(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドの少なくとも１を主成分として含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含むペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドと相互作用して、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性および／またはＨＬＡ−Ａ２拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を増強する化合物、および／または請求項３に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物のスクリーニング方法であって、請求項１に記載のペプチド、請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の組換えベクター、請求項５に記載の形質転換体、または請求項７に記載の抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規な腫瘍抗原に関し、詳しくは腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を有するペプチド、そのペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、このポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、組換えベクターを含む形質転換体、ペプチドの製造方法、ペプチドに対する抗体、これらに相互作用を有する化合物およびそのスクリーニング方法、これらを利用する医薬組成物、およびこれらを利用する診断のための分析手段に関する。
従来技術
生体における癌の排除には免疫系、特に細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：以下、ＣＴＬと略称することもある）が重要な役割を果たしている。癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞の浸潤が認められている（Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．，１２６：２００−２０５，１９９０）。この腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の標的分子である腫瘍抗原の発見は、メラノーマにおいて初めてなされた。腫瘍細胞内で生成された腫瘍抗原は、細胞内で分解されて８〜１１個のアミノ酸からなるペプチド（腫瘍抗原ペプチド）になり、主要組織適合性抗原であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ：以下、ＨＬＡと略称する）分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。
ＨＬＡは細胞膜抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。ＨＬＡはクラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原に大別されるが、細胞傷害性Ｔ細胞により抗原ペプチドとともに認識されるＨＬＡはクラスＩ抗原である。ＨＬＡクラスＩ抗原はさらにＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃなどに分類され、その遺伝子には多型が存在することが報告されている。ＨＬＡ−Ａ２４対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）は、日本人の人口の約６０％（多くはその９５％の遺伝型がＡ２４０２である）、コーカサス人の２０％、アフリカ人の１２％でみられる。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、日本人の約４０％、中国人の５３％、北コーカサス人の４９％、南コーカサス人の３８％、黒人アフリカ人の２３％においてみられる。
このＨＬＡに結合可能な腫瘍抗原ペプチドには、ＨＬＡの型（ｔｙｐｅ）ごとにその配列に規則性（モチーフ）がある。細胞傷害性Ｔ細胞はこの腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体を認識して腫瘍細胞を傷害する。ここにおいて、腫瘍抗原とは、腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうる、腫瘍細胞が有する蛋白質またはペプチドを意味する。また腫瘍抗原ペプチドとは、該腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるペプチドであり、ＨＬＡ分子と結合して細胞表面上に提示されることにより腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導または活性化しうるペプチドを意味する。さらに、腫瘍抗原が有する腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるアミノ酸配列の部位を腫瘍抗原エピトープ（腫瘍抗原決定基）という。
近年、細胞傷害性Ｔ細胞により認識されうる腫瘍抗原をコードする多くの遺伝子が、ヒトの癌細胞のｃＤＮＡから同定されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３〜１６４７，１９９１）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：１１８５〜１１９２，１９９６）。これらは、ＨＥＲ／ｎｅｕ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：４３２〜４３６，１９９５）、変異ｃｄｋ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：１２８１〜１２８４，１９９５）、そして変異ＣＡＳＰ−８（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６：７８５〜７９３，１９９７）などであり、増殖性細胞および悪性形質転換体中の存在が認められている。ＭＡＧＥ（メラノーマ抗原）ファミリー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５：３４７８〜３４８２、１９９５）やＳＡＲＴ１（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２７７〜２８８、１９９８）などの他のいくつかの遺伝子産物は、悪性細胞と精巣の両方で選択的に発現しているが、その他の正常細胞では発現していない。
多くのメラノーマ特異的な腫瘍抗原は、ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、およびチロシナーゼなどであり、これらは正常メラニン細胞にも存在する（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．，１：３５７〜３７４，１９８７）。それゆえ、ヒトの腫瘍抗原はほとんどの場合、真に腫瘍特異抗原というのではなく、むしろそれらはいくつかの正常細胞や組織で発現する自己抗原といえる。
現在、欧米では、腫瘍抗原ペプチドを投与し、癌患者の体内の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法の開発がなされており、メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。例えば、メラノーマ抗原ｇｐ１００ペプチドをメラノーマ患者に皮下投与し、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を静脈注射投与することにより、４２％の患者で腫瘍の縮小が認められている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４：３２１，１９９８）。このように、腫瘍抗原はワクチンとして利用することにより、有効な癌治療効果を期待できる。
しかしながら、同定されている腫瘍抗原はそのほとんどがメラノーマ由来であり、発病頻度の高い上皮性の癌や腺癌由来の腫瘍抗原についての報告は少ない。
既存の三大癌治療（手術療法、化学療法、および放射線治療）による１９９８年における５年生存率は全癌で４１％であるが、生存率をこれ以上増加させることは現状では難しく、上記三大治療法に加え新たな治療法の開発が望まれている。
ｓｒｃファミリー膜型チロシンキナーゼの１つであるｐ５６ｌｃｋ蛋白質をコードするｌｃｋ遺伝子は、Ｔ細胞の発生と機能において本質的な機能を有する。このｌｃｋ遺伝子の大腸癌細胞と小細胞性肺癌細胞における異常な発現（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．，１：３５７〜３７４，１９８７）、および転移性大腸癌での異所性発現が報告されている。また、腫瘍性形質転換の過程におけるＬｃｋ蛋白質の関与が示唆されてはいる（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：４６６０〜４６６６、１９９８）が、しかしながら、これらの癌細胞におけるＬｃｋ蛋白質の詳細な役割は知られていない。
発明の開示
本発明は上記現状に鑑み、腺癌および上皮性の癌、例えば大腸癌や肺癌の患者の特異的免疫療法に有用な、細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を有する新規な腫瘍抗原を見いだし提供することを目的とする。
具体的には、少なくともＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞により認識される、ｌｃｋ遺伝子がコードする抗原エピトープを有するペプチドを見いだし、提供することが本発明の目的である。詳しくは、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を有するペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ペプチドの製造方法、該ペプチドに対する抗体、これらに相互作用を有する化合物およびそのスクリーニング方法、これらを利用する医薬組成物、およびこれらを利用する診断手段を提供することを目的とする。
課題解決のため、本発明者は、ＨＬＡ−Ａ２４と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞であるＫＥ４−ＣＴＬ、ならびにＨＬＡ−Ａ２と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞であるＯＫ−ＣＴＬおよびＧＫ−ＣＴＬを癌患者から樹立し、この腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を活性化しうる腫瘍抗原を、遺伝子発現クローニング法（Ｇｅｎｅ  ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、ＫＥ腫瘍細胞株のｃＤＮＡライブラリーから同定し、さらにＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性および／またはＨＬＡ−Ａ２拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞により認識される該腫瘍抗原のエピトープを有するペプチドを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）下記の式で表されるアミノ酸配列（配列表の配列番号１０）からなるペプチド、
0004051602.tif 000002
ここで、Ｘａａは、ＡｓｐまたはＧｌｕ、
Ｘｂｂは、ＴｙｒまたはＰｈｅ、
Ｘｃｃは、ＬｅｕまたはＩｌｅ、
Ｘｄｄは、ＡｒｇまたはＧｌｎ、
Ｘｅｅは、ＳｅｒまたはＡｌａ、
Ｘｆｆは、ＶａｌまたはＰｈｅ、
Ｘｇｇは、ＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘｈｈは、ＰｈｅまたはＴｙｒ、
Ｘｉｉは、ＰｈｅまたはＴｙｒである、
（３）少なくとも前記（１）または（２）のペプチドからなる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、
（４）前記（１）または（２）のペプチドを用いることを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、
（５）少なくとも前記（１）または（２）のペプチドからなる癌ワクチン、
（６）前記（１）または（２）のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、
（７）前記（６）のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、
（８）前記（６）または（７）のポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含有する組換えベクター、
（９）前記（８）の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１０）前記（９）の形質転換体を培養する工程を含むペプチドの製造方法、
（１１）前記（１）または（２）のペプチドを免疫学的に認識する抗体、
（１２）前記（１）または（２）のペプチドと相互作用して、少なくともＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性および／またはＨＬＡ−Ａ２拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を増強する化合物、および／または前記（６）もしくは（７）のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物のスクリーニング方法であって、前記（１）もしくは（２）のペプチド、前記（６）もしくは（７）のポリヌクレオチド、前記（８）の組換えベクター、前記（９）の形質転換体、または前記（１１）の抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法、
（１３）前記（１２）のスクリーニング方法で得られた化合物、
（１４）前記（１）もしくは（２）のペプチド、前記（６）もしくは（７）のポリヌクレオチド、前記（８）の組換えベクター、前記（９）の形質転換体、前記（１１）の抗体、または前記（１３）の化合物のうちの少なくとも１つを癌治療有効量を含んでなる癌治療に用いる医薬組成物、
（１５）前記（３）の細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、前記（５）の癌ワクチン、または前記（１４）の医薬組成物を癌疾患に用いることを特徴とする治療方法、
（１６）前記（１）または（２）のペプチドの発現または活性に関連した疾病の診断方法であって、（ａ）該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、および／または（ｂ）個体由来の試料中の該ペプチドをマーカーとして分析することを含む方法、
（１７）前記（１６）の方法に使用する試薬キットであって、少なくとも前記（１）または（２）のペプチド、前記（６）または（７）のポリヌクレオチド、前記（１１）の抗体のうちの１つ以上からなる試薬キット、
からなる。
発明を実施するための最良の形態
（ｌｃｋ遺伝子の同定）
本発明者らは、まず日本人の多数においてみられるＨＬＡ−Ａ分子の型であるＨＬＡ−Ａ２４に着目し、このＨＬＡ−Ａ２４と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＫＥ４−ＣＴＬ）を、食道癌患者から樹立した（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８１：４５９−４６６、１９９９）。この細胞傷害性Ｔ細胞をエフェクターとして使用し、この細胞を活性化しうる腫瘍抗原を、遺伝子発現クローニング法を用いて、ＫＥ腫瘍細胞株のｃＤＮＡライブラリーから同定した。細胞傷害性Ｔ細胞の活性化の判定は、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて、該細胞傷害性Ｔ細胞から産生されるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を測定することにより行った。
その結果、１つのｃＤＮＡクローンがＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＫＥ４−ＣＴＬにより認識され、該ＫＥ４−ＣＴＬを活性化すること（図１参照）、およびこのｃＤＮＡクローンの塩基配列が１，７５０塩基（ｂｐ）長であり、かつｌｃｋ遺伝子の塩基配列におけるポジション２８３−２，０３２と１００％相同性を有することを見いだした。このポジションのｌｃｋ遺伝子の塩基配列は、５０９アミノ酸からなるＬｃｋ蛋白質においてその大部分を含むポジション３１−５０６のアミノ酸配列に対応する。
すなわち、Ｌｃｋ遺伝子とＨＬＡ−Ａ２４０２とを遺伝子工学的手法により発現させた細胞がＫＥ−ＣＴＬを活性化せしめることから、Ｌｃｋ遺伝子がコードする蛋白質は、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬを活性化しうる腫瘍抗原であることを確認した。
また、Ｌｃｋ蛋白質は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬのみならず、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬをも活性化しうる腫瘍抗原であることを、大腸癌患者より樹立したＣＴＬ株〔ＯＫ−ＣＴＬ−ｅ亜株（ｓｕｂｌｉｎｅ）（ＨＬＡ−Ａ０２０７）〕（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６３：４９９９−５００４、１９９９）および肺癌患者より樹立したＣＴＬ株〔ＧＫ−ＣＴＬ２−２−４亜株およびＧＫ−ＣＴＬ２−２−５（ＨＬＡ−Ａ０２０６）〕の３つのＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを用いて上記同様に見いだした（図２参照）。
かくして、ｌｃｋ遺伝子が、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性またはＨＬＡ−Ａ２拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅ）をコードすることを見いだした。
（Ｌｃｋ蛋白質の組織局在）
種々の細胞および組織における蛋白質レベルでのＬｃｋ（５６ｋＤおよび５９ｋＤ）の発現を、抗Ｌｃｋモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析により検討した。
Ｌｃｋ蛋白質は、扁平上皮癌（以下、ＳＣＣと略称することもある）または腺腫瘍細胞株などの試験した全ての悪性腫瘍細胞株、並びに食道癌、肺ＳＣＣおよび肺腺癌細胞などの、多種の臓器から得た新鮮腫瘍組織の大多数で検出された。特に、Ｌｃｋ蛋白質は大腸癌、肺癌、食道癌の組織で、高率に発現していた。一方、非腫瘍性の結腸組織のいずれでも全く検出されなかった。また、Ｌｃｋ蛋白質は未刺激の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）では認められなかったが、１０μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＰＨＡ）で４８時間刺激した後の活性化されたＰＢＭＣ（ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ）の細胞質画分には検出されるようになった。
（ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬを活性化しうるペプチド）
Ｌｃｋ蛋白質由来のＨＬＡ−Ａ２４０２分子への結合能を有するペプチドを得るために、ＨＬＡ−Ａ２４に結合しうる規則的配列（モチーフ、ｍｏｔｉｆ）を有するペプチドについて文献検索し、１３個の異なる９−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒのペプチドを、ｌｃｋ遺伝子産物の５０９アミノ酸配列（Ｎａｔｕｒｅ、３１９：６８２〜６８５、１９８６）に基づいて合成した。但し、一部のアミノ酸に変更を加えたものもある。
１３個のペプチドからの細胞傷害性Ｔ細胞を活性化しうる腫瘍抗原ペプチドの選択は、ＣＴＬが産生するＩＦＮ−γをそのＣＴＬ活性化作用の指標として測定することにより行った。
これらのペプチドのうち、３個のペプチド〔Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）、Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）〕がＣＴＬ活性化能を示し、ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を増強した（図３参照）。Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）またはＬｃｋ４８８−４９７（配列番号２）のＣＴＬ活性化能は濃度依存的であり、１ｎＭ程度で認められた。一方、Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）の活性は１００ｎＭ以上で認められた（図４参照）。
これら３個のペプチドによるＫＥ４−ＣＴＬの活性化は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８および抗ＭＨＣクラスＩモノクローナル抗体によって阻害されたが、抗ＣＤ４、抗ＭＨＣクラスＩＩおよび抗ＣＤ１３モノクローナル抗体では阻害されなかった。従って、ＫＥ４−ＣＴＬはＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４−の細胞表現型を有することが判明した。
（ペプチドによるＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導）
ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＫＥ−ＣＴＬを濃度依存的に活性化する３個のペプチド〔Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）、Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）〕はまた、大腸癌患者から得た末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から、Ｌｃｋを発現している腫瘍細胞株（ＫＥ４、ＳＷ６２０およびＣＯＬＯ２０１）に対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導した。
すなわち、Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）、Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで３回刺激し、さらに放射線照射した自己ＰＢＭＣ（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ−ＰＢＭＣ）を相当するペプチドでパルスしたものを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて刺激したとき、特にＬｃｋ４８６−４９４（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）で刺激したＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞（ＣＯＬＯ２０１）に対する反応より、ＨＬＡ−Ａ２４＋腫瘍細胞（ＫＥ４およびＳＷ６２０）に対する反応においてより多くのＩＦＮ−γを産生した。
一方、健常人から得たＰＢＭＣからは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として放射線照射した自己ＰＢＭＣに３個のペプチドのいずれかをパルスしたものを用いて刺激したときは、これら３個のペプチドはＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導しなかった（表３参照）。しかし、ペプチドをパルスした樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ；ＤＣ）をＡＰＣとして用いて刺激したときには、これら３個のペプチドは健常人から得たＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導した。
さらに、上記ペプチドが誘導したＣＴＬ活性を、５１Ｃｒ遊離試験により確認した。これらＬｃｋ由来の３個のペプチドで刺激したＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４＋ＫＥ腫瘍細胞およびＳＷ６２０腫瘍細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）したが、健常人から得たＨＬＡ−Ａ２４＋ＰＨＡ活性化Ｔ細胞またはＨＬＡ−Ａ２４−ＣＯＬＯ２０１腫瘍細胞はいずれも溶解しなかった。
Ｌｃｋ由来の上記ペプチドは大腸癌患者のＰＢＭＣにおいてＨＬＡ−Ａ２４拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができた。また、Ｌｃｋ由来のペプチドは、健常人のＰＢＭＣについては、腫瘍細胞に対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ活性を誘導できなかった。これらの結果から、健常人の末梢血中のＴ細胞はＬｃｋに対して免疫学的寛容状態にあると考えられる。本発明のＬｃｋペプチドは大腸癌患者のＰＢＭＣ中にＣＴＬを誘導することができる。
（Ｓｒｃファミリー由来のペプチドによるＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬの誘導）
ＨＬＡ−Ａ２４＋腫瘍細胞株を認識するＣＴＬを誘導することができる上記３個のペプチドのうち、２個のペプチドＬｃｋ４８６−４９４（配列番号１）（ＴＦＤＹＬＲＳＶＬ）およびＬｃｋ４８８−４９７（配列番号２）（ＤＹＬＲＳＶＬＥＤＦ）に、アミノ酸配列上の相同性が認められた。（以降、アミノ酸配列を表記する場合、１文字にて表記する場合と３文字にて表記する場合がある。）この２個のペプチドの重なる領域である一定のアミノ酸ＤＹＬＲＳＶをエピトープとして認識するＣＴＬは、腫瘍拒絶に対する意義を有することが推定される。
このアミノ酸配列に相同性をもつペプチドを検索したところ、Ｌｃｋと同じＳｒｃファミリーに属するチロシンキナーゼ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：８９７−９３０，１９８５）に、相同性を有するペプチドを含むものがあることが判明した（表５参照）。
これらＳｒｃファミリー由来のペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成したペプチド、Ｓｒｃ５１１−５１９（配列番号４：ＴＦＥＹＬＱＡＦＬ）、Ｙｅｓ５０８−５１６（配列番号５：ＴＦＥＹＩＱＳＦＬ）、Ｆｙｎ５１２−５２０（配列番号６：ＴＦＥＹＬＱＳＦＬ）、Ｌｙｎ４８９−４９７（配列番号７：ＴＦＤＹＬＱＳＶＬ）、Ｈｃｋ５０３−５１１（配列番号８：ＴＦＥＹＩＱＳＶＬ）、Ｂｌｋ４８２−４９０（配列番号９：ＴＦＥＦＬＱＳＶＬ）も、Ｌｃｋ由来のペプチドと同様、あるいはそれ以上のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ活性化能を示した。
上記相同性を有するペプチドのアミノ酸配列から導き出される、下記の一般式で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつ少なくともＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を有するペプチドも、本発明のペプチドに含まれる。
0004051602.tif 000003
ここで、Ｘａａは、ＡｓｐまたはＧｌｕ、
Ｘｂｂは、ＴｙｒまたはＰｈｅ、
Ｘｃｃは、ＬｅｕまたはＩｌｅ、
Ｘｄｄは、ＡｒｇまたはＧｌｎ、
Ｘｅｅは、ＳｅｒまたはＡｌａ、
Ｘｆｆは、ＶａｌまたはＰｈｅ、
Ｘｇｇは、ＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘｈｈは、ＰｈｅまたはＴｙｒ、
Ｘｉｉは、ＰｈｅまたはＴｙｒ、
である。
（Ｓｒｃファミリー由来のペプチドによる癌患者におけるＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導）
上記Ｓｒｃファミリー由来のペプチドは、癌患者より得たＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができた。すなわち、Ｓｒｃファミリー由来のペプチドで刺激した癌患者より得たＰＢＭＣは、ＫＥ４細胞およびＳＷ６２０細胞に対して反応し、ＩＦＮ−γを産生した。Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）は癌患者７例中４例、Ｓｒｃ５１１−５１９（配列番号４）は３例中２例、Ｙｅｓ５０８−５１６（配列番号５）は３例中１例、Ｆｙｎ５１２−５２０（配列番号６）は２例中１例、Ｈｃｋ５０３−５１１（配列番号８）は２例中２例、Ｂｌｋ４８２−４９０（配列番号９）は２例中１例において、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γを産生を誘導した。
本発明の３個のＬｃｋペプチドおよびＳｒｃファミリー由来のペプチドは、大腸癌患者のＰＢＭＣにおいてＨＬＡ−Ａ２４拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。従って、本発明のペプチドは、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤および誘導方法に使用可能である。また、Ｌｃｋは大腸、肺および食道を含む大多数の癌組織で検出される。ＨＬＡ−Ａ２４対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）は日本人の人口の約６０％（多くは、その９５％の遺伝型がＡ２４０２である）、コーカサス人の２０％、アフリカ人の１２％（ＨＬＡ  １９９１，Ｖｏｌ．１：１０６５〜１２２０，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９２）で見られる。従って、本発明のペプチドは比較的多数の癌患者における特異的免疫治療に適用しうる。
（ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を活性化しうるペプチド）
つぎに、Ｌｃｋ蛋白質がＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬによっても認識されることから、ＨＬＡ−Ａ２分子への結合能をもつＬｃｋ由来のペプチドを得るために、ＨＬＡ−Ａ２に結合しうるモチーフを有するペプチドについて文献検索し、２４種の異なる９−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒのペプチドを、ｌｃｋ遺伝子産物の５０９アミノ酸配列（Ｎａｔｕｒｅ、３１９：６８２〜６８５、１９８６）に基づいて合成した。ＣＴＬとしてＯＫ−ＣＴＬ株またはＧＫ−ＣＴＬ亜株（ｓｕｂｌｉｎｅ）２−２−４を用い、各ペプチドのＣＴＬ活性化能は、ＣＴＬが産生するＩＦＮ−γを指標として測定した。
これらのペプチドのうち、７個のペプチド〔Ｌｃｋ６１−６９（配列番号１１）、Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）、Ｌｃｋ２９４−３０３（配列番号１３）、Ｌｃｋ３４０−３４８（配列番号１４）、Ｌｃｋ３４７−３５５（配列番号１５）、Ｌｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）、Ｌｃｋ４９２−５００（配列番号１７）〕がＣＴＬ活性化能を示し、ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を増強した〔図１３の（Ａ）および（Ｂ）参照〕。Ｌｃｋ６１−６９（配列番号１１）、Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）、またはＬｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）の、ＣＴＬ活性化能は濃度依存的であった〔図１４の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）参照〕。
（ペプチドによるＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導）
また、ＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬを濃度依存的に活性化する３個のペプチド〔Ｌｃｋ６１−６９（配列番号１１）、Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）、Ｌｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）〕のうち、Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）またはＬｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）は、転移性大腸癌患者のＰＢＭＣから、腫瘍細胞株であるＰａｎｃ−１、ＳＷ６２０に対するＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを誘導した。
すなわち、転移を有する大腸癌患者のＰＢＭＣをこれら３個のペプチドのいずれかでｉｎ  ｖｉｔｒｏで３回刺激し、さらに放射線照射した自己ＰＢＭＣ（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ−ＰＢＭＣ）を相当するペプチドでパルスしたものを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて刺激したとき、Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）、Ｌｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）で刺激した該大腸癌患者のＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２−大腸癌細胞株ＣＯＬＯ３２０に対して反応しなかったが、ＨＬＡ−Ａ２＋大腸癌細胞株ＳＷ６２０やＨＬＡ−Ａ２＋膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１に反応してＩＦＮ−γを産生し〔図１５の（Ａ）および（Ｃ）参照〕、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞を溶解した〔図１５の（Ｂ）および（Ｄ）参照〕。
（癌患者におけるＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導）
Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）およびＬｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）は、大腸癌患者だけではなく、転移を有する肺癌患者および食道癌患者より得たＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導することができた。ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導は、ＨＬＡ−Ａ２＋大腸癌細胞株ＳＷ６２０に対するＩＦＮ−γの産生を指標にして測定した。Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）は癌患者６例中２例、Ｌｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）は６例中３例において、ＰＢＭＣ中にＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬを誘導した（表８参照）。従って、これら３個のペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤および誘導方法に使用可能である。また、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）は日本人の人口の約４０％、北コーカサス人の４９％、南コーカサス人の３８％、アフリカ人の２３％、中国人の５３％（ＨＬＡ  １９９１，Ｖｏｌ．１：１０６５〜１２２０，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９２）で見られる。従って、これらのペプチドは比較的多数の癌患者における特異的免疫治療に適用しうる。
（ペプチド）
本発明のペプチドは、配列表の配列番号１〜９または配列番号１１〜１７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性またはＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導または／活性化することができる。
また、本発明のペプチドは配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、少なくともＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化しうるペプチドでありうる。ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化しうるペプチドの選択は、後述する実施例に記載の方法を用いて行うことができる。
さらに、本発明のペプチドは、ＨＬＡ−２４拘束性ＣＴＬとＨＬＡ−２拘束性ＣＴＬの両方を誘導および／または活性化できるペプチドであってもよい。
このように特定されたペプチドを元にして、少なくともＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性および／またはＨＬＡ−Ａ２拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞による認識性の強さを指標とすることにより、１ないし数個のアミノ酸の欠失・置換・付加などの変異あるいは誘発変異を有するアミノ酸配列からなるペプチドも提供される。欠失・置換・付加などの変異あるいは誘発変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（Ｕｌｍｅｒ，Ｌ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，６６６，１９８３）を利用することが出来る。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基もしくはカルボキシル基などを修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
また、ｌｃｋ遺伝子のコードする蛋白質は、多型にもとづくと推定されるアミノ酸配列が若干異なるものがいくつか報告されている（Ｎａｔｕｒｅ，３１９：６８２−６８５，１９８６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１６４３−１６４６，１９８６、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３８：１１７−１２６，１９８８、Ｇｅｎｅ，８４：１０５−１１３，１９８９）。本発明のペプチドは、このアミノ配列が異なるｌｃｋ遺伝子産物由来のペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性および／またはＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬを誘導できるものも含まれる。
例えば、本発明のペプチドの１つであるＬｃｋ４８８−４９７は配列表の配列番号２に記載するアミノ酸配列ＤＹＬＲＳＶＬＥＤＦからなるが、Ｎａｔｕｒｅ，３１９：６８２−６８５，１９８６に報告されているＬｃｋ蛋白質のアミノ酸配列に基づく４８８−４９７位のアミノ酸配列はＤＹＬＲＳＶＬＤＤＦであり、この配列もＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフに含まれる。
本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性および／またはＨＬＡ−Ａ２拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性ＣＴＬを誘導および／または活性化しうる腫瘍抗原ペプチドであり、腫瘍特異的細胞傷害性ＣＴＬを誘導および／または活性化するために使用できる。すなわち、本発明のペプチドは、癌ワクチンなどとして癌の特異的免疫治療に使用できるものである。
（ポリヌクレオチド）
本発明のポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、配列番号１〜９および配列番号１１〜１７に記載のペプチド、およびこれらペプチドのアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加等の変異あるいは誘発変異を有し、かつ少なくともＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性および／またはＨＬＡ−Ａ２拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を有するペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに対する相補鎖である。さらに本発明のポリヌクレオチドには、これらポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含される。ポリヌクレオチド分子としてＤＮＡ分子を代表例にとると、「ＤＮＡ分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子」は、例えば前述のＭｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることを表す。
本発明のポリヌクレオチドは、いずれも本発明のペプチドの製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸としての試薬・標準品としても利用できる。
（形質転換体）
本発明は、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞、レトロウィルス等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によって、本発明からなるペプチドの提供が可能である。本発明のペプチドは、単純蛋白質の状態で細胞傷害性Ｔ細胞による認識性が確認されており、蛋白質への糖付加の有無を無視できるため、遺伝子組換え技術による製造方法において宿主の選択は生産性のみを考慮すればよく容易にできる。
形質転換は、自体公知の手段が応用され、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法があるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系が利用できる。ベクターは、選択した宿主の種類により選別され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。組合せは原核細胞、真核細胞によって分別され、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等を自体公知の方法によって組合せ利用できる。
形質転換体は、自体公知の各宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養される。培養は、発現産生されるペプチドの生理活性、特に細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を指標にしておこなってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養によって生産される。
（化学合成）
本発明のペプチドは、通常のペプチド化学において知られる方法でも製造できる。例えば、ペプチド合成（丸善）１９７５年、“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９６”が例示されるが、無論既知の方法が広く利用可能である。
（ペプチドの回収）
本発明のペプチドの回収は、細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を組合せるか、溶解度差に基づく硫安、アルコール等の分画手段によっても精製回収できる。より好ましくは、該ペプチドに対する抗体を作成し、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。
（抗体）
本発明のペプチドを免疫学的に認識する抗体は、自体公知の抗体作製法に従って得ることができる。例えば、本発明のペプチドをアジュバントの存在下または非存在下で単独または担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、兎、ヤギ、馬等が好適に用いられる。
ポリクローナル抗体は、本発明のペプチドで免疫された動物の血清から自体公知の抗体回収法、例えば好ましい手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法により得られる。
モノクローナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞を回収し、自体公知の永久増殖性細胞への形質転換手段を導入することによって行われる。
かくして得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、本発明のペプチドの精製用抗体、試薬、標識マーカーなどとして利用できる。
（スクリーニング）
本発明のペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、または本発明のペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数を組合せることによって細胞傷害性Ｔ細胞を誘導または活性化しうる化合物のスクリーニングに有効な手段を提供する。スクリーニング方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。本発明は、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物も対象とする。該化合物は、本発明のペプチドのＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性および／またはＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬによる認識性を増強する化合物、本発明のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物、本発明のペプチドと同様に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導もしくは活性化しうる化合物、また本発明のペプチドによるＣＴＬの誘導もしくは活性化を増強する化合物などでありうる。
（医薬組成物）
本発明のペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき作製したベクター、該ベクターにより形質転換させた細胞、本発明のペプチドを免疫学的に認識する抗体、本発明のスクリーニング方法によって得られる本発明のペプチドのＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性および／またはＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬによる認識性を増強する化合物や本発明のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物などを、単独または複数組合せて利用することによって、これらの少なくとも１つを含んでなる医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は癌の治療において有用である。
例えば、本発明のペプチドを含有する医薬組成物は、いわゆる癌ワクチンとして使用される。このとき細胞性免疫の賦活のために、本発明のペプチドは適当なアジュバントの存在または非存在下で、単独で用いるかまたは担体に結合して用いる。担体は、それ自体が人体に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。剤形は、自体公知のペプチド製剤の手段を応用して適宜選択できる。その投与量は、細胞傷害性Ｔ細胞による認識性により変化するが、一般的には活性本体として０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日ないし数月に１回投与する。
または、患者の末梢血より単核球画分を採取し、本発明のペプチドとともに培養し、ＣＴＬが誘導された該単核球画分を患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果を得ることができる。培養するときの単核球濃度、ペプチドの濃度等の培養条件は、簡単な実験により決定することができる。また、培養時、インターロイキン２などのリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、癌の遺伝子治療のために有用である。これらＤＮＡをベクターに担持させ、直接体内に導入する方法またはヒトから細胞を採取したのち体外で導入する方法があるが、いずれも利用できる。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等が知られているが、レトロウイルス系が推奨される。無論これらウイルスは複製欠陥性である。その投与量は、細胞傷害性Ｔ細胞による認識性により変化するが、一般的には本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド含量として０．１μｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μｇ〜５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日ないし数月に１回投与する。
（診断方法および診断用試薬キット）
本発明のペプチドは、該ペプチドの発現に関連した疾患（特に消化器系癌）の診断方法として有用であり、例えば当該ペプチドをコードしている核酸配列との相互作用・反応性を利用して、相応する核酸配列の存在量を決定すること、および／または当該ペプチドについて個体中の生体内分布を決定すること、および／または当該ペプチドの存在、個体由来の試料中の存在量を決定することによって行われる。すなわち、本発明のペプチドを診断マーカーとして検定するのである。その測定法は、自体公知の抗原抗体反応系、酵素反応系、ＰＣＲ反応系等を利用すればよい。また本発明には、上記診断方法に使用する試薬キットも含まれる。本発明の試薬キットは、少なくとも本発明のペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ペプチドを認識する抗体のうち１つ以上からなるものである。
実施例
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
実施例１
（ｌｃｋ遺伝子の同定）
細胞傷害性Ｔ細胞を活性化しうる腫瘍抗原を得るために、ＫＥ４腫瘍細胞のｃＤＮＡライブラリーから作製した合計１０５個のｃＤＮＡクローンをＨＬＡ−Ａ２４０２と共にトランスフェクションしたＶＡ１３細胞を刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）として用い、ＣＴＬとともに培養して、ＣＴＬを活性化せしめるｃＤＮＡクローンを得た。ＣＴＬの活性化は、ＩＦＮ−γの産生を指標にして測定した。この方法により、腫瘍拒絶抗原をコードする遺伝子の同定が可能である（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２７７〜２８８、１９９８）。
具体的には、エフェクター細胞として用いたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＫＥ４−ＣＴＬ）である。この細胞は、食道癌患者から樹立した（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８１：４５７−４６６、１９９９）。また、腫瘍抗原を得るために、ＫＥ４腫瘍細胞を用いてそのポリ（Ａ）＋ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、これをＳａｌＩアダプターと結合して発現ベクターｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中に挿入した。ＨＬＡ−Ａ２４０２または対照であるＨＬＡ−Ａ０２０１のｃＤＮＡを、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって得、そして、真核生物発現ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した。プラスミドＤＮＡプールまたはＫＥ４ｃＤＮＡライブラリーのクローンの２００ｎｇと、ＨＬＡ−Ａ２４０２のｃＤＮＡ２００ｎｇとを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）７０μｌ中で、リポフェクチン１μｌと、１５分間混合した。
混合物の３０μｌを、ついで、２×１０４個のＶＡ１３細胞に添加し、５時間インキュベーションした。次に、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地２００μｌを加え、２日間培養した。その後、ＫＥ４−ＣＴＬ（１０４細胞／ウエル）を添加した。１８時間インキュベーション後、上清の１００μｌを回収し、既に報告した（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２７７〜２８８、１９９８）ように、ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＦＮ−γを測定した。
その結果、１つのクローン（クローン２１）が、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＫＥ４−ＣＴＬを活性化することを見いだした（図１）。このｃＤＮＡクローンの塩基配列は１，７５０塩基（ｂｐ）長であり、かつ５０９アミノ酸からなるＬｃｋ蛋白質のアミノ酸配列のポジション３１−５０６に対応する塩基配列であるポジション２８３−２，０３２と１００％相同性を有することが判明した。すなわち、Ｌｃｋ遺伝子がコードする蛋白質は、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性にＣＴＬを活性化しうる腫瘍抗原であることが示唆された。
また、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＫＥ−ＣＴＬの代わりに、大腸癌患者より樹立したＣＴＬ株（ＯＫ−ＣＴＬ）の亜株であるＯＫ−ＣＴＬ−ｅ亜株（ＨＬＡ−Ａ０２０７）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６３：４９９９−５００４、１９９９）ならびに肺癌患者より樹立したＣＴＬ株（ＧＫ−ＣＴＬ）の２つの亜株であるＧＫ−ＣＴＬ２−２−４亜株（ＨＬＡ−Ａ０２０６）およびＧＫ−ＣＴＬ２−２−５亜株（ＨＬＡ−Ａ０２０６）の合計３つのＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬをエフェクター細胞として用い、ｌｃｋ遺伝子とＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０２０６、ＨＬＡ−Ａ０２０７、ＨＬＡ−Ａ２４０２、またはＨＬＡ−Ａ２６０１とをトランスフェクションしたＶＡ１３細胞を刺激細胞として用いて、Ｌｃｋ蛋白質がＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬのみならず、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬをも活性化しうる腫瘍抗原であることを見いだした〔図２の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）〕。
実施例２
（Ｌｃｋ蛋白質の発現）
種々の細胞および組織における蛋白質レベルでのＬｃｋ（５６ｋＤおよび５９ｋＤ）の発現を、抗Ｌｃｋモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析により検討した。
原発性の結腸癌（ｎ＝４９）、非腫瘍性の結腸（ｎ＝５）、肺癌〔腺癌：ｎ＝８，扁平上皮癌（ＳＣＣ）：ｎ＝８〕、食道癌細胞を検討に使用した。さらに、大腸癌細胞株（ＣＯＬＯ２０１，ＣＯＬＯ２０５，ＣＯＬＯ３２０，ＨＣＴ１１６，およびＳＷ６２０）、肺癌細胞株（ＬＫ８７：腺癌細胞、およびＬＫ７９：小細胞癌細胞）、食道癌細胞株（ＫＥ４）も検討に用いた。
試料は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ  ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）と０．０３トリプシンインヒビター単位／ｍｌのアプロチニンからなる緩衝液で溶解し、超音波処理し、そして１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。得られた上清を、細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）画分として使用した。溶解物は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
アクリルアミドゲル中で得られた蛋白質は、ＨｙｂｏｎｄＴＭ−ポリビニリジンジフルオライド膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写（ｂｌｏｔ）し、抗Ｌｃｋモノクロナール抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と室温で４時間インキュベーションした。他の方法は、既報告（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５４：１５８−１６５，１９９５）のウエスタンブロット分析に従った。
Ｌｃｋ蛋白質は未刺激の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）では認められなかったが、１０μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＰＨＡ）で４８時間刺激した後の活性化されたＰＢＭＣ（ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ）の細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）画分には検出されるようになった。Ｌｃｋ蛋白質はＳＣＣまたは腺腫瘍細胞株などの試験した全ての悪性腫瘍細胞株、並びに食道癌、肺ＳＣＣおよび肺腺癌細胞などの多種の臓器から得られた新鮮腫瘍組織の大多数で検出された。一方、非腫瘍性の結腸組織のいずれでも全く検出されなかった（表１）。
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実施例３
（ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬにより認識される腫瘍抗原ペプチド）
ＨＬＡ−Ａ２４分子結合性のＬｃｋ由来の腫瘍抗原ペプチドを特定するために、１３個の異なったペプチドを合成してＣ１Ｒ／Ａ２４０２に導入し、ＫＥ４−ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を増強する能力について試験した。
ＨＬＡ−Ａ２４０２分子への結合能をもつＬｃｋ由来ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ（ｍｏｔｉｆ）に対するペプチドについて文献検索し、１３種の異なるペプチドを、ｌｃｋ遺伝子産物の５０９アミノ酸配列（Ｎａｔｕｒｅ、３１９：６８２〜６８５、１９８６）に基づいて合成した。但し、一部アミノ酸に変更を加えたものもある。合成したペプチドを表２に示す。
0004051602.tif 000005
腫瘍抗原ペプチドの特定のために、ＨＬＡ−Ａ２４０２でトランスフェクションしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞の２×１０４個を、終濃度１０μＭのペプチドと２時間パルスした。ついで、１×１０４個のＫＥ４−ＣＴＬを加え、１８時間インキュベーションした。上清の１００μｌを回収し、ＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ−γを測定した。
合成した１３個のペプチドのうち、６個のペプチド〔Ｌｃｋ７１−８０、Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）、Ｌｃｋ３１７−３２５、Ｌｃｋ３５３−３６１、Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）〕が、ＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ産生増強活性を有しており（図３）、特に３個のペプチド〔Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）、Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）〕で強い活性が認められた。Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）、またはＬｃｋ４８８−４９７（配列番号２）ペプチドの、ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を増強する活性は濃度依存的であり、１ｎＭ程度で認められた。一方、Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）の活性は１００ｎＭ以上で認められた（図４）。
Ｃ１Ｒ／Ａ２４０２細胞の代わりにＶＡ１３細胞（２×１０４個）を用い、ＨＬＡ−Ａ２４０２でトランスフェクションしてこれらのペプチドをパルスし、刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）として使用した場合も、同様の結果が得られた。
また、上記のＣＴＬ活性化試験において、抗ＣＤ３（ＮｕＴ３）、抗ＣＤ４（ＮＵＴｈ／ｓ）、抗ＣＤ８（ＮｕＴＣ／ｉ）、抗ＣＤ１３（ＭＣＳ−２）、抗ＭＨＣクラスＩ（Ｗ６／３２）または抗ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＤＲ１）抗体（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：３１７〜３２３，１９９４）を用いたところ、３つの各ペプチドでパルスしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞に対する反応におけるＫＥ４−ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８および抗ＭＨＣクラスＩモノクローナル抗体によって阻害されたが、抗ＣＤ４、抗ＭＨＣクラスＩＩおよび抗ＣＤ１３モノクローナル抗体では阻害されなかった〔図５の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）〕。従って、ＫＥ４−ＣＴＬは、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４−表現型を有し、ＭＨＣクラスＩを認識する細胞傷害性Ｔ細胞であることが確認された。
さらに、ＣＴＬにおけるペプチドの特異性を確認するために、ＫＥ４−ＣＴＬの亜株（ｓｕｂｌｉｎｅ）を、親株であるＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＫＥ４−ＣＴＬから、限界希釈培養（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）によって、樹立した（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２７７〜２８８、１９９８）。得られたＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４−表現型を有する２０の異なったＫＥ４−ＣＴＬの細胞亜株（ｓｕｂｌｉｎｅ）について、上記３個の各ペプチドに対する反応性について試験した。
その結果、２つの亜株（亜株  ＃４９および＃９３）がＬｃｋ４８８−４９７（配列番号２）を、１つのクローン（クローン  ＃８０）がＬｃｋ４８６−４９４（配列番号１）を認識した〔図６の（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）〕。亜株  ＃１９はＬｃｋ２０８−２１６（配列番号３）およびＬｃｋ４８６−４９４（配列番号１）の両方と反応した〔図６の（Ａ）〕。他の１６の亜株はこれらのペプチドのいずれとも反応しなかった。このことから、ＣＴＬは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることが示唆される。
実施例４
（ペプチドによるＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導）
３個のペプチド〔（Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）、Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）〕について、大腸癌患者から得たＰＢＭＣから、Ｌｃｋ蛋白質を発現している腫瘍細胞株（ＫＥ４、ＳＷ６２０およびＣＯＬＯ２０１）に対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導する活性を試験した。
ＨＬＡ−Ａ２４＋患者または健常人のＰＢＭＣの２×１０６個を、培養培地（４５％ＲＰＭＩ−１６４０培地、４５％ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地／ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、およびＩＬ−２の１００Ｕ／ｍｌと０．１ｍＭのＭＥＭノンエッセンシャルアミノ酸溶液／ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬを含む１０％ＦＣＳ）２ｍｌを含む２４ウエルプレートの各ウエル中で、ペプチド１０μＭとインキュベーションした。
培養７日目および１４日目にこの細胞を回収して洗浄し、放射線照射（５０グレイ）した自己ＰＢＭＣまたは樹状細胞をペプチドでパルスしたものを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて刺激した。この樹状細胞は、１０％ＦＣＳと１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４と１００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球・マクロファージーコロニー刺激因子）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中で、ＰＢＭＣ（２×１０６細胞／ウエル）を７日間インキュベーションすることにより誘導した。
培養２１日目に採取した細胞をエフェクターとし、直ちに種々のターゲット（標的細胞）に対する反応性を、ＩＦＮ−γの産生能を指標としてＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果を図７に示す。Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）、Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで３回刺激したＰＢＭＣ、特にＬｃｋ４８６−４９４（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）で刺激したＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞（ＣＯＬＯ２０１）に対する反応より、ＨＬＡ−Ａ２４＋腫瘍細胞（ＫＥ４およびＳＷ６２０）に対する反応において、より多くのＩＦＮ−γを産生した。一方、健常人から得たＰＢＭＣは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として放射線照射したＰＢＭＣを用いてパルスした３個のペプチドのいずれを用いて刺激しても、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ活性は示さなかった。健常人から得られたＰＢＭＣはペプチドをパルスした樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ；ＤＣ）をＡＰＣとして用いて刺激したときにはＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ活性を示した（表３）。
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また、標的細胞からの５１Ｃｒ遊離試験のために、ペプチドを用いて３回刺激した上記ＰＢＭＣを、相当するペプチドで予めパルス処理した放射線処理ＨＬＡ−Ａ２４＋異種ＰＢＭＣ（２×１０５細胞／ウエル）からなるフィーダー細胞と共にさらに培養した。再培養の約２４日目に、これら細胞の細胞傷害性Ｔ細胞活性をＩＦＮ−γ産生量の測定により確認し、さらにこれら細胞について６時間の５１Ｃｒ遊離試験をエフェクター／ターゲット（標的細胞）の比率を変えて行い、細胞傷害性を直接的に検討した。上記３つのＬｃｋ由来のペプチドで刺激したＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４＋ＫＥ腫瘍細胞およびＳＷ６２０腫瘍細胞を溶解したが、健常人からのＨＬＡ−Ａ２４＋ＰＨＡ活性化Ｔ細胞またはＨＬＡ−Ａ２４−ＣＯＬＯ２０１腫瘍細胞を溶解しなかった。Ｌｃｋ４８８−４９７を用いた結果を図８の（Ａ）に、Ｌｃｋ２０８−２１６を用いた結果を図８の（Ｂ）に示す。従って、Ｌｃｋ由来のペプチドはＨＬＡ−Ａ２４拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうることが明らかとなった。
実施例５
（癌患者から得た末梢血単核球におけるＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬの誘導）
３個のペプチド〔Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）、Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）〕について、癌患者から得たＰＢＭＣから、Ｌｃｋ蛋白質を発現した腫瘍細胞株（ＫＥ４、ＳＷ６２０およびＣＯＬＯ２０１）に対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導する活性を、ＩＦＮ−γ産生量を指標に測定した。ＣＴＬの誘導方法、およびＩＦＮ−γ測定方法は実施例４と同様の方法を用いた。
その結果、表４に示すように、大腸癌患者および食道癌患者のＰＢＭＣから、Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）によりＣＴＬが誘導された。
0004051602.tif 000007
次に、該大腸癌患者のＰＢＭＣ（２×１０６個）を予め、３個のペプチド、Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）、Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）を加えて刺激し、その後、抗原提示細胞として各ペプチドを１０μｇ／ｍｌ加えてインキュベーションしたＨＬＡ−Ａ２４＋Ｃ１Ｒ／Ａ２４０２細胞に加えてさらに培養し、培養上清中に産生されたＩＦＮ−γ量を測定した。図９の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）に示すように、予め、Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）またはＬｃｋ４８８−４９７（配列番号２）で刺激した大腸癌患者のＰＢＭＣは、抗原提示細胞に提示されたペプチド、それぞれＬｃｋ４８６−４９４（配列番号１）またはＬｃｋ４８８−４９７（配列番号２）にのみ反応してＩＦＮ−γ産生、すなわちＣＴＬを誘導した。つまり、Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）またはＬｃｋ４８８−４９７（配列番号２）は大腸癌患者のＰＢＭＣから、予備刺激することによりペプチド特異的なＣＴＬを誘導しうることが判明した。一方、Ｌｃｋ２０８−２１６（配列番号３）またはペプチド非存在下で大腸癌患者のＰＢＭＣを予め刺激した場合は、ペプチド特異的なＣＴＬは誘導できなかった。
次に、該大腸癌患者から誘導されたＣＴＬの性状を検討するために、標的細胞としてＳＷ６２０細胞を用い、抗ＣＤ４（ＮＵＴｈ／ｓ）、抗ＣＤ８（ＮｕＴＣ／ｉ）、抗ＣＤ１４、抗ＭＨＣクラスＩ（Ｗ６／３２）または抗ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＤＲ１）抗体をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに上記大腸癌患者から誘導されたＣＴＬを加えて、インキュベーションし、上清中に産生されるＩＦＮ−γ量を測定した（図１０）。その結果、ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生は抗ＣＤ８および抗ＭＨＣクラスＩモノクローナル抗体によって阻害された。すなわち、大腸癌患者から誘導されたＣＴＬは、ＣＤ８＋ＣＤ４−表現型を有しＭＨＣクラスＩを認識する細胞傷害性Ｔ細胞であることが確認された。
上記大腸癌患者のＰＢＭＣ中のＣＴＬ前駆細胞について検討を行った。９６ウエルプレートにＳＷ６２０細胞を播いてインキュベーションし、予めＬｃｋ４８８−４９７（配列番号２）で刺激した上記大腸癌患者のＣＴＬを１個〜１００個／ウエルとなるよう加えてさらに培養し、標的細胞であるＳＷ６２０細胞の生存するウエルを確認した。対照として、ペプチドで刺激しない上記大腸癌患者のＣＴＬを用いた。結果は図１１に示す。大腸癌患者のＰＢＭＣ中のＣＴＬ前駆細胞の頻度は、ペプチドで刺激しないときは１／６３４であるが、Ｌｃｋ４８８−４９７（配列番号２）で刺激すると１／８１となる。すなわち、ペプチドで刺激することにより、ＣＴＬ前駆細胞が増加することが認められた。
実施例６
（ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ誘導性を有するペプチドの検討）
以上のように、Ｌｃｋ由来の３個のペプチドＬｃｋ２０８−２１６（配列番号３）（ＨＹＴＮＡＳＤＧＬ）Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）（ＴＦＤＹＬＲＳＶＬ）およびＬｃｋ４８８−４９７（配列番号２）（ＤＹＬＲＳＶＬＥＤＦ）がＨＬＡ−Ａ２４＋腫瘍細胞株を認識するＣＴＬを誘導することができることを見いだした。これらの結果から、２個のペプチドＬｃｋ４８６−４９４（配列番号１）およびＬｃｋ４８８−４９７（配列番号２）の重なる領域である一定のアミノ酸ＤＹＬＲＳＶを、ペプチドで誘導されたＣＴＬが腫瘍抗原エピトープとして認識すること、およびＬｃｋ蛋白質においてキナーゼドメインに含まれるこの部位が腫瘍拒絶に対する意義を有することが示唆される。このアミノ酸配列ＤＹＬＲＳＶに着目し、この配列に相同性をもつペプチドを検索したところ、表５に示す様に、Ｌｃｋと同じＳｒｃファミリーに属するチロシンキナーゼ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：８９７−９３０，１９８５）に、相同性を有するアミノ酸配列をもつものがあることが判明した。
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これらＳｒｃファミリー由来のペプチドのアミノ酸配列に基づいて、Ｓｒｃ５１１−５１９（配列番号４：ＴＦＥＹＬＱＡＦＬ）、Ｙｅｓ５０８−５１６（配列番号５：ＴＦＥＹＩＱＳＦＬ）、Ｆｙｎ５１２−５２０（配列番号６：ＴＦＥＹＬＱＳＦＬ）、Ｌｙｎ４８９−４９７（配列番号７：ＴＦＤＹＬＱＳＶＬ）、Ｈｃｋ５０３−５１１（配列番号８：ＴＦＥＹＩＱＳＶＬ）、Ｂｌｋ４８２−４９０（配列番号９：ＴＦＥＦＬＱＳＶＬ）を合成し、各１０μｇ／ｍｌを標的細胞としてのＳＷ６２０細胞とともにインキュベーションし、さらに実施例１および実施例２で用いたＫＥ４−ＣＴＬ細胞を加えて培養し、培養上清中に産生されたＩＦＮ−γ量を指標としてＣＴＬ誘導活性を調べた。また、陽性コントロールとして標的細胞にＫＥ４を使用した。その他の方法は実施例４と同様の方法を用いた。図１２に示すように、各Ｓｒｃファミリー由来のペプチドは、Ｌｃｋ由来のペプチドと同様、あるいはそれ以上のＣＴＬ誘導能を示した。
実施例７
（癌患者におけるＳｒｃファミリー由来のペプチドによるＣＴＬの誘導）
Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１：ＴＦＤＹＬＲＳＶＬ）、Ｓｒｃ５１１−５１９（配列番号４：ＴＦＥＹＬＱＡＦＬ）、Ｙｅｓ５０８−５１６（配列番号５：ＴＦＥＹＩＱＳＦＬ）、Ｆｙｎ５１２−５２０（配列番号６：ＴＦＥＹＬＱＳＦＬ）、Ｌｙｎ４８９−４９７（配列番号７：ＴＦＤＹＬＱＳＶＬ）、Ｈｃｋ５０３−５１１（配列番号８：ＴＦＥＹＩＱＳＶＬ）、Ｂｌｋ４８２−４９０（配列番号９：ＴＦＥＦＬＱＳＶＬ）について、転移性癌患者より得たＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬを誘導しうるか検討した。ＣＴＬの誘導方法およびＣＴＬの活性測定法は実施例４と同様の方法により行い、標的細胞としては、ＫＥ４細胞（ＨＬＡ−Ａ２４０２／２６）、ＳＷ６２０細胞（ＨＬＡ−Ａ０２０１／２４）、ＣＯＬＯ２０１細胞（ＨＬＡ−Ａ０１０１／０２０１）、ＶＡ１３細胞（ＨＬＡ−Ａ０２）を用いた。Ｌｃｋ４８６−４９４（配列番号１）は癌患者７例中４例、Ｓｒｃ５１１−５１９（配列番号４）は３例中２例、Ｙｅｓ５０８−５１６（配列番号５）は３例中１例、Ｆｙｎ５１２−５２０（配列番号６）は２例中１例、Ｈｃｋ５０３−５１１（配列番号８）は２例中２例、Ｂｌｋ４８２−４９０（配列番号９）は２例中１例において、ＰＢＭＣ中にＣＴＬを誘導した。しかし、Ｌｙｎ４８９−４９７は検討した２例いずれにおいてもＣＴＬは誘導しなかった。
実施例８
（ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬにより認識される腫瘍抗原ペプチド）
ＨＬＡ−Ａ２分子結合性のＬｃｋ由来の腫瘍抗原ペプチドを特定するために、２４個の異なったペプチドを合成してＶＡ１３（ＨＬＡ−Ａ０２）に導入し、ＯＫ−ＣＴＬまたはＧＫ−ＣＴＬ亜株（２−２−４）によるＩＦＮ−γ産生を増強する能力について実施例３と同様の方法で試験した。
ＨＬＡ−Ａ２分子への結合能をもつＬｃｋ由来ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ（ｍｏｔｉｆ）に対するペプチドについて文献検索し、２４種の異なるペプチドを、ｌｃｋ遺伝子産物の５０９アミノ酸配列（Ｎａｔｕｒｅ、３１９：６８２〜６８５、１９８６）に基づいて合成した。合成したペプチドを表６および表７に示す。
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腫瘍抗原ペプチドの特定のために、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションしたＶＡ１３細胞の２×１０４個を、終濃度１０μＭのペプチドと２時間パルスした。ついで、１×１０４個のＫＥ４−ＣＴＬを加え、１８時間インキュベーションした。上清の１００μｌを回収し、ＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ−γを測定した。
これらのペプチドのうち、７個のペプチド〔Ｌｃｋ６１−６９（配列番号１１）、Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）、Ｌｃｋ２９４−３０３（配列番号１３）、Ｌｃｋ３４０−３４８（配列番号１４）、Ｌｃｋ３４７−３５５（配列番号１５）、Ｌｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）、Ｌｃｋ４９２−５００（配列番号１７）〕がＯＫ−ＣＴＬ亜株およびＧＫ−ＣＴＬ亜株（２−２−４）のＩＦＮ−γ産生を増強した〔図１３の（Ａ）および（Ｂ）〕。また、パルスするペプチドの濃度を変化させて同様の実験を行ったところ、Ｌｃｋ６１−６９（配列番号１１）は特にＯＫ−ＣＴＬ亜株を、Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）は特にＧＫ−ＣＴＬ亜株（２−２−４）を、またＬｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）は特にＧＫ−ＣＴＬ亜株（２−２−５）を、濃度依存的に活性化し、これらＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を増強した〔図１４の（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）〕。
実施例９
（ペプチドによるＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導）
３個のペプチド〔（Ｌｃｋ６１−６９（配列番号１１）、Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）、Ｌｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）〕について、転移を有する大腸癌患者から得たＰＢＭＣから、腫瘍細胞株Ｐａｎｃ−１、ＳＷ６２０、ＣＯＬＯ３２０およびＶＡ１３に対するＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを誘導する活性について試験した。
転移を有するＨＬＡ−Ａ２＋大腸癌患者のＰＢＭＣを用い、実施例４と同様の方法でＣＴＬの誘導およびＩＦＮ−γの測定を行った〔図１５の（Ａ）および（Ｃ）〕。またＣＴＬの細胞傷害活性を５１Ｃｒ遊離試験により直接的に測定した〔図１５の（Ｂ）および（Ｄ）〕。Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）およびＬｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）は、転移を有するＨＬＡ−Ａ２＋大腸癌患者からのＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍特異的ＣＴＬを誘導した。
実施例１０
（癌患者におけるＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導）
３個のペプチド〔（Ｌｃｋ６１−６９（配列番号１１）、Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）、Ｌｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）〕について、種々の癌患者から得たＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを誘導しうるか検討した。ＣＴＬの誘導方法およびＣＴＬの活性測定法は実施例４と同様の方法により行い、標的細胞としては、ＳＷ６２０細胞（ＨＬＡ−Ａ０２０１／２４）を用いた。Ｌｃｋ２４６−２５４（配列番号１２）は癌患者６例中２例、Ｌｃｋ４２２−４３０（配列番号１６）は６例中３例において、ＰＢＭＣ中にＣＴＬを誘導した（表８）。
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産業上の利用の可能性
本発明のＬｃｋ由来のペプチドおよびＳｒｃファミリー由来のペプチドは、腫瘍抗原ペプチドであり、癌患者のＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２４拘束性および／またはＨＬＡ−Ａ２拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。Ｌｃｋ蛋白質は大腸、肺および食道を含む大多数の癌組織で発現している。すなわち、本発明の腫瘍抗原ペプチドは、癌を対象とする特異的免疫治療に用いることができる。また、ＨＬＡ−Ａ２４対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）は、日本人の人口の約６０％（多くはその９５％の遺伝型がＡ２４０２である）、コーカサス人の２０％、アフリカ人の１２％でみられる。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、日本人の約４０％、中国人の５３％、北コーカサス人の４９％、南コーカサス人の３８％、黒人アフリカ人の２３％においてみられる。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドを使用する特異的免疫療法は、多数の癌患者に適用しうる。本発明により提供されるペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、これを認識する抗体は、癌の治療および診断の分野で、極めて有用な手段を提供するものである。
配列表フリーテキスト
配列番号１０：
〈２２０〉
〈２３０〉Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼのアミノ酸配列に基づいて作製した、ＨＬＡ−２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する能力を有するペプチド。
〈２２２〉（３）
〈２３０〉Ｘａａは、ＡｓｐまたはＧｌｕでありうる。
〈２２２〉（４）
〈２３０〉Ｘａａは、ＴｙｒまたはＰｈｅでありうる。
〈２２２〉（５）
〈２３０〉Ｘａａは、ＬｅｕまたはＩｌｅでありうる。
〈２２２〉（６）
〈２３０〉Ｘａａは、ＡｒｇまたはＧｌｎでありうる。
〈２２２〉（７）
〈２３０〉Ｘａａは、ＳｅｒまたはＡｌａでありうる。
〈２２２〉（８）
〈２３０〉Ｘａａは、ＶａｌまたはＰｈｅでありうる。
〈２２２〉（１０）
〈２３０〉Ｘａａは、ＧｌｕまたはＡｓｐでありうる。
〈２２２〉（１２）
〈２３０〉Ｘａａは、ＰｈｅまたはＴｙｒでありうる。
〈２２２〉（１３）
〈２３０〉Ｘａａは、ＰｈｅまたはＴｙｒでありうる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１：  ｌｃｋ遺伝子産物を認識することにより、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＫＥ４−ＣＴＬ）が活性化しインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を産生することを示す図である。
図２：  ｌｃｋ遺伝子産物を認識することにより、ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞が活性化してインターフェロン−γ（ＩＦＮ−ｙ）を産生することを示す図である。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）はそれぞれＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬとして、ＯＫ−ＣＴＬ−ｅ亜株、ＧＫ−ＣＴＬ２−２−４亜株およびＧＫ−ＣＴＬ２−２−５亜株を用いたときの結果を示す。
図３：  Ｌｃｋ由来のペプチドをトランスフェクションしたＣ１Ｒ／Ａ２４０２細胞で刺激したＫＥ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生量を示す図である。
図４：  Ｌｃｋ由来のペプチドが濃度依存的にＫＥ−ＣＴＬを活性することを示す図面である。
図５：  ＫＥ−ＣＴＬによるペプチド認識を種々の抗体存在下で行い、ＫＥ−ＣＴＬの細胞表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）およびＭＨＣ拘束性を確認した結果を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）はそれぞれＬｃｋ由来のペプチドとして、Ｌｃｋ２０８−２１６、Ｌｃｋ４８６−４９４、およびＬｃｋ４８８−４９７を用いたときの結果を示す。
図６：  ＫＥ４−ＣＴＬ亜株（ｓｕｂｌｉｎｅ）のペプチド認識における差違を示す図面である。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）はそれぞれ亜株＃１９、亜株＃４９、亜株＃９３、およびクローン＃８０を用いた結果を示す。
図７：  Ｌｃｋ由来のペプチドが癌患者末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうることを、各種腫瘍細胞、ＫＥ４（ＨＬＡ−Ａ２４＋）、ＳＷ６２０（ＨＬＡ−Ａ２４＋）、ＣＯＬＯ２０１（ＨＬＡ−Ａ２４−）を標的細胞としてＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を指標に調べた結果を示す図である。
図８：  Ｌｃｋ由来ペプチドにより誘導されるＣＴＬの各種腫瘍細胞に対す細胞傷害性活性を、５１Ｃｒの遊離試験により検討した結果を示す図である。（Ａ）および（Ｂ）は、ペプチドとしてそれぞれＬｃｋ４８８−４９７およびＬｃｋ２０８−２１６を使用した結果を示す。
図９：  大腸癌患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からペプチドにより誘導されたＣＴＬの、ペプチドに対する特異性を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）は、それぞれ癌患者のＰＢＭＣの事前刺激に、ペプチドを使用しなかったとき、ペプチドとしてＬｃｋ２０８−２１６、Ｌｃｋ４８６−４９４、およびＬｃｋ４８８−４９７を使用したときの結果を示す。
図１０：  大腸癌患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からのペプチドによるＣＴＬ誘導を種々の抗体存在下で行い、誘導されたＣＴＬの細胞表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）およびＭＨＣ拘束性を確認した結果を示す図である。
図１１：  大腸癌患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中の、ペプチドにより誘導されるＣＴＬ前駆細胞の頻度を示す図である。図中、横軸は１ウエルあたりの加えたＣＴＬ数を表し、縦軸は増殖陰性分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｎｅｇａｔｉｖｅｃｕｌｔｕｒｅ）を表す。縦軸において、１はＣＴＬが誘導されず、ＣＴＬにより溶解（ｌｙｓｉｓ）されるべき標的細胞が１００％生存していることを示し、０．２は標的細胞が１００％死滅している（ＣＴＬ前駆細胞頻度＝１／９６）ことを示す。
図１２：  Ｓｒｃファミリー由来のペプチドによる、ＫＥ４−ＣＴＬの活性化を示す図である。
図１３：  Ｌｃｋ由来のペプチドのＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ活性化能を分析した結果を示す図であり、（Ａ）はＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬとしてＯＫ−ＣＴＬ株を使用したときの結果を、（Ｂ）はＧＫ−ＣＴＬ２−２−４亜株を使用したときの結果を示す。
図１４：  Ｌｃｋ由来のペプチドが濃度依存的にＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを活性化することを示す図である。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれＯＫ−ＣＴＬ−ｅ亜株、ＧＫ−ＣＴＬ２−２−４亜株、およびＧＫ−ＣＴＬ２−２−５亜株をＣＴＬとして使用したときの結果を示す。
図１５：  Ｌｃｋ由来のペプチドが癌患者末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうることを示す図である。（Ａ）および（Ｂ）は、大腸癌患者例１由来のＰＢＭＣからのＣＴＬの誘導を、ＩＦＮ−γの産生を指標に検討した結果、および細胞傷害性試験で確認した結果を示す。（Ｃ）および（Ｄ）は、大腸癌患者例２由来のＰＢＭＣからのＣＴＬの誘導を同様に検討した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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