(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−［３−（４−ベンジルピペリジンー１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン又はその塩を含有することを特徴とする神経細胞保護薬。
【請求項２】
神経細胞が脳神経細胞であることを特徴とする請求項１に記載の神経細胞保護薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１，４−ベンゾチアゼピン誘導体を含有してなる神経細胞、特に脳神経細胞の保護薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢化社会に伴って、脳梗塞、脳血栓、脳塞栓、一過性脳虚血発作又はくも膜下出血等の脳血管疾患が増加している。これらの疾患は、加齢、高血圧、動脈硬化、高脂血症等が原因となって発症すると考えられている。これらの疾患においては、脳神経細胞の活動エネルギー源である酸素やブドウ糖などの供給不足となり、その結果、虚血部位及びその周辺の脳神経細胞は死に至る。その後、脳血管性痴呆等の後遺症が現れることもある。
【０００３】
脳細胞保護薬としては、特開昭６３−５１３２８号（ヨーロッパ特許２５６８９０号、米国特許４８３５１５５号）に、
【化３】
0004063964.tif 000002
が記載されている。又、特開昭６３−３０１８１９号（ヨーロッパ特許２５０２４１号、米国特許４８０４６５７号）、特開平１−３１６３６３号（英国特許２２１６５１７号、ドイツ特許３９０６９２０号、フランス特許２６２８１０８号、米国特許４９４８７９６号）、特開平３−２０２２２号（ヨーロッパ特許４１０１１４号、米国特許５０５５４７０号）、特開平４−２２５９５３号（ヨーロッパ特許４５６１８３号）、特開平６−２２８９０５号、特開平９−２９５９７６号、国際公開ＷＯ９７／０３９６８号（ヨーロッパ特許７８７７２１号）等にも各種化合物が記載されているが、いずれも１，４−ベンゾチアゼピン誘導体は記載されていない。
【０００４】
一方、特開平２−４１６０６６号（国際公開ＷＯ９２／１２１４８号、ヨーロッパ特許５６５７２１号、米国特許５４１６０６６号）に、一般式〔Ｉ〕
【化４】
0004063964.tif 000003
〔式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３の低級アルコキシ基を表し、Ｒ1は水素原子、炭素数１〜３の低級アルコキシ基、置換フェニル基（ここで、置換基は水酸基又は炭素数１〜３の低級アルコキシ基である。）、
【化５】
0004063964.tif 000004
（ここで、Ｒ2は炭素数１〜３のアシル基である。）、Ｘは酸素原子又はＨ2を表し、ｎは１又は２を表し、Phはフェニル基を表す。〕で示される１，４−ベンゾチアゼピン誘導体又はその薬学的に許容される塩が記載されており、又これらの化合物の製造方法も記載されている。
【０００５】
特開平２−４１６０６６号広報によれば、心筋梗塞患者の心筋に二種類の壊死形態〔Static cell death（ＳＤ）及びKinetic cell death（ＫＤ）〕があり、ヒトの心筋梗塞の主体をなす細胞死はＫＤであることが記載されている。当該発明化合物はＫＤ抑制作用を有するため、心筋梗塞の予防及び治療剤として有用である旨の記載がある。しかし、神経細胞の保護に関しては何らの記載もない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、神経細胞、特に脳神経細胞の保護薬として有用な化合物を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、驚くべきことに下記一般式〔Ｉ〕で表される化合物が優れた神経細胞、特に脳細胞の保護作用を有することを見い出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、神経細胞、特に脳神経細胞の保護薬として有用な化合物、特に下記一般式〔Ｉ〕で示される化合物に関する。より詳しくは、下記（１）〜（５）に示す通りである。
【０００９】
（１）  心筋細胞保護作用を有する化合物又はその塩を有効成分として含有してなる神経細胞保護薬。
【００１０】
（２）  一般式〔Ｉ〕
【化６】
0004063964.tif 000005
〔式中、Ｒ1は水素原子又は低級アルコキシ基を表し、Ｒ2は水素原子、低級アルコキシ基、フェニル基（該フェニル基は水酸基又は低級アルコキシ基で置換されてもよい。）、
【化７】
0004063964.tif 000006
（ここで、R3はアシル基を表す。）を表し、Ｘは
−ＣＯ−  、  −ＣＨ2−  を表し、ｎは１又は２を表す。〕で示される化合物又はその塩若しくはそのプロドラッグを含有してなる神経細胞保護薬。
【００１１】
（３）  神経細胞が脳細胞である上記（２）に記載の細胞保護薬。
【００１２】
（４）  化合物が４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン又はその塩若しくはそのプロドラッグである上記（２）に記載の神経細胞保護薬。
【００１３】
（５）  神経細胞が脳細胞である上記（４）に記載の細胞保護薬。
【００１４】
本明細書において使用する用語の定義は次の通りである。
「神経細胞保護薬」とは、神経細胞が虚血等によって壊死するのを防止、抑制又は予防する薬剤を意味する。又「神経細胞」とは、中枢神経細胞、特に海馬ＣＡ１錐体細胞等の脳における神経細胞を意味する。
【００１５】
「低級アルコキシ基」とは、炭素数１乃至６個の直鎖又は分枝鎖アルコキシ基を意味し、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ基又はヘキシルオキシ基等であり、好ましくは炭素数１乃至３個のメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基又はイソプロポキシ基であり、特に好ましくはメトキシ基である。
【００１６】
「アシル基」とは、炭素数１のホルミル基；炭素数２乃至６個のアルカノイル基であるアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基若しくはピバロイル基等；又は、アリール基上に一乃至三個の置換基を有してもよいベンゾイル基等のアロイル基である。好ましくはホルミル基、アセチル基、ピバロイル基又はベンゾイル基等である。
【００１７】
化合物の「塩」とは、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩又は硝酸塩等の無機酸付加塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩又はアスコルビン酸塩等の有機酸付加塩；アスパラギン酸塩又はグルタミン酸塩等のアミノ酸付加塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。又、場合によっては含水物あるいは水和物であってもよい。
【００１８】
化合物の「プロドラッグ」とは、化学的又は代謝的に分解し得る基を有し、加水分解や加溶媒分解によって、又は生理的条件下で分解することによって医薬的に活性を示す本発明化合物の誘導体である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明に係る一般式〔Ｉ〕で示される化合物において、Ｒ1として好ましくは炭素数１乃至3の低級アルコキシ基であり、特に好ましくはメトキシ基である。Ｒ2として好ましくは炭素数１乃至3の低級アルコキシ基又は水素原子であり、特に好ましくは水素原子である。Ｘとして好ましくは
−ＣＯ−  である。ｎとして好ましくは２である。
【００２０】
本発明に係る化合物、特に一般式〔Ｉ〕で示される本発明化合物は優れた神経細胞、特に脳神経細胞保護作用を有する。本発明化合物を脳梗塞、脳血栓、脳塞栓、一過性脳虚血発作又はくも膜下出血等の疾患、更にはこれらに起因して起こる脳血管性痴呆の治療及び予防、特に再発予防に用いる場合、通常全身的、あるいは局所的に、経口又は非経口で投与される。
【００２１】
投与量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人当たり０．０１ｍｇ乃至１ｇの範囲で、一日一回から数回経口あるいは非経口投与される。
【００２２】
本発明化合物を経口投与のための固体組成物にする場合、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤等の剤形が可能である。このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤、分散剤又は吸着剤等、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ等、ヒドロキシプロピルセルロース、微晶性セルロース、澱粉、ポリビニルヒドリン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム又は無水ケイ酸末等と混合される。又、組成物は常法に従って、希釈剤以外の添加剤を混合させてもよい。
【００２３】
錠剤又は丸剤に調製する場合は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース又はヒドロキシメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸溶性物質のフィルムで皮膜してもよいし、二以上の層で皮膜してもよい。さらに、ゼラチン又はエチルセルロースのような物質のカプセルにしてもよい。
【００２４】
経口投与のための液体組成物にする場合は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶解剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等の剤形が可能である。用いる希釈剤としては、例えば精製水、エタノール、植物油又は乳化剤等がある。又、この組成物は希釈剤以外に浸潤剤、懸濁剤、甘味剤、風味剤、芳香剤又は防腐剤等のような補助剤を混合させてもよい。
【００２５】
非経口のための注射剤に調製する場合は、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、可溶化剤、懸濁剤または乳化剤を用いる。水性の溶液剤、可溶化剤、懸濁剤としては、例えば注射用蒸留水、生理食塩水シクロデキストリン及びその誘導体、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、トリエチルアミン等の有機アミン類あるいは無機アルカリ溶液等がある。
【００２６】
水溶性の溶液剤にする場合、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコールあるいはオリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類等を用いてもよい。又、可溶化剤として、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、蔗糖脂肪酸エステル等の界面活性剤（混合ミセル形成）、又はレシチンあるいは水添レシチン（リポソーム形成）等も用いられる。又、植物油等非水溶性の溶解剤と、レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール等からなるエマルジョン製剤にすることもできる。
【００２７】
非経口投与のためのその他の組成物としては、一つ又はそれ以上の活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方される外用液剤、軟膏のような塗布剤、座剤又はペッサリー等にしてもよい。
【００２８】
【実施例】
次に、本発明化合物の薬理試験について具体的に説明する。
実施例１
中大脳動脈永久閉塞誘発脳梗塞に対する縮小作用（ラット）
Sprague-Dawley系雄性ラットをハロタンで麻酔し、体温を３７．５±１℃に保持しながら、中大脳動脈（ＭＣＡ）を電気焼勺にて閉塞した。ＭＣＡ閉塞２４時間後に全脳を摘出し、大脳全球より２ｍｍ厚の冠状断面を６切片作成した。これらの切片をトリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）染色し、梗塞体積（６切片の梗塞面積の総和×２ｍｍ）を浮腫による患側大脳半球の膨張率で補正した値を算出した。被験物質は、予め大腿静脈に挿入したカニューレより、閉塞直後に静脈内投与し、その後１８０分間持続注入した。被験化合物として４−［３−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）プロピオニル］−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾチアゼピン（以下、被験化合物１という。）を用い、陽性対照としてＭＫ−８０１を用いた。結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
0004063964.tif 000007
【００３０】
ＭＣＡ閉塞により、約２１０ｍｍ3の梗塞が誘発された。これに対し、被験化合物１の０．０３ｍｇ／ｋｇ（４．３μｇ／ｋｇ＋０．１４μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）及び０．１ｍｇ／ｋｇ用量は有意に梗塞巣を縮小し、脳神経細胞を保護することが示された。ＮＭＤＡ拮抗剤であるＭＫ−８０１の０．１４８ｍｇ／ｋｇ（４０μｇ／ｋｇ＋０．６μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）用量も有意に梗塞巣を縮小した。これらの効果は大脳皮質で認められ、皮質以外の部位では認められなかった。
【００３１】
実施例２
中大脳動脈永久閉塞誘発脳梗塞に対する縮小作用（ラット）
Sprague-Dawley系雄性ラットをハロタンで麻酔し、体温を３７．５±１℃に保持しながら、中大脳動脈（ＭＣＡ）を電気焼勺にて閉塞した。ＭＣＡ閉塞１週間後にホルマリン灌流固定して全脳を摘出し、大脳全球より２ｍｍ間隔で冠状断面を５切片作成した。これらの切片をNissl染色した後、次式により梗塞率を算出した。
【数１】
0004063964.tif 000008
被験物質は、予め大腿静脈に挿入したカニューレより、閉塞直後に静脈内投与し、その後１８０分間持続注入した。結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
0004063964.tif 000009
【００３３】
ＭＣＡ閉塞により、３７％の梗塞が誘発された。これに対し、被験物質1の０．２１ｍｇ／ｋｇ（３０μｇ／ｋｇ＋１μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）用量は有意に梗塞巣を縮小し、脳神経細胞を保護することが示された。ＮＭＤＡ拮抗剤であるＭＫ−８０１の０．１４８ｍｇ／ｋｇ（４０μｇ／ｋｇ＋０．６μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）用量も有意に梗塞巣を縮小した。これらの効果は大脳皮質で認められ、皮質以外の部位では認められなかった。
【００３４】
実施例３
局所脳虚血モデルにおける神経症状改善作用の検討（ラット）
Sprague-Dawley系雄性ラットをハロタンで麻酔し、体温を３７．５±１℃に保持しながら、中大脳動脈（ＭＣＡ）を電気焼勺にて閉塞した。ＭＣＡ閉塞３週間後に歩行異常、姿勢異常、後肢片麻痺を各々０〜２点、計０〜６点の評点で以下の基準で評価し、その総合点で被験化合物の作用を表した。
歩行異常
０点：まっすぐ歩ける。
１点：麻痺側に倒れる傾向あり。
２点：ぐるぐる回ってしまう。
姿勢異常；尾を持ち逆さにした状態で、
０点：両前肢ともまっすぐ伸ばす。
１点：麻痺側前肢を胸に付け、他前肢はまっすぐ伸ばす。
２点：上半身を反対方向にひねる。
後肢片麻痺；麻痺側後肢の甲をペンで持ち上げたときに、
０点：すぐ逃げる。
１点：時々逃げる。
２点：逃げない。
被験物質は、予め頚静脈に挿入したカニューレより、閉塞直後に静脈内投与し、その後１８０分間持続注入した。結果を表３に示す。
【００３５】
【表３】
0004063964.tif 000010
【００３６】
閉塞３週間後の神経症状の総点（０〜６点）に対して、被験物質１の０．０２ｍｇ／ｋｇ及び０．２１ｍｇ／ｋｇ用量は有意な改善作用を示した。その効果は歩行異常と姿勢異常でより顕著であった。
【００３７】
実施例４
両側総頚動脈一過性虚血誘発神経細胞死に対する抑制作用（砂ネズミ）
砂ネズミをハロタンで麻酔し、頭皮下温を３７℃に保持しながら、両側総頚動脈を杉田式クリップにより３分間虚血した後、再灌流した。再灌流７日後にホルマリン灌流固定した後、全脳を摘出し、冠状断面（bregma  −１．９ｍｍ〜−１．４ｍｍ）を作成し、Nissle染色した。海馬ＣＡ１領域の残存する錐体細胞数を盲検で計数した。Vehicleと被験化合物１は虚血１時間前と１〜６日後の計７回経口投与した。ＡＭＰＡ拮抗剤であるＮＢＱＸは虚血再灌流直後、１５、３０分後の計３回腹腔内投与した。シクロオキシゲナーゼ阻害剤であるFlurbiprofenは虚血３０分前に腹腔内投与した。結果を表４に示す。
【００３８】
【表４】
0004063964.tif 000011
【００３９】
海馬ＣＡ１錐体細胞残存数は、sham群の３５７±２６個／ｍｍ（mean±S.D.）に対し、３分虚血再灌流群では６０±３１個／ｍｍで有意に減少していた。これに対し、被験化合物１の０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇの各用量、ＮＢＱＸ及びFlurbiprofenは有意な細胞死抑制作用を示した。
【００４０】
実施例５
グルタミン酸誘発神経細胞死に対する抑制作用（ラット胎児大脳皮質）
Wistar系妊娠ラットから胎児（胎生１９日目）を摘出し、大脳皮質解離神経細胞の初代培養を行った。培養１２〜１３日目に次のプロトコールに従ってグルタミン酸添加による細胞死を、トリパンブルー染色後の計数により判定した。
プロトコールＡ
１ｍＭグルタミン酸を１０分間添加した後、グルタミン酸非存在下で６０分間放置した。薬物添加はグルタミン酸添加直後から７０分間行った。
プロトコールＢ
０．５ｍＭグルタミン酸を５分間添加した後、グルタミン酸非存在下で２４時間放置した。薬物添加はグルタミン酸添加直後から２４時間５分行った。
結果を表５に示す。
【００４１】
【表５】
0004063964.tif 000012
【００４２】
プロトコールＡでは、グルタミン酸添加による細胞生存率（生細胞数／全細胞数）は４５％であった。被験化合物１は用量依存的に生細胞数を上昇させ、最小薬効量は１００ｎＭであった。ＭＮＤＡ拮抗剤であるＭＫ−８０１も同様の細胞死抑制作用を示した。
プロトコールＢではグルタミン酸添加による細胞生存率は３７％であった。被験化合物１は用量依存的に生存率を上昇させ、最小薬効量は１００ｎＭであった。ＭＫ−８０１も同様の細胞死抑制作用を示した。
【００４３】
【発明の効果】
本発明に係る化合物、特に一般式〔Ｉ〕で示される化合物は、上記実施例からも明らかな通り、優れた神経細胞、特に脳神経細胞の保護作用を有する。従って、神経細胞、特に脳神経細胞の死が起きる疾患、例えば、脳梗塞、脳血栓、脳塞栓、一過性脳虚血発作又はくも膜下出血等の疾患、更にはこれらに起因して起こる脳血管性痴呆の治療及び予防、特に再発予防に有用であると考えられる。それ故、これらの疾患に対して極めて有効な治療薬となることが期待される。