(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト前立腺細胞に特異的なエンハンサープロモーター（ＰＳＥ）の転写制御下にE1A、E1B、E4及びこれらの組み合わせからなる群から選択される増殖に必須のアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクター。
【請求項２】
さらにトランスジーンを含み、該トランスジーンが異種プロモーターの転写制御下にある、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３】
前記トランスジーンが細胞傷害性遺伝子である、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４】
該ＰＳＥがヒト前立腺特異的抗原遺伝子の転写開始部位に対して−5322から−3739の領域中のエンハンサー配列を含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５】
前記アデノウイルスベクターが該ＰＳＥの転写制御下にあるトランスジーンを含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６】
前記アデノウイルスベクターが前立腺特異的抗原を発現する哺乳動物細胞で複製コンピテントである、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７】
前記プロモーターがヒト前立腺特異的抗原遺伝子の転写開始部位に対して−540から＋８のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項８】
前記アデノウイルスベクターが、アデノウイルスヌクレオチド300から3600および27000から31000の間の領域のうちの少なくとも１つで欠失を有するＡｄ５ベクターである、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項９】
請求項１に記載のアデノウイルスベクターを用いて形質転換されたインビトロ細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載のアデノウイルスベクターを含む、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を発現する細胞における該アデノウイルス複製用組成物。
【請求項１１】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）がヒト前立腺特異的抗原である、請求項１０記載のアデノウイルス複製用組成物。
【請求項１２】
前立腺特異的抗原を発現する細胞における腫瘍を処置するための医薬の製造における、請求項１に記載のアデノウイルスベクターの使用。
【請求項１３】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）がヒト前立腺特異的抗原である、請求項１２に記載のアデノウイルスベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
関連出願に対する相互参照
本願は、1995年６月27日に出願した出願番号08/495,034の一部継続出願であり、その開示は本明細書中に参考として援用される。
緒言
技術分野
本発明の分野は細胞トランスフェクションである。
背景
インビトロおよびインビボで細胞の遺伝子型および表現型を変化させる能力は、多くの適用を有する。特に、専門化された（dedicated）細胞について、生理学的プロセスを研究するために、表現型を改変して特定のプロセスに影響し得ることに実質的な関心がある。生理学的経路のメンバーの量を増強するか、または弱めることにより、経路のメンバーの活性を阻害することにより、天然に存在するメンバーの対立遺伝子または変異アナログを提供することにより、この経路における種々のメンバーの役割、メンバーが関与する順番、代替経路の存在などを解明し得る。また、タンパク質を産生するために細胞を使用し得る。
アデノウイルスは、細胞の効率的な形質導入のために細胞増殖を必要としない。トランスジーンの導入により改変されたアデノウイルスは、タンパク質の一過性発現を提供する。アデノウイルスは、１つ以上の必須遺伝子を不活化することにより無能力にされ、次いでトランスフェクションにおける使用のためにヘルパー細胞株においてパッケージングされ得る。従って、アデノウイルスは、適切なように、細胞形質を改変するか、または細胞を殺傷するための便利なビヒクルを提供する。
多くの医学的適用のために、インビボまたはエクスビボにおいて標的細胞を特異的に改変し得ることに関心がある。改変は、ランダムなDNAの組み込みと関連し得（これにより、細胞内で遺伝子欠損を相補する遺伝子能力が導入され）、改変された細胞からの産物（これはそうでなければ宿主により検出不能に産生されるか、または産生されない）の分泌を提供し、疾患（特にウイルス疾患）などからの防御を提供する。多くの状況において、有効であるために、標的細胞の高いトランスフェクション効率を有さなければならない。このことは、特にインビボ改変において真である。さらに、エクスビボまたはインビボで存在し得る他の細胞と比較した場合、標的細胞に対する高い特異性を有することが望ましい。
遺伝子治療は、標的細胞へのクローン化した遺伝子の導入を包含する。種々のウイルスビヒクルおよび非ウイルスビヒクルが、これらの遺伝子を導入するために開発されてきた。ウイルスのうち、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、シンドビスウイルス、ボックスウイルスおよびアデノウイルスが、遺伝子導入のために使用されている。これらのビヒクルの全ては異なる性質を有する。例えば、レトロウイルスは、感染細胞の分裂の後、染色体に形質導入される遺伝子を組み込むことにより、高い効率でインビトロで遺伝子を形質導入する。アデノ随伴ウイルスは、分裂細胞および静止細胞の両方において、形質導入される遺伝子を安定に組み込み、そして発現し得る。対照的に、リポソームおよびアデノウイルスは、一過性遺伝子発現のみを可能にし、そして分裂標的細胞および静止標的細胞の両方を形質導入する。
ウイルスのうち、アデノウイルスは、最も容易に産生され、そして精製されるが、レトロウイルスは、不安定で、産生し難く、そして精製するのは不可能である。両方のクラスのウイルスは、高い効率で細胞を形質導入する。リポソームは、ウイルスと異なり、遺伝子の反復用量を可能にすることを保証し、免疫原性ではない。しかし、DNAと複合体化されたリポソームは、商業的な量で生産し難く、そして非効率的な遺伝子導入ビヒクルであり、たいていは標的細胞の１％未満しか形質導入しない。
遺伝子治療プロトコルの２つの主要な分類（インビボおよびエクスビボ）がある。インビボは、通常吸入または注射により、直接患者に治療薬剤を投与することをいうが、経口投与がいくつかの例において示唆されている。エクスビボ遺伝子治療は、患者から細胞を取り出し（例えば、生検で）、その細胞を組織培養に置き、その組織培養中の細胞に遺伝子を導入し、新しく遺伝子操作された細胞を特徴付け、そして最終的に静脈内注入により患者にその細胞を戻すプロセスをいう。治療的には、レトロウイルスは、エクスビボ導入にたいていは使用されるが、アデノウイルスおよびリポソームはインビボ遺伝子導入にたいていは使用される。
複製欠損アデノウイルスによるガンの処置において、宿主免疫応答は、２つのレベルで反復用量の治療薬剤の持続時間を制限する。第１に、アデノウイルス送達ビヒクル自体が免疫原性である。第２に、後期ウイルス遺伝子が形質導入細胞において頻繁に発現され、細胞性免疫を誘発する。従って、サイトカイン、腫瘍抑制遺伝子、リボザイムまたは自殺遺伝子を繰り返し投与する能力は、遺伝子発現の一過性の性質、ならびに遺伝子導入ビヒクルおよび導入ビヒクルのウイルス遺伝子産物の両方の免疫原性により制限される。
第１の場合、ベクターの免疫原性は、腫瘍特異的抗原に対する、細菌毒素と複合体化したマウスモノクローナル抗体が直面する問題に類似している。治療薬剤としてのこれらのタンパク質の使用（10年前に普及していた）は、必要とされる高用量および最終的には免疫原性により失敗した。導入ビヒクルの免疫原性が反復用法を制限する前に、その効力が改善されて臨床的に有用な治療終点を達成し得ない限り、同じ運命は複製欠損アデノウイルスに起こり得る。
第２の場合、形質導入細胞において、生じる免疫原性とともに、後期アデノウイルス遺伝子の所望でない転写および発現を排除するための工程が取られてきた。
従って、インビボでのこのようなベクターの使用における現在の限定および制限を実質的に低減するウイルスベクターを開発し得ることに実質的な関心がある。
関連文献
GrahamおよびVan de Eb（1973）Virology 52:456-467;Takiffら（1981）Lancet ii:832-834;BerknerおよびSharp（1983）Nucleic Acid Research 11:6003-6020;Graham（1984）EMBO J 3:2917-2922;Bettら（1993）J.Virology 67:5911-5921;ならびにBettら（1994）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8802-8806は、遺伝子改変されて複製欠損遺伝子導入ビヒクルを生成するアデノウイルスを記載する。これらのビヒクルにおいて、初期アデノウイルス遺伝子産物E1AおよびE1Bは欠失され、そしてFrank Graham（Grahamら（1987）J.Gen.Birol.36:59-72およびGraham（1977）J.Genetic Virology 68:937-940）により開発されたパッケージング細胞株293によりトランスで提供される。形質導入される遺伝子は、一般に、ウイルスゲノムの欠失されたE1AおよびE1B領域においてアデノウイルスに挿入される（Bettら（1994）、上述）。遺伝子の効率的な遺伝子導入のためのビヒクルとしてのアデノウイルスベクターは、Stratford-Perricaudet（1990）Human Gene Therapy 1:241-256;Rosenfeld（1991）Science 252:431-434;Wangら（1991）Adv.Exp.Med.Biol.309:61-66;Jaffeら（1992）Nat.Gent.1:372-378;Quantinら（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584;Rosenfeldら（1992）Cell 68:143-155;Stratford-Perricaudetら（1992）J.Clin.Invest.90:626-630;Le Gal Le Salleら（1993）Science 259:988-990;Mastrangeliら（1993）J.Clin.Invest.91:225-234;Ragotら（1993）Nature 361:647-650;Hayaskiら（1994）J.Biol.Chem.269:23872-23875により記載されている。
発明の要旨
制限された細胞型の形質導入のためのビヒクルとしての、アデノウイルスベクターおよびその使用のための方法が提供される。アデノウイルスベクターは、複製欠損またはコンピテントのいずれかである。複製欠損アデノウイルスベクターについて、アデノウイルスは、そこにおいて初期遺伝子がトランスで相補され得る標的細胞においてのみ増殖し得る。さらに、１つ以上の後期遺伝子および/または１つ以上のトランスジーンは、目的の標的細胞においてのみ転写的に活性である転写開始領域の制御下にあり得る。複製コンピテントアデノウイルスベクターについて、増殖に必須な初期および/または後期遺伝子の１つ以上のプロモーターは、上記の転写開始領域と置換され、ここで細胞特異的プロモーター下のトランスジーンがまた存在し得る。
アデノウイルスベクターは、種々の徴候の処置において、および一過的にトランスジェニックである哺乳動物宿主を作製し、そして内因性転写開始領域の細胞調節と平行して、調節されたアデノウイルス増殖およびトランスジーン発現を可能にするための使用を見出す。標的細胞において転写的にコンピテントであるアデノウイルスについて、アデノウイルスは細胞を殺傷するために使用され得るが、必要に応じて、１つ以上の目的のタンパク質を産生し得る。
特定の実施態様の説明
複製欠損または複製コンピテントアデノウイルスビヒクルが提供される。ウイルスは、標的宿主細胞により特異的に調節される転写開始領域の転写制御下にある少なくとも１つの遺伝子を含む。特異的に調節される転写開始領域により調節される遺伝子は、初期もしくは後期アデノウイルス遺伝子および/またはトランスジーンであり得る。特定の宿主細胞標的に制限される調節された転写を提供することにより、他の宿主細胞型とは異なるように、宿主標的細胞に遺伝子能力を導入するためのビヒクルとして使用され得るアデノウイルスを提供し得る。トランスジーンは、アデノウイルスの存在から生じる遺伝子型または表現型の任意の改変に加えて、標的細胞の遺伝子型または表現型を改変するように働く。コンピテントアデノウイルスを用いて、アデノウイルスの増殖は、その細胞傷害性効果のために使用され得る。
多くの異なる型のアデノウイルス（例えば、Ad2、Ad5およびAd40）があり、これらはわずかな程度またはかなりの程度で異なり得る。特に、Ad5とAd40とは、それらの宿主細胞向性（tropism）ならびにウイルスにより誘導される疾患の性質について異なる。本発明の目的のために、Ad5が例示される。
本発明について関心のあるアデノウイルス遺伝子は、２つの群（初期遺伝子および後期遺伝子）に分けられ得、後者の発現は主要後期プロモーターにより制御される。初期遺伝子の中には、E1A、E1B、E2、E3、およびE4がある。E1A遺伝子は、ウイルス感染の直後（０〜２時間）およびすべての他のウイルス遺伝子が発現する前に発現する。E1Aタンパク質は、トランス作用ポジティブ作用転写調節因子として作用し、そして他の初期ウイルス遺伝子およびプロモーター近位主要後期遺伝子の発現に必要とされる。その名称にかかわらず、主要後期プロモーターにより駆動されるプロモーター近位遺伝子は、Ad5感染後の初期の間に発現する。機能的E1A遺伝子の非存在下で、ウイルスDNA複製に必要な遺伝子産物が産生されないので、ウイルス感染は進行しない。
E1Bタンパク質はトランスで機能し、そして核から細胞質への後期mRNAの輸送に必要である、E1B発現の欠損は、後期ウイルスタンパク質の乏しい発現および宿主細胞タンパク質合成の遮断不能をもたらす。
E4遺伝子は、多くの転写産物を有する。E4転写単位のオープンリーディングフレーム（ORF）3およびORF6は、E1B由来の55kDaタンパク質ならびにE2F-1およびDP-1のヘテロダイマーを結合することにより主要後期転写単位mRNAの蓄積を増加する。ORF3およびORF6由来の機能的タンパク質の非存在下で、野生型ウイルスの効率の10-6未満の効率でプラークが産生される。
本発明に関連する主要後期遺伝子は、AD5ウイルスビリオンのタンパク質をコードするL1、L2およびL3のような遺伝子である。
欠失され得るアデノウイルスの領域は、通常少なくとも500nt、より通常は少なくとも約1kntであり、AD5ゲノムにおいて、E1のヌクレオチド300〜3600、特に342〜3523;E3の27000〜31000、特に28133〜30818または27865〜30995を含む。欠失は、所望の構築物の挿入に少なくとも十分であり、そしてパッケージングを可能にする。
本発明のベクターは、広範な種々の目的のために使用され得る。目的は標的細胞と共に変化する。適切な標的細胞は、アデノウイルスビヒクルにおける細胞特異的転写応答エレメントの転写活性化により特徴づけられる。転写開始領域は、通常、宿主における細胞の約５％未満、より通常は約１％未満、および望ましくは約0.1％未満において活性化される。
転写活性化の調節は、シス調節エレメントに結合した転写アクチベーター、基底転写エレメントに結合した因子の間の相互作用および転写メディエーターまたはコアクチベーターの活性の結果である。これらの因子のいずれもの非存在または存在が転写のレベルに影響し得る。さらに、因子は不活性形態で存在し得、ここで因子は化学的修飾により、特に、細胞シグナル機構の結果として活性化される。いくつかの場合において、シグナル分子は直接的に転写を活性化するように作用し得る。これらの機構のいずれもが、そこにおいてビヒクル転写開始領域が活性である細胞型を限定するように作用し得る。
非常に低い基底レベルの転写は非標的化細胞型において存在し得ることが当業者により理解される。転写活性化により、転写は、少なくとも約100倍、より通常には少なくとも約1000倍、標的細胞において基底レベル以上に増加されることが意図される。
細胞特異的応答エレメントは、複製能力が標的細胞においてのみ達成され得るように増殖に必須であるアデノウイルス遺伝子と共に、および/または標的細胞の表現型を変化させるためのトランスジーンと共に使用され得る。野生型アデノウイルスに存在しない任意の遺伝子がトランスジーンより意図され、しばしば、トランスジーンはまた、アデノウイルスによる導入の前に標的細胞において発現されない。
前立腺細胞に特異的なプロモーターおよびエンハンサー構築物を含む細胞特異的応答エレメントを使用することにより例示されるように、種々の遺伝子能力が前立腺特異抗原を発現する前立腺細胞に導入され得る。特に目的とすることは、前立腺細胞において特異的に活性な転写開始領域により制御される細胞傷害性効果を導入する機会である。その調節が所望される状態と関連する特異的に活性な転写因子を有する他の細胞型は、白血球、特に、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵臓細胞、神経細胞、およびケラチノサイトを含む。アデノウイルスは一過性発現（約６〜８週間）をもたらすので、細胞に一過的な能力を提供し得、ここで所望の結果は応答のために限定された期間のみを必要とする。
一過性発現を導入する目的は、腫瘍以外の所望でない増殖（例えば、乾癬病変）を含む処置され得る徴候、再狭窄、創傷治癒、組織修復、増強した免疫応答、感染に対する抵抗性、因子の産生、増強した増殖、代謝経路または他の生理学的な経路の研究、アデノウイルスによる改変前、改変中および改変後の細胞の活性を比較することによる、アデノウイルスにより導入されたトランスジーンの存在および非存在下での細胞の活性の比較などを含む。本発明のベクターは、細胞の混合物から特定の群の細胞を取り除くために使用され得、ここでこの群の細胞は標的細胞である。アデノウイルスを選択的に標的細胞において増殖能を有するようにすることにより、それらの細胞のみがアデノウイルスの増殖に際して殺傷される。例えば、培養またなインビボで、アデノウイルスと細胞の混合物とを組み合わせることにより、アデノウイルスは標的細胞においてのみ増殖し得る。この場合、標的細胞以外の細胞は、アデノウイルスにより影響されないが、標的細胞は殺傷される。標的細胞における増殖によるアデノウイルスの拡大は、その混合物から実質的に標的細胞が取り除かれたことを保証する。一旦標的細胞が破壊されると、アデノウイルスはもはや増殖し得ないが、標的細胞（例えば、変異細胞または腫瘍性細胞）の再発について混合物を連続的にモニターするために、培養において保持され得る。
細胞の性質、その成熟のレベルまたはその状態に基づいて、標的宿主細胞により特異的に発現される遺伝子を同定することにより、標的細胞特異的応答エレメントは、そのような細胞に遺伝子能力を提供するために使用され得る。ここで、遺伝子能力は、アデノウイルスビヒクルでトランスフェクトされた場合でさえ、他の細胞において存在しない。
標的細胞に依存して、種々のエンハンサーが標的細胞特異的転写を提供するために使用され得る。リンパ球に関して、Ｂ細胞については、Igエンハンサーを使用し得、Ｔ細胞については、Ｔ細胞レセプタープロモーターを使用し得る。異なる筋肉細胞については、異なるミオシンのプロモーターを使用し得る。内皮細胞については、異なるセレクチンの異なるプロモーターを使用し得る。それぞれの細胞の型について、標的細胞特異的な転写を可能にする、細胞に関連する特異的なタンパク質が存在する。
アンドロゲンに依存した細胞特異性（特に前立腺細胞における）を提供するために使用される領域は、約1.5kbエンハンサー領域および0.5kbプロモーター領域を含む。ヒトにおけるエンハンサー領域は、前立腺特異抗原（PSA）遺伝子の転写開始部位に対して、nt -5322とnt -3739との間に位置する。プロモーターはnt -540〜nt＋８からなる。２つの遺伝子エレメントの並列は、完全に機能的な、最小の前立腺特異的エンハンサープロモーター（PSE）を生じる。エンハンサーは、前立腺特異的DNA結合タンパク質を結合する３つの領域を含み、そのうちの１つは推定アンドロゲン応答エレメントを含む。プロモーター領域は、典型的なTATAおよびCAATボッックスならびに第２の推定アンドロゲン応答エレメントを含む。
ベクターは、２つのプラスミド（一方のプラスミドはアデノウイルスの左側領域を提供し、そして他方のプラスミドは右側領域を提供し、ここで２つのプラスミドは、相同組換えのための少なくとも約500ntの中間領域を共有する）を使用することにより便利に調製される。この場合、それぞれのプラスミドは、所望であれば、独立して操作され得、続いてコンピテント宿主に同時にトランスフェクトされる、アデノウイルスの増殖のために、適切な相補遺伝子、またはPSEからの転写の開始のための適切な転写因子を提供する。
簡便のために、アデノウイルスの必要な部分を提供するプラスミドが利用可能である。プラスミドpXC.1（McKinnon（1982）Gene 19:33-42）は、Ad5の野生型左側末端を含む。pBHG10は、E3における欠失を有して、Ad5の右側末端を提供する。E3における欠失は、野生型エンハンサー-プロモーターを欠失することなく、2kbの最小PSEを挿入するためのウイルスの余地を提供する。E3の遺伝子は、E4とは反対の鎖（r鎖）に位置する。
初期遺伝子の操作については、ウイルスゲノムにおいて、Ad5 E1Aの転写開始部位はnt 560であり、そしてE1Aタンパク質のATG開始部位はnt 610である。この領域は、細胞特異的エレメント（例えば、PSE）の挿入のために使用され得る。簡便に、制限部位は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用することにより導入され得る。ここで、使用されるプライマーは、Ad5ゲノムに限定され得るか、またはAd5ゲノムDNAを有するプラスミドの一部を含み得る。例えば、pBR322が骨格である場合、プライマーは、pBR322骨格のEcoRI部位およびAd5のnt 1339でのXpa1部位を使用し得る。２段階でPCRを行うことにより（ここで領域の中央での重複プライマーが独特の制限部位をもたらす配列変化を導入する）、その部位での細胞特異的応答エレメントの挿入を提供し得る。
同様のストラテジーはまた、E1Bを調節するための細胞特異的応答エレメントの挿入のために使用され得る。Ad5のE1Bプロモーターは、Sp1のための単一の高親和性認識部位およびTATAボックスからなる。この領域は、1636〜1701ntまで伸長する。この領域における細胞特異的応答エレメントの挿入により、E1B遺伝子の細胞特異的転写を提供し得る。E1Bを調節する細胞特異的応答エレメントを導入するためのテンプレートとして、E1Aを調節する細胞特異的応答エレメントを用いて改変された左側領域を使用することにより、得られるアデノウイルスは、E1AおよびE1Bの両方の発現について細胞特異的転写因子に依存する。
E4については、アデノウイルスゲノムの右側部分を使用しなければならない。E4転写開始部位は、優勢的にnt 35605であり、TATAボックスはnt 35631であり、そしてORF1の第１のAUG/CUGはnt 35532である（Virtanenら（1984）J.Virol.51:822-831）。他の遺伝子のために上記のストラテジーのいずれかを用いて、細胞特異的応答エレメントが、転写開始部位と開始コドンとの間の領域に導入され得る。再度、以前に操作したアデノウイルスゲノムを用いることにより、標的細胞特異的転写因子に依存した複数の遺伝子を提供し得、これはアデノウイルスがこれらの転写因子を欠く細胞において複製し得ないことを保証する。
複製欠損ウイルスについては、複製欠損ウイルスの増殖を提供するように、欠損を相補し得る適切な宿主細胞中のゲノムの改変を行い、複製に必須な１つ以上の遺伝子を不活化することのみを必要とする。次いで、宿主細胞を使用して標的細胞の形質導入のためにウイルスをパッケージングし得る。
特定の標的細胞においてコンピテントである、コンピテントアデノウイルスの使用は標的細胞におけるアデノウイルスの増殖を可能にし、宿主細胞の死および他の宿主細胞へのアデノウイルスの増殖をもたらす。さらに細胞傷害性を保証するために、細胞傷害性効果を有する１つ以上のトランスジーンを有し得る。この場合、標的細胞は破壊されるが、細胞傷害性因子の適切なレベルの発現を提供するという高い信頼性を提供し得る。
アデノウイルスビヒクルに導入され得る遺伝子能力は、アポトーシスを開始し得る因子、アンチセンスまたはリボザイム（これは、他の能力のうち、増殖に必須なタンパク質（例えば、構造タンパク質、転写因子、ポリメラーゼなど）をコードするmRNAに指向され得る）、ウイルスまたは他の病原体タンパク質（病原体が細胞内で増殖する場合）、細胞傷害性タンパク質（例えば、ジフテリアのα鎖、リシン、アブリンなど）、ヌクレアーゼ（例えば、RNase A）またはプロテアーゼ（例えば、トリプシン、パパイン、プロテイナーゼK、カルボキシペプチダーゼなど）の操作された細胞質性変異体をコードする遺伝子、またはFas遺伝子をコードする遺伝子などを含む。目的の他の遺伝子は、サイトカイン、抗原、膜貫通タンパク質など（例えば、IL-1、-2、-6、-12、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IFN-α、-β、-γ、TNF-α、-β、TGF-α、-β、NGFなど）を含む。
特異的な遺伝子改変に対する他の機会は、腫瘍侵潤リンパ球（TIL）のようなＴ細胞を含み、ここでTILは改変されて、拡大を増強し、細胞傷害性を増強し、増殖インヒビターに対する応答を低減し、リンホカインの発現を増強するなどをし得る。特定の表面膜タンパク質（例えば、B7、SV40 T抗原変異体など）の発現を提供することにより、標的細胞の脆弱性を増強することもまた所望し得る。
改変されたウイルスは、細胞が培養、エクスビボまたはインビボであるかどうかに依存して、種々の方法で標的細胞に送達され得る。前立腺については、多くの場合、細胞はインビボで送達される。送達は、リポソームの使用、直接注射、カテーテル、静脈内（intravenpis）、吸入、局所的適用などの種々の方法で達成され得る。アデノウイルスの高い効率のトランスフェクションにより、高レベルの改変細胞を達成し得る。毒素が産生される腫瘍形成の場合、首尾良くトランスフェクトされなかったかもしれない細胞に影響を及ぼすように、毒素は局所的に放出される。この様式で、正常細胞に対する著しい影響を伴うことなく、腫瘍性細胞を特異的に排除し得る。さらに、アデノウイルスタンパク質の発現は、標的細胞に対して免疫系を活性化するように働く。最後に、宿主細胞におけるアデノウイルスの増殖は、細胞死を導く。
アデノウイルスは、約104〜1011の用量で適切な生理学的に受容可能なキャリアにおいて投与され得る。感染多重度は、一般に、約0.001〜100の範囲である。ウイルスは、宿主の免疫応答の可能性に依存して１回以上投与され得る。必要であれば、免疫応答は、強力な免疫応答を伴うことなく、反復投与を可能にするように、種々の免疫抑制剤を使用することにより減少され得る。
以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のために提供されない。
実施例
I．ΔE1およびΔE3における挿入を有する複製欠損アデノウイルス
PSEエンハンサー領域は、前立腺特異抗原遺伝子の転写開始部位に関してヌクレオチド-5322とヌクレオチド-3739との間に位置する。プロモーターはヌクレオチド-540〜ヌクレオチド+８からなる。これらの２つの遺伝子エレメントの並置により十分に機能的な最小PSEが生じる。
以下はPSEの模式図である。
0004117347.tif 000002
複製欠損である組換えアデノウイルスベクターを構築するためのシャトルベクターは、アデノウイルスゲノムのE1領域のほとんどまたは全てを欠失させ、そして外来DNAを挿入するための制限部位を挿入することにより構築され得る。１つのこのようなベクター系は、F.Grahamおよび共同研究者により記載されている（Graham（1984）EMBO. J 3:2917-2922；Graham（1987）J. Gen. Virol. 68:937-940；GrahamおよびSmiley（1977）同書36:59-72およびGrahamおよびVan der Eb（1973）Virology 52:456-467）。この系において、プラスミドΔE1sp1AおよびΔE1sp1Bは、Ad5のヌクレオチド342と3523との間で欠失された配列を除くAd5ゲノムの最も左側の部位を含む。欠失の代わりは、２つのプラスミドにおいて反対の方向に存在するマルチクローニング部位である。外来DNAを挿入するための別の位置は、プラスミドBHG10およびBHG11（Bett（1994）PNAS 91:8802-8806）のE3領域におけるPacIクローニング部位であり、それぞれ、Ad5 E3配列の28133〜30818および27865〜30995を置き換える。E1および／またはE3配列の除去は、レポーターまたはエフェクター遺伝子に結合されるPSEを挿入するための余地を提供する。
Ａ．ΔE1におけるPSE駆動化遺伝子発現。
１．ΔE1におけるPSE-CAT。PSEが駆動するレポーターCAT遺伝子を、以下のようにΔE1sp1AおよびΔE1sp1BのE1欠失中に挿入した。pCATベーシック（Promega）のXbaI/BamHIフラグメント（CAT遺伝子コード配列とそれに続くSV40ポリアデニル化シグナル配列とを含む）を、同様に切断したΔE1sp1AおよびΔE1sp1Bに連結して、それぞれ、CN83およびCN112を得た。CN65のPSEプロモーターとPSAプロモーターとの間のHinDIII部位（Schuurら（1996）J.Biol.Chem. 271:7043-7051）を、HinDIIIでの部分消化、その後の、Klenowでの末端の充填、および再連結により除去し、CN84を得た。CN83およびCN112への挿入のためのPSE PCR産物を、プライマー：
18.69.1、5’-GCGCAAGCTTGGGCTGGG、（配列番号１）（HinDIII部位を含む）、および
18.69.2、5’-GGAAGATCTAGAAATCTAGCTG、（配列番号２）（BglII部位およびXbaI部位を含む）を用いてCN84を増幅することにより調製した。このDNAフラグメントをBglIIおよびHinDIIIで切断し、次いで、同様に切断したCN83およびCN112に連結して、それぞれ、プラスミドCN99およびCN117を得た。CN99においては、PSE-CAT転写単位は、Ad5 1-鎖に関して左から右の方向にあり、一方、CN117においては、PSE-CAT単位は右から左の方向に存在する。相同組換えにより得られるウイルスを、CN710（プラスミドCN117およびBHG11）、およびCN714（プラスミドCN99およびBHG10｛McKinnonら（1982）Gene 19:33-42｝）と称した。
２．ΔE1におけるPSE-β-ガラクトシダーゼ。PSE-β-ガラクトシダーゼ転写単位をΔE1sp1AおよびΔE1sp1BのE1欠失中に挿入したウイルスプラスミドをまた、PSE-CATウイルスプラスミドを構築するために使用したのと同様のストラテジーを使用して構築した。pCMVbeta（Clonetech）のXbaIフラグメント（β-ガラクトシダーゼ遺伝子、ならびにそれに５’末端で隣接するSV40スモールtイントロンおよび３’末端で隣接するSV40ポリアデニル化シグナル配列を含む）を、XbaIで切断したΔE1sp1Aおよびsp1Bプラスミドに挿入して、それぞれ、CN85およびCN86を構築した。PSEをPSE-CATプラスミドについて記載したようにCN84から増幅し、そしてBglII/HinDIIIで切断したCN85およびCN86に連結して、それぞれ、CN93およびCN138を構築した。CN93においては、PSE-b-ガラクトシダーゼ転写単位は、Ad5 1-鎖に関して、左から右の方向に存在し、一方CN138においては、PSE-β-ガラクトシダーゼ単位は右から左の方向に存在した。相同組換えにより得られたウイルスは、CN715（プラスミドCN138およびBHG10から）、CN700（プラスミドCN92およびBHG10から）、CN701（プラスミドCN93およびBHG10から）、およびCN709（プラスミドCN116およびBHG11から）であった。
３．ΔE1におけるPSE-ジフテリアＡ毒素遺伝子。レポーター遺伝子挿入は、PSEの制御下で、E1における治療遺伝子の挿入についての試験系を示した。プラスミドpCATベーシック（Promega）をBamHIで切断し、次いでXhoIIで部分消化を行って、残りのプラスミドDNAからSV40ポリアデニル化配列を切断した。800塩基対のSV40フラグメントを単離し、そしてBluescriptポリリンカーにおけるEcoRI部位に最も近いXhoII末端とBleuscript KSII+のBamHI部位とにクローン化した。このクローンをCN10と称した。ジフテリア毒素遺伝子Ａ鎖配列を、以下のようにPSE制御下、E1領域に挿入した。ジフテリア毒素遺伝子由来のＡ鎖配列を、必要とされる制限部位および転写制御配列を含有するプライマー：
7.18.1、5’-GAATTCCTGCAGTCTAGACATATGGGCGCCGAT、（配列番号３）（EcoRI、およびPstI、および開始コドンの部位を含む）
7.18.2．5’-ATTGAATTCCTGCAGTTATGCGGTGACACGATTTCCTG、（配列番号４）（EcoRI、PstI、および停止コドンの部位を含む）を用いて、PCR増幅した。
PCR増幅産物をEcoRIで切断し、そして同様に切断したCN10に連結して、SV40配列に関して正しい方向にあるDTA配列を有するCN44を得た。DTAおよびSV40配列を、XbaI/BamHIフラグメントとしてΔE1sp1AおよびΔE1sp1Bに挿入して、それぞれ、CN120およびCN82を得た。PSEをCN84からPCR増幅し、そしてCAT構築物について記載したようにCN120およびCN82に連結して、それぞれCN123およびCN98を作製した。CN123においては、PSE-DTA転写単位はAd5 1-鎖に関して左から右の方向に存在し、一方、CN98においてはPSE-DTA単位は右から左の方向に存在する。CN98およびBHG10の相同組換えはウイルスCN721を生じ；CN123およびBHG10の相同組換えは、ウイルスCN722を生じた。
Ｂ．ΔE3におけるPSE駆動化遺伝子発現。
E3におけるPSEで駆動される転写単位の挿入は、BHG11のPacI部位にPSE-CAT転写単位をクローン化することにより試験した。BHG11へ挿入するための転写単位を調製するために、CN105のKpnI/SacIフラグメントを、同様に切断したpABS.4に連結して、CN175を構築した。このCN175は選択のためのカナマイシン遺伝子および各末端にPacI部位を付加する。次いで、CN175のPacIフラグメントをPacIで切断したBHG11に連結し、そして両方向に挿入を有するクローンを同定した：CN301は、左から右の方向にPSE-CAT単位を含み、そしてCN302は右から左の方向にPSE-CAT単位を含む。次いで、CN301およびCN302をSwaIで切断してカナマイシン遺伝子フラグメントを切り出し、次いで再連結してCN303およびCN304を得た。
ウイルスの構築
ヒト胎児腎細胞株である293は、AD5のE1AおよびE1B遺伝子を効率よく発現し、そしてアデノウイルスDNAについて高いトランスフェクション効率を示す。293細胞を、１つは左末端Ad5プラスミドおよび１つは右末端Ad5プラスミドで同時トランスフェクトした。相同組換えにより293細胞における複製のために必要な遺伝子エレメント有するアデノウイルスが作製される。この293細胞は、E1AおよびE1Bタンパク質の合成の欠損を相補するために、これらのタンパク質をトランスで提供する。E4領域における変異を構築するために、W162細胞（WeinbergおよびKetner（1983）PNAS 80:5383-5386）において同時トランスフェクションおよび相同組換えを行った。このW162細胞はE4タンパク質の合成の欠損を相補するために、これらのタンパク質をトランスで提供する。
組み合わせられたプラスミドを、リポフェクチン（DOTMA:DOPE、Life Technologies）のようなカチオン性リポソームを用いて、細胞中へ同時トランスフェクトする。２つのプラスミドを組み合わせ、次いでプラスミドDNA溶液（血清または他の添加物を含まない最小必須培地200μl中の10mgの各プラスミド）と200μlの同じ緩衝液中の４倍モル過剰のリポソームとを混合する。次いで、DNA-脂質複合体を細胞上に置き、そして37℃、５%CO2で16時間インキュベートする。インキュベーション後、培地を10%ウシ胎児血清を有するMEMに変え、そして細胞を、37℃、５%CO2で２週間、培地を２回変えてさらにインキュベートする。この時間の終了時に、細胞および培地をチューブに移し、凍結-解凍を３回繰り返し、そしてこの溶解物を用いて、個々のウイルスをプラークとして検出するために適切な希釈で、293（またはW162）細胞を感染させた。
得られたプラークを２回プラーク精製し、そしてPCRにより、および必要に応じてDNA配列決定により、ウイルスを所望の配列の存在について特徴づけした。さらなる実験のために、ウイルスを塩化セシウム勾配遠心分離により、より大きなスケールで調製した。
以下の表は、所望の特徴を有する組換えAd5を作製するために使用した右末端および左末端Ad5プラスミドの組合せを列挙する：
0004117347.tif 000003
II．複製コンピテントな前立腺特異的弱毒化アデノウイルス。
Ａ．E1Aの発現を駆動するPSEを有するAd5
最小の前立腺特異的エンハンサー（PSE）のクローニングおよび特徴づけは、Prostate Specific Antigen Expression is Regulated by an upstream Enhancer（Schuurら、上述）に記載されている。プラスミドCN71は、本発明者らの最小PSE（PSA遺伝子の転写開始部位に関して-5322bp〜-3875bp）および-532〜+11のPSAプロモーターを含む。CN71を、PSAプロモーターを除去するXhoI/HindIIIで切断した。より短いプロモーター（-230〜+7）を、プライマー：
18.119、5’-GGACCTCGAGGTCTCCATGAGCTAC、（配列番号５）および
15.59B、5’-AGCTCGAGCTTCGGGATCCTGAG、（配列番号６）を使用してPCRにより増幅した。
PCR産物をXhoI/HindIIIで切断し、そしてXhoI/HindIIIで切断したCN71に連結して戻し、CN105を作製した。
１．E1Aを駆動するPSEを有し、および内因性Ad5 E1Aプロモーターおよびエンハンサーを保持する弱毒化Ad5。
E1A遺伝子は、ウイルス感染の直後（０〜２時間）に、および他の任意のウイルス遺伝子が発現される前に発現される。E1Aタンパク質は、他の初期ウイルス遺伝子（E1B、E2、E3、E4）および主要後期遺伝子のプロモーター近位遺伝子の発現に必要とされるトランス作用ポジティブ作用性転写調節因子として作用する。名称に関わらず、主要後期プロモーターによって駆動されるプロモーター近位遺伝子は、Ad5感染後の初期の間に発現される（Flint（1982）Biochem. Biophys. Acta 651:175-208；Flint（1986）Advances Virus Research 31:169-228；Grand（1987）Biochem. J. 241:25-38）。機能的E1A遺伝子の非存在下で、ウイルスDNA複製に必要な遺伝子産物が産生されないので、ウイルス感染は続行しない（Nevins（1989）Adv. Virus Res. 31:35-81）。Ad5 E1Aの転写開始部位は、ヌクレオチド560であり、そしてE1Aタンパク質のATG開始部位は、ウイルスゲノムのヌクレオチド610である。
pXC.1をMicrobix Biosystems Inc．（Toronto）から購入した。pXC.1は、アデノウイルス５の22bp〜5790bpの配列を含む。本発明者らは、オリゴ特異的変異誘発および連鎖PCR（linked PCR）により、E1A開始コドン（Ad5ヌクレオチド547）の12bp５’側にAgeI部位を導入した。プラスミドpXC.1を、プライマー：
15.133A、5’-TCGTCTTCAAGAATTCTCA（配列番号７）（EcoRI部位を含む）、および
15.134B、5’-TTTCAGTCACCGGTGTCGGA（配列番号８）（AgeI部位を導入するために１つの余分なAを含む）を用いてPCR増幅した。これにより、pBR322骨格のEcoRI部位〜Ad5ヌクレオチド560までのセグメントが作製された。pXC.1の第２のセグメント（Adヌクレオチド541〜Adヌクレオチド1339のXbaI部位まで）を、プライマー：
15.133B、5’-GCATTCTCTAGACACAGGTG（配列番号９）（XbaI部位を含む）および
15.133A、5’-TCCGACACCGGGTGACCTGAAA（配列番号10）（AgeI部位を導入するために１つの余分なTを含む）を用いて増幅した。これらの２つのPCR増幅DNAセグメントの混合物を混合し、そしてプライマー３および４を用いて増幅して、pXC.1のEcoRI部位〜XbaI部位のDNAセグメントを作製した。このDNAセグメントは、アデノウイルス配列の最も左の1317塩基を含み、そしてAdヌクレオチド547でAgeI部位を含んだ。このDNAセグメントをpXC.1の対応のセグメントを置き換えるために使用して、CN95を作製した。同様に、Age1末端を有するPSEを、プライマー：
15.176A、5’-CATTAACCGGTACCTCTAGAAAATCTAGC（配列番号11）および
15.176B、5’-CATTAACCGGTAAGCTTGGGGCTGGGG（配列番号12）を用いてCN105からPCR増幅し、CN95にクローン化した。CN96およびBHG10の相同組換えにより作製したウイルスをCN706と称した。
２．Ad5内因性プロモーターおよびエンハンサーについて欠失したPSE駆動Ad5 E1Aを有する弱毒化Ad5。
E1A遺伝子の偏在的な発現を減少させるために、本発明者らは内因性E1A転写調節DNA配列を欠失することを決定した。E1A遺伝子の転写調節配列は、DNAパッケージングに必須であるDNA配列中に入り組んで埋め込まれている（GraebleおよびHearing（1992）ならびにそこに引用される参考文献を参照のこと）。GraebleおよびHearing（1990）は、bp 194からbp 316までの欠失（これはすべての転写調節エレメントを除去し、そして７つのパッケージングシグナルのうち３つのみを保持する）を伴うアデノウイルス５が、収率を野生型に比較して３倍のみ減少させたことを示した。これらの観察は、E1A転写調節配列が必ずしも必要ではなく、そして７つのパッケージングシグナルのうち最初の３つの損失が受容可能な量でのウイルス産生を可能にしたことを示唆した。
ａ．第１の改変体において、E1AエンハンサーおよびプロモーターならびにAd5パッケージング配列を含むAd5ゲノムの領域を欠失させ、そして変異したパッケージング配列およびCN127からPCR増幅されたPSEのセグメントを含む合成DNAセグメントで置換した。この構築物において、Ad5ゲノムの最初の1339塩基を含むpXC.1のEcoRI/XbaIフラグメントを、pUC19中にクローン化して、さらなる操作のための基質としてのCN172を構築した。Ad5 nt 123〜nt 497に対応するDNA配列をCN172から以下のプライマーを使用するPCR増幅により欠失させた：
0004117347.tif 000004
（XhoI部位を含む）、および
0004117347.tif 000005
（XhoI部位を含む）。PCR産物のXhoIでの切断およびそれに続く再連結は、それにおいてXhoI部位がAd5 nt 123〜497を置換したCN178を生じた。変異したAd5パッケージング配列を含む合成DNAセグメントは、以下の２つの鎖からなった：
0004117347.tif 000006
鎖をアニールさせ、そしてT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてキナーゼ処理して、dsDNAを形成し、そして構築物中の他のDNAセグメントに連結させた。
連結のために使用したPSEセグメントを、以下のプライマーを使用してCN127からPCR増幅した：
0004117347.tif 000007
（XhoI部位を含む）、および
0004117347.tif 000008
（XhoIおよびHinDIII部位を含む）。連結のために、PSE PCR産物およびCN178の両方をXhoIで切断した。XhoI切断CN178、XhoI切断PSE PCR産物、およびキナーゼ処理したパッケージングオリゴヌクレオチドを等モル比で混合し、そしてT4 DNAリガーゼで連結した。生じた組換え体をCN201と名付けた。変異したパッケージング配列およびPSE駆動E1Aを含むCN201のEcoRI/XbaIセグメントをCN201から切り出し、そしてこれを使用してpXC.1の相同なセグメントを置換して、CN202を生成させた。
ｂ．第２の改変体において、異なるストラテジーを用いた。相対的に小さなプラスミドを用いて欠失変異誘発を実施するために、プラスミドCN145の2297 bp EcoRI-XhoIフラグメント（これは、E1Aプロモーター領域およびPSAエンハンサーを含む左末端アデノ配列を含む）を、同様に切断したpBluescript SKII+中にサブクローン化して、プラスミドCN169を得た。
欠失変異誘発のための計画は、Ad 194〜301位から配列を欠失させ、そしてそれを変異誘発されたプラスミドを親プラスミドから区別するための診断的マーカーとして作用するSalI制限部位5’-GTCGAC-3’で置換することであった。欠失は、すべてのE1AコアおよびE2F転写調節エレメントならびにパッケージングシグナルAIおよびAIIを除去したが、パッケージングシグナルAIII、AIV、AV、AVIおよびAVIIは保存する。このために、以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：
0004117347.tif 000009
このプライマーはAd5における配列302〜334に適合する。
0004117347.tif 000010
このプライマーはAd5における配列171〜193に適合する。
Stratagene由来のPCR変異誘発キットを、以下の操作において使用した。PCRチューブ中で、15pMolの各々のプライマーを、0.5pMol CN169；１mM dNTP、2.5μl 10×PCR 11（Stratagene）、dH2O（24μlまで）ならびに各々0.5μlのTaq PolymeraseおよびTaqExtender（Stratagene）に添加した。混合物を20μlの鉱油で重層し、そしてPCRのためにプログラムした：94℃４分間、63℃１分間、72℃４分間を１サイクルおよび94℃１分間、63℃１分間、72℃４分間を10サイクル。１μlのDpnI制限酵素（Stratagene）を親DNAを切断するために添加し、そして37℃で80分間インキュベートし、続いて１μlのPfu Polymerase（Stratagene）を添加し、そして72℃で50分間インキュベートして、Taqポリメラーゼによる前のPCRプロセスの間に生成された突出DNA末端を充填した。PCRは５kbの直鎖状DNAを生じ、これをT4 DNAリガーゼで連結して再環状化した。XL-1細菌を連結反応物で形質転換し、そして変異誘発された組換え体を単一のSalI制限部位の存在により同定した。組換え体の１つであるCN179を使用して、アデノおよびPSE配列を含むCN145のEcoRI-XhoIフラグメントをCN179のEcoRI-XhoIフラグメントと交換することにより、欠失を有する親プラスミドCN145を再び組立て、プラスミドCN185を得た。プラスミドCN185をBHG11とともにヒト293細胞中への同時トランスフェクションにおいて使用して、組換えアデノウイルスを生成させた。９つのウイルスプラークを単離した。１つのウイルス単離物をCN724と名付けた。
３．E1BのPSE駆動発現を有する弱毒化Ad5。
E1Bタンパク質はトランスで機能し、そして後期mRNAの核から細胞質への輸送のために必要である。E1B発現における欠乏はまた、後期ウイルスタンパク質の不十分な発現、および宿主細胞タンパク質合成の遮断の不能を生じる。E1Bのプロモーターは、Ad40およびAd5の宿主域における差異の規定エレメントであるとして関連付けられている：臨床的には、Ad40はエンテロウイルスであり、一方Ad5は急性結膜炎を引き起こす（Bailey, Mackayら（1993）Virology 193:631; Baileyら（1994）同上202:695-706）。Ad5のE1Bプロモーターは、Sp1のための単一の高親和性認識部位およびTATAボックスからなる。
Ad5中にE1BのPSE駆動発現を挿入するために、Ad5 nt 1682でＧ残基を、上記のようにオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって挿入することにより、EagI部位をE1B開始部位の上流に作製した。EagI部位におけるPSEの挿入を簡単にするために、CN95中の内因性EagI部位を、EagIでの消化、マングビーンヌクレアーゼ（mung bean nuclease）での処理、および再連結（relegation）により除去してCN114を構築した。以下のプライマー：
0004117347.tif 000011
（EcoRI部位を含む）、および
0004117347.tif 000012
（余分のＣを含む）を使用して、EcoRI部位とAd5 nt 1682との間のセグメントを増幅した。
以下のプライマー：
0004117347.tif 000013
（余分のＧを含む）、および
0004117347.tif 000014
（KpnI部位を含む）を使用して、1682とAd5 nt 2048におけるKpnI部位との間のセグメントを増幅した。プライマー９および12を用いる２つのセグメントの同時増幅により、Ad5 nt 1682においてEagI部位を有するフラグメントを得、これを使用してpXC.1中の対応するEcoRI/KpnI部位を置換して、CN124を構築した。CN105から以下のプライマー：
0004117347.tif 000015
（EagI末端を有する）を用いて増幅したPSEをCN124のEagI部位中へ連結して、CN125を構築した。CN125とBHG10との相同組換えから得られたウイルスをCN711と名付けた。
４．E1AおよびE1Bの両方のPSE駆動発現を有する弱毒化Ad5。
E1AおよびE1Bの両方のPSE駆動発現を有する左末端Ad5プラスミドを、CN124の構築について記載したように、プライマー９〜12を用いてCN95をPCR増幅することにより構築した。得られるDNAセグメントはCN95に由来するAgeI部位およびPCR変異誘発に由来するEagI部位を含む。このDNAセグメントをCN114（EagI部位がpXC.1から除去されたプラスミド）中へクローン化し戻して、プラスミドCN144を構築した。CN144はAd5 nt 547において単一のAgeI部位およびAd5 nt 1682において単一のEagI部位を含む。AgeI末端を有するPSEセグメントを、上記のようにCN105からPCR増幅するか、またはEagI末端もまたCN105からPCRにより増幅し、そしてCN144の適切な部位中へ連結して、CN145を構築した。CN145は、PSEがE1AおよびE1Bの両方の発現を駆動するが、両方の遺伝子のAd5の内因性のプロモーターおよびエンハンサーを保持するプラスミドである。PSEを左から右の方向で有するクローンを選択した。内因性のAd5 E1AおよびE1Bプロモーター／エンハンサーを両方のPSEセグメントの挿入により上流へ移動させた。CN145とBHG10との相同組換えにより誘導された得られたウイルスをCN716と名付けた。
５．E4のPSE駆動発現を有する弱毒化Ad5。
E4はAd5ゲノムの最右側末端に位置し、そして1-鎖から右から左へ読まれる（Flint、前出）。E4はAd5ゲノムから欠失され得、そしてW162細胞（VERO細胞の誘導体）によりトランスに供給され得る（WeinbergおよびKetner、前出）。E4の転写産物は複雑である。E4転写単位のオープンリーディングフレーム（ORF）３およびORF6は、E1B由来の55-kDaタンパク質（DixおよびLeppard（1993）J. Virol. 67:3226-3231）ならびにE2F-1とDP-1とのヘテロ二量体（HelinおよびHarlow（1994）J. Virol. 68:5027-5035）を結合することにより、主要後期転写単位mRNAの蓄積を増加させる。ORF3もORF6も機能的なタンパク質をコードしないような変異は、野生型ウイルスの効率の10-6未満の効率を有するプラークを生じる（BridgeおよびKetner（1989）J. Virol. 67:5911-5921）。
PSE駆動E4発現の挿入を容易にするために、Ad5の3’8kb＋pBR322骨格の一部を含むBHG10の10kb EcoRIフラグメントをBluescript KSII+のEcoRI部位中へクローン化して、CN108を構築した。Ad nt 33906におけるDraIII部位を、CN108の部分消化、Klenowでの末端充填、および再連結により除去して、CN113を構築した。XhoI部位を、以下のプライマーを用いて上記のようにオリゴヌクレオチド特異的変異誘発および連鎖した（linked）PCRによりAd nt 35577に導入した：
0004117347.tif 000016
（DraII部位を含む）、
0004117347.tif 000017
（余分のＣを含む）、
0004117347.tif 000018
（余分のＧを含む）、
0004117347.tif 000019
（ClaI部位を含む）。
XhoI部位ならびにDraIIIおよびClaI末端を含むPCR産物を使用して、CN113の対応するDraIII/ClaIフラグメントを置換して、CN122を構築した。
プラスミドCN70は、最小のPSE（PSA遺伝子の転写開始部位に対して-5322bp〜-4023bp）およびPSAプロモーターの-532〜+11を含む。CN70をXhoI/HindIIIで切断した。これはPSAプロモーターを除去する。以下のプライマーを用いるPCRにより増幅した、より短いプロモーター（-230〜+7）：
0004117347.tif 000020
をそのかわりに連結して、CN104を構築した。CN127を、CN104から以下のように構築した：CN104をXhoIで切断し、Klenowで末端充填し、そして再連結して、XhoI部位を除去した。CN127由来のPSEを以下のプライマーを使用してPCR増幅して：
0004117347.tif 000021
SalI末端を作製した。次いで、このDNAセグメントをXhoI切断CN122に連結して、PSEをE4の上流に適切な方向で挿入した。得られたプラスミドをCN135と名付けた。pABS4（Microbix）由来のカナマイシン耐性遺伝子をCN135中にPacI部位で挿入して、CN146を構築し；次いで、CN146のEcoRIフラグメント（挿入されたPSEおよびカナマイシン耐性遺伝子とともにアデノウイルス配列を含む）をBHG10の大きなEcoRIフラグメントに連結し、BHG10中の相同な野生型Ad配列を置換した。組換え体を、アンピシリンおよびカナマイシンの両方に対する耐性により同定し、次いでカナマイシン遺伝子をPacI消化および再連結により切り出して、CN190（これは、E4コード領域の上流に挿入されたPSEを有するBHG10である）を得た。
６．ΔE3でシトシンデアミナーゼを有するPSE駆動Ad5 E1Aを有する弱毒化したAd5。
そのゲノム中に組み込まれたシトシンデアミナーゼ（「cd」）遺伝子を含む前立腺の特異的アデノウイルスベクターは、この遺伝子を標的組織（すなわち、前立腺の腫瘍）へ送達し得た。従って、感染されたガン細胞は、5-FCを代謝し、そして化学治療剤5-FUを細胞分裂を抑制している周辺組織に放出し、そしていわゆる「バイスタンダー効果」を示す（Hirshowitzら、（1995）Human Gene Ther. 6:1055-1063; GriffithおよびJarvis（1993）J. Biol. Chem. 268: 20085-20090）。それに対して、非感染で、近位でない細胞は、影響を受けない。これは弱毒化したアデノウイルスベクター中のcd遺伝子のための２つの用途を示唆する。第１に、cdは、バイスタンダー死滅能力を提供するためのさらなる治療剤として作用し得、そして全身的毒性を伴わない局所腫瘍減少を促進し得る（MooltenおよびWells（1990）J.Nat’l Cancer Inst. 82:297-300）。第２に、遺伝子は、感染した局所細胞および感染していない局所細胞におけるウイルス性のDNAおよびRNAの合成を妨げることによって逃亡者感染（runaway infection）を停止するための想起機構（recall mechanism）として作用し得る。
酵素シトシンデアミナーゼ（シトシンを脱アミノ化してウラシルにする）は、多くの細菌および菌類において見出される。これらの微生物は、5-フルオロシトシン（5-FC）（無害なプロドラッグ）を、5-フルオロウラシル（5-FU）（DNAおよびRNA合成の両方を阻害する高い毒性の化合物に変換し得る（CalibrisiおよびChabner Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics（A.G.Gilman,T.Rall,A.S.Nies、およびP. Taylor編,Pergamon,NY）（1990））第８版,1209〜1263頁）；Damonら（1989）。哺乳動物細胞は、顕著な量のcd遺伝子を発現しないので、それらは、5-FUに感受性ではない。しかし、この遺伝子を発現するための遺伝子の導入によって改変された哺乳動物細胞は、5-FCを代謝し得る。この適用において、cdは、その遺伝子を含むそれらの細胞に選択的に感受性を付与する「自殺遺伝子」として作用する。
アデノウイルスベクター構築。プラスミドpCMV-cd（CMVプロモーターのcdコード領域の下流を含む）を、David Crooks（Stanford）から得た。プロモーターとcd ATGとの間の複数のクローニング領域中に配置したSpeI制限エンドヌクレアーゼ部位を、SpeI部位、BamHI部位、およびEcoRI部位の側面に配置した配列を認識する酵素でこのプラスミドを消化し、クレノウで末端を満たし、そして再連結することによって取り除いた（CN130）。この部位を取り除いて、SpeIでのCN130の消化すること、およびpABS4（Microbix, Toronto）（カナマイシン耐性遺伝子を含むシャトルプラスミド）中のXbaI部位に適切なフラグメントを連結することにより、CMV-cdカセットをクローン化した（CN131）。PacIでCN131を消化することによって、KanR遺伝子およびcd遺伝子を含むフラグメントを単離し、そして同様に切断したBHG11（Microbix）に連結した（CN141）。これはAd5のE3領域内に操作された唯一のPacI部位を含む。KanR遺伝子をSwaIでCN141を消化すること、およびベクターを再連結することにより取り除いた（CN148）。
E3領域中のcd遺伝子を含む２つのAd5組換えウイルスを構築した。１つは、E3領域にCMV-cdカセットのみを含む（CN719）。２つ目は、E3内のCMV-cdカセットおよびE1Aタンパク質の発現を調節する前立腺特異的エンハンサー（PSE）の最小エレメントを有する（CN720）。ウイルスを、低い継代数の293細胞（Ad E1AおよびE1Bタンパク質を発現するヒト腎臓細胞株）内でpXC1/CN148およびCN145（PSE-E1A）/CN148を用いて同時トランスフェクトすることにより達成させる相同組換えにより作製した。
インビトロでの特徴づけ。この最初の機能的アッセイにおいて、CN720（E3領域内にcd遺伝子を含む弱毒化した前立腺特異的アデノウイルス）を感染された細胞および隣接する細胞に5-FC感受性を付与するその能力を試験するために研究した。野生型Ad5（CN702）もまた試験した。４連で、DMEM、５％FBS中の96ウェルマイクロタイタープレートに播種したCV1細胞（半許容性（semipermissive）サル腎臓細胞株）を、CN702またはCN720のいずれかを有するウェル１〜11から一連の１：２希釈物中で感染させた。ウェル１の感染多重度は、CN702については約25、そしてCN720については２であった。各プレートの12列目を、非感染コントロールとして放置した。感染の１日後に培地を交換した。そして一方をCN720で感染させ、そして一方をCN702で感染させた細胞の２つのプレートを、５mMの5-FCで処理した。残りの２つのプレート上の培地を、完全なDMEMのみで交換した。これらの感染させた、未処理の細胞は、ウイルスの溶解能を示し、そしてそれらを使用して本実験における細胞死の２つの原因であるウイルス細胞溶解と5-FU毒性とを区別した。細胞を50％メタノール-50％アセトンで固定し、そしてプロドラッグが投与された６日後にギームザ染色した。プレートをSpectraMAX 340マイクロタイタープレートリーダー（Molecular Devices）において530nmでの吸光度を測定することによってアッセイした。細胞生存を、感染させていないウェルにおける細胞の吸光度と感染させたウェルにおける吸収とを関連づけることにより計算した。結果を、細胞生存対ウイルス希釈として図示した。
本実験からいくつかの結論が導かれ得た。最も重要なことは、グラフは組換えアデノウイルスがcd遺伝子を発現していることを示唆することである。両方のウイルスの細胞死滅能力は5-FCの存在下で増大するようであるが、おそらく高濃度のプロドラッグに対して全身性化した毒性のために、細胞死滅における変化はCN720について劇的である。CN720のグラフは、5-FC処理した細胞と未処理の細胞との間の明確な細胞生存の差を示し、これは、5-FUバイスタンダー効果の指標である。この結果は、Ad5の死滅能力を増大するか、またはDNAの複製を妨げる感染していない細胞における毒性薬物の細胞間プールを生成することによって逃亡者感染を活用する（想起機構）かのいずれかのcd機能を発展させる能力を示す。
インビトロモデルのように、６つの96ウェルプレートにヒト腸上皮細胞株であるDLD-1（DMEM、10％FBS中で、ヒトAdに対して許容性である）を播種した。上記のように、それらをAd5-cdウイルス（CN719）で感染させた。プロドラッグ（１mM）を、感染後の各時点（０時間、24時間、および48時間）で１つのプレートに添加した。残りの３つのプレートは未処理であり、そして感染させたコントロールとして取り扱った。１組の２つのプレート（一方はプロドラッグを含み、一方はプロドラッグを含まない）を、感染後７、８、および９日目に回収した。
これらの結果は前のデータを確実にし、そしてそれ拡張する。感染させたが未処理の細胞に比較して、増加した細胞死が、感染させたプロドラッグ処理した細胞における全ての時点で認められた。これらのデータはまた、感染がさらに進行するようにバイスタンダー効果がより明白であることを明らかにする。5-FCが感染後24時間および48時間で添加される場合、細胞死は、プロドラッグが最初の感染の直後に添加される場合より多い。これらのデータは、cd遺伝子を保有する組織特異性アデノウイルスが、野生型のアデノウイルスよりも優れた死滅能力を有することを示す。
７.サル細胞およびヒト細胞を含むように宿主域を増大させるためにΔE3中にPSE駆動E1AおよびSV40 T抗原を有する弱毒化したAd5
ヒトアデノウイルスは、サルの細胞中で効率的に複製されない。細胞質中の減少した繊維状mRNAのレベルに関して、不稔性感染は、E4タンパク質によって調節される後期遺伝子発現における欠損によって引き起こされる（RossおよびZiff（1992）J. Virology 66:3110-3117）。アデノウイルス-SV40ハイブリッド（アデノウイルス２ゲノムのE3領域に組み込まれたラージＴ抗原をコードするSV40ゲノムの小部分を含むことが示されている）は、この欠損を克服し、そしてサルの細胞を溶解する（LewisおよびRowe（1970）同書5:413-420; Lewisら、（1973）同書11:655-664）。ラージＴ抗原（Tag）は、これらのハイブリッドに対してこの宿主域の能力を付与すると考えられている（Tijanら、（1979）PNAS 75:1279-1283）。いくつかのAd2-SV40ハイブリッドは、SV40およびAd2感染培養物から単離されており、これらの各々は保存された量のTagカルボキシ末端コード領域および種々の長さのアミノ末端コード領域を含む。
本発明者らは、サルの研究における使用のための、Ad5組織特異的宿主域変異株を開発するためにこの範例を適用してきた。２つのストラテジーに着手した。まず、モデルとして宿主域変異体Ad2+ND1（マップ単位0.28〜0.11由来のSV40 Tagコード配列を保有する）を使用した（ZainおよびRobers（1978）J. Mol. Biol. 120:13）。全Tagコード配列、内因性SV40初期プロモーター、および逆方向SV40エンハンサーを含むプラスミドである、プラスミドpDIS中の666塩基対のPstI/BamHI制限フラグメント（Edgar Schrieberから得られた）は、適切な３’配列を含み、そしてシャトルプラスミドpABS4（Microbix）を介してBHG11（Microbix）のE3領域内の唯一のPacI制限部位にクローン化した。コード配列の上流は、適切なペプチドの発現を達成するために、スプライシングアクセプター配列、リボソーム認識配列、およびATGを含むオリゴ（＋）鎖：
26.99.1，5-GTTTGTGTATTTTAGATCAAAGATGCTGCA（配列番号35）、および（-）鎖：
26.99.2，5-GCATCTTTGATCTAAAATACACAAAC（配列番号36），をクローン化した（CN170）。この構築物の発現は、主要後期プロモーターを起源とする転写物に依存する。
第２のストラテジーは、アダプターオリゴ（＋）鎖：
27.183.1，5-TAAAGGAGGAGATCTGCCTAAAACACTGCA（配列番号37）、
および（-）鎖：
27.183.2、5-GTGTTTTAGGCAGATCTCCTCCTTT（配列番号38）
を用いることによってアミノ末端領域中のEcoNI部位とカルボキシ末端コード配列中のPstI部位との間にプラスミドpDIS中のTag配列における内部欠失を作製することを包含する。
エンハンサー、プロモーター、およびコード配列を含む全転写単位を、HpaII/BamHI消化によって切断し、そしてBHG11の唯一のPacI部位中のシャトルプラスミドを介してクローン化した（CN183）。この方法は、発現が主要後期プロモーターに依存しないAd5配列中の連続しない転写単位を作製する。
２つの宿主域Ad5-SV40ウイルスを産生した。その両方は、Tagのカルボキシ末端を含むがそのプロモーターを欠く。一方は、組織特異的な、E1Aタンパク質の発現を調節する前立腺特異的エンハンサー（PSE）を有する弱毒化されたウイルスである（CN725）。他方は、Tag挿入物を有する野生型Ad5である（CN726）。両方は、293細胞（CN145（PSE-E1A）またはpXC1（野生型Ad5左側末端）およびCN170を有するAd E1AおよびE1Bタンパク質を発現するヒト腎臓細胞株）を同時トランスフェクトすることによる相同組換えによって生成された。
宿主域変異体の特徴付け。野生型Ad5（CN702）およびCN726を、293細胞およびCV1細胞の両方（アフリカミドリザルの腎臓細胞株）上でプラーク形成した。プラークを両方の細胞単層において計数し、そして２つの細胞株間のプラークの比を決定した。CN726およびCN702の比は、それぞれ0.01および0.0007であった。サルの細胞におけるアデノウイルスの複製の能力は、サルにおける組換え弱毒化アデノウイルスの臨床前の評価を可能にし、それによりヒトにおける治療剤としてこれらのウイルスの用量および処方についての貴重な情報が得られる。
８．ヒトおよびサルの細胞における複製を可能にする拡張された宿主域を有する組換えAd5の生成のために、E2（DNA結合タンパク質（DBP））に変異を導入するための組換えDNAの構築。
野生型アデノウイルス５型は、ヒト細胞においてのみ複製可能である。治療的に弱毒化させたアデノウイルスの臨床前の評価のために、サルのような大きなヒト類似動物において効力および毒性を試験することが所望される。宿主域変異体hr404は、サルの細胞においてヒトAd5の複製表現型を付与することが記載されている（KlessigおよびGrodzicker（1979）Cell 17:957-966）。hr404変異の性質は、72K DNA結合タンパク質中のコドン130でのヒスチジンからチロシンへのアミノ酸の変換（H130Y）を生じる、DBP遺伝子におけるアデノ32657位での単一の点変異Ｃ-->Ｔであると示された（Kruijerら（1981）Nucleic Acids Res. 9:4439-4457）。
本発明者らは、プラスミドBHG 10（Bettら、前出）由来の、５型アデノウイルスの右末端配列を含む5.8kbのEcoRI-BamHIフラグメントを有する組換えDNA分子を構築した。そして部位特異的変異誘発によりDBP遺伝子にH130Y変異を導入した。このプラスミドは、ヒトおよびサルの細胞おける複製が可能である組換えアデノウイルスの構築を可能にするはずである。
BHG10（Bettら、前出）の5769bpのEcoRI−BamHIフラグメントを、同様に切断したpBluescript KSII+にクローン化してプラスミドCN184を得た。配置された制限部位を削除するために、2568bpのXhoIフラグメントを欠失させてプラスミドCN186を得た。変異誘発上流PCRプライマーは以下の通りである：
28.180U，5’-GCAACCCACCGGTGCTAATCAAGTATGGCAAAGGAGTAAGCGC-3’[配列番号39]。
H130Y変異を引き起こす変異したＴ残基を太字で下線を付した様式で示す。pCN186中の唯一のSgrAI部位を斜体で示す。下流PCRプライマーは以下の通りである：
28.180L，5’-TGGCCTTGCTAGACTGCTCCTTCAGC-3’[配列番号40]。
PCR増幅を、100pMolのこれらの各プライマー、鋳型として200ngのCN186、１mMのdNTP、１×Pfu緩衝液（Stratagene）、dH2Oで100μlとし、そして5Uのクローン化したPfuポリメラーゼ（Stratagene）を用いて、94℃で１分間、60℃で１分間、72℃で２分間の30サイクルで行った。PCRにより、予想された588bpのDNAフラグメントが得られた。このDNAフラグメントをWizard DNA clean-upカラム（Promega）で精製し、そして制限酵素SgrAIおよびAflIIで消化した。H130Y変異を含む目的の473bpのフラグメントをゲル精製し、そして単離した。DBP遺伝子への再挿入のために、変異したDNAフラグメントを、CN184由来の1639bpのAscI−SgrAIフラグメントおよびCN184由来の6609bpのAflII−AscIフラグメントと連結してプラスミドCN188を得た。
組換えアデノウイルスゲノムを、CN188の5.8kbのEcoRI−BamHIフラグメントと、BHG10の21562bpのEcoRI−Bst1107センターDNAフラグメントおよびBst1107切断したプラスミドCN144とのインビトロの連結により構築した。得られたウイルスをCN723と称した。
サル細胞中でのアデノウイルスの複製能力は、組換え弱毒化アデノウイルスのサル内での前臨床的な評価を可能にする。これにより、ヒトにおける治療薬剤としてのこれらのウイルスの投与量および処方のための貴重な情報が得られる。さらに、CN723中のhr404変異を使用すれば、サルの研究に使用される同じウイルスがヒトの臨床試験ウイルスとして使用され得る。
９．５型アデノウイルスのE4領域からのORF1、2、3、およびORF4の一部の欠失。
E4領域は、ウイルスゲノムDNAの複製の刺激および後期遺伝子発現の刺激を担う２つのポリペプチドをコードする。オープンリーディングフレーム（ORFS）３および６のタンパク質生成物はいずれもこれらの機能を果たし得る。しかし、ORF6タンパク質は活性のためにE1B 55Kタンパク質との相互作用を必要とするが、ORF3タンパク質は必要としない。前立腺上皮細胞E4に対してウイルスの複製をさらに制限するために、orfs１〜３が欠失され得、これによりウイルスDNA複製および後期遺伝子の合成がE4 ORF 6タンパク質に依存してするようになる。このような変異とその内部でE1B領域がPSEによって調節されている配列とを組み合わせることにより、E1B機能およびE4機能の両方がPSE駆動E1Bに依存するウイルスを得ることができる。
この型のウイルスを、ORFS1〜3のE4欠失を含むプラスミドdl1006（BridgeおよびKetner、J. Virol．（1989）63:631-638）由来の配列とBHG10との組み合わせ、続いてCN144での同時トランスフェクションにより構築し、組換えウイルスを構築した。プラスミドpdl1006をAvrIIおよびAgeIで切断して変異したE4領域を含む配列を単離した。このDNAセグメントを用いて、同じ酵素で切断したCN108の相同のセグメントと置換する。
CN108は、BSKSII+にクローン化されたBHG10由来の６kbのEcoRIフラグメントを含む。BHG10中のE3欠失のために、Ad5 nt 28752部位のAvrII部位が欠失されている。AvrIIは、Ad5 nt 35463でCN108をなお切断した；AgeIはAd5 nt31102でCN108をなお切断した。CN108由来の4.4kbのAvrII/AgeIフラグメントを、E4欠失を含むCN203を産生するdl1006由来の3.8kbのAvrII/AgeIフラグメントで置換した。CN203由来のEcoRIフラグメントをBHG10にクローン化してCN204を構築した。CN204とCN144との相同組換えによりウイルスCN726を得た。
この型の類似のウイルスを以下の様式で構築した。上記のようにAvrIIはAd5 nt 35463でCN108を切断した。SapIはCN108を２度切断し、その部位の１つはAd5 nt 34319であった。CN108の完全なAvrII切断および部分的なSapI切断、ならびにE4由来の1144bpを除去した再連結によりCN205を得た。CN205由来の5.3kbのEcoRI/BamHIフラグメントを、同様に切断したCN188にクローン化してCN206を得た。E4欠失およびhr404変異の両方を含むCN206の14kbのBamHIフラグメントを、BamHIで切断したBHG10にクローン化してCN207を作製した。293細胞中でのCN144とCN207との相同組換えによりCN727を得た。
10．PSEに制御されるAd5のE2領域
アデノウイルス５のE2領域は、72kDaのDNA結合タンパク質、80kDaの前駆体末端（precursor terminal）タンパク質、およびウイルスDNAポリメラーゼを含む、アデノウイルスゲノムの複製に関連するタンパク質をコードする。組換えアデノウイルス中で、前立腺特異的PSAエンハンサー／プロモーターによりE2遺伝子の発現を制御することが目的である。
Ad5のE2領域は、76.0および72.0のマップ単位にそれぞれマッピングされるE2初期およびE2後期と呼ばれる２つのプロモーターから右方向に転写される。E2後期プロモーターは感染の後期の間一次的に活性であり、そしてE1aトランス活性化タンパク質とは無関係であるが、E2初期プロモーターはウイルス複製の初期段階の間、非常に重要である。
nt 27053-27121にAd5にマッピングされるE2初期プロモーターは、主要なおよび主要でない転写開始部位（後者は約５％のE2転写を説明する）、２つの規範的なTATAボックス、２つのE2F転写因子結合部位およびATF転写因子結合部位からなる（E2プロモーター構造の詳細な概要については、SwaminathanおよびThimmapaya、Current Topics in Microbiology and Immunology（1995）199第３部：177-194を参照のこと）。
E2後期プロモーターは、逆鎖によりコードされるL4遺伝子のコード配列とオーバーラップし、従って遺伝的な操作が容易ではない。しかし、E2初期プロモーターは逆鎖の33kタンパク質をコードする配列と数塩基対オーバーラップするのみである。特に、SpeI制限部位（Ad5の27082位）は、上記の33kDaタンパク質の停止コドンの一部であり、そして主要なE2初期転写開始部位およびTATA結合タンパク質部位を、上流の転写因子結合部位E2FおよびATFから適切に分離することが注目される。従って、SpeI部位へのPSAエンハンサー／プロモーターの挿入は、Ad5の内因性E2初期プロモーターを破壊し、そしてE2転写産物の前立腺に制限される発現を可能にするはずである。
E2初期プロモーター領域内でのPSAエンハンサー／プロモーターを用いる組換えAd5の構築。E2領域を含む、Ad5のBamHI-EcoRIフラグメント（21562-27331位）を以前にpBluescript KSII+にサブクローン化してプラスミドCN184を得た。このプラスミドの改変体であるCN188（宿主域の適用の拡大を可能にするDBP遺伝子（H130Y）に変異を有する）を構築し、そして上記した。
プラスミドCN188を、E2領域へのPSAエンハンサー／プロモーターの挿入のために使用した。プラスミドをSpeIで線状化し、そして5’突出末端を仔ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、次いでKlenowポリメラーゼおよびdNTPで末端充填した。平滑末端にしたPSEエンハンサー／プロモーターを、SpeIで線状化した平滑末端にしたベクターCN188と連結した。E2領域内での転写開始を餅びくために適切な方向でPSEエンハンサー／プロモーターを有する組換えDNAを同定した。プラスミドCN196は、CN188の骨格にPSEエンハンサー／プロモーターを有する。プラスミドCN205の5.3kbのEcoRIフラグメント（E4遺伝子のorf1、2、3、および4の欠失を有する）を、EcoRIで切断したCN196中に適切な方向で挿入してプラスミドCN197を得た。
PSEエンハンサー／プロモーターにより制御されるE1A、E1B、およびE2初期遺伝子の発現、ならびにDBP遺伝子内のhr404変異H130Y、ならびにE4遺伝子のオープンリーディングフレーム1、2、3、および4の欠失を有する組換えウイルスゲノムを、CN144の9152bpのBamHI−Bst11071フラグメントと、BHG10の15802bpのBst11071−BamHIフラグメントおよびCN197の12425bpのBamHIフラグメントとのインビトロの連結によって得た。
ウイルス調製
ウイルスを上記のように調製した（上記）。以下の表は、所望の特性を有する組換えAd5を作製するために使用した右末端Ad5プラスミドと左末端Ad5プラスミドとの組み合わせを列挙する：
0004117347.tif 000022
結果：
ウイルス構築物および遺伝子構造
構築の最初の一回で、３種の複製コンピテントな、前立腺特異的アデノウイルスを作製した。E1A遺伝子の発現を駆動するPSEを含むCN706、E1B遺伝子の発現を駆動するPSEを含むCN711、およびE1A発現を駆動するPSEとE1B発現とを駆動するPSEとを含むCN716。ウイルスを、293細胞中での相同組換えによって作製し、そしてプラーク精製によって２回、クローン化した。PCRおよび挿入した配列とAdゲノム配列との間の接合部位の配列決定によって、ゲノムDNAの構造を分析した。全てのウイルスが所望の構造を含んだ（データは示さず）。
インビトロでのウイルス増殖
インビトロでのウイルスの増殖を、２つのアッセイによって特徴づけた：１回の感染において産生される感染性粒子の量を測定するための放出量アッセイ、および種々のタイプの細胞中でのウイルスの増殖を評価するためのプラークアッセイ。
放出量アッセイについては、LNCaP細胞（PSAを産生するCaP細胞株）またはHBL100細胞（非悪性乳房上皮細胞株）のいずれかを感染多重度（MOI）１（５×105PFU/サンプル）にて、ウイルスで感染させた。種々の時点でサンプルを採集し、そして存在する感染性ウイルスの量を293細胞におけるプラークアッセイによって測定した。表２は、CN706が、48時間後にLNCaP細胞において５×105pfuのインプットから6.3×106pfuを産生したことを示す。HBL100細胞において、同量のインプットウイルスからの増加は、2.0×106pfuであった。次いで、CN706は、LNCaP細胞中にインプットした感染性粒子あたり13pfuを生じ、これは同じ期間にわたってHBL100細胞中で産生されたものよりも３倍多かった。
CN711における放出量アッセイによってまた、HBL100細胞に対してLNCaP細胞において良好な増殖が示された（表２）。LNCaP細胞においては、５×105pfuのインプットウイルスが、48時間で４×107pfuを産生し、一方、HBL100細胞においては、48時間で８×106pfuが得られた。これは、LNCaP細胞中のウイルスにおいて40倍の増加を示し、またはHBL100細胞におけるよりも５倍多い収率を示した。
CN716についてのウイルス産生の差異は、２つの細胞株の間で広範な不均衡を示した。LNCaP細胞においては、1.7×107pfuが48時間後に得られ、一方、HBL100細胞においては、８×105pfuが同じ時点で得られた。従って、LNCaP細胞においては、34の感染性粒子が48時間でそれぞれインプットした粒子について産生され、一方、HBL100については、1.6の感染性粒子が産生された。
これらの結果は、初期遺伝子E1AおよびE1Bの発現が、挿入されたPSEによって制御され得ることを示す。この調節をさらに特徴づけるために、CN706ウイルスの産生をテストステロンアナログであるR1881の存在下または非存在下でのLNCaP細胞における放出量アッセイによってアッセイした。PSEはアンドロゲンの存在下で高度に活性であるが、アンドロゲンの非存在下では本質的に不活性であるので、初期タンパク質の産生はPSEによって制御され、そして従ってウイルスの産生はアンドロゲンのレベルに対して感受性であるはずである。表３に示すように、R1881の非存在下では、３×106pfuが、インプットウイルスよりも３倍増加して48時間で得られた。１nMまたは10nMのR1881の存在下では、２〜３倍多いpfuが48時間で得られた。対照的に、平行してアッセイした野生型アデノウイルスでは、R1881の存在下または非存在下において得られたpfuにおける差異は明らかではなかった。
0004117347.tif 000023
0004117347.tif 000024
CN706、CN711、およびCN716の増殖選択性をさらに評価するために、ウイルスを、単一の感染性ウイルス粒子が、複数回の感染および複製によって目に見えるプラークを産生するプラークアッセイによって分析した。典型的なアッセイの結果を、表４に示す。
0004117347.tif 000025
ウイルスストックを、等pfu/mlに希釈し、次いで使用して単層の細胞を１時間感染した。次いで接種物を除去し、そして細胞を培地を含む半固型寒天で重層し、そして37℃で１週間インキュベートした。次いで、単層中のプラークを、計数し、そして種々のウイルス細胞に対する感染性ウイルスの力価を算定した。データを293細胞に対するCN702の力価に対して標準化した。
野生型ウイルスCN702は、各５つの細胞株に対してほぼ同等の力価を示した。対照的に、PSEで修飾したウイルスのそれぞれは、異なる細胞タイプに対して種々の増殖のパターンを示した。CN706は、293細胞に対するよりも10倍低い力価をNLCaP細胞に対して生じた。しかし、HBL100細胞に対するその力価は、293細胞に対する力価の260倍低かった。非PSA分泌CaP細胞株TSUに対するCN706の力価は、PSAを分泌するLNCaP細胞とほぼ同程度であった。同様に、肺細胞株A549に対する力価はまた、LNCaP細胞に対する力価に近接していた。ウイルスCN711は、試験した細胞株に対する力価との有意な差異を示さなかった。
CN716ウイルスについてのデータは、LNCaP細胞株の増殖についての顕著な選択性を示した。このウイルスは、LNCaP細胞中で良好に増殖し、293細胞に対する力価よりも高い力価にさえ達した。他の細胞株に対するウイルスの増殖は、有意に低く、次に高い力価の株であるA549よりも18倍低かった。最も顕著な差異は、HBL100細胞に対してであり、この場合、力価はLNCaP細胞に対する力価と比較して225倍低かった。放出量アッセイおよびプラークアッセイから得たデータにより、PSA分泌CaP細胞についての選択的増殖特性を有するウイルスを開発するために、PSEを使用して、ヒトアデノウイルスを改変し得ることが示された。
LNCaP腫瘍異種移植片の処置
前立腺特異的ウイルスの開発における最終目標は、前立腺疾患を有する患者を処置することである。この目的の可能性を、Balb/c nu/nuマウスの皮下で増殖させたLNCaP腫瘍異種移植片を使用して試験した。試験ウイルスを、0.1mlのPBS＋10％グリセロール中のほぼ108pfuのウイルスの直接腫瘍内注射によるか、または尾静脈を介する静脈内注射のいずれかにより、マウスに接種した。腫瘍のサイズを測定し、そして、いくつかの実験においては、毎週、血液サンプルを採取した。
腫瘍サイズおよび血清PSAレベルに対するCN706の腫瘍内注射の効果を、模擬処置と比較した。CN706で処置した腫瘍のサイズは、２週間の間増加を続け、次いで実験の期間の間、連続的に減少した。実験の終了時点で、すべてのCN706で処置した腫瘍（全部で10）はサイズが減少し、そして５匹のマウスは腫瘍が治癒した。対照的に、緩衝液で処置した腫瘍は、実験の期間の間増殖を続け、42日目までに元のサイズのほぼ２倍に達した。
以前に発行された結果により、LNCaP腫瘍異種移植片モデルにおいて、血清PSAレベルが腫瘍サイズと相関することが示された。CN706で処置した腫瘍を有するマウスにおけるPSAレベルの測定によって、処置後１週間でPSAレベルが上昇し、続いて35日まで最後までPSAレベルは一定に低下することを示した。血清PSAレベルは実験の過程を通して増加し、35日目で平均して250ng/ml以上であった。
本明細書中で記載したウイルスに基づく治療は病変内部に（intralesionally）与えられるようであるが、ウイルスが静脈内投与の後に腫瘍増殖に影響し得るかどうかを決定することがまた、所望される。そうであるならば、次いで、直接注射に接触できない転移性の腫瘍沈着物を処置するために、ウイルスを使用し得ることが考えられる。LNCaP腫瘍を有する５匹のマウスの群に、尾静脈注射によりl08pfuのCN706を接種するか、または108pfuの複製欠損アデノウイルス（CMV-LacZ）を接種して、ウイルスの非特異的毒性効果を制御するか、あるいは緩衝液を接種してウイルスを保有させる。緩衝液またはCMV-LacZで処置したマウスの腫瘍は、実験の期間の間増殖を続け、最終的に平均して元のサイズのほぼ５倍に達した。CN706で処置したマウスの腫瘍は、接種の時点と７日目での最初の測定の時点との間でわずかに増殖し、次いで、平均の腫瘍サイズは42日目までに元の腫瘍容積のほぼ75％に減少した。
CN711を用いたヌードマウスにおけるLNCaP腫瘍の処置は、CN706を用いた処置と同様の結果を生じた。CN711で処置した動物（全部で５匹）では、腫瘍は接種から８日目まで増殖を続けた。その後、平均の腫瘍サイズは減少し、49日目までに65％に達した。緩衝液で処置したマウス（全部で４匹）の平均腫瘍サイズは、実験の期間を通して増加し、49日目までに元の腫瘍容積の300％に達した。
同じ実験プロトコルを使用して、LNCaP腫瘍におけるCN716ウイルスを試験した。マウスに、PBS＋10％グリセロール、CN716、またはCN702を接種した。緩衝液マウスにおいて腫瘍は急速に増殖し、そしてマウスは、３週間後に大きな腫瘍サイズのために死亡した。CN702で処置した腫瘍は、２週間増殖し続け、次いで42日目までに元の容積の80％にサイズが減少した。CN716で処置した腫瘍は、１週間元のサイズを維持し、次いで42日目までに元のサイズの40％にサイズが減少した。実験の終了時点で、４匹中２匹の処置したマウスは、それらの腫瘍が治癒した。
上述の結果から、ウイルスが複製欠損であるかまたは複製コンピテントであり得る場合、アデノウイルスは特定の宿主細胞について特異的なビヒクルとして提供され得ることが明らかである。ウイルスは、標的宿主細胞に導入するための広範に多様な遺伝子のためのビヒクルであり得る。特に、前立腺特異的エレメントを使用して、複製に不可欠な初期遺伝子を、前立腺細胞応答性エレメントの制御下にあるように改変し得る。
本明細書中で言及した全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願のそれぞれが参考として援用されるために具体的におよび個々に示されるのと同程度に本明細書中で参考として援用される。
本発明は今や十分に記載され、本発明の添付の請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく多くの変化および改変がなされ得ることが、当業者に明らかである。
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：カリドン，インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：組織特異的ウイルスベクター
（iii）配列数：４０
（iv）連絡住所：
（A）名称：フレー，ホバック，テスト，アルブリトン アンド ハーバート
（B）番地：４ エンバルカデロ センター，スイート ３４００
（C）市：サンフランシスコ
（D）州：カリフォルニア
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：94111-4187
（ｖ）コンピューター読み出し形態：
（A）媒体型：フロッピー ディスク
（B）コンピューター：IBM PC互換用
（C）OS：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン リリース #1.0，バージョン #1.30
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：PCT/US96/
（B）出願日：
（C）分類：
（viii）代理人／事務所情報：
（A）氏名：ロウランド，バートラム アイ．
（B）登録番号：20,015
（C）照会／記録番号：FP-62215-1-PC/BIR
（ix）電話回線情報：
（A）電話：415-494-8700
（B）テレファックス：415-494-8771
（C）テレックス：910 277299
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号１：
0004117347.tif 000026
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号２：
0004117347.tif 000027
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号３：
0004117347.tif 000028
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号４：
0004117347.tif 000029
（2）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号５：
0004117347.tif 000030
（2）配列番号６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号６：
0004117347.tif 000031
（2）配列番号７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号７：
0004117347.tif 000032
（2）配列番号８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号８：
0004117347.tif 000033
（2）配列番号９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号９：
0004117347.tif 000034
（2）配列番号１０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号１０：
0004117347.tif 000035
（2）配列番号１１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号１１：
0004117347.tif 000036
（2）配列番号１２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号１２：
0004117347.tif 000037
（2）配列番号１３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号１３：
0004117347.tif 000038
（2）配列番号１４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号１４：
0004117347.tif 000039
（2）配列番号１５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１５６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号１５：
0004117347.tif 000040
（2）配列番号１６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１５６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号１６：
0004117347.tif 000041
（2）配列番号１７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号１７：
0004117347.tif 000042
（2）配列番号１８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号１８：
0004117347.tif 000043
（2）配列番号１９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号１９：
0004117347.tif 000044
（2）配列番号２０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号２０：
0004117347.tif 000045
（2）配列番号２１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号２１：
0004117347.tif 000046
（2）配列番号２２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号２２：
0004117347.tif 000047
（2）配列番号２３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号２３：
0004117347.tif 000048
（2）配列番号２４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号２４：
0004117347.tif 000049
（2）配列番号２５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号２５：
0004117347.tif 000050
（2）配列番号２６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号２６：
0004117347.tif 000051
（2）配列番号２７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号２７：
0004117347.tif 000052
（2）配列番号２８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号２８：
0004117347.tif 000053
（2）配列番号２９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号２９：
0004117347.tif 000054
（2）配列番号３０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号３０：
0004117347.tif 000055
（2）配列番号３１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号３１：
0004117347.tif 000056
（2）配列番号３２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号３２：
0004117347.tif 000057
（2）配列番号３３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号３３：
0004117347.tif 000058
（2）配列番号３４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号３４：
0004117347.tif 000059
（2）配列番号３５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号３５：
0004117347.tif 000060
（2）配列番号３６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号３６：
0004117347.tif 000061
（2）配列番号３７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：３０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号３７：
0004117347.tif 000062
（2）配列番号３８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号３８：
0004117347.tif 000063
（2）配列番号３９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：４３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号３９：
0004117347.tif 000064
（2）配列番号４０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）記載：／記＝「プライマー」
（xi）配列：配列番号４０：
0004117347.tif 000065