(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンの資化能力を持ち、かつ塩素化ダイオキシンの分解・資化能力を有する、寄託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−１８５０１である、コリネバクテリウム  ウレアリティクム  ＮＫ３２菌株。
【請求項２】
請求項１に記載の菌株を用いることを特徴とする塩素化ダイオキシンの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、難分解性有機塩素化合物、特にダイオキシン類の分解能に優れた新規な微生物およびこの微生物を用いた難分解性有機塩素化合物の分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
難分解性ハロゲン化芳香族化合物、特にダイオキシン類は、人体に対して非常に高い毒性と催奇性を示し、また疎水的な性質から食物連鎖による生物濃縮が行われる。
近年、これらのダイオキシン類が化学物質の生成過程や廃棄物の燃焼過程で非意図的に生成し、焼却灰や廃棄物処分場の浸出水などを介して拡散する地球規模での環境汚染が大きな社会問題となっている。
ダイオキシン類は熱処理や化学的処理により分解することが可能なものであるが、環境中、特に土壌や河川の底泥などに低濃度で存在しており、その処理を前述の方法で行った場合には、効率が悪くまた経済的にも負担が大きい。
【０００３】
このような問題を解決するために、微生物を用いて塩化ダイオシキンを分解する方法が考えられ、シュ−ドモナス、スフィンゴモナス属やテラバクター属など、幾つかのダイオキシン分解能を有する微生物についての報告がなされている。
しかしながら、従来公知の塩化ダイオキシン類分解生成物には、次のような問題点があった。
▲１▼分解機構として共代謝（コメタボリズム）を伴うため、その栄養源として他の炭素源を供給する必要がある。
▲２▼高塩素化ダイオキシン類の分解能に劣る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、栄養源として新たな他の炭素源を必要とせず、しかも難分解性芳香族化合物特に塩化ダイオキシン類の分解能力に優れた新規微生物およびこれを用いた難分解性芳香族化合物の工業的に有利な分解方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために有効な新規微生物を全国各地の土壌及び産業排水処理場の活性汚泥等に求め探索した結果、コリネバクテリウム属の中の特定な菌株が有効であるとの知見を得た。
【０００６】
即ち、本発明によれば、第一に、ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンの資化能力を持ち、かつ塩素化ダイオキシンの分解・資化能力を有する、寄託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−１８５０１である、コリネバクテリウム  ウレアリティクム  ＮＫ３２菌株が提供される。
第二に、第一に記載の菌株を用いることを特徴とする塩素化ダイオキシンの分解方法が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明に係る新規微生物は、次のような行程によって天然から分離することにより得られる。
全国30ヶ所から土壌、産業排水処理場の活性汚泥等のサンプル約50点を採取し、まず、試験管に20ml の最少培地（組成：1000mlあたり 4.1 g Na2HPO4・2H20; 0.4 g KH2PO4; 0.5 g (NH4)2SO4; 0.1 g  MgCl2・6H2O;  50 mg Ca(NO3)2・4H2O; 20 mg Fe(NH4)2- citrate, 0.1ml a trace element solution without EDTA）と最終濃度0.2 mM のジベンゾフランを加え、採取試料約0.1ｇを加えて攪拌する。これを約1週間、30度にて培養し、試験管内における培養液の色や濁度の変化を観察し、変化のあった培養液から20μl を採取して、上記の組成の培地に接種して培養し、この操作を5回繰り返し、ジベンゾフランを分解・資化する菌を検索した。培養にて抽出した菌は0.2 mM のジベンゾフランを含む最少寒天培地でコロニーを単一化する。この単一菌を0.1 mM 無塩化ダイオキシンを含む液体最少培地で約7日間、30度にて振盪培養する。これらの菌株からダイオキシンの分解・資化能力を有するものとして得られた菌株が本発明に係る新規微生物であり、コリネバクテリウム・ウレアリティクム NK32株と命名する。
この菌株は、茨城県内で採取されたサンプル（土壌）から分離されたもので、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はFERM P-18501である。
【０００８】
次に、本発明に係る菌株の細菌学的性質を以下に示す。
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【０００９】
以上の諸性質をバージェイのマニュアル  オブ  ディターミナティブ  バクテリオロジー第８版（Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8 th     edition）に基づいて検索したところ、上記性質から本菌はコリネバクテリウム属に属し、コリネバクテリウム・ウレアリティクムに該当すると認められた。しかし、本菌はコリネバクテリウム・ウレアリティクムに属する公知の菌株とは黄色色素産生、β-ガラクトシダーゼ陽性、エスクリン加水分解陽性等に差異があり、新規な菌株と考えられる。なお、本菌は、例えばLB 培地で生育させた後に、350μl のグリセリンに750μl の生育菌を入れ、良く攪拌した後に、-80℃にて維持するといった条件で、保存することができる。
【００１０】
本発明に係る新規微生物は、難分解性芳香族化合物に対して、優れた資化能力と分解能力を示す。
対象となる難分解性芳香族化合物としては、芳香環を有する化合物の全て包含され、単素環あるいは複素環の何れであってもよく、またハロゲン、水酸基、カルボキシル基などで置換されていてもよい。
【００１１】
単素環としては、ベンゼン；クロロベンゼン等の置換基を有するベンゼン；安息香酸；フェノール；カテコール；サリチル酸；インドール；トルエン等が挙げられる。また複素環としては、ダイベンゾチオフェン；フルオレン−９−オン；キサンテン；ビフェニル；フルオレン；ベンゾフェノン；キサンテン−９−オン；アントロン；ナフタレン；ダイベンゾスベレノンなどが包含される。
【００１２】
また、本発明の対象となる難分解性芳香族化合物には、ジベンゾフラン、ＰＣＤＤｓ（ポリ塩化ジベンゾダイオキシン類）やＰＣＤＦｓ（ポリ塩化ジベンゾフラン類）等に代表されるダイオキシン類も包含される。
【００１３】
特に、本発明に係る新規微生物は、後記実施例に示されるように、ＰＣＤＤｓ（ポリ塩化ジベンゾダイオキシン類）やＰＣＤＦｓ（ポリ塩化ジベンゾフラン類）等に代表される塩素化ダイオキシン類と環境中で共存すると言われているジベンゾ−ｐ−ダイオキシンを栄養源として増殖し、塩素化ダイオキシン類の中でも極めて毒性の高い、２，３，７，８の何れかの位置に塩素が置換されたダイオキシン類の分解能に優れたものである。
【００１４】
従って、本発明に係る新規微生物は、従来のように、栄養源として新たな他の炭素源を必要とせず、２，３，７，８の何れかの位置に塩素が置換されたダイオキシン類を効率よく分解できるので、工業的に極めて有用なものということができる。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明に係る新規微生物の性質を試験の結果に基づいて説明する。
【００１６】
(１) ダイオキシンの資化能力
ダイオキシンの資化能力は次のような試験により判定した。0.1mMのダイベンゾ-p-ダイオキシンを含む液体最少培地20mlに菌株を植菌し、30℃にて振盪培養する。培養24時間ごとに培養液を採取し、培養液の濁度を分光光度計 [ヒュレットパッカード社製HP8452]  にて測定して、菌の生育の良否を観察し、資化能力の有無について判定する。またコントロールとしてCorynebacterium glutamicum
IAM 12435 を植菌したものを振盪培養した。
本試験の結果は、図１に示した。本発明に係る菌株コリネバクテリウム・ウレアリティクム（Corynebacterium urealyticm）NK32株は、公知のCorynebacterium glutamicum IAM 12435 と異なり、ジベンゾフランを栄養源として生育することが認められ、ダイオキシンに対して優れた資化能力を有することが分かる。
【００１７】
(２）芳香族化合物の資化能力
芳香族化合物の資化能力は次のような試験により判定した。0.2 mM の芳香族化合物を含む最少液体培地に菌株を植菌し、30℃で約72 時間培養する。72時間培養した後に菌の生育の良否を観察し、資化能力の有無について判定する。
本試験の結果は、表１に示すとおりであり、本発明に係る菌株コリネバクテリウム・ウレアリティクム（Corynebacterium urealyticm）NK32株はダイベンゾチオフェン、ナフタレン、ビフェニルなどの複環の芳香族化合物とともに、トルエン、ベンゼン、フェノールなどの単環の芳香族化合物などを栄養源として生育が認められた。従って幅広い化合物に対して資化能力を有し、既に知られている他の菌株より優れた芳香族化合物の資化能力を有することが分かる。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
（３）塩化ダイオキシンの分解試験
本試験は各種ダイオキシンの異性体の分解性を調査するために行ったものであり、次のような手順による。本発明に係る菌（Corynebacterium urealyticm NK32）をシャーレから１白金耳採取し、最少培地50 ml を入れた培養フラスコ（容量100ml ）に添加する。これを30 ℃で72 時間振盪培養（120rpm） する。この培養液を6,000rpm で15 分間の遠心分離にかけ、菌体を集めて燐酸バファー (pH7.5) で３回洗浄する。そして、最少培地5ml が入った培養フラスコ（容量50ml）に塩化ダイオキシン１ppm を入れ、上記菌体を加える。これを３０℃で７日間振盪培養する。
【００２０】
培養後、培養液に5 ml の酢酸エチルを加えて塩化ダイオキシンを抽出する。得られた抽出液のうち、1ml を窒素ガスの噴射によって濃縮する。この液中の塩化ダイオキシンをガスクロマトグラフーマススペクトロメータ（GC-MS）[ヒューレットパッカード社製HP5890, HP5971A] を用いて分析を行う。カラムとしては 内径0.25mm×長さ30m カラムDB5 を用いた。昇温条件は８０〜２８０℃まで１０分間で昇温させる。また、ヘリウムガスの流量は0.8 ml/minにて行う。
なお、塩化ダイオキシンの分解成分の同定及び定量にはおのおの市販の標準品を用いることができる。
本試験による分解率を次の式によって算出し、その分解試験結果を表２に示す。
【００２１】
【式１】
分解率（％）＝（検出塩素化ダイオキシン量／添加ダイオキシン量）×１００
【００２２】
【表２】
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【００２３】
一般に、塩化ダイオキシンには塩素の置換している数や位置によって、７５種類の異性体が存在し、毒性の高いものは2,3,7,8の何れかの位置、特にジ、トリテトラ体であり、微生物によるダイオキシンの分解能力はダイオキシン分子中の塩素の数が多くなるに従いその能力が低減すると言われているが、本菌は塩素の置換数（モノ置換）が１の場合よりも複数（ポリ置換）のものすなわち毒性の高いダイオキシンに対してその分解能力が向上していることが分かる。また、３塩素化に対しても分解性を有していることが分かる。
【００２４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係る新規微生物は、ダイオキシンや多くの種類の芳香族化合物の資化能力を有するとともに、塩化ダイオキシンの高い分解能力を有しているので、他の炭素源を加えることなしに、汚染水や汚染土壌にて生育させ、維持することができる。従って、河川水、下水等を汚染する塩化ダイオキシンの分解・処理、塩化ダイオキシンによって汚染された土壌等の浄化に用いることができる。また、この新規微生物は、高塩化物、例えば３塩素化程度の塩化ダイオキシンに対して分解性を有し、高塩化物を含む汚染水や汚染土壌の処理に用いることができ、さらに毒性を有する2,3,7,8,位へ塩素が置換した塩化ダイオキシンの分解処理に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ダイオキシンを栄養源として生育するコリネバクテリウム・ウレアリティクム （Corynebacterium urealyticm）NK32 株の増殖曲線のグラフである。
【図１】
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