(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下記（１）及び（２）の工程を有する「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
（１）検体中の軟骨型フィブロネクチンとコンドロイチン硫酸Ｅとを接触させる工程；
（２）前記接触により生じた「軟骨型フィブロネクチンとコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体」を検出する工程。
【請求項２】
「コンドロイチン硫酸Ｅ」が、固相に結合していることを特徴とする請求項１記載の「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
【請求項３】
「コンドロイチン硫酸Ｅ」が、更にリン脂質と共有結合していることを特徴とする請求項１又は２記載の「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」
【請求項４】
「検体」が「軟骨抽出液」であることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項記載の「軟骨型フィブロネクチン結合性物質の検出方法」。
【請求項５】
検体中の軟骨型フィブロネクチンを、コンドロイチン硫酸Ｅを用いて検出し、検出結果と軟骨腫瘍の有無とを関連づけることを特徴とする「軟骨腫瘍の検出方法」。
【請求項６】
検体が生体から取り出した軟骨組織であって、該軟骨組織を組織染色することで軟骨型フィブロネクチンの検出を行うことを特徴とする請求項５記載の「軟骨腫瘍の検出方法」。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、軟骨型フィブロネクチンの検出方法、軟骨型フィブロネクチンを検出して軟骨腫瘍を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本明細書中においては、「フィブロネクチン」を「FN」と、「グリコサミノグリカン」を「GAG」と、「コンドロイチン硫酸」を「CS」と、「コンドロイチン硫酸Ｅ」を「CSE」と略記する。
FNは細胞接着を促進する因子の一つであり、血漿型FN、細胞型FN、軟骨型FNなど数種類のFNが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。これらの構造的相違は、スプライシングの相違によることも知られている（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００３】
一般にFNはヘパリンやヒアルロン酸などのGAG、コラーゲンなどに接着性を有することが知られていた。また軟骨型FNがプロテオグリカンの１種であるデコリンに結合性を有することも知られていた（非特許文献５）。接着性において他の型のFNには特異性が低く、軟骨型FNのみに高い特異性を示す物質はこれまでは知られていなかった。
【０００４】
FNは5'末端から3'末端に向かって順にI-1（配列番号１５）、I-2（配列番号１７）、I-3（配列番号１９）、I-4（配列番号２１）、I-5（配列番号２３）、I-6（配列番号２５）、II-1（配列番号２７）、II-2（配列番号２９）、I-7（配列番号３１）、I-8（配列番号３３）、I-9（配列番号３５）、III-1（配列番号３７）、III-2（配列番号３９）、III-3（配列番号４１）、III-4（配列番号４３）、III-5（配列番号４５）、III-6（配列番号４７）、III-7（配列番号４９）、EDB（配列番号５１）、III-8（配列番号５３）、III-9（配列番号５５）、III-10（配列番号５７）、III-11（配列番号５９）、EDA（配列番号６１）、III-12（配列番号６３）、III-13（配列番号６５）、III-14（配列番号６７）、IIICS（V領域：配列番号６９）、III-15（配列番号７１）、I-10（配列番号７３）、I-11（配列番号７５）、I-12（配列番号７７）の各ドメインからなることが知られている（非特許文献６）。
【０００５】
【特許文献１】
特開平４−８０２０１号公報
【特許文献２】
特開平４−８０２０２号公報
【特許文献３】
特開平９−３０９７９号公報
【非特許文献１】
J. Biol. Chem., 259, 3962-3970 (1984)
【非特許文献２】
J. Cell. Biol., 80(2), 492-498 (1979)
【非特許文献３】
Nicleic Acids Res., 12(14), 5853-5868 (1984)
【非特許文献４】
EMBO J., 4(7), 1755-1759 (1985)
【非特許文献５】
J. Biol. Chem., 278, 11175-11181 (2003)
【非特許文献６】
Trends Glycosci.Glycotechnol., 8, 315-325
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
特に軟骨において存在する軟骨型FNは、他のFNと比して繊維形成能などの点で異なる性質を有しており、軟骨型FNのみを検出し、その局在を調べたり、或いはその発現量を測定することで、軟骨型FNの機能の解明を進めることができると考えられる。しかし、軟骨型FNのみに特異的に結合性を有する物質は知られておらず、そのような物質及びそれを用いた軟骨型フィブロネクチンの検出方法の探索が必要とされていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、軟骨型FNに特異的に結合性を有する物質を鋭意探索した結果、驚くべきことにGAGの１種であるCSEが軟骨型FNに特異的な結合性を示すこと、及び軟骨型FNに特異的に結合性を有するモノクローナル抗体の作成に成功し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１）  少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を有する「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
（ａ）検体中の軟骨型フィブロネクチンとコンドロイチン硫酸Ｅとを接触させる工程；
（ｂ）前記接触により生じた「軟骨型フィブロネクチンとコンドロイチン硫酸Ｅとの複合体」を検出する工程。
（２）  「コンドロイチン硫酸Ｅ」が、固相に結合していることを特徴とする請求項１記載の「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
（３）  「コンドロイチン硫酸Ｅ」が、更にリン脂質と共有結合していることを特徴とする（１）又は（２）記載の「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」
（４）  「検体」が「軟骨抽出液」であることを特徴とする（１）〜（３）いずれか記載の「軟骨型フィブロネクチン結合性物質の検出方法」。
（５）  検体中の軟骨型フィブロネクチンを、コンドロイチン硫酸Ｅを用いて検出し、検出結果と軟骨腫瘍の有無とを関連づけることを特徴とする「軟骨腫瘍の検出方法」。
（６）  検体が生体から取り出した軟骨組織であって、該軟骨組織を組織染色することで軟骨型フィブロネクチンの検出を行うことを特徴とする（５）記載の「軟骨腫瘍の検出方法」。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
【００１０】
（１）本発明軟骨型FN検出方法
本発明軟骨型FN検出方法は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を有する。
（ａ）検体中の軟骨型FNとCSEとを接触させる工程；
（ｂ）前記接触により生じた「軟骨型FNとCSEとの複合体」を検出する工程。
【００１１】
本発明軟骨型FN検出方法における「検体」は、「軟骨抽出液」、生検によって得られる「軟骨組織」、医薬品、医療用具等を目的とする軟骨型FNの製造の工程管理における「試作品又はサンプル」、「医薬品」等が例示され、特に「軟骨抽出液」が好ましい。ここで「軟骨抽出液」とは、軟骨から有機溶媒又は水性溶媒に溶解性を有する成分を抽出した溶液を指称する。
【００１２】
本発明軟骨型FN検出方法における「軟骨型FN」とは、その遺伝子構造と結晶型FN、細胞型FNなどの構造との対比によって知られている可変領域（EDA、EDB、及びV）と、III-15及びI-10モジュールを欠失したFNであり、正常軟骨組織で発現しているFNを指す。かかる「軟骨型FN」は配列番号２記載のアミノ酸配列からなる。例えばこれを遺伝子組換的手法により発現させるためには配列番号１記載の塩基配列を含む核酸を、常法に従って発現ベクターなどに組み込んで組換えベクターを調製し、これを適当な宿主細胞に導入して組換体を得てそれを成育させることで行うことができる。
【００１３】
本発明軟骨型FN検出方法における「CSE」とは、N-アセチル-D-ガラクトサミン（GalNAc）残基とD-グルクロン酸（GlcA）残基とがβ1,4グリコシド結合で結合した二糖がβ1,4グリコシド結合で連続した基本骨格を有する構造を有し、かかる基本骨格を構成するN-アセチル-D-ガラクトサミン残基中、4位炭素原子及び6位炭素原子の大半が硫酸化されているCSをいう。かかるGAGは、イカ軟骨に含まれているCSEと呼ばれるGAGと同等のGAGを指称して本明細書中では使用する。
【００１４】
本発明軟骨型FN検出方法における「CSE」は、タンパク質や脂質などの物質と結合した状態であっても使用することができる。かかる「タンパク質」や「脂質」は、軟骨型FNと結合したCSEの検出を容易としたり、或いは後述の固相担体に対してCSEを固定化することを容易とするものが好ましくは挙げられる。かかるタンパク質としては例えばアルブミンや酵素などが例示される。
【００１５】
また「脂質」としては動物、植物、微生物等の天然物由来、または化学的もしくは酵素的に合成もしくは部分的に分解された複合脂質または単純脂質を使用することができ、リン脂質等のグリセロ脂質、長鎖の脂肪酸、長鎖の脂肪酸アミン、コレステロール類、スフィンゴ脂質、セラミド等いずれも使用できる。特にホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルトレオニン、エタノールアミンプラスマロゲン、セリンプラスマロゲン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシトール等のリン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等の中性脂質等のグリセロ脂質が好ましく、その中でも特に１級アミノ基を有するリン脂質が好ましい。脂質中のアシル基の鎖長及び不飽和度は特に限定されないが、炭素数６以上のものが好ましい。アシル基としては例えばパルミトイル（ヘキサデカノイル）またはステアロイル（オクタデカノイル）などが例示される。なお、このような「脂質」と「軟骨型FN結合性脂質結合GAG」との結合はイオン結合、共有結合などが挙げられるが、特に共有結合がその強度の面から好ましい。
【００１６】
CSEと脂質との結合位置は特に限定されるものではないが、軟骨型フィブロネクチンを検出するという本発明の目的に照らすとそれらの結合を妨げる可能性が低い「CSEの末端部」が好ましく、特に反応のさせやすさの観点から「CSEの還元末端」への結合が好ましい。
【００１７】
特にCSEと脂質とが共有結合した「脂質結合CSE」の場合、CSEのカルボキシル基（ラクトンを含む）、ホルミル基（ヘミアセタール基も含む）、水酸基若しくは１級アミノ基、又はCSEに別途導入された前記基と、脂質のカルボキシル基、ホルミル基若しくは１級アミノ基、又は脂質に別途導入された前記基との間で形成される酸アミド結合（-CO-NH-）、エステル結合又はアミノアルキル結合（-CH2-NH-）によって共有結合したものが好ましい。
【００１８】
特に、CSEの還元末端のピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成されたCSEのカルボキシル基（ラクトンを含む）と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成された酸アミド結合（-CO-NH-）、CSEのGlcA残基のカルボキシル基と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成された酸アミド結合（-CO-NH-）、又はCSEの還元末端のピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成されたCSEのホルミル基と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成されたシッフ塩基を還元して形成されたアミノアルキル結合（-CH2-NH-）により結合されたものが好ましい。
【００１９】
なお、上記共有結合に関与するアミノ基、カルボキシル基、ホルミル基（ヘミアセタール基を含む）、水酸基はグリコサミノグリカン又は脂質に元来存在するもの、これらに化学的処理を施すことによって形成されたもの、或いは上記官能基を末端に有するスペーサー化合物を、予めCSE又は脂質と反応させることによって別途導入されたもののいずれであってもよい。
【００２０】
特に好ましい脂質結合CSEである、脂質がCSEの還元末端に共有結合した脂質結合CSEの製造法としては、例えば特開平4-80201号、特開平4-80202号及び特開平9-30979号に開示された方法が挙げられ、より具体的には例えば以下のような方法が使用できる。
【００２１】
還元末端限定酸化法
この方法は、CSEの還元末端の糖残基であるGlcA残基またはGlcNAc残基を還元し、限定酸化（部分酸化）することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開環（開裂）させるとともに、該CSEの還元末端にホルミル基を形成させてアルデヒド化合物とし、このアルデヒド化合物のホルミル基と脂質の１級アミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成させ、次いでシッフ塩基を還元し、アミノアルキル結合（-CH2-NH-）を形成させて、CSEと脂質とを共有結合させる方法である。
【００２２】
CSEの還元末端の糖残基の還元は、CSEに対して5〜50当量程度、好ましくは25〜30当量の還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩等）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、ホウ酸塩緩衝液等）中、通常10〜30℃、好ましくは15〜25℃で行うことができる。
【００２３】
上記還元後、限定酸化を行ってCSEの還元末端に特異的にホルミル基を有するアルデヒド化合物を製造する。限定酸化は、上記還元後のCSEに対して1〜10当量、好ましくは3〜6当量の酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム等の過ヨウ素酸アルカリ塩等）を用い、通常0〜10℃、好ましくは0〜4℃で行うことができる。
【００２４】
得られたアルデヒド化合物と１級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質等）とを反応させてシッフ塩基を形成させる反応は、水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）又は適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）に上記アルデヒド化合物を溶解した溶液と、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、通常15〜60℃の温度で反応させることができる。この反応時又は反応終了後に適当な還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩等）を作用させてシッフ塩基を還元することができる。
【００２５】
なお、脂質結合CSEを製造する際に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ基を有する２価官能性のスペーサー化合物（例えば、エチレンジアミン等のアルキレンジアミン、又はリジン等のアミノ酸等）と上記アルデヒド化合物とを反応させて、アミノアルキル結合（-CH2-NH-）を形成させ、次いで上記スペーサー化合物の他方の官能基（例えばアミノ基）と反応し得る官能基（例えば、カルボキシル基）を有する脂質（例えば、モノアシルグリセロールコハク酸エステル等のモノアシルグリセロールジカルボン酸エステル）と反応させてもよい。
【００２６】
還元末端ラクトン化法
この方法は、CSEの還元末端の糖残基であるガラクトース残基、ウロン酸残基又はヘキソサミン残基を酸化することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開環（開裂）させて該CSEの還元末端にカルボキシル基を形成させて、次いでラクトン形成反応に付すことによって該CSEの還元末端をラクトン構造とし、このラクトンと脂質の１級アミノ基とを反応させて酸アミド結合（-CO-NH-）を形成させることによって、CSEと脂質とを共有結合させる方法である。
【００２７】
CSEの還元末端の糖残基の酸化は、CSEに対して2〜20当量程度、好ましくは5〜15当量程度の酸化剤（ヨウ素、臭素等）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、リン酸塩緩衝液等）中、通常0〜40℃、好ましくは15〜30℃で行うことができる。
【００２８】
上記酸化反応後、強酸性陽イオン交換樹脂、例えばダウエックス50（商品名；ダウケミカル社製）、アンバーライトIR-120（商品名；オルガノ社製）及び／又は酸（塩酸、硫酸等の無機酸、または酢酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸の酸無水物）で処理することによって、CSEの還元末端が特異的にラクトン化されたラクトン化合物を製造することができる。
【００２９】
得られたラクトン化合物と１級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質）との反応は、適当な水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）又は適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）にラクトン化合物を溶解した溶液と、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、5〜80℃、好ましくは30〜60℃の温度で反応させればよい。
【００３０】
なお、還元末端限定酸化法の場合と同様に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ基を有する２価官能性のスペーサー化合物と上記ラクトン化合物とを反応させて酸アミド結合（-CO-NH-）を形成させ、スペーサー化合物の他方の官能基と脂質の官能基（例えばカルボキシル基）とを反応させてもよい。
【００３１】
ヘミアセタール法
糖鎖の還元末端糖は、環状構造と開環構造の平衡状態にあり、開環構造ではアルデヒド基が生じ、そこにアミノ基を有する脂質を加えるとシッフ塩基が形成される。この反応も平衡反応であり、その割合は反応条件により大きく変わる。ここに選択的還元剤を添加するとシッフ塩基が還元（水素付加）され、アミノアルキル型結合体が形成されることも基づく方法である。
【００３２】
具体的には、CSEがナトリウム塩等のアルカリ金属塩である場合等、以下の方法で有機溶媒溶解性塩とすることができる。すなわち、Dowex 50W-X8、Dowex 50W-X12、Dowex 50W-X4（いずれも室町化学社製）、Amberlite IR-120、Amberlite IRC-50（いずれもオルガノ社製）、Duolite 225、Duolite C26C（いずれもダイアプロシム社製）、Bio-Rex 70、Chelex 100、AG 50W-X8（いずれもバイオラド社製）、SE Cellulose（ワットマン社製）等のＨ＋型の陽イオン交換樹脂に通して脱陽イオン化して遊離型とし、ただちにテトラブチルアンモニウム等の有機アミンあるいはその水溶液を添加し、ｐＨを弱酸性から中性に調整する。この溶液を減圧濃縮し、室温で約３日間凍結乾燥して有機溶媒溶解性のCSE有機アミン塩乾燥粉末を得ることができる。
【００３３】
次いでCSEの有機溶媒溶解性塩と１級アミノ基を有する脂質とを、該CSEの有機溶媒溶解性塩および該脂質の双方を溶解しうる極性有機溶媒中、無水条件下、還元剤の存在下において反応させ、該CSEの還元末端糖アルデヒド基と該脂質の１級アミノ基とのアミノアルキル型結合を形成させることにより脂質結合CSEを合成する。具体的には、例えば上記の有機アミン塩乾燥粉末に無水極性有機溶媒を溶解し、その溶液をホスファチジルエタノールアミン等脂質の無水極性有機溶媒溶液に添加する。得られた混合液を窒素雰囲気下、20〜120℃で1〜24時間撹拌後、還元剤を加え更に20〜120℃で1〜24時間撹拌を続ける。上記還元剤を更に約24時間おきに２回添加し、20〜120℃で1〜72時間反応させ、シッフ塩基形成、還元アミノ化反応を完結させる。
【００３４】
ただし、脂質がCSEの還元末端に共有結合した脂質結合CSEの製造方法はこれらの方法に限定されるものではなく、CSEの還元末端に脂質を結合しうる方法であれば他の任意の方法によっても製造することができる。
【００３５】
CSEの末端以外に脂質を導入する方法としては、例えばCSEのGlcA残基のカルボキシル基と脂質の１級アミノ基とを反応させて、酸アミド結合（-CO-NH-）を形成させる方法が挙げられる。
【００３６】
上記反応に際し、縮合剤（例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド等）を用いて酸アミド結合（-CO-NH-）を形成させるか、或いはGlcA残基のカルボキシル基を該縮合剤の存在下、活性化剤（例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド、p-ニトロフェノール、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール等）と反応させて活性エステルとした後、該脂質と反応させて酸アミド結合（-CO-NH-）を形成させることができる。
【００３７】
なお、上記反応においてはCSEのGlcA残基を有機溶媒に溶解可能な塩（トリエチルアミン、トリブチルアミン等のアミンの塩等）とし、反応を有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン等）中で行うことが好ましい。
【００３８】
このような「CSE」は何にも結合していない可溶性の状態で本発明軟骨型FN検出方法に用いることも可能であるが、固相に結合していることが好ましい。かかる「固相」としては例えばプレート、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲルなどが例示される。その中でも特にプレート及びビーズが好ましくは例示され、殊にプレートが取扱の簡便性から好ましい。
【００３９】
上述の「軟骨型FN結合性脂質結合GAG」と「固相」との結合は、共有結合、イオン結合、物理的吸着などが挙げられ特に限定はされないが、その中でも単なる物理的吸着で十分な結合の強度を得られるため好ましい。
【００４０】
本発明軟骨型FN検出方法における「軟骨型FN結合性物質」と検体中の軟骨型FNとの接触は、検体が液体の場合には、反応容器中において検体と「軟骨型FN結合性物質」を混合し、軟骨型FNとCSEが相互作用できる方法、態様であれば順序、具体的方法は限定されない。例えば反応容器に入れた「軟骨型FN結合性物質」又は「軟骨型FN結合性物質」が固相化されたプレートに検体を添加、或いは反応容器に「軟骨型FN結合性物質」及び検体を同時に添加してなされる。また検体が固体の場合には、固相に固着していない「軟骨型FN結合性物質」を検体に加えて接触がなされることが好ましい。なお、かかる接触を保つ時間は、前記軟骨型FN結合性物質と検体中の軟骨型FNとが結合して複合体を形成するのに十分な時間であれば特に限定はされないが、数秒〜数時間、好ましくは5分以上10時間以内であり、最も好ましくは30分〜8時間である。また、接触を行う温度条件は、0〜40℃、4〜38℃が好ましく、20〜37℃が最も好ましい。更に、反応を行うpH条件は、6.0〜8.0は好ましく、特に6.5〜7.5が好ましい。
【００４１】
本発明軟骨型FN検出方法における「軟骨型FNとCSEとの複合体」の検出方法は、複合体に含まれるCSE又は軟骨型FNを特異的に検出することによりなされる。例えば、CSEを特異的に検出するためには、予めCSEを標識物質（例えば放射能、蛍光物質、特異的結合対（ビオチン等）、酵素など）でラベルしておき、かかる標識物質を検出することによって行うことも可能である。標識物質として放射能を用いる場合には、オートラジオグラフィー等を行うことでCSEを検出することができ、また標識物質として特異的結合対のビオチンを用いる場合には、ビオチンに結合するアビジンを持ちいてビオチンと結合したCSEを検出することができる。また、標識物質として酵素を使用する例としては、例えばCSEにペルオキシダーゼなどを結合しておき、その酵素反応を用いて基質（3,3'-ジアミノベンチジン（以下「DAB」と略記する）やo-フェニレンジアミンなど）を分解して発色基質を生じさせて検出を行うことも可能である。かかる二次抗体を使用する検出方法が簡便で且つ常法に従って行うことができるため好ましい。
【００４２】
本発明軟骨型FN検出方法の具体的な例としては、例えば下記が挙げられる。
組織染色の手法を用いる場合には、検体として生検によって得られた軟骨組織を用いる。かかる軟骨組織を公知の手法を用いてパラフィン切片などとし、かかる切片に予め放射能標識を行なったCSEを用いてパラフィン切片上に存在する軟骨型FNと反応させる。その後、切片を洗浄した後、かかる切片上の放射能をオートラジオグラフィーで検出することができる。すなわち放射能が認められた切片は、軟骨型FNが存在している切片であると判断される。オートラジオグラフィーにおけるドットの数、濃淡などを対比することで、軟骨型FNの定量を行うことも可能である。
【００４３】
また、ELISA的手法を用いる場合には、検体として生検によって得られた軟骨組織からの抽出液を用いることができる。例えば脂質結合CSEを固着させたマイクロプレートに、検体を分注し、一定時間インキュベートする。その後マイクロプレートを洗浄し、マウス抗軟骨型FnIgG抗体とインキュベートし、更にプレートを洗浄した後に西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたウサギ抗マウスIgG抗体などをプレートに分注して反応させる。プレートを洗浄した後、DAB溶液などの発色基質溶液と反応させて検出を行う。すなわちDAB溶液での反応後に発色が認められた検体には、軟骨型FNが存在していたと判断される。DAB溶液による反応後の発色度合いを対比することで、軟骨型FNの定量を行うことも可能である。
【００４４】
（２）本発明腫瘍検出方法
本発明腫瘍検出方法は、検体中の軟骨型FNを検出し、その結果と腫瘍の有無とを関連づけることを特徴とする「軟骨腫瘍の検出方法」である。
【００４５】
本発明腫瘍検出方法は、軟骨の腫瘍化に伴い軟骨性FNの量が減少することに基づく発明である。本発明腫瘍検出方法における「軟骨型FNの検出」は、上述の本発明軟骨型FN検出方法を用いて行うことができる。したがって本発明腫瘍検出方法で用いる検体は、軟骨由来の検体であることが好ましい。軟骨由来の検体とは、例えば生検によって得られた軟骨組織、かかる軟骨組織からの抽出液などが挙げられ、いずれも本発明腫瘍検出方法に使用することが可能である。本発明腫瘍検出方法においては、操作の簡便性の観点から、生検によって得られる軟骨組織を検体として用い、免疫染色の手法を用いて検出を行うことが好ましい。
【００４６】
本発明腫瘍検出方法における腫瘍の有無と上記検出結果の関連づけは、検出結果が健常軟骨組織における軟骨型FN量と比して検体における軟骨型FN量が減少していることを示した場合に、かかる検体には腫瘍が存在するとして関連づけることが好ましく、より好ましくは、検体において実質的に軟骨型FNが検出されなかった場合に、かかる検体には腫瘍が存在するとして関連づけを行う。
【００４７】
（３）本発明製造方法
本発明製造方法は、軟骨型FNを含む試料を、固相上に固着したCSEと接触させて、固相上に固着した「軟骨型FNとCSEとの複合体」を形成させ、かかる複合体を形成した固相を分離し、その後複合体から軟骨型FNを単離することを特徴とする軟骨型FNの製造方法である。
【００４８】
本発明製造方法における「試料」とは、軟骨型FNを含むものである液体である限りにおいて特に限定はされない。かかる「試料」の例としては、例えば軟骨抽出液、組換軟骨FNを発現する組換体の生育物（組換体の培養上清、組換体の抽出液、組換体の排泄物など）などが例示される。その中でも特に組換体の生育物が好ましい。
【００４９】
上述の組換体は例えば次のようにして調製することができる。
すなわち、配列番号１３及び配列番号１４記載のプライマー配列を用いて、ヒト由来の軟骨細胞から常法に従って調製した全RNAを鋳型として逆転写ポリメラーゼ  チェイン  リアクション法（RT-PCR法）により軟骨型FNの部分配列を増幅し、かかる増幅産物を例えばTAクローニングなどでクローン化することができる。そしてこのクローンを適当な制限酵素で消化して切り出した後、例えばJ. Biol. Chem., 139(1997), 295-307に記載されたpA1FNC（血漿型FNをコードする発現ベクター）の相同領域と常法で置換し、軟骨型FNを発現する発現ベクターを調製する。そして、かかる組換ベクターをベクターが適当に働く宿主細胞に感染、組み込み、組換体を調製することができる。
【００５０】
上記「宿主細胞」として真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。宿主細胞として真核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「真核細胞用の発現ベクター」を選択し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「原核細胞用の発現ベクター」を選択する。
【００５１】
本発明製造方法における「固相」とは、本発明軟骨型FN検出方法で記載した固相と同様であるが、本発明製造方法をバッチ法（静的吸着）で行う場合にはプレート及びビーズが例示され、またカラム法（動的吸着）で行うためにはゲルが挙げられる。これらの固相を利用することが軟骨型FNの大量製造が容易となるため好ましい。
【００５２】
本発明製造方法における「CSEの固相上への固着」は、タンパク質や脂質などと結合したCSEを使用してなされる。そしてかかるCSEと固相との固着は、製造工程における軟骨型FNの損失を最小限とするために、より強力な固着手段で固着されていることが好ましい。このような固着手段としては化学結合、その中でも特に共有結合が挙げられる。
【００５３】
本発明製造方法における「CSEと軟骨型FNとの接触」は例えば下記が挙げられる。すなわちバッチ法において、例えばプレートを固相として使用した場合には、CSEが固着したプレートに上記試料を添加する方法が挙げられる。また、ビーズを固相として使用した場合には、CSEが固着したビーズを、反応容器に予め添加しておき、かかる容器に上記試料を添加して接触させる方法、反応容器に予め上記試料を添加しておき、かかる容器にCSEが固着したビーズを添加する方法、及び反応容器にCSEが固着したビーズと上記試料とを同時に添加する方法が例示される。このような方法で接触がなされた場合には、CSEに軟骨型FNが結合して複合体を形成するのに十分な時間、接触状態を保つ必要がある。かかる時間としては例えば10秒以上120時間以下、好ましくは10分〜48時間、より好ましくは30分〜20時間が例示される。また、接触を行う温度条件は、0〜40℃、1〜24℃が好ましく、4℃〜20℃が最も好ましい。更に、反応を行うpH条件は、6.0〜8.0が好ましく、特に6.5〜7.5が好ましい。なお、かかるバッチ法を用いる場合には、上記複合体を形成させた後、既存の固液分離手段を用いて固相を単離する必要がある。
【００５４】
一方、カラム法においては、軟骨型FN結合性物質が固着したゲル又はビーズをカラムに充填し、かかるカラムに試料を通筒することで、試料中の軟骨型FNを固相に結合させて複合体をすることができる。
【００５５】
上記手法により形成された複合体から軟骨型FNを溶出させる方法としては、複合体を高濃度の塩の水溶液（例えば4mol/lの尿素を含むリン酸緩衝液など）などに浸漬し、十分に撹拌し、液相を回収することで軟骨型FNのみを容易に単離することが可能となる。
【００５６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
（調製１）軟骨型FNを含む検体の調製
ヒト肋軟骨から全RNAを常法に従って抽出し、これを鋳型としてプライマーとして配列番号１３及び１４の塩基配列を使用した逆転写ポリメラーゼチェインリアクション法（RT-PCR法）によってFNのIII-12からI-12モジュールをコードするcDNA（IIICS領域とC領域を欠失している）を調製した。ついで、TAクローニングにてこれをクローン化した（rFN/O）。このクローンを制限酵素Bgl II及びNde Iで処理したあと、血漿型FN発現ベクターpAlFNC（Manabe et al. J.Biol. Chem. 1997 139 295-307）の相同領域と常法に従って置換し、軟骨型FN発現ベクターを調製した。
上記rFN/Oと同様の手法で以下のクローンを含むベクターを調製した。
【００５７】
【表１】
0004169637.tif 000002
【００５８】
注：rFN/Cmの合成にはJ. C. S., 108, 907-915記載のプライマーを使用した。
【００５９】
各FN発現ベクター（4μg）と、ジヒドロ葉酸還元酵素発現ベクター（0.4μg）を、αMEM（ギブコ社製、核酸含有）中で６センチ培養皿を用いて培養したハムスター卵巣上皮由来培養細胞株CHODG44細胞に、リン酸カルシウム法を利用して導入し、35℃、二酸化炭素濃度3.5%で12時間培養した。次いで、培地を交換し、37℃、二酸化炭素濃度5%で24時間培養した。さらに、核酸非含有で、10nmol/lメソトレキセートを添加した培地に交換し、適宜培養系を拡大しつつ２週間培養した。
【００６０】
次に、形成されたコロニーをピックアップし、最も多くFNを発現しているものを選択し、１週間、血清濃度1%で大量培養した。回収した培養上清は、4℃、10,000rpmで遠心して不溶物を除き、TFTシステム（ファルマシア社製）で20分の1の体積に濃縮後、マウス抗ハムスターFN抗体3C12カラムに通して内在性のハムスターFNを除去した。さらに、マウス抗ヒトFN抗体119Aカラムによって各FNをアフィニティー精製した。
【００６１】
（調製２）生検により得られた軟骨組織の処理
生検により得られた軟骨組織は、10%緩衝ホルマリン（和光純薬工業株式会社製）に24時間浸して組織を固定した後、組織脱水溶液（和光純薬工業株式会社製）に2時間ずつ、7回浸して脱脂脱水した。次いで、キシレン（和光純薬工業株式会社製）に2時間ずつ3回浸した後、10%EDTA（pH7.4）に72時間ずつ3回浸して脱灰し、ティッシュプレップT580（フィッシャーサイエンティフィック社製）に2時間ずつ4回浸透し、パラフィン包埋した。
脱灰を除く全ての操作は、全てティッシュティックVIP-M1500（サクラ社製）により行った。
【００６２】
実施例１
CSA（クジラ軟骨由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量約15,000）、CSB（ニワトリ鶏冠由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量約32,000）、CSC（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量約20,000）、CSD（ブタ皮由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量約20,000）CSE（イカ軟骨由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量約100,000）、ヒアルロン酸（HA：ニワトリ鶏冠由来：生化学工業株式会社製：重量平均分子量23,000）、ヘパリン（Hep:ウシ腸管由来：和光純薬工業株式会社製：重量平均分子量約10,000）をそれぞれ100mgを使用し、特開平9-30979号公報記載の方法に従って、ホスファチジルエタノールアミン（以下「PE」とも略記する）結合体20mgを調製し（CSA-PE、CSB-PE、CSC-PE、CSD-PE、CSE-PE、HA-PE、及びHep-PE）、これを20μg/mlの濃度でリン酸緩衝生理的食塩水（以下「PBS」と略記する）に溶解し、何れかのGAG-PEを含むPBSを調製した。かかるPBSを96穴マルチプレートに一穴あたり50μlで分注し、4℃で10時間静置した。溶液を廃棄した後、加熱処理により変性させた牛血清アルブミンを3%(w/v)で含むPBSを一穴あたり200μlで分注し、24℃で3時間静置した。
【００６３】
その後、溶液を廃棄した後、調製１で調製した各FNをそれぞれ30nmol/lで含むPBSを一穴あたり50μlで添加し、4℃で静置した。
10時間静置した後、BSAを0.1%(w/v)で含むPBS（以下かかる組成のPBSを特に「洗浄液」と記載する）で3回洗浄し、その後、マウス抗ヒトFNIgGモノクローナル抗体136Hを1/3000倍にPBSで希釈した溶液を一穴あたり50μl添加し、24℃で1時間静置した。その後洗浄液で3回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体（シグマ社製）を1/3000倍にPBSで希釈した溶液を一穴あたり50μlで添加して、24℃で1時間静置した。その後更に洗浄液で4回洗浄した後、o-フェニレンジアミンを100μg/mlで含む0.003%過酸化水素水で発色を常法により行い、490nmの吸光度を測定した（図１）。
【００６４】
その結果、軟骨型FNのみが、コンドロイチン硫酸Eに強い結合性を示すことが明かとなった。
【００６５】
実施例２：腫瘍組織における軟骨型FNの量の変化
パラフィン包埋した各軟骨組織は、4μmの厚さで切片とした。作成した切片は、キシレン（和光純薬工業株式会社製）に10分ずつ3回浸し、次いで100%エタノールに3回、90%、80%、70%エタノールに１回ずつ各2分浸し、脱パラフィンを行った。
【００６６】
蒸留水で洗浄後、500μg/mlで牛睾丸由来ヒアルロニダーゼ（和光純薬工業株式会社製）を含む酢酸緩衝液（pH4.0、150mmol/l塩化ナトリウムを含む）を室温で30分各切片に対して反応させ、ヒアルロン酸の分解を行った後、PBSで3回洗浄、ついで500μg/mlでプロテアーゼ（シグマ社製）を含むPBSを室温で30分反応させた。PBSで3回洗浄後、0.3%でヤギ血清（ベクタステイン社製）を含むPBSで室温下1時間ブロッキングし、適宜希釈したマウス抗ヒトFN抗体136Hを添加し、4℃、12時間反応させた。さらにPBSで洗浄後、1％過酸化水素水に室温下20分反応させて内因性ペルオキシダーゼ処理を行い、さらに洗浄後、ビオチン結合抗マウスIgG抗体（ベクタステイン社製）、ヤギ血清をそれぞれ1μg/ml、0.3％で含むPBSを室温下1時間反応させた。洗浄後、VECTASTAIN ABC reaction reagent（ベクタステイン社製）を適量含むPBSにて室温、30分反応させ、洗浄後、200μg/mlでジアミノベンジジン（ナカライテスク社製）を含む37℃、50mmol/lトリス緩衝液（pH7.6）に浸し、かかる水溶液に過酸化水素水を添加し、反応させた。約10分後、蒸留水で洗浄して反応を停止し、次いで、70%、80%、90%エタノールに2分ずつ各１回浸し、100%エタノールに2分ずつ3回浸して脱水、さらにキシレンに10分ずつ3回浸し、EUKITT液（O.KINDLAR社製）でマウントし、スライドガラスを作成、顕微鏡で観察した。
【００６７】
その結果、正常軟骨組織では5B8による染色が認められたが、軟骨腫瘍ではその染色が全く認められなかった。一方、136Hによる染色では、共に広範囲に染色が認められ、特に軟骨腫瘍では、より強い染色像が認められた。
【００６８】
同様に、14C標識CSEを使用してオートラジオグラフィーにより組織中の軟骨型FNの量を検出することも可能である。
【００６９】
実施例３
生検によって得られた正常、あるいは腫瘍化したヒト軟骨を、4mol/l尿素及び各種プロテアーゼインヒビターを含む50mmol/lリン酸緩衝液に軟骨湿重量10mgあたり0.1mlの割合で、48時間ごとに３回浸すことで軟骨からFNを抽出した。次に、かかる緩衝液をPBSに対して透析し、ゼラチンカラムに添着して洗浄した後、4mol/l尿素で溶出、得られたフラクションを再度PBSに対して透析することで各軟骨組織中のFNをアフィニティー精製する。
【００７０】
次に、ゼラチンを2.5ng/wellでコートした96穴マルチプレートに各軟骨から抽出したFNを10nmol/lの濃度で50μlずつ添加し、4℃で12時間反応させる。次いで、14C標識CSEを1μg/mlの濃度で50μl/wellで添加して室温下、１時間反応させ、200μl/wellのPBSで3回洗浄後、オートラジオグラフィーに供し、正常軟骨組織におけるオートラジオグラフィーと対比することができる。
【００７１】
【配列表】
0004169637.tif 000003
0004169637.tif 000004
0004169637.tif 000005
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【００７２】
【発明の効果】
本発明によりCSEを用いた軟骨型フィブロネクチンの検出方法、該方法を用いた腫瘍検出方法が提供される。
【００７３】
【図面の簡単な説明】
【図１】  各種脂質結合GAGと様々な構造のFNとの結合性を示す図である。図中、白いバーはrFN/OのGAGへの結合性を示し、左下から右上に向かう斜線のバーはrFN/CmのGAGへの結合性を示し、横縞のバーはrFN/CのGAGへの結合性を示し、左上から右下へ向かう斜線のバーはrFN/ACのGAGへの結合性を示し、黒塗りのバーはrFN/BCのGAGへの結合性を示し、市松模様のバーはrFN/BACのGAGへの結合性を示す。また、図中CSAはコンドロイチン硫酸Ａを示し、CSBはコンドロイチン硫酸Ｂを示し、CSCはコンドロイチン硫酸Ｃを示し、CSDはコンドロイチン硫酸Ｄを示し、CSEはコンドロイチン硫酸Ｅを示し、HAはヒアルロン酸を示し、HSはヘパラン硫酸を示し、Hepはヘパリンを示す。
【図１】
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