(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示すアミノ酸配列からなる高活性グリセロール−１−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなる高活性グリセロール−１−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
配列番号５に示す塩基配列からなる高活性グリセロール−１−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子。
【請求項４】
配列番号６に示す塩基配列からなる高活性グリセロール−１−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、高活性を有するグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ及びグリセロールデヒドロゲナーゼ並びにこれらの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ（ジヒドロキシアセトン還元酵素）は、主に古細菌に見出される酵素であり、古細菌のエーテル脂質のグリセロリン脂質の幾何異性の立体配置の形成の鍵となる酵素である。グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼは、NADH又はNADPHの存在下でジヒドロキシアセトンリン酸を還元してグリセロール-1-リン酸を生成し、NAD又はNADPの存在下でグリセロール-1-リン酸を酸化してジヒドロキシアセトンリン酸を生成する（特許文献１、非特許文献１）。
【０００３】
またグリセロールデヒドロゲナーゼは、主に細菌や哺乳動物に見出される酵素である。グリセロールデヒドロゲナーゼは糖代謝に関与しており、NADH又はNADPHの存在下でジヒドロキシアセトンを還元してグリセロールを生成し、NAD又はNADPの存在下でグリセロールを酸化してジヒドロキシアセトンを生成する。
【０００４】
グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼによりグリセロール-1-リン酸から得られるジヒドロキシアセトンリン酸、及び、グリセロールデヒドロゲナーゼによりグリセロールから得られるジヒドロキシアセトンは、医薬品中間体として重要な化合物であることから、これらの酵素はジヒドロキシアセトンリン酸及びジヒドロキシアセトンの製造に有用な酵素である。
【０００５】
従って、これらの酵素であって活性の高いものを用いることができれば、製造効率ひいてはコストの点で好ましい。
【０００６】
【特許文献１】
特開2002-176990
【０００７】
【非特許文献１】
Eur. J. Biochem. 269, 969-976 (2002)
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高活性を有するグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ及びグリセロールデヒドロゲナーゼ並びにこれらの製造方法を提供することを主目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
▲１▼  好熱性古細菌アエロパイラムペルニクス（Aeropyrum pernix）のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼを構成する370アミノ酸残基のうち活性中心領域の一部であるN末端から144番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変換することよりグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの活性が10倍以上に増大する。また、このアスパラギン酸をアラニンに変換することによりグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの活性が３倍以上に増大する。
▲２▼  すなわち、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号144のアミノ酸残基を、野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基にすることにより酵素活性を増大させることができる。また、当該アミノ酸残基は酸性アミノ酸残基（特にアスパラギン酸残基）であることが多いため、これを非酸性アミノ酸残基にすること、特に中性アミノ酸残基にすること、さらに特にアスパラギン又はアラニンにすることにより酵素活性を著しく増大させることができる。
▲３▼  配列番号１に示すアエロパイラムペルニクス のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼと他の生物種由来のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼとの間でアミノ酸配列のアラインメントをとった場合、配列番号１のアミノ酸番号141〜151の配列に相当するAlaSerNaaYaaNaaNaaNaaSerNaaNaaSer（配列番号７；配列番号７中、Naaは任意のアミノ酸残基を示し、Yaaは野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基を示す）は他の生物種由来のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼに共通して見出される。他の生物種由来の野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおいても、配列番号１のアミノ酸番号144のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基、即ち、配列番号７におけるアミノ酸番号４のアミノ酸残基Yaaを、それとは異なるアミノ酸残基Xaaに置換することにより、酵素活性を増大させることができる。
【００１０】
項１．  グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼであって、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基が、野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基である高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ。
【００１１】
項２．  配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１におけるアミノ酸番号141〜151に相当するアミノ酸配列がAlaSerNaaXaaNaaNaaNaaSerNaaNaaSer（配列番号２；配列番号２中、Naaは任意のアミノ酸残基を示し、Xaaは野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を示す）である項１に記載の高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ。
【００１２】
項３．  アラインメント解析を行った場合に、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸残基以外のアミノ酸残基である項１又は２に記載の高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ。
【００１３】
項４．  アスパラギン酸残基以外のアミノ酸残基がアスパラギン残基又はアラニン残基である項３に記載の高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ。
【００１４】
項５．  配列番号３に示すアミノ酸配列からなる高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ。
【００１５】
項６．  配列番号４に示すアミノ酸配列からなる高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ。
【００１６】
項７．  配列番号５に示す塩基配列からなる高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子。
【００１７】
項８．  配列番号６に示す塩基配列からなる高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子。
【００１８】
項９．  野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基Yaaをそれとは異なるアミノ酸残基Xaaに置換する高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの製造方法。
【００１９】
項１０．  配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１におけるアミノ酸番号141〜151に相当するアミノ酸配列がAlaSerNaaYaaNaaNaaNaaSerNaaNaaSer（配列番号7；配列番号7中、Naaは任意のアミノ酸残基を示し、Yaaは野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基を示す）であるポリペプチドの、アミノ酸残基Yaaをそれとは異なるアミノ酸残基Xaaに置換する項９に記載の高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの製造方法。
【００２０】
項１１．  野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基Yaaがアスパラギン酸残基であり、それをアスパラギン酸以外のアミノ酸残基Xaaに置換する項９又は１０に記載の方法。
【００２１】
項１２．  配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアスパラギン酸残基をアスパラギン残基又はアラニン残基に置換する項１１に記載の方法。
【００２２】
項１３．  グリセロールデヒドロゲナーゼであって、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基が、野生型グリセロールデヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基である高活性グリセロールデヒドロゲナーゼ。
【００２３】
項１４．  配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１におけるアミノ酸番号141〜151に相当するアミノ酸配列がAlaSerNaaXaaNaaNaaNaaSerNaaNaaSer（配列番号２；配列番号２中、Naaは任意のアミノ酸残基を示し、Xaaは野生型グリセロールデヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を示す）である項１３に記載の高活性グリセロールデヒドロゲナーゼ。
【００２４】
項１５．  アラインメント解析を行った場合に、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸残基以外のアミノ酸残基である項１３又は１４に記載の高活性グリセロールデヒドロゲナーゼ。
【００２５】
項１６．  アスパラギン酸残基以外のアミノ酸残基がアスパラギン残基又はアラニン残基である項１５に記載の高活性グリセロールデヒドロゲナーゼ。
【００２６】
項１７．  野生型グリセロールデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基Yaaをそれとは異なるアミノ酸残基Xaaに置換する高活性グリセロールデヒドロゲナーゼの製造方法。
【００２７】
項１８．  配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１におけるアミノ酸番号141〜151に相当するアミノ酸配列がAlaSerNaaYaaNaaNaaNaaSerNaaNaaSer（配列番号7；配列番号7中、Naaは任意のアミノ酸残基を示し、Yaaは野生型グリセロールデヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基を示す）であるポリペプチドの、アミノ酸残基Yaaをそれとは異なるアミノ酸残基Xaaに置換する項１７に記載の高活性グリセロールデヒドロゲナーゼの製造方法。
【００２８】
項１９．  野生型グリセロールデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基Yaaがアスパラギン酸残基であり、それをアスパラギン酸以外のアミノ酸残基Xaaに置換する項１７又は１８に記載の方法。
【００２９】
項２０．  配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアスパラギン酸残基をアスパラギン残基又はアラニン残基に置換する項１９に記載の方法。
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明する。
(I) 高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ
本発明の高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基が、野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基であるグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼである。
【００３１】
本発明における「野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ」は、生物種ごとに定まる野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼである。例えば本発明のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼが生物(A)に由来するものであれば、その酵素についての「野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ」は生物(A)由来の野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼを意味し、例えば本発明のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼが生物(B)に由来するものであれば、「野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ」は生物(B)由来の野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼを意味する。
【００３２】
グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼは、補酵素のNADH又はNADPHの存在下でジヒドロキシアセトンリン酸を還元してグリセロール-1-リン酸を生成し、補酵素のNAD又はNADPの存在下でグリセロール-1-リン酸を酸化してジヒドロキシアセトンリン酸を生成する活性を有する。
【００３３】
本発明のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼはどのような生物に由来するものであってもよく、原核生物、真核生物又は古細菌などのいずれに由来するものであってもよい。特に、古細菌由来のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼが好ましい。
【００３４】
本発明のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１に示すアエロパイラムペルニクス由来のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼは、370アミノ酸残基から構成されており、N末端から103〜124番目、140〜151番目、180〜191番目、270〜273番目、287〜296番目のアミノ酸配列部分が活性中心として機能していることが報告されている（非特許文献１）。この活性中心の中で、141〜151番目のアミノ酸配列は他の生物種由来のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにも略共通して見出される。
【００３５】
本発明では、配列番号１に示すアエロパイラムペルニクス由来のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列との間でアラインメント解析を行った場合に、配列番号１におけるアミノ酸番号141〜151のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列がAlaSerNaaXaaNaaNaaNaaSerNaaNaaSer（配列番号２；配列番号２中、Naaは任意のアミノ酸残基を示し、Xaaは野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を示す）であることが好ましい。
【００３６】
アミノ酸残基Xaaは特に限定されないが、天然型の対応アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基であることが多いため、この場合は非酸性アミノ酸残基であることが好ましい。非酸性アミノ酸残基は、塩基性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基のいずれであってもよいが、特に中性アミノ酸残基であることが好ましい。
【００３７】
なお、野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基が中性アミノ酸残基である場合には、本発明のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおける当該アミノ酸残基はアラニン残基、グリシン残基又はアスパラギン残基であることが好ましい。また、野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基である場合には、本発明のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおける当該アミノ酸残基はアルギニン残基であることが好ましい。
【００３８】
本発明において、酸性アミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。中性アミノ酸としてはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンが挙げられる。また塩基性アミノ酸としては、リジン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。
【００３９】
また、これらのアミノ酸は、糖鎖、脂肪酸、リン酸等が結合することにより修飾されたものであってもよい。
【００４０】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメントをとった場合に、野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基、即ち、アミノ酸配列２におけるアミノ酸番号４のアミノ酸残基がアスパラギン酸である場合は、本発明のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおける当該アミノ酸残基は、特にアスパラギン、アラニン又はグリシン等の中性アミノ酸であることが好ましく、アスパラギン、アラニンであることがより好ましく、アスパラギンであることがさらにより好ましい。
【００４１】
また例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメントをとった場合に、野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基、即ち、アミノ酸配列２におけるアミノ酸番号４のアミノ酸残基がグルタミン酸である場合は、本発明のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおける当該アミノ酸残基は、特にグルタミン、アラニン又はグリシンなどの中性アミノ酸であることが好ましく、グルタミン又はアラニンであることがより好ましく、グルタミンであることがさらにより好ましい。
【００４２】
(II)高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの製造方法
本発明の高活性グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの製造方法は、野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基をそれとは異なるアミノ酸残基に置換する方法である。
【００４３】
グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの由来は特に限定されず、原核生物、真核生物又は古細菌等のいずれであってもよいが、特に古細菌由来のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおいて、上記アミノ酸残基の置換による活性増大効果が著しく、好ましい。
【００４４】
また、前述したように、配列番号１のアエロパイラムペルニクス由来のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１の141〜151番目のアミノ酸配列は他の生物種由来の野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにも略共通して見出されている。この共通配列は、AlaSerNaaYaaNaaNaaNaaSerNaaNaaSer（配列番号７；配列番号７中、Naaは任意のアミノ酸残基を示し、Yaaは野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基を示す）である。
【００４５】
従って、本発明方法では、野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ中の上記アミノ酸残基Yaaを、それとは異なるアミノ酸残基Xaaに置換してAlaSerNaaXaaNaaNaaNaaSerNaaNaaSer（配列番号２；配列番号２中、Naaは任意のアミノ酸残基を示し、Xaaは野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を示す）にすることが好ましい。
【００４６】
野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基は酸性アミノ酸残基である場合が多いため、これを非酸性アミノ酸残基に置換することが好ましい。非酸性アミノ酸は中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸のいずれであってもよいが、中性アミノ酸であることが好ましい。特に、アスパラギン又はアラニンとすることが好ましい。
【００４７】
なお、野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基が中性アミノ酸残基である場合には、当該アミノ酸残基をアラニン、グリシン又はアスパラギンに置換することが好ましい。また、野生型グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基である場合には、当該アミノ酸残基をアルギニン残基に置換することが好ましい。
【００４８】
なお、本発明方法に供される酵素の構成アミノ酸残基及び本発明の方法により得られる酵素の構成アミノ酸残基は、糖鎖、脂肪酸又はリン酸などが結合することにより修飾されたものであってもよい。
【００４９】
また、本発明により導入される野生型酵素とは異なるアミノ酸残基は、容量の点で置換前のアミノ酸残基と同程度又はそれ以下であることが好ましい。本発明は電荷に着目して活性を増大させる方法であるところ、置換により当該部位の容量が大きくなるとタンパク質のホールディングが変化して活性を低下させる恐れがあるからである。分子量を容量の目安として使用できる。
【００５０】
具体的には、アスパラギン酸は、アスパラギン、アラニン、グリシン等の中性アミノ酸に変換すること、特にアスパラギン又はアラニンに変換すること、さらに特にアスパラギンに変換することが好ましい。
【００５１】
また、グルタミン酸は、アラニン、グリシン、グルタミン等の中性アミノ酸に置換すること、特にグルタミン又はアラニンに変換すること、さらに特にグルタミンに変換することが好ましい。
【００５２】
アミノ酸残基の置換方法は、特に限定されず公知の方法を制限なく使用できる。このような公知の置換方法としては、置換前の酵素の遺伝子に対して、エキソヌクレアーゼを用いたDNA欠失導入、リンカー導入、位置指定突然変異導入、変異プライマーを用いたPCR法による塩基配列の改変などを行い、得られた遺伝子を用いて変異デヒドロゲナーゼを生産する方法が挙げられる。
(III)グリセロールデヒドロゲナーゼ及びその製造方法
本発明の高活性グリセロールデヒドロゲナーゼは、グリセロールデヒドロゲナーゼであって、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基が、野生型グリセロールデヒドロゲナーゼの当該アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基であるグリセロールデヒドロゲナーゼである。
【００５３】
グリセロールデヒドロゲナーゼは、補酵素のNADH又はNADPHの存在下でジヒドロキシアセトンを還元してグリセロールを生成し、補酵素のNAD又はNADPの存在下でグリセロールを酸化してジヒドロキシアセトンを生成する活性を有する。
【００５４】
その他の構成は前述した本発明のグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼと同様である。
【００５５】
また本発明のグリセロールデヒドロゲナーゼの製造方法は、野生型グリセロールデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとの間でアミノ酸配列のアラインメント解析を行った場合に、配列番号１のアミノ酸番号144に相当するアミノ酸残基を、それとは異なるアミノ酸残基に置換する方法である。
【００５６】
その他の構成は前述した本発明のグリセロールデヒドロゲナーゼの製造方法と同様である。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
（1）Aeropyrum pernix K1株からのグルコース-1-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
＜染色体DNAの調製＞
バクトマリン培地（Difco）37.4g とNa2S2O3-5H2O 1.0g を水1Lに溶かした後、pHを7.0-7.2に調整することにより培地を調製した。超好熱性古細菌Aeropyrum pernix K1株（理化学研究所においてJCM9820として登録）をこの培地に接種し、90℃で3日間振盪培養した。培養液を5,000rpmで10分間遠心分離することにより集菌した。
【００５８】
菌体を10mM トリス(pH 7.5)-1mM EDTA 溶液で２回洗浄後インサートアガロース（InCert Agarose、FMC社製）ブロック中に封入した。このブロックを１％N-ラウロイルザルコシン−1mg/ml プロテアーゼK溶液中で処理することにより、染色体DNAがアガロースブロック中に分離調製された。インサートアガロースブロックを用いた染色体DNAの分離条件は、アガロースブロックの添付マニュアルに従った。
＜グルコース-1-リン酸デヒドロゲナーゼを含有する発現ベクターの構築＞
独立行政法人製品評価技術機構のホームページ上で公開されている超好熱性古細菌Aeropyrum pernix K1株のグルコース-1-リン酸デヒドロゲナーゼ（APE0519）のDNAを、上記のようにして調製したゲノムからPCR法により増幅した。
【００５９】
PCRは、Nude1及びBamH1切断部位を含むアッパープライマー（5'-CGTAACGACTCCGGCATATGCTGTACCATAGCGT-3'：配列番号８）とロウアープライマー(5'-AGGGGAAGAGAGGCAGGATCCCTAGCCAGACTATATA-3'：配列番号９)を用いて行い、PCR条件はPCRキットの添付マニュアルに従った。
【００６０】
得られたPCR産物をpET11aベクター（Novagen社製）に組み込み、発現プラスミドを構築した。
（２）グルコース-1-リン酸デヒドロゲナーゼの生産
＜ジヒドロキシアセトン還元酵素を含有する形質転換体の作製＞
Esherichia coli BL21(DE3)のコンピテントセル0.1 mL(約1×107cfu)に、発現プラスミドを10 ng加え、氷中に30分間放置した。その後、42℃で30秒間ヒートショックを与え、2YT培養液0.9mlを加え、37℃で１時間震盪培養した。次いで、アンピシリンを含む2YT寒天培地に塗布して、37℃で１夜培養し、形質転換体を得た。この形質転換体を、アンピシリンを含む2YT培地で600nmにおける吸収が１に達するまで培養した後、IPTG（Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside）を加えて37℃で５時間培養した。培養液を6000rpmで20分間遠心することより集菌した。
＜グルコース-1-リン酸デヒドロゲナーゼの精製＞
菌体の２倍量のアルミナを加えて菌体を粉砕した後、５倍量の10mMトリス−塩酸緩衝液を85℃で30分間加熱後、11000rpmで20分間遠心分離し、上清をHitrapQ Superdexカラム（ファルマシア社製）に吸着させて活性画分を得た。精製工程における活性画分の検出は、補酵素NADHの存在下で、ジヒドロキシアセトンを基質にして分光器で340nmの光の吸収の減少を定量することにより行った。
（３）グルコース-1-リン酸デヒドロゲナーゼの改良
pET11aベクター(Novagen社製)に組み込まれたグルコース-1-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をテンプレートとして、PCRを使用した遺伝子操作手法（Mullis, K., et al., (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp. 51263.）で144番目のアスパラギン酸残基をアスパラギンに変換して変異体酵素N144D遺伝子を得た。また、144番目のアスパラギン酸残基をアラニンに変換して変異体酵素N144A遺伝子を得た。
【００６１】
これらの変異体酵素遺伝子を上記と同様にして、pET11aベクターに組み込み、(2)において説明した野生型グルコース-1-リン酸デヒドロゲナーゼの生成と同様の方法でEsherichia coli BL21を用いて変異型グルコース-1-リン酸デヒドロゲナーゼを調製及び精製した。
(4)酵素活性測定
得られた変異体酵素の活性を変異前の酵素の活性と比較した。グルコース-1-リン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定方法は以下に示す通りである。
活性測定方法
基質としてのジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)0.1−100 mM 、補酵素としてのNADH（0.32mM）、酵素溶液10μlを含む1.2mlの100mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)の反応液を室温下で５分間反応させて、340nmの吸光度を経時的に測定した。340nmの吸光度が直線的に減少する反応開始直後の部分について１分間に減少する吸光度を測定した。この測定値に基づき、非特許文献１（Eur. J. Biochem.
269, 969-976 (2002)  ）に記載の方法に従い、グルコース-1-リン酸デヒドロゲナーゼ活性を求めた。
【００６２】
得られた活性は、置換前の野生型グルコース-1-リン酸デヒドロゲナーゼでは299.9（min-1）であり、144番目のアスパラギン酸残基をアスパラギンに変換した変異体酵素N144Dでは3628.2（min-1）であり、144番目のアスパラギン酸残基をアラニンに変換した変異体酵素N144A遺伝子では1126.5（min-1）であった。144番目のアスパラギン酸残基をアスパラギン残基にすることにより酵素活性が10倍以上になり、アラニンに変換することより酵素活性が約３倍になることが分かる。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によれば、高活性を有するグリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ及びグリセロールデヒドロゲナーゼ並びにこれらの製造方法が提供された。
【００６４】
【配列表】
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