(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラスＩヒドロゲナーゼの大サブユニットにおいて、配列番号２記載のアミノ酸配列とアミノ酸の同一性を指標として整列させた場合に前記アミノ酸配列の１８１番目のプロリン又は２４３番目のロイシンに相当するアミノ酸をイソロイシンに置換することを特徴とする耐熱性ヒドロゲナーゼの作製方法。
【請求項２】
クラスＩヒドロゲナーゼの大サブユニットが、ラルストニア・ユウトロファ由来のクラスＩヒドロゲナーゼの大サブユニットである請求項１記載の耐熱性ヒドロゲナーゼの作製方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法によって作製された耐熱性ヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
請求項３記載の耐熱性ヒドロゲナーゼをコードするDNA。
【請求項５】
請求項４記載のDNAを含み、耐熱性ヒドロゲナーゼを生産する微生物。
【請求項６】
請求項５記載の微生物を培養し、得られる培養物から耐熱性ヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする耐熱性ヒドロゲナーゼの生産方法。
【請求項７】
相同組換え法による微生物の作製方法であって、以下の工程を含む耐熱性ヒドロゲナーゼを生産する微生物の作製方法。
（１）クラスＩヒドロゲナーゼの大サブユニットの全部又は一部をコードするDNA断片であって、配列番号２記載のアミノ酸配列とアミノ酸の同一性を指標として整列させた場合に前記アミノ酸配列の１８１番目のプロリン又は２４３番目のロイシンに相当するアミノ酸をコードする配列がイソロイシンをコードする配列に置換されているDNA断片を作製する工程
（２）（１）で作製したDNA断片、抗生物質に対する耐性遺伝子、及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子を含むベクターを作製する工程
（３）（２）で作製したベクターを微生物に導入する工程
（４）（３）でベクターを導入した微生物とクラスＩヒドロゲナーゼを生産する微生物を共存させる工程
（５）クラスＩヒドロゲナーゼを生産する微生物を前述の抗生物質を含む培地中で培養し、（１）で作製したDNA断片、抗生物質に対する耐性遺伝子、及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子がゲノムDNA中に挿入された菌株を選抜する工程
（６）（５）で選抜した菌株を前述の致死性遺伝子が致死性を発揮する条件下で培養し、抗生物質に対する耐性遺伝子及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子が脱落した菌株を選抜する工程
【請求項８】
クラスＩヒドロゲナーゼの大サブユニットが、ラルストニア・ユウトロファ由来のクラスＩヒドロゲナーゼの大サブユニットである請求項７記載の耐熱性ヒドロゲナーゼを生産する微生物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性ヒドロゲナーゼの作製方法、該方法によって作製された耐熱性ヒドロゲナーゼ、該耐熱性ヒドロゲナーゼをコードするDNA、該DNAを含む耐熱性ヒドロゲナーゼ生産微生物、該微生物の作製方法、及び該微生物を用いた耐熱性ヒドロゲナーゼの生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒドロゲナーゼは、水素による電子伝達体の還元やその逆反応による水素発生を触媒する酵素で、水素の工業的生産や燃料電池の触媒など様々な産業分野での利用が期待されている。このような工業的用途に利用されるヒドロゲナーゼは、安定性の高いものでなければならず、熱により容易に失活してしまうようなものは使用できない。
【０００３】
熱に対して耐性を示すヒドロゲナーゼは幾つか知られている。例えば、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Hydrogenovibrio marinus）由来のヒドロゲナーゼ（特開2000-350585号公報）や、好熱性細菌のパイロコッカス・フリオソス（Pyrococcus furious）由来のヒドロゲナーゼ（R.Sapra, M.F.J.M.Verhagen, and M.W.W.Adams, J. Bacteriol. 182:3423-3428(2000) ）などである。これらの酵素を、遺伝子組換技術を用いて大腸菌等の微生物に生産させることができれば、耐熱性ヒドロゲナーゼの生産性は飛躍的に向上する。しかし、クラスIヒドロゲナーゼがその機能を発揮するには、多数のコファクターが必要であり、単純にヒドロゲナーゼ遺伝子を大腸菌等に導入しても、活性のあるヒドロゲナーゼは得られない。また、ヒドロゲナーゼ遺伝子と共にコファクターの遺伝子を宿主に導入すれば、理論的には活性のあるヒドロゲナーゼを得られるはずであるが、現在までにこれに成功した事例はない。
【０００４】
以上のことから、活性のある耐熱性ヒドロゲナーゼは、もともとこの酵素の生産能を持つ微生物から得るしかないが、耐熱性ヒドロゲナーゼ生産菌は、上記したヒドロゲノビブリオ・マリナスを除き、ほとんどが好熱菌である。さらに好熱性ヒドロゲナーゼの遺伝子を大腸菌に導入して、活性のあるヒドロゲナーゼを得られた事例もない。また好熱菌は、１００℃近い高温で培養しなければならず、培養コスト等に大きな問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
非耐熱性ヒドロゲナーゼに耐熱性を付与する技術があれば、耐熱性ヒドロゲナーゼを得るために、わざわざ培養の困難な好熱菌等を培養する必要がなくなる。
【０００６】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、その目的は、ヒドロゲナーゼの耐熱性を向上させる手段を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ラルストニア・ユウトロファ由来のヒドロゲナーゼの大サブユニットの１８１番目のプロリン又は２４３番目のロイシンをイソロイシンに置換することにより、ヒドロゲナーゼの耐熱性が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明の第一は、ヒドロゲナーゼにおいて、配列番号２記載のアミノ酸配列の１８１番目のプロリン又は２４３番目のロイシンに相当するアミノ酸をイソロイシンに置換することを特徴とする耐熱性ヒドロゲナーゼの作製方法である。
【０００９】
本発明の第二は、上記方法によって作製された耐熱性ヒドロゲナーゼである。
【００１０】
本発明の第三は、上記耐熱性ヒドロゲナーゼをコードするDNAである。
【００１１】
本発明の第四は、上記DNAを含み、耐熱性ヒドロゲナーゼを生産する微生物である。
【００１２】
本発明の第五は、上記微生物を培養し、得られる培養物から耐熱性ヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする耐熱性ヒドロゲナーゼの生産方法である。
【００１３】
本発明の第六は、以下の工程を含む耐熱性ヒドロゲナーゼを生産する微生物の作製方法である。
（１）ヒドロゲナーゼの全部又は一部をコードするDNA断片であって、配列番号２記載のアミノ酸配列の１８１番目のプロリン又は２４３番目のロイシンに相当するアミノ酸をコードする配列がイソロイシンをコードする配列に置換されているDNA断片を作製する工程
（２）（１）で作製したDNA断片、抗生物質に対する耐性遺伝子、及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子を含むベクターを作製する工程
（３）（２）で作製したベクターを微生物に導入する工程
（４）（３）でベクターを導入した微生物とヒドロゲナーゼを生産する微生物を共存させる工程
（５）ヒドロゲナーゼを生産する微生物を前述の抗生物質を含む培地中で培養し、（１）で作製したDNA断片、抗生物質に対する耐性遺伝子、及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子がゲノムDNA中に挿入された菌株を選抜する工程
（６）（５）で選抜した菌株を前述の致死性遺伝子が致死性を発揮する条件下で培養し、抗生物質に対する耐性遺伝子及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子が脱落した菌株を選抜する工程
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１．耐熱性ヒドロゲナーゼの作製方法＞
本発明の耐熱性ヒドロゲナーゼの作製方法は、ヒドロゲナーゼにおいて、特定のアミノ酸をイソロイシンに置換することを特徴とするものである。
【００１５】
ヒドロゲナーゼとしては、クラスIヒドロゲナーゼを使用することができるが、他のヒドロゲナーゼを使用してもよい。クラスIヒドロゲナーゼとは、膜結合型で、分子内部にニッケル・鉄クラスターを保持しているタイプのヒドロゲナーゼをいい、通常、このヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ゲノムDNA上において、小サブユニット遺伝子、大サブユニット遺伝子の順に隣接して存在することが知られている（L.-F.Wu and M.A.Madrand, FEMS Microbiology Reviews 104:243-270(1993)）。
【００１６】
本発明で使用するヒドロゲナーゼとしては、ラルストニア・ユウトロファ（Ralstonia eutropha）、オリゴトロファ・カルボキシドボランス（Oligotropha carboxidovorans）、アゾトバクタ・ビネランディ（Azotobacter vinelandii）、アゾトバクター・クロロコッカム（Azotobacter chroococcum）、シュードモナス・ハイドロゲノボーラ（Pseudomonas hydrogenovora）、ロドバクタ・カプスラータ（Rhodobacter capsulatus）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）由来のヒドロゲナーゼ等を例示できるが、これらに限定されるわけではない。なお、これらのヒドロゲナーゼはいずれも公知であり、また、そのアミノ酸配列はGenBank等に登録されているので（表１）、当業者はこれらのヒドロゲナーゼを必要に応じ適宜使用することができる。
【００１７】
上述の特定のアミノ酸とは、ラルストニア・ユウトロファ由来のヒドロゲナーゼの大サブユニット（このサブユニットのアミノ酸配列は配列番号２に示す通りである）の１８１番目のプロリンに相当するアミノ酸（以下、「P181相当アミノ酸」という）、又は２４３番目のロイシンに相当するアミノ酸（以下、「L243相当アミノ酸」という）をいう。ヒドロゲナーゼのどのアミノ酸が、P181相当アミノ酸又はL243相当アミノ酸に相当するかは、ラルストニア・ユウトロファ由来のヒドロゲナーゼの大サブユニットのアミノ酸配列とそのヒドロゲナーゼの大サユニットのアミノ酸配列とをアミノ酸の同一性等を指標として整列させてみることによりわかる。上記で例示したヒドロゲナーゼのP181相当アミノ酸又はL243相当アミノ酸は、表１に示すとおりである。
【００１８】
【表１】
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＜２．耐熱性ヒドロゲナーゼ＞
本発明の耐熱性ヒドロゲナーゼは、上記方法によって作製されたものである。
＜３．DNA＞
本発明のDNAは、上記耐熱性ヒドロゲナーゼをコードするものである。本発明のDNAの一例としては、配列番号１記載の塩基配列で表されるDNAを挙げることができる。
＜４．微生物＞
本発明の微生物は、上記DNAを含み、耐熱性ヒドロゲナーゼを生産するものである。本発明の微生物としては、M2R株やM3R株を例示することができる。M2Rは、P181相当アミノ酸がイソロイシンに置換された変異型ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を持ち、M3R株は、L243相当アミノ酸がイソロイシンに置換された変異型ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を持つ。これらの菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに、それぞれ受託番号FERM P-18709、FERM P-18710として寄託されている（受託日：平成14年2月13日）。
＜５．耐熱性ヒドロゲナーゼの生産方法＞
本発明の耐熱性ヒロドゲナーゼの生産方法は、上記微生物を培養し、得られる培養物から耐熱性ヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするものである。
【００１９】
微生物の培養方法は、使用する微生物の種類に応じて決めればよい。例えば、ラルストニア・ユトロファを使用する場合は、LB培地（1% 酵母エキス、0.5%トリプトン、1% NaCl）、FN培地(O. Lenz, E. Schwartz, M. Eitinger, B. Friedrich (1994) J. Bacteriol. 176, 4385-4393)などで、培養温度を30〜37℃に設定し、培養することができる。
【００２０】
培養物からの耐熱性ヒドロゲナーゼの採取は、微生物からタンパク質を採取する際に常用される方法に従って行うことができる。例えば、耐熱性ヒドロゲナーゼが菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体を除去し、その後、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティ−クロマトグラフィー等を単独又は適宜組み合わせて用いることにより、培養物中から耐熱性ヒドロゲナーゼを採取することができる。また、耐熱性ヒドロゲナーゼが菌体内に生産される場合には、超音波、フレンチプレス、ガラスビーズを使用するホモジナイザーなどを用いて菌体を破砕し、その破砕液について上記と同様の処理を行うことにより、培養物中から耐熱性ヒドロゲナーゼを採取することができる。
【００２１】
なお、ここでいう培養物とは、培養後の培地上清、培養により得られた細胞若しくは細胞の破砕物のいずれをも意味するものである。
＜６．微生物の作製方法＞
本発明の微生物の作製方法は、以下の（１）〜（６）の工程を含むものである。
【００２２】
工程（１）では、ヒドロゲナーゼの全部又は一部をコードするDNA断片であって、P181相当アミノ酸又はL243相当アミノをコードする配列がイソロイシンをコードする配列に置換されているDNA断片を作製する。
【００２３】
ヒドロゲナーゼは、上述の耐熱性ヒドロゲナーゼの作製方法と同様のものを使用することができる。DNA断片は、ヒドロゲナーゼの全長をコードするものであることが好ましいが、相同組換えを起こさせることができるのであれば、ヒドロゲナーゼの一部分をコードするものであってもよい。ヒドロゲナーゼのどのアミノ酸が、P181相当アミノ酸又はL243相当アミノに相当するかは、上述の耐熱性ヒドロゲナーゼの作製方法と同様に、アミノ酸配列の整列によりわかる。配列の置換は、PCRなどによって行うことができる。
【００２４】
工程（２）では、（１）で作製したDNA断片、抗生物質に対する耐性遺伝子、及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子を含むベクターを作製する。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子を使用できるが、他の遺伝子を使用してもよい。特定条件下で致死性を発揮する遺伝子としては、例えば、sacB遺伝子を使用することができるが、他の遺伝子を使用してもよい。sacB遺伝子は、高スクロース条件下で致死性を発揮する遺伝子であり、この遺伝子が組み込まれた菌株は、スクロースを高濃度で含む培地中では死滅してしまう。なお、sacB遺伝子の配列は、GenBankに登録されている（Accession No. X02730）。
【００２５】
工程（３）では、（２）で作製したベクターを微生物に導入する。ここで使用する微生物は特に限定されず、大腸菌などでよい。ベクターを導入する方法も特に限定されず、常法に従って行うことができる。
【００２６】
工程（４）では、（３）でベクターを導入した微生物とヒドロゲナーゼを生産する微生物を共存させる。このように２種類の微生物を共存させることにより、ベクターとヒドロゲナーゼ生産微生物のゲノムDNA間で相同組換えが起こる。なお、ここでいうヒドロゲナーゼ生産微生物とは、工程（１）におけるヒドロゲナーゼと同種のヒドロゲナーゼを生産する微生物である。
【００２７】
工程（５）では、ヒドロゲナーゼを生産する微生物を前述の抗生物質を含む培地中で培養し、（１）で作製したDNA断片、抗生物質に対する耐性遺伝子、及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子がゲノムDNA中に挿入された菌株を選抜する。
【００２８】
工程（６）では、（５）で選抜した菌株を前述の致死性遺伝子が致死性を発揮する条件下で培養し、抗生物質に対する耐性遺伝子及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子が脱落した菌株を選抜する。致死性を発揮する条件は、使用した致死性遺伝子に応じて決めればよく、例えば、致死性遺伝子としてsacB遺伝子を使用した場合には、高濃度のスクロースを含む培地での培養が、致死性を発揮する条件になる。
【００２９】
【実施例】
ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来のヒドロゲナーゼは、高い酸素安定性と耐熱性を示す（特開2000-350585号公報）。この微生物由来のヒドロゲナーゼの大サブユニットに存在するイソロイシン残基の数を調べてみたところ、他の耐熱性ヒドロゲナーゼと同様にイソロイシン含量が高かった（表２）。
【００３０】
【表２】
0004117823.tif 000003
【００３１】
また、ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来のヒドロゲナーゼ（大サブユニット）のアミノ酸配列と他の微生物の由来のヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を整列させてみた（図１及び図２）。
【００３２】
デサルホビブリオ・ギガス由来のヒドロゲナーゼについては、その結晶構造が解析されており、タンパク質内部の疎水的コアの存在する位置（図中のInと記された部位）や大・小サブユニットの境界面の位置（図中のInterfaceと記された部位）が推定可能なので、ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来のヒドロゲナーゼにおけるこれらの位置も推定することができる。これらの部位のアミノ酸について、ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来のヒドロゲナーゼと他の微生物由来のヒドロゲナーゼを比較したところ、他の微生物では、バリン、ロイシン、アラニンなどであるのに対し、ヒドロゲノビブリオ・マリナスでは、より疎水的なイソロイシンになっていた。
【００３３】
以上のことから、非耐熱性ヒドロゲナーゼにおいて、疎水的コアや大−小サブユニット境界面に位置すると推定されるアミノ酸をイソロイシンに置換することにより、非耐熱性ヒドロゲナーゼを耐熱性ヒドロゲナーゼに変換できると予想される。
【００３４】
そこで、ラルストニア・ユウトロファ由来の非耐熱性ヒドロゲーナゼに耐熱性を付与するため、以下の実験を行った。
【００３５】
なお、図１及び図２において、アミノ酸配列上に示された矢印は、以下の実験で変異を導入したアミノ酸の位置を表している。また、アルファベットを伴う矢印はβ-シートを形成している部位を示し、数字を伴うボックスはα-ヘリックスを形成している部位を示す（いずれもデサルホビブリオ・ギガス由来のヒドロゲナーゼの結晶解析から推定されたものである。）。更に、図中のHma、Reu、Oca、Avi、Ach、Phy、Rca、Bja、Dgiは、それぞれヒドロゲノビブリオ・マリナス、ラルストニア・ユウトロファ、オリゴトロファ・カルボキシドボランス、アゾトバクタ・ビネランディ、アゾトバクタ・クロロコッカム、シュードモナス・ハイドロゲノボーラ、ロドバクタ・カプスラータ、ブラディリゾビウム・ジャポニカム、デサルホビブリオ・ギガスを表している。
【００３６】
〔実施例１〕  ラルストニア・ユウトロファの野生株の作製
Ralstonia eutropha H16株は細胞内に可溶性ヒドロゲナーゼと膜結合型ヒドロゲナーゼの２種類のヒドロゲナーゼを保有する（B. Friedrich, E. Schwartz (1993) Annu. Rev. Microbiol. 47, 351-383）。今回ヒドロゲナーゼに変異を導入するのは膜結合型のヒドロゲナーゼである。そのため、変異の効果をより明確に判断するために、Ralstonia eutropha H16株の可溶性ヒドロゲナーゼをマッサンツらの方法（C. Massanz, V.M. Fernandez, B. Friedrich (1997) Eur. J. Biochem. 245, 441-448）で欠落させたRalstonia eutropha HF387株を野生株として使用した。
【００３７】
〔実施例２〕  アミノ酸(１塩基)置換ヒドロゲナーゼの作製
Ralstonia eutropha H16株由来の膜結合型ヒドロゲナーゼ遺伝子がクローン化されたプラスミドpCH182（M. Bernhard, E. Schwartz, J. Rietdorf, B. Frisedrich (1996) J. Bacteriol. 178, 4522-4529）を保有する大腸菌をLB培地で培養し、QIAGENのPlasmid Midi Kitを用いてpCH182を抽出した。抽出したpCH182を鋳型DNAとして、２段階PCR法（O. P. Kuipers, H. J. Boot, W. M. de Vos (1991) Nucleic Acid Res. 19, 4558）を用いて、以下の５種類の変異を導入したDNA断片を調製した。
【００３８】
【表３】
0004117823.tif 000004
【００３９】
２段階PCR法は、表６に記載したプライマーを変異導入用プライマーとして1回目のPCRを行い、得られたPCR産物をQIAGENのQIAquick Gel Extraction Kitを用いて精製した後、これをメガプライマーとして2回目のPCRを行った。PCRの条件は以下の通りである。
【００４０】
【表４】
0004117823.tif 000005
【００４１】
【表５】
0004117823.tif 000006
【００４２】
【表６】
0004117823.tif 000007
【００４３】
得られたDNA断片をpBluescript(Stratagene Cloning Systems)に挿入し、大腸菌XL-1 Blue(Stratagene Cloning Systems)に形質転換した。形質転換体をLB培地で培養し、QIAGENのQIAprep Spin Miniprep Kitを用いてプラスミドを調製してシークエンスを行った。アマシャムファルマシアバイオテクのDYEnamic Direct Cycle Sequencing Kit with 7-deaza dGTP (no primer)を用いてシークエンス反応を行い、DNA sequencer LIC-4200S (LI-COR, Inc.)により解析を行った。
【００４４】
〔実施例３〕  変異ヒドロゲナーゼのラルストニア・ユウトロファ野生株への形質転換
上記５種類の変異が導入されたヒドロゲナーゼ遺伝子を含む断片を制限酵素で切り出して、ラルストニア・ユウトロファへの相同組換え導入用スーサイド・ベクターpLO3に挿入した。スーサイド・ベクターpLO3は、レンツらの方法（O. Lenz, B. Friedrich (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 12474-12479）に従って作製した。即ち、pNEB194(New England Biolabs, Inc.)のポリリンカー部位を含む0.08kbのHindIII-EcoRIをKlenow fragment(New England Biolabs, Inc.)で平滑末端化し、同じくKlenow fragmentで平滑末端化したpBR322(New England Biolabs, Inc.)のEcoRI-DraIサイトに連結した(pCH639)。pUD800（P. Gay, D. Le Cop, M. Steinmetz, T. Berkelman, C. I. Kado (1985) J. Bacteriol. 164, 918-921）のsacB遺伝子を含む1.96kb BamHI-NdeIを平滑末端化し、平滑末端化したpCH639のStyI-BsaIサイトに連結した(pCH640)。pCH640をNdeIで切断して平滑末端化した後、pJF145（J. P. Fuerste, W. Pansegrau, G. Ziegelin, M. Kroeger, E. Lanka (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1771-1775）由来のoriTを平滑末端化した0.47kb BamHI断片としてサブクローニングし、pLO3を作製した。
【００４５】
変異型ヒドロゲナーゼ遺伝子を挿入したスーサイド・ベクターpLO3をRalstonia eutropha HF387株に接合伝達し、相同組換えにより膜結合型ヒドロゲナーゼ遺伝子に変異が導入された組換え体を選抜した。接合伝達は、R. Simonらの方法（R. Simon, U. Priefer, U. Puehler (1983) Bio/Technology 1, 784-791）に従って行い、組換え体の選抜は、O. Lenzらの方法（O. Lenz, E. Schwartz, M. Eitinger, B. Friedrich (1994) J. Bacteriol. 176, 4385-4393）に従って行った。即ち、上述のプラスミドを保有する大腸菌をテトラサイクリン含有LB培地10mlで、 R.eutropha HF387株をLB培地10mlで37℃で一晩培養した。滅菌水で菌体を洗浄した後、菌体を1mlの滅菌水に懸濁し、0.2mlずつをLB平板培地上で混合して37℃で一晩培養することによってプラスミドの接合伝達を行わせた。次に、相同組換えにより野生型ヒドロゲナーゼ遺伝子に変異が導入された組換え体を選抜した。まず、pLO3に連結した変異型ヒドロゲナーゼ遺伝子とラルストニア・ユウトロファに存在する野生型ヒドロゲナーゼ遺伝子との間で相同組み換えを１ヶ所で起こした組換え体（pLO3がゲノム中にインテグレートされた状態）を、pLO3にコードされているテトラサイクリン耐性をマーカーとして選抜した。次に、この組換え体をLB培地10mlに植菌して37℃で一晩培養した後、15%のスクロースを含むLB平板培地に植菌して37℃で培養し、ゲノムにインテグレートされたpLO3上にある変異型ヒドロゲナーゼ遺伝子と野生型ヒドロゲナーゼ遺伝子との間の別の部位で、再度組み換えが生じることによってpLO3が脱落した組み換え体をsacBをマーカーとして選抜した。すなわち、この15%スクロース含有培地でコロニーを形成する高濃度スクロース耐性株を、外部から導入した変異型ヒドロゲナーゼ遺伝子と野生型ヒドロゲナーゼ遺伝子との間で遺伝子配列の交換が起こった相同組換え体として選抜した。
【００４６】
〔実施例４〕  ヒドロゲナーゼの活性中心の耐熱性評価
上記のようにして得られたヒドロゲナーゼ変異株をヒドロゲナーゼ発現用培地であるFGN培地（O. Lenz, E. Schwartz, M. Eitinger, B. Friedrich (1994) J. Bacteriol. 176, 4385-4393）で培養し、菌体から膜結合型ヒドロゲナーゼを含む膜画分をNishiharaらの方法（H. Nishihara, Y. Miyashita, K. Aoyama, T. Kodama, Y. Igarashi, Y. Takamura (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 232, 766-770）により調製した。
【００４７】
この膜画分を70℃に加熱して経時的にサンプリングし、残存する重水素置換活性を測定し、これによりヒドロゲナーゼの活性中心の耐熱性を評価した。重水素置換反応の測定は、 Cammackらの方法（R. Cammack, V. M. Fernandez, E. C. Hatchikian (1994) Methods. Enzymol. 234, 43-68）に従って行った。即ち、あらかじめ重水素で飽和した10mlの50mM酢酸バッファーに、シリンジで酵素液を添加することにより反応を開始した。気相中に発生する水素の量を質量分析計で経時的に測定し、単位時間当たりの水素発生量で活性強度を表した。この結果を図３に示す。
【００４８】
図３に示すように、変異の導入されたヒドロゲナーゼは、いずれも野生型ヒドロゲナーゼよりも活性が高く、活性中心の耐熱性は向上した。
【００４９】
〔実施例５〕  ヒドロゲナーゼのサブユニット構造の耐熱性評価
実施例４で調製した膜画分を55℃に加熱して経時的にサンプリングし、残存するメチレンブルー還元活性を測定した。メチレンブルーを還元するためには、ヒドロゲナーゼの活性中心(大サブユニット)で水素から引き抜かれた電子が小サブユニットにうまく伝達されることが必要なので、メチレンブルー還元活性を測定することにより、サブユニット構造の耐熱性を評価することができる。メチレンブルー還元反応の測定は、SchinkとH. G. Schlegelの方法（B. Schink, H. G. Schlegel (1979) Biochem. Biophys. Acta 567, 315-324）に従って行った。この結果を図４に示す。
【００５０】
図４に示すように、サブユニット構造の安定性については、野生型ヒドロゲナーゼよりも安定性が低下したものもあり（V115I、V253I、N168I,L170I）、安定性が向上したのは、P181I及びL243Iの２つだけであった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明は、ヒドロゲナーゼに耐熱性を付与する手段を提供する。これにより、非耐熱性のヒドロゲナーゼ生産菌を耐熱性ヒドロゲナーゼ生産菌に変えることができるようになる。従って、培養の容易な細菌を選択し、効率的に耐熱性ヒドロゲナーゼの生産が可能になる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒドロゲナーゼ大サブユニットのアライメントの結果を示す図である（前半）。
【図２】ヒドロゲナーゼ大サブユニットのアライメントの結果を示す図である（後半）。
【図３】ヒドロゲナーゼ画分の重水素置換活性の経時的変化を示す図である。
【図４】ヒドロゲナーゼ画分のメチレンブルー還元活性の経時的変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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