(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)図45ないし図52に示されたヒト由来核酸配列、または
(b)図45ないし図52に示されたヒト由来核酸配列からヌクレオチド724-810が欠除した核酸配列
を有する核酸によってコードされる哺乳類D2ドパミンレセプターの
膜横断領域V、VI、もしくはVII、または第3の細胞質ループ以外のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された哺乳類D2ドーパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
図45ないし図52に示されたヒト由来核酸配列、または図45ないし図52に示されたヒト由来核酸配列からヌクレオチド724-810が欠除した核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列
を有する核酸によってコードされるポリペプチドであって
膜横断領域V、VI、もしくはVII、または第3の細胞質ループ以外のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された哺乳類D2ドーパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
図1ないし図5に示されたラット由来核酸配列を有する核酸によってコードされる哺乳類D2ドパミンレセプターの
膜横断領域V、VI、もしくはVII、または第3の細胞質ループ以外のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された哺乳類D2ドーパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
図1ないし図5に示されたラット由来核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列
を有する核酸によってコードされるポリペプチドであって
膜横断領域V、VI、もしくはVII、または第3の細胞質ループ以外のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された哺乳類D2ドーパミンレセプターの生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
図45〜図48、図51、図52の領域IないしVIIから選ばれた膜横断領域をコードする、ヒト起源の天然DNA配列のDNA分子配列へ、またはそれに対し相補的なDNA分子へ高度に厳格な条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項６】
図1ないし図5のラット由来のDNA分子配列へ、またはそれに対し相補的なDNA分子へ高度に厳格な条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項７】
検出し得る標識基で標識された請求項５又は６に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項８】
核酸サンプルと請求項７の核酸ハイブリダイゼーションプローブとをハイブリダイズすることを含む、哺乳類Gタンパク結合ドパミンレセプターをコードする配列とハイブリダイズする配列の存在について前記核酸サンプルをプローブする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は哺乳類からのドーパミンリセプター及びそれに対応する遺伝子に関する。特に、本発明はＤ2 ドーパミンリセプター遺伝子の単離、配列及び／又はクローニング、変換細胞によるＤ2 ドーパミンリセプターの合成及びドーパミンリセプターをコードするＤＮＡの同定及びクローニングにより可能となる新規の産物の製造及び使用に関する。
【０００２】
ドーパミンリセプターは一般に非常に多くの神経学的及び他の異常−例えば運動異常、精神分裂、薬物依存、パーキンソン氏病、トゥレット症候群、晩発性運動障害及びその他多く−に関与している。その結果、ドーパミンリセプターは多くの薬理学的及び生化学的研究の対象となってきた。
【０００３】
一般に、ドーパミンリセプターは、薬理学的及び生化学的特徴に基づいてＤ1 及びＤ2 のサブタイプに分類される（１，２）。Ｄ2 ドーパミンリセプターは病理生理学及び上記の異常に関連づけられてきた。加えて、Ｄ2 ドーパミンリセプターは第２のメッセンジャー系を調節するためにグアニジンヌクレオチド結合蛋白質と相互作用することが知られている（６，７）。
【０００４】
ドーパミンリセプター及びその遺伝子の存在及び性質の解明について力点がおかれていたにも拘わらず、同定、単離、およびクローニングはこれまでなしえなかった。Ｇリセプターと結合する類縁のリセプターが、一次アミノ酸配列においてかなりの類似性を示し７個の推定上の膜横断領域（８）よりなると予測される構造形態を呈するということが知られているにもかかわらずそうであった。セロトニンリセプターに関しては、例えば、Ｊｕｌｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：５５８（１９８８）を参照のこと。
【０００５】
発明の概要
本発明は成功裏に人類を含む哺乳類のＤ2 ドーパミンリセプター遺伝子配列を同定し、単離し、クローン化しコード化されたドーパミンリセプターを製造した。対応するポリペプチドが合成された。遺伝子とポリペプチド双方の配列が決定された。本発明はまた、多くの新規で有用な核酸、細胞ライン、ベクター、及びポリペプチド及びとりわけ医薬品、並びにそれらを使用する方法を提供する。
【０００６】
このように、本発明はＤＮＡ配列─その同定された部分は構造遺伝子であり哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセプターの生物学的活性を有するポリペプチドをコードしている─の単離に関する。特にそれは、哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセプターをコードするＤＮＡ配列にハイブリッドされる単離されたＤＮＡ配列に関する。それはまた、特に哺乳類のドーパミンリセプターの生物学的活性を有するポリペプチド、特に哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセプター、をもコードするそのような配列のフラグメント、変種及び突然変異体に関する。好ましくは、ヒトのドーパミンリセプターである。他に好ましくは、その配列は図１ないし図７に示したようにラットのＤ2 ドーパミンリセプターである。無論、本発明の核酸はまた、前記の相補的ストランド、並びにコドンの変性による異なった配列及び前記の配列とハイブリッドした配列をも含むものである。
【０００７】
他に好ましくは、本発明は好ましくは放射性又はビオチン標識等の検出し得る部分で標識した、オリゴヌクレオチドのプローブとして有用な核酸配列及びフラグメントを含む。例えば、そのようなプローブは、Ｄ2 ドーパミンリセプターの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡと又はそれに関連した例えば、Ｄ2 ドーパミンリセプター遺伝子若しくはそのイントロンの制御を提供するＤＮＡ等のＤＮＡとハイブリッドさせることができる。本発明のＤＮＡはまたベクターの部分であることもできる。
【０００８】
本発明はまた、本発明のベクターで形質転換される細胞及びこれらの細胞をポリペプチド─例えばＤ2 ドーパミンリセプターの生物学的活性を有するもの─を製造するために培養する方法をも含む。好ましくは、該細胞はそのような方法に用いる場合には哺乳類起源のものである。
【０００９】
本発明はまた、前記の核酸配列によりコードされるポリペプチド、特に単離された哺乳類のドーパミンリセプター─好ましくはヒト起源のもの─に関する。本発明は更に、かかるリセプターの突然変異体又は変種、好ましくはリセプターから１又はより多くのアミノ酸が置換され、挿入され及び／又は除去されたもの、特にドーパミンリセプターの生物学的活性を保持している突然変異体にも関する。本発明はまた、抗体であって、好ましくは標識され、そして最も好ましくはモノクローナルであり、ドーパミンリセプター─好ましくはヒトのものである─のアミノ酸配列に結合することができるもの又はかかる抗体のフラグメントにも関する。
【００１０】
本発明は、上記の種々の産物の一、及び、典型的には、薬剤学的に許容し得る担体を含んでなる組成物に関し、並びに広範囲の効用のある結果を達成するためにこれらの産物を使用する方法にも関する。
【００１１】
図面の簡単な説明
本発明の種々の他の目的、態様及び付随する利点は、添付の図面と連結して考慮され一層よく理解されるときに一層完全に認識されるであろう。図において、図１ないし図７は、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列及びそれから導かれるラットのＤ2 ドーパミンリセプターのアミノ酸配列を示す。該核酸配列は、長い開環読み取りフレームの第１のメチオニンに始まる番号を付与されている。ヌクレオチド番号は、各行の右手末端におけるヌクレオチド配列の下に現れている。導かれるアミノ酸配列はヌクレオチド配列の上に示されている。二重下線は、５’非翻訳領域における小さい開環読み取りフレームを表す。仮定されるＮ−結合グリコシル化部位は、アスタリスクにより示されている。推定されるプロテインキナーゼＡリン酸化部位にはその上に線を引いてある。イントロンの繋ぎ接合は矢印で示されている。ポリＡアデニル化部位は下線が施されている。
【００１２】
図８は、ラットＤ2 ドーパミンリセプター、ハムスターβ2 −アドレナリンリセプター、ヒトα2 −アドレナリンリセプター、ヒトＧ−２１（セロトニン１ａ）リセプター、ブタのムスカリンＭリセプター及び牛のサブスタンスＫリセプターのアミノ酸配列の並びを示す。実線で囲み陰を付けたアミノ酸は、Ｄ2 ドーパミンリセプターと比較したとき少なくとも２つの他の配列において同一である残基を示している。推定される膜横断ドメインはメインはローマ数字で標識した括弧で示されている。変化しうる第３の細胞質ループ内の及びＣ末端における残基の数は括弧に入れてある。
【００１３】
図９は、ラットの脳及び下垂体におけるＲＧＢ−２トランスクリプトのＮｏｔｈｅｒｎブロット分析を示す。各レーンは２０μｇの全ＲＮＡを含有する。右の数字は、ＲＮＡサイズ標識（ＢＲＬ）で測定した分子量を示す。Ａ：臭球、Ｂ：海馬、Ｃ：小脳、Ｄ：口部皮質、Ｅ：前部皮質、Ｆ：視床、Ｇ：視床下部、Ｈ：髄質、Ｉ：扁桃体、Ｊ：中脳、Ｋ：中隔、Ｌ：後部基底神経節、Ｍ：前部基底神経節、Ｎ：下垂体神経性中葉、Ｏ：下垂体前葉
【００１４】
図１０〜１３は、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞からの膜に対する 3Ｈ−スピペロンの結合を示す。
【００１５】
ａ）１：Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞及びラット線条体から調製された膜に対する 3Ｈ−スピペロンの特異的結合を飽和等温線。４つの独立した実験からの結果を示す。（図１０）
２：データのスカッチャード分析。（図１１）
ｂ）Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜を用いた競合曲線。Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞からの膜における 3Ｈ−スピペロンの特異的結合の薬物による阻害を求めるための代表的な曲線を示す。各薬物は３回試験した。（図１２）
ｃ）Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１及びラット線条体に対するＫｉの表。結果は、種々の濃度の非標識薬物で０．５ｎＭの 3Ｈ−スピペロンを阻害した３つの実験の幾何平均である。いくつかの薬物にあっては、ラット線条体組織における阻害曲線は、２つのクラスの結合部位の存在を想定することによって最もよく当てはまった。阻害剤に対する高い又は低い親和性を有する結合部位の比率は括弧に示した。１０乃至２５％の特異的結合を示す結合部位クラスについてのＫｉ値は、放射性リガンドがＫｄ値１ｎＭでセロトニンリセプターに結合しているという仮定のもとに算定した。（図１３）
【００１６】
図１４は、図１〜７に示したアミノ酸配列び疎水性プロット、図１５はβ2 −アドレナリンリセプターのアミノ酸配列の疎水性プロットを示す。膜横断領域はローマ数字で印を付してある。
【００１７】
図１６〜２０は、図１〜７に示した核酸配列の２４７７塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限地図である。
【００１８】
図２１〜２３は、ヒトＤ2 ドーパミンリセプターの部分的配列を示し、示された中央のアミノ酸配列は正しいものである。
【００１９】
図２４は、ＬＺＲ１及びＬＺＲ２細胞に対する特異的な〔 3Ｈ〕スピペロン結合の飽和分析を示す。結果は、示してあるように、対照成長培養液または硫酸亜鉛を加えた培養液においてＬＺＲ１及びＬＺＲ２細胞を成長させた代表的な実験からのものである。データは、特異的に結合した放射性リガンドを遊離の放射性リガンドの補正した濃度で割った値を、特異的に結合した放射性リガンドに対してプロットしたものである。亜鉛処理のためには、成長培養液に１００μＭの硫酸亜鉛を１６時間加えた。対照細胞と亜鉛処理細胞の双方を、次いで洗浄しそして集める前に対照培養液で１日間成長させた。示した実験においては、対照のＬＺＲ１細胞又は亜鉛で処理したＬＺＲ１細胞についての、非線型回帰分析で決定したＢｍａｘ値は、それぞれ８７６及び９１４ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。対照の又は亜鉛処理したＬＲＺ２細胞のＢｍａｘ値は、それぞれ３８５及び５９３ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。
【００２０】
図２５〜２６は、アゴニストによる放射性リガンドの結合の阻害を示す。結果は、競合薬物の不存在下での特異的結合のパーセントとして表した特異的結合を、競合薬物の濃度の対数に対してプロットしたものである。膜は、次に記述するようにしてＬＲＺ１細胞から調製した。
【００２１】
Ａ．  アゴニストによる〔 3Ｈ〕スピペロンの結合の阻害を求めるために一回の実験からの曲線が示されている。各薬物は２回試験した。この実験においては、遊離の〔 3Ｈ〕スピロペリドール濃度は２３０ｐＭ、〔 3Ｈ〕スピロペリドールのＫD 値は６０ｐＭであった。この実験においては、Ｋ1 値及びＨｉｌｌ係数は、ブロモクリプチンについてはそれぞれ５ｎＭ及び１．０５、（−）３−ＰＰＰについては７９０ｍＭ及び０．８９、キンピロールについては８μＭ及び１．０、（＋）３−ＰＰＰに対しては３１μＭ及び１．０５、ＬＹ１８１９９０に対しては０．３ｍＭ及び０．７２であった。（図２５）
Ｂ．  〔 3Ｈ〕スピロペリドールの結合のＤＡによる阻害に対するＧＴＰ及びＮａＣｌの効果を測定した４つの独立した実験のうち１つの結果を示す。〔 3Ｈ〕スピロペリドールの濃度は３２３から４９８ｐＭであった。この実験においては、放射性リガンドの濃度は３２３ｐＭであった。白丸は０．１ｍＭのＧＴＰ及び１２０ｍＭのＮａＣｌの存在下でのＤＡによる阻害を表し、黒丸はＧＴＰ及びＮａＣｌの添加なしの場合の阻害を表す。この実験でのＩＣ50値及びＨｉｌｌ係数は、ＧＴＰ及びＮａＣｌの不存在下ではそれぞれ２９μＭ及び０．６５、存在下ではそれぞれ１１５μＭ及び１．０３であった。（図２６）
【００２２】
図２７〜２８は、ＬＺＲ１細胞におけるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害を示す。アゴニストが、ＬＺＲ１細胞から調製した膜におけるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害を求めるために試験された。各定量において５０乃至１００μｇの蛋白質が使用された。結果を、１０μＭのフォルスコリン存在下での全活性に対するパーセントとして表し、〔32Ｐ〕ｃＡＭＰ／ｍｇ蛋白質／分として示す。少なくとも各３回試験された６種の薬物について代表的な用量─作用曲線を示す。データは、酵素活性を薬物濃度の対数に対してプロットしたものである。阻害が何らみられないから、（−）３−ＰＰＰのデータについては曲線をプロットしていない。この図に示した実験においては、基準の及びフォルスコリンにより刺激された活性は、それぞれ約、０．８乃至１．５及び８．５乃至１５．８ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分であった。
【００２３】
図２９は、ＤＡ感受性アデニレートサイクラーゼの阻害を示す。結果は３つの実験の平均±ＳＥであり、１０μＭのフォルスコリン存在下における全活性のパーセントとしてプロットしてある。フォルスコリン（ＦＳＫ）は、示されているように、１０μＭのドーパミン（ＤＡ）又はＤＡ及び１０μＭの（＋）−ブタクラモール（ＢＵＴ）と共に、示した全ての実験において存在している。細胞のいくつかは、酵素活性の測定のために集める前に、百日咳トキシン（ＰＴ）で処理した。対照の基準活性及びＰＴ−処理細胞の活性は、それぞれ１．２±０．０７及び１．６±０．１５ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分であった。対照細胞における全フォルスコリン刺激活性（ＦＳＫ）は１１．９±１．０ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分であった。対平均に対してしたｔ−検定によると、対照細胞におけるＦＳＫとの比較は（＊）ｐ＜０．０５。
【００２４】
図３０〜３２は、百日咳トキシン処理によるドーパミン阻害の逆転を示す。膜アデニレートサイクラーゼ活性について下に掲げたデータは、平均（ｘ）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）及び％阻害（％Ｉｎｈ．）を示す。％阻害は方程式  １００×〔１−（Ｓ−Ｂ／Ｉ−ＢI ）〕から算出した。ここにおいて、Ｂ、Ｓ及びＩはそれぞれ、基準活性、刺激剤（Ｓ）又は阻害剤（Ｉ）の存在下での活性を示し、ＢI は阻害剤の存在下での基準活性を示す。結果は、対照と、百日咳トキシン（＋Ｐ．Ｔ．として示した）で前処理（１６時間、５０ｎｇ／ｍｌ）した細胞における、平行測定から得られた。
【００２５】
（Ａ）  アデニレートサイクラーゼ。  アデニレートサイクラーゼ測定用の膜は短時間１０μＭのフォルスコリン（ＦＳＫ）又は１００μＭのドーパミン（ＤＡ）に曝し、アデニレートサイクラーゼ活性は、ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分で表現した。（図３０）
（Ｂ）  細胞内ｃＡＭＰ。  細胞を短時間ＶＩＰ（２００ｎＭ）及びドーパミン（１μＭ）で処理し、ｃＡＭＰ蓄積量（ｐｍｏｌ／シャーレとして表現）を細胞抽出液にて測定した。（図３１）
（Ｃ）  細胞外ｃＡＭＰ。  同じ細胞のシャーレからの培養液サンプルよりｃＡＭＰを測定しｐｍｏｌ／シャーレで表した。（図３２）
【００２６】
図３３〜３６は、特異的ドーパミンＤ2 リセプターｍＲＮＡの表現及びＧＨ4 ＺＲ7 転換細胞における結合を示す。
（Ａ）  ＧＨ4 Ｃ1 細胞の全ＲＮＡ（２０μｇ／レーン）のＮｏｔｈｅｒｎブロット分析。  Ｙ軸はＲＮＡ分子量標準（ｋｂ）の移動を示す。（図３３）
（Ｂ）（１）  ＧＨ4 ＺＲ7 細胞より調製された膜への 3Ｈ−スピペロンの特異的結合が、飽和分析により特徴づけられた（実施例２「実験手順」を参照）。４つの独立した実験から得られたデータを、特異的に結合した放射性リガンド（縦座標）を補正した遊離の放射性リガンド濃度（全量引く全結合量）に対してプロットしてある。この実験ににおける算出されたＫD 及びＢｍａｘ値は、６０ｐＭ及び１１６５ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。（図３４）
（Ｂ）（２）  特異的結合／遊離（Ｙ軸）を 3Ｈ−スピペロンの特異的結合濃度（Ｘ軸）に対してプロットしたスキャッチャード法によるデータの変換。（図３５）
（Ｃ）ドーパミンによる特異的 3Ｈ−スピペロン結合の変位：  ＧＴＰ／ＮａＣｌの効果。ＧＨ4 ＺＲ7 細胞膜を、１００μＭＧＴＰ／１２０ｍＭＮａＣｌの不存在下（〇）又は存在下（・）にて、 3Ｈ−スピペロン（０．４７ｎＭ）及び示した濃度のドーパミン（Ｘ軸）と共にインキュベートした。結果は４つの実験のうちの１つである。示した実験におけるドーパミンについて算出されたＩＣ50及びＨｉｌｌ係数値は、ＧＴＰ／ＮａＣｌの不存在下では１６μＭ及び０．６１、ＧＴＰ／ＮａＣｌの存在下では５６μＭ及び０．８５であった。（図３６）
【００２７】
図３７〜３９は、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞における、ドーパミンによるｃＡＭＰの蓄積阻害及びＰＲＬの放出を示す。インキュベーションは、実施例２の「実験手順」に記述したように、３つ行った。
（Ａ）ドーパミンによる細胞外ｃＡＭＰ蓄積の阻害。  ＧＨ4 Ｃ1 及びＧＨ4 ＺＲ7 細胞の平行なシャーレを、種々の濃度のＶＩＰ、ドーパミン（Ｄ）並びに２５０ｎＭ、１０μＭ及び５μＭの（−）−スルピリド（−Ｓ）をそれぞれ加えてインキュベートした。無処理対照は「Ｃ」で表す。培養液は集められ、ｃＡＭＰを測定し、ｐｍｏｌ／シャーレ（縦座標）で表した。（図３７）
（Ｂ）ＧＨ4 ＺＲ7 細胞におけるドーパミンによる細胞内ｃＡＭＰの蓄積阻害。  細胞抽出液につきｃＡＭＰを測定し、縦座標に表した。薬物濃度は、（Ａ）におけると同様に、（＋）−スルピリドを除いて５μＭであった。（図３８）
（Ｃ）ＧＨ4 ＺＲ7 細胞における刺激されたＰＲＬ放出のドーパミンによる阻害。  示した処理の後、培養液サンプルにつきＰＲＬ（縦座標）を測定した。ＶＩＰ、ＴＨＲ、ドーパミン（Ｄ）及び（−）−スルピリド（−Ｓ）の濃度はそれぞれ２００ｎＭ，２００ｎＭ，１００ｎＭ及び２μＭであった。（図３９）
【００２８】
図４０〜４１は、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞における基準の及びＶＩＰ刺激ｃＡＭＰ蓄積のドーパミン阻害の用量−作用関係を示す。
（Ａ）示した各濃度のドーパミンの存在下における、細胞内（・）及び細胞外（〇）蓄積。  ドーパミンの不存在下において、基準のｃＡＭＰレベルは２２±６ｐｍｏｌ／シャーレ（細胞内）及び１２．４±０．６ｐｍｏｌ／シャーレ（細胞外）であった。ドーパミン作用のＥＣ50は４．９ｎＭ（細胞内）及び８．５ｎＭ（細胞外）であった。（図４０）
（Ｂ）各濃度のドーパミンの存在下における、細胞内（・）及び細胞外（〇）蓄積。ＶＩＰ（２５０ｎＭ）−刺激での細胞内及び細胞外ｃＡＭＰレベル（ドーパミンの不存在下において）は、それぞれ１４５±２．８ｐｍｏｌ／シャーレ及び１４６±２．８ｐｍｏｌ／シャーレ、であり基準ｃＡＭＰレベルは、それぞれ３５±１．６ｐｍｏｌ／シャーレ及び１５±０．２ｐｍｏｌ／シャーレであった。ドーパミン阻害のＥＣ50は５．５ｎＭ（細胞内）及び５．８ｎＭ（細胞外）であった。（図４１）
【００２９】
図４２は、ＶＩＰ−刺激ｃＡＭＰ蓄積のドーパミンによる阻害の特異的阻止を示している。ＧＨ4 ＺＲ7 細胞を、２５０ｎＭのＶＩＰ及び１００ｎＭのドーパミン、並びに示した濃度の種々のドーパミンアンタゴニストの存在下に、ＦＡＴ培養液（実施例２の「方法」参照）中でインキュベートし、細胞外ｃＡＭＰレベルを測定した。最大ｃＡＭＰレベルのパーセントを示した濃度のドーパミンアンタゴニストの対数に対してプロットしてデータとした。３つの定量の標準誤差は８％未満であった。基準の及びＶＩＰ−刺激ｃＡＭＰレベル（ドーパミン及びアンタゴニストの不存在下にて）は２５．８±１．６ｐｍｏｌ／シャーレ及び２１４±１４ｐｍｏｌ／シャーレであった。ドーパミン作用のアンタゴニストについてのＩＣ50及び推定Ｋｉ値は：スピペロン  ０．５６ｎＭ及び３０ｐＭ；  （＋）−ブタクラモール  ４．５ｎＭ及び０．２ｎＭ；  （−）−スルピリド  ３８ｎＭ及び１．８ｎＭ；  ＳＣＨ２３３９０  ＞１μＭ；  （−）−ブタクラモール  ＞１０μＭであった。推定ＫI 値は方程式  ＫI −ＩＣ50／（１＋（値ＤＡ〕／ＥＣ50））で算出された。ここにおいて、〔ＤＡ〕は１００ｎＭ及びドーパミンのＥＣ50は６ｎＭである。スピペロン、（＋）−ブタクラモール及び（−）−スルピリドのみ、基準ｃＡＭＰレベルを変化させなかった。
【００３０】
図４３〜４４は、ドーパミンＤ2 アゴニストによるアデニレートサイクラーゼの阻害を示す。アデニレートサイクラーゼ活性の阻害は１０μＭのフォルスコリンの存在下で測定した。全活性のパーセントとして表した酵素活性の３つ測定の平均を薬物濃度の対数に対してプロットしてデータとした。基準アデニレートサイクラーゼ活性の平均は４．６±０．２ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分であり、全フォルスコリン刺激活性は６３．８±０．２ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分であった。示した実験におけるＥＣ50値及び最大阻害は、ドーパミンについてはそれぞれ７９ｎＭ及び５７％、。キンピロールについては２００ｎＭ及び４９％、ブロモクリプチンにおいては５ｎＭ及び２３％、そして（＋）−３−ＰＰＰにおいては６００μＭ及び４０％であった。
【００３１】
図４５〜５４は、ヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの核酸配列を２番目の列に示す。導かれるアミノ酸配列は１番目の列に示してある。３番目の列はクローン化したラットｃＤＮＡ（文献９，実施例３）の核酸配列であり、それから導かれるアミノ酸配列のヒトドパミンＤ2 レセプター配列との違いが４番目の列に示されている。番号Ｉ−VII のボックスで囲んだ領域は推定される膜横断領域を表す。三角はエキソン／イントロンスプライシング接合を、ＤＮＡ配列中ピリオドで結んだ部分は存在しない塩基対部分を、アステリスクは可能性あるＮ−接合グリコシル化部位を示し、そしてタンパクキナーゼＡの標的にはアンダーラインを、ポリアデニル化信号には二重にアンダーラインを付してある。
【００３２】
図５５は、Ｌ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍ膜への〔 3Ｈ〕ドムペリドンの結合の競合曲線を示す。該放射性リガンドは、１ｎＭの濃度で使用され、特異的結合は１μＭの（＋）ブタクラモールを用いて決定した。データは３つの実験のうち１つを示してある。
【００３３】
図５６は、ヒトゲノムＤＮＡのＳｏｕｔｈｅｒｎブロットを示す。エキソン７を含んでいるゲノムＢａｍＨＩ  １．６−ｋｂフラグメントは、λＨＤ２Ｇ１から調製されプローブとして使用される（特異的活性、２×１０8 ｃｐｍ）。ＤＮＡは、ＢａｍＨＩ（レーン１）、Ｂｇ１ＩＩ（レーン２）、ＢａｍＨＩ／Ｂｇ１ＩＩ（レーン３）及びＨｉｎｄＩＩＩ（レーン４）で消化した。
【００３４】
図５７は、ヒトドーパミンＤ2 リセプター遺伝子及び下垂体ｃＤＮＡの概念的表現である。
（ａ）２つの重複するゲノム相、λｈＤ２Ｇ１及びλｈＤ２Ｇ２；  Ａ，ＡｐａＬＩ；  Ｂ，ＢａｍＨＩ；  Ｂｇ，Ｂｇ１ＩＩ；  Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩの制限地図。
（ｂ）ヒト遺伝子ローカスＤＲＤ２の図。  箱によって示されたエクソンに番号が付されている。実線の箱はコードしている配列を示し、開いた箱は翻訳されない配列を示す。ゲノムの配列決定の戦略が遺伝上にも拡張される。これらの領域は一定のスケールでは描かれていない。ＤＮＡ配列（＋はセンス配列を、−はアンチセンス配列を示す）は、各梯子を下から上へと矢印によって示された方向へと読まれる（右を指して、５’から３’へそして左を指して、３’から５’へと）。８７−ｂｐエキソンは５番である。イントロンのサイズはＳｏｕｔｈｅｒｎブロッティングと制限地図により決定され、一つの例外を除いて１０パーセント以内の正確さを有している：  すなわち、イントロン１は２０パーセント以内の正確さである。
（ｃ）ヒト下垂体ｃＤＮＡの構造。  エキソン／イントロン繋ぎ接合が三角形により示されている。膜横断領域をコードしている領域Ｉ−ＶＩＩは波線を含んだ箱によって囲まれている。８７−ｂｐ配列には斜線を付してある。翻訳開始部位（ＡＴＧ）及び終止部位（ＴＡＧ）は、ポリアデニル化信号配列（ＡＡＴＡＡＡＡ）と同様に示されている。
【００３５】
図５８は、Ｌ−ｈＰｉｔＤ２Ｚｅｍ，Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ１及びラット線条体のＩＣ50値（ｎＭ）の比較を示している。
【００３６】
図５９は、ヒトドーパミンＤ2 リセプター遺伝子におけるエキソン／イントロン接合を示している。
【００３７】
考察
本発明は、Ｇ蛋白質に結合するリセプターをコードする遺伝子ファミリー各々間の核酸配列の類似性を独特な方法で利用したものである。ハイブリッド形成プローブとして独特なハムスターβ2 −アドレナリンリセプター（β2 ＡＲ）遺伝子を使用することにより、ラットのＤ2 ドーパミンリセプターをコードしているｃＤＮＡが同定され単離された。該リセプターは、３つの基準のもとに特徴づけられる：  １）Ｇ蛋白質結合受容体のファミリーのメンバーであることが明らかである誘導アミノ酸配列、２）Ｄ2 ドーパミンリセプターに知られているのと平行した対応するｍＲＮＡの組織分布、及び、３）該ｃＤＮＡで形質転換されたＬｔｋ−細胞の薬理学的な性質。
【００３８】
ラットのゲノムライブラリーは、ハムスターのβ2 ＡＲ遺伝子のコード領域の大部分を含むｎｉｃｋ−翻訳１．３ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントによって緩和なハイブリッド化の条件下でスクリーンされた。ハムスターβ2 ＡＲリセプター遺伝子は、部分的なハムスター肺λｇｔ１０ゲノムＤＮＡライブラリー（サイズ分画された（５−７ｋｂ）ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡ）から、Ｄｉｘｏｎ等（９）の配列から設計された２つのオリゴヌクレオチドプローブ（３０−ｍｅｒ，ＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＧＴＣＧＧ；  ４０−ｍｅｒ，ＣＴＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＴ）によってクローン化される。その遺伝子のコード配列の大部分を含むハムスターβ2 ＡＲ遺伝子の１．３ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、ｎｉｃｋ翻訳によって標識され、市販のファージＥＭＢＬ３におけるラットゲノムＤＮＡライブラリーを探索するのに使用される。該ライブラリーは、コロニープラークスクリーンフィルター（ＮＥＮ）に移され、次のハイブリッド化条件下を用いて32Ｐ標識プローブでスクリーンされる：２５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ，０．１％ピロリン酸ナトリウム、１％ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）、３７℃。フィルターは２×ＳＣＣで及び０．１％ＳＤＳで５５℃にて洗浄した。
【００３９】
これらの条件を用いると数種のクローンがハムスタープローブにハイブリッド化することが見出された。ＲＧＢ−２と呼ばれる一つのクローンは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロット分析においてハムスターβ2 ＡＲプローブとハイブリッドとなる０．８ｋｂ  ＥｃｏＥＩ−ＰｓｔＩフラグメントを有することが見出された。このフラグメントは配列決定され、ハムスターβ2 ＡＲの膜横断領域ＶＩＩの核酸配列に高度の同一性（４０塩基中３２）を有する核酸鎖を有することが示された。可能な読み取りフレームの一つは、ハムスターβ2 ＡＲの膜横断領域ＶＩ及びＶＩＩのアミノ酸配列に有意な類似性を示した。このゲノムフラグメント内に、３’イントロン繋ぎ部位（１０）及び４００ｂｐの推定されるイントロン配列がある。
【００４０】
０．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメント（ｎｉｃｋ翻訳）が、５０％のホルムアミドを使用する以外は上記と同じハイブリッド化条件で、λｇｔ１０中のラット脳ｃＤＮＡライブラリーを探索するのに用いられた。フィルターの洗浄は０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＤＳＤにて６５℃で行った。これらの高度に厳しいハイブリッド化条件のもとで、サイズ約２．５ｋｂの２つの明らかなクローンが、５００，０００クローンのライブラリーの中から同定された。両方の鎖から、シーケネース（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いたＳａｎｇｅｒジデオキシチェーン決定法により、ＤＮＡ配列が得られた（２６）。配列と制限分析とが、これら２つのクローンが単一のクローンのレプリカであり、プローブとして使用されたゲノムフラグメントの配列を含むものであることを示した。ラットの脳から単離されたｍＲＮＡのＮｏｒｔｈｅｒｎブロット分析においてＲＧＢ−２  ｃＤＮＡが使用されたときには、約２．５ｋｂの帯が検出された。この発見は、ＲＧＢ−２クローンが殆ど完全な長さのものであることを示すものであった。
【００４１】
図１〜７は、ＲＧＢ−２  ｃＤＮＡの２４４５塩基の核酸配列を示す。４１５アミノ酸蛋白質（相対的分子量（Ｍｒ＝４７０６４））のｃＤＮＡコードにおける最長の開いた読み取りフレームはまた、該図に示されている。この分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定されたＤ2 リセプターのグリコシル化型について報告されている（１１）のと近似している。推定開始部位から３６塩基上流にあるフレーム内ジペプチドがＲＧＢ−２  ｃＤＮＡの５’非翻訳領域に見出される。小さな開いた読み取りフレームがβ2 ＡＲ  ｍＲＮＡの５’非翻訳配列に認められる（９）。
【００４２】
ＲＧＢ−２  ｃＤＮＡから導かれる蛋白質の数種の構造的特徴が、それがＧ蛋白質結合リセプターのファミリーに属することを示している。蛋白質配列の疎水性プロット（図１４〜１５）が、７つの膜横断領域（８）を表し得る７本の疎水性アミノ酸の鎖の存在を示している。更に、ＲＧＢ−２の一次アミノ酸配列は、他のＧ蛋白質結合リセプターと高度の類似性を示している（図８）。最大のアミノ酸同一性は推定される膜横断領域の内部に集まっている。これらの領域の内部において、ＲＧＢ−２蛋白質は、ヒトα2 −アドレナリンリセプター（１２）とは５０％、ヒトＧ−２１リセプター（１３）とは４２％、ハムスターβ2 ＡＲ−アドレナリンリセプター（９）とは３８％、ブタＭ1 リセプター（１４）とは２７％、及びウシｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｋ−リセプター（１５）とは２５％、の同一性を有している。
【００４３】
第３に、ＲＧＢ−２は、Ｇ蛋白質結合リセプターのファミリーのメンバーに共通ないくつかの構造的特徴を有している。信号配列を有しないＮ末端にＮ結合グリコシル化のための３個の一致配列がある。膜横断領域ＩＩに見出されるＡｓｐ８０は、全ての知られているＧ蛋白質結合リセプターにおいて保たれている。膜横断領域ＩＩＩには、Ａｓｐ１１４があり、それには陽イオン性アミン類に結合するリセプターにのみ見出されるＡｓｐ残基が対応する（１６）。リン酸化が、リセプター機能を制御する手段として提案されてきた（１７）。プロテインキナーゼＡによるリン酸化の潜在的部位は、第３の細胞質ループにあるＳｅｒ２２８に存在する。ロドプシンとβ−アドレナリンリセプターのＣ末端部分には、リセプターキナーゼ類の潜在的基質である多くのＳｅｒ及びＴｈｒ残基が見出される（１８）。これに対し、ＲＧＢ−２の短いＣ末端はＳｅｒ及びＴｈｒ残基を有しない。しかし、α2 −アドレナリンリセプターの場合のように、ＲＧＢ−２はリン酸化基質として役立ち得る第３の細胞質ループに多くのＳｅｒ及びＴｈｒ残基（２２残基）を有する。ＲＧＢ−２は、膜横断領域ＶとＶＩとの間に、短いＣ末端（１４アミノ酸）を伴った大きな細胞質ループ（１３５アミノ酸）を含む。この構造組織は、β2 −アドレナリンリセプターやＭ2 ムスカリンリセプターのようなＧI （阻害的ＧI 蛋白質）によって結合される他のリセプターに近似している。アドレナリンリセプター及びムスカリンリセプターのファミリーとは異なり、ＲＧＢ−２遺伝子は、膜横断領域ＶＩに位置するコード配列に少なくとも１つのイントロンを有する。
【００４４】
ＲＧＢ−２の同定に向けた最初の段階として、ＲＧＢ−２ｍＲＮＡの組織分布がＮｏｒｔｈｅｒｎブロット分析で試験された（図９）。
【００４５】
雄性のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから脳組織が切り取られ、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等（２７）及びＵｌｌｒｉｃｈ等（２８）に従ってＲＮＡが単離された。Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロットには、ＲＮＡはグリオキサール及びＤＭＳＯを用いて変性し、そして１．２％アガロースゲル上で展開した。電気泳動の後、ＲＮＡはナイロン膜上にブロットし（Ｎ−Ｂｏｎｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）、８０℃で２時間焼付けた。膜は、５０％ホルムアミド、０．２％ＰＶＰ（Ｍ．Ｗ．４０，０００）、０．２％ｆｉｃｏｌ（Ｍ．Ｗ．４００，０００）、ｐＨ７．５の０．０５％トリス、１ＭのＮａＣｌ、０．１％ＰＰｉ、１％ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）中で４２℃にて１６時間、前ハイブリッド化した。ＲＧＢ−２の１．６ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントでこのクローンのコード領域を含むものから製したランダムに標識した32Ｐ−標識フラグメント（１−２  １０8 ｄｐｍ／μｇ）が、４２℃で終夜該フィルターを探索するために、上記で得たハイブリッド化溶液中で１０7 ｄｐｍ／ｍｌの濃度で使用された。ブロットは２ｘ  ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで６５℃１０分間にて２回、０．５ｘ  ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにて室温１５分間にて２回、そして０．１ｘ  ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにて６５℃１５分間にて１回、洗浄した。ブロットは増感スクリーンを有するＸ線フィルムに−７０℃にて終夜曝した。
【００４６】
ＲＧＢ─２のｍＲＮＡは、ラット脳の種々の領域で異なったレベルに表現されるが、基底神経節が最も高い濃度を示す。更に、ＲＧＢ−２のｍＲＮＡは、ラットの下垂体神経性中葉に高濃度に見出され、この腺の前葉には少ない程度にした見出されない。ＲＧＢ−２のｍＲＮＡの表現パターンは、組織標本でのリセプターオートラジオグラフィー及び結合研究によって決定されたＤ2 ドーパミンリセプターの分布と著しく近似している。
ＲＧＢ−２によりコードされるリセプターの薬理学的特徴を研究するために、ｃＤＮＡが親核細胞にて表現された。全ＲＧＢ−２  ｃＤＮＡが：マウスのメタロチオネインプロモーター（２１）からの転写を開始させるユーカリオート表現ベクターｐＺｅｍ３（２０）中にクローン化された。このプラスミドは、選択的ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ｐＲＳＶｎｅｏ）と共に、標準ＣａＰＯ4 沈澱技術（２１）によりＬｔｋ−マウス繊維芽細胞ライン中に同時トランスフェクトされた。細胞は、３５０μｇ／ｍｌのＧ４１８中で選別された。トランスフェクト体は分離され、Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロット分析により、ＲＧＢ−２  ｍＲＮＡの表現の有無が試験された。ＲＧＢ−２に指令されたＬ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１を表現している細胞ラインが単離された。ＲＧＢ−２  ｍＲＮＡは親Ｌｔｋ−細胞ラインには検出されなかった。
ＲＧＢ−２  ｍＲＮＡがＤ2 ドーパミンリセプターに期待される組織分布を示したことから、Ｄ2 リガンド 3Ｈ−スピペロンを用いて、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞ライン、自然のＬｔｋ−細胞及びラット線条体につき薬理学的研究が行われた。
膜は、細胞を４℃にて０．２５Ｍ蔗糖、ｐＨ７．４の２５ｍＭトリス、６ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でＤｏｕｎｃｅホモジナイザーで細胞をホモジナイズすることにより調製した。ホモジナイズした溶液は８００×ｇで１０分間遠心し、そしてペレットは前記と同様にホモジナイズし遠心した。上澄は集められ、２００，０００×ｇで１時間遠心された。この遠心のペレットは、２５ｍＭのｐＨ７．４のトリス、６ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＥＤＴＡ中で、約２５０μｇ蛋白質／ｍｌの濃度に再懸濁され、少量ずつ−７０℃にて保存された。放射性リガンドの結合測定は、２ｍｌ（飽和分析）又は１ｍｌ（阻害曲線）で各２つ行われた。液は（最終濃度として）次のものを含む：５０ｍＭのｐＨ７．４のトリス、０．９％塩化ナトリウム、０．０２５％アスコルビン酸、０．００１％牛血清アルブミン、 3Ｈ−スピペロン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，９５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び適当な薬物。いくつかの実験においては、１００μＭのグアノシン５’−トリフォスフェートが含まれた。（＋）−ブタクラモール（２μＭ）が、非特異的結合を明らかにするために使用された。各測定において、インキュベーションは、１５−４０μｇの蛋白質の添加により開始され、３７℃で５０分間行われ、１０ｍｌの氷冷洗浄用緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４及び０．９％塩化ナトリウム）の添加によって停止された。サンプルは、硝子繊維フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ  Ｎｏ．３０）にて濾過され、追加の１０ｍｌの洗浄用緩衝液にて洗浄された。フィルター上に保持された放射活性は、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ  １７０１シンチレーションカウンターを用いてカウントされた。データは、データ解析プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒを用いて描く以外は、前記（２９）の通りにして解析された。得られたＩＣ50値は、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆ（３０）の方法によりＫi 値へと変換された。
【００４７】
対照Ｌｔｋ−細胞から調製された膜は、 3Ｈ−スピペロンの、（＋）−ブタクラモール−又はスルピリド置換性の結合を示さなかった。Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞から調製した膜への 3Ｈ−スピペロンの結合は、Ｋｄ値４８ｐＭ（図１０）で飽和した。この値は、平行実験におけるラット線条体膜はの 3Ｈ−スピペロンの結合において観察されたもの（５２ｐＭ）と一致する。図１０に示した実験において、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１から調製された膜についてのＫｄ及びＢｍａｘ値は、４０ｐｍ及び８７６ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であり、一方、線条体膜の対応する値は３７ｐｍ及び５４７ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。結合部位の濃度は、４つの実験で測定したところでは、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜においては９４５ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質及びラット線条体膜においては４５４ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。
【００４８】
Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞からの膜への 3Ｈ−スピペロンの結合は、多くの薬物により阻害され、得られたＫi 値は線条体膜を用いて得られたものとよく一致した（図１２，１３）。Ｄ2 アゴニストである（＋）−ブタクラモール及びハロペリドールは、最も強い阻害剤であり、スルピリドがこれに続いた。Ｄ1 ドーパミンアンタゴニストであるＳＣＨ２３３９０及びセロトニン５ＨＴ2 アンタゴニストであるケタンセリンは、 3Ｈ−スピペロン結合の阻止力がずっと弱かった。結合の阻害において（＋）−ブタクラモールが（−）−ブタクラモールよりずっと強かったことから、結合は立体選択性を有するものと思われた。これらの実験においては、ドーパミンアンタゴニストの絶対的親和性と薬物の強さの序列（スピペロン＞ハロペリドール＞スルピリド＞＞（−）−ブタクラモール）は、前に公表されたＤ2 ドーパミンリセプターの値（２）とよく一致している
Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜の全ての結合データは、単一のクラスの結合部位の存在を想定することにより最も良く当てはまった。他方、ラット線条体膜への 3Ｈ−スピペロンの結合の数種の薬物による阻害は、２つのクラスの結合部位の存在を想定することにより最もよく当てはまった。こうして、ＳＣＨ２３３９０及びケタンセリンは、ラット線条体膜への 3Ｈ−スピペロンの結合の１０−２０％を高い親和性をもって阻害した（図１３）。ラット線条体膜においては、スルピリドによる放射性リガンドの結合の阻害は、１つのクラスの結合部位により最もよく当てはまったが、（＋）−ブタクラモール置換性結合の１０−１５％は、使用した濃度のスルピリドでは阻害されなかった。ケタンセリン及びＳＣＨ２３３９０に高い親和性を有し且つスルピリドによっては置換されない結合部位は、ラット線条体膜の５ＴＨ2 セロトニンリセプターへの 3Ｈ−スピペロンの結合を示しているものと思われる。５ＴＨ2 リセプターへのＳＣＨ２３３９０の結合は既に記述されている（２２）。ラット線条体膜においては、Ｄ2 ドーパミンリセプター─８０乃至９０％の 3Ｈ−スピペロン結合を含んでなるクラスの結合部位─についての薬物の見かけの親和性は、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞から調製するされた膜への薬物の見かけの親和性と区別のつかないものであった（図１３）。
【００４９】
Ｄ2 ドーパミンリセプターの刺激の生理学的効果は、Ｇi により仲介されるように見える。ＧＴＰによるＤ2 ドーパミンリセプターへのアゴニストの結合の阻害は、アゴニストに対して高い親和性を有するリセプターＧi 複合体のＧＴＰ−誘導性の解離（２３、２４）によるものと考えられる。 3Ｈ−スピペロン結合がＫi 値１７μｍにてＬ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜において阻害されたとはいえ、このドーパミン結合は追加のＧＴＰには反応しなかった。しかしこの知見は、報告されているＬ細胞におけるＧi の欠如（２５）と符合している。ここに提示した薬理学的データは、Ｄ2 ドーパミンリセプターの結合特性がＲＧＢ−２  ｃＤＮＡを表現しているＬｔｋ−細胞において見出されたことを証明している。
【００５０】
前述のデータは、ＲＧＢ−２  ｃＤＮＡが、親核細胞にトランスフェクトされたとき、Ｄ2 ドーパミン結合蛋白質の表現を指令することを示している。このｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡがＤ2 ドーパミンリセプターの存在が知られている組織に局在していることから、そして、このｍＲＮＡがＧ蛋白質結合リセプターの全ての予期される特徴を有する蛋白質をコードすることから、ＲＧＢ−２はラットＤ2 ドーパミンリセプターのクローンである。
【００５１】
図１〜７に示した核酸配列は、例えばＥｃｏＲＩ部位又は他の適当な部位を用いて、広範な種類の通常のそして好ましくは市販のプラスミドに挿入することができる。図１６〜２０は、図１〜７の配列の制限地図である。
【００５２】
この開示に基づく本発明のドーパミンリセプター遺伝子、特に哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセプター遺伝子は、多くの通常の方法をもちいて今や日常的に製造し、単離し及び／又はクローン化することができる。例えば、ここに開示した手順は、ドーパミンリセプターＤＮＡ配列を含むライブラリーについて実質的に反復することができる。代わりに、ドーパミンリセプター遺伝子、特にヒトドーパミンＤ2 リセプター遺伝子、に選択的なオリゴヌクレオチドのプローブが、例えば図１の配列及び／又は省略されたイントロンから、日常的に設計され得る。これらは、ドーパミンリセプター核酸配列を含む核酸ライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。該プローブ、特にそのようなプローブの複数（例えば２又は３）の全て、にハイブリッドするこれらのライブラリーにおける配列は、高い確率をもって本発明のＤＮＡ配列であろう。無論、通常の方法を用いて図１〜７又はそのいかなるフラグメントの配列をも合成することが可能である。
【００５３】
本発明はまた、広範囲にわたる有用な産物の製造及び広範囲にわたる種々の有用な方法の使用を可能にし、並びにドーパミンリセプターの研究及び制御のための基礎的な道具を提供する。
【００５４】
これら産物及び方法は、よく知られた組み換えＤＮＡ、免疫化学的な及びその他のバイオテクノロジー産業の方法を用いて、それぞれ生産され及び実施されることができる。次を参照のこと：  米国特許第４２３７２２４号、米国特許第４２６４７３１号、米国特許第４２７３８７５号、米国特許第４２９３６５２号、ヨーロッパ特許第０９３６１９号、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８６）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｅｄｓ．），（１９８７）．
【００５５】
本発明は、第一に、ドーパミンＤ2 リセプターの１次アミノ酸配列の全て並びにその生物学的性質を有する、精製され及び単離されたポリペプチド産物を提供する。それは次のものを含む：  リン酸化及びグリコシル化のような共有結合的修飾のための全ての部位、機能的蛋白質の２次、３次及び４次構造を決定する全ての１次アミノ酸配列、抗原性及び抗体結合部位を提供する全ての分子部分、資質、炭水化物、及び蛋白質例えばグアニンヌクレオチド結合調節蛋白質のような他の生物学的分子との非共有結合的相互作用を提供する全ての蛋白質部分、アゴニスト、部分的アゴニストおよびアンタゴニストその他のリガンドへの結合部位を形成する全蛋白質部分、脱感作のような正常な生物学的活性に含まれる機能的なコンフォメーション変化のために必要な全蛋白質部分、及びこのリセプターの遺伝子のそのたの繋ぎにより生じ得る全蛋白質。
【００５６】
これらのポリペプチドは、例えば培養した細菌、酵母又は哺乳類細胞のような、原核又は親核ホストにより、完全に慣用の形質転換又はトランスフェクション（例えば哺乳類細胞ではリン酸カルシウムによる）技術を用いて、本発明の核酸から表現させることができる。脊椎動物（例えば哺乳類及び鳥類）細胞におけるそのような表現の産物は、自然の形態では関連するであろう他のヒト例えば又は夾雑物を含まないものとして得られるという点において、特に有利である。表現のための好ましいホストは、哺乳類でありこれは例えば、マウスＬｋｔ細胞、ハムスターＣＨＯ細胞、マウスＧＨ4 細胞、マウスＣ6 細胞、マウス／ラットＮＧ１０８−１５細胞及びマウスＡｔＴ２０細胞を含む。例えば、図１〜７の遺伝子が市販の成長ホルモンＧＨ4 細胞にトランスフェクトされると、ｃＡＭＰセカンドメッセンジャー系が調節されるのが認められた。好ましいベクターには、ｐＺｅｍ又はｐＲＳＶ又はワクチニアウイルス及びレトロウイルスのようなウイルスのベクターが含まれる。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、例えばグリコシル化及び非グリコシル化形態の双方の全ての可能な変種を含む。含まれる特定の炭水化物は、表現のために使用した哺乳類又は他の親核細胞に依存するであろう。本発明のポリペプチドはまた、先頭メチオニンアミノ酸残基を含むこともできる。
【００５８】
更に本発明には、合成的又は他の方法で、図１〜７のアミノ酸配列及び／又は本発明のドーパミンリセプター自身を複製した、又はこれを部分的にのみ複製した、ポリペプチドも含まれる。これら全体または部分的に複製したポリペプチドは、好ましくはまた、ドーパミンリセプター自身の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するであろう。更に本発明の範囲には、そのようなポリペプチドと免疫学的に反応性のあるモノクローナルまたはポリクローナル抗体（慣用の技術で生産され好ましくは標識された）をも含む。
【００５９】
好ましい部分的ポリペプチド（フラグメント）は図８に示した疎水性膜横断領域Ｖ，ＶＩ及びＶＩＩに位置する配列の一部を少なくとも含むものである。これらは、リガンド結合部位、特に領域ＶＩＩの位置に近似している。第３の細胞質ループもまた重要なフラグメント領域である。すなわち例えばＧ−蛋白質結合はこの領域及び領域Ｖ及びＶＩを必要とする。特定の領域リセプターに高度に選択的な抗体を得たい場合には、そのような抗体を生産するフラグメントが、膜横断領域Ｖ及びＶＩの間の高度に特徴的な領域、すなわちいずれも他のリセプターとは相同性が低いものである第３の細胞質ループ、又はＣ末端領域が選別され及び／又はこれらの領域にあるエピトープに特異的な抗体が選別されるであろう。他のリセプター／遺伝子の特異的領域は、イントロン配列、例えば上記のＲＧＢ−２の領域である。合成された特に好ましいペプチドは（図１〜７のアミノ酸番号を参照して）：（Ａ）２−１３；（Ｂ）１８２−１９２；（Ｃ）２６４−２７７；（Ｄ）２８７−２９８；及び（Ｅ）４０４−４１４である。これらは次の原理に基づいて選別される。すなわち、大きな数のＰｒｏ残基（Ｂ／Ｃ／Ｄ）を含むペプチドの知られた抗原性、Ｎ及びＣ末端（Ａ）及び（Ｅ）のカバリッジ、リセプター反応をブロックするに効果的な細胞外領域（リセプター反応領域）に抗体を向かわせる能力（Ａ／Ｃ／Ｄ）。これらフラグメントに対する抗体、例えば完全に慣用のハイブリドーマ技術によるモノクローナル抗体、は慣用の方法で作られる。
【００６０】
本発明はまた、  ドーパミンリセプター全体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列、並びに、そのような全体又は部分的配列を含んだ表現ベクター（例えばウイルス及び環状プラスミドベクター）にも関するものである。同様に、ホスト（例えば細菌、酵母及び哺乳類）又はそのようなベクターで形質転換され又はトランスフェクトされた細胞も含まれる。そのようなベクターにある配列に対応するポリペプチドを表現させる対応した方法もまた含まれるが、それらは例えば、外因性配列の大きい規模での表現のための及び例えば成長培養液、細胞溶解液又は細胞膜分画からのポリペプチドの単離のための、適当な条件のもとで形質転換され又はトランスフェクト細胞を培養することを含んでなるものである。
【００６１】
本発明のＤＮＡ配列はまた、ここに記述された自然の配列と異なるポリペプチドの変種、突然変異又は類縁体をコードするものをも含む。そのような相違は、自然の配列から１又はより多くのアミノ酸残基を除去することにより、そのような残基を置換することにより及び／又は自然の配列に１又はより多くのアミノ酸残基を加える添加により、誘導することができる。好ましくは、得られる修飾されたポリペプチドはドーパミンリセプターの生物学的又は免疫学的活性のうち少なくとも１つを保持するであろう。
ドーパミン親和性活性に影響を及ぼしそうな突然変異は、膜横断領域Ｖ，ＶＩ若しくはＶＩＩにおける又は第３の細胞質ループにおけるものであろう。加えて、ＤＮＡ配列はまた、ここにおいて述べられた、特に各図にて示した、他のＤＮＡ鎖のいかなる相補的な配列をも含む。すなわち、典型的にはここに述べたハイブリッド化条件下にて若しくはより激しい条件下にてここに述べたＤＮＡ配列にハイブリッドする又はそのようなＤＮＡ配列のフラグメントとハイブリッドするＤＮＡ配列、及び遺伝子コードの変性によりここに示したものと異なっているＤＮＡ配列。こうして、本発明は、ドーパミンリセプターをコードし及びここに示した配列の１又はより多くのものとハイブリッドする全てのＤＮＡ配列を含む。これらには、対立変種及びここに記述した実験にて述べた種以外の哺乳類からのドーパミンリセプターが含まれる。ｃＤＮＡ又はゲノムドーパミンリセプターＤＮＡの修飾は、部位指向性の突然変異技術を含むよく知られた技術により容易に達成することができる。そのような修飾されたＤＮＡ配列は、ドーパミンリセプターの生物学的活性の保持が望まれる場合には例えば膜横断領域Ｖ、ＶＩ若しくはＶＩＩや第３の細胞質ループではない選ばれた領域おいてなされた、除去、付加及び／又は置換を含むことができる。前述の生物学的活性及び／又は対応するＤＮＡ配列を保持しない修飾された蛋白質もまた、例えば本発明の種々の測定において、有用であろう。そのような特に好ましいものにおいては、膜横断領域Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ又は第３の細胞質ループは、配列の修飾により除去又は不活化されるであろう。グリコシル化部位の除去もまた、例えば酵母細胞におけるポリペプチドの表現のためには有用な変種である。
【００６２】
上記のように、ドーパミンリセプターをコードするＤＮＡ配列のかなりの部分が種々の哺乳類種で保存されているということが確立されている。従って、日常的な実験を用いるのみで、熟練した当業者は、５’側、図１〜７に示したイントロン性及び構造遺伝子配列並びに図２１〜２３に示したヒト配列を含むここに示した配列の詳細に従って製造されたプローブを用いて、他のドーパミンリセプター遺伝子特にＤ2 ドーパミンリセプターの存在を求めて、例えば与えられた哺乳類からのＤＮＡゲノムライブラリー又は好ましくはｃＤＮＡライブラリーを、容易にスクリーニングすることができる。プローブは好ましくは、図８に示した７つの高度に保存された膜横断領域、好ましくは領域ＶＩ及びＶＩＩ、から選ばれるであろう。そのような日常的スクリーニングは、プローブとハイブリッドするクローンを同定するであろう。これらから、ここに記述した技術を用いてドーパミンリセプターは日常的に選別されることができる。ヒトＤ2 ドーパミンリセプターに関しては、特に有用な原料としては、ｃＤＮＡには線条体、下垂体、神経芽細胞種、腎臓、胎盤細胞等が、ゲノムＤＮＡには肝臓、胎盤細胞等が含まれる。例えば赤毛ザルのような霊長類に関しては、特に有用なゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーとしては、脳、腎臓及び胎盤細胞が含まれる。
【００６３】
ヒトＤ2 ドーパミンリセプター遺伝子に関しては、図２１〜２３に示した部分的配列は、λｇｔ１０中のラット脳ｃＤＮＡの０．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントによる探索のための上記の激しいハイブリッド化条件の下で、全長ラットｃＤＮＡ、ＲＧＢ−２であるプローブを用いて下垂体ｃＤＮＡライブラリーを慣用によりスクリーニングすることによって同定された。ここに述べたｃＤＮＡライブラリーは、例えば上に引用した、例えばＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．の参考文献に記載されたような、完全に慣用の方法により調製することができる。この配列又はそのフラグメントもまた、ヒトドーパミンリセプター遺伝子を求めて上記の及び他の全く慣用の手順に従って、例えば上記の慣用のライブラリーをスクリーニングするために、プローブとして有用であり得る。図２１〜２３の配列と図１〜８に示した配列とを比較すればわかるように、図２１〜２３の部分的なヒトの配列は、図１〜７の第２５９番のアミノ酸に始まるＲＧＢ−２と高い相同性を有している。
【００６４】
同様に、本発明はより一般的に、最も広い意味における哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセプター遺伝子、例えばそのような調節及び構造遺伝子を、例えば読み取りフレーム中に、単体で又は組み合わせで、含むものである。例えば、ここに論ずる日常的な方法を用いて、そのような遺伝子が哺乳類ＤＮＡライブラリーからクローン化されてきたし、またそうされ得る。同様に、本発明は、生物学的に活性なそのような遺伝子のフラグメント、例えば哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセプターの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするフラグメント、又はそのようなコードするフラグメントの表現を調節するのに有用なフラグメント、又は、例えばそれとハイブリッドさせることにより、そのような遺伝子若しくはフラグメントのためのプローブとして有用なフラグメント、を含む。
【００６５】
本発明の種々のポリペプチド及び配列は、検出マーカー物質、典型的には共有結合により、及び更に典型的には放射性標識により、又はＤＮＡの場合にはビオチンのような非同位体標識により、慣用のように標識することができる。該ポリペプチド産物（例えば標識抗体）は、種々のサンプル中のドーパミンリセプターの存在の検出及び定量のために慣用の方法で使用することができる。すなわち、該標識ＤＮＡ産物は、通常のハイブリッド法（例えばＮｏｒｔｈｅｒブロット、Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロット、スポットアッセイ等）において、例えば、種々の哺乳類染色体地図におけるドーパミン遺伝子の位置をつきとめるため、標準レベルに比較してｍＲＮＡ又はリセプター濃度が異常に高い又は低いか否かを測定するため等の目的に、サンプル中の関連核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の存在を検出し及び定量するため、慣用の方法で使用することができる。それらはまた、やはり全く慣用の手順を用いて、例えば染色体異常を検出する等のため、例えばＲＦＬＰ分析（例えばＧｅｎｅｓ  ＩＩＩ，Ｌｅｖｉｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８７）を参照）を用いて、与えられた患者からのＤＮＡサンプルに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏの診断にてドーパミンリセプター遺伝子異常を同定するために、有用であろう。例えば、ドーパミンリセプターが精神分裂症に関与することが言われれいることから、本発明の産物及び方法は、精神分裂症の患者からの核酸を例えばサイズ分画形態で特徴づけ、とりわけ患者を精神分裂症サブグループに分類し、標準ＤＮＡ分画列との比較に基づき診断する等のために、使用することができる。無論、それらはまた、ヒト又は他の哺乳類ゲノムのマッピングにおいて、随伴する遺伝子を、例えばＲＦＬＰ分析及び適用しうるときは他の異常の分析において、同定するための遺伝子マーカーとして使用することもできる。上に論じた遺伝子の特徴的領域、例えばイントロン領域、第３の細胞質ループ等は、この点特に有用であろう。
【００６６】
本発明のポリペプチドが使用できる典型的な測定には、ＲＩＡ：ＥＬＩＳＡその他の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ双方の、よく知られたイムノアッセイ技術のあらゆるものが含まれる。ドーパミンリセプターのポリペプチド配列の種々のフラグメントはまた、与えられたフラグメント内のエピトープを求めて、対応するポリクローナル抗体又は好ましくはモノクローナル抗体（例えば、対応するハイブリドーマの慣用の調製及び表現により）を製造するために慣用のようにして使用することができる。抗体は、しばしば慣用のようにして、例えば放射性又は酵素的に標識されよう。好ましくは、得られるポリクローナル又はモノクローナル抗体はまた、上述のフラグメントに対してのみならず全蛋白質に対しても免疫特異的であろう。そのような抗体は、例えば、ドーパミンリセプター及び関連産物の検出及びアフィニティー精製又はクロマトグラフィーにおいて、慣用のようにして使用されよう。
【００６７】
無論、本発明のポリペプチドは、上記のようにして細胞から慣用の手順に従って表現されたもの及びやはり慣用の手順を用いて合成したものを含む。本発明は、第１に、自然環境の成分を実質上含まない哺乳類ドーパミンリセプターの非自然的調製を可能にする。「実質上純粋な」の語はここではこの意味、すなわち実質上これらの自然の成分を含まないという意味、で用いられている。本発明はまた、上記の種々の原料より単離することのできる又は全く慣用の方法を用いて合成的に調製することのできるＤＮＡ配列を含む。
【００６８】
更に本発明の範囲に含まれるのは、本発明のポリペプチド産物の１若しくはより多くの又は本発明の核酸配列の１若しくはより多くのものの有効量を、製薬産業においてよく知られている適当な慣用の賦形剤、補助薬及び／又は単体と混合してなる、薬剤学的組成物である。これらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの使用、例えば、サンプル中のドーパミンリセプターの存在の若しくはサンプル中の遺伝子若しくは異常遺伝子の存在の検出のため、又はサンプル中のリセプター若しくはその遺伝子の濃度を高めるため、又は遺伝子治療のようなｉｎ  ｖｉｖｏでの使用（例えば欠損遺伝子若しくは遺伝子を不活化し、例えば適当なモノクローナル抗体によりそれをブロックすること）のため及び／又は新しい機能的遺伝子（例えばレトロウイルスベクターを使用して）を提供するため、または与えられた位置におけるドーパミンリセプターの濃度を高めるため、例えばアンチセンスオリゴ配列を投与することによりリセプター表現及び／又は活性を調節するために、ヒトを含む全ての哺乳類において、使用することができる。かくして、これらの組成物は、疾患状態、とりわけ上述のようなドーパミンリセプターやその遺伝子の構造、表現又は濃度の異常に関連するものを、治療するに有用であろう。与えられた患者におけ与えられた状態に対する有効な個々の投与量は、よく知られているように、患者の全身状態、体重、特定のドーパミン欠乏疾患状態の同一性及び重症度を含む通常の状態によって変化するであろう。
【００６９】
本発明のポリペプチドはまた、薬物のような候補化合物のそれに対する親和性、例えばＤ2 ドーパミンリセプターに対する（例えばアゴニスト的又はアンタゴニスト的な）親和性、を試験するために、例えば競合的結合測定において使用することができる。そのような手順は、例えば、ここにおいて及び／又はドーパミンリセプターの自然の原料に基づく知られた慣用のプロトコールに類似の、例えば、Ｓｃｈｗａｒｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４（１９８０），７７２−７７８及びＣｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４６（１９７７），３７７−３８１の方法に従って、線条体リセプター、及び他のリセプターに対するトリチル化したドーパミンアゴニスト及びアンタゴニストの結合の阻害のための知られた試験と類似の、全く慣用の手順を用いて行うことができる。ドーパミンリセプターへのリガンドの結合によって開始される反応、例えばセカンドメッセンジャー系の調節のような細胞反応、を修正し又は開始させる能力を求めて物質をスクリーニングすることも可能である。そのような分析は、本発明の核酸配列で形質転換した本発明の細胞を利用することができる。
【００７０】
ドーパミンリセプターに対する又はドーパミンリセプター遺伝子、特にＤ2 ドーパミンリセプター、に対する本発明の抗体は、例えば放射線診断、ＭＲＩ又はポジトロン造影による、診断的造影技術にも使用することができる。放射性、パラマグネティック又はポジトロン標識は、抗体（好ましくは自然のモノクローナルな）に慣用の方法、例えばポジトロン放射、放射性核種若しくはパラマグネティック金属のためにはキレート性基の共有結合、により取りつけることができる。ＭＲＩ、放射線感受性又はポジトロン造影は、これらの試薬を用いて慣用の方法で達成することができる。例えば、Ｍａｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，３５，１３４９（１９８４）を参照。
【００７１】
適当な薬剤学的担体としては、水、生理的食塩水、ヒト血清アルブミン等が含まれる。組成物はまた、慣用のドーパミンアゴニスト、ドーパミンアンタゴニスト等の、関与する特定の疾患状態の緩和に適した他の活性成分を含むこともできる。組成物は、例えば抗体又はＤＮＡプローブ（例えば、遺伝子の相同性や異常を検出できるもの）を、例えば酵素、基質、ＤＮＡ制限フラグメント分析用材料のような検出方法に特異的な試薬と共に含有する、慣用のキットの形態で提供することができる。本発明はまた、例えば米国特許第４７３６８６６号に記載されているのに類似の、知られた方法を用いて、対応する形質転換動物、特に例えばラット、サル等のヒト以外の哺乳類、を製造するためにも有用である。そのような動物は例えば、特に商業的な研究目的に有用である。ＤＮＡ配列又は対応するｍＲＮＡはまた、例えばカエルからの卵母細胞に注入するのに慣用のようにして使用することができ、それは次いで慣用のようにして結合やセカンドメッセンジャーの解析に使用することができる。更に、１次アミノ酸配列が入手しうること自体、ドーパミンリセプターの２次及び３次構造についての実験的及びコンピューターモデル化と理解とを可能ならしめるものである。この３次元的情報は、例えば細胞膜、そのリガンド（結合ポケット）、関連蛋白質、メッセンジャー系等との相互作用等のリセプター機能の詳細をモデル化して理解するのに基礎を提供する。そのような解析は、理性的な薬物設計を可能にし、それによって例えば新しいドーパミンリセプター調節化学薬剤がこの相互作用の詳細に従って設計されることができる。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
さらに研究することなく、以上の説明を利用して、当業者は本発明のその全範囲において利用することができるものと信じられる。それ故言及した具体例は単に例示と考えるべきであり、開示の残部の限定と考えるべきではない。
【００７４】
以上の説明から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確かめることができ、そしてその精神および範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に適応させるため本発明の種々の変更および修飾を行うことができる。
【００７５】
上に引用したすべての出願、特許および文献のすべては参照のためここに取入れる。
【００７６】
実施例  
実施例１
要約
我々は最近ラットドパミンＤ−２レセプターに対する相補的ＤＮＡをクローンし、このレセプターを発現する細胞ラインをつくることを可能にした。Ｄ−２ｃＤＮＡ（ＲＧＢ−２）をマウスフィブロブラストＬｔｋ- 細胞中にトランスフェクトすることによって細胞ライン（ＬＺＲ１）がつくられた。以前Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１として記載された（１）ＬＺＲ１細胞はＤ−２レセプターの高密度を発現したが、野性タイプの細胞は発現しなかった。ＲＧＢ−２ｃＤＮＡのトランスフェクションは亜鉛誘発マウスメタロチオネインプロモーターによって調節されるけれども、ＬＺＲ１から調製された膜上のＤ−２レセプターの密度は該細胞を亜鉛で処理後も増加しなかった。ＬＺＲ２と命名されたＬｔｋ- 細胞から誘導された第２の細胞ラインは非誘発状態においてＤ−２レセプターの低密度を持っていたが、亜鉛による処理はレセプター密度に５０％増加を誘発した。多数のアゴニストは、発現したＤ−２レセプターに対する〔 3Ｈ〕スピロペリドールの結合を競合的にそして選択的に阻害した。ＬＺＲ１細胞においては、ドパミンはＧＴＰおよびＮａＣｌの存在したよりも不存在下において放射性リガンド結合のより強力な阻害剤であった。ドパミンは、ＬＺＲ１細胞から調製した膜においてフォルコリン刺激アデニレートサイクラーゼ活性を２７％減少させた。ドパミンによる阻害は（＋）ブタクラモールにより、または無傷の細胞の百日咳トキシンによる前処理によってブロックされた。これらデータは、ＲＧＢ−２  ｃＤＮＡはグアニンヌクレオチド結合タンパクと相互作用し、そしてアデニレートサイクラーゼ活性を阻害することができるドパミンＤ−２レセプターの発現を命令することを指示する。さらにＲＧＢ−２  ｃＤＮＡは、ドパミンＤ−２レセプターの生物学的および薬理学的特徴化のための道具として有用な多数の細胞ラインをつくる手段を提供する。
【００７７】
序論
ドパミン（ＤＡ）レセプターは、機能的および薬理学的プロフィルに基いて二つのサブタイプに分けられている（２）。ＤＡ  Ｄ−２レセプターはそれらのアデニレートサイクラーゼ活性を阻害する能力によって機能的に特徴化される（３）。Ｄ−２レセプターの活性化はカルシウムチャンネルを阻害し（４，５）、カリウム伝導度を増加し（６）、そしてイノシトールフォスフェートの蓄積を阻害し得る（７，８）。ＤＡレセプターの調節および機能的特徴の研究を妨げていた一つの要因は、該レセプターを発現する細胞ラインがないことであった。プロラクチン分泌腫瘍から誘導された一つの細胞ラインが最近その中でＤＡがアデニレートサイクラーゼ活性およびプロラクチン分泌を阻害すると記載された（９）。
【００７８】
我々は最近、β2 −アドレナリンレセプターおよびグラニンヌクレオチド結合タンパクと相互作用する他のレセプターと著名な同族性を有する、ＲＧＢ−２と命名したラット脳相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクローンした。三系統の証拠がＲＧＢ−２  ｃＤＮＡはＤＡ  Ｄ−２レセプターをコードすることを指示する。（１）このタンパクの推定アミノ酸配列はグアニンヌクレオチド結合タンパクへ結合するレセプターに典型的である７個の膜スパニング領域（１０）の存在を指示する。（２）ｃＤＮＡとハイブリダイズするメッセンジャＲＮＡの分布がＤ−２レセプターの分布と平行している。（３）ＲＧＢ−２  ｃＤＮＡをＤ−２選択性リガンド〔 3Ｈ〕スピロペリドールの高いアフィニティー結合を欠く細胞中へトランスフェクトする時、細胞はＤ−２レセプターの薬理学的プロフィル特徴（１）を有する放射性リガンドのための結合部位を発現する。
【００７９】
Ｄ−２レセプターｃＤＮＡのクローニングは、レセプター活性化の効果が容易に決定できる細胞ライン中にＤＡレセプターを発現させることが可能になる。我々は、マウスＬ細胞を亜鉛誘発マウスメタロチオネインプロモーターの規制のもとでＲＧＢ−２でトランスフェクトすることによって得られた細胞ラインへ〔 3Ｈ〕スピロペリドールおよび他のＤ−２アンタゴニストの結合を以前記載した（１）。我々はまた、以前使用したアッセイ条件のもとでは、ＤＡのＬＺＲ１膜への結合はＧＴＰへ応答しなかったことを報告した。我々は今や、ＲＧＢ−２  ｃＤＮＡによってコードされたＤ−２レセプターはアゴニストの結合のグアニンヌクレオチド感受性およびアゴニストがアデニレートサイクラーゼ活性を阻害する能力に関して機能的であることを示す。
【００８０】
方法
材料：〔α−32Ｐ〕アデノシン−５’−トリリン酸（ＡＴＰ，１０〜５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および〔 3Ｈ〕サイクリックＡＴＰ（３１．９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入し、〔 3Ｈ〕スピロペリドール（９５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍ（ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，Ｉ１）から購入した。グアノシン−５’−トリリン酸（ＧＴＰ），ＤＡ，サイクリックＡＴＰ，３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ＡＴＰおよびフォルコリンはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。キンピロール，ＬＹ１８１９９０（Ｌｉｌｌｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ブロモクリプチン（Ｓａｎｄｏｚ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ），（＋）および（−）３−ＰＰＰ（Ａｓｔｒａ）は親切な贈与品であった。
【００８１】
トランスフェクション：全ＲＧＢ−２  ｃＤＮＡはプラスドｐＺｅｍ３（１１）にクローンされた。ｃＤＮＡおよびベクターはベクター上のＢｇ１  II部位およびｃＤＮＡアダプター上のＳａ１  Ｉ部位へ部分的にはめ込むことによって両立性とされた。このプラスミドはプラスミドｐＲＳＶｎｅｏと共にアウスＬｔｋ- 細胞中へＣａＰＯ4 沈澱技術（１２）によって同時トランスフェクトされた。トランスフェクタントはＧ４１８の３５０μｇ／ｍｌ中で選択され、単離され、ノーザンブロット分析によってＲＧＢ−２  ｍＲＮＡの発現についてスクリーンされた。ＲＧＢ−２  ｍＲＮＡの高い発現に基いで選択されたサブクローンＬＺＲ１は以前Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１として一部特徴化された（１）。第２の細胞ライン、ＬＺＲ２は同じ方法で単離された。
【００８２】
組織培養：細胞は、１５０ｍｍ直径のＦａｌｃｏｎ組織培養プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）中２０，０００細胞／ｃｍ2 の密度においてプレートされ、成育培地をトリプシン−ＥＤＴＡ（０．１％トリプシン，０．０２％ＥＤＴＡ，リン酸塩緩衝食塩水中）で交換するか３日目に供給することによってサブカルチャーされ、そして５日または６日目に収穫された。細胞は、５％ウシ胎児血清および５％鉄補給子ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を補強したＤｕｌｂｅｃｃｏ修正イーグル培地（Ｓｉｇｍａ）中、１０％ＣＯ2 ／９０％空気雰囲気中３７℃で成育された。細胞は、成育培地を氷冷低張緩衝液（１ｍＭ  Ｎａ+ −ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で交換することによって溶解された。１０〜１５分間膨潤後、細胞をプレートからかき落とし、２４，０００ｘｇにおいて２０分遠心した。得られた粗膜分画をＢｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーでセッティング６において１０秒トリス等張食塩水（５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．４，０．９％ＮａＣｌ）中に再懸濁し、レセプター結合実験のため−７０℃で貯蔵するか、または直ちにアデニレートサイクラーゼ実験に使用するためトリス等張食塩水に再懸濁し、２４，０００ｘｇで２０分遠心し、トリス等張食塩水に再懸濁した。
【００８３】
レセプター結合アッセイ：膜調製物は解凍し、２４，０００ｘｇで２０分遠心し、指示した場合を除きトリス等張食塩水に再懸濁した。膜調製物の部分標本は、（最終濃度）５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．４，０．９％  ＮａＣｌ，０．０２５アスコルビン酸、０．００１％ウシ血清アルブミン、〔 3Ｈ〕スピロペリドール、および適当な薬物を含んでいるアッセイチューブへ加えた。（＋）ブタクラモール（２μＭ）は、ＫD 値に近い放射性リガンドの濃度においては典型的には総結合の１０％以下である非特異性結合を決定するために使用された。アッセイは、飽和分析のためには２ｍｌ，阻害分析のためには１ｍｌの容積を実施された。インキュベーションはタンパク１５〜５０μｇの添加によって開始され、３７℃で５０分実施され、そして各アッセイへ氷冷緩衝液（１０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，０．９％ＮａＣｌ）を加えることによって停止された。サンプルはガラス繊維フィルター（Ｓｃｈｌｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｎｏ．３０）を通して濾過され、洗浄緩衝液の１０ｍｌで洗浄された。フィルターに残っている放射能をＢｅｃｋｍａｎＬＳ  １７０１シンチレーションカウンターを用いてカウントした。データは、データ解析プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒ（Ｅ１ｓｅｖｉｅｒ−Ｂｉｏｓｏｆｔ）を用いて非直線回帰によって解析された。競合実験においては、ＫI 値が実験的に決定したＩＣ50値からＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆ法によって計算された。ＫI およびＫD の平均値は幾何平均である。ＤＡの結合に対するＧＴＰおよびＮａＣｌの効果を評価するために仕組まれた実験においては、新鮮な組織が使用される。細胞が収穫され、遠心され、そしてトリスＭｇ++（５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，４ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ）中にＭｇ++再懸濁された。組織は再遠心前にこの緩衝液中３７℃で１５分インキュベートされた。再懸濁したタンパクは、添加したＮａＣｌまたはＧＴＰなしのトリスＭｇ++か、または１２０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１００μＭ  ＧＴＰを含むアッセイへ添加された。
【００８４】
アデニレートサイクラーゼアッセイ：〔α32Ｐ〕ＡＴＰの〔32Ｐ〕ｃＡＭＰへの変換はＳａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１４）が記載したのと実質的に同じようにして決定した。トリス等張食塩水に再懸濁した膜（５０〜１００μｇタンパク）は、５０ｍＭ  トリスＨＣｌ，ｐＨ７．４，５ｍＭ  ｃＡＭＰ，１ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２５ｍＭ  ＡＴＰ，３０μＭ  ＧＴＰ，約２×１０6 ｃｐｍ〔α32Ｐ〕ＡＴＰ，および種々の薬物を含む０．２ｍｌのアッセイへ０．１ｍｌの容積で加えられた。アッセイは２５ｃＤＮＡへ加温することにより開始され、２０分後０℃へ冷却し、次に各アッセイへトリクロル酢酸（３０％溶液１００μｌ）を加えることによって停止された。〔 3Ｈ〕サイクリックＡＴＰ（約３０，０００ｃｐｍ）を内部標準として各アッセイへ加えた。アッセイ容積を水で１ｍｌとし、チューブを２０００ｘｇで１０分遠心した。上清中のサイクリックＡＭＰは、Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ４および中性アルミナを含むカラム上の逐次クロマトグラフィーによって単離した。各アルミナカラムからの２ｍｌ溶離液は液体シンチレーションカウントのためＢｉｏ−Ｓａｆｅ  ＩＩ（ＲＰＩ，Ｍｏｕｎｔ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔ，ＩＬ）１０ｍｌに溶かした。アルゴニストによるアデニレートサイクラーゼの阻害のための投与量レスポンス曲線は、プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒを使用する非直線回帰により解析した。データは以下の式にあてはめた。
【００８５】
Ｅ＝（１００−Ｅｍａｘ）／１＋（Ａ／ＥＣ50）N ＋Ｅｍａｘ
【００８６】
ここでＥは総刺激活性の％で表した酵素活性の量であり、Ａはアゴニストの濃度、ＥＣ50は酵素活性の５０％最高阻害を生ずるアゴニストの濃度、Ｅｍａｘはアゴニストの最高に阻害する濃度の存在下観察された酵素活性（総刺激活性の％で表す）、Ｎは傾斜計数である。ＥＣ50値の平均値は幾何平均である。タンパク濃度はＰｅｔｅｒｓｏｎ法（１５）によって決定した。
【００８７】
結果
〔 3Ｈ〕スピロプリドール結合の飽和分析：
ＬＺＲ１細胞から調製した膜上のＤ−２レセプターの密度は〔 3Ｈ〕スピロペリドール結合の飽和分析によって決定された。ＲＧＢ−２は亜鉛誘発マウスメタロチオネインプロモーターの制御下にあるので、細胞の１００μＭ硫酸亜鉛前処理の〔 3Ｈ〕スピロペリドール結合に対する効果も決定した。結合部位の密度は、対照ＬＺＲ１細胞においては７３６±１４０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクであり、亜鉛で処理したＬＺＲ１細胞では７５９±１５５ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクであった。ＬＺＲ２と命名した第２の細胞ラインは、Ｄ−２レセプターの低い密度（平均Ｂｍａｘ±ＳＥ，４３５±７１ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク）を持っていた。ＬＺＲ１細胞と対照的に、ＬＺＲ２細胞の結合部位密度は亜鉛処理により、６３０±５２ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクへ５０％増加した（ｎ＝２）。対照ＬＺＲ１およびＬＺＲ２細胞のための４２ｐＭの平均ＫD （ｐＫD ±ＳＥ，１０．３７±０．１５，ｎ＝４）は、亜鉛処理細胞の４７ｐＭの平均ＫD 値（１０．３３±０．１７）と有意差はなかった。すべての実験からの飽和分析のＳｃａｔｃｈａｒｄトランスフォーメーションは直線を与えた。野性タイプＬｔｋ- 細胞は〔 3Ｈ〕スピロペリドールの置換結合が検出されなかった（データ示さず）。ＬＺＲ１細胞はＤ−２レセプターの高密度を有するので、これら細胞はすべての以後のすべての実験に使用された。
【００８８】
アゴニストによる放射性リガンド結合の阻害：いくつかのアゴニストおよび関連化合物に対するＤ−２レセプターの見掛けアフィニティーを二つの実験において決定した（第２５図，表２）。試験した６化合物のうち、ブロモクリプチンが最強力であり、平均ＫI 値２ｎＭであったが、Ｄ−２選択性アゴニストキンピロールの不活性エナンチオマーであるＬＹ１８１９９０は最も弱かった。すべてのアッセイは、ＬＺＲ１細胞から調製した膜を用いて、０．１ｍＭ  ＧＴＰおよび１２０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下実施された。
【００８９】
他の実験においては、ＤＡによる放射性リガンド結合の阻止に対するＧＴＰおよびＮａＣｌの影響が決定された（第２６図）。これらの実験には新たに調製された膜が使用され、ホモジネーションおよびアッセイ緩衝液へ４ｍＭ  ＭｇＣｌ2 が加えられた。ＧＴＰおよびＮａＣｌの不存在下、平均ＩＣ50は２５μＭ（平均−ｌｏｇ（ＩＣ50）±ＳＥ＝４．６±０．３）であった。アッセイ緩衝液へＧＴＰおよびＮＣｌの添加は平均ＩＣ50値を、〔 3Ｈ〕スピロぺリドールの結合を変えることなく１６７μＭ（３．８±０．３，ｎ＝４）へ上昇させた。ＧＴＰおよびＮａＣｌの不存在下のＨｉｌｌ計数は０．５０ないし０．６８（平均０．６４）の範囲であったが、ＧＴＰおよびＮａＣｌの存在下の値は０．７７ないし１．１（平均０．９４）の範囲であった。ＧＴＰおよびＮａＣｌの不存在下で、ＤＡの阻害曲線は、結合部位に二つクラスが存在すると仮定することによって最良に適中し得る。高いアフィニティーの一クラスは、レセプター総数の４８±１４％を表わし、０．３μＭのＤＡに対する平均ＫI を持っていた。レセプター総数の５２±１３％を占める第２のクラスは平均ＫI 値２４μＭを持っていた。
【００９０】
アゴニストによるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害：
ＬＺＲ１細胞からの新たに調製した膜において、しかし野性タイプＬｔｋ- 細胞からの膜ではなくて、ＤＡはフォルスコリン刺激アデニレートサイクラーゼ活性の濃度依存変調を生ぜしめる。最大阻害は６２４ｎＭのＥＣ50値をもって総活性の２７％であった（第２７図、表２）。キンピロールはドパミンと大体同じく有効であり、すなわちキンピロールによって誘発される最高阻害はＤＡによる誘発と類似であった。ＬＹ１８１９９０はその活性異性体より強力でなくそして有効でなく（第２８図、表２）、アデニレートサイクラーゼ活性のＤ−２レセプター仲介阻害は立体選択的であることを示す。３実験のうち２実験だけにおいて、ＬＹ１８１９９０が測定し得る酵素活性阻害を示した（表２）との知見は、この化合物はアゴニスト活性を少ししかまたは全く持っていないことを示唆する。同様に、（−）３−ＰＰＰは検出し得るアゴニスト活性を持っていなかった。ブロモクリプチンは、ＥＣ50値４５ｎＭを持ち、最も強力なアゴニストであった。ブロモクリプチンおよび（＋）３−ＰＰＰはＤＡより有効でなく、このためこれら薬物は部分的アゴニストであるように見える。
【００９１】
１０ｍＭ  ＤＡによるＬＺＲ１細胞中のアデニレートサイクラーゼ活性の阻害は、アッセイへ（＋）ブタクモール１０μＭの添加によって防止され（第２９図）、ＤＡの阻害はレセプター仲介であることを示す。また、百日咳トキシンによるＬＺＲ１細胞の処理（５０ｎｇ／ｍｌ成育培地，１６時間）は、細胞から調製した膜においてＤＡ−阻害酵素活性をブロックし（第１０Ｃ図）、Ｇｉは酵素活性のＤＡによる阻害を仲介することを示す。興味あることに、百日咳トキシン処理細胞からの膜中のフォルスコリン刺激アデニレートサイクラーゼ活性は、対照膜中の活性よりも２．５倍大であった。
【００９２】
【表２】
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【００９３】
議論
以前に報告したように、ラットＤ−２レセプターｃＤＮＡで形質転換したＬｔｋ- 細胞はＲＡ  Ｄ−２レセプターの高密度を発現する（１）。我々は、Ｄ−２レセプターを７５０ないし１０００ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクの密度で安定に発現する（現在の結果；１を参照）、ＬＺＲ１と命名したこれら細胞のサブクローンの一つを特徴化した。
【００９４】
Ｄ−２  ｃＤＮＡはプライミド  ｐＺｅｍ３に含まれるので、亜鉛誘発プロモーターの規制のもとで、放射性リガンド結合の性質に対する亜鉛処理の効果が決定された。ＬＺＲ１細胞上のＤ−２レセプターは亜鉛の不存在下において最大に発現されるように思われ、そのため亜鉛処理はレセプターの密度に増加を生じなかった。亜鉛に対する応答性の欠如はＬｔｋ- 細胞ラインの特徴ではない。我々はＬｔｋ- 細胞の第２の形質転換されたラインＬＺＲ２を分離し、それではＤ−２レセプターの密度は４３５ないし６３０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクから亜鉛処理によって約５０％上昇される。〔 3Ｈ〕スピロペリドールに対するＤ−２レセプターのアフィニティーは亜鉛処理によって有意に変化しなかった。
【００９５】
ＬＺＲ１細胞上のＤ−２レセプターのいくつかのアゴニストおよび関連する薬物に対する見掛けアフィニティーは〔 3Ｈ〕スピロペリドールの特異結合のＧＴＰ存在下での薬物による阻害に決定された。ブロモクリプチンは２ｎＭのＫI 値をもって極めて強力なアゴニストであった。キンピロールの強度は、ＤＡと同様に約１０μＭであった。アゴニストの結合は立体選択的であった。これはＬＹ１８１９９０はその活性エチナチオマーであるキンピロールよりかなり弱く、そして（−）３−ＰＰＰは（＋）３−ＰＰＰより強力であるからである。これらデータはＬＺＲ１細胞上のＤ−２レセプターに対するアンダゴニストの結合の我々の以前の研究（１）を拡大する。
【００９６】
Ｄ−２レセプターの刺激の生理学的効果は、アデニレートライクラーゼ活性を阻害するグアニンヌクレオチド結合タンパクＧｉによって仲介されるものと考えられる（１６）。アゴニストの高いアフィニティー結合は、アゴニスト、レセプター、およびＧｉのα−サブユニット（Ｇｉα）よりなる三元複合体であると考えられ、ＧＴＰによるＤ−２レセプターへのアゴニスト結合の阻害はＧｉαからのＤ−２レセプターのＧＴＰ誘発解離を表明する。ＲＧＢ−２  ｃＤＮＡによってコードされたＤ−２レセプターのＧタンパクへ結合する能力を評価するため、放射性リガンド結合の阻害に対するＤＡの強度に対するＧＴＰの効果が決定された。ＬＺＲ１細胞を用いた予備研究において、我々は１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含みそして添加したＭｇ++を含まない我々の標準アッセイ緩衝液において、ＤＡの結合はＧＴＰへ感受性ではないが（１）、同じ条件下でラット線条体膜へのＤＡの結合はＧＴＰによって阻害される（データ示さず）ことを発見した。ＬＺＲ１膜におけるＧＴＰへの感受性の欠如については三つの可能性ある説明が存在した。（１）Ｌｔｋ- 細胞から誘導したＬＺＲ１細胞は適当なＧタンパクを欠いている可能性がある。（２）ＲＧＢ−２  ｃＤＮＡはＤ−２レセプターの結合サブユニットだけをコードする。ＲＧＢ−２によってコードされたこのタンパクの予想された主要構造とグアニンヌクレオチド結合タンパクへ結合した他のレセプター間の類似性のため、この可能性はありそうもなかった。（３）結合アッセイのイオン性条件が三元複合体の形成または不安定化のために適性ではなかった可能性がある。ここに記載した研究においては、イオン性条件はＧＴＰ感受性結合を観察する可能性を増すように変化された。高アフィニティーアゴニスト結合を最大にするため、組織はＭｇＣｌ2 と前インキュベートされ、そしてＭｇＣｌ2 はアッセイ緩衝液中に含めされた（１７）。三元複合体のＧＴＰ誘発不安定を最大にするため、ＮａＣｌをＧＴＰと共に加えた（１７）。これらの条件下、ＧＴＰおよびＮａＣｌの添加はＤ−２レセプターに対するＤＡの強度を低下させ、ＬＺＲ１細胞からの膜において阻害曲線の傾斜を増加させた。三元複合体の形成および不安定化のためのイオン必要性はＬＺＲ細胞からの膜においてラット線条体からの膜におけるよりも一層急務であったことは興味がある。
【００９７】
ＤＡ  Ｄ−２レセプターによるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害は良く特徴化された現象である（３，１８，１９）。いくつかの薬物によるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害はＬＺＲ１細胞からの膜において評価された。ＤＡおよびＤ−２選択性アゴニストであるキンピロールの最大有効濃度は、フォルスコリン刺激酵素活性を約３０％減少させた。ＤＡによる酵素活性の阻害はＤ−２アンタゴニストである（＋）ブタクラモールによってブロックされた。試験した最も強力なアゴニストであるブロモクリプチンは、他によって報告されたように（１９，２０）、部分的アゴニストのようであった。アゴニストによるアデニレートサイクラーゼの阻害は、キンピロールの右旋性エナンチオマーであるＬＹ１８１９９０は少ししかまたは全く有効性を持っていなかったので、立体選択的であった。以前報告されたように、部分的アゴニスト（＋）３−ＰＰＰは（−）３−ＰＰＰより強いアゴニストであるが、（−）３−ＰＰＰは高いアフィニティーをもってＤ−２レセプターへ結合する（２１，２２）。我々はＬＺＲ１細胞からの膜においては（−）３−ＰＰＰによるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害を観察しなかった。アゴニストによるアデニレート活性の阻害について決定したＥＣ50値は、リガンド結合のアッセイにおいて決定したＫI 値よりも一般に低かった（表１）。これはこれら細胞上のレセプター予備の存在のためかも知れないが、薬物は酵素活性の最高阻害において異なるとの観察は、最も有効なアゴニストであるＤＡおよびキンピロールに対してさえも多くのレセプター予備は存在しないことを示唆する。さらに、（＋）３−ＰＰＰのような部分的アゴニストのためのレセプター予備も存在しないであろう。代りの説明は、アゴニレートサイクラーゼ活性の阻害は、後部下垂体中のＤＡによる酵素活性の阻害について提案されているように（２３）、三元複合体の形成によって誘発された高アフィニティー状態におけるアゴニストのＤ−２レセプターへの結合に関係していることである。他方、ＧＴＰおよびＮａＣｌの存在下決定された本報告中のＫI 値は、低アフィニティー状態におけるアゴニストのレセプターへの結合を表明する。アデニレートサイクラーゼおよび放射性結合アッセイは異なる温度で実施されたので直接比較は困難であるが、高アフィニティークラスの部位へのＤＡ結合のＫI 値（０．３μＭ）は、ＤＡ阻害アデニレートサイクラーゼに対するＥＣ50値（０．６μＭ）に近く、低アフィニティークラスの部位へのＤＡの結合のためのＫI 値（２４μＭ）およびＧＴＰ存在下の結合のためのＫI 値（１７μＭ）はかなり高い。
【００９８】
ＤＡは、百日咳トキシンで処理したＬＺＲ１細胞からの膜中ではアデニレートサイクラーゼ活性を阻害しなかった。百日咳トキシン触媒ＧｉのＡＤＰリボシル化はアデニレートサイクラーゼのＧｉ仲介阻害を防止するので、この知見はＤ−２レセプターは形質転換したＬＺＲ１細胞中のＧｉαと相互作用するとの仮説と一致する。他の細胞タイプの百日咳トキシン処理後アデニレートサイクラーゼのイソプレテレノールによる刺激について観察されたように（２４）、百日咳トキシンによる無傷のＬＺＲ１細胞の処理はアデニレートサイクラーゼを刺激するフォルスコリンの能力を増強し、ある種の細胞ラインにおいてはＧｉはフォルスコリンおよびホルモン刺激アデニレートサイクラーゼ活性を変調するように通常作用することを示唆した。
【００９９】
我々は、Ｄ−２レセプターの高密度を安定して発現する、ＲＧＢ−２  ｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞ラインを特徴化した。この細胞ラインをもって、アデニレートサイクラーゼ活性を阻害するようにグアニンヌクレオチド結合タンパクと生産的に相互作用するＤＡ  Ｄ−２レセプターをコードするｃＤＮＡが決定された。ＲＧＢ−２  ｃＤＮＡは、殆どすべてのタイプの細胞において機能的Ｄ−２レセプターの発現を命令するように見える。例えば、ラット下垂体腫瘍から得たＧＨ4 Ｃ1 細胞は、ラット前部下垂体中のラクトトロフはＤ−２レセプターを発現するけれども、ＤＡレセプターを欠くプロラクチン分泌細胞である。ＧＨ4 Ｃ1 細胞へのＲＧＢ−２  ｃＤＮＡのトランスフェクションは、ここに記載したものと似た機能的特徴を有するＤ−２レセプターの発現を生ずる（２６）。Ｄ−２レセプターｃＤＮＡでのトランスフェクションによってつくられた細胞ラインは、Ｄ−２レセプターの作用および規制のメカニズムの研究に有用であろう。
【０１００】
【表３】
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【０１０１】
【表４】
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【０１０２】
【表５】
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【０１０３】
【表６】
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【０１０４】
実施例２
要約
我々は、Ｄ2 −ドパミンレセプターの薬理学との結合部位をエンコードするｃＤＮＡを記載した（Ｂｕｎｚｏｗ，Ｊ．Ｒ．ら（１９６８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３６，７８３−７８７）。我々は、このタンパクは機能性レセプターであること、すなわちｃＡＭＰ生産およびホルモン分泌を阻害するようにＧ−タンパクと結合することをここに明らかにする。このｃＤＮＡはドパミンレセプターを欠くラット体泌乳刺激ホルモン細胞株であるＧＨ4 Ｃ1 に表現された。安定なトランスフェクタントが単離され、ノーザン班上のＤ2 −ドパミンレセプターｍＲＮＡの最高レベルを持つ一クローンＧＨ4 ＺＲ7 が詳細に研究された。ＧＨ4 ＺＲ7 から単離された膜へのＤ2 −ドパミン拮抗体 3Ｈ−スピペロンの結合は、ＫD ＝９６ｐＭおよびＢｍａｘ＝２３００ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクで飽和し得る。ＧＴＰ／ＮａＣｌの添加は、 3Ｈ−スピペロン結合に対してドパミン競合のＩＣ50値を２倍増加させ、Ｄ2 −ドパミンレセプターは一種以上のＧタンパクと相互作用することを示した。ドパミン結合部位の機能へアクセスするため、ドパミンの急性生物学的作用がＧＨ4 ＺＲ7 細胞中で特徴化された。ドパミンは休止細胞内および細胞外ｃＡＭＰレベルを５０〜７０％（ＥＣ50＝８±２ｎＭ）減少し、そして基準レベルの８〜１２倍であるｃＡＭＰレベルのＶＩＰ−誘発増強を完全にブロックした（ＥＣ50＝６±１ｎＭ）。スピペロン，（＋）−ブタクラモール，（−）−スルピライドおよびＳＣＨ２３３９０によるＶＩＰ−増強ｃＡＭＰレベルのドパミン誘発阻害の拮抗作用は、Ｄ2 −レセプターにおけるこれら拮抗体のＫ1 値から予期される濃度において発生し、そして立体選択的であった。ドパミン（およびいくつかのＤ2 −選択的アゴニスト）は、ＧＨ4 ＺＲ7 膜中５００〜８００ｎＭのＥＣ50をもって、フオルスコリン刺激アデニレートサクラーゼ活性を４５±６％阻害した。細胞ｃＡＭＰおよび膜調製物中におけるアデニレートサイクラーゼ活性のドパミン阻害は、百日咳トキシンによる前処理（５０ｎＭ／ｍｌ，１６ｈ）によって停止された。ドパミン（２００ｎＭ）はＶＩＰおよびＴＲＨ−誘発プロラクチン放出を停止した。これらデータは、このｃＤＮＡクローンは、Ｇタンパクへ結合し、アデニルサイクラーゼと、そしてｃＡＭＰ依存および非依存ホルモン分泌を阻害する機能的ドパミン−Ｄ2 レセプターをエンコードすることを結論的に示す。ＧＨ4 ＺＲ7 細胞は、ドパミンＤ2 レセプターの生化学のそれ以上の解明に有用であることを証明するであろう。
【０１０５】
序論
下垂体からのＰＲＬ分泌を支配する主要エレメントは、下垂体門血流中のドパミン濃度である（１）。ドパミンは下垂体ラクトトロフ上のドパミン−Ｄ2 レセプターを介して基本およびホルモン刺激ＰＲＬ分泌を阻害するように作用する（１−５）。ドパミン−Ｄ2 レセプターは百日咳トキシン感受性阻害Ｇタンパクと相互作用し（６−９）、アゼニレートサイクラーゼ活性を減らし、そして他の剤によるｃＡＭＰレベルの増強をブロックする（６，１０−１２）。ドパミンはまた、ラクトトロフ中の〔Ｃａ++〕を減少させ、そして特にＴＲＨのような他の剤による〔Ｃａ++〕の上昇を阻害する（１３−１５）。ドパミンのｃＡＭＰおよび〔Ｃａ++〕の阻害は、一つ以上の百日咳トキシン感受性Ｇタンパクへの結合によって仲介され、そしてＰＲＬ分泌のドパミン阻害に貢献するように見える（１５）。ドパミン作用のこれらの要素間の正確な関係は、非均質細胞タイプの存在、細胞数の制限、および広汎なラクトトロフ調製物の応答性の変動のため、研究することが困難であった（１５，１６）。  ドパミン−Ｄ2 レセプターｃＤＮＡの最近のクローニング（１７）は、このレセプターの細胞内作用および調節を検討するための有用な道具を提供する。このＤ2 −ドパミンレセプタークローンが機能的レセプターの合成を指令し、ドパミン−Ｄ2 レセプター活性化を生物学的効果の間の経路を規定するかどうかを検討するため、我々は下垂体由来細胞株ＧＨ4 Ｃ1 細胞中へドパミン−Ｄ2 レセプターｃＤＮＡをトランスフェクトした。ＧＨ4 Ｃ1 細胞はラット下垂体細胞であり、これはＰＲＬおよびＧＨを合成分泌し、そして種々のホルモン、成長因子、神経伝達レセプター、二次メッセンジャーシステムおよびイオンチャンネルを有し、そしてラクトトロフ機能のアクセスし得るモデルを提供した（１８，１９）。しかしながら、これら細胞は正常ラクトトロフ上に存在するドパミン−Ｄ2 レセプターを欠いており、このためドパミン−Ｄ2 レセプターの機能の研究のための理想的ホストを提供する。本報告は、ｃＤＮＡクローンの遺伝子生産物はドパミン−Ｄ2 レセプターとして機能し、そして阻害Ｇタンパクへ結合し、ｃＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ放出を減少させることを明らかにする。ここで特徴化されたＧＨ4 Ｃ1 トランスフェクタントは、Ｄ2 レセプターにおけるドパミン作用のメカニズムをさらに研究することができる有用な細胞システムを提供するに違いない。
【０１０６】
実験操作
材料：ドパミンアゴニストおよびアンタゴニストは、キンピロール（リリー）、ブロモクリプチン（サンド研究所）、および（＋）および（−）３−ＰＰＰ（アトラス）を除いて、リサーチ、バイオケミカルズ、インコーポレーテッド（マサチューセッツ州ウオルサム）からのものであった。２−Ｏ−スクシニル−ｃＡＭＰに対するウサギ抗体−ウシ血清アルブミン複合体は、ＩＣＮ（カリフォルニア州アービン）から得、そしてｒＰＲＬ標準および抗−ｒＰＲＬ抗体はメリーランド州ベセスダ、ＮＩＤＤＫ、Ｓａｌｖａｔｏｒｅ  Ｒａｉｔｉ博士からのものであった。ペプチド類はＰｅｎｉｎｓｕｌａ社（カリフォルニア）またはＳｉｇｍａ社（ミズリー州セントルイス）からのものであった。α32Ｐ−ｄＣＴＰ（２，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ） 125Ｉ−２−Ｏ−（ヨードチロシルメチルエステル）スクシニルｃＡＭＰ（２，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）， 3Ｈ−ｃＡＭＰ（３１．９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ社（マサチューセッツ州ボストン）からのものであった。すべての他の薬品は主としてＳｉｇｍａ社から得た試薬級であった。
【０１０７】
方法：
ｐＺＥＭ−Ｄ2 −ｃＤＮＡの構築：ｐＺＥＭ−３プラスミド（２０）をメタロチオネインプロモーターとｈＧＨ３’−フランキング配列の間のＢｇ１  II部位において切断した。ドパミン−Ｄ2 ｃＤＮＡ全長（１７）は、λＧＴ１０からＳａ１  Ｉで切開し、そしてｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ（２５０μＭ）の存在下切断したｐＺＥＭ−３プラスミドヘリゲートし、そしてＥ．Ｃｏｌｉ株ＸＬ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中へ形質転換した。組換え物はそれらの32Ｐ標識Ｄ2 −ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、次に制限分析およびＤＮＡ配列によって特徴化された。オリエンテーションの意味におけるｃＤＮＡ挿入物による組換え物を調製し、真核細胞中へのトランスフェクションのためＣｓＣｌ勾配遠心によって精製した。
【０１０８】
細胞培養：Ａ．Ｈ．Ｔａｓｈｉｊｉａｎ，Ｊｒ．博士（マサチューセッツ州ボストン、ハーバート大学）から得たＧＨ4 Ｃ1 細胞およびサブクローンを、１０％ウシ胎児血液を補給したＨａｍ  Ｆ１０培地中、３７℃において５％ＣＯ2 中で発育させた。３Ｈ−スピペロン結合またはアデニレートサイクラーゼ活性の研究のため、細胞は１０％ウシ胎児血清を補給したＤｕｌｂｅｃｃｏの修正イーグル培地中、３７℃で１０％ＣＯ2 中で成育させた。培地はトランスフェクションまたは実験前１２〜２４時間に交換した。トランスフェクションのため、ＧＨ4 Ｃ1 細胞は２〜４×１０6 細胞／１０cm皿へ成育させた。２０μｇのｐＺＥＭ−Ｄ2 ｃＤＮＡおよび１μｇのｐＲＳＶ−ネオを２ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝化食塩水中リン酸カルシウムで共沈させ、細胞上に１０〜２０分置いた。加温Ｆ１０＋１０％ウシ胎児血清（ｐＨ７．０）８ｍｌを加え、細胞を３７℃で４〜５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、細胞をインキュベーター中に１６〜２０時間置いた。７００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ジェネチシン，Ｇｉｂｃｏ，Ｎ．Ｙ．）を補給した新しい培地を次の３〜４週にわたって添加し、ネオ抵抗を発現する安定なトランスフェクタントを選別した。個々のコロニー３〜５μｌを採取するため無菌マイクロピペットを使用して単一コロニーを単離した。トランスフェクタント細胞ラインのストックを液体窒素中に貯蔵冷凍すれば、Ｇ４１８は成育培地から排除した。
【０１０９】
ＲＮＡ単離およびノーザン斑分析：細胞をカルシウム不含Ｈｅｐｅｓ緩衝化食塩水＋０．０２％ＥＤＴＡ中で洗い、そしてトリス緩衝化グアニジウム塩酸塩で抽出し、１．７ｇ／ｍｌ  ＣｓＣｌパッドを通して遠心し（３３，０００ｒｐｍ，１６ｈ）、そしてペレットをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させる（２１）。ＲＮＡを再懸濁し、ＯＤ＝２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって定量する。ノーザン斑のため、ＲＮＡをグリオキサール／ＤＭＳＯ中で変性し（１ｈ，５０℃）、１０ｍＭリン酸ナトリウム中１％アガロースゲル上へ流した。ＲＮＡをナイロン膜（Ｎ−結合，Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に一夜しませ、８０℃で２時間焼付けした。プレハイブリッド化は６時間４２℃において記載したように行った。ランダムにプライムしたＤ2 −ｃＤＮＡの32Ｐ標準１．６Ｋｂ  ＢａｍＨＩ−Ｂｇ１  IIフラグメント（１〜２×１０6 ｄｐｍ／μｇ）を５０％ホルムアミド中４２℃における１６〜２０ｈのハイブリッド化のために使用した。斑点を２×ＳＳＣ中１０分間室温で洗浄し、０．２×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ中７０℃における３×１５分洗浄を行い、そして増感スクリーンを使用してＸ線フィルムへ一夜−８０℃において露出した。
【０１１０】
リガンド結合：細胞膜は、最初成育培地を氷冷した低張緩衝液（１ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４，２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で交換することによって調製した。１０〜１５分膨潤した後、細胞をプレートからかき落し、２４，０００ｇにおいて２０分遠心し、トリス等張食塩水（５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，０．９ＮａＣｌ）中セッティング６においてＢｒｉｎｋｍａｎ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーで１０秒分解し、レセプター結合実験のための−７０℃において貯蔵するか、またはアデニレートサイクサラーゼアッセイ（後記）に直ちに使用するため、５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４中に再懸濁し、上記のように遠心し、５０ｍＭトリス中に再懸濁した。結合アッセイのため、膜調製物は解凍し、遠心し（２４，０００ｇ×２０分）、特記した場合を除きトリス等張食塩水中に再懸濁した。膜調製物の部分標本を５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，０．９％ＮａＣｌ，０．０２５％アスコルビン酸、０．００１％ウシ血清アルブミン、 3Ｈ−スピペロンおよび指示した薬物を含んでいる試験管へ加える。（＋）−ブタクラモール（２μＭ）は非特異性結合を規定するために使用した。これは放射性リガンドのＫD 値近くの濃度における総結合の１０％以下であった。アッセイは、飽和分析のため２ｍｌのまたは阻害分析のため１ｍｌの容積において二度実施した。インキュベーションは膜タンパク１０〜５０μｇの添加によって関しされ、そして３７℃において５０分実施し、そして各試験管へ氷冷した緩衝液（１０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，０．９％ＮＣｌ）１０ｍｌの添加によって停止した。サンプルはガラス繊維フィルター（ＳｃｈｌｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ  Ｎｏ．３０）を通して直ちに濾過し、氷冷緩衝液１０ｍｌで洗った。フィルター上に保持された放射能をベックマンＬＳ１７０１シンチレーションカウンターを用いてカウントした。ドパミン結合に対するＧＴＰの効果を調べる実験においては、細胞を収穫し、遠心し、トリス−Ｍｇ++（５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ）中に再懸濁し、１５分間３７℃でインキューベートした。遠心後再懸濁したタンパクを、ＧＴＰまたはＮａＣｌを添加しないトリス−Ｍｇ++，または１２０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１００μＭ  ＧＴＰを添加したトリス−Ｍｇ++を含むアッセイへ加えた。
【０１１１】
ｃＡＭＰおよびＰＲＬアッセイ：細胞を実験３〜７日前に６ウエル，３５ｍｍ皿中にプレートした。細胞は２ｍｌ／ウエルの加温下１０＋０．１％（−）アスコルビン酸＋２ｍＭトリス（ｐＨ７．２）（ＦＡＴ）中５〜１０分プレインキュベートし、１ｍｌ／ウエルのＦＡＴ＋１００μｍ  ＩＢＭＸ＋実験化合物を加え、３７℃において３０分間インキュベートした。実験化合物はアッセイ直前につくったストック溶液から２００〜１０００倍希釈した。最終エタノール濃度はＧＨ4 ＺＲ7 細胞中の基準またはＶＩＰ増強ｃＡＭＰまたはＰＲＬレベルに対し影響のない濃度である、０．１％を決してこえなかった。培地を集め、細胞を沸騰水１ｍｌ中で直ちに分解した。細胞分解物および培地を遠心し（２０００ｇ，１０分，４℃），上清を細胞抽出物としてアッセイのため集めた。細胞抽出物および培地サンプルは、もし直ちにアッセイしなければアッセイまで−２０℃で冷凍した。ｃＡＭＰは、使用した抗体を１：５００希釈して記載した特異性ラジオイムノアッセイ（２２）によってアッセイした。４℃において１６時間インキュベーション後、１０％ＢＳＡ２０μｌおよび９５％エタノール１ｍｌを続いて加え、抗体−抗原複合体を沈澱させた。標準曲線はｃＡＭＰを標準として用い、０．５±０．２ｐｍｏｌのＩＣ50を示した。ＰＲＬは、ＦＡＴ培地中３０分インキュベーションの間ＩＢＭＸを省略したことを除き、上記のようにして得た培地サンプル中でアッセイした。ＰＲＬレベルは抗体−抗原複合体を沈澱するためＳｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ  Ａ分解物（ＩｇＳｏｒｎｂ，Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ）を使用する特異性ラジオイムノアッセイ（２３）によって測定した。
【０１１２】
アデニレートサイクラーゼアッセイ：α32Ｐ−ＡＴＰの32Ｐ−ｃＡＭＰへの転換は、本質上Ｓａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２４）によって記載されたように測定された。膜（１０〜５０μｇ）は１００μｌの容積において、５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，５ｍＭ  ｃＡＭＰ，１ｍＭ  ＩＢＭＸ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２５ｍＭ  ＡＴＰ，３０μｍ  ＧＴＰ，約２×１０6 ｃｐｍのα32Ｐ−ＡＴＰおよび種々の薬物を含んでいるアッセイ２００μｌへ添加された。３回実施されたアッセイは、２５℃へ加温することによって開始され、０℃へ冷却することにより停止された。各アッセイへトリクロル酢酸（３０％溶液１００μｌ）を加え、そして各チューブ 3Ｈ−ｃＡＭＰ（３０，０００ｃｐｍ）を内部標準として加えた。アッセイ容積は水の添加によって１ｍｌへ増量され、チューブは遠心（２０００ｇ×１０分）された。上清中のｃＡＭＰはＤｏｗｅｘ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ4 樹脂および中性アルミナを含むカラム上のシーケンシアルクロマトグラフィーによって単離された。各アルミナカラムからの２ｍｌ溶離物を液体シンチレーション計数のため１０ｍｌのＢｉｏ−ＳａｆｅII（ＲＰＩ，Ｍｏｕｎｔ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔ，ＩＬ）中に溶解した。
【０１１３】
計算：ｃＡＭＰおよびＰＲＬアッセイからのデータは、３回測定の平均±標準誤差として表わされる。曲線あてはめパラメータは、Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒプログラム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ）を使いる非直線回帰分析によって得られた。平均アフィニティー，ＥＣ50およびＩＣ50値は、実験の指示数の幾何平均である。競合実験においては、Ｋ1 値はＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆの方法（２５）により実験的に決定したＩＣ50値から計算された。すべての実験は第４２図に提供したもの（２回）を除いて、独立した３〜５回の試験の代表であった。
【０１１４】
結果：
安定なトランスフェクタントの特徴化：ＧＨ4 Ｃ1 細胞は、ｐＺＥＭ−Ｄ2 −ｃＤＮＡおよびｐＲＳＶ−ネオで同時トランスフェクトされ、抗生物質Ｇ４１８へ抵抗性のコロニーが単離され、最初ノーザン斑分析によって特徴化された。一クローンＧＨ4 ＺＲ7 は、他のクローンより高い２．５ｋｂ  Ｄ2 ＲＡＡレベルを持っていた（第３３図）。野性タイプ（トランスフェクトしない）ＧＨ4 Ｃ1 細胞、そしてｐＺＥＭ−３ベクター３中にラット５−ＨＴ1Aレセプター遺伝子を発現するＧＨ4 Ｃ1 細胞トランスフェクタント（ＧＨ4 ＺＤ10）は、Ｄ2 −レセプタープローブへハイブリッド化を示さなかった。３６時間１０μＭ  ＺｎＳＯ4 によるＧＨ4 ＺＲ4 細胞の前処理は、Ｄ2 レセプターｍＲＮＡの著しい増強を誘発し、転写されたｍＲＮＡは亜鉛感受性メタロチオネインプロモーターによって調節されること（２０）を示す。ＧＨ4 ＺＲ7 クローンは、このクローンにおけるドパミン−Ｄ2 レセプター発現の高レベルのため、以後の分析（後記）のために使用された。
【０１１５】
選択的ドパミン−Ｄ2 レセプターアンタゴニストである 3Ｈ−スピペロンの特異的結合は、ＧＨ4 ＺＲ4 細胞から調製した粗製膜中でアッセイされた（第３４図）。ＧＨ4 ＺＲ7 膜は、ＺｕＭ（＋）ブタクラモールによって置換された 3Ｈ−スピペロン結合の飽和し得る成分を示したが、野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞からの膜は特異的 3Ｈ−スピペロン結合を示さなかった（データ示さず）。５回の実験において、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞膜は２０４６±３１５ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクの最高特異性 3Ｈ−スピペロン結合と、９６±１ｐＭの平均ＫD 値を示した。これらの値は、これら細胞中のドパミン−Ｄ2 結合部位の強い発現と、そしてラット線状膜中に、そしてｐＺＥＭ−Ｄ2 −ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＬｔｋ- 細胞中に得られるもの（１７）に匹敵する 3Ｈ−スピペロンに対する親和性を指示する。
【０１１６】
発現されたドパミン結合部位がＧタンパクと相互作用するかどうか確かめるため、ドパミンによる 3Ｈ−スピペロン結合の阻害を１００μＭ  ＧＴＰおよび１２０ｍＭ  ＮａＣｌの不存在または存在下においてＧＨ4 ＺＲ7 細胞膜中でアッセイした（第３６図）。アッセイはドパミンの高いアフィニティー結合を向上させるため４ｍＭ  ＭｇＣｌ2 の存在下で実施された。添加したＧＴＰおよびＮａＣｌの不存在下では、ドパミンはＩＣ50＝４９±１５μＭと、Ｈｉｌｌ計数０．６９をもって 3Ｈ−スピペロン結合を阻害し、ドパミンに対し高いおよび低いアフィニティー部位の存在を示唆した。２種類の結合部位の存在を推測させるモデルに従ったデータの解析は、レセプターの４６±１５％はドパミンに対し高いアフィニティー（ＫD ＝０．５μＭ）を有し、残りのレセプターはアゴニスト煮対して低いアフィニティー（３０μＭ）を持っていることを示した。ＧＴＰおよびＮａＣｌの存在下においては、ドパミンに対するＩＣ50は、単一性（０．９３）へ近いＨｉｌｌ計数をもって１０９±２０μＭ（ＫI ＝１７μＭ）へ２倍シフトした。このように、ＧＴＰ／ＮａＣｌの存在は、線条細胞調製物中で観察されたように（６，７）、ドパミンレセプターを高いおよび低いアフィニティーレセプターの不均質集団から低アフィニティーアゴニスト集団状態にあるレセプターの殆ど均質な集団へコンバートする。これらのデータは、クローン化したドパミン結合部位はＧＨ4 細胞中に発現させる時Ｇタンパクと相互作用することを示唆する。
【０１１７】
ｃＡＭＰおよびＰＲＬレベルに対するドパミンの作用：発現したドパミン−Ｄ2 レセプタークローンの機能を直接テストするため、細胞ｃＡＭＰレベルに対するドパミンの作用を測定した。これらのアッセイは、これら細胞中のフオスフオジエステラーゼ活性を阻害するため、１００μＭ  ＩＢＭＸの存在下で実施した（２２）。このように、ｃＡＭＰレベルの観察された変化は、ｃＡＭＰの分解の変化ではなくその合成速度の変化を表わす。ベースｃＡＭＰレベルに対するドパミンの作用と、そしてｃＡＭＰのＶＩＰ−増強レベルのドパミン阻害が測定された。ＧＨ4 Ｃ1 細胞は、他者により記載されたように（２２，２６）、ｃＡＭＰ蓄積の増強をもってＶＩＰに応答する（第３７図）。ドパミンは、インキュベーションの間ＶＩＰが存在してもしなくても、野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞における細胞外ｃＡＭＰレベルに対して効果を持たなかった。この結果Ｄ2 −ドパミンレセプターｍＲＮＡおよびＧＨ4 Ｃ1 細胞中の結合欠如（第３４〜３６図）と一致し、これら細胞はドパミンがｃＡＭＰ濃度を上昇させないため検知し得るＤ2 −ドパミンレスポンスを欠いていることを指示する。ＧＨ4 ＺＲ7 からの培地においては、ドパミンはベースｃＡＭＰレベルを阻害し（５０〜７０％）、そしてＶＩＰ−増強ｃＡＭＰをベースレベルへ減少させた。ｃＡＭＰレベルを減少させるドパミンのこれらの作用は、すべて実験に一貫して観察され、そしてドパミンは細胞内ｃＡＭＰレベルの低下にも等しく有効であった（第３８図）。ＧＨ4 Ｃ1 細胞において以前観察されたように、細胞内および細胞外ｃＡＭＰレベルは平行して変化するが、ｃＡＭＰの低回収率のために一層著明であり得る。ｃＡＭＰ蓄積に対するドパミンの作用は、高度に選択的なドパミン−Ｄ2 アンタゴニストである（−）スルピライドによってブロックされるが、非活性立体異性体（＋）スルピライドはｃＡＭＰ蓄積に対するドパミン阻害をブロックしなかった。スルピライドによる立体選択的ブロックは、ドパミンによるＧＨ4 ＺＲ7 中のｃＡＭＰレベルの阻害は野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞中に存在しないドパミン−Ｄ2 レセプターの活性化によって仲介されたことを示した。
【０１１８】
ドパミン作用の生理学的成果は分泌の阻害であり、それはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中の急性（３０分）ＰＲＬ放出を測定することによってアッセイされた（第３９図）。ＶＩＰおよびＴＲＨはＰＲＬ分泌をそれぞれ１．５倍および３倍増強した。ＶＩＰはｃＡＭＰ依存メカニズムによってＰＲＬ放出を増強するものと考えられ（２２，２３，２６）、他方ＴＲＨはカルシウム代謝へリンクしたｃＡＭＰ非依存メカニズムによって作用する（１９，２７）。ドパミンはベースＰＲＬ放出を阻害しないが、ＶＩＰおよびＴＲＨ誘発ＰＲＬ分泌の増強はドパミンによってブロックされた。このようにドパミンはＧＨ4 ＺＲ7 細胞においてｃＡＭＰ依存およびｃＡＭＰ非依存分泌をブロックした。ドパミンのこれらの作用は（−）スルピライドによって逆転されるが、しかし（＋）スルピライドによっては逆転されない。ＧＨ4 Ｃ1 細胞においては、ドパミンはＰＲＬのベース、ＶＩＰ刺激またはＴＲＨ刺激分泌に対して効果を持たなかった（データ示さず）。
【０１１９】
生物学的応答に必要な濃度がドパミン−Ｄ2 レセプターに対するアフィニティーと相関するかどうかを調べるため、ｃＡＭＰレベルに対するドパミン作用について投与量レスポンス関係を調べた（第１５図）。ドパミンは似たｃＡＭＰレベルを強力に阻害した。さらに、ドパミンは、それぞれ８±２ｎＭおよび６±１ｎＭのＥＣ50値をもって、ベースおよびＶＩＰ増強ｃＡＭＰ蓄積を阻害した。これらのデータは、ドパミンは大体等しい強度をもってベースおよび促進ｃＡＭＰ蓄積を阻害することを示す。ドパミンのこれら阻害作用の高強度は、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞が機能的ドパミン−Ｄ2 レセプターを発現するとの主張を支持する。
【０１２０】
ＧＨ4 ＺＲ7 中のｃＡＭＰのＶＩＰ増強レベルのドパミン阻害の薬理学的特異性は、特異性レセプターアンタゴニストを使用してさらに検討された（第４２図）。このデータは、ある種のレセプターアンタゴニストは細胞外ｃＡＭＰのＶＩＰ増強レベルのドパミン誘発阻害を逆転することを示す。最高ｃＡＭＰ（１００％）はＶＩＰ単独の存在下におけるｃＡＭＰレベルに相当した。ドパミン−Ｄ2 アンタゴニスト（スピペロン，（＋）ブタクラモール，（−）スルピライド）の低濃度はドパミン作用をブロックしたが、特異性ドパミンアンタゴニストであるＳＣＨ２３３９０は非常に高濃度においてのみ活性であった。Ｄ2 −アンタゴニストの不活性立体異性体（−）ブタクラモール，（＋）スルピライド（第３９図）はドパミン作用に対し少ししかまたは全く効果がなかった。ドパミン不存在下添加したアンタゴニストはｃＡＭＰ濃度を変えなかった。アンタゴニストに対するＩＣ50値から得た推測ＫI 値（第４２図の説明を見よ）は、ドパミンレセプターの結合競合研究（１７）から決定した値に似ており、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞中ドパミンによるｃＡＭＰレベルの阻害は、ドパミン−Ｄ2 レセプターと薬理学的に区別されるレセプターによって仲介されることを示す。
【０１２１】
アデニレートサイクラーゼの阻害：ドパミンレセプターアゴニストによるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害を直接評価するため、32Ｐ−ＡＴＰの32Ｐ−ｃＡＭＰへの変換をＧＨ4 ＺＲ7 細胞から調製した膜中で測定した（第４３図）。ドパミンは総フォルスコリン（１０μＭ）刺激活性を０．３６μＭ（ｎ＝５）の平均ＥＣ50値をもって４５％阻害した。下垂体において（１１）そして線状（２８）膜において観察されたように、ブロモクリプチンは部分的アゴニストとして行動し、酵素活性を最高２３％阻害した（ＥＣ5 ＝６ｎＭ）。選択的Ｄ2 −アゴニストによるアデニレートサイクラーゼ活性の阻害は立体選択的であった。例えば、キンピロールはフォルスコリン刺激サイクラーゼ活性を４１％（ＥＣ50＝０．３２ｎＭ）阻害したが、ＬＹ１８１９９０すなわちキンピロールの不活性（＋）エナンチオマーは酵素活性の一貫した減少を生じなかった。同様に、（＋）３−ＰＰＰ（ＥＣ50＝０．８６ｎＭ）はドパミンのように有効であったが、エナンチオマー（−）３−ＰＰＰはアデニレートサイクラーゼ活性を一貫して減少しなかった。ＶＩＰもＧＨ4 ＺＲ7 細胞膜において、野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞膜について報告されているように（２９）、アデニレートサイクラーゼ活性を刺激した。２００ｍＭ  ＶＩＰにより刺激された総活性は２２±７ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク／分（ｎ＝３）であり、そしてＶＩＰ増強活性はラット前下垂体膜中５０〜５０％阻害（１１）と比較して、ドパミン（１００μＭ）によって４１％阻害された。これら調製物においてベースアデニレートサイクラーゼ活性に対するドパミンの効果は観察されなかった。それにもかかわらず、ドパミンによるフォルスコリンまたはＶＩＰ刺激アデニレートサイクラーゼ活性の阻害は、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞におけるドパミンによるｃＡＭＰ蓄積の阻害の可能性あるメカニズムを提供する。
【０１２２】
百日咳トキシン感受性：百日咳トキシンに対する感受性は、レスポンスを誘発するように阻害Ｇタンパク（例えばＧｉまたはＧｏ）へ結合する、ドパミン−Ｄ2 レセプター（６〜１２，１５）のようなレセプターの品質証明である。１６時間の百日咳トキシンによるＧＨ4 ＺＲ7 細胞の前処理（第３０図）は、フォルスコリン刺激膜アデニレートサイクラーゼ活性のドパミン仲介阻害を解離し、ドパミンによるベースおよびＶＩＰ刺激ｃＡＭＰ蓄積の阻害を破壊した。使用した百日咳トキシン濃度およびインキュベーション時間は野性タイプ細胞におけるソマトスタチンレスポンスの最高ブロックを生じ（３０）、そしてドパミンレスポンスはこれらの条件下で殆ど完全に阻害された。対照的に、ベースおよびＶＩＰ刺激ｃＡＭＰ蓄積、およびベースおよびフォルスコリン刺激サイクラーゼ活性は百日咳トキシン前処理によって有意に変化しなかった。これらデータは、発現されたｃＤＮＡクローンはＧＨ4 細胞中に存在する阻害Ｇタンパクへ機能的に結合し、そのため善意のレセプターを代表するドパミン−Ｄ2 結合部位をコードするという主張を支持する。
【０１２３】
議論
ドパミン−Ｄ2 結合部位をコードするｃＤＮＡクローンは、該クローンがアデニレートサイクラーゼ阻害、ｃＡＭＰ蓄積、およびＰＲＬ分泌の阻害（６〜１２，１５）へ百日咳トキシン感受性阻害Ｇタンパクによって結合される、機能的Ｄ2 レセプターを発現するかどうかを決定するため、ＧＨ4 Ｃ1 細胞中に発現された。ドパミン−Ｄ2 レセプターは、ＧＨ4 ＺＲ7 トランスフェクタント中のＤ2 レセプターｍＲＮＡの存在によって証明されるように、マウスメタロチオネインプロモーター（２０）の制御下Ｄ2 −ｃＤＮＡ構造から特異的に発現された。ドパミン−Ｄ2 レセプターｍＲＮＡレベルはトランスフェクトしないＧＨ4 Ｃ1 細胞中、またはラット５−ＨＴ1Aレセプターサブタイプでトランスフェクトした細胞中において検出できなかった（第３３図）。ＧＨ4 ＺＲ7 細胞中に発見されたｍＲＮＡスペシスはラット脳中に見られるＤ2 レセプターｍＲＮＡと大体同じ分子量であった（１７）。ドパミン−Ｄ2 ｍＲＮＡのレベルはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中１００μＭ  Ｚｎ++の添加によって増加し、ｍＲＮＡの発現はＺｎ++感受性マウスメタロチオネインプロモーターによって制御され、内因性遺伝子の転写を表わさないことを指示する。 3Ｈ−スピペロン結合の特異的結合はＧＨ4 ＺＲ7 細胞のみに存在し、１００μＭ  Ｚｎ++によって増加され、そのためこれら細胞におけるドパミン−Ｄ2 レセプターｍＲＮＡの発現に相関した。Ｄ2 −レセプターｍＲＮＡはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中の高アフィニティードパミンＤ2 結合部位の強力な発現が得られるように転写された。
【０１２４】
ＧＨ4 ＺＲ7 トランスフェクタント中のドパミン−Ｄ2 結合の存在は、ｃＡＭＰの強力な阻害およびＰＲＬ放出と、フォルスコリン刺激アデニレートサイクラーゼ活性の阻害に相関したが、ドパミンの作用はトランスフェクトしないＧＨ4 Ｃ1 細胞に見られなかった。ドパミンのこれら阻害作用は、下垂体ラクトトロフ中のドパミンの既知の生理学的作用（１，２）と正確に一致する。特に、ドパミンは、これらのプロセスの刺激はドパミン濃度が低濃度へ減少しない限り発生しないように、ラクトトロフ中のＰＲＬ分泌およびｃＡＭＰ蓄積を制御する（１，３〜５）。同様に、ドパミンの最高濃度の存在下、ＶＩＰはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中のｃＡＭＰレベルまたはＰＲＬ分泌を増強しない（第３９図）。ＧＨ4 ＺＲ7 細胞中のベースおよびＶＩＰ増強ｃＡＭＰ蓄積のドパミン阻害の強度（第４０図）は、下垂体門血流中のドパミン濃度が発情前記のメスラットにおいて７ｎＭから発情中２０ｎＭに変化し、そしてオスラットにおいては３ｎＭであること（３１）を考慮に入れ、ラクトトロフについて期待される濃度範囲内であった。特異性アゴニストおよびアンタゴニストを使用するアデニレートサイクラーゼおよびｃＡＭＰ蓄積のドパミン誘発阻害の薬理の詳細な解析は、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞中のドパミン作用はドパミン−Ｄ2 レセプターとは区別し得るレセプターによって仲介されるとの結論と完全に一致する。
【０１２５】
ドパミンの測定されたアフィニティー（第３６図）とｃＡＭＰ蓄積阻害するドパミンの強度（第３６図）との間の食い違いは、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞は全分のレセプターを持っていること、すなわち生物学的作用のためのＥＣ50をＫD 値より低い値シフトされるのに十分に過剰の結合部位を持っている可能性を生ずる。代りの説明の一つは、膜調製物中のレセプターは細胞自体よりもアゴニストに対して低アフィニティーを持っている（しかし測定したＩＣ50値はＫI ）値に相関しているからアンタゴニストに対するアフィニティーは不変）ということである。そのままの細胞中に存在する細胞質ゾルまたは膜関連成分は膜結合およびアデニレートサイクララーゼアッセイ条件では完全に置換されないから、膜調製物中のドパミンレセプターの最適機能を許容する成分が欠けている可能性がある。この主張はドパミンによる粒状アデニレートサイクラーゼの阻害に対するＥＤ50値、すなわち結合競合実験からドパミンに対して得られたＫI 値（５００ｎＭ）に近い値と、しかしそのままの細胞においてドパミンによるｃＡＭＰレベルの阻害に対して得られた１００倍高いＥＣ50値（６〜８ｎＭ）によって支持される。この条件の差はそのままの細胞対細胞調製物間のアッセイに見られた差を説明し得る。しかしながら、アンタゴニストのアフィニティーはｃＡＭＰ蓄積実験から得られた推定ＫI 値（第４２図）と良く相関し、アンタゴニスト結合は膜および全細胞において同様であることを指示した。
【０１２６】
発現されたドパミン−Ｄ2 結合部位のＧタンパクへの結合の別の証拠は、ＧＴＰの存在下ドパミン結合アフィニティーの低アフィニティーへのシフトである。このようなアフィニティーのＧＴＰ誘発シフトはラット脳からの膜におけるドパミン結合について報告されており（６，７）、そしてレセプターとＧタンパクとの相互作用のためである（８，９）。ＧＴＰの存在下、Ｇタンパクはレセプターから解離し、レセプターを低アフィニティーアゴニスト状態に置く（６，７）。ドパミンの場合、この二つの状態間のアフィニティーの差は小さく、そのため低アフィニティー状態へのＧＴＰ誘発シフトは小さく（２倍）、そしてＧタンパクの解離を最大にするためＮａ+ イオンの存在を必要とする（２８）。ドパミンアフィニティーにおけるＧＴＰ−誘発シフトの観察は、発現されたレセプターはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中の一種以上のＧタンパクと関連していることを示唆する。
【０１２７】
ドパミンの阻害作用は、レセプターが阻害Ｇタンパクへ結合することを指示するが、これは阻害Ｇタンパクを不活性化するようにＧＨ4 ＺＲ7 細胞を百日咳トキシンで前処理することによって一層直接的にテストされた（３０）。百日咳トキシン前処理は、ベースまたはＶＩＰ誘発ｃＡＭＰ蓄積を変えることなく、ドパミン作用を完全にブロックした。このように、百日咳トキシンは、多分ドパミン−Ｄ2 レセプターを阻害Ｇタンパクから解離することにより、生物学的レスポンスのドパミン増強形質導入を阻止した。他の系（３２）と異なって、しかし野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞（３０）と同様に、スチミュレーター（例えばＶＩＰ）によるｃＡＭＰレベルの増強は百日咳トキシン処理ＧＨ4 ＺＲ7 細胞においては増強されないし、ベースｃＡＭＰレベルも百日咳トキシンによって変化しなかった。これはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中に存在する阻害ＧタンパクはｃＡＭＰ生産を強くするように阻害しないことを示唆する。
【０１２８】
ＧＨ4 Ｃ1 細胞上のソマトスタチンレセプターの存在は、ソマトスタチンとドパミンの阻害作用の直接比較を許容する。ドパミンと同様に、ソマトスタチンはベースアデニレートサイクラーゼ活性（２９）またはベースＰＲＬ分泌（３０）を阻害しない。ＧＨ4 Ｃ1 細胞におけるＶＩＰ刺激サイクラーゼ活性（２９）、ＶＩＰ増強ｃＡＭＰ蓄積（２２）、およびＰＲＬ分泌（２３，３０）のソマトスタチン誘発阻害は、すべてＧＨ4 ＺＲ7 細胞においてドパミンによって誘発された最大阻害の約半分であった。ドパミンの大きな効果はＤ2 レセプターの過剰数の存在のためではなかった。これはｃＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ分泌実験の条件下でのレセプター数は、ＧＨ4 Ｃ1 細胞中のソマトスタチンレセプター数（１３，０００部位／細胞）（３３）より少ない１０，０００部位／細胞以下であったからである。
【０１２９】
これら細胞に発現されたドパミンレセプターは形質導入阻害作用においてソマトスタチンよりも有効であることが明らかであり、ＧＨ細胞に存在するＧタンパクに対するドパミンレセプターの一層効果的な結合を示唆する。
【０１３０】
ＧＨ4 Ｃ1 細胞におけるドパミン−Ｄ2 レセプターｃＤＮＡの発現の第２の理由は、ドパミン作用およびＤ2 レセプターメカニズムを研究する新しいモデルを確立することである。今日までドパミンＤ2 レセプターを発現する最も入手し易い細胞系であるラットラクトトロフ中のドパミン作用の現在の研究は、ドパミン阻害のメカニズムについて多岐の結論へ導いた。ノイロンにおいて、ドパミンはＤ2 レセプターが阻害Ｇタンパクへ結合することによって仲介される作用である（１５）、カリウムチャンネルを開くこと（３５）による膜電位を高分極する（３４）。ラクトトロフにおけるドパミンによって誘発された膜高分極（３６）はカルシウムチャンネルを閉じ、ベースカルシウム流入束を減らし、ドパミンによって誘発されたベース〔Ｃａ++〕の観察された低下（１３〜１５，３７，３８）を説明するであろう。しかしながら、ドパミンはある種の下垂体細胞において〔Ｃａ++〕を増加することが観察されている（３７）。ＧＨ4 ＺＲ7 細胞中の〔Ｃａ++〕のドパミン誘発変化を検討することにより、Ｄ2 レセプターが〔Ｃａ++〕の変化に特異的に関連し、そしてホルモン分泌のドパミン阻害の仲介において〔Ｃａ++〕の役割を確かめることが可能になるであろう。他の解決されない論争の一つは、ドパミンが分泌の増強を阻止し、そしてＴＲＨのようなカルシウム移動ホルモンによって阻害するメカニズムである。あるものはフォスファチジルイノシトール代謝（３９，４０）および〔Ｃａ++〕（１３，１４）のＴＲＨ誘発増強のドパミンによる阻害を報告し、他のものは変化を認めていない（３８，４１）。ＧＨ4 ＺＲ7 細胞においてドパミンによるＴＲＨ誘発ＰＲＬ放出の認められた阻害は、ドパミンはＴＲＨ誘発カルシウム移動またはフォスファチジルイノシトール代謝を変えるブロセス（例えばカリウムチャンネルの開口）へＧタンパクによって結合されることができることを示唆する。ＧＨ4 ＺＲ7 細胞は、ドパミン−Ｄ2 レセプターのメカニズムに関するこれらおよび他の疑問を研究するための均質な、豊富なそして高度に応答性の調製物を提供するであろう。
【０１３１】
この報告に提供されたデータは、発現されたクローン（１７）は、ＰＲＬ分泌、ｃＡＭＰ生産、およびアデニレートサイクラーゼ活性を含む検討されたすべての作用において、ドパミン−Ｄ2 レセプターの薬理を持っていることを指示する。Ｄ2 クローン、１）ドパミン−Ｄ2 結合部位のためのｃＤＮＡクローンはＧタンパク結合レセプターの原型構造を有する；２）該クローンは飽和し得るそして特異性結合性質を持ったタンパクを発現する；３）発現された結合部位に対するアゴニスト結合アフィニティーはＧＴＰの存在下減少する；４）発現されたレセプターはＧタンパクによって規制されることが既知の機能（例えばアデニレートサイクラーゼの阻害）へ結合される；５）Ｇタンパクを解離する剤（例えば百日咳トキシン）は適当するレスポンスの発生から発現されたレセプターの活性化を解離する；との機能的Ｇタンパク結合レセプターとしての分類のための五つの基本的基準を満たす。結論として、クローン化したドパミン−Ｄ2 レセプターとＧタンパクとの相互作用は生産的であり、αi またはαo サブユニットへ導びき、そしてｃＡＭＰ依存性およびｃＡＭＰ非依存性メカニズムによるｃＡＭＰおよびＰＲＬレベルの阻害へ導びく。
【０１３２】
【表７】
0004122403.tif 000008
【０１３３】
【表８】
0004122403.tif 000009
【０１３４】
【表９】
0004122403.tif 000010
【０１３５】
脚注
１  使用した略語は以下のとおり。
ＰＲＬ，プロラクチン；ＧＨ，成長ホルモン；〔Ｃａ++〕，細胞質ゾル不含カルシウム濃度；ＶＩＰ，血管活性腸ペプチド；ＴＲＨ，タイロトロピン放出ホルモン；ＩＢＭＸ，３−イソブチル−１−メチルキサンチン；ＫD ，平衡解離定数；ＥＣ50（ＩＣ50），５０％最大効果（阻害）を誘発するのに必要な濃度。
２  これらの結果は一部第７１回Ａｎｎｕａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡにおいて発表。抄録＃１２７８３  Ａｌｂｅｒｔ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，投稿準備中
【０１３６】
実施例３
要約
ヒトドパミンＤ2 レセプターをコードするクローンを下垂体ｃＤＡＮライブラリーから単離し、配列化した。推論されたタンパク配列は、一つの主な差をもってクローン化したラットレセプター〔Ｂｕｎｚｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ  ３３６，７８３−７８７〕と９６％同じである。ヒトレセプターはその推定３番目細胞質ループ中に追加の２９個のアミノ酸を含んでいる。サウザン班は１種だけのヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子の存在を示した。この遺伝子を含む２種の重複するファージが単離され、特徴化された。これらクローンのＤＮＡ配列分析は、コーディング配列は６個のイントロンによって中断され、そしてヒト下垂体レセプター中に存在する追加のアミノ酸は８７ベースペアの単一エキソンによってコードされることを示した。代替スプライシングにおけるこの配列の関与およびその生物学的意義が論ぜられる。
【０１３７】
序説
霊長類中枢神経系中のドパミンニューロンは、運動の開始および実行、感情安定性の推持、および下垂体機能の調節に関与する。パーキンソン病（１）および分裂症（２）を含むヒト神経病は、ドパミンレセプターとドパミンの間のインバランスの発現であると考えられる。ドパミンの効果を仲介するレセプターはＤ1 およびＤ2 サブタイプに分けられ、それらはそれらのＧタンパク結合（３，４），リガンド特異性、解剖学的分布および生理学的効果（５）によって区別し得る。ドパミンＤ2 レセプターは、プロラクチン分泌の調節（６）および抗精神薬に対するアフィニティー（７，８）の故に特別の臨床的関心である。
【０１３８】
ドパミンＤ2 レセプターはＧタンパク結合レセプターのファミリーに属す。このファミリーのメンバーが占める配列類似性は、我々がラット脳ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡをクローンすることを可能にする（９）。我々は、ここに記載するヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡを単離するためのこのクローンを使用した。これら二つのレセプターの推論されたアミノ酸配列は一つの著しい相違点を除いて非常に似ている。ヒトレセプターは、遺伝子のエクソンの一つによってコードされるその推定３番目細胞質レープ中に追加の２９個のアミノ酸を含んでいる。このゲノム組織は、２種のドパミンＤ2 レセプターｍＲＮＡの存在は代替スライシングイベントの結果であることを示唆する。
【０１３９】
材料および方法
ヒト下垂体ｃＤＮＡのクローニング
ヒト下垂体組織はカナダのＣｌｉｎｉｃａｌ  ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｄｅ  ｏｆ  ＭｏｎｔｒｅａｌのＮ．ＳｅｉｄａｈおよびＭ．Ｃｈｒｅｔｉｅｎ博士からの親切な贈物であった。ポリ（Ａ）ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡは以前記載された方法（９）で調製した。ｃＤＮＡはアガロースゲル上でサイズ選別（１〜６ｋｂ）し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ  １０１）を使用して単離し、ＥｃｏＲＩアダプターへリゲートし、そしてパッケージ（Ｇｉｇａｐａｋ  Ｇｏｌｄ）した。組換物（１．５×１０6 ）はレプリカナイロンフィルター（デュポンプラック／コロニーハイブリダイゼーションフィルター）上で〔32Ｐ〕標識ハイブリダイゼーションプローブでスクリーンされた。前ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ，２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ７）中３７℃で実施された。ＤＮＡの両方のストランドの完全な配列は、合成オリゴヌクレオチドをプライムしたシーケナーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてＭ１３ｍｐ１９中で決定された。
【０１４０】
発現および薬理
２．５ｋｂヒト下垂体とｃＤＮＡ（ｈＰｉｔＤ2 ）はｐＺｅｍ3 （Ｄｒ．Ｅ．Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓからの贈物）へクローンされ、ＣａＰＯ4 沈澱によってマウスＬｔＫ- 中へｐＲＳＶｎｅｏと共に同時トランスフェクトされた。安定なトランスフェクタントが選ばれ、Ｇ４１８（ゲネチシン硫酸塩，Ｇｉｂｃｏ）の７５０μｇ／ｍｌ中に保持された。膜収穫２０時間前に、これら細胞は７０μＭ硫酸亜鉛とインキュベートされた。膜はＬ−ＨＰｉＤ2 Ｚｉｍから、クローンしたラットドパミンＤ2 レセプターを発現するＬｔＫ- 細胞ライン（Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１）から、そして新たに分離したラット線条体（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）から、以前記載された（１１，１２）ように調製された。結合アッセイのため、膜タンパクはＬ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍからは１０〜１５μｇにおいて、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１からは５０〜７５μｇにおいて、ラット線条体からは２２０〜２５０μｇにおいて使用された。結合アッセイは、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ2 ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ，ｐＨ７．４中３７℃で６０分インキュベートされ、そしてガラスフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｎｏ．３２）上の急速濾過によって停止された。フィルターは０．５％ポリエチレンイミン中に事前浸漬した。フィルターは氷冷５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４中で２回洗った。飽和曲線は高度にＤ2 特異性アンタゴニスト〔 3Ｈ〕ドムペリドン（１３）の上昇する濃度を使用して発生させた。アンタゴニスト薬物はそれらの特異性結合〔 3Ｈ〕ドムペリドン（１ｎＭ）を阻害するそれらの能力について評価した。Ｂｍａｘ，Ｋｄ，およびＩＣ50値は以前記載された方法（１４）のように決定した。
【０１４１】
サウザンブロッティング
正常男性ドナーから調製したヒトゲノムＤＮＡはＭ．Ｌｉｔｔからの贈物であった。ＤＮＡ  ３μｇを制限酵素で消化し、フラグメントを０．７％アガロース中で電気泳動し、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）上へブロットした。前ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、以前記載されたように（１５）５０％ホルムアミド中３７℃において実施された。
【０１４２】
ゲノム配列決定
正常ヒト男性ＤＮＡから調製したゲノムバクテリオファージラムダライブラリーは、Ｓｔｒａｔｒａｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入し、そしてクローンしたラットドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの一部分づつでスクリーンした。ＤＮＡ配列はゲノム配列決定アプローチ（１６，１７）によって決定された。要約すると、使用した各制限酵素について、クローンしたゲノムファージＤＮＡ（５０μｇ）が消化され、化学的開裂にかけられ、そして得られたフラグメントが変性するポリアクリルアミドゲル中で分割された。次にＤＮＡはゲルから移されたナイロンフィルター（Ｐｌａｓｃｏ  Ｇｅｎｅｔｒａｎ）上に固定された。〔32Ｐ〕末端標識合成オリゴマーを使用して、配列の梯子がエクソン内に可視化され、隣接するイントロン中に読取られた。次にフィルターは異なるオリゴマーでプローブされるか、またはエクソンを横断して戻る補完的配列を読取るため新しいフィルターがつくられた。コーディング区域の両方のスタンダードが配列決定された。
【０１４３】
結果
ヒト下垂体ｃＤＮＡのクローニングおよび配列分析
プローブとしてラット脳Ｄ2 レセプターｃＤＮＡを使用し、ヒト下垂体ライブラリーから３種の部分的ｃＤＮＡが単離され、配列決定された。これら配列に基づく２種のオリゴヌクレオチドプローブがレセプタータンパクの全長（第４５〜５４図）をコードする４番目のｃＤＮＡ  ｈＰｉｔＤ2 を単離するために使用された。ヒト下垂体レセプターは７個の推定トランスメンブレン領域を含み、そしてシグナル配列を欠いている。全体として、ヒトおよびラットヌクレオチド配列は９０％類似であり、アミノ酸レベルにおいて９６％同一であることを示す。Ｎ−結合グリコシル化、タンパクキナーゼＡフォスフォリル化およびパルミトイル化のためのいくつかの一致した配列（１８）がヒトおよびラットレセプター間に保存される。これらタンパク間には１８個のアミノ酸の違い（１個の欠如を含む）があり、驚くべきことにヒトレセプターはその推定３番目細胞ループ中追加のアミノ酸２９個を含んでいる。
【０１４４】
ｈＰｉｔ  Ｄ2   ｃＤＮＡの発現および薬理学的評価
ヒト下垂体レセプターの薬理学的特徴を評価するため、そのｃＤＮＡをｐＺｅｍ３中にサブクローンし、マウスＬｔｋ- 細胞中に発現させた（Ｌ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍ）。これら細胞から調製した膜は、４．０５±０．３ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク（ｎ＝２）のＢｍａｘおよび０．７４±０．１１ｎＭ（ｎ＝２）のＫｄ値をもって、Ｄ2 選択性アンタゴニストである（１２，１３）〔 3Ｈ〕ドムペリドンとの特異性結合を示した。このＫｄ値は、マウス脳細胞膜中の公表された値０．７４ｍＭと良く一致している。このデータのＳｃａｔｃｈａｒｄプロットは直線であった。ｐＺｅｍ３のみでトランスフェクトした細胞から調製した膜には検出し得る〔 3Ｈ〕ドムペリドン結合は存在しなかった（データ示さず）。Ｌ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍに対する〔 3Ｈ〕ドムペリドン結合は多数のドパミンＤ2 特異性薬物によって阻害された（第５４図）。それらの強さの順序は、スピペロン，（＋）ブタクラモール，ハロペリドールおよびスルピライドの順であった。セロトニン選択性アンタゴニストであるミアンセリンおよびＤ1 選択性アンタゴニストであるＳＣＨ−２３３９０は、不活性異性体（−）ブタクラモールと同様に、非常に高濃度においてのみドムペリドン結合を阻害した。これらの値は、クローンしたラットドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡでトランスフェクトしたＬｔｋ- 細胞（Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１）から、そしてラット線条細胞からの膜について得たものに実質上同じである（第５８図）。
【０１４５】
ヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子
プローブとしてラットｃＤＮＡを一部分づつ使用し、ヒトゲノムライブラリーからクローンを単離した。このゲノムクローン，λＨＨ２Ｇ１は、ヒトＤ2 レセプターの最後の６４個のアミノ酸をコードする１．６ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメントと、そして３’非コード配列の１．２ｋｂを含んでいた。１．６ｋｂフラグメントは３種の制限酵素を消化したヒトゲノムＤＮＡのサウザンブロットをプローブするために使用された。各酵素はプローブへハイブリッド化された単一フラグメントを生成し（第５６図）、多分１種だけのヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子が存在することを指示する。
【０１４６】
ヒトレセプタータンパクのＮ末端をコードするゲノムクローンを単離するため、クローンしたラットドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡからの１１８ｂｐ制限フラグメント（アミノ酸残基１−３９に相当）が２番目のゲノムライブラリーをスクリーンするために使用された。λＨＤ２Ｇ２が単離され、４００個のヌクレオチドだけλＨＤ２Ｇ１と重複することが発見された。これらファージはヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子位置の３４ｋｂ  ＤＲＤ２をスパンし（１９）、そしてｈＰｉｔＤ2 ｃＤＮＡに見られる配列と、それにポリアデニル化シグナルの下流３．７ｋｂおよびほん訳開始部位の上流３．７ｋｂを延びる配列を含んでいる。この遺伝子のイントロン／エキソン構造を特徴化するため、オリゴヌクレオチドプローブおよび化学的開裂を採用するゲノム配列決定アプローチが使用された（第５７図）。このレセプターファミリーのヒトおよびラットメンバー間のヌクレオチド配列の違いは約１０％（未発表所見）であるため、我々はクローンしたラットドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡ中に存在するハイブリダイゼーションプローブおよび制限部位に依存してゲノム配列決定を開始することができた。我々の結果は、ヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子のコーディング部分は７個のエキソンに分れることを示した（第５７図）。興味あることに、エキソン５は８７ｂｐ長さであり、そしてクローンしたヒト下垂体レセプターに存在する２９個のアミノ酸配列全体をコードすることを発見した（第４５〜５４，５７図）。６個のイントロンの分析は、第２３図に要約するように、各自ＧＴ／ＡＧ規則（２０）に一致するアクセプターおよびドナー配列を含むことを明らかにした。これらイントロンの大体のサイズはサウザンブロティング実験の結果に基いたものである（データ示さず）。比較する時、ゲノムおよびｃＤＮＡ配列は二つの過渡点、一つは９３９（遺伝子においてＴからＣ）および他は９５７（遺伝子においてＣからＴ）において異なるだけであることが判明した。
【０１４７】
議論
我々のヒト下垂体Ｄ2 レセプターｃＤＮＡクローンに存在する余分の配列についていくつかの仮説を立てることができる。一つの可能性は、ヒト遺伝子はラット遺伝子が持っていない余分の８７個の塩基を含んでいることである。他の一つは、ヒトおよびラットの両方は２種の異なるドパミンＤ2 レセプターをコードする２種の異なる遺伝子を持っていることである。最後に、単一転写の代替スプライシングは１個のｍＲＮＡとそして８７個塩基なしの他のものを生ずることがあり得る。この最後の仮説の支持として、我々は多分１種だけのヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子ＤＲＤ２が存在すること、および８７ｂｐ配列はその遺伝子の別のエキソン上に含まれていることを示した。さらに、我々は８７ｂｐ配列を含むラット脳ｃＤＮＡをクローンした（未発表結果）。この配列はヒトｃＤＮＡに高度に類似であり、２９残基を含んでいるドパミンＤ2 レセプターはヒト下垂体独自のものでないことを確立した。
【０１４８】
Ｌ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍに発現されたヒトドパミンＤ2 レセプターは、ラット線条およびＬ−ＧＢ２Ｚｅｍ−１膜と実質上同じ薬物結合プロフィルを有する。それ故、アミノ酸２９個は結合に影響しないから、それらはレセプター機能の他のレベルにおいて関与し得る。例えば、β2 −アドレナリンレセプターの３番目の細胞質ループは適切なＧタンパク結合に必要であることが示されている（２１）。それ故、一つの可能性は、この配列はドパミンＤ2 レセプター刺激がアデニルサイクラーゼを阻害し、カリウムチャンネル伝導度を活性化するかまたはカルシウム移動を阻害するかどうかに影響し得ること（２２）である。他の可能性の一つは、２９個アミノ酸が後部シナプスドパミンＤ2 レセプターを前記シナプス自己レセプターから分化すること（２３）である。コンピューター検索（ＶＡＸ／Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）は有意な同族性の他の配列を同定するのに失敗したので、我々はこの配列はＤ2 レセプター独自のものであると考える。
【０１４９】
ゲノムおよびｃＤＮＡ配列の比較に基いて、ヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子は少なくとも７種のエキソンに分けられる。ムスカリンレセプター遺伝子の場合そうであることが示されたように（２４），遺伝子の５’端に一以上の追加のエキソンが固定されずに残っていることもあり得る。
【０１５０】
イントロンによるコーディング配列の中断はヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子を、オプシン遺伝子（２５）を除いてＧタンパク結合レセプター遺伝子ファミリーの大多数の他のメンバーから区別する。有意義な観察の一つは、このヒト遺伝子中二つのイントロン（Ｎｏ．３および５）の配置はウシおよびＤｒｏｓｏｐｈｉａオプシン遺伝子（２６，２７）に保存されたイントロン位置に殆ど正確に対応することである。この発見の最も簡単な解釈は、約１０億年令の遺伝子であるそれらの共通の祖先（２８）がこれらのイントロンを含んでいたことである。我々の遺伝子構造の特徴化は、エキソンがタンパク構造の認識し得るエレメントをコードする証拠を提供する（２９）。そのようなイントロンはトランスメンブレンセグメントII，III ，およびIVの後に見られ（第４５〜５４，５７図を見よ）、繰り返し構造がこれらレセプターの特徴をモチーフするとの議論が内部重複化によって発生し得る。さらに、３番目細胞質ループ内のいくつかのイントロンの存在は、ファミリーにわたって観察された長さの実質的変動の良い説明を提供する（３０）。
【０１５１】
構造的に別の形へ発展する代替的にスプライスされたドパミンＤ2 レセプターｍＲＮＡの可能性は興味深い。ドパミンＤ2 レセプターｍＲＮＡの一つの形または他の形の発現は、ヒト疾病に関する含蓄を持ち得るコントロールレベルを表わす。
【０１５２】
【表１０】
0004122403.tif 000011
【０１５３】
【表１１】
0004122403.tif 000012
【０１５４】
SEQUENCE LISTING
<110> Civelli Olivier
Bunzow, James R.
Grandy, David K.
Machida  Curtis A.
<120> Dopamine Receptors and Genes
<130> 90-1092-PP
<140> 298978/1999
<141> 1999-10-21
<150> 501298/1990
<151> 1991-05-18
<160> 25
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 2455
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS
<222> (128)..(1372)
<400> 1
ggctgccgga gcggcggccg tgcgtggatg cggcgggagc tggaagcctc gagcagccgg 60
cgccttctct ggccccgggc gccatatggc ttgaagagcc gtgccaccca gtggccccac 120
tgcccca atg gat cca ctg aac ctg tcc tgg tac gat gac gat ctg gag   169
Met Asp Pro Leu Asn Leu Ser Trp Tyr Asp Asp Asp Leu Glu
1               5                   10
agg cag aac tgg agc cgg ccc ttc aat ggg tca gaa ggg aag gca gac   217
Arg Gln Asn Trp Ser Arg Pro Phe Asn Gly Ser Glu Gly Lys Ala Asp
15                  20                  25                  30
agg ccc cac tac aac tac tat gcc atg ctg ctc acc ctc ctc atc ttt   265
Arg Pro His Tyr Asn Tyr Tyr Ala Met Leu Leu Thr Leu Leu Ile Phe
35                  40                  45
atc atc gtc ttt ggc aat gtg ctg gtg tgc atg gct gta tcc gca gag   313
Ile Ile Val Phe Gly Asn Val Leu Val Cys Met Ala Val Ser Ala Glu
50                  55                  60
aag gct ttg cag acc acc acc aac tac ttg ata gtc agc ctt gct gtg   361
Lys Ala Leu Gln Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Val Ser Leu Ala Val
65                   70                 75
gct gat ctt ctg gtg gcc aca ctg gta atg ccg tgg gtt gtc tac ctg   409
Ala Asp Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Met Pro Trp Val Val Tyr Leu
80                  85                  90
gag gtg gtg ggt gag tgg aaa ttc agc agg att cac tgt gac atc ttt    457
Glu Val Val Gly Glu Trp Lys Phe Ser Arg Ile His Cys Asp Ile Phe
95                  100                 105                 110
gtc act ctg gat gtc atg atg tgc aca gca agc atc ctg aac ctg tgt   505
Val Thr Leu Asp Val Met Met Cys Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys
115                 120                 125
gcc atc agc att gac agg tac aca gct gtg gca atg ccc atg ctg tat    553
Ala Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Ala Met Pro Met Leu Tyr
130                 135                 140
aac aca cgc tac agc tcc aag cgc cga gtt act gtc atg att gcc att    601
Asn Thr Arg Tyr Ser Ser Lys Arg Arg Val Thr Val Met Ile Ala Ile
145                 150                 155
gtc tgg gtc ctg tcc ttc acc atc tcc tgc cca ctg ctc ttc gga ctc    649
Val Trp Val Leu Ser Phe Thr Ile Ser Cys Pro Leu Leu Phe Gly Leu
160                 165                 170
aac aat aca gac cag aat gag tgt atc att gcc aac cct gcc ttt gtg   697
Asn Asn Thr Asp Gln Asn Glu Cys Ile Ile Ala Asn Pro Ala Phe Val
175                 180                 185                 190
gtc tac tcc tcc att gtc tca ttc tac gtg ccc ttc atc gtc act ctg    745
Val Tyr Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val Pro Phe Ile Val Thr Leu
195                 200                 205
ctg gtc tat atc aaa atc tac atc gtc ctc cgg aag cgc cgg aag cgg   793
Leu Val Tyr Ile Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg
210                 215                 220
gtc aac acc aag cgc agc agt cga gct ttc aga gcc aac ctg aag aca    841
Val Asn Thr Lys Arg Ser Ser Arg Ala Phe Arg Ala Asn Leu Lys Thr
225                 230                 235
cca ctc aag gat gct gcc cgc cga gct tag gag ctg gaa atg gag atg   889
Pro Leu Lys Asp Ala Ala Arg Arg Ala Gln Glu Leu Glu Met Glu Met
240                 245                 250
ctg tca agc acc agc ccc cca gag agg acc cgg tat agc ccc atc cct    937
Leu Ser Ser Thr Ser Pro Pro Glu Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ile Pro
255                 260                 265                 270
ccc agt cac cac cag ctc act ctc cct gat cca tcc cac cac ggc eta    985
Pro Ser His His Gln Leu Thr Leu Pro Asp Pro Ser His His Gly Leu
275                 280                 285
cat agc aac cct gac agt cct gcc aaa cca gag aag aat ggg cac gcc   1033
His Ser Asn Pro Asp Ser Pro Ala Lys Pro Glu Lys Asn Gly His Ala
290                 295                 300
aag att gtc aat ccc agg att gcc aag ttc ttt gag atc cag acc atg   1081
Lys Ile Val Asn Pro Arg Ile Ala Lys Phe Phe Glu Ile Gln Thr Met
305                 310                 315
ccc aat ggc aaa acc cgg acc tcc ctt aag acg atg agc cgc aga aag   1129
Pro Asn Gly Lys Thr Arg Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg Arg Lys
320                 325                 330
ctc tcc cag cag aag gag aag aaa gcc act cag atg ctt gcc att gtt   1177
Leu Ser Gln Gln Lys Glu Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala Ile Val
335                 340                 345                 350
ctc ggt gtg ttc atc atc tgc tgg ctg ccc ttc ttc atc acg cac atc   1225
Leu Gly Val Phe Ile Ile Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Thr His Ile
355                 360                 365
ctg aat ata cac tgt gat tgc aac atc cca cca gtc ctc tac agc gcc    1273
Leu Asn Ile His Cys Asp Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr Ser Ala
370                 375                 380
ttc aca tgg ctg ggc tat gtc aac agt gcc gtc aac ccc atc atc tac    1321
Phe Thr Trp Leu Gly Tyr Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr
385                 390                 395
acc acc ttc aac atc gag ttc cgc aag gcc ttc atg aag atc ttg cac    1369
Thr Thr Phe Asn Ile Glu Phe Arg Lys Ala Phe Met Lys Ile Leu His
400                 405                 410
tgc tgagtctgcc ccttgcctgc acagcagctg cttcccacct ccctgcctat     1422
Cys
415
gcaggccaga cctcatccct gcaagctgtg ggcagaaagg cccagatgaa cttggccttc 1482
tctcgaccct gcaggccctg cagtgttagc ttggctcgat gcccctctct gcccacacac 1542
cctcatcctg ccagggtagg gccagggaga ctggtatctt accasctctg gggttggacc 1602
catggctcag ggcagctcac agagtgcccc tctcatatcc agaccctgtc tccttggcac 1662
caaagatgca gcggccttcc ttgaccttcc tcttgggcac agaaactagc tcagtggtcg 1722
agcacaccct gstcgctggc ttggcctggc ccttgcttgc ctgtgccgga tcaggtggtg 1782
ggagggagcg acacgttctt actttatagg aaccacatag gaaagcaggg aacacgccaa 1842
gtcctccagg cacatcagtg tcaggagaca cacataaaca ccaggtagct ccatggaccc 1902
cagagaaact gaggctgaaa aatctgtttt ccactccaac tctagtgtga gtccctactt 1962
ttcatagcca tgggtattac tatgtcctac cttgttatag tatcccatgg ggtttctgta 2022
ccatttgggg gaa acaact ctaatcctca agggccccaa gagaatctgt aaggagaaaa 2082
ataggctgat ctccctctac tctccaatcc actccaccac ttcttgatat accttggatg 2142
tatccattcc tcacagcaaa tgctggccag tcaggccttg gaccagtgtt ggagttgaag 2202
ctggatgtgg taacttgggg ctctttgggg ctgggggggt tgttaacatc gtctctcttc 2262
catatctct  ccttcccagt gcctctgcct tagaagaggc tgtggatggg gtgctgggac 2322
tgctgatacc attgggcctg gccctgaatg aggaggggaa gctgcagttt ggagggttct 2382
gggatccaac tctgtaacat cactatacct gtaccaaaac taataaaacc ttgacaagag 2442
tcaaaaaaaa aaa                                                    2455
<210> 2
<211> 415
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 2
Met Asp Pro Leu Asn Leu Ser Trp Tyr Asp Asp Asp Leu Glu Arg Gln
1               5                   10                  15
Asn Trp Ser Arg Pro Phe Asn Gly Ser Glu Gly Lys Ala Asp Arg Pro
20                  25                  30
His Tyr Asn Tyr Tyr Ala Met Leu Leu Thr Leu Leu Ile Phe Ile Ile
35                  40                  45
Val Phe Gly Asn Val Leu Val Cys Met Ala Val Ser Ala Glu Lys Ala
50                  55                  60
Leu Gln Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Val Ser Leu Ala Val Ala Asp
65                  70                  75                  80
Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Met Pro Trp Val Val Tyr Leu Glu Val
85                  90                  95
Val Gly Glu Trp Lys Phe Ser Arg Ile His Cys Asp Ile Phe Val Thr
100                 105                 110
Leu Asp Val Met Met Cys Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Ala Ile
115                 120                 125
Ser Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Ala Met Pro Met Leu Tyr Asn Thr
130                 135                 140
Arg Tyr Ser Ser Lys Arg Arg Val Thr Val Met Ile Ala Ile Val Trp
145                 150                 155                 160
Val Leu Ser Phe Thr Ile Ser Cys Pro Leu Leu Phe Gly Leu Asn Asn
165                 170                 175
Thr Asp Gln Asn Glu Cys Ile Ile Ala Asn Pro Ala Phe Val Val Tyr
180                 185                 190
Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val Pro Phe Ile Val Thr Leu Leu Val
195                 200                 205
Tyr Ile Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Val Asn
210                 215                 220
Thr Lys Arg Ser Ser Arg Ala Phe Arg Ala Asn Leu Lys Thr Pro Leu
225                 230                 235                 240
Lys Asp Ala Ala Arg Arg Ala Gln Glu Leu Glu Met Glu Met Leu Ser
245                 250                 255
Ser Thr Ser Pro Pro Glu Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ile Pro Pro Ser
260                 265                 270
His His Gln Leu Thr Leu Pro Asp Pro Ser His His Gly Leu His Ser
275                 280                 285
Asn Pro Asp Ser Pro Ala Lys Pro Glu Lys Asn Gly His Ala Lys Ile
290                 295                 300
Val Asn Pro Arg Ile Ala Lys Phe Phe Glu Ile Gln Thr Met Pro Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Thr Arg Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg Arg Lys Leu Ser
325                 330                 335
Gln Gln Lys Glu Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala Ile Val Leu Gly
340                 345                 350
Val Phe Ile Ile Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Thr His Ile Leu Asn
355                 360                 365
Ile His Cys Asp Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr Ser Ala Phe Thr
370                 375                 380
Trp Leu Gly Tyr Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Thr
385                 390                 395                 400
Phe Asn Ile Glu Phe Arg Lys Ala Phe Met Lys Ile Leu His Cys
405                 410                 415
<210> 3
<211> 309
<212> PRT
<213> Mesocricetus auratus
<400> 3
Met Gly Pro Pro Gly Asn Asp Ser Asp Phe Leu Leu Thr Thr Asn Gly
1              5                  10                  15
Ser His Val Pro Asp His Asp Val Thr Glu Glu Arg Asp Glu Ala Trp
20                   25                  30
Val Val Gly Met Ala Ile Leu Met Ser Val Ile Val Leu Ala Ile Val
35                  40                  45
Phe Gly Asn Val Leu Val Ile Thr Ala Ile Ala Lys Phe Glu Arg Leu
50                  55                  60
Gln Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Asp Ser Leu Ala Cys Ala Asp Leu
65                   70                  75                  80
Val Met Gly Ile Ala Val Val Pro Phe Gly Ala Ser His Ile Ile Met
85                  90                  95
Lys Met Trp Asn Phe Gly Asn Phe Trp Cys Glu Phe Trp Thr Ser Ile
100                 105                 110
Gln Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Cys Val Ile Ala
115                 120                 125
Val Gln Arg Tyr Ile Ala Ile Thr Ser Pro Phe Lys Tyr Gln Ser Leu
130                 135                 140
Leu Thr Lys Asn Lys Ala Arg Met Val Ile Leu Met Val Trp Ile Val
145                 150                 155                 160
Ser Gly Leu Thr Ser Phe Ile Pro Ile Gln Met His Trp Tyr Arg Ala
165                 170                 175
Thr His Gln Lys Ala Ile Asp Cys Tyr His Arg Glu Thr Cys Cys Asp
180                 185                 190
Phe Phe Tyr Asn Gln Ala Tyr Ala Ile Trp Ser Ser Ile Val Ser Phe
195                 200                 205
Tyr Val Pro Leu Val Val Met Val Phe Val Tyr Ser Arg Val Phe Gln
210                 215                 220
Val Ala Lys Arg Gln Leu Gln Lys Ile Lys Glu His Lys Ala Leu Lys
225                 230                 235                 240
Thr Leu Gly Ile Ile Met Gly Ile Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro Phe
245                 250                 255
Phe Ile Val Asn Ile Val His Val Ile Gln Asp Asn Leu Ile Pro Lys
260                 265                 270
Glu Val Tyr Ile Leu Leu Met Trp Leu Gly Tyr Val Asn Ser Ala Pro
275                 280                 285
Asn Pro Ile Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg Ile Ala Phe Gln
290                 295                 300
Glu Ile Leu Cys Leu
305
<210> 4
<211> 307
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Gly Ser Leu Gln Pro Gln Ala Gly Asn Ala Ser Trp Asn Gly Thr
1               5                   10                  15
Glu Ala Pro Gly Gly Gly Ala Arg Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Gln Val
20                  25                  30
Thr Leu Thr Leu Val Cys Leu Ala Gly Leu Leu Met Leu Leu Thr Val
35                  40                  45
Phe Gly Asn Val Leu Val Ile Ile Ala Val Phe Thr Ser Arg Ala Leu
50                  55                  60
Lys Ala Pro Gln Asn Leu Phe Ile Val Ser Leu Ala Ser Ala Asp Ile
65                  70                  75                  80
Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Pro Phe Ser Leu Ala Asn Glu Val Met
85                  90                  95
Gln Tyr Trp Tyr Phe Gly Lys Thr Trp Cys Glu Ile Tyr Leu Ala Leu
100                 105                 110
Asp Val Leu Phe Cys Thr Ser Ser Ile Val His Leu Cys Ala Ile Ser
115                 120                 125
Leu Gln Arg Tyr Trp Ser Ile Thr Gln Ala Ile Glu Tyr Asn Leu Lys
130                 135                 140
Arg Thr Pro Arg Arg Ile Lys Ala Ile Ile Ile Thr Val Trp Val Leu
145                 150                 155                 160
Ser Ala Val Ile Ser Phe Pro Pro Leu Ile Ser Ile Glu Lys Lys Gly
165                 170                 175
Gly Gly Gly Gly Pro Gln Pro Ala Glu Pro Arg Cys Glu Ile Asn Asp
180                 185                 190
Gln Lys Trp Tyr Val Ile Ser Ser Cys Ile Gly Ser Phe Phe Ala Pro
195                 200                 205
Leu Leu Ile Met Ile Leu Val Tyr Val Arg Ile Tyr Gln Ile Ala Lys
210                 215                 220
Arg Arg Thr Arg Val Pro Arg Glu Lys Arg Phe Thr Phe Val Leu Ala
225                 230                 235                 240
Val Val Ile Gly Met Phe Val Val Cys Trp Phe Pro Phe Phe Phe Thr
245                 250                 255
Tyr Thr Leu Thr Ala Val Gly Cys Ser Val Pro Arg Thr Leu Phe Lys
260                 265                 270
Phe Phe Pro Trp Pro Gly Tyr Cys Asn Ser Ser Leu Asn Pro Val Ile
275                 280                 285
Tyr Thr Leu Phe Asn His Asp Phe Arg Arg Ala Phe Trp Lys Ile Leu
290                 295                 300
Cys Arg Cys
305
<210> 5
<211> 312
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Asp Val Leu Ser Pro Gly Gln Gln Asn Asn Thr Thr Ser Pro Pro
1               5                   10                  15
Ala Pro Phe Glu Thr Gly Gly Asn Thr Thr Gly Ile Ser Asp Val Thr
20                  25                  30
Val Ser Tyr Gln Val Ile Thr Ser Leu Leu Leu Gly Thr Leu Ile Phe
35                  40                  45
Cys Ala Val Ile Gly Asn Ala Cys Val Val Ala Ala Ile Ala Leu Glu
50                  55                  60
Arg Ser Leu Gln Asn Val Ala Asn Tyr Leu Ile Gly Ser Leu Ala Val
65                  70                   75                  80
Thr Asp Ile Met Val Ser Val Leu Val Ile Pro Met Ala Ala Leu Tyr
85                  90                 95
Gln Val Leu Asn Asn Trp Thr Leu Gly Gln Val Thr Cys Asp Leu Phe
100                 105                 110
Ile Ala Leu Asp Val Leu Gln Cys Thr Ser Ser Ile Leu His Leu Cys
115                 120                 125
Ala Ile Ala Ile Gln Arg Tyr Trp Ala Ile Thr Asp Pro Ile Asp Tyr
130                 135                 140
Val Asn Lys Arg Thr Pro Arg Pro Arg Ala Leu Thr Ser Leu Thr Trp
145                 150                 155                 160
Leu Ile Gly Phe Leu Ile Ser Ile  Pro Pro Met Leu Gly Trp Arg Thr
165                  170                 175
Pro Glu Asp Arg Ser Asp Pro Asp Ala Cys Thr Ile Ser Lys Asp Met
180                 185                 190
Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Thr Phe Gly Ala Phe Tyr Ile Pro Leu Leu
195                 200                 205
Leu Met Leu Val Leu Tyr Gly Arg Ile Phe Arg Ala Ala Arg Phe Arg
210                 215                 220
Ile Pro Lys Thr Arg Glu Arg Lys Thr Val Lys Thr Leu Gln Ile Ile
225                 230                 235                 240
Met Gly Leu Phe Ile Leu Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Val Ala Leu
245                 250                 255
Val Leu Pro Pro Cys Glu Ser Ser Cys His Met Pro Thr Ile Leu Gly
260                 265                 270
Ala Ile Ile Asn Trp Leu Gly Tyr Ser Asn Ser Leu Ile Asn Pro Val
275                 280                 285
Ile Tyr Ala Tyr Phe Asn Lys Asp Phe Gln Asn Ala Phe Trp Lys Ile
290                 295                 300
Ile Lys Cys Asn Phe Cys Arg Gln
305                 310
<210> 6
<211> 299
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 6
Met Asn Thr Ser Ala Pro Pro Ala Val Ser Pro Asn Ile Thr Val Leu
1               5                   10                  15
Ala Pro Gly Lys Gly Pro Trp Gln Val Ala Phe Ile Gly Ile Thr Thr
20                  25                 30
Gly Leu Leu Ser Leu Ala Thr Val Thr Gly Asn Ile Leu Val Ile Ile
35                 40                  45
Ser Phe Lys Val Asn Thr Glu Leu Lys Thr Val Asn Asn Tyr Phe Leu
50                  55                  60
Leu Ser Leu Ala Cys Ala Asp Leu Ile Ile Gly Thr Phe Ser Met Asn
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Thr Thr Tyr Leu Leu Met Gln Ile Trp Ala Leu Gly Thr Leu
85                  90                  95
Ala Cys Asp Leu Trp Leu Ala Leu Asp Tyr Val Ala Ser Asn Ala Ser
100                 105                 110
Val Met Asn Leu Leu Ile Ile Ser Phe Gln Arg Tyr Phe Ser Val Thr
115                 120                 125
Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Ala Lys Thr Arg Pro Arg Arg Ala Ala Lau
130                 135                 140
Met Ile Gly Leu Ala Trp Leu Val Ser Phe Val Leu Trp Ala Pro Ala
145                 150                 155                 160
Ile Leu Phe Trp Gln Tyr Leu Val Gly Glu Arg Thr Val Leu Ala Gly
165                 170                 175
Gln Cys Tyr Ile Gln Phe Leu Ser Gln Pro Ile Ile Thr Phe Gly Thr
180                 185                 190
Ala Met Ala Ala Phe Tyr Leu Pro Val Thr Val Met Cys Thr Ile Tyr
195                 200                 205
Trp Arg Ile Tyr Arg Glu Thr Glu Asn Arg Ala Arg Glu Leu Lys Glu
210                 215                 220
Lys Lys Ala Ala Arg Thr Leu Ser Ala Ile Leu Leu Ala Phe Ile Val
225                 230                 235                 240
Thr Trp Thr Tyr Asn Ile Met Val Leu Val Ser Thr Phe Cys Lys Asp
245                 250                 255
Cys Val Pro Glu Thr Leu Trp Glu Leu Gly Tyr Trp Ile Gly Tyr Val
260                 265                 270
Asn Ser Thr Leu Asn Pro Met Cys Tyr Ala Leu Gln Asn Lys Ala Phe
275                 280                 285
Arg Asp Thr Phe Arg Leu Leu Leu His Cys Arg
290                 295
<210> 7
<211> 313
<212  PRT
<213> Bos taurus
<400> 7
Met Gly Ala Cys Val Val Met Thr Asp Leu Asn Ile Ser Ser Gly Leu
1               5                   10                  15
Asp Ser Asn Ala Thr Gly Ile Thr Ala Phe Ser Met Pro Gly Trp Gln
20                  25                  30
Leu Ala Leu Trp Thr Ala Ala Tyr Leu Ala Leu Val Leu Val Ala Val
35                 40                  45
Met Gly Asn Ala Thr Val Ile Trp Ile Ile Leu Ala His Gln Arg Met
50                   55                 60
Arg Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Val Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu
65                  70                  75                  80
Cys Met Ala Ala Phe Asn Ala Ala Phe Asn Phe Val Tyr Ala Ser His
85                  90                  95
Asn Ile Trp Tyr Phe Gly Arg Ala Phe Cys Tyr Phe Gln Asn Leu Phe
100                 105                 110
Pro Ile Thr Ala Met Phe Val Ser Ile Tyr Ser Met Thr Ala Leu Ala
115                 120                 125
Ala Gln Arg Tyr Met Ala Ile Val Arg Pro Phe Gln Pro Arg Leu Ser
130                 135                 140
Ala Pro Gly Thr Arg Ala Val Ile Ala Gly Leu Trp Leu Val Ala Leu
145                 150                 155                 160
Ala Leu Ala Phe Pro Gln Cys Phe Tyr Ser Thr Ile Thr Thr Asp Glu
165                 170                 175
Gly Ala Thr Lys Cys Val Val Ala Trp Pro Glu Asp Ser Gly Gly Lys
180                 185                 190
Met Leu Leu Leu Tyr His Leu Ile Val Ile Ala Leu Ile Tyr Phe Leu
195                 200                 205
Pro Leu Val Val Met Phe Val Ala Tyr Ser Val Ile Gly Leu Thr Leu
210                 215                 220
Trp Arg Arg Ser Val Pro Gly Ala Lys Lys Lys Phe Val Lys Thr Met
225                 230                 235                 240
Val Ile Val Val Val Thr Phe Ala Ile Cys Trp Leu Pro Tyr His Leu
245                 250                 255
Tyr Phe Ile Ile Gly Thr Phe Gln Glu Asp Ile Tyr Cys His Lys Phe
260                 265                 270
Ile Gln Gln Val Tyr Leu Ala Leu Pro Trp Ile Ala Met Ser Ser Thr
275                 280                 285
Met Tyr Asn Pro Ile Ile Tyr Cys Cys Ile Asn His Arg Phe Arg Ser
290                 295                 300
Gln Phe Arg Leu Ala Pro Arg Cys Cys
305                 310
<210> 8
<211> 594
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (2).. (472)
<400> 8
c agc cca ccc gag agg acc cgg tac agc ccc atc cca ccc agc cac cac 49
Ser Pro Pro Glu Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ile Pro Pro Ser His His
1               5                   10                  15
cag ctg act ctc ccc gac cog tcc cac cat ggt ctc cac agc act ccc    97
Gln Leu Thr Leu Pro Asp Pro Ser His His Gly Leu His Ser Thr Pro
20                  25                  30
gac agc ccc gcc aaa cca gag aag aat ggg cat gcc aaa agg acc acc   145
Asp Ser Pro Ala Lys Pro Glu Lys Asn Gly His Ala Lys Arg Thr Thr
35                  40                  45
cca agg att gcc aag atc ttt gag atc cag acc atg ccc aat ggc aaa   193
Pro Arg Ile Ala Lys Ile Phe Glu Ile Gln Thr Met Pro Asn Gly Lys
50                  55                 60
acc cgg acc tcc ctc aag acc atg agc cgt agg aag ntc nnc cag cag   241
Thr Arg Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg Arg Lys Xaa Xaa Gln Gln
65                   70                  75                  80
aag gag aag aaa gcc act cag atg ctc gcc atn gtt ctc ggc gtg ttc   289
Lys Glu Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala Xaa Val Leu Gly Val Phe
85                  90                  95
atc atc tgc tgg ctg ccc ttc ttc atc aca cac atc ctg aac ata cac   337
Ile Ile Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Thr His Ile Leu Asn Ile His
100                 105                 110
tgt gac tgc aac atc ccg cct gtc ctg tac agc gcc ttc acg tgg ctg   385
Cys Asp Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Trp Leu
115                 120                 125
ggc tat gtc aac agc gcc gtg aac ccc atc atc tac acc acc ttc aac   433
Gly Tyr Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Thr Phe Asn
130                 135                 140
att gag ttc cgc aag gcc ttc ctg aag atc ctc cac tgc tgactctgct 482
Ile Glu Phe Arg Lys Ala Phe Leu Lys Ile Leu His Cys
145                 150                 155
gcctgccgca cagcagcctg cttcccacct ccctgcccag tgccggccag cctcaccctt 542
gcgaaccgtg agcaggaagg cctgggtgga tcggcctcct cttctagccc cg         594
<210> 9
<211> 157
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Ser Pro Pro Glu Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ile Pro Pro Ser His His
1               5                  10                  15
Gln Leu Thr Leu Pro Asp Pro Ser His His Gly Leu His Ser Thr Pro
20                  25                  30
Asp Ser Pro Ala Lys Pro Glu Lys Asn Gly His Ala Lys Arg Thr Thr
35                  40                  45
Pro Arg Ile Ala Lys Ile Phe Glu Ile Gln Thr Met Pro Asn Gly Lys
50                  55                 60
Thr Arg Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg Arg Lys Xaa Xaa Gln Gln
65                   70                  75                  80
Lys Glu Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala Xaa Val Leu Gly Val Phe
85                  90                  95
Ile Ile Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Thr His Ile Leu Asn Ile His
100                 105                 110
Cys Asp Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Trp Leu
115                 120                 125
Gly Tyr Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Thr Phe Asn
130                 135                 140
Ile Glu Phe Arg Lys Ala Phe Leu Lys Ile Leu His Cys
145                 150                 155
<210> 10
<211> 2482
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (34)..(1362)
<400> 10
agagcctggc cacccagtgg ctccaccgcc ctg atg gat cca ctg aat ctg tcc  54
Met Asp Pro Leu Asn Leu Ser
1               5
tgg tat gat gat gat ctg gag agg tag aac tgg agc cgg ccc ttc aac    102
Trp Tyr Asp Asp Asp Leu Glu Arg Gln Asn Trp Ser Arg Pro Phe Asn
10                  15                  20
ggg tca gac ggg aag gcg gac aga ccc cac tac aac tac tat gcc aca    150
Gly Ser Asp Gly Lys Ala Asp Arg Pro His Tyr Asn Tyr Tyr Ala Thr
25                  30                  35
ctg ctc acc ctg ctc atc gct gtc atc gtc ttc ggc aac gtg ctg gtg    198
Leu Leu Thr Leu Leu Ile Ala Val Ile Val Phe Gly Asn Val Leu Val
40                   45                  50                  55
tgc atg gct gtg tcc cgc gag aag gcg ctg cag acc acc acc aac tac    246
Cys Met Ala Val Ser Arg Glu Lys Ala Leu Gln Thr Thr Thr Asn Tyr
60                  65                  70
ctg atc gtc agc ctc gca gtg gcc gac ctc ctc g c gcc aca ctg gtc    294
Leu Ile Val Ser Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Val Ala Thr Leu Val
75                 80                   85
atg ccc tgg gtt gtc tac ctg gag gtg gta ggt gag tgg aaa ttc agc    342
Met Pro Trp Val Val Tyr Leu Glu Val Val Gly Glu Trp Lys Phe Ser
90                  95                 100
agg att cac tgt gac atc ttc gtc act ctg gac gtc atg atg tgc acg   390
Arg Ile His Cys Asp Ile Phe Val Thr Leu Asp Val Met Met Cys Thr
105                 110                 115
gcg agc atc ctg aac ttg tgt gcc atc agc atc gac agg tac aca gct    438
Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Ala Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Thr Ala
120                 125                 130                 135
gtg gcc atg ccc atg ctg tac aat acg cgc tac agc tcc aag cgc cgg   486
Val Ala Met Pro Met Leu Tyr Asn Thr Arg Tyr Ser Ser Lys Arg Arg
140                 145                 150
gtc acc gtc atg atc tcc atc gtc tgg gtc ctg tcc ttc acc atc tcc   534
Val Thr Val Met Ile Ser Ile Val Trp Val Leu Ser Phe Thr Ile Ser
155                 160                 165
tgc cca ctc ctc ttc gga ctc aat aac gca gac cag aac gag tgc atc    582
Cys Pro Leu Leu Phe Gly Leu Asn Asn Ala Asp Gln Asn Glu Cys Ile
170                 175                 180
att gcc aac ccg gcc tte gtg gtc tac tcc tcc atc gtc tcc ttc tac    630
Ile Ala Asn Pro Ala Phe Val Val Tyr Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr
185                 190                 195
gtg ccc ttc att gtc acc ctg ctg gtc tac atc aag atc tac att gtc    678
Val Pro Phe Ile Val Thr Leu Leu Val Tyr Ile Lys Ile Tyr Ile Val
200                 205                 210                 215
ctc cgc aga cgc cgc aag cga gtc aac acc aaa cgc agc agc cga gct    726
Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Val Asn Thr Lys Arg Ser Ser Arg Ala
220                 225                 230
ttc agg gcc cac ctg agg gct cca cta aag ggc aac tgt act cac ccc    774
Phe Arg Ala His Leu Arg Ala Pro Leu Lys Gly Asn Cys Thr His Pro
235                 240                 245
gag gac atg aaa ctc tgc acc gtt atc atg aag tct aat ggg agt trc    822
Glu Asp Met Lys Leu Cys Thr Val Ile Met Lys Ser Asn Gly Ser Phe
250                 255                 260
cca gtg aac agg cgg aga gtg gag gct gcc cgg cga gcc cag gag ctg    870
Pro Val Asn Arg Arg Arg Val Glu Ala Ala Arg Arg Ala Gln Glu Leu
265                 270                 275
gag atg gag atg ctc tcc agc acc agc cca ccc gag agg acc cgg tac    918
Glu Met Glu Met Leu Ser Ser Thr Ser Pro Pro Glu Arg Thr Arg Tyr
280                 285                 290                 295
agc ccc atc cca ccc agc cac cac cag ctg act ctc ccc gac ccg tcc    966
Ser Pro Ile Pro Pro Ser His His Gln Leu Thr Leu Pro Asp Pro Ser
300                 305                 310
cac cat ggt ctc cac agc act ccc gac agc ccc gcc aaa cca gag aag   1014
His His Gly Leu His Ser Thr Pro Asp Ser Pro Ala Lys Pro Glu Lys
315                 320                 325
aat ggg cat gcc aaa gac cac ccc aag att gcc aag atc ttt gag atc   1062
Asn Gly His Ala Lys Asp His Pro Lys Ile Ala Lys Ile Phe Glu Ile
330                 335                 340
cag acc atg ccc aat ggc aaa acc cgg acc tcc ctc aag acc atg agc    1110
Gln Thr Met Pro Asn Gly Lys Thr Arg Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser
345                 350                 355
cgt agg aag ctc tcc cag cag aag gag aag aaa gcc act cag atg ctc    1158
Arg Arg Lys Leu Ser Gln Gln Lys Glu Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu
360                 365                 370                 375
gcc att gtt ctc ggc gtg ttc atc atc tgc tgg ctg ccc ttc ttc atc   1206
Ala Ile Val Leu Gly Val Phe Ile Ile Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile
380                 385                 390
aca cac atc ctg aac ata cac tgt gac tgc aac atc ccg cct gtc ctg    1254
Thr His Ile Leu Asn Ile His Cys Asp Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu
395                 400                 405
tac agc gcc ttc acg tgg ctg ggc tat gtc aac agc gcc gtg aac ccc    1302
Tyr Ser Ala Phe Thr Trp Leu Gly Tyr Val Asn Ser Ala Val Asn Pro
410                 415                 420
atc atc tac acc acc ttc aac att gag ttc cgc aag gcc ttc ctg aag   1350
Ile Ile Tyr Thr Thr Phe Asn Ile Glu Phe Arg Lys Ala Phe Leu Lys
425                 430                 435
atc ctc cac tgc tgactctgct gcctgcccgc acagcagcct gcttcccacc       1402
Ile Leu His Cys
440
tccctgccca ggccggccag cctcaccctt gcgaaccgtg agcaggaagg cctgggtgga 1462
tcggccteet cttcttagcc ccggcaggcc ctgcagtgtt cgcttggctc catgctcctc 1522
actgcccgca caccctcact ctgccagggc agtgctagtg agctgggcat ggtaccagcc 1582
ctggggctgg ccccagctca ggggcagctc atagagtccc ccctcccacc tccagtcccc 1642
ctatccttgg caccaaagat gcagccgcct tccttgacct tcctctgggg ctctagggtt 1702
gctggagcct gagtcagggc ccagaggctg agttttctct ttgtggggct tggcgtggag 1762
caggcggtgg ggagagatgg acagttcaca ccctgcaagg cccacaggag gcaagcaagc 1822
tctcttgccg aggagccagg caacttcagt cctgggagac ccatgtaaat accagactgc 1882
aggttggacc ccaaggattc ccaagccaaa aaccttagct ccctcccgca ccccgatgtg 1942
gacctctact ttccaggcta gtccggaccc acctcacccc gttacagctc cccaagtggt 2002
ttccacatgc tctgagaaga ggagccctca tcttgaaggg cccaggaggg tctatgggga 2062
gaggaactcc ttggcctagc ccaccctgct gccttctgac ggccctgcaa tstatccctt 2122
ctcacagcac atgctggcca gcctggggcc tggcagggag gtcaggccct ggaactctat 2182
ctgggcctgg gctagggaca tcagaggttc tttgagggac tgcctctgcc acactctgac 2242
gcaaaaccac tttccttttc tattccttct ggcctttcct ctctcctgtt tcccttccct 2302
tccactgcct ctgccttaga ggagcccacg gctaagaggc tgctgaaaac catctggcct 2362
ggcctggccc tgccctgagg aaggagggca agctgcagct tgggagagcc cctggggcct 2422
agactctgta acatcactat ccgatgcacc aaactaataa aactttgacg agtcaccttc 2482
<210> 11
<211> 443
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Met Asp Pro Leu Asn Leu Ser Trp Tyr Asp Asp Asp Leu Glu Arg Gln
1                 5                  10                  15
Asn Trp Ser Arg Pro Phe Asn Gly Ser Asp Gly Lys Ala Asp Arg Pro
20                  25                  30
His Tyr Asn Tyr Tyr Ala Thr Leu Leu Thr Leu Leu Ile Ala Val Ile
35                  40                  45
Val Phe Gly Asn Val Leu Val Cys Met Ala Val Ser Arg Glu Lys Ala
50                  55                  60
Leu Gln Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Val Ser Leu Ala Val Ala Asp
65                   70                  75                  80
Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Met Pro Trp Val Val Tyr Leu Glu Val
85                  90                  95
Val Gly Glu Trp Lys Phe Ser Arg Ile His Cys Asp Ile Phe Val Thr
100                 105                 110
Leu Asp Val Met Met Cys Thr Ala Ser Ile Leu Asp Leu Cys Ala Ile
115                 120                 125
Ser Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Ala Met Pro Met Leu Tyr Asn Thr
130                 135                 140
Arg Tyr Ser Ser Lys Arg Arg Val Thr Val Met Ile Ser Ile Val Trp
145                 150                 155                 160
Val Leu Ser Phe Thr Ile Ser Cys Pro Leu Leu Phe Gly Leu Asn Asn
165                 170                 175
Ala Asp Gln Asn Glu Cys Ile Ile Ala Asn Pro Ala Phe Val Val Tyr
180                 185                 190
Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val Pro Phe Ile Val Thr Leu Leu Val
195                 200                 205
Tyr Ile Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Val Asn
210                 215                 220
Thr Lys Arg Ser Ser Arg Ala Phe Arg Ala His Leu Arg Ala Pro Leu
225                 230                 235                 240
Lys Gly Asn Cys Thr His Pro Glu Asp Met Lys Leu Cys Thr Val Ile
245                 250                 255
Met Lys Ser Asn Gly Ser Phe Pro Val Asn Arg Arg Arg Val Glu Ala
260                 265                 270
Ala Arg Arg Ala Gln Glu Leu Glu Met Glu Met Leu Ser Ser Thr Ser
275                 280                 285
Pro Pro Glu Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ile Pro Pro Ser His His Gln
290                 295                 300
Leu Thr Leu Pro Asp Pro Ser His His Gly Leu His Ser Thr Pro Asp
305                 310                 315                 320
Ser Pro Ala Lys Pro Glu Lys Asn Gly His Ala Lys Asp His Pro Lys
325                 330                 335
Ile Ala Lys Ile Phe Glu Ile Gln Thr Met Pro Asn Gly Lys Thr Arg
340                345                 350
Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg Arg Lys Leu Ser Gln Gln Lys Glu
355                 360                 365
Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala Ile Val Leu Gly Val Phe Ile Ile
370                 375                 380
Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Thr His Ile Leu Asn Ile His Cys Asp
385                 390                 395                 400
Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Trp Leu Gly Tyr
405                 410                 415
Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Thr Phe Asn Ile Glu
420                 425                 430
Phe Arg Lys Ala Phe Leu Lys Ile Leu His Cys
435                 440
<210> 12
<211> 1248
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS
<222> (I).. (1245)
<400> 12
atg gat cca ctg aac ctg tcc tgg tac gat gac gat ctg gag agg cag   48
Met Asp Pro Leu Asn Leu Ser Trp Tyr Asp Asp Asp Leu Glu Arg Gln
1                 5                 10                   15
aac tgg agc cgg ccc ttc aat ggg tca gaa ggg aag gca gac agg ccc   96
Asn Trp Ser Arg Pro Phe Asn Gly Ser Glu Gly Lys Ala Asp Arg Pro
20                 25                   30
cac tac aac tac tat gcc atg ctg ctc acc ctc ctc atc ttt atc atc   144
His Tyr Asn Tyr Tyr Ala Met Leu Leu Thr Leu Leu Ile Phe Ile Ile
35                  40                  45
gtc ttt ggc aat gtg ctg gtg tgc atg gct gta tcc cga gag aag gct   192
Val Phe Gly Asn Val Leu Val Cys Met Ala Val Ser Arg Glu Lys Ala
50                  55                  60
ttg cag acc acc acc aac tac ttg ata gtc agc ctt gct gtg gct gat    240
Leu Gln Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Val Ser Leu Ala Val Ala Asp
65                  70                  75                  80
ctt ctg gtg gcc aca ctg gta atg ccg tgg gtt gtc tac ctg gag gtg   288
Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Met Pro Trp Val Val Tyr Leu Glu Val
85                  90                  95
gtg ggt gag tgg aaa ttc agc agg att cac tgt gac atc ttt gtc act    336
Val Gly Glu Trp Lys Phe Ser Arg Ile His Cys Asp Ile Phe Val Thr
100                 105                 110
ctg gat gtc atg atg tgc aca gca agc atc ctg aac ctg tgt gcc atc    384
Leu Asp Val Met Met Cys Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Ala Ile
115                 120                 125
agc att gac agg tac aca gct gtg gca atg ccc atg ctg tat aac aca   432
Ser Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Ala Met Pro Met Leu Tyr Asn Thr
130                 135                 140
cgc tac agc tcc aag cgc cga gtt act gtc atg att gcc att gtc tgg   480
Arg Tyr Ser Ser Lys Arg Arg Val Thr Val Met Ile Ala Ile Val Trp
145                     150             155                 160
gtc ctg tcc ttc acc atc tcc tgc cca ctg ctc ttc gga ctc aac aat    528
Val Leu Ser Phe Thr Ile Ser Cys Pro Leu Leu Phe Gly Leu Asn Asn
165                 170                 175
aca gac cag aat gag tgt atc att gcc aac cct gcc ttt gtg gtc tac    576
Thr Asp Gln Asn Glu Cys Ile Ile Ala Asn Pro Ala Phe Val Val Tyr
180                 185                 190
tcc tcc att gtc tca ttc tac gtg ccc ttc atc gtc act ctg ctg gtc    624
Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val Pro Phe Ile Val Thr Leu Leu Val
195                 200                 205
tat atc aaa atc tac atc gtc ctc cgg aag cgc cgg aag cgg gtc aac    672
Tyr Ile Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Val Asn
210                 215                 220
acc aag cgc agc agt cga gct ttc aga gcc aac ctg aag aca cca ctc   720
Thr Lys Arg Ser Ser Arg Ala Phe Arg Ala Asn Leu Lys Thr Pro Leu
225                 230                 235                 240
aag gat gct gcc cgc cga gct cag gag ctg gaa atg gag atg ctg tca   768
Lys Asp Ala Ala Arg Arg Ala Gln Glu Leu Glu Met Glu Met Leu Ser
245                 250                 255
agc acc agc ccc cca gag agg acc cgg tat agc ccc atc cct ccc agt   816
Ser Thr Ser Pro Pro Glu Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ile Pro Pro Ser
260                 265                 270
cac cac cag ctc act ctc cct gat cca tcc cac cac ggc cta cat agc   864
His His Gln Leu Thr Leu Pro Asp Pro Ser His His Gly Leu His Ser
275                280                285
aac cct gac agt cct gcc aaa cca gag aag aat ggg cac gcc aag att   912
Asn Pro Asp Ser Pro Ala Lys Pro Glu Lys Asn Gly His Ala Lys Ile
290                 295                 300
gtc aat ccc agg att gcc aag ttc ttt gag atc cag acc atg ccc aat    960
Val Asn Pro Arg Ile Ala Lys Phe Phe Glu Ile Gln Thr Met Pro Asn
305                 310                 315                 320
ggc aaa acc cgg acc tcc ctt aag acg atg agc cgc aga aag ctc tcc    1008
Gly Lys Thr Arg Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg Arg Lys Leu Ser
325                 330                 335
cag cag aag gag aag aaa gcc act cag atg ctt gcc att gtt ctc gcc    1056
Gln Gln Lys Glu Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala Ile Val Leu Ala
340                 345                 350
gtc aac ccc atc atc tac acc acc ttc aac atc gag ttc cgc aag gcc    1104
Val Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Thr Phe Asn Ile Glu Phe Arg Lys Ala
355                 360                 365
ttc atg aag gat tgc aac atc cca cca gtc ctc tac agc gcc ttc aca    1152
Phe Met Lys Asp Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr Ser Ala Phe Thr
370                 375                 380
tgg ctg ggc tat gtc aac agt gcc gtc aac ccc atc atc tac acc acc    1200
Trp Leu Gly Tyr Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Thr
385                 390                 395                 400
ttc aac atc gag ttc cgc aag gcc ttc atg aag atc ttg cac tgc tga    1248
Phe Asn Ile Glu Phe Arg Lys Ala Phe Met Lys Ile Leu His Cys
405                 410                 415
<210> 13
<211> 415
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 13
Met Asp Pro Leu Asn Leu Ser Trp Tyr Asp Asp Asp Leu Glu Arg Gln
1                5                   10                  15
Asn Trp Ser Arg Pro Phe Asn Gly Ser Glu Gly Lys Ala Asp Arg Pro
20                  25                  30
His Tyr Asn Tyr Tyr Ala Met Leu Leu Thr Leu Leu Ile Phe Ile Ile
35                  40                  45
Val Phe Gly Asn Val Leu Val Cys Met Ala Val Ser Arg Glu Lys Ala
50                  55                  60
Leu Gln Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Val Ser Leu Ala Val Ala Asp
65                   70                  75                  80
Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Met Pro Trp Val Val Tyr Leu Glu Val
85                  90                  95
Val Gly Glu Trp Lys Phe Ser Arg Ile His Cys Asp Ile Phe Val Thr
100                 105                 110
Leu Asp Val Met Met Cys Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Ala Ile
115                 120                 125
Ser Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Ala Met Pro Met Leu Tyr Asn Thr
130                 135                 140
Arg Tyr Ser Ser Lys Arg Arg Val Thr Val Met Ile Ala Ile Val Trp
145                 150                 155                 160
Val Leu Ser Phe Thr Ile Ser Cys Pro Leu Leu Phe Gly Leu Asn Asn
165                 170                 175
Thr Asp Gln Asn Glu Cys Ile Ile Ala Asn Pro Ala Phe Val Val Tyr
180                 185                 190
Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val Pro Phe Ile Val Thr Leu Leu Val
195                 200                 205
Tyr Ile Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Val Asn
210                 215                 220
Thr Lys Arg Ser Ser Arg Ala Phe Arg Ala Asn Leu Lys Thr Pro Leu
225                 230                 235                 240
Lys Asp Ala Ala Arg Arg Ala Gln Glu Leu Glu Met Glu Met Leu Ser
245                 250                 255
Ser Thr Ser Pro Pro Glu Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ile Pro Pro Ser
260                 265                 270
His His Gln Leu Thr Leu Pro Asp Pro Ser His His Gly Leu His Ser
275                 280                 285
Asn Pro Asp Ser Pro Ala Lys Pro Glu Lys Asn Gly His Ala Lys Ile
290                 295                 300
Val Asn Pro Arg Ile Ala Lys Phe Phe Glu Ile Gln Thr Met Pro Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Thr Arg Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg Arg Lys Leu Ser
325                 330                 335
Gln Gln Lys Glu Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala Ile Val Leu Ala
340                 345                 350
Val Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Thr Phe Asn Ile Glu Phe Arg Lys Ala
355                 360                 365
Phe Met Lys Asp Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr Ser Ala Phe Thr
370                 375                 380
Trp Leu Gly Tyr Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Thr
385                 390                 395                 400
Phe Asn Ile Glu Phe Arg Lys Ala Phe Met Lys Ile Leu His Cys
405                 410                 415
<210> 14
<211> 11
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
ggaggtaggt g   11
<210> 15
<211> 11
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
tccccaggtg g   11
<210> 16
<211> 11
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
acaggtgagc c   11
<210> 17
<211> 11
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
cttgcaggta c   11
<210> 18
<211> 11
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
gcaggtacat t   11
<210> 19
<211> 11
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
cccccagacc a
<210> 20
<211> 11
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
aaaggtctca a   11
<210> 21
<211> 11
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
tccacagggc a   11
<210> 22
<211> 11
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
agtggtaagt g   11
<210> 23
<211> 11
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
ggtgcaggag g   11
<210> 24
<211> 11
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
ctcggtgagt c   11
<210> 25
<211> 11
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
cccccaggcg t   11
【図面の簡単な説明】
【図１】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列およびそれから導かれるラットＤ2 ドパミンレセプターのアミノ酸配列を示す図。
【図２】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列およびそれから導かれるラットＤ2 ドパミンレセプターのアミノ酸配列を示す図。
【図３】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列およびそれから導かれるラットＤ2 ドパミンレセプターのアミノ酸配列を示す図。
【図４】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列およびそれから導かれるラットＤ2 ドパミンレセプターのアミノ酸配列を示す図。
【図５】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列およびそれから導かれるラットＤ2 ドパミンレセプターのアミノ酸配列を示す図。
【図６】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列およびそれから導かれるラットＤ2 ドパミンレセプターのアミノ酸配列を示す図。
【図７】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列およびそれから導かれるラットＤ2 ドパミンレセプターのアミノ酸配列を示す図。
【図８】ラットＤ2 ドパミンレセプター、ハムスターＢ2 アドレナリンレセプター、ヒトα2 −アドレナリンレセプター、ブタムスカリンＭレセプターおよびウシサブスタンスＫレセプターのアミノ酸配列を示す図。
【図９】ラットの脳および下垂体ＲＧＢ−２トランスクリプトのノーザンブロット分析図。
【図１０】Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞およびラット線条体から調製した膜に対する 3Ｈ−スピペロンの特異的結合の飽和等温線。
【図１１】図１０のデータのスカッチャード変換図。
【図１２】Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜を用いた競合曲線。
【図１３】Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１およびラット線条体についてのＫｉ値の表。
【図１４】図１〜７に示したアミノ酸配列の疎水性プロット。
【図１５】β2 −アドレナリンレセプターアミノ酸配列の疎水性プロット。
【図１６】全体で図１〜７に示した核酸配列の２４７７塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
【図１７】全体で図１〜７に示した核酸配列の２４７７塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
【図１８】全体で図１〜７に示した核酸配列の２４７７塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
【図１９】全体で図１〜７に示した核酸配列の２４７７塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
【図２０】全体で図１〜７に示した核酸配列の２４７７塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
【図２１】全体でヒトＤ2 ドパミンレセプターの部分的配列。
【図２２】全体でヒトＤ2 ドパミンレセプターの部分的配列。
【図２３】全体でヒトＤ2 ドパミンレセプターの部分的配列。
【図２４】ＬＺＲ１およびＬＺＲ２に対する特異的〔 3Ｈ〕スピペロン結合の飽和分析。
【図２５】アゴニストによる〔 3Ｈ〕スピペロン結合阻害曲線のグラフ。
【図２６】ＤＡによる〔 3Ｈ〕スピロペリドール結合阻害に対するＧＴＰおよびＮａＣｌの効果を示すグラフ。
【図２７】ＬＺＲ１細胞におけるアデニレートサイクラーゼの阻害を示すグラフ。
【図２８】ＬＺＲ１細胞におけるアデニレートサイクラーゼの阻害を示すグラフ。
【図２９】ＤＡ感受性アデニレートサイクラーゼの阻害を示すグラフ。
【図３０】百日咳トキシン前処理によるトパミン阻害の逆転を示す表。
【図３１】百日咳トキシン前処理によるトパミン阻害の逆転を示す表。
【図３２】百日咳トキシン前処理によるトパミン阻害の逆転を示す表。
【図３３】ＧＨ4 Ｃ1 細胞の全ＲＮＡ（２０μｇ／レーン）のノーザンブロット分析。
【図３４】ＧＨ4 Ｃ1 細胞から調製した膜に対する 3Ｈ−スピペロン結合の飽和曲線。
【図３５】図３４のデータのスカッチャード法による転換図。
【図３６】ドパミンによる特異的 3Ｈ−スピペロン結合の移動のグラフ。
【図３７】ＧＨ4 ＺＲ7 細胞におけるドパミンによるｃＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ放出の阻害を示すグラフ。
【図３８】ＧＨ4 ＺＲ7 細胞におけるドパミンによるｃＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ放出の阻害を示すグラフ。
【図３９】ＧＨ4 ＺＲ7 細胞におけるドパミンによるｃＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ放出の阻害を示すグラフ。
【図４０】ＧＨ4 ＺＲ7 細胞における基準およびＶＩＰ刺激ｃＡＭＰ蓄積のドパミンによる阻害の用量依存曲線。
【図４１】ＧＨ4 ＺＲ7 細胞における基準およびＶＩＰ刺激ｃＡＭＰ蓄積のドパミンによる阻害の用量依存曲線。
【図４２】ＶＩＰ−刺激ｃＡＭＰ蓄積のドパミン誘発阻害の特異的ブロック曲線。
【図４３】ドパミンＤ2 アゴニストによるアデニレートサクラーゼの阻害を示すグラフ。
【図４４】ドパミンＤ2 アゴニストによるアデニレートサクラーゼの阻害を示すグラフ。
【図４５】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と対比して示す図。
【図４６】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と対比して示す図。
【図４７】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と対比して示す図。
【図４８】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と対比して示す図。
【図４９】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と対比して示す図。
【図５０】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と対比して示す図。
【図５１】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と対比して示す図。
【図５２】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と対比して示す図。
【図５３】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と対比して示す図。
【図５４】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と対比して示す図。
【図５５】Ｌ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍ膜への〔 3Ｈ〕ドムペリドン結合の競合曲線。
【図５６】ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット図。
【図５７】ヒトドパミンレセプター遺伝子および下垂体ｃＤＮＡの概略図。
【図５８】Ｌ−ｈＰｉｔＤ２Ｚｅｍ，Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ１およびラット線条体についてのＩＣ50値（ｎＭ）の比較表。
【図５９】ヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子におけるエキソン／イントロン接合を示す図。
【図１】
0004122403.tif 000013
【図２】
0004122403.tif 000014
【図３】
0004122403.tif 000015
【図４】
0004122403.tif 000016
【図５】
0004122403.tif 000017
【図６】
0004122403.tif 000018
【図７】
0004122403.tif 000019
【図８】
0004122403.tif 000020
【図９】
0004122403.tif 000021
【図１０】
0004122403.tif 000022
【図１１】
0004122403.tif 000023
【図１２】
0004122403.tif 000024
【図１３】
0004122403.tif 000025
【図１４】
0004122403.tif 000026
【図１５】
0004122403.tif 000027
【図１６】
0004122403.tif 000028
【図１７】
0004122403.tif 000029
【図１８】
0004122403.tif 000030
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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