(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）
（R1-Mn-X1）mL(X2-X3-R2)q  （I）
｛式中、MはOCH2CH2を表し、nは10〜100,000の正の整数を表し、mは3または4であり、
mが3のとき、Lは下記式(i)〜(v)のいずれかで表される基を表し、
【化１】
0004152187.tif 000031
（式中、RX1、RX2、RX3、RX4のうち、１箇所は水素原子であり、残りの３箇所は結合手を表し、RY1、RY2、RY3、RY4のうち、１箇所は水素原子であり、残りの３箇所は結合手を表す）
mが4のとき、Lは下記式(iii)又は(v)で表される基を表し、
【化２】
0004152187.tif 000032
qは1であり、R1はC1-8アルキルを表し、
X2-X3-R2は下記式(vi)〜(x)のいずれかで表される基を表し、
【化３】
0004152187.tif 000033
X1はR4-NH-C(=O)-R5(式中、R4は結合またはCH2を表し、R5は結合を表す）を表す｝で表わされる分岐型ポリアルキレングリコール。
【請求項２】
下記式(xi)〜(xviii)のいずれかで表される分岐型ポリアルキレングリコール。
【化４】
0004152187.tif 000034
[式中、Z1は
【化５】
0004152187.tif 000035
(式中、nは前記と同義である)
を表し、
Z2は
【化６】
0004152187.tif 000036
(式中、nは前記と同義である)
を表し、
Y1は、すべて前記のZ1を表すか、またはいずれか３つが前記のZ1を表し、他の１つは水素原子を表し、
Y2は、すべて前記のZ2を表すか、またはいずれか３つが前記のZ2を表し、他の１つは水素原子を表す]
【請求項３】
下記式(xi)で表される分岐型ポリアルキレングリコール。
【化７】
0004152187.tif 000037
(式中、Z1は前記と同義である)
【請求項４】
下記式(xii)で表される分岐型ポリアルキレングリコール。
【化８】
0004152187.tif 000038
(式中、Z1は前記と同義である)
【請求項５】
nが100〜1,000である請求項１〜４のいずれかに記載の分岐型ポリアルキレングリコール。
【請求項６】
分子量が500〜1,000,000である請求項１〜５のいずれかに記載の分岐型ポリアルキレングリコール。
【請求項７】
インターフェロン-α（Interferon-α）、インターフェロン-β（Interferon-β）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor）、スーパーオキサイドディスムターゼ（Superoxide dismutase）、および抗GD3抗体から選ばれる生理活性ポリペプチドが、請求項１〜６のいずれかに記載の分岐型ポリアルキレングリコールで修飾された化学修飾ポリペプチド。
【請求項８】
インターフェロン-β（Interferon-β）、および顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor）から選ばれる生理活性ポリペプチドが、請求項１〜６のいずれかに記載の分岐型ポリアルキレングリコールで修飾された化学修飾ポリペプチド。
【請求項９】
顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor）が、請求項１〜６のいずれかに記載の分岐型ポリアルキレングリコールで修飾された化学修飾ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の化学修飾ポリペプチドを含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生理活性を有するポリペプチド（生理活性ポリペプチド）の修飾剤として有用な分岐型構造を有するポリアルキレングリコール類および該ポリアルキレングリコール類で修飾された生理活性ポリペプチドに関する。さらに、該ポリアルキレングリコール類で修飾された生理活性ポリペプチドを含有する医薬に関する。
背景技術
生理活性ポリペプチドは特定の疾病に対する治療剤として有用であるが、血中に投与されると安定性が悪く、十分な薬理効果が期待できない場合が多い。例えば、分子量が６０，０００程度以下の生理活性ポリペプチドは血中に投与されても腎臓の糸球体より濾過され、大部分が尿中に排泄されるため、治療剤として用いられたとしても大きな治療効果が得られず、繰り返しの投与が必要になる場合が多い。また、他の生理活性ポリペプチドは血中に存在する加水分解酵素等によって分解され、生理活性を失うことがある。さらに、外因性の生理活性ポリペプチドにおいてもその生理活性が疾患の治療に有効なことがあるが、そのような外因性の生理活性ポリペプチドや遺伝子組換えによって製造された生理活性ポリペプチド等は内因性の生理活性ポリペプチドと構造が異なるために、血中に投与された場合には免疫反応を誘発し、アナフィラキシーショック等の重篤な副作用を起こす場合があることが知られている。さらに、生理活性ポリペプチドによってはそれが治療剤として用いられる際に、溶解性が悪い等の物性面が問題になることも多い。
生理活性ポリペプチドを治療剤として用いる際のこれらの問題を解決する方法の一つとして、１分子以上の不活性型ポリマー鎖を生理活性ポリペプチドに化学的に結合させる方法が知られている。多くの場合、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類を該ポリペプチドに化学的に結合させることによって、該ポリペプチドや蛋白質に望ましい特性が付与されている。
例えば、ポリエチレングリコールで修飾されたスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）では血中の半減期が著しく延長され、作用の持続性が見出されている［ファーマシューティカル  リサーチ  コミュニケーション（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９巻、２８７頁（１９８７年）］。また、顆粒球コロニー形成刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のポリエチレングリコール修飾も知られている［ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１１５巻、８１４頁（１９９４年）］。その他にもアスパラギナーゼ、グルタミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ウリカーゼ等のポリエチレングリコール修飾ポリペプチドの例がＧｉｌｌｉａｎ  Ｅ．Ｆｒａｎｃｉｓらによってまとめられている［ファーマシューティカル  バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、３巻、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ、２３５頁（１９９２年）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ］。また、生理活性ポリペプチドをポリアルキレングリコールで修飾することによって得られる効果としては、熱安定性が高まること［生物物理、３８巻、２０８頁（１９９８年）］、有機溶媒に可溶となること［バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチコミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．：ＢＢＲＣ）、１２２巻、８４５頁（１９８４年）］等も知られている。
一方、ペプチドや蛋白質とポリアルキレングリコールとの結合方法についても、例えばポリアルキレングリコールの末端にカルボン酸の活性エステル、マレイミド基、カーボネート、塩化シアヌル、ホルミル基、オキシラニル基等を導入してポリペプチドのアミノ基やチオール基に結合する方法が知られている［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］。これらの技術の中には、生理活性ポリペプチドの特定のアミノ酸残基に特異的にポリエチレングリコールを結合し、該ペプチドまたは蛋白質の生物活性を損なわずに血中安定性を向上させた例も含まれる。生理活性ポリペプチド中のアミノ酸残基特異的なポリエチレングリコール修飾の例としては、成長ホルモン放出因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）のカルボキシ末端にノルロイシンのスペーサーを介してポリエチレングリコールを結合した例［ジャーナル  オブ  ペプチド  リサーチ（Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．）、４９巻、５２７頁（１９９７年）］、インターロイキン−２の３位に遺伝子組換えによってシステインを導入しこの部位に特異的にポリエチレングリコールを結合した例［バイオテクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、８巻、３４３頁（１９９０年）］等が知られている。
前記ポリアルキレングリコール修飾ポリペプチドの多くは、直鎖型のポリアルキレングリコールを結合させる方法により得られるが、高活性の化学修飾ポリペプチドを得る方法として、分岐型ポリエチレングリコールを結合させる方法が優れていることが見出されている。一般的に、ポリアルキレングリコールの分子量が大きいほど、あるいは修飾率が高いほど化学修飾ポリペプチドの血中持続性は向上することが知られているが［ザ・ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６３巻、１５０６４頁（１９８８年）］、修飾率を高くすると生理活性ポリペプチドの生理活性が損なわれる場合がある。これは、生理活性に必要な生理活性ポリペプチド中の特定のアミノ基やチオール基等が化学修飾剤によって修飾されることが一つの原因である。修飾率に応じて生理活性が低下する例としてはインターロイキン−１５が知られている［ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７２巻、２３１２頁（１９９７年）］。
一方、分子量の大きいポリアルキレングリコール類では、分子量分布が均一かつ純度の高いものを合成することが困難である。例えば、モノメトキシポリエチレングリコールの場合、不純物としてジオール成分の混入が知られている。そこで、現在利用できる分子量分布が狭くて高純度のポリアルキレングリコール類を分岐させることによって分子量の大きい修飾剤を調製しようとする試みが行われている。これによって、修飾率を低減しても高い持続性を保持したまま高い生理活性を有する化学修飾ポリペプチドが得られる。また、ポリアルキレングリコール類を分岐させることで生理活性ポリベプチド分子のより多くの表面をポリアルキレングリコール類で覆うことができると考えられている。例えば、分岐構造を有する基に塩化シアヌルを利用した２本鎖型のポリエチレングリコール誘導体が知られている（特開平３−７２４６９、特開平３−９５２００）。この場合、平均分子量５，０００のメトキシポリエチレングリコールが利用されているが、この化合物ではトリアジン環由来の毒性が懸念される。また、特開平１−１５３０８８には、ポリエチレングリコールと無水マレイン酸の共重合体である櫛形ポリエチレングリコールからは直鎖型ポリエチレングリコールと比較して低い修飾率で高活性の化学修飾ポリペプチドが得られることが開示されているが、この化合物ではポリペプチドとの反応サイトが多数存在するため生理活性ポリペプチドの生理活性を損なうばかりでなく、分子量分布が均一ではない。また、桂皮酸を原料に用いベンゼン環を介してポリエチレングリコールを２本分岐させた例（特開平３−８８８２２）、リジンを原料に用い、ポリエチレングリコールを２本分岐させた例（ＷＯ９６／２１４６９、ＵＳ５，６４３，５７５）等も知られている。
以上の例に示されるようにポリアルキレングリコール類を２本分岐させた構造の化合物は知られているが、３本以上分岐させた構造の化合物は製造されていない。なお、ＵＳ５，６４３，５７５には水溶性で非抗原性のポリマーを３分岐した化合物が示唆されているが、３分岐した構造の化合物の製造方法および具体的な実施例等に関しては何ら開示されておらず、３分岐化合物の優れた効果に関しても何ら知見が得られていない。
生理活性ポリペプチドの活性を低下させずに、腎臓の糸球体での濾過が抑制され、より持続性に優れた化学修飾ポリペプチドが求められている。また、そのような性質を発揮する化学修飾ポリペプチドを製造するための、毒性が低く、安定性が改善され、分子サイズの増大効果に優れた分子量分布が狭く均一な修飾剤が求められている。
発明の開示
本発明の目的は、第一に生理活性ポリペプチドの化学修飾剤として分子サイズを増大させる効果に優れたポリアルキレングリコール鎖を有する分岐型の化学修飾剤を提供することにある。第二には、該分岐型のポリアルキレングリコールで修飾された生理活性ペプチドを提供することにある。
本発明者らは、生理活性ポリペプチドを修飾するための新規構造を有する分岐型ポリアルキレングリコール修飾試剤について鋭意検討した。その結果、ポリアルキレングリコール類を３本以上分岐させることで、従来知られている直鎖型あるいは２本鎖型ポリアルキレングリコール類以上の分子サイズ増大効果を有する修飾試剤が得られることを見出した。さらに、生理活性ポリペプチドを上記分岐型ポリアルキレングリコール類で修飾したところ、３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール修飾生理活性ポリペプチドにおいては、該生理活性を保持したまま、従来の直鎖型あるいは２本鎖型ポリアルキレングリコール類で修飾された生理活性ポリペプチドに比べ、予想以上に腎臓の糸球体での濾過が抑制され、血中持続性が著しく向上されることを見出した。
以上のように、前記分岐型ポリアルキレングリコール類が化学修飾剤として優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は３本以上の１本鎖ポリアルキレングリコール類が結合し、かつポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が結合した分岐型ポリアルキレングリコール類、生理活性ポリペプチドまたはその誘導体の該ポリアルキレングリコール修飾体、および該ポリアルキレングリコール修飾体を含有する医薬あるいは治療剤を提供するものである。また、別の観点からは、本発明は、生理活性ポリペプチドまたはその誘導体が少なくとも１個の上記ポリアルキレングリコール類で直接もしくはスペーサーを介して修飾された化学修飾ポリペプチド、および該化学修飾ポリペプチドを含有する医薬あるいは治療剤に関する。
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類としては、１本鎖ポリアルキレングリコール類が３本以上結合し、かつ、ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が結合していれば、いかなる分岐型ポリアルキレングリコール類も包含される。好ましくは１本鎖ポリアルキレングリコール類が３本以上結合し、かつ、ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が１〜３個所結合している分岐型ポリアルキレングリコール類、さらに好ましくは１本鎖ポリアルキレングリコール類が３本〜４本結合し、かつ、ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基が１個所結合している分岐型ポリアルキレングリコール類があげられる。
１本鎖ポリアルキレングリコール類としては、１本鎖ポリアルキレングリコール類であればいかなるものも包含されるが、好ましくはＲ１−Ｍｎ−Ｘ１（式中、Ｍ、ｎ、Ｒ１およびＸ１は下記と同義である）があげられる。
ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基としては、ポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基、あるいは該反応性を有する基に変換可能な基であればいかなるものも包含される。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類として好ましくは、式（Ｉ）
0004152187.tif 000002
｛式中、Ｌは４以上分岐が可能な基を表し、
ＭはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒおよびｓは同一または異なって、任意の正の整数を表す）または
（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記ｒおよびｓと同義である）を表し、
ｎは任意の正の整数を表し、
ｍは３以上の整数を表し、
ｑは１〜３の整数を表し、
Ｒ１は水素原子、低級アルキルまたは低級アルカノイルを表し、
Ｒ２はポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基を表し、
Ｘ１は結合、Ｏ、Ｓ、アルキレン、（ＯＣＨ２）ｔａ（式中、ｔａは１〜８の整数を表す）、（ＣＨ２）ｔｂＯ（式中、ｔｂは前記ｔａと同義である）、ＮＲ３（式中、Ｒ３は水素原子または低級アルキルを表す）、Ｒ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５［式中、Ｒ４は結合、アルキレンまたはＯ（ＣＨ２）ｔｃ（式中、ｔｃは前記ｔａと同義である）を表し、Ｒ５は結合、アルキレンまたはＯＲ５ａ（式中、Ｒ５ａは結合またはアルキレンを表す）を表す］、Ｒ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７［式中、Ｒ６は結合、アルキレンまたはＲ６ａＯ（式中、Ｒ６ａは前記Ｒ５ａと同義である）を表し、Ｒ７は結合、アルキレンまたは（ＣＨ２）ｔｄＯ（式中、ｔｄは前記ｔａと同義である）を表す］、Ｒ８−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８は前記Ｒ５ａと同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９（式中、Ｒ９は前記Ｒ５ａと同義である）を表し、
Ｘ２は結合、Ｏまたは（ＣＨ２）ｔｅＯ（式中、ｔｅは前記ｔａと同義である）を表し、
Ｘ３は結合またはアルキレンを表し、
３つ以上のＲ１−Ｍｎ−Ｘ１はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２が２または３個存在する場合（ｑが２または３である場合）には、それらは同一でも異なっていてもよい｝で表される化合物［以下、式（Ｉ）で表される化合物を化合物（Ｉ）と称する。他の式番号の化合物についても同様とする］があげられる。
式（Ｉ）の各基の定義において、低級アルキルおよび低級アルカノイルの低級アルキル部分は、直鎖状または分岐状の炭素数１〜８の、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等を包含する。アルキレンは、炭素数１〜８の、例えばメチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ｔｅｒｔ−ブチレン、ペンチレン、ネオペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン等を包含する。
式（Ｉ）において、ＭはＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒおよびｓは同一または異なって、任意の正の整数を表す）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記ｒおよびｓと同義である）を表し、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｓ（式中、ｒおよびｓはそれぞれ前記と同義である）または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒａ−［ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２］ｓａ（式中、ｒａおよびｓａはそれぞれ前記と同義である）である場合、ｒおよびｓ並びにｒａおよびｓａは、好ましくは１〜１００，０００であり、さらに好ましくは１〜１，０００である。
式（Ｉ）において、ｎは任意の正の整数を表し、好ましくは１０〜１００，０００であり、さらに好ましくは１００〜１，０００である。
Ｍｎで表されるポリアルキレングリコール部分の平均分子量は、約１，０００〜１，０００，０００が好ましく、５，０００〜１００，０００がさらに好ましい。Ｍｎが−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−である場合、原料となるポリエチレングリコール類はＭｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ（数平均分子量）で表される分子量分布が１．１以下の単分散のものが望ましく、平均分子量３０，０００以下であれば市販のものを用いることができる。例えば、平均分子量が２，０００、５，０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００等のモノメトキシポリエチレングリコールが利用できる。
式（Ｉ）において、ｑは１〜３の整数を表し、好ましくは１である。
式（Ｉ）において、ｍは３以上の整数を表し、好ましくは３〜４である。
式（Ｉ）で表される分岐型ポリアルキレングリコール類の分子量は、５００〜１，０００，０００の範囲にあることが好ましい。
式（Ｉ）において、Ｌは４以上分岐が可能な基であり、Ｌ上の置換基として、水酸基、置換もしくは非置換の低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、カルボキシ、シアノまたはホルミル等を有していてもよい。ここで、低級アルキルおよび低級アルコキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義であり、置換低級アルキルにおける置換基としては、水酸基、アミノ、低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルコキシ、低級アルコキシアルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルバモイル、低級アルキルカルバモイルオキシ等があげられる。低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルコキシ、低級アルコキシアルコキシ、低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルバモイルおよび低級アルキルカルバモイルオキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。
Ｌで表わされる４以上分岐が可能な基としては、Ｘ２−Ｘ３を介してポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基に変換可能な基、あるいは該反応性を有する基を結合でき、Ｘ１を介して１本鎖ポリアルキレングリコール類を３分子以上分岐させることができればいかなる基を用いてもよい。Ｌとしては、例えばポリオール類、ポリカルボン酸等で、分子量１，０００以下の化合物から水素原子４個以上を除いた基があげられる。ポリオール類の具体例としては、グルコース、Ｄ，Ｌ−ソルビトール、リボース、エリスリトール、ペンタエリスリトール、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ）、イノシトール、コール酸、３，４，５−トリヒドロキシベンゾイックアシッド（３，４，５−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，Ｇａｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、２，４，６−トリヒドロキシベンゾイックアシッド、３，４，５−トリヒドロキシベンズアルデヒド、キナ酸（Ｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、シキミ酸（Ｓｈｉｋｉｍｉｃ  ａｃｉｄ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の低分子化合物およびそれらの立体異性体等があげられ、ポリカルボン酸の具体例としては、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸、ピロメリト酸、ジエチレントリアミンペンタアセティックアシッド、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸、クエン酸、γ−カルボキシグルタミン酸等の低分子化合物およびそれらの立体異性体等があげられる。
Ｌとして好ましい基としては、トリシンから水素原子４個以上を除いた基、シキミ酸から水素原子４個以上を除いた基、キナ酸から水素原子４個以上を除いた基、エリスリトールから水素原子４個以上を除いた基、ペンタエリスリトールから水素原子４個以上を除いた基およびグルコースから水素原子４個以上を除いた基等があげられる。
Ｌ部分の構造の構築は、例えば市販品の化合物をそのまま利用するか、一般の有機合成法によってポリアルキレングリコール類の結合に適した形に誘導体化して利用するか、あるいは官能基の保護を行った後に利用して行うことができる［日本化学会編、実験化学講座  第４版（１９９２年）、有機合成Ｉ〜Ｖ、丸善、プロテクティブ  グループス  イン  オーガニック  シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第２版、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ  インコーポレイテッド（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）（１９９１年）等］。
上記で例示した以外のシクロヘキサン類は、例えば木檜ら［大有機化学、第６巻、１８３頁（１９５８年）、朝倉書店］またはＧ．Ｅ．ＭｃＣａｓｌａｎｄとＥ．Ｃｌｉｄｅ  Ｈｏｒｓｗｉｌｌ［ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、７６巻、２３７３頁（１９５４年）］の方法等に従って合成することができる。
化合物（Ｉ）において、Ｘ１を介したポリアルキレングリコール類とＬとの結合は通常の有機合成法で知られている反応を容易に組み合わせて行うことができる［日本化学会編、実験化学講座  第４版、１９−２３頁（１９９２年）、有機合成Ｉ〜Ｖ、丸善］。
式（Ｉ）において、Ｒ２はポリペプチド中のアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基と反応性を有する基か、該反応性を有する基に変換可能な基を表す。
すなわち、上記反応性を有する基としては、ポリペプチド中の、リジン、システイン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン等の各側鎖、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基のいずれかと反応性を有する基が包含され、例えば水酸基、カルボキシ、ホルミル、アミノ、ビニルスルホニル、メルカプト、シアノ、カルバモイル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、オキシラニル、低級アルカノイルオキシ、マレイミド、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、イミダゾリルカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシ、トレシル、低級アルカノイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアロイルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールジスルフィド、アジド等があげられる。
上記の各基の定義において、低級アルコキシカルボニルオキシ、ハロゲン化低級アルキル、低級アルカノイルオキシおよび低級アルカノイルオキシカルボニルの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。アリールオキシカルボニル、アリールオキシカルボニルオキシおよびアリールジスルフィドのアリール部分としては、炭素数６〜１４の、例えばフェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル等があげられる。アロイルオキシカルボニルのアロイル部分としては、炭素数７〜１３の、例えばベンゾイル、ナフトイル、フタロイル等があげられる。ハロゲン化カルボニルおよびハロゲン化低級アルキルのハロゲン部分としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられる。
置換低級アルコキシカルボニルオキシにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えば、水酸基、カルボキシ、ハロゲン等があげられる。ここで、ハロゲンは、前記と同義である。
置換アリールオキシカルボニル、置換アリールオキシカルボニルオキシ、置換アリールジスルフィドおよび置換アロイルオキシカルボニルにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えば水酸基、カルボキシ、ハロゲン、シアノ、低級アルキル等があげられる。ここで、ハロゲンおよび低級アルキルは、それぞれ前記と同義である。
Ｒ２で表される基は、Ｌ部分の構造を構築する原料に含まれていてもよいし、該原料化合物中の必要な官能基をあらかじめ適当な保護基［ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．（１９９１年）等］で保護し、Ｘ１を介してポリアルキレングリコール類をＬに結合して分岐させた後に脱保護、さらには必要により変換して形成してもよい。さらにポリアルキレングリコール類をＸ１を介してＬから分岐させた後に、通常の有機合成法によってＬに必要によりＸ２またはＸ３を介して前記Ｒ２を導入することもできる。
より具体的には、例えば以下の製造法で本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類を製造することができる。なお、本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類の製造法は、これらに限定されるものではない。
製造法１：Ｘ１が結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａまたは（ＣＨ２）ｔｂＯである化合物の製造
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１が結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａ（式中、ｔａは前記と同義である）、または（ＣＨ２）ｔｂＯ（式中、ｔｂは前記と同義である）である化合物（Ｉａ）は、例えば以下の方法により製造することができる。
水酸基を３個所以上有するポリオール類を、無水状態でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、ポリアルキレングリコールまたはそのモノアルキルエーテルもしくはモノカルボン酸エステル（以下、これらをまとめてポリアルキレングリコール類Ａという）のハロゲン化物もしくはトシル化物を３モル以上加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜１０日間反応させて、３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物が得られる。
ポリオール類はキナ酸、グルコース、ソルビトール、リボース、エリスリトール、ペンタエリスリトール、トリシン、イノシトール等の市販の化合物、または市販の化合物から導かれる化合物等から選ばれる。市販の化合物から導かれる化合物としては、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸（１，２，４，５−ｂｅｎｚｅｎｅｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｃ  ａｃｉｄ）等から選ばれるポリカルボン酸を通常の有機合成法［日本化学会編、実験化学講座  第４版、１９〜２１巻（１９９２年）、丸善］に従って適当な還元剤で還元することによって得られるポリオール類等があげられる。還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素等があげられる。
ポリオール類中の水酸基の配置は何れでもよく、反応に不必要な官能基をＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．（１９９１年）等に記載の方法によって適当に保護、あるいは誘導体化してから、反応に使用することができる。
ポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物およびトシル化物はＳａｍｕｅｌ  Ｚａｌｉｐｓｋｙの総括［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］等に開示された各種の方法で容易に製造することができる。結合に使用するポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物およびトシル化物としては分子量分布が均一であれば（好ましくは、Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）いかなる平均分子量のものも用いられる。
得られた３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物はそのままの純度、あるいはイオン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、二相分配、再結晶等の既知の方法で３本鎖、４本鎖、５本鎖、またはそれ以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を分岐数に応じて任意の純度に精製、単離して、次のステップに用いることができる。ここまでの工程で、化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２が水酸基である化合物（Ｉａｊ）のいくつかが得られる。
一方、ポリハライド類またはポリトシル類とポリアルキレングリコール類Ａを使用することによっても目的の３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を調製することができる。この場合、３モル相当以上のポリアルキレングリコール類ＡをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１モルのポリアルキレングリコール類Ａあたり１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１モル相当のポリハライド類またはポリトシル類を加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜１０日間反応させて目的物が得られる。
ポリハライド類は市販の化合物であるか、前記ポリオール類をハロゲン化合物に変換［日本化学会編、実験化学講座、第４版、１９巻（１９９２年）、丸善］して得られる。ポリトシル類はポリオール類をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、水酸基当たり１〜３０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、カリウムナフタレン等の適当な塩基の存在下、水酸基当たり１〜３モル相当のハロゲン化トシルを加えて、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させることで得ることができる。
次に、得られた３本鎖以上の分岐型ポリアルキレングリコール類を含む混合物または精製化合物に、Ｒ２を導入する。Ｒ２としては、ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物をポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類に結合した後、ポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類に残存している官能基をそのまま利用するか、あるいはあらかじめポリオール類に結合している官能基を保護しておき、ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を結合後、官能基の保護基を除去して得られる基を利用してもよい。この場合、前記ポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類中の１個所以上の水酸基、または他の官能基を適当な保護基で保護した後、前記と同様の方法で残りの水酸基、ハロゲンまたはトシル基部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を導入し、３本以上のポリアルキレングリコールが結合した化合物を合成し、保護基を除去した官能基をそのまま利用するか、あるいは該官能基の少なくとも一つを後述する方法に従ってＲ２に変換する。ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を結合する前、もしくは結合した後にポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類に存在する官能基としては、水酸基の他に、カルボキシ、アミノ、ハロゲン、シアノ、ホルミル、カルボニル等がある。適当な官能基の保護基としては水酸基の場合、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、アセチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ジメチルｔｅｒｔ−ブチルシリル、ジフェニルｔｅｒｔ−ブチルシリル、トリメチルシリル、トリフェニルシリル、トシル、テトラヒドロピラニル等があげられ、アミノの場合、メチル、エチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ニトロベンジルオキシカルボニル、Ｎ−フタルイミド、アセチル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル等があげられ、カルボキシの場合、ベンジル、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、９−フルオレニルメチル、メトキシエトキシメチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、シンナモイル、アリル、ニトロフェニル等があげられ、ホルミルの場合、ジメチルアセタール、ジエチルアセタール、ジベンジルアセタール、１，３−ジオキサニル等があげられる［ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．（１９９１年）］。
あらかじめ存在する官能基をそのまま、または保護、脱保護してＲ２として利用でき、Ｌ部分の構造を構築する原料となるポリオール類、ポリハライド類またはポリトシル類の具体例としては、シキミ酸、キナ酸、３，４，５−トリヒドロキシベンゾイックアシッド、コール酸またはこれらのハライド、トシル化物等があげられる。
化合物（Ｉ）のうち、Ｌを含む化合物に新たに置換基Ｒ２を導入して得られる化合物の場合、例えば以下の製造方法で容易に製造を行うことができる。
製造法１−１
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がカルボキシである式（Ｉａａ）
0004152187.tif 000003
（式中、Ｘ１ａは結合、Ｏ、アルキレン、Ｏ（ＣＨ２）ｔａまたは（ＣＨ２）ｔｂＯを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｍ、ｑ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物、
Ｒ２がカルバモイルである式（Ｉａｂ）
0004152187.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｍ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物、
Ｒ２がシアノである式（Ｉａｃ）
0004152187.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｍ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は例えば以下のように合成することができる。
化合物（Ｉａａ）、化合物（Ｉａｂ）および化合物（Ｉａｃ）は、ポリオール類を用いて、例えば製造法１に従って得られる化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２として水酸基を有する化合物（Ｉａｊ）を含む反応混合物または精製化合物を水、塩化メチレン、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒中、触媒量または１〜２０％の塩基存在下、１〜３０モル相当のアクリル酸、アクリルアミド、アクリロニトリル等と、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させて得ることができる。塩基としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム等があげられる。また、化合物（Ｉａａ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）を含む反応混合物または精製化合物を無水状態でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モル相当のα−ハロゲン化酢酸エステルと、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応させた後、加水分解して得ることもできる。さらに、化合物（Ｉａａ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モルのスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール等の活性化剤と、−２０〜１００℃で１時間〜１０日間反応させて活性化し、その後、γ−アミノ酪酸、グリシン、β−アラニン等のアミノ酸またはその誘導体と反応させることによっても得られる。
また、製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）を前記同様の塩基存在下、無水コハク酸、無水グルタル酸等の酸無水物と反応させることによっても化合物（Ｉａａ）を製造することができる。
また、化合物（Ｉａａ）は、例えばポリハライド類を用いて製造法１に従って、化合物（Ｉａ）のうちＲ２がハロゲン化低級アルキルである化合物（Ｉａｉ）を製造した後、ヒドロキシカルボン酸エステル、マロン酸エステル、γ−アミノ酪酸のエステル体、β−アラニンのエステル体、グリシンのエステル体等をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、化合物（Ｉａｉ）を加え、−２０〜１５０℃で１時間〜数日間反応を行った後、加水分解して得ることもできる。
さらに、化合物（Ｉａａ）は、例えば前記ポリオール類もしくはポリハライド類の一個所以上の水酸基またはハロゲンを、あらかじめカルボン酸あるいはカルボン酸の保護体を含む残基で置換し、これを用いて製造法１で示した方法でポリオール類もしくはポリハライド類の残りの３個所以上の水酸基またはハロゲンをポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物で置換することで得ることもできる。この場合、カルボン酸またはカルボン酸の保護体を含む残基の導入は、前記と同様にして行うことができる。カルボン酸を保護した場合には、ポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物をポリオール類もしくはポリハライド類に導入した後に脱保護して遊離カルボン酸を生成させる。
カルボン酸に変換された化合物は、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、二相分配、再結晶等の既知の方法で、任意の純度で精製、単離することができる。
製造法１−２
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がアミノである式（Ｉａｄ）
0004152187.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｍ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば製造法１−１で得られる化合物（Ｉａｃ）に適当な還元剤を作用させて得られる。還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素等があげられる。
また、化合物（Ｉａｄ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｉ）または化合物（Ｉａｉ）中のハロゲン部分がトシル基で置換された化合物に５当量〜過剰量のエチレンジアミン、プロピレンジアミン等のジアミン類を適当な塩基存在下で反応させることによっても得られる。
さらに、製造法１−１で示したのと同様に、化合物（Ｉａｄ）は、例えば化合物（Ｉａｊ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、１〜５０モルの水素化ナトリウム、酸化亜鉛、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン等の適当な塩基の存在下、１〜５０モルのスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール等の活性化剤と、−２０〜１００℃で１時間〜１０日間反応させて活性化し、その後、１当量〜過剰量のエチレンジアミンやプロピレンジアミン等のジアミン類と適当な塩基存在下で反応させることによっても得られる。
また、化合物（Ｉａｄ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上のアミノまたはアミノの保護体を導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がマレイミドである式（Ｉａｅ）
0004152187.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｍ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＯｓｋａｒ  Ｋｅｌｌｅｒらの方法［ヘルベチカ  キミカ  アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、５８巻、５３１頁（１９７５年）］またはＴｉｍｏｔｈｙ  Ｐ．Ｋｏｇａｎらの方法［シンセティック  コミュニケーション（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎ．）、２２巻、２４１７頁（１９９２年）］に従い、化合物（Ｉａｄ）とＮ−アルコキシカルボニルマレイミドとを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中で反応させることで得ることができる。Ｎ−アルコキシカルボニルマレイミドとしてはＮ−エトキシカルボニルマレイミドやＮ−メトキシカルボニルマレイミドを用いることができる。
また、化合物（Ｉａｅ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上のマレイミドを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｄ）、化合物（Ｉａｅ）およびそれらの合成中間体は、前記と同様の方法でポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１−３
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がホルミルである式（Ｉａｆ）
0004152187.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｍ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａ）のうちＲ２としてヒドロキシメチルを有する化合物（Ｉａｇ）を適当な酸化剤で酸化することで得られる。酸化剤としては塩化クロム酸ピリジニウム、クロム酸、銀イオン、ジメチルスルホキシド等があげられる。また、化合物（Ｉａａ）を前記と同様に適当な還元剤で還元することによっても得ることができる。
また、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）、化合物（Ｉａｉ）または化合物（Ｉａｉ）中のハロゲン部分がトシル基で置換された化合物にアミノエチルアセタール、ヒドロキシエチルアセタール、ハロゲン化エチルアセタール、ハロゲン化メチルアセタール等を結合させ、次いでアセタールを除去することによってもホルミルを導入することができる。
同様にして、製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）を用い、製造法１−１で示した方法に準じて水酸基を活性化し、続いてアミノエチルアセタール、ヒドロキシエチルアセタール等を結合させ、次いでアセタールを除去することによってもホルミルを導入することができる。
また、化合物（Ｉａｆ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上のアルデヒド、あるいはアルデヒドの保護体を導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法でも得られる。
化合物（Ｉａｆ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法でポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１−４
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がハロゲン化カルボニルである式（Ｉａｈ）
0004152187.tif 000009
（式中、Ｚ１はハロゲンを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｍ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＲ２がカルボキシである化合物（Ｉａａ）をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で１〜２４時間加熱することによって得られる。
ハロゲン化カルボニルにおけるハロゲンは前記ハロゲンと同義である。
製造法１−５
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がハロゲン化低級アルキルである式（Ｉａｉ）
0004152187.tif 000010
（式中、Ｚ２はハロゲン化低級アルキルを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｍ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＲ２が水酸基である化合物（Ｉａｊ）をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で１〜２４時間加熱することによって得られる。ハロゲン化低級アルキルにおけるハロゲンおよび低級アルキル部分はそれぞれ前記と同義である。
また、化合物（Ｉａｉ）は、例えば製造法１で得られる化合物（Ｉａｊ）またはＲ２がアミノである化合物（Ｉａｄ）に、前記同様適当な塩基存在下、５当量〜過剰量のジブロモエタンやジブロモプロパン等のジハロゲン化アルキル類を反応させることによっても得られる。
さらに、化合物（Ｉａｉ）は、例えば前記製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上のハロゲン化低級アルキルを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法によっても得られる。
化合物（Ｉａｉ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法でポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度のものとして単離、精製することができる。
製造法１−６
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がイソシアナートである式（Ｉａｋ）
0004152187.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｍ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば、化合物（Ｉａｄ）をトルエン、テトラヒドロフラン、塩化メチレン等の適当な溶媒中、ホスゲンまたは塩化オキサリルと０〜１５０℃で１〜２４時間反応させるか、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールと反応させた後に室温で分解させて得られる。
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がイソチオシアナート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）である化合物（Ｉａｐ）はホスゲンの代わりにチオホスゲンを用いる以外は上記の方法に従って製造することができる。
製造法１−７
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がスクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニルまたはフタルイミドオキシカルボニルである式（Ｉａｌ）
0004152187.tif 000012
（式中、Ｒ２ａはスクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニルまたはフタルイミドオキシカルボニルを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｍ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、通常のエステル合成方法に従って製造することができる。
例えば、化合物（Ｉａａ）１モルに対し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、置換もしくは非置換の水酸化アリール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはＮ−ヒドロキシフタルイミド１〜１０モルを、１〜１０モルのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤存在下、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド等の適当な溶媒中、−２０〜１００℃で１〜２４時間反応させることによって目的物を得ることができる。より詳しくは、Ａ．Ｆｒａｄｅｔら［ポリマー  ブルチン（Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．）、４巻、２０５頁（１９８１年）］、またはＫ．Ｇｅｃｋｅｌｅｒら［ポリマー  ブルチン（Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．）、１巻、６９１頁（１９７９年）］によるポリアルキレングリコールの末端にカルボキシル基を導入する方法、カルボキシメチルポリアルキレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造方法等に準じて得ることができる。
ここで、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルは前記と同義である。水酸化アリールのアリール部分はアリールオキシカルボニルのアリール部分と同義であり、置換水酸化アリールの置換基は、置換アリールオキシカルボニルの置換基と同義である。
製造法１−８
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２がビニルスルホニルである式（Ｉａｍ）
0004152187.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｍ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えば化合物（Ｉａｊ）を用いてＭａｒｇｈｅｒｉｔａ  Ｍｏｒｐｕｒｇｏらの方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、７巻、３６３頁（１９９６年）］で製造することができる。
製造法１−９
化合物（Ｉａ）のうち、Ｒ２が置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである式（Ｉａｎ）
0004152187.tif 000014
（式中、Ｒ２ｂは置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシを表し、Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ｎ、ｍ、ｑ、Ｘ１ａ、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物は、例えばＴａｌｉａ  ＭｉｒｏｎとＭｅｉｒ  Ｗｉｌｃｈｅｋの方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、４巻、５６８頁（１９９３年）］に準じて、Ｒ２が水酸基である化合物（Ｉａｊ）と過剰量のｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、エチルクロロホルメート等とをジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン等の塩基存在下で反応させることで得られる。
また、化合物（Ｉａｎ）は、例えば製造法１で示した方法に準じ、あらかじめＬを形成させるために利用するポリオール類等の化合物に１個所以上の置換もしくは非置換のアルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシを導入し、これを用いて該化合物の残りの水酸基またはハロゲン部分にポリアルキレングリコール類Ａまたはそのハロゲン化物もしくはトシル化物を３個所以上置換させる方法で得ることもできる。
化合物（Ｉａｎ）およびその合成中間体は、前記と同様の方法でポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度のものとして単離、精製することができる。
ここで、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシはそれぞれ前記と同義である。
製造法２：Ｘ１がＳである化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＳである化合物（Ｉｂ）は、例えば製造法１と同様に、ポリオール類をポリハライド類に変換した化合物［日本化学会編、実験化学講座  第４版、１９巻（１９９２年）、丸善］または市販のポリハライド類と、ポリアルキレングリコール類Ａのチオール誘導体とを、適当な溶媒中、適当な塩基の存在下で反応させることによって得ることができる。
また、化合物（Ｉｂ）は、前記の工程とは逆に、ポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物もしくはトシル化物をポリチオール類と反応させることによっても得ることができる。
ポリアルキレングリコール類Ａのチオール誘導体は市販のものを用いるか、Ｓａｍｕｅｌ  Ｚａｌｉｐｓｋｙらによってまとめられた方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］で調製できる。
各工程の反応条件、精製条件は製造法１に準じる。
製造法２−１
化合物（Ｉｂ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、Ｘ１が−Ｓ−である化合物を製造法２に従って製造した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法３：Ｘ１がＮＲ３である化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＮＲ３（式中、Ｒ３は前記と同義である）である化合物（Ｉｃ）は、例えば製造法１と同様に、ポリオール類をポリアミン類に変換した化合物または市販のポリアミン類と、ポリアルキレングリコール類Ａのハロゲン化物もしくはトシル化物とを、適当な溶媒中、適当な塩基の存在下で反応させることによって得ることができる。
化合物（Ｉｃ）は、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体をポリハライド類と反応させることによっても得ることができる。
また、化合物（Ｉｃ）はポリアルデヒド類１当量と、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体（該ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体は、ポリアルデヒド類の１つのホルミル基あたり１〜３０当量存在させる）とを、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、水、緩衝液等の適当な溶媒に溶解または懸濁し、−２０〜１００℃でシアノ水素化ホウ素ナトリウムや水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤（該還元剤は、ポリアルデヒド類の１つのホルミル基あたり１〜３０当量用いる）の存在下で反応させることによっても得ることができる。
さらに、化合物（Ｉｃ）は、ポリアミン類とポリアルキレングリコール類Ａのアルデヒド誘導体を用いても製造することができる。
前記ポリアルデヒド類としては市販の化合物をそのまま用いるか、ポリアルコール類を酸化して用いるか、あるいはポリカルボン酸類を還元して用いればよい。また、ポリアルキレングリコール類Ａのアルデヒド誘導体としては市販の化合物を利用できるし、また、ポリアルキレングリコール類Ａの末端のアルコールを酸化して用いることもできる。
各工程の反応条件、精製条件は製造法１に準じる。
製造法３−１
化合物（Ｉｃ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｃ）を製造法３に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて製造することができる。
製造法４：Ｘ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５またはＲ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７である化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉｄａ）は、例えばγ−カルボキシグルタミン酸、クエン酸、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸等から選ばれるポリカルボン酸化合物をペプチド合成法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］に従い、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の適当な溶媒中に溶解または懸濁し、次いでポリカルボン酸化合物中の１つのカルボキシル基あたり１〜３０当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノール等のアルコール体と、ポリカルボン酸化合物中の１つのカルボキシル基あたり１〜３０当量のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロりん酸塩等の縮合剤を加え、さらにポリカルボン酸化合物中の１つのカルボキシル基あたり１〜３０当量のポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体を加えて反応させることによって得ることができる。反応は無水条件下、−２０℃〜１００℃で、１時間〜１０日間攪拌することによって行われる。
また、ポリカルボン酸分子中の１個以上のカルボキシをメチル、エチル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル等の適当な保護基で保護した後、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体を残りのカルボキシに前記の方法で導入し、続いてカルボキシの保護基を通常の脱保護法で除去することによって、Ｒ２がカルボキシである３本鎖以上の分岐型ポリエチレングリコール誘導体を高純度に含む反応液を得ることもできる。この場合、カルボン酸の保護基の導入や該保護基の除去には通常のペプチドの合成法で用いられる方法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］を利用できる。ポリカルボン酸類中のカルボキシの配置は、立体配置を含めて何れでもよく、ポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体としては分子量分布が均一（好ましくは、Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）であればいかなる平均分子量のものを用いてもよい。
また、化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ６−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７（式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉｄｂ）は、前記工程とは逆に、ポリアミン類とポリアルキレングリコール類Ａのカルボン酸誘導体の活性エステル、あるいはポリアルキレングリコール類Ａの酸ハライド誘導体とを反応させる方法でも得ることができる。ポリアルキレングリコール類Ａの酸ハライド誘導体はポリアルキレングリコール類Ａのカルボン酸誘導体をハロゲン化チオニルまたはハロゲン化チオニルとトルエン、ジメチルホルムアミド等の適当な混合溶媒中、ピリジン、トリエチルアミン等の適当な触媒存在下で、０〜１５０℃で、１〜２４時間加熱することによって得ることができる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法４−１
化合物（Ｉｄａ）および化合物（Ｉｄｂ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｄａ）または化合物（Ｉｄｂ）を製造法４に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法５：Ｘ１がＲ８−Ｃ（＝Ｏ）−ＯまたはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９である化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ８−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ８は前記と同義である）またはＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ９（式中、Ｒ９は前記と同義である）である化合物（Ｉｅ）は、例えばポリアルキレングリコール類Ａとポリカルボン酸類、あるいはポリアルキレングリコール類Ａのカルボン酸誘導体とポリオール類の組合わせを用いて、脱水縮合により得ることができる。脱水縮合の方法としては通常のエステル合成で用いられるような、酸または塩基触媒下に脱水する方法か、あるいはジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ピリジン、塩化メチレン等の適当な溶媒中、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤で対応するアルコール体とカルボン酸を縮合する方法等を利用することができる。さらに、上記工程において酸ハロゲン化物と、対応するアルコール体を反応させることによっても目的物を合成できる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法５−１
化合物（Ｉｅ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｅ）を製造法５に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて得ることができる。
製造法６：Ｘ１がＲ６ａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨまたはＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏである化合物
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ６ａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ（式中、Ｒ６ａは前記と同義である）である化合物（Ｉｆａ）は、例えば以下のようにして製造することができる。
市販のポリアミン類、または前記製造法を組み合わせてポリオール類より調製したポリアミン類にポリアルキレングリコール類Ａのカーボネート誘導体を３モル以上反応させて、化合物（Ｉｆａ）を含む粗生成物が得られる。なお、ポリアルキレングリコール類Ａのカーボネート誘導体は、Ｔａｌｉａ  Ｍｉｒｏｎらの方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、４巻、５６８頁（１９９３年）］に従って製造することができる。また、ポリアルキレングリコール類Ａのカーボネート誘導体としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、イミダゾリルカルボニルオキシ誘導体等を利用することができる。
化合物（Ｉ）のうち、Ｘ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（式中、Ｒ４は前記と同義である）である化合物（Ｉｆｂ）は、例えば以下のようにして製造することができる。
化合物（Ｉｆｂ）はポリオール類のカーボネート誘導体とポリアルキレングリコール類Ａのアミノ誘導体とを上記と同様に反応させることによって得ることができる。
他の製造法に準じて官能基の保護、脱保護を組み合わせることによって、化合物（Ｉｆａ）または化合物（Ｉｆｂ）を選択的に生成させることもできる。
各工程の反応条件、精製条件はこれまでの製造法に記載した方法に準じる。
製造法６−１
化合物（Ｉｆ）のうち、Ｒ２がカルボキシ、カルバモイル、シアノ、アミノ、マレイミド、ホルミル、ハロゲン化カルボニル、ハロゲン化低級アルキル、イソシアナート、イソチオシアナート、スクシンイミドオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、ベンゾトリアゾリルオキシカルボニル、フタルイミドオキシカルボニル、ビニルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニルオキシまたは置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニルオキシである化合物は、化合物（Ｉｆ）を製造法６に従って合成した後、製造法１−１〜製造法１−９に記載された方法を組み合わせて調製することができる。
Ｒ１−Ｍｎ−Ｘ１をＬに結合して１本鎖化合物あるいは２本鎖化合物を取得し、同様の反応で前記と同一または異なるＲ１−Ｍｎ−Ｘ１をＬに結合して、３本鎖以上の化合物を取得することもできる。例えば、製造法１〜製造法６に示した方法のうちいずれかの反応を利用してＬ中の１個所あるいは２個所の官能基にポリアルキレングリコール類を結合させ、１本鎖あるいは２本鎖化合物を得る。生成する１本鎖あるいは２本鎖化合物の割合は、反応に使用するポリアルキレングリコール類と、Ｌ部分の構造を構築する原料の比を変えることで調節することができ、１本鎖あるいは２本鎖化合物を主成分にすることも可能である。得られた１本鎖あるいは２本鎖化合物はそのままの純度で、あるいは製造法１に示した方法に準じてポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度に、あるいは高純度に精製して次のステップに使用することができる。
このようにして得られた１本鎖あるいは２本鎖化合物と、前記と同一または異なるポリアルキレングリコール類を製造法１〜製造法６に示したいずれかの方法に準じて結合して、３本鎖以上の化合物が調製できる。なお、３本目以上のポリアルキレングリコール類は１本鎖あるいは２本鎖化合物を取得した反応と同様の反応に付すこともできるが、異なる反応に付し異なる結合様式を有するように調製してもよい。例えば、水酸基、アミノ、カルボキシ等の複数の官能基を有する化合物をＬ部分の構造を構築する原料に使用する場合、製造法１に示した方法でＸ１がＯである１本鎖あるいは２本鎖化合物をまず取得し、次いで製造法４に示した方法で３本目以上のポリアルキレングリコール類をＸ１がＲ４−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ５となるように反応させることができる。以上のように製造法１〜６の組合わせで複数のポリアルキレングリコール類が同一または異なる結合様式でＬに結合した３本鎖以上の化合物を得ることができる。さらに、使用するポリアルキレングリコール類は各反応の段階で分子量が異なっていてもよく、各々のポリアルキレングリコール類をＬに結合させる反応で異なる平均分子量のポリアルキレングリコール類を使用することで容易に目的物が得られる。
また、Ｌにポリアルキレングリコール類を導入する反応において、Ｌ中の１個所以上の官能基（例えば製造法１の場合、１個所以上の水酸基）を残し、他の官能基を適当な保護基で保護してから、ポリアルキレングリコール類と皮応、結合させ、その後、保護基を除去することも可能である。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類は、上記製造法で具体的に示された化合物以外であっても、上記製造法に準じて得ることができる。
なお、先にも述べたとおり、製造法１〜６の各工程において、原料に用いるポリアルキレングリコール類は市販のものを用いることもできるが、Ｓａｍｕｅｌ  Ｚａｌｉｐｓｋｙによってまとめられた各種の方法［バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）、６巻、１５０頁（１９９５年）］等によって容易に製造することも可能である。
得られた分岐型ポリアルキレングリコール類はシリカゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、再結晶、抽出等の方法によって、ポリアルキレングリコール類の分岐数に応じて任意の純度の分岐型ポリアルキレングリコール類に精製することができる。
得られた分岐型ポリアルキレングリコール類は前記生理活性ポリペプチドのアミノ酸側鎖、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基に直接、あるいはスペーサーを介して結合させることができる。
スペーサーとしてはアミノ酸やペプチドが好ましいが、ポリアルキレングリコール類を結合することができればそれ以外であってもよい。アミノ酸としてはリジン、システイン等の天然アミノ酸等を用いることができ、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ホモシステイン等を用いることもできる。より好ましくは、システインがあげられる。ペプチドとしては、アミノ酸残基２〜１０からなるものが好ましい。アミノ酸、ペプチド以外のスペーサーとしては、グリセロール、エチレングリコール、糖等があげられる。ここで、糖としては、グルコース、ガラクトース、ソルボース、ガラクトサミン、ラクトース等の単糖類や二糖類等があげられる。
これらのスペーサーは、生理活性ポリペプチド分子中のリジン、システイン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン等の残基の側鎖とアミド結合、チオエーテル結合、エステル結合等を介して結合するか、該ポリペプチドのＣ末端カルボキシル基とアミド結合やエステル結合するかペプチドのＮ末端アミノ基とアミド結合する。これらの結合は、通常のペプチド合成法［泉屋ら、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年）、丸善］や遺伝子組換法を用いて行うことができる。
この場合、生理活性ポリペプチドを合成するのと同時にＣ末端カルボキシル基にスペーサーとなるアミノ酸、ペプチド等を導入することが望ましいが、生理活性ポリペプチドを合成した後にスペーサーを結合してもよい。また、該ポリペプチドのＣ末端カルボキシル基等を化学合成的に活性化してスペーサーに結合することもできる。また、ポリアルキレングリコール類を予め結合したスペーサーを前記の方法で生理活性ポリペプチドに結合することもできる。
本発明で用いられる生理活性ポリペプチドとしては、ポリペプチド、抗体、およびそれらの誘導体等があげられる。ポリペプチドとしては、例えば、アスパラギナーゼ（Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、グルタミナーゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、アルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）、ウリカーゼ（Ｕｒｉｃａｓｅ）、スーパーオキサイドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｉｎ）、ストレプトキナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、プラスミン（Ｐｌａｓｍｉｎ）、アデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、プラスミノーゲン活性化因子類（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、プラスミノーゲン（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）等の酵素、インターロイキン１〜１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１〜１８）、インターフェロン−α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α）、インターフェロン−β（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β）、インターフェロン−γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）、インターフェロン−ω（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ω）、インターフェロン−τ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−τ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）、血小板増加因子（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）、繊維芽細胞増殖因子１〜１８（Ｆｉｂｒｏｂｒａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−１〜１８）、ミッドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、表皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、オステオジェニックプロテイン１（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ１）、幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、形質転換成長因子類（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）等のサイトカイン、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）、パラサイロイドホルモン（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）、グルカゴン様ペプチド類（Ｇｌｕｃａｇｏｌ  Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）等のホルモン、クローソ蛋白質（Ｋｌｏｔｈｏ）、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、アンジオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｅ）、アミリン（Ａｍｙｌｉｎ）、インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ１）、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）等があげられる。
本発明で使用される抗体は、公知の手段［アンティボディーズ  ア  ラボラトリー  マニュアル、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８８年）］を用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
本発明で使用される抗体として、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれも用いることができるが、モノクローナル抗体が好ましい。
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗体断片等があげられる。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体等があげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）および軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であればいかなるものも用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域のＣＤＲのアミノ酸配列をヒトの抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域の適切な位置に移植した抗体を意味する。
抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片、相補性決定領域を含むペプチド等があげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合の上部のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られた、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体で構成された、分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ間のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を酵素トリプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖとも称す）は、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと称す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬとしては、本発明のモノクローナル抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のいずれをも用いることができる。
ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖとも称す）は、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［プロテイン  エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、７巻、６９７頁（１９９４年）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のジスルフィド安定化抗体に含まれるＶＨあるいはＶＬとしてはモノクローナル抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のいずれをも用いることができる。
生理活性ポリペプチドの誘導体としては、アミノ酸置換体、アミノ酸欠失体、糖鎖付加体、糖鎖欠失体、部分ペプチド等があげられる。
上述した生理活性ポリペプチドまたはその誘導体の中でも、好ましくはインターフェロン−β、インターフェロン−α、インターフェロン−γ等のインターフェロン類、顆粒球コロニー刺激因子、スーパーオキサイドディスムターゼ等があげられる。
これらの生理活性ポリペプチドは動物臓器や組織から抽出する方法でも得られるが、通常のペプチド合成法、あるいは遺伝子組換え法で製造することによっても得ることができる。さらに、市販のポリペプチドも用いることができる。
また、反応に使用する該ポリペプチドとしては粗精製物を用いることができ、またゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、抽出等の精製法により化学修飾に適した純度に精製したものを用いることもできる。
該ポリペプチドはリン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の緩衝液もしくは水、またはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の適当な有機溶媒中、あるいはこれらの有機溶媒と水溶液との混合溶媒中で製造され、化学修飾反応に用いられる。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類は、ポリペプチド、さらに詳細にはそして好ましくは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、インターフェロン、インターロイキン等の遊離システイン残基を有するあらゆる天然型または遺伝子組換え型のポリペプチドの共有結合による部位特異的修飾にも使用することができる。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類で修飾された生理活性ポリペプチドの製造は、分岐型ポリアルキレングリコール類を生理活性ポリペプチド１モルあたり１〜１０００モル程度、好ましくは１〜５０モル程度用いて反応させることによって行われる。分岐型ポリアルキレングリコール類の生理活性ポリペプチドへの修飾の度合いは生理活性ポリペプチドに対する分岐型ポリアルキレングリコール類のモル比、反応温度、ｐＨ、反応時間等を調節することによって、任意に選択することができる。また、反応に使用する溶媒は反応を妨害しないものであればいずれでもよく、例えばりん酸緩街液、ほう酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム緩衝液、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、メタノール、アセトニトリル、ジオキサン等、あらゆるものから選択することができる。反応の温度、ｐＨおよび時間は生理活性ポリペプチドの活性が損なわれない条件であればいずれでもよく、例えば０〜５０℃、１０分〜１００時間、ｐＨ４〜１０が好ましい。
本発明の分岐型ポリアルキレングリコール類で修飾された生理活性ポリペプチドの精製は常法に従って、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外濾過等により行うことができる。合成または精製された生理活性ポリペプチドまたは分岐型ポリアルキレングリコール類で修飾された該生理活性ポリペプチドが該ポリペプチドの構造を有するものであることの確認は、質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびアミノ酸分析計によるアミノ酸組成分析により、また気相プロテインシーケンサーによりエドマン分解して得られたフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を逆相ＨＰＬＣで分析することによるアミノ酸配列分析等により行うことができる。
本発明の化学修飾ポリペプチドは人間または動物用の薬剤組成物の形態で投与することができ、該組成物は通常の薬剤製造法によって製造することができる。投与方法としては経口、静脈内、皮下、筋肉下、腹腔内、経皮投与または他の許容される方法等が可能であり、投与に適する組成物を用いることができる。これらの剤形には通常用いられる等張化剤、緩衝剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味剤、着色剤、酸化防止剤等の慣用の添加剤を添加して用いることができる。
化合物（Ｉ）の具体例を第１表および第２表に示す。
なお、第１表における化合物の構造について補足する。
１）実施例１で得られる化合物５ＴＲＣ（３ＵＡ）において、（Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２）に該当するカルボキシル基は−ＮＨＣＨ２−のメチレン基に結合している。［ＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｘ１］に該当するＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−はメチレンオキシ基（−ＣＨ２Ｏ−）に結合している。
２）実施例２で得られる化合物５ＳＫＡ（３ＵＡ）において、（Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２）に該当するカルボキシル基はシクロヘキセン環の１位に結合している。［ＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｘ１］に該当するＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−はシクロヘキセン環の３位、４位、５位の酸素原子に結合している。
３）実施例３で得られる化合物５ＱＮＡ（４ＵＡ）において、（Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２）に該当するカルボキシル基はシクロヘキサン環の１位に結合し、カルボキシル基は紙面の上に突き出す立体構造である。１位に結合するＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−は紙面の下に突き出す立体構造である。［ＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｘ１］に該当するＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−はシクロヘキサン環の１位、３位、４位、５位の酸素原子に結合している。
４）実施例４で得られる化合物５ＰＥＴ（３ＵＡ）において、（Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２）に該当する−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＯＨはメチレン基（−ＣＨ２−）に結合する。［ＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｘ１］に該当するＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−は、メチレンオキシ基（−ＣＨ２Ｏ−）に結合する。
５）実施例５で得られる化合物５ＰＥＴ（３ＵＭ）において、（Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２）に該当する３−マレイミドプロピルアミノカルボニルオキシ基はメチレン基（−ＣＨ２−）に結合する。
［ＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｘ１］に該当するＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−は、メチレンオキシ基（−ＣＨ２Ｏ−）に結合する。
６）実施例６で得られる化合物５ＰＥＴ（３ＵＵ）において、（Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２）に該当するマレイミドオキシカルボニルオキシ基はメチレン基（−ＣＨ２−）に結合する。
［ＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｘ１］に該当するＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−は、メチレンオキシ基（−ＣＨ２Ｏ−）に結合する。
７）実施例７で得られる化合物５ＰＥＴ（３ＵＲａ）において、（Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２）に該当する−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＨＯはメチレン基（−ＣＨ２−）に結合する。［ＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｘ１］に該当するＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−は、メチレンオキシ基（−ＣＨ２Ｏ−）に結合する。
８）実施例８で得られる化合物５ＳＵＧ（４ＵＡ）において、（Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２）に該当するカルボキシル基−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）は１位のオキシメチレン基（−ＯＣＨ２−）に結合する。
［ＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｘ１］に該当するＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−は、２位、３位、４位の酸素原子および５位のメチレンオキシ基に結合する。
0004152187.tif 000015
0004152187.tif 000016
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであり、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。実施例中の略号は特に断らない限り、それぞれ以下のことを意味する。なお、本明細書において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）の勧告〔ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１３８巻，９頁、１９８４年〕に従った。ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
ＲＩ：示差屈折（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ）
ＮＭＲ：核磁気共鳴（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）
ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｐｏｌｙ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））
ｍＰＥＧ：モノメトキシポリエチレングリコール（ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））
ＩＦＮ：インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
ｈＩＦＮ：ヒトインターフェロン（ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
ｒｈＩＦＮ：組換え型ヒトインターフェロン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
Ｇ−ＣＳＦ：顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）
ｒｈＧ−ＣＳＦ：組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）
ＳＯＤ：スーパーオキサイドディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｕｍｕｔａｓｅ）
ｂＳＯＤ：ウシスーパーオキサイドディスムターゼ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｕｍｕｔａｓｅ）
ｈＳＯＤ：ヒトスーパーオキサイドディスムターゼ（ｈｕｍａｎ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｕｍｕｔａｓｅ）
ＤＳＣ：Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）
ＴＦＡ：トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）
Ｔｓ：ｐ−トルエンスルホニル（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）
ＴｓＣｌ：塩化ｐ−トルエンスルホニル（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｒｏｌｉｄｅ）
ＤＭＡＰ：ジメチルアミノピリジン（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ｂｅｎｚｏｔｉａｚｏｌ−１−ｙｌｏｘｙ−ｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）
ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）
ＬＡＨ：水素化リチウムアルミニウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｉｄｅ）
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）
ＣＤＩ：Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（Ｎ，Ｎ’−ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ）
実施例１  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−トリシン誘導体の合成
略号：５ＴＲＣ（３ＵＡ）
０．５ｍｇ（２．８μｍｏｌ）のトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）（Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ、ナカライテスク社）と５０ｍｇ（１０．０μｍｏｌ）のＰＥＧ−ＮＣＯ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製、平均分子量５，０００、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｎ−Ｃ＝Ｏ）を、アルゴン気流下０．５ｍｌのＤＭＦに溶解し、１．４μｌ（１０．０μｍｏｌ）のＴＥＡを加え、さらに約１ｍｇの塩化銅を加え、室温で５時間攪拌した。さらに、１０ｍｇのＰＥＧ−ＮＣＯおよび１μｌのＴＥＡを加えて２時間攪拌した。その後、さらに１５ｍｇのＰＥＧ−ＮＣＯを追加し、室温で一昼夜攪拌した。
０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を５０ｍｌ加えた後、５０ｍｌのクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を除去した。残渣を少量の塩化メチレンに溶解し、ジエチルエーテルに滴下した。白色沈殿を濾取し、目的の化合物を含む粗生成物１５ｍｇを取得した（収率２０％）。次に、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液で溶出し、溶出液を酸性条件下、クロロホルムで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、溶媒を減圧下除去し、目的物を６．０ｍｇ取得した（収率８．０％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ）（東ソー）を用い、以下の条件で分析した。
移動相：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
流量：０．７ｍｌ／分
検出：ＲＩ
保持時間：１１．５分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３中）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，９Ｈ）、３．６４（ｓ，１２ｎＨ）、４．１０（ｓ，６Ｈ）、５．４３（ｂｒ，３Ｈ）
実施例２  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−シキミ酸誘導体の合成
略号：５ＳＫＡ（３ＵＡ）
３．２ｍｇのシキミ酸（Ｓｈｉｋｉｍｉｃ  ａｃｉｄ）をＤＭＦ２５０μｌに溶解した後、１５μｌのトリエチルアミン、触媒量の塩化銅を添加した。さらに３００ｍｇのＰＥＧ−ＮＣＯ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製、平均分子量５，０００、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｎ−Ｃ＝Ｏ）を添加し、室温で１時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して粗目的物２７０ｍｇ（８９％）を得た。
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、実施例１と同様にして精製した。目的画分をクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧除去して目的化合物１８ｍｇ（収率６％）を得た。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１１．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３中）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，９Ｈ）、３．６４（ｓ，１２ｎＨ）、５．１〜６．６（ｍ，４Ｈ）
実施例３  ５ｋＤａ３〜４本鎖分岐型ポリエチレングリコール−キナ酸誘導体の合成
略号：５ＱＮＡ（３ＵＡ）、５ＱＮＡ（４ＵＡ）
３ｍｇのキナ酸（（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−（−）−Ｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）をＤＭＦ２５０μｌに溶解した後、１７μｌのトリエチルアミン、触媒量の塩化銅を添加した。さらに３４４ｍｇのＰＥＧ−ＮＣＯ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．製）を添加し、室温で１時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した沈殿を濾取し、減圧乾燥して粗目的物３０６ｍｇ（８８％）を得た。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、実施例１と同様にして精製した。目的画分をクロロホルムで抽出し、溶媒を減圧除去して以下の化合物を得た。
0004152187.tif 000017
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３中）＞
化合物５ＱＮＡ（３ＵＡ）：δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，９Ｈ）、３．６４（ｓ，１２ｎＨ）、４．８〜５．７（ｍ，３Ｈ）
化合物５ＱＮＡ（４ＵＡ）：δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，１２Ｈ）、３．６４（ｓ，１６ｎＨ）、４．８〜５．７（ｍ，３Ｈ）
実施例４  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ペンタエリスリトール誘導体の合成
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）
ペンタエリスリトール（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）１３６ｍｇとＤＭＡＰ１２２ｍｇをアルゴン気流中ＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＣＤＩ７７８ｍｇを加え、０℃〜室温で一昼夜攪拌した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製、構造：ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−ＮＨ２）５．０ｇをＤＭＦ１０ｍｌに溶解し、上記の反応混合物１．２５ｍｌを加え、室温で２時間攪拌した。０．１ｍｏｌ／Ｌほう酸緩衝液（ｐＨ１０）１００ｍｌにγ−アミノ酪酸（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）２．６ｇを溶解した溶液を氷冷し、ここに反応液を注いだ。０℃で２時間、室温で４時間攪拌した後、塩酸でｐＨを酸性に調整し、クロロホルムで抽出し、溶媒を減圧下除去し、残渣を４．２ｇ得た（８４．６％）。残渣３．８ｇを１０００ｍｌのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で実施例１と同様にして精製し、目的物を２５４ｍｇ得た（収率６．７％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１１．４分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３中）＞
δ（ｐｐｍ）：５．４４（ｂｒｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，３Ｈ）、５．２５（ｂｒ，１Ｈ）、４．０９（ｂｒｓ，８Ｈ）、３．６５（ｓ，１２ｎＨ）、３．２９（ｓ，９Ｈ）、３．２６（ｍ，８Ｈ）、２．３７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、１．８０（ｂｒｍ，２Ｈ）、１．７７（ｍ，６Ｈ）
実施例５  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ペンタエリスリトール誘導体の合成
略号：５ＰＥＴ（３ＵＭ）
ペンタエリスリトール１３６ｍｇとＤＭＡＰ１２２ｍｇをＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＣＤＩ７７８ｍｇを加えてアルゴン気流中０℃〜室温で一昼夜攪拌した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製）１．０ｇをＤＭＦ２ｍｌに溶解し、上記の反応混合物０．２５ｍｌを加え、室温で２時間攪拌した。続いて１８７μｌのプロピレンジアミンを加え、室温で２時間攪拌後、ジエチルエーテルを加えた。白色沈殿を回収し、減圧乾燥して残渣９７５ｍｇを得た（収率９７．５％）。残渣を１００ｍｌのＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。０．２〜０．４ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌで溶出した画分をクロロホルムで抽出し、白色粉末１１０ｍｇを得た（収率１１．３％）。
次に、この白色粉末１００ｍｇを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液０．５ｍｌに溶解し、０℃でエトキシカルボニルマレイミド２．３ｍｇを加え、さらに０℃で１０分間攪拌した。
水１．５ｍｌを加え、室温で１５分間攪拌後、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を減圧濃縮後、ジエチルエーテルに滴下し、白色沈殿を減圧乾燥し、目的物３５ｍｇを得た（収率３５％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１１．３分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３中）＞
δ（ｐｐｍ）：６．７３（ｓ，２Ｈ）、５．３３（ｂｒ，３Ｈ）、４．０８（ｂｒｓ，８Ｈ）、３．６４（ｓ，１２ｎＨ）、３．３６（ｓ，９Ｈ）、３．２５（ｍ，６Ｈ）、３．１１（ｍ，２Ｈ）、１．７７（ｍ，８Ｈ）
実施例６  ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ペンタエリスリトール誘導体の合成
略号：５ＰＥＴ（３ＵＵ）
ペンタエリスリトール１３６ｍｇとＤＭＡＰ１２２ｍｇをＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＣＤＩ６８１ｍｇを加えてアルゴン気流中０℃〜室温で一昼夜攪拌した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製）１．０ｇをＤＭＦ２ｍｌに溶解し、前述した反応混合物２８６μｌを加え、室温で２時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、白色沈殿を回収して減圧乾燥し、残渣を１ｇ得た（収率１００％）。
残渣を、ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔカラム（３０ｍｍ×２５０ｍｍ、東ソー）を用いて精製した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含む０〜９０％アセトニトリル水溶液を用いた。３本鎖ＰＥＧを含む画分を減圧濃縮し、クロロホルムで抽出し、溶媒を減圧下除去し、残渣を１６５ｍｇ得た（収率１６．５％）。
次に、この白色粉末８０ｍｇを塩化メチレン１ｍｌに溶解し、ＤＳＣ４．１ｍｇ、ＤＭＡＰ２．１ｍｇを加え、アルゴン気流中室温で６時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、目的物を６３ｍｇ得た（収率７８．８％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１０．７分
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３中）＞
δ（ｐｐｍ）：５．４９（ｂｒ，３Ｈ）、４．１１（ｂｒｓ，８Ｈ）、３．６４（ｓ，１２ｎＨ）、３．３８（ｓ，９Ｈ）、３．２５（ｍ，６Ｈ）、２．８７（ｓ，４Ｈ）、１．７８（ｍ，８Ｈ）
実施例７  ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール−ペンタエリスリトール誘導体の合成
略号：５ＰＥＴ（３ＵＲａ）
ペンタエリスリトール１３６ｍｇとＤＭＡＰ１２２ｍｇをＤＭＦ５ｍｌに溶解し、ＣＤＩ６８１ｍｇを加えてアルゴン気流中０℃〜室温で一昼夜攪拌した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（平均分子量５，０００、日本油脂（株）社製）１．０ｇをＤＭＦ２ｍｌに溶解し、前述した反応混合物２８６μｌを加え、室温で２時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、白色沈殿を回収して減圧乾燥し、残渣を９５０ｍｇ得た（収率９５％）。続いて残渣をＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔカラム（３０ｍｍ×２５０ｍｍ、東ソー）を用いて精製した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含む０〜９０％アセトニトリル水溶液を用いた。３本鎖ＰＥＧを含む画分を減圧濃縮し、クロロホルムで抽出し、溶媒を減圧下除去し、残渣を３００ｍｇ得た（収率３１．６％）。
次に、得られた残渣（白色粉末）３００ｍｇを塩化メチレン１ｍｌに溶解し、ＤＳＣ１５．４ｍｇ、ＤＭＡＰ７．３ｍｇを加え、アルゴン気流中室温で６時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥した。塩化メチレン１ｍｌを加えて溶解し、４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｉｅｔｈｙｌａｃｅｔａｌ）３．５μｌを加え、室温で２時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、残渣を２５０ｍｇ得た（収率８３．３％）。
残渣１００ｍｇを１０％ＴＦＡを含む塩化メチレンに溶解し、０℃で１時間静置後、ジエチルエーテルに滴下して白色沈殿を減圧乾燥し、４０ｍｇの目的物を得た（収率４０．０％）。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムを用い、実施例１と同様の条件で測定した。
保持時間：１０．６分
実施例８  ３〜４本鎖分岐型ポリエチレングリコール−糖誘導体の合成
略号：５ＳＵＧ（３ＵＡ）、５ＳＵＧ（４ＵＡ）
５．１８ｇのα−Ｄ−グルコースペンタアセテートをＤＭＦ８０ｍｌに溶解し、２．３７ｇのヒドラジンアセテートを添加し、室温で１．５時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで抽出後、酢酸エチル層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶液を減圧濃縮して、α−Ｄ−グルコピラノース−２，３，４，６−テトラアセテート（α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ−２，３，４，６−ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）を４．０ｇ得た（収率８７％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３中）＞
δ（ｐｐｍ）：２．０２（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），４．１４（ｍ，１Ｈ），４．２７（ｍ，２Ｈ），４．９１（ｍ，１Ｈ），５．０９（ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），５．５５（ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ）
８５０ｍｇの上記化合物を塩化メチレン１５ｍｌに溶解し、０℃にて４．８ｍｌのトリクロロアセトニトリル、３６５ｍｌのＤＢＵ（１，８−ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［５．４．０］ｕｎｄｅｃ−７−ｅｎｅ）を添加し、０℃で１時間、室温で１５分間攪拌した。溶液を減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムで精製し、α−Ｄ−グルコピラノース−２，３，４，６−テトラアセテート１−（２，２，２−トリクロロエタンイミデート）（α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ−２，３，４，６−ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ−１−（２，２，２−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｎｉｍｉｄａｔｅ））を６３５ｍｇ得た（収率５３％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：２．０２（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），４．１３（ｍ，１Ｈ），４．２１（ｍ，１Ｈ），４．２８（ｍ，１Ｈ），５．１３（ｍ，１Ｈ），５．１９（ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ），５．５７（ｔ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），８．７１（ｓ，１Ｈ）
６９３ｍｇの上記化合物と１０９μｌのグリコール酸メチルを脱水塩化メチレンに溶解し、モレキュラーシーブス４Ａを１．６２ｇ添加し、アルゴン雰囲気下、室温で４時間攪拌した。反応液を０〜５℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルと脱水塩化メチレンの混合溶液（２：１）１６３μｌを添加し、０〜５℃で１９時間攪拌した。７７μｌのトリエチルアミンを添加し、セライトで濾過した。溶液を減圧下濃縮した後、シリカゲルカラムで精製し、［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］酢酸メチルエステル［（２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｏｘｙ］ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒを１６２ｍｇ得た（収率２７％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：２．０１（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），４．１４（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｓ，２Ｈ），４．６７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．０５（ｍ，１Ｈ），５．０９（ｔ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），５．２５（ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ）
１６２ｍｇの上記化合物をメタノール１ｍｌに溶解し、アンバーリストを添加した。ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（２８％）９．４μｌを添加し、室温で３時間攪拌した。セライトで濾過し、濾液を減圧下濃縮して［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］酢酸メチルエステル［（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｏｘｙ］ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒを８０ｍｇ得た（収率８２％）。
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（Ｄ２Ｏ，３００ＭＨｚ）＞
δ（ｐｐｍ）：３．３９（ｓ，２Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ），３．６９（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｍ，１Ｈ），４．０６（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ），４．４４（ｍ，１Ｈ）
＜質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）＞
実測値：［Ｍ＋Ｈ］＝２５３
理論値：Ｃ９Ｈ１６Ｏ８＝２５２
２ｍｇの上記化合物をＤＭＦ１００μｌに溶解し、７μｌのトリエチルアミン、触媒量のＣｕＣｌを添加した。１６０ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯを添加し、室温で２時間攪拌した。８０ｍｇのｍＰＥＧ−ＮＣＯを添加しさらに３時間攪拌した。溶液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を濾過により回収し、減圧乾燥した。得られた白色固体２００ｍｇを２ｍｌの１ｍｏｌ／Ｌ炭酸カリウム水溶液に溶解し、室温で４時間攪拌した。クロロホルムおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を添加し、クロロホルムで抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧下除去し、残渣を減圧乾燥し、白色固体１９５ｍｇを得た。２０ｍｌのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製し、下記に示す化合物を得た。
0004152187.tif 000018
＜１Ｈ−ＮＭＲ分析（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３中）＞
化合物５ＳＵＧ（３ＵＡ）：δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，９Ｈ），３．６４（ｔ，１２ｎＨ），４．１〜５．６（ｍ，７Ｈ）
化合物５ＳＵＧ（４ＵＡ）：δ（ｐｐｍ）：３．３８（ｓ，１２Ｈ），３．６４（ｔ，１６ｎＨ），４．１〜５．６（ｍ，７Ｈ）
実施例９  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＴＲＣ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例１の化合物（５ＴＲＣ（３ＵＡ））５ｍｇ（０．３３μｍｏｌ）に塩化メチレンで調製した１．５ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ溶液５０μｌ（０．６６μｍｏｌ）、１．４ｍｇ／ｍｌのＤＣＣ溶液１００μｌ（０．６６μｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中氷冷下３０分間、室温で２時間攪拌した。ジエチルエーテルを加えて生成した沈殿を減圧下乾燥してＮＨＳエステルを３．５ｍｇ（収率７０％）得た。
次に、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した参考例４で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１５０μｌ（０．９ｍｇ／ｍｌ）へ、上記で活性化した修飾試薬（ＮＨＳエステル）を３３．４ｍｇ（蛋白質１モルに対して３４モル）加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、エチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換し、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム０．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。反応液をチャージ後、同緩衝液５ｍｌでカラムを洗浄した後、塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出した。目的物を含む画分を回収し、０．０９１ｍｇ／ｍｌの目的物を０．４０ｍｌ得た（収率２７．０％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、以下の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
ゲル：ＰＡＧＥＬ  ＳＰＧ  ５２０Ｌ（アトー社製）
染色：ＦＡＳＴ  ＳＴＡＩＮＴＭ
分子量マーカー：Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオラッド社製）
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、以下の条件で分析した。
移動相：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
流量：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
分離カラム：ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ×２本）（東ソー社製）
保持時間：４２．０分（１分子結合体）
４４．１分（２分子結合体）
実施例１０  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例２の化合物（５ＳＫＡ（３ＵＡ））１６ｍｇ（１．１μｍｏｌ）を１００μｌの塩化メチレンに溶解し、２７２μｇのＤＣＣと１５２μｇのＮＨＳを加え、氷冷下１時間、室温で１時間攪拌した。ジエチルエーテルに滴下して生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例２の化合物のＮＨＳエステルを１４．５ｍｇ得た（収率９１％）。
次に、エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液で調製した参考例４で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１００μｌ（１．２ｍｇ／ｍｌ）へ、上記で得られたＮＨＳエステルを８．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して１００モル）加え、４℃で一昼夜静置して反応させた。反応液をゲル濾過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、エチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換し、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム０．６ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。反応液をチャージ後、同緩衝液３ｍｌでカラムを洗浄した後、塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出した。目的物を含む画分を回収し、４７μｇ／ｍｌの目的物を８０μｌ得た（収率３．３％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４１．７分（１分子結合体）
実施例１１  ５ｋＤａ  ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＰＥＴ（３ＵＵ）−ｒｈＩＦＮ−β
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例４で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液０．５ｍｌ（１．２ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例６で得られた５ＰＥＴ（３ＵＵ）を４．５ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液０．５ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、エチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．８ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、エチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）４．０ｍｌで洗浄後、０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、０．６７ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３６ｍｌを得た（収率４０％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４１．１分（１分子結合体）
３８．２分（２分子結合体）
実施例１２  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β
実施例４の化合物（５ＰＥＴ（３ＵＡ））２５４ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ）を、２．０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、ＮＨＳ５．９ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ１０．５ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン気流中０℃で１時間、室温で２時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥して実施例４の化合物のＮＨＳエステルを１３２．８ｍｇ得た（収率５２．３％）。
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例４で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１．０ｍｌ（１．１６ｍｇ／ｍｌ）へ、前記の５ＰＥＴ（３ＵＡ）のＮＨＳエステルを１３ｍｇ（蛋白質１モルに対して１５モル）加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、エチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、エチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）７．０ｍｌで洗浄後、０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、０．１４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１．０ｍｌを得た（収率１２％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４３．８分（１分子結合体）
４１．２分（２分子結合体）
実施例１３  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−１７Ｓｅｒ  ｒｈＩＦＮ−β
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１７Ｓｅｒ  ｒｈＩＦＮ−β（Ｃｈｉｒｏｎ社製）の溶液０．０５ｍｌ（２．１ｍｇ／ｍｌ）へ、実施例１２と同様にして得られた５ＰＥＴ（３ＵＡ）のＮＨＳエステル１．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、エチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換した。ゲル濾過で得られた画分をＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、エチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ６）８ｍｌで洗浄後、０．２〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、２７．８μｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３０ｍｌを得た（収率７．９％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
実施例１４  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒトインターフェロン−αの調製
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−α
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製した１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮ−α溶液［免疫生物研（ＩＢＬ）］０．１ｍｌへ、実施例１２と同様にして得られた５ＰＥＴ（３ＵＡ）のＮＨＳエステル１．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して２０モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄後、０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、０．５３ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液６５μｌを得た（収率３４％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４２．６分（１分子結合体）
４０．３分（２分子結合体）
実施例１５  ５ｋＤａ  ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
実施例２の化合物（５ＳＫＡ（３ＵＡ））１６ｍｇ（１．１μｍｏｌ）を１００μｌの塩化メチレンに溶解し、２７２μｇのＤＣＣと１５２μｇのＮＨＳを加え、氷冷下１時間、室温で１時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下して生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例２の化合物のＮＨＳエステルを１４．５ｍｇ得た（収率９１％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．７ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに上記活性化した化合物（ＮＨＳエステル）３．６ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、０．７ｍｌのＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。目的画分を濃縮し、０．４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１６５μｌを取得した（収率３６％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４２．３分（１分子結合体）
４０．２分（２分子結合体）
実施例１６  ５ｋＤａ４本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子を含む溶液の調製
略号：５ＱＮＡ（４ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
実施例３の化合物（５ＱＮＡ（４ＵＡ））６９ｍｇ（３．５μｍｏｌ）を５００μｌの塩化メチレンに溶解し、１．８ｍｇのＤＳＣと０．５６ｍｇのＤＭＡＰを加え、室温で６時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例３の化合物のＮＨＳエステルを４４ｍｇ得た（収率６３％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ８）で３．８ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０μｌに上記の活性化した化合物（ＮＨＳエステル）５．１ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。これ以上の精製操作を行わずに、得られた生成物を電気泳動、ゲル濾過ＨＰＬＣ分析により確認した。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４０．８分（１分子結合体）
実施例１７  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の調製
略号：５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ
実施例２の化合物（５ＳＫＡ（３ＵＡ））１６ｍｇ（１．１μｍｏｌ）を１００μｌの塩化メチレンに溶解し、２７２μｇのＤＣＣと１５２μｇのＮＨＳを加え、氷冷下１時間、室温で１時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例２の化合物のＮＨＳエステルを１４．５ｍｇ得た（収率９１％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４．４ｍｇ／ｍｌに調製した参考例６で得られたｒｈＧ−ＣＳＦ１４０μｌに上記の活性化した化合物（ＮＨＳエステル）１２．２ｍｇ（蛋白質１モル当たり２５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、１．８ｍｌのＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。目的画分を濃縮し、１．１ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液１１０μｌを取得した（収率１９％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４０〜４５分（１〜３分子結合体）
実施例１８  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＵ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．１ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．５ｍｌに、実施例６で得られた５ＰＥＴ（３ＵＵ）を１２．２ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）７．５ｍｌで洗浄後、０．２〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、１．２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．７５ｍｌを得た（収率５８．６％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４０．５分（１分子結合体）
３７．８分（２分子結合体）
実施例１９  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４．０ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．０５ｍｌに、実施例１２と同様にして得られた５ＰＥＴ（３ＵＡ）のＮＨＳエステル１．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄後、０．２〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、０．３４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３０ｍｌを得た（収率５６．７％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４２．３分（１分子結合体）
３９．５分（２分子結合体）
実施例２０  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＳＵＧ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
実施例８で得られた化合物（５ＳＵＧ（３ＵＡ））１００ｍｇ（６．７μｍｏｌ）に、２．３ｍｇのＮＨＳと４．１ｍｇのＤＣＣを加え、氷冷下１ｍｌの塩化メチレンに溶解し、氷冷下１時間、室温で１．５時間攪拌した。反応液をジエチルエーテルに滴下し、生成した白色沈殿を減圧乾燥し、実施例８の化合物のＮＨＳエステルを７６．６ｍｇ得た（収率７６．６％）。
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で３．９ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．１ｍｌに、上記の活性化した化合物（ＮＨＳエステル）１０．７ｍｇ（蛋白質１モルに対して３５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄後、０．２〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、０．２８ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．３９ｍｌを得た（収率２７．８％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４３．０分（１分子結合体）
４０．４分（２分子結合体）
実施例２１  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキサイドディスムターゼの製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＭ）−ｈＳＯＤ
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製したＣｕ，Ｚｎ型ｈＳＯＤ溶液（ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ，ＩＮＣ．製）０．５ｍｌ（１．３４ｍｇ／ｍｌ）に、実施例５で得られた５ＰＥＴ（３ＵＭ）３．１ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム０．７ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）で洗浄後、０．５〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、０．３３ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．６２ｍｌを得た（収率３０．６％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４１．１分（１分子結合体）
実施例２２  ５ｋＤａ  ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾抗ＧＤ３キメラ抗体の製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ＫＭ８７１
２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１．１ｍｇ／ｍｌに調製した抗ＧＤ３キメラ抗体（ＫＭ−８７１）溶液１．０ｍｌ（特開平５−３０４９８９に従って調製）に、実施例１２と同様にして得られた５ＰＥＴ（３ＵＡ）のＮＨＳエステル０．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液１．０ｍｌをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄後、０．２５〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、０．５２ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液４３０μｌを得た（収率２０．４％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜２分子結合体のバンドを確認した。
実施例２３  ５ｋＤａ３本鎖分岐型ポリエチレングリコール修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の製造
略号：５ＰＥＴ（３ＵＲａ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２．３５ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．６ｍｌに、実施例７の化合物（５ＰＥＴ（３ＵＲａ））５６．３ｍｇ（蛋白質１モルに対して５０モル）および１２０ｍｍｏｌ／Ｌに調製したＮａＢＨ３ＣＮ水溶液１０μｌを加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液を塩酸で酸性にして反応を停止し、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．カラム１．４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄後、０．１〜０．２ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、０．２４ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．５５ｍｌを得た（収率８．５％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４１．２分（１分子結合体）
参考例１  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール（従来型試薬）修飾組換え型ヒトインターフェロン−βの調製
略号：ＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＩＦＮ−β
エチレングリコールおよび塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．８）で調製した参考例４で得られるｒｈＩＦＮ−β溶液１．３ｍｌ（０．９７ｍｇ／ｍｌ）へ、ＰＥＧ２Ｌｙｓ（平均分子量１０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）８．３ｍｇ（蛋白質１モルに対して１２．５モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、エチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に緩衝液交換した。これをＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム１．４ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、エチレングリコールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）で洗浄後、０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、０．３６ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液２．７ｍｌを得た（収率７６．７％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４５．３分（１分子結合体）
４１．５分（２分子結合体）
参考例２  ５ｋＤａ２本鎖分岐型ポリエチレングリコール（従来型試薬）修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の調製
略号：ＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体
５０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で４．０ｍｇ／ｍｌに調製した参考例５で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体０．５ｍｌに、ＰＥＧ２Ｌｙｓ（平均分子量１０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）１０．６ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム２．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）１０ｍｌで洗浄後、０．２〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、１．０５ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．５ｍｌを得た（収率２６．３％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４４．３分（１分子結合体）
４１．７分（２分子結合体）
参考例３  ５ｋＤａ１本鎖型ポリエチレングリコール（従来型試薬）修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の調製
略号：ＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＧ−ＣＳＦ
等張りん酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４．４ｍｇ／ｍｌに調製した参考例６で得られるｒｈＧ−ＣＳＦ溶液０．５ｍｌに、ＰＥＧ２Ｌｙｓ（平均分子量１０，０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．製）１１．７ｍｇ（蛋白質１モルに対して１０モル）を加え、４℃で一昼夜反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に付し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換した。これをＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．カラム２．０ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通塔し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）１０ｍｌで洗浄後、０．２〜０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。目的画分を統合後、濃縮し、１．７８ｍｇ／ｍｌの目的物を含む溶液０．５ｍｌを得た（収率４０．５％）。
＜電気泳動＞
２−メルカプトエタノール非存在下、実施例９と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１〜３分子結合体のバンドを確認した。
＜ゲル濾過ＨＰＬＣ分析＞
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム２本を用い、実施例９と同様にして分析した。
保持時間：４４．２分（１分子結合体）
４１．８分（２分子結合体）
参考例４  組換え型ヒトインターフェロン−β（未修飾ｒｈＩＦＮ−β）の調製
配列番号１に示したアミノ酸配列を有するｒｈＩＦＮ−βは水上ら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒ、第８巻、６０５頁（１９８６年）］、および久我ら［現代化学増刊１２：医学における遺伝子工学、１３５頁（１９８６年）、東京化学同人］の方法に従って製造した。
ｒｈＩＦＮ−βをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＭＧ−１を保有する大腸菌Ｋ−１２株をＬＧＴｒｐＡｐ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、グルコース１ｇ／ｌ、Ｌ−トリプトファン５０ｍｇ／ｌ、アンピシリン５０μｇ／ｌ）でシード培養した。ｒｈＩＦＮ−βの生産には２リッタージャー発酵槽でＭＣＧＡｐ培地（Ｍ９培地にカザミノ酸０．５％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加）を用い、グルコース濃度を１％に、ｐＨを６．５に維持して数日間２０℃で培養した。なお、培養液は７５０ｒｐｍで振とうし、毎分１Ｌでエアレーションした。培養液から凍結融解法［ＤＮＡ、２巻、２６５頁（１９８３年）］で抽出液を調製した。さらに、菌体残渣から特開昭６１−６９７９９に開示された方法に従ってｒｈＩＦＮ−βを得た。
参考例５  組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体（未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体）の調製
配列番号２に示したアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦの１番目のスレオニンをアラニンに、３番目のロイシンをスレオニンに、４番目のグリシンをチロシンに、５番目のプロリンをアルギニンに、１７番目のシステインをセリンにそれぞれ置換したｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、特公平７−９６５５８に記載の方法により取得した。
上記のｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣｆＢＤ２８を保有する大腸菌Ｗ３１１０ｓｔｒＡ株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＥＣｆＢＤ２８  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７９）をＬＧ培地［バクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース１ｇを水１Ｌに溶かし、ＮａＯＨでｐＨを７．０とする］で３７℃、１８時間培養し、この培養液５ｍｌを２５μｇ／ｍｌのトリプトファンと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭＣＧ培地（Ｎａ２ＨＰＯ４０．６％、ＫＨ２ＰＯ４０．３％、塩化ナトリウム０．５％、カザミノ酸０．５％、ＭｇＳＯ４１ｍｍｏｌ／Ｌ、ビタミンＢ１４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌに摂取し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インドールアクリル酸（３β−ｉｎｄｏｌｅａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ、以下ＩＡＡと略す）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養液を８，０００ｒｐｍで、１０分間遠心して集菌し、３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、３０ｍｍｏｌ／Ｌトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍｌに懸濁し、０℃で１０分間超音波破砕（ＢＲＡＮＳＯＮ  ＳＯＮＩＣ  ＰＯＷＥＲ  ＣＯＭＰＡＮＹ社、ＳＯＮＩＦＩＥＲ  ＣＥＬＬ  ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ２００、ＯＵＴＰＵＴ  ＣＯＮＴＲＯＬ２）した。該超音波破砕物を９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して菌体残渣を得た。
菌体残渣からマーストンらの方法［バイオ・テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）、第２巻、８００頁（１９８４年）］に準じ、ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。
参考例６  組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ）の調製
配列番号２に示したアミノ酸配列を有するｒｈＧ−ＣＳＦを参考例５に記載した方法に準じて調製した。
試験例１  化学修飾インターフェロン−βの抗ウイルス活性
実施例９、１０、１２および１３で得られた化学修飾ｒｈＩＦＮ−βおよび未修飾ｒｈＩＦＮ−βの抗ウイルス活性を下記のニュートラルレッド（ＮＲ）取り込み法で調べた。
＜ＮＲ取り込み法＞
小長谷らの方法［蛋白質核酸酵素（別冊）、３３５頁（１９８１年）］を参考に、抗ウイルス活性を測定した。
すなわち、滅菌したトランスファープレートに５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加イーグルＭＥＭ培地を添加した。次に、ＩＦＮ国内標準品［α（ミドリ十字）、β（東レ）およびγ（ミドリ十字）］溶液を各々５０μｌずつウェルに分注し、２倍ずつの段階希釈を行った。一方、所定の濃度に培地で調製した化学修飾ＩＦＮまたは未修飾ＩＦＮ溶液も同様に５０μｌずつウェルに分注した。これらの溶液を、所定の細胞数のヒト羊膜由来の株化細胞（ＦＬ細胞）をいれた９６穴プレートにトランスし、数秒間攪拌した。３７℃にて一昼夜、ＣＯ２インキュベーターで培養し、抗ウイルス状態を作った。
次に、培養液を除去した後、ウイルス溶液を添加し、３７℃にて２日間、ＣＯ２インキュベーターで培養しウイルスを感染させた。ＩＦＮにより細胞の抗ウイルス状態が変化し、細胞変性が起こった。続いて、培養液を除去し、ニュートラルレッド（ＮＲ）溶液を添加した。３７℃にて１時間ＣＯ２インキュベーターに放置し、ＮＲ溶液を除去した。等張りん酸緩衝液でウェルを洗浄し、抽出液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸−３０％エタノール）を添加し、２〜３分間攪拌した。
ＮＲにより生き残った細胞を染色し、抽出後、４９２ｎｍでの吸光度を測定し、定量曲線をプロットした。定量曲線より算出した未修飾ＩＦＮの活性を１００％としたときの化学修飾ＩＦＮの相対活性を算出した。
各ＩＦＮ−βの比活性を第５表および第６表に示す。
0004152187.tif 000019
0004152187.tif 000020
第５表および第６表の結果より、本発明に係る化学修飾ＩＦＮ−βはいずれも抗ウイルス活性を保持していることが確認された。
試験例２  化学修飾インターフェロン−αの抗ウイルス活性
実施例１４で得られた化学修飾ｒｈＩＦＮ−αおよび未修飾ｒｈＩＦＮ−αの抗ウイルス活性を試験例１に示したＮＲ取り込み法で調べた。
各ＩＦＮ−αを濃度１μｇ／ｍｌで作用させたときの活性を第７表に示す（未修飾ＩＦＮ−αの活性を１００％として表示した）。
0004152187.tif 000021
試験例３  化学修飾組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体のマウス白血病細胞ＮＦＳ６０に対する増殖促進作用
実施例１５〜２０の化合物、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体、および未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦのマウス白血病細胞ＮＦＳ６０［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻、６６８７頁（１９８５年）］に対する増殖促進活性を、浅野らの方法［薬理と治療、１９巻、２７６７頁（１９９１年）］に従って測定した。
各化合物を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に作用させたときの結果を未修飾のポリペプチドの活性を１００％として第８表および第９表に示す。
0004152187.tif 000022
0004152187.tif 000023
第８表および第９表の結果より、本発明に係る化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体および化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦはいずれもＮＦＳ６０細胞に対する増殖促進作用を維持していることが確認された。
試験例４  化学修飾スーパーオキサイドディスムターゼの酵素活性
実施例２１で調製した化学修飾ＳＯＤの酵素活性をＭｃｃｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．とＦｒｉｄｏｖｉｃｈｉ，Ｉ．のキサンチン−キサンチンオキシダーゼ−シトクロムＣ系［ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４４巻、６０４９頁（１９６９年）］で測定した。ＳＯＤ活性１ユニット（Ｕ）とは、ｐＨ７．８、３０℃下で、シトクロムＣの還元速度を５０％阻害するＳＯＤの酵素量を示し、以下の式で算出した。
0004152187.tif 000024
化学修飾ヒトＳＯＤの酵素活性を第１０表に示す。
ＳＯＤ  ５０Ｕ／ｍｌ＝０．０００２５６ｍｇ（３９００Ｕ／ｍｇの場合）
ΔＡ／分：測定値
0004152187.tif 000025
第１０表より、本発明に係る化学修飾ｈＳＯＤは酵素活性を維持していることが確認された。
試験例５  化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体の結合活性
実施例２２で調製した化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体（５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ＫＭ８７１）の結合活性をＫｅｎｙａ．Ｓらの方法［キャンサー  イミュノロジー  アンド  イミュノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、３６巻、３７３頁（１９９３年）］に基づいて測定した。
未修飾抗体および化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体（５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ＫＭ８７１）の３．３μｇ／ｍｌの濃度におけるＧＤ３結合活性を第１１表に示す。
活性は、未修飾の抗ＧＤ３キメラ抗体の結合活性を１００％としたときの相対活性で示した。
0004152187.tif 000026
第１１表より、本発明に係る化学修飾抗ＧＤ３キメラ抗体（５ＰＥＴ（３ＵＡ）−ＫＭ８７１）でＧＤ３への結合活性が維持されていることが確認された。
試験例６  化学修飾インターフェロン−βの血中半減期延長効果
実施例９で得られた５ＴＲＣ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−β、参考例１で得られたＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＩＦＮ−β、および参考例４で得られた未修飾ｒｈＩＦＮ−βを等張りん酸緩衝液で１２．５μｇ／ｍｌの濃度に調製し、８〜１０週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雄性マウス（日本チャールズリバー）に２００μｌずつ静脈内注射した。経時的にマウスを殺し血清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により血中のＩＦＮ−βの濃度を算出した。
その結果を図１に示す。
未修飾ＩＦＮ−βが投与後１時間で検出限界以下になったのに対し、化学修飾ＩＦＮ−βでは数時間後も血中濃度が維持され、大幅な持続性が付与された。
また、本発明で開示された化合物、すなわち３本鎖分岐型ポリエチレングリコール類で修飾されたｒｈＩＦＮ−βは、２本鎖分岐型ポリエチレングリコール類で修飾されたｒｈＩＦＮ−βに比較してより血中持続性に優れ、高い血中濃度推移を示した。
試験例７  化学修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ類の血中半減期延長効果
実施例１５で得られた５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体、実施例１７で得られた５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ、参考例２で得られたＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体、参考例３で得られたＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＧ−ＣＳＦ、参考例５の未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体、参考例６の未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦを雄性ラットに０．１ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内注射し、経時的に尾静脈より血液を採取した。適宜希釈し、ＥＬＩＳＡにて血中の化合物濃度を測定した。２回の実験を行って得られた結果を図２に示す。
未修飾Ｇ−ＣＳＦ類に対し、化学修飾Ｇ−ＣＳＦ類では大幅に高い血中濃度が維持された。さらに、本発明で開示された化合物、すなわち、３本鎖分岐型ポリエチレングリコール類で修飾されたｒｈＧ−ＣＳＦ類は従来の２本鎖分岐型ポリエチレングリコール類で修飾された化合物に比べてより血中持続性に優れていることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明で開示された新規な分岐型の構造を有するポリアルキレングリコール類は生理活性ポリペプチド類の化学修飾試剤として有用である。さらに、該ポリアルキレングリコール修飾生理活性ペプチドは非修飾ペプチドと同様の生物活性を保持しているだけでなく、体内に投与されたときに長時間有効にその生理活性を示し、当該生理活性に関連した症状の改善剤、治療剤として有用である。
【配列表】
0004152187.tif 000027
0004152187.tif 000028
0004152187.tif 000029
0004152187.tif 000030
【図面の簡単な説明】
図１  化学修飾ヒト組換え型インターフェロン−βをマウスに静脈内注射したときの血中半減期延長効果を示す。
−■−：未修飾ｒｈＩＦＮ−βの血中濃度推移を表す。
−▲−：５ＴＲＣ（３ＵＡ）−ｒｈＩＦＮ−βの血中濃度推移を表す。
−●−：ＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＩＦＮ−βの血中濃度推移を表す。
図２  化学修飾ヒト組換え型顆粒球コロニー刺激因子類をラットに静脈内注射したときの血中半減期延長効果を示す。
−■−：未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体の血中濃度推移を表す。
−□−：未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦの血中濃度推移を表す。
−▲−：５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体の血中濃度推移を表す。
−△−：５ＳＫＡ（３ＵＡ）−ｒｈＧ−ＣＳＦの血中濃度推移を表す。
−●−：ＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体の血中濃度推移を表す。
−○−：ＰＥＧ２Ｌｙｓ−ｒｈＧ−ＣＳＦの血中濃度推移を表す。
【図１】
0004152187.tif 000039
【図２】
0004152187.tif 000040