(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列を具備するペプチド：
X1HX2DGSFSDEMNTX3LDX4LAX5X6DFINWLX7X8TKITDX9
（式中、X1はNH2、DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR, DFPEEVNIVEELRRRまたはその断片、
X2はGly、
X3はIleまたはVal、
X4はAsn、SerまたはHis、
X5はAlaまたはThr、
X6はArgまたはLys、
X7はIleまたはLeu,
X8はGlnまたはHis、および
X9はOH、Lys、Arg、Arg-Lys、Lys-Arg、Arg-ArgまたはLys-Lysである）。
【請求項２】
X1がNH2である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
X3がIleである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
X4がAsnである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
X5がAlaである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
X6がArgである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
X7がIleである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
X8がGlnである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
X9がOHである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
下記のアミノ酸配列を具備するペプチドと薬学的に許容される賦形剤または担体とを含んでなる医薬組成物：
X1HX2DGSFSDEMNTX3LDX4LAX5X6DFINWLX7X8TKITDX9
（式中、X1はNH2、DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR, DFPEEVNIVEELRRRまたはその断片、
X2はGly、
X3はIleまたはVal、
X4はAsn、SerまたはHis、
X5はAlaまたはThr、
X6はArgまたはLys、
X7はIleまたはLeu,
X8はGlnまたはHis、および
X9はOH、Lys、Arg、Arg-Lys、Lys-Arg、Arg-ArgまたはLys-Lysである）。
【請求項１１】
X1がNH2である、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
X3がIleである、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
X4がAsnである、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
X5がAlaである、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
X6がArgである、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
X7がIleである、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
X8がGlnである、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
X9がOHである、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項10〜18の何れか一項で定義されたペプチドを、別の食欲抑制剤または満腹感誘導剤と組合せて含む医薬組成物。
【請求項２０】
前記別の食欲抑制剤または満腹感誘導剤がグルカゴン様ペプチド-1である、請求項19に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ペプチドの量が、約10μg/kg体重〜約5mg/kg体重の範囲内にある、請求項10〜20の何れか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、食欲抑制性ペプチドまたは食欲抑制性ペプチド含有画分を含む医薬組成物の用途、および前記ペプチドを用いて食欲調節を得る方法に関する。
発明の背景
グルカゴンは、膵A細胞により産生され、低い血中グルコース濃度に応答して放出される。その主な作用部位は肝臓であり、ここでグルカゴンはグルコースの産生を刺激する。したがって、それは、血中グルコースの恒常性においてインスリンに対抗する主要ホルモンである（Unger,R.H.およびL.Orci（1990）.Glucagon,Diabetes Mellitus,第4版,New York,Elsevier,pp 104-120）。
グルカゴンは、より大きな前駆体から、限定されたタンパク質分解によりプロセッシングされる。プログルカゴン前駆体は、グルカゴンだけでなく、GLP-1およびGLP-2と称される2個の追加的なグルカゴン様ペプチドも含有することが、グルカゴン遺伝子の分子クローニングから明らかになっている。GLP-1およびGLP-2は別々のエキソンにコードされており、このことは別々の生物学的活性を示唆するものである。プログルカゴンを産生することが知られている３つの異なる組織（すなわち、膵A細胞、腸L細胞および中枢神経系（CNS））における識別的（differential）プロセッシングに、プログルカゴン前駆体が付されることが、後になって証明された。例えば、島A細胞においては前駆体からグルカゴンが選択的に切り出され、一方、腸L細胞およびCNSからはGLP-1およびGLP-2が選択的に遊離される［Unger,R.H.およびL.Orci（1990）.Glucagon,Diabetes Mellitus,第4版,New York,Elsevier,pp 104-120において概説されている］。
グルカゴン受容体とは明らかに異なる（L.J Jelinekら（1993）Science 259:1614-1616）特異的なGLP-1受容体が同定されており（Thorens.B..（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:8641-8645）、それらは、異なる組織分布を有する（R.V Camposら（1994）Endocrinology 134:2156-2164）。GLP-1は、食事後にL細胞から放出され、インクレチン（incretin）ホルモンとして作用する（すなわち、それは、グルコースにより誘導された、膵B細胞からのインスリンの放出を増強する）。したがって、GLP-1受容体は、島B細胞の表面上で高レベルで発現される（K.Moensら（1996）Diabetes 45:257-261）。
GLP-2による腸上皮増殖の誘導が示されており（Drucker,D.J.ら（1996）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7911-7916）、GLP-2培地中で増殖させた細胞による胃腸疾患の治療が開示されている（Drucker,D.JおよびKeneford,J.R.,WO96/32414）。GLP-2受容体については、現在のところ全く報告されていない。
プログルカゴン由来のペプチドおよび摂食行動
本発明者らは、移殖可能な食欲不振性グルカゴノーマ（O.D.Madsenら（1993）Endocrinology 133:2022-2030）およびラットにおける低血糖インスリノーマ（O.D.Madsenら（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6652-6656）の誘導および樹立を既に報告している。そのような腫瘍は、多能性MSL細胞の共通のクローン起源から誘導することができ（O.D.Madsenら（1986）J.Cell Biol.103:2025-2034）、それぞれ島A細胞およびB細胞に向かう成熟過程を反映している（O.D.Madsenら（1993）Endocrinology 133:2022-2030）。
グルカゴノーマに関連した食欲不振は非常に重篤である。それは急性発症し、数日後には完全な摂食停止につながる。げっ歯類における他の実験的腫瘍では、食欲不振のこの重症性に匹敵するものはほとんど生じず、そのような重症性は、末梢投与経路により作用する非常に強力な満腹因子をグルカゴノーマが産生していることを示唆している。食欲不振性グルカゴノーマが、グルカゴンおよびGLP-1の両方の生成につながる非生理的プロセッシングを示したことが既に示されている（O.D.Madsenら（1993）Endocrinology 133:2022-2030）。さらに、非食欲不振性グルカゴノーマ変異体は、該前駆体をプロセッシングする能力を有していなかった（O.D.Madsenら（1995）Scand.J.Clin.Lab.Invest.55,suppl 220:27-36）。また、患者によってかなりのばらつきがあるものの（S.J.Bhathenaら（1981）.Glucagonoma and glucagonoma syndrome,Glucagon.Phsiology,pathophsiology and morphology of the pancreatic A-cells,New York,Elsevier.413-438）、ヒトにおけるグルカゴノーマ症候群の構成要素の１つとして体重減少が挙げられる（J.J.Holst（1985）Glucagon-producing tumors,:Hormone-producing tumors of the gastrointestinal tract.New York,Churchill Livingstone.pp 57-84）。
グルカゴン
グルカゴンはラットにおける自発的食物摂取量の調節に関与しているが、その全体的な効果は非常に小さく、肝臓への迷走神経接続を介して発揮されることが示されている（N.Gearyら（1993）Am.J.Physiol.264:R116-R122）。この効果はグルカゴンの肝門注入によってのみ認められ、一方、薬理学的量の腹腔内投与は、絶食しているラットにおける食物摂取に何ら影響を及ぼさないことが示されている（O.D.Madsenら（1993）Endocrinology 133:2022-2030）。
GLP-1
摂食の調節におけるGLP-1の中心的な役割が、最近報告された（M.D.Turtonら（1996）Nature 379:69-72）。GLP-1の脳室内（ICV）投与は、絶食しているラットにおける摂食を抑制した。この場合もまた、GLP-1の末梢投与は、摂食行動に何ら影響を及ぼさなかったが（M.D.Turtonら（1996）Nature 379:69-72;O.D.Madsenら（1993）Endocrinology 133:2022-2030）、このことは、GLP-1を産生する腫瘍が、観察される食欲不振に有意に寄与していない可能性があることを示唆している。
発明の概要
GLP-2は、末梢投与されると、食物摂取の抑制に大きな影響を及ぼすことが見出された。通常はGLP-1と共に腸L細胞から放出されるGLP-2が、末梢性満腹因子としてのそれ特有の役割を果たすことが提案されている。
したがって、本発明は、酸エタノール抽出、ゲル濾過および分取HPLCにより調製されたグルカゴノーマ腫瘍抽出物のHPLC画分と医薬上許容される賦形剤または担体とを含んでなる医薬組成物であって、該画分が、図２の画分G4H9として示され、かつ、グルカゴン様ペプチド２（GLP-2）を主成分として（すなわち、40％以上）含有するか又は前記画分のいずれかの単一成分もしくは前記画分の２以上の成分の組合わせを含むことを特徴とする医薬組成物の使用に関する。
もう１つの側面において、本発明は、グルカゴン様ペプチド２（GLP-2）またはその変異体もしくはホモログを含んでなる医薬組成物の、食欲調節不全に関連した疾患または障害の予防または治療のための使用に関する。
さらにもう１つの側面において、本発明は、アミノ酸配列：
X1HX2DGSFSDEMNTX3LDX4LAX5X6DFINWLX7X8TKITDX9
（式中、X1はNH2、DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR, DFPEEVNIVEELRRRまたはその断片、
X2はAlaまたはGly、
X3はIleまたはVal、
X4はAsn、SerまたはHis、
X5はAlaまたはThr、
X6はArgまたはLys、
X7はIleまたはLeu、
X8はGlnまたはHis、または
X9はOH、Lys、Arg、Arg-Lys、Lys-Arg、Arg-ArgまたはLys-Lysである）
で表されるペプチドを含んでなる医薬組成物の、食欲調節不全に関連した疾患または障害の予防または治療のための使用に関する。
さらにもう１つの側面では、本発明は、食欲調節不全に関連した疾患または障害の治療方法であって、そのような治療を要する個体に、該個体において食欲を抑制したり又は満腹を誘導するのに十分な量の本発明で特定されるペプチドを投与することを含んでなる方法に関する。
さらにもう１つの側面では、本発明は、食欲調節不全に関連した疾患または障害の予防または治療用の医薬の製造のための、本発明で特定されるペプチドの使用に関する。
発明の詳細な説明
本発明の説明では、「ペプチド」なる語は、成熟GLP-2ペプチドまたはその前駆体形態、および該完全長ペプチドの活性を実質的に有するその機能的断片を含むと理解される。さらに、「ペプチド」なる語は、前記ペプチドのホモログを包含する意である。そのようなホモログは、ヒトGLP-2のアミノ酸配列に対して少なくとも50％、例えば少なくとも75％、特に少なくとも90％の同一性度を示すアミノ酸配列を含む。同一性度は、通常の方法により判定することができる。例えば、Altshulら，Bull.Math.Bio. 48:603-616,1986、およびHenikoffおよびHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919,1992を参照されたい。
本発明のペプチドのホモログは、１以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有していてもよい。これらの変化は、該ペプチドのフォールディングまたは活性に有意な影響を及ぼさない保存性のアミノ酸置換、小さな欠失（典型的には、１〜約５個のアミノ酸の欠失）、アミノ末端またはカルボキシ末端の小さな伸長（例えば、アミノ末端メチオニン残基、約15残基以下の小さなリンカーペプチド）、または精製を促進する小さな伸長（例えば、ポリヒスチジン領域、抗原エピトープまたは結合ドメイン）というような、性質上大きな影響を与えないものであることが可能である。一般的には、Fordら，Protein Exression and Purification 2:95-107,1991を参照されたい。保存性の置換の具体例は、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えば、グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、および小さなアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）の各群の範囲内のものである。
該ホモログは、対立遺伝子変異体（すなわち、突然変異により生じる遺伝子のもう１つの形態）、または該突然変異遺伝子にコードされるが、天然のGLP-2ペプチドと実質的に同じ活性を有する改変されたペプチドであってもよい。したがって、突然変異は、サイレント突然変異（コードされるペプチドを変化させないもの）であってもよく、あるいは改変されたアミノ酸配列を有するペプチドをコードするものであってもよい。
また、本発明のペプチドのホモログは、種ホモログ（すなわち、別の種に由来する同様の活性を有するペプチド）であってもよい。GLP-2の種ホモログとしては、例えば、ヒト、ウシ、ラット、ハムスター、モルモットおよびブタのGLP-2が挙げられる。
本発明の好ましい実施態様におけるGLP-2ペプチドは、X1がNH2、X2がAla、X3がIle、X4がAsn、X5がAla、X6がArg、X7がIle、X8がGln、またはX9がOHであるGLP-2ペプチドである。特に、該ペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD（ヒトGLP-2）またはHADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD（ラットGLP-2）またはHADGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITD（ブタGLP-2）。
該ペプチドのホモログの単離は、当該種の細胞のゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを調製し、標準的な方法（例えば、Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されている方法）に従い合成オリゴヌクレオチドプローブを使用して、あるいはSambrookら（前掲）に記載されているような特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、ホモログの全部または一部をコードするDNA配列に関してスクリーニングすることにより行なうことができる。
また、本発明は、GLP-2ペプチドの変異体を含んでなる組成物に関する。該変異体は、１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている変異体である。特に好ましい実施態様では、該成熟ペプチドの２位においてAlaがGlyで置換されている。この変異体は、天然ペプチドより長い血漿半減期を示すと予想され、このことは、適度な食欲抑制または満腹誘導効果を得るのに必要な投与量が一般に少なくなるため有利である。
前記のとおり特定されるGLP-2ペプチドまたはそのホモログもしくは変異体は、当該技術分野で十分に確立されている方法に従う組換えDNA法により製造することができる。
より詳しくは、GLP-2ペプチドをコードするDNA配列は、単離したり、あるいは公開されているヒトプレプログルカゴンDNA配列（J.W.Whiteら，Nucleic Acids Res.14,1986,pp.4719-4730;G.I.Bellら，Nature 304,1983,pp.368-371を参照されたい）に基づき合成することができる。例えば、該配列は、適当な組織からのゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを調製し、標準的な方法（Sambrookら，前掲を参照されたい）に従い合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによりGLP-2ペプチドの全部または一部をコードするDNA配列に関してスクリーニングすることにより得ることができる。本発明の目的においては、GLP-2ペプチドをコードするDNA配列は、好ましくは、ヒト由来である。
また、GLP-2ペプチドをコードするDNA構築物は、確立されている標準的な方法（例えば、BeaucageおよびCaruthers,Tetrahedron Letters 22（1981）,1859-1869に記載されているホスホアミジット法、またはMatthesら，EMBO Journal 3（1984）801-805に記載されている方法）により合成的に調製することができる。ホスホアミジット法では、オリゴヌクレオチドを、例えば自動DNA合成装置中で合成し、精製し、アニーリングさせ、連結し、適当なベクター中にクローニングする。
さらに、該DNA構築物は、合成、ゲノムまたはcDNA由来（適当なもの）の断片、完全DNA構築物の種々の部分に対応する断片を標準的な方法に従い連結することにより調製された、合成由来とゲノム由来との混合体、合成由来とcDNA由来との混合体、またはゲノム由来とcDNA由来との混合体であってもよい。
また、該DNA構築物は、例えば米国特許第4,683,202号またはSaikiら，Science 239（1988）,487-491またはSambrookら（前掲）に記載されている特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により調製することができる。
現在のところ好ましい実施態様においては、該DNA構築物は、G.I.Bellら，Nature 304,1983,pp.368-371の図３に示されているDNA配列、およびヒトGLP-2をコードしているが、遺伝暗号の縮重のためにBellら（前掲）の図３に示されているDNA配列とは異なっている核酸配列を含む。該DNA配列はさらに、ヒトGLP-2をコードする核酸分子（ゲノム、合成またはcDNAまたはRNAのいずれか）と高いストリンジェンシーの条件下（すなわち、5×SSC中に予浸し、20％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、50mMリン酸ナトリウム，pH6.8および50μgの超音波処理された変性ウシ胸腺DNAの溶液中、約40℃で１時間予備ハイブリダイズさせ、ついで、100μM ATPで補足された同じ溶液中、約40℃で18時間ハイブリダイズさせ、ついで0.4×SSC中、約45℃の温度で洗浄する）でハイブリダイズする核酸配列を含む。これは、例えば、他の種からのGLP-2（例えば、ラット、ウシ、ハムスター、モルモットまたはブタGLP-2）をコードするDNA配列であってもよい。
GLP-2を発現させるためには、GLP-2ペプチドをコードするDNA構築物を、適当な組換えベクター中に挿入する。これは、組換えDNA法に簡便に付すことができる任意のベクターであってもよく、ベクターの選択は、それを導入する宿主細胞に左右されることが多い。該ベクターは、例えば、自律複製ベクター（すなわち、染色体外に存在するベクターのうち、その複製が染色体の複製から独立しているもの、例えばプラスミド）であってもよい。あるいは、該ベクターは、宿主細胞中に導入されると、宿主細胞ゲノム中に組込まれ、それが組込まれた染色体と共に複製されるベクターであってもよい。
該ベクターは、好ましくは、GLP-2ペプチドをコードするDNA配列が、該DNAの転写に必要な追加的なセグメントに作動的に結合した発現ベクターである。一般には、該発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスDNAに由来するものであるか、あるいはそれらの両方の要素を含有していてもよい。「作動的に結合」なる語は、該セグメントが、その意図された目的（例えば、転写がプロモーターで開始され、該ペプチドをコードするDNA配列の全体にわたり進行する）のために協同して機能するように配置されていることを意味する。
該プロモーターは、選択した宿主細胞中で転写活性を示す任意のDNA配列であってもよく、また、宿主細胞に対して同種または異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来するものであってもよい。
GLP-2ペプチドをコードするDNAの転写を哺乳動物細胞中で指令するための適当なプロモーターとしては、例えば、SV40プロモーター（Subramaniら，Mol.Cell Biol. 1（1981）,854-864）、MT-1（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Palmiterら，Science 222（1983）,809-814）またはアデノウイルス2主要後期プロモーターが挙げられる。
昆虫細胞中で使用するための適当なプロモーターとしては、例えば、ポリヘドリンプロモーター（米国特許第4,745,051号;Vasuvedanら，FEBS Lett. 311,（1992）7-11）、P10プロモーター（J.M.Vlakら，J.Gen.Virology 69,1988,pp.765-776）、オートグラファ核多角体ウイルス（Autographa californica polyhedrosis virus）塩基性タンパク質プロモーター（EP 397485）、バキュロウイルス最初期遺伝子１プロモーター（米国特許第5,155,037号、米国特許第5,162,222号）またはバキュロウイルス39K遅延初期（delayed-early）遺伝子プロモーター（米国特許第5,155,037号、米国特許第5,162,222号）が挙げられる。
酵母宿主細胞中で使用するための適当なプロモーターには、酵母解糖遺伝子（Hitzemanら，J.Biol.Chem. 255（1980）,12073-12080;AlberおよびKawasaki,J.Mol.Appl.Gen. 1（1982）,419-434）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Youngら，Genetic Engineering of Microoranisms for Chemicals（Hollaenderら編）,Plenum Press,New York,1982）からのプロモーター、あるいはTPI1（米国特許第4,599,311号）またはADH2-4c（Russellら，Nature 304（1983）,652-654）プロモーターが含まれる。
糸状菌宿主細胞中で使用するための適当なプロモーターとしては、例えば、ADH3プロモーター（McKnightら，The EMBO J. 4（1985）,2093-2099）またはtpiAプロモーターが挙げられる。他の有用なプロモーターとしては、エイ・オリゼ（A.oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、エイ・ニガー（A.niger）中性α-アミラーゼ・エイ・ニガー（A.niger）酸安定性α-アミラーゼ、エイ・ニガー（A.niger）またはエイ・アワモリ（A.awamori）グルコアミラーゼ（gluA）、リゾムーコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼA、エイ・オリゼ（A.oryzae）アルカリプロテアーゼ、エイ・オリゼ（A.oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼまたはエイ・ニデュランス（A.nidulans）アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。TAKA-アミラーゼおよびgluAプロモーターが好ましい。
細菌宿主細胞中で使用するための適当なプロモーターには、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）マルトジェニック（maltogenic）アミラーゼ遺伝子、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）α-アミラーゼ遺伝子、バシラス・アミロリクファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）BANアミラーゼ遺伝子、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）アルカリプロテアーゼ遺伝子またはバシラス・ピュミルス（Bacillus pumilus）キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはファージλPRまたはPLプロモーターまたは大腸菌（E.coli）lac、trpもしくはtacプロモーターが含まれる。
また、GLP-2ペプチドをコードするDNA配列は、必要に応じて、ヒト成長ホルモンターミネーター（Palmiterら，前掲）または（真菌宿主用には）TPI1（AlberおよびKawasaki，前掲）もしくはADH3（McKnightら，前掲）ターミネーターなどの適当なターミネーターに作動的に結合していてもよい。該ベクターはさらに、ポリアデニル化シグナル（例えば、SV40またはアデノウイルス5Elb領域からのもの）、転写エンハンサー配列（例えば、SV40エンハンサー）および翻訳エンハンサー配列（例えば、アデノウイルスVA RNAをコードするもの）などの要素を含んでいてもよい。
該組換えベクターはさらに、該ベクターが当該宿主細胞中で複製されるのを可能にするDNA配列を含んでいてもよい。そのような配列（宿主細胞が哺乳動物細胞の場合）の一例として、SV40複製起点が挙げられる。
宿主細胞が酵母細胞の場合には、該ベクターの複製を可能にする適当な配列としては、酵母プラスミド２μ複製遺伝子REP1-3および複製起点が挙げられる。
また、該ベクターは、選択マーカー、例えば、宿主細胞の欠損を補う産物を与える遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）をコードする遺伝子またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）TPI遺伝子（P.R.Russell,Gene 40,1985,pp.125-130に記載されているもの）、薬物（例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはメトトレキセート）に対する耐性を付与する遺伝子を含んでいてもよい。糸状菌の場合、選択マーカーとしては、amdS、pyrG、argB、niaD、sCなどが挙げられる。
GLP-2ペプチドを宿主細胞の分泌経路に方向づけるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても公知である）を組換えベクター中に配置してもよい。該分泌シグナル配列は、正しいリーディングフレームにて、該ペプチドをコードするDNA配列に連結されている。分泌シグナル配列は、一般には、該ペプチドをコードするDNA配列の5'側に位置する。該分泌シグナル配列は、該ペプチドと通常に結合している配列であってもよいし、あるいは、別の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来するものであってもよい。
酵母細胞からの分泌のためには、発現されたペプチドを該細胞の分泌経路に効率的に方向づけるのを保証する任意のシグナルペプチドを、該分泌シグナル配列がコードしていてもよい。シグナルペプチドは、天然に生じるシグナルペプチドまたはその機能的部分であってもよいし、あるいは合成ペプチドであってもよい。適当なシグナルペプチドは、α-因子シグナルペプチド（米国特許第4,870,008号参照）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（O.Hagenbuchleら，Nature 289,1981,pp.643-646参照）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L.A.Vallsら，Cell 48,1987,pp.887-897参照）、酵母BAR1シグナルペプチド（WO 87/02670参照）または酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3（YAP3）シグナルペプチド（M.Egel-Mitaniら，Yeast 6,1990,pp.127-137参照）であることが判明している。
また、酵母中での効率的な分泌のためには、リーダーペプチドをコードする配列が、該シグナル配列の下流、かつ、GLP-2ペプチドをコードするDNA配列の上流に挿入されていてもよい。リーダーペプチドの機能は、発現されたペプチドを小胞体からゴルジ装置へ、さらには培地中への分泌のために分泌小胞へ方向づけること（すなわち、該ペプチドが細胞壁を横切り、あるいは少なくとも細胞膜を通過して、酵母細胞の周辺腔内に輸出されること）を可能にすることである。リーダーペプチドは、酵母α-因子リーダー（その用途は、例えば米国特許第4,546,082号、EP 16 201、EP 123 294、EP 123 544およびEP 163 529に記載されている）であってもよい。あるいは、リーダーペプチドは、合成リーダーペプチド、すなわち、天然では見出されないリーダーペプチドであってもよい。合成リーダーペプチドは、例えば、WO 89/02463またはWO 92/11378に記載のとおりに構築することができる。
糸状菌中で使用する場合には、シグナルペプチドは、アスペルギルス種（Aspergillus sp.）アミラーゼまたはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼまたはプロテアーゼ、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼをコードする遺伝子から簡便に誘導することができる。シグナルペプチドは、好ましくは、エイ・オリゼ（A.oryzae）TAKAアミラーゼ、エイ・ニガー（A.niger）中性α-アミラーゼ、エイ・ニガー（A.niger）酸安定性アミラーゼまたはエイ・ニガー（A.niger）グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来するものである。
昆虫細胞中で使用する場合には、シグナルペプチドは、鱗翅目のマンジュカ・セクスタ（Manduca sexta）脂質動員ホルモン前駆体シグナルペプチド（米国特許第5,023,328号参照）などの昆虫遺伝子（WO 90/05783参照）から簡便に誘導することができる。
GLP-2ペプチドをコードするDNA配列、プロモター、所望により用いるターミネーター、および／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結するのに用いる方法、ならびに複製に必要な情報を含有する適当なベクター中にそれらを挿入するのに用いる方法は、当業者によく知られている（例えば、Sambrookら，前掲を参照されたい）。
宿主細胞中に導入されるGLP-2ペプチドをコードするDNA配列は、当該宿主に対して同種であっても異種であってもよい。宿主細胞に対して同種である場合、すなわち、それが宿主細胞により天然で産生される場合には、それは、典型的には、その天然環境におけるものとは別のプロモーター配列に、あるいは適用可能であれば、その天然環境におけるものとは別の分泌シグナル配列および／またはターミネーター配列に作動的に結合させることになる。「同種」なる語は、当該宿主生物に固有のポリペプチドをコードするcDNA配列を包含する意である。「異種」なる語は、天然で宿主細胞により発現されないDNA配列を包含する意である。したがって、DNA配列は、別の生物に由来するものであっても、あるいは合成配列であってもよい。
本発明のDNA構築物または組換えベクターを導入する宿主細胞は、本発明のペプチドを産生する能力を有する任意の細胞であってもよく、細菌、酵母、真菌およびより高等な真核細胞を含む。
培養されるとGLP-2ペプチドを産生しうる細菌宿主細胞としては、例えば、バシラス属（Bacillus）の株、例えばバシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・レントゥス（Bacillus lentus）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バシラス・アミロリクファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バシラス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バシラス・ラウツス（Bacillus lautus）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megatherium）またはバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の株、またはストレプトマイセス属（Streptomyces）の株、例えばストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）またはストレプトマイセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）などのグラム陽性菌、あるいは大腸菌（Echenchia.coli）などのグラム陰性菌が挙げられる。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換により、あるいは自体公知の方法（Sambrookら，前掲参照）でコンピテント細胞を使用して行なうことができる。
大腸菌（E.coli）などの細菌中で該ペプチドを発現させる場合には、該ペプチドを細胞質中に、典型的には不溶性顆粒（封入体として公知である）として保つことが可能であり、あるいは細菌分泌配列により周辺腔に方向づけることが可能である。前者の場合には、該細胞を溶菌し、該顆粒を回収し変性させ、ついで変性剤を希釈することにより該ペプチドをリフォールディングさせる。後者の場合には、例えば超音波処理または浸透圧ショックにより細胞を破壊して周辺腔の内容物を遊離させ、該ペプチドを回収することにより、周辺腔から該ペプチドを回収することができる。
適当な哺乳動物細胞系としては、例えば、COS（ATC CRL 1650）、BHK（ATCC CRL 1632、ATCC CCL 10）、CHL（ATCC CCL39）またはCHO（ATCC CCL 61）細胞系が挙げられる。哺乳動物細胞にトランスフェクトし、該細胞中に導入されたDNA配列を発現させる方法は、例えば、KaufmanおよびSharp,J.Mol.Biol. 159（1982）,601-621;SouthernおよびBerg,J.Mol.Appl.Genet. 1（1982）,327-341;Loyterら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79（1982）,422-426;Wiglerら，Cell 14（1978）,725;CorsaroおよびPearson,Somatic Cell Genetics 7（1981）,603,Grahamおよびvan der Eb,Virology 52（1973）,456,およびNeumannら，EMBOJ. 1（1982）,841-845に記載されている。
適当な酵母細胞としては、例えば、サッカロミセス種（Saccharomyces spp.）またはシゾサッカロミセス種（Schizosaccharomyces spp.）、特に、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはサッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）株の細胞などが挙げられる。異種DNAで酵母細胞を形質転換し、それから異種ポリペプチドを産生させる方法は、例えば米国特許第4,599,311号、米国特許第4,931,373号、米国特許第4,870,008号、第5,037,743号および米国特許第4,845,075号（これらをすべて、参考として本明細書に組入れるものとする）に記載されている。形質転換細胞は、選択マーカーにより決定される表現型、一般には薬剤耐性、または或る特定の栄養素（例えばロイシン）の不存在下で増殖する能力により選択する。酵母中で使用するための好ましいベクターは、米国特許第4,931,373号に記載されているPOT1ベクターである。GLP-2ペプチドをコードするDNA配列の前に、シグナル配列、および所望によりリーダー配列（例えば、前記のとおり）を配置することができる。適当な酵母細胞のその他の具体例としては、クルイベロミセス（Kluyveromyces）の株、例えばケイ・ラクチス（K.lactis）、ハンゼヌラ（Hansenula）、例えばエイチ・ポリモルファ（H.polymorpha）、またはピチア（Pichia）、例えばピー・パストリス（P.pastoris）（Gleesonら，J.Gen.Microbiol. 132,1986,pp.3459-3465;米国特許第4,882,279号参照）が挙げられる。
他の真菌細胞としては、例えば、糸状菌、例えばアスペルギルス種（Aspergillus spp.）、ノイロスポラ種（Neurospora spp.）、フザリウム種（Fusarium spp.）またはトリコデルマ種（Trichoderma spp.）、特にエイ・オリゼ（A.oryzae）、エイ・ニデュランス（A.nidulans）またはエイ・ニガー（A.niger）の株の細胞が挙げられる。タンパク質の発現のためにアスペルギルス種（Aspergillus spp.）を使用することについては、例えば、EP 272 277およびEP 230 023に記載されている。エフ・オキシスポラム（F.oxysporum）の形質転換は、例えば、Malardierら，1989,Gene 78:147-156に記載されているとおりに行なうことができる。
糸状菌を宿主細胞として使用する場合には、GLP-2ペプチドをコードするDNA構築物でそれを形質転換することができる。これは、該DNA構築物を宿主染色体中に組込み、組換え宿主細胞を得ることにより簡便に行なうことができる。一般には、このような組込みが有利であると考えられる。なぜなら、該DNA配列は、該細胞内で安定に維持される可能性が高いからである。宿主染色体中への該DNA構築物の組込みは、常法（例えば、相同組換えまたは非相同組換え）により行なうことができる。
昆虫細胞の形質転換、およびその中での異種ポリペプチドの産生は、米国特許第4,745,051号、米国特許第4,879,236号、米国特許第5,155,037号、第5,162,222号、EP 397,485（これらのすべてを参考として本明細書に組入れることとする）に記載されているとおりに行なうことができる。宿主として使用する昆虫細胞系は、適切には、鱗翅目（Lipidoptera）細胞系、例えばスポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞またはトリコプルシア・ニー（Trichoplusiani）細胞（米国特許第5,077,214号参照）である。培養条件は、適切には、例えばWO 89/01029またはWO 89/01028あるいは前記の文献のいずれかに記載されているとおりである。
前記のとおり形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、ついで、GLP-2ペプチドの発現を許容する条件下、適当な栄養培地中で培養し、ついで、得られたGLP-2ペプチドを培地から回収する。
細胞を培養するのに使用する培地は、宿主細胞の増殖に適した通常の任意の培地、例えば、適当な補足物質を含有する最少または複合培地であってもよい。適当な培地は、商業的供給業者から入手可能であり、あるいは公開されている配合表（例えば、American Type Culture Collectionのカタログ中）に従い調製することができる。該細胞により産生されるGLP-2ペプチドを、ついで通常の方法により培地から回収することができる。それらの通常の方法は、宿主細胞を遠心分離または濾過により培地から分離し、上清または濾液のタンパク質性成分を塩（例えば、硫酸アンモニウム）により沈殿させ、種々のクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど）により精製することを含む。
本発明の医薬組成物においては、医薬組成物を製剤化する確立された任意の方法（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,1985に記載されている方法）により、GLP-2ペプチドを製剤化することができる。該組成物は、全身性注射または注入に適した形態であってもよく、そのような場合には、滅菌水または等張食塩水またはグルコース溶液などの適当な液体担体と共に製剤化することができる。該組成物は、当業者によく知られた通常の滅菌法により滅菌することができる。得られた水溶液は、使用のために包装するか、あるいは無菌条件下で濾過し、凍結乾燥することができ、その凍結乾燥調製物は投与前に滅菌水溶液と合わせることができる。該組成物は、生理的条件に近づけるために必要に応じて、緩衝剤、張度調整剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）の薬学的に許容される補助物質を含有していてもよい。
また、本発明の医薬組成物は、鼻腔、経皮、肺または直腸投与に適合させることができる。該組成物中で使用する薬学的に許容される担体または希釈剤は、通常の任意の固体担体であってもよい。固体担体としては、例えば、乳糖、石膏、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸が挙げられる。同様に、担体または希釈剤には、当該技術分野で公知の任意の徐放物質、例えば、モノステアリン酸グリセリルもしくはジステアリン酸グリセリルの単独体またはロウとの混合体を含めることが可能である。
本発明の組成物を徐放製剤の形態で提供することが、特に有利であるかもしれない。そのような場合、該組成物は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又は乳酸／グリコール酸共重合体などの適当な薬学的に許容される生分解性重合体によりカプセル化されたか、又はその中に分散されたGLP-2ペプチドを含有するマイクロカプセルまたは微粒子として製剤化することができる。
鼻腔内投与の場合には、該製剤は、エアゾール適用のための液体担体、特に水性担体中に溶解または懸濁されたGLP-2ペプチドを含有していてもよい。該担体は、可溶化剤（例えば、プロピレングリコール）、界面活性剤、例えばレシチン（ホスファチジルコリン）若しくはシクロデキストリンなどの吸収増強剤、または例えばパラベンなどの保存剤等の添加剤を含有していてもよい。
一般には、本発明の化合物を、単位投与当たり0.5〜500mgの該ペプチドと薬学的に許容される担体とを含む単位投与形として調剤する。
GLP-2ペプチドは、食欲調節不全に関連した疾患または障害の予防または治療などのための食欲抑制または満腹感誘導において使用することが有利であると考えられる。そのような疾患または障害としては、例えば、肥満およびII型糖尿病が挙げられる。患者に投与されるGLP-2ペプチドの用量は、治療する病気のタイプおよび重症度によって異なるが、一般には、約10μg/kg体重〜5mg/kg体重の範囲内にある。
本発明の医薬組成物においては、GLP-2ペプチドを、別の食欲抑制剤または満腹感誘導剤と組み合わせることができる。そのような薬剤の一例としては、食欲抑制に何らかの影響を及ぼすことが示されているGLP-1が挙げられる（M.D.Turtonら，Nature 379,1996年１月４日,pp.69-72参照）。
さらに、GLP-2受容体を発現すると予想される組織（例えば、視床下部組織）を使用する結合研究においてGLP-2の受容体を同定するために、適切に標識された形態のGLP-2ペプチド（例えば、放射能標識されたGLP-2）を使用することができると考えられる。該受容体がGLP-2結合により位置決定されたなら、発現クローニングにより該受容体をクローニングすることができる。すなわち、当該組織のcDNAライブラリーを調製し、該cDNAを適当なベクター中にクローニングし、該ベクターを適当な細胞中に導入して、該cDNAを発現させ、ついで、該受容体を発現するクローンをGLP-2に対する結合により同定することができる。ついで、該受容体を安定に発現する細胞系を、GLP-2アゴニスト（すなわち、該受容体に作用して、満腹感を誘導したり又は食欲を抑制する化合物）またはGLP-2アンタゴニスト（すなわち、例えば癌による食欲不振または神経性食欲不振の治療に使用するための、該受容体に対するGLP-2の作用を拮抗する化合物）に関するスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
つぎに、以下の実施例において本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は、特許請求する本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１
腫瘍組織の酸エタノール抽出
文献記載のとおりに（Madsen,O.D.ら（1993）Endocrinology 133,2022-2030）、ラットにおいて食欲不振性腫瘍を産生させた。50.07gの湿潤組織に相当する50個の食欲不振性12C3AN（MSL-G-AN）腫瘍（−80℃）を、700mlの酸エタノール（96％エタノール/0.7M HCl,HCl,3/1,vol/vol）により４℃でホモジナイズした。このホモジナイゼーションは、予め冷却（４℃）された２リットルのワーリングコマーシャルブレンダー（Waring Commercial Blender）中、最大速度にて５分間行なった。ホモジナイゼーション後、該混合物を４℃で16時間攪拌した。該混合物を9000RPM、４℃で１時間遠心した。真空回転（vacuum rotation）により、上清の容量を20％に減少させた。この過程の間にエタノールの大部分が除去され、多少の沈殿物が生じる。４℃、20.000RPMでの１時間の遠心により、この沈殿物を除去した。依然として脂質様物質を含有している該上清を濾過し、0.1％TFAで平衡化したLiChroprep RP-18（Merck）カラム（2.5×10cm）に流速2ml/分で適用した。該カラムを、100mlの0.1％TFAで流速４ml/分にて洗浄した。70％（vol/vol）アセトニトリルを含有する400mlの0.1％TFAで、結合物質を溶出した。そのアセトニトリルを真空回転により除去し、得られた混合物を凍結乾燥した。凍結乾燥後、該物質を50mlの水に溶解し、425μlの１N NaOHでpHを5.3に調整した。さらに、該混合物をpH6.0まで滴定すると、沈殿物が生じた。pH5.3にまで逆滴定すると、この沈殿物は再び溶解した。したがって、pHを5.3に維持し、該混合物を凍結乾燥した。
50個の腫瘍からの凍結乾燥物質の合計収量は、乾燥粉末として359mgであった。
実施例２
第1精製工程：セファデックスG-75上でのゲル濾過
38個の腫瘍に相当する酸エタノール抽出からの凍結乾燥物質（278mg）を、20mlの１M HAc中に再溶解し、セファデックスG75カラム（5×50cm）に適用した。該カラムを平衡化し、１M HAcで流速55ml/時間にて溶出し、10mlに相当する画分を集めた。各画分について、280nmでの吸収を記録した。該ゲル濾過のクロマトグラムを図１に示す。個々の画分を、5個の主要画分（G1（Fr.30-39）、G2（Fr.40-45）、G3（Fr.46-66）、G4（Fr.67-91）およびG5（Fr.92-118））中にプールし、凍結乾燥後、バイオアッセイに付した。
実施例３
第2精製工程：G4プールの分取HPLC
ゲル濾過プールの食欲抑制活性のいくらかは、該活性がG4プールに存在することを示した。このプールを、分取HPLCにより更に分画した。凍結乾燥されたG4物質（80個の腫瘍に相当）を15mlの0.1％TFAに再溶解し、0.1％TFA中で平衡化したVydac 214TP1022 C4カラム（2.2×25cm）上にポンプで注入した。該カラムを20mlの0.1％TFA、ついで100mlのMeCN/H2O/TFA（10.0：89.9：0.1,v/v/v）で洗浄した。該物質を、25℃、流速4ml分にて、MeCN/H2O/TFA（10.0：79.9：0.1,v/v/v）およびMeCN/H2O/TFA（65.0：34.9：0.1,v/v/v）から形成される直線勾配で110分かけて溶出した。紫外線吸収を214nmおよび280nmでモニターした。HPLCクロマトグラム（280nmでモニターしたもの）を図２に示す。10個の主要プールに相当する画分が、図２に示すとおりに生成した。該容量を真空回転により約25％にまで減少させ、該画分を凍結乾燥し、バイオアッセイにおいて試験した。
画分G4H9において食欲抑制活性が見出され（実施例６）、この画分のペプチドを、アミノ酸配列分析および質量分析により分析した（実施例４）。
実施例４
画分G4H9中のペプチドの化学的特徴づけ
アプライド・バイオシステムズ・モデル（Applied Biosystems Model）477気相シークエンサーを該製造業者の説明に実質的に従い使用する自動エドマン分解により、アミノ酸配列分析を行なった。質量分析は、API III LC/MS/MSシステム（Sciex,Thornhill,Ont.,Canada）を使用して行なった。該三重四重極装置は、2400の質量−電荷比（m/z）領域を有し、空気で補助される電子スプレー（pneumatically assisted electrospray）（イオンスプレーとも称される）インタフェースを備えている（Bruins,A.P.,Covey,T.R., & Henion,J.D.（1987）Anal.Chem.59,2642-2646およびCovey,T.R.,Bonner,R.F.,Shushan,B.I., & Henion,J.D.（1988）Rapid Commun.Mass Spectrom.2,249-256）。サンプルの導入は、シリンジ注入ポンプ（Sage Instruments,Cambridge,MA）により0.5〜1ml/分の液体流速で溶融キャピラリー（内径75mm）に通すことにより行なった。その装置のm/z目盛りは、単位分解能（unit resolution）下にてポリ（プロピレングリコール）（PPG）の単荷電（singly-charged）アンモニウム付加イオンで校正した。質量測定の精度は、一般には、0.02％より良好である。
画分G4H9
この画分中の優勢なペプチドは、アミノ酸配列：HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITDを有することが判明した。質量分析により判明した分子量は3796であった。このペプチドは、ラットGLP-2（1-33）と同一である。少量の以下の２つのペプチドも見出された：
DFPEEVAIAEELGRRHADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITDおよびHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR。
これらのペプチドは、それぞれ、スペーサーペプチド2によりN末端が伸長したラットGLP-2、およびラットGLP-1（1-36アミド）と同一である。
実施例５
マウスにおける食欲抑制を測定するための試験方法
マウスに、それらの通常の飼料を2日間与えなかった。飼料を与えない１日目は、20％ショ糖溶液に自由に近づけるようにした。飼料を与えない２日間の後、試験物質を含有する0.5mlの溶液をマウスに腹腔内注射した。注射の30分後、個々のマウスを、８個の15cm2の試験箱のうちの１個に入れた。これらの試験箱は、ステンレス鋼格子の床と、その箱の中に突出しているガラス製の飲用管とを有するものであった。該飲用管を、20％ショ糖を含有する貯蔵槽に接続した。該飲用管は、内側に電極を含有していた。この電極は、飲むことによる溶液との接触の検出を可能にするものであった。そのような検出は、該飲用管電極とステンレス鋼格子の床とに接続された電子装置を用いて、マウスを通る弱い（顕著でない）電流の流れを測定することにより行なった。試験中のショ糖溶液との接触の合計量を電子的に記録することにより、ショ糖溶液の消費を10分間にわたり測定した。ある与えられた試験物質により生じた食欲抑制の程度は、対照（担体で処理された）マウスによるショ糖の消費の継続時間を、試験物質で処理されたマウスの場合と統計学的に比較することにより判定した。処理群のマウスにおける食欲抑制の程度を、対照群の反応に対する割合（％）として表した。
実施例６
GLP-2を含有する画分によるマウスにおける食欲抑制に関する試験
試験物質で処理した後の食欲抑制に関して（実施例５参照）、マウスを試験した。該試験物質は、実施例３（ゲル濾過画分G4）または実施例４（HPLC画分G4H9）に従い調製し、リン酸緩衝食塩水に溶解した食欲不振性グルカゴノーマ腫瘍の抽出物よりなるものであった。3.3個の腫瘍に相当するゲル濾過画分G4からの凍結乾燥物質を含有する試験溶液は、ショ糖の消費を72％抑制した。G4ゲル濾過画分（実施例４および図２参照）の10個のHPLC亜画分のうち、GLP-2含有画分G4H9だけが、統計学的に有意な食欲抑制を与え、5.3個の腫瘍に相当する凍結乾燥物質を与えた場合に、ショ糖の消費を49％抑制した。
実施例７
合成GLP-2によるマウスにおける食欲不振に関する試験
リン酸緩衝食塩水に溶解した合成ブタGLP-2よりなる試験物質で処理した後で、実施例５に記載のとおり、食欲抑制に関してマウスを試験した。ブタGLP-2は、以下のアミノ酸配列を有する：HADGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITD。50マイクログラムの合成ブタGLP-2を含有する試験溶液の腹腔内注射は、ショ糖の消費を38％抑制した。
実施例８
マウスにおける食欲抑制を測定するための試験方法
この方法は、20％ショ糖の代わりに乳児用調製粉乳溶液（Complan▲Ｒ▼）を使用する以外は、実施例５に記載のとおりである。試験物質を、リン酸緩衝食塩水と１％アルブミンとよりなる担体に溶解する。担体に溶解した試験物質を、100マイクロリットルの容量で静脈内（IV）に、あるいは10マイクロリットルの容量で脳室内（ICV）に投与する。
実施例９
合成GLP-2によるマウスにおける食欲不振に関する試験
合成ヒトGLP-2よりなる試験物質で処理した後で、実施例８に記載のとおり、食欲抑制に関してマウスを試験した。ヒトGLP-2は、以下のアミノ酸配列を有する：HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。３マイクログラムの合成ヒトGLP-2を含有する試験溶液のIV注射は、ミルクの消費を24％抑制し、一方、３マイクログラムおよび10マイクログラムの合成ヒトGLP-2のICV注射は、ミルクの消費をそれぞれ32％および35％抑制した。
【図１】
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【図２】
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