はTAG-72結合を最適化する親マウス抗体由来の他の残基を保持する上で有益である。好ましくは、この様な方法は得られたヒト型化抗体に”ヒト様”特性を付与し、その結果抗原結合に影響する内部の接触残基を保持しながらも免疫原性を低くする。
【００５４】
本発明はさらに上記ヒト型化抗体及び抗体断片に実質相同である変異体または等価物を包含する。これらには、例えば保存的置換変異体、即ち同様のアミノ酸による１またはそれ以上のアミノ酸の置換が含まれるだろう。例えば、保存的置換とは、同一の分類内の別のアミノ酸によりアミノ酸が置換されることであり、例えば、ある酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸に、ある塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸に、ある中性アミノ酸が別の中性アミノ酸に置換されることを意味する。保存的アミノ酸置換により意図されることは当分野公知である。
【００５５】
”実質的に相同”という句は、対象となる（オリゴ−またはポリ−ペプチド、または蛋白質の）アミノ酸配列が、関連する参照アミノ酸配列に類似している場合に用いられる。この句は、対象配列と参照配列を”アラインメント（並び揃え）”した場合、即ち対象及び／又は参照配列中に挿入される”ヌル”塩基の数が最小に、そして両配列間で一致する塩基数の数が最大になるようにした時、これら対象配列と参照配列の間に少なくとも約75% 一致することとして−即ち、平行して同一アミノ酸残基が並べられた状態−定義される。”ヌル”塩基とは対象及び参照配列の一部ではなく；また対象配列中に挿入された”ヌル”塩基の最小数は参照配列中い挿入された最小数とはことなるだろう。
【００５６】
この定義では、参照配列は両アミノ酸配列がαTAG-72抗体又はαTAG-72結合親和性を持つ抗体断片のいずれかである蛋白または蛋白の一部になった場合に対象配列と”関連する”配列であると考えられる。これらαTAG-72抗体または抗体断片を含む各蛋白は独立した抗体または抗体断片、あるいは高−または多−機能蛋白質、例えば融合蛋白質、二重及び多重特異性抗体、単鎖抗体等の様なものである。
本発明は更に、発現されるであろうこれらヒト型化抗体からの核酸配列及び形質転換宿主細胞内でのこれらヒト型化抗体の産生に共される発現ベクターを目的としている。
【００５７】
好適実施態様では、これらヒト型化抗体及び対応する核酸配列はCC49に由来する。最も好適には、ヒト型化重鎖は図１または３記載のアミノ酸配列を有し、ヒト型化軽鎖は図２または４記載のアミノ酸配列を有する。しかし、論じたように本発明は更に、これらヒト型化可変重鎖及び軽鎖配列のその他の修飾体、例えばさらに１またはそれ以上の保存的アミノ酸置換を含む配列、又は抗原結合に影響する（促進する）１またはそれ以上の追加のマウスフレームワーク残基を保持する配列にあって、これら図に既に示した配列の変化体あるいは補足体であるものも含む。
【００５８】
主題のヒト型化抗体は特異的にTAG-72、様々な種類の型の癌細胞（例えば結腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌）に発現された汎癌抗原と結合し、さらにそれらはヒトに於いて有意に非免疫原性であることが期待されることから、TAG-72発現を特徴とする癌の治療または予防に関する治療薬として、または診断薬として好適であり、例えば腫瘍イメージング又は放射線ガイド手術システムに利用に有益であろう。Hinkleら、Antibody, Immunoconjugates and Radiophrmaceuticals, 4(3):339-358(1991)参照。当業者は、一連の実験により、癌治療を目的とした場合の抗体の有効かつ無毒量を決定できるだろう。しかし、一般には有効投与量は約0.05ないし100mg/kg体重/ 日である。
【００５９】
本発明の抗体は、前記治療方法に従い、その治療、予防または診断効果を上げるに十分な量が哺乳動物に投与されるだろう。この様な本発明の抗体は、懸濁液、注射液、あるいはその他の形状に整形する既知技術を用いて発明の抗体を通常の医薬品に受け入れ可能な担体または賦形剤、希釈体、及び／または添加物と組み合わせることで調整された通常の投与形態としてこれら哺乳動物に投与することができる。組み合わされる活性成分の量、投与経路、及びその他公知変数により医薬品として受け入れ可能な担体または希釈体の形状と特性が指定されることは、当業者により認識されるだろう。
【００６０】
医薬品として受け入れ可能な処方体には、例えば好適な溶媒、必要な場合にはベンジルアルコールの様な保存剤、及び緩衝剤が含まれる。有効な溶媒には、例えば水、水性アルコール、グリコール、及びリン酸とカルボン酸エステルが含まれる。これら水溶液は有機溶媒を容積として50％以上含まない。懸濁液タイプの処方体は、担体として例えば水性ポリビニルピロリドン、植物油の様な不活性油、高度に精製された鉱物油又は水性カルボキシメチルセルロースの様な水性セルロースエーテルの様な担体を懸濁溶媒として含むだろう。その中には、ゼラチンまたはアルギニンの様な増量剤も存在し、１またはそれ以上の天然あるいは合成界面活性剤、あるいは消泡在も用いられ、ソルビトールまたはその他の糖の様な１またはそれ以上の懸濁剤も使用されるだろう。それら処方体は１またはそれ以上のアジュバントを含むだろう。
【００６１】
本発明の抗体（またはその断片）の投与経路は口腔、非腸管であり、吸引または局所による。ここで使用される非腸管という用語は静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣、または腹膜内投与を含む。非腸管投与では皮下、静脈内及び筋肉内が一般に好ましい。本発明のヒト型化抗体を予防的または治療的に用いる日々の非腸管及び経口投与処方量は、一般に0.005 ないし100 、好ましくは0.5 ないし10mg/kg 体重/ 日の範囲である。
【００６２】
発明の抗体は更に吸引によっても投与できるだろう。”吸引”とは鼻腔及び経口吸引投与を意味する。エアゾール処方、または定量吸引器の様な、投与に適した投与形態は通常の技術により調製される。使用される本発明の化合物の好適投与量は一般には約0.1 ないし1000mgであり、好ましくは10ないし100mg/kg体重である。
【００６３】
本発明の抗体は局所的にも投与される。局所投与とは非全身投与を意味する。これには発明のヒト型化抗体（またはヒト型化抗体断片）処方体の皮膚外面、あるいは口腔内への投与、及び抗体の耳、眼、あるいは鼻内への滴下、及び殆ど血流内に侵入しないその他の投与方法が含まれる。全身投与とは、経口、静脈内、腹腔内、皮下及び筋肉内投与を意味する。治療、予防又は診断効果に必要とされる抗体量は当然選択された抗体、処置主題の病気の性質と重症度、治療を受ける動物、により異なり、そして最終的には医師の決定により決まる。本発明の抗体の好適な局所適用量は一般には約１ないし100mg/kg体重/ 日の範囲である。
【００６４】
製剤化
抗体及びその断片に関しては単独での投与も可能であるが、医薬品処方体として存在することが好ましい。活性成分は、局所投与の場合0.001 ％ないし10％w/w 、例えば処方体重量で1%ないし2%含まれ、10%w.wを越え含むことも可能であるが、好ましくは5%w/w を越えず、より好ましくは処方体の0.1%ないし1%w/w である。本発明の局所処方体は、１またはそれ以上のそれに受け入れ可能な担体及び適宜その他の治療成分を併せて活性成分を含む。担体は、処方体中の他の成分と適合し、レシピエントに対し有害でないと言う意味で”受け入れ可能”でなければならない。
【００６５】
局所投与に好適な処方には、塗布剤、ローション、クリーム、オイントメント、又は軟膏の様な治療を必要とする部位への皮膚を通した到達に好適な液体または半液体調製体、及び眼、耳又は鼻への投与に適した滴下剤が含まれる。本発明による滴下剤は無菌水性液、あるいは油性液、又は懸濁液を含み、そして活性成分を殺菌及び／又は抗真菌剤及び／又はその他好適保存剤の好適水性液に溶解し、好ましくは界面活性剤を加えて調製される。次に得られた液体を濾過により清浄及び滅菌し、無菌技術により容器に移す。滴下剤に好適な殺菌剤及び抗真菌剤の例は硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（0.002%）、塩化ベンズアルコニウム（0.01% ）及び酢酸クロルヘキシジン（0.01% ）である。油性液の調製に好適な溶媒にはグリセロール、希釈アルコール及びプロピレングリコールが含まれる。
【００６６】
本発明のローションは、皮膚又は眼への適用に好適なものが含まれる。眼用ローションは適宜殺菌剤を含む無菌水性液を含み、滴下液の調製と同様の方法により調製されるだろう。皮膚に適用されるローション又は塗布剤は、アルコールまたはアセトンのような乾燥が迅速で皮膚を冷やす作用物質、及び／又はグリセロールの様な湿潤剤、またはカストールオイル又はオラキスオイルの様な油を含む。
【００６７】
本発明によるクリーム、オイントメントは外面適用に適した活性成分の半固形処方体である。これらは、細かに分断された、または粉末体の活性成分を単独、または液体あるいは水性又は非水性懸濁液の中にて、好適な機械を利用してグリースまたは非グリース基剤と共に混合して作られる。基剤は硬、軟、あるいは液状パラフィン、グリセロール、蜜蝋、金属石けん、ムチン質の様な炭水化物、アーモンド、トウモロコシ、落花生、カストール、またはオリーブオイルの様な天然起源の油；綿脂、またはその誘導体、又はステアリン酸あるいはプロピレングリコールまたはの様なアルコールと一緒になったオレイン酸の様な脂肪酸、又はマクロゲルを含むだろう。
【００６８】
処方は、ソルビタンエステル又はそのポリオキシエチレン誘導体の様なアニオン性、カチオン性、あるいは非イオン性界面活性剤を含むだろう。天然ゴム、セルロース誘導体、シリカ含有シリカの様な無機物質、及びラノリンの様なその他添加物も含むだろう。
本発明のキットは、凍結乾燥されたヒト型化抗体又はヒト型化抗体断片を含み、それぞれ融解により（適宜別の希釈体を加える）又は液性賦形剤（好適には緩衝された）中に懸濁されて再調製される。キットは更にヒト型化抗体又はヒト型化抗体断片を混合し投与に好適な処方体を生成するのに適した緩衝液及び／又は賦形剤
【００６９】
（液体又は凍結された）、−又は水にて再調整される緩衝液及び／又は賦形剤粉末−も含む。即ち、好ましくはキット含有のヒト型化抗体又はヒト型化抗体断片は、前もって定められた熱、水、又はキット内に提供された液体の添加により、癌の治療又は診断に関するin vivo 又はin vitroでの利用に効果的である十分な濃度とpHの処方体が生ずる様な濃度で凍結され、凍結乾燥され、前希釈され、又は前混合されている。好ましくは、更にこれらキットはヒト型化抗体又はヒト型化抗体断片組成体の再調整、及び癌の治療又は検出への利用に関する説明書も含む。
【００７０】
キットは更に活性組成体を再調整する為の２又はそれ以上のコンポーネント部品も含むだろう。例えば、第２コンポーネント部品は−ヒト型化抗体又はヒト型化抗体断片に加えて−２官能価キレートをであり、２官能価キレート又は核種の様な治療成分はヒト型化抗体又はヒト型化抗体断片と混合することでそれらと結合体を形成する。上記緩衝液、賦形剤、及びその他のコンポーネント部品は別々またはキットと共に販売できる。
【００７１】
本発明のヒト型化抗体又はヒト型化抗体断片の個別投与量の最適量及び範囲は、治療対象の病気の性質と程度、投与の形状、経路、部位、及び特に治療を受ける動物により決定されること、そしてこれら最適条件は通常の技術により決定できることが当業者により認識されるだろう。更に、治療の最適方法、即ち所定日数に於ける１日当たりの発明の抗体又は抗体断片の投与回数は、通常の一連の治療決定試験を利用して当業者により確認できることも、当業者は認識するだろう。
【００７２】
主題のヒト型化抗体はその他の抗癌剤、例えば他の抗生物質または薬物と組み合わせて投与することもできるだろう。更に、主題のヒト型化抗体又は断片は直接又は関節に治療活性を持つエフェクターに結合することもできるだろう。好適なエフェクター成分には、例えばサイトカイン（IL-2、TNF 、インターフェロン、コロニー刺激因子、IL-1等）、細胞毒素（シュードモナス内毒素、リシン、アブリン等）、90Ｙ、131 Ｉ、99m Ｔｃ、111 Ｉｎ、125 Ｉ等の様な核種、薬物（メソトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン等）、免疫変調剤、治療酵素（例えばベータガラクトシダーゼ）、抗増殖剤等が含まれる。所望するエフェクターへの抗体の結合は公知である。Cheng らの米国特許第5,435,990 号を参照せよ。更に、これら結合を促進する２官能価リンカーも既知であり、広く入手できる。また。核種の結合に適したキレーター（キラント及びキレート）も公知であり、入手可能である。
【００７３】
あるいは、ATG-72に対する主題のヒト型化抗体又は断片はin vivo 及びin vitroの両方で免疫診断薬として利用できるだろう。特に好ましい利用は、TAG-72を発現している癌細胞傷害をin vivo 画像化するためのものである。主題の抗体は有意なHAMAまたはアレルギー反応を惹起しないことから、好適である。即ち、これらは繰り返し使用し、患者の病気状態をモニターすることに利用できるだろう。
【００７４】
上記の如く、主題のヒト型化抗体又はその断片のその他の好適応用は放射線ガイドシステム（Radioimmunoguided System) である。RIGSとしても知られているこの技術は、放射線標識されたモノクローナル抗体又はその断片を手術前に静脈投与することを含む。腫瘍に放射活性を取り込ませ、血液から放射活性を排出させた後、患者を手術室にはこび、携帯型のガンマ活性プローブ、例えばNecprobe1000を使用して手術的検査を行う。これは外科医による腫瘍の転移特定を支援し、切除の合併症を改善する。
【００７５】
RIGSシステムは目視検査及び／又は触診では発見できない腫瘍も発見できることから有益である。O'Dwyer ら、Arch.Surt.,121;1391-1394(1986)参照。この技術はHinkleら、Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmacouticals, 4:(3)339-358(1991) に詳細記されている（本技術を記載する数多くの参照を引用している）。この参考資料は更にCC49モノクローナル抗体そのものを用いた本技術の利用も開示している。本技術は特に結腸、乳房、膵臓及び卵巣の癌に有用である。
【００７６】
主題のヒト型化抗体又はそのヒト型化抗体断片は、in vivo 投与に好適な核種、例えば131 Ｉや125 Ｉの様なヨード放射性核種にて放射線標識される；111 Ｉｎ及び99m Ｔｃも好適な放射性標識である。
主題のヒト型化抗体は単独、又は他の抗体と組み合わせ利用できる。又、主題のヒト型化抗体は診断上効果的な組成体の形状にて調製される。一般に、これは診断状受け入れ可能な担体及び賦形剤、及び検出用に提供される標識体を含む。好適な標識体には診断的な放射性核種、酵素等が含まれる。腫瘍イメージングに適した抗体利用の方法は当分野公知である。
【００７７】
さらになる説明なしに、当業者はこれまでの記述を利用して本発明を完全に利用できると信じられる。本発明は、本発明を純粋に例示する事を目的とし、従って本発明の範囲の単なる例示であり、何れの場合も本発明の範囲を限定するものでない以下の実施例を考慮することで更に明瞭になるだろう。
【００７８】
実施例
材料と方法
ＤＮＡ鋳型調製
組換え作業はすべて、プラスミドM13 ベクター中のＤＮＡ配列で実施した。初期ヒト型化CC49VHを産生するためのNEWM枠組み構造領域の供給源は、図１３に示したヌクレオチド配列を有するＤＮＡセグメントを−M13 BamHI およびHindIII 部位間に−保有するM13 構築物であった。初期ヒト型化CC49VLを産生するためのREI 枠組み構造領域の供給源は、図２のREI アミノ酸配列をコードするＤＮＡＤＮＡセグメントを−M13 BamHI およびHindIII 部位間に−保有するM13 構築物であった。
【００７９】
重複延長手法を用いて所定のＤＮＡ配列中に突然変異を導入する場合には、二本鎖化M13 ＤＮＡを利用した。これに対比して、延長結紮手法を用いる場合には、２本のＤＮＡ鎖の１本のみとアニーリングするようオリゴヌクレオチドを設計した。この後者の手法では、M13 ＤＮＡを先ず処理してＤＮＡ中のすべてのチミジン塩基をウリジンに置換して、ウリジニル化ＤＮＡを産生した。これは、以下の成分：
【００８０】
1 μL のM13 プラスミドＤＮＡ
4mL のＬＢブロス
40μL のコンピテントRZ1032細胞
を組合せることにより、ｄＵＴＰアーゼおよびウラシルグリコシラーゼを欠くコンピテント細胞、普通はRZ1032細胞（Hercules,CA のBio-Rad から入手可能なCJ236 細胞による方法も適している）中にM13 プラスミドＤＮＡをトランスフェクトすることにより成し遂げた。
【００８１】
培養を37℃で5 時間振盪し、その結果生じた一本鎖化プラスミドＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を単離し、50μL のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中に溶解した。次に、以下の：
1 μL のウリジニル化ｓｓＤＮＡ
1 μL の10ｘグリコシラーゼ緩衝液
1Uのウラシルグリコシラーゼ（Gibco BRL, Gathersburg, MD）
40μL の25mMＭｇＣｌ2
と一緒に混合することにより、ウラシルグリコシラーゼでＤＮＡを処理した。
【００８２】
この混合物を次に、37℃で1 時間インキュベートした後、6.6 μL の25mMＭｇＣｌ2 および9.9 μL の1MＮａＯＨを付加した。次に混合物を37℃で5 分間さらにインキュベートした後、16.5μL の0.6MＨＣｌを付加して、混合物を中和した。次にＤＮＡをエタノール沈降させて、水中に溶解した。
【００８３】
M13 オリゴヌクレオチドプライマー
下記に例示したヒト型化CC49 VH およびVLの製造方法を通じて、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
0004080692.tif 000002
これらのプライマーは、（NEWMまたはREI ）標的枠組み構造配列と、M13 のBamH I部位−Hind III部位セクションとの両方に無関係なプラスミドM13 の領域と相補的である。
【００８４】
ネズミ可変部
下記の実施例により産生される抗体の抗体結合特徴を比較するために、キメラ重鎖（即ちネズミCC49 VH 領域およびヒトIgG1定常部を有する重鎖）および／またはキメラ軽鎖（即ちネズミCC49 VL 領域およびヒトκ定常部を有する軽鎖）を有する抗体を発現させた。これらのキメラ鎖の供給源は、両鎖を有するキメラCC49抗体を発現するATCC寄託細胞株HB9884（Budapest）であった。これらの抗体の重鎖は「MuVH」と、そしてその軽鎖は「MuVL」と名付けた。
【００８５】
オリゴヌクレオチドリン酸化プロトコール
非重複延長に用いられる突然変異化オリゴヌクレオチドを、以下の手法によりリン酸化した。最終容量25μL 中に、以下の成分を併合した：
10pmolの各オリゴヌクレオチド、
5 μL の5 ｘポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液、および
5UのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Gibco BRL ）
酵素の付加によりリン酸化反応を開始し、37℃で１時間進行させた。
【００８６】
非重複延長−連結のためのアニーリングプロトコール
非重複延長−連結のためのアニーリング工程は、すべての突然変異保有オリゴヌクレオチドおよび１つのプライマーオリゴヌクレオチドが、すべてのチミジン塩基がウリジン塩基に置換されていた一本鎖ＤＮＡ鋳型に対してアニーリングされる一アニーリングを実施することを包含する。突然変異化オリゴヌクレオチドを先ず、前記のオリゴヌクレオチドリン酸化プロトコールにしたがってリン酸化した。
【００８７】
20μL の最終容量中で、以下の成分を併合した：
10pmolの各突然変異保有リン酸化オリゴヌクレオチド、
1pmol のプライマーオリゴヌクレオチド、
4 μL の5 ｘアニーリング緩衝液、
0.2pmol ののｓｓＵ−ＤＮＡ鋳型。
次に、混合物を90℃に30分間加熱した後、70℃に急冷し、最後に徐々に冷却させて37℃とした。
【００８８】
非重複延長−連結のための延長−連結プロトコール
プライマーおよびリン酸化突然変異化オリゴヌクレオチドがｓｓＵ−ＤＮＡ鋳型にアニーリングされるアニーリング工程の完了後、延長−連結を以下のように実施した。20μL の最終容量中で、以下の成分を併合した：
20μL のアニール化ｓｓＵ−ＤＮＡ（即ち、前記のアニーリング手法の内容物）、
2 μL の5 ｘアニーリング緩衝液、
2 μL の0.1Mジチオトレイトール、
0.3 μL の0.1MＡＴＰ
1 μL の当モル量のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの6.25mM  ｄＮＴＰ混合物
2.5UのT7ＤＮＡポリメラーゼ（USB,ここでは、Amersham Life Sciences, Clevelard, OH ）
0.5UのT4ＤＮＡリガーゼ（Gibco BRL ）
水で全量を30μL とする。
次に、この混合物を室温で１時間インキュベートした。
【００８９】
標準ＰＣＲプロトコール
以下の手法を交互に用いて、非重複延長−連結ＤＮＡ配列を増幅し、且つ各重複ＤＮＡ配列の延長を実施した。50μL の最終容量中で、以下の成分を併合した：
2 μL の鋳型ＤＮＡ（アニール化ｓｓＵ−ＤＮＡまたは非アニール化ｓｓＤＮＡ）、
5 μL の10ｘVent緩衝液（NEB 、即ち、New England Biolabs, Bavery, MA ）または10ｘサーマラーゼThermalase緩衝液（New Haven, CT のIBI ）、
2 μL の当モル量のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの6.25mM  ｄＮＴＰ混合物
25pmolのオリゴヌクレオチドプライマー
25pmolの突然変異保有オリゴヌクレオチド（重複−延長用）または二次オリゴヌクレオチドプライマー、
1UのVentＤＮＡポリメラーゼ（NEB ）またはサーマラーゼThermalaseＤＮＡポリメラーゼ（IBI ）。
【００９０】
ＤＮＡポリメラーゼの付加により反応を開始し、次に以下の工程を約15回繰り返して、処理した：（１）94℃で30秒間、（２）50℃で30秒間、そして（３）75℃（VentＤＮＡポリメラーゼ用）または72℃（サーマラーゼ用）で30〜60秒間。 Vent ＤＮＡポリメラーゼに関しては75℃、サーマラーゼに関しては72℃の一定温度で5 分間で、反応を完了させた。
【００９１】
ＰＣＲ重複−延長増幅プロトコール
一対のＰＣＲ後、反応を実施した−２つの（部分的相補性）重複ＤＮＡセグメントの各々に関するもの−その結果生じた２つのセグメントを、以下のＰＣＲ手法により結合させた。50μL の最終容量中で、以下の成分を混合した：
【００９２】
1 μL の各重複ＤＮＡ（前記の重複ＰＣＲ延長反応から）、
5 μL の10ｘVent緩衝液（NEB ）またはサーマラーゼ（Thermalase）緩衝液（IBI ）、
2 μL の当モル量のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの6.25mM  ｄＮＴＰ混合物
25pmolの重複ＰＣＲ延長に用いられる各オリゴヌクレオチドプライマー
1UのVentＤＮＡポリメラーゼ（NEB ）またはサーマラーゼ（Thermalase）ＤＮＡポリメラーゼ（IBI ）。
【００９３】
ＤＮＡポリメラーゼの付加により反応を開始し、次に以下の工程を約15回繰り返して、処理した：（１）94℃で30秒間、（２）50℃で30秒間、そして（３）75℃（VentＤＮＡポリメラーゼ用）または72℃（サーマラーゼ用）で30〜60秒間。75℃（VentＤＮＡポリメラーゼ用）または72℃（サーマラーゼ用）の一定温度で5 分間で、反応を完了させた。
【００９４】
M13 からpSV ベクターへのヒト型化CC49可変部ＤＮＡ配列の転移およびその後の抗体発現
ヒト型化抗体を、ＮＳＯ細胞中で増殖したpSV ベクター中で発現させた。プラスミドM13 中で産生されたヒト型化可変部構築物を、10U のHind IIIおよびBamH I（ともにBRL 、即ちGibco BRL から）の各々を用いて、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液を含有する最終濃度を100 μL 中で37℃で1 時間、消化させた。その結果生じたＤＮＡ断片を次に、低融点アガロースゲル上を移動させて、ヒト型化構築物ＤＮＡを含有するバンドを切り出し、20μL のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液を含有するELUTIP 'd'カラムを用いてＤＮＡを精製した。
【００９５】
次に、Psv プラスミド中に構築物を挿入するために、10μL の精製ＤＮＡ調製物を1 μL のHind IIIおよびBamH I−消化pSV 調製物、3 μL の5 ｘリガーゼ緩衝液および1UのT4ＤＮＡリガーゼ（BRL ）と併合した。ヒト型化CC49 VH 構築物を、ヒトIgG 重鎖定常部を保有するpSVgptベクター中に挿入した；“aLys-17 ”に用いられたpSVgptベクターを、図５に示す。各ヒト型化可変部構築物をそれぞれの定常部に隣接して、即ち、図５に示したHuVHLYS またはHuVLLys セグメントを置換する用、挿入する。
【００９６】
その結果生じたベクターを、以下のようにNSO 細胞に移す。pSV −挿入手法により産生された約3 μg のVHベクター、または約6 μg のVLベクターを、次に、10U のPvu （BRL ）による消化によって線状化した。消化ＤＮＡを次に、エタノールで沈降させて、50μL の水中に再溶解させた。遠心分離によりNSO 細胞を収集し、0.5mL ダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）中に再懸濁後、Gene Pulser 浅鉢（Bio-Rad ）に移した。ピペッティングにより一VHおよび一VL構築物からのＤＮＡを細胞と静かに混合し、浅鉢を氷上に５分間放置した。次に、浅鉢をBio-Rad Gene Pulser の電極間に挿入し、980 μF で170Vのパルスを１回適用した。
【００９７】
次に浅鉢の内容物を、20MlのDMEMを含入するフラスコに移し、37℃で1 〜2 日間、細胞を休ませた。遠心分離により細胞を再び収穫し、36mLの選択DMEM中に再懸濁した。この再懸濁物の1.5mL アリコートを24ウエルプレートの各ウエル中に入れ、37℃で4 日間インキュベートし、この時点で各ウエル中の培地を1.5mL の新鮮な選択DMEMと取り換えた。37℃でさらに6 日間インキュベート後、生存細胞コロニーを肉眼で確認し、各ウエルの上清を抗体産生に関して検定した。全抗体産生（即ち精製なし）と精製抗体産生の両方を検定した。精製抗体を得るためには、上清をプロテインＡカラムに通した。
【００９８】
ＥＬＩＳＡ検定プロトコール
抗体濃度および抗体結合特徴を、以下に記載する酵素結合イムノソルベント検定（ELISA ）法を用いて検査した。
【００９９】
IgG 濃度の測定
トランスフェクト細胞から分泌されたIgG の濃度を、以下に記載する酵素結合イムノソルベント検定（ELISA ）法を用いて検査した。
ポリビニルクロリド（PVC ）微小滴定プレート（Dynatech Laboratories, Chantlly, VA,カタログ番号001-010-2101）を、Mill-Q（登録商標）水で稀釈したヤギ抗ヒトIgG （10mg/Ml.GAHIG, Southern Biotecnology Associates. Inc., Birmingham, AL.カタログ番号2010-01 ）で被覆し、50mL／ウエルを用いてプレート上に置いた。プレートを周囲温度で一夜、または37℃で３時間、風乾した。
【０１００】
使用前に、リン酸塩緩衝化生理食塩水（Sigma 、カタログ番号1000-3）（PBS/BAS ）中の0.2mL ／ウエルの1 ％（w/v ）ウシ血清アルブミン（Sigma, St. Louis, Mo、カタログ番号A7888 ）の付加により、非特異的結合を遮断した。インキュベーションはすべて、給湿容器中で実施した。プレートを37℃で1 〜2 時間インキュベートし、遮断溶液を除去した後に標本を付加した。標本の２倍連続稀釈液または500ng/mL（50μL ／ウエル）に設定した標準IgG 溶液をPBS/BSA 中に３通り作った。プレートを37℃で３時間、または4 ℃で一夜インキュベートした。
【０１０１】
プレートを、自動プレート洗浄機を用いて0.025 ％トゥイーン20（v/v 、Sigma ）で3 回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Southern Biotechnology Associate Inc. ）と結合させたヤギ抗ヒトIgG の1:1000稀釈液50μL/ウエルを付加し、37℃で1.5 時間インキュベートした。ウエルを自動プレート洗浄機を用いて0.025 ％トゥイーン20（v/v 、Sigma ）で3 回洗浄し、50μL/ウエルのOPD 基質緩衝液を付加した。4 分間発色させて、12.5％Ｈ2 ＳＯ412.5 μL で停止させ、492nm での吸光度を読み取った。標準IgG から構築された標準曲線に対する光学密度の平均の比較により、被験標本中のIgG の濃度を概算した。
【０１０２】
ヒト型化抗体の相対親和性の決定
ポリビニルクロリド（PVC ）微小滴定プレート（Dynatech Laboratories, Chantilly, VA、カタログ番号001-010-2101）上に固定した部分精製TAG-72抗原を用いて、抗体結合特徴を検査した。
【０１０３】
PVC プレートを、 Mill-Q 水中で1:300 に稀釈した50μL ／ウエルのTAG-72（Dow Chemical, Inc., #040191 ）で被覆した。プレートを周囲温度で一夜、または37℃で3 時間風乾した。使用前に、リン酸塩緩衝化生理食塩水（Sigma 、カタログ番号1000-3）（PBS/BAS ）中の0.2mL ／ウエルの1 ％（w/v ）ウシ血清アルブミン（Sigma, St. Louis, Mo、カタログ番号A7888 ）の付加により、非特異的結合を遮断した。
【０１０４】
プレートを37℃で1 〜2 時間インキュベートし、遮断溶液を除去した後に標本を付加した。インキュベーションはすべて、給湿容器中で実施した。PBS/BSA 溶液中の検査すべき標本の２倍連続稀釈液（出発濃度1.0 μg/ml〜10μg/ml）を、TAG 被覆プレート（50μL ／ウエル）の３通りのウエルに付加した。プレートを、4 ℃で一夜、または37℃で１〜２時間、インキュベートした。プレートを、自動プレート洗浄機を用いて0.025 ％トゥイーン20（v/v 、Sigma ）で3 回洗浄した。
【０１０５】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Southern Biotechnology Associate Inc. ）と結合させたヤギ抗ヒトIgG の1:1000稀釈液50μL/ウエルを付加し、37℃で1.5 時間インキュベートした。ウエルを、自動プレート洗浄機を用いて0.025 ％トゥイーン20（v/v 、Sigma ）で3 回洗浄し、50μL/ウエルのOPD 基質緩衝液を付加した。4 分間発色させて、12.5％Ｈ2 ＳＯ412.5 μL で停止させ、492nm での吸光度を読み取った。
【０１０６】
TAG-72との結合に関する親和性定数の決定
精製Hu-CC49 の２倍稀釈液を1.0 μg/ml〜0.003 μg/mlの範囲に亘ってPBS/BSA 中に調製し、標本（20μL/ウエル）を、上記と同様に調製し、遮断したTAG 被覆PVC に、３通り適用した。プレートを4 ℃で一夜インキュベートした。このインキュベーション後、標本をプレートからGAHIG 被覆トラッププレート上の対応するウエルに移した。
【０１０７】
元のTAG プレートを、自動プレート洗浄機を用いて0.025 ％トゥイーン20（v/v 、Sigma 、カタログ番号P1379 ）で3 回洗浄した。125 Ｉ−標識化ヤギ抗ヒトIgG プローブ（ICN Biomedicals, Inc. 、カタログ番号68088 ）をPBS/BSA 中で75,000 cpm/25 μL に稀釈した。このTAG プレートを37℃で１時間インキュベートした。
【０１０８】
37℃で１時間インキュベーション後、トラッププレートを前記と同様に洗浄し、125 Ｉ−標識化GAHIG プローブを付加した。このプレートを37℃で１時間インキュベートした。プローブを含有する両プレート（TAG およびGAHIG −トラップ）を次に微小プレート洗浄機で洗浄して、非結合プローブを除去した。プレートカッター（D. Lee, Sunyvals, CA、HWC-4 型）を用いてプレート枠からウエルを分離した。その結果生じたデータを、Scatchard （Ann. NYAcad., 51:600-672（1946））の方法により分析した。
【０１０９】
実施例１
ネズミCC49からのCDR グラフト化（初期ヒト型化）抗体の調製
それぞれヒトMabs REIおよびNEWMのＶL およびＶH 枠組み構造を用いて、ヒト型化CC49 Mabs （CC49 HuVH/HuVK）の構築を、我々は本実施例に記載する。上記の既知の方法にしたがって、ネズミCC49に関するCDR をヒト枠組み構造上にグラフトした。特に、ヒト枠組み構造は、従来の研究を基礎にして、適切であると予測された、即ち抗原結合に悪影響を及ぼさず、ヒトにおいて有意の免疫原性を示す抗体から選択した。
【０１１０】
それぞれ可変重鎖および軽鎖に関して選択されたヒト枠組み構造は、NEWMおよびREI であった。ヒト型化VHの初期バージョンの産生に際しては、従来の研究を基礎にして、抗原結合特性の保持を可能にし得るある種のネズミ枠組み構造残基も保持された。特に、ネズミ重鎖の残基Y27 ，T30 ，A72 、F95 およびT97 は最初に保持された。同時に、ネズミ枠組み残基A24 をさらに保持するヒト型化VHの代替バージョンを産生した。
【０１１１】
そのHind IIIおよびBamH I部位間に、図１３に示したヌクレオチド配列を有するＤＮＡセグメントを保有する一本鎖化M13 ＤＮＡ鋳型を用いて、前記のアニーリングおよび延長−結紮プロトコールにより、これらのNEWM−グラフト化ヒト型化CC49 VHSの産生を成し遂げた。この手法では、プライマー１１は、一組の突然変異化オリゴヌクレオチドと一緒に用いた。これらの突然変異化オリゴヌクレオチドを設計し、以下の配列を用いて合成した：
【０１１２】
１ａ．5'-GCTGTCTCACCCAGTGAATTGCATGGTCAGTGAAGGTGTAGCCAGACACGGTGCAGGTCA-3'；
１ｂ．5'-GCTGTCTCACCCAGTGAATTGCATGGTCAGTGAAGGTGTAGCCAGACGCGGTGCAGGTCA-3'
２．5'-CTGGTGTCTGCCAGCATTGTCACTCTCCCCTTGAACCTCTCATTGTATTTAAAATCATCATTTCCGGGAGAAAAATATCCAATCCACTCAAGAC-3'；および
３．5'-GGACCCTTGGCCCCAGTAGGCCATATTCAGGGATCTTGTACAGAAATAGACCGCGGTGTC-3'
【０１１３】
ネズミＦＲアミノ酸を保持するためにオリゴヌクレオチド中に設計されたコドンは、肉太書体で示されている。延長−連結後、VentＤＮＡポリメラーゼを用いる標準ＰＣＲプロトコールを用いて、増幅ＰＣＲを実施した。突然変異化オリゴヌクレオチド１の２つのバージョンの使用は、２つの初期ヒト型化V H の形成を生じた。これらは「CC49 NMVH 」と命名され、「HuVH」（オリゴヌクレオチド１ａを組み入れる構築物に関して）および「HuVHA 」（オリゴヌクレオチド１ｂを組み入れる構築物に関して）とも呼ばれた。
【０１１４】
ヒト型化VLの初期バージョンの産生において、ネズミ枠組み構造残基は独自に保持されなかった。REI −グラフト化ヒト型化CC49 Vの産生は、そのHind IIIおよびBamH I部位間に、図２に示したREIVK 配列をコードするｓｓＤＮＡセグメントを保有するssM13 を用いて、前記のアニーリングおよび延長−結紮プロトコールにより成し遂げた。この手法では、プライマー385 は、一組の突然変異化オリゴヌクレオチドと一緒に用いた。これらの突然変異化オリゴヌクレオチドを設計し、以下の配列を用いて合成した：
【０１１５】
2 １．5'-GTTCTTCTGATTACCACTGTATAAAAGACTTTGACTGGAC -3' ；
２２．5'-CAGATTCCCTAGCGGATGCCCAGTAG-3'
２３．5'-TTCTACTCACGTGTGATTTGCAGCTTGGTCCCTTGGCCGAACGTGAGGGGATAGGAATAGTATTGCTGGCAGTAGTAG-3'；および
２４．5'-GCTCTGGGTCATCTGGATGTCGG-3'
【０１１６】
延長−連結後、前記のサーマラーゼ標準ＰＣＲプロトコールを用いて、増幅ＰＣＲを実施した。その結果生じたヒト型化V L は「CC49 REVH 」と命名され、「HuVK」とも呼ばれた。
M13 ベクター中で適合される２つの重鎖構築物HuVHおよびHuVHA 、ならびに軽鎖構築物HuVHを増殖させ、TG1 細胞中で発現させた。これらの構築物のポリペプチド発現構築物をシーケンシングした。これらの構築物のアミノ酸配列を図１および２に示す。
【０１１７】
次に、これらのＤＮＡ構築物を、前記と同様にpSV 発現ベクター中に挿入した。これらの互いとの、またはキメラMuVHまたはMuVLをコードをコードするATCC（Budapest）HB 9884 ＤＮＡ配列との組合せを、次にNSO 細胞中に挿入した。特に、重鎖構築物の以下の４つの組合せを別々に前記のNSO 細胞中に移入した：HuVHA とMuVK、HuVHA とHuVK、MuVHとMuVK、ならびにHuVHとHuVK。これらの組合せを発現させ、その結果生じた抗体を次に、前記のELISA 検定を用いて、抗原結合特徴に関して検査した。これらの検定の結果を、図６〜９に示す。
【０１１８】
図６中のデータは、HuVHA を用いた場合、HuVKヒト型化軽鎖は、MuVKキメラ軽鎖と同様に機能する。図７および８は、完全ヒト型化HuVH/HuVK 抗体が、キメラMuVH/MuVK 抗体の約２分の１のTAG-72を結合する、ということを示す。さらに、図９は、A24 突然変異が抗体結合の増強を示さず、むしろA24 は、このELISA 検定により測定した場合に、親和性を約２分の１に低減する、ということを示唆する。
【０１１９】
ヒト型化CC49のさらなる開発
HuVKヒト型化軽鎖はMuVKキメラ軽鎖と同様に機能すると考えられるため、HuVHヒト型化重鎖の交互突然変異化バージョンの作製に、さらなる研究を向けた。図１に示したCC49 NMVH の位置76に示されるリシン残基を、ネズミＦＲ残基であるセリンで置換することにより、HuVHの一次変異体を作製した。
【０１２０】
２つのプライマー−および−突然変異オリゴヌクレオチド対−オリゴヌクレオチド10および4 、ならびにオリゴヌクレオチド11および5 を用いて、前記のVentＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ重複延長プロトコールにより、これを成し遂げた。各対は、プラスミドM13 のHind IIIおよびBamH I部位間に適合した、そして図１４に示したヌクレオチド配列を有するｄｓＤＮＡ鋳型の鎖の一方と一緒に用いた（対１１および５に関しては上鎖を用いた）。突然変異オリゴヌクレオチド４および５を設計し、以下の配列を用いて合成した：
４．5'-AGACACCAGCAGCAACCAGTTCAG-3'；および
５．5'-GCTGAACTGGTTGCTGCTGGTGTC-3'
【０１２１】
セリン残基コドンは肉太書体で示した。その結果生じたヒト型化CC49 VH を「HuVHS 」と名付けた。
図１に示したCC49 NMVH の位置74に示されるトレオニン残基を、ネズミＦＲ残基であるリシンで置換することにより、HuVHの二次変異体を作製した。２つのプライマー−および−突然変異オリゴヌクレオチド対−オリゴヌクレオチド10および6 、ならびにオリゴヌクレオチド11および7 を用いて、前記のVentＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ重複延長プロトコールにより、これを成し遂げた。
【０１２２】
各対は、プラスミドM13 のHind IIIおよびBamH I部位間に適合した、そして図１４に示したヌクレオチド配列を有するｄｓＤＮＡ鋳型の鎖の一方と一緒に用いた（対１１、８、７に関しては上鎖を用いた）。突然変異オリゴヌクレオチド６および７を設計し、以下の配列を用いて合成した：
６．5'-CTGGCAGACAAGAGCAAGAACCAG-3'；および
７．5'-TGGTTCTTGCTCTTGTCTGCCAGC-3'
【０１２３】
リシン残基コドンは肉太書体で示しされている。その結果生じたヒト型化CC49 VH を「HuVHK 」と名付けた。
M13 ベクター中で適合される２つの重鎖構築物HuVHS およびHUVHK を増殖させ、TG1 細胞中で発現させた。これらの構築物のポリペプチド発現構築物をシーケンシングした。これらの構築物のアミノ酸配列を図１に示す。
【０１２４】
次に、これらのＤＮＡ構築物を、前記と同様にpSV 発現ベクター中に挿入した。これらのHUVKとの組合せを、次にNSO 細胞中に挿入した。これらの組合せを発現させ、その結果生じた抗体を次に、前記のELISA 検定を用いて、抗原結合特徴に関して検査した。これらの検定の結果を、図10および１１に示す。これらの図は、K74 またはS76 突然変異はいずれも、抗原結合増強を生じなかった、ということを示す。実際、S76 突然変異は、このＥＬＩＳＡ検定により測定した場合に、親和性を約２分の１に低減した。
【０１２５】
実施例２
実施例１で得られたヒト型化CC49抗体に関する親和性定数の測定
実施例１の最終ヒト型化CC49抗体CC49 HuVH/HuVK（それぞれ図３および４に示した可変重鎖および可変軽鎖配列を有する）の親和性定数を、前記のELISA 検定プロトコールにしたがって測定した。 ATCC （Budapest）HB9884キメラCC49抗体を、内部対照として用いた。得られた値の精度を立証し、そして固有の検定−検定変動性を説明するために、このELISA 検定は、それぞれ、ヒト型化およびキメラCC49目抗体の精製標本を用いて実施した。このような分析からの典型的結果を、図１２に示す。これらの分析中に得られた結果の要約を、表１に示す。
【０１２６】
【表１】
0004080692.tif 000003
【０１２７】
これらの結果は、ヒト型化抗TAG-72抗体HuVH/HuVK （）がキメラCC49抗体（ MuVh/MuVK）の値に近い結合親和性を有する、ということを実証する。したがって                                                                        、このヒト型化抗体は、in vivo でTAG-72発現性癌腫を有効に標的にする、と予測される。さらに、その配列を基礎にして、この抗体はヒトにおいて免疫原性をほとんどまたは全く示さず、そしてネズミCC49に、そしてさらに、そのキメラバージョン関連して、有益な血漿クリアランス、代謝特性および有効な腫瘍ターゲッティングを示す。
【０１２８】
このヒト型化CC49抗体を産生するネズミの形質細胞腫細胞株は、アメリカ培養細胞コレクションに寄託され（1230 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852，1996年10月16日）、この細胞株は寄託番号ATCC CRL-12209を授与された。この寄託は、ブダペスト条約にしたがってなされた。この寄託細胞株は、35U.S.C.§120 下での本出願に対する優先権を主張する本出願またはあらゆるその他の出願に対する特許の発行時に、制限を伴わずに、最終的に利用可能にされる。
【０１２９】
前記に基づいて、実施例１〜３に開示したヒト型化抗体は、抗原結合特徴、即ち親モノクローナル抗体nCC49 （ネズミ抗体）に、そしてnCC49 から得られるキメラ抗体、例えばcCC49 に匹敵するTAG-72親和性を示す、と理解される。さらに、前記の結果に基づいて、これらの抗体は、in vivo 診断または療法としての利用にそれらをよく適合させる特性、例えば血清クリアランス改良、代謝特性、ならびにヒトにおける低または無免疫原性を有する。
【０１３０】
これらの特性は、本発明のヒト型化抗体を、反復的に、大投与量で、そして長期に亘って、有意の副作用、例えばHAMA応答または非特異的細胞傷害性を伴わずに投与可能にするために、非常に有意義である。これは、長期間に亘ってこれらの抗体を使用可能にするために、癌治療、ならびに癌診断にとって重要である。さらに、本発明のヒト型化抗体のクリアランス特性は、所望の標的部位、例えばTAG-72発現性癌に対して有効にこれらの抗体を標的にし得る。したがって、本発明のヒト型化抗体は、従来開示されたTAG-72に特異的な抗体に関する実質的改良を包含する。
【０１３１】
本発明のその他の実施態様は、本明細書または本明細書中に開示した本発明の実施の考察から、当業者には明らかになる。明細書および実施例は一例として考察されるだけのものであって、本発明の真の範囲および精神は、以下の請求の範囲に示されている。
【０１３２】
配列表
一般情報：
出願人：
名称：ダウケミカルカンパニー
番地名：1790 Bldg. Washington Street
市名：ミッドランド
州名：ミシガン
国名：アメリカ合衆国
郵便番号：48674
電話番号：517-636-1687
テレックス：517-638-9786
発明の名称：高親和性ヒト型化抗TAG-72モノクローナル抗体
配列の数：33
コンピューター読み取り形態：
媒体型：3-1/2"ディスク
コンピューター：IBM PCコンパチブル
オペレーティングシステム：MS-DOS
ソフトウェア：PatentIn
【０１３３】
配列番号１に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：115
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：ネズミCC49 VH
存在位置：1..115
配列：
【化１】
0004080692.tif 000004
【０１３４】
配列番号２に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：115
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：NEWM VH FR鋳型
存在位置：1..115
配列：
【化２】
0004080692.tif 000005
【０１３５】
配列番号３に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：115
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：ヒト化CC49 VH, HuVH
存在位置：1..115
配列：
【化３】
0004080692.tif 000006
【０１３６】
配列番号４に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：115
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：ヒト化CC49 VH, HuVHA
存在位置：1..115
配列：
【化４】
0004080692.tif 000007
【０１３７】
配列番号５に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：115
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：ヒト化CC49 VH, MuVHS
存在位置：1..115
配列：
【化５】
0004080692.tif 000008
【０１３８】
配列番号６に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：115
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：ヒト化CC49 VH, HuVHK
存在位置：1..115
配列：
【化６】
0004080692.tif 000009
【０１３９】
配列番号７に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：113
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：ネズミCC49 VK
存在位置：1..113
配列：
【化７】
0004080692.tif 000010
【０１４０】
配列番号８に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：113
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：REI VK FR 鋳型
存在位置：1..113
配列：
【化８】
0004080692.tif 000011
【０１４１】
配列番号９に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：113
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：ヒト化CC49 VK, HuVK
存在位置：1..113
配列：
【化９】
0004080692.tif 000012
【０１４２】
配列番号１０に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：115
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：ネズミCC49 VH
存在位置：1..115
配列：
【化１０】
0004080692.tif 000013
【０１４３】
配列番号１１に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：115
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：HuCC49 VH
存在位置：1..115
配列：
【化１１】
0004080692.tif 000014
【０１４４】
配列番号１２に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：117
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：NEWM VH
存在位置：1..117
配列：
【化１２】
0004080692.tif 000015
【０１４５】
配列番号１３に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：113
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：ネズミCC49 VL
存在位置：1..113
配列：
【化１３】
0004080692.tif 000016
【０１４６】
配列番号１４に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：113
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：HuCC49 VL
存在位置：1..113
配列：
【化１４】
0004080692.tif 000017
【０１４７】
配列番号１５に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：107
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：REI VL
存在位置：1..107
配列：
【化１５】
0004080692.tif 000018
【０１４８】
配列番号１６に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：345
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：HuvHおよびHuVHA を産生するために用いられる鋳型
存在位置：1..345
配列：
【化１６】
0004080692.tif 000019
【０１４９】
配列番号１７に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：345
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：HuvSおよびHuVHK を産生するために用いられる鋳型
存在位置：1..345
配列：
【化１７】
0004080692.tif 000020
【０１５０】
配列番号１８に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：17
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド10
存在位置：1..17
配列：
0004080692.tif 000021
【０１５１】
配列番号１９に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：16
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド11
存在位置：1..16
配列：
0004080692.tif 000022
【０１５２】
配列番号２０に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：22
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド385
存在位置：1..22
配列：
0004080692.tif 000023
【０１５３】
配列番号２１に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：22
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド391
存在位置：1..22
配列：
0004080692.tif 000024
【０１５４】
配列番号２２に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：60
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド1a
存在位置：1..60
配列：
0004080692.tif 000025
【０１５５】
配列番号２３に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：60
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド1b
存在位置：1..60
配列：
0004080692.tif 000026
【０１５６】
配列番号２４に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：94
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド2
存在位置：1..94
配列：
0004080692.tif 000027
【０１５７】
配列番号２５に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：60
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド3
存在位置：1..60
配列：
0004080692.tif 000028
【０１５８】
配列番号２６に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：39
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド21
存在位置：1..39
配列：
0004080692.tif 000029
【０１５９】
配列番号２７に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：26
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド22
存在位置：1..26
配列：
0004080692.tif 000030
【０１６０】
配列番号２８に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：78
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド23
存在位置：1..78
配列：
0004080692.tif 000031
【０１６１】
配列番号２９に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：23
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド24
存在位置：1..23
配列：
0004080692.tif 000032
【０１６２】
配列番号３０に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：24
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド4
存在位置：1..24
配列：
0004080692.tif 000033
【０１６３】
配列番号３１に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：24
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド5
存在位置：1..24
配列：
0004080692.tif 000034
【０１６４】
配列番号３２に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：24
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド6
存在位置：1..24
配列：
0004080692.tif 000035
【０１６５】
配列番号３３に関する情報
配列の特徴：
配列の長さ：24
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
特徴を表す記号：
名称／キーワード：オリゴヌクレオチド7
存在位置：1..24
配列：
0004080692.tif 000036
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、実施例１に開示されたマウスCC49V H 、FR出発材料にコードされたNEWNフレームワーク域、及びヒト型化NEWNをベースとしたV H (HuVH)のアミノ酸配列を揃え並べた。CCDRs は線で四角に囲んである。FRs に残存しているマウス残基は矢印（↑）で示した。変化型HuVHに残っているマウスFRは（A ）、(S) 及び(K) で示した。
【図２】  図２は、実施例１に開示されたマウスCC49V H 、FR出発材料にコードされたNE1 フレームワーク域、及びヒト型化REI をベースとしたV K のアミノ酸配列を揃え並べた。CCDRs は線で四角に囲んだ。
【図３】  図３は、CC49の可変重鎖、実施例１に開示されたHuCC49及びNEWNを揃えて並べている。
【図４】  図４は、CC49の可変軽鎖、実施例１に開示されたHuCC49及びNEWNを揃え並べている。
【図５】  図５は図３及び４に示した人化V H 及びV K を発現に利用したベクターの略図を含む。
【図６】  図６は、TAG-72に対するCC49抗体HuVHA/MuVK及びHuVHA/HuVKの結合を示すELISA である。
【図７】  図７は、TAG-72に対するCC49抗体MuVH/MuVK 及びHuVH/HuVK の結合を示すELISA である。
【図８】  図８は、TAG-72に対するCC49抗体MuVH/MuVK 及びHuVH/HuVK の結合を示すELISA である。
【図９】  図９は、TAG-72に対するCC49抗体MuVH/MuVK 及びHuVHA/HuVKの結合を示すELISA である。
【図１０】  図10は、TAG-72に対するCC49抗体HuVH/HuVK 及びHuVHK/HuVKの結合を示すELISA である。
【図１１】  図11は、TAG-72に対するCC49抗体HuVHS/HuVK及びHuVH/HuVK の結合を示すELISA である。
【図１２】  図12はヒト型化（HuVH/HuVK ）及びキメラ（MuVH/MuVK ）CC49モノクローナル抗体のスキャッチャード（Scatchard ）分析である。
【図１３】  図13は、初期ヒト型化NEWMをベースとしたVHs 、HuVH及びHuVHA の作製に用いた鋳型の単鎖DNA 配列を示す。
【図１４】  図14は、変化型ヒト型化VHs 、HuVHS 及びHuVHK の作製に用いた鋳型の二重鎖DNA 配列を示す。
【図１】
0004080692.tif 000037
【図２】
0004080692.tif 000038
【図３】
0004080692.tif 000039
【図４】
0004080692.tif 000040
【図５】
0004080692.tif 000041
【図６】
0004080692.tif 000042
【図７】
0004080692.tif 000043
【図８】
0004080692.tif 000044
【図９】
0004080692.tif 000045
【図１０】
0004080692.tif 000046
【図１１】
0004080692.tif 000047
【図１２】
0004080692.tif 000048
【図１３】
0004080692.tif 000049
【図１４】
0004080692.tif 000050