(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸化カドミウムを主成分とし、少なくとも５％以上のカドミウム原子が正に荷電しており、かつ、結晶性構造を有するナノストランドと核酸とを接触させて核酸をナノストランドに結合させてなることを特徴とするナノストランドの核酸処理方法。
【請求項２】
水酸化カドミウムを主成分とし、少なくとも５％以上のカドミウム原子が正に荷電しており、かつ、結晶性構造を有するナノストランドに核酸を含む溶液を接触させてナノストランドに核酸が結合されてなるナノ複合体を形成させた後、このナノ複合体をフィルター濾過により分取して、溶液から核酸を除去することを特徴とするナノストランドの核酸処理方法。
【請求項３】
水酸化カドミウムを主成分とし、少なくとも５％以上のカドミウム原子が正に荷電しており、かつ、結晶性構造を有するナノストランドと核酸とを接触させてナノストランドに核酸が結合されてなるナノ複合体を形成させた後、このナノ複合体を含む水溶液に配位性化合物を添加してナノ複合体のナノストランドを消失させ、核酸を解放することを特徴とするナノストランドの核酸処理方法。
【請求項４】
配位性化合物が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、イミノ二酢酸、または、大環状ポリアミンのいずれかであることを特徴とする請求項３に記載のナノストランドの核酸処理方法。
【請求項５】
水酸化カドミウムを主成分とし、少なくとも５％以上のカドミウム原子が正に荷電しており、かつ、結晶性構造を有するナノストランドと核酸とを接触させてナノストランドに核酸が結合されてなるナノ複合体を形成させた後、このナノ複合体を含む水溶液の液性を弱酸性にしてナノ複合体のナノストランドを消失させ、核酸を解放することを特徴とするナノストランドの核酸処理方法。
【請求項６】
ナノ複合体を含む水溶液の液性をｐＨ３．０−ｐＨ５．０の範囲にしてナノ複合体中のナノストランドを消失させることを特徴とする請求項５に記載のナノストランドの核酸処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドを利用した核酸処理方法に関するものである。
【０００２】
さらに詳しくは、この出願の発明は、ナノストランドの表面が、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電しており、ナノストランドが剛直で、かつ、直径が核酸を構成するポリヌクレオチド鎖と同様に非常に細い構造を有していることを特徴としており、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドを利用した核酸処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の分離や精製技術は、バイオテクノロジーを支える重要な基盤技術となっている。生体組織からのＤＮＡの抽出では、タンパク質を化学的に処理して遠心分離により除去した後、アルコールを添加してＤＮＡのみを取り出す。高分子電解質であるＤＮＡは、溶媒の極性を低下させることで、容易に沈殿する。極微量のＤＮＡ試料の場合、ビーズやガラスパウダー等の固体表面に吸着させて、分離や精製等の核酸処理が行われている。血液や各種細胞からＲＮＡを抽出する場合には、界面活性剤により不溶化して分離後、水溶液中に再溶解させる手法が用いられる（たとえば、非特許文献１）。これらの抽出操作の前処理として、クロロホルム等の有機溶媒を用いることも多い。
【０００４】
また、上記のような方法により精製されたＤＮＡは、ＰＣＲ法より増幅されて電気泳動に用いられたり、直接、ＤＮＡチップを用いて診断に利用されたりする。最近では、金ナノ粒子を用いたマイクロハイブリダイゼーション法（たとえば、非特許文献２）により凝集性を制御することで、遺伝子診断を行うことも可能となりつつある。
【０００５】
一方、近年のナノテクノロジーの発展とともに、マイクロ流路と組み合わせたＤＮＡチップの研究も盛んに行われている。ＤＮＡは、剛直な高分子電解質に特徴的な電場応答あるいは流体力学的な特性を有しており、これらは、マイクロ流路中でのＤＮＡの捕捉・結合や濃縮に利用されつつある。また、光ピンセットを用いて、単一ＤＮＡ鎖をマニピュレーションする技術も、特に基礎研究分野において活発に利用されている。
【０００６】
このように、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を対象とする分離や精製、濃縮の核酸処理方法は、近年、著しく発達したように見える。しかしながら、実用面で広く普及している方法は、ポリアニオンとしての溶解性を利用した抽出、遠心分離、ビーズ等の固体表面への吸着、ゲル電気泳動などの技術を巧みに組み合わせることで、多様な要求に対応させているに過ぎない。また、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸に結合させる物質としては、ビーズ等の固体表面、ＤＮＡやＲＮＡ自身（ハイブリダイゼーション等）、結合性タンパク質、そしてカチオン性の界面活性剤に限られている。
【０００７】
ポリアニオンであるＤＮＡやＲＮＡ等の核酸（以下、「核酸」とする場合がある）が、正に荷電した物質と強く相互作用することは、容易に予想できる。しかしながら、溶液中で核酸との効率的な結合を実現するには、いくつかの構造上の特徴を必要とする。
【０００８】
カチオン性界面活性剤が形成する棒状ミセルは、高い表面電荷密度を有し、核酸と強く結合する。しかしながら、このようなミセルは、一般に数ｍＭ以上の濃度条件においてのみ形成される。また、分子設計により剛直なロット状ミセルを形成させることも可能であるが、この場合、核酸と強固な凝集体を形成してしまうという問題があった。一方、カチオン性の高分子は、ＤＮＡ鎖に不必要に絡みつき、そのコンフォメーションに重大な影響を与える。さらに、一旦絡み合って吸着したカチオン性高分子を核酸から取り除くことは、極めて難しい。
【０００９】
剛直、かつ、正に荷電した無機物のナノファイバーであれば、核酸と絡み合いを最小限に抑え、かつ強力な相互作用が得られるものと期待できる。たとえば、ある種の金属塩は、アルカリ性にすることで金属酸化物のナノファイバーを形成し、その表面は正に荷電していることが知られている（特許文献１）。
【特許文献１】特願２００３−０５２８７７号公報
【非特許文献１】Ｄ．  Ｅ．  Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．３６２，  ｐ１８６−１８８，  １９９３
【非特許文献２】Ｃ．  Ａ．  Ｍｉｒｋｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．  ３８２，  ｐ６０７−６０９，  １９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＤＮＡ等の核酸との強い相互作用を実現するためには、ナノファイバーの表面が、少なくともＤＮＡ等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電している必要がある。また、核酸との相補的な静電相互作用により効率的な補足を達成するには、ナノファイバーが剛直で、かつ、直径２ｎｍのＤＮＡ鎖と同様に非常に細い構造であることが望まれる。さらに、核酸の抽出や精製を行うためには、上記ナノファイバーを核酸から取り除く技術が必要になる。しかしながら、このような条件を満たすことのできるナノファイバーは、いまだ見つかっておらず、生物由来の物質を利用する方法（ハイブリダイゼーション等）を用いない限り、水溶液中の核酸を効率的に処理することができなかった。
【００１１】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ナノストランドの表面が、少なくともＤＮＡやＲＮＡ等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電しており、ナノストランドが剛直で、かつ、直径が核酸を構成するポリヌクレオチド鎖と同様に非常に細い構造を有しており、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドを用いて、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の抽出や精製等を行うための新しい核酸処理方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この出願の発明は、前記の課題を解決するために、発明者が鋭意研究を行った結果として、以下の（１）から（６）の発明を提供する。
（１）水酸化カドミウムを主成分とし、少なくとも５％以上のカドミウム原子が正に荷電しており、かつ、結晶性構造を有するナノストランドと核酸とを接触させて核酸をナノストランドに結合させてなることを特徴とするナノストランドの核酸処理方法。
（２）水酸化カドミウムを主成分とし、少なくとも５％以上のカドミウム原子が正に荷電しており、かつ、結晶性構造を有するナノストランドに核酸を含む溶液を接触させてナノストランドに核酸が結合されてなるナノ複合体を形成させた後、このナノ複合体をフィルター濾過により分取して、溶液から核酸を除去することを特徴とするナノストランドの核酸処理方法。
（３）水酸化カドミウムを主成分とし、少なくとも５％以上のカドミウム原子が正に荷電しており、かつ、結晶性構造を有するナノストランドと核酸とを接触させてナノストラン
ドに核酸が結合されてなるナノ複合体を形成させた後、このナノ複合体を含む水溶液に配位性化合物を添加してナノ複合体のナノストランドを消失させ、核酸を解放することを特徴とするナノストランドの核酸処理方法。
（４）配位性化合物が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、イミノ二酢酸、または、大環状ポリアミンのいずれかであることを特徴とする前記発明（３）に記載のナノストランドの核酸処理方法。
（５）水酸化カドミウムを主成分とし、少なくとも５％以上のカドミウム原子が正に荷電しており、かつ、結晶性構造を有するナノストランドと核酸とを接触させてナノストランドに核酸が結合されてなるナノ複合体を形成させた後、このナノ複合体を含む水溶液の液性を弱酸性にしてナノ複合体のナノストランドを消失させ、核酸を解放することを特徴とするナノストランドの核酸処理方法。
（６）ナノ複合体を含む水溶液の液性をｐＨ３．０−ｐＨ５．０の範囲にしてナノ複合体中のナノストランドを消失させることを特徴とする前記発明（５）に記載のナノストランドの核酸処理方法。
【発明の効果】
【００１３】
上記第１の発明によれば、ナノストランドがＤＮＡやＲＮＡ等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電しており、また、剛直な構造を有しているため、核酸と効率よく結合させることができる。
【００１４】
上記第２の発明によれば、ナノ複合体を除去することにより、ナノストランドとともに核酸を効率よく除去することができる。
【００１５】
上記第３の発明によれば、ナノストランドが消失し、ナノ複合体に含まれる核酸を解放し、回収することができる。
【００１６】
上記第４の発明によれば、上記第３の発明と同様な効果が得られ、ナノストランドが消失し、ナノ複合体に含まれる核酸をさらに効率よく解放し、回収することができる。
【００１７】
上記第５および第６の発明によれば、ナノストランドが消失し、ナノ複合体に含まれる核酸を解放し、回収することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものである。以下にその実施の形態について説明する。
【００１９】
この出願の発明において、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドは、金属酸化物を主成分としている。このナノストランドは、構成成分全体のうち、少なくとも５％以上の金属原子が正に荷電しており、かつ、ナノストランドは結晶性構造を有していることを特徴としている。なお、この出願の発明における、核酸としては、二本鎖型ＤＮＡ、一本鎖型ＤＮＡ、様々なＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等）、ＰＣＲ法等に利用されるオリゴヌクレオチド、あるいは、これらの混合物等を例示することができる。
【００２０】
この出願の発明のナノストランドは、発明者が、様々な金属酸化物のナノファイバーを研究する過程で、「金属原子が正に荷電」および「結晶性構造」の２つの特徴を同時に有することが、核酸の効率的な捕捉（結合）に重要であることを見出したことに基づくものである。すなわち、このナノストランドは、正に荷電した原子の割合が極めて高く、数ナノメートル以下の極めて細長い構造であり、さらに、結晶性の高い構造であることから剛直性をも有しているものである。なお、発明者は、ナノストランドの幅が２ｎｍ程度であ
っても結晶性であり得ることを高分解能電子顕微鏡の観察により確認している（図示せず）。
【００２１】
この出願の発明のナノストランドは、一般に、金属イオンの塩の水溶液と塩基性水溶液との混合液から形成される。特に２価の金属イオンの塩の水溶液から形成させることが好ましい。さらに、２価の金属イオンの塩の中でも、カドミウム塩であることが特に好ましい。代表的な例としては、硝酸カドミウム（Ｃｄ（ＮＯ３）２）等が挙げられる。ナノストランドの形成には、２価の金属イオンの塩を他の金属イオンの塩と組み合わせて用いることもできる。
【００２２】
ランタノイド等の３価の金属イオンは、一般に、中性条件下で柔軟なナノファイバーを形成することが知られている。しかし、このようなナノファイバーは、ファイバーを構成する３価の金属イオンと比較して、核酸との結合力が弱い。また、３価の金属イオンは、核酸を強力に凝集してしまい、このように凝集した核酸は、再び分散させることが困難となる。一方、１価の金属イオンでは、ナノストランド全体の５％以上の金属原子が正に荷電したナノストランドを形成することができない。
【００２３】
この出願の発明は、ナノストランドの水溶液に酸（たとえば、塩酸や硫酸等）を添加すると、ナノストランドは消失して金属イオンとなる。このことを利用して、ナノストランドに捕捉、結合された核酸をナノストランドから解放することが可能となる。ナノストランドは、核酸との効率的な結合のために、中性付近で形成されるものが好ましい。この中性付近とは、液性がｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の範囲のこと指す。
【００２４】
前述の「金属原子が正に荷電」および「結晶性構造」の２つの特徴は、ナノストランドの形態によって明記することができる。すなわち、この出願の発明のナノストランドの結晶性構造において、円相当径が１．０〜３．０ｎｍの範囲であることが好ましく、長さが少なくとも円相当径の１００倍以上であり、さらに曲率半径が少なくとも２０ｎｍ以上であるものが特に好ましい。
【００２５】
また、この出願の発明に係るナノストランドは、配位性化合物の添加により消失することが望ましい。配位性化合物としては、特に限定されるものではないが、金属イオンとの大きな錯形成定数を有するものが好ましい。このため、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、リン酸基、チオール基、スルフィド基などの配位性基を有する化合物が好ましく、これらの配位性基を複数有するキレート型の化合物がより好ましい。もちろん、上記の配位性基を組み合わせて有するものであってもよい。たとえば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、イミノ二酢酸、大環状ポリアミン等が挙げられる。また、金属イオンに配位し、不溶性あるいは難溶性の無機塩を作るようなイオンを添加してもよい。
【００２６】
この配位性化合物によりナノストランドを消失させる場合においては、液性が中性付近、すなわちｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の範囲で行われることが好ましい。
【００２７】
さらに、酸性水溶液の添加により、ナノストランドを含有する水溶液の液性を弱酸性とすることで、ナノストランドを消失させてもよい。この弱酸性とは、ｐＨ３．０−ｐＨ５．０の範囲であることが好ましい。
【００２８】
次に、この出願の発明におけるナノストランドを用いた核酸の処理方法を以下に説明する。
【００２９】
この出願の発明のナノストランドは、金属塩の水溶液に激しく攪拌しながら塩基性水溶液を一気に加えることで形成される。金属塩の濃度は、０．１〜１０ｍＭ程度が好ましい
。また、塩基性水溶液としては、たとえば０．１〜１０  ｍＭ程度の水酸化ナトリウム水溶液が好適に用いられるが、塩基性水溶液は、この例示に限定されるものではない。上記水溶液の温度は、０〜４０℃の範囲内が好ましく、室温付近がより好ましい。添加に要する時間は、水溶液の量にも依存するが、１分以内であることが好ましい。
【００３０】
金属イオンと水酸化物イオンの組成比は、ナノストランドの形成において、重要である。たとえば、硝酸カドミウムと水酸化ナトリウムから水酸化カドミウムのナノストランドを形成する場合には、水酸化物イオンの添加量は、カドミウムイオンに対して、０．５〜１．５倍の範囲が好ましく、０．５〜１．０の範囲がさらに好ましい。水酸化物イオンの添加量が少ない後者の範囲では、表面に多くの正電荷を有するナノストランドが形成される。ナノストランドの表面の電荷量は、複数のスルホン酸基を有する色素分子で滴定することができる。また、ナノストランドの長さ、円相当径、曲率半径ならびに結晶性は、高分解能電子顕
微鏡より評価できる。
【００３１】
このようにして形成されたナノストランドと核酸とを接触させることで、核酸をナノストランドに静電的に捕捉、結合させることができる。接触は、通常、ナノストランドと核酸の水溶液を混合することで行われる。混合は室温で行うことが好ましい。
【００３２】
ナノストランドは、ビーズやガラスパウダー等の固体の表面に固定化することができ、このような状態で核酸と接触させることも可能である。
【００３３】
上記の混合して接触させる際、ナノストランドの濃度は、ナノストランドを構成している金属原子の濃度に換算して、０．０５〜５ｍＭの範囲が適当である。また、核酸の水溶液の濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ以下が適当である。さらに、ナノストランドを構成している金属原子の濃度は、核酸を構成している核酸塩基の濃度に換算して、その２０倍以上あることが好ましい。ナノストランドの濃度に対する核酸の濃度の下限は、たとえば、ＤＮＡの濃度が４．０×１０−５ｍｇ／ｍｌの場合で、９５％以上のＤＮＡを捕捉することが可能であることが確認されている。すなわち、この出願の発明のナノストランドは、極めて低濃度の核酸を捕捉することができる。
【００３４】
上記のようにナノストランドと核酸を接触させることによって、核酸を捕捉（結合）して、ナノ複合体を形成させることができる。このナノ複合体は、遠心分離や濾過等で分離することが可能である。ナノ複合体は、核酸の濃度が高い場合、ゲル状の物質として得られ、核酸の濃度が低い場合、水溶液に分散したまま存在する。いずれの場合においても、ナノ複合体は、０．２μｍ程度の細孔を有するフィルターで濾過、分離することが可能である。
【００３５】
このナノ複合体を形成させた後、上記に例示した各種の配位性化合物の添加、または、液性を弱酸性（ｐＨ  ３．０−ｐＨ  ５．０の範囲が好ましい）とすることにより、ナノストランドが消失する。前者の場合、ナノストランドを構成している金属原子に錯化させるのに十分な量の配位性化合物を加えればよい。配位性化合物は、水溶液として添加することが好ましく、ナノ複合体の水溶液に近いｐＨに調製して添加することがより好ましい。たとえば、水酸化カドミウムのナノストランドとＤＮＡとのナノ複合体からＤＮＡを解放させるためには、ＥＤＴＡ・３ＮａＯＨ水溶液（９０ｍＭ、ｐＨ  ７．７）を用いることが好ましい。ナノ複合体からの核酸の解放の程度は、先の０．２μｍ程度の細孔を有すフィルターによる分離実験から評価することが可能である。
【００３６】
この出願の発明は、ナノ複合体を前記のフィルターを用いて、濾過することによりナノ複合体を取り除くことができ、その結果、ナノ複合体を構成している核酸も除去すること
ができる。すなわち、この出願の発明は、核酸を除去するための方法として用いることができる。
【００３７】
さらには、核酸を効率よく分離、精製、あるいは、濃縮することのできる核酸処理方法として、ナノ複合体を前記フィルターを用いた濾過により分取し、このナノ複合体に配位性化合物の添加、または、このナノ複合体を含有する水溶液の液性を弱酸性（ｐＨ３．０−ｐＨ５．０の範囲が好ましい）とすることにより、このナノ複合体中に含まれるナノストランドを消失させることに基づいた核酸処理方法としても活用することができる。
【００３８】
なお、ナノ複合体の分取には、上記のフィルターを利用する以外に、遠心分離処理によって行うことも可能である。
【実施例】
【００３９】
次に、実施例を示して、この出願の発明の特徴をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、適宜変更することができる。したがって、この出願の発明は、以下の実施例によって限定されるものではない。
（製造例１）
製造例１として、カドミウム塩の水溶液のｐＨを適当な範囲に設定することで、水酸化カドミウムのナノストランドが形成されることを示すために、透過型電子顕微鏡による観察を行った。
【００４０】
１６ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液の所定量に純水を加えて２０ｍＬにする。この水溶液を、４ｍＭの硝酸カドミウム（Ｃｄ（ＮＯ３）２）の水溶液２０ｍＬに激しく攪拌しながら一気に加える。図１には、１６ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液の使用量に対し、硝酸カドミウムの水溶液との混合後のｐＨをプロットした。水溶液のｐＨは、水酸化ナトリウムの使用量とともに変化する。
硝酸カドミウム単独の水溶液は、ｐＨ５．４４であるが、水酸化ナトリウムの使用量が２ｍＬでは、ｐＨ８．１９となる。ｐＨ値は、水酸化カドミウムの使用量が硝酸カドミウムに対して２倍量（すなわち、１０ｍＬ）になるまで緩やかに上昇し、その後、急激に上昇する。ｐＨ９以上の水溶液では、暫くして白色の沈殿が生じてくる。なお、製造例１での全ての溶液には、混合の際のｐＨの局所的な上昇を緩和するため、少量のポリアクリルアミン塩酸塩（モノマーの濃度として０．２ｍＭ）を加えてある。
【００４１】
図中の矢印で示したｐＨにおいて、約１ｍＬの水溶液を清浄なガラス基板上に展開し、透過型電子顕微鏡用のマイクログリットを浮かべて１分間放置し、過剰に吸着した水溶液を濾紙で拭った後、常温で乾燥させた。
【００４２】
図２から４には、このようにして得られた試料の透過型電子顕微鏡像を合わせて示す。なお、図１中に示した矢印ａは図２と、矢印ｂは図３と、矢印ｃは図４とそれぞれ対応している。ｐＨ８．４３の試料（図２）では、極めて細いナノストランドが形成されており、その長さは、数マイクロメートルを超えるものもある。ｐＨ８．５９の試料（図３）では、直径２００ｎｍ程度の球状の塊が見られる。この塊は、ｐＨ８．７５（図４）で六角形の微結晶へと成長する。この微結晶は、六方晶系の水酸化カドミウムである。
【００４３】
本製造例では、カドミウム塩の水溶液のｐＨを適当な範囲に設定することで、幅が３ｎｍ以下の水酸化カドミウムのナノストランドを優先的に形成できることを示している。また、図１から明らかなように、ナノストランドの長さは直径の１００倍以上であり、曲率半径は２０ｎｍ以上である。
（製造例２）
製造例２として、水酸化カドミウムの剛直なナノストランドが形成されることを示すた
めに、高分解能透過型電子顕微鏡による観察を行った。
【００４４】
４ｍＭの硝酸カドミウム（Ｃｄ（ＮＯ３）２）の水溶液２０ｍＬに、２ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液２０ｍＬを激しく攪拌しながら一気に加えた。この水溶液を５日間室温で放置した。溶液のｐＨは、７．９５であった。この水溶液の約１ｍＬを清浄なガラス基板上に展開し、高分解能電子顕微鏡観察用のマイクログリットを浮かべて１分間放置し、過剰に吸着した溶液を濾紙で拭った後、常温で乾燥させた。図５から図７には、このようにして得られた試料の透過型電子顕微鏡像を示す。図５、図６、図７は、それぞれ異なる倍率（各図中のスケールバーを参照）で撮影されたものである。
【００４５】
図５および図６から明らかなように、ナノストランドは、約２ｎｍの一定の幅を有する。
図５および図６より高倍率で撮影した図７では、幅１．９ｎｍのナノストランドに沿って斜めに０．２６ｎｍの周期構造を確認することができる。
【００４６】
図８には、水酸化カドミウムの結晶学的データ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｘｅｓ：ｈｅｘａｇｏｎａｌ、ａ：３．４９６Å、ｃ：４．７０２Å、Ｓｐａｃｅ  ｇｒｏｕｐ：Ｐ−３ｍ１）を用いて計算されたナノストランドの推定構造の模式図を例示した。まず、ナノストランドの直径（１．９ｎｍ）から、水酸化カドミウムのユニットセルが７つ配列していることを推定し、その断面が六角形であると仮定した。
この３７個のユニットセルのプレートを１ユニットづつずらしてパッキングした。このようにして得られた推定構造では、ナノストランドの成長方向に対して斜めの０．２６ｎｍの周期構造が完全に再現できている。
【００４７】
以上の結果から、本製造例のナノストランドが水酸化カドミウムと同じ単位格子から形成されており、１．９ｎｍという極めて細い構造にも関わらず、結晶性の剛直なナノストランドであることが確認できた。
（製造例３）
製造例３として、ナノストランド全体の５％以上の金属原子が正に荷電している水酸化カドミウムの剛直なナノストランドが形成できることを示すために、色素分子（Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ）による滴定を行った。
【００４８】
４ｍＭの硝酸カドミウム（Ｃｄ（ＮＯ３）２）の水溶液２００ｍＬに、４ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬを激しく攪拌しながら一気に加えた。この水溶液の所定量に純水を加えて２４ｍＬにし、１ｍＭのＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ水溶液（１ｍＬ）を攪拌しながら加え、１時間室温で放置した。Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅの最終的な濃度は、０．０４ｍＭである。また、水酸化カドミウムのナノストランドの使用量（すなわち、前述の所定量）は、カドミウム原子の最終的な濃度に換算して、０ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．３２ｍＭ、０．４８ｍＭ、０．６４ｍＭ、０．８０ｍＭ、０．９６ｍＭとなるようにした。
【００４９】
次に、上記７つの水溶液をそれぞれ０．２μｍの細孔を有するＷｈａｔｍａｎ  ＰＶＤＦフィルターで濾過し、濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した。
【００５０】
図９に例示したように、６０８ｎｍに位置するＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅの吸収ピークは、ナノストランドの混合量を段階的に増やすことで、化学量論的に減少した。このことは、ナノストランドとＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅからなる一定組成の沈殿が得られていることを意味する。全ての色素分子を沈殿させるのに必要なナノストランドの使用量は、カドミウム原子数に換算してＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ分子の２４倍であった。図中に示すように、この色素が４つのアニオン電荷を有することを考慮すると、ナノストランドを構成するカドミウム原子の約６分の１が正に荷電しているものと考えられる。
【００５１】
図１０は、製造例２での推定構造において、六角形のプレートの頂点が正に荷電していると仮定した場合の構造を例示した模式図である。この場合、断面の３７個のカドミウム原子の中で６個のカドミウム原子が正に荷電しており、全体のカドミウム原子数の約６分の１が正に荷電していることを説明することができる。
【００５２】
以上の結果から、本製造例の水酸化カドミウムによる剛直なナノストランドにおいて、ナノストランド全体の５％以上の金属原子が正に荷電していることを確認することができた。
（実施例１）
実施例１として、水酸化カドミウムの剛直なナノストランドがＤＮＡを捕捉（結合）し、配位性化合物の添加によりナノストランドが消失し、ＤＮＡが解放されることを示すために、紫外・可視吸収スペクトルの測定を行った。
Ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ（２００〜２５００ｂｐ、１ｍｇ／ｍＬ）とＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（０．０４ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液（ＤＮＡ混合溶液）を調製し、４℃で２日間放置した。この溶液１ｍＬを２４ｍＬの純水に希釈した（溶液１）。一方、４ｍＭの硝酸カドミウムの水溶液２０ｍＬに、２ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液４０ｍＬを激しく攪拌しながら一気に加えた。この溶液２４ｍＬに、先のＤＮＡ混合溶液１ｍＬを加えると、瞬時に白色のゲルが形成した（溶液２）。図１１に、溶液１と溶液２の様子を写真として例示した。さらに、別に準備した白色のゲルを含む溶液２に、９０ｍＭのＥＤＴＡ・３ＮａＯＨ水溶液（ｐＨ７．７２）を１ｍＬ加えると、ゲルが完全に消失した（溶液３）。また、コントロール実験として、先のＤＮＡ混合溶液１ｍＬを１．３３ｍＭの硝酸カドミウム水溶液２４ｍＬと混合した（溶液４）。
【００５３】
上記４つの水溶液をそれぞれ０．２μｍの細孔を有するＷｈａｔｍａｎ  ＰＶＤＦフィルターで濾過し、濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した。その結果を図１２に示す。溶液１のスペクトルは、フィルターで濾過する前と全く同じであった。すなわち、Ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡは、０．２μｍの細孔のＰＶＤＦフィルターを通過することができる。溶液１のスペクトルにおいて、２５８ｎｍでの吸収ピークは、主にＤＮＡ鎖の複素環に、３５３ｎｍの吸収ピークは、ＤＮＡ鎖にインターカレートしたＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に由来する。ナノストランドと混合した溶液２では、ＤＮＡ鎖やＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に由来する吸収ピークが全く観察されない。即ち、全てのＤＮＡ鎖は、ナノス
トランドと結合してゲル化し、フィルターで除去されている。一方、ＥＤＴＡを加えた溶液３では、これらピーク強度が完全に回復する。この結果は、ナノストランドを構成していたカドミウムイオンがＥＤＴＡ−Ｃｄ２＋錯体を形成し、ナノストランド自身が消失したため、ナノストランドに拘束されていたＤＮＡが解放されたことを示している。
【００５４】
また、コントロール実験として調製した溶液４では、溶液１と比較して吸収ピークの強度がやや減少した。この結果は、ＤＮＡ鎖がカドミウムイオンによって僅かに凝集していることを示している。しかしながら、カドミウムイオンによる凝集の効果は、ナノストランドによるゲル化の効果より著しく小さい。
【００５５】
以上の結果から、本実施例の水酸化カドミウムの剛直なナノストランドが、ＤＮＡを捕捉（結合）し、配位性化合物の添加により消失し、ＤＮＡを解放することが確認できた。（実施例２）
実施例２として、水酸化カドミウムの剛直なナノストランドがＤＮＡを効率的に捕捉することを示すために、蛍光スペクトルの測定を行った。
【００５６】
Ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ（２００〜２５００ｂｐ、１ｍｇ／ｍＬ）とＨｏｅ
ｃｈｓｔ  ３３３４２（０．０４ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液（ＤＮＡ混合溶液）を調製し、４℃で２日間放置した。この溶液を純水で１０分の１に希釈した（希釈溶液）。この希釈溶液１０μＬを２４．９９ｍＬの純水に希釈した（溶液１）。一方、４ｍＭの硝酸カドミウム（Ｃｄ（ＮＯ３）２）の水溶液２０ｍＬに、２ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液４０ｍＬを激しく攪拌しながら一気に加えた。この溶液２４．９９ｍＬに、先の希釈溶液１０μＬを加えた（溶液２）。
溶液１と溶液２をそれぞれ０．２μｍの細孔を有するＷｈａｔｍａｎ  ＰＶＤＦフィルターで濾過し、濾液の蛍光スペクトルを測定した。その結果を図１３に示す。溶液１では、３６０ｎｍの励起光を照射すると、４５０ｎｍにピークをもつＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の蛍光スペクトルが得られた。一方、溶液２では、この蛍光が確認できない。この実験条件では、ＤＮＡとＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の濃度は、それぞれ、４．０×１０−５ｍｇ／ｍＬ、１．６×１０−６ｍｇ／ｍＬである。このような条件でもＤＮＡの少なくとも９５％は、ＰＶＤＦフィルターによって濾過されている。
【００５７】
図１４には、実施例２でのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を含んだＤＮＡ鎖と水酸化カドミウムのナノストランドから形成されたゲルの構造を模式的に例示した。本実施例のナノストランドは、ＤＮＡ鎖（直径２ｎｍ）とほぼ同じ幅をもち、結晶性で剛直であり、かつ表面に正電荷が高密度にかつ周期的に配列していると考えられる。このため、ＤＮＡ鎖との相補的な静電相互作用が可能となり、低濃度のＤＮＡを効率的に捕捉、結合する。この図１４に示すように、ＤＮＡ鎖とナノストランドは、多くの部分で平行に配向しており、静電的に強く吸着しているものと考えられる。また、ＤＮＡ鎖とナノストランドは、互いに橋架することで、ゲルを形成する。この結果、本実施例の水酸化カドミウムの剛直なナノストランドは、ＤＮＡを効率的に捕捉、結合することが可能となる。
（実施例３）
実施例３として、水酸化カドミウムの剛直なナノストランドがＲＮＡを結合し、弱酸性にすることでナノストランドが消失し、ＲＮＡが解放されることを示すために、紫外・可視吸収スペクトルの測定を行った。
【００５８】
Ｂａｋｅｒ'ｓ  Ｙｅａｓｔ  ＲＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液（ＲＮＡ溶液）を調
製し、４℃で２日間放置した。
この溶液１ｍＬを２４ｍＬの純水に希釈した（溶液１）。一方、４ｍＭの硝酸カドミウム（Ｃｄ（ＮＯ３）２）の水溶液５ｍＬに、０．２１１ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液９５ｍＬを激しく攪拌しながら一気に加えた。この溶液２４ｍＬに、先のＲＮＡ溶液１ｍＬ  を加えた（溶液２）。さらに、別に準備した溶液２に、１６０ｍＭの塩酸水溶液を５０μＬを加えた（溶液３）。また、コントロール実験として、先のＲＮＡ溶液１ｍＬを０．２ｍＭの硝酸カドミウム水溶液２４ｍＬと混合した（溶液４）。
【００５９】
上記４つの水溶液をそれぞれ０．２μｍの細孔を有するＷｈａｔｍａｎ  ＰＶＤＦフィルターで濾過し、濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した。その結果を図１５に示した。溶液１のスペクトルは、フィルターで濾過する前と全く同じであった。すなわち、Ｂａｋｅｒ'ｓ  Ｙｅａｓｔ  ＲＮＡは、０．２μｍの細孔のＰＶＤＦフィルターを通過す
ることができる。溶液１のスペクトルにおいて、２５８ｎｍでの吸収ピークは、ＲＮＡ鎖の複素環に由来する。ナノストランドと混合した溶液２では、ＤＮＡ鎖の複素環に由来する吸収ピークが４７％減少した。すなわち、一部のＲＮＡ鎖は、ナノストランドと結合し、フィルターで除去されている。一方、ＨＣＬを加えた溶液３では、このピークの強度が増加する。この結果は、ナノストランドを構成していたカドミウムイオンが再溶解し、ナノストランド自身が消失したため、ナノストランドに拘束されていたＲＮＡが解放されたことを示している。
【００６０】
そして、コントロール実験として調製した溶液４では、溶液１と比較して吸収ピークの
強度がやや減少した。この結果は、ＲＮＡ鎖がカドミウムイオンによって僅かに凝集することを示している。
【００６１】
以上の結果から、本実施例の水酸化カドミウムの剛直なナノストランドが、ＲＮＡを捕捉（結合）し、弱酸性にすることで消失され、ＲＮＡを解放することを確認することができた。
【００６２】
なお、実施例３では、ナノストランドの濃度を実施例１の１５％に設定している。この値は、カドミウム元素の濃度として０．２ｍＭに対応し、正に荷電したカドミウムイオンの濃度として、０．０３３ｍＭに対応する。一方、実施例３の実験条件下のＲＮＡの濃度は、０．０４ｍｇ／ｍＬである。この値は、ＲＮＡのユニット分子量を３５０とすると、０．１１４ｍＭに対応することとなる。
したがって、混合溶液中のナノストランドが有する正の荷電量は、ＲＮＡの負の荷電量の約３０％に相当する。実施例３におけるＲＮＡの結合率は４７％であり、ＲＮＡを効率的に捕捉・結合していると言える。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
この出願の発明は、金属酸化物を主成分とし、核酸を効率的に捕捉（結合）するための優れた化学的、構造的な特徴を有するナノストランドを提供する。また、このナノストランドは、配位性化合物の添加、あるいは弱酸性にすることで消失し、核酸を解放することができる。このため、微量な生体試料からの核酸の抽出あるいは除去、核酸の分離や精製や濃縮などを効率的に行うことが可能となる。その結果、この出願の発明のナノストランドは、遺伝子診断やＤＮＡ鑑定、核酸に関連する医学的、生物学的な研究や治療等に役立ち、また、水溶液中の核酸の機能を一時的に抑制することにも利用できる。
【００６４】
この出願の発明のナノストランドと核酸との結合により精製されるナノ複合体は、ＤＮＡの保存、安定化、あるいは固定化手法としても魅力的であり、核酸の新しいマニピュレーション手法として期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】製造例１での水酸化ナトリウムの添加量に対する水溶液のｐＨ変化ならびに水酸化カドミウムのナノストランドの電子顕微鏡観察像を示した図である。
【図２】図１における、矢印ａのｐＨの水溶液中に形成されたナノストランドの電子顕微鏡観察像を示した図である。
【図３】図１における、矢印ｂのｐＨの水溶液中に形成されたナノストランドの電子顕微鏡観察像を示した図である。
【図４】図１における、矢印ｃのｐＨの水溶液中に形成されたナノストランドの電子顕微鏡観察像を示した図である。
【図５】製造例２での水酸化カドミウムのナノストランドの高分解能電子顕微鏡像を低倍率にて例示した図である。
【図６】製造例２での水酸化カドミウムのナノストランドの高分解能電子顕微鏡像を中倍率にて例示した図である。
【図７】製造例２での水酸化カドミウムのナノストランドの高分解能電子顕微鏡像を高倍率にて例示した図である。
【図８】製造例２での高分解能電子顕微鏡観察で得られたナノストランドの大きさと格子イメージに基づき、水酸化カドミウムの結晶学的データから計算されたナノストランドの推定構造を例示した模式図である。なお、この推定構造では、電子顕微鏡の観察イメージに合致するように、カドミウム原子の直径が酸素原子の２倍に設定されている。
【図９】製造例３での水酸化カドミウムのナノストランドによるＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅの滴定における濾液の紫外・可視吸収スペクトル変化を示す図である。図中のＣｄ：ＥＢは、カドミウム原子とＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅのモル比を表す。
【図１０】製造例３での滴定において推定されたナノストランドの電荷密度を模式的に例示した図である。この模式図は、製造例２の推定構造に基づいており、簡略のため、カドミウム原子のみを描いてある。
【図１１】実施例１でのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を含んだＤＮＡの水溶液（溶液１）ならびにＤＮＡと水酸化カドミウムのナノストランドから形成されたゲル（溶液２）の様子を例示した図である。
【図１２】実施例１での溶液１、溶液２、溶液３、溶液４を、それぞれフィルターで濾過し、濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した結果を示した図である。図中には、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の構造ならびにＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を含んだＤＮＡ鎖の模式図を合わせて例示している。
【図１３】実施例２での溶液１、溶液２を、それぞれフィルターで濾過し、濾液の蛍光スペクトルを測定した結果を示した図である。４１０ｎｍでのピークは、測定機器に由来するものである。
【図１４】実施例２でのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を含んだＤＮＡ鎖と水酸化カドミウムのナノストランドから形成されたゲルの構造を模式的に例示した図である。
【図１５】実施例３での溶液１、溶液２、溶液３、溶液４を、それぞれフィルターで濾過し、濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した結果を示した図である。
【図１】
0004058520.tif 000002
【図２】
0004058520.tif 000003
【図３】
0004058520.tif 000004
【図４】
0004058520.tif 000005
【図５】
0004058520.tif 000006
【図６】
0004058520.tif 000007
【図７】
0004058520.tif 000008
【図８】
0004058520.tif 000009
【図９】
0004058520.tif 000010
【図１０】
0004058520.tif 000011
【図１１】
0004058520.tif 000012
【図１２】
0004058520.tif 000013
【図１３】
0004058520.tif 000014
【図１４】
0004058520.tif 000015
【図１５】
0004058520.tif 000016