(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性分子層および／またはそれの付加物を担体の分子に配向して単分子結合させるために、原核微生物の第二細胞壁ポリマーを用い、その際に第二細胞壁ポリマーがポリマー担体構造と機能性分子あるいは分子群との間の結合因子である、該第二細胞壁ポリマーの使用方法において、二次元の結晶質タンパク質層によって形成された分子層が、それに結合する前記第二細胞壁ポリマーの側との反対側に、１つ以上の同じかまたは異なる機能領域を有していることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
二次元の結晶質タンパク質層自身が機能性脂質膜の支持体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単分子結合した分子が疎水性鎖でありそして親水性の第二細胞壁膜ポリマーと両親媒性分子を形成している、請求項１または２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項４】
担体の分子が二次元の結晶質タンパク質層の分子であり、その際に第二細胞壁ポリマーが機能性脂質層への結合因子であり、組み合わされた一つの複合体を形成する、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
機能性脂質層を介して、組み合わされた第二の複合体が鏡像的に互いに結合される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
結晶質タンパク質層が同じかまたは異なるタンパク質分子で構成されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
機能性脂質層が小胞構造を有している、請求項４〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
担体が自己組織化した疎水性の鎖よりなるミセルである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
担体と機能性分子層とよりなる複合体において、機能性分子層の分子が、分離され精製された第二細胞壁ポリマー鎖を介して担体に配向して単分子結合しており、その際に該鎖の末端が機能性分子層の分子に結合させるために官能基が転化されていることを特徴とする、上記複合体。
【請求項１０】
第二細胞壁ポリマー鎖が担体および／または結合すべき分子にレクチン様結合によって係留されている、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
ポリマーマトリックス上に結晶質のタンパク質層が第二細胞壁ポリマーを介して結合している、請求項９または１０に記載の複合体。
【請求項１２】
結晶質タンパク質層に、第二細胞壁ポリマーと反対側で脂質膜または脂質小胞が配置されている、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
結晶質タンパク質層に、第二細胞壁ポリマーと反対側で機能性領域が規則的な間隔および配置で設けられている、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１４】
機能性領域が、互いに相違するが、規則的なパターンで設けられている、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
第二細胞壁ポリマーが、直接的に担体上に適用されている結晶質タンパク質層から突出しておりそして機能性脂質層に結合している、請求項９または１０に記載の複合体。
【請求項１６】
２つの結晶質タンパク質層が機能性脂質層を介して鏡像的に互いに対峙して結合している、請求項１５に記載の複合体。
【請求項１７】
一つのタンパク質層が他のタンパク質層と異なる他のタンパク質分子で構成されている、請求項１６に記載の複合体。
【請求項１８】
小管状物の一方の末端のところで開口を覆うように配置されている、請求項９〜１７のいずれか一つに記載の複合体。
【請求項１９】
担体が疎水性で自己組織化した鎖よりなるミセルである、請求項９〜１８のいずれか一つに記載の複合体。
【請求項２０】
複合体が診断、ドラグ−スクリーニング、高スループットスクリーニングのための特異的な機能性分子の担体として使用される、請求項９〜１９のいずれか一つに記載の複合体。
【請求項２１】
複合体が細胞を特異的に結合させるために、単分子層の状態で使用され、その際にＳＣＷＰが細胞表面で露出されている、請求項９〜２０のいずれか一つに記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は原核微生物の第二細胞壁ポリマーの用途並びに担体と分子層とよりなる複合体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
結晶質細胞表面層（いわゆるＳ−層；“Ｓ”は表面を意味する）は原核微生物（始原細菌および真性細菌）の非常に沢山の表面構造一つである。Ｓ−層は唯一のタンパク質または糖タンパク質（分子量：約５０，０００〜２００，０００）で構成されている。［Sleytr, U.B., P.Messner, D.Pumおよび M.Sara.( 著者)1996 。結晶質細菌細胞表面タンパク質(Crystalline Bacterial Cell Surface Proteins) 。In: Molecular Biology Intelligence Unit. Academic Press, R.G. Landes Company, Austin, U.S.A.; Sleytr, U.B., P.Messner, D.Pumおよび M.Sara. 1999 。結晶質細菌細胞表面層(S- 層)[Crystalline Bacterial Cell surface layers(S-layer)] ：超分子細胞構造からバイオミメテックスおよびナノテクノロジーまで，Angew.Chem.Int. Ed. 38: 1034-1054; Sleytr, U.B. および T.J. Beveridge. 1999 。Bacterial S-layers. Trends Microbiol. 7(6): 253-260 。] 沢山の微生物の分離されたＳ−層（糖）蛋白質は固体担体（例えば珪素ウエファー、ポリマー、金属）上で、水／空気−界面で並びに拡げられた脂質膜およびリボソームのところで懸濁物状態の単分子結晶質格子に自己組織化する能力を有する。Ｓ−層の各孔は均一な大きさおよび形態である。浸透実験で、Ｓ−層が限外濾過領域に鮮明な分子量分離境界を有することがわかった。この性質が、限外濾過膜を製造するのにＳ−層を利用させてもきた（ヨーロッパ特許第０，１５４，６２０号明細書）。
【０００３】
広範囲の予備実験で、多くの桿菌類のＳ−層（糖）タンパク質が拡げられた脂質膜（例えばリン脂質、テトラエーテル脂質および他の両親媒性分子）上で再結晶化し得ることが判っている。この目的のために、脂質を最初に槽中で水／空気−界面でラングミュア（Lugmuir)−技術によって単分子層の状態で拡げる。脂質膜のところでＳ−層（糖）タンパク質を再結晶化するためには、バリヤー間の拡げられた脂質膜を規定された広がり圧に調整するのが有利であり得る。拡げられた脂質膜上でＳ−層（糖）蛋白質を再結晶させるために、溶解されたＳ−層（糖）蛋白質を液面下相に導入し、そこにおいてＳ−層（糖）蛋白質は拡散によるかまたは液面下相の活性混合物によって拡げられた脂質膜に接する。この場合、液面下相のｐＨ−値、イオン濃度およびイオン組成はＳ−層（糖）蛋白質の再結晶化挙動に影響を及ぼし得る。［Sleytr, U.B., P.Messner, D.Pumおよび M.Sara.( 著者)1996 。結晶質細菌細胞表面タンパク質(Crystalline Bacterial Cell Surface Proteins) 。IN: Molecular Biology Intelligence Unit. Academic Press, R.G. Landes Company, Austin, U.S.A.; Sleytr, U.B., P.Messner, D.Pumおよび M.Sara. 1999.結晶質細菌細胞表面層( Ｓ−層) [Crystalline Bacterial Cell surface layers(s-layers)] ：超分子細胞構造からバイオミメテックスおよびナノテクノロジーまで，Angew.Chem.Int. Ed. 38:1034-1054;  Sleytr, U.B. および T.J. Beveridge. 1999 。Bacterial S-layers. Trends Microbiol. 7(6): 253-260 。］
密閉された単分子Ｓ−層の状態での再結晶化は核化種（結晶子）から始まる。この場合、個々の結晶質Ｓ−層領域は、互いに重なりあって生じそして結合して一つの層に一体化するまでの間成長する。Ｓ−層の再結晶化の際に選択された条件次第で二重の層も生じ得るが、その場合には個々の層は内側または外側で結合し合っていてもよい。予備実験で、Ｓ−層が支持する脂質膜が“むき出しの”脂質膜として非常に高い機械的安定性を有することがわかっている。別の予備実験では、Ｓ−層の再結晶化によって脂質膜の機能が悪影響を受けないこともわかっている。例えば脂質膜の特異的伝導性および特異的能力は繋がり合う結合したＳ−層の形成過程で顕著には変化しない[ Sleytr, U.B., P.Messner, D.Pumおよび M.Sara. 1999 。結晶質細菌細胞表面層( Ｓ−層)[Crystalline Bacterial Cell surface layers(s-layers）] ：超分子細胞構造からバイオミメテックスおよびナノテクノロジーまで，Angew.Chem.Int. Ed. 38:1034-1054; [Schuster,B., U.B.Sleytr,A. Diederich, G.Baehr, および M.Winterhalter. 1999 。Ｓ−層で支持した平らな脂質膜の安定性の検査（Probing the stability of S-layer-supported planar lipid membranes.) Eur.Biophys.J. 28 : 585-590; Pum, D.およびU.B. Sleytr.1999。分子ナノ技術における細菌 S- 層の用途(The application of bacterial S-layers in molecular nanotechnology). Trends Biotechnol. 17: 8-12] 。更に官能性分子は S- 層の再結晶化の前にまたは後にも脂質膜中に組み込まれる。この機能性実験は電圧固定(Voltage-Clamp) によっても黒色脂質膜技術(Black-Lipid Membrane Technik)でも実施される。[Schuster,B., D.Pum および U.B.Sleytr 、1998。Ｓ−層で支持されたテトラエーテル脂質膜上での電圧固定の研究(Voltage clamp studies on S-layer supported tetraether lipid membranes) ．Biochim.Biophys.Acta 1369: 51-60.; Schuster, B., D.Pum, O.Braha, H.Bayley および U.B.Sleytr 、1998。Ｓ−層で支持された脂質二分子層の自己組合せα−溶血素細孔（Self-assembledα-hemolysin pores in an S-layer-supported lipid bilayer), Biochim. Biophys. Acta 1370: 280-288 ] 。この場合、α−溶血素( α-HL)の例のところで、これらの七量体細孔( ７つの同一のα−ＨＬ分子よりなるトランス膜孔）が、孔形成性分子が脂質側から持ち上がる時にだけ形成されることを知ることができた。しかしながら限外濾過膜領域にあるＳ−層の分子ふるい効果のためにα−ＨＬ分子はＳ−層格子を通って脂質膜まで突き進むことはできない。これに対して、小さな分子（例えばバリノミシンの様なイオンチャンネル）は両側から持ち上がり、脂質膜中に入り込みそして次いで機能性イオンチャンネルとして電気生理学的方法で測定することができることを知ることができた。単分子−および二分子層脂質膜（他の両親媒性分子、例えばヘキサデシルアミンとの混合物も含む）とＳ−層（糖）タンパク質格子を持つリポソームとの間の相互作用は、従来には広い範囲の生物物理学的方法で研究された（Him, R.,B.Schuster, U.B.SleytrおよびT.M. Bayerl. 1999 。動的光散乱により研究された平らな脂質二分子層の集積運動へのＳ−層タンパク質吸着および- 結晶化の影響（The effect of S-layer protein adsorption and crystallization on the collective motion of a planar lipid bilayer studied by dynamic light scattering). Biophys. J., 77: 2066-2074.[Schuster,B., U.B. Sleytr,A. Diederich, G.BaehrおよびM.Winterhalter.1999 。Ｓ−層で支持した平らな脂質膜の安定性の検査（Probing the stability of S-layer-supported planar lipid membranes.) Eur.Biophys.J. 28: 583-500; Hianik,T.,S.Kuepcue, U.B.Sleytr, P.Rybar, R.KrivabekおよびU.Kaatze. 1999。結晶質細菌細胞表面タンパク質とリポソーム中の脂質二層との相互作用(Interaction of crystalline bacterial cell surface proteins with lipid bilayers in liposomes),音速の研究( A sound velocity study). Colloids Surface A 147: 331-339、; Mader, C.,S.Kuepcue, M.Sara および U.B.Sleytr,1999。熱的または機械的応力に対するリポソームへのＳ−層の安定化作用（Stabilizing effect of an S-layer on liposomes towards thermal or mechanical stress) , Biochim. Biophy. Acta 1418: 106-116.; Gyoervary, E.,B.Wetzer, U.B. Sleytr, A.Sinner, A.OffenhaeusserおよびW.Knoll. 1999 。シラン−、デキストラン−およびＳ−層支持された単分子層および二分子層における脂質の横方向拡散（Lateral diffusion of lipids in silane-,dextran- and S-layer-supported mono- and bilayers.), Laungmuir 15: 1337-1347; Weygand, M.,B.Wezer, D.Pum,  U.B.Sleytr, N.Cuvillier, K.Kjaer, P.B.Howes および  M.Loesche. 1999 。脂質に結合する細菌Ｓ−層タンパク質: X-線反射率および俯角入射拡散の研究(Bacterial S-layer protein coupling to lipids: X-ray reflectivity and grazing incidence diffraction stadies). Biophys. J.76: 458-468;  Wetzer, B.,A.Pfandler, E.Gyoevary, D.Pum. M. Loesche およびU.B.Sleytr. 1998。リン脂質単分子層でのＳ−層再構成（S-layer reconstruction at phospholipid monolayers). Langmuir. 14: 6899-6906.] 。この場合には、Ｓ−層格子の再結晶化によって脂質膜の性質（例えば流動性）および分子配列が実質的に影響を受け得ることがわかった［Guoervary, E.,B.Wetzer, U.B.Sleytr, A.Sinner, A.Offenhaeusser および W. Knoll. 1999 。シラン−、デキストラン−およびＳ−層支持された単分子層および二分子層における脂質の横方向拡散（Lateral diffusion of lipids in silane-,dextran- and S-layer-supported mono- and bilayers.), Laungmuir 15: 1337-1347.］。Ｓ−層で支持された脂質膜は、細胞質膜の外側に細胞壁成分として一つだけＳ−層を持つ各始原細菌（Archaee)の細胞外皮の超分子構造原理に実質的に相応している。しかしながら始原細菌の分離されたＳ−層（糖）タンパク質は脂質膜のところで再結晶させるのが非常に困難であり得るので、他の原核微生物（例えばバシラス類）のＳ−層（糖）タンパク質を使用するのが好ましい。従って製造される複合体Ｓ−層脂質膜は、始原細菌の天然の構成単位を使用しなければならない必要もなしに、細胞境界面（細胞エンベロープ）が始原細菌にならって造られているバイオミメテックス構造である。
【０００４】
本発明者の研究および刊行物から、グラム陽性菌の場合にＳ−層（糖）タンパク質が非常に特殊な相互作用によって下側にある硬い細胞壁層（いわゆるペプチドグリカン含有層）に結合し得ることは公知である。この特殊な結合は明らかにＳ−層タンパク質といわゆる第二細胞壁ポリマー（以下、ＳＣＷＰと呼ぶ）との間でしばしば行われる。ＳＣＷＰはペプチドグリカン層のマトリックスのところで共有結合しそしてそこから（例えばＨＦでの処理によって）分離できそして純粋な状態で得ることができる。色々なＳ−層タンパク質のアミノ酸配列の比較から、ペプチドグリカン含有細胞壁層、特にＳＣＷＰ成分のところでのＳ−層の結合の原因になっている領域が見出された。
【０００５】
Pum.D.および Sleytr. 1999 の“分子ナノ技術における細菌Ｓ−層の用途(The application of bacterial S-layers in molecular nanotechnology) ”、Trends Biotechnol. 17: 8-12 およびSleytr, U.B.およびM. Sara. 1997 。Bacterial and archaeal S-layer proteins: structure-function relationships and their biotechnologial applications.Trends Biotechnol. 15: 20-26 から既に公知の通り、Ｓ−層は脂質膜の上に安定化作用をするが、これら刊行物は、Ｓ−層タンパク質が槽中において液面下の相から、拡がった脂質膜のところまたは黒色脂質膜のところで再結晶化する方法に関する。
【０００６】
ＳＵＭ−支持された脂質膜のこの原理は、機能性脂質膜についての全く新規な用途をももたらすことができた。脂質膜をＳＵＭ上に貼り付ける（例えばLungmuir Blodgett-または Langmuir Schaefer-Technik) かまたはこの上に直接的に組み立てること、即ち最初に脂質膜を槽において拡げることによって製造し、次いでＳ−層タンパク質を脂質膜のところで液面下の相から再結晶化させることは非常に簡単である。ＳＵＭｓを使用することが、例えば医薬物質のスクリーニングの際に膜合体する分子または膜に結合する分子（例えばイオンチャンネル、信号伝達分子）へのそれの影響が必要とされる様に、電圧固定測定技術の原理に従う新規の試験方法を開発することを可能とする。
【０００７】
更に、緩衝溶液が充填された細く延ばされたピペットを（機能性）脂質膜に十分に注意して、正に測定可能な接触が生じるほどまでに接近させる電圧固定技術も公知である。次いでこの伝達膜機能（Transmembranenfunktionen) を電気生理学的に測定する（例えば伝達膜電流の測定）。しかしながらこの十分に確立された方法論は高スループットスクリーニング（研究段階での沢山の物質の試験）のために必要とされる様なパラレル試験には使用されない。
【０００８】
従って従来技術の水準の知識は、Ｓ−層（糖）タンパク質が脂質膜（ラングミュア膜、黒色脂質膜) のところで中間的- または巨視的寸法で溶液から再結晶される、複合のＳ−層脂質膜を製造するための方法である
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、なかでも、脂質膜を安定化させる新規の方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この課題は本発明に従って、（機能性）分子、好ましくは分子層を配向した単分子結合させるためにおよび／または機能性分子を担体の分子に付加するために分離され精製された第二細胞壁ポリマーを用いることによって解決される。これによってＳ−層タンパク質の１つ以上の領域といわゆる第二細胞壁ポリマーとの間の特異的相互作用が超分子構造の製造に利用できる。
【００１１】
このＳ−層膜の製造は既に、多くの国で与えられた特許の対象である（例えばヨーロッパ特許（Ｂ１）第０１５４６２０号明細書）。この方法は、実質的に、多孔質担体、（好ましくは）開放細胞のスポンジ状構造を持つ微細濾過膜、または核微量技術(Kernspurtechnik) （例えば角膜孔−膜（Nuclepore-Membranen)に従って製造された膜にＳ−層断片または細胞壁断片、即ちＳ−層保有始原生物を付加させる方法に関する。互いに密着しＳ−層状態に付加した後に（これは沢山の個別の層で構成されていてもよい）、Ｓ−層格子が（好ましくはグルタルアルデヒドで）内部−および中間分子的に化学的架橋される。化学的架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用する場合には、Ｓ−層膜の化学的安定性を高めるために、生ずるシッフ塩基を専ら好ましくは水素化ホウ素で還元する。こうして製造されるＳ−層膜はＳ−層格子の分子ふるい効果のために限外濾過膜として使用される。以下においてこのＳ−層限外濾過膜について略字“ＳＵＭｓ”を使用する。
【００１２】
機能性脂質膜（または他の造膜性の例えば両親媒性分子よりなる膜）のための担体としてＳＵＭｓを使用することによって、拡げられた脂質膜の上にＳ−層を再結晶化させる上述の方法に比較して技術的におよび用途的に優れた本質的長所が得られる。
【００１３】
ＳＵＭｓ上に（機能性の）脂質膜を適用または製造することは全く色々なやり方で行うことができる。
【００１４】
１．  槽に拡がった脂質膜［ラングミューア−・ブロドゲット（Blodgett）−またはラングミューア・シエーファー技術（Schaefer-Technik）] よりなるＳＵＭｓの浸漬および／または引き上げ（Austauchen) 。拡がったテトラエーテル脂質膜の場合、一度の浸漬または引き上げによって既に“機能性の”脂質膜が製造できるが、例えばリン脂質の場合には二段階( 浸漬工程および引き上げ工程) が必要とされる。
【００１５】
２．Ｓ−層格子のところでの化学的に結合した脂質単分子層の製造。この場合、両親媒性分子の疎水性部分はＳＵＭから離れて存在する。次に第二の脂質膜はラングミューア・ブロドゲット（Blodgett）−またはラングミューア・シエーファー技術（Schaefer-Technik）（上記参照）に相応して適用される。
【００１６】
３．Ｓ−層格子には相応する機能性（例えばビオチニル化部分（Biotinilierung) 、システイン残基、ストレプトアビジン領域）が組み入れられていてもよい。相応するＳＵＭ−表面はこの様にして脂質分子または他の両親媒性分子にて特異的な相互作用が入り込む。この様にして、脂質膜が繰り返し現れる特殊な結合場所に相応してＳＵＭのＳ−層（糖）タンパク質マトリックスに結合しているＳ−層／脂質膜−複合体が製造される。
【００１７】
４．  ＳＵＭの上に脂質膜を適用した後に、場合によっては脂質膜（または両親媒性分子）のヘッド基とＳ−層マトリックスとの共有的な化学架橋を行ってもよい。この架橋反応は好ましくはＳＵＭの多孔質担体を通って（例えば微細濾過膜を通って）架橋剤が浸透する間に行う。
【００１８】
第二細胞壁ポリマーの結合は機能性分子の相応する領域、好ましくは分子層および／または担体の相応する領域によって行われるのが有利であり、それによって一方では正確な局在およびもう一方では機能性分子あるいは分子層の正確な配向も存在することが達成される。この場合に分子、好ましくは分子層または担体の分子へのレクチン様結合を介して第二細胞壁ポリマーの結合を行うことができ、このことは同様に、分子あるいは分子層が担体に結合するための領域あるいはエピトープ（Epitope)の正確な選択を可能とする。
【００１９】
本発明に従う特に有利な用途は、第二細胞壁ポリマーがポリマー担体構造と機能性分子、分子群あるいは分子層との間の結合因子であり、それによってポリマー担体構造に相応する機能性分子を直接的に取り付けることができる。この場合、担体構造は微細濾過膜でもよい。更に分子層は単分子の結晶的に規則正しいタンパク質層の状態で存在していてもよく、それによってタンパク質層の結晶質構造のために一方では鮮明なカットオフ(cut-off) を示す相応するフィルターをもたらすことができそしてもう一方ではタンパク質分子自身に再び機能性分子を直接的にまたは間接的に取り付けることができる。この目的のためには、単分子の結晶的に規則正しいタンパク質層自身が機能性脂質膜の支持体であることが重要であり、それによって例えば高性能濾過(Hyperfiltration) 等に使用することができる非常に安定な複合構造が達成される。更に単分子の規則正しい結晶質タンパク質層がそれに結合する前記第二細胞壁ポリマーの側との反対側に、一つまたは二つの同じまたは異なる機能性領域を備えていてもよく、それによってタンパク質層は別の分子の規則正し結合のための媒介物として使用される。特異的な結合性のために単分子の規則正しい分子は両親媒性を有しそして疎水性鎖並びに親水性の第二細胞壁ポリマーよりなる。これによって水性または非水性相層への付加方向が制御できる。更に担体の分子は単分子の結晶的に規則正しいタンパク質層であってもよく、その際に第二細胞壁ポリマーは組み合わせた複合体の形成下に機能性脂質層の結合因子を生成する。この様に脂質分子はタンパク質層から相応して離され、その際に更にタンパク質層への脂質層の固定が達成される。この場合、機能性脂質層を介して組み合わされた２つの複合体が鏡像様に互いに結合され得る。このことはいわゆるサンドイッチ原理に相応して層を形成することを可能とする。この場合、単分子の結晶的に規則正しいタンパク質層は同じかまたは異なるタンパク質分子で構成され得る。このことは、複合体の外側に異なる結合領域、電荷、機能性分子等が存在することを可能とする。このことが用途分野を著しく拡大させる。
【００２０】
更に機能性脂質層は小胞状構造を有していてもよく、このことが自然界に相応する適切な人造複合体を可能とする。
【００２１】
本発明は、既に挙げた通り、分子層の分子が本発明の用途に相応して、分離され精製された第二細胞壁ポリマー鎖を介して担体に、配向して単分子的に結合しており、その際に上記鎖の末端が関係する分子の所に結合させるために変性されていることを特徴とする、担体および分子層よりなる複合体にも関する。これは、正確に組織化された化学的で機能的に正確に規定された複合体の生成を可能とする。
【００２２】
この場合、第二細胞壁ポリマー鎖は担体および／または結合すべき分子にレクチン様結合によって係留されていてもよく、それによってタンパク質分子の適当な領域に相応する結合が達成されていてもよい。安定した複合体を得るためには、ポリマーマトリックスに単分子の結晶的に配向したタンパク質層が第二細胞壁ポリマーを介して結合されていてもよい。その際に第二細胞壁ポリマーはアンカー並びに方向付けおよび／または意図する分配に役立つ。単分子の結晶的に配向したタンパク質層のところに第二細胞壁ポリマーと反対側に脂質膜または−小胞が配置されていてもよく、これによって別の用途分野も与えられる。更に、単分子の結晶的に配向したタンパク質層のところに、第二細胞壁ポリマーと反対側に機能性領域が規則的な間隔および配列で設けられてもよい。このことは別の機能性分子をタンパク質層に意図的に付加することを可能とする。
【００２３】
機能性分子の色々な種類の結合および分布を得るためには、機能性領域が互いに相違するが、規則的なパターンで設けられていてもよい。
【００２４】
更に第二細胞壁ポリマーは、好ましくは直接的に担体上に適用されている単分子の結晶的に配向したタンパク質層から飛び出しておりそして機能性脂質層を結合させていてもよい。従って、担体上に好ましくは直接的に適用されたタンパク質層のために安定な担体層が得られ、その際に脂質層がタンパク質層への相互作用なしに第二細胞壁ポリマーに結合している。この場合、２つのこの種のタンパク質層は機能性脂質層を介して鏡像的に互いに対峙して結合することができ、それによって安定なサンドイッチ様に結合した複合体が得られる。この場合、一方のタンパク質層がもう一方のタンパク質層と異なるタンパク質分子よりなり、その結果、複合体の両側に異なる結合挙動、領域および機能性が存在する。
【００２５】
上述の公知の電圧固定技術の変形において、複合体が小管状物の一方の末端に開口を大きく開いて配備されていてもよい。公知の開口するピペットに比較して本発明の複合体を有するかゝる小管状物（以下、ＳＵＭ−小管状物と呼ぶ）は膜を妨害することなしに、広がった機能性脂質膜に非常に迅速に接近させることができる。この様に、例えば互いに並んで配置された沢山のＳＵＭ−小管状物が機能性脂質膜の所で測定過程のために同時に使用される。原則として、第一段階で全部のＳＵＭ−小管状物が機能性脂質膜で被覆される測定法を使用することができる。これは、先行する段階で機能性分子を組み入れることによって［Schster,B.,D.PumおよびU.B.Sleytr.1998 。"Voltage clamp studiers on S-layer supported tetraether lipid membrans. Biochim. Biophys. Acta 1369:51-60]、拡げられたテトラエーテル脂質膜中に浸漬することによって行うことができる。第二段階ではＳＵＭ−小管状物は，膜を結合されたかまたは集成させた機能性分子への影響が調べるられる色々な物質が存在する小さな容器（例えば類似の微小滴定プレート）中に沈下させる。この電気生理学的測定は古典的な電圧固定技術に相応して行う。
【００２６】
ＳＵＭｓはＳＣＷＰと結合して巨視的領域における機能性脂質膜のための担体としても役立ち得る。現在のところ脂質膜を全面的に安定化するための匹敵する担体層は存在しない。
【００２７】
更に本発明の複合体は特殊な機能性分子の担体として診断法、医薬ターゲッティング、医薬デリバリー(Drug-Delivery) 、人造ウイルス(Kunstviren)用医薬スクリーニング、高スループットスクリーニング等のために使用することができる。
【００２８】
本発明の用途では、Ｓ−層で被覆されている小胞状構造、例えばリポソームあるいは脂質滴（脂質粒子）も生成される。
【００２９】
更に担体として自己組織化した疎水性の鎖よりなるミセルも使用できる。
【００３０】
図面において複合体の概略的な種々の実施態様を断面図でかつ拡大した寸法で図示する。
【００３１】
図１はＳ−層の基本的な用途である限外濾過膜を図示しており、全ての図中において以下の略字が使用されている：
ＭＦ：微細濾過膜、
Ｓ−Ｌ：Ｓ−層、
ＦＬ：機能性脂質膜、即ち組み入れた膜機能を有する脂質膜、特にトランス          膜機能（例えばイオンチャンネル）、
この様な構造は本発明者の独自の研究で既に従来技術である。
【００３２】
図２は他のポリマーへのＳＣＷＰの化学的な結合およびこの分子と、（スポンジ様構造を持つ）微細濾過膜を製造するための通例のポリマーとの適切な混合物を図示している。（例えば相転化法による）水溶液中での沈降法の場合に、親水性ＳＣＷＰが水性相に飛び出し、一方、それに（共有結合した）ポリマー鎖が密集したポリマー構造中に係留されている。
【００３３】
原則として、ポリマー構造（フィルム、スポンジ状または他の多孔質構造）の表面をＳＣＷＰｓで機能性化するために他の可能性も考えられる。これら全ての方法の場合に、親水性ＳＣＷＰ鎖は、Ｓ−層タンパク質の相応する結合領域との接触を可能とするために、ポリマー構造の表面から十分な密度で飛び出しているべきである。
【００３４】
重合方法の他に化学的結合法も利用することができる。例えばＳＣＷＰの末端に、ポリマー構造の表面の基と反応し得る反応性基を組み入れてもよい。逆にポリマーマトリックス上の予備活性化された基をＳＣＷＰ上で反応性基と反応させることもできる。
【００３５】
図３に相応して、ＳＣＷＰで機能化されたポリマー表面上に、Ｓ−層の（糖）タンパク質の溶液からＳ−層を再結晶化させることができる。この方法はポリマー表面に完全な単分子Ｓ−層被覆をもたらす。天然のＳ−層（糖）タンパク質の他に、組み入れられた特殊な機能を有するＳ−層ヒュージョン・タンパク質（Fusion proteine)（例えばストレプトアビジンのビオチン結合領域、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、抗体−または抗原領域）も再結晶化のために使用することができるので、この方法によってポリマーマトリックスの非常に一様な機能化が達成される（図３参照）。
【００３６】
図４に従うＳ−層ヒュージョンタンパク質を使用する場合、同時に２つ以上の同一であるが、異なった機能化されたＳ−層タンパク質を使用してもよい。それによって、均一のタンパク質基本構造のためにＳＣＷＰ上に均一なＳ−層格子が形成されるが、しかしこれは不連続に間隔を置いて（しかし統計的分布で）異なった結合位置（機能性領域）を有する。
【００３７】
図５は、ＳＣＷＰ、と分子の構造コンセプトにおいて例えばグリコール脂質に相当する疎水性鎖とよりなる両親媒性分子を使用することを図示している。類似する分子が例えば始原細菌(Archaea) の細胞質膜中にも認められる。この場合、特に糖脂質当量の分子の製法を図示している。
【００３８】
図６は天然に産するかまたは完全合成の分子を使用することを図示している。この場合にはこの分子は中心の疎水性部分と２つの親水性領域とで構成されている。
【００３９】
図７は複合体のＳＵＭ／脂質膜を製造するために５図および６図に示した分子を利用することを図示している。図５および図６に概略的に示す両親媒分子の利用は複合体のＳＵＭ／脂質膜を構成する際に広範な変法を可能とする。異なるＳ−層のタンパク質に結合する２つの異なるＳＣＷＰを使用するという基本的な変法が特に優れている。
【００４０】
図８はＳＣＷＰを使用して複合体のＳ−層／機能性脂質膜を製法すること図示している。図８では以下の略語を使用している：
Ａ：    ＡタイプのＳ−層タンパク質、
ＳＣＷＰ−Ａ：タイプＡのＳ−層タンパク質に特異的に結合する第二細胞壁ポ          リマー、
Ｂ：    タイプＢのＳ−層タンパク質、
ＳＣＷＰ−Ｂ：タイプＢのＳ−層タンパク質に特異的に結合する第二細胞壁ポ          リマー。
【００４１】
微細濾過膜上に最初にＳ−層（例えばタイプＡ）を適用する。この工程は実質的に、ＳＵＭｓを製造する上述の方法に相応する。次にＳＵＭ上に（機能性脂質膜の製造に適する；実施例参照）両親媒性分子の単分子層をラングミュ−ア・シェーファーかまたはラングミュア・ブロードゲット技術によって付着させる。ＳＵＭへの単分子層の結合は両親媒性分子のＳＣＷＰ−部分とＳＵＭ上のＳ−層との間での特異的な相互作用によって行われる。ＳＵＭｓ上のＳ−層への脂質単分子層のこの係留は機能性脂質膜の安定性および寿命を本質的に向上させる。
【００４２】
図５に図示した分子に代えて、図６に示した分子も機能性脂質膜の製造に使用することができ、この場合には後者は一段階で機能性脂質膜を製造することを可能とする。これに対して図５に概略的に示す分子を使用した場合には、第二段階で両親媒性分子の別の単分子層を適用しなければならない。この外側層がＳＣＷＰ−部分を有する両親媒性分子を含有する場合には、別のＳ−層のための特異的結合位置として露出したＳＣＷＰ−鎖を利用することができる。この第二のＳ−層は例えば脂質膜上にＳ−層（糖）タンパク質の溶液から再結晶化させることができる。これに代えてＳ−層を最初の段階で水／空気−境界で再結晶化させそして次に初めて脂質膜の上に適用（沈着）させてもよい。
【００４３】
図８に示す超分子層系は一様なまたは異なるＳＣＷＰ−Ｓ層相手を使用して行うことができる。この図においてはタイプＡのＳ−層およびタイプＡのＳＣＷＰ並びにタイプＡのＳ−層およびタイプＡのＳＣＷＰとタイプＢのＳ−層およびタイプＢのＳＣＷＰとが図示されている。
【００４４】
担体に脂質膜を付加するためにいわゆるリポソームヒュージョン技術が色々な場合に使用される。この場合、脂質膜は脂質小胞（いわゆるリポソーム）の状態で提供される。このリポソーム中には好ましくは既に所望の機能性分子が取り込まれている。相応する実験条件の下では脂質小胞は、つながり合った脂質膜を最終的に形成するために、固体担体の表面に接触した際に開放する。
【００４５】
ＤＣＷＰ−系は場合によっては図９に相応して、この小胞融合を促進しそして脂質膜のＳＵＭへの結合を強化するために使用してもよい。
【００４６】
ＳＵＭで支持された（安定化された）機能性脂質膜の、高スループット・スクリーニングのための利用。
【００４７】
原則としてこの用途のためには２つの測定構造が提示される：
ａ）電圧固定−またはパッチ固定法(Patch Clamp Method)
ｂ）黒色脂質膜法(bkack lipid menbrane method)
両方の場合にＳＵＭを利用することが寿命およびそれ故に機能性脂質膜の利用可能性を延長するはずである。
【００４８】
ＳＵＭ小管状物の製造：
図１０に相応してＳＵＭをガラス−または合成樹脂小管状物の末端に、ＳＵＭが張り覆う開口が生じる様に取り付けている。この部分は原則としてパッチ固定- または電圧固定ピペットの開口に相当する：( 機能性) 脂質膜がピペット開口を方持ち式に張り覆っているのでなく、ＳＵＭによって支持されている点が相違する。脂質膜の適用およびそれの機能化は既に上述した種々の方法によって行うことができる。
【００４９】
ＳＵＭ−小管状物を使用する場合の他の長所は、脂質膜の適用後に別のＳ−層を付加または再結晶（図７および図８参照）によって適用できることにある。この追加的Ｓ−層は（更なる）安定化並びに保護機能を満足する。この関係ではＳ−層の鮮明な分子分離境界を指摘する。
【００５０】
ＳＵＭ上の脂質膜の適用後あるいは場合によって行う他のＳ−層の再結晶化の前または後に、Ｓ−層（糖タンパク質）マトリックスおよび脂質膜の内部的および／または中間分子的な化学的架橋を行うことができる。この目的のためには適当な架橋剤を水性相中に導入しなければならない。
【００５１】
ＳＵＭ−小管状物は個々にまたはグループ配置（図１１参照）で使用することができる。グループでの配置は一つの作業段階での脂質膜の適用、および次いで、機能性化した膜への影響が調べられる種々の物質が存在する任意の複数の容器でのパラレル測定を可能とする。ＳＵＭ−小管状物を使用する場合、緩衝溶液またはＨ2 Ｏが充填されたガラス製小管状物中に有効物質を直接的に添加してもよい。更に、小管状物においておよびそれとは別にそれが浸漬される容器中において、場合によって生じる圧力変化によって機能性脂質膜の統合に悪影響を与えることなしに、環境条件（例えばイオン濃度、イオン組成、ｐＨ値、温度）を必要ならば変化させてもよい。冒頭に既に述べた、圧力変化に対するＳＵＭに結び付いた脂質膜のこの安定性が本発明に従って使用する場合に正に特に重要なのである。上述の長所は黒色脂質膜の測定装置にも直接的に適用される。
【００５２】
ＳＣＷＰ−（炭化水素）成分と機能性分子部分との結合体の場合には、炭化水素部分は無傷のＳＣＷＰ、ＳＣＷＰから化学的分解によって製造される部分構造（オリゴ糖断片）またはＳｃｗｐ（オリゴ糖誘導体）の合成製造された部分構造よりなる。
【００５３】
この場合、機能性分子部分は脂質相（例えばリポソーム）または金への結合、固体相、例えばＳ−層）への固定係留または重合性（生じる結合体はコモノマーとして作用する）、別の薬学的効果、さらに組み合わされた機能、例えば脂質相への結合と免疫刺激作用（脂質−Ａ−誘導体、ＦＫ−５６５タイプのリポペプチド）または最終的には検出性（例えば蛍光）を有する。
【００５４】
炭化水素部分と機能性部分との連結は種々の方法で化学的に行うことができる。即ち、
還元的アミン化（シッフ塩基の生成、続いての第二アミンへの還元）、
チオ尿素の形成または
アミドの形成。
【００５５】
還元的アミン化は、炭化水素部分のカルボニル成分のところで、ＳＣＷＰからの還元性リン酸エステルの開裂による還元性ＳＣＷＰの形成、硝酸での部分的脱−Ｎ−アシル化および脱アミン化によるアンヒドロマンノース（アンヒドログルコース？）−末端基の形成、ウロン酸含有ＳＣＷＰのβ−離脱によるまたは過ヨウ素酸塩での分解（場合によっては部分的分解）によって行うことができる。官能性部分のアミノ成分ところでの還元的アミン化は、ホスファチジルエタノールアミン(Phosphatidylethanolamin) により、エチレンジアミン、プロピレンジアミンあるいはＳＣＷＰの還元性末端でのアミノ基導入により、アリルアミン、アミノメタクリル酸およびそれの誘導体、不飽和基を含有する他のアミノ化合物（アルドリッヒ−カタログ）またはＳ−層（ε−リシン−ＮＨ2 −基）により行うことができる。炭化水素部分のアミノ基は、カルボニル成分とエチレンジアミンまたは他のジアミン化合物との反応によって生じ得る。官能性部分のカルボニル成分はＳ−層のまたは多糖類のスミス（Smith)生成物として得ることができる。
【００５６】
チオ尿素の生成はＦＩＴＣ（フルオレスセイン−イソチオシアナート）によりまたは第一アミンをチオホスゲンとの反応によってイソチオシアナートに転化することによて行うことができる。
【００５７】
アミドの生成は、炭化水素（ＳＣＷＰ）のカルボン酸部分のところで臭素酸化ラクタル- ラクトンにより、還元的アミン化と同様にアミノ成分のところで、炭化水素（ＳＣＷＰ）のアミノ成分のところでカルボニル成分とエチレンジアミンまたは他のジアミン化合物との反応による生成によっておよび官能性分子のカルボン酸部分のところで長鎖脂肪酸および分岐した脂肪酸の活性エステルとして、アスパラガス酸(Spargelsaere)またはリポン酸(Liponsaere)の活性エステルとして並びにメタクリル酸（誘導体）および他の不飽和カルボン酸の活性エステルとして行うことができる。
【００５８】
【実施例】
グループ１：第二細胞壁ポリマーの変性
第二細胞壁ポリマー（ＳＣＷＰ）を種々桿菌類のペプチドグリカン含有小胞から４８％濃度フッ素酸（ＨＦ）を使用してRies等の処方(1997)に従って抽出し、ゲルクロマトグラフィーによって精製し、溶出液を蒸留水で透析し、内部透析物を−２０℃で凍結しそして凍結乾燥する。Ｓ−層タンパク質およびＳＣＷＰを持つ微生物は以下の通りである: バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus) ＰＶ７２／ｐ６（Sara等、1996) 、SbsA(Kuen 等、1994) 、タイプＡのＳＣＷＰ（Egelseer等、1998);バシラス・ステアロサーモフィラス ATCC 12980( Egelseer 等、1996) 、SbsC( Jarosch 等、2000) 、タイプＡのＳＣＷＰ（Egelseer等、1998);バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus) ＰＶ７２／ｐ２（Sara等、1996) 、SbsB(Kuen 等、1997) 、タイプＢのＳＣＷＰ（Ries等、1997;Sara 等、1998);バシラス・スフェリカス(B.sphaericus) CCM 2177 （Sara等、1989) 、SbpA、タイプＣのＳＣＷＰ(Ilk等、1999);テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカス (Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus) L 111- 69 , （Sara等、1988) 、Stta、タイプＤのＳＣＷＰ。個々のＳ−層タンパク質の性質および相応するＳＣＷＰの正確な一覧表を以下の表１に示す：
【００５９】
【表１】
0004122157.tif 000002
【００６０】
実施例１：ポリマー鎖の潜在アルデヒド基（還元性末端）の遊離アミノ基への            転化
タイプＡ、Ｂ、ＣおよびＤのＳＣＷＰの還元性末端（潜在アルデヒド基）を変性するために以下の処置を行う：１０ｍｇの凍結乾燥物質を２ｍＬのカルバゾールヒドラジド飽和溶液（ｐＨ６．２）に溶解する。次いで２００μＬのナトリウムシアノホウ化水素（ＮａＢＨ3 ＣＮ：２０ｍｇ／ｍＬ蒸留水）を添加し、１００℃で１５分、次いで９０℃で１６時間培養（inkubiert)する。過剰の試薬を除くために蒸留水で２４時間透析し、試料を−２０℃で凍結させそして凍結乾燥する。遊離アミノ基を測定するためにそれぞれ１ｍｇのＳＣＷＰを２ｍＬの５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）に溶解し、そして１００μＬのブチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル［ＢＯＣ−Ｌｅｕｓｅ；３．５ｍｇ／ｍＬ（１００％濃度エタノール）］を添加する。反応混合物を１８時間２０℃で撹拌し、次いでエタノールと蒸留水との３０／７０容量比の混合物に対してそして次に蒸留水で透析する。内部透析物を次いで凍結乾燥しそして０．５ｍｇの凍結乾燥物質を６ＮのＨＣｌで１１０℃で６時間、アミノ酸およびアミノ糖分析（アミノ酸分析器のBiotronik;Maintal, D) に関して加水分解する。グルコースアミンとロイシンとの比からポリマー鎖の変性度を決めることができる。この変性度は全てのＳＣＷＰについて＞９５％であった。
【００６１】
実施例２：ＳＣＷＰ中に導入されたアミノ基のチオール基への転化
ＳＣＷＰ中に導入されたアミノ基を転化するために、実施例１で変性された５ｍｇのＳＣＷＰを５ｍＬの０．２５Ｍ濃度トリエタノールアミン−ＨＣｌ−緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解する。４ｍｇの２−イミノチオラン（４−メルカプトブチルイミダート）の添加後に、この溶液を窒素雰囲気で３７℃において２時間培養し、次いで試薬を除くために、脱気された蒸留水で１８時間、４℃で透析する。内部透析物を次いで凍結させそして凍結乾燥する。導入されたチオール基の数はエルマン(Ellman)(1959)の方法に従って測定する。アミノ基が定量的にチオール基に転化できることがわかる。
【００６２】
実施例３：導入されたアミノ基のビオチンでの変性
遊離アミノ基（実施例１参照）を変性するために、タイプＡ、Ｂ、ＣおよびＤの５ｍｇの凍結乾燥されたＳＣＷＰを２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、０．５ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（シグマ）を添加する。変性は Pierce 社によって推奨される処方に従って行う。過剰の試薬を除くために、蒸留水で１８時間、４℃で透析し、内部透析物を−２０℃で凍結させそして凍結乾燥する。
【００６３】
実施例４：導入されたアミノ基の活性化
導入されたアミノ基の活性化するために実施例１からの５ｍｇの凍結乾燥物質をｐ−フェニレンジアミンの５００μＬの溶液［１０ｍｇ／ｍＬ（蒸留水）］に溶解する。次いで１００μＬのＮａＢＨ3 ＣＮ−溶液［２０ｍｇ／ｍＬ（蒸留水）］を計量供給し、１００℃で１５分、次いで９０℃で１６時間培養する。次に試薬を、蒸留水に対する透析（１８時間、４℃）によって除くかまたは抽出剤として０．１ＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．８）を用いて Superdex S75-カラムで精製することによって選択的に除く。ＳＣＷＰｓ中に導入されたアミノ基のジアゾ化を Manjon(1985) によって提案された方法に従ってＮａＮＯ2 ／ＨＣｌを用いて行う。ジアゾ化のためにｐ−フェニレンジアミンで変性した５ｍｇのＳＣＷＰを、２部のＮａＮＯ2 溶液（蒸留水中４％濃度）と５部の２ＮのＨＣｌとの予め冷却された３５μＬの混合物中で４℃で１時間撹拌する。過剰の試薬を蒸留水での透析（４℃、４時間）によって除き、そしてこのジアゾ化ＳＣＷＰ含有溶液を直ちに遊離アミノ基を含有する物質と接触させる。
【００６４】
実施例５：ＨＦ抽出された天然のおよび化学変性されたＳＣＷＰの生物学的活            性の実証
冒頭に挙げたＳ−層タンパク質と色々なタイプのＳＣＷＰとの間の特異的結合を実証するために、“Surface Plasmon Resonance Technique ”（SPR ）を使用する( 装置: Biacore 2000, Biacore, Uppsala, スエーデン) 。Ｓ−層タンパク質を組み合わされていないモノマーおよび／またはオリゴマーとして水溶液の状態で１００μｇ／ｍＬ（蒸留水）の濃度で予備活性化されたカルボキシ−デキストラン−金−チップ上に固定する。共鳴装置はチップの表面が約７０％までＳ−層タンパク質で覆われており、その際に使用された方法のためにサブユニット（Subeinheiten) の固定化が統計的配向で行われることがわかる。例えば、バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus) ＰＶ７２／ｐ２のＳ−層タンパク質ＳｂｓＢ、エシェリキア・コリ(Escherichia coli ）での組み替え製造されたＳ−層タンパク質（ r SbsB32-920 ；野生型菌株の成熟した SbsB に相当する）およびＮ−末端短縮型（ r SbsB208-920  ；三つのＳＬＨ−モチーフが欠ける）を用いる実験である。吸着曲線によって、チップ上への固定化がわかる。  SbsBおよび r SbsB はＢタイプのＳＣＷＰ［濃度範囲１〜１００μｇ／ｍＬ（５０ｍＭ濃度のＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液）、ｐＨ７．２］が特異的に認められる；
r SbsB258-920（＝Δ３ＳＬＨ−モチーフ）はタイプＢのＳＣＷＰに対して親和性を有していない；
SbsBおよび r SbsB32-920 は実施例１〜４に従って変性されたタイプＢのＳＣＷＰに対して天然のタイプＢのＳＣＷＰに対してと匹敵する親和性を有している；
ＨＦで抽出されたSbsBおよび r SbsB32-920 は、リゾチームで消化したペプチドグルカンに結合しない。
【００６５】
比較実験をＳ−層タンパク質 SbsA 、 SbsC および r SbsC31-1099を用いておよびタイプＡのＳＣＷＰを用いて、並びに SbpA 、r SbpAを用いておよびタイプＣのＳＣＷＰと SttA を用いておよびタイプＤのＳＣＷＰを用いて実施する。いずれの場合にもそれぞれのＳ−層タンパク質とそれに関係するＳＣＷＰとの間に特異的結合がもたらされる。
【００６６】
グループ２の例：変性されたＳＣＷＰｓが固体担体の分子に結合してＳ−層タンパク質の配向した単分子結合をもたらす。
【００６７】
実施例６：固体担体としての微細濾過膜（ＭＦ）の使用
担体として平均孔径０．４μｍおよび１４ｍｍの直径を持つＭＦ（Pall Carboxydyne) を使用する。遊離カルボキシル基を活性化するために、ＥＤＣの溶液［１０ｍｇ／ｍｌ（蒸留水）、ｐＨ４．７］にＭＦを２０℃で１時間入れ、次いで氷冷した蒸留水で３度洗浄する。タイプＣのＳＣＷＰを共有結合させるために、実施例１に記載で変性された５ｍｇの物質を５ｍＬの蒸留水に溶解し、その際にこの溶液のｐＨ値を０．０１ＮのＮａＯＨで９．０に調整する。２０℃で４時間培養した後に、ＭＦを取り出しそして５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液（ｐＨ７．２）で５度洗浄する。次いでＭＦをSpbA- タンパク質溶液［１００μｇ／ｍＬ（１０ｍＭのＣａＣｌ2 −溶液）］に入れそして２０℃で６時間培養する。未結合のＳ−層タンパク質を除くために、ＭＦを１０ｍＬの５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液（ｐＨ７．２）で５度洗浄しそして１ｍｍ2 の大きさの切片に切断し、これを１００μＬのＳＤＳ−溶液（ドデシル硫酸ナトリウム；蒸留水中１０％濃度）を用いて１００℃で１０分間抽出処理する。次いで２５μＬの透明な抽出液を７５μＬのサンプル溶液（Laemmli 、１９７１）と混合し、１〜１０μＬのこの混合物をＳＤＳ−ゲル（１０％濃度分離ゲル）に適用する。この試料のタンパク質バンドの強さ（ＳＤＳ−ゲル上のＳｐｂＡの分子量１２７，０００）および相応するＳｐｂＡ−標準との比較によって、結合したＳ−層タンパク質の量を８０〜１００μｇ／ｃｍ2 （ＭＦ）と査定することができる。このことは製造元によって与えられた、タンパク質のための高多孔質ＭＦの最大の結合能力に相当する。
【００６８】
実施例７：固体担体としての酸化珪素ウエファー（ＳＯＷ）の使用
３×５ｍｍの大きさのＳＯＷをアミノシラン（蒸留水中５％、ｐＨ３．５）の５００μＬの溶液に３７℃で３０分培養する。蒸留水およびエタノールで５度洗浄した後に、シラン化されたＳＯＷを１１０℃で１５分乾燥し、次いでｍ−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステルの溶液（スルホ−ＭＢＳ、Pierce; １５０μｇ／ｍＬ（０．１Ｍ濃度のリン酸ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ７．０）中で３７℃で２時間予備活性化し、そして蒸留水で洗浄する。（実施例２に記載した様な）変性されたタイプＢのＳＣＷＰを結合させるために、１ｍｇの凍結乾燥物／ｍＬ（０．１Ｍ濃度のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を溶解し、そして５００μＬをＳＯＷに適用する。Ｎ2 雰囲気で２０℃で２時間培養した後にこの小板状物を０．１Ｍ濃度のリン酸ナトリウム緩衝液および蒸留水で洗浄し、配向結合させるためにSbsBまたは r SbsB ［１００μｇ／ｍＬ（５０ｍＭ濃度のＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝液；ｐＨ７．２］を供給し、そしてタイプＢのＳＣＷＰで機能化されたＳＯＷをこの溶液中で２０℃で４時間培養する。ＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液で洗浄することによって過剰のＳ−層タンパク質を除き、ＳＯＷをＡＦＭ中で試験しそして傾斜したＳ−層格子の配向が測定される。SbsBおよび r SbsB がサブユニットの内側（３ＳＬＨ−モチーフであるＮ−末端領域）と結合していることがわかる。ＳＯＷｓの沢山の実験で、SbsBがタイプＢのＳＣＷＰの不存在下に外側と結合することが知られている（Neubauer等、2000) 。従ってS-層のサブユニットのＳＯＷへの配向結合は固体担体に共役結合したタイプＢのＳＣＷＰを介して行われる。SbsBの代わりに組み換え製造されたSbsB- ストレプトアビヂン(Streptavidin)- ヒュージョンタンパク質も使用できる。
【００６９】
実施例８：固体担体としての酸化珪素ウエファー（ＳＯＷ）の使用
チオール基の導入のために、３×５ｍｍの大きさのＳＯＷを３−メルカプトシランの溶液（５０％濃度アセトン中７％）中に３７℃で３０分置く。５０％濃度アセトンで５度洗浄した後に、ＳＯＷを１１０℃で１５分にわたって窒素雰囲気で乾燥する。チオール基を活性化するために、２，２’−ジピリジルジスルフィッド［５ｍｇ／ｍＬ（１０％濃度エタノール）］の溶液５００μＬをＳＯＷに適用する。培養時間は２０℃で２時間である。ＳＯＷを取り出した後に、１０％濃度エタノールおよび蒸留水で多数回洗浄しそして次にタイプＡのＳＣＷＰの５００μＬの溶液［３ｍｇ／ｍＬ（蒸留水）；実施例２に記載した通り変性］中で２０℃で６時間培養する。過剰のタイプＡのＳＣＷＰを除く為に、このＳＯＷを蒸留水および５０ｍＭ濃度のリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）で何度も洗浄する。配向結合させるために、タイプＡのＳＣＷＰが付着したＳＯＷを以下のＳ−層タンパク質型の溶液［１００μｇ／ｍＬ（５０ｍＭ濃度のＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝液），ｐＨ７．２］に８時間にわたって入れておく：SbsC( 野生型タンパク質) 、r SbsC31-1099 、r SbsC258-1099およびr SbsC342-1099。後者の二つの形はタイプＡのＳＣＷＰの原因になるＮ−末端結合領域（Jarosch 等、2000) が欠けている。ＳＯＷは種々のＳ−層タンパク質型と一緒に培養した後にＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液および蒸留水で洗浄し、次いでＡＦＭで試験する。Ｓ−層タンパク質 SbsC により形成される傾斜したＳ−層格子のために、結合側を明瞭に測定することが可能である。バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)  ATCC 12980 の無傷の細胞または細胞壁破片の様なベースベクター自体の配向を有することがわかる。Ｎ−末端の短縮された r SbsC-型の場合には、ＡＦＭで格子構造を検知することができない。
【００７０】
実施例９：固体担体としてのＭＦの使用
実施例１に記載した様に変性されたタイプＡのＳＣＷＰをカルボジイミドで活性化されたＭＦと結合させる（実施例６参照）。以下の形のSbsCを１５０μｇ／ｍＬ（５０ｍＭ濃度のＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液；ｐＨ７．２）の濃度で供給し、そして１４ｍｍの直径を有する円盤状膜を２０℃で８時間培養する：r SbsC31-1099 、r SbsC258-1099、r SbsC342-1099、r SbsC31-844、r SbsC31-860、r SbsC31-880、r SbsC31-900、r SbsC31-920および SbsC 。培養後にＭＦを５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液（ｐＨ７．２）で洗浄し、１ｍｍ2 の大きさの粒子に切断し、ＳＤＳ−溶液で抽出しそしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験する（実施例６参照）。相応する標準系列のために、完全なＮ−境界を誤解させるそれぞれの状態の結合量は８０〜１００μｇ／ｃｍ2 （ＭＦ）で評価することができる。これに対してr SbsC258-1099およびｒSbsC342-1099  の場合にはタイプＡのＳＣＷＰで機能化されたＭＦへの結合が生じない。種々の短縮形態を使用することが親和性研究の結果を証明し（Egelseer等、1998; Jarosch 等、2000) そしてＳＰＲ−測定が専らＮ−境界はＳＣＷＰとの相互作用に原因することを証明している。
【００７１】
グループ３の例：ＳＣＷＰからの糖脂質（ＧＬ）の合成
実施例１０：あらゆる種類のＳＣＷＰからのＧＬ
凍結乾燥した天然のＳＣＷＰｓを蒸留水に溶解し［１０ｍｇ／ｍｌ（蒸留水）］そしてジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン［ＤＰＰＥ；２０ｍｇ／４００μＬ（クロロホルム：メタノール＝１：１）］の溶液と混合する。固定された反応小管状物中での４時間にわたる６０℃での培養の後に、この溶液に４ｍｇのＮａＢＨ3 ＣＮを添加しそして培養(Inkubation)を６０℃で１６時間継続する。生じるＧＬをクロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５）によって精製する。カラム溶出液をグルコースアミンおよびリン酸塩で検査する。両方の成分を含有するそれぞれのフラクションを精製しそして凍結乾燥する。
【００７２】
実施例１１：あらゆる種類のＳＣＷＰからのＧＬ
還元性末端を有するＳＣＷＰの代わりに、遊離チオール基を含有する実施例２に従って変性したＳＣＷＰｓを使用する。脂質成分としてＤＰＰＥを使用する。ＳＣＷＰｓを活性化するためにそれぞれ、１ｍＬの５０ｍＭ濃度リン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）にそれぞれ５ｍｇを溶解し、そして１ｍｇのスルホ−ＭＢＳを添加する。３７℃で２時間培養した後に反応混合物をＤＰＰＥ溶液［５００μＬのクロロホルム：メタノール（１：１−容量比）中３ｍｇ］と混合し、そしてこの混合物を撹拌下に２０℃で１６時間培養する。ＧＬｓを、実施例１０に記載した様に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５−カラムによってゲルクロマトグラフィー法で精製する。
【００７３】
グループ４の例：リポソームを製造するためにおよびＳ−層タンパク質を配向結合させるためにＧＬを使用
実施例１２：リポソーム中へのＧＬの組み入れの確認
ＤＰＰＣ、コレステリン、およびタイプＣのＳＣＷＰからの実施例１０または１１に従うＧＬを１０：５：４のモル比で含有するリポソームを、 Mader等(1999)によって提案された方法にしたがて製造しそして出発成分をゲルクロマトグラフィーで精製する。タイプＢのＳＣＷＰの親水性鎖がリポソームの表面に露出されているかどうかを確認するために、隣位の水酸基だけが攻撃される過ヨウ素酸塩酸化反応を実施する。この反応に使用されるリポソームは２μｍｏｌ／ｍＬ（０．２Ｍ濃度酢酸ナトリウム緩衝溶液；ｐＨ４．５）のＤＰＰＣ−濃度に相当する。この懸濁液に、２０ｍＭの最終濃度が達成されるような量の過ヨウ素酸ナトリウムを添加する。この反応混合物を暗所で撹拌下に２０℃で１時間培養する。遠心分離処理しそして０．２Ｍ濃度の炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８．２）でリポソームを２度洗浄した後に、これを２ｍＬのフェリチン溶液［１ｍｇ／ｍＬ（０．２Ｍ濃度炭酸水素ナトリウム；ｐＨ８．２］中で培養する。次いでリポソームを炭酸水素ナトリウム溶液で何度も洗浄する。透過型電子顕微鏡での検査のために、試料を陰画対比し並びに超薄切片用に埋め込む。陰画対比されるプレパラートでは、リポソーム表面がフェリチンで完全に覆われていることが判り、超薄切片では、リポソーム表面にフェリチンの単分子層が確認できる。過ヨウ素酸塩酸化反応の後、タイプＢのＳＣＷＰはもはや生物学的活性がないが、遊離アルデヒド基が露出したアミノ基を持つ異分子と共有結合するために用いることができる。
【００７４】
実施例１３：Ｓ−層タンパク質 SbsB の配向再結晶化
ＤＰＰＥおよびタイプＢのＳＣＷＰよりなるＧＬ（実施例１０参照）を含有する実施例１２に記載のリポソームを、Ｓ−層タンパク質 SbsB の配向再結晶のために使用する。ＤＰＰＥおよびコレステロールを含有するリポソームに SbsB を外側で結合させ、タイプＢのＳＣＷＰのための結合領域を持つこのＮ−境界が外部媒体中に向けられる（Mader 等、1999) 。ＤＰＰＥおよびタイプＢのＳＣＷＰよりなるＧＬを含有するリポソームの場合には、全部で４μｍｏｌのＤＰＰＥ含有量を有する２ｍＬの懸濁液を２ｍＬの SbsB-溶液［１ｍｇ／ｍｌ（５０ｍＭ濃度ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝溶液），ｐＨ７．２］と一緒に２０℃で６時間培養し、過剰のＳ−層タンパク質を除くためにこの懸濁物を遠心分離処理し、リポソームを５０ｍＭ濃度ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．２）で洗浄しそしてプレパラートを−８０℃での凍結乾燥およびＰｔ／Ｃでの傾斜陰影付け（Schraegbeschattung) の後に透過型電子顕微鏡で検査する。Ｇｌ含有リポソームの場合には鮮明なＳ−層格子の滑らかな外側が露出されるが、ＤＰＰＥ−コレステロール−リポソームの場合には粗い内側が確認できることがわかる。
【００７５】
実施例１４：ＤＰＰＣ／コレステロール／ＨＤＡ−含有リポソームのＳＣＷＰでの変性
リポソームをMader 等、1999によって提案される通り製造する。実施例２の所に記載した、２−イミノチオランで変性したタイプＣのＳＣＷＰを、リポソーム表面の機能化のために使用する。この理由で、５μｍｏｌのＤＰＰＣ濃度に相当するリポソームを３ｍＬの０．２ｍＭ濃度リン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、そして２ｍｇのスルホ−ＭＢＳを、ＨＤＡの遊離アミノ基を活性化させるためにこれに添加する。２０℃で２時間培養した後に遠心分離処理し、リポソームをタイプＣのＳＣＷＰの２ｍＬの溶液［１．５ｍｇ／ｍｌ（リン酸ナトリウム緩衝溶液）；ｐＨ７．０；実施例２に従って変性されている］中に懸濁させそして２０℃で１８時間培養する。ＳＣＷＰの固定は、実施例１２に記載した様に過沃素酸塩酸化反応およびフェリチンの固定によって確認される。Ｓ−層蛋白質 SbsA の再結晶化を実施例１３の工程と同様にして実施する。ＳｂｐＡ−蛋白質の配向結合が、凍結乾燥されそしてＰｔ／Ｃを蒸着したプレパラートを電子顕微鏡で見ることで確認される。
【００７６】
実施例１５： r SbsB-ストレプトアビジン- ヒュージョン蛋白質の使用
E.coli中で C- ターミナル組み換えで製造されたSbsB- ストレプトアビジン- ヒュージョン蛋白質（４ｍｇの凍結乾燥物）を、５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で２ｍＬの６Ｍのグアニジン塩酸塩に溶解し、０．８ｍｇのストレプトアビジンを添加しそしてこの溶液を２０℃で１時間、蒸留水で透析する。内部透析物を取り出した後に、４０，０００ｘｇで遠心分離処理しそして可溶性の r SbsB-ストレプト(4）を含有する透明な上澄液を１２０μｇ／ｍＬ（０．２  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液）（ｐＨ７．２）の蛋白質濃度に調整する。１ｍＬの蛋白質溶液を次に、実施例１３に従って製造された１ｍＬのリポソーム懸濁液と混合し、そしてこの試料を２０℃で２時間培養する。遠心分離処理した後にリポソームを０．２ＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液（ｐＨ７．２）で２度洗浄し、最後にビオチニル化された(biotinliern) 人間のＩｇＧと一緒に培養しそしてMader 等(2000)によって開発された処方に従って結合を検査する。ビオチニル化された人間のＩｇＧの結合はＳ−層外側で露出したストレプトアビジン残基によるだけで可能である。所望の配向は（Ｓ−層内側にあるＮ−境界上での結合）タイプＢのＳＣＷＰがＨＤＡに共有結合したリポソームについてのみ観察される。
【００７７】
グループ５の例：脂質二重層の構造
実施例１６：固体表面として珪素ウエファーとの管状蛋白質の脂質二重層
ＳＯＷ（３×５ｍｍ）に、メルカプトシランでシラン化すること（実施例８参照）によってチオール基を導入し、これに、異種二官能性架橋剤としてのスルホ- ＭＢＳによって実施例1 に従って変性されたタイプＡのＳＣＷＰ［１ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ濃度リン酸カリウム緩衝溶液；ｐＨ７．０］を結合させる。リン酸塩緩衝溶液および蒸留水でのＳＯＷの徹底的な洗浄の後に、SbsA- 蛋白質の５００μＬの溶液［１００μｇ／ｍＭ（５０ｍＭ濃度ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝溶液；ｐＨ７．２］を適用し、２０℃で６時間培養し、緩衝溶液で洗浄しそして単分子層として存在するSbsA- 蛋白質をグルタルアルデヒド（５０ｍＭ濃度リン酸カリウム緩衝溶液中０．５％；ｐＨ７．２］で２０℃で２０分架橋させる。次いでSchuster等(1998)によって提案された方法に従ってＤＰＰＥよりなる二分子層を、α- 溶血素またはバリノマイシンを挿入することによって(Schuster 等, 1998 a,b) 適用する。
【００７８】
実施例１7 ：固体担体としてのＳ−層−限外濾過膜（ＳＵＭ）の使用
ＳＵＭ−円盤（直径２５ｍｍ）を、Ｓ−層外側だけを露出する様に限外濾過セル中にはめ込む。Ｓ−層蛋白質の遊離カルボキシル基をＥＤＣ−溶液［６ｍｇ／ｍＬ（蒸留水）；ｐＨ４．７］の添加によって２０℃で８０分活性化し、膜表面を氷冷された蒸留水で３度洗浄しそして次に実施例１に従って変性されたタイプＡのＳＣＷＰの２ｍＬの溶液［１ｍｇ／ｍＬ；ｐＨ９．０］を、Ｓ−層外側に共有結合させるために適用する。２０℃で５時間培養した後にこのＳＵＭを５０ｍＭ濃度ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．２）で３度そして蒸留水で３度洗浄し、最後にSbsA- 蛋白質の溶液［１００μｇ／ｍＬ（５０ｍＭ濃度ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝溶液）；ｐＨ７．２］で２０℃で５時間培養する。膜円盤を緩衝溶液で洗浄した後に一部を粉砕し、そして結合したSbsA- 量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定するためにＳＤＳ−溶液で抽出処理する。平行するプロセスで製造されるSbsA- ＳＣＷＰ−ＳＵＭを、Ｓ−層蛋白質を安定化させるために（実施例１６に記載されている様に）グルタルアルデヒドで架橋させ、そしてＤＰＰＥ膜および必須の膜蛋白質（例えばα−溶血素）で被覆するために使用する。
【００７９】
実施例１８：ＳＵＭへのＧＬの共有結合
ＳＵＭの使用および実施例１０または１１に記載の、タイプＣのＳＣＷＰとＤＰＰＥよりなるＧＬでの被覆。次いでタイプＣのＳＣＷＰで機能化されたＳＵＭを SbpA-蛋白質の溶液［５０μｇ／ｍＬ（１０ｍＭ濃度ＣａＣｌ2 ）］と一緒に２０℃で６時間培養しそしてＳＵＭ表面を１０ｍＭ濃度のＣａＣｌ2 溶液で徹底的に洗浄する。 SbpA-蛋白質の配向した単分子結合を確認するために、このＳＵＭを透過型電子顕微鏡での検査並びに凍結乾燥に付し、超薄切片のために使用する。四角形の格子を有する密集した単分子層が存在し、Ｓ−層格子の滑らかな外側が露出していることが分かる。
【００８０】
グループ６の例：ＳＣＷＰ含有コポリマーの製造
実施例１９：アクリルアミドの使用下でのコポリマーの製造
１ｍＬの蒸留水当たり実施例１に従って変性された２０ｍｇのタイプＣのＳＣＷＰ、６．８ｍｇのアクリルアミドおよび３μＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを含有する溶液を水流ポンプで３０分脱気処理する。アンモニウムペルオキソジスルファート（１ｍｇ）の添加後に４℃で１８時間反応させる。次いで生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０で分離し（２．６×１００ｃｍ、０．０１Ｍ濃度炭酸水素ナトリウム）、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２によって脱塩処理しそして凍結乾燥する。ＳＣＷＰの含有量はアミノ糖−分析によって測定される。
【００８１】
実施例２０：ポリビニルアルコールの使用下でのコポリマーの製造
ポリビニルアルコールの溶液（ＰＶＡ；蒸留水中３％濃度）を製造しそして１ｍＬのこの溶液に２０ｍｇの天然タイプＡのＳＣＷＰを添加する。次いで精製した対象担体の上に１００μＬを注ぎかけそしてフィルムを安定化させるためにこれを３７℃で３０分乾燥する。場合によってはフィルムをグルタルアルデヒドの溶液（０．１Ｍ濃度リン酸ナトリウム緩衝溶液中０．５％；ｐＨ７．２）中で１０分にわたて培養することによって化学的に固定する。蒸留水で洗浄したＰＶＡ−ＳＣＷＰ−フィルムはＳ−層蛋白質  SbsCを配向再結晶させるためにマトリックスとして使用する（実施例８および９参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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