(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（Ｉ）
【化１】
0004033502.tif 000011
〔式中、Ｘは任意のヌクレオチドを表し、Ｘｎ及びＸｍは任意のオリゴヌクレオチドで形成され、一緒になってステムループを形成する。〕で示されるＲＮＡ鎖もしくは下線部配列がＤＮＡ鎖（この場合、ＵはＴと読み替える）からなるその類似体であるリボザイム。
【請求項２】
化学式（II）
【化２】
0004033502.tif 000012
で示されるＲＮＡ鎖もしくは下線部配列がＤＮＡ鎖（この場合、ＵはＴと読み替える）からなるその類似体であるリボザイム。
【請求項３】
前記下線部配列がチオリン酸ジエステル結合をもつオリゴヌクレオチドである、請求項１又は２記載のリボザイム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のリボザイムを含有するリポソーム、並びにセンダイウイルスもしくは該ウイルスより得られた膜融合促進物質を含有してなる組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のリボザイムを含有する、高リポ蛋白質（ａ）血症もしくは動脈硬化症の予防及び／又は治療剤。
【請求項６】
請求項４記載の組成物を含有する高リポ蛋白質（ａ）血症もしくは動脈硬化症の予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なリボザイム、リポソーム製剤及びその用途に関する。詳細には、アポ（ａｐｏ）蛋白（ａ）のリボザイム、リボザイムを含有するリポソーム製剤、リボザイムを含有する動脈硬化症又は高リポ蛋白質血症の治療及び／又は予防のための使用、治療剤及び／又は予防剤ならびに治療方法及び／又は予防方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リポ蛋白質（ａ）（以下Ｌｐ（ａ）と称する。）はその中心にＬＤＬ（低密度リポ蛋白質）をもち、その周囲にアポ蛋白（ａ）と呼ばれる糖蛋白質がジスルフィド結合により、ａｐｏ  Ｂ−１００と呼ばれる蛋白質と結合した高分子複合体である。Ｌｐ（ａ）の血中濃度の上昇が虚血性心疾患や脳梗塞等の動脈硬化性疾患と密接に結びついていることは、数多くの疫学調査により報告されている。アポ蛋白（ａ）の発現を抑え、Ｌｐ（ａ）の血中濃度を下げることにより、これらの疾患の治療又は予防につながると考えられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
１９８７年に、アポ蛋白（ａ）のｃＤＮＡの塩基配列が決定され、その結果、アポ蛋白（ａ）が、血栓溶解に重要なプラスミノーゲンのｃＤＮＡと高い相同性を有することが明らかになった。従って、アンチセンス技術を用いたアポ蛋白（ａ）の抑制は困難が予測され、有効な手段が存在しなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
これらの課題を解決するために、本発明者等は、アポ蛋白（ａ）を産生する細胞に、アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを切断するリボザイムを含有する製剤を投与することにより、アポ蛋白（ａ）の発現を抑制できることを見出した。
【０００５】
一方、リボザイムを生体内で効率良く働かせるために、ウイルスベクターを用いてリボザイムを細胞内へ導入する方法が採られていたが、あまり有効ではなかった。本発明者等は、リボザイムをリポソーム製剤で投与することにより、効果的に細胞内でリボザイムを働かせることができることをも見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００６】
本発明のリポソーム製剤で用いられるリボザイムはどのようなものでもよい。例えば選択された特定の遺伝子の過剰発現を予防及び／又は治療するために用いる場合には、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡを分解するものであればよく、具体的にはアポ蛋白（ａ）の発現抑制には、アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを切断できるものであればどのようなものでも良い。
【０００７】
このようなリボザイムとしては、上記ｍＲＮＡを分解するように設計されたハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム等が挙げられる。ハンマーヘッド型リボザイムとしては、例えばジャガイモやせいも病ウイロイド、アボガドサンブロッチウイロイド等のウイロイドに含まれるリボザイム、アルファルファ条斑ウイルス、ベルベットタバコ斑紋ウイルス等のウイソイドに含まれるリボザイムが挙げられる。
【０００８】
これらのリボザイムを例えば、アポ蛋白（ａ）に特異的にデザインし、核酸合成機等を用いることにより製造することができる。リボザイムは通常ＲＮＡで構成されるが、その安定化のためにＤＮＡ、核酸修飾体、擬核酸を含むものであってもよく、またリボザイムであるオリゴヌクレオチドの一部又は全部が、リン酸ジエステル結合部の酸素原子をイオウ原子で置換したチオリン酸ジエステル結合をもつオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、又はリン酸ジエステル結合を電荷をもたないメチルホスフェート基で置換したオリゴヌクレオチド等の生体内で分解を受けにくくするために改変されたオリゴヌクレオチドが含まれていてもよい。
【０００９】
本発明で用いられる好ましいリボザイムとしては、アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを特異的に切断できるが、プラスミノーゲンのｍＲＮＡを切断できないものが挙げられる。このようなリボザイム、例えばハンマーヘッド型リボザイムは、以下のようにして作成することができる。
【００１０】
アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡにおいて、ハンマーヘッド型リボザイムの特異的切断部位であるＧＵＸ（Ｘは任意のヌクレオチド）部位を検索する。さらに、その特異的切断部位を含む周辺の配列が、プラスミノーゲンのｍＲＮＡに類似の配列を持たない配列、又は少なくともプラスミノーゲンのｍＲＮＡに特異的切断部位ＧＵＸを持たない配列を検索し、その配列を特異的に切断するようにリボザイムをデザインする。その配列は、アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡの５’末端付近（約２００塩基）から選ばれるのが好ましく、またアポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡが二次構造を取るとき、一本鎖になる部分に特異的切断部位ＧＵＸが存在するような配列から選ばれるのが好ましい。その具体的な例としては、一般式（１）で表されるＲＮＡ鎖又はその類似体であるところのリボザイムが挙げられる。
【００１１】
【化３】
0004033502.tif 000002
【００１２】
〔式中、Ｘは任意のヌクレオチドを表し、Ｘｎ及びＸｍは任意のオリゴヌクレオチドで形成され、一緒になってステムループを形成し、3'- （Ｙ）ＣＡ（Ｚ）-5' でアポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡの相補配列となり、（Ｙ）及び（Ｚ）は３塩基以上のヌクレオチドである。〕
【００１３】
好ましいリボザイムとしては、一般式（２）で表されるＲＮＡ鎖又はその類似体であるところのリボザイムが挙げられる。
【００１４】
【化４】
0004033502.tif 000003
【００１５】
〔式中、Ｘは任意のヌクレオチドを表し、Ｘｎ及びＸｍは任意のオリゴヌクレオチドで形成され、一緒になってステムループを形成する。〕
【００１６】
本発明で用いられるリボザイムの製造方法としては、遺伝子工学で一般的に用いられる核酸合成法を用いることができる。例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて目的のリボザイムを直接合成してもよいし、また少量のリボザイム、又は当該リボザイムを含む核酸もしくは当該核酸の一部を合成した後、ＰＣＲ法又はクローニングベクター等を用いて核酸を増幅してもよい。
【００１７】
さらに、これらの方法により得られた核酸を、制限酵素等を用いて切断し、あるいはＤＮＡリガーゼ等を用いて結合するなどして、目的とする核酸を製造してもよい。また、さらに細胞内でより安定なリボザイムを得るために、核酸の塩基、糖、リン酸部分に例えばアルキル化、アシル化等の化学修飾を施してもよい。
【００１８】
リボザイムを主成分として含有する本発明の製剤は、通常は血管内に投与されるが、主薬であるリボザイムが目的の組織に取り込まれるような製剤であれば特に限定されるものではなく、経口投与、他の非経口投与、外用の形で投与してもよい。さらに、リボザイムの効果をあげるために、フッシリティター等を使用することもできる。
【００１９】
本発明の製剤は、溶液、懸濁液、シロップ、リポソーム製剤、乳剤、シロップ等の液体の投与形態であってもよいし、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤等の固形の投与形態であってもよい。必要に応じ、上記製剤には、各種助剤、安定剤、潤滑剤、その他一般に使用される添加剤、例えば乳糖、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、白陶土、蔗糖、コーンスターチ、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、落下生油、オリーブ油、カカオバター、エチレングリコール等が添加され得る。
【００２０】
リボザイムを含有する製剤としては、一般に用いられている遺伝子導入法で用いられる形態による製剤が好ましい。例えばセンダイウイルス等を用いた膜融合リポソーム製剤、エンドサイトーシスを利用するリポソーム製剤等のリポソーム製剤、リポフェクトアミン（ライフテックオリエンタル社製）等のカチオン性脂質を含有する製剤、又はレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等を用いるウイルス製剤を用いるのが有利であり、特に膜融合リポソーム製剤が好ましい。
【００２１】
リポソーム製剤は、そのリポソームの構造体が、大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）、多重層リポソーム（ＭＬＶ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）のいずれであってもよい。その大きさも、ＬＵＶでは２００ｎｍから１０００ｎｍ、ＭＬＶでは４００ｎｍから３５００ｎｍ、ＳＵＶでは２０ｎｍから５０ｎｍ程度の粒子径を取り得るが、センダイウイルス等を用いる膜融合リポソーム製剤の場合は、粒子径２００ｎｍから１０００ｎｍのＭＬＶを用いるのが好ましい。
【００２２】
リポソームの製造方法は、リボザイムが保持されるものであれば特に限定されることなく用いられ、慣用の方法、例えば逆相蒸発法（Szoka,F.,et al:Biochim. Biophys. Acta, Vol.601 559(1980)）、エーテル注入法（Deamer, D. W. :Ann. N. Y. Acad. Sci., Vol.308 250(1978) ）、界面活性剤法（Brunner, J., et al: Biochim. Biophys. Acta, Vol.455 322(1976) ）等が用いられ得る。
【００２３】
リポソーム構造を形成するための脂質としては、リン脂質、コレステロール類、窒素脂質等が用いられるが、一般的にはリン脂質が好適である。具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを常法によって水素添加したものの他、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルセリン等の合成リン脂質が挙げられる。
【００２４】
これらのリン脂質を含む脂質は単独で用いることもできるが、二種以上を併用することも可能である。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基を有する原子団を分子内に持つ脂質を用いることにより、電気的に陰性なリボザイムの結合率を増加させることもできる。これらリポソーム形成時の主要なリン脂質の他に、一般にリポソーム形成用添加剤として知られるコレステロール、ステアリルアミン、α−トコフェロール等の添加剤を用いることもできる。
【００２５】
このようにして得られるリポソーム製剤は、患部の細胞内又は目的とする組織の細胞内への取り込みを促進するために、膜融合促進物質、例えばセンダイウイルス、不活化センダイウイルス、センダイウイルスより精製された膜融合促進蛋白質、ポリエチレングリコール等が加えられていてもよい。
【００２６】
リポソーム製剤の製造法の例を具体的に説明すると、例えば前記したリン脂質等のリポソーム形成物質とリポソーム形成用添加剤としてのコレステロール等と共に、テトラヒドロフラン、クロロホルム、エタノール等の有機溶媒に溶解し、これを適当な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリポソーム形成物質の膜を形成する。これにリボザイムを含有する緩衝液を加えて攪拌し、得られたリポソームにさらに所望により前記した膜融合促進物質を加えた後、リポソームを単離する。
【００２７】
このようにして得られるリボザイムを含有するリポソーム製剤は、適当な溶媒中に懸濁させるか、あるいは一旦凍結乾燥したものを適当な溶媒に再分散させて治療に用いることができる。
【００２８】
リボザイムを主成分として含有する製剤における、リボザイムの含有割合は、適用疾患、適用部位、投与形態及び投与方法に応じて、種々設定することができるが、通常０．０１％から１００％、好ましくは０．０１％から１０％である。
【００２９】
リボザイムを主成分として含有する製剤の投与方法は、疾患の種類、使用するリボザイムの種類等により適宜選択することができる。かかる製剤中におけるリボザイムとしての投与量は、年齢、その他患者の条件、疾病の種類、使用するリボザイムの種類等により適宜選択されるが、例えば血液内投与、筋肉内投与、関節内投与等では、一般には１回あたり１０から１０，０００ｎmoleを１日１から数回投与することができる。
【００３０】
【実施例】
以下に本発明の実施例及び実験例を示すことにより、本発明をさらに具体的に説明する。
【００３１】
〔実施例１：リボザイムの製造〕
アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡの５’末端周辺の二次構造を予測し、切断部位となる構造がＧＴＨ（ＨはＣ、Ｕ又はＡ）であり、ループアウトしている１２０番、１５１番、１６４番付近をターゲットとするリボザイム（配列表の配列番号１〜３、下記の式（３）〜（５）参照）を設計した。
【００３２】
【化５】
0004033502.tif 000004
【００３３】
【化６】
0004033502.tif 000005
【００３４】
【化７】
0004033502.tif 000006
【００３５】
これらの設計に従い、ＤＮＡ−ＲＮＡ合成機を用いて合成した。但し、式（３）〜（５）において、下線部はＳオリゴＤＮＡ（ＵのかわりにＴを用いた）を用い、それ以外はＲＮＡを用いて合成した。
【００３６】
〔実施例２：リポソーム製剤の製造〕
フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン及びコレステロール（重量比１：４．８：２、合計１０ｍｇ）をテトラヒドロフランに溶解させて三つの脂質溶液を得た。ロータリーエバポレーターを用いて、これら脂質溶液からテトラヒドロフランを留去し、脂質をフラスコ内表面にそれぞれ付着させた。
【００３７】
これら各フラスコに、実施例１で得られた各リボザイム（各１０nmol）を含む三つの生理食塩水（ＢＳＳ；139mM のNaCl, 5.4mM のKCl, 10mM のTris-HCl, pH 7.6) 200 μl をそれぞれ加え、常法により攪拌及び超音波処理して、リボザイムを含むリポソーム懸濁液をそれぞれ調製した。得られた各リポソーム懸濁液（0.5ml, 10mg の脂質を含有する。）に、精製したセンダイウイルス（Ｚ株：10000 hemaglutinating units ）を混合し、ＢＳＳでそれぞれ合計４ｍｌとした。なお、センダイウイルスは、使用する３分前にＵＶ照射（１１０ｅｒｇ／ｍｍ2 ／ｓｅｃ）により不活化した。
【００３８】
各混合物を４℃で５分間保持した後、３７℃で穏やかに３０分間振とうした。スクロース密度勾配遠心により、リポソームに結合していないセンダイウイルスを除いた後、最上層を採取し、ＢＳＳで濃度を調節して、１μＭのリボザイムが封入されたリポソーム製剤をそれぞれ得た。
【００３９】
また、同様にヒトアポ蛋白（ａ）遺伝子（２００μｇ）を用い、上記の方法と同様にしてヒトアポ蛋白（ａ）遺伝子を封入したリポソーム製剤を得た。
【００４０】
〔実験例〕
マウス培養肝細胞に、実施例２で得られたヒトアポ蛋白（ａ）遺伝子封入リボソーム単独、又は式（４）の構造を持つリボザイムを封入したリポソーム及びヒトアポ蛋白（ａ）遺伝子封入リポソームの混合物を添加し、４℃で１０分間、その後３７℃で３０分間インキュベートした後、３日後に上清の中のリポ蛋白（ａ）、アポ蛋白（ａ）及びプラスミノーゲンを測定した。結果は、表１に示すようにリボザイムの投与により、プラスミノーゲン発現は変化なく、ヒトアポ蛋白（ａ）遺伝子封入リポソーム単独の場合よりも、アポ蛋白（ａ）の発現・産生のみが抑制された。発現・産生量は培養上清をそれぞれに対するモノクローナル抗体を用いて測定した。表１中の数値の単位はｍｇ／ｄｌである。
【００４１】
【表１】
0004033502.tif 000007
【００４２】
また、アポ蛋白（ａ）遺伝子の導入された培養肝細胞培地の血管平滑筋細胞への添加により細胞増殖は抑制された。アポ蛋白（ａ）遺伝子の導入されたマウス肝臓においても、リボザイムはアポ蛋白（ａ）遺伝子発現を抑制した。
【００４３】
アポ蛋白（ａ）に対するリボザイムがプラスミノーゲンに影響を与えることなく、選択的にアポ蛋白（ａ）のみを抑制することが示され、動脈硬化、特に高リポ蛋白（ａ）血症に有効であると考えられる。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のリポソーム製剤は、リボザイムを含有するものであるから、効果的に細胞内でリボザイムを働かせることができる。特にリポソームがセンダイウイルス又はその処理物で処理されたものは、患部の細胞内又は目的とする組織の細胞内への取り込みが促進される。
【００４５】
本発明のリポソーム製剤において、リボザイムが特定の遺伝子から転写されたｍＲＮＡを特異的に分解するものであれば、当該遺伝子に起因する疾患等を予防及び／又は治療することが可能となる。例えば、リボザイムがアポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを分解するリボザイムであれば、動脈硬化症や高リポ蛋白質（ａ）血症の予防及び／又は治療が可能となる。
【００４６】
本発明のリボザイムは、アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを分解するリボザイムであり、血栓溶解に重要なプラスミノーゲンに影響を与えることなく、選択的にアポ蛋白（ａ）のみを抑制できるから、当該リボザイムを含有する製剤、特にリポソーム製剤は、動脈硬化症や高リポ蛋白質（ａ）血症の予防及び／又は治療に有効である。
【００４７】
【配列表】
0004033502.tif 000008
【００４８】
0004033502.tif 000009
【００４９】
0004033502.tif 000010