(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなる単離、精製ペプチド。
【請求項２】
配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離、精製ペプチド。
【請求項３】
発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対して防御免疫を惹起することができ、および／または発熱性外毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化を阻害し、発熱性外毒素または発熱性外毒素混合物により誘導される毒性ショックに対して防御し得る、請求項１のペプチドの機能的誘導体であって、請求項２に記載されたペプチドである、誘導体。
【請求項４】
発熱性外毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化を阻害し、かつ、発熱性外毒素または発熱性外毒素混合物により誘導される毒性ショックから防御する組成物であって、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、およびそれらの任意の混合物から選択される単離、精製ペプチドと、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる、組成物。
【請求項５】
発熱性外毒素により誘導される毒性ショックに対して防御免疫を惹起する免疫原性組成物であって、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、およびそれらの任意の混合物から選択される単離・精製ペプチドと、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項６】
少なくとも１種の発熱性外毒素により誘導される活動不能の治療のための医薬組成物であって、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、およびそれらの任意の混合物から選択される単離、精製ペプチドと、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる、医薬組成物。
【請求項７】
発熱性外毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化を阻害し、かつ、発熱性外毒素または発熱性外毒素混合物により誘導される毒性ショックから防御するための医薬の製造のための、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、およびそれらの任意の混合物から選択される単離、精製ペプチド、またはそれを含んでなる組成物の使用。
【請求項８】
発熱性外毒素により誘導される毒性ショックに対して免疫防御を惹起するための医薬の製造のための、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、およびそれらの任意の混合物から選択される単離、精製ペプチド、またはそれを含んでなる免疫原性組成物の使用。
【請求項９】
少なくとも１種の発熱性外毒素により誘導される活動不能を予防および／または治療するための医薬の製造のための、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、およびそれらの任意の混合物から選択される単離、精製ペプチド、またはそれを含んでなる組成物の使用。
【請求項１０】
医薬が、単離・精製ペプチドまたはそれを含んでなる組成物の有効量を所定の間隔時間に患者に繰り返し投与するためのものである、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は発熱性外毒素中のタンパク質ドメインと構造的に関係のあるペプチドに関する。本発明のペプチドは該発熱性外毒素により媒介されるＴ細胞の活性化に拮抗し、かつ、該外毒素により誘導される毒性ショックに対して防御免疫を惹起することができる。本発明はさらに、該外毒素により誘導される毒性ショックに対して防御免疫を惹起することができる、毒性ショックの治療または予防のための、該ペプチドを含有する医薬製剤、および該ペプチドを含有するワクチンに関する。
【０００２】
発明の背景
発熱性外毒素族は超抗原毒とも呼ばれ、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)および化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)により産生される。黄色ブドウ球菌外毒素（ＳＥ）からなる外毒素は摂取後の嘔吐および下痢を徴候とする主要なヒト食中毒症例を引き起こす[Schlievert, J Infect Dis 167:997 (1993)]。黄色ブドウ球菌は自然界に広く見られ、しばしばヒトと関わっている。ＳＥ族の５つの主要な血清型（ＳＥＡ〜ＳＥＥおよびＳＥＧで示される）のうち、ＳＥＢはが最も優勢である[Marrack and Kappler, Science 248:705 (1990)]。ＳＥＢはまた外科的または傷害的創傷に不随し得る非月経性毒性ショック症候群のヒト症例、ならびに特に子供が攻撃を受けやすいインフルエンザ患者の気道のウイルス感染の主要な原因として認識されている[Schlievert (1993) 同上; Tseng et al., Infect Immun 63:2880 (1995)]。毒性ショック症候群はその最も重篤な形態においてはショックおよび子をもたらす[Murray et al., ASM News 61:229 (1995); Schlievert (1993)同上]。より一般には、アトピー性皮膚炎[Schlievert (1993)同上]および川崎病症候群[Bohach et al., Crit Rev Microbiol 17:251 (1990)]では、ＳＥＡ〜ＳＥＥおよび毒性ショック症候群毒１（ＴＳＳＴ−１）を含むブドウ球菌外毒素族のメンバーの膜が毒性ショック症候群に関連づけられている。
【０００３】
エアゾル暴露後にヒトにおいて致死的なショックを引き起こす可能性があり、またＳＥＢが比較的容易に大量生産できるということから、ＳＥＢは生物兵器として使用され得るという観点がある[Lowell et al., Infet Immun 64:1706 (1996)]。ＳＥＢは主としてその致死性の点で潜在的な生物兵器であると考えられる。しかしＳＥＢはまた、その強力な嘔吐および下痢誘発力により、一時的であっても戦闘力の有効性を著しく損ない、それによって通常の軍事手段に攻撃を受けやすくし得る活動不能剤(incapacitating agent)である。言うまでもないことであるが、ＳＥＢの有害な作用は軍事的局面に関してのみならず、概して攻撃しなければならない。
【０００４】
ＳＥＢは感染した生物に逆説応答を誘導する有毒な細胞分裂促進剤であり、一方では免疫系の強力な刺激剤であり、他方では免疫応答によって妨げられない、感染性細菌の増殖を可能とし得る絶大な免疫抑制剤である[Hoffman, Science 248:685 (1990); Smith and Johnson J Immunol 115:575 (1975); Marrack et al., J Exp Med 171:455 (1990); Pinto et al., Transplantation 25:320 (1978)]。細胞の免疫応答中に、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）で例示されるＴｈ１型サイトカイン遺伝子発現の活性化と、他方、ＣＤ８細胞およびその他の細胞サブセットによる[Ketzinel et al., Scand J Immunol 33:593 (1991); Arad et al., Cell Immunol 160:240 (1995)]、またＴｈ２細胞、ＩＬ−４およびＩＬ−１０由来の阻害性サイトカインによる[Mosmann and Coffman, Annu Rev Immunol 7:145 (1989)]、その細胞媒介性の抑制との間で、抗原または細胞分裂促進剤により動的な相互作用が誘導される。
【０００５】
ＳＥＢは発熱性外毒素族のメンバーであり[Herman et al., Ann Rev Immunol 9:745 (1991)]、細菌外毒素およびＭｌｓタンパク質からなる。これらの抗原毒は通常の抗原の２０，０００倍高い齧歯類またはヒトＴ細胞産生を刺激する。このように、ＳＥＢはいくつかのマウスで全Ｔ細胞の３０〜４０％を活性化する[Marrack and Kappler (1990)同上]。実際に、ＳＥＢの毒性にはＴ細胞を必要とし、Ｔ細胞またはＳＥＢ反応性Ｔ細胞を欠いたマウスは、正常な動物において体重減少および死をもたらすＳＥＢ用量でも影響を受けない[Marrack et al. (1990)同上; Marrack and Kappler (1990)同上]。正常抗原とは異なり、ＳＥＢおよび関連の有毒細胞分裂促進剤はプロセッシングおよび抗原提示を必要としないが[Janeway et al., Immunol Rev 107:61 (1989)]、Ｔ細胞受容体β鎖（Ｖ−β）の可変部分の特異的部位に結合することでＴ細胞を活性化する[Choi et al., Nature 346:471 (1990)]。Ｔ細胞受容体の毒素との相互作用に重要な領域はＶ−βドメインの外面の、通常の抗原認識に関与しない領域にある[Choi et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 86:8941 (1989)]。同時に、発熱性外毒素はＭＨＣクラスII分枝と直接結合し[Scholl et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 86:4210 (1989)]、従って主としてＣＤ４＋Ｔ細胞に作用するが、ＣＤ８＋細胞もまた活性化される[Fleischer and Schrezenmeier, J Exp Med 167:1697 (1988); Fraser, Nature 339:221 (1989); Misfeldt, Infect Immun 58:2409 (1990)]。現在のところ、発熱性外毒素は抗原とクラスII ＭＨＣおよびＴ細胞受容体との通常の相互作用を迂回することから、極めて効果的にＴ細胞を活性化するということで一致を見ている[Janeway, Cell 63:659 (1990)]。もう１つの見解としては、発熱性外毒素は最小量の通常抗原の作用を助け、従ってそれを著しく過大にするコリガンドとして作用するということである[Janeway (1990)同上]。
【０００６】
ＳＥＢおよび関連の外毒素の毒性はサイトカイン、特にＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の迅速かつ過剰な産生を刺激するこれらの分子の能力に関連するものと考えられる。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βは活性型Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞から分泌され、一方、ＴＮＦ−βはＴｈ１細胞、単球およびマクロファージにより分泌される。突然産生された高レベルのこれらサイトカインは毒素関連の毒性において中心的な病因として関連づけられており[Schard et al., EMBO J 14:3292 (1995)]、毒性ショックをもたらす血圧の急激な低下を引き起こすと考えられる。
【０００７】
研究はＳＥによるＴ細胞の強い刺激のもっともらしい説明を与えているが、これらの毒素にはまたなぜ強い免疫抑制性もあるのかはまだ明らかでない。それらは、抗体の産生およびプラーク形成細胞の発生をはじめ、一次Ｔ細胞応答とＢ細胞応答の双方に低下をもたらす[Hoffman (1990)同上; Smith and Johnson (1975)同上; Marrack et al. (1990)同上; Pinto et al. (1978)同上; Ikejima et al., J Clin Invest 73:1312 (1984); Poindexter and Schlievert, J Infect Dis 153:772 (1986)]。
【０００８】
ヒトのブドウ球菌毒素感受性はマウスの１００倍優っている。黄色ブドウ球菌由来のもう１つの発熱性外毒素である毒性ショック症候群毒１、すなわちＴＳＳＴ−１はヒトＴ細胞を刺激して、鍵となるサイトカインＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βを０．１ｐｇ／ｍｌ未満発現させるが、一方、ネズミ細胞は約１０ｐｇ／ｍｌを要する[Uchiyama et al., J Immunol 143:3173 (1989)]。マウスはそれらのＴ細胞レパートリーから、最もよく反応するＶ−β鎖を示す細胞を欠如させることによって、またはこれらのＶ−β遺伝子を欠失させることによって有毒な細胞分裂促進剤に対して相対耐性を発達させたようである[Morrack and Kappler (1990)同上]。かかる欠損はヒトにおいては検出されず、かなり矛盾のあるものとなっている。
【０００９】
活動不能および致死の可能性のあるヒトにおけるＳＥＢ（および同じ超抗原族の外毒素）の作用は、民間人であれ軍人であれ、ＳＥＢの予防、ＳＥＢに暴露した者の治療および安全なＳＥＢワクチンを必要としている。
【００１０】
この必要性は危急のものであるにもかかわらず、防御または治療方法はまだない。従ってＤ−ガラクトサミンに感作したＳＥＢ中毒のネズミモデルにおいて（あるものはＳＥＢ毒素による筋肉内抗原投与に基づき、またあるものは粘膜のＳＥＢ暴露を用いた鼻内抗原投与に基づく）、プロテオソーム−ＳＥＢトキソイドワクチンでマウスを保護できたが、ここではＳＥＢトキソイド成分は生物学的に活性な完全なタンパク質分子を３０日間ホルマリンで処理することで調製したものであった[Lowell et al. (1996)同上]。本発明者らは、毒素から防御するというより、ＳＥＢ分子内の特定のペプチドドメインに対して形成された抗体がＳＥＢのヒトＴ細胞を刺激する能力を高めることを示した[ＷＯ９８／２９４４４; Arad et al., Nature Medicine, 6(4):414-421 (2000)]。ＳＥＢに暴露した人において防御免疫を付与することができないだけでなく、毒性応答の著しい悪化をもたらし得る特定のＳＥＢ感作抗体を惹起する危険性という観点から、この発見はＳＥＢトキソイドのワクチンとしての使用を制限するものである。
【００１１】
他の研究者らはそれぞれ３０個のアミノ酸長のオーダーで、一連の重複するＳＥＢペプチドを合成することで、完全なＳＥＢタンパク質分ではなく断片の使用することに頼ろうとした[Jett et al., Infect Immun 62:3408 (1994)]。これらのペプチドを用いてウサギで抗血清を作製し、次ぎにＳＥＢにより誘導されたヒトＴ細胞およびマクロファージの混合物の増殖を阻害するその能力を調べた。この努力によっても有効なまたは特異的な阻害応答は得られなかった。このように、ＳＥＢタンパク質分子のアミノ酸１１３〜１４４を含むペプチドｐＳＥＢ（１１３〜１４４）、ならびにアミノ酸１３０〜１６０、１５１〜１８０および１７１〜２００にわたるペプチドはそれぞれ、ＳＥＢにより誘導されたリンパ球増殖を若干阻害した抗血清を２．５倍まで惹起した[Jett et al. (1994)同上]。
【００１２】
いく人かの研究者がペプチドワクチンの作出を試みた。例えば、Mayordomo et al. [J Exp Med 183:1357 (1996)]はネズミ腫瘍の治療のためにワクチンとしてｐ５３由来のペプチド変異体を用いた。Huges and Gilleland [Vaccine 13:1750 (1995)]は緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の該膜タンパク質エピトープを提示する合成ペプチドを用いてネズミ急性肺炎モデルで緑膿菌感染から防御することができた。ヒトのおいてペプチド免疫を用いる試みでは、Brander et al. [Clin Exp Imunol 105:18 (1996)]が、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞標的化複合ワクチンがメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞応答を再刺激したが、細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導することはできなかったことを示した。
【００１３】
外毒素の主な供給源はすでに記載したように黄色ブドウ球菌と化膿連鎖球菌である。肉食細菌である化膿連鎖球菌は、Ｔ細胞の過剰な活性化というよく似た作用様式で一連の異なる毒素を産生する。黄色ブドウ球菌は主成分としてのＳＥＢに次いで、ＳＥＡ、ＳＥＣ類、ＳＥＥおよびＴＳＳＴ−１（毒性ショック症候群毒１）も産生し、化膿連鎖球菌は主要な毒素としてＳＰＥ  Ａの他、その他の発熱性外毒素を産生する。従って、ブドウ球菌性の食中毒、そしてより深刻な生物戦争、または化膿連鎖球菌により引き起こされる毒性ショックでは、毒素混合物に遭遇する。かかる混合物の組成は確信を持って予測することはできない。生物戦争の最悪のシナリオでは、免疫学的研究に好ましいような単一の精製された発熱性外毒素ではなく、例えば黄色ブドウ球菌を培養することにより産生されるような手に入りやすくて未精製の自然の毒素混合物が用いられるのが必然である。
【００１４】
明らかにこの複雑性は広域の発熱性外毒素アンタゴニストならびに広域ワクチンの開発を要求するものである。感作能がなく、致死量の毒素から試験動物を保護できるアンタゴニストが本発明者らにより見出された[ＷＯ９８／２９４４４およびArad et al., (2000)同上]。これらのアンタゴニストは発熱性外毒素のあるドメインに構造的に関連するペプチドであり、このドメインは外毒素内に中央折り返し点があり、ＳＥＢのドメイン番号をもとにして、β鎖７で始まり、β鎖７は短いβ鎖８を介してα−へリックス４につながり、α−へリックス４内で終わる。このドメインはＭＨＣクラスII分子との相互作用は知られていない。
【００１５】
これらのアンタゴニストペプチドは同一人が所有するＷＯ９８／２９４４４およびArad et al., Nature Medicine, 6(4):414-421 (2000)に詳細に記載され、その内容は引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
【００１６】
このようにＷＯ９８／２９４４４は特に、ＳＥＢに対してのみならず、例えばＳＥＡ、ＳＥＣ、ＴＳＳＴ−１など、広範囲のＳＥ毒系に対して防御を付与できるワクチンを開示している。さらにこの公報ＷＯ９８／２９４４４はＳＥＢまたは他のいずれもの発熱性外毒素により誘導される毒性ショックの予防、および暴露した患者の治療を開示している。発明者らによる先行技術は、ＳＥＢならびに他のいずれもの発熱性外毒素の作用に拮抗する薬剤の設計を示し、その解毒剤は急性食中毒の医学的治療にも、毒性ショックおよび関連の病状の際に生命を守ることにも大きな価値を持つ。これまで発明者らによって開発されたペプチドはさらに、急性毒性ショック、および例えば偶発性食中毒によるものであり得るかかる毒素の有害な作用の応急処置または短期予防および救急予防に用いられる、またそれらに対する長期予防のための発熱性外毒素による中毒に対する免疫向けワクチンに用いられる、対発熱性外毒素アンタゴニストであることが示されている。
【００１７】
さらに改良を加えた毒素アンタゴニストの研究では、発明者らは、in vitroヒト免疫応答における発熱性外毒素作用の遮断、厳密には毒素により媒介されるＩＦＮ−γｍＲＮＡの誘導の阻害、および多くの発熱性外毒素により媒介される応答に対する防御免疫の惹起において該公知のペプチドアンタゴニストよりも優れた新規な１４マーのペプチド新規開発し、これが本発明の主な目的であり、広域ワクチンとしての開発の可能性を示唆するものである。
【００１８】
本発明のこの目的またその他の目的は以下の記載により明らかとなる。
【００１９】
発明の概要
本発明は配列番号１のアミノ酸配列を有する単離、精製ペプチドに関し、ここではｐ１４とも呼ぶ。本発明のｐ１４ペプチドは毒素により媒介されるＴ細胞の活性化に拮抗し、および／または発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物によって誘導される毒性ショックに対して防御することができる。
【００２０】
本発明はさらに、毒素により媒介されるＴ細胞の活性化に拮抗し、かつ発熱性外毒素または発熱性外毒素混合物によって誘導される毒性ショックから防御することができるｐ１４の誘導体に関する。かかる誘導体は本明細書では機能的誘導体と呼ぶ。本発明のペプチドの特異的な機能的誘導体は、そのＮ末端およびＣ末端の双方にＤ−Ａｌａを有するｐ１４（配列番号２、本明細書ではｐ１４Ａとも呼ぶ）、およびそのＮ末端にリシル−パルミトイル残基を有するｐ１４の誘導体（配列番号３、ｐ１４−ＬＰとも呼ぶ）である。
【００２１】
本発明のペプチドおよび誘導体は毒素により媒介されるＴ細胞の活性化に拮抗し、かつ、例えばＳＥＢ、ＳＥＡ、ＳＥＣ、ＴＳＳＴ−１、ＳＰＥＡ、ＳＰＥＣ、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ＳＥＨ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３から選択される発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物によって誘導される毒性ショックに対して防御することができる。これらの外毒素は本発明のペプチドおよび誘導体により標的とされる構造ドメインを共有しているが、このドメインはＳＥＢのドメイン番号をもとにして、β鎖７内で始まり、β鎖７は短いβ鎖８を介してα−へリックス４につながり、α−へリックス４内で終わる。本発明のペプチドおよび誘導体は種々の毒素におけるこれらドメインの配列と少なくとも３０％の相同性を有している。
【００２２】
このように発熱性外毒素は黄色ブドウ球菌または化膿連鎖球菌によって産生される細菌の外毒素であり得る。
【００２３】
本発明によれば、このペプチドはそのＮ末端を介してラウリル−システイン（ＬＣ）またはリシル−パルミトイル残基と、および／またはそのＣ末端を介してシステイン（Ｃ）残基と、または該ペプチドを免疫化のためのアジュバントと結合するのに好適なその他の残基とさらに結合してもよい。これらには機能的誘導体を得るために使用できるいくつかの修飾がある。
【００２４】
さらに、このペプチドはオリゴマー、特にダイマー、トリマーの形態であってもよいし、あるいは拘束されたコンホメーションであってもよく、ここで拘束コンホメーションは内部架橋、小範囲の環化、延長またはその他の化学修飾によって得られる。
【００２５】
本発明のペプチドおよび誘導体はＩＬ−２、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−β遺伝子によってコードされる、発熱性毒素誘導性のｍＲＮＡの発現を阻害することができる。
【００２６】
さらに、本発明のペプチドおよび誘導体は、免疫化された個体において、好適な免疫アジュバントの存在下で、発熱性毒素により媒介されるＴ細胞の活性化を遮断する抗体の産生を惹起することができる。
【００２７】
第２の態様では、本発明は、少なくとも本発明のペプチドもしくはその機能的誘導体、またはそれらの任意の混合物の治療上有効量を有効成分として含んでなる、毒素により媒介されるＴ細胞の活性化の治療または短期の予防のための医薬組成物を提供する。本発明のペプチドおよび誘導体は発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対して防御することができる。
【００２８】
さらに本発明は、少なくとも本発明のペプチドもしくはその機能的誘導体、またはその混合物の免疫学的有効量を有効成分として含んでなる、少なくとも１種の発熱性外毒素により誘導される毒性ショックに対して長期免疫を付与するワクチンを提供する。
【００２９】
さらに本発明は、本発明の単離、精製ペプチドまたは誘導体を含んでなる、少なくとも１種の発熱性外毒素により誘導される活動不能の予防および／または治療のための組成物に関する。
【００３０】
また、急性毒性ショック、および例えば少なくとも１種の発熱性外毒素により誘導される偶発性食中毒によるものであり得る有害な作用の応急処置または短期予防のための方法も本発明により提供され、該方法はかかる治療を必要とする患者に、治療上有効量の本発明の医薬組成物、あるいは治療上有効量の本発明のペプチドもしくはその機能的誘導体またはその混合物を投与することを含んでなる。
【００３１】
さらに本発明は、有効免疫量の本発明のワクチンを患者に投与することを含んでなる、発熱性外毒素または発熱性外毒素混合物により誘導される毒性ショックに対して長期免疫を付与する方法を提供する。
【００３２】
なおさらに本発明は、本発明の単離・精製ペプチドまたは誘導体を含んでなる、少なくとも１種の発熱性外毒素により誘導される活動不能の予防または治療方法を提供する。
【００３３】
発明の具体的な説明
本発明は発熱性外毒素により誘導される毒性ショックの長期および短期の治療および予防のために有効な薬剤、特に配列番号１のアミノ酸配列を有する１４マー（mer）のペプチドに向けられ、発熱性外毒素内の特定ドメインおよびその機能的誘導体に関する。ペプチドの生物学的特性は以下のいくつかの基準によって評価できる。
【００３４】
１．ＳＥＢアゴニスト活性の欠損
正常なヒト血液提供者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、他のいずれの誘導剤も存在しない状態で、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子によりコードされるｍＲＮＡの発現を誘導する能力によってアッセイされる。
【００３５】
２．発熱性外毒素アンタゴニスト活性
ＰＢＭＣにおいて、ＳＥＢなどの発熱性外毒素によって誘導される、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−β遺伝子によりコードされるｍＲＮＡの発現を阻害する能力によってアッセイされる。
【００３６】
３．免疫原性
免疫化したウサギにおいて、ＳＥＢと結合する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の産生を惹起するペプチドの能力によってアッセイされる。
【００３７】
４．免疫原性
免疫化したウサギにおいて、ヒト細胞免疫応答に対するＳＥＢなどの発熱性外毒素の有害な作用を遮断する抗体の産生を惹起するペプチドの能力によってアッセイされ、ＰＢＭＣにおいてＳＥＢによる、またはＴＳＳＴ−１もしくはより関連のある毒素ＳＥＡなどその他の発熱性外毒素によるＩＬ−２およびＩＦＮ−γｍＲＮＡの誘導を阻害する、ペプチドに対して生じたウサギ血清の能力によってモニターされる。
【００３８】
５．抗ＳＥＢワクチンなどのワクチンの活性
Ｄ−ガラクトサミンマウスモデルにおいて、致死量のＳＥＢに対して免疫化動物を保護するペプチドの能力によってアッセイされる。
本発明者らはこれら５つの基準の各々を満たすペプチドを得た。かかるペプチドのいくつかはＷＯ９８／２９４４４に開示されている。発明者らは今般、特定の１４マーのペプチドおよびその誘導体が先行技術のペプチドに比べて改良された特性を示すことを見出した。このように、本発明の特定の具体例では、１４マーのペプチドアンタゴニストを設計した。このペプチドはin vitroにおいてヒト免疫応答に対するＳＥＢならびにその他の発熱性外毒素の作用を遮断し、厳密にはＳＥＢにより媒介されるＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−β  ｍＲＮＡの誘導を阻害する。このペプチドは急性毒性ショック、および例えば発熱性外毒素により誘導される偶発性食中毒によるものであり得る有害な作用の治療に使用できることは明らかである。
【００３９】
本発明のペプチドは発熱性外毒素のドメインのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有し（このドメインは外毒素中で中央折り返しを形成し、ＳＥＢのドメイン番号をもとにして、β鎖７で始まり、β鎖７内は短いβ鎖８を介してα−へリックス４につながり、α−へリックス４内で終わる）、毒素アゴニスト活性を持たず、かつ、毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化に拮抗することができる。この領域における相同性は他の発熱性外毒素中の対応領域とせいぜい約３０％またはそれ未満でさえあるという低いものである。具体的には、本発明のペプチドｐ１４はアミノ酸配列ＶＱＹＮＫＫＫＡＴＶＱＥＬＤ（配列番号１）を有し、先行技術のｐ１２（配列番号４）の配列ＹＮＫＫＫＡＴＶＱＥＬＤの前のＮ末端にＳＥＢ配列の２個の付加的アミノ酸（ＶＱ）を有する。ｐ１４Ａ（配列番号２）は、先行技術のｐ１２Ａ（配列番号５）（ＷＯ９８／２９４４４）と同様に、より強いプロテアーゼ耐性のためのＤ−アラニンをその両末端に隣接させている。
【００４０】
表１は本願に記載される特定のペプチドおよびそれらの配列番号をまとめたものである。
【表１】
0004076766.tif 000002
【００４１】
もう１つの具体例では、本発明のペプチドアンタゴニストはＳＥＢ、ＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１に対してヒトリンパ性細胞を防御する抗体を惹起することができ、このことは発熱性毒素に対する広域な防御免疫を付与し得ることを示している。しかし、特定の他のＳＥＢタンパク質ドメインに由来するペプチドに対して生じた抗体は、毒素から防御するというよりももしろ、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γｍＲＮＡのより高い誘導によって発現されるように、実際にはＳＥＢおよびＳＥＡに対するヒトＰＢＭＣの応答を高めた。これらＳＥＢアンタゴニストペプチドでマウスを免疫化すると、致死量のＳＥＢに対する防御を惹起し、その結果試験動物が生存した。これらのペプチドはまた発熱性外毒素により誘導される毒性ショックに対して長期免疫を付与するのに使用できることは明らかである。
【００４２】
このように第１の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるペプチド、およびかかるペプチドの機能的誘導体に関するものであり、ここで該単離、精製ペプチドは毒素アドニスト活性を持たず、外毒素により誘導される毒性ショックに対して防御免疫を惹起することができる。本明細書で用いられる用語の誘導体および機能的誘導体とは、毒素アゴニスト活性を示さず、かつ、外毒素により誘導される毒性ショックに対して防御免疫を惹起するペプチドの能力を妨げず、および／または毒素により媒介されるＴ細胞の活性化に拮抗するペプチドに対する任意の、挿入、欠失、置換および修飾を伴ったペプチド（以下、「誘導体」と呼ぶ）を意味する。誘導体は該ドメインと最低の、例えば約３０％または３０％よりいくらか低い相同性を維持すべきである。
【００４３】
第２の態様では、本発明は、毒素アゴニスト活性を阻害せず、かつ、毒素により媒介されるＴ細胞の活性化に拮抗することができる配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる単離・精製ペプチド、およびかかるペプチドの機能的誘導体に関する。本発明のペプチドは発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対して防御することができる。
【００４４】
発熱性外毒素は通常、細菌外毒素、特に黄色ブドウ球菌または化膿連鎖球菌により産生される外毒素である。
【００４５】
本発明の単離・精製ペプチドは配列番号１で示されるアミノ酸配列（以下、ｐ１４またはｐ１４（１４８〜１６１）とも呼ぶ）、およびその機能的誘導体を含んでなる。ｐ１４およびその機能的誘導体は発熱性外毒素または発熱性外毒素混合物により誘導される毒性ショックに対して防御免疫を惹起し、および／または毒素により媒介されるＴ細胞の活性化に拮抗することができる。これらのペプチドはまた、急性毒性ショック、および例えば発熱性外毒素により誘導される偶発性食中毒によるものであり得る有害な作用のいずれもの応急処置のために、またかかる毒性ショックに対する長期免疫の付与のために使用することができる。上記に示されたように、ｐ１４ペプチドと同様、機能的誘導体も好ましくは該発熱性外毒素のタンパク質ドメインと少なくとも３０％の相同性を有する。ｐ１４（配列番号１）はその１４のアミノ酸残基のうち１１において、配列番号６で示される天然に存在するタンパク質の配列の１４８〜１６１位と相同である。
【００４６】
さらに、後記の実施例で示されるように、ｐ１４ペプチドはまたＴＳＳＴ−１に対して毒素アンタゴニスト活性を有するが、ＴＳＳＴ−１の対応領域とは３０％未満の相同性しかなく、１４のアミノ酸残基のうち４つを共有している。
【００４７】
直鎖ペプチドの構造の欠如は、それらをヒト血清中のプロテアーゼの作用を受けやすくし、可能性のあるコンホメーションのわずかしか活性ではないので、標的部位に対するそれらの親和性を低下させるように働く。従ってアンタゴニストペプチド構造を最適化することが望ましい。
【００４８】
ペプチド構造を改良するためには、本発明のペプチドをそれらのＮ末端を介してラウリル−システイン（ＬＣ）またはリシル−パルミトイル残基と、および／またはそれらのＣ末端を介してシステイン（Ｃ）残基と、あるいは以下でさらに詳細に記載されるが、ペプチドを免疫化のためのアジュバントと結合させるのに好適な他の残基に結合させることができる。プロテアーゼ耐性を向上させるには、Ｄ−ＡｌａをＮ末端またはＣ末端のいずれか、あるいは両者に結合させればよい。
【００４９】
本発明のペプチドならびにその誘導体は総て正電荷有していてもよいし、負電荷を有していてもよいし、あるいは中性であってもよく、また、ダイマー、マルチマーの形態であってもよいし、あるいは拘束されたコンホメーションであってもよい。
【００５０】
拘束コンホメーションは内部架橋、短範囲の環化、延長または他の化学修飾によって得られる。ダイマーおよびトリマーなどのオリゴマーも考えられる。
【００５１】
さらに本発明のペプチドをそのＮ末端および／またはＣ末端において種々の同一または異なるアミノ酸残基で延長してもよい。かかる延長の一例としては、ペプチドをそのＮ末端および／またはＣ末端において、天然に存在するアミノ酸残基であっても合成アミノ酸残基であってもよい同一または異なる疎水性アミノ酸残基で延長することができる。好ましい合成アミノ酸残基はＤ−アラニンであり、記載のように、これによりペプチドのプロテアーゼ耐性が増す。
【００５２】
合成アミノ酸残基で延長されたペプチドの具体例としては、発熱性外毒素により誘導される毒性ショックに対して防御免疫を惹起し、および／または毒素により媒介されるＴ細胞の活性化に拮抗することができる配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（以下、ｐ１４Ａとも呼ぶ）、およびその機能的誘導体である。一つ好ましい態様では、本発明のペプチドはそのＮ末端およびＣ末端の双方にＤ−Ａｌａ残基を有するｐ１４Ａである。
【００５３】
かかる延長のさらなる例は、そのＮ末端および／またはＣ末端の双方においてシステイン残基で延長したペプチドにより提供される。もちろんかかる延長はジスルフィド結合の形成から生じるＣｙｓ−Ｃｙｓ環化による拘束されたコンホメーションをもたらしてもよい。
【００５４】
もう１つの例は、Ｎ末端リシル−パルミトイルテールの組み込み（リシンはリンカーとして働き、パルミチン酸は疎水性アンカーとして働く）による誘導体ｐ１４Ａ−ＬＰ（配列番号３）の作製である。
【００５５】
さらに本ペプチドは天然に存在するアミノ酸残基であっても合成のアミノ酸残基であってもよい、延長された芳香族アミノ酸残基であってもよい。好ましい芳香族アミノ酸残基としては、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。あるいは、本ペプチドはそのＮ末端および／またはＣ末端において、天然に存在する発熱性外毒素のアミノ酸配列の対応する位置に存在するアミノ酸で延長することができる。
【００５６】
しかしながら、本発明によれば、本発明のペプチドはそのＮ末端および／またはＣ末端において、天然には存在しない、もしくは合成アミノ酸である種々の同一または異なる有機部分で延長することができる。かかる延長の一例として、本ペプチドはそのＮ末端および／またはＣ末端において、Ｎ−アセチル基またはＤ−アラニン基で延長してもよい。このようにして延長されたペプチドはもまた、本発明の他のペプチドとして、急性毒性ショック、およびそれにより引き起こされる有害な作用のいずれもの応急処置に、またかかる毒性ショックに対する長期免疫を付与するために使用することができる。
【００５７】
本発明のペプチドは後記の実施例に示されるように、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−β遺伝子によりコードされる発熱性毒素により誘導されるｍＲＮＡの発現を阻害することができる。
【００５８】
さらに本発明のペプチドは、免疫化した個体においてＴ細胞活性化を遮断する抗体の産生を惹起することができる。抗体の産生は好適な免疫アジュバントの存在下で高まる。好ましいアジュバントとしてはスカシガイ・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、プロテオソームまたはミョウバンが挙げられる。
【００５９】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも本発明のｐ１４ペプチドまたはその機能的誘導体の治療上有効量を有効成分として含んでなる、毒素により媒介されるＴ細胞の活性化を治療または予防するための医薬組成物に関する。上記のように、本ペプチドは上記発熱性外毒素のタンパク質ドメインのアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を含んでなる。本発明の医薬組成物はまた、発熱性外毒素または発熱性外毒素混合物により誘導される毒性ショックに対する防御に有用である。
【００６０】
本明細書の目的のための医薬上「有効量」とは、当技術分野で既知の考慮により決定されるものである。この量は毒素により媒介されるＴ細胞の活性化に十分拮抗するものでなければならない。
【００６１】
本願を通じて用いられる毒素により媒介される活性化とは、単一の発熱性外毒素またはかかる毒素の混合物により媒介されるＴ細胞の活性化を意味し得る。
【００６２】
実施例１〜３は１４のアミノ酸からなる短いペプチド（ｐ１４またはｐ１４Ａ、配列番号６に示される天然に存在するＳＥＢタンパクの配列の１４８〜１６１位に相当）は、対応するＴＳＳＴ−１との配列の相同性が比較的低くとも（３０％未満）、マウスにおいてＳＥＢにより、またＴＳＳＴ−１により誘導される毒性ショックに対して著しく有効なアンタゴニスト活性を示すことを示している。さらに、ｐ１４ＡはＳＥＢ抗原投与から７時間後というように遅れて投与した時でも、毒性ショックに対して防御免疫を惹起することができた。さらにｐ１４Ａは抗原投与して保護されたマウスに、種々の毒素に対して広スペクトル耐性を迅速に発展させることができた。
【００６３】
本発明の医薬組成物は単位投与形で調製することができ、製薬分野で周知のいずれの方法によって製造してもよい。さらに本発明の医薬組成物は医薬上許容される担体、賦形剤または安定剤などの医薬上許容される添加剤、および所望によりその他の治療成分をさらに含んでもよい。もちろん許容される担体、賦形剤または安定剤は使用する用量および濃度で受容者に無毒なものである。
【００６４】
本発明の組成物の治療上の用量はもちろん、患者群（年齢、性別など）、治療する症状の性質、および投与経路によって異なり、主治医により決定される。
【００６５】
さおさらなる態様では、本発明は、少なくとも１種の本発明のペプチドまたはその誘導体の免疫学的有効量を有効成分として含んでなる、発熱性外毒素により誘導される毒性ショックに対する免疫を付与するためのワクチンに関し、かかるペプチドおよび誘導体の混合物を含んでもよい。
【００６６】
用語「免疫学的有効量」とは発熱性外毒素または発熱性外毒素混合物により誘導される毒性ショックに対して免疫を付与するに十分な任意の量を意味する。
【００６７】
本発明のワクチンは所望により好適な免疫アジュバントまたはその混合物をさらに含んでもよい。好適なアジュバントとしては、プロテオソーム、ＫＬＨおよびミョウバン、ならびにプロテオソームとミョウバン、およびＫＬＨとミョウバンの組合せが挙げられる。
【００６８】
後記の実施例で示されるように、本発明のワクチンは発熱性外毒素に対して防御免疫を惹起することができる。
【００６９】
毒性ショック症候群に対して用いる抗体を開発する努力は、主としてモノクローナル抗体または可溶性受容体でＴＮＦの作用を阻害することによって毒性カスケードの下流の現象を遮断することに注がれていた。毒素に応答して産生される高レベルのサイトカインはこのアプローチを無効にする。本発明は、Ｔ細胞の活性化が起こる前に毒性カスケードの最上で毒素作用を阻害するアンタゴニストを用いて、全く異なる戦略で発熱性外毒素の作用を遮断することができるということを示す。
【００７０】
実施例では、毒素アンタゴニスト活性を評価するための、ＰＢＭＣにおける、ＩＦＮ−γ遺伝子（ならびに本明細書には示されていないがＩＬ−２およびＴＮＦ−β遺伝子）の発現による、発熱性外毒素により媒介されるヒト細胞免疫応答の活性化の分子的方法、解析を詳細に記載する。ヒトＰＢＭＣでの研究は毒素拮抗特性、免疫特性およびワクチン効力を評価する動物試験と組合せたが、これらの方法が発熱性外毒素系の他のメンバーに対してもヒトＰＢＭＣを中和するか、またはそれを保護する薬剤を考案する際に適用できることが示される。
【００７１】
ヒトはマウスよりも発熱性外毒素に対する感受性がはるかに高く、一方、霊長類モデルはコストなどのその他の制限要因を有することから、毒素により媒介される免疫応答の活性化および抑制のメカニズムを分析し得るヒトin vitro系が必要とされる。本発明はかかる系を提供し、それは以下のような主な利点がある。
【００７２】
（１）サイトカイン産生の調節に関与する細胞間相互作用を保護する、新しく調製されたヒトリンパ系細胞集団は身体の末梢免疫系に可能な限り近いものである。
【００７３】
（２）初期の免疫応答の結果はＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−β  ｍＲＮＡの一時的および高度に調節された発現を追跡することにより正確かつ直接的に分析することができる。
【００７４】
（３）ＩＦＮ−γ（ならびに所望によりＩＬ−２およびＴＮＦ−β）遺伝子の発現はＳＥＢにより惹起される活性に鋭敏な感受性がある。
【００７５】
（４）この分子学的アプローチは一連の事象の累積した結果である細胞増殖または抗体産生などの生物学的応答の測定よりもはるかに直接的かつ特異的である。
【００７６】
（５）提示したアプローチは、ヒトＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−β遺伝子の活性化に不可欠なＳＥＢ中の機能的ドメインをマッピングする手段を与え、アンタゴニストおよびワクチン双方の開発を助ける働きをし得る。
【００７７】
このように本発明はまた、発熱性外毒素または発熱性外毒素混合物により誘導される毒性ショックを治療する方法に関する。該方法はかかる治療を必要とする患者に、治療上有効量の本発明の医薬組成物、または治療上有効量の少なくとも１種の本発明のペプチドもしくはその機能的誘導体を投与することを含んでなる。
【００７８】
さらなる態様では、発熱性外毒素または発熱性外毒素混合物により誘導される毒性ショックを予防する方法が提供され、該方法はかかる治療を必要とする患者に、治療上有効量の本発明の組成物、または治療上有効量の少なくとも１種の本発明のペプチドもしくはその機能的誘導体を投与することを含んでなる。
【００７９】
本発明はまた、発熱性外毒素により誘導される毒性ショックに対して患者を免疫化する方法に関し、該方法は患者に、有効免疫量の本発明のワクチン、または少なくとも１種の本発明のペプチドもしくはその機能的誘導体を投与することを含んでなる。
【００８０】
本発明のペプチドまたはワクチンの治療上の用量はもちろん、患者群（年齢、性別など）、治療する症状の性質、および投与経路によって異なり、主治医により決定される。
【００８１】
本発明のペプチドおよびワクチンは優良医療規範に従って投与および服用できる。特に本発明の免疫化法は本発明のペプチドまたはワクチンの１回の投与を含んでなる。投与は、静脈内、筋肉内または皮下注射をはじめ種々の方法で行える。しかし、鼻内投与などのその他の投与方法も可能である。
【００８２】
本明細書に記載の発熱性外毒素アンタゴニストペプチドの設計はこれまで軽視されていた領域、発熱性外毒素の予防および毒素に曝された個体の治療における新規な適用を見出すだけでなく、安全な発熱性外毒素ワクチンの開発をも促進する。定義されるペプチドワクチンは悪化させる特性がなく、トキソイドワクチンよりも優れていると考えられる。
【００８３】
ヒトでは、発熱性外毒素に曝されることによる毒性ショックは、（１）活動不能と（２）死という異なる２つの要素を持つ。
【００８４】
致死濃度よりも数ｌｏｇ低い濃度でさえ、発熱性外毒素は著しく活動不能をもたらし、高い罹病率を示す[USAMRIID Manual, (1998) Eitzen E, Pavlin J, Cieslak T, Christopher G, Culpepper R, eds. Medical Management of Biological Casualties Handbook. 3rd ed. Fort Detrick, Maryland: United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 1998]。例えば食中毒（集団食中毒であり得る）で見られる活動不能応答は多数の人々に影響を及ぼす。さらに、活動不能応答は軍隊の脅威であり、国家の保安の脅威である。死に対する防御については、発明者らはペプチドアンタゴニストｐ１２Ａおよびｐ１４Ａがマウスにおいて毒素によりもたらされる死を回避することを示した。マウスにおいて嘔吐または下痢などの活動不能症状は見られなかった。活動不能を予防および／または治療する実験はブタにおいて行った（実施例７）。
【００８５】
吐気、すなわち、悪心、嘔吐および食欲不振は典型的には中脳（髄質）によって制御される一連の神経症状である。嚥下および嘔吐の血管運動・呼吸中枢および反射中枢は髄質にある。延髄の嘔吐中枢は、吐気を引き起こす最終の共通の経路の起点であり、髄質をよじることで嘔吐が起こる[Hamilton, (1956) Textbook of human anatomy. McMillan & Co Ltd, London]。嘔吐中枢は実際には嘔吐に関与する原動力、呼吸、血管および唾液分泌のプロセスのパターンを制御する絡み合った神経ネットワークである。真の嘔吐中枢はいくつかの神経学的経路を介し、ドーパミン、ヒスタミン、アセチルコリン、セロトニン（５ＨＴ）、ノルエピネフリン、およびグルタミンに応答する髄質の種々のタイプの神経伝達受容体により刺激される。制吐剤（主としてドーパミンおよびセロトニンアンタゴニスト）はこれらの受容体を遮断することによって働く。
【００８６】
真の嘔吐中枢に対するこれら複数の経路の作用は複雑である。マウスのＳＥＢへの経口暴露の数時間内に、腸管粘膜に存在するＴ細胞ではＩＬ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子の強い発現が誘導される[Spiekermann and Nagler-Anderson, (1998) Spiekermann GM, Nagler-Anderson C (1998) J Immunol 161:5825-5831]。このように、結果としての粘膜Ｔ細胞の活性化および高レベルＴｈ１サイトカインに対する腸管粘膜の他の細胞の応答は脳への神経伝達物質の放出を誘発し、内臓感覚系の必須の役割を助ける。嘔吐に関しては胃からの刺激は必要とされないことに注目すべきである。胃は上記で説明したように種々の刺激に応答して産生される髄質からのシグナルを受容した際に嘔吐反射のエフェクターとして働く。大腸の刺激が小腸へ向けて移動し、最終的に肛門へ達すると下痢が起こる。
【００８７】
後記の実施例（特に実施例７ならびに図９および１０）で示されるように、本発明者らは、それが本発明の目的であるが、発熱性外毒素アンタゴニストが毒素により媒介される活動不能症状（ＳＥ中毒および初期致死ショックに対するヒト応答に類似）を著しく軽減することを見出した。毒素はＴｈ１サイトカインの誘導および放出を惹起し、次いで髄質のニューロンを直接的または間接的に活性化して活動不能症状を引き起こす細胞免疫応答を標的とすることで働くと考えられる。このようにＴ細胞の活性化を遮断する発熱性外毒素アンタゴニストの単一の作用様式は死および活動不能の双方を防ぐその能力を説明する。図９および１０のデータは、発熱性外毒素に対する免疫応答においてヒトに近い動物であるブタモデルにおいて、毒素による活動不能に対するアンタゴニストの保護作用の確実性を示す。
【００８８】
このように本発明はさらに、少なくとも１種の発熱性外毒素により誘導される活動不能の予防および／または治療のための医薬組成物に関し、該組成物は配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド、およびその任意の混合物から選択される単離・精製ペプチドと、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる。
【００８９】
本発明はさらに、少なくとも１種の発熱性外毒素により誘導される活動不能を予防および／または治療する方法に関し、該方法はかかる治療を必要とする患者に、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド、およびその任意の混合物から選択される少なくとも１種の治療上有効量の単離・精製ペプチド、またはそれを含んでなる組成物を投与することを含んでなる。有効量の単離ペプチドまたはそれを含んでなる組成物は所定の時間間隔で繰り返し患者に投与してもよい。毒性ショックになった時患者には通常塩の点滴を施すが、容易に水に溶けるアンタゴニストペプチドとの混合にはクリアランスを相殺するため、救急期のその持続投与を見込んでおく。このことは好ましく、極めて迅速なアンタゴニスト投与経路である。投与経路、用量および処置頻度は主治医により決定される。
【００９０】
実施例
材料および方法
細胞培養およびヒトサイトカイン遺伝子発現の誘導
健康なヒト提供者のＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ(Pharmacia)で分離し、５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、４×１０６／ｍｌの濃度に再懸濁し、２％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  ＭＥＭ非特異的アミノ酸、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプト−エタノール、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５μｇ／ｍｌナイスタチンを添加した同培地で培養した。ＳＥＢ（ロット１４〜３０、the Department of Toxinology, U. S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseasesから）、ＳＥＡまたはＴＳＳＴ−１(Sigma)を加えて１００ｎｇ／ｍｌとした。
【００９１】
ＲＮアーゼプロテクション解析
グアニジニウムイソチオシアネートで全ＲＮＡを抽出した[Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem 162: 156 (1987)]。ＲＮアーゼプロテクション解析は、ｐＢＳ(Promega)に挿入したＤＮＡから、in vitroでα−［３２Ｐ］ＵＴＰを用いて転写されたゲノムアンチセンスＲＮＡプローブを用いて行った[Arad et al. (1995)同上]。Ｔ７プロモーターから転写されたＩＬ−２プローブ（６００ヌクレオチド（ｎｔ））はＩＬ−２遺伝子の３番目のエキソンおよび３番目のイントロンの一部に相補的であり、８Ｍ尿素−ポリアクリルアミドゲルでは、ＩＬ−２  ｍＲＮＡで保護された１１７ｎｔのＲＮＡ断片が得られる。Ｔ３プロモーターから転写されたＩＦＮ−γプローブ（２７４ｎｔ）はＩＦＮ−γ遺伝子の３番目のエキソンおよび３番目のイントロンの一部に相補的であり、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡで保護された１８３ｎｔのＲＮＡ断片が得られる。 Ｔ３プロモーターから転写されたＴＮＦ−βプローブ（７００ｎｔ）はエキソン１の一部、エキソン２、エキソン３およびイントロン３の一部ならびにエキソン４に相補的であり、ＴＮＦ−β  ｍＲＮＡは２７４および２６３ｎｔの２断片を保護する。ハイブリダイゼーションではセンスＲＮＡ転写物を検出するシグナルが得られなかった。１８Ｓ  ｒＲＮＡ（９０ｎｔを保護する）またはβ−アクチン（４１５ｎｔを保護する）のアンチセンスＲＮＡプローブを負荷対照とした。
【００９２】
ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ  ＲＮＡの定量ドットブロットハイブリダイゼーション
１ｍｌ培養物からＰＢＭＣを回収し、７．５Ｍグアニジニウム−ＨＣｌに溶解した。エタノール中、−２０℃で一晩沈殿させたＲＮＡをホルムアルデヒドに溶解し、６０℃で１５分間インキュベートした。１０×クエン酸ナトリウム生理食塩水による４種の連続２倍希釈物を９６ウェルドットブロット装置を用いて２組、ニトロセルロースシートに塗布した。真空炉にて８０℃で焼き付けた後、シートをヒトＩＬ−２およびＩＦＮ−γ各々の３２Ｐ標識アンチセンスＲＮＡプローブとそれぞれハイブリダイズした。感光させたオートラジオグラムをＥＬＩＳＡリーダーで６３０ｎｍで走査した。ＲＮＡレベルをＡ６３０の単位で表した。所定のＲＮＡサンプルの連続２倍希釈物では、各サンプルに存在する特異的ＲＮＡの濃度に比例した遺伝子発現強度の２００倍レンジを超える直線的光学濃度応答が得られる[Arad et al. (1995) 同明細書参照; Gerez et al., Clin Immunol Immunopathol 58: 251 (1991); Kaempfer et al., J Clin Oncol 14: 1778 (1996)]。
【００９３】
ＳＥＢ関連ペプチドの合成
ペプチドは、一般に、引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ９８／２９４４４に記載されるように合成した。
【００９４】
ｐ１４はフルオロニル−メトキシカルボニル化学を用いて合成し、切断し、その側鎖をトリフルオロ酢酸で脱保護した。トリフルオロ酢酸−ペプチドスレートは培地に可溶であった。同じ手法を用いてＤ−Ａｌａを結合した。
【００９５】
Ｎ末端ラウリルシステイン（ＬＣ−）およびリシル−パルミトイル（ＬＰ−）ならびにＣ末端システイン（Ｃ−）は他のアミノ酸に用いた同じ条件の下で加えた。
【００９６】
ペプチドはＨＰＬＣにより９５％を超える純度であった。
【００９７】
免疫化
実施例５に記載のようにマウスを免疫化した。
【００９８】
毒性ショックに対するマウスの保護
１０〜１２週齢の１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(Harlan, Jerusalem, Israel)群を腹腔内注射による毒素抗原投与時に２０ｍｇＤ−ガラクトサミン(Sigma)を腹腔内注射により免疫化した。
【００９９】
毒性ショックに対するブタの保護
５日齢混血ブ（主としてヨークシャー；２．５ｋｇ）を各試験条件について６匹の群に無作為化し、各群の各々個体にＳＥＡ（２５μｇ）を腹腔内注射した。アンタゴニストペプチドはＳＥＡの３０分前およびＳＥＡ後５時間まで図に示された時間に腹腔内投与した。嘔吐および下痢は８時間までは毎時、次いで１２時間までは３時間ごと、さらに２１時間目と２４時間目に評価した。
【０１００】
実施例１
致死抗原投与したマウスにおけるｐ１４Ａの有効な防御活性
図１の試験では、ＳＥＢ暴露から２０時間までに９０％の対照マウスが死に至った。しかしながら、ＳＥＢを致死抗原投与する直前にｐ１４Ａを投与した場合にはこれらのマウスの９０％が生存していた（図１）。ｐ１４Ａの防御効果は１５の試験にわたって再現性が認められた。生存している動物には苦痛である様子もなく、挙動においても正常な対照動物と見分けがつかないほどであった。それらはモニターした２週間に限っては生存していた。ｐ１４Ａ単独に暴露したマウスは十分に生存可能な状態であり、副作用もみられなかった。
【０１０１】
この防御効果はＢＡＬＢ／ｃマウス株に特有のものではなかった。Ａ／ＪマウスもまたＳＥＢによる死を防ぐＩＰｐ１２Ａにより防御された［ＷＯ９８／２９４４４］。このことから防御が厳密にＭＨＣ依存性でないことが示され、従ってアンタゴニストペプチドがＭＨＣクラスII分子と相互作用することが知られていない超抗原ドメインを標的化するという事実に一致している。
【０１０２】
実施例２
アンタゴニストペプチドでＳＥＢにより誘導される致死ショックからマウスを防御・救済する
アンタゴニストペプチド単独に暴露したマウスは生存可能な状態であり、副作用もみられなかった。ＳＥＢを抗原投与したマウスのうち、毒素暴露から２４時間の時点でまだ生存しているのは３０％だけで、後には２０％となった。しかしながら、毒素の３０分前にｐ１４を施した場合にはＳＥＢを抗原投与した総てのマウスが防御された（ｐ＝０．０００３）。生存している動物には苦痛である様子もなく、挙動においても正常な対照動物と見分けがつかないほどであった。それらはモニターした２週間に限っては生存していた。アンタゴニストペプチドの投与を、致死抗原投与の３時間（ｐ＝０．０５）、５時間（ｐ＝０．０８）または７時間後にまで遅らせた場合には部分的防御が得られた。２０〜４０時間の間にはｐ１４Ａの漸減的防御効果がみられ、それぞれ７０％、６０％および５０％の生存を得た。ｐ１４Ａによって、ＳＥＢ抗原投与前に施した場合に感染が完全に防御されるだけでなく、すでに毒性ショックに陥っているマウスを救うことができることに注目すべきである。これらの結果は図２に示されている。
【０１０３】
アンタゴニストペプチドがＳＥＢに対し２０〜４０倍モル過剰である場合に防御されるまたは救われることから、ペプチドがin vivoにおいて効力のある超抗原アンタゴニストであることがわかる。
【０１０４】
実施例３
致死抗原投与したマウスにおけるｐ１４Ａの有効な防御活性
超抗原の致死性研究用に許容される動物モデルのＤ−ガラクトサミン感作マウスを用いて、ｐ１２Ａおよびｐ１４Ａの防御活性を調査した。図３では、ＳＥＢを致死抗原投与する直前に、ｐ１２Ａで処置したマウスでは約７０％生存、未処置（ペプチドを投与しない）の動物ではたった４０％であるのに対して、ｐ１４を投与した場合にはこれらのマウスの約９０％が６０時間を超えた後でも生存していたことがわかる。ｐ１４Ａの防御効果は１５にわたる試験で再現性が認められた。生存している動物には苦痛である様子もなく、挙動においても正常な対照動物と見分けがつかないほどであった。それらはモニターした２週間に限っては生存していた。ｐ１４Ａまたはｐ１２Ａ単独に暴露したマウスは十分に生存可能な状態であり、副作用もみられなかった。
【０１０５】
実施例４
ＩＦＮ−γ遺伝子発現の誘導に対するｐ１４Ａの有効な拮抗活性
ＰＢＭＣ集団におけるＴＳＳＴ−１またはＳＥＢによるＩＦＮ−γの誘導の程度に対するｐ１４Ａおよびｐ１２Ａ（配列番号５）の効力を比較し、その結果を図４および５に示している。
【０１０６】
ｐ１４Ａはｐ１４の誘導体であり、そのＮおよびＣ両末端にＤ−Ａｌａ残基を有している。同様に、ｐ１２Ａはｐ１２の誘導体であり、そのＮおよびＣ両末端にＤ−Ａｌａ残基を有している。ＴＳＳＴ−１はＳＥＢの全配列とほんの６％しか相同性を示さないが、ｐ１２Ａおよびｐ１４Ａとも、この毒素により誘導されるＩＦＮ−γ発現を阻害した（ＴＳＳＴ−１、図４）。また、ｐ１２Ａおよびｐ１４Ａの両方がＳＥＢにより誘導される発現も阻害した（図５）。ｐ１４ＡがＴＳＳＴ−１またはＳＥＢのいずれに対しても、ｐ１２Ａよりも極めて有効な拮抗活性を示したことは驚くべきことであった。
【０１０７】
ｐ１２Ａおよびｐ１４ＡはＴＳＳＴ−１の関係のあるドメインとほとんど相同性を有していない。それにもかかわらず、両ペプチドともＴＳＳＴ−１により誘導されるＩＦＮ−γ発現を阻害した。またこの際、実際にｐ１４Ａがｐ１２Ａの４／１２に対して、たった４／１４アミノ酸残基しかＴＳＳＴ−１の関連ドメインと共有していないにもかかわらず、ｐ１４Ａで予期しない有利な結果が得られた。
【０１０８】
実施例５
保護マウスには致死ショックに対する広スペクトル耐性が急速に展開する
アンタゴニストペプチドが広域防御活性を示すかどうかを調べるために、本発明者らは、ＳＥＢと全体で２７％のアミノ酸配列相同性しか示さない［Betley and Mekalanos 1988. J. Bacteriol. 170: 34-41］超抗原、ＳＥＡの致死抗原投与中にその効果を調べた。図６Ａからわかるように、ｐ１４ＡはまたＳＥＡの致死抗原投与からもマウスを保護した。ＷＯ９８／２９４４４では、アンタゴニストペプチドｐ１２ＡがＳＥＢ、連鎖球菌毒素ＳＰＥＡ（ＳＥＡと３０％、ＳＥＢと４８％相同性を有する）またはＳＥＡおよびＳＥＢ各々と全体で７％および６％の配列相同性しか示さないＴＳＳＴ−１による死からマウスを保護したことを示した。
【０１０９】
図６の試験では、ｐ１４Ａでの防御によりＳＥＡの致死抗原投与で生存した（図６Ａ）７匹のマウスに２週間後、ＳＥＢを再び抗原投与した。この際ペプチドアンタゴニスト不在下であった（図６Ｂ）。これらのマウスは総て生存していたが、１０匹の対照群ではＳＥＢ暴露で生存したものはいなかった。２週間後、ＳＥＢのこの第２の抗原投与で生存したマウスをもう一度さらに別の超抗原毒素、このときＴＳＳＴ−１に、再びペプチドアンタゴニスト不在下で暴露させた。ＴＳＳＴ−１を抗原投与した対照群では１０匹総てのマウスが死に至ったが、処置群では７匹のうち１匹だけが死に至った（図６Ｃ）。これらの６匹の生存個体に２週間後、そこでＳＰＥＡを４回抗原投与した。これら６匹のマウスのうち４匹が生存していたが、対照群では１０匹のマウスのうち１匹しかＳＰＥＡ暴露で生存していなかった。このように、ｐ１４Ａにより、ＳＥＡが媒介する致死ショックから保護されたマウスは異なる発熱性外毒素の連続的抗原投与に対する抵抗力を急速に獲得していた。
【０１１０】
実施例６
アンタゴニストペプチドでＳＥＡにより誘導される致死ショックからマウスを保護する
ＳＥＡを抗原投与する３０分前にマウスにｐ１４Ａを注射した。この結果は図７に示されている。わかるように、アンタゴニストペプチドによる前処置でＳＥＡ抗原投与に対して１００％の防御が得られた。これに対し、未処置のマウスでは６０時間後、１０％しか生存していなかった。ｐ１４ＡがＳＥＡの関係のあるドメインと１０／１４残基しか一致性を示していなくとも、ｐ１４ＡはＳＥＡの有利なアンタゴニストである。
【０１１１】
実施例６
アンタゴニストペプチドによる免疫化でＳＥＢにより誘導される致死ショックからマウスを防御する
本発明者らはアンタゴニストペプチドを細胞膜に固定することにより、その免疫原性が高まる可能性を考察した。ｐ１４Ａを、リジンがリンカーとして、パルミチン酸が疎水性アンカーとして作用する、Ｎ末端リシル−パルミトイルリーダーで合成してｐ１４Ａ−ＬＰを得た。図８はｐ１４Ａ−ＬＰおよびｐ１４Ａによるマウスの免疫化を示している。ｐ１４Ａ−ＬＰで免疫化した１１匹のマウスのうち１０匹が、ｐ１４Ａで免疫化した１０匹のマウスのうち７匹が致死ＳＥＢ抗原投与で生存していた。これに対し、アジュバントで免疫化した対照群では１０匹のマウスのうち３匹だけであった。免疫化した生存個体に２週間後、再び抗原投与すると、ｐ１４Ａ−ＬＰで免疫化した１０匹のマウスのうち７匹が、ｐ１４Ａで免疫化した７匹のマウスのうち４匹が２倍用量のＳＥＢでも生存していた。この用量は投薬を受けていない１０匹の対照マウスを２４時間内に１０匹とも死に至らしめることができる用量である（図８Ｂ）。ＳＥＢの最初の抗原投与から１週間後に採収した免疫化マウス血清の酵素結合免疫収着検定（ＥＬＩＳＡ）によりかなりのレベルの抗ＳＥＢ  ＩｇＭ（０．８３５単位）が認められたが、ｐ１４Ａペプチドに対して向けられたＩｇＭは極めて低い値（０．０８単位）であった。さらにこれらの血清を漸増濃度のｐ１４Ａ、１０μｇ／ｍｌまで、とともに一晩プレインキュベーションしたが、それらのＳＥＢとの結合能力は低下しなかった（０．８４０単位）。アンタゴニストペプチドがＳＥＢ−結合抗体を完成していないことは明らかである。アンタゴニストペプチドは抗ＳＥＢ−抗体を誘導しているが、まだそれ自体に対する抗体が検出されていないことは注目すべきである。このことから、アンタゴニストペプチドのそれが誘導する抗体に対する親和性は毒素の親和性よりもはるかに低いことが示される。これらの結果は、アンタゴニストペプチドを用いる抗毒素ワクチンアプローチには、疎水性アンカーの利用に限定されるものではないが、生産性があることを示している。
【０１１２】
実施例７
ｐ１４ＡでＳＥＡにより誘導される活動不能からブタを保護する
ヒトＴ細胞はブドウ状球菌超抗原に対し、ネズミのものより少なくとも２オーダーの大きさで感作しやすい。ヒトは毒性ショック症候群を引き起こしやすいが、マウスは、ＴＣＲの最も高い反応性のあるＶβ鎖を示す細胞がネズミＴ細胞のすべての範囲から消失しているかまたは関連のＶβ遺伝子が欠失していることが明らかであり［Arad et al., 2000,同明細書参照］、耐性である。そのためマウスは超抗原毒素に対して自然耐性を有しており、それらが毒性ショックを受ける前に感作しているはずである。さらにマウスは体重および免疫系に関してヒトとはかけ離れている。よって人間により近い動物モデルでもアンタゴニストの効果を立証しておくことが重要である。
【０１１３】
本発明者らは両方の問題：毒素活動不能およびより高度な動物モデルの使用、に取り組んできた。ブタはヒトとよく似た免疫系を有している；例えば、ブタおよびヒト間の、ショックを媒介するＴｈ１サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−γをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列相同性は７５〜８５％のオーダーであるが、ヒトおよびマウスｍＲＮＡ間では類似性は認められない。
【０１１４】
ブタは感作の必要のない急性超抗原暴露に感受性であり、ヒトに見られるものとよく似た活動不能症状をひき起こす。悪心、嘔吐（ニューロン応答）ならびに重症の下痢（腸免疫応答）をはじめとする毒性ショックの早期活動不能症状の再現可能なブタモデルを確立した。図９からわかるように、アンタゴニストペプチドｐ１４Ａは毒素により誘導される活動不能を効果的に緩和している。
【０１１５】
５日齢混血ブタ（主としてヨークシャー；２．５ｋｇ）を、各試験条件について６匹の群に無作為し、各群の各々の個体にＳＥＡ（２５μｇ）により重症の活動不能を引き起こした。これは静脈または腹腔経路のいずれによって与えても類似した動態および強さで、２時間以内には目にも明らかとなり、２４〜３６時間で鎮静した。腹腔経路は静脈経路と同様に効果的であり、なお外傷が少なくてすむことから活動不能試験にはＳＥＡの腹腔内投与を用いた。この結果からはブタが特別にＳＥＡ感受性であることが確認される［Taylor et al., Infect Immun 36: 1263 (1982)］。この選択的感受性の理由には、ＳＥＡがそのβを捕らえて独立した第２の部位にあるＭＨＣII分子と結合し、それをいっそう強固に結合して、ＭＨＣII分子間に架橋をもたらしていることがある［Hudson et al., J Exp Med 182: 711 (1995); Schad et al., EMBO J 14: 3292 (1995); Abrahmsen et al., EMBO J 14: 2978 (1995)］。毒素アンタゴニストにより標的化されるドメインはＭＨＣIIの結合部位およびＳＥＡのＴＣＲ結合部位とも離れている。それにもかかわらず、アンタゴニストｐ１４Ａにより１０匹のマウスのうち７匹がＳＥＡによる死から保護され、かつ生存個体には広域防御免疫が惹起され（図６）、図７の試験ではＳＥＡ抗原投与した１０匹のマウスのうち１０匹にそれが現れた。
【０１１６】
次の基準を用いてブタの活動不能を評価した：嘔吐（評点４）；下痢、軽度（評点１）、中度（評点２）、重度（評点４）、および水下痢（評点６）（データなし）。長期食欲不振および雌ブタの乳首の代わりの吸水口の使用、無関心ならびによろめきがはっきりと観察されるが、これらは容易に定量できない；体温格差は正常な対照動物と平均１℃未満にとどまる。
【０１１７】
本発明者らはヒトＰＢＭＣ（図４および５）および致死毒性ショックから保護されたマウス（図３）においてin vitroでの超抗原の作用を阻害する能力に関し、ｐ１２Ａよりもｐ１４Ａの方が効果があることを示した。ｐ１４ＡアンタゴニストペプチドによりブタのＳＥＡ活動不能症状（嘔吐および下痢）が鎮静した。
【０１１８】
図９からわかるように、漸増用量のｐ１４Ａにより全般的な活動不能、ならびに嘔吐および下痢が目に見えて緩和された。これらの結果は、実施した６回のアンタゴニスト投与の最後の投与後に起こり、広く維持、発症する全般的活動不能（ｐ＝０．００２）および下痢（ｐ＜０．００１）に関してはかなり有意であり、ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定で有意であった。また、嘔吐もアンタゴニスト用量に応じて緩和した。
アンタゴニストペプチド単独では副作用はみられなかった：ｐ１４Ａ単独を受けた混合群の１８匹のブタでは活動不能のいずれの症状も認められなかった（図９）。
本発明者らはアンタゴニストペプチドｐ１４Ａによる、対照動物では長期化し、たいてい５時間（試験群におけるアンタゴニストペプチドの最終投与時間）を超えて２４時間まで、発症する下痢の効果的な抑制を認めた；このことからアンタゴニストペプチドの長期にわたる効果が示される。
【０１１９】
ｐ１４Ａアンタゴニストペプチドｐ１４ＡによりブタのＳＥＡ活動不能症状（嘔吐および下痢）が抑制され、アンタゴニストの投与回数によってその効果が高まった（図１０）。この抑制は統計学的に有意である。ＳＥＡ暴露後にｐ１４Ａアンタゴニストペプチドの投与を４回受けたブタ群は、ＳＥＡ暴露後にアンタゴニストペプチドの投与を２回しか受けていない群よりも低い活動不能を示した。また後の両方の群はＳＥＡ暴露の３０分前に１用量のアンタゴニストペプチドを受けていたが、より多くの回数の毒素後処置を行うほどより効果の高い活動不能の抑制が得られる。これらの結果から、例えば、毒性ショックにあるおよび重症の食中毒にあるヒトで見られるような、活動不能症状の治療におけるアンタゴニストペプチドの可能性ある効用が示される。
【０１２０】
このように、アンタゴニストペプチドｐ１４Ａは、マウスだけでなく、免疫系がヒトのものとより密接に関係している動物であるブタにおいても、in vivoで毒素アゴニスト活性を全く検出することなく超抗原毒素、ＳＥＡの毒性ショック症状を止めることが可能である。
【０１２１】
これらの実施例は本発明の範囲の具体例をさらに記載し、例示するものである。これら実施例は本発明を限定するものではなく、単に例示を目的としたものであり、本発明の精神および範囲を逸脱することなくその多くの変法が可能である。
【０１２２】
本明細書において引用される総ての参考文献は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１２３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
以下の図面により本発明をさらに詳細に説明する。
【図１】アンタゴニストペプチドがＳＥＢにより誘導される致死ショックからマウスを保護することを示す説明図。
１０匹のＢａｌｂ／ｃマウスに２０ｍｇＤ−ガラクトサミンを感作させ、同時に１０μｇＳＥＢを抗原投与した（○）。もう一方の１０匹のマウスにはＳＥＢ抗原投与３０分前に２５μｇのｐ１４Ａを施した（●）。生存個体をモニターした。
【図２】アンタゴニストペプチドがＳＥＢにより誘導される致死ショックからマウスを保護・救済することを示す説明図。
１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群に２０ｍｇＤ−ガラクトサミンを感作させ、同時に１０μｇＳＥＢを抗原投与した。同時に注射した。１アリコートの２５μｇのｐ１４ＡをＳＥＢ抗原投与３０分前（▲）またはＳＥＢ投与後の３（黒四角）、５（○）もしくは７（●）時間後に注射した。ｐ１４Ａを受けなかった１０匹の感作無投薬マウスをＳＥＢ対照とした（□）。総ての注射は腹腔内により行った。
【図３】アンタゴニストペプチドｐ１２Ａおよびｐ１４ＡによるＳＥＢにより誘導される致死ショックからのマウスの保護を示す説明図。
１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群に、２０ｍｇＤ−ガラクトサミンとともに５μｇの毒素を腹膜内注射してＳＥＢ(Sigma)を抗原投与した。示されたように２５μｇのｐ１２Ａまたはｐ１４ＡのいずれかをＳＥＢ投与３０分前に腹膜内注射した。生存個体をモニターした。
【図４】ＴＳＳＴ−１によるＩＦＮ−γ遺伝子発現誘導に対するアンタゴニストペプチドｐ１２Ａおよびｐ１４Ａの効力を示す説明図。
健康なヒト提供者のＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ(Pharmacia)で分離し、５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、４×１０６／ｍｌの濃度に再懸濁し、２％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  ＭＥＭ非特異的アミノ酸、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、５×１０−５Ｍ  ２−ＭＥ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５μｇ／ｍｌナイスタチンを添加した同培地で培養した。一晩静置した後、１ｍｌ中４×１０６ＰＢＭＣのアリコートを、１００ｎｇ／ｍｌのＴＳＳＴ−１(Sigma)単独の存在下または示された１０μｇ／ｍｌのｐ１２Ａもしくはｐ１４Ａの存在下で、示された回数培養した。全ＲＮＡを示された回数抽出し、連続２倍希釈物を３２Ｐ標識ＩＦＮ−γアンチセンスＲＮＡプローブを用いるブロットハイブリダイゼーション解析[Arad et al., (2000) 同上]に付した。オートラジオグラムを濃度計で６３０ｎｍにて定量し、６３０ｎｍの吸光度をプロットする。
【図５】ＳＥＢによるＩＦＮ−γ遺伝子発現誘導に対するアンタゴニストペプチドｐ１２Ａおよびｐ１４Ａの効力を示す説明図。
１ｍｌ中４×１０６ＰＢＭＣのアリコートを、１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢ（ロット１４〜３０、the Department of Toxinology, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases(USAMRIID, Frederick, Maryland)から）単独の存在下または指示された１０μｇ／ｍｌのｐ１２Ａもしくはｐ１４Ａの存在下で、示された回数培養した。全ＲＮＡを示された回数抽出し、連続２倍希釈物を３２Ｐ標識ＩＦＮ−γアンチセンスＲＮＡプローブを用いるブロットハイブリダイゼーション解析に付した。オートラジオグラムを濃度計で６３０ｎｍにて定量し、６３０ｎｍの吸光度をプロットする。図４の場合と同じＰＢＭＣ集団を用いた。
【図６】アンタゴニストにより保護したマウスには致死ショックに対する広域免疫が急速に現れることを示す説明図。
（Ａ）２０ｍｇＤ−ガラクトサミンによる感作および１０μｇＳＥＡによる同時抗原投与３０分前に、１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスにｐ１４Ａを施した（●）。さらにｐ１４Ａの注射は行わずに、７匹の生存個体に２週間後、１０μｇＳＥＢ（▲；Ｂ）、続いて２週間後に１０μｇＴＳＳＴ−１（黒四角；Ｃ）、さらに２週間後に１５μｇＳＰＥＡ（▲；Ｄ）を再び抗原投与した。各抗原投与では、１０匹の感作無投薬マウスを毒素対照とした（○、△、□）。総ての注射は腹腔内により行った。
【図７】アンタゴニストペプチドがＳＥＡにより誘導される致死ショックからマウスを保護することを示す説明図。
１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群に１０μｇＳＥＡを腹腔内により抗原投与し、ＳＥＡ投与３０分前に２５μｇのｐ１４Ａを腹腔内注射した。
【図８】アンタゴニストペプチドでの免疫化でＳＥＢにより誘導される致死ショックからマウスを保護することを示す説明図。
Ａ：１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｐ１４Ａ−ＬＰについては１１匹のマウス）に、フロイントアジュバント（ＦＡ）中の示されたペプチド１０μｇを３回注射（０、２および４週間目）して免疫化し、その後６週間目に１０μｇＳＥＢおよび２０ｍｇＤ−ガラクトサミンを腹腔内注射して抗原投与した。生存個体をモニターした。Ｂ：最初の抗原投与から２週間後、Ａの生存個体（ｐ１４Ａ−ＬＰ、ｎ＝１０；ｐ１４Ａ、ｎ＝７）に２０μｇＳＥＢおよび２０ｍｇＤ−ガラクトサミンを再び抗原投与した。ＬＰ、リシル−パルミトイル。ＦＡおよびｐ１４Ａ−ＬＰ（▲）、ＦＡおよびｐ１４Ａ（□）またはＦＡ単独（黒四角）で免疫化したマウス；ＳＥＢを抗原投与した無投薬対照マウス（○）。
【図９】発熱性外毒素アンタゴニストでＳＥＡにより用量依存的に起こる浮力かからブタを保護することを示す説明図。
ブタ群（全体の群の大きさ、ｎ）に、０時間に２５μｇ／ｋｇＳＥＡを腹腔内により抗原投与した。示されたようにｐ１４Ａ（２５、５０または１００μｇ／ｋｇ）をＳＥＡ投与から〜０．５時間および１、２、３、４および５時間後に腹腔内により施した。それぞれのブタを、１１時点を２４時間にわたって観察した。これらの時点の曲線の下にある面積を全般的活動不能、嘔吐および下痢についてプロットする。全般的活動不能のスコアは嘔吐および下痢スコアの合計である。群間の反復測定解析の結果、ｐ値を得る。統計解析はＷｉｎｄｏｗｓ９．０ソフトウェアのＳＰＳＳを用いてＴｕｋｅｙ  ＨＳＤ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定によりデータ集合のＡＮＯＶＡを行った（なお、ｐ≦０．０５には１つのアステリスクを付けている）。毒素投与なしのｐ１４Ａ対照を右に示す。
【図１０】アンタゴニストペプチドの反復投与によるＳＥＡにより誘導される活動不能からのブタの保護を示す説明図。
６匹の子ブタ群に２５μｇ／ｋｇＳＥＡを腹腔内により抗原投与した。ｐ１４Ａ（５０μｇ／ｋｇ）を０、１．５および２．５時間（×３）にまたは０、１．５、２．５、３．５および４．５時間（×５）にＩＰにより施した。嘔吐および下痢の活動不能スコアをそれぞれ示す。生理食塩水対照動物にはＳＥＡもｐ１４Ａも与えなかった。曲線の下にある面積を、評価した全般的活動不能、嘔吐および下痢について、１０時点を２４時間にわたってプロットする。統計解析はＷｉｎｄｏｗｓ９．０ソフトウェアのＳＰＳＳを用いてＴｕｋｅｙ  ＨＳＤ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定によりデータ集合のＡＮＯＶＡを行った（なお、ｐ≦０．０５には１つのアステリスクを付けている）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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