(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列からなるコレステロール低減化ペプチド。
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドを有効成分とするコレステロール低下剤。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドを含有するコレステロール低下食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コレステロールの低減化に関するものであり、更に詳細には、新規コレステロール低減化ペプチドを使用するコレステロール低減システムに関するものである。
【０００２】
本発明に係るペプチドは、コレステロール低減剤として医薬品として使用するほか、コレステロール低減用の飲料、食品、栄養食品、機能性食品、特定保健用食品等飲食品として使用し、コレステロールの低減のほか、コレステロール蓄積の予防等に広く利用できるものである。
【０００３】
【従来の技術】
ステロールとその誘導体は、生体に必須の構成成分である。トリアシルグリセロールは、エネルギー貯蔵としての役割を果たすだけであるが、コレステロールやその脂肪酸エステルは細胞膜の重要な構成成分であると同時に、胆汁酸・ステロイドホルモン・ビタミンＤなどの体内で種々の重要な機能を果たす誘導体を生じる。コレステロールの代謝調節は心血管系を健康に保つ上で重要であり、その異常は動脈硬化症をきたすことになる。
【０００４】
近年、食餌性繊維をはじめ、大豆蛋白質、不飽和脂肪酸など、さまざまな食品成分がコレステロール代謝に好ましい影響を及ぼすことが、国内外で活発に研究されている。
【０００５】
例えば、キャロルとハミルトンは血漿コレステロール値に対する食餌蛋白質について検討し、大豆蛋白質がカゼイン蛋白質に比べて血漿コレステロール値を低下させることを明らかにしている（K. K. Carrol and R. M. G. Hamilton, J. Food Sci., 40, 18-23(1975)）。
【０００６】
また、特開昭６０−１１４２５によれば、大豆蛋白質を酵素を用いて加水分解して得られた分子量２００〜１５００のオリゴペプチドに血中コレステロール濃度低下作用があることが示されている。このように大豆蛋白質などを代表とする植物性蛋白質、およびその酵素分解物などには、一般に血清コレステロール低下作用、抗動脈硬化作用を有すると考えられている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、大豆蛋白質由来の血清コレステロール低下剤の研究、開発がさかんに行われている技術の現状に鑑み、本発明者らは、従来にない全く新規にして効果にすぐれ且つ安全性も高いコレステロール低下剤の開発、しかも大豆蛋白質由来ではなく全く新しいタイプのペプチド系コレステロール低下剤の開発を、新規技術課題として設定した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を解決するため、発想の根本的転換を行い、新しいタイプのコレステロール低下剤を開発するには新しいスクリーニング法を開発する必要があるとの観点にたち、各方面から検討の結果、ＣａＣｏ−２細胞を用いる新しいスクリーニング法を開発するのにはじめて成功し、そしてこの新しいスクリーニング法を利用して、数多く合成したペプチドの中からコレステロール低下性にすぐれた新規ペプチドのスクリーニングに成功し、本発明の完成に至ったものである。
【０００９】
ＣａＣｏ−２細胞を利用するコレステロール低下性ペプチドのスクリーニング方法の基本は、コレステロールの吸収は、小腸で胆汁酸とともにミセル化して吸収される点にはじめて着目し、ペプチドによるこのコレステロールのミセル形成の抑制、阻害を小腸上皮細胞モデルのひとつであるＣａＣｏ−２細胞を用いて測定し、目的とするペプチドをスクリーニングするものである。
【００１０】
更に具体的には、３０〜３００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、合成ペプチド（０．１〜１０ｍｇ／０．５ｍｌ／ウエル）、０．５〜３０ｍＭの胆汁酸又は胆汁酸塩を混合しておき、この混合物に、０．０１〜１μＣｉ−コレステロール、０．０１〜１ｍＭのｃｏｌｄコレステロール、０．１〜１０ｍＭのモノオレイン、０．０５〜５０ｍＭのホスファチジルコリンを添加混合した後、音波処理（０．５〜１０分間）後、得られたミセルをＣａＣｏ−２細胞含有ウエルに加えてインキュベートする。５〜６０分間反応させた後、ＣａＣｏ−２細胞内に取り込まれたコレステロールを測定し、コレステロール取込量の低い合成ペプチドを目的ペプチドとして選択するものである。
【００１１】
音波処理は、超音波処理を含め、混合、粉砕を行う各種音波処理を広く包含するものであって、市販の装置が適宜使用される。ＣａＣｏ−２細胞は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変性イーグル培地、Dulbecco's Modified Eagle Medium）で培養し、ついで培地を除去し、このＣａｃｏ−２細胞含有ウエルに前記ミセルを加えたときに、０．１〜１０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度の濃度（ＭＴＴ法により測定）となるように調製する。なお、培養液としては、上記のほか、市販の細胞培養液も適宜使用可能である。
【００１２】
上記において、コレステロールとしては、放射性同位元素でラベルしたコレステロールを使用したので、コレステロールのＣａＣｏ−２細胞内の取込量はその放射強度を測定することにより測定するが、放射ラベルにかえて、酵素や蛍光ラベルしたコレステロールも使用することができる。また、格別に標識しないコレステロールも使用可能であって、その場合の取込量は、細胞を分離、破壊した後、例えば酵素法を用いる市販のコレステロール定量キット（例えば、モノテストコレステロール；スタンダードはプレチセットコレステロール：いずれもベーリンガーマンハイム山之内製）を用いて測定すればよい。
【００１３】
合成ペプチドに添加する胆汁酸としては、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸等各種の胆汁酸及びこれらの胆汁酸塩が単用ないし２種以上併用できる。
【００１４】
このようにして細胞内へのコレステロールの取込量を測定し、測定値の低いペプチドをコレステロールの吸収を阻害、抑制するペプチドとして分離することにより、目的とするペプチドのスクリーニングを行うことができる。
【００１５】
同様にして、ペプチドに代えて他の物質を使用することにより、例えば14Ｃ−コレステロールを含むミセル溶液と該他の物質をＣａＣｏ−２に添加することにより、ペプチド以外の物質についても、コレステロール吸収阻害性物質、コレステロール吸収抑制性物質等コレステロール低下性を有する物質をスクリーニングすることができ、したがって、本発明は、きわめてすぐれたコレステロール低下剤の微量・迅速スクリーニング方法を提供するものである。
【００１６】
本発明に係るスクリーニング方法を利用することにより、コレステロール吸収抑制ペプチドが同定されるだけでなく、新規ペプチド、新規物質はもとより、既知のペプチド、既知の物質の中からコレステロール吸収抑制剤を新たに開発することも可能となり、また、より強力な活性を発現するペプチド(物質)をデザインすることも可能となり、且つより強力に血清コレステロール低下作用を発現するアミノ酸組成の発見等も可能となり、これらの効能をより効率的に発揮することのできる医薬はもとより飲食品の開発も可能となる。
したがって、本発明に係る小腸上皮細胞の機能を発現する培養細胞であるこのＣａＣｏ−２細胞を用いる方法は、コレステロール吸収抑制を広く測定する方法を提供するものである。
【００１７】
このようにして本発明者らによって新規に開発されたスクリーニング法を利用して、数多く合成したペプチドをスクリーニングしたところ、コレステロール吸収抑制作用にすぐれたペプチドを２種類（Ｃ−８２２及びＣ−８２７）発見し、更に検討の結果、コレステロール低下剤ないし低下食品として使用できることを確認して、本発明を完成した。
【００１８】
本発明に係るペプチドＣ−８２２及びＣ−８２７は、それぞれ、次のアミノ酸配列（Ｃ−８２２：配列表の配列番号１、Ｃ−８２７：配列表の配列番号２）からなる。
0004059934.tif 000002
これらのペプチドは、従来合成、分離されたことはなく、ましてやコレステロール吸収抑制作用を有することなど全く知られていないものであるが、自動合成機等により容易に合成、入手することができる。
【００１９】
これらのペプチドは、後記する実施例からも明らかなように、すぐれたコレステロール吸収抑制作用を有するので、この作用を利用した飲食品、特定保健用飲食品、健康飲料、健康食品、栄養食品その他各種タイプの飲食品（なお、本発明において、食品には飲料も包含される）として用いることができるほか、コレステロール吸収抑制剤ないしコレステロール低下剤等医薬品としても用いることができる。
【００２０】
飲食品として使用する場合には、本有効成分であるペプチドをそのまま、使用したり、他の食品ないし食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。本有効成分を用いる本発明に係る飲食品は、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよいが、甘味料、酸味料、ビタミン剤その他ドリンク剤製造に常用される各種成分を用いて、健康ドリンクに製剤化すると好適である。
【００２１】
医薬品として使用する場合、本有効成分は、種々の形態で投与される。その投与形態としては例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。その使用量は症状、年令、体重、投与方法および剤形等によって異なるが、通常は、成人に対して１回約０．１ｍｇ乃至１，５００ｍｇを投与することができる。
【００２２】
本発明に係る有効成分は、毒性は全くないか又は極めて低く、卓越した安全性を示し、ラットに対して１日当り５００ｍｇ経口投与したが急性毒性は全く認められなかった。したがって飲食品として使用する場合は、予防用、保健用、飲食品として使用する場合のいずれにおいても有効成分の使用量に格別の限定はないし、医薬として使用する場合でも、患者に応じて上記範囲内で適宜使用すればよい。また、本有効成分は多量に服用しても格別の急性毒性を示さないので、必要あれば上記範囲よりも多量に使用しても差し支えない。
【００２３】
以下、本発明の実施例について詳述する。
【００２４】
【実施例１】
合成ペプチドとしてＣ−８２２及びＣ−８２７を用い、それらのコレステロール吸収抑制作用について、ＣａＣｏ−２細胞を用いて試験を行った。
【００２５】
14Ｃ−コレステロールを含むミセルとペプチドを下記表１に示すように混合、超音波処理した後、ＣａＣｏ−２細胞を含有するプラスチック製のウエルに添加して、取り込み実験に供した。
すなわち、ミセル溶液の調製は、最終濃度がそれぞれ、［４−14Ｃ］コレステロール（０．０２μＣｉ／ｍｌ）、コレステロール（０．１ｍＭ＝０．０３８７ｍｇ／ｍｌ）、モノオレイン（１ｍＭ＝０．３５７ｍｇ／ｍｌ）、フォスファチジルコリン（５ｍＭ＝３．８６ｍｇ／ｍｌ）、タウロコール酸ナトリウム（５ｍＭ＝２．６９ｍｇ／ｍｌ）と、合成ペプチド２種類（それぞれを５ｍｇ／ｍｌ）を１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、３分間ソニケーションして行った。
【００２６】
【表１】
0004059934.tif 000003
【００２７】
取り込み実験は、ＤＭＥＭ培地で１２日間培養ディッシュ（２４穴プレート）に培養した、ＣａＣｏ−２細胞の培地を吸引除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、上記で調製したミセル溶液０．５ｍｌを、プレートの１穴あたり添加し、２０分間ＣＯ2インキュベーターで、インキュベートした。ＣａＣｏ−２細胞数は、０．２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（ＭＴＴ法により測定）であった。インキュベート後、冷ＰＢＳで２回洗浄し、０．５ｍｌの０．１％ＳＤＳ溶液にて、細胞を溶解した。シンチレーションバイアルに細胞を移し、７．５ｍｌのシンチレーター（Ａｑｕａｓｏｌ−２）加えて、細胞に取り込まれた14Ｃ−コレステロールの量を測定した。得られた結果を図１に示した。なお、ｃｏｎｔｒｏｌは、ペプチドを使用しないブランク（対照）を示す。
【００２８】
【実施例２】
合成ペプチドは、実施例１と同じＣ−８２２とＣ−８２７を用い、ＣａＣｏ−２細胞へのミセル添加量を実施例１の半分（１．２５ｍｇ／０．５ｍｌ／ｗｅｌｌ）とし、細胞数を実施例１の約４倍（０．８７×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ：ＭＴＴ法により測定）としたほかは、実施例１と同様の処理を行い、14Ｃ−コレステロールの取込量を測定した。
【００２９】
得られた結果を図２に示した。これら図１及び図２の結果から、ペプチドＣ−８２２及びＣ−８２７は、いずれもすぐれたコレステロール吸収抑制作用を有することが確認された。
【００３０】
【実施例３】
ビタミンＣ  ２０ｇ、グラニュー糖  ５０ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物３０ｇに、ペプチドＣ−８２２を５０ｇ加えて充分に混合した。混合物を１００等分して袋に詰め、１袋１．５ｇのスティック状コレステロール低減用栄養健康食品を１００袋製造した。
【００３１】
【実施例４】
ペプチドＣ−８２２（５０ｇ）にかえてペプチドＣ−８２７（４０ｇ）を用い、また、ビタミンＣ（２０ｇ）にかえてビタミンＣとクエン酸の等量混合物（３０ｇ）を用いたほかは、実施例３と同様の処理をくり返し、充分に乾燥せしめた後、コレステロール低減用栄養健康食品を製造した。
【００３２】
【実施例５】
ペプチドＣ−８２２粉末１００ｇ、糖類１５０ｇ、蜂蜜１５ｇ、アスコルビン酸１ｇ、クエン酸０．５ｇ、香料適量に水を加えて１Ｋｇとし、これを９５℃で２０分間殺菌し、１００ｍｌずつ無菌的にビンに充填して、飲食品タイプの健康ドリンクを製造した。
【００３３】
【実施例６】
ペプチドＣ−８２７粉末の２０％水溶液２００ｇ、酢酸トコフェロール５ｇ、硝酸チアミン１０ｇ、ニコチン酸アミド２０ｇ、無水カフェイン５０ｇ、安息香酸塩及び香料適量に脱イオン水を加えて３０Ｌとし、殺菌した後３０ｍｌずつ無菌的にビンに充填して、医薬品としての健康ドリンクを製造した。
【００３４】
【実施例７】
（１）ペプチドＣ−８２２                                  ５０ｇ
（２）ラクトース                                          ９０ｇ
（３）コーンスターチ                                      ２９ｇ
（４）ステアリン酸マグネシウム                              １ｇ
（１）、（２）及び（３）（但し１７ｇ）を混合し、（３）（但し７ｇ）から調製したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒に（３）（但し５ｇ）と（４）を加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して、１錠あたり有効成分（１）を５０ｍｇ含有する錠剤１０００個を製造した。
【００３５】
【実施例８】
ペプチドＣ−８２２にかえてペプチドＣ−８２７を使用したほかは、実施例７と同様に処理して、錠剤を製造した。
【００３６】
投与量は、患者の症状、年令によっても異なるが、０．１〜１５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで１日１〜４回投与する。本発明において用いるペプチドは、既述のように安全性にはほとんど問題はなく、したがって上記用量をこえて投与しても差し支えはない。また、健康の維持、増進、保健、栄養剤等としてこれを利用する場合は、上記用量よりも少ない量を長期間に亘って服用すればよい。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、血清コレステロール濃度をきわめて効率的に低減せしめることができ、しかも安全性がきわめて高いので、血清コレステロール濃度低減のための予防ないし治療剤として有用であるだけでなく、そのための飲食品としても利用することができる。
【００３８】
また更に、本発明によれば、ＣａＣｏ−２細胞を利用する新規なコレステロール吸収抑制物質の微量・迅速スクリーニング法が提供され、コレステロール吸収抑制物質を効率的にスクリーニングすることができるので、本方法を利用することにより新規なコレステロール低下剤の開発が大いに期待される。
【００３９】
【配列表】
0004059934.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】合成ペプチドによるコレステロール吸収抑制を示す。
【図２】合成ペプチドのミセル添加量を変化させた場合のコレステロール吸収抑制を示す。
【図１】
0004059934.tif 000005
【図２】
0004059934.tif 000006