(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプル中のエンドトキシンを検出するのに適する変形細胞分解産物中のグルカン感受性経路を阻害する方法であって、該変形細胞分解産物を、２〜１０のグルコースモノマー単位を有するβ−１，４−グルカンと接触させる段階を含んでなり、該β−１，４−グルカンの全てのグリコシド結合が、β−１，４−グリコシド結合である方法。
【請求項２】
β−１，４−グルカンがセロビオースである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
セロビオースの量が１５〜５０ｍｇ／ｍｌである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
セロビオースの量が１５〜４０ｍｇ／ｍｌである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
セロビオースの量が１５〜３５ｍｇ／ｍｌである、請求項２記載の方法。
【請求項６】
セロビオースの量が１５〜２５ｍｇ／ｍｌである、請求項２記載の方法。
【請求項７】
該β−１，４−グルカンが少なくとも１の化学部分を含み、該化学部分がβ−１，３−グリコシド結合を含まず、そして該化学部分がβ−１，３−グリコシド結合によっては該β−１，４−グルカンに結合していない、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該β−１，４−グルカンと試験サンプルが、接触の段階の前に予備混合されている、請求項１記載の方法。
【請求項９】
試験サンプルが、接触の段階の前に変形細胞分解産物に添加される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
試験サンプルが、接触の段階の後に変形細胞分解産物に添加される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
変形細胞分解産物が、Limulus polyphemus、Tachypleus tridentatus、Tachypleus gigas、及び Carcinoscorpius rotundicauda からなる群から選択されるカブトガニの変形細胞から調製される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
エンドトキシンが、速度論的発色法、エンドポイント発色法、ゲル−クロット法、濁度法、及び酵素結合免疫吸着アッセイ法からなる群から選択される方法により検出される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
変形細胞分解産物が、凍結乾燥されてから接触の段階の前に解凍されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
変形細胞分解産物が、凍結乾燥されてから接触の段階の後に解凍されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
試験サンプル中のエンドトキシンの存在を特異的に検出するための試薬であって：
変形細胞分解産物；及び
２〜１０のグルコースモノマー単位を有するβ−１，４−グルカンであって、全てのグリコシド結合がβ−１，４−グリコシド結合であるβ−１，４−グルカン
を含んでなる試薬。
【請求項１６】
該β−１，４−グルカンがセロビオースである、請求項１５記載の試薬。
【請求項１７】
凍結乾燥された試薬である、請求項１５記載の試薬。
【請求項１８】
試験サンプル中のエンドトキシンの存在を検出するためのキットであって：
変形細胞分解産物；
２〜１０のグルコースモノマー単位を有するβ−１，４−グルカンであって、全てのグリコシド結合がβ−１，４−グリコシド結合であるβ−１，４−グルカン；及び
該キットをエンドトキシンの検出に用いるための使用説明書
を含んでなるキット。
【請求項１９】
該β−１，４−グルカンがセロビオースである、請求項１８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変形細胞分解産物を用いるエンドトキシン検出の分野に関する。より特定すると、本発明は、リムルス(Limulus) 変形細胞分解産物を用いるエンドトキシンの検出に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カブトガニ血液リンパは、エンドトキシン（リポ多糖類) に応答して血液リンパの凝固を引き起こすエンドトキシン媒介セリンプロテアーゼ経路を含有している (Iwanaga ら, Curr. Opin. Immunol. 5, 74-82, 1993)。リムルス細胞分解産物（ＬＡＬ）は、ヒト及び動物用医薬品、生体物質、及び医療装置を含む種々の試験サンプル中のエンドトキシンを検出するアッセイに広く用いられている。医薬品及び研究生成物は、しばしば、細菌性エンドトキシンからの汚染物質について試験される。これら汚染物質が体内に注射されると、発熱及び場合によっては死を含む重篤な副作用を引き起し得る。
【０００３】
ＬＡＬアッセイでは、リムルス変形細胞の抽出物には、ＬＡＬに高い鋭敏性及び／又は安定性を与える成分が混ざっており、それらがＬＡＬ試薬を形成している。試験サンプルは、このＬＡＬ試薬と混合され、ＬＡＬ試薬と混合された一連の既知のエンドトキシンスタンダードと比較される。サンプル及びスタンダードの結果を比較して、サンプル中のエンドトキシンの濃度を決定する。
エンドトキシンについてのＬＡＬアッセイは、完全に特異的という訳ではない。別のグルカン感受性酵素的経路を通ってＬＡＬと反応するβ−１，３−グルカン類にも応答する（Iwanaga ら, 1993を参照のこと) 。これらβ−グルカン類は、種々の分子量とそのグルコースサブユニット間に主としてβ−１，３−グリコシド結合を有するグルコースのポリマーである。充分な量のβ−グルカンが試験サンプル中に存在すると、偽陽性結果が得られる。偽陽性は、高価な医療装置又は大量の製品を不必要に廃棄するという事態を製造業者にもたらす。
ＬＡＬ試験における陽性結果がエンドトキシンに起因するのか又はβ−グルカン汚染物質に起因するのかを見極めるのは困難なことが多い。かくして、β−グルカン汚染物質に起因する偽陽性結果の発生を少なくするか又は無くするエンドトキシン特異的アッセイについての必要性が、依然として当該技術分野に存在している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、サンプル中のエンドトキシンをより特異的に検出する手段を提供することである。本発明のこの目的及び他の目的は、以下に記載する１又はそれを越える態様により達成される。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の１つの態様は、試験サンプル中のエンドトキシンを検出するのに適する変形細胞分解産物中のグルカン感受性経路を阻害する方法を提供する。変形細胞分解産物を、その変形細胞分解産物中のグルカン感受性酵素的経路を阻害するのに有効な量のβ−１，４−グルカンと接触させる。このβ−１，４−グルカン中の全てのグリコシド結合は、β−１，４−グリコシド結合である。
本発明のもう１つの態様は、試験サンプル中のエンドトキシンを検出するための試薬を提供する。この試薬は、変形細胞分解産物とβ−１，４−グルカンを含んでなる。このβ−１，４−グルカン中の全てのグリコシド結合は、β−１，４−グリコシド結合である。
本発明のいま１つの態様は、試験サンプル中のエンドトキシンを検出するためのキットを提供する。このキットは、変形細胞分解産物、β−１，４−グルカン、及びそのキットをエンドトキシンの検出に用いるための使用説明書を含んでなる。このβ−１，４−グルカン中の全てのグリコシド結合は、β−１，４−グリコシド結合である。
【０００６】
かくして、本発明は、グルカン汚染物質の存在に起因する偽陽性結果を出しがちなＬＡＬアッセイの傾向を少なくして、ＬＡＬアッセイをエンドトキシン検出についてより特異的にするための試薬及び方法を当該技術分野に提供する。本発明は、なかんずく、試験サンプルが痕跡量のβ−グルカンを含有するときに偽陽性結果を回避できるエンドトキシン特異的アッセイを提供する。
【０００７】
【好ましい態様の詳細な説明】
本発明者らは、全てのグリコシド結合がβ−１，４−グリコシド結合であるβ−グルカン類を用いると、カブトガニ変形細胞分解産物中のグルカン感受性経路を阻害し、エンドトキシンについてのＬＡＬ試薬及びＬＡＬアッセイを特異的にすることができることを発見した。
変形細胞分解産物を調製する方法は当該技術分野で周知である。例えば、Levin と Bang, Bull. Johns Hopkins Hosp. 115, 265-74, 1968；Young ら, J. Clin. Invest., 51, 1790-97, 1972 を参照のこと。変形細胞分解産物は、Limulus polyphemus、Tachypleus tridentatus、Tachypleus gigas、及び Carcinoscorpius rotundicauda のようなあらゆる種のカブトガニから単離される変形細胞から調製することができる。変形細胞分解産物は、調製されたばかりのものであっても、一般に知られているように、凍結乾燥されてから使用前に解凍されたものであってもよい。本発明の方法は、細胞分解産物の供給源に限定されるものではない。変形細胞分解産物は、例えば、速度論的発色法、エンドポイント発色法、ゲル−クロット法、濁度法、又は酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法における使用に適する試薬の形態であることができる。そのような試薬は、例えば、米国特許第４，３２２，２１７号、４，５１０，２４１号、及び５，３１０，６５７号に開示されている。この細胞分解産物のエンドトキシン感受性範囲は、好ましくは０．００５〜５０ＥＵ／ｍｌの範囲である。
【０００８】
全てのグリコシド結合がβ−１，４−グリコシド結合であるどのようなβ−１，４−グルカンも、本発明の方法に用いることができる。ダイマー（セロビオース）が好ましいが、少なくとも３、４、５、６、７、８、９若しくは１０又はより多くのグルコースモノマー単位を含むポリマーでも、阻害剤として使用できる。場合により、β−１，４−グルカンは、アルキル、カルボキシメチル、メチル又はヒドロキシメチル基のような１又はそれを越える化学部分を含むことができる。その化学部分がグルコースモノマー又はポリマーである場合は、β−１，３−又はβ−１，６−グリコシド結合によってそのβ−１，４−グルカンに結合していることはない。その化学部分がグルコースポリマーである場合は、それはβ−１，３−グリコシド結合を含まない。そのような化学部分にカップリングしているか又はしていない２又はそれを越える異なるβ−１，４−グルカンの混合物も、グルカンに対する変形細胞分解産物の応答を阻害するために、本発明に従って用いることができる。
【０００９】
グルカン感受性酵素的経路を阻害するためのアッセイにおける具体的なβ−１，４−グルカンの最適濃度は、使用される変形細胞分解産物製剤で変動し得る。具体的な供給源の変形細胞分解産物中のグルカン感受性酵素的経路を阻害するのに有効である特定のβ−１，４−グルカンの量は、例えば、日常試験により決定することができる。以下の実施例４に記載するように、種々の濃度のβ−１，４−グルカンを、ザイモサンＡのようなβ−グルカンを含有する物質が加えられた変形細胞分解産物アッセイに添加することができる。好ましくは、本発明による阻害性添加剤として使用されるβ−１，４−グルカンは、セロビオースである。セロビオースの有効量は、１００ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、一般には１００ｎｇ／ｍｌ〜７０ｍｇ／ｍｌ、最も高頻度には１５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１５〜４０ｍｇ／ｍｌ、１５〜３５ｍｇ／ｍｌ、又は１５〜２５ｍｇ／ｍｌである（図３を参照のこと）。０．０５、０．１、０．１５、０．１７５、１、１．５、２、２．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０又は７０ｍｇ／ｍｌのような濃度のセロビオースを変形細胞分解産物アッセイで使用することができる。
【００１０】
本発明によれば、変形細胞分解産物は、β−１，４−グルカンと接触させられる。その最終反応混合物は、変形細胞分解産物、β−１，４−グルカン、及び試験サンプルを含む。しかしながら、これら変形細胞分解産物、β−１，４−グルカン、及び試験サンプルは、どのような順序で添加されてもよい。例えば、試験サンプルを変形細胞分解産物とβ−１，４−グルカンの混合物に添加してもよい。また、試験サンプルを、変形細胞分解産物がβ−１，４−グルカンと接触させられる前に、その変形細胞分解産物に添加してもよい。変形細胞分解産物及びβ−１，４−グルカンを凍結乾燥してから接触段階前に解凍してもよい。また、変形細胞分解産物をβ−１，４−グルカンと接触させる段階の前に、β−１，４−グルカンと試験サンプルを予備混合してもよい。β−１，４−グルカン、変形細胞分解産物、及び試験サンプルを添加する全ての可能な順序が、本発明の範囲内のものである。
【００１１】
試験サンプルは、水、医療装置、医薬品、及び組織培養液や血液や血清のような生物学的試験サンプルを包含する、起こり得るエンドトキシン汚染を測定するのに有用な如何なるサンプルであってもよい。β−１，４−グルカンの存在下での変形細胞分解産物の試験サンプルに対する応答は、当該技術分野で周知なやり方で検出され得る。例えば、濁度法、ゲル−クロット形成アッセイ、速度論的発色法、エンドポイント発色法、及び酵素結合免疫吸着法は全て、本発明の方法で使用するのに適している。そのようなアッセイの実行は、日常的なものである。例えば、Moritaら, BACTERIAL ENDOTOXINS: STRUCTURE, BIOMEDICAL SIGNIFICANCE, AND DETECTION WITH THE LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE TEST, pp. 53-64, 1985 ；Kambayashiら, J. Biochem. Biophys. Meth. 22, 93-100, 1991 ；Matuura と Tsuchiya,  米国特許第５，１７９，００６号；及び Cooper ら, PDA J. Pharm. Sci. Technol. 51, 2-6, 1997 を参照のこと。用いられる具体的なタイプのアッセイに適するあらゆる方法を用いて陽性結果及び陰性結果を検出することができ、それらには、変形細胞分解産物アッセイの結果を読み取って計算するように特別にデザインされた自動読取装置及びソフトウェアーが包含される（例えば、Bio Whittaker 社の Kinetic-QCL読取装置及び WinKQCLソフトウェアー）。
【００１２】
本発明は、試験サンプル中のエンドトキシンを特異的に検出するのに用いることができる試薬も提供する。その試薬は、変形細胞分解産物、好ましくはカブトガニ変形細胞分解産物、最も好ましくはリムルス変形細胞分解産物、及びβ−１，４−グルカンを含んでなる。そのβ−１，４−グルカンは、好ましくはセロビオースであるが、上に記載したように、付加的な化学部分にカップリングしているか又はしていない２又はそれを越えるグルコースモノマーを含むどのようなポリマーであってもよい。この試薬は、保存及び輸送の便宜から、凍結乾燥された形態で提供されることができる。場合により、この試薬は、ＬＡＬアッセイに高い鋭敏性又は安定性を与える追加の成分を含んでいてもよい（米国特許第４，３２２，２１７号；４，５１０，２４１号；５，３１０，６５７号を参照のこと）。
【００１３】
本発明は、試験サンプル中のエンドトキシンの特異的検出のためのキットも提供する。そのキットは、変形細胞分解産物、好ましくはカブトガニ変形細胞分解産物、最も好ましくはリムルス変形細胞分解産物、及びβ−１，４−グルカンを含んでなる。その変形細胞分解産物は、β−１，４−グルカンと一緒に又は別々に凍結乾燥されていてもよい。好ましくは、β−１，４−グルカンはセロビオースであるが、上に記載したように、付加的な化学部分にカップリングしているか又はしていないβ−１，４−グリコシド結合により連結された他のグルコースポリマーも使用することができる。そのキットを使用してエンドトキシンを特異的に検出するための使用説明書も含められる。場合により、変形細胞分解産物とβ−１，４−グルカンを含んでなる上記の本発明の試薬をキットで提供してもよい。
以下は、例示のためだけに示すのであって、上に一般的に説明した発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【００１４】
【実施例】
実施例１
この実施例は、以下の実施例で使用する材料及び方法を説明するものである。
エンドトキシン溶液：精製大腸菌エンドトキシン、つまり参照スタンダードエンドトキシン（ＲＳＥ）ロットＥＣ−６を、Center for Biologics Evaluation and Research Center,ＦＤＡ(Rockville, MD) から得た。１０，０００エンドトキシン単位を含有する１つのバイアル瓶を５．０ｍｌのＬＡＬ試薬水（ＬＡＬ−ＲＷ）で解凍して、３０分間渦を巻かせた。このストックを逐次希釈してスタンダードとサンプルの両方を調製した。
ＦＤＡ菌株シアトル１９４６（カタログ番号２５９２２）から誘導された天然大腸菌をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得た。試験前にトリプチカーゼ大豆ブロス中で培養して２〜８℃で保存した。
リムルス変形細胞分解産物反応性物質（ＬＡＬ−ＲＭ）：Baxter Health Care社(Deerfield, IL) から得た CF-Capillary Flow Dialyzer, Model CF23 をＬＡＬ−ＲＷで濯ぐことによって、ＬＡＬ−ＲＭサンプルを調製した。濯ぎ液を凍結乾燥してからＬＡＬ−ＲＷで解凍した。ＬＡＬ−ＲＭサンプルは、＜−１０℃で保存した。
【００１５】
ザイモサンＡ：サッカロミセス・セレビシエからのザイモサンＡ（カタログ番号Ｚ−４２５０）を Sigma Chemical 社(St. Louis, MO) から得た。ザイモサンＡは、β−１，３−グリコシド結合を含有するグルカン、並びに諸タンパク質及び脂質を含んでなる。５．０ｍｇのサンプルを５ｍｌの９０％ギ酸（カタログ番号Ａ−１１９−５００，Fisher Chemical 社 (Fair Lawn, NJ)）と混合した。この溶液をザイモサンＡが完全に溶解するまで５６℃に加熱した（約３時間）。水酸化ナトリウム及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの添加により、この調製物の中和を行った。このストック中のザイモサンＡの最終濃度は３１７μｇ／ｍｌでｐＨは６．５であった。この溶液を使用するまで２〜８℃で保存した。
セロビオース：β−Ｄ（＋）−セロビオースを Aldrich Chemical 社（カタログ番号Ｃ１，７７０−５）又は Sigma Chemical 社（カタログ番号Ｃ−７２５２）のいずれかから得た。セロビオースをＬＡＬ−ＲＷ中に溶解させてから、Sartorius （カタログ番号Ｄ２０）からの Ultrasartフィルターで超濾過してエンドトキシンを除去することによって、セロビオースストック溶液を調製した。超濾過したセロビオースを試験して、＜０．００５のＬＡＬ反応性単位を含有することが分かった。このセロビオース調製物を２〜８℃で保存した。
【００１６】
実施例２
この実施例は、後の試験で使用するＬＡＬ−ＲＭの最適量を見出すためのＬＡＬ−ＲＭの滴定を示すものである。
上記のＬＡＬ−ＲＭ調製物をＬＡＬ−ＲＷで希釈して、Bio Whittaker 社により Kinetic-QCLとして販売されている凍結乾燥リムルス変形細胞分解産物（ＬＡＬ）試薬（ＫＱＣＬ Bio Whittaker Kinetic-QCL試薬＃Ｋ５０−６４３）を用いて試験した。この試薬は、米国特許第５，３１０，６５７号に記載された通りに調製されたものである。この調製物は、０．００５〜５０ＥＵ／ｍｌの範囲のエンドトキシンに対して直線的応答を示した。ＫＱＣＬ試薬は、２．６ｍｌのＬＡＬ−ＲＷ又はセロビオースが溶解した２．６ｍｌのＬＡＬ−ＲＷのいずれかで解凍させた。
この実施例及び後の実施例に記載した試験は、エンドトキシン汚染を最小にした条件下で行われた。一連のエンドトキシンスタンダードは、２０００ＥＵ／ｍｌのＥＣ−６ストックを用いて調製された。０．００５、０．０５、０．５０、５．０及び５０ＥＵ／ｍｌのスタンダード濃度を全ての試験に含めた。
【００１７】
スタンダード又はサンプル（１００μｌ）を９６ウェルマイクロプレートに添加した。そのマイクロプレートを、エンドトキシン試験を行うためにデザインされたインキュベーティングマイクロプレート読取装置（Kinetic-QCL 読取装置＃２５−１４１Ｂ, Bio Whittaker 社）中に入れた。そのプレートを10分間予備インキュベートした後、１００μｌのＫＱＣＬをセロビオースと一緒に又はセロビオースなしに、そのマイクロプレートの適切なウェルに添加した。そのマイクロプレートを３０秒間震盪した。
エンドトキシン試験を行うために特別にデザインされたソフトウェアー（WinKQCL ＃２５−３００, Bio Whittaker 社）を用いて試験の実行とデータ解析を行った。サンプル結果を“ＬＡＬ反応性単位”として示した。これは、ＥＣ−６スタンダード曲線に対して測定されたＬＡＬ活性である。結果を図１に示す。
典型的な鐘状曲線が認められた。ＫＱＣＬ試薬の最大活性は、ＬＡＬ−ＲＭの１：４０００希釈液で見られた。より高濃度のＬＡＬ−ＲＭでは、より低い値が得られ、これは、過剰のβ−グルカンがＬＡＬアッセイ中に存在するときの“飽和効果”を象徴するものである。
【００１８】
実施例３
この実施例は、後の試験で使用するザイモサンＡの最適量を見出すための、ＬＡＬアッセイのザイモサンＡに対する用量−応答を示すものである。
上記のザイモサンＡ調製物（３１７μｇ／ｍｌ）をＬＡＬ−ＲＷで希釈して、上の実施例２に記載した、Bio Whittaker ＫＱＣＬ試薬＃Ｋ５０−６４３を用いて試験した。結果を図２に示す。
典型的な鐘状応答曲線が認められた。最大活性は１５９ｎｇ／ｍｌのザイモサンＡで見られた。より高濃度のザイモサンＡでは、より低い値が得られ、これは、過剰のβ−グルカンがＬＡＬアッセイ中に存在するときの“飽和効果”を象徴するものである。
【００１９】
実施例４
この実施例は、後の試験で使用するセロビオースの最適量を見出すための比較試験を示すものである。
ＬＡＬ−ＲＭ及びザイモサンＡの調製物を、ＬＡＬ−ＲＷで解凍したＫＱＣＬ試薬及び種々の濃度のセロビオースで解凍したＫＱＣＬ試薬で試験した（図３を参照のこと）。各々の調製物を、上の実施例２（図１）及び実施例３（図２）で決定されたＫＱＣＬアッセイにおける最大反応性を与える希釈度又は濃度で試験した。
ＫＱＣＬ試薬にセロビオースを添加すると、ＬＡＬ−ＲＭ及びザイモサンＡの両方の調製物中に存在するグルカンへの応答が阻害された。試験したセロビオースの最小濃度（０．１５６ｍｇ／ｍｌ）は、グルカン阻害物質としての効果を殆ど有さなかった。完全な阻害は、約２５ｍｇ／ｍｌもの低濃度のセロビオースで認められた。ＬＡＬ−ＲＷで解凍したＫＱＣＬ試薬又はセロビオースで解凍したＫＱＣＬ試薬でのＥＣ−６エンドトキシンの試験は、両方の試薬のエンドトキシンに対する特異性を証明するものであった。
これら結果は、最適量のセロビオースの添加により、エンドトキシンの調製物が、グルカンからの干渉を受けることなく、速度論的発色ＬＡＬアッセイで分析され得ることを示すものである。
【００２０】
実施例５
この実施例は、前に調製した凍結乾燥ＬＡＬ試薬にグルカン汚染物質を添加したときに、セロビオースが、ＬＡＬアッセイのグルカン汚染物質に対する応答を阻害することを示すものである。
ＫＱＣＬ試薬と３５ｍｇ／ｍｌのセロビオースで解凍したＫＱＣＬ試薬の間で比較を行った。両方の調製物を用いて、ＬＡＬ−ＲＷ、精製ＥＣ−６エンドトキシン、天然大腸菌、ＬＡＬ−ＲＭ、及びザイモサンＡのサンプルを試験した。結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
0004154072.tif 000002
【００２２】
試験したＬＡＬ−ＲＷ調製物は、両方の試薬で陰性であった（＜０．００５のＬＡＬ反応性単位）。両方の試薬は、精製ＥＣ−６及び天然大腸菌のサンプルに対して類似の応答を示した。ＬＡＬ−ＲＭ又はザイモサンＡのサンプルをこれら２種の試薬で試験したときに有意な差が見られた。ＫＱＣＬ試薬は、ＬＡＬ−ＲＭ又はザイモサンＡのいずれかで試験したときに陽性結果を示した。対照的に、セロビオースで解凍したＫＱＣＬ試薬を用いてＬＡＬ−ＲＭ又はザイモサンＡのいずれかで試験したが、ＬＡＬ反応性は見られなかった。
これら結果は、反応混合液中に有効量のセロビオースを含めることにより、試験サンプルが、グルカン汚染物質又は不純物からの干渉を受けることなく、速度論的発色アッセイで、エンドトキシンについて分析され得ることを示すものである。
【００２３】
実施例６
この実施例は、セロビオースをＬＡＬ試薬と共存凍結乾燥させると、セロビオースが、速度論的発色ＬＡＬ試薬のグルカン類に対する応答を効果的に阻害することを示すものである。
ＫＱＣＬ試薬と、ＫＱＣＬ試薬を３５ｍｇ／ｍｌのセロビオースと共存凍結乾燥させることにより調製された本発明の試薬との間で比較を行った。両方の調製物を用いて、ＬＡＬ−ＲＷ、精製ＥＣ−６エンドトキシン、天然大腸菌エンドトキシン、ＬＡＬ−ＲＭ（１：２０００）、及びザイモサンＡ（１５９ｎｇ／ｍｌ）のサンプルを試験した。結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
0004154072.tif 000003
【００２５】
両方の試薬は、精製ＥＣ−６及び天然大腸菌のサンプルに対して類似の応答を示した。しかしながら、セロビオースの存在下では、ＬＡＬ−ＲＭでもザイモサンＡのサンプルでも、ＬＡＬ反応性は測定されなかった。これら結果は、有効量のセロビオースを添加することにより、エンドトキシンの調製物が、グルカン類からの干渉を受けることなく、分析され得ることを示すものである。更に、セロビオースを、この実施例で使用したＫＱＣＬ試薬のようなＬＡＬ試薬に添加し、次いで凍結乾燥することができる。
【００２６】
実施例７
この実施例は、濁度法ＬＡＬエンドトキシンアッセイにおいて、セロビオースが、同じくグルカン応答を遮断することを示すものである。
濁度法ＬＡＬ試薬である  PyrogentR 5000（Bio Whittaker,カタログ番号Ｎ３８３，Ｎ３８４）を添付の使用説明書に記載された通りに使用して、濁度法ＬＡアッセイを行った。このアッセイの、ＬＡＬ−ＲＷ、精製ＥＣ−６エンドトキシン、天然大腸菌エンドトキシン、ＬＡＬ−ＲＭ、及びザイモサンＡへの応答を、３５ｍｇ／ｍｌのセロビオースの存在下又は不存在下で測定した。結果を表３に示す。
【００２７】
【表３】
0004154072.tif 000004
【００２８】
精製ＥＣ−６エンドトキシン及び天然大腸菌エンドトキシンの両方に対し、セロビオースの存在下でも不存在下でも陽性結果が得られた。しかしながら、セロビオースの不存在下では、ＬＡＬ−ＲＭ及びザイモサンＡの両方に応答して陽性結果が得られた。アッセイ中でのセロビオースの存在は、PyrogentR 5000試薬のＬＡＬ−ＲＭ及びザイモサンＡに対する応答を阻害した。
これら結果は、ＬＡＬ濁度法アッセイ中でのセロビオースの存在により、ＬＡＬ中のグルカン応答経路が阻害され得ることを示すものである。
【００２９】
実施例８
この実施例は、ゲル−クロット法ＬＡＬエンドトキシンアッセイにおいて、セロビオースが、グルカン応答を遮断することを示すものである。
このアッセイの、ＬＡＬ−ＲＷ、精製ＥＣ−６エンドトキシン、天然大腸菌エンドトキシン、ＬＡＬ−ＲＭ、及びザイモサンＡへの応答を、３５ｍｇ／ｍｌのセロビオースの存在下又は不存在下で測定した。堅いゲルが試験管の底に生成した後にその試験管を１８０°反転してもゲルがそのままの場合に陽性結果とした。結果を表４に示す。
【００３０】
【表４】
0004154072.tif 000005
【００３１】
精製ＥＣ−６エンドトキシン及び天然大腸菌エンドトキシンの両方に対し、セロビオースの存在下でも不存在下でも陽性結果が得られた。しかしながら、セロビオースの不存在下では、ＬＡＬ−ＲＭ及びザイモサンＡの両方に応答してゲル−クロットが生成した。アッセイ中でのセロビオースの存在は、ＬＡＬ−ＲＭ及びザイモサンＡに応答してゲル−クロットが生成するのを阻害した。
これら結果は、ゲル−クロットアッセイ中でのセロビオースの存在により、ＬＡＬ中のグルカン応答経路が阻害され得ることを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】速度論的発色性ＬＡＬ（ＫＱＣＬ）試薬の、異なる濃度のＬＡＬ−反応性物質（ＬＡＬ−ＲＭ）に対する用量−応答曲線を示す。
【図２】速度論的発色性ＬＡＬ（ＫＱＣＬ）試薬の、異なる濃度のザイモサンＡに対する用量−応答曲線を示す。
【図３】種々の濃度のセロビオースの存在下での、速度論的発色性ＬＡＬ（ＫＱＣＬ）試薬の、ＬＡＬ−ＲＭに対する及びザイモサンＡに対する用量−応答曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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