(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の特性を有するカテプシンＣ様酵素；
（１）至適反応温度が７５−８５℃、
（２）至適反応ｐＨがｐＨ７−８、
（３）活性発現に塩素イオンを要求しない、
（４）分子量が１６０±２０ｋＤである。
【請求項２】
パイロコッカス属に属する菌を培養することによって得られる請求項１記載のカテプシンＣ様酵素。
【請求項３】
パイロコッカス属に属する微生物がパイロコッカスホリコシである請求項２項記載のカテプシンＣ様酵素。
【請求項４】
パイロコッカス属に属する微生物を培養し、その培地から請求項１−３いずれか一の請求項に記載のカテプシンＣ様酵素をゲルろ過クロマトグラフを用いて回収することを含むカテプシンＣ様酵素の製造方法。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載された核酸を含む発現ベクターを用いて、宿主細胞を形質転換することを含む、請求項１−３いずれか一の請求項に記載のカテプシンＣ様酵素の製造方法；
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であり、且つカテプシンＣ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、
（ｄ）配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列の相補的な鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、且つカテプシンＣ活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターを用いて、宿主を形質転換することにより製造されたカテプシンＣ様酵素。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なプロテアーゼの製造に関する。より具体的には、カテプシンＣ活性を有するパイロコッカス属に属する古細菌由来の新規なカテプシンＣ様酵素、パイロコッカス属に属する古細菌由来の新規カテプシンＣ様酵素をコードするDNA、超好熱菌を用いるパイロコッカス属に属する古細菌由来のカテプシンＣ様酵素の生産に関する。
【０００２】
【従来の技術】
各種動物細胞のリソゾーム分画に見出されるプロテアーゼとして、カテプシンが多種類知られている。このうちカテプシンＣは、パパイン様システインプロテアーゼで、ポリペプチドに作用してN末端から、ジペプチドを遊離する酵素で、ジぺプチジルペプチダーゼとも呼ばれている。カテプシンＣは、骨髄細胞やリンパ球の細胞質顆粒リソソームにあって免疫・炎症応答に必要なセリンプロテアーゼを切断し、活性化する（非特許文献１：Mcguire,MJ等、J.Biol.Chem.268,2458(1993)。カテプシンＣ欠損症は、歯周病の原因の一つである。（非特許文献２：Nature Genet.23,421-424(1999)。
【０００３】
カテプシンＣは、従来高等動物由来のもの、あるいは高等動物由来のカテプシンＣをコードする遺伝子を酵母(非特許文献３：Appl.Microbiol.Biotechnol.(2002)59,252-258)、昆虫細胞等(非特許文献４：Biochemistry(2001)40,1671-1678)に発現させたものが報告されているにすぎず、動物細胞以外から由来するカテプシンＣは知られていない。
【０００４】
【非特許文献１】
J.Biol.Chem.268,2458(1993)
【非特許文献２】
Nature Genet.23,421-424(1999)
【非特許文献３】
Appl. Microbiol.Biotechnol.(2002)59,252-258
【非特許文献４】
Biochemistry(2001)40,1671-1678
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
これまで見出されている高等動物のカテプシンＣは、界面活性剤等の化学薬品に敏感であり、活性発現に塩素イオンを必要としていた。リソソームに存在する酵素は酸性領域に至適pHを持つものが多く至適反応温度も80℃以上のものはみいだされていない。本発明の課題は、歯磨き剤、洗剤、アミノ酸分析等に有用な、カテプシンＣ様の作用をする構造的に安定な耐熱性酵素を工業生産する技術を見出すことである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意検討した結果、ゲノム情報配列が解析され、多くの耐熱性酵素の供給源である９０℃以上で生育するパイロコッカス属に属する微生物をジャーファーメンター培養し、その培養液中特に上清中にカテプシンＣ（ジペプチジルペプチダーゼ）の高活性を見出し、その生産、単離精製法及びその性質を解明して本酵素が歯磨き剤等に有用な、構造的に安定なカテプシン様酵素であり、その遺伝子をクローニングし大腸菌で発現させカテプシンＣ活性を確認し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
パイロコッカス属に属する微生物としては、好適には、パイロコッカス  ホリコシ（JCM9974、JCM微生物カタログ第７版（１９９９）を用いることができる。
【０００８】
なお本発明において、カテプシンＣ様とは、Ｎ末からジペプチドを生じるジぺプチジルペプチダーゼ活性を有していることを意味する。
【０００９】
本願発明のカテプシンＣ様酵素は、従来公知のカテプシンＣとは、アミノ酸配列に相同性がほとんど無く、更に、カテプシンＣがリソゾームで作用することから至適pHは酸性であるのに対し、本願出願のカテプシンＣ様酵素は中性で活性があることから、従来公知のカテプシンＣとは、全く異なる酵素である。
【００１０】
更に、従来のカテプシンＣは、システインプロテアーゼであるところ、本願発明のカテプシンＣ様酵素は、システイン酵素阻害剤によって阻害されない場合もあり、システインプロテアーゼとも断定できない。
【００１１】
本願発明には、
（１）低重合体構造を有する活性発現に塩素イオンを要求しないカテプシンＣ様酵素、
（２）至適反応温度が７５〜８５℃の範囲、至適反応pH7-8、であるカテプシンＣ様酵素、
（３）分子量160±20kDである上記のカテプシンＣ様酵素、
（４）パイロコッカス属に属する微生物由来のカテプシンＣ様酵素、及び
（５）パイロコッカス属に属する微生物が、パイロコッカスホリコシ（Pyrococcus horikoshii）であるカテプシンＣ様酵素、を包含する。
【００１２】
上記カテプシンＣ様ペプチドは、パイロコッカス属に属する微生物、好適にはパイロコッカスホリコシ（Pyrococcus horikoshii）を、適切な培養条件下（例えば、９５℃）で培養・増殖した後、培養液を遠心分離、上清を例えば、メンブレンフィルターにより濃縮して酵素液を調製した後、上記酵素液を疎水性クロマトグラフィー陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー、及び／又はゲルろ過クロマトグラフを適宜組み合わせて精製することができる。
【００１３】
例えば、疎水性クロマトグラフィーとしては、アルキルアガロース、Phenyl Sepharose等、陰イオン性クロマトグラフィーとしては、DEAESepharose、QSepharoseHP、ゲル濾過クロマトグラフィーとしてはSephadex200、SepharoseHPを用いることができる。
【００１４】
更に本件発明は、
（６）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するカテプシンＣ様酵素、（７）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個、好適には、１〜１０個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含むカテプシンＣ様酵素、
（８）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と、７０％以上の同一性、好適には８５％以上の同一性、更に好適には、９５％以上の同一性を有する、カテプシンＣ様酵素、
（９）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ配列を含む、単離されたDNA分子等の核酸、
（１０）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個、好適には、１〜１０個のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ配列を含む、単離されたDNA分子等の核酸、
（１１）配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオ配列を含む、単離されたDNA分子等の核酸、及び
（１２）配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオ配列の相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、且つカテプシンＣ活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたDNA分子等の核酸を包含する。
【００１５】
なお、アミノ酸配列の同一性、及びポリヌクレオオチド配列の同一性とは、２以上のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列の比較により決定された、配列間の関係の程度を意味する。同一性を決定するプログラムとしては、アミノ酸配列については、ClustalW、DNASIS等のプログラムがあるが、本件発明における同一性の数値は、ClustalWをデフォルト条件で用いた場合の数値を意味する。
【００１６】
また、ストリンジェントな条件は、周知のストリンジェント条件を用いることができるが、例えば、５０％ ホルムアルデヒド、５ＸＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸）、５．Ｘデンハルト溶液、サケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストラン、４２℃、更に０．２ＸＳＳＣ、０．１％ ＤＳ、４２℃で洗浄などの条件が挙げられる。
【００１７】
更に、本発明には、上記（９）から（１２）いずれかに記載のDNA分子を含む組み替えベクターも包含する。
【００１８】
例えば、耐熱性プロリンジペプチド分解酵素の発現用のプロモータの調節下に上記（９）から（１２）のいずれかに記載のDNA分子を含んで成り、宿主細胞において、カテプシンＣ活性を有するポリペプチドを発現する能力を有する、発現ベクターが挙げられる。具体的には、プロモータとしては、T７プロモータ（Novagen社）、mFDH1プロモータ(非特許文献３)、AUG1プロモータ(Invitrogen社)を用いることができる。発現ベクターとしては、各宿主において、公知の発現ベクターを用いることができるが、大腸菌においては、例えば、pET 11-aベクター（T７プロモータ（Novagen社））、メタノール酵母では、pMFXU4ベクター（mFDH1プロモータ(非特許文献３)）あるいはpMETαベクター（AUG1プロモータ(Invitrogen社)）をもとに発現ベクターを調製することができる。無論、本件カテプシンＣ様酵素の核酸配列を、それぞれの宿主におけるコドン使用頻度に併せて変更した後に、組み換えベクターに載せることもできる。
【００１９】
また、本願発明には、ベクターにより形質転換された形質転換体を包含する。また、宿主としては、微生物細胞、昆虫由来の細胞、動物細胞、または植物細胞を用いることができ、例えば、大腸菌、Candida.bondini、COS―７細胞が挙げられる。
【００２０】
上記ベクターを、宿主に導入する手段としては、それぞれの宿主に好適な公知の方法を用いることができ、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、更には、大腸菌では、高温ショック法、メタノール酵母では、リチウム酢酸法、等がある。
【００２１】
形質転換体としては、具体的には、本件カテプシンＣ様酵素をコードする遺伝子を、例えば、pET11-aに組み込んだベクターで形質転換した大腸菌、ＦＤＨＩプロモータを有するpMFXU４に組み込んだベクターで形質転換したメタノール酵母、バキュロウイルスのプロモータを用いたベクターに組み込んで導入した昆虫由来の細胞株の形質転換体がある。
【００２２】
更に、本願発明には、形質転換体を培養する工程、得られる培養物よりカテプシンＣ様酵素を回収する工程を含む、カテプシンＣ様酵素活性を有する酵素蛋白の形質転換体を用いた製造方法並びに当該製造方法で得られたカテプシンＣ様酵素も包含される。
【００２３】
更に、本願発明には、進化工学的手法により至適温度を３７度付近に改変した歯磨き洗浄剤にとくに好適なカテプシンＣ様酵素も包含する。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２５】
［実施例１］  パイロコッカスホリコシの培養とカテプシンＣ活性の検出
13.5gのNaCl、4gのNa2SO4、0.7gのKCl、0.2gのNaHCO3、0.1gのKBr、30mgのH3BO3、10gのMgCl2・6H2O、1.5gのCaCl2、25mgのSrCl2、１.0mLのレザスリン溶液（０.2g/L）、１.0gの酵母エキス、５gのバクトペプトンを蒸留水１Lに溶かした培養液１５Lを３０分加圧殺菌した。常圧に戻った後、乾熱滅菌した粉末硫黄を0.1-0.2％となるように加えた。次ぎに窒素ガスを飽和し、別に加圧滅菌した25%硫化ナトリウム溶液を１０mL加えて、レザスリン溶液のピンク色が着色しないことを確認して嫌気性としたのち、パイロコッカスホリコシ菌を培養液1.5Lを接種し、95℃で２２時間毎分１００回転の撹拌をしながら培養した。
【００２６】
培養液沈澱の活性は、培地を遠心分離し、沈澱を培地の５０mMのトリス緩衝液に懸濁し凍結融解、超音波処理をして抽出した細胞結合部分の活性は2.97単位／mL培養液の活性があった。一方培養液上清の活性は、そのままでは活性が検出できなかったがメンブランフィルターで２倍に濃縮後測定すると237.84単位／mL培養液の活性があった。カテプシンＣ活性は、H-Gly-Phe-p-nitroanilide（Bachem社製）を用いて測定し、1分間に１マイクロモルのパラニトロアニリドを遊離する量を１単位とした。蛋白mgあたりの活性は154.8であった。
【００２７】
［実施例２］  カテプシンＣ様酵素の精製
実施例１で得られた酵素液を疎水性クロマトグラフ（Hiload16/10Phenyl Sepharose  アマシャムバイオサイエンス社製）を100mM燐酸ナトリウム緩衝液pH7.5硫安濃度を１モルで吸着させ、活性部分は硫安濃度０モルで溶出した。比活性は6,200になり収率は31%であった。本酵素は、疎水性カラムに吸着する疎水性蛋白である。
【００２８】
陰イオン交換樹脂（HiTrap Q SepharoseHPアマシャムバイオサイエンス社製）に前述の疎水性クロマトグラフ溶出液を吸着させ10Mトリス緩衝液pH８で洗浄した。活性は0.3-0.4Mの食塩濃度の時に溶出した。比活性は7,137になり収率は10.7%であった。本酵素は、陰イオン交換樹脂に吸着する酸性蛋白である。
【００２９】
ゲルろ過クロマトグラフ（Hiload26/60Sephadex200prepgradeアマシャムバイオサイエンス社製）にかけた。50mMの燐酸ナトリウム緩衝液で溶出すると溶出液234mLの分子量160±20kDに相当するところに活性ピークが存在した。比活性は12,578になり収率は6.5%であった。また、この画分をSDS電気泳動にかけると62±2kDの主成分と41±1kDの微少成分のバンドが検出された。したがって本酵素は、低重合体構造をとる蛋白であった。
【００３０】
電気泳動で精製したタンパクのN末端分析を行なうとTSIEWDEKTFでありアミノ酸配列であった。アミノ酸配列は、配列番号１の配列で、そのアミノ酸配列コードする核酸配列は配列番号２の配列である。
【００３１】
［実施例３］  酵素の酵素学的性質
カテプシンＣ活性は、200mMのH-Gly-Phe-p-nitroanilide（Bachem社製）１μL、50mM燐酸ナトリウム緩衝液pH7.5を949μL酵素液50μLの混合溶液を80℃で反応させ406nmの吸光度変化を観察し、パラニトロアニリドの分子吸光度9.91mMとして、1分間に１マイクロモルのパラニトロアニリドを遊離する量を１単位とした。
【００３２】
塩素イオンの含まれていない酵素液に10mM,20mM,30mM,40mMの食塩を入れて活性測定したが、塩素イオンの添加による活性上昇は観察されなかった。従って、本酵素の活性発現には食塩は必要でなく、食塩を添加するための味の変化を受けることがなく本酵素は使用できる。
【００３３】
反応温度は、精製酵素の至適反応温度は80℃であった(表１)。粗酵素の場合は、ばらつきが多いが、至適反応温度は90-100℃、37℃では至適温度の28%の活性があった。
【００３４】
【表１】
0004058514.tif 000002
【００３５】
精製酵素の反応pHを表２に示す。pH7-8で100%の高活性に達した。したがって反応至適条件は、pH7-８、80℃である。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
精製酵素のカテプシンＣの蛍光基質に対する生産物の相対活性を示す。表３のように本酵素は各種のカテプシンＣ基質を分解する。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
また、本精製酵素は、インシュリンB鎖のような長鎖に対する分解活性を有する。
精製酵素の阻害剤との挙動は表4に示す。
【００４０】
【表４】
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【００４１】
上記阻害剤は、セリン酵素の阻害剤（PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), TLCK(N-tosyl-L-phenylalaninecholomethyl ketone),DFP(diisopropyl fluorophosphate),金属酵素阻害剤（o-phenanthrolin), EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid),SH酵素阻害剤（2-ME(2-mercaptoethanol),及びシステイン酵素阻害剤（NEM(N-ethylmalaimide), MIA(monoiodoacetic acid),Cystatinである。
【００４２】
以上の結果から、セリン酵素阻害剤、金属酵素阻害剤、システイン酵素阻害剤ともに阻害したので、本件カテプシンＣ様酵素は、セリン、金属、システインが活性発現に関与していることは推定される。
【００４３】
［実施例４］  カテプシンＣ様酵素の遺伝子工学的製造
（１）染色体DNAの調製
Pyrococcus horikoshii(（JCM9974、JCM微生物カタログ第７版（１９９９）を実施例１のごとく培養し、培養菌体を集菌し緩衝液で洗浄後、SDS存在下プロテイナーゼKで菌体を分解後クロロホルムフェノール溶液で変性タンパク質を除去した後、核酸をアルコール沈澱させた。粗精製核酸をRNaseを働かせRNAを除去し、パイロコッカスホリコシ菌のDNAを得た。
【００４４】
（２）カテプシンＣ様酵素遺伝子を含むプラスミドの調製
カテプシンＣ様酵素遺伝子と推定されるORFを調製するためのPCR反応のプライマーを設計した。そのプライマーを用いて、上記のDNAを鋳型としてPCR反応条件を検討したところ次ぎの条件が適していることが判明した。
The upper primer(5'GTG ATA CCC ATA TGA CTT CTA TCG AAT G3'下線部はNde I site)
;the lower primer(5'GCT CGG ATC CAG TCA ATA AGA3'下線部はBam HI site)アニーリング温度５９度
調製した遺伝子は、ベクタープラスミド(pET-11a novagen社製)に結合させカテプシンＣ様酵素遺伝子を含むプラスミドを調製した。
【００４５】
（３）酵素の大腸菌への導入
上記調製したプラスミドをコンピテンシーの高い大腸菌（XL２-Blue MRF' stratagene社製）に形質導入した。
【００４６】
（４）酵素の生産と精製
上記大腸菌から精製したプラスミドを酵素生産用の大腸菌（BL21-Codon Plus(DE3)RIL stratagene社製）に導入し、その大腸菌を３７℃で培養した。一夜培養後,IPTGを加え37℃で4時間培養した。培養液を遠心分離して菌体を集め、凍結融解してカテプシンＣ酵素を抽出した。抽出液は、85℃、30分間熱処理し、熱変性しやすいタンパクを沈澱除去し上清の活性を測定した。上述のように調製したプラスミドで形質転換した形質転換体の上清を酵素液としH-Gly-Phe-p-nitroanilideに反応させた。生産量は、培養液mLあたり31単位の活性が生産された。本酵素は、通常のように３７℃で培養してもインクルージョンボデーにならず、活性のあるカテプシンＣ様酵素が短時間に高活性で生産された。
【００４７】
［実施例４］  カテプシンＣ様酵素活性に対する界面活性剤の影響
実施例２で調製した本件精製酵素に対する界面活性剤の影響を、濃度を変えて測定した。その結果を下記表に示す。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
【発明の効果】
反応動力学的解析によると、この酵素のGly-Phe-p-naphthylamideに対する最大反応速度は、1.55x105／secであり、非常に大きな反応速度を示した。非常に効率の良い酵素であり、かつ高温でも使用できることから、種々の洗浄などに用いることが可能で、極めて有用な酵素である。
【００５０】
【配列表】
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