(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリサッカライドをポリペプチドへ接合する方法であって、
（ａ）前記ポリサッカライドを、ポリサッカライドのヒドロキシル基と反応する官能基を有し、オレフィン基を有し、かつ前記官能基としてエポキサイドか又は脱離基を含んでいるアルキル化剤と反応させ、それによりアルキル化ポリサッカライドを生成させること、
（ｂ）前記アルキル化ポリサッカライドを、前記オレフィン基をアミン反応性アルデヒド基へ変換するよう処理すること、
（ｃ）前記アミン反応性アルデヒド基を前記ポリペプチド上のアミン官能基と反応させ、前記ポリペプチドへ接合したポリサッカライドを製造すること、を含む前記方法。
【請求項２】
前記ステップ（ａ）のアルキル化ポリサッカライドは、各自下記式のモノサッカライド単位から独立に選ばれた繰り返しモノサッカライド単位の配列を有するポリマーであり：
0004182269.tif 000007
式中：
Ａの一つは前記単位の他の一つのＣｌグリコシド単位への結合手であり、他のＡはＨおよびＱＬよりなる群から独立に選ばれ、
ＬはＯとＱを連結する連結基であり、
ＱはＣ（Ｚ）＝Ｄであり、
ＤはＯまたはＣＲ1Ｒ2であり、
Ｒ1およびＲ2は独立にＨ，アルキルまたはアリールであり、
ＺはＨまたはＣ（Ｙ）＝Ｏであり、
ＹはＲ3，ＯＲ3またはＮＲ3Ｒ4であり、
Ｒ3およびＲ4は独立にＨ，アルキルまたはアリールであり、
Ｌ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3およびＲ4のどれも一所になって環を形成することができ、
ただし前記ポリマー中少なくとも二つのＡはＱＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマーは、５０ないし５０，０００の繰り返しモノサッカライド単位を有する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ポリマーの一つの単位のメチレンオキシ酸素上のＡは、ポリマーの他の一つの単位のＣｌグリコシドへの結合手である請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ＱがＣ（Ｚ）＝Ｄであり、ＤはＣＲ1Ｒ2そしてＺはＨである請求項２または４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマーにおいて、前記ポリマーのモノサッカライド単位２０個あたり、前記モノサッカライド単位の少なくとも一つにおいて少なくとも二つのＡがＱＬである請求項２または４に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｃ）の中の方法は、ポリペプチドとのアミン反応性アルデヒド基の還元的アミノ化を含んでいる請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｂ）は、前記アルキル化ポリサッカライドのオゾン分解を含んでいる請求項１の方法。
【請求項９】
前記ポリサッカライドは、デキストランである請求項１の方法。
【請求項１０】
前記アルキル化剤は、式
Ｌ3（Ｚ1）＝ＣＲ5Ｒ6
を有し、式中、
Ｌ3は前記ポリサッカライドのヒドロキシル基と反応性の官能基を含んでおり、エポキサイドか、または脱離基を含んでいるアルキル基を含んでいる基であり、
Ｒ5およびＲ6は独立にＨ，アルキルまたはアリールであるか、または相互にまたはＬ3と一所になって環を形成することができ、Ｚ1はＨまたはＣ（Ｗ）＝Ｏであり、
ＷはＲ7，ＯＲ7またはＮＲ7Ｒ8であり、
Ｒ7およびＲ8は独立にＨ，アルキルまたはアリールである、請求項１の方法。
【請求項１１】
Ｌ3は脱離基を含んでいるアルキル基であり、前記脱離基は臭素、塩素、ヨウ素、アリールスルホネート、アルキルスルホネート、アリールサルフェートおよびアルキルサルフェートよりなる群から選ばれる請求項１０の方法。
【請求項１２】
Ｌ3はＣＨ2ＯＣＨ2（Ｃ2Ｈ3Ｏ）であり、（Ｃ2Ｈ3Ｏ）はオキサニル基である請求項１０の方法。
【請求項１３】
Ｌ3は、ＣＨ2Ｂｒである請求項１０の方法。
【請求項１４】
前記オレフィン基は、前記アルデヒド官能基が得られるようにオゾン分解へかけられる請求項１の方法。
【請求項１５】
前記アミン反応性アルデヒド基は、α−ケトカルボキシル酸のアルデヒド基である請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明の背景
（本発明の分野）
医学および臨床化学の分野においては、細胞、タンパク、酵素、助因子、核酸、基質、抗原、抗体等のような生理学的に反応性の種の多数の研究および測定は、特異性結合ペアメンバーまたは標識等を含んでいる接合体を用いて実施される。特異性結合ペアメンバーの結合を含んでいるアッセイは既知である。これらのアッセイ技術も一般にアッセイの検出部において使用される標識を含んでいる。
ポリサッカライド、特にデキストランが特異性結合ペアメンバーの安定性を増加するため特異性結合ペアメンバーへ接合されていた。ポリサッカライドへこれらのメンバーの接合はまた、これら分子のかさ高さを増加する。これは相補性の特異性結合ペアメンバーへの結合を妨害することによって特異性結合ペアメンバーを含んでいるアッセイにおけるそれらの有効性を増強することができる。加えて、これら接合体は、表面に存在する時、大きく減少した非特異性結合をもって表面への相補特異性結合ペアメンバーの特異性結合を許容する。
アミノデキストランまたはカルボキシメチルデキストランが特異性結合ペアメンバーへの接合体の形成に使用されて来た。デキストランの例えばタンパクへの結合はその時アミドの形成によって実施することができる。しかしながらアミノデキストランおよびカルボキシメチルデキストランは非特異性結合を制御するためしばしば中和しなければならない電荷を持っている。そのような中和は接合体生体分子を同時に誘導体化することなしには実行困難である。
接合の一代替方法は、最初アルデヒド基を導入するため過ヨウ素酸でポリサッカライドを部分酸化することである。リガンドおよびレセプターを含んでいるアミンへのカップリングはその時還元的アミノ化によって実施することができる。部分酸化したデキストランは荷電していないが、部分酸化を精密にコントロールすることは困難である。安定性を損なうことのないポリサッカライドへアルデヒド基を導入するための操作はもっと容易に実施され、そしてそれ故容易な接合を許容する操作が必要である。
（関連技術の説明）
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９０）１３１：２５７−２６７においてＬａｕｒｉｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌは、活性化したニトロセルロース上の小さいペプチドのドット免疫結合およびイムノブロッティングまたはピコグラムおよびナノグラム量を論じている。
Ｍａｒｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８３）１２８：３４２−３５０により、アガロースポリアルデヒドマイクロスフェアビーズに基づく効果的免疫吸着体：合成およびアフィニティクロマトグラフィーが開示されている。
米国特許Ｎｏ．４，２６４，７６６（Ｆｉｓｃｈｅｒ）は免疫学的診断試薬を開示している。
米国特許Ｎｏ．４，８０１，５０４（Ｂｕｒｄｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ）はポリマー粒子へ結合したポリサッカライドを有する蛍光標識を論じている。
ヨーロッパ特許Ｎｏ．０３１５４５６Ｂ１において減少した免疫原性または改善された薬物動態を有するポリサッカライド修飾イムノグロブリンが論じられている。
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ（１９９０）５５：２６５−２７３においてＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌは血小板活性化因子のアルデヒドアナログの簡便な合成および特異性抗体の製造におけるその使用を記載している。
本発明の概要
一面において本発明は、各自下記式のモノサッカライド単位から独立に選ばれた反復するモノサッカライド単位の配列を含むポリマーに関する。
0004182269.tif 000002
式中、Ａは一つは他の一つの単位のＣ１グリコシル炭素への結合手であり、他のＡはＨおよびＱＬからなる群から独立に選ばれ、ここにＬはＯおよびＱを連結する連結基であり、ＱはＣ（Ｚ）＝ＤであってそのうちＤはＯであるかまたはＣＲ1Ｒ2であってＲ1およびＲ2はＨ，アルキルまたはアリールから独立に選ばれ、そしてＺはＨまたはＣ（Ｙ）＝ＯであってＹはＲ3，ＯＲ3またはＮＲ3Ｒ4であり、Ｒ3およびＲ4はＨ，アルキルまたはアリールから独立に選ばれ、さらにＬ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3およびＲ4のどれも一所になって環を形成することができ、ただしポリマー中少なくとも二つのＡはＱＬであることを条件とする。また上のポリマーのポリペプチドのような生体分子との反応によって製造された化合も含まれる。
本発明の他の面は以下の構造を有する化合物である。
0004182269.tif 000003
式中、
ｎ＝５０ないし５０，０００；
Ａ1＝ＨおよびＱ1Ｌ1より選ばれた基；
Ｌ1＝ＯとＱ1を連結する連結基；
Ｑ1＝Ｃ（Ｚ）＝Ｄ；
Ｄ＝ＯまたはＣＲ1Ｒ2；
Ｒ1，Ｒ2＝独立にＨ，アルキルまたはアリール；
Ｚ＝ＨまたはＣ（Ｙ）＝Ｏ；
Ｙ＝Ｒ3，ＯＲ3またはＮＲ3Ｒ4；
Ｒ3，Ｒ4＝独立にＨ，アルキルまたはアリール；
であり、Ｌ1，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3およびＲ4のどれも一所になって環を形成することができ、ただし化合物中少なくとも二つのＡ’はＱ’Ｌ’であることを条件とする。上の化合物のポリペプチドとの反応によって製造された化合物も含まれる。
本発明の他の面は、アルデヒド官能基の各自が未修飾ポリサッカライドの別のヒドロキシル基の水素原子に相当する位置へリンカーを介して結合したペンダントアルデヒド官能基を有する修飾したポリサッカロイドである化合物である。
本発明の他の一具体例は、デキストランへアミン反応性官能基を導入する方法である。この方法はデキストランのヒドロキシルと反応する官能基およびオレフィン基を有するアルキル化剤と反応させることを含む。生成したアルキル化ポリサッカライドはオレフィン基をアミン反応性官能基へ変換するように処理され、生体分子へ接合したポリサッカライドを製造するため生体分子上のアミン官能基と反応させる。
特定具体例の説明
本発明は、イムノアッセイにおいて使用するためマクロ分子のポリサッカライドへの接合のための簡単な費用のかからない方法を提供する。アルデヒドのようなアミン反応性官能基がマクロ分子へ連結のためポリサッカライドへ導入される。本発明の一利益は、以前の方法と異なって、ポリサッカライド中へ導入されるアミン反応性官能基の数を制御できることである。
本発明の特定具体例の説明へ進む前に、多数の術語が定義されるであろう。
「モノサッカライド」
アルデヒドアルコールまたはケトンアルコールのようなより簡単な化合物、例えばヘキソースまたはペントースへ加水分解することができない炭水化物。
「ポリサッカライド」
３以上のモノサッカライド単位を含んでいる炭水化物。ポリサッカライドはより簡単なモノサッカライド単位へ加水分解することができる。例示であって限定でないポリサッカライドの例はデキストラン、デンプン、グリコーゲン、ポリリボース等である。
「デキストラン」
線状の１，６−結合（９８％）グルコース単位よりなるポリサッカライド，重合したグルコース。
「アルキル」
脂肪族炭化水素から１個のＨ原子の除去により得られる分岐したまたは分岐しない一価の基であり、低級アルキルおよび高級アルキルの両方を含む。
「低級アルキル」
例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、イソブチル、ペンチル等のような１ないし５個の炭素原子を含んでいるアルキル。
「高級アルキル」
ヘキシル、ヘプチル、オクチル等の６個以上、通常６ないし２０個の炭素原子を含んでいるアルキル。
「アルキリデン」
例えば同じ炭素原子から２個の水素原子を取ったエチリデンのような脂肪族炭化水素から誘導された二価の有機基。
「アリール」
例えばフェニル（ベンゼンから）、ナフチル（ナフタレンから）等のように１個の水素原子を除去し、そして一以上の芳香族環、通常１〜４個の芳香族環を含んでいる芳香族炭化水素から誘導された有機基、例えばフェニル、ナフチル、フェナントリル。
「アラルキル」
アリール基が結合したアルキル基を有する有機基、例えばベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルエチル等。
「アルコキシ」
酸素原子によって分子の残りへ結合したアルキル基、例えばメトキシ、エトキシ等。
「アリールオキシ」
酸素原子によって分子の残りへ結合したアリール基、例えばフェノキシ、ナフトキシ等。
「アラルコキシ」
酸素原子によって分子の残りへ結合したアラルキル基、例えばベンジルオキシ、１−ナフチルエトキシ等。
「アミン反応性官能基」
例えばアルデヒド、α−ケトカルボキシル酸等のような、通常アミンの求核性または塩基性によってアミン官能基と反応性の官能基。
「ヒドロキシル基と反応する官能基を有するアルキル化剤」
例えばオキシラニル基、例えばハライド（クロライド、ブロマイド、ヨーダイド）、アリールスルホネート、アルキルスルホネート、アリールサルフェート、アルキルサルフェート、トジレート、アクリルアミドのようなアクリル酸誘導体のような脱離基を含んでいるアルキル等のような、中性またはイオン化したヒドロキシル基の求核性によりヒドロキシル基と反応性の官能基を持っている化合物。
「生体分子」
例えばアビジン、ストレプトアビジン、タンパクＡ、タンパクＧ、抗体等のようなポリペプチド。
「接合体」
一般に連結基を介して単一構造を形成するように結合した二以上の構造からなる分子。
「連結基」
二つ以上の下位構造を接続する構造の部分。連結基は結合手から、各自独立して通常炭素、酸素、イオウ、窒素およびリン、通常炭素および酸素よりなる群から選ばれた１ないし３０またはそれ以上の原子、通常約１ないし２０原子、好ましくは１ないし１０原子の鎖まで変化し得る。連結基中のヘテロ原子は普通約０から８、通常約１から６、もっと好ましくは２から４の範囲にある。鎖中の原子の数は接続される下位構造間の最短のルートに沿って水素または他の一価原子以外の原子の数を数えることによって決定される。連結基の原子は例えばアルキル、アリール、アラルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ等の形で炭素、酸素等のような水素以外の原子で置換されてもよい。一般に特定の連結基の長さは、連結基による生体分子へ結合される本発明のポリマーの能力の妨害が最小である限り、合成の便利さを提供するように随意に選定することができる。
連結基は脂肪族または芳香族でよい。ヘテロ原子が存在する時は、酸素は普通炭素、イオウ、窒素またはリンへ結合したオキシまたはオキソとして存在し、イオウはチオエーテルまたはチオノとして存在し、窒素は普通炭素、酸素、イオウまたはリンへ結合したニトロ、ニトロソまたはアミノとして存在し、リンはフォスフォネートまたはフォスフェートモノ−またはジエステルとして炭素、イオウ、酸素または窒素へ結合しているであろう。連結基に存在する官能基はエステル、アミド、チオアミド、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、アゾ基、チオエーテル、カルボキシレート等を含むことができる。
例示としてそして限定でない本発明に使用し得る種々の連結基の例は、全体をここに参照として取り入れる米国特許Ｎｏ．３，８１７，８３７、特にカラム３０，６９行ないしカラム３６，１０行に見られる。
好ましい連結基はアルキレン、すなわち（ＣＨ2）pを含み、ここでｐは１ないし１０，好ましくは１ないし５の整数であり、このアルキレンの１個以上の炭素、通常１個の炭素上の１個以上の水素、通常１個の水素はＲ9がＨ，アルキルまたはアリールであるＯＲ9で置換されることができ、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、フェニレン、ｐ−ベンジレン等を含み、そしてアルキレンオキシアルキレン、すなわち（ＣＨ2）qＸ（ＣＨ2）rであり、ここでｑおよびｒは同一または異なって１ないし５好ましくは１ないし３の整数であり、Ｘは独立にＯまたはＳ、好ましくはＯであり、そしてアルキレンの一方または両方、通常一方の１個以上の水素、通常１個の水素はＲ9がＨ，アルキルまたはアリール，好ましくはＨであるＯＲ9で置換されても良く、例えばメチレンオキシメチレン、メチレンオキシエチレン、エチレンオキシエチレン、１−メチレンオキシ−２−ヒドロキシエチレン等を含む。
「特異性結合ペアのメンバー（“ｓｂｐメンバー”）」
表面上または空胴中の他の分子の特定の空間的な極性組織へ特異的に結合し、それにより相補的であることを規定する区域を有する二つの異なる分子の一つ。特異性結合ペアのメンバーはリガンドおよびレセプター（アンチリガンド）と呼ばれる。これらは通常抗原−抗体のような免疫学的ペアであろうが、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、核酸重複体、ＩｇＧ−タンパクＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡ等のようなポリヌクレオチドのような他の特異性結合ペアは免疫学的ペアではないが、本発明で説明する目的のためｓｂｐメンバーの定義に含められる。
「検体」
検出すべき化合物または組成物。検体は特異性結合ペアのメンバーを含むことができ、そして通常一価（モノエピトープ性）の通常ハプテン性の、そして少なくとも一つの共通エピトープまたは決定基部位を占めるリガンドであり得る。
モノエピトープ性リガンド検体は一般に約１００ないし２，０００分子量、もっと普通には１２５ないし１，０００分子量であろう。検体は薬物、代謝物、農薬、汚染物質等を含む。例示であって限定でない代表的検体は、（ｉ）モルフィン、コディン、デキストロモルファン、それらの誘導体および代謝物を含むモルフィンアルカロイド；コカインおよびベンジルエクゴニン、それらの誘導体および代謝物を含むコカインアルカロイド；リセルグ酸ジエチルアミドを含む麦角アルカロイド；ステロイドアルカロイド；イミダゾールアルカロイド；キナゾリンアルカロイド；イソキノリンアルカロイド；キニンおよびキニジンを含むキニンアルカロイド；ジペルテンアルカロイド、それらの誘導体および代謝物のようなアルカロイド類；（ii）エストロゲン、アンドロゲン、副腎皮質ステロイド、胆汁酸、ジゴキシンおよびジゴキシゲニンを含む強心性グリコシドおよびアグリコン、サポニンおよびサポニゲニン、それらの誘導体および代謝物、ジエチルスチルベストロールのようなステロイド模倣物質を含むステロイド類、（iii）バルビツレート例えばフェノバルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダントイン、プリミドン、エトスクシミド、およびそれらの代謝物を含む、５ないし６環状メンバーを有するラクタム類、（iv）アンフェタミン、エフェドリン、Ｌ−ドパ、エピネフリンを含むカテコールアミン、ナルセイン、パパベリン；およびこれらの代謝物を含む炭素数２〜３のアルキルを有するアミノアルキルベンゼン類、（ｖ）オキサゼパム、クロールプロマジン、テグレトール、それらの誘導体および代謝物を含む、複素環がアゼピン、ジアゼピンおよびフェノチアジンであるベンゾ複素環類、（vi）テオフィリン、カフェイン、それらの誘導体および代謝物を含むプリン類、（vii）カンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノールを含むマリハナから誘導される薬物、（viii）チロキシン、コルチゾル、トリヨードチロニン、テストステロン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、アンギオテンシンＬＨＲＨのようなポリペプチド、およびシクロスポリン、ＦＫ５０６、マイコフェノール酸（ＭＰＡ）等のようなホルモン、（ix）ビタミンＡ，Ｂ例えばＢ12，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｋ，葉酸、チアミンのようなビタミン類、（ｘ）ヒドロキシル化および不飽和の程度および部位が異なるプロスタグランジン類、（xi）イミプラミン、クロミプラミン、ドキセピンおよびデスメチルドキセピンを含む三環抗うつ剤、（xii）メトトレキセートを含む抗ガン剤、（xiii）ペニシリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリン、テラマイシン、それらの代謝物および誘導体を含む抗生物質（xiv）ＡＴＰ，ＮＡＤ，ＦＭＮ、アデノシン、グアノシン、チミジン、シチジンを含む適切な糖およびリン酸置換基を有するヌクレオシドおよびヌクレオチド類、（xv）メタドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン、バルプロン酸、ブチロフェノン、抗ヒスタミン剤、クロラムフェニコール、アトロピンのような抗コリン薬物、それらの代謝物および誘導体を含む他の個々の薬物、（xvi）スペルミ��、ガラクトース、フェニルピルビン酸およびポルフィンタイプ１を含む病的状態に関連した代謝物、（xvii）ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシンおよびアミカシンのようなアミノグルコシド、および（xviii）ポリハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル、チオフォスフェート、カーバメート、ポリハロゲン化サルフェンアミド、それらの代謝物および誘導体のような農薬を含んでいる。
多価検体は普通ポリアミノ酸すなわちポリペプチドおよびタンパク、ポリサッカライド、核酸およびそれらの組合せである。そのような組合せはバクテリア、ビールス、クロモソーム、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜等の成分を含んでいる。大部分について、ポリエピトープ性リガンド検体は少なくとも５，０００、もっと普通には少なくとも約１０，０００の分子量を持つであろう。ポリ（アミノ酸）カテゴリーにおいては、関心あるポリ（アミノ酸）は一般に分子量５，０００ないし５，０００，０００、もっと普通には約２０，０００ないし１，０００，０００であろう。関心あるホルモンの中で、分子量は普通約５，０００ないし６０，０００であろう。
多糖類のタンパクは類似の構造特徴を有するタンパク、特定の生物学的機能を有するタンパク、特定の微生物特に発病微生物に関連したタンパク等のファミリーと考えることができる。そのようなタンパクは、例えばイムノグロブリン、サイトカイン、酵素、ホルモン、ガン抗原、栄養マーカー、組織特異性抗原等を含む。例示であって限定でなく、そのようなタンパクはプロタミン、ヒストン、アルブミン、リポタンパク、ヌクレオタンパク、グリコタンパク、Ｔ−細胞レセプター、プロテオグリカン、ＨＬＡ、未分類タンパク例えばソマトトロピン、プロラクチン、インスリン、ペプシン、ヒト血漿中に発見されるタンパク、血液凝固因子、例えば小胞刺激ホルモンのようなタンパクホルモン、黄体ホルモン、ルテオトロピン、プロラクチン、絨毛ゴナドトロピン、組織ホルモン、サイトカイン、例えばＰＳＡ，ＣＥＡ，α−フェトタンパク、酸性フォスファターゼ、ＣＡ１９．９およびＣＡ１２５のようなガン抗原、例えばアルカリ性フォスファターゼ、ミオグロビン、ＣＰＫ−ＭＢおよびカルシトニンのような組織特異性抗原、およびペプチドホルモンを含む。他の関心あるポリマー物質はムコポリサッカライドおよびポリサッカライドである。
レセプター検体については、分子量は一般に１０，０００ないし２×１０8，もっと普通には１０，０００ないし１０6の範囲であろう。イムノグロブリンＩｇＡ，ＩｇＧ，ＩｇＥおよびＩｇＭについては、分子量は一般に約１６０，０００ないし約１０6まで変化するであろう。酵素は普通分子量約１０，０００ないし１，０００，０００の範囲であろう。天然レセプターは広く変化し、一般に少なくとも分子量が約２５，０００であり、そして１０6またはそれ以上であることができ、アビジン、ＤＮＡ，ＲＮＡ，チロキシ結合グロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、トランスコルチン等を含む。
術語「検体」はさらにｍ−ＲＮＡ，ｒ−ＲＮＡ，ｔ−ＲＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡ重複体等を含んでいる。
検体は宿主からの体液を含む生物学的組織のようなサンプル中に直接見出される分子であり得る。サンプルは直接検査することができ、また望まない物質を除くことにより検体をもっと容易に検出できるようにするために前処理することができる。サンプルは細胞を分離または溶解し、タンパクを沈澱、加水分解または変性し、脂質を加水分解し、検体を可溶化する等のため前処理することができる。そのような前処理は、例示であって限定でなく、遠心、有機溶媒、例えばメタノールのようなアルコールによるサンプルの処理、および洗剤による処理を含む。サンプルはアッセイを妨害しない任意の便利な媒体中に調製することができる。
関心ある検体は、関心ある検体がサンプル中に存在する時のみにその存在が検出される、関心ある検体に相補的な特異性結合ペアメンバーのような関心ある検体を証明する剤を検出することによって測定し得る。このような検体を証明する剤はアッセイにおいて検出される検体となる。
生物学的組織は宿主の器官または他の体部分からの剔出した組織、および例えば尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、糞、痰、脳脊髄液、涙液、粘液等を含む。好ましくはサンプルは血漿または血清である。
「ポリヌクレオチド」
天然状態では約５０ないし５００，０００以上のヌクレオチドを有し、単離した状態では約１５ないし５０，０００以上のヌクレオチド、通常約１５ないし２０，０００ヌクレオチド、もっと頻繁には１５ないし１０，０００ヌクレオチドを有するポリマーヌクレオチドである化合物または組成物。ポリヌクレオチドはＤＮＡ（２本鎖および１本鎖）、およびＲＮＡ，通常ＤＮＡを含む、天然に存在するまたは合成的に製造した精製したまたは未精製形の任意の起源からの核酸を含み、そしてｔ−ＲＮＡ，ｍ−ＲＮＡ，ｒ−ＲＮＡ，ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ，クロロプラストＤＮＡおよびＲＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはその混合物、遺伝子、クロモソーム、プラスミド、例えばバクテリア、イースト、ビールス、バイロイド、かび、糸状菌、植物、動物、ヒトのような生物学的材料のゲノムおよびそのフラグメント等でよい。
「リガンド」
それに対するレセプターが天然に存在するかまたは調製することができる任意の有機化合物。
「ハプテン」
対応する抗体へ特異的に結合することができるが、それ自体はその抗体の調製のための免疫原（抗原）として作用しない化合物。ハプテンを認識する抗体は免疫原性（または抗原性）担体へ連結したハプテンを含む化合物に対して調製することができる。ハプテンはリガンドの下位セットである。
「リガンドアナログ」
レセプターに対し類縁のリガンドと競合することができる、通常分子量１００以上の修飾したリガンド、有機基または検体アナログ。修飾はリガンドアナログを他の分子へ結合する手段を提供する。リガンドアナログは通常リガンドとはリガンドアナログをハブまたは標識へ連結する結合手で水素を置換すること以上に異なるであろうが、しかしそうでなくてもよい。リガンドアナログはリガンドに類似した態様でレセプターへ結合することができる。アナログは例えばリガンドに対する抗体のイディオタイプに対して向けられた抗体であることができよう。
「レセプター（“アンチリガンド”）」
分子の特定の空間的および極性組織、例えばエピトープ性または決定基性部位を認識することができる任意の化合物または組成物。例示的なレセプターは天然に存在するレセプター、例えばチロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン、核酸、タンパクＡ、補体成分Ｃｌｑ等を含む。
「特異性結合」
他の分子の実質的に低い認識に比較して二つの異なる分子の一つの他方の分子の特異性認識。一般に分子はそれらの表面上または空胴内に結合部位とも呼ばれる二つの分子間の特異性認識を与える区域を持っている。特異性結合の例は抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチド相互作用等である。
「非特異性結合」
特異性表面構造には比較的無関係な分子間の非共有結合。非特異性結合は分子間の疎水性相互作用を含むいくつかの要因から発生し得る。
「抗体」
他の分子の特定の空間的および極性組織へ特異的に結合しそしてそれにより相補的であると定義される免疫グロブリン。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであることができ、そしてホストの免疫および血清の採取（ポリクローナル）のようなこの分野で良く知られた技術により、または連続ハイブリッド細胞ラインを調製しそして分泌されたタンパクを採取する（モノクローナル）ことにより、または少なくとも天然抗体の特異性結合に必要なアミノ酸配列をコードする核酸配列またはその変異体をクローニングしそして発現させることによって調製することができる。抗体は完全なイムノグロブリンまたはそのフラグメントを含むことができ、このイムノグロブリンはＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ３，ＩｇＭ等のような種々のクラスおよびアイソタイプを含む。それらのフラグメントはＦａｂ，ＦＶおよびＦ（ａｂ’）2，Ｆａｂ’等を含むことができる。加えてイムノグロブリンまたはそれらのフラグメントの凝集体、ポリマーおよび接合体も、特定の分子に対する結合親和性が維持されている限り、適切な場合に使用することができる。
「置換」
分子の一つの水素原子がハロゲン等の単一原子、または上に記載した官能基を形成する原子群の部分であり得る他の原子によって置換されていることを意味する。そのような置換基は親水性または親油性を付与する基または官能基であり得る。親水性は酸素、窒素、イオウ、リン等のような一以上の原子を持っている官能基によって得ることができ、そのような基はスルホネート、サルフェート、フォスフェート、アミジン、フォスフォネート、カルボキシレート、ヒドロキシル、特にポリオール、アミン、エーテル、アミド等を含む。例示的な官能基はカルボキシアルキル、スルホノキシアルキル、ＣＯＮＨＯＣＨ2ＣＯＯＨ，ＣＯ−（グルコサミン）、糖、デキストラン、シクロデキストリン、ＳＯ2ＮＨＣＨ2ＣＯＯＨ，ＳＯ3Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＳＯ3Ｈ，ＰＯ3Ｈ2，ＯＰＯ3Ｈ2，ヒドロキシル、カルボキシル、ケトンおよびそれらの組合せである。親油性は水素またはハロゲンで置換された炭素原子のような官能基によって得ることができ、そしてアルキル、アルキリデン、アリールおよびアラルキルを含むことができる。親油性基または官能基は通常少なくとも６炭素原子、もっと普通には少なくとも１０炭素原子、そして好ましくは少なくとも１２炭素原子の通常３０炭素原子より多くない１ないし６の直鎖または分岐鎖脂肪族基を持つであろう。
「支持体または表面」
ストリップ、ロッド、プレート、ウエル、粒子またはビーズのような多数の形状の任意の一つを持つことができる多孔質または非多孔質水不溶性材料である、固相、典型的には支持体または表面。広範囲の適切な支持体は、Ｕｌｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ米国特許Ｎｏ．５，１８５，２４３，カラム１０〜１１，Ｋｕｒｎ，ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．４，８６８，１０４，カラム６，２１〜４１行、およびＭｉｌｂｕｒｎ，ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．４，９５９，３０３，カラム６，１４〜３１行に開示されており、これらを参照としてここに取り入れる。
表面は親水性か、または親水性化することができ、そしてシリカ、硫酸マグネシウムおよびアルミナのような無機粉末、例えば濾紙、クロマトグラフ用紙等のような繊維含有紙のような天然ポリマー材料、特にセルロース材料およびセルロースから誘導された材料、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）等で、それ自体でまたは他の材料との併用で使用される合成または修飾された天然に存在するポリマー、バイオガラスとして入手し得るガラス、セラミックス、金属その他を含む。リポソーム、リン脂質小胞および細胞のような天然または合成アセンブリも使用することができる。
本発明の化合物の使用以外の、支持体または表面へｓｂｐメンバーの結合は文献に普通に利用し得る良く知られた技術によって達成することができる。例えば千畑一郎、Ｈａｌｓｔｅｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７８）“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”およびＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３０５９（１９７０）を見よ。
「信号発生システム（“ｓｐｓ”）」
結合および／または未結合標識の量、すなわち検出すべき化合物へ結合した、または結合しなかった標識の量へ関係する検出し得る信号を発生する、少なくとも一つの成分は検出し得る標識である一つ以上の成分。標識は信号を発生するかまたは信号を発生するように誘起し得る任意の分子であり、そして例えば発蛍光剤、放射性標識、酵素、化学発光剤または光増感剤でよい。このように信号は場合に応じ酵素活性、ルミネセンス、吸光度または放射活性を検出することによって検出および／または測定することができる。
適切な標識は、例示であって限定でなく、アルカリ性フォスファターゼ、グリコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（“Ｇ６ＰＤＨ”）および西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素；リボザイム；ＱＢレプリカーゼのようなレプリカーゼのための基質；プロモーター；染料；フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン化合物、フイコエリスリン、フイコシアニン、アロフイコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンのような発蛍光剤；イソルミノールのような化学発光剤；増感剤；補酵素；酵素基質；125Ｉ，131Ｉ，14Ｃ，3Ｈ，57Ｃｏおよび75Ｃｅのような放射性標識；ラテックスおよび炭素粒子のような粒子；金属ゾル；クリスタライト；リポソーム；細胞等を含み、それらは染料、触媒または他の検出可能な基でさらに標識することができる。好適な酵素および補酵素はＬｉｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．４，２７５，１４９，カラム１９〜２８、およびＢｏｇｕｓｌａｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．４，３１８，９８０，カラム１０〜１４に開示されており、好適な発蛍光剤および化学発光剤はＬｉｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．４，２７５，１４９，カラム３０および３１に開示されており、これらを参照としてここに取り入れる。
外部手段により、望ましくは例えば電磁線、熱および化学試薬によって目視検査によって検出可能な信号をそれによって標識が発生することができる多数の方法が存在する。標識または他のｓｂｐメンバーはｓｂｐメンバー、他の分子へまたは支持体へ結合されることもできる。
標識は染料、発蛍光剤、化学発光剤、および放射性アイソトープを含む、電磁線により、または電気化学的検出により検出可能な基を含んでいる。
標識は信号を直接発生することができ、それ故信号を発生するため追加の成分を必要としない。多数の有機分子、例えば発蛍光剤は紫外および可視光を吸収することができ、この場合光吸収はエネルギーをこれら分子へ移動させ、そしてそれらを励起エネルギー状態へ高める。この吸収されたエネルギーは次に第２の波長において光の発光によって消失する。信号を直接発生する他の標識は放射性アイソトープおよび染料を含む。
代わって、標識は信号を発生するため他の成分を必要とすることもでき、そして信号発生システムはその時基質、補酵素、エンハンサー、追加の酵素、酵素製品と反応する物質、触媒、アクチベーター、助因子、阻害剤、スキヤベンジャー、金属イオン、および信号発生物質の結合のために必要な特異性結合物質を含むことができる、測定可能な信号を発生するために必要なすべての成分を含むであろう。好適な信号発生システムの詳細な議論はＵｌｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．５，１８５，２４３，カラム１１〜１３に見ることができ、それを参照としてここに取り入れる。
標識および／または他のｓｂｐメンバーはｓｂｐメンバーへまたは支持体へ本発明の化合物および組成物を利用して結合することができる。代わって、標識は例えば抗体、抗体のためのレセプター、抗体へ接合した小分子へ結合することができるレセプター、またはリガンドアナログのようなｓｂｐメンバーへ共有結合することができる。ｓｂｐメンバーへの標識の結合は、標識の水素原子をｓｂｐメンバーへの結合手で置換することを生ずる化学反応によって達成することができ、または標識とｓｂｐメンバーの間の連結基を含むことができる。他のｓｂｐメンバーもｓｂｐメンバーへ共有結合することができる。例えば発蛍光剤および消光剤のような二つのｓｂｐメンバーは、各自検体と特異性複合体を形成する異なる抗体へ結合することができる。複合体の形成は発蛍光剤および消光剤を密接な近接にもたらし、このため消光剤が発蛍光剤と相互作用し、信号を発生することを許容する。接合方法はこの分野では良く知られている。例えばＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．３，８１７，８３７を見よ。
「アッセイ」
検体の存在または量の測定のための方法。
「検体の量の測定」
定量的、半定量的、定性的および検体を測定するための他の方法は検体の量を測定するための方法と考えられる。例えば、検体を含有する疑いのあるサンプル中の検体の存在または不存在を単に検出する方法は本発明の範囲内に含まれると考えられる。術語「検出」および「測定」および測定のための他の普通の同意語は本発明の範囲内に含まれることが意図される。
「補助材料」
本発明に従ったアッセイにおいては種々の補助材料が使用されるであろう。例えばバッファーが通常アッセイ媒体中に存在するであろうし、アッセイ媒体およびアッセイ成分のための安定剤も然りである。これらの添加剤に加えて、しばしばアルブミンのようなタンパク、ホルムアミドのような有機溶媒、第４級アンモニウム塩、デキストランサルフェートのようなポリアニオン、界面活性剤特に非イオン界面活性剤、結合エンハンサー例えばポリアルキレングリコール等も含めることができる。
「完全にまたは部分的に逐次的に」
種々の剤が同時でなく混合される時、一つ以上の他の一つ以上と下位混合物を形成するように混合されることができる。
一面において本発明は、各自が独立して下記式のモノサッカライドから選ばれる繰り返しモノサッカライド単位の配列を含むポリマーに関する。
0004182269.tif 000004
式中：
Ａの一つは他の一つの単位のＣ１グリコシド炭素（式中に示してある）への結合手であり、他のＡは独立にＨおよびＱＬから選ばれ；
ＬはＯとＱを連結する連結基であり、
ＱはＣ（Ｚ）＝Ｄであり；
ＤはＯまたはＣＲ1Ｒ2であり、
Ｒ1およびＲ2は独立にＨ，アルキルまたはアリールであり；
ＺはＨまたはＣ（Ｙ）＝Ｏであり；
ＹはＲ3，ＯＲ3またはＮＲ3Ｒ4であり；
Ｒ3およびＲ4は独立にＨ，アルキルまたはアリールであり；
Ｌ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3およびＲ4のいずれも一所で環を形成することができ、ただしポリマー中少なくとも二つのＡはＱＬであることを条件とする。
通常、存在する時環は３ないし８員環、好ましくは５ないし７員環であり、一以上の不飽和結合を持つことができる。環はアリールまたはアラルキールであることができる。環の一以上の原子は水素以外の置換基によって置換され、一以上の官能基を形成してもよい。水素以外の環の原子は通常炭素であるが、しかし酸素、イオウ、ホウ素、ケイ素および／または窒素を含むことができる。そのような環の例はベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピリミジン、フラン、インデン、インダン、ピロール、チオフエン、イミダゾール等である。
上のポリマーは一般に約３ないし５０，０００、好ましくは２５ないし１０，０００、もっと好ましくは５０ないし１，０００の繰り返しモノサッカライド単位を持っている。好ましくは、ポリマーのモノサッカライド単位２０毎に、もっと好ましくは１０毎に少なくとも一つのモノサッカライド単位中にＱＬであるＡが存在する。
以下は例示であって限定でない本発明に従ったポリマーの例である。
Ｌはアルキレン、例えばメチレン（−ＣＨ2−），エチレン（−ＣＨ2ＣＨ2−）等か、またはアルキレンオキシヒドロキシアルキレン、例えば１−メチレンオキシ−２−ヒドロキシエチレン（−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−）等である。
Ｑは（ｉ）−ＣＨ＝Ｏ，（ii）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ3，（iii）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ3，（iv）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ3Ｒ4，（ｖ）−ＣＨ＝ＣＲ1Ｒ2，（vi）（Ｒ1Ｒ2）Ｃ＝Ｃ（Ｏ）−Ｒ3，（vii）Ｃ＝Ｃ−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ3，および（viii）（Ｒ1Ｒ2）Ｃ＝Ｃ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ3Ｒ4である。
Ｒ3およびＲ4は低級アルキル、好ましくはメチルである。本発明に従った特に好ましいポリマーは、ポリマーが修飾デキストランであり、ポリマーの単位の一つのメチレンオキシ酸素上のＡがポリマーの他の一つの単位Ｃ１グリコシド炭素への結合手であり、そしてＱＬがＨＣ（Ｏ）ＣＨ2−またはＨＣ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ2Ｃ（ＯＨ）ＨＣＨ2−であるポリマーである。
本発明のポリマーは多数の方法で製造することができる。上のポリマー製造の一例の以下の議論は例示であって限定ではない。以下に記載する方法は容易に実施され、そしてポリサッカライドの安定性を損なわない。この方法はポリサッカライドを、ポリサッカライドのヒドロキシル基と反応する官能基を有するアルキル化剤と反応させ、それによりアルキル化剤がオレフィン基を有するアルキル化ポリサッカライドを生成させ、次にオレフィン基をアミン反応性官能基へ変換するようにアルキル化ポリサッカライドを処理することを含む。
このアルキル化剤は以下の構造を有する。
Ｌ3（Ｚ1）Ｃ＝Ｒ5Ｒ6
式中、
Ｌ3はポリサッカライドのヒドロキシル基と反応性の官能基を含む基であり、
Ｒ5およびＲ6は独立にＨ，アルキル，アリールであるか、または相互にまたはＬ3と一所に環を形成し、
Ｚ1はＨまたはＣ（Ｗ）＝Ｏであり、
ＷはＲ7，ＯＲ7またはＮＲ7Ｒ8であり、
Ｒ7およびＲ8は独立にＨ，アルキルまたはアリールである。
通常、存在する時環は３ないし８員環、好ましくは５ないし７員環であり、一以上の不飽和結合を持つことができる。環はアリールまたはアラルキールであることができる。環の一以上の原子は水素以外の置換基によって置換され、一以上の官能基を形成してもよい。水素以外の環の原子は通常炭素であるが、しかし酸素、イオウ、ホウ素、ケイ素および／または窒素を含むことができる。そのような環の例はベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピリミジン、フラン、インデン、インダン、ピロール、チオフエン、イミダゾール等である。
所望のポリマーが使用すべき特定のアルキル剤を決定する。例えばＱＬがＨＣ（Ｏ）ＣＨ2−である上に記載したポリマーを製造するためには、Ｌ3が臭素のような脱離基を有するメチレンであり、Ｚ1，Ｒ5およびＲ6がＨであるアルキル化剤を使用する。ＱＬがＨＣ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ2（ＯＨ）ＨＣＨ2−である上に記載したポリマーを製造するためには、Ｌ3がＣＨ2ＯＣＨ2（Ｃ2Ｈ3Ｏ）であり、（Ｃ2Ｈ3Ｏ）がオキシラニル基であるアルキル化剤を使用する。水溶性ポリマーが望ましい時は後者のアルキル化剤が好ましい。デキストランの水溶性の維持は、一般にアルデヒド基の導入の間デキストラン中へ親水性を付与する基を導入することによって達成することができる。従って好ましいアルキル化剤はＣＨ2＝ＣＨＣＨ2ＯＣＨ2（Ｃ2Ｈ3Ｏ）であり、これは追加の酸素原子を含んでいるＱＬ，すなわちＨＣ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ2（ＯＨ）ＨＣＨ2−の導入の結果となる。
例えば、デキストランは酸性水性媒体中でアリルグリシジルエーテルＣＨ2＝ＣＨＣＨ2ＯＣＨ2（ＯＣ2Ｈ3Ｏ）で処理される。エポキシ環の酸触媒開環が採用され、これはエポキサイドの二つの炭素原子の一つへデキストランの炭素原子の一つに結合しているヒドロキシル基の付加をもたらし、アリルオキシデキストランを与える。このステップについて媒体のｐＨは約１ないし４，好ましくは１．５ないし２．５である。通常、この反応は例えばＺｎ（ＢＦ4）2，Ｈ2ＳＯ4，ＳｎＣｌ2等のようなルイス酸の存在下で実施するのが望ましい。従ってデキストラン分子の結合に悪影響し、または他の有害効果を及ぼすような低いまたは高い反応のためのｐＨであってはならない。ルイス酸を使用する時、ｐＨは望まない反応物質の沈澱の発生のようなルイス酸に対する有害効果を招くほど高くてはならない。使用するルイス酸の量はデキストランの約１０〜３０％（重量／重量）である。ｐＨの制御はデキストランへ導入されるアルデヒド基の数を制御するので、ｐＨコントロールは重要である。
反応時間は通常約６〜１８時間、好ましくは約１０〜１５時間である。反応は例えばアルゴン、ネオン、窒素等の不活性ガスの雰囲気内で実施するのが好ましい。反応混合物の温度は一般に約７０〜９０℃，通常約７５〜８５℃，好ましくは約８０℃である。
試薬の添加順序は、通常デキストラン、ルイス酸およびアリルグリシジルエーテルのようなアルキル剤を水に約６０〜８０℃，好ましくは約６８〜７２℃に加熱して溶解することを含む。所望時間の後、反応混合物を冷却し、そして得られたアリルオキシデキストランを例えば濾過、限外濾過等によって精製する。
上の操作は平均してデキストラン分子の５〜２０，通常７〜１２，好ましくは８〜１０モノサッカライド単位あたり１個のアリルオキシ基を導入する。通常一般に２，３または４位のヒドロキシル基においてアルキル化されたモノサッカライド単位１個につき１個のアリルオキシ基が導入される。
アリルオキシデキストランはアルデヒド官能基を導入するように処理される。この目的のため二重結合が適当な手段により二重結合を開裂しそして末端アルデヒド基を導入するように酸化される。酸化は末端アルデヒド基を導入するがしかしデキストラン分子の他の部分に影響しない任意の手段によって実施することができる。アリルオキシデキストランの二重結合を酸化する便利な一方法は、アリルオキシデキストランをオゾン分解にかけ、次いでジメチルサルファイドによる還元的後処理を行うことである。この目的のためオゾンを反応混合物中で約１５〜３０℃，通常約２０〜２８℃，好ましくは約２４〜２７℃の温度において発生させる。このステップのための反応媒体のｐＨは約５〜８，好ましくは約６〜７である。使用されるオゾンの量は一般にアリル基の全部をアルデヒドへ酸化するのに十分な量である。この反応のための時間は通常５〜１０時間、好ましくは約５〜１０時間である。反応は不活性ガスの雰囲気内で実施するのが好ましい。所望時間後、反応混合物を冷却し、オゾナイドを例えばサルファイド、チオ置換フォスフィン等のような還元剤の添加によって還元する。生成したデキストランアルデヒド産物は有機溶媒による沈澱、透析等によって精製される。
本ポリマーを製造するための上の方法の代替として、上のアルキル化剤をＣＨ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ2（Ｃ2Ｈ3Ｏ）に置き換えることができる。このアルキル化剤から得られる産物は所望のデキストランアルデヒドである。従って所望のデキストランが直接アルキル化により得られるが、遊離アルデヒドは酸性条件下で副反応を受けるので先に述べたアルキル化剤が好ましい。
一代替具体例においては、導入したアミン反応性官能基はα−ケトカルボキシル酸である。再び所望するポリマーが使用すべき特定のアルキル化剤を決定する。例えばＱＬがＨＣ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）ＨＣＨ2−である上に記載したポリマーを製造するため、Ｌ3がＣＨ2ＯＣＨ2（Ｃ2Ｈ3Ｏ）であり、（Ｃ2Ｈ3Ｏ）がオキシラニル基であり、そしてＺ1がＣ（Ｏ）ＯＨであるアルキル化剤が使用される。例えば、デキストランは酸性水性媒体中において式ＣＨ2＝Ｃ（ＣＯＯＨ）ＣＨ2ＯＣＨ2（Ｃ2Ｈ3Ｏ）のアルキル化剤で処理される。上に記載したように、酸触媒エポキシ環開環が実現し、エポキサイド環の炭素原子へデキストランのヒドロキシル基の付加がおこり、アリルオキシデキストランを与える。このステップのための媒体のｐＨは約１〜４，好ましくは１．５〜２．５である。通常前に記載したのと類似の条件下で、反応をルイス酸の存在下に実施するのが望ましい。所望時間後、反応混合物を冷却し、生成する産物を濾過、限外濾過等によって精製する。精製物はアルデヒド官能を導入するために処理される。この目的のため二重結合が適当な手段によって酸化され、二重結合を開裂しそしてα−ケト酸生成物を得るようにオキソ官能基を導入する。酸化はオキソ官能基を生成するがしかし分子の他の部分に影響しない任意の手段によって実施することができる。この産物の二重結合を酸化する便利な一方法は、前に記載したように産物をオゾン分解へかけることである。生成するα−ケト酸産物は濾過、限外濾過等によって精製される。
本ポリマーを製造するための上の方法の代替法は、上に述べたアルキル剤をＣ（Ｏ）（ＣＯＯＨ）ＣＨ2ＯＣＨ2（Ｃ2Ｈ3Ｏ）で置き換えることである。このアルキル化剤からの直接の産物はα−ケト酸置換デキストランである。
本発明に従った他の例示的アプローチにおいては、ＱＬがＨＣ（Ｏ）ＣＨ2−であるデキストランアルデヒドポリマーを製造することができる。このアプローチにおいては、例えばアリルブロマイドのような脱離基を含んでいるアルキル化剤が使用される。反応は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基の存在下、デキストランのポリサッカライド単位の酸素原子によるアルキル化剤の臭素の置換を含む。デキストランは、不活性雰囲気中上記の置換を達成するのに十分な量の塩基の存在下、アリルブロマイドと混合される。このステップのため媒体のｐＨは約１０〜１４，好ましくは１１〜１４である。反応のためのｐＨは、デキストラン分子の結合に影響し、または他の有害効果を引き起こすほど低く、または高くてはならない。ｐＨの制御はデキストランへ導入されるアルデヒド基の数をコントロールし、このためｐＨコントロールは重要である。
この反応のための時間は通常約２〜８時間、好ましくは約３〜５時間である。反応は不活性雰囲気内で実施するのが好ましい。
試薬の添加順序は重要でない。好ましくは、デキストランは水に約５０〜８０℃，好ましくは約６０〜７０℃に加熱して溶解される。次に媒体のｐＨを所望レベルへ調節する。次にアリルブロマイドを反応混合物へ加え、温度を必要により所望の反応温度へ上げる。所望時間後、反応混合物を冷却し、生成するアリルデキストラン産物を有機溶媒による沈澱、限外濾過等によって精製する。
上の操作は平均してデキストラン分子のポリサッカライド単位３〜２０，通常７〜１５，好ましくは８〜１２個あたりアリル基１個を導入する。
アリルデキストランはアリルオキシデキストランのため前に記載したようにアルデヒド官能を導入するために処理される。生成するデキストランアルデヒド産物は有機溶媒による沈澱、限界濾過等によって前に記載したように精製される。
本発明の他の一面は、本ポリマーをポリペプチドのような生体分子へ接合する方法である。ポリサッカライドは、前に記載したようにポリサッカライドのヒドロキシル基と反応する官能基を有するアルキル化剤と反応させられ、それによってアルキル化ポリサッカライドを生成させる。アルキル化サッカライドは前に記載したようにアミン反応性官能基を得るように処理される。アミン反応性官能基を有するポリサッカライドは生体分子上のアミン官能基と反応させられ、生体分子へ接合されたポリマーをつくる。この反応を達成するための反応条件はアミン反応性官能基の性格にある程度依存する。例えば、アルデヒド官能を有するポリサッカライドは生体分子のアミンと反応させられる。一般にこの反応は緩和な酸性条件下シアノボロハイドライド等のような還元剤の存在下で実施される。反応剤を含んでいる反応媒体のｐＨは、適切な数のアミン基がプロトン化されるのを許容するほど十分に低くなければならないが、しかし遊離アミン化合物の不十分な量を招くほど低くてはならない。ｐＨは通常約４〜６，好ましくは５．０〜５．５である。反応のための時間は通常約１０〜２０時間、好ましくは約１４〜１８時間である。反応混合物の温度は一般に約１５〜３０℃，通常約２０〜２５℃である。ポリペプチドと反応しなかったアルデヒド官能基をブロックすることがしばしば望ましい。この目的のため上で製造した接合体は残っているアルデヒド基と安定な産物を形成する適当なブロッキンク試薬で処理される。そのようなブロッキンク剤は、例えばヒドロキシルアミン、セミカルバジド、フェニルヒドラジン、ヒドラジン、シアン化ナトリウム等であることができ、ヒドロキシルアミンが好ましい。生成する産物は例えば限外濾過、沈澱、透析等のような慣用の手段によって精製される。
ポリペプチドへ接合した本発明のポリサッカライド化合物は検体のアッセイに用いることができる。アッセイ方法は普通、検体を含有する疑いがあるサンプルをアッセイ媒体中でアッセイを実施するための試薬と混合することを含む。そのような試薬は検体のための結合パートナー、検体アナログ、その上に試薬が結合した表面、ｓｂｐメンバーの結合パートナーを含むことができる。試薬の一以上を標識することができる。試薬は、サンプル中の検体の存在または量に関連して標識からの信号が得られるように選定される。アッセイは、アッセイ成分または生成物の分離なし（均質）または分離あり（不均質）で実施することができる。
均質イムノアッセイは、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．３，８１７，８３７ラカム３第３行〜カラム６第６４行に開示されたＥＭＩＴTMアッセイ製品（Ｓｙｖａ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）；Ｕｌｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．３，９９６，３４５カラム１７第５９行〜カラム２３第２５行に記載されている方法のようなイムノ蛍光法；Ｍａｇｇｉｏ，ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．４，２３３，４０２カラム６第２５行〜カラム９第６３行に開示されている酵素チャンネリング技術、および前出Ｍａｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌで論じている酵素リンクイムノメーベントアッセイ（“ＥＬＩＳＡ”）のような他の酵素イムノアッセイによって例示される。不均質アッセイの例はＹａｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３９：１１５７（１９６０）に開示されているラジオイムノアッセイである。上の開示はすべて参照としてここに取り入れられる。本発明を適用し得る他の方法は、参照として取り入れるＵｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．４，８５７，４５３カラム１１第２１行〜カラム１４第４２行およびカラム１８第２１行〜カラム２１第５５行に開示されている。
不均質アッセイは通常一以上の分離ステップを含み、そして競合法または非競合法であることができる。多種類の競合および非競合不均質アッセイフォーマットが参照として取り入れるＤａｖａｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．５，０８９，３９０カラム１４第２５行〜カラム１５第９行に開示されている。典型的な競合不均質アッセイにおいては、それへ結合した検体のための抗体を有する支持体が、サンプルと、酵素のような検出可能な標識へ接合された検体アナログ（接合体）を含んでいる媒体と接触させられる。サンプル中の検体は抗体への結合のため接合体と競合する。媒体と支持体の分離の後、支持体または媒体中の標識活性が慣用技術によって測定され、そしてサンプル中の検体の量に関係づけられる。
典型的な非競合サンドイッチアッセイは、参照として取り入れるＤａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ，米国特許Ｎｏ．４，４８６，５３０カラム８第８行〜カラム１５第６３行に開示されているアッセイである。この方法においては、アッセイ媒体中に免疫サンドイッチ複合体が形成される。この複合体は検体と、検体へ結合する第１の抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）と、そして検体、または第１の抗体と検体との複合体へ結合する第２の抗体を含む。その後この免疫サンドイッチ複合体が検出され、そしてサンプル中の検体の量に関係づけられる。免疫サンドイッチ複合体は、第１の抗体および第２の抗体の一方または両方が標識または標識と結合することができる置換基を含んでいる、複合体中の標識の存在によって検出される。
サンドイッチアッセイは大部分抗原およびレセプター検体の検出に用途がある。このアッセイにおいて検体は検体に特異性の二つの抗体によって結合され、このためこのアッセイは二部位イムノメトリックアッセイとも呼ばれている。一つのアプローチにおいて、他に不溶化抗体として知られる、支持体へ結合した未標識抗体の最初のインキュベーションは、検体含有の疑いあるサンプルを含んでいる媒体と接触させられる。洗浄および分離ステップの後、支持体は、第２のインキュベーション期間の間、一般に標識を含んでいる第２の抗体を含んでいる媒体と接触させられる。支持体は再び洗浄され、そして媒体から分離され、媒体または支持体のどれかが標識の存在について検査される。標識の存在または量は検体の存在または量に関係づけられる。このアプローチのもっと詳細な議論については、その開示を参照としてここに取り入れる米国特許Ｎｏ．ＲＥ２９，１６９および４，４７４，８７８を見よ。
上のサンドイッチアッセイの変法においては、適当な媒体中のサンプルは検体に対する標識抗体と接触させられ、そしてある時間インキュベートされる。次に媒体は検体に対する第２の抗体を結合した支持体と接触させられる。インキュベーション期間の後、支持体は媒体から分離され、そして未結合試薬を除去するため洗浄される。支持体または媒体は標識の存在について検査され、検体の存在また量に関係づけられる。このアプローチのもっと詳しい議論については、参照としてここに取り入れる米国特許Ｎｏ．４，０９８，８７６を見よ。
上の他の一変法においては、支持体へ結合した第１の抗体と、標識した抗体とは媒体中で合併され、そして１回のインキュベーションステップでインキュベートされる。分離および洗浄ステップ、それに標識の検査は上に記載したとおりである。このアプローチのもっと詳しい議論については、その適切な開示を参照として取り入れる米国特許Ｎｏ．４，２４４，９４０を見よ。
本発明は上のアッセイの全部に適用し得る。本発明に従ったアッセイの特定例が例示のためそして限定でなく以下に記載される。このアッセイはある抗体を含有する疑いのあるサンプル中の該抗体の検出のためであり、その開示をここに参照として取り入れる、１９９４年９月２１日出願の米国特許出願Ｎｏ．０８／３１０，０２８にもっと詳しく記載されている。このアッセイにおいては、該抗体と結合しそのため抗原−抗体複合体を形成する抗原と、そして該複合体と結合するがしかし前記抗原が複合体の一部でない時は抗原へ結合しない第１の結合剤を含んでいる水性アッセイ媒体がつくられる。媒体へ加えられる抗原の量はＺであり、ＺはＸないしｎＸの範囲内であるがＹより小さく、ここでｎは５〜１０００，好ましくは１０〜１００であり、Ｘはサンプル中に抗体が存在しない時信頼して検出される抗原の最低量であり、そしてＹはサンプル中の抗体の予想される最高量である。複合体が第１の結合剤へ結合する時複合体の結合に関し抗原を選択的に結合する第２の結合剤がアッセイ媒体と合併される。その存在または量がサンプル中の抗体の存在または量に関係づけられる。
上の方法の重要な特徴は、第１の結合剤が第２の結合剤の複合体への結合を阻止する態様で抗原−抗体複合体へ結合できることである。これら結合剤はｓｂｐメンバーであり、そして第１の結合剤が結合した複合体への第２の結合剤の結合は、第１の結合剤が可溶性ポリマーまたは懸濁可能な固相へ結合される時により良く防止される。これは、第１の結合剤が結合した複合体は遊離抗原の測定を妨害しないため、第２の結合剤の添加前に、第１の結合剤が結合した複合体を媒体から分離する必要でないという追加の利益を提供する。
第１の結合剤を形成するｓｂｐメンバーは、それが抗原−抗体複合体を結合し、そして抗原がこの複合体の部分でない時抗原を結合しないように、すなわち第１の結合剤は媒体中に存在する遊離または未結合抗原へ有意義に結合しないように選定される。このｓｂｐメンバーはサンプル中に存在する他の物質、例えば非検体抗体も結合し得る。このことは第１の結合剤が、抗原が検体抗体へ結合している時を除いて抗原を結合しない限り許容される。
第１の結合剤のために適当なｓｂｐメンバーは、限定でなしに、イムノグロブリンに対する抗体；補因子Ｃｌｑ；リウマチ因子；タンパクＧおよび／またはタンパクＡを含む。これら物質のあるものはイムノグロブリン、例えば抗Ｆａｂ抗体およびタンパクＡを非選択的に結合し、あるものは抗Ｆｃ抗体およびリウマチ因子のような比較的特異性のイムノグロブリンを選択的に結合し、そしてあるものは免疫複合体、例えばＣｌｑを選択的に結合する。上に記したように、抗原−抗体複合体への第２の結合剤の結合を阻止するため、第１の結合剤が懸濁し得る固相または可溶性ポリマーをさらに含むこと、すなわち第１の結合剤が懸濁し得る固相または可溶性ポリマーへ結合していることが好ましい。本発明によれば、上の第１の結合剤の一つ、例えばタンパクＡは上に記載したデキストランアルデヒドへ接合され、そして接合体が上に記載したアッセイに使用される。
第２の結合剤は抗原を結合することができるｓｂｐメンバーである。それは抗体、好ましくはモノクローナル抗体、または抗原に対する他のレセプター；例えば抗原が酵素であれば非可逆的インヒビターのようなそれへ抗原が結合するリガンド；または他のメンバーが抗原へ結合している場合ｓｂｐの一方のメンバーであることができる。第２の結合剤がポリペプチド、例えば抗体の場合、それは可溶性ポリマーを形成するように本発明のデキストランアルデヒドと接合することができる。
第２の結合剤の添加後、第２の結合剤へ結合した抗原が検出され、その存在または量がサンプル中の抗体の存在または量に関係づけられる。この関係は反比例する。けだしサンプル中に存在する抗体の濃度が高ければ高い程、遊離抗原の量、すなわち第２の結合剤へ結合した抗原の量が低くなるからである。遊離抗原の検出は多数の方法で達成することができる。不均質フォーマットにおいては、第２の結合剤は分離し得る支持体、すなわち懸濁し得るまたは懸濁できない固相へ結合される。例えば、第２の結合剤は抗−抗原抗体であるか、または抗原へ結合したリガンドへ結合できるストレプトアビジンのようなレセプターであることができる。これらのフォーマットにおいては、サンプルと抗原とが最初に合併され、そして第１の結合剤が次に添加される。支持体へ結合した第２の結合剤の添加後、支持体は混合物から分離される。第２の結合剤−支持体へ結合した抗原の量は直接または間接に測定することができる。抗原がそれへ結合した標識を持っている時は、支持体上の標識の存在を検出することができる。ある種の支持体、特にインジウム、シリカおよび音響デバイスについては、未標識抗原さえも直接測定することができる。代わって、抗原は抗原を特異的に標識する試薬を添加することにより、例えば抗原に対する標識抗体のような標識剤を添加することによって間接的に測定することができる。次に標識は当業者に良く知られた方法によって検出することができる。
抗体の検出は感染性疾患の診断において有用な道具である。自家抗体の検出も自家免疫病の診断において有用である。上のアッセイ方法は、ヒト免疫不全ビールス（ＨＩＶ）、ルベラまたはヘルペスに対する多数の抗体、およびインスリン、６５ｋｄおよび６７ｋｄアイソフォームのグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、特にＧＡＤ65、および他の小島細胞抗原に対する自家抗体のような自家抗体を検出するために使用することができる。インスリン依存性真性糖尿症（ＩＤＤＭ）へ発展中の患者のためのリスク因子として自家抗体の検出に関する多くの研究が行われている。タイプＩ糖尿病または若年型糖尿病としても知られるＩＤＤＭの指標であると信じられるいくつかの自家抗体がある。これらはインスリンのような膵臓小島細胞抗原に対する自家抗体、および最近ではグルタミン酸デカルボキシラーゼの６５ｋｄイソフォーム（ＧＡＤ65）およびＩＡ−２に対する自家抗体を含む。ＧＡＤ65に対する自家抗体はＩＤＤＭの発展に対する最も最期のマーカーの一つであることが示唆されている。これらの自家抗体はＩＤＤＭの臨床的発病数年前に存在し、この時点ではこの病気の進行をおくらせるための介入ステップを取ることが可能であろう。
従って、上の方法を例証するアッセイは以下のとおりである。組み換えＧＡＤ65をビオチンで標識し、ｂＧＡＤを提供する。この接合体を次に患者血清サンプルとインキュベートする。次に本発明のタンパクＡおよびデキストランアルデヒドの接合体を添加し、インキュベーションを続ける。懸濁液をストレプトアビジンでコートしたマイクロタイターウエルへ移す。遊離ｂＧＡＤを結合するためのインキュベーション後、ウエルを洗い、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のような標識へ接合した、または接合しないＧＡＤに対するマウスモノクローナル抗体とインキュベートする。未接合抗体を使用する時は、ウエルを再び洗い、次に標識した抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベートする。どちらの場合でも、標識した抗体を添加した後、ウエルを最終時洗浄し、どれかの追加のｓｂｐメンバーとインキュベートする。例えば、もし標識がＨＲＰであれば、最終インキュベーションは過酸化水素およびテトラメチルベンジジンを含むことができ、そして発色はインキュベーション後に読み取られるであろう。
本発明においてこのフォーマットに従って実施したアッセイにおいて、抗ＧＡＤ65陰性であることが既知のサンプルは信号に最小の抑制を示した。抗ＧＡＤ65陽性であることが既知のサンプルは抑制された発色を持っていた。
本発明は以下の実施例によってさらに説明される。
実施例
ここでの部および％は特記しない限り重量による。温度は摂氏（℃）である。
実施例１
タンパクＡ−デキストラン接合体の製造
材料および機器
デキストランＴ−５００、Ｐｈａｒｍａｃｉａから、カタログ＃１７−０３２０−０２
アリルグリシジルエーテル、Ａｌｄｒｉｃｈから、カタログ＃Ａ３，２６０−８
テトラフルオロホウ酸亜鉛、Ｚｎ（ＢＦ4）2，４０ｗｔ％溶液、Ａｌｄｒｉｃｈから、カタログ＃３３，３８６−７
水酸化ナトリウム、Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ  ＡＲから、ロット７７０７ＫＭＲＴ、１０Ｍおよび１．０Ｍ水溶液を調製するために使用した。
ジメチルサルファイド、（ＣＨ3）2Ｓ，Ａｌｄｒｉｃｈから、カタログ＃Ｍ８，１６３−２
１−ヘプタノールはＡｌｄｒｉｃｈ，カタログ＃２８０−５から得た。
水（脱イオン）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過ユニットから得た。
ＵＶ−可視スペクトルはＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計に記録した。
使用したオゾネーターはＰｏｌｙｍｅｔｒｉｃｓ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＣｏからのＰｏｌｙｚｏｎｅモデルＴ−８１６シリアル３６４１であった。
Ｍｉｎｉｋｒｏｓラブシステム（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ  Ｉｎｃ．カタログ＃ＳＹＬＳ１２１０１Ｎ）およびＭｉｎｉｋｒｏｓ接線フローモジュール（Ｍ２５Ｓ−３００−０１Ｎ，Ｍ２５Ｓ−６００−０１Ｎ，Ｍ２１Ｍ−３００−０１Ｎ）もやはりＭｉｃｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ，ＣＡからであった。
オゾン発生に使用した酸素（超ドライ）はＡｌｔａｉｒ  Ｇａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡから得た。
ナトリウムシアノボロハイドライド、ＮａＣＮ  ＢＨ3はＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（カタログ＃１５，６１５−９）からであった。
ヒドロキシルアミン塩酸塩、ＮＨ2ＯＨ・ＨＣｌはＭａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ  ＣＡＲグレード、ロット＃５２５８ＫＶＥＮからであった。
タンパクＡは５０ｍｇ／ｍｌ水溶液として供給されるＲｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（製品コード１５００１−１０−００，製品ロットＲＣ７１５１）からであった。
酢酸ナトリウム、ＮａＯＡｃはＭａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ（ＡＲグレード、ロット＃７３６４ＫＰＮＪ）からであった。
酢酸バッファー、０．１Ｍ，ｐＨ５．０
1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ＷＰ−２５０ＭＨｚスペクトロメーター上Ｄ2Ｏ（Ａｌｄｒｉｃｈから、９９．５％）中で行った。1Ｈ化学的シフトは４．６７ｐｐｍにおける参照ピークとして水を使用して記録した。アセトンおよびエタノールを13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて内部参照として使用した。９９．１ｐｐｍにおけるアノマー炭素を後に参照ピークとして使用した。
サイズ排除クロマトグラフィーはＬＫＢコントローラーＬＣＣ５００プラス二つのポンプＰ−５００と、自動モーター弁ＭＶ−７よりなるＰｈａｒｍａｃｉａ  ＦＰＬＣシステム上で実施した。使用したカラムはＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＨＲ  １０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａカタログ＃１７−５３７−０１）であった。使用したレコーダーはＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＤ  Ｒｅｃ−１０２であった。デテクターはＷａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ応差屈折計Ｒ４０１であった。
凍結乾燥は８Ｌ  ＶｉｒＴｉｓベンチトップフリーズドライヤー（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）上で実施した。
１）デキストランアルデヒドの製造
デキストラン（４００ｇ，５００ｋＤ）を４Ｌビーカー中水１．５Ｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に上から攪拌しながら７０℃へ加熱することによって溶解した。デキストランは７０℃の水へ３０〜５０ｇづつ加え、最初の分量が溶解してから各分量を加えた。上からの攪拌は３００〜４００ｒｐｍにセットした。
熱デキストラン溶液をエーレンマイヤーフラスコ中フリット濾過漏斗（粗）を通して濾過し、濾液をあらかじめ７０℃へ平衡化した３頸フラスコ中へ注いだ。ビーカーは熱水５０ｍＬで洗い、洗液は濾過漏斗を通してエーレンマイヤー中へ濾過した。
フラスコサイドネックから漏斗を外し、そこへ２ネッククライゼン蒸留アダプターを挿入した。上方攪拌機をスタートし、６００〜７００ｒｐｍにセットし、そしてデキストラン溶液の温度が７０℃へ到達することを許容した。油浴の温度は７２〜７５℃にセットした。反応はアルゴン下で実施した。Ｚｎ（ＢＦ4）2の溶液（４００ｍＬ，水中２５ｗｔ％，ｐＨ１．８±０．２）をデキストラン溶液を入れたフラスコ中へクライゼンアダプター上の漏斗を用いて注加した。クライゼンアダプターから漏斗を外し、圧力平衡化枝管を有する添加漏斗（容量５００ｍＬ）に換えた。
アリルグリシジルエーテル（添加すべき１．５Ｌのうち５００ｍＬ）を８〜１０ｍＬ／ｍｉｎで添加漏斗へ加え（３×５００ｍＬ分量）、その間反応温度は７０±２℃に保った。アリルグリシジルエーテルの添加は１．５Ｌ全部を添加するまで継続した。次に反応混合物の温度を８０℃へ上げた。反応は連続的に攪拌（６００〜７００ｒｐｍ）しながらアルゴン下８０℃において１２〜１３時間進めた。
油浴から反応容器を除去し、反応混合物を３０℃へ冷却した。次に冷やした反応混合物は水６．０Ｌ（栓を備えたＮａｌｇｅｎｅバケット）中へ注ぎ、人手で攪拌した。希釈した反応混合物はＭｉｃｒｏｇｏｎ接線フロー透析濾過システムを用いて限外濾過によって精製した。アリルオキシデキストランは１．０〜１．５Ｌへ濃縮された。
濾液の部分標本（５０ｍＬ）を取り、分析目的のため凍結乾燥した。アリルオキシデキストランの残りの水溶液は４℃において貯蔵し、次のステップのために使用した。上のアリルオキシデキストランの1Ｈおよび13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは期待した産物と一致した。
アリルオキシデキストランは上方攪拌機を備えた４．０Ｌビーカー中でオゾン分解へかけた。混合物を３００〜３５０ｒｐｍで攪拌し、室温になることを許容した。オゾンをオゾネーターによって発生させ、アリルオキシデキストラン中へ浸漬したガス泡立て器によって圧力９．０ｐｓｉおよび２．０ＬＰＭ（リットル／分）の流量で加えた。ヘプタノール１０ｍＬを消泡剤として加えた。反応を13Ｃ−ＮＭＲによってモニターし、１１８および１３４ｐｐｍにおけるオレフィン共鳴の消失を反応完了のための指示として用いた。オゾン添加は５〜６時間継続した。反応混合物を約１０℃へ冷却した。これへジメチルサルファイド５０ｍＬを加え、アルゴン雰囲気下の攪拌を１０時間継続した。反応混合物はその間攪拌（３００〜３５０ｒｐｍ）しながら室温へ達するのを許容した。生成したデキストランアルデヒドはＭｉｃｒｏｇｏｎ限外濾過によって精製した。
２）デキストランアルデヒドへタンパクＡの接合
上からのデキストランアルデヒドの２ｍｇ／ｍＬ溶液を０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５±０．１）中に６５〜７０℃に加熱して調製した。このデキストランアルデヒド溶液を室温（２２〜２５℃）へ冷却し、タンパクＡ溶液１ｍＬを攪拌しながらデキストランアルデヒド溶液へ加えた。混合液のｐＨは５±０．１に保った。水中のナトリウムシアノボロハイドライド溶液（６３ｍｇ／ｍＬ）の２００μＬを攪拌しているタンパクＡおよびデキストランの溶液へ加えた。反応混合物は一夜（１６〜１８時間）攪拌した。酢酸液緩衝液中１．０Ｍのヒドキシルアミン溶液（ｐＨ５．０）を調製し、この溶液１．０ｍＬを上の反応混合物へ加えた。攪拌は室温で３〜４時間継続した。反応混合物はＡｍｉｃｏｎ  ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１００（ＭＷＣＯ  １００ｋＤ）中で精製した。濾液を２８０ｎｍにおけるＯＤを記録することによりタンパクＡについて分析した。最初の遠心後の残留分を水で希釈し、そしてチューブを４ｋｒｐｍにおいて３０分間遠心した。濾液は再び上に記載したように分析した。上の精製ステップは追加の８回繰り返された。残留分をプールし、デキストランは旋光度により測定し、タンパクＡはＡ２８０における吸光度により測定した。
デキストランアルデヒドとタンパクＡとの接合は、市販のタンパクＡ溶液の代わりに固体のタンパクＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの５００ｍｇバイアル）を使用したことを除き、上に記載したのと同様なやり方でも実施された。固体タンパクＡを脱イオン水１０ｍＬに溶かした。タンパクＡ−デキストラン接合体の精製はＭｉｃｒｏｇｏｎ  Ｉｎｃ．からのＭｉｎｉｋｒｏｓ  Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍを用いる限外濾過によって実施された。
実施例２
タンパクＡ−デキストランアルデヒド接合体を使用するアッセイ略号
ＡＥＴ            ２−アミノエチルイソチオウロニウムブロマイド
ｂＧＡＤ65        ビオチニル化ＧＡＤ
ＢＳＡ            ウシ血清アルブミン
ＥＤＴＡ          エチレンジアミンテトラ酢酸
ＥＬＩＳＡ        酵素リンクイムノソーベントアッセイ
ＧＡＤ65          ヒト組換えグルタミン酸デカルボキシラーゼ
分子量６５，３００
ＨＲＰ            西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＩＤＤＭ          インスリン依存性真性糖尿病
ＭＡｂ            モノクローナル抗体
ＰＢＳ            リン酸緩衝化食塩水
ＰＬＰ            ピリドキサール−５−リン酸
ＲＩＡ            ラジオイムノアッセイ
ＲＴ              室温
ＳＡＶ            ストレプトアビジン
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＴＣＥＥＰ        トリス（カルボキシエチル）フォスフィン
ＴＭＢ            ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
材料の調製
ストレプトアビジンコートプレートは標準技術によってつくられた。ＨＲＰ標識抗マウス抗体は、マウスＩｇＧに対するヤギアフィニティー精製抗体γ−鎖特異性（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であった。他のすべての薬品は試薬級であり、そしてＳｉｇｍａおよびＦｉｓｃｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌのようなソースから市販されている。すべての溶液はＨ2Ｏ中に調製され、すべての反応は特記しない限り環境条件下で実施された。
緩衝液組成
反応緩衝液の組成は以下のとおりである。
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％ＴＲＩＴＯＮTMＸ−１００，１０ｍＭベンズアミジン（１５．７ｍｇ／１０ｍＬ），Ｐｅｆａｂｌｏｃ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ）２．４ｍｇ／１０ｍＬ，Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍａ，２２９，５００ＫＩＵ／ｍＬ）５０μＬ／１０ｍＬ，およびＰｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ（Ｓｉｇｍａ）０．２ｍｇ／１０ｍＬ
ヒト組換えＧＡＤ65の発現および精製
組換えヒトＧＡＤ65を発現するバキュロウイルスをファーメンテーター中で発育させ、収穫した。ペレットをガラスホモジナイザーを用いて溶解した。崩壊後細胞リゼートを遠心および洗浄し、洗浄したペレットを膜結合ＧＡＤ65を得るように抽出した。この膜抽出物を次にＱセファロースカラムにロードし、ＫＣ１勾配液で溶出した。酵素的に活性な分画をプールし、フェニルセファロースカラムにロードした。溶出は逆リン酸勾配によって行った。溶出した分画は酵素活性についてアッセイし、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＡ上で純度についてテストした。タンパク染色により９５％近い純度を有する分画をプールした。このプールをＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮した。濃縮したＧＡＤ65をグリセロール中５０％とし、−７０℃において凍結した。
ＧＡＤ65のヨウ素化
ヨウ素化プロトコールは、125Ｉ−ＧＡＤ65を得るための市販の、Ｅｎｚｙｍｏｂｅａｄキット（ＢｉｏＲａｄ）に基づいていた。キットと共に販売されている単一反応バイアル中の中味を最初再水和した。この再水和したバイアルへ精製ＧＡＤ65２μｌ（１μｇ）、125Ｉ  ５μｌ（０．５ｍＣｉ）、１％β−Ｄ−グルコース２５μｌ，０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）５０μｌ，およびＨ2Ｏ  １８μｌ（総容積１５０μｌ）を加え、次いでインキュベートした。Ｅｎｚｙｍｏｂｅａｄとの反応後、バイアルの中味をサイズ排除ゲルカラム上に直接ロードし、２００μｌ分画をＰＢＳ，１ｍＭ  ＡＥＴおよび１ｍＭ  ＰＬＰで溶出した。125Ｉを含んでいる分画は１μｌ部分標本のカウンティングによって同定した。
アッセイに使用前に、125Ｉ−ＧＡＤ65はプールした正常ヒト血清を用いて前吸収した。125Ｉ−ＧＡＤ65の２００ｍｌを反応緩衝液８０μｌとプールしたＩＤＤＭ陰性対照８血清１００μｌと、そしてＰＢＳ２０ｍｌと混合した。４℃において一夜インキュベーション後、ＰＢＳ中タンパクＡ−セファロースの５０％懸濁液を加え、４℃で１時間インキュベートした。この懸濁液を次にマイクロ遠心へかけ、上清を集め、ペレットをＰＢＳ４００μｌで洗い、二つの上清をプールし、そして部分標本として−７０℃で保存した。
ビオチニル化ＧＡＤ65
ＧＡＤ緩衝液，ｐＨ７．０中の精製ＧＡＤ65２８２μｇ／４５０ｍｌを６Ｎ  ＮａＯＨ  １μｌを用いてｐＨ８．０〜８．２へ調節した。ＧＡＤ緩衝液の組成はリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８〜７．０）２０ｍｌ，ＰＬＰ２０μｌ，ＡＥＴ１ｍＭ，ＥＤＴＡ１ｍＭ，ＴＲＩＴＯＮＸ−１００  ０．１％，およびグリセロール１０％であった。次に、１０ｍＭ  ＰＬＰ４μｌおよびＴＣＥＰ４１ｍｇ／ｍｌ溶液５μｌを加えた。氷上でインキュベーション後、ビオチニル化はヨードアセチルＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）の５μｌを暗所で４℃において３時間加えることによって実施された。未反応ビオチンは遠心によって分離した。ビオチン：ＧＡＤ65の比は約３〜５モルビオチン／モルＧＡＤ65であると決定された。
マウス抗ＧＡＤ65抗体
マウスを上に記載した発現および精製されたＧＡＤ65で免疫化し、そしてＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒにより記載されたような標準的操作に従ってＭＡｂを上昇させた。
得られたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は標準的ＥＬＩＳＡフォーマットによりテストされ、そしてＧＡＤ65に対する特異性に基づいて最良のＭａｂを選択した。
初期のアッセイにおいてはＳＡＶ−コートプレートへ結合したｂＧＡＤ65を検出するため６種の抗−ＧＡＤＭＡｂの混合物が用いられた。各ＭＡｂは０．２％アジ化ナトリウム添加ＰＢＳ中、１ｐｍｏｌ／μｌであった。各ＭＡｂの最終濃度は０．２ｐｍｏｌ／１００μｌ／ウエルであった。
後期アッセイはＨＲＰで標識したたった１種の抗ＧＡＤＭＡｂを使用し、ＨＲＰ標識抗マウスＭＡｂの必要性をなくした。
タンパクＡ−セファロース懸濁液
タンパクＡ−セファロース（ＣＬ−４Ｂ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）をＰＢＳおよび１％アジト中５０％懸濁液へ調製した。
タンパクＡ−デキストラン
上の実施例１からのタンパクＡ−デキストランの接合体をリン酸緩衝化食塩水溶液（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）とした。
ＭＩＣＲＯＴＲＡＫTMプレートウォッシャーおよびリーダー
マイクロタイタープレートウォッシャーおよびリーダーはＭＩＣＲＯＴＲＡＫ  ＥＩＡシステム（Ｓｙｖａ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の部品である。使用した洗液はＭＩＣＲＯＴＲＡＫクラミディアＥＩＡ洗浄バッファー，クエン酸三ナトリウム０．５５９ｇ／ｍｌ，クエン酸０．００２ｇ／ｍｌ，ＴＷＥＥＮ２０  ０．０１８２ｍｌ／ｍｌ，グリセロール０．３１７５ｍｌ／ｍｌ，ｐＨ６．５〜６．９であった。各洗浄サイクルは３００μｌ／ウエル×５のためにセットした。
ヒト血清サンプル
これら実験に使用したヒト血清は、対照サンプル（ＧＡＤ65に対する自家抗体なし）か、またはフロリダ大学のＤｒ．Ｎｏｅｌ  Ｍａｃｌａｒｅｎにより提供されたＩＤＤＭ患者からの血清（ＧＡＤ65に対する自家抗体存在）であった。
Ａ）ＧＡＤ65のためのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
ヒト血清によって結合された125Ｉ−ＧＡＤ65を測定するため、反応緩衝液中ヒト血清６μｌ，陰性ヒト血清で前吸収した125Ｉ−ＧＡＤ65１０μｌ（約１５０，０００ｃｐｍ）を全容積２５μｌ中に含む反応液の４℃における一夜のインキュベーションを行った。一夜インキュベーション後、５０％タンパクＡ−セファロース５０μｌを加え、インキュベーションをゆっくり振とうしながら４℃で１時間続けた。タンパクＡ−セファロースインキュベーション後、懸濁液をＲＴで遠心し、氷冷した２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４と、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと、０．５％ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００で３回洗った。各洗液をガンマ計数管でカウントし、ペレットは最終洗浄後カウントした。
下表は陰性血清および陽性血清を使用した３洗液を各自またはペレットへ結合した分に見られる典型的カウントを要約する。
0004182269.tif 000005
ＲＩＡは放射標識した物質を過剰に使用するので、入力カウントの非常に小さいパーセントが結合した分画中に最終的に得られる。これは結合した放射性ＧＡＤ65のパーセントとして以下のように示される。
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この実施例の欠乏アッセイは抗原と抗体間の反応と、抗体へ複合化しない抗原のその後の検出を含んでいる。サンプル中の抗抗原抗体の量はこの実施例の欠乏アッセイにおいてＡ450値に反比例的に相関することが期待された。その結果、このアッセイにおいてはいくつかの正常な対照血清の平均値マイナス２または３標準偏差により決定されたカットオフ値よりＡ450値が下廻る時「陽性」と判定される。これは対照平均ｃｐｍ＋２または３標準偏差より高いｃｐｍ値を有するサンプルが「陽性」と判定される典型的なＲＩＡと対照となしている。この後者は以下のアッセイに最良に例示されている。
Ｂ）ＧＡＤ65のための酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）（遠心なし）
ＢＳＡ緩衝液（１０ｍＭ  Ｋｐｈｏｓ，ｐＨ７．０，１ｍＭ  ＡＥＴ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２０μＭ  ＰＬＰ，０．１％  ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００，１０％グリセロールおよび１ｍｇ／ｍｌ無プロテアーゼＢＳＡ）中のヒト血清２５μｌを１５μｌ  ｂＧＡＤ56（１．５ｆｍｏｌ／アッセイ）および１０μｌ  ５×反応緩衝液と最終容積５０μｌへ混合した。これをＲＴで２時間インキュベートした。
タンパクＡ−デキストラン５０μｌ（ＰＢＳ中ストックの１：２５希釈液）を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。
上清液８０μｌ（未結合ｂＧＡＤ56を含有）を吸引し、あらかじめ洗浄したＳＡＶコートしたプレートへ移動した。ＲＴで１時間インキュベーション後、プレートをＭＩＣＲＯＴＲＡＫシステムで洗った。
ＭＡｂ（６Ｇ１Ｏ）−ＨＲＰ接合体１００μｌ（あらかじめ３７℃へ温めたＳｙｖａ接合体希釈剤中１：３２０希釈）を加え、振とうしながらＲＴで１時間インキュベートし、次にＭＩＣＲＯＴＲＡＫシステム上で洗浄した。
ＴＭＢ基質を加え、そしてＲＴで３０分間発色させた。発色は１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4で停止し、４５０ｎｍにおいて読取った。
患者血清９のうち７がこの方法によって正しく診断された。これは９サンプルのうちたった２を正しく判定した慣用のＥＬＩＳＡ技術と対照的である。
Ｃ）ＥＩＡとＲＩＡとの比較
本発明のアッセイの分析性能を評価するため、ＲＩＡ法によって前にアッセイしたステト血清で比較を行った。主な目的は血清の性格、すなわち対照か、ある範囲のＧＡＤ56タイターを有する患者サンプルであるかに関係なく、二つの方法が相関しているかどうかを決定することであった。
アッセイプロトコールは以下の修飾を加えた上のＢ）に記載したとおりであった。血清（２４μｌ），ｂＧＡＤ56（１２ｆｍｏｌを含有する２０ｍｌ）、５×反応緩衝液（２０μｌ）および脱イオン水（３６μｌ）を４℃で一夜インキュベートした。タンパクＡ−セファロース（５０％懸濁液２００μｌ）を加え、さらに４℃で１時間インキュベートした。これを次にＲＴにおいて２分間遠心した。上清（１８０μｌ）を注意深く集め、二つの９０μｌ部分標本の各自をフレート中の二つのＳＡＶコートしたウエルへ加え、二系列値を発生させた。プロトコールの残りは上のＢ）のとおりであった。
得られた臨床データはこのアッセイの結果とＲＥＡから得られたデータの間のすぐれた相関性を指示した。
本発明をその特定具体例を参照して記載したが、当業者には本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく種々の変更を加えることができそして均等物で置換できることが理解または明らかであろう。加えて、本発明の目的、精神および範囲に対し、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスステップに適応させるため多数の修飾を加えることができる。すべてのそのような修飾は請求の範囲内であることが意図される。