(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
飼育密度上昇による二次感染を伴うヒト以外の動物の疾患の治療用医薬組成物であって、該動物疾患がセルプリナ・ピロシコリ（Serpulina pilosicoli），ラウソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis），パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida），パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）およびこれらの混合から成る群より選択される細菌による感染と関連しており、治療上有効量の遊離塩基の形または獣医学的に許容される塩の形での下記式Ｉ
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の化合物を少なくとも1種類の獣医学的に許容される担体または希釈剤とともに含有することを特徴とする前記組成物。
【請求項２】
対象となる動物がこのような治療を必要とするブタである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
セルプリナ・ピロシコリ（Serpulina pilosicoli）感染に関連するブタ大腸炎の治療のための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ラウソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis）感染に関連する回腸炎の治療のための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）感染に関連する動物疾患の治療のための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
対象となる動物がパスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）感染に関連する肺炎に罹患しているラム、ヒツジまたはウシである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
式Ｉの化合物がその塩酸付加塩から成る請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
飼育密度上昇による二次感染を伴うヒト以外の動物の疾患の治療用医薬組成物の製造方法であって、該動物疾患がセルプリナ・ピロシコリ（Serpulina pilosicoli），ラウソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis），パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida），パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）およびこれらの混合から成る群より選択される細菌による感染と関連しており、治療上有効量の遊離塩基の形または獣医学的に許容される塩の形での下記式Ｉ
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の化合物を少なくとも1種類の獣医学的に許容される担体または希釈剤と組合わせることを含む前記方法。
【請求項９】
ヒト以外の動物の疾患の治療方法であって、該疾患がブタ大腸炎およびブタにおける回腸炎から成る群より選択され、治療上有効な量の遊離塩基または獣医学上許容される形態の下記式Ｉの化合物を動物に投与することを含む前記治療方法。
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【請求項１０】
飼育密度上昇による二次感染を伴うヒト以外の動物の疾患の治療方法であって、該動物疾患がセルプリナ・ピロシコリ（Serpulina pilosicoli），ラウソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis），パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida），パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）およびこれらの混合から成る群より選択される細菌による感染と関連しており、治療上有効な量の遊離塩基または獣医学上許容される形態の下記式Ｉの化合物を動物に投与することを含む前記治療方法。
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【発明の詳細な説明】
本発明は、プロイロムチリン誘導体に関し、下記式Ｉの化合物
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すなわち、遊離塩基もしくは獣医学的に許容される塩の形での１４−Ｏ−［１−［（Ｒ）−２−アミノ−３−メチルブチリルアミノ］−２−メチルプロパン−２−イルチオアセチル］ムチリンの、飼養密度を高めることで発現が促進される動物疾患の治療における獣医学的使用（以下、簡潔に「本発明の使用」と称する）に関するものである。
遊離塩基または獣医学的に許容される塩の形（Econor▲Ｒ▼）での式Ｉの化合物を以下、簡潔に「本発明の薬剤」と称する。該薬剤は好ましくは塩であり、特には塩酸塩の形とする。その形での本薬剤は、一般名バルネムリン（valnemulin）塩酸塩で知られている。
「治療」という用語は、予防処置および治療処置のための投与と理解すべきである。
遊離塩基の形または化学療法上もしくは獣医学上許容される塩の形の式Ｉの化合物は、例えばＥＰ１５３２７７から公知であり、それの均等物が例えばＵＳＰ４６７５３３０、具体的には該特許の実施例１２として公知である。
該特許からはさらに、
−濃度約０．００８〜２５μｇ／ｍＬでのin vitroにおける各種細菌に対する阻害活性；
−一般に濃度約０．００８〜０．５μｇ／ｍＬでのin vitroにおけるマイコプラズマおよびクラミジアに対する阻害活性；
−約１２〜５０ｍｇ／ｋｇの用量での、各種細菌株を用いたマウスならびにマイコプラズマ株を用いた雌ニワトリにおけるin vivo阻害活性；
−飼料１ｋｇ中２０〜１５０ｍｇの用量での、特にニワトリにおけるin vivoでのコクシジウムに対する抗寄生虫活性；ならびに
−飼料１ｋｇ中１０〜５０ｍｇの用量での、雌ニワトリおよびブタにおけるin vivoでの成長促進活性
も公知である。それによって本化合物は、一般に抗細菌活性の抗生物質として、さらには特にニワトリにおけるコクシジウム症の化学療法用の動物薬として、ならびに雌ニワトリおよびブタにおける成長促進剤として有用となっている。
驚くべきことに、本発明の薬剤は、Mycoplasma hyopneumoniae感染によって生じるブタにおける流行性肺炎；Serpulina（以前はTreponema）hyodysenteriae感染によって生じるブタの赤痢；Serpulina pilosicoli感染関連のブタ大腸炎；Lawsonia intracellularis感染関連のブタにおける回腸炎（ブタ増殖性腸疾患およびブタ腸管腺腫症）；Mycoplasma gallisepticum感染関連の家禽における慢性呼吸器疾患および関節炎；Pasteurella multocida、Actinobacillus（Haemophilus）pleuropneumoniaeおよび／またはHaemophilus parasuis感染関連のブタにおける二次肺炎；Pasteurella haemolytica感染関連の仔ヒツジ、ヒツジおよびウシにおける肺炎（輸送熱、運送熱、仔ウシ複合病、ウシ肺パスツレラ症）；ならびにMycoplasma hyosynoviae感染関連のブタにおける多発関節炎などの、飼養密度上昇によって発現が促進される動物疾患の治療に特に有効であることが認められている。
さらに驚くべきことに、該薬剤に対する耐性の誘発は極めて低いことが認められている。
そこで本発明は、上記で定義の獣医学的使用に関するものである。
本発明はさらに、飼養密度上昇によって発現が促進される動物疾患の治療で使用される医薬品製造への本発明の薬剤の使用に関するものである。
本発明はさらに、飼養密度上昇によって発現が促進される動物疾患の治療方法において、そのような治療を必要とする動物に、治療上有効量の本発明の薬剤を投与する段階を有してなる方法に関するものでもある。
本発明はさらに、飼養密度上昇によって発現が促進される動物疾患の治療で使用される動物薬において、１以上の獣医学的に許容される担体または希釈剤とともに、遊離塩基もしくは獣医学的に許容される塩の形での式Ｉの化合物を含有する動物薬に関するものでもある。
本発明はさらに、上記の用途用の医薬品製造方法において、１以上の獣医学的に許容される担体または希釈剤と本発明の薬剤とを混合する段階を有してなる製造方法に関するものでもある。
飼養密度上昇によって発現が促進される動物疾患に罹患している動物は例えば、本発明の薬剤で抗菌的に治療を受けていないか、あるいは成長促進を目的として本発明の薬剤の投与を受けていない動物であることができる。
Ａ）Mycoplasma hyopneumoniae感染
Mycoplasma hyopneumoniae感染は、例えばテイラーの著作（Taylor, D.J., Pig Diseases, 6th Ed. (1995), Publ. D.J.Taylor, Glasgow, UK, pp.164−165）などの獣医学手引書に記載されているような従来の方法で診断することができる。この用途での本発明の薬剤の有用な活性は、例えば以下のようにして求められる。
１．in vitro活性
各種群における流行性肺炎発生からの１０の飼育場単離株および基準株「Ｊ」を本試験で用いる。これら単離株をフィルタークローニングし、円板成長阻害試験によって同定し、７〜１０代で使用する。２倍濃度のバルネムリンおよびフマル酸水素チアムリンを含有する１．８ｍＬの試験管に入った液体培地（Friis, N.F. et al., Acta Vet.Scand. 32(1991) 425-429）中で、最小阻害濃度（ＭＩＣ）試験を行う。マイコプラズマを１０倍希釈で接種し、１０2〜１０4の呈色単位を接種した試験管を用いて、培地における成長を肉眼で読みとる。初回読み取りを２〜４日後に行い、最終読み取りは、呈色がそれ以上進まなくなっている１０〜１４日後に行う。ＭＩＣは、対照と比較して、成長阻害を示す被験化合物の最低濃度として求める（Friis, N.F. and Szancer, J., Acta Vet.Scand. 35(1994) 389-394）。
結果を表１に示す。
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いずれの被験M.hyopneumoniae株も、バルネムリンの効果に対して非常に感受性で、初回読み取りおよび最終読み取りのいずれにおいても、チアムリンの場合の１／１０〜１／４０のＭＩＣ値を有している。従ってこの化合物は、感染群の罹患動物治療での使用に関して特に興味深いものである。
２．in vitro活性
各種のブタ流行性肺炎（ＥＰＰ）感染群からのブタの肺から、組織検体を得る。検体をドライアイス上で冷却しながら輸送して、培養に供する。マイコプラズマ・エクスペリエンス（Mycoplasma Experience）寒天での直接培養によって、切開したばかりの肺組織からM.hyopneumoniaeを回収する。この方法により、ＥＰＰ肺検体に存在する場合が多いMycoplasma hyorhinisなどの他の急速に成長するマイコプラズマ類から、M.hyopneumoniaeの明瞭なコロニーを識別し、クローニングによって容易に分離することができる。単離株をサブクローニングし、M.hyoponeumoniae NCTC 10110に対して形成した特異的ウサギ抗血清を用いる円板成長阻害によって同定する。
抗生物質投与用の培地を、マイコプラズマ・エクスペリエンス肉汁で得て、それを３６℃で好気的にインキュベーションする。
市販の固体培地（Mycoplasma Experience Ltd.）を用いて、肺組織からM.hyopneumoniaeを単離する。フェノールレッドおよびグルコースを含む液体培地（Mycoplasma Experience Ltd.）（ｐＨ７．６）をＭＩＣアッセイに使用する。
被験化合物の原液を、脱イオン水中１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、孔径０．２μの膜フィルター（Sartorius Minisart, N）による濾過で滅菌し、−２０℃で保存する。ＭＩＣ試験で使用するため、原液を液体培地で希釈して、必要な最終濃度を二連で得る。ＭＩＣ試験を、タナーらの方法に従って実施する（Tanner & Wu, Avian Diseases 36(1992) 714-717）。−７０℃で保存した肉汁培地１ｍＬずつ、あるいは−７０℃で寒天上にて保存した培地から、活発に成長する負荷培地を調製する。その負荷培地を希釈して、１０3〜１０5呈色単位／ｍＬの標的力価を得る。負荷接種物０．１ｍＬずつをマイクロタイターウェルで抗生物質希釈液０．１ｍＬずつと混合する。各マイクロタイター平板には、ｐＨ６．８の未接種培地（M.hyopneumoniae）（終点対照）および抗生物質を含まない接種負荷対照を含有させる。いずれの平板も粘着フィルムで封止し、３６℃で好気的にインキュベーションする。負荷対照ウェルでの呈色が終点対照のｐＨと一致した時点で、ＭＩＣを記録する。ＭＩＣは、呈色を示さない最低濃度である。
バルネムリンと２つの基準化合物チアムリンおよびエンロフロキサシン（enrofloxacin）についての結果を、表２に示してある。
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いずれの株も、バルネムリンに対して非常に感受性であることが認められた。これらの株のほとんどが、エンロフロキサシンに対して非常に良好な感受性を示したが、個々の株については、バルネムリンのＭＩＣは、エンロフロキサシン０．００２５μｇ／ｍＬに対して感受性のものであっても、５倍以上低かった。これらの結果から、飼育場単離株はバルネムリンに対して極めて感受性が高いことがわかる。
３．耐性の形成
Mycoplasma hyopneumoniae基準株ＮＣＴＣ  １０１１０（National Collection of Type Cultures，London，UKから入手）および最近の飼育場単離株（ＭＥＶＴ  Ｇ２３）を、酸呈色が起こるまで、フェノールレッドを含むマイコプラズマ・グルコース肉汁中、３６℃で好気的に成長させる。無菌グリセリン（５体積％）を加えた後、培地を１ｍＬずつに分配し、−７０℃で凍結させる。これらの培地を用いて、さらなる肉汁培養を行い、それの力価測定を行って、インキュベーション（３６℃）後のマイクロタイター平板での呈色単位（ｃｃｕ）数を得る。複製によって、最低阻害濃度（ＭＩＣ）試験および順化試験における第１代で所定数のｃｃｕにて、抗生物質希釈液の負荷を行うことができる。
グルコースおよびフェノールレッド（ＭＥＧＢ）を含む市販培地（Mycoplasma Experience Ltd.）を、ｐＨ７．６で用いる。
被験化合物原液を、脱イオン水中１０００μｇ／ｍＬで調製する。渦流攪拌後、溶液を孔径０．２μの膜フィルターで濾過することで滅菌する（Sartorius Minisart, N）。ＭＩＣ試験用には、原液をマイコプラズマ肉汁で希釈して、必要最終濃度を二連で得る。順化試験では、原液を１ｍＬずつに分け、−２０℃で冷凍する。これらを解凍し、５日〜７日間隔で使用して、広範囲濃度（二倍連続希釈）の薬剤のＭＥＧＢ溶液１．９ｍＬずつを調製して、M.hyopneumoniaeの両方の株に対するＭＩＣを含むようにする。各場合について、オキシテトラサイクリン塩酸塩を調製する。希釈範囲は世代ごとに徐々に変えて、マイコプラズマにおける耐性の形成を可能とする。
試験法
ＭＩＣ試験をタナーらの方法に従って実施してから（Tanner & Wu, Avian Diseases 36(1992) 714-717）、順化試験（下記）を実施し、１０代後に、化合物希釈液０．１ｍＬずつを負荷接種物０．１ｍＬずつと混合して、マイクロタイター中で１ｍＬ当たり１０3〜１０5呈色単位（ｃｃｕ）を含むようにする。各マイクロタイター平板には、未接種培地、ｐＨ６．８の培地（終点対照）および薬剤を含まない接種負荷対照を含める。いずれの平板も封止し、３６℃で好気的にインキュベーションする。負荷対照ウェルでの呈色がｐＨ６．８対照と一致した時点で（黄橙赤色）、ＭＩＣを記録する。ＭＩＣは、呈色を示さない最低濃度である。
順化試験
第１代実験では、試験対象のM.hyopneumoniae株のＭＩＣを含む濃度の抗生物質溶液１．９ｍＬずつに、１０3ｃｃｕ／ｍＬ〜１０5ｃｃｕ／ｍＬを含む肉汁培地０．１ｍＬを接種する。M.hyopneumoniaeを接種した薬剤を含まない肉汁からなる成長対照と未接種培地対照を、各継代実験に含める。７日間のインキュベーション（３６℃）後、酸呈色を示す薬剤を含む肉汁の２つの最も高い濃度のものを蓄積し、それを用いて、マイコプラズマ肉汁に新鮮な連続薬剤希釈液を接種する（薬剤含有肉汁１．９ｍＬに培地０．１ｍＬ）。このプロセスを１０世代までの間、５〜７日ごとに繰り返す。マイコプラズマ株が特定抗生物質に対して耐性となったら、あるいは１０世代目となったら、各株を再度薬剤含有肉汁中で成長させて、ＭＩＣを測定する。
結果：
抗生物質に対する曝露の前後におけるM.hyopneumoniae株「Ｊ」および飼育場単離株のＭＩＣを表３に示してある。
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曝露前に、両方の株ともバルネムリンに対して非常に感受性であり、ＭＩＣが基準株で０．００２５μｇ／ｍＬ、飼育場単離株で０．００１μｇ／ｍＬであることが認められた。これらの活性レベルは、チロシンおよびオキシテトラサイクリンの場合の５０〜１００倍であった。これらのＭＩＣ結果を用いて、順化試験における薬剤の希釈範囲を選択した。
バルネムリンに対する曝露１０周期後、耐性形成はM.hyopneumoniaeの両方の株で非常に小さく、ＭＩＣ上昇は、基準株と飼育場単離株のそれぞれで、０．００２５〜０．００５μｇ／ｍＬ、０．００１〜０．００２５μｇ／ｍＬであった。それとは対照的に、M.hyopneumoniaeの両方の株で、酒石酸チロシンに対して顕著な耐性が形成された。基準株では、チロシン含有肉汁での４〜５継代以内で最初に耐性が生じ、８世代までにＭＩＣは＞５００μｇ／ｍＬまで上昇し、この抗生物質に対する耐性が＞２０００倍であることを反映していた（表３）。飼育場単離株では、８継代以内に顕著な耐性が生じ、ＭＩＣは５００倍上昇して６２．５μｇ／ｍＬとなった。このレベルの耐性は、チロシン含有肉汁での１０〜１１継代後にも続いた。M.hyopneumoniaeの両方の株で、曝露１０周期中にオキシテトラサイクリンに対する耐性に４倍の上昇が生じ、ＭＩＣは０．２５μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬまで上昇した。
これらの結果は、バルネムリンが、チロシンおよびオキシテトラサイクリンのいずれよりも、M.hyopneumoniaeに対する活性がかなり高く、M.hyopneumoniae株でそれ自体に対する耐性をほとんど誘発しないことを示している。
４．in vivoでの実験的誘発流行性肺炎の予防
ノトバイオートブタのM.hyopneumoniae感染に由来する継代肺組織を用いた流行性肺炎の実験モデルを用いて、該疾患予防におけるバルネムリンの能力を評価した。３つの試験を実施した。試験１および２は、M.hyopneumoniaeの標準負荷株を用いた新規化合物の用量決定試験であり、試験３では第２の負荷株に対する飼料中２００ｐｐｍで含有される化合物の効力を評価した。M.hyopneumoniae感染を起こしていない群からの６〜７週齢の大きい白色ランドレース雄ブタを用いる。負荷物は、３日連続で経鼻的にホモジネートとして投与するM.hyopneumoniaeを含む肺炎を起こしている肺である。試験１および２で使用した負荷物に存在する株に対するバルネムリンの最低阻害濃度（ＭＩＣ）は０．０１６μｇ／ｍＬであり、試験３で使用した負荷物から単離された株についての値は０．００７８μｇ／ｍＬであった。負荷物は、M.hyopneumoniaeによるノトバイオートブタの感染に由来するものであって、その後ＳＰＦ（特定病原体を含まない）ブタで継代させて、−７０℃以下で保存しておいたものである。
試験１：
１日当たり０（対照）、２．５、５、７．５または１０ｍｇ／ｋｇの用量で、１日１回胃ゾンデによるバルネムリン塩酸塩の投与（強制経口投与）。群当たりブタ６頭。
試験２
飼料中０、１００、２００、３００または４００ｐｐｍ（０、５、１０、１５および２０ｍｇ／ｋｇ／日に相当）の用量でのバルネムリン塩酸塩の投与。群当たりブタ６頭。
試験３：
飼料中０または２００ｐｐｍ（０および１０ｍｇ／ｋｇ／日に相当）でのバルネムリン塩酸塩の投与。群当たりブタ８頭。投薬は、負荷感染の第１日から、負荷感染から約３週間後に行った剖検まで行った。肺病変を定量し（肺炎に冒された肺の大体のパーセントを評点とするケンブリッジ肺病変評点システム（Goodwin,R.F.W. and Whittlestone,P., J.Hyg. 69(1971) 391-397））、肺−体重比を推算し、肺からM.hyopneumoniaeを単離することで疾患を評価した。
結果を表４に示してある。
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試験１では、投薬せずに負荷を行ったブタで平均病変評点が１３．２であった。バルネムリンにより、用量７．５および１０ｍｇ／ｋｇでそれぞれ病変は７１％および８７％減少したが、用量２．５および５ｍｇ／ｋｇ／日では、この薬剤の病変低減効果はやや低かった。M.hyopneumoniaeが再単離されたのは、２．５ｍｇ／ｋｇで投薬されたブタと比較して、１０ｍｇ／ｋｇで投与したブタの方が少なかった（４頭と１頭）。
試験２では、未投薬負荷ブタの平均病変評点は２２．１であった。２００、３００または４００ｐｐｍでバルネムリンを投与したブタはそれぞれ、４６％、４３％および７１％の病変減少を示した。顕微鏡的病変と肉眼観察される病変を反映していると考えられる肺重量の方が、それより大きい効果を示しており、２００ｐｐｍまでの低い濃度で大幅な低下があった。１００ｐｐｍで投薬を行ったブタでは病変の減少は認められなかった。剖検時には、いずれの未投与ブタでもM.hyopneumoniaeが再単離されたが、バルネムリンを４００ｐｐｍまたは３００ｐｐｍで投与されたブタからは再単離されなかった。２００ｐｐｍおよび１００ｐｐｍを投与したブタではそれぞれ、３頭および４頭から再単離された。
試験３では、平均病変評点は１０．８であった。飼料中２００ｐｐｍでのバルネムリン投与によって、病変評点は７９％低下した。投与ブタと未投与ブタの間で、剖検時に検出されたM.hyopneumoniaeレベルに差はなかった。
このようにバルネムリンは、M.hyopneumoniaeの２つの異なる株を含む負荷物を用いた独立の実験で、ブタの実験的に誘発した流行性肺炎の予防に有効であることが明らかである。
従って本発明の薬剤は、Mycoplasma hyopneumoniae感染によって生じるブタでの流行性肺炎の治療に有用である。そのためには当然のことながら、有効用量は、使用する特定の塩、投与形態、動物の大きさおよび年齢、所望の効果によって変わるものである。例えば予防のためには、比較的低い用量を長期間にわたって投与することになると考えられる。しかしながら一般に、１日用量約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇで、好適には１日２〜４回に分けてあるいは持続性製剤で薬剤を投与した場合に、満足できる結果が得られる。ほとんどの動物について、１日総用量は約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約１００ｍｇ〜約５００ｍｇであり、１日１回または２回で投与する。有利には、単独療法として投与することができる。
飲料水中の好ましい用量は、０．０１〜０．０５％（重量／体積）、特には０．０１〜０．０２５％であり、飼料中の場合は１００〜４００ｐｐｍ（ｇ／メートルトン）、特には１００〜２００ｐｐｍ（ｇ／メートルトン）である。
Ｂ）Serpulina hyodysenteriae感染
Serpulina hyodysenteriae感染は例えばTaylor,D.J.,Pig Diseases,6th Ed(1995),Publ.D.J.Taylor, Glasgow, U.K.143-144ページのような獣医学の手引書に記載されている通常の方法で診断しうる。本使用における本発明薬剤の有益な活性は以下のように決定される。
１．ＭＩＣ測定
ブタ赤痢発生からのS.hyodysenteriaeの飼育場単離株９株および基準株ＡＴＣＣ３１２１２を含め、ＡＴＣＣ２９７９６（Serpulina innocens、群３
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も含める。同定は、５％ウシ血液を含むＴＳＡ（トリチカーゼ（Tryticase）大豆寒天）での溶血パターンならびにインドール産生および馬尿酸化合物加水分解についての試験（Rosco Diagnostic Tablets, Taastrup, DK）に基づいたものである。細菌を寒天平板から０．９％生理食塩水に移し入れ、マクファーランド（McFarland）スケールで濁度を１．０に調節してから、２倍濃度のバルネムリン塩酸塩、フマル酸水素チアムリン、ジメトリダゾール、リンコマイシン塩酸塩およびチロシンの入った寒天平板に各単離物１０μＬを接種する。嫌気的に４日間成長させた後に成長および溶血を記録し、スピロヘータが成長しない抗生物質の最低濃度としてＭＩＣを求める。
S.hyodysenteriaeについてのＭＩＣ測定値の結果を表５に示してある。
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いずれのS.hyodysenteriae株もバルネムリンに関して非常に感受性で、チアムリンの場合の１／２〜１／３２のＭＩＣ値を示している。S.hyodysenteriaeについてのバルネムリンの高い感受性により、その化合物は感染群における罹患動物の治療での使用に関して興味深いものとなる。
２．ＭＩＣ測定
寒天希釈法によって、ブタ糞から単離したS.hyodysenteriae株１０株に対しての最小阻害濃度（ＭＩＣ）を測定する。ＮＣＴＣ（National Collection of Type Cultures）株または基準株を、全てのＭＩＣ試験における対照として使用する。S.hyodysenteriaeについての寒天培地は、７％脱線維素無菌ヒツジ全血を含むＢＡＢ２（Unipath CM271）から成るものである。いずれの抗菌剤も、二連の希釈液で試験に供する。調製した抗生物質希釈液を、予め５０℃まで冷却しておいた適当量のＭＨ寒天に加え、混和し、用量２０ｍＬずつを注ぐ。いずれのS.hyodysenteriaeインキュベーションも、窒素８０％、水素１０％および二酸化炭素１０％を含む厳重な嫌気的雰囲気を提供する嫌気的ワークステーションで３７℃（±０．５℃）（Don Whitley Scientific）にて行う。いずれの菌株も、好気的雰囲気中３７℃で２４時間インキュベーションする。微生物数を、ブランクとしてＭＨ肉汁を用いて、１×１０8コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬ相当の光学密度（ＯＤ）に調節する。抗生物質を含む平板に二連で、１個の平板に約１μＬの接種物を加える分岐接種装置（Denley Instruments）を用いて接種を行い、全ての菌株についてスポット当たり１０4〜１０5ｃｆｕの接種物を加えるようにする（Amon, J.Antimicrob.Chemother.21(1988) 701-710; Ericsson et al., Acta Pathol.Microbiol. et Immunol.Scand. 217(1971)(B) Suppl., 1-90）。対照平板を、試験平板と同じ条件下でインキュベーションする。２４時間後および４８時間後にＭＩＣを読み取り、後者は確定的読み取り値である。ＭＩＣは、単一のコロニーであるか接種物によって生じたかすかな曇りであるかを問わず、成長がない抗生物質の最低濃度と定義される（National Committee for Clinical Laboratory Standards (1989), Antimicrobial Susceptibility Testings, NCCLC Publications SC3, Villanova, PA, USA）。
Serpulina hyodysenteriaeに対するＭＩＣ（μｇ／ｍＬ）は、バルネムリンで０．１、チアムリンで０．３、リンコマイシンで５０．０、チロシンで２００．０、ジメトリダゾールで３０．０であった。いずれのS.hyodysenteriae株も、被験薬剤中最も活性なバルネムリンに対して感受性で、３〜６００倍の感受性であった。
３．負荷試験
各種含有濃度で摂取させたバルネムリンを、ブタ赤痢予防に関してチアムリンと比較する２つの試験を行った。疾患の重度を、身体状態、糞粘稠度および組成に関しての臨床評点によって求められる臨床疾患の証拠によって評価する。糞中へのSerpulina hyodysenteriaeの排泄、剖検時の病変、成長速度および飼料変換率も求める。
試験１では、２０、３０および４０ｐｐｍで摂取させたバルネムリン塩酸塩を、３０ｐｐｍで摂取させたフマル酸水素チアムリン対照および未投与対照と比較する。従来法で飼育したブタ９頭（５〜６週齢）からなる５群を各投与群に用いる。ブタには１４日間にわたって未投与飼料を摂取させてから、S.hyodysenteriaeの基準株（Ｐ１８Ａ）を負荷させる。負荷は、連続２日での経口投与によって行う。第２回負荷の翌日、薬剤添加飼料を摂取させる。試験２では、ブタ約９頭からなる４群を用いた以外は、同様の手順に従う。これらの群に５、１０および２０ｐｐｍでバルネムリン塩酸塩を摂取させ、未投与対照と比較する。この試験では、用いるブタは、屋外飼育群からの動物であり、屋外群から単離して、ブタ赤痢を起こす能力を有することが予め明らかになっているS,hyodysenteriae株を負荷する。いずれの試験でも、臨床疾患の証拠を毎日評価し、臨床評点を割り当て、直腸綿棒サンプリングを週２回行ってS.hyodysenteriaeの単離を行い、全てのブタについて定期的に体重を測定する。飼料摂取量も記録する。負荷２１日後に剖検を行い、病変の有無について大腸を調べる。大腸の４領域で粘膜掻き取りも行い、S.hyodysenteriaeの培養を行う。
試験１では、負荷８日後に未投与対照群で、最初に臨床ブタ赤痢が認められ、ブタ９頭中８頭が罹患していた。３０ｐｐｍでバルネムリンを摂取した群の１頭およびチアムリン群の９頭中２頭でも臨床疾患が認められた。２０ｐｐｍおよび４０ｐｐｍバルネムリン投与群では、疾患の証拠は認められなかった。対照群については１頭当たりの平均臨床評点は３６であったのに対して、チアムリン投与群での評点は６であった。全ての投与群について、記録された評点間の差は、対照と統計的に異なっていた（ｐ＜０．００１）。対照群の全てのブタならびにチアムリン投与群の罹患ブタ２頭から取った直腸綿棒サンプルから、S.hyodysenteriaeが単離された。３０ｐｐｍでバルネムリン投与を受けたブタ２頭からも、S.hyodysenteriaeが単離され、これはこの群における偶発的感染後に認められたブタ赤痢の臨床徴候と同時であった。２０ｐｐｍ群および４０ｐｐｍ群では、S.hyodysenteriaeは単離されなかった。薬剤添加飼料を摂取した全ての群について、体重増および飼料変換率にはほとんど差がなかった。剖検では、疾患の臨床徴候があった対照群およびチアムリン投与群のブタが、大腸粘膜表面の壊死を伴う粘着性粘液からなるブタ赤痢の代表的病変を示した。病変は、チアムリン投与群の１頭および対照ブタ１頭でも認められ、そのいずれのブタも過去にブタ赤痢の臨床徴候を示したことはなかった。これら罹患動物全てから取った粘膜掻き取りサンプルから、S.hyodysenteriaeが単離された。３０ｐｐｍでバルネムリンを摂取させた群の１頭にもブタ赤痢の病変があったが、粘膜掻き取りサンプルからはS.hyodysenteriaeは単離されなかった。２０ｐｐｍおよび４０ｐｐｍでバルネムリンを摂取させた群では、剖検で病変は認められなかった。
試験２では、負荷５日後に未投与対照ブタで、最初に臨床ブタ赤痢が認められ、その後、その群の９頭全てが罹患し、そのうちの６頭は疾患が重度であったために屠殺せざるを得なかった。５ｐｐｍでバルネムリンを摂取した群では、ブタ赤痢の臨床徴候が負荷８日後に最初に認められ、その後１０頭中５頭が罹患した。しかしながら、バルネムリン５ｐｐｍ群での罹患数は、対照と比較して有意に少なかった（ｐ＜０．０５）。１０ｐｐｍおよび２０ｐｐｍでバルネムリンを摂取した群では、疾患の臨床徴候は認められなかった。バルネムリン５ｐｐｍ群における平均臨床評点１１は、対照における評点７７と比較して有意に低かった（ｐ＜０．００５）。試験中、全ての対照ブタから取った直腸綿棒サンプルから、S.hyodysenteriaeが単離された。しかしながら、バルネムリン５ｐｐｍ群で罹患した５頭中では、S.hyodysenteriaeが単離されたのは２頭のみからであった。試験終了後、いずれの濃度でバルネムリンを摂取したブタも、対照と比較して有意に重かった（それぞれ、５ｐｐｍではｐ＝０．００５；１０ｐｐｍおよび２０ｐｐｍではｐ＜０．０５）。剖検時に、対照ブタの残り３頭の大腸粘膜で、ブタ赤痢の代表的病変が認められた。５ｐｐｍでバルネムリンを摂取した群では、最初に疾患の徴候を示した５頭中、剖検時に病変があったのは２頭のみであったが、これらの動物からはS.hyodysenteriaeは単離されなかった。しかしながら、他の２頭から取った粘膜掻き取りサンプルからはS.hyodysenteriaeが単離され、これら動物はその時点で代表的な病変を有していたが、疾患の臨床徴候は示していなかった。１０ｐｐｍおよび２０ｐｐｍでバルネムリンを摂取させたブタでは病変は認められず、これらの群からはS.hyodysenteriaeは単離されなかった。
このように、含有量を１０ｐｐｍまで下げたバルネムリンが、ブタ赤痢の臨床徴候発生、糞中へのスピロヘータ放出および剖検時の病変の存在を予防する上で有効である。３０ｐｐｍでは、数頭のブタがブタ赤痢の臨床徴候を示したが、それは抗生物質の摂取に影響を与えたと考えられる偶発的感染と同時であった。抗生物質摂取およびブタ赤痢発生率に対する同時疾患の影響については既報の報告に記載されている（Burch, D.G.S., Vet.Rec.110(1982), 244-246）。体重増データの分析からは、投与群間に差は示されず、この抗生物質は摂取の嗜好に影響を与えなかったことが分かる。５ｐｐｍではバルネムリンは、臨床疾患やスピロヘータ放出を完全には予防しなかったが、対照と比較した場合、臨床評点およびスピロヘータ放出において有意な低減があった。この試験では、３０ｐｐｍで摂取させたチアムリンによってはブタ赤痢は予防されなかったが、対照群と比較して疾患の発生率が低下して、臨床評点が低くなった。しかしながらこの試験では、１０ｐｐｍのバルネムリンによる飼料中投薬の方が、ブタ赤痢予防においては、３０ｐｐｍのチアムリンより明らかに有効である。
４．さらなる負荷試験
従来法飼育のブタ６０頭（３．５〜４週齢）の群に１４日間にわたって未投薬の飼料を摂取させ、次に経口にてS.hyodysenteriaeの基準株（Ｐ１８Ａ）を負荷する。疾患の臨床徴候が認められた時点で、ブタを群当たり８頭の投与群６群に割り付け、１０日間にわたって抗生物質含有飼料を摂取させ、次にさらに１４日間にわたって未投薬飼料を摂取させる。バルネムリン塩酸塩を５０、７５、１００および１５０ｐｐｍで摂取させ、１００ｐｐｍでのフマル酸水素チアムリン対照および未投薬対照と比較する。疾患の広範囲の臨床徴候を持つブタを各投与群に含める。投与群に割り付けた後、臨床疾患の証拠を毎日評価し、臨床評点を割り当て、週２回直腸綿棒サンプリングを行ってS.hyodysenteriaeの単離を行い、定期的にブタの体重を測定する。飼料摂取も記録する。負荷から２４日後に剖検を行い、各ブタの大腸について病変の有無を調べる。大腸の４領域で粘膜掻き取りも行い、S.hyodysenteriaeの培養を行う。
負荷後で割り付け前に、感染から７日後に、臨床的ブタ赤痢が認められ、最初の２つの投与群（対照およびチアムリン）を負荷８日後に形成した。他の群は、バルネムリン７５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍおよび１５０ｐｐｍという順で負荷から１２日後、１５日後、２０日後および２８日後に形成した。各群には、糞中に血液および／または粘液を持ったブタと、疾患の軽度の臨床徴候、すなわち軟便のみを持つ動物を含めた。試験４日目に、未投薬対照群の全てのブタが、疾患の重度の臨床徴候を示しており、屠殺した。投与期間中、チアムリン群では、計３頭の動物が、重度のブタ赤痢のために死亡したか、あるいは安楽死が必要であった。バルネムリンを投与した全てのブタが、試験終了まで生残した。あらゆる濃度でバルネムリンを摂取した群で、疾患の臨床徴候が急速に消失し、試験第５日までに臨床疾患は認められなくなった。８日目までに、この改善はチアムリン摂取の生残ブタにおいても認められた。バルネムリン群における平均臨床評点は４〜１０の範囲であったのに対して、チアムリン群で記録された平均スコアは３０であった。第３日〜第１０日における臨床評点の統計解析から、バルネムリン摂取全群とチアムリン投与群の間には有意差があることが明らかになった（ｐ＜０．００１）。バルネムリンを摂取した全てのブタで投与期間中体重は常に上昇を続け、その全てでチアムリン群より生存体重増（ＤＬＷＧ）が大きかった（０．１に対して０．４〜０．９の範囲）。投与期間中、飼料変換比（ＦＣＲ）はバルネムリン群（１．９〜２．５の範囲）と比較して、チアムリン投与群の方がかなり大きかった（６．４）。割り付け時には、各投与群で大半のブタからS.hyodysenteriaeが単離された。割り付けから５日後、いずれの投与群のブタからも、直腸綿棒サンプリングでS.hyodysenteriaeは検出できなかった。
投与後期間では、５０ｐｐｍでバルネムリンを摂取した群の１頭が、薬剤添加飼料中止から４日後に疾患の臨床徴候を示し、チアムリン投与群の１頭も試験最終日にブタ赤痢を示した。しかしながら、これらのブタの糞からはS.hyodysenteriaeは検出されなかった。この投与後期間では、全ての投与群間でＤＬＷＧまたはＦＣＲにはほとんど差は認められなかった。試験終了後の剖検では、７５、１００および１５０ｐｐｍでバルネムリンを摂取したいずれのブタでも、ブタ赤痢病変は認められなかった。５０ｐｐｍでバルネムリンを摂取した群では、１頭で臨床的ブタ赤痢があり、その群の他の１頭においてその時点で大腸に若干の発赤があった。これら２頭およびブタ赤痢病変のなかったその群の他の３頭からの粘膜掻き取りサンプルから、S.hyodysenteriaeも単離された。７５ｐｐｍでバルネムリンを摂取させた群の１頭でも粘膜掻き取りサンプルからS.hyodysenteriaeが生じた。ただしそのブタでは、臨床的ブタ赤痢の証拠は認められなかった。
このように、チアムリンと比較して、５０、７５、１００および１５０ｐｐｍのバルネムリンによって臨床的ブタ赤痢から回復するのに必要な日数が少なくなった。さらに、これらのバルネムリン投与群で動物の死亡や安楽死の必要性はなかった。チアムリン群と比較して、バルネムリン投与群についての臨床評点に有意差があった（ｐ＜０．００１）。糞中でのS.hyodysenteriaeの放出も、薬剤添加飼料中止後に全てのバルネムリン濃度で予防された。しかしながら、５０および７５ｐｐｍでバルネムリン投与を受けたブタからの粘膜掻き取りサンプルから、S.hyodysenteriaeが単離された。３５および４０ｐｐｍのチアムリンは、糞からS.hyodysenteriaeを消失させるが、粘膜掻き取りサンプルからの回収は予防しないことが明らかになっている（Taylor,D.J., Vet.Rec. 106(1980) 526-528）。１００ｐｐｍのチアムリンを実験条件下で使用して（Taylor,D.J., Proc.7th IPVS Congress Mexico(1982), 47）、食欲不振になるほど重度ではない動物でのブタ赤痢の治療に奏功している。その試験では、１００ｐｐｍのチアムリンによって、未投薬対照と比較して死亡率が低下したが、一部の死亡は防げなかった。それは、この実験的負荷によって誘発された疾患の重度のためであったと考えられる。
以上のようにこの試験では、５０、７５、１００および１５０ｐｐｍで飼料に入れたバルネムリンによって、実験的に発生させたブタ赤痢の治療に奏功し、死亡の予防および臨床徴候の消失があった。投与中、S.hyodysenteriae排泄は防止され、５０ｐｐｍで投与していた１頭で投与を中止した後に再発があった。５０ｐｐｍおよび７５ｐｐｍでのバルネムリンによっては、全てのブタでS.hyodysenteriaeを完全に消失したわけではなかったが、１００ｐｐｍでは非常に有効であった。
従って本発明の薬剤は、Serpulina hyodysenteriae感染によって生じるブタ赤痢の治療において有用である。その用途では当然のことながら、使用する特定の塩、投与形態、動物の大きさおよび年齢、所望の効果に応じて有効用量は変動する。例えば、予防には長期間にわたって比較的低用量を投与することになると考えられる。しかしながら一般に、１日用量約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇで、好適には１日２〜４回に分けて、あるいは飼料中または飲料水中に入れて自由に摂取させて、あるいは持続性製剤で薬剤を投与した場合に、満足できる結果が得られる。ほとんどの動物について、１日用量は約１０ｍｇ〜約４００ｍｇ、例えば予防のためには約１０ｍｇ〜約２００ｍｇまたは治療のためには約２０ｍｇ〜約４００ｍｇであり、飼料または飲料水中に入れて自由に摂取させるか、あるいは１日１回または２回で投与する。
飲料水中の好ましい用量は、０．００１〜０．０５％（重量／体積）、特には０．００１〜０．００５％であり、飼料中の場合は２０〜１００ｇ／メートルトン、特には２０〜７５ｇ／メートルトンである。
Ｃ）Serpulina pilosicoli感染関連のブタ大腸炎
大腸炎は、例えばテイラーの著作（Taylor, D.J., Pig Diseases, 6th Ed. (1995), Publ. D.J.Taylor, Glasgow, UK, pp.148-149）などの獣医学手引書に記載されているような従来の方法で診断することができる。この用途での本発明の薬剤の有用な活性は、例えば以下のようにして求められる。
１．ＭＩＣ値
ブタ赤痢発生からのＷＢＨＳの飼育場単離株９株を下痢のある群および下痢のない群から含め、ＡＴＣＣ２９７９６（Serpulina innocens、群３）
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も含める。同定は、５％ウシ血液を含むＴＳＡ（トリチカーゼ（Tryticase）大豆寒天）での溶血パターンならびにインドール産生および馬尿酸化合物加水分解についての試験（Rosco Diagnostic Tablets, Taastrup, DK）に基づいたものである。９種類の弱β型溶血スピロヘータ中、１種類を群２に、４種類を群３に、５種類を群４に割り付ける
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細菌を寒天平板から０．９％生理食塩水に移し入れ、マクファーランド（McFarland）スケールで濁度を１．０に調節してから、２倍濃度のバルネムリン塩酸塩、フマル酸水素チアムリン、ジメトリダゾール、リンコマイシン塩酸塩およびチロシンという抗菌剤の入った寒天平板に各単離物１０μＬを接種する。嫌気的に４日間成長させた後に成長および溶血を記録し、スピロヘータが成長しない抗生物質の最低濃度としてＭＩＣを求める。
ＷＢＨＳについてのＭＩＣ測定値の結果を表６に示してある。ＷＢＨＳはこれら５種類のいずれの抗菌剤に対しても感受性であった。調べた抗菌剤のいずれについても、ＷＢＨＳの３つの群間で感受性に差はなかった。バルネムリンについて得られるＭＩＣ値は１０株中９株で非常に低い値であるが、４つの基準化合物のいずれによっても、その値はほとんどの株でかなり高いものである。
両方のＷＢＨＳについてのバルネムリンの高い感受性から、該化合物は感染群での罹患動物治療での使用に関して興味深いものとなる。
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従って本発明の薬剤は、Serpulina pilosicoli感染関連のブタ大腸炎の治療において有用である。その用途では当然のことながら、使用する特定の塩、投与形態、動物の大きさおよび年齢、所望の効果に応じて有効用量は変動する。例えば、予防には長期間にわたって比較的低用量を投与することになると考えられる。しかしながら一般に、１日用量約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇで、好適には１日２〜４回に分けて、あるいは飼料中または飲料水中に入れて自由に摂取させて、あるいは持続性製剤で薬剤を投与した場合に、満足できる結果が得られる。ほとんどの動物について、１日用量は約１０ｍｇ〜約４００ｍｇ、例えば予防のためには約１０ｍｇ〜約２００ｍｇまたは治療のためには約２０ｍｇ〜約４００ｍｇであり、飼料または飲料水中に入れて自由に摂取させるか、あるいは１日１回または２回で投与する。
飲料水中の好ましい用量は、０．００１〜０．０５％（重量／体積）、特には０．００１〜０．００５％であり、飼料中の場合は２０〜１００ｇ／メートルトン、特には２０〜７５ｇ／メートルトンである。
Ｄ）Lawsonia intracellularis感染関連のブタにおける回腸炎
Lawsonia intracellularis感染は、例えばテイラーの著作（Taylor, D.J., Pig Diseases, 6th Ed. (1995), Publ. D.J.Taylor, Glasgow, UK, pp.154-157）などの獣医学手引書に記載されているような従来の方法で診断することができる。この用途での本発明の薬剤の有用な活性は、例えば以下のようにして求められる。
１．in vitro活性
一部変更を加え、全体的にローソンらの方法（Lawson,G.H.K. et al., J.Clin.Microbiol. 31(1993), 1136-1142）に従って行う（標準的カービー−バウアー（Kirby-Bauer）円板法は細胞内細菌には適用できない）。
細胞：
ＩＥＣ−１８ラット腸細胞細胞培養物（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８９）の単層を得て、それを標準的な細胞培養法で維持する。小型の培養瓶（Tracs）中のカバーグラス上で分裂細胞の１日齢単層（密集率約３０％）を第０日感染用に得る。
接種物：
Lawsonia intracellularisの３つの菌株のバッチを接種物として用いる。これらは上記のローソンの参考文献に記載の方法に従って、ブタの腸から得て細胞培養で継代させた増殖性出血性腸疾患（ＰＨＥ）型およびブタ腸腺腫症（ＰＩＡ）型の増殖性腸疾患に罹患しているブタ由来のものである。その２つのＰＨＥ株について部分的に、マコリストら報告の方法に従って（McOrist,S. et al., Infect.Immun. 61(1993), 4286-4292）、ブタにおける病原性を調べた。数代の細胞継代後に接種物ロットを回収し、１ｍＬ瓶に入れて−７０℃で冷凍保存する。予備試験によって、５日間の試験で容易に認識できる細胞感染が生じると考えられる解凍瓶の適切な希釈度を明らかにした。
各使用に際して、抗生物質を１００倍原液として調製する。抗生物質の各ロットの活性を、大腸菌の実験室株を用いる標準的なカービー−バウアー円板法によって確認する。
感染：
第０日に、各株の瓶を解凍し、培地によって１／８〜１／３２に希釈し、４つの群１〜４での使用に供する。
群４（連続投与）については、この接種物を最初に、各種濃度の抗生物質を含む培地で３７℃にて１時間インキュベーションしてから、細胞に加える。
群３（細胞外活性）については、この接種物を、各種濃度の抗生物質を含む培地中で調製してから、直ちに細胞に加える。
群１（対照）および群２（細胞内活性）については、接種物を抗生物質を含まない培地中で調製して、細胞に加える。接種物（±抗生物質）を含んだ細胞が培地計０．５ｍＬに入っている培養瓶（Tracs）をスチール製広口瓶に入れ、４０％大気（Ｏ2８％）まで排気し、２分間放置し、水素を再充填し、最後に１０％ＣＯ2を再充填する。次にトラックス（Tracs）を広口瓶から取り出し、インキュベータセットに入れて、３７℃の８％Ｏ2、８．８％ＣＯ2および残り窒素という加湿雰囲気を提供する。
第１日および第２日に全ての瓶を取り出し、群２および４では抗生物質を含み群１および３では抗生物質を含まない新鮮培地を再補充し、インキュベータに戻す。第５日に全てのカバーグラスを取り出し、特異的モノクローナル抗体を組み込んだ間接免疫ペルオキシダーゼ染色によってLawsonia intracellularisの染色を行う。Lawsonia intracellularisにひどく感染した（細胞当たり＞３０、重度感染細胞＝ＨＩＣ）各カバーグラスにおける細胞数を、感染の主要尺度として用いる。ＨＩＣの病巣数および全体的な細胞観察も記録する。対照（群１）、細胞内活性抗生物質アッセイ（群２）、細胞外活性抗生物質アッセイ（群３）および連続投与アッセイ（群４）におけるＨＩＣを、それぞれ３株までについて３連のアッセイで比較する。各種接種物強度について一部のアッセイを繰り返す。試験群に関連する対照の平均ＨＩＣの誘導後に、パーセント比を計算する。平均対照ＨＩＣは、対照のトラックス総数を感染対照トラックス数で割ったものである。次に、ＨＩＣ値を平均対照ＨＩＣで割り、１００を掛けてパーセント値を出すことで、試験トラックスのパーセント比を計算する。すなわち、抗生物質が効果を示さない試験トラックスはパーセント比がほぼ１００であると考えられ、抗生物質が成長を完全に阻害する場合には、比は０になると考えられる。
バルネムリン塩酸塩で得られた値を表７に示す。この表は、投与後も未感染のままであった細胞のパーセントを示すものである。
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これらの結果は、Lawsonia intracellularisの有意な成長阻害を起こす（＜１％成長）バルネムリン塩酸塩の最小濃度が＜２μｇ／ｍＬであることを示している。
２．負荷試験
３５頭の離乳ブタに対して、ローソンらの方法（Lawson et al., J.Clin.Microbiol. 31(1993) 1135-1142）に従って、同じ日にラット腸細胞系ＩＥＣ−１８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８９）での培養によって得られたブタ増殖性腸疾患病原体の単離株であるLawsonia intracellularis（ＬＲ１８９／５／８３株）の毒性接種物を負荷する。対照ブタ７頭に緩衝液を投与する。負荷ブタ２１頭中７頭を未投与のままとする。その７頭では体重増が減少しており、いずれのブタにおいても、負荷から３週間後の剖検で得た腸切片に検出された増殖性腸疾患の病変が発生した。負荷２週間後に、７頭中６頭で肉眼で明らかな病変があり、３頭で軽度ないし中等度の下痢が生じた。「予防」投与戦略について調べるため、他の負荷ブタ２群について、それぞれ用量２５ｐｐｍおよび７５ｐｐｍで（すなわち、１．２５ｍｇ／ｋｇおよび３．７ｍｇ／ｋｇ）負荷の２日前に調製した混合物を介して、バルネムリン塩酸塩を経口投与し、それを安楽死まで続ける。「治療」戦略について調べるため、他の負荷ブタ２群について、それぞれ用量２５ｐｐｍおよび７５ｐｐｍで、負荷の７日前に調製した混合物を介して、バルネムリン塩酸塩を経口投与し、それを安楽死まで続ける。
予防群の７頭中３頭および治療群の７頭中５頭で、剖検時に取った腸切片に増殖性腸疾患の病変は肉眼で認められなかった。対照ブタは正常のままであった。従って、投与した薬剤の実際の用量が低いものであったとしても、かなりの割合の負荷ブタにおいて、バルネムリンによって、疾患が予防または治療された。
従って本発明の薬剤は、Lawsonia intracellularis感染関連のブタ回腸炎の治療において有用である。その用途では当然のことながら、使用する特定の塩、投与形態、動物の大きさおよび年齢、所望の効果に応じて有効用量は変動する。例えば、予防には長期間にわたって比較的低用量を投与することになると考えられる。しかしながら一般に、１日用量約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約６．５ｍｇ／ｋｇで、好適には飼料中または飲料水中に入れて自由に摂取させて、あるいは１日２〜４回に分けて、あるいは持続性製剤で薬剤を投与した場合に、満足できる結果が得られる。ほとんどの動物について、１日の総用量は約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約１５ｍｇ〜約５００ｍｇで、１日１回または２回投与する。
飲料水中の好ましい用量は、０．００１〜０．０５％（重量／体積）、特には０．００１〜０．００５％であり、飼料中の場合は２０〜４００ｇ／メートルトン、特には２０〜２００ｇ／メートルトンである。
Ｅ）Mycoplasma gallisepticum感染関連の家禽における慢性呼吸器疾患および関節炎
感染は、例えばMycoplasma gallisepticum感染の場合、ホフスタットらの編著（Diseases of Poultry, 8th Ed. (1984), Ed. Hofstad et al., Iowa State University Press, pp.196-198）などの獣医学手引書に記載されているような従来の方法で診断することができる。この用途での本発明の薬剤の有用な活性は、例えば以下のようにして求められる。
１．in vitro活性：ＭＩＣ
バルネムリン塩酸塩の抗菌効果を、チロシン（Tylansoluble）およびフマル酸水素チアムリンとの比較で、標準的な連続微量希釈法によって求める。
被験化合物１２．８ｍｇを蒸留水１００ｍＬに溶かして、原液を得て、それを用時まで−２０℃で保存する。使用するMycoplasma gallisepticum基準株は、Ｘ９５、Ｓ６オランダ（Holland）、Ｓ６ベンチ（Bench）（英国）、ＭＳ−１６（日本）、ＭＫ−７（日本）および１２２６、ならびに各種の新鮮な飼育場単離株である。
これら菌株の抗生物質感受性を、微量肉汁希釈法（Stipkovits et al., Vet.Microbiol. 15(1987), 65-70）の変法を用いて調べる。２連の抗生物質希釈液を用いて、マイクロタイタープレートの全てのウェルに、試験培地を加える（１００μＬ）。接種物（１００μＬ）は、１０5ｃｆｕ／ｍＬを含む。プレートをセロテープで封止し、３日間にわたって３７℃でインキュベーションする。第３日の読み取りで培地の呈色を完全に防止する抗生物質の最低濃度を最小阻害濃度（ＭＩＣ）とする。呈色のないウェルについて、それを寒天培地で平板培養することで、マイコプラズマの生存性を調べる。全てのマイコプラズマ株を培地Ｂ（Ernφ,H. and Stipkovits,L., Acta Vet.Scand. 14(1973), 436-449）１０ｍＬ中で増殖させる。初期の対数成長期まで３７℃でインキュベーションした後、培地１ｍＬずつを種培養物として試験管に分配し、−２０℃で保存する。グルコース発酵マイコプラズマ菌株は、１％グルコース（ｐＨ７．８）を補給した改良培地Ｂｇで調べ、アルギニン加水分解株は１％アルギニン（ｐＨ７．３）を含む培地Ｂａ（Ernφ,H. and Stipkovits,L., supra, 450-463）で調べ、グルコースおよびアルギニン陰性株は１％塩化トリフェニルテトラゾリウムを含む培地Ｂで調べる。
希釈度を考慮した上での各種菌株群および抗生物質についての平均ＭＩＣ値を計算する。
基準株のＭＩＣ値を表８に示してあり、マイコプラズマ単離株の値については表９に示してある。
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基準マイコプラズマ菌株で得られた結果から、３つの化合物がほぼ同じ活性範囲を示していることがわかる。しかしながらトリ飼育場単離株のＭＩＣ値は、被験物質間の顕著な差を反映している。バルネムリンに対しては均等に高い感度（０．０３〜０．０６μｇ／ｍＬ）が示されているが、チアムリンに対する感度はやや低く（０．０６〜１μｇ／ｍＬ）、チロシンについては、抵抗株が明らかである（０．０６〜３２μｇ／ｍＬ）。
２．負荷試験
２．１．予防
雄ブロイラー若鶏群をMycoplasma gallisepticum（ＭＧ）の毒性株で感染させ、各群にそれぞれ、バルネムリン（濃度０．００３１２、０．００６２５、０．０１２５および０．０２５％）、チアムリン（０．００６２５、０．０１２５および０．０２５％）およびチロシン（０．０５％）のいずれかを投与する。感染は第２日に、各肺に生存微生物約１０6ｃｆｕを含むMycoplasma gallisepticum培養物０．１ｍＬを注射することで行い（Jordan,F.T.W., The Veterinary Record 127(1990), 502）、投薬は感染１時間以内に開始して、３日連続で続ける。感染未投与群および未感染群も設ける。
得られた結果から、臨床徴候および死亡の予防は、２つの相対的に高い用量のバルネムリン（０．０１２５および０．０２５％）、チアムリンの３用量、上記濃度のチロシンを投与された群で同等に満足できるものであった。病変が認められたヒナはほとんどなく、チロシン投与の方が重度は軽く、次にチアムリン投与群そして次に２つの相対的に高い用量のバルネムリン（０．０１２５および０．０２５％）投与群であった。バルネムリンの相対的に低い方の２つの用量は、この点では相対的に効果が低かった。チロシン投与群で最大の体重増があり、次は有意に低かったが（ｐ＜０．０５）未感染トリの群、チアムリン投与の群および最低用量を除く全ての用量でのバルネムリン投与群であった。体重増が最も小さかったのは、最低用量のバルネムリン投与群および未感染未投与群であり、それらに有意差はなかった。生存中または剖検時に、未感染群、チアムリン最高用量投与群およびチロシン投与群のヒナからはＭＧは回収されず、バルネムリン最高用量投与群からの１羽のみから単離された。他のいずれの感染群からも、比較的高い割合の単離が行われた。チロシン投与群については陽性反応が比較的高い割合であったため、その群では血清検査結果はそれを完全には反映していなかった。
このように、高い方の２用量のバルネムリンは、若齢ヒナでのMycoplasma gallisepticum感染予防において、基準化合物と同等の効果を有することが認められた。
２．２．治療
雄ブロイラーヒナ群をMycoplasma gallisepticum（ＭＧ）の毒性株で感染させ、各群にそれぞれ、濃度０．０１２５％、０．０２５％、０．０５％のバルネムリン、同濃度のチアムリン、０．０５％のチロシンおよび０．０８３％のリンコスペクチン（lincospectin）・スペクチノマイシン混剤（リンコ−スペクチン）を投与する。さらに、未投与で放置した感染群および未感染群も設ける。ヒナは２日齢で、各肺に微生物約３．４×１０5個を注射して感染させる。２４時間後に飲料水での投薬を開始し、連続３日間継続する。ただし、リンコ−スペクチンの場合は投与を連続５日間継続した。
得られた結果から、バルネムリンの３濃度全ておよび０．０５％のチアムリンで、死亡率抑制は５％以下としたのが最良であったことが明らかである。バルネムリンの最高用量および最低用量を投与したヒナでは病変が認められず、チアムリンおよびチロシン投与の場合にはごく少数のヒナでしか認められなかった。全ての濃度でのバルネムリンでの体重増がチアムリン投与群より大きく、チロシン群と同等であった。第２３日の実験終了時には、バルネムリン投与のトリ３群およびチロシン投与群からはマイコプラズマは回収されなかった。その時点での血清検査結果では、全ての感染群に陽性の反応を示す動物があった。
死亡率、体重増、ＭＧ単離および血清凝集試験結果を考慮すると、飲料水中で投与した２つの高い方の用量（０．０２５％および０．０５％）のバルネムリンは、０．０５％のチアムリンまたは０．０５％のチロシンと少なくとも同等以上で、リンコ−スペクチンよりかなり良好な結果を与える。
従って本発明の薬剤は、Mycoplasma gallisepticum感染関連の家禽の慢性呼吸器疾患および関節炎の治療において有用である。その用途では当然のことながら、使用する特定の塩、投与形態、動物の大きさおよび年齢、所望の効果に応じて有効用量は変動する。例えば、予防には長期間にわたって比較的低用量を投与することになると考えられる。しかしながら一般に、１日用量約０．００５〜約０．０５％（重量／体積）、特には０．０１〜０．０３％で飲料水に入れて、そして２０〜４００ｇ／メートルトン、特には２０〜２００ｇ／メートルトンの用量で飼料に入れて投与した場合に、満足できる結果が得られる。
Ｆ）Pasteurella multocida、Actinobacillus(Haemophilus)pleuropneumoniaeおよび／またはHaemophilus parasuis感染による二次感染
Pasteurella multocida、Actinobacillus(Haemophilus)pleuropneumoniaeおよび／またはHaemophilus parasuisによる二次感染は、例えばテイラーの著作（Taylor, D.J., Pig Diseases, 6th Ed. (1995), Publ. D.J.Taylor, Glasgow, UK, pp.185-187; 187-194; and 194-197）などの獣医学手引書に記載されているような従来の方法で診断することができる。この用途での本発明の薬剤の有用な活性は、例えば以下のようにして求められる。
ブタ呼吸器から取得したものに由来する最近のPasteurella multocida、Haemophilus pleuropneumoniaeおよびHaemophilus parasuis単離株に対するバルネムリン塩酸塩の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を求め、チアムリンと比較する。１０種類のP.multocida、１０種類のH.pleuropneumoniaeおよび３種類のH.parasuisを含む細菌単離株培養物を用いるが、それらは剖検で評価した罹患ブタから最近５年以内に単離したものである。Pasteurella単離株中の３株は毒性のPasteurella multocida株であった。H.pleuropneumoniaeおよびH.parasuisの場合、試験前日に、１匙の各純粋培養物を１％供血仔ウシ血清および２ｍｇ／ｍＬニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を含むトッド-ヒューウィット肉汁（Unipath CM190）１０ｍＬに接種する。P.multocidaの場合、試験当日に、１匙の各純粋培養物を１％供血仔ウシ血清を含む栄養肉汁（Unipath CM67）１０ｍＬに接種する。調製した各肉汁培地を１０％ＣＯ2中、３７℃で１８時間インキュベーションする。インキュベーション後および試験当日に、２３個の肉汁培地を、無菌生理食塩水中１ｍＬ当たり細菌１０5〜１０6個に調節して、ＭＩＣ培地の接種に備える。各被験化合物について、オックスフオード黄色ブドウ球菌ＮＣＴＣ６５７１の標準対照培養物も準備して、ＭＩＣ試験結果のバリデーションを行う。各場合で、対照微生物から準備した肉汁培地は、試験微生物の培地と同一である。バルネムリンは塩酸塩であり、チアムリンは水素化フマル酸塩として用いる。試験当日、有効成分を３．２ｍｇ／ｍＬで含む被験化合物の原液を無菌蒸留水溶液として調製する。さらに、９つの２倍希釈液を無菌蒸留水溶液として調製して、各抗生物質を３２０μｇ〜１．２５μｇ／ｍＬの範囲とし、ＭＩＣ培地に組み入れる。溶解ウマ血液（Oxoid SR50）を含む感作寒天（Oxoid CM409）をメーカーの説明に従って調製し、必要に応じてｐＨ７．４に調節する。２種類のHaemophilus種に対するＭＩＣアッセイ用に調製したＭＩＣ培地の全てのロットについて、２ｍｇ／ｍＬのＮＡＤを加えて、必要な成長因子を得る。９０ｍｍシャーレで、融解寒天（５０℃）１８ｍＬを、被験化合物の各調製希釈液２ｍＬ（１０個の希釈液の１個）と混合する。各希釈液から４連の平板を準備する。各ＭＩＣアッセイについて、寒天１８ｍＬおよび無菌蒸留水２ｍＬを含む容器も４連で準備して、成長指標として用いる。
乾燥ＭＩＣ平板に調製した試験微生物０．２μＬを接種する。P.multocidaを接種した平板は３７℃で空気中にて１８時間インキュベーションし、H.pleuropneumoniaeおよびH.parasuisを接種した平板は１０％ＣＯ2中で３７℃にて１８時間インキュベーションする。接種後、微生物の成長を最初に肉眼で調べ、次に立体ズーム顕微鏡での顕微鏡検査によって調べる。ＭＩＣ値を、顕微鏡検査によって４つの平板全てにおける接種箇所で成長が検出できない被験化合物の最低濃度として得る。
得られた結果を表１０に示してある。
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上記の結果から、チアムリンと比較してバルネムリンが、P.multocidaに対して平均で２．５倍、H.pleuropneumoniaeに対して５．５倍、H.parasuisに対して３倍の活性を有していたことが明らかである。
従って本発明の薬剤は、Pasteurella multocida、Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniaeおよびHaemophilus parasuis感染関連のブタにおける二次肺炎の治療において有用である。その用途では当然のことながら、使用する特定の塩、投与形態、動物の大きさおよび年齢、所望の効果に応じて有効用量は変動する。例えば、予防には長期間にわたって比較的低用量を投与することになると考えられる。しかしながら一般に、１日用量約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇで、好適には飼料中または飲料水中に入れて自由に摂取させて、あるいは１日２〜４回に分けて、あるいは持続性製剤で薬剤を投与した場合に、満足できる結果が得られる。ほとんどの動物について、１日の総用量は約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約１００ｍｇ〜約５００ｍｇであり、１日１回または２回で投与する。
有利には該薬剤は、単独療法として投与することができる。
飲料水中の好ましい用量は、０．０１〜０．０５％（重量／体積）であり、特には０．０１〜０．０２５％であり、飼料中の場合は１００〜４００ｐｐｍ、特には１００〜２００ｐｐｍである。
Ｇ）Pasteurella haemolytica感染関連の仔ヒツジ、ヒツジおよびウシにおける肺炎
Pasteurella haemolytica感染は、ラドスティッツらの編著（Veterinary Medicine, 8th Ed.(1994), Eds.Radostits,O.M., Blood,D.C. and Gay,C.C., Publ.Bailliere Tindall, London, U.K., pp.748-770）などの獣医学手引書に記載されているような従来の方法で診断することができる。この用途での本発明の薬剤の有用な活性は、例えば以下のようにしてin vivoで求められる。
Pasteurella haemolyticaＡ１の抑制感染による仔ウシでの肺炎の治療におけるバルネムリン塩酸塩の２つの製剤について、臨床効力を求める。
第−６日に、鼻の綿棒サンプリングを行ってP.haemolyticaＡ１がないことが認められている仔ウシ２４頭について体重を測定し、群間で均等な性別分布となるようにしながら生存体重に従って均衡を取った６頭から成る投与群４群に割り付ける。仔ウシを従来の仔ウシ飼育ユニットの個々の檻で飼育し、そこで３３日間馴致させてから割り付けを行う。試験前期に採血を２回行って、事前のP.haemolyticaＡ１曝露の指標として、ロイコトキシン抗体分析を行う。
投与は第−１日に開始し、約２７時間後に負荷を行う。
群１−対照
群２−バルネムリン塩酸塩２．５％注射（２．５ｍｇ／ｋｇ、１日２回）
群３−経口での仔ウシ代用乳を介してのバルネムリン塩酸塩１０％混合物（５．０ｍｇ／ｋｇ、１日２回）
いずれの仔ウシにも、光ファイバー気管支鏡を用いてのPasteurella haemolyticaＡ１肉汁培地（Ｍ４／１／３、Moredun Research Institute−１．２５×１０7ｃｆｕ／ｍＬ）３０ｍＬを気管支内に堆積させることで、第０日に負荷を行う。臨床検査を、第−３日および第−２日には１日１回、第１日から第３日には１日２回行う。直腸温度、呼吸速度、呼吸の性質および行動という４つの各パラメータに対して臨床評点を割り当てる。臥位のままの仔ウシおよび／または抑鬱および／または呼吸困難の徴候を示している仔ウシ、あるいは第０〜３日の間の１回の検査で総臨床評点が５より高い仔ウシは、人道的理由から、致死用量のペントバルビトンナトリウムＢＰ（Vet）２０％ｗ／ｖの静注によって直ちに安楽死させ、２４時間以内に剖検を行う。P.haemolytica負荷から４日後まで生存している仔ウシは、第０〜３日の間に安楽死させた仔ウシの場合と同様の方法で、第４日に安楽死させる。全ての仔ウシから肺を摘出し、連結病変および胸膜癒着を肉眼で評価する。標準的部位８ヶ所から肺組織検体を切除し、P.haemolyticaの有無について調べて、隔離指数値を求める。心臓血綿棒サンプルを、一気に屠殺した仔ウシから取り、P.haemolyticaの有無について調べる。
個々の仔ウシおよび群の合計、群平均および群中央値を、総臨床評点、連結病変評点、隔離指数、肋膜炎評点および総評点という全てのパラメータについて計算する。直腸温度、呼吸速度、呼吸の性質および行動という総臨床評点を構成する全てのカテゴリについて個々の仔ウシおよび群の合計、群平均および群中央値を計算する。クラスカル・ウォーリスの検定による基礎解析を適用して（Minitab 9）、総臨床評点、連結病変評点、隔離指数、肋膜炎評点および総評点という各パラメータについて群評点間に差があるか否かを求める。クラスカル・ウォーリスの検定が有意であれば、それらの群は全く同一というわけではないことが示されるのであって、それらが全く異なるものであることが示されるわけではない。どの群が異なるかを調べるには、群ペアについてマン・ウィットニー検定（Minitab 9）を用いて検定を行う。
未投与仔ウシ（群１）と比較すると、P.haemolyticaＡ１の負荷２７時間前から５日間にわたって、仔ウシ代用乳を介して１日２回、用量５．０ｍｇ／ｋｇ／投与でバルネムリン１０％混合物を経口投与した仔ウシの方が、総臨床評点は有意に低いことがわかった（ｐ＝０．０１３）。
P.haemolyticaＡ１の負荷２７時間前から５日間にわたって、１日２回、用量２．５ｍｇ／ｋｇ／投与でバルネムリン２．５％注射剤を筋肉注射した仔ウシにおいても、総臨床評点は相対的に低かったが、統計的有意差はなかった。
総臨床評点を比較した場合、投与を受けた群間に有意差はなかった。
従って本発明の薬剤は、Pasteurella haemolytica感染関連の仔ヒツジ、ヒツジおよびウシにおける肺炎の治療において有用である。その用途では当然のことながら、使用する特定の塩、投与形態、動物の大きさおよび年齢、所望の効果に応じて有効用量は変動する。例えば、予防には長期間にわたって比較的低用量を投与することになると考えられる。しかしながら一般に、１日用量約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇで、好適には飼料中または飲料水中に入れて自由に摂取させて、あるいは１日２〜４回に分けて、あるいは持続性製剤で薬剤を投与した場合に、満足できる結果が得られる。ほとんどの動物について、１日の総用量は約２５０ｍｇ〜約３０００ｍｇ、好ましくは約２５０ｍｇ〜約１０００ｍｇであり、１日１回または２回で、または飼料中に入れて自由に接種させて投与する。
Ｈ）Mycoplasma hyosynoviae感染関連のブタにおける多発関節炎
Mycoplasma hyosynoviae感染は、例えばテイラーの著作（Taylor, D.J., Pig Diseases, 6th Ed. (1995), Publ. D.J.Taylor, Glasgow, UK, pp.172-173）などの獣医学手引書に記載されているような従来の方法で診断することができる。この用途での本発明の薬剤の有用な活性は、例えば以下のようにして求められる。
１．組織単離株でのin vitro活性（ＭＩＣアッセイ）
各種のブタ流行性肺炎（ＥＰＰ）感染群からのブタの肺から、組織検体を得る。検体をドライアイス上で冷却しながら輸送して、培養に供する。当初Mycoplasma hyopneumoniaeの回収用に摘出した肺検体からの４つの摘出物について、M.hyopneumoniaeの培養時に、一部の検体がMycoplasma hyosynoviaeの代表的形態を有するコロニーのかなりの成長を生じていることが認められた後にMycoplasma hyosynoviaeの単離を再度行った。提供された他の肺検体から、さらに３つの単離株を回収した。いずれの単離株についても、Mycoplasma hyosynoviaeに対して形成した特異的ウサギ抗血清による円板成長阻害によって血清学的に確認した。市販の固体培地（Mycoplasma Experience Ltd.）を用いて、肺組織からM.hyosynoviaeを単離する。フェノールレッドおよびアルギニン（ｐＨ７．０）を含む液体培地（Mycoplasma Experience Ltd.）を用いて、ＭＩＣアッセイを行う。
被験化合物の原液を、脱イオン水中１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、孔径０．２μの膜フィルター（Sartorius Minisart, N）による濾過で滅菌し、−２０℃で保存する。ＭＩＣ試験で使用するため、原液を液体培地で希釈して、必要な最終濃度を二連で得る。ＭＩＣ試験を、タナーらの方法に従って実施する（Tanner & Wu, Avian Diseases 36(1992) 714-717）。−７０℃で保存した肉汁培地１ｍＬずつ、あるいは−７０℃で寒天上にて保存した培地から、活発に成長する負荷培地を調製する。その負荷培地を希釈して、１０3〜１０5呈色単位／ｍＬの標的力価を得る。負荷接種物０．１ｍＬずつをマイクロタイターウェルで抗生物質希釈液０．１ｍＬずつと混合する。各マイクロタイター平板には、ｐＨ７．６の未接種培地（終点対照）および抗生物質を含まない接種負荷対照を含有させる。いずれの平板も粘着フィルムで封止し、３６℃で好気的にインキュベーションする。負荷対照ウェルでの呈色が終点対照のｐＨと一致した時点で、ＭＩＣを記録する。ＭＩＣは、呈色を示さない最低濃度である。
バルネムリン塩酸塩と２つの基準化合物チアムリンおよびエンロフロキサシン（enrofloxacin）について得られた結果を、表１１に示してある。
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Mycoplasma hyosynoviaeの７つの飼育場単離株のバルネムリンに対する感受性は、他の２つの化合物の場合よりかなり高く、最近の飼育場単離株がバルネムリンに対して極めて感受性であることが示されている。
従って本発明の薬剤は、Mycoplasma hyosynoviae感染関連のブタにおける多発関節炎の治療に有用である。そのためには当然のことながら、有効用量は、使用する特定の塩、投与形態、動物の大きさおよび年齢、所望の効果によって変わるものである。例えば予防のためには、比較的低い用量を長期間にわたって投与することになると考えられる。しかしながら一般に、１日用量約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇで、好適には飲料水もしくは飼料に入れて自由に摂取させるか、あるいは１日２〜４回の分割用量で、あるいは持続性製剤で薬剤を投与した場合に、満足できる結果が得られる。ほとんどの動物について、１日総用量は約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約１００ｍｇ〜約５００ｍｇであり、１日１回または２回で投与する。
有利には、単独療法として投与することができる。
飲料水中の好ましい用量は、０．０１〜０．０５％（重量／体積）、特には０．０１〜０．０２５％であり、飼料中の場合は１００〜４００ｐｐｍ（ｇ／メートルトン）、特には１００〜２００ｐｐｍ（ｇ／メートルトン）である。
これらのいずれの用途においても、当該化合物は、遊離塩基の形あるいは例えば四級塩または特に酸付加塩の形の獣医学的に許容される塩の形で使用することができる。そのような塩の形のものは、遊離塩基形のものと同程度の活性を示す。好適な酸付加塩の連としては、水素化フマル酸塩、フマル酸塩、ナフタリン−１，５−スルホン酸塩および特には塩酸塩がある。
本発明の薬剤は、経口、局所または非経口投与することができ、従来の化学療法上許容される希釈剤および担体そして適宜に他の賦形剤と混合することができ、錠剤、カプセルまたは注射剤などの形で投与することができる。当該薬剤はさらに、飼料混合物（飼料プレミックスとして）用または飲料水用の優れた添加剤を形成するものである。
獣医学的に許容される担体で好ましいものとしては例えば、砂糖、コーンスターチ、乳糖、セルロースなどの一般に使用される医薬賦形剤、ならびに粉砕もみ殻、飼料用小麦および大豆粉などの穀類担体系および穀類副産物；さらには、粉砕石灰石、硫酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよびカオリンなどの固体希釈剤あるいは獣医学的に許容されるオイル（植物油または鉱油）、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような液体物質などがある。好適にはこれら製剤を動物に対して経口投与し、好ましくは薬剤添加飼料または薬剤添加ペレットの形で飼料中に混合する。
飲料水に入れて使用する場合は、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、承認された液体界面活性剤およびソルビトールなどの溶媒を加えたまたは加えない水溶液を使用する。
例えば筋肉注射用には、代表的には、エタノールもしくはプロピレングリコールのような溶媒を含むことができる水溶液として、あるいは獣医学的に許容されるオイルの溶液として製剤する。許容されるオイルの例としては、ゴマ油、中等度鎖トリグリセリド類（例：ミグリオール（Miglyol））、ミリスチン酸イソプロピルおよびオレイン酸エチルがある。製剤は、保存剤、緩衝剤および他の一般的な賦形剤を含むことができる。
本発明で使用される獣医製剤は、必要な割合で成分を混合することで調製できる。次に製剤を、投与用の適切な容器に入れる。
以下の実施例は、本発明を説明するものである。
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本発明の薬剤は良好に耐容される。塩酸塩の形での式Ｉの化合物のラットにおける急性毒性を、１回量を１０００ｍｇ／ｋｇおよび２０００ｍｇ／ｋｇとし、用量群当たり雄５匹および雌５匹のラットに経口投与して求めた。死亡は１〜８日以内に起こった。得られたＬＤ50値は１０００ｍｇ／ｋｇ（経口）を上回る。