(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(c)を含んでなる複合体を含む、毒素を細胞内へ輸送するための組成物：
(a)プロテインＡの抗体結合部位を含む領域Ｅ及びＤと、ビオチン結合部位を含む部分ストレプトアビジンと、を含んでなるストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質によって形成された四量体、
(b)前記抗体結合部位に結合された４つの抗体(但し、該抗体は細胞表面タンパク質であるEGFR、HLA-DR、CD33またはCD34に特異的なものである)、及び
(c)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化毒素。
【請求項２】
前記毒素が
(a)チミジンキナーゼ、
(b)エンドヌクレアーゼ、
(c)リボヌクレアーゼ、
(d)αトキシン
(e)リシン、
(f)アブリン、
(g)シュードモナス(Pseudomonas)エキソトキシンＡ、
(h)ジフテリア毒素、
(i)サポリン、
(j)モモルディン(momordin)、
(k)ゲロニン(gelonin)、
(l)アメリカヤマゴボウ(pokeweed)抗ウイルス性タンパク質、
(m)α-サルシン(sarcin)、及び
(n)コレラ毒素
からなる群より選択されるものである請求項１記載の組成物。
【請求項３】
以下の(a)〜(c)を含んでなる複合体を含む、プロドラッグを細胞内へ輸送するための組成物：
(a)プロテインＡの抗体結合部位を含む領域Ｅ及びＤと、ビオチン結合部位を含む部分ストレプトアビジンと、を含んでなるストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質によって形成された四量体、
(b)前記抗体結合部位に結合された４つの抗体(但し、該抗体は細胞表面タンパク質であるEGFR、HLA-DR、CD33またはCD34に特異的なものである)、及び
(c)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化プロドラッグ。
【請求項４】
以下の(a)〜(c)を含んでなる複合体を含む、MDR遺伝子産物を細胞内へ輸送するための組成物：
(a)プロテインＡの抗体結合部位を含む領域Ｅ及びＤと、ビオチン結合部位を含む部分ストレプトアビジンと、を含んでなるストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質によって形成された四量体、
(b)前記抗体結合部位に結合された４つの抗体(但し、該抗体は細胞表面タンパク質であるEGFR、HLA-DR、CD33またはCD34に特異的なものである)、及び
(c)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化MDR遺伝子産物。
【請求項５】
以下の(a)〜(c)を含んでなる複合体を含む、一本鎖核酸を細胞内へ輸送するための組成物：
(a)プロテインＡの抗体結合部位を含む領域Ｅ及びＤと、ビオチン結合部位を含む部分ストレプトアビジンと、を含んでなるストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質によって形成された四量体、
(b)前記抗体結合部位に結合された４つの抗体(但し、該抗体は細胞表面タンパク質であるEGFR、HLA-DR、CD33またはCD34に特異的なものである)、及び
(c)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化一本鎖核酸。
【請求項６】
以下の(a)〜(d)を含んでなる複合体を含む、二重らせん核酸を細胞内へ輸送するための組成物：
(a)プロテインＡの抗体結合部位を含む領域Ｅ及びＤと、ビオチン結合部位を含む部分ストレプトアビジンと、を含んでなるストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質によって形成された四量体、
(b)前記抗体結合部位に結合された４つの抗体(但し、該抗体は細胞表面タンパク質であるEGFR、HLA-DR、CD33またはCD34に特異的なものである)、
(c)前記ビオチン結合部位に結合された、ホモプリンまたはホモピリミジン部分を有するビオチン化一本鎖核酸、及び
(d)前記ビオチン化一本鎖核酸と共に三重らせん構造を形成する二本鎖ＤＮＡ。
【請求項７】
以下の(a)〜(c)を含んでなる複合体を含む、病原性細菌またはウイルスのタンパク質を細胞内へ輸送するための組成物：
(a)プロテインＡの抗体結合部位を含む領域Ｅ及びＤと、ビオチン結合部位を含む部分ストレプトアビジンと、を含んでなるストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質によって形成された四量体、
(b)前記抗体結合部位に結合された４つの抗体(但し、該抗体は細胞表面タンパク質であるEGFR、HLA-DR、CD33またはCD34に特異的なものである)、及び
(c)前記ビオチン結合部位に結合された病原性細菌またはウイルスのビオチン化タンパク質。
【請求項８】
前記複合体において前記抗体結合部位が４箇所存在し、前記ビオチン結合部位が４箇所存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ストレプトアビジンにおいて配列番号２に示すアミノ酸配列中のRYD配列(Arg-Tyr-Asp)が改変されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
トランスフェリン受容体に結合する抗体をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体がIgG抗体である請求項１〜10のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１〜11のいずれか１項に記載の組成物、及び
(b)製剤学上許容し得る担体
を含み、かつ前記ストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質に結合されていない毒素を実質的に含まない、医薬組成物。
【請求項１３】
毒素を細胞内へ輸送するための方法であって、
(a)i)プロテインＡの抗体結合部位を含む領域Ｅ及びＤと、ビオチン結合部位を含む部分ストレプトアビジンと、を含んでなるストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質によって形成された四量体、
ii)前記抗体結合部位に結合された４つの抗体(但し、該抗体は細胞表面タンパク質であるEGFR、HLA-DR、CD33またはCD34に特異的なものである)、及び
iii)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化毒素
を含んでなる複合体を形成する工程、
(b)該複合体を、前記ビオチン結合部位に結合していない毒素から単離する工程、並びに
(c)該単離した複合体を細胞と接触させて毒素を細胞内に導入する工程
を含む前記方法。
【請求項１４】
物質を細胞内へ輸送するための方法であって、
(a)i)プロテインＡの抗体結合部位を含む領域Ｅ及びＤと、ビオチン結合部位を含む部分ストレプトアビジンと、を含んでなるストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質によって形成された四量体、
ii)前記抗体結合部位に結合された４つの抗体(但し、該抗体は細胞表面タンパク質であるEGFR、HLA-DR、CD33またはCD34に特異的なものである)、及び
iii)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化物質
を含んでなる複合体を形成する工程、並びに
(b)該複合体を細胞と接触させて該物質を細胞内に導入する工程
を含み、
前記物質が一本鎖核酸、MDR遺伝子産物及びプロドラッグからなる群より選択されるものである前記方法。
【請求項１５】
二本鎖ＤＮＡを細胞内へ輸送するための方法であって、
(a)i)プロテインＡの抗体結合部位を含む領域Ｅ及びＤと、ビオチン結合部位を含む部分ストレプトアビジンと、を含んでなるストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質によって形成された四量体、
ii)前記抗体結合部位に結合された４つの抗体(但し、該抗体は細胞表面タンパク質であるEGFR、HLA-DR、CD33またはCD34に特異的なものである)、
iii)前記ビオチン結合部位に結合されたビオチン化一本鎖核酸、及び
iv)前記ビオチン化一本鎖核酸と共に三重らせん構造を形成する二本鎖ＤＮＡ
を含んでなる複合体を形成する工程、並びに
(b)該複合体を細胞と接触させて二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入する工程
を含む前記方法。
【請求項１６】
前記複合体が４つの抗体結合部位と４つのビオチン結合部位を有するものである請求項13、14または15に記載の方法。
【請求項１７】
前記ストレプトアビジンにおいて配列番号２に示すアミノ酸配列中のRYD配列(Arg-Tyr-Asp)が改変されている、請求項13、14または15に記載の方法。
【請求項１８】
前記複合体がトランスフェリン受容体に結合する抗体をさらに含むものである請求項13、14または15に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体がIgG抗体である請求項13、14または15に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
１．緒言
本発明は、真核細胞、特に高等脊椎動物の細胞の細胞質または核に毒素および核酸を導入するのに用いうる方法および組成物に関する。本発明は、抗体と結合している毒素および核酸の細胞への有効かつ特異的な送達を可能にする。本発明は、特に、毒素または核酸と抗体との非共有結合性複合体を形成するための、ストレプトアビジン配列とプロテインＡ配列との融合タンパク質の使用に関する。
本発明は、in vivoまたはex vivoにて毒素またはアンチセンスヌクレオチドをヒト細胞(例えば、腫瘍細胞)へ導入することによる、ヒト疾患の治療方法を提供する。本発明は、さらに、外因性の二重らせんＤＮＡ分子を培養細胞に導入することによる、生物学的研究を行う方法および生物学的産物の製造に有用な方法も提供する。
２．発明の背景
特定の細胞の細胞質または核への化合物の選択的導入は、生物学的および医学的研究ならびに医学的実践における有効な技術である。細胞性毒素の細胞特異的ターゲッティングは、毒素を細胞結合性タンパク質(好ましくは標的細胞に結合することが可能なもの)と複合化することによって達成されている。この複合体の細胞結合性タンパク質は、対応する表面抗原または受容体を認識する抗体(特にモノクローナル抗体)またはタンパク質リガンド(例えば、増殖因子)でありうる。毒素と抗体との複合体はイムノトキシンと呼ばれている。
従来では、複合体の毒素と細胞結合性タンパク質とは、化学的結合または遺伝子融合を介する共有結合により連結されていた。慣用のイムノトキシンは、非特異性の異種二官能性(heterobifunctional)架橋試薬を用いて毒素成分を抗体(典型的には、モノクローナル抗体)に化学的に連結することによって得られる。したがって、この方法によれば、幾つかの毒素分子が抗体のF(ab)部分に連結することによって該抗体の抗原結合能を障害している異成分性の産物が得られる。したがって、この結合化学は毒素の活性を部分的に破壊することが可能である。
化学的共役に伴う問題の多くは、組み換えＤＮＡ技術を用いて一本鎖の融合毒素を作製することによって克服してきた。しかしながら、この技術には、それぞれの標的細胞に対する新規な組み換え毒素が必要である。新規な組み換え毒素の各々の生物学的活性は予測不可能である。
別の技術が開発されており、そこでは、細胞毒素が抗体またはリガンドに非共有結合によって結合している。そのような技術の１つは、Staphylococcal aureusプロテインＡと免疫グロブリンとの間の特異的な相互作用を利用して、２種の特異性を有する抗体複合体を生ずる。この技術によれば、プロテインＡは２種の異なる特異性を有する抗体、すなわち、毒素特異的抗体および細胞表面特異的抗体と複合化する。このような複合体は、リシン毒素を標的細胞へ送達するのに用いられている(Lakyら、1986／1987,Immunology Letters 14:127-132)。第２のイムノトキシン・ターゲッティング系では、一本鎖の抗体を、ビオチンに対して強く特異的な結合親和性を有するストレプトアビジンと融合させる。この構築体を用いて、ビオチン化した毒素を標的細胞へ送達する(Dubelら、1995,Journal of Immunological Methods,178:201-209)。
近年、Sanoらは、ストレプトアビジンとEscherichia coli中のプロテインＡの１つまたは２つの免疫グロブリンＧ(IgG)結合性ドメインとから構成される融合タンパク質を記載した(米国特許第5,328,985号、1994年７月12日発行；この特許は引用によりその全体を本明細書に組み込む)。このストレプトアビジン−プロテインＡ(ST-PA)融合タンパク質は、機能性のビオチンおよびIgG結合部位を有する。Sanoは、さらに、ストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質と、BSAに対するモノクローナル抗体と、ビオチン化セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼとの複合体を記載した。
Sanoはさらに、ST-PA融合タンパク質を用いて細胞を標識する方法も記載した。細胞は、細胞表面抗原Thy-1に対する抗体と共にインキュベートした。次に、キメラタンパク質−ビオチン化マーカー複合体を細胞懸濁液に添加した。この技術は、表面上にThy-1抗原を有する細胞の表面にビオチン化FITCを送達するのに用いた。しかしながら、Sanoは、化合物を特定の細胞の細胞質または核へ送達するのにST-PA融合タンパク質を用いることについては記載も示唆もしていなかった。
イムノトキシンは、受容体介在性エンドサイトーシスにより細胞に侵入すると思われる(Pastanら,1986,Cell,47:1-44およびPirkerら,1987,Lymphokines 14:361-382)。イムノトキシン複合体の抗体部分が表面受容体へ結合した後、まず、被覆ピットへの該複合体のクラスター化(clustering)、次いで、細胞内のエンドソームまたレセプトソームへの該複合体のインターナリゼーション(internalization)が起こる(Middlebrookら,1994,Microbiol,Rev.48:199-221；Morrisら,1985,Infect.Immun.50:721-727；Fitzgeraldら,1980,Cell,21:867-873)。細胞に到達する際、複合体は、毒素が細胞内膜を通って(該複合体が細胞の死滅を引き起こす可能性のある)細胞質へと移動する前に、pHおよびタンパク質分解酵素活性が様々に異なる各種の細胞内区画を通って輸送されてもよい。
開発されている第２の分野は、核酸を細胞に導入するための方法に関する。最も広く用いられている方法は、リン酸カルシウムまたはDEAE−デキストランを用いて、核酸の取込みを促進するものである。これらの方法は、細胞表面へのＤＮＡの付着、エンドサイトーシスによる細胞質への侵入、および続いて行われる核への輸送の各工程を含むと思われる。Maniatis,Laboratory Cloning Manual,第２巻,16.30。細胞型に応じて、培養細胞数の最大20％までがリン酸カルシウムまたはDEAE-デキストランを用いてＤＮＡを取り込むことができる。
エレクトロポレーションは、もう１つのトランスフェクション法であり、その方法では、電場をかけて細胞膜に孔をあける。ＤＮＡは、これらの孔を通って細胞に侵入すると思われる。
核酸を細胞に導入するのにリポソームも用いられている。この技術によれば、カチオン性および中性の脂質を含有する人工的な脂質二重層の小胞が、細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの輸送を媒介する。このリポソーム媒介性トランスフェクションの機構は十分には理解されていないが、ＤＮＡ上の負電荷を帯びたリン酸基が、リポソームの陽電荷を帯びた表面に結合し、残りの陽電荷が細胞表面の負電荷を帯びたシアル酸残基と結合すると思われる。
Sanoは、核酸を細胞に導入するのに上記複合体を用いなかった。Sanoらは単一のビオチン分子を線状化pUC19プラスミドの１端部に組み込むことによる、ST-PA融合タンパク質を有するＤＮＡ−抗体複合体を記載していた。これは、上記の核酸を細胞にトランスフェクトする方法とは異なる。
３．発明の概要
本発明は、毒素または核酸を特定の細胞型内へ送達する方法、及び該方法を実施するための複合体に関する。本発明によれば、細胞表面抗原を認識する抗体がST-PA融合タンパク質の抗体結合部位に非共有結合で結合され、ビオチン化毒素またはビオチン化核酸がビオチン結合部位に結合されている。別の態様では、毒素または核酸は、ビオチン結合部位に結合する第三のビオチン化分子(アダプター)に結合させることができる。
本発明の一態様では、核酸は特定の細胞型に送達される。核酸は、ST-PA融合タンパク質のビオチン結合部位に結合するビオチン化一本鎖核酸でありうる。別の態様では、核酸は、ビオチン化一本鎖核酸と共に相補的な三重らせんを形成する二重らせん核酸であってもよく、これもビオチン結合部位と結合する。
本発明の方法は、ストレプトアビジン-プロテインＡ融合タンパク質と、細胞表面タンパク質に特異的な抗体(該細胞表面タンパク質は、該抗体と結合した後でエンドサイトーシスを受けるものである)と、ある標的物質(例えば、ビオチン化多剤耐性(mdr)遺伝子産物、プロドラッグ、毒素または核酸)との間で複合体を形成する工程；該複合体を、ビオチン結合部位に結合していない毒素から単離する工程；並びに標的細胞を該複合体と接触させて該標的物質を細胞内へ取り込ませる工程に関する。
３．１．定義：
本明細書において用いられる毒素は、完全毒素(holotoxins)、改変毒素、毒素の触媒サブユニット、または通常は細胞中に存在しない、特定の条件下で細胞の死滅を引き起こす任意の酵素をいう。ビオチン化毒素は、直接的にビオチン化されている毒素、またはビオチン化アダプターに結合している毒素をいう。
「抗体」という用語は、１種以上の機能性抗原結合性ドメインおよびプロテインＡに特異的に結合するFcドメインを含有する任意の分子をいう。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ：細胞表面上にある対応する表面抗原または受容体に結合しているイムノトキシンまたは組み換え毒素の略図である。
図１Ｂ：細胞表面上にある対応する表面抗原または受容体に結合しているストレプトアビジン−プロテインＡ／ビオチン化高分子複合体の略図である。
図２：ST-PA／抗EGFR mAB／ビオチン−βガラクトシダーゼ複合体およびST-TGF／ビオチン−βガラクトシダーゼ複合体の、A431細胞へのビオチン−βガラストシダーゼの送達の比較である。
図３：βガラクトシダーゼが細胞中に輸送された後の、細胞βガラクトシダーゼ染色の経時的分析である
図４Ａ：細胞系、およびST-PA−ビオチン−βガラクトシダーゼ−抗体複合体により標的とされる細胞表面分子である。
図４Ｂ：ST-PA−mAb−ビオチン−βガラクトシダーゼのヒト細胞への輸送であり、そこにおいて、mAbはHLA-DR、CD33またはCD34細胞表面分子に対して特異的である。
図５：ビオチン化ポリ(dT)オリゴヌクレオチドを用いて三重らせんＤＮＡを形成するための、pAT−βガラクトシダーゼ発現ベクター構築体の略図である。
図６Ａ：フィブロネクチン(配列番号１)とストレプロアビジン(配列番号２)との間のアミノ酸相同性である。太字体は相同な残基を示す。各タンパク質のRGDおよびRYDドメインに下線を引いてある。フィブロネクチンについて示す配列は、残基1481から始まり、ストレプトアビジンの配列は残基49から始まる。
図６Ｂ：ストレプトアビジン遺伝子のRYD配列を改変するように設計した、オリゴヌクレオチドプライマーDES(配列番号３)およびDER(配列番号４)である。
図６Ｃ：ストレプトアビジンのRYD配列を改変するのに用いる方法論の略図である。
５．好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、標的物質(例えば、毒素、プロドラッグ、mdr遺伝子産物、または核酸)と、細胞が有効濃度の該抗体にさらされた場合にエンドサイトーシスによって取り込まれる該細胞上の細胞表面抗原に特異的な抗体と、ST-PA融合タンパク質との複合体によって、該標的物質を細胞へ特異的に送達する方法を提供する。
ストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質(ST-PA)は、抗体結合部位において細胞特異的抗体と非共有結合によって結合し、そしてビオチン結合部位においてビオチン化標的物質と非共有結合によって結合する。標的物質がビオチン化される様式および方法は重要ではない。本発明は、そのような方法および試薬のいずれか、または全部を用いることを包含する。
１つの実施態様において、本発明は、細胞を特異的に破壊するための方法(例えば、短期培養または長期培養における宿主中またはex vivoでの腫瘍細胞の破壊)を提供する。毒素は、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、αトキシン、リシン、アブリン、PsuedomonasエキソトキシンＡ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルディン(momordin)、ゲロニン(gelonin)、アメリカヤマゴボウ(pokeweed)抗ウイルス性タンパク質、α−サルシンおよびコレラ毒素からなる群から選ばれうる。毒素はビオチン化し、PA-ST／Ab／ビオチン化毒素の複合体を形成する。次いで、有効量の該複合体を宿主内またはex vivo培養系に投与することができる。
別の実施態様において、本発明は、細胞傷害性プロドラッグ、すなわち、酵素(通常は細胞中に存在する酵素)によって細胞傷害性化合物へと変換される非毒性化合物を細胞に導入するのに、該細胞に対する抗体を用いる方法を提供する。この実施態様は、ST-PAキメラタンパク質の、腫瘍選択性モノクローナル抗体およびプロドラッグとの複合体を用いることを意図する。プロドラッグとして好適な化合物は、例として、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙げられる。
本発明のさらにもう１つの実施態様は、一本鎖核酸を細胞に送達するための複合体を意図する。本明細書において用いられる「一本鎖の核酸」という用語は、天然に存在する核酸または天然に存在しない核酸をいう。送達すべき核酸は、ランダムな組み込み、ＤＮＡポリメラーゼを用いる伸長反応、およびビオチン化プライマーを用いるＰＣＲなどの現在利用可能な方法のいずれかを用いてビオチン化することが可能である。そのような核酸は、該核酸が相補的であるｍＲＮＡを特異的に破壊するのに用いうる。
本発明のさらにもう１つの実施態様は、細胞のゲノムに組み込み可能であるか、もしくはエピソームによって複製可能である二重らせんＤＮＡ、および転写可能な二重らせんＤＮＡの、細胞への導入に関するものである。ビオチンを二重らせんＤＮＡに直接組み込むことにより、該ＤＮＡの複製および転写の両方が阻止される可能性がある。これらの問題を克服するために、細胞に送達されるべき二重らせんＤＮＡは、一本鎖核酸を用いて三重らせん核酸の領域を形成しうる配列を含有するように改変される。
三重らせんＤＮＡの形成は記載されており、典型的には、Ｔ−Ａ−ＴおよびＣ−Ｇ−Ｃのヌクレオチドの三つ組からなる。三重らせんＤＮＡの第３の鎖は、Ａ字型ＤＮＡヘリックスの大きな窪みを占めており、ホモポリマー性二重らせんＤＮＡとフーグスティーン型塩基対を形成する。あるいはまた、三重らせんは、二重らせんＤＮＡを用いて形成してもよい。本明細書で用いられる「三重らせん(triplex)」という用語は、二重らせんＤＮＡと一本鎖核酸との間のフーグスティーン型塩基対によって形成される構造をいう。
この実施態様では、複合体は、一本鎖核酸とフーグスティーン型の対を形成している二重らせんＤＮＡを含有し、これはビオチン化し、ST-PA／mAb複合体と複合体化する。この二重らせんＤＮＡは、線状の二重らせんＤＮＡであってもよく、これは、細胞のゲノムへの組み換えには好適である。あるいは、その二重らせんは、環状またはスーパーコイル型環状ＤＮＡであってもよく、これはエピソームによって複製しうる。
本発明のこの実施態様は、クローニングしたＤＮＡを細胞に導入するのに望ましいあらゆる条件下(例えば、産物を発現するのに望ましい条件下、または細胞の表現型を変えるのに望ましい条件下)で用いて、クローニングした任意の遺伝子の機能を調べることが可能である。
本発明のさらにもう１つの実施態様は、抗原提示細胞上に見出される細胞表面タンパク質に対する抗体と、ST-PA融合タンパク質と、病原性細菌またはウイルスのビオチン化タンパク質との複合体を含み、そのような複合体は、抗原提示細胞に対して抗原を局在化し、その結果、CD4陽性Ｔ細胞の免疫応答を他のリンパ球と比較して増強するのに使用可能である。
本発明の複合体は、単に、ST-PAと、モノクローナル抗体と、ビオチン化物質とを適当な比率で混合することによって形成することが可能である。これらの成分は任意の順番で混合することが可能である。
ST-PA融合タンパク質は、最大４つのビオチン化分子および４つのIgG分子を結合する四量体を形成し、該IgG分子はそれぞれ２価である。理論上の限定がない限り、細胞表面へのこの本発明の複合体の８価の結合により、該複合体は、他のイムノトキシンおよび免疫医薬複合体と比較して優れた結合およびインターナリゼーション特性を有するようになる。
ビオチンでブロックされたストレプトアビジンは、タンパク質中に存在するArg-Tyr-Asp配列(「RYD部位」)を介して細胞表面と特異的に相互作用する能力を有する。この部位は、タンパク質のビオチン結合性クレフトとは異なり、フィブロネクチンのRGD含有細胞結合性ドメイン(フィブロネクチン−細胞表面相互作用を仲介する)と高い相同性を有する(Alonら,1993,Europ,J.Cell Biol.60:1-11)。研究から、ストレプトアビジンがフィブロネクチンの類似した擬似体として作用することが示唆される(Alonら,1993,Europ.J.Cell Biol.60:1-11)。
フィブロネクチンおよびストレプトアビジンの保存されたRYDおよびRGDドメインは、多くの膜結合受容体との相互作用の普遍的な認識配列として作用する。本発明の１つの実施態様において、複合体のストレプトアビジン成分は、RYD部位を変えるように改変することが可能である。本明細書において用いられる「改変RYD配列」という用語は、ストレプトアビジンと細胞表面タンパク質との非ビオチン結合部位関連相互作用をなくす、RYD部位またはフランキング領域についてのあらゆる改変を包含する。そのような改変の１つは、アスパラギン酸をグルタミン酸で置換することである。
６．実施例：
６．１  材料及び方法
米国特許第5,328,985号(1994年７月12日発行)に記載されたプラスミドpTSAPA-2は、ストレプトアビジンとプロテインＡ(領域Ｅ及びＤ)とのキメラ遺伝子を担持するものである。ST-PAの遺伝子融合体の発現と精製を、以下の方法に従って行なった。
融合タンパク質の調製：
細菌株溶原菌BL21(DE3)(pLysS)を、pTSAPA-2ストレプトアビジン-プロテインＡ融合体発現ベクターによって形質転換した。形質転換株を、37℃にて50μg/mlのアンピシリン、34μg/mlのクロラムフェニコール及び0.2％グルコースを補給したLB培地中で増殖させた。培養物の600nmにおける吸光度が0.8〜1.0ODになったところで、水に溶解した100mMイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を0.4mMの最終濃度となるよう添加し、lac UV5プロモーターの下流に位置するT7ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を誘発した。誘発後、細胞を37℃で振盪しながら２時間インキュベートした。
ストレプトアビジン−プロテインＡ融合キメラタンパク質の精製を、特に記載しない限り４℃または氷上にて行なった。誘発後に２時間インキュベートしたBL21(DE3)(pLysS)(pTSAPA-2)の培養物(100ml)を、2,900×gにて15分間遠心分離した。細胞ペレットを10mlの２mM EDTA、30mM Tris-Cl(pH8.0)、0.1％TritonX-100、0.5mM PMSFに懸濁し、細胞を溶菌し、該溶菌液を−70℃で使用時まで保存した。解凍した細胞溶菌液へ、PMSF、ロイペプチン、及びペプスタチンＡをそれぞれ0.5mM、１μM、及び１μMの最終濃度となるよう添加した。次いで溶菌液を、12mM MgSO4の存在下、室温にて20分間10μg/mlのデオキシリボヌクレアーゼＩ及び10μg/mlのリボヌクレアーゼＡで処理した。混合物を39,000×gで15分間遠心分離し、ペレットを100mlの７Ｍ塩酸グアニジンに一晩４℃で攪拌しながら溶解させた。ペレットを溶解させた後、次いでタンパク質を150mM NaCl、50mM Tris-Cl(pH7.5)、0.05％Tween20、0.1mM PMSF、１μＭロイペプチン、１μＭペプスタチンＡ、0.02％NaN3で透析した。塩酸グアニジンをゆっくりと除去するため、タンパク質溶液を含む透析バッグを攪拌せずに一晩透析溶液(dialysis solution)(〜1,000ml)中に放置し、次いで透析溶液を３回取り替え、攪拌しながら４℃で透析を行なった。透析物(dialysate)を39,000×gで15分間遠心分離し、上清を、予め５〜10床容積のTST緩衝液で洗浄しておいたIgG Sepharose 6 Fast Flowカラム(1.2×1.1cm)にかけた。該カラムは、次いで1)0.5Ｍ酢酸、pH3.4[pHはNH4CH3COOH(NH4Ac)にて調整]；2)150mM NaCl、50mM Tris-Cl(pH7.5)、0.05％Tween20(TST緩衝液)；3)0.5Ｍ酢酸、pH3.4；及び4)TSTのそれぞれ２〜３床容積で平衡化した。サンプルをカラムにかけ、1)10床容積のTST、及び2)２床容積の５mM NH4Ac、pH5.0でカラムを洗浄することによって未結合タンパク質を除去した。溶離は0.5Ｍ酢酸、pH3.4を用いて行なった。溶出液を１〜２mlのフラクション毎に回収し、280nmにおけるODが最も高いフラクションを１Ｍ NaCl、50mM炭酸ナトリウム(pH11.0)で透析した。透析物を39,000×gで15分間遠心分離することによって清澄にし、予め１Ｍ NaCl、50mM炭酸ナトリウム(pH11.0)で平衡化した2-イミノビオチンアガロースカラム(1.2×1.2cm)にかけた。同一の溶液で未結合タンパク質を除去した後、結合タンパク質を６Ｍ尿素、50mM酢酸アンモニウム(pH4.0)で溶離させた。溶離させたタンパク質を、0.02％NaN3を含むTris緩衝化食塩水[TBS；150mM NaCl、20mM Tris-Cl(pH7.5)]で透析し、透析物を0.22μmフィルター(Millex-GV、Millipore)で濾過した後、４℃で保存した。
ST-PA/mAb/ビオチン化β-ガラクトシダーゼ複合体の形成：
約２μgの抗体、約28μgの融合タンパク質、及び約２単位のビオチン化β-ガラクトシダーゼの混合物を、室温で少なくとも10分間インキュベートした。インキュベート後、複合体はそのままで使用可能である。
β-ガラクトシダーゼ染色：(X-GAL染色)
プレートに付着している細胞のβ-ガラクトシダーゼ染色を、Sanes,ら,1986,EMBO J.5:3133-3142に従って行なった。
Molecular Probes,Inc.のプロトコールを使用して、懸濁液中で増殖する細胞におけるlacZβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を検出した。
上記のプロトコールを使用して、融合タンパク質に結合させた抗体とビオチン化β-ガラクトシダーゼ酵素とを含む複合体が、選択した細胞にうまく導入されたかどうか判定した。導入が完了していれば、細胞は一晩インキュベートすると青くなる。
２)ストレプトアビジンタンパク質RYD配列の改変
ビオチンでブロックしたストレプトアビジンは、おそらく、タンパク質のビオチン結合性クレフトとは異なるRYD含有配列を介して細胞表面に特異的に結合する(Kd＝３×108Ｍ)。
RYDドメイン(配列)を別のアミノ酸残基に変えることにより、様々な細胞のビオチンに関係しない特異的な表面結合を排除できるものと期待される。
RYD配列を改変する一つの方法は、RYD配列をRYEに変えることである。RYD配列のRYEへの変更は、逐次PCR法を使用して点突然変異を導入することによって達成可能である。これは、２つのプライマー、即ち、DES(配列番号１)及びDER(配列番号２)(図５参照)を設計し、pTSAPA-2発現ベクターをストレプトアビジン遺伝子の鋳型として用いることにより達成することができる。まず、２対のプライマー(即ち、T7プロモーター/DER及びT7ターミネータ/DES)を用いてPCRを行なう。次に、これら２つの増幅ＤＮＡ断片を精製し、プールして１つのサンプルとする。次いで、プールした第一ラウンドの精製産物を鋳型として用い、T7プロモータープライマー及びT7ターミネータープライマーを用いてPCRの第２ラウンドを行なう。ストレプトアビジン遺伝子成分の突然変異RYE配列は、PCRの第二ラウンドの産物を配列分析することによって確認する。
３)ビオチン-β-ガラクトシダーゼのA431細胞への送達
化合物を細胞へ送達するST-PAの能力を調べるため、この複合体の送達を、コアとなるストレプトアビジンがTGFα受容体に共有結合で結合している複合体の場合と比較した。
ストレプトアビジン-TGF-α(ST-TGF)の発現ベクターであるpTSA-TGFαは、pTSAPA-2におけるプロテインＡの遺伝子を成熟ヒトTGF-α遺伝子(アミノ酸１〜50個)で置換することにより構築した。
ビオチン化タンパク質を特定の細胞型へ送達するST-PA及びST-TGFα融合タンパク質の能力を証明するため、ビオチン化β-ガラクトシダーゼを該融合タンパク質のストレプトアビジン成分と複合させた。β-ガラクトシダーゼのA431細胞への送達は、公知の染色法及びFACS分析を使用して定量した。
ST-PA／ビオチンβ-ガラクトシダーゼを抗EGFR mAbと複合させ、次いで得られた複合体を上皮増殖因子受容体(EGFR)を過剰発現するA431ヒト類表皮細胞とインキュベートした。あるいは、ST-TGFをビオチン-β-ガラクトシダーゼと混合し、得られた複合体をA431細胞へ投与した。
図２に示すように、ST-PA融合タンパク質は、A431細胞の表面にあるEGFRを介してビオチン-β-ガラクトシダーゼをA431細胞へ効率よく送達した(陽性細胞＞99％)。ST-TGFα融合タンパク質も、ビオチン-β-ガラクトシダーゼのA431細胞への効率的な送達を示した(陽性細胞＞99％)。驚くことに、ST-TGFα融合タンパク質によって各細胞へ送達されるビオチン-β-ガラクトシダーゼの量は、ST-PA送達系で観察される量よりも少なかった(観察された平均蛍光活性は、それぞれ214と2402であった)。
ST-PA融合タンパク質によるビオチン-β-ガラクトシダーゼのA431細胞への高効率の送達は、各ST-PA四量体に含まれるビオチンとIgGに対する４つの結合部位に起因する可能性がある(図１Ｂ参照)。図３に示す経時実験より、99％よりも多くの細胞が、ビオチン-β-ガラクトシダーゼを細胞へ輸送した２日後までにβ-ガラクトシダーゼに対して陽性染色になることが証明された。
４)特異性の異なるmAbを用いたビオチンβ-ガラクトシダーゼの細胞への送達
ビオチンβ-ガラクトシダーゼのA431細胞への送達を調べる際に用いた実験手順を、抗体／ST-PA／ビオチン化β-ガラクトシダーゼ複合体の他の細胞型への送達を調査するのにも使用した。この調査には、複数の異なる細胞表面分子を認識する抗体を利用した。本実験に使用した細胞系及び細胞表面分子を図４Ａにまとめる。図４Ｂに示すように、ST-PA/mAb複合体は、試験したヒト細胞型へ、これらの細胞表面に存在するHLA-DR、CD33及びCD34分子を介してβ-ガラクトシダーゼを非常に効率よく輸送した(陽性細胞＞99％)。
５)pAT-β-ガラクトシダーゼ発現ベクター
ビオチンはＤＮＡへ組み込ませることが可能であるものの(例えば、発現プラスミド)、ビオチンをＤＮＡへランダムに組み込ませると転写活性が失われる可能性がある。細胞へ導入すべきＤＮＡの転写活性を保つために、新規な遺伝子輸送系を開発した。該遺伝子輸送系は、発現カセットの下流にポリ(dA)／ポリ(dT)域(tract)を有するpAT-発現ベクターを使用するものである(図５参照)。この輸送系によれば、細胞へ送達すべきＤＮＡを発現ベクターにクローニングする。pAT-発現ベクターは、ST-PA融合タンパク質のビオチン結合部位に結合するビオチン化ポリ(dT)オリゴヌクレオチドと共に三重らせんＤＮＡを形成する。ST-PA融合タンパク質の抗体結合部位に結合する抗体は、ＤＮＡを送達すべき細胞を標的とする。
三重らせんＤＮＡの形成及びβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の細胞へのＤＮＡ輸送についてのプロトコールは、以下の通りである。β-ガラクトシダーゼ遺伝子をpAT-発現ベクターの発現カセットにクローニングする(図５参照)。４μgのpAT-β-ガラクトシダーゼ発現ベクター及び20pmolのビオチン化ポリ(dT)オリゴヌクレオチド(Promega)をTMN緩衝液(10mM Tris、pH8.0、10mM MgCl2、50mM NaCl)に溶解した混合物を、37℃で１時間インキュベートする。次いでST-PA融合タンパク質(0.5μg)及びmAb(1.0μg)を混合物に添加し、得られた混合物を室温で30分間インキュベートする。三重らせんＤＮＡ-ST-PA-mAb複合体を細胞(１×106個)に添加し、37℃で48時間インキュベートする。β-ガラクトシダーゼ活性をFACSによって検出する。
参考文献
0004124482.tif 000002
配列表
(１)一般的情報：
(ｉ)出願人：メルエロ、ダニエル
オオノ、コウイチ
レヴィン、ブランディ
(ii)発明の名称：ストレプトアビジン−プロテインＡ融合タンパク質を用いた高効率の組織特異的化合物送達系
(iii)配列の数：４
(iv)住所：
(Ａ)名宛人：ペニー アンド エドモンズ
(Ｂ)通り名：１１５５アベニュー オブ ザ アメリカズ
(Ｃ)市名：ニューヨーク
(Ｄ)州名：ニューヨーク
(Ｅ)国名：アメリカ合衆国
(Ｆ)郵便番号：１００３６−２７１１
(ｖ)コンピューター読み取り可能形式：
(Ａ)媒体の型：フロッピーディスク
(Ｂ)コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換機
(Ｃ)オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
(Ｄ)ソフトウェア：パテントイン リリース＃1.0、バージョン＃1.30
(vi)本出願のデータ：
(Ａ)出願番号：
(Ｂ)出願日：
(Ｃ)分類：
(viii)代理人の情報：
(Ａ)代理人名：プワサン、ブライアン エム.
(Ｂ)登録番号：２８，４６２
(Ｃ)参照／事件番号：８１０５−００７
(ix)テレコミュニケーションの情報：
(Ａ)電話番号：(２１２)７９０−９０９０
(Ｂ)テレファックス：(２１２)８６９−８８６４
(Ｃ)テレックス：６６４４１ PENNIE
(２)配列番号：１：
(ｉ)配列の特色：
(Ａ)配列の長さ：２０アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：
0004124482.tif 000003
(２)配列番号：２：
(ｉ)配列の特色：
(Ａ)配列の長さ：２１アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：
0004124482.tif 000004
(２)配列番号：３：
(ｉ)配列の特色：
(Ａ)配列の長さ：１８塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(genomic)
(xi)配列：
0004124482.tif 000005
(２)配列番号：４：
(ｉ)配列の特色：
(Ａ)配列の長さ：１５塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(genomic)
(xi)配列：
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【図１Ａ】
0004124482.tif 000007
【図１Ｂ】
0004124482.tif 000008
【図２Ａ】
0004124482.tif 000009
【図２Ｂ】
0004124482.tif 000010
【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
0004124482.tif 000013
【図５】
0004124482.tif 000014
【図４Ｂ】
0004124482.tif 000015
【図４Ｃ】
0004124482.tif 000016
【図４Ｄ】
0004124482.tif 000017
【図４Ｅ】
0004124482.tif 000018
【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
0004124482.tif 000020
【図６Ａ】
0004124482.tif 000021
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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