(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のポリヌクレオチドであって、配列番号１のＤＮＡ配列において第７５１位のｔ（チミン）がａ（アデニン）に且つ第７５２位のｇ（グアニン）がａ（アデニン）に塩基置換しているポリヌクレオチドまたはその相補配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１のポリヌクレオチドの一部であって、配列番号１の第７５１位置換塩基ａおよび第７５２位置換塩基ａを含む２０〜１００の連続したＤＮＡ配列から成るオリゴヌクレオチドまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１のポリヌクレオチドとその相補配列からなる二本鎖ポリヌクレオチド、または請求項１のポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが配列番号１の第７５１位置換塩基ａおよび第７５２位置換塩基ａを含む１５〜３０の連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。
【請求項４】
請求項１のポリヌクレオチドにコードされるか、または該ポリヌクレオチドの発現によって得られるポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列において、第２５１位のＴｒｐ（トリプトファン）がＬｙｓ（リジン）にアミノ酸置換されているポリペプチド。
【請求項５】
請求項２のオリゴヌクレオチドを標識化したことを特徴とするＤＮＡプローブ。
【請求項６】
請求項２のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする原発性高蓚酸尿症Ｉ型に関してハイリスクであることを判定するためのＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子診断の技術分野に属し、特に、原発性高蓚酸尿症Ｉ型の病因遺伝子となるアラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼをコードする異常遺伝子とそれを利用する原発性高蓚酸尿症Ｉ型の診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
原発性高蓚酸尿症Ｉ型（以下、ＰＨ１と略記することがある）は、比較的稀な常染色体劣性遺伝のグリオキシル酸代謝異常であり、蓚酸やグリコール酸の産生と尿中排泄の増加により、不溶性の蓚酸カルシウムが、腎臓をはじめとする全身に蓄積する疾患である。その臨床症状は多彩であるが、多くの罹患者は腎不全その他により予後不良となる。原因はグリコール酸の代謝産物であるグリオキシル酸がペルオキシゾーム酵素のアラニン：グリオキシル酸トランスフェラーゼ（ＡＧＴ）異常によりグリシンに代謝されず、グリオキシル酸の酸化物の蓚酸とグリコール酸が過剰に産生、排出されることによる。ＡＧＴ遺伝子の異常に関しては、既に幾つかの病因変異が知られている。例えば、ＡＧＴ遺伝子のｃＤＮＡの第３３位と第３４位の間にシトシンが挿入され、premature stopコドンが出現するナンセンス変異（Ｑ１２ｆｓ×１６７）が見出されている。ＰＨ１は発症前に肝移植して治療できる病気であるので、発症前の早期診断が重要であり、このためにはＰＨ１の発症の可能性の有無を確実に知ることができるようにＡＧＴに関する遺伝子レベルでの更なる検討が望まれている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、このたび、ＰＨ１の病因となる新たなＡＧＴ遺伝子の変異を見出した。すなわち、後にも詳述するように、ＰＨ１と確定診断された患者とその両親の遺伝子を用い、ＡＧＴ遺伝子のｃＤＮＡの異常を検索したところ、患者の遺伝子では第７５１位がチミンではなくアデニンに、また、第７５２位がグアニンではなくアデニンに変異していることを見つけ、これが母親由来であり、比較検索した健常者２００名の遺伝子にはこの変異は見られないことから、これらの変異が病因であることを確認した。
【０００４】
本発明は、このような知見を基礎に導かれたものであり、この出願は、前述の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（１５）の発明を提供する。
（１）  アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子のポリヌクレオチドであって、配列番号１のＤＮＡ配列において第７５１位のｔ（チミン）がａ（アデニン）に且つ第７５２位のｇ（グアニン）がａ（アデニン）に塩基置換しているポリヌクレオチドまたはその相補配列。
（２）  前記発明（１）のポリヌクレオチドの一部であって、配列番号１の第７５１位置換塩基ａおよび第７５２位置換塩基ａを含む２０〜１００の連続したＤＮＡ配列から成るオリゴヌクレオチドまたはその相補配列。
（３）  前記発明（１）のポリヌクレオチドもしくは前記発明（２）のオリゴヌクレオチド、またはそれらの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド。
（４）  前記発明（３）のポリヌクレオチドとその相補配列からなる二本鎖ポリヌクレオチド、または前記発明（３）のポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが配列番号１の第７５１位置換塩基ａおよび第７５２位置換塩基ａを含む１５〜３０の連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。
（５）  前記発明（１）または（３）のポリヌクレオチドにコードされるか、または該ポリヌクレオチドの発現によって得られるポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列において、第２５１位のＴｒｐ（トリプトファン）がＬｙｓ（リジン）にアミノ酸置換されているポリペプチド。
（６）  前記発明（５）のポリペプチドの一部であって、配列番号２の第２５１位置換アミノ酸Ｌｙｓを含む５〜３０の連続したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
（７）  前記発明（６）のオリゴペプチドを抗原として作製された抗体。
（８）  原発性高蓚酸尿症Ｉ型の診断方法であって、被験者から単離した染色体ＤＮＡ中に前記発明（３）のポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
（９）  被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、前記発明（１）のポリヌクレオチドもしくは前記発明（２）のオリゴヌクレオチド、またはそれらの相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する前記発明（８）の方法。
（１０）  被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、前記発明（４）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する前記発明（８）の方法。
（１１）  原発性高蓚酸尿症Ｉ型の診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に前記発明（５）のポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
（１２）  被験者から単離した生体試料中に、前記発明（７）の抗体と反応するポリペプチドが存在するか否かを検出する前記発明（１１）の方法。
（１３）  前記発明（２）のオリゴヌクレオチドを標識化したことを特徴とするＤＮＡプローブ。
（１４）  前記発明（２）のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするＤＮＡチップ。
（１５）  前記発明（７）の抗体を標識化したことを特徴とする標識化抗体。
【０００５】
以下、これらの各発明の実施形態について詳しく説明する。なお、本明細書においては、１０１個以上のヌクレオチドの連続配列をポリヌクレオチド、２〜１００個の連続ヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドと定義する。また、３１個以上のアミノ酸連続配列をポリペプチド、２〜３０個の連続アミノ酸配列をオリゴペプチドと定義する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
この出願の発明（１）は、ＡＧＴ遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）の変異ＤＮＡ配列であり、配列番号１のＤＮＡ配列において第７５１位のｔ（チミン）がａ（アデニン）に且つ第７５２位のｇ（グアニン）がａ（アデニン）に塩基置換しているポリヌクレオチドまたはその相補配列である。
なお、配列番号１で示されるＡＧＴ遺伝子のＤＮＡ配列は、GenBankにAccessin No. NM 000030として登録されている。既述したように、本発明に係る異常遺伝子は、この正常（野生型）ＡＧＴ遺伝子のｃＤＮＡの７５１位および第７５２位の２つの塩基が変異したミスセンス変異（missense mutation）に因るものである。
【０００７】
発明（１）のポリヌクレオチドは、例えば、後記の発明（２）のオリゴヌクレオチドをプローブとして、ＰＨ１患者の全ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができ得る。また後記の発明（４）のプライマーセットを用い、ＰＨ１患者のｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲによって単離することもできる。あるいは、野生型（正常）ＡＧＴ遺伝子のｃＤＮＡに、市販のミューテーションキット等を用いて前記の塩基置換を導入することによって取得することもできる。
【０００８】
この出願の発明（２）は、前記発明（１）のポリヌクレオチドの一部であって、上記の置換塩基を含む２０〜１００の連続したＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補配列である。
発明（２）のオリゴヌクレオチドは、公知の方法によって化学的に合成して作製することができる。また、発明（１）のポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断するなどの方法によって作製することもできる。
発明（２）のポリヌクレオチドは、後記の発明（８）のＰＨ１の診断方法等に使用することができる。
【０００９】
この出願の発明（３）は、前記発明（１）のポリヌクレオチドもしくは前記発明（２）のオリゴヌクレオチド、またはそれらの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ）である。ここで、ストリンジェント（stringent）な条件とは、それらのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、染色体由来のゲノムＤＮＡとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。よく知られているように、ストリンジェント条件は、塩濃度、温度、およびその他の条件によって決まり、例えば、塩濃度が低いほど、温度が高いほど、ストリンジェンシー（stringency）は高くなり、ハイブリダイズしにくくなる。塩濃度は、一般に、ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ＋クエン酸三ナトリウム）の濃度を調節することによって調節され、ストリンジェントな塩濃度は、例えば、ＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな温度は、一般に、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より１５〜２５℃低い温度であり、例えば、約３０℃以上である。溶液に有機溶媒（例えばホルムアミド）を加えることにより、温度を下げることができる。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。１つの好ましい例として、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。１つの好ましい例として、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳの条件で、６８℃の温度により洗浄を行う。ストリンジェントな条件については、例えば、J. Sambrookらによる「Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、特に１１．４５節“Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”」に詳述されており、それらの記載を参照することによって容易に適切な条件を使用することができる。
発明（３）のポリヌクレオチドは、例えば、発明（２）のオリゴヌクレオチドをプローブとして、上述したようなストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄処理により、ＰＨ１患者の染色体ＤＮＡから調製したゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。
これらの発明（３）のポリヌクレオチドは、後記の発明（８）のＰＨ１の診断方法において検出対象等となるものである。
【００１０】
この出願の発明（４）は、前記発明（３）のポリヌクレオチドとその相補配列からなる二本鎖ポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ）、または前記発明（３）のポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットである。そしてこれらのプライマーセットは、一方のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号１の置換塩基を含む１５〜３０の連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなっている。他方のプライマーは、配列番号１の置換塩基の５’側または３’側の任意の連続ＤＮＡ配列またはその相補配列とすることができる。
これらのプライマーセットは、それぞれの置換塩基を含む配列番号１に基づいて公知のＤＮＡ合成法により作製することができる。また、プライマーの端部にはリンカー配列等を付加することもできる。
発明（４）のプライマーセットは、後記の発明（８）のＰＨ１の診断方法等に使用することができる。
【００１１】
この出願の発明（５）は、発明（１）または（３）のポリヌクレオチドにコードされるか、または該ポリヌクレオチドの発現によって得られるポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列において、第２５１位のＴｒｐ（トリプトファン）がＬｙｓ（リジン）にアミノ酸置換されているポリペプチドである。
すなわち、既述したように、発明（１）のポリヌクレオチドにおける塩基置換は、ミスセンス変異であり、２個の塩基置換によって正常（野生型）ポリペプチドのアミノ酸が上記のように変異している。
これらのポリペプチドは、ＰＨ１患者の生体試料から公知の方法に従って単離する方法、それぞれの置換アミノ酸残基を含む配列番号２のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは発明（１）のポリヌクレオチド（変異ｃＤＮＡ）を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。これらの発明（５）ポリペプチドは、例えば、後記の発明（１１）のＰＨ１の診断方法の検査対象とすることができる。
【００１２】
この出願の発明（６）は、前記の発明（５）のポリペプチドの一部であって、置換アミノ酸を含む５〜３０の連続したアミノ酸配列を有するオリゴペプチドである。これらのオリゴペプチドは、所定のアミノ酸配列に基づいて化学的に合成する方法、あるいは発明（５）のポリペプチドを適当なプロテアーゼによって消化する方法等によって作製することができる。これらのオリゴペプチドは、例えば、後記の発明（７）の抗体作製のための抗原として使用することができる。
【００１３】
発明（７）の抗体は、前記の発明（６）のオリゴポリペプチドを抗原として作製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。これらの抗体は公知の抗体作製法により作製することができる。また、この抗体は、発明（５）のポリペプチドを特異的に認識することができ、後記の発明（１１）のＰＨ１の診断方法等に使用することができる。
【００１４】
この出願の発明（８）は、被験者がＰＨ１を発症する可能性があるか否かを診断する方法である。すなわち、被験者の生体試料から染色体ＤＮＡを単離し、このＤＮＡ中に、発明（３）のポリヌクレオチドが存在する場合に、この被験者をＰＨ１に関してハイリスクと判定する。ポリヌクレオチドの検出は公知の様々な方法によって行うことができるが、発明（９）または（１０）の方法が好ましい。
【００１５】
発明（９）の方法では、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、前記発明（１）のポリヌクレオチドまたは発明（２）のオリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する。被験者がＰＨ１に関連した遺伝子変異を有している場合には、染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡとポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でもハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは公知の方法によって検出することができ、例えば、発明（１３）のＤＮＡプローブや、発明（１４）のＤＮＡチップを用いて、例えば、ＡＳＯ（allele specific oligomer）法によるハイブリダイゼーションを行うことにより、簡便かつ高精度で行うことができる。
【００１６】
また発明（１０）の方法では、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、前記の発明（４）のプライマーセットを用いて、公知の方法に従いＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）を行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する。被験者がＰＨ１に関連した遺伝子変異を有している場合には、プライマーセットによって規定されるポリヌクレオチドのＰＣＲ産物が得られる。ＰＣＲ産物の分析も公知の方法に従って実施することができる。例えば、正常（野生型）ＡＧＴ遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）の第７４３位から第７５３位には制限酵素Van91Ｉによって認識、切断される「CCANNNNNTGG」に相当する配列があるが、既述のように変異したＡＧＴ遺伝子の対応する部位にはこの配列はないので、このような酵素を用いるＲＦＬＰ（restriction fragment length polymorphism）法により、ＰＣＲ産物の分析を行うことができる。
【００１７】
この出願の発明（１１）も、被験者がＰＨ１を発症する可能性があるか否かを診断する方法であり、被験者から単離した生体試料中に、発明（５）のポリペプチドが存在する場合に、その被験者をＰＨ１に関してハイリスクと判定する。ポリペプチドの存在は様々な公知方法によって行うことができるが、発明（１２）の方法が好ましい。発明（１２）の方法は、発明（７）抗体を用いる方法であって、特に発明（１５）の標識化抗体を用いることによって、簡便かつ高精度の検出が可能となる。標識は、酵素、アイソトープ、蛍光色素等の公知の各種のものを使用することができる。
なお、発明（８）や発明（１１）に従ってＰＨ１を診断するに当たっては、従来からの既知のＡＧＴ遺伝子変異、例えば、既述したようなＡＧＴのｃＤＮＡの第３３位と第３４位の間にシトシンが挿入されpremature stopコドンが出現する変異に基づく同様の方法を併用することにより、ＰＨ１の信頼性の高い診断が確保できる。
【００１８】
以下に、本発明の基礎となった遺伝子変異を確認した研究内容について説明する。研究は、臨床像が異なるＰＨ１の日本人姉妹例でのＡＧＴの分子生物学的および酵素学的検討を行うことを目的として実施した。
方法
発端者の妹、その姉、その家族および健常対照者末梢血より調製したＤＮＡを遺伝子解析の材料とした。患者、その両親より腹腔鏡にて肝臓の一部を生検し、ＡＧＴ酵素活性の測定に使用した。患者および両親のＡＧＴ遺伝子の全エクソンと隣接イントロンをGenBankの情報に基づき、ＰＣＲで増幅し、直接シークエンスを行った。変異と思われる塩基置換は健常対照者１００名のアレルでの検索を行った。解析はインフォームドコンセントを得て行われ、倫理委員会で承認された。
【００１９】
症例
発端者は妹で診断時５才であり、妊娠分娩歴に異常がなく、非血縁の無症状の両親の間に生まれた。新生児期よりおむつに「砂のようなもの」が排泄されることに気付いていたが、放置していた。５才時外陰部痛を機に外尿道孔での結石嵌頓とサンゴ状の腎結石が発見された。７才の姉は、腎結石を含め全く症状は認められなかった。ＧＣ／ＭＳ分析法により姉妹の尿中で蓚酸とグリコール酸が同程度著増しており、ＰＨ１と化学診断した。
【００２０】
成績
まず、生検肝臓中ＡＧＴのアラニンおよびグリオキシル酸に対するミカエリス定数（Ｋｍ）を測定した。病理解剖から得られた正常肝臓を対照とした。アラニンに対するＫｍは対照および両親のＡＧＴでは７．５ｍＭであったが娘達のそれは２５ｍＭであった。グリオキシル酸に対するＫｍは対照および両親では０．３ｍＭであったが、姉妹のそれは５０ｍＭ以上であった。続いて、ビタミンＢ６に対するホロ酵素活性を検討したところ、正常肝は５％がホロ酵素であったのに対し、両親はほぼ５０％、姉妹は９０％以上がホロ酵素であった。すなわち、患者、両親のＡＧＴ活性低下はビタミンＢ６欠乏によるものではないことを示した。ＡＧＴ遺伝子の解析の結果、姉妹ともエクソン１での１塩基挿入ｃ．３３−３４ｉｎｓＣ（第３３位と第３４位の間にシトシンが挿入）とエクソン７での２塩基置換ｃ．７５１Ｔ＞Ａ；ｃ．７５２Ｇ＞Ａ（第７５１位がｔ→ａ、第７５２位がｇ→ａに置換）の複合へテロ接合体であることがわかった。前者はpremature stopをもたらすナンセンス変異Ｑ１２ｆｓ×１６７（グルタミンＱから始まる12個の異常アミノ酸が出現して停止する、全体で１６７個のアミノ酸）であり、後者は２５１位アミノ酸Ｔｒｐのコドンの１，２番目に位置しＴｒｐからＬｙｓへのアミノ酸置換をもたらすミスセンス変異（ｃ．７５１Ｔ＞Ａ；ｃ．７５２Ｇ＞Ａ；ｃ．７５２Ｇ＞Ａ：Ｗ２５１Ｋ）であった。家族のゲノム解析を行ったところ、父親はＱ１２ｆｓ×１６７を、母親と母方祖母はＷ２５１Ｋをヘテロ接合体として有していた。生ずる制限酵素Van91Ｉ切断を用いて、ｃ．７５１Ｔ＞Ａ；ｃ．７５２Ｇ＞Ａ：Ｗ２５１Ｋ変異の検索を１００名の健常対照者のＤＮＡで行ったが、本変異は見出されなかった。
【００２１】
結論
本姉妹のＡＧＴはアラニンに対する親和性が対照に比べ３倍も低く、グリオキシル酸に対する親和性に至っては１７０倍以上も低いことが分かった。すなわち、インビボでは姉妹の酵素は殆ど活性を発揮していないと考えられた。姉妹はともにＡＧＴ遺伝子に父親由来のＱ１２ｆｓ×１６７と、母親由来のＷ２５１Ｋを複合ヘテロ接合体として有していた。既述したように、ｃ．３３−３４insＣ：Q12ｆｓ×１６７はＰＨ１ですでに報告があるが、ｃ．７５１Ｔ＞Ａ；ｃ．７５２Ｇ＞Ａ；ｃ．７５２Ｇ＞Ａ：Ｗ２５１Ｋ変異の報告はない。しかしながら、２５１位のアミノ酸Ｔｒｐは数種の哺乳動物のＡＧＴに保存されている領域に位置していること、さらに健常対照の２００アレルに見出されなかったことから、ｃ．７５１Ｔ＞Ａ；ｃ．７５２Ｇ＞Ａ；ｃ．７５２Ｇ＞Ａ：Ｗ２５１Ｋを、ＰＨ１をもたらす新規のＡＧＴ病因遺伝子異常と判断した。本姉妹は、ＡＧＴに同じ遺伝子異常、同様な酵素学的異常を有し、しかもその結果としての尿中の蓚酸とグリコール酸の排泄が同程度にもかかわらず、臨床的に明らかに異なっており、ＰＨ１の表現型の多様性が分子生物学的、酵素学的に実証された。
【００２２】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、原発性高蓚酸尿症Ｉ型（ＰＨ１）の病因遺伝子となる新規なアラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子と、それを利用するＰＨ１の診断方法を提供するものであり、遺伝子レベルでのＰＨ１の早期診断と治療の発展に資することができる。
【００２３】
【配列表】
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