(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶離液を送液するための１台以上の溶離液ポンプと反応試薬液を送液するための１台以上の試薬液ポンプを具備し、溶離液ポンプによる試料の分離カラムへの送液により該カラムから溶出する溶出液に対し、試薬液ポンプにより反応試薬液を送液して分離された試料に反応試薬を混合し、反応によって得られた生成物を検出器で検出するように構成される反応型液体クロマトグラフにおける送液装置であって、溶離液ポンプと試薬液ポンプが共にモータにより駆動されるポンプであり、前記モータには、単一の基準クロック信号の周波数をＮ倍又は１／Ｎ倍（Ｎは１以上の自然数）した周波数の異なる信号で、信号のクロック数に比例する回転角度だけ前記モータを駆動制御する制御手段を備えることを特徴とする前記装置。
【請求項２】
溶離液を送液するための１台以上の溶離液プランジャポンプと反応試薬液を送液するための１台以上の試薬液プランジャポンプを具備し、溶離液プランジャポンプによる試料の分離カラムへの送液により該カラムから溶出する溶出液に対し、試薬液プランジャポンプにより反応試薬液を送液して分離された試料に反応試薬を混合し、反応によって得られた生成物を検出器で検出するように構成される反応型液体クロマトグラフにおける送液装置であって、溶離液プランジャポンプと試薬液プランジャポンプが共にモータにより駆動されるポンプであり、これらモータを単一の基準クロック信号又は該信号から生成された信号で駆動制御する制御手段を備え、かつ、前記ポンプのプランジャ運動の周波数比が一桁の整数比となり、各プランジャの位置関係が同一となるのに要する時間が検出器で検出される分離カラムから溶出される目的成分のピーク巾の１／２以下の時間となるように制御することを特徴とする前記装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料を分離カラムに供することで分離し溶出させ、溶出液中の成分に対して蛍光化試薬等を混合してラベル化し、その後ラベルについて検出を行ういわゆるポストカラム反応を実施するためのポストカラム反応型液体クロマトグラフ装置に関するものであり、詳しくはこのような液体クロマトグラフ装置において好適に用いられる送液装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ポストカラム反応型液体クロマトグラフでは、溶離液の流れの中に試料を入れて分離カラムに送り、分離カラムから溶出される溶出液中の目的成分に対して別のポンプで蛍光ラベル化剤等の反応試薬を送液し、両者を合流、混合させて反応混合液を形成し、ラベル化した後に検出する。ラベル化剤には目的成分を吸光性誘導体化するものや蛍光誘導体化するもの等がある。
【０００３】
ポストカラム反応型液体クロマトグラフでは、理論上は試料中の目的成分を高感度に検出できることから、カテコールアミンやアミノ酸の分析などに多用されている。具体的に血漿中のカテコールアミン成分を分析する場合には、ＤＰＥ  （ＤｉｐｈｅｎｙｌＥｔｈｙｌｅｎｅＤｉａｍｉｎｅ）を蛍光誘導体化のためのラベル化剤として使用する方法が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ポストカラム反応型クロマトグラフでは、少なくとも１種類の溶離液と少なくとも１種類の反応試薬液を送液する必要があるため、複数のポンプヘッドを備えた多連ポンプを使用したり、一連ポンプを２台以上使用したり、又は多連ポンプと一連ポンプを各１台以上組合せて使用するのが普通である。
【０００５】
多連ポンプでは、送液する液体の流量比（流速比又は流量比）が固定されており、これを容易に変えることができないというマイナス面がある。マイクロメータヘッドでプランジャのストロークを制限することにより、１ストロークで送液する液量を変えることができるポンプも知られているが、該ポンプでは流量を調整するためにはストロークを変えて流量を測定するという作業を繰り返し行わねばならず、操作性は良好ではない。
【０００６】
そこで従来では、プランジャポンプ等の一連ポンプを必要に応じて２台以上使用し、溶離液や試薬液等を別個に送液する装置が多用されている。
【０００７】
ところが、例えば前記したカテコールアミン分析においては、蛍光誘導体化のためのラベル化剤であるＤＰＥ自体が微小の蛍光を発するため、該反応試薬液が目的成分を含まない溶出液部分と混合された反応混合液には蛍光バックグランドが存在する。このため、溶離液の送液流量が減少し又は反応試薬液の送液流量が増加する等して反応試薬液の混合割合が変わると検出される蛍光強度が変動し、これによりバックグランドの変動を誘因されてベースラインに擬似的なピークが生じ、本来同定・定量されるべき目的成分に由来する微少ピークの同定・定量が困難になる。即ち、従来の装置を使用すると、ベースラインが安定している時  （ベースラインが直線的である時）と波打つ時（ベースラインが曲線的になる時）があり、ベースラインを常に直線的とすることは困難であった。
【０００８】
本発明者は、カテコールアミン分析の際にベースラインを注意深く観察した結果、バックグランドの前記波打ち現象は数分の周期で起こるが、その大きさや周期は一定ではなく、時間の経過と共に変化することを見出した。またベースラインの変動は反応試薬液を送液するポンプの吐出圧力の小さな変動と同期していることを見出した。これらの観察結果から、本発明者は、複数のポンプの駆動クロックが時間と共にドリフト等により独立に変化して各ポンプの駆動速度の比に変化が生じ、その結果、各ポンプの送液量と圧力とが相互に作用して送液量と圧力に周期や大きさが変化する変動が生じ、反応試薬液と溶離液の混合割合の変動がバックグランドを変化させると推定した。
【０００９】
そこで本発明の目的は、各ポンプの送液量比を容易に変化できるように２台以上の一連ポンプを使用し、しかも前記した従来技術の課題である反応試薬液と溶離液の混合割合の変動を抑制してバックグランドに擬似的なピークが生じるのを防止し得る、ホストカラム反応型クロマトグラフ用送液装置を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために成された本発明の反応型液体クロマトグラフ用送液装置は、溶離液を送液するための１台以上の溶離液ポンプと反応試薬液を送液するための１台以上の試薬液ポンプを具備し、溶離液ポンプによる試料の分離カラムへの送液により該カラムから溶出する溶出液に対して試薬液ポンプによる反応試薬液の送液により分離カラムで分離された試料に反応試薬を混合し、反応によって得られた生成物を検出器で検出するように構成される反応型液体クロマトグラフにおける送液装置であって、溶離液ポンプと試薬液ポンプを基準クロック信号又は基準クロック信号から生成された信号で制御する制御手段とを備えることを特徴とする装置である。
【００１１】
本発明者の知見によれば、従来から多用されているプランジャポンプ等の一連ポンプを２台以上使用すると、各ポンプ出口の圧力変動の包絡線がＡＭ変調を受けたようになる。この現象は、各ポンプのプランジャの往復運動の周波数がわずかに異なったり一方の周波数を整数倍したものが他方の周波数を整数倍したものとわずかに異なると、その差に等しい周波数で圧力にビートが生じるためと考えられる。圧力が変調を受けると、流量の圧力依存性の非直線性によって各ポンプの流量がわずかながら変化する。圧力変調の周期が長い場合には、流量の割合の変動が長周期になり、カラムからの溶離液と反応試薬液が反応コイル又は反応カラムを通過しても均一に混合されなくなり、圧力の変動と同期してベースラインの変動が観察される。
【００１２】
そこで、このような現象を解決するため本発明では、複数のポンプによる送液の圧力変動が短時間周期で現れるようにし、その結果としてベースラインの変動が短時間周期で現れ、全体として見たときにベースラインを直線的にするための構成を採用するのである。
【００１３】
本発明の装置は、溶離液を送液するための少なくとも１台の溶離液ポンプと反応試薬液を送液するための少なくとも１台の試薬液ポンプを具備する。通常、溶離液ポンプは１台であるが、例えば溶離液を切り替えて溶出させる操作や溶離液の組成を変化させて溶出させる操作を行う場合には２台以上を用いることができる。試薬液ポンプについても通常は１台で良いが、例えばラベル化剤等が２以上の試薬液から構成され、かつ、これらを予め混合すると不安定になってしまう場合や、２以上の反応試薬を順次目的成分に混合して反応させる必要がある場合等には、２台以上のポンプを使用することができる。
【００１４】
ポストカラム反応型液体クロマトグラフでは、分離カラムにおいて分離された目的成分と反応試薬液の混合と反応を、分離カラムの下流に接続された、一定温度に維持された反応チューブや不活性ビーズを充填した反応カラム等で行う。従って本発明においては、溶離液用ポンプに試料導入装置（サンプリング装置）、分離カラム、反応チューブ（反応カラム）そして検出器等の一連の装置を接続するともに、分離カラムと反応チューブ（反応カラム）の間の配管部分に分岐を設け、この部分に試薬液ポンプ（反応試薬液）を接続すれば良い。むろん、反応チューブ等を使用しない場合には、分離カラムから検出器に至るまでの配管部分に前記のような分岐を設ければ良い。
【００１５】
本発明の装置では、パルス数に対応する角度だけ回転するモータで直接又は間接的に駆動され、断続的に液体を送液する一連ポンプを利用し、これを制御することで前記目的を達成するものである。従ってこのようなモータを装備するポンプであれば、いかなるポンプであっても本発明の溶離液用ポンプ及び／又は試薬液用ポンプとして使用することができる。かかるポンプとしては、例えばプランジャの往復運動によりチャンバからの送液とチャンバへの入液を繰り返すプランジャポンプやペリスタポンプ等の送液量が周期的に変動するポンプであって、パルス数に応じて駆動される例えばパルスモータやＤＣサーボモータで駆動制御されるものであれば何ら制限はない。
【００１６】
本発明では、溶離液用及び試薬液用ポンプとして同一タイプのものを使用することはもちろん、異なるタイプのポンプを使用することもできるが、中でも送液量の調整及び制御が容易なプランジャポンプを両ポンプとして使用することが好ましい。プランジャポンプは、モータにより直接又は間接的に往復動するプランジャとチェック弁を含む微量高圧ポンプであり、一般的なものではプランジャ直径が２〜３ｍｍ程度でストロークは１０ｍｍ以下、そしてプランジャは数秒に１回から１秒に数回の頻度で往復駆動される。むろん本発明においては、ここに例示したようなプランジャポンプ以外のプランジャポンプを使用することに何ら制限はない。
【００１７】
本発明では、溶離液用及び試薬液用ポンプの全てを、単一の基準クロック信号又は単一の基準クロック信号から生成された信号で制御することを特徴とする。即ち、発振回路等により繰り返しパルス信号又は交流信号を発振させ、そのまま、分周して又は逓倍してモータコントローラやモータドライバ等に加えモータを駆動制御するのである。分周又は逓倍は、例えば基準クロック信号をＮ倍したり１／Ｎ倍することが例示できる（Ｎは１以上の自然数）。各ポンプを駆動するためのクロック信号の周波数は等しくなくても良く、例えば使用するポンプを２群に分け、第１の群及び第２の群への周波数比を１：２や１：３のような１と単純な整数の比としたり、又は、２：３や３：４のような単純な整数の比としてこれらを駆動制御することが例示できる。
【００１８】
本発明において溶離液及び試薬液用ポンプとしてプランジャポンプを使用する場合は、モータとプランじゃの間に減速比が異なる減速装置が挿入されたり、更には２台以上のポンプ間でパルスモータのステップ角が異なることがあり、各モータの回転制御の制御信号の比が単純な整数の比で表されても、プランジャの運動の周波数の比は単純な整数比で表されないことがあり得る。このような場合には、プランじゃ運動の周波数の比が小さな整数比、例えば一桁の整数比で表されるように２台以上のポンプのモータをそれぞれ駆動制御することが好ましい。
【００１９】
プランジャポンプにおけるプランジャ運動の周波数比を一桁の整数比となるようにモータの駆動制御を行う場合として、２台以上のプランジャの位置関係を検出器で検出されるピーク巾の１／２以下の時間で同一の位置関係に復帰するように制御する場合が例示できる。より具体的には、例えば、第１群のプランジャポンプでは１往復／２秒となるように駆動制御し、第２群のプランジャポンプでは１往復／３秒となるように駆動制御する場合を例示できる。この場合、６秒毎に両プランジャの位置関係は同一となる。特に２台以上のプランジャの位置関係を５秒以内に所定の位置関係に復帰するような駆動制御が好ましい例として例示できる。この例では例えば、第１群のプランジャポンプでは１往復／１秒となるように駆動制御し、第２群のプランジャポンプでは１往復／２秒となるように駆動制御し、２秒毎に両プランジャの位置関係を同一とするのである。このように２台以上のプランジャポンプを制御することにより、圧力変動周期、即ち全ポンプによる送液総量の変動周期が短時間化され、その結果としてベースラインは全体的に直線的、即ち長時間周期のベースラインの変動がなくなる。各プランジャの位置関係が同一となるのに要する時間が短いほど反応コイルや反応カラム内で溶離液と反応試薬液が均一に混合されるため、ベースラインの変動の周期が短くなると共に変動の巾が小さくなり、その結果、議事ピークの巾が小さくなる。また疑似ピークとピークの判別を容易ならしめるためにも、変動の周期、即ち両プランジャの位置関係が同一となるのに要する時間、はピークの巾に比較して十分に短いことが好ましい。例えばカテコールアミンの分析においては、ピークの立ち上がりからベースラインに戻るまで約２０秒かかることから、５秒前後で元に戻ればピークの同定に大きな影響はない。
【００２０】
またこのような理由により、プランジャポンプ以外のポンプを用いる場合は、各ポンプを駆動制御する周波数の比を、流量変動の周波数比が単純な整数の比となるように設定することが好ましい。また特別な例として、例えば１：１等、単純な整数比となるように設定することもできる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２２】
図１は、本発明の構成を採用したカテコールアミン分析装置の液体クロマトグラフィー部を示すものである。１は溶離液用ポンプ、２は溶離液、３は市販の試料導入装置（オートサンプラ、ＡＳ−８０２０、商品名、東ソー（株）製）、４は市販の逆相分離モード用カラム（ＯＤＳカラム、商品名、東ソー（株）製）、５は抵抗管、６は試薬液用ポンプ、７及び８はそれぞれＤＰＥを含む蛍光誘導体化試薬又は酸化剤として過塩素酸カリウムを含む試薬、９は反応チューブ、１０は蛍光検出装置（Ｘｅランプを光源とする検出装置）である。本例では２種類の反応試薬液を用いているが、試薬液用ポンプとしては１台の２連プランジャポンプを用いた。なお、溶離液用ポンプ１及び試薬液用ポンプ６はいずれもサファイアプランジャとボール式チェック弁を用いた微量高圧ポンプであり、モータとプランジャの間の減速比は同一である。また各ポンプの流量は、溶離液用ポンプは１２μｌ／ストローク、試薬液用ポンプは６μｌ／ストロークである。
【００２３】
試料導入装置から１００μｌの試料（ヒト血漿、標準試料、ブランク試料等）をサンプルループで秤り取り、続いてポンプ１により溶離液を送液して試料を分離カラム４に送液した。分離カラムから溶出した目的成分（カテコールアミン）に対し、ポンプ６により送液された反応試薬７及び８を混合し、反応チューブ内でこれらを混合し、８５℃約３分反応させ、蛍光検出器で３５０ｎｍの励起光を照射し、４００ｎｍ以上の波長で蛍光を測定した。
【００２４】
上記装置について、不図示の単一発信回路でクロック信号を発生し、それぞれポンプ１及びポンプ６を駆動するモータを同一速度で回転させた。この時の各ポンプの送液量は各０．２ｍｌ／分及び０．１ｍｌ／分であり、シリンジ運動の周波数は１６．７ｒｐｍ及び１６．７ｒｐｍである。
【００２５】
比較のため、各ポンプをそれぞれ独立した発信回路に接続し、ポンプ１は０．２ｍｌ／分、ポンプ６は０．０８ｍｌ／分の送液量となるように制御した。この場合のシリンジ運動の周波数は１６．７ｒｐｍ及び１３．３ｒｐｍである。
【００２６】
本発明の構成を採用した場合のポンプ６の送液口における圧力変動を図２、検出器で検出されたベースラインの変動の様子を図３に、比較用構成でのポンプ６の送液口における圧力変動を図４、検出器で検出されたベースラインの変動の様子を図５にそれぞれ示す。
【００２７】
図２〜５により、本発明の構成を採用することで圧力パターンの変動がなくなり、ベースラインが安定することが分かる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の反応型液体クロマトグラフ装置用送液装置では、複数のポンプを使って安定な圧力パターンで送液することができる。また、ポンプの流量を変えても複数のポンプを使って安定な圧力パターンで送液することができる。
【００２９】
本発明により、複数のプランジャが完全に同期して運動する場合には、プランジャの周期と同じ圧力変動が生じるだけであり、一周期の中で生じる混合比の変動は反応コイルを通過する間に平均化されてバックグランドの変動は非常に小さくなる。また複数のプランジャが規則的に繰り返す関係を保って運動する場合であっても、繰り返し周期で圧力変動が生じ、また混合比の変動を生じるが、繰り返し周期を短く設定することにより、混合比の変動は反応コイルを通過する間に平均化されてバックグランドの変動は小さくなる。
【００３０】
また本発明によれば、何らかの理由により基準クロックが少々変化したとしても、複数のポンプの回転などは同じ割合で影響を受けることになるため、送液量の割合は変化せず、安定したベースラインを得ることができる。
【００３１】
このように本発明は、流量を減らすためにポンプの回転数等を低下させた時に特に有効である。また送液量はポンプの圧力が上昇するにつれて一般に減少するが、ポンプのシール部材等が摩耗し、送液量の圧力依存性が大きくなったポンプ等においても特に有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は液体クロマトグラフ装置の概略を示す図である。
【図２】図２は本発明による反応型液体クロマトグラフ装置における試薬液用ポンプの圧力変動を示す図である。
【図３】図３は本発明による反応型液体クロマトグラフ装置におけるベースライン変動の様子を示す図である。
【図４】図４は従来技術による反応型液体クロマトグラフ装置における試薬液用ポンプの圧力変動を示す図である。
【図５】図５は従来技術による反応型液体クロマトグラフ装置におけるベースライン変動の様子を示す図である。
【符号の説明】
１  溶離液用ポンプ、２  溶離液、３  試料導入装置、４  分離カラム、５抵抗管、６  試薬液用ポンプ、７、８  反応試薬、９  反応チューブ、１０  検出器
【図１】
0004182564.tif 000002
【図２】
0004182564.tif 000003
【図３】
0004182564.tif 000004
【図４】
0004182564.tif 000005
【図５】
0004182564.tif 000006