(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号39で示される重鎖アミノ酸配列の可変領域および配列番号41で示される軽鎖アミノ酸配列の可変領域を有する、A33に結合する組換えヒト抗体。
【請求項２】
抗体重鎖定常領域のクラスがIgGである、請求項１に記載の組換えヒト抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組換えヒト抗体を有効成分とする、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はＡ３３抗原に特異的に結合する抗Ａ３３抗体に関する。さらに本発明は、抗Ａ３３抗体を有効成分とする、Ａ３３を発現している細胞に起因する疾患に対する予防又は治療剤、特に悪性腫瘍治療剤に関する。
【背景技術】  癌（腫瘍）は、わが国における死亡原因の第一位を占め、さらに患者数は年々増加してきており、有効性及び安全性の高い薬剤や治療法の開発が強く望まれている。中でも、大腸癌は、１９９９年度の調査で全癌の１２．２％を占めており、死亡率は、男性では第３位、女性では第２位であるが、近年では著しく増加して今後、大腸癌は罹患率や死亡率で胃癌を追い抜くと予想されている。また、胃癌は、１９９９年度の調査で全癌の１７．４％を占めており、死亡率は、男性では第２位、女性では第１位である。
治療薬としての抗体の使用は、種々の病態（癌型）の治療における重要かつ価値のあるアプローチとして認められつつある。抗体の特異性により、腫瘍特異的抗原が異種細胞の特性を示す病態の治療に有用である。抗体は、細胞表面に発現する蛋白質である腫瘍特異的抗原に結合し、このような細胞を有効に標的とする。現在、細胞膜上に存在するレセプターであるＣＤ２０を標的としたキメラ抗体（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを標的としたヒト化抗体などのモノクローナル抗体が、悪性腫瘍を対象疾患として使用されており、その治療効果が認められている。抗体は、血中半減期が長く、抗原への特異性が高いという特徴を持ち、抗腫瘍剤として特に有用である。例えば、腫瘍特異的な抗原を標的とした抗体であれば、投与した抗体は腫瘍に集積することが推定されるので、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）や抗体依存的細胞性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）による、免疫システムの癌細胞に対する攻撃が期待できる。また、その抗体に放射性核種や細胞毒性物質などの薬剤を結合しておくことにより、結合した薬剤を効率よく腫瘍部位に送達することが可能となり、同時に、非特異的な他組織への該薬剤到達量が減少することで、副作用の軽減も見込むことができる。腫瘍特異的抗原に細胞死を誘導するような活性がある場合はアゴニスティックな活性を持つ抗体を投与することで、また、腫瘍特異的抗原が細胞の増殖及び生存に関与する場合は中和活性を持つ抗体を投与することで、腫瘍特異的な抗体の集積と、抗体の活性による腫瘍の増殖停止又は退縮が期待される。抗体は、上記のようにその特徴から抗腫瘍剤として適用するのに適切であると考えられる。
最初の抗体製造への進出には、対象動物としてマウスが使用された。しかしながら、多数の理由によりマウス抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用は制限されている。ヒト宿主によって外来物として認識されるマウス抗体は、いわゆる「ヒト抗マウス抗体」すなわち「ＨＡＭＡ」応答を惹起する（Ｓｃｈｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．（１９８５），４５，８７９−８８５参照）。さらに、マウス抗体のＦｃ部分は、ヒト補体または細胞傷害活性の刺激に有効ではない。
このような問題を回避するためのアプローチのひとつとしてキメラ抗体が開発された（欧州特許出願１２０６９４及び１２５０２３参照）。キメラ抗体は、２つまたはそれ以上の種由来の抗体の一部（マウス抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域など）を含む。このようなキメラ抗体の利点はマウス抗体の特徴は保持するが、ヒトＦｃを持つためヒト補体または細胞傷害活性を刺激することができる。しかし、このようなキメラ抗体も依然として「ヒト抗キメラ抗体」すなわち「ＨＡＣＡ」応答を惹起する（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７０，２１５３−２１５７，１９８９参照）。
さらに、置換された抗体の一部のみが相補性決定領域（すなわち「ＣＤＲ」）である組換え抗体が開発された（英国特許ＧＢ２１８８６３８Ａ及び米国特許第５５８５０８９号）。ＣＤＲ移植技術を使用してマウスＣＤＲ、ヒト可変部フレームワーク及び定常領域からなる抗体（すなわち「ヒト化抗体」）が産生されている（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８），３３２，３２３−３２７参照）。
「Ａ３３」と呼ばれるクラスＩの細胞膜タンパクでＩｇスーパーファミリーのひとつであり腫瘍特異的抗原である抗原に対するマウス抗Ａ３３抗体及びヒト化抗体について報告されている（特許文献１及び非特許文献１から５を参照）。この抗原は、結腸癌及び胃癌に関連することが公知である（特許文献２、特許文献３及び非特許文献６を参照）。また、このヒト化Ａ３３抗体を用いて、近年、フェーズＩの臨床試験を結腸癌患者を対象に行っている（非特許文献４および５を参照）。前者の抗体単独投与の報告では、抗体投与可能な患者１１名のうち１名に部分反応が認められた。また、後者の抗体と化学療法との併用試験を行った報告では、抗体投与可能な患者１２名のうち３名に部分反応、１名に混合反応が認められた。近年、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社より開発が進められているアバスチン（ベバシズマブ；ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体）でさえも、フェーズＩ臨床試験において、標準化学療法との併用で１２名中１名の部分反応を示したという報告がある（Ｍａｒｇｏｌｉｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００１）１９，８５１−８５６）。このことからも、抗体単独投与で１１名中１名に部分反応が認められたことは、大腸癌において高い抗腫瘍効果を示すことが期待される。
しかしながら、上記のようにフェーズＩ臨床試験において非常に高い腫瘍反応をヒト化Ａ３３抗体は示したが、両試験とも５０％以上の高い確率でヒト抗ヒト化抗体（すなわち「ＨＡＨＡ」）が産生された。興味深いことに、腫瘍反応性の高かった患者に関しては、ＨＡＨＡが認められなかった。
【特許文献１】米国特許第５９５８４１２号明細書
【特許文献２】米国特許第５６４３５５０号明細書
【特許文献３】米国特許第５１６０７２３号明細書
【非特許文献１】Ｋｉｎｇ  Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９５）７２，１３６４−１３７２
【非特許文献２】Ｗｅｌｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９４），１２，１５６１−１５７１
【非特許文献３】Ｗｅｌｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９６），１４，１７８７−１７９７
【非特許文献４】Ｗｅｌｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００３），９，１３３８−１３４６
【非特許文献５】Ｗｅｌｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００３），９，１３４７−１３５３
【非特許文献６】Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ  Ｐ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９６），９，４６５−４７１
【発明の開示】
本発明の目的は、Ａ３３に結合でき、かつＡ３３を発現する腫瘍細胞をＡＤＣＣやＣＤＣによる免疫システムを用いて特異的に攻撃し、さらにＨＡＨＡの産生されない抗体を開発することにより現在治療困難な固形腫瘍をはじめとした各種悪性腫瘍の予防又は治療剤を提供することにある。
上述のように、Ａ３３抗原を標的とした抗体は、抗腫瘍剤として適用するのに適切であると考えられる。しかも、ＨＡＨＡの産生されない抗体であれば、さらに高い抗腫瘍効果が得られる可能性がある。そこで、本発明者らは、Ａ３３に対する抗体の作製に関して鋭意研究した結果、Ａ３３を発現する癌細胞に対して抗腫瘍効果を示すモノクローナル抗体の取得に成功し、さらに該モノクローナル抗体の可変領域の配列を特定し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
本発明は、その第１の態様において、マウス−マウスハイブリドーマにより産生されるＡ３３と結合するモノクローナル抗体、例えば２６３Ａ１７、１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ又は１２５Ｒ５ＡＡＡＡにより産生される好ましくはヒト抗体であるモノクローナル抗体又はその機能的断片を提供する。２６３Ａ１７、１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ又は１２５Ｒ５ＡＡＡＡにより産生されるモノクローナル抗体のタイプはヒトイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）型である。上述ハイブリドーマのうち１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ又は１２５Ｒ５ＡＡＡＡは、２００４年８月２４日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれ順番に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０７（識別のための表示：Ｍ１０）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０６（識別のための表示：Ｍ１６５）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０８（識別のための表示：Ｍ９６）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０９（識別のための表示：Ｎ２６）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０４（識別のための表示：Ｑ４７）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０５（識別のための表示：Ｑ５４）およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０３（識別のための表示：Ｒ５）として寄託されている。
本発明の実施形態において、本発明の抗体は上記ハイブリドーマが産生する抗体の可変領域を有する、抗体又はその機能的断片である。
本発明の別の実施形態において、本発明の抗体はサブクラスが改変された抗体も含み、ハイブリドーマ２６３Ａ１７が産生する抗体であってサブクラスがヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３若しくはヒトＩｇＧ４である抗体若しくはその機能的断片、ハイブリドーマ１２５Ｍ１０ＡＡが産生する抗体であってサブクラスがヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３若しくはヒトＩｇＧ４である抗体若しくはその機能的断片、ハイブリドーマ１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡが産生する抗体であってサブクラスがヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３若しくはヒトＩｇＧ４である抗体若しくはその機能断片、ハイブリドーマ１２５Ｍ９６ＡＢＡが産生する抗体であってサブクラスがヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３若しくはヒトＩｇＧ４である抗体若しくはその機能的断片、ハイブリドーマ１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡが産生する抗体であってサブクラスがヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３若しくはヒトＩｇＧ４である抗体若しくはその機能的断片、ハイブリドーマ１２５Ｑ４７ＢＡが産生する抗体であってサブクラスがヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３若しくはヒトＩｇＧ４である抗体若しくはその機能的断片、ハイブリドーマ１２５Ｑ５４ＡＡＡＡが産生する抗体であってサブクラスがヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３若しくはヒトＩｇＧ４である抗体若しくはその機能的断片、またはハイブリドーマ１２５Ｒ５ＡＡＡＡが産生する抗体であってサブクラスがヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３若しくはヒトＩｇＧ４である抗体若しくはその機能的断片である。
また、本発明の別の態様において、本発明はハイブリドーマ２６３Ａ１７、１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ又は１２５Ｒ５ＡＡＡＡが産生する抗体の可変領域を含む、Ａ３３と結合する抗体又はその機能的断片を提供する。
本発明の実施形態において、本発明の抗体は配列番号２３及び２５に示されるアミノ酸配列の可変領域を有する抗体又はその機能的断片である。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体は配列番号２７及び２９に示されるアミノ酸配列の可変領域を有する抗体又はその機能的断片である。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体は配列番号３１及び３３に示されるアミノ酸配列の可変領域を有する抗体又はその機能的断片である。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体は配列番号３５及び３７に示されるアミノ酸配列の可変領域を有する抗体又はその機能的断片である。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体は配列番号３９及び４１に示されるアミノ酸配列の可変領域を有する抗体又はその機能的断片である。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体は配列番号４３及び４５に示されるアミノ酸配列の可変領域を有する抗体又はその機能的断片である。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体は配列番号４７及び４９に示されるアミノ酸配列の可変領域を有する抗体又はその機能的断片である。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体は配列番号５１及び５３に示されるアミノ酸配列の可変領域を有する抗体又はその機能的断片である。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体は配列番号８７および８９に示されるアミノ酸配列の全領域を有する抗体又はその機能的断片である。
本発明はさらに、別の態様において、上記の抗体又はその機能的断片であって、腫瘍（例えばヌードマウスに移植された大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５細胞に由来するもの）の増殖を抑制する抗体又はその機能的断片を提供する。腫瘍の抑制の際、腫瘍を担持する被検動物（例えば結腸癌細胞担癌マウスモデル等の担癌実験動物、体重２０ｇとする）に本発明の抗体又はその機能的断片を投与する量は、１０μｇ／ｂｏｄｙ〜１００μｇ／ｂｏｄｙである。例えば、投与量として１００μｇ／ｂｏｄｙ又は５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０μｇ／ｂｏｄｙ又は０．５ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
本発明の実施形態において、本発明の抗体は下記のいずれかの特性を有する。
（ａ）  ＡＤＣＣ試験
正常ヒト末梢血由来単核球存在下において、Ａ３３を発現したヒト癌細胞に対して抗体依存的細胞性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を示す。
（ｂ）  ＣＤＣ試験
ヒト血清由来補体存在下において、Ａ３３を発現したヒト癌細胞に対して補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を示す。
（ｃ）  Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
Ａ３３を発現したヒト癌細胞を担持した非ヒト動物に対して抗腫瘍効果を示す。
（ｄ）  競合試験
キメラ抗Ａ３３（ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ−８７７９が産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から成る）と（ｉ）強く競合する（ブロッカー）、（ｉｉ）弱く競合する（パーシャルブロッカー）、あるいは（ｉｉｉ）競合しない（ノンブロッカー）。
（ｅ）  免疫組織化学試験
ヒト成人結腸癌組織、ヒト成人正常結腸組織およびヒト正常小腸組織を染色する。
本発明はさらに、別の態様において、ハイブリドーマ１２５Ｍ１０ＡＡ（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０７）、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０６）、１２５Ｍ９６ＡＢＡ（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０８）、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０９）、１２５Ｑ４７ＢＡ（受託番号ＦＢＲＭ  ＢＰ−１０１０４）、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０５）及びハイブリドーマ１２５Ｒ５ＡＡＡＡ（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０３）からなる群から選択されるハイブリドーマの保有する抗体をコードする核酸又は該抗体の機能的断片をコードする核酸、該核酸によりコードされるタンパク質、前記核酸を有する発現ベクター、該発現ベクターを有する大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び植物細胞並びに哺乳動物からなる群から選ばれる宿主を提供する。
本発明はさらに、別の態様において、ハイブリドーマ２６３Ａ１７、１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ及びハイブリドーマ１２５Ｒ５ＡＡＡＡからなる群から選択されるハイブリドーマから抗Ａ３３モノクローナル抗体をコードする遺伝子、例えば重鎖アミノ酸配列の可変領域をコードする遺伝子および軽鎖アミノ酸配列の可変領域をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を有する発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して、該宿主を培養し、該モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清又は宿主の分泌物等の培養物から抗Ａ３３モノクローナル抗体またはその機能的断片を採取することを含む、抗Ａ３３モノクローナル抗体またはその機能的断片の製造方法を提供する。
本発明はさらに、別の態様において、上記抗体又はその機能的断片を有効成分として含有する、腫瘍の予防、治療又は診断剤を提供する。
予防又は治療可能な腫瘍として、大腸癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、黒色腫、腎細胞癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、前立腺癌、睾丸癌、中皮癌からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。
本発明のさらに別の実施形態において、本発明の抗体又はその機能的断片は、ＣＯＬＯ２０５細胞が移植された担癌ヌードマウスにおいて、腫瘍移植後に前記抗体又はその機能的断片の投与量１０または１００μｇ／ｋｇでＶｅｈｉｃｌｅ投与群または抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１抗体投与群と比べて有意に腫瘍の抑制が認められることを特徴とする。
本発明は、さらにハイブリドーマＭ１０（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０７）により産生される抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識するＡ３３に結合する抗体、ハイブリドーマＭ９６（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０８）により産生される抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識するＡ３３に結合する抗体、ハイブリドーマＭ１６５（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０６）により産生される抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識するＡ３３に結合する抗体、ハイブリドーマＮ２６（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０９）により産生される抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識するＡ３３に結合する抗体、ハイブリドーマＱ４７（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０４）により産生される抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識するＡ３３に結合する抗体、ハイブリドーマＱ５４（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０５）により産生される抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識するＡ３３に結合する抗体、およびハイブリドーマＲ５（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０３）により産生される抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識するＡ３３に結合する抗体である。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−２５９０９０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１Ａは、各モノクローナル精製抗体を用いて、ＣＯＬＯ２０５細胞を標的としたときのＡＤＣＣ活性を示す図である。
図１Ｂは、各モノクローナル精製抗体を用いて、ＣＯＬＯ２０５細胞を標的としたときのＣＤＣ活性を示す図である。
図１Ｃは、各モノクローナル精製抗体を用いて、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞を標的としたときのＡＤＣＣ活性を示す図である。
図１Ｄは、各モノクローナル精製抗体を用いて、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞を標的としたときのＣＤＣ活性を示す図である。
図２Ａは、組換え型抗体を用いて、ＣＯＬＯ２０５細胞を標的としたときのＡＤＣＣ活性を示す図である。
図２Ｂは、組換え型抗体を用いて、ＣＯＬＯ２０５細胞を標的としたときのＣＤＣ活性を示す図である。
図２Ｃは、組換え型抗体を用いて、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞を標的としたときのＡＤＣＣ活性を示す図である。
図２Ｄは、組換え型抗体を用いて、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞を標的としたときのＣＤＣ活性を示す図である。
図３Ａは、精製抗体及び組換え型抗体によるウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図３Ｂは、精製抗体及び組換え型抗体によるウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図４は、精製抗体及び組換え型抗体によるヒト結腸癌組織の免疫組織染色の結果を示す写真である。
図５は、精製抗体及び組換え型抗体によるヒト正常小腸組織の免疫組織染色の結果を示す写真である。
図６は、精製抗体及び組換え型抗体によるヒト正常結腸組織の免疫組織染色の結果を示す写真である。
図７Ａは、ＣＯＬＯ２０５細胞を移植したときのマウス担癌モデルに対する組換え型抗体ｃＡ３３およびｒｅｃ２６３の抗腫瘍効果を示す図である。
図７Ｂは、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞を移植したときのマウス担癌モデルに対する組換え型抗体ｃＡ３３およびｒｅｃ２６３の抗腫瘍効果を示す図である。
図７Ｃは、ＣＯＬＯ２０５細胞を移植したときのマウス担癌モデルに対するハイブリドーマ精製抗体１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡおよび１２５Ｍ９６ＡＢＡの抗腫瘍効果を示す図である。
図７Ｄは、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞を移植したときのマウス担癌モデルに対する組換え型抗体ｒｅｃＮ２６およびｒｅｃＭ１６５の抗腫瘍効果を示す図である。
図７Ｅは、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞をマトリジェルと共に移植したときのマウス担癌モデルに対する組換え型抗体ｒｅｃＮ２６およびｒｅｃＭ１６５の抗腫瘍効果を示す図である。
図７Ｆは、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞をマトリジェルと共に移植したときのマウス担癌モデルに対する組換え型抗体ｒｅｃＭ１０およびｒｅｃＱ５４の抗腫瘍効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
Ａ３３について、すでにマウス抗Ａ３３抗体及びヒト化抗Ａ３３抗体が取得されており、マウス抗Ａ３３抗体（Ｗｅｌｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９４），１２，１５６１−１５７１；Ｗｅｌｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９６），１４，１７８７−１７９７参照）あるいはヒト化Ａ３３抗体（Ｗｅｌｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００３），９，１３３８−１３４６；Ｗｅｌｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００３），９，１３４７−１３５３参照）を用いて、結腸癌患者を対象にしたフェーズＩの臨床試験を実施したことも報告されている。しかしながら、非常に高い確率でＨＡＭＡあるいはＨＡＨＡが抗体投与患者に産生されてしまい、その後の臨床試験には至っていない。一方、非常に興味深いことに、ヒト化抗Ａ３３抗体の臨床試験で腫瘍反応性が認められた患者は、ＨＡＨＡの産生が認められなかった。
本発明の新規ヒト抗Ａ３３モノクローナル抗体は完全ヒト抗体であり、マウス抗体あるいはヒト化抗体で常に問題となるマウスの配列からなる部分に対する抗原性については、すでに回避されている。すなわち、上述した臨床試験の報告ではヒト化抗体を用いたためＨＡＨＡが産生されたが、本発明の新規ヒト抗Ａ３３モノクローナル抗体は完全ヒト抗体であるため、抗体の抗原性が回避され、ＨＡＨＡが産生されないので、結腸癌患者に対して、高い抗腫瘍効果が期待できる。
該抗体のクラスとしてはイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、同Ａ（ＩｇＡ）、同Ｅ（ＩｇＥ）および同Ｍ（ＩｇＭ）が用いられるが、好ましくはＩｇＧである。更にＩｇＧのサブクラスとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が用いられるが、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４であり、更に好ましくはＩｇＧ１である。
以下、本発明で用いる語句の意味を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
１．Ａ３３及びその抗体
本発明の抗体は、クラスＩの細胞膜タンパクでＩｇスーパーファミリーのひとつであるＡ３３に対する抗体である。
本発明における「Ａ３３と結合する抗体」とは、Ａ３３又はその一部に反応性を有する抗体、またはＡ３３またはその一部を認識する抗体である。「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を１つ以上保持するものを意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及びこれらの重合体等が挙げられる［Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８  Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ］。あるいは、「機能的断片」は、抗体の断片であって抗原と結合しうる断片である。
本発明で「ヒト抗体」とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意味する。ヒト抗体は、後述のようにヒト抗体遺伝子座を導入し、ヒト由来抗体を産生する能力を有するトランスジェニック動物に抗原を投与することにより得ることができる。該トランスジェニック動物としてマウスが挙げられ、ヒト抗体を産生し得るマウスの作出方法は、例えば、国際公開ＷＯ０２／４３４７８号公報に記載されている。
本発明の抗体としては、例えば、後述の実施例に記載される、Ａ３３を発現する癌細胞に対して低濃度で抗腫瘍効果を示す各種の抗体、を挙げることができる。
本発明の抗体には、抗体を構成する重鎖及び／又は軽鎖の各々のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は軽鎖からなるモノクローナル抗体も包含される。本発明の抗体のアミノ酸配列中に、前記のようなアミノ酸の部分的改変（欠失、置換、挿入、付加）は、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより導入することができる。この塩基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて定法により導入することができる［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１９８４  Ｖｏｌ８１：５６６２］。ここで、抗体とは、イムノグロブリンを構成する重鎖可変領域及び重鎖定常領域、並びに軽鎖の可変領域及び軽鎖の定常領域を含む全ての領域が、イムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。
本発明の抗体は、いずれのイムノグロブリンクラス及びアイソタイプを有する抗体をも包含する。
本発明の抗Ａ３３抗体は、下記のような製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、Ａ３３、その一部又はその一部と抗原の抗原性を高めるための適当なキャリア物質（例えば、牛血清アルブミン等）との結合物を、必要に応じて免疫賦活剤（フロインドの完全又は不完全アジュバント等）とともに、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスなどの非ヒト哺乳動物に免疫する。Ａ３３は、天然のＡ３３もリコンビナントＡ３３も用いることもできる。あるいは、Ａ３３をコードする遺伝子を導入し、Ａ３３を細胞表面に過剰に発現している動物細胞を投与することにより、免疫感作を行うことができる。モノクローナル抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって取得することができる。
本発明の抗体は、当業者に周知である遺伝子工学的改変（例えば、欧州特許ＥＰ３１４１６１公報を参照のこと）により異なるサブクラスのものに変換されたものも包含する。すなわち、本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法を用いて元のサブクラスとは異なるサブクラスの抗体を得ることができる。ＡＤＣＣは、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＮＫ細胞、好中球などの表面に発現しているＦｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒを介して、抗体の定常領域と結合することにより細胞を認識し、認識した細胞が活性化することにより誘導される、細胞障害活性のことを言う。一方、ＣＤＣは抗体が抗原と結合することによって、活性化された補体系によって引き起こされる細胞障害活性のことを言う。これらの活性は、抗体のサブクラスによって、その活性の強弱が異なることが解っており、それは、抗体の定常領域の構造の違いに起因することがわかっている（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ．ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．）。例えば、本発明の抗体のサブクラスをＩｇＧ２又はＩｇＧ４に変換することにより、Ｆｃレセプターに対する結合度の低い抗体を取得することができる。逆に、本件発明の抗体のサブクラスをＩｇＧ１又はＩｇＧ３に変換することにより、Ｆｃレセプターに対する結合度の高い抗体を取得することができる。さらに、本発明の抗体の定常領域のアミノ酸配列を遺伝子工学的に改変すること、あるいはそのような配列を有する定常領域配列と結合することにより、Ｆｃレセプターに対する結合度を変化させること（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ．Ｊｒ．ａｎｄ  Ｔｒａｖｅｒｓ  Ｐ．（１９９７），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｈｕｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．参照）、あるいは補体に対する結合度を変化させること（Ｍｉ−Ｈｕａ  Ｔａｏ，ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ参照）は可能である。例えば、重鎖定常部分のＥＵナンバリングシステム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）における３３１番目のプロリン（Ｐ）をコードする配列ＣＣＣをセリン（Ｓ）をコードするＴＣＣに変異させプロリンをセリンに置換することにより補体に対する結合度を変化させることができる。仮に抗癌剤について考えた場合、抗体単独で細胞死誘導活性がない場合は、Ｆｃレセプターを介した抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）による抗腫瘍活性を有する抗体が望ましいが、抗体単独で細胞死誘導活性がある場合はＦｃレセプターとの結合度が低い抗体がより望ましい場合もある。また免疫抑制剤について考えた場合、Ｔ細胞と抗原提示細胞の結合のみを立体的に阻害する場合などＡＤＣＣ活性或いはＣＤＣ活性を有さない抗体が望ましい。また、ＡＤＣＣ活性或いはＣＤＣ活性が毒性の原因となりうる場合、毒性の原因となる活性をＦｃ部分の変異あるいはサブクラスを変更することにより回避した抗体が望ましい場合もある。
本発明において、モノクローナル抗体の製造にあたっては、下記の作業工程を包含する。すなわち、（１）免疫原として使用する、生体高分子の精製及び／又は抗原タンパク質を細胞表面に過剰に発現している細胞の作製、（２）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓等の摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、（３）骨髄腫細胞（ミエローマ）の調製、（４）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、（５）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、（６）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、（７）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、（８）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性及びその認識特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
Ａ３３には、多型が存在するが、本発明の抗体は、現在知られている全てのＡ３３多型を認識して結合するので、患者の有するＡ３３の型の違いにかかわらず、本発明の抗体を含む治療・予防剤は有効に作用する。
以下、抗Ａ３３モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
（１）  抗原の精製
抗原としては、Ａ３３をコードするＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに組み込み、該発現ベクターを動物細胞に導入し、取得した形質転換株そのものを使用できる。因みに、Ａ３３のタンパク質の一次構造は公知である［ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００５３０５、配列番号１２］ので、当業者に周知の方法により、Ａ３３のアミノ酸配列からペプチドを化学合成し、これを抗原として使用することもできる。
また、免疫原としては、Ａ３３の全長をＦＭ３Ａ細胞又はＬ９２９細胞に導入し、細胞表面にＡ３３を過剰に発現している細胞も有効である。ｐΔＥＧＦＰ−Ｎ１−Ａ３３は、Ａ３３タンパク質をコードするＤＮＡを、動物細胞用発現ベクターｐΔＥＧＦＰ−Ｎ１（改変ｐＥＧＦＰ−Ｎ１［ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス・クロンテック社製］のＥＧＦＰタンパク質をコードしている領域を削除した）に組み込むことにより作製できる。ただし、Ａ３３をコードするＤＮＡ、ベクター、宿主等はこれらに限定されない。
具体的には、ｐΔＥＧＦＰ−Ｎ１−Ａ３３でＦＭ３Ａ細胞又はＬ９２９細胞を形質転換して得られた形質転換株を培養し、ｐΔＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターが挿入された細胞に獲得されるネオマイシン耐性の形質及びマウスＡ３３抗体（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ−８７７９）を用いたＡ３３発現の確認とを指標に、Ａ３３をその細胞表面に過剰に発現しているＦＭ３Ａ細胞又はＬ９２９細胞を作製することができる。
（２）抗体産生細胞の調製工程
（１）で得られた抗原と、フロインドの完全若しくは不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、ヒト由来の抗体を産生する能力を有するトランスジェニックマウスが最も好適に用いられるが、そのようなマウスは富塚らの文献［Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，２０００  Ｖｏｌ  ９７：７２２］に記載されている。
マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射、足蹠注射などいずれでもよいが、腹腔内注射、足蹠注射又は静脈内注射が好ましい。
免疫は、一回、又は、適当な間隔で（好ましくは２週間から４週間間隔で）複数回繰返し行うことができる。その後、免疫した動物の血清中の抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効果を高めることができる。一般的には、最終免疫後３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を、後の細胞融合に用いることが好ましい。
ここで用いられる抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法（以下、「ＲＩＡ法」という）、固相酵素免疫定量法（以下、「ＥＬＩＳＡ法」という）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、及び操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法がより好適である。
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、ヒト抗体に対する抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により覆い、該表面を洗浄後、一次抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗Ａ３３抗体を結合させる。さらに二次抗体として酵素標識されたヒト抗体に対する抗体を加えてヒト抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
（３）ミエローマの調製工程
ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることが出来るが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７（１９７８）］、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）［Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９（１９７６）］、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）［Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８−１５５０（１９７９）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｈｏｒｉｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）］などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン及びウシ胎児血清（以下、「ＦＣＳ」という）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地に８−アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下、「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下、「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地（例えば、１０％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地）で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
（４）細胞融合
抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾臓、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。次いで、脾細胞とミエローマを融合させればよい。この脾細胞と工程（３）で得られたミエローマを融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単な、ポリエチレングリコールを用いる方法である。この方法は、例えば以下の手順よりなる。
脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）、又はリン酸緩衝生理食塩液（以下、「ＰＢＳ」という）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が５：１〜１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（以下「ＨＡＴ」という）液及びヒトインターロイキン−６（以下、「ＩＬ−６」という）を含む正常培地（以下、「ＨＡＴ培地」という）中に懸濁して培養用プレート（以下、「プレート」という）の各ウェルに分注し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
（５）ハイブリドーマ群の選択
上記ミエローマ細胞が、８−アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、及びミエローマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あるいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、抗体産生細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細胞であるハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを選択することができる。
コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（以下、「ＨＴ培地」という）への培地交換を行う。以後、培養上清の一部を採取し、例えば、ＥＬＩＳＡ法により抗Ａ３３抗体価を測定する。ただし、ＥＬＩＳＡ用の抗原として上記融合タンパク質を用いる場合は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合する抗体を産生するクローンを選択しないように、該クローンを除外する操作が必要である。そのようなクローンの有無は、例えばヒトＩｇＧのＦｃ領域を抗原としたＥＬＩＳＡ等により確認することができる。
以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、その他の細胞株もハイブリドーマの選択方法に応じて使用することができ、その場合使用する培地組成も変化する。
（６）クローニング工程
（２）の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個づつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡便であり、よく用いられる。
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗Ａ３３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
なお、本発明のヒト抗Ａ３３モノクローナル抗体の産生細胞であるマウス−マウスハイブリドーマ１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ又は１２５Ｒ５ＡＡＡＡは、平成１６年８月２４日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれ順番に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０７（識別のための表示：Ｍ１０）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０６（識別のための表示：Ｍ１６５）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０８（識別のための表示：Ｍ９６）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０９（識別のための表示：Ｎ２６）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０４（識別のための表示：Ｑ４７）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０５（識別のための表示：Ｑ５４）およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０３（識別のための表示：Ｒ５）として寄託されている。
（７）ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、スピナー培養、あるいはホローファイバーシステム等を用いた培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲルろ過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、抗Ａ３３モノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えばＢＡＬＢ／ｃ）若しくはｎｕ／ｎｕマウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等の腹腔内で該ハイブリドーマを増殖させることにより、抗Ａ３３モノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ  ＧＩＩキット；アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を利用することもできる。
かくして得られるモノクローナル抗体は、Ａ３３に対して高い抗原特異性を有する。
（８）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、又はＲＩＡ法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。
さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍＬ］より算出する方法等により行うことができる。
モノクローナル抗体の認識エピトープの同定は以下のようにして行うことができる。まず、モノクローナル抗体の認識する分子の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いてその分子の様々な部分ペプチドを作成する方法、遺伝子組換え技術を用いて目的の部分ペプチドをコードするＤＮＡ配列を好適な発現プラスミドに組み込み、大腸菌等の宿主内外で生産する方法等があるが、上記目的のためには両者を組み合わせて用いるのが一般的である。例えば、抗原タンパク質のＣ末端又はＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製した後、それらに対するモノクローナル抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定する。
その後、さらに細かく、その対応部分のオリゴペプチド、又は該ペプチドの変異体等を、当業者に周知のオリゴペプチド合成技術を用いて種々合成し、本発明の予防又は治療剤が有効成分として含有するモノクローナル抗体のそれらペプチドに対する結合性を調べるか、又は該モノクローナル抗体と抗原との結合に対するペプチドの競合阻害活性を調べることによりエピトープを限定する。多種のオリゴペプチドを得るための簡便な方法として、市販のキット（例えば、ＳＰＯＴｓキット（ジェノシス・バイオテクノロジーズ社製）、マルチピン合成法を用いた一連のマルチピン・ペプチド合成キット（カイロン社製）等）を利用することもできる。
又、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えば哺乳類細胞細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を調製することもできる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ，Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ）。
本発明は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマが保有する抗体の遺伝子配列を含む核酸、特に後述の本発明のハイブリドーマの産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の核酸も包含する。ここで、核酸にはＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。
ハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子を調製するには、モノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域、Ｌ鎖Ｃ領域、Ｈ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｃ領域をそれぞれコードするＤＮＡをＰＣＲ法等により調製する方法が採用される。プライマーは、抗Ａ３３抗体遺伝子又はアミノ酸配列から設計したオリゴＤＮＡを、鋳型としてはハイブリドーマから調製したＤＮＡを使用することができる。これらのＤＮＡを１つの適当なベクターに組み込み、これを宿主に導入して発現させるか、あるいはこれらのＤＮＡをそれぞれ適当なベクターに組み込み、共発現させる。
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌、枯草菌又は酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージが挙げられる。
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
宿主への遺伝子の導入方法は公知であり、任意の方法（例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等）が挙げられる。また、後述の動物に遺伝子を導入する方法としては、マイクロインジェクション法、ＥＳ細胞にエレクトロポレーションやリポフェクション法を使用して遺伝子を導入する方法、核移植法などが挙げられる。
本発明において、抗Ａ３３抗体は、形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物、（ｃ）形質転換体の分泌物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培養するには、使用する宿主に適した培地を用い、静置培養法、ローラーボトルによる培養法などが採用される。
培養後、目的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより抗体を採取する。また、目的抗体が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる各種クロマトグラフィーを用いた一般的な生化学的方法を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的の抗体を単離精製することができる。
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて、目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれた動物宿主、例えばトランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、トランスジェニックヒツジ又はトランスジェニックブタを作製し、そのトランスジェニック動物から分泌されるミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，８３０−８３４）。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地、あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
（９）  抗体の性質
本発明の抗体は下記のいずれかの特性を有する。
（ａ）  ＡＤＣＣ試験
正常ヒト末梢血由来単核球存在下において、Ａ３３を発現したヒト癌細胞に対して抗体依存的細胞性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を示す。
（ｂ）  ＣＤＣ試験
ヒト血清由来補体存在下において、Ａ３３を発現したヒト癌細胞に対して補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を示す。
（ｃ）  Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
Ａ３３を発現したヒト癌細胞を担持した非ヒト動物に対して抗腫瘍効果を示す。
（ｄ）  競合試験
キメラ抗Ａ３３（ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ−８７７９が産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から成る）と（ｉ）強く競合する（ブロッカー）、（ｉｉ）弱く競合する（パーシャルブロッカー）、あるいは（ｉｉｉ）競合しない（ノンブロッカー）。
（ｅ）  免疫組織化学試験
ヒト成人結腸癌組織、ヒト成人正常結腸組織およびヒト正常小腸組織を染色する。
このような抗体として、例えばハイブリドーマ２６３Ａ１７、１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ及びハイブリドーマ１２５Ｒ５ＡＡＡＡの産生する抗体が挙げられ、１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ又は１２５Ｒ５ＡＡＡＡは、２００４年８月２４日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれ順番に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０７（識別のための表示：Ｍ１０）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０６（識別のための表示：Ｍ１６５）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０８（識別のための表示：Ｍ９６）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０９（識別のための表示：Ｎ２６）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０４（識別のための表示：Ｑ４７）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０５（識別のための表示：Ｑ５４）およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０３（識別のための表示：Ｒ５）として寄託されている。
２．医薬組成物
本発明のヒト抗Ａ３３抗体を含有する製剤もまた、本発明の範囲内に含まれる。このような製剤は、好ましくは、抗体に加えて、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを含んでおり、他の抗体又は抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。かかる予防又は治療剤は、種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は、注射剤、点滴剤、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。
その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇを皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。
本発明は、本発明の抗体又は医薬組成物を用いた上記疾患の予防又は治療法をも包含し、さらに本発明は本発明の抗体の上記疾患の予防又は治療剤の製造への使用をも包含する。
本発明の抗体またはその機能的断片により予防・治療が可能な腫瘍は、大腸癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、黒色腫、腎細胞癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、前立腺癌、睾丸癌、中皮癌等であり、本発明の抗体を適用する際の腫瘍は１種類に限られず、複数種類の腫瘍が併発したものでもよい。
３．製剤例
本発明の分子は、水又はそれ以外の薬理学的に許容し得る溶液に溶解した無菌性溶液又は懸濁液のアンプルとして使用に供される。また、無菌粉末製剤（本発明の分子を凍結乾燥するのが好ましい）をアンプルに充填しておき、使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈してもよい。
以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がその実施例に記載される態様のみに限定されるものではない。
【実施例】実施例１  マウス抗Ａ３３抗体の調製
ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングや様々な実験に使用するためのポジティブコントロール抗体として、マウス抗Ａ３３抗体の調製を実施した。ＡＴＣＣよりマウス抗Ａ３３抗体を産生するＡＳ３３ハイブリドーマ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｎｏ．ＨＢ−８７７９）を購入し、ＡＴＣＣの付属説明書に従い、ハイブリドーマを培養した。このハイブリドーマを凍結保存した。その後、ＡＳ３３  ハイブリドーマを１０％  Ｌｏｗ  ＩｇＧ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ハイクローン社製）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）に馴化した。この馴化したハイブリドーマを凍結保存した。次に、その一部を抗体精製を目的として、ウシインシュリン（５μｇ／ｍｌ、ギブコ・ビーアールエル社製）、ヒトトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ、ギブコ・ビーアールエル社製）、エタノールアミン（０．０１ｍＭ、シグマ社製）、亜セレン酸ナトリウム（２．５×１０−５ｍＭ、シグマ社製）、１％  Ｌｏｗ  ＩｇＧ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ハイクローン社製）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）に馴化した。フラスコにて培養し、培養上清を回収した。回収した上清中のハイブリドーマ由来精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬを１．４ＯＤとして算出した。
実施例２  キメラ抗Ａ３３抗体の調製
ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングや様々な実験に使用するためのポジティブコントロール抗体として、重鎖及び軽鎖の定常領域がヒトＩｇＧ１であるキメラ抗Ａ３３抗体の調製を実施した。
（１）キメラ抗Ａ３３抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニングと発現ベクター作製
実施例１で購入したマウス抗Ａ３３抗体産生ハイブリドーマＡＳ３３を１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ハイクローン社製）含有ＤＭＥＭ培地（ギブコ・ビーアールエル社製）で培養し、ＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてプロトコールに従い、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。次に、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡよりＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（タカラバイオ社製）によりｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを精製した。得られたｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（２．５μｇ）を材料としてＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス・クロンテック社）を用いて、その添付の説明書に従ってクローニング実験を実施して、抗体遺伝子の可変領域のｃＤＮＡを取得した。
１）１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（２．５μｇ）／３μｌ
５’−ＣＤＳ  ｐｒｉｍｅｒ  １μｌ
ＳＭＡＲＴ  ＩＩ  Ａ  ｏｌｉｇｏ  １μｌ
上記組成の反応液を７０℃で２分間インキュベートした後、下記の試薬及び酵素を加え４２℃で１．５時間インキュベートしてｃＤＮＡの合成を行なった。
５Ｘ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ
ＤＴＴ（２０ｍＭ）１μｌ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（１０ｍＭ）１μｌ
ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １μｌ
反応終了後、１００μｌのＴｒｉｃｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて７２℃で７分間インキュベートした。
２）ＰＣＲによる重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の増幅
得られたｃＤＮＡを鋳型として、マウス抗Ａ３３抗体の重鎖（以下、重鎖はＨ鎖とも称す）可変領域、および軽鎖（以下、軽鎖はＬ鎖とも称す）可変領域ＤＮＡの３’末端各々に特異的なＰＣＲ用プライマー（Ｈ鎖用：ＧＰＡＨｖＲ３Ｎｈｅ（５’−ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＣＣ  ＴＴＧ−３’）（配列番号１））、Ｌ鎖用：ＧＰＡＬｖＲ３Ｂｓｉ、（５’−ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＴＧ−３’）（配列番号２））のいずれか一方と、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ付属のＵＰＭプライマー（合成したｃＤＮＡの５’末端に作製される共通配列に相補的なオリゴヌクレオチド）をプライマーセットとして使用し、ＰＣＲによるＨ鎖リーダ配列と可変領域（以下、ＨＶとも称す）及びＬ鎖リーダ配列と可変領域（以下、ＬＶとも称す）の増幅を行った。ｃＤＮＡの増幅は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（トーヨーボー社製）を用いて下記の反応液を調製して実施した。
ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｈ２Ｏ                                          ２９．５μｌ
ｃＤＮＡ                                                          ２．５μｌ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（１０Ｘ）                              ５μｌ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（２ｍＭ）                                            ４μｌ
ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）                                                ２μｌ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ（１ｕｎｉｔ／μｌ）    １μｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  ｍｉｘ（ＵＰＭ）（１０Ｘ）      ５μｌ
Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ（ＧＳＰ）                  １μｌ
Ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ                                            ５０μｌ
サーマルサイクリングの増幅反応条件は下記のとおりで実施した。
５  ｃｙｃｌｅｓ：
９４℃  ３０ｓｅｃ
７２℃  １ｍｉｎ
５  ｃｙｃｌｅｓ：
９４℃  ３０ｓｅｃ
７０℃  ３０ｓｅｃ
７２℃  １ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ
９４℃  ３０ｓｅｃ
６８℃  ３０ｓｅｃ
７２℃  １ｍｉｎ
増幅したＰＣＲ断片は、エタノール沈殿で回収した後、アガロースゲル電気泳動で回収し、メンブランを用いるＤＮＡ精製キットであるＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製した。精製したＨＶ及びＬＶの増幅断片は、それぞれＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）のＰＣＲ  ４  Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングを行い、得られたクローンのプラスミドＤＮＡについてインサートＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列決定のためにプライマーとして、Ｍ１３ＦＷ（５’−ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＧ−３’）（配列番号３）及びＭ１３ＲＶ（５’−ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＣ−３’）（配列番号４）を用いた。決定したＨＶ及びＬＶの遺伝子領域中にコードされる抗体のアミノ酸配列は、Ｋｉｎｇ  Ｄ．Ｊ．らの報告しているマウス抗Ａ３３抗体（Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９５  Ｄｅｃ；７２（６）：１３６４−７２）可変領域のアミノ酸配列と完全に一致した。
３）キメラ抗Ａ３３抗体の発現ベクター（Ｎ５ＫＧ１＿ｍＶｈＣＡ３３）の作製
取得した抗体のＨＶ鎖を含むプラスミドＤＮＡを鋳型として、末端に連結のための制限酵素部位を付加するようにデザインしたプライマー（増幅のためのプライマーセットＧＰＡＨｖ２Ｆ５Ｓａｌ（５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＡＧＴ  Ｔ−３’）（配列番号５）及びプライマーＧＰＡＨｖＲ３Ｎｈｅ（配列番号１））を用いて、マウス抗Ａ３３抗体のＨＶをＰＣＲで増幅（９４℃３分→９４℃１０秒、６８℃４５秒（３５サイクル）→７２℃７分）した。ＨＶの増幅断片は精製した後、ＰＣＲ  ４  Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターでサブクローニングを行った。サブクローンについて挿入部分のＤＮＡ塩基配列解析を行い、鋳型とした遺伝子配列と相違がないデザインどおりの配列を有するプラスミドＤＮＡを選択した。そのプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩとＮｈｅＩで消化して、アガロースゲル電気泳動で約４４０ｂｐのＤＮＡを回収し精製した。他方、ベクターであるＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ  Ｌａｒｋ（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎ５ＫＧ１（ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ６００１３５８）の改変ベクター）については同様に制限酵素ＳａｌＩとＮｈｅＩで処理を行った後、脱リン酸化処理としてＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５）（タカラバイオ社製）にて処理した後に、アガロースゲル電気泳動とＤＮＡ精製キットで約８．９ｋｂのＤＮＡを回収した。これら２つの断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ２．１（タカラバイオ社製）にてライゲーション反応した後、大腸菌ＤＨ５αへ導入して形質転換体を得た。形質転換体をスクリーニングして目的とするＨＶが挿入されたクローン、Ｎ５ＫＧ１＿ＧＰＡ３３Ｈｖ（クローン＃２）を選択した。こうして得られたＮ５ＫＧ１＿ＧＰＡ３３ＨｖにＬＶを挿入するため、本プラスミドＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩ、及び、ＢｓｉＷＩで順次切断し、さらに脱リン酸化を行った後、約９．２ｋｂのベクターＤＮＡを精製した。他方、マウス抗Ａ３３抗体のＬＶを含むプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＬＶ領域をＰＣＲで増幅した。増幅のためのプライマーセットは、ＧＰＡＬｖ２ＦＢｇｌ（５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＡＧ−３’）（配列番号６）及びＧＰＡＬｖＲ３Ｂｓｉ（配列番号２）を用いた。精製したＬＶの増幅断片はＰＣＲ  ４  Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにてサブクローニングを行った。サブクローンについて挿入部分のＤＮＡ塩基配列解析を行い、鋳型とした遺伝子配列と相違がないデザインどおりの配列を有するプラスミドＤＮＡを選択した。そのＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩとＢｓｉＷＩで消化して、アガロースゲル電気泳動で約４００ｂｐのＤＮＡを回収し精製した。このＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩとＢｓｉＷＩ切断処理した前記のＮ５ＫＧ１＿Ａ３３Ｈｖベクター断片にライゲーションして、大腸菌へ導入して形質転換体を得た。形質転換体をスクリーニングして、目的とするＬＶが挿入されたクローン、Ｎ５ＫＧ１＿ＧＰＡ３３ＨｖＬｖ（クローン＃２）を選択した。最終的に得られたキメラ抗Ａ３３抗体発現プラスミドＤＮＡの大量精製を行い、Ｌ鎖とＨ鎖のＤＮＡ断片挿入断片とその挿入部位周辺のＤＮＡ塩基配列に変異がないことを確認した。
キメラ抗Ａ３３の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
0004088655.tif 000002
0004088655.tif 000003
0004088655.tif 000004
重鎖核酸配列（配列番号７）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は４０８番目のアデニン（Ａ）と４０９番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号８）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１３６番目のセリン（Ｓ）と１３７番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。また、重鎖核酸配列（配列番号７）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は５７番目のチミン（Ｔ）と５８番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号８）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は１９番目のシステイン（Ｃ）と２０番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置する。
以上より、キメラ抗Ａ３３抗体重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号７）は５８番目のグアニン（Ｇ）から４０８番目のアデニン（Ａ）までである。また、重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）は２０番目のグルタミン酸（Ｅ）から１３６番目のセリン（Ｓ）までである。
軽鎖核酸配列（配列番号９）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は３９３番目のアデニン（Ａ）と３９４番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号１０）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１３１番目のリジン（Ｋ）と１３２番目のアルギニン（Ｒ）の間に位置する。また、軽鎖核酸配列（配列番号９）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は７２番目のアデニン（Ａ）と７３番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号１０）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は２４番目のグアニン（Ｇ）と２５番目のアスパラギン酸（Ｄ）の間に位置する。
以上より、キメラ抗Ａ３３抗体軽鎖の可変領域の核酸配列（配列番号９）は７３番目のグアニン（Ｇ）から３９３番目のアデニン（Ａ）までである。また、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）は２５番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１３１番目のリジン（Ｋ）までである。
後述する表５に合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
このように調製されたキメラ抗Ａ３３組換え型抗体発現ベクターを宿主細胞に導入し、組換え型抗体発現細胞を作製した。発現のための宿主細胞には、例えばＣＨＯ細胞のｄｈｆｒ欠損株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、ＣＨＯ−Ｒａｓ（Ｋａｔａｋｕｒａ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１：１０３−１０９，１９９９）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）などが用いられる。
宿主細胞へのベクターの導入はエレクトロポレーションやリポフェクションになどにより実施した。エレクトロポレーションは抗体発現ベクター約２μｇを制限酵素で線状化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｅｒをもちいて３５０Ｖ、５０μＦの条件で、４×１０６個のＣＨＯ細胞に遺伝子を導入し、９６ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅに播種した。リポフェクションは、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  Ｐｌｕｓ（ギブコ・ビーアールエル社製）を用いてマニュアルに従って実施した。ベクターの導入処理後、発現ベクターの選択マーカーに対応した薬剤を添加して培養を継続した。コロニーを確認した後、実施例６に示した方法によって、抗体発現株を選別した。選別した細胞からの抗体精製は、実施例８に従って行った。
実施例３  抗原の調製
免疫原や抗体のスクリーニングなどで使用するＡ３３が細胞膜上に過剰発現している細胞を得るため、Ａ３３全長アミノ酸の発現プラスミドベクターを作製した。Ａ３３をコードするＤＮＡは、ＰＣＲ法により作製した。
ａ）全長Ａ３３発現ベクターの調製
全長Ａ３３発現ベクターを調製するために、Ａ３３をコードするｃＤＮＡを保持するプラスミドベクターｐΔＥＧＦＰ−Ｎ１−ＧＰＡ３３を作製した。ｐΔＥＧＦＰ−Ｎ１−ＧＰＡ３３は以下の方法で作製された。完全長Ａ３３  ＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋＤＮＡ  ＮＭ＿００５８１４：配列番号１１，タンパク質  ＮＰ＿００５３０５：配列番号１２）を、その５’末端にＥｃｏＲＩ配列を、その３’末端にＮｏｔＩ配列と終止コドンを付加する為のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い修飾した。ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス・クロンテック社より購入したＨｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーとしてＡ３３−Ｆ２  ５’−ＧＣＡＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＡＧＡＴ−３’（配列番号１３）及びＡ３３−Ｒ１  ５’−ＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧ−３’（配列番号１４）を合成し、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（トーヨーボー社製）を使用して、（９４℃、１５秒；６０℃、３０秒；６８℃、６０秒間）×３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。合成された配列を、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩで消化し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片として単離し、同一酵素で解裂されていたｐΔＥＧＦＰ−Ｎ１−ベクター（改変ｐＥＧＦＰ−Ｎ１［ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス・クロンテック社製］のＥＧＦＰタンパク質をコードしている領域を削除した）に連結した。得られたプラスミドをｐΔＥＧＦＰ−Ｎ１−ＧＰＡ３３と命名した。ｐΔＥＧＦＰ−Ｎ１−ＧＰＡ３３に組み込まれたＡ３３は、９７７ｂｐのｃＤＮＡがコードされている。以下、実施例中のすべてのＰＣＲの反応温度調節は、ジーンアンプＰＣＲシステム９７００；（株）パーキンエルマー・ジャパン社製を使用した。
ｂ）Ａ３３発現細胞の作製
ａ）で作製したｐΔＥＧＦＰ−Ｎ１−ＧＰＡ３３を、ＦＭ３Ａ細胞（厚生労働省研究資源バンク事業（ＪＣＲＢ）Ｎｏ．０７０１）及びＬ９２９細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１）の２つの細胞株に導入して、２種類のＡ３３発現細胞を作製した。ＦＭ３Ａ細胞には、エレクトロポレーション法を用いた。ｐΔＥＧＦＰ−Ｎ１−Ａ３３ベクター２０μｇを、ＢＴＸ社製エレクトロポレーターをもちいて３５０Ｖ、９５０μＦの条件で、５×１０６個のＦＭ３Ａ細胞に遺伝子を導入し、６ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅに播種した。３７℃、５．０％炭酸ガス下で４８時間培養した後、Ｇ４１８（ギブコ・ビーアールエル社製）を１ｍｇ／ｍＬになるように加え、１週間培養した。細胞膜表面上に発現しているＡ３３抗原の確認は、ＡＳ３３ハイブリドーマ（ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ−８７７９）の培養上清を用いて行った。ＡＳ３３ハイブリドーマ培養上清を一次抗体、Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ標識したヤギ抗マウスＩｇ  ｇａｍｍａ  Ｆ（ａｂ’）２抗体（ダコー社製）を２次抗体として用いたフローサイトメーター（ＦＣＭ：ベクトンディキンソン社製）解析を行い、遺伝子導入された細胞でＧ４１８耐性の形質を獲得したもののうち、細胞膜表面上にＡ３３を発現している細胞を選択的にソーティングした。
Ｌ９２９細胞へは、Ｔｒａｎｓ  ＩＴ−ＬＴ１（タカラバイオ社製）を用いて導入した。遺伝子導入はマニュアルの方法にて行った。３７℃、５．０％炭酸ガス下で２４時間培養した後、Ｇ４１８（ギブコ・ビーアールエル社製）を１ｍｇ／ｍＬになるように加え、１週間培養した。ＦＭ３Ａ細胞のときと同様に、細胞膜表面上に発現しているＡ３３抗原の確認は、ＡＳ３３ハイブリドーマの培養上清を用いて行った。ＡＳ３３ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ−８７７９）を１次抗体、Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ標識したヤギ抗マウスＩｇ  ｇａｍｍａ  Ｆ（ａｂ’）２抗体（ダコー社製）を２次抗体として用いたフローサイトメーター（ＦＣＭ：ベクトンディキンソン社製）解析を行い、遺伝子導入された細胞でＧ４１８耐性の形質を獲得したもののうち、細胞膜表面上にＡ３３を発現している細胞を選択的にソーティングした。
両細胞株ともヒト全長Ａ３３抗原を高発現するシングルクローンが取得できた。Ａ３３抗原タンパク質を高発現したＦＭ３Ａ細胞をＦＭ３Ａ／Ａ３３と、Ｌ９２９細胞をＬ９２９／Ａ３３と命名した。
ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質を免疫原あるいは、抗体をスクリーニングする際のＥＬＩＳＡに使用するために作製した。
ｃ）可溶型細胞膜外Ａ３３ヒトＦｃ融合タンパク質発現ベクターの調製
可溶型細胞膜外Ａ３３ヒトＦｃ融合タンパク質発現ベクター（以下ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃと示す）を調製するために、Ａ３３の細胞膜外領域をコードするｃＤＮＡを保持するプラスミドベクター  ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ−ｈｕｍａｎＦｃ−Ａ３３ＥＸＲを作製した。ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ−ｈｕｍａｎＦｃ−Ａ３３ＥＸＲは以下の方法で作製された。分泌シグナル配列を含む細胞膜外領域Ａ３３ＤＮＡ（配列番号１１）を、その５’末端にＥｃｏＲＩ配列を、その３’末端にＮｏｔＩ配列と終止コドンを付加する為のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い修飾した。ａ）で作製したｐΔＥＧＦＰ−Ｎ１−Ａ３３ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーとしてＡ３３−Ｆ２（配列番号１３）及びＧＰＡ−ＥＸＣＲＲ２  ５’−ＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧ−３’（配列番号１５）を合成し、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（トーヨーボー社製）を使用して、（９４℃、１５秒；６０℃、３０秒；６８℃、６０秒間）×３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。合成された配列を、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩで消化し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片として単離し、同一酵素で解裂されていたｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ−ｈｕｍａｎＦｃベクター（改変ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ［インビトロジェンライフテクノロジーズ社製］のＸｂａ  Ｉ部位とＡｐａ  Ｉ部位のところにＦＬＡＧ及びヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を導入したプラスミド）に連結した得られたプラスミドをｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ−ｈｕｍａｎＦｃ−Ａ３３ＥＸＲと命名した。
ＰＣＲ用プライマー等のオリゴヌクレオチドの合成は、全てＤＮＡ自動合成機（モデル３９４８；（株）パーキンエルマー・ジャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）を用いて、そのマニュアルに従って行った［Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３，３１８５−３１９１参照］。各オリゴヌクレオチドは合成終了後、支持体から開裂させ脱保護を行い、得られた溶液を乾固した後蒸留水に溶解し、使用するまで−２０℃で凍結保存した。
ｄ）  ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質の発現と精製
ｃ）で構築したｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質発現ベクターを宿主細胞に導入し、可溶型細胞膜外Ａ３３タンパク質発現細胞を作製した。発現のための宿主細胞には、例えばＣＨＯ細胞のｄｈｆｒ欠損株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、ＣＨＯ−Ｒａｓ（Ｋａｔａｋｕｒａ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１：１０３−１０９，１９９９）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）などが用いられる。
宿主細胞へのベクターの導入はエレクトロポレーションやリポフェクションになどにより実施した。エレクトロポレーションはｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質発現ベクター約２μｇを制限酵素で線状化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｅｒをもちいて３５０Ｖ、５００μＦの条件で、４×１０６個のＣＨＯ細胞に遺伝子を導入し、９６ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅに播種した。リポフェクションは、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  Ｐｌｕｓ（ギブコ・ビーアールエル社製）を用いてマニュアルに従って実施した。ベクターの導入処理後、発現ベクターの選択マーカーに対応した薬剤を添加して培養を継続した。
培養上清からのｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質の精製は以下の方法で行った。ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質を含む培養上清をＨｉｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、吸着緩衝液としてＰＢＳ、溶出緩衝液として２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ２．７）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）を添加してｐＨ５．５に調製した。調製された可溶型細胞膜外Ａ３３タンパク質溶液は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（アミコン社製）を用いてＰＢＳに置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ミリポア社製）でろ過滅菌し、精製ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質を得た。ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬを１．４ＯＤとして算出した。
実施例４  ヒト抗体産生マウスの作製
免疫に用いたマウスは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、かつ、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を含む１４番染色体断片（ＳＣ２０）及びヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を同時に保持する。このマウスはヒトＩｇ重鎖遺伝子座を持つ系統Ａのマウスと、ヒトＩｇκ鎖トランスジーンを持つ系統Ｂのマウスとの交配により作製された。系統Ａは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウス系統であり、例えば富塚らの報告［Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，２０００  Ｖｏｌ９７：７２２］に記載されている。また、系統Ｂは内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、ヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を保持するマウス系統（トランスジェニックマウス）であり、例えばＦｉｓｈｗｉｌｄらの報告［Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，（１９９６），１１４：８４５］に記載されている。
系統Ａの雄マウスと系統Ｂの雌マウス、あるいは系統Ａの雌マウスと系統Ｂの雄マウスの交配により得られた、血清中にヒトＩｇ重鎖及びκ軽鎖が同時に検出される個体［Ｉｓｈｉｄａ＆Ｌｏｎｂｅｒｇ，ＩＢＣ’ｓ  １１ｔｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２０００］を、以下の免疫実験に用いた。なお、前記ヒト抗体産生マウス（ＫＭマウスと称する）は、契約を結ぶことによって、キリンビール株式会社より入手可能である。
実施例５  Ａ３３に対するヒトモノクローナル抗体の調製
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行１９９１）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。免疫原としてのＡ３３は、実施例１で調製したＡ３３発現ＦＭ３Ａ細胞あるいはｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質を用いた。被免疫動物は、実施例２で作製したヒト免疫グロブリンを産生するヒト抗体産生マウスを用いた。
Ａ３３に対するヒトモノクローナル抗体の調製を目的として、ヒト抗体産生マウスに、実施例３で作製したＡ３３発現ＦＭ３Ａ細胞（１×１０７細胞／匹）を腹腔内にＲＩＢＩアジュバント（コリクサ社製）と混合して初回免疫した。初回免疫から以降、同細胞とＲＩＢＩアジュバントを毎週計８回免疫した。以下に述べる脾臓の取得３日前に、ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質２０μｇ／マウス個体を尾静脈投与及び５μｇ／マウス個体のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６を皮下投与した。
また、ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質１０μｇ／マウス個体をＣｐＧアジュバント（キアゲン社製）と混合して初回免疫した。初回免疫から以降、同タンパク質とＣｐＧアジュバントを２週間毎に２回免疫し、さらに２週間後に同タンパク質のみ免疫した。以下に述べる脾臓の取得３日前に、ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質１０μｇ／マウス個体を尾静脈投与した。
また、ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質１０μｇ／マウス個体とＡ３３発現ＦＭ３Ａ細胞（５×１０６細胞／匹）をＲＩＢＩアジュバントとともに腹腔内に免疫し、２週間毎に１〜４回免疫した。以下に述べる脾臓の取得４日前に、ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質５μｇ／マウス個体を腹腔内投与した。
免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得し、３５０ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、５０単位／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む無血清ＤＭＥＭ培地（ギブコ・ビーアールエル社製）（以下「無血清ＤＭＥＭ培地」という）１０ｍＬ中に入れ、メッシュ（セルストレイナー：ファルコン社製）上でスパーテルを用いてつぶした。メッシュを通過した細胞懸濁液を遠心して細胞を沈澱させた後、この細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄してから、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞数を測定した。一方、１０％ＦＣＳ（シグマ社製）を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ・ビーアールエル社製）（以下、「血清入りＤＭＥＭ培地」という）にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で細胞濃度が１×１０６細胞／ｍＬを越えないように培養したミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８１）を同様に無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞数を測定した。回収した細胞の懸濁液とマウスミエローマ懸濁液とを細胞数５：１で混合し、遠心後、上清を完全に除去した。このペレットに、融合剤として５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガーマンハイム社製）１ｍＬを、ピペットの先でペレットを撹拌しながらゆっくり添加した後、予め３７℃に加温しておいた無血清ＤＭＥＭ培地１ｍＬを２回に分けてゆっくり添加し、さらに７ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地を添加した。遠心後、上清を除去して得られた融合細胞を、以下に記載する限界希釈法によるスクリーニングに供した。ハイブリドーマの選択は、１０％ＦＣＳ、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）（または１０％ハイブリドーマクローニングファクター（以下「、ＨＣＦ」という。：バイオベース社製））及びヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ）（以下、「ＨＡＴ」という。：シグマ社製）を含有するＤＭＥＭ培地中で培養することにより行った。さらに、ＨＴ（シグマ社製）、１０％ＦＣＳ、ＩＬ−６（または１０％ＨＣＦ）含有ＤＭＥＭ培地を用いて限界希釈法によりシングルクローンにした。培養は、９６穴マイクロタイタープレート（ベクトンディッキンソン社製）中で行った。抗Ａ３３ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの選択（スクリーニング）及び各々のハイブリドーマが産生するヒトモノクローナル抗体の特徴付けは、後述する酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びフローサイトメトリー（ＦＭＣ）で測定することにより行った。
実施例６に述べるＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ、タンパクＥＬＩＳＡ、並びにＦＭＣ解析により、ヒト免疫グロブリンγ鎖（ｈＩｇγ）及びヒト免疫グロブリン軽鎖κを有し、かつＡ３３に特異的な反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産生する多数のハイブリドーマを得た。なお、本実施例を含め以下のいずれの実施例中、並びに実施例における試験結果として示した表又は図中においては、各々の本発明のヒト抗Ａ３３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンは記号を用いて命名した。また、当該記号の前後に「抗体」を付したものは、それぞれのハイブリドーマにより産生される抗体、または当該ハイブリドーマから単離された抗体遺伝子（全長あるいは可変領域）を保持する宿主細胞により生産された組換え抗体を意味する。また文脈上明らかな範囲において、ハイブリドーマクローンの名称が抗体の名称をあらわす場合がある。以下のハイブリドーマクローンはシングルクローンを表す：２６３Ａ１７、１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ及び１２５Ｒ５ＡＡＡＡ。１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ又は１２５Ｒ５ＡＡＡＡは、２００４年８月２４日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれ順番に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０７（識別のための表示：Ｍ１０）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０６（識別のための表示：Ｍ１６５）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０８（識別のための表示：Ｍ９６）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０９（識別のための表示：Ｎ２６）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０４（識別のための表示：Ｑ４７）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０５（識別のための表示：Ｑ５４）およびＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１０３（識別のための表示：Ｒ５）として寄託されている。
実施例６  ヒト免疫グロブリンγ鎖（ｈＩｇγ）及びヒト免疫グロブリン軽鎖κ（Ｉｇκ）を有する、ヒト抗Ａ３３モノクローナル抗体産生クローンの選択
Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡの場合、以下のように実施した。実施例３で作製したＦＭ３Ａ／Ａ３３を９６穴プレート（ファルコン社製）の各ウェルに１×１０５個加えた後、ハイブリドーマ上清を加え、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、２％ＦＣＳ入りのＰＢＳで２回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体（５０μｇ／ウェル：ＩＢＬ社製）を加え、４℃で３０分間インキュベートした。２％ＦＣＳ入りＰＢＳで２回洗浄し、ＴＭＢ発色基質（ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに１００μＬずつ加え、室温下で２０分間インキュベートした。各ウェルに０．５Ｍ硫酸（１００μＬ／ウェル）を加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（１４２０  ＡＲＶＯマルチラベルカウンター：ＷＡＬＬＡＣ社製）で測定して陽性反応を示した抗体産生クローンを選択した。この際に、Ａ３３抗原を発現していないＦＭ３Ａ細胞をネガティブコントロールとして使用した。すなわち、ＦＭ３Ａ／Ａ３３細胞に反応し、ＦＭ３Ａ細胞に反応しない培養上清を、陽性反応を示した抗体産生クローンとして選択した。
また、タンパクＥＬＩＳＡの場合は、以下のように実施した。実施例３で作製したｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質を１μｇ／ｍｌ炭酸緩衝液ｐＨ９．４に調製したものを５０μｌずつ、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ヌンク社製）の各ウェルに加え、室温で１時間あるいは４℃で一晩インキュベートし、ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質をマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルに１０％ＦＣＳ入りＰＢＳを加え、３７℃で１時間インキュベートし、ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質が結合していない部位をブロックした。このようにして、各ウェルをｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質でコーティングしたマイクロプレートを作製した。各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清（５０μｌ）を加え、室温下で１時間反応させた後、各ウェルを０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヒツジ抗ヒトＩｇκ抗体（５０μｌ／ウェル、Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ社製）を０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で２５００倍に希釈した溶液を、各ウェルに５０μｌ加え、３７℃１時間インキュベートした。マイクロプレートを、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＴＭＢ発色基質液（ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに１００μｌずつ加え、室温下で２０分間インキュベートした。各ウェルに０．５Ｍ硫酸（１００μｌ／ウェル）を加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、モレキュラーデバイス社製）で測定して、陽性反応を示した抗体産生クローンを選択した。
さらに、ＦＭＣの場合は、以下のように実施した。Ａ３３抗原を発現するヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５細胞に対するハイブリドーマ培養上清の反応性の検討を行った。２×１０６／ｍｌの濃度でＣＯＬＯ２０５細胞株を０．１％ＮａＮ３、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳのＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に浮遊させた。細胞浮遊液（５０μｌ／ウェル）を９６−ｗｅｌｌ丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。各々のハイブリドーマの培養上清（５０μｌ）を加え、氷温下３０分間インキュベートした。陰性コントロールは各サブクラスに応じ、ヒトＩｇＧ１抗体（シグマ社製）を用い、ハイブリドーマ培養培地で２μｇ／ｍｌの濃度に調製し、５０μｌ添加後氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、ＲＰＥ蛍光標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）５０μｌを加え、氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで１回洗浄した後、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の平均蛍光強度を測定した。その結果、ＣＯＬＯ２０５細胞株に強い結合活性を有することから、細胞に発現しているＡ３３と結合する抗体であることが判明した。
実施例７  各モノクローナル抗体培養上清のサブクラス同定
ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質を１μｇ／ｍｌ炭酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という。）に調製したものを５０μｌずつ、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ヌンク社製）の各ウェルに加え、室温で１時間あるいは４℃で一晩インキュベートし、ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質をマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルに１０％ＦＣＳ入りＰＢＳを加え、室温で１時間あるいは４℃で一晩インキュベートし、ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質が結合していない部位をブロックした。このようにして、各ウェルをｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質でコーティングしたマイクロプレートを作製した。次いで、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、各ウェルにそれぞれ西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヒツジ抗ヒトＩｇＧ１抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ２抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ３抗体又はヒツジ抗ヒトＩｇＧ４抗体（それぞれ１６００、６４００、２５０００、２５０００倍希釈、５０μＬ／ウェル、Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ社製）を加え、室温下で１．５時間インキュベートした。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、基質緩衝液（ＴＭＢ、１００μＬ／ウェル、ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに加え、室温下で２０分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍ硫酸（１００μＬ／ウェル）を加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、モレキュラーデバイス社製）で測定し、各クローンのサブクラスを決定した。ヒト抗Ａ３３抗体は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を重要視しているため、サブクラスがＩｇＧ１のもののみ選抜した。
最終的に選択したクローンのみの結果を表１に示す。
【表１】
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実施例８  各抗体の調製
実施例６から得られたハイブリドーマの培養上清からのヒト抗Ａ３３モノクローナル抗体の精製は以下の方法で行った。ヒト抗Ａ３３モノクローナル抗体を含む培養上清を１０％ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ（インビトロジェン社製）を含むＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）で培養した培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｇｅｌ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、吸着緩衝液としてＰＢＳ、溶出緩衝液として０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．６）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を添加してｐＨ７．２付近に調整した。調製された抗体溶液は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５脱塩カラム（ＮＡＰカラム；アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてＰＢＳに置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ミリポア社製）でろ過滅菌し、精製ヒト抗Ａ３３モノクローナル抗体を得た。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬを１．４ＯＤとして算出した。
実施例９  Ａ３３発現細胞に対する各モノクローナル精製抗体の反応試験
Ａ３３抗原を発現するヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５細胞、ＬｏＶｏ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２２９）、ＬＳ１７４Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＬ−１８８）及びＮＣＩ−Ｈ５０８細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２５３）に対する実施例８で取得した各モノクローナル精製抗体の反応性の検討を、ＦＣＭで行った。また、陰性コントロール細胞としてＡ３３抗原を発現していないヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ−３８）も行った。２×１０６／ｍｌの濃度で各細胞株を０．１％ＮａＮ３、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳのＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に浮遊させた。細胞浮遊液（５０μｌ／ウェル）を９６−ｗｅｌｌ丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。各々のモノクローナル精製抗体をＳＢで２０００、４００、８０、１６ｎｇ／ｍｌを５０μｌ加え、氷温下３０分間インキュベートした。陰性コントロールはサブクラスに応じ、ヒトＩｇＧ１抗体（シグマ社製）を用い、ＳＢで２０００、４００、８０、１６ｎｇ／ｍｌの濃度に調製し、５０μｌ添加後氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、ＦＩＴＣ蛍光標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）５０μｌを加え、氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで１回洗浄した後、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の平均蛍光強度を測定した。
その結果を表２に示す。ＣＯＬＯ２０５細胞では、平均蛍光強度半値を９０、ＬｏＶｏ細胞では、平均蛍光強度半値を２５、ＬＳ１７４Ｔ細胞では、平均蛍光強度半値を１２５、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞では、平均蛍光強度半値を１２５とし、そこに達する抗体濃度が１０＜＝ｘ＜１００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋＋、１００＜＝ｘ＜１０００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋、１０００＜＝ｘ＜１００００ｎｇ／ｍｌのときは＋、結合が認められなかった場合は、−と示した。Ａ３３抗原を発現しているどの細胞に対しても、各モノクローナル精製抗体は結合を示した。
【表２】
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実施例１０  各モノクローナル精製抗体のマウス抗Ａ３３抗体との競合試験
実施例８で取得した各モノクローナル精製抗体が、マウス抗Ａ３３抗体と同様なエピトープを認識するか否かをＦＣＭを用いた競合実験にて検討した。２×１０６／ｍｌの濃度でＣＯＬＯ２０５細胞株を０．１％ＮａＮ３、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳのＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に浮遊させた。細胞浮遊液（５０μｌ／ウェル）を９６−ｗｅｌｌ丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。そこに、実施例１で調製したマウス抗Ａ３３精製抗体を１００μｇ／ｍｌの濃度で加えたものと加えないものを、１μｇ／ｍｌの各モノクローナル精製抗体（５０μｌ）とともにウェルに加え、氷温下３０分間インキュベートした。抗Ａ３３精製抗体を加えないマウス陰性コントロールは、ヒトＩｇＧ１抗体（シグマ社製）を用い、ＳＢで１μｇ／ｍｌの濃度に調製し、５０μｌ添加後氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、ＦＩＴＣ蛍光標識ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体（アイビーエル社製）５０μｌを加え、氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで１回洗浄した後、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の平均蛍光強度を測定した。各モノクローナル精製抗体のマウスＡ３３抗体との阻害率を下記式により算出した：阻害率＝｛１００−（１００ｘマウスＡ３３抗体プレインキュベートした後の平均蛍光強度）／（マウスＡ３３抗体なしでプレインキュベートした後の平均蛍光強度）｝。阻害率が２５％以下のものを「ノンブロッカー」、２５％以上９０未満のものを「パーシャルブロッカー」、９０％以上のものを「ブロッカー」と命名した。その結果、２６３Ａ１７、１２５Ｍ１０ＡＡ及び１２５Ｍ９６ＡＢＡは、「ノンブロッカー」、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ及び１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡは「ブロッカー」、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ及び１２５Ｒ５ＡＡＡＡは、「パーシャルブロッカー」と分類された。その結果を表３に示す。
【表３】
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実施例１１  正常ヒト単核球の取得方法
最初に正常ヒト末梢血由来単核球をＦｉｃｏｌｌ（Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ：アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）を用いて定法に従って調製した。抗凝固剤としてクエン酸ナトリウム液を含んだ採血バッグ（テルモ社製）に採取した正常ヒト血液をＦｉｃｏｌｌに重層し、比重遠心（８００Ｇ、室温１５分間）により単核細胞を分離した。中間層を単核球として抽出してＰＢＳで希釈して２００Ｇで１０分間遠心分離を３回繰り返し、上清中に残留した血小板を除去した。以上の方法で正常ヒト末梢血由来単核球（以下ＰＢＭＣという）を取得し、実施例１２のＰＢＭＣとして使用した。さらに、ＰＢＭＣからＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＩＩ（ミルテニバイオテック社製）を用い、付属の説明書に従ってＣＤ４＋  Ｔ細胞を単離した残りの細胞群も実施例１２のＰＢＭＣとして使用した。
実施例１２  各モノクローナル精製抗体での細胞傷害性試験
抗体を介した細胞傷害性活性は、ＮＫ細胞或いは好中球などのキラー活性を有する細胞と抗体の存在下でターゲット細胞への傷害活性（抗体依存性細胞性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、以下、ＡＤＣＣ）、及び補体と抗体の存在下でターゲット細胞への傷害活性（補体依存性細胞傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）以下、ＣＤＣ）の測定を実施した。抗体は、実施例８で作製した各モノクローナル精製抗体と抗Ａ３３抗体のコントロールとしてｃＡ３３組換え型抗体を用いた。さらに、陰性コントロールとして抗ＤＮＰ  ＩｇＧ１抗体を用いた。
方法は簡単には、ターゲット細胞に放射性クロム（５１Ｃｒ）を細胞質内に取り込ませ、細胞死により培養液中に遊離される５１Ｃｒ量をγ線量で測定した。
具体的には、ターゲット細胞として大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−８６）及びＮＣＩ−Ｈ５０８細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２５３）を１０６個を１５μＬのＦｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）に懸濁し、５０μＬ（３７ＭＢｑ／ｍＬ）の５１Ｃｒラベルされたクロム酸ナトリウム（パーキエルマー社製：以下、５１Ｃｒと書く）を添加し、１時間３７℃で培養した。次に、培地を１０ｍＬ添加し、遠心して培地を捨てることを３回繰り返すことで、細胞内に取り込まれていない５１Ｃｒを除いた。
ＡＤＣＣアッセイは、５１Ｃｒラベルしたターゲット細胞５０００個に対して、実施例１１記載の方法で取得した健常人末梢血単核球５０００００個を、Ｖ底９６ウェルプレート（コースター社製）中で全体容量２００μＬで、各抗体濃度とともに３７℃、５％  ＣＯ２存在下で４時間培養した。
ＣＤＣアッセイは、５１Ｃｒラベルしたターゲット細胞５０００個に対して、最終濃度５％のヒト血清由来補体（シグマ社製）を、Ｖ底９６ウェルプレート中で全体容量２００μＬで、各抗体濃度とともに３７℃、５％  ＣＯ２存在下で４時間培養した。
ＡＤＣＣ・ＣＤＣアッセイともに培養後、プレートを遠心して細胞を沈めた後、各モノクローナル精製抗体を０．４−５００ｎｇ／ｍｌに調製し５０μＬを粉末シンチレーター含有の９６穴プレート（ＬｕｍａｐｌａｔｅＴＭ−９６：パッカード社製）に移し、５５℃、１．５時間で乾燥した。乾燥を確認後、専用カバー（ＴｏｐＳｅａｌＴＭ−Ａ：９６−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ：パッカード社製）でプレートをカバーし、シンチレーションカウンター（トップカウント：パッカード社製）でγ線量を測定した。
その結果を図１Ａ〜図１Ｄ、表４に示す。ＡＤＣＣは、ＣＯＬＯ２０５細胞の場合は、特異的溶解率半値を１５％とし、そこに達する抗体濃度が１＜＝ｘ＜１０ｎｇ／ｍｌのときは＋＋＋、１０＜＝ｘ＜１００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋、１００＜＝ｘ＜１０００ｎｇ／ｍｌのときは＋、特異的溶解率が認められなかった場合は、−と示した。また、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞の場合は、特異的溶解率半値を１５％とし、そこに達する抗体濃度が１＜＝ｘ＜１０ｎｇ／ｍｌのときは＋＋＋、１０＜＝ｘ＜１００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋、１００＜＝ｘ＜１０００ｎｇ／ｍｌのときは＋、特異的溶解率が認められなかった場合は、−と示した。
ＣＤＣでは、ＣＯＬＯ２０５細胞の場合は、特異的溶解率半値を１０％とし、そこに達する抗体濃度が１０＜＝ｘ＜１００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋＋、１００＜＝ｘ＜１０００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋、ｘ＞＝１０００ｎｇ／ｍｌのときは＋、特異的溶解率が認められなかった場合は、−と示した。また、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞の場合は、特異的溶解率半値を２５％とし、そこに達する抗体濃度が１０＜＝ｘ＜１００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋＋、１００＜＝ｘ＜１０００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋、ｘ＞＝１０００ｎｇ／ｍｌのときは＋、特異的溶解率が認められなかった場合は、−と示した。
ＡＤＣＣでは、ｃＡ３３及び１２５Ｑ５４ＡＡＡＡが高い傷害活性を示した。一方、ＣＤＣでは、１２５Ｍ１０ＡＡが高い傷害活性を示した。
【表４】
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実施例１３  各モノクローナル抗体をコードする遺伝子の調製
（１）各モノクローナル抗体のｃＤＮＡ合成
ハイブリドーマ２６３Ａ１７、１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ及び１２５Ｒ５ＡＡＡＡを１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−６または１０％  ＨＣＦ（バイオベース社製）、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ハイクローン社製）含有ＤＭＥＭ培地（ギブコ・ビーアールエル社製）で培養し、遠心分離により細胞を集めた後ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）を添加し、取扱説明書にしたがってＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抗体ｃＤＮＡの可変領域のクローニングは、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス・クローンテック社製）を用い、添付の説明書にしたがって行った。
５μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを作製した。
１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５μｇ／３μｌ
５’  ＣＤＳ  １μｌ
ＳＭＡＲＴ  ｏｌｉｇｏ  １μｌ
上記組成の反応液を７０℃で２分間インキュベートした後、
５×Ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ
ＤＴＴ  １μｌ
ＤＮＴＰ  ｍｉｘ  １μｌ
ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １μｌ
を加え４２℃で１．５時間インキュベートした。
さらに、１００μｌのＴｒｉｃｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた後、７２℃で７分間インキュベートし、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを取得した。
（２）ＰＣＲによる重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の増幅と塩基配列の確認
（２）−１；ハイブリドーマ２６３Ａ１７のＰＣＲによる重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の増幅ｃＤＮＡの増幅は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（トーヨーボー社製）を用いて下記の反応液を調製して実施した。
ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｈ２Ｏ                                          ２９．５μｌ
ｃＤＮＡ                                                          ２．５μｌ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（１０Ｘ）                              ５μｌ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（２ｍＭ）                                            ４μｌ
ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ）                                                ２μｌ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（１ｕｎｉｔ／μｌ）                                １μｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  ｍｉｘ（ＵＰＭ）（１０Ｘ）      ５μｌ
Ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ（ＧＳＰ）                  １μｌ
Ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ                                            ５０μｌ
上記組成の反応液を再蒸留水にて最終容量５０μｌとし、ＰＣＲに供した。
２６３Ａ１７の重鎖遺伝子の増幅は、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ付属のＵＰＭプライマとＩｇＧ１ｐプライマー（５’−ＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＧ−３’）（配列番号１６）を用い、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返した。一方、２６３Ａ１７の軽鎖遺伝子の増幅は、ＵＰＭプライマーとｈｋ−２（５’−ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＧＣ−３’）（配列番号１７）プライマーを使って、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返して増幅した。
（２）−２；ハイブリドーマ１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ及び１２５Ｒ５ＡＡＡＡのＰＣＲによる重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の増幅
反応条件は、（２）−１と同様に行った。１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ及び１２５Ｒ５ＡＡＡＡの重鎖遺伝子の増幅は、ＵＰＭプライマーとＩｇＧ１ｐプライマー（配列番号１６）を用い、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返した。さらに、この反応液１μｌを鋳型とし、ＮＵＰＭプライマー（ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス・クローンテック社製）とＩｇＧ２ｐ／Ｇ１３４プライマー（５’−ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＣＣＧ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＧ  ＧＣＧ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  Ｃ−３’）（配列番号１８）を用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。一方、１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ及び１２５Ｒ５ＡＡＡＡの軽鎖遺伝子の増幅は、ＵＰＭプライマーとｈｋ−２プライマー（配列番号１７）を使って、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返して増幅した。さらに、この反応液１μｌを鋳型とし、ＮＵＰＭプライマーとｈｋ−５プライマー（５’−ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＴＴＣ−３’）（配列番号１９）を用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。
（２）−３；ハイブリドーマ１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ及び１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡのＰＣＲによる重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の増幅
反応条件は、（２）−１と同様に行った。１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ及び１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡの重鎖遺伝子の増幅は、ＵＰＭプライマーとｈｈ−２プライマー（５’−ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＧＣＴ  Ｇ−３’）（配列番号２０）を用い、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返した。さらに、この反応液１μｌを鋳型とし、ＮＵＰＭプライマーとｈｈ−４プライマー（５’−ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＧＧ−３’）（配列番号２１）を用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。一方、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ及び１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡの軽鎖遺伝子の増幅は、ＵＰＭプライマーとｈｋ−２プライマー（配列番号１７）を使って、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返して増幅した。さらに、この反応液１μｌを鋳型とし、ＮＵＰＭプライマーとｈｋ−５プライマー（配列番号１９）を用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。
以上のように増幅した各々の重鎖及び軽鎖のＰＣＲ断片は、エタノール沈殿で回収した後、アガロースゲル電気泳動で回収し、メンブランを用いるＤＮＡ精製キットであるＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製した。精製したＨＶ増幅断片あるいはＬＶ増幅断片は、それぞれＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）のＰＣＲ  ４  Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングを行い、得られたクローンのプラスミドＤＮＡについてインサートＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列決定のためにプライマーとして、Ｍ１３ＦＷ（配列番号３）及びＭ１３ＲＶ（配列番号４）を用いた。
２６３Ａ１７の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
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重鎖核酸配列（配列番号２２）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は４２９番目のアデニン（Ａ）と４３０番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号２３）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１４３番目のセリン（Ｓ）と１４４番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。また、重鎖核酸配列（配列番号２２）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は５７番目のチミン（Ｔ）と５８番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号２３）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は１９番目のシステイン（Ｃ）と２０番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置する。
以上より、２６３Ａ１７抗体重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号２２）は５８番目のグアニン（Ｇ）から４２９番目のアデニン（Ａ）までである。また、重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号２３）は２０番目のグルタミン酸（Ｅ）から１４３番目のセリン（Ｓ）までである。
軽鎖核酸配列（配列番号２４）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は３８７番目のアデニン（Ａ）と３８８番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号２５）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１２９番目のリジン（Ｋ）と１３０番目のアルギニン（Ｒ）の間に位置する。また、軽鎖核酸配列（配列番号２４）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は６６番目のシトシン（Ｃ）と６７番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号２５）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は２２番目のシステイン（Ｃ）と２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）の間に位置する。
以上より、２６３Ａ１７抗体軽鎖の可変領域の核酸配列（配列番号２４）は６７番目のグアニン（Ｇ）から３８７番目のアデニン（Ａ）までである。また、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号２５）は２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までである。
１２５Ｍ１０ＡＡの重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
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重鎖核酸配列（配列番号２６）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は４４１番目のアデニン（Ａ）と４４２番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号２７）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１４７番目のセリン（Ｓ）と１４８番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。また、重鎖核酸配列（配列番号２６）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は７８番目のシトシン（Ｃ）と７９番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号２７）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は２６番目のセリン（Ｓ）と２７番目のグルタミン（Ｑ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｍ１０ＡＡ抗体重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号２６）は７９番目のシトシン（Ｃ）から４４１番目のアデニン（Ａ）までである。また、重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号２７）は２７番目のグルタミン（Ｑ）から１４７番目のセリン（Ｓ）までである。
軽鎖核酸配列（配列番号２８）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は３８１番目のアデニン（Ａ）と３８２番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号２９）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１２７番目のリジン（Ｋ）と１２８番目のアルギニン（Ｒ）の間に位置する。また、軽鎖核酸配列（配列番号２８）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は６０番目のアデニン（Ａ）と６１番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号２９）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は２０番目のグリシン（Ｇ）と２１番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｍ１０ＡＡ抗体軽鎖の可変領域の核酸配列（配列番号２８）は６１番目のグアニン（Ｇ）から３８１番目のアデニン（Ａ）までである。また、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号２９）は２１番目のグルタミン酸（Ｅ）から１２７番目のリジン（Ｋ）までである。
１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
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重鎖核酸配列（配列番号３０）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は４２０番目のアデニン（Ａ）と４２１番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号３１）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１４０番目のセリン（Ｓ）と１４１番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。また、重鎖核酸配列（配列番号３０）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は５７番目のチミン（Ｔ）と５８番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号３１）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は１９番目のシステイン（Ｃ）と２０番目のグルタミン（Ｑ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ抗体重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号３０）は５８番目のシトシン（Ｃ）から４２０番目のアデニン（Ａ）までである。また、重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号３１）は２０番目のグルタミン（Ｑ）から１４０番目のセリン（Ｓ）までである。
軽鎖核酸配列（配列番号３２）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は３８１番目のアデニン（Ａ）と３８２番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号３３）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１２７番目のリジン（Ｋ）と１２８番目のアルギニン（Ｒ）の間に位置する。また、軽鎖核酸配列（配列番号３２）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は６０番目のアデニン（Ａ）と６１番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号３３）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は２０番目のグリシン（Ｇ）と２１番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ抗体軽鎖の可変領域の核酸配列（配列番号３２）は６１番目のグアニン（Ｇ）から３８１番目のアデニン（Ａ）までである。また、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号３３）は２１番目のグルタミン酸（Ｅ）から１２７番目のリジン（Ｋ）までである。
１２５Ｍ９６ＡＢＡ重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
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重鎖核酸配列（配列番号３４）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は４２０番目のアデニン（Ａ）と４２１番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号３５）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１４０番目のセリン（Ｓ）と１４１番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。また、重鎖核酸配列（配列番号３４）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は５７番目のシトシン（Ｃ）と５８番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号３５）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は１９番目のセリン（Ｓ）と２０番目のグルタミン（Ｑ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｍ９６ＡＢＡ抗体重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号３４）は５８番目のシトシン（Ｃ）から４２０番目のアデニン（Ａ）までである。また、重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号３５）は２０番目のグルタミン（Ｑ）から１４０番目のセリン（Ｓ）までである。
軽鎖核酸配列（配列番号３６）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は３８１番目のアデニン（Ａ）と３８２番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号３７）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１２７番目のリジン（Ｋ）と１２８番目のアルギニン（Ｒ）の間に位置する。また、軽鎖核酸配列（配列番号３６）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は６０番目のアデニン（Ａ）と６１番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号３７）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は２０番目のグリシン（Ｇ）と２１番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ抗体軽鎖の可変領域の核酸配列（配列番号３６）は６１番目のグアニン（Ｇ）から３８１番目のアデニン（Ａ）までである。また、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号３７）は２１番目のグルタミン酸（Ｅ）から１２７番目のリジン（Ｋ）までである。
１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
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重鎖核酸配列（配列番号３８）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は４２０番目のアデニン（Ａ）と４２１番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号３９）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１４０番目のセリン（Ｓ）と１４１番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。また、重鎖核酸配列（配列番号３８）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は５７番目のチミン（Ｔ）と５８番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号３９）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は１９番目のシステイン（Ｃ）と２０番目のグルタミン（Ｑ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｍ９６ＡＢＡ抗体重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号３８）は５８番目のシトシン（Ｃ）から４２０番目のアデニン（Ａ）までである。また、重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号３９）は２０番目のグルタミン（Ｑ）から１４０番目のセリン（Ｓ）までである。
軽鎖核酸配列（配列番号４０）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は３８８番目のアデニン（Ａ）と３８９番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号４１）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１２６番目のリジン（Ｋ）と１２７番目のアルギニン（Ｒ）の間に位置する。また、軽鎖核酸配列（配列番号４０）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は５７番目のチミン（Ｔ）と５８番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号４１）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は１９番目のグリシン（Ｇ）と２０番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｍ９６ＡＢＡ抗体軽鎖の可変領域の核酸配列（配列番号４０）は５８番目のグアニン（Ｇ）から３８８番目のアデニン（Ａ）までである。また、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号４１）は２０番目のグルタミン酸（Ｅ）から１２６番目のリジン（Ｋ）までである。
１２５Ｑ４７ＢＡの重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
0004088655.tif 000026
0004088655.tif 000027
重鎖核酸配列（配列番号４２）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は４２０番目のアデニン（Ａ）と４２１番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号４３）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１４０番目のセリン（Ｓ）と１４１番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。また、重鎖核酸配列（配列番号４２）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は５７番目のチミン（Ｔ）と５８番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号４３）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は１９番目のシステイン（Ｃ）と２０番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｑ４７ＢＡ抗体重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号４２）は５８番目のグアニン（Ｇ）から４２０番目のアデニン（Ａ）までである。また、重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号４３）は２０番目のグルタミン酸（Ｅ）から１４０番目のセリン（Ｓ）までである。
軽鎖核酸配列（配列番号４４）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は３８７番目のアデニン（Ａ）と３８８番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号４５）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１２９番目のリジン（Ｋ）と１３０番目のアルギニン（Ｒ）の間に位置する。また、軽鎖核酸配列（配列番号４４）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は６６番目のチミン（Ｔ）と６７番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号４５）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は２２番目のシステイン（Ｃ）と２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｑ４７ＢＡ抗体軽鎖の可変領域の核酸配列（配列番号４４）は６７番目のグアニン（Ｇ）から３８７番目のアデニン（Ａ）までである。また、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号４５）は２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までである。
１２５Ｑ５４ＡＡＡＡの重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
0004088655.tif 000028
0004088655.tif 000029
0004088655.tif 000030
重鎖核酸配列（配列番号４６）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は４２０番目のアデニン（Ａ）と４２１番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号４７）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１４０番目のセリン（Ｓ）と１４１番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。また、重鎖核酸配列（配列番号４６）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は５７番目のチミン（Ｔ）と５８番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号４７）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は１９番目のシステイン（Ｃ）と２０番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ抗体重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号４６）は５８番目のグアニン（Ｇ）から４２０番目のアデニン（Ａ）までである。また、重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号４７）は２０番目のグルタミン酸（Ｅ）から１４０番目のセリン（Ｓ）までである。
軽鎖核酸配列（配列番号４８）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は３８７番目のアデニン（Ａ）と３８８番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号４９）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１２９番目のリジン（Ｋ）と１３０番目のアルギニン（Ｒ）の間に位置する。また、軽鎖核酸配列（配列番号４８）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は６６番目のチミン（Ｔ）と６７番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号４９）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は２２番目のシステイン（Ｃ）と２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ抗体軽鎖の可変領域の核酸配列（配列番号４８）は６７番目のグアニン（Ｇ）から３８７番目のアデニン（Ａ）までである。また、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号４９）は２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までである。
１２５Ｒ５ＡＡＡＡの重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
0004088655.tif 000031
0004088655.tif 000032
重鎖核酸配列（配列番号５０）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は４２０番目のアデニン（Ａ）と４２１番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号５１）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１４０番目のセリン（Ｓ）と１４１番目のアラニン（Ａ）の間に位置する。また、重鎖核酸配列（配列番号５０）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は５７番目のチミン（Ｔ）と５８番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、重鎖アミノ酸配列（配列番号５１）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は１９番目のシステイン（Ｃ）と２０番目のグルタミン酸（Ｅ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｒ５ＡＡＡＡ抗体重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号５０）は５８番目のグアニン（Ｇ）から４２０番目のアデニン（Ａ）までである。また、重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号５１）は２０番目のグルタミン酸（Ｅ）から１４０番目のセリン（Ｓ）までである。
軽鎖核酸配列（配列番号５２）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は３８７番目のアデニン（Ａ）と３８８番目のシトシン（Ｃ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号５３）における抗体可変領域と抗体定常領域の境界は１２９番目のリジン（Ｋ）と１３０番目のアルギニン（Ｒ）の間に位置する。また、軽鎖核酸配列（配列番号５２）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は６６番目のチミン（Ｔ）と６７番目のグアニン（Ｇ）の間に位置し、軽鎖アミノ酸配列（配列番号５３）におけるシグナル配列と抗体可変領域の境界は２２番目のシステイン（Ｃ）と２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）の間に位置する。
以上より、１２５Ｒ５ＡＡＡＡ抗体軽鎖の可変領域の核酸配列（配列番号５２）は６７番目のグアニン（Ｇ）から３８７番目のアデニン（Ａ）までである。また、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号５３）は２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までである。
実施例１４  ハイブリドーマ１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ及び１２５Ｍ１０ＡＡに発現するヒト抗体重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の定常領域を含む全長配列の決定
実施例１３において、各抗体の抗体可変領域のＤＮＡ塩基配列及びアミノ酸配列を決定したが、ＫＭマウス由来ハイブリドーマ１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ及び１２５Ｍ１０ＡＡについて定常領域を含む全長配列の解析を実施した。ｃＤＮＡの合成は実施例１３に従って、ハイブリドーマ１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ及び１２５Ｍ１０ＡＡより調製したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを材料としてＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス・クローンテック社製）を用いて行なった。
１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５μｇ／３μｌ
３’ＣＤＳ  ｐｒｉｍｅｒ  １μｌ
Ｈ２Ｏ  １μｌ
上記組成の反応液を７０℃で２分間インキュベートした後、
５×Ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ
ＤＴＴ  １μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １μｌ
ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １μｌ
を加え４２℃で１．５時間インキュベートした。
さらに、５０μｌのＴｒｉｃｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた後、７２℃で７分間インキュベートし、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを取得した。
定常領域のコード領域全体を含むＤＮＡを取得するために、上記の合成したｃＤＮＡをテンプレートとし、また各抗体遺伝子の５’端のＡＴＧイニシエーションコドン付近に結合する配列を有する合成ＤＮＡ（５‘プライマー）とヒト抗体遺伝子３’非翻訳領域に特異的に結合する合成ＤＮＡ（３’プライマー）をプライマーセットとして用いて、ＰＣＲによる増幅反応を行った。この増幅反応により、抗体遺伝子（ｃＤＮＡ）のＡＴＧイニシエーションコドンから、ストップコドンを含む３’非翻訳領域までの全長配列を得ることができる。
１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡの重鎖のＤＮＡ増幅は、Ｈ鎖５’プライマー：Ｎ２６Ｈ５Ｓａｌ１（配列番号５８）とＨ鎖３’プライマー：Ｈ＿３ＵＴＲ１８４８（５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＴＣＣＴＣＧＴＧ−３’、配列番号７４）のプライマーセット、または、Ｈ鎖５’プライマー：Ｎ２６Ｈ５Ｓａｌ１（配列番号５８）とＨ鎖３’プライマー：Ｈ＿３ＵＴＲ１８７５（５’−ＡＴＧＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＣ−３’、配列番号７５）のプライマーの組合せで、９４℃１５秒、６８℃２分のインキュベーションサイクルを３５回繰り返した。一方、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡの軽鎖（κ）の増幅は、Ｌ鎖５’用プライマー：Ｎ２６ＫＡ１０Ｍｉｎｏｒ  Ｌ  Ｂｇｌ（配列番号６４）とＬ鎖３’用プライマー：Ｌ＿３ＵＴＲ＿８２３（５’−ＧＡＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＧＣＡＡＴＡ−３’、配列番号７６）のプライマーセットを用いて行なった。プライマー以外の反応液組成は実施例１３の（２）−１と同じ組成にて実施した。
１２５Ｍ１０ＡＡの重鎖のＤＮＡ増幅用としては、Ｈ鎖５’用プライマー：Ｍ１０Ｈ５Ｓａｌ（配列番号７０）とＨ鎖３’用プライマー：Ｈ＿３ＵＴＲ１８４８（配列番号７４）のプライマーセット、または、Ｈ鎖５’プライマー：Ｍ１０Ｈ５Ｓａｌ（配列番号７０）とＨ鎖３’プライマー：Ｈ＿３ＵＴＲ１８７５（配列番号７５）であり、１２５Ｍ１０ＡＡの軽鎖（κ）のＤＮＡ増幅用としては、Ｌ鎖５’用プライマー：Ｍ１０ＫＢｇｌ（配列番号６６）とＬ鎖３’用プライマー：Ｌ＿３ＵＴＲ＿８２３（配列番号７６）のプライマーセットである。
増幅した各ＰＣＲ断片は、エタノール沈殿で回収した後、アガロースゲル電気泳動で回収し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（（株）キアゲン社製）にて精製した。精製した増幅断片は、それぞれＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＰＣＲ  ４  Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングした。取得したクローンについて、シーケンシング鋳型用ＤＮＡ調製試薬であるＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）を使用して、添付のプロトコールに従ってシーケンシング鋳型用ＤＮＡを調製して、インサートＤＮＡの塩基配列を決定した。ヒト抗体重鎖のＤＮＡ塩基配列解析のプライマーとして、Ｍ１３ＦＷ（配列番号３）、Ｍ１３ＲＶ（配列番号４）、ｈｈ４（配列番号２１）、ｈｈ１（５’−ＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣ−３’）（配列番号７７）、ＣＭＶＨ９０３Ｆ（５’−ＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣ−３’）（配列番号７８）、ＣＭＶＨＲ１３０３（５’−ＴＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＴＴＧＣＴＣＴ−３’）（配列番号７９）、ｈｈ−６（５’−ＧＧＴＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＣＣＴＴ−３’）（配列番号８０）、ｈｈ−２（配列番号２０）、Ｈ＿３ＵＴＲ１８４８（配列番号７４）、及びＨ＿３ＵＴＲ１８７５（配列番号７５）を、また、ヒト抗体軽鎖（κ）のＤＮＡ塩基配列解析用のプライマーとして、Ｍ１３ＦＷ（配列番号３）、Ｍ１３ＲＶ（配列番号４）、ｈｋ−５（配列番号１９）、及びｈｋ−１（５’−ＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣ−３’）（配列番号８１）を用いた。
１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ抗体の重鎖、及び軽鎖全領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖及び軽鎖全領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
0004088655.tif 000033
0004088655.tif 000034
0004088655.tif 000035
0004088655.tif 000036
0004088655.tif 000037
0004088655.tif 000038
１２５Ｍ１０ＡＡ抗体の重鎖、及び軽鎖全領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖及び軽鎖全領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
0004088655.tif 000039
0004088655.tif 000040
0004088655.tif 000041
0004088655.tif 000042
0004088655.tif 000043
0004088655.tif 000044
実施例１５  組換え抗体発現ベクターの構築
２６３Ａ１７、１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ、１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ及び１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ抗体については、組換え抗体発現ベクターを構築した。
２６３Ａ１７、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ及び１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ抗体については、取得した抗体のＨＶ鎖を含むプラスミドＤＮＡを鋳型として、末端に連結のための制限酵素部位（５’末側ＳａｌＩ、３’末側ＮｈｅＩ）を付加するように設計したプライマーを用いた。具体的なプライマーは、以下のとおり。
２６３Ａ１７；
ＨＶ鎖５’用プライマー：Ａ３３  ２−６Ａ２  Ｈ  ＶＨ３−２３  Ｓａｌ  Ｉ（配列番号５４）
５’−ＧＣＧ  ＡＣＴ  ＡＡＧ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＴＧ−３’
ＨＶ鎖３’用プライマー：Ａ３３  ２−６Ａ２  Ｈ  ＶＨ３−２３  Ｎｈｅ  Ｉ（配列番号５５）
５’−ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＧ−３’
１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ；
ＨＶ鎖５’用プライマー：Ｍ１６５Ｈ５Ｓａｌ（配列番号５６）
５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＣＧＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ−３’
ＨＶ鎖３’用プライマー：Ｍ１６５Ｈ３Ｎｈｅ（配列番号５７）
５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＴＧＣ−３’
１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ；
ＨＶ鎖５’用プライマー：Ｎ２６Ｈ５Ｓａｌ１（配列番号５８）
５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＣＧＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ−３’
ＨＶ鎖３’用プライマー：Ｎ２６Ｈ３Ｎｈｅ１（配列番号５９）
５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＴＴＣ  ＣＣ−３’
各Ａ３３抗体のＨＶをＰＣＲで増幅（９４℃  ３分→９４℃  １０秒、６８℃  ４５秒（３５サイクル）→７２℃  ７分）した。増幅されたＤＮＡ断片をＳａｌＩ、ＮｈｅＩで消化し、同一酵素で解裂されていたＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ  Ｌａｒｋベクター（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎ５ＫＧ１（ＵＳｐａｔｅｎｔ  ６００１３５８）の改変ベクター）に導入した。挿入された配列がサブクローニングしたＨＶのＤＮＡ塩基配列解析によって決定されたものと同一であることを、ベクターを鋳型として配列を決定することにより確認した。
引き続いて、得られたＨＶが挿入されたプラスミドベクターにＬＶの挿入を行なった。取得した抗体のＬＶ鎖を含むプラスミドＤＮＡを鋳型として、末端に連結のための制限酵素部位（５’末側ＢｇｌＩＩ、３’末側ＢｓｉＷＩ）を付加するように設計したプライマーを用いた。具体的なプライマーは、以下のとおり。
２６３Ａ１７；
ＬＶ鎖５’用プライマー：Ａ３３  ２−６Ａ２  Ｋ  Ｌ１９  ＢｇｌＩＩ（配列番号６０）
５’−ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＣＣ−３’
ＬＶ鎖３’用プライマー：Ａ３３  ２−６Ａ２  Ｋ  Ｌ１９  ＢｓｉＷＩ（配列番号６１）
５’−ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＧＴＡ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＡＴＣ  ＴＣＣ  ＡＧ−３’
１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ；
ＬＶ鎖５’用プライマー：Ｍ１６５Ｋ５Ｌ６Ｂｇｌ２（配列番号６２）
５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＴＣＴ−３’
ＬＶ鎖３’用プライマー：Ｍ１６５Ｋ３Ｌ６ＢｓｉＷ１（配列番号６３）
５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＣＧ  ＴＡＣ  ＧＴＴ  ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＧＧＣ−３’
１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ；
ＬＶ鎖５’用プライマー：Ｎ２６ＫＡ１０Ｍｉｎｏｒ  Ｌ  Ｂｇｌ（配列番号６４）
５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＴ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＴＴＧ  ＧＧ−３’
ＬＶ鎖３’用プライマー：Ｎ２６ＫＡ１０Ｍｉｎｏｒ  Ｌ  Ｂｓｉ（配列番号６５）
５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＣＧ  ＴＡＣ  ＧＴＴ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＧ−３’、
各Ａ３３抗体のＬＶをＰＣＲで増幅（９４℃  ３分→９４℃  １０秒、６８℃  ４５秒（３５サイクル）→７２℃  ７分）した。増幅したＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ、ＢｓｉＷＩで消化し、同一酵素で解裂されていたＮ５ＫＧ１−ＨＶベクターに導入した。挿入された配列がサブクローニングしたＬＶのＤＮＡ塩基配列解析によって決定されたものと同一であることを、ベクターを鋳型として配列を決定することにより確認した。
１２５Ｍ１０ＡＡ及び１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ抗体については、取得した抗体のＬＶ鎖を含むプラスミドＤＮＡを鋳型として、末端に連結のための制限酵素部位（５’末側ＢｇｌＩＩ、３’末側ＢｓｉＷＩ）を付加するように設計したプライマーを用いた。具体的なプライマーは、以下のとおり。
１２５Ｍ１０ＡＡ；
ＬＶ鎖５’用プライマー：Ｍ１０ＫＢｇｌ（配列番号６６）
５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴ−３’
ＬＶ鎖３’用プライマー：Ｍ１０ＫＢｓｉ（配列番号６７）
５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＣＣＧ−３’
１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ；
ＬＶ鎖５’用プライマー：Ｑ５４Ｋ５Ｂｇｌ（配列番号６８）
５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣ−３’
ＬＶ鎖３’用プライマー：Ｑ５４Ｋ３Ｂｓｉ（配列番号６９）
５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＧＧ−３’
各Ａ３３抗体のＬＶをＰＣＲで増幅（９４℃  ３分→９４℃  １０秒、６８℃  ４５秒（３５サイクル）→７２℃  ７分）した。増幅したＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ、ＢｓｉＷＩで消化し、同一酵素で解裂されていたＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ  Ｌａｒｋベクターに導入した。挿入された配列がサブクローニングしたＬＶのＤＮＡ塩基配列解析によって決定されたものと同一であることを、ベクターを鋳型として配列を決定することにより確認した。
引き続いて、得られたＬＶが挿入されたプラスミドベクターにＨＶの挿入を行なった。取得した抗体のＨＶ鎖を含むプラスミドＤＮＡを鋳型として、末端に連結のための制限酵素部位（５’末側ＳａｌＩ、３’末側ＮｈｅＩ）を付加するように設計したプライマーを用いた。具体的なプライマーは、以下のとおり。
１２５  Ｍ１０ＡＡ；
ＨＶ鎖５’用プライマー：Ｍ１０Ｈ５Ｓａｌ（配列番号７０）
５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＣＧＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＡＧＣ−３’
ＨＶ鎖３’用プライマー：Ｍ１０Ｈ３Ｎｈｅ（配列番号７１）
５’  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＣＣＧ  ＴＧＧ  ＴＣＣ  ＣＴ−３’
１２５  Ｑ５４ＡＡＡＡ；
ＨＶ鎖５’用プライマー：Ｑ５４Ｈ５Ｓａｌ（配列番号７２）
５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＣＧＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＴ−３’
ＨＶ鎖３’用プライマー：Ｑ５４Ｈ３Ｎｈｅ（配列番号７３）
５’−ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＴＴＣ  ＣＣ−３’
各Ａ３３抗体のＨＶをＰＣＲで増幅（９４℃  ３分→９４℃  １０秒、６８℃  ４５秒（３５サイクル）→７２℃  ７分）した。増幅したＤＮＡ断片をＳａｌＩ、ＮｈｅＩで消化し、同一酵素で解裂されていたＮ５ＫＧ１−ＬＶベクターに導入した。挿入された配列がサブクローニングしたＨＶのＤＮＡ塩基配列解析によって決定されたものと同一であることを、ベクターを鋳型として配列を決定することにより確認した。
表５に合成ＤＮＡの塩基配列を、表６に組換えベクター及び産生される抗体の名称を示す。
【表５】
0004088655.tif 000045
0004088655.tif 000046
【表６】
0004088655.tif 000047
実施例１６  組換え型抗体の作製
実施例１５で構築した組換え型抗体発現ベクターを宿主細胞に導入し、組換え型抗体発現細胞を作製した。発現のための宿主細胞には、例えばＣＨＯ細胞のｄｈｆｒ欠損株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、ＣＨＯ−Ｒａｓ（Ｋａｔａｋｕｒａ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１：１０３−１０９，１９９９）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）などが用いられる。
宿主細胞へのベクターの導入はエレクトロポレーションやリポフェクションになどにより実施した。エレクトロポレーションは抗体発現ベクター約２μｇを制限酵素で線状化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｅｒをもちいて３５０Ｖ、５００μＦの条件で、４×１０６個のＣＨＯ細胞に遺伝子を導入し、９６ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅに播種した。リポフェクションは、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  Ｐｌｕｓ（ギブコ・ビーアールエル社製）を用いてマニュアルに従って実施した。ベクターの導入処理後、発現ベクターの選択マーカーに対応した薬剤を添加して培養を継続した。コロニーを確認した後、実施例６に示した方法によって、抗体発現株を選別した。選別した細胞からの抗体精製は、吸着後ＰＢＳで洗浄して、Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ３．２×１０ｃｍカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、吸着後ＰＢＳで洗浄して、２０ｍＭ（グリシン）クエン酸ナトリウム、５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ２．７）緩衝液で溶出した。溶出液を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて中和した。次に、陰イオン交換カラムであるＨｉｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）で、さらに同じく陽イオンカラムであるＨｉｔｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）で精製した。調製された抗体溶液は、透析膜（１００００カット、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてＰＢＳに置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ミリポア社製）でろ過滅菌し、純度を少なくとも９５％以上、エンドトキシン０．１ＥＵ／ｍｇ以下の精製抗体を取得した。組換え型の精製抗Ａ３３抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬを１．４ＯＤとして算出した。
実施例１７  組換え型抗体による反応試験
Ａ３３抗原を発現するヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＬ−１８８）及びＮＣＩ−Ｈ５０８細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２５３）に対する実施例１６で取得した組換え型抗体の反応性の検討を、ＦＣＭで行った。また、陰性コントロール細胞としてＡ３３抗原を発現していないヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ−３８）も行った。試験方法は、実施例９と同様に行った。
その結果を表７に示す。ＣＯＬＯ２０５細胞では、平均蛍光強度半値を４５、ＬＳ１７４Ｔ細胞では、平均蛍光強度半値を１００、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞では、平均蛍光強度半値を１７５とし、そこに達する抗体濃度が１０＜＝ｘ＜１００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋＋、１００＜＝ｘ＜１０００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋、１０００＜＝ｘ＜１００００ｎｇ／ｍｌのときは＋、結合が認められなかった場合は、−と示した。Ａ３３抗原を発現しているどの細胞に対しても、組換え型抗体は結合を示した。
【表７】
0004088655.tif 000048
0004088655.tif 000049
実施例１８  組換え型抗体のマウス抗Ａ３３抗体との競合試験
実施例１６で取得した組換え型抗体をマウス抗Ａ３３抗体と同様なエピトープを認識するか否かをＦＣＭを用いた競合実験にて検討した。試験方法は、実施例１０と同様に行った。
実施例１０の各モノクローナル精製抗体の結果と同様に、ｒｅｃ２６３及びｒｅｃＭ１０は、「ノンブロッカー」、ｒｅｃＭ１６５及びｒｅｃＮ２６は「ブロッカー」、ｒｅｃＱ５４は、「パーシャルブロッカー」と分類された。その結果を表８に示す。
【表８】
0004088655.tif 000050
実施例１９  組換え型抗体での細胞傷害性試験
実施例１６で取得した組換え型抗体でのＡＤＣＣ及びＣＤＣの測定を実施した。ＡＤＣＣアッセイは、５１Ｃｒラベルしたターゲット細胞（ＣＯＬＯ２０５あるいはＮＣＩ−Ｈ５０８）５０００個に対して、実施例１１記載の方法で取得した健常人末梢血単核球５０万個を、Ｖ底９６ウェルプレート（コースター社製）中で全体容量２００μＬで、各抗体濃度とともに３７℃、５％  ＣＯ２存在下で４時間培養した。
ＣＤＣアッセイは、５１Ｃｒラベルしたターゲット細胞（ＣＯＬＯ２０５あるいはＮＣＩ−Ｈ５０８）５０００個に対して、最終濃度５％のヒト血清由来補体（シグマ社製）を、Ｖ底９６ウェルプレート中で全体容量２００μＬで、各抗体濃度とともに３７℃、５％  ＣＯ２存在下で４時間培養した。
試験方法は、実施例１２と同様に行った。
その結果を図２Ａ〜図２Ｄおよび表９に示す。ＡＤＣＣは、特異的溶解率半値をＣＯＬＯ２０５細胞をターゲットとしたときは、１２．５％とし、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞をターゲットとしたときは、３０％とした。そこに達する抗体濃度が１＜＝ｘ＜１０ｎｇ／ｍｌのときは＋＋＋、１０＜＝ｘ＜１００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋、１００＜＝ｘ＜１０００ｎｇ／ｍｌのときは＋、特異的溶解率が認められなかった場合は、−と示した。ＣＤＣでは、特異的溶解率半値をＣＯＬＯ２０５細胞をターゲットとしたときは、７％とし、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞をターゲットとしたときは、２０％とした。そこに達する抗体濃度が１０＜＝ｘ＜１００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋＋、１００＜＝ｘ＜１０００ｎｇ／ｍｌのときは＋＋、ｘ＞＝１０００ｎｇ／ｍｌのときは＋、特異的溶解率が認められなかった場合は、−と示した。ＡＤＣＣでは、ｃＡ３３，ｒｅｃＭ１０及びｒｅｃＱ５４が高い傷害活性を示した。一方、ＣＤＣでは、ｒｅｃＭ１０が高い傷害活性を示した。
【表９】
0004088655.tif 000051
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実施例２０  精製抗体及び組換え型抗体によるウエスタンブロット解析
マウス抗Ａ３３抗体及びｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａ３３抗体は、コンフォメーショナルなエピトープを認識すると報告されている。すなわち、ウエスタンブロッティング解析で、還元条件（５％  β−メルカプトエタノール）下では、反応性が認められないと報告されている。そこで、ヒト抗Ａ３３精製抗体及び組換え型抗体の反応性について調べることを目的とし、ウエスタンブロット解析を実施した。
実施例３で調製したｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質を還元（５％  β−メルカプトエタノール）及び非還元条件下で、１０〜２０％ポリアクリルアミドグラジェントゲル（第一化学薬品社製）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。このとき、１レーンあたりｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質が２．５ｎｇになるように希釈した。一方、マーカーとしてビオチン化ＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード  ブロードレンジ（バイオラッド社製）も１レーンにアプライした。ｓｈＡ３３ＥＸ−ｈＦｃタンパク質をＰＶＤＦ膜にパンザーセミドライエレクトロブロッター（第一化学薬品）にて１５０ｍＡ／枚、１時間ブロットした。ＴＢＳ緩衝液及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ入りＴＢＳ（ＴＴＢＳ）にて、タンパク質がブロッティングされた膜を洗浄し、ブロックエース（大日本製薬社製）にてブロッキングを行った。ＴＴＢＳにて２回を洗浄した。１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡ、１２５Ｍ９６ＡＢＡ、１２５Ｑ４７ＢＡ、及び１２５Ｒ５ＡＡＡＡは、ハイブリドーマ精製抗体を１μｇ／ｍｌで、室温６０分にて反応させた。一方、キメラ抗Ａ３３抗体、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ（すなわちｒｅｃＭ１６５）及び１２５Ｎ２６Ｆ６ＡＡ（すなわちｒｅｃＮ２６）は、組換え型抗体を１μｇ／ｍｌで、室温６０分にて反応させた。ＴＴＢＳで洗浄した後、検出用抗体として、１０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ヒトＫａｐｐａ鎖Ｆ（ａｂ’）２抗体（バイオソース社製）を用いた。このとき、マーカーを検出するために３０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたストレプトアビジンも加えて反応させた。ＴＴＢＳで２回、ＰＢＳで１回洗浄したのち、ウエスタンブロッティングディテクションシステムＥＣＬ−ｐｌｕｓ（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用い、バンドの検出を行った。イメージアナライザーＬＡＳ−１００（フジフィルム社製）を用い、化学発光を取り込み、画像処理を行った。
結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。その結果、１２５Ｑ５４ＡＡＡＡのみ還元条件下でも約６７ｋＤタンパク質のバンドと反応した。その他の抗体は、キメラ抗Ａ３３抗体と同様に非還元条件下でのみ反応が認められた。
実施例２１  精製抗体及び組換え型抗体での免疫組織化学
ヒト抗Ａ３３抗体の特異性、選択性がキメラ抗Ａ３３抗体と同等か否かを評価するために、免疫組織化学によって腫瘍組織切片及び正常組織切片との反応性を解析した。
（１）精製抗体及び組換え型抗体の蛍光標識
実施例８によって調製された各モノクローナル精製抗体あるいは実施例１６で調製された組換え型抗体、ｒｅｃ２６３、１２５Ｍ１０ＡＡ、ｒｅｃＭ１６５、ｒｅｃＮ２６及び１２５Ｑ５４ＡＡＡをＡｌｅｘａ  ＦｌｏｕｒＴＭ４８８（モリキュラー・プローブ社製）で直接標識した。陽性コントロールとしてキメラ抗Ａ３３抗体、陰性コントロールとして抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１抗体も同様に直接標識した。精製抗体及び組換え型抗体の蛍光標識化は以下のように行った。Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ４８８を付属の説明書に従い、実施例８あるいは実施例１６で調製した抗Ａ３３抗体に結合させた。２ｍｇ／ｍｌの精製抗体及び組換え型抗体０．５ｍｌに５０μｌの１Ｍ炭酸緩衝液を添加後、Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ４８８と混合し、撹拌しながら室温１時間反応させた。ヒドロキシルアミンを添加し反応を止め、ゲルろ過カラム（ＮＡＰ５、アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）に混合液を供し、抗体に未結合のＡｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ４８８を除去した。この条件で抗体１分子に４−６つの蛍光物質が結合した。蛍光標識された抗体はＣＯＬＯ２０５細胞に結合し、その結合活性は標識されていない抗体と同等であった。
（２）免疫組織化学
使用した組織切片は、ヒト成人結腸癌凍結組織切片（バイオチェーン社製）、ヒト成人正常結腸凍結組織切片（バイオチェーン社製）、ヒト成人小腸凍結組織切片（バイオチェーン社製）及びヒト成人胃凍結組織切片（バイオチェーン社製）である。１０％ヤギ血清（ギブコ・ビーアールエル社製）含有ＰＢＳで、室温にて１−２時間ブロッキングした。ＰＢＳにて２回洗浄し、実施例２１（１）でＡｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ４８８にて標識された各モノクローナル精製抗体あるいは組換え型抗体を１μｇ／ｍｌで室温３０〜６０分反応させた。その後、封入し、蛍光顕微鏡（ＢＸ５１、オリンパス社製）で観察し、画像はオリンパス社製ＤＰ７０にて解析した。
その結果を図４〜６に示す。Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ  Ｐ．らの報告している大腸癌組織の免疫組織染色（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １９９６  ９：４６５−４７１）と同様にキメラ抗Ａ３３抗体、ｒｅｃ２６３、１２５Ｍ１０ＡＡ、ｒｅｃＭ１６５、ｒｅｃＮ２６及び１２５Ｑ５４ＡＡＡとも結腸癌組織の腺上皮細胞や形成異常腺構造に幅広く、均一に強く染色することが認められた（図４）。また、正常小腸組織（図５）、正常結腸組織（図６）にもキメラ抗Ａ３３抗体と同様な染色が認められた。一方、正常胃組織では、論文でも染色が認められなったのと同様本抗体でも染色が認められなかった。また、陰性コントロールの抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１抗体では、すべての組織で染色は認められなかった。
実施例２２  マウス担癌モデルに対するハイブリドーマ精製抗体及び組換え型抗体の効果
実施例１６から得られたヒト抗Ａ３３組換え型抗体の効果を、以下に記載する方法に従ってマウス担癌モデルを用いて検討した。使用した大腸癌細胞株は、ＣＯＬＯ２０５細胞とＮＣＩ−Ｈ５０８細胞である。
ＣＯＬＯ２０５細胞株を使用したマウス担癌モデルの作製方法は、以下のとおりである。６週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア社より購入）の背部皮下に、大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５を５×１０６／マウス個体で移植した。移植後１、２、７及び１０日後に１０匹１群として、担癌マウスの腹腔内に、キメラ抗Ａ３３及びｒｅｃ２６３抗体１０、１００μｇ／マウス個体（２００μｌの１％ヌードマウス血清含有ＰＢＳに溶解したもの）を投与し、移植７、９、１１、１４、１７、２１日後の腫瘍の大きさを測定した。抗体の陰性コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として、同量のヒト抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１抗体を使用した。「ｖｅｈｉｃｌｅ」は抗体投与をするにあたり溶解するための媒体として使用した１％ヌードマウス血清含有ＰＢＳ（２００μｌ）を示す。
ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞株を使用したマウス担癌モデルの作製方法は、以下のとおりである。６週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア社より購入）の背部皮下に、大腸癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ５０８を腫瘍細胞の生着性を高めるマウス悪性肉腫からなるマトリジェル（ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス社製）と１：１の容量になるように、１×１０７／マウス個体で移植した。移植後１，４及び７日後に１０匹１群として、担癌マウスの腹腔内に、キメラ抗Ａ３３及びｒｅｃ２６３抗体１０、１００μｇ／マウス個体（２００μｌの１％ヌードマウス血清含有ＰＢＳに溶解したもの）を投与し、移植７、１１、１４、１８、２１、２７、３３、４０、４８、５５、６２日後の腫瘍の大きさを測定した。抗体の陰性コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として、同量のヒト抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１抗体を使用した。「ｖｅｈｉｃｌｅ」は抗体投与をするにあたり溶解するための媒体として使用した０．１％ヌードマウス血清含有ＰＢＳ（２００μｌ）を示す。
以上の実験の結果を図７に示す。
ＣＯＬＯ２０５細胞株を移植した系では、ｒｅｃ２６３抗体を１０μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後７、９、１１日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１抗体投与群と比較して、移植後７、９、１１、１４日後に腫瘍の大きさに有意な差が認められた（ｐ＜０．０５）。また、１００μｇ／マウス個体で投与した群では、抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１抗体投与群と比較して、移植後１４，１７日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。一方、キメラ抗Ａ３３組換え型抗体を１０μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後７、１１日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１抗体投与群と比較して、移植後７、９、１１、１４、１７、２１日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。また、１００μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後７，９，１４日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１抗体投与群と比較して、移植後７、９、１１、１４、１７、２１日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）（図７Ａ）。
一方、ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞株を移植した系では、ｒｅｃ２６３抗体を１０μｇ／マウス個体で投与した群では、抗腫瘍効果を全く示さなかった。一方、１００μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後１８日後以降で腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。また、抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１抗体投与群と比較して、ほぼすべての測定日で腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。一方、キメラ抗Ａ３３組換え型抗体を１０μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後２１、５５、６２日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。また、抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１抗体投与群と比較して、移植後７、２１、３３日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。また、１００μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、ほぼすべての測定日で腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。また、抗ＤＮＰ−ＩｇＧ１抗体投与群と比較して、移植後３３日後まで腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。
以上のことから、本発明の抗体は２種類の大腸癌細胞株を用いたマウス担癌モデルで高い抗腫瘍効果を有することが示された（図７Ｂ）。
ヒト抗Ａ３３産生ハイブリドーマ精製抗体及びヒト抗Ａ３３組換え型抗体の効果を、マウス担癌モデルを用いて検討した。使用した大腸癌細胞株は、ＣＯＬＯ２０５細胞とＮＣＩ−Ｈ５０８細胞である。
（１２５Ｍ１０ＡＡ，１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ及び１２５Ｍ９６ＡＢＡハイブリドーマより精製した抗体のＣＯＬＯ２０５細胞株を使用したときの抗腫瘍効果）
６週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア社より購入）の背部皮下に、大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５を５×１０６／マウス個体で移植した。移植後１、３、７、１０、１４、１７日後に１０匹１群として（Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群は、１５匹１群）、担癌マウスの腹腔内に、１２５Ｍ１０ＡＡ、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ及び１２５Ｍ９６ＡＢＡ抗体２０μｇ／マウス個体（２００μｌの１％ヌードマウス血清含有ＰＢＳに溶解したもの）を投与し、移植７、１０、１２、１４、１７日後の腫瘍の大きさを測定した。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は抗体投与をするにあたり溶解するための媒体として使用した１％ヌードマウス血清含有ＰＢＳ（２００μｌ）を示す。
以上の実験の結果を図７Ｃに示す。図７Ｃ中、Ｍ１０は１２５Ｍ１０ＡＡ抗体を、Ｍ９６は１２５Ｍ９６ＡＢＡ抗体を、Ｍ１６５は１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ抗体を示す。１２５Ｍ１０ＡＡ抗体を投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後すべての測定日において腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。また、１２５Ｍ１６５ＤＡＡＡ抗体を投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後１２、１４、１７日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。一方、１２５Ｍ９６ＡＢＡ抗体を投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後１２、１４日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。
（Ｎ２６及びＭ１６５組換え型抗体のＣＯＬＯ２０５及びＮＣＩ−Ｈ５０８細胞株を使用したときの抗腫瘍効果）
６週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア社より購入）の背部皮下に、大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５を５×１０６／マウス個体で移植した。移植後１、３、６日後に１０匹１群として、担癌マウスの腹腔内に、ｒｅｃＮ２６及びｒｅｃＭ１６５抗体１０及び１００μｇ／マウス個体（２００μｌの１％ヌードマウス血清含有ＰＢＳに溶解したもの）を投与し、移植８、１０、１３、１５、１７、２０、２３日後の腫瘍の大きさを測定した。
以上の実験の結果を図７Ｄに示す。図７Ｄ中、Ｍ１６５−１０はｒｅｃＭ１６５抗体（１０μｇ／匹投与）を、Ｍ１６５−１００はｒｅｃＭ１６５抗体（１００μｇ／匹投与）を、Ｎ２６−１０はｒｅｃＮ２６抗体（１０μｇ／匹投与）を、Ｎ２６−１００はｒｅｃＮ２６抗体（１００μｇ／匹投与）を示す。ｒｅｃＮ２６抗体を１０μｇ／ｈｅａｄで投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後１０、１３日後において腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。ｒｅｃＮ２６抗体を１００μｇ／ｈｅａｄで投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後８、１０、１３、１５、１７、２０日後において腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。また、ｒｅｃＭ１６５抗体を１００μｇ／ｈｅａｄで投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後８、１０、１３、１５、１７、２０日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。
６週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア社より購入）の背部皮下に、大腸癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ５０８を腫瘍細胞の生着性を高めるマウス悪性肉腫からなるマトリジェル（ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス社製）と１：１の容量になるように、１×１０７／マウス個体で移植した。移植後１、４及び７日後に１０匹１群（Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群は、１２匹１群）として、担癌マウスの腹腔内に、ｒｅｃＮ２６及びｒｅｃＭ１６５抗体１０及び１００μｇ／マウス個体（２００μｌの１％ヌードマウス血清含有ＰＢＳに溶解したもの）を投与し、移植後１１、１８、２８、３６、４３、５０、５７、６４日後の腫瘍の大きさを測定した。
以上の実験の結果を図７Ｅに示す。図７Ｅ中、Ｎ２６−１０はｒｅｃＮ２６抗体（１０μｇ／匹投与）を、Ｎ２６−１００はｒｅｃＮ２６抗体（１００μｇ／匹投与）を、Ｍ１６５−１０はｒｅｃＭ１６５抗体（１０μｇ／匹投与）を、Ｍ１６５−１００はｒｅｃＭ１６５抗体（１００μｇ／匹投与）を示す。ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞株を移植した系では、ｒｅｃＮ２６抗体を１０μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後１１、１８、３６、４３日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。また、１００μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後１１、１８、２８、３６、５０日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。一方、ｒｅｃＭ１６５抗体を１０μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後１１、１８日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。また、１００μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後全ての測定日において腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。
（Ｍ１０及びＱ５４組換え型抗体のＮＣＩ−Ｈ５０８細胞株を使用したときの抗腫瘍効果）
６週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア社より購入）の背部皮下に、大腸癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ５０８を腫瘍細胞の生着性を高めるマウス悪性肉腫からなるマトリジェル（ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス社製）と１：１の容量になるように、１×１０７／マウス個体で移植した。移植後１、４及び７日後に１０匹１群として、担癌マウスの腹腔内に、ｒｅｅＭ１０及びｒｅｃＱ５４抗体１０及び１００μｇ／マウス個体（２００μｌの１％ヌードマウス血清含有ＰＢＳに溶解したもの）を投与し、移植後１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３日後の腫瘍の大きさを測定した。
以上の実験の結果を図７Ｆに示す。図７Ｆ中、Ｍ１０−１０はｒｅｃＭ１０抗体（１０μｇ／匹投与）を、Ｍ１０−１００はｒｅｃＭ１０抗体（１００μｇ／匹投与）を、Ｑ５４−１０はｒｅｃＱ５４抗体（１０μｇ／匹投与）を、Ｑ５４−１００はｒｅｃＱ５４抗体（１００μｇ／匹投与）を示す。ＮＣＩ−Ｈ５０８細胞株を移植した系では、ｒｅｃＭ１０抗体を１０μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後１４、２１、２８、４２、４９、５６日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。また、１００μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。一方、ｒｅｃＱ５４抗体を１０μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後２８、４２日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）。また、１００μｇ／マウス個体で投与した群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して、移植後１４、２１、２８、３５、４２、５６日後に腫瘍を有意に抑制することが認められた（ｐ＜０．０５）
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想及び発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形及び変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形及び変更をも包含することを意図している。
【産業上の利用可能性】  本発明により、Ａ３３を発現している細胞に起因する疾患に対する予防又は治療剤、特に悪性腫瘍治療薬としてＡ３３多型を有する患者にも有用である分子が提供された。
現在Ａ３３のｍＲＮＡには９つの多型が知られているが、そのうちの７つは非翻訳領域における多型である。また、残りの２つのうちの１つは３番目のコドンにおける多型であるためアミノ酸置換をしないサイレントミューテーションである。また、残りの２つのうちのもう１つはアミノ酸置換を伴う多型であるがシグナル配列内にある。以上のことから、本抗体は、Ａ３３の多型にかかわらず治療、予防剤に有効である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【配列表】
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