(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経シナプス結合後部のＰＳＤ形成に関与する蛋白質ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰと結合する蛋白質であって、配列番号１のアミノ酸配列からなるラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭ。
【請求項２】
請求項１のラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭをコードするラット遺伝子。
【請求項３】
請求項２の遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列からなるｃＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２のラット遺伝子の個体差に基づく多型遺伝子の発現産物であって、配列番号１のアミノ酸配列における１もしくは複数のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、神経シナプス結合後部のＰＳＤ形成に関与する蛋白質ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰと結合するラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭ。
【請求項５】
請求項３のｃＤＮＡを保有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項１または４のラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭに対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、神経シナプス結合後部のＰＳＤ形成に関与する蛋白質ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに特異的に結合する蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭに関するものである。さらに詳しくは、この発明は、ヒトの神経系の形成や発達、あるいは記憶、学習等のメカニズムの解明、さらには神経系の機能的または構造的障害を原因とする各種神経疾患の診断、予防および治療のための技術開発等に有用な新規の蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトをはじめとする多細胞生物の正常な機能維持には、秩序ある細胞接着とそれに引き続く細胞間の情報交換を支える細胞間結合の成立、さらにその細胞間結合を通じて受け渡しされる情報に基づいて引き起こされる細胞の分化といった一連の生命現象の時系制御が極めて重要である。
【０００３】
多細胞生物に認められる細胞間結合には多くの共通性が存在するが、一方で、細胞の種類による特異性も存在し、とくに神経シナプス結合は他の細胞間結合とは大きく異なる特徴を有している。第一に、神経シナプス結合は極性を有し、その前部と後部では構造が著しく異なる。前シナプス膜は神経伝達物質の放出に関わる構造を有するのに対し、後シナプス膜はpostsynaptic density (ＰＳＤ) と呼ばれる特異な細胞骨格構造を有している（Curr. Opin. Neurobiol. 3, 732-737, 1993; Trends Neurosci. 20, 264-268, 1997 ）。第二には、神経シナプス結合は一度成立した後にも神経刺激伝達に伴い結合の性状の変化（可塑性）を示すということである。この可塑性は、記憶・学習のメカニズムの基本を成す現象であると考えられており、正に神経シナプス結合を他の細胞間結合から際立たせる特徴である。可塑性のメカニズムの詳細は未だ明らかでないが、神経シナプス結合の前部に依存する前シナプス可塑性と、後部に依存する後シナプス可塑性の存在が知られている。いずれにしても神経シナプス結合の特徴的な構造が深く関与していることが予測され、この構造の解明が可塑性のメカニズム、さらには記憶・学習のメカニズム解明に必須であると考えられている。
【０００４】
効果的な神経伝達のためには、後シナプス膜において神経伝達物質受容体が正確な位置に存在することが必要であり、そのためにＰＳＤｓが重要な役割を果たしている。最近の研究から、ＰＳＤｓにおいて様々な受容体の蓄積とクラスタリングに機能する幾つかの分子が同定されている。例えば、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90とそのアイソフォーム（isoforms）はＮＭＤＡ受容体およびＳhaker 型Ｋ+ チャネルに結合し（例えば、Neuron 9, 929-942, 1993 ）、またＧＲＩＰおよびＨomerはＡＭＰＡ受容体と代謝性グルタミン酸受容体にそれぞれ結合する（Nature 386, 279-284, 1997; Nature 386, 284-288, 1997）ことが知られている。これら分子の共通の特徴は、それらが、蛋白質−蛋白質相互作用のためのモジュールＰＤＺドメインを有するということである（例えば、Trends Biochem. Sci. 20, 102-103, 1995; Trends Biochem. Sci. 20, 350, 1995; Curr. Biol. 6, 1385-1388, 1996; Neuron 17, 575-578, 1996）。
【０００５】
ＰＤＺドメインは最初、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90の約９０アミノ酸の繰り返しとして見出され、その後、３つの蛋白質［ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90、ショウジョウバエ（Drosophilia ）のdiscslarge腫瘍抑制蛋白質Ｄlg−Ａ、tight junction蛋白質ＺＯ−１）に含まれることからＰＤＺと命名された（Neuron 9, 929-942, 1992; J. Biol. Chem. 268, 4580-4583, 1993; Cell 66, 451-464, 1991; J. Cell Biol. 121, 491-502, ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 7834-7838, 1993 ）。このＰＤＺドメインは様々な蛋白質のＣ末端配列に結合する。すなわち、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90の第１および第２のＰＤＺドメインはＮＭＤＡ受容体およびＳhaker 型Ｋ+ チャネルと結合するが（Science 269, 1737-1740, 1995; Nature 378, 85-88, 1995 ）、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90はＮ末端のディサルフィド結合を介してこれらの受容体およびチャネルと結合する（Neuron 18, 803-814, 1997）。またＰＳＤ-95/ＳＡＰ90の第３のＰＤＺドメインはニューロリギン（neuroligins ）と呼ばれる神経細胞接着分子の細胞質ドメインと結合する（Science 277, 1511-1515, 1997）。
【０００６】
ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90は、ＰＤＺドメインの他に１つのＳＨ３ドメインと１つのグアニル酸キナーゼ（ＧＫ）ドメインを有している。ＳＨ３ドメインはｓｒｃチロシンキナーゼのシグナル伝達モジュールとして規定されていたが、その後他の多くの蛋白質でも同定されている（Cell 80, 237-248, 1995）。ただし、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90におけるＳＨ３ドメインの機能は不明である。ＧＫドメインは酵母グアニル酸キナーゼと相同であり、様々な膜関連蛋白質に存在する。これらの蛋白質は特定の膜構造を維持していると考えられており、膜関連グアニル酸キナーゼ（membrane-associated guanylate kinase：ＭＡＧＵＫ）と命名されている（Mech. Dev. 44, 85-89, 1993; Curr. Biol. 6, 382-384, 1996）。
【０００７】
近年、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90のＧＫドメインと相互作用する分子が３つの研究グループによって同定され、ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰと命名されている（J. Cell Biol. 136, 669-678, 1997; J. Biol. Chem. 272, 11943-11951, 1997; Genes Cells 2, 415-424, 1997; J. Neurosci. 17, 5687-5696, 1997 ）。これらの分子のうち、ＳＡＰＡＰ（１，２）はこの出願の発明者らが見出した分子であり、既に特許出願している（特願平9-11714 、9-11715 ）。またこの出願の発明者らは、ＨＥＫ293 細胞においては、このＳＡＰＡＰが細胞膜と強固に結合し、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90を細胞膜に補充することを見出してもいる（J. Biol. Chem. 272, 11943-11951, 1997 ）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明者らおよびその他の研究グループから提出された様々な知見により、ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰはＰＳＤの中核的な蛋白質であると考えられるが、ＰＳＤ形成におけるその役割を解明するためには、ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰと相互作用する新規分子を特定することが不可欠である。
【０００９】
また、このような分子の同定とその機能の解明は、ヒトの記憶・学習といった高次脳機能の理解に大きな前進をもたらすばかりか、この分子あるいはこの分子の活性、作用に影響する様々な物質、化合物等は、中枢神経系の機能的または構造的障害を原因とする様々な神経疾患の原因解明、並びにそれら疾患の診断、予防および治療法等の開発に大きく寄与するものと期待される。
【００１０】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、神経シナプス結合後部のＰＳＤ形成に関与するＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに特異的に結合する未知分子を提供することを目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決する発明として、配列番号１のアミノ酸配列を有するラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭを提供する。
この出願はまた、配列番号１のアミノ酸配列における１もしくは複数のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭを提供する。
【００１２】
この出願はさらに、前記のラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭをコードするラット遺伝子と、この遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を有するｃＤＮＡ、配列番号２の塩基配列における一部連続配列からなるＤＮＡ断片を提供する。
またこの出願は、前記のｃＤＮＡを保有する組換えベクターと、前記のラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭに対する抗体を提供する。
【００１３】
さらにまた、この出願は、配列番号１と相同のアミノ酸配列を有し、前記のラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭと同一の機能を有する動物性蛋白質、この動物性蛋白質をコードする動物遺伝子、およびこの動物遺伝子のｃＤＮＡを提供する。
この発明によって提供される蛋白質は、下記実施例に示したように、yeast   two-hybrid法を用いてＳＡＰＡＰとの相互作用分子を探索した結果単離された新規の蛋白質分子であり、ＭＡＧＵＫの逆構造を有し、Ｎ末端ＧＫ様ドメインと２つのＷＷドメインおよび５つのＰＤＺドメインを有している。この蛋白質分子は、ＧＫ様ドメインを介してＳＡＰＡＰに結合し、またＰＤＺドメインを介してＮＭＤＡ受容体およびニューロリギンに結合する。そして、この蛋白質は、シナプス結合における受容体および細胞接着蛋白質を統合させることから、Ｓ−ＳＣＡＭ（synaptic scaffolding molecule ）と命名された。
【００１４】
以下、この発明の蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭについて実施の形態を詳しく説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
この発明のラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、配列番号２に塩基配列を示したｃＤＮＡの157 から3990番目までの配列領域にコードされている蛋白質分子である。
この蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭは公知の方法、すなわちラットの脳、細胞株などから単離する方法、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によってＳ−ＳＣＡＭを取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで発現できる。また翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等で、ｃＤＮＡがコードするＳ−ＳＣＡＭを大量に発現させることができる。
【００１６】
この発明の蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭを大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を挿入結合して組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、ｃＤＮＡがコードしているＳ−ＳＣＡＭを微生物内で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、ｃＤＮＡがコードするタンパク質部分のみを取得することもできる。
【００１７】
この発明のラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭを動物細胞で発現させる場合には、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を、動物細胞用プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A) 付加部位等を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、動物細胞内に導入すれば、この発明のＨ３７タンパク質を動物細胞内で発現できる。
以上のとおりの方法によって得られるラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭは、例えば、この蛋白質を特異的に認識する抗体を作成するための抗原として使用することができる。
【００１８】
この発明のラット蛋白質Ｓ−ＳＣＭには、配列番号１で表されるアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片もまた抗体を作製するための抗原として用いることができる。
この発明の遺伝子は、上記の蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭをコードするラットの遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして、既存のゲノムライブラリーから単離することができる。
【００１９】
この発明のｃＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列を有することを特徴とするものであり、この発明の前記蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭをコードしている。この発明の蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭは少なくともラットの脳組織で発現しているので、配列番号２の塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。
【００２０】
一般に哺乳動物の遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号２において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明に含まれる。
同様に、これらの変更によって生じる１または複数個のアミノ酸残基の付加、欠失および／または他のアミノ酸残基による置換がなされているタンパク質も、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明に含まれる。
【００２１】
この発明のＤＮＡ断片には、配列番号２で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）、あるいはそれらのアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片も含まれる。
この発明の蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭに対する抗体は、蛋白質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００２２】
この発明の動物遺伝子は、ラット以外の哺乳動物の遺伝子であって、前記のラット蛋白質Ｓ−ＳＣＡＮと同一の機能を有する動物性蛋白質をコードする遺伝子である。このような遺伝子は、例えば、この発明のｃＤＮＡをプローブとして様々な動物種のｃＤＮＡライブラリーから相同のｃＤＮＡを単離し、さらにこのｃＤＮＡをプローブとしてゲノムライブラリーから単離することができる。また、このｃＤＮＡを微生物、動物細胞または植物細胞等で発現させることにより、Ｓ−ＳＣＡＭと同一の機能を有する動物性蛋白質を得ることができる。
【００２３】
以下、この発明の蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭについて、その取得方法、特性の確認等に関する実施例を示し、この発明をさらに詳細かつ具体的に説明する。
【００２４】
【実施例】
実施例１：Ｓ−ＳＣＡＭの特定
ＳＡＰＡＰ１（特願平9-11714：配列番号１）の第397 〜568 アミノ酸残基に対応するペプチドをプローブとして、yeast two-hybrid法によりラット脳ｃＤＮＡライブラリーλＺＡＰｌｌ（Stratagene社製）をスクリーニングした。プローブとしたＳＡＰＡＰ１領域は、図１に示したように、強力なＰＳＤ-95/ＳＡＰ90結合ドメインであり、プロリンリッチ領域である（J. Biol. Chem. 272:11943-11951, 1997）。このスクリーニングにより、９個のポジティブクローンが得られるが、うち２個はＰＳＤ-95/ＳＡＰ90であり、１個はＰＳＤ-93 ／chapsyn （Neuron 17:103-113, 1996; Cell 84:757-767, 1996）であった。残りの６クローンは全て同一の新規配列からなるｃＤＮＡであり、ＧＫ様ドメインとＷＷドメインを含んでいた。このｃＤＮＡの全配列は配列番号２に示したとおりであり、このｃＤＮＡは配列番号１および図２に示した1,277 アミノ酸残基からなる蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭをコードしていた。この蛋白質は、配列番号１および図２に示したとおり、Ｎ末端に１つのＧＫ様ドメインを有し、その下流に２つのＷＷドメインと５つのＰＤＺドメインを有している。Ｓ−ＳＣＡＭのＧＫ様ドメインは約５０アミノ酸からなり、ＧＫドメインとの相同部分は極わずかであった。最初のＷＷドメインはＹＡＰおよびＮedd-4 （J. Biol. Chem 270:14733-14741, 1995; Biochem. Biophys. Chem. 272:31589-31597, 1997）のそれと極めて類似している。２番目のＷＷドメインは第２位トリプトファンが欠失した不完全なものであった。ＰＤＺドメインは中央からＣ末端にかけての全領域に分布しており、４番目と５番目のＰＤＺドメインの間に２組のアミノ酸反復配列が存在する。最初の反復配列（図２：下線）は７アミノ酸配列（ＳＰｘＡＱｘｘ）の４コピーからなり、２番目の反復配列（図２：２重下線）は８アミノ酸配列（ＲＱＰＰｘｘＤＹ）の８コピーからなっている。
【００２５】
以上のとおりの構造を有するＳ−ＳＣＡＭは、その類似体であるCaenorhabditis elegansのＫ０１Ａ．６クローン発現産物と高い相同性を示した。また、最近報告された蛋白質ＭＡＧＩ−１（J. Biol. Chem. 272:31589-31597, 1997）とも類似の構造を有していた。ＭＡＧＩ−１はＫ−ＲasＢ結合蛋白質として同定され、３つのスプライスバリアントが報告されている。そのうち、ＭＡＧＩ−１ｂはＳ−ＳＣＡＭとアミノ酸レベルで４８％相同である。ただし、ＭＡＧＩ−１は２番目のＷＷドメインと最初のＰＤＺドメインの間にはポリグルタミン領域（７グルタミン）を有するのに対し、Ｓ−ＳＣＡＭにはそのような領域は存在しない。また、最近特定されたＷＷドメイン含有ヒト遺伝子ＷＷＰ３（J. Biol. Chem. 272:14611-14616, 1997）もＳ−ＳＣＡＭと高い相同性を有している。ＷＷＰ３はアトロピン−１（atrophin-1）と相互作用するＷＷドメインを有する蛋白質遺伝子として同定された（Mol. Brain Res. 36:219-226, 1996; Hum. Genet. 100:114-122, 1997 ）。アトロピン−１はＤＲＰＬＡ（dentatorubral pallidoluysian atrophy）の原因遺伝子の発現産物であり、ポリグルタミン反復配列を有している。そして、ＷＷＰ３のアミノ酸配列の８０％以上がＭＡＧＩ−１と相同であることから、ＷＷＰ３はヒトＭＡＧＩ−１であり、Ｓ−ＳＣＡＭはＷＷＰ３／ＭＡＧＩ−１のアイソフォームであると考えられる。
実施例２：Ｓ−ＳＣＡＭの組織分布の確認
ノーザンブロット分析の結果、図３Ａに示したとおり、7.5 kbの強いバンドと6.8 kbの弱いバンドが脳でのみ観察された。一方、図３Ｂに示したように、ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析では、分子量180 kD、155 kDおよび140 kDの蛋白質が脳においてのみ検出された。また、同じ分子量の蛋白質は、Ｓ−ＳＣＡＭのｃＤＮＡ組換えベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の抽出物からも検出された。
【００２６】
以上の結果から、この発明のＳ−ＳＣＡＭは、少なくともラットの脳において特異的に発現する蛋白質であることが確認された。
実施例３：Ｓ−ＳＣＡＭとＳＡＰＡＰとの相互作用の確認
ＳＡＰＡＰの様々なアイソフォームを発現するＣＯＳ細胞と35Ｓ−メチオニン標識Ｓ−ＳＣＡＭによるブロットオーバーレイによって、ＳＡＰＡＰとＳ−ＳＣＡＭの相互作用を調べた。その結果、図４Ａに示したとおり、Ｓ−ＳＣＡＭは全てのＳＡＰＡＰアイソフォームと結合したが、コントロール蛋白質ニューラビン−１（neurabin-1：J. Cell Biol. 139:951-961, 1997 ）とは結合しなかった。
【００２７】
次に、Ｓ−ＳＣＡＭにおけるＳＡＰＡＰ結合ドメインを決定するため、様々なプローブを作成し（図４Ｂ）、ＳＡＰＡＰ１とのオーバーレイアッセイに供した。その結果、図４Ｃに示したとおり、Ｓ−ＳＣＡＮの全長およびＮ末端領域を含む蛋白質（Ｓ−ＳＣＡＭ、Ｓ−ＳＣＡＭ−２）はＳＡＰＡＰ１と結合したが、Ｓ−ＳＣＡＭの中央領域およびＣ末端領域を含む蛋白質（Ｓ−ＳＣＡＭ−３、Ｓ−ＳＣＡＭ−４）はＳＡＰＡＰ１と結合しなかった。この結果から、ＧＫ様ドメインを含むＮ末端領域が、ＳＡＰＡＰとの結合に不可欠であることが確認された。ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90は、そのＧＫドメインを介してＳＡＰＡＰに結合するので、Ｓ−ＳＣＡＭとＰＳＤ-95/ＳＡＰ90はＳＡＰＡＰの同一領域に結合するものと考えられる。このことを確認するため、ＧＳＴ−ＰＳＤ−９５−２（ＰＤＺドメイン含有）またはＧＳＴ−ＰＳＤ−９５−４（ＧＫドメイン含有）の存在下で、ＳＡＰＡＰ１を35Ｓ−メチオニン標識Ｓ−ＳＣＡＭとオーバーレイした。その結果、図４Ｄに示したとおり、ＧＳＴ−ＰＳＤ−９５−４はＳＡＰＡＰ１と35Ｓ−メチオニン標識Ｓ−ＳＣＡＭとの結合を抑制したのに対し、ＧＳＴ−ＰＳＤ−９５−２は結合抑制を生じさせなかった。この結果から、Ｓ−ＳＣＡＭとＰＳＤ-95/ＳＡＰ90はＳＡＰＡＰの結合部位を共有しており、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90のＧＫドメインと同様に、Ｓ−ＳＣＡＭのＧＫ様ドメインがＳＡＰＡＰに結合していることが確認された。
実施例４：Ｓ−ＳＣＡＭとＮＭＤＡ受容体およびニューロリギンとの相互作用の確認
Ｓ−ＳＣＡＭのＰＤＺドメインは、様々な蛋白質のなかでも、ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90のＰＤＺドメインと最も高い相同性を示した。ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90のＰＤＺドメインは、ＮＭＤＡ受容体、Ｓhaker 型Ｋ+ チャネルおよびニューロリギンと結合することが知られているので（Science 269:1737-1740, 1995; Nature 378:85-88, 1996; Science 277:1511-1515, 1997）、Ｓ−ＳＣＡＭの様々なＰＤＺドメインとこれら分子との結合を、yeast two-hybrid法により調べた。
【００２８】
結果は表１に示したとおりである。すなわち、１番目のＰＤＺドメインはニューロリギン１と結合するのに対し、５番目のＰＤＺドメインはＮＭＤＡ受容体と結合し、またＳhaker 型 Kv1.4Ｋ+ チャネルと僅かに結合した。このことから、Ｓ−ＳＣＡＭはその別々のＰＤＺドメインによってＮＭＤＡ受容体およびニューロリギンと結合することが確認された。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
次に、正常細胞におけるＳ−ＳＣＡＭとＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡＲ２Ａ）およびニューロリギン１の相互作用を調べるため、各分子の発現ベクターを様々な組み合わせでＨＥＫ293 細胞にトランスフェクトし、発現させた。結果は図５に示したとおりである。すなわち、Ｓ−ＳＣＡＭを単独で発現させた場合にはサイトゾル（cytosol ）でのみ検出され（図５Ａ）。ＮＭＤＡＲ２Ａとニューロリギン１は細胞膜に、そして僅かながらサイトゾルでも検出された（図５Ｂ）。一方、Ｓ−ＳＣＡＭとＮＭＤＡＲ２Ａとを共発現させると、それらは細胞膜に共存し（図５Ｃ）、Ｓ−ＳＣＡＭとニューロリギンを共発現させると同じくそれらは細胞膜に共存した。これらの結果は、 in vivoにおいてＳ−ＳＣＡＭがＮＭＤＡ受容体およびニューロリギンとの相互作用により細胞質膜に移行することを示唆する。
【００３１】
さらに、自然状態のニューロンにおいてＳ−ＳＣＡＭがＮＭＤＡ受容体と相互作用を示すか否かを調べるため、ラット脳シナプトゾームの粗抽出物から抗Ｓ−ＳＣＡＭ抗体を用いてＳ−ＳＣＡＭを免疫沈降した。また、抗ＮＭＤＡモノクローナル抗体を用い、ＮＭＤＡ受容体が共免疫沈降するか否かを調べた。結果は図６に示したとおりであり、抗Ｓ−ＳＣＡＭ抗体はＮＭＤＡを共免疫沈降させたが、抗体非添加の血清ではそのような現象は観察されなかった。この結果からも、Ｓ−ＳＣＡＭが in vivoにおいてＮＭＤＡ受容体と相互作用していることが確認された。
実施例５：ニューロンにおけるＳ−ＳＣＡＭの分布の確認
ニューロンにおけるＳ−ＳＣＡＭの分布を確認するため、ラット海馬ニューロン初代培養（培養１４日目）を、抗Ｓ−ＳＣＡＭ抗体と、抗ＮＭＤＡＲ１または抗ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90抗体で二重染色した。結果は図７に示したとおりである。すなわち、Ｓ−ＳＣＡＭの染色パターンはＰＳＤ-95/ＳＡＰ90のパターンと似ており、細胞体および軸索に検出された（図７Ａ）。また、軸索でのＳ−ＳＣＡＭの分布はＮＭＤＡＲ１と類似していた（図７Ｂ）。ＳＡＰＡＰの分布はＰＳＤ-95/ＳＡＰ90と類似しているので（図７Ｃ）、Ｓ−ＳＣＡＭはＳＡＰＡＰと同一部位に分布していることが確認された。
【００３２】
さらに、抗Ｓ−ＳＣＡＭ抗体を用いた免疫ブロッティングによりラット脳細胞の下部構造におけるＳ−ＳＣＡＭの分布を調べた。結果は図８に示したとおりであり、抗体シグナルはcytosolic synaptosomal（Ｓ２）と粗synaptosomal pellet （Ｐ２）の両方に検出された。シナプトソームの下分画では、シナプロソーム膜画分（ＳＰＭ）で最も強いシグナルが検出された。また、ＰＳＤでもシグナルが検出されたが、Ｓ−ＳＣＡＭはＰＳＤにおいてＳＡＰＡＰほど豊富ではなかった。
【００３３】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明の蛋白質Ｓ−ＳＣＡＭは神経シナプス結合後部における情報伝達および可塑性に関与する分子ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ／ＤＡＰに特異的に結合する新規な蛋白質であり、この蛋白質はヒトをはじめとする動物の神経系の発生や発達、あるいは記憶、学習等のメカニズムの解明、さらには神経系の機能的または構造的障害を原因とする各種神経疾患の診断、予防および治療のための技術開発等に有用である。
【００３４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ラット脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためにプローブとして用いたＳＡＰＡＰ部分を示した模式図である。
【図２】この発明のＳ−ＳＣＡＭのアミノ酸配列図である。
【図３】Ｓ−ＳＣＡＭの組織分布を調べた（Ａ）ノーザンブロット分析、（Ｂ）ウエスタンブロット分析の結果である。
【図４】Ｓ−ＳＣＡＭとＳＡＰＡＰの相互作用を調べた結果であり、（Ａ）Ｓ−ＳＣＡＭとＳＡＰＡＰの各アイソフォームとの相互作用を示すブロット図、（Ｂ）Ｓ−ＳＣＡＭの部分発現ベクターの構成図、（Ｃ）ＧＫ様ドメインを含むＳ−ＳＣＡＭ断片とＳＡＰＡＰ１との相互作用を示すブロット図、（Ｄ）ＰＳＤ-95/ＳＡＰ90のＧＫドメインによるＳ−ＳＣＡＭとＳＡＰＡＰの結合抑制を示すブロット図である。
【図５】ＨＥＫ細胞におけるＳ−ＳＣＡＭとＮＭＤＡ受容体の相互作用を示す写真図であり、（Ａ）Ｓ−ＳＣＡＭ発現ベクターをトランスフェクトした細胞、（Ｂ）ＮＭＤＡＲ２Ａ発現ベクターをトランスフェクトした細胞、（Ｃ）Ｓ−ＳＣＡＭ発現ベクターとＮＭＤＡＲ２Ａ発現ベクターをトランスフェクトした細胞をそれぞれ示す。
【図６】ラットのシナプトソーム画分からのＳ−ＳＣＡＭおよびＮＭＤＡ受容体の共免疫沈殿の結果を示すブロット図である。
【図７】初代培養ニューロンにおけるＳ−ＳＣＡＭの分布を示す写真図である。
【図８】ラット脳の細胞下部構造におけるＳ−ＳＣＡＭの分布を示すブロット図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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