(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドコサヘキサエン酸産生菌の染色体DNAをSau3AIで処理して得られる、図１で示される制限酵素地図を有する約37kbの遺伝子断片に含まれ、イコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸の生合成に関与する酵素群をコードする遺伝子。
【請求項２】
ドコサヘキサエン酸産生菌がシーワネラsp. SCRC-21406(FERM BP-5979)である、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号：１で示される塩基配列によってコード化されたイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸の生合成に関与する酵素群をコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号：２，４，６及び８で示される塩基配列群から選ばれた少なくとも一つの塩基配列を含んで成るイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸の生合成に関与する酵素群をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号：３，５，７及び９で示されるアミノ酸配列群から選ばれた少なくとも一つのアミノ酸配列を含んで成るイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸の生合成に関与する酵素群をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項３または４に記載の遺伝子を含んで成るプラスミド。
【請求項７】
請求項６に記載のプラスミドにより形質転換された微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬、食品、飼料などの原料として有用なイコサペンタエン酸（以下ＥＰＡと称する）及び／又はドコサヘキサエン酸（以下ＤＨＡと称する）の生合成に関与する酵素群をコードする遺伝子、遺伝子を含有するプラスミド、該プラスミドにより形質転換された微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、微生物の働きにより、ＤＨＡを製造する試みがなされている。例えば、海洋性微細藻類｛Phytochemistry, 30, 2963-2967 (1991), 特開平7-8221, 特開平7-95875｝や鞭毛菌類｛J. Am. Oil  Chem. Soc., 68, 509-514 (1991), 特開平1-199588｝を用いたＤＨＡ含有トリグリセリドの製造法の報告がある。また、高圧条件下あるいは5℃以下の低温下における深海性微生物によるＤＨＡの産生に関する報告｛Appl. Environ. Microbiol., 51, 730-737 (1986)（ビブリオ・マリナスATCC15381）; Lipids, 29, 527-528 (1994)｝、海洋細菌を用いたＤＨＡ及びＤＨＡ含有リン脂質の製造法の報告（特開平10-191993）がある。しかしながら、これらの微生物のＤＨＡ生合成に関与する遺伝子については報告されていない。
【０００３】
一方、ＤＨＡと同様の高度不飽和脂肪酸であるＥＰＡを生産する海洋細菌の染色体ＤＮＡ中より、ＥＰＡ生合成系遺伝子群が取得されており、これを導入した組み換え大腸菌を用いたＥＰＡの製造法が報告されている〔特開平6-46864号{WO93/23545-A (EPO594868-A)}、特開平8-242867号、WO98/01565〕。しかしながら、これらの報告にはＤＨＡの生産に関する記述はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
有用な物質を生産する野生株の該有用物質の生産性は一般に低く、それらの微生物の能力を工業的に利用しようとする場合、種々の方法により微生物の改良、すなわち生産性の向上が行われる。本発明は、遺伝子組み換え法を用いて、文献未知のＤＨＡ生合成酵素群遺伝子を見出し、他の生物体に導入することにより、ＤＨＡ生産性の向上を目指すと共に、ＤＨＡ生合成能を持たない生物へのＤＨＡ生合成能の賦与を目的とし、ひいてはＤＨＡの有利な製造法を確立しようとするものである。また同時に、ＥＰＡのより効率的な生産に使用可能な新たな遺伝子群を見出すことをも目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究の結果、ＤＨＡ産生海洋細菌シーワネラsp. SCRC-21406株(FERM BP-5979)の染色体DNA中より、ＥＰＡ生合成系遺伝子群の欠失変異体のＥＰＡ生産能を回復させる能力を有する遺伝子群を見出した。さらにこれをＥＰＡ生合成系遺伝子群と組み合わせることによってＤＨＡの生産が可能であることを見出し、本発明を完成した。
従って本発明は、ＥＰＡ及び／又はＤＨＡの生合成酵素群遺伝子、それを含有する発現型プラスミド、該プラスミドにより形質転換された微生物を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明においては、ＤＨＡを生産する能力を有する微生物（遺伝子源微生物）からDNAを抽出し、このDNAを制限酵素で切断することによってＥＰＡ及び／又はＤＨＡ生合成に関与する酵素群をコードする遺伝子を切り出し、これを適当なベクターに導入することによって発現型プラスミドを作成する。
【０００７】
本発明においては、ＤＨＡ生合成酵素群の遺伝子源の例として、シーワネラsp. SCRC-21406株(FERM BP-5979)を用いる場合について具体的に説明しているが、ＤＨＡを生産することができるものであればいずれでもよく、特に属、種あるいは株などを限定するものではない。これらの微生物については公的微生物寄託機関で容易に入手でき、また自然界から新たに分離することもできる。
【０００８】
本発明の遺伝子を用いることにより、例えばエシェリヒャ・コリ(Escherichia coli)や枯草菌(Bacillus subtilis)のごとき異種宿主もしくはシーワネラ属細菌のごとき同種宿主である細菌、あ るいはさらに酵母、糸状菌等を形質転換することにより、ＥＰＡやＤＨＡ生産株を人為的に創製することができる。さらに、大豆、ひまわり、アブラナ、ごま等の高等植物に本遺伝子を導入することにより、ＥＰＡやＤＨＡ産生植物を作り出すことも可能である。ＥＰＡ及び／又はＤＨＡ生合成酵素群遺伝子の発現のための領域としては、これらの酵素の遺伝子に本来付随している制御領域を使用することも可能であるが、発現量を向上させ、あるいは発現の誘導を可能にするためには別途プロモーター／オペレーター系を用意するのが好ましい。宿主として大腸菌を用いる場合には、このようなプロモーター／オペレーター系として、T7, lac, bla, trp、tac、lavUV5、PL、PR、lPP等のプ ロモーター／オペレーター系を用いることができ、ＳＤ配列として、trpリーダ ーペプチド、lacZ、メタピロカテカ−ゼまたはcII遺伝子等のＳＤ配列を用いる ことができる。さらにコード領域の下流に転写ターミネーター、例えば、大腸菌のリボゾーム遺伝子のrrnBT1T2ターミネーター等を設けることができる。さらに、前記遺伝子の発現においては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の宿主／ベクター系を用いることができ、この場合のプロモーターとしては酵母のアルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター、酸性ホスファターゼ遺伝子のプロモーター、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素のプロモータ ー、エノラーゼ遺伝子のプロモーター等を使用することができ、この場合のプラスミドは酵母中で複製するための配列、及び該プラスミドを含有する酵母を選択するための選択マーカーとしての栄養要求性マーカー、例えばLeu、Trp、His等 の要求性の配列を含有することが好ましい。
【０００９】
高等植物への遺伝子導入においては、ベクターを用いる方法や直接導入法などがある。ベクターとしてはTiプラスミドや、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、ジェミニウイルス、カサバラテントウイルス、トマトゴールデンモザイクウイルスなどのＤＮＡウイルス、ブロムモザイクウイルス(BMV)、タバコモザイクウ イルス(TMV)などのＲＮＡウイルスを用いることができ、この場合のプロモータ ーとしてCaMVの35Ｓプロモーターなどを挙げることができる。また、プロトプラストへの直接導入法としてリン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム法などが挙げられる。また、植物細胞への直接導入法としてパーティクルガン法も挙げられる。
【００１０】
なお、一般に大腸菌における特定の蛋白質の発現量は遺伝子のコピ−数、転写効率、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率、蛋白質の安定性等に影響される。遺伝子工学的技術を用いてこれらの制御領域であるプロモーター、ＳＤ領域、ターミネーター等を改変するためにはプラスミドは小型である方が取り扱いが容易である。また、遺伝子のコピー数は、その遺伝子をコードしているプラスミドの大きさに関連し、小型である方がコピー数は増加する傾向がある。このため、本発明の実施例で述べるＥＰＡ及び／又はＤＨＡの生合成に関与する酵素群遺伝子を含有するDNA断片をプラスミドに挿入し、このプラスミドDNAのサブクローニングを反復することによって該遺伝子断片中の不要部分を切除することにより、一層小型のプラスミドを得ることも可能である。この方法によって得られる、より小型化したＥＰＡ及び／又はＤＨＡ生合成酵素群遺伝子も本発明に含まれる。また、酵素の安定性や活性を高めるために、公知の手法を用いて、遺伝子の一部塩基配列（アミノ酸配列）を変換することも可能であり、あるいは遺伝子の複製の段階において数塩基の挿入、欠失または置換が起こる可能性もあるが、これらの変異遺伝子も本発明に含まれる。
なお、本発明において、ＥＰＡ及び／又はＤＨＡの生合成に関与する酵素群をコードする遺伝子は、配列番号２，４，６及び８で示される塩基配列によってコードされるものとストリンジェントな条件でハイブリダイズするものを包含する。
【００１１】
本発明の宿主大腸菌としては、エシェリヒャ・コリK12株に由来する任意の菌 株を使用することができる。例えば、JM83、JM101、JM103、JM105、JM109、JM109(DE3)、RR1 、RB791、W3110、C600、HB101、DH1、AG1、NM554、BL21(DE3)等を使用することができる。また宿主酵母としては、AH22、DC5、D-13-1A、YNN140等が挙げられる。
【００１２】
なお、本発明の遺伝子がコードする酵素群は、宿主生物体が本来有する生合成系により合成される高級脂肪酸をＥＰＡ及び／又はＤＨＡに誘導できる。さらには、本遺伝子群の一部を用いて宿主生物体の脂肪酸組成を変革することも可能である。
【００１３】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００１４】
【実施例】
【００１５】
実施例１−１．  シーワネラsp.SCRC-21406のゲノムDNAの調製
ペプトン1.0%、酵母エキス0.5%を1/2濃度の人工海水に溶解し、pH7.0に調整した培地100mlを121℃、20分間加熱滅菌した後、シーワネラsp.SCRC-21406(FERM BP-5979)を接種し、15℃で24時間好気的に培養した。培養後、遠心分離機で菌体を採取し、20mlのSET緩衝液(50mM EDTA, 20%Sucrose, 50mM Tris-HCl, pH7.6)で一回洗浄した。得られた菌体をドライアイス／アセトン中で２分間凍結し、水中で溶解したのち、2mlの同緩衝液に懸濁した。ここに1mgのリゾチームと1mgのRNase Aを添加し、混合したのち氷中で15分間放置した。さらに10%SDSを125ml加え、37℃で6時間振とうしたのち、0.6mgのプロテイナーゼKと1.5mlのクロロホルムを加えて37℃で一晩振とうした。ここに蒸留水1mlとクロロホルム10mlを添加し、5分間おだやかに混合したのち、フェノール10mlを加えてさらに5分間混合し、遠心分離して上層を採取した。ここにクロロホルム10mlを加え、5分間おだやかに混合したのち再び遠心分離して上層を得た。これをもう一度繰り返し、得られた上層に0.2mlの5M食塩水と12mlのエタノールを加えて軽く混ぜ、析出したDNAをガラス棒で巻き取った。これをエタノール中で洗って、3mlのTEN緩衝液(1mM EDTA, 10mM NaCl, 10mM Tris-HCl, pH7.6)に溶解した。得られたDNA量は約4.7mgであった。このDNA 157μｇを制限酵素Sau3AIを用いて部分分解した後、0.3%アガロースゲル上で電気泳動し、約20kbp以上のDNA断片を電気溶出により単離した。これをフェノール／クロロホルム抽出したのちエタノール沈殿し、500mlのTE緩衝液(1mM EDTA, 10mM Tris-HCl, pH7.6)に溶解した。このうち100mlを20%PEG/2.5M NaCl 100mlと混合し、遠心分離を行って沈殿を得た。この沈殿物を100mlのTE緩衝液に溶解し、フェノール、フェノール／クロロホルム、クロロホルムで抽出したのちエタノール沈殿して、10mlのTE緩衝液に溶解した。
【００１６】
実施例１−２．  ゲノムDNAライブラリーの作製
ベクターとしてコスミドpWE15（STRATAGENE社製）を用いた。10μｇのpWE15を制限酵素BamHIを用いて完全分解し、子牛小腸アルカリフォスファターゼで末端の脱リン酸化を行ったのち、フェノール、クロロホルムで抽出した。これをエタノール沈殿し、10μlのTE緩衝液に溶解した。上記の方法により得られたベクターDNA1.5μgと、実施例１で調製したゲノムDNAの制限酵素Sau3AI部分分解物1.3μgを混合し、T4DNAリガーゼ175Uを添加して、4℃で一晩反応させてDNA鎖を連結した。この反応物の2/5量を常法によりパッケージングしてファージとし、大腸菌K12/XL1-Blue MR株に感染させた。このファージ感染させた大腸菌液を、50μg/mlのアンピシリン及びカナマイシンを含むLB寒天平板培地（トリプトン1%、酵母エキス0.5%、食塩1%、寒天2%）に塗布し、37℃で一晩培養した。出現したコロニー1687個を同組成培地の保存用96穴プレートに釣菌し、ライブラリーとした。
【００１７】
実施例１−３．  コロニーハイブリダイゼーション
１−３−１．  メンブレンの作製
実施例１−２で作成したシーワネラsp.SCRC-21406のゲノムライブラリーのコロニー約1687個を96個ずつ100mMアンピシリン及び50mMカナマイシンを含むLB寒天培地に拾い、37℃で1晩培養した。生育後、ナイロンメンブレン（HybondTMN、アマシャム製）にコロニーを写し取った。このメンブレンを変性溶液（0.5NNaOH、1.5MNaCl）で7分間、中和溶液（1.5MNaCl、0.5MTris-HCl,pH7.2、1mMNa2EDTA）で3分間2回処理した後、2xSSC（30mMクエン酸ナトリウム、300mM塩化ナトリウム）で洗い風乾した。
【００１８】
１−３−２．  DNAプローブの作製
DNAプローブ作製の鋳型DNAとして、ＥＰＡ産生海洋細菌シーワネラsp.SCRC-2874株の有するＥＰＡ生合成系遺伝子群（特開平8-242867に記載）のORF9のSpeI(31447)-NheI (32522)断片を使用した。ランダムプライマーDNAラベリングキットVer.2（タカラ製）を用いて、上記DNA断片25ngを仕様書に従って[a-32P]ラベルした。DNAに取り込まれなかった遊離の[a-32P]dCTPをMicroSpinTMS-300HR（ファルマシア製）カラムを用いて除き、精製してDNAプローブとした。
【００１９】
１−３−３．  ハイブリダイゼーション
上記１−３−１で作製したメンブレンを50%ホルムアミド、5xSSCP（0.1M リン酸ナトリウム緩衝液、pH6.8、75mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム）、5mg/mlスキムミルク、ソニケーションした鮭の精子のDNA250μg/ml及び0.5%SDSを含むプレハイブリダイゼーション溶液に浸して42℃で3時間以上置きプレハイブリダイゼーションを行った。その後、プレハイブリダイゼーション溶液を捨て、１−３−２で作製したプローブを加えたハイブリダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液に10%dextransulfateを加えたもの）にメンブレンを浸して1晩42℃で置きハイブリダイゼーションを行った。上記のように処理を行ったメンブレンを0.1％SDSを含む2 x SSC溶液を用いて5分間、新しい同溶液に交換して10分間振盪しながら室温で洗った。その後、0.1％SDSを含む0.1x SSC溶液で65℃、10分間洗浄した。洗い終わったメンブレンはラップフィルムに包み、オートラジオグラフィーまたはBAS-1500（富士写真フィルム製）による画像解析を行ってアイソトープの分布を調べた。その結果、40個の陽性クローンが得られた。
【００２０】
１−３−４．  陽性クローンのコスミドの分析
上記１−３−３で得られた陽性クローンよりコスミドを調製し、制限酵素EcoRIを用いて切断後アガロース電気泳動を行った。泳動後アガロースゲルのエチジウムブロマイド染色を行ってDNAバンドを検出し、挿入断片の入っている29個のクローンを選んだ。
【００２１】
実施例１−４．ドットハイブリダイゼーション
１−４−１．  メンブレンの作製
実施例１−３で得られた29個の陽性クローンのコスミドDNA溶液各1μlを含む2x SSC溶液55.5μlを調製し、95℃で5分間加熱処理した後2分間氷冷したものを1μlずつナイロンメンブレンにスポットした。このメンブレンを変性溶液で1分間、中和溶液で1分間処理した後、風乾させてラップフィルムに包み、UVランプで4分間照射してDNA をメンブレンに固定した。
【００２２】
１−４−２．  DNAプローブの作製
DNAプローブ作製の鋳型DNAとして、実施例１−３−２のORF9のSpeI-NheI断片の他に、ＥＰＡ生合成遺伝子のORF6中のDraIII(13887)-DraIII(16031)断片、EcoRI(17922)-EcoRI (18252)断片、ORF7のEcoRI-XbaI断片（約1kb）、ORF8のPstI-PstI断片（約1.2kb）を用いた。DNA断片のラべリング及び精製は実施例１−３−２と同様に行った。
【００２３】
１−４−３．   ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは、実施例１−３−３と同様の方法で行った。メンブレンの洗浄は、0.1％SDSを含む2 x SSC溶液については、実施例１−３−３と同様の方法で行った。その後の洗浄については以下のように行った。DNAプローブがORF6のDraIII-DraIII断片、ORF8のPstI-PstI断片及びORF9のSpeI-NheI断片の場合は、0.1％SDSを含む0.1x SSC溶液で65℃10分間2回、ORF7のEcoRI-XbaI断片の場合は、0.1％SDSを含む0.2x SSC溶液で55℃10分間の洗浄を行った。洗い終わったメンブレンは、実施例１−３−３と同様に処理を行い解析した結果、21種のクローンより得たコスミドがORF9のSpeI-NheI断片とハイブリダイズし、そのうち4種が非常に強くハイブリダイズした。この4種のクローンのうち、クローン10C7のみが他の3種類のDNAプローブすべてとハイブリダイズした。
【００２４】
実施例１−５．  サザンブロットハイブリダイゼーション
１−５−１．  メンブレンの作製
実施例１−４−３ですべてのDNAプローブとハイブリダイズすることがわかった陽性クローン、10C7のコスミドDNAをp10C7と命名した。このp10C7を制限酵素EcoRIで切断し、0.7％アガロースゲル （ SeaKem GTG、FMC製）を用いて100Vで約4時間電気泳動を行った。泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ってDNAバンドを検出したところ、６本のバンドが観察された。これらのバンドを分子量の大きいものから順にE1〜E6と命名した。観察後のゲルを蒸留水で洗浄し、0.25NHCl中で15分間振盪したのち蒸留水で洗浄して変性溶液中で30分間振盪後、ブロッティング溶液（0.25NNaOH、1.5MNaCl）に浸し、ナイロンメンブレンに1時間減圧ブロットを行った。メンブレンを2 x SSCで洗った後に風乾した。
【００２５】
１−５−２．  ハイブリダイゼーション
DNAプローブは実施例１−４−２で作成したものを用いた。ハイブリダイゼーション及びメンブレンの洗浄は、実施例１−４−３と同様の方法で行った。洗い終わったメンブレンは、実施例１−４−３と同様に処理を行い解析した。その結果、コスミドp10C7の制限酵素EcoRI切断断片は、ＥＰＡ 生合成遺伝子のORF6,8,9のDNAプローブとのハイブリダイズが認められた。すなわち、コスミドp10C7はシーワネラsp.SCRC-2874株のＥＰＡ 生合成遺伝子群の塩基配列と相同性を有することが示された。
【００２６】
実施例１−６．    コスミドp10C7の制限酵素地図の作成
形質転換菌XL1-Blue MR/p10C7株より調製したコスミドp10C7のゲノムDNA挿入部分を種々の制限酵素で切断し、制限酵素切断地図を作成した（図１）。
【００２７】
実施例１−７．  形質転換菌JM109/p10C7の作成
コスミドp10C7を用いて、大腸菌JM109株を形質転換してJM109/p10C7を得た。本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成１０年１１月１８日にＦＥＲＭ  Ｐ−１７０５８として寄託されている。
【００２８】
実施例１−８．    配列の解析
コスミドp10C7のゲノムDNA挿入部分のうち、図１の白色部分の全塩基配列を配列番号：１に示す。この塩基配列中には４個のオープンリーデイングフレーム(ORF)：a〜dを特定することができ、これらのそれぞれの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号：２、４、６、８に示す。全塩基配列（配列番号：１）とORFa〜d（配列番号：２、４、６、８）との関係は表１の通りである。
【００２９】
0004182192.tif 000002
【００３０】
前記種々のORFの塩基配列より推定されるアミノ酸配列（配列番号３、５、７、９）と、ＥＰＡ生合成酵素群をコードする遺伝子群の各ORFの塩基配列より推定されるアミノ酸配列（特開平8-242867に記載）とを比較したところ、ある程度の相同性を有することが見出された。その結果を表２に示す。
【００３１】
0004182192.tif 000003
【００３２】
この結果より、配列番号２、４、６、８（コスミド10C7に含まれるORFa,b,c,d）のコードするタンパクは、ＥＰＡ生合成酵素群をコードするORF6,7,8,9の産物とそれぞれ機能的に類似していることが予想された。
【００３３】
実施例２−１．  コスミド10C7のゲノムDNA挿入部分の制限酵素断片のサブクローニング
コスミド10C7のゲノムDNA挿入部分のORFbを含むEcoRI(2391)-EcoRI(14761)断片をプラスミドpSTV28（宝酒造社製）のEcoRI部位に挿入して、プラスミドEco-Eco/pSTV28を作成した。また、ORFdを含むPstI(16802)-PstI(22263)断片をプラスミドpSTV28のPstI部位に挿入して、プラスミドPst-Pst/pSTV28を作成した。また、ORFcを含むEcoRV(11172)-PvuI(17457)断片を末端平滑化後プラスミドpSTV29のSmaI部位に挿入して、プラスミドEco-Pvu/pSTV29を作成した。各サブクローンの挿入断片の位置を図２に示す。
【００３４】
実施例２−２．  ＥＰＡ生合成系遺伝子群のORF9,10欠失クローンの作成
ＥＰＡ生合成酵素群をコードする遺伝子群を含むプラスミドpEPA（特開平8-242867に記載）のXhoI(5660)-SpeI(31446)断片（ORF2〜8を含む）をプラスミドpBluescript（STRATAGENE社製）のXhoI-SpeI部位に連結して、pXS-BS2を作成した。pXS-BS2の挿入断片の位置を図３に示す。本プラスミドはＥＰＡの生合成に必須な遺伝子のうちのORF9を欠失している。
【００３５】
実施例２−３．  ＥＰＡ生合成系遺伝子群のORF2,4,5,8,10欠失クローンの作成ＥＰＡ産生能を有するプラスミドΔ2,4,5,10/pNEB（WO98/01565に記載）から PstI(24813)-EcoT22I(28946)（ORF8の一部）部分を欠失させて、Δ2,4,5,8,10/pNEBを作成した。Δ2,4,5,8,10/pNEBの挿入断片の位置を図３に示す。本プラスミドはＥＰＡの生合成に必須な遺伝子のうちのORF8を欠失している。
【００３６】
実施例２−４．  ORF7またはORF9欠失ＥＰＡ生合成系遺伝子群の相補によるＥＰＡ生産能の回復
実施例２−１で作成したプラスミドのうちの１種を導入した大腸菌JM109株を、さらにpEPAΔ7（pEPAからORF7の一部であるSalI(22260)-NruI(23845)部分を欠失させたプラスミド、特開平8-242867に記載）または実施例２−２で作成したpXS-BS2を用いて形質転換した。これらの形質転換株と、pEPAΔ7またはpXS-BS2のみを有する形質転換株を、50μg/mlのアンピシリン及びクロラムフェニコールを含むLB培地5mlに接種し、25℃で培養した。遠心分離により菌体を得、１回洗浄したのち凍結乾燥し、塩化水素飽和のメタノール2mlに溶解して密閉容器に入れ、80℃で１時間保温して脂肪酸をメチルエステル化した。放冷後、ヘキサン2mlで３回抽出し、ヘキサン層を乾固して10mlのメタノールに溶解した。この溶解物の一部をガスクロマトグラフィーにより分析したところ、ＥＰＡのピークが観察された。それぞれの形質転換株の保有するプラスミドの組み合わせと、ピークの面積比から算出した菌体の全脂肪酸エステル中におけるＥＰＡメチルエステルの割合を表３に示す。
【００３７】
0004182192.tif 000004
【００３８】
上記の結果より、ＥＰＡ生合成系遺伝子群のうちのORF7またはORF9を欠失させたクローンのＥＰＡ産生能が、コスミドp10C7由来のDNA断片の存在によって回復することが示された。すなわち、コスミドp10C7中にはORF7及びORF9と同様の機能を有する、高度不飽和脂肪酸の生合成に関与する遺伝子が含まれていることが示された。
【００３９】
実施例２−５．  ORF8欠失ＥＰＡ生合成系遺伝子群の相補によるＥＰＡ生産能の回復及びＤＨＡ生産
実施例２−１で作成したプラスミドEco-Pvu/pSTV29を導入した大腸菌JM109株を、さらに実施例２−３で作成したプラスミドΔ2,4,5,8,10/pNEBを用いて形質転換し、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含む寒天平板培地を用いて選別を行って、２種のプラスミドを有する組み換え体JM109/p3,6,7,9/pcを得た。この形質転換株を、実施例２−４と同様にして18℃で培養し、菌体の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーにより分析した。その結果、ＥＰＡのピークが観察され、その全脂肪酸エステル中における割合は、ピークの面積比から約22.0%と算出された。一方、ガスクロマトグラフィー上でEPAメチルエステルよりも高分子側に新たなピークが観察された。このピークの物質の全脂肪酸エステル中における割合は、ピークの面積比から約1.5%と算出された。GC-MS分析の結果、このピークの物質の分子量は342であり、ＤＨＡ(22:6)メチルエステルの値と一致し、各フラグメントのピークは標品のそれと一致したことから、本物質はＤＨＡメチルエステルと同定された。なお、MSフラグメントピークは以下の通りであった。Mass : 342(M+), 327, 311, 299, 286, 273, 241, 215, 206, 173, 159, 145, 131, 119, 105, 91, 79, 67, 55, 41, 27.
【００４０】
上記の結果より、ORF8を欠失させたＥＰＡ生合成系遺伝子群を有するクローンのＥＰＡ産生能が、コスミドp10C7由来のDNA断片の存在によって回復し、さらにＤＨＡの生産能も獲得したことが示された。すなわち、コスミドp10C7中にはORF8と同様の機能を有し、かつＤＨＡの生合成に関与する遺伝子が含まれていることが示された。
【００４１】
【配列表】
【００４２】
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【００４３】
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【００４４】
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【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
【図面の簡単な説明】
【図１】コスミドp10C7の制限酵素地図を示す。図面の太線部分はドコサヘキサエン酸産生菌の染色体由来の遺伝子断片を示す。太線内の白色部分は塩基配列を決定した部分を示す。
【図２】コスミドp10C7のサブクローンの挿入断片の位置を示す。
【図３】ＥＰＡ生合成系遺伝子群のサブクローンの挿入断片の位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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