(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトｉＮＯＳを特異的に認識し、ヒトｎＮＯＳまたはヒトｅＮＯＳと交差反応性のないモノクローナル抗体で、さらに、配列番号１〜５からなる群から選択されるペプチドによって示されるヒトｉＮＯＳの特定領域に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
イソタイプ  マウスＩｇＧまたはＩｇＭである請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
ａ．ヒトｉＮＯＳの試料を、請求項１に記載のモノクローナル抗体と接触させ、そして
ｂ．上記試料中のヒトｉＮＯＳの存在を検出する工程を含む試料の免疫学的検定法。
【請求項４】
前記免疫学的検定法が、臨床診断のための検定法である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試料中のヒトｉＮＯＳの存在を検出する工程が、定性分析である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記のヒトｉＮＯＳの存在を検出する工程が、定量分析である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫学的検定法が、直接法、間接法、酵素キャプチャー法、競合結合法、置換法よりなる群から選ばれる請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫学的検定法が、ＩＦＡ、リニアあるいはラジアルフロー法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、ディップスティック法、蛍光ポラライゼーション法、酵素キャプチャー法およびＲＩＡよりなる群から選ばれる方法である請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願の相互参照
この出願は、先に1996年４月１２日出願された出願番号第08／634,332号の出願の一部継続出願である。
発明の背景
この出願は、ヒトiＮＯＳの検出および／または定量のための免疫学的検定もしくは他の手法に用いることができる新規でかつ有用なモノクロナール抗体に関する。
近年、窒素酸化物（ＮＯ）はエフェクターおよび／または調節分子であることが認められてきている。たとえば最近、脈管構造においての内皮依存性弛緩の原因である可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化におけるＮＯの作用に注目した研究分野がある。
ランガスミーら（Rangassmy et al.，米国生理学会（1994））による“気管支機能において窒素酸化物がパラ分泌を役割する免疫組織化学的実証”と表題された論文は、気管支血管でのこの効果を認めている。
これに関連して研究者は、中枢および末梢神経系においてＮＯが新しい神経伝達物質として作用することを見出している。さらに、活性化されたマクロファージ細胞毒性は、参照番号に基づいた固有宿主（host defense）機構で活性化されることが見出された。ＮＯは、いまや哺乳類系で分泌される生合成的に誘導された最小のエフェクター分子であると考えられている。コッシュランド（koshland，Science Magazine，258巻（1992年12月））による“最近の分子”と表題された論文の記載された参照文献は、ＮＯの生物学上の重要性を詳述している。ラッフィーら（Laffira et al.，Hepatology，22巻，No.，（1995））による“腹水および収縮過多性循環を伴う硬変患者からの中性好性白血球および単核細胞による窒素酸化物の生成増加”と表題された論文、およびゲラーら（Geller et al.，Proc. Natl. Sci. USA，90巻（1993年４月））による“ヒト肝細胞からの誘発性窒素酸化物合成酵素の分子クローニングおよび発現”と表題された論文は、肝臓中の窒素酸化物合成酵素（ＮＯＳ）および窒素酸化物の活性を記述している。後者の文献には、ヒト誘発性ＮＯＳを描写するアミノ酸配列が示されている。一般的に、これらの論文は、iＮＯＳ誘発およびそれに続くＮＯの過剰生成に伴って肝臓が炎症および破壊した肝細胞のその随伴活性を伴った硬変について述べている。
臓器移植の拒絶反応は、活性化された単核細胞、マクロファージ、および／または中性好性白血球が活性のままで固有宿主機構により媒介され、iＮＯＳが不可避的にＮＯの生成を誘導する作用によって引き起こされる。一方、特にiＮＯＳを阻害し、それによってＮＯの生成を抑止すると同時に神経細胞のＮＯＳ（ｎＮＯＳ）かまたは内皮の（ｅＮＯＳ）、この酵素の他の２つのイソ体（isofroms）のいずれかを抑制する薬剤の開発も図られている。
コンガーら（Conger et al.，The Jouynal of Clinica Investigation，Inc.，96巻（1995年７月））による“ラットの虚血後急性腎不全における内皮依存性血管拡張剤には無反応にも拘らず増加した窒素酸化物合成酵素の活性”と表題された論文では、ラット腎臓障害における窒素酸化物の活性を認めている。
ワイルドハートら（Wildhirt et al.，Cardiovascular Reseach，29巻（1995））による“心筋梗塞における窒素酸化物合成酵素イソ酵素の免疫組織化学”と表題された論文は、心臓に損傷を与えたウサギの損傷した心筋層中で、Ｌ−アルギニンからシトルリンおよび窒素酸化物への転化を認めている。
ＮＯ生合成経路は近年、広範囲に実験されている。最近、ＮＯを産生するイソ酵素のファミリーが存在することが認められた。セッサ（Sessa，J. Vasc. Res.（1994））による“窒素酸化物合成酵素のタンパク質ファミリー”は、３つのＮＯＳイソ酵素を認めている。３つのＮＯＳイソ酵素は全て、Ｌ−アルギニンおよび酸素からシトルリンおよびＮＯへの転化を触媒作用する。さらに、この触媒転化が要求する５つの共通要素が見出された。これらはカルモデュリン、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、ＦＭＮおよびテトラヒドロビオプテリンである。一般に合成酵素（ＮＯＳ）の３つのイソ体は、好球性イソ体であるタイプ１（ｎＮＯＳ）；誘発性イソ体であるタイプ２（ｉＮＯＳ）；内皮性イソ体であるタイプ３（ｅＮＯＳ）に分類される。ｎＮＯＳおよびｅＮＯＳは、本質的にそれらが存在する細胞中で発現される。ｉＮＯＳは、本質的に発現されないが、いくつかのサイトカインおよびリポ多糖類（ＬＰＳ）によって多少は誘発される。またｎＮＯＳは、神経伝達物質として働くことも見出されている。さらにｉＮＯＳは、固有宿主および細胞免疫に関係する。またｅＮＯＳは、血圧（vascular tone）および血流コントロールに関与する。３つの（３）ＮＯＳ酵素イソ体は、それらがほぼ６０％の配列相同であることから、真性イソ酵素のカテゴリーに分類される。
ｉＮＯＳは、特定の病理学的疾患状態に強く関与している。ワイガートら（Weigert et al.，Journal of the American Society of Nephrology、５巻、No.12（1995））による“内毒血症（endotoxemic）ラット大動脈における誘発性窒素酸化物合成酵素の発現および選択的阻害”では、敗血症ショックに関してiＮＯＳの果たす重要性を検討している。特に敗血症および敗血症ショックが起きると、多量のグラム陰性菌由来のＬＰＳおよびサイトカインは、単核細胞、マクロファージ、好中球、肝細胞、または他の細胞体中、iＮＯＳの発現を生理的に誘発することができ、ＮＯの過剰産生を誘発する。次いでまた全身系の広範な血管拡張による敗血症および敗血症ショックに伴う有害な効果を引き起こす。
ＮＯＳに対するモノクロナール抗体の開発およびそのような抗体を生物薬学的検証に用いることがいくつかの研究グループにより報告されている。ハットリら（Hattori et al.，Hybridoma，12巻、No.６（1993））による“モノクロナール抗体による窒素酸化物合成酵素の安定化”と表題された論文では、活性化したラット腹膜マクロファージから誘導したラットiＮＯＳに対するモノクロナール抗体のパネルについて述べている。そこには、ラットiＮＯＳの酵素活性を無効にするモノクロナール抗体はないが、酵素を安定化させるモノクロナール抗体がいくつか報告されている。
ゲリアら（Gelea et al.，FASAB journal，9巻，（1995年12月））による“脳発達中の血管におけるカルシウム依存性窒素酸化物合成酵素の一過性発現”と表題された論文には、ラットiＮＯＳに対して培養されたモノクロナール抗体を用いてタンパク質ストリップを検出することが記載されている。さらに先のRengasamyの論文には、上記のように、ウシｎＮＯＳに対して開発されたモノクロナール抗体の解析および開発が記載されている。ウェウタン免疫ブロットにより、このモノクロナール抗体はウシｎＮＯＳ、ウシｅＮＯＳおよびマウスiＮＯＳを認識することが分かった。同一のモノクロナール抗体が、免疫組織化学的方法により、ラットｎＮＯＳ、ラットｅＮＯＳおよびラットiＮＯＳを認識することがわかった。
フジサワら（Fujisawa et al.，Journal of Neurochemistry，64巻（1995））による“ヒトグリア膠芽腫株化細胞における誘発性窒素酸化物合成酵素”と表題された論文には、ヒトグリア膠芽腫株化細胞であるＡ−１７２細胞におけるiＮＯＳ誘発について記載している。
トレーシーら（Tracy et al.，米国生理学会，Rapid Communication（1994））による“ヒト肺における誘発性ＮＯ合成酵素の免疫化学的検出”と表題された論文は、ＲＡＷ264.7マクロファージにおけるiＮＯＳ誘発について記載している。誘発されたＲＡＷ264.7細胞に由来するマウスiＮＯＳに対して培養されたポリクロナール抗体が、ヒト肺組織におサるiＮＯＳの発現の研究に使用された。
ポロックら（Pollock et al.，米国生理学会（1993））による“特定のモノクロナール抗体を用いた内皮性窒素酸化物合成酵素の解析および位置決定”は、ウシｅＮＯＳに対して開発され、ｎＮＯＳまたはiＮＯＳとはクロス反応しないモノクロナール抗体パネルの解析および開発を記載している。
米国特許第4,376,110号および第4,879,219号には、モノクロナール抗体を用いて抗体源物質を検出する免疫学的検定が記載されている。
ケンタッキー州、レキシントンのトランスダクション・ラボラトリー（Transdution Laboratories）のパンフレットには、種々のラットＮＯＳイソ体の組換えフラグメントに対して培養されたいくつかのマウスモノクロナール抗体が提示されている。
サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Santa Cruz Biothechnology）社の“シグナル中間媒体−ＮＯＳ”と名称されたパンフレットには、種々のＮＯＳイソ体を特定するポリクロナール型抗ペプチド抗体が提示されている。
ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション（Boehringer Mannheim Corporation）による“イソストリップ（Isostrip）”と名称されたパンフレットには、処理済ストリップを用いて簡素化されたマウス免疫グロブリンのサブクラスおよびκまたはλ軽鎖を検出するためのマウスモノクロナール抗体のイソ体を分類するキットが例示されている。
ヒトｉＮＯＳを特定するためのイムノアッセイに用いるヒトｉＮＯＳに対するモノクロナール抗体のパネルの開発は、生物医学的分野に特筆すべき進歩をもたらすであろう。
発明の開示
本発明によれば、新規でかつヒトiＮＯＳを特定するために有用なモノクロナール抗体の試験体群（パネル）が開発され、ヒトiＮＯＳを特定するための免疫学的検定（イムノアッセイ）に有用であることが実証された。これらのモノクロナール抗体は、種々の標準的な技術により解析される。
さらにヒトiＮＯＳに反応し、またタンパク質の特定線状合成ペプチド類似体にも結合するこのモノクロナール抗体を用いる種々の試験法が開発された。たとえば競合結合ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）などの試験法が開発された。このような方法としてさらには、ウェウタンブロット、ディップスティック、蛍光ポーラリゼイション、酵素捕獲（キャプチャー）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などが開発された。試験は、ヒト敗血症ショックのマウスモデルおよび敗血症ショックのヒト標本を用いて行われ、制御された環境下で実証された。
本発明では、ヒトiＮＯＳの特定領域がいくつか用いられた。すなわちヒトiＮＯＳのＡ３、Ａ４、Ａ３＋Ａ４、Ｆ６、Ｇ１１および／またはＨ１ローカス（locus）をターゲットとした。これらローカスとの結合における特定の結合対および特定の結合薬分子もまた開発された。たとえば上記したモノクロナール抗体が、特定の結合体構成要素として使用される。勿論、ポリクロナール抗体、オリゴヌクレオチド、人工抗体として刻印されたポリマー、結合部位を呈するファージおよびこれら類似体もまたこの目的で使用することができる。また本発明では、ペプチドを組合わせて試験に用いてもよい。
上記に掲示したiＮＯＳ領域のペプチドおよびペプチド類似体は、直接、間接的に、競合結合、置換もしくは他の形式よる試験および試験キットのための特異的な結合対パートナーまたは特異的結合をする試薬分子とともに用いることができる。このような試験および試験キットのどれであってもiＮＯＳの定量的または定性的な分析に用いることができる。このような試験は、臨床診断法であってもよい。
さらに以下に掲示するようなペプチドおよびペプチド類似体は、満足しうる結果が得られるならば活性領域または活性部分であってもよい。特に21Ｃ10-lＤ10、2Ｄ2-Ｂ2、および5Ｂ３-Ｅ6として同定されたクローンのためのエピトープマッピングが行われた。しかしながら、合成ペプチド、組換えペプチド、組換えタンパク質、融合タンパク質、融合ペプチド、タンパク質発現ファージ、ペプチド発現ファージ、ペプチドライブラリー、ペプチド類似体ライブラリー、およびこれらの相同体を用いることができ、ここでは活性成分がヒトiＮＯＳのＡ３、Ａ４、Ａ３＋Ａ４、Ｆ６、Ｇ１１および／またはＨ１ローカスの相同体であることは特筆すべきである。さらに本発明の試験では、ヒトiＮＯＳの領域は完全または部分的に結合することができる。たとえばＦ６領域は、検定試薬中、ヒトiＮＯＳのＨ１領域の狭小部分と結合することができる。
本発明の試験は、ヒトおよびマウスモデルにおける敗血症、敗血症ショック、心筋梗塞、移植による臓器中組織の拒絶反応、たとえば狼瘡、乾癬、多重性硬化症などのある種の自己免疫疾患の“突然の再発（flare ups）”の監視、などのさまざまな病理学的状態のために、細胞および組織中のヒトiＮＯＳを検出または測定することができる。特に、ＩＦＡおよび競合結合ＥＬＩＳＡ試験法により、このような組織をいくつか試験した。しかしながら上記したように、本発明の本質に結びつく他の検定法もまた用いることができる。また競合結合ＥＬＩＳＡなどのある種の試験では、ペプチドを組合わせて用いることによって増感させた。たとえばＡ３＋Ａ４に対するペプチドは、Ａ４単独に対する試験に比べて４倍の増感がみられた。アビジン−ビオチン複合体を用いたときには、検定感度を１２から１５倍増感した。２つを組合わせると、感度は４８から６０倍に高くなる。
免疫学的検定および免疫学的検定構成成分のための新規でかつ有用な方法が開示されていることは明白であろう。
本発明の目的は、hiＮＯＳの臨床的試験法として用いることができるhiＮＯＳに対して特異的なモノクロナール抗体を使用する免疫検定法の開発である。
本発明の他の目的は、hiＮＯＳの３つの（３）イソ体に対して特異的な別々のポリクロナール型ウサギ抗ペプチド抗体のパネルを開発することである。
本発明のさらに他の目的は、hiＮＯＳ領域に相同し、本発明のモノクロナール抗体に結合するペプチド配列を産生することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトiＮＯＳタンパク質に反応して特異的に結合し、どの免疫検定方法によっても一様に存在を示す物質を用いる免疫学的検定を実施しうる方法を提供することである。
本発明の他の目的は、ヒトiＮＯＳタンパク質の相同体に特異的に結合して、サンプル中のヒトｉＮＯＳタンパク質の存在を示す物質を用いる免疫学的検定法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、hiＮＯＳと領域に相同し、本発明のモノクロナール抗体に結合する切断ペプチドの配列を提供することである。
本発明の他の目的は、モノクロナール抗体の特異的性質を試験するためのヒトｉＮＯＳ以外のタンパク質由来の相同ペプチドを提供することである。
さらに本発明の他の目的は、本発明のモノクロナール抗体のパネルを解析し、それら個々の種々の検定および方法における用途を確認することである。
本発明は、特に本明細書に示される本発明の特別な特徴および態様に関係する他の目的および効果も備えている。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のモノクロナール抗体の全パネルのうちのいくつかのモノクロナール抗体が結合するhiＮＯＳの領域を示す５つのアミノ酸配列の配列表である。
図２−６は、実施例３に示されるように、本発明のモノクロナール抗体を用いて生理的に試験されたマイクロタイタープレートの写像である。
図７Ａ−Ｄは、本発明のモノクロナール抗体のエピトープマッピングのために使用しうるペプチド配列の配列表である。
図８は、本発明のモノクロナール抗体の特異的性質を決定するために使用しうるペプチド配列の配列表である。
図９は、ポリクロナール型ウサギ抗ペプチド抗体および４つのマウスモノクロナール抗体を用いてhiＮＯＳを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡを示すグラフである。
図１０は、マウスＩｇＧ2bモノクロナール抗体21Ｃ10-1Ｄ10および２つのマウスＩｇＧ1モノクロナール抗体を用いてhiＮＯＳを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡを示すグラフである。
図１１は、マウスＩｇＭモノクロナール抗体7D8-B3および３つのマウスＩｇＧモノクロナール抗体を用いてhiＮＯＳを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡを示すグラフである。
図１２は、４種の初期モノクロナール抗体およびＨＲＰ結合させたヤギの抗マウスＩｇＧ第２抗体を用いたhiＮＯＳのウェウタン免疫ブロット倍の拡大写真である。
図１３は、マウスＩｇＭモノクロナール捕獲抗体7D8-B3、およびマウスＩｇＧ1モノクロナール検出抗体1E8-B8を用いて、非誘導または誘導Ａ-172細胞溶解物中のhiＮＯＳを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡを示すグラフである。
図１４は、マウスＩｇＭモノクロナール捕獲抗体7D8-B3、およびマウスＩｇＧ1モノクロナール検出抗体1E8-B8を用いて、非誘導または誘導ＲＡＷ264.7細胞溶解物中のiＮＯＳを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡを示すグラフである。
図１５は、マウスＩｇＧ1モノクロナール抗体1E8-B8で誘導したＡ-172細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。
図１６は、マウスＩｇＧ1モノクロナール抗体2A12-A4で誘導したＡ-172細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。
図１７は、マウスＩｇＭモノクロナール抗体2H11-D11で誘導したＡ-172細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。
図１８は、マウスＩｇＧ1モノクロナール抗体1E8-B8で誘導したＲＡＷ264.7細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。
図１９は、マウスＩｇＧ1モノクロナール抗体2A12-A4で誘導したＲＡＷ264.7細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。
図２０は、マウスＩｇＧ1モノクロナール抗体1E8-B8で誘導したヒト単核細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。
図２１は、マウスＩｇＧ1モノクロナール抗体2A12-A4で誘導したヒト単核細胞の間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。
図２２は、リポ多糖類の誘導から１６時間後のマウス腹腔洗浄細胞のマウスＩｇＧ1 κモノクロナール抗体5B3-E6を用いたｉＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ800倍の拡大写真である。
図２３は、リポ多糖類の誘導から１６時間後のマウス腹腔洗浄細胞のマウスＩｇＧ1 κモノクロナール抗体2D2-B2を用いたiＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ800倍の拡大写真である。
図２４は、リポ多糖類の誘導から１２時間後のマウス皮膜形成細胞のマウスＩｇＧ1 κモノクロナール抗体5B3-E6を用いたiＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ800倍の拡大写真である。
図２５は、リポ多糖類の誘導から１２時間後のマウス皮膜形成細胞のマウスＩｇＧ1 κモノクロナール抗体2D2-B2を用いたiＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ800倍の拡大写真である。
図２６は、ＣＭ／ＬＰＳの誘導から４０時間後のヒトＡ-172細胞のマウスＩｇＧ1 κモノクロナール抗体5B3-E6を用いたhiＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。
図２７は、ＣＭ／ＬＰＳの誘導から４０時間後のヒトＡ-172細胞のマウスＩｇＧ1 κモノクロナール抗体2D2-B2を用いたhiＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。
図２８は、ＣＭ／ＬＰＳの誘導から４０時間後のマウスＲＡＷ264.7細胞のマウスＩｇＧ1 κモノクロナール抗体2D2-B2を用いたiＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ1600倍の拡大写真である。
図２９は、ヒト敗血症患者（No.２）から得られた皮膜形成細胞のマウスＩｇＧ1 κモノクロナール抗体2D2-B2を用いたhiＮＯＳの間接的な免疫蛍光染色を示すｘ800倍の拡大写真である。
図３０は、マウスＩｇＧ1モノクロナール抗体21C10-1D10を用い、ＣＭ／ＬＰＳの誘導から４０時間後のＡ-172およびＲＡＷ264.7細胞から得られる細胞溶解物中のiＮＯＳを定量する競合結合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。
図３１は、マウスＩｇＧ1モノクロナール抗体21C10-1D10を用い、３人のヒト敗血症性ショック患者の完全血の皮膜形成細胞から得られる細胞溶解物中のhiＮＯＳを定量する競合結合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。
図３２は、マウスＩｇＧ1モノクロナール抗体21C10-1D10、およびアミノ酸１８個のＡ４ペプチドPS-5104と比較する長さ３０のアミノ酸Ａ３＋Ａ４ペプチドPS-5251を用いた、４通りに希釈した腹水でのhiＮＯＳ競合結合ＥＬＩＳＡにおける増感を示す４つのグラフのパネルである。
図３３は、マウスＩｇＧ1モノクロナール抗体21C10-1D10、Ａ４ペプチド（PS-5104）およびＡ４ローカスのアミノ末端領域に対する抗体決定基（エピトープ）の位置を決定する表Ｖ中のカルボキシ末端切断ペプチド（PS-5265からPS-5268）を用いた競合結合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。
図３４は、マウスＩｇＧ1モノクロナール抗体21C10-1D10、基準Ａ４ペプチド（PS-5104）および抗体エピトープをPS-5213，ＶＴＱＤＤＬＱと定める表VII中のアミノ末端伸長領域（series）（PS-5211からPS-5216）を用いた競合結合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。
図３５は、マウスモノクロナール抗体2D2-B2、基準Ｆ６ペプチド（PS-5166）および抗体のエピトープをPS-5294，ＶＱＧＩＬＥＲＶと定める表Ｘ中の中間領域の３つの伸長領域に由来するペプチドを用いた競合結合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。
図３６は、マウスモノクロナール抗体5B3-E6、基準Ｆ６ペプチド（PS-5166）および抗体のエピトープをPS-5294，ＶＱＧＩＬＥＲＶと定める表Ｘ中の中間領域の３つの伸長領域に由来するペプチドを用いた競合結合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。
発明の好ましい実施態様
以下に本発明のいくつかの態様例として、好ましい態様例について上記図を参照しながら詳細に説明する。
誘導型ヒトＮＯＳ（hiＮＯＳ）を特定するためのマウスモノクロナール抗体の試験体群（パネル）が開発された。モノクロナール抗体類は、酵素結合免疫溶解試験（ＥＬＩＳＡ）、ウェウタン免疫ブロット、125Ｉ−ｈｉＮＯＳのイムノプレシピテーション、および細胞の間接的免疫蛍光染色などのさまざまな方法により分析された。モノクロナール類は、全てまずＥＬＩＳＡで検出されたが、ＥＬＩＳＡに基づく試験では、全てうまく検出できた。しかしながら試験された他の全ての方法のうちには、抗hiＮＯＳモノクロナール抗体がうまく適合したものもあり、そうでないものもあった。唯一、モノクロナール抗体1Ｅ8-B8が試験した全ての試験方法に適合することがわかった。2A12-A4、2D2-B2、5B3-E6、2H11-D11、7D8-B3、および21C10-1D10などの他の試験体は、試験された方法に全てではないが適合した。したがってそれぞれのモノクロナール抗体試験体は、それを特定するに好適な試験方法、あるいは目的がなにかに応じて試験する必要があるだろう。このようなモノクロナール抗体は、免疫学的検定におけるhiＮＯＳの検出および定量に用いられた。
これらモノクロナール抗体は、免疫原として無傷のhiＮＯＳを用いて誘導された。しかしながらこれらモノクロナール抗体の全てではないかも知れないが多くは、hiＮＯＳの断片（フラグメント）またはそのペプチド類似体を用いて、マウスでの初期免疫反応を惹起することによって開発することが可能であろう。さらに、ポリクロナール型ウサギ抗ペプチド抗体の別のパネルが開発された。このポリクロナール抗体は、３つのＮＯＳイソ体（ｎＮＯＳ、ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳ）に特異的に作用する。このポリクロナール抗体は、ヒトＮＯＳの上記各イソ体のアミノ末端またはカルボキシ末端に擬似するウサギ中の限定されたアミノ酸配列に対して培養された。このポリクロナール抗体の製造に用いられたペプチドは公知の技術にしたがって合成した。
またマウスを免疫し、モノクロナール抗体のパネルを開発するために精製ヒトiＮＯＳが用いられた。モノクロナール抗体は、タンパク質フラグメント、融合タンパク質およびタンパク質またはマウスを免疫するhiＮＯＳのペプチド類似体を用いて開発することができるが、hiＮＯＳ領域に対する免疫反応を惹起する。ハイブリドーマ、細胞のクローンの製造、およびモノクロナール抗体の製造には標準的な技術を用いた。ハイブリドーマおよびクローンは、ＥＬＩＳＡおよびウェウタン免疫ブロットによりスクリーンし、培養液上清としてモノクロナール抗体の製造に用い、さらにマウスからの腹水として用いた。またモノクロナール抗体は標準的な技術によりイソ体であることが分析された。モノクロナール抗体は、次いでhiＮＯＳの酵素活性を抑制する能力が試験された。タンパク質の領域を決定するための各モノクロナール抗体が確認され、全長１１５３個のアミノ酸の構造のhiＮＯＳをカバーするための互いに重複する９６のペプチド、各１８個のアミノ酸が合成された。各ペプチドは、先のペプチドと重複する１１アミノ酸を有するカルボキシ末端ペプチドを除いてその隣接位で重複する６個のアミノ酸を有していた。ペプチドはマイクロタイタープレート上で特定のウエルを感作するために用いられ、各クローンからの培養液上清または腹水は各ウエルに供された。結合したモノクロナール抗体の存在が検出された。iＮＯＳタンパク質の特定領域は、モノクロナール抗体により結合されたとき同定される。図１は本発明のモノクロナール抗体のどれかに結合することにより決定されたヒトiＮＯＳの特定領域を示すペプチド配列である。
ひとたびその領域に結合することにより特定のモノクロナール抗体が決定される領域は、公知のタンパク質データベースのコンピューター検索により、他のタンパク質との相似配列が検索される。このサービスは、米国国立衛生研究所のナショナル・バイオテクノロジイ情報センターで提供される。この検索には、ベイシック・ロジスティック・アライメント統計的ツール（ＢＬＡＳＴ）と称されるプログラムが用いられる。このプログラムの使用は、アルツシュールら（Altscul,et.al.，分子生物学雑誌、215巻（1990）））による“基準位置配列検索ツール”と表題された中に記載されている。下記表は、コンピューターの検索結果を示す。
0004117911.tif 000002
0004117911.tif 000003
0004117911.tif 000004
ここで“Ｘxx”はＢＬＡＳＴリスト（caluculation）中には使用されてない不一致アミノ酸を示す。
“Ｐ値”は非一致の確率を示す。換言すればこの値が小さいほど、よりそれに一致する確率である。たとえば表１中、ペプチドＡ３のＢＬＡＳＴ計算結果は、hiＮＯＳ（２５−４２）と完全な配列相同性がみられる。このことは、このペプチドが相同的に作製されたhiＮＯＳの領域であるため予想された。コンピューター検索は、他に２つのタンパク質と相同の配列を見出しただけであった。配列相同の１つは、マウスiＮＯＳ（２５−４２）についてＰ値が０．０２より小さかった。他の配列相同は、ラットiＮＯＳ（２５−４２）についてＰ値が０．０３より小さかった。上記データベース中の他のタンパク質に、０．１より小さなＰ値での配列相同は見つからなかった。配列相同のためのタンパク質データベースの検索は、ペプチドＡ４ではヒトiＮＯＳ（３７−５４）のみとの相同がみられた。データベース中にはどのタンパク質の領域も、０．１より小さなＰ値でその配列に一致するものは他にみつからなかった（すなわち９９．９％より大きな確率で一致しない）。hiＮＯＳ（７８１−７９８）であるペプチドＦ６に対する配列相同の検索では、ヒトiＮＯＳとの配列相同およびマウスとラットのiＮＯＳとの配列相同がみつかった。この検索では、０．１より小さなＰ値でその配列に一致するものは他にみつからなかった。しかしながらhiＮＯＳ（９８５−１００２）であるペプチドＧ１１との配列相同の検索では、表Ｉ中のいくつかのタンパク質との相同がみられた。これらはマウスおよびラットのiＮＯＳ、ヒトｎＮＯＳ（1256−1273）、ヒトｅＮＯＳ（1017−1031）およびウシｅＮＯＳ（1019−1033）である。hiＮＯＳ（1009−1026）であるペプチドＨ１に対する配列相同のコンピューター検索では、ラットおよびマウスのiＮＯＳとの相同がみられただけであった。０．５より小さなＰ値での配列相同は他にみつからなかった。ヒトｅＮＯＳおよびヒトｎＮＯＳとの相同が少ないがみられ、Ｐ値が０．５以上であることは注目すべきである。
モノクロナール抗体の結合がみられた１８マー（mer）それぞれに由来する配列、すなわち表１中のペプチドＡ３（PS-5103）、Ａ４（PS-5104）、Ｆ６（PS-5166）、Ｇ１１（PS-5183）およびＨ１（PS-5185）を用いてこれら領域のための一連のエピトープマッピングを設計し実施した。１８-merのアミノ酸末端に由来する４つの切断ペプチド系列、同様に１８-merのカルボキシ末端に由来する４つの切断ペプチド系列を作成した。本発明のモノクロナール抗体に結合しうる最短のアミノ酸はどれであるかを決定するためにさまざまな長さに切断した。図７はこのように切断された本発明のモノクロナール抗体のどれかと結合したペプチドを示すアミノ酸配列である。
さらにいくつかのペプチド相同を設計し、ＢＬＡＳＴ検索に基づいて合成した。これらペプチド相同を用いてhiＮＯＳ以外のタンパク質に対するモノクロナール抗体の特異性を調べた。このような他のタンパク質は、たとえばｈＮＯＳ、heＮＯＳ、マウスiＮＯＳおよびラットiＮＯＳである。
サンプル中のhiＮＯＳを検出および定量するためのイムノアッセイを準備した。精製したヤギ抗ウサギＩｇＧを用いてマイクロタイタープレートを感作した。プレートをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。ウサギポリクロナール型抗ペプチド抗体を添加してサンプル中のhiＮＯＳに結合することにより抗体を“捕獲”させた。表III中のパネルから種々のマウスモノクロナール抗体を試験し、そのhiＮＯＳ検出および定量能力を調べた。この方法により、表III中のクローン1E8-B8、21Ｄ10-lＤ10、2A12-A4およびその他の作用がみられた。iＮＯＳを迅速に検出するためのストリップ法などの他の方法も本発明のアッセイに使用可能であると考えられる。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法での使用に加え、表III中のモノクロナール抗体のパネルのサンプル中のhiＮＯＳを検出する能力についてウェウタン免疫ブロット法により試験した。この方法では、培地中の細胞をサイトカイン／ＬＰＳ混合物で誘導した。後者の方法は、本発明のモノクロナール抗体によってウェウタン免疫ブロット法で検出可能な細胞によりiＮＯＳ産生を誘発した。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法およびウェウタン免疫ブロット法での使用に加え、表IIIのパネル中の各モノクロナール抗体のhiＮＯＳをイムノプレシピテートする能力を調べた。これは、125Ｉ標識されたhiＮＯＳを用いてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法により試験された。この方法により、パネル中の２０種のうち１０のモノクロナール抗体が、hiＮＯＳのイムノプレシピテートさせることがわかった。能力が認められたこの１０のうち、モノクロナール抗体２Ｈ１１−Ｄ１１、５Ｂ３−Ｅ６および２１Ｄ１０−１Ｄ１０は、放射線標識されたタンパク質を最もイムノプレシピテートさせることがわかった。
また、表III中のモノクロナール抗体を細胞中に固定して、iＮＯＳを識別し結合する能力を調べた。iＮＯＳ産生の誘発を、全くタイプの異なる３つ培養細胞中で、初期抗体として抗hiＮＯＳモノクロナール抗体を用いて、誘発された細胞の間接的免疫蛍光染色して試験した。試験された３種の誘発、培養された細胞は、Ａ−１７２（ヒトグリア膠芽腫株化細胞）、ＲＡＷ264.7（マウスマクロファージ細胞株化細胞）および血液から単離された正常ヒト単核細胞である。この試験方法では、５つのモノクロナール抗体１Ｅ８−Ｂ８、２Ｄ２−Ｂ２、５Ｂ３−Ｅ６、２Ａ１２−Ａ４および２Ｈ１１−Ｄ１１が特にうまくいこと、パネル中の他モノクロナールはあまりうまくいかないかまたは全く細胞を染色しないことがわかった。
上記には、本発明を充分に開示することを目的として、本発明の態様を示したが、本発明の精神および原理を損なわない範囲であれば適宜に変化させ得ることはこの技術に熟練した当業者であれば明らかなことである。
次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明またはそのいかなる態様も以下に特定されるこれら実施例およびに限定されるものではない。
実施例１
ポリクロナール抗体の作製
ヒトＮＯＳの各イソ体のアミノ末端かカルボキシ末端に擬似する限定されたアミノ酸配列を有するペプチドを調製した。各ペプチドを、ｆｍｏｃタンパク質法による固相ペプチド合成により合成した。予備処理用ＨＰＬＣを用いた標準的な手法により、固相サポート樹脂から付着した合成ペプチドを単離、精製した。それらの純度を分析用ＨＰＬＣにより分析した。
１．各合成ペプチドは、抗体源を抗体をの誘発を構築するためにＥＤＡＣまたはスルホＭＢＳ合成物（chemistries）を用いて、担体タンパク質であるスカシ貝ヘモシアニン（ＫＨＬ）に接合した。
２．各ペプチド／タンパク質接合物は、ウサギでの抗体源として用いた。２−４のウサギグループ毎に別々の抗体源を用いて免疫した。ウサギでの抗ペプチド抗体の製造のために、以下のような標準的プロトコルで発育させたウサギを、免疫し、高めて、採血した。
３．ウサギ採血のそれぞれに由来する抗血清をＥＬＩＳＡによって試験し、合成ペプチド類似体を特定する抗体を作製した。抗体源のペプチド部を特定する抗体の産生能があることがわかったこれら抗血清は、その無傷のタンパク質を認定する能力が評価された。
表IIはこのような合成ペプチドの概要を示す。
0004117911.tif 000005
実施例２
モノクロナール抗体の作製
精製されたヒトiＮＯＳを用いてマウスを免疫し、モノクロナール抗体のパネルを開発した。ハイブリドーマの作成、細胞クローン、モノクロナール抗体の製造には標準的技術を用いた。このような技術は“モノクロナール抗体の製造”（Current Protocol in Immunology(1991)）と表題されたプロトコル中に記載されている。簡潔には、免疫マウスから脾臓を無菌的に取出し、脾臓細胞（splenocytes）を単離し、ポリエチレングリコールとともにＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合させた。ハイブリドーマをＥＬＩＳＡでスクリーンし、hiＮＯＳに対するマウスＩｇＧまたはＩｇＭを製造した。完全ハイブリッドは、特定希釈液により培養されクローンされた。クローンはＥＬＩＳＡおよびウェウタンブロット法でスクリーンした。完全ハイブリッドは培養され、冷凍保存のため液体窒素中で凍結し、培地上清としてモノクロナール抗体の製造に用いるとともに、Ｂａｌｂ／Ｃ雌マウス由来の腹水として用いた。
さまざまなクローンによって製造されたモノクロナール抗体は、種々の方法により解析られた。ＥＬＩＳＡ、ウェウタンブロット、125Ｉ−hiＮＯＳ（Ｉ．Ｐ．）イムノプレシピテーションおよび細胞の間接的免疫蛍光染色（Ｉ．Ｆ．Ａ．）などである。またモノクロナール抗体のイソ体が分類された。表IIIにこれら結果を示す：
0004117911.tif 000006
ここで“ＮＤ”は“検出されず”を意味し、“＋”は“あり”；“−”は“なし”；および“弱”はモノクロナール抗体が高濃度であるときのみ結合したことを示す。
実施例３
モノクローナル抗体のエピトープマッピング
実施例２の各モノクローナル抗体が、タンパク質のどの領域を認識しているのかを決定するために、ｈｉＮＯＳのアミノ酸１１５３個の全長をカバーするよう、９６個の互いに重複するペプチドを合成した。いずれのペプチドも、アミノ酸１８個の長さとし（１８マー）、カルボキシ末端アミドとして合成した。構造中の天然に生じたシステイン残基は、いずれもセリンで置換した。各ペプチドは、カルボキシ末端のペプチド以外は、隣接するペプチドと６個のアミノ酸が重複しており、カルボキシ末端のペプチドは、手前のペプチドと１１個のアミノ酸が重複していた。これらのペプチドは、モノクローナル抗体のパネルをＥＬＩＳＡ法によってエピトープ・マッピングするために使用した。各ペプチドは、一連のマイクロタイタープレートの特定のウェルを感作するのに使用した。次に、各モノクローナル抗体の培養上清あるいは腹水を、感作済みのプレートの全ウェルにそれぞれ加え、各ウェルについて、結合マウスモノクローナル抗体の有無を調べた。この一連の実験で得られた代表的な結果を、図２〜６に示し、また、下記の表ＩＶにまとめて示す。
0004117911.tif 000007
0004117911.tif 000008
実施例４
合成ペプチドを用いたエピトープ・マッピングと特異性解析
モノクローナル抗体が結合することがわかった１８マーの各配列（表ＩＶのペプチドＡ３、Ａ４、Ｆ６、Ｇ１１、Ｈ１）を使用して、これらの領域に関しての一連のエピトープ・マッピング用ペプチドを設計、作製した。ＢＬＡＳＴでのサーチで見つかったｉＮＯＳの相同体も、ｉＮＯＳモノクローナル抗体の特異性の解析に使用した。各１８マーのアミノ末端から所定数のアミノ酸を欠失させた４つの一連の切断ペプチド、ならびに各１８マーのカルボキシ末端から所定数のアミノ酸を欠失させた４つの一連の切断ペプチドを作成した。いずれの一連の切断ペプチドも、１８マーのカルボキシ末端あるいはアミノ末端から、アミノ酸を３つずつ順次欠失させたものである。その結果、それぞれの１８マーについて、各末端からアミノ酸が３つずつ順次短くなっていく２種の一連の切断ペプチドが得られた。表Ｖ、図７Ａ−Ｄ、図８に、作製した切断されたペプチドならびにｈｉＮＯＳのペプチド相同体を示す。このうち、ｈＩＮＯＳのペプチド相同体は、上述のコンピュータによるＢＬＡＳＴサーチでこれらの領域に対して配列相同性が見いだされた場合に、ヒトｎＮＯＳ、マウスならびにラットｉＮＯＳ、ヒトｅＮＯＳから作製したものである。
0004117911.tif 000009
0004117911.tif 000010
0004117911.tif 000011
0004117911.tif 000012
0004117911.tif 000013
0004117911.tif 000014
0004117911.tif 000015
表中の「＋」は正の結合を、「−」は結合しなかったことそ、「弱」は、モノクローナル抗体の濃度が極めて高かった場合にのみ結合が生じたことを示す。
モノクローナル抗体が各種の切断類似体、あるいはｎＮＯＳならびにｅＮＯＳ類似体に結合する能力を、もとの９６の１８マーのスクリーニングに使用したのと同様の方法で、ＥＬＩＳＡによって調べた。
Ａ−３ローカスについては、モノクローナル抗体２１Ｃ１０−１Ｄ１０は、ペプチドＡ−３（ＰＳ−５１０３）のみに対して強く結合し、マウス相同ｍｉＮＯＳ（２５−４２）（ＰＳ−５２４１）には弱く結合した。２１Ｃ１０−１Ｄ１０は、切断ペプチドのいずれとも結合せず、ラット相同ｒｉＮＯＳ（２５−４２）（ＰＳ−５２４２）にも結合しなかった。
Ａ−４ローカスについては、最初のスクリーニングで、２種のモノクローナル抗体（６Ｇ１２−Ｈ７ならびに２１Ｃ１０−１Ｄ１０）の結合が確認された。これらの抗体は、切断ペプチドに対しする特異性が互いに異なっていた。モノクローナル抗体６Ｇ１２−Ｈ７は、Ａ−４（ＰＳ−５１０４）ならびに２種の切断類似体（ＰＳ−５２６１ならびにＰＳ−５２６５）に対して強く結合し、ＰＳ−５２６２とも弱く結合した。このことから、もとの１８マーは、配列がThr Gln Asp Asp Leu Gln Tyr His Asn Leu Ser Lysであるような１２マーまでは少なくとも短縮が可能で、全タンパク質のこのペプチド類似体に対しても結合可能性が依然として維持されていることがわかる。一方、モノクローナル抗体２１Ｃ１０−１Ｄ１０は、もとの１８マーであるＡ−４（ＰＳ−５１０４）と、カルボキシ末端が３残基分切断されたｈｉＮＯＳ（３７−５１）ペプチド配列（ＰＳ−５２６５）のみと結合した。
Ｆ６ローカスについては、モノクローナル抗体２Ｄ２−Ｂ２は、Ｆ６（ＰＳ−５１６６）ならびにその切断類似体のうちの３つ、すなわちＰＳ−５２２２、ＰＳ−５２２６、ＰＳ−５２２７と結合し、ＰＳ−５２２８と弱く結合し、ヒトｅＮＯＳ（８０６−８２４）（ＰＳ−５２２１）とは全く結合しないことがわかった。切断ペプチドで得られた結果からすると、エピトープは、Val Gln Gly Ile Leu Glu Arg Val Valの配列に含まれているはずである。
Ｇ１１ローカスについては、最初のスクリーニングで、２種のモノクローナル抗体１Ｅ８−Ｂ８ならびに２Ａ１２−Ａ４の結合が見いだされた。これらの２種を、切断ペプチドならびに２種の相同体との結合について調べたところ、双方のモノクローナル抗体について似たような認識パターンが認められた。双方とも、予測通り、Ｇ−１１（Ｐ４１８３）と強く結合し、また、双方とも、ヒトｎＮＯＳ（１２５６−１２７３）（ＰＳ−５２０１）を認識したものの、結合は、Ｇ−１１よりはるかに弱かった。また、双方とも、一連のアミノ末端切断ペプチドの最初のものであるＰＳ−５２０３を認識したものの、１Ｅ８−Ｂ８の結合は、２Ａ１２−Ａ４について観察された結合より、はるかに弱かった。
最後に、Ｈ１ローカスについては、モノクローナル抗体２４Ｂ１０−２Ｃ７がＨ１（ＰＳ−５１８５）と結合することがわかった。このモノクローナル抗体は、ヒトｅＮＯＳ相同体ならびにｎＮＯＳ相同体であるＰＳ−５２８１もＰＳ−５２８２も認識しなかったものの、一連の子アミノ末端切断ペプチドの最初の２つであるＰＳ−５２８３とＰＳ−５２８４に強く結合した。モノクローナル抗体２４Ｂ１０−２Ｃ７は、次に短いアミノ末端切断ペプチドであるＰＳ−５３８５にも弱く結合した。こうした結果から、このモノクローナル抗体が、ペプチドＨ−１（ＰＳ−５１８５）のカルボキシ末端側に位置する配列を認識していることがわかる。
実施例５
試料中のｈｉＮＯＳの量を測定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
ｈｉＮＯＳ用のサンドイッチＥＬＩＳＡを開発する最初の試みでは、「捕獲用」の抗体として、ポリクローナルなウサギ抗iＮＯＳ抗血清を使用した。この方法では、アフィニティ精製したヤギ抗ウサギＩｇＧを１μｇ／ウェル／１００μｌ使用して、マイクロタイタープレートを感作した。次に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でプレートをブロックした。ウサギポリクローナル抗ペプチド抗体（ｈｉＮＯＳのカルボキシ末端に対して特異的なもの）を加え、結合させた。この抗体は、試料中のｈｉＮＯＳに結合する「捕獲用」抗体として使用した。表ＩＩＩのパネルの各種マウスモノクローナル抗体が試料中のｈｉＮＯＳを検出および／または定量する能力について調べた（図９）。結果からわかるように、このアッセー方法では、ＩＥ８−Ｂ８、２１Ｃ１０−１Ｄ１０、２Ａ１−Ａ４、７Ｄ８−Ｂ３がうまく作用することがわかった。しかし、広範な解析を必要とするポリクローナルなウサギ抗ペプチド抗体を繰り返し作製しなくてもすむように、ｈｉＮＯＳ用に作製した表ＩＩＩのパネルの各種マウスモノクローナル抗体を、「捕獲用」抗体と検出用抗体の両方に使用するサンドイッチＥＬＩＳＡを設計した。このアッセー方法では、アフィニティ精製したヤギ抗マウスＩｇＧ2A、またはＩｇＧ2B、ＩｇＭを使用してマイクロタイタープレートを感作した。次に、「捕獲用」モノクローナル抗体として、２Ａ１−Ｆ８、６Ａ１２−Ａ１２、２１Ｃ−１Ｄ１０、またはＩｇＭクラスのモノクローナル抗体のいずれかを加えた。次に、ＢＳＡでプレートをブロックし、ｈｉＮＯＳを含有することがわかっている試料を、マイクロタイタープレートに加えた。その後、これらを十分洗浄した。検出用のモノクローナル抗体には、「捕獲用」とは異なったイムノグロブリンクラスの抗体を使用した。ＩｇＧ2Bであるモノクローナル抗体２１Ｃ１０−１Ｄ１０を「捕獲用」抗体として用いた場合には、図１０に示すように、マウスＩｇＧ1モノクローナル抗体、たとえばＩＥ８−Ｂ８、２Ｄ２−Ｂ２を検出用抗体として使用した。「捕獲用」モノクローナル抗体をＩｇＭクラスの抗体とした場合には、検出用抗体として、マウスのＩｇＧクローンのいずれもが使用可能であり、こうした抗体としては、図１１に示すＩＥ８−Ｂ８（ＩｇＧ1）、２Ｄ２−Ｂ２（ＩｇＧ1）、２１Ｃ１０−１Ｄ１０（ＩｇＧ2B）がある。このように、表ＩＩＩのモノクローナル抗体のパネルを使用すると、モノクローナル抗体にもとづいた抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを作成することができる。ｈｉＮＯＳに対して作製されたマウスモノクローナル抗体パネルの各種イムノグロブリンクラスのモノクローナル抗体を用いることによって、ポリクローナルな「捕獲用」抗体を使用しなくてもすむようになる。
実施例６
ウェスタン免疫ブロット
表ＩＩＩのモノクローナル抗体のパネルを、サンドイッチＥＬＩＳＡでの使用についてだけでなく、ウェスタン免疫ブロット法で試料中のｈＮＯＳを検出する能力についても調べた。試料を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動して、タンパク質を分子量に応じて分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ＰＢＳ／トゥイーン２０バッファーで１：４に希釈したヤギ練乳で膜をブロックした。一次抗ｈｉＮＯＳモノクローナル抗体を結合させ、次に、図１２に示すように、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用して膜を発現させた。モノクローナル抗体は、サイトカイン／ＬＰＳ混合物で誘導するとｉＮＯＳを含有するようになることが報告されている細胞の細胞ライセートを使用したウェスタンブロットについても調べた。細胞は、米国メリーランド州ロックヴィルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から株化細胞Ａ−１７２ならびにＲＡＷ２６４．７を購入し、細胞の増殖後、サイトカイン／ＬＰＳ混合物による誘導の前ならびに後に回収した（図１３、図１４）。この細胞毒性混合物は、前出のゲラーらの文献に、サイトカイン／ＬＰＳ混合物として記載されている。細胞ペレットは、細胞の回収後にＰＢＳで十分に洗浄して、余分のタンパク質を除去した。細胞は、凍結解凍を２回繰り返し、超音波処理を行うことによって溶解させた。細胞ライセートは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファーで１：２に希釈し、１０分間煮沸した。試料を、上述のようにして、７．５％のゲルで電気泳動した。非誘導細胞がｉＮＯＳを含有していなかったのに対し、サイトカイン／ＬＰＳ混合物で誘導した細胞では、１３０ｋｄのバンドが認められた。このことから、サイトカイン／ＬＰＳ混合物によってｉＮＯＳが誘導されており、表ＩＩＩのモノクローナル抗体によって、未知試料中のｉＮＯＳをウェスタンブロット法で検出できることが示された。
これらの誘導細胞のライセートは、ウェスタン免疫ブロット法によって調べただけでなく、実施例５のサンドイッチＥＬＩＳＡ法によっても、ｉＮＯＳを検出および／または定量できるかどうかについても調べた。図１３および１４に示すこのＥＬＩＳＡ試験の結果にはっきり示されているように、非誘導細胞にｉＮＯＳが含まれていなかったの対して、サイトカイン／ＬＰＳ混合物による誘導後は、実質的な量のｉＮＯＳが含まれていた。
実施例７
誘導細胞の免疫蛍光染色
各種のモノクローナル抗体が、ｉＮＯＳを産生するよう誘導を行った細胞中でｉＮＯＳと結合する能力を、３種の異なる細胞、すなわち、ヒト膠芽腫株化細胞Ａ−１７２、マウスマクロファージ株化細胞ＲＡＷ２６４．７、正常ヒト単球について調べた。細胞は、正常培養液中で２日間培養し、サイトカイン／ＬＰＳ混合物（ＣＭ）で４０時間処理することによってｉＮＯＳを産生するよう誘導した。この処理の後に、細胞を２種の方法、すなわち細胞溶解に適した方法、ならびに免疫染色法に適した方法で処理した。溶解させる細胞は、培養フラスコから剥がし、５回洗浄し、少量のＰＢＳ中で凍結させて溶解させた。このライセートは、実施例５および６に記載したウェスタン免疫ブロットならびにサンドイッチＥＬＩＳＡでの試験に使用した。免疫染色に用いる細胞は、４回洗浄し、７０％あるいは１００％のアセトンで固定した。これらの細胞を、一次マウス抗ｈｉＮＯＳモノクローナル抗体と６０分間反応させ、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭと反応させた。細胞は、落射蛍光顕微鏡によって観察、撮影した。図１５〜１７に、誘導済みのＡ−１７２細胞について、表ＩＶの１Ｅ８−Ｂ８、２Ａ１２−Ａ４、２Ｈ１１−Ｄ１１をそれぞれ用いた場合に観察された間接免疫蛍光染色パターンを示す。図１８と図１９に、固定したＲＡＷ２６４．７について、表ＩＶの１Ｅ８−Ｂ８ならびに２Ａ１２−Ａ４をそれぞれ用いた場合に観察された間接免疫蛍光染色パターンを示す。このパターンは、ウェスタン免疫ブロット法で得られた結果と似ている。つまり、これらの２種のモノクローナル抗体は、マウスｉＮＯＳと交叉反応しうるということになる。図２０と２１に、表ＩＶの２種のマウス抗ｈｉＮＯＳモノクローナル抗体、１Ｅ８−Ｂ８ならびに２Ａ１２−Ａ４を、それぞれ、誘導済みの正常ヒト単球に使用することによって得られた間接免疫染色の結果を示す。単球は、密度勾配遠心法によって正常なヒト血液から単離したもので、その際には、米国ニューヨーク州ウェストベリー（Westbury）のアキュアト・ケミカル・アンド・サイエンティフィック社（Accurate Chemical and Scientific Corp）から入手したオプティプレップ（Optiprep）を、アプリケーション・シート２．３．に詳述された製造業者の指示にしたがって使用した。これらの結果からわかるように、これらのマウス抗ｈｉＮＯＳモノクローナル抗体は、正常ヒト細胞ならびに組織で誘導されたｈｉＮＯＳを認識し、結合することができる。
実施例８
モノクローナル抗体がｈｉＮＯＳの酵素活性を阻害する能力についての試験
基質と補助因子の存在下で生成した窒素化合物（nitrite）の量を測定することによって、ｈｉＮＯＳの酵素活性を測定した。１３種の異なった抗ｈｉＮＯＳモノクローナル抗体を、ｈｉＮＯＳの活性を阻害する能力について調べた。調べたいずれのモノクローナル抗体も、ディングら（Ding et al.，”Macrophage Deacrivity Factor and Transforming Growth Factors - beta 1，beta 2，and beta 3 Inhibit Induction of Macrophate Nitogen Oxide Synthesis by IFN-gammal”，Journal of Immunology，Vol. 145(1990)）ならびにナカネら（”Cloned Human Brain Nitric Oxide Syntase in Highly Expressed in Skeletal Muscle”，FEBS Letters，vol. 316(1993)）に記載されたグライゼ（Greise）比色分析では、酵素の活性を阻害しなかった。
実施例９
アッセイ用反応物質の調製
実施例１の低温保存細胞からの新たな腹水調製物を用いて、実施例２の手順を繰り返した。この手順は、実施例２の最初の調製から約１２ヶ月後に実施したものである。
下記に示す表ＶＩの結果は、実施例２のデータを補強するものであった。
0004117911.tif 000016
表ＶＩの競合結合ＥＬＩＳＡは、マイクロタイターＥＬＩＳＡプレートにコーティングした合成ペプチドと、溶液状態の標準あるいは未知物質のｉＮＯＳとに対する抗体の結合の競合に基づくものである。本発明のモノクローナル抗体の多数が、特異的なタンパク質の直鎖状合成ペプチド類似体と結合したことが見いだされたのは当然かもしれない。モノクローナル抗体の大半は、生理学的試料中のｉＮＯＳを測定するうえで十分な感度を有していなかった。しかし、１種のモノクローナル抗体、すなわち２１Ｃ１０−１Ｄ１０は、生理学的試料のｉＮＯＳの測定に使用しうる感度を有していた。プレートをコーティングするペプチドをもっと長い合成ペプチドとし、ＡＢＣ増幅を行ってＥＬＩＳＡを「微調整」することにより、感度を５０〜６０倍向上させることができた。このアッセイは、臨床検査技師にとって許容できるものであれば、数多くの態様のいずれによって実施してもよい。表ＶＩに記載した競合結合ＥＬＩＳＡの最低感度は、２０フェムトモルで、完了に３時間を要する。さらにプレインキュベーションを行った場合には、感度が２〜３倍向上し、理論上、最低感度が６〜１０フェムトモルの範囲のＥＬＩＳＡが実現される。
実施例１０
免疫蛍光アッセイ
細胞の間接免疫蛍光染色を、ハイマーら（Heimer and Taylor，J. Clin. Path.，27(1974)，p. 254）ならびにジョンソンら（Johnson et al.，J. Immunol.，Meth. 55(1982)，p. 231）を参考として、以下の方法によって行った。細胞は、１分ずつ３回、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）をとりかえて洗浄し、その後すばやく水で洗浄し、十分に水をきった。ガラス上で増殖させた細胞は１００％アセトンで固定し、プラスチック上で増殖させた細胞は、８０％アセトン／２０％水で固定した。固定には室温で１０〜１５分を要した。試料を風乾し、２０℃で保存した。モノクローナル抗体を、ＰＢＳで１：５００／１：２，５００／１：１２，５００に希釈した培養上清として加えた。上清あるいは腹水は、室温で直接固定細胞に加え、３７℃で時間、あるいは室温で２時間培養した。次に、各サンプルをＰＢＳ中で１分ずつ４回洗浄し、水を切った。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス二次抗体を、ＰＢＳで１：１２０に希釈したハイクロン（hyclone）とともに加えた。試料を、３７℃で０分、あるいは室温で４５分インキュベートした。細胞は、再度、ＰＢＳ中で１分ずつ３回洗浄し、次に水で洗浄して塩を取り除いた。水を切った後、退色を低減させるためにＤＡＢＣＯを含有するグリセリン系のマウンティングメジュームを使用して、カバースリップをマウントした。ＦＩＴＣ用の励起・発光波長を備えた落射蛍光顕微鏡を使用して、免疫蛍光染色を観察した。
この免疫蛍光アッセイでは、モノクローナル抗体５Ｂ３−Ｅ６ならびに２Ｄ２−Ｂ２を使用した。染色は、Ｆ６ペプチド（ＰＳ−５１６６）で特異的にブロックした。ｉＮＯＳは多種の細胞で誘導され、モノクローナル抗体５Ｂ３−Ｅ６ならびに２Ｄ２−Ｂ２によって検出された。誘導プロセスの結果、強い免疫蛍光を発する細胞が得られた。ラットでのｉＮＯＳの誘導を行った場合には、固定組織片が、モノクローナル抗体５Ｂ３−Ｅ６ならびに２Ｄ２−Ｂ２によって（蛍光でなくＤＡＢを使用して）特異的に免疫染色されることも見いだした。この免疫染色は、適切なペプチド（Ｆ６＝ＰＳ−５１６６）によってのみブロックが可能であった。このアッセイは、現在の手順では、間接免疫蛍光法を使用しているので９０分を要する。直接法を使用すると、所要時間が３０分以下まで短縮されるはずである。
図２２〜２９は、実施例９の反応物質を使用して試料を間接免疫蛍光染色したものである。
このアッセイについては、特定の培養条件以外ではｈｉＮＯＳ酵素を産生しないＡ−１７２細胞（ヒト膠芽腫の株化細胞）のライセートを使用して実証した。免疫蛍光分析、ウェスタンブロッティング、ポリクローナル抗体を使用したＲＩＡ、モノクローナル抗体とペプチドを使用した競合結合ＥＬＩＳＡによって、これらの対照にｈｉＮＯＳが存在していないことが示された。また、ｈｉＮＯＳが、サイトカインとＬＰＳの混合物によって誘導されることも確認された。
実施例１１
競合結合ＥＬＩＳＡ
試料を競合結合ＥＬＩＳＡで調べた。プレートは一晩にわたって感作させ、４回洗浄し、２％正常ウマ血清（ＮＨＳ）を加えたＰＢＳ（ブロック溶液）で３時間にわたってブロックした。２倍の濃度の試料を、１５μｌのブロック溶液とともに、各プレートに加えた。２倍濃度の２１Ｃ１０−１Ｄ１０腹水を１５μｌの量のＰＢＳに希釈した溶液も、２％ＮＨＳならびに０．１％トゥイーン２０とともに加えた。試料を室温で３０分インキュベートした。０．１％トゥイーン２０を加えたＰＢＳでＡＢＣ錯体を１：１２０の濃度に希釈した溶液のプレインキュベーションを、室温で１時間行った。３０分後に、ＰＢＳでプレートを４回洗浄し、さらに２回洗浄した。２％のＮＨＳおよび０．１％の結晶ＢＳＡを加えたＰＢＳで１：４８０に希釈したｂｉｏｔ−ＨＭＩｇＧ１００μｌを、室温で３０分にわたって加えた。プレートを再度４回洗浄した。ＡＢＣ錯体を、等量のＰＢＳならびに０．１％トゥイーン２０で希釈した。このＡＢＣ混合液に、２％ＮＨＳと０．１％結晶ＢＳＡを加えた。プレインキュベートしておいたＡＢＣ溶液１００μｌ／ウェルを室温で加え、３０分間静置した。試料を８回洗浄した。呈色反応を、０．５ｍｇ／ｍｌのＯＰＤならびに０．０８％の過酸化水素を加えた１０ｘのリン酸クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）中で、３７℃にて５５分間実施した。
本発明のモノクローナル抗体の多数が、当該タンパク質の特異的な直鎖状合成ペプチド類似体と結合した。そのモノクローナル抗体と合成ペプチドのペアを調べたところ、モノクロナール抗体の１つである２１Ｃ１０−１Ｄ１０が、ヒトｉＮＯＳの測定に使用しうることを見いだした。プレートをコーティングするペプチドをもっと長い合成ペプチドとし、ＡＢＣ増幅を行ってＥＬＩＳＡを「微調整」することにより、感度を５０〜６０倍向上させることができた。このＥＬＩＳＡは、測定では、完了に３時間を要した。さらにプレインキュベーションを行った場合には、感度が２〜３倍向上し、ＥＬＩＳＡの最低感度が６〜１０フェムトモルの範囲となるはずである。図３０および図３１は、本実施例のＥＬＩＳＡアッセイをｉＮＯＳならびにｈｉＮＯＳの定量に用いたものである。図３２では、Ａ４ペプチドのかわりにＡ３＋Ａ４ペプチドを使用することによって本実施例のアッセイの感度を増大させている。
このアッセイについては、特定の培養条件以外ではｈｉＮＯＳ酵素を産生しないＡ−１７２細胞（ヒト膠芽腫の株化細胞）のライセートを使用して実証した。免疫蛍光分析、ウェスタンブロッティング、ポリクローナル抗体を使用したＲＩＡ、モノクローナル抗体とペプチドを使用した競合結合ＥＬＩＳＡによって、これらの対照にｈｉＮＯＳが存在していないことが示された。また、ｈｉＮＯＳが、サイトカインとＬＰＳの混合物によって誘導されることも確認された。
実施例１２
Ａ４ローカスについての２１Ｃ１０−１Ｄ１０によるエピトープ・マッピング
モノクローナル抗体２１Ｃ１０−１Ｄ１０によるエピトープ・マッピングを、ｈｉＮＯＳのＡ４ローカスのアミノ末端についてさらに実施した。表ＶＩＩに、結果を示す。
0004117911.tif 000017
図３３は、マウスＩｇＧ1モノクローナル抗体２１Ｃ１０−１Ｄ１０、Ａ４ペプチド（ＰＳ−５１０４）、実施例４の表Ｖのカルボキシ末端切断ペプチド（ＰＳ−５２６５〜ＰＳ−５２６８）を使用した「第２工程」の競合結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。表ＶＩＩＩに、ペプチドＰＳ−５２６１〜ＰＳ−５２６９のエピトープ・マッピングを示すが、ここでは、図３３にマッピングしたＰＳ−５２６５〜ＰＳ−５２６８ペプチドが目立っている。
0004117911.tif 000018
標準のＡ４ペプチド（ＰＳ−５１０４）と、表ＶＩＩの一連のアミノ末端延長ペプチド（ＰＳ−５２１１〜ＰＳ−５２５７）をマウスＩｇＧ1抗体と組み合わせて使用したところ、エピトープがＰＳ−５２１３のVTQDDLQであることがわかった。この「第３工程」のエピトープ・マッピングを図３４のグラフに示す。
実施例１３
Ｆ６ローカスについての２Ｄ２−Ｂ２ならびに５Ｂ３−Ｅ６によるエピトープ・マッピング
モノクローナル抗体２Ｄ２−Ｂ２ならびに５Ｂ３−Ｅ６によるエピトープ・マッピングを、Ｆ６ローカスの中央領域についてさらに実施した（第３工程）。表ＩＸに、このマッピングの結果を、使用したペプチドとともに示す。表には、マウスモノクローナル抗体２Ｄ２−Ｂ２ならびに５Ｂ３−Ｅ６を、Ｆ６ローカスの中央領域をマッピングする一連のペプチドとともに使用することによって競合法ＥＬＩＳＡで得られた結果も示す。また、表ＩＸには、これらの双方の抗体のエピトープの配列がＶＱＧＩＬＥＲＶ（ｈｉＮＯＳ  ７８４−７９１）であることも特定されている。
0004117911.tif 000019
【図１】
0004117911.tif 000020
【図２】
0004117911.tif 000021
【図３】
0004117911.tif 000022
【図４】
0004117911.tif 000023
【図５】
0004117911.tif 000024
【図６】
0004117911.tif 000025
【図７Ａ】
0004117911.tif 000026
【図７Ｂ】
0004117911.tif 000027
【図７Ｃ】
0004117911.tif 000028
【図７Ｄ】
0004117911.tif 000029
【図８】
0004117911.tif 000030
【図９】
0004117911.tif 000031
【図１０】
0004117911.tif 000032
【図１１】
0004117911.tif 000033
【図１２】
0004117911.tif 000034
【図１３】
0004117911.tif 000035
【図１４】
0004117911.tif 000036
【図１５】
0004117911.tif 000037
【図１６】
0004117911.tif 000038
【図１７】
0004117911.tif 000039
【図１８】
0004117911.tif 000040
【図１９】
0004117911.tif 000041
【図２０】
0004117911.tif 000042
【図２１】
0004117911.tif 000043
【図２２】
0004117911.tif 000044
【図２３】
0004117911.tif 000045
【図２４】
0004117911.tif 000046
【図２５】
0004117911.tif 000047
【図２６】
0004117911.tif 000048
【図２７】
0004117911.tif 000049
【図２８】
0004117911.tif 000050
【図２９】
0004117911.tif 000051
【図３０】
0004117911.tif 000052
【図３１】
0004117911.tif 000053
【図３２】
0004117911.tif 000054
【図３３】
0004117911.tif 000055
【図３４】
0004117911.tif 000056
【図３５】
0004117911.tif 000057
【図３６】
0004117911.tif 000058