(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中乾燥法により水溶性生理活性ポリペプチドとポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合物とを含む凍結乾燥品を生体内適合性ポリマー含有の油相に分散させ、成型することを特徴とする徐放性製剤の製造法。
【請求項２】
油相に分散した凍結乾燥品の平均粒子径が０．０５μｍないし５０μｍである請求項１記載の製造法。
【請求項３】
水溶性生理活性ポリペプチドとポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合物との重量比が１：０.００１ないし１：１０００である請求項１記載の製造法。
【請求項４】
油相が生体内適合性ポリマーを含む有機溶媒相である請求項１記載の製造法。
【請求項５】
有機溶媒中の生体内適合性ポリマーの濃度が０.０１％（Ｗ／Ｗ）ないし８０％（Ｗ／Ｗ）である請求項４記載の製造法。
【請求項６】
水溶性生理活性ポリペプチド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合物および生体内適合性ポリマーの全量に対する界面活性剤の使用割合が０.００２％（Ｗ／Ｗ）ないし５０％（Ｗ／Ｗ）である請求項４記載の製造法。
【請求項７】
水溶性生理活性ポリペプチドがホルモン類である請求項１記載の製造法。
【請求項８】
ホルモン類が成長ホルモン類である請求項７記載の製造法。
【請求項９】
ホルモン類がインスリン類である請求項７記載の製造法。
【請求項１０】
水溶性生理活性ポリペプチドがサイトカイン類である請求項１記載の製造法。
【請求項１１】
サイトカイン類がインターフェロン類またはインターロイキン類である請求項１０記載の製造法。
【請求項１２】
生体内適合性ポリマーが生体内分解性ポリマーである請求項４記載の製造法。
【請求項１３】
生体内分解性ポリマーが脂肪酸ポリエステルである請求項１２記載の製造法。
【請求項１４】
脂肪酸ポリエステルが乳酸−グリコール酸共重合体である請求項１３記載の製造法。
【請求項１５】
乳酸−グリコール酸共重合体の分子量が３,０００ないし７０,０００で、この乳酸／グリコール酸の組成比が１００／０ないし３０／７０である請求項１３記載の製造法。
【請求項１６】
脂肪酸ポリエステルがヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体である請求項１３記載の製造法。
【請求項１７】
ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体の分子量が３,０００ないし７０,０００で、このヒドロキシ酪酸／グリコール酸の組成比が１００／０ないし４０／６０である請求項１６記載の製造法。
【請求項１８】
徐放性製剤がマイクロカプセルである請求項１記載の製造法。
【請求項１９】
マイクロカプセルの平均粒子径が１．０ないし２００μｍである請求項１９記載の製造法。
【請求項２０】
徐放性製剤が注射剤である請求項１記載の製造法。
【請求項２１】
水溶性生理活性ポリペプチドとポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合物とを含む凍結乾燥品が生体内適合性ポリマー含有の油相に分散した分散液。
【請求項２２】
油相に分散した凍結乾燥品の平均粒子径が０．０５μｍないし５０μｍである請求項２１記載の分散液。
【請求項２３】
水溶性生理活性ポリペプチドとポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合物とを含む水溶液または懸濁液の凍結乾燥品が生体内適合性ポリマー含有の油相に分散した徐放性製剤用原料。
【請求項２４】
請求項１記載の製造法により製造される医薬用徐放性製剤。
【請求項２５】
水溶性生理活性ポリペプチドが成長ホルモン類である請求項２４記載の製剤。
【請求項２６】
成長ホルモン分泌不全症、下垂体性小人症、ターナー症候群、慢性腎疾患、軟骨異栄養症、成人性下垂体不全症、ダウン症候群、シルバー症候群、骨形成不全症、骨粗鬆症、又は若年性慢性関節症の予防又は治療用である請求項２５記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性ポリペプチドを持続して放出するのに適した徐放性製剤の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生理活性ポリペプチドまたはその誘導体は、生体において種々の薬理作用を示すことが知られており、一方で最近の遺伝子工学あるいは細胞工学技術の進歩により純度の高いものを大量に生産することが可能となって、医薬品として臨床応用されているものが増えている。しかしながら、これらの生理活性ポリペプチドを経口投与する場合は、消化管内で酵素によって容易に分解されるので、その吸収率はきわめて低い。また生体内半減期が短いものも多い。このため通常、筋肉内や皮下に反復して注射する方法、あるいは静脈内に点滴注射する方法が取られているが、これらの方法は限られた回数の投与を必要とする場合には忍容しうるが、慢性疾患を対象として頻回投与する場合には、患者の肉体的負担は非常に大きい。例えば、Ｃ型肝炎患者の場合にはインターフェロンα（ＩＦＮα）が４週以上にわたり連日投与されており、また下垂体性小人症の場合には乳幼児あるいは若年患者に対して数カ月から１０年以上の長期にわたり連日あるいは隔日に皮下あるいは筋肉内投与されている。しかもこれらの疾患で、症状の緩解、完治あるいは身長増加の効果を得るためには、臨床上有用な量の有効成分を長期間にわたって持続させることが必要と云われている。この問題を解決するために、生理活性ポリペプチドを含有する徐放性製剤の開発が数多く試みられている〔クリニカル  リビューズ  イン  セラピュティック  ドラッグ  キャリヤー  システムス（Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems）, １２号，第１〜９９頁（１９９５年）〕。
【０００３】
ＷＯ９４／１９０２０には、ポリペプチドとポリオールの混合物を有機溶媒に溶解させることによるポリペプチドの安定化法が開示されている。ＷＯ９４／１２１５８には、ポリマーと成長ホルモンとの混合物を有機溶媒に加えて急速冷凍することによって得られる徐放性製剤が開示されている。特開昭６３−２９３０には、ポリペプチドをポリラクチドに分散させてなるマトリックスが開示されている。特開平４−４６１１６および特開平６−６５０６３には、生体内分解性ポリマーおよび脂肪酸塩を有機溶媒に溶解し、Ｏ／Ｗ型エマルションとすることによる徐放性製剤の製造法が開示されている。特公平６−５７６５８には、生理活性ポリペプチドをアテロコラーゲンやアテロコラーゲンとゼラチンとの混合物からなる担体中に均一に含有させた徐放性製剤が開示されている。ファーマシューティカル  リサーチ（Pharmaceutical Research），第９巻、１号、３７〜３９頁（１９９２）、ファーマシューティカル  リサーチ（Pharmaceutical Research），第１１巻、２号、３３７〜３４０頁（１９９４）およびジャーナル  オブコントロールド  リリース（Journal of Controlled Release），第３３巻、４３７〜４４５頁（１９９５年）には、界面活性剤とポリマーの有機溶媒溶液にポリペプチドの水溶液を添加して得られるＷ／Ｏ／Ｗエマルションから得られる徐放性製剤が記載されている。このように、従来技術では、そのほとんどが界面活性剤と生体内分解性ポリマーとを有機溶媒に溶解し、その油相に生理活性ポリペプチドの水溶液を添加するＷ／Ｏ／Ｗ法が採用されている。また、生体内分解性ポリマーと界面活性剤とを含有する油相に生理活性ポリペプチドの粉末を直接添加するＳ／Ｏ／Ｗ法も報告されている。しかしながら、いずれの方法においても生理活性ポリペプチドの安定性が損なわれるため収率に多大の影響を及ぼしたり、あるいは得られた徐放性製剤の品質が劣るため、ＬＨＲＨアナログなどの若干のペプチドを除いて医薬品として臨床上実用化されているものはない。
前記のように、生理活性ポリペプチドの生理活性を保持しながら徐放性製剤を製造する試みは種々報告されているが、ＬＨＲＨアナログなどの若干のペプチドを除いて、特に高次構造を有するポリペプチドの場合生体内適合性ポリマーへの生理活性ポリペプチドの取り込み率、初期放出の抑制あるいは長期にわたる一定した徐放性などの点で未だ臨床上満足すべき製剤は得られていない。すなわち、投与初期の血中濃度が予想外に高くなったり、薬物放出速度が徐放期間中に一定でなかったりあるいは製造工程中に生理活性ポリペプチドが変性し十分な収率、効果が得られていない。また徐放性埋め込み剤の場合には、投与部位での疼痛により十分なコンプライアンスが得られないことや、基剤として用いられる異種動物コラーゲンに由来する抗原性が危惧される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
生理活性ポリペプチドの生理活性を保持しながら、長期にわたる一定した徐放性を有する臨床上有用な徐放性製剤およびその製造法の開発が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記の問題点を解決するため鋭意研究を進めたところ、あらかじめ生理活性ポリペプチドと界面活性剤とを混合し、これを急速乾燥することによって得られた微粒子を、油相に分散させてから徐放性製剤に成型すると、予想外にも生理活性ポリペプチドのポリマーへの取り込み率が向上し、初期放出が飛躍的に抑制され、かつ長期間にわたる一定した放出速度を示す優れた徐放性製剤が得られることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
すなわち、本発明は
（１）生理活性ポリペプチドと界面活性剤とを含む急速乾燥品を油相に分散させ、成型することを特徴とする徐放性製剤の製造法；（２）油相に分散した急速乾燥品の平均粒子径が約０．０５μｍないし約５０μｍである前記(1)記載の製造法；（３）生理活性ポリペプチドと界面活性剤との重量比が約１：０.００１ないし約１：１０００である前記(1)記載の製造法；（４）油相が生体内適合性ポリマーを含む有機溶媒相である前記(1)記載の製造法；（５）有機溶媒中の生体内適合性ポリマーの濃度が約０.０１％（Ｗ／Ｗ）ないし約８０％（Ｗ／Ｗ）である前記(4)記載の製造法；（６）生理活性ポリペプチド、界面活性剤および生体内適合性ポリマーの全量に対する界面活性剤の使用割合が約０.００２％（Ｗ／Ｗ）ないし約５０％（Ｗ／Ｗ）である前記(4)記載の製造法；
【０００６】
（７）生理活性ポリペプチドが水溶性である前記(1)記載の製造法；（８）生理活性ポリペプチドがホルモン類である前記(1)記載の製造法；（９）ホルモン類が成長ホルモン類である前記(8)記載の製造法；（１０）ホルモン類がインスリン類である前記(8)記載の製造法；（１１）生理活性ポリペプチドがサイトカイン類である前記(1)記載の製造法；（１２）サイトカイン類がインターフェロン類またはインターロイキン類である前記(11)記載の製造法；（１３）生体内適合性ポリマーが生体内分解性ポリマーである前記(4)記載の製造法；（１４）生体内分解性ポリマーが脂肪酸ポリエステルである前記(13)記載の製造法；（１５）脂肪酸ポリエステルが乳酸−グリコール酸共重合体である前記(14)記載の製造法；（１６）乳酸−グリコール酸共重合体の分子量が約３，０００ないし７０，０００で、この乳酸／グリコール酸の組成比が約１００／０ないし約３０／７０である前記(14)記載の製造法；（１７）脂肪酸ポリエステルがヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体である前記(14)記載の製造法；（１８）ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体の分子量が約３,０００ないし約７０,０００で、このヒドロキシ酪酸／グリコール酸の組成比が約１００／０ないし約４０／６０である前記(17)記載の製造法；
【０００７】
（１９）界面活性剤が非イオン性である前記(1)記載の製造法；（２０）非イオン性界面活性剤の親水性親油性比（ＨＬＢ）が１０以上である前記(19)記載の製造法；（２１）界面活性剤がポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合物、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、およびポリビニルピロリドンから選ばれた１種または２種以上の非イオン性界面活性剤からなる前記(1)記載の製造法；（２２）非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合物である前記(19)記載の製造法；（２３）徐放性製剤がマイクロカプセルである前記(1)記載の製造法；（２４）マイクロカプセルの平均粒子径が約１.０ないし約２００μm である前記(23)記載の製造法；（２５）徐放性製剤が注射剤である前記(1)記載の製造法；（２６）生理活性ポリペプチドと界面活性剤とを含む急速乾燥品が油相に分散した分散液；（２７）油相に分散した急速乾燥品の平均粒子径が約０．０５μｍないし５０μｍである前記(26)記載の分散液；（２８）生理活性ポリペプチドと界面活性剤とを含む水溶液または懸濁液の急速乾燥品が生体内適合性ポリマー含有の油相に分散した徐放性製剤用原料；および（２９）前記(1)記載の製造法により製造される医薬用徐放性製剤；（３０）生理活性ポリペプチドが成長ホルモン類である前記(29)記載の製剤；（３１）成長ホルモン分泌不全症、下垂体性小人症、ターナー症候群、慢性腎疾患、軟骨異栄養症、成人性下垂体不全症、ダウン症候群、シルバー症候群、骨形成不全症、骨粗鬆症、又は若年性慢性関節症の予防又は治療用である前記(30)の製剤などに関する。
【０００８】
本明細書においてアミノ酸、ペプチドなどに関して略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  コミッション・オン・バイオケミカル・ノーメンクレーチャー（Commission on Biochemical Nomenclature）による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものとする。またアミノ酸に光学異性体がありうる場合は、特に明示しない限りＬ体を示すものとする。
本発明の構成成分である生理活性ポリペプチドとしては、哺乳動物にとって有用な生理活性を有し、臨床上用いることができる種々のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。該「生理活性ポリペプチド」は、その分子量が、モノマーとして、例えば約２，０００ないし約２００，０００のものが用いられ、好ましくは約５，０００ないし約５０，０００、特に約５，５００ないし約３０，０００のものが汎用される。好ましい生理活性ポリペプチドには、生化学の分野で高次構造を有すると云われるタンパク質に分類される高分子が含まれる。本発明で用いられる生理活性ポリペプチドの種類は、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、その代表的なものとしては、例えば成長因子類、ホルモン類、サイトカイン類および酵素類などが挙げられる。より具体的には、例えば以下の高分子ペプチド、タンパク質などが挙げられる。
【０００９】
（１）成長因子類としては、例えば神経成長因子（ＮＧＦ−１，ＮＧＦ−１など）、神経栄養因子（ＮＴＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２，ＩＧＦ−３など）、繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ）、骨形成原成長因子（ＢＭＰ−１，ＢＭＰ−２，ＢＭＰ−３，ＢＭＰ−４など）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＰ）、軟骨誘導因子などが挙げられる。
（２）サイトカイン類としては、例えばインターフェロン類（ＩＦＮ−α，−β，−γなど）、インターロイキン類（ＩＬ−１〜ＩＬ−１１など）、カケクチン、オンコスタチン、コロニー刺激因子類（Ｇ−，Ｍ−，ＧＭ−ＣＳＦなど）、トロンボポエチン（ＴＰＯ），エリスロポエチン（ＥＰＯ）などが挙げられる。
（３）酵素類としては、例えば組織プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）、ストレプトキナーゼ、プロテインＣ、メタロプロテアーゼ類、スーパーオキシド・ディスムターゼ（ＳＯＤ）、第ＶＩＩＩ及びＩＸ因子などが挙げられる。
（４）ホルモン類としては、例えば成長ホルモン（ＧＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、インスリン、グルカゴン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、カルシトニンなどが挙げられる。
【００１０】
本発明で用いられる生理活性ポリペプチドは、ある一定の水溶性を有するものが好ましく、その溶解度は水に対して、２０℃で約１ｍｇ／１００ｍｌ以上、好ましくは約１００ｍｇ／１００ｍｌ以上であるものが汎用される。
該「生理活性ポリペプチド」の好ましい例としては、例えばホルモン類〔例えば、成長ホルモン類（ヒト成長ホルモン類など）、インスリン類（ヒトインスリン類など）など〕、サイトカイン類（例えば、インターフェロン類、インターロイキン類など）などが挙げられる。
本発明で用いられる生理活性ポリペプチドは、天然由来あるいは遺伝子組換え技術によって得られたもの〔例えば、遺伝子組換えヒト成長ホルモン（以下、rhＧＨと略称することがある）〕いずれでもよい。これらは糖鎖を有していてもよく、また糖鎖構造が異なっていてもよい。さらに、これらはムテイン、誘導体、類縁体および活性フラグメントなども含む。以下において「生理活性ポリペプチド」、「成長ホルモン類」、「インスリン類」、「インターフェロン類」、「インターロイキン類」などと言う場合は、それぞれこれら糖鎖を有しているものムテイン、誘導体、類縁体および活性フラグメントを含む。
【００１１】
また、本発明で用いられる生理活性ポリペプチドとしては、金属塩であってもよい。かかる金属塩としては、生体に悪影響をおよぼさない金属塩であれば特に限定されないが、生理活性ポリペプチドと水溶性多価金属塩との接触により得られる生理活性ポリペプチド金属塩が好ましい。本明細書では、これら金属塩になっているものも含めて、単に「生理活性ポリペプチド」と称する。該「水溶性多価金属塩」における多価金属としては、例えばアルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウムなど）、亜鉛（II価）、鉄（II価、III価）、銅（II価）、スズ（II価、IV価）、アルミニウム（II価、III価）などが挙げられ、亜鉛、カルシウムなどが汎用される。該「水溶性多価金属塩」としては、多価金属と酸との塩、例えば多価金属と無機酸との塩または多価金属と有機酸との塩が挙げられる。該「多価金属と酸との塩」は、例えば常温（２０℃）で水に対する溶解度が約２０ｍｇ／ｍｌ以上の塩が好ましく、より好ましくは溶解度が約１００ｍｇ／ｍｌ以上の塩であり、特に溶解度が約２００ｍｇ／ｍｌ以上の塩が汎用される。該「多価金属と無機酸」との塩における無機酸としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸、チオシアン酸などが挙げられる。該「多価金属と有機酸との塩」における有機酸としては、例えば脂肪族カルボン酸、芳香族酸などが挙げられる。該「脂肪族カルボン酸」としては、例えば炭素数２ないし９の脂肪族カルボン酸（例えば脂肪族モノカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、脂肪族トリカルボン酸など）などが挙げられる。これらの脂肪族カルボン酸は、飽和あるいは不飽和のいずれであってもよい。該「脂肪族モノカルボン酸」としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族モノカルボン酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸など）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族モノカルボン酸（例えば、アクリル酸、プロピオール酸、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸など）などが挙げられる。該「脂肪族ジカルボン酸」としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族ジカルボン酸（例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸など）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族ジカルボン酸（例えば、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸など）などが挙げられる。該「脂肪族トリカルボン酸」としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族トリカルボン酸（例えば、トリカルバリル酸、１，２，３−ブタントリカルボン酸など）が挙げられる。該「脂肪族カルボン酸」は、水酸基を１または２個有していてもよく、このような例としては、例えばグリコール酸、乳酸、グリセリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸などが挙げられる。該「脂肪族カルボン酸」は、脂肪族モノカルボン酸である場合が好ましく、より好ましくは炭素数２ないし９の脂肪族モノカルボン酸であり、特に酢酸などが汎用される。該「芳香族酸」としては、例えば安息香酸、サリチル酸などが挙げられ、特に安息香酸が汎用される。多価金属と無機酸との塩、すなわち無機酸多価金属塩としては、例えばハロゲン化塩（例えば、塩化亜鉛、塩化カルシウムなど）、硫酸塩、硝酸塩、チオシアン酸塩などが挙げられる。多価金属と脂肪族カルボン酸との塩、すなわち脂肪族カルボン酸多価金属塩としては、例えば酢酸カルシウム、酢酸亜鉛、プロピオン酸カルシウム、グリコール酸亜鉛、乳酸カルシウム、乳酸亜鉛、酒石酸亜鉛などが挙げられ、例えば酢酸カルシウム、酢酸亜鉛などが好ましく、特に酢酸亜鉛が汎用される。多価金属と芳香族酸との塩、すなわち芳香族酸多価金属塩としては、例えば安息香酸塩、サリチル酸塩などが挙げられ、特に安息香酸亜鉛が汎用される。
【００１２】
本発明で用いられる生理活性ポリペプチドは、あらかじめ界面活性剤と接触させてから油相に添加される。あらかじめ界面活性剤と生理活性ポリペプチドとを混合することによって、生理活性ポリペプチドは、その生理活性を臨床上有用な範囲で、例えば、少なくとも５０％以上を維持し、しかも安定で微細な粒子となり、油相への分散性が非常によくなる。これにより、薬物への取り込み率が良好で、投与後の初期放出が抑制され、放出速度の一定した徐放性製剤が得られる。該「油相」としては、例えば生体内適合性ポリマーを含む有機溶媒相などが用いられる。
【００１３】
該「界面活性剤」としては、イオン性および非イオン性界面活性剤が用いられるが、特に非イオン性界面活性剤が好ましい。とりわけ、親水性親油性比（ＨＬＢ）が１０以上（好ましくは１２ないし３０）の非イオン性界面活性剤が好ましい。例えば、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合物〔ポロクサマー類（旭電化工業）：プルロニックＦ−６８，Ｆ−８７，Ｆ−１０８，Ｆ−１２７，Ｌ−４４など〕、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル〔ポリソルベート類（日光ケミカルズ）：Tween ８０，６０，４０，２０など〕、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油類〔日光ケミカルズ：ＨＣＯ−６０，−５０，−４０など〕、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類〔日光ケミカルズ：ポリオキシエチレンラウリルエーテルなど〕、ソルビタン脂肪酸エステル〔スパン類（日光ケミカルズ）：スパン８０，６０，４０，２０，セスキオレイン酸ソルビタンなど〕、ショ糖脂肪酸エステル〔ＤＫエステル類（第一工業）：ＳＳ，Ｆ５０，Ｆ１０など〕、ポリビニルアルコール類、ポリビニルピロリドン類が挙げられる。好ましくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合物、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ、特にポロクサマー類（例えば、プルロニックＦ−６８）などのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合物などが汎用される。またこれらの非イオン性界面活性剤は、適当な親水性親油性比（ＨＬＢ：hydrophile-lipophile balance）を得るために二種以上のものを適宜混合して用いてもよい。非イオン性界面活性剤を二種以上用いる場合、そのＨＬＢは１０以上（好ましくは１２ないし３０）である場合が好ましい。
該「油相」で用いられる有機溶媒としては、例えば沸点が１２０℃以下で、かつ水と混和しない性質のもので、高分子重合物を溶解するものであればよい。その具体例としては、例えばハロゲン化炭化水素類（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素など）、脂肪酸エステル類（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチルなど）、エーテル類（例えば、エチルエーテル、イソプロピルエーテルなど）、芳香族炭化水素類（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなど）などが挙げられる。これらは二種以上適宜の割合で混合して用いてもよい。
【００１４】
界面活性剤と生理活性ポリペプチドとの混合操作は、ふつう生理活性ポリペプチド水溶液中で行われる。この際、その水溶液は水溶性成分を含んでいてもよく、例えばｐＨ調節剤（例えば、炭酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウムなど）、安定化剤（例えば、血清アルブミン、ゼラチンなど）、保存剤（例えば、パラオキシ安息香酸類など）、塩類（例えば、塩化ナトリウムなど）、糖類（例えば、マンニトール、トレハロース、デキストロースなど）、アミノ酸（例えば、グリシン、アラニンなど）などが挙げられる。生理活性ポリペプチドに対する界面活性剤の割合は、その生理活性ポリペプチドの生理活性が臨床上有用である（例えば、５０％以上）と判断される限り特に限定されない。例えば、生理活性ポリペプチドと界面活性剤とを水中で混合する際の重量比は、例えば約１：０．００１ないし約１：１０００、好ましくは約１：０．０１ないし約１：５０、より好ましくは約１：０．０５ないし約１：２０である。また、本発明の徐放性製剤の製造時における、生体内分解性ポリマー、生理活性ポリペプチドおよび界面活性剤の全量に対する界面活性剤の使用割合は、一般的に約０．００２％（Ｗ／Ｗ）ないし約５０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０．０５％（Ｗ／Ｗ）ないし約２０％（Ｗ／Ｗ）である。
該「急速乾燥品」とは、例えば生理活性ポリペプチドと界面活性剤とを含む混合物を急速に乾燥して得られる調製品を示し、急速乾燥の方法としては、例えば凍結乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥あるいはこれらを組み合わせた処理などがあげられる。急速乾燥とは、混合物中の生理活性ポリペプチドの生理活性が臨床上有用な範囲（例えば、５０％以上）に維持され、かつ油相に分散した急速乾燥品の平均粒子径が約０．０５μｍないし約５０μｍ、好ましくは約０．１μｍないし約３０μｍであればその条件は特に問わない。特に好ましくは約０．１μｍないし約１０μｍである。一般に、例えば生理活性ポリペプチドが熱変性による失活を起こさないような温度範囲で実施することが好ましい。
【００１５】
該「生体内適合性ポリマー」としては、生体内に投与後、生体組織に適合して生体への障害反応などを示さないものであれば特に限定されない。例えば、生体内で代謝分解されて、最終的に体外に排泄されるものが好ましい。なかでも、水に難溶または不溶である高分子重合物などが汎用される。例えば脂肪酸ポリエステル類〔例えば、α−ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）、ヒドロキシトリカルボン酸類（例えば、クエン酸など）などの一種以上から合成された重合体、共重合体あるいはこれらの混合物など〕、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル類、ポリアミノ酸類（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）などが挙げられる。これらは、適宜の割合で混合して用いてもよい。重合の形式はランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよい。生体内分解性ポリマーは、脂肪酸ポリエステル類〔例えば、α−ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）、ヒドロキシトリカルボン酸類（例えば、クエン酸など）などの一種以上から合成された重合体、共重合体あるいはこれらの混合物など〕が汎用される。
前記した脂肪酸ポリエステル類中、α−ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）の一種以上から合成された単重合体又は共重合体が生体内分解性および生体適合性の観点から好ましい。また、これらの重合体は適宜混合して使用してもよい。
【００１６】
本発明で用いられる生体内適合性ポリマーは、自体公知の方法により製造される。前記α−ヒドロキシカルボン酸類はＤ−体、Ｌ−体およびＤ，Ｌ−体の何れでもよいが、Ｄ−体／Ｌ−体（モル／モル％）が約７５／２５ないし約２５／７５の範囲のものが好ましい。このＤ−体／Ｌ−体（モル／モル％）は、特に約６０／４０ないし約３０／７０の範囲のものが汎用される。前記α−ヒドロキシカルボン酸類の重合体（単重合体及び共重合体を含む。以下、単に共重合体と称する）の例としては、例えばグリコール酸と他のα−ヒドロキシカルボン酸類との共重合体が挙げられ、該「α−ヒドロキシカルボン酸類」としては、例えば乳酸、２−ヒドロキシ酪酸などが好ましい。α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合体は、例えば乳酸−グリコール酸共重合体、２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体などが好ましく、特に乳酸−グリコール酸共重合体が汎用される。該「乳酸−グリコール酸共重合体」の組成比（乳酸／グリコール酸）（モル／モル％）は本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、約１００／０ないし約３０／７０のものが用いられる。該組成比の好ましい例としては、約９０／１０ないし約４０／６０であり、特に約８０／２０ないし約４５／５５のものが汎用される。該「乳酸−グリコール酸共重合体」は、重量平均分子量が例えば約３，０００ないし約７０，０００のものなどが用いられ、約３，０００ないし約２０，０００のものが好ましい。特に約５，０００ないし１５，０００のものが汎用される。また、該「乳酸−グリコール酸共重合体」は、分散度（重量平均分子量／数平均分子量）が約１．２ないし約４．０のものが好ましく、特に約１．５ないし約３．５のものが汎用される。該「乳酸−グリコール酸共重合体」は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法などに従って合成できる。該共重合体は無触媒脱水重縮合で合成されたものが好ましい。
【００１７】
該「２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体」としては、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、例えばグリコール酸が約１０ないし約７５モル％、残りが２−ヒドロキシ酪酸である場合が好ましい。さらに好ましくは、グリコール酸が約２０ないし約７５モル％の場合である。特に、グリコール酸が約３０ないし約７０モル％のものが汎用される。該「２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体」は、重量平均分子量が、例えば約２，０００ないし約２０，０００のものが好ましい。該「２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体」は、分散度（重量平均分子量／数平均分子量）が、例えば約１．２ないし４．０のものが好ましく、特に約１．５ないし３．５のものが汎用される。該「２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体」は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法などに従って合成できる。該共重合体は無触媒脱水重縮合で合成されたものが好ましい。
該「α−ヒドロキシカルボン酸類」としては、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、その重合体の好ましい例としては乳酸の重合体が挙げられる。該「乳酸重合体すなわちポリ乳酸」は、重量平均分子量が、例えば約３，０００ないし約２０，０００のものが好ましく、特に約５，０００ないし約１５，０００のものが汎用される。該「乳酸重合体」は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法などに従って合成できる。該重合体は無触媒脱水重縮合で合成されたものが好ましい。
【００１８】
該「２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体」は、さらにポリ乳酸と混合して使用してもよい。該「ポリ乳酸」としては、Ｄ−体、Ｌ−体およびこれらの混合物の何れでもよいが、例えばＤ−体／Ｌ−体（モル／モル％）が約７５／２５ないし約２０／８０の範囲のものが用いられる。Ｄ−体／Ｌ−体（モル／モル％）は、約６０／４０ないし約２５／７５であるものが好ましく、特に約５５／４５ないし約２５／７５であるものが汎用される。該「ポリ乳酸」は、重量平均分子量が、例えば約１，５００ないし約２０，０００のものが用いられ、約１，５００ないし約１０，０００のものが好ましい。また、該「ポリ乳酸」は、分散度が約１．２ないし約４．０のものが用いられ、特に約１．５ないし約３．５のものが汎用される。該「ポリ乳酸」の製造法については、乳酸の二量体であるラクタイドを開環重合する方法と乳酸を脱水重縮合する方法などが知られている。本発明で使用する比較的低分子のポリ乳酸を得るためには、例えば特開昭６１−２８５２１に記載されているような乳酸を直接脱水重縮合する方法などが好ましい。
２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体とポリ乳酸とを混合して使用する場合、その混合比が、例えば約１０／９０ないし約９０／１０（重量％）であるものが用いられる。その混合比は、約２０／８０ないし約８０／２０の場合が好ましく、特に約３０／７０ないし約７０／３０の場合が汎用される。
【００１９】
本明細書中、重量平均分子量とは、重量平均分子量が１２０，０００、５２，０００、２２，０００、９，２００、５，０５０、２，９５０、１，０５０、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質としてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の分子量をいう。ＧＰＣ測定により数平均分子量も計算される。分散度は重量平均分子量と数平均分子量とから計算される。ＧＰＣ測定はＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌｘ２（昭和電工製）、ＲＩモニターＬ−３３００（日立製作所製）を使用し、移動相としてクロロホルムを用いた。
本発明で用いられる生体内適合性ポリマーは、金属塩となっていてもよい。該「生体内適合性ポリマー」を金属塩にするために用いられる金属塩は、生体に悪影響をおよぼさない金属塩であれば特に限定されない。該「金属塩」としては、例えば単価金属または多価金属と無機酸あるいは有機酸との塩が用いられる。該「単価金属」としては、例えばアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムなど）などが挙げられる。該「多価金属」としては、例えばアルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウムなど）、亜鉛（II価）、鉄（II価、III価）、銅（II価）、スズ（II価、IV価）、アルミニウム（II価、III価）塩などが挙げられる。該「金属」の中では、多価金属が好ましい。さらに好ましくはアルカリ土類金属、亜鉛であり、特にカルシウム、亜鉛などが汎用される。該「無機酸」としては、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸、硫酸、硝酸、チオシアン酸などが挙げられる。該「有機酸」としては、例えば脂肪族カルボン酸、芳香族酸などが挙げられる。該「脂肪族カルボン酸」としては、例えば炭素数１ないし９の脂肪族カルボン酸（例えば、脂肪族モノカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、脂肪族トリカルボン酸など）などが挙げられる。該「脂肪族カルボン酸」は、飽和あるいは不飽和のいずれであってもよい。該「脂肪族モノカルボン酸」としては、例えば炭素数１ないし９の飽和脂肪族モノカルボン酸（例えば、炭酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸など）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族モノカルボン酸（例えば、アクリル酸、プロピオール酸、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸など）などが挙げられる。該「脂肪族ジカルボン酸」としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族ジカルボン酸（例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸など）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族ジカルボン酸（例えば、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸など）などが挙げられる。該「脂肪族トリカルボン酸」としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族トリカルボン酸（例えば、トリカルバリル酸、１，２，３ーブタントリカルボン酸など）などが挙げられる。該「脂肪族カルボン酸」は、水酸基を１または２個有していてもよく、このような例としては、例えばグリコール酸、乳酸、グリセリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸などが挙げられる。該「脂肪族カルボン酸」は、脂肪族モノカルボン酸である場合が好ましく、より好ましくは炭素数２ないし９の脂肪族モノカルボン酸であり、特に酢酸などが汎用される。該「芳香族酸」としては、例えば安息香酸、サリチル酸、フェノールスルホン酸などが挙げられる。生体内適合性ポリマーを金属塩とするために用いられる金属塩は、多価金属と無機酸または有機酸との塩（以下、多価金属塩と略称する）が好ましい。該「多価金属塩」としては、例えば亜鉛と無機酸との塩〔例えば、ハロゲン化亜鉛（例えば、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、フッ化亜鉛など）、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、チオシアン酸亜鉛など〕、亜鉛と有機酸との塩〔例えば、脂肪族カルボン酸亜鉛塩（例えば、炭酸亜鉛、酢酸亜鉛、グリコール酸亜鉛、乳酸亜鉛、酒石酸亜鉛など）、芳香族酸亜鉛塩（例えば、安息香酸亜鉛、サリチル酸亜鉛、フェノールスルホン酸亜鉛など）など〕、カルシウムと無機酸との塩〔例えば、ハロゲン化カルシウム（例えば、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、フッ化カルシウムなど）、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、チオシアン酸カルシウムなど〕、カルシウムと有機酸との塩〔例えば、脂肪族カルボン酸カルシウム塩（例えば、炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、酒石酸カルシウム、乳酸カルシウム、クエン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムなど）、芳香族酸カルシウム塩（例えば、安息香酸カルシウム、サリチル酸カルシウムなど）など〕などが用いられる。該「多価金属塩」は、酢酸亜鉛、酢酸カルシウムなどが汎用される。本明細書においては、金属塩になっているものも含めて単に「生体適合性ポリマー」と称することがある。
【００２０】
本発明の徐放性製剤は、生理活性ポリペプチドと界面活性剤とを混合して得られる固形または半固形成分を、生体内適合性ポリマーを含む油相中に分散させることによって製剤化される。生理活性ポリペプチドと界面活性剤とを混合する場合、これらを含む混合物（例えば、水溶液または懸濁液が好ましい）を急速乾燥することによって得られた急速乾燥品が好ましい。本発明の急速乾燥品は、油相に分散させた後、より微細な粒子として油相中に均一に分散させることが好ましいので、この時、例えば超音波照射あるいはホモゲナイザーによる微粒化操作などに付すことが好ましい。該「徐放性製剤」の製造法としては、例えば水中乾燥法、相分離法、噴霧乾燥法あるいはこれらに準ずる方法などが挙げられる。
以下に徐放性製剤として、例えばマイクロカプセルを製造する場合の製造方法について記述する。
【００２１】
（ａ）水中乾燥法（Ｓ／Ｏ／Ｗ法）
本方法においては、まず生理活性ポリペプチドと界面活性剤とを混合し、ついで急速乾燥（例えば、凍結乾燥、真空乾燥など）に付し、急速乾燥品を得る。一方で、生体内適合性ポリマーを含む有機溶媒溶液を作製する。本発明の徐放性製剤の製造に使用する有機溶媒は、例えば沸点が１２０℃以下であることが好ましい。該「有機溶媒」としては、例えばハロゲン化炭化水素類（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素など）、脂肪酸エステル類（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチルなど）などが挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。該「有機溶媒」は、ジクロロメタン、酢酸エチルなどが好ましく、特にジクロロメタンが汎用される。生体内適合性ポリマーの有機溶媒溶液中の濃度は、生体内適合性ポリマーの分子量や有機溶媒の種類などによって異なるが、ふつう約０.０１％（Ｗ／Ｗ）ないし約８０％（Ｗ／Ｗ）の範囲のものから選ばれる。好ましくは約０.１％（Ｗ／Ｗ）ないし約７０％（Ｗ／Ｗ）のものが選ばれ、特に約１％（Ｗ／Ｗ）ないし約６０％（Ｗ／Ｗ）のものが汎用される。
【００２２】
このようにして得られた生体内適合性ポリマー含有の有機溶媒溶液中に、前記の生理活性ポリペプチドと界面活性剤との急速乾燥品を添加し、分散させる。Ｓ／Ｏ懸濁液は、例えばポリトロン（キネマチカ社製）のようなホモゲナイザーを用いた乳化操作あるいは超音波照射などにより、分散性を向上させることができる。次いでこのＳ／Ｏエマルションを、さらに必要により、界面活性剤（例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなど）を含有する水相中に加えて、タービン型撹拌機などを用いてＳ／Ｏ／Ｗエマルションを作成したのち、油相溶媒を蒸発させマイクロカプセルを製造する。このときの水相体積は、例えば油相体積の約１倍ないし約１０,０００倍から選ばれる。好ましくは、約２倍ないし約５,０００倍、特に約５倍ないし約２,０００倍から選ばれる。またこの際、該「水相」に pＨ調節剤（例えば、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウムなど）、安定化剤（例えば、血清アルブミン、ゼラチンなど）、保存剤（例えば、パラオキシ安息香酸類など）あるいは浸透圧調整剤として、例えば塩類（例えば、塩化ナトリウムなど）、糖類（例えば、マンニトールなど）などを加えてもよい。
このようにして得られたマイクロカプセルは、遠心分離あるいは濾過操作により分取した後、マイクロカプセル表面に付着する乳化剤などを蒸留水で数回繰り返し洗浄除去し、再び蒸留水などに分散し、また必要であればマンニトールなどの添加物を加えて凍結乾燥する。その後、必要であれば、減圧下加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒を除去する。加温条件としては、例えばマイクロカプセルを毎分１０ないし２０℃の昇温速度で示差走査熱量計で求めた生体内適合性ポリマーの中間点ガラス転移温度よりも約５℃以上高い温度まで加温し、マイクロカプセル自体が所定の温度に達した後、１週間以内、好ましくは２、３日以内、より好ましくは約１時間ないし２４時間、同温度で保持する。
【００２３】
（ｂ）相分離法（コアセルベーション法）
本法によりマイクロカプセルを製造する場合には、前記（ａ）の生理活性ポリペプチド、界面活性剤および生体内適合性ポリマーを含むＳ／Ｏ懸濁液にコアセルベーション剤を撹拌下徐々に加えてマイクロカプセルを析出固化させる。該「コアセルベーション剤」は、エマルション体積の約０.０１倍ないし約２,０００倍の体積量が加えられる。さらに好ましくは約０.０５倍ないし約５００倍、特に約０.１倍ないし約２００倍の体積量である場合が好ましい。また該「コアセルベーション剤」は、生体内適合性ポリマーの溶剤として用いた有機溶媒と混和する高分子、鉱物油または植物油等で、該「生体内適合性ポリマー」を溶解しない化合物であれば特に限定されない。具体的には、例えばシリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタンなどが用いられる。これらは２種以上混合して用いてもよい。このようにして得られたマイクロカプセルは、遠心分離あるいは濾過操作により分取した後、ヘプタンなどで繰り返し洗浄し、コアセルベーション剤を除去する。さらに（ａ）と同様にして洗浄を行い、次いで凍結乾燥する。
該「水中乾燥法」および「相分離法」でのマイクロカプセルの製造では、粒子どうしの凝集を防ぐために凝集防止剤を加えてもよい。該「凝集防止剤」としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例えば、コーンスターチなど）、ヒアルロン酸あるいはそのアルカリ金属塩などの水溶性多糖類；フィブリノーゲンやコラーゲンなどの蛋白；塩化ナトリウムやリン酸水素ナトリウムなどの無機塩類などが適量用いられる。
【００２４】
（ｃ）噴霧乾燥法
本法によりマイクロカプセルを製造する場合には、前記（ａ）の生理活性ポリペプチド、界面活性剤および生体内適合性ポリマーを含むＳ／Ｏ懸濁液を、ノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧し、きわめて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発させ、微粒子を調製する。該「ノズル」としては、例えば二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型などがある。所望により凝集防止を目的として前記（ｂ）記載の凝集防止剤を別ノズルより噴霧することも可能である。このようにして得られたマイクロカプセルは、必要であれば前記（ａ）と同様に減圧下加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒を除去する。
【００２５】
本発明の徐放性製剤は、例えば前記で得られたマイクロカプセルをそのまま、あるいはこのマイクロカプセルを原料物質として種々の剤型、例えば非経口剤（例えば、筋肉内、皮下、臓器、骨周縁部、関節部などへの注射剤または埋め込み剤、鼻腔、直腸、子宮などへの経粘膜剤など）、経口剤〔例えば、カプセル剤（例えば、硬カプセル剤、軟カプセル剤など）、顆粒剤、散剤などの固形製剤、懸濁剤などの液剤など〕などとして投与することができる。
本発明の徐放性製剤は、特に注射剤であることが好ましい。前記方法で得られたマイクロカプセルを注射剤とするには、マイクロカプセルを分散剤（例えば、Tween ８０、ＨＣＯ−６０などの界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウムなどの多糖類、硫酸プロタミン、ポリエチレングリコール４００など）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベンなど）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）、局所麻酔剤（例えば、塩酸キシロカイン、クロロブタノールなど）などとともに水性懸濁剤としたもの、ゴマ油、コーン油などの植物油またはこれにレシチンなどのリン脂質を混合したもの、あるいは中鎖脂肪酸トリグリセリド（例えば、ミグリオール８１２など）とともに分散して油性懸濁剤としたものを徐放性注射剤とする。
【００２６】
徐放性製剤が、例えばマイクロカプセルである場合、微粒子であることが特に好ましい。マイクロカプセルの粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合にはその分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば、平均粒子径として約０.１ないし３００μｍの範囲が挙げられる。該「微粒子」は、平均粒子径が約１ないし２００μｍのものが好ましく、特に約２ないし１００μｍの範囲の粒子径を有するものが汎用される。
前記したマイクロカプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
本発明の徐放性製剤は、低毒性で哺乳動物（例えば、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギなど）に対して各生理活性ポリペプチドに応じた適応症の予防および／または治療に安全に用いることができる。
本徐放性製剤の適応は、使用する生理活性ポリペプチドにより異なる。徐放性製剤は、該「生理活性ポリペプチド」が、例えばインスリンである場合には糖尿病など、成長ホルモンである場合には、成長ホルモン分泌不全症、ターナー症候群、下垂体性小人症、慢性腎疾患、軟骨異栄養症、成人性下垂体不全症、ダウン症候群、シルバー症候群、骨形成不全症、骨粗鬆症、あるいは若年性慢性関節症など、インターフェロン−αである場合にはウイルス性肝炎（例えば、Ｃ型肝炎、ＨＢe抗原陽性活動性肝炎など）や癌（例えば、腎癌、多発性骨髄腫など）など、エリスロポエチンあるいはトロンボポエチンの場合には貧血（例えば、腎透析時貧血など）など、Ｇ−ＣＳＦの場合には好中球減少症（例えば、制ガン剤治療時）や感染症など、ＩＬ−２の場合には癌（例えば、血管内皮腫、腎臓癌など）など、ＦＧＦの場合には消化管潰瘍など、ＦＧＦ−９の場合には血小板減少症など、ＮＧＦの場合には老人性痴呆や神経病（ニューロパシー）など、ｔＰＡの場合には血栓症など、腫瘍壊死因子の場合には癌などのそれぞれ治療または予防に有効である。
【００２７】
徐放性製剤の投与量は、生理活性ポリペプチドの種類と含量、放出の持続時間、対象疾患、対象動物などによって種々異なるが、該「生理活性ポリペプチド」の有効濃度が体内で保持される量であればよい。該「生理活性ポリペプチド」の投与量としては、例えば徐放性製剤が１週間型製剤である場合、好ましくは、成人１人当たり約０.０００１ないし１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０.０００５ないし１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回、あるいは１ケ月に１回など、該「生理活性ポリペプチド」の種類と含量、剤型、放出の持続時間、対象疾患、対象動物などによって適宜選ぶことができる。
徐放性製剤の有効成分である生理活性ポリペプチドが、例えばヒト成長ホルモンで、２週間型製剤を下垂体性小人症の患者に投与する場合には、有効成分として通常、約０.０１ないし約５ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０.０３ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選び、２週間に１回投与するのがよい。また生理活性ポリペプチドがインスリンの場合、糖尿病患者に対する投与量は、有効成分として通常、約０.００１ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０.０１ないし約０.２ｍｇ／ｋｇの範囲から適宜選び、１週間に１回投与するのがよい。
徐放性製剤は、常温あるいは冷所に保存されるが、好ましくは冷所である。ここでいう常温あるいは冷所とは日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５ないし２５℃、冷所とは１５℃以下を意味する。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下に実施例および試験例を挙げて、さらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
実施例１
ヒト成長ホルモン（rhＧＨ）６０ｍｇおよびプルロニックＦ−６８  ２０ｍｇを蒸留水６ｍｌに溶解後、凍結乾燥した。得られた粉末を乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝７５／２５；ポリスチレン換算平均分子量８４００）１９２０ｍｇの塩化メチレン２.５ｍｌ溶液に分散し、ポリトロンで微粒化した後、１５℃に冷却した０.１％  ＰＶＡ水溶液８００ｍｌ中でホモジナイザーを使用してＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間ゆっくり撹拌し、塩化メチレンの揮散と共にマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機で捕集し、同時に精製水で水洗した。捕集されたマイクロカプセルは、一昼夜凍結乾燥することによって粉末として得られた。
【００２９】
比較例１
rhＧＨ  ６０mgを蒸留水６ｍｌに溶解後、凍結乾燥した。得られた粉末を乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝７５／２５；ポリスチレン換算平均分子量８４００）１９４０ｍｇの塩化メチレン２.５ｍｌ溶液に分散し、ポリトロンで微粒化した後、１５℃に冷却した０.１％  ＰＶＡ水溶液８００ｍｌ中でホモジナイザーを使用してＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。以下実施例１の方法と同様の操作によりマイクロカプセル粉末を得た。〔表１〕に実施例１および比較例１の方法で得られたマイクロカプセルの特性を示す。
【表１】
0004117922.tif 000002
〔表１〕の結果より、界面活性剤（プルロニックＦ−６８）の添加により、マイクロカプセル中へのrhＧＨ取り込み率が向上し、in vitro 溶出試験での初期放出（１日放出量）を抑制することが可能となった。
【００３０】
比較例２
rhＧＨ ６０mgを蒸留水６mlに溶解後、凍結乾燥した。得られた粉末を、予めプルロニックＦ−６８  ２０mgと乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝７５／２５，ポリスチレン換算平均分子量８４００）１９２０mgとを塩化メチレン２.５mlに溶解した液に分散し、ポリトロンで微粒化した。次いで１５℃に冷却した０.１％ＰＶＡ水溶液８００ml中でホモジナイザーを使用してＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。以下実施例１の方法と同様の操作によりマイクロカプセル粉末を得た。
〔表２〕に実施例１および比較例２の方法で得られたマイクロカプセルの特性を示す。
【表２】
0004117922.tif 000003
〔表２〕の結果より、界面活性剤（プルロニックＦ−６８）を予め rhＧＨに添加し得られた凍結乾燥粉末を用いる実施例１の方法により調製されたマイクロカプセルは、同量の界面活性剤を溶解した油相（ジクロロメタン）を用いる比較例２の方法により調製されたマイクロカプセルより、マイクロカプセル中への rhＧＨ取り込み率が向上し、in vitro 溶出試験での初期放出（１日放出量）を抑制することが可能となった。
【００３１】
実施例２
rhＧＨ  １００ｍｇおよびプルロニックＦ−６８  １００ｍｇを蒸留水２０ｍｌに溶解後、凍結乾燥した。得られた粉末を乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０；ポリスチレン換算平均分子量１０１００）１８００ｍｇの酢酸エチル２.５ｍｌ溶液に分散し、ポリトロンで微粒化した後、１５℃に冷却した０.５％ ＰＶＡ水溶液８００ｍｌ中でホモジナイザーを使用してＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間ゆっくり撹拌し、酢酸エチルの揮散と共にマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機で捕集し、同時に精製水で水洗した。捕集されたマイクロカプセルは、一昼夜凍結乾燥することによって粉末として得られた。
【００３２】
実施例３
rhＧＨ  ５０ｍｇ、プルロニックＦ−６８  ５０ｍｇおよびＨＣＯ−６０  １０ｍｇを蒸留水１０ｍｌに溶解後、凍結乾燥した。得られた粉末をヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体（ヒドロキシ酪酸／グリコール酸＝７５／２５；ポリスチレン換算平均分子量１２，０００）１８９０ｍｇの塩化メチレン５ｍｌ溶液に分散し、ポリトロンで微粒化した後、１５℃に冷却した５％のマンニトールを含有する０.２％  ＰＶＡ水溶液１０００ｍｌ中でホモジナイザーを使用してＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間ゆっくり撹拌し、塩化メチレンの揮散とともにマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機で捕集し、同時に精製水で水洗した。捕集されたマイクロカプセルは、一昼夜凍結乾燥することによって粉末として得られた。
【００３３】
実施例４
インターフェロン−α  １０ｍｇおよびプルロニックＦ−６８  ３０ｍｇを蒸留水１０ｍｌに溶解後、凍結乾燥した。凍結乾燥した得た粉末をヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体（ヒドロキシ酪酸／グリコール酸＝７５／２５；ポリスチレン換算平均分子量１２，０００）１９６０ｍｇの塩化メチレン５ｍｌ溶液に分散し、ポリトロンで微粒化した後、１５℃に冷却した０.２％  ＰＶＡ水溶液１０００ｍｌ中でホモジナイザーを使用してＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間ゆっくり撹拌し、塩化メチレンの揮散とともにマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機で捕集し、同時に精製水で水洗した。捕集されたマイクロカプセルは、一昼夜凍結乾燥することによって粉末として得られた。
【００３４】
実施例５
rhＧＨ  ６０mgとプルロニックＦ−６８  ２mgとを含む水溶液４.７mlに、サケ由来遊離プロタミン１００mgを含む水溶液０.５mlを加え、２５℃で２０分間ゆっくり撹拌し不溶性複合体を形成後、凍結乾燥した。得られた粉末をカルボキシル基末端を完全にエチルエステル化したポリ乳酸重合体（乳酸１００％，ポリスチレン換算平均分子量９０００）１８３８mgの塩化メチレン５ml溶液に分散し、まずポリトロンを用いて１５,０００ rpm で１分間、さらに超音波照射２分間により微粒化した。次いで１５℃に冷却した５％マンニトール含有０.１％ ＰＶＡ水溶液８００ml中でホモジナイザーを使用してＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間ゆっくり撹拌し、塩化メチレンの揮散と共にマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機で捕集し、同時に精製水で水洗した。捕集されたマイクロカプセルは、一昼夜凍結乾燥することによって粉末として得られた。
【００３５】
実施例６
rhＧＨ  ７５mgとポリオキシエチレン硬化ヒマシ油ＨＣＯ−６０  １５mgとを５mＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（pＨ７.８）１５mlに溶解後、酢酸亜鉛水溶液（５mg／ml）を徐々に添加し（rhＧＨ：Ｚn＝１：７モル比）不溶性複合体を形成した。遠心分離後、沈渣を少量の蒸留水に再分散し凍結乾燥した。得られた粉末を乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０，ポリスチレン換算平均分子量１５０００）１４２５mgの塩化メチレン２ml溶液に分散し、まず超音波照射にて５分間、さらにポリトロンを用いて１５,０００ rpm で１分間処理し微粒化した。次いで１５℃に冷却した１０％マンニトール含有０.１％ＰＶＡ水溶液８００ml中でホモジナイザーを使用してＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。この後、実施例５と同様の方法によりマイクロカプセルを作製した。
【００３６】
実施例７
Ａ法：
rhＧＨ  ７５mgとプルロニックＦ−６８  １５mgとを蒸留水６mlに溶解後、凍結乾燥した。得られた粉末を乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０，ポリスチレン換算平均分子量１５０００）１４１０mgの塩化メチレン３ml溶液に分散し、ボルテックスミキサーで約３０秒間混合した。このＳ／Ｏ分散液０.１mlを塩化メチレンで希釈後、レーザ回折式粒度分布測定装置に供し rhＧＨの粒径を測定した。上記Ｓ／Ｏ分散液を、１５℃に冷却した１０％マンニトール含有０.１％ＰＶＡ水溶液８００ml中でホモジナイザーを使用してＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。この後、実施例５と同様の方法によりマイクロカプセルを作製した。
Ｂ法：
rhＧＨ  ７５mgとプルロニックＦ−６８  １５mgとを蒸留水６mlに溶解後、凍結乾燥した。得られた粉末を乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０，ポリスチレン換算平均分子量１５０００）１４１０mgの塩化メチレン３ml溶液に分散し、まず超音波照射にて５分間、さらにポリトロンを用いて１５,０００ rpm で１分間処理し十分に微粒化した。このＳ／Ｏ分散液０.１mlを塩化メチレンで希釈後、レーザ回折式粒度分布測定装置に供し rhＧＨの粒径を測定した。上記Ｓ／Ｏ分散液を実施例７−Ａ法と同様の方法により処理し、マイクロカプセルを作製した。
【００３７】
比較例３
rhＧＨ  ７５mgを蒸留水６mlに溶解後、凍結乾燥した。得られた粉末を乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０，ポリスチレン換算平均分子量１５０００）１４１０mgの塩化メチレン３ml溶液に分散し、ボルテックスミキサーで約３０秒間混合した。このＳ／Ｏ分散液０.１mlを塩化メチレンで希釈後、レーザ回折式粒度分布測定装置に供し rhＧＨの粒径を測定した。上記Ｓ／Ｏ分散液を実施例７Ａ法と同様の方法により処理し、マイクロカプセルを作製した。
〔表３〕に実施例７のＡ法、Ｂ法および比較例３の方法で得られたマイクロカプセルの特性を示す。
【表３】
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〔表３〕の結果より、本発明に従って、液中 rhＧＨ平均粒子径が２０μｍ以下のＳ／Ｏ分散液を使用し調製したマイクロカプセルは、rhＧＨを界面活性剤とともに急速乾燥せず、かつ平均粒子径が３０μｍ以上のＳ／Ｏ分散液を使用し調製したマイクロカプセルよりも rhＧＨ取り込み率が向上した。
【００３８】
試験例１
前記実施例１及び比較例１で得られた２種のマイクロカプセルをＳＤラット（雄性、６週齢）に１５ｍｇ／ｋｇで皮下投与し、その血清中濃度をラジオイムノアッセイ（Ａb ビーズＨＧＨ：栄研化学）により測定した。これによって得られた結果を〔図１〕に示す。
プルロニックＦ−６８の添加により、Ｓ／Ｏ／Ｗ型マイクロカプセルで頻繁に観察される投与後初期のrhＧＨ血清中濃度の上昇を抑制し、より安定して長期間薬物の放出を持続させることが可能となった。その結果、in vivo での初期放出の指標である、１８日間のＡＵＣ（Area Under the Concentration）に対する最初の１日間のＡＵＣの比は、界面活性剤無添加時の９４％に対し、プルロニックＦ−６８添加時は５６％に抑制された。
【００３９】
試験例２
前記実施例１の方法および比較例２の方法で得られた２種のマイクロカプセルをＳＤラット（雄性、６週齢）に１５mg／kgで皮下投与し、その血清中濃度を試験例１記載のラジオイムノアッセイにより測定した。これによって得られた結果を[図２]に示す。
プルロニックＦ−６８を予め rhＧＨに添加し得られた凍結乾燥粉末を用いる実施例１の方法により調製されたマイクロカプセルは、同量の界面活性剤を溶解した油相（ジクロロメタン）を用いる比較例２の方法により調製されたマイクロカプセルより、投与後初期の rhＧＨ血清中濃度の上昇が小さく、より安定した持続性を発揮した。その結果、投与１時間後の血清中濃度は比較例２のマイクロカプセルでは５７４ng／mlであったが、実施例１のマイクロカプセルでは１８８ng／mlであった。また in vivo での初期放出の指標である、１８日間のＡＵＣに対する最初の１日間のＡＵＣの比は、プルロニックＦ−６８油相添加の比較例２の方法の６７％に対し、プルロニックＦ−６８／rhＧＨ凍結乾燥の実施例１の方法は５６％に抑制された。
【００４０】
試験例３
前記実施例７のＡ，Ｂ法および比較例３の方法で得られた３種のマイクロカプセルをＳＤラット（雄性、６週齢）に１５mg／kgで皮下投与し、その血清中濃度を試験例１記載のラジオイムノアッセイにより測定した。これによって得られた結果を〔図３〕に示す。  プルロニックＦ−６８の添加により、Ｓ／Ｏ／Ｗ型マイクロカプセルで頻繁に観察される投与後初期のrhＧＨ血清中濃度の上昇を抑制し、より安定して長期間薬物の放出を持続させることが可能となった。その結果、in vivo での初期放出の指標である、１４日間のＡＵＣに対する最初の１日間のＡＵＣの比は、界面活性剤無添加時の７９％に対し、プルロニックＦ−６８添加でボルテックス混合の場合には４１％、プルロニックＦ−６８添加で超音波−ポリトロン処理の場合には４９％に抑制された。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によればあらかじめ生理活性ポリペプチドと界面活性剤とを混合し、ついで急速乾燥したものを油相に均一に分散させてから徐放性製剤に成型することによって、初期放出が抑制され、長期間にわたる一定した放出速度を示す優れた徐放性製剤を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】は実施例１及び比較例１により得られた２種のマイクロカプセルをＳＤラットに皮下投与した試験例１の結果であり、rhＧＨ血清中濃度の経時変化を示す。
【図２】は、試験例２結果であり、実施例１及び比較例２で得られた２種のマイクロカプセルをＳＤラットに皮下投与したときの rhＧＨ血清中濃度の経時変化を示す。
【図３】は、試験例３の結果であり、実施例７のＡ法、Ｂ法及び比較例３により得られた３種のマイクロカプセルをＳＤラットに皮下投与したときの rhＧＨ血清中濃度の経時変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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