(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種タンパク質に融合する、ネイスセリア・メニンギチジス（Neisseria  meningitidis）のP64K抗原のN−末端の最初の47アミノ酸から誘導され、そして以下のアミノ酸配列番号６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の安定化体ペプチドを有する融合タンパク質。
0004071282.tif 000011
【請求項２】
異種タンパク質がネイスセリア・メニンギチジス（Neisseria  meningitidis）の外膜タンパク質である請求の範囲第１項による融合タンパク質。
【請求項３】
異種タンパク質がネイスセリア・メニンギチジス（Neisseria  meningitidis）のOpc（5c）又はネイスセリア・メニンギチジス（Neisseria  meningitidis）のPorAタンパク質である請求の範囲第２項による融合タンパク質。
【請求項４】
異種タンパク質が、HIV−1からのgp120タンパク質に由来する可変領域3（V3）の中央部分の複数のコピーを有する多重エピトープ性ポリペプチドである請求の範囲第１項による融合タンパク質。
【請求項５】
異種タンパク質を融合ポリペプチドとして大腸菌内で生成する方法であって、ネイスセリア・メニンギチジス（Neisseria  meningitidis）のP64K抗原のN−末端の最初の47アミノ酸から誘導される、以下のアミノ酸配列番号６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のペプチドを前記異種タンパク質の発現のための安定化体として用いること、及び、該安定化体に対して特異的なモノクローナル抗体を該安定化体と融合するあらゆるタンパク質の免疫検出に用いること、を包含する異種たんぱく質の生成方法。
0004071282.tif 000012
【請求項６】
発現する異種タンパク質が、ワクチン調製品中で免疫原として用いることが可能なあらゆるタンパク質である請求の範囲第５項による方法。
【請求項７】
発現する異種タンパク質が、ＨＩＶ由来のｇｐ１２０タンパクのＶ３領域の中央部分の複数のコピーを含む多重エピトープ性ポリペプチド又はネイスセリア・メニンギチジス（Neisseria  meningitidis）の外膜タンパク質Opc（5c）若しくはPorAである請求の範囲第５項による方法。
【請求項８】
ネイスセリア・メニンギチジス（Neisseria  meningitidis）のP64K抗原のN−末端の最初の47アミノ酸から誘導され、以下のアミノ酸配列番号６の安定化体ペプチドに特異的であり、かつ該安定化ペプチドに融合するあらゆるタンパク質の免疫検出及び精製に用いられるモノクローナル抗体。
0004071282.tif 000013
【請求項９】
大腸菌のトリプトファンプロモーターの制御の下にあるネイスセリア・メニンギチジス（Neisseria  meningitidis）のP64K抗原のN−末端の最初の47アミノ酸から誘導され、そして以下のアミノ酸配列番号６の安定化体ペプチドをコードする配列、続いて関心のあるポリペプチドをコードするDNA断片のフレーム内にクローン化するための制限部位XbaI、EcoRV及びBamHI及び転写終止シグナルとしてのファージT4ターミネーターを、選択マーカーとしてのアンピシリン耐性遺伝子の他に有する、大腸菌における融合タンパク質の発現ベクター。
0004071282.tif 000014
【請求項１０】
ネイスセリア・メニンギチジス（Neisseria  meningitidis）の外膜タンパク質をコードするDNA断片のフレーム内にクローニングするための請求の範囲第９項による発現ベクター。
【請求項１１】
HIV−1に由来するgp120タンパク質に属する可変領域3（V3）の中央部分のコピーを含む多重エピトープ性ポリペプチドをコードするDNA断片のフレーム内にクローン化するための請求の範囲第９項による発現ベクター。
【請求項１２】
タンパクに融合する安定化タンパクを含む融合タンパクを産生する大腸菌の組換え株であって、前記安定化タンパクは、ネイスセリア・メニンギチジス（Neisseria  meningitidis）のP64K抗原のN−末端の最初の47アミノ酸から誘導され、以下のアミノ酸配列番号６を有する前記組換え株。
【請求項１３】
ヒト又は動物において用いられるワクチン調製品における請求の範囲第１項ないし第４項の融合タンパク質の使用。
【請求項１４】
請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかの融合タンパク質を適切なアジュバントの他に含むワクチン調製品。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生物工学及び遺伝子工学の分野に関し、特には、微生物ホスト中の異種蛋白質の、組換えDNAの技術を用いるそれらの細菌性タンパク質への融合による発現に関する。
従来の技術
大腸菌内でのあらゆる起源のタンパク質の生成に対する組換えDNAの技術の有用性が広く示されている。これに関して、しばしばクローン化して発現させる遺伝子の各々が個別の事例を示すという事実のために新しい変種が必要にはなるが、多くのベクターが開発されている（Denhardt, D.T. and Colasanti, J. ;Vectors, Butterworths, Stoneham, M, pp. 1791987及びLukacsovich, T. et al., Journal of Biotechnology, 13, 2431990）。
細胞内合成は、その達成可能な高い発現レベルのために、大腸菌内での異種ポリペプチドの獲得に最も用いられる戦略である（Goeddel, D.V, Methods Enzymol., 185, 3-7, 1990）。しかしながら、ホストのプロテアーゼに対する感受性又は発現したタンパク質の毒性のような因子が、高い効率の調節配列の使用とは無関係に、前記レベルを大きく低下させることがある（Reads, C.A. and Saier, M.H., J.Bacteriol., 153, 685-692; Gwyn, G.W., Membrane Protein Expression Systems: To User's Guide, Portland Press, London, UK, 29-82）。
適切なベクター中の、ホスト細胞中で安定なポリペプチドをコードする核酸配列を有するフレーム内に存在する関心のあるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のクローン化により、細胞質中での融合タンパク質として知られるハイブリッド産物の発現が生じる（Marston, F.A.O., Biochem.J. 240, 11986）。このようなポリペプチドは、一般に、包接体を形成することによりホストによるタンパク分解性の分解に対する感受性が低く、又は毒性が少なく、その結果、安定化体ペプチドを用いずに得られるものよりも高い発現レベルを生じる（Itakura, K. et al., Science, 198, 10561977）。加えて、この種類の発現は、引き続く組換え産物の復元に異なる方法が利用可能である場合、精製の初期工程を容易に、かつ安価にする（Fischer, B., Sumner, I. and Goodenough, P., Biotechnol. Bioeng., 41, 3-13）。
これらの包接体は、大腸菌内において多くの組換えタンパク質が発現する間、細胞質ゾル内に電気密集体（electrodense bodies）として現われる不溶性タンパク質凝集体である（Rinas, Or. and Bailey, J., Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, 609-614）。これらは部分的に折り畳まれているポリペプチド間の相互作用の結果である。このようなポリペプチドの凝集は、それらの内部で疎水性残基が溶媒に露出しているため、熱力学的に好都合である（Kiefhaber, T., Rudolph, R. et al., Biotechnology, 9, 825-829）。多量の二硫架橋形成アミノ酸（システイン）又はベータ転回形成アミノ酸（プロリン）よる細菌細胞質ゾル中での多くの真核性タンパク質のゆっくりとした折り畳みは、それらの安定化体ペプチドとしての多大な使用を刺激している。抗体への結合活性を有するポリペプチドのこの目的での前者の使用例は、国際特許出願PCR WO9207939 A2 920514号によるヒト母乳の脂肪のグロブリン（HMFG）に由来するもの；欧州特許出願EP 0464533 A1 920108号に記述される免疫グロブリンの定常領域に由来するもの；成長ホルモン（EP 0429586 A1 910605号）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（WO 8809372 A1 881201号）及びブタアデニレートキナーゼ（EP 0423641 A2 910424号及びEP 0412526 A2 910213号）のヒトアンギオゲニンに由来するもの（欧州特許出願EP 0423641 A2 910424号）である。
しかしながら、融合タンパク質の重要な部分を構成する安定化体ポリペプチドの使用には、前者がワクチンの候補である場合、不都合が幾つかある。これは、外来配列が存在することにより、B及びT細胞エピトープの本来の順序（Denton, G., Hudecz, F., Kahtar, J. et al., Peptide Research, 7, 258-264）又は抗原存在細胞によるそれらの処理（Del Val, M., Schlicht, H., Ruppert, T., et al., Cell, 66, 1145-1153）が変化し得るためであり、これは特異的なエピトープ抑制の現象によってその候補の免疫原性にさえ深刻な影響を及ぼし得る（Etlinger, H., Immnol. Today, 13, 52-55）。
前述の現象の結果として、依然として発現を安定化する小断片を定義しようとする試みがなされている場合がある。例えば、ドイツ特許出願35 41 856 A1（Hoechst AG）は、ヒトタンパク質インターロイキン（IL−2）のN−末端の少なくとも最初の95アミノ酸で一致する安定化体ペプチドを用いて、大腸菌内で合成される不溶性形態の融合タンパク質を得る可能性について報告する。同様に、同じ企業からの欧州特許出願0 416 673 A2号及び229 998号においては、前記タンパク質の最初の58又は38アミノ酸と一致する安定化体ペプチドが用いられている。欧州特許416 673 B1号においてはIL−2の最初の58アミン酸も用いられており、ヒト血清アルブミン（欧州特許出願EP 0423641 A1 920212号）のN−末端断片；結合組織の活性化ペプチドIII（WO 90136647 A1 901115号）及びヒトカリクレインの断片（EP 0381433 A1 900808号）を用いる場合に同様の戦略が同じ目的で用いられる。これらの発明は従来の問題を解決はするが、得られる融合ポリペプチドは、それらの中にヒトタンパク質に相同もしくは等価の配列が存在することによる自己免疫疾患の誘発の可能性のため、ヒトにおいて用いられるワクチンの調製に含めることはできない。
細胞内発現への細菌起源の安定化体ポリペプチドの使用に代わり、したがって、ヒト起源の抗原との交叉反応性がない代替法の調査も成功している。この目的で最も用いられるタンパク質のうちの1つは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ（Itakura, K. et al., Science, 198, 10561977）又はそのタンパク質（Hoechst AG社のドイツ特許出願EP 0235754 A2 870909号）である。この系の主として不都合な点はこのタンパク質の大きなサイズであり、これは所望のペプチドがそのハイブリッドタンパク質全体の小さな割合を示すにすぎないという状況を惹起する（Flowers, N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 25, 2671986；Goeddel, D.V. et al., P.N.A.S. USA, 76,106）。同様の問題は、破傷風菌類毒素及びシュードモナス種の外毒素のC断片の使用を提示する（国際特許出願PCT WO 9403615 A1 940217号及び欧州特許出願EP 0369316 A2 900523号）。大いに確約されている発現の変形は大腸菌のチオレドキシンとの融合を使用するものであり（PCT特許出願WO 9402502 A1 940203号）、これは浸透圧によって細胞から解放され（Elyaagoubi, A., Kohiyama, M., Richarme, G., J.Bacteriol., 176, 7074-7078）精製が容易になる特性を用いるものである。しかしながら、この概要は包接体の獲得に対しては機能的ではない。これは、包接体がこの手順では遊離しないためである。
これらの問題の多くはモジュラー融合タンパク質を設計することにより解決されている。これらにおいては、安定化体タンパク質をスペーサーによって関心のあるタンパク質から分離する。このスペーサーは両者が独立して折り畳まれることを許容し、そのアミノ酸配列はそれを特異的エンドペプチダーゼの攻撃に対して感受性にする。選択された安定化体を認識するリガンドが存在する場合、その融合ポリペプチドをアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、異なるプロテアーゼを用いる処理により最終的にそれを安定化体から分離することが可能である（Cress, D., Shultz, J. and Breitlow, S., Promega you Note, 42, 2-7）。さらなる利点は、精製の中間工程の後工程として、発現させるタンパク質の各々に対する抗体を必要とすることなく、この分子相互作用を利用することの可能性である。その公知の例は、Upjohn社のPCT特許出願WO 9115589 A1 911017号に記述されるものによる、6Hysを縦一列に有する安定化体及びニッケルキレートのアフィニティマトリックスを含んでなる系におけるヒスチジン（Hys）とニッケル（Ni）及び亜鉛（Zn）のような幾つかの金属との親和性を用いるものである。これらの全てにもかかわらず、この種の発現系は全ての場合において機能的であるわけではない。これは、とりわけ、関心のあるタンパク質が選択されたプロテアーゼに対する制限部位を有し、又はスペーサーが溶媒に利用可能であるように折り畳まれ（Uhlen, M. and Moks, T., Meth. Enzymol. 185, 129-140; Cress, D., Shultz, J. and Breitlow, S., Promega you Note, 42, 2-7）、安定化体とアフィニティマトリックスとの結合を妨害し（New England Biolabs, The NEB Transcript, 3, 14）、又は、その精製のために、単にその生物学的活性に影響を及ぼす条件を必要とする可能性があるためである。これらの理由のため、発現させるタンパク質の各々が特定の事例を示すので、異なる変形があることが望ましい。このために、アミロース樹脂に対する親和性を有する大腸菌のマルトース結合タンパク質（MalE）に基づく安定化体タンパク質（欧州特許出願EP 0426787 A1 910515号）が、固定化基質のマトリックスを用いて得ることができるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素（欧州特許出願EP 0131363 A1 850116号）又はグルタチオン−S−トランスフェラーゼ（Amrad Corp., Ltd.の欧州特許出願EP 0293249 A1 88130号）において；特許出願PCT WO 9109946 A1 910711号によるスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のプロテインAにおいて；及びイン・ビボでビオチン化され、ビオチンの親和性に基づくアビジンによる精製を可能にするプロプリオニバクテリウム・シェルマニイ（Proprionibacterium shermanii）のトランスカルボキシラーゼ複合体の12.5kDaサブ単位（Cress, D., Shultz, J. and Breitlow, S., Promega Notes, 42, 2-7,特許出願EP 0472658 A1 920304号又はWO 9014431 A1 901129号）において開発されている。
米国イリノイ大学と共同でBiotechnology Research and Developmet Corporationによって開発された欧州特許出願EP 0472658 A1 920304号又はWO 9014431 A1 901129号に説明される方法が特に関心の高い結果である。この出願においては、発現系は、大腸菌のピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のE2サブ単位としても知られるジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（EC 2.3.2.12）のリポ酸結合ドメインを用いることが説明されている。このドメインは、翻訳後に、イン・ビボで、そのリジンのうちの1つの窒素にリポ酸分子が付加されることにより修飾され（Guest, J.R., Angier, J.S. and Russell, G.C., Ann.N.Y.Acad.Sci., 573, 76-99）、これが、リポイル化ドメイン（lipoylate domains）のみを認識する抗体を用いることにより、それとの融合タンパク質の精製及び同定に利用される。
しかしながら、この方法は多くの欠点を有する。まず第1に、リポ酸への結合ドメインを有する蛋白質の過剰発現が細胞のリポイル化の能力を過剰なものとし、その結果として、リポイル化されていないドメイン（Thousands, J.S. and Guest, J.R., Biochem.J., 245, 869-874; Ali, S.T. and Guest, J.R., Biochem. J., 271, 139-145）又はオクタノイレート（Ali, S.T., Moir, A.J., Ashton, P.R. et al. Mol. Microbiol., 4. 943-950; Dardel, F., Packman, L.C. and Peham, R.N., FEBS Lett. 295, 13-16）が生じ、これが免疫親和性による精製の間の収率を減少させる可能性があることが知られている。第2に、これらのドメインの文脈中のリポ酸を特異的に認識する抗体の存在を共通の因子として有する自己免疫に起源するものと考えられる一群の疾患が存在する。それらの中には、肝臓内胆管の炎症及び進行性障害を特徴とする慢性疾患である一次胆汁性肝硬変（Tuaillon, N., Andre, C., Briand, J.P. et al., J.Immunol., 148, 445-450）；及び広く用いられる、トリフルオロアセチルリジンの形成によってあるタンパク質を誘導体化する麻酔剤であるハロタンによって誘発される肝炎（Gut, J., Christen, Or., Frey, N. et al., Toxicology, 97, 199-224）がある。この疾患の患者の血清は、その分子構造がジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼの文脈中でリポ酸によって模倣される前記複合体を認識する（Gut, J., Christen, Or., Frey, N. et al., Toxicology, 97, 199-224）。このため、そのようなペプチドにおけるリポ酸の存在は、それを含む融合タンパク質がヒトにおいて用いられるワクチン候補を構成する場合、回避することが望ましい。
発明の開示
本発明の目的は、大腸菌内で異種蛋白質を融合ポリペプチドとして高レベルで発現する手順である。これは、包接体として発現する能力をそれらに付与するN．メニンギチジスB：4：P1. 15（N. meningitidis B:4:P1.15）のP64K抗原（欧州特許出願0 474 313 A2）の最初の47アミノ酸に由来する安定化体配列誘導体を使用することに基づく。この配列は、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼのリポ酸結合ドメインの一部との相同性を示すものの、それ自体での修飾の可能性を排除するように遺伝子操作されており、かつ免疫原性が低いという利点を示す。また、この手順は前述の安定化体を特異的に認識するモノクローナル抗体の使用も包含し、これはそれらと融合するあらゆるタンパク質の免疫検出を可能にする。
特には、本発明においては、制限部位XbaI、EcoRV及びBamHIが続く大腸菌のトリプトファンプロモーター（ptrip）の制御の下にある前記配列を坦持する組換えプラスミドが発現ベクターとして用いられる。これらは、関心のあるポリペプチドをコードするDNA断片のインフレームクローニングを可能にする。また、このベクターは、バクテリオファージT4の遺伝子32の転写に対するターミネーター及び選択マーカーとしてのアンピシリンに対する耐性遺伝子も有する。
また、この手順は、得られる融合ポリペプチドをヒトにおいて用いられる運命にあるワクチン調製品に含めることも可能にし、用いられる安定化体ペプチドの性質は外来タンパク質又はそれに結合する多重エピトープ性ペプチドに対する防御免疫応答の生成を可能にする。
大腸菌内での組換えDNA技術による融合蛋白質の生成のための、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼのリポ酸結合ドメインの一部に相同の安定化体ペプチドの遺伝子操作及び使用が本発明の新規性を構成する。特には、N．メニンギチジスB：4：P1. 15のP64K抗体（欧州特許出願0 474 313 A2号）の最初の47アミノ酸の安定化体ペプチド誘導体及びこの安定化体を特異的に認識するモノクローナル抗体の前述の目的での使用が本発明の新規性を構成する。
実施例
［実施例1］
Ｎ．メニンギチジスのLpdA抗原（P64K、LpdA）は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（EC1. 8. 1. 4）の集団、具体的には、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ中に存在するものに類似するリポ酸結合ドメインをそのN−末端部分に有することを特徴とするそれらの亜群に属する、594アミノ酸の蛋白質である（Kruger, N., Oppermann, F.B., Lorenzl, H. and Steinbuchel, A., J.Bacteriol., 176, 3614-3630, 1994; Hein, S. and Steinbuchel, A., J.Bacteriol., 176, 4394-4408, 1994）。このLpdA蛋白質は、そのN−末端に5アミノ酸（MLDKR）が付加されてクローン化され、大腸菌内で過剰発現されている（欧州特許出願0 474 313 A2号；図1）。LpdA及びP64Kという名称は等価であるが、この組換えタンパク質を指すP64Kという名称を用いる。
前記抗原に由来する異なる断片の免疫原性を決定し、より免疫原性が少ないものを安定化体ペプチドとして用いる可能性を分析するため、合成ペプチドに対するポリクローナル血清抗−P64Kの反応性を評価することにより、P64Kに存在するB細胞に対するエピトープの位置を決定した。
この目的で、P64Kタンパク質をブチル−TSKにおける疎水性クロマトグラフィー及びゲル濾過により精製し（欧州特許出願0 474 313 A2号）、それをトリクロロ酢酸（TCA）での沈殿により変性させ、NaOHで中和し、ゲル濾過クロマトグラフィーによってリン酸タンポン中に平衡化した。この調製品を20μgの用量で2μgの水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いて、皮下経路で30匹のBalb／cマウスを免疫し（第0日）、7及び21日後に同じ抗原で追加免疫した。最初の抽出の28日後に血清を集めた。得られた血清を合わせ、その結果得られた混合物を分割して−20℃で保存した。
さらに、それぞれがこの組換えタンパク質の配列全体を覆い、かつ10アミノ酸づつ重複する20アミノ酸（a. a. ）のペプチド59個を、固相での合成用の市販キット（Multipin Peptide Synthesis System, Chairon Mimotope Pty, Ltd., USA）を用いて、96ウェルプレート形式で、製造者によって与えられる指示に従って合成した。続いて、これらにタンパク質のN−末端から番号を付けた。これらのペプチドに対する血清抗P64Kの反応性を、1：2000の希釈率の血清を用いて決定した。用いられた免疫検定の形式は前記市販キットの製造者が推奨するものと同じものであった。
これらの結果を図2に示す。図2には、各ペプチドの吸光値が示されている。免疫原が変性され、隠されているエピトープが露出している可能性があるにもかかわらず、最初の110アミノ酸（ペプチド1ないし11で表される）が免疫原性に乏しいセグメントを形成することは明らかである。このセグメントは、本質的に、リポ酸結合ドメイン並びにプロリン及びアラニンに富むスペーサー領域を含み、このプロリン及びアラニンはそれをタンパク質の残部に結合させる。この結果は、この安定化体ペプチド（又はそれに由来する派生断片）が、それが融合するポリペプチドの免疫原性に対する影響が小さいであろうことから、安定化体ペプチドとして有利に用いることができることを示す。この利点は、その融合ポリペプチドがワクチン候補を構成する場合、特に重要である。
［実施例2］
異なる異種蛋白質を、大腸菌内において、N．メニンギチジスB：4：P1. 15のP64K抗原のリポ酸結合ドメインとのそれらの融合を介して発現させるため、前記タンパク質の最初の47アミノ酸（配列番号1）から誘導される安定化体ペプチドをコードする配列が導入されている発現ベクターpM−83を構築した。この配列を、バクテリオファージT4のターミネーターを転写終止のシグナルとして、アンピシリン耐性遺伝子を選択マーカーとして含む、大腸菌のトリプトファンプロモーターの制御の下でクローン化する。
PM−83発現ベクターを得るため、最初に、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）（Randall, K. et al., Science, 42394, 487-491, 1988）を用いて、P64K抗原をコードするヌクレオチド配列を坦持するプラスミドpM−6（欧州特許出願0 474 313 A2号、図1）から安定化体ペプチドを増幅した。この目的のため、オリゴヌクレオチドプライマー1573及び1575を用いた。これらのプライマーは、増幅されるDNA断片中に、それによってコードされる安定化体のアミノ及びカルボキシ末端に一致するNcoI及びXbaI制限部位を導入する。
0004071282.tif 000002
得られた安定化体によってコードされるアミノ酸配列を図3に示す（配列番号6）。制限部位NcoIの導入によってロイシン2がバリンに変更され、プライマー1575によって配列ETD（45−47位）が取り除かれてその位置に配列DLEが導入される。このようにして、リポ酸の結合リジン（48位）が安定化体の一部を形成することがなくなり、これらのドメインで高度に保存されるその近辺（Russell, G.C., Guest, J.R., Biochim. Biophys. Record, 1076, 225-232,1991）が変更される。これらの全ては、これらのドメインを有する融合タンパク質の翻訳後リポイル化、及び一次胆汁性肝硬変（Tuaillon, N., Andre, C., Briand, J.P. et al., J.Immunol., 148, 445-450）患者体内に存在するものに類似する特異性を有する自己抗体のこれらのタンパク質を用いる免疫の間の生成の可能性を排除することを保証する。
予めXbaI／NcoIで消化されたこの断片（配列番号5）をプラスミドpILM−29（Guillen, G., Loyal, M., Alvarez, A. et al., Acta Biotecnologica, 15, 96-106,1995）にクローン化することによりプラスミドpM−83を構築した。このプラスミドpILM29はヒトIL−2の最初の58アミノ酸と一致する安定化体ペプチドに融合するN．メニンギチジスのタンパク質Opc（5c）の遺伝子を有し、したがって、このようなクローニングによりIL−2の断片が除去され、OpcがP64Kタンパク質の安定化体に融合する（図4）。pM−80と命名された得られたプラスミドから酵素XbaI及びBamHIを用いてopc遺伝子を切り出し、その場所にオリゴヌクレオチド1576及び1577のハイブリダイゼーションによって形成されるアダプターをクローン化した。これにより、安定化体断片の3’先端に制限部位XbaI、EcoRV及びBamHIが導入された。
0004071282.tif 000003
このプラスミドをpM−83と命名した（図4）。正しいリーディングフレームの維持に加えて、全てのDNA断片及びオリゴヌクレオチドの挿入をSanger,F.ら（PNAS, USA, 74: 54631977）に従うDHA配列決定により確認した。
［実施例3］
得られる融合タンパク質がワクチン候補である場合には、安定化体がヒトペプチドと高い相同性を有する領域を含まないことが重要である。pM−83（実施例2）の安定化体ペプチドとヒトタンパク質との類似性を、核酸のEMBLデータライブラリーv. 38（Curl, C.M., Fuchs, R., Higgins, D.G. et al., Nucl. Acids Beast. 21, 2967-2971, 1993）及びアミノ酸配列のSWISS−PROT v. 38（Bairoch, A. and Boeckmann, B., Nucl. Acids Beast. 21, 3093-3096, 1993）（いずれも1994年3月版）のデータベースにおいて相同性を検索することにより決定した。この検索のため、BLASTプログラムのうちの2つ：１つのアミノ酸配列をタンパク質配列の基準（この場合SWISS−PROT）と比較するBLASTP、並びにアミノ酸配列をこの場合EMBLデータライブラリーであるヌクレオチド配列の基準の両方向及び全てのリーディングフレームにおける翻訳の全てと比較するTBLASTNを用いた（Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, And. W. and Lipman, D.J., J. Mol. Biol., 215; 403-410, 1990）。いずれの場合においても、バロリゼーションマトリックス（valorization matrix）PAM120［Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. and Orcutt, B.B., in: Dayhoff, M.Or.（of.）, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, supl.3, 345-352, Natn. Biomed. Beast. Found., Washington, 1978］を用いた。
その結果を図5及び6において観察することができる。図5及び6においては、BLASTP及びTBLASTNのそれぞれの結果のシートが示される（よりよく理解するため、原核生物及び下等真核生物の相同配列は省略されている）。（ヒト及びラットのピルビン酸キナーゼ；及びヒト及びイヌのムチンのC−末端において）両アルゴリズムによって検出される相同性が最も高い平常の発生確率を示すため（比較として、アゾトバクター・ビネランディ（Azotobacter vinelandii）のジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼの同じ確率は3.7×10-5である）、ヒト又は他のあらゆる哺乳動物のタンパク質がP64Kから誘導される安定化体との有意の類似性を示さないことは明らかである。
上述の全てから、前記安定化体がワクチン候補においてまず間違いなく用いられるものと結論付けることができる。
［実施例4］
高レベルかつ包接体の形態での細胞内合成を可能にするpM-38中の本発明の安定化体の能力を、ヒトインターロイキン−2の最初の22もしくは58アミノ酸に融合する幾つかのタンパク質、この目的で広く用いられる融合ペプチド、又は実施例2に記述されるものに従って修飾されたP64K抗原の最初の47a.a.に融合する幾つかのタンパク質の発現を比較することにより評価した。
このために、N．メニンギチジスB：4：P1. 15の外膜蛋白質PorA及びOpcをコードする遺伝子をベクターpFP15（hIL2−58；欧州特許416 673 B1号）又はpM−83（P64K−47）にクローン化し、ヒト免疫不全ウイルス、HIVの幾つかの単離体の免疫原領域を含む多重エピトープ性ポリペプチド（MEP）をコードする遺伝子をベクターpILS31（hIL2-22, Castellanos-Sierra, L.R., Hardy, E., Ubieta, R., et al.,提示された論文）又はpM−83にクローン化した。得られる発現プラスミドはpILM−28（IL2−58 PorA; Guillen, G., Alvarez, A., Lion, L., et al., 494-498 in: Conde-Gonzalez, C.J., Morse, S., Rice, P. et al.（eds）., Pathobiology and Immunobiology of Neisseriaceae, Instituto de Salud Publica Nacional, Cuernavaca, Mexico, 1994）、pM−82（P64K−47 PorA; Niebla, ., Alvarez, A., Gonzalez, S. et al., 85-86 in: Evans, J.S., Yost, S. and Maiden, M.C.J. et al.（eds.）., Neisseria 94: Proceedings of the IX International Pathogenic Neisseria Conference, Winchester, England, 1994）、pILM−29（IL2−58 Opc; Guillen, G., Leal, M., Alvarez, A. et al., Acta Biotecnologica, 15, 97-106, 1995）、pM−80（実施例2、図4）、pTAB4（IL2−22＋MEP）及びpTAB9（P64K−47 MEP）である。
TAB4及びTAB9タンパク質は、HIV−1のgp120タンパク質の可変領域3（V3）の中央部分の幾つかのコピーを含む多重エピトープ性ポリペプチド（MEP）である。これらのMEPを構築するため、以下の単離体のV3領域の15個の中央アミノ酸を選択した。
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これらの領域を、配列AGGGA（配列番号17）の5アミノ酸のスペーサーペプチドで結合する。
これを達成するため、スペーサーペプチドによって結合されているV3エピトープをコードするDNA配列を化学合成により得（配列番号21）、ヒトIL−2の最初の22アミノ酸に融合しているトリプトファンプロモーターの制御の下でクローン化した（図7）。pTAB3と命名された得られたプラスミドから、MEPの遺伝子、トリプトファンプロモーター及びT4ターミネーターを含む断片を酵素ScaI及びHindIIIを用いる消化により切り出し、pUC19（Yanisch-Perron, C. et al., 1985, Gene 33, 103-119）にクローン化してpTAB4を得た（図7）。最後に、酵素NcoI及びXbaIを用いる消化によりヒトIL−2から誘導される安定化体をコードする配列を除去し、その場所に、実施例2に記述されるポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）によって得られるP64K抗体の最初の47アミノ酸をコードする断片をクローン化することによりpTAB9を構築した。得られたMEPの配列を図8に、その構造を図9Aに示す。
これらのプラスミドの全てに用いられる大腸菌K−12のホスト株は、pILM−28、pILM−29、pM−800及びpM−82についてはW3110（Hill, C.W., and Hamish, B.W. Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 7069, 1991; Jensen, K.F., J. Bacteriol., 175, 3401-3407, 1993）であり、pTAB4及びpTAB9についてはW3110 trpA905であった。その発現は、全ての場合において、アンピシリン（Ap）を50μg／mL及びトリプトファン（W）を100μg／mL含む5mLのLB培地（Sambrook, J., Fritsch, Y.F. and Maniatis, T., Mokecular Cloning: To Manual Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, New York, USA）の培養物を接種し、これを37℃で12時間成長させることにより達成した。この培養物を用いて、50mLのLB−Ap（pTAB4及びpTAB9）又はM9塩（Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972, New York, USA）、1％のグルコース、1％のカゼイン加水分解物、CaCl2 0.1mM、MgCl2 1mM及び50μg／mLのApを含んでなる定義された培地の培養物を接種し、37℃及び250r.p.m.で12時間成長させた。その後、全タンパク質試料を取って変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE, Laemmli, O.K., Nature, 227, 680, 1970s）によって分析し、クーマシー・ブリリアント・ブルーR−250で染色した。発現パーセントをレーザーBromma−LKBの濃度計において分析した。それらの細胞位置を、ライソザイム及び超音波での処理を組み合わせることよって細胞を溶解し、次いで可溶性蛋白質を不溶性のものから遠心によって分離することにより決定した。タンパク質の不溶性を包接体としてのその発現を仮定する基準として用いた。これは、それらが同じ挙動（膜又はペプチドグリカンとの会合）を示し得る他の条件がこの場合に当てはまるものとは考えられないためである。
これらの結果の要約を図10Aに見ることができる。全ての場合において、P64Kから誘導される安定化体の下での発現は、異種蛋白質：全細胞性タンパク質の関係（MEPの場合については図10Bを参照）に関わるIL−2のペプチドに融合する場合に得られる発現に匹敵し、これは融合ペプチドの発現のためのベクターとして用いられるpM−83の能力を裏付ける。これらのポリペプチドが、MEPのようにそれらの小さいサイズ及びホストのプロテアーゼに対する感受性により、又はタンパク質PorA及び一般の細菌性ポリン（porins）の場合におけるそれらの毒性により融合していない場合、大腸菌内で発現させることが困難であることに価値はない（Carbonetti, N.H. and Sparling, P.F.; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 9084-9088）。全ての場合において、pTAB9について例示されるように（図10C）、生成物が包接体として得られた。
結論として、N．メニンギチジスのP64K抗体の最初の47アミノ酸（P64K−47）に由来する安定化体誘導体を使用することにより、他の系のもの（欧州特許出願0 416 673 A2号及び229 998号、Hoechst AG；欧州特許0 416 673 B1号；Castellanos-Sierra, L.R., Hardy, E., Ubieta, R., et al.、提示された原稿）に匹敵する包接体としての異種蛋白質の発現の効率が、ヒト起源の抗原との有意の相同性がないことから生成物が直接（すなわち、安定化体から分離されることなく）用いられるというさらなる利益を伴って生じる。
［実施例5］
安定化体を特異的に認識するリガンド（例えば、抗体、補因子等）の利用可能性は、組換えタンパク質のあらゆる発現系において望ましい特性である。これは、前述のものが、例えば、前記リガンドがクロマトグラフィー樹脂に固定されている場合にはアフィニティ精製の、及び（抗体の場合には）免疫学的技術による精製の中間工程の後工程の効率的な計画の設計を、発現した異種タンパク質の素性とは関わりなく、可能とすることによるものである。
このような目的は、この安定化体に対するモノクローナル抗体（MAb）を得るために、マウスをタンパク質TAB13（配列番号20）で免疫することにより達成された。TAB13は、さらなるV3コンセンサス領域が存在することが異なるTAB9から誘導されるMEPである（図9B）。
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このMEPを、TAB4及びTAB9について説明されるものに類似する方法で発現させ（実施例4）、精製した（実施例6）。
その後、Balb／cマウスを、水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いる20μgのTAB13の3用量を15日間隔で皮下投与することにより免疫した。この動物に、リン酸バッファー中の同じ抗原20μgを最後の投与の20日後に腹腔内投与することにより追加免疫した。その脾臓細胞をミエローマX63 Ag8 653と融合させ、得られたハイブリドーマを単離して確立されている方法（Gavilondo, J.V.（ed.）, Monoclonal Antibodies: Theory and Practical, Elfos Scientiae, 1995, The Havana, Cuba）に従って試験した。
この単離ハイブリドーマによって分泌される抗体の反応性を、MEP Tab13、P64Kタンパク質又はTAB13に存在する異なるV3領域を示す合成ペプチドでプレートを被覆してELISAにより評価した。得られた合計18個の陽性クローンにおいて、そのうちの448／30／7と命名されたものは64Kに加えてTAB13を認識したが、gp120に由来するペプチドは認識しなかった。
pM−83の安定化体ペプチドによるこのMAbの特異性及びそれを含むタンパク質の免疫学的検出へのその使用可能性を、異なる試料、P64Kから誘導される安定化体（P64K−47）に融合する異種タンパク質、又は同じ融合タンパク質もしくはIL−2の最初の58アミノ酸（IL2−58）に融合するものを用いて、ウェスタンブロッティングによって決定した。これを行うため、大腸菌MM294株をpILM−28（IL2−58＋porA）、pM−82（P64K−47＋porA）、pTAB13（P64K−47＋MEP）、pM−6（P64K）及びpFP15（IL−2）で形質転換した（Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: To Manual Laboratory, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA）。P64Kの最初の120アミノ酸を有し、前述のプラスミドと同じ調節シグナルの制御の下にあるリポ酸への結合ドメインを含む発現プラスミドpM−134も用いた。このセグメントは、プライマー1573（配列番号2）及び2192（配列番号4）を用いてPCRによって増幅し、酵素NcoI及びBamHIで消化して、同様に消化されているプラスミドpFP15（実施例4を参照）にクローン化した。これらの形質転換体を、実施例4においてpTAB4及びpTAB9について指定されている成長条件で発現させた。
得られた結果を図11に示す。ここから理解することができるように、MAb 448／30／7は、プラスミドpM−6、pM−82、pTAB13及びpM134の試料と、これらのタンパク質の全てが抗原的に異なるにもかかわらず反応性であるため、おそらく安定化体P64K−47内部の直線状エピトープを認識する。この実験は、あらゆる場合においてこの反応性が安定化体（例えば、プラスミドpILM−28及びpM−82：いずれも異なる安定化体の下に遺伝子porAを坦持する）に融合するタンパク質によるものではないことを示し、これはこのMAbの認識の特異性を立証するものである。
結論として、安定化体p64K−47によって形成される発現系、この安定化体とMAb 448／30／7とを有するプラスミドが、広く様々なタンパク質を包接体の形態で効率的に合成し、発現するポリペプチドの各々に対する免疫学的プローブの従来の有用性なしでそれらを検出することを可能にする。
［実施例6］
安定化体に融合しているポリペプチドに対する免疫応答に有害な効果がないことが、ワクチン候補のための発現系を選択する際に考慮される重要な因子である。安定化体P64K−47に基づく発現系の利点の1つはまさにその低下した免疫原性（実施例1）であり、これは前述のことを保証するものである。それにもかかわらず、免疫応答における安定化体P64K−47の融合タンパク質に対する影響を、MEP TAB4（IL2−22）及びTAB9（P64K−47）に存在するV3領域の他のペプチドに対する抗体応答を比較することにより、定性的に評価した。
TAB4及びTAB9の発現及び精製のため、実施例4に説明されるようにW3110 trpA905＋pTAB4及びW3110 trpA905＋pTAB9株のバイオマスを得た。このバイオマスを、フッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）及び非イオン性洗浄剤トリトンX−100の存在下においてライソザイム及び超音波での処理を組み合わせることにより破壊し、分別遠心によって包接体を得、これらの包接体のカオトロフィック剤（caotrophic agents）及び洗浄剤を用いる2回の連続洗浄サイクル（TAB4：１．尿素4M  トリトンX−100  1％、2．尿素8M。TAB9：１．尿素8M  トリトンX−100  1％、2．塩化グアニジウム6M）によりMEPを部分的に精製及び可溶化した。最後に、得られた上清を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のC4 VYDACカラム中で20ないし80％のアセトニトリルの勾配によって精製した。ほぼ90％の純度が達成された。
これらの精製組換えタンパク質を、水酸化アルミニウムのゲル中で、タンパク質のmg当り60mgのアジュバントの関係を用いてアジュバント処理した。これらの調製品を用いて、200μg／用量で皮下投与することにより5群のウサギを免疫した。その免疫応答を、免疫に用いられたMEP又はそこに存在するV3領域の1つの各々に対応するペプチドで十分に被覆されている96ウェルのポリスチレンプレート（High binding, Costar, USA）を用いて、ELISAにより評価した。それらの力価を、前免疫血清の混合物の2倍を超える吸光度値を有する各血清の最大希釈として算出した。全ての血清を2回分析した。
得られた値（図12）は、V3領域に対する力価が様々なIL2−22＋MEP（TAB4）とP64K−47＋MEP（TAB9）との間で類似することを示す。これらのペプチドの認識頻度はTAB9が僅かに大きいものの、この差は統計的には意味がない（p＜0.05）。結論として、この異種タンパク質の免疫原性は安定化体P64K−47によってはほとんど影響を受けず、かつ現在用いられている他の発現系に匹敵するものである。
図面の説明
図1：P64Kをコードする遺伝子lpdAのヌクレオチド配列。本来遺伝子lpdAには存在しない、プラスミドpM−6（欧州特許出願0 474 313 A2号）に付加された配列はイタリック体で示されている。
図2：P64Kのペプチドに対するマウスのポリクローナル血清の反応性。結果を陽性とみなす最小値として0.4光学密度を選択した。
図3：プラスミドpM−6からPCRによって増幅されたDNA配列から推定される、安定化体のアミノ酸配列。下線が付された配列はオリゴヌクレオチドプライマーに相当する。
図4：プラスミドpM−83を構築するための戦略。
図5：BLASTPプログラムを用いる、安定化体の配列（’Query’）とSWISS−PROTベースに存在するもの（’Sbjct’）との間の相同性の検索結果。ヒトタンパク質又は哺乳動物タンパク質についての対応する結果のみを示す。P（N）は無作為配列を含んでなるベース内にN等価整列を発見する確率を表し、相同の有意性はこのP（N）の値に従って減少する。同一の残基はそれらの一文字コードで、保存される置換は’＋’で表し、差異は示さない。
図6：TBLASTNプログラムを用いる、安定化体の配列（’Query’）とEMBLデータライブラリーの配列の可能性のある翻訳の全て（’Sbjct’）との間の相同性の検索結果。ヒトタンパク質又は哺乳動物タンパク質に対応する結果のみを示す。P（N）は無作為配列を含んでなるベース内にN等価整列を発見する確率を表し、相同の有意性はこのP（N）の値に従って減少する。同一の残基はそれらの一文字コードで、保存される置換は’＋’で表し、差異は示さない。
図7：プラスミドpTAB4及びpTAB9を構築するための戦略。
図8：MEP TAB9のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
図9：A：MEP TAB4及びTAB9の一般構造。B：MEP TAB13の一般構造。
図10：ヒトIL−2又はP64K抗原の最初の47アミノ酸に由来する安定化体誘導体の下での遺伝子porA、opc及びMEPの発現の比較。
A：比較表。hIL2−58はヒトIL−2の最初の58アミノ酸を指し、hIL2−22は最初の22アミノ酸を指し、かつP64K−47はP64K抗原の最初の47アミノ酸に由来する安定化体誘導体を指す。
B：SDS−PAGEによるプラスミドTAB4及びTAB9におけるMEPの発現の比較分析。レーンA：分子量マーカー；B：W3110 trpA905株の全タンパク質；C：W3110 trpA905＋pTAB4の全タンパク質；D：精製TAB4；E：W3110 trpA905 pTAB9の全タンパク質；F：精製TAB9。
C：包接体におけるTAB9の発現。A：試料の可溶性蛋白質。B：不溶性タンパク質又は膜タンパク質。
図11：1：陰性対照、2：pM−6（P64K）、3：pM−82（P64K−47＋porA）、4：pTAB13（P64K−47＋MEP）、5：pFP15（IL−2）、6：pM−134（P64K−120）、7：pILM−28（IL2−58＋porA）で形質転換された大腸菌MM294の全タンパク質試料に関する、MAb 448／30／7を用いるウェスタンブロッティング。分子量マーカーを左に示す。
図12：TAB4及びTAB9で免疫したウサギのELISAによる力価の逆数。MG：抗V3の力価の逆数の幾何平均；R：V3ペプチドとの反応性のパーセント。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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