(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にリステリア溶血素を担持するラクトバチルス・カゼイの菌体を含有することを特徴とする、感染症、自己免疫疾患、炎症及び腫瘍から選ばれるいずれかの疾患の経口用予防・治療剤。
【請求項２】
表面にリステリア溶血素を担持するラクトバチルス・カゼイの菌体が、表面にリステリア溶血素を融合タンパク質として発現させたラクトバチルス・カゼイの菌体であることを特徴とする請求項１記載の経口用予防・治療剤。
【請求項３】
融合タンパク質が、シグナル配列とリステリア溶血素遺伝子と膜アンカー配列とを順次結合したＤＮＡの発現産物であることを特徴とする請求項２記載の経口用予防・治療剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の経口用予防・治療剤を有効成分として含有することを特徴とする、感染症、自己免疫疾患、炎症及び腫瘍から選ばれるいずれかの疾患の予防・治療用の機能性食品素材又は食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、経口用インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）誘導剤等の経口用サイトカイン誘導剤に関し、より詳細には、表面にリステリア溶血素等のサイトカイン誘導物質を担持する乳酸菌等の微生物菌体を含有する経口用サイトカイン誘導剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウイルス感染細胞が産生しウイルス感染細胞を抵抗性にする物質として独自に発見され、Ｂ型およびＣ型肝炎治療剤、あるいは癌免疫療法剤として実用化されている。ＩＦＮは程度の差はあるものの種々のウイルスに対し抗ウイルス作用を示すが、それが産生されたのと同種の細胞においてのみ有効であること、また対象疾患により長期治療が必要であること、ＩＦＮは分子量２万前後の糖蛋白であり、経口投与や胃内投与によってはほとんど吸収されないことなどから、経口投与可能なＩＦＮ誘導剤が求められていた。これまでＩＦＮ誘導剤として、二本鎖核酸、ポリＩ：ポリＣ、ポリカルボキシレートなどの高分子ポリマーあるいはフルオレイン類やピリミジノン類などの低分子化合物が報告されている。しかし、これらは安全性に問題があり、また経口投与ではＩＦＮ誘導効果が低いなどの欠点があり治療にはほとんど使われていなかった。
【０００３】
また、種々の任意の有用タンパク質を菌体表面に固定化するため、 ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) NCDO763株由来の 763プロテアーゼのアンカー配列をコードする遺伝子配列と、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列とを繋いだ融合遺伝子配列を得る工程と、前記融合遺伝子配列を宿主菌内に導入する工程と、前記融合遺伝子配列が導入された宿主菌を培養して前記目的とするタンパク質を菌体表面に固定化する工程とを備えた菌体表面へのタンパク質の固定化方法（特開平１０−１１７７８３号公報）や、抗原に対する免疫反応を効果的に増強するため、１）コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルブミン、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン、アルギン酸、ペクチン、アガロースまたはアラビアゴム、２）グリコール酸、乳酸もしくはアミノ酸の重合体またはこれらの二以上の共重合体、並びに３）ハイドロキシアパタイト、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはポリ塩化ビニルからなる群から選ばれる生体親和性材料からなる担体に、抗原または抗原誘導物質を担持させ、所望によりさらに免疫調節物質またはその他の添加物を含む組成物からなる免疫増強製剤（特開平１１−１９３２４６号公報）や、アスコルビン酸と、乳酸菌や３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類などの他の免疫賦活物質を併用することにより、免疫賦活効果を相乗的に増強した医薬品、医薬部外品、食品、飼料または化粧料用の製剤（特開２００１−６４１７４号公報）が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
細胞から放出され、細胞間の相互作用を媒介するタンパク質性因子として知られるサイトカインは、その免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖・分化の調節作用等により、種々の疾病の治療に用いられている。そして、多くの場合、サイトカイン自体を投与する治療法が行われているが、骨髄抑制、胃腸障害、心機能障害や脱毛といった副作用を伴い、治療を受ける患者にとって大きな負担となっている。例えば、ＩＦＮは夢の抗ウイルス薬として注目されていたが、精製したＩＦＮ−γ及びその誘導剤は、経口的投与では充分な効果が期待できなかった。本発明の課題は、経口投与により生体にＩＦＮ−γ等のサイトカインの産生を促進することができ、感染症、自己免疫疾患、炎症、腫瘍などの各種疾患の治療に有用な経口用サイトカイン誘導剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、乳酸菌菌体表層にリステリア溶血素やサルモネラの鞭毛タンパク質フラジェリンを膜アンカー配列により固定して発現させることにより、腸管のＭ細胞あるいは上皮細胞を介して、免疫系に認識されやすくなり、効果的なＩＦＮ−γ誘導能やインターロイキン−８（ＩＬ−８）誘導能が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、（１）表面にリステリア溶血素を担持するラクトバチルス・カゼイの菌体を含有することを特徴とする、感染症、自己免疫疾患、炎症及び腫瘍から選ばれるいずれかの疾患の経口用予防・治療剤や、（２）表面にリステリア溶血素を担持するラクトバチルス・カゼイの菌体が、表面にリステリア溶血素を融合タンパク質として発現させたラクトバチルス・カゼイの菌体であることを特徴とする上記（１）記載の経口用予防・治療剤や、（３）融合タンパク質が、シグナル配列とリステリア溶血素遺伝子と膜アンカー配列とを順次結合したＤＮＡの発現産物であることを特徴とする上記（２）記載の経口用予防・治療剤に関する。
【０００７】
また本発明は、（４）上記（１）〜（３）のいずれか記載の経口用予防・治療剤を有効成分として含有することを特徴とする、感染症、自己免疫疾患、炎症及び腫瘍から選ばれるいずれかの疾患の予防・治療用の機能性食品素材又は食品に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の経口用サイトカイン誘導剤としては、その表面にサイトカイン誘導物質を担持する微生物菌体を含有するものであればどのようなものでもよく、本発明の経口用サイトカイン誘導剤の経口投与により生体内で誘導されるサイトカインとしては、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α等のインターフェロン類や、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８等のインターロイキン類や、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−α等の腫瘍壊死因子類や、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子類や、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経増殖因子ファミリー（ＮＧＦ）、brain-derived neurotrophic factor（ＢＤＮＦ）、ciliary neurotrophic factor（ＣＮＴＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、肝細胞増殖因子（ＩＩＧＦ）等の増殖因子の他、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ステムセルファクター（ＳＣＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、プロラクチンホルモンなどを例示することができる。これらサイトカインの誘導は、サイトカイン誘導物質を担持（固定化）した微生物菌体が経口投与により腸管に送られ、腸管のMセルあるいは上皮細胞に作用することによって生起すると考えられる。
【０００９】
また、上記サイトカイン誘導物質としては、サイトカインの内因性放出又は産生を誘導しうる物質であれば特に制限されるものではなく、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）由来のリステリア溶血素、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）等のエンドトキシン、サルモネラの鞭毛タンパク質フラジェリン、百日ぜきワクチン、ジフテリアワクチン、リポテイコ酸等の菌体成分、コンカナバリンＡ、レンズ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレクチン等のＴリンパ球刺激レクチン、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質（特開平０９−２８９８９６号公報参照）、４−アミノ−２−エトキシメチル−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール等の化合物などを例示することができる。
【００１０】
本発明において、微生物菌体の表面にサイトカイン誘導物質を担持（固定）させる方法としては特に制限されず、例えば、菌体表面上にサイトカイン誘導物質を融合タンパク質として発現させる方法や、菌体表面に存在する種々のタイプのレセプターと特異的親和性を有する物質にサイトカイン誘導物質を結合させる方法や、合成高分子を用いて菌体表面に固定する方法等を挙げることができるが、サイトカイン誘導物質が、上記リステリア溶血素や鞭毛タンパク質フラジェリン等のタンパク質などから構成されている場合、特に上記菌体表面上にサイトカイン誘導物質を融合タンパク質として発現させる方法が、タンパク性サイトカイン誘導物質を菌体表面上に安定して担持（固定）させることができるので好ましい。
【００１１】
上記の微生物菌体表面上にサイトカイン誘導物質を融合タンパク質として発現させる方法としては、上記特開平１０−１１７７８３号公報や特表平１０−５０８２０７号公報に記載された公知の方法も含め特に制限されるものではないが、菌体での発現量を制御するプロモーターと、生産されたタンパク性サイトカイン誘導物質が菌の細胞膜を通過するのを助けるシグナル配列と、タンパク性のサイトカイン誘導物質の遺伝子と、菌体膜結合性のある疎水性リンカーをコードする膜アンカー配列とが順次結合されたＤＮＡ（融合遺伝子配列）を組み込んだベクターで微生物を形質転換する方法を挙げることができる。そして、融合遺伝子配列を組み込んだベクターの構築、かかるベクターの微生物菌体への導入、形質転換微生物の培養等は、この分野の常法により行うことができる。
【００１２】
本発明においては、上記タンパク性のサイトカイン誘導物質の遺伝子ＤＮＡを構成する塩基配列の一部に、欠失、置換、付加等の変異処理を施した変異サイトカイン誘導物質遺伝子を用いたり、遺伝的に変異しているサイトカイン誘導物質遺伝子を用いて、その構成アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、サイトカイン誘導能を調節することができる融合タンパク質を使用することもできる。かかる融合タンパク質を用いることにより、ヒトも含め動物におけるサイトカイン誘導能を調節することが可能になる。
【００１３】
本発明の経口用サイトカイン誘導剤の調製に用いられる微生物としては、特に制限されるものではないが、腸管のＭセルあるいは上皮細胞に作用してサイトカインの誘導を効率よく惹起させる微生物や、ヒトや動物にとって無害な微生物が好ましく、中でも、その菌体表面上にサイトカイン誘導物質を融合タンパク質として発現させることができる微生物が好ましい。かかる微生物としては、従来から食品原料として摂食され、その安全性が確認されている乳酸菌、パン酵母（サッカロミセス・セルビシェ）、納豆菌（バチルス・ズブチリス）を好ましく例示することができるが、サイトカイン誘導能や類縁菌が腸管内で正常菌叢を形成しているという点で乳酸菌が好ましい。
【００１４】
上記乳酸菌としては、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ビフィドバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属等に属する乳酸菌を挙げることができるが、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）等のＴｈ１誘発型乳酸菌株が、サイトカイン誘導能やヒトにおける長期にわたる安全な食経験のある点で好ましい。Ｔｈ１誘発型乳酸菌株は、ヘルパーＴ細胞クローンであるＴｈ１を誘発することから、Ｔｈ１が分泌するＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−β等のサイトカインを誘導する上で有利に用いることができる。また、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)等のＴｈ２誘発型乳酸菌株は、Ｔｈ２が分泌するＩＬ−４等のサイトカインを誘導する上で有利に用いることができる。
【００１５】
本発明の内因性サイトカインの産生を必要とする疾病の予防・治療薬としては、経口用ＩＦＮ−γ誘導剤等の本発明の経口用サイトカイン誘導剤を有効成分として含有するものであれば医薬品、医薬部外品等どのようなものでもよく、内因性サイトカインの産生を必要とする疾病としては、Ｃ型肝炎、インフルエンザなどのウイルスや、リステリア菌などの細胞内寄生細菌などの微生物による感染症や、上皮性悪性腫瘍等の各種悪性腫瘍の他、自己免疫疾患、炎症などを挙げることができる。本発明の内因性サイトカインの産生を必要とする疾病の予防・治療薬は、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等通常、その使用目的に応じた製剤形態で使用することができ、製剤化に際しては、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。また、上記本発明の予防・治療薬の投与量は、患者の年齢、性別、その他の条件、疾患の程度などに応じて適宜決定できる。
【００１６】
本発明の内因性サイトカインの産生を必要とする疾病の予防・治療用の機能性食品素材又は食品としては、経口用ＩＦＮ−γ誘導剤等の本発明の経口用サイトカイン誘導剤を有効成分として含有する食品や食品素材であればどのようなものでもよく、本発明の経口用サイトカイン誘導剤を食品素材又は食品に添加・配合することにより調製することができる。上記食品素材又は食品としては、チーズ、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜をあげることができる。
【００１７】
本発明のサイトカインの誘導方法としては、本発明の経口用サイトカイン誘導剤を、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリ等の動物に経口投与し、生体内にサイトカインを誘導する方法であれば特に制限されるものではないが、特に、本発明のサイトカインの誘導方法により、内因性ＩＦＮ−γの産生を誘導すると、かかるＩＦＮ−γによりヘルパーＴ細胞の機能をＴｈ１型に傾けるために、Ｔｈ１型免疫機能低下の改善に有効であり、例えば、腫瘍により誘導される免疫抑制状態や抗癌剤治療により誘導される免疫機能低下からの回復や、エイズの発症予防や、Ｉ型アレルギーの予防・治療や、ストレス、加齢に伴う免疫機能低下の抑制等、種々の生体機能調節、各種疾患に対する抵抗性の向上に有効である。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（経口投与による血中ＩＦＮ−γの誘導）
１−１（リステリア溶血素遺伝子及びその関連遺伝子の調製）
ＩＦＮ−γ誘導物質として、リステリア溶血素であるリステリオリジンＯ（ＬＬＯ）を用いた。ＬＬＯ遺伝子の供給源としては、産生ＬＬＯが溶血活性を有するリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）Ｙ７株や産生ＬＬＯが変異して溶血活性を示さないリステリア・モノサイトゲネスＢＵＧ株を用いてＬＬＯ遺伝子やその関連遺伝子を調製した。まず、リステリア・モノサイトゲネスＹ７株から常法により染色体ＤＮＡを調製し、この染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号１で表される塩基配列からなるセンスプライマーと配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅し、全長約１５００ｂｐの配列番号３に示されるＬＬＯ全長遺伝子（Ｙ７）を調製した。同様に、リステリア・モノサイトゲネスＢＵＧ株の染色体ＤＮＡから、配列番号１で表される塩基配列からなるセンスプライマーと配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いて、全長約１５００ｂｐの配列番号４に示される変異ＬＬＯ遺伝子（ＢＵＧ）を調製した。なおＰＣＲは、９４℃６０秒、４５℃６０秒、７２℃１２０秒を１サイクルとし、これを３０回繰返す条件により行った。
【００１９】
１−２（膜表面アンカーリング発現ベクターと分泌型発現ベクターの構築）
上記ＬＬＯ全長遺伝子（Ｙ７）、変異ＬＬＯ遺伝子（ＢＵＧ）を、オランダＴＮＯのリアー博士らの開発した膜表面アンカーリングプラスミドベクターｐＬＰシリーズに組み込み、膜表面アンカーリング発現ベクターを構築した。この膜表面アンカーリングプラスミドベクターｐＬＰＭ１１は、ラクトバチルス・アミロフォラス（Lactobacillus amylovorus）のα−アミラーゼ遺伝子由来のプロモーター（Ｐａｍｙ）とシグナル配列（ＳＳ）と、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）のプロテアーゼＰ由来のアンカー配列（Ａｎｃｈｏｒ）と、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）のcbh由来のターミネーター配列（Ｔcbh）を有している。ＬＬＯ関連遺伝子を制限酵素BamHI及びSal Iを用いて、ＳＳとＡｎｃｈｏｒとの連結部に存する制限酵素BamHI及びSal I切断部位に挿入した。かかるＬＬＯ関連遺伝子が組み込まれた膜表面アンカーリング発現ベクターの融合タンパク発現ユニットの模式図を図１として示す。また、膜表面アンカーリングプラスミドベクターｐＬＰＭ１１からアンカー配列（Ａｎｃｈｏｒ）を除去した分泌型プラスミドベクターにも、同様にそれぞれＬＬＯ全長遺伝子（Ｙ７）、変異ＬＬＯ遺伝子（ＢＵＧ）を組み込み、分泌型発現ベクターを構築した。
【００２０】
１−３（経口用ＩＦＮ−γ誘導剤の調製）
宿主乳酸菌として、ラクトバチルス・カゼイＡＴＣＣ３９３株を用い、上記構築した膜表面アンカーリング発現ベクターと分泌型発現ベクターをエレクトロポレーション法により導入した。次に、ウエスタンブロット、溶血テスト及びフローサイトメトリー解析により、それぞれ目的の膜表面アンカーリング発現ベクターや分泌型発現ベクターが導入された形質転換体を選別し、経口用ＩＦＮ−γ誘導剤を含む各種形質転換乳酸菌を調製した。
【００２１】
１−４（羊赤血球を用いた溶血テスト）
ＬＬＯ全長遺伝子（Ｙ７）を菌体表面に発現させた乳酸菌（ＡｎｃｈｏｒＹ７）と、変異ＬＬＯ遺伝子（ＢＵＧ）を菌体表面に発現させた乳酸菌（ＡｎｃｈｏｒＢＵＧ）と、溶血活性を有するＬＬＯを菌体から分泌するタイプの乳酸菌（Ｙ７）と、溶血活性を示さない変異ＬＬＯを菌体から分泌するタイプの乳酸菌（ＢＵＧ）の、それぞれ培養上清と洗浄菌体浮遊液を用いて、羊赤血球を用いた溶血アッセイを行った。溶血アッセイは、９６穴Ｖ字プレートに供試検体１００μlを取り、最終濃度が１％となるように羊血球を加え、２０分後に溶血を観察した。結果を図２に示す。図２に示される溶菌像は、ＬＬＯとして溶血活性のあるＹ７を組み込んだ分泌型、菌体表層結合型の組換え体及びアンカーのみの陰性コントロールの培養上清、洗浄菌体浮遊液共に、上から原液、２倍希釈、４倍希釈、８倍希釈、１６倍希釈したサンプルを示す。また、ＢＵＧを組み込んだものは、いずれも溶菌活性がみられなかった。
【００２２】
１−５（経口投与による血中ＩＦＮ−γの誘導）
上記各種形質転換乳酸菌を８週齢雄のＣ５７ＢＬ／６Ｃｒマウス（各々ｎ＝３〜５）に、５×１０8ＣＦＵ／マウスで各週毎３回、ゾンデを用いて胃内投与した。また、対照としてアンカーのみを発現した乳酸菌（ＮＣ）や、比較のため溶血活性を有する精製ＬＬＯも相当量を胃内投与した。最終投与２週間後に全採血し、血中に誘導されたＩＦＮ−γをマウスＩＦＮ−γELISAキットEM-1001 (ENDOGEN社)を用いて定量した。結果の一部を図３に示す。溶血活性をもつＬＬＯ全長遺伝子（Ｙ７）を菌体表面に発現させた乳酸菌（Ｙ７＋Ａ）投与群のマウスには血中ＩＦＮ−γの誘導が有意に認められたが、溶血活性のない変異ＬＬＯ遺伝子（ＢＵＧ）を菌体表面に発現させた乳酸菌（ＢＵＧ＋Ａ）投与群のマウスには血中ＩＦＮ−γの僅かな上昇が認められたに過ぎず、対照として膜表面アンカーのみを発現した乳酸菌（ＮＣ）投与群のマウスにおいては、血中ＩＦＮ−γの誘導は認められなかった。溶血活性を有する精製ＬＬＯ投与群のマウスでは５頭中、１頭にのみ弱いＩＦＮ−γ誘導がみられた。
【００２３】
実施例２（腸管モデルにおけるＩＬ−８の誘導）
２−１（サルモネラの鞭毛タンパク質フラジェリン遺伝子の調製）
ＩＬ−８は、１９８７年に松島らによって単球由来の好中球走化性因子（ＭＤＮＣＦ）として精製され（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84, 9233, 1987）、炎症反応の際に炎症局所で産生されるサイトカインであり、かかるＩＬ−８の誘導物質として、サルモネラの鞭毛タンパク質であるフラジェリンを用いた。フラジェリン遺伝子の供給源としては、エンテリティディス菌（Salmonella enteritidis）＃４０株を用いた。まず、上記エンテリティディス菌から常法により染色体ＤＮＡを調製し、この染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号５で表される塩基配列からなるセンスプライマーと配列番号６で表される塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅し、配列番号７で表されるフラジェリン遺伝子を調製した。なおＰＣＲは、９４℃３０秒、５５℃６０秒、７２℃１２０秒を１サイクルとし、これを２５回繰返す条件により行った。
【００２４】
２−２（形質転換乳酸菌の調製）
上記調製したフラジェリン遺伝子を、制限酵素BamHI及びSal Iを用いて、実施例１記載の膜表面アンカーリングプラスミドベクターのＳＳとＡｎｃｈｏｒとの連結部に存する制限酵素BamHI及びSal I切断部位に挿入した。ネガティブコントロールとしての膜表面アンカーリングプラスミドベクターｐＬＰＭ１１を、エレクトロポレーション法により宿主乳酸菌としてのラクトバチルス・カゼイＡＴＣＣ３９３株に導入した。ウエスタンブロット及びフローサイトメトリー解析により、フラジェリンタンパクの菌体表層への発現を確認し、経口用ＩＬ−８誘導剤としての形質転換乳酸菌を調製した。
【００２５】
２−３（腸管モデルにおけるＩＬ−８の誘導）
１０％牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、２４穴スミロンセルタイトＣ−１プレート（住友ベークライト社製）でＣａｃｏ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３７）を２×１０5細胞／wellとなるように培養し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で約１０日間培養して、形態的及び機能的に小腸様の単層の細胞層となるよう分化させた。上記の形質転換乳酸菌を抗生物質不含のＤＭＥＭで２×１０7ＣＦＵ／well（ＭＯＩ 100）で加え、４℃１時間で菌を細胞に付着させ、３７℃一晩インキュベートした後、培養液中に産生されたＩＬ−８を測定した。培養液中のＩＬ−８は、Human Interleukin-8 ELISAキットEH2-IL8 (ENDOGEN社)を用いて定量した（ｎ＝３）。結果を図４に示す。フラジェリン遺伝子を菌体表面に発現させた乳酸菌投与群（fliＣ＋Ａ）の腸管モデルにはＩＬ−８の誘導が有意に認められたが、対照とした膜表面アンカーリングプラスミドベクターのみを導入した乳酸菌投与群（Ａｎｃｈｏｒ）及び培地群（ＤＭＥＭ）では、ＩＬ−８の産生は微量であった。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によると、経口投与により、免疫反応で重要な役割をするＩＦＮ−γ、ＩＬ−８等のサイトカインの生体内での産生を促進することができ、感染症、自己免疫疾患、炎症、腫瘍など多くの疾患の治療と予防を容易にすることが可能となる。
【００２７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＬＬＯ遺伝子が組み込まれた膜表面アンカーリング発現ベクターの融合タンパク発現ユニットの模式図である。
【図２】本発明の経口用ＩＦＮ−γ誘導剤の発現方式の模式図とその溶血テストの結果を示す図である。
【図３】本発明の経口用ＩＦＮ−γ誘導剤をマウスに胃内投与した場合における血中ＩＦＮ−γの誘導の結果を示す図である。
【図４】本発明の経口用ＩＬ−８誘導剤を腸管モデルに投与した場合におけるＩＬ−８の誘導の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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