(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列を含む、精製および単離された核酸分子。
【請求項２】
対象のタンパク質をコードするＤＮＡヌクレオチド配列および図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列を含む組換えＤＮＡベクター。
【請求項３】
ＡＡＶのＲＥＰおよびＣＡＰタンパク質をコードするＤＮＡヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２に記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項４】
図１０（配列番号２）に示した細菌のγδリゾルベースにより認識されるＤＮＡヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２に記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項５】
図１０（配列番号２）に示した細菌のγδリゾルベースにより認識されるＤＮＡヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３に記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項６】
組換えＤＮＡ分子を複製し、ＡＡＶ粒子へキャプシド化する方法であって、ヘルパーウイルス、ＡＡＶのＲＥＰおよびＣＡＰタンパク質をコードする組換え核酸、および対象のＤＮＡ配列と図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列を含む組換え核酸を含有す真核細胞を培養することにより、１６５塩基対の逆方向末端反復配列および対象のＤＮＡ配列を含む該核酸を複製し、ＡＡＶ粒子へ集合させることからなる方法。
【請求項７】
ヘルパーウイルスがアデノウイルスである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ヘルパーウイルスが単純ヘルペスウイルスである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＡＡＶのＲＥＰおよびＣＡＰタンパク質をコードする組換え核酸が、
（ａ）ＡＡＶのＲＥＰおよびＣＡＰ  ＲＮＡの発現を制御するプロモーター、
（ｂ）ＲＥＰおよびＣＡＰ  ｍＲＮＡのための転写開始シグナル、
（ｃ）ＲＥＰおよびＣＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列、および
（ｄ）転写終止シグナル、
を含むプラスミドベクターである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
対象のＤＮＡ配列および１６５塩基対の逆方向末端反復配列を含む組換え核酸が、
（ａ）プロモーター、
（ｂ）該プロモーターの制御下で転写される対象のＤＮＡ配列、および
（ｃ）図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列、
を含むプラスミドベクターである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
組換えＤＮＡ分子を複製し、ウイルス粒子へキャプシド化する方法であって、
（ａ）（i）対象の遺伝子および図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列を含む組換えウイルスベクター、（ii）ヘルパー機能をもたらすウイルス遺伝子、および（iii）該ウイルスベクター配列の隣に位置する２つの図１０（配列番号２）に示した細菌γδリゾルベース認識配列、を含む組換え核酸を増殖し、
（ｂ）増殖した核酸を細菌γδリゾルベースで処理し、そして
（ｃ）ヘルパーウイルスおよび該リゾルベース処理組換え核酸を含む真核細胞を培養することにより、該分割した組換えＤＮＡを複製し、ウイルス粒子へキャプシド化する、
ことからなる方法。
【請求項１２】
組換えＤＮＡ分子を複製し、ＡＡＶ粒子へキャプシド化する方法であって、
（ａ）図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列および図１０（配列番号２）に示した細菌γδリゾルベース認識配列を含む組換え核酸を、細菌のγδリゾルベース酵素で処理し、そして
（ｂ）ヘルパーウイルスおよび該リゾルベース処理組換え核酸を含む真核細胞を培養することにより、該分割した組換えＤＮＡを複製し、ＡＡＶ粒子へキャプシド化する、
ことからなる方法。
【請求項１３】
ヘルパーウイルスがアデノウイルスである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ヘルパーウイルスが単純ヘルペスウイルスである、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
細菌γδリゾルベース認識配列を含む組換え核酸が、
（ａ）細菌γδリゾルベース認識配列、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）該プロモーターの制御下で転写される対象のＤＮＡ配列、および
（ｄ）図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列、
を含むプラスミドベクターである、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
細菌γδリゾルベース認識配列を含む組換え核酸が、
（ａ）細菌γδリゾルベース認識配列、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）該プロモーターの制御下で転写される対象のＤＮＡ配列、
（ｄ）図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列、および
（ｅ）ＡＡＶのＲＥＰおよびＣＡＰタンパク質をコードするＤＮＡヌクレオチド配列、
を含むプラスミドベクターである、請求項12に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
１．序論
本発明は、組換えＤＮＡ断片を複製し、アデノウイルス随伴ウイルス（adenovirus associated virus：ＡＡＶ）キャプシドタンパク質から構成されるウイルス粒子へキャプシド化（encapsidation）するための系に関する。本発明は、遺伝病に苦しんでいる患者の治療に用いられる組換えウイルス株を得るための手段を提供する。
２．発明の背景
最もよく研究されている遺伝子治療のモデルは、病気の表現型を修正するために新しい遺伝情報を発現する組換え病原ウイルスを用いる遺伝子導入を伴うものである。最近まで、最も広く研究されてきた遺伝子治療用のウイルスベクターはレトロウイルスであった（Miller，A．D．，1990，Human Gene Ther．1:5-14）。レトロウイルスの使用は、例えば、挿入突然変異誘発をもたらすことがある宿主ゲノムへのレトロウイルスの無作為組込み、あるいはレトロウイルスＬＴＲ（long terminal repeat）と関連したプロモーター活性によるがん原遺伝子発現の偶然の活性化といった数多くの問題点を抱えている。ヒト以外の霊長類動物においてレトロウイルスベクターを使用した最近の研究からは、Ｔ細胞リンパ腫が発生することが証明されている。近頃では、遺伝子治療の分野における研究努力はこれら特定の性質を欠いているウイルスベクターの開発に集中している。
ＡＡＶは宿主細胞に感染する際に２つの経路をとることができる。ヘルパーウイルスが存在すると、ＡＡＶは溶菌サイクルに入り、そこでウイルスゲノムが転写、複製されて、新たに形成されたウイルス粒子へキャプシド化される。ヘルパーウイルス機能が存在しないと、ＡＡＶゲノムはＡＡＶ両末端と宿主細胞配列間の組換えにより宿主細胞ゲノムの特定領域へプロウイルスとして組込まれる〔Cheung，A．ら，1980，J．Virol．33:739-748; Berns，K．I．ら，1982，Virus Persistence，Mahey，B．W．J．ら編集（Cambridge Univ．Press，Cambridge），pp．249-265〕。
プロウイルスの組込み部位の特性付けおよびフランキング細胞配列の分析は、ヒト染色体１９の長腕へのＡＡＶウイルスＤＮＡの特定の標的指向性（targeting）を示す（Kotin，R．M．ら，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:2211-2215; Samulski，R．J．ら，1991，EMBO J．10:3941-3950）。ＡＡＶのこの特性は、ウイルスベクターＤＮＡが宿主遺伝子のコード領域に無作為に組込まれることから生じる挿入突然変異誘発の可能性を低くする。さらに、レトロウイルスのＬＴＲ配列とは対照的に、ＡＡＶのＩＴＲ（inverted terminal repeat：逆方向末端反復）配列は転写調節要素を欠き、がん原遺伝子の挿入活性化の危険性を減らすようである。
ＡＡＶゲノムはＲｅｐ（複製）およびＣａｐ（キャプシド）タンパク質をコードする主要なオープン・リーディング・フレームを含む４６８０ヌクレオチドの直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子から構成される。パリンドローム配列（ＤＮＡ複製の開始に際してプライマーとして機能するヘアピン構造を形成するために折り畳むことができる）を含む２つの１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がＡＡＶコード領域に隣接している（図１）。さらに、実験的観察から、ウイルスの組込み、宿主ゲノムからの救済、および成熟ウイルス粒子へのウイルス核酸のキャプシド化にとってはＩＴＲ配列が必要とされることが示された（Muzyczka，N．1992，Current Topics in Microbiology & Immunology．158，97-129）。
ＡＡＶを用いる近頃の実験は、原核生物ベクターにクローン化されたＡＡＶ配列が感染性であるという発見によって容易になっている（Samulskiら，1982，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．79:2077-2081）。無傷のＡＡＶゲノムを含むプラスミドをヘルパーウイルスの存在下で細胞にトランスフェクトすると、ＡＡＶはプラスミドベクターから救済され、溶菌経路に入って成熟ウイルス粒子の生産をもたらす。ヘルパーウイルスの不在下では、組換えＡＡＶベクターは宿主細胞のゲノムに組込まれ、その後細胞がヘルパーウイルスに感染するまでプロウイルスとしてそのままの状態で存在する。
３．発明の概要
本発明は、in vitroで合成することができかつ発現ベクターおよび／または遺伝子治療に有用なベクターを遺伝子工学的に作製するために使用することができる、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含む新規な１６５塩基対のＤＮＡ断片のin vitro合成に関する。この１６５ｂｐＤＮＡ配列（本明細書中では二重Ｄ  ＩＴＲ配列と呼ぶことにする）は野生型のＡＡＶには存在することが見いだされていない新規な形状をしている。
本発明は、二重Ｄ  ＩＴＲ配列が、シス（cis）において、環状二本鎖ＤＮＡ分子を直鎖状複製分子（共有結合で閉鎖された末端を有する）に変換するための、またはＡＡＶウイルス粒子内にキャプシド化するための、あるいは宿主ゲノムへ組込むための、十分な情報を提供できる点に部分的に基づいている。本発明は、組換えＤＮＡ分子を複製して成熟ウイルス粒子にパッケージするためのin vivo系を提供する。得られる組換えウイルス株は任意の細胞または組織へ遺伝情報を導入するための便利で効率のよい手段を提供する。この系は、障害されている遺伝子の正常な対応遺伝子の発現を介して所定の遺伝子異常を修正することを意図している遺伝子治療に応用することができる。
本発明はまた、トランスフェクションに先立って、組換えウイルスベクターおよび／または遺伝子治療に有用なベクターを細菌のγδリゾルベースでin vitro処理することに関する。組換えベクターへのリゾルベース認識配列の遺伝子工学的操作は、通常は複製およびキャプシド化される直鎖状のＤＮＡ分子の一部として含まれる細菌のプラスミド配列を取り除くという選択肢をもたらす。複製およびキャプシド化の前に、これらの細菌配列を取り除くことにより、発現ベクターに対象の外来ＤＮＡ配列を挿入するための最大量のスペースを作りだすことが可能となる。
本発明は、ＡＡＶの二重Ｄ  ＩＴＲ断片がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅されてプラスミドベクターに挿入される実施例により説明される。成熟ウイルス粒子にキャプシド化された組換えＤＮＡを含むウイルス株は、ヘルパー機能を発現している宿主細胞への発現ベクターのトランスフェクションにより得ることができる。
【図面の簡単な説明】
図１．  ＡＡＶの救済および複製メカニズム。（Ａ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）はＡ，Ａ’，Ｂ，Ｂ’，Ｃ，Ｃ’配列の塩基対合により折り畳まれてＴ字状構造を形成することができる。（Ｂ）ＩＴＲ部位での感染性プラスミドの切除は２本の直鎖状ＤＮＡ断片、つまりＡＡＶとプラスミドベクター、を生成する。（Ｃ）プラスミドの環状体から共有結合閉鎖末端を有する線状体への救済後の二重Ｄプラスミドから生成される想定断片。
図２．  環状ＤＤ−ＩＴＲプラスミドからの救済中間体。
図３．  二重Ｄ  ＩＴＲを含むプラスミドの複製検定。ヘルパープラスミドｐＡＡＶ／Ａｄの同時トランスフェクションを行ってまたは行わずに、プラスミドｐＤＤ−２をＡｄ５感染２９３細胞にトランスフェクトした。感染の４８時間後に低分子量ＤＮＡを抽出し、ＤｐｎＩ消化を行ってまたは行わずに、１％アガロースゲルで分離した。（Ａ）ゲルのエチジウムブロミド染色。（Ｂ）32Ｐ標識プラスミドｐＧＥＭ  ３Ｚプローブによるサザンブロット。
図４．ｐＤＤ−２とｐｓｕｂ２０１およびｐＳＭ６２０との複製の比較。プラスミドｐＤＤ−２を等量のｐＡＡＶ／Ａｄ（レーン１）、ｐｓｕｂ２０１（レーン２）またはｐＳＭ６２０（レーン３）とともにＡｄ５感染２９３細胞に同時トランスフェクトした。低分子量ＤＮＡを抽出し、ＤｐｎＩで消化し、１％アガロースゲルで分析した。（Ａ）エチジウムブロミド染色。（Ｂ）ＩＴＲオリゴヌクレオチドプローブによるサザンブロット。
図５．  大きさが異なる二重Ｄプラスミドの複製検定。ｐＤＤ−２またはｐＤＤ−ｎｅｏをヘルパーｐＡＡＶ／ＡｄとともにＡｄ５感染２９３細胞に同時トランスフェクトした。低分子量ＤＮＡを抽出し、ＤｐｎＩで消化し、１％アガロースゲルで分析した。（Ａ）エチジウムブロミド染色。（Ｂ）32Ｐ標識プラスミドｐＧＥＭ  ３Ｚプローブによるサザンブロット。
図６．  ｐＤＤ−２の救済および複製の制限分析。プラスミドｐＤＤ−２をＡｄ５感染または非感染２９３細胞に、ヘルパープラスミドｐＡＡＶ／Ａｄの同時トランスフェクションを行ってまたは行わずに、トランスフェクトした。低分子量ＤＮＡをＳｓｐＩまたはＳｃａＩのいずれかで消化し、１％アガロースゲルで分離した。32Ｐ標識ＩＴＲプローブを用いてサザンブロットを行った。
図７．  ＰＣＲにより増幅しかつＥｃｏＲＩで切断したｄｄ−ＩＴＲのプラスミドｐＧＥＭ−３ＺのＥｃｏＲＩ部位へのクローニング。
図８．  リゾルベース配列を含む親プラスミドのin vitro複製。
図９．  二重Ｄ  ＩＴＲ配列（配列番号１）。
図10．  細菌のγδリゾルベース認識配列（配列番号２）。
５．発明の詳細な説明
本発明は、本明細書中で二重Ｄ  ＩＴＲ配列と呼ばれる、新規な修飾ＡＡＶ  ＩＴＲヌクレオチド配列のin vitro構築に関する。本発明は、ＰＣＲ技法を用いる二重Ｄ  ＩＴＲ  ＤＮＡ断片の合成、ならびにこの断片が、シスにおいて、組換えＤＮＡ断片の複製および成熟ＡＡＶウイルス粒子へのそのキャプシド化、または宿主ゲノムへの組換えＤＮＡの特異的組込みのための十分な情報を提供するという証明に基づいている。本発明はさらに、真核生物ベクター中での二重Ｄ  ＩＴＲ  ＤＮＡ配列の使用、ならびに遺伝子代償療法におけるこれらのベクターの使用に関する。
二重Ｄ  ＩＴＲ配列は遺伝子工学的に操作して、対象の異種遺伝子を導入および／または発現させるように設計されたベクターとすることができる。遺伝子治療に用いる場合、対象の異種遺伝子は、所定の遺伝病に関係した欠損または変異遺伝子の正常もしくは野生型でありうる。組換えベクターは、対象の遺伝子のコード領域および二重Ｄ  ＩＴＲ配列を含むことに加えて、プロモーター／エンハンサー要素のような他の必要な調節要素、さらに翻訳およびポリアデニレーションシグナルを含むことができる。プロモーターおよびエンハンサー領域の選択は対象の遺伝子の希望するレベルおよび組織特異的発現に密接に関係してくるだろう。
ヘルパーウイルス機能を提供しかつトランス（trans）においてＲＥＰおよびＣＡＰタンパク質を供給する宿主細胞系への組換えベクターのトランスフェクションは、組換えウイルス株を得ることを可能とする（Muzyczka，N．，1992，Current Topics in Microbiology and Immunology 158:97-129）。その後、得られたウイルス株は、標的とされた所定の細胞または組織へ新しい遺伝情報を運搬および導入するための非常に効率のよい手段として使用することができる。
5.1.AAVウイルス配列
AAVゲノムは、REP（複製）タンパク質およびCAP（キャプシド）タンパク質をコードする２つのオープン・リーディング・フレームを含む4680のヌクレオチドからなる。145 bp逆方向末端反復配列（ITR）がゲノムの両末端に位置され、それらは互いに塩基対合することができるだけでなく、一本鎖の場合にはＡ、A’、Ｂ、B’、Ｃ、C’配列の塩基対合成によりそれら自体で個々に折り畳まれてDNA複製のためのＴ字形構造を形成できる点で特異である（図1A）。
無傷AAVゲノムを含むプラスミドがアデノウイルス感染細胞にトランスフェクトされる場合、AAVはプラスミドベクターから救済または複製されてウイルス溶菌サイクルに入り、成熟ウイルス粒子の生産をもたらすことができる。加えて、AAVコード領域が欠失され、異種DNA配列により置換される場合、組換えAAVが依然としてウイルス溶菌サイクルを完結でき、但し、ITRが無傷であり、かつREPタンパク質およびCAPタンパク質、または機能性均等物がトランスで供給されることを条件とする。しかしながら、２つのITR配列のうちの１つが欠失される場合、ウイルスDNAの複製が観察されず、これは両方のITRがAAV生存に必要とされることを示す。
本発明は、ITR配列中に存在する下記の20塩基対のＤ配列（AGGAACCCCTAGTGATGGAG）（配列番号５）がウイルス複製に必要とされたという発見に一部基いている。これは、Ｄ配列を欠失したウイルス変異体がそれらのDNAを複製できないことにより最初に実証された。更に、末端分割部位変異体の複製中に、自然欠失がITRのＡ配列に対してのみ起こり、Ｄ末端に対しては起こらないことがわかり、これはＤ配列を保持するための選択プロセスを示唆した。
Ｄ配列の機能を更に解明するために、付加的な20bp D’配列と共に単一の145bp ITR配列を含む新規な修飾末端反復構造を構築した（図９）（配列番号１）（下記の第6.13節を参照のこと）。得られる165bp配列は自然界に存在するウイルス中で同定されていない。鋳型としてのAAV DNAおよびAAV ITR配列のＤ配列＋5’末端の６bpのEcoRI認識部位から誘導された単一プライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応が行われ、これはＤ配列またはD’配列並びにEcoRI部位がITRの両側に配置されたDNA断片をもたらした。PCR生成DNA断片がEcoRIにより開裂されて付着末端を生じ、続いてpGEM3ZのEcoRI部位にクローン化された（図７）。二重D ITR構造を含む組換えプラスミドが細胞にトランスフェクトされて、二重D ITRが組換えDNAの複製、キャプシド化、組込みおよび救済に機能し得るか否かを測定した。これらの実験からの結果は、新規な二重D ITR構造が溶菌性または潜在性AAVウイルス感染中に２つの野生型ITRの通常必要とされる機能を行うのに充分であることを示す（下記の第6.2.3.節および第6.2.4.節を参照のこと）。
5.2.AAVウイルス配列および異種結合配列を含む組換えベクターの構築
本発明の二重D ITR配列（配列番号１）は組換えDNAの複製および成熟ウイルス粒子へのキャプシド化を誘導するのに必要とされる必要な情報を与える。二重D ITRヌクレオチド配列を含むDNA断片は、当技術分野で普通使用される幾つかの方法により得られる。本明細書に記載された特定の実施態様では、鋳型としてのAAV DNAおよびAAV ITRのＤ配列から誘導されたプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が二重D ITR DNA断片を得るのに使用された。このアプローチの合理性は天然ITR配列の予想二次構造に基いている。PCR反応の第一ラウンドにおいて、AAVウイルスITRはヘアピン構造を形成し、そして伸長プロセスを自己開始して基部にＤおよびD’を含む長いＴ形ヘアピン構造を生じる。変性後に、このDNAは単一プライムドPCR反応の鋳型として利用できる。二重D ITR DNA断片を単離するための別法として、DNA配列を化学的に合成することが挙げられるが、これに限定されない。
本発明に従って使用し得る改変ヌクレオチド配列は、それらがシスにおいて組換えDNAの複製、キャプシド化、組込みおよび救済のための情報を与えるそれらの能力を保持する点で機能上均等である二重D ITR配列の誘導体および類似体を含む。特に、二重D ITR誘導体はヌクレオチド配列の付加、置換または欠失を含んでいてもよいが、依然として生物学的機能を保持する。
通常の組換えDNA方法が真核生物発現ベクターへの新規な二重D ITR配列の挿入に使用し得る。これらとして、in vitro組換えDNA技術、合成技術およびin vivo組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、二重D ITR DNA配列は、適当な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を増幅DNA断片のそれぞれの末端に付加するオリゴヌクレオチドプライマーを使用してPCR反応で増幅し得る（第6.1.3節を参照のこと）。また、所望される制限部位は制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特別に化学合成されたオリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド配列（リンカー）を、相補付着末端を有する発現ベクターへ増幅二重D断片の末端でつなぐことにより生成し得る。
種々の宿主組換えベクター系が当業者により同等に良好に使用し得る。組換えベクターはE.coliにおける複製に必要な細菌プラスミド配列を含むことができ、またはシス作用性二重D ITR配列が対象の遺伝子に直接連結され得る。加えて、プラスミドは適当な転写／翻訳調節配列とポリアデニレーションシグナルの間に挿入された対象の異種遺伝子をコードするDNA配列を含むであろう。種々のプロモーター／エンハンサー要素が、所望されるレベルおよび組織特異的発現に応じて使用し得る。組換えDNA技術または合成技術により生成されたプロモーターは、対象の挿入遺伝子の転写を与えるのに使用し得る。また、特定の開始シグナルが挿入タンパク質コード配列の効率のよい翻訳に必要とされる。これらの配列はATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、ポリアデニレーションシグナルが転写mRNAの安定性を増大するために含まれていてもよい。
AAVウイルスベクター系の１つの潜在的な欠点は、５Kbより大きいDNA断片が成熟ウイルス粒子にパッケージされ得ないことにより課せられたサイズ制限である。所定の発現ベクターにおいて、2-3KbのDNA配列はE.coli中のプラスミドの増殖に必要とされる細菌プラスミド配列に由来する。これらのDNA配列は複製起点（ori）配列並びにアンピシリンおよびテトラサイクリンの如き抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を含む。実際に、これは対象の異種遺伝子の挿入のための2Kbのスペースのみを残す。
本発明の下記の特定の非限定的実施態様はこのサイズ制限問題に取り組んでいる。対象となる配列のクローニングに利用可能なスペースの量を増大するために、細菌組換え系（γδ）は、細菌プラスミドDNA配列の大半がin vitroで所定の組換えプラスミド構築物から組換えられ、それにより外来遺伝子の挿入のためのスペースの最大量を可能にするような様式でプラスミドを分割するのに使用し得る。γδリゾルベース配列は、外来遺伝子の挿入に利用可能なスペースを増大するための一般的な方法として、AAV系に限定されない種々のウイルスベクター系中で使用し得る。
親の二重Ｄ発現ベクタープラスミドは、二重D ITR配列の他に、γδリゾルベース酵素でin vitroで分割される場合に組換えを促進するように正しい方向で２コピーのγδ分割部位（図10）（配列番号２）（120塩基対）を含むように遺伝子工学的に操作し得る。γδリゾルベースの存在下で、組換えプラスミドは２つの環状DNA分子に変換されるはずである（図８）。１つのプラスミド分子は１コピーのγδ分割部位と共に一次細菌プラスミド配列を含むだろう。その他の分割プラスミド分子は二重D ITRシス作用性配列、１コピーのγδ分割部位および対象の遺伝子のコード領域を含むと予想されるであろう。ヘルパーウイルス並びにウイルスREPタンパク質およびCAPタンパク質の存在下で直線状複製分子に変換されるのはこのプラスミド分子であり、次にその直線状複製分子が成熟ウイルス粒子にキャプシド化されるであろう。
現在、環状プラスミド分子を複製直線状DNA断片に変換するのに必要とされるCAPタンパク質およびREPタンパク質を供給するにあたって、第２のプラスミドが必要とされる。本発明の更に特定の実施態様では、γδ分割部位を含むプラスミドが必要とされるウイルスREP機能およびCAP機能のためのコード領域を含むように操作し得る。通常、REPコード配列およびCAPコード配列は発現ベクターから排除されるであろう。何となれば、それらは挿入物のサイズを更に制限するからである。in vitro組換え系を使用して、これらのコード配列をプラスミド構築物中に含有させてもよい。何となれば、それらはリゾルベース酵素による２つのγδ分割部位での分割中に組換えられるからである（図８）。生産物は２種の連鎖状DNA分子である。
in vitroγδ反応は線形反応であるので、分割分子の量は親プラスミド対分割環状体の所望の比を生じるようにin vitro分割反応において調節し得る。次にプラスミドの混合物を宿主細胞にトランスフェクトすることができる。これは生産的複製にトランスで必要とされるAAV REP遺伝子およびCAP遺伝子を含む１つの環状分子を導入し、そして他の環状分子が二重D ITR配列および対象の遺伝子を含む。二重Ｄ環状分子は直線状DNA分子に複製され、続いてこれがREP/CAP環状プラスミド上に導入されたトランス因子によりウイルス粒子にキャプシド化され得る。
本発明は、第一に、（i）対象の遺伝子を含む組換えウイルスベクター配列、（ii）ヘルパー機能を与えるウイルス遺伝子、および（iii）ウイルスベクター配列に隣接する２つのγδリゾルベース認識配列（配列番号２）を含むプラスミドを増殖し、そして第二に、リゾルベース酵素を使用して対象の遺伝子を含む組換えウイルスベクター配列を残りのプラスミド配列から分離するための、上記のγδリゾルベース系の同様の使用を更に提供する。これらの方法によれば、ベクター機能およびヘルパー機能が誘導されるウイルスは、AAV、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルスを含むが、これらに限定されない任意の好適なウイルスであり得る。特に好ましい実施態様において、プラスミドのウイルスベクター部分は二重D ITR配列を含み、または両方のAAV ITRを含む。一般に、ウイルスベクター部分は、対象の遺伝子のキャプシド化および転写に必要な配列を含む。
5.3.組換えウイルス株の生産
本発明は、ヘルパーウイルス、AAV REPタンパク質およびCAPタンパク質をコードする組換えDNA、並びに対象のDNA配列および165塩基対の二重D ITR配列を含む組換え核酸を含む真核細胞を培養することを特徴とする組換えDNA分子を複製し、AAV粒子にキャプシド化する方法に関する。
組換えウイルス株を作出するために、二重D ITR組換え発現ベクタープラスミドを、ヘルパーウイルス機能を与え、そしてAAV REPタンパク質およびCAPタンパク質をトランスで供給できる宿主細胞系にトランスフェクトする。REPタンパク質およびCAPタンパク質は直線状組換えDNAの複製および成熟ウイルス粒子へのキャプシド化に必要とされる。
REPタンパク質およびCAPタンパク質は、該タンパク質のそれぞれをコードできる組換えプラスミドによる宿主細胞系のトランスフェクションによりトランスで供給される。DNAトランスフェクションは、当業者に公知の方法を使用して行い得る。これらとして、リポフェクション、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿によるDNAトランスフェクションが挙げられる［Ausubelら，1989，Current Protocols for Molecular Biology］。プラスミドは、REPタンパク質およびCAPタンパク質を一時的にまたは安定に発現させる目的で宿主細胞系にトランスフェクトされる。第6.1.節に記載された特定の実施態様において、AAVコード領域を含むプラスミドpAAV/ADがREPタンパク質およびCAPタンパク質を発現させる目的で宿主細胞にトランスフェクトされた。
別の実施態様において、二重D ITR発現ベクターはREPタンパク質およびCAPタンパク質を直接発現するように操作し得る。この場合、プラスミドベクター中にγδリゾルベース配列を入れることがまた重要となり、その結果、REPコード領域およびCAPコード領域は、外来DNAの挿入に関してサイズ制限が課せられないようにin vitroリゾルベース反応中に組換えられる。
ウイルスREPタンパク質およびCAPタンパク質を発現することの他に、宿主細胞系はヘルパーウイルス機能を与えることができなければならない。アデノウイルスおよび単純ヘルペスウイルスの両方が、二重D ITR配列を含むDNA断片の複製のためのヘルパーウイルスとして利用し得る。これらの２種のウイルスまたはAAVのヘルパーウイルスとして作用するウイルスのいずれかによる感染を許容する宿主細胞はどれも、本発明の実施に使用し得る。感染多重度（MOI）および感染時間の期間は、使用されるウイルスの型および使用される細胞系に依存するであろう。
本明細書に記載された特定の実施態様では、組換え二重D ITR発現ベクターで既にトランスフェクトされた293細胞が10のMOIでAd5により感染された。48時間後に、細胞は凍結および解凍を３回行い、そして56℃で１時間インキュベートしてアデノウイルスを不活化した。得られる細胞溶解産物は、選択された細胞または組織を感染するのに使用し得る組換えウイルス粒子を含む。
5.4.組換えベクターの使用
患者が苦しんでいる多数のヒト遺伝子疾患があり、これらは鎌状赤血球貧血症、サラセミア、レッシュ−ナイハン症および膵嚢胞性繊維炎の如き疾患を含む。現在の治療はこれらの疾患と関連する徴候を殆ど軽減せず、そして遺伝子疾患の治療のための新規な方法を開発する努力が現在なされている。
分子技術における最近の進歩は、所定の欠損遺伝子の正常な対応遺伝子を単離することを可能にし、これが“遺伝子治療”の概念、および遺伝子疾患にかかっている患者の治療の実施可能な手段としての遺伝子治療の容認をもたらした。最近まで、レトロウイルスが遺伝子治療における使用につき最も広く研究されたウイルスベクターであった。残念なことに、幾つかの難点がレトロウイルスの使用と関連し、これらは宿主染色体へのレトロウイルスDNAのランダム組込みを含み、挿入突然変異誘発またはがん原遺伝子発現の活性化をもたらす。
AAVベクターは遺伝子治療で使用するためのレトロウイルス系の実施可能な代替物を提供する。宿主染色体へのAAVの非ランダムな組込みおよびITR構造と関連する転写活性の欠如は、AAVが遺伝子疾患の治療に特に有益であり得ることを示す。
本明細書に記載された対象の遺伝子を含む、二重D ITR発現ベクターは、遺伝子疾患の治療に有益であり得る。対象となる遺伝子はあらゆる突然変異遺伝子または欠損遺伝子の野生型対応物であり、その発現がその天然プロモーターにより調節されるように（例えば、発現が正常に調節されるように）または異種プロモーターにより調節されるように二重D ITR組換えベクターに挿入し得る。組換えウイルス株は、最初に両末端が共有結合で閉鎖された直線状DNA分子への環状二本鎖分子の変換を可能にする好適な宿主細胞系へ二重D ITRプラスミドをトランスフェクトすることにより発生し得る。次にこれは組換えDNAの複製および成熟ウイルス粒子へのキャプシド化を可能にする。次に得られたウイルス株は遺伝子欠損により冒された組織または細胞を感染するのに使用し得る。
6.実施例：新規な165塩基対の末端反復配列はアデノ随伴ウイルスの生活環に必要とされる唯一のシス要素である
下記の文節は二重D ITR配列の合成および機能特性付けを記載する。
6.1.材料および方法
6.1.1.DNAトランスフェクション
ヒト細胞系293を、10％のFCS（ウシ胎児血清、ハイクローン（HyClone）を含むDMEM（ダルベッコ改良イーグル培地、ギブコ（GIBCO））中に維持した。プラスミドDNAのトランスフェクションを、製造業者により記載されたリポフェクション（BRL）方法により行った。簡単に言えば、６cmの皿中の細胞をDMEMで２回洗浄し、１時間にわたってOpti-MEM（ギブコ）１ml中で10moi（感染多重度）でアデノウイルス５で感染した。次にプラスミドDNA５μgを室温で10分間にわたってリポフェクチン（BRL）50μlとともにインキュベートし、Opti-MEM２mlと混合し、アデノウイルス感染細胞に添加した。12時間のインキュベーション後に、細胞に４％のFCSを含むDMEM３mlを供給し、更に36時間インキュベートした。
6.1.2.サザンハイブリダイゼーション
トランスフェクトした細胞からの低分子量DNAをHirt（Hirt，B．1967，J．Mol．Biol．26:365-369）により記載されたようにして抽出した。DNAを制限酵素（ニューイングランド・バイオラブ（New England BioLab））により消化し、アガロースゲルで分離し、次にジーンスクリーン＋ナイロン膜（デュポン（Du Pont））に移した。32P標識プラスミドDNAによるハイブリダイゼーションを製造業者により推奨されたようにして行った。N．Muzyczkaにより親切に提供されたITRのＡ領域から誘導されたr-32P-ATP末端標識ITRオリゴヌクレオチドプローブA-1（5’TTGGCCACTCCCTCTCTGCG3’）（配列番号４）によるハイブリダイゼーションを以下のようにして行った。その膜を、5X SSC、10Xデンハート溶液、10％硫酸デキストランおよび５％SDSを含む溶液10ml中で60℃で少なくとも１時間にわたってプレハイブリダイズさせた。32P末端標識オリゴ−プローブ25ngおよびH2O0.5ml中の熱変性サケ精子DNA200μgを添加した。ハイブリダイゼーションを60℃で一夜続けた。その膜を3X SSCおよび５％SDS中で60℃で30分間にわたって２回洗浄し、そして0.2X SSC中で室温で10分間にわたって１回洗浄した。
6.1.3.PCRおよびITRプラスミドの構築
AAVおよびAd5感染細胞からの低分子量DNAをAAVのＤ配列から誘導された単一プライマーによるPCR反応の鋳型として使用した。PCRを、20mMのトリス-HCl（pH8.8）、1.5mMのMgCl、50mMのKCl、2.5％のホルムアミド、100μモルのdATP、dCTPおよびdTTP、75μモルの7-デアゾ-dGTP、25μモルのdGTP、1.5UのAmpliTag（パーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer Cetus））、１ngのAAV DNAおよび100pモルのプライマーTR-1（5’-GGAATTCAGGAACCCCTAGTGATGG-3’）（配列番号３）を含む反応溶液50μl中で94℃で１分間、45℃で30秒間そして72℃で１分間で35サイクルにわたって行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、EcoRIで切断し、そしてEcoRIで切断され、かつ脱リン酸化されたpGEM3Zプラスミド（プロメガ（Promega））と連結した。連結したプラスミドをE.coli Sure株（ストラタゲン（Stratagene））に形質転換した。pDDと称される陽性クローンを二重Ｄ末端反復配列の存在につきスクリーニングし、そしてdGTPに代えて用いた7-デアゾ-dGTPによるジデオキシ配列決定法により確認した（Sanger，F．ら，1977，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74:5463-5467）。続いて、neo遺伝子をpDD-2のSalI部位にクローン化してプラスミドpDD-neoを得た。
6.1.4.neo-耐性細胞系のクローニング
Ad5感染293細胞をpDD-neoおよびpAAV/Ad［Samulskiら，1989．J．Virol．63:3822-3828］で48時間にわたって同時トランスフェクトした。細胞を３回凍結、解凍し、次に56℃で１時間インキュベートしてAd5ウイルスを不活化した。DD-neo組換えAAVウイルスを含む細胞溶解産物を使用してヒト細胞系デトロイト６に感染させた。細胞を24時間接種し、次に400μg/mlのG418で選択してneo-耐性クローンを得た。種々のクローンを10のMOIで野生型AAVおよびAd5で重感染して潜在性neo-AAVを救済した。
6.2.結果
6.2.1.二重Ｄ配列を含むITRの構築
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して他の末端に付加されたD’配列を含む逆方向末端反復配列を構築した。その合理性はITRのＴ形構造に基いている。PCR反応の第一ラウンドにおいて、AAVウイルスIRTは伸長を自己開始して基部にＤおよびD’を含む長いＴ形ヘアピン構造を生じるであろう。変性後に、このDNAは単一プライムドPCRの鋳型として利用できる。
ITR領域中の高GC含量および強いパリンドローム構造のために、幾つかの戦略、例えば、7-デアゾ-dGTP、2.5％のホルムアミド、および高濃度のプライマーを使用してPCR問題に取り組んで、充分な所望のPCR産物を得た。クローニングの便宜のために、EcoRI認識部位をプライマーの5’側に結合し、その結果、PCR産物をEcoRIにより切断し、pGEM 3Zのポリリンカーに容易にクローン化できた。細菌宿主中のITRの不安定性のために、組換えプラスミドを、ITRがかなり安定であるE.coli Sure株（ストラタゲン）に形質転換した。上記の戦略を使用することにより、本発明者らは多数の陽性クローンを得た。幾つかのクローンを制限消化および配列決定により特性付けした。pGEM 3ZのEcoRI部位にD’ABB’CC’A’Dの挿入物を有するクローンの１つが図２に示される。このプラスミドをpDD-2と称し、下記のトランスフェクション実験に使用した。
6.2.2.pDD-2複製はREPに依存性である
複製の能力を分析するために、ヘルパープラスミドpAAV/Ad（これは機能性REP遺伝子およびCAP遺伝子を含むがITRを含まず、その結果、それは複製できない）の同時トランスフェクションにより、またはそれによらずにプラスミドpDD-2をAd5感染293細胞にトランスフェクトした。機能性起点の欠如のために、この分子はREPタンパク質およびCAPタンパク質をトランスで供給し得るにすぎない。48時間のトランスフェクション後に、プラスミドDNAを抽出し、DpnI消化を行って、または行わないで１％のアガロースで分離した。DpnIはインプットされたメチル化プラスミドDNAのみを消化し、一方、複製（脱メチル化）DNAを無傷で残す。結果は、ヘルパープラスミドの不在下で、pDD-2プラスミドは複製せず、それ故、そのDNAが完全にDpnI感受性であることを実証した（図３、レーン１および２）。しかしながら、ヘルパープラスミドの存在下で、pDD-2はDpnI消化に対する耐性および単量体分子および二量体分子（すなわち、典型的なAAV複製パターン）の  在により証明されるように非常に効率よく複製した（図３、レーン３および４）。pDD-2複製は２つの因子、すなわちシスのDD-ITRおよびトランスのREP遺伝子産物に依存性である。何となれば、クローニングベクターpGEM-3Zは同じ条件下で複製せず、またCAP遺伝子を含まないでREP遺伝子のみを含むプラスミドがpDD-2にヘルパー機能をトランスで供給し得るからである（データは示されていない）。１つの修飾ITRを含むpDD-2の複製は非常に効率的であったので、pDD-2と２種のその他の感染性AAVプラスミド、psub201［Sam-ulskiら，1987．J．Virol，61:3096-3101］およびpSM620［Sam-ulskiら，1982，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．79:2077-2081］（これは２つのITRならびに野生型REP遺伝子およびCAP遺伝子を有する）の比較を行った。pDD-2を、等量のpAAV/Adヘルパー（ITRを含まない）、psub201またはpSM620と共にAd5感染細胞に同時トタンスフェクトした。プラスミドDNAをトランスフェクションの２日後に抽出し、DpnIで消化し、１％のアガロースゲルで分離した。ITRを含む全ての複製DNAを検出できるようにITRのＡ配列からのオリゴヌクレオチドプローブを用いてサザンブロットを行った。図４に示されるように、AAVコード遺伝子を含む全ての３種のプラスミドはpDD-2複製を同等に良好に補足することができる。しかしながら、psub201それ自体は極めて低いレベルで複製したが、それはpDD-2複製を効率よく補足することができる。pSM201はpDD-2と同様のレベルで複製した。
pDD-2複製の有効性が特別なDD-ITRによるものであったか、または更に小さいサイズのプラスミド（2.9kb）によるものであったかを調べるために、1.2kbのneo遺伝子断片をpDD-2のポリリンカーでSalI部位に挿入した。新規なプラスミドpDD-neoはサイズが4.1kbであり、野生型AAVのサイズ（4.68kb）に近似する。このプラスミドは環状二本鎖から直線状分子に変換し、親pDD-2と同様に有効に複製した（図５）。DD-ITRプラスミドを7.5kbまでのサイズで構築した。これらの分子もまた効率よく複製する（データは示されていない）。上記の結果は、DD-ITRがRep依存性複製のための優れた基質であることを示唆する。
6.2.3.複製および救済はAAV機構によるものである
AAV逆方向末端反復配列はウイルス複製起点であることが証明された。in vitroで、これらの配列はREPタンパク質、部位およびストランド特異的ニッカーゼおよびヘリカーゼにより基質として認識される。また、ITRはAAV救済の基質として考えられていた［Muzyczka，N．1992，Current Topics in Microbiology ＆ Immunology．158，97-129］。二重Ｄプラスミドは１つの特異なITRを含み、そして本発明者らはこの配列がREPタンパク質の存在下でのみ複製することを実証したので、救済および複製が同様のAAV救済および複製機構によるものであると予想することは魅力的である（図１、ＡおよびＢ）。
上記の仮説を試験するために、pDD-2 DNAをヘルパープラスミドを用いて、または用いないでAd5感染293細胞にトランスフェクトし、または非感染293細胞にトランスフェクトした。続いて、プラスミドDNAをそれぞれ２種の単一切断酵素ScpIおよびScaIにより制限分析にかけた（地図については、図２を参照のこと）。ITRを含む断片のみが検出されるようにITRオリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡを釣り上げた。。結果を図６に示す。SspIまたはScaI消化後に、直線状全長プラスミドバンドが全てのレーン（Ｐ〜６）で観察できた。このバンドは分割されなかったインプット環状プラスミドに由来した。レーン１および４（Ad5＋ヘルパープラスミド）では、予想分子量を有する４つの付加的なバンドも見られた。それらのうちの２つは消化二量体分子の内部の頭−頭結合断片および尾−尾結合断片から生じた。その他の２つのバンドは消化された単量体および二量体外部断片により誘導され、おそらくpDD-2が特異な二重D ITR部位で分割され、AAV複製機構により複製されることを示唆する。Ad5感染細胞（レーン２および５）および非感染細胞（レーン３および６）では、分割単量体からの２つの不明瞭なバンドが目視できたことが注目に値し、これは或る細胞機構がその他のAAV配列またはAAV遺伝子産物の不在下で二重D ITR部位で救済プロセスを開始できることを示唆する。このような救済されたDNAはRepタンパク質の不在下で複製できなかったが（図３、レーン２を参照のこと）、これは二重Ｄ基質が２つの野生型ITRを含む通常のAAVプラスミドでは見られないAAV認識の第一段階に関与する特別な特徴を与え得ることを示唆する。
6.2.4.１つのシスのDD-ITRはAAV生存にとって充分である
単一の修飾DD-ITRを含むプラスミドは野生型AAVと同様に効率よく複製できたので、それ故下記の質問が問われた。すなわち、この複製DNAはウイルス粒子にキャプシド化され得るのか？そうである場合、これらのウイルス粒子は細胞を感染し、そして細胞DNAへの組込みにより潜在性感染を樹立することができるのか？最後に、これらの潜在性配列は続いて染色体から離れて救済され、そして野生型AAVおよびアデノウイルスによる重感染後に生産的経路に再度入ることができるのか？
上記の質問に答えようと努めて、プラスミドpDD-neoを使用して第6.1.4.節に記載されたようにしてDD-neoウイルス調製物をつくった。次に組換えウイルス粒子を含む細胞溶解産物を使用してヒトデトロイト６細胞を感染した。感染２週間後に細胞をG418に対して選択した。幾つかのneo耐性クローンを分離し、これは組換えウイルスがつくられ、そして形質導入が行われたことを示す。DD-neor細胞系を野生型AAV-2およびAd5で重感染し、導入のDNAの救済および複製につき分析した。次にウイルスDNAを抽出し、neo遺伝子断片で釣り上げた。DD-neoウイルスDNAを救済したpDD-neor細胞系の例は単量体および二量体として複製した（データは示されていない）。これらの結果は、165bpの単一DD-ITRがAAV生活環の全段階を実現するのに必要とされる唯一のシス配列であることを実証した。こうして、プラスミドからの救済、DNAの複製、ウイルスのキャプシド化、細胞への感染、染色体への組込みそして再度の救済の如きプロセスは全てこの特異な二重Ｄ逆方向末端反復配列により媒介された。
本発明は本明細書に開示された実施態様により範囲を限定されるべきではなく、これらは本発明の単なる側面の説明として意図され、そして機能上均等であるあらゆるクローン、DNAまたはアミノ酸配列が本発明の範囲内にある。実際に、本明細書に示され、記載されたものに加えて、本発明の種々の改良が以上の説明および添付図面から当業者に明らかになるであろう。このような改良は請求の範囲内に入ることが意図されている。
また、ヌクレオチドおよびペプチドにつき示された全ての塩基対並びにアミノ酸残基の数およびサイズはおよそのものであり、説明の目的で使用されることが理解されるべきである。
種々の刊行物が本明細書に引用され、これらは参考として本明細書にそのまま組み込まれる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：165
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：DNA（genomic）
配列
0004117023.tif 000002
配列番号：２
配列の長さ：120
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：DNA（genomic）
配列
0004117023.tif 000003
配列番号：３
配列の長さ：25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：DNA（genomic）
配列
0004117023.tif 000004
配列番号：４
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：DNA（genomic）
配列
0004117023.tif 000005
配列番号：５
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：DNA（genomic）
配列
0004117023.tif 000006
【図１Ａ】
0004117023.tif 000007
【図１Ｂ】
0004117023.tif 000008
【図１Ｃ】
0004117023.tif 000009
【図２】
0004117023.tif 000010
【図３】
0004117023.tif 000011
【図４】
0004117023.tif 000012
【図５】
0004117023.tif 000013
【図６】
0004117023.tif 000014
【図７】
0004117023.tif 000015
【図８】
0004117023.tif 000016
【図９】
0004117023.tif 000017
【図１０】
0004117023.tif 000018