(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）及び夾雑物質を含有するピキア属に属する遺伝子組み換え酵母の培養液からＩＬ−６Ｒを精製する方法であって、前記培養液を陽イオン交換体より形成される流動床内において陽イオン交換体とｐＨ５で接触させてＩＬ−６Ｒを吸着させた後、ＩＬ−６Ｒを陽イオン交換体より分離することからなるＩＬ−６Ｒの精製方法。
【請求項２】
陽イオン交換体のイオン交換基がスルホプロピル基であることを特徴とする請求項１に記載のＩＬ−６Ｒの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えばインターロイキン６レセプター（以下、本明細書においてはＩＬ−６Ｒと記載する）を発現する遺伝子組み換え微生物や遺伝子組み換え動物細胞の培養液等のＩＬ−６Ｒ及び種々の夾雑物質を含む溶液からＩＬ−６Ｒを効率よく精製（製造）する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ−６Ｒは、インターロイキン６（ＩＬ−６又は、Ｂ細胞分化因子）の受容体蛋白質であり、ＩＬ−６と結合すると細胞膜上の糖蛋白質であるｇｐ１３０と結合し、細胞機構に刺激を伝達することが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００巻、２８１頁、１９９４年参照）。ＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６の各種生理作用の発現に必須の蛋白質である。
【０００３】
近年、ＩＬ−６が関与する系の生理作用として、造血幹細胞の増殖や血小板増多作用等が報告され、その臨床応用が期待されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻、２８５９頁、１９９５年、及び、Ｂｌｏｏｄ、７４巻、１２４１頁、１９８９年参照）。
【０００４】
ところで、ＩＬ−６Ｒに限らず生体成分として極微量にしか存在しない蛋白質を生産し、例えば臨床的応用に供するためには、遺伝子工学的手法により目的蛋白質の遺伝子を微生物や動物細胞に導入し、大量に発現させ、これらの細胞破砕液や培養液を原料として主にカラムクロマトグラフィーにより精製するという工程がとられている。
【０００５】
通常、精製工程においては、カラムクロマトグラフィーによる分画を行う前に硫酸アンモニウムによる塩析、有機溶媒による分別沈殿、固形物を除くための濾過等が粗精製工程として行われている。そして、カラムクロマトグラフィーによる精製は、カラムに充填される担体による分画原理に基づき、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過等の異なる手法が知られている。一般的に、目的とする蛋白質を均一に精製する（例えば電気泳動的に均一に精製する）ためには、異なる原理のカラムクロマトグラフィーを複数組み合わせて精製を実施する場合が多い。
【０００６】
このカラムクロマトグラフィーの組み合わせや各クロマトグラフィーの順序、吸着溶出条件等は、目的とする蛋白質のｐＨ安定性、熱安定性、無機塩に対する安定性、有機溶媒に対する安定性、プロテアーゼ等に対する安定性を考慮したうえで、目的蛋白質と夾雑蛋白質との分離効率等を踏まえて決定される。
【０００７】
このように蛋白質の精製は、煩雑な複数の工程から構成されるため、精製工程を短くし得る効率のよい方法、例えば夾雑蛋白質の除去率の高い粗精製法、カラムクロマトグラフィーを選択することが蛋白質精製（製造）の適否を決定付けることがある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
アフィニティークロマトグラフィーを用いるＩＬ−６Ｒの精製（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１９９巻、４７〜５４頁、１９９６年及び、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８巻、６７３〜６７６頁、１９９０年等参照）が知られているが、これらはの方法ではいずれも蛋白質を吸着基から分離する際の条件が過酷で、クロマトグラフィー担体の劣化、アフィニテイリガンドの溶出による分離効率の低下、目的蛋白質の変性による収率の低下があり、ＩＬ−６Ｒの精製（製造）、特に工業生産規模での精製（製造）方法としては適していないという課題がある。  他のインターロイキンについては、粗精製工程として硫酸アンモニウムによる塩析を行い、その後にカラムクロマトグラフィーによる工程を行う方法（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、２９６巻、１７１〜１７９頁、１９８４年参照）が知られているが、複雑な工程が組み合わされており、カラムクロマトグラフィーによる精製の前に前処理として微生物や動物細胞、更には固形物の除去や濃縮といった操作をも必要とする等、操作性に課題がある。
【０００９】
従って本発明の目的は、カラムクロマトグラフィーの手法を用いてＩＬ−６Ｒの精製（製造）を行うにあたり、煩雑な前処理工程を必要とせず、高収量でＩＬ−６Ｒを得るための精製方法であって、特に、工業的生産規模での製造（精製）にも適用可能なＩＬ−６Ｒの精製方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、上記目的を達成するために各種クロマトグラフィーの手法について検討した結果、本願発明を完成するに至った。即ち本発明は、ＩＬ−６Ｒ及び夾雑物質を含有する溶液からＩＬ−６Ｒを精製する方法であって、前記溶液をイオン交換体より形成される流動床内においてイオン交換体と接触させてＩＬ−６Ｒを吸着させた後、ＩＬ−６Ｒをイオン交換体より分離することを特徴とするＩＬ−６Ｒの精製方法である。以下、本願発明を詳細に説明する。
【００１１】
本願発明において、ＩＬ−６Ｒを精製する原料となる溶液に特に制限はなく、ＩＬ−６Ｒ及び夾雑物質を含有するものが該当する。夾雑物質は、原料となる溶液により異なるが、ＩＬ−６Ｒ及び夾雑物質を含有する溶液が遺伝子組み換え微生物又は遺伝子組み換え動物細胞の培養液である場合には当該微生物や動物細胞が生産し分泌する蛋白質等のほか、これら微生物や動物細胞等の細胞断片等が含まれる。また、例えばヒトの尿等の生体に由来する溶液が原料である場合には、夾雑物質にはこれら溶液に含まれるＩＬ−６Ｒ以外の蛋白質等が含まれる。
【００１２】
ＩＬ−６Ｒを精製する原料となる溶液としては、前記の通りヒトの尿等の生体に由来する溶液を用いることもできるが、かかる溶液中にはＩＬ−６Ｒが極微量にしか存在しないという事実に鑑みて、遺伝子工学的手法によりＩＬ−６Ｒ遺伝子（例えば特開平２−２８８８９８号公報参照）を微生物や動物細胞に導入して大量に発現させ、これらの細胞破砕液や培養液を原料として用いることが好ましい。中でも、ピキア属に属する酵母を宿主細胞としてこれにＩＬ−６Ｒ遺伝子を導入して得られる細胞破砕液を原料として用いることが特に好ましい。本願発明者らの知見によれば、ピキア属に属する酵母によればＩＬ−６Ｒの大量発現が容易であり、また、本願発明の精製を実施する場合の原料として好適だからである。  本願発明における流動床は、イオン交換体（例えばクロマトグラフィーで使用されるイオン交換体）を充填したカラムであって、該カラムの下部から原料及び緩衝液を送液することでイオン交換体粒子の沈降が打ち消され、イオン交換体がカラム内で互いに凝集、会合することなく安定な浮遊平衡状態を形成し、原料に含まれる夾雑蛋白質、微粒子や細胞破砕物などの他の夾雑物質を素通りさせるとともにＩＬ−６Ｒを吸着するものである。
【００１３】
原料を流動床内でイオン交換体と接触させてＩＬ−６Ｒを選択的にイオン交換体に吸着させた後、カラム内を適当な緩衝液で洗浄し、送液を方向を下降方向に切り替え、イオン交換体からＩＬ−６Ｒを解離させるための溶出緩衝液を送液してＩＬ−６Ｒを回収する。この一連の操作により、通常の蛋白質精製において行われている硫安アンモニウムによる塩析、有機溶媒による分別沈殿、濾過等の粗精製工程を行うことなく、カラムクロマトグラフィーによる直接的なＩＬ−６Ｒの精製が可能となり、精製工程に要する時間を大幅に短縮することができる。原料が微生物や動物細胞を含む培養液等の場合にも、同様になんら粗精製工程を行うことなく本願発明を実施することは可能であるが、予め遠心分離操作により菌体等を除いた遠心上清を使用することもできる。
【００１４】
イオン交換体へのＩＬ−６Ｒの吸着率を高めるために、原料の塩濃度を一定以下に低減するが特に好ましい。かかる塩濃度の指標としては、例えば電気伝導度計で原料の電気伝導度をモニターし、ＮａＣｌ濃度として５０ｍＭ以下になるように調整することが好ましく例示できる。塩濃度の低減には、純水や緩衝液による原料の希釈、緩衝液を外液とする透析等を実施することが例示できる。
【００１５】
イオン交換体には陰イオン交換体と陽イオン交換体があるが、本願発明においてはいずれのイオン交換体であっても使用することができる。本願発明で使用される陽イオン交換体の一例を示せば、イオン交換基がカルボキシメチル基（ＣＭ）基、リン酸基（Ｐ）基、スルホエチル基（ＳＥ）基、スルホプロピル基（ＳＰ）基が例示できる。中でも入手が容易でＩＬ−６Ｒの吸着が良好であり、しかも再生操作が単純なＳＰ基が特に好ましい。一方、本願発明で使用される陰イオン交換体の一例を示せば、イオン交換基がジメチルアミノエチル基（ＤＥ基）、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ基）、第４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）基（ＱＡ基）、第４級アミノエチル（ジエチル、モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）基（ＱＡＥ基）等を例示することができる。中でも入手が容易でＩＬ−６Ｒの吸着が良好であり、しかも再生操作が単純なＤＥＡＥ基が特に好ましい。陽イオン交換体又は陰イオン交換体のいずれを使用する場合であっても基材自体は特に制限されず、例えばアガロース等を用いることができる。
【００１６】
イオン交換体へのＩＬ−６Ｒの吸着は静電結合によるが、この吸着力は使用するイオン交換基、ＩＬ−６Ｒが吸着する際のｐＨ環境（例えばイオン交換基を平衡化する際の緩衝液のｐＨ、原料溶液のｐＨ）によって変化する。従ってイオン交換体の選択又はｐＨ条件の設定にはＩＬ−６Ｒの等電点を考慮することが重要であるが、アルカリ性環境下で陰イオン交換体を使用して、又は、酸性環境下で陽イオン交換体を使用してＩＬ−６Ｒを吸着させ、回収試験を行うことで適当なイオン交換体の選択及びｐＨ条件を設定することができる。より具体的には、ＩＬ−６Ｒ及び夾雑物質を含有する溶液を種々のイオン交換体と接触して吸着させ、洗浄後溶出させ、ＩＬ−６Ｒの各イオン交換体に対する吸着割合を検討すれば良い。なお、本願発明の実施に先立ち精製に用いる原料溶液ｐＨをイオン交換体のｐＨ環境と概ね同一にしておくことが好ましい。
【００１７】
本願発明において、ＳＰ基を有する陽イオン交換体を使用する場合についての一例を具体的に説明する。陽イオン交換体をＩＬ−６Ｒを吸着するときのｐＨで平衡化し、一方で原料を透析してそのｐＨを概ね平衡化されたイオン交換体のｐＨと同一にしておく。イオン交換体の平衡化ｐＨは、交換基が陰イオン性を帯びている範囲であれば良い。一般的に蛋白質は、その等電点より低いｐＨ条件であれば陽イオン交換体と静電結合するため、平衡化するｐＨは、ＩＬ−６Ｒの等電点及び夾雑蛋白質の等電点等を総合的に考慮して設定する。特に分離されるべき夾雑蛋白質の諸性質及び等電点が明らかでありかつ該夾雑蛋白質の等電点がＩＬ−６Ｒの等電点と異なる」場合は、該夾雑蛋白質の等電点とＩＬ−６Ｒの等電点の間のｐＨになるように原料のｐＨ及び陽イオン交換体を平衡化するｐＨを調整することでＩＬ−６Ｒと夾雑蛋白質との効率的な分離を実現することができる。ＩＬ−６Ｒを、イオン交換体に吸着させた後回収し、夾雑物質と分離・精製する。原料として好ましくＩＬ−６Ｒ発現ピキア属酵母培養液を使用する場合は、酸性条件下でＩＬ−６ＲのＳＰ基への吸着を行うことにより、ＩＬ−６Ｒと夾雑蛋白質を良好に分離できる。即ち、本願発明によりピキア属に属する組換え酵母の培養液からＩＬ−６Ｒを精製する場合、酸性条件下でＩＬ−６ＲとＳＰ基を有する陽イオン交換体を接触させることが好ましく、中でもｐＨ４．０〜ｐＨ６．５の範囲が特に好ましい。以上のようにして陽イオン交換体に吸着したＩＬ−６Ｒを溶出させるには、ｐＨ４．０〜ｐＨ９．０程度、好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ８．０程度で、塩濃度が０．１Ｍ〜１．０Ｍ程度、好ましくは０．１Ｍ〜０．３Ｍ程度の溶出溶液を用いれば良い。
【００１８】
次に、ＤＥＡＥ基を有する陰イオン交換体を使用する場合についての一例を具体的に説明する。陰イオン交換体をＩＬ−６Ｒを吸着するときに用いるｐＨで平衡化し、一方で原料を透析してそのｐＨを概ね平衡化されたイオン交換体のｐＨと同一にしておく。イオン交換体の平衡化ｐＨは、交換基が陽イオン性を帯びている範囲であればよい。一般的に蛋白質は、その等電点より高いｐＨ条件であれば陰イオン交換体と静電結合するため、平衡化するｐＨは、ＩＬ−６Ｒの等電点及び夾雑蛋白質の等電点等を総合的に考慮し設定する。特に分離されるべき夾雑蛋白質の諸性質及び等電点が明らかである場合は、該夾雑蛋白質の等電点とＩＬ−６Ｒの等電点の間のｐＨになるように原料のｐＨ及び陰イオン交換体を平衡化するｐＨを調整することでＩＬ−６Ｒと夾雑蛋白質との効率的な分離を実現することができる。ＩＬ−６Ｒを、イオン交換体に吸着させた後回収し、夾雑物質と分離・精製する。原料として好ましくＩＬ−６Ｒ発現ピキア属酵母培養液を使用する場合は、アルカリ性条件下でＩＬ−６ＲのＤＥＡＥ基への吸着を行うことにより、ＩＬ−６Ｒと夾雑蛋白質を良好に分離できる。即ち、本願発明によりピキア属に属する組換え酵母の培養液からＩＬ−６Ｒを精製する場合、アルカリ性条件下でＩＬ−６ＲとＤＥＡＥ基を有する陰イオン交換体を接触させることが好ましく、中でもｐＨ７．０〜ｐＨ８．５の範囲が特に好ましい。以上のようにして陰イオン交換体に吸着されたＩＬ−６Ｒを溶出させるには、ｐＨ４．０〜ｐＨ９．０程度、好ましくはｐＨ７．０〜ｐＨ８．０程度で、塩濃度が０．１Ｍ〜１．０Ｍ程度、好ましくは０．１Ｍ〜０．３Ｍ程度の溶出溶液を用いれば良い。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２０】
実施例１  陰イオン交換体への吸着試験
前処理として、ＩＬ−６Ｒ発現ピキア属酵母培養液（特開平７−３３０１０６号参照）の遠心上清を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、塩濃度を下げると共に該培養遠心上清のｐＨを８．０とした。この培養遠心上清を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ基を交換基とする陰イオン交換体を充填したカラム（１．０×２．５ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液で洗浄後、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出させた。
【００２１】
培養遠心上清、陰イオン交換体素通り画分、洗浄操作による溶出画分及び溶出液による溶出画分中のＩＬ−６Ｒ量及び総蛋白質量を求めた。ＩＬ−６Ｒの定量は、文献に記載されたエンザイムイムノアッセイ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１９９巻、４７−５４頁、１９９６年参照）に従った。蛋白質の定量は市販の定量キット（日本バイオ・ラッド  ラボラトリー（株）製のプロテインアッセイキット、カタログ番号  ５００−０００１）を使用して行った。結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
0004154743.tif 000002
【００２３】
実施例２  陽イオン交換体への吸着試験
前処理として、実施例１において記載したＩＬ−６Ｒ発現ピキア属酵母培養液の遠心上清を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析し、塩濃度を下げると共に該培養遠心上清のｐＨを５．０とした。この培養遠心上清を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＰ基を交換基とする陽イオン交換体を充填したカラム（１．０×２．５ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液で洗浄後、５００ｍＭ  ＮａＣｌ含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出させた。
【００２４】
培養遠心上清、陽イオン交換体素通り画分、洗浄操作による溶出画分及び溶出液による溶出画分中のＩＬ−６Ｒ量及び総蛋白質量を求めた。定量は、実施例１と同様にして行った。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
0004154743.tif 000003
【００２６】
比較のため、前処理として、ＩＬ−６Ｒ発現ピキア属酵母培養液の遠心上清を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対して透析し、塩濃度を下げると共にそのｐＨを６．５としたものを、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＳＰ基を交換基するイオン交換体を充填したカラム（１．０×２．５ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液で洗浄し、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で溶出させた結果について表３に示す。
【００２７】
【表３】
0004154743.tif 000004
【００２８】
表２及び３の結果から、ＩＬ−６Ｒ発現ピキア属酵母由来のＩＬ−６Ｒの等電点は６．５より低いと考えられる。比較のための実験ではＩＬ−６Ｒのイオン交換体への吸着率が低いことから、ＩＬ−６Ｒを陽イオン交換体に吸着させる場合は、イオン交換基の平衡化ｐＨ及び原料のｐＨを酸性条件、特にｐＨ６．５以下とすることが好適であることが分かる。
【００２９】
実施例３
ＩＬ−６Ｒ発現ピキア属酵母培養液（９．０リットル）を２０ｍＭ酢酸緩衝液( ｐＨ５．０）で希釈して塩濃度を下げた。塩濃度は電気伝導度計で該培養液の電気伝導度をモニターし、ＮａＣｌ濃度として５０ｍＭ程度とした。希釈した培養液（５４リットル）に更に５０％酢酸水溶液を滴下し、ｐＨメーターでモニターしながらｐＨを５．０に調整した。調整した培養液（ＩＬ−６Ｒ量が２７８ｍｇ、総蛋白質量が２１．４ｇ）を、予め２０ｍＭ酢酸緩衝液( ｐＨ５．０) で平衡化したＳＰ基を交換基とする陽イオン交換体を充填した市販のカラム、ファルマシア  バイオテク（株）製、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ  Ｃ−５０、ベット高１６ｃｍ、５×１００cm）に上方送液することにより添加した。添加後、２０ｍＭ酢酸緩衝液( ｐＨ５．０) を上方送液して洗浄し、続いて送液方向を逆転させて５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液( ｐＨ７．０) を添加して溶出させ、９６０ｍｌのの溶出液（ＩＬ−６Ｒ量が１５８ｍｇ、総蛋白質量が６６２ｍｇ）を回収した。
【００３０】
以上の通り、溶出液の総蛋白質にしめるＩＬ−６Ｒの割合は２３．８％であり、吸着流動床による精製操作を行うことによる培養液からのＩＬ−６Ｒの回収率は５６．８％であり、１８倍精製された。
【００３１】
実施例４
ＩＬ−６Ｒ発現ピキア属酵母培養液（９．４リットル）を遠心操作により菌体と上清に分けた。その上清（８．５リットル）を２０ｍＭ酢酸緩衝液で希釈して塩濃度をさげた。塩濃度は電気伝導度計で該培養液の電気伝導度をモニターし、ＮａＣｌ濃度として５０ｍＭ程度とした。希釈した培養液遠心上清（ＩＬ−６Ｒ量が２６３ｍｇ、総蛋白質量２６．５ｇ、５１リットル）に更に５０％酢酸水溶液を滴下し、ｐＨメーターでモニターしながらｐＨを５．０とした。調整した培養遠心上清を、予め２０ｍＭ酢酸緩衝液( ｐＨ５．０）で平衡化したＳＰ基を交換基とする陽イオン交換体を充填した市販のカラム（ファルマシア  バイオテク（株）製、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ  Ｃ−５０、ベット高１６ｃｍ、５×１００cm）に上方送液により添加した。添加後、２０ｍＭ酢酸緩衝液( ｐＨ５．０) を上方送液して洗浄し、続いて送液方向を逆転して５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液( ｐＨ７．０) を添加して溶出させ、７２０ｍｌの溶出液（ＩＬ−６Ｒ量が１６９ｍｇで、総蛋白質量が７５０ｍｇ）を得た。
【００３２】
以上の通り、溶出液の総蛋白質量にしめるＩＬ−６Ｒの割合は２２．５％であり、吸着流動床による精製操作を行うことによる培養遠心上清からのＩＬ−６Ｒの回収率は６４．３％となり、２２．５倍精製された。
【００３３】
実施例  ５
ＩＬ−６Ｒ発現ピキア属酵母培養液（５．８リットル）を遠心操作により菌体と上清に分けた。その上清（４．３リットル）を２０ｍＭ酢酸緩衝液で希釈して塩濃度をさげた。塩濃度は電気伝導度計で該培養液の電気伝導度をモニターし、ＮａＣｌ濃度として５０ｍＭ程度とした。希釈した培養液遠心上清（ＩＬ−６Ｒ量が１０８ｍｇ、総蛋白量が６．０２ｇ、３８リットル）に更に５０％酢酸水溶液を滴下し、ｐＨメーターでモニターしながらｐＨを５．０とした。調整した培養遠心上清を、予め２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＰ基を交換基とする陽イオン交換体を充填した市販のカラム（ファルマシア  バイオテク（株）製、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ  Ｃ−５０、ベット高１６ｃｍ、５×１００cm）に上方送液により添加した。添加後、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を上方送液して洗浄し、続いて送液方向を逆転して２０ｍＭリン酸緩衝液( ｐＨ７．４) を添加して溶出させ、７２０ｍｌの溶出液（ＩＬ−６Ｒが４９．４ｍｇで、総蛋白質量が１２６ｍｇ）を回収した。
【００３４】
以上の通り、溶出液の総蛋白質量にしめるＩＬ−６Ｒの割合は３９．４％であり、吸着流動床による精製操作を行うことで培養遠心上清からのＩＬ−６Ｒの回収率は４５．７％となり、２１．７倍精製された。
【００３５】
実施例６
実施例で得られた溶出液を市販のゲル濾過カラム（ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ、東ソー（株）製）に供し、ＩＬ−６Ｒのピークの有無を検討した。なお送液緩衝液としては１００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた。
【００３６】
用いたシステムは、紫外吸光度検出器（ＵＶ−８０２０、東ソー（株）製）、送液ポンプ（ＣＣＰＳ、東ソー（株）製）、カラムオーブン（ＣＯ−８０２０、東ソー（株）製）である。測定条件は、検出波長が２８０ｎｍ、ポンプの送液流速が１．０ｍｌ／分、カラム温度が２５℃である。
【００３７】
実施例で得られた溶出液の他に、培養遠心上清及び蛋白質的に均一に精製されたＩＬ−６Ｒについて同様の測定を行った。結果を図１〜図３に示す。これらから明らかなように、培養遠心上清（図１）では精製ＩＬ−６Ｒ（図３）の保持時間にはピークを確認することはできなかったが、吸着流動床操作による精製後の溶出液（図２）では精製ＩＬ−６Ｒの保持時間にピークを確認することができた。
比較例
本発明の効果を他の精製法と比較するために、一般的な精製法である硫安塩析法と比較した。
【００３８】
ＩＬ−６Ｒ発現ピキア属酵母培養液（１リットル）を限外ろ過膜（ＵＦ３０００ＰＳ、ポリスルホン膜、東ソー（株）製、分画分子量３００万）で処理して清澄な透過液を得た後、限外ろ過膜（ＵＦ１０ＰＳ、ポリスルホン膜、東ソー（株）製、分画分子量１万）で２００ｍｌまで濃縮した。
【００３９】
濃縮された溶液に３５．２ｇの硫酸アンモニウムを加え、３０％飽和硫安濃度になるよう調製した後、４℃で５時間放置した。該溶液を遠心分離し、上清に更に硫酸アンモニウムを加えて最終的に飽和硫安濃度（６５％）になるように調整した。４℃で一晩放置後、遠心分離を行い沈殿を回収した。
【００４０】
沈殿物を５０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液( ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液に対して４℃で一晩透析した。
【００４１】
硫安塩析及び透析後の水溶液中の総蛋白質にしめるＩＬ−６Ｒの割合は２．４％であり、培養上清中の総蛋白質にしめるＩＬ−６Ｒの割合は１．２％であった。  以上の通り、限外ろ過膜による清澄化・濃縮処理及び硫安塩析による分画操作を行うことによる培養上清からのＩＬ−６Ｒの回収率は４５％であったが、ＩＬ−６Ｒは２倍程度精製されたのみであった。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、イオン交換体を流動床として使用することで、夾雑物質を多量に含む溶液からIL-6R を効率よく回収精製することができる。特に、精製原料の濾過、濃縮等の前処理が不要であり、精製操作を容易にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例４中、培養遠心上清のゲル濾過TSK-gel G3000SW のクロマトグラフである。
【図２】図２は、実施例４中、吸着流動床溶出液のゲル濾過TSK-gel G3000SW のクロマトグラフである。
【図３】図３は、実施例４中、精製IL-6R のゲル濾過TSK-gel G3000SW のクロマトグラフである。
【図１】
0004154743.tif 000005
【図２】
0004154743.tif 000006
【図３】
0004154743.tif 000007