(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体由来の試験サンプル中の標的抗原に対する抗体を検出／定量する方法であって、該方法は以下：
ａ）該試験サンプルを、
ｉ）固相抗被験体免疫グロブリン抗体、
ｉｉ）リガンドに結合した該標的抗原を含む融合タンパク質、および
ｉｉｉ）検出マーカーに結合した抗リガンド抗体
と同時にインキュベートして、該被験体由来の該試験サンプル中の抗標的抗原抗体と、該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、リガンドに結合した該標的抗原と、検出マーカーに結合した該抗リガンド抗体との間の反応を行う工程；ならびに
ｂ）該検出マーカーを適切な手段により検出する工程、
を包含し、該標的抗原がＣ型肝炎ウイルスの少なくとも１つのエピトープである、方法。
【請求項２】
前記標的抗原がＣ型肝炎ウイルスの少なくとも２つのエピトープを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的抗原がＣ型肝炎ウイルス由来のＮＳ３抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンドがスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記検出マーカーが化学発光試薬である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記化学発光試薬がアクリジニウムエステルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被験体由来の試験サンプル中の２つ以上の標的抗原に対する抗体を検出／定量する方法であって、ここで該標的抗原は同じ供給源由来であり、該方法は以下：
ａ）該試験サンプルを、
ｉ）固相抗被験体免疫グロブリン抗体、
ｉｉ）リガンドに結合した第１標的抗原を含む融合タンパク質、
ｉｉｉ）該リガンドに結合した少なくとも第２標的抗原、および
ｉｖ）検出マーカーに結合した抗リガンド抗体
と同時にインキュベートして、該被験体由来の該試験サンプル中の抗第１標的抗原抗体、
該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、リガンドに結合した該第１標的抗原と、検出マーカーに結合した該抗リガンド抗体との間、ならびに該被験体由来の該試験サンプル中の抗第２標的抗原抗体と、該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、該リガンドに結合した該少なくとも第２標的抗原と、検出マーカーに結合した該抗リガンド抗体との間の反応を行う工程；ならびに
ｂ）該検出マーカーを適切な手段により検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
前記供給源がＣ型肝炎ウイルスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１標的抗原がＣ型肝炎ウイルス由来のＮＳ３抗原である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも第２標的抗原がＣ型肝炎ウイルス由来のコア抗原である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記リガンドがＳＯＤである、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出マーカーが化学発光試薬である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学発光試薬がアクリジニウムエステルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
被験体由来の試験サンプル中の２つ以上の標的抗原に対する抗体を検出／定量する方法であって、ここで該標的抗原は異なる供給源由来であり、該方法は以下：
ａ）該試験サンプルを、
ｉ）固相抗被験体免疫グロブリン抗体、
ｉｉ）第１リガンドに結合した第１標的抗原を含む融合タンパク質、
ｉｉｉ）第２リガンドに結合した少なくとも第２標的抗原、
ｉｖ）第１光試薬に結合した抗第１リガンド抗体、および
ｖ）第２光試薬に結合した少なくとも抗第２リガンド抗体
と同時にインキュベートして、該被験体由来の該試験サンプル中の抗第１標的抗原抗体と、該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、第１リガンドに結合した該第１標的抗原と、第１光試薬に結合した抗第１リガンド抗体との間、ならびに該被験体由来の該試験サンプル中の抗第２標的抗原抗体と、該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、第２リガンドに結合した該少なくとも第２標的抗原と、第２光試薬に結合した該抗第２リガンド抗体との間の反応を行う工程であって、ここで該第１および少なくとも該第２光試薬は検出可能に異なる波長の光を発する、工程；ならびに
ｂ）各々の該光試薬の発光シグナルを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記異なる供給源が同じウイルスのサブタイプである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記異なる供給源が異なるウイルスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１リガンドがＳＯＤである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２リガンドがユビキチンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記光試薬の少なくとも１つがアクリジニウムエステルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１リガンドに結合した前記第１標的抗原および前記第２リガンドに結合した前記第２標的抗原が、融合タンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
単回インキュベーション工程における試験サンプル中の１つ以上の標的抗原に関する抗体の検出用のための試験キットであって、ここで該標的抗原は同一供給源由来であり、該試験キットは、コンパートメント、固相抗被験体免疫グロブリン抗体、第１リガンドに結合した少なくとも第１標的抗原を含む融合タンパク質、および検出マーカーに結合した抗第１リガンド抗体を備える、キット。
【請求項２２】
前記リガンドがＳＯＤである、請求項２１に記載の試験キット。
【請求項２３】
前記検出マーカーが化学発光試薬である、請求項２１に記載の試験キット。
【請求項２４】
前記検出マーカーがアクリジニウムエステルである、請求項２３に記載の試験キット。
【請求項２５】
前記固相抗被験体免疫グロブリン抗体および検出マーカーが同じコンパートメント中に格納される、請求項２３に記載の試験キット。
【請求項２６】
前記第１リガンドに結合した第２標的抗原をさらに含む、請求項２４に記載の試験キット。
【請求項２７】
単回インキュベーション工程における試験サンプル中の２つ以上の標的抗原に関する抗体の検出用の試験キットであって、ここで該標的抗原は異なる供給源由来であり、該試験キットは、コンパートメント、固相抗被験体免疫グロブリン抗体、第１リガンドに結合した第１標的抗原を含む融合タンパク質、第２リガンドに結合した少なくとも第２標的抗原、第１光試薬に結合した抗第１リガンド抗体、および第２光試薬に結合した少なくとも抗第２リガンド抗体を備え、該第１および少なくとも該第２光試薬は検出可能に異なる波長の発光シグナルを発する、キット。
【請求項２８】
前記検出マーカーが化学発光試薬である、請求項２７に記載の試験キット。
【請求項２９】
前記検出マーカーがアクリジニウムエステルである、請求項２７に記載の試験キット。
【請求項３０】
前記第１リガンドがＳＯＤである、請求項２７に記載の試験キット。
【請求項３１】
前記第２リガンドがユビキチンである、請求項２７に記載の試験キット。
【請求項３２】
前記固相抗被験体免疫グロブリン抗体および検出マーカーが同じコンパートメント中に格納される、請求項２７に記載の試験キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、出願番号第６０／０５９，７０３号および同第６０／０８３，９２１号に対して米国特許法第１１９条の下で優先権の利益を主張し、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、サンプル中の抗原に対する抗体の検出／定量に関する。
【０００３】
（発明の背景）
抗体捕獲アッセイは一般的に、サンプル中の特定の抗原に対する抗体の検出に使用される。このような抗体の検出は、特定の抗原に対する曝露に関する情報を提供するだけでなく、疾患の進行に関する情報をも提供し得る。しかし、固相抗原を利用する抗体補足アッセイは、サンプル中の実際の抗体価の測定を可能にしない。試験サンプル中の少なくとも２つの異なる基質の検出および／または定量に関するアッセイが記述されている。本明細書中に参考として援用される米国特許第５，３９５，７５２号（’７５２特許）は、試験サンプル中の少なくとも２つの基質の検出中の使用に関する検出マーカーとして化学発光化合物を記載する。最小の重複を伴って、異なる波長での光を発する化学発光化合物が利用される。しかし、検出マーカー、すなわち化学発光化合物は、この試験サンプル中で検出／定量されるべき特定の基質に特異的である。
【０００４】
実際の力価の測定を容易にし、試験サンプル中の同じ供給源に対して指向される異なる抗体種の検出に適用し得、ならびに試験サンプル中の異なる供給源に対する異なる抗体の検出に適用し得る試験サンプル中の抗体をアッセイする方法が必要である。
【０００５】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は単回インキュベーション工程におけるサンプル中の特定の標的抗原に対する抗体の検出／定量の方法に関する。
【０００６】
別の局面において、本発明は、単回インキュベーション工程において単一の検出マーカーを使用する、単一試験サンプル中の同じ供給源由来の少なくとも２つの抗原に対する抗体の検出／定量の方法に関する。
【０００７】
なお別の局面において、本発明は、単回インキュベーション工程において、検出可能マーカーとして異なる波長で光を発する少なくとも２つの光試薬を使用する、単一試験サンプル中の同じ供給源由来の少なくとも２つの抗原に対する抗体の検出／定量の方法に関する。
【０００８】
さらなる局面において、本発明は、単回インキュベーション工程において検出マーカーとして異なる波長で光を発する光試薬を使用する、単一試験サンプル中の１つより多い供給源由来の抗原の検出方法に関する。さらなる局面において、本発明は、単一の検出マーカーを使用する単一被験体由来の試験サンプル中の特定の供給源に関する抗体プロフィールおよび実際の抗体価を測定する方法に関する。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は本発明による方法を実施するための試験キットに関する。本発明によるキットにおいて、固相および検出マーカーは同じコンパートメントに格納され得る。
【００１０】
（詳細な説明）
本発明の実施には、他に示されなければ、当業者内でウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このような技術は、この文献中に完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；およびＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，ＩおよびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．  Ｋｎｉｐｅ，編）を参照のこと。
【００１１】
単回インキュベーション工程中に（すなわち同時に）行われ得る、単一標的抗原、同じ供給源由来の複数標的抗原、または単一試験サンプル中異なる供給源由来の複数標的抗原に対する抗体の検出に関するアッセイが記載される。このアッセイは高処理能力自動システムで行われ得、従ってデータ繰り込みを可能にする。本発明によるアッセイは、高い感受性（１００％）および特異性（献血者サンプルで９９．５〜９９．７％）を示す。汎用固相および／または汎用検出マーカーが使用される。
【００１２】
以下の定義が本明細書中で使用される。
【００１３】
本明細書中で使用する用語「標的抗原」には、単一エピトープおよび複数エピトープ抗原、ならびにハプテンが含まれる。
【００１４】
本明細書中の標的抗原に関して使用する用語「供給源」には、ウイルス、細菌、腫瘍、真菌、などが含まれるがこれらに限定されない。異なる供給源は、例えばウイルス、異なるウイルス、あるいはウイルスおよび細菌の異なるサブタイプであり得る。
【００１５】
本明細書で使用する用語「リガンド」とは、結合パートナーをいう。好ましい実施態様において、このリガンドはスーパーオキシドジスムターゼ（「ＳＯＤ」）およびユビキチンである。
【００１６】
本明細書で使用する用語「検出マーカー」には、発色団、酵素、その切断産物が検出可能である酵素反応性化合物、ローダミン、ビオチン、ストレプトアビジン、蛍光化合物、化学発光化合物、およびこれらのマーカーの誘導体ならびに／または組合せがあるがこれらに限らない。提供した実施例において、化学発光化合物ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ，Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用した。任意のマーカーを使用した標識は、至適検出を得るためおよび抗体の結合のための条件下で実施した。
【００１７】
検出マーカーを検出する手段は、使用されるマーカーに依存する。この適切な手段および状況は当業者により容易に決定され得る。以下の実施例中に示すように、アッセイ中ＤＭＡＥが検出マーカーである場合、得られる抗リガンドＤＭＡＥ結合体は、ＮａＯＨ／Ｈ2Ｏ2と反応した場合発光により検出可能なＤＭＡＥを備えるトレーサーである。２つ以上の光試薬を含むアッセイにおいて、少なくとも２つの光電子増倍管は測定結果を得るために利用されねばならない。
【００１８】
個々の抗原の検出マーカーでの標識は、非常に退屈であり得、さらに得られる標識は安定でないかもしれない。本発明は、汎用検出マーカーを提供する。本発明において、この抗原はリガンド、例えば抗原／リガンド融合タンパク質と結合している。この融合タンパク質は、このリガンドに対して指向される抗体を含む検出マーカーと対合する。このリガンドに対して指向される抗体はこの検出マーカーと結合している。多くの異なる抗原は、同じリガンドに融合し得る。この様式において、多くの抗原は、単一の汎用マーカーで検出され得る。
【００１９】
本明細書中に使用される用語「被験体」とは、この試験サンプルの供給源をいい、そしてヒトおよび他の脊椎動物を含むがこれらに限定されない。好ましい実施態様において、被験体はヒトである。本明細書で使用される用語「試験サンプル」とは、この標的抗原に対する抗体が存在し得る被験体由来の任意の生物学的液体をいい、血清および血漿を含むがこれらに限定されない。
【００２０】
「抗被験体免疫グロブリン抗体」とは一般に、この被験体由来の免疫グロブリンに対して指向される抗体をいう。好ましい実施態様において、抗被験体免疫グロブリン抗体は、ラット抗ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）である。より好ましい実施態様において、抗被験体ヒト抗体はラット抗ヒトＩｇＧである。従って、この抗被験体免疫グロブリン抗体は、試験サンプル中抗体を検出／定量するための汎用固相を提供する固相と結合している。
【００２１】
この固相は、常磁性微粒子（「ＰＭＰ」）、磁性ラテックス微粒子（「ＭＬＰ」）、またはマイクロタイタープレートであり得る。好ましくはこの微粒子は、直径約１０μｍ未満である。
【００２２】
本発明に従う試験キットはまた、標準物質または対照を含む。上述のとおり、好ましい実施態様において、この標的抗原は、融合タンパク質としてそのリガンドと結合している。例えば、この抗原は、ｃ１００−３（ＮＳ４，３６３ａａ）Ｃ型肝炎ウイルス抗原の生成について以前に記載した方法を使用するヒトＳＯＤとのＣ末端融合のように、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内での内部の抗原として発現され得る。Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４，３６２−３６４、その全体が本明細書中で参考として援用される；およびＣｏｕｓｅｎｓら，Ｇｅｎｅ，１９８７，６１，２６５−２７５、その全体が本明細書中で参考として援用される。このｃ３３ｃ抗原（ＮＳ３，３６３アミノ酸）はまた、５−１−１抗原の合成について記載される方法によりＥ．ｃｏｌｉ中に、内部ＳＯＤ融合ポリペプチドとして発現した。Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４．３５９−３６２、その全体が本明細書中で参考として援用される。この組換えＨＣＶ抗原は、Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８９，１００１１−１００１５に記載されるとおり精製した。以下に詳述した特定の実施例において、全ての抗原はＳＯＤ融合タンパク質として調製した。しかし他の適切な融合タンパク質は、融合パートナーリガンドを認識する適切な抗体の入手可能性に依存して作製され得る。
【００２３】
ＭＥＦＡ−６は複数エピトープ抗原であり、そしてＣ型肝炎ポリタンパク質のコア、エンベロープ、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５領域由来のエピトープを含み、１、２、および３型のＨＣＶ株由来の等価な抗原決定基を含む。ＨＣＶエピトープをコードする多様なＤＮＡセグメントは、ＰＣＲ増幅によるか、または合成オリゴヌクレオチドにより構築した。ＭＥＦＡ−６抗原は、このコアおよびＮＳ５領域由来のＨＣＶエピトープの複数コピー；ＮＳ４  ５−１−１領域由来の異なる血清型エピトープ；ｃ１００Ｃ末端領域、Ｅ１、およびＥ２領域、ならびにＨＣＶ  ＮＳ３（ｃ３３ｃ）領域由来の主要な線状エピトープの単一のコピーを含む。ＭＥＦＡ−６融合タンパク質の一般的な構造式は、ｈＳＯＤ−Ｅ１−Ｅ２−ｃ３３ｃ−５−１−１（１型）−５−５−１（３型）−５−１−１（２型）−ｃ１００−ＮＳ５（２コピー）−コア（２コピー）である。この抗原は、酵母中で非常に高い発現レベルを有し、高程度の均質性まで精製し、そして以下に記載のイムノアッセイにおいて高い感受性および高い選択性を示す。ＭＥＦＡ−６は、本明細書中にその全体が参考として援用される１９９７年５月２３日に出願したＰＣＴ出願ＵＳ９７／０８９５０に記載されるとおり調整した。
【００２４】
抗ＳＯＤ−ＤＭＡＥは汎用検出マーカーとして使用された。抗ＳＯＤ抗体はＤＭＡＥに共有結合した反応部分を有するアミノ酸側鎖（例えば、リジンε側鎖またはシステインチオール）の反応によりＤＭＡＥで標識した（その全体が本明細書中に参考として援用される１９９５年１０月１９日に公開したＷＯ９５／２７７０２，Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐを参照のこと）。アミノ酸側鎖のチオールは、ＤＭＡＥ−ＥＤ−ＭＣＣまたはＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＰＥＧ−ＢｒＡｃ（Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して標識され得る。標識手順は一般的に、本明細書中に参考として援用されるＷＯ９５／２７７０２に記載されるとおりであり、最適な検出および抗原性を提供するために各抗原について必要な場合、条件において変更を伴う。
【００２５】
感受性は光学密度ユニット（ｓ／ｃｏ）においてカットオフされたアッセイ検出により分割されたアッセイサンプルの光学密度として報告された。全ての公知のネガティブサンプルは１未満のｓ／ｃｏ値を示した。
【００２６】
【実施例】
（実施例１：手動アッセイ）
Ｍａｇｉｃ  Ｌｉｔｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＳｙｓｔｅｍＩＩ（ＭＬＡＩＩ）を手動アッセイに使用する。容積、濃度、時間、および温度のようなパラメーターをガイダンスのために提供するが、適宜調製し得る。簡単には、試験サンプルの１０μｌアリコートを、ＨＣＶについての抗体プロフィールを得るための５つの別々の７５×１２ｍｍ試験管に添加した。各試験管に、１００μｌのサンプル希釈液または緩衝液、ラット抗ヒトＩｇＧ抗体と結合した常磁性微粒子（ＰＭＰ）（ＰＭＰ／抗ヒトＩｇＧ，３０μｇ／アッセイ）を含む１００μｌの固相緩衝液、５０μｌＨＣＶ抗原／ＳＯＤ融合タンパク質（コア（ｃ２２−３，５０ｎｇ），ＮＳ３（ｃ３３ｃ，１００ｎｇ），ＮＳ４（ｃ−１００−３  １００ｎｇ），ＮＳ４（５−１−１  １００ｎｇ），およびＮＳ５（１００ｎｇ））、ならびにリガンド試薬（ＬＲ）希釈液中にＤＭＡＥ（３千万の相対光単位「ＲＬＵ」）と結合した１００μｌ抗ＳＯＤを添加し、そして３７℃で１８分間インキュベートした。この固相／光試薬希釈緩衝液は、５０ｍＭＴｒｉｓ、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム、３．７５％  ＢＳＡ、０．００３％  酵母、０．０５ｇ／Ｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍｇ／Ｌ  アンホテリシンＢ、２４ｍｇ／Ｌ  硫酸ゲンタマイシン、３０μｇ／試験固相および４５×１０6試験光試薬（抗ＳＯＤ*ＤＭＡＥ抗体）を含んだ。補助的な希釈緩衝液は、５０ｍＭＴｒｉｓ、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム、３．７５％  ＢＳＡ、０．００３％  酵母、０．０５ｇ／Ｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍｇ／Ｌ  アンホテリシンＢ、２４ｍｇ／Ｌ  硫酸ゲンタマイシン、０．０５ｇ／Ｌ  腹水ＩｇＧ１および０．１ｇ／Ｌ  腹水ＩｇＧ２Ａ（ブロッキング抗体）を含んだ。洗浄試薬はＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０を含んだ。酸性試薬は、０．５％  Ｈ2Ｏ2／０．１Ｎ  ＨＮＯ3を含む。塩基性試薬は界面活性剤を有する＜０．２５Ｎ  ＮａＯＨを含む。
【００２７】
この試験管を、そのＰＭＰ粒子を沈降するに充分な時間、磁石上に静置した。このサンプルを、そのＰＭＰ粒子を保持するために磁石を使用してデカンテーションした。このＰＭＰ粒子を１ｍｌのＰＢＳ中でボルテックスしながら２回洗浄した。この洗浄溶液は、ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０９％  ＮａＮ3、および１ｍＭ  ＥＤＴＡであった。混合、インキュベート、沈降、およびデカンテーションの工程を、少なくとも１回繰り返し得る。各試験管に、１００μｌの水を添加しＰＭＰ粒子を再懸濁した。次にこの試験管をＭＬＡ−ＩＩ器具中に置き、そして２秒間発光を測定した。
【００２８】
慢性の有償提供者サンプルを使用する結果を表１中に示した。
【００２９】
（実施例２：自動アッセイと他の商業的なアッセイとの比較）
上述の手動抗ＨＣＶアッセイを、ＡＣＳ：Ｃｅｎｔａｕｒ装置を使用する自動使用について適用した。以下の手順を使用した。簡単には、このＡＣＳ：Ｃｅｎｔａｕｒシステムは自動的に以下の工程を行う：システム作業指示書中に、またはオンラインヘルプシステム中に記述されるとおり、１）１０μｌのサンプルをキュベットに施す；２）１００μｌの補助的な希釈緩衝液、１００μｌの光試薬／固相、５０μｌの抗原試薬２（例えば、ＭＥＦＡ−６）、５０μｌの抗原試薬１（例えば、ｃ３３ｃ）を施し、そしてこの混合物を３７℃で１８分間インキュベートする；３）この固相を混合物から分離し、そして結合していない試薬を吸引する；４）キュベットを洗浄試薬１で洗浄する；５）各々３００μｌの酸性試薬および塩基性試薬を施して、化学発光反応を開始する；そして６）選択による結果を報告する。
【００３０】
この固相／光試薬希釈緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム、３．７５％  ＢＳＡ、０．００３％  酵母、０．０５ｇ／Ｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍｇ／Ｌ  アンホテリシンＢ、２４ｍｇ／Ｌ  硫酸ゲンタマイシン、３０μｇ／試験固相、および４５×１０6試験光試薬（抗ＳＯＤ*ＤＭＡＥ抗体）を含んだ。この補助的な希釈緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム、３．７５％  ＢＳＡ、０．００３％  酵母、０．０５ｇ／Ｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍｇ／Ｌ  アンホテリシンＢ、２４ｍｇ／Ｌ  硫酸ゲンタマイシン、０．０５ｇ／Ｌ  腹水ＩｇＧ１および０．１ｇ／Ｌ  腹水ＩｇＧ２Ａ（ブロッキング抗体）を含有した。洗浄試薬はＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０を含んだ。酸性試薬は０．５％  Ｈ2Ｏ2／０．１Ｎ  ＨＮＯ3を含む。塩基性試薬は界面活性剤を有する＜０．２５Ｎ  ＮａＯＨを含む。
【００３１】
結果を市販のセロコンバージョンパネルを使用するＯｒｔｈｏ３．０、Ａｂｂｏｔｔ３．０、およびＲＩＢＡ（登録商標）３．０アッセイと比較した。そしてこの結果を表ＩＩに示す。Ｏｒｔｈｏ、Ａｂｂｏｔｔ、およびＲＩＢＡ（登録商標）アッセイの結果は、以下のセロコンバージョンパネルについてのこれらの販売者により提供される；ＢＢＩ（ＢＢＩ）とは、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄをいい、そしてＢＣＰとはＢｉｏＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓをいう。ＰＨＶはそのパネル名を命名する接頭辞である。ロット番号１〜４とは、ディッツ（ｄｉｔｓ）由来の試薬（試薬コンパートメントおよび固相）複数ロットをいう。
【００３２】
この結果から明らかであるように、本発明によるアッセイは、Ｏｒｔｈｏ３．０、およびＡｂｂｏｔｔ３．０よりも何回かの採決回数分抗体の検出を可能にした。早いＲＩＢＡ（登録商標）アッセイは、ＨＣＶ発明を確認する。
【００３３】
（実施例３：自動アッセイの感受性）
本発明のによるアッセイの感受性は、Ｏｒｔｈｏ３．０アッセイにおいて陽性とスクリーニングされた５１０人の患者の試験集団において確かめた。アッセイ条件は上述のとおりであった。試験の結果を表ＩＩＩに示す。表中で、「ＩＶＤＡ」とはＩＶ薬物乱用をいい、「ＳＴＤ」とは性行為感染症をいい、「Ｎ」とは試験した各グループのサンプル数をいい、ならびに「ＲＲ」とは繰り返し反応性を言う。このアッセイにおいて初期に反応性（陽性）であるサンプルを再試験した；このサンプルが繰り返し試験の上で反応性（陽性）である場合、「繰り返し反応性」とみなす。
【００３４】
表ＩＩＩから解るとおり、ＲＩＢＡ（登録商標）３．０アッセイにおいてＨＣＶについて陽性であると試験された全てのサンプルは、本発明に従うアッセイを使用して繰り返し陽性であった。
【００３５】
（実施例４：単一サンプル中の複数ウイルスについてのアッセイ）
アッセイ条件は、異なるリガンドおよび異なる光試薬を各抗原について使用することを除いて、上述の実施例３に記載のとおりである。ＭＥＦＡ−６−ＳＯＤは抗−ＳＯＤ−ＤＭＡＥを用いて使用および検出する；ｃ３３ｃユビキチンは抗ユビキチン−ＬＥＡＥ（長い波長を発するアクリジニウムエステル）を用いて使用および検出する。
【００３６】
上述の実施例は、本発明を例示することを意味し、そしていかなる場合においても本発明を限定すると解釈されない。当業者は、本発明の精神と範囲内である修飾を認める。本明細書中に引用した全ての参考文献はその全体が参考として援用される。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
【表２】
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【００３９】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明に従う例示のアッセイフォーマットを示す。
【図１】
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