(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアゲノムのＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺伝子配列中の領域から選択された動物特異的遺伝子配列をプライマー対とし、試料中のＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する工程、および該増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含む、動物識別方法であって、該プライマー対が、以下の組み合わせ：配列表の配列番号１の配列と配列表の配列番号２の配列；配列表の配列番号３の配列と配列表の配列番号４の配列；配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１１の配列；配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１１の配列；配列表の配列番号８の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号６の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号１３の配列と配列表の配列番号１４の配列；配列表の配列番号１７の配列と配列表の配列番号１８の配列；配列表の配列番号１９の配列と配列表の配列番号２０の配列；および、配列表の配列番号２２の配列と配列表の配列番号２４の配列；からなる群より選択される、方法。
【請求項２】
前記試料が、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、肉骨粉、および肉骨粉含有飼料からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
動物特異的遺伝子配列検出用プライマー対であって、該プライマー対が、ミトコンドリアゲノムのＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺伝子配列中の領域から選択され、そして以下の組み合わせ：配列表の配列番号１の配列と配列表の配列番号２の配列；配列表の配列番号３の配列と配列表の配列番号４の配列；配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１１の配列；配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１１の配列；配列表の配列番号８の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号６の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号１３の配列と配列表の配列番号１４の配列；配列表の配列番号１７の配列と配列表の配列番号１８の配列；配列表の配列番号１９の配列と配列表の配列番号２０の配列；および、配列表の配列番号２２の配列と配列表の配列番号２４の配列；からなる群より選択される、プライマー対。
【請求項４】
飼料中に含まれる動物由来の成分を検出する方法であって、ミトコンドリアゲノムのＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺伝子配列中の領域から選択された動物特異的遺伝子配列をプライマー対とし、飼料中のＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する工程、および該増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含み、該プライマー対が、以下の組み合わせ：配列表の配列番号１の配列と配列表の配列番号２の配列；配列表の配列番号３の配列と配列表の配列番号４の配列；配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１１の配列；配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１１の配列；配列表の配列番号８の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号６の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号１３の配列と配列表の配列番号１４の配列；配列表の配列番号１７の配列と配列表の配列番号１８の配列；配列表の配列番号１９の配列と配列表の配列番号２０の配列；および、配列表の配列番号２２の配列と配列表の配列番号２４の配列；からなる群より選択される組み合わせである、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物種識別方法およびそれに用いるプライマー対配列に関する。詳細には、ミトコンドリアゲノムＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺伝子配列に由来する動物特異的遺伝子配列を増幅する工程を含む動物種識別方法、および該増幅工程で使用されるプライマー対配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の牛に由来する肉骨粉が飼料に添加され、その飼料を与えられた牛がＢＳＥに罹患し、問題となっている。そして、ＢＳＥと類似する病気が種々の家畜にも存在する可能性が指摘されている。そこで、ＢＳＥの発生以来、先端技術を用いた鋭敏な動物種の検出技術の開発が、必要となっており、特に行政上の緊急対応事項となっている。
【０００３】
動物種識別については、従来、免疫学的手法、ならびに核遺伝子を用いる遺伝子識別手法が用いられてきた。免疫学的手法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法が挙げられる。核遺伝子を用いる遺伝子識別手法としては、例えば、ＰＣＲ法が挙げられる。しかし、加熱処理されている肉骨粉などは、タンパク質の変性や核酸の断片化が生じている可能性が高いこと、および肉骨粉混入飼料には植物由来成分が多く、動物由来成分について微量分析が必要であることなど、現在行われている動物種識別方法には、多くの問題点がある。このように加熱処理後サンプルについても実施可能な、感度が高くかつ有効な検出方法の開発が急務である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、免疫学的手法あるいは核遺伝子を用いる遺伝子識別手法以外に、微量混入する動物由来成分の動物種を検出し、同定する方法が望まれている。特に、家畜あるいはペットに与える飼料中に、どのような動物の肉あるいは肉骨粉が使用されているかを検出することは重要であり、大量に存在する植物の遺伝子、あるいは他の動物種の遺伝子の中から、微量存在する特定の動物由来遺伝子のみを検出の対象とする、感度の高い検出方法が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、母性遺伝し、核遺伝子と比較してコピー数の多い、ミトコンドリアゲノムに着目し、ミトコンドリア遺伝子を動物種識別の対象にして検討した。その中で、発明者らは、動物ミトコンドリアゲノムに存在するＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺伝子（ａｔｐ８遺伝子）が、植物（イネ）ミトコンドリアゲノムに存在しないことを明らかにして、植物系の飼料中の微量の動物遺伝子を検出する材料となり得ること、およびこの動物ミトコンドリアａｔｐ８遺伝子の特定の配列を利用して動物種を識別できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
したがって、本発明は、ミトコンドリアゲノムのＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺伝子配列に由来する動物特異的遺伝子配列をプライマー対とし、試料中のＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する工程、および該増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含む、動物種識別方法を提供する。
【０００７】
好適な実施態様では、上記動物は哺乳動物であり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の配列番号１の配列と配列表の配列番号２の配列との組み合わせである。
【０００８】
好適な実施態様では、上記動物は反芻動物であり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の配列番号３の配列と配列表の配列番号４の配列との組み合わせである。
【０００９】
好適な実施態様では、上記動物はウシであり、より好適には、上記プライマー対は、以下の組み合わせ：配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１１の配列；配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１１の配列；配列表の配列番号８の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１０の配列；および、配列表の配列番号６の配列と配列表の配列番号１０の配列；からなる群より選択される組み合わせである。
【００１０】
好適な実施態様では、上記動物はブタであり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の配列番号１３の配列と配列表の配列番号１４の配列との組み合わせである。
【００１１】
好適な実施態様では、上記動物はヒツジであり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の配列番号１７の配列と配列表の配列番号１８の配列との組み合わせである。
【００１２】
好適な実施態様では、上記動物はヤギであり、より好適には、上記プライマー対が、配列表の配列番号１９の配列と配列表の配列番号２０の配列との組み合わせである。
【００１３】
好適な実施態様では、上記動物はニワトリであり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の配列番号２２の配列と配列表の配列番号２４の配列との組み合わせである。
【００１４】
別の好適な実施態様では、上記試料は、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、肉骨粉、および肉骨粉含有飼料からなる群より選択される。
【００１５】
本発明はまた、配列表の配列番号１の配列と配列表の配列番号２の配列との組み合わせである、哺乳動物特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供する。
【００１６】
本発明はまた、配列表の配列番号３の配列と配列表の配列番号４の配列との組み合わせである、反芻動物特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供する。
【００１７】
本発明はまた、以下の組み合わせ：配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１１の配列；配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１１の配列；配列表の配列番号８の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１０の配列；および配列表の配列番号６の配列と配列表の配列番号１０の配列；からなる群より選択される組み合わせである、ウシ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供する。
【００１８】
本発明はまた、配列表の配列番号１３の配列と配列表の配列番号１４の配列との組み合わせである、ブタ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供する。
【００１９】
本発明はまた、配列表の配列番号１７の配列と配列表の配列番号１８の配列との組み合わせである、ヒツジ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供する。
【００２０】
本発明はまた、配列表の配列番号１９の配列と配列表の配列番号２０の配列との組み合わせである、ヤギ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供する。
【００２１】
本発明はまた、配列表の配列番号２２の配列と配列表の配列番号２４の配列との組み合わせである、ニワトリ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、配合飼料中に含まれる動物由来の成分を検出する方法を提供し、この方法は、ミトコンドリアゲノムのＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺伝子配列に由来する動物特異的遺伝子配列をプライマー対とし、試料中のＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する工程、および該増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含む。
【００２３】
【発明の実施の形態】
ミトコンドリアゲノムは、酸化的リン酸化（電子伝達系）に必要な酵素類の生合成に必須であり、ＡＴＰ合成酵素、シトクロムｃオキシダーゼなどがミトコンドリアＤＮＡ上にコードされている。ＡＴＰ合成酵素は、いくつかのサブユニットから構成されており、上述のように、発明者らは、ＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺伝子（ａｔｐ８遺伝子）が、動物ミトコンドリアゲノムに存在するが、植物（イネ）ミトコンドリアゲノムに存在しないことを見出した。そして、これによって、飼料中に植物由来のＤＮＡが大量に存在するにもかかわらず、動物種を識別できることが可能となった。
【００２４】
動物のａｔｐ８遺伝子は、いくつか知られている。例えば、ウシのａｔｐ８遺伝子配列（ウシ）を基準とし、いくつかの動物種におけるａｔｐ８遺伝子配列を、ウシとの相同性が最大となるようにアラインしたものを、図１に示す。図１においては、１：ウシ、２：アルパカ、３：ネコ、４：イヌ、５：ヤギ（１）、６：ヤギ（２）、７：ウマ、８：カモシカ、９：マウス、１０：ウサギ、１１：ラット、１２：ロバ、１３：ヒツジ、１４：シカ、１５：マッコウクジラ、および１６：ナガスクジラのａｔｐ８遺伝子の遺伝子配列を示す。なお、図の矢印は、ウシのａｔｐ８構造遺伝子の始まりの位置を示す。
【００２５】
また、図２は、ウシ、ニワトリ、およびブタのａｔｐ８遺伝子をアラインしたものを示す。
【００２６】
図１および図２に示すように、ａｔｐ８遺伝子には遺伝子の多様性がある。この多様性を利用して、各種動物における特異的配列を検出することにより、各動物種の識別が可能である。
【００２７】
各種動物を識別するために、それぞれの動物種に特異的なＤＮＡ配列を検出する方法としては、サザンブロット法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などが挙げられるが、微量のＤＮＡ試料でも検出が可能な点、および精度を向上させる点で、本発明においてはＰＣＲ法が好ましく用いられる。本発明におけるＰＣＲは、目的の動物種に特異的なＤＮＡ配列を含む一対のプライマーを用いて行い、増幅されたＤＮＡ断片を検出する。
【００２８】
ＰＣＲ法は、例えば、以下のように行われる。まず、ａｔｐ８遺伝子配列中の目的の動物種に特徴的な配列を有するいくつかの領域から、プライマーとして２箇所を選択し、それぞれのプライマーを合成する。プライマーは、それぞれ約２０ヌクレオチドの長さである。この一対のプライマーを用いて、プライマーに挟まれた領域のＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅する。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を含む試料について電気泳動を行って、該ＤＮＡ断片の有無を検出する。
【００２９】
プライマーは、任意の約２０ヌクレオチド長さのＤＮＡ配列であり、公知のデータベースの各種動物のａｔｐ８遺伝子配列のアラインメントに基づいて適宜選択される。例えば、哺乳動物に特異的な遺伝子の検出を目的とする場合、哺乳動物間で相同性が高く、かつ、非哺乳動物とは相同性が低い領域を選択すればよく、特定の動物に特異的な遺伝子の検出を目的とする場合は、その動物に特異的であり、かつ、他の動物とは相同性の低い領域を選択すればよい。プライマーは、対として使用するため、５’側および３’側の２箇所の領域を選択する。プライマーとして選択可能な領域が２箇所よりも多い場合は、種々の組み合わせのプライマーを用い得る。
【００３０】
例えば、図３は、ウシのミトコンドリアａｔｐ８遺伝子の配列であり、図中に示す記号は、ウシ特異的遺伝子を検出するためのプライマーとして用い得る領域（配列）である。また、哺乳動物を特異的に検出するための配列（anicon5（配列番号１）およびanicon3（配列番号２））と、反芻動物を特異的に検出するための配列（rumicon5（配列番号３）およびrumicon3（配列番号４））も図３に併せて示す。詳細は実施例において記述するが、例えば、５’側のプライマーとしてanicon5を、３’側のプライマーとしてanicon3を用いると、哺乳動物特異的な遺伝子配列を検出できる。同様に、rumicon5とrumicon3とをプライマーとして用いると、反芻動物特異的な遺伝子配列を検出できる。また、５’側のプライマーとして、cow5（配列番号５）、cow51（配列番号６）、cow52（配列番号７）、cow53（配列番号８）、およびcow54（配列番号９）のいずれかを用い、３’側のプライマーとして、cow3（配列番号１０）あるいはcow31（配列番号１１）を用いる。例えば、cow52とcow31、cow52とcow3、cow54とcow31、cow53とcow3、cow54とcow3、およびcow51とcow3の各プライマー対は、ウシ特異的遺伝子配列を検出できる。
【００３１】
また、図１および図２に示す四角で囲まれた領域は、それぞれの動物種を特異的に検出するための実験に用いた配列の例を示す。
【００３２】
プライマーとして選択された領域のＤＮＡ配列は、通常用いられる方法によって合成される。一般的には、ＤＮＡ自動合成機を用いて支持体上でヌクレオチドを伸長し、次いで、脱保護および支持体からの切断を行う。次いで、通常用いられる方法（例えば、カラムクロマトグラフィー）によって精製して、目的のプライマーを得ることができる。
【００３３】
測定される試料としては、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、肉骨粉、肉骨粉含有飼料などが挙げられる。試料からのミトコンドリアＤＮＡの抽出は、例えば、以下のように行う。約５０ｍｇ〜５００ｍｇの試料（例えば、生肉の場合５０ｍｇ、乾燥粉体試料の場合１００〜５００ｍｇ）を、約１０倍量の緩衝液に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアＤＮＡ抽出キット（例えば、和光純薬工業製）を用いて抽出する。このようなキットは、組織細胞中のゲノムＤＮＡの混入が少なく、より高純度のミトコンドリアＤＮＡを回収するものであり、遠心分離、沈殿採取などによるＤＮＡの抽出、濃縮操作などを行う。このようにして、試料中に存在する大量のゲノムＤＮＡの混入が低いミトコンドリアＤＮＡを効率的に抽出できる。
【００３４】
プライマーの使用量は、特に制限されないが、一般的に、約0.4μＭで使用することが好ましい。
【００３５】
前処理した試料について、上記の選択したプライマー対を用いてＰＣＲを行って、プライマーに挟まれた領域のＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲは、通常行われる条件で実施され、各プライマー対についてそれぞれ適切な条件を設定する。例えば、まず95℃で９分熱変性した後、変性：92℃、１分；アニーリング：40〜65℃、２分；伸長：72℃、２分の反応を、30〜60サイクル繰り返し、最後に72℃、５分反応させてＰＣＲを終了する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、通常AmpliTaq GOLDポリメラーゼが用いられる。プライマー対によって増幅されたＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）の大きさは、選択されたプライマー対間の塩基数に応じて変動するが、約１２０〜約１８０ｂｐであり得る。このＰＣＲ産物は、次いで、上記ＤＮＡ断片を分離できる条件下で、例えば、アガロースゲル電気泳動を行う。
【００３６】
電気泳動したゲル上のＤＮＡ断片は、当業者が通常用いるエチジウムブロマイド染色、蛍光検出、サザンハイブリダイゼーションなどの検出手段によって検出され得る。
【００３７】
このようにして、試料中に目的の動物種由来のＤＮＡが存在していれば、増幅されたＤＮＡ断片がゲル上で検出され得る。検出限界は、用いるプライマー対の種類および組み合わせ、試料の量、ＰＣＲ条件、検出方法などの種々のファクターによって異なり得る。適切な条件を選択すれば、微量の試料においても、高感度でＤＮＡの存在を検出することができる。例えば、適切な条件を選択すれば、試料がウシ由来の肉骨粉を含む配合飼料である場合、特定のウシ特異的なプライマー対を用いて、0.001重量％の牛肉骨粉の混入でさえも検出することが可能である。
【００３８】
なお、以下に述べる実施例においては、プライマー配列が特定されて示されているが、本発明はその例に限定されることを意図していない。そのプライマー配列を含み、あるいはその配列において１または２以上の塩基配列の置換を含み、ハイブリダイズの条件を変えることによって、目的のＤＮＡとハイブリダイズし得、特定の動物種を特異的に検出し得る配列もまた、本発明の範囲に含まれることはいうまでもない。
【００３９】
【実施例】
（プライマーの合成）
図１および図２に示す各種動物のａｔｐ８遺伝子配列のアラインメントに基づいて、以下の各実施例または比較例に用いるプライマー領域を選択した。選択した領域のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。
【００４０】
（実施例１：哺乳動物由来ＤＮＡ配列の特異的検出）
肉牛、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウサギ、クジラ、ニワトリ、タラ、サケ、イワシ、カニ、エビ、およびアサリの１５種類の肉試料から、ミトコンドリアＤＮＡを以下のように調製した。各肉試料を１０倍量の緩衝液（10mM Tris-HCl, pH 7.5、20mM EDTA, pH 7.5）に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアＤＮＡ抽出キット（和光純薬工業製）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００４１】
それぞれのＤＮＡ試料を鋳型とし、anicon5（配列番号１）とanicon3（配列番号２）とを、それぞれ５’側および３’側プライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである：反応緩衝液（10mM Tris-HCl, pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.001%(W/V)ゼラチン）；95℃で９分熱変性した後、変性：92℃、１分；アニーリング：50℃、２分；伸長：72℃、２分の反応を４５サイクル繰り返し、最後に72℃、５分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）を検出した。結果を図４に示す。図中のＭは分子量マーカーである。
【００４２】
図４から明らかなように、anicon5（配列番号１）およびanicon3（配列番号２）をプライマーとして用いて、それぞれの動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、哺乳動物においてのみ、増幅されたＤＮＡ断片の生成が認められた（矢印のバンド位置）。すなわち、anicon5（配列番号１）およびanicon3（配列番号２）をプライマー対とすることにより、種々の動物肉試料の中から、哺乳動物由来のＤＮＡのみを特異的に検出できることが示された。したがって、anicon5（配列番号１）とanicon3（配列番号２）との組み合わせは、哺乳動物に属する動物種を特異的に検出するプライマー対である。図３に、哺乳動物検出のためのプライマーとして用い得る領域を示した。
【００４３】
（実施例２：反芻動物由来ＤＮＡ配列の特異的検出）
実施例１と同様に調製した１５種類のＤＮＡ試料を鋳型とし、rumicon5（配列番号３）とrumicon3（配列番号４）とを、それぞれ５’側および３’側プライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである：95℃で９分熱変性した後、変性：92℃、１分；アニーリング：45℃、２分；伸長：72℃、２分の反応を、４５サイクル繰り返し、最後に72℃、５分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）を検出した。結果を図５に示す。
【００４４】
図５は、rumicon5（配列番号３）およびrumicon3（配列番号４）をプライマーとして用いて、それぞれの動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、反芻動物である肉牛、乳牛、ヒツジ、およびヤギに由来するＤＮＡ断片が生成することが認められた（矢印のバンド位置）。一方、反芻動物に属さない動物のＤＮＡからは、ＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）は検出できなかった。すなわち、rumicon5およびrumicon3をプライマー対とすることにより、種々の動物肉試料の中から、反芻動物由来のＤＮＡのみを特異的に検出できることが示された。したがって、rumicon5（配列番号３）とrumicon3（配列番号４）との組み合わせは、反芻動物由来の動物種を特異的に検出するプライマー対である。図３に、反芻動物検出のためにプライマーとして用い得る領域を示した。
【００４５】
なお、rumicon5（配列番号３）におけるｒは、ｇとａとのミックスであり、ｋはｇとｔとのミックスである。すなわち、rumicon5（配列番号３）は混合プライマーであるが、それぞれが単独で使用され得ることは当業者に明白である。
【００４６】
（実施例３：ウシ由来ＤＮＡ配列の特異的検出）
表１に記載の種々のプライマー対を用いて、ウシ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびニワトリの肉から調製したＤＮＡを鋳型として、アニーリングの条件を表１の条件とした以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行った。結果を図６〜８に示す。
【００４７】
【表１】
0004117370.tif 000002
【００４８】
図６に示す結果は、cow51（配列番号６）およびcow3（配列番号１０）をプライマー対として用いた場合に、ウシ由来の肉から得られるＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）と同じ大きさのＤＮＡ断片が、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびニワトリのＤＮＡを鋳型とした場合には生じなかったことを示す。図７のcow52とcow3との組み合わせ、および図８のcow52とcow31との組み合わせは、他の動物種で類似するＤＮＡ断片が検出されていない点で、特にウシ特異的検出に適切なプライマー対であることがわかる。一方、図７に示すように、cow5（配列番号５）およびcow31（配列番号１１）のプライマー対を用いた場合に、ヒツジにおいて、わずかにウシのＤＮＡを鋳型として得られるＤＮＡ断片と同じ大きさのバンドが見られた。同様に、図８では、cow51（配列番号６）およびcow31（配列番号１１）のプライマー対、ならびにcow53（配列番号８）およびcow31（配列番号１１）のプライマー対を用いた場合にも、ウシのＤＮＡを鋳型として得られるＤＮＡ断片と同じ大きさのバンドが見られた。したがって、これらのプライマー対は、ウシ特異的な検出をするには、適切な組み合わせではない。
【００４９】
（実施例４：ブタ由来ＤＮＡ配列の特異的検出）
表２に記載の種々のプライマー対を用いて、ブタ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製したＤＮＡを鋳型として、アニーリングの温度を表２の温度に変えた以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行った。
【００５０】
【表２】
0004117370.tif 000003
【００５１】
pig51（配列番号１３）とpig3（配列番号１４）とをプライマー対として用いた結果を図９に示す。図９から明らかなように、ブタ肉由来試料においてのみ、ＤＮＡ断片を検出した（矢印のバンド位置）。したがって、このプライマー対は、ブタ由来ＤＮＡ配列の特異的検出に有用である。なお、図に示していないが、pig5（配列番号１２）とpig3（配列番号１４）；pig5（配列番号１２）とpig31（配列番号１５）；pig5（配列番号１２）とpig32（配列番号１６）；pig51（配列番号１３）とpig31（配列番号１５）；pig51（配列番号１３）とpig32（配列番号１６）との組み合わせは、いずれも特異的検出には適切ではなかった。
【００５２】
（実施例５：ヒツジ由来ＤＮＡ配列の特異的検出）
sheep5（配列番号１７）とsheep3（配列番号１８）とを、それぞれ５’側および３’側プライマーとして、ヒツジ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製したＤＮＡを鋳型として、アニーリングの条件を46℃、２分とした以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行った。結果を図１０に示す。
【００５３】
この結果、sheep5（配列番号１７）とsheep3（配列番号１８）とをプライマー対として用いることにより、ヒツジ由来ＤＮＡ配列の特異的検出が可能となることが示された。
【００５４】
（実施例６：ヤギ由来ＤＮＡ配列の特異的検出）
goat5（配列番号１９）とgoat3（配列番号２０）とを、それぞれ５’側および３’側プライマーとして用いて、ヤギ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製したＤＮＡを鋳型として、アニーリングの条件を46℃、２分とした以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行った。結果を図１０に示す。
【００５５】
この結果、goat5（配列番号１９）とgoat3（配列番号２０）とをプライマー対として用いることにより、ヤギ由来ＤＮＡ配列の特異的検出が可能となることが示された。
【００５６】
また、goat5（配列番号１９）とgoat31（配列番号２１）とをプライマー対とし、アニーリングの条件を54℃、２分とした以外は、上記と同様にＰＣＲを行ったところ、ヤギ由来ＤＮＡ配列の特異的検出には適切ではなかった（図示せず）。
【００５７】
（実施例７：ニワトリ由来ＤＮＡ配列の特異的検出）
表３に記載の種々のプライマー対を、それぞれ５’側および３’側プライマーとして用いて、ニワトリ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製したＤＮＡを鋳型として、アニーリングの条件を表３に記載の条件とした以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行った。chick5（配列番号２２）とchick3（配列番号２４）とをプライマー対として用いた場合の結果を図１１に示す。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
図１１から明らかなように、chick5（配列番号２２）とchick3（配列番号２４）とをプライマー対として用いることにより、ニワトリ由来ＤＮＡ配列の特異的検出が可能である（矢印のバンド位置）。
【００６０】
chick51（配列番号２３）とchick3（配列番号２４）、chick5（配列番号２２）とchick31（配列番号２５）、およびchick51（配列番号２３）とchick31（配列番号２５）の、それぞれのプライマー対を用いたときは、ニワトリ由来ＤＮＡ配列の特異的検出には適切ではなかった（図示せず）。
【００６１】
（実施例８：配合飼料中の哺乳動物由来ＤＮＡ配列の検出）
家畜用配合飼料（主成分：トウモロコシ、マイロ、グルテンフィード、ふすま、米ぬか、大豆油かす、なたね油かす）に所定の割合でウシ由来の肉骨粉（オーストラリア産）を混合した。得られた飼料を５００ｍｇとり、上記実施例１と同様に１０倍量の緩衝液に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアＤＮＡ抽出キット（和光純薬工業製）を用いてミトコンドリアＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型として、実施例１で用いた哺乳動物由来ＤＮＡ配列を特異的に検出するプライマー対であるanicon5（配列番号１）とanicon3（配列番号２）とを用いて、実施例１と同じ条件でＰＣＲを行った。結果を図１２に示す。肉骨粉が０．０１重量％含まれている場合でも、哺乳動物由来のＤＮＡ配列を検出できることが判明した。
【００６２】
（実施例９：配合飼料中の反芻動物由来ＤＮＡ配列の検出）
実施例８と同様に配合飼料から抽出したＤＮＡを鋳型として、実施例２で用いた反芻動物由来のＤＮＡ配列を特異的に検出するrumicon5（配列番号３）およびrumicon3（配列番号４）のプライマー対を用いて、実施例２と同様の条件でＰＣＲを行った。結果を図１３に示す。肉骨粉が０．１〜１重量％含まれている場合でも、反芻動物由来のＤＮＡ配列を検出できることが判明した。
【００６３】
（実施例１０：配合飼料中のウシ由来ＤＮＡ配列の検出）
実施例８と同様に配合飼料から抽出したＤＮＡを鋳型として、実施例３で用いたウシ特異的プライマー対であるcow52（配列番号７）およびcow31（配列番号１１）を用いて、実施例３と同様の条件でＰＣＲを行った。結果を図１４に示す。肉骨粉がわずか０．００１重量％しか含まれていない場合でも、ウシ由来のＤＮＡ配列を検出できることが判明した。
【００６４】
【発明の効果】
本発明の方法を用いると、試料中の微量の動物由来ＤＮＡ配列を高感度で検出することができる。そのため、例えば、飼料中にわずかに混入された肉骨粉の動物種の識別も可能である。特に、家畜用配合飼料に微量のウシ肉骨粉が混入している場合も検出可能である。
【００６５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】種々の動物由来ミトコンドリアａｔｐ８遺伝子の配列アラインメントを示す図である。
【図２】ニワトリ、ウシ、およびブタのミトコンドリアａｔｐ８遺伝子の配列アラインメントを示す図である。
【図３】ウシ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を行うために用いたプライマーの、ミトコンドリアａｔｐ８遺伝子上での位置関係を示す図である。
【図４】哺乳動物特異的配列を有するプライマー対（anicon5およびanicon3）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図５】反芻動物特異的配列を有するプライマー対（rumicon5およびrumicon3）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図６】ウシ特異的配列を有するプライマー対（cow3およびcow51）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図７】種々のウシ特異的配列を有するプライマー対を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図８】種々のウシ特異的配列を有するプライマー対を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図９】ブタ特異的配列を有するプライマー対（pig51およびpig3）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図１０】ヒツジ特異的配列を有するプライマー対（sheep5およびsheep3）およびヤギ特異的配列を有するプライマー対（goat5およびgoat3）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図１１】ニワトリ特異的配列を有するプライマー対を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図１２】ウシ肉骨粉含有家畜用配合飼料における、哺乳動物特異的プライマー対によるＤＮＡ検出の結果を示す電気泳動写真である。
【図１３】ウシ肉骨粉含有家畜用配合飼料における、反芻動物特異的プライマー対によるＤＮＡ検出の結果を示す電気泳動写真である。
【図１４】ウシ肉骨粉含有家畜用配合飼料における、ウシ特異的プライマー対によるＤＮＡ検出の結果を示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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