(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバントである疎水化多糖類と抗原とを含み、癌、ウイルス疾患、又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療に用いるワクチン製剤。
【請求項２】
疎水化多糖類と抗原との複合体を含む請求の範囲第１項に記載のワクチン製剤。
【請求項３】
疎水化多糖類の集合体微粒子内に封入された抗原を含む請求の範囲第２項に記載のワクチン製剤。
【請求項４】
疎水化多糖類がアルキル基またはステロール残基が導入された多糖類である請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項５】
疎水化多糖類が、多糖類を構成する糖単位１００個あたり１〜５個の糖単位の１級水酸基が下記式（Ｉ）：−Ｏ−（ＣＨ2）mＣＯＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ（Ｉ）
（式中、Ｒはアルキル基またはステロール残基を示し；ｍは０または１を示し；ｎは任意の正の整数を示す）で表される基を有することを特徴とする多糖類である請求の範囲第４項に記載のワクチン製剤。
【請求項６】
多糖類がプルランまたはマンナンである請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項７】
ステロール残基がコレステロール残基である請求の範囲第４項ないし第６項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項８】
抗原が、ＭＨＣクラスＩ抗原にオリゴペプチドとして提示され細胞障害性Ｔ細胞を惹起するタンパク質である請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項９】
抗原がＥｒｂＢ−２タンパク質である請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１０】
抗原が癌細胞抗原、ウイルス抗原、又は自己抗原反応性Ｔ細胞レセプターである請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１１】
細胞障害性Ｔ細胞を活性化する請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗原と疎水化多糖類とを含むワクチン製剤に関する。さらに詳しく言うと、抗原、例えば癌細胞抗原またはウイルス抗原等とアジュバントとして作用する疎水化多糖類とを含み、該抗原及び該疎水化多糖類が複合体を形成したワクチン製剤に関する。本発明のワクチン製剤は、特に、抗原に対して特異的な細胞障害性Ｔ細胞（以下、本明細書において「ＣＴＬ」と略称することがある）を活性化及び誘導する作用を有しており、癌、ウイルス性疾患、又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療のためのワクチンとして極めて有用である。
背景技術
ＣＴＬは、そのＴ細胞レセプターなどを介して癌細胞やウイルス感染細胞を特異的に認識して破壊・傷害する作用を有しており、生体内での癌もしくはウイルスに対する生体防御機構として重要である。ＣＴＬのＴ細胞レセプターは、癌細胞やウイルス感染細胞の表面に発現されている特異抗原を直接認識するのではなく、マクロファージ、樹状細胞といった抗原提示細胞や癌細胞もしくはウイルス感染細胞それ自身の表面に発現されているＭＨＣクラスＩ抗原及びそれに結合した特異抗原由来のオリゴペプチド（その特異抗原の「ＣＴＬエピトープ」）の複合体を認識することが近年明らかになった。
ＭＨＣクラスＩ抗原／特異抗原由来のオリゴペプチド複合体は、以下のようなプロセシング経路を経て生成すると考えられている。すなわち、抗原蛋白質が細胞質内で合成された後、その一部は細胞内のプロテアーゼ複合体（「プロテアゾーム」）によりオリゴペプチドに分解される。その後、さらにその一部（９〜１０アミノ酸残基）が、小胞体膜に存在する輸送タンパク質（TAP：transporter in antigen processing）によって細胞質から小胞体膜内に輸送され、その中でＭＨＣクラスＩ抗原との親和性の高いものが優先的にＭＨＣクラスＩ抗原と結合して細胞表面に現われる。
癌細胞、ウイルス感染細胞、又は自己抗原反応性リンパ球を排除することによって癌、ウイルス性疾患、又は自己免疫疾患を予防及び／又は治療する目的で、人為的にＣＴＬを活性化するワクチン（ＣＴＬ活性化ワクチン）の開発が試みられている。この目的を達成するためには、特異抗原を発現する癌細胞又はウイルス感染細胞それ自身で生体を免疫するか、あるいは特異抗原またはそれ由来のオリゴペプチドを抗原提示細胞の上記のプロセシング経路に導入してＭＨＣクラスＩ抗原との複合体として発現させることが必要である。
「ＣＴＬ活性化ワクチン」を開発するために、実際には、１）特異抗原タンパク質をコードする遺伝子をウイルスベクターなどを用いて導入する方法、２）いくつかのＣＴＬエピトープを含むある程度の大きさの特異抗原タンパク質を何らかの方法で細胞質内に導入する方法、又は３）ＣＴＬエピトープとなりうる特異抗原由来９〜１０アミノ酸のオリゴペプチドを直接抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ抗原に結合させる方法などが試みられている。
これらのうち、１）の方法はいわゆる遺伝子治療に相当するものであり、一般的に、その効果及び安全性について未だ評価が定まっていないという問題がある。また、３）の方法は、実験動物においては効果が確認されているものの、ヒトに応用する場合には実際的な問題が生じると考えられる。すなわち、患者一人一人の持つＭＨＣクラスＩ抗原には様々な種類の抗原が存在しており、そのような多様性に対応して生じるＣＴＬエピトープの多様性をカバーする必要がある。つまり、各々のＭＨＣクラスＩ抗原に対する高親和性オリゴペプチドのアミノ酸配列モチーフを明らかにし、さらに各々のＭＨＣクラスＩ抗原に対応するカスタム化を医薬品として実現せねばならず、現実にはこのタイプのワクチンの開発は極めて困難である。
一方、２）のアプローチについてはいくつかの具体的な成功例が知られており、効果及び安全性の面で満足できることから、様々な患者に対して適用可能なＣＴＬ活性化ワクチンの開発を可能にする方法としてもっとも期待されている。もっとも、特異抗原タンパク質をポリペプチドのまま生体に投与して特異的ＣＴＬを活性化する場合には、何らかのアジュバントとの混合物として投与することが多い。このようなアジュバントとして、例えば、イスコム（ＩＳＣＯＭ）（Takahashi et a1., Nature, 344, 873-875, 1990）、ＱＳ−２１（Newman et al., J. Immunol., 148, 2357-2362, 1992）、マンナン被覆リポソーム（ＷＯ９２／４８８７号公報）、ＡＦ（Raychaudhuri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8308-8312, 1992）などが知られている。
多糖類−コレステロール誘導体がリポソームの多糖被覆剤（特開昭６１−６９８０１号公報）、又は脂肪乳剤被覆剤（特開昭６３−３１９０４６号公報）として使用できることが知られている。また、前述のようにマンノースを含む多糖類で被覆された癌細胞抗原またはウイルス抗原−リポソーム複合体がＣＴＬ誘導活性を有することも知られている（ＷＯ９２／４８８７号公報参照）。
しかしながら、これらはいずれも（抗原）タンパク質をリポソーム化または脂肪乳剤化したのち、多糖類−コレステロール誘導体で被覆するものであり、多糖類−コレステロール誘導体と（抗原）タンパク質のみからなる複合体に関しては、その複合体が具体的にどのような効果を生み出すのかについては全く報告されていない。
上述したように、特異抗原タンパク質をポリペプチドのまま人体に投与して特異的ＣＴＬを活性化しようとする場合には、何らかのアジュバントとを用いることが必要であるが、現在のところ、免疫効率がよく、安全で調製の容易なアジュバントは見いだされていない。
発明の開示
そこで、本発明者らは、より簡便で効果の高いアジュバントとなりうる物質を見出すべく鋭意検討した。その結果、本発明者らは、天然多糖にアルキル基またはコレステロール基を導入した疎水化多糖類が、リン脂質を必要とせずに、極めて容易かつ効率的に癌細胞抗原タンパク質またはウイルス抗原タンパク質を内包化して複合体を形成することを見出した。また、これらの複合体を動物に投与すると特異的ＣＴＬが活性化され、生体防御反応をもたらすことを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
すなわち本発明は、疎水化多糖類と抗原とを含むワクチン製剤、及び疎水化多糖類と抗原との複合体を含むワクチン製剤を提供するものである。この発明の好ましい態様によれば、疎水化多糖類の集合体微粒子内に封入された抗原を含む上記ワクチン製剤；及びアジュバントである疎水化多糖類を含む上記ワクチン製剤が提供される。該ワクチン製剤は、例えば、抗癌用、抗ウイルス用、又は自己免疫疾患治療用として用いることができる。
これらの発明の好ましい態様により、疎水化多糖類がアルキル基またはステロール残基が導入された多糖類である上記ワクチン製剤；疎水化多糖類が、多糖類を構成する糖単位１００個あたり１〜５個の糖単位の１級水酸基が下記式（Ｉ）：−Ｏ−（ＣＨ２）mＣＯＮＨ（ＣＨ２）nＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ  （Ｉ）
（式中、Ｒはアルキル基またはステロール残基を示し；ｍは０または１を示し；ｎは任意の正の整数を示す）で表される基を有する多糖類である上記ワクチン製剤；多糖類がプルラン又はマンナンである上記ワクチン製剤；ステロール残基がコレステロール残基である上記ワクチン製剤が提供される。
本発明のさらに好ましい態様により、抗原がＭＨＣクラスＩ抗原にオリゴペプチドとして提示され細胞障害性Ｔ細胞を惹起するタンパク質である上記ワクチン製剤；抗原がＥｒｂＢ−２タンパク質である上記ワクチン製剤；抗原が癌細胞抗原、ウイルス抗原、又は自己抗原反応性Ｔ細胞レセプターである上記ワクチン製剤が提供される。
本発明の別の観点からは、上記ワクチン製剤を哺乳類動物に投与する工程を含む免疫感作方法、及び抗原に特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導するための上記方法が提供される。さらに別の観点からは、疎水化多糖類を含むアジュバントが提供され、その好ましい態様によれば、抗原とともにワクチン製剤に配合するための上記アジュバントが提供される。さらに、上記ワクチン製剤を製造するための疎水化多糖類の使用も提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、コレステロール化マンナンまたはコレステロール化プルランと癌遺伝子産物ヒトＥｒｂＢ−２タンパク質との複合体などによって免疫されたマウスに対してヒトＥｒｂＢ−２発現（ＣＭＳ７ＨＥ）または非発現（ＣＭＳ７ｎｅｏ）マウス癌細胞を接種した後の、各個体の腫瘍細胞の増殖曲線を示したものである。縦軸は、腫瘍の長径及び短径を測定して近似計算によって算出した腫瘍体積（ｍｍ３）、横軸は腫瘍接種後の日数を表す。図中、１から３は、それぞれＣＨＭ−ｅｒｂＢ２、ＣＨＭ−ＣＡＢ（対照群）、及びＣＨＰ−ｅｒｂＢ２マウスのデータを示す。
第２図は、コレステロール化マンナンまたはコレステロール化プルランと癌遺伝子産物ヒトＥｒｂＢ−２タンパク質との複合体などによって免疫されたマウスに対してヒトＥｒｂＢ−２発現（ＣＭＳ７ＨＥ）または非発現（ＣＭＳ７ｎｅｏ）マウス癌細胞を接種した後の、各個体の腫瘍細胞の増殖曲線を示したものである。縦軸は、腫瘍の長径及び短径を測定して近似計算によって算出した腫瘍体積（ｍｍ３）、横軸は腫瘍接種後の日数を表す。図中、４から７は、それぞれＣＨＰ−ＣＡＢ（対照群）、ＥｒｂＢ−２タンパク質のみ（対照群）、ＣＡＢのみ（対照群）、及び非免疫（ｎａｉｖｅ）マウスのデータを示す。
第３図は、第１図と同じ条件で免疫されたマウスから得られた脾細胞を採取し、試験管内でヒトＥｒｂＢ−２発現Ｂａｌｂ／ｃマウス由来ＣＭＳ１７ＨＥ細胞で刺激培養した後、51Ｃｒで標識された各標的細胞に対するその細胞障害活性を測定した結果を表す（図２の１から７までの略号は、第１図または第２図に記載された免疫処理群の略号と同義である）。図中、縦軸は、標識された細胞からの非特異的な51Ｃｒの漏出分を差し引いて計算した細胞障害活性を表し、横軸は標的細胞に対する脾細胞の割合を表す。
第４図は、第３図のＣＨＭ−ｅｒｂＢ２免疫群と同様な条件下において、さらに様々なマウス免疫細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体を１：２倍希釈の濃度で加えたときのヒトＥｒｂＢ−２特異的なＣＴＬ活性の変化を表したものである。図中、１は抗体無添加のデータを示し、２は抗ＣＤ３、３は抗ＣＤ４、４は抗ＣＤ８、５は抗Ｋｄ、６は抗Ｄｄ、７は抗Ｌｄ、８は抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体添加のデータをそれぞれ示す。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において用いられる「アジュバンド」という用語は、抗原に対する免疫応答を修飾する目的で抗原とともに用いられる物質を意味しており、通常は抗体産生や細胞性免疫の強化に用いられるもののほか、場合により免疫応答の質的変化のために用いられるものも包含する。
＜１＞抗原
本発明において用いられる抗原としては、免疫を惹起する物質であれば特に限定されないが、例えば、ポリペプチド、ポリペプチド複合体、グリコプロテイン、核酸等を用いることができる。該抗原はウイルスや癌細胞などの病理学的標的そのもの、またはその一部であってもよい。あるいは、新生物組織またはウイルス感染細胞等の病的組織が発現する抗原であってもよい。本発明においては、抗原タンパク質、なかでもＭＨＣクラスＩ抗原にオリゴペプチドとして提示されＣＴＬを惹起するタンパク質が好適に用いられる。抗原タンパク質は抗原決定基を含んでいればよく、その起源や純度は特に限定されないが、例えば遺伝子組み換え法により作製したものが好適である。抗原タンパク質の分子量は、一般的には５００〜１００，０００程度、好ましくは２，０００〜１００，０００程度である。具体的には、癌遺伝子産物、ＥｒｂＢ−２タンパク質、ｒａｓ  ｐ２１タンパク質、癌抑制遺伝子産物ｐ５３タンパク質、ウイルス由来タンパク質、またはＴ細胞レセプター、例えば自己抗原反応性（自己免疫疾患惹起）Ｔ細胞レセプター等の全体ならびにそれらの部分配列を含むタンパク質などが挙げられる。
＜２＞疎水化多糖類
疎水化多糖類または疎水化多糖類集合体微粒子は、例えば、Akiyoshi et a1., Macromolecules, 6, pp.3062-3068, 1993; Akiyoshi et al., J. Proc. Japan. Acad., 71, 71B, p.15, 1995;  特開昭６１−６９８０１号公報、特開平３−２９２３０１号公報、特開平７−９７３３３号公報等に記載されたそれ自体既知の方法で製造することができる。
疎水化多糖類における多糖類は、糖残基がグリコシド結合した高分子であれば特に限定されることはない。多糖類を構成する糖残基としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース等の単糖類、または二糖類またはオリゴ糖類などの糖類に由来する残基を用いることができる。糖残基は１，２−、１，３−、１，４−または１，６−グリコシド結合していてもよく、その結合はα−またはβ−型結合のいずれであってもよい。また、多糖類は直鎖状でも分枝鎖状のいずれでもよい。糖残基としてはグルコース残基が好ましく、多糖類としては、天然または合成由来のプルラン、デキストラン、アミロース、アミロペクチン、又はマンナン、好ましくはマンナンまたはプルランなどが用いられる。
疎水基としては、例えば、１本鎖及び２本鎖のアルキル基またはステロール残基を１００単糖あたり１〜５個（重量比で５％以下）導入したものが望ましい。もっとも、疎水基は上記の基に限定されるわけではなく、封入される抗原の分子量や等電点に応じて封入率のよいものを適宜選択することができる。ステロール残基としては、例えば、コレステロール、スチグマステロール、β−シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール残基などが挙げられるが、好ましくは、コレステロール残基を用いることができる。また、アルキル基としては、好ましくは炭素数２０以下、さらに好ましくは炭素数１０〜１８のアルキル基を用いることができ、これらは直鎖又は分岐鎖のいずれであってもよい。
疎水化多糖類としては、例えば、多糖類を構成する糖単位１００個あたり１〜５個の糖単位の１級水酸基が下記式（Ｉ）：
−Ｏ−（ＣＨ２）mＣＯＮＨ（ＣＨ２）nＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ  （Ｉ）
（式中、Ｒはアルキル基またはステロール残基を示し；ｍは０または１を示し；ｎは任意の正の整数を示す）で表されるものが好ましい。ここで、アルキル基又はステロール残基としては好ましくは上記のものを用いることができ、ｎは好ましくは１〜８である。なお、疎水化多糖類としては、特開平７−９７３３３号公報に記載されたようなリンカーを介して結合したものであってもよい。
＜３＞疎水化多糖類による抗原の封入方法
疎水化多糖類と抗原との複合体は、疎水化多糖類の集合体微粒子と抗原とを室温で混合した後に、ゲルクロマトグラフ法で処理することにより単離・精製できる（Nishikawa, Macromolecules, 27, pp.7654-7659, 1994）。このようにして得られた疎水化多糖類と抗原との複合体は、そのまま本発明のワクチン製剤として用いることができるが、必要に応じて常法に従って滅菌等の操作を施すことも可能である。
＜４＞疎水化多糖類と抗原との複合体による免疫
本発明のワクチン製剤は、他の既知のワクチン製剤等と同様に、その所定量を動物に投与することによって該動物を免疫化することができ、同様にしてワクチン製剤の力価を評価することができる。本発明のワクチン製剤の投与経路は皮下注射が一般的であるが、この投与経路に限定されることはなく、例えば、静脈内または筋肉内のような非経口投与や経口投与も採用し得る。免疫感作に必要な本発明のワクチン製剤の投与量は適宜決定できるが、例えば、通常投与量としては抗原として５０〜１５０μｇ／同程度の量を目安とし、投与は１〜４回行うのが適当である。
なお、本発明のワクチン製剤の製剤化の際には、それ自体既知の通常使用され得る製剤、担体及び希釈剤を、採用される投与経路にしたがって適宜使用することができる。
実施例
以下に実施例をあげて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１：コレステロール化マンナンまたはプルランと癌遺伝子産物ＥｒｂＢ−２タンパク質との複合体の調製
疎水化多糖は秋吉らの方法（Akiyoshi et a1., Macromolecules, 26, 3062-3068(1993)）によって合成した。その結果、コレステロール化マンナン（以下、「ＣＨＭ−５５−２．３」と略記する）としては、分子量約５５，０００のマンナン（シグマ社製）に１００単糖当たり約２．３個のコレステロール残基が導入された。また、コレステロール化プルラン（以下、「ＣＨＰ−１０８−０．９」と略記する）としては、分子量約１０８，０００のプルラン（林原生物化学研究所製）に１００単糖当たり約０．９個のコレステロール残基が導入された。水溶液中では、１つの集合体当たり平均７分子のコレステロール残基が会合して形成された疎水性ドメインが約７個含まれるものとなった。
上記疎水化多糖をＤＭＳＯに溶解した後、ＰＢＳ（ｐＨ７．９）に透析し、さらにプローブ型のソニケーター（トミー精工製ＵＲＰ）を用いて４０Ｗで１０分間超音波処理した。この溶液を１．２μｍ、０．４５μｍ、０．２μｍの順でフィルター濾過して疎水化多糖の集合体微粒子水溶液を得た。各溶液の疎水化多糖濃度をフェノール硫酸法で定量した結果、ＣＨＰ−１０８−０．９は９．６２ｍｇ／ｍｌ、ＣＨＭ−５５−２．３は６．９７ｍｇ／ｍｌであった。
一方、癌遺伝子産物ヒトＥｒｂＢ−２タンパク質のアミノ酸の１番目から１４７番目に相当するポリペプチド（Coussens et a1., Science, 230, 1132, 1985）のＮ末端にヒスチジン・ヘキサマーを融合させた組み換えタンパク質を大腸菌を用いて発現させ、抗原タンパク質として用いた。すなわち、下記に示すオリゴヌクレオチド・プライマー２本を用いて、ヒトＥｒｂＢ−２タンパク質のアミノ酸の１番目から１４７番目に相当するポリペプチドをコードする部分を含むｃＤＮＡをＰＣＲ法にて増幅した。
0004033497.tif 000002
得られた４６３ｂｐのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理して末端を平滑化した後、制限酵素ＢｃｌＩで切断した。さらに、発現プラスミドベクター、ｐＱＥ１１（Qiagen社）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、末端をＴ４ポリメラーゼで平滑化した後、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。このようにして作製されたｐＱＥ１１ベクター由来の約３．３ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ΔＨｉｎｄＩＩＩ断片に、上記ヒトＥｒｂＢ−２ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をライゲーション・キット（宝酒造製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。アンピシリン耐性のクローンについて制限酵素地図を作製して目的のクローンを選別した後、添付されたQiagen社のマニュアルにしたがって、組み換えタンパク質を精製した。１リットルの培地で培養した組み換え体から、およそ２０ｍｇの組み換えタンパク質を得た。
前記疎水化多糖水溶液にヒトＥｒｂＢ−２組み換えタンパク質溶液（ＰＢＳ／６Ｍ尿素中にタンパク質２．０ｍｇ／ｍｌを含む）を加えて混合することにより、疎水化多糖と抗原との複合体を含有する無色透明の水溶液（ＣＨＭまたはＣＨＰ５ｍｇ／ｍｌ、ヒトＥｒｂＢ−２組み換えタンパク質０．２５ｍｇ／ｍｌ）を得た。この溶液についてＤＬＳ（Dinamic Light Scattering）測定を行った結果、粒径約２５０ｎｍ、ｋ２/ｋ１２=０．１５６の複合体微粒子を得たと考えられた（以下、このようにして得られたコレステロール化マンナンとＥｒｂＢ−２タンパク質との複合体を「ＣＨＭ−ｅｒｂＢ２」、コレステロール化プルランとＥｒｂＢ−２タンパク質との複合体を「ＣＨＰ−ｅｒｂＢ２」と略記する）。
一方、疎水化多糖が存在しない同一緩衝液を用いた条件では、ヒトＥｒｂＢ−２組み換えタンパク質は全て不溶化し、沈澱として析出した。
免疫実験の陰性対照としては、Carbonic Anhydrase II（シグマ社製、以下「ＣＡＢ」と略記する）を用いて疎水化多糖とタンパク質との複合体を作製した（以下、コレステロール化マンナンとＣＡＢとの複合体を「ＣＨＭ−ＣＡＢ」、コレステロール化プルランとＣＡＢとの複合体を「ＣＨＰ−ＣＡＢ」と略記する）。
実施例２：ＣＨＭ−ｅｒｂＢ２及びＣＨＰ−ｅｒｂＢ２のワクチン作用（ＣＴＬ誘導効果及び制癌効果）
１群３匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、実施例１で調製したＣＨＭ−ｅｒｂＢ２またはＣＨＰ−ｅｒｂＢ２の懸濁液をタンパク質として一匹あたり２５μｇを１週間間隔で２回皮下投与した。その後、Ｂａｌｂ／ｃマウスと同系のマウス線維芽肉腫細胞株（DeLeo et a1., J. Exp. Med., 146, 720, 1977参照）に常法により選択マーカーのｎｅｏ遺伝子とヒトＥｒｂＢ−２を発現させた組み換え細胞ＣＭＳ７ＨＥ、または陰性対照として同様にしてマウス線維芽肉腫細胞株にｎｅｏ遺伝子のみを発現させた組み換え細胞ＣＭＳ７ｎｅｏを皮下に接種した。
接種した腫瘍の大きさを経時的に計測したところ、第１図に見られるように、ＣＨＭ−ｅｒｂＢ２またはＣＨＰ−ｅｒｂＢ２で免疫されたマウスでは３匹中３匹ともヒトＥｒｂＢ−２を発現する腫瘍の増殖抑制及び完全退縮が観察された（第１図の１及び３の左欄）。一方、ＣＨＭ−ｅｒｂＢ２またはＣＨＰ−ｅｒｂＢ２で免疫された場合でも、接種された腫瘍がヒトＥｒｂＢ−２を発現していない場合には腫瘍の増殖抑制効果は観察されず（第１図の１及び３の右欄）、この免疫操作の抗原特異性が示唆された。組み換えヒトＥｒｂＢ−２のみ（第２図の５）や、関連のないＣＡＢで免疫した場合にも（第１図の２、第２図の４および６）、腫瘍の増殖抑制効果はほとんど観察されなかった。
また、上記実験と同様の方法で免疫されたマウスから脾細胞を採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで放射線処理したＢａｌｂ／ｃマウスと同系のヒトＥｒｂＢ−２発現ＣＭＳ１７ＨＥ細胞によって刺激した後、51Ｃｒにて標識されたＣＭＳ７ＨＥ細胞、ＣＭＳ１７ＨＥ細胞、ＣＭＳ７ｎｅｏ細胞、ＣＭＳ１７ｎｅｏ細胞、及びＣＭＳ７細胞に対する細胞障害活性を常法にて測定した。その結果、第３図に示すように、ＣＨＭ−ｅｒｂＢ２またはＣＨＰ−ｅｒｂＢ２で免疫されたマウスから得られた脾細胞を用いた場合にのみ、標的細胞数：脾細胞数の割合に依存してヒトＥｒｂＢ−２発現細胞（ＣＭＳ７ＨＥ；ＣＭＳ１７ＨＥは刺激に用いた細胞なので陽性対照に相当する）が、非発現細胞（ＣＭＳ７ｎｅｏ、ＣＭＳ１７ｎｅｏ及びＣＭＳ７）に比べて強く殺傷された（第３図の１及び３）。
上記のうち、ＣＨＭ−ｅｒｂＢ２免疫マウスから得られた脾細胞のヒトＥｒｂＢ−２特異的ＣＴＬ活性を測定する際に、様々なマウス免疫細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体を１：２倍希釈の濃度で加えると、ＣＤ３、ＣＤ８、マウスＭＨＣクラスＩ分子のうちＫｄに対する抗体のみがヒトＥｒｂＢ−２特異的ＣＴＬ活性を抑制した（第４図）。抗ＣＤ４、抗Ｄｄ、抗Ｌｄまたは抗マウスＭＨＣクラスＩＩ分子抗体にはそのような活性は認められなかった。このことから、観察されたヒトＥｒｂＢ−２特異的ＣＴＬ活性は、ＭＨＣクラスＩ拘束性のＣＤ８陽性Ｔリンパ球によるものであることが示唆された。
産業上の利用可能性
本発明のワクチン製剤は、抗原に対する免疫応答の優れた修飾作用、特に細胞障害性Ｔ細胞の活性化及び誘導作用を有しており、癌、ウイルス疾患、自己免疫疾患の予防及び／又は治療用のワクチンとして用いることができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：２
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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【図１】
0004033497.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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