(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５ｍＭ−５０ｍＭのＣｙＤＴＡおよび０．１重量％−１重量％のＢｒｉｊ−３５を含有するウレアーゼ液状試薬であって、該ウレアーゼはクレブシエラ属に由来する微生物ウレアーゼであってその濃度が１単位／ｍｌ−５０単位／ｍｌである上記ウレアーゼ液状試薬。
【請求項２】
５ｍＭ−５０ｍＭのＣｙＤＴＡおよび０．１重量％−１重量％のＢｒｉｊ−３５を添加することを含む、ウレアーゼの溶液中での安定化方法あって、該ウレアーゼはクレブシエラ属に由来する微生物ウレアーゼであってその濃度が１単位／ｍｌ−５０単位／ｍｌである上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、溶液中で安定に保存可能な酵素ウレアーゼ液状試薬に関する。
【０００２】
本発明はさらに、ウレアーゼが溶液中で活性を長期間保持可能な、ウレアーゼの溶液保存安定化方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
ウレアーゼは以下の式（１）：
【化１】
0004122084.tif 000002
で表される反応によって、尿素を加水分解し、アンモニアと二酸化炭素を生ずる酵素である。ウレアーゼは基質特異性の高い酵素であり、細菌、糸状菌、植物（特にマメ科）、動物に広く分布する。
【０００４】
血清及び尿中の尿素窒素量は、種々の腎機能障害及び肝実質障害時に変動することが知られており、その障害度並ぴに予後の診断に関して極めて重要な意義をもつ。尿素、クレアチンのようにアンモニアを生成する生体物質の含有量を測定する場合、先ず当該生体物質からアンモニアを発生させて、生じたアンモニアの量および／または当該生体物質の量を測定することができる。ウレアーゼは、このような測定系に特に有用である。
【０００５】
具体的には、例えば、先ず、尿素等のアンモニアを生成する生体物質を含有する試料にα−ケトグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイド（リン酸））及びＧＬＤＨ（グルタミン酸脱水素酵素）を加える。さらにウレアーゼを添加して最初に試料中の尿素をウレアーゼで加水分解してアンモニアを生成させ、次に、アンモニアの生成速度を、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨよりなる酵素共役系を用いて得たＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度から求める。得られたアンモニアの生成速度から、試料中のアンモニアを生成する生体物質、例えば尿素態窒素、を定量することができる。このような測定系において、共存する妨害物質の影響を受けない迅速、正確な定量方法が望まれている。
【０００６】
近年、多くの臨床検査用測定試薬組成物が、凍結乾燥された粉末から溶液状のものに置き換えられる傾向にある。これは多忙な臨床検査業務の現場において、粉末状の測定試薬組成物を、使用の都度、溶液に溶かす作業過程が省略され、現場の負担が軽減されるからである。ウレアーゼに関しても簡便な液体状の試薬の開発が希求されている。
【０００７】
しかし、とりわけ微生物ウレアーゼを含む液状試薬を開発する場合、ウレアーゼ自体の失活が早く長期保存が困難であるという問題を伴う。また、保存時の偶発的温度変化に対する安定性の面からも長期間保存に適したものが得られていなかった。ウレアーゼに対する基質または基質アナログからなる阻害剤を添加することで安定化をはかる方法が一般的に知られている。しかしながら、細菌等の微生物ウレアーゼに対しては、基質または基質アナログからなる阻害剤の存在により見かけの該酵素活性が大きく低下する恐れがあり、その結果尿素の測定において好ましくない。見かけの酵素活性を変化することなく、液状下における長期に保存安定を可能とする方法の開発も希求されている。
【０００８】
よって、本発明前には保存時の安定性に優れた微生物ウレアーゼを含む液状試薬は知られていなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、キレート剤および／または界面活性剤を含有することを特徴とする、ウレアーゼ液状試薬を提供する。本発明の試薬は液体状であり、かつ保存安定性に優れていることを特徴とする。
【００１０】
本発明のウレアーゼの液状試薬は、一態様において、ウレアーゼが微生物、好ましくはクレブシエラ属、より好ましくはクレブシエラ・エアロジェネスに由来する。
【００１１】
本発明のウレアーゼの液状試薬は、一態様において、キレート剤が２価金属イオンに対するキレート剤である。
【００１２】
本発明は、また、キレート剤および／または界面活性剤を添加することを含む、ウレアーゼの溶液中での安定化方法を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記従来の課題である液状試薬に求められる溶液安定性確保のために種々の安定化法の研究に努め検討した結果、ウレアーゼに対してキレート剤または界面活性剤を単独ならびに併用使用することで、保存時の温度変化に対する安定性、アルカリ溶液安定性が高まり、溶液中においても高い酵素活性を長期間維持することを見いだした。さらに、本発明の液状試薬は、保存安定性が高いだけでなく、尿素等の測定系にそのまま用いることができるという利点を有する。即ち、固体状の場合のように測定のたびに溶媒に溶解させる必要がなく、また、そのまま用いても測定系になんら影響を与えることがない。
【００１４】
よって、本発明のウレアーゼ液状試薬は、溶液中にキレート剤および／または界面活性剤を含有することを特徴とする。
【００１５】
ウレアーゼは尿素を加水分解してアンモニアと二酸化炭素を生ずる酵素であり、酵素番号３．５．１．５．が挙げられ、前述した式（１）に示す反応を触媒する。細菌、糸状菌、植物（特にマメ科）、動物に広く分布する。本発明の試薬中のウレアーゼは限定されず、公知の所望のウレアーゼを用いることができる。限定されるわけではないが、微生物ウレアーゼが好ましく、例えばクレブシエラ属に由来するウレアーゼであり、クレブシエラ・エアロジェネス（Klebsiea aerogenes）など任意のものを使用することができる。
【００１６】
クレブシエラ・エアロジェネスの代表的な株は、例えばＭＪ．Ｔｏｄｄ ａｎｄＲＰ．Ｈａｕｓｉｎｇｅｒ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ Ｖｏｌ．２６２，ＮＯ．１３，ｐｐ５９６３−５９６７に記載されている。該酵素の理化学的性質は分子量２２０ｋｄａであり、１０量体（α２β４γ４）のαサブユニット：７２,０００、βサブユニット：１１,０００、γサブユニット：９,０００からなる。また、至適ｐＨは７−８である。クレブシエラ・エアロジェネス由来のウレアーゼは、例えば精製ウレアーゼ標品を１−１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解した場合、冷蔵保存すれば１週間程度保持することが可能である。熱安定性に関しては５０℃以下（１時間熱処理）である。又この微生物の基準菌株として、クレブシエラ・エアロジェネスは寄託番号ＡＴＣＣ １３８８３（ＩＦＯ １４９４０）にて寄託されている。
【００１７】
本発明のウレアーゼは、限定されるわけではないがクレブシエラ属などを含む生物から公知の方法によって、抽出、精製することができる。また、該ウレアーゼは, 天然に得られたウレアーゼであっても、あるいは遺伝子工学によって得られた組換え型ウレアーゼであってもよい。また、ウレアーゼの生理活性を有するものであれば、天然または遺伝子工学技術によって得られた変異型ウレアーゼであっても良い。当業者は本明細書の開示に基づいて容易にウレアーゼを本願発明に適用し、使用することができる。
【００１８】
本発明の液状試薬は、水性媒体中にウレアーゼを含むことを特徴とする。ウレアーゼは１単位／ｍｌ−５０単位／ｍｌ、好ましくは、５単位／ｍｌ−２０単位／ｍｌの濃度で含まれる。この場合のウレアーゼの単位は、ウレアーゼの活性測定の標準的な条件下、例えば、３７℃、ｐＨ８．０で、１分間あたりの尿素を分解する量を１単位とする。
【００１９】
本発明で使用するキレート剤は、限定されるわけではないが、例えば同人化学研究所  総合カタログ第２０版（１９９６）に記載されたものを使用して行うことができる。２価金属イオンに対するキレート剤、例えばＥＤＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＧＥＤＴＡが好ましい。キレート剤の添加量は特に限定されないが、好ましくは１ｍＭ−１００ｍＭであり、より好ましい添加量は５ｍＭ−５０ｍＭである。
【００２０】
界面活性剤は、限定されるわけではないが、日本生化学会編  生化学データブック（１）第２版（１９７９）に記載されたものを使用して行うことができる。例えば非イオン系界面活性剤であり、ポリオキシエチレングリコール（ＰＯＥ：Polyoxyethleneglycol）を主体としたＰＯＥ（ｎ）ｐ−オクチルフェニルエーテル（たとえばｎ＝９，１：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（商品名）、ｎ＝９：（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（商品名））、ＰＯＥ（ｎ）ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ−３５（商品名））、ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０（商品名））、ソルビタンラウレート、ソルビタンミリステートなどが好ましく、適宜必要に応じて使用可能である。界面活性剤の添加量は特に限定されないが、好ましくは０．０１重量％−１重量％である。
【００２１】
本発明において、キレート剤および界面活性剤は、保存溶液中に各々単独でウレアーゼと共存させても、あるいは両者をともに存在させてもよい。両者を共に存在させるのがより好ましい。
【００２２】
本発明において、キレート剤および／または界面活性剤は試薬中のウレアーゼの濃度に関係なく、上述したような所望の添加量でウレアーゼの保存安定性に寄与する。また、本発明のウレアーゼ液状試薬は、生体物質の定量方法であって少なくとも測定系の一部にウレアーゼ活性を利用する方法において、そのまま利用することが可能である。即ち、上述したような所望の添加量のキレート剤および／または界面活性剤を含んだ状態で、上記測定系に何ら影響を及ぼすことなく用いることができる（実施例１および２）。
【００２３】
ウレアーゼを利用した試料中の生体物質に由来する尿素の測定方法
本発明のウレアーゼの液状試薬は、限定されるわけではないが、例えば、生体物質の定量方法であって、少なくとも測定系の一部にウレアーゼ活性を利用する方法において利用可能である。例えば、体液、即ち血液、血清、血漿、尿、髄液、腹腔液等、また透析液等の試料中の生体物質に由来する尿素の測定方法に利用できる。
【００２４】
より詳細には、好ましくは、先ずこれらの試料に存在する内因性のアンモニアをα−ケトグルタール酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを作用させることにより除去する。次いで、ウレアーゼを加えて尿素を加水分解し、アンモニアの生成させる。また生体物質がクレアチンの場合には、先ず、水酸化バリウムの作用により尿素（及びサルコシン）を生成させてから、ウレアーゼを用いることができる。ウレアーゼは例えば、２５℃−４０℃、５分−１時間反応させる。当業者は生体物質に応じて容易に反応を選択することが可能である。
【００２５】
さらに、上記ウレアーゼ反応により新たに生成されたアンモニアを測定することにより生体物質由来の尿素および／または生体物質の量を測定することができる。アンモニアの測定は、公知の方法を用いて、例えば以下のように行うことができる。
【００２６】
ウレアーゼ反応後、ＧＬＤＨ、α−ケトグルタル酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含む、アンモニア測定試薬を作用させる。反応は、好ましくはアルカリ条件、ｐＨ約８−約１１において２５℃−４０℃で、５分−１時間行う。
【００２７】
上記反応により消費されたアンモニアの量は、例えば、限定されるわけではないが、ＮＡＤＰＨは３４０ｎｍにおいて特異的な吸光特性を有するので、当該波長における吸光度をＧＬＤＨを反応させる前後で測定し、その変化を既知量のアンモニアおよび／または生体物質を使用して得られたデータと比較することにより、測定することができる。得られたアンモニアの量から、生体物質由来の尿素および／または生体物質の量を得ることができる。
【００２８】
以下、実施例によって本発明を具体的に詳細に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００２９】
【実施例】
実施例１：各種キレート剤ならびに界面活性剤の安定化効果
クレブシエラ由来微生物ウレアーゼを用い、各種キレート剤ならびに界面活性剤の存在による保存安定効果を以下のように試験した。
【００３０】
まず、以下の表１に示す成分を含む試薬を調製した。
【００３１】
【表１】
0004122084.tif 000003
【００３２】
保存用試薬ＳＲ１を調製後、３７℃で１週間保存した。先ず、試料と測定用試薬Ｒとを混合し、次に保存されていた試薬ＳＲ１を加えて反応を開始した。試料、試薬Ｒおよび試薬ＳＲ１は１５：３２０：８０（μＬ）の割合で混合した。反応は３７℃で２ないし３分間行った。尿素に由来するアンモニアに対する応答性を、試薬ＳＲ１を加える前後の吸光度変化量（△Ａ３４０／分）として算出した。測定機器は、自動分析機コーバスファラ（ロシュ社製）を用い、測定モードはＰ−ｌ−ＳＲ１−Ａとした。
【００３３】
ウレアーゼ活性の残存率を、調製直後の試薬ＳＲ１を用いた場合の活性（吸光度変化量）に対する割合（％）として算出した。結果を以下の表２に示す。
【００３４】
【表２】
0004122084.tif 000004
【００３５】
その結果、上記のキレート剤、界面活性剤を存在させることで、ウレアーゼ液状試薬の保存後の残存活性率が無添加のものに比べ高く、共存させることが有用であることが判明した。より具体的には、キレート剤または界面活性剤を添加したものは８０％程度の活性残存率を有しており、酵素として例えば尿素態窒素の測定系に実用状十分使用することができる。
【００３６】
実施例２：キレート剤と界面活性剤を併用した場合の尿素測定試薬保存安定性
キレート剤と界面活性剤を併用した場合の、ウレアーゼの尿素測定試薬中での保存安定性を以下にように、尿素測定における測定感度より調べた。
【００３７】
【表３】
0004122084.tif 000005
【００３８】
試薬ＳＲ２を調製後、３７℃で１週間または２週間保存した。保存後、試料と試薬Ｒを混合し、次に保存されていた試薬ＳＲ２を加えて反応を開始した。試料、試薬Ｒ、および試薬ＳＲ２は１５：３２０：８０（μＬ）の割合で混合した。反応は３７℃で２ないし３分間行った。尿素に由来するアンモニアに対する応答性を、試薬ＳＲ２を加える前後の吸光度変化量（△Ａ３４０／分）として算出した。測定機器は、自動分析機コーバスファラ（ロシュ社製）を用い、測定モードはＰ−ｌ−ＳＲ１−Ａとした。
【００３９】
測定感度の結果を図１に示した。図１からわかるように、キレート剤および界面活性剤を添加した本発明のウレアーゼ液状試薬では、初期値△Ａ３４０／分＝５０×１０-3／分であるのに対し、３７℃２週間保存後も△Ａ３４０／分＝４２×１０-3／分と８０％以上活性が残存していた。これに対し、無添加の対照は、３７℃２週間保存後は△Ａ３４０／分＝１３×１０-3／分と残存活性が３０％以下になっていた。
【００４０】
【発明の効果】
上記の通り、本発明の液状試薬は、キレート剤および／または界面活性剤を用いることにより、溶液中で高い酵素活性を長期間維持する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のウレアーゼ液状試薬の保存安定性を、尿素測定における測定感度より調べた結果を示す。
【図１】
0004122084.tif 000006