(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセスであって、以下の工程：
a）プロテオソーム、透析可能な界面活性剤、および両親媒性決定因子の混合物を形成する工程、
b）該混合物をダイアフィルトレーションまたは限外濾過に供して該界面活性剤を除去することにより、両親媒性決定因子-プロテオソーム複合体を形成する工程、
c）両親媒性決定因子-プロテオソーム複合体形成の量をモニターする工程、および
d）該両親媒性決定因子-プロテオソーム複合体を回収する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項２】
前記限外濾過が、接線方向流を含む、請求項１に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項３】
前記限外濾過が、中空繊維カートリッジ、プラットフォームメンブレン、およびメンブレンカートリッジから選択されるシステムにおいて行われる、請求項１に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項４】
前記限外濾過システムが、10,000の公称分子量カットオフ（NMWC）孔サイズを有する中空繊維カートリッジである、請求項３に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項５】
前記限外濾過システムが、3,000の公称分子量カットオフ（NMWC）孔サイズを有する中空繊維カートリッジである、請求項３に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項６】
浸透する試料の継続的な測定によって透析可能な界面活性剤をモニターする工程をさらに包含する、請求項１に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項７】
前記モニターする工程が、透過物試料または滞留物試料の光学密度を測定する工程を包含する、請求項１に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項８】
前記モニターする工程が、透過物試料を、界面活性剤が存在する場合に、既知量のSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）と混合して沈澱を形成し、そして沈澱の量を決定することにより、界面活性剤除去の量を測定する工程を包含する、請求項１に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項９】
前記透過物中の前記界面活性剤が本質的に除去されたときに、プロテオソーム-両親媒性決定因子複合体が回収される、請求項８に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項１０】
前記界面活性剤がｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンである、請求項１に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項１１】
前記両親媒性決定因子がリポ多糖である、請求項１に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項１２】
前記リポ多糖がグラム陰性細菌から得られる、請求項１１に記載のプロテオソーム-リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項１３】
前記グラム陰性細菌がプレジオモナスである、請求項１２に記載のプロテオソーム-リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項１４】
前記プレジオモナスがプレジオモナスシゲロイデスである、請求項１３に記載のプロテオソーム-リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項１５】
前記グラム陰性細菌が赤痢菌属である、請求項１２に記載のプロテオソーム-リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項１６】
前記赤痢菌属が、フレクスナー赤痢菌、ソンネ赤痢菌、またはボイド赤痢菌である、請求項１５に記載のプロテオソーム-リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項１７】
前記グラム陰性菌がナイセリア属である、請求項１２に記載のプロテオソーム-リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項１８】
前記ナイセリア属が髄膜炎菌である、請求項１７に記載のプロテオソーム-リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項１９】
前記プロテオソームが、髄膜炎菌または淋菌に由来する、請求項１に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項２０】
前記プロテオソーム-両親媒性決定因子複合体の回収が、界面活性剤除去のモニターされた割合が減少している場合か、または一定の場合に、達成される、請求項１に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項２１】
請求項１に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセスであって、以下の工程：
e）前記回収されたプロテオソーム-両親媒性決定因子複合体を、生理学的に受容可能なキャリアと混合してワクチンを形成する工程、
をさらに包含する、プロセス。
【請求項２２】
プロテオソーム-両親媒性決定因子複合体を前記複合体の回収前に濃縮する工程をさらに包含する、請求項２１に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項２３】
前記濃縮が、所望の最終濃度まで継続される、請求項２２に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項２４】
前記プロセスが、種々の両親媒性決定因子を用いて行われて、一連の種々のプロテオソーム-両親媒性決定因子複合体が形成され、ここで該複合体は多価ワクチンを形成するように工程e）においてアセンブリされる、請求項２１に記載のプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項２５】
有効量でレシピエントに投与することによって疾患に対して防御するための、請求項２４に記載のプロセスに従って調製されるワクチン。
【請求項２６】
レシピエントに投与することによって疾患に対して防御するための、請求項２１に記載のプロセスに従って調製されるワクチン。
【発明の詳細な説明】
１．発明の分野
本発明は、粘膜投与および非経口投与のための、非共有結合的に複合体を形成した多価プロテオソームワクチンの産生方法および組成物に関する。
２．発明の背景
多価サブユニットワクチンが、その構成要素の各々に対する至適な免疫応答を刺激するためには、適切な構成要素が、適切に会合し、そして各々が免疫系に利用可能であるべきであり、これによりそれらが免疫系の細胞によって効率的に認識されそしてプロセスされ得る。このような非共有結合的に複合体を形成したワクチンの主要な例としては、ペプチド、リポペプチド、トランスメンブランタンパク質またはトキソイドタンパク質、多糖類またはリポ多糖類（LPS）（1987年６月23日に出願された米国特許出願第07/065,440号「Immunogenic peptide vaccines and methods of preparation」；1989年４月12日に出願された同第07/336,952号「Immunopotentiaing system for large proteins and polypeptides」；1992年10月８日に出願された同第07-958,426号「Oral or Intranasal Vaccines Using Hydrophobic Complexes Having Proteosomes and Lipopolysaccharides」；1993年３月11日に出願された同第08/029,666号「Immunopotentiating Systems for Preparation of Immunogenic Materials」；1993年10月29日に出願された同第08/143,365「Immunopotentiating Systems for Preparation of Immunogenic Materials」；1993年10月29日に出願された同第93/10,402号「Submicron Emulsions as Vaccine Adjuvants」；1994年５月18日に出願された同第08/063,613号「Solid Fat Nanoemulsions as Vehicles for Vaccine Delivery」、ならびに刊行物Orr, N., Robin, G., Cohen, D., Arnon, R.およびLowell, G. H.（1993）. Immunogenicity and Efficacy of Oral or Intranasal Shigella flexneri 2a and Shigella sonnei Proteosome-Lipopolysaccharide Vaccines in Animal Models. Infect. Immun. 61:2390; Mallett, C. P., T. L. Hale, R. Kaminski, T. Larsen, N.Orr, D. Cohen,およびG. H. Lowell. 1995. Intranasal or intragastric immunization with proteosome-Shigella lipopolysaccharide vaccines protect against lethal pneumonia in a murine model of shigellosis. Infect. Immun. 63:2382-2386.; Lowell GH, Kaminski RW, Grate Sら、（1996）Intranasal and intramuscular proteosome-staphylococcal enterotoxin B（SEB）toxoid vaccines: immunogenicity and efficacy against lethal SEB intoxication in mice. Infec. Immun. 64:1706-1713.; Lowell, G.H.（1990）Proteosomes, Hydrophobic Anchors, Iscoms and Liposomes for Improved Presentation of Peptide and Protein Vaccines. in New Generation Vaccines: G. C. WoodrowおよびM. M. Levine編（Marcel Dekker, NY）.第12章（141-160頁）およびLowell, G.H., W.R. Ballou, L.F. Smith, R.A. Wirtz, W.D. Zollinger and W.T. Hockmeyer. 1988. Proteosome-lipopeptide vaccines: enhancement of immunogenicity for malaria CS peptides. Science 240:800.）を含む種々の抗原と非共有結合的に複合体を形成した、ナイセリア属の外膜タンパク質プロテオソームからなり得るプロテオソームワクチンが挙げられる。
本明細書中に引用される全ての文献の内容は、明白に参考として援用される。
疾患に対して防御するためのワクチン投与における実際の適用については、個体が、種々の生物によって引き起こされる疾患の罹患（contraction）に感受性であるという事実に通常起因して、いくつかのこのような抗原を同時に送達することがしばしば必要である。さらに、いくつかの生物が、それらが互いに関連していてもいなくても、しばしば同一の場所に特有であり、そしてそれゆえ防御を必要とする個体は、いくつかの型のワクチンを接種する必要があり得る。
過去において、構成要素の非共有結合的複合体形成を必要とするワクチンの産生は、単純な透析を用いて達成されてきた。その透析においては、構成要素が透析可能な界面活性剤の存在下で透析用チューブに入れられ、その混合物は界面活性剤を除去する目的で７〜10日間透析される。このシステムの実施上の欠点は、以下を含むいくつかの理由によりこの技術の高度な開発および商業化をひどく妨害する傾向がある。１）時間：手順時間の長さ：ワクチンを透析している間にGMP供給源を何週間も用いる必要があることは、それにかかる過剰の費用およびこの長時間の間に起こる機械的もしくは生物学的な構成要素の分解もしくは汚染の機会を増大することの両方の理由により非実用的である。２）汚染：汚染の機会の増加：透析用チューブは滅菌することが難しく、透析用チューブは手で系を開けたり閉じたりすることを必要とし、それにより構成要素を入れるプロセスおよび取り出すプロセスの両方の間に、構成要素を汚染に曝す。チューブに入れる作業とチューブから取り出す作業との間に何日もあるので、プロセスの最初の日々における小さな混入の危険性が、何日もの透析の間に容易に拡大され得、この方法を実際的なワクチン製造のためには役立たないものにする。バッグに孔を開ける危険性は、産物が損失する結果となり得る。３）温度：関与する長期にわたる時間のために、この透析を４℃で行う必要性がある。４）透析する液体の容積：プロセスのスケールアップのためのワクチンを製造するために、多量の透析液の使用が必要である。なぜなら、透析チューブの外側の液体：透析用チューブの内側の液体の比、200:1が、代表的には要求されるからである。従って、例えば、試験用の２リットルのワクチンの産生には、チューブの外液を１日あたり400リットル、10日あたり4,000リットル必要とし、そして生産用の20〜200リットルの産生には、40,000〜4,000,000リットルを必要とする。これらの量は、本発明において使用する方法と比べて、浪費的でありそして非実践的である；多量の産物は問題が多いので、透析用チューブは計測不能である。そして５）ワクチンの効果を最大にするように界面活性剤の除去の完了を容易に測定することができない。透析用バッグは、200容積の緩衝液を含む容器の中に置かれるので、界面活性剤除去の継続的な測定は、実践的でなく、また実行可能でもない。そして６）さらに、好ましい実施態様において使用される界面活性剤、Empigen BBの存在の測定について記載されている方法はない。
本発明において解決される第２の問題は、多価ワクチンの産生および送達の方法の実証である。構成要素は、一緒にまたは別々にのいずれかで作製され、そして投与前に一緒に混合され得る。本発明は、このような多価ワクチンを調製するための至適な方法を実証する。
３．発明の要旨
本発明の主題は、非経口投与または特に粘膜投与のいずれかについて設計されたプロテオソーム-両親媒性決定因子ワクチンの産生および製造に広く関する。粘膜投与としては、呼吸性（例えば、鼻腔内、咽頭内、および肺内を含む）投与、胃腸性（例えば、経口または直腸を含む）投与、または局所性（例えば、結膜または耳を含む）投与が挙げられるがこれらに限定されず、これらは全身性（血清）抗体応答および粘膜性（呼吸性および胃腸性を含む）抗体応答の両方を誘導する。両親媒性決定因子は、疎水性および親水性の領域を有する分子であり、プロテオソームとともに適切に処方された場合には、プロテオソームと連携して、被験体に免疫応答を生じさせる複合体を形成する。代表的な両親媒性決定因子には、糖脂質、リポ糖類（無毒化されたリポ多糖類を含む）、リポペプチド、トランスメンブランタンパク質、エンベロープタンパク質もしくはトキソイドタンパク質、または内因性の疎水性アミノ酸アンカーを有するタンパク質もしくはペプチドが含まれる。これらの決定因子物質は、エシェリキア属、クレブシエラ属、シュードモナス属、ヘモフィルスブルセラ属、赤痢菌属、およびナイセリア属を含むグラム陰性細菌から得られ得る。より詳細には、本発明は、プロテオソームワクチンに関する。このプロテオソームワクチンにおいては、髄膜炎菌性の外膜タンパク質プロテオソーム調製物（髄膜炎菌（N. meningiditis）または淋菌（N. gonorrhea）、もしくは他のナイセリア属の種の任意の株から調製される）が、天然のまたは無毒化された赤痢菌またはナイセリア属のリポ多糖類もしくはリポオリゴ糖類と非共有結合的に複合体化し、その結果、髄膜炎菌または赤痢菌を含む複合体の、任意の構成要素部分を含むグラム陰性生物によって引き起こされる疾患に対して防御するように設計されたワクチンを形成する。より詳細には、本発明は、赤痢菌リポ多糖類の型特異的菌体（somatic）多糖Ｏ抗原を認識し、それにより細菌性赤痢に対して同一防御を与える抗体応答を誘導するLPSを含むプロテオソームワクチンに関する。なおより詳細には、プロテオソームと複合体化する場合、このような抗赤痢菌防御性免疫応答を誘導するリポ多糖類は、相同な生物または抗原的に交差反応する生物由来のLSPを用いて、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）病に対する免疫についてソンネ赤痢菌またはプレジオモナスシゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）のいずれかから、フレクスナー赤痢菌2a（Shigella Flexneri 2a）病に対する免疫についてフレクスナー赤痢菌2aから調製および精製され、フレクスナー赤痢菌2a（または3aなど）、ボイド赤痢菌（S. boydii）、ソンネ赤痢菌（S. sonnei）などによって引き起こされる細菌性赤痢に対する同一免疫を与える。なおより詳細には、本発明は、フレクスナー赤痢菌2a（フレクスナー赤痢菌2a病について）、およびプレジオモナスシゲロイデスまたはソンネ赤痢菌（ソンネ赤痢菌病について）由来の赤痢菌LPSを用いて独立に作製された、２つのプロテオソームワクチンが、一緒に投与され、それにより２つの生物を認識する抗体を誘導し、それにより２つの型の疾患に対しての防御を与える点において多価であるプロテオソーム-赤痢菌ワクチンの首尾良い投与を記載する。最も詳細には、本発明は、プロテオソー���-赤痢菌LPSワクチンに関し、グループＢ2b型髄膜炎菌由来のプロテオソームが、中空繊維ダイアフィルトレーション技術を用いてプレジオモナスシゲロイデスLPSと複合体化し、粘膜経路、呼吸経路、および/または胃腸経路により投与され、ソンネ赤痢菌の菌体Ｏ抗原LPSを認識し、それによりこの生物によって引き起こされる細菌性赤痢に対して防御する抗体を誘導するワクチンを産生する。他の従来の限外濾過/ダイアフィルトレーション（例えば、プラットフォームメンブレンおよびメンブレンカートリッジ）が、考察される。
本発明は、非共有結合的に複合体化したワクチンを、以下に記載する様式で産生する方法論を提供する；１）必要な時間を減少させる、２）汚染の機会を減少させる、３）このようなワクチンが産生され得る温度を室温にまで上昇させる、４）最小限の試薬の使用を必要とするように、産生プロセスの効率的なスケールアップを可能にする、５）透析物の信頼のおけるそして効率的なサンプリングを可能にし、界面活性剤の除去速度を反復的に測定し得、そうして作業の効率を至適化する。これは、ワクチンの複合体化の効率を直接増大させ、その結果より低い用量で測定可能により大きな免疫原性を有するワクチンを産生する。このようにして、産物の全体の質が顕著に増強される。６）さらに、好ましい実施態様において使用される界面活性剤、Empigen BBの存在を測定する方法が記載される。他の透析可能な界面活性剤が、Empigen BBの代わりに使用され得る。さらに、本発明の方法を用いて、ワクチンが、ワクチン免疫原性により測定される至適なワクチン効力を保持する様式で凍結乾燥、そして再水和され得る。
本発明の方法は、界面活性剤の除去によって複合体化をもたらすための中空繊維限外濾過/ダイアフィルトレーションカートリッジの使用を包含する。カートリッジのハウジングの大きさを変えることにより、多くのワクチンを産生するための透析時間が＞７〜10日から72時間未満に、そして通常48または24時間未満に減少され得る。この短時間が用いられるので、産物のプロセスまたは完全性を損なわずに反応温度を４℃から通常の室温にまで上昇させ得る。プロセスは約20℃で行われたが、０℃〜40℃の間の温度が意図される。このシステムは閉鎖されるので、汚染の可能性が高度に減少される。さらに、ハウジングの大きさを増大することにより、非常に大量の材料が、比較的短時間内に処理され得、それにより商業的開発のための手順の効率的なそして再現性のあるスケールアップを可能にする。さらに、透過物が界面活性剤の除去を測定するために反復的にサンプルされ得る。これは、界面活性剤Empigen BB（好ましい実施態様において使用される界面活性剤）の存在を測定するための本発明の試験を用いて達成され得る。本発明の方法論の独自性は、実験での評価が必要であった。なぜなら、定常的な透析用バッグを用いて７〜10日間かけてゆっくりと透析することによって達成された免疫原性物質へのワクチンの複合体化および構造が、中空繊維技術（ここでは、複合体化される部分が、定常的な透析用チューブの流速に比べて非常に高い流速でチューブを通して移動している）を用いる際に、匹敵され得るかまたは改善され得るかが明白ではなかったからである。
用いたメンブレンの見かけの分子量カットオフが、1,000、3,000、5,000、10,000、30,000、50,000、またはそれより大きいものから選択され得るので、非共有結合的に複合体化されるべき構成要素の大きさに依存して、このシステムは、天然または無毒化されたリポ多糖類、脂質、ペプチド、リポペプチド、リポ糖類、多糖類、ガングリオシド、またはトランスメンブランタンパク質、エンベロープタンパク質もしくは天然のタンパク質もしくはトキソイドタンパク質を、互いに、またはプロテオソームの髄膜炎菌外膜タンパク質調製物に複合体化させることに容易に適応可能である。
得られる産物は、非経口的に、または粘膜から（すなわち、呼吸管または胃腸管を介して、例えば、鼻腔内から、経口的に、口咽頭吸入により、局所的に、または直腸から）のいずれかで投与されるワクチンとして使用され得る。記載される実施例において、プロテオソームは、プレジオモナスシゲロイデスLPSと非共有結合的に複合体を形成し、ソンネ赤痢菌性赤痢に対する防御のために必要な抗ソンネ赤痢菌LPS応答を誘導するワクチンを形成する。
本方法論は、３つの段階を有する：予備的作業；プロテオソームと両親媒性決定因子（例えば、プレジオモナスシゲロイデスLPS）との複合体化；その後の滅菌濾過。
多価ワクチンを至適に送達するために、本発明は最良の方法が、特定のワクチンを独立に作製し、次いで２つの個々に作製されたワクチンを用いて、同日にそれぞれ至適な濃度で免疫することであることを示す。非共有結合的複合体の形成される間にハイブリッドワクチンを作製するような他の可能性もまた、達成されているか、または考慮されている。
【図面の簡単な説明】
図１：プロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPSワクチンでの鼻腔内免疫：いくつかの調製物によって減少された用量で誘導された血清IgG応答。
図２：プロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPSワクチンでの鼻腔内免疫：いくつかの調製物によって減少された用量で誘導された血清IgA応答。
図３：プロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPS（ソンネ赤痢菌について）とプロテオソーム-フレクスナー赤痢菌2aワクチンとの一緒の同日のまたは同週間隔での投与により、ソンネ赤痢菌およびフレクスナー赤痢菌2aLPS構成要素の両方に対する良好な免疫原性が生じる。
図４：赤痢菌LPSのプロテオソームビヒクルとの会合を示す、プロテオソーム-赤痢菌LPSワクチンのイムノゴールド標識された電子顕微鏡写真。
図５：プロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPSワクチンは、細菌性赤痢の動物モデルにおける致死のソンネ赤痢菌肺炎に対して防御する。
図６：プロテオソーム-フレクスナー赤痢菌2aLPSワクチンを用いた鼻腔内免疫または経口免疫は、免疫後30〜60日間持続し得る、抗赤痢菌属LPS IgGおよびIgAを血清中に、ならびにIgAを腸および肺の洗浄液中に誘導する。
図７：異なる量のワクチンを用いた、ソンネ赤痢菌についてのプロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPSワクチンの１または２用量でのヒトの鼻腔内免疫または経口免疫：抗赤痢菌属LPS IgA、IgG、およびIgM末梢血液ASC応答、ならびに血清、唾液、および尿抗体応答の誘導。
図８：複合体化されていないプレジオモナスシゲロイデスLPSの適用後のHPLC画分中のLPS、ならびにプロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPSワクチンの適用後のHPLC画分中でのLPSとタンパク質との同時溶出によるLPSとプロテオソームタンパク質との非共有結合複合体の実証。
図９：髄膜炎菌外膜タンパク質-無毒化リポオリゴ糖ワクチンに対するマウスの殺菌性の抗体応答、髄膜炎菌株9162に対する相反力価の相乗平均。
５．発明の詳細な説明：
実施例１
本実施例は、約２〜３グラムのタンパク質を含むプロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスワクチンの産生について詳述する。手順は、メンブレンカートリッジのハウジングの大きさの適切なスケールアップおよび容量の適切な増加を伴って、10〜1000倍多い材料を用いたスケールアップについても、等しく適用可能である。複合体化されるべき抗原を保持するために適切な大きさの分子量カットオフを有する、適切な大きさのメンブレンを用いて、本実施例の手順は、プロテオソームと、他の天然もしくは無毒化されたリポ多糖類、脂質、ペプチド、リポペプチド、リポ糖類、多糖類、ガングリオシド、またはトランスメンブランタンパク質、エンベロープタンパク質もしくは天然のタンパク質もしくは無毒化されたタンパク質との、互いとの、あるいはプロテオソームの髄膜炎菌外膜タンパク質調製物との複合体化にも等しく適用可能である。Empigen BBは、本実施例の手順において例として使用される界面活性剤である；本実施例の手順は、構成要素を可溶化する任意の透析可能な界面活性剤に、等しく適用可能である。本実施例の手順は、A/G technologyのカートリッジを使用するが、任意のブランドのカートリッジタイプの限外濾過/ダイアフィルトレーションシステムに等しく適用可能である。
5.0.0.1  予備的作業
5.0.0.1.  30％ Empigen BB（これは、本実施例のプロセスにおいて用いられる界面活性剤である）のストック溶液を滅菌濾過する。
5.0.0.2.  ２×TEEN/２％Empigen BB（0.1M Tris、0.02ＭナトリウムEDTA、0.3Ｍ塩化ナトリウム、WFI、および２％Empigen BB、pH 8.0）を調製する。
5.0.0.3.  0.05Ｍ Tris、0.15Ｍ塩化ナトリウム（pH 8.0）を含むTNS（Tris Normal Saline）の溶液150Ｌを、界面活性剤を透析除去する目的で調製する。
5.0.0.4.  UFカートリッジ洗浄のために、10リットルの水酸化ナトリウムを調製する。
5.0.0.5.  必要な量のフレクスナー赤痢菌2aリポ多糖（LPS）を解凍する。
5.0.1.  プロテオソームとフレクスナー赤痢菌2a LPSとの複合体化
5.0.1.6.  等容量の２×TEEN緩衝液をLPSの容量に添加し、そして十分に混合する。
5.0.1.7.  ある量のバルクプロテオソームを解凍し、mgで測定し、工程５で解凍したLPSの量に等しくする。
5.0.1.8.  このプロテオソームに、１リットルあたり30mlの滅菌濾過したEmpigenを添加する。十分に混合し、そして工程５からのLPSと混ぜ合わせる。
5.0.1.9.  両方の構成要素を十分に混合する。通常、撹拌プレート上での15分間と撹拌棒の組合せが適切である。
5.0.1.10.  プロテオソーム複合体が形成され得るように界面活性剤を透析除去するために、10,000の見かけの分子量カットオフ（NMWC）孔サイズを有する、滅菌されたシリコンチューブおよび蠕動ポンプに連結された中空繊維カートリッジ（A/G Technology, Inc.によって製造される）を用いて、限外濾過システム（接線方向流技術に基づく）をセットアップする。衛生圧力計をカートリッジの入水口側および出水口側に取り付け、作業の間中圧力をモニターする。背圧バルブを、背圧を調節するためにカートリッジの出水口側に取り付ける。
5.0.1.11  限外濾過システムを、温度50℃で60分を超える時間、WFIおよび0.5Ｎ NaOHで洗浄しそして衛生化する。このシステムを、使用前に、WFIでフラッシュし、そしてTNS緩衝液で平衡化する。
5.0.1.12.  入水口の液体を容器から吸引し、そして回復（return）滞留物を同じ貯蔵槽に戻すように、滅菌貯蔵槽容器を並べて配置する。液体が、カートリッジメンブレン（浸透または濾過）を通過したら、TNS緩衝液を、直接添加することによるか、または連続的給送システムによるかのいずれかで補充する。試料貯蔵槽へのTNS緩衝液を含む容器にシリコンチューブを連結することにより、連続的給送システムをセットアップし、次いで試料貯蔵槽を密閉する。液体が濾過により試料貯蔵槽から除去されるにつれ、真空が形成され、「TNS」緩衝液がその容器から試料貯蔵槽に吸引される。システムが密閉されたままであれば、貯蔵槽の試料のレベルは一定に保たれる。
5.0.1.13.  ダイアフィルトレーションを開始するために再循環ポンプを始動する。ポンプスピードおよび背圧バルブを調節し、15±４psiの背圧を得る。
5.0.1.14.  Empigen Precipitin Testを用いて、10〜15リットル毎に取り出される透過物試料を試験することにより、Empigen BBの累進的除去を評価する。この試験は、チェッカーボード型のアッセイを形成するために、透過物および既知量のEmpigen BBを含む標準溶液の連続希釈を作製し、溶液を酸性化するためにHClを添加し、次いでSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）の連続希釈を添加することからなる。EmpigenとSDSとの等量が存在する場合に、最大量の沈殿物が形成される。このようにして、最大量の沈澱物が形成されるSDS、透過物、および標準の希釈を記録することにより、存在するEmpigenの量を定量し得る。ダイアフィルトレーションが進行するにつれ、Empigenの量がより少なくなり、そしてより少ないSDSを含むチューブが、最大量の沈澱物を有するチューブである。分光光度計を用いてODを600nmで測定することにより、沈殿物の存在を定量する。
5.0.1.15.  本実施例で使用した構成要素の量を得るには、少なくとも120リットルの透過物を処理し、そしてEmpigen Precipitin Testにおいて顕著に沈殿物がなくなる（最大OD 600nmが0.05よりも低い）まで、ダイアフィルトレーションを続ける。
5.0.1.16.  透析が完了した後、最終容量が6.0に近いOD280値を得るように、産物を濃縮する。システムを排水し、そして300〜400mlの「TNS」緩衝液で洗浄する。システムを再び排水し、そして両方のプールを合わせる。多量のWFIを再循環させ、その後50℃で、＞60分間、0.5Ｎ NaOHを再循環させることにより、カートリッジを洗浄する。NaOHをWFIですすぎ出し、そして0.01Ｎ NaOH中にシステムを保存する。
5.0.2.  滅菌濾過
5.0.2.17.  所望ならば、複合体を滅菌濾過し得る。0.22μ濾過の前または後に、プロテオソーム濃度を調節し得る。滅菌濾過は、Millipore Corpからの濾過ユニットを用いて通常行われる。これらのユニットは、Milliparksと呼ばれ、種々のサイズがある。濾過されたバルクを、充填作業まで４℃で貯蔵し、そして無菌性について試験する。
5.0.3.0  特定の目的：髄膜炎菌外膜タンパク質プロテオソームのバルクGMP調製物と、フレクスナー赤痢菌2aリポ多糖とを合わせ、界面活性剤を除去することにより非共有結合複合体にする。
5.0.3.1  適用：このGMP手順により、フレクスナー赤痢菌2a感染に対するワクチンとして使用するための、プロテオソームとフレクスナー赤痢菌2aリポ多糖との非共有結合複合体のバルク調製物形成の産生が生じる。
実施例２
バルク髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）株9162の精製外膜タンパク質（プロテオソーム）と、8532株から精製されたアルカリで無毒化した髄膜炎菌L8リポオリゴ糖との非共有結合複合体形成。
5.1.0  バルク9162外膜タンパク質（プロテオソーム）ロット0136、およびバルク無毒化された髄膜炎菌L8リポオリゴ糖（LOS）ロット0203を、貯蔵から取り出し、そして室温で解凍した。500mgのLOSを含む滅菌蒸留水中のバルクLOSの容量（182ml）と、0.05Ｍ Tris-HCl、0.15Ｍ NaCl、0.01Ｍ EDTA、および0.1％ Empigen BBを含む緩衝液中のタンパク質400mgを含むバルクプロテオソームの容量（306ml）とを合わせた。
5.1.2  0.22μmの孔サイズのフィルターを通してEmpigen BB（30％溶液）を滅菌濾過し、そして60分の１容量を、プロテオソーム、LOS混合溶液に添加し、そして室温で１時間撹拌した。
5.1.3  界面活性剤緩衝液溶液を、プロテオソーム、LOS溶液から除去し、そして3000分子量カットオフ孔サイズを有するA/G Technology限外濾過カートリッジUFP-3-C-6を用いた限外濾過により、滅菌蒸留水と交換した。
5.1.4  装置のセットアップ、衛生化、洗浄、洗浄、および清浄の手順は、実施例１に記載のものと同一であった。入水口の圧力は、15±４PSIであり、そして透過流速度は、175ml/分であった。
5.1.5  毎３〜４リットル後に、実施例１に記載の沈澱方法によって、Empigen BB界面活性剤の存在について透過物を試験した。試験において得られる沈殿物がなくなるまで、そしてさらに５リットル、限外濾過を続けた。総計37リットルの透過物を、回収した。
5.1.6  滞留物は清澄で、そしてこれをタンパク質およびLOSについてアッセイされた0.22μm孔サイズフィルターを通して滅菌濾過し、そしてバルク産物として４℃で保存した。
5.1.7  バルク産物を、0.2mg/mlのタンパク質濃度に希釈し、そしてNaClの濃度を0.15Ｍに調節した。0.01％のチオメルサール（Thimerasol）を防腐剤として添加し、そして得られるバルクを滅菌条件下で最終容器バイアルに分け、標識し、そして-70℃で保存した。
5.1.8  生理食塩水溶液として与えられ、そしてアジュバントとしての水酸化アルミニウムゲルに吸収された場合の、免疫原性について、この産物をマウスにおいて試験した。結果を以下の表１に示し、これはワクチン複合体がマウスの腹腔内に与えられた場合に免疫原性であったことを示す。
0004033489.tif 000002
5.1.9  プロテオソームのLOSとの複合体化を、プロテオソームおよびLOS構成要素のカラムクロマトグラフィーにより、複合体化前および後に評価した（図９）。バルク髄膜炎菌L8 LOSおよび最終プロテオソーム/LOS複合体のSephacryl S300低圧カラム上でのクロマトグラフ分析。カラムを0.05Ｍ Tris-HCl、0.01Ｍ EDTA、0.15Ｍ NaCl緩衝液中で流した。タンパク質のアッセイは、280nmでの吸光度によった。そしてLOSのアッセイは、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）の阻害によった。ELISAにおいて、プラスチックプレートに吸収された精製L8 LOSに結合するL8モノクローナル抗体が、Sephacrylカラムからの画分の連続希釈により阻害された。複合体形成前に、LOSは39番目の画分に中心のある広がったピークにおいてカラムから溶出した。複合体形成の後、LOSを、33番目の画分にほぼ中心のあるピークにおいてプロテオソームとともに溶出した。
5.1.10  特定の目的：髄膜炎菌外膜タンパク質プロテオソームのバルクGMP調製物と、無毒化された髄膜炎菌リポ多糖とを合わせて、界面活性剤の除去により非共有結合複合体を形成させる。
5.1.11  適用：  本実施例のGMP手順により、髄膜炎菌感染に対するワクチンとしての使用のためのプロテオソームと無毒化された髄膜炎菌リポ多糖との非共有結合複合体のバルク調製物の形成が産生される。
実施例３
本実施例もまた、プロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスワクチンの産生に関する。手順は、メンブレンカートリッジのハウジングサイズの適切なスケールアップおよび容量の適切な増加を伴って、10〜1000倍多い材料を用いてスケールアップに等しく適用可能である。
5.8.1  25mLの滅菌濾過したEmpigen BB（30％溶液）の調製。
5.8.1.1  0.2μ孔サイズのメンブレンフィルターを有する100ml Nalgeneディスポーザブルフィルターユニットを用いて、約25mlのEmpigen BB（30％溶液）を滅菌濾過する。
5.8.2  ２％Empigen BBを有する４ＬのTEEN ２×（0.1Ｍ Tris、0.02Ｍ EDTANa2、0.3Ｍ NaCl、WFI、および２％Empigen BB溶液からなる）の調製。
5.8.3  「TNS」の10Ｌ溶液を15倍、合計150リットルに調製する：TNSは、0.15Ｍ NaCl、0.05Ｍ Tris緩衝液（pH 8.0±0.2）からなる。
5.8.4  10lの0.5Ｎ NaOHを調製する。
5.8.6  必要ならば、バルクプレジオモナスシゲロイデスリポ多糖（LPS）を解凍し、プロテオソームとの複合体化のために調製し、そしてロット番号およびLPSの濃度、LPSのmgでの必要量および除去すべきLPSの計算された容量を記録する。
5.9.0  プロテオソームとプレジオモナスシゲロイデスLPSとの複合体化
5.9.1  複合体化のためのLPSの調製
5.9.1.2  バルクLPSのアリコートを、清潔な、滅菌した、目盛りを付けた５Ｌのボトルの中へプールする。総容量を測定し、そしてLPSの総量を決定する。
5.9.1.3  工程5.9.1.2で使用したLPSの容量と等容量の２×TEEN緩衝液を添加し、合わせた総容量を測定し、次いで、撹拌棒を入れて撹拌棒と撹拌プレートとの組合せで15±2分間混合する。
5.9.2  複合体化のためのプロテオソームの調製
5.9.2.1  総時間を記録し、もしあれば、プロテオソームを解凍する。
5.9.2.2  バルクプロテオソームのアリコートを、清潔な、滅菌した、１Ｌのメスシリンダー中にプールする。総容量を測定し、そしてプロテオソームの総量を決定する。
5.9.2.3  工程5.9.2.2のシリンダーから、別の清潔な、滅菌した、１Ｌのメスシリンダーに、工程5.9.1.2で用いたLPSのmg量と等しいmg量を含むプロテオソームの容量を移す。
5.9.2.4  プロテオソームを含むシリンダーに、１Ｌのプロテオソームあたり30mlのEmpigen BBを用いて、0.22μ濾過した30％Empigen BBを添加する。撹拌棒で15±2分間混合する。
5.9.3  プロテオソームとプレジオモナスシゲロイデスLPSとの混合
5.9.3.1  撹拌棒で穏やかに撹拌しながら、工程5.9.3.2からのプロテオソームを、LPSの入った目盛りの付いた５Ｌのボトルに添加し、そして15±2分間撹拌する。
5.9.3.3  １mlサンプルを４つ取り出し、そして後のローリー法によるタンパク質およびKDOアッセイによるLPSの濃度の測定のために-75℃で保存する。
5.9.4  限外濾過/ダイアフィルトレーションによる界面活性剤の除去
5.9.4.1  Ultrafiltration System Details System：A/G Technology, Inc.中空繊維カートリッジ、10,000NMWC孔サイズ、ハウジングサイズ６、限外濾過カートリッジ。
注：グリセロールをフラッシュするように新しいカートリッジを調整することが必要である。これは、６リットルのWFIを６sq/ftカートリッジまたはそれ未満を通して背圧無しでフラッシュすることにより行い得る。透過物溶液は、貯蔵槽を補給するために再利用されるべきではない。
注：全ての限外濾過工程は、その後、洗浄、衛生化、および貯蔵工程が続く。新しいカートリッジは、使用前に清浄および衛生化されていなければならない。
5.9.4.2  A/G限外濾過システムをセットアップしそして衛生化する。システムを、50±５℃の初期温度で最低60分間２〜３リットルの0.5Ｎ水酸化ナトリウムで再循環することにより、清浄および衛生化する。システムを４〜５リットルのWFIでフラッシュし、その後、２〜３リットルの「TNS」（0.05Ｍ Tris/通常生理食塩水緩衝液（pH 8.0±0.2）を少なくとも20±５分間再循環する。
5.9.4.3  液体で満たした入水ラインと出水ラインを貯蔵槽から取り出し１リットルのメスシリンダー内に移し、そしてUFシステムが空になるまでポンピングすることによって、UFシステム（チューブを含む）で保持し得る容量（hold up volume）を測定する。
5.9.4.4  ２リットルのサイドアームの付いた容器を平皿（pan）の中に置き、そしてダイアフィルトレーション手順の持続時間の間ウェットアイスで容器を包む。
5.9.4.5  1.7〜1.9Ｌの工程5.9.3.3からのバルクプロテオソーム-LPS混合物を、２Ｌのサイドアームの付いた容器中に移す。２つの10mlピペットを取り付けた２つ穴のストッパーを、容器の上に置き、そしてダイアフィルトレーションシステムからの入水口および出水口チューブを容器のピペットに連結する。
5.9.4.6  再循環ポンプのスイッチを入れ、そしてポンプの設定を４〜６に調節する。背圧クランプを調節して15±４psiの入水圧を得る。1.0±0.1Ｌの総容量（保持容量を含む）まで濃縮する。
5.9.4.7  工程5.9.3.3からの１±0.1Ｌの混合物を２Ｌのサイドアームの付いた容器に移し、そして工程5.9.4.6を反復する。
5.9.4.8  工程5.9.3.3からの全てのプロテオソーム-LPS混合物が２Ｌのサイドアームの付いた容器へ移され、そして保持容量を含む滞留物容量が1.4±0.2Ｌになるまで、工程5.9.4.7と同様に混合物を移し、そして工程5.9.4.9として濃縮を続ける。
5.9.4.10  液体が膜を通して取り除かれるにつれ、TNS（0.05Ｍ Tris、通常生理食塩水）が２リットルのサイドアームの付いた容器中に連続して供給されるように、限外濾過装置をセットアップする。TNSを含み、ボトルの底に伸びるチューブを取り付けた10リットルのボトルを用いて、貯蔵槽をセットアップする。限外濾過システムからの入水および出水ラインを連結する。再循環ポンプのスイッチを入れ、そしてポンプのセッティングを４〜６に調節する。背圧クランプを調節し15±４psiの入水圧を得る。
5.9.4.11  UFユニットにおいて透過物の流速を測定し、そして測定をするときの入水圧を記録する。
5.9.4.12  15〜20mlの透過物のサンプルを、12±５リットルが処理される毎に回収し、インハウス（in-house）標識（「透過物 NO. P1、P2、P3など」）を適用し、そして時間、処理された容量、およびサンプルの最大O.D.600を記録する。Empigen Precipitin Testを用いてEmpigen BBの存在についてサンプルを試験することにより、Empigenの累進的除去を評価する。この試験は、チェックボード型のアッセイを形成するために、透過物および別に既知量のEmpigen BBを含む溶液の連続希釈を作製し、溶液を酸性化するためにHClを添加し、次いでSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）の連続希釈を添加することからなる。最大沈澱は、等量のEmpigenとSDSが存在するときに形成される。このようにして、存在するEmpigenの量は、沈澱が形成される透過物およびSDSの希釈を記録し、そしてこれらの希釈を標準希釈と比較することにより定量され得る。ダイアフィルトレーションが進行するにつれ、Empigenの量はより少なくなり、そしてより少ないSDSを含むチューブは、最大沈澱を有するチューブである。沈澱の存在は、分光光度計を用いて600nmでのODを測定することにより定量する。
本実施例において使用した構成要素の量を得るには、少なくとも120リットルの透過物が処理され、そしてEmpigen Precipitin Testにおいて有意な沈澱がなくなる（最大OD 600nmが、0.05未満）まで、ダイアフィルトレーションを続ける。
5.9.4.13  500±50mlの最終滞留物容量（保持容量（工程9.4.3）を含む）まで産物を濃縮する。0.5mlのサンプルを除去し、サンプルを１：10に希釈し、そしてO.D.280を測定する。
5.9.4.14  濃縮された滞留物の所望の最小O.D.は、5.7である。O.D.が5.7未満の場合は、400±50ml（保持容量（工程5.9.4.3）を含む）まで濃縮を続け、そしてO.D.280を繰り返す。
5.9.4.15  滞留物ラインを滞留物溶液の外に出し、そして濾過物出水ラインを閉鎖して、カートリッジおよびラインが空になるまで逆方向にゆっくりポンピングする。供給ラインおよび滞留物ラインを、滞留物ボトルから350±50mlのTNSを含む新しい清潔な容器に移す。ポンプを逆流させそしてTNSを２〜３分間ゆっくりと再循環する。
5.9.4.16  TNSを再循環させた後、ポンプを止め、システムを排水し、滞留物洗浄溶液を、清潔な、滅菌した、１Ｌのメスシリンダーに収集し、そして容量およびO.D.280を測定する。
5.9.4.17  元の滞留物溶液（工程5.9.4.12または5.9.4.13）を洗浄滞留物溶液（工程5.9.4.15）と合わせ、そして滞留物の最終容量を測定する。滞留物バルクを無菌濾過まで４℃±２℃で保存する。
5.9.4.18  WFI、続いて0.5Ｎ水酸化ナトリウムを用いて濾過ユニットを、始め50±５℃で最低60分間洗浄する。洗浄剤をWFIですすぎ出し、次いで保存剤として３〜４リットルの0.1Ｎ NaOHでフラッシュする。
5.9.5  滅菌濾過
所望ならば、複合体を滅菌濾過し得る。バルク複合体化プロテオソームおよびLPSを得、そして沈澱または混濁のあらゆる存在について検査する。バルク複合体化産物が透明ならば、Millipak 40（0.22μ濾過ユニット）を用いてそれを無菌濾過し、滅菌した、脱パイロジェン化した（depyrogenated）容器に入れる。この工程はSterile Cabinetにおいて行う。
5.9.6  特定の目的：髄膜炎菌外膜タンパク質プロテオソームのバルクGMP調製物と、プレジオモナスシゲロイデスリポ多糖（ソンネ赤痢菌についての）のバルクGMP調製物とを合わせ、界面活性剤を除去することにより非共有結合複合体にする。
5.9.7  適用：このGMP手順は、ソンネ赤痢菌感染に対するワクチンとしての使用のための、プロテオソームとプレジオモナスシゲロイデス2aリポ多糖との非共有結合複合体のバルク調製物形成の産生をもたらす。
5.10  免疫原性研究：
5.10.1  中空繊維限外濾過/ダイアフィルトレーションを用いたプロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPSワクチンの免疫原性。
図１および図２は、界面活性剤を除去しそして複合体化を容易にするために中空繊維（HF）ダイアフィルトレーション技術（HF-1、HF-2、およびGMP/HF-3）を用いて作製された３つの異なるプロテオソーム-赤痢菌LPSワクチン調製物が、試験された最も低い、最もストリンジェントな用量で、単純な透析用チューブ（DT）を用いて作製された調製物よりも効果的であることを実証する。すなわち、より強いIgG（図１）およびIgA（図２）免疫応答が、より古い、より非効率的な技術によって産生されたワクチンよりも、本発明を用いて産生されたワクチンにより誘発された。より強い免疫応答は、よりよいレベルの防御をもたらすので、これらのデータは、本発明が、作製するのにより効率的なだけでなく、より強力なワクチンを生ずることを明らかに示す。さらに、最も低い用量（0.1μg/用量）で投与された場合に、より強力な応答がこのワクチンによって誘発され、これにより、より古い技術を用いて必要とされるよりも少量のワクチンが、本発明を使用して必要とされることが示される。多価ワクチンの形成において多くの異なる抗原を必要とするので、投与されるワクチンの総量を最小化するためには、より低い用量で効果的なワクチン構成要素を用い得ることは非常に有利である。従って、中空繊維技術を用いてワクチンを産生する本発明の技術は、広範な特異性を有する多価ワクチンを処方する能力に直接影響し、そしてそれを促進する。ワクチンの商業的開発にとってワクチンを凍結乾燥し得ることは有利であるので、水溶液からのHFワクチン複合体の凍結乾燥が、驚くことに試験された全ての用量のうち最も高いものであった応答を常に誘発したワクチンを生じたことを見出したことを本発明者らはうれしく思った。従って、HF技術により作製された0.1μgのワクチン（凍結乾燥を伴うか、または伴わない）が投与された場合、抗LPS IgG（図１）およびIgA（図２）のより高い免疫原性が見出された。本発明のスケールアップおよびGMP手順は、HF技術を用いたので、これらのデータはGMP/HF-3を表す網目状の陰影を付けたバーにより図１および図２に示されるように有意である。
5.10.2  多価ワクチンを用いた免疫原性研究
図３に示すように、プロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPS（ソンネ赤痢菌について）およびプロテオソーム-ソンネフレクスナー赤痢菌2aワクチンの同日または同週間隔での投与は、両方のLPS構成要素：ソンネ赤痢菌LPSおよびフレクスナー赤痢菌2aLPS、に対する良好な免疫原性を生じる。
5.11  プロテオソーム-赤痢菌属ワクチンの電子顕微鏡写真
赤痢菌属LPSとプロテオソームとの会合は、図４に示す電子顕微鏡写真にはっきりとそして劇的に示される。この図において、プロテオソーム粒子は、放射不透明の（radio-opaque）黒いドットでちりばめられている。これらの点は、特定の抗赤痢菌LPS抗体を認識する二次抗体に金ビーズで連結されている。従って、金のドットの存在は、赤痢菌LPSの存在を示す。観察されるように、金のドットは、プロテオソーム粒子を囲んでドットするので、プロテオソームに非共有結合的に連結したLPSを有するプロテオソームワクチンの画像が、これにより確認されそして視覚化される。驚くことに、本発明のHF技術を用いて作製されたワクチンの不変的な粒子的性質は、より古い技術を用いたDT調製物が電子顕微鏡により検査された場合には見出されない（結果を示さず）。
5.12  プロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPSワクチンは、赤痢菌の動物モデルにおいて、致死性のソンネ赤痢菌肺炎に対して防御する
図５において見られ得るように、プロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPSワクチンは、プレジオモナスシゲロイデスでの致死性の感染に対する非常に有意な防御を一貫して与えることが、動物が致死性の肺炎を誘導する生物で抗原投与された細菌性赤痢の動物モデルにおいて測定された。これらのデータはまた、プロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPSワクチンによって産生されたのは正確かつ防御的な抗体だけでなく、この鼻腔内サブユニットワクチンもまた致死性の肺炎に対して防御し得ることを実証する。
5.13  プロテオソーム-フレクスナー赤痢菌2a LPSワクチンでの鼻腔内免疫または経口免疫は、免疫後30〜60日間持続し得る、抗赤痢菌LPS IgGおよびIgAを血清中に、ならびにIgAを腸および肺洗浄液に誘導する。
図６に示すように、プロテオソーム-フレクスナー赤痢菌2a LPSワクチンでの２つの免疫化は、免疫後30〜60日間持続し得る抗体を、血清中ならびに肺および腸の分泌において誘導する。これらのデータは、プロテオソームワクチンが共通の粘膜性免疫系を刺激し、免疫化部位から離れた場所でさえも特定の抗体を分泌し得ることを示す。詳細には、鼻腔内免疫は、腸の分泌において抗体を誘導し得、そしてその逆も可能である。この能力は、身体全体への入口の粘膜の門脈を通して宿主を侵襲する病原体に対して防御するプロテオソームワクチンの潜在的有用性を拡張する。
5.14  図７は、異なるワクチン量を用いたソンネ赤痢菌についての１または２用量のプロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPSワクチンでのヒトのボランティアの鼻腔内または経口免疫後の、抗赤痢菌属LPS IgA、IgG、およびIgM末梢血ASC応答、ならびに血清、唾液、および尿のIgAおよびIgG抗体応答の誘導を示す。示すように、鼻腔内免疫は、用量依存性の様式で応答を誘発し、最も高い用量が６人全てのボランティアにおいて応答を誘導した。
IgA、IgG、およびIgM血清応答が、鼻腔内群の各々において誘発された。さらに、強力な抗体分泌細胞ASC応答が誘導され、これにより粘膜免疫が抗体分泌細胞（最も注目すべくはIgA分泌細胞）の輸送を刺激したことが示される。最も重要なことに、IgA応答がまた、唾液において、そして特に尿試料において見出され、これにより分泌性IgAが粘膜表面で産生されことが示される（IgAは腎臓を透過しないので、尿IgAは、抗体の局所分泌性IgAを反映し、およびこのような鼻腔内ワクチンはまた、局所的腸IgAを産生し、そして鼻腔内ワクチンは、グラム陰性生物によって引き起こされる尿管感染に対して防御するために用いられ得ることを示唆する）。これらのASCおよび抗体応答の大部分が、１回のみの免疫後に見出されたことは注目に値し、これは追加免疫が必要でないかもしれないことを示唆する。IgAおよびIgGのASCならびに尿IgAがまた、経口免疫後に見出された。経口投与の最も効果的な使用は、必要であれば、鼻腔内感作後の追加免疫としての使用であり得る。
5.15  多分子プロテオソームタンパク質とLPSとの非共有結合複合体化の実証を図８に示す。グラフは、非複合体化プレジオモナスシゲロイデスLPSの適用後のHPLC画分中のLPS（カラム溶出プロフィールのプロテオソーム-LPSワクチンを適用した場合とは異なる部分で起こる）を示す。プロテオソーム-プレジオモナスシゲロイデスLPSワクチン適用後のHPLC画分における、LPSとタンパク質との同時溶出を、プロテオソームの最も大きいタンパク質凝集体に対応するピークとともに示す。LPSを定量化するために阻害ELISAを用いて、そしてプロテオソームタンパク質を定量するためにA280でのODを用いてデータを測定した。HPLCカラムはTosohaas G50000Pwxlであった。そして分子量標準を矢印で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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