(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
創傷治癒との関連において、損傷組織と隣接または周辺組織との望ましくない癒着を防止するまたは実質的に減ずることができる作用剤を製造するための、キトサンと、該キトサンに固定された、乾燥重量で7.7％以上の含有量のヘパリンの使用であって、該固定化は、イオン結合によるもの、共有結合によるもの、および溶液からの沈殿による機械的封入によるものより選択される、上記使用。
【請求項２】
ヘパリンがイオン結合によってキトサンに固定される、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
ヘパリンが共有結合によってキトサンに固定される、請求項1に記載の使用。
【請求項４】
作用剤がフィルムまたは膜の形である、請求項1〜3のいずれか1つに記載の使用。
【請求項５】
作用剤がチューブまたはホースの形である、請求項1〜3のいずれか1つに記載の使用。
【請求項６】
作用剤がゲルの形である、請求項1〜3のいずれか1つに記載の使用。
【請求項７】
作用剤が粉末、エーロゾルまたは溶液の形である、請求項1〜3のいずれか1つに記載の使用。
【請求項８】
キトサンが多くても約90％のN-アセチル化度を有する、請求項1〜7のいずれか1つに記載の使用。
【請求項９】
キトサンが多くても約50％のN-アセチル化度を有する、請求項1〜7のいずれか1つに記載の使用。
【請求項１０】
キトサンと、該キトサンに固定された、乾燥重量で7.7％以上の含有量のヘパリンとを含んでなる、創傷治癒に関連した組織の望ましくない癒着を防止するまたは実質的に減ずるための作用剤であって、該固定化は、イオン結合によるもの、共有結合によるもの、および溶液からの沈殿による機械的封入によるものより選択される、上記作用剤。
【請求項１１】
フィルムまたは膜の形である、請求項10に記載の作用剤。
【請求項１２】
ゲルの形である、請求項10に記載の作用剤。
【請求項１３】
チューブまたはホースの形である、請求項10に記載の作用剤。
【請求項１４】
粉末、エーロゾルまたは溶液の形である、請求項10に記載の作用剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規な抗癒着剤、すなわち創傷治癒に関連した組織の望ましくない癒着を防止することができる製品、に関するものである。この製品はまた、組織の再生を刺激することによって治癒の質を高めることも可能である。
さらに、本発明は、このような組織の望ましくない癒着を防止する方法を含むものである。
発明の背景
希望どおりに、または目下の要求に応じて、我々が自由に動けるということは、生活の質にとって最も重要なことである。主として皮膚、粘膜および神経組織と密接に協同した筋骨格系の適切な機能は、我々の可動能力の必要条件であり、それ自体が骨、筋肉、腱などの異なる構造を互いに対して自由に動かせることを必要とする。こうした活動には動くための滑走帯、最小の摩擦および最大の自由が必要である。したがって、例えば、隣接する筋肉と腱の間の、さらに皮膚と隣接組織の間の、滑走系（sliding system）が最適な機能にとって必要とされる。同じことが胃腸管、心臓、脳、脊髄などの器官の構造についても言える。滑走系は疎性結合組織の薄板によって形成されており、これは、腹腔、胸腔、心膜腔、そして脳や脊髄においては、中皮細胞によりその境界が定められている。腱傍結合組織も同様の構造設計を示す。
これらの滑走系は炎症や損傷に対して非常に敏感である。瘢痕組織が容易に形成されて、機能障害や機能不全さえも引き起こす。腹腔においては癒着が生じて（すなわち、弦線の形成）、隣接または周辺構造の膜様の癒合が生命を脅かす症状の腸疝痛を引き起こしかねない。創傷の治療、腫瘍の摘出または他の疾患の治療のために、あるいは再構築を行うために実施した外科手術は常に瘢痕を形成させ、その結果、「自然かつ本来の」滑走系の多かれ少なかれ広範囲にわたる減失に結びつく。
皮膚および粘膜内層に対する損傷の治癒は、一方では結合組織の再生能に限りがあるため、そして他方では未成熟な肉芽組織（正常組織と同様の成熟度を獲得する能力が制限されている）の形成のため複雑である。。こうして、ほとんど例外なく、若者でも成人でも、損傷後に真皮が再形成されることはない。真皮に対する小さくかつ／また表在性の損傷は、失われた組織を、隣接する組織型に似た構造の形成および反応性の肉芽組織の形成で置換することにより治癒される。しかし、深部の火傷、III度の熱傷、または真皮の一部の損失といった、より広範囲の組織損失の治癒には、瘢痕の形成、可変的であるが持続的な組織の減失、さらに永久的な変形を必然的に伴う。瘢痕組織における機械抵抗性の構成成分は、主に短繊維のIII型コラーゲンと比較的劣った組織で構成されており、したがって、正常かつ最適なＩ型コラーゲンと比べたとき機械的性質が弱くなっている。組織の充実性のみならず、無定形の可塑性基質の割合も減少している。血管の数が正常組織の血管数に対して経時的に減少し、血管の分布およびタイプも変化している。対応する正常な血管と比べたとき、より劣った機能の、幅の広い、壁の薄い血管がひんぱんに現れ、リンパ管系も同様に異常である。かくして、滑走系は最終的に硬質の繊維性コラーゲン結合組織で置き換えられる。
さらに複雑で、非常に重要な要因が筋繊維芽細胞（myofibroblast）の出現によってもたらされる。筋繊維芽細胞は、マクロファージの一部と同様に、細胞をゆっくりかつ強力に収縮させて、その収縮を長時間維持することを可能にする、筋タンパク質の細胞質束の数が増加している「普通の」結合組織細胞（繊維芽細胞）である。これは患部組織をさらに変形させてその機能を制限する拘縮（contracture）をもたらすことがある。筋繊維芽細胞の増加は、例えば、乳房インプラント（乳房を大きくしたり、乳房を再構成するために埋め込まれるシリコーン補てつ物；詳細については、C. Lossing & H-A Hansson, Plastic Reconstr. Surgery, 1993, Vol. 91, pp. 1277-1286を参照のこと）の周囲と、縫合糸や他の異種材料のインプラントの周辺に見られる。筋繊維芽細胞はある種のリウマチ様疾患の関節のまわりにもかなりの頻度で現れて、指を変形させ、時には脱臼さえも引き起こす。この細胞はデュプュイトラン拘縮患者を苦しめる手の変形を起こす病因となる。普通の繊維芽細胞と同様に筋繊維芽細胞は、特異的なヘテロダイマー受容体によってコラーゲン糸に付着するが、その受容体の１つのユニットは常にβ１−インテグリンにより構成されている。インテグリンをブロックすることは拘縮の排除につながり、炎症を軽減させる薬剤は、インテグリンの発現に影響を及ぼすかもしれない。
こうして、明確に規定された滑走面をもつまたはもたない疎性結合組織の滑走系は最小限の炎症の場合にのみ回復するにすぎない。しかし、肉芽組織は炎症過程との関連においてのみ形成され、炎症過程それ自体が未成熟な細胞および組織成分を形成させる。修復過程で形成された新しい組織が正常な分化レベルに到達できないのは、瘢痕組織が、失われた本来の成熟組織と比べて、質的にも量的にも劣っているという理由による。再生された組織が成熟するには、細胞、繊維および基質の分化を制御し促進する増殖因子へのアクセスが必要である。
背景技術
創傷（例えば、外科的切除や事故によるもの）、炎症または腫瘍の治癒と関連した組織の望ましくない付着を防止するという課題を解決するために、多岐にわたる研究が行われている。PCT出願No. US90/02406には、この特殊な問題と関連した技術が記載されており、また、背景技術の比較的詳しい解説がなされている。上記の特許出願に記載された技術は、生物分解性の生物活性膜からなるサンドイッチ構成物の使用に基づくもので、サンドイッチ構成物の相対する面が異なる組成を有し、それにより異なる生物学的機能を担っている。しかしながら、この製品は市場に出回っていないようである。
発明の概要
したがって、本発明の目的は、使用した際に最小限の炎症を短期間生じさせるにすぎず、さらに生物許容性で、妨害性の分解産物をもたらすことなく生物分解性である抗癒着剤を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、界面を誘導することができ、かつ、例えば外科的切除との関連において、機械的および技術的取扱いを簡便化した抗癒着剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、創傷治癒に関連した隣接または周辺組織と器官の望ましくない癒着を防止したり、実質的に減ずる方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、創傷治癒に関連した組織の再生を刺激することである。
上記のおよび他の目的は以下の説明により解明されるであろうが、こうした目的のために、本発明により、キトサンとそれに固定された多糖との新規な使用が提供される。前記の多糖はヘパリン、ヘパラン硫酸およびデキストラン硫酸から選ばれる。この組成物を用いると、創傷治癒に関連した損傷組織と隣接または周辺組織との望ましくない癒着を防止したり、実質的に減少させることができる作用剤が得られる。
用いる多糖は、主に３つの異なる方法で、キトサンに固定化することができる。こうして、固定化はイオン結合により、共有結合により、または溶液からの沈殿に関連したキトサンへの機械的封入により行われる。アミノ基を有する基質に関連の多糖を共有結合させる方法は米国特許第4,613,665号に記載されている。
多糖としては、特にヘパリンまたはヘパラン硫酸を用いることが好ましく、これらの物質はいくつかの製造会社から販売されている。生物学的活性が保持されているという条件で、多糖の部分的加水分解型ももちろん使用可能である。
本発明にしたがって用いられる抗癒着剤はさまざまな物理的形態で存在することができ、例えばフィルムまたは膜、ゲル、チューブまたはホース、粉末、エーロゾルまたは溶液であり得る。こうした形態を関係する損傷に適合させることはもちろんのことである。ほとんどの場合にはフィルムが有用であるが、特殊な場合、例えば筋肉や腱のような細長い限定された組織と関連した場合にはチューブやゲルも使用できる。
キトサンはβ-D-グルコースアミン単位から構成された直鎖状の1,4-結合多糖である。キトサンは、特に昆虫や甲殻類の外殻を形成するポリマーであるキチンのN-脱アセチル化により製造される。商業的には、キチンは水産物業界からの廃棄物であるカニとエビの殻から回収されている。キチンのアルカリ処理を制御することにより、さまざまな程度にN-アセチル化されたキトサンが得られる。キチンを濃アルカリ（通常は水酸化ナトリウム）で処理すると、N-脱アセチル化が起こり、すなわち、アセトアミド基がアミノ基に変換されてキトサンを生成する。
キトサンの有用性に影響を及ぼすキトサンの物理的性質は、N-アセチル化度、分子量および均一性によって決まる。キトサンは生物分解性であって、消化系のキチナーゼによっても、体液中のリゾチームや他の酵素によっても分解される。
本発明の使用に関連して、キトサンは多くても約９０％、好ましくは多くても約５０％のN-アセチル化度をもつことが有利である。特に、N-アセチル化度は約２５％より低いことが好適である。
本発明はまた、創傷治癒に関連した組織の望ましくない癒着を防止したり、実質的に減ずる方法を提供する。この方法は、創傷治癒部位に、キトサンと、それに固定された、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびデキストラン硫酸から選ばれる多糖からなる作用剤を適用することを含む。
関係する創傷の特性に応じて、その作用剤はフィルムの形で、ゲルの形で、またはチューブやホースの形で適用することができる。適用のために選ばれる製品は、例えば対応する外科手術と関連づけて、容易に決定することができる。
好適な実施態様の例
非限定的な例と関連させて以下に本発明を例示することにする。例において、フィルムはすべて、54cm2の表面積をもつペトリ皿上で製造したものである。
例１
キトサンフィルムの製造
キトサン（アセチル化度50%；Pronova）の塩酸塩5gを蒸留水（0.5L，1%v/w）に溶解した。得られた溶液10mLをペトリ皿に移し、蒸発させ、70℃の加熱室に入れて24時間乾燥させてキトサンのフィルムを形成させた。次に、得られたフィルムをリン酸ナトリウム緩衝液，0.2M，pH9.0の添加により中和した。フィルムはペトリ皿中の上記緩衝液に入れたままで室温に２〜４時間保持し、その後水で３，４回洗い、乾燥させた。
例２
キトサンフィルムの製造
キトサン（アセチル化度20%；Pronova）の塩酸塩5gを2%酢酸溶液（0.5L，1%v/w）に溶解した。この溶液を滅菌のために125℃のオートクレーブに１時間入れた。冷却後ペトリ皿でフィルムを形成させたが、その場合20mLの溶液を使用した。次に、フィルムを室温で乾燥させ、リン酸ナトリウム緩衝液，0.2M，pH9.0をペトリ皿に添加して中和した。フィルムをこの緩衝液に入れたままで室温に２〜４時間保持し、その後蒸留水で３，４回洗い、再度乾燥させた。
例３
ヘパリンの亜硝酸分解
ヘパリン1gを水300mLに溶解した。この溶液を氷水で０℃に冷却して低温に維持した。最初に亜硝酸ナトリウム（NaNO2）10mgを加えた。次に、この溶液に攪拌しながら酢酸2mLを加えた。反応混合物を０℃に２時間維持し、透析し、凍結乾燥させた。分解ヘパリンの収量は0.7gであった。
例４
ヘパリンの過ヨウ素酸酸化
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化したヘパリンナトリウムの溶液を次の方法で調製した。過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）1gを蒸留水200mLに溶解した。過ヨウ素酸ナトリウムの溶液にヘパリンナトリウム10gを加え、暗室で一夜攪拌した。得られた溶液を、グリセロール10mLを添加して２時間攪拌した後に、水に対して透析した。水を１時間ごとに交換した。これにより、過ヨウ素酸塩−酸化ヘパリンを約19mg/mLの濃度で含む溶液が得られた。
例５
ヘパリンを共有結合させたキトサンフィルムの製造（エンドポイント結合）
例１にしたがって製造した中和キトサンフィルムに、水0.5Lに溶解した、例３のようにして製造した亜硝酸分解ヘパリン125mgおよびNaCl 4.4gを含む溶液20mLを添加した。この溶液に水素化シアノホウ素ナトリウム15mgを加えた。この溶液のpHを0.5M塩酸または他の酸を用いて3.9に調整した。キトサンフィルムを含む溶液を室温に14時間放置した後、フィルムを水で３，４回洗い、乾燥させた。
例６
ヘパリンを共有結合させたキトサンフィルムの製造（マルチポイント結合）
例２にしたがって製造した中和キトサンフィルムを次の溶液20mL中に24時間入れておいた。塩化ナトリウム4.4gと例４に記載したように製造した過ヨウ素酸酸化ヘパリン125mgを水0.5Lに溶解し、pHを0.5M塩酸で3.9に調整した。この溶液に水素化シアノホウ素ナトリウム15mgを加え、室温に10時間保持した。処理したフィルムを次に水で３，４回洗い、乾燥させた。ヘパリンを共有結合させる技術に関する詳細については、上記の米国特許第4,613,665号を参照のこと。
例７
ヘパリンをイオン結合させたキトサンフィルムの製造
中和キトサンフィルムを例２のようにして製造した。ヘパリン溶液（NaCl4.4gを含む水0.5L中に125gを溶解したもの）を加えた。室温で３時間後、フィルムを２×0.5Lの水で洗い、乾燥させた。
例８
生物学的試験（対照）
例２にしたがって製造したフィルムを次の動物モデルにおいて抗癒着膜として使用した。
ラットの腹壁を開き、矢状線のそれぞれの側に外科的手法で約12×10mmの傷をつくった。一方の傷を例２からのフィルム（約18×15mm）で被覆し、他方の傷を開いたままにした。縫合糸が腹腔内に露出しないようにDexon▲Ｒ▼7-0を使って膜を縫い合わせた。
その結果を２週間後と４週間後に評価した。これに関して、腹腔内にあまり多くはないが膜に対する癒着が観察された。一方、組織の傷をフィルムで覆わなかった場合には、かなり多い癒着が観察された。
フィルムの下の腹部の傷は本質的に瘢痕組織の形成を伴って治癒し、フィルムの周囲には炎症反応の徴候と被膜（capsule）の形成が見られた。
例９
生物学的試験（本発明による）
例３にしたがって製造したフィルムを次の動物モデルにおいて抗癒着膜として使用した。
ラットの腹壁を開き、矢状線のそれぞれの側に外科的手法で約12×10mmの傷をつくった。
一方の傷をフィルム（約18×15mm）で被覆し、他方の傷を開いたままにした。例８と同様にして膜を縫い合わせた。
開いたままの損傷部はいくつかの癒着を示したのに対して、フィルムで覆った傷においては、あるにしても、癒着がごくわずかだった。
例１０
ヘパリンをイオン結合させたキトサンフィルムの製造
キトサン（アセチル化度45%；Pronova）の塩酸塩5gを水（0.5L，1%v/w）に溶解した。この溶液を滅菌のために125℃のオートクレーブに１時間入れた。冷却後ペトリ皿でフィルムを形成させたが、その場合20mLの溶液を使用した。次に、フィルムを室温で乾燥させ、ヘパリン溶液（水0.5L中に125g）を加えた。室温で３時間後、フィルムを２×0.5Lの水で洗い、乾燥させた。
例１１
キトサンフィルムの製造
キトサン（アセチル化度45%；Pronova）の塩酸塩5gを水（0.5L，1%v/w）に溶解した。この溶液を滅菌のために125℃のオートクレーブに１時間入れた。冷却後ペトリ皿でフィルムを形成させたが、その場合20mLの溶液を使用した。次に、フィルムを室温で乾燥させ、リン酸ナトリウム緩衝液，0.2M，pH9.0をペトリ皿に添加して中和した。フィルムをこの緩衝液に入れたままで室温に２〜４時間保持し、その後蒸留水で３，４回洗い、再度乾燥させた。
例１２
生物学的試験（本発明による）
例１０で上述したようにキトサン−ヘパリンから製造したフィルムを、上記のように腹壁につくった傷（10×12mm，深さ1mm）を覆うために配置した。腹壁の対側に同一の傷をつくり、例１１に記載したキトサンフィルムで被覆した。２週間後に癒着の発生を評価した。ヘパリン−キトサンフィルムで覆った傷には癒着がなかったが、普通のキトサンフィルムで覆った傷には少数の小さな癒着が見られた。ヘパリン−キトサンフィルムを光学顕微鏡で検査したところ、中皮様細胞による被覆度を含めて創傷治癒が向上し、しかも、ヘパリン−キトサンフィルムと損傷腹壁組織との界面における炎症細胞の浸潤が、普通のキトサンフィルムで覆った対応損傷部よりも広範でないことが明らかになった。
例１３
キトサン−ヘパリンフィルムの製造
キトサン（アセチル化度16%；Pronova）の塩酸塩5gを2%酢酸溶液（0.5L，1%v/w）に溶解した。この溶液を滅菌のために125℃のオートクレーブに１時間入れた。冷却後ペトリ皿でフィルムを形成させたが、その場合20mLの溶液を使用した。次に、フィルムを70℃のオーブンに入れて16時間蒸発させた。このフィルムを0.1M NaOH溶液で室温で３時間処理した後、蒸留水で３，４回洗い、再度70℃で２時間乾燥させた。その後、得られたフィルムをペトリ皿に移し、0.2Mホスフェート緩衝液（pH6.4）に溶解した天然ヘパリン（1%w/v、ブタ粘膜、Kabivitrum）の無菌溶液30mLを加えた。フィルムを室温に一夜放置した後、滅菌水で洗い、LAFベンチで乾燥させた。フィルムを0.5%、0.1%、0.01%および0.00%ヘパリン溶液でそれぞれ処理することにより、さらに４種類のフィルムを上記のように製造した。ヘパリン化フィルムの元素分析を行ったところ、フィルムはそれぞれ1.2%、0.9%、1.3%、0.23%および0.007%の硫黄を含んでいた。これらの数値はそれぞれヘパリン含有量9.2%、7.7%、10.8%、1.9%および0%に相当した。
例１４
in vitro創傷の作製
乳房切断標本からヒトの無菌皮膚を得た。それぞれの実験において、一人のドナーから得た皮膚のみを使用した。無菌条件下で、生検パンチ（Stiefel Laboratories, UK）を使って直径６mmの円を切り取った。各切片の中心に、３mmの生検パンチを使って部分的な傷を表皮側につくり、続いて切片を表皮側を上にして12ウェルプレート（Costar）に移した。各ウェルにダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）を表皮レベルまで満たし、傷を気／液界面に保持した。全ての試料にウシ胎児血清（FCS，2%）と抗生物質（ペニシリン50μg/mLおよびストレプトマイシン50μg/mL）を加えた。
例１５
in vitro治癒試験
例１４に記載したin vitro創傷を５群に分割し、１群に10の生検材料を含めた。全ての傷を例１３に記載したヘパリン化フィルムで覆った。培地を毎日交換した。７日後、切片を4%中性緩衝ホルムアルデヒド中で固定し、エタノール−キシレン系列により脱水し、パラフィン中に包埋した。横断面（厚さ10〜20mm）をヘマトキシリンとエオシンで染色し、光学顕微鏡で再上皮形成の程度を調べた。全体的にケラチノサイトで覆われた傷のみを治癒と見なした。
図１から明らかなように、ヘパリン含有量が２％以下のフィルムは細胞増殖を促進しなかった。
例１６
ゲル組成物の調製
0.9% NaClを含む水を用いて次の４種類のゲル組成物を調製した。
Ａ＝2%メチルセルロース
Ｂ＝2%メチルセルロース＋0.2%ヘパリンナトリウム
Ｃ＝0.5%メチルセルロース＋1%キトサン（アセチル化度16%）
Ｄ＝0.5%メチルセルロース＋1%キトサン（アセチル化度16%）＋0.2%ヘパリンナトリウム
例１７
in vitro治癒試験
例１４に記載したin vitro創傷を６群に分割し、１群に10の生検材料を含めた。５群の全ての傷を例１６に記載したゲル組成物で被覆した。残りの１群は培地（2%FCS）でのみ処理した。培地を毎日交換した。７日後、切片を4%中性緩衝ホルムアルデヒド中で固定し、エタノール−キシレン系列により脱水し、パラフィン中に包埋した。横断面（厚さ10〜20mm）をヘマトキシリンとエオシンで染色し、光学顕微鏡で再上皮形成の程度を調べた。全体的にケラチノサイトで覆われた傷のみを治癒と見なした。
図２から明らかなように、キトサンとヘパリンの組合せからなるゲルは、キトサンのみまたはヘパリンのみを含むゲルよりも良好に傷を治した。
例１８
生物学的試験（本発明による）
例７にしたがって製造したフィルムを用いて例９を繰り返した。
上記の生物学的実験から明らかなように、本発明による技術を用いることにより、癒着の防止および増殖の促進を含めた治癒特性を実質的に向上させることが可能である。本発明は上記の例に制限されず、本発明の範囲は請求の範囲によってのみ限定される。
本発明の適用に関して、次の器官および構造（例えば、腹壁、胸壁、肺、心膜、中心血管、腸管、尿管、頭蓋骨、脳髄膜、脊髄、腱、神経、筋肉、骨、粘膜、角膜、皮膚など）における創傷と関連させて、上記のように製造したフィルムもしくは膜、ゲルまたは粉末、あるいは溶液を使用することができる。
チューブやホース、またはゲルの形の製品は増殖刺激のガイドとして使用できると同時に、周囲への癒着を防ぐという事実により滑走面を維持することができる。こうした製品は神経、腱および靱帯、腸管、尿管、血管などと関連させて使用することができる。
本発明を増殖因子と組み合わせることにより、治癒の質がより一層高まるであろう。
【図１】
0004033485.tif 000002
【図２】
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