(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然若しくは合成のヌクレオシド、又は少なくとも二種のそのようなヌクレオシドからのオリゴヌクレオチド〔そのヌクレオシドは、核酸塩基の非置換若しくは置換した基及び式Ｒ1−Ｏ−（式中、Ｒ1は保護基である）の保護された水酸基を含むか、又は水酸基の酸素原子に直接結合するか若しくは固体担体に結合基を介して結合している〕をヌクレオシド単量体又はオリゴヌクレオチド〔それには、上記の基以外に、式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で示される基が、
【化１】
0004071295.tif 000006
結合している〕から製造する方法であって、
不活性有機溶媒の存在又は非存在下かつ４ないし１０のｐＫ値を有する無機塩基又は有機窒素塩基の少なくとも触媒量の存在下に、該ヌクレオシド又は該オリゴヌクレオチドと、１ないし３０個の炭素原子を有する脂肪族、脂環式、芳香−脂肪族又は芳香族アルコール、２ないし５０個の炭素原子を有するポリオール又は重合体ポリオールの過剰量とを反応させて、式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の基を−ＯＨ基に変換することを特徴とする方法。
【請求項２】
溶媒がエーテル類、ハロゲン化炭化水素類、カルボキサミド類、ラクタム類、スルホキシド類、スルホン類、芳香族炭化水素類、ニトリル類、脂肪族及び脂環式炭化水素類よりなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
溶媒がエーテル類、ハロゲン化炭化水素類、ニトリル類、カルボキサミド類及びラクタム類よりなる群から選ばれる請求項２記載の方法。
【請求項４】
溶媒がテトラヒドロフラン又はジオキサンである請求項３記載の方法。
【請求項５】
溶媒がアセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル及びフェニルアセトニトリルよりなる群より選ばれる請求項２記載の方法。
【請求項６】
脂肪族、脂環式、芳香−脂肪族又は芳香族アルコール、ポリオール又は重合体ポリオールが、式（Ｉ）の基のモル当量当り少なくとも１００モル当量ないし１０００モル当量までの過剰量で存在する請求項１記載の方法。
【請求項７】
反応が温度範囲−２０℃ないし＋５５℃で行なわれる請求項１記載の方法。
【請求項８】
反応が温度範囲−１５℃ないし３５℃で行なわれる請求項７記載の方法。
【請求項９】
反応が室温で行なわれる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
アルコールが１ないし２０個の炭素原子を有するアルカノールである請求項１記載の方法。
【請求項１１】
アルコールが１ないし１２個の炭素原子を有するアルカノールである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
アルコールが１ないし６個の炭素原子を有するアルカノールである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
アルコールがメタノール、エタノール、ｎ−及びイソプロパノール、ｎ−、ｉｓｏ−及びｔｅｒｔ−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、エチレングリコール、ジエチレングリコールモノメチル及びモノエチルエーテルよりなる群から選ばれる請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
アルコールが１ないし４個の炭素原子を有するアルカノールである請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
アルコールがメタノールである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
アルコールが５ないし１２個の炭素原子を有するシクロアルカノールである請求項１記載の方法。
【請求項１７】
アルコールが５ないし８個の炭素原子を有するシクロアルカノールである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
アルコールがシクロペンタノール、シクロヘキサノール、メチルシクロヘキサノール、シクロヘプタノール及びシクロオクタノールよりなる群から選ばれる請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
アルコールが７ないし３０個の炭素原子を有する芳香−脂肪族アルコールである請求項１記載の方法。
【請求項２０】
アルコールが７ないし２０個の炭素原子を有する芳香−脂肪族アルコールである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
アルコールが非置換又はアルキル若しくはアルコキシ置換の、ベンジルアルコール及びβ−フェニルエタノールよりなる群から選ばれる請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
アルコールが６ないし３０個の炭素原子を有する芳香族アルコールである請求項１記載の方法。
【請求項２３】
アルコールが６ないし１２個の炭素原子を有する芳香族アルコールである請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
アルコールがフェノール、ナフトールあるいは非置換及びアルキル−若しくはアルコキシ置換の、フェノール又はナフトールよりなる群から選ばれる請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
ポリオールが２ないし２０個の炭素原子を有する請求項１記載の方法。
【請求項２６】
ポリオールがエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、シクロヘキサンジオール、ジヒドロメチルシクロヘキサン、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、トリメチロールプロパン、ペンタエリトリトール、ジペンタエリトリトール、グリセロール及び糖類よりなる群から選ばれる請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
重合体ポリオールがポリビニルアルコール、多糖類並びにヒドロキシアルキルポリアクリラート類及びヒドロキシアルキルポリメタクリラート類よりなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項２８】
無機塩基が塩基性の、金属酸化物、重金属酸化物及び水酸化物よりなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項２９】
無機塩基が塩基性アルミナである請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
無機塩基が塩基性二酸化ケイ素である請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
塩基の触媒量が０．０１ないし２０％モルの範囲である請求項１記載の方法。
【請求項３２】
有機窒素塩基が芳香族アミン、芳香族Ｎ−複素環及びＮ−アルキルモルホリンよりなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項３３】
塩基がイミダゾール、ピリジン、ポリビニルピリジン、Ｎ−メチルモルホリン、アニリン及びｏ−ジアミノベンゼンよりなる群から選ばれる請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドが固体担体に結合されている請求項１記載の方法。
【請求項３５】
反応を求核的に触媒する無機塩基の触媒量が、更に用いられる請求項１記載の方法。
【請求項３６】
ルイス酸の触媒量が更に用いられる請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、少なくとも二つの同一若しくは異なるヌクレオシド単量体を含む、天然若しくは合成ヌクレトシド、ヌクレオシド類似体又はオリゴヌクレオチドの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一定の配列順序を有する多くのヌクレオチド類は、現在、亜リン酸トリエステル法で合成されている。この方法において、オリゴヌクレオチドは３´−末端から段階的に５´の方向に合成される。合成は５´−水酸基及び、必要に応じて、そのヌクレオシド塩基に保護基を有する３´−末端ヌクレオチドの結合で化学的に不活性な固相への結合により開始する。次いで、５´−水酸基の保護基が除去される。適当に保護されたヌクレオシドの３´−ホスホルアミダイトとの反応は、ヌクレオチド間の結合を形成する。得られた亜リン酸トリエステルは、さらに所望のヌクレオチド間の結合に酸化される。次の合成サイクルは、固相に固定されたジヌクレオチドの５´−末端保護基の除去で始められる。この合成サイクルは、固相に結合したオリゴヌクレオチドが得られるまで繰り返される。合成は、ヌクレオシド塩基、水酸基及びヌクレオチド間の結合での保護基の除去で終わる（Caruthers, M. H., Science 230:281-285, 1985 ）。ホスホルアミダイトの構造により、用いるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドは、代表的には式：
【０００３】
【化２】
0004071295.tif 000002
で示される基を含んでいる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
この合成法の問題点は、ホスホルアミダイトと固相に固定されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの遊離の水酸基との間における縮合反応である。この反応工程において、水の除去が厳密に保証されなければならない。無水溶媒の使用でも、水の除去は完全に保証されない。このために、固相オリゴヌクレオチド合成のカップリング工程において、ヌクレオシドホスホルアミダイトのかなりの量は、ヌクレオシドホスホルアミダイトの加水分解物、例えばヌクレオシドシアノエチルヒドロゲンホスホナートに変換される。この最後に述べた化合物は、カップリング反応に関与しない。それでもやはり、高いカップリング収率を得るためには大過剰のホスホルアミダイトを用いることが必要である。最新式のＤＮＡ合成装置においては、固相に固定された水酸基組成物の量に比較して２ないし２０倍過剰のヌクレオシドホスホルアミダイトが用いられる。ヌクレオチド結合の最高収率は、用いたホスホルアミダイトに対して２０％である。用いたヌクレオシドの少なくとも８０％はヌクレオシドホスホルアミダイトの加水分解物として棄てられる。この問題は使用する装置の改良、例えば特殊な計量装置によっても完全に克服することができない［参照：Chemische Rundschau Nr. 37, Seite 11(1992)］。
【０００５】
ベーリンガー（Boehringer, M. P., Eidgenoessische Technische Hochschuleの学位論文, ETH No. 9377, 1991）は、ヌクレオシド類似体のメチルホスホルアミダイトを水酸化ナトリウム溶液と反応させ、遊離の水酸基を有するヌクレオシド類似体を得た。しかしながら、彼が用いた条件下では、ヌクレオシド塩基の保護基は除去される。
【０００６】
プレドボジテレフら（Predvoditelev, D. A., Tyuganova, M. A., Nifant'ev, E. E., Rogovin, Z. A., Zh. Prikl. Khim. 40:171-177, 1967 ）、ニフントエフら（Nifnt'ev, E. E., Predvoditelev, D. A., Fursenko, I. V., Zh. Obsh. Khim. 51:2435-2441, 1981）、トロエフ及びシメオノフ（Troev, K., Simeonov, M., Phosphorus and Sulfur 19:363-367, 1984 ）並びにウェストハイマーら（Westheimer, F. H., Huang, S., Covitz, F., J. Am. Chem. Soc. 110:181-185, 1988 ）が記載している非ヌクレオチドジアルキルホスファイト類のエステル交換反応法は、すべて、保護されたヌクレオシドに応用した場合、核酸塩基の保護基が容易に除去される欠点を有している。これらの方法で必要とする高温は、熱分解反応、例えば保護基の熱脱離、特に脱トリチル化が起こるので広範な用途には障害になる。
【０００７】
別な方法は、テトラキスベンジルオキシチタンでのルイス酸触媒エステル交換反応であり、適度の収率で、４０℃で７２時間にわたって行なわれるが、チタン酸エステルが加水分解に敏感なのが特に不利である（Froneman, M., Modro, T. A., Synthesis 201-204, 1991 ）。
【０００８】
【課題を解決しようとする手段】
予期しないことであるが、本発明はヌクレオシドヒドロゲンホスホナート類又はヒドロゲンホスフィナート類を、ヒドロゲンホスホナート又はヒドロゲンホスフィナートの官能基が存在していた位置に遊離の水酸基を有するヌクレオシドに変換する方法を提供するものである。本発明の方法では、ヒドロゲンホスホナート又はヒドロゲンホスフィナート基は、他のアシル保護基に比較して高い選択性でアルコールに変換される。除去の選択性は非常に高いので、所定の反応条件下で数日間経過した後でも、ヌクレオシド塩基の保護基は除去されない。さらに、この方法で高収率が得られる。新規な方法は、手動又は自動のオリゴヌクレオチド合成の型通りの連続操作の際に、標準の亜リン酸トリエステル法によるヌクレオチドカップリングで起こるヌクレオシドの過剰量を回収することを初めて可能とするものである。
【０００９】
本発明は、天然若しくは合成のヌクレオシド、ヌクレオシド類似体又は少なくとも二種のそのようなヌクレオシド及び／又はヌクレオシド類似体からのオリゴヌクレオチド〔その塩基性分子は核酸塩基Ｂの非置換若しくは置換した基及び式Ｒ1−Ｏ−（式中、Ｒ1は保護基である）の保護された水酸基を含むか、又は水酸基の酸素原子に直接結合するか若しくは固体担体に結合基を介して結合している〕をヌクレオシド単量体又はオリゴヌクレオチド〔その塩基性分子には、上記の基以外に、式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）：
【００１０】
【化３】
0004071295.tif 000003
【００１１】
で示される基が結合している〕から製造する方法であって、不活性有機溶媒の存在又は非存在下かつ４ないし１０のｐＫ値を有する無機塩基又は有機窒素塩基の少なくとも触媒量の存在下に、該ヌクレオシド又は該オリゴヌクレオチドと、１ないし３０個の炭素原子を有する脂肪族、脂環式、芳香−脂肪族又は芳香族アルコール、２ないし５０個の炭素原子を有するポリオール又は重合体ポリオールの過剰量とを反応させて、式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の基を−ＯＨ基に変換することを特徴とする方法を提供するものである。
【００１２】
式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の基は、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの３´若しくは５´−位に結合することができるが、一方Ｒ1 Ｏ−基又は固体担体は５´若しくは３´−位に結合する。式（Ｉ）の基は５´−位に、式（Ｉｂ）の基は３´−位に、そして式（Ｉａ）の基は３´若しくは５´−位に結合するのが好ましい。
【００１３】
好適にヌクレオチド結合が連結する第二級水酸基を有し、本発明の方法に用いるのに適した、多くのヌクレオシド、ヌクレオシド類似体又はオリゴヌクレオチドは、公知であり、例えばタウンゼント（Townsent, L. B., Hrsg., Chemistry of Nucleosides and Nucleotides 1, Pleum Press, New York, 1988 ）に記載されており、又は公知の方法で製造することができる。全く一般的に、これらの化合物は、核酸塩基を含み、−Ｏ−又は−Ｓ−で中断された開鎖状のＣ−構造あるいは炭素環式又はＯ−若しくはＳ−複素環構造であってよい。
【００１４】
開状鎖の炭素構造は、代表的には３ないし１２個、好適には３ないし６個の炭素原子を有している。炭素環及び複素環構造は、３ないし１２個、好適には３ないし８個、最も好適には４又は５個の環員炭素原子を有する単環系である。これらは５ないし１６個、好適には８ないし１６個の炭素原子を有する双環又は三環系であってもよい。この構造は、さらに置換基、代表的には保護されたＯＨ基を含んでいてもよい。
【００１５】
核酸塩基Ｂがプリン基又はその類似体である場合には、それは式（II）、（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）、（IIｄ）又は（IIｅ）：
【００１６】
【化４】
0004071295.tif 000004
【００１７】
（式中、Ｒ7 はＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ2 又はＯＨであり；Ｒ8 、Ｒ9 及びＲ10は、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2 、ＮＨＮＨ2 、ＮＨＯＨ、ＮＨ０（１ないし１２個の炭素原子を有する）アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル（そのヒドロキシル及びアミノ基は非置換又は保護基で置換されてもよい）、アルコキシ若しくは１ないし１２個の炭素原子を有するアルキルチオ又はフェニル、ベンジル、１ないし２０個の炭素原子を有する第一級アミノ若しくは２ないし３０個の炭素原子を有する第二級アミノであり；そして、Ｒ11はＨ、Ｃ1 −Ｃ4 アルキルである）で示される基である。
【００１８】
第一級アミノは、好適には１ないし１２個、最も好適には１ないし６個の炭素原子を含み、第二級アミノは、好適には２ないし１２個、最も好適には２ないし６個の炭素原子を含む。
【００１９】
好適に１ないし６個の炭素原子を含む、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル及びアミノアルキルの代表例は、メチル、エチル、プロピルの異性体、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル及びドデシル、並びに相当するアルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル及びアミノアルキル基である。アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル及びアミノアルキルは、最も好適には１ないし４個の炭素原子を含む。好ましいアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル及びアミノアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−及びイソプロピル、ｎ−、ｉｓｏ−及びｔｅｒｔ−ブチル、メトキシ、エトキシ、メチルチオ及びエチルチオ、アミノメチル、アミノエチル並びにヒドロキシメチル及びヒドロキシエチルである。
【００２０】
第一級アミノ及び第二級アミノは、代表的には式Ｒ14Ｒ15Ｎ［式中、Ｒ14はＨ、又は独立してＲ15の意義を有し；そしてＲ15は１ないし２０個、好適には１ないし１２個、最も好適には１ないし６個の炭素原子を有する、アルキル、アミノアルキル又はヒドロキシアルキル；カルボキシアルキル又はカルボアルコキシアルキル（そのカルボアルコキシ基は、２ないし８個の炭素原子を有し、そのアルキル分は１ないし６個、好適には１ないし４個の炭素原子を有する）；２ないし２０個、好適には２ないし１２個、最も好適には２ないし６個の炭素原子を有するアルケニル；フェニル、モノ−若しくはジ（Ｃ1 −Ｃ4 アルキルフェニル若しくはＣ1 −Ｃ4 アルコキシ）フェニル、ベンジル、モノ−若しくはジ（Ｃ1 −Ｃ4 アルキルベンジル若しくはＣ1 −Ｃ4 アルコキシ）ベンジル；又は１，２−、１，３−若しくは１，４−イミダゾリル−Ｃ1 −Ｃ6 アルキルであるか；又はＲ14とＲ15は、一緒になって、テトラ−若しくはペンタメチレン、３−オキサ−１，５−ペンチレン、−ＣＨ2 −ＮＲ16−ＣＨ2 ＣＨ2 −又は−ＣＨ2 ＣＨ2 −ＮＲ16−ＣＨ2 ＣＨ2 −（式中、Ｒ16はＨ又はアルキルである）である］の基である。アミノアルキルのアミノ基は、一つ又は二つのＣ1 −Ｃ4 アルキル又はＣ1 −Ｃ4 ヒドロキシアルキル基で置換されていてもよい。ヒドロキシアルキルの水酸基は、Ｃ1 −Ｃ4 アルキルでエーテル化されていてもよい。
【００２１】
アルキルの例は上記のものである。アミノアルキルの代表例は、アミノメチル、アミノエチル、１−アミノプロプ−２−イル又は−３−イル、１−アミノ−ブタ−２−イル又は−３−イル又は−４−イル、Ｎ−メチル−又はＮ，Ｎ−ジメチル又はＮ−エチル−又はＮ，Ｎ−ジエチル又はＮ−２−ヒドロキシエチル−又はＮ，Ｎ−ジ−２−ヒドロキシエチルアミノメチル又は−アミノエチル又は−アミノプロピル又は−アミノブチルである。ヒドロキシアルキル基の例は、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエタ−２−イル、１−ヒドロキシプロプ−２−又は−３−イル、１−ヒドロキシ−ブタ−２−イル、−３−イル又は−４−イルである。カルボキシアルキル基の例は、カルボキシメチル、カルボキシエチル、カルボキシプロピル及びカルボキシブチルであり；そして、カルボアルコキシアルキル基の例は、メチル又はエチルでエステル化された該カルボキシアルキル基である。アルケニルは、代表的にはアリル、ブタ−１−エン−３−イル又は−４−イル、ペンタ−３−又は−４−エン−１−イル又は−２−イル、ヘキサ−３−又は−４−又は−５−エン−１−イル又は−２−イルである。アルキルフェニル、アルコキシフェニル及びアルキルベンジルの代表例は、メチルフェニル、ジメチルフェニル、エチルフェニル、ジエチルフェニル、メチルベンジル、ジメチルベンジル、エチルベンジル、ジエチルベンジル、メトキシフェニル、ジメトキシフェニル、エトキシフェニル、ジエトキシフェニル、メトキシベンジル、ジメトキシベンジル、エトキシベンジル、ジエトキシベンジルである。アルキル分が好適には２ないし４個の炭素原子を有するイミダゾリルアルキルは、代表的には１，２−、１，３−若しくは１，４−イミダゾリルエチル又は−ｎ−プロピル又は−ｎ−ブチルである。Ｒ16は、好適にはＨ、メチル又はエチルである。
【００２２】
第一級アミノ及び第二級アミノの好適な例は、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、アリルアミノ、モノ−又はジ（１−ヒドロキシエタ−２−イル）アミノ、フェニルアミノ及びベンジルアミノ、アセチルアミノ及びベンゾイルアミノである。
【００２３】
本発明の好適な実施態様において、Ｒ7 は水素である。本発明の別の好適な実施態様において、Ｒ10は水素である。本発明のさらに別の好適な実施態様において、Ｒ8 及びＲ9 は、それぞれ互いに独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2 、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ2 、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ベンゾイルアミノ、メトキシ、エトキシ及びメチルチオである。
【００２４】
プリン系類似体の代表例は、プリンに加えて、アデニン、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンジルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、３−カルバアデニン、７−カルバアデニン、１−カルバアデニン、６−ヒドロキシプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−メチルチオプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン、３−カルバ−６−クロロプリン、グアニン、２−メチルグアニンである。アデニン、２−アミノアデニン及びグアニンは、特に好ましい。
【００２５】
核酸塩基が類似のピリミジン基である場合、該基は好適には式（III ）、（III ａ）及び（III ｂ）：
【００２６】
【化５】
0004071295.tif 000005
【００２７】
（式中、Ｒ11はＨ又はＣ1 −Ｃ4 アルキルであり、Ｒ12、Ｒ13及びＲ30は、それぞれ互いに独立して、好適な意義を含めてＲ8 に関して述べた意義を有し；そして式（III ｂ）のＮＨ2 の水素原子は、Ｃ1 −Ｃ6 アルキル又はベンゾイルで置換されていてもよい）で示されるウラシル、チミン及びシトシンの基並びに式（III ）、（III ａ）及び（III ｂ）の基のジヒドロ誘導体である。好適には、Ｒ12はＨ、Ｃ1 −Ｃ6 アルキル又はヒドロキシアルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ2 、ベンゾイルアミノ、モノ−又はジＣ1 −Ｃ6 アルキルアミノであり、そしてＲ13は好適にはＨ、Ｃ1 −Ｃ6 アルキル、Ｃ1 −Ｃ6 アルコキシ、Ｃ1 −Ｃ6 ヒドロキシアルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ2 、ベンゾイルアミノ又はモノ−若しくはジＣ1 −Ｃ6 アルキルアミノである。
【００２８】
Ｒ11は好適にはＨ又はメチルである。Ｒ12は好適にはＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ2 、ＮＨＣＨ3 、Ｎ（ＣＨ3 ）2 又はＣ1 −Ｃ4 アルキルである。Ｒ13は好適にはＨ、Ｃ1 −Ｃ4 アルキル、さらに特にメチル又はＮＨ2 、ＮＨＣＨ3 若しくは（ＣＨ3 ）2 Ｎである
【００２９】
ピリミジン類似体の代表例は、ウラシル、チミン、シトシン、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、ジヒドロウラシル、プソイドウラシル、１−メチルプソイドウラシル、５−メチルウラシル、３−メチルシトシン及び５−メチルシトシンである。
【００３０】
本発明の範囲内で、保護基は化学において通常の公知の保護基を意味するものと解されるべきである。そのような保護基の例は、Ｃ1 −Ｃ8 アルキル；単環又は双環のＣ7 −Ｃ12アラルキル；単環又は双環のＣ7 −Ｃ12アラルコキシ；単環又は双環のＣ7 −Ｃ12ハロアラルキル；ジフェニルメチル；１ないし４個のメチル又はメトキシ基で置換されたジフェニルメチル；トリフェニルメチル；１ないし６個のメチル又はメトキシ基又は１ないし３個のｔｅｒｔ−ブチル基で置換されたトリフェニルメチル；フェニル又はナフチルで置換されたキサンテニル；−Ｓｉ（Ｒ4 ）（Ｒ5 ）（Ｒ6 ）［式中、（Ｒ4 ）、（Ｒ5 ）及び（Ｒ6 ）は、それぞれ互いに独立して、Ｃ1 −Ｃ20アルキル、ベンジル又はフェニルである］；Ｒ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ＲはＣ1 −Ｃ6 アルキル；ベンジル；メチル、メトキシ又はハロゲンで置換されたベンジル；Ｃ1 −Ｃ12アルコキシ；フルオレンで置換されたＣ1 −Ｃ12アルコキシ；フェノキシ；メチル、メトキシ又はハロゲンで置換されたフェノキシ；ベンジルオキシ；メチル、メトキシ又はハロゲンで置換されたベンジルオキシ；Ｒ17−ＳＯ2 −（式中、Ｒ17はＣ1 −Ｃ12アルキル、Ｃ5 −Ｃ6 シクロアルキル、フェニル、Ｃ1 −Ｃ12アルキル又はハロゲンで置換されたフェニル、ベンジル又はＣ1 −Ｃ12アルキル若しくはハロゲンで置換されたベンジル）；非置換又は直鎖若しくは分岐状の、Ｃ1 −Ｃ6 アルキル若しくはＣ1 −Ｃ6 ハロアルキル、ハロゲン、Ｃ1 −Ｃ6 アルコキシ、Ｃ1 −Ｃ6 アルキルチオ、ニトロ及びシアノよりなる群から選ばれた一つ又は一つ以上の基で置換された，Ｃ1 −Ｃ12アルコキシアセチル又はフェノキシアセチルである。
【００３１】
Ｃ1 −Ｃ8 アルキルの代表例は、メチル、エチル、ｎ−及びイソプロピル、ｎ−、ｉｓｏ−及びｔｅｒｔ−ブチルであり；単環のＣ7 −Ｃ12アラルキルの代表例は、ベンジル、メチルベンジル及びジメチルベンジルであり；単環又は双環のＣ7 −Ｃ12アラルコキシの代表例は、メトキシベンジル及びジメトキシベンジルであり；単環又は双環のＣ7 −Ｃ12ハロアルキルの例はブロモベンジルであり；置換したジフェニルメチルの代表例は、ジ（メチルフェニル）メチル、ジ（ジメチルフェニル）メチル、ジ（メトキシフェニル）メチル及びジ（ジメトキシフェニル）メチルであり；置換したトリフェニルメチルの代表例は、トリ（メチルフェニル）メチル、トリ（ジメチルフェニル）メチル、トリ（メトキシフェニル）メチル、トリ（ジメトキシフェニル）メチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル及びトリス−ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルメチルであり；シリル基の代表例は、トリフェニルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリ−ｎ−プロピルシリル、イソプロピルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、ｎ−オクチルジメチルシリル、（１，１，２，２−テトラメチルエチル）ジメチルシリルであり；Ｒ−Ｃ（Ｏ）−基の例は、アセチル、トリフルオロアセチル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ベンゾイル、メチルベンゾイル、メトキシベンゾイル、クロロベンゾイル、ブロモベンゾイル、メトキシ−又はエトキシカルボニル、ｎ−又はイソプロポキシカルボニル又はｎ−、ｉｓｏ−又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル又はフェノキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、メチル−又はメトキシ−又はクロロフェノキシカルボニル又はクロロベンジルオキシカルボニル又は９−フルオレニルメトキシカルボニルであり；Ｒ17−ＳＯ2 −基の例は、メチルフェニルスルホニル、エチルフェニルスルホニル、プロピルフェニルスルホニル、ブチルフェニルスルホニル、フェニルフェニルスルホニル、ベンジルフェニルスルホニル、ｐ−ブロモフェニルスルホニル、ｐ−メトキシフェニルスルホニル及びｐ−メチルフェニルスルホニルであり；そしてアルコキシアセチル及びフェノキシアセチルの代表例は、メトキシアセチル、エトキシアセチル、フェノキシアセチル、（ｐ−メチルフェノキシ）アセチル、（ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシ）アセチルである。アミジンの保護基は、また、核酸塩基に頻用されるものである。
【００３２】
ヌクレオシド及びオリゴヌクレオシドは、結合基により固体担体に共有結合的に結合され得る。適切な担体は、代表的にはシリカゲル、調整多孔質ガラス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリウレタン類、ポリオレフィン類、メラミン、ポリアミド類、ポリエステル類、ポリエーテル類、ポリアルコール類、シクロデキストリン、セルロース及びエーテル化又はアシル化されたセルロース誘導体類、グリコーゲン、澱粉、キチン及びキトサンである。担体を選択することにより、結合基はジカルボン酸類、ジウレタン類又はアルコキシシリルウレタン類から誘導することができる。
【００３３】
本発明の方法は、追加の溶媒の存在で行なうことができる。追加の溶媒がない場合、新規な方法に用いられるアルコール、ポリオール又は重合体ポリオールは、液体である限り、溶媒である。適切な追加の溶媒は、反応バッチにおいて、アルコール、ポリオール又は重合体ポリオールと競合しない溶媒である。これらの溶媒は、単独又は少なくとも二つの溶媒の混合物として用いることができる。ポリオール類の場合、ポリオールの膨潤によってアルコール基をこの方法に利用できるようにする溶媒又は可溶化剤を用いることも可能である。このような溶媒の代表例は、エーテル類、ハロゲン化炭化水素類、カルボキサミド類、ラクタム類、スルホキシド類、スルホン類、芳香族炭化水素類、ニトリル類、脂肪族及び脂環式炭化水素類、好適にはエーテル類、ハロゲン化炭化水素類、ニトリル類、カルボキサミド類及びラクタム類よりなる群から選ばれる溶媒である。本発明の範囲内での可溶化剤は、好都合には、塩類、例えば酢酸アンモニウム及び炭酸水素アンモニウムである。
【００３４】
特に適切なエーテル類は、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコールジエチル及びジメチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル又はトリエチレングリコールジメチルエーテル、好適にはテトラヒドロフラン、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル又はジオキサンである。特に適切なハロゲン化炭化水素類は、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン及び１，１，２，２−テトラクロロエタンである
【００３５】
有用なアミド類はＮ−アルキル化又はＮ−ジアルキル化アミド類である。代表例は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素及びヘキサメチルホスホルトリアミドである。
【００３６】
好適なラクタム類は、γ−ブチロラクタム、ε−カプロラクタム、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−アセチルピロリドン及びＮ−メチルカプロラクタムよりなる群から選ばれるラクタムである。
【００３７】
本発明の範囲内でさらに適切な溶媒は、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、ジエチルスルホン、トリメチレンスルホン、テトラメチレンスルホン、ベンゼン、置換したベンゼン、好適にはクロロベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼン、１，２，４−トリクロロベンゼン、ニトロベンゼン、トルエン及びキシレン、アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル、フェニルアセトニトリル、ペンタン、石油エーテル、ヘキサン、シクロヘキサン及びメチルシクロヘキサンである。
【００３８】
本発明の方法で用いられる脂肪族、脂環式、芳香−脂肪族又は芳香族アルコール、ポリオール又は重合体ポリオールは、以下においてアクセプターに属するものとする。
【００３９】
１ないし２０個、好適には１ないし１２個、最も好適には１ないし６個の炭素原子を有するアルカノール、代表的にはメタノール、エタノール、ｎ−及びイソプロパノール、ｎ−、ｉｓｏ−及びｔｅｒｔ−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、エチレングリコール、ジエチレングリコールモノメチル及びモノエチルエーテルよりなる群からの例を用いるのが好都合である。本発明の方法に用いられるアルコール類の好ましい下位の群は、Ｃ1 −Ｃ4 アルカノール類を含む。メタノールを用いるのが特に好ましい。
【００４０】
５ないし１２個、好適には５ないし８個の環員炭素原子を有する、アルキル置換のシクロアルカノール、代表的にはシクロペンタノール、シクロヘキサノール、メチルシクロヘキサノール、シクロヘプタノール及びシクロオクタノールよりなる群から選ばれたものもまた適している。
【００４１】
さらに適切なアクセプターの例は、７ないし３０個、好適には７ないし２０個の炭素原子を有する芳香−脂肪族アルコール類、好適には非置換又はアルキル−若しくはアルコキシ置換のベンジルアルコール及びβ−フェニルエタノールよりなる群から好適に選ばれたもの；６ないし３０個、好適には６ないし１２個の炭素原子を有する芳香族アルコール、好適にはフェノール及び非置換又はアルキル−若しくはアルコキシ置換のナフトールよりなる群から好適に選ばれたもの；２ないし２０個の炭素原子を有するポリオール類、好適にはエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、シクロヘキサンジオール、ジヒドロキシメチルシクロヘキサン、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、トリメチロールプロパン、ペンタエリトリトール、ジペンタエリトリトール、グリセロール及び糖類よりなる群から好適に選ばれたもの；重合体ポリオール、好適にはポリビニルアルコール、多糖類並びにポリアクリラート類及びポリメタクリラート類よりなる群から選ばれたものである。アルキル及びアルコキシ置換基は、好適に１ないし４個の炭素原子を有する。
【００４２】
本発明の範囲内で、糖類のアクセプターは、代表的には単、二、三、四及び五糖類のような単糖及びオリゴ糖を意味するものと解されるべきである。本発明の好適な実施態様において、単糖及びオリゴ糖はアルドース類又はケトース類である。本発明の特に好適な実施態様において、単糖類はアルドペントース類、アルドヘキソース類、ケトペントース類又はケトヘキソース類である。
【００４３】
アルドペントースは、代表的にはＤ−リボース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロース又はＤ−リキソースであり；アルドヘキソースは、代表的にはＤ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グロース、Ｄ−イドース、Ｄ−ガラクトース又はＤ−タロースであり；ケトペントースは、代表的にはＤ−リブロース又はＤ−キシルロースであり；ケトヘキソースは、代表的にはＤ−プシコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ソルボース又はＤ−タガトースである。
【００４４】
二糖類は、代表的にはトレハロース、マルトース、イソマルトース、セロビオース、ゲンチビオース、サッカロース又はラクトースである。
【００４５】
三糖類は、代表的にはラフィノースである。
【００４６】
多糖類は、代表的にはセルロース、澱粉、デキストラン、グリコーゲン、フラクタン類、イヌリン、マンナン類、キシラン類及びアラビナン類である。
【００４７】
本発明の実施において用いられる無機塩基は、好適には塩基性の金属酸化物、重金属酸化物及び水酸化物よりなる群から選択される塩基であり、好適にはＳｉＯ2 又は塩基性アルミナである。
【００４８】
さらに適切な無機塩基は、エステル交換反応が求核性触媒の条件下で行なわれ、緩衝系の組成物であってよい塩基である。好適には、無機塩基は、アルコール類又は反応混合物に可溶な、金属若しくはアンモニウムのフッ化物又は金属若しくはアンモニウムのアルドキシマート、ケトキシマート、ヒドロキソマート、スルファート、ホスファート、ホスホナート、ピロホスファート、スルファマート、ニトライト、ニトラート及びスルホナートであり、金属は好適にはアルカリ金属イオン、例えばＮａ+ 、Ｌｉ+ 、Ｋ+ 、Ｒｂ+ 及びＣｓ+ である。金属の、アルドキシマート、ケトキシマート、ヒドロキソマート、スルファマート、スルホナート及びホスホナートは、水素原子、Ｃ1 −Ｃ6 アルキル基あるいは非置換又はハロゲン、Ｃ1 −Ｃ4 アルキル、Ｃ1 −Ｃ4 アルコキシ、シアノ若しくはニトロで置換されたフェニル基を有していてもよい。フッ化アンモニウムは、好適にはフッ化テトラ（Ｃ1 −Ｃ6 アルキル）アンモニウム、代表的にはフッ化テトラ（ｎ−ブチル）アンモニウム・ＨＦである。別な例は、ＣｓＦ、ＫＦ、ＣＨ3 −Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｏ- 及びＭｇ（ＣＦ3 ＣＯ）2 である。特にこれらの求核性塩基を、有機窒素塩基と一緒に、好都合には触媒量で用いることが有利であることが分った。
【００４９】
特に有用な有機の窒素塩基は、芳香族アミン、芳香族のＮ−複素環及びＮ−Ｃ1 −Ｃ4 アルキルモルホリンよりなる群から選ばれる塩基である。代表的な例は、イミダゾール、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリン、アニリン及びｏ−ジアミノベンゼン並びにポリビニルピリジンである。
【００５０】
本発明の方法に用いられる塩基の量は、触媒量ないし大量、代表的には当量又は過剰量までの範囲である。本発明の範囲内での触媒量は、ヌクレオシド又はヌクレオチド１モルに基づいて、０．０１ないし２０モル％、好都合には０．１ないし１０モル％、好適には０．１ないし５モル％の範囲である。
【００５１】
本発明の方法で、式（Ｉ）の基のモル当量当りアクセプターの水酸基の１００モル当量以上１０００モル当量又はそれ以上の過剰量までを用いるのが好ましい。
【００５２】
新規な方法は、ヌクレオシド又はヌクレオチドの１モルに基づいて、０．０１ないし２０モル％、好都合には０．１ないし１０モル％、好適には０．１ないし５モル％のルイス酸をさらに使用することによって実質的に促進させることができる。得られる高い反応速度は、相当な利点である。適切に用いられてよいルイス酸は、金属塩（ＬｉＣｌ）、ホウ酸塩又は有機金属錯体である。この新規な方法において、有機窒素塩基、求核性無機塩基及びルイス酸の併用は、高い選択性が得られるので特に有利である。
【００５３】
反応は、好都合には、−２０℃ないし＋５５℃、好適には１５℃ないし３５℃の温度範囲、最も好適には室温で行なわれる。
【００５４】
反応は、好都合には、アルコールと塩基の溶液又は混合物に、式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを加え、そして反応を終結させることによって行なわれる。所望の化合物を単離するには、不溶の組成物があれば濾過して除き、次いで溶媒を除去する。残渣は結晶化又はクロマトグラフィーのような常法により精製することができる。新規な方法の特に有利な実施態様において、オリゴヌクレオチド合成からの排溶液は、大過剰に用いられたヌクレオチド組成物を回収するためにアルコールと塩基の溶液又は混合物に直接加えられる。この方法で、式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の基を有する化合物を含む排溶液は、反応溶液又は反応混合物に戻されるので、反応の開始時には非常に大過剰の塩基が存在し、上記の排溶液の酸組成物を中和することができる。反応の過程で塩基の濃度は減少する、そして必要な場合には補充することができる。これらの酸組成物は、好適には亜リン酸トリエステル法によるヌクレオチド縮合に有効なテトラゾール又はその他の酸類であってよい。
【００５５】
反応混合物の後処理のため、生成した亜リン酸エステル類は、通常の酸化剤、例えばＩ2 ／Ｈ2 Ｏ／ピリジン又はＳ8 ／ピリジンで処理することができ、相当するリン酸エステル又はチオリン酸エステルを生成する。反応溶液を蒸留すると、逆反応はもはや起こることなく、所望の生成物の単離には、クロマトグラフ法を行なわず抽出法が有効なことが多い。
【００５６】
クエン酸緩衝溶液（ｐＨ約３〜４）で抽出して有機窒素塩基、例えばイミダゾールを除去するのが有利であることが分った。水性媒体で後処理する場合、ほとんど完全な分離及び良好な相分離が行なわれる。
【００５７】
新規な方法の特定の実施態様において、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドが固体担体に結合し、Ｈ−ホスホナート又はＨ−ホスフィナート基を含み、有機窒素塩基の存在下に反応する場合、シアノエタノールがアクセプターとして用いられる。この反応の実施態様において、弱塩基性のイオン交換ポリマーと不可逆的に反応するビスシアノエチルホスファイト又はシアノエチルメチルホスフィナートが生成する。得られたリン化合物は塩を形成してイオン交換体に結合し、同時に、生成したアクリロニトリルはイオン交換体に保持される。この方法の実施態様において、エステル交換反応に際しての逆反応は避けられ、特に大過剰のアクセプターの使用を避けることができる。
【００５８】
【実施例】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。実施例２、５及び７で用いた溶離溶液は次のようにして得た：
固相のオリゴヌクレオチド合成反応器からの排溶液は、ガオらの方法（Gao, H., Gaffney, B. L., Jones, R. A., Tetrahedron Lett., 1991）に準じて集めた。反応器から出た後、ヌクレオシドによって分離された排溶液を、メタノール／アセトニトリル（２：１）溶液５０mlに直接加えた。
【００５９】
実施例１：
ジメトキシトリチルチミジン−３´−イル−β−シアノエチルホスホロジイソプロピルアミダイトから５´−ジメトキシトリチルチミジンの製造
アセトニトリル４mlに溶解したジメトキシトリチルチミジン−３´−イル−β−シアノエチルホスホロジイソプロピルアミダイト３６０mg（０．４８mmol）の溶液に、テトラゾール２７０mg（３．８６mmol）と水９μl （０．５mmol）を加えた。５分後、ホスホロアミダイトの加水分解は終了し、５´−ジメトキシトリチルチミジン−３´−シアノエチルヒドロゲンホスホナートを得た。
この溶液にメタノール４mlとイミダゾール３５０mgを加え、２４時間後、反応溶液を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた白黄色の固体をジクロロメタン５０mlにとった。
水５０ml及び炭酸水素ナトリウム水溶液５０mlで抽出した後、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。塩及び残存しているイミダゾールを濾別した。濾液を蒸留して濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A., J. Org. Chem. 43:2923, 1978）により分離した。生成物の画分を併せ、濃縮し、ジクロロメタン５０mlにとり、１M 炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液５０mlで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。塩を濾別し、濾液を減圧下に１mlの容量まで濃縮した。濃縮した生成物の溶液を、室温でｎ−ペンタン５０mlに加えて沈殿させた。ｎ−ペンタン２００mlを加え、−２０℃に冷却して沈殿を完結させた。沈殿物を濾過により捕集し、ｎ−ペンタン５０mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で真空乾燥した。５´−ジメトキシトリチルチミジン４３１mg（８２．５％）を固体として得た。。
【００６０】
実施例２：
オリゴヌクレオチド合成反応器の排溶液から５´−ジメトキシトリチルチミジンの製造
ＤＮＡ合成の過程で反応器中に生成した５´−ジメトキトリチルチミジン−３´−イル−β−シアノエチルホスホナート０．２４mmolを含む排溶液１００mlを、イミダゾール１ｇを含むメタノール溶液５０ml中に加えた。反応終了後、反応溶液を減圧下に濃縮乾燥し、得られた白黄色固体をジクロロメタン１００mlにとった。ＮａＨ2 ＰＯ4 ／ＮａＨＰＯ4 の１M 溶液（ｐＨ５．５）１００mlで三回抽出した後、水層を併せ、ジクロロメタン５０mlで抽出した。有機相を併せ、次いで炭酸水素ナトリウム飽和水溶液１００mlで二回抽出した。炭酸水素ナトリウム相をジクロロメタン５０mlで抽出し、すべての有機相を併せ、硫酸ナトリウムで乾燥した。つづく再結晶はベンゼン５mlを用い−２０℃に冷却して行った。次いで、ｎ−ヘキサン５０mlを加え、−２０℃で２０時間結晶化を続けた。沈澱物を濾取し、ｎ−ヘキサン５０mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で真空乾燥した。５´−ジメトキシトリチルチミジン１３１mg（合成器中のヌクレオチド間カップリング１００％の乾燥固体の９９％）を得た。
【００６１】
実施例３：
Ｎ2 −イソブチリル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシグアノシン−３´−イル−β−シアノエチルホスホロジイソプロピルアミダイトからＮ2 −イソブチリル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシグアノシンの製造
アセトニトリル８mlに溶解したＮ2 −イソブチリル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシグアノシン−３´−イル−β−シアノエチルホスホロジイソプロピルアミダイト８３９mg（１mmol）の溶液に、テトラゾール３５０mg（５mmol）と水１８μ l（１mmol）を加えた。５分後、ホスホロアミダイトの加水分解は終了し、５´−ジメトキシトリチルグアノシン−３´−イル−シアノエチルヒドロゲンホスホナートを得た。
この溶液にメタノール４mlとイミダゾール３５０mgを加えた。２４時間後、反応溶液を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた白黄色の固体をジクロロメタン５０mlにとった。
水５０ml及び炭酸水素ナトリウム水溶液５０mlで抽出した後、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。塩及び残存しているイミダゾールを濾別し、濾液を蒸留して濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーに付して分離した。生成物の画分を併せ、濃縮した。濃縮物をジクロロメタン５０mlにとり、炭酸水素トリエチルアンモニウムの１M 溶液５０mlで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。塩を濾別し、濾液を減圧下に１mlの容量まで濃縮した。濃縮した生成物の溶液を、室温でｎ−ペンタン５０mlに加えて沈殿させた。さらにｎ−ペンタン４５０mlを加え、−２０℃に冷却して沈殿を完結させた。沈殿物を濾取し、ｎ−ペンタン１００mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で真空乾燥した。Ｎ2 −イソブチリル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシグアノシン５７７mg（乾燥固体の９０．３％）を得た。
【００６２】
実施例４：
Ｎ6 −ベンゾイル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシアデノシン−３´−イル−β−シアノエチルホスホロジイソプロピルアミダイトからＮ6 −ベンゾイル−５´−デオキシアデノシンの製造
アセトニトリル８mlに溶解したＮ6 −ベンゾイル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシアデノシン−３´−イル−β−シアノエチルホスホロジイソプロピルアミダイト８５７mg（１mmol）の溶液に、テトラゾール３５０mg（５mmol）と水１８μ l（１mmol）を加えた。５分後、ホスホロアミダイトの加水分解は終了し、５´−ジメトキシトリチルアデノシン−３´−シアノエチルヒドロゲンホスホナートを得た。
この溶液にメタノール４mlとイミダゾール３５０mgを加え、２４時間後、反応溶液を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた白黄色の固体をジクロロメタン５０mlにとった。
水５０ml及び炭酸水素ナトリウム水溶液５０mlで抽出した後、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。塩及び残存しているイミダゾールを濾別し、濾液を蒸留して濃縮し粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーに付して分離した。生成物の画分を併せ、濃縮した。濃縮物をジクロロメタン５０mlにとり、炭酸水素トリエチルアンモニウムの１M 溶液５０mlで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。塩を濾別し、濾液を減圧下に１mlの量まで濃縮した。濃縮した生成物の溶液を、室温でｎ−ペンタン５０mlに加えて沈殿させた。さらにｎ−ペンタン４５０mlを加え、次いで−２０℃に冷却して沈殿を完結させた。沈殿物を濾取し、ｎ−ペンタン１００mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で真空乾燥した。Ｎ6 −ベンゾイル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシアデノシン５６２mg（乾燥固体の８５．５％）を得た。
【００６３】
実施例５：
オリゴヌクレオチド合成反応器の排溶液のＮ6−ベンゾイル−５′−ジメトキシトリチル−２′−デオキシアデノシン−３′−イル−β−シアノエチルホスホナートからＮ6−ベンゾイル−５′−ジメトキシトリチル−２′−デオキシアデノシンの製造
ＤＮＡ合成の過程で反応器中に生成したＮ6−ベンゾイル−５′−ジメトキシトリチル−２′−デオキシアデノシン−３′−イル−β−シアノエチルホスホナート０．８２mmolを含む排溶液３００mlを、イミダゾール１ｇを含むメタノール溶液５０mlに加えた。反応終了後、反応溶液を減圧下に濃縮乾燥し、得られた白黄色の固体をジクロロメタン１００mlにとった。ＮａＨ2ＰＯ4／ＮａＨＰＯ4の１M溶液（ｐＨ５．５）１００mlで三回抽出後、水相を併せ、ジクロロメタン５０mlで抽出した。有機相を併せ、次いで炭酸水素ナトリウム飽和水溶液１００mlで二回抽出した。炭酸水素ナトリウム層をジクロロメタン５０mlで抽出し、すべての有機相を併せた。併せた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾液を蒸留して濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーに付して分離した。生成物の画分を併せ、濃縮した。濃縮物をジクロロメタン５０mlにとり、炭酸水素トリメチルアンモニウムの１M溶液５０mlで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。塩を濾別し、減圧下に１mlの容量まで濃縮した。濃縮した生成物溶液を、室温でｎ−ペンタン５０mlに加えて沈澱させた。ｎ−ペンタン２００mlを加えて、次いで−２０℃に冷却して沈澱を完結させた。沈澱物を濾取し、ｎ−ペンタン５０mlで洗浄し、Ｐ4Ｏ10／ＫＯＨ上で真空乾燥した。Ｎ6−ベンゾイル−５′−ジメトキシトリチル−２′−デオキシアデノシン３８０mg（合成器内のヌクレオチドカップリング化合物の乾燥固体の７５．５％）を得た。
【００６４】
実施例６：
Ｎ4 −ベンゾイル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシシチジン−３´−イル−β−シアノエチルホスホロジイソプロピルアミダイトからＮ4 −ベンゾイル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシシチジンの製造
アセトニトリル８mlにとったＮ4 −ベンゾイル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシシチジン−３´−イル−β−シアノエチルホスホロジイソプロピルアミダイト８３３mg（１mmol）の溶液に、テトラゾール３５０mg（５mmol）と水１８μl （１mmol）を加えた。５分後、ホスホロアミダイトの加水分解は終了し  、５´−ジメトキシトリチルシチジン−３´−イル−シアノエチルヒドロゲンホスホナートを得た。
この溶液にメタノール４mlとイミダゾール３５０mgを加えた。２４時間後、反応溶液を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた白黄色の固体をジクロロメタン５０mlにとった。
水５０ml及び炭酸水素ナトリウム水溶液５０mlで抽出した後、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。塩及び残存しているイミダゾールを濾別した。濾液を蒸留して濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーに付して分離した。生成物の画分を併せ、濃縮した。濃縮物をジクロロメタン５０mlにとり、炭酸水素トリエチルアンモニウムの１M 溶液５０mlで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。塩を濾別し、濾液を１mlの容量まで減圧下に濃縮した。濃縮した生成物の溶液を、室温でｎ−ペンタン５０mlに加えて沈殿させた。さらにｎ−ペンタン４５０mlを加え、−２０℃に冷却して沈殿を完結させた。沈殿物を濾取し、ｎ−ペンタン１００mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で真空乾燥した。Ｎ4 −ベンゾイル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシシチジン５２７mg（乾燥固体の８３．２％）を得た。
【００６５】
実施例７：
オリゴヌクレオチド合成反応器の排溶液からＮ4 −ベンゾイル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシシチジンの製造
ＤＮＡ合成の過程で反応器中に生成したＮ4 −ベンゾイル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシシチジン−３´−イル−β−シアノエチルホスホナート０．２７mmolを含む排溶液１００mlをイミダゾール１ｇを含むメタノール溶液５０ml中に加えた。反応終了後、反応溶液を減圧下に濃縮乾燥し、得られた白黄色の固体をジクロロメタン１００mlに加えた。ＮａＨ2 ＰＯ4 ／ＮａＨＰＯ4 の１M 溶液（ｐＨ５．５）１００mlで三回抽出後、水相を併せ、ジクロロメタン５０mlで抽出した。有機相を併せ、次いで炭酸水素ナトリウム飽和水溶液１００mlで二回抽出した。炭酸水素ナトリウム相をジクロロメタン５０mlで抽出し、すべての有機相を併せた。併せた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸留して濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーに付して分離した。生成物の画分を併せ、濃縮した。濃縮物をジクロロメタン５０mlにとり、炭酸水素トリメチルアンモニウムの１M 溶液５０mlで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。塩を濾別し、濾液を１mlの容量まで減圧下に濃縮した。濃縮した生成物溶液を、室温でｎ−ペンタン５０mlに加えて沈澱させた。ｎ−ペンタン２００mlを加え、次いで−２０℃に冷却して沈澱を完結させた。沈澱物を濾取し、ｎ−ペンタン５０mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で真空乾燥した。Ｎ4 −ベンゾイル−５´−ジメトキシトリチル−２´−デオキシシチジン１６３mg（合成器内のヌクレオチドカップリング化合物の乾燥固体の９１．５％）を得た。
【００６６】
実施例８：
オリゴヌクレオチド合成反応器の排溶液からＮ−メチル−Ｎ−（５´−ジメトキシトリチル−３´−デオキシチミジン−３´−イル）−（５´−デオキシチミジン−５´−イル）アセトアミドの製造
ＤＮＡ合成の過程で反応器中に形成されたＮ−メチル−Ｎ−（５´−ジメトキシトリチル−３´−デオキシチミジン−３´−イル）−（３´−シアノエチル−Ｈ−ホスホニル−５´−デオキシチミジン−５´−イル）アセトアミド１６０mgを含む排溶液５mlを、イミダゾール１ｇのメタノール溶液５０mlに加えた。反応を２０〜２５℃で３日間行った。反応混合物を水５mlで希釈した。次いで、この反応混合物にヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００ml及びテトラヒドロフラン７５０mlの溶液を、褐色のヨウ素の色が少なくとも５分間残っているような量まで加えた。次いで、反応混合物を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた黄色固体を４０％ＮａＨＣＯ3 水溶液１００ml及び酢酸エチル５０mlよりなる乳濁液にとった。水相を分離し、有機相を炭酸水素ナトリウム水溶液５０mlで二回抽出した。水相を併せ、もう一度酢酸エチル１０mlで抽出した。有機相を併せ、ＭｇＳＯ4 の１M 水溶液５０mlで二回抽出し、無水硫酸ナトリウム２ｇで乾燥した。塩を濾別し、濾液を減圧下で濃縮乾固した。固体をＣＨＣｌ3 ／メタノール（９：１）５mlにとり、この溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付した。生成物の画分を併せ、高真空で乾燥した。Ｎ−メチル−Ｎ−（５´−ジメトキシトリチル−３´−デオキシチミジン−３´−イル）−（５´−デオキシチミジン−５´−イル）アセトアミドを、無色の泡状物として４０mg（理論量の３１％）の収量で得た。
【００６７】
1H-NMR(CDCl3, 基準=TMS, d[ppm]): 8.8(2s, NH); 7.7(s, 1H, H6); 7.45-7.2(DMTr); 7.09(s, 1H, H6); 6.82(2m, 4H, DMTr): 6.33(t, 1H, 1'); 6.15(t, 1H, 1'); 5.26, 4.95(m, 1H, NRCH3の 3',２個の回転異性体 3:1); 4.25-4(m, 2H); 3.75(s, 6H, DMTr); 3.63, 3.4, 3.25(3m, 4H); 2.9, 2.85(2s, 3H, NRCH3 のCH3,２個の回転異性体 3:1); 2.65-2(m); 1.88(2H); 1.8(1H, 2s, CH35, ２個の回転異性体 3:1); 1.5(1H); 1.45(2H, 2s, CH35,２個の回転異性体 1:3).
【００６８】
実施例９：
オリゴヌクレオチド合成反応器の排溶液から５´−ジメトキシトリチル−Ｎ6 −ピバロイル−２´−［１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］アデノシンの製造
ＤＮＡ合成の過程で反応器中に形成された（５´−ジメトキシトリチル−Ｎ6 −ピバロイル−２´−［１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］アデノシン−３´−イル）−３´−シアノエチル−Ｈ−ホスホナート１６０mgを含む排溶液５mlを、イミダゾール１ｇのメタノール溶液５０mlに加えた。反応を２０〜２５℃で３日間行った。反応混合物を水５mlで希釈した。次いで、この反応混合物にヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００ml及びテトラヒドロフラン７５０mlの溶液を、褐色のヨウ素の色が少なくとも５分間残っているような量まで加えた。次いで、反応混合物を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた黄色固体を４０％ＮａＨＣＯ3 水溶液１００ml及び酢酸エチル５０mlよりなる乳濁液にとった。水相を分離し、有機相を炭酸水素ナトリウム水溶液５０mlで二回抽出した。水相を併せ、もう一度酢酸エチル１０mlで抽出した。有機相を併せ、ＭｇＳＯ4 の１M 水溶液５０mlで二回抽出し、無水硫酸ナトリウム２ｇで乾燥した。塩を濾別し、濾液を減圧下で濃縮乾固し、粗生成物３２０mgを得た。固体をＣＨＣｌ3 ／メタノール（９：１）５mlにとり、この溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付した。生成物の画分を併せ、高真空で乾燥した。生成物の５´−ジメトキシトリチル−Ｎ6 −ピバロイル−２´−［１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］アデノシンは黄色の油状物として沈澱し、２２３mg（理論量の５８％）の収量であった。
【００６９】
1H-NMR(CDCl3, 基準=TMS, d[ppm]): 8.69(s, 1H, adenine); 8.48(s, 1H,  アデニン); 8.2(s, 1H, アデニン); 7.5-7.2(m, 9H, DMTr); 7.12-6.88(m, 4H, 2-フルオロフェニル); 6.83(2m, 2H, DMTr); 6.25(d, 1H, 1'); 5.35(m); 4.43(m,  1H); 4.3(m, 1H); 3.76(s, 6H); 3.5, 3.38(2m, 2H, 5'); 3.15(m, 1H, Fpmp); 2.96(m, 2H, Fpmp); 2.78(s, 3H,Fpmpの CH3, m, 1H, Fpmp); 2.15-1.75(m, 4H, Fpmp); 1.4(9H).
【００７０】
実施例１０：
５´−ジメトキシトリチル−２´−［１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］ウリジン−３´−イル−シアノエチルホスホロジイソプロピルアミダイトの加水分解液から５´−ジメトキシトリチル−２´−［１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］ウリジンの製造；メタノール及びＫＦとのエステル交換反応、Ｉ2 アクセプターではなく抑止溶液としてＩ2 ／Ｈ2 Ｏを後処理において使用
アセトニトリルに溶解した５´−ジメトキシトリチル−２´−［１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］ウリジン−３´−イル−シアノエチル−Ｈ−ホスホナート０．１３８mmol及びテトラゾール０．６９４mmolの溶液１０mlを、ＫＦの０．１M メタノール溶液５０mlに加えた。反応は、２０〜２５℃で２日間で終了した。反応混合物を水５mlで希釈した。次いで、この反応混合物にヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００ml及びテトラヒドロフラン７５０mlの溶液を、褐色のヨウ素の色が少なくとも５分間残っているような量まで加えた。次いで、反応混合物を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた黄色固体を水５０mlと酢酸エチル５０mlよりなる乳濁液にとった。有機相を併せ、水５０mlで四回抽出した。水相を併せ、酢酸エチル１０mlでもう一度抽出した。有機相を併せ、ＮａＣｌ飽和溶液５０mlで抽出し、無水硫酸ナトリウム２ｇで乾燥した。塩を濾別して濾液を濃縮した。得られた固体物を酢酸エチル５−１０mlにとり、この溶液をｎ−ペンタン２００mlにゆっくりと加えた。生成物は白色の無定形沈澱として析出した。沈澱物を濾過により捕集し、ｎ−ペンタン５０mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で２４時間真空乾燥し、５´−ジメトキシトリチル−２´−［１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］ウリジンの６７．７mg（理論量の７５％）を得た。
【００７１】
1H-NMR(CDCl3, 基準=TMS, d[ppm]): 7.75(d, 1H, H6); 7.45-7.15(m, 9H,DMTr); 7.1-6.75(m, 4H, Fpmp, 2m, 4H, DMTr); 6.15(d, 1H, 1'); 5.2(d, 1H, H5); 4.74(m, 1H, 2'); 4.33(m, 1H, 3'); 4.15(m, 1H, 4'); 3.76(s, 6H,DMTr); 3.38(m, 2H, 5'); 3.12(s, 3H,  Fpmpの CH3); 3.2-2.8(m, 4H, Fpmp); 2.15-1.8(m, 4H).
【００７２】
実施例１１：
５´−ジメトキシトリチル−Ｎ4 −ベンゾイル−２´−［１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］シチジン−３´−イル−シアノエチルホスホロジイソプロピルアミダイトの加水分解物から５´−ジメトキシトリチル−Ｎ4 −ベンゾイル−２´−［１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］シチジンの製造
アセトニトリルに溶解した５´−ジメトキシトリチル−Ｎ4 −ベンゾイル−２´−［１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］シチジン−３´−イル−シアノエチル−Ｈ−ホスホナート０．１２９mmol及びテトラゾール０．６４５mmolの溶液１０mlをＫＦの０．１M メタノール溶液５０mlに加えた。反応は２０〜２５℃で２日間で終了した。反応混合物を水５mlで希釈し、ヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００mlとテトラヒドロフラン７５０mlの溶液を、褐色のヨウ素に色が少なくとも５分間残っているような量まで加えた。反応混合物を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた黄色固体を水５０mlと酢酸エチル５０mlよりなる乳濁液にとった。有機相を併せ、水５０mlで四回抽出した。水相を併せ、もう一度酢酸エチル１０mlで抽出した。有機相を併せ、ＮａＣｌ飽和水溶液１０mlで抽出し、無水硫酸ナトリウム２ｇで乾燥した。塩を濾別して濾液を濃縮した。得られた固体を酢酸エチル５〜１０mlにとり、この溶液をｎ−ペンタン２００mlにゆっくりと加えた。生成物は白色無晶形沈澱として析出した。この沈澱物を濾取し、ｎ−ペンタン５０mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で２４時間真空乾燥して、５´−ジメトキシトリチル−Ｎ4 −ベンゾイル−２´−［１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］シチジン８３mg（理論量の８０％）を得た。
【００７３】
1H-NMR(CDCl3,基準=TMS, d[ppm]): 8.28(d, 1H); 7.82(d, 2H, Bz); 7.6- 7.23(m, 14H, Bz, DMTr, C); 7.03-6.77(d, 4H, DMTr, 2d, 4H, Fpmp); 4.66 (t, 1H, 1'); 4.38(t, 1H, 2'); 4.17(m, 1H, 3'); 3.74(s, 6H, DMTr); 3.48(m, 2H, 5'); 3.25-2.85(s, 3H, Fpmp, m, 4H, Fpmp); 2.18-1.95(m, 4H,  Fpmp).   19F-NMR(CDCl3, 基準=TFA, d[ppm]): -123.5.
【００７４】
実施例１２：
５´−ジメトキシトリチル−Ｎ4 −（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル）−２´−デオキシシチジン−３´−イル−シアノエチルホスホロジイソプロピルアミダイトの加水分解物から５´−ジメトキシトリチル−Ｎ4 −（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル）−２´−デオキシシチジンの製造
５´−ジメトキシトリチル−Ｎ4 −（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル）−２´−デオキシシチジン−３´−イル−シアノエチル−Ｈ−ホスホナートの加水分解物からの５´−ジメトキシトリチル−Ｎ4 −（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル）−２´−デオキシシチジン２００mgを含むアセトニトリル溶液４mlを、ＫＦの０．２Ｍメタノール溶液４０mlに加えた。脱ホスフィチル化(dephosphitylation) を２０〜２５℃で４時間行なった。この反応混合物にピリジン１ml、次いで硫黄５０mg加えた。反応混合物を２０〜２５℃で６０分撹拌し、濾過し、氷水１００mlに加えた。得られた乳濁液を酢酸エチル３０mlで三回抽出した。有機相を併せ、ＮａＣｌ飽和水溶液５０mlで抽出し、無水硫酸ナトリウム２ｇで乾燥した。塩を濾別して濾液を減圧下に濃縮乾固した。この固形物を酢酸エチル１０mlにとり、この溶液をｎ−ヘキサン３００mlにゆっくりと加えた。生成物は白色の無定形沈澱として析出した。この沈殿物を濾過により捕集し、ｎ−ペンタン５０mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で２４時間真空乾燥して、５´−ジメトキシトリチル−Ｎ4 −（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル）−２´−デオキシシチジン１１２．８mg（理論量の７２．１％）を得た。
【００７５】
実施例１３：
イミダゾールによるエステル交換、抑止剤はＩ2 ／水、クエン酸緩衝液による後処理：オリゴヌクレオチド合成反応器の排溶液から５´−ジメトキシトリチル−３´−（３−Ｎ−トリフルオロアセチルアミノプロピル）−２´−デオキシウリジンの製造
ＤＮＡ合成の過程で反応容器中に形成された５´−ジメトキシトリチル−３´（３−Ｎ−トリフルオロアセチルアミノプロピル）−２´−デオキシウリジン−３´−イル−シアノエチル−Ｈ−ホスホナート１２０mgを含む排溶液５mlを、メタノール５０ml当りイミダゾール１ｇを含む溶液８０mlに加えた。反応を２０〜２５℃で３日間行い、水８mlで希釈した。次いで、この反応溶液に、ヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００ml及びテトラヒドロフラン７５０mlよりなる溶液を、褐色のヨウ素の色が少なくとも５分間残っているような量まで加えた。反応混合物を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた黄色の固体をｐＨ３〜４の緩衝液５０mlと酢酸エチル４０mlよりなる乳濁液にとった。緩衝液は、水１リットル当りＮａＯＨ２４ｇ、クエン酸１１７ｇ及び塩化ナトリウム３５ｇからなる。イミダゾールを含む水相を分離し、有機相を緩衝溶液５０mlで二回抽出した。次いで、有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、塩化ナトリウム飽和水溶液で順次抽出した。有機相を脱水硫酸ナトリウム２ｇで乾燥した。塩を濾別し、濾液を濃縮した。得られた固体を酢酸エチル５〜１０mlにとり、この溶液をｎ−ペンタン２５０mlにゆっくりと加えた。生成物は白色の無定形沈澱として析出した。この沈殿物を濾過により捕集し、ｎ−ペンタン５０mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で２４時間真空乾燥して５´−ジメトキシトリチル−３´−（３−Ｎ−トリフルオロアセチルアミノプロピル）−２´−デオキシウリジン８０mg（理論量の８６％）を得た。
【００７６】
1H-NMR(CDCl3,基準=TMS, d[ppm]): 7.45-6.9(m, 9H, DMTr); 6.73(2m, 4H, DMTr); 6.48(t, 1H, 1'); 4.56(m, 1H, 3'); 4.04(m, 1H, 4'); 3.7(s, 6H, DMTr); 3.5-3.4(2m); 3.35-3.25(2m, 2H, 5'); 2.97(s, 2H, NH2); 2.47-2.37(m, 1H, 2'); 2.35-2.2(m, 1H, 2'); 1.82(m, 1H); 1.6(m, 1H); 1.45-1.15(m, 4H, アミノプロピル).
【００７７】
実施例１４：
オリゴヌクレオチド合成反応器の排溶液から５´−ジメトキシトリチル−３´−（プロピン−１−イル）−２´−デオキシウリジンの製造
ＤＮＡ合成の過程で反応器中に形成された５´−ジメトキシトリチル−３´−（プロピン−１−イル）−２´−デオキシウリジン−３´−イル−シアノエチル−Ｈ−ホスホナート２５０mgを含む排溶液５mlを、メタノール５０ml当りイミダゾール１ｇを含む溶液６７mlに加えた。反応を２０〜２５℃で３日間行い、反応混合物を水８mlで希釈した。次いで、この反応混合物に、ヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００ml及びテトラヒドロフラン７５０mlよりなる溶液を、褐色のヨウ素の色が少なくとも５分間残っているような量まで加えた。反応混合物を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた黄色の固体をｐＨ３〜４の緩衝液５０mlと酢酸エチル４０mlよりなる乳濁液にとった。緩衝液は、水１リットル当りＮａＯＨ２４ｇ、クエン酸１１７ｇ及び塩化ナトリウム３５ｇからなる。イミダゾールを含む水相を分離し、有機相を緩衝溶液５０mlで二回抽出した。次いで、有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、塩化ナトリウム飽和水溶液で順次抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム２ｇで乾燥した。塩を濾別し、濾液を濃縮した。得られた固体を酢酸エチル５〜１０mlにとり、この溶液をｎ−ペンタン２５０mlにゆっくりと加えた。生成物は白色の無定形沈澱として析出した。この沈殿物を濾過により捕集し、ｎ−ペンタン５０mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で２４時間真空乾燥して５´−ジメトキシトリチル−３´−（プロピン−１−イル）−２´−デオキシウリジン１２５mg（理論量の６８％）を得た。
【００７８】
1H-NMR(CDCl3, 基準=TMS, d[ppm]): 7.95(s, 1H, NH); 7.4-7.15(10H, DMTr);6.78(2s, 4H, DMTr); 6.24(t, 1H, 1'); 4.5(m, 3'); 4.06(m, 4'); 3.73(s, 6H, DMTr); 3.28(m, 2H, 5'); 2.43(m, 1H, 2'); 2.22(m, 1H, 2'); 1.61(s, 3H, プロピルのCH3 ).
【００７９】
実施例１５：
オリゴヌクレオチド合成反応器の排溶液から５´−ジメトキシトリチル−３´−（３−トリフルオロアセチルアミノプロピン−１−イル）−２´−デオキシウリジンの製造
ＤＮＡ合成の過程で反応器中に形成された５´−ジメトキシトリチル−３´−（３−トリフルオロアセチルアミノプロピン−１−イル）−２´−デオキシウリジン−３´−イル−シアノエチル−Ｈ−ホスホナート２５０mgを含む排溶液５mlを、メタノール５０ml当りイミダゾール１ｇを含む溶液７８mlに加えた。反応を２０〜２５℃で３日間行い、反応混合物を水７．８mlで希釈した。次いで、この反応混合物に、ヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００ml及びテトラヒドロフラン７５０mlよりなる溶液を、褐色のヨウ素の色が少なくとも５分間残っているような量まで加えた。反応混合物を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた黄色の固体をｐＨ３〜４の緩衝液５０mlと酢酸エチル４０mlよりなる乳濁液にとった。緩衝液は、水１リットル当りＮａＯＨ２４ｇ、クエン酸１１７ｇ及び塩化ナトリウム３５ｇからなる。イミダゾールを含む水相を分離し、有機相を緩衝溶液５０mlで二回抽出した。次いで、有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、塩化ナトリウム飽和水溶液５０mlで順次抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム２ｇで乾燥した。塩を濾別し、濾液を濃縮した。得られた固体を酢酸エチル５〜１０mlにとり、この溶液をｎ−ペンタン２５０mlにゆっくりと加えた。生成物は白色の無定形沈澱として析出した。この沈殿物を濾過により捕集し、ｎ−ペンタン５０mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で２４時間真空乾燥して５´−ジメトキシトリチル−３´−（３−トリフルオロアセチルアミノプロピン−１−イル）−２´−デオキシウリジン１１３mg（理論量の７３％）を得た。
【００８０】
1H-NMR(CDCl3, 基準=TMS, d[ppm]): 8.15(s, 1H, NH); 7.4-7.15(10H, DMTr, H6); 6.26(t, 1H, 1'); 4.53(m, 1H, 3'); 3.97(m, 2H, 5'); 3.73(s, 6H, DMTr); 3.3(m, 2H, プロピルのCH2 ); 2.48(m, 1H, 2'); 2.25(m, 1H, 2').
【００８１】
実施例１６：
オリゴヌクレオチド合成反応器の排溶液からＮ−（５´−ジメトキシトリチル−３´デオキシチミジン−３´−イル）−Ｎ−プロピル−（３´−デオキシチミジン−５´−イル）アセトアミドの製造
ＤＮＡ合成の過程で反応器中に形成されたＮ−（５´−ジメトキシトリチル−３´−デオキシチミジン−３´−イル）−Ｎ−プロピル−（３´−デオキシチミジン−３´−シアノエチル−Ｈ−ホスホニル−５´−イル）アセトアミド２００mgを含む排溶液５mlを、メタノール５０ml当りイミダゾール１ｇを含む溶液７８mlに加えた。反応を２０〜２５℃で７日間行い、反応混合物を水２０mlで希釈した。次いで、この反応混合物に、ヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００ml及びテトラヒドロフラン７５０mlよりなる溶液を、褐色のヨウ素の色が少なくとも５分間残っているような量まで加えた。反応混合物を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた黄色の固体をｐＨ３〜４の緩衝液５０mlと酢酸エチル４０mlよりなる乳濁液にとった。緩衝液は、水１リットル当りＮａＯＨ２４ｇ、クエン酸１１７ｇ及び塩化ナトリウム３５ｇよりなる。イミダゾールを含む水相を分離し、有機相を緩衝溶液５０mlで二回抽出した。次いで、有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、塩化ナトリウム飽和水溶液５０mlで順次抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム２ｇで乾燥した。塩を濾別し、濾液を濃縮した。得られた固体を酢酸エチル５〜１０mlにとり、この溶液をｎ−ペンタン６００mlにゆっくりと加えた。生成物は白色の無定形沈澱として析出した。この沈殿物を濾取し、ｎ−ペンタン５０mlで洗浄し、Ｐ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で２４時間真空乾燥してＮ−（５´−ジメトキシトリチル−３´−デオキシチミジン−３´−イル）−Ｎ−プロピル−（３´−デオキシチミジン−５´−イル）アセトアミド１０７mg（理論量の６６％）を得た。
【００８２】
1H-NMR(CDCl3, 基準=TMS, d[ppm]): 7.65(s, 1H, H6); 7.4-7.15(m, 9H, DMTr); 7.1(s, 1H, H6); 6.77(2s, 4H, DMTr); 6.53(t, 1H, 1'); 6.13(t, 1H, 1'); 4.28(m, 1H, 3'); 4.1(m, 2H, 3', 4'); 3.72(s, 6H, DMTr, m, 1H); 3.52(m, 1H, 4'); 3.5(d, 1H); 3.15-2.85(m, 3H, 5', アセトアミドのCH2 ); 2.56(m,1H, 2'); 2.45-2.25(m, 3H, 2', プロピルのCH2 ); 2.2-2.1(2H, 2'); 1.83(s, 3H, CH35); 1.45(s, 3H, CH35); 1.22(m, 2H, プロピルのCH2); 0.73(t, 3H, プロピルのCH2).
【００８３】
実施例１７：
オリゴヌクレオチド合成反応器の排溶液から５´−ジメトキシトリチル−２´−プロピル−５−メチルウリジンの製造
ＤＮＡ合成の過程で反応器に形成された５´−ジメトキシトリチル−２´−プロピル−５−メチルウリジン−３´−イル−シアノエチル−Ｈ−ホスホナート４００mgを含む排溶液５mlを、メタノール５０ml当りイミダゾール１ｇを含む溶液１００mlに加えた。反応を２０〜２５℃で７日間行い、反応混合物を水２０mlで希釈した。次いで、この反応混合物に、ヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００ml及びテトラヒドロフラン７５０mlよりなる溶液を、褐色のヨウ素の色が少なくとも５分間残っているような量まで加えた。反応混合物を減圧下に蒸留して濃縮し、得られた黄色の固体をｐＨ３〜４の緩衝液５０mlと酢酸エチル４０mlよりなる乳濁液にとった。緩衝液は、水１リットル当りＮａＯＨ２４ｇ、クエン酸１１７ｇ及び塩化ナトリウム３５ｇよりなる。イミダゾールを含む水相を分離し、有機相を緩衝溶液５０mlで二回抽出した。次いで、有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、塩化ナトリウム飽和水溶液５０mlで順次抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム２ｇで乾燥した。塩を濾別し、濾液を濃縮乾固した。得られた固体をＰ4 Ｏ10／ＫＯＨ上で２４時間真空乾燥して、５´−ジメトキシトリチル−２´−プロピル−５−メチルウリジン２５８mg（理論量の８６％）を黄色油状物として得た。
【００８３】
1H-NMR(CDCl3, 基準=TMS, d[PPM]): 8.45(s, 1H, NH); 7.57(s, 1H, H6); 7.45-7.15(m, 9H, DMTr); 6.75(2s, 4H, DMTr); 5.9(d, 1H, 1'); 4.38(m, 1H, 3'); 4.0(m, 1H, 4'); 3.95(m, 1H, 2'); 3.72(s, 6H, DMTr); 3.8-3.4(m, 2H,プロピル); 3.6-3.3(4m, 2H, 5'); 1.56(m, 2H, プロピル); 1.88(t, 3H,プロピル).
【００８４】
実施例１８：
アクセプターアルコールとしてメタノールを用いたポリマー上での亜リン酸のエステル交換反応
チミジン−５´−イル−シアノエチル−Ｈ−ホスホナートで誘導体化し、３６mmol／ｇの密度にヌクレオシドを結合させた調整多孔質ガラス（ＣＰＧ）６８５mgを、Ｎ−メチルモルホリンの２％メタノール溶液１０mlと反応させた。ヌクレオシドは、スクシニル基によりＣＰＧと３´−ＯＨ基に共有結合的に結合した。１時間後、固相１３７mgのサンプルを反応混合物から除去した。担体をアセトニトリル２mlで四回洗浄し、ヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００ml及びテトラヒドロフラン７５０mlと１時間反応させた。次いで、固相をアセトニトリル２mlで十回、次にジエチルエーテル２mlで十回洗浄した。担体を乾燥し、５５〜６０℃でアンモニアの濃水溶液で処理した。もはやヌクレオシドの存在しない固体担体を濾過して除去した。濾液を最初に凍結乾燥してから酢酸トリメチルアンモニウムの０．１M 溶液（ｐＨ７）にとり、ＨＰＬＣで分析した。５´−チミジンモノホスファート、チミジン及びチミジン−５´−メチルホスファートの混合物が検出された。チミジン−５´−ホスファートは、抽出物からヨウ素酸化及びアンモニア分解によって生成した。チミジン−５´−メチルホスファートは、チミジン−５´−イル−メチル−Ｈ−ホスホナートの脱ホスフィチル化の中間体から、酸化及び加水分解処理の過程で生成した。チミジンは、サクシニル基−結合基の鹸化後、ポリマーと結合したチミジンの脱ホスフィチル化の生成物から生成した。残りの担体に上記の酸化及び加アンモニア分解処理を３６時間行った。チミジンのみを担体の濾液から得た。
【００８５】
実施例１９：
アクセプターアルコールとしてシアノエタノールを用いるポリマー上での亜リン酸のエステル交換反応
チミジン−５´−イル−シアノエチル−Ｈ−ホスホナートで誘導体化され、３６mmol／ｇの密度にヌクレオシドを結合させた調整多孔質ガラス（ＣＰＧ）１３９mgを、Ｎ−メチルモルホリンの１０％シアノエタノール溶液１０mlと反応させた。ヌクレオシドは、スクシニル基によりＣＰＧと３´−ＯＨ基に共有結合的に結合した。１００分後、担体をアセトニトリル２mlで四回洗浄し、ヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００ml及びテトラヒドロフラン７５０mlと１時間反応させた。次いで、固相をアセトニトリル２mlで十回、次にジエチルエーテル２mlで十回洗浄した。担体を乾燥し、５５〜６０℃で濃アンモニア水溶液で処理した。もはやヌクレオシドの存在しない担体を濾別した。濾液を最初に凍結乾燥してから酢酸トリメチルアンモニウムの０．１M 溶液（ｐＨ７）にとり、ＨＰＬＣで分析した。５´−チミジンモノホスファートとチミヂジンの比が３：９７の混合物が検出された。チミジン−５´−ホスファートは、抽出物からヨウ素酸化及び加アンモニア分解によって生成した。チミジンは、サクシニル基−結合基の鹸化後、ポリマーと結合したチミジンの脱ホスフィチル化の生成物から生成した。
【００８６】
実施例２０：
アクセプターアルコールとしてメタノールを用い、ジトリフルオロ酢酸マグネシウム（Ｍｇ（ＯＴｆ）2 ）の存在下、ポリマー上でのエステル交換反応
チミジン−５´−イル−シアノエチル−Ｈ−ホスホナートで誘導体化され、３６mmol／ｇの密度にヌクレオシドを結合させた調整多孔質ガラス（ＣＰＧ）１３９mgを、Ｎ−メチルイミダゾール：メタノール（１：９）にとったＭｇ（ＯＴｆ）２の０．１M 溶液１０mlと反応させた。ヌクレオシドは、スクシニル基によりＣＰＧと３´−ＯＨ基に共有結合的に結合された。３０分後、担体をアセトニトリル２mlで四回洗浄し、ヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００ml及びテトラヒドロフラン７５０mlと１時間反応させた。次いで、固相をアセトニトリル２mlで十回、次にジエチルエーテル２mlで十回洗浄した。担体を乾燥し、５５〜６０℃で濃アンモニア水溶液で処理した。もはやヌクレオシドの存在しない担体を濾別した。濾液を最初に凍結乾燥してから酢酸トリメチルアンモニウムの０．１M 溶液（ｐＨ７）にとり、ＨＰＬＣで分析した。チミジン及びチミジン−５´−イル−メチルホスファートの混合物が検出された。チミジン−５´−メチルホスファートは、ヨウ素酸化及び加水分解の過程で、チミジン−５´−イル−メチル−Ｈ−ホスホナートの脱ホスフィチル化の中間体から生成した。チミジンは、スクシニル基−結合基の鹸化後、ポリマーと結合したチミジンの脱ホスフィチル化の生成物から生成した。チミジンのチミジン−５´−イル−メチルホスファートに対する比は９７：３であった。
【００８７】
実施例２１：
アクセプターアルコールとしてシアノエタノールを用い、ＬｉＣｌの存在下、ポリマー上での亜リン酸のエステル交換反応
チミジン−５´−イル−シアノエチル−Ｈ−ホスホナートで誘導体化し、３６mmol／ｇの密度にヌクレオシドを結合させた調整多孔質ガラス（ＣＰＧ）１３９mgを、Ｎ−メチルモルホリン：シアノエタノール（１：９）にとったＬｉＣｌの０．１Ｍ溶液１０mlと反応させた。ヌクレオシドは、スクシニル基によりＣＰＧと３´−ＯＨ基に共有結合的に結合した。３０分後、担体をアセトニトリル２mlで四回洗浄し、ヨウ素３０ｇ、水２０ml、ピリジン２００ml及びテトラヒドロフラン７５０mlと１時間反応させた。次いで、固相をアセトニトリル２mlで十回、次にジエチルエーテル２mlで十回洗浄した。担体を乾燥し、５５〜６０℃で濃アンモニア水溶液で処理した。もはやヌクレオシドの存在しない担体を濾別した。濾液を最初に凍結乾燥してから酢酸トリメチルアンモニウムの０．１M 溶液（ｐＨ７）にとり、ＨＰＬＣで分析した。チミヂジン及びチミジン−５´−ホスファートの混合物が検出された。チミジン−５´−ホスファートは、ヨウ素酸化及び加アンモニア分解によって抽出物から生成した。チミジンは、スクシニル基−結合基の鹸化後、ポリマーと結合したチミジンの脱ホスフィチル化の生成物から生成した。チミジンのチミジン−５´−ホスファートに対する比は９８：２であった。