(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
麦芽発酵飲料をメンブランフィルタで濾過した後、当該メンブランフィルタを消泡剤溶液で洗浄し、更に弱アルカリ水溶液で洗浄して得たサンプルに、ＡＴＰ注出試薬、発光試薬を噴霧してその発光量を測定することを特徴とする麦芽発酵飲料中の微生物迅速検出方法。
【請求項２】
麦芽発酵飲料をメンブランフィルタで濾過する際、濾過すべき麦芽発酵飲料の上面に形成された泡層を通して飲料液面が確認されてから吸引濾過を行い、濾過終了後、当該メンブランフィルタを弱アルカリ水溶液で洗浄して得たサンプルに、ＡＴＰ注出試薬、発光試薬を噴霧してその発光量を測定することを特徴とする麦芽発酵飲料中の微生物迅速検出方法。
【請求項３】
メンブランフィルタの消泡剤溶液として、濾過すべき麦芽発酵飲料のアルコール含有量と同等の含有量を有するエタノール等の低級アルコールを使用することを特徴とする請求項１記載の麦芽発酵飲料中の微生物迅速検出方法。
【請求項４】
メンブランフィルタの消泡剤溶液として、濾過すべき麦芽発酵飲料中に混入した微生物に悪影響を与えない界面活性剤溶液或いはシリコン系消泡剤溶液を使用することを特徴とする請求項１記載の麦芽発酵飲料中の微生物迅速検出方法。
【請求項５】
メンブランフィルタの弱アルカリ水溶液による洗浄を複数回行うことを特徴とする請求項１又は２記載の麦芽発酵飲料中の微生物迅速検出方法。
【請求項６】
麦芽発酵飲料をメンブランフィルタで濾過した後、当該メンブランフィルタを消泡剤溶液で洗浄し、更に弱アルカリ水溶液で洗浄して得たサンプルをATP・FREEで糖類、有機酸類、無機塩類及びビタミン類からなる群より選択され、微生物の代謝を活性化する微生物のATP活性剤を含有する寒天プレートに１〜数時間載置した後、ＡＴＰ注出試薬、発光試薬を噴霧してその発光量を測定することを特徴とする麦芽発酵飲料中の微生物迅速検出方法。
【請求項７】
麦芽発酵飲料をメンブランフィルタで濾過する際、濾過すべき麦芽発酵飲料の上面に形成された泡層を通して飲料液面が確認されてから吸引濾過を行い、濾過終了後、当該メンブランフィルタを弱アルカリ水溶液で洗浄して得たサンプルをATP・FREEで糖類、有機酸類、無機塩類及びビタミン類からなる群より選択され、微生物の代謝を活性化する微生物のATP活性剤を含有する寒天プレートに１〜数時間載置した後、ATP注出試薬及び発光試薬を噴霧してその発光量を測定することを特徴とする麦芽発酵飲料中の微生物迅速検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、飲料中に混入した微量の微生物の生菌数を培養操作をすることなく測定する方法に関し、詳しくは微生物由来のATP 量を指標とする生菌数の測定方法を利用して、ビール、発泡酒などの麦芽発酵飲料中に存在する1〜100 細胞程度の生菌数を培養をすることなく測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
飲料中に存在する微生物の生菌数を迅速に計測する方法として、生細胞に特異的に存在するアデノシン三リン酸（以下「ＡＴＰ」という）を補酵素としてルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を行わしめ、ＡＴＰ含量に比例して発生する微少な発光を高感度検出器で検出することによって、微生物の存在を確認するというＡＴＰ−ルシフェラーゼ法が微生物の迅速検査法として注目されており、これを具現化するものとして、メンブランろ過法とATP バイオルミネッセンス法を組み合わせた装置、即ち、メンブランフィルタで検体である飲料を濾過し、フィルタ上に微生物を捕捉した後、抽出剤、次いで発光試薬を噴霧し、上記ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を行わしめ、高感度の発光輝点計数システムにより微生物数を計数する方法である。この方法を具現化する便利な装置として微生物迅速検出装置（日本ミリポア社、以下、ＲＭＤＳという）があり、ビールなどの飲料業界で既に実用化されている（防菌防黴、27、759-764、(1999)）。ＲＭＤＳは、ビール酵母などの細胞あたりのATP 含量の多い微生物であれば、培養をすることなく検出が可能であるが、ビールを腐敗させる乳酸菌として知られるラクトバチラスブレビス(Lactobacillus brevis)などの細菌を検出するためには、メンブランろ過後、寒天培地上で16〜24 時間程度の培養時間が必要であった[Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1032-1037(2000)]。
【０００３】
以前より行われていた寒天平板法によるビール製品などの微生物検査には、2〜4 日の時間を必要としていた事に対し、ＲＭＤＳの実用化により24 時間以内には前述の微生物の検査を終了する事が可能となったが、さらに検査時間を短縮する要望がある。
【０００４】
ＲＭＤＳを用いてビール中の細菌をより短時間で検出するために、従来から微生物中のATPを発光させるために使用されているルシフェリン-ルシフェラーゼ試薬（ＲＭＤ試薬、日本ミリポア）の活性を高める事で発光反応を増強させ、より少数の微生物細胞を検出する方法がある（日本空気清浄協会シンポジウム、29-38、(1997)）。本方法を達成するための試薬として高感度試薬（日本ミリポア）が市販されている。一方、ATP-ルシフェリン-ルシフェラーゼによる発光反応により消費されたATP をピルベートオルトホスフェートジキナーゼにより、ADP などからATP にリサイクルすることで発光反応を長時間継続させ、より高感度に微生物細胞を検出する方法が報告されている（特開平11-69994）。
【０００５】
これらの方法は、ATP を含まない溶媒に混入している微生物細胞の検出には非常に有効であるが、ビールなど溶液中にATP を含む溶媒に混入した微生物細胞を検出する場合、細胞に含まれるATP が溶媒中に含まれるATP 量に対して微量過ぎるため、溶媒の発光が障害となり、微生物細胞を検出出来ない問題があった。すなわち、発光反応を増強させ、ＲＭＤＳの検出感度を上げていった場合、検査対象となる微生物のATP 量が微量になるほど、溶媒中のATP の存在が問題となり、これを除去する方法が必要となってくる。
【０００６】
飲料水などをメンブランろ過を行ったフィルタに残存するATP を除去する方法として、フィルタを滅菌した蒸留水、イオン交換水、pH 緩衝液、糖水溶液、ポリアルコール水溶液（特開平11-89592、特開平02-163098）、エタノール含有液、食塩水（特許-02812338）などの洗浄液で洗浄する方法やアデノシンリン酸デアミナーゼ溶液、アデノシンリン酸デアミナーゼとその他の酵素（例えば、アピラーゼ、アフカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、アデノシントリホスファターゼ、グルコキナーゼ）の混合溶液でフィルタ上のATP を分解処理する方法がある（特開平11-69994、特開平11- 89592、特許-02905727、特開平10-165200、特開2000-189197、特開平11- 56393、特開平09-182600、特開2001.340100）。
【０００７】
しかしながら、前述の洗浄液による洗浄では十分にビール成分が除去されず、ビールに由来する発光が強いため、細菌細胞の発光を検出するために必要なシグナル／ノイズ（S/N）は得られない。即ち、微生物自体の発光量（S/NのＳに相当する）に比してその周囲の発光量（Ｓ／ＮのＮに相当する。以下「バックグランドノイズ」という）が大きいため、見極めが不可能になる。表１に示すデータは、洗浄剤の効果を測定した調査結果を示す。使用したサンプル（フィルタ）の作製方法は以下のとおりである。即ち、0.4μm リング付きアイソポアフィルタ（日本ミリポア社製）を装着したカップ状ろ過器に350ml の市販ビール（無菌ビール）を無菌的（クリーンルームで）に注ぎ、吸引ろ過を行った。ビールを完全に吸引ろ過した後、滅菌した洗浄液（蒸留水10ml、蒸留水300ml、0.1% Tween80 300ml、5%エタノール300ml、1% マルトース）を用いてメンブランフィルタの洗浄を行い、寒天培地（例えば特開08-224096に開示のもの）にのせた。次いで前述の操作でＲＭＤＳにより90 秒間、発光を蓄積した。得られた画像データについて、直径300 画素の範囲の発光量を測定し、1 秒あたりの発光量に換算した。発明者の実験によると、細菌細胞を無培養で検出するための条件の１つとして、ビール、発泡酒等の溶媒をほぼ除去すると、メンブランフィルタの発光量（バックグランドノイズ）は、100RLU/sec未満になることが確認された。従って、表１に示すとおり、これまで知られていたように水、界面活性剤、アルコール、糖溶液、pH 緩衝液などで洗浄し、乳酸菌などをRMDS により24 時間以内に検出することを目的として開発された栄養培地にメンブランフィルタを乗せる方法では、メンブランフィルタに溶媒もしくは栄養培地由来の発光物質がかなり残存しており、バックグラウンドノイズが高すぎることが分かる。
【０００８】
アルカリ溶液や界面活性剤などビール成分の洗浄に重点を置いた場合、細胞に損傷を与え、洗浄操作により菌体内のATP が溶出してしまう可能性が考えられる。従って、洗浄によりビール成分を除去する場合には、測定対象となる細胞に損傷を与えることなく、ビール成分を洗浄できる洗浄剤が必要となる。
【０００９】
また、ATP 分解酵素による処理を行った場合、細菌細胞が含有するATP 量に対してフィルタに残存するビール由来のATP の量が多すぎるため、ビール由来のATP を十分に短時間で分解処理をするATP 分解酵素の力価を使用した処理条件では、ATP 分解酵素を十分に除去あるいは失活させる事が困難であり、細胞に含有するATP が分解されるという影響を受ける。
【００１０】
そこで、細菌細胞に含有するATP の検出に影響を与えずにフィルタに残存するビール、発泡酒等の麦芽発酵飲料に由来するATP を除去する方法が必要とされる。
【００１１】
加えて、無培養で微生物を検出するためには、Ｓ／ＮのＳを増大させることも必要であり、検知すべき微生物由来のＡＴＰを短時間に増加させる必要がある。
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記観点からなされたものであり、数100ml〜数L のビール、発泡酒等麦芽発酵飲料中に混入した1〜100 細胞程度の微量な細菌細胞の生菌数を培養操作をすることなく、測定する方法を提供する事を課題とする。
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、麦芽発酵飲料をメンブランろ過したフィルタの洗浄方法の工夫及び使用する培地の選択によりフィルタに残存する麦芽発酵飲料由来のATP に影響を受けることなく、メンブランフィルタ上の微量な細菌細胞の生菌数を培養することなく、測定出来る事を見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
即ち、上記課題を解決するための条件の1つとして、メンブランフィルタに残存する検体（ビール、発泡酒等の麦芽発酵飲料）成分を除去し、バックグランドノイズを低減することにある。
【００１３】
この残存物は、大きく分けると、泡とその他の飲料成分である。泡については、ビール、発泡酒等の発酵麦芽飲料ではメンブラン濾過を行うに当たり、濾過器に注いだ時に発生する泡がフィルタに残存すると、この泡に含まれるＡＴＰがバックグラウンドノイズとなる。濾過器に注ぐ時、発泡によって大量の泡を発生させると、この後吸引濾過を行っても、泡がフィルタに残存してしまう。その対策として、濾過器にはできるだけ発泡しないよう静かに注ぎ、被検体液の表面に形成される泡層から液表面が観察される状態となった時、吸引濾過を開始するようにする。
【００１４】
また、消泡作用を有し、且つ検出すべき微生物に悪影響を与えないエタノール等の低級アルコール、テレビン油（商品名 ： Tween80）等の界面活性剤或いはシリコン系消泡剤を用いて濾過後のメンブランフィルタを洗浄することにより泡を除去することが出来、Ｓ／Ｎが大幅に向上することが分った。
【００１５】
更に、検体ビールの液温を１０℃以下に下げることにより、発泡を生じ難くすることも解決策の１つとなる。但し、４℃以下になると濾過渋滞が発生し易くなるため、４℃＜液温≦１０℃が適当である。
【００１６】
更に、フィルタに残存する飲料成分については、炭酸水素ナトリウム等の弱アルカリ水溶液で洗浄することにより、除去することが出来た。
【００１７】
上記残存泡対策と残存飲料成分対策を併用することにより、フィルタの残存物がほぼ除去され、バックグランドノイズ（Ｓ／ＮのＮに相当する）が大幅に低減される。
【００１８】
上記の如く検体をフィルタより洗い流して検体に含まれるＡＴＰを除去した後、更にATP・FREEの培地に30分〜２時間置いてフィルタに僅かに残存するＡＴＰを培地側に拡散させてメンブランフィルタからＡＴＰをさらに除去することでさらなるバックグランドノイズの低減を図ることが出来た。
【００１９】
更に、上記発明において、ATP・FREE培地に微生物の代謝を活性化する成分を添加することにより微生物中のＡＴＰを増加させ、検出Ｓ／ＮのＳを上げることが出来た。
【００２０】
上記ＡＴＰ発光量の測定に際して、Ｓ／Ｎを大幅に改善することにより、無培養で短時間に微生物の有無及び菌数を検出することが出来る。
【発明の実施の形態】
検体液のろ過方法としては、メンブランフィルタ、例えば、0.4μm リング付きアイソポアフィルタ（日本ミリポア）をカップ状ろ過容器（例えば、アドバンテック社製47mmポリサルホンホルダー）などに装着し、製品ビール（発泡酒）を無菌的に吸引ろ過し、微生物をメンブランフィルタ上に捕捉する方法が採用される。ビールをカップ状ろ過容器に注ぎ、吸引ろ過を行う。ビールを完全に吸引ろ過した後、メンブランフィルタを別のカップ状ろ過器に移し替え、0.1〜1.0%、このましくは0.1%の炭酸水素ナトリウムを100〜500ml、好ましくは100ml をカップ状ろ過器に注ぎ、1 分〜10 分、このましくは5 分間保持し、吸引ろ過を行い、洗浄する。なお、好ましくは上記炭酸水素ナトリウムによる洗浄は複数回繰返し行うと、より効果が期待できる。
【００２１】
完全に吸引した後、当該サンプルにATP 抽出試薬及び発光試薬を噴霧し、該サンプルのフィルタ上に存在する微生物のＡＴＰを発光させる処理を行う。即ち、寒天プレートから取り出したフィルタを25〜45℃好ましくは35℃で1〜20 分、好ましくは2 分間乾燥させる。乾燥後、ATP 抽出試薬（高感度試薬キット、日本ミリポア社製）を60μl噴霧する。次にフィルタを25〜45℃好ましくは35℃で1〜20分、好ましくは1分間乾燥させた後、ルシフェリン-ルシフェラーゼからなる発光試薬（高感度試薬キット、日本ミリポア社製）を60〜100μl噴霧する。
以上処理したサンプルをRMDSにて、その発光量を測定する。
【００２２】
また、予め検体である麦芽発酵飲料をメンブランフィルタで濾過し、得られたメンブランフィルタをサンプルとして、上記麦芽発酵飲料由来のATPをほぼ除去するメンブランフィルタの処理方法を用いて洗浄した後、更にサンプルのメンブランフィルタをATP・FREEでATP活性剤を含有する寒天プレート（0.5〜1.5%の寒天を含む、好ましくは1.0％ 、以下「ＡＴＰ・ＦＲＥＥ寒天プレート」という）に３０分から２時間程度載置した後、ATP抽出・発光処理を行い、RMDS にてその発光量を測定する。また、上記寒天プレートに微生物の代謝を活性化する栄養素（糖類、有機酸、無機塩、ビタミン類）を添加し、サンプルであるメンブランフィルタを当該寒天プレートに１時間〜数時間程度載置することにより、サンプルに残存する微生物内のATPを増加させる。これによって、Ｓ／ＮのＳを高めてＳ／Ｎをアップする。
【００２３】
【実施例１】
ビールをカップ状ろ過器に注ぐと発泡し、ビールの界面に泡の層を形成する。この状態で吸引ろ過を開始するとビールの液層は吸引されるが、泡の層の厚さや泡の状態によっても差があるが、泡がメンブランフィルタに残る（図１・右）。この状態で無菌水などを用いてメンブランフィルタを洗浄しても、泡が無菌水の界面に浮き上がり、先に無菌水が吸引されていくので完全に泡を除去することは困難である。
【００２４】
一方、（図１左）はビールの吸引ろ過後、10ml の５％エタノールにてサンプルであるメンブランフィルタ表面を洗浄したものである。エタノールは消泡剤として知られており、これによって図１のとおりサンプル上の泡層は消失（洗浄）されているのがわかる。ここで、使用するエタノールの濃度については、検体（ビール・発泡酒）のアルコール含有量と同等もしくは近いものとする。ビール、発泡酒は一般的にアルコール含有量が4.0〜5.5％であるので、これらに使用するエタノールのアルコール含量は4.O％以上10％以下が好ましい。
【００２５】
なお、使用する洗浄剤に付いてはエタノールのような低級アルコールの他にも、テレビン油等の界面活性剤あるいはシリコン系消泡剤も使用可能である。
【００２６】
また、泡層の処理については上記消泡剤による洗浄のほかに、ビールをカップ状ろ過器に注いだ後、泡がはじけて泡の層が低下しビール液面が目視でできるまで待ってから吸引濾過を行う。これによって、図１左と同等のサンプル状態を得ることが可能となる。
【００２７】
次に、図１左のフィルタを0.1〜1.0%の炭酸水素ナトリウム溶液を100ml、カップ状ろ過器に注ぎ、5 分保持後、吸引、さらに100mlの等濃度の炭酸水素ナトリウム溶液を加え吸引を行った。この洗浄処理によりフィルタに残存するビール成分を低減する。得られた洗浄サンプルにATP抽出・発光処理を施し、RMDS で発光量の測定を行った。その測定結果を図２−１（Ａ）に示す。発光量は100RLU/secを下回っており、目標とするバックグランドノイズ量をクリアしている。
【００２８】
なお、図１右の泡洗浄及びビール成分洗浄処理を施さないサンプルは、炭酸水素ナトリウムによる洗浄もせず、ATP抽出・発光処理を施し、RMDSで発光量を測定した。その結果、発光量は13，451RLU/secであった。したがって、図１左の洗浄処理を施したサンプルは、洗浄を施さないサンプルに比較してバックグランドノイズは１／１３４以下に低減されていることとなる。
【００２９】
【実施例２】
実施例１で用いたサンプル（図１左のフィルタを吸引濾過後、0.1〜1.0%の炭酸水素ナトリウム溶液を100ml、カップ状ろ過器に注ぎ、5 分保持後、吸引、さらに100mlの等濃度の炭酸水素ナトリウム溶液を加え吸引を行った。この洗浄処理によりフィルタに残存するビール成分を低減したもの）を更にATP・FREE寒天プレートに数時間置いた後、ATP抽出・発光処理を施し、RMDSで発光量を測定した。その結果を図２−１（Ｂ）に示す。上記図２−１（Ａ）と比較しても、更にバックグランドノイズは改善されており、50〜60RLU/secとなった。
また、実施例１で用いた図１右のサンプルに対して液洗浄（炭酸水素ナトリウムによる２回洗浄）を施した後、上記ATP・FREE寒天プレートに数時間置いたサンプルの発光量を測定したところ、図２−２（Ａ）の結果が得られた。図２−１（Ｂ）の測定結果と比較すると、全ての測定値が100RLU/secを大きく越えている。このことから、ビールの泡の除去を行わないと、たとえビール液の洗浄を行ったとしても泡が残存してしまい、それによるバックグランドノイズの影響は免れないことが分る。
【００３０】
なお、図２−２（Ｂ）に示すグラフは、残存泡及び残存液洗浄を行った後、従来の改変Ａ培地に数時間置いた後のサンプルの発光量を測定したものであり、上記ATP・FREE寒天プレートを用いた場合と比較して大幅にバックグランドノイズが悪化していることがわかる。
【００３１】
これは、サンプルのメンブランフィルタが培地に含まれるATPを吸収してしまい、洗浄によりビール由来のATPが大幅に低減されたにもかかわらず、ATPが増加してしまったことによる。
【実施例３】
フィルタに残存するビール成分を洗浄するための炭酸水素ナトリウムの濃度について検討した。検体ビールを濾過して得たメンブランフィルタを10mlの５％エタノールで洗浄して、残存泡層を消滅させ、次に、フィルタを別のカップ状濾過器に移し替え、用意した、0.1％，0.2％，0.5％，0.8％，1.0％濃度の各炭酸水素ナトリウム溶液で夫々洗浄炭酸水素ナトリウム溶液を100ml、カップ状ろ過器に注ぎ、5 分保持後、吸引、さらに100mlの等濃度の炭酸水素ナトリウム溶液を加え吸引を行った。次に、ATP・FREE寒天プレートに数時間置いた後、ATP抽出・発光処理を施し、RMDSで発光量を測定した。図３にその測定結果を示す。0.5％濃度の炭酸水素ナトリウムを使用した場合がもっとも低ノイズであるが、この範囲内ではすべての場合、発光量100RLU/secを下回る結果が得られた。
【実施例４】
ビールをメンブランフィルタにてろ過を行い、フィルタ表面を20ml の10％エタノールで洗浄を行った。洗浄後、フィルタを新しいカップ状ろ過器に移し、0.1〜1.0%の炭酸水素ナトリウム溶液を100ml、カップ状ろ過器に注ぎ、5 分保持後、吸引してサンプル１とした。さらに100mlの等濃度の炭酸水素ナトリウム溶液を加え吸引を行い、サンプル２とし、両サンプルを夫々ATP・FREE寒天プレート数時間置いた後、RMDS で測定を行った。
【００３２】
その測定結果を図４に示す。炭酸水素ナトリウム溶液の1 回洗浄では、いずれも、100RLU/secを越える結果となったのに対し、2 回洗浄では、全ての測定値が85RLU/sec以下の結果となった。
【００３３】
従って、炭酸水素ナトリウム溶液による洗浄は2 回もしくはそれ以上の洗浄を行う事が必要との結論に至った。
以上の結果をまとめるとバックグラウンドノイズの低減のための最も望ましい手順は以下のとおりである。
【００３４】
メンブランフィルタ、例えば、0.4μm リング付きアイソポアフィルタ（日本ミリポア）をカップ状ろ過容器に装着し、製品ビール（発泡酒）を無菌的に注ぐ。ビールをカップ状ろ過容器に注いだ後、ビールの泡が減少し、ビールの液面が目視で確認出来るまで静置してから、吸引を開始する。もしくは、ビールのメンブランろ過後にフィルタに残存する泡を5%エタノールなどの低級エタノール溶液あるいは0.1%Tween 80 などの界面活性剤で洗浄する。以上、いずれかの操作によりメンブランフィルタ上に残存する泡が目視では確認できない状態とする。その後、メンブランフィルタを新しいカップ状ろ過器に移し替え、0.1〜1.0%このましくは0.1%の炭酸水素ナトリウムを100〜500ml、好ましくは100ml をカップ状ろ過器に注ぎ、1 分〜10 分、このましくは5 分間保持し、吸引ろ過を行う。完全に吸引した後、さらに0.1〜1.0%、このましくは0.1%の炭酸水素ナトリウムを100〜500ml、好ましくは100ml をカップ状ろ過器に注ぎ、吸引ろ過を行う。ろ過後、メンブランフィルタをATP・FREE寒天プレート（寒天濃度1.0%）に３０分から２時間置く。
【実施例５】
本発明者によると、従来の発光試薬を用いてビール酵母の無培養検査を行う場合、一度培地に接触させる（30 分以内の保持）事で、発光量が増加する事を経験している。これは、酵母細胞が増殖したのではなく、培地中の栄養素を細胞内に取り込み、代謝した結果、細胞内ATP が増加したものと考えられる。
【００３５】
例えば、乳酸菌は、各種の糖を栄養源として発酵し、乳酸、酢酸、ぎ酸、アルコールなどを生成する経路（EMP 経路、HMP 経路、ED 経路、ビフィズム経路）の他、ぶどう酒の製造に利用される有機酸（リンゴ酸）を乳酸と二酸化炭素に変換し、酸度を低減させるマロラクティック発酵が知られている。従って、サンプルに残存する微生物に糖、有機酸などの基質（ATP を含む天然物成分はバックグラウンドノイズを上昇させるため、ATP を完全に分解、除去しなくては使用出来ない）を加えることで代謝が活性化し、微生物中のATP を増加させることが出来ると考えられる。しかも培養ではないため、これらの処理に要する時間は数時間と考えられる。これによると、微生物の数が数個であっても、ATP発光量即ちＳ／ＮのＳを増加させることが出来、先に述べたバックグランドノイズ即ちＳ／ＮのＮの低減とを併せて大幅なS/Nの改善が達成され、培養することなく、ATP発光の測定を行える可能性がある。
【００３６】
そこで、このATP発光量の増加の可能性を確認するため、以下のとおりサンプルを作成し、ATP発光量の測定を行った。
【００３７】
乳酸菌をビールに懸濁し、メンブランろ過を行った。乳酸菌はフィルタあたり50cell程度になるように希釈した。得られたサンプルは先に述べたとおりビール由来のATPによるバックグランドノイズを除去するために洗浄を行う。次にATP・FREE寒天プレートを準備し、以下の処理を行う。即ち、寒天プレートの基本組成として、有機酸として0.2%リンゴ酸、Bacto Yeast N itrogen Base(以下「YNB」という。商品名、DIFCO社製  培地のベースとして使用される。別紙成分表（表２）あり)、寒天１％、ｐＨ5.2とし、この寒天プレートに（１）糖類として１％グルコースを添加したもの（２）糖類無添加（上記基本組成の寒天プレートそのもの）（３）比較例としてATP・FREE寒天プレートに１％グルコースを加えたもの、以上３種類の寒天プレートに夫々サンプルを１時間ほど載置した後、当該サンプルにATP抽出・発光試薬を添加した後、RMDSにて発光量を測定した。
【００３８】
その結果を図５に示す。糖（グルコース）、有機酸（リンゴ酸）、ＹＮＢの栄養源を含む寒天プレートを用いた場合、最も検出菌数が多く、ATPの増加が大きいことが明らかとなった。上記３種類の栄養源のいずれかが欠けると、ATP増加が少ないことが解る。
【００３９】
次に、有機酸について検討すると、クエン酸、リンゴ酸、乳酸を夫々用いて実験を行った。その結果を図６に示す。
【００４０】
乳酸を用いた場合の検出菌数がクエン酸、リンゴ酸を用いた場合と比較して明らかに少なかった。これは、乳酸菌の主な最終代謝産物である乳酸の存在により、代謝が阻害されたと考えられる。この結果から考えられることは、酢酸も同様に乳酸菌の最終代謝産物であるため、検出菌数の低下が推測される。一方、クエン酸及びリンゴ酸使用による結果から、マロラクティック発酵に関与するフマール酸あるいはオキサロ酢酸など、の添加も有効であると推測される。
【００４１】
なお、本実験に使用した寒天プレートは、基本的に１％グルコース、YNB、寒天１％、pＨ5.2のものを用いた。また、寒天プーレトへの載置時間は２〜５時間とした。
【実施例６】
これまでの調査で、糖類、有機酸の有用性については、確認できたが、ここでは、その他の成分についての有用性について調査した。 微生物の栄養源としてYNB を使用しているが、このYNBの成分組成を表２に示す。この成分の中から（７Ｂ）YNBからN源（硫酸アンモニウム）とアミノ酸類を除去したもの（７Ｃ）YNBからアミノ酸類を除去したもの（７Ｃ）YNBからビタミン類を除去したものを各々寒天プレート（１％グルコース、0.2％リンゴ酸、寒天１％、PH5.2）に添加したものにサンプルを１時間載置した。各サンプルの測定結果を図７に示す。図７には比較のため、YNBを添加したサンプルについても測定を行った（７Ｄ）。この測定結果から、とくに有意な差異は見受けられなかった。即ち、上記各成分については微生物のATP代謝を活性化するものではないことが確認された。
【００４２】
次に、YNBに含有されている無機塩類および微量元素（何れも表１参照）の影響について調査した。使用した寒天ブレートは上記のものと同じものを使用し、（８Ａ）YNB添加（８Ｂ）無機塩類＋微量元素（８Ｃ）無機塩類（８Ｄ）微量元素（８Ｅ）YNB無添加の寒天プレートを夫々容易した。また、上記各寒天プレートへの載置時間は１時間とした。作成したサンプルをATP抽出・発光処理し、RMDSにて発光量を測定した。その結果を図８に示す。図８より上記（８Ｄ），（８Ｅ）の場合が明らかに計数菌数が少なかった。このことから、YNBの成分の中でも、ATP代謝を活性化する成分は無機塩類ということが明らかになった。
【実施例７】
寒天プレートのＰＨについて検討した。使用した寒天プレートは１％グルコース、0.2％リンゴ酸、YNBを添加したものを用い、ＰＨを変化させた寒天プレートを用意した。一方、サンプルは上記寒天プレートに１時間載置して作成し、菌数を測定した。図９はその結果を示すもので、この結果から、PHは3.8〜5.5の範囲内であれば、測定に支障が無いことがわかる。
【実施例８】
寒天プレートへの載置時間について検討した。使用した寒天プレートは実施例７で使用したものと同じものを使用した。図10にその測定結果を示す。この結果から、１時間以上であれば、安定的にほぼ同一の結果が得られた。このことから寒天プレートへの載置時間は１時間程度で充分であることが確認された。
【００４３】
以上実施例５〜８で検討した結果から、ATP発光量を測定することにより微生物の有無或いは菌数を測定する場合、測定用サンプルの作製時に、測定すべき微生物の代謝を活性化して細胞内のATPを増加させる栄養源を添加することにより、ATP発光のS/Nを改善（Ｓの改善）することにより、先に述べたサンプルのバックグランドノイズの低減（ATP発光のＮを低減する）と併せてサンプル中の存在菌数が１〜100程度の極めて微量な場合にも充分ATP発光を測定することが可能になり、長時間の微生物培養を行うこと無く、１時間程度寒天プレートに載置してATPを増加させることにより測定が可能になることが確認された。なお、バックグランドノイズ低減のためにはATP・FREE寒天プレートに、最低３０分載置することにより効果が得られたが、併用の場合には、ATP量を増加させるために１時間程度かかるため、無培養ATP発光測定を可能にするためには寒天プレートに１時間程度載置する必要があることが確認された。
【００４４】
特に、乳酸菌の微生物菌数測定については、先に述べたバックグランドノイズの低減と共にサンプル作製時に乳酸菌の栄養源となる糖類（グルコース、ガラクトース、フラクトース等）、有機酸（リンゴ゛酸、クエン酸）及び無機塩類（硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等）を最低限添加することにより、ATP発光のS/Nを改善することが出来る。
【発明の効果】
以上詳述したところから明らかなように、
本発明によれば、消泡作用を有し、且つ検出すべき微生物に悪影響を与えないエタノール等の低級アルコール、テレビン油（商品名 ： Tween80）等の界面活性剤或いはシリコン系消泡剤を用いて濾過後のメンブランフィルタを洗浄することにより泡を除去することが出来、Ｓ／Ｎが大幅に向上することができる。
【００４５】
また、フィルタに残存する飲料成分について、炭酸水素ナトリウム等の弱アルカリ水溶液で洗浄することにより、除去することが出来る。
【００４６】
そして、上記残存泡対策と残存飲料成分対策を併用することにより、フィルタの残存物がほぼ除去され、バックグランドノイズ（Ｓ／ＮのＮに相当する）が大幅に低減される。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】メンブランフィルタ上に泡が残存しないサンプル(左)と泡が残存しているサンプル（右）を示す図である。
【図２】本発明の洗浄処理を行って実施した発光量の測定結果を示す。図２−１（Ａ），（Ｂ）は実施例１による測定結果、図２−２（Ａ），（Ｂ）は実施例２の測定結果を示す。
【図３】実施例３の測定結果を示す図である。
【図４】実施例４の測定結果を示す図である。
【図５】実施例５の実験結果を示す図である。
【図６】実施例５の有機酸について実施他測定結果を示す図である。
【図７】実施例６の測定結果を示す図である。
【図８】実施例６の無機塩類及び微量元素について実施した測定結果を示す図である。
【図９】実施例７の測定結果を示す図である。
【図１０】実施例８の測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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