(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質、すなわち、
（１）殺虫活性を有しない；
（２）溶血活性がない；
（３）タンパク質電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子サイズが20〜75kDa である；
（４）バチルス・チューリンジエンシス由来のサイトライシンタンパク質に対する抗体と反応しない；および
（５）バチルス・チューリンジエンシス菌に由来する；
性質を有する脊椎動物の細胞を認識または認識・破壊するタンパク質の調製方法であって、
殺虫活性を有しないバチルス・チューリンジエンシス菌株の生産する結晶性タンパク質をアルカリにより可溶化した後、必要に応じてプロテアーゼ処理して得たタンパク質について溶血活性を測定し、溶血活性を有しないタンパク質を選別することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物から有用なタンパク質を得る技術分野に属し、詳述すれば、バチルス・チューリンジエンシス菌に由来し脊椎動物の細胞を選択的に認識し、または認識且つ破壊する性能を有する新規なタンパク質とその調製法に関する。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
バチルス・チューリンジエンシス（Bacillus thuringiensis：以下、ＢＴと略称することがある）は、1901年に日本人研究者石渡繁胤によって蚕の病原細菌として発見された。以来、ＢＴ菌が生産するタンパク質（結晶性タンパク質）は微生物殺虫剤として幅広く農業害虫や衛生害虫の防除に利用されてきた。
【０００３】
しかし、ＢＴのうち結晶性タンパク質が昆虫に対する殺虫活性を持つ菌株は30〜40％にすぎず、他の殺虫活性を持たないＢＴ菌株が生産する結晶性タンパク質の持つ性質については不明であった。
また、これまでの研究によって、殺虫活性を持つＢＴ菌の結晶性タンパク質はアルカリによる可溶化の後、プロテアーゼによって活性化されて昆虫に対する毒性を発揮することが知られている。殺虫活性を持つ結晶性タンパク質はプロテアーゼによって活性化された状態で、昆虫細胞に選択的な破壊活性を示すクライトキシンタンパク質（Cry タンパク質）（活性化時点で通常、分子サイズ60〜70kDa)と、昆虫の細胞に非選択的破壊活性を持ち、かつ、赤血球の溶血活性（haemolytic activity)を有するサイトライシンタンパク質（Cyt タンパク質）（活性化時点で通常、分子サイズ22〜30kDa)に分けられることが明らかになっている。
【０００４】
しかし、細胞認識タンパク質としてのＢＴ菌の結晶性タンパク質は、Cry タンパク質に代表される選択性の高さ、数十の遺伝子型に分類される多様性の豊富さ、原核生物の遺伝子であるが故の改変のし易さという、レクチン、抗体等、他の細胞認識タンパク質にない優れた特徴を持っているにもかかわらず、その用途は、昆虫を標的とした殺虫剤としての利用に限定されている。また、殺虫活性を持たないＢＴ菌株が生産する結晶性タンパク質の持つ活性に関する知見も皆無である。
【０００５】
一方、種々の細胞や組織を認識、識別、破壊する技術は、医療分野における抗ガン剤の開発、薬学分野におけるＤＤＳの開発、診断薬の開発、農林水産分野における特定の細胞、組織の選択的認識による動植物の育種、さらに化学工業分野における新規有害生物制御剤の開発など、幅広い分野で開発が期待されており、レクチン、抗体等を中心に種々の生物種からの探索が進められている。しかし、生体の多様な細胞または組織の認識、識別、破壊に十分な細胞認識タンパク質は得られていないのが現状である。
本発明の目的は、上記のごとき幅広い分野で利用が可能な微生物由来の新しいタンパク質および該タンパク質を得る技術を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、バチルス・チューリンジエンシス菌に関する研究を進めてゆくうちに、これまで知られていない性質を有するＢＴ菌由来の新しいタンパク質（結晶性タンパク質）群が存在することを見出し、本発明を導き出したものである。
【０００７】
かくして、本発明に従えば、上述の目的を達成し得るものとして、殺虫活性を有しないバチルス・チューリンジエンシス菌株の生産する結晶性タンパク質をアルカリにより可溶化した後、必要に応じてプロテアーゼ処理して得たタンパク質について溶血活性を測定し、溶血活性を有しないタンパク質を選別することを特徴とする脊椎動物の細胞を認識または認識・破壊するタンパク質の調製方法が提供される。
【０００８】
本発明は、さらに、上記の方法によって得られ、（１）殺虫活性を有しない；（２）溶血活性がない；（３）タンパク質電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子サイズが20〜75kDa である；（４）バチルス・チューリンジエンシス由来のサイトライシンタンパク質に対する抗体と反応しない；および（５）バチルス・チューリンジエンシス菌に由来するという性質を有することを特徴とする脊椎動物の細胞を認識または認識・破壊するタンパク質を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
適用されるＢＴ菌株
本発明のタンパク質は、殺虫活性を有しない各種のバチルス・チューリンジエンシス菌株から分離されるものである。ここで、本明細書において用いる「殺虫活性」という語は、従来よりＢＴ菌またはＢＴ菌由来のタンパク質から成る殺虫剤が有するように蚊や蛾に代表される双翅目および鱗翅目等の昆虫を生体として死に到らしめる性質を指称する。
【００１０】
本発明は、各種の土壌、塵埃、生体などから分離され、上で定義したような殺虫活性を有さず、これまでその活性（性状）が不明であった各種のＢＴ菌株を後述のように処理することによって、ガン細胞を含む脊椎動物の細胞を選択的に認識したり破壊し得る一群の新規なタンパク質が得られるという事実の発見に基づくものである。本発明者が見出したところによれば、このようなタンパク質群を生産するのは、ＢＴ菌株のうち、特定の亜種（血清型）のＢＴ菌株に限定されず、これまで知られている各種の血清型（Ｈ血清型）に属するもののみならず、未知の血清型に属するＢＴ菌株の中にも、そのようなタンパク質を生産するものがある。
【００１１】
タンパク質の調製
本発明のタンパク質を調製するには、各種の入手源から殺虫活性を有しないＢＴ菌を用意する。起源がはっきりしており既に殺虫活性を有しないことが明らかである菌株はそのまま用いる。殺虫活性が不明である菌については、以下のように殺虫活性を有しないことが明らかになったものを用いる：すなわち、イエバエ、チカイエカ、ハマダラカ、ユスリカ、チョウバエ等の双翅目昆虫、コナガ、カイコ、ヨトウ等の鱗翅目昆虫、およびその他の目に属するコオロギ、バッタ、シロアリ、ゴキブリ等の昆虫５〜20頭の幼虫または成虫を用いて殺虫活性の測定を行う。チカイエカ、ハマダラカ、ユスリカ、チョウバエ等の場合には幼虫の飼育水中に20μg/ml〜 160μg/mlのＢＴ菌株の生産する結晶性タンパク質を添加して、25℃、72時間飼育する。また、イエバエ、コナガ、カイコ、ヨトウ、コオロギ、バッタ、シロアリ、ゴキブリ等の場合には、１ｇの飼料中に40μｇ〜80μｇのＢＴ菌の生産する結晶性タンパク質を添加し25℃、72時間飼育する。その結果、死亡率が80％以上の菌株を殺虫活性有りとして、本発明のタンパク質調製から除外し、死亡率が80％未満の菌株を殺虫活性無しとして本発明のタンパク質の調製に使用する。
【００１２】
次に、殺虫活性を有しないＢＴ菌株の生産する結晶性タンパク質をアルカリにより可溶化する。ここで、「アルカリによる可溶化」は、従来よりＢＴ菌から殺虫活性を有するタンパク質を得る場合と同様の条件下に実施する。例えば、各ＢＴ菌40μｌ（320 μｇ結晶性タンパク質含有）を１ml蒸留水で３回洗浄した後、50mM  Ｎａ2 ＣＯ3 （ｐＨ10）、10mM DTT、１mM EDTA からなる緩衝液240 μｌを加えて37℃で１時間可溶化処理する。
【００１３】
さらに、プロテアーゼ処理を行うが、これによってアルカリ可溶化によって得られたタンパク質が活性化される。プロテアーゼ処理は、プロテアーゼとして一般に、セリンプロテアーゼであるプロテアーゼＫを用い、ｐＨ7.2 、37℃の条件下で実施する。また、アルカリ可溶化だけで活性化されたタンパク質が得られる菌株については、プロテアーゼ処理は行わない。
【００１４】
本発明のタンパク質は、上記のようにして得られたＢＴ菌タンパク質について、次に、溶血活性を測定し、溶血活性を有しないものを選別することによって調製することができる。ここで、本発明に関連して用いる「溶血活性」とは、ＢＴ菌の特性を表すものとして哺乳動物由来の赤血球に対する溶血性を指称し、具体的には、以下のように決定する。すなわち、アルセバー溶液で調製したヒトまたはヒツジの血液を、赤血球濃度２％（v/v)になるよう20mMトリス緩衝液で調製する。この２％（v/v)赤血球溶液40μｌに対し活性化タンパク質溶液を20μｌずつ添加し27℃18時間放置する。さらに800gで10分間遠心した上澄みの吸光度（540nm)を測定し、本タンパク質溶液の代わりに20mMトリス緩衝液を添加した対照実験と比較して吸光度差が0.5 以下の場合に溶血活性がないものとして選別する。
【００１５】
タンパク質の特性
以上のように殺虫活性を有さず且つ溶血活性がないＢＴ菌から調製された本発明のタンパク質は、ガン細胞を含む脊椎動物細胞を認識したり破壊する機能を有する。例えば、本発明のタンパク質は、ヒト白血病細胞を選択的に認識して破壊しながらヒト正常白血球には何らの影響を与えない。また、本発明のタンパク質は、その他の脊椎動物、例えば、魚類の細胞を特異的に認識し破壊することもできる。
【００１６】
タンパク質電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析の結果、本発明のタンパク質は、その主要バンドが20〜75kDa の範囲にあるような分子サイズを有する。
さらに、本発明のＢＴ菌由来タンパク質は、従来より知られたＢＴ菌由来のタンパク質であるサイトライシンに対する抗体（抗サイトライシンポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体）とは特異的に反応しない。したがって、本発明のタンパク質は、既知サイトライシンとは免疫学的に異なる新規のタンパク質である。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明の特徴をさらに明らかにするため実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
〔実施例１：タンパク質の調製〕
土壌、耕地土壌、森林土壌、養蚕農家塵埃、貯穀塵埃、病死昆虫、植物、淡水等から分離され、serovar thuringiensis,  alesti, kurstaki,  sumiyoshiensis, fukuokaensis,  sotto,  keniyae,  galleriae,  canadensis, oyamensis, aizawai, morrisoni, ostriniae, higo等の50種のＨ血清型と未知の血清型に属する約2000株のＢＴ菌株の中から、殺虫活性を有しない菌株約1200株を選びだした。なお、血清型（亜種）の同定は、フランスパスツール研究所より入手した標準菌株を用いることにより行った。殺虫活性を有しないＢＴ菌株から、以下のようにタンパク質を調製した。
【００１８】
可溶化処理
まず、各ＢＴ菌40μｌ（320 μｇ結晶性タンパク質含有）を１ml蒸留水で３回洗浄する。50mM  Ｎａ2 ＣＯ3 （pH 10)、10mM DTT、１mM EDTA からなる緩衝液240 μｌを加えて37℃で１時間可溶化処理する。次に遠心により本タンパク質を含む上清を回収し、さらに必要に応じて最終濃度が30μｇ／mlとなるようにプロテアーゼＫを加えて本タンパク質を活性化する。その後、１Ｎ HClにより本タンパク質溶液のpHを中性付近に戻し、フィルター濾過により除菌したものを活性化タンパク質溶液とする。本タンパク質溶液を保存する場合は、グリセロールを加えて凍結する。
【００１９】
溶血活性測定
次に、このタンパク溶液について次のように溶血活性を測定した：アルセバー溶液で調製したヒトまたはヒツジの血液を、赤血球濃度２％（v/v)になるよう20mMトリス緩衝液で調製する。この２％(v/v) 赤血球溶液40μｌに対し実施例１で調製した活性化タンパク質溶液を20μｌずつ添加し27℃18時間放置する。さらに800gで10分間遠心した上澄みの吸光度（540nm)を測定し、本タンパク質溶液の代わりに20mMトリス緩衝液を添加した対照実験と比較して吸光度差が0.5 以下の場合に溶血活性がないものとして選別した。
【００２０】
分子サイズ測定
タンパク質の分子サイズは29、45、66、97.4、116および205kDaの分子サイズマーカーを用いる電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、条件：通常10％ゲル、200V）により測定した。電気泳動図の１例を図１に示す。上述のようにして得られたＢＴ菌由来タンパク質のうち後述の脊椎動物の細胞を認識または認識・破壊するものの代表例を表１にまとめて示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
〔実施例２：ヒト白血病細胞破壊能テスト〕
表１に掲記するＢＴ菌由来タンパク質を用いてヒト白血病細胞に対する破壊能を調べた。
細胞の調製
ヒト白血病細胞（MOLT-4) は、（財）理化学研究所より購入した。MOLT-4は常法によりＲＰＭＩ1640培地を用いて培養（37℃、５％ＣＯ2)した後、2.2 ×105cell/mlの濃度で96穴マルチウェルプレートに90μｌずつ分注した。この96穴マルチウェルプレート中のMOLT-4細胞をさらに24時間培養した後、試験に用いた。
ヒト正常白血球細胞は、フィブリン除去したヒト全血をトリス緩衝液で２倍に希釈した後、リンパ球分離溶液の上に重層し18〜20℃、400gで30分間遠心して回収した。ＲＰＭＩ1640培地で2.2 ×105cell/mlの濃度に調製し、96穴マルチウェルプレートに90μｌずつ分注し、さらに24時間培養した後試験に用いた。
【００２３】
細胞破壊効果および生存細胞率の測定
96穴マルチウェルプレートに90μｌずつ分注したMOLT-4細胞に対して、実施例１で調製したタンパク溶液を10μｌずつ添加した。添加後１時間および24時間経過した時点での細胞破壊効果（ＣＰＥ：Cytopathic effect)を倒立顕微鏡で観察した。さらに生存細胞率（ＭＴＴ）を市販の Cell Titer 96TM試薬を用いて常法により測定した。ヒト正常白血球細胞についても同様に行った。結果を表２にまとめて示す。なお、表２には後の細胞認識テストに関する実施例４の結果も併せて示している（右端欄）。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
これらの結果から、ヒト白血病細胞（MOLT-4）を特異的に認識、破壊し、ヒト正常白血球には何ら影響を与えず、溶血活性がない結晶性タンパク質を生産するＢＴ菌が存在することが明らかである。
〔実施例３：魚類細胞破壊能テスト〕
表１のＢＴ菌由来タンパク質を用いて魚類細胞に対する破壊効果を調べた。
細胞の調製
魚類細胞としてキンギョの鱗細胞を用いた。キンギョ鱗細胞（ＧＦ−Scale)は、（財）理化学研究所より購入した。ＧＦ−Scale は常法によりＤＭ−160AU （２％ＦＢＳ）培地を用いて培養（37℃、５％ＣＯ2 ）した後、2.2 ×105cell/mlの濃度で96穴マルチウェルプレートに90μｌずつ分注した。この96穴マルチウェルプレート中のＧＦ−Scale 細胞をさらに24時間培養した後、試験に用いた。
【００２６】
細胞破壊効果および生存細胞率の測定
96穴マルチウェルプレートに90μｌずつ分注したＧＦ−Scale 細胞に対して、実施例１で調製したタンパク質溶液を10μｌずつ添加する。添加後１時間および24時間経過した時点での細胞破壊効果（ＣＰＥ）を倒立顕微鏡で観察する。さらに生存細胞率（ＭＴＴ）を、市販 Cell Titer 96TM試薬を用いて常法により測定した。結果を表３に示す。
【００２７】
【表３】
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【００２８】
この結果から、キンギョ鱗細胞（ＧＦ−Scale)を認識、破壊し、溶血活性がない結晶性タンパクを生産するＢＴ菌が存在することが明らかとなった。
〔実施例４：細胞認識能テスト〕
実施例１の溶血活性測定において、溶血が認められないものについて、目視によって赤血球の凝集性を確認した。代表例を表２に示す。
この結果から、ヒツジ赤血球に対し認識能（凝集能）を有する結晶性タンパク質を生産するＢＴ菌が存在することが明らかとなった。
【００２９】
〔実施例５：イムノブロットによる既知サイトライシンとの比較〕
表２および表３に示すタンパク質のうち活性が認められたものについて電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオライド）膜に常法で転写した。この膜を常法により一次抗体（既知サイトライシンのポリクローナル抗体）、続いて二次抗体（アルカリホスファターゼ）と反応させた。その後、アルカリホスファターゼの基質であるＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）とＸ−リン酸による発色反応を観察したところ、いずれも発色が認められなかった。
このように本タンパク質は既知サイトライシンの抗体とは特異的に反応せず、本タンパク質は既知サイトライシンとは免疫学的に異なる新規のタンパク質であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のタンパク質の代表例の分子サイズを示す電気泳動図（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。
【図１】
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