(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
過酸化水素分解性を有するビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属・Ｓ−１−６細菌株より生産され、ＳＤＳ−電気泳動における分子量が５７，０００、ゲル濾過における溶液中の分子量がその約４倍であり、活性の温度範囲が５℃〜６０℃であり、かつ、至適ｐＨが６〜８である高力価カタラーゼ。
【請求項２】
過酸化水素分解性を有するビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属・Ｓ−１−６細菌株を培養し、該培養物からカタラーゼを分離精製することを特徴とする請求項１に記載の高力価カタラーゼの製造方法。
【請求項３】
過酸化水素分解性を有するビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属・Ｓ−１−６細菌株より得られた請求項１に記載の高力価カタラーゼを過酸化水素含有排水に接触させることを特徴とする過酸化水素含有排水の処理法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、新規のカタラーゼ生産菌である、強度の過酸化水素分解活性を有するビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属・Ｓ―１―６細菌株より生産される高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにこの高力価カタラーゼを用いる過酸化水素含有排水の処理方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
カタラーゼは、動植物中に広く分布し、哺乳動物では肝臓、赤血球、高等植物では、クロロプラストに多量に含まれており、微生物では嫌気的に生育するものを除いてほとんど全ての細菌に存在することが知られている。
【０００３】
現在、過酸化水素は有害性の低い酸化剤、漂白剤、殺菌剤として注目されており、工業的には、製紙工業、繊維工業、油脂工業、皮革工業において、漂白、脱リグニン、顕色剤、脱タンニン等のために用いられており、食品分野では、牛乳の殺菌、数の子の漂白に使われ、一般家庭内で使われる洗濯用の漂白剤としても注目されており、環境対策上問題の多い塩素系漂白剤の代替品としても、年々その必要性は高まってきている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
過酸化水素は、それ自身の分解により、水と酸素という安全な物質となるので、処理さえ安全かつ迅速に行なえば２次汚染の心配はないが、排水として高濃度の過酸化水素含有水が直接流出した際には、過酸化水素が自然に分解されるとはいえ、通常は、排水中に過酸化水素が残留することになり、反応性が高く殺菌作用が強い点から考えても、周辺地域に対して重大な環境汚染を引き起こすことが予想されるので、それを排水中から完全に除去する対策を講じる必要がある。
【０００５】
現在、過酸化水素が残留する排水の処理方法としては以下の方法があるが、それぞれ問題点がある。活性汚泥法や曝気による方法では、活性汚泥の機能の維持や管理の面でコストがかかり、また、過酸化水素処理能力上からも問題がある。金属触媒に接触させる方法や活性炭に接触させて分解する方法は、時間がかかり、微量な過酸化水素を除去できないという問題がある。
【０００６】
重亜硫酸ナトリウム等の還元剤と反応させる方法は、過酸化水素量に対して還元剤を等量を添加しなければならないので、処理操作の管理の面で煩雑であるばかりでなく、還元剤を入れ過ぎた場合には、残留した還元剤による自然破壊が行なわれる問題がある。
【０００７】
この点、カタラーゼを添加する方法は、極めて少量でも排水中の過酸化水素を短時間で分解することができるが、カタラーゼ自体が高価であるので、そのコスト低減が重要な課題になっている。
【０００８】
本発明者は、先に、高濃度の過酸化水素を含む水産加工場の排水の環境の下でも、十分活発に生存し、しかも過酸化水素を分解する能力を有する微生物を発見し、これを特願平７−９００２４号として出願した。この微生物は、ビブリオ属に属する新規微生物であって、本発明者によってビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属・Ｓ−１−６細菌株と命名されて、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号・ＦＥＲＭ  Ｐ−１４５３１号として平成６年９月９日に登録された。
【０００９】
しかし、特願平７−９００２４号の発明は、菌体そのものを排水中に投与するので、比較的多量の菌体を必要とする欠点があった。また、細菌を培養した場所と投与する場所が離れている場合には、菌体の保存や輸送上の問題があった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記欠点を除くために、鋭意研究した結果、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属・Ｓ−１−６細菌株（以下Ｓ−１−６細菌株と称する）より分離したカタラーゼが新規物質であり、しかも高力価の過酸化水素分解能を有することを突き止め、本発明を完成することができた。
【００１１】
すなわち、本発明の高力価カタラーゼは、過酸化水素分解性を有するＳ−１−６細菌株より生産される新規な物質である。
本発明のカタラーゼの特徴は、過酸化水素分解性を有するＳ−１−６細菌株より生産され、ＳＤＳ−電気泳動における分子量が５７，０００、ゲル濾過における溶液中の分子量がその約４倍であり、活性の温度範囲が５℃〜６０℃であり、かつ、至適ｐＨが６〜８である。
また、本発明の高力価カタラーゼの製造方法は、過酸化水素分解性を有するＳ−１−６細菌株を培養し、該培養物からカタラーゼを分離精製することを特徴とするものである。
【００１２】
カタラーゼの分離精製は、培養したＳ―１―６細菌株を集菌した後、細胞破壊装置によって、菌体を破壊し、遠心分離によって膜画分と可溶性画分に分離する。得られた可溶性画分をクロマトグラフィーにかけて、カタラーゼ画分を分離する。さらに、このカタラーゼ画分をゲル濾過によって精製、濃縮することにより、本カタラーゼを得ることができる。
【００１３】
さらに、本発明の過酸化水素含有排水の処理方法は、過酸化水素分解性を有するＳ―１―６細菌株より得られた高力価カタラーゼを、過酸化水素含有排水に接触させることを特徴とするものである。
【００１４】
本発明に用いられるＳ―１―６細菌株は、本発明者が、北海道留萌市の井原水産株式会社の本社工場の排水中から採取したもので、魚体や魚卵由来の有機化合物を含有する水産加工工場の排水中でも長期的に生存が可能な細菌で、しかも、強度の過酸化水素分解活性を有している。
【００１５】
次に、Ｓ−１−６細菌株についてさらに詳しく説明する。
Ｓ−１−６細菌株の細菌学的性質は、以下の通りである。
１．形態的所見（２５℃、２４時間培養）
幹菌  長さ１．０〜１．５μｍ×幅０．４μｍ
鞭毛：無
運動性：無
胞子の有無：生産されない
グラム染色：グラム陰性
【００１６】
２．培養所見（２５℃、２４時間培養）
（１）肉汁寒天平板培地
コロニーの形状及び性質
外形：円形、大きさ：均質、表面：平板、色：白、透明度：不透明
【００１７】
３．生理学的所見
（１）ＤＮＡの分解：陽性
（２）ゼラチン分解：陰性
（３）カゼイン分解：陰性
（４）デンプン分解：陽性
（５）ＮａＣｌ存在による生育：
０．０％：  陽性
０．５％：  陽性
６．０％：  陽性
【００１８】
（６）シモンズ及びクリスチャンセンのクエン酸培地での生育： 陽性
（７）有機窒素源要求性：              陰性
（８）マッコンキ−寒天培地での生育：  陽性
（９）硫化水素の産生：                陰性
（１０）ＯＮＰＧ利用：                陽性
（１１）シアン耐性：                  陰性
（１２）尿素分解：                    陰性
（１３）マロン酸の利用：              陰性
（１４）リパ−ゼ産生：                陰性
（１５）インド−ル生成：              陰性
（１６）ＶＰテスト：                  陰性
（１７）ＭＲテスト：                  陽性
（１８）Ｏ／１２９感受性試験：        陽性
（１９）酸素に対する態度：            好気性
【００１９】
（２０）各種温度帯での生育：
２℃      ＋
５℃      ＋
１０℃    ＋
２５℃    ＋
３０℃    ＋
３５℃    ＋
４０℃    ＋
５０℃    −
【００２０】
（２１）ＯＦ試験：（ただし、Ｎは無反応、Ｆは発酵を示す）
キシロ−ス：     Ｆ
ラフィノ−ス：   Ｎ
ブドウ糖：       Ｆ
マンノ−ス：     Ｆ
イノシト−ル：   Ｎ
マンイト−ル：   Ｆ
スクロ−ス：     Ｆ
フルクト−ス：   Ｆ
グルシト−ル：   Ｎ
マルト−ス：     Ｆ
ガラクト−ス：   Ｆ
ラムノ−ス：     Ｎ
アラビノ−ス：   Ｆ
トレハロ−ス：   Ｎ
（２２）硝酸塩還元：       陽性
【００２１】
（２３）基質利用性テスト：（基質成分を使用する培地全体の１％となるよう作成し、それぞれの基質についてその利用の有無を確認した。）
〈次の培地成分で培養し、各試薬との反応を見た。〉
各種基質成分              １０ｇ
ＮＨ4Ｃｌ                   ２ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4                ２ｇ
ＫＨ2ＰＯ4                  １ｇ
ＭｇＳＯ2                   ０．１ｇ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ          ０．０５ｇ
※Trace Element               １ｍｌ
蒸留水                      １ｌ
【００２２】
※Trace Element
ＥＤＴＡ                    １．８ｇ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ          ５．０ｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ          ５．０ｇ
ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ          １．５ｇ
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ          ０．４ｇ
Ｃｏ（ＮＯ3）2・６Ｈ2Ｏ     ０．２５ｇ
Ｈ3ＢＯ3                    ０．１ｇ
蒸留水                  １００ｍｌ
−結果−
ブドウ糖：                    陽性
マンニト−ル：                陽性
β−ハイドロキシブチレ−ト：  陰性
コントロ−ル（基質無）：       陰性
【００２３】
（２４）オキシダ−ゼ試験：          陽性
（２５）カタラーゼ試験：            陽性
（２６）Ｃ＋Ｇ（シトシン＋グアニン）mol％in DNA：４３．２mol％
【００２４】
ＣＧ含有量等上記の生化学的性質より、Ｓ−１−６細菌株はビブリオ属の新規微生物と同定される。なお、その菌学的性質は運動性が無く、灰褐色のコロニ−を形成し、グラム陰性菌に属する過酸化水素分解細菌といえる。
【００２５】
本発明において、菌学的性質を調べるため、実験方法等は、坂崎利一他２名著「新細菌培地学講座  上下巻」、Cowan & Steel's 著「医学細菌同定の手引き＜第３版＞」および長谷川武治編著「改訂版  微生物の分類と同定  上下巻」に準拠した。
【００２６】
使用する培地としては、窒素源、炭素源、無機塩を含むものを使用することができる。窒素源としては酵母エキス、ペプトン、肉エキスを使用することができ、炭素源としてはグルコ−ス等公知の材料が用いられる。
【００２７】
本発明において使用するのに適した寒天培地を以下に例示する。
ポリペプトン    １．０重量％
酵母エキス      ０．５重量％
ＮａＣｌ        ０．５重量％
寒天            １．５重量％
なお、本発明において、ＰＹＳ培地とは、上記成分から、寒天成分を除いたものを指す。
【００２８】
次に、本発明のカタラーゼについて、さらに詳しく説明する。
本発明のカタラーゼの蛋白質のＮ末端のアミノ配列を調べたところ、これまでに報告されているカタラーゼの中で相同するものは見当らなかったので、本発明のカタラーゼは新規なカタラーゼであるものと思考される。
【００２９】
すなわち、Ｓ−１−６細菌株の有するカタラーゼと既知の微生物が有するカタラーゼのＮ末端のアミノ酸配列を比較すると、以下のごとくなる。
0004080011.tif 000002
【００３０】
なお、各アミノ酸の略記号は下記の通りである。
Ａ：Alanine，Ｃ：Cysteine，Ｄ：Aspartis acid，Ｅ：Glutamic acid，
Ｆ：Phenylalanine，Ｇ：Glycine，Ｈ：Histidine，Ｉ：Isoleucine，
Ｋ：Lysine，Ｌ：Leucine，Ｍ：Methionine，Ｎ：Asparagine，Ｐ：Proline，
Ｑ：Glutamine，Ｒ：Arginine，Ｓ：Serine，Ｔ：Threonine，Ｖ：Valine，
Ｗ：Tryptophan，Ｙ：Tyrosine．
【００３１】
また、本発明のカタラーゼは、ＳＤＳ―電気泳動（ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でポリアクリルアミド中で行なうゲル電気泳動）における分子量が５７，０００で、ゲル濾過における溶液中の分子量がその約４倍であることから、４量体で存在する事が確認された。また、本発明のカタラーゼのピリジンフェロヘモクロムの吸収極大が５５７ｎｍ、５２５ｎｍ、４１９ｎｍに見られたことからプロトヘムを活性中心に持つことが明らかになった。
【００３２】
本発明のカタラーゼは、強度の過酸化水素分解活性を有するので、これを、水産加工場等から排出される過酸化水素含有排水中に投与すれば、排水中の過酸化水素を効率よく分解消滅させることができる。本発明のカタラーゼの排水に対する添加量は、約０．４％の過酸化水素含有水１０リットルに対して、０．５ｍｇ〜３．０ｍｇ、好ましくは１．０ｍｇ〜２．０ｍｇである。
【００３３】
本発明のカタラーゼの排水への投与方法は、本カタラーゼを直接排水中に投与する方法、透析膜等の袋に収納してこの袋を排水中に浸漬する方法、本カタラーゼを水に溶解して排水中に投与する方法等任意である。
【００３４】
なお、本発明のカタラーゼは、水産加工場より排出される過酸化水素含有排水の処理ににおいて、特に顕著な効果を奏するので、この排水の処理について主として述べているが、これ以外の過酸化水素含有排水、例えば、パルプ工場、食品工場、薬品工場、半導体工場等より排出される過酸化水素含有排水の処理に適用できることは勿論である。
【００３５】
【実施例】
北海道留萌市の井原水産株式会社の本社工場の排水中から採取したＳ―１―６細菌株を使用する。
ＰＹＳ培地としては、蒸留水１リットル中に、ポリペプトン１０ｇ（日本製薬株式会社）、酵母エキス５ｇ（極東製薬工業株式会社）、塩化ナトリウム５ｇ（和光純薬工業株式会社）を溶かしたものを使用する。
【００３６】
植え継ぎ用の培地は、上記ＰＹＳ培地に１５ｇの寒天粉末を加え、寒天を温めて溶かして試験管に分注し、斜面培地にした物を使用し、この培地にＳ―１―６細菌株を植菌して培養しておく。
【００３７】
そして、２リットルの振とうフラスコに上記ＰＹＳ培地を８００ｍｌ入れ、このＰＹＳ培地に上記植え継ぎ用の培地で培養したＳ―１―６細菌株を一白金耳分採取し、これを植菌後、２７℃、１００ｒｐｍの振とうシェーカーにかけて４８時間培養してＳ―１―６細菌株を増殖する。その結果、１リットルあたり３ｇ（湿菌体）前後のＳ―１―６細菌株が得られた。
【００３８】
上記の条件の培地で培養したＳ―１―６細菌株を遠心分離によって集菌した後、加圧型細胞破壊装置（フレンチプレス）により菌体を破砕し、遠心により未破砕の菌体を取り除き、得られた無細胞抽出液を超遠心により膜画分と可溶性画分に分ける。
【００３９】
可溶性画分を陰イオンクロマトグラフィー（カラム充填剤としてＤＥＡＥ―Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ・東ソー株式会社製、使用）にかけた後、溶出したカタラーゼ画分を１０ｍＭのトリス―ＨＣｌ緩衝液で２倍に希釈した後、ＤＥＡＥ―Ｔｏｙｏｐｅａｒｌに再度かけ溶出させた後、カタラーゼ画分を２ｍｌになるまで濃縮し、ゲル濾過（カラム充填剤としてセファクリルＳ―３００；ファルマシア  バイオテク株式会社製、使用）により精製することにより、本発明のカタラーゼを得た。
【００４０】
本発明のカタラーゼの活性は、後述の（１）温度活性測定と（２）ｐＨ活性測定の２つ方法によって測定した。なお、対象としては市販の牛肝臓製カタラーゼを使用した。
【００４１】
その結果、実施例の方法で精製されたカタラーゼは、電気泳動で均一な精製標品が得られたことが確認された。
精製されたカタラーゼの吸収スペクトルは、４０６ｎｍに吸収極大を示し、還元剤であるジチオナイトによって明らかな還元は見られなかった。
【００４２】
（１）温度活性測定
活性測定の計算方法
まず、１分間あたりの２４０ｎｍにおける吸光値の減少を求める。
例  ８５ｍｍ（記録紙上のｙ軸の値（ｍｍ）を１分間あたりに換算した物：過酸化水素の減少の幅）×１．５Ａｂｓ（吸光値としての測定の幅）÷１５０ｍｍ（記録紙上としてのｙ軸の全幅：１．５Ａｂｓの範囲）＝１分間あたりの吸光値の減少値。
【００４３】
求めた１分間あたりの吸光値の減少値を、過酸化水素のミリモル吸光係数である０．０４３６で割り、さらに添加した酵素の質量（ｍｇ）で割ることによりμmol / min / mg protein( Unit / mg ) が求まる。なお、酵素の含有量（ｍｇ／ｍｌ）は、蛋白溶液の濃度の測定法であるローリー法を用いて調べ、そのときの検量線に使われたサンプルは、牛血清アルブミンである。調べたい酵素のタンパク含量は、その日に作られた検量線から推定されている。測定の単位である １μmol / min / mg protein は、酵素１ｍｇが１分間あたり１μmolの過酸化水素を分解したということを表している。
【００４４】
恒温循環水槽を吸光度測定器に繋いで、反応溶液である３０ｍＭ過酸化水素を含んだ１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ７は、測定したい温度（１０〜６０℃  １０℃ごと）と同温になるまで恒温水槽の中に入れて置き、同温となった際、反応液１ｍｌを石英製の光透過のキュベットに入れ、マイクロシリンジによる酵素の添加とかき混ぜ棒による攪拌で反応を開始し、過酸化水素の吸光波長である２４０nmでの吸光値の減少の初速度を見積もることによって測定した。
【００４５】
その結果、図１−ａに示すように、Ｓ−１−６細菌株のカタラーゼ、市販の牛肝臓カタラーゼともほとんどその活性の強度は温度に依存せず、前者は後者より幅広い温度域において高い活性を持つことが明らかになった。
【００４６】
（２）ｐＨ活性測定
恒温水槽を吸光度測定器に繋いで、測定温度を２０℃と設定し、反応溶液である３０ｍＭの過酸化水素を含んだ１００ｍＭの各種異なるｐＨのバッファー（ｐＨ４〜１０、範囲はｐＨ１刻み）を測定温度の２０℃になるまで恒温水槽の中に入れておく、反応液１ｍｌを石英製の光透過のキュベットに入れ、マイクロシリンジによる酵素の添加とかき混ぜ棒による攪拌で反応を開始し、過酸化水素の吸光波長である２４０nmでの吸光値の減少の初速度を見積もることによって測定した。
【００４７】
その結果、図１−ｂに示すように、Ｓ−１−６細菌株より得られたカタラーゼの最適ｐＨはｐＨ６〜８であった。また、ｐＨにより活性の強度は変化するものの、いずれのｐＨにおいても市販の牛肝臓から得られたカタラーゼよりもかなり高い活性を示すことが明らかとなった。
【００４８】
上記ｐＨ活性測定に使用した各種緩衝液の内容を次に示す。
酢酸緩衝液（１００ｍＭの酢酸溶液と１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液を混ぜ合わせｐＨを調節して作る混合緩衝液、ｐＨ４〜５）、コハク酸緩衝液（無水コハク酸とＮａＯＨとを混合した緩衝液、ｐＨ４〜６）、リン酸緩衝液（１００ｍＭのリン酸一水素二ナトリウムと１００ｍＭのリン酸二水素ナトリウムとの混合緩衝液、ｐＨ６〜８）、ほう酸緩衝液（ほう酸―ＮａＯＨ緩衝液で、この溶液には、ＮａＯＨでｐＨを合わす前に、ほう酸の量と同量の１００ｍＭのＫＣｌが含まれている、ｐＨ８〜１０）、炭酸水素ナトリウム緩衝液（炭酸水素ナトリウム―ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ９〜１０）、上記の緩衝液の濃度は全て１００ｍＭである。
【００４９】
【発明の効果】
本発明によるカタラーゼと市販の牛肝臓のカタラーゼのカタラーゼ活性の温度依存性を比較した結果、本発明のカタラーゼは測定を行った５℃〜６０℃までの幅の広い温度領域で活性をほとんど失わず（ただし、５℃では、若干活性が落ちた）、市販のカタラーゼのおよそ２〜３倍強い活性を示し、工業的利用に適していることが示された。
【００５０】
また、本発明のカタラーゼと市販の牛肝臓のカタラーゼとのカタラーゼ活性のｐＨ依存性を比較した結果、いずれのｐＨにおいても本発明のカタラーゼは市販品よりも活性が上回っていた。
【００５１】
このように、活性の強度はｐＨによって変化するものの、広範囲のｐＨで高い活性を示すことから、上記活性の温度依存性の結果と総合すると、本発明のカタラーゼは、広範囲の条件で応用可能な極めて工業的利用価値の高いものと判定することできる。
【００５２】
また、本発明のカタラーゼは、排水中から容易に採集できる細菌を母体として、極めて安価に量産できると共に、過酸化水素に対する活性が高力価であることから、過酸化水素含有排水に投与する場合、従来のカタラーゼに比べてその投入量を減らすことができるので、排水処理のコストを大幅に低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のカタラーゼの酵素活性の比較試験の結果を示すもで、図１−ａは、本発明のカタラーゼと対象とする市販のカタラーゼとの温度変化による酵素活性の変化を比較して示したグラフ、図１−ｂは、本発明のカタラーゼと対象とする市販のカタラーゼとのｐＨ変化による酵素活性の変化を比較して示したグラフである。
【図１】
0004080011.tif 000003