(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞に特異的に発現するアルブミン遺伝子のエンハンサー／プロモーターの下流に、宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体をコードするDNAを配置したことを特徴とする発現ユニット（但し、該化合物は、該宿主内で人工的に発現させた該受容体との結合により、該受容体を発現している細胞に対して選択的な毒性を示す）であって、該宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物がジフテリア毒素であり、該毒素に対する受容体がHB-EGF（heparin-binding EGF-like growth factor）前駆体／ジフテリア毒素受容体である発現ユニット。
【請求項２】
請求項１に記載の発現ユニットを含むベクター。
【請求項３】
請求項１に記載の発現ユニットまたは請求項２に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載の発現ユニットまたは請求項２に記載のベクターを有する非ヒト動物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物、および請求項１に記載の発現ユニットを含むDNA、とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、特定の時期に動物の特定の器官、組織、または細胞を特異的に破壊する方法、該方法に用いる発現ユニット、ベクター、宿主細胞、およびキット、並びに該方法により特定の器官、組織または細胞が破壊された非ヒト動物に関する。
背景技術
組織や細胞のもつ本来の機能を明らかにするためにその組織や細胞を欠失させて、影響を検討するという手法がある。この手法としては組織・細胞の外科的除去（laser ablationを含む）や標的細胞に毒素を特異的に発現させる方法（Palmiter, R. D. et al.（1987）Cell 50, 435-443、Breitman, M. L. et al.（1987）Science 238, 1563-1565、Borrelli, E. et al.（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7572-7576、Heyman, R. A. et al（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2698-702、Lowell, B. B. et al.（1993）Nature 366, 740-742、Ross, S. R. et al.（1993）Genes Dev. 7, 1318-1324）が挙げられる。
しかし、目的とする細胞が個体内に散在する場合、前者の方法ではその細胞だけを効率良く除去することは不可能である。また、標的器官、組織、または細胞が発生過程に必須な場合、後者の方法では個体は胎児期に死亡してしまい、出生後の解析が不可能である。
発明の開示
そこで、本発明は、特定の器官、組織、または細胞を特異的に、かつ任意の時期に破壊する方法を提供することを課題とする。
ジフテリア毒素は58,000Daのタンパク質であり、断片Aと断片Bの2つのドメインからなる。この毒素は、断片Bドメインを介して、細胞表面に存在するヘパリン結合EGF様成長因子「heparin-binding EGF-like growth factor（HB-EGF）」の前駆体/ジフテリア毒素受容体（DTR）に結合し、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。このエンドソームがリソソームと融合するとpHの影響により毒素自体のコンフォメーション変化が起こり、細胞質内に毒素の断片Aドメインが入る。そこで、断片Aドメインはペプチド鎖伸長因子（elongation factor 2）をADPリボシル化して不活性化し、タンパク質合成を阻害して細胞を死に至らしめる（Honjo, T. et al.（1968）J. Biol. Chem. 243, 3553-3555、Pappenheimer AM Jr.（1977）Ann. Rev. Biochem. 46, 69-94、Kohno, K. et al.（1986）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4978-4982、Mekada, E. et al.（1988）J. Cell Biol 107, 511-519、Moskaug, JO. et al.（1991）J. Biol. Chem. 266, 2652-9）。HB-EGFの前駆体に対するジフテリア毒素の結合能は動物種間により異なる。マウスのHB-EGF前駆体のジフテリア毒素に対する結合能はヒトやサルのそれよりも低く、ヒトやサルはジフテリア毒素に感受性を示すが、マウスは非感受性を示す（Mitamura T et al, Journal of Biological Chemistry, 270（3）. 1995. 1015-1019）。従って、ある種の器官、組織、または細胞に特異的なプロモーターの下流にヒト「HB-EGF（hHB-EGF）/DTR」遺伝子を接続し、これを導入したトランスジェニックマウスを作製し、標的の器官などで特異的に「hHB-EGF/DTR」遺伝子を発現させることができれば、ジフテリア毒素投与により任意の時期に目的の組織や細胞を破壊できると考えられる。
実際に、ジフテリア毒素非感受性であるマウスフィブロブラスト（fibroblast）由来L細胞に「hHB-EGF/DTR」遺伝子を導入して発現させると、該細胞が毒素感受性になることが示されている（Naglish, J. G. et al.（1992）Cell 69, 1051-1061）。
そこで、本発明者らは、特定の器官、組織または細胞に特異的なプロモーターとして肝実質細胞に特異的に発現するアルブミンのエンハンサー/プロモーター（Gorski, K. et al.（1986）Cell 47, 767-776、Pinkert, C. A. et al.（1987）Genes Dev. 1, 268-276）を選択し、該プロモーターの下流に「hHB-EGF/DTR」遺伝子を接続し、これをマウスに導入して、トランスジェニックマウスを作製した。次いで、本発明者らは、「hHB-EGF/DTR」遺伝子が実際にトランスジェニックマウス内の肝細胞に特異的に発現していることを確認し、さらに該トランスジェニックマウスにジフテリア毒素を投与して、肝実質細胞の破壊が進行するか否かを検討した。この結果、本発明者らは、ジフテリア毒素の投与によりその投与時期に応じて該トランスジェニックマウスにおける肝細胞を特異的に破壊することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、化合物の投与により所望の器官、組織または細胞を特異的に、かつ所望の時期に破壊しうる方法に関し、より具体的には、
（１）  特定の器官、組織または細胞に特異的に機能するプロモーターの下流に、宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体をコードする遺伝子を配置したことを特徴とする発現ユニット（但し、該化合物は、宿主内で人工的に発現させた受容体との結合により、受容体を発現している細胞に対して選択的な毒性を示す）、
（２）  宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物がジフテリア毒素であり、該毒素に対する受容体がHB-EGF（heparin-binding EGF-like growth factor）前駆体／ジフテリア毒素受容体である、（１）に記載の発現ユニット、
（３）  （１）または（２）に記載の発現ユニットを含むベクター、
（４）  （１）もしくは（２）に記載の発現ユニットまたは（３）に記載のベクターを保持する宿主細胞、
（５）  （１）もしくは（２）に記載の発現ユニットまたは（３）に記載のベクターを有する非ヒト動物、
（６）  （５）に記載の非ヒト動物に対し、宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物を特定の時期に投与することを特徴とする、該非ヒト動物内の該特定の時期の特定の器官、組織または細胞を特異的に破壊する方法、
（７）  非ヒト動物がマウスであり、宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物がジフテリア毒素である、（６）に記載の方法、
（８）  （６）または（７）に記載の方法により特定の器官、組織または細胞が破壊された非ヒト動物、
（９）  （１）に記載の化合物、および（１）に記載の発現ユニットを含むDNA、とを含むキット、に関する。
本発明は、特定の器官、組織または細胞に特異的に機能するプロモーターの下流に、宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体をコードするDNAを配置したことを特徴とする発現ユニットに関する。
本発明において用いられる「特定の器官、組織または細胞に特異的に機能するプロモーター」としては、特に制限はないが、例えば、マクロファージ、樹状細胞に対して特異的なH-2 class II遺伝子プロモーター、顆粒球に対して特異的なインターフェロンアルファー遺伝子プロモーター、Tリンパ球に対して特異的なインターロイキン2, 4, 5遺伝子プロモーター、腎臓ベーター細胞に対して特異的なインスリン遺伝子プロモーター、グリア細胞に対して特異的なGDNF遺伝子プロモーター、Ｂリンパ球に対して特異的なイムノグロブリン遺伝子プロモーター、神経細胞に対して特異的なBDNF遺伝子プロモーター、肝臓実質細胞に対して特異的なHGF遺伝子プロモーター、Tリンパ球、神経細胞に対して特異的なTHY-1遺伝子プロモーター、Ｔリンパ球に対して特異的なＴ細胞受容体遺伝子プロモーター、肝臓特異的なHMG（ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａリダクターゼ）遺伝子プロモーター、IX因子遺伝子プロモーターなどが挙げられる。
また、本発明において用いられる「宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物」としては、例えば、マウスに対してはジフテリア毒素などが挙げられる。該化合物としては、受容体遺伝子が導入されていない宿主に対しては毒性を示さず、該遺伝子が導入され、かつ該遺伝子が発現している特定の器官、組織または細胞に対しては選択的に毒性を示すものであれば、特に制限はない。
また、「宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体」としては、該化合物との結合により、該受容体を発現している細胞に対し毒性を示すものであれば特に制限はないが、その発現自体で細胞に悪影響を与える受容体は好ましくない。該受容体としては、例えば、ジフテリア毒素に対してHB-EGF（heparin-binding EGF-like growth factor）前駆体／ジフテリア毒素受容体などが好適に用いられる。
該受容体をコードするDNAとしては、該受容体タンパク質をコードしうるものであればその形態に制限はなく、cDNA、ジェノミックDNA、および化学合成DNAなどが含まれる。また、該受容体をコードするDNAは、常法（Molecular Cloning 2nd edition chapter 16,17 Cold Spring Harbor Laboratory Press）により調製することが可能である。
プロモーターの下流への該受容体をコードするDNAの配置は、常法（Molecular Cloning 2nd edition chapter 16,17 Cold Spring Harbor Laboratory Press）により行うことが可能である。これにより本発明の発現ユニットが調製される。
また、本発明は上記発現ユニットを含むベクターに関する。
本発明のベクターとしては、真核動物で発現可能な遺伝子を保持するものであれば特に制限されず、例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-Dextran法、リポフェクション法、リポソーム法、ＨＶＪ膜融合リポソーム法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃および電気穿孔法による発現プラスミドベクターは原理上宿主の種類に関係なく利用可能であり、好ましい。また宿主に対し感染指向性を持つ種々のレトロウイルスベクターが利用可能である。その他アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ＨＩＶベクター、シンドビスウイルスベクター等が利用可能である。
本発明のベクターへの発現ユニットの挿入は、例えば、所望の核酸断片を所望の制限酵素消化によってユニーク制限部位に粘着末端を形成するように処理し、この末端と適合性のあるベクター由来核酸断片を結合することにより行うことができる（Molecular Cloning 2nd edition chapter 16,17 Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
また、本発明は、上記ベクターを保持する宿主細胞に関する。
本発明のベクターが導入される宿主細胞としては、種々の動物細胞を用いることができ、特に制限はない。
宿主細胞へのベクターの導入は、以下の方法で行うことが可能である。例えば、化学的手法としては、リン酸カルシウム法（Molecular Cloning,16.32,Cold Spring Harbor Press（1989））、DEAE-dextran法（Molecular Cloning,16.41,Cold Spring Harbor Press（1989））、リポフェクション法（Ann-N-Y-Acad-Sci. 716, 23-34（1994））、リポソーム法（Ann-N-Y-Acad-Sci. 716, 144-153（1994））等が挙げられる。また最近では、ポリリジン等のポリカチオンに蛋白質や糖を結合させた遺伝子キャリアーシステムについて研究がなされている（J. Controlled Release. 19, 269-274（1992））。物理的手法としては、核酸の細胞への直接注入法であるマイクロインジェクション法（Hypertension. 22, 599-607（1993））、核酸に覆われた金などの微粒子を細胞に衝突、貫入させる遺伝子銃（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568（1990））、電気穿孔法（Cancer. Treat. Rev. 20, 105-115（1994））等が挙げられる。しかし、これらの方法はいずれも導入遺伝子を細胞の染色体DNA上に組み込む機能が備わっておらず、このため長期的な遺伝子の維持またはその発現は困難である。好ましくは、遺伝子導入領域に核酸を挿入させるのに十分な時間、宿主細胞の中に該核酸自身を保持するための適当な要素を有するベクターである。このようなベクターは高等な真核細胞に入ること、好ましくは染色体内に組み込まれることが可能でなくてはならないが、所望の期間宿主外由来受容体遺伝子を発現する能力を保持するベクターであれば染色体外に核酸を保持するタイプのベクターも利用可能である。具体的には、組換えウイルスベクターが挙げられる。組み換えウイルスベクターとしては、例えば、それぞれ、その由来となるウイルスによりアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等の種類が挙げられる。また、特定の塩基配列を認識する蛋白質とインテグラーゼとを利用して、所望の染色体位置、もしくは核酸領域に外来遺伝子を導入する方法も適用可能である（Science, 267,1443-1444（1995））。
また、本発明は、上記発現ユニットまたは上記ベクターを有する非ヒト動物、および化合物の投与による該非ヒト動物内の特定の器官などの破壊方法に関する。本発明の非ヒト動物は、導入されたプロモーターの機能に応じて特定の器官、組織、または細胞に特異的に上記化合物の受容体を発現するという特徴を有する。従って、本発明の非ヒト動物に対し、該化合物を投与すれば、特定の器官、組織または細胞に特異的に発現している受容体との結合により、該特定の器官などに対し毒性を示し、化合物の投与時期に応じて、該非ヒト動物内の特定の器官などを特異的に破壊することが可能である。化合物の投与時期としては、特に制限はないが、血中の化合物濃度が「宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体」の半飽和濃度を充分に超える時期が好ましい。
該非ヒト動物は、トランスジェニック動物作成法としてして知られる以下の方法により作製することが可能である。例えば、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接注入する方法（マイクロインジェクション法／Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7380-7384（1980））、組換えレトロウイルスベクターを用いて遺伝子を導入する方法（レトロウイルス法／Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6148-6152, 6927-6931, 8587-8591（1985））、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9065-9069（1986））等が挙げられる。基本的にはトランスジェニックマウスにおける方法で作出することが可能であり、トランスジェニックマウスの作製方法としては３つの方法が知られている（Hogan B.ら,「マウス胚の操作マニュアル」近代出版,東京,1989、野村達次ら,「発生工学実験マニュアル」,講談社,東京,1987、山村研一,「マウスから見た分子医学」,南江堂,東京,1993）。例えば、受精卵を採取し、単離した遺伝子をマイクロマニュピレーターを用い、受精卵の前核中に注入し、得られた受精卵を卵管へ移入する方法が用いられる。またESクローンに電気穿孔法を用いて所望の遺伝子を導入し目的細胞を薬剤で選抜し、マイクロマニュピレーターを用い、受精卵に注入しキメラ胚を作製して同様にトランスジェニックマウスを作製することも可能である。
作出された非ヒト動物は、組織および細胞特異的な遺伝子プロモーターの発現により、特異的な細胞に由来する疾患の病態モデル動物の作製、具体的には糖尿病モデル、障害性神経疾患のモデル、特定の発達段階で記憶に関与する神経細胞をノックアウトするにより、記憶のメカニズム研究用のモデル動物を作製することができる。また、所望の時期に動物の成長を停止させ、小型の動物を作製することも可能である。
また、本発明は、宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物、および特定の器官、組織または細胞に特異的に機能するプロモーターの下流に、宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体をコードするDNAを配置したことを特徴とする発現ユニットを含むDNA、とを含むキットに関する。例えば、本発明のキットに含まれる「発現ユニットを含むDNA」を動物細胞に導入してトランスジェニック動物を作出し、所望の時期に本発明のキットに含まれる「宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物」を投与することで、該化合物の投与時期に応じて該トランスジェニック動物内の特定の器官などを特異的に破壊することができる。
【図面の簡単な説明】
図１において、Ａは、プラスミド「pMS7」の構造を示す図である。Ｂは、本発明においてトランスジェニックマウスの作製のために受精卵に導入したトランス遺伝子の構造を示す図である。
図２において、Ａ上段は、トランスジェニックマウス（Tg16）の各種器官における「hHB-EGF/DTR」の発現を検出したノーザンブロッティング解析の結果を示すX線フィルム像である。Ｂ上段は、トランスジェニックマウスの系統別ノーザンブロッティング解析の結果を示すX線フィルム像である。Ｃ上段は、Tg24系統内でのノーザンブロッティング解析の結果を示すX線フィルム像である。なお、下段には上段に対応する器官の全RNAの電気泳動像を示した。
図３は、肝切片における「hHB-EGF/DTR」の発現を検出したインサイチューハイブリダイゼーションの結果を示す顕微鏡写真である。ＡおよびＣは、トランスジェニックマウスTg16の肝切片を用いて検出した。ＡはhHB-EGFアンチセンスプローブを用いたものであり、ＣはhHB-EGFセンスプローブを用いたものである。また、Ｂは野生型マウスの肝切片で検出したものである。
図４は、トランスジェニックマウスTg16における毒素投与後のGOTの値の変化を経時的に測定した結果を示す図である。
図５は、トランスジェニックマウスTg16における毒素投与後のGPTの値の変化を経時的に測定した結果を示す図である。
図６は、トランスジェニックマウスTg24における毒素投与後のGOTの値の変化を経時的に測定した結果を示す図である。
図７は、トランスジェニックマウスTg24における毒素投与後のGPTの値の変化を経時的に測定した結果を示す図である。
図８は、トランスジェニックマウスTg67における毒素投与後のGOTの値の変化を経時的に測定した結果を示す図である。
図９は、毒素投与後35時間目の肝細胞切片の顕微鏡写真像である。Ａは野生型マウスを用いたものであり、ＢはトランスジェニックマウスTg16を用いたものである。なお、図中の「Ｐ」は門脈（portal vein）を示し、「Ｃ」は中心静脈（central vein of liver）を示す。
図１０は、野生型マウスへのジフテリア毒素投与後の血中の該毒素濃度を経時的に測定した結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ジフテリア毒素の精製
ジフテリア菌（PW8株、凍結乾燥）を400μlの滅菌蒸留水に懸濁した。これを1.5%アガープレート培地に植菌し、37℃で24時間培養した。単一コロニーを2.5ml、50mlの液体培地で順に前培養し、1lの液体培地で本培養した。前培養および本培養は、250rpm、35℃で24時間行った。また、通気性を高めるために、培養フラスコのフタには滅菌ガーゼを使用した。ジフテリア毒素の調製には、上記の方法で、培養液を8l用意した。遠心（4000rpm、15分、4℃）により、培養上清を回収し（できるだけ菌体を除く）、最終濃度が0.1mMになるようにフェニルメチルスルフォニルフルオライド（PMSF）を添加した。次に、限外ろ過膜（Millipore社製のプレップスケールスパイラルUFカートリッジ）を用いて、培養上清を500mlに濃縮した。最終濃度40%の硫化アンモニウムを加え、4℃で30分間ゆっくりと撹拌し、その後、遠心（10000rpm、30分、4℃）により、沈殿を回収した。この沈殿を緩衝液A（25mM NaH2PO4、25mM Na2HPO4、150mM NaCl、0.1mM PMSF、pH6.5）に再溶解（全量を500ml）し、再度、最終濃度40%の硫化アンモニウムを加え、4℃で30分間ゆっくりと撹拌し、その後、遠心（10000rpm、30分、4℃）により、沈殿を回収し、緩衝液Aで溶解（全量を100ml）した。予め緩衝液B（20mM Tris-HCl、0.1mM PMSF、pH7.5）で平衡化した「DEAE sepharoseFF」（Pharmacia社製）カラム（径2.5mm×200mm）に緩衝液Bで20倍希釈したサンプルの半量（1l）を流した。流速は100ml/hrとした。同流速で、0.2M NaClを含む緩衝液B 500mlでサンプルの溶出を行った。残りのサンプル（1l）についても同様の操作を行った。上記の2回のDEAEカラムクロマトグラフィーで得られた溶出画分（1l）を、限外ろ過膜を用いて、溶媒をPBS（-）に置換し、濃縮した。これにより最終濃度が5.92mg/mlのジフテリア毒素を得た。
［実施例２］プラスミドおよび導入遺伝子の構築
導入遺伝子を調製するために「pRcHBEGF」（Iwamoto, R. et al.（1994）EMBO 13, 2322-2330）よりヒトHB-EGF cDNAをBam HI、Not Iで切り出し、クレノウ断片（DNAポリメラーゼI、Toyobo社製）で平滑化後、「EcoRI linker」（Takara社製のPhosphorylated linker）を付け、いったんpBluescript（SK-）に挿入した（このプラスミドを「pMS6-1」と命名した）。該プラスミドから、再びEcoRIで断片を切り出し、「pBstN」（奈良先端科学技術大学院大学動物分子工学小林和人博士より供与）のEcoRI部位に挿入し、プラスミド「pMS6」を作成した。次に、アルブミンエンハンサープロモーターを「p2335A-1」（大阪大学細胞工学センター金田安史博士より供与された。該プロモーターの調製については、文献「Gorski, K. et al.（1986）Cell 47, 767-776」参照）よりNot I、Bam HIで切り出し、「pMS6」のβ-グロビンイントロン（β-globin intron）の5'側のNot I、Bam HI部位に挿入し、「pMS7」とした（図１）。ベクターの除去は、「pMS7」をNot I、Xho Iで処理し、0.8%アガロース電気泳動によって分離し、「Prep-A-Gene DNA精製kit」（Bio-Rad社製）あるいは「Ultrafree-MC 0.45mm」（Millipore社製）によって行った。インジェクションには塩化セシウムを用いた密度勾配遠心法によって精製したものを用いた。
［実施例３］トランスジェニックマウスの作製
マウスはICR（日本クレア社から購入）を使用した。
（１）受精卵の採取
採卵予定日より3日前の午前10時に雌マウスに牝馬血清生殖腺刺激ホルモン（pregnant mare serum gonadotrophin（PMSG）、セロトロピン、帝国臓器社製）を5IU/匹腹腔内投与した。採卵予定日の20時間前（前日の午後2時）にヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン（human chorionic gonadotrophin（hCG）、プベローゲン、三井ゾーキ社製）を5IU/匹腹腔内投与し、雄マウスと同ケージにて飼育交配させた。翌朝雌マウスの卵管を切除し、実体顕微鏡下にて受精卵をヒアルロニダーゼ培養液中（1mg/ml、Sigma社製）で卵丘細胞を除去し、受精卵を「PB1」（140mM NaCl、2.7mM KCl、8mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、1mM CaCl2、0.5mM MgCl2、6H2O、5.6mMグルコース、9mMピルビン酸ナトリウム、100IU/mlペニシリンGカリウム、3mg/mlウシ血清アルブミン）培地中で洗浄した。さらにパラフィンオイルで覆われた「HP」（88mM NaCl、4.8mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO47H2O、1.7mM乳酸カルシウム、23mM NaHCO3、5.6mMグルコース、21.6mM乳酸ナトリウム、0.2mMピルビン酸ナトリウム、75μg/mlペニシリンGカリウム、50μg/ml硫酸ストレプトマイシン（streptomycin sulfate）、3mg/mlウシ血清アルブミン）培養液液滴中でインジェクションまで37℃、5%CO2中で培養した。
（２）マイクロインジェクションと移植
3.2ng/ml（注入量を2pl、1bpを660ダルトンとして6kb DNAが1000コピー入るように計算）のDNA（図1B）を受精卵の雄性前核中にインジェクションした。この卵を１時間37℃、5%CO2中で培養した後、偽妊娠マウスの卵管に移植した。胚操作を行い、78匹のマウスを獲得した。
（３）PCR解析（トランスジェニックマウス判定）
PCR緩衝液（50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.0、1.5mM MgCl2、0.1%（W/V）ゼラチン、0.45% NP-40、0.45% Tween20、500μg/mlプロテアーゼK）100ml中に3週令マウスの耳片を少量入れ、55℃で1時間インキュベートした後95℃で5分の処理でプロテアーゼKを失活させ、この溶解物（lysate）5μlを用いてPCRを行った。プライマーには、ヒトHB-EGF cDNAに特異的なプライマー「M1」（5'-GCTCTTTCTGGCTGCAGTTC-3'（配列番号：１））およびプライマー「M2」（5'-GCGATTTTCCACTGGGAGGC-3'（配列番号：２））を用いた。また反応には「rTaq DNA Polymerase」（2U, Takara社製）を用い、「94℃で1分、58℃で1分、72℃で1分」の処理を35サイクル行った。0.8%アガロースゲルを用いてPCR産物を電気泳動した。PCR解析の結果、78匹のマウスの内、6検体で約430bpのバンドが検出された。即ち、6匹（Tg16（雄）、Tg18（雄）、Tg24（雄）、Tg51（雄）、Tg62（雌）、Tg67（雄））のトランスジェニックマウスが得られた。これらのF1およびF2トランスジェニックマウスを以下の実験に用いた。
（４）ノーザンブロッティング解析
得られたトランスジェニックマウスが肝特異的に「hHB-EGF/DTR」を発現していることを確かめるために、「Tg16」と「Tg24」の肝臓、腎臓、脾臓、筋、心臓および肺のノーザンブロッティング解析を行った。具体的には、6〜8週令マウスを頸椎脱臼して、肝臓、腎臓、脾臓、骨格筋、心臓および肺の摘出を行い、AGPC法（Han, J. H. et al.（1987）Biochem. 26, 1617-25）によりRNAを抽出した。全RNA 15μgを1%アガロース、2%ホルマリンゲルで電気泳動後、ナイロン膜（Hybond-N、Amersham社製）に20×SSCを用いてブロットし、RNAの膜への固定は80℃、2時間でベーキング（baking）することにより行った。42℃で2時間のプレハイブリダイゼーション（5×SSPE、50%ホルムアミド、5×デンハルト、0.5% SDS、20μg/ml牛胸腺DNA）を行った後、[α-32P]dCTPで標識した「hHB-EGF」cDNA（783bp）断片をプローブとして42℃で一晩ハイブリダイゼーションした。なお、プローブ作製は「random primer DNA laveling kit ver.2」（Takara社製）により行った。「6×SSC、0.1% SDS」により室温で10分の処理を2回行い、「2×SSC、0.1% SDS」により室温で10分の処理を2回行い、さらに「0.1×SSC、0.1% SDS」により55℃で5分の処理を1回行って洗浄し、X線フィルム（Kodak社製）に16時間感光させシグナルを検出した。この結果、「hHB-EGF/DTR」の発現は他臓器ではみられず、肝特異的であることが確かめられた（図2A）。また、トランスジェニックマウスの系統間・系統内での「hHB-EGF/DTR」発現レベルをノーザンブロッティング解析により検討した。この結果、トランスジェニックマウスの「hHB-EGF/DTR」発現レベルは系統間で異なっており、本実施例で実際に毒素投与を行った3個体については、「Tg16」が最も高い発現レベルを示し、「Tg67」が最も低い発現レベルを示した。「Tg24」はこれらの間の発現レベルを示した（図2B）。しかし、同腹子間での「hHB-EGF/DTR」発現レベルは一致していた（図2C）。
［実施例４］インサイチューハイブリダイゼーション
さらに、「hHB-EGF/DTR」の発現が肝細胞特異的であることを確かめるために、「Tg16」の肝切片を用いて、インサイチューハイブリダイゼーションを行った。
（１）標本の作製
8週令マウス個体より肝臓を取り出し、直ちにドライアイスで凍結し、厚さ７μmで切片を作製し、シランコートスライドグラスに貼り付け、インサイチューハイブリダイゼーションに用いるまで-80℃で保存した。
（２）プローブの作製
インサイチューハイブリダイゼーションのプローブの作製のために「pRcHBEGF」（Iwamoto, R. et al.（1994）EMBO 13, 2322-2330）より「hHB-EGF」cDNAをBgl II、Sal Iで切りだし、pBluescript（sk-）のBam HI、Sal I部位に接続し、プラスミド「pMS10」を作製した。「pMS10」をアンチセンス鎖作製のためにXba Iで、センス鎖作製のためにXho Iでそれぞれ制限酵素消化し、得られた鋳型DNAを「Dig DNA labeling mixture」（Boehringer社製）を用いて標識した。なお、アンチセンス鎖作製のためにはT7ポリメラーゼ（Promega社製）、センス鎖作製のためにはT3ポリメラーゼ（Promega社製）を用いた。
（３）標本の前処理
切片を4%ホルムアミド、0.1Mリン酸緩衝液（20mM NaH2PO4、80mM Na2HPO4 pH7.4）で室温20分固定し、0.1Mリン酸緩衝液で２回洗浄した後、0.2M HCl、0.1Mリン酸緩衝液で室温20分内因性のアルカリフォスファターゼを失活させ、再び0.1Mリン酸緩衝液で2回洗浄した。「10μg/mlプロテアーゼK、50mM Tris-Cl、5mM EDTA（pH8.0）」で室温にて5分間処理し、0.1Mリン酸緩衝液で２回洗浄し、「4%ホルムアルデヒド、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）」で固定した後、「0.25%無水酢酸、0.1Mトリエタノールアミン溶液」で10分間アセチル化した。0.1Mリン酸緩衝液で洗浄した後、アルコール系列およびクロロホルムにて脱水脱脂後、風乾した。
（４）ハイブリダイゼーション
まずハイブリダイゼーション緩衝液（10% デキストラン硫酸ナトリウム（dextran sulfate Na）、20mM Tris-Cl（pH8.0）、0.3M NaCl、0.2% sarcosyl、0.2mg/ml変性サケ精子DNA、500ng/ml酵母tRNA、1xデンハルト溶液、50%ホルムアミド）のみを用いて37℃で60分間湿箱中でプレハイブリダイゼーションを行い、続いてDIG標識したプローブを含んだハイブリダイゼーション緩衝液をスライド当たり100mlのせて湿箱中にて55℃１晩ハイブリダイゼーションを行った。4xSSCで60℃にて20分、高ストリンジェンシー（High stringency）溶液（50%ホルムアミド、2xSSC）で60℃にて30分間洗浄した。RNase緩衝液（10mM Tris-Cl pH7.4,1mM EDTA pH8.0, 0.5M NaCl）で37℃にて10分間の洗浄を3回行い、その後2μg/mlの「RNase A」（Sigma社製）を含んだRNase緩衝液で37℃で30分間処理し、再びRNase緩衝液で37℃10分間洗浄した。さらに高ストリンジェンシー（High stringency）溶液で60℃にて30分洗浄した後、「DIG nucleic acid detection kit」（Boehringer社製）に従って発色を行った。この結果、「hHB-EGF/DTR」の発現は肝非実質細胞ではみられず、肝細胞特異的であることが確かめられた（図3A）。なお、野生型マウスの肝切片（図3B）、およびセンスプローブを使用したもの（図3C）では、シグナルは検出されなかった。
［実施例５］血清中GOT（glutamic oxaloacetic transaminase）およびGPT（glutamic pyruvic transaminase）活性値の測定
得られたトランスジェニックマウスは肝細胞特異的に「hHB-EGF/DTR」を発現していた。そこで、次に、毒素投与により肝細胞が特異的に破壊されることを調べるために、「Tg16」、「Tg24」、「Tg67」系統のマウスに実際にジフテリア毒素を投与して、肝障害の有無を検討した。毒素投与後の肝障害の測定は、血清中のGOT、GPT値の測定にて行った。なお、GOTおよびGPTは、肝障害のマーカーとなりうる酵素であり、肝障害が生じると該酵素の活性が増加することが知られている。投与した毒素量は5種類で、体重（kg）当たり50μg、5μg、500ng、50ng、5ngである（以下、投与毒素量は「μg/kg DT」または「ng/kg DT」と示す）。また、各毒素濃度で用いたマウスの数は3匹である。具体的には、毒素投与の12時間前、投与後12〜120時間（12時間おきに）、6〜8週令マウスの尾の先端から100μlの採血を行った。10分間室温で血液凝固させ、4℃にて10,000rpmで10分間の遠心分離により血清を得た。「GOT、GPT活性値測定キット」（トランスアミナーゼC-テストワコー、和光純薬社製）を用いてGOT、GPT活性値測定を行った。また、毒素投与は生理的食塩水を用いて適当な濃度に希釈した毒素溶液100μlを背筋へ筋注することにより行った。この結果、野生型マウスへの50μg/kg DTの投与では、血清中GOT、GPT値は正常であった（図4、5）。しかし、図4、5で示すように、「Tg16」では500ng/kg DTの投与により約12時間後に血清中GOT、GPT値が上昇し始め、約60時間で死亡した。50ng/kg DTの投与では約50時間後に血清中GOT、GPT値が上昇し始め、72時間でピークに達し、120時間前後で正常値に回復した。また、そのピークはGOTで正常値の4倍、GPTで10倍であった。5ng/kg DTの投与では正常値を示していた。「Tg24」でも500ng/kg DTの投与により約12時間後に血清中GOT、GPT値が上昇し始め、約55時間で死亡した（図6、7）。50ng/kg DTの投与では約50時間後に血清中GOT、GPT値が上昇し始め、84時間でピークに達し、120時間前後で正常値に回復した（図8）。また、そのピークはGOTで正常値の3倍、GPTで5倍であった。5ng/kg DTの投与では正常値を示していた。「Tg67」では500ng/kg DTの投与により約24時間後に血清中GOT、GPT値が上昇し始めるが、60時間でピークに達し、120時間前後で正常値に回復した。また、そのピークはGOTで正常値の7倍、GPTで20倍であった。50ng/kg DT、5ng/kg DTの投与では正常値を示していた。さらに、50、5μg/kg DTの投与では、この3系統とも約12時間後に血清中GOT、GPT値が上昇し始め、約30〜50時間で死亡した。
［実施例６］組織標本作成
また、毒素投与による肝とそれ以外の組織への影響を調べるために、HE染色法による、肝臓、腎臓、脾臓、心臓および肺の組織学的観察を行った。検体には、500ng/kg DTの投与後35時間で死亡した「Tg16」と50μg/kg DTの投与後35時間の野生型マウスを用いた。具体的には、心停止直後に臓器の摘出を行い、10%中性ホルマリンにより固定し、24時間後PBS（-）に置換し、パラフィン切片作製後ヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）した。この結果、野生型マウスの肝組織は正常な組織像を示していたが、「Tg16」では広範囲での肝細胞の壊死、肝細胞内での脂肪の蓄積が観察され、肝を構成するその他の細胞には異常は見られなかった（図9）。また、この「Tg16」と野生型マウスの腎臓、脾臓、心臓および肺は正常な組織像を示していた。この結果からジフテリア毒素の投与による影響はトランスジェニックマウスの肝細胞に特異的であり、その影響の程度は、「Tg16」、「Tg24」、「Tg67」という順に小さくなっていき、「hHB-EGF/DTR」の発現量と正の相関関係があることが判明した（図2B、図4〜8）。
［実施例７］血中ジフテリア毒素の濃度測定
毒素投与後の体内での毒素濃度を測定した。野生型マウスに上記の方法で体重kgあたり50mgの毒素を投与し、投与後1、2、4、7、24時間に前述した方法で採血した。この血液と既知の濃度の毒素を毒素感受性細胞であるvero細胞（ATCC CRL-1586、久留米大学分子生命科学研究所目加田教授より供与された）に投与し、タンパク質合成50%阻害、「medium effective dose」（ED50）を比較することで血中ジフテリア毒素の濃度を算出した。タンパク質合成阻害率の具体的な測定方法は以下に示す。
24穴のプラスティックdish（corning）に5x104個となるよう培養細胞（vero細胞）をまき、その培養液中（500ml）に種々の濃度（最終濃度;0、10-3、10-2、10-1、1、10ng/ml）のジフテリア毒素または種々の希釈率の血液（最終濃度;1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5%）を5μl加えて37℃で6時間培養し、200mlのメチオニン・システイン不含培地（Gibco社製）に交換後、35Sラベル化メチオニン・システイン（5μCi/ml）を加えて１時間取り込ませた後PBS（-）で洗浄、細胞を0.1N NaOHで溶解し10%トリクロロ酢酸を加えた。生成した沈殿物を10穴吸引式グラスフィルター（glass filter）フォルダーを用いてグラスフィルターに吸着させ、その放射活性を液体シンチレーションカウンター（Beckman社製）で測定した（Kohno, K. et al.（1985）Somatic Cell Molec. Genet. 11, 421-431、Umata, t. et al.（1990）J. Biol. Chem. 265, 21940-21945）。この結果、図11が示すように、血中ジフテリア毒素の濃度は毒素投与後2〜4時間でピーク（1mg/ml）に達し、24時間後には100ng/mlであった（図10）。
［実施例８］「hHB-EGF」発現による影響
マウス胚に導入された「hHB-EGF」はジフテリア毒素の受容体としてだけでなく、成長因子としての機能ももつ。従って、このトランスジェニックマウスに肝形成障害が生じることも予想された。しかし、図2で示したように「hHB-EGF」は過剰発現しているにもかかわらず、肝の形態学的・組織学的異常は見られなかった。また、体重当りの肝重量を測定した結果、野生型マウスとトランスジェニックマウス（Tg16）で差はなく、肝重量は体重の約6、7%であった。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、特定の器官などを特異的に破壊できるため、目的とする細胞が個体内に散在する場合に該細胞だけを効率良く除去することができないという外科的除去の問題点もない。また、本発明によれば、化合物の投与時期に応じて標的器官などを破壊し得るため、標的器官などが発生過程に必須な場合には個体が胎児期に死亡してしまい出生後の解析が不可能であった従来の毒素を発現させる方法の問題点も有しない。即ち、本発明により、空間的、時間的に制御可能な細胞のノックアウト法が提供された。
配列表
（１）出願人氏名又は名称：株式会社ディナベック研究所
（２）発明の名称：ノックアウト動物
（３）整理番号：Ｄ３−９０２ＰＣＴ
（４）出願番号：
（５）出願日：
（６）優先権の基となった出願をした国名及び出願の番号：
日本国  平成９年特許願第３３２４７号
（７）優先日：１９９７年１月３１日
（８）配列の数：２
配列番号：１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0004080544.tif 000002
配列番号：２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0004080544.tif 000003
【図１】
0004080544.tif 000004
【図２】
0004080544.tif 000005
【図３】
0004080544.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004080544.tif 000010
【図８】
0004080544.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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