(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  溶質を含んだ第１の溶液と、少なくとも１種の疎水性モノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーとを接触させ、これによって溶質を前記ポリマーに吸着させる工程、ここで前記疎水性モノマーが、フェニル基、フェニレン基、または直鎖もしくは枝分かれ鎖のＣ2〜Ｃ18−アルキル基を含む；および
（ｂ）  前記ポリマーを溶媒もしくは混合溶媒で洗浄し、これによってポリマーから溶質を脱着させ、溶質の第２の溶液を形成させる工程、このとき前記第２の溶液は定量分析に適している；
を含む、定量分析に適した溶質の溶液を形成させる方法であって、該ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーを含む、前記の方法。
【請求項２】
前記第１の溶液が、水、水溶液、または水と１種以上の極性有機溶媒との混合物を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記溶媒が、極性の水混和性有機溶媒または極性の水混和性溶媒と水との混合物である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記溶媒が、アセトン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、およびイソプロパノールからなる群から選ばれる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記溶媒が水不混和性の有機溶媒である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記溶媒が、ジエチルエーテル、酢酸エチル、クロロホルム、およびジクロロメタンからなる群から選ばれる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記疎水性モノマーがジビニルベンゼンである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーがポリ（ジビニルベンゼン−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマーが15モル％〜30モル％のＮ−ビニルピロリドンを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
極性有機溶質と前記極性有機溶質より極性の低い１種以上の追加溶質とを含んだ水溶液と、少なくとも１種の疎水性モノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーとを接触させ、これによって前記追加溶質がポリマーに吸着され、前記極性有機溶質が溶液中に残留する、という工程を含む、
定量分析に適した極性有機化合物の溶液を形成させる方法であって、該疎水性モノマーが、フェニル基、フェニレン基、または直鎖もしくは枝分かれ鎖のＣ2〜Ｃ18−アルキル基を含み、該ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーを含む、前記の方法。
【請求項１１】
前記疎水性モノマーがジビニルベンゼンである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーがポリ（ジビニルベンゼン−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーである、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマーが15モル％〜30モル％のＮ−ビニルピロリドンを含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種の疎水性モノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーを、端部がオープンの容器中に充填した状態にて含む、抽出に適したマイクロタイターウェルプレートであって、該水湿潤性ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーと、７０〜８８モル％の少なくとも１種の疎水性モノマーとを含み、該疎水性モノマーがスチレン、エチルビニルベンゼン及びジビニルベンゼンよりなる群から選択される、前記のマイクロタイターウェブプレート。
【請求項１５】
Ｎ−ビニルピロリドンモノマーと、少なくとも１種の疎水性モノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーと溶液とを接触させ、これによって溶液中の溶質をポリマーに吸着させる工程を含む、溶液から１種以上の溶質を除去する方法であって、
該水湿潤性ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーと、７０〜８８モル％の少なくとも１種の疎水性モノマーとを含み、該疎水性モノマーがスチレン、エチルビニルベンゼン及びジビニルベンゼンよりなる群から選択され、
該ポリマーはより極性の高い溶質よりもより極性の低い溶質をより強く吸着することができ、そして該溶質は極性が低下していく順序の一連の溶媒でポリマーを洗浄することによって、極性が低くなっていく順序にてポリマーから脱着できる、前記の方法。
【請求項１６】
（ａ）  溶質と第１の溶媒又は第１の混合溶媒とを含んだ第１の溶液と、少なくとも１種の疎水性モノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーとを接触させ、これによって溶質を前記ポリマーに吸着させる工程、ここで該水湿潤性ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーと、７０〜８８モル％の少なくとも１種の疎水性モノマーとを含み、該疎水性モノマーがスチレン、エチルビニルベンゼン及びジビニルベンゼンよりなる群から選択され；および
（ｂ）  前記ポリマーを、第１の溶媒又は第１の混合溶媒よりも極性の低い第２の溶媒又は第２の混合溶媒で洗浄し、これによってポリマーから溶質を脱着させ、溶質の第２の溶液を形成させる工程、このとき前記第２の溶液は定量分析に適している；
を含む、定量分析に適した溶質の溶液を形成させる方法。
【請求項１７】
極性有機溶質と前記極性有機溶質より極性の低い１種以上の追加溶質とを含んだ水溶液と、少なくとも１種の疎水性モノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーとを接触させ、これによって前記追加溶質がポリマーに吸着され、前記極性有機溶質が溶液中に残留する、という工程を含み、
該水湿潤性ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーと、７０〜８８モル％の少なくとも１種の疎水性モノマーとを含み、該疎水性モノマーがスチレン、エチルビニルベンゼン及びジビニルベンゼンよりなる群から選択される、
定量分析に適した極性有機化合物の溶液を形成させる方法。
【請求項１８】
少なくとも１種の疎水性モノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーを、端部がオープンの容器中に充填した状態にて含む、抽出に適したマイクロタイターウェルプレートであって、
該水湿潤性ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーと、７０〜８８モル％の少なくとも１種の疎水性モノマーとを含み、該疎水性モノマーがスチレン、エチルビニルベンゼン及びジビニルベンゼンよりなる群から選択され、該ポリマーはより極性の高い溶質よりもより極性の低い溶質をより強く吸着することができ、そして該溶質は極性が低下していく順序の一連の溶媒でポリマーを洗浄することによって、極性が低くなっていく順序にてポリマーから脱着できる、前記のマイクロタイターウェルプレート。
【請求項１９】
該疎水性モノマーがダウ社製ＤＶＢ  ＨＰ−８０である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
該疎水性モノマーがダウ社製ＤＶＢ  ＨＰ−８０である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）  溶質を含んだ第１の溶液と、少なくとも１種の、ジビニルベンゼンを含む疎水性モノマーと、Ｎ−ビニルピロリドンモノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーとを接触させ、これによって溶質を前記ポリマーに吸着させる工程；および
（ｂ）  前記ポリマーを溶媒もしくは混合溶媒で洗浄し、これによってポリマーから溶質を脱着させ、溶質の第２の溶液を形成させる工程、このとき前記第２の溶液は定量分析に適している；
を含む、定量分析に適した溶質の溶液を形成させる方法であって、該ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーを含む、前記の方法。
【請求項２２】
極性有機溶質と前記極性有機溶質より極性の低い１種以上の追加溶質とを含んだ水溶液と、少なくとも１種の疎水性モノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーとを接触させ、これによって前記追加溶質がポリマーに吸着され、前記極性有機溶質が溶液中に残留する、という工程を含む、
定量分析に適した極性有機化合物の溶液を形成させる方法であって、該疎水性モノマーがジビニルベンゼンを含み、該ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーを含む、前記の方法。
【請求項２３】
少なくとも１種の疎水性モノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーを、端部がオープンの容器中に充填した状態にて含む、抽出に適したマイクロタイターウェルプレートであって、該水湿潤性ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーと、７０〜８８モル％の少なくとも１種の疎水性モノマーからなり、該疎水性モノマーがジビニルベンゼンを含む、前記のマイクロタイターウェブプレート。
【請求項２４】
Ｎ−ビニルピロリドンモノマーと、少なくとも１種の疎水性モノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーと溶液とを接触させ、これによって溶液中の溶質をポリマーに吸着させる工程を含む、溶液から１種以上の溶質を除去する方法であって、
該水湿潤性ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーと、７０〜８８モル％の少なくとも１種の疎水性モノマーからなり、該疎水性モノマーがジビニルベンゼンを含み、
該ポリマーはより極性の高い溶質よりもより極性の低い溶質をより強く吸着することができ、そして該溶質は極性が低下していく順序の一連の溶媒でポリマーを洗浄することによって、極性が低くなっていく順序にてポリマーから脱着できる、前記の方法。
【請求項２５】
（ａ）  溶質と第１の溶媒又は第１の混合溶媒とを含んだ第１の溶液と、少なくとも１種の疎水性モノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーとを接触させ、これによって溶質を前記ポリマーに吸着させる工程、ここで該水湿潤性ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーと、７０〜８８モル％の少なくとも１種の疎水性モノマーからなり、該疎水性モノマーがジビニルベンゼンを含む；および
（ｂ）  前記ポリマーを、第１の溶媒又は第１の混合溶媒よりも極性の低い第２の溶媒又は第２の混合溶媒で洗浄し、これによってポリマーから溶質を脱着させ、溶質の第２の溶液を形成させる工程、このとき前記第２の溶液は定量分析に適している；
を含む、定量分析に適した溶質の溶液を形成させる方法。
【請求項２６】
極性有機溶質と前記極性有機溶質より極性の低い１種以上の追加溶質とを含んだ水溶液と、少なくとも１種の疎水性モノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーとを接触させ、これによって前記追加溶質がポリマーに吸着され、前記極性有機溶質が溶液中に残留する、という工程を含み、
該水湿潤性ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーと、７０〜８８モル％の少なくとも１種の疎水性モノマーからなり、該疎水性モノマーがジビニルベンゼンを含む、
定量分析に適した極性有機化合物の溶液を形成させる方法。
【請求項２７】
少なくとも１種の疎水性モノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーを、端部がオープンの容器中に充填した状態にて含む、抽出に適したマイクロタイターウェルプレートであって、
該水湿潤性ポリマーが１２モル％〜３０モル％のＮ−ビニルピロリドンモノマーと、７０〜８８モル％の少なくとも１種の疎水性モノマーからなり、該疎水性モノマーがジビニルベンゼンを含み、該ポリマーはより極性の高い溶質よりもより極性の低い溶質をより強く吸着することができ、そして該溶質は極性が低下していく順序の一連の溶媒でポリマーを洗浄することによって、極性が低くなっていく順序にてポリマーから脱着できる、前記のマイクロタイターウェルプレート。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
固相抽出（solid phase extraction）は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による定量分析用のサンプルを調製する際にしばしば使用されるクロマトグラフィー法である（McDonald and Bouvier, eds. Solid Phase Extraction Applications Guide and Bibliography, sixth edition, Milford, MA: Waters（1995））。固相抽出は、互いに妨害しあっていると考えられるマトリックス成分から複雑な溶液中の当該成分を分離し、検体を検出・測定が可能なレベルにまで濃縮するのに使用することができる。したがって固相抽出は、例えば、固体の種々の可溶性成分が微量有機物質の分析を妨害する場合がある、というような環境サンプル（environmental samples）の分析に対して有用である。固相抽出はさらに、分析を妨害する血漿タンパク質や他のマトリックス成分をあらかじめ除去する必要のある、血漿中の医薬製剤や代謝産物の分析に対して重要である。
水溶液の固相抽出は一般に、クロマトグラフィー用吸着剤を収容している１回使用カートリッジに該溶液を通すことによって行われる。最も広く使用されている吸着剤は、表面が疎水性のオクチル（Ｃ8）官能基やオクタデシル（Ｃ18）官能基で官能化された多孔質シリカ粒子からなる。このような吸着剤は、使用前に、水混和性の極性有機溶媒で湿潤させてアルキル鎖を溶媒和させなければならない。これによってこれらの鎖と水相との接触が増し、溶質に対して、したがって溶質の保持に対して利用可能な吸着剤の表面積が増大する。予備湿潤されないか、あるいは乾燥した吸着剤は、溶質の保持が良くなく、したがって溶液成分の分離が不充分である。
抽出操作中は吸着剤が湿潤状態のままでなければならないという要件のために固相抽出が複雑となり、サンプルの分析が実質的に遅くなる。例えば、固相抽出カートリッジは一般に、異なった流量を有し、減圧マニホルド（a vacuum manifold）（複数のサンプルを処理するための現時点での技術）に対して使用するときには、乾燥を防ぐために個別にモニターしなければならない。このため、自動化された固相抽出のための機器の開発がより一層複雑となり、吸着剤の乾燥を防ぐためにしばしば複雑精巧な安全装置が組み込まれる。
したがって、有機溶媒による湿潤を必要としないか、あるいは減圧マニホルドに対して使用中に湿潤用溶媒のバルクが除去されたとしても湿潤状態のままであるような吸着剤を使用する固相抽出法が求められている。このような固相抽出法により、定量分析（特に複数サンプルに対する定量分析）のためのより速やかなサンプル調製が可能となり、また自動化固相抽出のためのより安価でより単純な方法の開発が可能となる。
発明の総括
本発明は、溶液から有機溶質を除去するための方法に関する。本発明の方法は、１種以上の疎水性モノマーと１種以上の親水性モノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマー（a water-wettable polymer）と溶液とを接触させ、これによってポリマー上に溶質を吸着させるという工程を含む。溶液は、極性溶媒（例えば、極性有機溶媒、水/有機溶媒混合物、または好ましくは水）あるいは水溶液〔例えば、水性緩衝液（aqueous buffer）、酸水溶液、塩基水溶液、または塩水溶液〕を含んでよい。
疎水性モノマーは疎水性部分を含んでよい。適切な疎水性部分としては、フェニル基、フェニレン基、およびＣ2〜Ｃ18−アルキル基があるが、これらに限定されない。適切な疎水性モノマーとしては、ジビニルベンゼンとスチレンがある。
親水性モノマーは親水性部分を含んでよい。１つの実施態様においては、親水性部分は、飽和、不飽和、または芳香族の複素環式基（例えば、ピロリドニル基やピリジル基）である。他の実施態様においては、親水性部分はエーテル基である。適切な親水性モノマーとしては、例えば、Ｎ−ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、およびエチレンオキシドなどがある。
本発明の方法の１つの実施態様においては、ポリマーは、約12モル％以上のＮ−ビニルピロリドンを含んだポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーである。好ましい実施態様においては、コポリマーは、約15〜約30モル％のＮ−ビニルピロリドンを含む。
本発明はさらに、定量分析に適した、溶質を含有する溶液を形成させる方法を提供する。１つの実施態様においては、本発明の方法は、少なくとも１種の疎水性モノマーと少なくとも１種の親水性モノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーと、溶質を含んだ第１の溶液とを接触させ、これによってポリマー上に溶質を吸着させるという工程を含む。次いで、溶質がポリマーから脱着されるようポリマーを適切な溶媒または混合溶媒で洗浄し、これによって溶質を含んだ第２の溶液が形成される。この第２の溶液が定量分析に適している。
他の実施態様においては、本発明は、定量分析に適した、極性有機溶質を含有する溶液を形成させる方法を提供する。本発明の方法は、極性有機溶質とより極性の低い少なくとも１種の追加の溶質とを含んだ溶液と、少なくとも１種の疎水性モノマーと少なくとも１種の親水性モノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーとを接触させ、これによって追加の溶質をポリマー上に吸着させ、極性溶質を水相中に残存させる、という工程を含む。したがって、このようにして得られる水相は、定量分析に適した、極性有機溶質を含有する溶液である。
本発明はさらに、端部がオープンの容器と該容器中に充填されたポリマーを含んだ固相抽出カートリッジを含む。本発明の固相抽出カートリッジは、必要に応じて多孔質の保持手段（例えば溶融ガラス）を含んでもよい。ポリマーは、少なくとも１種の疎水性モノマーと少なくとも１種の親水性モノマーとを共重合させることによって形成される。適切なポリマーとしては、約12モル％以上（好ましくは約15モル％〜約30モル％）のＮ−ビニルピロリドンを含有するポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーがある。固相抽出カートリッジは、約0.225ｇ〜約１ｇのポリマーを含むのが好ましい。
本発明は、あらかじめ吸着剤を有機溶媒で湿潤させることなく、水溶液からの１種以上の溶質の固相抽出を可能にする。本発明の方法は、溶質の同定に対して有用であり、種々の極性を有する広い範囲の溶質の抽出が可能となる。本発明の方法の特別の利点は、吸着剤ポリマーがその溶質保持能力を低下させることなく、抽出工程中において吸着剤が乾燥していてもよいということである。したがって本発明は、分析用サンプルを調製するためのより単純な方法を提供し、これによってサンプルの調製時間が短縮され、サンプルの処理量が増大する。本発明の方法はさらに、現在使用されている方法より自動化しやすい。
【図面の簡単な説明】
図面は、本発明の固相抽出カートリッジの１つの実施態様を示している概略断面図である。
発明の詳細な説明
本発明は、固相抽出プロセスの前およびプロセス時に吸着剤を過剰の有機溶媒で湿潤させることを必要としない、水溶液または緩衝剤入り水溶液（buffered aqueous solutions）を固相抽出するための方法を提供する。本発明は、親水性モノマーと疎水性モノマーを適切な比にて含んだポリマーまたは樹脂を、広い範囲のクロマトグラフィー極性を有する有機溶質の驚くほど効果的な保持を維持しつつ、水によって湿潤させることができるという発見に基づいている。
実施例に示されているように、ポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマー中のＮ−ビニルピロリドンを比較的少量増大させても、予備湿潤されたポリマーが減圧にて数分間乾燥された条件下において極性有機溶質の保持が大幅に改良された。例えば、これらの条件下では、９モル％のＮ−ビニルピロリドンを含んだこのようなコポリマーによるアセトアミノフェンの回収は10.4％であった。コポリマー中のＮ−ビニルピロリドン13モル％に増大させると、アセトアミノフェンの回収は92％となった。プロカインアミド、ラニチジン（ranitidine）、およびカフェインに対しても類似の結果が観察された。比較的無極性の溶質の場合、これら２種のコポリマー間の回収量の差はそれほど大きくはなかった。
さらに、13モル％〜22モル％のＮ−ビニルピロリドンを含んだポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーが有機溶質を保持する能力を、オクタデシル（Ｃ18）−結合シリカゲルの保持能力と比較した。実施例において説明されているように、Ｃ18−結合シリカ吸着剤は、有機溶媒で予備湿潤し、次いで抽出前に減圧にて乾燥したときに、極性有機溶質の保持は良くなかった。例えば、この吸着剤は、これらの条件下においてｍ−トルイジンの回収率は2.8％であった。これとは対照的に、13モル％のＮ−ビニルピロリドンを含んだポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーでは、類似の条件下におけるｍ−トルイジンの回収率は96.3％であった。水湿潤性と有機溶質の保持という相反する性質の間のバランスは、親水性モノマーと疎水性モノマーの適切な比を有するコポリマーにおいて達成できる、ということをこれらの結果は全体として示している。
１つの実施態様においては、本発明は溶液から溶質を除去する方法である。本発明の方法は、少なくとも１種の疎水性モノマーと少なくとも１種の親水性モノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーと溶液とを接触させ、これによってポリマー上に溶質を吸着させるという工程を含む。溶液は、水、または水と水混和性の極性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、またはアセトニトリル）との混合物を含んでもよい。溶液はさらに、水もしくは水性緩衝液と極性の水混和性有機溶媒との混合物を含んでもよい。特に好ましい実施態様においては、溶液は、酸性、塩基性、もしくは中性の水溶液、あるいは主として水性の、すなわち約50容量％以上の水を含有する溶液である。溶質は有機化合物であるのが好ましい。
溶液は、ポリマーと溶液との密な接触を可能にするいかなる仕方（例えば、バツチプロセスまたはクロマトグラフィープロセス）でポリマーと接触させてもよい。例えば、溶液は、多孔質のポリマーカラム、ポリマーディスク、またポリマープラグに強制的に通してもよいし、あるいは溶液をポリマーと共に攪拌（例えばバッチ攪拌反応器において）してもよい。溶液はさらに、マイクロタイタープレート（microtiter plate）のポリマー含有ウェル（polymer-containing well）に加えてもよい。ポリマーは、例えば、ビーズやペレットの形態をとってもよい。溶液は、当該溶質がポリマー上に吸着するのに充分な時間にわたってポリマーと接触させる。この時間は通常、溶質がポリマー表面と溶液との間で平衡になるのに必要な時間である。ポリマー上への溶質の吸着または分配（partition）は、部分的であっても全体的であってもよい。
本発明の方法に使用するための好ましいポリマーは水湿潤性であり、種々の極性を有する多種の溶質を保持する能力を有する。本明細書で使用している“水湿潤性”物質とは、水によって部分的あるいは全面的に溶媒和される物質を表わしている。したがってこのような物質は、エネルギー的に好ましいか又は有利な水分子との相互作用を起こす。これらの相互作用により、水と接触したときに、水分子にとって、したがって水溶液中に存在する溶質にとって利用可能な物質の表面積の量が増大する。
本明細書で使用している“モノマー”とは、１つ以上の重合可能な官能基を含んだ重合前の分子、およびポリマーの反復構造単位を表わす。ポリマーは２種以上の異なったモノマーを含んでもよく、この場合はコポリマーとも呼ばれる。コポリマーが含んでいるあるモノマーの“モル％”とは、コポリマーを構成している種々の（２種以上の）モノマーの総モル数に対する当該モノマーのモル分率（％で表示）である。
本発明の方法の１つの実施態様においては、溶液を乾燥形態のポリマーと接触させる。他の実施態様においては、溶液をポリマーと接触させる前に、例えばポリマーを極性有機溶媒で、次いで水または水性緩衝液で処理することによってポリマーを湿潤させる。
親水性モノマーは親水性基を含んでよい。１つの実施態様においては、親水性基は複素環基（例えば、飽和、不飽和、または芳香族複素環基）である。適切な例としては、ピロリドニル基やピリジル基等の窒素含有複素環基がある。他の実施態様においては、親水性部分がエーテル基である。親水性モノマーとしては、例えば、Ｎ−ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、疎水性部分（a hydrophobic moiety）、４−ビニルピリジン、またはエチレンオキシドなどがある。
親水性モノマーは、例えば、炭素環式基（フェニル基やフェニレン基など）またはアルキル基（直鎖もしくは枝分かれ鎖のＣ2〜Ｃ18−アルキル基など）を含んでもよい。適切な疎水性モノマーとしてはスチレンやジビニルベンゼンがあるが、これらに限定されない。
好ましい実施態様においては、溶液と接触させようとするポリマーはポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーである。ポリマーは約12モル％以上のＮ−ビニルピロリドンを含んでよい。特に好ましい実施態様においては、ポリマーは約15〜約30モル％のＮ−ビニルピロリドンを含む。
ポリマーは、例えば約５〜約500_m（好ましくは約20〜約200_m）の範囲の直径を有するビーズの形態をとってもよい。本発明のコポリマーは、約200〜約800m2/ｇの範囲の比表面積、および約0.5〜約100nmの範囲の直径の孔を有するのが好ましい。
溶質を含んだ溶液は、必要に応じて１種以上のさらなる溶質を含有してもよい。１つの実施態様においては、溶液は複数種の溶質を含む水溶液である。このタイプの溶液としては、血漿、尿、髄液、滑液、および組織（例えば、肝臓組織、筋組織、脳組織、および心臓組織）の抽出物を含めた他の生物学的液体などがある。このような抽出物は、乾燥し、そして引き続き水中または水／有機溶媒混合物中にて元に戻した水性抽出物または有機抽出物であってもよい。
溶液はさらに、地下水、地表水、飲料水、あるいは環境サンプル（例えば土壌サンプル）の水性抽出物もしくは有機抽出物であってもよい。溶液はさらに、食品物質（例えば、フルーツジュースもしくは野菜ジュースまたは牛乳）であっても、あるいは食品物質（例えば、フルーツ、野菜、穀物、または食肉）の水性抽出物または水性／有機抽出物であってもよい。
溶質は、ポリマーへの吸着に適した極性を有するいかなる有機化合物であってもよい。このような溶質としては、例えば、薬物、殺虫剤、除草剤、トキシン、および化石燃料の燃焼もしくは他の産業活動から生じる環境汚染物（例えば、水銀、鉛、またはカドミウム等の重金属を含んだ金属含有化合物）などがある。溶質はさらに、上記物質の代謝産物もしくは分解生成物であってもよい。溶質はさらに、タンパク質、ペプチド、ホルモン、ポリヌクレオチド、ビタミン、補助因子、代謝産物、脂質、および炭水化物等の生体分子を含んでもよい。
本発明の方法の１つの実施態様においては、端部がオープンの容器中にポリマーを粒子として充填して、固相抽出カートリッジを形成させる。容器は、例えば、溶液が一方の端部から容器に入り、容器中でポリマーと接触し、そして他方の端部から容器を出ていくよう、両端がオープンの円柱形容器もしくはカラムであってよい。ポリマーは容器中に小さな粒子〔例えば、約５_m〜約500_m（好ましくは約20_m〜約200_m）の直径を有するビーズ〕として充填することができる。ポリマー粒子はさらに、多孔質膜をからませた容器中に充填することもできる。
容器は、抽出プロセスの時間枠内において、工程で使用する溶液と溶媒に対して相容性のあるいかなる材料で造られていてもよい。このような材料としては、ガラスや種々のプラスチック（例えば、高密度ポリエチレンやポリプロピレン）などがある。１つの実施態様においては、容器は、その長さの大部分にわたって円柱状であり、一方の端部の先端が細くなっている。このような容器の１つの例はシリンジバレルである。
固相抽出カートリッジは、ポリマーをカートリッジ中に保持するために、そして溶液がカートリッジ中に流入するときに、カートリッジへの溶液の出入りを可能にしつつ不溶固体物質を溶液から除去するために、ポリマーに隣接したカートリッジの一端または両端に多孔質保持手段（例えば、フィルターエレメントまたはフリット）をさらに含んでもよい。このようなフィルターは、例えば、溶融ガラスまたは多孔質ポリマー（例えば多孔質高密度ポリエチレン）から造り上げることができる。
容器中のポリマーの量は容器の体積によって限定され、約0.001ｇ〜約50ｇの範囲であるが、好ましくは約0.025ｇ〜約１ｇである。ある抽出に対して適切なポリマーの量は、吸着させようとする溶質の量、ポリマーの有効表面積、および溶質とポリマーとの間の相互作用の強さによって決まる。この量は、当業者であれば容易に決定することができる。
本発明は上記のような固相抽出カートリッジを含み、このときポリマーは、少なくとも１種の疎水性モノマーと少なくとも１種の親水性モノマーとを共重合させることによって形成される水湿潤性ポリマーである。ポリマーは、例えば、約12モル％以上のＮ−ビニルピロリドンを含むポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーであってよい。好ましい実施態様においては、コポリマーは、約15モル％〜約30モル％のＮ−ビニルピロリドンを含む。カートリッジは、単一サンプルの処理にて使用してから廃棄するという一回使用カートリッジであっても、あるいは複数のサンプルを処理するのに使用できるようなカートリッジであってもよい。
本発明の固相抽出カートリッジの好ましい実施態様が図面の断面にて示されている。容器１は成形ポリプロピレンで造り上げることのできるシリンジバレルであり、約１cm3〜約50cm3の範囲の体積を有することができる。水湿潤性ポリマー２は、Ｎ−ビニルピロリドンとジビニルベンゼンとの共重合によって製造され、約12モル％〜約30モル％のＮ−ビニルピロリドンを含有する。ポリマー２は、容器中に、約20_m〜約200_mの直径を有する多孔質ビーズとして充填される。容器中に充填されるポリマー２の重量は、容器の体積に応じて約0.025ｇ〜約10ｇの範囲であってよい。フリット３とフリット４は、多孔質の高密度ポリエチレンで形成されている。
処理しようとする溶液を固相抽出カートリッジの上部に加え、カートリッジに自然流の状態で流し、吸着させようとする溶質をポリマーと接触させる。溶液は、重力にしたがってカートリッジを流れることができる。カートリッジの両端間に圧力差をつけることによって流量の増大を達成することができる。このような圧力差は、カートリッジの下端に減圧源を取り付けることによって、カートリッジの上端に正圧を加えることによって〔例えば、カートリッジの上部に加圧ガス（例えば、空気や窒素）を加えることにより〕、あるいはポリマーより上のカートリッジ内の空気をピストンまたはプランジャーで圧縮することによって造り出すことができる。カートリッジを通る溶液の流量は、カートリッジ両端の圧力差を調節することによって変えることができる。適切な溶液流量（溶液の線速度で表示）は最高約14mm/秒であるが、好ましいのは約0.7〜約3.5mm/秒である。
本発明の他の態様は、定量分析に適した溶質の溶液を形成させる方法である。１つの実施態様においては、溶質はポリマーへの吸着に適した極性を有する。本発明の方法は、少なくとも１種の疎水性モノマーと少なくとも１種の親水性モノマーとを共重合させることによって形成されるポリマーと、溶質を含んだ第１の溶液とを接触させ、これによって溶質をポリマー上に吸着させるという工程を含む。次いでポリマーを適切で強力な溶媒もしくは混合溶媒で洗浄し、これによってポリマーから溶質を脱着または溶離させ、溶質を含有する第２の溶液を形成させる。この第２の溶液は、溶質の定量分析に適している。
ポリマーと接触させる溶液は、当該溶液を希薄状態にて（例えば、正確な定量化を行うには低すぎる濃度にて）含んでいてもよい。溶質をポリマー上に吸着させ、次いで実質的により少ない体積のより極性の低い溶媒を使用して溶質を脱着させることによって、最初の溶液の濃度より実質的により高い濃度の、当該溶質を含んだ溶液を調製することができる。本発明の方法はさらに結果として溶媒交換を行っていることになる。すなわち、最初の溶液から溶質が除去され、そして第２の溶媒中に再び溶解される。
ポリマーは、溶液との接触の前に予備処理または湿潤の必要がない。１つの実施態様においては、ポリマーを水混和性の有機溶媒で処理し、次いで水または水性緩衝液で処理してから、溶液をポリマーと接触させる。他の実施態様においては、溶液を乾燥ポリマーと接触させる。すなわち、溶液の処理の前にポリマーが湿潤されていない。
ポリマーと接触させる溶液は極性溶媒を含んでいてもよく、極性溶媒を主として含んだ（すなわち、50容量％以上含んだ）酸性、塩基性、または中性の水溶液もしくは水性緩衝液であるのが好ましい。溶液はさらに、水混和性の極性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、またはジメチルスルホキシド）またはこのような溶媒と水との混合物を含んでいてもよい。
当該溶質を含んでいる溶液はさらに、１種以上の追加の溶質を含んでもよい。１つの実施態様においては、追加の溶質は当該溶質より極性が高く、したがって当該溶質よりポリマーに対する吸着の程度が弱い。このような追加溶質は、当該化合物を脱着させないような溶媒でポリマーを洗浄することによってポリマーから脱着させることができ、これによって当該溶質を実質的に含まない追加溶質の溶液を形成させることができる。追加溶質の脱着に適した溶媒は通常、かなり極性が高いので当該化合物を脱着させない。
追加溶質を脱着させた後に、ポリマーを適切な（すなわち、より極性の低い）溶媒で洗浄することによって当該化合物を脱着させることができる。これによって、より極性の高い溶質を実質的に含有しない、有機溶質の定量分析に適した有機溶質溶液が形成される。
１つの実施態様においては、当該溶質がポリマーに吸着するが、これに対して１種以上の追加溶質はポリマーに吸着しない。このような追加溶質は、例えば極性がかなり高いのでポリマーに吸着しない。追加溶質はさらに、大きな分子、例えばタンパク質のような巨大分子（ポリマー中の孔を通過することができず、したがってポリマー表面積全体のわずかなフラクションにだけ接近する）を含んでもよい。このような分子は一般に、ポリマーによって保持されるとしてもごくわずかである。
さらに他の実施態様においては、追加溶質は当該溶質より極性が低く、したがって当該化合物より強くポリマーに吸着する。当該化合物は、適度に弱く吸着されるか又は全く吸着されない。吸着される場合、当該溶質は、追加溶質を脱着させない極性をもつ溶媒でポリマーを洗浄することによって、ポリマーから脱着される。したがって、他の溶質を脱着させることなく当該化合物をポリマーから脱着させることができる。
１つの実施態様においては、追加溶質が当該検体ともなる。したがって、溶液中に最初に存在している一連の溶質を分離することができ、本発明の方法を使用して、定量分析に適したそれぞれの溶液を形成させることができる。この場合は、溶質がポリマーに吸着するように、溶液をポリマーと接触させる。次いで、極性が低下していて順序の一連の溶媒でポリマーを洗浄することによって、極性が低くなっていく順序にて（すなわち、殆どの極性溶質が最初に、次いで順に極性の低い溶質が）溶質をポリマーから脱着させる。
本発明の方法に適したポリマー、溶液、および溶質としては前記したものが含まれる。ポリマーから溶質を脱着させるのに適した溶媒は一般に、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、およびイソプロパノール等）、アセトニトリル、アセトン、およびテトラヒドロフラン等の極性の水混和性有機溶媒、あるいはこれら溶媒と水との混合物である。脱着用溶媒は、無極性もしくは適度に極性の水不混和性溶媒（例えば、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、クロロホルム、または酢酸エチル）である。これら溶媒の混合物も適切である。好ましい溶媒または混合溶媒は、個々の場合に応じて決定しなければならない。当業者であれば、通常の仕方でなされるクロマトグラフィー法を利用することにより〔McDonald and Bouvier, supra,（1995）; Snyder and Kirkland, Introduction to Modern Liquid Chromatography, New York: J.Wiley and Sons（1974）〕、過度の実験を行わなくても適切な溶媒を決定することができる。
本発明の方法は、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー／質量分析法、およびイムノアッセイを含む種々の方法を介する定量分析に適した溶質の溶液を調製するのに使用することができる。
本発明の方法において使用される吸着剤ポリマーは、標準的な合成法によって製造できる。例えば、ポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーは、当業界によく知られているラジカル重合の標準的な方法を使用して、ジビニルベンゼンとＮ−ビニルピロリドンとを共重合させることによって合成できる。このタイプのコポリマーを形成させるための１つの方法が、Meitznerらによる米国特許第4,382,124号（該特許文献を本明細書に含める）に開示されている。得られるコポリマーの組成は、２種のモノマーの最初の化学量論により決まる。コポリマー生成物の組成は、モノマー間の反応性の差のために、出発物質の比率とは実質的に同じとならない場合がある。
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に且つ具体的に説明する。
例示用物質（Exemplification Materials）
モデル溶質であるプロカインアミド、アセトアミノフェン、ｍ−トルイジン、ｍ−トルアミド、プロプラノロール、カフェイン、および２，７−ジヒドロキシナフタレンは、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカル社から入手したが、ドクサピン、ラニチジン、およびベタメタゾン−17−バレラートは、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社から購入した。tＣ18結合シリカ固相抽出カートリッジは、マサチューセッツ州ミルフォードのウォーターズ・コーポレーションから入手した（カタログ番号WAT054960）。約９モル％のＮ−ビニルピロリドンを含んだポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーはウォーターズ・コーポレーションから入手した（PorpakRR）。ポリ（ジビニルベンゼン）もウォーターズから入手した（StyragelR）。
ポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーの製造
5.0ｇのヒドロキシプロピルメチルセルロース（メトセルE15，ミネソタ州ミッドランドのダウケミカル杜）を1000mlの水に溶解して得た溶液を3000mlのフラスコに加えた。175ｇのジビニルベンゼン（DVB HP-80，ダウ）、102ｇのＮ−ビニル−２−ピロリドン（インタナショナル・スペシャルティ・プロダクツ）、および1.85ｇアゾビスイソブチロニトリル（Vazo 64，デラウェア州ウィルミントンのデュポンケミカル社）を242ｇのトルエン中に溶解して得た溶液を上記混合物に加えた。こうした得られた二相混合物を室温にて30分充分に攪拌して、所望のミクロンサイズの油滴を形成させた。次いで得られた懸濁液を適度に攪拌しながら70℃に加熱し、この温度で20時間保持した。次いでこの懸濁液を室温に冷却し、濾過し、そしてメタノールで洗浄した。得られた濾過ケークを、減圧にて80℃で16時間乾燥した。ポリマー生成物の組成は元素分析によって求めた。元素分析値: Ｎ: 2.24％; Ｎ−ビニルピロリドンのモル％: 20％。
ジビニルベンゼンモノマーとＮ−ビニルピロリドンモノマーの出発比率を変えることにより、本発明の方法にしたがって約13、14、16、および22モル％のＮ−ビニルピロリドンを含む一連のポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）を製造した。
ポリマー層の入口と出口にポリエチレンフリットを要する１ccのSep-Pak VacRカートリッジ容器（ウォーターズ・コーポレーション）中に50mgの各ポリマーを充填して、固相抽出カートリッジを形成させた。
方法
20mMのリン酸塩緩衝液（pH７）に各モデル化合物を溶解して、10_g/mlの濃度を有する溶液を形成させた。
モデル溶質の固相抽出
二組の条件で状態調節した固相抽出カートリッジを使用して、モデル溶質の溶液を固相抽出にて処理した。どちらの場合も、カートリッジに減圧マニホルドを取り付け、１mlのメタノールで処理した。１ml/分のメタノール流量を得るために、減圧を約４″Hgに設定した。第１の組の条件（“湿潤条件”）では、メタノールのレベルが吸着剤の頂部に達したときに減圧を解除した。第２の組の条件（“乾燥条件”）では、メタノールでの状態調節の後に吸着剤を減圧にて乾燥した。上記のように、カートリッジを約１ml/分の流量（４″Hgの減圧下で）にて１mlのメタノールで処理した。メタノールのレベルが吸着剤の頂部に達したときに、減圧を10″Hgに設定し、これを10分保持してポリマー層を乾燥した。
湿潤と乾燥のいずれの場合も、１mlのモデル化合物溶液を１ml/分の流量にてカートリッジに加えた。次いで、１mlの20mMリン酸塩緩衝液（pH７）を１ml/分の流量にて加えた。それから１mlのメタノールを１ml/分の流量で加えて、モデル化合物を脱着・溶離させた。この溶離液に内部標準を加え、高速液体クロマトグラフィーによって溶離液中のモデル化合物を定量した。
結果
極性化合物（プロカインアミド、アセトアミノフェン、およびラニチジン）、適度に極性の化合物（カフェイン、ｍ−トルアミド、ｍ−トルイジン、２，７−ジヒドロキシナフタレン、およびプロプラノロール）、および無極性化合物（ジプロピルフタレート、ドクサピン、およびベタメタゾン−13−バレラート）について結果を要約する。吸着剤がポリ（ジビニルベンゼン）の場合、この吸着剤を湿潤条件にて状態調節すると、ドクサピンを除く全ての化合物が89％以上の回収率を示した。ドクサピンの回収率はかなり低かったが、それはこの化合物が定量分析のための溶離を起こさせるのに１ml以上のメタノールを要したからである。吸着剤を乾燥条件下で処理すると、ジプロピルフタレートとベタメタゾンバレラートだけが80％以上の収率で回収され、プロカインアミド、アセトアミノフェン、およびラニチジンの回収率は10％未満であった。
吸着剤がtＣ18−結合シリカの場合、試験した各化合物は、湿潤条件下では高収率（＞85％）で回収された。吸着剤を乾燥処理しても、ジプロピルフタレート、ドクサピン、およびベタメタゾンバレラートの回収に対しては殆ど影響を及ぼさなかったが、カフェイン、ｍ−トルイジン、ｍ−トルアミド、２，７−ジヒドロキシナフタレン、およびプロプラノロールの収率を約13％以下に減少させた。
吸着剤がポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーの場合、各化合物の回収率は、吸着剤を湿潤状態に保持したときは約80〜100％の範囲であった。コポリマーが９モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むという組成のときは、湿潤条件でも乾燥条件でも、無極性化合物の高い回収率が得られた。より極性の高い化合物は、湿潤条件下においては高収率で回収されたが、乾燥条件下においては収率が急激に低下した。乾燥条件下でのこれら化合物の回収率は、コポリマーのＮ−ビニルピロリドン成分を約13モル％以上に増やすと大幅に増大した。湿潤条件下でのこれら化合物の回収率は、コポリマーの組成が変化しても本質的に不変であった。
同等物（Equivalents）
当業者であれば、通常の実験を使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様に対する多くの同等物を認識もしくは確認することができる。このような同等物は、このあとに記載の請求の範囲の範囲に包含される。
0004062637.tif 000002