(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞前駆体またはナイーブな抗原特異的Ｔ細胞を捕捉するための支持体であって、該支持体が表面上に固定された純粋な空のＭＨＣクラスＩ分子の集団を有し、かつ、該ＭＨＣクラスＩ分子が組換えショウジョウバエ（Drospophila）細胞から発現されたＫbm3もしくはＬd分子であり、１つ以上の抗原に結合することができ、そして該支持体が脂質二重層ではない、ことを特徴とする上記の細胞を捕捉するための支持体。
【請求項２】
支持体がビーズである、請求項１記載の細胞を捕捉するための支持体。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、生来の（naive）個体の全Ｔリンパ球集団を包含する不均一なリンパ球集団から抗原特異的Ｔ細胞系を導き出す方法に向けられる。本方法は、特異的なＴ細胞抗原レセプターのリガンドとしてはたらく抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体で被覆された支持体上での抗原特異的Ｔリンパ球の捕捉による抗原特異的リンパ球の濃縮の段階、次いで抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体で被覆された表面を使用する拡張（expansion）の段階を基礎とする。
発明の背景
抗原特異的免疫応答は抗原特異的なエフェクターＢおよびＴリンパ球により媒介される。これらの細胞は、全レパートリーを表す多様な抗原のレセプターを発現し、かつ、特異的抗原および適切な副刺激との遭遇に際して活性化されたようになり、拡張しそしてエフェクター細胞に分化する、一般に低頻度の休止前駆細胞から生ずる。
癌もしくはウイルス感染のような状態のためのエクスビボ免疫療法の開発は、抗原特異的前駆体リンパ球の低頻度により制限される。例えば、マウスの末梢リンパ様組織中のウイルス特異的ＣＴＬ前駆体（ＣＴＬｐ）の頻度は一般に１／100,000〜１／1,000,000より小さい（ラウ（Lau）ら、1994；ホウ（Hou）ら、1994）。抗原で被覆された支持体上での捕捉による抗原特異的リンパ球の単離がＴＮＰに特異的なマウス脾の休止Ｂ細胞について記述されている（スノウ（Snow）ら、1983a）。この単離処置は、ハプテン化ウマ赤血球上でロゼット形成（rosetting）段階を必要とし、そして40％純度のハプテン特異的Ｂ細胞の回収を可能にした。この技術は、活性化の要件（シュタイン（Stein）ら、1986）ならびに活性化後の初期のシグナル発生（signaling）事象（スノウ（Snow）ら、1986；マイヤーズ（Myers）ら、1987；グルップ（Grupp）ら、1987；ノエル（Noelle）とスノウ（Snow）、1990；ゴールド（Gold）とデフランコ（DeFranco）、1994）を研究するのに有用であった。しかしながら、これは、ＴＮＰに特異的なＢ細胞の比較的高頻度（約１％）のために非常に好都合な状況であった（スノウ（Snow）ら、1983a）。低い前駆体頻度の別の抗原に特異的な休止Ｂ細胞を使用するＢ細胞活性化についての研究は今日まで報告されていない（ラドブルフ（Radbruch）とレクテンヴァルト（Recktenwald）、1995）。低い前駆体頻度はまたＴ細胞でも問題である。加えて、Ｂ細胞は抗原を直接認識する一方、Ｔ細胞は主要組織適合抗原系（ＭＨＣ）分子に結合される抗原ペプチドの組み合わせから作成される複合体構造を認識する。ＴＣＲ／ＭＨＣ−ペプチドの相互作用は低いないし中等度の親和性を有する（10-4〜10-7Mの範囲：マツイ（Matsui）ら、1991；ウェーバー（Weber）ら、1992；シクレヴ（Sykulev）ら、1994a；コール（Corr）ら、1994；シクレヴ（Sykulev）ら、1994b）。抗体は通常、数桁より大きな親和性を表し、そして多価性を活用する。希少な細胞集団の単離の新技術が今や利用可能である。これらは細胞選別および／もしくは磁気分離を基礎とする（ベローネ（Bellone）ら、1995；ラドブルフ（Radbruch）とレクテンヴァルト（Recktenwald）、1995）。また、ＴＣＲの組換えリガンドも、組換えの空の（empty）ＭＨＣ分子（ジャクソン（Jackson）ら、1992）およびＭＨＣ結合抗原ペプチド（エンゲルハルト（Engelhard）、1994；ラメンゼー（Ramensee）ら、1995）を組み合わせることにより今や利用可能である。これらの合成ＭＨＣ−ペプチド複合体がビーズ上に固定されてＴＣＲの多価リガンドを生じ得る。理論的には、多価性は低親和性を克服するのを助けるはずである。ＴＣＲと固定されたペプチド−ＭＨＣ複合体との間の相互作用は、あるインビトロ系で安定な相互作用の確立につながることが以前に示されている。第一に、脂質単層（ナカナシ（Nakanashi）ら、1983）もしくは脂質で被覆された、細胞の大きさにされたビーズ（ケイン（Kane）ら、1988）上に固定されたＭＨＣクラスＩ抗原は、クローニングされた同種細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の結合を引き起こすのに十分である。第二に、同系のクローニングされたＣＴＬは、ペプチド依存性の様式で、ＭＨＣで被覆されたビーズに結合する（ケイン（Kane）とメシャー（Mescher）、1993；メシャー（Mescher）、1995）。第三に、クローニングされた同系���ＣＴＬは、ペプチド特異的な様式で、ＲＭＡ−Ｓ細胞すなわち大量の空のＭＨＣ分子を発現する細胞系と集塊を形成し得る（デブルイン（De Bruijn）ら、1992）。これらの報告の２つにおいて、ＴＣＲとＭＨＣ−ペプチドの相互作用は接着の主要媒介物でなかった。それらはむしろ、おそらく補助分子を介する接着の活性化につながったシグナルを伝達することにより、集合の早期の事象で初期の役割を演じた。ここで、われわれは、磁気ビーズ上に固定されかつペプチドを装填された、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）細胞から精製された空のＭＨＣクラスＩ分子（ジャクソン（Jackson）ら、1992）を使用する抗原特異的Ｔ細胞を単離する方法を記述する。Ｔ細胞のこの人工的支持体は、高密度の同一のＭＨＣ−ペプチド複合体で被覆される。Ｔ細胞の単離は、２ＣＴＣＲについてトランスジェニックのマウスから精製された、生来のＴ細胞の集団を使用して至適化された（シャ（Sha）ら、1988）。２ＣＴＣＲの多様な親和性および特異性のリガンドが同定されている（シクレヴ（Sykulev）ら、1994a、b）。２ＣＴ細胞は、10-4M程度の２ＣＴＣＲに対する親和性を有したペプチド−ＭＨＣ複合体をもつビーズ上で吸着され得た。吸着はＭＨＣで制限されかつペプチド特異的であった。なぜなら、それは、２ＣＴＣＲにより認識された適正なＭＨＣ−ペプチドの組み合わせでのみ起こったからである。加えて、生来の動物からの無関係のＴ細胞と混合された２ＣＴ細胞がこの吸着処置を使用して回収され得た。この技術は、生来の動物から抗原特異的Ｔ細胞を回収するのに成功して使用された。
発明の要約
本発明は、リンパ球の不均一集団からの抗原特異的Ｔリンパ球の単離および培養での拡張の方法を提供する。本発明はまた、患者の疾患もしくは状態の治療のため患者から抗原特異的Ｔリンパ球の集団を調製する方法も提供する。本発明は、空のクラスＩペプチドが多様な抗原を受容しかつ結合し得ることにおいて機能性である空のクラスＩペプチドを含有するマトリックスを提供する。これらのマトリックスは、特異的な予め決められた量の１種もしくはそれ以上の抗原を含有するよう調製され得る。こうしたマトリックスは、本発明の方法での使用を包含するがしかしこれに制限されない多様な目的上有用である。
【図面の簡単な説明】
図１のパネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ：フローサイトフルオロメトリーを使用するアビジン被覆された磁気ビーズへのビオチニル化Ｌdの結合の分析。
パネルＡは、増大する量のＬdとともにインキュベーションされ、その後フルオレセイン標識抗Ｌd抗体３０．５．７で染色されたビーズの平均蛍光値の用量反応曲線を示す。パネルＢは未標識のアビジン被覆された磁気ビーズの緑色蛍光（ＦＬ１）ヒストグラムを示す。パネルＣは、106個のビーズあたり３μgのビオチニル化Ｌdとのインキュベーション後のアビジン被覆された磁気ビーズの緑色蛍光（ＦＬ１）ヒストグラムを示し；染色はフルオレセイン標識抗Ｌd抗体３０．５．７を使用して実施した。パネルＤは、106個のビーズあたり３μgの非ビオチニル化Ｌdとのインキュベーション後のアビジン被覆された磁気ビーズの緑色蛍光（ＦＬ１）ヒストグラムを示し；染色はフルオレセイン標識抗Ｌd抗体３０．５．７を使用して実施した。
図２のパネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ：緑色（ＦＬ１）対赤色（ＦＬ２）蛍光ドットプロットを使用する抗原ペプチドの存在下のＬd被覆ビーズ−２ＣＴ細胞複合体形成の評価。細胞をフルオレセインで緑色に染色し；ビーズをフィコエリトリンで赤色に染色した。磁気ビーズは自己蛍光性であり；補償を、フィコエリトリン染色されたビーズが未染色のビーズと同一の緑色蛍光強度を表すように設定した。パネルＡはビーズ単独を示す。パネルＢは２ＣＴ細胞単独を示す。パネルＣはＱＬ９の存在下にインキュベーションされたＬd被覆ビーズおよび２ＣＴ細胞を示す。パネルＤはｐ２Ｃａの存在下にインキュベーションされたＬd被覆ビーズおよび２ＣＴ細胞を示す。パネルＥはＳＬ９の存在下にインキュベーションされたＬd被覆ビーズおよび２ＣＴ細胞を示す。パネルＦはＬＣＭＶペプチドの存在下にインキュベーションされたＬd被覆ビーズおよび２ＣＴ細胞を示す。
図３のパネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ：側方散乱（side scatter）（ＳＳＣ）対前方散乱（forward scatter）（ＦＳＣ）ドットプロットを使用する、抗原ペプチドの存在下でのＭＨＣ被覆ビーズ−２ＣＴ細胞複合体形成の評価。パネルＡ：細胞、ビーズおよび細胞−ビーズ複合体を含有する領域の境界を示す。パネルＢはビーズ単独を示す。パネルＣは２ＣＴ細胞単独を示す。パネルＤはＱＬ９の存在下にインキュベーションされたＬd被覆ビーズおよび２ＣＴ細胞を示す。パネルＥはｐ２Ｃａの存在下にインキュベーションされたＬd被覆ビーズおよび２ＣＴ細胞を示す。Ｆ：ＬＣＭＶペプチドの存在下にインキュベーションされたＬd被覆ビーズおよび２ＣＴ細胞。パネルＧはｄＥＶ−８の存在下にインキュベーションされたＫbm3被覆ビーズおよび２ＣＴ細胞を示す。パネルＨはＥ１の存在下にインキュベーションされたＫbm3被覆ビーズおよび２ＣＴ細胞を示す。
図４のパネルＡ、ＢおよびＣ：ＭＨＣ被覆された磁気ビーズ上への２ＣＴ細胞の吸着に対する多様なパラメータの影響。パネルＡは時間依存性を示す。すなわち、精製された２ＣＴ細胞をＭＨＣ被覆されたビーズおよびペプチドと混合し、そして多様な時間量、室温でインキュベーションし；細胞の付着をその後フローサイトフルオロメトリーにより定量した。パネルＢは温度依存性を示す。すなわち、精製された２ＣＴ細胞をＭＨＣ被覆されたビーズおよびペプチドと混合し、そして多様な温度でかつ多様な時間量、インキュベーションし；細胞の付着をその後フローサイトフルオロメトリーにより定量した。パネルＣはＣＤ８依存性を示す。すなわち、精製された２ＣＴ細胞もしくは精製されたＣＤ８-２ＣＴ細胞をＭＨＣ被覆されたビーズおよびペプチドと混合し、そして室温で３時間インキュベーションし；細胞の接着をその後フローサイトフルオロメトリーにより定量した。
図５のパネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ：１：3000の比の２ＣＴ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞の混合物で開始する、Ｋbm3被覆された磁気ビーズ上での捕捉を使用する２ＣＴ細胞の濃縮。パネルＡはフルオレセイン標識された精製された２ＣＴ細胞の緑色蛍光（ＦＬ１）ヒストグラムを示す。パネルＢはＣ５７ＢＬ／６マウスからの精製されたＣＤ８+Ｔ細胞の緑色蛍光（ＦＬ１）ヒストグラムを示す。パネルＣは、１：3000の比でＣ５７ＢＬ／６マウスからのＣＤ８+Ｔ細胞と混合された精製されたフルオレセイン標識２ＣＴ細胞の緑色蛍光（ＦＬ１）ヒストグラムを示す。パネルＤは、ｄＥＶ−８の存在下のＫbm3被覆された磁気ビーズとのインキュベーション後に溶出された細胞の緑色蛍光（ＦＬ１）ヒストグラムを示す。パネルＥは、Ｅ１の存在下のＫbm3被覆された磁気ビーズとのインキュベーション後に溶離された細胞の緑色蛍光（ＦＬ１）ヒストグラムを示す。
図６：Ｋb−ＯＶＡ−８もしくはＫb−ＶＳＶ−８で被覆された磁気ビーズ上の吸着を使用する、生来のＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＣＴＬのインビトロの機能的活性。培養されたＴ細胞を、実施例４に示されたようなクロム遊離アッセイにより細胞傷害性について試験した。ＥＬ４細胞を標的として使用した。ペプチドは１μMの最終濃度で使用した。
図７：Ｌd−ＬＣＭＶ被覆された磁気ビーズ上の吸着を使用する、生来のＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＴＬのインビトロの機能的活性。培養されたＴ細胞を、実施例４に示されたようなクロム遊離アッセイにより細胞傷害性についてインビトロで試験した。Ｌdを発現するＲＭＡ−Ｓ（パネルＡ）、ＢＡＬＢ／ｃのＣＬ−７（パネルＢ）、ＭＣ５７（パネルＣ）もしくはＹＡＣ−１（パネルＤ）を標的として使用した。ペプチドは１μMの最終濃度で使用した。
図８：Ｌd−ＬＣＭＶ被覆された磁気ビーズ上の吸着を使用する、生来のＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＴＬのインビボの機能的活性。ＬＣＭＶに急性に感染したマウスでのインビボ活性を実施例４に示されたようにアッセイした。ＬＣＭＶ感染ＢＡＬＢ／ｃマウスに第１日に107のＣＴＬ抗ＬＣＭＶＮＰ１１８−１２６を注入した一方、４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスはＰＢＳのみを受けた。対照として、われわれは、107のＣＴＬ抗ＬＣＭＶＮＰ１１８−１２６もしくはＰＢＳのいずれかを注入されたＬＣＭＶ−Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した。
発明の詳細な記述
本発明は、生来の個体からの全Ｔ細胞を包含する混合された細胞集団からインビトロで抗原特異的なＴ細胞系を導き出す新たな方法を提供する。生来のＴ細胞集団からインビトロでＴ細胞系を導き出すことはいくつかの種類の問題を提出する。すなわち、第一に、前駆体の頻度は典型的に非常に低く、しばしば10-5より低い；第二に、生来のＴ細胞は、以前に活性化されたＴ細胞より一般により強い刺激を必要とする、活性化のための特別の要件を有する。
本発明の方法は２段階を含んで成る。すなわち、抗原特異的Ｔ細胞の細胞調製物を濃縮するための単離の一段階、および濃縮された細胞集団から抗原特異的な細胞系を導き出すインビトロの増殖の一段階。これらの段階は所望されるように反復されてよいことが当業者に容易に明らかである。抗原特異的Ｔ細胞の単離の段階はＭＨＣで被覆された支持体を利用し、これは抗原ペプチドおよびＴ細胞とのインキュベーションに際して抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体に特異的なＴ細胞の単離を可能にした。多種多様のＭＨＣ分子が本発明の方法での使用に適することが当業者に容易に明らかであろうが、限定されるものでないが、いずれかの哺乳類もしくは鳥類の種からの古典的および非古典的ＭＨＣタンパク質が挙げられ、ヒトＨＬＡタンパク質およびマウスＨ−２タンパク質が好ましい。多様な起源からのＭＨＣ分子が本発明での使用に適することもまた当業者に容易に明らかであろうが、限定されるものでないが、天然に存在する供給源および細菌、昆虫細胞もしくは哺乳類細胞で発現されたＭＨＣタンパク質のような組換え供給源由来のＭＨＣが挙げられ、昆虫細胞が好ましい。加えて、多種多様のＭＨＣ被覆された支持体が本発明での使用に適することが当業者に容易に明らかであろうが、限定されるものでないが、カラム（アクリルアミド、アガロース、など）、ガラスビーズ、ラテックスビーズ、メンブレン（ニトロセルロース、ナイロン、など）、マイクロタイタープレートのようなプラスチック（例えばポリスチレン）表面、デキストランのような高分子量多糖、赤血球、および磁気ビーズを挙げることができ、磁気ビーズが好ましい。最後に、多種多様の処置が、本発明の方法での使用のために支持体上にＭＨＣ分子を付着させるのに使用され得ることが当業者に容易に明らかであろうが、限定されるものでないが、受動的吸着、架橋剤の使用、アビジン被覆された支持体上での吸着のためのＭＨＣ分子のビオチニル化、ＭＨＣ分子の遺伝子工学による認識部位の導入もしくは抗体被覆された支持体上での吸着のための本来の認識部位の使用を挙げることができ、アビジン−ビオチンおよび抗体認識が好ましい。
この処置を確立するためにいくつかの供給源（resources）の組み合わせが利用された。すなわち、第一に、われわれは、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）細胞で産生された空の組換えＭＨＣ分子（ジャクソン（Jackson）ら、1992）を使用し、これは同一のペプチドを均一に装填されたＭＨＣタンパク質の使用を可能にし；第二に、２ＣＴＣＲについてトランスジェニックのマウスのリンパ節から精製された、生来のＴ細胞（シャ（Sha）ら、1988）を使用し、これらの細胞は同一レベルで同一のＴＣＲを均一に発現する。これは単一の細胞レベルでの分析を可能にした。また、２ＣＴＣＲに対するその親和性が最近決定された（シクレヴ（Sykulev）ら、1994a、b）いくつかの異なるペプチド−ＭＨＣ複合体を使用した。これは、多様な親和性の複合体を使用する処置を検討することを可能にした。使用されたＭＨＣクラスＩ分子はＬd、ＫbおよびＫbm3を包含した。２Ｃの細胞傷害性Ｔ細胞のクローンはＢＡＬＢ．Ｂ（Ｈ−２b）マウス由来であったため（シャ（Sha）ら、1988）、ＬdおよびＫbm3は２ＣＴＣＲに対し同種の制限要素である一方、Ｋbは同系である。アビジン被覆された磁気ビーズ上の固定されたビオチニル化Ｌd、ＫbおよびＫbm3を使用した。２ＣＴ細胞を、いくつかの抗原ペプチドの存在下ににこうしたビーズ上に吸着させた。吸着は、制限要素としてＬd、Ｋbm3もしくはＫbを使用して、10-4〜10-7Mの範囲の２ＣＴＣＲに対する親和性をもつペプチド−ＭＨＣ複合体の存在下で観察された。最後に、対照ペプチドはＭＨＣ被覆されたビーズと２ＣＴ細胞との間の相互作用を引き起こさなかったため、吸着は特異的であった。
ＭＨＣ被覆されたビーズ上へのＴ細胞の吸着の特徴をさらに研究した。すなわち、吸着は時間依存性であり、室温で実施された場合に１ないし４時間で安定期（plateau）に達した。吸着はその時間を越えて減少することを開始し、これは脱接着（de-adhesion）過程の開始を反映するとみなされる。吸着はまた温度依存性でもあった。すなわち、それは検査されたペプチド−ＭＨＣ複合体の３種について室温でより37℃でわずかにより小さく、また、別の１種については室温でより劇的により小さくさえあった。これは、より高温でのＭＨＣ分子の安定性の減少による。４℃での吸着は室温でよりずっとより小さく、これは分子会合を低下させる低温での細胞膜の流動性での変化の結果であるらしかった。加えて、より高温でのみ起こるいくつかのシグナル発生（signaling）事象は、ＴＣＲと抗原の相互作用により誘発される接着におけるＣＤ８の役割についての以前の報告（ケイン（Kane）とメシャー（Mescher）、1993）で言及されたように、吸着に寄与することができた。興味深いことに、細胞−ビーズ複合体の形成のＣＤ８依存性は使用された抗原により変動した。試験されたペプチドのなかで、ｐ２ＣａおよびｄＥＶ−８が最もＣＤ８依存性であり、これらは抗原提示細胞の表面に天然に存在するように単離され；細胞表面上で見出されていないＱＬ９およびＳＩＹＲはＣＤ８非依存性であった。いずれの場合においても、ＭＨＣ被覆されたビーズ上でのＴ細胞捕捉のＣＤ８依存性はＴＣＲとリガンドの親和性と完全に相互に関連しなかった。最後に、捕捉はＴＣＲとリガンドの親和性と完全に相互に関連しなかった。なぜなら、われわれは、Ｋbm3−ｄＥＶ−８（1.8×104Ｍ-1）、Ｋb−ＳＩＹＲ（3.1×104Ｍ-1）もしくはＫbm3−ＳＩＹＲ（3.4×104Ｍ-1）での捕捉を一貫して観察したが、しかしＬd−ｐ２Ｃａ−Ａ３（２×104Ｍ-1）もしくはＫb−ｄＥＶ−８（1.2×104Ｍ-1）では観察しなかった。捕捉は、Ｌdのバッチにより、Ｌd−ＳＬ９（1.4×104M-1）で観察されたもしくはされなかった。これは、与えられたペプチド−ＭＨＣ複合体に対する単一のＴＣＲの親和性を知ることが全細胞レベルでの相互作用についての予測をなすのにおそらく十分でないという予測と矛盾しない（アグラワル（Agrawal）とリンダーマン（Linderman）、1996）。ＭＨＣ被覆されたビーズがＴ細胞による抗原認識の規則を研究するためのプローブとして有用であることができることが予期される。
抗原特異的ＣＴＬ前駆体の低頻度集団を回収するこの技術の適合性を検討するため、生来の動物からの無関係のＴ細胞と混合された２ＣＴ細胞を回収することを試みた。本発明の処置は、0.03％程度の２ＣＴ細胞の頻度から開始して、一段階の精製で約800ないし1600倍の抗原特異的Ｔ細胞の精製を可能にしたことが示された。細胞回収は、Ｋbm3−ｄＥＶ−８およびＫb−ＳＩＹＲのような２ＣＴＣＲに対し低親和性のペプチド−ＭＨＣ複合体を使用する場合に約50％であり、そして高親和性のＬd−ＱＬ９複合体で90〜100％に達した。最終的な２ＣＴ細胞の純度は、２ＣＴＣＲについての同系の制限要素Ｋbを使用する場合に47.6±2.1％、そして、同種の制限要素Ｌdを使用する場合に24.8±6.9％であった。これは、この差異はＬd被覆されたビーズを使用して捕捉される抗Ｌd同種Ｔ細胞により説明され得ることを示唆する。これは、ビーズから溶出される非２Ｃ細胞の若干が特異的に捕捉されていたことを意味することができた。一緒にすれば、これらの結果は、本方法が、そのＴＣＲがＭＨＣ−ペプチド複合体に対し低親和性を有し得る細胞を包含する、生来の動物からの低頻度のＴ細胞前駆体を精製するのに適したことを示した。
本発明の単離処置が、新たなインビトロＴ細胞増殖段階と共同して使用される場合に、生来のマウスからのＣＴＬ前駆体で濃縮するために使用できたこともまた示された。細胞増殖段階は、ＭＨＣ−ペプチド複合体および抗ＣＤ２８抗体で被覆された組織培養プレート中の単離された細胞の培養物を基礎とした。抗ＣＤ２８抗体、Ｂ７−１およびＢ７−２のようなＣＤ２８の他のリガンド、またはインテグリンおよび他の細胞接着分子のような他のＴ細胞副刺激分子に対するリガンドもしくは抗体、またはインターロイキン−２もしくはインターロイキン−４のようなサイトカイン、あるいはそれらのいずれかの組み合わせを包含するがしかしこれらの制限されない他の副刺激分子が、本発明の方法での使用に適することが当業者に容易に明らかであることができる。コンカナバリンＡもしくは抗ＴＣＲ抗体での刺激を包含する他の古典的な増殖プロトコールは、抗原特異的ＣＴＬが生来のリンパ球集団から導き出されることができなかったことは注目すべきである。これは、細胞が単離後に100％純粋でなく、そして従って回収されるために若干の特異的な刺激を必要とするためらしい。加えて、高密度の均一なリガンドが刺激されていない（unprimed）Ｔ細胞を活性化するのに必要であり、これは本発明の方法ならびに抗原提示細胞としてＭＨＣを発現する昆虫細胞（カイ（Cai）ら、1996）を使用することにより提供されるが、しかしそれらの表面上に抗原の不均一な集団を提示する古典的な抗原提示細胞を使用することにより提供されない。加えて、本発明のこの全く合成的な増殖系は外因性の抗原提示細胞の使用を必要とせず、これは汚染および交差刺激（cross-priming）のような潜在的な複雑化を排除する。興味深いことに、拡張に先立つ単離に使用されたＭＨＣ被覆された磁気ビーズから細胞を分離することは必要でなく、これは操作の時間を減少させる。しかしながら、抗原特異的Ｔリンパ球は、所望の場合は、培養するためもしくは他の目的上、支持体から溶離もしくは除去されてよい。Ｔリンパ球は、延長されたインキュベーションおよび／もしくは抗ＭＨＣ抗体の添加のような当業者に既知の多様な技術を使用して溶離されてよい。本方法を使用して、ＬＣＭウイルス特異的なＣＴＬが、Ｌd被覆された磁気ビーズおよびＬＣＭＶ核タンパク質ペプチドを使用して未感染のＢＡＬＢ／ｃマウスから導き出され得た。濃縮は確かに起こっていた。なぜなら、生来の動物での10-5未満の前駆体頻度（エーヘン（Oehen）ら、1992、ラウ（Lau）ら、1994）と比較して、回収された104個の細胞中で最低１個の細胞が抗原特異的であったためである。加えて、同一条件で培養された同一の動物からの未分離の全ＣＤ８+Ｔ細胞は特異的ＣＴＬ活性を生じなかった。最後に、特異的ＣＴＬ活性はただ１回の再刺激後に測定され、これは拡張処置後の特異的前駆体Ｔ細胞の高頻度を強く示す。われわれはまた、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからＯＶＡ−８特異的ＣＴＬならびにＶＳＶ−８特異的ＣＴＬを回収するのにも本発明の拡張処置を使用した。拡張は、ＶＳＶ−８特異的ＣＴＬがＫb−ＯＶＡ−８被覆されたビーズを使用して捕捉された細胞から成長され得ず、また、ＯＶＡ−８特異的ＣＴＬがＫb−ＶＳＶ−８被覆されたビーズを使用して捕捉され��細胞から成長され得なかったため、特異的であった。Ｋb−ＯＶＡ−８被覆されたビーズ上での捕捉後の濃縮された集団でのＯＶＡ−８特異的ＣＴＬのＣＴＬ前駆体の頻度はおよそ１／3500であった。濃縮は、従って、確かに起こっていた。なぜなら、生来のＣ５７ＢＬ／６マウスでのＣＴＬ抗ＯＶＡ−８の前駆体頻度は１／30,000であるからである（ディロン（Dillon）ら、1994）。しかしながら、濃縮は、２ＣＴ細胞を使用する実験から期待されたより小さいようであった（表II）。これは、２ＣＴ細胞を用いる測定が濃縮段階の能力を直接反映する一方、全ＣＤ８+Ｔ細胞から開始する実験においては濃縮は過小評価されたらしかったため、驚くことではない。すなわち、若干のＣＤ８+細胞は、細胞傷害性の活性を表すことなく捕捉されかつ拡張されることができたか、もしくは、捕捉されていることができたがしかし培養で成長できなかったか、もしくは「捕捉可能」であるためには弱すぎる、ＭＨＣ被覆されたビーズとの相互作用を有することができた。２ＣＴ細胞が捕捉後にＣＴＬに拡張し得るため、捕捉がＴ細胞を非応答性にすることはありそうでない。
磁気分離は希少な細胞集団を精製するのに選択すべき方法であることが証明されている。これらは、ヒト末梢血造血系前駆細胞（0.18％から54.4％までの精製、300倍の濃縮、＞39％の回収）（カトー（Kato）とラドブルフ（Radbruch）、1993）、ヒト末梢血burst forming cell-erythroid（0.04％から56.6％までの精製、1400倍の濃縮、13％の回収）（サワダ（Sawada）ら、1990）および末梢血のＩｇＡ1を発現するＢリンパ球（0.1〜1.5％から80％までの精製、80％までの回収）（イルシュ（Irsch）ら、1994）を包含する。抗原特異的Ｔ細胞の濃縮のための本発明の方法は、濃縮および回収の数字により判断されるように、これらの方法より本質的により良好である。これは、上で挙げられた精製方法は特異的細胞に対するリガンドとして抗体を使用したためとりわけ重要であり；抗体はＴＣＲに対するＭＨＣ−ペプチド複合体のものよりずっとより大きい、抗原に対する親和性を有する。本発明の方法は、細胞表面分子に対する他の低親和性リガンドを介する細胞の精製にもまた有用であり、低親和性リガンドは、可溶性の形態で使用される場合に細胞表面に安定に結合されたままであるには低すぎる親和性を有する分子を意味する。対照的に、抗体のような高親和性リガンドは、可溶性の形態で使用される場合に細胞表面上で安定に結合されたままである。
興味深いことに、抗原特異的Ｔ細胞の蛍光標識が可能である（アルトマン（Altman）ら、1996）とは言え、フローサイトメトリーによる細胞選別は磁気分離の代用となり得なかった。なぜなら、Ｔ細胞前駆体は、通常、フローサイトメトリーで検出できるには希少すぎ、また、分析および選別の速度が制限する因子のままであるからである。対照的に、磁気分離は、希少な抗原特異的Ｔ細胞集団を分離するのに、ならびに多数の細胞を迅速に選別するのに使用され得る。これらの特徴は、磁気単離を、臨床的使用のため抗原特異的Ｔ細胞を導き出す魅力的な処置とする。
結論として、これは、生来の個体に適用可能である抗原特異的Ｔ細胞の精製方法の最初の報告である。われわれは、それがいくつかの異なるＭＨＣ分子および多様なペプチドに適用され得たことを示した。本発明の方法は、ヒト末梢血からウイルスもしくは腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞系を導き出すための使用を包含するがしかしこれに制限されない多様な状況で使用できる。本発明の方法を使用して導き出される細胞は、それら自身、培養での増殖および患者への再注入、診断的分析、ならびに他の治療上の応用を包含するがしかしこれらに制限されない多様な目的上有用である。
以下の実施例は、しかしながら、本発明の範囲を以下の実施例に制限することなく本発明を具体的に説明する目的上提供される。
実施例１
アビジン被覆された磁気ビーズ上でのビオチニル化ＭＨＣクラスＩ分子の付着
可溶性ＭＨＣクラスＩ分子Ｌd、ＫbおよびＫbm3を、ショウジョウバエ（Drosophila melaogaster）細胞中で発現し（ジャクソン（Jackson）ら、1992）、そして以前に記述されたように（シクレヴ（Sykulev）ら、1994a）精製した。ビオチニル化を、製造元の説明書に従ってビオチン−ＢＭＣＣ（ピアース（Pierce）、イリノイ州ロックフォード）を使用して実施した。
ダイナビーズ（Dynabeads）Ｍ５００（ダイナル（Dynal）、ニューヨーク州レイクサクセス）をニュートラビジン（neutravidin）（ピアース（Pierce）、イリノイ州ロックフォード）で被覆し、そしてその後、穏やかな攪拌下に４℃で２時間、３％ＦＣＳを含有するＰＢＳ中で希釈されたビオチニル化ＭＨＣクラスＩ分子とともにインキュベーションした。ビーズをその後、10％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で３回洗浄し、そして20μMのペプチドとともに１時間インキュベーションした。ビーズをその後、直ちに細胞吸着に使用した。
ビオチニル化されたＬdを試験モデルとして使用して、アビジン被覆された磁気ビーズへのビオチニル化ＭＨＣクラスＩの付着を研究した。多様な量のこの分子をビーズとともにインキュベーションした。ビーズをその後、フルオレセイン標識されたコンホメーション感受性の抗Ｌdモノクローナル抗体３０．５．７を使用して染色した。Ｌdの接着をフローサイトフルオロメトリー分析により評価した。平均蛍光値は、図１Ａに示されるように、106個のビーズあたり０と1.5μgのＬdの間のＬdの量で直線的に増加し、そして106個のビーズあたり３μgのＬdで安定期に達した。飽和に達するのに必要とされたＬdの量はいくつかのバッチのビーズおよびビオチニル化されたＬdと同一であった。ビーズあたりの固定されたＭＨＣ分子の数を定量するため、われわれは、以下のような固相イムノアッセイを使用することにより結合の前および後の溶液中のＭＨＣクラスＩ分子の濃度を測定した。すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子Ｌdを、２８−１４−８Ｓ抗Ｌd（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックヴィル）で被覆されていた6.8μmのポリスチレンラテックスサルフェートビーズ（インターフェイシャル  ダイナミクス  コーポレーション（Interfacial Dynamics Corporation）、オレゴン州ポートランド）上で吸着させ；ビーズをその後フルオレセイン標識３０−５−７抗Ｌdを使用して染色し；平均蛍光値（ＭＦＶ）をフローサイトフルオロメトリーにより測定した。標準曲線を既知濃度のＬdを用いて確立し、そしてＭＦＶを濃度に対してプロットした。飽和する条件での固定されたＬdの量はビーズあたり1.23±0.10×106個の分子であることが見出された。蛍光ヒストグラムは、未染色のビーズ（図１Ｂ）および飽和する量のＬd（図１Ｃ）で吸着されたビーズの蛍光を示す。付着はアビジンとビオチンの相互作用を介して起こった。なぜなら、ビオチニル化されない分子はビーズに結合しなかったからである（図１Ｄ）。ＫbおよびＫbm3で被覆されたビーズを調製し、そして同一の技術を使用して試験した。飽和はＬdに関する限りは同一範囲の濃度を使用して達成された。
実施例２
抗原ペプチドの存在下でのＭＨＣクラスＩ被覆された磁気ビーズ上への抗原特異的Ｔ細胞の捕捉
マウスおよび細胞系。ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）およびＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）マウスはハルラン  スプラグ  ドーレイ（Harlan Sprague Dawley）（カリフォルニア州サンディエゴ）からであった。２Ｃトランスジェニックマウス（シャ（Sha）ら、1988）は、Ｒ．Ｗ．ジョンソン（Johnson）Ｐ．Ｒ．Ｉ飼育場で繁殖させた。全てのマウスを特定の病原体を含まない条件下に飼育した。Ｌdを発現するＲＡＭ．Ｓ細胞（カイ（Cai）とスペント（Spent）、1996）およびＥＬ４細胞（Ｈ−２b、ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックヴィルから得られた）をＣＴＬアッセイで標的細胞として使用した。抗クロノタイプ（clonotypic）１Ｂ２ハイブリドーマは以前に記述された（クランツ（Kranz）ら、1994）。
正常マウスからのＣＤ８+Ｔ細胞の精製
精製は滅菌条件下で４℃で実施した。マウスの鼠蹊部、腋窩、頸部、腸骨および腸間膜のリンパ節を切り離し、そして単一細胞懸濁物に分離した。アビジン被覆された磁気ビーズ（ダイナル（Dynal）、ニューヨーク州レイクサクセス）をビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇ（サザン  バイオテクノロジー（Southern Biotechnology）、アラバマ州バーミンガム）で被覆し、そしてその後細胞懸濁物とともにインキュベーションしてＩｇを発現する細胞を吸着した。吸着されない細胞をその後、Ｈ−２bバックグラウンドをもつマウスについて、２μg/mlのＨ１２９．１９（抗ＣＤ４、ギブコ  ＢＲＬ（Gibco BRL）、メリーランド州ゲイタースバーグ）、１μg/mlのＡＦ６−１２０．１（抗Ｉ−Ａb、ファーミンゲン（Pharmingen）、カリフォルニア州サンディエゴ）、１μg/mlのＫＨ７４（抗Ｉ−Ａb、ファーミンゲン（Pharmingen）、カリフォルニア州サンディエゴ）および１μg/mlの３４−５−３（抗Ｉ−Ａd，b、ファーミンゲン（Pharmingen）、カリフォルニア州サンディエゴ）；もしくは、Ｈ−２dバックグラウンドをもつマウスについて、２μg/mlのＨ１２９．１９および１μg/mlの３４−５−３とともにインキュベーションした。細胞をその後３回洗浄し、そしてＣＤ４もしくはＭＨＣクラスIIを発現する細胞を、ヒツジ抗ラットＩｇ被覆された磁気ビーズ（ダイナル（Dynal）、ニューヨーク州レイクサクセス）上での吸着により排除した。純度は抗体染色およびフローサイトフルオロメトリーにより判断されるように90ないし94％のＣＤ８+細胞に達した。
２Ｃトランスジェニックマウスからの２ＣＴ細胞の精製
２ＣＴ細胞を上述された処置に従ってマウスリンパ節から精製した。精製された細胞は抗クロノタイプ抗体１Ｂ２と97〜98％反応性であった。加えて、ＣＤ８-（ＣＤ４-）細胞もまた、抗ＣＤ８ａ抗体５３−６．７（ギブコＢＲＬ（Gibco BRL）、メリーランド州ゲイタースバーグ）およびヒツジ抗ラットＩｇで被覆された磁気ビーズを用いてＣＤ８+細胞を除去することにより調製し得た。
ペプチド
これらの研究で使用されたＬdおよびＫb結合ペプチドは、標準的固相ペプチド合成法（ｔＢｏｃ化学）によりアプライド  バイオシステム（Applied Biosytem）の４３０Ａおよび４３１Ａ装置で合成した。ペプチドの配列は以下のようであった。すなわち
ＱＬ９：ＱＬＳＰＦＰＦＤＬ［配列番号１］
ｐ２Ｃａ：ＬＳＰＦＰＦＤＬ［配列番号２］
ＳＬ９：ＳＰＦＰＦＤＬＬＬ［配列番号３］
ｐ２Ｃａ−Ａ３：ＬＳＡＦＰＦＤＬ［配列番号４］
ｄＥＶ−８：ＥＱＹＫＦＹＳＶ［配列番号５］
ＳＩＹＲ：ＳＩＹＲＹＹＧＬ［配列番号６］
ＬＣＭＶ：ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ［配列番号７］
ＭＣＭＶ：ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ［配列番号８］
ＯＶＡ−８：ＳＩＩＮＦＥＫＬ［配列番号９］
ＶＳＶ−８：ＲＧＹＶＹＱＧＬ［配列番号１０］
Ｅ１：ＥＩＩＮＦＥＫＬ［配列番号１１］
ＭＨＣ被覆された磁気ビーズ上の２ＣＴ細胞の吸着
抗原特異的Ｔ細胞を捕捉するＭＨＣクラスＩ被覆されたビーズの能力を試験するため、われわれは、Ｌd、Ｋbm3もしくはＫbで被覆された磁気ビーズおよび２ＣＴＣＲのトランスジェニックマウスから精製されたＴ細胞を使用した。２ＣＴＣＲは広範囲に特徴づけられており、また、Ｌdと共同して多様な親和性で認識されるいくつかの抗原ペプチド（表Ｉ）が報告されている（シクレヴ（Sykulev）ら、1994a、b）。さらに、Ｋbm3およびＫbは、最近、ペプチドｄＥＶ−８およびＳＩＹＲと共同して２ＣＴＣＲの制限要素としてはたらくことが示されている（トールクィスト（Tallquist）とピース（Pease）、1995；ウカダ（Ukada）ら、1996；トールクィスト（Tallquist）ら、1996）。２ＣＴＣＲに対するＫbm3−ｄＥＶ−８およびＫb−ＳＩＹＲ複合体の親和性がそれぞれ1.8×104M-1および3.1×104M-1であったことが最近測定された。別の方法で示されない限り、ビーズを、飽和する量のビオチニル化Ｌd、Ｋbm3もしくはＫb分子で被覆した。
細胞を、107個のビーズ／mlの最終濃度に達するようにビーズとともに懸濁した。細胞濃度は、図２、３および４で106個／ml、また、図５、６および７で107個／mlであった。ペプチドを20μMの濃度で添加した。吸着を、本文に示された時間の期間および温度下で穏やかな攪拌下に実施した。ビーズに吸着された細胞をその後顕微鏡下で計数した。明確なロゼット（細胞あたりビーズ３個もしくはそれ以上）が観察されなかった場合には、付着を、カバーグラスを静かにたたくことにより試験した。高親和性ペプチドＱＬ９、中間的な親和性のペプチドｐ２Ｃａおよび低親和性ペプチドＳＬ９の存在下での室温でのインキュベーションに際して、大多数の２ＣＴ細胞が、インキュベーションの４時間後の顕微鏡検査により判断されるように、Ｌd被覆されたビーズに接着した（表Ｉ）。類似の結果（60〜80％の細胞が捕捉された）を５回の独立の実験で得た。細胞の接着は、それが非２Ｃ反応性のＬd−ＬＣＭＶおよびＬd−ＭＣＭＶ複合体の存在下で起こらなかったため、特異的であった。
吸着を、緑色対赤色蛍光ドットプロット、もしくは前方対側方散乱ドットプロットのいずれかを記録することによりＦＡＣＳスキャン[FACSscan]（商標）（ベクトン  ディッキンソン  アンド  カンパニー（Becton Dickinson & Co.）、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用するフローサイトフルオロメトリーによってもまた定量した。緑色対赤色蛍光ドットプロットを使用する細胞−ビーズ複合体形成を評価するため、ビーズをフィコエリトリンで赤色に標識し（図２Ａ：ビーズ単独）、そして細胞をＮＨＳ−フルオレセイン（ピアース（Pierce）、イリノイ州ロックフォード）で緑色に標識した（図２Ｂ：細胞単独）。細胞−ビーズ複合体形成を、緑色（Ｇ）および赤色（Ｒ）の事象の出現により評価した。ビーズに複合体形成された（complexed）細胞のパーセントを比ＲＧ／Ｇ＋ＲＧとして算出し、式中Ｇは下右の四分円での事象の数であり、また、ＲＧは上右の四分円での事象の数である。われわれは、こうした緑色対赤色蛍光ドットプロット（図２）で、細胞−ビーズ複合体形成が、抗原ペプチドＱＬ９（図２Ｃ）、ｐ２Ｃａ（図２Ｄ）およびＳＬ９（図２Ｅ）の存在下で極めて明白であったことを見出し、85％を越える細胞が高赤色蛍光値に移動した。若干の赤色および緑色に彩色された事象（2.2％）が、対照ペプチド（ＬＣＭＶ）とともにインキュベーションされたサンプルで検出された（図２Ｆ）。これは、最もありそうには、少量のフルオレセイン標識された細胞破片のビーズへの非特異的吸着によった。
側方散乱対前方散乱ドットプロットもまた、細胞（図３Ｃ）およびビーズ（図３Ｂ）が非常に異なる側方および前方の散乱を有したという事実のおかげでこの定量に使用でき、これはそれぞれ細胞およびビーズを表す事象の集団を含有するはっきりと明確な領域（図３Ａ）を引き出すことを容易にした。ビーズより大きな前方散乱および細胞より大きな側方散乱を伴う事象の付加的な集団の出現は、細胞−ビーズ複合体形成を反映し；これは細胞およびビーズの領域と性質の異なる複合体領域を定義することを可能にした。ビーズに吸着された細胞のパーセントを比ＣＯ／ＣＯ＋ＣＥとして算出し、式中ＣＯは複合体領域中の事象の数であり、また、ＣＥは細胞領域での事象の数であった。こうした前方対側方散乱の測定は、ビーズに対する２ＣＴ細胞の抗原特異的吸着を示した。すなわち、図３に示された実験において、４時間のインキュベーション後に、91.0％および78.9％の細胞がそれぞれＱＬ９（図３Ｄ）およびｐ２Ｃａ（図３Ｅ）の存在下にＬd被覆されたビーズに吸着され、また、63.8％の細胞がｄＥＶ−８の存在下にＫbm3被覆されたビーズに吸着され（図３Ｇ）、そして75.7％の細胞がＳＩＹＲの存在下にＫb被覆されたビーズに吸着された（示されない）。それらの側方散乱値により異なったいくつかの集団は複合体領域で可視的であり；それらは異なる数のビーズを含有する複合体を表すらしかった。非２Ｃ反応性のＬd−ＬＣＭＶ（図３Ｆ）、Ｋbm3−Ｅ１（図３Ｈ）およびＫb−Ｅ１複合体の存在下では、それぞれ2.6％、1.1％および0.2％の事象が複合体領域で見出された。
われわれは、フローサイトフルオロメトリー分析を使用して、細胞−ビーズ複合体形成に対する多様なパラメータの影響を定量した。ビーズへの細胞の付着は時間依存性であった。結合はインキュベーションの５分後に検出可能であり、その後増大して１と４時間との間で安定期に達し、そして６時間後に目に見えて減少した（図４Ａ）。吸着の力学は多様なペプチド−ＭＨＣ複合体について著しく平行であった。付着はまた、図４Ｂに示されるように温度依存性でもあった。４℃では、小さなパーセントの細胞のみが、延長されたインキュベーション後でさえビーズ上に捕捉された。室温での吸着は、Ｌd−ｐ２Ｃａを除いて37℃での吸着に非常に類似であり、Ｌd−ｐ２Ｃａについては37℃での付着レベルは室温で測定された値の約25％であり、ｐ２Ｃａの37℃でＬdを安定化することの無能（カイ（Cai）とシュプレント（Sprent）、1996）と矛盾しない。最後に、細胞捕捉のＣＤ８依存性はペプチド−ＭＨＣ複合体で変動した。すなわち、例えば、Ｌd−ＱＬ９およびＫbm3−ＳＩＹＲの捕捉は主としてＣＤ８非依存性であった一方、Ｌd−ｐ２ＣａおよびＫbm3−ｄＥＶ−８はＣＤ８依存性を表した（図４Ｃ）。
実施例３
無関係のＴ細胞と混合された抗原特異的Ｔ細胞の回収
生来の動物でのＴ細胞前駆体の頻度は典型的に低い。磁気ビーズは他の系で低頻度の細胞集団を濃縮するのに適すると見出されている（サワダ（Sawada）ら、1990；カトー（Kato）とラドブルフ（Radbruch）、1993）。ＭＨＣクラスＩ被覆された磁気ビーズがＴ細胞前駆体の濃縮に使用され得るかどうかを評価するため、われわれは、フルオレセイン標識された２ＣＴ細胞を、生来のＣ５７ＢＬ／６マウスから精製されたＣＤ８+Ｔ細胞と混合した。ペプチドの存在下でのＭＨＣ被覆された磁気ビーズとのインキュベーション後、吸着された細胞を溶出しそして計数し、そして２ＣＴ細胞のパーセントをフローサイトフルオロメトリーにより測定した。図５に示される実験において、２ＣＴ細胞は0.03％の初期頻度で検出不可能であった。Ｋbm3被覆されたビーズおよびｄＥＶ−８ペプチドを使用する吸着の後、緑色蛍光の明確なピークが観察され、最初のフルオレセイン染色された２ＣＴ細胞集団と同一の強度を表した。このピークは溶出された細胞の65.1％に相当した。ｄＥＶ−８の代わりに対照ペプチドを使用した場合はピークは観察されなかった。われわれは、３種の異なるＭＨＣ−ペプチド複合体で被覆されたビーズを使用する比較できる実験で、２ＣＴ細胞で800〜1600倍の濃縮を達成した（表II）。全ての場合で、溶出された集団中の非蛍光細胞は初期の細胞集団の小さな画分のみに相当した（〜0.2％）。
実施例４
生来のマウスからの抗原特異的ＣＴＬのインビトロの単離および拡張インビトロの細胞媒介性の細胞傷害性
ＬＣＭＶアームストロング（Armstrong）に感染した（48時間；多重感染（multiplicity of infection）：細胞あたり１ＰＦＵ）Ｌdを発現するＲＭＡ．Ｓ細胞、ＥＬ４細胞（Ｈ−２b）、ＭＣ５７細胞（Ｈ−２b）、もしくはＬＣＭＶアームストロングに感染した（48時間；多重感染：細胞あたり１ＰＦＵ）ＢＡＬＢ／ｃのＣＬ−７細胞（Ｈ−２d）を標的細胞として使用した。標的細胞を、20％ＦＣＳの存在下に、37℃で60分、細胞106個あたり100μCiのＮａ251ＣｒＯ4（ニュー  イングランド  ヌクレア（New England Nuclear）、デラウェア州ウィルミントン）で負荷した。それらを３回洗浄し、そしてウェルあたり細胞4,000ないし10,000個で96穴プレート中に等分した（aliquoted）。ペプチドおよびエフェクター細胞をその後添加した。最終体積は200μl／ウェルであった。プレートを37℃で５時間インキュベーションした。100μlの上清を収集し、そしてγ線計数装置で計数した。特異的溶解（specific lysis）のパーセントを以前に報告されたように（ヴンダーリッヒ（Wunderlich）とシアラー（Shearer）、1991）算出した。
ＣＴＬ活性についてのインビボアッセイ
レシピエントマウスに、第０日に２×103ＰＦＵのＬＣＭＶアームストロングを静脈内注入し、そして第１日に細胞を静脈内に養子的に移入した。第２日にマウスを殺し、そして、脾を、以前に記述されたように（バーン（Byrne）とオールドストーン（Oldstone）、1984）ベロ（Vero）細胞でのプラークアッセイにより感染性ウイルスの力価についてアッセイした。ウイルス力価は組織１グラムあたりのプラーク形成単位（pfu/g）として表した。
細胞培養物
ビーズ上に吸着された細胞を、10％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭで３回ビーズを洗浄することにより回収し、そしてその後、10μMのペプチドの存在下に、適切なＭＨＣクラスＩ分子および抗ＣＤ２８抗体で被覆された96穴プレートで培養し；これらの条件は休止２ＣＴ細胞を活性化するのに十分である。平坦底のウェルのプレートを使用して、全ての細胞が固定された刺激分子との接触にあることを確実にした。８％ＣＯ2を含有する湿気のある雰囲気下での37℃での２日の培養後、培地の体積の半分を、コンカナバリンＡで活性化されたラット脾細胞からの培養上清（ｃｏｎＡ上清）20％を含有する新たな培地により置き換えた。８〜12日後、細胞を、１μMのペプチドを適用された脾細胞で再刺激し、そして10％のｃｏｎＡ上清および２ng/mlのＴＧＦβ1の存在下で培養した（リー（Lee）とリッチ（Rich）、1991；ツァング（Zhang）ら、1995）。
ＭＨＣ被覆された磁気ビーズ上での吸着を使用する、生来のマウスのＴ細胞からの抗原特異的ＣＴＬ系統の発生；単離段階の抗原特異性
この捕捉方法が、生来の動物から抗原特異的Ｔ細胞を単離するのに応用可能であることができるかどうかを検討するため、われわれは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２bハプロタイプ）のリンパ節から精製されたＣＤ８+Ｔ細胞の２個のアリコートを、室温で４時間の間、ＯＶＡ−８ペプチド（アリコート１）もしくはＶＳＶ−８ペプチド（アリコート２）のいずれかの存在下にＫb被覆された磁気ビーズとともにインキュベーションした。３回の洗浄後、細胞を、10μMのＯＶＡ−８もしくはＶＳＶ−８ペプチドの存在下に、Ｋbおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂで被覆された96穴プレートの12個のウェル中での培養に植え付けた（put in）。培養物を前節で示されたように処理した。細胞の成長は吸着された細胞を含有するウェルで７日後に可視的であった。細胞を第９日に支持細胞（feeder cell）上で再刺激し、そして第18日に細胞傷害性の活性について試験した。ＯＶＡ−８とともに培養されたアリコート１からの細胞はＯＶＡ−８ペプチドに特異的なＣＴＬ活性を表し（図６Ａ）、そして、ＶＳＶ−８とともに培養されたアリコート２からの細胞はＶＳＶ−８に特異的なＣＴＬ活性を表した（図６Ｃ）。対照を逆の組み合わせにより提供した。すなわち、ＯＶＡ−８ペプチドを使用して捕捉された細胞は検出可能な抗ＶＳＶ−８ＣＴＬ前駆体を含有しなかった。なぜなら、それらは、培養でそれらを活性化するのにＯＶＡ−８よりもむしろＶＳＶ−８を使用した場合に、抗ＶＳＶ−８のＣＴＬを生じなかったからであり（図６Ｂ）；同様に、ＶＳＶ−８ペプチドを使用して捕捉された細胞は検出可能な抗ＯＶＡ−８ＣＴＬ前駆体を含有しなかった（図６Ｄ）。
濃縮後のＣＴＬｐの頻度の推定値を得るため、われわれは、Ｋb被覆されたビーズおよびＯＶＡ−８ペプチドを使用する濃縮実験を反復した。代表的実験において、Ｋb−ＯＶＡ８被覆された磁気ビーズへの吸着により回収された12,000個の細胞を等分し、そして捕捉直後に96穴プレートの12個のウェルで別個に培養した。特異的ＣＴＬが３個のウェル中の培養された捕捉された細胞から回収され、捕捉後の前駆体の頻度がおよそ１／3,500であったことを示した。類似の結果を３回の独立の実験で得た。
生来のマウスのＴ細胞からの抗ＬＣＭＶＣＴＬの発生；インビトロおよびインビボの抗ウイルス活性
われわれは、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２dハプロタイプ）のリンパ節から精製された107個のＣＤ８+Ｔ細胞を、室温で４時間の間ＬＣＭＶペプチドの存在下にＬd被覆された磁気ビーズと一緒にインキュベーションすることにより、抗ＬＣＭＶＣＴＬを導き出した。３回の洗浄後、約104個の細胞を回収し、そして、10μMのＬＣＭＶペプチドの存在下にＬdおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂで被覆された96穴プレートの12個のウェル中に培養物を接種した。細胞を前節で示されたように培養した。図７Ａに示されるように、われわれはＬＣＭＶペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を得た。細胞はまた、未感染の標的に対するバックグラウンド活性のみを表しつつ、Ｈ−２dハプロタイプのＬＣＭＶに感染した標的も殺した（図７Ｂ）。抗アロタイプ活性（図７Ｃ）ならびに若干のＮＫ／ＬＡＫ活性もまた存在した（図７Ｄ）。全ての細胞は、フローサイトフルオロメトリーにより判断されるようにＣＤ８を発現した。インビボアッセイは、細胞がＬＣＭＶに急性に感染したＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２d）でウイルスの力価を著しく低下させることが可能であったことを示した（図８）。この低下は、ウイルスの力価の有意の低下がＣＴＬ注入後にＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b）で観察されなかったため、ＭＨＣ特異的であった。
関係書目の引用
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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