(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、被検試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量する第２工程とから成る、低密度リポ蛋白、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及び／又はカイロミクロンを含むかもしれない被検試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法。
【請求項２】
前記第２工程は、前記第１工程の産物に、少なくとも低密度リポ蛋白に作用する界面活性剤を加え、前記コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することから成る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも低密度リポ蛋白と作用する界面活性剤は、全てのリポ蛋白に作用するものである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第１工程で用いられる、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤は、ＨＬＢ値が１３以上１５以下であるポリアルキレンオキサイド誘導体である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２工程で用いられる、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤は、ＨＬＢ値が１１以上１３未満であるポリアルキレンオキサイド誘導体である請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記第１工程で用いられる、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤は陽イオン界面活性剤である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記陽イオン界面活性剤は第４級アンモニウム塩を有する請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第２工程で用いられる、少なくとも低密度リポ蛋白に作用する界面活性剤は陰イオン界面活性剤である請求項２記載の方法。
【請求項９】
前記第１工程は、前記界面活性剤濃度を０．１〜１０ｇ／ｌとして行われる請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２工程は、ＨＬＢ値が１１以上１３未満である前記ポリオキシアルキレン誘導体又は前記陰イオン界面活性剤の濃度を１〜１００ｇ／ｌとして行われる請求項５又は８記載の方法。
【請求項１１】
前記第１及び第２の工程は、ｐＨ５〜８の緩衝液中で行なわれる請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
上記第１及び第２工程は、温度２５〜４０℃で行なう請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動脈硬化症の臨床診断に重要な低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）中のコレステロール（以下、「ＬＤＬコレステロール」ということがある。本明細書において単に「コレステロール」という場合にはエステル型コレステロール及び遊離型コレステロールの両者を包含する）の分別定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＬＤＬは血液中におけるコレステロール運搬の主役であり粥状動脈硬化において血管壁に沈着したコレステロールは主にＬＤＬに由来している。血漿におけるＬＤＬの増加は虚血性心疾患等の粥状硬化性疾患の主要な危険因子の１つであり、ＬＤＬコレステロールを分別定量することは臨床的に有用である。
【０００３】
従来のＬＤＬコレステロールの定量法は、分画操作とコレステロール定量操作の２段階から求める方法と血中の総コレステロール、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）中のコレステロール、トリグリセリドをそれぞれに求めるＦｒｉｅｄｅｗａｌｄの式により算出する方法がある。
【０００４】
分画操作には、超遠心法、沈殿法、免疫化学的方法等がある。超遠心法を用いる場合には、比重の差を利用して超遠心分離機によりＬＤＬを分離し、そのコレステロール量を測定するものである。沈殿法はＨＤＬ抗体、ポリアニオン及び２価の陽イオンを添加し、不溶性沈殿物を生成させて遠心分離により上清中のＬＤＬコレステロールを定量する方法（WPI Acc No.85-116848/20)である。免疫化学的方法はＨＤＬ、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）に対する抗体をラテックスに結合させ、凝集反応後に遠心又はフィルタにより取り除き、ＬＤＬコレステロールを定量する方法（WPI Acc No.84-301275/49)が報告されているが、いずれも簡便性や経済性に問題がある。
【０００５】
Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄの式では総コレステロールからＨＤＬコレステロールを引き、さらにトリグリセリドの１／５量を引きＬＤＬコレステロールを求める。しかし、食事の影響や個体差を加味していないため正確性に問題がある。
【０００６】
また近年、分画操作を要しないＬＤＬコレステロールの定量法（WPI Acc No.83-766269/38)が報告されているが、ＬＤＬに対する特異性が不十分である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、煩雑な遠心分離操作を要せず、ＬＤＬコレステロールを簡便に分別定量する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは第１工程で低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、被検試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロール以外のコレステロールを消去し、続く第２工程において残存するコレステロールを測定することにより、低密度リポ蛋白中のコレステロールを定量することができることを見出し本願発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、被検試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量する第２工程とから成る、低密度リポ蛋白、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及び／又はカイロミクロンを含むかもしれない被検試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
リポ蛋白中に含まれるコレステロールとしては、エステル型コレステロール（コレステロールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明細書において、単に「コレステロール」という場合には、これらの両者を包含する。
【００１１】
本発明の方法に供される被検試料としては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、例えば、血液、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１２】
本発明の方法は、第１工程及び第２工程から成り、第１工程では低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、被検試料中のＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールを消去し、続く第２工程では、被検試料中の残存コレステロールを定量する。第１工程でＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールが消去されているので、第２工程で定量されるコレステロールは、主として被検試料中のＬＤＬ中のコレステロールである。
【００１３】
第１工程におけるコレステロールの「消去」とは、コレステロールを分解し、かつ、その分解産物が次の第２工程で検出されないようにすることを意味する。ＬＤＬ以外のリポ蛋白、すなわち、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等に含まれるコレステロールの選択的な消去は、以下の方法により行われる。
【００１４】
すなわち、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去する。
【００１５】
過酸化水素を消去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼを用いてフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と過酸化水素を反応させて無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
第１工程の反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍｌ程度が好ましく、由来としてはシュードモナス属細菌から生成されるものが効果的である。また、コレステロールオキシダーゼの濃度は０．１〜  ０．７Ｕ／ｍｌ程度が好ましく、細菌や酵母由来のものを用いることが好ましい。さらに、カタラーゼの濃度は４０〜１００Ｕ／ｍｌ程度が好ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合のペルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍｌが好ましく、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物の濃度としては０．４〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００１７】
第１工程で用いられる、ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ値が１３以上１５以下、好ましくは１３以上１４以下であるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。なお、界面活性剤のＨＬＢ算出方法は周知であり、例えば「新界面活性剤」、堀内博著、昭和６１年、三共出版に記載されている。
【００１８】
ＨＬＢ値が１３以上１５以下のポリアルキレンオキサイド誘導体の好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１３以上１５以下の化合物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１９】
また、第１工程で用いられる界面活性剤として陽イオン界面活性剤を用いることもできる。この場合の陽イオン界面活性剤としては、下記一般式（Ｉ）で示される、第４級アンモニウム塩を親水基として有するものが好ましい。
【００２０】
【化１】
0004059586.tif 000002
【００２１】
ただし、式（Ｉ) 中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖状のアルキル基を示し、Ｒ１ は炭素数３〜２０のアルケニル基を示す。
【００２２】
第１工程で用いられる上記界面活性剤の濃度は、０．１〜１０ｇ／ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは０．５〜５．０ｇ／ｌ程度である。
【００２３】
第１工程は、ｐＨ５〜８の緩衝液中で行うことが好ましい。
【００２４】
第１工程で、ＬＤＬとの反応を抑え、他のリポ蛋白の消去をさらに高めるために、反応液中に２価の金属イオンを含ませてもよい。２価の金属イオンとしては銅イオン、鉄イオン及びマグネシウムイオンを使用することができるが、特にマグネシウムイオンが好ましい。２価の金属イオンの濃度は５〜２００ｍＭ程度が好ましい。
【００２５】
なお、第１工程の反応液中には、任意的に、リポ蛋白分解酵素を加えることもできる。この酵素を加えることにより、特にＶＬＤＬ中のコレステロールが反応しやすくなるので好ましい。この酵素の反応液中濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍｌ程度が好ましい。
【００２６】
第１工程の反応温度は２５〜４０℃程度が適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間は２〜１０分間程度でよい。
【００２７】
続く第２工程では、被検試料中の残存コレステロールを定量する。これは、例えば、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤を加え、第１工程で加えたコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより行なうことができる。ここで、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤は、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面活性剤でもよいし、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であってもよい。
【００２８】
全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ値が１１以上１３未満、好ましくは１２以上１３未満であるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。
【００２９】
ＨＬＢ値が１１以上１３未満のポリアルキレンオキサイド誘導体の好ましい具体例として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１１以上１３未満の化合物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００３０】
また、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面活性剤として、陰イオン界面活性剤を挙げることができる。ここで用いられる陰イオン界面活性剤としては、特に限定されないが、芳香環に炭素数４〜１８の直鎖状又は分枝状アルキル基が結合したものを有するものが好ましい。ここで、芳香環は、ベンゼン、ナフタレン、ジフェニール等のように炭素と水素のみから成るものが好ましい。さらに、上記芳香環にスルホン酸塩のような親水基が結合したものが好ましい。このような好ましい陰イオン界面活性剤の例を下記式（II）ないし（VI）に示す。
【００３１】
【化２】
0004059586.tif 000003
【００３２】
【化３】
0004059586.tif 000004
【００３３】
【化４】
0004059586.tif 000005
【００３４】
【化５】
0004059586.tif 000006
【００３５】
【化６】
0004059586.tif 000007
【００３６】
但し、式（II）〜（VI）において、Ｒは炭素数４〜１８の直鎖状又は分枝状アルキル基を示す。また、第２工程で用いられる好ましい陰イオン界面活性剤として、高級アルコール硫酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００３７】
第２工程で用いられる界面活性剤の濃度は、０．１〜１００ｇ／ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは１〜５０ｇ／ｌ程度である。
【００３８】
第２工程のその他の好ましい反応条件は、第１工程における好ましい反応条件と同様である。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
第１試薬
ＢＥＳ緩衝液、ｐＨ6.0                                      100 mmol/L
HDAOS:N-(2−ヒドロキシスルホプロピル)-3,5-
ジメチオキシアニリン                                       0.7 mmol/L
シュードモナス属細菌由来コレステロールエステラーゼ
（旭化成工業社製商品名「ＣＥＮ」）                         0.8  U/ml
ストレプトミセス属細菌由来コレステロールオキシダーゼ
（東洋紡績社製商品名「ＣＯＯ」）                           0.5  U/ml
カタラーゼ                                                  80  U/ml
塩化マグネシウム                                            10 mmol/L
花王社製エマルゲンＢ６６
（ポリオキシエチレン誘導体（HLB=13.2））                    0.2  ％
【００４１】
第２試薬
ＢＥＳ緩衝液、ｐＨ7.0                                      50 mmol/L
４- アミノアンチピリン                                     4.0 mmol/L
ペルオキシダーゼ                                           2.4単位/ml
アジ化ナトリウム                                           0.1％
花王社製エマルゲンＡ６０
（ポリオキシエチレン誘導体（HLB=12.8））                   5.0％
【００４２】
コレステロール濃度として100mg/dlに精製したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭをそれぞれ含む4 種類の試料各4 μl に、あらかじめ37℃で加温した第１試薬300 μl を混和し、37℃で5 分間反応させた後に、第２試薬100 μl を加え5 分間反応させ、600nm における吸光度を測定した。測定された吸光度からコレステロール量を算出し、試料中のコレステロール量との比を計算して捕捉率を求めた。結果を下記表１に示す。
【００４３】
【表１】
0004059586.tif 000008
【００４４】
表２に示されるように、上記方法によれば、ＬＤＬ中のコレステロールはかなりの部分について捕らえているが、それ以外のリポ蛋白中コレステロールはほとんど捕らえておらず、ＬＤＬ中コレステロールを選択的に定量できることがわかる。
【００４５】
実施例２
第１試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ7.0                                 50 mmol/L
ＨＤＡＯＳ                                                 0.7 mmol/L
シュードモナス属細菌由来コレステロールエステラーゼ
（旭化成工業社製商品名「ＣＥＮ」）                         0.8  U/ml
ストレプトミセス属細菌由来コレステロールオキシダーゼ
（東洋紡績社製商品名「ＣＯＯ」）                           0.5  U/ml
カタラーゼ                                                  80  U/ml
塩化マグネシウム                                            10 mmol/L
花王社製エマルゲンＢ６６                                   0.2  ％
【００４６】
第２試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ7.0                                   50 mmol/L
４- アミノアンチピリン                                      4.0 mmol/L
ペルオキシダーゼ                                           2.4単位/ml
アジ化ナトリウム                                           0.1％
TritonＸ100                                                3.0％
【００４７】
実施例１と同様な操作を行い各リポ蛋白との反応性を求めた。結果を下記表２に示す。
【００４８】
【表２】
0004059586.tif 000009
【００４９】
実施例３
試料として健常人血清を用い、実施例１、２の操作を行い、ＬＤＬコレステロール濃度を求めた。対照法としてＦｒｉｅｄｅｗａｌｄの計算式（CLIN.CHEM.、41、1414、1995）を用いて血清中のＬＤＬコレステロール濃度を求めた。その結果を図１及び図２の相関図として示した。
【００５０】
図１及び図２に示されるように、両方法による定量結果は非常によく一致しており、本発明の方法により正確にＬＤＬ中のコレステロールが定量できることが明らかになった。
【００５１】
実施例４
第１試薬
グッド緩衝液、ｐＨ７．０                           50 mmol/l
ＨＤＡＯＳ                                          0.7 mmol/l
コレステロールエステラーゼ                          0.8 U/ml
コレステロールオキシダーゼ                          0.5 U/ml
カタラーゼ                                         80 単位/ml
陽イオン界面活性剤（ラウリルトリメチル
アンモニウムクロライド）                            0.1%
【００５２】
第２試薬
４−アミノアンチピリン                              4.0 mmol/l
ペルオキシダーゼ                                    2.4 単位/ml
アジ化ナトリウム                                    0.1%
非イオン界面活性剤（ポリオキシエチレン
ラウリルエーテル）                                  0.1%
（非イオン界面活性剤は第２反応に使用）
【００５３】
試料２０μｌに予め３７℃で加温した第１試薬１８０μｌを混和し、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬を６０μｌ加え５分間反応させ６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５４】
図３はＬＤＬコレステロール濃度と吸光度との関係を示すもので、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ存在下においてもＬＤＬコレステロールを特異的かつ濃度依存的に測定できることを示している。
【００５５】
実施例５
試料として血清を用い、実施例４の操作を行いＬＤＬコレステロール濃度を求めた。対照法としてFriedewaldの計算式（CLIN.CHEM.,41,1414,1995)を用いて血清中のＬＤＬコレステロール濃度を求めた。その結果を表３に示す。表３に示すように、本発明の方法による結果はFriedwald の計算式による結果と良好な相関を示した。
【００５６】
【表３】
0004059586.tif 000010
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、煩雑な遠心分離操作を要せず簡便にＬＤＬコレステロールを分別定量する方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるＬＤＬコレステロールの測定結果と、Friedewald算出値との相関関係を示す図である。
【図２】実施例２におけるＬＤＬコレステロールの測定結果と、Friedewald算出値との相関関係を示す図である。
【図３】実施例４においてＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ非存在下及び存在下におけるＬＤＬコレステロール濃度と本発明の方法により測定された吸光度との相関関係を示す図である。
【図１】
0004059586.tif 000011
【図２】
0004059586.tif 000012
【図３】
0004059586.tif 000013