(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＰ２ＡｃおよびｅＲＦ１間の相互作用に影響を与える試薬をスクリーニングすることを含む、タンパク質発現のモデュレーターを同定する方法であって、前記ＰＰ２ＡｃおよびｅＲＦ１の間の相互作用を、遺伝子試験により、固相結合アッセイにより、また溶液中におけるタンパク質結合の物理的検定により、検知するものである方法。
【請求項２】
検知を、遺伝子試験によるレポーター遺伝子発現の評価により行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃをスクリーニングする化合物と共にインキュベートし；および
（ｂ）ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃ間の相互作用の調節を検知する段階を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）ｅＲＦ１のフラグメント（フラグメントは少なくとも配列番号１のアミノ酸残基を含む）およびＰＰ２Ａｃのフラグメント（フラグメントは少なくとも配列番号２のアミノ酸残基を含む）を、スクリーニングする化合物と共にインキュベートし、；および
（ｂ）前記ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃのフラグメント間の相互作用の調節を検知する段階を含む、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）のモデュレーターに関する。特に、本発明はＰＰ２Ａ調節におけるｅＲｆ１の関与、および細胞内シグナリングおよびタンパク質合成の調節におけるｅＲＦ１−ＰＰ２Ａ相互作用のモデュレーターの使用に関する。
タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）は、代謝、シグナル伝達、増殖、発達、細胞周期進行および形質転換を含む、多くの細胞過程の調節に関与している（Mumby,M.C.and Walter,G.（1993）Physiol.Rev.,73,673-699; Mayer-Jaekel,R.E.and Hemmings,B.A.（1994）Trends Cell Biol.,4,287-291にレビュー）。ＰＰ２Ａは、三量体ホロ酵素のファミリーであり、これは、６５ｋＤａ（ＰＲ６５／Ａ）の定常調節サブユニットに結合した３６ｋＤａ触媒サブユニット（ＰＰ２Ａｃ）がさらに三番目の可変調節サブユニットと会合したものから構成される。数個の三量体ＰＰ２Ａホロ酵素が精製され、これには５４、５５、７２または７４ｋＤａのいずれかの異なる可変サブユニットが含まれている。
インビトロ再構成アッセイにより、および調節タンパク質欠損酵母およびショウジョウバエ変異体の解析により実証されているように、定常および可変サブユニットの両方が、ＰＰ２Ａ活性および基質特異性の制御に重要である。例えば、ショウジョウバエａａｒ1変異体の脳抽出物のＰＰ２Ａ活性（ここで、ＰＲ５５をコードしている遺伝子はＰ因子挿入により分裂されている）は、ｐ３４cdc2によりリン酸化されたヒストンＨ１およびカルデスモンに対して、野生型ハエに比べて数倍低い。対照的に、ＰＰ２Ａのホスホリラーゼ・ホスファターゼ活性は、ａａｒ1および対照ハエで類似している。可変調節サブユニットはまた、潜在二次メッセンジャーおよびウイルスタンパク質に標的を示す。セラミドはＰＲ５５サブユニットを含む三量体ＰＰ２Ａのみを活性化するが、ＰＰ２Ａｃ−ＰＲ６５ニ量体には影響を与えないことが実証されている。しかし、最近のデータにより、定常も可変調節領域もＰＰ２Ａ活性のセラミド刺激には必要でないことが示されている。なぜなら、ＰＰ２ＡｃおよびＰＰ２Ａｃ−ＰＲ６５二量体の両方共三量体ホロ酵素と同じ方法でセラミドにより刺激されるからである。このことは、ＰＰ２Ａｃ自体がセラミド作用の標的であることを示唆している。さらに、ＰＰ２Ａはまた、ポリオーマウイルス・スモールｔおよびミドルＴおよびＳＶ４０スモールｔなどの特定のＤＮＡ腫瘍ウイルスの抗原の形質転換に関連することが示されている。これらの腫瘍タンパク質が、三量体ホロ酵素から正常細胞可変調節サブユニットを離すことにより、ＰＰ２Ａ活性を変化させると信じられている。いくつかのウイルスタンパク質はＰＰ２Ａホロ酵素の特異的な形にしか相互作用せず、例えば、ＳＶ４０スモールｔ抗原は、Ｂサブユニット（ＰＲ５５）のみを置換でき、三量体ＰＰ２ＡのＢ’サブユニットは置換できない。また、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ４は、ＰＲ５５を含む三量体ＰＰ２Ａに結合することが示されている。合わせて考えると、これらの例は、ＰＰ２Ａｃ活性は、調節タンパク質によりインビボでしっかりと調節されていることを示している。
真核生物の翻訳装置の数多くの成分が、リン酸化されていることが知られており、ある場合においては、リン酸化が翻訳速度を調節していることが示されている。さらに、翻訳の忠実性の維持に直接機能している延長および終結因子がリン酸化されている。リン酸化レベルはまた、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）における翻訳忠実性の制御に関与している。なぜなら、アロサプレッサー遺伝子であるｓａｌ３は、二特異性タンパク質ホスファターゼをコードしていることが現在知られているｃｄｃ２５の対立遺伝子であるからである。翻訳の忠実性の維持にタンパク質ホスファターゼが関与している別の例が報告されており、この中で最も際立つものは、最近、セリン／トレオニンタンパク質ホスファターゼとして同定されたＰＰＱと呼ばれる酵母翻訳アロサプレッサーＳＡＬ６である。
シグナル伝達における基本的な問題は、どのようにタンパク質キナーゼおよびタンパク質ホスファターゼが、正しい時間および場所で迅速に選択的に、正しい標的タンパク質のリン酸化／脱リン酸化の調節を行うかである。Hubbard and Cohen、（1993）Trends Biochem.Sci.,81,172-177の標的に関する仮定では、「標的サブユニット」は、タンパク質キナーゼおよびホスファターゼを、特異的亜細胞部位に指向させ、そこでその標的に作用させるものと仮定する。幅広い基質特異性を有するいくつかのタンパク質キナーゼおよびホスファターゼが、特異的相互作用タンパク質により、その標的に集められる数多くの証拠がある。ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）のII型ホロ酵素は、その調節（ＲII）サブユニットとＡ-キナーゼアンカータンパク質（A-kinase anchor proteins）すなわちＡＫＡＰとの相互作用を介して特異的亜細胞部位に結合できることが示された。興味深いことに、ＰＫＡアンカータンパク質は、当初、アフィニティークロマトグラフィー後にＲIIと同時に精製されたタンパク質として同定された。さらに、ＲＡＣＫ（活性化Ｃ−キナーゼのレセプター（receptors for activated Ckinase））と呼ばれるタンパク質群が、タンパク質キナーゼＣイソ酵素の活性化形に結合し、酵素の特定の亜細胞コンパートメントへの転移を仲介し、そこで作用を発現することが示された。
ＰＰ２Ａでは、この型の調節は、その構成要素である調節サブユニットにより仲介されると考えられている。しかし、ＰＰ２Ａが関与する数多くの細胞過程に関しては、調節形態によっては、内因性ホロ酵素成分のみではなく外因性タンパク質からもなされていると推測することが妥当である。細胞周期進行および形質転換などの疾患に関連性のある過程におけるＰＰ２Ａの役割は、治療における標的としてのＰＰ２Ａおよびその制御機構を包含する。
ｅＲＦ１は、リボソームからのポリペプチド鎖の放出に影響を与えることにより遺伝子発現を調節するポリペプチドである（Frolova et al.、（1994）Nature,372,701-703）。ｅＲＦ１タンパク質ファミリーのメンバーが、元来、酵母Saccharomyces cerevisiaeから同定されたリボソーム関連タンパク質に非常に類似した配列を基礎としていくつかの高等真核生物から同定された（Breining,P.and Piepersberg,W.（1986）Nuc.Acid.Res,、14,5098-5107）。Ｓｕｐ４５と呼ばれるこのタンパク質は、インビボにおいて欠陥ナンセンス抑制を示す変異体を遺伝子解析することにより、翻訳忠実性の維持に関与している。酵母Ｓｕｐ４５は、真核生物の相対物に対して〜７０％のアミノ酸相同性を示し、ＳＵＰ４５遺伝子の変異は、アフリカツメガエルＳｕｐ４５相同体Ｃl１と相補性であり得る。このことは、翻訳終結におけるその機能が保存された進化上の特徴であることを示している。
ｅＲＦ１は、インビボにおいて翻訳に必要な唯一の終結因子ではないことが示された。なぜなら、真核生物の翻訳終結はＧＴＰ依存性過程であるが、ｅＲＦファミリーのメンバーはそれ自体共通したＧＴＰ結合部位を全く含まないことが以前に示されているからである（Frolova et al.、1994）。真核生物翻訳終結機構の付加的成分の候補は、Ｓｕｐ３５タンパク質ではないかと提案されている（Tuite,M. and Stansfield, I.（1994）Nature,372,614-615）。Saccharomyces cerevisiaeに元来記載のように、ＳＵＰ３５遺伝子における変異は、ＳＵＰ４５変異体と類似した表現型の配列を示し、このことは、Ｓｕｐ３５が翻訳終結過程に関与（Stansfield and Tuite、1994でレビュー）し、いくつかの共通ＧＴＰ結合部位も含むことを示している。
実際、ごく最近の発見により、Ｓｕｐ４５（ｅＲＦ１）およびＳｕｐ３５（ｅＲＦ３とも呼ばれる）は、実際、酵母および高等真核生物の両方において、終結因子複合体を形成することが示された（Zhouravleva,G.et al.（1995）EMBO J.、14,4065-4072; Stansfield,I.et al.（1995）EMBO J.、14,4365-4373）。Ｓｕｐ３５（ｅＲＦ３）は、それ自体終結因子としては不活性であるが、ｅＲＦ１の活性を強く刺激し、終結因子複合体の機能の１つは、ＧＴＰ結合および加水分解であり得る。Ｓｕｐ３５は、機能的に異なるコンフォメーションで存在できるプリオン様タンパク質であるという報告から、真核生物の翻訳終結を調節している可能性が示唆される。
ウサギ骨格筋由来の異なるＰＰ２Ａホロ酵素の同時精製法は、そのサブユニット構造をさらに解析するために開発された。この試みにより、おそらくＰＰ２Ａを核基質に標的化させる機能がある可変調節サブユニット（ＰＲ６１と呼ばれる）の新規な型の異なるアイソフォームを含むＰＰ２Ａ。の２つのヘテロ三量体形が精製される。さらに、５４ｋＤａおよび５５ｋＤａの２つの新規なタンパク質が、アフィニティー精製後に三量体ＰＰ２Ａ1ホロ酵素と同時精製されることが分かった。５４ｋＤａタンパク質はｅＲＦ１である。
本発明の要約
従って、本発明はＰＰ２ＡおよびｅＲＦ１間の相互作用に影響を及ぼす試薬をスクリーニングすることを含むタンパク質発現のモデュレーターを同定する方法を提供する。さらに、本発明は、本発明に記載の方法を取り込むスクリーニング系およびｅＲＦ１−ＰＰ２Ａ相互作用を標的とするタンパク質モデュレーターを提供する。
本発明の詳細な説明
本発明は、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａｃ）と、ポリペプチド鎖終結因子としてタンパク質合成の終結に機能する、近年確立されたｅＲＦ１と呼ばれるタンパク質ファミリーに属するタンパク質との相互作用の解明を基礎とする（Frolova et al.、1994）。このタンパク質の同定は、精製ＰＰ２Ａ調製物のサブユニット組成物、およびこのような調製物に典型的に見られる同時精製タンパク質を解析することにより促進された。この結果の新規性は、ｅＲＦ１が、これまでにＰＰ２Ａの触媒サブユニットと相互作用することが分かっている確立されたＰＰ２Ａの調節サブユニット以外の最初の細胞タンパク質であるということである。また、ＰＰ２Ａがタンパク質合成調節に関与している機構も明らかにする。本発明から導かれる結果の見解から、ｅＲＦ１は、（ｉ）ポリペプチド鎖終結、および（ii）ＰＰ２Ａのポリソームへの集合、において２つの役割を果たすと考えられ、ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａの両方共ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａ間の相互作用に影響を与えることができるタンパク質発現のモデュレーターを同定する有用な方法を提供する。
従って、本発明の方法は、ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃ間の相互作用を検定し、この相互作用をタンパク質合成のモデュレーターの可能性のある化合物をスクリーニングするために使用することを模索する。ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃ間の相互作用は、数多くの方法で検定し得、好ましい検定法は、遺伝子試験におけるレポーター遺伝子の活性化、溶液中におけるタンパク質結合の物理的検定（例えば分光学的解析）および固相結合アッセイ（ここで、ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃは、共同結合対として機能し、検定は、例えば、ＥＬＩＳＡなどのアッセイで一般的な酵素／基質試薬等を用いて行う）を含む。
本発明により、「ｅＲＦ１」は、ｅＲＦ１ファミリーの全てのポリペプチド、並びに少なくとも１つの共通した構造決定基を含むその誘導体を含む。「共通の構造決定基」は、問題となる誘導体が、ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃの結合に関与する特徴と一致する、ｅＲＦ１の構造的特徴を少なくとも１つ有することを意味する。構造的特徴は、天然発生または変性ｅＲＦ１ポリペプチドまたはそのフラグメントに対して生じた抗体と交差反応することができるエピトープまたは抗原部位の所持、ｅＲＦ１と相同性があるアミノ酸配列および共通した構造／機能関連性を有する特徴の所持を含む。従って、本発明により提供されるｅＲＦ１は、一次転写の選択的スプライシングにより産生されたｍＲＮＡによりコードされたスプライスバリアント、アミノ酸変異体、グリコシル化変異体、およびＰＰ２Ａｃへの結合に関与するｅＲＦ１の特性を保持しているｅＲＦ１の他の共有結合誘導体を含む。誘導体の具体例は、置換、化学的、酵素的、または他の適当な手段により、天然アミノ酸以外の成分を用いて共有結合修飾したｅＲＦ１分子を含む。このような成分は、酵素または放射性アイソトープなどの検出可能な成分であり得る。さらに、特定の種、好ましくは哺乳動物で見られる天然のｅＲＦ１変異体が含まれる。このような変異体は、同じ遺伝子ファミリーの関連遺伝子により、特定の遺伝子の対立形質変異体によりコードされるか、またはｅＲＦ１遺伝子の選択的スプライシング変異体を示し得る。
共通の構造特性を保持する誘導体は、ｅＲＦ１のフラグメントであり得る。ｅＲＦ１のフラグメントは、その個々のドメイン、並びにドメイン由来の小ポリペプチドを含む。好ましくは、本発明に記載のｅＲＦ１由来の小ポリペプチドは、ｅＲＦ１に特徴的な一つの特性を定義する。フラグメントは、ｅＲＦ１の特性の一つを保持している限り、理論的にはどのようなサイズでもよい。好ましくは、フラグメントは５ないし２００アミノ酸長である。長いフラグメントは全長ｅＲＦ１の切断物と考え、一般的に「ｅＲＦ１」の用語で包含される。
ｅＲＦ１の誘導体はまた、アミノ酸欠失、付加または置換を含み得るその変異体を含み、ｅＲＦ１に特徴的な少なくとも一つの特性を保持する必要性がある。
従って、保存的アミノ酸置換は、５’または３’末端からの切断のように、実質的にｅＲＦ１の性質を変化させることなく行い得る。欠失および置換はさらに、本発明により構成されるｅＲＦ１のフラグメントに施し得る。ｅＲＦ１変異体は、ｅＲＦ１をコードするＤＮＡから、インビトロで変異誘発し、例えば、１つ以上のアミノ酸を付加、交換および／または欠失することにより産生し得る。例えば、ｅＲＦ１の置換、欠失または挿入変異体は、組換え法により調製でき、ｅＲＦ１の天然形との免疫交差反応でスクリーニングした。
ｅＲＦ１のフラグメント、変異体および他の誘導体は、好ましくは、ｅＲＦ１と実質上相同性を保持する。本明細書で記載のように、「相同性」は、２つのものが、当業者が起源および機能において類似していることを決定するに十分な特徴を保持することを意味する。好ましくは、相同性は配列同一性を意味するために使用する。従って、ｅＲＦ１の誘導体は、好ましくは、野生型ヒトｅＲＦ１と実質上配列同一性を示す（Frolova et al.、1994）。
「実質上相同」（ここで、相同性は配列同一性を示す）は、５０％以上の配列同一性、好ましくは７５％以上の配列同一性、および最も好ましくは９０％以上の配列同一性を意味する。
本明細書に記載のように、ＰＰ２ＡおよびＰＰ２Ａｃなる用語は、タンパク質ホスファターゼ２Ａおよびその触媒サブユニットを意味し、ｅＲＦ１について上記したように解釈する。
欠失解析により、ＰＰ２ＡｃおよびｅＲＦ１の間の相互作用に関与する結合ドメインは、ＰＰ２Ａｃの５０Ｎ末端アミノ酸内、およびヒトｅＲＦ１のＣ末端部分のアミノ酸残基３３８ないし３８１間に位置することが判明したため、上記に定義したＰＰ２ＡｃおよびｅＲＦ１の好ましいフラグメント、変異体および他の誘導体は、少なくともこれらの結合ドメインまたは機能的に等価なアミノ酸配列を含む。
本発明に記載の好ましい方法は、Fields,S.and Song,O.（1989）Nature,340,345-346により開発された二重ハイブリッド法に基づく。この方法によると、転写因子のＤＮＡ結合および転写活性化ドメインが分離され、２本のポリペプチドが形成され、その協同作用を検知する。ポリペプチドが協同作用すると、ＤＮＡ結合および転写活性化ドメインが会合し、転写因子が機能し、これによりレポーター遺伝子の発現をアップレギュレートする。他方で、もしポリペプチドが協同作用しないのであれば、その２つのドメインは会合しないので、活性化転写因子は全く形成されない。この方法では、レポーター遺伝子のアップレギュレーションの検定は、ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃの間の協同作用がうまくいくかどうかに依存し、結合の最終的な検定は、レポーター遺伝子発現のアッセイにより行う。可視的マーカー、例えば緑蛍光タンパク質またはβガラクトシダーゼなどの発現が好ましい。
方法の解釈は、スクリーニングする化合物の性質に依存する。従って、もし阻害剤のスクリーニングであれば、対照に比してレポーター遺伝子発現が欠如していると、化合物の活性の指標になる。逆に、対照に比してレポーター遺伝子発現が増加していると、化合物はｅＲＦ１／ＰＰ２Ａｃ相互作用を増強する活性があることを示す。このパターンは、転写活性化剤とは反対に転写サイレンサから誘導したＤＮＡ結合および／または転写影響ドメインの使用により逆転し得る。
本発明の方法を、スクリーニング法の設計に適用することによって、タンパク質合成異常に使用するための推定的治療剤を同定し得る。従って、本発明は、
（ａ）ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃまたはそのフラグメントを、スクリーニングする化合物と共にインキュベートし；および
（ｂ）ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃ間の相互作用のあらゆる調節を検定する段階を含む、細胞内シグナリングのモデュレーターの可能性をスクリーニングする方法を提供する。
本発明で使用するＰＰ２ＡｃおよびｅＲＦ１は、単離ポリペプチドまたはそのフラグメントの形であり得る。上記で概略を示したように、ＰＰ２ＡｃおよびｅＲＦ１の好ましいフラグメントは、少なくとも、互いのそれぞれの結合ドメイン、すなわち、ＰＰ２Ａｃの５０Ｎ末端アミノ酸（配列番号１）およびヒトｅＲＦ１のＣ末端部位におけるアミノ酸３３８から３８１（配列番号２）、または互いに結合できる機能的に等価なそのフラグメントを含む。さらに、ＰＰ２ＡｃおよびｅＲＦ１は、別のポリペプチドと複合体を形成しているポリペプチドまたはフラグメント形であり得る。例えば、二重ハイブリッド法基本スクリーンの場合、ポリペプチドまたはフラグメントは、酵母アクチベーターＧＡＬ４などの別のタンパク質由来のＤＮＡ結合または転写活性化ドメインと複合体を形成する。ＰＰ２Ａｃポリペプチドまたはそのフラグメントは、転写アクチベーターまたはＤＮＡ結合エレメントのいずれかに結合するが、ｅＲＦ１ポリペプチドまたはそのフラグメントは相補ドメインに結合する。
さらに、本発明の方法を適用して、ｅＲＦ１−ＰＰ２Ａｃ相互作用を調節する細胞成分を検出および特徴付けることにより、ＰＰ２Ａの活性を制御する機構をさらに解明し得る。
本発明の別の態様において、ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃ間の相互作用を調節する化合物が得られる。このような化合物は、ｅＲＦ３のような、この相互作用の増強剤であり得るか、好ましくはその阻害剤であり、ｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃ間の結合を妨害するように作用する。
候補の化合物は、ｅＲＦ１またはＰＰ２Ａｃ由来のポリペプチドを含み、これは、結合対の片方、並びに２つの分子の結合を妨害できる抗ｅＲＦ１および抗ＰＰ２Ａｃ抗体と結合を競合できる程度でそれぞれのタンパク質を模倣する。しかし、好ましいのは、特異的に結合を阻害し、医薬適用に適した低分子量化合物である。最も好ましい態様において、候補化合物は、ＰＰ２Ａｃの５０Ｎ末端アミノ酸（配列番号１）およびヒトｅＲＦ１のＣ末端部分のアミノ酸残基３３８から３８１により提供される実質上同等の生理学的結合特性を有するポリペプチド、またはこれらのポリペプチドに特異的に指向するモノクローナル抗体である。
本発明に記載の化合物は、タンパク質合成の異常なアップレギュレーションおよび関連した細胞増殖におけるモデュレーターの候補であり、従って、細胞増殖と関連した疾患、特に癌の処置に有用であり得る。
本発明はさらに、以下の実施例において、説明の目的だけのために記載する。
実験項
ＰＰ２Ａ1ホロ酵素と５４ｋＤａおよび５５ｋＤａの２つのタンパク質の同時精製
ＰＰ２Ａを、Zolnierowicz et al.,（1994）Biochemistry,33,11858-11867により修飾されたプロトコールを用いてウサギ骨格筋から精製する。ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフイー段階において、カラム（５×４０cm）を０．０５から０．６Ｍの勾配のＮaＣl２０００mlを用いて溶出する。０．２７−０．３２Ｍ、０．３４−０．３８Ｍおよび０．３９−０．４４Ｍ ＮaＣl（それぞれ、プール１、プール２およびプール３と呼ぶ）でＤＥＡＥセファロースから溶出したＰＰ２Ａに対応する画分を合わせ、さらに精製する。プール１および３におけるＰＰ２Ａは、ポリ−Ｌ−リジンアガロース、ω−アミノヘキシルセファロースおよびチオホスホリラーゼａ−セファロースカラムで連続的にクロマトグラフィーすることにより精製する。プール２のＰＰ２Ａについては、酵素を、ポリ−Ｌ−リジンアガロースおよびチオホスホリラーゼａ−セファロースにより精製する。全部で３つのＰＰ２Ａ調製物の最終精製段階は、０．２から０．５Ｍの勾配のＮaＣl４０mlを用いるイオン交換ＭonoＱ ＦＰＬＣ（０．５×５cmカラム、ファルマシア）を含む。精製時のＰＰ２Ａ活性は、Waelkens et al.（1987）J.Biol.Chem.,262,1049-1059により記載されたように、プロタミン刺激ホスホリラーゼ・ホスファターゼ活性をアッセイすることにより監視する。最終段階から得られた精製タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによる免疫検出により解析する。
ＤＥＡＥセファロースプール１、２および３から得られた部分精製物質を、先行文献で報告されたＰＰ２Ａの構成サブユニットに対して生じたいくつかの抗血清を用いて解析する（Hendrix et al.,（1993a）J.Biol.Chem.,268,15267-15276; Hendrix et al.,（1993b）J.Biol.Chem.,268,7330-7337; Turowski et al.,（1995）J.Cell Biol.,129,397-410）。プール１に対応するＭonoＱ  ＦＰＬＣ画分（０．２７−０．３２Ｍ ＮaＣlの間のＤＥＡＥセファロースから溶出）により、３６ｋＤａ触媒（ＰＰ２Ａｃ）および６５ｋＤａ調節（ＰＲ６５）サブユニット、および５６から６１ｋＤａの範囲の見かけの分子量をもつ新規な型の可変調節サブユニットを含む三量体ＰＰ２Ａホロ酵素の存在が示された。Tung et al.（1985）Eur.J.Biochem.,148,253-263により以前に確立された分類法によると、この三量体ホロ酵素はＰＰ２Ａ0に相当する。
チオホスホリラーゼａ−セファロース精製段階後のプール２（０．３４および０．３８Ｍ ＮaＣlの間のＤＥＡＥセファロースから溶出された分画）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、この調製物は３６ｋＤａ触媒および６５ｋＤａ調節サブユニット、並びに５４−５５ｋＤａの範囲のいくつかのタンパク質を含むことが判る。さらに、ＭonoＱ ＦＰＬＣにより分画すると、５４および５５ｋＤａの２つのタンパク質からＰＰ２Ａ1（５５ｋＤａ調節サブユニットであるＰＲ５５を含む三量体）およびＰＰ２Ａ2（酵素のニ量体形）が分離される。これら２つのタンパク質はＰＲ５５には無関係であるようである。なぜなら、これらは抗−ＰＲ５５抗体と交差反応しないからである。この調製物中の遊離ＰＲ５５ａをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析により同定する（分画３７および３８）。これにより、同定されたＰＰ２Ａ2はおそらく複合体からのＰＲ５５、および、多分５４および５５ｋＤａタンパク質の解離により生じたことを示唆している。ＰＰ２Ａ1と同時精製される５４ｋＤａタンパク質はポリペプチド鎖終結因子活性をもつｅＲＦ１ファミリータンパク質のメンバーである
ＭonoＱ ＦＰＬＣクロマトグラフィーにより精製される５４および５５ｋＤａタンパク質を用いて、確立された方法により、タンパク質配列情報が得られる。５４ｋＤａタンパク質由来の３０アミノ酸を含む３つのトリプシンペプチドの配列が得られる：ペプチド３、ＹＦＤＥＩＳＱＤＴＧＫ、ペプチド９／１０、ＩＬＹＬＴＰＥＱＥＫ、およびペプチド２５／２６、Ｓ／ＧＦＧＧＩＧＧＩＬ。ＦＡＳＴＡプログラムを用いてこれらの配列を比較することにより、Saccharomyces cerevisiae ＳＵＰ４５遺伝子によりコードされた予想タンパク質配列に７６％相同性を示すことが判る。ＰＰ２Ａ1と同時精製されるこのタンパク質に対応するｃＤＮＡを、以下のように逆転写／ＰＣＲ法を用いて単離する。
一本鎖ｃＤＮＡを前述したようにヒト乳癌細胞系Ｔ４７Ｄから調製する（Healy et al.,（1991）Mol.Cell.Biol.,11,5767-5780）。ＨindIII制限部位（下線）を含む２つの変性オリゴヌクレオチドを合成する；センス５’−ＡＣＡＡＧＣＴＴＴＡＹＴＴＹＧＡＹＧＡＲＡＴＩＷＳＣ−ＡＲＧＡ−３’（これはアミノ酸配列ＹＦＤＥＩＳＱＤに対応）およびアンチセンス５’−ＡＣＡＡＧＣＴＴＴＴＹＴＣＹＴＧＹＴＣＩＧＧＩＧＴＩＡＲＲＴＡ−３’（これはアミノ酸ＹＬＴＰＥＱＥＫに対応）。ＡmpliＴaq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer）を用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物を、Sambrook et al.（1989）Molecular cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NYに記載のようにゲル精製し、pBluescript（Stratagene）のＨindIII部位にサブクローニングし、Sequenase2.0（USB）を用いてシークエンスする。ＰＣＲクローン１８は、酵母ＳＵＰ４５遺伝子産物と５７％同一性がある６２アミノ酸ポリペプチドをコードする１８８ｂｐの挿入断片を含み、次いで、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene)をスクリーニングするために使用する。Feinberg and Vogelstein（1983）Anal.Biochem,132,6-13のランダムプライマー法により、ＤＮＡを［α-32Ｐ］ｄＡＴＰを用いて約１０9cpm/μgの比活性となるように標識する。ｃＤＮＡライブラリースクリーニングを前記のように行う（Hendrix et al.1993a）。ヒトｅＲＦ３をコードするｃＤＮＡを、以下のＰＣＲオリゴヌクレオチド：センス５’ＡＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＴＴＴＣＡＧＡＡＣＣＴ３’（下線はHindIII部位）およびアンチセンス５’ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＣＧ３’（下線はＢamHI部位）を用いて上記のように調製した逆転写Ｔ４７Ｄ全ｃＤＮＡから増幅する。ＰＣＲ産物は、pBluescriptでサブクローニングし、上記のようにシークエンスする。
ヒト胎児脳ライブラリーから単離し、シークエンスにより解析した数個のクローンの中で、唯一、ＢＢＺ．ｅＲＦ−１−４ｂと呼ばれるものが、全長のオープンリーディングフレーム（１３１１ｂｐ）並びに２３１ｂｐの５’非翻訳領域および約２，２２ｋｂの３’-非翻訳領域を含む。このｃＤＮＡは、ＴＢ３−１ｃＤＮＡと同一である（Frolova et al.,1994）。相同タンパク質をコードするｃＤＮＡは、シロイナズナ（Quigley et al.、The EMBL data bank、Release 37）およびアフリカツメガエル（Tassan et al.,（1993）Mol.Cell.Biol.,13,2815-2821）においても同定されている。このｃＤＮＡによりコードされたタンパク質はｅＲＦ１である。配列を比較することにより、ｅＲＦ１タンパク質は種間で高度に保存されており、酵母とヒトタンパク質では６７．５％が同一性を示すことが判明している。
ヒトｅＲＦ１をコードするｍＲＮＡは広範に発現されている
異なるヒト組織から単離したポリ（Ａ）+ＲＮＡにおける、ヒトｅＲＦ１をコードする転写レベルを解析する。ランダムプライマー多重転写物により標識された完全なヒトｅＲＦ１ｃＤＮＡ（ＢＢＺ．ｅＲＦ１−４ｂ）に対応するプローブを用いて、確立された方法を用いてノーザンブロットにより約２、２．５および４ｋｂが検出される。ヒトｅＲＦ１をコードするｍＲＮＡは、広範に発現されているようであり、最も高い転写レベルは肺、骨格筋および胎盤組織に認められる。検出された３種類の転写物の中で、４ｋｂ種が全ての組織で発現レベルが高いことが分かる。ImageQant softwareによる定量により、２．５および２ｋｂクラスの転写物が、高分子量転写物よりも約２から４倍発現が低いことが示される。このｍＲＮＡ分布は、Ｃl１であるアフリカツメガエルｅＲＦ１相同体で報告されたものと異なり、ここでは、発現のパターンは、はるかに制限され、ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方共、肝臓には完全に存在しない（Tassan et al.,1993）。
ヒトｅＲＦ１は、酵母二重ハイブリッド法におけるＰＰ２Ａの触媒サブユニットと特異的に相互作用する
ＰＰ２ＡのどのサブユニットがヒトｅＲＦ１と会合するか、および、ｅＲＦ１に結合し、S.cerevisiaeおよびアフリカツメガエルにおけるポリペプチド鎖終結におけるその活性を刺激することが示されているｅＲＦ３が同じように相互作用の対象になり得るかを評定するために、Matchmaker（登録商標）二重ハイブリッド法（Clontech Laboratories,Inc.）を用いて、酵母二重ハイブリッド法（Fields and Song,1989）を行う。全長ヒトＰＰ２Ａｃα（Khew-Goodall et al.,（1991）Biochemistry,30,89-97）、ＰＲ６５α（Hemmings et al.,（1990）Biochemistry,29,3166-3173）、ＰＲ５５α（Mayer et al.,（1991）Biochemistry,30,3589-3597）、ｅＲＦ１およびｅＲＦ３をコードするｃＤＮＡを、それぞれ、ｐＧＢＴ９およびｐＧＡＤ４２４発現ベクターを用いて、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合および／またはトランス活性化ドメインを用いてフレーム内融合する。一連のＮおよびＣ末端欠失は、ＰＣＲを基本とした方法を用いてＰＰ２ＡｃおよびｅＲＦ１の両方について構築する。ヒトｅＲＦ１の３つのＮ末端（ｅＲＦ１51-437、ｅＲＦ１93-437およびｅＲＦ１150-437）および３つのＣ末端切断（ｅＲＦ１1-411、ｅＲＦ１1-381およびｅＲＦ１1-338）をコードするＰＣＲ産物を、ＧＡＬ４トランス活性化ドメインを用いてｐＧＡＤ４２４フレーム内にサブクローニングする。ＰＰ２Ａｃαの３つのＮ末端（ＰＰ２Ａｃ50-309、ＰＰ２Ａｃ100-309およびＰＰ２Ａｃ150-309）および３つのＣ末端（ＰＰ２Ａｃ1-259、ＰＰ２Ａｃ1-209およびＰＰ２Ａｃ1-159）切断をコードするＰＣＲ産物を、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを用いてｐＧＢＴ９フレーム内にサブクローニングする。野生型ＧＡＬ４タンパク質（ｐＣＬ１）、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ｐＴＤ１）、ｐ５３（ｐＶＡ３）およびラミンＣ（ｐＬＡＭ５’）をコードする対照プラスミド（後者３つは融合させて適当なＧＡＬ４ドメインとする）は、製造業者により提供され、対照の相互作用として使用する。発現構築物をS.cerevisiae宿主株ＳＦＹ５２６（lacＺレポーター遺伝子）およびＨＦ７ｃ（ｌａｃＺおよびＨＩＳ３レポーター遺伝子）に形質転換する。融合タンパク質の発現は、ロイシンおよびトリプトファンを欠失する選択的ＳＤ培地上での増殖に選択した２つの形質転換体で確認し、ＰＰ２ＡサブユニットとヒトｅＲＦ１およびｅＲＦ３との相互作用を２つの異なるレポーター遺伝子ｌａｃＺおよびＨＩＳ３の発現を監視することにより評価する。ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現は、基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド［Ｘ−Ｇal］およびＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド［ＯＮＰＧ］を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより決定し、一方、ＨＩＳ３レポーター遺伝子の発現は、ロイシン、トリプトファンおよびヒスチジンを欠失する３つの選択的ＳＤ培地上での増殖を監視することにより評価する。全ての培地および試薬は製造業者の指示に従って調製する。野生型ＧＡＬ４タンパク質により誘導、またはＳＶ４０ラージＴとｐ５３間の相互作用によりもたらされるレポーター遺伝子の転写活性化は、陽性対照として使用する。内因性転写活性化能力またはいずれかの分子の非関連タンパク質への非特異的結合を除外するために、空のベクターまたはＧＡＬ４の反対側のドメインに融合しているヒト��ラミンＣをコードするベクターを用いた同時形質転換を陰性対照として使用する。
これらの実験により、両方のレポーター系において、ヒトｅＲＦ１はｅＲＦ３に結合し、ＰＰ２Ａｃと直接、特異的に相互作用するが、ＰＲ６５またはＰＲ５５とは相互作用しないことが示される。なぜなら、フィルターβ−ガラクトシダーゼアッセイ（表１）により確認されたように、ＰＰ２Ａｃ／ｅＲＦ１二重形質転換体のみがβ−ガラクトシダーゼ陽性であり、増殖にヒスチジンを必要としないからである。この解析により、ｅＲＦ１に結合するＰＰ２Ａサブユニットは、それ自体触媒サブユニットであることが分かる。一方、ｅＲＦ３は興味深いことに、この系で試験した３つのＰＰ２Ａサブユニットのいずれにも結合しない。
ＰＰ２ＡｃおよびｅＲＦ１の相互作用に必要なドメインの同定
二重ハイブリッド法における全長タンパク質の相互作用の解析に加えて、この会合に必要なｅＲＦ１およびＰＰ２Ａｃ両方における領域を位置づける。この目的のために、一連の両方のタンパク質のＮおよびＣ末端切断断片を構築し、上記のように同じ実験方法で試験する。ＰＰ２Ａｃの３つのＣ末端欠失変異体（ＰＰ２Ａｃ1-259、ＰＰ２Ａｃ1-209およびＰＰ２Ａｃ1-159）全てが、ｅＲＦ１と相互作用できるが、どのＮ末端欠失変異体（ＰＰ２Ａｃ50-309、ＰＰ２Ａｃ100-309およびＰＰ２Ａｃ150-309）も相互作用できない。従って、ｅＲＦ１への結合に必要なＰＰ２Ａｃの領域は、タンパク質のＮ末端５０アミノ酸残基内に位置する。ＰＰ２ＡｃのＣ末端切断物が全長ｅＲＦ１に結合するのに相違が見られることから、タンパク質のＣ末端部分もこの相互作用に影響を与える配列を含むことが示唆される。ｅＲＦ１のＮ末端欠失変異体（ｅＲＦ１51-437、ｅＲＦ１93-437およびｅＲＦ１150-437）は、依然としてこの相互作用を保持し、ｅＲＦ１の３つのＣ末端欠失体（ｅＲＦ１1-411、ｅＲＦ１1-381およびｅＲＦ１1-338）の中、Ｔｈｒ338でタンパク質を切断した最大のものだけがＰＰ２Ａｃに結合できない。このことから、ｅＲＦ１上の推定結合ドメインは、Ｔｈｒ338およびＡｓｎ381の間に存在することが示される。しかし、これらの実験から定義した最小限のポリペプチド（ＰＰ２Ａｃ1-159およびｅＲＦ１1-381）でさえ、依然として、比較的わずかではあるが互いに相互作用できる。二重ハイブリッド法で試験した全相互作用の要約を、表１に示す。
0004033490.tif 000002
0004033490.tif 000003
ｅＲＦ１の免疫沈降物はＰＰ２Ａ活性を含む
ＰＰ２ＡとｅＲＦ１間の複合体形成が哺乳動物細胞で生じるかどうかを試験するために、これら２つのタンパク質が免疫共沈降するかどうかを決定する。同実験条件下におけるＰＰ２ＡｃおよびＰＲ６５間の会合は、陽性対照として使用する。ＣＯＳ−１細胞において一過性に発現させるために、ヒトｅＲＦ１、ｅＲＦ３およびＰＲ６５αをそれぞれのＮ末端で赤血球凝集素（ＨＡ）−エピトープで標識する。ＰＣＲにより、以下のオリゴヌクレオチド：センス５’−ＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＧＴ−３’およびアンチセンス５’−ＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＡＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧ−３’を用いて、ヒトｅＲＦ１ｃＤＮＡの翻訳領域の５’末端にＥcoＲＩ部位を、および３’末端にＸbaI部位を導入する。ＥcoＲＩ−Ｘbalフラグメントを哺乳動物発現ベクターｐＥＶ３Ｓにサブクローニングし（Strubin,M.et al.（1995）Cell,80,497-506）、ＨＡタグをタンパク質のＮ末端に付加する。ヒトｅＲＦ３をコードするＨindIII−ＢamＨＩフラグメントを、ｐＭＶベクターを通して通過させ、ＨＡタグをタンパク質のＮ末端に付加し、次いで、ＫpnＩ−ＳacＩフラグメントとしてｐＥＣＥ真核細胞発現ベクターにサブクローニングする。ＨＡ標識ヒトＰＲ６５αをコードするｐＲＣ／ＣＭＶ発現構築物を同じように構築する。
細胞をＤＥＡＥ−デキストラン法によりトランスフェクションし、１×ＴＢＳ（１５０ｍＭ ＮaＣl、５０ｍＭ Ｔris−ＨＣl ｐＨ７．４）中で４８−６０時間トランスフェクションさせた後回収する。全細胞を、０．１％２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニル−メチルスルホニルフルオライド、１ｍＭベンズアミジン−ＨＣl、０．１ｍＭ Ｎα−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン−ＨＣl、０．１ｍＭトシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、２μg/mlロイペプチン、２μg/mlアプロチニンおよび２μg/mlペプスタチンＡを含有する１×ＴＢＳ中で、ダウンス（Dounce）ホモジナイザーにおいて２０ストローク溶菌する。ホモジネートを４℃で１５分間１０，０００×ｇで遠心する。タンパク質標準物質としてウシ血清アルブミンを用いて、製造業者の指示に従って、Bio-Rad Bradford試薬を用いてタンパク質定量を行う。
新しく調製したＣＯＳ−１細胞抽出物を、１/２０用量のパンソルビン（Pansorbin）（Calbiochem）を用いて２回事前に洗浄する。溶菌緩衝液で３回洗浄したプロテインＡセファロース（Pharmacia Biotech Inc.）を、ＨＡタグに特異的な１２ＣＡ５モノクローナル抗体と共に一晩４℃でインキュベートし、ついで、溶菌緩衝液で徹底的に洗浄し、過剰の抗体を除去する。事前に洗浄した抽出物を、抗体で飽和させた一定量のプロテインＡセファロースに加え、４時間４℃で撹拌しながらインキューべートする。ペレット化ビーズを溶菌緩衝液中で３回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために１×ＳＤＳサンプル緩衝液中に、またはホスファターゼ活性測定のためにアッセイ緩衝液中に再び懸濁する（Shacter,E.（1984）Anal.Biochem.,138,416-420）。
ペプチド特異的抗血清の調整およびウエスタンブロット解析
ヒトｅＲＦ１に対する抗血清を、タンパク質のＣ末端に相当するペプチドＹＱＧＧＤＤＥＦＦＤＬＤＤＹ（アミノ酸４２４−４３７）を用いて免疫化することにより調製する。ペプチド合成およびグルタルアルデヒドを用いたキーホールリンペットヘモシアニンへのカップリング、および続くウサギの免疫化、並びにタンパク質移動およびウエスタンブロット解析を、Hendrix et al.（1993b）に記載のように行う。精製ホロ酵素のＰＰ２Ａサブユニットを検出するために使用した抗体は、ペプチド特異的ウサギポリクローナル抗血清：Ａｂ Ｃ1-20（ＰＰ２ＡｃのＮ末端ペプチドに対して）、Ａｂ ６５α177-196（ＰＲ６５の内部ペプチド、Turowski et al.,1995）、Ａｂ５５α1-19（ＰＲ５５αのＮ末端ペプチドに対して、Hendrix et al.,1993b）、およびＡｂ７２／１３０COOH（ＰＲ７２／１３０のＣ末端ペプチドに対して、Hendrix et al.,1993a）である。免疫沈降物中の特異的タンパク質を検出するために使用する抗体は：Ａｂ ｅＲＦ１424-437（ヒトｅＲＦ１のＣ末端ペプチドに対して）、Ａｂ Ｃ1-20およびＡｂ ６５177-196、並びにＨＡタグに特異的な１２ＣＡ５モノクローナル抗体である。Ａｂ ｅＲＦ１424-437および１２ＣＡ５では、ＩｇＧ画分を、Harlow and Lane（1988）Antibodies: A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH,NYに記載のプロテインＡ/セファロースビーズ（Pharmacia）上で精製し、他の抗体は粗抗血清として使用する。125Ｉ-コンジュゲートサル抗ウサギＩｇＧ（Amersham Corp.）を用いてオートラジオグラフィーで免疫検出を行う。一次抗体を１：１００に希釈し、二次抗体を遮断緩衝液中で１：１０００に希釈する。ブロットをホスホルメーガー（Phosphorlmager）に１２−２４時間あて、ImageQuant software（Molecular Dynamics）を用いて定量する。
Ｎ末端を赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープで標識したヒトｅＲＦ１、ｅＲＦ３またはＰＲ６５を用いて一過性にトランスフェクションさせたＣＯＳ−１細胞抽出物、並びに、偽性トランスフェクション細胞の抽出物を、抗ＨＡ標識モノクローナル抗体１２ＣＡ５を用いて免疫沈降させる。32Ｐ標識ペプチド（ＬＲＲＡＳＶＡ Ｖal6、Ａla7）を基質として用いて、トランスフェクションＣＯＳ−１細胞抽出物および免疫沈降物のＰＰ２Ａ活性を測定する。１０ｎＭオカダ酸の存在下および非存在下においてアッセイを行い、これは、ＰＰ１およびＰＰ２Ａ活性を区別するために典型的に使用される。これらの実験の結果により、抽出物のＰＰ２Ａ比活性は、全トランスフェクション細胞において同程度であり、ＨＡ標識ｅＲＦ１またはＰＲ６５でトランスフェクションした細胞の１２ＣＡ５免疫沈降物は、偽性トランスフェクション細胞の免疫沈降物と比較して、かなりのオカダ酸感受性ＰＰ２Ａ様ホスファターゼ活性を含むことが示される（表II）。ｅＲＦ１に関連した全細胞質のＰＰ２Ａ活性の量も定量する。ｅＲＦ１の免疫沈降物は、全細胞質ＰＰ２Ａ活性の約１％（０．４−１．６％の範囲）に低下するが、ＰＲ６５免疫沈降物の活性は約１０倍高い（表II）。ｅＲＦ３の免疫沈降物では、バックグラウンド以上に大きくＰＰ２Ａ活性は低下しない。この結果により、ＰＰ２ＡおよびｅＲＦ３のｅＲＦ３との相互作用は互いに排他的ではないことが示唆される。
0004033490.tif 000004
ＰＰ２Ａ活性を、ＨＡ標識ヒトｅＲＦ１、ｅＲＦ３またはＰＲ６５αで一過性にトランスフェクションさせたＣＯＳ−１細胞の抽出物および１２ＣＡ５免疫沈降物において測定する。ＰＰ２Ａ活性は、二重アッセイで１０ｎＭオカダ酸の存在下および非存在下、基質として32Ｐ標識合成ペプチド（ＬＲＲＡＳＶＡ）を用いて測定する。数値は、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。抽出物の比活性（Ｕ/mgタンパク質）は、偽性トランスフェクションおよびＨＡ−ＰＲ６５/ＨＡ−ｅＲＦ１／ＨＡ−ｅＲＦ３トランスフェクション細胞（約２．４Ｕ／mg）と同じである。偽性トランスフェクション細胞の免疫沈降物では、プロテインＡセファロース細胞への非特異的結合により低下したホスファターゼ活性の値は、０．１ｍＵ以下である。
ＰＰ２ＡｃおよびｅＲＦ１はインビボで哺乳動物細胞において会合している
どのＰＰ２Ａサブユニットが、ｅＲＦ１との複合体中に存在するかを決定するために、ＨＡ−ｅＲＦ１免疫沈降物について、ＰＰ２Ａの以下の異なるサブユニット（Ａｂ Ｃ1-20、Ａｂ６５177-196、Ａｂ５５α1-19およびＡｂ７２/１３０COOH）に特異的なウサギポリクローナル抗ペプチド抗体を用いてウエスタンブロットを行う。これらの実験により、ＰＰ２ＡｃはＨＡ−ｅＲＦ１−またはＨＡ−ＰＲ６５−トランスフェクション細胞由来の免疫沈降物からは検出できるが、偽性トランスフェクション細胞からは検出できない。ｅＲＦ１免疫沈降物中のＰＰ２Ａの他の確立された調節サブユニットの存在を調べたところ、ＰＲ５５またはＰＲ７２ではなくＰＲ６５が検出される。従って、ｅＲＦ１は、ＰＰ２ＡｃおよびＰＲ６５からなるＰＰ２Ａのコアニ量体と複合体を形成し、新規な三量複合体（これは他のＰＰ２Ａの複合体よりもはるかに豊富である）を形成すると結論づけられる。これらの結果は、哺乳動物細胞においてＰＰ２Ａ触媒サブユニットおよびｅＲＦ１タンパク質がインビボで会合している初めての証拠を提供する。
ＣＯＳ−１細胞におけるＨＡ標識ｅＲＦ１の発現は、ポリソームと会合したＰＰ２Ａの量を増加させる
分画した指数関数的に増加しているＣＯＳ−１細胞、並びに、ＨＡ標識ｅＲＦ１で一過性にトランスフェクションさせたＣＯＳ−１細胞における、ＰＰ２Ａ分布を調べる。これらの細胞由来のリボソーム（８０Ｓ）を、３８％スクロース・クッションを通して細胞遊離抽出物を高速遠心することにより得る。リボソーム（Ｓ６）およびサイトゾル（プロテインキナーゼＡの調節ＲIIサブユニット）タンパク質に特異的な抗体を用いて対照を作成し、うまく分離したかを評定する。ＰＰ２Ａ分布を、全細胞遊離抽出物、およびスクロースおよびリボソーム画分で解析する。基質として32Ｐ標識ペプチド（Kemptide Val6、Ala7）を用いてウエスタンブロットおよび活性測定により解析を行う。これらの実験により、非トランスフェクションＣＯＳ−１細胞では、ポリソームに存在するＰＰ２Ａは、全細胞質ＰＰ２Ａ活性（１−２％）に対して非常に少なく、これは、ウサギ網状赤血球溶菌液を用いて行った前の研究から推定したものと一致する。しかし、ｅＲＦ１の過剰発現は、ポリソームに存在するＰＰ２Ａの量を顕著に増加させ、このことは、ＰＰ２Ａｃに結合できる遊離ｅＲＦ１量を増加させることによりＰＰ２Ａをポリソームに補充できることを示唆している。活性測定のデータは、次いで、ＰＰ２ＡおよびｅＲＦ１のウエスタンブロット解析により確認され、これによると、ｅＲＦ１の過剰発現に続いてＣＯＳ−１細胞においてＰＰ２ＡｃおよびＰＲ６５が顕著に増加することが示されている。ｅＲＦ１抗体と交差反応性を示すゆっくりと移動するバンドは、ＨＡ標識形を表す。S.cerevisiae相同体Ｓｕｐ４５（Stansfield et al.,1992）に関する前報告とは対照的に、哺乳動物ｅＲＦ１は、ポリソーム画分にもっぱら存在するのではなく、むしろ、細胞質およびポリソーム画分間に均等に分布しており、このことは、哺乳動物細胞において４０Ｓサブユニットに比較的緩く付着していることを示唆し得る。
上記の分画ＣＯＳ−１細胞からの続く免疫沈降実験、次に活性測定およびイムノブロットにより、ＰＰ２Ａニ量体および会合したオカダ酸感受性ホスファターゼ活性が、ｅＲＦ１の免疫沈降画分に存在することが示され、このことにより、ポリソーム画分で検知された実際に増加したＰＰ２ＡはｅＲＦ１と会合していることが確認される。
ｅＲＦ１のポリペプチド鎖終結因子活性に対する異なる形のＰＰ２Ａの効果
当初、ＰＰ２Ａの基礎またはプロタミン刺激活性に対するｅＲＦ１の効果は全く観察されていなかったので、ｅＲＦ１のポリペプチド鎖終結因子活性に関するＰＰ２Ａの効果を調べる。従って、ｅＲＦ１により仲介されるｆ［35Ｓ］メチオニル-tＲＮＡfMet-ＡＵＧ−８０Ｓ基質複合体からのｆ［35Ｓ］メチオニンの停止コドン依存性放出を、インビボ終結アッセイにおいて測定する（Tate,W.P.and Caskey,C.T.（1990）in Spedding,G（編）, Ribosomes and Protein Synthesis.A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 88-100）。これらの実験は、見かけ上均一となるように精製した組換えヒト・ヒスチジン標識ｅＲＦ１（Ｈis−ｅＲＦ１）およびＧＳＴ標識ｅＲＦ３（ＧＳＴ−ｅＲＦ３）、並びにＰＰ２Ａｃ、ＰＰ２Ａ2およびＰＰ２Ａ1の精製調製物を用いて行う。Ｈｉｓ−ｅＲＦ１はそれ自体終結因子として活性であるが、等モル濃度の異なる形のＰＰ２Ａで処理しても、組換えタンパク質の活性には劇的な効果をもたらさない。S.cerevisiaeおよびアフリカツメガル相同体で以前報告したように、ＧＳＴ−ｅＲＦ３はｅＲＦ１終結因子活性を刺激することができる。異なるＰＰ２Ａ調製物は、Ｈｉｓ−ｅＲＦ１のｅＲＦ３刺激活性に対して全く有意な効果をもたらさない。さらに、ｅＲＦ１（ＭＱ１）を含む（Ａｂ ｅＲＦ１424-437を用いてウェスタンブロットアッセイにより確認）ＰＰ２ＡのMonoQ精製調製物の解離活性を試験する。この調製物に存在するｅＲＦ１は、組換えタンパク質よりも幾分低いが、終結アッセイでも活性がある。しかし、１０ｎＭオカダ酸（Sigma）の存在下における活性は非処理サンプルと大差はない。
ＰＰ２ＡおよびｅＲＦ１との相互作用をより理解するために、トランスフェクションＣＯＳ−１細胞のＨＡ−ｅＲＦ１の免疫沈降物における終結活性を測定する。データから、ｅＲＦ１の活性は、等量の組換えタンパク質と比較して極度に低い（＞５％）ことが示唆される。これらの免疫沈降物は、ＰＰ２ＡｃおよびＰＲ６５を含む。これらの結果により、少なくとも２つの可能性が示唆される：
（ａ）ｅＲＦ１免疫沈降物は、その活性を阻害する付加的タンパク質を含む（この場合、部分精製ｅＲＦ１は、この仮想阻害タンパク質を欠失しており、これによりその活性が説明される）、または（ｂ）１２ＣＡ５モノクローナル抗体を介してプロテインＡセファロースビーズに固定されたｅＲＦ１は、サイズ制限のため、リボソーム上の基質に接近できない。
合わせて考えると、これらの結果により、ｅＲＦ１活性、並びに、ＰＰ２Ａおよび／またはｅＲＦ３との会合との間の複雑な関係が示される。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：ノバルティス  アクチエンゲゼルシャフト
（Ｂ）通り：シュバルツバルトアレー
（Ｃ）市：バーゼル
（Ｅ）国籍：スイス連邦
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：４００２
（Ｇ）電話：＋４１  ６１  ６９６  １１  １１
（Ｈ）ファックス：＋４１  ６１  ６９６  ７９  ７６
（Ｉ）テレックス：９６２  ９９１
（ii）発明の名称：ホスファターゼモデュレーター
（iii）配列の数：２
（iv）コンピューター解読形式：
（Ａ）媒介型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ互換性
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0、Version #1.30（EPO）
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｖ）フラグメント型：Ｎ末端
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：結合部位
（Ｂ）存在位置：１．．５０
（Ｄ）他の情報：/ノート＝「ｅＲＦ１に対するＰＰ２Ａｃの結合部位」
（xi）配列の記載：配列番号１：
0004033490.tif 000005
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４４アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を表す記号：結合部位
（Ｂ）存在位置：１．．４４
（Ｄ）他の情報：/ノート＝「ＰＰ２Ａｃに対するｅＲＦ１の結合部位」
（xi）配列の記載：配列番号２：
0004033490.tif 000006