(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列からなる膵臓特異的遺伝子ＴＳＡ３０５。
【請求項２】
以下（ａ）及び（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる膵臓特異的遺伝子ＴＳＡ３０５：
（ａ）配列番号：２で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（ｂ）配列番号：２で示される塩基配列の相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、６×ＳＳＣ中６５℃一夜の条件下或いは５０％ホルムアミドを含む４×ＳＳＣ中３７℃一夜の条件下においてハイブリダイズし、２×ＳＳＣ中６５℃での３０分間の洗浄条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項３】
ヒト遺伝子である請求項１又は２に記載の遺伝子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号：４又は配列番号：５で示される塩基配列からなり、プライマーとして使用される請求項２に記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子によってコードされるＴＳＡ３０５蛋白。
【請求項６】
請求項５に記載のＴＳＡ３０５蛋白に結合性を有する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、膵臓に特異的に発現している遺伝子ＴＳＡ３０５、より詳しくは、線虫のｓｅｌ−１と高い相同性を有し、癌に対して抑制的に働くと考えられる新規な膵臓特異的遺伝子に関する。また本発明は、かかる遺伝子によってコードされる新規な蛋白質及びその特異抗体にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
膵臓癌は、日本人及び西側諸国の癌関連死亡順位において４位及び５位を占める消化器系の悪性腫瘍の中でも最も予後不良な癌のひとつである(Poston, J. G., et al., Gut., 32, 800-812 (1991))。癌研究における最も重要なゴールは、癌化に至る早期の遺伝子変化を見分けることである。この変化の見極めは、早期診断のための遺伝子的なツールの開発とこの致死的な疾患をより効果的に治療するための新規な治療的アプローチとを導くことができる。
【０００３】
一方、線虫のｓｅｌ−１遺伝子は、線虫において神経発生の際の外胚葉からニューロブラストへの分化を抑制するＮｏｔｃｈ／ｌｉｎ−１２に対して抑制的に働くことが報告されている（Genetics, 143 (1), 237-247 (1996) : Development, 124 (3), 637-644 (1997)）。該Ｎｏｔｃｈ／ｌｉｎ−１２は、その強制発現が乳癌や白血病を惹起させるため、癌関連遺伝子と考えられており、該癌関連遺伝子の抑制的な働きをなす上記ｓｅｌ−１遺伝子は、癌に対しても抑制的に働くとも考えられるが、現在尚之等遺伝子の役割については明確に解明されている訳ではない。
【０００４】
かかる遺伝子の生理的役割の解明とそれにより得られる情報は、癌化や炎症等の疾患の発症機能の解明に重要であり、これらは、基礎科学研究の分野はもとより、医薬品分野においても癌や炎症等の疾患の解明やその処置法等の開発面からも望まれているところである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、斯界で要望される前記の情報、殊にｓｅｌ−１遺伝子と相同性を有する新規な蛋白相同物をコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
上記目的より、本発明者は、各種ヒト組織由来の遺伝子につき検索を重ねた結果、該目的に合致する新しい膵臓特異的遺伝子の単離、同定に成功し、ここに本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明によれば、以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかの蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝子ＴＳＡ３０５、特にヒト遺伝子である当該遺伝子が提供される。
【０００８】
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＴＳＡ３０５との結合活性を有する蛋白質。
【０００９】
また、本発明によれば、上記の遺伝子によってコードされるＴＳＡ３０５蛋白及びこれに結合性を有する特異抗体が提供される。
【００１０】
更に、本発明によれば、以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子ＴＳＡ３０５、特にヒト遺伝子である当該遺伝子が提供される。
【００１１】
（ａ）配列番号：２で示される塩基配列の全部又は一部を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００１２】
加えて、本発明によれば、遺伝子検出用の特異プローブ又は特異プライマーとして使用されるＤＮＡ断片である上記遺伝子が提供される。
【００１３】
以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明遺伝子の一具体例としては、後述する実施例に示される「ＴＳＡ３０５」と名付けられたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列から演繹されるものを挙げることができる。その塩基配列は、配列番号：２に示されるとおりである。
【００１５】
該遺伝子は、配列番号：１に示される７９４アミノ酸配列の新規な膵臓特異的蛋白（ＴＳＡ３０５蛋白という）をコードするヒトｃＤＮＡであり、全長７８８５塩基からなっている。
【００１６】
本発明遺伝子ＴＳＡ３０５の発現産物であるＴＳＡ３０５蛋白は、ＦＡＳＴＡプログラム（Person W. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 85, 2444-2448 (1988)）を利用したGenBank/EMBLデーターベースの検索の結果、線虫のｓｅｌ−１遺伝子（前記文献参照）と非常に高い相同性を有していることが確認された。このことから、本発明遺伝子は、胚発生の全般に関わるとされている癌関連遺伝子Ｎｏｃｔｃｈ／ｌｉｎ−１２に対して、上記ｓｅｌ−１と同様に、抑制的に働くと考えられる。
【００１７】
また、本発明遺伝子の染色体上の位置は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の原因遺伝子が存在するとされる第１４染色体ｑ２４．３−ｑ３１．１である。このことから、本発明遺伝子は、糖尿病との関連が強く示唆される。
【００１８】
更に、本発明遺伝子の遺伝子産物は、フィブロネクチンＴｙｐｅIIコラーゲン結合ドメインを含む蛋白であることが明らかとなった。かかるＮ末端付近のコラーゲン結合部位は線維化との関わりを示唆するものであり、このことから本発明遺伝子は、線維症との関連も強く示唆される。
【００１９】
加えて、本発明遺伝子は、試験した膵癌標本の全てにおいてその発現の欠失が認められ、主に正常膵臓に発現することから、癌化における潜在的な予測の価値を提言する。
【００２０】
従って、本発明に係わる遺伝子ＴＳＡ３０５及びその遺伝子産物の提供は、上記乳癌、白血病、線維症、糖尿病、膵癌等の各種疾患、殊に膵癌の解明、把握、診断、予防及び治療等に極めて有用な情報乃至手段を与える。また、本発明遺伝子は、上記各種疾患の処置に利用される本発明遺伝子の発現を誘導する新規薬剤の開発の上でも好適に利用できる。更に、個体或は組織における本発明遺伝子の発現又はその産物の発現の検出や、該遺伝子の変異（欠失や点変異）又は発現異常の検出等は、上記疾患の解明や診断上において好適に利用できると考えられる。
【００２１】
本発明遺伝子は、具体的には配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝子又は配列番号：２で示される塩基配列の全部或は一部を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子として例示されるが、特にこれらに限定されることなく、例えば、上記特定のアミノ酸配列において一定の改変を有する遺伝子や上記特定の塩基配列と一定の相同性を有する遺伝子であることができる。
【００２２】
即ち、本発明遺伝子には、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝子もまた包含される。ここで、「アミノ酸の欠失、置換又は付加」の程度及びそれらの位置等は、改変された蛋白質が、配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同様の機能を有する同効物であれば特に制限されない。具体的には、ＴＳＡ３０５とのインビトロ結合活性を保持するものが挙げられる。
【００２３】
尚、これらアミノ酸配列の改変（変異）等は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発明の具体例遺伝子）に基づいて人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因及び手段等を問わず、上記特性を有する全ての改変遺伝子を包含するものである。
【００２４】
上記の人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154: 350, 367-382 (1987)；同 100: 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12: 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕等の遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法等の化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89: 4801 (1967)；同91: 3350 (1969)；Science, 150: 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22: 1859 (1981)；同24: 245 (1983)〕及びそれらの組合せ方法等が例示できる。
【００２５】
本発明遺伝子のひとつの態様としては、配列番号：２で示される塩基配列の全部或は一部を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子を例示できるが、この塩基配列は、上記アミノ酸配列（配列番号：１）の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例でもあり、本発明遺伝子はこれらに限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ選択した塩基配列を有することも勿論可能である。該コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮することができる〔Ncleic Acids Res., 9: 43 (1981)〕。
【００２６】
また、本発明遺伝子は、例えば配列番号：２の具体例で示されるように、一本鎖ＤＮＡの塩基配列として表示されるが、本発明はかかる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオオチドやこれらの両者を含むコンポーネントも当然に包含するものであり、また、ｃＤＮＡ等のＤＮＡに限定されることもない。
【００２７】
更に、本発明の遺伝子は、前記のとおり、配列番号：２に示される塩基配列の全部又は一部を含むポリヌクレオチドからなるものに限定されず、当該塩基配列と一定の相同性を有する塩基配列からなるものも包含するものである。かかる遺伝子としては、少なくとも、下記に掲げるようなストリンジェントな条件下で、配列番号：２で示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし、一定の条件下での洗浄してもこれより脱離しないものが挙げられる。
【００２８】
即ち、配列番号：２の塩基配列を有するＤＮＡと、６×ＳＳＣ中６５℃一夜の条件下或は５０％ホルムアミドを含む４×ＳＳＣ中３７℃一夜の条件下においてハイブリダイズし、２×ＳＳＣ中６５℃での３０分間の洗浄条件下においても該ＤＮＡから脱離しない塩基配列を有する遺伝子が例示される。ここで、ＳＳＣは、標準食塩−クエン酸緩衝液である（standard saline citrate; 1×SSC = 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate）。
【００２９】
本発明の遺伝子は、その具体例についての配列情報に基づいて、一般的な遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）等参照〕。
【００３０】
具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78: 6613 (1981)；Science, 222: 778 (1983)等〕。
【００３１】
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、本発明遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞等、特に膵臓組織が例示され、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従い実施できる。尚、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab. Inc.）より市販の各種ｃＤＮＡライブラリー等を用いることもできる。
【００３２】
本発明遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮＡにより産生される蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を例示できる。
【００３３】
ここで用いられるプローブとしては、本発明遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡ等が一般的に例示できるが、勿論既に取得された本発明遺伝子そのものやその断片等も良好に利用できる。
【００３４】
また、上記特異抗体に代えてＴＳＡ３０５蛋白を利用した、蛋白質相互作用クローニング法（protein interaction cloning procedure）によることもでき、更に、本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００３５】
本発明では、またディファレンシャルデイスプレイ法（Liand P., et al., Science, 257, 967-971 (1992)）によって、異なる条件下の細胞もしくは複数の異なる細胞群間のｍＲＮＡの発現を直接比較、検討することができる。
【００３６】
本発明遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science, 230: 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法も好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、レース法（ＲＡＣＥ：Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6): 35 (1994))、殊に５’−レース（５’−ＲＡＣＥ）法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8: 8998 (1988)〕等の採用が好適である。かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、既に本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従い合成できる。
【００３７】
尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法等によればよい。
【００３８】
上記で得られる本発明遺伝子或は各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74: 5463 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Method in Enzymology, 65: 499 (1980)〕等に従って、また簡便には市販のシークエンスキット等を用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００３９】
本発明遺伝子の利用によれば、一般の遺伝子工学的手法を用いることにより、その遺伝子産物を容易に大量に安定して製造することができる。従って、本発明は、本発明にかかるＴＳＡ３０５遺伝子を含有するベクター（発現ベクター）及び該ベクターによって形質転換された宿主細胞並びに該宿主細胞を培養することによりＴＳＡ３０５蛋白を製造する方法をも提供するものである。
【００４０】
該製造方法は、通常の遺伝子組換え技術〔Science, 224: 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130: 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 5990 (1983)及び前記引用文献等参照〕に従うことにより実施できる。
【００４１】
上記宿主細胞としては、原核生物及び真核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられるものが広く挙げられるが、好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株に含まれるものが例示できる。また、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)〕等が、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞等が好適に用いられているが、これらに限定される訳ではない。
【００４２】
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的には、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕等が例示できる。また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕等を例示できる。
【００４３】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適利用できる。上記ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく用いられるが、これらに限定されず各種のベクターを利用することができる。プロモーターとしても特に限定なく、例えばトリプトファン(trp) プロモーター、lpp プロモーター、lac プロモーター、PL/PR プロモーター等をいずれも好適に使用できる。
【００４４】
尚、本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用でき、該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Promega 社）等を例示できる。
【００４５】
上記所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入方法・形質転換法にも特に制限はなく、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質転換体も、常法に従い培養することができ、該培養により本発明遺伝子によりコードされる目的のＴＳＡ３０５蛋白が発現・産生され、形質転換体の細胞内、細胞外若しくは細胞膜上に蓄積若しくは分泌される。
【００４６】
上記培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００４７】
かくして得られる組換え蛋白（ＴＳＡ３０５蛋白）は、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作従って分離、精製することができる〔「生化学データブックII」、1175-1259頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25): 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163: 313 (1987) 等参照〕。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等が挙げられ、特に好ましい上記方法としては、本発明のＴＳＡ３０５蛋白の特異抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを例示できる。
【００４８】
しかして、本発明は、例えば上記の如くして得られる、新規なＴＳＡ３０５蛋白自体をも提供するものである。該蛋白は、ＴＳＡ３０５との結合活性を有することにより特徴付けられ、前記のとおり医薬分野において有用である。
【００４９】
また、このＴＳＡ３０５蛋白は、該蛋白の特異抗体を作成する為の免疫抗原としても利用できる。ここで抗原として用いられるコンポーネントは、例えば上記遺伝子工学的手法に従って大量に産生された蛋白或はそのフラグメントであることができ、これら抗原を利用することにより、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）及びモノクローナル抗体を収得することができる。該抗体の製造方法自体は、当業者によく理解されているところであり、本発明においてもこれら常法に従うことができる〔続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（1986）等参照〕。
【００５０】
例えば、抗血清の取得に際して利用される免疫動物としては、ウサギ、モルモット、ラット、マウスやニワトリ等の通常動物を任意に選択でき、上記抗原を使用する免疫方法や採血等もまた常法に従い実施できる。
【００５１】
また、モノクローナル抗体の取得も、常法に従い、上記免疫抗原で免疫した動物の形質細胞（免疫細胞）と形質細胞腫細胞との融合細胞を作成し、これより所望抗体を産生するクローンを選択し、該クローンの培養により実施することができる。免疫動物は、一般に細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択され、通常マウスやラット等が有利に用いられている。免疫は、上記抗血清の場合と同様であり、所望により通常のアジュバント等と併用して行なうこともできる。
【００５２】
尚、融合に使用される形質細胞腫細胞としても、特に限定なく、例えばｐ３（p3/x63-Ag8）〔Nature, 256: 495-497 (1975)〕、ｐ３−Ｕ１〔Current Topics in Microbiology and Immunology, 81: 1-7 (1978)〕、ＮＳ−１〔Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1976)〕、ＭＰＣ−１１〔Cell, 8: 405-415 (1976)〕、ＳＰ２／０〔Nature, 276: 269-271 (1978)〕等、ラットにおけるＲ２１０〔Nature, 277: 131-133 (1979)〕等及びそれらに由来する細胞等の各種の骨髄腫細胞をいずれも使用できる。
【００５３】
上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合は、通常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下に公知の方法に準じて行なうことができ、所望のハイブリドーマの分離もまた同様に行ない得る〔Meth. in Enzymol., 73: 3 (1981)；上記続生化学実験講座等〕。
【００５４】
また、目的とする抗体産生株の検索及び単一クローン化も常法により実施され、例えば抗体産生株の検索は、上記の本発明抗原を利用したＥＬＩＳＡ法〔Meth. in Enzymol., 70: 419-439 (1980)〕、プラーク法、スポット法、凝集反応法、オクテロニー（Ouchterlony）法、ラジオイムノアッセイ等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法に従い実施することができる。
【００５５】
かくして得られるハイブリドーマからの本発明抗体の採取は、該ハイブリドーマを常法により培養してその培養上清として得る、また、ハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させその腹水として得る方法等により実施される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。このようにして得られる抗体は、更に塩析、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフイー等の通常の手段により精製することができる。
【００５６】
かくして得られる抗体は、本発明のＴＳＡ３０５蛋白に結合性を有することによって特徴付けられ、これは、前述したＴＳＡ３０５蛋白の精製及びその免疫学的手法による測定乃至識別等に有利に利用できる。本発明は、かかる新規な抗体をも提供するものである。
【００５７】
また、本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報を基にすれば、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明遺伝子の発現の検出を行うことができる。
【００５８】
かかる検出は常法に従って行うことができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロット解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situ ＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Res., 21: 3159-3166 (1993)〕や in situ ハイブリダイゼーション等の細胞レベルでのそれら測定、ＮＡＳＢＡ法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350: 91-92 (1991)〕及びその他の各種方法によりいずれも良好に実施し得る。
【００５９】
尚、ＲＴ−ＰＣＲ法を採用する場合において、用いられるプライマーは、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り何等限定されず、本発明の遺伝情報に基いてその配列を適宜設定することができる。通常、これは２０〜３０ヌクレオチド程度の部分配列を有するものとすることができる。
【００６０】
このように、本発明は、本発明にかかるＴＳＡ３０５遺伝子の検出用の特異プライマー及び／又は特異プローブとして使用されるＤＮＡ断片をも提供するものである。
【００６１】
【発明の効果】
本発明によれば、新規な膵臓特異的遺伝子ＴＳＡ３０５及びこれによりコードされる蛋白が提供され、これらの利用により、膵臓癌等の癌や癌化の解明、その診断、予防及び治療等に有用な技術が提供される。
【００６２】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。
【００６３】
【実施例１】
(1-1)  〔α-33Ｐ〕ＡＴＰで標識した表出方法
組織特異的な手法において発現したヒト遺伝子を確認するために〔α-33Ｐ〕ＡＴＰで標識した表出方法を用いた。該方法の手順は本質的に以下に示すリアングの方法(Liang P., et al., Science, 257, 967-971 (1992))によって行なった。  即ち、１３のヒト組織（成人脳、胎児脳、肺、肝臓、胃、膵臓、脾臓、乳、膀胱、胎盤、睾丸、腎臓及び心臓：クローンテック社製）の各々から単離したポリＡ ＲＮＡ（０．２μｇ）を、ジエチルピロカーボネート処理された水の８μl中で３’-アンカード・オリゴｄＴプライマーＧ（Ｔ）１５ＭＡ（ＭはＧ、Ａ及びＣの混合液である）の２５pmolと混合し、６５℃で５分間加熱した。この溶液に４μｌの５×ファースト・ストランド緩衝液（ＢＲＬ社製）、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ（ＢＲＬ社製）、１μlの２５０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ＢＲＬ社製）、１μｌのリボヌクレアーゼ・インヒビター（４０単位；ＴＯＹＯＢＯ社製）及び１μｌのスーパースクリプトII逆転写酵素（２００単位；ＢＲＬ社製）を加えた。各反応液の最終容量は２０μｌであった。各溶液を３７℃で１時間培養した後、３０μｌの蒸留した水の付加により２．５倍までに希釈し、使用時まで−２０℃で貯蔵した。
【００６４】
ｃＤＮＡは、〔α-33Ｐ〕ＡＴＰで標識した（アマシャム社製）３’−アンカード・プライマーの存在下でＰＣＲによって増幅した。このｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、以下のとおり実施された。即ち、各２０μｌのＰＣＲ混合液は、２μｌのＲＴ反応混合液、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（タカラ社製）、４μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．２５μｌのＥx Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／ｍｌ：タカラ社製）、〔α-33Ｐ〕ＡＴＰで標識した２５pmolの３’−アンカード・オリゴ−ｄＴプライマー及び２５pmolの５’−プライマー（No．２０、５’−ＧＡＴＣＴＧＡＣＡＣ−３’の任意配列を有する１０−ｍｅｒデオキシオリゴヌクレオチド・プライマー）を含んでいた。また、ＰＣＲ反応は以下の条件で行なった。即ち、９５℃で３分間、４０℃で５分間及び７２℃で５分間を１サイクルとして行ない、それから９５℃で０．５分間、４０℃で２分間及び７２℃で１分間を４０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間反応させた。
【００６５】
ＰＣＲ反応サンプルをエタノールで抽出し、フォルムアミド・シークエンシング染料中に再懸濁して、６％アクリルアミド７．５Ｍウレア・シークエンシング・ゲル上で反応させた。ゲルは固定することなしに乾燥させ、一晩オートラジオグラフィーを実施した。
【００６６】
(1-2)  増幅されたｃＤＮＡ断片のサブ・クローニング
予め乾燥ゲルを載せた３ＭＭ濾紙上にラジオアクティブインクで印を付けておき、これとオートラジオグラムをあわせることにより、目的のｃＤＮＡを含むバンドが含まれるゲルを、３ＭＭ濾紙ごと切り出した後、３００μｌのｄＨ2Ｏにて１時間撹袢した。ポリアクリルアミド・ゲルと濾紙を取り除いた後、ｃＤＮＡを担体として１μｌの１０ｍｇ／ｍｌグリコーゲンと０．３Ｍ ＮａＯＡｃの存在下、エタノール沈澱によって再回収し、１０μｌのｄＨ2Ｏに再溶解した。再増幅のために、５μｌのこの溶液が用いられた。ＰＣＲの条件とプライマーは最初のＰＣＲに対してと同じであった。適当な大きさの再増幅産物を第一のＰＣＲ産物として再回収し、それからそのＰＣＲ産物をPuc118ベクター(タカラ社製)のHinc II部位にクローンニングした。核酸配列はＡＢＩ３７７自動シークエンサー（アプライド・バイオ・システムズ社製）によって決定した。
【００６７】
上記方法にて、１３のヒト組織から単離したｍＲＮＡを用いて異なる表出パターンを比較した結果、膵臓に特異的に発現した一つのＰＣＲ産物を確認した。これをＴＳＡ３０５と命名した。
【００６８】
この産物は、３７１ヌクレオチドからなっていた。ＦＡＳＴＡプログラム(Person W. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 2444-2448 (1988))を使用するＧｅｎＢａｎｃｋ／ＥＭＢＬデータ・ベース中のＤＮＡ配列とこのヌクレオチド・データとの比較より、このＰＣＲ産物が他の如何なる公知のＤＮＡ配列と相同性がないことが明らかとなった。
【００６９】
(1-3)  ｃＤＮＡのスクリーニング
ヒト正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーは、オリゴ（dT）＋ランダムヘキサマー−プライムド・ヒト正常膵臓ｃＤＮＡとＵｎｉ-ＺＡＰTM ＸＲ(ストラタジーン社製)を用いて、構築した。１×１０6個のクローンの全体を上記方法によって単離し、〔α−32Ｐ〕−ｄＣＴＰにて標識されたｃＤＮＡ断片を用いてそのスクリーニングを行なった。陽性クローンを選択し、それらの挿入ｃＤＮＡ部をpBluescript II SK(-)中のイン・ビボに切り出した。
【００７０】
その結果、本発明者らは、ＴＳＡ３０５に対して約１００のプラークを確認した。この結果より、全ＲＮＡ間の転写量は、およそ０．０１％であると計算された。ＴＳＡ３０５に相同する集合したｃＤＮＡ配列（ＴＳＡ３０５）は、計算された分子量８８７６８Ｄａを有する７９４アミノ酸の蛋白をコードする２３８２ヌクレオチドのオープン・リーディング・フレームを含む７８８５ヌクレオチドを含んでいた。
【００７１】
一次配列からこの遺伝子の産物（ＴＳＡ３０５蛋白）は、フィブロネクチンＴｙｐｅIIコラーゲン結合ドメインを含む蛋白であることが明らかとなった。
【００７２】
その染色体上の位置は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の原因遺伝子が存在するとされる第１４染色体ｑ２４．３−ｑ３１．１であった。
【００７３】
また、本発明遺伝子ＴＳＡ３０５は、線虫のｓｅｌ−１と高いホモロジーを有していた。
【００７４】
(2)  組織における発現
組織におけるＴＳＡ３０５の発現プロファイルを調べるため、各種のヒト組織を用いたノーザンブロット分析を行った。
【００７５】
ノーザン・ブロツト分析には、ヒトＭＴＮ（Multiple-Tissue Northern）ブロットＩとII（クローンテック社製）を使用した。ｃＤＮＡ断片は、Ｔ３とＴ７プロモーター配列のプライマー・セットを用い、ＰＣＲによって〔α−32Ｐ〕−ｄＣＴＰで標識した。増幅産物を含むメンブランをプレハイブリダイズ（条件は製品のプロトコールに従った）し、そしてそれから製品のプロトコールに従い、ハイブリダイゼーションを行なった。
【００７６】
ハイブリダイゼーション後、洗浄した膜を−８０℃で２４時間オートラジオグラフに露光した。その結果は図１に示すとおりである。
【００７７】
該図において、用いたヒト組織は、心臓（Heart）、脳（brain）、睾丸（Placenta）、肺（Lung）、肝臓（Liver）、骨格筋（Skeletal muscle）、腎臓（Kidney）、膵臓（Pancreas）、脾臓（Spleen）、胸腺（Thymus）、膀胱（Prostate）、胎盤（Testis）、卵巣（Ovary）、小腸（Small intestine）、結腸（Colon）及び末梢血白血球（Peripheral blood leukocyte）である。
【００７８】
該図より、ＴＳＡ３０５に相同する転写体が膵臓（Pancreas）において特異的に観察された。
【００７９】
(3)  ＦＩＳＨ
染色体の整列のためのＦＩＳＨは、公知の方法(Takahashi E., et al., Hum. Genet., 86, 14-16 (1990))に従って、各コスミドＤＮＡの０．５μｇをプローブとして使用して実施した。ＦＩＳＨはプロビア１００フィルム（フジ社製、ＩＳＯ１００）又はＣＣＤカメラ・システム（アプライド・イメージング、サイトビジョン社製）によって捕えられた。
【００８０】
その結果、１００の典型的なＲ−バンド(前)分裂中期の細胞を試験したシグナルは、第１４染色体のバンドｑ２４．３−ｑ３１．１に局在していた。従って、ＴＳＡ３０５染色体の局在部位は、１４ｑ２４．３−ｑ３１．１と同定できた。
【００８１】
(4)  ＲＴ−ＰＣＲ分析による膵臓癌細胞株と膵臓癌組織における転写物の発現
ＴＳＡ３０５遺伝子の発現がヒト膵臓癌細胞株と膵臓癌組織において変異するかどうかを調べるために、４つの細胞株（Ａｓｐｃ１（転移性腺癌, J. Natl. Cancer Inst., 67, 563-569 (1981)），Ｂｘｐｃ３（腺癌・未分化, Cancer Invest., 4, 15-23 (1986)），ＭｉａＰａｃａ２（腺癌, Int. J. Cancer, 19, 128-135 (1977)）及びＰＡＮＣ１（類上皮性、膵管癌, Int. J. Cancer, 15, 741-747 (1975)）と９の膵臓の癌組織（東京大学医科研究所、中村先生より供与）のＲＴ−ＰＣＲ分析を行なった。
【００８２】
即ち、全ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（和光社製）を使用して細胞株と膵臓癌組織から単離した１０μｌの全ＲＮＡを１０単位のＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉ（ベーリンガー・マインハイム社製）で１５分間処理し、フェノール−クロロフォルムで２回抽出し、エタノールで沈澱させた。一本鎖ｃＤＮＡをオリゴｄ（Ｔ）とランダムプライマーを使用してSuperscript ITM ＲＮａｓｅＨ-逆転写酵素（ライフ・テクノロジー社製）によって合成した。２μｌの各産物をＰＣＲ増幅のために用いた。
【００８３】
配列番号：４及び配列番号：５として示す塩基配列のプライマーＰ１及びＰ２Ｓを、２５サイクルのＰＣＲ増幅のために使用した。
【００８４】
尚、ＰＣＲ反応は２５ｎｇｃＤＮＡ、１０μＭ各プライマー、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ及び０．２５ＵのＥｘｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）を含む２０μｌ溶液中で行なった。ＰＣＲ産物は、エチジウム・ブロマイト染色した１．５％アガロースゲル中に溶解させた。
【００８５】
上記に従い、４種の細胞株（レーン１＝Ａｓｐｃ１，レーン２＝Ｂｘｐｃ３，レーン３＝ＭｉａＰａｃａ２，レーン４＝ＰＡＮＣ１）と正常膵臓組織（NormalPancreas、レーン５）をＲＴ−ＰＣＲ分析した結果は、図２に示す通りである。尚、図の上段はＴＳＡ３０５の結果を、下段はコントロールとしてのβ2−ミクログロブリン（β2−microglobulin）の結果を示す。
【００８６】
該図より、ＴＳＡ３０５発現は、全ての癌組織においては見当らず、正常膵臓組織（レーン５参照）にのみ認められることが判った。
【００８７】
(5)  膵癌におけるＴＳＡ３０５遺伝子の発現（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＴＳＡ３０５遺伝子の発現を、膵癌患者サンプル（１Ｔ、２Ｔ、３Ｔ、５Ｔ、６Ｔ、７Ｔ、１０Ｔ及び１１Ｔ）、膵癌(Tumor Pancreas)及び正常膵（Invitrogen; Human Normal Pancreas）並びに同一患者膵臓の癌部（２３Ｔ）及び非癌部（２３Ｎ）について、ＲＴ−ＰＣＲ法により検出した。即ち、各サンプルよりｍＲＮＡを抽出し、ＴＳＡ３０５の１５８１−２３８２ｂｐ（８０１塩基対）をＲＴ−ＰＣＲにて増幅させ、発現の有無を検出した。濃度コントロールとしてβ2−ミクログロブリン（microglobulin）を用いた。結果を図３に示す。
【００８８】
該図より、正常膵臓の発現に比べて、膵臓癌サンプル全例においてＴＳＡ３０５遺伝子の発現の低下或いは欠損が観察された。
【００８９】
【配列表】
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【００９０】
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0004058567.tif 000004
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の(2)に従うノーザンブロット分析により調べた本発明遺伝子のヒト組織における分布を示す図面代用写真である。
【図２】実施例１の(4)に従う、正常膵臓細胞（ノーマル，Normal）、４種の細胞株（Cell line）をＲＴ−ＰＣＲ分析した結果を示す図面代用写真であり、上段はＴＳＡ３０５の結果を、下段はコントロールとしてのβ2−ミクログロブリンの結果を示す。
【図３】実施例１の(5)に従う、膵癌サンプルその他をＲＴ−ＰＣＲ分析した結果を示す図面代用写真であり、上段はＴＳＡ３０５の結果を、下段はコントロールとしてのβ2−ミクログロブリンの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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