(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＣＤ１９抗原を特異的に認識する免疫グロブリン鎖または抗体の結合部位を含有してなる第１のドメイン；ならびに
（ｂ）ヒトＴ細胞のＣＤ３抗原を特異的に認識する免疫グロブリン鎖または抗体の結合部位を含有してなる第２のドメイン、
を含有してなり、前記ドメインが、ＶL ＣＤ１９−ＶHＣＤ１９−ＶH ＣＤ３−ＶL ＣＤ３の順で配列されている単鎖多機能性ポリペプチド。
【請求項２】
前記２つのドメインがアミノ酸配列ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒを有するポリペプチドリンカーによって連結されているものである、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記第１および／または第２のドメインが、天然の抗体に由来するＶH およびＶL 領域を含んでなるものである、請求項１または２記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記抗体が、モノクローナル抗体、合成抗体、またはヒト化抗体である、請求項１〜３いずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ドメインの少なくとも１つが抗体の可変領域の単鎖フラグメントである、請求項１〜４いずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記第１のドメインが、配列番号：９のヌクレオチド８２〜４１４（ＶL ）およびヌクレオチド４６０〜８３１（ＶH ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を含有してなるＶHおよびＶL 領域を含有してなるものであり、および前記第２のドメインが、配列番号：９のヌクレオチド８４７〜１２０３（ＶH）およびヌクレオチド１２５８〜１５７５（ＶL ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を含有してなるＶHおよびＶL 領域を含有してなるものである、請求項１〜５いずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項７】
（ａ）前記第１のドメインの結合部位が、少なくとも１０-7Ｍの親和性を有するものであり；および／または
（ｂ）前記第２のドメインの結合部位が、１０-7Ｍよりも低い親和性を有するものである、請求項１〜６いずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項８】
二重特異性単鎖抗体である、請求項１〜７いずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項９】
イオンを封鎖し得るか、または固相支持体または予め選択された決定基に選択的に結合し得る生物学的活性に適切な立体配座を有するエフェクター分子を含有してなる少なくとも１つのさらなるドメインを含有してなるものである、請求項１〜８いずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記さらなるドメインが共有結合または非共有結合によって連結されているものである、請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
発現に際して請求項１〜１０いずれか１つに記載のポリペプチドをコードするものであるポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１記載のポリヌクレオチドを含有してなるベクター。
【請求項１３】
請求項１１記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２記載のベクターでトランスフェクトされた細胞。
【請求項１４】
その工程が請求項１３記載の細胞を培養する工程および培養物からポリペプチドを単離する工程を含む、請求項１〜１０いずれか１つに記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０いずれか１つに記載のポリペプチド、請求項１１記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２記載のベクターを含有してなる組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容され得るキャリアーをさらに含有してなる、医薬組成物である請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
適切な検出手段をさらに含有してなる、診断用組成物である請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
Ｂ細胞悪性疾患の治療、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患の治療またはＢ細胞の欠乏のための医薬組成物の調製のための、請求項１〜１０いずれか１つに記載のポリペプチド、請求項１１記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２記載のベクターの使用。
【請求項１９】
前記Ｂ細胞悪性疾患が非ホジキンリンパ腫である、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
遺伝子治療用の組成物の調製のための、請求項１１記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２記載のベクターの使用。
【請求項２１】
（ａ）請求項１〜１０いずれか１つに記載のポリペプチドの存在下で、スクリーニング対象の化合物とともにＴ細胞の活性化を許容する条件下にＴ細胞およびＣＤ１９陽性細胞を培養する工程、ならびに
（ｂ）該化合物の該細胞との相互作用から産生されるシグナルの存在または非存在を検出する工程、
を含む、Ｔ細胞の活性化または刺激の活性化因子またはインヒビターの同定方法。
【請求項２２】
Ｂ細胞悪性疾患の治療、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患の治療またはＢ細胞の欠乏のための請求項１５または１６記載の組成物。
【請求項２３】
Ｂ細胞障害によって引き起こされる病理学的症状を遅延させるための請求項１５または１６記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＣＤ１９およびＣＤ３抗原の各々に対して特異的な少なくとも２つの結合部位を含有する新規の単鎖多機能性ポリペプチドに関する。本発明はさらに、上記ポリペプチドが少なくとも１つのさらなるドメイン、好ましくは予め規定された機能を有するドメインを含有するポリペプチドに関する。さらに、本発明は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびに上記ポリヌクレオチドを含有するベクター、およびそれにより形質転換された宿主細胞および上記ポリペプチドの産生におけるそれらの使用に関する。さらに、本発明は、上記のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含有する組成物、好ましくは医薬組成物および診断用組成物に関する。本発明のさらなる目的は、免疫治療、好ましくは非ホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ）リンパ腫のようなＢ細胞悪性疾患に対する免疫治療のための医薬組成物の製造のための上述のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびベクタ─の使用である。
【０００２】
いくつかの文献が本明細書の本文全体で引用される。本明細書中に引用される文献（任意の製造業者の仕様書、指導書などが含まれる）の各々が参考として援用される；しかし、引用されるいかなる文献も本発明の先行技術であるとは認めない。
【０００３】
医学的重要性にも拘わらず、非ホジキンリンパ腫のようなＢ細胞媒介性疾患における研究は、臨床的に有用なデ─タをほんの少数しか産生しておらず、そのような疾患を治療するための従来のアプロ─チは、冗長かつ不快なままであり、そして／または再発の高い危険性を有する。例えば、高い段階の非ホジキンリンパ腫の一次治療としての高用量の化学療法は、全体の生存を改善し得るが、約５０％の患者が依然としてこの疾患により死亡する（２−４）。さらに、低い段階の非ホジキンリンパ腫様慢性リンパ白血病および被膜細胞リンパ腫は依然として治療不能である。このことは、免疫療法のような代替のストラテジ─の調査を刺激している。ＣＤ抗原によって規定される細胞表面分子に対する抗体は、治療用試薬の開発の独特な機会を示す。所定のＣＤ抗原の発現は、特定の系統のリンパ造血細胞に高度に制限されており、過去数年にわたって、リンパ球特異的抗原に対する抗体が、インビトロまたは動物モデルのいずれかにおいて効果的である治療を開発するために使用されている（５−１３）。この点に関して、ＣＤ１９は、非常に有用な標的であることが示されている。ＣＤ１９は、プロＢ細胞から成熟Ｂ細胞までの全てのＢ系統で発現され、それは切断されておらず、全てのリンパ腫細胞において均一に発現され、幹細胞において欠失している（８，１４）。興味深い治療法は、ＣＤ１９に対する一方の特異性およびＴ細胞上のＣＤ３抗原に対する他方の特異性を有する二重特異性抗体の適用である。しかし、これまでに利用可能な二重特異性抗体は、低いＴ細胞細胞障害性を欠点として有しており、十分な生物学的活性を発揮させるには同時刺激因子が必要である。
【０００４】
従って、本発明の基礎となる技術的問題は、種々の形態の非ホジキンリンパ腫のようなＢ細胞媒介性疾患の治療に有用な手段および方法を提供することであった。上記技術的問題に対する解法は、請求の範囲において特徴付けられる実施様態を提供することによって達成される．
【０００５】
従って、本発明は以下を含有する単鎖多機能性ポリペプチドに関する：
（ａ）ＣＤ１９抗原を特異的に認識する、免疫グロブリン鎖または抗体の結合部位を含有する第１のドメイン；ならびに
（ｂ）ＣＤ３抗原を特異的に認識する、免疫グロブリン鎖の結合部位または抗体の結合部位を含有する第２のドメイン。
【０００６】
本発明における用語「第１のドメイン」および「第２のドメイン」とは、ある一方の結合部位がｐａｎＢ細胞マーカーＣＤ１９（これは広範な多数の悪性Ｂ細胞において均一に発現される）に対するものであり、他方の結合部位がヒトＴ細胞のＣＤ３抗原に対するものであることを意味する。
本発明において使用される用語「結合部位」は、天然の抗体のようなエピトープ、遊離ｓｃＦｖフラグメントまたはそれらに対応する免疫グロブリン鎖（好ましくはＶH 鎖）の１つに特異的に結合し得る三次元構造を含有するドメインをいう。従って、上記ドメインは、抗体または免疫グロブリン鎖のＶH および／またはＶL ドメイン、好ましくは少なくともＶH ドメインを含有し得る。他方で、本発明のポリペプチドに含有される上記結合部位は、ＣＤ１９およびＣＤ３抗原の各々を認識する抗体または免疫グロブリン鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有し得る。この点に関して、本発明のポリペプチド中に存在する結合部位のドメインは、抗体に由来するだけでなく、他のＣＤ１９結合タンパク質またはＣＤ３結合タンパク質（例えば天然に存在する表面レセプタ─またはリガンド）にも由来し得ることに注意されたい。本発明によれば、上記結合部位はドメインに含まれる。
本明細書において使用される用語「多機能性ポリペプチド」とは、異なる起源、すなわち、２つの異なる分子（任意に異なる種に由来する）に由来する少なくとも２つのアミノ酸配列を含有するポリペプチドをいう。ここで、少なくとも２つの上記起源は結合部位を特異化する。従って、上記結合部位は、上記多機能性ペプチドの複数の機能または少なくともいくつかの機能を特異化する。このようなポリペプチドとしては、例えば、二重特異性単鎖（ｂｓｃ）抗体が挙げられる。本明細書において使用される用語「単鎖」とは、ポリペプチドの上記第１のドメインおよび第２のドメインが（好ましくは核酸分子によってコードされ得る共直線性アミノ酸配列の形態で）共有結合していることを意味する。ＣＤ１９とは、プロＢ細胞および成熟Ｂ細胞のようなＢ系統において発現される抗原であって、それが切断されておらず、全てのリンパ腫細胞において均一に発現され、幹細胞において欠失している抗原をいう（８、１４）。
ＣＤ３とは、多分子Ｔ細胞レセプター複合体の一部分としてＴ細胞上に発現され、３つの異なる鎖ＣＤ３ε、ＣＤ３δおよびＣＤ３γからなる抗原をいう。例えば、固定化抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞上のＣＤ３クラスター形成は、Ｔ細胞レセプターの連動状態に類似するがそのクローン典型的な特異性とは独立したＴ細胞活性化を導く。実際、ほとんどの抗ＣＤ３抗体はＣＤ３ε鎖を認識する。
ＣＤ１９またはＣＤ３抗原を特異的に認識する抗体は、先行文献、例えば（２４）、（２５）および（４３）の各々に記載されており、当該分野に公知の従来法によって生産し得る。
【０００７】
単鎖形式ではなく、ＭＨＣ独立様式でリンパ腫細胞上のＴ細胞細胞傷害性を再標的化する二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ３抗体は、インビトロ（５、６、９〜１１、１３、４３）、動物モデル（７、２８）ならびにいくつかの試験的な臨床試験（１２、２９、３０）において効果的であることが既に示されている。これまでにこれらの抗体は、ハイブリッド−ハイブリドーマ技術、モノクローナル抗体を共有結合させること（３１）またはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）アプローチ（４３）によって構築された。より広範な臨床試験は、これらの抗体の生物学的活性が低いので高用量が適用されなければならず、抗体単独の適用では有益な治療効果を提供しないという事実によって妨害されている。さらに、臨床等級の材料の入手可能性が制限されていた。
【０００８】
特定の理論に束縛されることなく、上記に規定した二重特異性抗体様様式、従って二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ３抗体のような産生されたポリペプチドは、通常、Ｔ細胞のいかなる前刺激および／または共刺激をも必要とすることなく、細胞傷害性Ｔリンパ球の補充によってＣＤ１９陽性標的細胞を破壊し得る。このことは、他の分子形式によって産生された全ての既知の二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ３抗体とは鮮明な対照を示し、例えば二重特異性単鎖抗体を構築するのに使用される特定のＣＤ１９抗体特異性またはＣＤ３抗体特異性に通常は依存しない。Ｔ細胞の前刺激および／または共刺激への非依存性は、実施例に記載される特定のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体によって例示されるような、本発明のポリペプチドによって媒介される例外的に高い細胞傷害性に実質的に貢献し得る。
本発明のポリペプチドのさらなる優位な特性は、その小さく比較的コンパクトな構造に起因して産生および精製が容易であり、それにより低収量、不明確な副産物の出現、またはハイブリッド−ハイブリドーマ、化学結合、または細菌の封入体からの再生によってこれまで産生されたＣＤ１９×ＣＤ３特異的抗体について報告された煩雑な精製手順（１５〜１９）の問題を回避する。下記に、本発明のポリペプチドの優位な、そして予測せぬ特性を、付随する実施例によって非限定的な様式で考察するであろう。この付随する実施例は、下記で言及される本発明の好ましい態様のいくつかを含み、本発明の広範な概念を説明する。
【０００９】
本発明に従って、ＣＨＯ細胞における発現によって組換え二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ３単鎖抗体を生産するために真核細胞発現系（１）を使用した。かかる発現系は、組換え二重特異性単鎖抗体の生産のために開発された。十分に機能的である抗体を、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーカラム上でのＣ末端ヒスチジンタグによって培養上清から容易に精製した。ＣＤ１９およびＣＤ３への特異的結合を、ＦＡＣＳ解析によって実証した。得られた本発明のｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３（二重特異性単鎖ＣＤ１９×ＣＤ３）分子は、いくつかの予測せぬ特性を示した：
−このｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３は、インビトロおよびインビボで高いリンパ腫指向性のＴ細胞細胞傷害性を誘導した。１０〜１００ｐｇ／ｍｌの非常に低い濃度および５：１および２．５：１の低いＥ（エフェクター）：Ｔ（標的）比でさえも、リンパ腫細胞株の有意な特異的溶解を観察した。さらに、コンパッショネイトな（ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎａｔｅ）使用において３μｇ〜１０μｇの本発明のｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３分子は、明白かつ有意な医学的状態の改善を示した。数ｎｇ／ｍｌまたは数μｇ／ｍｌの範囲でさえも細胞傷害性活性を示す、ハイブリッド−ハイブリドーマ技術またはダイアボディアプローチ  （これもまた異なる形式を示す）によって産生された、これまでに公開されたＣＤ１９×ＣＤ３抗体と比較して、本発明のｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３抗体は、例えば付随する実施例４、５および７に実証したように大いにより効果的であるようである（５〜７、２７、４３）。
−低濃度の本発明のｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３でさえも、いかなるＴ細胞前刺激をも必要とすることなく、低いＥ：Ｔ比で迅速なリンパ腫指向性細胞傷害性（４時間後）を誘導し得た。対照的に、従来のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体（５〜７、２７）は、これらの条件（すなわち、Ｔ細胞前刺激なし、低Ｅ：Ｔ比）下で３０００ｎｇ／ｍｌまでの高濃度でさえも有意な細胞傷害性活性を示さなかった。前刺激を伴わない細胞傷害性活性の誘導は、別の従来のＣＤ１９×ＣＤ３抗体の事例でも報告されているが、この効果は、本発明のｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３（１００ｐｇ／ｍｌ、２．５：１）と比較して高濃度および高Ｅ：Ｔ比（１００ｎｇ／ｍｌ、２７：１）（９）でのみ達成された。さらに、この従来の抗体の細胞傷害性効果は、二重特異性抗体自身での前処理の１日後のみに観察された。一方、本発明のｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３は、４時間後にはすでにリンパ腫指向性細胞傷害性を誘導した。本発明者らの知る限りでは、このような低い濃度およびＥ：Ｔ比での非刺激Ｔ細胞のこのような迅速かつ特異的な細胞傷害性活性は、これまでに使用された他の二重特異性抗体については記載されていない。近年、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ＣＤ３二重特異的Ｆ（ａｂ）2 抗体は、本発明のｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３と同様の濃度で細胞傷害性活性を誘導することが示されたが、この抗体は、ＩＬ−２での２４時間の前刺激を必要とした（３２）。従って、本発明のｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３抗体は、この分子と記載された他の二重特異性抗体とを区別する独特の細胞傷害性特性を示す。
本発明のｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３は、以下の事実によって示されるように、抗原特異的である細胞傷害性効果を媒介する：
−この抗体が、ＣＤ１９抗原を発現しないＢ系統の細胞株であるプラスマ細胞腫細胞株ＮＣｌおよびＬ３６３を溶解しなかった；および
−リンパ腫細胞に対する細胞傷害性は、親抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７によってブロックされ得た［ＨＤ３７抗体はＨＤ３７ハイブリドーマに由来する（２２）］。
ＥＧＴＡでのカルシウム欠乏によるパーフォリン経路のブロックは、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３媒介性細胞傷害性を完全にブロックした。このことは、特異的溶解が抗体自身の直接的効果よりもむしろＴ細胞媒介性の効果であることを示唆する。
全体として、本発明の一般的な教示に従って構築されたｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３抗体は、その相当に高い生物学的活性ならびにその迅速かつ容易な生産の可能性、およびそれによる十分な量の高品質な臨床等級の材料の生産に関して、これまでに記載されているＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体よりも優れている。
【００１０】
それゆえ、本発明のｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３分子は、臨床試験において、非ホジキンリンパ腫のようなＢ細胞媒介性疾患の治療における二重特異性抗体の治療的利益を証明するのに適切な候補であることが予測される。
【００１１】
本発明のポリペプチドの好ましい態様において、上記ドメインは、ポリペプチドリンカーによって連結される。上記リンカーは、上記第１のドメインと第２のドメインとの間に配置される。ここで、上記ポリペプチドリンカーは、好ましくは、複数の親水性ペプチド結合アミノ酸を含有し、上記第１のドメインのＮ末端と上記第２のドメインのＣ末端とを連結する。
【００１２】
本発明のさらに好ましい態様において、上記ポリペプチドの上記第１および／または第２のドメインは、天然の抗体に由来するＶH およびＶL 領域を模倣するか、またはそれに相当する。本発明のポリペプチドに対する結合部位を提供する抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、合成抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメントなど）、またはそれらの内のいずれかの化学的に修飾された誘導体であり得る。モノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６  （１９７５）、４９５、およびＧａｌｆｒｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１）、３（これらは当該技術分野によって開発された改変で、免疫化された哺乳動物に由来する脾臓細胞へのマウス骨髄腫細胞の融合を含む）に最初に記載された技術によって調製され得る。
さらに、上述の抗原に対する抗体またはそのフラグメントは、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８に記載されている方法を使用することによって入手され得る。抗体は、ヒトを含むいくつかの種から入手され得る。上記抗体の誘導体がファージディスプレイ技術によって得られる場合、ビアコアシステム（ＢＩＡｃｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ）に使用されるような表面プラスモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いて、ＣＤ１９またはＣＤ３抗原のエピトープに結合するファージ抗体の効率を増大させ得る（Ｓｃｈｉｅｒ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７  （１９９６）、９７〜１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３  （１９９５）、７〜１３）。キメラ抗体の生産は、例えば、ＷＯ８９／０９６２２に記載されている。ヒト化抗体を生産する方法は、例えば、ＥＰ−Ａ１  ０  ２３９  ４００およびＷＯ９０／０７８６１に記載されている。本発明に従って利用される抗体のさらなる供給源は、いわゆる異種間抗体である。マウスにおけるヒト抗体のような異種間抗体の生産の一般的な原理は、例えば、ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５に記載されている。
【００１３】
本発明に従って使用される抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖は、当該分野で公知の従来技術（例えば、１つまたは複数の、アミノ酸欠失、挿入、置換、付加、および／または組換えならびに／あるいは当該分野で公知である任意の他の修飾、これら単独または組み合わせ）を用いてさらに改変され得る。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎をなすＤＮＡ配列にそのような改変を導入する方法は、当業者に周知である；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）  Ｎ．Ｙ．を参照のこと。適用される改変は、好ましくは、核酸レベルで行われる。
【００１４】
本発明のさらに好ましい態様において、上記ポリペプチドの少なくとも１つの上記ドメインは、抗体の可変領域の単鎖フラグメントである。
【００１５】
周知であるように、Ｆｖ（完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体フラグメント）は、非共有的会合による１つの重鎖および１つの軽鎖可変領域（ＶH およびＶL ）の二量体からなる。天然の抗体において見出される配置に対応するこの配置において、各々の可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＶH −ＶL 二量体の表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用する。集合的に、６つのＣＤＲは、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。ＣＤＲに隣接するフレームワーク（ＦＲ）は、ヒトおよびマウスほどに多様な種の天然の免疫グロブリンに本質的に保存されている三次構造を有する。これらのＦＲは、それらの適切な方向でＣＤＲを保持するのに寄与する。定常部ドメインは、結合機能には必要とされず、ＶH −ＶL 相互作用の安定化を補助し得る。単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのみのＣＤＲを含有するＦｖの半分）でさえ、通常、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識および結合する能力を有する（Ｐａｉｎｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１（１９７２）、１３２７〜１３３７）。従って、本発明のポリペプチド結合部位の上記ドメインは、同一または異なる免疫グロブリンのいずれかのＶH −ＶL 、ＶH −ＶH またはＶL −ＶL ドメインの組であり得る。ポリペプチド鎖内のＶH またはＶL ドメインの順序は、本発明については重要ではなく、上記のドメインの順序は、通常、機能のいかなる喪失をも伴うことなく逆転され得る。しかし、抗原結合部位が適切に折り畳まれ得るようにＶＨおよびＶＬドメインが配列されることは重要である。
【００１６】
本発明のポリペプチドの好ましい態様において、上記ドメインはＶL ＣＤ１９−ＶH ＣＤ１９−ＶH ＣＤ３−ＶL ＣＤ３の順序で配列される。ここで、「ＶL 」および「ＶH 」とは、特定の抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３抗体の可変ドメインの軽鎖および重鎖を意味する。
【００１７】
上記のように、上記結合部位は、可動性リンカー、好ましくは上記ドメイン間に配置されるポリペプチドリンカーによって好適に連結される。ここで、本発明のポリペプチドが、水溶液に配置されたときに結合に適した立体配座をとる場合、上記ポリペプチドリンカーは、上記結合部位を含有する上記ドメインの一方のＣ末端と上記結合部位を含有する上記ドメインの他方のＮ末端との間の距離を橋渡しするに十分な長さの複数の親水性のペプチド結合アミノ酸を含む。好ましくは、上記ポリペプチドリンカーは、多数のグリシン、アラニンおよび／またはセリン残基を含有する。上記ポリペプチドリンカーは、多数のアミノ酸配列の連続したコピーを含有することがさらに好ましい。通常、ポリペプチドリンカーは１〜１５個のアミノ酸を含有するが、１５個よりも多いアミノ酸のポリペプチドリンカーも同様に働き得る。
本発明の好ましい態様において、上記ポリペプチドリンカーは、１〜５個のアミノ酸残基を含有する。本発明の特に好ましい態様において、本発明のポリペプチド中の上記ポリペプチドリンカーは、５個のアミノ酸を含有する。付随する実施例に示されるように、上記ポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒを有利に含有する。
【００１８】
さらに特に好ましい態様において、必要に応じて、親抗体中の下記ＣＤＲとともに存在するフレームワーク領域との組み合わせで、本発明のポリペプチドの上記第１のドメインは、Ｆｉｇｕｒｅ８のヌクレオチド８２〜４１４（ＶL ）およびヌクレオチド４６０〜８３１（ＶH ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を含むＶH およびＶL 領域の少なくとも１つのＣＤＲを含有し、そして／または上記第２のドメインは、Ｆｉｇｕｒｅ８のヌクレオチド８４７〜１２０３（ＶH ）およびヌクレオチド１２５８〜１５７５（ＶL ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を含有するＶH およびＶL 領域の少なくとも１つのＣＤＲ、より好ましくは２つのＣＤＲ、最も好ましくは３つのＣＤＲを含む。Ｆｉｇｕｒｅ８に示される可変領域に含まれるＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔ「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、第３版、１９８３；第４版、１９８７；第５版、１９９０）によって決定され得る。当業者は、それらに由来する結合部位または少なくとも１つのＣＤＲが本発明のポリペプチドの構築に使用され得ることを容易に理解するであろう。好ましくは、上記ポリペプチドは、Ｆｉｇｕｒｅ８のヌクレオチド８２〜１５７５に示されるＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。当業者は、本発明のポリペプチドの結合部位が当該分野で公知の方法（例えば、ＥＰ−Ａ１  ０  ４５１  ２１６およびＥＰ−Ａ１  ０  ５４９  ５８１に記載される）に従って構築され得ることを容易に理解するであろう。
本発明のポリペプチドの結合部位のドメインは、好ましくは、それが由来する、例えば、抗体または免疫グロブリン鎖の結合特異性に少なくとも実質的に同一な特異性を有する。このような結合部位ドメインは、ＣＤ３抗原については少なくとも１０5 Ｍ-1、好ましくは１０7 Ｍ-1よりも高くなく、ＣＤ１９抗原については優位には１０10Ｍ-1までまたはそれ以上の結合親和性を有し得る。
本発明のポリペプチドの好ましい態様では、
（ａ）第１のドメインの上記結合部位が、少なくとも約１０-7Ｍ、好ましくは少なくとも約１０-9Ｍ、最も好ましくは少なくとも約１０-11 Ｍの親和性を有する；および／または
（ｂ）第２のドメインの上記結合部位は、約１０-7Ｍよりも少ない、好ましくは約１０-6Ｍよりも少ない、最も好ましくは１０-5Ｍのオーダーの親和性を有する。
上記の好ましい態様に従って、破壊対象の標的細胞を高い効率で捕捉するように、ＣＤ１９抗原を認識する結合部位が高い親和性を有する場合には有利である。他方で、ＣＤ３抗原を認識する結合部位の結合親和性は、天然のＣＤ３レセプターの結合親和性のオーダーまたはＴ細胞レセプターのそのリガンドとの相互作用（これは標的細胞表面上のＭＨＣペプチド複合体である）に関して通常見られる結合親和性のオーダーであるべきである。本発明の他の好ましい態様において、上記のポリペプチドは二重特異性単鎖抗体である。
本発明は、少なくとも１つのさらなるドメインを含有するポリペプチドにさらに関する。
上記ドメインは、共有または非共有結合によって連結されている。この連結は、当該分野で公知の方法および前記方法による遺伝学的融合に基づいてもよいし、または例えば、ＷＯ９４／０４６８６に記載されるような、例えば化学的架橋によって行われてもよい。本発明のポリペプチド中に存在するさらなるドメインは、好ましくは、可動性リンカー、優位にはポリペプチドリンカーによって結合部位ドメインの１つにに連結され得る。ここで、上記ポリペプチドリンカーが、水溶液に配置されたときに結合に適した立体配座をとる場合、上記ポリペプチドリンカーは、上記ドメインの一方のＣ末端と上記ドメインの他方のＮ末端との間の距離を橋渡しするに十分な長さの複数の親水性のペプチド結合アミノ酸を含む。好ましくは、上記ポリペプチドリンカーは、上記の態様に記載されたようなポリペプチドリンカーである。本発明のポリペプチドは、切断可能リンカー、またはエンテロキナーゼのようなプロテイナーゼの切断部位をさらに含み得る；付随する実施例も参照のこと。
【００１９】
さらに、上記さらなるドメインは、予め規定された特異性または機能を有し得る。例えば、文献には、生物活性物質（例えば、薬物、毒素、および酵素）を、体の特定の場所に標的化して、悪性細胞を破壊するか、または位置づけるか、あるいは局在化薬物または酵素の効果を誘導するための概念に対する多数の参照文献を含む。生物活性物質をモノクローナル抗体に結合することによってこの効果を達成することが提案されている（例えば、Ｎ．Ｙ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＧｈｏｓｅ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．６１（１９７８），６５７〜６７６を参照のこと）。
このことに関して、本発明のポリペプチドが、当該分野で公知の従来法によってさらに改変され得ることがまた理解される。このことは、本発明のポリペプチドおよび異種タンパク質に由来し得る他の機能性アミノ酸配列［例えば、核局在化シグナル、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ホルモン結合ドメイン、タンパク質タグ（ＧＳＴ、ＧＦＰ、ｈ−ｍｙｃペプチド、ＦＬＡＧ、ＨＡペプチド）］を含有するキメラタンパク質の構築を可能にする。付随する実施例に記載されるように、本発明のポリペプチドは、好ましくは約８アミノ酸長のＦＬＡＧタグを含有する；Ｆｉｇｕｒｅ８を参照のこと。
【００２０】
本発明のポリペプチドは、Ｂ細胞障害（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞に由来する慢性リンパ白血病（Ｂ−ＣＬＬ））を患う患者および／またはＢ細胞関連自己免疫疾患（例えば、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群）を有する患者に治療的に使用され得る。このような治療は、例えば、本発明のポリペプチドの投与によって達成され得る。このような投与は、非標識ならびに標識ポリペプチドを利用し得る。
例えば、本発明のポリペプチドは、治療薬剤で標識されて投与され得る。これらの薬剤は、本発明の抗体または抗原に直接的または間接的に結合され得る。直接的結合の１つの例は、スペーサー成分の使用によるものである。これらのスペーサー成分は、続いて、不溶性または可溶性であり得［Ｄｉｅｎｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１  （１９８６），１４８］、標的部位で抗原からの薬物放出が可能であり得るように選択され得る。免疫治療用の本発明のポリペプチドに連結され得る治療薬剤の例は、薬物、放射性同位体、レクチン、および毒素である。本発明のポリペプチドに結合され得る薬物としては、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、およびビンブラスチンのような薬物として古典的に呼ばれる化合物が挙げられる。
本発明の放射性同位体を結合したポリペプチドを例えば免疫治療に使用する場合、白血球分布ならびに安定性および放出のような因子に応じて所定の放射性同位体が他のものよりも好ましくあり得る。自己免疫応答に応じて、いくつかのエミッター（ｅｍｉｔｔｅｒｓ）が他のものよりも好ましくあり得る。一般に、αおよびβ粒子放出性放射性同位体が免疫治療において好ましい。212 Ｂｉのようなショートレイジ（ｓｈｏｒｔ  ｒａｇｅ）の、高エネルギーαエミッターが好ましい。治療目的のために本発明のポリペプチドに結合させ得る放射性同位体の例は、125 Ｉ、131 Ｉ、90Ｙ、67Ｃｕ、212 Ｂｉ、212 Ａｔ、211 Ｐｂ、47Ｓｃ、109 Ｐｄおよび188 Ｒｅである。
レクチンは、タンパク質であり、通常、植物材料から単離され、特定の糖成分に結合する。多くのレクチンはまた、細胞を凝集し、リンパ球を刺激し得る。しかし、リシンは、免疫治療的に使用されている有毒なレクチンである。これは、リシンのα−ペプチド鎖（これは、毒性を担う）を毒性作用の部位特異的送達が可能であるようにポリペプチドに結合することによって達成される。
毒素は、植物、動物、または微生物によって産生される有毒物質である。これらは十分な用量ではしばしば致命的である。ジフテリア毒素は、治療的に使用され得るコリネバクテリウム  ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）によって産生される物質である。この毒素は、適切な条件下で分離され得るαおよびβサブユニットからなる。毒性のＡ成分は、本発明のポリペプチドへの結合され得、本発明のポリペプチドへの結合により非常に近傍にもたらされ、相互作用するＢ細胞およびＴ細胞への部位特異的送達に使用され得る。
本発明のポリペプチドに結合され得る上記のような他の治療薬剤、ならびに対応するエキソビボおよびインビボ治療プロトコルは、公知であるか、または当業者によって容易に確認され得る。適切である場合には、当業者は、タンパク質性材料自身の代わりに上記のポリペプチドのいずれか１つをコードする以下に記載される本発明のポリヌクレオチドまたは対応するベクターを使用し得る。
【００２１】
従って、当業者は、本発明のポリペプチドが、所望の特異性および生物学的機能を有する他のポリペプチドの構築に使用され得ることを容易に理解するであろう。本発明のポリペプチドは、特に医学分野において（例えば、所定の形態のガンおよび自己免疫疾患のようなＢ細胞関連障害のための新規の治療アプローチの開発において、または対応する細胞性シグナル伝達経路の解析および調節のための興味深いツールとして）重要な治療的および科学的役割を演じることが予期される。
【００２２】
本発明のさらに好ましい態様において、上記の少なくとも１つのさらなるドメインは、生物学的活性に適切な立体配座を有するエフェクター分子、イオンを封鎖し得るアミノ酸配列、および固相支持体または予め選択された抗原に選択的に結合し得るアミノ酸配列からなる群から選択される分子を含む。
好ましくは、上記のさらなるドメインとしては、酵素、毒素、レセプター、結合部位、生合成抗体結合部位、成長因子、細胞分化因子、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、間接的に検出可能な成分、代謝拮抗物質、放射活性原子または抗原が挙げられる。上記抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、アレルゲン、自己抗原、ウイルス、微生物、ポリペプチド、ペプチドまたは多数の腫瘍細胞であり得る。
さらに、イオンを封鎖し得る上記配列は、好ましくは、カルモジュリン、メタロチオネイン、それらの機能性フラグメント、またはグルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、およびアルギニンの少なくとも１つに富んだアミノ酸配列から選択される。さらに、固相支持体に選択的に結合し得る上記ポリペプチド配列は、正または負に荷電したアミノ酸配列、システイン含有アミノ酸配列、アビジン、ストレプトアビジン、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡの機能性フラグメント、ＧＳＴ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグまたはＬｅｘＡであり得る。付随する実施例に記載されるように、単鎖抗体によって例示される本発明のポリペプチドはまた、Ｎ末端ＦＬＡＧタグおよび／またはＣ末端Ｈｉｓタグとともに発現されており、それにより容易な精製および検出が可能である。実施例において使用されるＦＬＡＧタグは、８個のアミノ酸（Ｆｉｇｕｒｅ８参照のこと）を含有し、それゆえ、本発明に従って好適に使用される。しかし、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐのような付随する実施例にて使用されるＦＬＡＧの短縮版からなるＦＬＡＧタグは、同様に適切である。
【００２３】
上記のエフェクター分子およびアミノ酸配列は、例えば、所定の細胞の環境に進入した場合に、それ自身が活性であるかまたはそうではなく、そして除去され得る形式（ｐｒｏｆｏｒｍ）で存在し得る。
【００２４】
本発明の最も好ましい態様において、上記レセプターは、Ｔ細胞活性化に重要な共刺激表面分子であるか、またはエピトープ結合部位またはホルモン結合部位を含む。
【００２５】
本発明のさらに最も好ましい態様において、上記共刺激表面分子は、ＣＤ８０（Ｂ７−１）またはＣＤ８６（Ｂ７−２）である。
さらに、さらなる態様において、本発明は、発現の際に上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。上記ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの適切な転写および翻訳を確実するために、当該分野で公知の適切な発現調節配列に融合され得る。
上記ポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドを単独または組み合わせて含有する、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成により産生されたＤＮＡまたはＲＮＡあるいは組換え的に産生されたキメラ核酸分子であり得る。好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、ベクターの一部分である。このようなベクターは、適切な宿主細胞内および適切な条件下での上記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子のようなさらなる遺伝子を含有し得る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、発現調節配列に作動可能に連結され、それによって原核生物細胞または真核生物細胞内での発現が可能になる。上記ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへのポリヌクレオチドの転写を含む。真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞中での発現を確実にする調節エレメントは、当業者に周知である。それらは、転写の開始を確実する調節配列ならびに任意で転写の終結および転写産物の安定化を確実するポリＡシグナルを含む。さらなる調節エレメントとしては、転写ならびに翻訳のエンハンサー、および／あるいは天然に会合しているかまたは異種のプロモーター領域が挙げられ得る。原核生物宿主細胞における発現を許容する、可能な調節エレメントとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターが挙げられ、真核生物宿主細胞において発現を許容する調節エレメントの例としては、酵母におけるＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモーターまたは哺乳動物および他の動物細胞におけるＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶプロモーター［ラウス肉腫（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ）ウイルス］、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサーまたはグロビンイントロンが挙げられる。転写の開始を担うエレメントにに加えて、上記の調節エレメントはまた、ポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル（例えば、ＳＶ４０−ポリＡ部位またはｔｋ−ポリＡ部位）を含み得る。さらに、使用される発現系に応じて、ポリペプチドを細胞の区画に指向させるか、ポリペプチドを培地中に分泌させ得るリーダー配列が、本発明のポリヌクレオチドのコード配列に付加され得、それらは当該分野において周知である；さらに、例えば、付随する実施例を参照のこと。リーダー配列（単数または複数）は、適切な段階で翻訳、開始および終結の配列と組み合わされ、好ましくは、リーダー配列は、周辺質空間または細胞外の培地に翻訳されたタンパク質またはその一部分の分泌を指向させ得る。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または精製の単純化；前述を参照のこと）を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。これに関連し、適切な発現ベクターは、当該分野において公知である（例えば、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ−ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ））。
好ましくは、発現調節配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし得るベクター中の真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主用の調節配列もまた使用され得る。一旦、ベクターが、適切な宿主中に取り込まれると、その宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で維持され、そして所望される場合、本発明のポリペプチドの回収および精製が続き得る；例えば、付随する実施例を参照のこと。
【００２６】
上記のように、本発明のポリヌクレオチドは、単独またはベクターの一部分として使用されて、例えば、Ｂ細胞障害に関連する疾患の遺伝子治療または診断のために細胞中で本発明のポリペプチドを発現し得る。上記のポリペプチドのいずれか１つをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドまたはベクターは、次いで目的のポリペプチドを産生する細胞中に導入される。エキソビボまたはインビボ技術によって治療用遺伝子を細胞に導入することに基づく遺伝子治療は、遺伝子伝達の最も重要な適用の１つである。インビトロまたはインビボでの遺伝子治療のための適切なベクター、方法または遺伝子送達系は、文献に記載されており、当業者に公知である；例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１９９６）５３４〜５３９；Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９（１９９６），９１１〜９１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６（１９９２），８０８〜８１３；Ｖｅｒｍａ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９（１９９４），２３９；Ｉｓｎｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ  ３４８（１９９６），３７０〜３７４；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７７（１９９５）、１０７７〜１０８６；Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｂｌｏｏｄ  ９１（１９９８），３０〜３６；Ｖｅｒｍａ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５（１９９８），６９２〜６９９；Ｎａｂｅｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１１（１９９７），２８９〜２９２；Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（１９９８），２２４３〜５１；Ｗａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１９９６），７１４〜７１６；ＷＯ  ９４／２９４６９；ＷＯ  ９７／００９５７、ＵＳ  ５，５８０，８５９；ＵＳ  ５，５８９，４６６；またはＳｃｈａｐｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７（１９９６），６３５〜６４０、および本明細書中に引用される参照文献を参照のこと。本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、細胞への直接的な導入あるいはリポソームまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）による導入のために設計され得る。好ましくは、上記細胞は、生殖系列細胞、胚細胞、または卵細胞あるいはそれらに由来するものであり、最も好ましくは、上記細胞は幹細胞である。胚幹細胞の例は、とりわけ、Ｎａｇｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  （１９９３），８４２４〜８４２８に記載されるような幹細胞であり得る。
上記に従って、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクター、特に遺伝子操作に慣習的に使用されるプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージに関する。好ましくは、上記ベクターは発現ベクターおよび／あるいは遺伝子伝達または標的化ベクターである。ウイルスに由来する発現ベクター（例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルス）は、標的とする細胞集団への本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの送達のために使用され得る。当業者に周知である方法は、組換えベクターを構築するために使用され得る；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）  Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術を参照のこと。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞への送達のためにリポソーム中に再構築され得る。本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターは、周知の方法によって宿主細胞に伝達され得、これは細胞宿主のタイプに応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核生物細胞に一般に利用され、一方、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは、他の細胞宿主に使用され得る；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照のこと。一旦発現されると、本発明のポリペプチドは、当該分野の標準的な手順によって精製され得、それらには、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが挙げられる；Ｓｃｏｐｅｓ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと。薬学的使用には、少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質的に純粋なポリペプチドが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均一性が最も好ましい。一旦、部分的にまたは所望の均一性まで精製されると、ポリペプチドは、次いで治療的（体外を含む）にまたはアッセイ手順を開発および実施するのに使用され得る。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、上記のポリヌクレオチドまたはベクターを含有する細胞に関する。好ましくは、上記細胞は真核生物細胞であり、ポリペプチドの治療的使用が予想される場合には最も好ましくは哺乳動物細胞である。勿論、酵母およびあまり好ましくない原核生物細胞（例えば、細菌細胞）も、とりわけ、産生されるポリペプチドが診断手段として使用される場合には同様に利用し得る。
宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノム中に組み込まれてもよいし、染色体外に維持されてもよい。
用語「原核生物」は、本発明のポリペプチド発現のためにＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされ得る全ての細菌が含まれることを意味する。原核生物宿主としては、グラム陰性ならびにグラム陽性の細菌［例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，セラチア  マルケセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびバチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）］が挙げられ得る。用語「真核生物」は、酵母、高等植物、昆虫および好ましくは哺乳動物細胞が含まれることを意味する。組換え体産生手順において使用される宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもよいし、されていなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた、開始のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当業者に一般に公知である任意の技術を用いて、宿主を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。特に好ましいのは、本発明のポリペプチドのコード配列ならびにそれに遺伝学的に融合されたＮ末端のＦＬＡＧタグおよび／またはＣ末端Ｈｉｓタグを含有するプラスミドまたはウイルスの使用である。好ましくは、上記ＦＬＡＧタグは、約４〜８アミノ酸であり、最も好ましくは８アミノ酸である。融合された、作動可能に連結された遺伝子を調製し、例えば哺乳動物細胞および細菌内でそれらを発現させる方法は、当該分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。本明細書中に記載される遺伝学的構築物および方法は、真核生物宿主または原核生物宿主中での本発明のポリペプチドの発現に利用され得る。一般に、挿入されたポリヌクレオチドの効率的な転写を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターが、宿主に関連して使用される。発現ベクターは、代表的には複製起点、プロモーター、およびターミネーター、ならびに形質転換細胞の表現型選択を提供し得る特定の遺伝子を含む。さらに、本発明の細胞を含有するトランスジェニック動物、好ましくは哺乳動物は、本発明のポリペプチドの大規模産生のために使用され得る。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は上記のポリペプチドの調製方法に関し、それには上記ポリペプチドの発現に適切な条件下で本発明の細胞を培養すること、およびその細胞または培養培地からそのポリペプチドを単離することが含まれる。形質転換された宿主は、至適な細胞増殖を達成するための当該分野で公知の技術に従って発酵槽中で増殖および培養され得る。本発明のポリペプチドは、次いで増殖培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から単離され得る。例えば、微生物により発現された本発明のポリペプチドの単離および精製は、任意の従来の手段（例えば、分離用クロマトグラフィーによる分離、免疫学的分離（例えば、本発明のポリペプチドのタグに指向するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含む分離または付随する実施例に記載されるような分離）により行われ得る。
【００２９】
従って、本発明は、ＣＤ１９およびＣＤ３抗原の各々のエピトープに対する親和性および特異性を有する結合部位、および任意にさらなる機能性ドメインを含有するポリペプチドの組換え体産生を可能にする。前述から明白であるように、本発明は、治療的および診断的アプローチにおける任意の使用のための結合部位を含有する、大きなファミリーのポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドが、例えば、薬物標的化および画像診断への適用のために上記のような他の成分にさらに結合され得ることは当業者にとって明白なことである。そのような結合は、付着の部位へのポリペプチドの発現の後に化学的に行われてもよいし、結合産物がＤＮＡレベルで本発明のポリペプチドに操作されてもよい。このＤＮＡは次いで適切な宿主系にて発現され、発現されたタンパク質が収集され、必要であれば再生される。上記のように、結合部位は、好ましくは抗体の可変領域に由来する。この点に関して、ハイブリドーマ技術は、免疫応答を生じる本質的に任意の所望の物質に対する抗体を分泌する細胞株の産生を可能にする。次いで、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖をコードするＲＮＡがハイブリドーマの細胞質から入手され得る。ｍＲＮＡの５’末端部分は、本発明の方法に用いられるｃＤＮＡを調製するのに使用され得る。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、引き続いて、細胞、好ましくは哺乳動物細胞において発現され得る。
【００３０】
宿主細胞に応じて、再生技術が適切な立体配座を達成するために必要とされ得る。必要であれば、結合を至適化するために求められる点置換が、従来のカセット変異誘発または本明細書中に開示されるような他のタンパク質工学方法論において行われ得る。本発明のポリペプチドの調製はまた、生物学的活性タンパク質（例えば、酵素、毒素、成長因子、細胞分化因子、レセプター、代謝拮抗物質、ホルモンあるいは種々のサイトカインまたはリンホカイン）のアミノ酸配列（あるいは対応するＤＮＡまたはＲＮＡ配列）の知識に依存し得る。このような配列は、文献に報告されており、コンピューター化されたデータバンクを通じて利用可能である。例えば、本発明のポリペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドは、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）１リンカーによって連結されるヒト共刺激タンパク質ＣＤ８０（Ｂ７−１）の単鎖Ｆｖフラグメントおよび細胞外部分からなる本発明のポリペプチドが構築され得る。ＣＤ８０共刺激タンパク質はＩｇスーパーファミリーに属する。これは２６２アミノ酸のかなりグリコシル化されたタンパク質である。より詳細な記載が、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３  （１９８９），２７１４〜２７２２によって公表された。安定な発現は、例えば、Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５  （１９９０），５３７〜５６６に記載されるようなＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ細胞において行われ得る。次いでこのタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いることによってＣ末端に付着したＨｉｓタグにより精製され得る（Ｍａｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２（１９９５），７０２１〜７０２５）。
【００３１】
さらに、本発明は、本発明の上述のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターを含有する組成物を提供する。
【００３２】
好ましくは、本発明は、本発明の上述のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターを含有する医薬組成物である組成物に関する。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され得るキャリアーをさらに含み得る。適切な医薬用キャリアーの例は、当該分野において周知であり、リン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、滅菌水溶液などが挙げられる。このようなキャリアーを含有する組成物は、周知の従来法によって処方され得る。これらの医薬組成物は、適切な用量で被検体に投与され得る。適切な組成物の投与は、異なる方法（例えば、静脈内投与、腹部内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、皮内投与）によって達成され得る。投与レジメは、担当医師および臨床的因子によって決定される。医学分野で周知あるように、任意の患者に対する用量は多くの因子に依存し、それらには、患者の大きさ、身体表面面積、投与する特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全身の健康、および同時に投与される他の薬物が挙げられる。一般に、医薬組成物の調節投与としてのレジメは、１日あたり１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲であるべきである。レジメが持続性注入である場合、それはまた、体重の１キログラムあたり１分あたり１μｇ〜１０ｍｇ単位であるべきである。しかし、持続性注入のより好ましい用量は、体重の１キログラムあたり１時間あたり０．０１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲であり得る。特に好ましい用量は、本明細書以下で説明する。経過は、定期的評価によってモニターされ得る。用量は変化するが、ＤＮＡの静脈内投与の好ましい用量は、約１０6 〜１０12コピーのＤＮＡ分子である。本発明の組成物は、局所的に投与されてもよいし、体系的に投与されてもよい。投与は、一般に、非経口的（例えば、静脈内）であり；ＤＮＡはまた、例えば、内部または外部の標的部位への微粒子銃送達または動脈内の部位へのカテーテルによって、標的部位に直接的に投与され得る。非経口投与用の調製物としては、無菌の水性または非水系の溶液、懸濁物、およびエマルジョンが挙げられる。非水系溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。水性のキャリアーとしては、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁物が挙げられ、それらには生理食塩水および緩衝化培地が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ）のブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルは、液体補充物および栄養補充物、電解質補充物（例えば、リンゲルのブドウ糖に基づく補充物）などを含む。保存剤および他の添加物もまた存在し得る（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなど）。さらに、本発明の医薬組成物は、タンパク質性キャリアー（例えば、血清アルブミンまたは免疫グロブリン好ましくはヒト起源の免疫グロブリン）を含み得る。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の使用意図に応じて、さらに生物学的活性な薬剤を含み得ることが予想される。このような薬剤は、消化器系に作用する薬物、細胞分裂停止剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃａ）として作用する薬物、高尿酸血症（ｈｙｐｅｒｕｒｉｋｅｍｉａ）を防止する薬剤��よび／またはＴ細胞共刺激分子のような薬剤または当該分野で公知のサイトカインであり得る。
【００３３】
本発明の種々のポリヌクレオチドおよびベクターは、単独または標準的なベクターおよび／または遺伝子送達系（必要に応じて薬学的に許容され得るキャリアーまたは賦形剤とともに）を用いて任意の組み合わせで投与され得ることが本発明によって予想される。投与に続いて、上記ポリヌクレオチドまたはベクターは、被検体のゲノムに安定に組み込まれ得る。
【００３４】
他方で、所定の細胞または組織に特異的であり、その細胞中に存続するウイルスベクターが使用され得る。適切な医薬用キャリアーおよび賦形剤は、当該分野で周知である。本発明に従って調製された医薬組成物は、Ｂ細胞関連性の免疫不全および悪性疾患に関連する種々の疾患の予防または治療、あるいはそれを遅延するために使用され得る。
【００３５】
さらに、遺伝子治療において、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含有する本発明の医薬組成物を使用することが可能である。適切な遺伝子送達系としては、とりわけ、リポソーム、レセプター媒介性送達系、裸のＤＮＡ、およびウイルスベクター（例えば、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスウイルスベクター）が挙げられる。遺伝子治療のための身体の特定部位への核酸の送達はまた、Ｗｉｌｌｉａｍｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８  （１９９１），２７２６〜２７２９）に記載されるような微粒子銃送達系を用いて達成され得る。核酸の送達のためのさらなる方法としては、例えば、Ｖｅｒｍａ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１５  （１９９８），６９２〜６９９に記載されるような粒子媒介性遺伝子伝達が挙げられる。導入されたポリヌクレオチドおよびベクターが、上記細胞への導入の後に遺伝子産物を発現し、好ましくは上記細胞の生存期間の間、その状態のままであることを理解されたい。例えば、適切な制御配列の制御下でポリヌクレオチドを安定して発現する細胞株は、当業者に周知な方法に従って操作され得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、同一または別々のプラスミド上の本発明のポリヌクレオチドおよび選択マーカーで形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞を、富化培地中で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に転換する。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞の染色体に安定に組み込まれたプラスミドを有する細胞の選択を可能にし、増殖巣（これは次いでクローン化され、細胞株に拡大され得る）を形成するように増殖させる。このような操作された細胞株はまた、例えばＢ細胞／細胞相互作用に関与する化合物の検出のためのスクリーニング法において特に有用である。
多数の選択系が使用され得、それらには、各々ｔｋ- 、ｈｇｐｒｔ- またはａｐｒｔ- 細胞における単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｃｅｌｌ  １１  （１９７７），２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８  （１９６２），２０２６）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｃｅｌｌ  ２２  （１９８０），８１７）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、代謝拮抗物質耐性は、ｄｈｆｒ（メトトレキセートに対する耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７  （１９８０），３５６７；ＯＨａｒｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８  （１９８１），１５２７））；ｇｐｔ（マイコフェノール酸に対する耐性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８  （１９８１），２０７２））；ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ−４１８（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０  （１９８１），１））；ｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシン（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，Ｇｅｎｅ  ３０  （１９８４），１４７））；またはプロマイシン（ｐａｔ，プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ）に関する選択の基剤として使用され得る。さらなる選択可能な遺伝子が記載されている（例えば、ｔｒｐＢ（細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）、ｈｉｓＤ（細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（ｈｉｓｔｉｎｏｌ）を利用すること可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５  （１９８８），８０４７）；およびＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（オルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与する）（ＭｃＣｏｌｏｇｕｅ，１９８７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編））。
【００３６】
別の態様において、本発明は、上記の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターのいずれか１つ、および必要に応じて検出のための適切な手段を含有する診断用組成物に関する。
【００３７】
本発明のポリペプチドはまた、イムノアッセイにおける使用に適切である。ここで、本発明のポリペプチドは、液相にて利用されるか、または固相担体（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）に結合して利用され得る。本発明のポリペプチドを利用し得るイムノアッセイの例は、直接的または間接的な形式のいずれかの競合および非競合イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（イムノメトリックアッセイ（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ））およびウエスタンブロットアッセイである。
本発明のポリペプチドは、多数の異なる担体（ｃａｒｒｉｅｒ）に結合され得、上記ポリペプチドに特異的に結合する細胞を単離するのに使用され得る。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾されたセルロース、コロイド金属、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のために可溶性であってもよいし、または不溶性であってもよい。
【００３８】
当業者に公知な多数の異なる標識および標識方法が存在する。本発明に使用され得る標識のタイプの例としては、酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物が挙げられる；さらに上記に考察した態様を参照のこと。
【００３９】
本発明はまたＢ細胞悪性疾患の治療、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患の治療またはＢ細胞の欠乏（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）のための医薬組成物の調製のための、上記の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびベクターの使用に関する。
二重特異性抗体を用いる、ヒトＴ細胞の再標的化細胞傷害性活性に関する最近の臨床研究は、不応性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）ホジキン病（３３）、乳ガンおよび卵巣ガン（３４〜３７）および悪性神経膠腫（３８）の治療において有望な結果を示した。
−ｂｓｃ抗体は、それらの低分子量のために腫瘍への進入を促進する（ＦａｂまたはＦｖフラグメントについて示されているように）（３９）；および
−ｂｓｃ抗体は、従来の二重特異性抗体のＦｃ部分によって媒介される全身性のサイトカイン放出によって引き起こされる、用量依存性および用量制限性の毒性を減少するようである（４０）；および
−インタクトなモノクローナル抗体（ＣＤ２０に指向する）でさえも、進行した段階のＮＨＬにおいて腫瘍退行を導いた（４１、４２）ということを考慮すれば、本発明のポリペプチドが、さらなる治療的改良に貢献する興味深い分子であることであることが予測され、実際に示された。
従って、好ましい態様において、本発明の医薬組成物は、非ホジキンリンパ腫の治療に使用される。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびベクターの投与の用量範囲は、Ｂ細胞媒介性疾患の症状が寛容される所望の効果を産生するに十分な大きさの範囲である。用量は、本質的に有害な副作用（例えば、不必要な交差反応、アナフィラキシー反応など）を引き起こすほどに大きくないべきである。一般に、用量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度によって変化し、当業者によって決定され得る。用量は、任意の反対の徴候  （ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）の場合には個々の医師によって調整され得る。上記用量の範囲は、例えば、０．０１μｇ〜１０ｍｇの本発明のポリペプチドに設定することが予想される。特に好ましい用量は、０．１μｇ〜１ｍｇであり、さらにより好ましくは、１μｇ〜１００μｇであり、最も好ましくは、例えば付随する実施例７に説明されるような３μｇ〜１０μｇの用量である。
【００４０】
さらに、本発明は、Ｔ細胞活性化化合物または共刺激化合物を同定するか、またはＴ細胞の活性化および刺激のインヒビターを同定する方法に関し、以下を含む：
（ａ）本発明のポリペプチドの存在下で、必要に応じてＴ細胞活性化に応じて検出可能シグナルを提供し得る成分の存在下で、ＣＤ１９陽性細胞（好ましくはＢ細胞）およびＴ細胞をスクリーニングされるべき化合物とともに、細胞と化合物との相互作用を許容する条件下で培養する工程；および
（ｂ）細胞との化合物の相互作用から産生されるシグナルの存在または非存在を検出する工程。
この態様は、共刺激分子としての化合物の能力を試験するために特に有用である。この方法において、ＣＤ１９陽性細胞／Ｂ細胞は、Ｔ細胞に対する一次活性化シグナル（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）を提供し、従って、クロノタイプＴ細胞レセプターを回避する。次いで、試験対象の化合物のいずれが、Ｔ細胞を実際に活性化するするのに依然として必要であるかを本発明に従って決定され得る。本発明の方法において、ＣＤ１９陽性細胞／Ｂ細胞は、同一のＴ細胞表面上のＣＤ３複合体に結合される二重特異性分子を連結する刺激細胞として機能する。培養、検出、および必要に応じて試験を実行するための生物学的方法は、当業者に明白である。
本発明の方法における用語「化合物」は、同一であってもよいし、そうでなくともよい単一物質または複数の物質を含む。
上記化合物は、例えば、植物、動物または微生物からのサンプル（例えば、細胞抽出物）に含まれ得る。さらに、上記化合物は、当該分野において公知であるが、Ｔ細胞活性化を阻害し得ることが知られておらず、Ｔ細胞共刺激因子として有用であることも知られていない。複数の化合物は、例えば、培養培地に添加されるか、細胞に注入され得る。
１または複数の化合物を含有するサンプルが、本発明の方法において同定される場合、問題の化合物を含有するとして同定された元のサンプルから化合物を単離することか、または例えば、それが多数の異なる化合物からなる場合、サンプルあたりの異なる物質の数を減少させ、本来のサンプルの細分化をともなう方法を繰り返すために元のサンプルをさらに細分化し得る。次いで、上記サンプルまたは化合物が、本明細書中および付随する実施例に記載されるような当該分野で公知の方法により所望の特性を示すかどうかを決定され得る。サンプルの複雑さに応じて、上記の工程は、数回、好ましくは本発明の方法に従って同定されるサンプルが、限定された数または単一の物質のみを含むようになるまで行われ得る。好ましくは、上記サンプルは、物質または類似の化学的および／または物理的特性を含み、最も好ましくは上記物質は同一である。本発明の方法は、例えば、先行文献に記載される他の細胞に基づくアッセイに従って、または付随する実施例に記載されるような方法を使用および改良することによって当業者によって容易に行われ、設計され得る。さらに、当業者は、さらにどの化合物および／または細胞が本発明の方法を行うために使用されることかを容易に認識する（例えば、インターロイキン、または酵素、必要であれば次にＴ細胞活性化を刺激するか、抑制する前駆体に所定の化合物を変換するもの）。このような本発明の方法の適応は、充分に当業者の技術内にあり、過度の実験を必要とすることなく実施され得る。
【００４１】
本発明の方法に従って使用され得る化合物としては、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小有機化合物、リガンド、ペプチド模倣物、ＰＮＡなどが挙げられる。上記化合物はまた、既知のＴ細胞活性化因子またはインヒビターの機能性誘導体またはアナログであり得る。化学的誘導体およびアナログの調製の方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ編  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｉｎｃ．，１７５  Ｆｉｆｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１００１０  Ｕ．Ｓ．Ａ．およびＯｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡに記載されている。さらに、上記誘導体およびアナログは、当該分野で公知の方法に従って、または例えば、付随する実施例に記載されるようにして、それらの効果について試験され得る。さらに、ペプチド模倣物および／またはＴ細胞活性化の適切な活性化因子またはインヒビターのコンピューター補助設計が、下記の方法に従って使用され得る。適切なコンピュータープログラムが、相補的構造モチーフに関するコンピューター補助検索による本発明の推定上のインヒビターと抗原との相互作用部位の同定のために使用され得る（Ｆａｓｓｉｎａ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ５  （１９９４），１１４〜１２０）。タンパク質およびペプチドのコンピューター補助設計のためのさらなる適切なコンピューターシステムは、先行文献に記載されている（例えば、Ｂｅｒｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２  （１９９４），１０３３〜１０３６；Ｗｏｄａｋ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５０１    （１９８７），１〜１３；Ｐａｂｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５  （１９８６），５９８７〜５９９１）。上記コンピューター分析から得られる結果は、例えば、既知のＴ細胞活性化因子またはインヒビターを至適化するために本発明の方法と組み合わせて使用され得る。適切なペプチド模倣物はまた、例えば、本明細書中および付随する実施例に記載される方法に従って、連続した化学修飾および、得られる化合物を試験することによってペプチド模倣物のコンビナトリアルライブラリー（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ）の合成によって同定され得る。ペプチド模倣物のコンビナトリアルライブラリーの産生および使用の方法は、先行文献に記載されており、例えば、Ｏｓｔｒｅｓｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６７  （１９９６），２２０〜２３４およびＤｏｒｎｅｒ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４  （１９９６），７０９〜７１５に記載されている。さらに、Ｂ細胞／Ｔ細胞相互作用のインヒビターまたは活性化因子の三次元構造および／または結晶構造は、本発明の方法において試験されるべきＴ細胞活性化のペプチド模倣物のインヒビターまたは活性化因子の設計のために使用され得る  （Ｒｏｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５  （１９９６），１２９３３〜１２９４４；Ｒｕｔｅｎｂｅｒ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４  （１９９６），１５４５〜１５５８）。
【００４２】
要約すると、本発明は、Ｂ細胞／Ｔ細胞媒介性免疫応答を調節し得る化合物を同定する方法を提供する。
Ｂ細胞／Ｔ細胞媒介性応答を活性化することが見出された化合物は、ガンおよび関連する疾患の治療に使用され得る。さらに、ウイルス疾患を特異的に阻害することも可能であり得、それによってウイルス感染またはウイルス伝播を防止し得る。Ｔ細胞の活性化または刺激のサプレッサーとして同定された化合物は、移植片拒絶を回避するために臓器移植に使用され得る；上述も参照のこと。
本発明の方法によって同定または入手される化合物は、従って、診断適用および特に治療適用に非常に有用であることが予測される。従って、さらなる態様において、本発明は、医薬組成物の生産のための方法に関し、本発明の上記方法の工程（ｂ）において同定される化合物を薬学的に許容され得る形態で処方する工程を含む。さらに、上記成分は、ペプチド模倣物によって改変され得ることが予想される。ペプチド模倣物のコンビナトリアルライブラリーの産生および使用のための方法は、先行文献に記載されている（例えば、Ｏｓｔｒｅｓｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６７  （１９９６），２１０〜２３４，Ｄｏｒｎｅｒ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４  （１９９６），７０９〜７１５、Ｂｅｅｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２  （１９９４），２１３〜２１６、またはａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９  （１９９８），２０５〜２２３）。
本発明の方法に従って同定される治療的に有用な化合物は、特定の化合物に対する任意の適切な方法（例えば、経口、静脈内、非経口、経皮、経粘膜、あるいは外科手術または移植（例えば、固体または半個体の生物学的に適合可能および再吸収可能なマトリックスの形態である化合物での）によって、化合物の効果が所望される部位またはその付近で患者に投与され得る。治療用量は、当業者によって適切であるように決定される。上述を参照のこと。
【００４３】
さらに、本発明は、Ｂ細胞悪性疾患の治療、Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患の治療またはＢ細胞の欠乏のための方法および／またはＢ細胞障害によって引き起こされる病理学的状態を遅延させる方法を提供する。これらの方法は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターを、上記悪性疾患、疾患および／または病理学的状態により冒された哺乳動物に導入する工程を含む。上記哺乳動物がヒトであることがさらに好ましい。
【００４４】
これらおよび他の態様は、本発明の詳細な説明および実施例によって開示され、そして包含される。本発明に従って使用される任意の抗体、方法、使用および化合物に関するさらなる文献は、例えば、電子機器を用いて、公共図書館およびデータベースから検索され得る。例えば、公共の図書館およびデータベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」は、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌでインターネット上で利用可能である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／のようなさらなるデータベースおよびアドレスは、当業者に公知であり、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｙｃｏｓ．ｃｏｍを用いても入手され得る。バイオテクノロジーにおける特許情報の概観ならびに遡及的検索および現状の認識のために有用な特許情報の関連ソースの調査は、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２  （１９９４），３５２〜３６４に記載されている。
【００４５】
本発明は、ここから以下の生物学的な実施例に関して記載される。実施例は、単なる例証であり、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。
【００４６】
実施例１：可変（Ｖ）免疫グロブリンドメインのクローニング
ＨＤ３７ハイブリドーマ（２２）由来のＶ軽鎖（ＶＬ）およびＶ重鎖（ＶＨ）ドメインを、標準的なＰＣＲ法（２３）に従ってクローン化した。ｃＤＮＡ合成を、オリゴｄＴプライマーおよびＴａｑポリメラーゼを用いて行った。
【００４７】
0004169478.tif 000002
【００４８】
ＰＣＲによるＶドメインの増幅のために、本発明者らは、ＶL ドメインに隣接したプライマー５’Ｌ１および３’Ｋ、ならびにＤｕｅｂｅｌら（２４）によって記載されたプライマーに基づく重鎖のための５’Ｈ１および３’Ｇを使用した。
抗ＣＤ３ｓｃＦｖフラグメントのｃＤＮＡは、Ａ．Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ（２５）の好意により提供された。
【００４９】
実施例２：二重特異性単鎖フラグメントおよび真核生物発現の構築
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖフラグメントを入手するために、別々のプラスミドベクターにクローン化された対応するＶＬおよびＶＨ領域を、各々オリゴヌクレオチドプライマーペア５ＶＬＢ５ＲＲＶ／３ＶＬＧＳ１５および５ＶＨＧＳ１５／３ＶＨＢｓｐＥＩを用いて、ＶＬおよびＶＨ特異的ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。それによって重複する相補的配列をＰＣＲ産物に導入し、これを引き続く融合ＰＣＲの間に１５アミノ酸（Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ1 ）3 リンカーのコード配列を形成するように組み合わせた。この増幅工程を、プライマーペア５ＶＬＢ５ＲＲＶ／３ＶＨＢｓｐＥＩを用いて行い、得られた融合産物（または抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖフラグメント）を、制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＢｓｐＥＩで切断し、そのようにしてＮ末端ＦＬＡＧタグ（１）を有する抗１７−１Ａ／抗ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の（ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ１クローン化）コード配列、またはＦＬＡＧ／エピトープ（２１）を有さない改変版の（ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ１クローン化）コード配列のいずれかを含むｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳベクター（ストラテジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にクローン化した。それによって各々、抗１７１Ａ特異性を抗ＣＤ１９特異性により置換し、Ｃ末端の抗ＣＤ３  ｓｃＦｖフラグメントを連結する５アミノ酸（Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ1 ）1 リンカーを保存した。引き続いて、ＶＬCD19−ＶＨCD19−ＶＨCD3 −ＶＬCD3 のドメイン配列を有する両方の版の抗ＣＤ１９／抗ＣＤ３二重特異性単鎖抗体をコードするＤＮＡフラグメントを、記載される発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＲＦ（１）に各々、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩでサブクローン化した。得られたプラスミドＤＮＡを、エレクトロポレーションによってＤＨＦＲ欠乏性ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした；選択、遺伝子増幅およびタンパク質産生を、記載されるように行った（１）。以下の実施例において、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３のＦＬＡＧ含有版を用いて得られた結果を説明する。
【００５０】
トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清からのｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の精製により、４ｍｇ／リットルの培養上清が生じた。ｂｓｃ−Ａｂを、記載されるようなＮｉ−ＮＴＡカラムにおけるアフィニティークロマトグラフィーによってｂｓｃ−ＡｂのＣ末端ヒスチジン尾部により精製した（１）。ｂｓｃ−Ａｂを、２００ｍＭイミダゾールの濃度の個別のピークとしてＮｉ−ＮＴＡカラムから溶出させた。ＳＤＳ−Ｐａｇｅを、Ｌａｅｍｍｌｉ（２６）に従って１２％ゲルで行い、続いてｂｓｃ−Ａｂの精製を分析するためにクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果（Ｆｉｇ．１）は、予想されたサイズのｂｓｃ−Ａｂ（６０ｋＤａ）を示す。
【００５１】
実施例３：ｂｓｃ−ＡｂＣＤ１９×ＣＤ３の結合特性
ＣＤ３およびＣＤ９へのｂｓｃ−Ａｂの結合特異性を、ＣＤ３陽性ジャーカット細胞、ヒトＰＢＭＣおよびＢｌｉｎ  Ｉ、ＳＫＷ６．４、Ｄａｕｄｉ、ＢＪＡＢおよびＲａｊｉ多数の異なるＣＤ１９陽性Ｂ細胞リンパ腫細胞株におけるフローサイトメトリー解析により示した。ＣＤ１９陽性Ｂ細胞株Ｄａｕｄｉ，Ｒａｊｉ，ＢＪＡＢ（Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫）、ＳＫＷ６．４（ヒトＥＢＶ形質転換Ｂ細胞）およびＢｌｉｎ−１（プレＢ細胞株）を、フローサイトメトリー解析およびクロム放出アッセイに使用した。Ｊｕｒｋａｔは、ＣＤ３陽性Ｔ細胞株である；ＢＬ６０およびプラスマ細胞腫細胞株ＮＣＩおよびＬ３６３は、表面分子、ＣＤ３およびＣＤ１９の両方に関してネガティブである。細胞株を、１０％  ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ）を有する完全なＲＰＭＩ  １６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）において培養した。
１×１０6 細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％  Ｖｅｒｎｉｍｍｕｎ（Ｃｅｎｔｅｏｎ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および０．１％  ＮａＮ3 を有する２００μｌ  ＰＢＳ中に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。遠心分離工程（１００×ｇ、５分）の後、細胞を５０μｌのｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３（１０％  Ｖｅｎｉｍｍｕｎおよび０．１％  ＮａＮ3 を有する２００μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液）中で３０分間４℃にてインキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ｂｓｃ−Ａｂの検出のために、Ｈｉｓタグに対するＦＩＴＣ結合抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を使用した。ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３と同じ発現系によって産生された無関係のｂｓｃ−Ａｂ  １７−１Ａ×ＣＤ３、またはＨｉｓタグ抗体単独では、陰性対照として働いた。フローサイトメトリーを、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎを用いて行った。ＣＤ１９もＣＤをも発現しないＢＬ６０細胞において、結合は検出され得なかった（Ｆｉｇ．２）。
【００５２】
実施例４：ＣＤ１９陽性リンパ腫細胞に対するｂｓｃ−ＡｂＣＤ１９×ＣＤ３の細胞傷害性活性
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３抗体が、51Ｃｒ放出アッセイ（Ｆｉｇｕｒｅ３）において、いくつかのリンパ腫細胞株に対して高度に細胞傷害性であることを示した。エフェクター細胞としてヒト末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐTM（Ｎｙｃｏｍｅｄ）グラジエント遠心分離および引き続く血小板を除去するための１００×ｇ遠心分離工程を用いて、無作為のドナーの新鮮なバフィーコートから単離した。ＣＤ１９陽性Ｂ細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｍ−４５０  ＣＤ１９（Ｄｙｎａｌ）を用いて欠乏させた。その欠乏した細胞集団を、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析し、これはＣＤ１９陽性細胞の９９％の欠乏を示した。ＰＢＭＣを、３７℃、５％ＣＯ2 で一晩インキュベートし、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞株（Ｒａｊｉ，Ｂｌｉｎ  Ｉ，Ｄａｕｄｉ，ＢＪＡＢ，ＳＫＷ６．４）を標的細胞として使用した。細胞傷害性を、１０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ）を有するＲＰＭＩ  １６４０完全培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を用いて丸底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中での標準的なクロム放出アッセイにおいて測定した。
８０μｌ培地の容量の非刺激ＰＢＭＣを、２０μｌの異なる濃度のｂｓｃ−Ａｂを含有する各々のウェルに添加した。次いで１００μｌの51Ｃｒ標識標的細胞（１×１０4 ）を添加し、プレートを３分間１００×ｇで遠心分離し、４時間３７℃、５％ＣＯ2 でインキュベートした。さらなる遠心分離工程の後に、５０μｌの上清を取り出し、ガンマカウンターにおいて放出された51Ｃｒについてアッセイした（ＴｏｐＣｏｕｎｔ，Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ）。
自然発生的な放出を、エフェクター細胞または抗体を有さない標的細胞をインキュベートすることによって測定し、最大放出を、標的細胞を１０％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とともにインキュベートすることによって測定した。エフェクター細胞を伴わない、標的細胞とｂｓｃＡｂとの標的細胞のインキュベーションは、測定可能な溶解を生じなかった。特異的溶解の割合を、特異的放出（％）＝［（ｃｐｍ、実験的放出）−（ｃｐｍ、自然発生的放出）］／（（ｃｐｍ、最大放出）−（ｃｐｍ、自然発生的放出））×１００として計算した。全ての試験を、３つ組で行った。３つ組内のＳＤは、全ての実験において６％より低かった。インビボ条件に類似させるために、本発明者らは、健康なドナーに由来する非刺激ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。４時間以内の細胞傷害性の迅速な導入を、いかなるＴ細胞前刺激プロトコルをも伴うことなく観察し得た。ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３抗体と同じ系によって産生されたが異なる腫瘍特異性（ｂｓｃ１７−１Ａ×ＣＤ３）を有するコントロールとしてのｂｓｃ抗体は、培地バックグラウンドよりも有意に高い溶解活性を示さなかった。さらに、ＣＤ１９を発現しないプラスマ細胞腫細胞株ＮＣＩおよびＬ３６３を標的細胞として用いても、細胞傷害性活性を観察し得なかった（Ｆｉｇｕｒｅ４）。漸増する量のＣＤ１９特異的親モノクローナル抗体ＨＤ３７を用いる競合アッセイにおいて、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の細胞傷害性活性は、ほぼ完全にブロックされ得た（Ｆｉｇｕｒｅ５）。これらのコントロールは、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３媒介細胞傷害性効果が抗原特異的であることを示す。ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３抗体がいかにしてＣＤ１９陽性細胞を死滅するかの分子機序に関するさらなる情報を得るために、本発明者らは、ＥＧＴＡによってｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３媒介性細胞細胞傷害性をブロックすることを試みた。Ｆｉｇｕｒｅ６に示されるように、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の細胞傷害性活性は、ＥＧＴＡにより完全にブロックされ得た。このことは、特異的溶解が、抗体自身の直接的  （例えば、アポトーシス誘導）効果よりむしろＴ細胞媒介性効果（おそらくパーフォリン経路による）であることを指摘する。１ｎｇ／ｍｌより低い抗体濃度でさえ、非刺激Ｔ細胞を使用して、Ｂｌｉｎ−１細胞に対する有意な細胞傷害性効果を観察し得た（Ｆｉｇｕｒｅ７）。比較的低いＥ：Ｔ比（５：１、２．５：１）および１０〜１００ｐｇ／ｍｌの非常に低い抗体濃度でさえ、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３抗体は、非刺激Ｔ細胞の特異的細胞傷害性活性を迅速に誘導し得た（Ｆｉｇｕｒｅ７）。対照的に、ハイブリッド−ハイブリドーマ技術（５〜７、２７）によって産生された従来の二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ３抗体は、これらの条件下で３０００ｎｇ／ｍｌまでの濃度でさえも有意な細胞傷害性活性を示さなかった（Ｆｉｇｕｒｅ７）。この従来の二重特異性抗体は、文献（５〜７、２７）と一致して特異的なＴ細胞細胞傷害性（示さず）を誘導するために、さらなるＴ細胞前刺激および約１００ｎｇ／ｍｌの高い抗体濃度を必要とした。
【００５３】
実施例５：ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の細胞傷害性活性を介する自己Ｔ細胞による原発性  （悪性）Ｂ細胞の欠乏
原発性悪性Ｂ細胞におけるｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の細胞傷害性活性を評価するために、Ｂ−ＣＬＬ（Ｂ細胞由来慢性リンパ性白血病）を罹患する患者の末梢血由来の単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール密度勾配遠心分離によって単離した。これらの細胞を、１０％ＦＣＳおよび必要に応じて６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で、５日間３７℃にて／５％ＣＯ2 でｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の存在下または非存在下で継続的に培養した。フローサイトメトリー解析は、この特定のＮＨＬ（非ホジキンリンパ腫）−患者（後にｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３で体系的に治療した；実施例７を参照のこと）の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が、９２．６％のＣＤ１９陽性Ｂ細胞（＝標的細胞）および７．４％のＣＤ３陽性Ｔリンパ球（＝エフェクター細胞）を２．６：４．８のＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比で含有することを示した。これらのＣＤ１９陽性Ｂ細胞の大多数は悪性細胞からなった。ウェルあたり３×１０6 ＰＢＬ／ｍｌを、各々１ｍｌの容量で２４ウェル組織培養プレートに播種した。陰性対照として、培養培地＋ＩＬ−２および０．５μｇ／ｍｌの濃度で無関係の二重特異性単鎖抗体ｂｓｃ１７−１Ａ×ＣＤ３（１）を有する培養培地＋ＩＬ−２を使用した。Ｆｉｇ．９に示すように、インキュベーションの５日後にこれらの条件下でＣＤ１９−陽性細胞の欠乏は検出し得なかった。しかし、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を０．５μｇ／ｍｌまたは０．０５μｇ／ｍｌの濃度で（ＩＬ−２の存在下または非存在下のいずれかで）添加した場合、ほとんど全てのＣＤ１９陽性Ｂ細胞が死滅した。その時点で、培養細胞は、約１：２〜１：３のＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比で主としてＴリンパ球からなっていた。このことは、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞に対するｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の例外的な細胞傷害性を示す。なぜなら、自己Ｔ細胞による原発性Ｂ細胞の全欠乏が、１：１０よりも少ない非常に不利な開始エフェクター標的細胞比で、さらにＩＬ−２または他の種のさらなるＴ細胞刺激を伴うことなく、わずか５０ｎｇ／ｍｌの濃度で誘導されたからである。
【００５４】
実施例６：治療的使用のためのｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の精製
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３ならびにさらにヘキサヒスチジンおよびＦＬＡＧタグをコードする発現ベクター（ｐＥＦ−ＤＨＦＲ；実施例２を参照のこと）で安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生した。細胞を、中空繊維リアクター（Ｕｎｉｓｙｎ）中の無血清培地（Ｒｅｎｃｙｔｅ）において増殖させた。５００ｍｌの細胞培養上清を収集し、０．２μｍフィルターによりフィルター滅菌した（ＡｃｒｏＣａｐ；Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ）。
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を、マウス抗ＦＬＡＧ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）およびアルカリホスファターゼに連結したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）用いてウエスタンブロッティングによって検出し、定量した。検出を、ＢＣＩＰ／ＮＢＴシステム（Ｄｅｖｉｔｒｏｎ）を用いて化学発光によって行った。タンパク質濃度を、タンパク質スタンダードとしてウシＩｇＧ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）により測定した。カラム画分の純度を、ＭＯＰＳ緩衝液系（Ｎｏｖｅｘ）を使用する還元性ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ４〜１２％ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって評価した。
均一になるまでのｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の精製は、陽イオン交換クロマトグラフィー、コバルトキレートアフィニティクロマトグラフィーおよび、最終工程として、ゲル濾過を必要とした。これらの精製工程を標準的なプロトコル（以下を参照のこと）を使用して行った。精製手順の流れ図をＦｉｇｕｒｅ１０に示す。
【００５５】
陽イオン交換クロマトグラフィー：ＣＨＯ細胞由来の細胞培養上清を、２倍容量の緩衝液Ｃ（３０ｍＭのモルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３ｍＭベンズアミジンハイドロクロライド、ｐＨ  ５．５）と混合し、２０ｍｌ／分の流速で７０ｍｌ−ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陽イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過させた。このカラムを、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＭＥＳ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．８）で平衡化した。５カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した後、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を、緩衝液Ａ中の４５％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．８）の段階勾配で溶出させた。溶出物は、４７ｍＭのイミダゾールを含有する０．０４５容量の１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５を含んでおり、引き続いてこれをフィルター滅菌した（０．２μｍ；ＡｃｒｏＣａｐ）。陽イオン交換クロマトグラフィーの代表的な溶出プロフィールをＦｉｇｕｒｅ１２に示す。ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３は画分６に含まれていた。
コバルトキレートアフィニティ精製：陽イオン交換カラムからの溶出物を、緩衝液ＡＯ  （５０ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中で平衡化した１０ｍｌ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を２．５ｍｌ／分の流速で通過させた。このカラムを、０．１Ｍの塩化コバルト溶液で予め平衡化させた。３３カラム容量の緩衝液ＡＯ、緩衝液Ａ（５０ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 、４００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのイミダゾール、ｐＨ６．４）および緩衝液Ａ中の０〜１２％の緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 、４００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ６．４）の勾配で洗浄した後、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を３０ｍｌの１００％緩衝液Ｂによって一段階で溶出させた。溶出物をフィルター滅菌し、続いてＭａｃｒｏＳｅｐデバイス（Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ；１０ｋＤカットオフ）において約１０倍に濃縮した。コバルトキレートアフィニティクロマトグラフィーに関する代表的な溶出プロフィールをＦｉｇｕｒｅ１３に示す。ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を画分番号７において検出した。
ゲル濾過：コバルトキレートアフィニティカラムに由来する濃縮溶出物を、リン酸緩衝化生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ）で平衡化した１２４ｍｌ−Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；プレップ等級（ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ））に０．７５ｍｌ／分の流速で載せた。ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を、約５５ｋＤａに対応する分子サイズを有する画分に溶出させた（Ｆｉｇｕｒｅ１４、画分番号７）。ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を含有するゲル濾過画分に、５％のヒト血清アルブミン（Ｂｅｈｒｉｎｇ）を補充し、続いて０．１μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によりフィルター滅菌した。
【００５６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した、細胞培養上清および種々の活性カラム画分中のｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の豊富さをＦｉｇｕｒｅ１１に示す。ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を、細胞培養上清中に検出された主要なタンパク質バンドであった（レーン２）。高度に精製した抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３（これはヒト治療に使用した）は、検出可能な不純物を示さなかった（Ｆｉｇ．１１、レーン５）。
【００５７】
実施例７：Ｂ細胞リンパ腫を罹患する患者におけるｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の臨床的使用
コンパッショネイトな使用において、Ｂ細胞由来の慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）を罹患する患者（Ａ〜Ｂ、女性、１９３７生まれ）を、二重特異性鎖抗体ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３で治療した。
【００５８】
患者病歴および原理：
患者を１９９２年にＢ−ＣＬＬであると診断した。最初の診断のときに、上記疾患は、種々のリンパ節領域および脾臓で発症していた；さらに、自己免疫起源の溶血性貧血症および免疫グロブリン欠損症が観察された。上記患者は、カルビマゾール（ｃａｒｂｉｍａｚｏｌ）２．５ｍｇ／ｄでの治療によって良好に調節され、甲状腺機能正常（ｅｕｔｈｙｒｅｏｔｉｃ）状態にある結節性甲状腺腫を有する。
上記患者に、１９９２年から１９９４年まで、クロラムブシルおよびプレドニゾンを用いる多サイクルの化学療法を与えた。この疾患の進行の後、治療をシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）およびプレドニゾン（ＣＨＯＰ、８サイクル）に変更し、１年以上の間緩解を達成した。新たな再発の後、患者に別の６サイクルのＣＨＯＰを与え、続いてクロラムブシルおよびプレドニゾンならびに疾患の何ら改善を引き起こさなかったクロラムブシル単独の課程を与えた。１９９８年１２月に、脾臓の放射線照射を行い、患者の進行する脾腫を調節した。彼女は、多発性の感染性合併症を伴って著明な骨髄抑圧（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）を経験した。患者は、貧血および血小板減少症により赤血球および血小板置換の頻繁な注入を必要とした。
【００５９】
疾患および障害した骨髄機能の段階の進行に応じて、より攻撃的または高用量の化学療法は、患者に対して指示しなかった。抗ＣＤ２０抗体ｒｉｔｕｘｉｍａｂでの治療は適切ではない。なぜならば、Ｂ−ＣＬＬにおけるｒｉｔｕｘｉｍａｂの効力はこれまで明確には示されてないからである。
【００６０】
ＦＡＣＳ分析により、患者の末梢血細胞の９５％がＣＤ１９陽性細胞であり、一方、７７％の細胞がＣＤ２０抗原を発現したことが明らかになった。患者の末梢血細胞とｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３とのインキュベーションは、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞の明白な欠乏を示した（実施例５を参照のこと）。それゆえ、医師は、患者をコンパッショネイトな使用で新規ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３で治療することにした。患者に、化合物が新規であることおよびこの治療の潜在的な危険性および利点に関して詳細に通知した。彼女は、説明を完全に理解し、このコンパッショネイトな使用に関してインフォームドコンセントに同意した。
【００６１】
臨床的投与の記載：
治療を開始する前に、上記患者に臨床試験および広範な診断手順を受けさせ、疾患の程度を確認し、いかなるさらなる危険因子をも排除した。患者は、貧血、血小板減少症および体重減少を有するが、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の使用を妨げるいかなる心血管性機能障害または他の合併症をも有することなく、適正な臨床状態であった。最初の治療の日の前夜の間に、患者は片頭痛を罹患した。ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の投与のために、患者を集中治療条件下で病棟に維持し、生じ得る任意の緊急事態の迅速な治療を確実にした。いかなる急速なサイトカイン反応および腫瘍溶解の合併症をも防止するために、患者に、２ｍｇのクレマスチン（Ｔａｖｅｇｉｌ（登録商標））および２００ｍｇのシメチジン（Ｔａｇａｍｅｔ（登録商標））ならびに３００ｍｇのアロプリノールおよび２０ｍｇのオメプラゾール（Ａｎｔｒａ（登録商標））の予防的ＩＶ用量を与えた。
アルカリ化およびヘパリン治療を、上記治療および経過観察期間の間じゅう行った。さらに、患者に全ての必要な対症治療を行った。
血液サンプルを、薬物の投与の前および間に採取し、生化学的、血液学的および免疫学的なパラメータをフォローした。
【００６２】
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の第１の投与（１９９９年４月１４日）：
上記患者に、３μｇのｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の第１用量を２０分間注入として５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する等張性リン酸緩衝液で投与した。注入の間、患者はいかなる有害な影響をも有さなかった。注入の約１時間後、患者は、約５分間の悪寒、続いて数時間の間、発汗、約１０ｍｍＨｇの血圧の穏やかな低下および体温の穏やかな上昇（＋０．５℃）を有した。さらに、彼女の頭痛はわずかに悪化した。患者を別の２０ｍｇのＴａｖｅｇｉｌ（登録商標）および２００ｍｇのＴａｇａｍｅｔ（登録商標）、２５０ｍｇのプレドニゾロン（Ｓｏｌｕ−Ｄｅｃｏｒｔｉｎ（登録商標）
）および５０ｍｇのペチジン（Ｄｏｌａｎｔｉｎ（登録商標））で治療した。全ての症状は、同じ日に、続発症を伴うことなく解放された。
【００６３】
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の第２の投与（１９９９年４月１５日）：
１０μｇのｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の第２用量を、１日後に同一条件下で投与した。注入の約１時間後、患者は、著しい悪寒、発熱（３９．２℃）、わずかな換気亢進および降圧反応を有した。患者を、２ｍｇのＴａｖｅｇｉｌ、２００ｍｇのＴａｇａｍｅｔおよび３００ｍｇのＳｏｌｕ−Ｄｅｃｏｒｔｉｎおよび１５ｍｇのピリトラミド（ｐｉｒｉｔｒａｍｉｄｅ）（Ｄｉｐｉｄｏｌｏｒ（登録商標））で治療した。彼女の心血管機能の安定化のために、患者にドーパミン注入を与え、容積置換をした。この治療に続いて、症状は著しく減少した。それでも、患者を一晩、循環器科部門に移し、生命徴候の適切なモニタリングおよび緊急事態の場合の即時の治療を確実にした。患者は、いかなるさらなる合併症をも伴うことなく、翌朝、通常病棟に移された。
【００６４】
次の３日間の間、患者は、副発熱（ｓｕｂｆｅｂｒｉｌｅ）温度（約３７．２℃）を有し続け、第２用量の１日後（１９９９年４月１６日）に微量の胸水を発生し、下肢の穏やかな浮腫を発生した（１９９９年４月１８日）。心血管機能は、安定したままであり、検査室評価は、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の第２用量の後のγ−グルタミルトランスフェラーゼの増加以外は安全に関して著しい変化を示さなかった（Ｆｉｇｕｒｅ１５）。
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３に患者が耐性を示し、有害な影響は対症治療で調節されたので、新規ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の投与はこの患者に継続される。
【００６５】
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の臨床的および免疫学的有効性：
臨床結果：
脾臓および５つの腹部および腋窩のリンパ節の超音波検査を、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の第２用量の投与後１日目および４日目に行った。１０μｇ用量の１日後（１９９９年４月１６日）にすでに、リンパ節ならびに脾臓は、ベースライン評価と比較して約２０％の縮小を示した。この観察を、１９９９年４月１９日に第２超音波評価において確認した。脾臓の重量は、３５０ｇ減少した（ベースラインで１６３０ｇから１９９９年４月１９日には１２８０ｇに）（表１；ｆｉｇｕｒｅ１６）。
【００６６】
血液学的結果：
白血球の数（主として悪性Ｂ細胞を含む）は、治療の課程および経過観察期間の間に減少した（表２；ｆｉｇｕｒｅ１７）。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、Ｔ細胞活性化および炎症誘発性サイトカインの効果を反映する急性期反応タンパク質である。これは、１０μｇのｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の投与後に著しく増大し、次の３観察日の間に持続的に減少した（表２；ｆｉｇｕｒｅ１８）。
【００６７】
免疫学的結果：
上記化合物の投与に対する急性免疫学的応答を反映する血清サイトカインのレベルを、新規化合物の投与前および投与後種々の間隔で測定した。サイトカインおよび可溶性ＩＬ−２レセプターの血清レベルを、製造業者の指示に従って定量的ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。
腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αは、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の投与後の最初の１時間以内に、用量依存性様式で有意に増大した（ｆｉｇｕｒｅ１９）。
インターロイキン６（ＩＬ−６）およびインターロイキン８（ＩＬ−８）もまた、有意な、用量依存性増大を示した。それらの最大レベルを、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の投与後２〜４時間に観察した（ｆｉｇｕｒｅ２０、２１）。全てのサイトカインは、数時間以内にベースラインレベルに戻った。
【００６８】
可溶性ＩＬ−２レセプターはベースラインですでに上昇していた。このことは、ＩＬ−２レセプターを発現する多数の悪性Ｂ細胞によって説明され得る。新規ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の投与に続いて、可溶性ＩＬ−２レセプターの増大を観察した。このことは、エフェクター細胞の活性化を指摘する（ｆｉｇｕｒｅ２２）。
【００６９】
結論：
新規ｂｓｃＣＤ１９−ＣＤ３を、抵抗性Ｂ−ＣＬＬを罹患する患者に安全に投与した。３μｇおよび１０μｇでのｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の耐容性（ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ）は、受容可能であり、予防的手段および対症治療によって良好に調節され得る。
新規ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３は、超音波検査において示したように、患者の以前に拡大した脾臓およびリンパ節の縮小を引き起こした。脾臓およびリンパ節の拡大は、悪性Ｂ細胞での浸潤によって引き起こされるので、縮小は、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の投与の結果としての悪性Ｂ細胞の破壊を反映する。
当該分野で知られる任意の他の二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ３抗体とは非常に対照的に、本発明の二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ３抗体（ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３）は、悪性Ｂ細胞により浸潤されたリンパ器官の縮小によって測定されるように、Ｂ細胞由来非ホジキンリンパ腫において臨床的有効性を示す。好都合なことに、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３は、体系的投与の後に良好に耐性である驚くほど低用量で臨床的に有効であることが示された。従って、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の臨床的有効性は、インビトロで測定されたような例外的な細胞傷害性活性を確認する。
【００７０】
表１：Ｂ細胞リンパ腫を罹患する患者のリンパ節および脾臓のサイズにおけるｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の効果。
超音波測定
【００７１】
【表１】
0004169478.tif 000003
【００７２】
３つの腹部のリンパ節、１つの左および１つの右の腋窩リンパ節および脾臓のサイズを、Ｔｏｓｈｉｂａ  ＳＳＡ１００デバイスを用いて超音波検査によって決定し、測定した。サイズを三次元でｍｍで示す。脾臓の重量を、その次元および超音波密度から計算した。
【００７３】
表２：ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３での治療に応答した選択されたマーカーの血液レベル。
【００７４】
【表２】
0004169478.tif 000004
【００７５】
γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の血液レベルを、標準的な臨床生化学法によって測定し、単位／ｍｌ（ＧＧＴ）、単位／ｌ（ＬＤＨ）およびｍｇ／ｄｌ（ＣＲＰ）で示す。白血球の数を、ギガポイント／ｌで示し、白血球数を、全白血球のパーセントで示す。治療前の１９９９年４月１４日のベースラインレベルを第１のレーンに示す。４月１５日における３μｇのｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３に対する応答（４月１４日に投与した）を、第２のレーンに示す。同じ日の１０μｇの化合物での第２の治療に対する応答を第３のレーンに示す。薬物治療後４日目の選択されたマーカーの血液レベルを最後の第４のレーンに示す。
【００７６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｆｉｇｕｒｅ１：
ＳＤＳ−Ｐａｇｅ：  異なる量のタンパク質を用いた、精製ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３フラグメントのクーマシー染色。マーカーの分子量を左に示す。
【図２】Ｆｉｇｕｒｅ２：
異なるＣＤ１９陽性Ｂ細胞株（ＢＪＡＢ、ＳＫＷ６．４、Ｂｌｉｎ−１、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ）、ＣＤ１９ネガティブＢ細胞株ＢＬ６０およびＣＤ３陽性ジャーカット細胞および原発性ヒトＰＢＭＣにおける、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３（２００μｇ／ｍｌ）を用いた、ＦＡＣＳ分析分析。破線は陰性対照を示す。
【図３】Ｆｉｇｕｒｅ３：
非刺激ヒトＰＢＭＣおよび異なるＢ細胞株を用いた51Ｃｒ放出アッセイにおけるｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の細胞傷害性。エフェクター：標的細胞比１０：１；インキュベーション時間４時間。全ての３つ組で標準偏差は７％よりも低かった。
【図４】Ｆｉｇｕｒｅ４：
非刺激原発性ヒトＰＢＬを用いた、プラスマ細胞腫細胞株Ｌ３６３およびＮＣｌおよびリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉに対するクロム放出細胞傷害性アッセイ；Ｅ：Ｔ比２０：１；インキュベーション時間８時間。
【図５】Ｆｉｇｕｒｅ５：
クロム放出アッセイにおける、親抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７によるｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の細胞傷害性の阻害；インキュベーション時間８時間；Ｅ：Ｔ比２０：１；ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の濃度１ｎｇ／ｍｌ。
【図６】Ｆｉｇｕｒｅ６：
漸増する量のＥＧＴＡの添加後の、Ｄａｕｄｉ細胞に対して非刺激ＰＢＭＣを用いた細胞傷害性アッセイ、Ｅ：Ｔ比１０：１、インキュベーション時間４時間。
【図７】Ｆｉｇｕｒｅ７：
異なるＥ：Ｔ比で、非刺激ヒトＰＢＭＣおよび標的細胞としてＢｌｉｎ−１を用いた51Ｃｒ放出アッセイにおけるｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の細胞傷害性；インキュベーション時間４時間；従来の二重特異性抗体の濃度３μｇ／ｍｌ；ｂｓｃ１７−１Ａ×ＣＤ３の濃度１００ｎｇ／ｍｌ；図に示されたＥ：Ｔ比。
【図８】Ｆｉｇｕｒｅ８：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３抗体のＤＮＡおよびタンパク質の配列（変種を含むＦＬＡＧタグ）。数値は、ヌクレオチド（ｎｔ）位置、対応するアミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示す。二重特異性抗体をコードするＤＮＡ配列は１位で始まり、１５９３位で終わる。第１の６つのｎｔ（−１０〜−５位）および最後の６つのｎｔ（１５９６〜１６０１位）は、各々ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩの制限酵素切断部位を含む。ヌクレオチド１〜５７は、リーダー配列を示す；ヌクレオチド８２〜４１４および４６０〜８３１は、各々ＶL ＣＤ１９およびＶH ＣＤ１９をコードする；ヌクレオチド８４７〜１２０３および１２５８〜１５７５は、各々ＶH ＣＤ３およびＶL ＣＤ３をコードする；ヌクレオチド１５７６〜１５９３はＨｉｓタグをコードする。
【図９】Ｆｉｇｕｒｅ９：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３による自己原発性Ｔリンパ球の漸加による原発性（悪性疾患）ＣＤ１９+ Ｂ細胞の欠乏。
Ａ）開始点（ｔ＝０）：ｎ＝３×１０6 ＰＢＬ／ウェルを、２４ウェル組織培養プレートに、各々１ｍｌ  ＲＰＭＩ  １６４０培地の容積で各々１０％  ＦＣＳを補充して播種した。ＣＤ１９+ Ｂ細胞ならびにＣＤ４+ Ｔ細胞およびＣＤ８+ Ｔ細胞の最初の割合を示す。
Ｂ〜Ｇ）６０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を伴うかまたは伴わない、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３（図に示される濃度）の非存在下（Ｂ〜Ｃ）または存在下（Ｄ〜Ｇ）での３７℃／５％ＣＯ２でのインキュベーションのｔ＝５日後の相対的なＢ細胞およびＣＤ4+細胞およびＣＤ8+Ｔ細胞計数。陰性対照は、無関係の標的細胞特異性を有する二重特異性単鎖抗体（１７−１Ａ×ＣＤ３）を含むか、または二重特異性抗体全くなし（Ｃ）である。
【図１０】Ｆｉｇｕｒｅ１０：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の精製工程。
【図１１】Ｆｉｇｕｒｅ１１：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の純度に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。コロイドのクーマシーブルー染色したＳＤＳ４〜１２％グラジエントポリアクリルアミドゲルが示される。レーン１および６、分子サイズマーカー；レーン２、細胞培養上清；レーン３、陽イオン交換クロマトグラフィー由来の活性画分；レーン４、コバルトキレートアフィニティークロマトグラフィー由来の活性画分；レーン５、ゲル濾過由来の活性画分。細胞培養上清および種々のカラム画分の由来の等量のタンパク質（２μｇ）を分析した。分子量スタンダードのサイズｋＤａを右に示す。矢印は、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の位置を示す。
【図１２】Ｆｉｇｕｒｅ１２：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３の陽イオン交換クロマトグラフィー。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸収により測定した（ｍＡＵ、左）。タンパク質の溶出プロフィールを実線により示す。ＮａＣｌステップグラジエントのプロフィールを直線の実線により示し（％Ｂ、右）、回収した画分を破線により示す。ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を画分Ｆ６において検出した。
【図１３】Ｆｉｇｕｒｅ１３：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３のコバルトキレートアフィニティークロマトグラフィー。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸収により測定した（ｍＡＵ、左）。タンパク質の溶出プロフィールを実線により示す。イミダゾールグラジエントを直線の実線により示し（％Ｂ、右）、回収した画分を破線により示す。ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を画分Ｆ７において検出した。
【図１４】Ｆｉｇｕｒｅ１４：
抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３のゲル濾過。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸収により測定した（ｍＡＵ、左）。タンパク質の溶出プロフィールを実線により示す。破線は回収した画分を示す。ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を、約６０ｋＤａの分子サイズに相当する画分Ｆ７において見出した。
【図１５】Ｆｉｇｕｒｅ１５：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を用いた治療に応答したγ−グルタミルトランスフェラーゼ  （ＧＧＴ）の血液レベル。ＧＧＴレベルを、標準的な臨床的生化学法によって決定した。これを単位／ｌで示す。時間軸は、最初の薬物治療のオンセット後の日数（ｄ）を示し、０で始まり、個々の薬物添加の時間（ｈ）が続く。矢印は薬物投与の時間点を示す。
【図１６】Ｆｉｇｕｒｅ１６：
患者Ａ〜Ｂの脾臓の超音波測定。
Ａ：ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３療法の前の、１９９９年４月１２日付けの脾臓サイズの測定。この図は、悪性Ｂ細胞での浸潤に起因する拡大した脾臓（サイズ１４６ｍｍ×６９．２ｍｍ）を示す。
Ｂ：４月１４日の３μｇ  、およびそれに続く４月１５日の１０μｇでの治療後の、１９９９年４月１６日付けの脾臓サイズの測定。この図は、ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３での全身性治療によって生じた、１３２ｍｍ×５８．９ｍｍのサイズまでの脾臓の縮小を実証する。表１に示されたサイズ値に対する単一測定の矛盾は、異なる空間平面における超音波に基づく器官サイズ測定によって説明される。
２つの次元を（＋）および（Ｘ）により標識する。
【図１７】Ｆｉｇｕｒｅ１７：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を用いた治療に応答した血液リンパ球計数。リンパ球の数をギガパーツ／リットルで示す。時間軸は、最初の薬物治療のオンセット後の日数（ｄ）を示し、そして０で始まり、個々の薬物添加の時間（ｈ）が続く。
矢印は薬物投与の時間点を示す。
【図１８】Ｆｉｇｕｒｅ１８：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を用いた治療に応答したＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の血液レベル。ＣＲＰレベルを、標準的な臨床生化学法によって測定し、ｍｇ／ｄｌで示す。時間軸は、最初の薬物治療のオンセット後の日数（ｄ）を示し、そして０で始まり、個々の薬物添加の時間（ｈ）が続く。矢印は薬物投与の時間点を示す。
【図１９】Ｆｉｇｕｒｅ１９：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を用いた治療に応答した腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）の血液レベル。ＴＮＦレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ｎｇ／ｍｌで示す。時間軸は、最初の薬物治療のオンセット後の日数（ｄ）を示し、そして０で始まり、個々の薬物添加の時間  （ｈ）が続く。矢印は薬物投与の時間点を示す。
【図２０】Ｆｉｇｕｒｅ２０：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３を用いた治療に応答したインターロイキン−６（ＩＬ−６）の血液レベル。ＩＬ−６レベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ｐｇ／ｍｌで示す。時間軸は、最初の薬物治療のオンセット後の日数（ｄ）を示し、そして０で始まり、個々の薬物添加の時間（ｈ）が続く。矢印は薬物投与の時間点を示す。
【図２１】Ｆｉｇｕｒｅ２１：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３での治療に応答したインターロイキン−８（ＩＬ−８）の血液レベル。ＩＬ−８レベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ｐｇ／ｍｌで示す。時間軸は、最初の薬物治療のオンセット後の日数（ｄ）を示し、そして０で始まり、個々の薬物添加の時間（ｈ）が続く。矢印は薬物投与の時間点を示す。
【図２２】Ｆｉｇｕｒｅ２２：
ｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３での治療に応答した可溶性インターロイキン−２レセプターα鎖（ＩＬ−２Ｒ）の血液レベル。ＩＬ−２ＲレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、単位／ｍｌで示す。時間軸は、最初の薬物治療のオンセット後の日数（ｄ）を示し、そして０で始まり、個々の薬物添加の時間（ｈ）が続く。矢印は薬物投与の時間点を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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