(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジダ・ルゴサ由来の組換え型リパーゼ１により、下記式で表される基質を、水性媒体中で開裂させる段階を含んで成るＤ−もしくはＬ−メントールを製造する方法：
0004170624.tif 000016
［式中、Ｒは、未分枝もしくは分枝Ｃ1−Ｃ20−アルキル、またはＣ6−Ｃ14−アリールを表す］。
【請求項２】
前記基質が、Ｄ,Ｌ−安息香酸メンチル、Ｄ,Ｌ−酢酸メンチル、及びＤ,Ｌ−イソ吉草酸メンチルからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記基質が安息香酸メンチルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記開裂反応が、ｐＨ７でかつ２０〜６０℃の範囲の温度で行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記リパーゼが固定されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、Ｄ，Ｌ−メンチル誘導体に酵素によるエナンチオ選択的開裂を受けさせることでＬ−メントールを生じさせる方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
メントールを合成で製造する方法は一般に公知である（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｏｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ；Ｂａｕｅｒ，Ｋ．、Ｇａｒｂｅ，Ｄ．およびＳｕｒｂｕｒｇ，Ｈ．、Ｖｅｒｌａｇ  ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９０、第２版、４４−４６頁）。そのようにして得た生成物がラセミ混合物であると、それらは天然に存在するＬ−メントール、例えばペパーミント油に由来するＬ−メントールに比べて味および匂いが顕著に劣る。従って、Ｄ，Ｌ−メントールを分割する方法に多大な興味が持たれている。
【０００３】
この分割を例えば物理的方法を用いて達成することは可能である。そのような方法は、例えば光学的に活性なアミンとラセミ型フタル酸メチル水素もしくはこはく酸メチル水素の塩の分別結晶化を行うことを包含する。加うるに、ラセミ型メントール混合物を光学的に活性な酸、例えばメトキシ酢酸などでエステル化しそしてジアステレオマー化合物の混合物を結晶化で分離することを通して、Ｄ−もしくはＬ−メントールをラセミ型メントール混合物から分離することも可能である。そのようなジアステレオマーエステルに鹸化を受けさせることでＤ−もしくはＬ−メントールを得る。
【０００４】
光学的に高純度のＤ−およびＬ−メントールをＤ，Ｌ−メントール混合物から分離する目的で産業的に用いられているさらなる方法（ドイツ特許出願公開第２１０９  ４５６号）は、カルボン酸のメンチルエステルを中間体として経由して進行させる方法である。好適には、安息香酸エステルまたはヘキサヒドロ安息香酸エステルに加えて４−メチル安息香酸エステル、３，５−ジニトロ安息香酸エステルおよび４−エトキシ安息香酸エステルが用いられる。このような方法は光学対掌体を選択的に結晶化させる方法であり、これが実施可能なのは、前記光学対掌体がこれにさらなる処理をさらなる精製操作なしに受けさせることができるほど高い純度で得られる時である。
【０００５】
加うるに、酵素または微生物を用いてＬ−メントールをＤ，Ｌ−メントール混合物から単離することも可能である。
【０００６】
また、リパーゼを用いるとエステルが水性媒体中で加水分解を受けそして前記加水分解が非常に高い特異性および選択性を伴って起こり得ることも公知である。加うるに、ある種のリパーゼは、特定の有機溶媒中で相当する酸とアルコールからエステルを合成する逆反応に触媒作用を及ぼす能力も有する。
【０００７】
ラセミ型Ｄ，Ｌ−メントール混合物から高純度のＬ−メントールを得る目的でいろいろな方策が用いられてきた。このように、例えばＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、２７（１９８６）２９には、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）のリパーゼを用いるとラセミ型ラウリン酸メンチルが水性媒体中で加水分解を受けてＬ−メントールが優先的（ｅｅ：７０％）に放出されることが開示されている。このようなエナンチオ選択的優先性はまたラセミ型メントールをラウリン酸でエステル化する時にも見られ、Ｌ−ラウリン酸メンチルが高い鏡像異性体純度（ｅｅ：８６％）で生じる。リパーゼを非水性媒体中で用いてラセミ型メントールにラウリン酸によるエステル化をエナンチオ選択的に受けさせることも可能であり、その結果として、再び、Ｌ−ラウリン酸メンチルが優先的（ｅｅ：９５％）に生じる。この反応は本質的に１０時間で完了する。Ｄ，Ｌ−メントールとトリラウリンのエステル交換またはＤ，Ｌ−ラウリン酸メンチルとイソブタノールのエステル交換も同様に高いエナンチオ選択性を伴って進行するが、その変換速度は極めて低い（反応時間：１５日以上）。
【０００８】
また、反応を非水性媒体中で酵素の触媒作用下で実施することも知られているが、これは前記物質が水中で示す溶解度が劣る場合のみである。有機溶媒の代替として、超臨界液、特に超臨界二酸化炭素を用いることも可能である。このように、またＣｈｅｍｉｅ  Ｉｎｇｅｎｉｅｕｒ  Ｔｅｃｈｎｉｋ、６９（１９８６）２９にもＤ，Ｌ−メントールのラセミ混合物を分割すること、より正確には、いろいろな酢酸エステルとラセミ型メントールのエナンチオ選択的エステル交換による分割が開示されている。エノールエステルである酢酸イソプロペニルを用いた時に最良の結果が達成される。そのようなエステルは、反応が完了した後に行う加水分解で生じるアルコール（前記ケースではイソプロペニルアルコール）が直ちに異性化して相当するケトンが生じることで前記アルコールが如何なる逆反応にも利用されないと言った利点を有する。研究された酵素はカンジダ・ルゴサのリパーゼＡＹ、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）（以前はシュードモナス・セパシア）のリパーゼＰＳ、カンジダ・アンタルクチカ（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）ＢのＮｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）のリポチームＩＭ  ６０およびシュードモナス・マルギナタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｔａ）のエステラーゼＥＰ  １０である。
【０００９】
エステラーゼＥＰ  １０は、ＥＰ  １０エステラーゼの遺伝子を含有する組換え型大腸菌株から入手可能である。エステラーゼＥＰ  １０は系（ｓｙｓｔｅｍ）内ではるかに最高のエナンチオ選択性を示す。Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５は、選択した条件下で、いろいろな酢酸エステルを用いたエステル交換で実質的に全く変換を示さない。
【００１０】
カンジダ・ルゴサのリパーゼ（リパーゼＡＹ）がラセミ型メントールに対して示すエナンチオ選択性は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１、（１９９５）２７０の報告によれば、前記リパーゼをノニオン性界面活性剤で標的処理（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）しておくと有意に高くなり得る。そのような研究は、明らかに、ラウリン酸によるＬ−メントールのエステル化を有機媒体中で起こさせる時の効率が酵素に大きく依存することを示している。この反応でカンジダ・ルゴサのリパーゼが示す効果はリゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）、ブルクホルデリア・セパシア、シュードモナス種、ムコル・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｓｕ）、黒色アスペルギルスのリパーゼおよびブタの膵臓に由来するリパーゼが示す効果よりも有意に高い。加うるに、カンジダ・ルゴサのリパーゼをノニオン性界面活性剤で処理しておくと結果として前記リパーゼの効力が約５倍高くなることも分かっている。
【００１１】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３９、（１９９８）４３３３には、ブタ膵臓のリパーゼの場合にはマイクロ波照射を用いてもラセミ型メントールでパルミチン酸をエステル化する時の反応速度もエナンチオ選択率も全く変化しないことが開示されている。
【００１２】
リパーゼは、また、無水カルボン酸もアシル供与体として受け入れ得る。エノールエステルの場合に既に述べたように、無水カルボン酸はアシル転移が準不可逆的であると言った利点を有する。Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  ＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８、（１９９６）５３６によれば、カンジダ・ルゴサのリパーゼＡＹ−３０はラセミ型メントールと無水酢酸、無水プロピオン酸および無水酪酸の反応で特定のエナンチオ選択性を果たし得る。この酵素を用いて達成された最良の結果は、無水酪酸に関してｎ−ヘキサンを溶媒として用いて４８時間後である（ｅｅ：生じたＬ−酪酸メンチルは８６％）。
【００１３】
前記反応のエナンチオ選択性は使用するリパーゼおよび使用する無水物の両方に大きく依存する。このように、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４３、（１９９５）６３９には、カンジダ・ルゴサのリパーゼＯＦ  ３６０と無水プロピオン酸を用いた時に非常に高い光学純度（ｅｅ：９５％）のＬ−プロピオン酸メンチルが生じることが開示されている。
【００１４】
Ｄ，Ｌ−メントール混合物からＬ−メントールを得ることを可能にするさらなる方法は、ラセミ型エステル混合物を酵素でエナンチオ選択的に開裂させる方法である。このように、Ｄｅｃｈｅｍａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｃｏｎｆ．（１９８９）１４１には、カンジダ・ルゴサのリパーゼを用いてＤ，Ｌ−酢酸メンチルを加水分解反応させることが開示されているが、放出されたＬ−メントールは、むしろ、前記酵素のエナンチオ選択性が低いことを示している。
【００１５】
【発明の要約】
本発明の目的は、産業用途で用いるに適したＤ，Ｌ−メントールまたはそれの誘導体の分割を高い絶対的エナンチオ選択性を伴わせて起こさせて高純度のＬ−メントールもしくはＤ−メントールまたは高純度のＬ−メンチルエステルもしくはＤ−メンチルエステルを得ることにある。
【００１６】
Ｄ−もしくはＬ−メントールおよび誘導体を製造する方法を見いだし、この方法は、リパーゼを酵素として用いてＤ，Ｌ−メンチル誘導体をエナンチオ選択的に開裂させる（ｃｌｅａｖｅｄ）ことを特徴とする。
【００１７】
【発明の詳細な記述】
本発明の方法に従い、驚くべきことに、鏡像異性体過剰度（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  ｅｘｃｅｓｓ）（ｅｅ値）が９９％を越える鏡像異性体を＞１００の選択率（Ｅ値）で得る。
【００１８】
本発明の方法で用いるＤ，Ｌ−メンチル誘導体は、例えば式
【００１９】
【化１】
0004170624.tif 000002
【００２０】
［式中、Ｒは、水素、未分枝もしくは分枝Ｃ1−Ｃ20−アルキル、Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル、Ｃ6−Ｃ14−アリール、Ｃ7−Ｃ15−アリールアルキル、Ｃ1−Ｃ20−アルコキシ、Ｃ1−Ｃ20−アルキルアミノを表し、ここで、上述した炭化水素基は場合によりヒドロキシル、ホルミル、オキシ、Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ、カルボキシ、メルカプト、スルホ、アミノ、Ｃ1−Ｃ6−アルキルアミノまたはニトロまたはハロゲン、好適には塩素で一置換または多置換されていてもよい］
で表される化合物である。
【００２１】
好適なＤ，Ｌ−メンチル誘導体は脂肪族もしくは芳香族カルボン酸とＤ，Ｌ−メントールのエステルである。例えば、下記のエステルを挙げることができる：Ｄ，Ｌ−酢酸メンチル、Ｄ，Ｌ−安息香酸メンチル、Ｄ，Ｌ−イソ吉草酸メンチル。
【００２２】
特にＤ，Ｌ−安息香酸メンチルが好適である。
【００２３】
本発明の方法で用いるＤ，Ｌ−メンチル誘導体は本質的に公知である。
【００２４】
本発明の方法では一般にカンジダ・ルゴサのリパーゼを用いる。
【００２５】
また、組換え型ＤＮＡ技術（ヨーロッパ特許出願公開第２３８  ０２３号）を用いてリパーゼを産出させることができることも知られている。この場合、本分野の技術者に公知の方法を用いて、リパーゼをコード化する遺伝子を選択した株から受け入れ有機体に転移させる。この受け入れ有機体が前記リパーゼを産出する。
【００２６】
最も好適な態様では、支持材料に固定した組換え型リパーゼを用いる。適切な支持材料は、例えばプラスチック、例えばポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリアクリレート、ラテックス、ナイロンまたはＴｅｆｌｏｎなど、多糖類、例えばアガロースまたはデキストランなど、イオン交換樹脂（カチオン性およびアニオン性の両方）、シリコン重合体、例えばシロキサンなど、またはケイ酸塩、例えばガラスなどである。酵素を固定する方法は本分野の技術者に公知（Ｋ．Ｍｏｓｂａｃｈ、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９７６）であり、当該支持材料に架橋、吸着または共有結合させることを包含する。
【００２７】
また、カンジダ・ルゴサのリパーゼは市販されており、例えばリパーゼＡＹ（供給業者：Ａｍａｎｏ、名古屋、日本）である。
【００２８】
驚くべきことに、本発明の好適な形態では、カンジダ・ルゴサの組換え型リパーゼ（ＷＯ  ９９／１４３３８）を用いてＤ，Ｌ−安息香酸メンチルに加水分解を受けさせるとこれは非常に高いエナンチオ選択率（Ｅ＞１００）および＞９９．９％の（−）−メントール鏡像異性体過剰度で進行することを見いだした。この結果をガスクロ分析、ＮＭＲ分光測定および旋光測定で実証した。
【００２９】
カンジダ・ルゴサの２種類のリパーゼ（市販品および組換え型）が異なる加水分解挙動を示すことは、市販調合物には所望酵素ばかりでなくいくらか異なる特性を示す多数種のイソ酵素も入っている可能性があることで説明可能である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験の結果、使用した組換え型リパーゼが示した蛋白質帯は１つのみ（ＷＯ  ９９／１４３３８参照）であるがリパーゼＡＹは複数の蛋白質帯を示すことが分かった。
【００３０】
本発明の方法で用いる溶媒は一般に水、緩衝剤水溶液および有機溶媒であり得る。好適に用いる有機溶媒はヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、シクロヘプタン、トルエン、ジクロロメタン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラヒドロフランまたはエタノールである。好適に用いる緩衝剤水溶液は燐酸塩緩衝液または酢酸塩緩衝液である。
【００３１】
本発明の方法では、前記リパーゼをメンチル誘導体０．００１ミリモルを基準にして一般に１から１００００単位（Ｕ）、好適には１０から１０００単位（Ｕ）用いる。
【００３２】
本発明の方法に従う開裂を一般に０から９０℃、好適には２０から６０℃の範囲の温度で実施する。
【００３３】
本発明の方法に従う開裂を一般に１から１２の範囲のｐＨ、好適には約ｐＨ７で実施する。
【００３４】
本発明の方法は例えば下記の如く実施可能である：１番目の段階で、ＷＯ  ９９／１４３３８に類似した様式で発酵装置内で酵素を産出させる（実施例１を参照）。２番目の段階で、その結果として生じたリパーゼに精製を受けさせる（実施例１参照）。３番目の段階で、酵素を用いてメンチル誘導体に開裂を受けさせる（実施例３参照）。
【００３５】
このようにして生じさせた高純度のメントール鏡像異性体は高い分析および知覚要求に従う。
【００３６】
【実施例】
実施例１
フェド−バッチ（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）発酵ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）
ベクター：ｐＧＡＰ［インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］
プラスミド：Ｌｉｐ  １（カンジダ・ルゴサのリパーゼ）
発現：構成性（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）
発酵
４２  ｌの生反応装置（Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いてフェド−バッチ発酵をｐＨが６で３０℃の複合培地中で実施した。前記培地は酵母抽出液を１％とペプトンを２％とグリセロールを１％と燐酸Ｋ緩衝液を０．１Ｍ含有していてｐＨ６であった。純粋なグルコース供給材料用供給溶液はグルコース含有量が２０％の溶液でありそして混合供給材料用供給溶液はグルコース含有量が２０％でグリセロール含有量が５％の溶液であった。前記生反応装置に上述した培地中で一晩振とうしたＯＤ600が２から３の培養物を５００ｍｌ接種した。撹拌機の速度を４００ｒｐｍにしてばっ気速度を１５  ｌ（ＳＴＰ）／分にした。発酵中に６００ｎｍの所の光学密度、湿った状態のバイオマス物（ｂｉｏｍａｓｓ  ｗｅｔ  ｍａｔｔｅｒ）（ＢＷＭ）、乾いた状態のバイオマス物（ＢＤＭ）および上澄み液の脂肪分解活性を測定した。前記供給溶液の供給を３００から６００ｍｌの量で行い、１回目の供給を２４時間後に行った後に１２時間毎に行った。前記混合供給材料の供給開始は７２時間の時であった。発酵を１７０から１９０時間で終了させた。
【００３７】
以下に記述する処理を受けさせた後の凍結乾燥濃縮物が示した活性は１ｇ当たり４０，０００Ｕであった。全収量は２１ｇの乾燥物であった。
複合培地中で培養したＣＲＬ（カンジダ・ルゴサのリパーゼ）の精製
成熟したカンジダ・ルゴサはピキア・パストリスによって活性形態のリパーゼを前記培地の中に分泌するが、ＳＤＳゲルを調製して分析した結果、上澄み液にまだ蛋白質が混入して存在していることが分かった。従って、組換え型リパーゼから不純物を除去する精製プロトコルを開発した。
【００３８】
次に行う精製段階を邪魔する塩類を除去する目的で、５０ｍｌの発酵上澄み液を交差流濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ：０．２μｍ）した後、これに透析［Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（商標）透析管］を受けさせた。次に、３０ｋＤの膜（Ｐａｌｌ、Ｏｍｅｇａ  Ｍｉｎｉｓｅｔｔｅ、ＭＷ：３０，０００）を用いて前記リパーゼ溶液を限外濾過することで、それのさらなる濃縮を行った。ＦＰＬＣカラムにＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを充填し、このカラムを２５ｍＭのトリス（ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡状態にした後、前記リパーゼ溶液を加えた。平衡用緩衝液を用いた洗浄段階後、ＮａＣｌ勾配を用いて前記リパーゼを溶離させた。ｐＮＰＰ迅速試験（以下を参照）を用いて、それらの画分をリパーゼ活性に関して試験した。黄色の着色を示した画分を一緒にし、限外濾過し、凍結乾燥（Ｆｉｎｎ  Ａｑｕａ  Ｌｙｏｖａｃ  ＧＴ２）させた後、ｐＨスタット（ｐＨスタット）で脂肪分解活性を測定した。この精製プロトコルを表１に要約する。
【００３９】
【表１】
0004170624.tif 000003
【００４０】
酵素アッセイ
ｐＨスタット（Ｍｅｔｒｏｈｍ）を用いて活性をｐＨ７．２で常規通り測定した。
【００４１】
６６ｍＭのトリブチリンを２０ｍｇ／ｍｌのアラビアゴム安定剤と一緒に乳化させた後、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（Ｔ２５、Ｊａｎｋｅ  ＆  Ｋｕｎｋｅｌ）を最大速度で用いて７分間均一にした。
【００４２】
アッセイ溶液（ａｓｓａｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を２０ｍｌ仕込んだ後、前記酵素溶液を１０から１００μｌ加えた。次に、ｐＨスタットを用いて活性を測定した。１単位を、脂肪酸を１分当たり１μモルの量で放出する酵素の量として定義する。
ｐＮＰＰ迅速試験
多数のサンプルを迅速に試験することができるように迅速試験を用いた。溶液Ａはイソプロパノールに溶解しているパルミチン酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ、１０ｍＭ）から成る。溶液Ｂはトリス緩衝剤（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）とコレート（ｃｈｏｌａｔｅ）［０．８％（重量／体積）］とアラビアゴム［１％（重量／体積）］から成る。反応混合物を９部の溶液Ｂと１部の溶液Ａで構成させるが、これを常に新しく生じさせるべきである。ピペットを用いて試験下の溶液（５０μｌ）をミクロタイタープレートに入れた後、反応混合物（２００μｌ）を加えた。基質が開裂を起こすことで生じる黄色を目で推定するか或は分光測定で量化した。
【００４３】
実施例２
安息香酸メンチルの抽出に関する予備実験
Ｄ，Ｌ−安息香酸メンチルに加水分解をアラビアゴム［０．２％（ｍ／ｖ）］が安定剤として入っている燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２、１００ｍＭ）中で受けさせた。次に、この反応混合物をガスクロ分析にかけるにはそれを適切な溶媒で抽出する必要があった。
【００４４】
適切な溶媒を決定する目的で、Ｄ，Ｌ−安息香酸メンチルとＤ，Ｌ−メントールを等モル量でイソオクタンに溶解させることでシグナル面積比［安息香酸メンチル／メントール］の標準を得た。ガスクロ測定で得たシグナル面積比［安息香酸メンチル／メントール］は１．７であった。
【００４５】
次に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去した後、その残留物を１０ｍｌの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２、１００ｍＭ）で取り上げて、これにアラビアゴム［０．２％（ｍ／ｖ）］を添加し、この混合物を１０分間均一にした後、各場合とも１ｍｌの分量でプラスチック製反応容器に加えた。この混合物を４０℃で１時間インキュベートした後、いろいろな溶媒（各々５００μｌ）の層で覆って振とうしながら１時間抽出した。表２に、ＧＣ測定に従って得たシグナル面積比［安息香酸メンチル／メントール］を示す。
0004170624.tif 000004
従って、安息香酸メンチルとメントールの抽出で用いるに酢酸エチルが最も適切な溶媒であることが分かった。
【００４６】
実施例３
カンジダ・ルゴサに由来する組換え型リパーゼ（組換え型ＣＲＬ）を用いたＤ，Ｌ−安息香酸メンチルの加水分解
反応を各場合ともアラビアゴムを安定剤として０．２％（ｍ／ｖ）用いた１ｍｌの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２、１００ｍＭ）中で４０℃で実施した。用いた酵素の量は各場合ともＤ，Ｌ−安息香酸メンチル０．０１ミリモル当たり４００Ｕの精製カンジダ・ルゴサリパーゼであった。メントールの鏡像異性体過剰度をガスクロで測定しそして安息香酸メンチルのそれをシグナル面積を基礎に計算した。
【００４７】
【表２】
0004170624.tif 000005
【００４８】
表３は、カンジダ・ルゴサに由来する組換え型リパーゼが選択した反応条件下でＤ，Ｌ−安息香酸メンチルの加水分解に関して示すエナンチオ選択率は非常に高い（Ｅ＞１００）ことを示している。
【００４９】
実施例４
Ｄ，Ｌ−安息香酸メンチルに加水分解を受けさせる時の最適な温度の決定
表４に、Ｄ，Ｌ−安息香酸メンチルに加水分解をいろいろな温度で受けさせた時の結果を要約する。この反応を各々アラビアゴムが安定剤として０．２％（ｍ／ｖ）入っている１ｍｌの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２、１００ｍＭ）中で実施した。最適な温度を決定する目的で３０℃、４０℃、５０℃および６０℃の反応温度を選択した。用いた酵素の量は各場合ともＤ，Ｌ−安息香酸メンチル０．０１ミリモル当たり８００Ｕの精製カンジダ・ルゴサリパーゼであった。メントールの鏡像異性体過剰度をガスクロで測定しそして安息香酸メンチルのそれを計算した。
【００５０】
【表３】
0004170624.tif 000006
【００５１】
表４は、Ｄ，Ｌ−安息香酸メンチルに加水分解を受けさせる時の最適な温度は５０℃であることを示している。反応を６０℃で行っても反応性が更に向上することはないことを観察した。両方の温度とも、用いた条件下で４時間後と言った早い時期に変換率が５０％になる、従って、所望安息香酸メンチル鏡像異性体の変換が完了することを確認した。
【００５２】
実施例５
組換え型カンジダ・ルゴサリパーゼと市販リパーゼの間の比較
Ｄ，Ｌ−安息香酸メンチルの加水分解に関する実験を、ここまで、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔにおいて組換え技術で産出させて精製したカンジダ・ルゴサリパーゼ（Ｂｒｏｃｃａ  １９９８）を用いて実施してきた。
【００５３】
加うるに、以下に記述する市販リパーゼもラセミ型安息香酸メンチルに対する立体選択性に関して広範に試験した：カンジダ・ルゴサの市販リパーゼ（Ａｍａｎｏ  ＡＹ）、ブルクホルデリア・セパシアの市販リパーゼ（以前はシュードモナス・セパシア；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｅｎｚｅｒｇ；Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ  Ｌ−１）、リゾムコル・ミエヘイの市販リパーゼ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｅｎｚｅｒｇ；Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ  Ｌ−９）およびリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の市販リパーゼ（Ａｍａｎｏ  Ｆ）。表５に、リゾムコル・ミエヘイのリパーゼを用いてＤ，Ｌ−安息香酸メンチルを４０℃で１６時間の反応時間反応させた時の結果を示す。生成物の鏡像異性体過剰度は２％のみであり、このことは、エナンチオ選択率が非常に低いことを意味している。
【００５４】
【表４】
0004170624.tif 000007
【００５５】
ブルクホルデリア・セパシアのリパーゼもリゾプス・オリザエのリパーゼも１６時間の反応時間では全く変換を示さなかった。
【００５６】
表６に、Ａｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（名古屋、日本）から商業的に入手可能なカンジダ・ルゴサリパーゼを用いたＤ，Ｌ−安息香酸メンチルの加水分解を示す。この反応を４０℃および５０℃で実施した。
【００５７】
【表５】
0004170624.tif 000008
【００５８】
表６は、市販のカンジダ・ルゴサリパーゼが示す活性は高いがまた安息香酸メンチルに対するエナンチオ選択性は非常に低いことも示している。
【００５９】
実施例６
組換え型カンジダ・ルゴサリパーゼを用いたＤ，Ｌ−安息香酸メンチルの加水分解−調製バッチ
反応式：
【００６０】
【化２】
0004170624.tif 000009
【００６１】
手順：
５００ｍｌの丸底フラスコに入れた２５０ｍｌの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１００ｍＭ）にＤ，Ｌ−安息香酸メンチルを２．１ｇ（８ミリモル）懸濁させた後、精製組換え型カンジダ・ルゴサリパーゼを５ｇ加えた。激しい撹拌を行いながら反応を４０℃で２０時間実施した。この反応過程の後、それを薄層クロマトグラフィーにかけた。次に、この反応混合物をトルエン（２５０ｍｌ、２ｘ１００ｍｌ）で抽出し、有機相を一緒にしてＮａ2ＳＯ4で乾燥させた後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。
【００６２】
残存する若干黄色がかった反応混合物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）で精製した。比率が１０：１の石油エーテル／酢酸エチルを可動相として用いた。
収量：
（−）−メントールを２５５ｍｇ（１．６ミリモル、２０．０％）の収量および安息香酸メンチルを４２１ｍｇ（１．６ミリモル、２０．０％）の収量で得た。
特徴付け：
回転角の測定：
メントール：
［α］20D＝−５１．３                    ［α］20D＝−５０±１
（ｃ＝１．００、ＣＨ2Ｃｌ2）
安息香酸メンチル：
［α］20D＝＋８６．３                    ［α］20D＝＋８４．５
（ｃ＝１．００、ＣＨ2Ｃｌ2）            （ｃ＝１．００、ＣＨ2Ｃｌ2）
ＮＭＲ分光測定：
メントール
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００．１ＭＨｚ）ＴＭＳに対比させたδ：０．８１（ｄ；Ｊ＝６．９；３Ｈ）；０．９２（２ｄ；６Ｈ）；０．９７（ｄ、１Ｈ）；１．１０（ｄ；Ｊ＝１０．２；１Ｈ）；１．４０−１．４７（ｍ；２Ｈ）；１．５９−１．６７（ｍ；２Ｈ）；１．９６（ｄ、１Ｈ）；２．１７（ｍ；１Ｈ）；３．４２（ｄｔ；Ｊ＝１０．４、４．１；１Ｈ）。
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１２５．８ＭＨｚ）ＴＭＳに対比させたδ：１６．１０；２１．０３；２２．２３；２３．１５；２５．８３；３１．６６；３４．５６；４５．０６；５０．１５；７１．５４。
安息香酸メンチル：
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００．１ＭＨｚ）ＴＭＳに対比させたδ：０．８０（ｄ；Ｊ＝７．０；３Ｈ）；０．９２（２ｄ；Ｊ＝５．２、４．７；６Ｈ）；１．０８−１．１９（ｍ；２Ｈ）；１．５３−１．５８（ｍ；２Ｈ）；１．７０−１．７５（ｍ；２Ｈ）；１．９３−２．００（ｍ、１Ｈ）；２．１１−２．１５（ｍ、１Ｈ）；４．９４（ｄｔ；Ｊ＝１０．９、４．４；１Ｈ）、７．４１−７．５６（ｍ；３Ｈ）；８．０４（ｔ；２Ｈ）。
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１２５．８ＭＨｚ）ＴＭＳに対比させたδ：１６．５２；２０．７８；２２．０５；２３．６４；２６．５０；３１．４５；３４．３４；４０．９８；４７．２９；７４．８２；１２８．２９；１２９．５６；１３０．８８；１３２．６８；１６６．０９。
ガスクロマトグラフィー：
メントール：≧９９．９％ｅｅ
実施例７
Ｄ，Ｌ−酢酸メンチルの加水分解
表７に、Ｄ，Ｌ−酢酸メンチルの加水分解の結果を要約する。この反応をアラビアゴムを安定剤として０．２％（ｍ／ｖ）含有させた燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２、１００ｍＭ）中で実施した。最適な温度を決定する目的で４０℃、５０℃および６０℃の反応温度を選択した。使用した酵素の量は各場合ともＤ，Ｌ−酢酸メンチル０．００１ミリモル当たり８００Ｕの精製カンジダ・ルゴサリパーゼであった。鏡像異性体過剰度をガスクロで測定した。
【００６３】
【表６】
0004170624.tif 000010
【００６４】
表７は、カンジダ・ルゴサの組換え型リパーゼは選択した反応条件下でＤ，Ｌ−酢酸メンチルの加水分解に関して高いエナンチオ選択性を示すことを表している。
【００６５】
比較の目的で、Ａｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（名古屋、日本）から商業的に入手可能なカンジダ・ルゴサリパーゼ（Ａｍａｎｏ  ＡＹ）を用いてＤ，Ｌ−酢酸メンチルに加水分解を受けさせた（表８）。この表は、前記市販調合物がＤ，Ｌ−酢酸メンチルに対して示すエナンチオ選択性は組換え型カンジダ・ルゴサリパーゼのそれよりも有意に低いことを明らかに示している。
【００６６】
【表７】
0004170624.tif 000011
【００６７】
実施例８
Ｄ，Ｌ−イソ吉草酸メンチルの加水分解
表９に、Ｄ，Ｌ−イソ吉草酸メンチルの加水分解の結果を要約する。この反応をアラビアゴムを安定剤として０．２％（ｍ／ｖ）含有させた燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２、１００ｍＭ）中で実施した。最適な温度を決定する目的で４０℃、５０℃および６０℃の反応温度を選択した。使用した酵素の量は各場合ともＤ，Ｌ−イソ吉草酸メンチル０．００１ミリモル当たり８００Ｕの精製カンジダ・ルゴサリパーゼであった。鏡像異性体過剰度をガスクロで測定した。
【００６８】
【表８】
0004170624.tif 000012
【００６９】
表９は、カンジダ・ルゴサの組換え型リパーゼを用いてＤ，Ｌ−イソ吉草酸メンチルに加水分解を受けさせると生成物が＞９９％ｅｅの鏡像異性体過剰度を達成することを示している。この反応の最適な温度は５０℃であることを確認した。６０℃にした場合には６時間後に酵素の活性が失われることを観察したが、これは、反応の沈滞が起こったことによるものであり、このような沈滞は、酵素が高い温度で変性したことによるものであろう。
【００７０】
実施例９
Ｄ，Ｌ−アントラニル酸メンチルの加水分解
Ｄ，Ｌ−アントラニル酸メンチルの加水分解は選択した標準的条件（燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、１００ｍＭ、３０℃、４０℃、５０℃および６０℃、反応時間２４時間）下で全く変換を示さなかった。
【００７１】
実施例１０
カンジダ・ルゴサの遊離リパーゼの固定化
適切な支持材料の決定
カンジダ・ルゴサの未変性リパーゼ（精製を受けさせておいた）を固定する目的でいろいろな支持材料を試験した。Ｃｅｌｉｔｅ（商標）５４５（Ｆｌｕｋａ）、ＥＰ１００（２００−４００ミクロンのポリプロピレン粉末、Ａｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌ）、Ｈｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｅｌｌ（商標）（Ｆｌｕｋａ）、ＳｉＯ2（Ｆｌｕｋａ）およびＡｌ2Ｏ3（Ｆｌｕｋａ）への固定化はリパーゼが疎水的に吸着されることを基にして起こる一方、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）への結合はイオン的相互作用によって起こる。使用する支持材料に応じて、精製リパーゼを支持体１ｇ当たり２０００から３０００単位用いた。
【００７２】
固定化を実施した後のサンプルを濾過した後、ｐＨスタットを用いて濾液および固定物（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｅ）が示す活性をトリブチリンに対比させて測定した（ｐＨ７．２、３０℃）。表１０に、いろいろな支持材料の固定効率を示す。
【００７３】
【表９】
0004170624.tif 000013
【００７４】
支持材料であるＥＰ１００およびＳｉＯ2を用いて固定した時に活性のある固定カンジダ・ルゴサリパーゼの収量が最も高かったことから、このような固定物をＤ，Ｌ−安息香酸メンチルの加水分解で用いた。
【００７５】
実施例１１
ＥＰ１００およびＳｉＯ2に固定した組換え型カンジダ・ルゴサリパーゼを用いたＤ，Ｌ−安息香酸メンチルの加水分解
この反応を各場合ともアラビアゴムを安定剤として０．２％（ｍ／ｖ）用いた１５ｍｌの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２、１００ｍＭ）中で５０℃で実施した。使用した固定物の量は各場合ともＤ，Ｌ−安息香酸メンチル０．１ミリモル当たり１２００単位であった。反応時間を８時間にした。鏡像異性体過剰度をガスクロで測定した。
【００７６】
【表１０】
0004170624.tif 000014
【００７７】
表１１は、カンジダ・ルゴサリパーゼの固定物がＤ，Ｌ−安息香酸メンチルの加水分解に関して示すエナンチオ選択率は非常に高い（Ｅ＞１００）を示している。この結果はカンジダ・ルゴサの遊離リパーゼを用いた時に得た結果に相当している。
【００７８】
本発明を説明の目的でこの上に詳細に記述してきたが、そのような詳細は単にその目的であり、それに関して本分野の技術者が本発明の精神および範囲から逸脱することなく変更を行うことができるのは、本請求の範囲で限定可能なことを除いた点に関してであると理解されるべきである。
【００７９】
本発明の特徴および態様は以下のとおりである。
【００８０】
１．  リパーゼを酵素として用いてＤ，Ｌ−メンチル誘導体をエナンチオ選択的様式で開裂させる段階を含んで成るＤ−もしくはＬ−メントールまたはそれの誘導体を製造する方法。
【００８１】
２．  前記Ｄ，Ｌ−メンチル誘導体が式：
【００８２】
【化３】
0004170624.tif 000015
【００８３】
［式中、Ｒは、水素、未分枝もしくは分枝Ｃ1−Ｃ20−アルキル、Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル、Ｃ6−Ｃ14−アリール、Ｃ7−Ｃ15−アリールアルキル、Ｃ1−Ｃ20−アルコキシ、Ｃ1−Ｃ20−アルキルアミノを表し、ここで、上述した炭化水素基は場合によりヒドロキシル、ホルミル、オキシ、Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ、カルボキシ、メルカプト、スルホ、アミノ、Ｃ1−Ｃ6−アルキルアミノまたはニトロまたはハロゲンで一置換または多置換されていてもよい］
で表される第１項記載の方法。
【００８４】
３．  前記Ｄ，Ｌ−メンチル誘導体が脂肪族もしくは芳香族のＤ，Ｌ−メンチルエステルである第２項記載の方法。
【００８５】
４．  前記Ｄ，Ｌ−メンチル誘導体がＤ，Ｌ−安息香酸メンチルである第３項記載の方法。
【００８６】
５．  前記リパーゼがカンジダ・ルゴサのリパーゼである第１項記載の方法。
【００８７】
６．  前記リパーゼが組換え型リパーゼである第１項記載の方法。
【００８８】
７．  前記リパーゼがカンジダ・ルゴサの組換え型リパーゼ１である第６項記載の方法。
【００８９】
８．  前記反応をｐＨが約７の水性媒体中で１０から７０℃の範囲の温度で実施する第１項記載の方法。
【００９０】
９．  前記リパーゼが固定リパーゼである第１項記載の方法。