(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔリンパ球共刺激作用とＢリンパ球抑制作用または／およびインターロイキン１２産生促進作用を有するラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３１７）の菌体を含んでなる免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳酸菌に属するラクトバチルス（ Lactobacillus ）の菌体またはその処理物を含んでなる免疫賦活剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御に重要な役割を果たしており、その防御機構の中心はＴリンパ球である。Ｔリンパ球はこれらの微生物や腫瘍を、抗原受容体を介して認識することにより刺激を受け、抗原特異的に活性化され、これらの異物を排除する能力を高める。常に微生物に曝され、また細胞が変異している生体内では、こうしたＴリンパ球は抗原受容体を介して常に活性化される一方で、抗原受容体以外の経路でも抗原非特異的に活性化されている。抗原特異的および抗原非特異的のいずれの活性化においても、他からの刺激、すなわち共刺激が加わるとＴリンパ球の活性化はさらに促進される。現在用いられている免疫賦活剤は、免疫担当細胞を非特異的に活性化することにより、微生物感染、腫瘍に対する生体の防御機構を高めるものであるが、有効性において満足しうるものは少なく、また、これらの免疫賦活剤は、一般に作用の特異性が低いため、たとえばＢリンパ球の活性化による全身性エリテマトーデス、慢性関節リュウマチ等の自己免疫疾患のような副作用が懸念される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、自体免疫賦活作用を有し、さらに他の免疫賦活物質と併用することにより、より強い免疫賦活作用を示し、実質的に副作用がなくたとえば食品に配合して投与することもできる免疫賦活剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため免疫賦活剤に関する研究を重ねたところ、乳酸菌の１種であるラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）Ｌ−１３７株の菌体がＴリンパ球共刺激作用を示すことを見いだした。また該菌体が抗原受容体を介する刺激により活性化されたＴリンパ球の活性をさらに上昇させ、また抗原受容体以外の経路により抗原非特異的に活性化されたＴリンパ球の活性をも上昇させることを突き止めた。これらのＴリンパ球の活性化に伴い、Ｔリンパ球のインターフェロン−γの産生が増強される一方、Ｂリンパ球への抗原受容体を介する刺激および抗原受容体以外の経路による活性化は抑制される事実も判明した。これとは別に該菌体がマクロファージのインターロイキン１２の産生を選択的に促進する作用を有していることも判明した。すなわち、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体は、抗原受容体を介するＴリンパ球の活性化を上昇させることにより、生体内で常時起こっている微生物および腫瘍細胞に対する排除反応を高め、特にインターフェロン−γの産生を増強することから、ウイルスや腫瘍に対する防御能を高める。しかし、単独ではリンパ球をほとんど活性化しないことから、生体にとって好ましくない免疫応答を誘導せず、また、Ｂリンパ球の抗原受容体を介する活性化や抗原非特異的な活性化を抑制することにより、免疫賦活に伴い予測されるＢリンパ球のポリクローナルな活性化により誘導される自己免疫疾患等は増悪させない。またラクトバチリス・プランタラムＬ−１３７菌体は、腫瘍細胞傷害性を有するナチュラルキラー細胞を活性化するサイトカインであるインターロイキン１２のマクロファージからの産生を高める結果、腫瘍に対する防御能を特に高めるとともに、後天性免疫不全症候群（AIDS）の発症予防にも有用である。しかし腫瘍壊死因子αの産生は軽度にしか上昇させないため、通常のマクロファージの活性化剤により上昇する腫瘍壊死因子αにより引き起こされる、発熱、体重減少、エンドトキシンショックへの感受性増大などの副作用を誘導しない。このように、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体は副作用がなく常用に適した免疫賦活剤であり、また該菌体は抗原非特異的なＴリンパ球の活性化を上昇させたり、またマクロファージによるインターロイキン１２の産生を促進するので他の免疫賦活剤との併用も有効であることを見いだし本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、Ｔリンパ球共刺激作用とＢリンパ球抑制作用または／およびインターロイキン１２産生促進作用を有するラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３１７）の菌体を含んでなる免疫賦活剤、である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられる菌は、ラクトバチルス属に属し、Ｔリンパ球共刺激作用およびＢリンパ球活性化抑制作用または／およびマクロファージのインターロイキン１２産生を促進する作用を有するものであればどのような菌でもよい。
菌のＴリンパ球共刺激作用並びにＢリンパ球活性抑制作用は、たとえばマウス脾臓細胞をフィトヘマグルチニン等のＴリンパ球増殖刺激物質またはリポポリサッカライドなどのＢリンパ球増殖刺激物質を含む培地で培養するときラクトバチルス属に属する菌を添加し、一定期間培養して培地中の細胞のミトコンドリア代謝活性を臭化３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムを用いて測定する比色定量法により容易に判定することができる。
菌のマクロファージのインターロイキン１２産生促進作用は、たとえばマウス腹腔マクロファージを組織培養プレートで培養し、ラクトバチリス属に属する菌を添加し一定期間培養して培地中のインターロイキン１２濃度をエンザイムイムノアッセイで測定することにより容易に判定することができる。
本発明の免疫賦活剤との共刺激作用によりＴリンパ球の活性を上昇させる物質、すなわち本発明の免疫賦活剤と併用しうる免疫賦活剤としては、たとえばインターロイキン２などのサイトカイン類、フィトヘマグルチニンなどのレクチン類、抗ＣＤ３抗体などの抗Ｔリンパ球表面抗原抗体などが挙げられる。
【０００６】
本発明に用いられるラクトバチルス属に属する菌の代表的なものとしてラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を挙げることができるが、この菌は工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年１１月３０日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３１７，微工研  菌寄第１５３１７号として寄託されている。
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７は、フィリピンの発酵食品ブロングイスダ（Burong  isda）から分離された微生物であり、特定の糖類（グルコン酸、アラビノース、ラムノースおよびスターチ）に対する資化性が、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus  plantarum）ＪＣＭ  １１４９基準株およびラクトバチルス・プランタラムＬ−０５１（微工研菌寄第１１９１２号）と相違する。すなわち、下記の糖類に対して次のような資化性を示す。
グルコン酸      −
アラビノース    −
ラムノース      −
スターチ        ＋
さらに、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７と前記ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ  １１４９基準株およびラクトバチルス・プランタラムＬ−０５１株との菌学的性質を対比すると、〔表１〕の通りである。
【０００７】
【表１】
0004064481.tif 000002
【０００８】
以上の菌学的性質、および細胞壁のペプチドグリカンタイプがメゾ−ジアミノピメリン酸（meso-diaminopimelic acid）であること、さらに、Ｌ−１３７菌株と２２タイプの乳酸菌基準株との間での DNA-DNA交雑実験法を行ったところ、Ｌ−１３７菌株はラクトバチルス・プランタラムにのみ強くDNAの相同性が得られたことにより、本発明に用いられる微生物はラクトバチルス・プランタラムと同定された。
本発明の微生物については、Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol.73, No.3, 193-197(1992)及び Vol. 80, No.2, 124-130(1995)にも報告されている。
本発明の免疫賦活剤は、ラクトバチルス属に属し、Ｔリンパ球共刺激作用とＢリンパ球活性化抑制作用を有する菌を天然培地、合成培地、半合成培地などの培地に培養することにより得ることができる。
培地としては、窒素源および炭素源を含有するものが用いられる。窒素源としてはたとえば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等であり、炭素源としては、たとえば、グルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、水アメ、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等が用いられる。
このほか、無機質として、たとえば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン更に各種ビタミン類その他を添加することができる。
【０００９】
培養温度は２５〜４０℃、好ましくは２７〜３５℃であり、培養時間は１２〜４８時間程度であり、通気振盪してもよい。
培地のｐＨは３〜６、好ましくは４〜６である。培養終了後菌体を採取し蒸留水を加え、遠心分離などの手段により上清を除き、必要によりその操作を繰り返し、遠心分離や濾過等により菌体を採取する。
採取された菌体は生菌のまま、またはたとえば過熱、紫外線照射、ホルマリン処理などにより不活性化して投与に適した剤型にすることもできる。分離された生菌体、死菌体はさらに摩砕や破砕処理をし、得られた処理物を必要により加熱滅菌、無菌濾過し、濾液を凍結乾燥して製品とすることもできる。
菌体の処理物にはたとえば、上記摩砕物、破砕物、それらからの抽出液、凍結乾燥品が含まれる。
また、本発明に用いられる乳酸菌の一種、ラクトバチルス・プランタラム  Ｌ−１３７株は、元々発酵食品であるブロングイスダから分離されたものであり、食品、たとえば果菜類、穀類から選択された少なくとも１種または、果菜類や穀類を発酵可能な形態に処理したもの、たとえば切断物、粉砕物、摩砕物、搾汁、搾汁濃縮物を本発明において用いられる菌により発酵させた菌を含む発酵物をそのまま用いることができ、これも本発明の好ましい態様の１つである。
前記の発酵法を利用すると、野菜汁に対して、フレッシュなニンジン汁などを得るためのフレッシュスクイーズ法などの特別な前処理を施す必要がなく、また乳成分を添加する必要がなく、乳酸菌の果菜類などの処理物（野菜汁など）に対する高い発酵能により、乳酸菌を多量に含み味覚的にも極めて優れた発酵物を得ることができる。また、被発酵処理物が臭いのきつい果菜類や穀類を含んでいても、野菜類などの特有の不快臭や加熱による不快臭を顕著に低減できるとともに、風味を改善でき、極めて容易に食することができる発酵食品が得られる。しかも、サイレージと異なり発酵食品から分離された食習慣のある乳酸菌であるため、本発明の微生物は安全性も高い。
【００１０】
上述の乳酸菌発酵物は、果菜類及び穀類から選択された少なくとも一種の処理物を前記乳酸菌により発酵させることにより得られる。前記果菜類には、種々の可食性植物、例えば、野菜類（例えば、ニンジン、トマト、ホウレン草、ぱせり、シソ葉、大葉、芽キャベツ、小松菜、カボチャ、大根葉、ピーマン、ケール、カンショ葉、春菊、セリなどの緑黄色野菜類、セロリ、キャベツ、アスパラガス、キュウリ、スイカなどの他の野菜類）、リンゴ、バナナ、パパイヤ、アボガド、ミカン、グレープフルーツ、レモン、パイナップル、ピーチ、柿、イチゴ、ブドウ、メロン、ココナッツなどの果物類などが含まれる。穀類には、米、トウモロコシ、大豆、小麦、ライ麦などが含まれる。これらの果菜類などは単独で又は二種以上組み合わせて使用でき、必要に応じて、これらの果菜類などは、ジャガイモ、サツマイモなどのイモデンプン類と併用してもよい。好ましい果菜類には、ニンジンなどの緑黄色野菜類、バナナなどの果物類、米などの穀類などが含まれる。
また、処理物としては、切断物、粉砕物、摩砕物、搾汁、搾汁濃縮物などが単独又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい処理物には、野菜汁、果汁などの搾汁や搾汁濃縮物などの搾汁類が含まれる。この搾汁類において、ニンジンを用いる場合、ニンジン汁の濃度はBrix２〜３０程度の範囲から選択できる。
また、５０重量％以上のニンジン処理物を含む処理物は、発酵飲料などの風味を改善する上で有用である。
【００１１】
前記果菜類などの処理物は、通常、ブランチング処理及び／又は殺菌処理に供された後、前記乳酸菌による発酵に供される。ブランチング処理は、前記果菜類などやその処理物、特に果菜類やその切断物を加熱処理し、酵素活性を失活させることにより行うことができ、ブランチング処理の後、遠心分離やフィルタープレスなどの方法で搾汁しジュースを得る場合が多い。また、殺菌処理は、ブランチング処理された前記果菜類などやその処理物、特に搾汁類について行う場合が多い。なお、ブランチング処理および殺菌処理は、風味を損なわない範囲で選択でき、ブランチング処理は、慣用の方法、例えば、必要に応じてオートクレーブを用い、７０〜１００℃で短時間処理することにより行うことができる。殺菌処理は、慣用の方法、例えば、７０〜１２５℃程度の温度又は高温短時間で加熱殺菌する方法、紫外線などの光線を照射する方法などが採用できる。
前記微生物による発酵は、前記乳酸菌を搾汁類などの処理物に直接接種して行ってもよいが、通常、適当な培地や前記処理物を用いて馴化培養した前記乳酸菌をスターターとして搾汁類などの処理物に接種して行う場合が多い。発酵は、慣用の方法、例えば、処理物に対して０.５〜３重量％程度のスターターを接種し、２５〜４０℃（例えば、２５〜３８℃）、好ましくは２７〜３８℃（例えば、２７〜３５℃）程度で行うことができる。発酵時間は、果菜類などの処理物の種類などに応じて、例えば、数時間〜数日間程度の範囲から選択できる。
本発明の好ましい態様には、ニンジンなどの緑黄色野菜、果物及び穀類のうちの少なくとも一種の処理物（特に野菜および果物のうち少なくとも一種から得られた搾汁類）を前記乳酸菌で発酵させ、乳酸菌発酵飲料（緑黄色野菜ジュース、果物ジュースなど）やその加工品（緑黄色野菜ゼリー，スプレットなど）として得る方法が含まれる。
【００１２】
なお、発酵に際しては、必要に応じて、他の微生物、例えば、乳酸菌（ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ラムノサスなど）やエンテロコッカス属微生物（エンテロコッカス・フェカーリスなど）、酵母などを併用してもよい。
さらに、必要に応じて、前記処理物に、種々の添加剤、例えば、ビタミン、アミノ酸、ミネラル、植物繊維、糖類、蜂蜜などの甘味料、香料、牛乳、脱脂粉乳などの乳成分、果汁などを添加して発酵させてもよく、得られた乳酸菌発酵物に前記添加剤を添加してもよい。
このようにして、果菜類などの処理物を前記乳酸菌により発酵させると、得られる乳酸菌発酵物の風味を改善できる。この方法により得られた乳酸菌発酵物は、被発酵処理物が臭いのきつい果菜類や穀類を含んでいても、不快臭を顕著に低減できるとともに、加熱による不快臭も抑制できる。また、乳酸菌の発酵により適度な酸味（例えば、ｐＨ４〜５程度）を呈するとともに、官能的に優れた風味を有しており、極めて容易に食することができる。
【００１３】
本発明の免疫賦活剤は、自体公知の食品あるいは、食品成分、医薬担体または賦形剤と自体公知の方法で合して、免疫力を高める食品や医薬剤としても利用可能である。用いる食品あるいは、食品成分、医薬担体または賦形剤は特に限定するものではなく、当該免疫賦活剤の具体的用途に応じて当業者が適宜選択できる。また免疫賦活剤の形態も特に限定する物ではなく、具体的用途に応じて種々の固体や液体の形態とすることができる。本発明の免疫賦活剤は、医薬として用いる場合、経口投与あるいは、非経口投与が考えられるが、一般的に請求項１に記載の有効成分のいずれか、あるいは組み合わせて用いることが可能であり、その投与量は、投与形態にもよるが、経口投与の場合有効成分として成人１日当たり４０ｍｇ〜４０ｇであり、静注の場合は０.１ｍｇ〜１ｇである。本発明の免疫賦活剤を食品として用いる場合、調味料、畜肉加工品、水産加工品、農産加工品、ステープル、調味食品、調味済食品、デザート類、乳油製品、菓子、スナック菓子等の形態で提供することも可能である。
本発明の免疫賦活剤は、たとえば、ウイルス、バクテリヤ等の微生物による感染症や各種悪性腫瘍などの予防・治療に有効である。
【００１４】
【実施例】
以下に実施例および試験例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
実施例１
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥菌体の製造方法
乳酸菌培養培地であるＧＹＰ培地のグルコースの代わりにスターチを加えた培地２００ｍｌにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして１重量％接種し、３２℃で２４時間前培養を行った。その後、６ＬのＧＹＰ培地にその前培養した培養液をスターターとして１重量％接種し、３２℃にて２４時間静地培養した。培養後、５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、５０００ｒｐｍで３５分遠心分離したのち、上清を除き菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散した。そして７０℃で１０分間殺菌した。これを凍結乾燥し、乾燥菌体を７.０７ｇ得た。
【００１５】
実施例２
４倍濃縮ニンジン汁のラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７発酵物の製造方法
Ｌ−１３７乾燥菌体の作成方法と同様の方法で６リットルのＧＹＰ培地で３２℃、２４時間培養したのち生理食塩水中に分散、遠心分離することにより集めた菌体ペーストを４倍濃縮ニンジン汁（人参１／６濃縮搾汁  宮崎農協製を蒸留水ににより希釈したもの）３００ｍｌに添加し、３２℃で２４時間培養した。そして７０℃で１０分間殺菌した。こうして得られたニンジン発酵液を適当量の蒸留水で希釈し、凍結乾燥した。凍結乾燥物として約７７.４ｇを得た。
【００１６】
試験例１
本試験例では、実施例１で得たラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体を用いて、マウス脾臓リンパ球の増殖反応に対するラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体のＴリンパ球共刺激効果およびＢリンパ球抑制効果を検証した。
マウス（B10．A、雌、8週令）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ １６４０培地中で脾臓を押し潰し、＃２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置により測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ １６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μｌを播種した。Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッカロイド（Difco 社製）を２００μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液、Ｂリンパ球増殖刺激物質の抗マウスイムノグロブリンＭ（Cappel 社製）を２００μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液、Ｔリンパ球増殖刺激物質のフィトヘマグルチニン（Difco 社製）をＲＰＭＩ １６４０培地で４００倍希釈した液、およびＲＰＭＩ １６４０培地を、それぞれ１穴当たり５０μｌ播種した脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｂリンパ球刺激群（１）、Ｂリンパ球刺激群（２）、Ｔリンパ球刺激群（１）、無刺激群とした。Ｔリンパ球刺激群（２）として、細胞播種前にＴリンパ球増殖刺激物質の抗マウスＣＤ３抗体（Cedarlane 社製）を１０μｇ／ｍｌの濃度でホウ酸緩衝液に溶解した液を１穴当たり１００μｌ加え、３７℃で３時間放置し、抗マウスＣＤ３抗体を各穴に付着させ、３時間後にＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄後、ＲＰＭＩ １６４０培地を１穴当たり５０μｌ加えた穴に細胞を播種した。これらの５群にＲＰＭＩ １６４０培地（対照）あるいはラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体を５０μｇ／ｍｌ、１２,５μｇ／ｍｌおよび３.１３μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液をそれぞれ１穴当たり５０μｌ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間培養し、培養後代謝活性を調べた。
細胞代謝活性は、培養の終わる３時間前に臭化３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムを５ｍｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液を１穴当たり１０μｌ加え、培養終了時に２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり５０μｌ加え、３７℃で１日放置後、マイクロプレートリーダーで培養液の吸光度５５０ｎｍを測定することにより細胞代謝活性を求めた。〔表２〕にその結果を示す。
【００１７】
【表２】
0004064481.tif 000003
〔表２〕から明らかなごとく、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体は、脾臓細胞が刺激を受けていない無刺激群では、わずかに細胞代謝活性を上昇させたにすぎなかったが、抗原受容体を介するＴリンパ球刺激群（２）および抗原受容体以外の経路のＴリンパ球刺激群（１）では顕著に細胞代謝活性を上昇させ、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体のＴリンパ球共刺激効果が認められた。一方、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体は、抗原受容体を介するＢリンパ球刺激群（２）および抗原受容体以外の経路のＢリンパ球刺激群（１）では細胞代謝活性の上昇を抑制する作用が認められた。
【００１８】
試験例２
本試験例では、実施例１で得たラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体を用いて、マウス脾臓リンパ球のインターフェロン−γ産生反応に対するラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体の増強効果を検証した。
マウス（B10．A、雌、7週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ １６４０培地中で脾臓を押し潰し、＃２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。
脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ １６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。
Ｔリンパ球増殖刺激物質のフィトヘマグルチニン（Difco 社製）をＲＰＭＩ １６４０培地で４００倍希釈した液を１穴当たり５０μｌ播種した脾臓細胞浮遊液に加えた。これにＲＰＭＩ １６４０培地（対照）あるいはラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体を２００μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液をそれぞれ１穴当たり５０μｌ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で３日間培養し、培養後の培養上清のインターフェロン−γをエンザイムイムノアッセイで測定した。
エンザイムイムノアッセイは、ハムスター抗マウスインターフェロン−γ抗体（Genzyme 社製）をホウ酸緩衝液で３μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え、５℃で３日間放置しハムスター抗マウスインターフェロン−γ抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。培養上清を１穴当たり５０μｌ加え室温で９０分間放置し、培養上清のインターフェロン−γをプレートに付着したハムスター抗マウスインターフェロン−γ抗体と結合させた。洗浄後ラット抗マウスインターフェロン−γ抗体を加え、プレートに結合させたインターフェロン−γに結合させた。洗浄後ペルオキシダーゼで標識した抗ラットＩｇＧ抗体を加え、プレートに結合させたラット抗マウスインターフェロン−γ抗体に結合させた。洗浄後、過酸化水素０.００６％とオルトフェニレンジアミン０.１％を含有するリン酸緩衝液を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を１.５Ｎ硫酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４９２ｎｍを測定し、リコンビナントマウスインターフェロン−γで作成した標識曲線から、培養上清中のインターフェロン−γの濃度を求めた。〔表３〕にその結果を示す。
【００１９】
【表３】
0004064481.tif 000004
〔表３〕から明らかなごとくラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体はフィトヘマグルチニンにより誘導されるインターフェロン−γの産生を大幅に上昇させた。
【００２０】
試験例３
本試験例では、実施例１で得たラクトバチリス・プランタラムＬ−１３７菌体を用いて、マウス腹腔マクロファージのインターロイキン１２産生性に対するラクトバチリス・プランタラムＬ−１３７菌体の促進効果を検証した。
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、１５週齢）の腹腔に無菌的にＲＰＭＩ １６４０培地を注入し、腹部を良く揉んだ後、注入したＲＰＭＩ １６４０培地を回収し腹腔細胞浮遊液を得た。腹腔細胞浮遊液の細胞数とそれに含まれるマクロファージの割合を自動血球計測装置で測定した後、マクロファージとして１×１０6／ｍｌの細胞数にＲＰＭＩ １６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。３７℃の５％炭酸ガス培養器内に２時間放置し、腹腔マクロファージを各穴に付着させ、２時間後にＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄後、ＲＰＭＩ １６４０培地を１穴当たり１００μｌ加えた。
これにＲＰＭＩ １６４０培地（対照）あるいはマクロファージ活性化物質のリポポリサッカライド（Difico 社製）を０.２μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液、あるいはラクトバチリス・プランタラムＬ−１３７菌体を０.２μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液をそれぞれ１穴当たり１００μｌ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で１５時間培養し、培養後の培養上清のインターロイキン１２と腫瘍壊死因子αをエンザイムイムノアッセイで測定した。
エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスインターロイキン１２ ＩｇＧ２ａ抗体（Genzyme 社製）あるいはハムスター抗マウス腫瘍壊死因子α＆β抗体（Genzyme 社製）をホウ酸緩衝液で６μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え３７℃で１日間放置し、ラット抗マウスインターロイキン１２ ＩｇＧ２ａ抗体あるいはハムスター抗マウス腫瘍壊死因子α＆β抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。培養上清を１穴当たり５０μｌ加え室温で９０分間放置し、培養上清のインターロイキン１２あるいは腫瘍壊死因子αをプレートに付着したラット抗マウスインターロイキン１２ ＩｇＧ２ａ抗体あるいはハムスター抗マウス腫瘍壊死因子α＆β抗体と結合させた。洗浄後ラット抗マウスインターロイキン１２ ＩｇＧ １抗体（Genzyme 社製）あるいはラビット抗マウス腫瘍壊死因子α抗体（Genzyme 社製）を加え、プレートに結合させたインターロイキン１２あるいは腫瘍壊死因子αに結合させた。洗浄後ペルオキシダーゼで標識した抗ラットＩｇＧ １抗体あるいは抗ラビットＩｇＧ抗体を加え、プレートに結合させたラット抗マウスインターロイキン１２ＩｇＧ １抗体あるいはラビット抗マウス腫瘍壊死因子α抗体に結合させた。洗浄後、過酸化水素０.００６％とオルトフェニレンジアミン０.１％を含有するリン酸緩衝液を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を１.５Ｎ硫酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４９２ｎｍを測定し、リコンビナントマウスインターロイキン１２あるいは腫瘍壊死因子αで作成した標準曲線から、培養上清中のインターロイキン１２あるいは腫瘍壊死因子αの濃度を求めた。
〔表４〕にその結果を示す・
【００２１】
【表４】
0004064481.tif 000005
〔表４〕から明らかなごとくラクトバチリス・プランタラムＬ−１３７菌体は、マクロファージからのインターロイキン１２の産生を大幅に上昇させたが、腫瘍壊死因子αの産生は軽度にしか上昇させなかった。強力なマクロファージ活性化剤であるリポポリサッカライドのサイトカイン産生促進作用と比較すると、ラクトバチリス・プランタラムＬ−１３７菌体が選択的にマクロファージのインターロイキン１２の産生を上昇させることが明らかとなった。
【００２２】
【発明の効果】
本発明の免疫賦活剤は、有効成分の生産性が容易で且つ高く、また得られた免疫賦活剤は人体に投与した場合安全性が高く且つ免疫賦活効果も高く単独または他の免疫賦活剤と併用して、ウイルス、バクテリヤ等による感染症、悪性腫瘍等の予防・治療に用いることができる。