(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２（OATP2）のアミノ酸配列を含んでなる有機陰イオン輸送タンパク質（「OATP」）をコードする単離精製された核酸分子。
【請求項２】
（a）配列番号１の核酸配列、（b）（a）のコード領域、（c）（a）もしくは（b）の相補鎖、または（d）遺伝暗号が縮重しているために（a）、（b）もしくは（c）とは異なる核酸配列、を含んでなる請求項１の核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸分子と該核酸分子に作動的に結合された発現制御配列とを含んでなる発現ベクター。
【請求項４】
請求項１または２に記載の核酸分子と該核酸分子に作動的に結合された発現制御配列とを含んでなる発現ベクターを含有する形質転換体宿主細胞。
【請求項５】
配列番号２（OATP2）のアミノ酸配列を含んでなるOATP 。
【請求項６】
OATP2の製造方法であって、
a）該OATP をコードする請求項１または２に記載の核酸分子を適切な発現ベクターに挿入する工程、
b）該発現ベクターを適切なトランスフェクション宿主細胞にトランスフェクトする工程、
c）該トランスフェクト宿主細胞を適切な培養培地で生育する工程、
d）該培養培地からOATP を精製する工程、
を含む方法。
【請求項７】
請求項５に記載のOATPに特異的な抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体である請求項７の抗体。
【請求項９】
a）請求項５のOATPをコードする核酸配列を適切な発現ベクターに挿入し、
b）該発現ベクターを適切なトランスフェクション宿主細胞にトランスフェクトし、
c）該トランスフェクト宿主細胞を適切な培養培地で生育し、
d）該培養培地からOATPを精製する、
ことによって製造される請求項５のOATP。
【請求項１０】
請求項５のOATPに結合する能力を持つリガンドを同定する方法であって、
（a）リガンド-OATP複合体の形成が可能な条件で、該OATPを、該OATPに結合する能力を持つ可能性のある該リガンドと反応させる工程、および
（b）リガンド-OATP複合体、遊離のリガンドまたは非複合体化OATPに関するアッセイを行なう工程、
を含む方法。
【請求項１１】
請求項５のOATPによって輸送される能力を持つ基質を同定する方法であって、
（a）膜を横切る基質の移動が可能な条件で、該OATPを、該OATPによって輸送される能力を持つ可能性のある該基質と反応させる工程、および
（b）膜を横切る該基質の移動に関するアッセイを行なう工程、
を含む方法。
【請求項１２】
第２のポリペプチドに取り付けられた請求項５のOATPを含んでなる融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項５のOATPによる基質の輸送を増強または阻害する能力を持つモジュレーターを同定する方法であって、
a）膜を横切る該基質の移動が可能な条件で、該OATPを、該基質および基質の輸送を増強または阻害する能力を持つ可能性のある該モジュレーターと反応させること、
b）該モジュレーターによる該化合物の輸送の増強または阻害を測定すること、
を含む方法。
【請求項１４】
ATCC受託番号207213に含まれるOATP遺伝子または該OATP遺伝子の相補鎖を含んでなる請求項２の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は米国仮特許出願第60/135,081号（1999年5月20日出願）に基づく優先権を主張し、当該仮特許出願は参照により完全な形で本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
（技術分野）
本願発明はOATP2、OATP-RP1、OATP-RP2、OATP-RP3、OATP-RP4およびOATP-RP5と呼ばれる有機陰イオン輸送タンパク質（organic anion transport protein）（OATP）の新規メンバーの全部または一部をコードする単離された核酸に関する。また本願発明は、上記核酸配列を含有するベクター、そのベクターを含有する宿主、ならびにOATP2、OATP-RP1、OATP-RP2、OATP-RP3、OATP-RP4およびOATP-RP5のアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドに関する。本輸送体の組織発現ならびに本輸送体の基質の一部についても記載する。また本願発明は、例えば特定組織への薬物のターゲティング、内因性基質の濃度の調整、および本発明の新規OATPによって輸送される能力を持つ基質の同定などを目的とする上記新規OATP類の使用法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
肝臓は、洞様毛細血管膜を横切って多種多様な代謝産物、薬物および他の生体異物を肝細胞内に輸送することによって、それらを排除する機能を果たしている。これらの過程を媒介する輸送系は、例えばラット肝およびヒト肝におけるNa+/タウロコール酸共輸送体ポリペプチド（NTCP）（Hagenbuch, B.ら（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10629-33、Hagenbuch, B.ら（1994）J. Clin. Invest. 93:1326-31）ならびに主として肝臓、腎臓および脳で発現され広範囲にわたる基質をナトリウム非依存的に輸送する有機陰イオン輸送ポリペプチド（OATP）のファミリー（Meier, P.J.ら（1997）Hepatology 26:1667-77、Wolkoff, A.W.（1996）Semin. Liver Dis. 16:121-127）など、数種類が記述されている。後者の輸送体ファミリーが肝臓、腎臓および脳の脈絡叢に分布することは、多数の有機陰イオンを排除するためにこれらの器官が共通して持っている生理学的要求を反映していると思われる。ラットには3つのOATPアイソフォーム、すなわちroatp1（Jacquemin, E.ら（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:133-37）、roatp2（Noe, B.A.ら（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10346-50）、およびroatp3（Abe, T.ら（1998）J. Biol. Chem. 273:11395-401）がある。OATP類は胆汁酸に加えて、他の様々な化合物を輸送することが知られている。それらの化合物には、輸送体によって、硫酸エストロン、エストラジオール17β-グルクロニド、アルドステロンおよび強心配糖体などの非抱合型および抱合型ステロイドがある（Boussuyt, X.ら（1996）J. Pharmacol. Exp. Ther. 276:891-6、Boussuyt, X.（1996）J. Hepatol. 25:733-8、Kanai, N.ら（1996）Am. J. Physiol.  270:F319-F325、Kanai, N.ら（1996）Am. J. Physiol. 270:F326-F331、Noe, B.A.ら（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10346-50）。他の基質には、ブロモスルホフタレイン（Jacquemin, E.ら（1996）J. Pharmacol. Exp. Ther. 279:1507-13）、マイコトキシン（Kontaxi, M.ら（1996）J. Pharmacol. Exp. Ther. 279:1507-13）、ロイコトリエンC4（Li, L.ら（1998）J. Biol. Chem. 273:11395）および甲状腺ホルモン（Abe, T.ら（1998）J. Biol. Chem. 273:11395）がある。
【０００４】
いくつかのタンパク質が同定されている。Jacquemin, E.ら（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:133-137には、OATP輸送体ファミリーのメンバーの最初のクローニングと同定（すなわちラットoatp1）が報告されている。ヒトOATPの最初のクローニングと同定は、Kullak-Ublick, G.A.ら（1995）Gastroenterology 109:1274-1282に報告された。その発現は肝臓、腎臓、脳および他の器官に認められた。著者らは、基質特異性に基づいて、このタンパク質はラットoatp1のヒトオルソログではないと結論している。
【０００５】
ラットoatp1の基質特異性はKullak-Ublick, G.A.ら（1994）Hepatology 20:411-416で議論されており、またヒトOATPの基質特異性はBossuyt, X.ら（1996）J. Hepatol. 25:733-738で議論されている。
【０００６】
ラットoatp1がステロイドの輸送に関与すること（Bossuyt, X.ら（1996）J. Pharmacol. Exp. Ther. 276:891-896）およびヒトOATPが精神活性ホルモンDHEASの輸送体として作用すること（Kullak-Ublick, G.A.ら（1998）FEBS Lett. 424:173-176）を示すデータが、後に開示された。OATPファミリーおよび肝臓における有機陰イオン輸送を概観するには、Wolkoff, A.W.（1996）Semin. Liver Dis. 16:121-127を参照されたい。
【０００７】
甲状腺ホルモンT3およびT4を輸送することが明らかになった第3のラットOATPアイソフォームがクローニングされ、Abe, T.ら（1998）J. Biol. Chem. 273：22395-22401に報告された。
【０００８】
本明細書で言及する文献は上述した文献も後述する文献もすべて参照により完全な形で本明細書に組み込まれるものとする。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は新規有機陰イオン輸送タンパク質（「OATP」）および該OATPをコードするポリヌクレオチドを包含する。本明細書に開示するOATPはOATP2、OATP-RP2、OATP-RP3、OATP-RP4、OATP-RP5およびOATP-RP1と呼ばれる。各OATPのポリヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と共に本明細書に開示する。本発明のOATPをコードするcDNAはAmerican Type Culture Collectionに寄託され、受託番号ATCC207213（OATP2）、ATCC207212（OATP-RP2）、ATCC207209（OATP-RP3）、ATCC207210（OATP-RP4）、ATCC207211（OATP-RP5）およびATCC207214（OATP-RP1）を与えられている。
【００１０】
本発明者らは上記の新規OATPをコードするcDNAを配列決定し、推定タンパク質の一次配列を決定した。本明細書に、OATP2の核酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）、OATP-RP2の核酸配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）、OATP-RP3の核酸配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）、OATP-RP4の核酸配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）、OATP-RP5の核酸配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）、ならびにOATP-RP1の核酸配列（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を開示する。
【００１１】
本発明のOATPは（1）本明細書に開示するOATPのcDNAを適切な発現ベクターに挿入し、（2）その発現ベクターを適切なトランスフェクション宿主にトランスフェクトし、（3）そのトランスフェクト細胞を適切な培養培地で生育し、（4）そのトランスフェクト細胞内の輸送活性をアッセイすることによって製造できる。
【００１２】
したがって本発明は、OATPをコードする配列を持つ単離精製された核酸分子（好ましくはDNA分子）、または本発明のOATPに特有な前記核酸分子のオリゴヌクレオチド断片を提供する。本発明の好ましい一態様では、単離精製された核酸分子が配列番号１に示す配列（OATP2）を持つ。もう一つの好ましい態様では、単離精製された核酸分子が配列番号３に示す配列（OATP-RP2）を持つ。さらにもう一つの好ましい態様では、単離精製された核酸分子が配列番号５に示す配列（OATP-RP3）を持つ。さらにもう一つの好ましい態様では、単離精製された核酸分子が配列番号７に示す配列（OATP-RP4）を持つ。さらにもう一つの好ましい態様では、単離精製された核酸分子が配列番号９に示す配列（OATP-RP5）を持つ。さらにもう一つの好ましい態様では、単離精製された核酸分子が配列番号１１に示す配列（OATP-RP1）を持つ。
【００１３】
また本発明は相補的ヌクレオチド塩基配列に水素結合した本発明の核酸分子またはそのオリゴヌクレオチド断片からなる二本鎖核酸分子も包含する。
【００１４】
「単離精製された核酸」「単離精製されたポリヌクレオチド」「実質的に純粋な核酸」および「実質的に純粋なポリヌクレオチド」という用語（例えば実質的に純粋なDNA）は、次の一方または両方に当てはまる核酸分子を指す：（1）当該核酸が由来する生物の天然のゲノムでは当該核酸に直接隣接している配列（例えばコード配列）の一方または両方（すなわち5'末端に一つ、3'末端に一つ）が直接隣接していない核酸分子、または（2）当該核酸が由来する生物中で当該核酸と一緒に存在する核酸配列を実質的に含まない核酸分子。これらの用語は、例えばベクター（例：自律複製型のプラスミドもしくはウイルス）または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれている組換えDNA、または他のDNA配列とは無関係な独立した分子（例えばPCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成するcDNAまたはゲノムDNA断片）として存在する組換えDNAを包含する。実質的に純粋なDNAまたは単離精製されたDNAには、付加されたOATP配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも包含される。
【００１５】
本発明は一態様として（a）配列番号２に示すアミノ酸配列（OATP2）を持つタンパク質の全部または一部をコードする配列からなる単離精製された核酸分子、（b）(a）に相補的な核酸配列、（c）(a）に対して少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の配列一致度を示す核酸配列、または（d）少なくとも18塩基長であってストリンジェントな条件で（a）または（b）にハイブリダイズする（a）または（b）の断片を提供する。
【００１６】
2つの配列間の相同性の程度（配列一致率）は、例えばこの目的によく使用されるコンピュータープログラムを使って2つの配列を比較することによって決定できる。適切なプログラムの一つはDevereuxら（1984）Nucl. Acids Res. 12:387に記載のGAPコンピュータープログラムである。GAPプログラムにはSmithおよびWaterman（1981）Adv. Appl. Math. 2:482によって改訂されたNeedlemanおよびWunsch（1970）J. Mol. Biol. 48:433の整列方法が使用されている。簡単に述べるとGAPプログラムでは、整列した記号（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）のうち一致する記号の数を、当該2つの配列のうちの短い方の記号の総数で割った値を一致率と定義する。
【００１７】
本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」という用語は、あるヌクレオチド配列が、（a）本明細書に示すアミノ酸配列を持つタンパク質をコードする配列からなる単離精製された核酸分子にハイブリダイズするか、または（b）(a）に相補的な核酸配列にハイブリダイズするような、当技術分野既知の条件を包含する。ストリンジェントな条件でのポリヌクレオチドのスクリーニングは、Nature 313:402-404（1985）に記載の方法に従って行なうことができる。ストリンジェントな条件で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列は、例えば本明細書に開示するDNA配列の対立遺伝子変異体であってもよいし、他に由来するものであってもよい。核酸ハイブリダイゼーションの一般的技術は、Sambrookら著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（第2版、コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク・コールドスプリングハーバー（1984））およびHaymesら著「Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach」（IRL Press，ワシントンD.C.（1985））に開示されており、これらの刊行物は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００１８】
本発明はもう一つの態様として、（a）配列番号４に示すアミノ酸配列（OATP-RP2）を持つタンパク質の全部または一部をコードする配列からなる単離精製された核酸分子、（b）(a）に相補的な核酸配列、（c）(a）に対して少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の配列一致度を示す核酸配列、または（d）少なくとも18塩基長であってストリンジェントな条件で（a）または（b）にハイブリダイズする（a）または（b）の断片を提供する。
【００１９】
本発明はもう一つの態様として、（a）配列番号６に示すアミノ酸配列（OATP-RP3）を持つタンパク質の全部または一部をコードする配列からなる単離精製された核酸分子、（b）(a）に相補的な核酸配列、（c）(a）に対して少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の配列一致度を示す核酸配列、または（d）少なくとも18塩基長であってストリンジェントな条件で（a）または（b）にハイブリダイズする（a）または（b）の断片を提供する。
【００２０】
本発明はもう一つの態様として、（a）配列番号８に示すアミノ酸配列（OATP-RP4）を持つタンパク質の全部または一部をコードする配列からなる単離精製された核酸分子、（b）(a）に相補的な核酸配列、（c）(a）に対して少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の配列一致度を示す核酸配列、または（d）少なくとも18塩基長であってストリンジェントな条件で（a）または（b）にハイブリダイズする（a）または（b）の断片を提供する。
【００２１】
本発明はもう一つの態様として、（a）配列番号１０に示すアミノ酸配列（OATP-RP5）を持つタンパク質の全部または一部をコードする配列からなる単離精製された核酸分子、（b）(a）に相補的な核酸配列、（c）(a）に対して少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の配列一致度を示す核酸配列、または（d）少なくとも18塩基長であってストリンジェントな条件で（a）または（b）にハイブリダイズする（a）または（b）の断片を提供する。
【００２２】
本発明はもう一つの態様として、（a）配列番号１２に示すアミノ酸配列（OATP-RP1）を持つタンパク質の全部または一部をコードする配列からなる単離精製された核酸分子、（b）(a）に相補的な核酸配列、（c）(a）に対して少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の配列一致度を示す核酸配列、または（d）少なくとも18塩基長であってストリンジェントな条件で（a）または（b）にハイブリダイズする（a）または（b）の断片を提供する。
【００２３】
また本発明は、（a）配列番号１に示す配列（OATP2）からなる精製単離された核酸分子、（b）(a)に相補的な核酸配列、（c）(a)に対して少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の配列一致度を有する核酸配列、または（d）少なくとも18塩基長であってストリンジェントな条件で（a）または（b）にハイブリダイズする（a）または（b）の断片も提供する。
【００２４】
さらに本発明は、（a）配列番号３に示す配列（OATP-RP2）からなる精製単離された核酸分子、（b）(a)に相補的な核酸配列、（c）(a)に対して少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の配列一致度を有する核酸配列、または（d）少なくとも18塩基長であってストリンジェントな条件で（a）または（b）にハイブリダイズする（a）または（b）の断片を提供する。
【００２５】
さらに本発明は、（a）配列番号５に示す配列（OATP-RP3）からなる精製単離された核酸分子、（b）(a）に相補的な核酸配列、（c）(a）に対して少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の配列一致度を示す核酸配列、または（d）少なくとも18塩基長であってストリンジェントな条件で（a）または（b）にハイブリダイズする（a）または（b）の断片を提供する。
【００２６】
さらに本発明は、（a）配列番号７に示す配列（OATP-RP4）からなる精製単離された核酸分子、（b）(a)に相補的な核酸配列、（c）(a)に対して少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の配列一致度を有する核酸配列、または（d）少なくとも18塩基長であってストリンジェントな条件で（a）または（b）にハイブリダイズする（a）または（b）の断片を提供する。
【００２７】
さらに本発明は、（a）配列番号９に示す配列（OATP-RP5）からなる精製単離された核酸分子、（b）(a)に相補的な核酸配列、（c）(a)に対して少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の配列一致度を有する核酸配列、または（d）少なくとも18塩基長であってストリンジェントな条件で（a）または（b）にハイブリダイズする（a）または（b）の断片を提供する。
【００２８】
さらに本発明は、（a）配列番号１１に示す配列（OATP-RP1）からなる精製単離された核酸分子、（b）(a)に相補的な核酸配列、（c）(a)に対して少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の配列一致度を有する核酸配列、または（d）少なくとも18塩基長であってストリンジェントな条件で（a）または（b）にハイブリダイズする（a）または（b）の断片を提供する。
【００２９】
また本発明は置換、欠失または挿入突然変異を含む１または複数の構造突然変異を持つ本発明のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列も包含する。例えばシグナルペプチドを欠失させるか、または保存的アミノ酸置換を施して、依然として生物学的に有能または活性なタンパク質を生成させることができる。
【００３０】
さらに本発明は本発明の核酸分子またはそのオリゴヌクレオチド断片と、前記核酸分子またはオリゴヌクレオチド断片に作動的に結合された発現制御配列とからなる組換え分子も包含する。本発明の組換え分子を含む形質転換体宿主細胞も提供する。
【００３１】
もう一つの側面として本発明は、本発明のOATPをコードする新規遺伝子を含む細胞もしくは精製された細胞調製物または本発明のOATPをコードする遺伝子を他の形で誤発現（misexpression）させる細胞もしくは精製された細胞調製物を特徴とする。本細胞調製物はヒトまたは非ヒト細胞（例えばマウス細胞またはラット細胞などのげっ歯類動物細胞、ウサギ細胞、非ヒト霊長類細胞またはブタ細胞）からなることができる。好ましい態様として、本細胞はOATP導入遺伝子、例えば異種型のOATP遺伝子、例えばヒトに由来する遺伝子（非ヒト細胞の場合）を含有する。OATP導入遺伝子は誤発現（例えば過剰発現または過少発現）させることができる。別の好ましい態様として、本細胞は内因性OATP遺伝子を誤発現させる遺伝子、例えば発現が阻害されている遺伝子、例えばノックアウトを含有する。かかる細胞はOATP対立遺伝子の突然変異または誤発現に関係する障害を研究するためのモデル、薬剤スクリーニング用モデルとして役立ちうる。
【００３２】
さらに本発明は、本発明の核酸分子を含むプラスミドも提供する。また、本明細書に開示する核酸配列を含むベクターならびに該ベクターを含む宿主細胞も、本発明に包含される。
【００３３】
本発明は本発明の新規OATPまたはその活性部分も包含する。生物学的に有能または活性な型の本タンパク質またはその一部も、本明細書では「活性OATPまたはその一部」という。
【００３４】
さらに本発明は、本発明OATPのエピトープまたは本タンパク質の一部に対して特異性を有する抗体も包含する。これらの抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。本抗体は検出可能な物質で標識することができ、それらは例えば組織および細胞中の本発明の新規OATPを検出するために使用できる。さらに本発明の抗体またはその一部を使って、OATP発現細胞を破壊する標的指向型抗体（例えば抗体-毒素融合タンパク質または放射標識抗体）を作成することもできる。
【００３５】
また本発明により、本発明の新規OATPタンパク質の一部もしくは全部または本タンパク質の一部をコードするヌクレオチドプローブの構築が可能になる。したがって本発明は、本発明の新規OATPの性質を示すタンパク質または本タンパク質に特有なペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むプローブに関する。本プローブは、例えば検出可能な（例：放射活性）物質で標識して、ヌクレオチド配列の混合物から本発明の新規OATPの性質を示すタンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択するために使用できる。
【００３６】
また本発明は、生殖細胞と体細胞の全てが本発明の組換え分子（好ましくは本発明のOATPまたはその一部をコードする本発明の核酸分子からなる組換え分子）を含有しているトランスジェニック非ヒト動物（例えばマウスまたはラットなどのげっ歯類動物、ウサギまたはブタ）または胚も提供する。組換え分子は構造突然変異を持つ本発明のOATPをコードする核酸配列からなってもよいし、本発明のOATPもしくはその一部をコードする核酸配列と、当該天然タンパク質の発現を駆動する調節要素とは異なる１または複数の調節要素とからなってもよい。もう一つの好ましい態様として、上記の動物は誤発現されるまたは発現されないOATP遺伝子（例えばノックアウト）を持つ。かかるトランスジェニック動物は、本発明のOATPの突然変異または誤発現に関係する障害を研究するためのモデルとして役立ちうる。
【００３７】
さらに本発明は、本発明の新規OATPを結合する能力を持つ物質を同定する方法であって、当該物質と新規OATPタンパク質または同タンパク質の一部との複合体の形成が可能な条件で本発明の新規OATPまたは同タンパク質の一部を反応させ、物質-OATP複合体に関するアッセイ、遊離の物質に関するアッセイ、非複合体化OATPに関するアッセイ、またはOATPの活性化に関するアッセイを行なうことからなる方法も提供する。
【００３８】
本発明は、一態様として、本発明の新規OATPタンパク質、そのアイソフォームまたは同タンパク質の一部に結合する能力を持つ基質を同定する方法であって、本発明の新規OATPタンパク質、そのアイソフォームまたは同タンパク質の一部を、同タンパク質、アイソフォームまたは同タンパク質の一部に結合する能力を持つ可能性がある少なくとも1つの基質と、基質-輸送体タンパク質複合体の形成が可能な条件で反応させ、基質-輸送体タンパク質複合体に関するアッセイ、遊離の基質に関するアッセイ、非複合体化OATPタンパク質に関するアッセイ、またはOATPの活性化に関するアッセイを行なうことからなる方法を提供する。この方法の好ましい一態様では、本発明の新規OATPタンパク質、そのアイソフォームまたは同タンパク質の一部に結合して輸送される能力を持つ基質が同定される。
【００３９】
また本発明は、本発明OATPの潜在的に有用な薬理学的アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法も提供する。本法は、本発明のOATPによって輸送されることが知られている化合物の存在下に、被験薬剤を、本発明の新規OATPを発現させる細胞に添加し、前記既知化合物の輸送の増強または阻害を測定することによって、薬剤候補を試験することからなる。
【００４０】
本発明のOATPは器官（例えば肝臓）内に輸送されうる化合物の同定にも役立つ。肝臓内に能動輸送されることが見出された化合物は、肝臓を標的とする他の治療薬の担体として役立つ。
【００４１】
本発明のOATPまたはその断片（または前記OATPもしくはその断片をコードする核酸）と１または複数の追加成分（例えば担体、希釈剤または溶剤）とを含む組成物も、本発明の範囲に包含される。前記追加成分はその組成物をインビトロまたはインビボでの医薬用途または獣医学的用途に役立つものにする成分であることができる。
【００４２】
本発明のOATPのアゴニストおよびアンタゴニストは本発明に包含される。薬理学的アゴニストまたはアンタゴニストは、本発明のOATPによって輸送される化合物の流れを増加または減少させるのに役立つ。上記本発明のアゴニストおよび/またはアンタゴニストは許容できる担体、希釈剤または溶剤と共に投与することが好ましい。
【００４３】
もう一つの側面として、本発明は、障害（例えば本発明のOATPの異常なまたは不要なレベルまたは生物学的活性を特徴とする障害）の危険にさらされている哺乳動物（例えばヒト）の処置方法に関する。さらに、肝臓障害の危険にさらされている哺乳動物（例えばヒト）の治療方法も、本発明に包含される。OATP2はもっぱら肝臓で発現されるので、OATP2に最適化された化合物は肝臓送達をターゲティングするのに役立つ。これらの化合物はそれ自体が有用な治療薬であるか、または他の治療化合物を肝臓内に連行するのに役立ちうる。さらに、OATP2-化合物相互作用を遮断すると、肝臓による初回通過抽出が減少するために、薬物の血漿濃度が増加し、全身半減期が延びることによる利益が得られる。
【００４４】
また、本発明のOATPの全部または一部を含んでなる融合タンパク質も本発明の範囲に包含される。
【００４５】
本発明の主たる目的は、本明細書に開示する核酸配列およびアミノ酸配列によって同定される新規ヒトOATPの同定である。本発明のさらなる目的は、上記cDNAの使用方法、OATPタンパク質、新規OATPに特異的なモノクローナル抗体、本発明のOATPタンパク質の一部を含んでなる融合タンパク質、および新規OATPのアゴニストおよび/またはアンタゴニストである。
【００４６】
（詳細な説明）
本明細書で使用する用語には、個別に別段の定義を下さない限り、以下の定義が適用される。
【００４７】
「クローニング」−遺伝物質（例えばゲノム、ゲノムライブラリー、またはcDNAライブラリー）から特定の遺伝子をプラスミドまたは他のベクター内に単離すること。
「コード領域」−活性タンパク質をコードする核酸配列の領域。
「OATP」−有機陰イオン輸送タンパク質。
「ストリンジェントな条件」（核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される場合）−0.1×SSCおよび0.1％SDS中、少なくとも約65℃の温度で洗浄を行なうサザンブロット法。Maniatisら著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1982））を参照されたい。本明細書に開示する新規配列を使って新規OATPをコードする核酸配列を同定する際に、よりストリンジェンシーの低い条件（例えば1×または2×SSC、0.1％SDS）を使用しうることは、当業者には理解されるだろう。
「ノーザンブロット法」−相補的核酸（通例、cDNAまたはオリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションによって特定のRNA断片を同定する方法。
「オープンリーディングフレーム」または「ORF」−アミノ酸をコードする一続きのヌクレオチドトリプレットを含有し終止コードを含まないDNA配列。
「プラスミド」−微生物内に見出される細胞質自律複製型DNA要素。
「プロモーター」−RNAポリメラーゼが結合して転写を開始するDNA上の一領域。
「サザンブロット法」−相補的核酸（通例、cDNAまたはオリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションによって特定のDNA断片を同定する方法。
「輸送」−輸送体にばく露した時に生体膜を横切って起こる物質の再分布を測定することによって決定される生体膜を横切る物質の移動。
【００４８】
本明細書における他の用語の定義については、F. Shermanら「Laboratory Course Manual for methods in Yeast Genetics」（コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1987））およびLawin, B.「Genes IV」（オックスフォード大学出版局、オックスフォード（1990））を参照されたい。略号の定義についてはAldrichimica Acta 第17巻第1号（1984）を参照されたい。
【００４９】
用途および有用性
図3に、本発明の新規有機陰イオン輸送タンパク質のアミノ酸配列をこのファミリーの既知の輸送体と整列する。本発明の配列と既知有機陰イオン輸送体の配列の間の配列相同性の程度は、本発明のタンパク質が有機陰イオン輸送体であることを示している。
【００５０】
OATPタンパク質は肝臓への化合物の輸送に関与すると当業者は考えている。当業者は本発明のOATPタンパク質を使って、肝臓への化合物の輸送速度を上昇もしくは低下させる薬剤に関するアッセイ、または特定器官（例えば肝臓）内に運搬することが望まれる他の化合物の担体として役立つ本発明のOATPによって輸送される化合物に関するアッセイを行なうことができる。
【００５１】
したがって、本発明のOATPによる基質輸送速度を上昇もしくは低下させる薬剤、または担体として同定される薬剤は、肝臓疾患の処置に有用である。
【００５２】
本発明のOATPの一部は器官特異的/選択的である（例えばOATP2−肝臓、OATP-RP4−心臓および骨格筋、OATP-RP5−脳および精巣）ので、これらのOATPの特異的基質およびこれらのOATPによって輸送される分子状担体には、化合物特異性が組み込まれる。したがって、本発明の上記OATPによって輸送される薬剤は、それらOATPを発現する組織には送達されるが、上記OATPを持たない組織には送達されず、その結果、組織特異的ターゲティングが達成される。
【００５３】
本発明のOATP核酸またはアンチセンス核酸は有用な治療薬または診断薬になりうる。そのような遺伝子治療を行うために、後述するように、また当技術分野の文献にさらに詳述されているように、本核酸をベクターに組み込み、そして/または製剤化することができる。
【００５４】
また本発明は、薬物に対する応答を予測するための診断的遺伝子検査手段の基礎を提供する。本明細書に開示しクレームする輸送体の少なくとも1つは既知薬物の輸送体である（すなわちOATP2はプラバスタチンを肝細胞内に輸送する）。本明細書に開示する他の輸送体も同様に他の薬物を組織に輸送するだろう。当業者は（1）様々な配列決定法によって一般集団内の対立遺伝子変異体（遺伝子型）に関して本輸送体遺伝子を検査し、（2）患者におけるこれらの輸送体遺伝子型と、輸送された薬物に対する応答との関連を臨床試験で決定することができる。特定の対立遺伝子変異体は薬物の輸送に関して有効性が高いかまたは低い場合があり、それは薬物効力と関係するだろう。したがって、本願輸送体の遺伝子型別は、薬物療法に対する患者の応答を予測するための臨床診断試験の基礎をなしうる。
【００５５】
当業者は、本発明のポリペプチドおよび核酸を使って、ベクター、細胞または細胞株および抗体を作製することができる。これらは全てOATPの正および負のモジュレーター（すなわちアゴニストおよび/またはアンタゴニスト）ならびにOATP担体を同定するためのアッセイに役立つ。本明細書で使用する「正のモジュレーター」という用語は、ある器官（例えば肝臓）内へのある化合物の輸送速度または輸送量を上昇させる化合物、またはある器官内へのある化合物の輸送速度または輸送量を低下させる薬物または化合物を指す。「負のモジュレーター」という用語は、第2の化合物の細胞内へのまたは細胞外への輸送を妨げるために、前記第2の化合物に結合される化合物を指す。本明細書で使用する「担体」という用語は、本発明のOATPによって輸送される薬剤または化合物であって、他の化合物に結合または会合させて当該他の化合物をある器官（例えば肝臓）内に連行することができるものを指す。担体には、ある器官内に本来なら該器官内に輸送されない化合物を輸送するために使用される薬剤が包含され、OATPによって輸送される能力を持つ化合物の器官内への輸送を増加させる薬剤も包含される。
【００５６】
OATPモジュレーターおよびOATP担体はサル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ヒトなどの様々な哺乳動物種に投与できる。医薬分野の当業者はOATPモジュレーターおよびOATP担体を、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤または注射剤などの通常の全身投与用剤形に組み込むことができる。上記の剤形は、必要に応じて生理学的に許容できる担体材料、賦形剤、滑沢剤、緩衝剤、抗菌剤、充填剤（マンニトールなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム）なども含むだろう。
【００５７】
製造方法
概論
本明細書は、OATPの完全長ヒトcDNAクローン、好ましくはOATP2の核酸配列（配列番号１）、OATP2のアミノ酸配列（配列番号２）、OATP-RP2の核酸配列（配列番号３）、OATP-RP2のアミノ酸配列（配列番号４）、OATP-RP3の核酸配列（配列番号５）、OATP-RP3のアミノ酸配列（配列番号６）、OATP-RP4の核酸配列（配列番号７）、OATP-RP4のアミノ酸配列（配列番号８）、OATP-RP5の核酸配列（配列番号９）、OATP-RP5のアミノ酸配列（配列番号１０）、OATP-RP1の核酸配列（配列番号１１）およびOATP-RP1のアミノ酸配列（配列番号１２）のクローニングと機能的発現を記載する。
【００５８】
上記のOATPをコードするヌクレオチド配列を含むDNAクローンは1999年4月20日にAmerican Type Culture Collection（「ATCC」）（バージニア州20110-2209マナッサス、ユニバーシティ・ブールバード10801番）に寄託され、以下のATCC受託番号を与えられている：207209（OATP-RP3）、207210（OATP-RP4）、207211（OATP-RP5）、207212（OATP-RP2）、207213（OATP2）および207214（OATP-RP1）。本明細書で言及する寄託物は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて維持されるだろう。これらの寄託物は当業者の便宜を図って用意したものに過ぎず、米国特許法第112条に基づいて寄託が必要であると認めるものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列と、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列とは、参照により本明細書に組み込まれるものとし、万一、本明細書に記載する配列の説明と何らかの矛盾が生じた場合は、本寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列とそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が優先される。上記寄託物を製造、使用または販売するには許諾が必要な場合があり、本明細書はそのような許諾を与えるものではない。
【００５９】
核酸
本明細書に開示するOATP遺伝子配列を知ることで、当業者は既知の方法によって本発明のOATP核酸を得ることができる。かかる方法には（1）サザンブロット法およびノーザンブロット法、（2）ウェスタンイムノブロット法、（3）化学合成、（4）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)によるプライマーからの合成、（5）発現クローニング、および（6）サブトラクションcDNAクローニングなどがある。
【００６０】
好ましい本発明の核酸配列としては以下の配列（好ましくは以下に示すコード配列）が挙げられる：
OATP2（配列番号１および２）：
【化１】
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【化２】
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【化３】
0004071442.tif 000004
【化４】
0004071442.tif 000005
【００６１】
OATP-RP2（配列番号３および４）：
【化５】
0004071442.tif 000006
【化６】
0004071442.tif 000007
【化７】
0004071442.tif 000008
【化８】
0004071442.tif 000009
【００６２】
OATP-RP3（配列番号５および６）：
【化９】
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【化１０】
0004071442.tif 000011
【化１１】
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【化１２】
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【００６３】
OATP-RP4（配列番号７および８）（Yと記載したヌクレオチド713はC（この場合、コードされるアミノ酸XはLeu）またはT（この場合、コードされるアミノ酸XはPhe）であることができ、Kと記載したヌクレオチド2397はG（この場合、コードされるアミノ酸XはGly）またはT（この場合、コードされるアミノ酸XはVal）であることができる）：
【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
0004071442.tif 000016
【化１６】
0004071442.tif 000017
【００６４】
OATP-RP5（配列番号９および１０）：
【化１７】
0004071442.tif 000018
【化１８】
0004071442.tif 000019
【化１９】
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【化２０】
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【００６５】
OATP-RP1（配列番号１１および１２）：
【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【００６６】
当業者は、本発明のOATPをコードする核酸を改変して有用な突然変異を作製することもできる。例えば配列を改変して核酸中に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を追加することができる。かかる突然変異はサイレントであってもよいし、突然変異したコドンによってコードされるアミノ酸を変化させてもよい。これらの改変核酸は、例えば本発明のOATPをコードする核酸を突然変異させて、コードされているポリペプチド中の１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位または付加をもたらすことによって作製できる。部位特異的突然変異導入法については、Taylor, J.W.ら（1985）Nucl. Acids Res. 13:8749-64およびKunkel, J.A.（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:482-92を参照されたい。さらに、部位特異的突然変異導入用のキットも市販されている（例えばBioRad Laboratories（カリフォルニア州リッチモンド）やAmersham Corp.（イリノイ州アーリントン）が販売）。破壊、欠失および切断法については、Sayers, J.R.ら（1988）Nucl. Acids Res. 16:791-800を参照されたい。
【００６７】
本発明は、例えば（1）選択的スプライスエクソン変異体、（2）対立遺伝子変異体、および（3）融合コンストラクトがOATPまたはその断片を含んでなっているキメラタンパク質などの改変核酸も包含する。本明細書の開示を利用すれば当業者はかかる改変核酸を取得することができる。
【００６８】
発現ベクター
さらに本発明は、本発明のOATPをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。本発明ベクターは、好ましくは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１に示す核酸配列の全部または一部を含み、上記のOATPをコードするヌクレオチド配列（すなわちコード領域）が好ましい。
【００６９】
発現ベクターは通常プラスミドであるが、本発明は、等価な機能を果たすベクターであって、当技術分野で今後知られることになる他の形態のベクターも包含する。当業者は、OATPをコードする配列を適切な宿主細胞の染色体に安定に組み込むこともできる。
【００７０】
発現ベクターは通例、OATPの発現に影響を及ぼす能力を持つ調節要素を含有する。これらの調節要素は、異種または天然OATP配列であることができる。通例、ベクターは複製起点、プロモーターおよび転写終結配列を含有する。ベクターは、発現産物の安定性を図るmRNA安定性配列、発現産物の分泌を図る分泌リーダー配列、構造遺伝子を（例えば成長培地中の栄養素または他の誘導物質の有無によって）調節できるようにする環境フィードバック配列、形質転換された宿主細胞の表現型による選択を可能にするマーキング配列、制限エンドヌクレアーゼによる切断部位を与える制限部位、ならびに原核細胞、酵母、真菌、植物および高等真核生物を含む様々なタイプの宿主での発現を可能にする配列など、他の調製配列も含みうる。
【００７１】
本発明の発現ベクターは少なくとも本発明の核酸およびタンパク質の複製と、好ましくは発現とを指示することができる。適切な複製起点としては、例えばCol E1複製起点、SV40ウイルス複製起点、エプスタイン-バーウイルス複製起点およびM13複製起点が挙げられる。適切なプロモーターとしては、例えばサイトメガロウイルスプロモーター、lacZプロモーター、gal10プロモーターおよびAutographa californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）多角体プロモーターが挙げられる。適切な終結配列としては、例えばウシ成長ホルモン、SV40、lacZおよびAcMNPV多角体ポリアデニル化シグナルが挙げられる。選択可能マーカーの例には、ネオマイシン耐性、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性などがある。
【００７２】
本発明のOATPをコードするDNAはいくつかの市販ベクターに挿入できる。哺乳類細胞に適合するpcDNA3またはpCEP4などのベクター、pBlueBacなどのバキュロウイルスベクター、pcDNA2などの原核ベクター、およびpYes2などの酵母ベクターが挙げられる。ベクター改変技術については、Sambrookら（1989）「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（第2版、コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）を参照されたい。
【００７３】
宿主細胞
さらに本発明は、OATP（好ましくは本発明のOATP2、OATP-RP2、OATP-RP3、OATP-RP4、OATP-RP5またはOATP-RP1）をコードする配列を含む発現ベクターを含有する宿主細胞に関する。本宿主細胞は、好ましくは、実質的に配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１に示すヌクレオチド配列を持つDNA配列の全部または一部（特にそのコード配列）を含む発現ベクターを含有する。適切な宿主細胞には原核細胞（例えば大腸菌HB101、DH5α、XL1Blue、Y1090およびJM101株）と真核細胞（例えばSpodoptera frugiperda昆虫細胞、CHO細胞、COS-7細胞、HEK293細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、およびS. cerevisiae細胞）の両方が含まれる。
【００７４】
発現ベクターは当技術分野で知られる様々な方法によって宿主細胞に導入できる。代表的方法はリン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション、リポソーム融合、核注入法およびウイルスまたはファージ感染によるトランスフェクションである。次に大量のOATPが発現できる条件で宿主細胞を培養することができる。
【００７５】
上記改変宿主細胞は次に示す一般的な5つのアプローチのいずれかによって同定できる：
（a）OATPをコードする配列に相補的なプローブによるDNA-DNAハイブリダイゼーション（サザンブロット法）、
（b）マーカー遺伝子機能（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性など）の検出。マーカー遺伝子はOATP配列と同じプラスミド中の同じプロモーターまたは異なるプロモーターの制御下に置くことができる、
（c）ハイブリダイゼーションアッセイ（例えばRNA配列に相補的なプローブを用いるノーザンブロット法またはヌクレアーゼ保護アッセイ）によるmRNA転写物の検出、
（d）遺伝子発現の免疫検出（例えばOATPに対する抗体を用いるウェスタンブロット法による検出）、
（e）発現ベクター配列またはOATPをコードする配列に相同なプライマーを使ったPCR。このPCRは予想される長さのDNA断片を生成して、宿主細胞中に当該発現系が組み込まれていることを示す。
【００７６】
DNA配列は様々な既知の方法によって決定できる。例えばSangerら（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-7に記載のジデオキシ連鎖停止法およびMaxam-Gilbert（1977）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-4に記載のマクサム-ギルバート法を参照されたい。
【００７７】
本発明の宿主細胞は、本明細書から明白な種々の方法で使用できる。本細胞は、本発明のOATPに結合するかまたは本発明のOATPの機能を他の形で調整もしくは調節する化合物であってOATP2、OATP-RP2、OATP-RP3、OATP-RP4、OATP-RP5またはOATP-RP1活性の調整（例えば活性化または不活化）に役立つであろう化合物のスクリーニング、シグナル伝達機序とタンパク質-タンパク質相互作用の研究、および後述の用途に使用するOATPの製造に使用できる。
【００７８】
全ての発現ベクターとDNA調節配列が同等にうまく機能して本発明のDNA配列を発現させるわけではない。全ての宿主細胞が同じ発現系で同等にうまく機能するわけではない。しかし当業者は、本明細書に示す指針を利用することにより、不当な実験を行なったり本発明の範囲から逸脱することなく、発現ベクター、DNA調節配列および宿主細胞の中から選択することができる。
【００７９】
ポリペプチド
さらに本発明は、本発明のOATPのアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドに関する。配列番号２（OATP2）、配列番号４（OATP-RP2）、配列番号６（OATP-RP3）、配列番号８（OATP-RP4）、配列番号１０（OATP-RP5）または配列番号１２（OATP-RP1）に示すアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドが好ましい。本発明のOATPの一部を使用する場合は、その部分が元のOATPと同じ生物学的活性を示すことが好ましい。例えば、OATP2、OATP-RP2、OATP-RP3、OATP-RP4、OATP-RP5またはOATP-RP1の全部または一部を含み輸送活性を示すポリペプチドは本発明の範囲に包含される。また、当該タンパク質は輸送活性を示しえないが、当該タンパク質もしくはその一部を調整するかまたは当該タンパク質もしくはその一部に結合する化合物のスクリーニングに使用することができるように、上記の部分が１または複数の突然変異を含有してもよい。
【００８０】
これらのポリペプチドは当技術分野で知られている方法によって製造できる。例えば、Houghtonら（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. 82:5131-5に記載されている固相法などの化学合成法を使用できる。もう一つの方法はmRNAのインビトロ翻訳である。また、上述した宿主細胞中でポリペプチドを産生させてもよく、これは好ましい方法である。例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１の全部または一部からなるDNAを上述のようにPCRによって合成し、合成したDNAを発現ベクターに挿入し、その発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、その宿主細胞を培養して、所望のポリペプチドを製造することができる。
【００８１】
上記のポリペプチドは、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーなど、いくつかある既知技術のいずれかによって単離、精製することができる。例えばニッケルカラムでの精製が可能になるようにヒスチジンタグをタンパク質に付加してもよい。
【００８２】
本発明のポリペプチドは幅広く様々な方法で使用できる。例えば本発明のポリペプチドを使ってポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製することができる。得られた抗体は免疫検出（例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイまたは免疫細胞化学）、様々な供給源からのポリペプチドの免疫精製（例えばアフィニティークロマトグラフィー）または免疫療法に使用できる。
【００８３】
既知の技術を使って改変OATPを製造することができる。このような改変は、活性の増減を引き起こしたり、タンパク質産生レベルを高めたり、またはタンパク質の精製を簡単にしたりするものであることができる。このような改変は結合に関与する特定のOATPアミノ酸を同定するのに役立ち、延いてはOATPモジュレーターの合理的薬物設計に役立つ。関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および/または両親媒性の類似性に基づいてアミノ酸置換を施すことができる。例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸とグルサミン酸があり、正に荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがあり、類似する親水性値を有し非荷電極性ヘッドグループまたは無極性ヘッドグループを持つアミノ酸には以下のアミノ酸がある：ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニン、チロシン。これらの改変ポリペプチドは全て本発明の範囲に包含される。
【００８４】
好ましい類似体には、１または複数の保存的アミノ酸置換、または類似体の生物学的活性を消失させない１または複数の非保存的アミノ酸置換、欠失または挿入を本発明の新規OATP（またはその生物学的活性断片）との相違点とするタンパク質が含まれる。保存的置換には、通例、類似した特徴を持つアミノ酸間での置換、例えば次の各グループ内での置換が包含される：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；フェニルアラニン、チロシン。他の保存的アミノ酸置換は以下の表から採用することができる。
【表１】
保存的アミノ酸置換
0004071442.tif 000026
【００８５】
本発明に包含される他の類似体には、タンパク質またはペプチドの安定性を増加させる改変を施されたものがある。例えばそのような類似体はそのタンパク質またはペプチド配列中に１または複数の（ペプチド結合の代わりをする）非ペプチド結合を含有しうる。また、天然に存在するL-アミノ酸以外の残基、例えばD-アミノ酸または非天然もしくは合成アミノ酸（例えばβ-またはγ-アミノ酸）を含む類似体も包含される。
【００８６】
上記ポリペプチドの他の変異体も数多く考えられる。そのような変異体には、ポリペプチドの塩およびエステルならびに上記ポリペプチドの前駆体（例えばメチオニン、N-ホルミルメチオニンおよびリーダー配列などのN末端置換基を持つもの）がある。本発明はそのような変異体を全て包含する。
【００８７】
核酸検出方法
さらに本発明はOATPタンパク質をコードする核酸を検出する方法に関する。この方法では（a）配列未知の核酸を、既知のコード配列に相補的な配列を持つ核酸（例えば配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１（特にそのコード配列）に由来する少なくとも約10ヌクレオチドの配列）と接触させ（後者の核酸は検出可能なマーカーを持つ）、（b）配列未知の核酸のいずれかに結合したマーカーの存在を決定する。結合したマーカーの存在は、所望の核酸の存在を示す。この方法は、他の組織に由来するOATP核酸（これは異なる調節要素をもっているかもしれない）および他の種（例えばサル）に由来する核酸を検出するために応用することができる。
【００８８】
この方法で解析される核酸を得る方法は当業者には一般に知られている。ゲノムDNAの場合は、組織を急速凍結し、その組織を容易に消化できる断片に破砕し、破砕した組織をプロテイナーゼKおよびSDS中でインキュベートして、細胞性タンパク質の大部分を分解することができる。次に、逐次フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出を行なうことによってゲノムDNAを除タンパクし、エタノール沈殿によってDNAを回収し、回収したDNAを乾燥し、緩衝液に再懸濁することができる。RNAの場合は、培養細胞を4Mグアニジニウム溶液中で溶解し、溶解液を20ゲージ針で取り出し、塩化セシウム段階勾配によってRNAをペレット化し、上清を除去することができる。このペレットは精製されたRNAを含有するはずである。
【００８９】
検出可能なマーカーは、相補的核酸のヌクレオチドの一つに結合した放射性イオンであることができる。一般的な放射性ラベルは32Pおよび35Sであるが、ビオチンなどの他のラベルを使用してもよい。相補的核酸にラベルを取り付ける様々な方法（例えばランダムプライマーによる32Pまたは35S結合法）が当業者には知られている。
【００９０】
上記のような核酸検出法の実施方法は当業者には広く知られている。例えば放射標識されたOATP相補ヌクレオチドプローブを使ってサザンまたはノーザンブロットを行なうことができる。その場合はオートラジオグラフィーによってハイブリダイゼーションを検出できる。マーカーに応じて他の検出方法（例えば分光測光法）も使用できる。
【００９１】
OATPモジュレーターおよび本発明のOATPによって輸送される化合物を検出する方法
さらに本発明は、本発明のOATPのモジュレーターを検出する方法および本発明のOATPによって輸送される化合物（例えば他の化合物の担体として使用できる肝臓内に輸送される化合物）を検出する方法に関する。OATPモジュレーターのスクリーニングでは、OATPタンパク質を発現させる細胞における分子（例えばポリペプチド、天然物、合成化合物）の結合を検出する。もう一つの選択肢として、正のOATPモジュレーターおよび/または負のOATPモジュレーターのスクリーニングでは、既知化合物の輸送の増強および/または阻害を検出する。OATP被輸送化合物のスクリーニングでは、OATPによる分子（例えばポリペプチド、天然物、合成化合物）の輸送を検出する。
【００９２】
本発明のOATPのクローニングと配列決定により、OATPに結合し、OATP活性を調整し、そして/またはOATP活性によって輸送される天然物および合成化合物のスクリーニングに役立つ細胞の構築が可能になる。OATPモジュレーターを検出する方法には、上述のように適切なベクターを適合する宿主細胞に形質転換する必要がある。得られた形質転換細胞を試験物質（例えば合成化合物または天然物）で処理し、次に試験化合物の存在下および不在下で活性を測定する。
【００９３】
OATPアッセイ
OATP活性を測定するためのアッセイは次のように行なわれる。HEK293細胞をポリ-d-リジン被覆培養皿中のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）＋10％ウシ胎仔血清＋ペニシリンおよびストレプトマイシンに播種し、Lipofectamine Plus（Life Technologies，Inc.）を使ってOATP輸送体発現プラスミドを同時トランスフェクトする。24時間後に細胞と培地を基質輸送についてアッセイする。もう一つの選択肢として、OATPを安定に発現させるように操作された細胞株を播種して、トランスフェクションを行なわずに直接アッセイすることもできる。輸送を測定するために、培地を除去し、無血清DMEMで１回洗浄し、[3H]-基質だけを含む同じ培地を加えることによって、または様々な濃度の非標識試験化合物の存在下で、単層を三重にアッセイする。OATP2の場合は、[3H]-基質を[3H]-プラバスタチン、[3H]-タウロコール酸または[3H]-硫酸デヒドロエピアンドロステロンとするか、または［125I]-甲状腺ホルモン（T4）とすることができる。単層は輸送体に応じて室温で5〜10分間インキュベートする。次に、細胞を5％BSAを含有する氷冷DMEMで1回、0.1％BSAを含むDMEMで2回、そしてDMEM単独で1回、すばやく洗浄する。細胞を0.1N NaOH中で溶解し、溶解液の一部を使って放射性ラベルの組み込みを、液体シンチレーション計数によって決定し、別の一部を使って溶解液中のタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイによりBSAを標品として決定する。輸送活性は細胞内に輸送された基質のモル数/mg-細胞タンパク質/分として表す。
【００９４】
薬物ターゲティング
本発明のOATPの組織発現も本発明に包含される。本発明のOATPは、本明細書に記載のOATPを発現させる特定の器官に薬物をターゲティングするためおよび内因性基質の濃度を調整するためにも役立つ。
【００９５】
例えば、本明細書に開示する新規有機陰イオン輸送体OATP2は、胆汁酸および男性ホルモンである硫酸デヒドロエピアンドロステロン（「DHEAS」）を含むいくつかの生物学的に重要な有機陰イオンの細胞取り込みと、起こりうる分泌とを調整する能力を持つので、治療標的候補である。さらにまた、OATP2は少なくとも１つの薬物（すなわちプラバスタチン）を輸送し、このファミリーの他のメンバーは様々な他の生体異物を輸送することが知られているので、この輸送体は肝臓内への薬物の送達または他の組織からの薬物の排出を最適化するために利用できるだろう。
【００９６】
OATP2は、それがもっぱら肝臓だけで発現される唯一の既知有機イオン輸送体である点で、OATPファミリーのなかでもユニークである。したがってこの輸送体に最適化された薬物は、他の既知の輸送体のどれよりも高い選択性で肝臓に送達されるようにターゲティングすることができる。このアプローチを一般化するために、OATP2によって効率よく認識され輸送される小分子「アダプター」（OATP2被輸送化合物）を同定することができるだろう。そして、肝臓ターゲティング用の他の薬物がOATP2によって輸送されない場合は、当該他の薬物に前記アダプターを添付することができる。
【００９７】
もう一つの選択肢として、治療化合物がもっぱらまたは実質的にOATP2によって肝臓内に取り込まれる場合は、OATP2による輸送を許さない機能を該化合物に付加することによって、肝クリアランスを阻害し、それによって循環濃度を上昇させるか、末梢における化合物半減期を増大させることができる。また、内因性物質が肝臓取り込みおよび循環系からのクリアランスにOATP2を利用している場合は、競合的または非競合的なOATP阻害剤によって、該物質の血漿レベルを上昇させることができる。例えばDHEASは、年齢と共に減少する副腎アンドロゲンであり、いくつかの動物データによれば、DHEAS欠乏症の代償療法は加齢性免疫不全症を刺激し、認識機能とインスリン感受性を増大させ、骨量を維持しうることが示唆されている。DHEASのOATP2との相互作用を遮断することによって内因性DHEASの肝クリアランスを阻害すると、ホルモン補充を行なわなくてもホルモンレベルを上昇させることができるだろう。
【００９８】
本明細書に記載する情報を使えば、当業者は、本明細書に開示するOATP（例えばOATP2）によって輸送される分子（天然分子と合成分子の両方（治療薬を含む））を同定することができる。OATPは全体として一般に広い基質特異性を示す（「多特異性」輸送体）。したがって、これらの輸送体にはさらに多くの基質が同定されると予想される。
【００９９】
遺伝子治療
センス核酸分子およびアンチセンス核酸分子は、OATP関連適応症のための治療薬として使用することもできる。所望のDNAまたはRNAの合成を指示するベクターを構築するか、当技術分野の文献に記載されているように核酸を製剤化することができる。
【０１００】
アンチセンス分子の有用性はいくつかの文献で述べられている。ToulmeおよびHelence（1988）Gene 72:51-8、Inouye（1988）Gene 72:25-34、UhlmannおよびPeyman（1990）Chemical Reviews 90:543-584、Biotechnology Newswatch（1996年1月15日号）の第4頁、Robertson（1997）Nature Biotechnology 15:209（1997）、GibbonsおよびDzau（1996）Science 272:689-93を参照されたい。アンチセンス分子はゲノムDNAおよび/またはcDNA、5'および3'隣接制御領域、他の隣接配列、イントロン配列、三重鎖DNAの形成に使用される非古典的ワトソン-クリック塩基対形成配列に基づいて設計できる。このようなアンチセンス分子にはアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体などが含まれ、少なくとも約15〜25塩基からなりうる。
【０１０１】
アンチセンス分子はOATP DNAまたはRNAに非共有結合的または共有結合的に結合しうる。そのような結合は、例えばOATP DNAまたはRNAを切断するか、その切断を容易にするか、核または細胞質mRNAの分解を増進するか、あるいは転写、翻訳、トランス活性化因子の結合またはプレmRNAのスプライシングもしくはプロセシングを阻害することができるだろう。アンチセンス分子は、安定性、細胞内外への輸送、結合親和力、標的分子の切断などを増大させる機能をさらに含有してもよい。これらの効果はすべてOATPタンパク質の発現量を減少させ、したがってそのアンチセンス分子をOATPモジュレーターとして有用なものにするだろう。
【０１０２】
（実施例）
以下の実施例は本発明の理解を助けるために記載するものであって、もっぱら特許請求の範囲によって定義される本願発明の範囲を制限するものではない。
【０１０３】
実施例１
OATP2、OATP-RP1、OATP-RP2、OATP-RP3、OATP-RP4およびOATP-RP5完全長cDNAの単離および哺乳類発現ベクターへのクローニング
ヒトOATP2はヒトOATPに相同な配列に関して公開ESTデータベースを検索することによって同定された。一つのEST配列、GenBankアクセッション番号T753863が、OATPと有意な配列一致度を持つ部分cDNAをコードしていた。OATP-RP1、OATP-RP2、OATP-RP3、OATP-RP4およびOATP-RP5の部分cDNAをコードするEST配列は、ヒトOATPに相同な配列に関して公開ESTデータベースとIncyte, Inc. ESTデータベースを検索することによって同定された。OATP-RP1に対応するESTクローンIDは820117、2668489、1610706、2972518および588148である。これらのクローンは完全長cDNAの一部だけをコードするコンティグに相当する。OATP-RP2に対応するIncyte ESTクローンIDは1664737および2641944である。これらのクローンは完全長cDNAの一部だけをコードするコンティグに相当する。OATP-RP3に対応するIncyte ESTクローンIDは2493241、2497845および2664024である。これらのクローンは全長cDNAの一部だけをコードするコンティグに相当する。OATP-RP4に対応するIncyte ESTクローンIDは1494683および1685219である。これらのクローンは完全長cDNAの一部だけをコードするコンティグに相当する。OATP-RP5に対応するIncyte ESTクローンIDは925716である。このクローンは完全長cDNAの一部だけをコードする。上記遺伝子のそれぞれの完全長クローンはGene Trapper cDNA Positive Selection System（Life Technologies，Inc.）を使って取得した。この方法では、ESTコンティグまたは個々のEST配列のそれぞれに相補的な１または複数のオリゴヌクレオチドの3'末端をビオチン化し、pCMVSport2（LifeTechnologies，Inc.）中に構築した一本鎖ヒトcDNAライブラリーへのハイブリダイゼーションに使用した。各遺伝子に使用したオリゴヌクレオチドの配列およびスクリーニングしたライブラリーの由来組織を表２に示す。
【表２】
Gene-Trapper Selectionを用いてOATP完全長cDNAを選別するために使用したオリゴヌクレオチド
0004071442.tif 000027
【０１０４】
ビオチン化オリゴヌクレオチドと一本鎖cDNAとのハイブリッドをストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ上に捕捉した。洗浄後、捕捉した一本鎖cDNA標的をビオチン化オリゴヌクレオチドから解離させ、DNAポリメラーゼによってdsDNAに変換した。形質転換と平板培養の後、各遺伝子についていくつかの陽性クローンを配列決定によって同定した。OATP-RP1の場合は、上記の技術によって部分cDNAを得た（pSP-RP1A）。OATP-RP1コンティグの一部であるもう一つのcDNAクローンは公開ESTデータベースを検索することによって同定された（GenBankアクセッション番号AI027850）。OATP-RP1（配列番号１１）の最初の477ヌクレオチドを含有するこのクローン（Research Genetics, Inc.から入手）のEcoRI-NotI断片を、EcoRI-NotI消化したpSP-RP1Aに結合して、完全長配列を作製した。
【０１０５】
複数のOATP-RP4 cDNAクローンを配列決定したところ、2つの多型部位が同定された。すなわち、配列番号７のヌクレオチド番号713は配列番号8でLeuをコードするCであるか、配列番号８でPheをコードするTであることができる。同様に、配列番号７のヌクレオチド番号2397は、配列番号８でGlyをコードするGであるか、配列番号８でValをコードするTであることができる。
【０１０６】
発現研究のために、CMVプロモーター駆動型発現カセットが反転しているpCEP4（Invitorogen，Inc.）の改変型発現ベクターpCEP4βRに、OATP2 cDNAをクローニングし、一過性トランスフェクションに使用した。これを達成するために、配列番号１のヌクレオチド59〜2361に相当するpCMVSport2中のOATP2 cDNAをKpnIおよびNotIによる消化で切り出した。この断片をKpnI-NotI消化pCEP4βRにクローニングした。このクローン、pCEP-OATP2を、一過性トランスフェクション発現研究に使用した。
【０１０７】
実施例２
OATP2、OATP-RP1、OATP-RP2、OATP-RP4およびOATP-RP5の組織および細胞分布
OATP2、OATP-RP1、OATP-RP2、OATP-RP4およびOATP-RP5発現の組織分布を、様々なヒト細胞に由来するポリA+RNAのノーザンブロッティングによって決定した（図１）。過去に文献に記載されたこのファミリーの輸送体、すなわちヒトOATP、ラットoatp1、ラットoatp2およびラットoatp3は全て、肝臓、腎臓および脳に発現する。上記の輸送体は全て、胆汁酸と、これらの輸送体の一部に特異的な他の様々な基質とを輸送する。これに対し、やはり胆汁酸を輸送するOATP2の発現は極めて肝臓特異的であり、大きい3.2kbのハイブッド形成バンドおよびいくつかの小さいハイブリッド形成バンドが肝臓由来のRNAだけに観察され、他の組織由来のRNAには観察されなかった。この輸送体を発現させる特異的細胞タイプを、ヒト肝標本に対するOATP2リボプローブのインサイチューハイブリダイゼーションによって調べた。強いハイブリダイゼーションシグナルが肝小葉の全体にわたる肝細胞に局在して見え、小葉中心領域、中間帯領域または門脈周囲領域の間でシグナル強度の有意な相違はなかった。胆管、クップファー細胞または血管にはシグナルは観察されず、またヒト肺由来のどの細胞タイプにもシグナルは観察されなかった（非掲載データ）。
【０１０８】
OATP-RP1は試験したほとんど全ての組織に発現し、骨格筋、肺、胎盤および心臓に最も豊富だった。OATP-RP2は試験した全ての組織に遍在的に発現する。OATP-RP4ははるかに制限された発現パターンを持ち、骨格筋と心臓では豊富であり、前立腺と胸腺でははるかに少ない。OATP-RP5の発現も組織特異的であり、脳と精巣とが、転写物が検出される唯一の部位だった。
【０１０９】
実施例３
トランスフェクト細胞におけるOATP2の発現
HEK293細胞誘導体である293EBNA細胞（Invitorogen，Inc.）にOATP2発現ベクターpCEP-OATP2またはpCEP4ベクターのみ（MOCK）をトランスフェクトし、[3H]-標識基質の輸送を24時間後に決定した。図2Aは[3H]-プラバスタチンおよび[3H]-DHEASの特異的取り込みを表す。図2Bおよび2Cはそれぞれ[3H]-タウロコール酸および[125I]-甲状腺ホルモン（T4）の特異的取り込みを表す。pCEP-OATP2または空のベクター（MOCK）をトランスフェクトした細胞内への放射標識基質の5分間の取り込みを過剰の非標識基質の不在下（黒いバー）および存在下（白いバー）で決定した。このようにOATP2は少なくとも一部のHMG CoAレダクターゼ阻害剤、胆汁酸、副腎ステロイドおよび甲状腺ホルモンの肝特異的ヒト輸送体である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  OATP2、OATP-RP1、OATP-RP2、OATP-RP4およびOATP-RP5のmRNA組織分布を示すノーザンブロット。各レーンの上に示した略号に対応する組織を下に示す。
【図２】  OATP2がプラバスタチン、硫酸デヒドロエピアンドロステロン（DHEAS）、タウロコール酸および甲状腺ホルモン（T)を輸送することを示す図。図2Aは[3H]-プラバスタチンおよび[3H]-DHEASの特異的取り込みを示す。図2Bは[3H]-タウロコール酸の特異的取り込みを示す。図2Cは[125I]-甲状腺ホルモン（T4）の特異的取り込みを示す。pCEPOATP-RP1または空のベクター（MOCK）をトランスフェクトした細胞への5分間にわたる放射標識基質の取り込みを過剰の非標識基質の不在下（黒いバー）および存在下（白いバー）で決定した。
【図３】  OATPファミリーメンバーの配列アラインメントを示す図。ヒトOATP2、OATP-RP1、OATP-RP2、OATP-RP3、OATP-RP4およびOATP-RP5のタンパク質配列が他の既知OATPファミリーメンバーと整列されている。コンセンサス配列も太字で示してある。コンセンサスは、与えられた位置で12個の配列のうち少なくとも6個が一致した場合に表示した。コンセンサスと合致する残基は大文字で記載した。
【図１】
0004071442.tif 000028
【図２】
0004071442.tif 000029
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0004071442.tif 000031
【図３Ｃ】
0004071442.tif 000032
【図３Ｄ】
0004071442.tif 000033
【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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