(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基本培地ならびに
（ａ）ＡＤＣ−１（商標）、タンパク質加水分解物またはメチルセルロース、
（ｂ）インスリンおよび
（ｃ）Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe、
Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn、
Ser-Phe-Phe-Leu-Arg-Asn-Pro-Gly-Glu-Asn-Thr-Phe-Glu-Leuまたは
Ser-Phe-Phe-Leu-Arg-Asnのアミノ酸配列からなるトロンビンレセプター活性化因子
を含んでなる無血清培地中で哺乳動物細胞系を培養する工程を含む、インターロイキン−６の生産方法。
【請求項２】
基本培地がＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０またはそれらの混合物である請求項１記載のインターロイキン−６の生産方法。
【請求項３】
タンパク質加水分解物がラクトアルブミン加水分解物である請求項１または２記載のインターロイキン−６の生産方法。
【請求項４】
タンパク質加水分解物がコーングルテン加水分解物である請求項１または２記載のインターロイキン−６の生産方法。
【請求項５】
用いられるインスリンおよび／またはトロンビンレセプター活性化因子が組換えの方法でつくられたものである請求項１、２、３または４記載のインターロイキン−６の生産方法。
【請求項６】
インスリンおよび／またはトロンビンレセプター活性化因子が哺乳動物細胞においてインターロイキン−６とともに発現されるものである請求項５記載のインターロイキン−６の生産方法。
【請求項７】
０．１μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌの間のインスリンを含んでなる請求項１、２、３、４、５または６記載のインターロイキン−６の生産方法。
【請求項８】
１μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌのトロンビンレセプター活性化因子を含んでなる請求項１、２、３、４、５、６または７記載のインターロイキン−６の生産方法。
【請求項９】
細胞系がＣＨＯ細胞系である請求項１記載のインターロイキン−６の生産方法。
【請求項１０】
細胞系が、インターロイキン−６をコードする遺伝子でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系である請求項１または９記載のインターロイキン−６の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、組換えの方法によりえられるタンパク質のような哺乳動物細胞産物の生産を支持することができる無血清培地に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
今日、細胞培養は種々の生物学的に活性な産物、たとえばウイルスワクチン、モノクローナル抗体、無抗体免疫調節剤、ポリペプチド成長因子、ホルモン、酵素、腫瘍特異的抗原などの生産のために広く用いられている。これらの生産物は、正常細胞、形質転換細胞まおよび遺伝的に処理された細胞によって生産される。
【０００３】
細胞を培養するためには、培養培地に血清を添加することが必要である。血清は、たいていの生物学的に活性な産物の生産のためだけでなく、すべての細胞系の生長のための全般な栄養物として働く。血清には、ホルモン、成長因子、キャリアータンパク質、接着および伸展因子、栄養物、微量元素などが含まれている。培養培地には、通常約１０％以下の動物血清、たとえば牛胎児血清（ＦＢＳ）が含まれる。
【０００４】
広く使われてはいるが、血清には多くの制約がある。血清には高濃度でおびただしいタンパク質が含まれており、それによって、細胞の生産する少量の所望のタンパク質が劇的に妨げられる。工程の後の方でこれらの血清タンパク質を生産物から分けることが必要で、このことが工程を複雑にし、コストを増加させる。別の制約は、バッチ間での血清の不一致のために生産物中の種々の血清タンパク質汚染について重大な制約の懸念が生じることである。
【０００５】
近年、牛の潜状期間の長い、感染性の神経病変であるＢＳＥ（牛海綿状脳症）の出現によって、生物学的に活性な産物の生産に動物由来の血清を用いることについて、さらに制約への関心が高まってきた。
【０００６】
ＦＢＳなどの動物の血清を用いることのさらなる欠点は、需要の増加により供給が不安定となり、価格の上昇変動が起こることである。
【０００７】
したがって、細胞の生長および生物学的に活性な産物の生産を支持するための代替の培地補助剤の開発が強く望まれている。
【０００８】
哺乳動物からの組換えバイオ医薬の製造のための無血清培地の長所および欠点は、徹底的に見直された（バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）、１９８７；バーンズおよびサトー（Ｓａｔｏ）、１９８０；ブロード（Ｂｒｏａｄ）ら、１９９１；ジェイム（Ｊａｙｍｅ）、１９９１）。無血清培地に対する補助剤として用いられる主な添加物のリストがバーンズ（１９８７）ならびにバーンズおよびサトー（１９８０）にまとめられている。
【０００９】
広い範囲の細胞の種類および培養条件に用いることができる血清添加培地とは異なり、無血清の処方では一般に特定の範囲に限られる（バーンズら、１９８４、サトーら、１９８２、トーブ（Ｔａｕｂ）、１９８５、ウェイズ（Ｗｅｉｓｓ）ら、１９８０）。
【００１０】
たいていの市販の無血清培地には、アルブミンのようなキャリアータンパク質が含まれている。キャリアータンパク質の存在は、細胞のバイアビリティーの保護のために必要であるが、前述のような、精製工程のためには不利である。
【００１１】
ＣＨＯ細胞は、トランスフェクションならびに可能な診断および治療応用のための種々の外来遺伝子産物の発現を行なう、適切な哺乳動物宿主として出現した（ファミレッチ（Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ）とフレデリックス（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ）、１９８８、マリノ（Ｍａｒｉｎｏ）、１９８９）。
【００１２】
いくつかの市販の無血清培地はＣＨＯ細胞の培養にも用いることができる。しかしながら、これらには複数の不利益がある。たいていのものは小規模の実験室での使用に適するものであり、大規模のバイオリアクターには高価すぎる。いくつかのものは細胞の生長には適するが、生産培地としての役割はほとんど果さない。これらの培地はそれぞれその開発の目的であった特定の系には適するであろうが、他の系には用いられないのである。非接着性の哺乳動物細胞のためのある既知の無血清培地（米国特許第５，０６３，１５７号明細書）は、基本培地に加えて、トランスフェリン、インスリン、ペプトン、β−Ｄ−キシロピラノース誘導体、セレナイトおよび生物学的ポリアミンを含んでなる。前記の生産に関する特許における開示は、単に特定のマウスハイブリドーマ細胞を培地、すなわち基本培地に加えて６種の成分を含む培地中で培養することに関するものである。いかなる他の哺乳動物細胞におけるＦＳＨ抗体以外の生物学的に活性な産物の生産も教示されていない。
【００１３】
また別の哺乳動物細胞のための無血清細胞生長培地が、米国特許第４，４４３，５４６号明細書に開示されている。この生長培地は、基本培地に加えて７種の成分を含んでいる。
【００１４】
ヨーロッパ特許明細書第４８１，７９１号には、水、浸透圧調整剤、緩衝剤、エネルギー源、アミノ酸、鉄源、生長因子およびその他の任意の成分を含んでなるＣＨＯ細胞用培養培地が開示されている。例示された２つの培地はそれぞれ１９および１７種の成分を含んでいる。
【００１５】
大規模な生産のための無血清培地の開発における主な目的物は、無血清、無タンパク質（または低タンパク質）、最少の添加物で定義されるためコストの低い培地、培養／生産／精製の工程手順を複雑にするおそれのある成分を含まない有効な培地である。
【００１６】
それでもなおタンパク質が培地に存在するのであれば、それらの動物源から直接に単離されるのではなく、組換えの方法によりえられたものであるのが好ましい。
【００１７】
既知の無血清培地への可能な添加物のリストは非常に長いが、多くのばあいにおいて、まだ正しい組合せは見つけられていない。実際に、その必要が知られるようになって１０年以上がたつのにもかかわらず、約４０の無血清培地しか市販されていない。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明によって、哺乳動物細胞のための生産支持能を有する無血清培地は、基本培地に最少量の添加物を含むだけでよいということが今や明らかになった。
【００１９】
本発明により、基本培地ならびに（ａ）細胞バイアビリティー保護剤、（ｂ）インスリンおよび（ｃ）トロンビンもしくはトロンビンレセプター活性化因子のいずれかを含んでなる哺乳動物細胞用無血清培地が提供される。
【００２０】
トロンビンレセプター活性化因子（以下、「ＴＲＡ」という）は、トロンビンがレセプターの元のＮ末端の近辺を切断することによりレセプターを活性化したのちにＮ末端になるレセプターの領域を含むペプチドである。
【００２１】
本発明の無血清培地は、哺乳動物細胞の生物学的に活性な産物の生産を血清入りのものに匹敵する程度に支持する。
【００２２】
基本培地は、いかなる既知の培地、たとえばＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０またはそれらの混合物からなっていてよい。それらはすべて、たとえばギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社、米国、またはベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社、ドイツなどから市販されている。
【００２３】
細胞バイアビリティー保護剤は、ＡＤＣ−１（バイオロジカル  インダストリーズ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）社、ベイト  ヘメク（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）、イスラエル国）、タンパク質加水分解物またはメチルセルロースなどを含んでいてよい。
【００２４】
用いられるインスリンおよびトロンビンは、好ましくは組換えの方法によって調製されたものである。
【００２５】
タンパク質加水分解物：哺乳動物細胞培養において生長因子としてペプチドを用いることがルツキー（Ｒｕｔｓｋｙ）の総説（１９８１）に記載されている。他の加水分解物としては、たとえばラクトアルブミン加水分解物も、培地補助剤として用いられている（グレース（Ｇｒａｃｅ）、１９６２）。
【００２６】
メチルセルロースは非栄養補助剤として培養培地に加えられる。これは、培養細胞にとって有利であることが知られている（ヒンク（Ｈｉｍｋ）、１９９１）。
【００２７】
インスリンはすべての種類の細胞に対して成長因子として働くことが知られており、いくつかの無血清培地において添加剤として用いられている。
【００２８】
トロンビンおよびトロンビンレセプター活性化因子：血液凝固の役割に加えて、トロンビンは種々の細胞と特異的なレセプターをとおして結合し、シグナルを生ずることがわかった。血小板上には、少なくとも２つのトロンビン結合サイトがある（ワークマン（Ｗｏｒｋｍａｎ）、１９７７）。血小板の刺激は、凝固プロセスの一部として働く。しかしながら、トロンビンは内皮細胞にも高および低新和力でもって結合し（アウブレイ（Ａｗｂｒｅｙ）、１９７９、マコビッチ（Ｍａｃｈｏｖｉｃｈ）、１９８２；バウエル（Ｂａｖｅｒ）、１９８３）、その結果、プロスタサイクリンが遊離され（ウエクスラー（Ｗｅｋｓｌｅｒ）、１９７８）、プロテインキナーゼが活性化され（オーエン（Ｏｗｅｎ）、１９８１）、プラスミノーゲン活性化因子の活性が阻害される（ルスクトフ（Ｌｕｓｋｕｔｏｆｆ）、１９７９）。
【００２９】
綿維芽細胞においては、トロンビンはＤＮＡ合成および細胞分裂を刺激する（ゼッター（Ｚｅｔｔｅｒ）ら、１９７７、グレン（Ｇｌｅｎｎ）ら、１９８０、チェン（Ｃｈｅｎ）１９８１；クニングハム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）ら１９７９）。トロンビンのヒト線維芽細胞への結合は、表面結合糖タンパク質、フィブロネクチンの生産および放出も刺激する（モシャー（Ｍｏｓｈｅｒ）とバヘリ（Ｖａｈｅｒｉ）、１９７８）。
【００３０】
トロンビンは血小板のような細胞を、特異的なレセプターをとおして活性化することが知られている。最近、ブー（Ｖｕ）ら（１９９１）によって、その活性化の機作にはレセプターの切断が含まれることが示唆され、新たに生じたレセプターのＮ末端領域がつながれたリガンドとして働くということが提案された。その新たなＮ末端領域に対応する配列の合成ペプチドは、血小板活性化におけるトロンビンにとって代わることができる。
【００３１】
【実施例】
本発明により、最少量の添加物を含み、従来法によっても従来法と組換えの方法の組合せによっても簡単に調製するのに役立つ、哺乳動物細胞産物の生産に用いるのに適した無血清培地が提供される。
【００３２】
前述のとおり、本発明の無血清培地の成分はすべて、それ自体既知であり、市販されているので、簡単に手に入れることができる。
【００３３】
本発明の１つの実施態様としては、基本培地に異なる成分を単に混合することによって従来法で無血清培地が調製される。すなわち、たとえば２０ｍｌのＡＤＣ−１（１×５０濃縮）を９８０ｍｌの基本培地に加える。これに対して０．１μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌの間のインスリンと０．０１μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌの間のトロンビンを加える。
【００３４】
インスリンおよびトロンビンは通常の組換えの方法、たとえばｃＤＮＡのクローニング、成熟プロセス化タンパク質をコードするＤＮＡ断片の単離、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現するのに適した発現ベクターの構築および発現によって、生産してもよい。
【００３５】
前述のように、ＡＤＣ−１はタンパク質加水分解物のような異なる細胞バイアビリティー保護剤で置き換えることができる。適切な加水分解物は、たとえばラクトアルブミン加水分解物、コーングルテン加水分解物などである。本発明のまた別の実施態様では、無血清培地には基本培地９００ｍｌに対して加えられる１０％のラクトアルブミン加水分解物１０ｍｌまたは５％のコーングルテン加水分解物１０ｍｌを含む。さらに、０．１μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌの間のインスリンおよび０．０１μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌの間のトロンビンが添加される。コーングルテン加水分解物は、動物由来でないため、制御の理由から好ましい。
【００３６】
本発明のさらに別の実施態様では、インスリンおよびトロンビンの発現のための遺伝子を、生物学的に活性な細胞産物の組換え生産のために用いられる哺乳動物細胞中へ挿入する。トロンビンとインスリンをコードする遺伝子とともにこれらのタンパク質の発現を司令する適切なプロモーターを、それらが分泌されることが可能な適切な構築でもってトランスフェクトさせる。用いられた細胞はＳＶ４０早期プロモーターに連結された種々の遺伝子で形質転換されたＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞である。（チャルナジョブスキー（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ）、１９８４）。
【００３７】
遺伝子はＩＬ−６、ＴＢＰ−ＩおよびｒＩＦＮ−β（組換えインターフェロンβ）をコードするものであったが、哺乳動物細胞系における発現に好適な遺伝子であればいかなるものを用いてもよい。トランスフェクションを行なうための特定のＣＨＯ変異体はプロリン依存性であるので、用いる基本培地にプロリンを添加することが必要である。
【００３８】
前記したように、トロンビンはそのレセプターをアミノ末端細胞外ドメインで切断して新規のＮ末端をさらし出させることにより活性化させると信じられている。切断を受けたのちの新たなトロンビンレセプターのＮ末端配列に対応する、相異なる長さのペプチドが、本発明の無血清培地での使用に好適であることが見い出された。短いペプチド配列は、化学的もしくは組換えの方法により容易に合成できるので、これを利用することで無血清培地の調製が簡素化できる。また、これを利用することで市販のトロンビンそのものを用いなくてよくなる。市販のトロンビンは哺乳類由来であるので制御の点で問題を引き起こすかもしれない。
【００３９】
本発明は、下記の実施例により示されるがこれらに限定されるものではない。
【００４０】
実施例１：細胞成長および生産
細胞生長および生産は下記の系で行なわれた。
【００４１】
実験系：
Ａ）２４ウェルプレート中、１０％ＦＢＳ添加培地１ｍｌに細胞を０．２５×１０6 細胞／ウェルとなるよう播種した。３７℃で一晩インキュベートしたのち、培地をとり除き単層の細胞を無血清培地（ＳＦＭ）で２度すすいだ。そののち細胞生長または生産のレベルを種々の培地組成で２４時間ごとに培地変換を行ないながら３〜５日以上のあいだモニターした。
【００４２】
Ｂ）２５ｃｍ2 の組織培養フラスコ中１０％ＦＢＳ添加培地に０．５×１０6 細胞／フラスコとなるよう播種し、生長培地を生産培地に置き換えるまで３日間インキュベートした。
【００４３】
Ｃ）スピナー（ｓｐｉｎｎｅｒ）を用いて生産を１００ｍｌおよび１リットルスピナー（ベルコ（Ｂｅｌｌｃｏ）社製）中でモニターした。細胞はマイクロキャリアに付着させた。ほとんどの実験はディスクキャリア（６ｍｍディスク、ポリエステルの不織布をポリプロピレンスクリーンに重ね合わせて構成されたもの（ステリリン（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ）社、米国）を用いて行なった。いくつかの実験においては、キャリアとしてバイオシロン（Ｂｉｏｓｉｌｏｎ）（ヌンク（Ｎｕｎｃ）社、ロスキルデ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）、デンマーク）を用いた。細胞を１０％ＦＢＳ添加培地中に播種し、２〜３日間の生長期間ののち、培地を無血清の生産培地に変えた。生産期間の初期には２４時間ごとに培地交換を行ない、数日ののちには１２時間ごとに培地交換を行なった。
【００４４】
実施例２：基本無血清培地（ＳＦＭ）の処方
ＩＬ−６生産組換えＣＨＯ細胞は、プロリンおよび２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で生存し、よく増殖する。培地から血清を除去すると、血清を適切な補助剤に置換しない限り細胞死が起こる。
【００４５】
表１は、細胞生長およびＩＬ−６生産に対する培地成分の効果を示す。ＩＬ−６生産ＣＨＯ細胞は、１０％ＦＢＳ培地で０．５×１０6 細胞／フラスコとなるよう２５ｃｍ2 フラスコ中に播種し、培地を生産培地に変えるまで３日間インキュベートした。
【００４６】
細胞数およびＩＬ−６レベルは、生産培地を毎日交換して５日間ののち、測定した。細胞数には、培地交換により洗い去られた非付着細胞は含まれていない。
【００４７】
表１に要約したように、細胞バイアビリティー保護剤、たとえばＡＤＣ−１（バイオロジカル  インダストリーズ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）社、バイトハエメク（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）、イスラエル）は、（ＦＢＳまたはフィブロネクチンの存在下で細胞が初期付着したのち）細胞増殖をほとんど伴わずに細胞のバイアビリティーを維持した。細胞分裂はインスリンによって刺激されうるので、ＡＤＣ−１とインスリンの両方を添加した培地中では細胞はＦＢＳ添加培地と同様によく生長する。しかしながら、無血清下では、細胞のＩＬ−６生産能が経時的に減少し、無血清培地中５日後には、細胞の特定生産能（μｇ  ＩＬ−６／１０6 細胞）は半分にまで減じられた。
【００４８】
細胞の生産能の減少を組織培養（ＴＣ）フラスコ（表１）およびディスクキャリアを用いたスピナーにおいて証明した（図１）。
【００４９】
【表１】
0004124493.tif 000002
【００５０】
実施例３：生産に対するトロンビンの効果。
【００５１】
ウシトロンビン（シグマ社製）を基本ＳＦＭ（ＤＭＥＭ＋ＡＤＣ−１＋インスリン）に添加すると、ＩＬ−６生産は大きく増強された（図２）。プロトロンビンは生産に影響を及ぼさなかった。しかしプロトロンビンを活性因子Ｘａにより切断してトロンビンを遊離させると、生産が刺激された。生産刺激活性は、トロンビン阻害剤である血清タンパク質抗トロンビンＩＶにより阻害される（図２）。
【００５２】
実施例４：生長因子の機能的寄与
インスリンもトロンビンもいずれもＣＨＯ細胞の生長を刺激する。いずれもどちらかをＡＤＣ−１含有培地に添加すると細胞生長は同程度となる（図３Ａ）。しかしながら、インスリンのみ存在下でのＩＬ−６生産はきわめて低く、一方トロンビンは有意に生産レベルを刺激した（図３Ｂ）。ウェル中での短期間の実験においては（図３）、トロンビンのみを用いた生産能は、インスリンとトロンビンの両方をＡＤＣに添加したばあいにごくわずか増大したにすぎなかった。しかしながらスピナー（１００ｍｌ）中で生産をモニターすると、初期にインスリン添加でも無添加でも同等であったＩＬ−６レベルが、インスリン非存在下では９日ののちに明らかに減少した（図４）。これらの結果よりインスリンが最適な長期間の生産に必須であることが示唆された。
【００５３】
図５に示されるように最高の生産能をうるためにはインスリンに加えてトロンビンおよびＡＤＣ−１が必要である。ＡＤＣ−１またはトロンビンを除くと、生産の４〜５日のちにＩＬ−６レベルが減少してしまう。
【００５４】
実施例５：生産のための無血清培地
組換えＣＨＯ細胞によるＩＬ−６生産を高レベルに保つべく見い出された培地組成物は、基本培地（ＤＭＥＭ＋プロリン）に３つの添加物を含む：
１．ＡＤＣ−１；
２．インスリン  ０．２μｇ／ｍｌ；
３．トロンビン  ０．０２μｇ／ｍｌ。
【００５５】
各成分の最適なソースおよび可能な代替物を知るべく分析を行なった。
【００５６】
インスリン
ほとんどの実験は、シグマ社製のウシインスリンを用いて行なった。さらに別の調製物を種々のソースからえて、それらの潜在能力を測定するためにＡＤＣ−１とともに基本培地に添加した。ウシおよびヒトのいずれのインスリンも調べた。ヒトに注射するのに用いられる組換えヒトインスリン（ノボ  ノルディスク（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）社、デンマーク、およびイーライ  リリイ（ＥｌｉＬｉｌｌｙ）社、ＳＡ、スイス）は、制御上の理由のためとくに興味の対象となるものであった。
【００５７】
表２は細胞増殖およびＩＬ−６生産におよぼす異なるソースからのインスリンの効果を示す。ＩＬ−６生産ＣＨＯ細胞は、２４ウェルプレートに１×１０6 細胞／ウェルとなるよう播種した。３日後、培地をインスリン添加または無添加のＳＦＭに変えた。さらに４日間インキュベートしたのち細胞を計数し、ＩＬ−６レベルを測定した。表２に要約したように、検査したインスリン群はすべてＣＨＯ細胞の生長因子として同等の活性を有していた。同等のＩＬ−６生産レベルも観察された。
【００５８】
【表２】
0004124493.tif 000003
【００５９】
トロンビン
最初の実験に用いた市販のトロンビンはシグマ社製の非常に比活性が低い（５０〜１００ＩＵ／ｍｇタンパク）ウシトロンビンであった。ブルーセファロースカラムに結合させて、この製剤からトロンビンを精製した。
【００６０】
図６に要約したように、活性のほとんどは１Ｍチオシアネートで溶出されたが、タンパク質の大部分は結合しないかまたは０．３Ｍの塩で洗い出された。
【００６１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図７に示す。レーン１はマーカー、レーン２はトロンビン１００ＩＵ／ｍｇ（シグマ社製）レーン３はトロンビンのブルーセファロース活性画分、レーン４はトロンビン２０００ＩＵ／ｍｇ（シグマ社製）である。活性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図７、レーン３）で見かけの分子量３７Ｋの主たるタンパク質のバンドが見られた。これは比活性２０００ＩＵ／ｍｇタンパクの市販（シグマ社製）精製ウシトロンビンのタンパク質のバンドと類似していた（図７、レーン４）。
【００６２】
シグマ社のウシトロンビンのブルーセファロースの活性画分（１．０Ｍチオシアネート）を生産のために１リットルスピナー中のＳＦＭへの添加物として用いた。トロンビンは培地中０．０２μｇ／ｍｌの最終濃度となるようにして用い、培地にはＡＤＣ−１およびインスリン（０．２μｇ／ｍｌ）も添加した。４週間以上にわたる生産のあいだ、一貫して高レベルの生産が観察された（図８）。
【００６３】
ＡＤＣ−１
市販のタンパク非含有補助剤（ＡＤＣ−１）はバイオロジカルインダストリーズよりえられ、これの代わりにたとえばラクトアルブミンの加水分解物（図９）もしくはコーングルテンの加水分解物（ＣＧ）（図８）のようなタンパク質加水分解物またはメチルセルロース（ＭＣ）（図９）を用いることができる。
【００６４】
前記成分を基本培地（ＤＭＥＭ＋プロリン）にインスリンおよび精製トロンビンとともに添加した（図８）。３つの成分を培地に加える限りにおいてすべての組合せで生産レベルは同等であった。
【００６５】
ＡＤＣ−１および種々の代替物はすべてオートクレーブ可能であり、制御という点から有利である。
【００６６】
実施例６：無血清培地の多様性
ほとんどの実験はＩＬ−６生産ＣＨＯ細胞を用いて行なった。しかしながら、ほかの組換え産物の生産も３成分すなわちＡＤＣ−１（または同等のもの）、インスリンおよびトロンビン添加の培地で証明された。ＣＨＯ細胞による組換え腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＢＰ）の生産を１００ｍｌスピナー中で調べた（図１１）。３成分すなわちＡＤＣ−１、インスリンおよびトロンビン存在下では生産レベルは２％ＦＢＳ中で生産している細胞のものと同程度であった。トロンビンを添加しないと、生産は５日後に減少した。
【００６７】
組換えＩＮＦ−βを１００ｍｌスピナー中バイオシロンマイクロキャリア上のＣＨＯ細胞により生産した。生産レベルは２％ＦＢＳ添加培地中でもＡＤＣ、インスリンおよびトロンビンを添加した無血清培地中でも同じであった（図１２）。
【００６８】
実施例７：
トロンビンレセプターの新たなアミノ酸末端を模倣した１４残基のアミノ酸ペプチドについて、ＩＬ−６生産を刺激する活性においてトロンビンと置き換えることができるか否かを調べた。ペプチド（Ｈ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＨ）は、２つのソースよりえた。高度に精製したペプチド（トロンビンレセプターアクチベーター）はバケム（Ｂａｃｈｅｍ）社（スイス）より購入し、粗調製物はワイツマン  インスチチュート  オブ  サイエンス（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）（イスラエル）で合成した。
【００６９】
ＩＬ−６生産ＣＨＯ細胞を用いて２４ウェルプレート中、ＳＦＭの成分として、両者をトロンビンと比較した。
【００７０】
表３はＩＬ−６生産に対するトロンビンレセプターアクチベーターの効果を示す。
【００７１】
表３Ａに要約したように、ＩＬ−６生産は前記ペプチドによりトロンビンによると同程度にまで刺激された。しかしながら、ペプチドを用いたばあい、１０００倍高い濃度が必要であった。期待したように精製ペプチドは粗調製物に比して、より低い濃度で有効であった。
【００７２】
【表３】
0004124493.tif 000004
【００７３】
表４に示されるように、下記ペプチドを用いても同様の結果がえられた。
【００７４】
Ａ−トロンビンレセプター（４２〜５５）、ヒト
Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
Ｂ−トロンビンレセプター（４２〜４７）、ヒト
Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ
Ｃ−トロンビンレセプター（４２〜５５）、ハムスター
Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
Ｄ−トロンビンレセプター（４２〜４７）、ハムスター
Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ
すべてネオシステム（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ）社、フランスより入手。
【００７５】
【表４】
0004124493.tif 000005
【００７６】
実施例８
生産条件下でのペプチドの活性を調べるために、ディスクキャリアを用いた１リットルスピナーをセリゲン（ＣｅｌｌｉＧｅｎ、商標）（ニュー  ブルンスウィック  サイオンティフィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ）社、ニュージャージ州、米国）バイオリアクターコントロールに接続した。ＴＢＰクローン１０８−１−２２−１２／４の細胞を播種し、生長期間ののち、２％ＦＢＳで生産を開始した。
【００７７】
１０日後、血清添加生産培地をコーングルテン加水分解物、インスリンおよびＴＲＡ（トロンビン  レセプター  アクチベーター）を含むＳＦＭに置き換えた。生産は４０日間継続した。生産中の一定期間ＴＲＡをトロンビンに置き換えた。トロンビンをＴＲＡに置き換えても、生産レベルに影響はなかった（図１０）。図１０には、ＳＦＭ中でのＴＢＰ生産、トロンビンレセプターアクチベーターの効果を示した。
【００７８】
実施例９：ＣＨＯ細胞でのトロンビンおよびインスリンのクローニングと発現
はじめに通常の方法でトロンビンおよびインスリンをコードするｃＤＮＡをクローニングしたのち、シグナルペプチドと連結した成熟タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ断片を単離した。シグナルペプチドはそれら自身のものでもよいしＣＨＯ細胞において適正に分泌されるシグナルペプチドでもよい。そののち、ＣＨＯ細胞内での発現のためにたとえばＳＶ４０またはＣＭＶのようなプロモーターに連結したこれらのＤＮＡ断片を含む発現ベクターを構築した。
【００７９】
発現ベクターを所望のタンパク質の組換え生産するのに用いられるＣＨＯクローンの１つにトランスフェクトし、第２のタイプの選択すなわちゲンタマイシン（Ｇ４１８）を用いる。インスリンとトロンビンは無血清培地中に分泌され、ＣＨＯクローンによる異種のタンパクの生産や分泌を支持する。
【００８０】
【発明の効果】
本発明により、哺乳動物細胞による生物学的に活性な産物の生産を支持することができる無血清培地が提供される。本発明の無血清培地は、最少量の添加物を含んでなるため低価格で容易に調整でき、活性産物の生産に有用である。
【００８１】
参考文献
Awbrey,B.J.,Hoak,J.C.,and Owen,W.G. Binding of human thrombin to cultured human endothelial cells,J.Biol.Chem.254:4092(1979).
Barnes,D.,and Sato,G.Serum-free cell culture:A unifying approach. Cell22:649-655(1980).
Barnes,D.W.,Sirbasku,D.A.,and Sato,G.H. Cell culture methods formolecular and cellular biology. Vols.1-4,Liss,New York(1984).
Bames,D. Serum-free animal cell culture. Bio Techniques 5:534-542(1987).
Bauer,P.I.,Machovich,R.,Aranyi,P.,Buki,K.,Csonka,E.,and Horvath,I., Mechanism of thrombin binding to endothelial cells.Blood 61:368(1983).
Broad,D.,Boraston,R.,and Rhodes M. Production of recombinant proteins in serum-free media. Cytotechnology 5:47-55(1991).
Chen,L.B. Thrombin as a growth factor for cultured cells. “The growth requirements of vertebrate cells in vitro. ”Eds.Waymouth C.,Ham,R.G., Chapple,P.J.,Cambridge University Press,pp.380-387(1981).
Chernajovsky,Y.,Mory,Y.,Chen,L.,Marks,Z.,Novick.D.,Rubinstein,M.,and Revel,M.Efficient constitutive production of human fibroblast interferon by hamster cells transformed with the IFN-β gene fused to an SV40 early promoter. DNA 3:297-307(1984).
Cunningham,D.D.,Carney,D.H.and Glenn,K.C.,A cell-surface component  involved in thrombin-stimulated cell division.Hormones and Cell Culture. Eds. Sato,G.H.,and Ross,R.,Cold Spring Harbor,New York,199(1979).
Familletti P.C.,and Fredericks,J.E. Techniques for mammalian cell immobilization.Bio/Technology 6:41-44(1988).
Glenn,K.C.,Karney,D.H.,Fenton II,J.W.,and Cunningham,D.D.,Thrombinactive site regions required for fibrinoblast receptor binding and initiation of cell division. J.Biol.Chem.255:6609(1980).
Grace,T.D.L. Establishment of four strains of cells from insect tissues grown in vitro.Nature 195:788-789(1962).
Hink,W.F. A serum-free medium for the culture of insect cells and production of recombinant proteins. In Vitro Cell Dev.Biol.27A:397-401. (1991).
Jayme,D.W. Nutrient optimization for high density biological production applications.Cytotechnology 5:15-30(1991).
Loskuroff,D. Effect of thrombin on the fibrinolyric activity of cultured bovine endothelial cells. J.Clin.Invest.64,329(1979).
Machovich,R.and Csonka,E. Mechanism of the binding of thrombin to endothelial cells. Acta Biochim.Biophys.Acad.Sci.Hung.17:66(Abstr.) (1982).
Marino,M.H.,Expression systems for heterologous protein production. Bio Pharm.Jul/Aug:18-33(1989).
Morita,M.,and Iwanaga,S. Prothrombin activator from Echis carinarus venom. Methods in Enzymology 80:303-311(1981).
Mosher,D.F.and Vaheri,A. Thrombin stimulates the production and release of a major surface-associated glycoprotein(fibronectin)in cultures of human fioroblast. Exp.Cell Res.112:323(1978).
Owen,W.G.and Esmon,C.T. Functional properties of an endothelial cell cofactor for thrombin catalyzed activation of protein C.J.Biol.Chem. 256:5532(1981).
Sato,G.H.,Pardee A.B.,and Sirbasku,D.A. Growth of cells in hormonally-defined media.Books A and B. Cold Spring Harbor,New York(1982).
Taub,M.Tissue Culture of Epithelial Cells. Plenum,New York(1985).
Vu,T.K.H.,Hung,D.T.,Wheaton,V.I.,and Coughlin,S.R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell 64:1057-1068(1991).
Weiss,S.A.,Lester,T.L.,Kalter,S.S.,and Heberling,R.L. Chemically defined serum-free media for the cultivation of primary cells and their susceptibility to viruses. In Vitro 16:616-628(1980).
Weksler,B.B.,Ley,C.W.,and Jaffe,E.A. Stimulation of endothelial cell prostacyclin (PGI2 )production by thrombin,trypsin and ionophore A231817. J.Clin.Invest.62:923(1978).
Workman,E.F.,White,G.C.,and Lundblad,R.L. High affinity binding of thrombin to platelets.Inhibition by tetranitromethane and heparin. Biochem.Biophys.Res.Commun.75:925(1977).
Zetter,B.R.,Chen,L.B.,and Buchanan,J.M. Binding and internalization of thrombin by normal and transformed chick cells. Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A.74:596(1977).
【図面の簡単な説明】
【図１】スピナー中でのＩＬ−６生産に対する培地成分の効果を示すグラフである。ＩＬ−６生産ＣＨＯ細胞は、ディスクキャリアを用いた１００ｍｌスピナーに播種した。１０％ＦＢＳ中で７日間生長させたのち、培地を２％ＦＢＳ添加の生産培地またはＡＤＣ−１  ２０％（ｖ／ｖ）＋インスリン０．２μｇ／ｍｌ添加無血清培地（ＳＦＭ）に置き換えて、ＩＬ−６生産を２４時間ごとに測定した。結果は、２つのスピナーでの平均を示した。
【図２】ＳＦＭ中でＩＬ−６生産刺激におよぼすトロンビンの効果を示すグラフである。種々の成分をＳＦＭに添加し、２４ウェルプレート中のＩＬ−６生産ＣＨＯ細胞に加えた。
【図３】インスリンとトロンビンの細胞生長およびＩＬ−６生産におよぼす効果を示すグラフである。
【図４】１００ｍｌスピナー中でＩＬ−６生産におよぼすインスリンの効果を示すグラフである。
【図５】１００ｍｌスピナー中でＩＬ−６生産におよぼすＡＤＣ−１およびインスリンの効果を示すグラフである。
【図６】比活性が低い（５０〜１００ＩＵ／ｍｇ）市販のトロンビン（シグマ社製）を付したブルーセファロースカラムからのトロンビンの溶出パターンを示すグラフである。
【図７】種々のトロンビン調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図８】１リットルスピナー中でのＴＢＰの生産を示すグラフである。
【図９】インスリンとトロンビンを含有する無血清培地への種々の細胞バイアビリティ保護剤の効果を比較するために１００ｍｌスピナー中でのＴＢＰ生産を示したグラフである。
【図１０】１リットルバイオリアクター中でのＴＢＰ生産を示すグラフである。
【図１１】１００ｍｌスピナー中でのＴＢＰ生産に対する培地成分の効果を示すグラフである。
【図１２】１００ｍｌスピナー中でのＣＨＯ細胞によるｒＩＦＮ−βの生産を示すグラフである。
【図１】
0004124493.tif 000006
【図２】
0004124493.tif 000007
【図３】
0004124493.tif 000008
【図４】
0004124493.tif 000009
【図５】
0004124493.tif 000010
【図６】
0004124493.tif 000011
【図７】
0004124493.tif 000012
【図８】
0004124493.tif 000013
【図９】
0004124493.tif 000014
【図１０】
0004124493.tif 000015
【図１１】
0004124493.tif 000016
【図１２】
0004124493.tif 000017