(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞の遺伝子に変異を導入するためのオリゴヌクレオ塩基化合物であって、
a）1）合計で少なくとも15個のヌクレオチド；および
2）少なくとも３個の連続リボ型ヌクレオチドであって、該リボ型ヌクレオチドの2'炭素が、アルキルオキシまたはハロゲンで置換されたメチレンであり、該リボ型ヌクレオチドと他のヌクレオチドとの結合がホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、またはメチルホスホネート結合である、該少なくとも３個の連続リボ型ヌクレオチド；
を含んでなる、3'端と5'端を有するヌクレオチドの第１ストランド、ならびに、
b）3'端と5'端を有するヌクレオチドの第２ストランド、
を含んでなり、かつ、第２ストランドのヌクレオチドが第１ストランドのヌクレオチドにワトソン・クリック型塩基対合しており、第１ストランドの連続リボ型ヌクレオチドが2'-デオキシリボ型ヌクレオチドにワトソン・クリック型塩基対合しており、少なくとも１個のリボ型ヌクレオチドは2'Ｏ-メチル置換ヌクレオチド以外のものであり、さらに第１ストランドと第２ストランドとが非オリゴヌクレオ塩基成分によって共有結合している、上記のオリゴヌクレオ塩基化合物。
【請求項２】
非オリゴヌクレオ塩基成分が、第１ストランドの３'端を第２ストランドの５'端に共有結合させている、請求項１記載のオリゴヌクレオ塩基化合物。
【請求項３】
非オリゴヌクレオ塩基成分が、第１ストランドの５'端を第２ストランドの３'端に共有結合させている、請求項１記載のオリゴヌクレオ塩基化合物。
【請求項４】
非オリゴヌクレオ塩基成分が、第１ストランドの５'端を第２ストランドの３'端に共有結合させており、かつ第１ストランドの３'端を第２ストランドの５'端に共有結合させている、請求項１記載のオリゴヌクレオ塩基化合物。
【請求項５】
真核細胞の遺伝子に変異を導入するためのオリゴヌクレオ塩基化合物であって、
a）1）合計で少なくとも15個のヌクレオチド；および
2）少なくとも３個の連続リボ型ヌクレオチドであって、該リボ型ヌクレオチドの2'炭素が、アルキルオキシまたはハロゲンで置換されたメチレンであり、該リボ型ヌクレオチドと他のヌクレオチドとの結合がホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、またはメチルホスホネート結合である、該少なくとも３個の連続リボ型ヌクレオチド；
を含んでなる第１ストランドを含有する、3'末端と5'末端をもつ第１鎖、ならびに、
b）3'末端と5'末端をもち第２ストランドを含有する第２鎖、
を含んでなり、かつ、第１ストランドの連続リボ型ヌクレオチドが第２ストランドの2'-デオキシリボ型ヌクレオチドにワトソン・クリック型塩基対合するように、第２ストランドのヌクレオチドが第１ストランドのヌクレオチドにワトソン・クリック型塩基対合している、上記のオリゴヌクレオ塩基化合物。
【請求項６】
真核細胞の染色体上の標的配列内に変異を導入するための医薬を製造するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオ塩基化合物の使用であって、但し前記オリゴヌクレオ塩基化合物は前記細胞の核内に保持される、前記使用。
【発明の詳細な説明】
１．発明の分野
本発明は、標的とする真核細胞のゲノム中に特異的な遺伝的改変を生じさせる化合物およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、前記標的細胞の核内にキメラ突然変異性ベクター（CMV）とよばれるオリゴヌクレオ塩基（oligonucleobase）化合物を導入することに関し、該化合物は改変しようとする標的細胞の遺伝子（「標的遺伝子」）に相同性を示す領域と１以上の差異を示す領域を有する配列を含んでいる。CMVの構造は、CMVと標的遺伝子との間で遺伝的組換えが生じるように、すなわちCMVの配列が標的遺伝子の配列と置き換わるように設計されている。
２．発明の背景
２．１．真核細胞における部位特異的な遺伝的改変
分子生物学分野における当業者であれば、新規ポリ核酸配列（すなわち新規遺伝子）を標的真核細胞中に単に導入するのではなく、むしろ標的細胞中の確定された既存の遺伝子を改変する方が望ましいことが度々あることを理解できよう。該標的細胞は培養に用いることもできるし、またはトランスジェニック動物を構築するために用いることもできる。
培養した真核細胞中にＤＮＡを導入するために、多様な技術が開発された。これらの技術はリン酸カルシウム沈殿およびDEAE−デキストラン媒介エンドサイトーシス、電気穿孔、リポソーム媒介融合および複製能を有していないウイルスを用いる形質導入を含む。しかしながら、そうした技術により機能的遺伝子が真核細胞中に頻繁に導入されうるものの、これらの技術では特定の既存遺伝子の改変（突然変異）は容易には達成されない。導入の後、細胞ゲノム中の特定位置での相同的組換えではなく、非正統的組換えによりランダムな位置に外因性ＤＮＡが隔離される。
本発明以前には、高等真核細胞（すなわち、哺乳動物細胞または鳥類細胞）中に部位特異的遺伝的改変を導入するための一般的な満足しうるスキームは存在しなかった。非常に長い（＞１kb）核酸を導入することにより高等真核細胞において相同的組換えが達成されうるが、これらの技術は煩雑な選択技法を使用する必要がある。何故なら、高等真核細胞における非正統的組換え率は相同的組換え率をかなり上回っているからである（Thomas,K.R. & Capecchi,M.R., 1987, Cell.52:503）。また、Valancius,V. & Smithies O,, 1991,Mol.Cell.Biol.11:4389（真核細胞における線状プラスミドとスーパーコイルプラスミドとの相同的組換えの比較）も参照のこと。
優先的に部位特異的突然変異誘発を生じさせるための１つのアプローチは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを直接細胞中に導入することである。この技術は酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいてうまく用いられ、該酵母中では相同的組換えが高等真核細胞におけるよりもかなり活性である（Moerschell,R.P.,ら、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85:524-28；Yamamoto,T.,ら、1992,Yeast 8:935-48）。しかし、今日まで一本鎖オリゴヌクレオチドによる哺乳動物細胞または鳥類細胞の形質転換に成功したという報告はない。
哺乳動物における標的ＤＮＡの構造と相同的組換え率との関係は、交互のプリンおよびピリミジン塩基からなる領域、すなわち[d（TG）30・d（AC）30]が初期の組換え率を表すということを示す研究により推測される。これらの成果は培養哺乳動物細胞における非複製プラスミドの研究により立証された（Wahls,W.P.ら,1990, Mol.Cell.Biol. 10:785-93）。これらの実験は、外来核酸と細胞のゲノムとの間の組換えを示すことを目的としたものではなかった。
細菌（E.coli）における相同的組換えを促進するタンパク質RecAを使用して、真核細胞における相同的組換えを促進させようとする試みがなされた。しかし、これらの試みは明らかに成功を収めていない。例えば、W.Bertlingによる米国特許第4,950,599号は、真核細胞におけるRecAを使用しての部位特異的突然変異は非常に低率であり、また相同的組換え率も全く増加しなかったことを開示している。D.ZarlingおよびE.Senaによる特許公開WO 93／22443、ならびにD.C.GruenertおよびK.Kunzelmannによる公開94／04032のいずれも、嚢胞性繊維症に関連する培養細胞株中の遺伝的欠損を修復することを目的としている。こ
れらの公開公報は操作方法の実施例に関するデータよりもむしろ原理を立証する実験データを主に開示している。従って、ポリヌクレオチド／RecA複合体を核に近づけるために、ZarlingおよびGruenertは膜透過性を向上させた（membrane-permeabilized）細胞を使用しているが、これらの細胞はさらなる増殖能を有していない。さらに、無傷の細胞においてRecA促進化相同的組換えが起きたと断言した場合でさえ、これらの公開公報はその頻度の定量的概算を全く提示していない。従って、原核細胞由来のRecAの使用により、生存可能な真核細胞における相同的組換え率が、相同的組換えの自然発生率より有意に大きくなるということを示すには説得力が無い。
２．２．ＤＮＡ・ＲＮＡ塩基対を有するキメラオリゴヌクレオチド
公開公報もしくは特許出願を本節に含めることは、これらの公開公報もしくは出願が、本発明以前になされたまたは本発明者以外の人物の概念から生じたものであるとの自認として理解されるべきものではない。
相補的なデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを有し、かつバクテリオファージＭ13mp19の断片に相同性の配列を含有するオリゴヌクレオチドがKmiec,E.B.ら、November 1994, Mol. and Cell.Biol. 14:7163-7172に記載された。このオリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドからなる１つの連続セグメントを有していた。Kmiecらは該オリゴヌクレオチドがUstilago maydisからのREC2相同性対合酵素（REC2 homologous pairing enzyme）の基質であることを示した。
特許公開公報WO 95／15972（1995年６月15日発行）およびE.B.Kmiecによる対応する米国特許出願第08／353,657号（1994年12月９日出願）は、真核細胞における遺伝的改変の導入のためのCMVを記載している。Ustilago maydis遺伝子およびマウスras遺伝子における具体例が報告されている。後者の具体例はras遺伝子中にトランスフォーミング突然変異を導入し、その結果NIH 3T3細胞におけるras遺伝子中にうまく生じた突然変異が細胞コロニーの増殖を引き起こす（「形質転換」）ように設計された。WO 95／15972公開公報は、NIH 3T3の最大形質転換率は0.1％未満（すなわちras CMVに暴露した細胞106個につき約100個の形質転換体）であると報告している。Ustilago maydis系においては、形質転
換体の割合は106個につき約600個であった。ヒトbcl−２遺伝子中に突然変異を導入するように設計したキメラベクターが、Kmiec E.B., February 1996, Seminars in Oncology 23:188に記載された。
K−rasのコドン12における突然変異を修復するように設計したCMVが、Kmiec E.B.,December 1995, Advanced Drug Delivery Reviews 17:333-40に記載された。このCMVを試験するにあたり、ヒト膵腺癌由来の細胞系Capan2においてLIPOFECTINTMを使用してCapan2細胞中に該CMVを導入した。CMVへの暴露の24時間後に、細胞を収穫しゲノムＤＮＡを抽出した；K-rasのコドン12を含有する断片をPCRにより増幅し、その変換率を対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより概算した。修復率は約18％であると報告された。
肝臓／骨／腎臓型アルカリ性ホスファターゼをコードする遺伝子内の突然変異を修復するように設計したCMVがYoon,K.ら、March 1996, Proc.Natl.Acad.Sci.93:2071において報告された。該アルカリ性ホスファターゼ遺伝子をプラスミドによりCHO細胞中に一時的に導入した。６時間後にCMVを導入した。該CMV導入の24時間後にプラスミドを回収し分析した。その結果、約30〜38％のアルカリ性ホスファターゼ遺伝子がCMVにより修復されたことが示された。
米国特許出願第08／640,517号（E.B.Kmiec, A. Cole-StraussおよびK.Yoonにより1996年５月１日出願）は、造血細胞の遺伝性疾患（例えば鎌状赤血球症、地中海貧血およびゴシェ病）の治療に役立つ方法およびCMVを開示している。
【図面の簡単な説明】
図１．  キメラ突然変異性ベクターの具体例の一般的な形態。
図２Aおよび２B．図２AはオリゴヌクレオチドDh1（配列番号18）およびキメラオリゴヌクレオチドCh1（配列番号15）、Ch2（配列番号16）およびCh3（配列番号17）の配列および構造を示す。図２Bは前記キメラベクターCh1の配列とアルカリ性ホスファターゼ遺伝子のヌクレオチド693-728（配列番号19）との関係を例示している。ＤＮＡヌクレオチドは大文字、ＲＮＡヌクレオチドは小文字で印刷してある。
図３．  βSグロビン（配列番号21のヌクレオチド1〜25）、βAグロビン（配列番号20のヌクレオチド1〜25）、δグロビン（配列番号25）、ならびにキメラベクターSC1〜SC5（配列番号20〜24）のコドン3〜9の配列ならびにコドン２および10の隣接ジヌクレオチド。ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドは図２Aと同様にして示す。
図４Aおよび４B．  図４Aおよび４Bは、それぞれEBで形質転換したリンパ芽球の培養物中に添加したSC1のnMの関数としてのβSからβAへ変換したβグロビンのコピー数の比率、およびSC２のnMの関数としてのβAからβSへ変換したβグロビンのコピー数の比率を示す。
図５．  図５は、cd 34+造血幹細胞の培養物に添加したSC２のngの関数としてのβAからβSへ変換したβグロビンのコピー数の比率を示す。
４．定義
本発明は以下の定義に従って理解されるべきものである。
オリゴヌクレオ塩基はヌクレオ塩基のポリマーであり、該ポリマーはワトソン・クリック型塩基対合により相補的な配列を有するＤＮＡにハイブリダイズできる。
ヌクレオ塩基はプリン、ピリミジン、またはそれらの誘導体もしくは類似体である塩基を含む。ヌクレオ塩基はペプチドヌクレオ塩基、すなわちペプチド核酸のサブユニット、およびモルホリンヌクレオ塩基ならびにヌクレオシド、ヌクレオトイドおよびヌクレオチドを含む。ヌクレオシドはペントースフラノシル部分（例えば場合によって置換されたリボシドまたは2'−デオキシリボシド）を含有し、かつリンを含有しない他のヌクレオ塩基に結合しているヌクレオ塩基である。ヌクレオトイドは、リン酸エステルではないリン含有結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびメチルホスホネートを有するペントースフラノシル含有ヌクレオ塩基である。ヌクレオチドは未置換ホスホジエステルにより連結されるペントースフラノシル含有ヌクレオ塩基である。
オリゴヌクレオ塩基鎖は、ポリマーの最も隔たったヌクレオ塩基である5'および3'末端を１つ有する。特定のオリゴヌクレオチド鎖は全ての型のヌクレオ塩基を含みうる。オリゴヌクレオ塩基化合物は、相補的でかつワトソン・クリック型塩基対合によりハイブリダイズする１以上のオリゴヌクレオ塩基鎖を含む化合物である。
ヌクレオ塩基はデオキシリボ型かリボ型かのいずれかである。リボ型ヌクレオ塩基はペントースフラノシル含有ヌクレオ塩基であり、ここで２'炭素はヒドロキシル、アルキルオキシまたはハロゲンで置換されたメチレンである。デオキシリボ型ヌクレオ塩基は、リボ型ヌクレオ塩基以外のヌクレオ塩基であり、かつペントースフラノシル部分を含有しない全てのヌクレオ塩基を含む。
オリゴヌクレオ塩基ストランドは、一般的にオリゴヌクレオ塩基鎖およびオリゴヌクレオ塩基鎖のセグメントまたは領域の両方を含む。オリゴヌクレオ塩基ストランドは3'端および5'端を有する。オリゴヌクレオ塩基ストランドがある鎖と同一の広がりを有する場合、該ストランドの3'端および5'端は該鎖の3'末端および5'末端でもある。
領域はオリゴヌクレオ塩基の一部分であり、その配列はある特定の供給源（例えば、ヒトβグロビン遺伝子の断片の配列を有する少なくとも15ヌクレオチドからなる領域を有するCMV）に由来する。セグメントはある特徴的な構造特性を有するCMVの部分である。所定のセグメントまたは所定の領域は2'−デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを共に含有しうる。しかし、リボ型セグメントまたは2'−デオキシリボ−型セグメントはそれぞれリボ型および2'−デオキシリボ−型ヌクレオ塩基だけしか含有しない。
５．発明の概要
本発明は、キメラ突然変異性ベクター（Chimeric Mutational Vector：ＣＭＶ）と称するオリゴヌクレオ塩基化合物を提供する。ＣＭＶを用いて植物および動物細胞に特定の遺伝的変化を導入することができる。本発明は、遺伝子治療の医療分野、生物医学的研究の分野、医薬創製の分野、そして特異的に突然変異を導入した植物および動物を作出するために農業の分野で応用可能である。ＣＭＶは２つの相補的なオリゴヌクレオ塩基ストランドを含む。これら２つのストランドは１本の鎖上に、またはオリゴヌクレオチドを架橋するための任意の化学により結合され得る２本の鎖上に存在することができる。
ＣＭＶのストランドの配列は、標的遺伝子に遺伝的変化を導入するミューテーター領域を除いて標的遺伝子に相同である。ＣＭＶはまた、標的遺伝子と無関係の配列を有する領域を含むこともできる。ミューテーター領域は少なくとも１塩基の相同領域に3'および5'の両方向で直接隣接している必要がある。
ＣＭＶのオリゴヌクレオ塩基はリボ型または2'-デオキシリボ型のいずれかである。リボ型のヌクレオ塩基は2'酸素またはハロゲンを有するペントースフラノシル部分を含む。第１ストランドの相同領域の少なくとも３個の連続塩基は、第２ストランドのデオキシリボ型ヌクレオ塩基にワトソン・クリック型塩基対合しているリボ型ヌクレオ塩基である。ＲＮアーゼに感受性であるヌクレオ塩基は本発明で使用するのに適していない。
６．発明の詳細な説明
本発明は、真核細胞のゲノムに特定の変化を導入するために使用しうるキメラ突然変異性ベクター（ＣＭＶ）と称する化合物を提供する。ＣＭＶは適切な配列を有するＤＮＡにハイブリダイズする、すなわちプリンとピリミジンのワトソン・クリック型塩基対を形成する、プリンとピリミジンとのポリマーから構成されている。各ＣＭＶはそれぞれ少なくとも１５塩基の第１および第２ストランドに分割され、これらのストランドは互いに相補的で、共有結合で連結され得るが、必ずしもその必要はない。オリゴヌクレオ塩基と称するプリンとピリミジンとのポリマーは、ヌクレオ塩基と称する２つの型のサブユニットから構成される。２つの型のヌクレオ塩基が存在する。リボ型のヌクレオ塩基は2'ヒドロキシル、置換ヒドロキシルまたは2'ハロ置換リボースを有するリボヌクレオシドである。リボ型ヌクレオ塩基以外の全てのヌクレオ塩基はデオキシリボ型ヌクレオ塩基である。
第１および第２ストランドの配列は、標的遺伝子に相同な少なくとも２つの領域および標的遺伝子と異なって標的遺伝子に遺伝的変化を導入する１以上の領域（「ミューテーター領域」）から成る。ミューテーター領域は相同領域に3'および5'の両方向で直接隣接している。本発明の好ましい実施態様において、各ミューテーター領域は少なくとも３塩基の相同領域に3'および5'の両方向で隣接している。本発明の好ましい実施態様において、各ミューテーター領域は少なくとも３塩基のリボ型オリゴヌクレオ塩基セグメントにより3'および5'の両方向で挟まれており（flanked）、これらのセグメントはミューテーター領域に隣接している必要はない。フランキングリボ型ヌクレオ塩基セグメントはミューテーター領域に直接隣接している必要はなく、すなわち、デオキシリボ型ヌクレオ塩基を含む相同領域の部分が介在してもよい。全ての相同領域の合計の長さは少なくとも１４塩基であることが好ましい。ＣＭＶがミューテーター領域により分離された２つの相同領域を含む場合、それらの相同領域はそれぞれが、より好ましくは８〜１２塩基の長さであり、最も好ましくは１０塩基の長さでありうる。
第１ストランドの少なくとも２つの相同領域は、第２ストランドのデオキシリボ型ヌクレオ塩基にワトソン・クリック型塩基対合している、少なくとも３個の連続リボ型ヌクレオ塩基から成る。好ましい実施態様では、第２ストランドのデオキシリボ型ヌクレオ塩基にワトソン・クリック型塩基対合しているリボ型ヌクレオ塩基は９〜２５個、より好ましくは２０個存在する。一実施態様では、第２ストランド中にリボ型ヌクレオ塩基が存在しない。一実施態様では、第１ストランドのミューテーター領域はデオキシリボ型ヌクレオ塩基から成り、デオキシリボ型ヌクレオ塩基により挟まれている。あるいはまた、ミューテーター領域は第１ストランドのリボ型ヌクレオ塩基および第２ストランドのデオキシリボ型ヌクレオ塩基から構成されてもよい。
ＣＭＶはさらに、少なくとも３個のヌクレアーゼ耐性リボ型ヌクレオ塩基を含む点に特徴がある。好ましい実施態様では、全部のリボ型ヌクレオ塩基がヌクレアーゼ耐性である。
ミューテーター領域は２キロベースくらい大きくてもよいし、エキソンをコードしてもよい。好ましくは、ミューテーター領域は２０個以下、より好ましくは６個以下、最も好ましくは３個以下の塩基から成る。ミューテーター領域は、標的遺伝子の挿入または欠失が起こるように、ＣＭＶの相同領域に相同性の標的遺伝子領域を分離している配列の長さと異なる長さでありうる。欠失を導入するためにＣＭＶを用いる場合は、ミューテーター領域内として同定できる塩基が存在しない。むしろ、この突然変異は標的遺伝子において分離されている２つの相同領域の並置により起こる。一実施態様において、ミューテーター領域は６〜１個、より好ましくは３〜１個の塩基の欠失である。複数の別個の突然変異を単一のＣＭＶによって導入することができ、その場合には同一のＣＭＶ中に複数のミューテーター領域が存在する。また、単一の遺伝子に複数の遺伝的変化を導入するために、あるいは同一細胞の複数の遺伝子に遺伝的変化を導入するために、複数のＣＭＶを同時に使用することもできる。
好ましい実施態様では、ＣＭＶはＲＮアーゼ耐性である。それゆえ、ＲＮアーゼ感受性である天然のリボ型ヌクレオ塩基のみの使用は本発明にとって適切でない。ＣＭＶのリボ型ヌクレオ塩基は、好ましくは非ホスホジエステル結合のリボヌクレオチド（「リボヌクレオトイド」）、2'O-置換または2'ハロリボヌクレオチド、2'O-置換、および場合により2'置換されていてもよいリボヌクレオシドから選択されるリボ型ヌクレオ塩基を少なくとも３個含むべきである。ＣＭＶの好ましい実施態様では、ヌクレアーゼ感受性の、すなわち2'O-リボヌクレオチドを使用しない。
一実施態様において、ＣＭＶは40〜100塩基の１本のオリゴヌクレオ塩基鎖である。別の実施態様において、ＣＭＶはそれぞれが20〜100塩基の第１および第２オリゴヌクレオ塩基鎖を含んでなり、その場合、第１鎖が第１ストランドを含み、第２鎖が第２ストランドを含む。第１鎖と第２鎖は共有結合で結合していてもよいし、また、ワトソン・クリック型塩基対合によってのみ結びついていてもよい。
6.1.  キメラ突然変異性ベクターの使用
キメラ突然変異性ベクターを用いて、既知の配列を有するどのような真核生物遺伝子の配列にも変化を導入することが可能である。かかる変化は１個以上のヌクレオチドの置換をもたらしたり、１個以上のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。好ましい実施態様において、置換、挿入または欠失は20個以下の連続塩基から成り、より好ましい実施態様では、置換、挿入または欠失が６個以下の塩基から成り、最も好ましくは３個以下の塩基から成る。挿入は約２キロベースくらいに長くてもよい。挿入や欠失は遺伝子のコード部分と調節部分に行うことができる。
細胞をＣＭＶでトランスフェクトするには、現在知られているかまたは細胞をＤＮＡでトランスフェクトするために今後開発されるどのような技術を使用してもよい。そのような技術として、エレクトロポレーション、リポソーム導入およびリン酸カルシウム沈降が挙げられる。一実施態様では、リポソーム導入化合物、例えばDOTAP（N-[1-（2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルスルフェート, Boehringer-Mannheim）またはLIPOFECTINのような均等物を用いてトランスフェクションを行う。ＣＭＶの量は本発明の実施にとって決定的なものではないが、良好な結果は10nM/105細胞により達成される。105細胞につき３μgのDOTAP中の約500ngのＣＭＶの割合を使用できる。トランスフェクトした細胞を無血清培地、ヒト血清アルブミンまたはヒト血清を補充した培地中で培養するように改変した、以下の実施例１〜３のトランスフェクション技術を使用できる。
本発明はキメラ突然変異性ベクターの使用方法を包含する。キメラ突然変異性ベクターの使用には、ゴシェ病、地中海貧血、鎌状赤血球症などの遺伝性疾患の修復が含まれる。その他の用途としては、特定の突然変異を有するトランスジェニック動物もしくは植物のみならず、「ノックアウト体」、すなわち特定の遺伝子の機能的コピーを欠失しているトランスジェニック動物もしくは植物を作出するための停止コドンまたはフレームシフト突然変異の導入がある。本発明により意図される別の使用方法では、特定の突然変異体が対象遺伝子の構造機能関係を研究する目的で作出される。あるいはまた、ある生物種において望ましい突然変異が同定されたら、ＣＭＶを用いて他の生物種の相同遺伝子にそれを導入することができる。
医療目的では、本発明は、患者の体内から取り出して培養し、その後患者に移植して戻すことのできる任意の細胞型に突然変異を導入したり、突然変異を修復するために用いられる。肝細胞、特に肝貯蔵（幹）細胞を取り出して培養し、再移植する技術は、Naughton, G.B.およびSibanda, B.の特許公開WO94/08598（1994年４月28日）に記載されている。肝細胞の突然変異の修復により治癒され得る遺伝性疾患の例には、ＬＤＬ受容体の突然変異により引き起こされる家族性高コレステロール血症、α１-アンチトリプシン遺伝子の突然変異により引き起こされる家族性気腫、それぞれ凝固因子VIIIおよびIXの突然変異により引き起こされる血友病およびクリスマス病などがある。
本発明のさらに別の使用では、選択可能な表現型をもつ突然変異体が得られるように、細胞集団に突然変異を起こさせるためにＣＭＶが用いられる。本発明のこの面によると、３個の非野生型ヌクレオチドがミューテーター領域のそれぞれの位置に存在するように、１または数個のヌクレオチドのミューテーター領域をもつＣＭＶの混合物を合成する。このようなＣＭＶの混合物で細胞集団を処理すると、標的遺伝子にさまざまな突然変異が誘発される。適切な選択工程後に、所望の表現型をもつ突然変異体が回収される。
6.2.  典型的なキメラ突然変異性ベクターの構造
6.2.1.  一本鎖キメラ突然変異性ベクター
一実施態様において、キメラ突然変異性ベクター（ＣＭＶ）は、約40〜約100個のペントースフラノシル含有ヌクレオ塩基から構成される単一の5',3'-結合オリゴヌクレオ塩基鎖である。一本鎖ＣＭＶは不対ヌクレオチドを含んでいてもよく、それらは１または２個のヘアピンターンを形成し、その１または２個のターンがＣＭＶを第１および第２ストランドに分割し、その結果、第１ストランドの少なくとも15塩基が第２ストランドの塩基にワトソン・クリック型塩基対合される。
図１は、セグメント（a）〜（h）を含む一本鎖ＣＭＶの具体例の構造を示す。図１の具体例では、第１ストランドがセグメント（c）、（d）および（e）から成り、セグメント（a）から成る第２ストランドに相補的である。この特定の具体例では、ＣＭＶの3'末端が（a）セグメントの3'端にあるように示してあり、5'末端が（h）セグメントの5'端にあるように示してある。しかし、末端の位置およびセグメントに対するＣＭＶの3'および5'方向の配向は、末端が第１または第２ストランドの相同領域またはミューテーター領域を妨害しない限り、ほかの位置であってもよい。セグメントは順に（a）から（h）と表示してある。
ある実施態様では、セグメントの長さおよび特徴は次のとおりである。セグメント（a）は16〜40ヌクレオチドであり、好ましくは20〜30ヌクレオチドである。セグメント（a）の領域の配列は、意図した突然変異を含む遺伝子（「突然変異標的遺伝子」）のコード鎖または非コード鎖のいずれの配列でもよい。セグメント（a）の配列の位置は、変化させるべき標的遺伝子の部分を含まねばならない。標的遺伝子が標的細胞内で正常に転写されない場合、セグメント（a）の配列は標的遺伝子のコード鎖の配列であることが好ましい。標的遺伝子が標的細胞内で転写されない場合は、コード鎖配列も非コード鎖配列も好ましくない。セグメント（a）の配列により、セグメント（a）に相補的でなければならないセグメント（c）〜（e）の配列および合計した長さが決まる。
セグメント（c）および（e）と塩基対合されるセグメント（a）の部分のオリゴヌクレオ塩基は任意の2'-デオキシリボ型ヌクレオ塩基でありうる。リボヌクレオチドセグメントと称するセグメント（c）および（e）のヌクレオ塩基は、任意のリボ型ヌクレオ塩基2'O-リボヌクレオチド、すなわち既知のまたは今後開発されるヌクレオチドでありうる。好ましい実施態様において、介在セグメントと称するセグメント（d）のヌクレオチドは2'-デオキシリボ型ヌクレオ塩基である。あるいはまた、セグメント（d）はリボ型ヌクレオ塩基で構成されてもよく、その場合はセグメント（c）と（d）と（e）の間の境界が定まらない。セグメント（b）および（f）〜（h）はどのような型のヌクレオ塩基であってもよい。
好ましい実施態様において、セグメント（c）および（e）の配列は標的遺伝子に対して完全に相同である。しかし、（c）または（e）セグメント中の１塩基ミューテーター領域は、相同位置で標的遺伝子の突然変異を起こさせることができる。
セグメント（b）および（g）は長さが約４ヌクレオチドで、一本鎖のヘアピンターンを形成し、このターンによりセグメント（a）と（c）〜（e）およびセグメント（f）と（h）がワトソン・クリック型塩基対、すなわち二重鎖核酸を形成することができる。別の実施態様では、第１および第２ストランドを共有結合させるべきセグメント（b）および（c）の機能が非オリゴヌクレオ塩基成分によって補助されてもよい。
第１および第２リボ型セグメントとも称するセグメント（c）および（e）は、一実施態様では、2'-O-メチルリボヌクレオチドから成る。好ましい実施態様において、セグメント（c）および（e）は独立して６〜13ヌクレオチドである。
介在セグメントとも称するセグメント（d）は、一実施態様では、長さが４〜20ヌクレオチドである。標的遺伝子が15より少ないヌクレオチドで分離された点突然変異を２以上含む場合は、それぞれを同一のＣＭＶによって修復することができる。
セグメント（f）および（h）は、セグメント（a）および（h）の間に切れ目（ニック）を入れるＣＭＶの3'および5'端を並置状態に至らせる二重鎖を形成する。セグメント（f）、（g）および（h）により形成された構造をヘアピンキャップと称する。ヘアピンキャップは終端および非終端を含む。終端はこの鎖の末端を形成し、5'または3'末端のいずれかでありうる。ヘアピンキャップの機能は3'または5'末端の位置をコントロールすることである。ヘアピンキャップの非終端はストランドの端に連結され、図１に示すように、この鎖の第２末端である相補ストランドの端がヘアピンキャップの終端に並置される。3'および5'末端は、一実施態様において、脱リン酸化されていてもよい。別の実施態様では、3'および5'末端がホスホジエステル結合または同様の結合で共有結合されており、その結果ＣＭＶは閉鎖された環状オリゴヌクレオチドとなる。セグメント（f）および（h）は閉鎖環状ＣＭＶから欠失されていてもよい。好ましい実施態様では、ヘアピンキャップのオリゴヌクレオ塩基の方向はそれが連結されるストランドの方向と同じである。ヘアピンキャップの向きがそれが連結されるストランドの向きとアンチパラレルであるときは、ヘアピンの終端の3'または5'の指定は相補鎖の終端の構造によって決定される。
好ましい実施態様において、ＣＭＶはこの鎖とパラレルに方向づけられた１つのヘアピンキャップを含み、並置された3'および5'端を有する一本鎖ＣＭＶである。このタイプの具体例は８種類存在し、それらはヘアピンキャップと鎖との連結（ライゲーション）位置により、また、第１ストランドの配列が標的遺伝子のコード鎖の配列であるか非コード鎖の配列であるかによって規定される。これら８種を表Ｉに示す。図１は表Ｉの種２および６を例示したものである。
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6.2.2.  二本鎖キメラ突然変異性ベクター
また、ＣＭＶは二本鎖であってもよく、各鎖が3'および5'末端を有し、その際、第１鎖が第１ストランドを含み、第２鎖が第２ストランドを含む。第１鎖と第２鎖は共有結合リンカーによって架橋されていてもよいし、第１鎖と第２鎖がワトソン・クリック型塩基対合のみによって会合されていてもよい。二本鎖ＣＭＶの第１および第２ストランドの領域およびセグメントの長さは、一本鎖ＣＭＶに関する前記説明に従って構築される。一実施態様では、第１および第２鎖がそれらの会合安定性を高める３〜10塩基の相補セグメントを第１および第２ストランドに隣接して含んでいてもよい。
二本鎖ＣＭＶの別の実施態様は２本のオリゴヌクレオ塩基鎖と２つのヘアピンキャップを含むことができる。第１ストランドが第１鎖の一部となり、第２ストランドが第２鎖の一部となる。ヘアピンキャップは両方とも一方のストランドの各端に連結される。「クレードル」（Cradle:揺りかご）形状と称する特定の形状では、ヘアピンキャップが第２ストランドの各端に連結される。「アンチクレードル」形状では、ヘアピンキャップが第１ストランドの各端に連結される。「頭−尾」（head-to-tail）と称する別のタイプの形状は、ストランドのそれぞれに連結されたヘアピンキャップから成る。ＣＭＶのストランドはアンチパラレル様式でのみハイブリダイズするので、頭−尾タイプの特定形状は２種類存在するだけであり、すなわち、ヘアピンキャップが両方ともストランドの3'端または5'端のいずれかに連結されたものである。
6.3.  ＣＭＶの合成およびヌクレオ塩基の選択
ＣＭＶはオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を合成するためのどのような方法でも合成することができる。長さが約100塩基までの鎖をもつＣＭＶの場合は、固相合成が好ましい方法である。また、長さが約50塩基以上のＣＭＶ鎖のサブセグメントを固相法で合成して、それらを当業者には公知の液相法で連結してもよい（Wosnick, M.A., 1987, Gene 60:115-117）。当業者には理解されるように、アニーリングしたとき相補サブセグメントの端が互い違いになる（stagger）ように、固相法で相補サブセグメントを合成してもよい。隣接サブセグメントに互い違いの相補端をもたせることにより、隣接サブセグメントを公知の酵素的方法により連結することができる。この方法により、100塩基よりかなり大きいＣＭＶの鎖を合成することが可能となる。
ＣＭＶ鎖のヌクレオ塩基はワトソン・クリック型塩基対合によりＤＮＡにハイブリダイズする既知のまたは今後開発されるどのようなヌクレオ塩基であってもよい。適当なヌクレオ塩基にはヌクレオチドとヌクレオトイドが含まれる。典型的なヌクレオトイドをもつオリゴヌクレオ塩基の構造および合成は次の文献に見いだせる。ホスホロチオエート、Eckstein, F., Ann. Rev. Biochem., 1985, 54, 367；ホスホルアミデート、Froehler, B.C.ら, Nucleic Acid Research, 1988, 16, 4831；メチルホスホネート、Miller, P.S.ら, 1985, Biochimie, 1985, 67, 769。キラル特定的（chiral-specific）リン含有結合を有するオリゴヌクレオトイドの製造方法は米国特許第5,212,295号に記載されている。適切に選択された異性体を有するキラル特定的オリゴヌクレオチドは向上した安定性でもってＤＮＡにハイブリダイズする。
デオキシリボ型ヌクレオ塩基として使用できる、非リンヌクレオ塩基により結合されるペントースフラノシル含有ヌクレオ塩基はヌクレオシドと称される。ＤＮＡとの二本鎖（ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖と少なくとも同程度に安定している）を形成するヌクレオシドは種々の結合化学により結合される。そうした化学およびオリゴヌクレオ塩基におけるそれらの使用方法は次の文献に記載されている。メチルヒドロキシルアミン結合、Vasseurら, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4006, 米国特許第5,386,023号および第5,489,677号；アルキレンジオキシ結合、米国特許第5,223,618号；および3'-チオホルムアセタール、Jonesら, J.Org. Chem. 1993, 58, 2983。
ＣＭＶ中で使用できる他のヌクレオシドには次のものが含まれる。カルバメート、Stirchakら, J. Org. Chem. 1987, 52, 4202；スルホネート＆スルホンアミド、Glemarecら, Tetrahedron 1993, 49, 2287, Reynoldsら, J. Org. Chem. 1992, 57, 2983；スルホン、Huang, Z., J. Org. Chem. 1991, 56, 3869；スルファメート、Huie, E.M.ら, J. Org. Chem., 1992, 57, 4569；およびジイソプロピルシリル＆シリル、Cormier and Ogilvie, Nucleic Acids Res., 1988, 16, 4583, Ogilvie & Cormier, Tetrahedron Lett. 1985, 26, 4159。
ペントースフラノシル含有ヌクレオ塩基はリボ型または2'-デオキシリボ型のいずれかでありうる。ＣＭＶ中で用いる少なくとも３個のリボ型ヌクレオ塩基はヌクレアーゼ耐性でなければならない。適当なヌクレアーゼ耐性のリボ型ヌクレオ塩基は、2'ＡＸ-ヌクレオシド、2'ＡＸ-ヌクレオトイド、2'ＡＲ-ヌクレオチド（ここでＡ＝Ｏ、Ｆ、ClまたはBrであり、Ａ＝ＯであるときＸ＝ＨまたはＣ1-6アルカンおよびＲ＝Ｃ1-6アルカンであり、Ａがハロゲンであるとき、ＸおよびＲは存在しない）からなるリボヌクレアーゼ耐性ヌクレオ塩基の群から選択できる。
ペントースフラノシル部分をもたないヌクレオ塩基はデオキシリボ型ヌクレオ塩基として使用できる。適当な例として、モルホリノカルバメート（Wang & Weller, Tetrahedron Lett., 1991, 32, 7385）によるペントースフラノシルホスフェート部分の置換、およびペントースフラノシルホスフェート部分がアミノエチルグリシンで置換されるペプチド核酸が含まれる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）はEgholmら, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1895およびHuang, B.S.ら, J. Org. Chem., 1991, 56, 5006およびBuchardtらのWO92/20703に記載されており、ＰＮＡ／オリゴヌクレオチド・キメラポリマーの製造方法はWO95/14706に記載されている。
当業者であれば、ＰＮＡがどちらの方向でもＤＮＡにハイブリダイズできる、すなわち、ＰＮＡのどちらの末端も3'または5'末端でありうる、ことを理解できよう（Peffer, N.J.ら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10648-52）。ペプチドヌクレオ塩基がペントースフラノシルヌクレオ塩基を有するオリゴヌクレオ塩基ストランド中に存在するとき、このストランドの3'および5'端はペントースフラノシル部分の方向により決定され、また、ペプチドヌクレオ塩基を有する鎖中にまったく存在しない場合は、相補ストランドのペントースフラノシルヌクレオ塩基の方向により決定される。ＣＭＶの第１ストランドは少なくとも３個のペントースフラノシルヌクレオ塩基を含まねばならないことに注目されたい。
７．実施例
実施例7.1.  エピソームのアルカリ性ホスファターゼを修復するためのＣＭＶの使用
野生型ヒト肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスファターゼｃＤＮＡをSV40初期プロモーターの制御下に含有する発現プラスミドを得て、pHAPと名づけた。このｃＤＮＡの変異型を含有する同一のプラスミドを得て、p711と名づけた。pHAPとp711の配列を交換するためのＣＭＶのデザインを図2Aに示す。ＣＭＶＣh1は711位のミスセンス突然変異を修復するためにデザインされた。それは突然変異に対応する部位にＧ残基（野生型配列）を有する。Ｃh2は711位に対応する部位にＧの代わりにＡを含むことを除いてＣh1と同一のデザインを有する。Ｃh3はＣh1と同じ配列を有するが、リボヌクレオチドセグメントの配列が非コード鎖の代わりにアルカリ性ホスファターゼ遺伝子のコード鎖の配列である。オリゴヌクレオチドＤh1はＣh1と同じ配列を有するが、2'-デオキシヌクレオチドだけを含んでいた。
図2Bに示したp711の模式図は、アルカリ性ホスファターゼｃＤＮＡのコード領域の711位の単一の点突然変異Ａ、SV40初期プロモーター（ＰE）、SV40複製起点（ori）、ポリアデニル化付加部位およびスプライシングのためのsmall-tイントロン配列（SV40 poly A）を示す。図2Bの斜線部分は複製起点とβ-ラクタマーゼ（AmpR）遺伝子をコードするpBR322由来の配列を示す。ＣＨＯ細胞をp711でトランスフェクトし、６時間後ＣＭＶＣh1を前もってp711でトランスフェクトしておいたＣＨＯ細胞に導入した。両トランスフェクションともリポフェクチンを用いて実施した。野生型表現型への変換の程度は、生化学的レベルとＤＮＡ配列レベルの両方で、分光光度測定、組織化学的染色およびHirt ＤＮＡの分析によりモニターした。
材料および方法
オリゴヌクレオチドの合成および精製：  ABI 394 DNA/RNA合成機で1000Å広孔CPGを用いて0.2μmoleのスケールでキメラオリゴヌクレオチドを合成した。DNAホスホルアミダイト（Applied Biosystems, Foster City, CA）の環外アミン基は、アデニンおよびシチジンについてはベンゾイルで、グアニンについてはイソブチリルで保護する。2'-O-メチルRNAホスホルアミダイト（Glen Research, Sterling, VA）は、アデニンについてはフェノキシアセチル基で、グアニンについてはジメチルホルムアミジンで、シチジンについてはイソブチリルで保護する。合成が完了したら、エタノール：濃水酸化アンモニウム（１：３）中で20時間55℃にて加熱して塩基保護基を除去する。粗製のオリゴヌクレオチドサンプルは7M尿素および10%グリセロールと混合し、70℃に加熱し、7M尿素を含有する10%ポリアクリルアミドゲル上に載せる。ゲル電気泳動後、ＤＮＡバンドをUVシャドーイングにより可視化し、ゲルから切り出し、粉砕し、TEバッファー（10mM Tris-HClおよび1mM EDTA, pH7.5）中に振とうしながら一晩溶出した。ゲル片を含む溶出液は0.45μmスピンフィルター（Millipore, Bedford, MA）を通し、エタノールで沈殿させた。サンプルをさらにG-25スピンカラム（Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN）で脱塩したところ、精製オリゴヌクレオチドの95％以上が全長であるとわかった。
一過性トランスフェクションおよび組織化学的染色:  ＣＨＯ細胞は10%FBS（B.R.L. Bethesda, MD）を含有するDEME（B.R.L. Bethesda, MD）中に維持した。OPTIMEM 1ml中のリポフェクチン10μgを各ウェルに添加して一過性のトランスフェクションを実施した。オリゴヌクレオチドのトランスフェクション後24時間してアルカリ性ホスファターゼ活性を測定した。組織化学的染色のために、細胞を0.15M NaClで３回洗浄し、染色溶液と共に20分インキュベートし、50%エタノールで固定した。染色溶液は水50ml中にFast Violet 2mg、ナフトールAS-MXホスフェートアルカリ溶液2mlを含んでいた。
アルカリ性ホスファターゼ活性の分光光度測定：  １×104個のＣＨＯ細胞に96ウェルプレートでOPTIMEM（B.R.L. Bethesda, MD）100μl中のリポフェクチン１μgとともに１μgのプラスミドp711を添加して、３回の反復実験で一過性トランスフェクションを実施した。６時間後、異なる量のＣh1または他のＣＭＶをOPTIMEM 100μl中のリポフェクチン１μgと混合し、各ウェルに添加した。18時間後、培地を吸引し、10% FBSを含有するDMEM 200μlを各ウェルに添加した。キメラオリゴヌクレオチドのトランスフェクションの24時間後にアルカリ性ホスファターゼ活性を測定した。Elisa Amplification System（B.R.L. Bethesda, MD）を用いて分光光度測定を実施した。細胞を0.15M NaClで３回洗浄し、10mM NaCl, 0.5% NP40, 3mM MgCl2および10mM Tris-HCl pH7.5を含有するNP40バッファー100μl中に溶解した。細胞溶解液のフラクション（20μl）をElisa基質50μlおよびElisa増幅剤（B.R.L. Bethesda, MD）50μlと共にインキュベートし、増幅剤と５分インキュベートした後、0.3M H2SO4を50μl添加して反応を停止させた。反応の程度は検出法の直線範囲内で実施した。吸光度をElisaプレートリーダー（B.R.L. Bethesda, MD）で波長490nmにて読み取った。
Hirt ＤＮＡの単離、コロニーハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ断片の直接ＤＮＡ配列決定：  キメラオリゴヌクレオチドのトランスフェクションの24時間後に、改変アルカリ溶解法によるベクターＤＮＡの単離のために細胞を回収した。細胞をトリプシン処理で分離し、洗浄し、50mM Tris-HCl pH8.0, 10mM EDTAを含有する溶液100μlおよび50mM Tris-HCl pH8.0, 10mM EDTA, 100μg／mlのRNアーゼAを含有する溶液110μl中に再懸濁した。等容量の細胞溶解溶液（0.2N NaOHおよび1% SDS）を添加し、次に中和溶液（3M KAc, pH5.5）100μlを添加した。室温で10分インキュベートした後、10,000rpmで10分遠心した。上清を等容量のフェノール-クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。Hirt ＤＮＡを大腸菌DH5α細胞（B.R.L. Bethesda, MD）に形質転換した。Hirt ＤＮＡからのコロニーは、点突然変異を識別するようにデザインされた各プローブを用いる特異的ハイブリダイゼーションについてスクリーニングした。コロニーをアンピシリンプレート上で増殖させ、ニトロセルロースフィルター上に２回反復してリフトし、コロニーハイブリダイゼーションのために処理した。ブロットは、5xDenhardts, 1% SDS, 2x SSCおよび100μg/mlの変性サケ精子DNAを含有する溶液中37℃で32P-末端標識オリゴヌクレオチドプローブ、711-A（5'-CCGCCTACACCCACTCG-3'（配列番号１））または711-G（5'-CCGCCTACGCCCACTCG-3'（配列番号２））にハイブリダイズさせた。ブロットをTMAC溶液（3.0Mテトラメチルアンモニウムクロリド/50mM Tris-HCl, pH8.0, 2mM EDTAおよび0.1% SDS）中52℃で洗浄した。711-Gまたは711-Aにハイブリダイズすることがわかった20個のコロニーから、Qiagenミニプレプキット（Chatworth, CA）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。各プラスミドの711位に隣接する数100塩基の配列を自動シーケンシング（ABI 373A, Applied Biosystem, Foster City, CA）により両方向で決定した。711位に隣接するアルカリ性ホスファターゼｃＤＮＡの位置630-650および803-822に対応する、２つのプライマー（5'-CAATGTCCCTGATGTTATGCA-3'（配列番号３）および5'-CGCTGGGCCAAGGACGCT-3'（配列番号４））を用いてVentRポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）により190bpのＰＣＲ増幅断片を作製した。この断片をゲル精製し、自動ＤＮＡシーケンシング（ABI 373A,Applied Biosystem, Foster City, CA）にかけた。
オリゴヌクレオチドの安定性の測定：  10ngの32P-末端標識オリゴヌクレオチドを500ngの未標識オリゴヌクレオチドと混合し、上記のようにトランスフェクトした。オリゴヌクレオチドの非特異的結合を低減させるため、細胞をPBSおよび1M NaCl/HAc pH2.5含有溶液で十分に洗浄した。10mM Tris-HCl pH7.5, 0.5mM MgCl2および0.5% Triton X-100を含有する溶液中で細胞を溶解して粗溶解物を調製し、次にフェノール-クロロホルムで抽出した。溶解物を7M尿素を含む15%ポリアクリルアミドゲルおよびオートラジオグラフィーにより分析した。10% FBSを含むDMEM中でインキュベートしたオリゴヌクレオチドを同じ方法で処理し分析した。
我々の実験デザインでは、前もってp711でトランスフェクトしておいたＣＨＯ細胞に種々のキメラオリゴヌクレオチドを導入した。野生型表現型への変換度は組織化学的染色によりモニターした。活性酵素を発現している細胞上には赤色の色素が沈着した。変異型遺伝子を含有する細胞をＣh1でトランスフェクトしたとき、平均11nMで、トランスフェクトＣＨＯ細胞３個に約１個の頻度で赤色細胞が出現した。これに対して、Ｃh2もＤh1も酵素活性を増加させなかった。細胞をＣh3でトランスフェクトしたときは、野生型への変換が低レベルで観察された。野生型プラスミドpHAPの発現により測定されたトランスフェクション頻度は30%であると概算された。
さらに、酵素活性を上記の分光光度測定法で測定した。アルカリ性ホスファターゼ活性の用量依存的増加が、p711プラスミドの存在下で17nMまでのＣhlで観察された。17nMのＣh1で処理した細胞の酵素活性は、野生型プラスミドpHAPでトランスフェクトした細胞から認められた活性の60%に近似していた。同量のＣh1がpHAPでトランスフェクトした細胞の酵素活性に影響を与えなかったので、この増加は配列特異的である。さらに、Ｃh1配列からの単一塩基対変化を含むＣh2は酵素活性の増加をもたらさなかった。Ｃh1と同じ配列を含むがリボヌクレオチドセグメントを含まないオリゴヌクレオチドＤh1は、増加を示さなかった。かくしてアルカリ性ホスファターゼ活性の分光光度測定は組織化学的染色から得られた結果と一致した。
キメラオリゴヌクレオチドによる標的ＤＮＡ配列の点突然変異の修正：  ＤＮＡ配列レベルでの変化を確かめるために、キメラオリゴヌクレオチドのトランスフェクションの24時間後に、改変アルカリ溶解法（Wang, G.ら, 1995, Mol. Cell. Biol. 15, 1759）により、p711および種々のオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした細胞からHirt抽出物を調製した。Hirt ＤＮＡはDH5α細胞を効率的に形質転換し、106個のトランスフェクトＣＨＯ細胞から104個のAmpRコロニーが得られた。DH5α形質転換体は、それぞれ変異型および正常ｃＤＮＡの位置703-719に対応する、点突然変異（A）および野生型（G）配列を識別するようにデザインされたプローブを用いる特異的ハイブリダイゼーションについてスクリーニングした（Weiss, MJ., 2988, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:7666）。修正率は、少なくとも２つの別個のトランスフェクション実験から作製された多重プレートの500以上のコロニーを用いて、711-Gまたは711-Aプローブにハイブリダイズしたコロニーの数の平均をとることで測定した（表II）。別個の合成により作製されたＣh1の２つのバッチについて、同様の変換頻度が観察された。p711およびＣh1でトランスフェクトした細胞から調製したHirt ＤＮＡから生成されたコロニーの約70%は711-Aプローブにハイブリダイズしたが、30%のコロニーは711-Gプローブへのハイブリダイゼーションを示した（表II）。かくして、11nMのＣh1では再現可能に30%の修正率が観察された。ハイブリダイゼーションは特異的で、２集団間に交差ハイブリダイゼーションは観察されなかった。ＤＮＡシーケンシングは、711位に隣接するアルカリ性ホスファターゼｃＤＮＡの位置630-650および803-822に対応する２つのプライマー（5'-CAATGTCCCTGATGTTATGCA-3'（配列番号５）および5'-CGCTGGGCCAAGGACGCT-3'（配列番号６））を用いて両方向でこれらのコロニーのうちの20個から調製したプラスミドＤＮＡを用いて実施した。それぞれの場合に配列変換が確認され、標的ヌクレオチドの周囲の数100個の塩基内には他の配列変化が観察されなかった。Ｃh2またはＤh1処理細胞から調製したHirt抽出物からの全コロニーは711-Aプローブだけにハイブリダイズした（表II）。Ｃh3のHirt抽出物からの一部のコロニーは野生型プローブにハイブリダイズしたが、Ｃh1よりも相当に低い程度にしかハイブリダイズしなかった（表II）。これらの結果から、異なって示されたアルカリ性ホスファターゼ活性はＤＮＡ配列レベルでの点突然変異の（ＡからＧへの）修正によるものであることが確認された。
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プラスミドＤＮＡを増やすために使用したRecA欠損大腸菌株は、エピソームＤＮＡを用いて修復機能と相同対合機能を果たすことができる。配列変換が大腸菌によって媒介されるという可能性を除外するために、Hirt ＤＮＡのＰＣＲ増幅断片の直接ＤＮＡシーケンシングをおこなった。711位に隣接する２つのプライマーを用いて、VentRポリメラーゼの作用により190bp断片を生成した。これらの結果から、p711とＣh1の組合せでトランスフェクトした細胞からHirt ＤＮＡサンプルを調製したとき、711位はＡ（70%）とＧ（30%）の混合物であることが示された。これに対して、Hirt ＤＮＡをオリゴヌクレオチドＤh1から調製した場合は、711位に混合配列が観察されなかった。これらの結果から、哺乳動物細胞においてキメラオリゴヌクレオチドによる配列修正が生じたことが明確に示された。
キメラオリゴヌクレオチドの安定性：  キメラオリゴヌクレオチドの安定性を細胞内および10% FBS含有増殖培地中で測定した。10ngの放射能標識オリゴヌクレオチドＣh1を、組織化学的染色およびHirt ＤＮＡ分析を実施したのと同じトランスフェクション実験に加えた（「材料および方法」参照）。キメラオリゴヌクレオチドは非常に安定している。キメラオリゴヌクレオチドを10% FBS含有増殖培地中でインキュベートしたとき、24時間のインキュベーション後に検出可能な分解が全く観察されなかった。さらに、細胞から単離したオリゴヌクレオチドは同じインキュベーション時間において分解を示さなかった。インキュベーションの24時間後に細胞から単離したときも、キメラオリゴヌクレオチドのモノマーだけが検出された。すなわち、ここで採用した実験条件のもとでは、キメラオリゴヌクレオチドの末端同士の連結は起きなかった。
実施例7.2.  ＥＢＶ形質転換細胞系においてβグロビン遺伝子に突然変異を起こすためのＣＭＶの使用
鎌状赤血球症のβグロビンに見られる突然変異を修復するためのＣＭＶ、ＳＣ１がデザインされた（図３）。この分子は５個のＤＮＡ残基の短い領域に隣接する2'-O-メチルＲＮＡ残基の２つの介在ブロックを有するＤＮＡ残基から構成される。この分子を二本鎖形状にフォールディングしたとき、一方のストランドはＤＮＡ残基のみを含み、他方のストランドはＲＮＡ／ＤＮＡブロックを含んでいた。この事例では、内部配列が、星印で示される太字の塩基（Ｔ）１個を除いて、βS突然変異の部位にかかる25残基の範囲においてβSグロビン配列に相補的である。ＲＮＡ残基により挟まれた５個のＤＮＡ残基はβSコード配列中の突然変異Ｔ残基を中央に配置していた。対照のキメラオリゴヌクレオチド（ＳＣ２）は、星印で示される太字の塩基（Ａ）を除いて、同様にデザインされた。また、βA、βSおよび密接に関連したδグロビン遺伝子のゲノム配列も図3Aに示してあり、βS突然変異の特定部位を太字で印刷してある。
リンパ芽球細胞を次のように調製した。鎌状赤血球症患者の臨床廃棄物から、また、この疾患の病歴も徴候もない研究者の一人から、ヘパリン処理血液を得た。フィコールでの密度勾配遠心により血液（約８ml）から単核細胞を調製し、マーモセット細胞系B95-8（Coriell Institute for Medical Research #GM07404D）内で増やしたエプスタイン-バーウイルスを感染させた。感染は、T25フラスコ内で20%ウシ胎児血清を補充したRPMI培地10ml中のロイコアグルチニンPHA-L0.1mgを添加することで実施した。５日目に開始して１週間に２回培養物を供給し、細胞の60〜70%が21日目に生存したままであれば、感染が達成されたとみなした。βAおよびβSリンパ芽球細胞は10%ウシ胎児血清を含有するRPMI培地中に維持した。
βS対立遺伝子についてホモ接合性の上記リンパ芽球細胞に次のようにＣＭＶを導入した。実験の前日に24ウェル組織培養プレートの各ウェル内の培地１mlに細胞（１×105/ml）をまいた。トランスフェクションを行うために、キメラオリゴヌクレオチドを20mM HEPES（pH7.3）20ml中のDOTAP（N-[1-（2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルスルフェート,Boehringer-Mannheim）３mgと混合し、室温で15分インキュベートし、培養細胞に添加した。６時間後、遠心により細胞を回収し、洗浄し、E.S. Kawasaki（PCR Protocols, M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White編, pp.146-152, Academic Press,（1990））の手法に従ってＰＣＲ増幅のために調製した。
単一塩基突然変異の修正は、βS突然変異から生じる公知の制限断片長多型を利用することにより評価した（R.F. Greevesら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:5081; J.C. Chang and Y.W. Kan, 1982, N. Eng. J. Med. 307:30; S.H. Orkinら, 同書, p.32; J.T. Wilsonら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:3628）。βS対立遺伝子中のＡからＴへのトランスバージョンはBsu36I制限部位（CCTGAGG）の欠失をもたらす。こうして、βS対立遺伝子はBsu36Iで切断したゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションにより検出することができる。通常存在するβグロビン遺伝子の1.2kbp Bsu36I ＤＮＡ断片がβS対立遺伝子には存在せず、診断上の1.4kbp断片により置換される。ホモ接合性βSリンパ芽球細胞から回収したゲノムＤＮＡをこの手法で分析したとき、予想された1.4kbp断片が観察された。しかし、ＳＣ１ ＣＭＶでトランスフェクトした細胞からのＤＮＡには２つの断片が観察された。1.4kbpの断片に加えて1.2kbpの断片が存在し、これはβS対立遺伝子の部分的修正が用量依存的に起こったことを示している。
修正効率を迅速にかつ感度よく測定するために、我々はＰＣＲに基づくＲＦＬＰ分析を採用した。βグロビン配列の分析のために、プライマーBG02（5'-TCCTAAGCCAGTGCCAGAAGA-3'（配列番号７））およびBG05（5'-CTATTGGTCTCCTTAAACCTG-3'（配列番号８））およびExpand Taqポリメラーゼ（Boehringer-Mannheim）を用いて粗製細胞溶解物から増幅することで、345bpのＰＣＲ断片を作製した。δグロビン遺伝子の分析のために、プライマーDG06（5'-CTCACAAACTAATGAAACCCTGC-3'（配列番号９））およびDG07（5'-GAAAACAGCCCAAGGGACAG-3'（配列番号10））を用いる増幅反応で同じ細胞抽出物を用いて335bpの断片を作製した。ゲルをSYBRTMグリーン（FMC Bioproducts）で染色し、Molecular Dynamicsフルオロイメージャーを用いて蛍光強度を定量した。ABI 373Aシーケンサーを用いて両方向でのＤＮＡ配列決定をおこなった。
上記のプライマーはゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅後にβS突然変異の部位にかかる345bp断片を得るためにデザインされた。正常細胞からの断片はBsu36I認識配列を含み、228bpと117bpの断片をもたらしたが、βS遺伝子からのＤＮＡは配列CCTGTGGを含み、切断に対して抵抗したままだった。これらの分析は、ＳＣ１で処理したβS細胞から増幅された345bpのＤＮＡ断片は一部がBsu36Iで切断され、全部ではないものの一部の染色体の突然変異が修正されたことを示している。電気泳動分離および蛍光色素SYBRTMグリーンによる染色後に３つのＤＮＡ断片の相対強度を比較することで定量的測定が得られた。染色したバンドをレーザーフルオロイメージャーを使って画像化し、相対レベルを算出した。変換効率はサイバーグリーン（cyber green）で染色したアガロースゲルをフルオロイメージャーで走査することにより定量化した。βSリンパ芽球細胞105個につきＳＣ１を2.5〜25.0pMの量で投与した実験は、βSからβAへの変換率が約40〜55%であることを示した（図4A）。
上記の方法により、ＣＭＶ ＳＣ２による鎌状突然変異の導入の効率も測定した。分析は、修正レベルが導入キメラ分子の最高レベル25nMで50%を超えたことを示したが、2.5nMでさえβグロビン遺伝子の30%の修正が観察された（図4B）。
ＰＣＲで増幅した345bp断片の直接配列決定をおこなってコード鎖中のＴからＡへの変化を確かめた。12nM/105細胞より高い濃度のキメラ分子でトランスフェクトしたβS細胞からのＤＮＡサンプルでは、配列分析によるとβS突然変異の部位でＡおよびＴ残基がほぼ同量混じっていた。未処理のβS細胞からのＤＮＡはその位置にＴのみを含み、βA細胞からのＤＮＡはＳＣ１で処理したときＡのみを含んでいた。対照ＣＭＶ ＳＣ２でトランスフェクトしたβS細胞の処理はβグロビン遺伝子配列になんの変化も引き起こさなかった。しかし、ＳＣ２でトランスフェクトした正常細胞由来のＤＮＡは、予想された配列位置でのＴおよびＡ残基の混合により証明されたとおり、一部がβS変異型配列に変換されていた。
ＣＭＶの作用の特異性は、βグロビン遺伝子に90%以上の相同性を示す関連δグロビン遺伝子を配列決定することにより評価した。βおよびδグロビン遺伝子はＳＣ１の５bpＤＮＡのコアターゲッティング領域にわたり同一である。図３には２箇所の単一塩基の相違に下線が引いてある。ＳＣ２がδグロビン遺伝子を改変したか否かを調べるため、上記のようにＤＮＡ配列分析をおこなった。これらの結果から、βAグロビン配列ではＳＣ２により指令された変化が観察されたのに対して、δグロビン遺伝子にはＳＣ２ ＣＭＶにより何の変化も導入されなかったことが明らかになった。
実施例7.3.  ＨＳＣのβグロビン遺伝子に突然変異を起こさせるためのＣＭＶの実験的使用
材料および方法
幹細胞の単離および精製：  正常なボランティアに１日２回300μgのG-CSFを５日間皮下投与した。G-CSF治療の４日目と５日目に、彼らはCOBEスペクトラフェレーシスマシーンを使って４時間の幹細胞成分献血を受けた。Ficoll-Hypaque（密度1.077g/ml, Pharmacia）で密度勾配遠心（2000rpm, 10分, 室温）にかけて単核細胞を調製した。単球の大多数がプラスチックへの付着後に分離された（30分, 37℃, 5%CO2, 10% FBSを含むRPMI中）。プラスチックにゆるく付着している細胞を分離するためスワーリング（swirling）して細胞を回収し、PBSで３回洗浄した。この集団を100x106細胞／mlの濃度でPBS/1% BSA中のビオチン化マウス抗CD34抗体と共に室温で25分インキュベートした。抗体で処理した細胞をアビジンカラムに通し、このカラムを通過するものを分析用に集めた。次に、カラムをPBSで洗い、カラムに付着しているCD34+細胞を、カラムを圧搾することで回収した。最終純度をFACSで評価した。
細胞を熱不活性化10% FCSを含むRPMIに再懸濁し、24ウェルプレートに各ウェ
ルが１×105個の細胞を受け取るように１×105個／mlでまいた。示した量のキメラオリゴヌクレオチドを20μlの20mM HEPES（pH7.3）中のDOTAP ３μgと混合した。この混合物を氷上で15分インキュベートした後細胞に添加した。37℃,5%CO2で16時間後、細胞を回収し、ペレット化し、PBSで洗い、溶解バッファーで溶解した。
ＰＣＲ増幅および分析：  ＰＣＲでゲノムＤＮＡを増幅するため、それぞれPCO2（5'-TCCTAAGCCAGTGCCAGAAGA-3'（配列番号11））およびPCO5（5'-CTATTGGTCTCCTTAAACCTG-3'（配列番号12））およびExpand Taqポリメラーゼ（Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN）を用いて50μlの反応容量中で、94℃で30秒、52.5℃で30秒、72℃で30秒、を35サイクルおこなって345bpの断片を生成した。δ遺伝子座については、5'プライマーが5'-CTCACAAACCTAATGAAACCCTGC-3'（配列番号13）で、3'プライマーが5'-GAAAACAGCCCAAGGGACAG-3'（配列番号14）であり、94℃で30秒、59℃で30秒、72℃で30秒、を35サイクルおこなった。
ＰＣＲ産物をDde IまたはBSU36I制限エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）で消化し、1.2%アガロースゲル（1X TBE）に載せて電気泳動をおこなった。ゲルを暗室にて1:20,000サイバーグリーン系（FMC, Rockland, ME）を含む1X TBE 200ml中で20分染色し、フルオロイメージャー（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）で定量した。ＰＣＲ産物を水でQiaquick ＰＣＲ精製スピンカラム（Qiagen, Chatsworth, CA）にかけ、容量を５μlになるまで乾燥し、260nmのO.D.により分光分析的に濃度を測定した。ＤＮＡサンプル（30μg）の配列決定を自動Applied Biosystems Model 373A DNAシーケンシングシステム（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて直接おこなった。
オリゴヌクレオチドの合成および精製：  ABI 394 DNA/RNA合成機で1000Å広孔CPGを用いて0.2μmoleのスケールでキメラオリゴヌクレオチドを合成した。この構築物では、DNAホスホルアミダイト（Applied Biosystems）の環外アミン基は、アデニンおよびシチジンについてはベンゾイルで、グアニンについてはイソブチリルで保護する。2'-O-メチルRNAホスホルアミダイト（Glen Research, Sterling, VA）は、アデニンについてはフェノキシアセチル基で、グアニンについてはジメチルホルムアミジンで、シチジンについてはイソブチリルで保護する。合成後、エタノール：濃水酸化アンモニウム（１：３）中で20時間55℃にて加熱して塩基保護基を除去する。粗製のオリゴヌクレオチドはポリアクリルアミドゲルで精製し、サンプルを7M尿素および10%グリセロールと混合し、70℃に加熱し、7M尿素を含有する10%ポリアクリルアミドゲル上に載せる。ゲル電気泳動後、ＤＮＡバンドをUVシャドーイングにより可視化し、ゲルから切り出し、粉砕し、TEバッファー（10mM Tris-HClおよび1mM EDTA, pH7.5）中で振とうしながら一晩溶出した。ゲル片を含む溶出液は0.45μmスピンフィルター（Millipore, Bedford, MA）を通し、エタノールで沈殿させた。サンプルをさらにG-25スピンカラム（Boehringer-Mannheim）で脱塩したところ、精製オリゴヌクレオチドの95%以上が全長であるとわかった。
結果：  オリゴヌクレオチド取り込み実験において最初に、単離したCD34+富化集団を使用した。キメラ分子ＳＣ２をリポソーム製剤DOTAPと上記の条件下で混合した。ただし、オリゴヌクレオチドの5'末端に放射性タグを付けた。漸増量の標識および未標識オリゴヌクレオチドをリポソームと15分インキュベートした。次にこの混合物を細胞と６時間インキュベートし、その後細胞をPBSで十分に洗浄して非特異的結合を低減させた。細胞を遠心し、ペレット画分を0.2Mグリシン（pH4.5）で洗浄し、残りの非特異的結合を排除した。細胞ペレットの放射能をシンチレーション計数により測定した。キメラオリゴヌクレオチドは用量依存的様式で細胞により吸収された。我々の実験戦略はナノモル濃度に関心が集まっていたので、曲線を25nMを超えて延長することはしなかった。放射能標識キメラオリゴヌクレオチドの比活性および各細胞が等しく形質転換を受け入れるという仮定に基づくと、CD34+細胞集団の約50%までが基質でトランスフェクトされると概算される。各実験につき、放射能標識キメラ分子をDOTAPの非存在下で細胞と混合してバックグラウンドレベルを測定したところ、このレベルが0.05%を超えることはなかった。
βA遺伝子型をもつ２つの対立遺伝子を含有するCD34+富化細胞の集団を、種々の量のＳＣ２および３μg/mlのDOTAPでトランスフェクトした。上記のようにトランスフェクションの16時間後にゲノムＤＮＡを単離し、制限酵素多型および直接ＤＮＡシーケンシングによりβAからβSへの変換度を測定した。105個の細胞から単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅にかけ、２つのプライマーPCO2およびPCO5を用いて345bp断片を生成した。βA特異的配列は制限酵素Dde Iで切断されて192、108および45塩基対の３種の断片をもたらすが、βS配列は１回だけ切断されて、300bpと45bpの断片を生成するだろう。漸増レベルの未切断300bp断片がＳＣ２の漸増濃度の関数として観察され、βAからβSへの遺伝子型の変換を示す（図５）。キメラオリゴヌクレオチドの比較的低い濃度（600ng＝30nM x１ml）で50%の変換頻度が観察された。対照的に、完全な相補性でもってβA部位に対合するキメラ分子であるＳＣ１で処理した細胞には変換がまったく観察されなかった。
正常細胞内でのＤＮＡ配列変化（ＡからＴ）を確認するため、345bp断片の直接ＤＮＡシーケンシングを実施した。ホモ接合性βA対立遺伝子を含有するCD34+集団を上記のように23nMのＳＣ２でトランスフェクトした。ゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲ増幅し、サンプルを自動ＤＮＡシーケンシングにかけた。βA単独およびＳＣ１で処理したβAのＤＮＡ配列は両方ともＴを含んでいた。これに対して、ＳＣ２で処理したβA細胞のＤＮＡ配列は予想された位置でのＴからＡへの用量依存的変換を示した。ＳＣ２ ＣＭＶはβグロビン遺伝子のコード鎖と同一の（a）セグメントを含有する。ＳＣ５と称するＣＭＶはβグロビン遺伝子の非コード鎖の断片と同一の（a）セグメントを含んでいた。我々はＳＣ２とＳＣ５を用いて上記のようにトランスフェクション実験を繰り返した。図５に示す結果は、ＳＣ５が活性であるが、ＳＣ２ほど活性ではなく、20nM以下の濃度では明らかに不活性であることを示している。
ＳＣ２で処理しておいたβA細胞からのゲノムＤＮＡを、２つのδグロビン特異的プライマー、PCO6およびPCO7、を用いてＰＣＲ増幅した。野生型δグロビン配列だけが見いだされ、ＳＣ２ ＣＭＶはβグロビンに特異的であることが確認された。
配列表
（２）配列番号１の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：17塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号１
0004063326.tif 000004
（２）配列番号２の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：17塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号２
0004063326.tif 000005
（２）配列番号３の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号３
0004063326.tif 000006
（２）配列番号４の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号４
0004063326.tif 000007
（２）配列番号５の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号５
0004063326.tif 000008
（２）配列番号６の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：18塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号６
0004063326.tif 000009
（２）配列番号７の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号７
0004063326.tif 000010
（２）配列番号８の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号８
0004063326.tif 000011
（２）配列番号９の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：23塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号９
0004063326.tif 000012
（２）配列番号10の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号10
0004063326.tif 000013
（２）配列番号11の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号11
0004063326.tif 000014
（２）配列番号12の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号12
0004063326.tif 000015
（２）配列番号13の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：24塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号13
0004063326.tif 000016
（２）配列番号14の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号14
0004063326.tif 000017
（２）配列番号15の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：68塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：Ch1
（B）存在位置：1...68
（C）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号15
0004063326.tif 000018
（２）配列番号16の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：68塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：Ch2
（B）存在位置：1...68
（C）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号16
0004063326.tif 000019
（２）配列番号17の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：68塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：Ch3
（B）存在位置：1...68
（C）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号17
0004063326.tif 000020
（２）配列番号18の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：68塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：Dh1
（B）存在位置：1...68
（C）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号18
0004063326.tif 000021
（２）配列番号19の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：36塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（xi）配列の記載：配列番号19
0004063326.tif 000022
（２）配列番号20の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：68塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：SC1
（B）存在位置：1...68
（C）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号20
0004063326.tif 000023
（２）配列番号21の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：68塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：SC2
（B）存在位置：1...68
（C）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号21
0004063326.tif 000024
（２）配列番号22の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：68塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：SC3
（B）存在位置：1...68
（C）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号22
0004063326.tif 000025
（２）配列番号23の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：68塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：SC4
（B）存在位置：1...68
（C）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号23
0004063326.tif 000026
（２）配列番号24の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：68塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：SC5
（B）存在位置：1...68
（C）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号24
0004063326.tif 000027
（２）配列番号25の情報
（i）配列の特色
（A）配列の長さ：25塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：Delta
（B）存在位置：1...25
（C）他の情報：
（xi）配列の記載：配列番号25
0004063326.tif 000028
【図１】
0004063326.tif 000029
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0004063326.tif 000031
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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