(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表される、不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物を発蛍光団で標識した発蛍光性不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物誘導体。
【化１】
0004080616.tif 000008
0004080616.tif 000009
（式中、Ｆｌｕ．はダンシル基、Ａは−ＮＨ−ＣＨ２−で表される直鎖の有機結合基、
【化２】
一般式（１）の
0004080616.tif 000010
において、Ｒは、マレイン酸無水物を形成する二重結合、環状不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物である３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物（ＴＨＰＡ）を形成する環構成原子群、及びendo−ビシクロ〔２．２．２〕−オクト−５−エン−ジカルボン酸無水物（ＥＢＯＡ）を形成する構成原子群である。
【請求項２】
請求項１に記載の一般式（１）においてＲがマレイン酸無水物を形成する二重結合である請求項１に記載の発蛍光性不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物誘導体。
【請求項３】
一般式（２）で表される、発蛍光団で標識した不飽和脂肪族ジカルボン酸誘導体。
【化３】
0004080616.tif 000011
0004080616.tif 000012
（式中、Ｆｌｕ．及びＡは、請求項１に記載の一般式（１）の定義と同じであり、
【化４】
一般式（２）の
0004080616.tif 000013
において  Ｒは請求項１に記載の定義と同じである。
【請求項４】
請求項３に記載の一般式（２）においてＲがマレイン酸無水物を形成する二重結合である請求項３に記載の発蛍光団で標識した不飽和脂肪族ジカルボン酸誘導体。
【請求項５】
請求項３に記載の一般式（２）の化合物を脱水剤により脱水して生成させる請求項１に記載の一般式（１）の化合物を含有する発蛍光標識化試薬。
【請求項６】
請求項４に記載の一般式（２）中のＲがマレイン酸無水物を形成する二重結合を構成する原子群である請求項５に記載の発蛍光標識化試薬。
【請求項７】
脱水剤が（トリメチルシリル）エトキシアセチレンであることを特徴とする請求項５又は６に記載の発蛍光標識化試薬。
【請求項８】
請求項１に記載の一般式（１）で表される発蛍光性不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物誘導体を被検出化合物のアミノ基と反応させて発蛍光誘導体を生成させ、前記発蛍光誘導体を発蛍光測定して前記被検出化合物を検出後、弱酸性下において前記発蛍光誘導体から被検出化合物を元の活性構造を回復させて脱離させることを特徴とする発蛍光分析法（人間を診断する方法を除く）。
【請求項９】
請求項１に記載の一般式（１）中のＲがマレイン酸無水物を形成する二重結合を構成する原子群である請求項８に記載の発蛍光分析法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の第１は、特に生理活性など生物学的な機能を有する化合物を可逆的に発蛍光誘導体として標識化できる、発蛍光標識試薬として有用な発蛍光性不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物誘導体、具体的にはダンシルアミノメチルマレイン酸無水物であり、第２は、脱水剤との反応により前記発蛍光性不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物誘導体を生成する不飽和脂肪族ジカルボン酸誘導体であり、第３は、前記不飽和脂肪族ジカルボン酸誘導体に脱水剤、具体的には（トリメチルシリル）エトキシアセチレンを反応させて生成する前記発蛍光性不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物誘導体を含有する発蛍光標識化試薬であり、そして第４は、前記発蛍光標識試薬を用いて、前記発蛍光性不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物誘導体を被検出化合物のアミノ基に可逆的に反応させて発蛍光誘導体を生成させ、発蛍光測定後、弱酸性下で前記発蛍光誘導体から被検出化合物を元の活性構造を回復させて脱離させる発蛍光分析法、に関する。ここにいうダンシル基は、５−ジメチルアミノナフタレンスルホニル基である。
【０００２】
【従来技術】
生体内には、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、低分子アミンなどアミノ基を有する生理活性など生物学的な機能を持った化合物が数多く存在する。これらの化合物の中には、神経ペプチドや各種ホルモンなどのように極微量に存在して、強い生理活性などを示すものや、極めて限られた部位に、極めて短い時間のみ、かつ極微量にしか存在しないものがある。このようなものの検出、定量には超高感度分析法が必要である。発蛍光標識法は高感度で、かつ高選択性的に極微量物質を検出できる特性を有することから、前記のように極微量にしか存在しない物質の検出手段として、特に生化学の分野において利用されてきた。しかしながら、従来の発蛍光標識化法は、使用される発蛍光標識用試薬が、例えばフルオレセインイソチオシアネートのように、被標識物質である生理活性物質の活性物質としての本来の化学構造を喪失させてしまうものであるから、該喪失に伴って生理活性の変化や抗体に対する免疫反応性の変化等が起こることが報告されている（文献：T.Blundell,G.Dodson,D.Hodgkin and D.Mercola,"Advances in Protein Chemistry",eds.C.B.Anfinsen,Jr.,J.T.Edsall and F.M.Richards,pp330-362,Academic Press,New York and London(1972).）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
一方、前記被標識物質（被検出化合物）は当該物質の持つ生理活性をも指標として追跡される場合が多いから、発蛍光標識化法による分析、検出の後においても、該被標識物質の持つ本来の生理活性を指標とする測定ができることが望まれてる。従って、発蛍光標識用試薬の成分である発蛍光標識化剤としては、被検出化合物を発蛍光標識化剤により発蛍光誘導体を形成しての分析、検出後に、前記発蛍光誘導体から、該被検出化合物を該化合物が本来持っていた生理活性構造を回復させて脱離できるものが好ましい。すなわち、発蛍光標識法の高感度、高選択性的な検出の特性を持ちながら、検出後において発蛍光標識化剤を温和な条件で発蛍光誘導体から離脱でき、従って、その際被検出化合物は元の本来の生理活性構造を回復して脱離される特性を持つ発蛍光標識用試薬を見出することが望まれていた。ところで、マレイン酸無水物を含む不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物などは、化学物質のアミノ基と可逆的に反応することが知られていた。従って、該可逆的反応の特性を前記発蛍光標識法に応用できないかと考え、前記マレイン酸無水物などが化学物質のアミノ基に反応するときの前記特性をもつ、発蛍光標識用試薬として有用な化合物を見出すことを本発明の基本的な課題とした。
【０００４】
従って、前記課題を解決するモデルとしては、図１に示すものが考えられる。ここにおいて、Ｒは不飽和脂肪族カルボン酸無水物の構成原子団の一部であり、Ｆｌｕ．は前記酸無水物を標識する発蛍光標識団であり、Ａは、Ｆｌｕ．とＲとを結合させる有機結合基であり、Ｈ２Ｎ−○−＋−□は生理活性を持つ被検出化合物一般を示し、アミノ基を持つことを特徴とする化合物である。前記発蛍光標識団で標識された酸無水物は、前記被検化合物のアミノ基に結合して発蛍光誘導体を生成する。発蛍光誘導体を発蛍光検出し、発蛍光検出を終了した後、前記発蛍光誘導体から被検出物質を、その本来の生理活性構造を保持して脱離させる。換言すれば、前記発蛍光誘導体の生成は可逆特性を持つ。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は、一般式（１）で表される、不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物を発蛍光団で標識した発蛍光性不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物誘導体であり、
【化５】
0004080616.tif 000002
0004080616.tif 000003
（式中、Ｆｌｕ．はダンシル基、Ａは−ＮＨ−ＣＨ２−で表される直鎖の有機結合基、
【化６】
一般式（１）の
0004080616.tif 000004
において、Ｒは、マレイン酸無水物を形成する二重結合、環状不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物である３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物（ＴＨＰＡ）を形成する環構成原子群、及びendo−ビシクロ〔２．２．２〕−オクト−５−エン−ジカルボン酸無水物（ＥＢＯＡ）を形成する構成原子群である。好ましくは、前記一般式（１）においてＲがマレイン酸無水物を形成する二重結合である前記発蛍光性不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物誘導体である。
【０００６】
第２は、一般式（２）で表される、脱水により前記一般式（１）で表される発蛍光性ジカルボン酸無水物誘導体を生成する発蛍光団で標識した不飽和脂肪族ジカルボン酸誘導体、すなわち前記一般式（１）の前駆体であり
【化７】
0004080616.tif 000005
0004080616.tif 000006
（式中、Ｆｌｕ．及びＡは、請求項１に記載の一般式（１）の定義と同じであり
【化８】
一般式（２）の
0004080616.tif 000007
において  Ｒは前記一般式（１）における定義と同じである。
【０００７】
第３は、前記一般式（２）の化合物を脱水剤により脱水して生成する前記一般式（１）の化合物を含有する発蛍光標識化試薬であり、そして、第４は、前記一般式（１）で表される発蛍光性不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物誘導体を被検出化合物のアミノ基と反応させて発蛍光誘導体を生成させ、前記発行誘導体を発蛍光測定して前記被検出化合物を検出後、弱酸性下において前記発蛍光誘導体から被検出化合物を元の活性構造を回復させて脱離させることを特徴とする発蛍光分析法である。
【０００８】
具体的には、前記したように、第１は前記一般式（１）中のＦｌｕ．がダンシル基であり、Ａが−ＮＨ−ＣＨ２−であり、不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物残基が、Ｈを結合したときマレイン酸無水物を表す原子群である発蛍光性不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物誘導体、すなわち、ダンシルアミノメチルマレイン酸無水物であり、第２は脱水剤として（トリメチルシリル）エトキシアセチレンを用い脱水閉環してダンシルアミノメチルマレイン酸無水物を生成させる前記一般式（２）中のＦｌｕ．がダンシル基であり、Ａが−ＮＨ−ＣＨ２−であり、不飽和脂肪族ジカルボン酸残基が、Ｈを結合したときマレイン酸を表す原子群である不飽和脂肪族ジカルボン酸誘導体、すなわち、ダンシルアミノメチルマレイン酸であり、第３はダンシルアミノメチルマレイン酸無水物の前駆体化合物であるダンシルアミノメチルマレイン酸を、脱水剤として（トリメチルシリル）エトキシアセチレンを用いて生成させたダンシルアミノメチルマレイン酸無水物を含有する発蛍光性標識用試薬であり、そして、第４は、前記発蛍光標識用試薬を被検出化合物のアミノ基に反応させて発蛍光誘導体を生成させ、前記発蛍光誘導体を発蛍光測定して前記被検出化合物を検出後、弱酸性下において前記発蛍光誘導体から被検出化合物を元の活性構造を回復させて脱離させる発蛍光分析法である。従って、本発明の発蛍光分析においては、被検出化合物である活性物質は、発蛍光分析後に純活性物質として回収される。以上のように、本発明者らは、特にダンシルアミノメチルマレイン酸無水物が、アミノ基を持つ化合物と可逆的に反応することを見出して前記本発明の課題を解決したものである。
【０００９】
前記不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物としては、マレイン酸無水物以外に、例えば環状不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物である３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物（ＴＨＰＡ）やendo−ビシクロ〔２．２．２〕−オクト−５−エン−ジカルボン酸無水物（ＥＢＯＡ）（これらの酸無水物が、アミノ基に対してマレイン酸無水物と同様に可逆的に反応することについては、文献：Y.Kimura,K.Zaitsu,Y.Motomura and Y.Ohkura,Biol.Pharm,Bull.17(7),881-885(1994).を参照）などを挙げることができる、従って、「不飽和脂肪族」には、環状構造のものを含む。また、−Ａ−としては、−ＮＨ−ＣＨ２−以外に、例えば−ＣＨ２−を挙げることができる。
【００１０】
また、前記具体的化合物であるダンシルアミノメチルマレイン酸無水物は、イタコン酸の二重結合に臭素を付加して２−ブロモ−２−（ブロモメチル）コハク酸を得、トリフルオロ酢酸無水物を用いて２−ブロモ−２−（ブロモメチル）コハク酸無水物を得、２，６−ルチジンにより脱臭化水素をしてブロモメチルマレイン酸無水物を得、これを加水分解してブロモメチルマレイン酸とし、これをアンモニア水溶液と反応させアミノメチルマレイン酸を得、これにダンシルクロライドを反応させてダンシルアミノメチルマレイン酸を得、これを（トリメチルシリル）エトキシアセチレンにより脱水閉環して製造される。
【００１１】
ところで、発蛍光標識法に使用される蛍光標識化剤には、分析感度の面から１．吸光係数及び蛍光量子収率が高いこと２．バックグラウンドと迷光をさけるために、励起光（ｅｘ．）と蛍光（ｅｍ．）との差が大きい（５０ｎｍ以上）こと３．比較的長波長のレーザー光を励起光（ｅｘ．）として用いることができることなどの特性が要求されている。これらの特性が向上することによって、より小型の半導体レーザー発信器からの励起光を利用できるようになり、測定装置の小型化が可能になるし、その用途も広げることができる。更に、前記特性を持つ本発明の発蛍光標識用試薬と組み合わせれば、発蛍光標識法の生化学分野での新しい応用が考えられる。例えば、生体微小部位における活性アミノ化合物の消長を分析する方法などへの発展が考えられる。
【００１２】
【本発明の態様】
特に、本発明のダンシルアミノメチルマレイン酸無水物（ＤＡＭＡ）の合成経路を図２に示す。
１．ブロモメチルマレイン酸無水物（１）を加水分解してブロモメチルマレイン酸（２）とする。そのときの条件は室温で（１）に水を加えて反応させる。
２．化合物（２）をアンモニア水溶液と反応させアミノメチルマレイン酸（３）を得る。そのときの条件は２５％アンモニア水に（２）を氷冷下に加えて、室温放置する。
３．化合物（３）にダンシルクロライド（5-ジメチルアミノナフタレンスルホニルクロライド：図２右下ＤＮＳ−Ｃｌ）を反応させて、発蛍光性標識用試薬前駆体であるダンシルアミノメチルマレイン酸（４）（ＤＡＭ）を得る。その時の条件は、溶媒に２００ｍＭホウ酸塩緩衝液（ＰＨ１０．０）を用い、ＤＮＳ−Ｃｌアセトン溶液を滴下し、５０℃で加熱し、反応させる。
４．化合物（４）に脱水剤として（トリメチルシリル）エトキシアセチレン（ＴＭＳ）を用い脱水閉環して本発明の目的化合物（５）を生成させる。その時の条件はアセトニトリルを溶媒として、５０℃で加熱する。図３は、ダンシルアミノメチルマレイン酸無水物（ＤＡＭＡ）の生成を裏付ける赤外線吸収スペクトルであり、下向きの矢印の２つの吸収は酸無水物構造の生成を支持する。
【００１３】
図４は、本発明のダンシルアミノメチルマレイン酸無水物（ＤＡＭＡ）をベンジルアミンに反応させて発蛍光誘導体を生成する反応を示す。ベンジルアミンの検出及びその反応を図４を参照しながら説明する。ＤＡＭを脱水剤として（トリメチルシリル）エトキシアセチレンを用い脱水閉環して生成させたＤＡＭＡは、生体内におけるタンパク質やペプチド、他の低分子アミンなどと発蛍光誘導体を生成させて、発蛍光分析の対象とされるものであるが、ここではアミノ基を含有する前記分析の対象化合物のモデルとして、ベンジルアミンを用い、発蛍光誘導体化による高感度化、並びに発蛍光誘導体の可逆性について検討した。
Ａ： ベンジルアミン発蛍光誘導体の合成ダンシルアミノメチルマレイン酸無水物（ＤＭＡ）を酢酸エチル中で室温においてベンジルアミンと反応させた（図４から理解されるように、２種のＮ−ベンジル−２−ダンシルアミノメチルマレインアミド酸（ＢＤＡＭ）が生成する。）これをオープンカラムで精製し、ＢＤＡＭ（ベンジルアミン発蛍光誘導体）の粉末を得る。図５は、ＢＤＡＭを確認するＦＡＢ−ＭＳ（高速原子衝撃質量分析）スペクトルである。点線の右側は強度を１０倍にして表示している。３６８．１（Ｍ＋＋１）に吸収が見られる。４９０．１は（Ｍ＋＋ＮａでありＮａ塩の状態のものでる。）
【００１４】
Ｂ： ベンジルアミンの検出限界。得られた、前記蛍光誘導体およびベンジルアミンそれぞれについて逆相ＨＰＬＣにより、検出感度の比較を行った。図６は、ベンジルアミンのクロマトグラムで、検出には２５４ｎｍにおける紫外線吸収（縦軸）を用いた。
カラム          ＯＤＳ−８０Ｔｓ
カラム温度      ４０℃
移動相          ４０％メタノールを含む
１０ｍＭ燐酸塩緩衝液
ｐＨ    ７．０
流速            １ｍｌ／ｍｉｎ
検出            ２５４ｎｍ
検出限界はＳ／Ｎ＝１０において２００ｐｍｏｌである。
【００１５】
Ｃ： ベンジルアミン発蛍光誘導体の検出限界。
図７は、ベンジルアミン蛍光誘導体（ＢＤＡＭ）のクロマトグラムで、分光計光検出器で、励起波長（ｅｘ．）３４０ｎｍ、および蛍光波長（ｅｍ．）５２０ｎｍで発蛍光検出した。カラム ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム温度 ４０℃ 移動相 ２０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ検出限界はＳ／Ｎ＝５において１００ｆ（フェムト＝１０−１５）ｍｏｌとなる。このことから、本発明の発蛍光標識剤を用いてダンシル発蛍光誘導体化することにより検出限界が、２００ｐｍｏｌから１００ｆｍｏｌへと約２０００倍検出感度を上げることができた。
【００１６】
Ｄ： 本発明の蛍光標識剤の検出化合物に対する可逆性、すなわちベンジルアミン蛍光誘導体からのベンジルアミン脱離について検討する。ベンジルアミンの検出にはキャピラリー電気泳動法（ＨＰＣＥ）を用いた。（ＨＰＬＣ法を適用した場合、試料中の夾雑物の影響でベンジルアミンの検出が困難であったので前記方法用いた。）図８は、ＨＰＣＥを用いてベンジルアミン、副生物として考えられるダンシルアミド（ＤＮＳ−ＮＨ２）、原料ジカルボン酸であるダンシルアミノメチルマレイン酸（ＤＭＡ）の４種について分析を行ったエレクトロフェログラムである。キャピラリー 溶融シリカ，内径５０μｍ、長さ６５ｃｍ（有効長４５ｃｍ）泳動液 １５０ｍＭ硼酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）電気泳動 ２０ＫＶ固定電圧，室温検出 紫外線２５４ｎｍこの４種の化合物は良好に分離され、夾雑物の影響はほとんど受けずにベンジルアミンの検出が可能であった。このとき、ベンジルアミンは、２５−１００μＭの範囲で、吸光度は濃度に比例する。（図９参照）すなわち、この方法を用いて、ベンジルアミン発蛍光誘導体からのベンジルアミン脱離の反応を観察できることが解った。
【００１７】
ベンジルアミン発蛍光誘導体からのベンジルアミン脱離の追跡操作法は以下のとおりである。１．２１ｍＭのＢＤＡＭ１００μｌにＡ，ｐＨ３．５の１００ｍＭ酢酸ナに加えたサンプル、またはＢ，ｐＨ７．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウムトリウム緩衝液９００μｌ（マイクロリトル）に加えたサンプルを作り、これを室温または６０℃に保持した。０時間経過、１．２５時間経過、２．５時間経過および２４時間経過時に、それぞれ、１００μｌのサンプルを取り、それに、１０％のメタノールを含む１５０ｍＭホウ酸塩緩衝液ｐＨ７．０を１００μｌ加えて、ＨＰＣＥを用いてベンジルアミン脱離の反応を観察した。
【００１８】
図１０は、前記ｐＨ３．５のサンプルを室温に保持し、０時間および２４時間経過時のサンプルを電気泳動にかけ、２１０ｎｍの吸光度から得られた、ベンジルアミン脱離の反応特性の観察結果である。０時間後のサンプル（ａ）には、ベンジルアミンは全く認められないが、２４時間後のサンプル（ｂ）には、約２．５分にベンジルアミンと考えられるピークが認められた。なお、３分以降に見られる大きなピークは酢酸ナトリウム由来のものである。
【００１９】
図１１は、前記ｐＨ７．０のサンプルを室温に保持し、０時間および２４時間経過時のサンプルを電気泳動にかけ、２１０ｎｍの吸光度から得られた、ベンジルアミン脱離の反応特性の観察結果であるが、いずれにもベンジルアミンのピークが認められない。図１２は、前記図１０および図１１での観察結果を、縦軸として、計算上全てのベンジルアミンが再生した場合を１００％とした。ベンジルアミンのピーク値はその濃度に比例するから、ピーク値からベンジルアミン再生率を算出し、反応（経過）時間を横軸として、ベンジルアミンの再生特性を示した。これらの結果から、ＢＤＡＭ（ベンジルアミン発蛍光誘導体）からベンジルアミンの再生は弱酸性条件で可能であり、脱離も６０℃において、約１時間後に８０％と高いので、今回設計したＢＤＡＭは可逆的蛍光性標識試薬として有用であることを示す。
【００２０】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明のダンシルアミノメチルマレイン酸無水物は、アミノ基を有する化合物類の蛍光標識化剤として使用したとき、被検出生理活性物質である微量のタンパクやペプチドの検出特性を推測するモデルとして用いたベンジルアミンと室温において数分間で反応すること、また脱離もｐＨ３．５、温度６０℃と比較的温和な条件において、約１時間で約８０％で回収されること、また、検出感度も約２０００倍程度向上させることが可能である、という優れた効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 化合物のアミノ基を可逆的に標識する発蛍光性ジカルボン酸無水物誘導体による、発蛍光誘導化のモデル
【図２】 ダンシルアミノメチルマレイン酸無水物の合成（生成）経路
【図３】 ダンシルアミノメチルマレイン酸無水物の確認の赤外吸収スペクトル
【図４】 ダンシルアミノメチルマレイン酸無水物によるベンジルアミンの発蛍光誘導体の生成
【図５】 Ｎ−ベンジル−２−ダンシルアミノメチルマレインアミド酸の確認のＦＡＢ−ＭＳ（高速原子衝撃質量分析スペクトル）
【図６】 ２００ｐｍｏｌ ベンジルアミンに対するエレクトロフェログラム
【図７】 １００ｆｍｏｌＮ−ベンジル−２−ダンシルアミノメチルマレインアミド酸に対するエレクトロフェログラム
【図８】 ベンジルアミンおよび 関連化合物のエレクトロフェログラム
【図９】 ベンジルアミンの吸光度と濃度の関係
【図１０】 ｐＨ３．５、０時間（ａ）、２４時間（ｂ）における反応混合物のエレクトロフェログラム
【図１１】 ｐＨ７．０、０時間（ａ）、２４時間（ｂ）における反応混合物のエレクトロフェログラム
【図１２】 ベンジルアミンの再生
【図１】
0004080616.tif 000014
【図２】
0004080616.tif 000015
【図３】
0004080616.tif 000016
【図４】
0004080616.tif 000017
【図５】
0004080616.tif 000018
【図６】
0004080616.tif 000019
【図７】
0004080616.tif 000020
【図８】
0004080616.tif 000021
【図９】
0004080616.tif 000022
【図１０】
0004080616.tif 000023
【図１１】
0004080616.tif 000024
【図１２】
0004080616.tif 000025