(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
さまざまな蛍光染料の励起波長や放出波長および調整可能なレーザスペクトルやフィルタ透過スペクトルが、別々のデータファイルに記録され、
データ記憶装置に保存されていて、それらデータファイルを組み合わせた計算加工から顕微鏡プリセットデータを求めるものであり、
蛍光染料の励起波長が第一データファイル（Ｄ１）に、
調整可能なレーザスペクトルが第二データファイル（Ｄ２）に、
蛍光染料の放出波長が第三データファイル（Ｄ３）に、
そして調整可能なフィルタ透過スペクトルが第四データファイル（Ｄ４）に記録され、
前記すべてのデータファイルのデータは、バイナリー値のチェーンとして記録され、
チェーンの各バイナリー値が波長域λ１〜λ2の対応する一特定区分△λに付与されること、
およびその場合光線強度が閾値ｙ以下である区分△λには常にバイナリー値「０」が、光線強度が閾値ｙ以上である区分△λには常にバイナリー値「１」が付与され、
レーザスペクトルの選択のために当該蛍光染料の励起波長に相応する第一データファイル（Ｄ１）の中のバイナリー値チェーンを、第二データファイル（Ｄ２）のすべてのバイナリー値チェーンと「論理積」関数を使って順次組み合わせ、
それによって得られたバイナリー値チェーンのうちで、バイナリー値「１」が少なくとも１回現れるバイナリー値チェーンを求め、
その中で隣接して現れるバイナリー値「１」の数が最も多いバイナリー値チェーンを選び、それを結果として記録し、
そしてバイナリー値チェーンの結果が記録されているレーザスペクトルを、顕微鏡の配置調整のためにプリセットし、
フィルタ透過スペクトルの選択のために、当該蛍光染料の放出波長に相応する第三データファイル（Ｄ３）の中のバイナリー値チェーンを、第四データファイル（Ｄ４）のすべてのバイナリー値チェーンと「論理積」関数を使って順次組み合わせ、  
それによって得られたバイナリー値チェーンのうちで、バイナリー値「１」が少なくとも１回現れるバイナリー値チェーンを求め、その中で隣接して現れるバイナリー値「１」の数が最も多いバイナリー値チェーンを選び、それを結果として記録し、  
そしてバイナリー値チェーンの結果が記録されているフィルタ透過スペクトルを顕微鏡の配置調整のためにプリセットすることを特徴とし、
少なくとも一つの蛍光染料を含む、又は少なくとも一つの蛍光染料の塗布された試料に対し、それぞれ蛍光染料の励起波長に相応する照射光のレーザスペクトルを選択して、
またその透過スペクトルが蛍光染料の放出波長に相応する顕微鏡光路への転向用光学フィルタを選択して行う
検査の前又は検査の途中における共焦点レーザ顕微鏡の配置調整のための方法
【請求項２】
光線強度を、試料に当たるレーザ光の強度基準とし、閾値ｙをこの光線強度の５０％と想定することを特徴とする請求項１に記載の方法
【請求項３】
波長域がλ１＝３００ｎｍ〜λ２=７００ｎｍで、各バイナリー値の対象域が△λ=０．１ｎｍであることを特徴とする上記請求項の一つに記載の方法
【請求項４】
レーザ構成要素（１）とフィルタが制御可能な調整機器と繋がっていること、
さまざまな蛍光染料の励起波長や放出波長、あるいはレーザスペクトルや調整可能な透過スペクトルに関するデータファイル（Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４）用記憶装置の装備されていること、
および制御装置（２９）を通じて調整機器に連結しているデータファイル組み合わせのための計算加工装置が存在することを特徴とし、
前記データファイル（Ｄ１）用記憶装置には蛍光染料の励起波長が記録され、
前記データファイル（Ｄ２）用記憶装置には、調整可能なレーザスペクトルが記録され、
前記データファイル（Ｄ３）用記憶装置には蛍光染料の放出波長が記録され、
前記第四データファイル（Ｄ４）用記憶装置には調整可能なフィルタ透過スペクトルが記録され、
さらに、前記すべてのデータファイル（Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４）用記憶装置のデータは、バイナリー値のチェーンとして記録され、
チェーンの各バイナリー値が波長域λ１〜λ２の対応する一特定区分△λに付与されること、
およびその場合光線強度が閾値ｙ以下である区分△λには常にバイナリー値「０」が、光線強度が閾値ｙ以上である区分△λには常にバイナリー値「１」が付与され、
前記計算加工装置は、レーザスペクトルの選択のために、当該蛍光染料の励起波長に相応する第一データファイル（Ｄ１）の中のバイナリー値チェーンを、第二データファイル（Ｄ２）のすべてのバイナリー値チェーンと「論理積」関数を使って順次組み合わせ、
それによって得られたバイナリー値チェーンのうちで、バイナリー値「１」が少なくとも１回現れるバイナリー値チェーンを求め、
その中で隣接して現れるバイナリー値「１」の数が最も多いバイナリー値チェーンを選び、それを結果として記録し、
さらに、フィルタ透過スペクトルの選択のために、当該蛍光染料の放出波長に相応する第三データファイル（Ｄ３）の中のバイナリー値チェーンを、第四データファイル（Ｄ４）のすべてのバイナリー値チェーンと「論理積」関数を使って順次組み合わせ、
それによって得られたバイナリー値チェーンのうちで、バイナリー値「１」が少なくとも１回現れるバイナリー値チェーンを求め、
その中で隣接して現れるバイナリー値「１」の数が最も多いバイナリー値チェーンを選び、それを結果として記録し、
前記制御装置（２９）は、バイナリー値チェーンの結果が記録されているレーザスペクトルを、顕微鏡の配置調整のためにプリセットし、
さらにバイナリー値チェーンの結果が記録されているフィルタ透過スペクトルを顕微鏡の配置調整のためにプリセットし、
少なくとも一つの蛍光染料を含む試料（１６）に向けて照射されるスペクトル可変性レーザ光線の生成用レーザ構成要素を有するほか、試料（１６）から反射および／又は放出する光の光路に於いて選択的に向きを変えることのできる、さまざまな透過スペクトルを生むフィルタの装備された共焦点レーザ顕微鏡
【請求項５】
励起波長のデータファイルと調整可能なレーザスペクトルのデータファイルとの組み合わせおよび放出波長のデータファイルと調整可能な透過スペクトルのデータファイルとの組み合わせにおける計算加工作業に、それぞれ「論理積」関数による方法が想定されていることを特徴とする請求項４に記載の共焦点レーザ顕微鏡
【請求項６】
さまざまなレーザスペクトルの調整のために、同調化可能な光フィルタ（６，１１）および／又は制御可能な光変調器の後続されている複数の単線又は複線レーザ（２，３，４）が、レーザ構成要素（１）の中に装備されていることを特徴とする請求項４あるいは５に記載の共焦点レーザ顕微鏡
【請求項７】
輪状フィルタ架台の上に設置されていて、
その輪を回転させることによって互いに入れ替え可能な線状フィルタおよび／又は輪状分離器架台の上に設置されていて、
その輪を回転させることによって互いに入れ替え可能なスペクトル分離器が装備されていて、
その輪状フィルタおよび輪状分離器がそれぞれ電子工学的に制御可能な調整機器に接続されていることを特徴とする請求項４〜６のうちの一つに記載の共焦点レーザ顕微鏡
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は共焦点顕微鏡、特に単一又は複数のスペクトル線を持つレーザ光を生成し、蛍光染料を含む、又は蛍光染料の塗布された試料にそのレーザ光を照準、照射することによって発生する染料反射光および／又は放出光を画像判定の基礎とし、また蛍光染料の放出波長に対応する単一フィルタ又は複合フィルタを顕微鏡光路内に設置することによって画像判定能力に影響が生じるようにしたレーザ走査顕微鏡の機器配置調整のための方法に関するものである。
本発明は、さらにこの方法実施のためのシステム構成をも対象にしている。
【０００２】
【従来の技術】
共焦点顕微鏡は光顕微鏡の特殊改良開発製品として微小構造に対する分解能を引き上げるだけでなく、微小構造を立体空間のＺ座標に於いても結像させて測定することを可能にする。その結果、蛍光技術はブライトフィールド、位相コントラストおよび干渉コントラストの測定に記載の旧来のコントラスト法と並び、否それにも増して光学精密機器の製造に於いて、また学術的にも関心の的になっている。
【０００３】
蛍光技術では、励起波長と放出波長がさまざまなスペクトル帯にある色々な弗化クロムを利用して物質の構造を同時に複数の色で表現するということを基本としている。それにより、さまざまな色素分子のスペクトル特性を基にして形態学に関する情報のほか、生理学的パラメータについても詳細を知ることができる。
【０００４】
蛍光技術に記載の測定法に共焦点顕微鏡を利用すれば、イオンおよび分子の濃度変化を解明することが可能になる。その場合、光強度依存性についてだけでなく、それに加えて励起又は放出スペクトルのずれについてもデータ表示することでイオン濃度の定量化を可能にする指示器を利用することも重要である。照射光源としてはそれぞれ一波長を持つ単独レーザを幾つか組み合わせるか、又は複数の利用可能な波長を持つ「マルチライン」混合ガスレーザを使用する。
【０００５】
「科学技術情報」第II巻、第１号、９〜１９ページ（１９９５年６月）には上記のような方法および使用機器の技術に関する記載がある。それには、対象物を照射光路にてさまざまな励起波長により逆方向から細部まで精密に照射するという方法に対応し得るよう、検出装置の構成も放射波長に適合していなければならないことが詳細に説明されている。その場合、試料の全く同一の領域からスペクトル別に異なった情報を検出し、それを画素レベルで記録して画像判定用として保存することが肝要である。例えば、微小構成体の立体的な細胞構造、組織構造の確定又は染色体内複数遺伝子の位置特定を可能にする三次元データの利用がそれによって初めて実現できる。
【０００６】
例えば、蛍光法における反射光、放出光の判定のための連続検出には、励起光線分離器として共焦点光路に中性分離器および簡式二色性分離鏡が設置されるが、この場合相次いでなされる計測記録過程で分離器の取換が必要である。検出された放出スペクトル帯の区分には、例えば遮断フィルタが利用されるが、スペクトル分離の微小測定には、波長フィルタおよび帯フィルタを選択することもできる。
フィルタの構成要素はすべて機械的に組み立てられ、部品調整を要する場合は然るべきものと交換される。
【０００７】
放出光を複数の検出管路へ分岐させる方法は、確かに、照射用、検出用有孔遮光器が、検出器すべてに対し正確に共焦点の位置に配置されるという利点はあるが、しかし検出管路の数が増すと共にフィルタの組み合わせも多くなってくる。その結果、共焦点顕微鏡の使用者が、試料の像又は試料の中から選択した特定面の像を得るためには、蛍光染料の励起波長および放出波長について正確な知識を持っていなければならないことになる。
【０００８】
本発明では、例えば励起波長で染料に入射したエネルギーが、続いての過程で低エネルギーの波長に転換され、その後再び染料外へ放出されるという現象を利用している。その場合放出光は、既述の鏡、フィルタおよび色分離器を通ってそれぞれ検出管路に達し、検出機能を持つ光電子増倍管（ＰＭＴ）に記録されて画像の加工に用いられる。
【０００９】
それぞれの光子が試料から検出器へ到る経路は、顕微鏡使用者の選択した機器の照準設定に依存する。つまり主観的影響要因が入るため、機器配置調整の選択次第で実際の光子径路が正しかったり、好ましくなかったりあるいは間違っていたり、結果が左右される。
【００１０】
正しい機器配置調整がなされていると言えるのは、試料中の染料への励起光線に相応するスペクトル組成を持つレーザ光が選択されていて、また放出側ではその透過スペクトルが染料の放出波長に相応する色分離器およびフィルタが顕微鏡光路のほうに向けて設置されている場合である。
【００１１】
例えば、染料の励起光線に相応したレーザの配置が選択されていても、放出スペクトルの一部しか透過しない色分離器や、フィルタが放出光路のほうに向けて設置されているという場合では、確かに機能性はあるが最適の調整とは言えず、好ましくない。その場合ではそれぞれの検出器にせいぜい比較的弱いシグナルが到達するだけという結果になる。選択したレーザ波長が選択染料の励起波長に正確には一致していない場合も類似現象が現れる。
【００１２】
励起側でレーザの選択を間違った場合および／又は放出側で放出スペクトルのほかに透過スペクトルも併せ持つ鏡又はフィルタの組み合わせを選択した場合、調整法として完全に誤っている。結果的には、当該システムでは像が全く生成されないことになる。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、以上の状況を踏まえ、顕微鏡使用者に光学関係の予備知識がなくても僅かな時間で選択染料に最も適合した機器配置調整ができるための方法を提供することを課題としている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の方法では、この課題はさまざまな蛍光染料の励起波長と放出波長を別々のデータファイルに記録してデータ記憶装置に保存することによって解消される。
同様に、顕微鏡で調整可能な試料照射用レーザスペクトルおよび設置されたフィルタおよび／又はスペクトル分離器によって得られる透過スペクトルをデータファイルに記録して保存する。
【００１５】
さらに本発明に記載の方法では、これらのデータファイルの計算加工から、顕微鏡配置調整のためのプリセットデータを求める。その場合、当該蛍光染料の励起波長に関するデータファイルを選択可能なすべてのレーザスペクトルと組み合わせることにより、当該蛍光染料の励起波長に対応するレーザスペクトルを少なくとも一つ選択する。
【００１６】
同様に、当該蛍光染料の放出波長に関するデータをフィルタ複合の可能性に関するデータと組み合わせることにより、当該蛍光染料の放出波長に対応する透過スペクトルを求める。
このように、本発明の方法は、レーザスペクトルおよび透過スペクトルを主観的に選択する公知である上記の方法に代わるものである。
【００１７】
本発明の方法によれば、当該ファイルに励起波長および放出波長のデータが保存されている蛍光染料それぞれの場合について、当該作業過程に要する顕微鏡配置確認およびプレセッティングが客観的になし得る。しかも、顕微鏡の調整が最高の形でなされるだけでなく、マニュアル方式の場合より迅速に調整目的が達せられる。
【００１８】
本発明の別な実施態様では、さまざまな蛍光染料の励起波長を第一のデータファイルに、調整可能なレーザスペクトルを第二のデータファイルに、蛍光染料の放出波長を第三のデータファイルに、および調整可能なフィルタ透過スペクトルを第四のデータファイルに記録して保存する。
【００１９】
第一と第二のデータファイルを組み合わせての計算結果から、当該蛍光染料の励起波長に対応するレーザ光線スペクトルについて少なくとも一つの調整指針が求められる。同様に、第三と第四のデータファイルを組み合わせての計算結果から、当該蛍光染料の放出波長に対応するフィルタ透過スペクトルについて少なくとも一つの調整指針が求められる。
【００２０】
それぞれのデータファイルは、何時でも補充でき、修正も可能である。励起波長と放出波長に関するデータが、それぞれ保存されている第一と第三のデータファイル間には、対象とする蛍光染料が同一であって、当該蛍光染料を呼び出した際に、組み合わせの目的でそれぞれのデータが利用される限りに於いては関係がある。
【００２１】
本発明の場合、すべてのデータファイルのデータを、それぞれバイナリーデータのチェーンとして記録し、そのようなチェーンの各バイナリー値を同一波長域λ1〜λ2の特定区分△λに位置づけることを極めて代表的な実施態様として想定している。但し、一単位区分△λで測定される光線強度が閾値y以下の場合は、常に当該単位区分△λをバイナリー値「０」と定義する。他方、光線強度が閾値ｙ以上になる区分△λは常にバイナリー値「１」と定義する。
【００２２】
これは、試料照射に用いられるレーザスペクトル側のデータから言えば、波長域λ1〜λ2にあって、閾値y以上の強度を持つレーザ光線が試料に照射される単位区分△λはいずれもバイナリー値「１」と判定されるということになる。波長域λ1〜λ2にあって、光線強度が閾値ｙ以下であるその他の区分△λはすべてバイナリー値「０」に分類される。
【００２３】
蛍光染料の励起波長データの場合では、波長域λ1〜λ2にあって試料に照射されるレーザ光の強度が、当該蛍光染料に確実に励起を起こさせる閾値ｙ以上の値となる区分△λだけが、バイナリー値「１」と判定されることになる。光線強度が閾値y以下で、確実に励起を発生させるには十分でないその他区分△λはいずれもバイナリー値「０」と判定される。
【００２４】
放射波長データに関しては、波長域λ1〜λ2における励起染料の測定で、閾値ｙ以上の光線強度の現れる区分△λだけがバイナリー値「１」と判定される。
フィルタや複合フィルタにおける判定については、閾値ｙ以上の光線強度の場合に、当該のフィルタ又は複合フィルタが透明である区分△λだけが、バイナリー値「１」となる。それ以外のすべての区分△λはバイナリー値「０」となる。
【００２５】
以上のようなデータ記録方法により、保存すべき情報のすべてについて常に同数のバイナリー値から成るバイナリー値チェーンが得られる。それぞれのチェーン内で隣接するバイナリー値「１」の数がそれぞれの帯幅の尺度である。単独で存在する、又は複数隣接するバイナリー値「１」の位置はそれぞれの場合で次の尺度になっている :
- 染料の励起に適している波長（第一データファイル）、
- 試料に当たる照射光線の波長（第二データファイル）、
- 試料から出る放出光線の波長（第三データファイル）および
- 単一フィルタ又は複合フィルタを透過する波長（第四データファイル）
【００２６】
それにより、すべてのバイナリー値チェーンについて、バイナリー値チェーンに含まれるバイナリー値「１」が同じ又は異なった波長を、あるいはまた同じ又は異なったスペクトル帯を、表しているのかどうかということまで、互いに比較することが可能である。
【００２７】
例えば、選択蛍光染料の励起波長についてのバイナリー値チェーン（第一データファイル）を、配置調整用に選択されたレーザスペクトルのバイナリー値チェーン（第二データファイル）と比較すれば、両バイナリー値チェーンのバイナリー値の位置から、レーザスペクトルの帯幅が励起スペクトルの帯幅を部分的に又は完全に覆っているか、あるいは全く覆っていないかが識別できる。
【００２８】
顕微鏡の調整の点から効果的と言えるのは、両データファイルのバイナリー値チェーンのうちバイナリー値「１」の位置が少なくとも部分的に重なり合っている場合だけであり、できれば完全に重なり合っているのが好ましい。
【００２９】
区分△λのバイナリー値が「０」であるか「１」であるかの判定基準としては、試料に照射されるレーザ光線の強度が利用される。その場合、閾値ｙはこの光線強度の５０％に設定されることが圧倒的に多い。
【００３０】
本発明の実施態様では、いかなるバイナリー値チェーンの測定でもその基礎条件として特に波長域λ1＝３００ｎｍ〜λ2＝７００ｎｍの範囲を想定していることが多い。そのほか、帯幅０.１ｎｍに相当する単位区分△λを、それぞれ「０」か「１」に分類することを主たる方法として想定している。
【００３１】
適切なレーザスペクトルをコンピュータ計算で選択するには、本発明に記載の方法の場合、第一データファイルの中から当該蛍光染料の励起波長に相当するバイナリー値チェーンを選び出し、それらを第二データファイルのすべてのバイナリー値チェーンと「論理積」関数に基づいて順次論理的に組み合わせるということを想定している。
【００３２】
それらの組み合わせから新たなバイナリー値チェーンが得られるので、その中から隣接して現れるバイナリー値「１」の数が最も多いバイナリー値チェーンを求め、それを結果として記録する。顕微鏡の配置調整には、こうして（第二のデータファイルからの）バイナリー値チェーンが、組み合わせ結果の中に反映されるレーザスペクトル、即ち積表示バイナリー値チェーンに於いて隣接して現れるバイナリー値「１」の数が最も多くなるレーザスペクトルを選択する。
【００３３】
適切なフィルタ透過スペクトルの選択には、第三データファイルの中から当該蛍光染料の放出波長に相当するバイナリー値チェーンを選び出し、それらを第四データファイルのすべてのバイナリー値チェーンと「論理積」関数に基づいて順次組み合わせる。この場合でも積の形でバイナリー値チェーンが得られ、そのうちバイナリー値「１」を少なくとも一つ持つバイナリー値チェーンを選択する。
【００３４】
それらのバイナリー値チェーンのうち隣接して現れるバイナリー値「１」の数が最も多いバイナリー値チェーンを求め、結果として記録する。こうして、顕微鏡の配置調整のための複合フィルタとしては、（第四データファイルからの）バイナリー値チェーンが、組み合わせ結果として積表示バイナリー値チェーンの中に反映されるものを想定する。
【００３５】
バイナリー値チェーンの形態でのデータ記録およびこのバイナリー値の「論理積」関数による顕微鏡の最適配置調整法に代わるものとして、電子工学における振動回路の計算に準拠して、不連続波長を持つレーザ光を振動回路に代わるインプットデータとして評価する方法が考えられる。この場合、フィルタは例えばＲＣ構成体によりシミュレーションできる。
【００３６】
レーザ走査顕微鏡のそれぞれの配置調整ではＲ（「抵抗値」）およびＣ（「容量」）を変えて、その時の写真放射の品質を算定し、判定する。その中で結果が最高なものを機器調整の計算要素として想定する。このようにして光路の全組み合わせが記録でき、その結果顕微鏡光路に向けて適切なフィルタ又は色分離器を設置することが可能となる。
【００３７】
本発明の上記課題はさらに、少なくとも一つの蛍光染料を含む試料に向けて照射されるスペクトル可変性レーザ光線の生成用レーザ構成要素を有するほか、試料から反射および／又は放出される光の光路に於いて、選択的に向きを変えることのできるさまざまな透過スペクトルを生むフィルタの装備された共焦点レーザ顕微鏡によって解決される。
【００３８】
その場合、本発明に記載の方法では、レーザ構成要素およびフィルタが制御可能な調整機器と連結していること、蛍光染料の励起波長、放出波長に関するデータファイル用記憶装置、調整可能な各種レーザスペクトルに関するデータファイル用記憶装置および調整可能な各種透過スペクトルに関するデータファイル用記憶装置の備わっていること、さらにはこれらデータファイル組み合わせのための計算加工システムがあって、その端末が制御装置を通じて調整機器と結合していることが前提とされる。
【００３９】
計算作業では、励起波長データと対応のレーザスペクトルデータとの「論理積」演算および放出波長データと対応の透過スペクトルデータとの「論理積」演算を前提としている。
【００４０】
本発明に記載のレーザ顕微鏡では、実施態様として、別々に制御されるように構成された −および／又はその作用によりさまざまなレーザスペクトルの選択を可能にする制御装置、即ち常に同調させ得るように制御するスペクトルフィルタ（ＡＯＴＦ）および／又は制御型音響光学変調器(ＡＯＭ）の後続されている − 複数の単線又は複線レーザをレーザ構成要素に装備させることができる。
そのほか、複数の線状フィルタおよび／又はスペクトル分離器を輪の上に配置し、その輪を回転させることによって互いに交換し得るようになっていることを前提としている。
【００４１】
【発明の実施の態様】
以下に本発明を実施例を基にして詳しく説明する。
図１は、波長λ1＝３００ｎｍ〜λ2＝７００ｎｍの範囲を横座標に取ったグラフである。この範囲に対応してバイナリー値チェーンが表されており、各単位区分△λにそれぞれバイナリー値「０」か「１」が与えられている。
このグラフの縦座標は、光線強度をパーセントで表示したものである。各区分△λに与えられるバイナリー値のうち、バイナリー値が「１」と定義付けされるのは、照射された光線の強度が閾値ｙを越えている場合だけである。但し、閾値は試料に当たった光線強度の５０％と想定する。
この実施例で表されているのは、帯幅が区分△λに相当する単一線レーザ光なので、一区分△λだけがバイナリー値「１」となる。
【００４２】
図２は名称表示のない選択蛍光染料についての同一波長域λ1〜λ2における励起波長および放出波長の判定結果を示したものである。
この場合も同様に、各区分△λには、バイナリー値「０」か「１」が付与されている。染料を蛍光へと励起させるために必要な光線強度が閾値ｙ以下しかない区分△λは、常にバイナリー値「０」と定義付けされ、一方染料の励起に必要な光線強度が閾値ｙ以上ある区分△λは、それぞれバイナリー値「１」と判定される。隣接するバイナリー値「１」の数は、蛍光染料の励起を可能にするだけの光線強度を持つ帯幅についての尺度である。
【００４３】
図２には、そのほか同一蛍光染料の放出帯幅の判定結果も表わされている。励起光線の場合と同様、放出光線の場合でも隣接するバイナリー値「１」の数が放出光線帯幅を表す尺度となる。
【００４４】
図３は、同様に同一波長域λ1〜λ2について見たフィルタ透過スペクトルのグラフである。ここでは、閾値ｙ以上の強度を持つ光線がフィルタを通過する区分△λに、バイナリー値「１」が付与される。隣接するバイナリー値「１」の数はフィルタ帯幅の尺度である。
【００４５】
図１〜図３のグラフでは、いずれもバイナリー値測定開始点は波長λ1＝３００ｎｍに、バイナリー値測定最終点は波長λ2＝７００ｎｍに相当する。バイナリー値チェーンは、いずれも同じ数だけの単位区分△λを有しているので、その間に存在するすべてのバイナリー値の位置も定義付けされている。それにより、レーザスペクトルのほか蛍光染料の励起波長、放出波長について、さらにはフィルタ透過スペクトルについて、それぞれのデータの比較が可能になる。
【００４６】
そのような比較として、個別波長、個別調整位置毎に保存されたデータを本発明に基づいて計算加工した例を図４に示した。
図４では、図１のグラフと図２の励起波長グラフとが重ねられている。グラフの下方には図１および図２のバイナリー値チェーンが転記されていて、「論理積」関数によって互いに組み合わされている。組み合わせた結果も同様にバイナリー値チェーンになっているが、この場合では図１のバイナリー値チェーンでも図２のバイナリー値チェーンでも、バイナリー値「１」と定義付けされる区分△λだけがバイナリー値「１」を持つ。
【００４７】
その結果から、適切なスペクトル特性を持つレーザ光線の選択により、当該蛍光染料の励起を十分な光線強度で行うことができる。この配置調整はプリセットのための作業であり、試料の鏡検を成功させるための重要な前提条件がそれによって満たされる。
蛍光染料とのバイナリー値チェーンの組み合わせの結果が、バイナリー値「１」を含まないチェーンになるレーザスペクトルの場合、いずれも顕微鏡の配置調整には適していない。
【００４８】
図５は同様の作業を示しており、図２に表された蛍光染料の放出波長に合わせたフィルタ透過スペクトルの配置調整である。そこに示された選択染料の放出スペクトルについてのバイナリーデータとフィルタＡのバイナリーデータとの組み合わせから、フィルタＡは適していないことが判る。それは組み合わせ結果として示されたバイナリ値チェーンにバイナリー値「１」が現れないからである。つまり、放出光線がフィルタを通過し得ないのである。
他方、選択染料のバイナリーデータとフィルタＢのデータとの組み合わせの場合は様子が異なっている。組み合わせ結果のチェーンに於いてバイナリー値「１」が複数個連なっており、この配置が適切であることを証明している。
【００４９】
図６には本発明に記載の方法の実施に用いる共焦点レーザ顕微鏡が例示されている。それには可視領域、即ち波長６３３ｎｍ、５４３ｎｍおよび４８８ｎｍのレーザ光生成のためのレーザ２，３および４の装備されたレーザ構成要素１が設置されている。レーザ２，３および４から出た光線は、複数の集光器５，ＡＯＴＦ６およびファイバー７を経由して、座標ｘ，ｙで光線転向ユニット９の備えられた走査装置８に進入する。
【００５０】
第二のレーザ構成要素１０にはＵＶレーザが備えてあり、その光は、ＡＯＴＦ１１および光誘導ファイバー１２を経由して走査装置８に進入する。
両光路には、光誘導ファイバー７および１２に後続して、視準レンズ１３が設置されている。それらとそれぞれのファイバーエンドとの距離は変更可能であり、その目的のために制御可能な調整装置（図示してない）が接続されている。
【００５１】
レーザ光は光線転向装置９から走査対物レンズ１４を通って、簡略図示された顕微鏡１５の中に入り込み、そこで蛍光染料を含む、又はそのような染料の塗布された試料１６のほうに向けられる。レーザ光線はそこから試料へ到るまでに鏡胴レンズ１７、光線分離器１８および顕微鏡対物レンズ１９を通過する。
【００５２】
試料の入射点から反射および／又は出射した光は、それぞれ顕微鏡対物レンズ１９を通って逆戻りし、光線転向装置９に達したのち、光線分離器２０を通過し、その後結像レンズ２１により複数の検出管路２２毎に分岐され、その各検出管路２２に一つずつ配置された光電子増倍管２３のほうに向けられる。
【００５３】
各検出管路２２への分岐のため、光は、例えば、転向プリズム２４から二色光線分離器２５のほうへ向けられる。各検出管路２２には、光線方向にも光線垂直方向にも調節可能で直径の変更できるピンホール２６および放射フィルタ２７が配置されている。
【００５４】
光電子増倍管２３の出口は制御装置２９と連結している判定機器２８の信号導入部に通じている。制御装置２９の出口はレーザ構成要素１および１０の信号導入部とも、例えば視準レンズ１３，ピンホール２６など光学素子又は光学ユニットのポジション調整用装置の信号導入部とも結合している（詳細は図示されていない）。
【００５５】
例えば、走査装置８に入って光線分離器３０により分岐されたレーザ光線の一方は光電子受光器３１に向けられる。そこには複数の線状フィルタ３２および中性フィルタ３３が輪状に設置されていて、その輪を回転することによって入れ替え可能になっている。受光器３１の出口も同様に判定機器２８の信号導入部に繋がっている。線状フィルタ３２と中性フィルタ３３の配置されている輪状フィルタ架台は、その制御導入部が制御装置２９の信号出口と結合している調整機器と繋がっている（図には描かれていない）。
【００５６】
さらにまた、判定機器とデータ記憶装置３４とが連結されている。尚、後者にはさまざまな蛍光染料の励起波長、放出波長、レーザスペクトルおよび調整可能な透過スペクトルに関するデータファイルＤ１〜Ｄ４が呼び出し可能な状態で保存されている。
【００５７】
判定機器２８には、かなり前の段落で既に述べたように、第一データファイルＤ１と第二データファイルＤ２との、および第三データファイルＤ３と第四データファイルＤ４との本発明に記載の組み合わせのための計算加工装置が存在する。計算結果は ― これも記述済みであるが、それぞれ制御命令の形で ― 制御装置２９を通じて両ＡＯＴＦ６，１１に伝えられるほか、放出フィルタ２７やそのほか例えば、位置および直径の変え得るピンホール２６にも連結している調整機器にも伝えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試料に照射されるレーザ光線の帯幅およびそれに対応するバイナリー値チェーンの例
【図２】選択蛍光染料における励起波長および放出波長に対応するバイナリー値チェーンの例
【図３】フィルタ透過スペクトルおよびそれに対応するバイナリー値チェーンの例
【図４】図１と図２のスペクトル組み合わせにおける論理積の例
【図５】図２と図３のスペクトル組み合わせにおける論理積の例
【図６】本発明に記載の方法の実施に用いる顕微鏡システムの原理図式。
【符号の説明】
１  レーザ構成要素
２,３,４  レーザ
５  集光器
６  ＡＯＴＦ
７  ファイバー
８  走査装置
９  光線転向ユニット
１０  レーザ構成要素
１１  ＡＯＴＦ
１２  光誘導ファイバー
１３  視準レンズ
１４  走査対物レンズ
１５  顕微鏡
１６  試料
１７  鏡胴レンズ
１８  光線分離器
１９  顕微鏡対物レンズ
２０  光線分離器
２１  結像レンズ
２２  検出管路毎
２３  光電子増倍管
２４  転向プリズム
２５  二色光線分離器
２６  ピンホール
２７  放射フィルタ
２８  判定機器
２９  制御装置
３０  光線分離器
３１  光電子受光器
３２  線状フィルタ
３３  中性フィルタ
３４  データ記憶装置
【図１】
0004145421.tif 000002
【図２】
0004145421.tif 000003
【図３】
0004145421.tif 000004
【図４】
0004145421.tif 000005
【図５】
0004145421.tif 000006
【図６】
0004145421.tif 000007