(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
0004169332.tif 000031
（式中、Ｒ1は炭素数１から６のアルキル基を意味し、Ｒ2は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物を、バチルス セレウス ATCC14579(Bacillus cereus ATCC14579)もしくはマイクロバクテリウム ラエヴァニフォルマス IF014471(Microbacterium laevaniformas IFO14471)由来のエステル不斉加水分解能を有する酵素、該微生物の培養液、該微生物菌体、または該微生物菌体処理物で処理した後の混合物から単離採取することを特徴とする式（Ｉ−ａ）
【化２】
0004169332.tif 000032
（式中、Ｒ1及びＲ2は前記と同じ。）で表される光学活性な化合物の製造方法。
【請求項２】
Ｒ2が置換基を有していてもよいアラルキル基である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
Ｒ2がベンジル基である請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
Ｒ1がエチル基である請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
酵素が、前記エステル不斉加水分解能を有する微生物の菌体を、高圧下に破砕し、陰イオンクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、次いで陰イオンクロマトグラフィーで精製することにより得られるエステル不斉加水分解能を有する酵素である請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
式（Ｉ）
【化３】
0004169332.tif 000033
（式中、Ｒ1は炭素数１から６のアルキル基を意味し、Ｒ2は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物を、バチルス セレウス ATCC14579(Bacillus cereus ATCC14579)もしくはマイクロバクテリウム ラエヴァニフォルマス IF014471(Microbacterium laevaniformas IFO14471)由来のエステル不斉加水分解能を有する酵素、該微生物の培養液、該微生物菌体、または該微生物菌体処理物で処理した後の混合液から単離採取して式（Ｉ−ａ）
【化４】
0004169332.tif 000034
（式中、Ｒ1及びＲ2は前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、この化合物（Ｉ−ａ）を非アルコール系溶媒中、一級アルコール類存在下で、水素化ホウ素金属化合物で処理して式（ＩＩ）
【化５】
0004169332.tif 000035
（式中、Ｒ2は前記と同じ。）
で表される化合物を得、この化合物（ＩＩ）と、式（ＩＩＩ）
【化６】
0004169332.tif 000036
（式中、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、各々独立してハロゲン原子を意味する。）で表される化合物とを塩基存在下で処理して、式（ＩＶ）
【化７】
0004169332.tif 000037
（式中、Ｒ2、Ｘ1およびＸ2は、前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（ＩＶ）のニトロ基のアミノ基への変換とＲ2の脱離とを同時に行うことを特徴とする式（Ｖ）
【化８】
0004169332.tif 000038
（式中、Ｘ1およびＸ2は、前記と同じ。）で表される化合物の製造方法。
【請求項７】
式（ＩＶ）
【化９】
0004169332.tif 000039
（式中、Ｘ1およびＸ2は、各々独立してハロゲン原子を意味する。Ｒ2は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物のニトロ基のアミノ基への変換とＲ2の脱離とを同時に還元条件下で行い、式（Ｖ）
【化１０】
0004169332.tif 000040
（式中、Ｘ1およびＸ2は、前記と同じ。）で表される化合物を得ることを特徴とする請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
非アルコール系溶媒が芳香族炭化水素である請求項６または７記載の製造方法。
【請求項９】
一級アルコール類がメタノールである請求項６〜８のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１０】
水素化ホウ素金属化合物が水素化ホウ素ナトリウムである請求項６〜９のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１１】
Ｒ2が置換基を有していてもよいアラルキル基である請求項６〜１０のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１２】
Ｒ2がベンジル基である請求項６〜１１のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１３】
式（Ｉ）
【化１１】
0004169332.tif 000041
（式中、Ｒ1は炭素数１から６のアルキル基を意味し、Ｒ2は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物を、バチルス セレウス ATCC14579(Bacillus cereus ATCC14579)もしくはマイクロバクテリウム ラエヴァニフォルマス IF014471(Microbacterium laevaniformas IFO14471)由来のエステル不斉加水分解能を有する酵素、該微生物の培養液、該微生物菌体、または該微生物菌体処理物で処理した後の混合物から単離採取して式（Ｉ−ａ）
【化１２】
0004169332.tif 000042
（式中、Ｒ1及びＲ2は前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、この化合物を非アルコール系溶媒中、一級アルコール類存在下で、水素化ホウ素金属化合物で処理して式（ＩＩ）
【化１３】
0004169332.tif 000043
（式中、Ｒ2は前記と同じ。）
で表される光学活性な化合物を得、この化合物（ＩＩ）と式（ＩＩＩ）
【化１４】
0004169332.tif 000044
（式中、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、各々独立してハロゲン原子を意味する。）で表される化合物を塩基で処理して、式（ＩＶ）
【化１５】
0004169332.tif 000045
（式中、Ｒ2、Ｘ1およびＸ2は、前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、この化合物（ＩＶ）のニトロ基のアミノ基への変換とＲ2の脱離とを同時に行って、式（Ｖ）
【化１６】
0004169332.tif 000046
（式中、Ｘ1およびＸ2は、前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（Ｖ）に式（ＶＩ）
【化１７】
0004169332.tif 000047
（式中、Ｙは炭素数１〜６のアルコキシ基、ハロゲン原子又はジ（Ｃ1−Ｃ6アルキル）アミノ基を意味し、Ｒ3およびＲ4は各々独立して炭素数１〜６のアルキル基を意味する。）
で表される化合物を反応させて、式（ＶＩＩ）
【化１８】
0004169332.tif 000048
（式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ3およびＲ4は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（ＶＩＩ）にスルホニル化合物を反応させて式（ＶＩＩＩ）
【化１９】
0004169332.tif 000049
（式中、Ｒ5は置換基を有していてもよいアルキルスルホニル基または置換基を有していてもよいアリールスルホニル基を意味し、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ3およびＲ4は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（ＶＩＩＩ）を塩基条件下に閉環して式（ＩＸ）
【化２０】
0004169332.tif 000050
（式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｒ3およびＲ4は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（ＩＸ）をホウ素化合物の存在下又は非存在下に加熱して式（Ｘ）
【化２１】
0004169332.tif 000051
（式中、Ｒ6は炭素数１〜６のアルキル基、又はＢＺ2（ここでＺはハロゲン原子、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ基、又はＣ2−Ｃ7アルキルカルボニルオキシ基を示す）を示し、Ｘ1およびＸ2は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（Ｘ）に４−メチルピペラジンを反応させて式（ＸＩ）
【化２２】
0004169332.tif 000052
（式中、Ｘ1およびＲ6は前記と同じ。）で表される化合物を得、次いで加水分解することを特徴とする、式（ＸＩＩ）
【化２３】
0004169332.tif 000053
（式中、Ｘ1は前記と同じ。）で表される化合物の製造方法。
【請求項１４】
式（ＩＶ）
【化２４】
0004169332.tif 000054
（式中、Ｘ1およびＸ2は、各々独立してハロゲン原子を意味する。Ｒ2は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物のニトロ基のアミノ基への変換とＲ2の脱離とを同時に還元条件下で行い、式（Ｖ）
【化２５】
0004169332.tif 000055
（式中、Ｘ1およびＸ2は、前記と同じ。）で表される化合物を得ることを特徴とする請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
非アルコール系溶媒が芳香族炭化水素である請求項１３または１４記載の製造方法。
【請求項１６】
一級アルコール類がメタノールである請求項１３〜１５のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１７】
水素化ホウ素金属化合物が水素化ホウ素ナトリウムである請求項１３〜１６のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１８】
Ｒ2が置換基を有していてもよいアラルキル基である請求項１３〜１７のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１９】
Ｒ2がベンジル基である請求項１３〜１８のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項２０】
Ｘ1がフッ素原子である請求項１３〜１９のいずれか１項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗菌性化合物の製造に有用な光学活性なプロポキシアニリン誘導体の製造方法とそのための中間体の製造方法に関する。
背景技術
Ｓ−（−）−９−フルオロ−３−メチル−１０−（４−メチル−１−ピペラジニル）−７−オキソ−２，３−ジヒドロ−７Ｈ−ピリド［１，２，３−ｄｅ］［１，４］ベンゾオキサジン−６−カルボン酸（レポフロキサシン、ＬＶＦＸ；特開昭６２−２５２７９０号公報）は優れた合成抗菌剤として知られている。
この合成抗菌剤の製造中間体として式（Ｖ）
0004169332.tif 000002
（式中、Ｘ１およびＸ２は、各々独立してハロゲン原子を意味する。）で表される化合物（以下、化合物（Ｖ）と表し、他の番号で表される化合物も同様に表す。）は有用であり、下記の製法にて製造可能なことが知られている（特開平１−２５０３６９号および特開平２−７２３号公報）。
0004169332.tif 000003
すなわち、化合物（Ｖ）は、市販の乳酸エステルの水酸基をテトラヒドロピラニル基で保護して得た化合物（Ａ）を水素化リチウムアルミニウムにより還元して化合物（Ｂ）を得、この化合物（Ｂ）と化合物（Ｃ）とを水素化ナトリウムで処理して化合物（Ｄ）を得、その後、テトラヒドロピラニル基を除去し、ニトロ基を還元することにより、合成できる。
しかし、化合物（Ａ）の原料である乳酸エステルのうち安価に入手容易なものでは光学純度が９７％ｅｅ程度であり、９９％ｅｅ以上という高い光学純度を要求されるレボフロキサシンの原料としては不適当である。
そのため、乳酸エステルを用いない化合物（Ｂ）の別途製造方法も開発されている（特開平２−２６５７０１）。また、還元に用いる水素化リチウムアルミニウムは安全面より大量に取り扱うことは困難であった。さらに、上記の製造方法は比較的工程数が多かった。さらにまた、テトラヒドロピラニル基を除去する際にはラセミ化を伴なうことが報告されている（Ｓ．Ｃｈｌａｄｅｋ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．（Ｌｏｎｄｏｎ），１７１９（１９６４））。
そのため、化合物（Ａ）のテトラヒドロピラニル基をベンジル基とした化合物（（Ｒ）−２−ベンジロキシプロピオン酸エステル）の使用を検討した。しかし、従来は（Ｒ）−２−ベンジロキシプロピオン酸エステルとしては９７％ｅｅ程度の光学純度のものしか入手できなかった。医薬としてのレボフロキサシンは９９％ｅｅ以上というさらに高い光学純度を要求されるのに対し、中間工程で光学純度を向上することが困難なため、９７％ｅｅ程度の（Ｒ）−２−ベンジロキシプロピオン酸エチルはレボフロキサシンの原料としては使用できなかった。
そこで、これらの課題を解決すべき方法の開発が望まれていた。
本発明の目的は、光学活性なプロポキシアニリン誘導体及び抗菌剤として有用なレボフロキサシンの安価で効率的な製造方法とそのための中間体の製造方法を提供することである。
さらに本発明は、エステル不斉加水分解能を有する微生物の菌体を、高圧下に破砕し、陰イオンクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、次いで陰イオンクロマトグラフィーで精製することにより得られるエステル不斉加水分解能を有する酵素を提供するものである。
発明の開示
本発明者らは鋭意検討した結果、ラセミ体である乳酸エステル誘導体をエステル不斉加水分解能を有する酵素等で処理することにより、一方の光学異性体のエステル部分を特異的に加水分解する方法を見出し、また、この加水分解により得られた化合物を中間体として用いることにより従来より安価かつ短工程で光学活性なプロポキシアニリン誘導体が製造できることを見出した。また、エステル不斉加水分解反応により生じた不要な光学異性体をラセミ化によって基質に戻すリサイクル法も見出した。これらの知見により光学純度の高いレボフロキサシンが効率的に製造できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、式（Ｉ）
0004169332.tif 000004
（式中、Ｒ１は炭素数１から６のアルキル基を意味し、Ｒ２は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物を、エステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物で処理した後の反応液から単離採取することを特徴とする式（Ｉ−ａ）
0004169332.tif 000005
（式中、Ｒ１はおよびＲ２は前記と同じ。）で表される光学活性な化合物の製造方法に係るものである。
また、本発明は、式（Ｉ）
0004169332.tif 000006
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同じ。）で表される化合物を、エステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物で処理した後の反応液から単離採取して式（Ｉ−ａ）
0004169332.tif 000007
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、この化合物（Ｉ−ａ）を非アルコール系溶媒中、一級アルコール類存在下で、水素化ホウ素金属化合物で処理して式（ＩＩ）
0004169332.tif 000008
（式中、Ｒ２は前記と同じ。）
で表される光学活性な化合物を得、この化合物（ＩＩ）と式（ＩＩＩ）
0004169332.tif 000009
（式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、各々独立してハロゲン原子を意味する。）で表される化合物を塩基で処理して、式（ＩＶ）
0004169332.tif 000010
（式中、Ｒ２、Ｘ１およびＸ２は、前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、この化合物（ＩＶ）のニトロ基のアミノ基への変換とＲ２の脱離とを同時に行うことを特徴とする式（Ｖ）
0004169332.tif 000011
（式中、Ｘ１およびＸ２は、前記と同じ。）で表される化合物の製造方法に係るものである。
さらに本発明は、式（Ｉ）
0004169332.tif 000012
（式中、Ｒ１は炭素数１から６のアルキル基を意味し、Ｒ２は水酸基の保護基を意味する。）で表される化合物を、エステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物で処理した後の混合液から単離採取して式（Ｉ−ａ）
0004169332.tif 000013
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、この化合物（Ｉ−ａ）を非アルコール系溶媒中、一級アルコール類存在下で、水素化ホウ素金属化合物で処理して式（ＩＩ）
0004169332.tif 000014
（式中、Ｒ２は前記と同じ。）
で表される化合物を得、この化合物（ＩＩ）と、式（ＩＩＩ）
0004169332.tif 000015
（式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、各々独立してハロゲン原子を意味する。）で表される化合物を塩基で処理して、式（ＩＶ）
0004169332.tif 000016
（式中、Ｒ２、Ｘ１およびＸ２は、前記と同じ。）で表される光学活性な化合物を得、この化合物（ＩＶ）のニトロ基のアミノ基への変換とＲ２の脱離とを同時に行って、式（Ｖ）
0004169332.tif 000017
（式中、Ｘ１およびＸ２は、前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（Ｖ）に式（ＶＩ）
0004169332.tif 000018
（式中、Ｙは炭素数１〜６のアルコキシ基、ハロゲン原子又はジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ基を意味し、Ｒ３およびＲ４は各々独立して炭素数１〜６のアルキル基を意味する。）で表される化合物を反応させて、式（ＶＩＩ）
0004169332.tif 000019
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ３およびＲ４は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（ＶＩＩ）にスルホニル化合物を反応させて式（ＶＩＩＩ）
0004169332.tif 000020
（式中、Ｒ５は置換基を有していてもよいアルキルスルホニル基または置換基を有していてもよいアリールスルホニル基を意味し、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ３およびＲ４は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（ＶＩＩＩ）を塩基条件下に閉環して式（ＩＸ）
0004169332.tif 000021
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ３およびＲ４は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（ＩＸ）をホウ素化合物の存在下又は非存在下に加熱して式（Ｘ）
0004169332.tif 000022
（式中、Ｒ６は炭素数１〜６のアルキル基、又はＢＺ２（ここでＺは、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、又はＣ２−Ｃ７アルキルカルボニルオキシ基を示す）を示し、Ｘ１およびＸ２は前記と同じ。）で表される化合物を得、この化合物（Ｘ）に４−メチルピペラジンを反応させて式（ＸＩ）
0004169332.tif 000023
（式中、Ｘ１およびＲ６は前記と同じ。）で表される化合物を得、次いで加水分解することを特徴とする、式（ＸＩＩ）
0004169332.tif 000024
（式中、Ｘ１は前記と同じ。）で表される化合物の製造方法に係るものである。
さらに本発明は、エステル不斉加水分解能を有する微生物の菌体を、高圧下に破砕し、陰イオンクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、次いで陰イオンクロマトグラフィーで精製することにより得られるエステル不斉加水分解能を有する酵素を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、化合物（Ｉ）をエステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物で処理した後の混合液から単離採取して得られた化合物（Ｉ−ａ）を水素化ホウ素金属化合物で処理し、得られた化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）とを塩基存在下で処理して得た化合物（ＩＶ）を還元反応により一工程で光学活性プロポキシアニリン誘導体（Ｖ）に導き、当該化合物（Ｖ）から抗菌剤として有用な化合物（ＸＩＩ）を製造するものである。
本発明による化合物（Ｉ）から化合物（ＸＩＩ）への反応工程図を下記に示す。
0004169332.tif 000025
0004169332.tif 000026
反応工程中の置換基について説明する。
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、各々独立してハロゲン原子を意味するが、ハロゲン原子としてはフッ素原子が好ましい。
Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、直鎖状、分岐状、環状のいずれをも含むアルキル基を意味するが、炭素数は１から６が好ましく、特にメチル基、エチル基、イソブチル基が好ましい。
Ｒ２は、水酸基の保護基を意味する。この保護基は、通常使用されるものであればよい。例えば、（置換）アルコキシカルボニル基類、（置換）アラルキルオキシカルボニル基類、（置換）アシル基類、（置換）アルキル基類、（置換）アルケニル基類、（置換）アラルキル基類、アルキル基あるいはアラルキル基（これらは、同一でも異なっていてもよい）によって置換された置換シリル基類である〔本明細書において「（置換）」とは、「置換基を有していてもよい」との意味である。〕。具体的には、第三級ブトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基等の（置換）アルコキシカルボニル基類；ベンジルオキシカルボニル基、パラメトキシベンジルオキシカルボニル基、パラニトロベンジルオキシカルボニル基等の（置換）アラルキルオキシカルボニル基類；アセチル基、メトキシアセチル基、トリフルオロアセチル基、クロロアセチル基、ピバロイル基、ホルミル基、ベンゾイル基等の（置換）アシル基類；第三級ブチル基、アリル基（プロペニル基）、ベンジル基、パラニトロベンジル基、パラメトキシベンジル基、トリフェニルメチル基、フェネチル基等の（置換）アルキル基類、（置換）アルケニル基、または（置換）アラルキル基類；メトキシメチル基、第三級ブトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基等のエーテル類；トリメチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、第三級ブチルジメチルシリル基、トリベンジルシリル基、第三級ブチルジフェニルシリル基等の置換シリル基類である。以上の保護基のうち、Ｒ２としては、還元条件で除去できるものが好ましく、具体的には（置換）アラルキル基が好ましく、さらにベンジル構造を有する（置換）アラルキル基、特にベンジル基が好ましい。
Ｒ５は、（置換）アルキルスルホニル基または（置換）アリールスルホニル基を意味するが、炭素数１〜６のアルキルスルホニル基または（置換）ベンゼンスルホニル基が好ましい。このうち、特にメタンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基が好ましい。
Ｒ６はＣ１−Ｃ６アルキル基、又はＢＺ２（ここでＺはハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基又はＣ２−Ｃ７アルキルカルボニルオキシ基を示す）を意味する。炭素数１〜６のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、前記Ｘ１、Ｘ２及びＸ３と同じものが挙げられる。Ｃ２−Ｃ７アルキルカルボニルオキシ基としては、アセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基、ブチリルオキシ基等が挙げられる。このうち、Ｒ６としてはＢＦ２が特に好ましい。
Ｙは炭素数１〜６のアルコキシ基、ハロゲン原子又はジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ基を意味するが、炭素数１〜６のアルキコキシ基が好ましく、特にメトキシ基、エトキシ基が好ましい。
なお、上記工程図では片方の異性体のみの製法を示したが、化合物（Ｉ−ａ）の立体配置が逆のものを使用すれば、もう一方の異性体も同様に合成することができる。また、化合物（Ｉ）を利用すれば、化合物（Ｖ）のラセミ体も得ることができる。
以下に、本願発明を各工程毎に詳細に述べる。
工程（ａ）
工程（ａ）は、化合物（Ｉ）を、エステル不斉加水分解能を有する酵素、またはエステル不斉加水分解能を有する微生物の培養液、該微生物菌体、もしくは該微生物菌体処理物にて処理することにより化合物（Ｉ−ａ）を得る工程である。
まず、化合物（Ｉ）を適当な緩衝液に懸濁し、次いで酵素、微生物の培養液、該微生物菌体または該微生物菌体処理物を加え攪拌して処理する。反応に使用する酵素はエステル不斉加水分解能を有していれば特に限定されないが、酵素としては微生物、動物および植物由来の市販酵素製剤が挙げられる。
本発明に用いられる酵素としては、リパーゼが好ましい。リパーゼは固定化されたものでもよい。
また、微生物としては、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、ナンニジア（Ｎａｎｎｉｚｚｉａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属等のカビ；ジゴアスカス（Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）等の酵母；またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等の細菌が挙げられる。これらの微生物のうちでも細菌が好ましく、さらにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはマイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属が好ましく、さらにバチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、またはマイクロバクテリウム  ラエヴァニフォルマス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｅｖａｎｉｆｏｒｍａｓ）が好ましく、特にバチルス  セレウスＤＳＣ０００７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＤＳＣ０００７）、バチルス  セレウスＡＴＣＣ１４５７９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ１４５７９）、またはマイクロバクテリウム  ラエヴァニフォルマス  ＩＦＯ１４４７１（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｅｖａｎｉｆｏｒｍａｓ  ＩＦＯ１４４７１）が好ましい。
さらにこれらの微生物菌体処理物としては、微生物菌体破砕物及びそれらの精製品が挙げられる。
本発明においては、これらの微生物、特に細菌類の菌体から精製した酵素を用いるのが反応効率の点からより好ましい。このような精製酵素としては、菌体を、高圧下に破砕し、陰イオンクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、次いで陰イオンクロマトグラフィーで精製することにより得られるものが特に好ましい。なお、酵素の精製の程度は、所望の活性を示す程度でよい。
また、これらの精製酵素は、上記の如く菌体を処理して得られるものでもよく、さらに組換えＤＮＡ技術により大腸菌等の他の宿主で生産させたものでもよい。組換えＤＮＡ技術により酵素を得るには、例えば次の手順が挙げられる。まず、前記の精製酵素を逆相クロマトグラフィーでさらに精製して蛋白質のアミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸配列を基にプローブを作成し、菌体のＤＮＡ断片から不斉加水分解酵素の活性本体をコードするＤＮＡをクローニングする。次いでこれをＰＣＲで増幅し、組換えプラスミド調製し、大腸菌等への導入、当該大腸菌等を培養して目的酵素を得ることができる。
この処理によって、下記の化合物（Ｉ）
0004169332.tif 000027
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同じ。）
のうちの一方の光学異性体のエステル部分が選択的に加水分解されて、化合物（Ｉ−ｂ）
0004169332.tif 000028
（式中、Ｒ２は前記と同じ。）
が生成し、未反応の化合物（Ｉ−ａ）
0004169332.tif 000029
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同じ。）
が混合液から単離できる。すなわち、この混合液に酢酸エチル、クロロホルム等の有機溶媒を加えて攪拌・分液等の処理をすることにより、化合物（Ｉ−ａ）を単離採取することができる。なお、処理に用いた酵素および菌体等は、化合物（Ｉ−ａ）の抽出前に、濾過等により除いておくのがよい。
これらの加水分解及び単離の処理温度は、通常５℃から６０℃の範囲であればよいが、好ましくは２０℃から４０℃の範囲である。また、処理液のｐＨは、４から９の範囲であればよいが、好ましくは６から８の範囲である。処理時間は、１時間から７日間の範囲であればよいが、好ましくは１時間から３０時間の範囲である。処理液中の化合物（Ｉ）の濃度は、通常は重量割合で０．１％から１０％の範囲で行なうが、好ましくは０．５％から５％の範囲である。酵素および微生物の培養液、該微生物菌体または該微生物菌体処理物の使用量は特に限定されないが、乾燥重量に基づいて、化合物（Ｉ）に対し重量比で０．０５倍から０．５倍が適当である。
また、反応混合物から分離された化合物（Ｉ−ｂ）は、エステル化後ラセミ化反応に供し、さらにエステル不斉加水分解反応に付すことにより再利用できる。
工程（ｂ）
工程（ｂ）は、化合物（Ｉ−ａ）を非アルコール溶媒中、一級アルコール類存在下で、水素化ホウ素金属化合物で処理することにより化合物（ＩＩ）を得る工程である。
水素化ホウ素金属化合物としては、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カルシウム、水素化ホウ素カリウム、水素化ホウ素亜鉛、水素化ホウ素マグネシウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等を挙げることができる。これらのうち、水素化ホウ素ナトリウムが好ましい。水素化ホウ素金属化合物の使用量は、化合物（Ｉ−ａ）に対して１から５倍モルの範囲でよく、好ましくは１．１から２倍モル程度である。
溶媒としては、ｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン、シクロヘキサン、シクロペンタン等の炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル（ＩＰＥ）、メチル第三級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメトキシエタン、１，４−ジオキサン等のエーテル系溶媒；クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン（ＥＤＣ）等のハロゲン化炭化水素系溶媒が挙げられる。この他に、水、酢酸エステル類等を挙げることができる。これらの溶媒は単独でもよいが複数種を組み合わせてもよい。これらの溶媒のうち、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒が好ましい。
一級アルコール類は、特に限定されないが、メタノールが好ましい。一級アルコール類の使用量は、化合物（Ｉ−ａ）に対して３から１５倍モルの範囲でよく、好ましくは４から８倍モル程度である。
反応温度は使用する溶媒により異なるが、−７８℃から溶媒の沸点で、好ましくは１０℃から溶媒の沸点である。反応時間は１から２４時間の範囲でよく、好ましくは２から１６時間の範囲である。
工程（ｃ）
工程（ｃ）は、化合物（ＩＩ）を溶媒中、塩基存在下にて処理することにより化合物（ＩＩＩ）を得る工程である。
溶媒は各種溶媒を使用することができ、例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン等の炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ｎ−ブタノール、第三級ブタノールのアルコール系溶媒；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル（ＩＰＥ）、メチル第三級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメトキシエタン、１，４−ジオキサン等のエーテル系溶媒；ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）等のアミド系溶媒；クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン（ＥＤＣ）等のハロゲン化炭化水素系溶媒を挙げることができる。この他に、水、アセトニトリル、酢酸エステル類、アセトン等を挙げることができる。これらの溶媒は単独でもよいが複数種を組み合わせてもよい。これら溶媒のうち、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒が好ましい。
反応温度は塩基の種類や使用する溶媒により異なるが、−７８℃から溶媒の沸点で、好ましくは−１０℃から溶媒の沸点である。
塩基としては、有機または無機のいずれであってもよく、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム等の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびアルコキサイド等、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化リチウム等の金属水素化物、ｎ−ブチルリチウム、メチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等のアルキルリチウム試薬、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン等の三級アミン類、その他、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）、１，８−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン（ＤＢＮ）、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルフォリン等の複素環化合物を用いることができる。これらの塩基のうち、炭酸カリウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属の炭酸塩、または水酸化カリウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物、または第三級ブトキシナトリウム、第三級ブトキシカリウム等のアルカリ金属アルコキサイドが好ましい。また、炭酸カリウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属の炭酸塩および水酸化カリウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物を組み合わせて使用することもできる。塩基の使用量は通常、化合物（ＩＩＩ）のモル数に対して０．１から１５倍モルの範囲でよく、好ましくは１から５倍モル程度である。
また、反応を促進させるためにテトラブチルアンモニウムブロミド、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド等の四級アンモニウム塩やヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属のヨウ化物およびクラウンエーテル等の存在下で行うこともある。
工程（ｄ）
工程（ｄ）は、化合物（ＩＶ）のニトロ基のアミノ基への変換とＲ２の脱保護とを還元反応によって同時に行うことにより化合物（Ｖ）を得る工程である。
還元反応は、通常の水素添加法等により行うことができる。例えば、触媒存在下の接触水添法が挙げられるが、この方法に用いることのできる触媒としては、通常使用される金属触媒でよい。これらのうちで好ましくは、パラジウム−炭素、ラネーニッケル、ラネーコバルトである。
溶媒は反応を阻害しないものであれば特に制限されないが、炭化水素系としては、ｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン、ベンゼン、トルエン、キシレン等が挙げられる。アルコール系としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ｎ−ブタノール、第三級ブタノールが挙げられる。エーテル系としては、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル（ＩＰＥ）、メチル第三級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメトキシエタン、１、４−ジオキサン等が挙げられる。アミド系としてはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）等が挙げられる。ハロゲン化炭化水素系としては、クロロホルム、塩化メチレン、１、２−ジクロロエタン（ＥＤＣ）等が挙げられる。この他に、水、アセトニトリル、酢酸エステル類、アセトン等を挙げることができる。これらの溶媒は単独でもよいが複数種を組み合わせてもよい。これら溶媒のうち、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）等のアルコール系溶媒、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、またはこれらと水の混合溶媒が好ましい。
水素源としては、水素ガスのほかにギ酸アンモニウムを使用することができる。ギ酸アンモニウム量は、化合物（ＩＶ）のモル数に対して１から１５倍モルの範囲でよく、好ましくは２から５倍モル程度である。
反応温度は塩基の種類や使用する溶媒により異なるが、−７８℃から溶媒の沸点で、好ましくは室温から８０℃である。反応時間は１から２４時間の範囲でよく、好ましくは２から１６時間の範囲である。
工程（ｅ）
工程（ｅ）は、化合物（Ｖ）に式（ＶＩ）のメチレンマロネート化合物を反応せさて化合物（ＶＩＩ）を得る工程である。
用いるメチレンマロネート化合物（ＶＩ）としては、ジエチル  エトキシメチレンマロネート、ジメチルメトキシメチレンマロネート等が挙げられる。
この反応は、例えば化合物（Ｖ）に対して好ましくは等モル以上のメチレンマロネート化合物（ＶＩ）を用い、無溶媒で両者を１００〜１８０℃程度に加熱攪拌するか、適当な溶媒中で加熱還流することによって実施できる。
この際の溶媒としては、反応に対して悪影響を与えないものならば特に限定されず、例えばベンゼン、トルエン、キシレン、ｎ−ヘキサン、サイクロヘキサン、ｎ−ペンタン等の炭化水素類；メタノール、エタノール、プロパノール類；ブタノール類等の低級アルコール類；ジエチルエーテル、テトラハイドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等のアミド類；ジメチルスルホキサイド、スルホラン等の非プロトン性極性溶媒等を挙げることができる。溶媒を使用する場合には、反応は溶媒の沸点以下の温度で実施すればよい。
工程（ｆ）
工程（ｆ）は、化合物（ＶＩＩ）にスルホニル化合物を反応させて化合物（ＶＩＩＩ）を得る工程である。
用いるスルホニル化合物としてはｐ−トルエンスルホニルクロリド、メタンスルホニルクロリド、クロロメタンスルホニルクロリド等が挙げられる。
反応は塩基の存在下に行うのが好ましく、当該塩基としては、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン等の三級アルキルアミン類；Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン等のジアルキルアニリン類；ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−メチルモルホリン等の複素環アミン類；１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデセン等を例示することができる。
溶媒を使用する場合は、非プロトン系の溶媒が望ましく、ジエチルエーテル、テトラハイドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等のアミド類；ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等を例示することができる。反応温度は０〜１００℃程度が好ましい。
工程（ｇ）
工程（ｇ）は、化合物（ＶＩＩＩ）を塩基条件下に閉環させて化合物（ＩＸ）を得る工程である。
用いる塩基としては無機塩基、有機塩基の何れでもよく、無機塩基としては水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の金属水酸化物、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の金属炭酸塩類；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の金属炭酸水素塩類を挙げることができる。有機塩基としてはトリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン等の三級アルキルアミン類；Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン等のジアルキルアニリン等、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−メチルモルホリン等の複素環アミン類；ナトリウムメトキサイド、ナトリウムエトキサイド、ナトリウムイソプロポキサイド、カリウム第三級ブトキサイド等の金属アルコキサイド等、この他１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデセン、Ｎ−ベンジルトリメチルアンモニウムハイドロキサイド等を例示することができる。
反応溶媒としてはメタノール、エタノール、プロパノール類；ブタノール類等の低級アルコール類；ジエチルエーテル、テトラハイドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、２−メトキシエチルエーテル、エチレングリコール・ジエチルエーテル等のエーテル類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−メチル−２−ピロリドン等のアミド類；ジメチルスルホキサイド、スルホラン等の非プロトン性極性溶媒等を挙げることができる。
反応温度は室温から１５０℃の範囲で実施すればよい。
また、この閉環反応では反応促進剤としてヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、クラウンエーテル等をプロポキシベンゼン化合物に対して１／２０当量またはそれ以上を加えるのが有効なことである。
工程（ｈ）
工程（ｈ）は、化合物（ＩＸ）をホウ素化合物の存在下又は非存在下に加熱して化合物（Ｘ）を得る工程である。
反応をホウ素化合物の非存在下に行えば、式（Ｘ）中、Ｒ６がＣ１−Ｃ６アルキル基である化合物が得られる。一方、反応をホウ素化合物の存在下に行えば、式（Ｘ）中、Ｒ６がＢＺ２である化合物が得られる。ホウ素化合物としては、具体的には、三フッ化ホウ素・テトラヒドロフラン錯体、三フッ化ホウ素・ジエチルエーテル錯体等が挙げられる。
ホウ素化合物の非存在下の反応は、ポリリン酸等の溶媒中で１００℃〜２００℃に加熱して行うのが好ましい。ホウ素化合物の存在下の反応は、無水酢酸、無水プロピオン酸等の溶媒中で、三フッ化ホウ素・テトラヒドロフラン錯体、三フッ化ホウ素・ジエチルエーテル錯体等を加えて１５０℃〜２００℃に加熱して行うのが好ましい。
工程（ｉ）
工程（ｉ）は、化合物（Ｘ）に４−メチルピペラジンを反応させて化合物（ＸＩ）を得る工程である。なお、式（Ｘ）中のＲ６がＣ１−Ｃ６アルキル基である場合は、塩基性または酸性条件下で加水分解してカルボン酸にしてから４−メチルピペラジンを反応させるのが好ましい。
反応は塩基の存在下に行うのが好ましい。この塩基は無機塩基でも、有機塩基でもよく、無機塩基としては、アルカリ金属、もしくはアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素塩等を挙げることができる。有機塩基としてはトリアルキルアミンや含窒素複素環化合物を挙げることができる。具体的には、トリエチルアミン、トリブチルアミン、エチルジイソプロピルアミン等、また、４−メチルモルホリン、ジメチルアミノピリジン等、さらには４−メチルピペラジンを過剰量使用して塩基と兼用させてもよい。この反応は、溶媒、例えばジメチルスルホキシドを使用することができる。
工程（ｊ）
工程（ｊ）は、化合物（ＸＩ）を加水分解して化合物（ＸＩＩ）を得る工程である。
この加水分解反応は、例えば、塩基存在下でプロトン性溶媒中加熱することにより行うことができる。例えば、アルコール溶媒中、トリアルキルアミン存在下に加熱する条件を例示することができるが、具体的にはエタノール中、トリエチルアミンの存在下に加熱攪拌すればよい。
式（ＸＩＩ）中、Ｘ１がフッ素原子である化合物がレボフロキサシンである。
実施例
以下、実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、得られた化合物の光学純度（％ｅｅ）は、ＨＰＬＣまたはＧＣに付して測定した。
得られた化合物の絶対配置は、別途合成した絶対配置が既知のサンプルと比較して決定されたものである。
実施例１：（Ｒ）−２−ベンジロキシプロピオン酸エチル
２−ベンジロキシプロピオン酸エチル（３００ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）（３０ｍｌ）に懸濁し、リパーゼＦｉｎｅ  Ｇｒａｄｅ（生化学工業社製、リゾパス  デレマー；６ｍｇ）を加え３０℃にて２４時間攪拌した。反応液に酢酸エチルを加え、セライトろ過により変性蛋白質を除去し、更に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７．０に調整後、分液抽出した。有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒留去することにより、油状の標題化合物（１０２ｍｇ、９８．８％ｅｅ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．３０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．４４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．０５（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．２２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．２３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ）７．２３−７．４２（５Ｈ，ｍ）
実施例２：（Ｒ）−２−ベンジロキシ−１−プロパノール
４０℃にて、水素化ホウ素ナトリウム（２１．８ｍｇ）をトルエン０．８ｍｌに懸濁し、その溶液に実施例１で得た（Ｒ）−２−ベンジロキシプロピオン酸エチル（１００ｍｇ、９８．８％ｅｅ）のトルエン溶液（０．８ｍｌ）を加えた。反応液にＭｅＯＨ（０．１５ｍｌ）を加え、そのままの温度にて３時間攪拌した。反応液に水を加え、トルエンにて抽出した。有機層を水、飽和塩化アンモニウム水溶液にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。溶媒留去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、油状物質として標題化合物（７９ｍｇ、９９％ｅｅ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．２０（１Ｈ，ｂｓ），３．４３−３．７２（３Ｈ，ｍ），４．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），７．２２−７．４４（５Ｈ，ｍ）
参考例１
マイクロバクテリウム  ラエヴァニフォルマス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｅｖａｎｉｆｏｒｍａｓ）ＩＦＯ  １４４７１の種菌を普通ブイヨン培地１００ｍｌ（坂口フラスコ）に接種し、３０℃で一晩振とう培養した。遠心分離により集菌後、凍結乾燥しＩＦＯ  １４４７１の凍結乾燥菌体を得た。
実施例３：（Ｒ）−２−ベンジロキシプロピオン酸エチル
２−ベンジロキシプロピオン酸エチル２．０ｇ（９．６ｍｍｏｌ）を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに懸濁し、参考例１にしたがって調製したＩＦＯ  １４４７１の凍結乾燥菌体１００ｍｇを加え３０℃で攪拌した。反応の進行に伴い（カルボン酸の生成により）ｐＨが低下するので、１Ｎ水酸化ナトリウムを加え系内のｐＨを６．８から７．２の間に保った。１４時間反応後、酢酸エチル１００ｍｌを加え暫く攪拌した後、セライト濾過により菌体を除いた。分液後、更に酢酸エチル１００ｍｌで抽出を行った後、酢酸エチル層を集め５％重曹水で２回洗浄して完全にカルボン酸を除去した。有機層を乾燥後、溶媒を溜去することにより標題化合物を０．９３ｇ（４６．５％、９９．９％ｅｅ）得た。１Ｈ−ＮＭＲは実施例１と一致した。
実施例４：（Ｒ）−２−ベンジロキシプロピオン酸エチル
２−ベンジロキシプロピオン酸エチル２．０ｇ（９．６ｍｍｏｌ）を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに懸濁し、参考例１と同様の方法で調製したＡＴＣＣ１４５７９の凍結乾燥菌体１００ｍｇを加え３０℃で攪拌した。反応の進行に伴い（カルボン酸の生成により）ｐＨが低下するので、１Ｎ水酸化ナトリウムを加え系内のｐＨを６．８から７．２の間に保った。１６時間反応後、酢酸エチル１００ｍｌを加え暫く攪拌した後、セライト濾過により菌体を除いた。分液後、更に酢酸エチル１００ｍｌで抽出を行った後、酢酸エチル層を集め５％重曹水で２回洗浄して完全にカルボン酸を除去した。有機層を乾燥後、溶媒を溜去することにより標題化合物を０．８８ｇ（４４．０％，９９．９％ｅｅ）得た。１Ｈ−ＮＭＲは実施例１と一致した。
実施例５：２−ベンジロキシプロピオン酸エチル（ラセミ化工程）
実施例３で酢酸エチルによる抽出操作の際のすべての水層を集め１０％塩酸によりｐＨ２に調整した後、酢酸エチル１００ｍｌで２回抽出した。有機層を乾燥後、溶媒を溜去して（Ｓ）−ベンジロキシプロピオン酸を０．８３ｇ（４８．０％，９６％ｅｅ）得た。そのうちの０．８ｇ（４．４ｍｍｏｌ）をエタノール１０ｍｌに溶解し、濃硫酸０．０１ｍｌ加えて加熱還流した。８時間後、溶媒を溜去により除き残渣を酢酸エチル２０ｍｌで抽出した。５％重曹水（１０ｍｌ）及び水（１０ｍｌ）で洗浄した後、有機層を乾燥後溶媒を溜去して（Ｓ）−ベンジロキシプロピオン酸エチルを得た。これをトルエン１０ｍｌに溶解し氷冷攪拌下、ナトリウムエトキシド０．３３ｇ（１．１ｅｑ）を加え室温で１４時間攪拌し、光学活性カラムを用いたガスクロマトグラフィーを用いてラセミ化反応終了を確認した。その後、反応液を１０％クエン酸水溶液（１０ｍｌ）中に滴下した。有機層を水１０ｍｌで洗浄し乾燥後、溶媒を溜去することにより、標題化合物を０．７４ｇ得た。１Ｈ−ＮＭＲは実施例１と一致した。このラセミ体は、実施例１〜４のようなエステル不斉加水分解の原料として用いることができる。
比較例１：（Ｒ）−２−ベンジロキシプロピオン酸メチル
−３０℃にて、ベンジルブロマイド（９．８６ｇ）および６０％水素化ナトリウム（２．１１ｇ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の混合溶液（５０ｍｌ、３：２容積比）に溶解した。その溶液に（Ｒ）−乳酸メチル（５．０ｇ、９９％ｅｅ）を加えた。そのままの温度にて、３０分間攪拌した。次いで、室温にて３０分間攪拌し、さらに５０℃にて３０分間攪拌した。反応液に水、ジイソプロピルエーテルを加え、有機層を水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。溶媒留去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、黄色油状物質として標題化合物（８．８７ｇ，９２．１％ｅｅ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．７５（３Ｈ，ｓ），４．０７（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），７．２２−７．３７（５Ｈ，ｍ）
実施例６：（Ｒ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−ベンジロキシプロポキシ）ニトロベンゼン
氷冷下、水酸化カリウム（５．４０ｇ）および炭酸カリウム（３．３３ｇ）をトルエン１８０ｍｌに懸濁した。その溶液に、実施例２と同様にして得られた（Ｒ）−２−ベンジロキシ−１−プロパノール（４．０ｇ）および２，３，４−トリフルオロニトロベンゼン（４．１３ｇ）のトルエン溶液（４０ｍｌ）を加え、そのままの温度にて１時間攪拌した。反応液に水を加え、トルエンにて抽出した。有機層を水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。溶媒留去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、黄色油状物質として標題化合物（７．５５ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．９３−４．０３（２Ｈ，ｍ），４．５３−４．６５（２Ｈ，ｍ），６．９０−６．９９（１Ｈ，ｍ），７．２３−７．３５（５Ｈ，ｍ），７．６０−７．６６（１Ｈ，ｍ）
実施例７：（Ｒ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−ベンジロキシプロポキシ）ニトロベンゼン
氷冷下、ターシャルブトキシナトリウム（６３．６ｍｇ）をトルエン（０．５ｍｌ）に懸濁した。その溶液に、実施例２と同様にして得られた（Ｒ）−２−ベンジロキシ−１−プロパノール（１００ｍｇ）加えた。次いで、氷冷下、その溶液を２，３，４−トリフルオロニトロベンゼン（１０３．５ｍｇ）のトルエン溶液（０．５ｍｌ）へ加え、１時間攪拌した。反応液に水を加え、トルエンにて抽出した。有機層を水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。溶媒留去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、黄色油状物質として標題化合物（１６１．２ｍｇ）を得た。なお、スペクトルデータは実施例６で得たものと一致した。
実施例８：（Ｒ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−ヒドロキシプロポキシ）アニリン
室温にて、実施例６で得られた（Ｒ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−ベンジロキシプロポキシ）ニトロベンゼン（１．０ｇ）をエタノール（１０ｍｌ）に溶解し、７．５％Ｐｄ−Ｃ（１．０ｇ）を加え、水素雰囲気下、６時間攪拌した。Ｐｄ−Ｃを濾去後、得られた濾液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、油状物質として標題化合物（６００ｍｇ、９９．０％ｅｅ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．２３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．８１−４．８９（１Ｈ，ｍ），４．０６−４．１７（２Ｈ，ｍ），６．３７−６．４４（１Ｈ，ｍ），６．７７−６．８７（１Ｈ，ｍ）
実施例９：（Ｒ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−ヒドロキシプロポキシ）アニリン
室温にて、実施例６で得られた（Ｒ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−ベンジロキシプロポキシ）ニトロベンゼン（０．３ｇ）をトルエン（３ｍｌ）に溶解し、１０％Ｐｄ−Ｃ（９０ｍｇ）を加え、８０℃にて水素雰囲気下、４時間攪拌した。Ｐｄ−Ｃを濾去後、得られた濾液を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、油状物質として標題化合物（１８１．０ｍｇ、９９．０％ｅｅ）を得た。スペクトルデータは実施例８で得たものと一致した。
実施例１０：２，３−ジフルオロ−６−（２，２−ジエトキシカルボニルエテニル）アミノ−［（Ｒ）−２−ヒドロキシプロポキシ］ベンゼン
１００℃にて、実施例８と同様にして得られた（Ｒ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−ヒドロキシプロポキシ）アニリン（１．０２ｇ）およびジエチルエトキシメチレンマロネート（１．１４ｇ）を無溶媒にて１時間攪拌した。さらに微減圧にて発生するエタノールを除去しながら３０分間攪拌した。反応混合物を放冷後、減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、標題化合物（１．８３ｇ，９９．０％ｅｅ）を白色結晶として得た。
融点：５２−５５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．２２−１．４６（ｍ，９Ｈ）、３．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ）、３．８８−４．４３（ｍ，７Ｈ）、６．７５−７．０８（ｍ，２Ｈ），８．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ）
実施例１１：２，３−ジフルオロ−６−（２，２−ジエトキシカルボニルエテニル）アミノ−［（Ｒ）−２−（メタンスルホニルオキシプロピル）オキシ］ベンゼン
実施例１０と同様にして得られた２，３−ジフルオロ−６−（２，２−ジエトキシカルボニルエテニル）アミノ−［（Ｒ）−２−（ヒドロキシプロピル）オキシ］ベンゼン３．００ｇを１，２−ジクロロエタン３０ｍｌに溶解し、氷冷撹拌下にトリエチルアミン０．９８ｇを加え、さらに同温度でメタンスルホニルクロライド１．０１ｇを撹拌下に加えた。室温で２時間撹拌して不溶物を濾去した。濾液を１，２−ジクロロエタンにて希釈し水洗後無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥した有機層にシリカゲル１．５ｇを加え、３０分間撹拌した後、不溶物を濾去した。溶媒を減圧留去し、残渣をジイソプロピルエーテルより結晶化後濾取した。標記の化合物３．２７ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．２２−１．４７（６Ｈ，ｍ），１．５８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．５０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），３．１３（３Ｈ，ｓ），３．９８−４．６０（６Ｈ，ｍ），４．９５−５．３５（１Ｈ，ｍ），６．７９−７．１４（２Ｈ，ｍ），８．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ）
実施例１２：（Ｓ）−ジエチル（７，８−ジフルオロ−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−［１，４］ベンゾオキサジン−４−イル）メチレンマロネート
実施例１１で得られた２，３−ジフルオロ−６−（２，２−ジエトキシカルボニルエテニル）アミノ−［（Ｒ）−２−（メタンスルホニルオキシプロピル）オキシ］ベンゼン３．００ｇを無水ＤＭＦ、１５ｍｌに溶解し、炭酸カリウム０．９２ｇを加え、８０℃で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチルで抽出し、抽出液を水洗して無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、標記の化合物２．１４ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．２２−１．４２（９Ｈ，ｍ），３．９０−４．４４（７Ｈ，ｍ），６．７４−６．８８（２Ｈ，ｍ），７．７８（１Ｈ，ｓ）
実施例１３：（３Ｓ）−９，１０−ジフルオロ−３−メチル−７−オキソ−２，３−ジヒドロ−７Ｈ−ピリド［１，２，３−ｄｅ］［１，４］ベンゾオキサジン−６−カルボン酸ボロンジフルオリドキレート錯体
実施例１２で得られた（Ｓ）−ジエチル（７，８−ジフルオロ−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−［１，４］ベンゾオキサジン−４−イル）メチレンマロネート（２ｇ）および無水酢酸（２ｍｌ）を混合して１４０℃にて４７％三フッ化ホウ素・テトラヒドロフラン錯体（０．８ｍｌ）を加え、そのままの温度で１時間加熱攪拌した。生成する低沸点物を留去した後に反応液を室温までに冷却する。反応混合物にアセトン（１０ｍｌ）を加えてそのままの温度で３０分攪拌した。析出した結晶を集めてアセトンで洗浄し、標記の化合物１．５５ｇを得た。
実施例１４：（３Ｓ）−（−）−９−フルオロ−３−メチル−１０−（４−メチル−１−ピペラジニル）−７−オキソ−２，３−ジヒドロ−７Ｈ−ピリド［１，２，３−ｄｅ］［１，４］ベンゾオキサジン−６−カルボン酸（レボフロキサシン）
実施例１３で得られた（３Ｓ）−９，１０−ジフルオロ−３−メチル−７−オキソ−２，３−ジヒドロ−７Ｈ−ピリド［１，２，３−ｄｅ］［１，４］ベンゾオキサジン−６−カルボン酸ボロンジフルオリドキレート錯体（３１０ｍｇ）をジメチルスルホキシド（６ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３２ｍｌ）およびＮ−メチルピペラジン（０．１３ｍｌ）を加え、室温で１７時間攪拌した後減圧乾固した。残留物をジエチルエーテルで洗浄した後、トリエチルアミン（０．５ｍｌ）を含む９５％エタノール（２０ｍｌ）に溶解して８時間加熱還流した。冷後減圧乾固して得た残留物を、希塩酸（５％）に溶解してクロロホルムと振り分け、水層を水酸化ナトリウム（１ｍｏｌ／ｌ）でｐＨ１１とし、次いで塩酸（１ｍｏｌ／ｌ）でｐＨ７．４に調整した。これをクロロホルム（５０ｍｌ×３）で抽出して芒硝乾燥後クロロホルムを留去し、得た粉末をエタノール−ジエチルエーテルより再結晶し、透明微針晶の標記の化合物１２０ｍｇを得た。
融点：２２５〜２２７℃（分解）
元素分析：Ｃ１８Ｈ２０ＦＮ３Ｏ４・１／２Ｈ２Ｏとして；
計算値：Ｃ，  ５８．３７；Ｈ，  ５．７２；Ｎ，  １１．３５
分析値：Ｃ，  ５８．１７；Ｈ，  ５．５８；Ｎ，  １１．２７
実施例１５
（１）菌体破砕（フレンチプレス）
ＡＴＣＣ  １４５７９の坂口培養菌体（培地量１２００ｍｌ）を２０ｍＭリン酸緩衝液８０ｍｌ（ｐＨ７．０，含１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ＤＴＴ）に懸濁し、フレンチプレスにて１５０００ｐｓｉの圧力をかけて菌体を破砕した。
破砕した菌体を遠心分離機（１０，０００Ｇ，３０ｍｉｎ）にて遠心分離することにより、菌体抽出液８５．０ｍｌ（総活性１２３ｕｎｉｔ，比活性０．０３２ｕｎｉｔ／ｍｇ）を得た。
（２）  陰イオンクロマトグラフィー
菌体抽出液を下記の陰イオンクロマト精製条件にて分画した。各画分につき２−ベンジロキシプロピオン酸エチルの加水分解活性を測定し、活性画分２０６ｍｌ（総活性８８ｕｎｉｔ，比活性０．０５８ｕｎｉｔ／ｍｇ，活性収率７２％）を得た。
陰イオンクロマトグラフィー精製条件
担体；Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（ファルマシアバイオテク）４００ｍｌ
カラム；５０ｍｍ×２００ｍｍＨ
移動相；Ａ液：２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０（含１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ＤＴ
Ｔ）９００ｍｌ
Ｂ液：Ａ液＋１．０Ｍ  ＮａＣｌ  ９００ｍｌ
Ａ→Ｂ  ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ
検出；２８０ｎｍ，温度；４℃
１５分毎に画分分取、２−ベンジロキシプロピオン酸エチルの加水分解反応
実施
（３）  疎水クロマトグラフィー
陰イオン交換カラム活性画分２０６ｍｌに硫酸アンモニウム５４．４ｇ（２．０Ｍ相当）を少量ずつ添加し、３０分攪拌後、生じた沈殿物を遠心分離（１０，０００Ｇ，３０ｍｉｎ）にて除去した。得られた上清を下記の疎水クロマトグラフィー精製条件にて分画した。各画分につき２−ベンジロキシプロピオン酸エチルの加水分解活性を測定し、活性画分（２５１−３０８ｍｉｎ）を見出した。分取した活性画分を限外ろ過にて脱塩濃縮し、活性本体画分１．０ｍｌ（総活性１６．８ｕｎｉｔ，比活性３．２３ｕｎｉｔ／ｍｇ，活性収率１９％）を得た。
疎水クロマトグラフィー精製条件
担体；Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＥＴＨ（ファルマシアバイオテク）１００ｍｌ
カラム；４５ｍｍ×６０ｍｍＨ
移動相；Ａ液：２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０（含１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ＤＴ
Ｔ）６００ｍｌ
Ｂ液：Ａ液＋２．０Ｍ硫安６００ｍｌ
Ｂ→Ａ  ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ
検出；２８０ｎｍ，温度；４℃
７分毎に画分を分取、２−ベンジロキシプロピオン酸エチルの加水分解反応実施
（４）  陰イオンクロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ  Ｑ）
疎水クロマトグラフィー活性画分１．０ｍｌを陰イオンクロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ  Ｑ）にて分画した。各画分につき２−ベンジロキシプロピオン酸エチルの加水分解活性を測定し、活性画分（２３−２５ｍｉｎ）を見出した。分取した活性画分を限外ろ過にて脱塩濃縮し、活性本体画分１．０ｍｌ（総活性５．９ｕｎｉｔ，比活性４．５４ｕｎｉｔ／ｍｇ，活性収率３５％）を得た。この活性本体の分子量は、約３８，０００（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）、約４０，０００（ゲル濾過）であった。
陰イオンクロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ  Ｑ）精製条件
カラム；陰イオン交換カラムＭｏｎｏ  Ｑ  １ｍｌ（ファルマシアバイオテク）
移動相；Ａ液：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
Ｂ液：Ａ液＋１．０Ｍ  ＮａＣｌ
Ａ→Ｂ  ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ
流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出；２８０ｎｍ，温度；ｒｔ
１分毎に画分分取、２−ベンジロキシプロピオン酸エチルの加水分解反応実施
0004169332.tif 000030
得られた微生物由来精製酵素を用いて実施例１、２、３及び４と同様にエステル不斉加水分解反応を行ったところ、光学純度９９％ｅｅ以上の（Ｒ）−２−ベンジロキシプロピオン酸エチルが効率良く得られた。
産業上の利用可能性
本発明方法によれば、安価でかつ短工程で光学純度の高い、光学活性プロポキシアニリン誘導体（Ｖ）が得られ、これにより抗菌剤として有用な光学純度の高いレボフロキサシンが工業的に有利に得られる。