(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が所望の特性を獲得するために進化させる方法であって、以下の工程：
（１）異なる細胞の集団のプロトプラストを形成する工程；
（２）該プロトプラストを融合させてハイブリッドプロトプラストを形成する工程であって、該ハイブリッドプロトプラストにおいて、該プロトプラスト由来のゲノムが組み換わって、ハイブリッドゲノムを形成する、工程；
（３）細胞の再生を促進する条件下で該ハイブリッドプロトプラストをインキュベートする工程；
（４）前記所望の特性の獲得に向かって進化した、再生した細胞を単離するために選択またはスクリーニングする工程；
（５）工程（４）において再生した細胞を、工程（１）において該プロトプラストを形成するために使用して、再生した細胞が該所望の特性を獲得するまで、（１）〜（４）の工程を反復する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記異なる細胞が真菌細胞であり、そして前記再生した細胞が真菌菌糸体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞の第１の亜集団が第１のマーカーを含み、そして細胞の第２の亜集団が第２のマーカーを含む、請求項１に記載の方法であって、そして該方法が、該第１のマーカーおよび第２のマーカーの両方を発現する再生された細胞を同定するために選択またはスクリーニングする工程をさらに包含する、方法。
【請求項４】
少なくとも１回のサイクルにおいて、プロトプラストをDNAフラグメントのライブラリーで形質転換する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酵素を用いて菌糸体または胞子を処理することによって、プロトプラストが提供される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記所望の特性が、タンパク質または２次代謝産物の発現であるか、あるいはタンパク質または２次代謝産物の分泌である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１回のサイクルにおいて、前記プロトプラストを変異原性薬剤に曝露する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願への相互参照
本出願は、USSN 60/035,054（1997年１月17日出願）の優先権に由来し、その全体での全ての目的についての参照により援用される。
技術的分野
本発明は、細胞および生物のゲノムを進化させて新たな、そして改良された特性を得るために分子遺伝学の技術分野を適用する。
背景
細胞は、分子生物学における多くの確立された使用を有する。例えば、細胞は、形質転換および組換えのようなプロセスにおいてDNAを操作するための宿主として一般には使用される。細胞はまた、細胞中に形質転換されたDNAによりコードされる組換えタンパク質の発現に使用される。幾つかのタイプの細胞もまた、トランスジェニック動物およびトランスジェニック植物の産生のための前駆体として使用される。一般に、これら全てのプロセスは今や日常的なものだが、これらのプロセスで使用される細胞のゲノムは、天然の細胞のゲノムからほとんど進化しておらず、そして上記のプロセスにおける使用のための新たな、または改善された特性の獲得に向かっては特に進化していない。
人工的または強制的な分子進化への伝統的アプローチは、個別の表現型および選択可能な表現型を有する個々の遺伝子の最適化に集中する。このストラテジーは遺伝子をクローン化すること、その遺伝子の個別の機能およびその遺伝子が選択され得るアッセイを同定すること、その遺伝子の選択された部位を変異すること（例えば、エラープローンPCRまたはカセット突然変異誘発）、および遺伝子の公知である機能を改良するための遺伝子の改変体を選択することである。次いで、改良された機能を有する改変体は、所望のタイプの細胞で発現され得る。このアプローチは多くの制限を有する。第一に、単離されそして機能的に特徴づけられた遺伝子にのみ適用可能である。第二に、このアプローチは通常、個別の機能を有する遺伝子にのみ適用可能である。つまり、単一の表現型を協同的に付与する多数の遺伝子は、通常この様式では最適化され得ない。おそらくは、ほとんどの遺伝子は協同的な機能を有する。最後には、このアプローチは、単一の遺伝子についてでさえ、順列の総数のうちの極めて限定された数のみを探索し得る。例えば、あらゆる可能性のあるアミノ酸を有するタンパク質中の10部位での変化でさえも、2010個の改変体を産生し得、これは、トランスフェクションおよびスクリーニングの現存する方法により適応され得るよりも多い。
これらの制限を考慮すると、伝統的なアプローチは、細胞ゲノムを改良するには、多くの有用な性質において不適切である。例えば、組換えタンパク質を発現するための細胞の能力の改良は、とりわけ転写、翻訳、翻訳後の修飾、分泌またはタンパク質分解において役割を有する実質的な数の既知および未知の遺伝子のいくつかまたは全てにおける修飾を必要とする。このような機能を有する全ての公知の遺伝子の最適化する個々の試みでさえ、実際には不可能な課題であり、ましてや未だ理解されていない様式で発現に寄与し得る今まで未知の遺伝子を最適化させることはそうである。
本発明は、特に、従来の方法の困難性および制限性を克服する、細胞全体および生物のゲノムを進化させるための新規の方法を提供する。
定義
用語「コグネイト」は、進化的におよび機能的に種間で関連する遺伝子の配列を言う。例えばヒトゲノムでは、ヒトCD4遺伝子はマウスCD4遺伝子に対しコグネイト遺伝子である。なぜなら、これら２つの遺伝子の配列および構造が、これらが高度に相同であり、そして両方の遺伝子が、MHCクラスII拘束性の抗原認識によりT細胞活性化のシグナリングにおいて機能するタンパク質をコードすることを示すからである。
一般に、スクリーニングは、２工程のプロセスである。まず、いずれの細胞が、スクリーニングマーカーを発現するのか否かを決定し、次いで、所望の特性を有する細胞を物理的に分離する。選択は、スクリーニングの一つの形態である。ここで、同定および物理的な分離が、選択マーカーの発現によって同時に達成される。これにより、ある遺伝的環境下において、マーカーを発現する細胞が生き残るが、一方他の細胞は死滅することが可能になる（または逆も同じ）。スクリーニングマーカーは、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグリーン蛍光タンパク質を含む。選択マーカーは、薬物耐性遺伝子および毒素耐性遺伝子を含む。
外来性DNAセグメントは、細胞に対して異質（または異種）であるか、または細胞に対して同種であるが、そのエレメントが通常は見出されない、宿主細胞の核酸内に位置する。外来性DNAセグメントは発現されて、外来性ポリペプチドを生じ得る。
用語、遺伝子は、生物学機能に関連するDNAの任意のセグメントに言及するために、広く使用される。従って、遺伝子は、コード配列および／またはそれらの発現に必要とされる調節配列を含む。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質についての認識配列を形成する、発現されないDNAセグメントを含む。
配列同一性パーセントは、比較のウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較すること、一致した位置の数を得るために、両方の配列で同一の核酸塩基が存在する位置の数を測定すること、比較のウィンドウにおいて位置の総数によって一致した位置の数を除することによって計算される。比較ウィンドウを整列するための配列の最適な整列は、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるアルゴリズムGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTAのコンピューター化実行において行われ得る。
用語、天然に存在する、は天然に見出され得る物質を記載するために使用される。例えば、天然の供給源から単離され得、そして実験室においてヒトによって意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が天然に存在する。一般に、用語、天然に存在するは、非病理学性（病気ではない）個体（それは、種にとって代表的である）に存在する物質をいう。
無性組換えは、接合体を形成するための配偶子の融合なしで生じる組換えである。
発明の要旨
１つの局面において、本発明は所望の機能を獲得する細胞を進化させる方法を提供する。このような方法は、DNAフラグメントのライブラリーを細胞の大多数へ導入することを必要とし、それにより少なくともフラグメントの１つがゲノム中のセグメントまたは細胞のエピソームとの組換えを受け、改変された細胞を産生する。次いで、改変された細胞は、所望の機能の獲得に向かって進化した改変された細胞についてスクリーニングされる。次いで、所望の機能に向かって進化した、改変された細胞由来のDNAは、DNAフラグメントのさらなるライブラリーと組み換えられ、少なくともこれらの１つは改変された細胞のゲノムまたはエピソームのセグメントとの組換えを受け、さらに改変された細胞を産生する。次いで、さらに改変された細胞は、所望の機能の獲得に向かってさらに進化した、さらに改変された細胞のために、さらに改変された細胞についてスクリーニングされる。組換えおよびスクリーニング／選択の工程は、さらに改変された細胞が所望の機能を獲得するまで、必要なだけ繰り返される。
いくつかの方法では、DNAフラグメントのライブラリーまたはさらなるライブラリーは、ゲノムのセグメントによる組換えを刺激するためにrecAタンパク質でコートされる。いくつかの方法では、フラグメントのライブラリーは一本鎖DNAを産生するために変性され、一本鎖DNAは二重鎖（そのいくつかは、フラグメントの改変部位でのミスマッチを含む）を産生するためにアニール化され、そしてミスマッチを含む二重鎖は、固定化したMutSに対するアフィニティークロマトグラフィーにより選択される。
いくつかの方法では、所望の機能はタンパク質の分泌であり、そして複数の細胞がタンパク質をコードする構築物をさらに含む。必要に応じて、タンパク質は分泌されなければ複数の細胞に対して毒性であり、そして所望の機能の獲得に向かって進化した改変された細胞またはさらに改変された細胞は、細胞を増殖させ、そして生存する細胞を回収することによりスクリーニングされる。
いくつかの方法では、所望の機能は、増強された組換えである。このような方法では、フラグメントのライブラリーは、しばしば組換えの能力を集合的に付与する遺伝子のクラスターを含む。スクリーニングは、マーカー（この発現は、組換えによって除去し得る変異体により阻止される）をコードする遺伝子をさらに含む細胞を使用して達成され得る。細胞は、組換えによる変異の除去から生じるマーカーの発現によりスクリーニングされる。
いくつかの方法では、複数の細胞が植物細胞であり、そして所望の特性は化学物質または微生物に対する改善された耐性であり、そしてスクリーニングの工程では、改変されたまたはさらに改変された細胞が、化学物質または微生物に曝露され、そして所望の機能の獲得に向かって進化し、改変されたまたはさらに改変された細胞は、曝露を生存するためのそれらの能力により選択される。
いくかの方法では、複数の細胞が動物の胚細胞であり、そしてこの方法は形質転換された細胞をトランスジェニック動物へと増殖させることをさらに含む。
本発明は、インビボでの組換えを行うための方法をさらに提供する。これらの方法は、細胞中隔形成遺伝子を発現し得ない細胞を提供することを必要とする。少なくとも１つの遺伝子に由来する少なくとも第１および第２のセグメントは、細胞に導入され、ここでセグメントは少なくとも２つのヌクレオチドではお互いに異なるので、セグメントは組み換わってキメラ遺伝子のライブラリーを生成する。キメラ遺伝子は、所望の機能を獲得したライブラリーから選択される。
本発明は、ウイルス感染の処置における薬物の効力を予測する方法をさらに提供する。このような方法は、組換え核酸セグメントのライブラリーを作製するために、ウイルス由来（このウイルスの感染は薬物により阻止される）の核酸セグメントの、ウイルス由来の少なくとも第２の核酸セグメント（この第二の核酸セグメントは、少なくとも２つのヌクレオチドにおいて、上記の核酸セグメントと異なる）での組換えを生じる。次いで、宿主細胞は、薬物を含む培地中の組換え核酸セグメントを含むゲノムを有するウイルスの集団に接触され、そして宿主細胞の感染から得られた子孫ウイルスが回収される。
最初の子孫ウイルス由来の組換えDNAセグメントは、第２の子孫ウイルス由来の少なくとも１つの組換えDNAセグメントと組み換わり、組換え核酸セグメントのさらなるライブラリーを生成する。宿主細胞は、薬物を含む培地中の、さらなるライブラリーまたは組換え核酸セグメントを含むゲノムを有するウイルスの集団と接触され、そしてさらなる子孫ウイルスが宿主細胞により産生される。組換えおよび選択の工程は、さらなる子孫ウイルスが薬物に対する所望される耐性の程度を獲得するまで必要なだけ繰り返され、これにより獲得される耐性の度合いおよび獲得するために必要とされる繰り返しの数が、ウイルスの処置における薬物の効力の尺度を提供する。
本発明は、病原性の微生物による感染の処置における、薬物の効力を予測する方法をさらに提供する。これらの方法は、微生物の複数の細胞のDNAフラグメントのライブラリーでの形質転換を必要とし、ここで、そのフラグメントの少なくともいくつかは、細胞のゲノムのセグメントとの組換えを受け、改変された微生物細胞を生成する。改変された微生物は、薬物を含む培地中で増殖され、そして生存する微生物が回収される。生存する微生物由来のDNAは、DNAフラグメントのさらなるライブラリーと組み換えられ、ここで、フラグメントの少なくともいくつかは、さらに改変された微生物細胞を作製するために、生存する微生物由来のDNAのコグネイトセグメントと組換えられる。さらに改変された微生物は、薬物を含む培地中で増殖され、そしてさらなる生存する微生物が、収集される。組換えおよび選択の工程は、さらなる生存する微生物が薬物に対する所望の程度の耐性を獲得するまで必要なだけ繰り返され、これにより獲得される耐性の程度および獲得するために必要とされる繰り返しの数が、病原性微生物の殺傷における薬物の効力の尺度を提供する。
本発明は、所望の機能を獲得するために細胞を進化させる方法をさらに提供する。これらの方法は、異なる細胞の集団の提供を必要とする。細胞は以下の条件で培養され、これによりDNAが細胞間で交換され、ハイブリッドゲノムを有する細胞を形成する。次いで、細胞は、所望の特性の獲得に向かって進化した細胞についてスクリーニングまたは選択される。DNAの交換およびスクリーニング／選択の工程は、次のサイクルにおいて異なる細胞の集団を形成する１つのサイクルに由来するスクリーニングされた／選択された細胞を用いて、細胞が所望の特性を獲得するまで必要なだけ繰り返される。
DNA交換の機構は、接合、ファージ媒介形質導入、プロトプラスト融合、および細胞の有性組換えを含む。必要に応じて、DNAフラグメントのライブラリーは、細胞へ形質転換され得る。
言及したように、所望の特性を獲得するために細胞を進化させる方法は、細胞間でのプロトプラスト媒介によるDNAの交換により果たされる。このような方法は、異なる細胞の集団のプロトプラストを形成することが必要である。次いで、プロトプラストはハイブリッドプロトプラストを形成するために融合され、この中で、プロトプラストに由来するゲノムが組み換わって、ハイブリッドのゲノムを形成する。ハイブリッドのプロトプラストは、細胞の再生成を促進させる条件下でインキュベートされる。次の工程は、所望の特性の獲得に向かって進化した、単離されて再生成された細胞の選択またはスクリーニングである。DNAの交換および選択／スクリーニングの工程は、次のサイクルでプロトプラストを形成するために使用される、１つのサイクルで再生された細胞を用いて、再生された細胞が所望の特性を獲得するまで、必要なだけ繰り返される。真菌類は、上記の方法を行うために好ましい生物である。いくつかの方法は、親細胞の非融合プロトプラストを含まない融合したプロトプラストの選択またはスクリーニングの工程をさらに含む。いくつかの方法は、親ゲノムを有する細胞を含まないハイブリッドゲノムと融合したプロトプラストの選択またはスクリーニングの工程をさらに含む。いくつかの方法では、親のゲノムを有する細胞を含まないハイブリッドのゲノムと融合したプロトプラストの選択またはスクリーングの工程をさらに含む。いくつかの方法では、プロトプラストは、細胞壁を分解する酵素で菌糸体または胞子を処置することにより提供される。いくつかの方法では、真菌類は、貧弱な株であり、インタクトな細胞壁の合成の能力が欠失し、そしてプロトプラストが自発的に形成する。いくつかの方法では、プロトプラストは、プロトプラストを生成するための細胞壁形成の阻害剤で菌糸体を処置することにより形成される。
いくつかの方法では、所望の性質は、タンパク質または二次代謝物（例えば、タキソール）の発現および／または分泌である。いくつかの他の方法では、所望の特性は、別の株と異核共存体を形成するための適合性である。
本発明は、所望の性質の獲得に向かって細胞を進化させる方法をさらに提供する。これらの方法は、これらの異なる細胞の集団の提供を必要とする。DNAは、異なる細胞の第１の亜集団から単離され、そしてリポソーム中に包理される。プロトプラストは異なる細胞の第２の亜集団から形成される。リポソームはプロトプラストと融合され、これによりリポソーム由来のDNAはプロトプラストにより吸収され、そしてプロトプラストのゲノムと組み換わる。プロトプラストは再生条件下でインキュベートされる。次いで、再生しているまたは再生された細胞は、所望の特性に向かう進化について選択またはスクリーニングされる。次いで、この方法は、あるサイクルでの所望の特性に向けて進化し、次のサイクルで異なる細胞群を形成する細胞を用いて繰り返される。
本発明は、人工染色体を使用して、所望の特性の獲得に向かって細胞を進化させる方法をさらに提供する。このような方法は、人工染色体中へクローン化されたDNAフラグメントライブラリーの細胞の集団中への導入を必要とする。次いで、細胞は、有性組換えが細胞間で生じるような条件下で培養され、そして人工染色体の中にクローン化されたDNAフラグメントは、細胞の集団の内在性染色体の対応するセグメントと相同的に組み換わり、そして内在性染色体は、互いに組み換わる。次いで、所望の特性の獲得に向けて進化した細胞は、選択またはスクリーニングされる。
本発明は、所望の特性の獲得のために、人工染色体へクローン化されたDNAセグメントを進化させる方法をさらに提供する。これらの方法は、セグメント改変体（各改変体は人工染色体の別々のコピーへクローン化される）のライブラリーの提供を必要とする。人工染色体のコピーは細胞集団の中に導入される。細胞は有性組換えが細胞間で生じ、そして相同組換えが改変体を保有する人工染色体のコピー間で生じるような条件下で培養される。次いで、改変体は、所望の性質の獲得に向かって進化について、スクリーニングまたは選択される。
本発明は、高組換え形成性recAタンパク質をさらに提供する。このようなタンパク質クローン物の例は、図13で示される２、４、５、６、および13である。
【図面の簡単な説明】
図１：遺伝子のインビトロシャッフリングについてのスキーム。
図２：MutSを使用したミスマッチ配列の富化についてのスキーム。
図３：MutSを使用したミスマッチ配列の富化についての代替スキーム。
図４：より大きい魚を産生させる成長ホルモン遺伝子の進化についてのスキーム。
図５：プロトプラスト融合によるシャッフリングについてのスキーム。
図６：有性生殖が予め不能である真菌類への生殖周期の導入についてのスキーム。
図７：プロトプラスト融合による真菌のシャッフリングについての一般的なスキーム。
図８：細胞壁形成を担う酵素のインヒビターの使用により産生されるプロトプラストでの、プロトプラスト融合による真菌のシャッフリング。
図９：プロトプラストを自発的に形成する細胞壁合成が不在である真菌株を使用するプロトプラスト融合物による真菌のシャッフリング。
図１０：Saccharomyces cerevisiaeおよび関連生物のYAC媒介性全ゲノムシャッフリング。
図１１：大きなDNAフラグメントのYAC媒介性シャッフリング。
図１２：（A、B、CおよびD）野生型recAタンパク質（新たなMinshallと称される）およびその５つの高組換え形成性（hyperrecombinogenic）改変体のDNA配列。
図１３：野生型recAタンパク質およびその５つの高組換え形成性改変体のアミノ酸配列。
発明の詳細な説明
Ｉ．一般
A．基礎のアプローチ
本発明は、再帰的配列組換えにより、新しいまたは改良された特性を獲得するための細胞を人工的に進化させるための方法を提供する。簡潔には、再帰的配列組換えは、分子の多様性を生じるための組換えおよびスクリーニング/選択の連続するサイクルを伴う。すなわち、変異の存在における差異を除いて、互いに実質的な配列および／または構造的な同一性を示す核酸分子のファミリーを作製する。各々の組換えサイクルに引き続いて、少なくとも１サイクルの所望の特徴を有する分子のスクリーニングまたは選択が行われる。１回目に選択される分子は、次の回で多様性を生じるための開始物質を形成する。
進化される細胞は、細菌、古細菌、または真核生物細胞であり、そして同種の細胞株または混合培養物を構成し得る。進化のために適切な細胞は、遺伝子工学およびタンパク発現に通常使用される細菌および真核生物細胞株を含む。適切な哺乳動物細胞は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類、およびヒト由来の細胞株および初代培養物を含む。そのような細胞は、胚幹細胞および造血幹細胞を含む幹細胞、接合子、線維芽細胞、リンパ球、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、マウス線維芽細胞（NIH3T3）、腎臓、肝臓、筋肉、および皮膚細胞を含む。目的の他の真核生物細胞は、トウモロコシ、コメ、コムギ、ワタ、ダイズ、サトウキビ、タバコ、およびシロイヌナズナを含む植物細胞；サカナ、藻類、真菌（penicillium、aspergillus、podospora、neurospora、saccharomyces）、昆虫（例えば、baculo lepidoptera）、酵母（picchiaおよびsaccharomyces、Schizosaccharomyces pombe）を含む。グラム陰性およびグラム陽性の両方の多くの細菌細胞型、例えば、Bacillus subtilis、B. licehniformis、B. cereus、Escherichia coli、Pseudomonas、Salmonella、actinomycetesおよびErwinia、もまた目的のものである。E. coliおよびBacillus subtilisの完成ゲノム配列は、Blattnerら、Science 277:1454〜1462（1997）；Kunstら、Nature 390:249-256（1997）により記載される。
進化は、改変体細胞の集団を生じることにより開始する。典型的には、集団内の細胞は同型であるが、前駆細胞の改変体を表す。いくつかの例において、変異は、異なる細胞が、種内の異なる個体から、または異なる種から得られる場合に天然に生じる。他の例において、改変は、前駆細胞の突然変異誘発により誘導される。突然変異誘発は、細胞を変異原性因子に供することにより、または細胞がミューテーター細胞である（例えば、変異の誘発に好都合であるDNA複製、組換え、および/または修復に関与する遺伝子における変異を有する）場合は単にミューテーター細胞を増殖することによりもたらされ得る。ミューテーター細胞は、単一の表現型変化の連続的選択（例えば、リファンピシン耐性の獲得、次いでナリジクス耐性、次いでLac-からlac+（Maoら、J. Bacteriol. 179:417-422（1997）を参照））により生じられ得る。
他の例において、改変は、細胞へのDNAフラグメントのライブラリーの移入の結果である（例えば、結合、形質変換、形質導入、または天然の能力（natural competent）による）。ライブラリーの少なくとも１つおよび通常は多数のフラグメントは、細胞内において相同組換えが生じるのを可能にするのに十分である、コグネイトまたは対立遺伝子との、完全ではないがいくらかの配列または構造的同一性を示す。フラグメントのライブラリーは、１つ以上の供給源に由来し得る。フラグメントの１つの供給源は、トランスフェクトされる細胞とは異なる種、細胞型、生物、または個体由来のフラグメントのゲノムライブラリーである。この状況において、ライブラリー中の多数のフラグメントは、形質転換される細胞内のコグネイトまたは対立遺伝子（しかし、天然に存在する種の改変、多型、および変異の存在に起因して、その遺伝子とは異なる）を有する。あるいは、ライブラリーは、放射線、誤差を含むPCR、ミューテーター生物における増殖、またはカセット突然変異誘発のような従来の方法により、DNAを誘導される変異に供した後に形質転換されているものと同様の細胞型からのDNAに由来し得る。これらの状況のどちらにおいても、ゲノムライブラリーは、例えば、選択される染色体に由来する完全なゲノムライブラリーもしくはサブゲノムライブラリー、または細胞内の染色体の一部分もしくはエピソームエレメントであり得る。DNAフラグメントのこれらの供給源と同様に、またはその代わりに、ライブラリーは、既知の機能を有する天然または選択された遺伝子の改変型を表すフラグメントを含み得る（すなわち、フォーカス（focused）ライブラリー）。
ライブラリー内のフラグメントの数は、単一フラグメントから約1010まで変化し得るが、ライブラリーは通常103から108フラグメントを有する。フラグメントは、相同遺伝子組換えを受け得るのに十分な長さであり、そして細胞に導入され得るのに、およびもし必要であれば導入前に操作をするのに十分に短くなくてはならない。フラグメントの大きさは、10bから1000kbまでの範囲であり得、500〜10,000塩基の大きさが通常である。フラグメントは、二本鎖または一本鎖であり得る。
フラグメントは、全ゲノムとして、またはウイルス、プラズミド、YACS、HAC、もしくはBACの成分として細胞内に導入され得るか、あるいはフラグメント自体として導入され得、この場合、全てまたはほとんどのフラグメントが複製起点を欠損している。一本鎖ゲノムを有するウイルスフラグメントの使用は、組換えを促進する一本鎖形態でフラグメントを送達する利点を提供する。フラグメントはまた、導入前に選択マーカーに結合され得る。複製起点を有するベクター内へのフラグメントの封入は、細胞への導入後により長い期間を与え、ここでフラグメントは、細胞に対して分解または選択され、そして細胞から欠失される前に、コグネイト遺伝子での組換えを受け得、それによって組換えゲノムを有する細胞の割合を増加する。必要に応じて、ベクターは、単離DNAフラグメントより長く存在し得るが、細胞株における永続的な保持は可能ではない、自殺ベクターである。そのようなベクターは、ベクターを保有する細胞のスクリーニングまたは選択に十分な時間、一時的にマーカーを発現し得るが、次いで分解されるかまたはその他の様式でマーカーを発現し得なくされる。このようなベクターの使用は、以下に議論される引き続く回の組換えを行う際には有益であり得る。例えば、いくつかの自殺ベクターは、同じベクターから発現される短命（short-lived）分子によって中和される長命（long-lived）毒素を発現する。毒素単独の発現は、ベクターが確立されるのを可能にしない。JenseおよびGerdes、Mol. Microbiol. 17:205〜210（1995）；Bernardら、Gene 162:159〜160。あるいは、ベクターは、欠損する複製起点の取り込み（すなわち、温度感受性）、または複製起点の脱落により自殺型にされ得る。ベクターはまた、酵母におけるoraBまたは多数の細菌におけるsacBのような負の選択マーカーの封入によって自殺型にされ得る。これらの遺伝子は、特異的化合物の存在下にのみ毒性になる。そのようなベクターは、広範な安定性を有するように選択され得る。
細胞への導入後、フラグメントは、相同、非相同、または部位特異的組換えによって、ゲノムまたは細胞のエピソーム内に存在するDNAと組換えし得る。本目的のために、相同組換えは、細胞の進化に最も有為に貢献する。なぜなら、この形態の遺伝子組換えは、トランスフェクトされる細胞のDNAとDNAフラグメントとの間に存在する多様性を増幅するからである。例えば、トランスフェクトされるDNAフラグメントが２つの位置においてコグネートまたは対立遺伝子と異なる場合、４つの組換え産物が可能であり，そしてこれらの組換え産物の各々は、形質転換集団中の異なる細胞において形成され得る。従って、フラグメントの相同組換えは、この遺伝子中の開始時の多様性を倍加する。多数のフラグメントが対応するコグネイトまたは対立遺伝子と組換えをする場合、開始産物に関する組換え産物の多様性は、フラグメントの数と指数関数的に増加する。組換えは、改変されたゲノムおよび/またはエピソームを有する改変された細胞を生じる。
天然の改変、突然変異誘発、または組換えのいずれの結果でも、改変細胞は、新しいまたは改良された特性の獲得に向けて進化した細胞のサブセットを同定するためにスクリーニングまたは選択される。スクリーニングの本質は、当然のことながら特性に依存し、いくつかの実施例が以下で考察される。必要に応じて、スクリーニングは、引き続くサイクルの組換えを実施する前に反復される。ストリンジェンシーは、スクリーニングの反復サイクルにおいて増加され得る。
スクリーニングを通過した細胞の亜集団は、さらなる回の組換えに供される。いくつかの場合において、さらなる回の組換えは、細胞間のDNAの交換を可能にする条件下で細胞を増殖することによってもたらされる。例えば、プロトプラストが、細胞から形成され、融合され、そして組換えゲノムを有する細胞は、融合したプロトプラストから増殖される。あるいは、DNAの交換は、電場における細胞の増殖によって促進され得る。接合性移入装置を有する細胞について、DNAの交換は、単に細胞を増殖することにより促進され得る。
他の方法において、さらなる回の組換えは、スプリット（split）およびプールアプローチによって行われる。すなわち、生存細胞を、２つのプールに分割する。DNAを、１つのプールから単離して、そして必要であれば増幅し、次いでもう一方のプールに形質転換する。従って、第１のプールからのDNAフラグメントは、フラグメントのさらなるライブラリーを構成し、そしてさらなる多様性を生じる第２のプール内のコグネイトフラグメントと組換える。
他の方法において、スクリーニングを通過した細胞のいくつかまたは全てが、新しいDNAフラグメントのライブラリーでトランスフェクトされ、これは、組換えの第１の回に使用したライブラリーと同一または異なり得る。この状況において、新しいライブラリーの遺伝子は、生存細胞内のコグネイト遺伝子での組換えを受ける。遺伝子がベクターの成分として導入される場合、このベクターの、前回のトランスフェクションにおいて使用された任意のベクターとの適合性が考慮されるべきである。前回に使用されるベクターが自殺ベクターである場合、不適合性の問題は存在しない。しかしながら、前回に使用したベクターが自殺ベクターでない場合、異なる不適合起源を有するベクターが、引き続く回において使用されるべきである。これらの形式のすべてにおいて、さらなる組換えは、細胞のDNA成分におけるさらなる多様性を生じ、さらなる改変された細胞を生じる。
さらに改変された細胞は、初回と同様の原理に従って、別の回のスクリーニング/選択に供される。スクリーニング/選択は、特性の獲得に向けてさらに進化したさらに改変された細胞の亜集団を同定する。細胞のこの亜集団は、同様の原理に従うさらなる回の組換えおよびスクリーニングに供され得、必要に応じて各回にてスクリーニングのストリンジェンシーは増加される。結局、所望の特性を獲得した細胞が同定される。
B．変異
１．recAタンパク質でのフラグメントのコーティング
ライブラリーフラグメントとコグネイト内因性遺伝子間の相同遺伝子組換えの頻度は、細胞への導入前にレコンビノジェニックタンパク質（recombinogenic）でフラグメントをコーティングすることにより増加し得る。Patiら、Molecular Biology of Cancer 1、1（1996）；SenaおよびZarling、Nature Genetics 3、365（1996）；Revetら、J. Mol. Biol. 232、779〜791（1993）；KowalczkowskiおよびZarling Gene Targeting（CRC 1995）、Ch.7. 「レコンビノジェニックタンパク質は、相同対合および/または鎖交換促進を促進するを参照。最も特徴的recAタンパク質は、E. coli由来であり、そしてPharmacia（Piscateway、NJ）により入手可能である。野生型タンパク質に加えて、多くの変異recA様タンパク質が同定されている（例えば、recA803）。さらに、多くの生物が鎖移入活性を有するrecA様レコンビナーゼを有する（例えば、Ogawaら、Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 18、567〜576（1993）；Johnson ＆ Symington、Mol. Cell. Biol. 15、4843〜4850（1995）；Fugisawaら、Nocl. Acids Res. 13、7473（1985）；Hsiehら、Cell 44、885（1986）；Hsiehら、J. Biol. Chem. 264:5089（1989）；Fishelら、Proc. Natl, Acad. Sci. USA 85、3683（1988）；Cassutoら、Mol. Gen. Genet. 208、10（1987）；Ganeaら、Mol. Cell Biol. 7、3124（1987）；Mooreら、J. Biol. Chem. 19、11108（1990）；Keeneら、Nucl. Acids Res. 12、3057（1984）；Kimiec、Cold Spring Harbor Symp. 48、675（1984）；Kimeic、Cell 44、545（1986）；Kolodnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84、5560（1987）；Suginoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85、3683（1985）；Halbrookら、J. Biol. Chem. 264、21403（1989）；Eisenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7481（1988）；McCarthyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5854（1988）；Lowenhauptら、J. Biol. Chem. 264:20568（1989））。そのようなレコンビナーゼタンパク質の例は、recA、recA803、uvsX（Roca、A.I.、Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol.25、415（1990））、sep1（Kolodnerら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）84、5560（1987）；Tishkoffら、Molec. cell. Biol. 11:2593）、RuvC（Dunderdaleら、Nature 354:506（1991））、DST2、KEM1、XRN1（Dykstraら、Molec. Cell. Biol. 11、2583（1991））、STPα/DST1（Clarkら、Molec. Cell. Biol. 11、2576（1991））、HPP−1（Mooreら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88、9067（1991））、他の真核生物細胞レコンビナーゼ（Bishopら、Cell 69、439（1992）；Shinoharaら、Cell 69:457）を含む。
recAタンパク質は、一本鎖DNAをコートするときに核タンパク質フィラメントを形成する。この核タンパク質フィラメントにおいて、recAタンパク質の１つのモノマーは、約３ヌクレオチドと結合している。特定の配列（例えば、核形成配列）がポリヌクレオチド上へのrecAの最初のローディングを好都合にするが、一本鎖DNAをコートするrecAのこの特性は、本質的には配列非依存性である。核タンパク質フィラメントは、シャッフルされる本質的に任意のもの上において形成され得、そして原核生物細胞および真核生物細胞において一本鎖DNAおよび二重鎖DNAの両方と複合体を形成し得る。
recAまたは他のレコンビナーゼと接触する前に、フラグメントは、しばしば、例えば熱処理により変性される。次いで、recAタンパク質は、約1〜10μMの濃度で添加される。インキュベーション後、recAコーティング一本鎖DNAは、化学的形質転換またはエレクトロポレーションのような従来の方法によりレシピエント細胞内に導入される。フラグメントは、コグネイト内因性遺伝子との相同組換えを受ける。レコンビナーゼコーティングに起因する組換えの頻度の増加のために、フラグメントはベクターの成分として導入される必要はない。
フラグメントは、時に、組換えを促進するか、核酸を分解から保護するか、または核に核酸を標的化するタンパク質と結合する他の核酸でコートされる。そのようなタンパク質の例は、Agrobacterium virE2を含む（Durrenbergerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86、9154-9158（1989））。
２．MutS  選択法
E. coliミスマッチ修復タンパク質MutSは、少なくとも１つのミスマッチの塩基を含む二本鎖DNAのフラグメントを富化するためにアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用され得る。MutSタンパク質は、ミスマッチの点付近に、個々の鎖により形成されるバブルを認識する。例えば、HsuおよびChang、WO 9320233を参照のこと。部分的ミスマッチの二重鎖を富化するアフィニティーの方策は、フラグメントの入来（incoming）ライブラリーとレシピエント細胞内の対応するコグネイトまたは対立遺伝子間の多様性を増加するために、本方法に取り入れられ得る。
図２は、MutSが多様性を増加するために使用される１つの図を示す。富化のためのDNA基質は、実質的には互いに類似であるが、いくつかの部位にて異なる。例えば、DNA基質は、多型に起因する差異を有する異なる個体からの完全または部分ゲノム（例えば、染色体ライブラリー）を表し得る。基質はまた、野生型配列の誘導変異体を表し得る。DNA基質はプールされ、制限消化され、そして一本鎖DNAのフラグメントを提供するように変性される。次いで、一本鎖DNAは、再アニーリルされる。いくつかの一本鎖フラグメントは、完全にミスマッチの相補鎖と再アニールし、完全にミスマッチの二重鎖を生じる。他の一本鎖フラグメントはアニールし、ミスマッチ二重鎖を生じる。ミスマッチ二重鎖は、MutSクロマトグラフィーにより完全にマッチの二重鎖から富化される（例えば、MutSをビーズに固定化する）。クロマトグラフィーにより回収されるミスマッチ二重鎖は、上記のようにコグネイト内因性遺伝子との組換えのためにレシピエント細胞内に導入される。MutSアフィニティークロマトグラフィーは、互いに異なるフラグメントおよびコグネイト内因性遺伝子の割合を増加する。従って、入来フラグメントと内因性遺伝子との間の組換えは、より大きな多様性を生じる。
図３は、MutS富化のための第２の方策を示す。この方策において、MutS富化のための基質は、比較的短いセグメント（例えば、遺伝子または遺伝子のクラスター）の改変体を表し、ここでほとんどの異なる改変体は、単一のヌクレオチドのみで異なる。MutS富化の目標は、天然に存在する配列より多くのそれぞれ由来の改変体を含む組換えのための基質を提供することである。このことは、重複フラグメントを生じるために基質をランダムにフラグメント化することにより達成される。第１の方策と同様に、フラグメントは変性され、そして再アニールされる。再アニールは、MutSアフィニティークロマトグラフィーにより完全にマッチの二重鎖から分離され得るいくつかのミスマッチ二重鎖を生じる。先と同様に、MutSクロマトグラフィーは、少なくとも単一のミスマッチを保有する二重鎖を富化する。次いで、ミスマッチ二重鎖は、より長いフラグメントに再アセンブリされる。これは、変性、再アニール、および部分的にアニールされた二重鎖の鎖伸長のサイクルにより達成される（Ｖ項を参照）。数回のそのようなサイクルの後、元々の基質と同じ長さのフラグメントが達成される（これらのフラグメントが、複数の部位にて互いに異なることを除く）。次いで、これらのフラグメントは細胞内に導入され、ここでコグネイト内因性遺伝子との組換えを受ける。
３．対立遺伝子交換のためのポジティブ選択
本発明はさらに、出発細胞と比較して改変された遺伝子を有する細胞の富化方法を提供する。これは、DNAフラグメントライブラリーを、ポジティブおよびネガティブの両選択マーカーを含む自殺ベクター（すなわち、レシピエント細胞型において機能的な複製起源を欠いている）に導入することにより達成され得る。必要に応じて、異なる供給源（例えば、B. subtilis、B. licheniformisおよびB. cereus）からの複数のフラグメントライブラリーが、異なる選択マーカーを有する異なるベクターにクローニングされ得る。適切なポジティブ選択マーカーは、neoR、カナマイシンR、hyg、hisD、gpt、ble、tetR、hprt、ura3およびsacBを含む。適切なネガティブ選択マーカーは、hsv-tk、hprt、gpt、およびシトシンデアミナーゼを含む。ネガティブ選択を適用するための別のストラテジーは、野生型rpsL遺伝子（リボソームタンパクS12をコードする）を、ストレプトマイシン耐性を付与された変異体rpsL遺伝子を有する細胞における使用のためのベクターに含ませることである。変異体形態のrpsLは、野生型rpsLを有する細胞において劣性である。従って、Sm耐性についての選択は、rpsLの野生型コピーを有する細胞に対して選択をする。SkorupskiおよびTaylor、Gene 169:47-52（1996）を参照。あるいは、ポジティブ選択マーカーのみを有するベクターは、そのマーカーを発現する細胞についての１ラウンドの選択、およびこのマーカーを欠損している細胞についての後続ラウンドのスクリーニングとともに使用され得る（例えば、薬物感受性についてのスクリーニング）。ポジティブ選択マーカーを欠損している細胞についてのスクリーニングは、ネガティブ選択マーカーの発現に対するスクリーニングと等価である。例えば、Bacillusは、CAT遺伝子および組込まれる配列を有するベクターで形質転換され得る。HarwoodおよびCutting、Molecular Biological Methods for Bacillus pp. 31-33を参照。クロラムフェニコール耐性についての選択は、ベクターを取り込んだ細胞を単離する。組換えを可能にするに適切な期間後、CAT感受性についての選択は、CAT遺伝子を欠損している細胞を単離する。そのような細胞の約50％は、組込まれる配列との組換えを受ける。
ポジティブ選択マーカーならびに、必要に応じてネガティブ選択マーカーおよびDNAフラグメントを有する自殺ベクターは、そのフラグメントと相同な染色体DNA中の部位で単一の交差により宿主染色体DNAに組込み得る。組換えは、相同配列の直接リピートが隣接する組込まれたベクターを生じる。いくつかの細胞において、後続の、リピート間の組換えは、ベクターの切除、およびゲノムによるベクターからの所望の変異の獲得または野生型に対するゲノムの復帰のいずれかを生じる。
本発明の方法において、適切なベクターへのクローニングされた遺伝子ライブラリーの移入後、ポジティブ選択は、ポジティブ選択マーカーの発現のために適用される。自殺ベクターの組込まれなかったコピーは、細胞から迅速に排除されるので、この選択は、宿主染色体中にベクターを組み込んでいる細胞について富化する。ポジティブ選択を生き残った細胞は、その後増殖されて、そしてネガティブ選択に供され得るか、またはポジティブ選択マーカーの欠損についてスクリーニングされ得る。ネガティブ選択は、ネガティブ選択マーカーを発現する細胞に対して選択する。従って、組込まれたベクターを保持する細胞は、ネガティブマーカーを発現し、そして選択的に排除される。選択の両ラウンドを生き残った細胞は、最初にベクターを組み込まれその後ベクターを排除された細胞である。これらの細胞は、ベクターとの相同組換えにより改変された遺伝子を有する細胞について富化されている。
４．遺伝子の個別至適化
一般に、上記の方法は、至適化される遺伝子数、その地図上の位置または機能に関する知識を必要としない。しかし、いくつかの場合において、１またはそれ以上の遺伝子についてこの情報が入手可能であれば、それを利用し得る。例えば、進化により獲得される特性が、細胞の増強された組換えである場合、既知または未知の多数の他の遺伝子が、さらなる寄与をなし得るとしても、重要であると思われる遺伝子の１つはrecAである。この状況において、recA遺伝子は、少なくとも部分的に、他の候補遺伝子と別に、進化され得る。recA遺伝子は、第Ｖ項に記載される再帰組換えのいずれの方法によっても進化され得る。簡潔には、このアプローチは、多様な形態のrecA遺伝子を取得する工程、その形態が組換わるのを可能にする工程、改良された特性を有する組換え体を選択する工程、およびその組換え体をさらなるサイクルの組換えおよび選択に供する工程を包含する。recAの個別改良におけるいずれの点においても、多様な形態のrecAは、上記の一般的方法において使用されるライブラリー中の他の遺伝子をコードするフラグメントと共にプールされ得る。このように、獲得することを求められる特性に対して重要であることが既知である遺伝子における改変体を、そうでない場合より高い割合で含むように、ライブラリーはシードされる。
５．シャッフリングのためのDNA基質の収集
いくつかのシャッフリング法においては、DNA基質は、天然供給源から単離され、そして酵素反応を阻害する扱いにくい不純物に起因して、DNA改変酵素または重合化酵素によって容易に操作されない。このような困難性は、収集株を介してDNA基質をプロセスすることにより回避し得る。収集株は、代表的には、天然のコンピテンス、および実質的多様性を有する配列間での相同組換えの能力を有する細胞型である（例えば、わずか75％の配列同一性を示す配列）。収集株は、標的生物由来の遺伝子またはDNAにおける他の目的の領域に隣接する２つのセグメントと互いに相補的であるそれぞれ２つのセグメントにより隣接する負の選択マーカーをコードするベクターを保有する。収集株は標的生物由来のDNAのフラグメントと接触される。フラグメントは天然のコンピテンスにより取りこまれ、そして標的生物からの目的のフラグメントは、収集株のベクターと組換わり、負の選択マーカーの欠失を生じる。負のマーカーに対する選択は、目的のフラグメントを取り込んだ細胞の単離を可能とする。シャッフリングは収集株内で行われ得るか、またはベクターは、インビトロシャッフリングのために収集株から単離され得るか、またはインビボシャッフリングのために異なる細胞型へ移入し得る。あるいは、ベクターは接合、プロトプラスト融合または、電気融合によって異なる細胞型に移入させ得る。適切な収集株の例は、Acinetobacter calcoaceticus mutSである。Youngら、第97回ASM Meeting Abstracts。本株は天然コンピテントであり、非配列特異的にDNAを取り込む。また、mutS突然変異のために、本株は75%配列同一性しか表示しない配列の相同組換えが可能である。
III．適用
Ａ．組換え形成性
全細胞進化の１つの目的は、改良された組換え能力を有する細胞の生成である。そのような細胞は、セクションＶに説明される再帰的配列組換えのインビボフォーマットを含む分子遺伝学において様々な目的のために有用である。E. coliにおいては、遺伝的組換えに関与するおよそ30個の遺伝子（例えば、recA、recB、recC、recD、recE、recF、recG、recO、recQ、recR、recT、ruvA、ruvB、ruvC、sbcB、ssb、topA、gyrAおよびＢ、lig、polA、uvrD、Ｅ、recL、mutD、mutH、mutL、mutU、、helD）およびDNA部位（例えば、chi、recN、sbcC）が同定され、そして他の生物においてもコグネイト形態のいくつかのこれらの遺伝子が発見されている。（例えば、酵母におけるrad51、rad55、rad57、Dmc1（参照：Kowalczykowskiら、Microbiol. Rev. 58:401-465（1994）；Kowalczkowski ＆ Zarling、前出）およびRad51とDmc1のヒトホモログが同定されている（Sandlerら、Nucl. Acids Res. 24:2125-2132（1996）を参照のこと）。recAを含むE. coli遺伝子の少なくともいくつかは、哺乳動物細胞内で機能的であり、SV40巨大Ｔ抗原核標的化配列との融合体として核に対して標的化し得る（Reissら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:3094−3098（1996））。さらに、mutL、mutS、mutHのようなミスマッチ修復遺伝子における突然変異は、相同性要件を緩和し、より互いに異なる配列間の組換えを可能にする（Rayssiguierら、Nature 342:396-401（1989））。互いに異なる株間での組換えの程度は、ミスマッチ修復遺伝子を損なわせ、そしてSOS遺伝子を刺激することにより増強され得る。このようなことは、適切な変異体株の使用および/または代謝ストレス条件（これは、SOSを刺激しミスマッチ修復遺伝子を阻害することが発見された）下における増殖により達成し得る。Vulicら、Proc. Natl. Acd. Sci. USA 94（1997）。
組換えの開始基質は上記の一般原理に従って選択される。すなわち、基質は総ゲノムまたはその分画であり得、その組換え遺伝子または部位を含む。本質的に無作為のフラグメントの大きなライブラリーは、１またはそれ以上の既知組換え遺伝子（例えば、recA）の改変体を構成するフラグメントの集団を用いて播種され得る。あるいは、ライブラリーは、様々な既知組換え遺伝子および部位の改変体形態を混合することによって形成され得る。
フラグメントのライブラリーは、改善されるべきレシピエント細胞中に導入され、組換えが起こり、改変された細胞を生成する。レシピエント細胞は、好ましくは、組換えによって修正され得るような様式でその発現が不能化されているマーカー遺伝子を含む。例えば、該細胞は、異なる部位における突然変異を保有するマーカー遺伝子の２つのコピーを含み得、そのコピーは組換えを起こして、野生型遺伝子を生成し得る。適切なマーカー遺伝子は、グリーン蛍光タンパク質である。タンパク質のＮ末端付近に停止コドンを有するGFPの１コピー、またＣ末端付近に停止コドンを有するGFPの別のコピーをコードするベクターが構築され得る。分子のそれぞれの末端における停止コドン間の距離は、500bpであり、約25%の組換え事象が、活性GFPを生成する。細胞内のGFPの発現は、細胞が停止コドンどうしの間で組換わるような相同組換えが可能であり、隣接するコード配列を生成するというシグナルになる。GFPを発現する細胞のスクリーニングにより、組換えの最高能力を有する細胞を濃縮する。同タイプのスクリーニングが組換えの引き続くラウンドに続いて使用され得る。しかし、以前のラウンドで使用した選択マーカーが自殺ベクター上に存在しない限り、引き続くラウンドは、以前のラウンドで使用したベクターとは異なる複製起点または異なる正の選択マーカーを保有する第２のベクター内において第２の不能化スクリーニングマーカーを使用すべきである。
Ｂ複数ゲノムコピー数
富化培地で増殖する定常期培養における細菌細胞の大部分は、2、4、または8個の染色体を含む。最小培地において、細胞は１または２個の染色体を含む。細菌細胞あたりの染色体数は、従って定常期に入る時の細胞の増殖速度に依存する。これは、急速に増殖する細胞が複数の複製フォークを含むために、終結後に細胞内にいくつかの染色体を生成するからである。試験された全ての株が定常期において１個より多い染色体を有するが、染色体数は株依存的である。定常期細胞内の染色体数は時間と共に減少する。これは、哺乳動物細胞内のアポトーシスと同様に、総染色体のフラグメント化および分解に起因するようである。複数ゲノムコピーを含む細胞内のゲノムのこのフラグメント化は、大量の組換えおよび突然変異誘発を生じる。有用な突然変異体は、増殖の継続を可能とするエネルギー源を使用する方法を見出し得る。
いくつかの細胞型（例えば、Deinococcus radians（DalyおよびMinton、J. Bacteriol.177:5495-5505（1995）））は、細胞サイクルを通して倍数性を示す。この細胞型はゲノムの多数のコピーの存在のために高度に放射線耐性である。ゲノム間の高頻度の組換えにより、種々のDNA損傷因子により誘発される突然変異の迅速な除去が可能となる。
本発明による方法の目標は、Deinoccocus radiansのそれと類似である増加されたゲノムコピー数を有するための他の細胞型の進化である。好ましくは、増加されるコピー数は、全てまたは大部分の増殖条件下で、細胞サイクルの全体または大部分を通して維持される。そのような細胞内における複数ゲノムコピーの存在は、これらの細胞内で、細胞内の異なるゲノム内の遺伝子のコピー間、および細胞内のゲノムとトランスフェクトされたフラグメント間の両方において、より高頻度の相同性組換えを生じる。組換えの増加頻度は、他の有用な特徴の獲得のためにより迅速に細胞を進化させることを可能とする。
組換えの開始基質は、そのいくつかのみがゲノムコピー数と関連のある遺伝子の多様なライブラリー、ゲノムコピー数に役割を有することが既知であるまたは推測される遺伝子の改変体から形成されたフォーカスライブラリー、またはその２つの組み合わせであり得る。一般原理として、増加したコピー数は、複製に関与する遺伝子の進化、および細胞中隔形成が複製を損なうことなしに阻害されるような細胞中隔形成によって達成されることが期待される。複製に関与する遺伝子は、tus、xerC、xerD、dif、gyrA、gyrB、parE、parC、dif、TerA、TerB、TerC、TerD、TerE、TerFを含み、そして染色体分割および遺伝子コピー数に影響を与える遺伝子は、minD、mukA（tolC）、mukB、mukC、mukD、spoOJ、spoIIIEを含む（WakeおよびErrington、Annu. Rev. Genet. 29:41-67（1995））。基質の有用な供給源は、複数ゲノムコピー数の所望の表現型を有することが既知であるDeinoccocus radiansのような細胞型のゲノムである。上記の基質に加えてまたはその代わりに、細胞中隔形成に関与することが既知である遺伝子に対するタンパク質またはアンチセンスRNAインヒビターをコードするフラグメントもまた使用し得る。
天然においては、細胞型内の複数ゲノムコピーの存在は、このコピー数を維持するために必要とされる栄養要求性が大きいために通常有利ではない。しかし、人工的条件が高コピー数を選択するために工夫され得る。組換えゲノムを有する改変された細胞は、富化培地で増殖され（その条件下では、複数コピー数は不利とならない）、そして組換えによる修復を受けやすいDNA切断を誘導する紫外線、ガンマ放射線、または化学的変異誘発物質（例えば、マイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレン）に、単独または組み合わせて曝露される。これらの条件は、突然変異が削除され得るより大きい効率のために複数コピー数を有する細胞を選択する。変異誘発物質への曝露を生存する改変された細胞は、複数ゲノムコピーを有する細胞を得るために濃縮される。所望であれば、選択された細胞はゲノムコピー数について個々に分析され得る（例えば、適切なコントロールによる定量的ハイブリダイゼーションにより）。選択を生存するいくつかまたは全て細胞の集団が、次のラウンドの組換えのための基質を提供する。結果として、細胞は、細胞サイクルを通じて少なくとも2、4、6、8、または10ゲノムコピーを有するように進化される。
C.分泌
細菌細胞および真核生物細胞のタンパク質（あるいは代謝産物）分泌経路は、（例えば、タンパク質医薬、低分子薬物あるいは特殊化学物質の製造のために）望ましい分子をより効率的に搬出するように進化し得る。効率の改善は、多サブユニット集合（抗体のような）あるいは分泌前の広範な翻訳後修飾を必要とするタンパク質に対して、とくに望ましい。
分泌の効率は、シグナルペプチドコード配列、コード配列を切断するかまたは認識するタンパク質をコードする配列および分泌タンパク質のコード配列を含む多くの遺伝子配列に依存し得る。後者はタンパク質の折りたたみ、およびタンパク質が膜に組み込まれ、そして膜を通過し得る容易性に影響を与え得る。大腸菌（Ｅ.coli）の細菌性分泌経路はSecA,SecB,SecE,SecDおよびSecF遺伝子を包含する。Bacillus subtilisでは、主要遺伝子は5種類のシグナルペプチダーゼ遺伝子（sipS,sipT,sipU,sipVおよびsipW）とともに、secA,secD,secE,secF, secY,ffh,ftsYである（Kunstら、上述）。翻訳後修飾を必要とするタンパク質に関しては、このような修飾をもたらす遺伝子の進化は分泌改善に寄与し得る。同様に、多サブユニットタンパク質の集合の役割を有する発現産物（例えば、シャペロニン）を有する遺伝子も分泌改善に寄与し得る。
組換えのための基質選択は、上述で考察した、一般的な原則に従う。この場合では、上述に参照した焦点ライブラリーは公知の分泌遺伝子の改変体を含む。真核生物タンパク質を発現する原核生物細胞の進化に関して、組換えの初期基質は、少なくとも一部、真核生物の供給源からしばしば得られる。入来フラグメントはレシピエント細胞の染色体DNAおよびこのような細胞に存在するスクリーニングマーカー構築物の両者との組換えを受け得る（下述を参照のこと）。組換えの後者型はスクリーニングマーカー構築物に組み込んだシグナルコード配列の進化にとって重要である。分泌改善はマーカー構築物を進化させる細胞に封入することによりスクリーニングし得る。マーカー構築物はマーカー遺伝子をコードし、発現配列と作動可能に連結し、そして通常は、シグナルペプチドコード配列と作動可能に連結する。
マーカー遺伝子は、時折、目的の組換えタンパク質を有する融合タンパク質として発現される。分泌遺伝子とともに、組換えタンパク質コード配列を進化させる場合、このアプローチは有用である。
あるバリエーション（variation）では、マーカー遺伝子は、生成物を分泌しなければ、構築物を含有する細胞に毒性を示す生成物をコードする。適切なトキシンタンパク質はジフテリアトキシンおよびリシントキシンを含む。このような構築物を保有する改変細胞の増殖は、トキシンの分泌を改善するように進化させた細胞を選択する。あるいは、マーカー遺伝子は公知のレセプターに対するリガンドをコードし得るが、リガンドを保有する細胞は標識化レセプターを使用するFACSにより検出され得る。必要に応じて、このようなリガンドは、分泌後にリガンドを細胞膜表面に結合するリン脂質アンカー配列に作動可能に連結され得る。（共有に係る同時係属出願08/309,345を参照のこと）。さらなるバリエーションでは、分泌されたマーカータンパク質は、個々の細胞を寒天滴に接種することにより、このマーカータンパク質を分泌する細胞の近傍に維持され得る。分泌タンパク質は寒天マトリック内に閉じ込められ、例えば、FACStmにより検出され得る。別のバリエーションでは、目的のタンパク質はb−ラクタマーゼまたはアルカリホスファターゼとともに融合タンパク質として発現される。これらの酵素は市販の色素産生基質（例えば、X-gal）を代謝するが、ペリプラズムへの分泌後のみ、代謝する。そのため、細胞コロニーの着色基質の外観は融合タンパク質の分泌能を示し、色素強度は分泌の効率と関連する。
これらのスクリーニングおよび選択方法により同定された細胞は、増加したタンパク質の量を分泌する能力を有する。この能力は分泌増加および発現増加に寄与し得るか、あるいは分泌増加のみに由来し得る。
D．発現
細胞はまた、組換えタンパク質の発現増加を獲得するように進化し得る。発現レベルは、もちろん、組換えタンパク質が発現される構築物、ならびにその中に含有されるプロモーター、エンハンサーおよび転写終結部位のような調節配列に大いに依存する。発現は転写、翻訳後修飾および翻訳の役割を有する、多数の宿主遺伝子によって影響され得る。加えて、リボヌクレオチド合成に関与する宿主遺伝子ならびに転写および翻訳のためのアミノ酸モノマーは発現効率に間接的に影響を及ぼし得る。組換えのための基質の選択は、上述の考察の一般的な原則に従う。この場合、焦点ライブラリーは発現の役割を有することが公知である遺伝子の改変体を含む。真核生物タンパク質を発現する原核生物細胞の進化に関して、組換えのための初期基質は、少なくとも一部、真核生物の供給源からしばしば得られる：すなわちタンパク質の分泌および／集合に関与するシャペロニンのようなタンパク質をコードする真核生物遺伝子。入来フラグメントはレシピエント細胞の染色体DNAおよびこのような細胞に存在するスクリーニングマーカー構築物の両者との組換えを受け得る（以下を参照のこと）。
改善された発現についてのスクリーニングは、進化する細胞中にレポーター構築物を含むことによりもたらされ得る。レポーター構築物は、容易に検出されかつ非毒性である、GFPのようなレポータータンパク質を発現する（そして、通常分泌する）。レポータータンパク質は単独か、あるいは融合タンパク質として目的のタンパク質とともに発現し得る。レポーター遺伝子を分泌するとすれば、スクリーニングは、分泌が改善されたか、もしくは発現が改善されたかのいずれか、または両者を有する細胞を効果的に選択する。
E.植物細胞
再帰的配列組換えのさらなる適用は、病原体疾患、化学物質、殺ウイルス剤、殺真菌剤、殺虫剤（例えば、BTトキシン）、除草剤（例えば、アトラジンまたはグリフォセート）および殺菌剤に対する耐性を獲得するための植物細胞の進化および植物細胞由来のトランスジェニック植物である。組換えの基質は再び、全ゲノムライブラリー、これのフラクションまたは上述の薬剤の一つに耐性を付与することが公知であるか、もしくは推測されている遺伝子の改変体を含む焦点ライブラリーであり得る。頻繁には、ライブラリーフラグメントは進化すべき植物に対して、異なる種類の植物より得られる。
エレクトロポレーション（Fromら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82, 5824（1985）,カリフラワー モザイクウイルス（CaMV）のようなウイルスベクターによる感染（Hohnら、Molecular Biology of Plant Tumors,（Academic Press,New York,1982）549-560頁；Howell, 米国特許第4,407,956号），小ビーズもしくは粒子のマトリック内、またはその表面上のいずれかへの核酸を有する小粒子による高速度弾道貫入法（high velocity ballistic penetration）（Kleinら、Nature 327,70-73（1987）,ベクターとしての花粉の使用（WO 85/01856）あるいはDNAフラグメントがクローン化されるTiプラスミドで形質転換したAgrobacterium tumefaciensの使用を含む標準方法によって、ＤＮＡフラグメントは、培養植物細胞または植物プロトプラストに導入される。TiプラスミドはAgrobacterium tumefaciensによる感染の際に植物細胞に伝達され、そして植物ゲノムに安定に組み込まれる（Horschら、Science 233、496-498（1984）；Fraleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,4803（1983）。
真菌プロトプラストについて以下で記述される同じ原則に従って、植物プロトプラスト間での遺伝子交換により、多様性も生成され得る。植物プロトプラストの形成および融合の手順は、Takahashiら、米国特許第4,677,066号；Akagiら、米国特許第5,360,725号；Shimamotoら、米国特許第5,250,433号；Cheneyら、米国特許第5,426,040号により記述されている。
組換えを生じさせ、組換え遺伝子を発現するために適切なインキュベーション期間後に、耐性を獲得させるべき薬剤に植物細胞を接触させ、生存植物細胞を採集する。これらの植物細胞の一部あるいはすべては組換えおよびスクリーニングのさらなるラウンドに供され得る。最後には、必要とする程度の耐性を有する植物細胞が得られる。
次いで、これらの細胞はトランスジェニック植物に培養され得る。培養プロトプラストからの植物再生は、Evansら、“Protoplasts Isolation and Culture,”Handbook of Plant Cell Cultures 1,124-176（MacMillan Publishing Co.,New York, 1983）；Davey, “Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts,”Protoplasts,（1983）12-29頁,（Birkhauser,Basel（1983）;Dale, “Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops,”Protoplasts,（1983）31-41頁,（Birkhauser,Basel 1983）；Binding, “Regeneration of Plants,”Plant Protoplasts,21-73頁,（CRC Press,Boca Raton,1985）に記述されている。
上述の方法のバリエーションとして、植物細胞について記述されると同じ一般的な戦略に従って、組換えおよびスクリーニングの１回以上の予備的ラウンドを細菌細胞で実施し得る。増殖速度がより速くそして細菌細胞にDNAを導入し得る効率はより高いので細菌細胞では、より迅速な進化が達成され得る。1回以上の組換え／スクリーニング後、DNAフラグメントライブラリーは細菌より回収され、植物に形質転換される。ライブラリーは完全なライブラリーあるいは焦点ライブラリーのいずれかであり得る。植物配列、とくに耐性を付与する役割を有することが公知であるか、または推測される植物配列に特異的なプライマー由来の増幅により、焦点ライブラリーを作製し得る。
実施例：アトラジンを異化するプラスミドのコンカテマー集合
Pseudomonasアトラジン異化遺伝子AtzAおよびAtzBは、pMD1（deSouzaら、Appl.Environ.Microbiol.61,3373−3378（1995）;de Souzaら、J.Bacteriol. 178,4894−4900（1996）からpUC18にサブクローン化された。AtzAを含有する1.9kb AvaIフラグメントは末端充填（end−filled）され、pUC18のAvaI部位に挿入された。AtzBを含有する3.9kb ClaIフラグメントは末端充填され、pUC18のHincII部位にクローン化された。次いで、AtzAはEcoRIおよびBamHIを用いてpUC18から切り出され、AzBはBamHIおよびHindIIIを用いて切り出され、そして２つの挿入断片はEcoRIおよびHindIIIで消化したpUC18に同時に連結された。この結果、pUC18にAtzAおよびAtzBを含有する5.8kb挿入断片を生じた（総プラスミド サイズ8.4kb）。
再帰的配列組換えは次のように実施した。8.4kbプラスミド全体を、50mMのTris-Cl pH7.5、10mMのMnCl2中のDNaseIで処理し、500と2000bpとの間のフラグメントをゲル精製した。Tth−XL酵素およびPerkin Elmerの緩衝液、2.5mMのMgOAc、400μMのdNTPsおよび連続希釈のDNAフラグメントを使用するPCR反応で、フラグメントを集合させた。次のようなサイクルでプログラムしたMJ Research「DNA Engine」で、集合反応を実施した：
1       94℃，  20秒
2       94℃，  15秒
3       40℃，  30秒
4       72℃，  30秒＋サイクルあたり2秒
5       ステップ2に進む、39回以上
6       4℃
本発明者らは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する集合反応より、AtzAおよびAtzB遺伝子を増幅し得なかったので、代わりにフェノール抽出およびエタノール沈殿法により反応物からDNAを精製し、次いで、プラスミドを直線化させる制限酵素で集合したDNAを消化した（KpnI：pUC18のKpnI部位はサブクローニングの間に失われ、AtzAのKpnI部位のみが残った）。直線化プラスミドをゲル精製し、一晩、自己連結させ、大腸菌NM522株に形質転換した（宿主株の選択は重要であった：TG1、DH10B、DH12Sを含む、多数の他の市販株からは、品質の劣る、ごくわずかのプラスミドしか得られなかった）。
50μg/mlのアンピシリンを含有するLBプレート上に形質転換反応の連続希釈液をプレートした。形質転換の残余物はグリセロールで25％とし、そして-80℃に凍結した。形質転換細胞をいったん力価測定したら、500μg/mlのアトラジンを含有する直径150mmのプレート上に200個と500個との間の密度で凍結細胞をプレートして、37℃で増殖させた。
500μg/mlのアトラジンは不溶性の沈殿物を形成する。AtzAおよびAtzBの遺伝子生成物はアトラジンを可溶性生成物に形質転換する。従って、pUC18の野生型AtzAおよびAtzB遺伝子を含む細胞は、アトラジンを分解した、明瞭な輪により取り囲まれる。AtzA酵素およびAtzB酵素が活性であればあるほど、ますます急速に明瞭な輪が形成され、アトラジンを含むプレート上で増殖する。最も急速に最大のクリアゾーンをつくるコロニーとして陽性物を選んだ。（約）40個の最良コロニーを選び、プールして、50μg/mlのアンピシリンの存在下で増殖させ、これらからプラスミドを調製した。工程全体（DNase処理からアトラジンプレート上にプレーティングするまで）を2000−4000コロニー／サイクルで4回反復した。
4回目のラウンドで改変を行なった。細胞を、500μg/mlのアトラジンおよび500μg/mlのアトラジンアナログであるテルブチラジンの両方にプレートした。しかし、これらは、野生型AtzAおよびAtzB遺伝子により分解されなかった。両化合物を分解する陽性物が得られた。アトラジンクロルヒドラーゼ（AtzA遺伝子の産物）は野生型遺伝子より生成されたものよりも10−100倍、高かった。
F．トランスジェニック動物
1．トランスジーン最適化
トランスジェネシスの１つの目標は、乳汁中に組換えタンパク質を分泌する、例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウシのようなトランスジェニック動物を作製することである。この目的のためのトランスジーンは、典型的には、乳汁タンパク質遺伝子（例えば、α、βもしくはγカゼイン、β−ラクトグロブリン、酸性乳清タンパク質またはα−ラクトアルブミン）由来のプロモーターおよびエンハンサー、シグナル配列、組換えタンパク質コード配列および転写終結部位を作動可能な連結中に含む。必要に応じて、トランスジーンは免疫グロブリンのような多重鎖タンパク質の複数鎖をコードし得、これらの場合では、2本鎖は、通常、個々に調節配列のセットに作動可能に連結する。トランスジーンは再帰的配列組換えによる発現および分泌のために最適化され得る。組換えの適切な基質は、異なる種あるいは個々の動物からの乳汁タンパク質遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーのような調節配列を含む。組換えのサイクルを、第Ｖ節で考察した任意のフォーマットにより、インビトロまたはインビボで実施し得る。スクリーニングを、HC11あるいはMacTのような乳腺由来細胞の培養物について、インビボで実施し、トランスジーンおよび上述で考察したようなレポーター構築物でトランスフェクトする。組換えおよびスクリーニングの数サイクル後に、最高レベルの発現および分泌を生じるトランスジーンを、乳腺組織培養細胞から抽出し、そしてトランスジェニック動物へ成熟する胚細胞を（例えば、接合体および胚性幹細胞）トランスフェクトするのに使用する。
2．動物全体の最適化
このアプローチでは、入来フラグメントのライブラリーをES細胞または接合体のような胚細胞に形質転換する。フラグメントは、成長ホルモンのような所望の性質を付与することが公知である遺伝子の改変体であり得る。あるいは、このフラグメントは多くの遺伝子を含む部分的ゲノムライブラリーまたは完全なゲノムライブラリーであり得る。
フラグメントを、以下に記載のマイクロインジェクションにより、通常、接合体に導入する：Gordonら、Methods Enzymol. 101, 414（1984）；Hoganら、Manipulation of the Mouse Embryo:A Laboratory Manual（C.S.H.L. N.Y. 1986）（マウス胚）;およびHammerら，Nature 315, 680（1985）（ウサギ胚およびブタ胚）；Gandolfiら、J. Reprod. Fert. 81,23−28（1987）；Rexroadら、J.Anim.Sci. 66,947−953（1988）（ヒツジ胚）およびEyestoneら、J.Reprod.Fert. 85,715−720（1989）；Camousら、J.Reprod.Fert. 72、779-785（1984）;およびHeymanら、Theriogenology 27、5968（1987）（ウシ胚）、すべての目的のため、これら全体を参考として援用する。次いで、接合体を成熟させ、そして胚を妊娠するレシピエント雌性動物に導入して、トランスジェニック子孫を生ませる。
あるいは、胚性幹細胞（ES）にトランスジーンを導入し得る。これらの細胞を、インビトロで培養した着床前の胚から得る。Bradleyら、Nature 309, 255−258（1984）。トランスジーンを、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによりこのような細胞に導入し得る。形質転換したES細胞を、非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わせる。ES細胞は胚をコロニー化し、いくつかの胚は、生じたキメラ動物の生殖細胞系を形成する。Jaenisch, Science, 240, 1468−1474（1988）を参照のこと。
接合体を使用するかまたはESを使用するかには関係なく、所望の特性（例えば、大きさの増加および／または成長速度）に関して、スクリーニングを完全な動物で実施する。所望の特性の獲得に向かって進化した動物から、DNAを抽出する。次いで、このDNAを使用して、さらなる胚細胞にトランスフェクトする。これらの細胞はまた、スプリットアンドプール（split and pool）アプローチで、所望の特性を獲得した動物から得られる。すなわち、このような動物の１つのサブセットからのDNAを、この動物の別のサブセットから調製した胚細胞に形質転換する。あるいは、所望の特性の獲得に向かって進化した動物からのDNAを、新鮮な胚細胞にトランスフェクトし得る。いずれかの選択肢により、トランスフェクトした細胞は、トランスジェニック動物に成熟して、そしてこの動物を、所望の特性に関して、さらなるラウンドのスクリーニングに供する。
図4は、より大きいサイズに魚を進化させるための、このアプローチの適用を示す。最初にライブラリーを、成長ホルモン遺伝子の改変体について調製する。改変体は天然であり得るか、または誘導され得る。ライブラリーをrecAタンパク質でコーティングし、魚受精卵にトランスフェクトされる。次いで、魚卵は異なるサイズの魚に成熟する。次に、大きい魚からのゲノムDNAの成長ホルモン遺伝子フラグメントをPCRにより増幅し、次のラウンドの組換えに使用する。
G.予測ツールとしての迅速な進化
再帰的配列組換えを使用し、試験下の薬物の曝露に応答する病原性微生物の自然進化をシミュレートし得る。再帰的配列組換えを使用すると、進化は自然進化よりも速い速度で進行する。進化速度の１つの測定尺度は、微生物が薬物に対する規定のレベルの耐性を獲得するまでに必要とされる、組換えおよびスクリーニングのサイクル数である。この分析からの情報は、異なる薬物の相対的な長所を比較することにあたり、特に反復投与についての長期間の効力を予測するにあたり、役立つ。
この分析に使用した病原性微生物は、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌（treptoccｉ）、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌（conococcｉ）、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス中毒症、炭疽、プラーク、レプトスピラ症およびライム病細菌のような、ヒト感染症の通常の感染源である細菌を含む。進化は、試験下での薬物に感受性である細菌の単離物をDNAフラグメントのライブラリーで形質転換することによりもたらされる。フラグメントは、進化させる細菌のゲノムの変異バージョンであり得る。薬物の標的が公知のタンパク質である場合、このタンパク質をコードする遺伝子の改変体を含む焦点ライブラリーを使用し得る。あるいは、ライブラリーは、他の種類の細菌、とくに典型的にヒト組織に存在することがみいだされており、これにより、インビボの組換えに利用可能な供給源物質をシミュレートし得る細菌由来であり得る。ライブラリーはまた、薬物に耐性であることが公知である細菌由来であり得る。組換えを生じさせ、そして組換え遺伝子を発現させるために適切な期間にわたって、細菌を形質転換および増殖させた後に、細菌を、試験下の薬物に曝露することによりスクリーニングして、生存細菌を採集する。生存細菌を、さらなるラウンドの組換えに供する。生存細菌の１つのサブセットからのDNAを第２のサブセットの細菌に導入するスプリットアンドプールアプローチにより、続くラウンドをもたらし得る。あるいは、DNAフラグメントの新鮮なライブラリーを生存細菌に導入し得る。続くラウンドの選択を、薬物の漸増濃度で実施し得、それにより、選択のストリンジェンシーを増大させる。
同じような戦略を使用して、ウイルスの薬物耐性獲得をシミュレートし得る。目的は、あったとしても、徐々にしか耐性が獲得され得ない薬物を同定することである。進化させるウイルスは、少なくとも穏やかに有効な薬物が利用可能である、ヒトの感染症を引き起こすウイルスである。組換えの基質は、誘導された変異体、同じウイルス株の自然変異体あるいは異なるウイルス由来であり得る。薬物の標的が公知である場合（例えば、HIVの逆転写酵素遺伝子を阻害するヌクレオチドアナログ）、標的遺伝子の改変体を含む焦点ライブラリーを作製し得る。フラグメントのライブラリーとのウイルスゲノムの組換えは、通常インビトロで行われる。しかし、フラグメントのライブラリーがこのようなゲノムに含まれ得るウイルスゲノムまたはフラグメントの改変体を構成する状況では、組換えはまた、例えば、細胞を複数の基質コピーでトランスフェクトすることにより、インビボで行い得る（第Ｖ節を参照のこと）。スクリーニングに関して、組換えウイルスゲノムを、ウイルスによる感染に感受性である宿主細胞内に導入し、そして細胞をウイルスに対して有効な薬物に曝露する（最初は、低濃度で）。細胞を遠心して、未感染ウイルスを除去し得る。感染期間後、子孫ウイルスを培養培地から採集し得、そしてこの子孫ウイルスは、薬物に対する耐性を少なくとも一部獲得したウイルスに富んでいる。あるいは、ウイルス感染した細胞を、軟寒天ローン（lawn）にプレートし、そして耐性ウイルスをプラークから単離し得る。プラークのサイズは、ウイルスの耐性の程度をいくらか示唆する。
スクリーニングで生存する子孫ウイルスを、予め決められたレベルの薬物耐性を獲得するまで、漸増ストリンジェンシーにて、組換えおよびスクリーニングのさらなるラウンドに供する。予め決められたレベルの薬物耐性は、耐えられない副作用がなく、患者に実際に投与する薬物の最大用量を反映し得る。この分析は、増えつつある承認された抗HIV薬の一覧（例えば、AZT，ddI，ddC，d4T，TIBO82150、ネバリピン、3TC，クリキシバンおよびリトナビル）のような、種々の薬物の組み合わせに対する耐性の獲得を調査するためにとくに価値がある。
IV．遺伝子交換の促進
（１）総論
本発明のいくつかの方法は、細胞間でのDNA交換を誘導する条件下で細胞を増殖させることより、細胞性DNAの組換えをもたらす。DNA交換は、エレクトロポレーション、微粒子銃、細胞融合のような一般的に適用可能な方法、またはいくつかの例では、接合あるいはアグロバクテリウム媒介移入−により促進され得る。例えば、Agrobacteriumは、T−DNA S.cerevisiaeを形質転換し得、T−DNAは相同組換えおよびギャップ修復メカニズムの両方により、酵母ゲノムに組み込まれる（Piersら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93（4）;1613-8（1996））。
いくつかの方法では、細胞間の初期の多様性（すなわち、ゲノム交換前）は、先祖細胞型の、化学物質または照射に誘導される変異誘発により誘導され、必要に応じて、所望の表現型に関するスクリーニングが続く。他の方法では、多様性は、細胞を異なる個体、株または種から得る場合と同様に、天然である。
いくつかのシャッフル方法では、誘導されたDNA交換を、組換えの各サイクルにおける組換えをもたらす唯一の手段として使用する。他の方法では、誘導された交換を、生物の自然の有性組換えとの組み合わせに使用する。他の方法では、誘導された交換および／または天然の有性組換えを、フラグメントライブラリーの導入と組み合わせて使用する。このようなフラグメントライブラリーは全ゲノム、全染色体、機能的もしくは遺伝的に関連した遺伝子の群、プラスミド、コスミド、ミトコンドリアゲノム、ウイルスゲノム（複製性および非複製性）またはこれらのいずれかのフラグメントであり得る。DNAはベクターと連結し得るか、または遊離型であり得る。いくつかのベクターは、宿主ゲノムとの相同またはあるいは非相同組換えを促進する配列を含む。いくつかのフラグメントは、組換えを刺激するため、ガラスビーズ、超音波処理、または化学的もしくは酵素的フラグメント化での剪断により引き起こされるような二本鎖切断を含む。
各々の場合では、細胞間でDNAを交換し得、その後DNAは組換えをうけて、ハイブリッドゲノムを形成し得る。ハイブリッドゲノムを有する細胞を、所望の表現型に関してスクリーニングする。そしてこの表現型を有する細胞を単離する。これらの細胞は、再帰的組換え／選択スキームにおける次回サイクルの組換えのための出発物質を形成する。
細胞間でのＤＮＡ交換を促進する１つの手段は、プロトプラスト融合のような細胞融合による。プロトプラストは、細胞からその細胞壁を除去することにより生じ、その統合性を維持するには等張または高張媒体に依存する膜結合細胞のままの状態である。細胞壁を部分的に除去すると、生じる細胞は厳密にはスフェロプラストと呼ばれ、完全に除去されると、プロトプラストと呼ばれる。しかし、ここでは用語プロトプラストは、他に示さなければ、スフェロプラストを含む。
プロトプラスト融合は、Shaffnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163（1980）により記述され、他の例示的な手順は、Yoakumら、米国特許第4,608,339号、Takahashiら、米国特許第4,677,066号およびSambrookeら、第16章により記述される。プロトプラスト融合は、株、種および属間で報告されている（例えば、酵母とニワトリとの赤血球間）。
プロトプラストを、細菌細胞および真核生物細胞（哺乳動物細胞および植物細胞を含む）両方について、細胞壁をはがす化学的処理を含むいくつかの方法により調製し得る。例えば、細胞壁を、10−20％スクロース、50mM EDTA緩衝液中のリゾチームによる消化によりはがし得る。球状プロトプラストへの細胞の変換を、位相差顕微鏡によりモニターし得る。プロトプラストを、細胞壁合成の阻害剤を補充した培地中で細胞を増殖させるか、または細胞壁形成の能力を欠く変異株の使用によっても調製し得る。好ましくは真核生物細胞を、α因子、K. lactisキラートキシン、レフロナミド（leflonamide）およびアデニル酸シクラーゼインヒビターのようなインヒビターを用いた停止によって、G1期に同期化する。必要に応じて、すべてではないが、いくつかの融合されたプロトプラストは、紫外線照射、ヒドロキシルアミンあるいはクペロンでの処理により、殺傷され得るおよび／またはそのDNAがフラグメント化し得る（Reevesら、FEMS Microbiol.Lett. 99, 193−198（1992））。この状況では、殺傷されたプロトプラストは、ドナーと呼ばれ、生きているプロトプラストはアクセプターと呼ばれる。死んだドナー細胞を使用することは、以下に記述するようにハイブリッドゲノムを用いて融合細胞を続けて認識するのに有利であり得る。さらに、ドナー細胞のDNAを切断することは、アクセプターDNAとの組換えを刺激するのに有利である。必要に応じて、アクセプターおよび／または融合細胞を、組換えをさらに刺激するためにUV照射に短時間（だが、致死的ではない）曝露し得る。
いったん形成されると、プロトプラストは、DDTの存在下で種々の浸透圧調節剤（osmolyte）および塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、スクロース、ソルビトールのような化合物で、安定化し得る。緩衝液、pH、還元剤および浸透圧安定剤の組合わせを、異なる細胞型に関して最適化し得る。PEG、塩化カルシウムもしくはプロピオン酸カルシウムのような化学薬品または電気融合で処理することにより、プロトプラストを融合するように誘導し得る（Tsoneva,Acta Microbiologica Bulgaria 24, 53−59（1989）。電場を使用する細胞融合方法もまた記述されている。Chang，米国特許第4,970,154号を参照のこと。条件を、異なる株のために最適化し得る。
融合細胞は、２つの成分プロトプラストからのゲノムを含む異核共存体である。融合細胞を、スクロース勾配沈殿法または細胞選別により融合されていない親細胞から富化し得る。異核共存体の２つの核は融合（核合体）し得て、そして相同組換えがゲノム間で生じ得る。染色体はまた、非対称的に分離し得て、全染色体を喪失するかまたは獲得した、再生されたプロトプラストを生じる。組換えの頻度を、紫外線照射での処理あるいはrecAまたは他の組換え遺伝子（例えば、MutSまたはMutLまたは酵母rad遺伝子）、および他の種のそのコグネイト改変体を過剰発現する株の使用によって増加させ得る。過剰発現は、外因性組換え遺伝子導入の結果かまたは内因性組換え遺伝子を過剰発現する株の選択の結果（これは、天然の改変体もしくは誘導された変異の結果としてである）のいずれかであり得る。細胞壁を再生させ、異核共存体から子孫細胞へ組換えゲノムを組換えおよび分離させ、ならびに組換え遺伝子を発現させる条件下で、融合プロトプラストを増殖させる。融合細胞の回収後または、時折その以前もしくはその間に、細胞を、所望の特性に対する進化に関してスクリーニングまたは選択する。
その後、引き続く組換えのラウンドを、前回のラウンドの選択／スクリーニングで生存した細胞由来のプロトプラストを調製することにより実施し得る。プロトプラストは融合し、組換えが融合したプロトプラストで生じて、そして細胞が融合細胞から再生する。プロトプラスト、再生した細胞あるいは再生しつつある細胞を、さらなる選択またはスクリーニングに供する。
あるいは、引き続く組換えのラウンドを、上述のようにスプリットプール（split pool）に基づいて実施し得る。すなわち、前回ラウンドの選択／スクリーニングで生存した細胞の第１の亜集団を、プロトプラストの形成のために使用する。前回ラウンドの選択／スクリーニングで生存した細胞の第２の亜集団を、DNAライブラリー調製についての供給源として使用する。次に、第２の亜集団の細胞由来のDNAライブラリーを、第１の亜集団由来のプロトプラストに形質転換する。このライブラリーは、プロトプラストのゲノムとの組換えを受けて、組換えゲノムを形成する。細胞が、プロトプラストから再生して、そして選択／スクリーニングを、再生しつつある細胞かまたは再生した細胞に適用する。さらなるバリエーションでは、核酸フラグメントの新鮮なライブラリーを、前回ラウンドの選択／スクリーニングで生存したプロトプラストに導入する。
プロトプラスト融合を使用するシャッフリングのための例示的な形式を図５に示す。この図は次のような工程を示す：ドナーおよびレシピエント株のプロトプラスト形成、異核共存体形成、核合体、組換え、および組換えゲノムの別々の細胞への分離。必要に応じて、組換えゲノムは、性周期を有するならば、減数分裂および交配の結果として、相互にさらなる組換えを受け得る。次いで、細胞を、所望の特性に関してスクリーニングまたは選択する。次いで、選択／スクリーニングで生存した細胞を、プロトプラスト化のさらなるサイクルの出発物質として使用する。
２．ハイブリッド株の選択
本発明は、二つ以上の異なる亜集団からの親細胞からの成分融合により形成された細胞を同定する選択戦略を提供する。通常、ハイブリッド細胞の選択を行った後に、（遺伝子交換の結果として）進化して所望の特性を得た細胞の選択およびスクリーニングを行う。このような選択スキームのほとんどの基本的前提は、二つの初期の亜集団が二つの異なるマーカーを有することである。従って、ハイブリッドゲノムを有する細胞は、両マーカーの選択により同定され得る。
このようなスキームの一つでは、少なくとも一つの亜集団の細胞は、その細胞膜に付着する選択的マーカーを保有する。適当な膜マーカー例には、ビオチン、フルオレセインおよびローダミンが挙げられる。マーカーは、アミドまたはチオール基に連結し得るか、または酢酸ヨウ素、ヨードアセタミド、マレイミドなど、より特異的な化学的誘導体を介して連結し得る。例えば、以下のようにマーカーは付着され得る。細胞またはプロトプラストを、リジンのアミノ基または膜タンパク質のN-末端アミノ基と反応する、化学的に活性なリガンドの化学的結合を妨害しない緩衝液（例えば、PBS）で洗浄する。このリガンドは、それ自体がアミン反応性である（例えば、イソチオシアネート、スクシンイミジルエステル、塩化スルホニル）か、ヘテロ二官能性リンカー（例えば、EMCS、SIAB、SPDP、SMB）がアミン反応性になることにより活性化される。リガンドは、タンパク質誘導体化磁気ビーズまたは他の捕捉固体支持体により容易に結合される分子である。例えば、リガンドは、スクシンイミジル活性化ビオチンであり得る（分子プローブ:B-1606、B-2603、S-1515、S-1582）。このリンカーを細胞の表面内および表面上に在るタンパク質のアミノ基と反応させる。次に、細胞を洗浄して、過剰の標識剤を除去した後、第二の選択マーカーを保有する第二の亜集団からの細胞と接触させる。
また、第二の亜集団の細胞は膜マーカーを保有し得るが、第一の亜集団とは異なる膜マーカーである。あるいは、第二亜集団は、遺伝子マーカーを保有し得る。遺伝子マーカーは、薬物耐性または緑色蛍光タンパク質の発現のようなスクリーニング可能な特性などの選択的特性を付与し得る。
第一および第二の亜集団の細胞の融合および回収後、細胞を両方の親亜集団上のマーカーの存在についてスクリーニングまたは選択する。例えば、特異的ビーズに吸着させることにより、１つの集団について融合物を富化し、次いで、マーカーを発現する融合物をFACStmにより分類する。両マーカーの両スクリーニングで残存する細胞は、プロトプラスト融合を受けた細胞であり、従って組換えゲノムを有する可能性がより高い。通常、マーカーは別々にスクリーニングまたは選択される。ビオチンなどの膜結合マーカーは、細胞膜マーカー（例えば、親和性マトリックス上で融合細胞を選別することにより）についての親和性富化によりスクリーニングされ得る。例えば、ビオチン膜標識について、細胞を、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Dynal）を使用して親和性精製し得る。これらのビーズを数回洗浄し、非融合宿主細胞を除去する。あるいは、細胞を膜マーカーに対する抗体に対して選別し得る。さらなる多様性において、膜マーカーが蛍光体であれば、マーカーを保有する細胞は、FACStmにより同定され得る。遺伝子マーカーのスクリーニングは、マーカーの性質に依存し、これには、薬物処理培地上での増殖能または緑色蛍光タンパク質のFACStm選択が挙げられる。第一および第二の細胞集団が異なる波長の蛍光性マーカーを有する場合、両マーカーをFACStm分類法により同時にスクリーニングし得る。
ハイブリッド細胞のさらなる選択スキームでは、融合する第一および第二の細胞の集団は、異なるサブユニットのヘテロ多量体酵素を発現する。通常、ヘテロ多量体酵素は、二つの異なるサブユニットを有するが、３つ、４つ以上の異なるサブユニットを有するヘテロ多量体酵素を使用し得る。酵素が二つより多くの異なるサブユニットを有するなら、各サブユニットは、異なる亜集団の細胞（例えば、３つの亜集団における３つのサブユニット）で発現するか、または一つより多くのサブユニットが、同じ亜集団の細胞（例えば、１つの亜集団に１つのサブユニット、第二の亜集団に２つのサブユニット）で発現し得る。
次に、第一および第二の亜集団成分細胞のゲノムの組み合わせを示すハイブリッド細胞を、インタクトな酵素のアッセイにより認識し得る。このようなアッセイは結合アッセイであり得るが、機能性アッセイ（例えば、酵素の基質を代謝する能力）がより代表的である。酵素活性は、例えば、蛍光または別の容易に検出し得る発光スペクトルを有する生成物に基質をプロセシングすることにより検出し得る。このようなアッセイで使用されるヘテロ多量体酵素の個々のサブユニットは、好ましくは解離形態の酵素活性を有さないか、または少なくとも結合形態よりも解離形態で有意に低い活性を有する。好ましくは、融合に使用される細胞は、内因性形態のヘテロ多量体酵素を欠乏するか、または少なくとも細胞融合により形成されたヘテロ多量体酵素から生じる内因性活性よりも有意に低い内因性活性を有する。
ペニシリンアシラーゼ酵素、セファロスポリンアシラーゼおよびペニシリンアシルトランスフェラーゼは、適当なヘテロ多量体酵素の例である。これらの酵素は、単一遺伝子によりコードされ、酵素前駆体として翻訳され、翻訳後自己触媒性タンパク質分解により切断され、スペーサーエンドペプチドを除去し、二つのサブユニットを生成する。これらのサブユニットは、会合して活性ヘテロ多量体酵素を形成する。いずれのサブユニットも、他のサブユニットの非存在下で活性でない。しかし、これらの個別の遺伝子部分が共同形質転換により同じ細胞内で発現されるなら、活性は再構成され得る。使用され得る他の酵素は、異なる遺伝子（例えば、faoAおよびfaoB遺伝子は、Pseudonmonas fragiの3-オキソアシル-CoAチオラーゼをコードする（Biochem.J 328,815-820（1997））によりコードされるサブユニットを有する。
例示の酵素は、Escherichia coliからのペニシリンGアシラーゼであり、単一遺伝子によりコードされる二つのサブユニットを有する。適切な発現調節配列に作動可能に連結される二つのサブユニットをコードする遺伝子フラグメントを、内因性ペニシリンアシラーゼ活性を欠く、第一および第二の亜集団の細胞にトランスフェクトする。第一および第二の亜集団からの成分細胞の融合により形成された細胞は、二つのサブユニットを発現し、これらは、会合して、例えば、ペニシリンアシラーゼのような機能的酵素を形成する。次に、融合細胞を、ペニシリンアシラーゼにより分解されるペニシンリンG含有寒天プレートで選択し得る。
別のバリエーションにおいて、融合細胞を栄養要求性変異体の相補性により同定する。細胞の親の亜集団を、公知の栄養要求性変異で選択し得る。あるいは、開始集団の細胞の栄養要求性変異を、突然変異誘発因子に暴露することにより自発的に生成し得る。栄養要求性変異を有する細胞を、最小および完全培地上でプレートされた複製により選択する。栄養要求性を生じた病変は、ゲノムを通じてアミノ酸、ヌクレオチドおよびビタミン生合成経路の遺伝子に分散すると思われる。親細胞の融合後、融合から生じた細胞を、最小培地での増殖能力により同定し得る。次に、これらの細胞を所望の特性への進化についてスクリーニングまたは選択し得る。さらに、新鮮な栄養要求性変異を生成する突然変異誘発段階を、組換え、ならびにスクリーニングおよび／または選択の次のサイクルに組み込み得る。
上記の方法のバリエーションでは、各ラウンドのシャッフリングにおいて、栄養要求性変異の新たな生成は、同じ栄養素要求体を再調査することにより回避し得る。例えば、栄養素要求体を、トランスポゾン保有選択マーカーを使用するトランスポゾン突然変異誘発により生成し得る。栄養素要求体は、複製プレーティングなどのスクリーニングにより同定される。栄養素要求体をプールし、栄養要求性集団の細胞上でファージを増殖させることにより、広汎性形質導入ファージ溶解物を調製する。個別の栄養素要求集団の細胞を遺伝子交換させ、相補性を使用して遺伝子交換および組換えを受けた細胞を選択する。次に、これらの細胞を、所望の特性の獲得性についてスクリーニングおよび選択する。この時、スクリーニングおよび選択で残存した細胞は、形質導入トランスポゾンライブラリーの導入により再生された栄養要求性マーカーを有する。次に、新たに生成した栄養要求性細胞を、さらなる遺伝子交換およびスクリーニング／選択に供し得る。
さらなるバリエーションにおいて、栄養要求性変異を、ターゲティングベクターによる相同組換えにより生成する。このベクターは、進化させる細胞のゲノムの生合成領域と相同の領域が隣接する選択マーカーを含む。ベクターとゲノムとの間の組換えは、栄養要求性変異を起こすゲノムに、ポジティブな選択マーカーを挿入する。細胞を導入する前は、ベクターは直線である。任意に、ベクターの導入の頻度を、ヘアピン形成でアニールした自己相補性オリゴヌクレオチドで末端をキャッピングすることにより増加し得る。遺伝子交換およびスクリーニング／選択は、上述のように進行する。各ラウンドにおいて、ターゲティングベクターを再導入し、同じ集団の栄養要求性マーカーを再生する。
別のバリエーションにおいて、融合細胞を、親細胞の亜集団の一つに存在するゲノムマーカー、および第二の亜集団の細胞上に存在するエピソームマーカーについてスクリーニングすることにより同定する。例えば、ミトコンドリアを含有する第一の亜集団の酵母を使用し、小さな表現型（すなわち、ミトコンドリアを欠乏）を有する第二の亜集団の酵母を補足し得る。
さらなるバリエーションでは、遺伝子交換を、一方の亜集団が死滅した二つの亜集団の細胞間で行う。次に、生存細胞を死滅親亜集団上に存在するマーカーについてスクリーニングする。
３．リポソーム媒介性移入
核酸フラグメントライブラリーをプロトプラストに導入する上記の方法において、核酸を、時々、リポソームに被包してプロトプラストによる取り込みを促進する。プロトプラストによるDNAのリポソーム媒介性取り込みについては、Redfordら、Mol.Gen.Genet.184,567-569（1981）で記載されている。リポソームは、大容量のDNAをプロトプラストへ効率的に送達し得る（Deshayesら、EMBO J.4、2731-2737（1985）を参照のこと）。さらに、DNAを直線フラグメントとして送達し得、しばしば、全ゲノムが、より組換え性である。いくつかの方法では、フラグメントを、リポソームに被包化する前に変異させる。いくつかの方法において、フラグメントを、RecAおよび相同物、またはヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）と結合させた後にリポソームに被包し、組換えを促進する。
４．糸状真菌のシャッフリング
糸状真菌は、上述のシャッフリング方法を実施するのに特に適している。糸状真菌は、有性増殖の構造に基づき、主に、４つの分類：Phycomycetes、Ascomycetes、BasidiomycetesおよびFungi Imperfectiに分割される。Phycomycetes（例えば、Rhizopus、Mucor）は、胞子嚢に有性胞子を形成する。胞子は、単核性または多核性であり、しばしば、有隔菌糸（多核体性）を欠乏する。Ascomycetes（例えば、Aspergillus、Neurospora、Penicillum）は、減数分裂の結果として子嚢中に有性胞子を産生する。代表的に、子嚢は、四つの減数分裂生成物を含有するが、さらなる有糸分裂の分裂の結果として、いくつかは８つの減数分裂生成物を含有する。Basidiomycetesには、マッシュルーム類、錆菌類および黒穂菌類などが含まれ、担子柄の表面上に有性胞子を形成する。マッシュルーム類などのholobasidiomycetesでは、担子柄は分裂しない。錆菌類（Uredinales）および黒穂真菌（Ustilaginales）などのhemibasidiomycetesでは、担子柄は分裂する。ほとんどのヒト病原体を含むFungi imperfectiは、有性期栄養生殖を行わない。
真菌は、無性、有性または擬似有性手段により生殖し得る。無性生殖は、菌糸の栄養性増殖、核分裂、ならびに生殖体を伴わない細胞分裂および核融合の無い細胞分裂を含む。細胞分裂は、胞子形成、菌糸の出芽またはフラグメント化により起こり得る。
有性生殖は、細胞間の遺伝子物質をシャッフリングする機構を提供する。有性生殖周期は、単相および複相の変化を特徴とする。二つの単相生殖体核が融合すると、複相が生じる（核合体）。生殖体核は、雌雄同型真菌の場合のように、同じ親株（自家稔性）から生じ得る。雌雄異型真菌では、親株は、異なる接合型株から生じる。複相細胞は、本質的に、染色体の１回の分裂を伴う２回の核分裂から成る減数分裂を介して、単相に変換する。１回の減数分裂の生成物は、四分染色体（四単相核）である。場合によっては、有糸分裂は、減数分裂後に起こり、８生成細胞を生じさせる。生じた細胞の配置（通常、胞子に囲い込まれる）は、親株と類似する。単相および複相期の長さは、種々の真菌で異なる：例えば、Basidiomycetes、およびAscomycetesの多くは、ほとんど単相に近い生活環（すなわち、減数分裂は、核合体後直ちに起こる）を有するが、他の菌（例えば、Saccharomyces cerevisiae）は、生活環のほとんどが複相である（核合体は、減数分裂の、すぐ後に起こる）。有性生殖は、同じ株の細胞間（自己増殖）または異なる株からの細胞間（異系交配）で起こり得る。
有性二形性（雌雄異体）は、異なる菌糸上で雄および雌器官を個別に産生する。これは、真菌間では稀な現象であるが、数例が公知である。異体生（１座−２対立遺伝子）は、自家不適合性の接合適合性株間での異系接合を可能にする。最も単純な型は、接合型／因子の２対立遺伝子−１座系であり、以下の生物により示される：
NeurosporaのAとa
Saccharomycesのaとα
SchizzosaccharomycesおよびZygomycetesの＋とー
Ustilagoのa1とa2
複合−対立形質異体性は、いくつかの高度なBasidiomycetes（例えば、GasteromycetesおよびHymenomycetes）によって示される。これは、異体性であり、複合対立遺伝子によって決定されるいくつかの接合型を有する。これらの生物における異体性は、１つの接合型因子を有する二極性か、または二つの非結合因子であるAおよびBを有する四極性である。安定な稔性異核共存体形成は、異なるA因子の存在および、四極性生物の場合、異なるB因子の存在に依存する。この系は、異系接合の促進および自家生殖（self-breeding）の予防に有効である。異なる交配因子数は非常に大きく（すなわち、数千）（Kothe、FEMS Microboil.Rev.18、65-87（1996））、非親性接合因子は、組換えにより生じ得る。
擬似有性生殖は、細胞間の遺伝物質をシャッフリングするさらなる手段を提供する。このプロセスは、接合型または生殖体の関与なしに、親DNAの組換えを可能にする。擬似有性融合は、菌糸融合によって起こり、異なる核を含む共通のプロトプラストを生じさせる。二つの核は、生じた異核共存体で独立して分裂し得るが、場合によっては、融合する。融合は、単相化に続いて起こるが、染色体の損失および相同染色体間の有糸分裂交雑を伴い得る。プロトプラスト融合は、擬似有性生殖の一形態である。
上記四分類において、真菌もまた、栄養適合性群により分類される。栄養適合性群内の真菌は、互いに異系共存体を形成し得る。従って、異なる真菌株間の遺伝物質交換については、通常、真菌を同じ栄養適合性群から調製する。しかし、いくつかの遺伝子交換は、擬似有性生殖の結果として、異なる不適合性群からの真菌間で生じ得る（Timberlakeら、US 5,605,820を参照）。さらに、他で述べたように、真菌の天然の栄養適合性群は、シャッフリングの結果、増大し得る。
Aspergillus nidulans、A.flavus、A.fumigatus、Penicillium chrysogenum、P.notatum、Cephalosporium chrysogenum、Neurospora crassa、Aureobasidium pullulansの単離物のいくつかは、核型化されている。ゲノムサイズは、一般的に、Aspergilli間では20と50Mbとの間の範囲である。核型の違いは、しばしば、類似株間で存在し、また外因性DNAでの形質転換によっても生じる。糸状真菌遺伝子は、通常、約50〜100bpサイズのイントロンを含有し、類似コンセンサス5'および3'スプライス配列を有する。促進および終結シグナルは、しばしば、交叉認識性であり、一つの真菌（例えば、A.nidulans）から別の真菌（例えば、P.chrysogenum）への遺伝子／経路の発現を可能にする。
真菌細胞壁の主要成分は、キチン（またはキトサン）、β-グルカンおよびマンノタンパク質である。キチンおよびβ-グルカンは、骨格（scaffolding）を形成し、マンノタンパク質は、壁の有孔性、抗原性および粘着性を指令する間質成分である。キチンシンセターゼは、β-（1,4）-結合性N-アセチルグルコサミン（GIcNAc）残基の重合を触媒し、逆平行に広がる直線鎖を形成し；β-（1、3）-グルカンシンセターゼは、ブドウ糖の同種重合を触媒する。
シャッフリングの一般的な目的の一つは、真菌を進化させて遺伝子工学、特に非関連遺伝子のシャッフリングのための有用な宿主にすることである。A.nidulansは、一般的に、その有性周期および有用性が古典的遺伝子および分子遺伝学において十分に確立されているので、このような操作のための宿主として働く優れた真菌微生物である。別の一般的な目的は、特異的な化合物（例えば、抗菌剤（ペニシリン類、セファロスポリン類）、抗真菌剤（例えば、echinocandins、aureobasidins）および木材分解酵素）を作製する真菌の能力を改善することである。これらの一般的な目的の中にはいくつかの重なりがあり、従って、いくつかの所望の特性は、両目的を達成するために有用である。
所望の特性の一つは、現在有性周期を欠く真菌への減数分裂器官の導入性である（Sharonら、Mol.Gen.Genet.251,60-68（1996）を参照のこと）。有性周期を真菌P. chrysogenum（a fungus imperfecti）へ導入するスキームを、第６図に示す。プロトプラストの亜集団は、A.nidulans（有性周期を有する）から形成されるが、P.chrysogenumからは形成されない。この二つの株は、好ましくは、異なるマーカーを保有する。A.nidulansのプロトプラストは、uvまたはヒドロキシルアミンによる処理で死滅する。二つの亜集団は融合して異核共存体を形成する。いくつかの異核共存体では、核が融合し、いくつかの組換えが起こる。融合細胞を、新しい細胞壁が生成する条件下で培養した後、有性組換えを起こさせる。次に、組換えゲノムを有する細胞を選択する（例えば、それぞれの親菌株上に存在する栄養要求性マーカーの相補性について選択することによる）。ハイブリッドゲノムを有する細胞は、有性周期に必要な遺伝子を獲得する確立がより高い。次に、細胞のプロトプラストを、有性周期を有することが公知のさらにもう一つの細胞集団の死滅プロトプラスト（前回と同じか、異なる）と同様の方法で交雑した後、ハイブリッドゲノムを有する細胞について選択し得る。
別の所望特性は、真菌のミューテーター株の産生である。このような真菌は、機能性産物の発現を損なうかまたは妨害する一つ以上の突然変異を有するマーカー遺伝子を含む真菌株をシャッフルすることにより生成され得る。シャッフル産物（shufflant）を陽性マーカーの発現について選択する条件下で増殖させる（一方、発現しない少量の残余増殖を認める）。最も速く増殖するシャッフル産物が、次のシャッフルラウンド用の出発物質を形成するために、選択される。
別の所望特性は、真菌の宿主範囲を拡大し、他の栄養和合性群由来の真菌を用いて異核共存体を形成し得るようにすることである。種間の不和合性は、異なる不和合性座（例えば、「het」座）での特定の対立遺伝子の相互作用から生じる。二つの株が菌糸接合を受ければ、株がこれらの座で異なる場合、致死的細胞質不和合性反応が生じ得る。株は、完全に和合性である同一座を保有しなければならない。これらの座の幾つかは、様々な種において同定されており、不和合性効果は、幾分付加的である（従って、「部分的不和合性」が生じ得る）。いくらかの耐性およびhet陰性突然変異株がこれらの生物について記載されている（例えば、DalesおよびCroft、J.Gen.Microbiol.136,1717-1724（1990））。さらに、耐性遺伝子（tol）が報告されており、この遺伝子は、接合型異核共存体不和合性を抑制する。シャッフルは、異なる不和合性群からの株のプロトプラスト間で行われる。好ましいフォーマットは、生存受容株およびUV照射死滅受容株を使用する。UV照射は、DNA不活化het遺伝子に突然変異を導入するのに役立つ。二つの株は、異なる遺伝子マーカーを保有すべきである。この株のプロトプラストを融合し、細胞を再生した後、マーカーの相補性についてスクリーニングする。続くシャッフルおよび選択ラウンドは、スクリーニング生存細胞とドナー細胞の新鮮集団のプロトプラストとを融合することにより、同じようにして行われ得る。
別の所望特性は、AscomycetesおよびFungi imperfectiへの複合対立形質性的異質接合性の導入であり、これらの真菌は、通常、この特性を示さない。この接合系は、自殖させずに異系交配をさせる。このような接合系は、このような系を有するGasteromycetesまたはHymenomycetes由来のDNAでAscomycetesおよびFungi imperfectiをシャッフルすることにより導入され得る。
もう一つの所望特性は、シャッフル宿主としての真菌株の使用を容易にするプロトプラストの自発形成である。ここで、進化させる真菌株は、代表的には突然変異誘発される。簡潔には、進化させる真菌の胞子を、完全なプロトプラストを形成するのに不十分な時間、細胞壁分解剤で処理し、次に、他の真菌株由来のプロトプラストと混合する。二つの異なる亜集団の融合により形成されたプロトプラストを、上述のように遺伝的または他の選択／またはスクリーニングにより同定する。これらのプロトプラストを使用して菌糸、次に胞子を再生し、次のシャッフルラウンド用の出発物質を形成する。次のラウンドでは、少なくとも幾つかの生存胞子を細胞壁除去酵素で処理するが、前回よりも時間を短くする。処理後、部分的除去細胞を第一の標識で標識する。次に、これらの細胞をプロトプラストと混合するが、このプロトプラストは、前のラウンドにおける選択に生存した他の細胞または、新鮮真菌株に由来し得る。これらのプロトプラストを第二の標識で物理学的に標識する。この細胞をプロトプラストが融合する条件下でインキュベートした後、両標識を有する融合物を選択する。これらの融合物は、次のシャッフルラウンド用の菌糸および胞子を生成するなどのために使用される。最後に、プロトプラストを自発的に（すなわち、細胞壁分解剤を添加することなく）形成する子孫を同定する。
別の所望特性は、生合成経路における酵素をコードする遺伝子、トランスポータータンパク質をコードする遺伝子、および代謝フラックス制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子の獲得および／または改良である。この状況では、経路の遺伝子は、進化させる真菌に、経路を所有する別の真菌株との遺伝子交換または経路を所有する生物由来のフラグメントライブラリーの導入のいずれかにより導入され得る。次に、これらの真菌の遺伝子物質は、本願で述べた種々の手順により、さらなるシャッフルおよびスクリーニング／選択にかけられ得る。真菌のシャッフル産生株を代謝経路により生成される化合物またはその前駆体の産生について選択／スクリーニングする。
別の所望特性は、熱などの極端な条件に対する真菌の安定性を増加させることである。この状況では、安定性を付与する遺伝子は、このような特性をすでに有する株由来のDNAによるDNA交換または形質転換により獲得され得る。あるいは、進化させる株は、ランダム突然変異誘発にかけられ得る。進化させる真菌の遺伝子物質は、本願に記載の手順のいずれかによりシャッフルし、シャッフル産物を極端な状態に生存暴露により選択し得る。
別の所望特性は、栄養要求性の変化下での真菌増殖能である（例えば、特定の炭素または窒素源上での増殖）。栄養要求性の変化は、例えば、有益な商業産物を生成するが、深遠なため高価である栄養要求性を有する真菌の天然単離物にとって、特に有益である。進化させる株は、所望の栄養要求性を有する株由来のDNAによる遺伝子交換および／または形質転換を受ける。次に、進化させる真菌は、必要に応じて、本願に記載のようにさらなるシャッフルにかけ得、そして組換え株が所望の栄養環境での増殖能について選択され得る。必要に応じて、栄養環境は、進化させる真菌の自然要求性近くから開始する連続するシャッフルラウンドおよび所望の栄養要求性に近づける続くラウンドで変化され得る。
もう一つの所望特性は、真菌での天然のコンピテンスの獲得である。シャッフルによる天然のコンピテンスの獲得手順は、一般的にPCT/US97/04494に述べられている。進化させる真菌は、代表的には、すでにこの特性を有する細菌株または真菌株由来のDNAによる遺伝子交換または形質転換を受ける。次に、組換え型ゲノムを有する細胞を選択性マーカー保有プラスミドの取り込み能により選択する。上述の手順のいずれかを使用して、さらなるラウンドの組換えおよび選択を行い得る。
別の所望特性は、プロテアーゼおよびDNase分泌の増減である。この状況では、進化させる真菌は、所望の特性を有することが公知の別の株からの交換または形質転換によりDNAを獲得し得る。あるいは、進化させる真菌は、ランダム突然変異誘発にかけられ得る。進化させる真菌を上記のようにシャッフルする。単離物の選択／スクリーニングを行う前に、代表的には、プールした真菌単離物を溶解してプロテアーゼまたはDNaseを周囲培地に放出させる。このような酵素の存在またはその欠乏は、ペプチドまたはDNA結合を介して支持体に連鎖した蛍光分子と培地とを接触させることによりアッセイされ得る。この結合の切断により、検出可能な蛍光が培地に放出される。
別の所望特性は、変化したトランスポーター（例えば、MDR）を有する真菌を産生することである。このような変化したトランスポーターは、例えば、新しく二次代謝物を産生するように進化させた真菌において、新たな二次代謝物の合成に必要な前駆体を細胞へ導入するか、または細胞から二次代謝物を流出させるために有用である。トランスポーターは、トランスポーター改変体のライブラリーを真菌細胞に導入し、細胞を有性または擬似有性組換えにより組換えさせることにより、進化させ得る。細胞へ前駆体を輸送する能力を有するトランスポーターを進化させるため、細胞を前駆体存在下で増殖させた後、細胞を代謝物の産生についてスクリーニングする。代謝物を搬出する能力を有するトランスポーターを進化させるため、細胞を代謝物の産生を支持する条件下で増殖させ、培養培地への代謝物の搬出についてスクリーニングする。
真菌シャッフルの一般的方法を図７に示す。凍結ストックからの胞子または寒天プレートからの新鮮胞子を使用して適切な液体培地に接種する（１）。胞子が発芽して菌糸を成長させる（２）。菌糸を採取し、次に、ろ過および／または遠心分離により洗浄する。必要に応じて、試料をDTTで前処理し、プロトプラストの形成を高める（３）。プロトプラストの形成を浸透性安定化培地（例えば、1m NaCl/20mM MgSO4、pH 5.8）で細胞壁分解酵素（例えば、Novozyme 234）を添加して行う（４）。細胞壁分解酵素を浸透性安定化溶液で反復洗浄することにより除去する（５）。プロトプラストは菌糸、デブリおよび胞子からミラクロスろ過および密度遠心法により分離され得る（６）。プロトプラストを遠心分離により採取し、適当な濃度に再懸濁する。この工程により、いくらかのプロトプラスト融合を導き得る（７）。融合は、PEG（例えば、PEG 3350）添加、および／または遠心分離およびPEG添加または無添加の再懸濁の反復により刺激され得る。電気融合もまた行われ得る（８）。必要に応じて、融合プロトプラストは、庶糖密度勾配遠心沈殿法（または、上述の他のスクリーニング方法）により非融合プロトプラストから富化され得る。必要に応じて、融合プロトプラストを紫外線照射により処理し、組換えを刺激し得る（９）。プロトプラストを浸透性安定化寒天プレート上で培養し、細胞壁を再生し、菌糸を形成する（10）。菌糸を使用して、胞子を生成する（11）。これは、次のシャッフルラウンドの出発物質として使用される（12）。所望特性についての選択は、再生菌糸または、これらから得られた胞子のいずれかで行われ得る。
代替の方法において、プロトプラストを、細胞壁合成に必要な一つ以上の酵素を阻害することにより形成する（図８を参照）。阻害剤は、使用条件下で殺真菌性よりもむしろ静真菌性であるべきである。阻害剤例としては、以下に記載される抗真菌性化合物が挙げられる（GeorgopapadakouおよびWalsh,Antimicrob.Ag.Chemother.40,279-291（1996）;LymanおよびWalsh,Drugs 44,9-35（1992））。他の例には、キチンシンターゼ阻害剤（ポリオキシンまたはニッコルナイシン（nikkornycin）化合物）および／またはグルカンシンターゼ阻害剤（例えば、エキノカンジン類（echinocandins）、パプロカンジン類（papulocandins）、ニューモカンジン類（pneurncandins））が挙げられる。阻害剤は、浸透性安定化培地で適用すべきである。細胞壁を除去した細胞は、融合され得るか、さもなければ、遺伝子形質や転換／株発育プログラムでドナーまたは宿主として用いられ得る。この方法を反復利用する可能なスキームを図８に概略する。
さらなる変法において、真菌株を使用してプロトプラストを調製する。これは、無傷細胞壁の合成するそれらの能力が遺伝学的に欠損しているか、または損なわれている（compromised）（図９を参照）。このような突然変異株は、一般的に脆弱性、浸透改善性、または細胞壁欠失性と呼ばれ、株寄託機関から入手され得る。このような株例としては、Neurospora crassa os突然変異株がある（Selitrennikoff,Antimicrob.Agents.Chemother.23,757-765（1983））。このような突然変異の幾つかは、温度感受性である。温度感受性株は、選択および増幅の目的で許容温度で、そしてプロトプラスト形成および融合の目的で非許容温度で増殖され得る。温度感受性株のNeurospora crassa os株は、ソルボースおよびポリオキシン含有浸透性安定化培地中、非許容温度で成長させるとき、プロトプラストとして増殖するが、許容温度でソルビトール含有培地に移した際に全細胞を生成すると記載されている。US 4,873,196を参照。
他の適切な株は、キチン合成、グルカン合成、および他の細胞壁関連プロセスに関与する遺伝子の標的化突然変異誘発により生成し得る。このような遺伝子の例として、Saccharomyces cerevisiaeおよびCandida spp.のCHT1、CHT2、およびCALI（またはCSD2）（Georgopapadakou & Walsh 1996）；S.cerevisiae、Candida albicans、Cryptococcus neoformans、Aspergillus fumigatus、ChvAINdvA Agrobacterium、およびRhizobiumにおけるETGI/FKSI/CNDI/CWH53/PB RIおよび相同体が挙げられる。他の例は、Aspergillus nidulansのMA、orlB、orIC、MD、tsE、およびbimGである（Borgia, J. Bacteriol. 174, 377-389（1992））である。OrlAl、tse6、およびbimG11変異体株は、突然変異を有するため、制限的温度で溶解する。溶解は浸透圧性安定化により防止される。突然変異は、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）の添加により補完される。bimG11変異体株は、分生子の１型タンパク質ホスファターゼに対してtsである。他の適切な遺伝子は、Aspergillus fumigatusのchsA、chsB、chsC、chsD、およびchsE；Neurospora crassaのchs1およびchs2；Phycomyces blakesleeanus MMおよびS.cerevisiaeの２および３である。Chs1は、非必須の修復酵素であり、chs2は隔膜形成に関与し、そしてchs3は細胞壁成熟および芽環（bud ring）形成に関与する。他の有用な株は、S.cerevisiae CLY変異体株（細胞溶解）ts株（Paraviciniら、Mol.Cell Biol.12,4896-4905（1992））（例えば、PKC 1遺伝子（CLY 15株）の欠失）、srb（アクチン遺伝子）におけるVY 1160-ts変異体（SchadeらActa Histochem.Suppl.41,193-200（1991））、およびカタツムリの内臓から単離した細胞壁消化酵素に対して高い感受性を有するses単相変異体（Metha & Gregory,Appl.Environ.Microbiol.41,992-999（1981））である。他の有用な株は、C.albicans chs 1、2、3キチンシンセターゼ、浸透圧性改善条件性致死突然変異体（osmotic remedial conditional lethal mutant）（Payton & de Tiani、Curr.Genet.17,293-296（1990））；カタツムリの内臓から単離した細胞壁消化酵素に対して高い感受性を有するC.utilis突然変異体（Metha & Gregory,1981,前出）；およびN.crassa突然変異体os-1、2、3、4、5、6（Selitrennikoff, Antimictob. Agents Chemother. 23, 757-765（1983））である。このような突然変異体は、37℃では細胞壁無しで増殖し、分裂するが、22℃では細胞壁を生成する。
標的化突然変異誘発は、陽性−陰性選択ベクターでの細胞の形質転換により達成し得る。このベクターは、標的化するセグメントに隣接する相同領域、相同領域間に陽性選択マーカー、および相同領域外に陰性選択マーカーを含む（Capecchi,US 5,627,059を参照のこと）。１つの変法（variation）において、陰性選択マーカーは、陽性選択マーカーのアンチセンス転写物であり得る（US5,527,674を参照のこと）。
他の適切な細胞を、選択と組み合わせた無作為突然変異誘発またはシャッフリング操作により選択し得る。例えば、細胞の第一の亜集団を突然変異させ、突然変異誘発から回復させ、細胞壁を不完全分解した後、細胞の第二の亜集団のプロトプラストと接触させる。両方の亜集団からのマーカーを保有するハイブリッド細胞を同定し（上述のように）、そしてこれに続くシャッフリンのラウンドにおける出発物質として使用する。この選択スキームは、自発的プロトプラスト形成能力を有する細胞および組換え形成性が増強された細胞の両方について選択する。
さらなる変法において、自発プロトプラスト形成能力を有する細胞を、組換え形成性を増強した、本発明の他の方法を使用して進化させた細胞と交雑し得る。このハイブリッド細胞は、全ゲノムシャッフリングに特に適した宿主である。
細胞壁合成または維持に関与する酵素の突然変異を有する細胞は、単に浸透圧性保護培養物中での細胞の増殖の結果として、自発的プロトプラスト形成に起因して、融合を受け得る。この突然変異が条件付きであれば、細胞を非許容的条件に移す。プロトプラスト形成および融合を、PEGまたは電場のような促進剤（Philipova & Venkov,Yeast 6,205-212（1990）;Tsonevaら、FEMS Microbiol.Lett. 51,61-65（1989））の添加により促進し得る。
５．酵母におけるシャッフリング方法
酵母は、単細胞として増殖する真菌の亜種である。酵母は、発酵飲料およびパン種の製造、燃料としてのエタノールおよび低分子量化合物の製造、ならびにタンパク質および酵素の異種製造に使用される（酵母株およびその使用の添付のリストを参照のこと）。常用される酵母株には、Saccharomyces cerevisiae、Pichia sp.、Canidia sp.およびSchizosacchromyces pombeが挙げられる。
いくつかのタイプのベクターは、組み込みプラスミド（YIp）、酵母複製プラスミド（２μサークルに基づくベクターのようなYRp）、酵母エピソームプラスミド（YEp）、酵母動原体プラスミド（YCp）、または酵母人工染色体（YAC）を含む酵母におけるクローニングに利用できる。各ベクターは、LUE2、URA3、およびH1S3のようなプラスミドの存在、またはURA3（5-フルオロオロチン酸存在下で増殖した細胞に対して毒性を有する遺伝子）のようなプラスミドの非存在について選択するのに有用なマーカーを保有し得る。
多くの酵母は、有性周期および無性（栄養性）周期を有する。有性周期は、細胞が減数分裂を経験する毎に、微生物の全ゲノムの組換えを伴う。例えば、S.cerevisiaeの複相細胞を窒素および炭素制限条件に暴露した場合、複相細胞は、減数分裂を経験し、子嚢を形成する。各子嚢は、交配型「a」二つおよび交配型「α」二つの四つの単相胞子を保有する。富化培地に戻す際に、反対の交配型の単相胞子は、交配して複相細胞をもう一度形成する。反対の交配型の子嚢は、子嚢内で交配するか、または子嚢が、例えば、チモラーゼで分解する場合には、単相細胞は、他の子嚢の胞子と交配し得る。この有性周期は、酵母の内因性ゲノムおよび／または酵母に挿入した外因性フラグメントのライブラリーをシャッフリングするためのフォーマットを提供する。このプロセスにより、ハイブリッド遺伝子のスワッピングまたは蓄積が生じ、細胞交配により分配した相同性配列のシャッフリングを行う。
いくつかの公知遺伝子に突然変異を有する酵母株は、シャッフリングに有用な特性を有する。これらの特性には、細胞内での組換え頻度の増加および自発的突然変異頻度の増加が挙げられる。これらの特性は、コーディング配列の突然変異または野生型コーディング配列の改変された発現（通常、過剰発現）の結果であり得る。HOヌクレアーゼは、MAT遺伝子座にHMLa/αおよびHMRa/αの転写をもたらし、その結果、交配型のスイッチングが起こる。この酵素をコードする遺伝子における突然変異体は、その交配型をスイッチしないが、これを用いて、ライブラリーを収容または所望の表現型を有するなどの明確な遺伝子型の株間で交雑を強制し、出発株の交配を妨害し得る。PMS1、MLH1、MSH2、MSH6は、ミスマッチの修復に関与する。これらの遺伝子における突然変異は全て、突然変異誘発表現型（Chambersら、Mol. Cell. Biol. 16, 6110-6120（1996））を有する。TOP3 DNAトポイソメラーゼの突然変異は、６倍増強した染色体内相同組換え（Bailisら、Molecular and Cellular Biology 12, 4988-4993（1992））を有する。RAD50〜57遺伝子は、放射線に対する耐性を付与する。Rad3は、ピリミジン二量体の除去において機能する。RAD52は、遺伝子変換において機能する。RAD50、MRE11、XRS2は、相同性組換えおよび非正統的組換えの両方で機能する。HOP1、RED1は、初期減数分裂組換えで機能する（Mao-Draayer,Genetics 144,71-86）。HOP1またはRED1いずれかの突然変異は、HIS2組換えホットスポットでの二重鎖分裂を減少させる。これらの遺伝子が欠失する株は、YAC上に保有される縦列発現ライブラリーのような高組換え形成性構築物の安定性を維持するのに有用である。HPR1の突然変異は、高組換え形成性である。HDF1は、DNA末端結合活性を有し、二重鎖分裂修復およびV（D）J組換えに関与する。この突然変異を保有する株は、プロトプラスト融合か、またはエレクトロポレーションのいずれかによる任意ゲノムフラグメントの形質転換に有用である。Kar-1は、核合体を防止する優性の突然変異である。Kar-1突然変異体は、ドナーからレシピエント株への単染色体の指向性移入に有用である。この技術は、株間のYAC移入で広範に使用されており、そして他の生物への進化した遺伝子／染色体の移入においても有用である（Markie,YAC Protocols,Humana Press, Totowa, NJ, 1996）。HOT1は、rDNA反復配列のプロモーターおよびエンハンサー領域内のS.cerevisiae組換えホットスポットである。この遺伝子座は、おそらくその高レベル転写のため、隣接配列での有糸分裂組換えを誘発する。この領域の転写制御下で挿入された遺伝子および／または経路は、有糸分裂組換えを多く受ける。CDC2は、ポリメラーゼδをコードし、そして有糸分裂遺伝子変換に必要である。この遺伝子の過剰発現は、シャッフリングまたはミューテーター株で使用し得る。CDC4の温度感受性突然変異は、G1で、制限温度で細胞周期を停止させ、そしてこれを使用して、最適化融合とこれに続く組換えに対して、プロトプラストを同時に進行させ得るであろう。
糸状菌に関するように、酵母のシャッフリングを行う一般的な目的には、遺伝子操作の宿主生物として、および種々化合物の産生器官としての酵母の改善などが挙げられる。どちらの場合においても、所望の特性の一つは、酵母の異種タンパク質を発現および分泌する能力を改善することである。以下の実施例は、酵素を進化させて、増大した量のRnase Aを発現および分泌させるためのシャッフリングの使用を記載する。
ＲＮａｓｅＡは、ピリミジンヌクレオチドの後に特異的なＲＮＡの結合、Ｐ−０5の開裂を触媒する。この酵素は、各々触媒作用を必要とする８半のシスチン残基を有する塩基性１２４アミノ酸ポリペプチドである。ＹＥｐＷＬ−ＲＮａｓｅＡは、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲＮａｓｅＡの発現および分泌に影響するベクターであり、このベクターを保有する酵母は、培養培地（ｄｅｌＣａｒｄａｙｒｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８（３）：２６、１〜２７３（１９９５））１Ｌ当たり１〜２ｍｇの組換えＲＮａｓｅＡを分泌する。この全体の収量は、酵母において異種的に発現されるタンパク質のとしては少なく、そしてシャッフリングにより少なくとも１０〜１００倍に改良され得る。ＲＮａｓｅＡの発現は、いくつかのプレートおよびマイクロタイタープレートアッセイにより容易に検出される（ｄｅｌＣａｒｄａｙｒｅおよびＲａｉｎｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３、６０３１〜６０３７（１９９４））。全体のゲノムシャッフリングについて記載された各フォーマットは、ＹＥｐＷＬ．ＲＮａｓｅＡを保有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株のシャッフリングに使用され得、そして得られた細胞は、培地へのＲＮａｓｅＡの増加した分泌量の多いものについてスクリーニングされ得る。新たな株は、ＲＮａｓｅＡが十分に高いレベルで観察されるまで、シャッフリングフォーマットを通して再帰的にサイクルされる。ＲＮａｓｅＡの使用は、適正なフォールディングおよびジスルフィド結合の形成だけでなく、適正なグリコシル化も必要とするため、特に有用である。従って、発現系、フォールディング系および分泌系の多数の成分が最適化される。また、得られた株は、他の異種タンパク質分泌を改良するよう進化され得る。
酵母をシャッフリングする別の目的は、酵母のエタノールに対する寛容性を増加させることである。これは、エタノールの工業的生産、およびアルコール性のより強いビールおよびワインの生産の両方に有用である。シャッフリングされる酵母株は、優れたエタノール耐性を有することが公知または公知でない他種の酵母株との交換またはそれによる形質転換により、遺伝物質を獲得する。進化される株がシャッフリングされ、シャッフルされたもの（ｓｈｕｆｆｌａｎｔ）は、エタノール接触下での生存能についてスクリーニングされる。漸増濃度のエタノールが、続く回のシャッフリングに使用され得る。同じ原理が、浸透圧耐性を改良するために、パン酵母のシャッフリングに使用され得る。
シャッフリング酵母の別の望ましい形質は、所望の栄養条件下での増殖能である。例えば、これは、メタノール、デンプン、糖蜜、セルロース、セロビオースまたはキシロースのような、入手可能性に応じた低炭素源下で、酵母を増殖させるのに有用である。シャッフリングおよび選別の原理は、糸状菌について議論されたものと類似している。
別の望ましい形質は、糸状菌または細菌によって天然に産生される二次代謝産物の産生能である。このような二次代謝産物の例としては、シクロスポリンＡ、タキソール、およびセファロスポリンがあげられる。進化される酵母は、遺伝的変換を受けるか、または二次代謝物を産生する生物からのＤＮＡと形質転換がされる。例えば、タキソールを産生する真菌としては、Ｔａｘｏｍｙｃｅｓ  ａｎｄｒｅａｎａｅおよびＰｅｓｔａｌｏｔｏｐｉｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ（Ｓｔｉｅｒｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０、２１４〜２１６（１９９３）；Ｓｔｒｏｂｅｌら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４２、４３５〜４４０（１９９６））があげられる。また、ＤＮＡは、天然にタキソールを産生するＴａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａのような樹木からも得られ得る。タキソール経路、タキサジェン合成における酵素は、タキソール生合成における重要なステップを触媒すると考えられており、ボベラル（ｖｏｖｅｒａｌ）タキソール産生を制限制限すると見なされ得、この酵素をコードするＤＮＡはクローニングされている（ＷｉｌｄｕｎｇおよびＣｒｏｔｅａｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７１．９２０１〜４（１９９６））。次いで、このＤＮＡはシャッフルされ、シャッフルされたものは、二次代謝産物の産生についてスクリーニング／選別される。例えば、タキソールの産生は、タキソールに対する抗体の使用や、質量分光分析またはＵＶ分光分析によりモニターされ得る。あるいは、タキソール合成における中間体の数またはタキソール合成経路における酵素の産生がモニターされ得る（ＣｏｎｃｅｔｔｉおよびＲｉｐａｎｉ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ  ３７５、４１９〜２３（１９９４））。二次代謝産物の他の例としては、ポリオール、アミノ酸およびエルゴステロールがあげれられる。
別の望ましい形質は、酵母の凝集性（ｆｌｏｃｃｕｌｅｎｃｅ）を増加させて、エタノールの調製における分離を容易にすることである。酵母は、最大凝集塊を形成するシャッフルされた酵母についての選択とともに、上述の手順のいずれかによってシャッフルされ得る。
酵母プロトプラスト化の例示的手順
酵母のプロトプラスト調製は、ＭｏｒｇａｎによるＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂａｓｅｌ、１９８３）に概説される。新鮮な細胞（約１０8）は、緩衝液（例えば０．１Ｍリン酸カリウム）で洗浄され、次いで、５０ｍＭ  ＤＴＴのような還元剤を含む同じ緩衝液に再懸濁され、ゆっくりと攪拌しながら３０℃で１時間インキュベートされ、次いで、緩衝液で再度洗浄されて還元剤が除去される。次いで、これらの細胞は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ２３４（１ｍｇ／ｍＬ）のような細胞壁分解酵素、およびスクロース、ソルビトール、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ4、ＭｇＣｌ2またはＮＨ4Ｃｌのような種々の浸透圧安定剤のいずれかを、任意の種々の濃度で含む緩衝液に再懸濁される。次いで、これらの懸濁液は、ゆっくりと振盪しながら（約６０ｒｐｍ）３０℃で、プロトプラストが放出されるまでインキュベートされる。増殖性融合体を産生しやすいプロトプラストを調製するためのいくつかのストラテジーが可能である。
プロトプラストの形成は、プロトプラストの細胞周期が同期してＧ１で停止されている場合に増大され得る。これは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合、接合因子（ａまたはαのいずれか）の添加により達成され得る（ＣｕｒｒａｎおよびＣａｒｔｅｒ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２９、１５８９〜１５９１（１９８３））。これらのペプチドは、アデニル酸シクラーゼインヒビターとして働き、ｃＡＭＰの細胞内レベルを減少させることにより細胞周期をＧ１で停止する。さらに、性因子は、ａおよびα細胞の有性融合を行う際に細胞壁の弱体化を誘導することが示されている（ＣｒａｎｄａｌｌおよびＢｒｏｃｋ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．３２、１３９〜１６３（１９６８）；Ｏｓｕｍｉら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９７、２７〜３８（１９７４））。従って、プロトプラストの調製において、細胞は、接合因子あるいはレフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）またはＫ．ｌａｃｔｉｓのキラー毒素のような他の公知のアデニル酸シクラーゼインヒビターで処理されて、Ｇ１で停止され得る（Ｓｕｇｉｓａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０４、４６４〜４６６（１９８３））。次いで、プロトプラストの融合の後（工程２）、ｃＡＭＰは、再生培地に加えられて、Ｓ期およびＤＮＡ合成を誘導し得る。あるいは、ＣＤＣ４遺伝子において温度感受性変異を有する酵母株を使用が使用され得、その結果細胞が同期され、そしてＧ１で停止され得る。融合細胞が許容温度に戻された後、ＤＮＡ合成および増殖が再び行われる。
一旦好適なプロトプラストが調製されると、物理的または化学的手段によって融合を誘導する必要がある。各同数の細胞型のプロトプラストは、浸透圧安定剤（例えば、０．８Ｍ  ＮａＣｌ）およびＰＥＧ６０００（３３％ｗ／ｖ）を含むリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ５．８、２×１０8細胞／ｍＬ）内で混合され、次いで、３０℃で５ｍｍインキュベートされ、この間に融合が行われる。ポリオール、または水と結合する他の化合物が使用され得る。次いで、融合体が洗浄され、そして浸透圧が安定したＰＥＧ非含有緩衝液に再懸濁され、そして浸透圧が安定した再生培地に移され、ここで所望の形質について、細胞が選別またはスクリーニングされ得る。
６．人工染色体を用いたシャッフリング方法
酵母人工染色体（Ｙａｃ）は酵母ベクターであり、ここに、非常に大きなＤＮＡフラグメント（例えば５０〜２０００ｋｂ）がクローニングされ得る。（例えば、ＭｏｎａｃｏおよびＬａｒｉｎ、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２（７）、２８０〜２８６（１９９４）；Ｒａｍｓｅｙ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１（２）、１８１〜２０１（１９９４）；Ｈｕｘｌｅｙ、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．１６、６５〜９１（１９９４）；Ｊａｃｏｂｏｖｉｔｓ、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、４（８）、７６１〜３（１９９４）；ＬａｍｂおよびＧｅａｒｈａｒｔ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５（３）、３４２〜８（１９９５）；Ｍｏｎｔｌｉｕら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６、５７７〜８４（１９９４）を参照のこと）。これらのベクターは、テロメア（Ｔｅｌ）配列、セントロメア（Ｃｅｎ）配列、自律複製配列（ＡＲＳ）を有し、そして陽性選択遺伝子（例えば、ＴＲＰ１）および陰性選択遺伝子（例えば、ＵＲＡ３）を有し得る。２ＹＡＣは、他の酵母染色体が減数分裂および有糸分裂の両方を行うのと同様に維持、複製、分離し、これによりクローン化ＤＮＡが本当の減数分裂組換えに暴露されるための手段を提供する。
ＹＡＣは、インビボでの巨大なＤＮＡフラグメントのライブラリーのシャッフリングのためのビヒクルを提供する。シャッフリングための基質は、代表的には、２０ｋｂから２Ｍｂの大フラグメントである。フラグメントは、無作為のフラグメントであ得るか、または所望の形質がコードされていることが公知であるフラグメントであり得る。例えば、フラグメントは、抗生物質の産生に関与する遺伝子のオペロンを含み得る。また、ライブラリーは、全体のゲノムまたは染色体を含み得る。ウイルスゲノムおよびいくつかの細菌ゲノムは、単一のＹＡＣにインタクトにクローニングされ得る。いくつかのライブラリーにおいて、フラグメントが単一の微生物から得られる。他のライブラリーは、いくつかのライブラリーが異なる個体または種から得られるように、変異フラグメントを含む。フラグメント改変体はまた、変異の誘発により産生され得る。代表的には、フラグメント内の遺伝子は、酵母内の天然に関連する調節配列から発現される。しかし、あるいは、個々の遺伝子は、酵母の調節エレメントに連結されて、発現カセットを形成し得、そして異なる遺伝子を各々含有するこのようなカセットのコンカテマーが、ＹＡＣに導入され得る。
いくつかの場合において、フラグメントは酵母ゲノムに取り込まれ、そしてシャッフリングが使用されて、改良酵母株が進化される。他の場合において、シャッフリングプロセスを通じて、フラグメントはＹＡＣの成分として残存し、そしてＹＡＣ内の所望の形質の獲得後、所望のレシピエント細胞に移入される。
ａ．酵母株の進化法
フラグメントは、ＹＡＣベクターでクローニングされ、そして得られたＹＡＣライブラリーは、酵母コンピテント細胞に形質転換される。ＹＡＣ含有形質転換体は、ＹＡＣに存在する陽性選択マーカーについて選別することによって確認される。細胞は回復が可能になり、次いでプールされる。その後、細胞は、高栄養培地から細胞を、窒素および炭素制限培地に移すことにより胞子形成が誘導される。胞子形成過程において、細胞は減数分裂を行う。次いで、胞子を、高栄養培地に戻すことにより、接合が誘導される。必要に応じて、胞子は溶解されて、接合が刺激され得る。接合は、異なる挿入部を含有するＹＡＣ間、およびＹＡＣと天然酵母染色体間での組換えを生じる。後者は、胞子を紫外線で照射することにより促進され得る。組換えは、ＹＡＣにおけるフラグメントによって発現される遺伝子の結果として、または宿主遺伝子との組換えの結果としてのいずれか、あるいはその両方の結果として、新たな表現型を生じ得る。
ＹＡＣと天然酵母染色体間の組換えを誘導した後、ＹＡＣは、しばしば、ＹＡＣの陰性選択マーカーに対する選択によって排除される。例えば、マーカーＵＲＡ３を含有するＹＡＣは、５−フルオロオロト酸含有培地で増殖させることにより、選択され得る。残存する任意の外来または改変遺伝物質は、天然酵母染色体内に含有されている。必要に応じて、ＹＡＣの排除後、さらなる回の天然酵母染色体間の組換えが行われ得る。必要に応じて、同じまたは異なるＹＡＣライブラリーは、細胞に形質転換され得、そして上記ステップが繰り返される。
ＹＡＣの排除後、次いで、酵母は、所望の形質についてスクリーニングまたは選別される。この形質は、移入されたフラグメントにより付与された新たな形質（例えば、抗生物質の産生）であり得る。また、形質は、外来遺伝子発現または分泌する改良された能力、改良された組換え原性、温度または溶媒に対する改良された安定性、あるいは商品や研究対象として酵母株に要求される他の形質のような、酵母の改良された形質であり得る。
選別／スクリーニングで残った酵母株は、次いで、さらなる回の組換えに供される。組換えは、選別／スクリーニングで残った酵母の染色体間で独占的であり得る。あるいは、フラグメントのライブラリーは、酵母細胞に導入され得、そして先のように外来酵母染色体と組換えられ得る。このフラグメントのライブラリーは、前回の形質転換で使用されたライブラリーと同じであるかまたは異なり得る。ＹＡＣが先述のように排除され、続いてさらなる回の、さらなるＹＡＣライブラリーとの組換えおよび／または形質転換が行われる。組換えに続いて、上述のように、さらに選別／スクリーニングが行われる。さらなる回の組換え／スクリーニングが、酵母株が進化して所望の形質を獲得するまで、必要なだけ行われ得る。
ＹＡＣライブラリーの導入による酵母を進化させるための例示的な模式図は、図１０に示される。図の最初の部分は、内在性二倍体ゲノムおよび配列の改変を提示するフラグメントのＹＡＣライブラリーを含有する酵母を示す。このライブラリーは、細胞に形質転換されて、ＤＮＡ１μｇあたり１００〜１０００のコロニーを生じる。最も効率よく形質転換された酵母細胞は、単一のＹＡＣおよび内在性染色体を保有する。減数分裂は、窒素および炭素制限培地で増殖させることにより誘導される。減数分裂の過程で、ＹＡＣは、同じ細胞内の他の染色体と組換えを行う。減数分裂から生じる一倍体胞子は接合し、そして二倍体形態となる。二倍体形態は、組換え染色体を含有しており、一部は内在性染色体由来、一部はＹＡＣ由来である。必要に応じて、ＹＡＣは、ＹＡＣに存在する陰性選択マーカーに対する選択によって、細胞から除去され得る。ＹＡＣが選択されるかどうかに関わらず、次いで、細胞は、所望の形質についてスクリーニング／選別される。選別／スクリーニングで残った細胞は、別のＹＡＣライブラリーにより形質転換されて、別のシャッフリングサイクルを開始する。
ｂ．レシピエント細胞株に移入するためＹＡＣの進化方法
これらの方法は、部分的に、複数のＹＡＣが同じ酵母細胞に保有され得るという事実に基づいており、そしてＹＡＣ−ＹＡＣ組換えが起こることが公知である（ＧｒｅｅｎおよびＯｌｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０、９４〜９８（１９９０））。ＹＡＣ間組換えは、２０ｋｂを超えるフラグメントに存在する相同遺伝子ファミリーがインビボでシャッフルされ得るためのフォーマットを提供する。
ＤＮＡフラグメントの開始集団は、互いに配列類似性を示すが、例えば、誘導、対立遺伝子または種の多様性により異なっている。しばしば、ＤＮＡフラグメントは、共通の経路において機能する複数の遺伝子をコードすることが公知であるか、またはそうであると考えられている。
フラグメントは、Ｙａｃにクローニングされ、そして代表的には、形質転換体についての陽性選択により酵母に形質転換される。形質転換体は誘導されて胞子を形成し、その結果として、染色体は減数分裂を行う。次いで、細胞は接合される。得られた二倍体細胞の多くは、異なる挿入遺伝子を各々含有する２種のＹＡＣを含む。これらは、再び誘導されて、胞子が形成され、そして接合される。得られた細胞は、組換え配列のＹＡＣを保有する。次いで、細胞は、所望の形質についてスクリーニング／選別される。代表的には、このような選別は、シャッフリングに使用される酵母株を生じる。しかしながら、シャッフルされるフラグメントが酵母内で発現されない場合、ＹＡＣは単離され、そして適切な細胞型に移入され、ここでスクリーニングのために発現される。このような形質の例としては、所望の化合物の合成または分解、所望の遺伝子産物の分泌の増大、または他の検出可能な表現型があげられる。
選別／スクリーニングで残った細胞は、所望の表現型が観察されるまで、プール、胞子形成、接合および選別／スクリーニングの連続するサイクルに供される。組換えは、単に、細胞を、高栄養培地から窒素および炭素制限培地に移して胞子形成を誘導し、次いで胞子を高栄養培地に戻して接合を誘導することにより達成され得る。胞子は、溶解されて接合を刺激し得る。
ＹＡＣが所望の形質をコードするまで進化された後、これらは他の細胞型に移され得る。移入は、ＤＮＡが単離され得、そしてプロトプラスト融合または電気穿孔により再形質転換され得る。例えば、ＹＡＣの酵母から哺乳動物細胞への移入は、ＭｏｎａｃｏおよびＬａｒｉｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２、２８０〜２８６（１９９４）；Ｍｏｎｔｏｌｉｕら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６、５７７〜８４（１９９４）；Ｌａｍｂら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５、３４２〜８（１９９５）によって議論される。
酵母内でＹＡＣフラグメントライブラリーをシャッフリングするための例示的な模式図は、図１１に示される。遺伝子改変体を示すＹＡＣフラグメントのライブラリーは、二倍体内の在性染色体を含む酵母に形質転換される。形質転換酵母は、二倍体内在性染色体に加えて、単一のＹＡＣを含有し続ける。酵母は、減数分裂および胞子形成を行うように誘導される。胞子は一倍体ゲノムを含有し、このいくつかは、内在性酵母染色体のみを含み、そしていくつかは酵母染色体およびＹＡＣを含む。胞子は接合を誘導して、二倍体細胞を得る。二倍体細胞のいくつかは、異なる挿入遺伝子を保有する２つのＹＡＣ並びに二倍体内在性染色体を含む。細胞は再び、減数分裂および胞子形成を行うように誘導される。２種のＹＡＣを含む細胞では、組換えが挿入遺伝子間で起こり、そして組換えＹＡＣは子嚢細胞に分離される。従って、いくつかの子嚢細胞は、二倍体内在性染色体に加えて、組換え挿入遺伝子を含有するＹＡＣ染色体を含む。子嚢細胞は胞子に成熟し、再び接合させて二倍体細胞作製し得る。いくつかの二倍体細胞は、二倍体内在性染色体の二倍体相補体に加えて２種の組換えＹＡＣを含む。次いで、これらの細胞は、減数分裂、胞子形成および接合のさらなるサイクルを通じて得られ得る。各サイクルにおいて、ＹＡＣ挿入遺伝子間でさらに組換えが起こり、そして挿入遺伝子のさらなる組換体が形成される。一回または数回の組換えサイクルが行われた後、細胞は、所望の形質を獲得したか否かについて試験される。次いで、組換えのさらなるサイクル、続く選別は、同様の様式において行われ得る。
ｃ．非連結遺伝子をクローニングするためのＹＡＣの使用
ＹＡＣのシャッフリングは、詳細は、連結してはいないが機能的に類似する遺伝子のある種から別の種に移行を、特に、このような遺伝子が同定されていない場合に、特に影響されやすい。例えば、タキソールのようないくつかの商業的に重要な天然物質を得る場合である。代謝経路における遺伝子の異なる生物への移行は、このような物質を天然に産生する生物が大量培養にあまり適さないため、しばしば所望される。
このような遺伝子のクラスターは、有用な化合物を産生する生物からのＤＮＡの全ゲノムライブラリーを、ＹＡＣライブラリーにクローニングすることにより、単離され得る。次いで、このＹＡＣライブラリーは、酵母に形質転換される。酵母は、胞子形成および接合され、その結果ＹＡＣ間および／またはＹＡＣと天然酵母染色体間で組換えが起こる。次いで、選別／スクリーニングは、遺伝子の所望の収集物の発現のために行われる。遺伝子が、生合成経路をコードする場合、その経路の生成物の存在から発現が検出され得る。その経路における個々の酵素、または最終発現産物の中間体の産生、あるいはこのような中間体を代謝する細胞の能力は、合成経路の部分的な取得を示す。元のライブラリーまたは異なるライブラリーは、選別／スクリーニングで残った細胞に導入され得、そして所望の代謝経路の最終産物が産生されるまで、さらなる回の組換えおよび選別／スクリーニングが行われる。
７．結合媒介性遺伝子交換
結合は、細胞ゲノムの進化の過程で、いくつかの形式で使用され得る。ＤＮＡの結合性移行は、細胞間の接触する間に起こる。Ｇｕｉｎｅｙ（１９９３）、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｗｅｌｌ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）７５〜１０４頁；ＲｅｉｍｍａｎｎおよびＨａｓｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｗｅｌｌ編、Ｐｌｅｍｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３））１３７〜１８８頁を参照のこと（全ての目的のために、その全体を参考として援用する）。結合は、グラム陰性菌の多くの間で生じ、そしてある種のグラム陽性菌でも行われる。また、結合性移行は、細菌と植物細胞（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）または酵母間で行われることが公知である。同時係属出願中の事件整理番号（ａｔｔｏｒｎｅｙ  ｄｏｃｋｅｔ  ｎｏ．）１６５２８Ｊ−０１４６１２に記載のように、結合性移行を担う遺伝子は、それ自身、進化して、このような移行が起こり得る細胞型の範囲（例えば、細菌から哺乳動物）が拡張され得る。
結合性移行は、移行起点（ｏｒｉＴ）および隣接遺伝子（ＭＯＢ  Ａ、ＢおよびＣ）ならびに１５〜２５のｔｒａとよばれる、結合が生じるのに必要な構造および酵素をコードする遺伝子によりもたらされる。移行起点は、ＤＮＡ移行のためにシスの位置に必要な部位であると定義される。ｔｒａ遺伝子には、ｔｒａ  Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｖｉｒ  ＡＢ（対立遺伝子１〜１１）、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、ＩＨＦおよびＦｉｎＯＰがあげられる。ｔｒａ遺伝子は、ｏｒｉＴに対してシスまたはトランスの位置で発現され得る。他の細胞酵素（ＲｅｃＢＣＤ経路のもの、ＲｅｃＡ、ＳＳＢタンパク質、ＤＮＡジャイレース、ＤＮＡ  ｐｏｌＩおよびＤＮＡリガーゼを含む）もまた、結合性移行に関与している。ＲｅｃＥまたはｒｅｃＦ経路では、ＲｅｃＢＣＤを代用し得る。
ｔｒａ遺伝子にコードされる構造タンパク質の１つは、性線毛であり、これは、細胞表面から伸びる単一のポリペプチド凝集体から構築されるフィラメントである。性線毛は、レシピエント細胞の多糖類に結合し、そしてＤＮＡが移行し得る結合性架橋を形成する。このプロセスは、ＭＯＢ遺伝子にコードされた部位特異的ヌクレアーゼを活性化し、この酵素は、ｏｒｉＴに移行されるＤＮＡを特異的に切断する。次いで、切断されたＤＮＡは、他のｔｒａ酵素の作用により結合性架橋を通過する。
移動性ベクターは、エピソームの形態、または染色体に組み込まれて存在し得る。エピソーム移動性ベクターは、細胞間において、ベクターに挿入されたフラグメントを交換するのに使用され得る。一体型移動性ベクターは、染色体から隣接する遺伝子を移動させる場合に使用され得る。
ａ．ゲノムＤＮＡの交換を促進するための一体型移動性ベクターの使用
Ｅ．ｃｏｌｉのＦプラスミドを染色体に高頻度で組み込み、そして組み込んだ部位から一方向に遺伝子を移動させる（Ｃｌｅｗｅｌｌ、１９９３、前出；Ｆｉｒｔｈら、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２、２３７７〜２４０１（１９９６）；Ｆｒｏｓｔら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８、１６２〜２１０（１９９４））。他の移動性ベクターは、宿主染色体に高頻度で一体に組み込まれないが、特定の条件下での増殖により誘導され得る（例えば、変異誘発剤での処理、プラスミド複製のための非許容温度での増殖）。ＲｅｉｍａｎｎおよびＨａｓｓ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｗｅｌｌ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９３）６章を参照のこと。特に重要なものは結合性プラスミドＩｎｃＰ群であり、これは、広範囲の宿主によって代表される（Ｃｌｅｗｅｌｌ、１９９３、前出）。
結合性プラスミド（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｆ因子）の染色体挿入を保有するドナー「雄」細菌は、Ｆ因子を欠く（Ｆ-）レシピエント「雌」腸内細菌に、効率よく染色体ＤＮＡを供与し得る。ドナーからレシピエントへの結合性移行は、ｏｒｉＴで開始される。ニックされた一本鎖のレシピエントへの移行は、縦列染色体コピーの移動を許容する回路機構によって、５’から３’方向に生じる。レシピエントに侵入すると、ドナー鎖は断続的に複製される。直線状一本鎖ドナーＤＮＡ鎖は、レシピエント内でのｒｅｃＡ媒介性相同組換えの開始に強力な基質である。ドナー鎖とレシピエント染色体間の組換えは、ドナーの特質の遺伝継承を生じる。従って、Ｆの染色体コピーを保有する株はＨｆｒ（ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）と称される（Ｌｏｗ、１９９６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、２４０２〜２４０５頁；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２、２４０６〜２４１２（１９９６））。
一体型移動性ベクターを有する株の染色体ＤＮＡ移行能は、細菌の集団間の迅速で効率的な遺伝物質の交換手段を提供し、これにより、陽性変異の組合せおよび陰性変異の希釈を可能にする。このようなシャッフリング方法は、代表的には、少なくともいくつかの遺伝的多様性を備えた一体型移動性ベクターを有する株の集団を用いて開始する。遺伝的多様性は、天然の改変体、変異誘発剤への暴露、またはフラグメントライブラリーの導入の結果であり得る。細胞の集団は、選別せずに培養されて、遺伝的交換、組換え、および組換え遺伝子の発現を可能にする。次いで、細胞は、所望の形質を獲得した進化についてスクリーニングまたは選別される。次いで、選別／スクリーニングで残った集団は、Ｈｆｒ媒介性遺伝的交換または他のものによるさらなる回のシャッフリングに供され得る。
Ｈｆｒ、および結合性移行のレシピエントとしての一体型ｍｏｂベクターを有する他の株との天然の効率は、いくつかの手段によって改良され得る。天然Ｈｆｒ株の比較的低いレシピエント効率は、ＦのｔｒａＳおよびｔｒａＴ遺伝子産物に起因する（Ｃｌｅｗｅｌｌ、１９９３、前出；Ｆｉｒｔｈら、１９９６、前出；Ｆｒｏｓｔら、１９９４、前出；Ａｃｈｔｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３８、７７９〜７９５（１９８０））。これらの産物は、Ｆ+株の内膜および外膜にそれぞれ局在され、ここで、これらは、ともにＤＮＡが供与され得る２つの株間の過剰な接合を阻害するのに役立つ。ｔｒａＳおよびｔｒａＴならびに他の株のコグネイト遺伝子の効果は、これらの酵素を発現させ得ないノックアウト細胞の使用によって排除され得るか、または低炭素源で細胞を増殖させることにより低減され得る（Ｐｅｔｅｒｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８、３０３７〜３０４３（１９９６））。
いくつかの方法において、細胞の開始集団は、異なるゲノム部位で取り込まれる移動性ベクターを有する。ｏｒｉＴからの指向性移行は、代表的には、ｏｒｉＴに近接した部分の特質のより頻繁な継承を生じる。これは、接合対が不安定であり、そして分離する傾向にあり（特に液体培地内において）、移行が妨げられるためである。異なる部位の染色体交換で取り込まれる移動性ベクターを有する細胞集団では、よりランダムな様式を生じる。Ｈｆｒ株のキットは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｈ  ＣｅｎｔｅｒおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｆｒｏｓｔら、１９９４、前出）より入手可能である。あるいは、ランダムな部位および配向でｏｒｉＴを有する株のライブラリーは、ｏｒｉＴを保有するトランスポゾンを用いた変異誘発の挿入により生成され得る。トランスポゾン由来ｏｒｉＴ部位からの移動のための移行機能は、ヘルパーベクターにより提供され得る。
必要に応じて、一体化移動性ベクターを保有する株は、ミスマッチ修復遺伝子において不完全である。配列の非相同性から生じるドナーの特質の継承は、メチル化特異的ミスマッチ修復系を欠く株において増加する。
Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（これらはＤＮＡレベルで２０％分岐している）のような種間での遺伝子間接合性移行はまた、レシピエント株がｍｕｔＨ、ｍｕｔＬまたはｍｕｔＳである場合、可能である（Ｒａｙｓｓｉｇｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２、３９６〜４０１（１９８９）を参照のこと）。このような移行は、以下の実施例に示されるように、数カ所での組換えを行うために使用され得る。
実施例では、マップ位置０でｔｈｒ５５７、３３分でｐｙｒＦ２６９０、６２分でｓｅｒＡ１３、および４３分でｈｆｒＫ５のマーカーを有するＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  Ｈｆｒドナー株を使用する。ＭｕｔＳ  ＋／−、Ｆ−Ｅ．ｃｏｌｉレシピエント株は、２１分でｐｙｒＤ６８、５１分でａｒｏＣ３５、８５分でｉｌｖ３１６４、および５９分でｍｕｔＳ２１５のマーカーを有した。三栄養要求性Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  Ｈｆｒドナーおよび同質遺伝子型ｍｕｔＳ  ＋／−三栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉレシピエントは、３ｍＬのＬｂブロスに播種され、十分に増殖するまで３７℃で振盪された。１００μＬのドナーと各レシピエントは、１０ｍＬの新たなＬＢブロスと混合され、次いで、Ｎａｌｇｅｎｅ２５０ｍＬの再利用可能な（ｒｅｓｕａｂｌｅ）濾過装置を用いて、滅菌Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ０．４５μＭ  ＨＡフィルターに沈殿された。ドナーおよびレシピエント単独は、同様に希釈され、そして沈殿させて隔世遺伝についてチェックされた。細胞を含むフィルターは、細胞側を上にして、ＬＢ寒天培養皿の表面に置かれ、３７℃で一晩インキュベートされた。フィルターは、滅菌鉗子の補助で取り出され、５ｍＬの最小塩ブロスを入れた５０ｍＬ容滅菌管に入れられた。激しく攪拌して、細胞はフィルターから洗い流された。１００μｌの接合混合物、ならびにドナーおよびレシピエントコントロールは、生存細胞数計測のためＬＢ培地に塗布され、そして１箇所組換え体数計測のためレシピエントに必要な３種栄養素のうち２種、２箇所組換え体数計測のため必要な３種の栄養素のうち１種、または３箇所組換え体数計測のため必要な３種の栄養素のうち０種のいずれかで補充された最小グルコースに塗布された。培養皿は、４８時間３７℃でインキュベートされ、その後コロニー数が計測された。
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データは、Ｈｆｒの接合を用いて適当な頻度で組換えが生じ得ることを示している。遺伝間組換えは、メチル特異性ミスマッチ修復を欠くレシピエントでは、１００〜２００倍に増大する。
ｂ．接合によるフラグメントの導入
移動性ベクターはまた、フラグメントライブラリーを進化させる細胞への移行に使用され得る。このアプローチは、進化させる細胞が、フラグメントライブラリーによる直接的な形質転換は効率よく行われ得ないが、このフラグメントライブラリーで形質転換され得る一次細胞との接合は可能である場合に、特に有用である。
宿主細胞に導入されるＤＮＡフラグメントは、宿主細胞ゲノムに関連する多様性を有する。この多様性は、天然の多様性または変異誘発の結果であり得る。ＤＮＡフラグメントライブラリーは、移行の起源を有する移動性ベクターにクローニングされる。このようなベクターには、ｍｏｂ遺伝子を含むものもあり、あるいはこれらの機能はまた、トランスの位置で提供され得る。ベクターは、一次細胞と意図された宿主細胞間の効率的な結合性移行が可能であるべきである。ベクターはまた、選別可能な表現型を与えなければならない。この表現型は、進化した表現型と同じであり得るか、または薬剤耐性マーカーのようなマーカーにより付与され得る。好ましくは、ベクターは、意図された宿主細胞内で自己排除が可能であり、それにより、クローン化フラグメントが、複製でなく宿主の相同宿主セグメントとの遺伝的交換を行った細胞について選別が可能になるべきである。これは、意図された宿主型における複製機能の起源を欠くベクターの使用、またはベクターにおける陰性選択マーカーの封入により達成され得る。
適切なベクターとしての１つは、広範囲の細胞を宿主とする結合性プラスミドであり、これは、Ｓｉｍｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １、７８４〜７９１（１９８３）；ＴｒｉｅｕＣｕｏｔら、Ｇｅｎｅ  １０２、９９〜１０４（１９９１）；Ｂｉｅｒｍａｎら、Ｇｅｎｅ  １１６、４３〜４９（１９９２）に記載される。これらのプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換され得、次いで形質転換が困難または不可能な細菌に、コンピテンスの化学的または電気的導入によって、強制的に接合され得る。これらのプラスミドは、ＩｎｃＰプラスミドの起源ｏｒｉＴを含有する。移動機能は、染色体に組み込まれた必要遺伝子のコピーにより、トランスの位置に付与される。ＤＮＡの結合性移行は、いくつかの場合に置いて、レシピエントのペニシリンの準阻害性濃度での処置によって補助される（グラＴｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔら、１９９３、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０９、１９〜２３）。
ライブラリーフラグメントとの対立遺伝子交換が行われた細胞は、所望の表現型への進化についてスクリーニング／選別され得る。続く回の組換えは、結合性移行工程を繰り返すことにより、行われ得る。フラグメントのライブラリーは、新たに準備され得るか、または前回の選別／スクリーニングで残った細胞の一部（すべてではない）から得られ得る。結合媒介性シャッフリングは、他のシャッフリング方法と組み合わせられ得る。
８．形質導入ファージによる遺伝的組換えの促進
形質導入は、ある細胞から別の細へのウイルス殻内の非ウイルス性遺伝物質の移行である（Ｍａｓｔｅｒｓ、ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｃｅｌｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２、２４２１〜２４４２（１９９６））。おそらく一般化された形質導入ファージの２つの最もよい例は、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのバクテリオファージＰ１およびＰ２２でる。一般化された形質導入バクテリオファージ粒子は、溶菌的感染の際、宿主の同じ大きさのウイルス−ゲノム二本鎖フラグメント（これはドナーを提供する）染色体ＤＮＡがファージ頭部に封入される場合に、低頻度で形成される。わずかな配列特異性を有するＤＮＡを効率的に封入するバクテリオファージＰ２２の無差別的高形質導入（ＨＴ）変異体が単離されている。感受性の宿主の感染は、５０％までのファージが粒子に形質導入される溶菌液を生じる。一般化された形質導入粒子の感受性レシピエント細胞への吸着は、ドナー染色体フラグメントの感染を生じる。ドナーフラグメントへの注入後のＲｅｃＡ媒介性相同組換えにより、ドナーの特質が遺伝する。
一般化された形質導入ファージは、遺伝的多様性を有する細胞集団と、ファージにより感染されやすい細胞集団間での遺伝物質の交換に使用し得る。遺伝的多様性は、細胞間の天然の変化の結果、細胞の導入された変異、または細胞へのフラグメントライブラリーの導入であり得る。次いで、ＤＮＡは、一般化された形質導入により、細胞間で交換される。ファージが細胞の溶菌を生じない場合、全体の細胞集団をファージの存在下で増殖させ得る。ファージが溶菌性感染を生じる場合、形質導入は、分割プール基準に基づいて行われる。すなわち、細胞の開始集団は２種類に分類される。ある分集団は、形質導入ファージを調製するために使用される。次いで、形質導入ファージは、他の文集団に感染される。好ましくは、感染は、細胞が未感染のままでないよう、１細胞あたりファージの多重度で行われる。感染で残った細胞を増殖させ、所望の形質への進化についてスクリーニングまたは選別される。次いで、スクリーニング／選別で残った細胞は、さらなる回の一般化された形質導入により、または他のシャッフリング手法により、シャッフルされ得る。
上述の方法の効率は、感染性（非形質導入ファージ）により細胞の感染を低減させることにより、そして溶原菌形を低減することにより、増大され得る。前者は、クエン酸塩およびＥＧＴＡのような二価カチオンのキレート剤を培地に包含させることによって達成され得る。二価カチオンは、ファージ吸収およびキレート剤の包含に必要であり、これにより、不要な感染を防ぐ手段を提供する。一般化された形質導入ファージの組み込み不能（ｉｎｔ-）誘導体は、溶原菌形成を防ぐのに使用され得る。さらなる変動は、ミスマッチ修復遺伝子における欠損を有する宿主細胞は、形質導入ＤＮＡとゲノムＤＮＡ間の組換えの増大に使用され得る。
Ｖ．反復配列組換え法
反復配列組換え（時々、ＤＮＡシャッフリングまたは分子育種といわれる）のフォーマットおよび実施例のいくつかは、本発明者らおよび同僚により、継続出願中の出願整理番号１６５２８Ａ−０１４６１２（出願日１９９６年３月２５日）、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１２６（出願日１９９５年２月１７日、公開番号ＷＯ９５／２２６２５）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０、１５１０（１９９５）；Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇｅｎｅ、１６４、４９〜５３（１９９５）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３、５４９〜５５３（１９９５）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１、１０７４７〜１０７５１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０、３８９〜３９１（１９９４）；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２（１）：１〜３（１９９６）；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、３１５〜３１９（１９９６）（その各々を、全ての目的についてその全体を参考として援用する）に記載されている。
（１）インビトロフォーマット
インビトロでのシャッフリングのための１つのフォーマットは、図１に示される。組換えのための開始基質は、関連配列のプールである。図１パネルＡのＸ’は、配列分岐の位置を示している。配列は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、組換えまたは再集合される遺伝子またはＤＮＡフラグメントのサイズに依存する種々の長さであり得る。好ましくは、配列は５０ｂｐから５０ｋｂである。
関連基質のプールは、図１パネルＢに示されるように、例えば、約５ｂｐから５ｋｂ以上の重複フラグメントに変換される。しばしば、フラグメントの長さは、約１０ｂｐから１０００ｂｐであり、時々、約１００ｂｐから５００ｂｐである。変換は、多数の異なる方法（例えば、ＤＮＡアーゼまたはＲＮＡアーゼによる分解、ランダムシェアリングまたは制限酵素による限定分解）により行われ得る。あるいは、基質のフラグメントへの変換は、基質の不完全ＰＣＲ増幅または単一プライマーからプライムされるＰＣＲにより行われ得る。あるいは、適切な一本鎖フラグメントが、核酸合成装置により作製され得る。特定の長さおよび配列の核酸フラグメントの濃度は、しばしば、全核酸重量の０．１％または１％未満である。混合物中の異なる特異的核酸フラグメントの数は、通常、少なくとも約１００、５００または１０００である。
核酸フラグメントの混合集団は、少なくとも部分的に一本鎖の形態に変換される。変換は、約８０℃から１００℃、より好ましくは９０℃から９６℃に加熱することにより行われて、一本鎖核酸フラグメントが形成され、次いでアニーリングされ得る。また、変換はまた、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質またはｒｅｃＡタンパク質で処理することにより行われ得る。次いで、他の一本鎖核酸フラグメントと同一の配列領域を有する一本鎖核酸フラグメントは、２０℃から７５℃、および好ましくは４０℃から６５℃へ冷却することにより、アニーリングされ得る。再生は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、他の体積排除剤または塩の添加により加速され得る。塩の濃度は、好ましくは０ｍＭから２００ｍＭであり、より好ましくは１０ｍＭから１００ｍＭである。塩は、ＫＣｌまたはＮａＣｌであり得る。ＰＥＧの濃度は、好ましくは０％から２０％、より好ましくは５％から１０％である。再アニールされるフラグメントは、図１パネルＣに示されるように、異なる基質由来であってもよい。アニールされた核酸フラグメントは、ＴａｑまたはＫｌｅｎｏｗのような核酸ポリメラーゼ、あるいはｐｆｕまたはｐｗｏのようなプルーフリーディングポリメラーゼ、およびｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下でインキュベートされる。同一の配列領域が広い場合、Ｔａｑポリメラーゼが、４５〜６５℃のアニーリング温度で使用され得る。同一の配列領域が狭い場合、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼが、２０〜３０℃のアニーリング温度で使用され得る（Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）（前出））。ポリメラーゼは、アニーリング前、アニーリングと同時、またはアニーリング後に、ランダムな核酸フラグメント混合物に添加され得る。
異なる順列のフラグメントを含むポリヌクレオチドの収集物を作製するための、ポリメラーゼの存在下での、重複フラグメントの変性、再生およびインキュベーションのプロセスは、時々、インビトロでの核酸のシャッフリングといわれる。このサイクルは、所望の回数の間反復される。好ましくは、サイクルは、２〜１００回反復され、より好ましくは１０〜４０回反復される。得られる核酸は、図１パネルＤに示されるように、約５０ｂｐから約１００ｋｂ、好ましくは約５００ｂｐから約５０ｋｂの二本鎖ポリヌクレオチドである。集団は、それに対する実質的に配列同一性を示すが、数カ所で分岐している開始基質の変異体である。集団は、開始基質よりも多くのメンバーを有する。シャッフリングから得られるフラグメントの集団は、必要に応じてベクターにクローニングされた後、宿主細胞を形質転換するのに使用される。
インビボシャッフリングのバリエーションとして、組換え基質の結果は、不完全に伸長した増幅産物の実質的な画分（代表的には、少なくとも２０％以上）を産生せる条件下で、全長配列を増幅することにより、作製され得る。不完に伸長した増幅産物を含む増幅産物は、変性され、少なくとも１回、さらにアニーリングおよび増幅のサイクルを繰り返す。少なくとも１回のさらなるアニーリングおよび増幅サイクルに供される。このバリエーションは、「スタッタリング（ｓｔｕｔｔｅｒｌｉｎｇ）」と称される。続く増幅回において、不完全に伸長した増幅産物は、異なる配列関連テンプレート種とアニーリングし、そして伸長する。
さらに別のバリエーションでは、フラグメント混合物は、一種以上のオリゴヌクレオチドをスパイク（ｓｐｉｋｅ）される。オリゴヌクレオチドは、野生型配列の予め特徴付けられた変異、または固体または種間の天然の改変部位を含むよう設計され得る。また、オリゴヌクレオチドは、十分な配列または野生型フラグメントとのアニールを許容するような変異または改変を側方に有する構造相同性を含む。オリゴヌクレオチドはランダム配列であり得る。アニーリング温度は相同部の長さに依存して調整され得る。
さらにバリエーションでは、組換えは、テンプレートの転換（例えば、あるテンプレートプライマーに由来するＤＮＡフラグメントが、関連するが異なるテンプレートの相同位置で伸長する場合）により、少なくとも１回目のサイクルで起こる。テンプレートの転換は、ｒｅｃＡ、ｒａｄ５１、ｒａｄ５５、ｒａｄ５７または他のポリメラーゼ（例えば、ウイルスポリメラーゼ、逆転写酵素）を増幅混合物に添加することにより誘導され得る。また、テンプレートの転換は、ＤＮＡテンプレート濃度を増加させることにより、増加され得る。
さらに別のバリエーションでは、少なくとも１回の増幅サイクルは、関連配列かつ異なる長さの重複一本鎖ＤＮＡフラグメントの収集物を用いて行うことができる。フラグメントは、Ｍ１３のような一本鎖ＤＮＡファージを用いて行われ得る。各フラグメントは、収集物由来の第２フラグメントのポリヌクレオチド鎖伸長とハイブリダイズし、そして伸長し、従って、配列組換えポリヌクレオチドが形成される。さらに別のバリエーションでは、可変長であるｓｓＤＮＡフラグメントは、Ｖｅｎｔまたは他のＤＮＡポリメラーゼによって、第１ＤＮＡテンプレート上で、単一のプライマーから作製され得る。この一本鎖ＤＮＡフラグメントは、ウラシル含有環状ｓｓＤＮＡからなる第２Ｋｕｎｋｅｌ型テンプレートのプライマーとして使用される。このことは、第１テンプレートの第２への複数の置換を生じる（Ｌｅｖｉｃｈｋｉｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２９、５７２〜５７７（１９９５）を参照のこと）。
（２）インビボ形式
（a）プラスミド−プラスミド組換え
組換えのための最初の基質は、遺伝子の改変体形態を含むポリヌクレオチドの収集物である。改変体形態は、しばしば、基質間での相同組換えを可能にするのに充分な、互いに実質的な配列同一性を示す。ポリヌクレオチド間の多様性は、天然（例えば、対立遺伝子変異体または種変異体）、誘導（例えば、エラー傾向性PCR）、またはインビトロ組換えの結果であり得る。多様性はまた、代替のおよび／または混合したコドン使用を伴う天然タンパク質をコードする再合成遺伝子から生じ得る。基質間には、少なくとも、組換えによって、出発物質が存在するよりも多様な産物が生じ得る、十分な多様性が存在するはずである。少なくとも２つの部位で異なる少なくとも２つの基質が存在しなければならない。しかし、通常は、103〜108メンバーの基質のライブラリーが使用される。多様性の程度は、組み換えられている基質の長さおよび進化されるべき機能的変化の程度に依存する。0.1〜50％の間の位置での多様性が、代表的である。多様な基質が、プラスミドに取り込まれる。プラスミドは、しばしば、標準的なクローニングベクター（例えば、細菌のマルチコピープラスミド）である。しかし、以下に記載するいくつかの方法において、プラスミドは、動員機能を含む。基質は、同じまたは異なるプラスミドに取り込まれ得る。しばしば、異なるタイプの選択マーカーを有する少なくとも２つの異なるタイプのプラスミドが、少なくとも２つのタイプのベクターを含む細胞の選択を可能にするために用いられる。また、異なるタイプのプラスミドが用いられる場合、異なるプラスミドが、２つの別個の不適合な群から得られて、細胞内での２つの異なるプラスミドの安定な共存を可能にし得る。それにもかかわらず、同じ不適合な群由来のプラスミドが、相同組換えを生じさせるに十分な時間、同じ細胞内でなお共存し得る。
多様な基質を含むプラスミドは、任意のトランスフェクション法（例えば、化学的な形質転換、天然の反応能、エレクトロポレーション、ウイルス形質転換または微粒子銃）によって、原核細胞または真核細胞へ最初に導入される。しばしば、プラスミドは、飽和濃度（最大トランスフェクション能力に関して）またはその付近で存在して、同じ細胞への１つ以上のプラスミドが進入する確率を増大させる。種々の基質を含むプラスミドは、同時にまたは複数回、トランスフェクトされ得る。例えば、後者のアプローチにおいて、細胞はプラスミドの第１のアリコートでトランスフェクトされ得、トランスフェクタントは選択されそして増殖され、次いでプラスミドの第２のアリコートで感染され得る。
プラスミドが細胞内へ導入されると、組換え遺伝子を生成するための基質間の組換えは、単に細胞を増殖させることによって、複数の異なるプラスミドを含む細胞内で起こる。しかし、ただ１つのプラスミドしか受容していない細胞は、組換えを行えず、そして進化のためのこのようなプラスミドへの基質の潜在的な寄与が、充分利用されない（しかし、これらのプラスミドが変異細胞中で増殖される場合、ある程度まで寄与し得るか、またはさもなくば点変異を集積する（すなわち、紫外線照射によって））。進化の速度は、全ての基質に組換えを行わせることによって増加され得る。これは、トランスフェクトされた細胞をエレクトロポレーションに供することによって達成され得る。エレクトロポレーションの条件は、外来DNAを細胞に導入するために従来使用されている条件と同一である（例えば、1,000〜2,500ボルト、400μF、および１〜２mMギャップ）。これらの条件下で、プラスミドは、細胞間で交換され、これにより全ての基質が組み換えを行うことが可能になる。さらに、組換えの産物は、互いまたは元の基質とのさらなる回数の組換えを受け得る。進化の速度はまた、接合性転移（conjugative transfer）の使用によって増大され得る。接合性転移系は多くの細菌（E. coli、P.aeruginosa、S. pneumoniae、およびH. influenzae）において公知であり、そしてまた細菌と酵母との間または細菌細胞と哺乳動物細胞との間へDNAを転移させるために使用され得る。
接合性転移を利用するために、基質を、MOB遺伝子を有するプラスミド中にクローニングし、そしてtra遺伝子もまた、MOB遺伝子に対してシスまたはトランスで提供される。接合性転移の効果は、プラスミドが細胞間で移動することを可能にするという点で、エレクトロポレーションと非常に類似し、そして接合性転移の効果は、任意の基質と以前の組換えの産物との間での組換えを以前の組換えの産物との間での組換えを、単に培養物を増殖させることによって生じさせる。これらのベクターにおいて接合性転移がどのように活用されるかの詳細は、以下により詳細に議論される。進化の速度はまた、プラスミドまたは染色体の交換を誘発するための、細胞のプロトプラストの融合により増大され得る。融合はPEGのような化学薬剤、またはウイルスまたはウイルスタンパク質（例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素、HSV-1 gBおよびHSV-1 gD）により誘発され得る。進化の速度はまた、ミューテーター宿主細胞（例えば、Mut L、S、D、T、H；ヒト毛細管拡張性運動失調（Ataxia telangiectasia）細胞株）の使用により増大され得る。
細胞が増殖しそして組み換えが生じるための時間は、もちろん、細胞型とともに変化するが、一般には重要ではない。なぜなら、わずかな程度の組換えでさえ、出発物質に比較して多様性を実質上増大させるからである。組換え遺伝子を含むプラスミドを有する細胞は、所望の機能についてのスクリーニングまたは選択に供される。例えば、進化させつつある基質が薬物抵抗性遺伝子を含む場合、細胞は薬物抵抗性について選択される。スクリーニングまたは選択を生き残った細胞は、一回以上のスクリーニング/選択、続く組換えに供され得るか、またはさらなる回数の組換えに直接供され得る。
次の回の組換えは、前回とは無関係にいくつかの異なる形式によって達成され得る。例えば、組換えのさらなる回が、単に上記のプラスミドのエレクトロポレーションまたは接合媒介性細胞内転移を再開することによってなされ得る。あるいは、新鮮な基質（単数または複数）（前の基質と同じまたは異なる）は、選択/スクリーニングを生存する細胞にトランスフェクトされ得る。必要に応じて、新しい基質は、異なる選択マーカーを有するプラスミドベクターおよび／またはもとのプラスミドと異なる不適合なグループからのプラスミドベクターに含まれる。さらなる代替として、選択/スクリーニングを生存する細胞が、２つの亜集団に再分割され得、そして片方の亜集団由来のプラスミドDNAがもう一方にトランスフェクトされ得る。ここで、２つの亜集団からのプラスミド由来の基質はさらなる回数の組換えを受ける。後者の２つの選択肢のいずれかにおいて、進化の速度は、上記のように、DNA抽出、エレクトロポレーション、接合、またはミューテーター細胞の使用により増加され得る。なおさらなる改変では、スクリーニング/選択を生存する細胞由来のDNAは、抽出され得、そしてインビトロDNAシャッフルに供され得る。
第２回目の組換え後、第２回目のスクリーニング/選択が、好ましくはストリンジェンシーを増大させた条件下で行われる。所望であれば、さらなる回数の組換えおよび選択/スクリーニングが、第２回目と同じストラテジーを用いて行われ得る。連続回の組換えおよび選択/スクリーニングを用いて、生存する組換え基質は、所望の表現型を取得するように進化する。代表的には、反復組換えのこの方法および他の方法において、所望の表現型を獲得した組換えの最終産物は、出発物質と0.1％〜25％の位置で異なり、そして世代あたり10-9位置あたり約１つの変異の天然に獲得される変異の速度より何桁も速い（例えば、少なくとも10倍、100倍、1000倍または10,000倍）速度で進化していた（AndersonおよびHughes、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 906-907（1996）を参照のこと）。
（b）ウイルス−プラスミド組換え
プラスミド−プラスミド組換えのために用いられるストラテジーはまた、ウイルス−プラスミド組換え（通常は、ファージ−プラスミド組換え）にも使用され得る。しかし、ウイルスの使用に特有のいくつかのさらなる注釈が適切である。組換えのための最初の基質は、プラスミドおよびウイルスベクターの両方にクローニングされる。どの基質がウイルスベクターに挿入され、そしてどれがプラスミドに挿入されるかは、通常重要ではないが、通常ウイルスベクターは、プラスミド由来の異なる基質を含むべきである。以前のように、プラスミド（およびウイルス）は、代表的には、選択マーカーを含む。プラスミドおよびウイルスベクターは共に、上記のように、トランスフェクションによって細胞に導入され得る。しかし、より有効な手順は、プラスミドで細胞をトランスフェクションし、トランスフェクタントを選択し、そしてウイルスでトランスフェクタントを感染させることである。多くのウイルスの感染の効率は、細胞の100％にほぼ等しいので、この経路でトランスフェクトされそして感染されたほとんどの細胞は、異なる基質を有するプラスミドおよびウイルスの両方を有する。
相同組換えは、プラスミドとウイルスとの間で生じ、組換えプラスミドおよび組換えウイルスの両方を生成する。糸状ファージのような、細胞内DNAが二本鎖および一本鎖の形態の両方で存在するいくつかのウイルスについては、その両方が組み換えを行い得る。迅速に細胞を殺すウイルスでなければ、組換えは、エレクトロポレーションの使用または接合によって増大されて、細胞間でプラスミドを移動させる。組換えはまた、１つの細胞由来の子孫ウイルスを他の細胞に再感染させることによって、ウイルスのいくつかのタイプを増大され得る。いくつかのウイルスのタイプについては、ウイルス感染細胞は、重複感染に抵抗性を示す。しかし、このような抵抗性は、多重複度での感染により、および／または重複感染に対する抵抗性が低下しているウイルスの変異株を用いて克服され得る。
プラスミド含有細胞をウイルスで感染させた結果は、ウイルスの性質に依存する。いくつかのウイルス（例えば、糸状ファージ）は、細胞内でプラスミドと共に安定に存在し、そしてまた細胞から子孫ファージを排出させる。他のウイルス（例えば、コスミドゲノムを有するλ）は、プラスミドのように、子孫ビリオンを産生することなく細胞中に安定に存在する。他のウイルス（例えば、Ｔファージおよび溶解性λ）は、プラスミドとの組換えを受けるが、最終的には宿主細胞を殺しそしてプラスミドDNAを破壊する。宿主を殺すことなく細胞に感染するウイルスについては、組換えプラスミドおよびウイルスを含む細胞が、プラスミド−プラスミド組換えと同様のアプローチを使用して、スクリーニング/選択され得る。選択/スクリーニングを生存する細胞によって排出された子孫ウイルスはまた、採取されそして組換えの次回の基質として使用され得る。自らの宿主細胞を殺すウイルスについては、組換えから生じる組換え遺伝子は、子孫ウイルス中にのみ残る。スクリーニングまたは選択アッセイが、細胞中での組換え遺伝子の発現を必要とする場合、組換え遺伝子は、子孫ウイルスから他のベクター（例えば、プラスミドベクター）に移され、そして選択/スクリーニングが行われる前に、細胞に再トランスフェクトするべきである。
糸状ファージについては、組換えの産物は、組換えを生存する細胞およびこれらの細胞から排出されたファージの両方に存在する。組換え産物の二重供給源は、プラスミド−プラスミド組換えと比較して、いくつかのさらなる選択肢を提供する。例えば、DNAは、インビトロ組換えの回で使用するためにファージ粒子から単離され得る。あるいは、子孫ファージは、前回のスクリーニング/選択を生存する細胞、または組換えのための新鮮な基質でトランスフェクトされた新鮮な細胞を、トランスフェクトまたは感染させるために使用され得る。
（ｃ）ウイルス−ウイルス組換え
プラスミド−プラスミド組換えおよびプラスミド−ウイルス組換えについて記載した原理は、いくつかの改変を用いて、ウイルス−ウイルス組換えに適用され得る。組換えのための最初の基質は、ウイルスベクターにクローニングされる。通常、全ての基質について同じベクターが使用される。好ましくは、ウイルスは、本来、または変異の結果、細胞を殺さないウイルスである。挿入後、いくつかのウイルスゲノムは、通常インビトロでパッケージングされ得る。パッケージングされたウイルスは、高多重度で細胞を感染するために使用され、従って、細胞が異なる基質を保有する複数のウイルスを受容する確率は高い。
初回の感染後、次の工程は、前節で議論したような感染の性質に依存する。例えば、ウイルスが、λコスミドまたはM13、F1もしくはFdファージミドのようなファージミドゲノムを有する場合、ファージミドは、細胞内でプラスミドのように挙動し、そして単に細胞を増殖させることによって組換えを受ける。組換えは、細胞のエレクトロポレーションによって増大され得る。選択/スクリーニングに続いて、組換え遺伝子を含むコスミドは、生存する細胞から（例えば、cos-溶原性宿主細胞の熱誘導によって）回収され、インビトロで再パッケージングされ、そしてさらなる回の組換えのために多重複度で新鮮な細胞を感染させるために使用され得る。
ウイルスが糸状ファージである場合、複製形態のDNAの組換えは、感染させた細胞の培養物を増殖させることによって起こる。選択/スクリーニングによって、特性が改善された組換え遺伝子を有するウイルスベクターを、このような細胞から排出されたファージと共に含む細胞のコロニーが同定される。次の選択肢は、プラスミド−ウイルス組換えと本質的に同じである。
（ｄ）染色体−プラスミド組換え
この形式は、染色体およびプラスミドに保有される基質の両方を進化させるために使用され得る。この形式は、多くの染色体遺伝子が表現型に寄与する状況、または進化させるべき染色体遺伝子の正確な位置が不明である状況で、特に有用である。組換えのための最初の基質が、プラスミドベクターにクローニングされる。進化させる染色体遺伝子が既知である場合、基質は、高い程度の配列同一性を示すが、染色体遺伝子由来のいくらかの分岐も示す配列のファミリーを構成する。進化させる染色体遺伝子が位置づけされていない場合、最初の基質は、通常、ごく少数のみしか進化させるべき遺伝子（単数または複数）に対する配列同一性を示さないDNAセグメントのライブラリーを構成する。プラスミド保有基質と染色体遺伝子（単数または複数）との間の分岐は、変異誘発によって誘導され得るか、または染色体を保有する細胞の種とは異なる種からプラスミドが保有する基質を得ることによって誘導され得る。
組換えのための基質を保有するプラスミドは、進化させる染色体遺伝子（単数または複数）を有する細胞にトランスフェクトされる。進化は、単に培養物を増殖させることによって起こり得、そして接合またはエレクトロポレーションによって細胞間でプラスミドを転移させることによって加速され得る。進化は、ミューテーター宿主細胞の使用、またはミューテーター宿主細胞で進化させつつある非ミューテーター宿主細胞培養物の播種、およびエレクトロポレーションもしくは接合によりプラスミドの細胞内転移を誘導することによって、さらに加速され得る。好ましくは、播種に用いられるミューテーター宿主細胞は、進化させつつある非ミューテーター細胞の純粋な培養物の単離を容易にするために、ネガティブな選択マーカーを含む。選択/スクリーニングによって、所望の機能を獲得するように進化した染色体および／またはプラスミドを保有する細胞が同定される。
次の回の組換えおよび選択/スクリーニングは、プラスミド−プラスミド組換えについて記載した様式と同様の様式で進行する。例えば、さらなる組換えは、プラスミドのエレクトロポレーションまたは接合性転移と組み合わせて、組換えを生存する細胞の増殖によってなされ得る。あるいは、組換えのためのさらなる基質を保有するプラスミドが、生存する細胞に導入され得る。好ましくは、このようなプラスミドは、異なる不適合な群由来であり、そして元のプラスミドと異なる選択マーカーを保有し、少なくとも２つの異なるプラスミドを含む細胞の選択を可能にする。さらなる代替として、プラスミドおよび／または染色体DNAは、生存細胞の亜集団から単離され得、そして第２の亜集団にトランスフェクトされ得る。染色体DNAは、トランスフェクションの前に、プラスミドベクターにクローニングされ得る。
（ｅ）ウイルス−染色体組換え
上記の他の方法におけるように、ウイルスは、通常、細胞を殺さないウイルスであり、そしてしばしばファージまたはファージミドである。手順は、実質的にプラスミド−染色体組換えと同じである。組換えのための基質が、ベクター中にクローニングされる。次いで、基質を含むベクターが、細胞へトランスフェクトされるか、またはインビトロでパッケージングされ、そして感染によって細胞に導入され得る。ウイルスゲノムは、単に培養物を増殖させることによって、宿主染色体と組換えられる。進化は、エレクトロポレーションによりウイルスゲノムを細胞内転移させることによって、または子孫ビリオンによる細胞の再感染によって、加速され得る。スクリーニング/選択によって、所望の機能を獲得するように進化した染色体および／またはウイルスゲノムを有する細胞が同定される。
次の回の組換えについて、いくつかの選択肢が存在する。例えば、ウイルスゲノムは、エレクトロポレーションによる選択/組換えを生存する細胞間を転移させれ得る。あるいは、選択/スクリーニングを生存する細胞から排出されたウイルスはプールされ、そして多重複度で細胞を重複感染させるために使用され得る。あるいは、組換えのための新鮮な基質が、プラスミドまたはウイルスベクターのいずれかで、細胞内に導入され得る。
実施例
1.高組み換え形成性RecAの進化
RecAタンパク質はほとんどのE.coli相同組換え経路に関係する。recA中のほとんどの変異は、組換えを阻止するが、いくつかは組換えを増加することが報告されている（Kowalczykowskiら、Microbiol. Rev., 58, 401-465（1994））。以下の実施例はインビボシャッフル形式において有用である高組換え形成性活性を得るためのRecAの進化を記載する。
高組換え形成性RecAを、基質長および相同性の組換え頻度に対する効果を測定するために、Shenら、Genetics 112, 441-457（1986）；Shenら、Mol. Gen. Genet. 218, 358-360（1989）により開発された系の改変を使用して選択した。ShenおよびHuangの系は、そこでその二つが組換えし得る小さな（31から430bp）相同領域を有するプラスミドおよびバクテリオファージを使用した。限定宿主中で、プラスミド配列を組込んだファージのみがプラークを形成し得た。
recAをシャッフルするために、内因性recAおよびmutSを、MC1061宿主株から欠失させた。この株において、組換えはプラスミドとファージとの間にみられなかった。次いで、E.coli recAを、２つの組換えベクター（Bp221およびπMT631c18）中へクローン化した。クローン化したRecAを含むプラスミドを、相同ファージ：λV3（Bp221と430bpの同一性）、λV13（Bp221と430bpの範囲で89%の同一性）およびλlink H（18位の１つのミスマッチを除いて、πMt631c18と31bpの同一性）と組換えし得た。
次いで、クローン化されたRecAを、標準的DNase処理に続くPCRに基づく再構築を使用してインビトロでシャッフルした。シャッフルしたプラスミドを、組み換えしない宿主株中へ形質転換した。これらの細胞を、一晩増殖させ、ファージλVc、λV13またはλlink Hに感染させ、そしてMC1061欠失プラスミドの10倍過剰の存在下でNZCYMプレート上にプレートした。recA対立遺伝子がプラスミドとファージとの間の組換えをより有効に促進すればするほど、対立遺伝子はバクテリオファージDNA中により高度で現れる。従って、プレートから全てのファージを採集すること、およびrecA遺伝子を回収することによって、最高の組換え形成性recA対立遺伝子について選択する。
３回のシャッフル後の野生型および高組換え形成性RecAのプールについての組換え頻度は以下のようであった：
0004062366.tif 000003
これらの結果は、430bpの基質についての50倍の組換えの増加を示し、そして31bpの基質について５倍の増加を示す。
５つの個々のクローン単離体について、BP221とV3との間の組換え頻度を以下に示し、そしてそのDNA配列およびタンパク質配列ならびにその整列は図12および13に含まれる。
野生型    ：1.6×10-4
クローン２：9.8×10-3（61倍増加）
クローン４：9.9×10-3（62倍増加）
クローン５：6.2×10-3（39倍増加）
クローン６：8.5×10-3（53倍増加）
クローン13：0.019    （116倍増加）
クローン２、４、５、６および13は、recA中においてさらなる改良が所望される場合、次の回のシャッフルで基質として使用され得る。野生型recA配列由来の改変がすべて、高組換え形成表現型に必ずしも寄与しない。サイレント改変は、戻し交雑により除去され得る。あるいは、コドン５、18、156、190、236、268、271、283、304、312、317、345および353で野生型由来の個々の点の改変を組み入れているrecAの改変体を、活性について試験し得る。
２．高組換え形成性についての生物全体の進化
増加したレベルの組換えを有するE.coli株についての選択の可能性は、DNA鎖間架橋薬剤であるマイトマイシンＣへの曝露後の、野生型、ΔrecA、mutSおよびΔrecA mutS株の表現型から示される。
E.coliのマイトマイシンＣへの曝露は、DNAの鎖間架橋を生じ、それによって、DNA複製の抑制が生じる。E.coli中の鎖間DNA架橋の修復は、RecA依存的組換え修復経路を介して生じる（Friedbergら、DNA Repair and Mutagenesis（1995）191-232頁））。修復の間の架橋のプロセシングは時折、二本鎖DNA切断を生じる。これもまたRecA依存的組換え経路により修復される。従って、recA-株は、マイトマイシンＣ曝露に対して野生型株よりも有意により感受性である。実際、マイトマイシンＣは、RecA+株とRecA-株との間を区別するための単純ディスク（disk）感受性アッセイに使用される。
その組換え形成性特性に加えて、マイトマイシンＣは変異原である。マイトマイシンＣのようなDNA傷害剤への曝露は、代表的に、DNA傷害の複製のエラー傾向性修復に関与する産物を含むE.coli SOSレギュロンの誘導を生じる（Friedbergら、1995,前出、465-522頁にて）。
Δ（recA-srl）：：Tn10対立遺伝子（機能しない対立遺伝子）の野生型およびmutS E.coliへのファージP1媒介性全般的形質導入後に、テトラサイクリン抵抗性形質導入体を、マイトマイシンＣ感受性アッセイを使用してrecA-表現型についてスクリーニングした。野生型株およびmutS株の増殖が、ディスク中央から半径約10mmの領域内で抑制されたことが、10μgのマイトマイシンＣで飽和して37℃で48時間後に、1/4インチフィルターディスクを有するLBオーバーレイ中で観測された。高レベルのマイトマイシンＣでDNA架橋は組換え修復を飽和し、DNA複製の致死的妨害物を生じる。両方の株が、抑制区域内に偶発的コロニー形成単位を生じたが、コロニーの頻度はmutS株において約10〜20倍高かった。これは、多分、mutSバックグラウンドの自然変異の増加速度による。並行比較は、ΔrecA株およびΔrecA mutS株が、ディスク中央から約15mm広がる領域中で増殖が抑制され、マイトマイシンＣに対して有意により感受性であることを証明した。しかし、recA+株とは対照的に、Mitr個体は増殖抑制領域内にはみられず、mutSバックグラウンド中にさえみられなかった。recA+バックグラウンド中にあるが、ΔrecAバックグラウンド中にない、Mitrの出現は、Mitrが機能性RecAタンパク質に依存し、そしてMitrがマイトマイシンＣ誘導性傷害の組換え修復の能力の増加から生じ得ることを示唆する。
RecA媒介組換え修復の能力の増加を導く変異は、多様であり得、予測され得ず、連結され得ず、そして潜在的に相乗的であり得る。Mitrおよび染色体シャッフルについての選択を交代させる反復プロトコルは、組換えの能力の劇的な増加を伴って個々の細胞を進化させる。
反復プロトコルは次のようである。マイトマイシンＣへのmutS株の曝露に続いて、Mitr個体をプールし、そして例えば、Hfr媒介性染色体シャッフルまたはスプリットプール（split-pool）普遍形質導入を介して戻し交配する。Mitrを生じ、そして、おそらく組換え修復の能力の増加を生じる対立遺伝子は、ミスマッチ修復の非存在下で集団中でシャッフルされる。さらに、マイトマイシンＣへの曝露後のエラー傾向性修復は、次の回のシャフリングのための新しい変異を導入し得る。このプロセスは、マイトマイシンＣに対してますますよりストリンジェントな曝露を使用して繰り返される。最初の回の多くの並行選択は、種々の対立遺伝子を作製するための手段である。必要に応じて、単離物の組換え形成性を、プラスミド×プラスミドアッセイまたは染色体×染色体アッセイ（例えば、Konrad, J. Bacteriol. 130 167-172（1977）のアッセイ）を使用して、高組換えについてモニターし得る。
３．Streptomyces coelicolorのゲノム全体のシャッフル
ゲノム全体の反復変異および組換えが、特定の表現型を改良するために使用され得ることを証明するために、S. coelicolorは、青色色素γ-アクチノロジン（actinorhodin）の全体的な生成を改良するために単独でおよび密接な近縁株S. lividansと共にの両方で、反復してシャッフルされる。この株改良ストラテジーは、組換えを含まない同様の株改良プログラムと比較される。
S. coelicolorおよびS. lividansの胞子懸濁液を滅菌水中で再懸濁し、そしてStratalimker（Stratagene）を使用してUV変異誘発（600「エネルギー」単位）に供する。そして、得られた変異体を胞子形成アガー上で「増殖」させる。胞子を回収し、そして固体RG-2培地（Bystrykhら、J. Bact. 178, 2238-2244（1996））上へプレートする。コロニー産生性のより大きなまたはより暗色の青色色素の暈を選択し、液体RG-2培地中で増殖させ、そして産生したγ−アクチノロジン量をマイクロタイター形式を使用してアルカリ培養上清の650nmの吸光度を測定することにより分光学的に決定する。色素濃度および構造をLC/MS、MS/MSおよび／またはNMRによりさらに確認する。野生型よりも高いレベルでγ−アクチノロジンを産生する細胞は、株改良プログラムで増殖させる。各々の変異体から単離した胞子を、（1）上記（組換えコントロール無し）のように再び変異誘発させてそしてスクリーニングするか、または（2）増殖させ、プロトプラストとして調製し、そして融合させるかのどちらかである。Streptomycesプロトプラストを調製および融合するための手順は、Genetic Manipulation of Streptomyces--A Laboratory Manual,（Hopwood,D. A. ら）に記載される。次いで、再生され融合されたプロトプラストを、融合した細胞よりも高レベルでγ−アクチノロジンを産生する、組換えを受けたクローンについて、上記のようにスクリーニングする。選択されたクローンは、再度のUV変異誘発に供し、そしてこのスクリーニングおよび組換えを所望されるレベルのγ−アクチノロジン産生に到達するまで反復して繰り返す。
本発明の好ましい実施態様の上記の説明は、例示および説明の目的のために提供されている。これらは、網羅的でも、開示された詳細な形態に本発明を制限するものでもない。そして多くの改変および変更は、上記の教示の観点から可能である。当業者に明らかであり得るこのような改変および変更は、本発明の範囲内にあることが意図される。上記に引用される全特許文書および刊行物は、あたかも各々の項目が個々に表示されるように、同じ程度全ての目的についてそれら全体が参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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