(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
In vitroにおいて細胞の増殖を促進する方法であって、
In vitroにおいて、細胞と細胞増殖基質とを、前記細胞を増殖に導く条件下でコンタクトさせる工程を包含し、
前記細胞増殖基質は、温血脊椎動物の胃粘膜下組織を含むこと、
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記胃粘膜下組織は、筋層及び少なくとも粘膜層の管腔部分から剥離された粘膜下層を含むこと、
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞と細胞増殖基質とをコンタクトさせる前記工程は、流動状の粘膜下組織で被覆された培養器で、前記細胞を培養する工程を包含することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞増殖基質は、流動状胃粘膜下組織と液体細胞培養培地を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
培養困難な微生物の増殖を支持するための培養培地組成物であって、
温血脊椎動物の胃粘膜下組織を含むこと、
を特徴とする組成物。
【請求項６】
さらに、付加的栄養、ミネラル、又は増殖因子を含むことを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記胃粘膜下組織は、筋層と粘膜層の少なくとも管腔部分とから剥離された粘膜下層を含むこと、
を特徴とする請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
前記胃粘膜下組織は、流動状の胃粘膜下組織であることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記胃粘膜下組織は、前記組織を可溶化し、実質的に均質な溶液を作製するのに十分な時間、酵素で消化されることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
In vitroにおいて培養困難な細胞を増殖する方法であって、
In vitroにおいて、細胞と細胞増殖基質とを、前記細胞を増殖に導く条件下でコンタクトさせる工程を包含し、
前記細胞増殖基質は、温血脊椎動物の胃粘膜下組織を含むこと、
を特徴とする方法。
【請求項１１】
感染性物質を同定するための方法であって、
温血脊椎動物の胃粘膜下組織を含む細胞増殖基質にサンプルを接種し、
前記細胞増殖基質上の前記サンプルを、前記細胞の増殖に導く条件下で培養する工程を含むこと、
を特徴とする方法。
【請求項１２】
感染性物質の増殖特性をin vitroで分析する方法であって、
温血脊椎動物の胃粘膜下組織を含む細胞増殖基質に細胞を接種する工程と、
前記細胞増殖基質上の前記感染性物質を、選択された種々の細胞増殖条件下で培養する工程と、
前記細胞増殖基質上に接種された前記感染性物質を組織学的に検査する工程と、
を包含する分析方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は粘膜下組織組成物および培養条件の難しい細胞の増殖の促進のためのこれら組成物の使用に関する。より詳細に述べるならば、本発明は粘膜下組織細胞培養基質を使用してin vitro増殖を高め、それによって脊椎動物感染性病原体のin vitro増殖、したがって同定および診断を高めることに向けられる。
発明の背景
細菌は非常に種々様々の環境に生息する多様な微生物群である。特に、多くの細菌種は脊椎動物ホスト表面にもその中にも生息する。脊椎動物の管腔にコロニーを形成する細菌は、一般的にはそのホスト生体内の前記細菌の最適環境を含む組織と特異的相互作用をおこす。多くの細菌は、精密に調整された特異性を有する粘着性を発現して真核細胞表面のタンパク質または炭水化物構造と相互作用し、そのため、適した受容体を有する限られた範囲のホストおよび組織のみが細菌コロニー形成のために利用できる。
例えば、もし細菌が脊椎動物消化器系の粘膜層に粘着できないならば、それらは局所的非特異的ホスト防御機構（蠕動、繊毛運動および、上皮細胞集団および粘液層のターンオーバー）によって速やかに除去される。その上、スペースおよび栄養に対する細菌間の競争、およびｐＨおよび抗菌ペプチド等の生化学パラメーターの細菌耐性によって、特殊なニッシェにコロニーを形成できる細菌種／菌株が選択される。この選択プロセスの結果は組織向性と呼ばれることが多い。
検出法が改良されるにつれて、新しい細菌種が発見され続けている。しかし、多くの検出された菌種は、これら微生物に特異的な培養条件が必要なために、それらの天然の微小環境の外では培養が困難であることがわかっている。したがって、微生物の培養を試みる研究者たちは、その微生物が増殖するin vivo環境に似たin vitro微小環境を作り出そうと試みている。微生物のin vitro増殖を可能にすることは、感染性および病原性微生物の同定のために、また諸疾患の診断のために特に重要である。その上、in vivo環境を模したin vitro微小環境は、このような微生物のin vitro研究を可能にする。
多くの感染性物質は、既存の培養培地に載置された際、現在の技術的状態では増殖できず、したがって検出されないことが多い。In vitro培養が困難であることが証明された医学的に重要な微生物の１つがピロリ菌（Helicobacterpylori）―螺旋形グラム陰性微小好気性菌―である。ピロリ菌は脊椎動物種の胃を内張りする粘膜層に生息し、その粘膜層によって胃酸から一部防御されている。その微生物は胃の上皮細胞と相互作用するタンパク質を分泌し、マクロファージおよび白血球等の食細胞を誘引し、これらの食細胞は炎症および胃炎をおこす。その上、この細菌は、尿素のアンモニアおよび二酸化炭素への分解を助ける酵素であるウレアーゼを産生する。アンモニアは胃酸を中和し、ピロリ菌のさらなる増殖を可能にする。ピロリ菌は胃潰瘍の形成に寄与する毒素も分泌する。ピロリ菌は慢性活性胃炎および胃十二指腸潰瘍の原因物質であると示唆されている。より最近には、ピロリ菌感染は胃腺癌および胃の粘液関連性リンパ組織リンパ腫の発生とも関係づけられている。
多くの細菌は酸性環境では生存できないが、ピロリ菌は霊長類の胃の表面にコロニーを形成できる唯一の細菌ではない。ピロリ菌の発見以来、科学者たちはその他の霊長類、例えばイヌ、ネコ、齧歯類、ケナガイタチ、さらにはチータ等の胃から１１種類のその他の微生物を分離した。これらの細菌は今ではヘリコバクター科のメンバーであると考えられている。すべてが螺旋形でよく動き、胃内容物を規則的に排除する筋収縮に耐えることができる特性を有する。これらの微生物は酸素濃度５パーセントで最もよく増殖する。このレベルは胃粘膜層に見いだされる酸素濃度と一致している（周囲空気は２１パーセント酸素）。
抗体をベースとした血液試験を用いてピロリ菌の存在を明らかにした研究によって、世界人口の３／１ないし半分がピロリ菌を有していることが示された。米国および西ヨーロッパでは、子供たちは滅多に感染していないが、この細菌の蔓延は年齢と共に高まり、これらの国々の６０歳の人々の半数以上はこの細菌に感染している。これに対し、発展途上国では子供たちの６０ないし７０パーセントが１０歳までに陽性の試験結果を示し、その感染率は成人ではより高くなる。ピロリ菌感染は特殊施設に収容された子供たちでも共通である。ピロリ菌は未治療の人では長期存続が可能であり、治療しなければピロリ菌はホストの一生を通じて胃粘膜に居続ける。
ピロリ菌感染の存在を検出する最初のスクリーニングとしては血液試験が有用であるが、この血液試験はピロリ菌に対する抗体の検出に基づいており、したがって生きているピロリ菌の存在を直接試験するものではない。抗体のスクリーニングはその人がピロリ菌に感染していたかどうかに関する情報を提供するに過ぎない。さらに、血液試験は偽陽性を与えることが知られている。本発明はピロリ菌を増殖させる特殊な細胞培養基質を用いてピロリ菌の存在を直接分析試験する方法を記載するものである。
１９８３年にピロリ菌は複合培地（ウォルカー培地）を用い、培養期間を延長することによって（通常の２日間の培養の代わりに５日間の培養）、初めてin vitro培養された。これは現在もピロリ菌増殖法として用いられているが、この方法は長い培養時間を必要とし、高価な複合培地処方を使用するという欠点を有する。さらに、現在用いられている培養培地はピロリ菌の天然in vivo環境を模することができない。培養細胞の代謝的活性および細胞の形態は、それらが増殖する基質の組成によって影響を受ける。多分、培養細胞は、それらの天然環境に極く似た基質に培養された際に最もよく機能する（すなわち、増殖し、それらの天然in vivo機能を行う）。したがって、ピロリ菌のin vitro増殖に基づく現在の細胞機能研究は、培養細胞の増殖および発達に適した生理的環境をもたらす細胞増殖基質がないこと故の限界を有していると言える。本発明の組成物は、脊椎動物種の胃を天然に占領している細胞の増殖に現在使用できるものよりも適切な生理的増殖環境を提供する。
発明の概要
本発明は、培養困難な微生物のin vitro培養を可能にするために必要な微小環境を提供する、脊椎動物粘膜下組織を含む細胞外基質に向けられている。天然に生ずる細胞外基質は、原核生物微生物、真菌類、および標準的培養培地では増殖困難の、比較的よくわかっていない種々の属および種の感染性病原体の増殖基質として役立つことがある。本発明の細胞外基質はこれら微生物の増殖を高め、したがってこれら微生物によって起きる病的状態の検出および診断を向上させる。同様に、胃、尿路管、または腸から分離した胃粘膜下組織を含む細胞培養基質を用いて、これらの組織のソース器官の天然in vivo環境を模することができる。このため、このような基質でin vitro増殖する細胞は、これら微生物の種々の使用し得る治療薬に対する感受性に関して、生理学的により有効なデータを与える。
発明の詳細な説明
定義
細胞培養に関して本明細書に用いる用語“コンタクト”とは、粘膜下組織と培養細胞との間の直接接触、および液体連通等の間接接触の両方を含むものとする。
ここに使用する用語“「培養困難な細胞を増殖に導く条件」”および“「原核細胞を増殖に導く条件」”とは、これら細胞の増殖のために最適と考えられる滅菌方法、温度および栄養源等の環境条件を言う。典型的にはこれらの条件は細胞がその天然環境においてさらされている諸条件を模したものである。
ここに用いる用語“「培養困難な微生物」”または“「培養困難な細胞」”とは、標準的増殖基質で増殖できない（または非常にゆっくりと増殖する）微生物または細胞を言う。特に、「培養困難な微生物」は原核生物、真菌病原体および標準的培養培地では増殖が難しい、あまりわかっていない種々の属および種の感染性病原体を含む。
本発明により、「培養困難な微生物」のin vitro増殖を支持する方法および組成物が提供される。一般に、上記方法は「培養困難な細胞」と脊椎動物粘膜下組織由来基質とを、in vitroで、これら細胞の増殖に導く諸条件のもとでコンタクトさせる段階を含む。
本発明により使用するための粘膜下組織由来基質は高度に保存されたコラーゲン類、糖タンパク質類、グリコプロテイン類、プロテオグリカン類およびグリコサミノグリカン類をそれらの天然の形および天然濃度で含む。本発明に使用するための粘膜下組織は食肉生産用に飼育されるブタ、ウシ、およびヒツジまたはその他の温血脊椎動物といった動物から採取される胃、膀胱または腸組織等の種々のソース臓器から得ることができる。この組織は普通は食肉加工の際廃棄される副産物である。その組織を天然の形、または細切しまたは部分的に消化した流動形で用いることができる。脊椎動物粘膜下組織は市場における食肉生産工程の豊富な副産物であり、したがって、その粘膜下組織がその天然本来のシート形で用いられる際は特に低コストの細胞増殖基質である。
一般に、粘膜下組織は消化管、気道、腸管、尿路管および生殖管を含む温血脊椎動物の組織から、粘膜下組織を平滑筋層および粘膜層両方から剥離することによって作成される。腸粘膜下組織の調製は米国特許第４，９０２，５０８号に記載され、特許請求されており、その開示は参照として本明細書の記載の一部とする。膀胱粘膜下組織およびその調製は米国特許第５，５５４，３８９号に記載され、その開示は参照として本明細書の記載の一部とする。胃粘膜下組織も同様な組織処理法を用いて得られ、特徴づけられる。
一実施態様によると、前記細胞培養基質は温血脊椎動物の胃組織に由来する胃粘膜下組織を含む。胃壁は、粘膜層（上皮層と、網状または微細疎性組織からなる固有層と、腺層とを含む）、粘膜下層（疎性組織からなり、腺はない）、筋層（３層の筋からなる）、および漿膜（筋層を覆う疎性結合組織の外側の中皮層）からなる。血管、リンパ組織および神経組織も粘膜下層を含む胃組織に広がっている。
本発明による胃粘膜下組織は粘膜層の腺部分および外筋の平滑筋層から剥離された胃粘膜下組織を含む。その組成物は増殖基質物質として用いるとき、in vitroで細胞の成長および増殖をおこし得ることがわかった。特に、胃粘膜下組織を含む細胞基質は、自然に霊長類の胃に生息する微生物のin vitro増殖を高めることが判明した。さらに、その物質は病原性微生物培養物の成長および増殖の天然パターンを評価し、疾患過程の病因をより良く特徴づけることができる有用な手段として役立つ。
本発明の一実施態様による粘膜下組織細胞培養基質は、隣接胃組織層から剥離された温血脊椎動物の胃粘膜下組織を含んでなる。一実施態様において、胃粘膜下組織は霊長類の胃組織または脊椎動物の消化管のその他の酸産生組織から調製される。
一実施態様において、本発明の粘膜下組織細胞培養基質は温血脊椎動物の胃切片の外筋の平滑筋層と粘膜層の少なくとも管腔部分とから剥離された粘膜下組織を含んでなる。一実施態様において、粘膜下組織組成物は温血脊椎動物の胃の粘膜下層と粘膜層の基底部分とを含む。典型的には、以下に述べる剥離法が実質的に胃粘膜下組織からなる組織組成物を与える。これらの組成物をここでは胃粘膜下組織という一般名で呼ぶことにする。
胃切片からの胃粘膜下組織の調製は、米国特許第４，９０２，５０８号に詳述されている腸粘膜下組織の調製と同様である。その開示は参照として本明細書の記載の一部とする。胃組織切片をまず最初に縦方向にふき取ることで剥離し、外側層（特に平滑筋層）と粘膜層の管腔部分とを除去する。こうして得た粘膜下組織は約１００ないし約２００マイクロメーターの厚さを有し、主として（９８パーセントより多い）無細胞性の、好酸性染料で染まる（Ｈ＆Ｅ染色）細胞外基質からなる。血管および、線維細胞と一致する紡錘細胞が組織全体に無秩序に散在することがある。典型的には、その粘膜下組織を水で約２時間すすぎ、任意に凍結水和状態で、下記のようにして使用するまで保存する。
流動状粘膜下組織は米国特許第５，２７５，８２６号に記載のように、流動状腸粘膜下組織の調製に同様の方法で調製することができる。その開示は参照として本明細書の記載の一部とする。この粘膜下組織を引裂、切断、摩砕、剪断等によって細砕する。凍結または凍結乾燥状態の粘膜下組織を摩砕するのが好ましい。ただし、粘膜下組織片の懸濁液を高速（高剪断）ブレンダーにかけ、遠心分離によって脱水し、過剰の水をデカントするという方法でも良い結果が得られる。さらに、トリプシンまたはペプシン等のプロテアーゼ類、またはその他の適切な酵素類、または酵素混合物の使用を含む粘膜下組織の酵素消化を、前記組織を可溶化し、実質的に一様の、または均質な溶液を形成するのに十分な時間行うという方法で、細切した流動状組織を可溶化することができる。
本発明は粉末状粘膜下組織の使用も考慮する。一実施態様において、粉末形粘膜下組織は、粘膜下組織を液体窒素下で粉末にして、０．１ないし１ｍｍ2の寸法の粒子にすることによって調製される。次いで前記粒状組成物を一晩凍結乾燥し、滅菌し、固体の実質的に無水の粒状混成物を得る。或いは、粘膜下組織の粉末形は流動状粘膜下組織から、細砕および／または部分的消化された胃粘膜下組織の懸濁液または溶液を乾燥することによって形成できる。
本発明の粘膜下組織組成物はグルタールアルデヒドなめし、酸性ｐＨにおけるホルムアルデヒドなめし、エチレンオキシド処理、プロピレンオキシド処理、ガスプラズマ滅菌、ガンマ照射、および過酢酸滅菌を含む一般的滅菌方法を用いて滅菌できる。移植片の機械的強度およびビオトロピック特性を顕著には弱めない滅菌方法が好ましくは用いられる。例えば、強いガンマ照射は移植片材料の強度の損失をおこすと考えられている。粘膜下組織移植片のより魅力的な特徴の一つはそれらがホスト−リモデリング反応を誘発し得ることであるから、その特性を減損する滅菌方法は使わないことが好ましい。好ましい滅菌方法は、移植片を過酢酸、低量ガンマ照射（≦２．５ｍＲａｄ）およびガスプラズマ滅菌にさらすことを含む。過酢酸滅菌が最も好ましい方法である。典型的には、組織移植片組成物を滅菌した後、上記組成物を無孔性プラスチックラップに包み、エチレンオキシドまたはガンマ照射滅菌方法を用いて再び滅菌する。
本発明の粘膜下組織組成物は、本発明により、in vitroで培養される「培養困難な細胞」の成長および増殖の促進の方法及び組成物に用いられる。一般的にその方法は「培養困難な細胞」と脊椎動物粘膜下組織由来基質とを、in vitroで、細胞増殖に導く条件下でコンタクトさせる段階を含む。原核細胞のような細胞類の培養に用いる最適細胞培養条件は個々の細胞型にある程度依存するとはいえ、細胞増殖条件は当業者には一般的に公知である。
温血脊椎動物の胃粘膜下組織は本発明に使用する細胞培養基質の好ましいソースの一つである。出願人は胃粘膜下組織を含む組成物を用いて培養条件の難しい原核細胞のin vitro成長または増殖を促進できることを見いだした。本発明により、胃粘膜下組織を、例えば天然のシート様形態等を含む種々の形で細胞増殖基質として用い、またはゲル基質として、または当業者には公知の細胞／組織培養培地の補助的成分として、または培養器具のコーティングとして用い、粘膜下組織とコンタクトしている細胞の増殖を助け、促進する生理学的により有効な基質を提供することができる。上記粘膜下組織は細胞培養の用途に使用する前に滅菌するのが好ましい。
一好適実施態様において、ピロリ菌等の培養困難な原核細胞を、原核細胞増殖に導く諸条件下で温血脊椎動物の胃粘膜下組織シート上に直接接種する。胃粘膜下組織は多孔性であるため、細胞の栄養はその粘膜下組織基質を通って拡散することができる。このため、例えば、細胞は胃粘膜下組織の管腔表面または管腔側とは反対の外管腔表面どちらに培養してもよい。管腔表面は材料となる臓器の管腔に面する粘膜下組織表面であり、in vivoでは普通は内部粘膜層に隣接している。一方、外腔表面（abluminal surface）とは、臓器の管腔から離れる方向を向いている粘膜下組織表面であり、普通、in vivoでは平滑筋組織と接触している。
種々の細胞増殖条件の、培養細胞の増殖特性に与える影響をin vitro分析するためには、上記細胞を温血脊椎動物の胃粘膜下組織を含む細胞増殖培地に接種し、上記細胞の増殖に必要な栄養を含む培養培地を上記細胞に提供する。その後上記接種細胞をあらかじめ選択した変動可能の細胞増殖条件下で時間も種々変えて培養し、次いで粘膜組織基質およびその基質上の細胞集団を組織学的に試験する。選択される増殖条件が、上記栄養培地中の細胞増殖を変化させる化合物たとえばサイトカイン類または細胞傷害性物質等の存在または濃度であってもよい。或いは選択される増殖条件は、温度、ｐＨ、電磁放射、または栄養組成物等の環境因子の変更であるかも知れない。選択される増殖条件が細胞の形態および成長に与える影響をその後、対照（選択された増殖条件がない場合の培養細胞）-および試験細胞培養物の組織学的分析によって評価することができる。
本発明のもう一つの実施態様では、本発明による細胞増殖基質が酵素的消化によって可溶化した流動状粘膜下組織から形成される。消化された流動化粘膜下組織をゲル化して固体または半固体基質を形成できる。例えば胃粘膜下組織を流動状にし、酵素消化し、ゲル化して、胃粘膜下組織を含むゲル状細胞培養基質を形成できる。本発明によって使用するための流動状粘膜下組織の粘度は、粘膜下組織成分濃度および水和程度の調節によって操作することができる。その粘度を２５℃で約２ないし約３００，０００ｃｐｓの範囲に調節できる。比較的高粘度の組成物、例えばゲルは、上記粘膜下組織消化溶液から、そのような溶液のｐＨを約６．０ないし約７．４のｐＨに調節することによって調製することができる。その後真核または原核細胞を上記基質の表面に直接接種し、細胞増殖に導く諸条件下で培養することができる。
本発明の細胞増殖基質は、細胞増殖を容易にするミネラル、アミノ酸、糖類、ペプチド類、または糖タンパク質等の栄養と組み合わせることができる。一好適実施態様において、流動状または粉末状の粘膜下組織を標準培養培地の補充物として用いて、標準培地のin vitro培養される「培養困難な細胞」の増殖を促進、誘発する能力を高めることができる。
本発明により、「培養困難な微生物」（真核および原核生物両方を含む）のin vitro増殖を助けるための細胞培養組成物が提供され、その組成物は温血脊椎動物の粘膜下組織を含んでなる。上記組成物はさらに、培養細胞の最適増殖のために必要な付加的栄養、および／または増殖因子を含んでもよい。本発明の粘膜下組織基質は市販の細胞培養液体培地（血清をベースとしたもの及び血清なしのものどちらでもよい）と共に用いることができる。本発明により増殖する際には、増殖する細胞は粘膜下組織と直接接触していてもよいし、上記粘膜下組織と液体連通するだけでもよい。
例１
胃粘膜下組織の調製
本発明の組織移植片材料を以下の諸段階によって調製する。
先ず最初に、食道および小腸を胃の流入および流出点で切断することによって胃を材料となる動物から取り出す。上記胃から余分な腸間膜組織または脂肪をすべて除去し、胃の内容物を排出し、水道水ですすぐことにより残る残留物を胃の内側から除去する。
次いでこの胃を裏返して胃の内側層を露出させる。この胃において、胃の流入点または流出点になり始める部分を除去する。胃は典型的にはまるごとのままであるが、別のやり方として、胃を切って平坦にしてから、要らない組織を除去してもよい。胃の管腔表面を鋏または止血鉗子のハンドル部分を用いてこすり、粘膜層の少なくとも管腔部分を含む胃の内側層をこすり取る。この時点では薄い残留層が残る。組織がまるごとのままである場合には、その胃組織を再び裏返して胃の管腔表面を移植片構成物の内側に戻す。次いで外側筋線維層に小さいカット部分を作成する。その後鋏または止血鉗子を用いて粘膜下組織から筋層を剥離し、筋にあるそのカット部分を拡げ、筋層をこすり取る。
残った組織を再び裏返し、管腔側を組織移植片の外側にする。管腔表面をこすり、褐色がかった残りの内側残留物を除去する。胃組織を、その組織が桃白色に見えるようになるまでこすり取る。胃組織の調製中は、定期的に水で湿らせることによってその組織を保存するように注意する。胃粘膜下組織を水道流水で約２時間すすぎ、すべての血液またははがれた疎性組織を除去する。すすいだ後の組織は白く見えていなければならない。組織がまだ桃色がかっている際にはそれを白色に見えるようになるまで水中でこする。完全にすすいだ後、組織を手またはしぼり機（mechanical (w?)ringer）でしぼる（(w?)ringing）することによって、余分な水を除去する。組織を液体窒素中でマイナス８０℃で保存する。
例２
胃粘膜下組織のin vitro細胞増殖特性
胃粘膜下組織が細胞外基質としてin vitro細胞増殖を促進するように機能する能力を、数種類の細胞型を標準的細胞培養条件下で胃粘膜下組織表面に接種することによって試験した。試験した細胞型は３Ｔ３線維芽細胞、腸上皮細胞、およびＦＲ（ラット胎児）間葉細胞を含んでいた。３種類の細胞型すべてはこの細胞外基質上で、プラスチック表面の場合にはこれら細胞の増殖のために必要となる補助物質を添加せずとも、容易に増殖できることを示した。したがって、この物質は細胞増殖を助けるための細胞培養基質として機能するのに必要な構造および組成物“栄養”を含む、と結論づけることができる。
例３
カービー−バウエル（Kirby-Bauer）試験
胃粘膜下組織がピロリ菌の増殖を阻止するかどうかを確認するためにカービー−バウエル試験を行った。ピロリ菌の個々のコロニーをチョコレート寒天プレートから分離し、小さいチューブ中で滅菌生理食塩水１ｍｌに接種するように用いた。その後この滅菌生理食塩水を用いて、滅菌綿スワブを用いてチョコレート寒天プレートに接種した。胃粘膜下組織の小片（直径約２５−５０ｍｍ）を前記接種済チョコレート寒天プレートの中程に載置し、プレート表面に押し付けて、その粘膜下組織が確実にチョコレート寒天に粘着するようにした。この実験を２回行った。すなわち２枚のプレートでは粘膜下組織の管腔側がチョコレート寒天と接触し、２枚のプレートでは粘膜下組織の外管腔表面が寒天と接触する。次いでそれらのプレートを３７℃で有気インキュベーターのキャンピー瓶（Campy jar）中でインキュベートした。インキュベーション後、それらプレートをインキュベーターおよびカンピージャーから取り出した。プレートを観察し、粘膜下組織の周りに阻止領域があるかどうかを調べた。カービー−バウエル試験の結果は、胃粘膜下組織はピロリ菌またはその他の微生物の増殖を阻止しないことを示す。
例４
胃粘膜下組織基質上のピロリ菌のin vitro増殖
滅菌フード中で滅菌生理食塩水２ｍｌを小さいチューブに移した。ピロリ菌を含む２つのチョコレート寒天プレートをぬぐい、この細菌を上記滅菌食塩液に移すという方法で上記食塩液にピロリ菌を接種した。チョコレート寒天は下記のものを含む一般的に用いられる栄養豊富な培地である。
カゼインのパンクレアチン消化物          ７．５ｇ
上質の食肉ペプトン                      ７．５ｇ
コーンスターチ                          １．０ｇ
燐酸二カリウム                          ４．０ｇ
燐酸一カリウム                          １．０ｇ
塩化ナトリウム                          ５．０ｇ
寒天                                  １２．０ｇ
ヘモグロビン                          １０．０ｇ
イソビタレックス（Iso Vitalex）補充   １０．０ｍｌ
接種２ｍｌ生理食塩水の１００μｌを滅菌食塩液５ｍＬに移し、細胞濃度を測定するためのマックファーランド試験を行った。（５×１０7）（５．１）＝０．１Ａ。したがってＡ＝２．５５×１０9微生物／ｍＬである。
ピロリ菌含有生理食塩水の逓減希釈を次のように行った。接種２ｍＬ溶液から３００μｌをとり、ウォーカーズ(Walker’s)培地２７００μｌに加え、１０-1濃度を得た。次いで１０-1濃度溶液の３００μｌをウォーカーズ培地２７００μｌに加え、１０-2濃度を得た。１０-5濃度に達するまでこの方法を続ける。
管腔側を上にした胃粘膜下組織シートを２４穴（24 well）トレーから、蓋の頂部に置いた。分離滅菌２４ウェル−トレーの蓋には適切な対照およびサンプルのラベルで印を付けた。胃粘膜下組織を、アルコール滅菌し、火にあてた鋏で〜１ｃｍ片に切り、個々の片を、アルコール滅菌し、火にあてた鉗子を用いて適切な印のついたウェルに移した。胃粘膜下組織を管腔側を上にして、または管腔側を下に向けてそれらのウェルに載置した。４００ｍｌの適切な濃度（希釈）の培地及び細菌（１０-3、１０-4、１０-5）を各ウェルに加えた。さらに、一連の“粘膜下組織のみの対照”のウェルを調製した。これらは粘膜下組織を含むウェルに滅菌食塩液４００μｌのみを入れたものである。最後にトランスファー培地と細菌のみ（粘膜下組織を含まず）を“細菌のみ”の対照として適切なウェルに加えた。
上記マイクロリッター（microliter）トレーをキャンピー（Campy、米国登録商標）ポーチに入れ、有気（Ｏ2）インキュベーター中で３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを各マイクロタイター(microtiter)ウェルの上澄液および膜両方から取り、チョコレート寒天プレート上に載置した。１０-5までの希釈の各濃度（元の接種生理食塩水を含む）ごとに２つのサンプルを培養し、粘膜下組織の存在下で培養したピロリ菌の増殖効率を調べた。
粘膜下組織上澄液に存在する細菌数を定量するために、上澄液１００μｌをウェルから取り、チョコレート寒天プレート上に接種し、アルコールと火で滅菌したホッケースチック（hockey stick）で広げた。粘膜下組織膜の上および中に増殖するピロリ菌の数を測定するために、細胞を次のようにして組織から分離した。粘膜下組織をウェルから取り、２または３枚に切った。これらの片を新鮮なウォーカーズ培地４００μｌを含む遠心分離管に入れ、その管を〜３０秒間渦状に振とうした。渦状に振とうした溶液１００μｌをチョコレート寒天プレート上に接種し、アルコールと火で滅菌したホッケースチックで広げた。
次いで接種したチョコレート寒天プレートをキャンピー瓶の中で３７℃で、有気インキュベーター中で３−４日間インキュベートした。それらのプレートをインキュベーターおよびキャンピー瓶から取り出し、各プレート上のコロニー数を解剖顕微鏡で観察して測定した。１ｍＬあたりの微生物数を次のように計算した。コロニー数×希釈ファクター（１０3、１０4または１０5のいずれか）×１０（プレート上には１００μｌを置いたため）＝微生物数／ｍＬ。例えば１０-3希釈プレート上の５７コロニーは５７×１０3×１０＝５．７×１０5微生物／ｍＬに等しい。胃粘膜下組織の存在下におけるピロリ菌のin vitro培養から蓄積されたデータを表１に示す。
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結果
計算値を元の逓減希釈およびマックファーランド標準から得られた数と比較し、胃粘膜下組織が存在する場合のピロリ菌インキュベーション中に起きた増殖程度を調べた。表１のデータが示すように、胃粘膜下組織はピロリ菌の増殖を促進し得る。チョコレート寒天プレート上のコロニー数は予想通り、各逓減希釈で増加し、それはピロリ菌の増殖を示す。これらの実験では相変わらず汚染が問題である。したがって、胃粘膜下組織上にピロリ菌が増殖する最適条件はまだ確認されていない。しかし、これらの実験は、胃の粘膜下組織のピロリ菌増殖促進能力を明らかに示す。最適条件が決まるならば、他の微生物による汚染の問題は排除されるであろう。
本実験は細菌細胞培養培地の存在下における胃粘膜下組織基質上のピロリ菌の増殖を分析したものである。別の実施態様において、胃粘膜下組織基質を用いて真核細胞培養培地の存在下におけるピロリ菌を培養することができる。真核細胞培養培地、最も好ましくは哺乳細胞培養培地の存在は、より生理的な環境をもたらし、したがって細菌が寄生し、病原性をあらわすためのホストとしての胃粘膜下組織の機能を最適化する。
このようにして諸条件がピロリ菌のin vitro増殖のために最適化されると、これら細菌の天然環境をよりよく模する環境においてこれら細菌の抗生物質感受性を評価することができる。そのため、本発明の培養基質は、ソース組織からのピロリ菌の存在の検出に用いられるだけでなく、ピロリ菌感染患者を効果的に治療するのに必要な最適抗生物質および抗生物質濃度を研究するために用いることもできる。