(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、スクシニル化した蛋白質を抗原とし、該抗原を免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体が、スクシニル化したカギアナカサガイのヘモシアニンを抗原とし、該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体が、モノメチルスクシネートで修飾した蛋白質を脱メチル化することにより得られるスクシニル化蛋白質を抗原とし、該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２又は３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体が、モノメチルスクシネートで修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンを脱メチル化することにより得られるスクシニル化蛋白質を抗原とし、該抗原で免疫された恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、ドコサヘキサエン酸の酸化分解物で修飾した蛋白質を抗原とし、該抗原で免疫された恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体が、ドコサヘキサエン酸の酸化分解物で修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンを抗原とし、該抗原で免疫された恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞。
【請求項９】
スクシニル化した蛋白質を抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とすることを特徴とするスクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体産生ハイブリッド細胞の製造方法。
【請求項１０】
スクシニル化したカギアナカサガイのヘモシアニンを抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とすることを特徴とする請求項９に記載のハイブリッド細胞の製造方法。
【請求項１１】
モノメチルスクシネートで修飾した蛋白質を脱メチル化することにより得られるスクシニル化蛋白質を抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とすることを特徴とする請求項９又は１０に記載のハイブリッド細胞の製造方法。
【請求項１２】
モノメチルスクシネートで修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンを脱メチル化することにより得られるスクシニル化蛋白質を抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とすることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞の製造方法。
【請求項１３】
ドコサヘキサエン酸の酸化分解物で修飾した蛋白質を抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とすることを特徴とするハイブリッド細胞の製造方法。
【請求項１４】
ドコサヘキサエン酸の酸化分解物で修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンを抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とすることを特徴とする請求項１３に記載のハイブリッド細胞の製造方法。
【請求項１５】
（１）スクシニル化した蛋白質を抗原として調製し、（２）該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、（３）該ハイブリッド細胞を培養して培養液中からスクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１６】
抗原が、スクシニル化したカギアナカサガイのヘモシアニンであることを特徴とする請求項１５に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１７】
抗原が、モノメチルスクシネートで修飾した蛋白質の脱メチル化物であることを特徴とする請求項１５に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１８】
抗原が、モノメチルスクシネートで修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンの脱メチル化物であることを特徴とする請求項１５に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１９】
（１）ドコサヘキサエン酸の酸化分解物で修飾した蛋白質を抗原として調製し、（２）該抗原で免疫した恒温動物（ヒトを除く）から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、（３）該ハイブリッド細胞を培養して培養液中培養液中からスクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項２０】
抗原が、ドコサヘキサエン酸の酸化分解物で修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンであることを特徴とする請求項１９に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質中のリジンのε−アミノ基がスクシニル化されて生じたスクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体、ハイブリッド細胞およびそれらの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の脂質成分としては、トリグリセライド、リン脂質、コレステロールエステルあるいは遊離型脂肪酸などが知られている。特に、これらの化合物が高度不飽和脂肪酸残基を有する場合、生体に作用する様々な酸化ストレスによって、過酸化を受け易く、更に、二次酸化により生じた分解物が様々な病態に関与していることが最近明らかにされつつある。
【０００３】
前記高度不飽和脂肪酸としては、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸（略号：ＤＨＡ）などが代表的なものであるが、近年、ＤＨＡは血栓症予防効果や学習機能向上などの機能を有するため、広く健康食品として注目されているものである。ところが、ＤＨＡは、その構造上、６つの二重結合を有するため、非常に酸化されやすい性質を有しており、種々の過酸化分解物が生じるという性質をも有する。
【０００４】
このようにして生じたＤＨＡの酸化分解物は、ニューロプロスタン（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３；１３６０５−１３６１２，１９９８）やニューロケタル（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６；３０９６４−３０９７０，２００１）などの反応性物質に変化すること、老齢ラットにＤＨＡを過剰投与することでＤＮＡ傷害が生じること（Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ  Ｒｅｓ  ３４；４２７−４３５，２００１）、抗酸化効果のあるビタミンＥが欠乏した状態でのＤＨＡを多く含む魚油の実験動物への投与による各組織中チオバルビツール酸反応生成物が上昇すること（Ｌｉｐｉｄｓ  ２５；１２５−１２９，１９９０）等のＤＨＡの酸化による生体に対する影響が知られている。
【０００５】
このような背景から、これまでにも高度不飽脂肪酸の過酸化分解物がアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質中の構成アミノ酸の反応可能な側鎖と反応して生成する特徴的な構造に着目し、マロンジアルデヒドが蛋白質中のリジン残基と反応して生成するジヒドロピリジン構造を特異的に認識する抗体（特開平１０−７２４９９号公報）、高度不飽和脂肪酸に由来する過酸化分解物であるアクロレインが蛋白質中のリジン残基と反応して生成するホルミルデヒドロピペリジノリジン構造を特異的に認識する抗体（特開平１１−１４７８９９号公報）、ｎ−３系高度不飽和脂肪酸過酸化分解物である４−ヒドロキシ−２−ヘキセナールが蛋白質中のアミノ酸と反応して生成する構造を特異的に認識する抗血清（特開平１１−７１４００号公報）およびそれら抗体および／あるいは抗血清を提供する方法が開発され、高度不飽和脂肪酸の過酸化分解に由来する酸化ストレスに関する生化学・医学的な研究に対する有用性を評価するための手段が開示されている。
【０００６】
しかしながら、これらの抗体は、ＤＨＡを含めた高度不飽和脂肪酸および／あるいはｎ−３系の高度不飽和脂肪酸の過酸化分解により生じた酸化分解物が生体中のアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質中の構成アミノ酸の反応可能な側鎖と反応して生じる特異的な構造を認識するけれども、必ずしもＤＨＡの酸化により生じた分解物に由来するアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質中の構成アミノ酸の反応可能な側鎖と反応して生成した特異的な構造のみを検出できるものではなく、これまでに、生体成分のＤＨＡによる特異的な損傷の程度を知る指標を検出、定量する経済的で精度の高い手段は存在しなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記のような背景のもとで、ＤＨＡのみに由来する酸化ストレスを評価するため、ＤＨＡのみに由来する酸化分解物が蛋白質と反応して生じた構造を特異性高く認識するモノクローナル抗体についてなされたものである。
本発明の第１の目的は、スクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することにある。
本発明の第２の目的は、前記モノクローナル抗体を産生することができるハイブリッド細胞を提供することにある。
本発明の第３の目的は、前記モノクローナル抗体を産生することができるハイブリッド細胞の製造方法を提供することにある。
本発明の第４の目的は、前記モノクローナル抗体の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決する為の手段】
本発明者らは、上記問題点に鑑み検討した結果、ＤＨＡの酸化により生じた分解物とアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質を反応させることにより生じるスクシニルリジン構造は、ＤＨＡの酸化分解に特異的に由来することを見出し、スクシニルリジン構造を有する蛋白質を抗原として調製し、該抗原で免疫したマウスから得られる抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とのハイブリッド細胞が、スクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は次の〔１〕〜〔２０〕である。
【０００９】
〔１〕スクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体である。
〔２〕前記モノクローナル抗体が、スクシニル化した蛋白質を抗原とし、該抗原を免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする前記〔１〕に記載のモノクローナル抗体である。
〔３〕前記モノクローナル抗体が、スクシニル化したカギアナカサガイのヘモシアニンを抗原とし、該抗原で免疫した恒温動物から得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする前記〔２〕に記載のモノクローナル抗体である。
〔４〕モノクローナル抗体が、モノメチルスクシネートで修飾した蛋白質を脱メチル化することにより得られるスクシニル化蛋白質を抗原とし、該抗原で免疫した恒温動物から得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする前記〔２〕又は〔３〕に記載のモノクローナル抗体である。
〔５〕モノクローナル抗体が、モノメチルスクシネートで修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンを脱メチル化することにより得られるスクシニル化蛋白質を抗原とし、該抗原で免疫された恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする前記〔２〕〜〔４〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体である。
【００１０】
〔６〕モノクローナル抗体が、ドコサヘキサエン酸の酸化分解物で修飾した蛋白質を抗原とし、該抗原で免疫された恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする前記〔１〕に記載のモノクローナル抗体である。
〔７〕モノクローナル抗体が、ドコサヘキサエン酸の酸化分解物で修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンを抗原とし、該抗原で免疫された恒温動物から得られる抗体産生細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞から得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする前記〔６〕に記載のモノクローナル抗体である。
〔８〕前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞である。
〔９〕スクシニル化した蛋白質を抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とすることを特徴とするスクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体産生ハイブリッド細胞の製造方法である。
〔１０〕スクシニル化したカギアナカサガイのヘモシアニンを抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とすることを特徴とする前記〔９〕に記載のハイブリッド細胞の製造方法である。
【００１１】
〔１１〕モノメチルスクシネートで修飾した蛋白質を脱メチル化することにより得られるスクシニル化蛋白質を抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とすることを特徴とする前記〔９〕又は〔１０〕に記載のハイブリッド細胞の製造方法である。
〔１２〕モノメチルスクシネートで修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンを脱メチル化することにより得られるスクシニル化蛋白質を抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とすることを特徴とする前記〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載のハイブリッド細胞の製造方法である。
〔１３〕ドコサヘキサエン酸の酸化分解物で修飾した蛋白質を抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とすることを特徴とするハイブリッド細胞の製造方法である。
〔１４〕ドコサヘキサエン酸の酸化分解物で修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンを抗原として調製し、該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とすることを特徴とする前記〔１３〕に記載のハイブリッド細胞の製造方法である。
〔１５〕（１）スクシニル化した蛋白質を抗原として調製し、（２）該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、（３）該ハイブリッド細胞を培養して培養液中からスクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法である。
【００１２】
〔１６〕抗原が、スクシニル化したカギアナカサガイのヘモシアニンであることを特徴とする前記〔１５〕に記載のモノクローナル抗体の製造方法である。
〔１７〕抗原が、モノメチルスクシネートで修飾した蛋白質の脱メチル化物であることを特徴とする前記〔１５〕に記載のモノクローナル抗体の製造方法である。
〔１８〕抗原が、モノメチルスクシネートで修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンの脱メチル化物であることを特徴とする前記〔１５〕に記載のモノクローナル抗体の製造方法である。
〔１９〕（１）ドコサヘキサエン酸の酸化分解物で修飾した蛋白質を抗原として調製し、（２）該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、（３）該ハイブリッド細胞を培養して培養液中培養液中からスクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法である。
〔２０〕抗原が、ドコサヘキサエン酸の酸化分解物で修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンであることを特徴とする前記〔１９〕に記載のモノクローナル抗体の製造方法である。
【００１３】
【本発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、スクシニルリジン構造を特異的に認識することを特徴とするモノクローナル抗体である。本発明では、スクシニルリジン構造とは、こはく酸の一方のカルボン酸がリジンのε−アミノ基とアミド結合してなるカルボキシアルキルリジン構造である。このスクシニルリジン構造となる抗原用の原料としては、アミノ酸のリジン、リジン含有ペプチド、リジン含有蛋白質が挙げられる。
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、前記のスクシニル化した蛋白質を調製し、これを抗原として免疫された恒温動物から得られる抗体産生細胞と、得られた抗体産生細胞を継代培養可能なマウスミエローマ細胞とのハイブリッド細胞を調製し、このハイブリッド細胞の中から目的のモノクローナル抗体のみを産生するハイブリッド細胞をスクリーニングし、このハイブリッド細胞が抗体を産生する環境下で大量培養し、培養物から取得することにより製造される。
前記の抗原として用いるスクシニル化蛋白質は、蛋白質中のリジンのε−アミノ基に、こはく酸の一方のカルボン酸が酸アミド結合したカルボキシアルキルアミド付加体がより好ましい。
本発明のモノクローナル抗体の製造に用いることができる抗原は、スクシニル化された蛋白質が好ましく、蛋白質としては、例えば、ウシ血清アルブミン（略号：ＢＳＡ）、卵白アルブミン、リポプロテイン、カギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）などが挙げられ、さらに好ましくはＫＬＨが用いられる。
【００１４】
抗原として用いるスクシニル化された蛋白質を調製するための方法は、蛋白質とＤＨＡの自動酸化により生じた酸化分解物の両者を反応させて得るか、蛋白質とこはく酸、無水こはく酸あるいはこはく酸クロリドを反応させて得るか、蛋白質とモノメチルスクシネートを反応後に脱メチル化することにより得ることが可能であるが、蛋白質を効率的にスクシニル化できるため、モノメチルスクシネートを反応後に脱メチル化する方法が良い。
【００１５】
例えば、蛋白質とＤＨＡの自動酸化により生じた酸化分解物を反応させる方法としては、蛋白質とＤＨＡを適当な緩衝液中でインキュベートすることにより得ることができる。例えば、予め酸化処理したＤＨＡに蛋白質溶液を添加しても良いし、両者を同時に加えた液を酸化処理しても良い。ＤＨＡは直接ＤＨＡを反応液に混合しても良いが、エタノールやメタノール等の有機溶媒で希釈した溶液を添加すると取扱いが容易である。反応に用いる緩衝液としては、反応を阻害する成分を含有していなければ特に制限はなく、好ましくはリン酸塩、炭酸塩などの緩衝液が挙げられ、例えば１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭのリン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは該反応が進行するｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜９で、インキュベート時間は、例えば、２５〜６０℃で１時間以上、好ましくは３０〜４０℃で５〜４０時間である。なお、ＤＨＡと蛋白質の仕込み比率に特に制限はないが、蛋白質１モル量に対してＤＨＡ０．1〜１００００倍モル量の範囲、特に、１０〜１０００倍モル量の範囲が適当である。さらに、最終的にはカラムによる分離精製、透析等の一般的な蛋白質の分離方法を単独で、あるいは組み合わせることにより精製して抗原として用いることができる。
【００１６】
また、反応を速やかに進行させるにはＤＨＡの酸化を誘導するための酸化誘導剤を添加しても良く、例えば、銅イオン（II）や鉄イオン（II、III）、アスコルビン酸などの適当な酸化誘導剤を単独で、あるいは複合して適当な濃度で加えて酸化分解反応を加速した方が良い。その他、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ系酸化剤を用いることも可能である。
【００１７】
蛋白質とこはく酸、無水こはく酸あるいはこはく酸クロリドを反応させてスクシニル化蛋白質を得る方法としては、これらのこはく酸誘導体をジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶解し、この溶液を蛋白質が溶解した適当な緩衝液中に添加してインキュベートすることにより得ることができる。反応条件は上記に示した蛋白質とＤＨＡの酸化分解物とを反応させる方法と同様にして調製することが可能である。なお、蛋白質とこはく酸誘導体の仕込み比率に特に制限はないが、蛋白質同士が架橋しない程度であることが望ましく、蛋白質１モル量に対して１〜１０００倍程度のこはく酸、無水こはく酸あるいはこはく酸クロリドのモル量の範囲、特に、５〜５００倍モル量の範囲が適当である。また、蛋白質同士の架橋が生じて反応液が濁った場合は遠心分離や膜分離等の操作で架橋した蛋白質を除去して目的のスクシニル化蛋白質を得ることもできる。
【００１８】
蛋白質とモノメチルスクシネートを反応後に脱メチル化してスクシニル化蛋白質を得る方法としては、モノメチルスクシネートと蛋白質を反応させた後に脱メチル化することにより得ることが可能である。例えば、モノメチルスクシネートと水溶性カルボジイミドおよびスルホ−ヒドロキシスクシンイミド（略号：スルホ−ＮＨＳ）を適当な溶媒中で混合撹拌した液に蛋白質溶液を混合し、モノメチルスクシニル化蛋白質を調製後、脱メチル化してスクシニル化蛋白質を得ることができる。モノメチルスクシネートと水溶性カルボジイミドおよびスルホ−ＮＨＳを混合するときに用いる溶媒としては水に混和可能な有機溶媒で有れば特に制限はないが、ジメチルスルホキシドやエタノールが特に利用される。
【００１９】
このようにして混合反応させたモノメチルスクシネートと水溶性カルボジイミドおよびスルホ−ＮＨＳに対して混合する蛋白質溶液は、例えば、ＢＳＡ、卵白アルブミン、リポプロテイン、ＫＬＨなどが挙げられ、好ましくはＫＬＨが用いられる。また、蛋白質を溶解する緩衝液としては反応を阻害する成分を含有していなければ特に制限はなく、好ましくはリン酸塩、炭酸塩などの緩衝液が挙げられ、例えば１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭのリン酸緩衝液があげられる。緩衝液のｐＨは該反応が進行するｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜９である。
【００２０】
用いる蛋白質濃度は特に制限はないが、蛋白質分子を効率的にスクシニル化することおよび最終的な分離精製のためには０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬ、特に、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲が好ましい。脱メチル化する条件としては、モノメチルスクシニル化された蛋白質がスクシニル化される条件で有れば特に制限はないが、例えば、モノメチルスクシニル化された蛋白質を水酸化ナトリウムを加えてインキュベートすることで脱メチル化が可能であり、脱メチル化に用いる水酸化ナトリウム濃度は０．０１Ｎ〜１０Ｎの範囲であれば差し支えないが、０．１〜１Ｎの範囲が実用的である。インキュベートする時間は水酸化ナトリウム濃度により異なるが、例えば、０．５Ｎの水酸化ナトリウム濃度であれば、３０分〜３時間が適当である。このようにして得られたスクシニル化蛋白質は、最終的に塩酸での中和、カラムによる分離精製、透析等を組み合わせることにより抗原として用いることが可能なスクシニル化蛋白質とすることができる。
【００２１】
本発明で前記抗原により免疫される動物は、恒温動物であればいかなる動物でも使用できる。例えば、該免疫動物としては、マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ニワトリ等であれば特に制限されないが、抗体産生細胞を融合するミエローマ細胞がマウス由来のものであるため、好ましくはマウスが使用される。
【００２２】
前記抗原により、前記恒温動物を免疫する方法は、通常の公知の免疫方法を用いることができる。例えば、７ないし３０日、特に１２ないし１６日間隔で２または３回の投与が好ましい。１回の投与量は、免疫される恒温動物の種類により異なるが、例えば、約０．０５〜２ｍｇ程度を目安とする。抗原の投与経路は皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等を選択することができるが、好ましくは腹膜腔、皮下もしくは筋肉内に注射して行う投与形態である。さらに好ましくは、前記投与経路を２ないし３組み合わせた投与経路、例えば、腹膜腔注射、皮下注射および筋肉内注射全ての投与経路を組み合わせる投与形態である。
【００２３】
なお、この場合、前記抗原は適当な緩衝液、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含有するリン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、上記のようなアジュバントを使用しなくとも良い。ここで、アジュバントとは前記抗原と共に投与したとき、非特異的に前記抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
【００２４】
そして、前記抗原を免疫した恒温動物を７〜３０日間処置せずに放置した後、該恒温動物の血清を少量採取し、抗体価をウエスタンブロット法、凝集法、酵素免疫測定法、一元放射状免疫拡散法等から選ばれた測定法により測定することができるが、より簡便には酵素免疫測定法により測定するのが良い。抗体価が上昇に応じて、抗原の追加投与を適当回数行うこともできる。例えば、０．０１〜１ｍｇ、特に、０．０５〜０．５ｍｇの投与量で１回もしくは２回の追加投与が行われる。最後の投与の１〜３０日後、特に好ましくは１〜７日後に免疫した恒温動物から抗体を産生するリンパ球を含む組織を摘出する。このとき摘出する組織は、抗体を産生するリンパ球を含む抹消リンパ系組織ならいずれでも良いが、好ましくは脾臓である。
【００２５】
得られた抗体を産生するリンパ球を含む組織からハイブリッド細胞を得るには、例えば、「単クローン抗体実験操作入門」（講談社サイエンティフィック  安藤民衛ら  １９９１）等に記載されている方法により、継体培養可能な細胞とすることを目的として、例えば、仙台ウイルスやポリエチレングリコール存在下、ある種のガン細胞と抗体を産生するリンパ球を含む組織から得られた細胞とを融合させて、ハイブリッド細胞とすることができる。ここで用いられるガン細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物由来のガン細胞を用いることが望ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。
【００２６】
実際に用いられる細胞融合の方法としては、公知の技術（Ｊ  ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄ  ３９：２８５−３０８，１９８０）を用いることができる。例えば、免疫されたマウスから得られた脾臓とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存在下で融合を行い、ハイブリッド細胞のみが生育可能であるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成した後、培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗体を産生するハイブリッド細胞を得ることができる。
【００２７】
スクリーニングする方法としては、例えば、ウエスタンブロット法あるいは酵素免疫化学的測定法等が挙げられる。また、目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は、限界希釈法を繰り返すことにより最終的に単一のハイブリッド細胞を得ることができる。さらには、これらスクシニルリジン基を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞はモノクローナル抗体を産生する環境下で大量培養することによりスクシニルリジン基を特異的に認識するモノクローナル抗体を製造することができる。
【００２８】
さらに、これらのモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞が産生したスクシニルリジン基を特異的に認識する抗体は、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いる蛋白質分画、水性二層分配法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の蛋白質の一般的な生化学的分離方法を、単独もしくはいくつかの方法を組み合わせて使用することにより精製することができる。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体はヒトのスクシニルリジンの検出だけでなく、ヒト以外の異種の恒温動物マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ等の生体中に存在するスクシニルリジンの検出にも応用することができる。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は本実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
１．抗原の調製
モノメチルスクシネート（フルカ社製）０．０５ｇ、水溶性カルボジイミド（ピアス社製）０．０７２２ｇおよびスルホ−ＮＨＳ（ピアス社製）０．０８３３ｇをジメチルスルホキシド（和光純薬工業社製：特級）中で攪拌しながら室温で２４時間インキュベートした。その液に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で１０ｍｇ／ｍＬとしたＫＬＨ溶液を１ｍＬ添加し、室温で４時間インキュベートした。この溶液に１ｍＬの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。この反応液を０．５Ｎ塩酸で中和し、リン酸緩衝生理食塩水に対し、透析外溶液を適時に交換しながら３〜５日間透析し、スクシニル化ＫＬＨを得、これを抗原とした。
【００３１】
２．免疫方法
スクシニル化ＫＬＨ（０．２〜０．６ｍｇ／ｍＬ）は等量のフロイントの完全アジュバントとよく混合してエマルジョンとし、これをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オス、６〜８週齢）の腹腔内に１００μＬ免疫した。初回免疫から１０〜１４日後、抗原とフロイントの不完全アジュバントをよく混合してエマルジョンとして、追加免疫を行った。追加免疫から３週間後、抗原とリン酸緩衝生理食塩水（略号：ＰＢＳ）を混合して最終免疫を行った。なお、抗体価は、追加免疫の１週間後、マウス眼孔静脈から血液を採取し、得られた血清を用いて酵素免疫化学的方法で抗原に対する抗体が産生していることを確認した。酵素免疫化学的方法では、免疫したマウスから得られた血清と比較対照となる免疫前のマウスから得られた血清の間に比較的大きな抗体価の差異が見られ、抗体価の上昇が確認された。
【００３２】
３．抗体価の確認方法
抗体価は、ＢＳＡのスクシニル化物（スクシニル化ＢＳＡ）を固相とした酵素免疫測定法により確認した。すなわち、抗原の調製に記載した方法と同様にＢＳＡとメチルスクシネートを反応させて得られたメチルスクシニル化ＢＳＡを脱メチル化後、透析してスクシニル化ＢＳＡを得た。これを９６穴イムノプレートに物理吸着させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ＴＴＢＳ」と略す。）で３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）あるいは蒸留水で４倍希釈したブロックエース（雪印乳業（株）社製、以下、「ブロッキング液」と略す。）でブロッキングを行った。このプレートのウエルにマウスから得られた血清（緩衝液で希釈した血清を含む。）（１００μＬ／ウエル）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されているマウス抗体に反応するウサギ抗体をＴＴＢＳで５０００−１００００倍希釈した液（１００μＬ／ウエル）（以下、「酵素標識抗体溶液」と略す。）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍＬ）および過酸化水素（０．００３％）を含むクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５）（１００μＬ／ウエル）（以下、「発色液」と略す。）を入れて室温で１５−２０分間反応させた。発色反応は１Ｍの硫酸（５０μＬ／ウエル）（以下、「反応停止液」と略す。）を入れることで停止し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。
【００３３】
４．細胞融合
免疫したマウスからマウス脾臓を摘出し、よくほぐして脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。この洗浄した脾細胞と同様にＲＰＭＩ−１６４０培地でよく洗浄したミエローマ細胞であるマウス６５３細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３：ＣＲＬ・１５８０）を細胞数が７：１の割合になるように混和し、培地に対して５０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール１５４０溶液を徐々に加えて５分間混和した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて反応を停止させた後、５分間遠心分離して上清を廃棄した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えた後、５分間遠心分離を行い上清を廃棄した。この操作を２回繰り返して細胞を洗浄し、ハイブリッド細胞を調製した。
【００３４】
５．クローニング
前述の得られた細胞に３０ｍＬのＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁し、９６穴マイクロプレートの各ウエルに１００μＬずつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的にハイブリッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）でウエル中の１／２量の培養上清を置換した。この操作を２〜３回繰り返した。この培養上清を用いて酵素免疫化学的方法により抗体価を確認し、スクリーニングを行った。なお、抗体価の確認方法は、前述の抗体価の確認方法と同様であるが、試験に用いる試料を血清の代わりに得られた培養上清を用いた。スクリーニングにより抗体活性の確認されたウエルの細胞は限界希釈を行い培養し、最終的にはスクリーニングと限界希釈を繰り返すことによりスクシニルリジン構造に対して高い抗体活性を有し、且つ単一の細胞からなるクローン１株（２Ｂ１２株）を得た。
【００３５】
このモノクローナル抗体についてマウスＩｇＧサブクラスの検討を行った。培養上清を試料としてマウスＩｇＧサブクラス検定キット（商品名：Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｋｉｔ、商品コード：ＲＰＮ２９，アマシャム社製）で抗体のサブクラスの検討を行ったところ、ＩｇＧ１、κ（カッパー）鎖であった。この培養上清の一部を用いて抗体の精製について検討したところ、硫酸アンモニウムによる塩析、あるいはプロテインＡをリガントとするアフィニティークロマトグラフィーを常法通り行うことにより本発明のモノクローナル抗体を精製することができた。
【００３６】
〔実施例２〕
前記実施例１で得られたクローンから得られた抗体の反応特異性について確認を行った。該２Ｂ１２株は、独立行政法人産業技術総合研究所に平成１３年１１月２２日に寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６２７として寄託されている。なお、検討に用いるモノクローナル抗体は、培養上清を希釈してそのまま用いた。
１．   モノクローナル抗体の反応特異性の評価法−１
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ社製、マキシソープ）にウエル当たり１００μＬの蛋白質あるいは修飾蛋白質（４μｇ蛋白質／ｍＬ）を加え、４℃で一昼夜静置してプレートに物理吸着させ、ウエル当たり３００μＬのＴＴＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＴＴＢＳもしくは蒸留水で４倍希釈したブロックエース（雪印乳業（株）社製）をウエル当たり３００μＬ加えてブロッキングした。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μＬのＴＴＢＳで希釈した本モノクローナル抗体溶液（１μｇ／ｍＬ）を加えて、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μＬの酵素標識抗体溶液を加えて、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μＬの発色液を加えて室温で１５−２０分間インキュベートした。ウエル当たり５０μＬの反応停止液を加えた後、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。
【００３７】
２．   モノクローナル抗体の反応特異性評価法−２
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに抗原の調製法に準じて調製したスクシニル化ＢＳＡを加えてプレートに物理吸着させたプレートのウエルに、本発明によるモノクローナル抗体のかわりに、本発明によるモノクローナル抗体（１μg／ｍＬ）に各種濃度の競合物質を添加したものを試料とする以外は前記の「１．モノクローナル抗体の反応特異性の評価法−１」に記載の方法と同様にして吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。
【００３８】
３．   モノクローナル抗体の反応特異性−１
種々の物質で修飾した特定の蛋白質に対する本発明のモノクローナル抗体の抗原抗体反応性を評価した。すなわち、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で２．５ｍＭの脂肪酸を終濃度で０．２５ｍＭ／２．５ｍＭの硫酸鉄・７水和物／アスコルビン酸となるように混合し、３７℃で２４時間インキュベートした液に、１ｍｇ／ｍＬの濃度のＢＳＡを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を等量加えて混合撹拌した液を３７℃で２４時間インキュベートして調製した修飾ＢＳＡを用い、前記の「モノクローナル抗体の反応特異性評価法−１」の酵素免疫測定法により測定した。得られた結果を、縦軸は各種脂肪酸、横軸はＤＨＡに由来する吸光度を１とした場合の相対値（Ｂ／ＢＤＨＡ）を示したグラフとして図１に示した。図１から明らかなように、本発明によるモノクローナル抗体は、ドコサヘキサエン酸の酸化により生じた分解物が反応した蛋白質以外とは抗原抗体反応性を示さないことは明らかである。
【００３９】
４．   モノクローナル抗体の反応特異性−２
不飽和脂肪酸の過酸化分解物として知られているアルデヒド修飾した特定の蛋白質に対する本発明のモノクローナル抗体の抗原抗体反応の特異性を評価した。すなわち、５０ｍＭリン酸緩衝液で１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製したＢＳＡ溶液１ｍＬに対し、終濃度で１ｍＭとなるように各種アルデヒド溶液を添加して３７℃で２４時間インキュベートしたＢＳＡを用い、前記の「モノクローナル抗体の反応特異性評価法−１」の酵素免疫測定法により測定した。なお、図中の略号ＳＵＬはスクシニル化ＢＳＡを示し、前記の抗原の調製方法の項に従って調製した。得られた結果を、縦軸は反応させた物質、横軸はＳＵＬに由来する吸光度を１とした場合の相対値（Ｂ／ＢＳＵＬ）を示したグラフとして図２に示した。図２から明らかなように、本発明によるモノクローナル抗体は、スクシニル化された蛋白質以外とは抗原抗体反応性を示さないことは明らかである。
【００４０】
４．   モノクローナル抗体の反応特異性−３
カルボキシアルキルアミド化した特定の蛋白質に対する本発明のモノクローナル抗体の抗原抗体反応の特異性を評価した。すなわち、カルボキシアルキルアミドを修飾したＢＳＡを用い、前記の「モノクローナル抗体の反応特異性評価法−１」の酵素免疫測定法により測定した。得られた結果を縦軸はｎの数（化学式のメチレン基の数）、横軸はＳＵＬに由来する吸光度を１とした場合の相対値（Ｂ／ＢＳＵＬ）を示したグラフとして図３に示した。図３から明らかなように、本発明によるモノクローナル抗体は、スクシニル化（ｎ＝２）された蛋白質と特異性高く反応することは明らかである。
【００４１】
５．   モノクローナル抗体の反応性−４
Ｎ−α−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）のスクシニル化物を合成した。得られたＮα−アセチルスクシニルリジン（ＳｕｃＬｙｓ）、ＡｃＬｙｓ並びにこはく酸について、本発明によるモノクローナル抗体との反応特異性を前記「モノクローナル抗体の反応特異性評価法−２」に準拠した競合酵素免疫測定法に従って評価した。得られた結果を、縦軸はそれぞれ競合物質の存在下における吸光度、横軸は競合物質の濃度を示したグラフとして図４に示した。図４から明らかなように、スクシニルリジンのみが、本発明によるモノクローナル抗体と固相化されたスクシニル化ＢＳＡとの反応を阻害した。従って、本発明によるモノクローナル抗体は、スクシニルリジン構造を特異的に認識することが明らかとなった。
【００４２】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は、蛋白質中の構成アミノ酸であるリジン側鎖がスクシニル化されて生じたスクシニルリジン構造を特異的に認識する新規モノクローナル抗体である。そのため、本発明のモノクローナル抗体は、ドコサヘキサエン酸の過酸化に由来する生体に対する影響を明らかにするために非常に有用であり、臨床診断、臨床病理、分析等において利用することが期待される。
さらに、本発明のハイブリッド細胞は、スクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生することができる。
本発明のハイブリッド細胞の製造方法によれば、スクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞を効率的に得ることができる。
本発明のモノクローナル抗体の製造方法によれば、スクシニルリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を効率的に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】種々の脂肪酸とＢＳＡを脂質過酸化条件下に混合して得られた蛋白質に対する本発明のモノクローナル抗体の反応性について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図２】種々のアルデヒドをＢＳＡに反応させて得られた蛋白質に対する本発明のモノクローナル抗体の反応性について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図３】本発明のモノクローナル抗体の認識構造について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図４】本発明のモノクローナル抗体の認識構造について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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