(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトプロテインCの変異体であって、
ａ）該変異体のアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４に示すアミノ酸配列のAPC部分と1-10アミノ酸残基が相違しており、かつ
ｂ）該変異体のアミノ酸配列には、配列番号４のアミノ酸配列と比較してN-グリコシル化部位が少なくとも1個導入されており、該少なくとも1個のN-グリコシル化部位が、D214N、K251N、S252N、M338N、S336N+M338T、およびL386N+H388Tより成る群から選ばれる置換によって導入されている変異体。
【請求項２】
活性型である、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
該少なくとも1個の導入N-グリコシル化部位が、D214N、K251N、S252N、S336N+M338T、およびL386N+H388Tより成る群から選ばれる置換によって導入されている、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項４】
該少なくとも1個の導入N-グリコシル化部位が、D214N、K251N、S336N+M338T、およびL386N+H388Tより成る群から選ばれる置換によって導入されている、請求項３に記載の変異体。
【請求項５】
該少なくとも1個の導入N-グリコシル化部位が、D214N、K251NおよびL386N+H388Tより成る群から選ばれる置換によって導入されている、請求項４に記載の変異体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の変異体をコードしているヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項６に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のヌクレオチド配列または請求項７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項１から５のいずれかに記載の変異体、および製薬的に許容し得る担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１０】
敗血症を処置するための、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
敗血症を処置する医薬を製造するための、請求項１から５のいずれかに記載の変異体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、プロテインCのポリペプチド変異体と非ポリペプチド部分との新規なコンジュゲート体、係るコンジュゲート体を製造する手段および方法、係るコンジュゲート体を含む医薬組成物、ならびに医療、特に種々の凝固異常の治療のための医療における係るコンジュゲート体の使用に関する。本発明はさらに、本発明のコンジュゲート体におけるポリペプチド部に関する。
【０００２】
（背景技術）
血液凝固は、様々な血液成分または因子の複雑な相互作用で構成されるプロセスであって、これは最終的にフィブリン凝塊を生成する。一般に、凝固「カスケード」に参加する血液成分は、プロ酵素またはチモーゲン、即ちアクティベーターの作用によって活性型に変換される、酵素的に不活性な蛋白である。血液凝固の調節は、主として活性化プロテインC（APC）により成し遂げられるプロ凝固因子VaおよびVIIIaの蛋白分解的不活性化によって酵素的に達成される（Esmon, J Biol Chem 1989; 264; 4743-4746）。
【０００３】
プロテインCは、半減期がおよそ7時間のチモーゲンとして血漿中を循環するセリンプロテアーゼであり、血漿レベルは典型的には3-5mg/lの範囲である。これは461アミノ酸の一本鎖前駆体ポリペプチドとして肝臓でインビボ産生される。このポリペプチドは、a) 42アミノ酸シグナル配列の開裂；b) 二本鎖不活性チモーゲン（ジスルフィド橋を介して262アミノ酸重鎖に結合した155アミノ酸軽鎖）を生成するリジンおよびアルギニン残基（156位および157位）の開裂；c) 軽鎖のN末端領域に9個のγ-カルボキシグルタミン酸残基を生成する、軽鎖の9個のグルタミン酸残基のビタミンK依存性カルボキシ化；およびd) 4個の部位における炭水化物の結合（1個は軽鎖、そして3個は重鎖において）、を包含する複数の翻訳後修飾を受ける。最後にこの二本鎖チモーゲンは、重鎖のN末端（158-169位）でのドデカペプチド（活性化ペプチド）の除去によって活性化され、活性化プロテインC（APC）を生成する。
【０００４】
プロテインCは、内皮細胞の管腔表面にあるトロンボモジュリンと複合体形成したトロンビンによる限定プロテオリシスによって活性化される。上に説明したように、活性化は重鎖N末端から小さな12アミノ酸ペプチド（活性化ペプチドと称する）を遊離させる。APCは血漿中でおよそ15分間の半減期を持つ。
【０００５】
その補助因子プロテインSの存在下でAPCは第VaおよびVIIIa因子を蛋白分解的に不活性化し、それによりトロンビンの生成を低下させる（Esmon, Thromb Haemost 1993; 70; 29-35）。プロテインSは、別の血漿蛋白C4b結合蛋白と可逆的に結合して循環する。遊離のプロテインSのみがAPCの補助因子として働く。C4b結合蛋白は急性相の反応体であるため、この蛋白の血漿レベルは多くの疾病において甚だしく変動し、したがってプロテインC系の抗凝固活性に影響を及ぼす。
【０００６】
ヒトプロテインCをコードしている遺伝子は、染色体2q13-q14にマッピングされており（Patracchini et al., Hum Genet 1989; 81; 191-192）、11kbに及び、そしてコード領域（エキソンIIないしIX）と、エキソンIを含む5'非翻訳領域を含んでいる。エキソンIIないしIXがコードしている蛋白ドメインは、第IXおよびX因子といった他のビタミンK依存凝固蛋白との、かなりの相同性を示す。エキソンIIはシグナルペプチドをコードしており、一方エキソンIIIはプロペプチドと、9個のGlu残基を含む38アミノ酸配列をコードしている。このプロペプチドは、Glu残基をカルシウムイオンと結合できるジカルボン酸（Gla）に変換する（この工程は燐脂質結合とプロテインCの抗凝固活性にとって必要である）カルボキシラーゼのための結合部位を含んでいる（Cheung et al., Arch Biochem Biophys 1989; 274; 574-581）。エキソンIV、VおよびVIは、それぞれ短い連結配列と2個のEGF様ドメインをコードしている。エキソンVIIは、トロンビンによるプロテインＣの活性化後に遊離される12アミノ酸活性化ペプチドを含むドメイン、および、開裂除去された時に成熟二本鎖型の該蛋白を生成するジペプチド156-157の両者をコードしている。
【０００７】
ヒトプロテインCの完全なアミノ酸配列はFoster et al., PNAS. USA 1986; 82; 4673-4677により報告されており、シグナルペプチド、プロペプチド、軽鎖、重鎖および活性化ペプチドを含んでいる。
【０００８】
プロテインCは内皮細胞蛋白レセプター（EPCR）に結合する。APCのEPCRへの結合はAPCが第VaおよびVIIIa因子を不活性化できなくさせ、一方プロテインCのEPCRへの結合は、トロンビン-トロンボモジュリン複合体によるプロテインCの活性化速度を増大させるように見受けられる。これらの相互作用の生理的重要性は現在のところ分かっていない。プロテインCのEPCRへの結合は、燐脂質に依存しない様式でGlaドメインの存在に厳密に依存しているようである（Esmon et al., Haematologica 1999; 84; 363-368）。
【０００９】
APCは血漿中でプロテインCインヒビターならびにα-1-抗トリプシンおよびα-2-マクログロブリンによって阻害される。
【００１０】
ヒトAPCの実験的三次元構造は2.8Å分解能で決定され、Mather et al., EMBO J 1996; 15; 6822-6831により報告された。彼等はGlaドメイン無しの形のAPCのX線構造を報告している。この構造は共有結合したインヒビターを含んでいる（D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、PPACK）。
【００１１】
現在プロテインCはモノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーにより生成されるプロトロンビン濃縮物から単離される。さらに、プロテインCは哺乳動物細胞または修飾プロテインCからの発現により組換え産生される。
【００１２】
APCは遺伝的および後天性プロテインC欠損症の治療に使用され、そして、幾つかの型のループス、卒中または心筋梗塞後、静脈血栓症後、汎発性血管内凝固症候群（DIC）、敗血症性ショック、肺塞栓のような塞栓、骨髄移植のような移植、火傷、妊娠、大手術／外傷および成人呼吸窮迫症候群（ARDS）の患者において抗凝固剤としての使用が示唆されている。
【００１３】
組換えAPCはEli Lilly and Coにより生産され、敗血症の治療（Bernard et al., N Engl J Med(2001), 344, pp.699-709）のための第III相治験が近年終了した。重篤な敗血症の患者に24μg/kg/hの用量で輸液として計96時間投与した。
【００１４】
しかしながら、半減期が短いため、APCの所望の治療または予防効果に到達しこれを維持するためには、比較的高用量および頻回投与が必要となる。その結果、充分な用量調節はこれを獲得するのが困難であり、また、高レベルAPCの頻回の静脈内投与の必要性は問題があり且つ高価である。
【００１５】
長い循環半減期を持つ分子ならば必要な投与回数が減り、ことによると増強した治療効果を伴う、より適当な治療的APCレベルを提供するかも知れない。
【００１６】
APCの循環半減期は、例えば腎クリアランスの低下、蛋白分解的分解の低下、または阻害の低下の結果として増大し得る。これは、例えば、該蛋白に腎クリアランスの低下を付与し、そして／または該蛋白との物理的接触から蛋白分解酵素またはインヒビターを効果的にブロックすることのできる、非ポリペプチド部分（例えばPEGまたは炭水化物）とAPCとのコンジュゲーションによって達成できる。さらにこれは、プロテインC分子を、これが依然として活性でありそれでいて該蛋白へのインヒビターの結合をブロックするように突然変異させることによっても達成できる。
【００１７】
PEG化した野生型APCはJP8-92294に記載されている。
WO91/09960は、プロテインCの重鎖部分に修飾を含むハイブリッド蛋白を開示している。
【００１８】
WO01/59084は、10、11、12、32、194、195、228、149、254、302または316位にある少なくとももう一つの置換と組み合わせた置換D167F+D172Kを含むプロテインC変異体を記載している。WO01/59084に開示のこの変異体は、増大した抗凝固活性を有すると述べられている。
【００１９】
WO98/44000は増大したアミド分解活性を持つプロテインC変異体を広範に記載している。
【００２０】
EP0323149は、重鎖に以下の突然変異を持つプロテインCのチモーゲン型を記載している：D167F/G/Y/W。このような変異体はトロンビンによる活性化に対して増大した感受性を有すると述べられている。
【００２１】
WO00/66754は、194、195、228、249、254、302または316位に本来存在する残基の置換が、野生型APCに比してヒト血中でのAPCの半減期の増大を導くと報告した。WO00/66754に開示のこの変異体は本発明の範囲内ではない。
【００２２】
WO99/63070はプロテインCのC末端切除型を記載している。
EP0946715は、プロテインCのGlaドメインが、他のビタミンK依存性ポリペプチド、例えば第VII因子、第X因子およびプロトロンビン由来のGlaドメインに置換されているキメラプロテインCポリペプチドを報告した。
【００２３】
WO99/20767およびWO00/66753は、Glaドメインに修飾を含むビタミンK依存性ポリペプチド変異体を開示している。
【００２４】
US5453373は、変化したグリコシル化パターンおよび変化した活性化領域、例えばN313QおよびN329Qを有するヒトプロテインC誘導体を開示している。US5453373に開示のこの変異体は本発明の範囲内ではない。
【００２５】
US5460953は、1またはそれ以上の天然に存在するグリコシル化部位が除去されるように改変された、プロテインCのチモーゲン型をコードしているDNA配列を開示している。より具体的には、US5460953は変異体N97Q、N248Q、N313QおよびN329Qを開示している。US5460953に開示のこの変異体は本発明の範囲内ではない。上に述べた先行技術文献のいずれに開示された変異体も、本発明の範囲内ではない。
【００２６】
US5270178は、I 171が除去され且つAspがAsnに置換されている特別のプロテインC変異体を目的とするものである。
【００２７】
US5041376は、輸送可能な蛋白の機能部位またはエピトープを同定および保護するための方法に関するものであって、ここではさらなるN連結グリコシル化部位が導入されている。
【００２８】
US5766921は、ヒト血漿またはα1-抗トリプシンによる不活性化に対する抵抗性が増大しているプロテインC変異体を目的とするものであって、ここでは重鎖が、対応する牛重鎖由来の置換を含んでいる。
【００２９】
WO01/57193は、一方の突然変異が10、11、32または33位にあり、他方が194、195、228、249、254、392または316位にある、二重の突然変異を含むプロテインC変異体を報告している。
【００３０】
WO01/36462は、所望により10および／または11位の置換と組み合わせた12位の置換を含むプロテインC変異体に関するものである。
【００３１】
WO00/26354は、アレルギー誘発性を低下させたグリコシル化蛋白変異体を調製する方法を目的とするものである。
【００３２】
WO00/26230は、免疫原性を低下させた蛋白変異体を選択する方法を目的とするものである。
【００３３】
前駆体型を包含するヒト野生型プロテインCのDNA配列および対応アミノ酸配列は、特にUS4775624およびUS4968626に開示されている。
【００３４】
上に明示した特許／特許出願のいずれに開示される変異体も、本発明の範囲内には無い。
【００３５】
（発明の簡単な説明）
本発明は、プロテインCのポリペプチド変異体と非ポリペプチド部分との新規なコンジュゲート体、係るコンジュゲート体を製造する手段および方法、係るコンジュゲート体を含む医薬組成物、ならびに医療、特に種々の凝固異常の治療のための医療における係るコンジュゲート体の使用に関するものである。本発明はさらに、本発明に係るコンジュゲート体のポリペプチド部に関するものである。
【００３６】
したがって第一の態様では、本発明は、該非ポリペプチド部分のための結合基を含む、少なくとも1個の導入されたそして／または少なくとも1個の除去されたアミノ酸残基の点で親プロテインCポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を含むプロテインCポリペプチドに共有結合した、少なくとも１個の非ポリペプチド部分を含むコンジュゲート体に関するものである。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は親プロテインCポリペプチドの変異体に関するものであり、この変異体はD172、D189、S190、K191、K192、K193、D214、E215、S216、K217、K218、L220、V243、V245、S250、K251、S252、T253、T254、D255、L296、Y302、H303、S304、S305、R306、E307、K308、E309、A310、R312、T315、F316、V334、S336、N337、M338、I348、L349、D351、R352、E357、E382、G383、L386、L387およびH388より成る群から選ばれる位置に置換を含むが、但し、この置換はT254S、T254A、T254H、T254K、T254R、T254N、T254D、T254E、T254G、T254Q、Y302S、Y302A、Y302T、Y302H、Y302K、Y302R、Y302N、Y302D、Y302E、Y302G、Y302Q、F316S、F316A、F316T、F316H、F316K、F316R、F316N、F316D、F316E、F316GおよびF316Qより成る群からは選ばれる置換ではない。
【００３８】
さらに別の態様では、本発明は、本発明に係るコンジュゲート体のポリペプチド部に関するものである。
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、本発明に係るコンジュゲート体のポリペプチド部をコードしているヌクレオチド配列、本発明に係るポリペプチド変異体をコードしているヌクレオチド配列、本発明に係るヌクレオチド配列を含む発現ベクター、および本発明に係るヌクレオチド配列を含むまたは本発明に係る発現ベクターを含む宿主細胞に関するものである。
【００４０】
本発明のさらに別の態様は、本発明に係るコンジュゲート体または変異体を含む医薬組成物ならびに本発明に係るコンジュゲート体および変異体を製造し使用する方法に関するものである。
【００４１】
（発明の詳細な説明）
定義
本明細書および発明の文脈において、以下の定義を適用する：
「コンジュゲート体」(または互換的に「コンジュゲート化ポリペプチド」）という語は、1またはそれ以上のポリペプチドが1またはそれ以上の非ポリペプチド部分、例えばポリマー分子、親油性化合物、糖部分または有機誘導体形成物質と共有結合することにより形成される不均質（混成のまたはキメラの、という意味において）分子を指す意味である。好ましくは、このコンジュゲート体は関連する濃度および条件において可溶性、即ち血液のような生理的液体に可溶性である。本発明に係るコンジュゲート化ポリペプチドの例はグリコシル化ポリペプチドおよびPEG化ポリペプチドを包含する。
【００４２】
「共有結合する」または「共有結合した」という語は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド部分が相互に直接共有結合で連結しているか、または橋、スペーサーもしくはリンケージ部分（群）といった介在部分（群）を介して相互に間接的に共有結合で連結していることを意味する。
【００４３】
「非コンジュゲート化ポリペプチド」という語は、コンジュゲート体のポリペプチド部について使用できる。
【００４４】
「非ポリペプチド部分」という語は、アミノ酸モノマーで構成され互いにペプチド結合により連結しているペプチドポリマーとは異なる分子を意味し、この分子は本発明に係るポリペプチドの結合基とコンジュゲートすることができる。このような分子の好ましい例は、ポリマー分子、糖部分、親油性化合物または有機誘導体形成物質を包含する。本発明に係るコンジュゲートの文脈において使用する場合、この非ポリペプチド部分は該ポリペプチドの結合基を介して該コンジュゲート体のポリペプチド部に連結するという事が理解できるであろう。上に述べたように、この非ポリペプチド部分は、結合基に直接共有結合でき、または橋、スペーサーもしくはリンカー部分（群）といった介在部分（群）を介して結合基に間接的に共有結合することができる。
【００４５】
「ポリマー分子」という語は、2またはそれ以上のモノマーの共有結合によって形成される分子であって、ここで、そのポリマーがヒトアルブミンまたはその他の豊富な血漿蛋白である場合を除いて、このモノマーのいずれもアミノ酸残基ではない。「ポリマー」という語は「ポリマー分子」または「ポリマー性基」という語と互換的に使用できる。
【００４６】
「糖部分」という語は、インビボまたはインビトログリコシル化により該ポリペプチドに結合できる（その結果、グリコシル化ポリペプチドの形態のポリペプチドコンジュゲート体を生成する）、1またはそれ以上の単糖類残基を含む炭水化物含有分子を指す意味である。「インビボグリコシル化」という語は、インビボ、即ち該ポリペプチドの発現に使用されるグリコシル化を行う細胞における翻訳後プロセシングの間に、例えばN結合またはO結合グリコシル化によって起こる糖部分の結合を意味することを意図している。正確なオリゴ糖の構造は、大部分、問題となるグリコシル化を行う生物に依存する。「インビトログリコシル化」という語は、インビトロで引き起こされる合成的グリコシル化を指すことを意図しており、通常、ポリペプチドの結合基に対する糖部分の共有結合を含み、所望により架橋剤の使用を含む。インビボおよびインビトログリコシル化は後により詳細に論ずる。
【００４７】
「N-グリコシル化部位」は、配列N-X-S/T/C"［式中、Xはプロリン以外のアミノ酸残基であり、Nはアスパラギンであり、そしてS/T/Cはセリン、スレオニンまたはシステインのいずれかであり、好ましくはセリンまたはスレオニンであり、最も好ましくはスレオニンである］を有する。「O-グリコシル化部位」はセリンまたはスレオニン残基のOH基である。
【００４８】
「結合基」という語は、ポリマー分子、糖部分、親油性分子または有機誘導体形成物質といった非ポリペプチド部分を結合することのできる、ポリペプチドの官能基、特にポリペプチドのアミノ酸残基または炭水化物部分における官能基を指す意味である。有用な結合基およびそれらに適合する非ポリペプチド部分は下の表から明らかである。
【００４９】
0004071105.tif 000002
0004071105.tif 000003
【００５０】
インビボN-グリコシル化について「結合基」という語は、それがN-グリコシル化部位を構成するアミノ酸残基群を示すという普通でない態様で使用する。N-グリコシル化部位にあるアスパラギン残基はグリコシル化の際に糖部分が結合するにもかかわらず、このような結合は、N-グリコシル化部位に他のアミノ酸残基が存在しない限り起こらない。
【００５１】
したがって、非ポリペプチド部分が糖部分でありコンジュゲーションがN-グリコシル化によって達成される場合、目的ポリペプチドのアミノ酸配列の変化に関係して用いられる「非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基」という語は、機能的N-グリコシル化部位がそのアミノ酸配列に導入されるか、または該配列から除去されるように、N-グリコシル化部位を構成する1またはそれ以上のアミノ酸残基が変化を受けねばならないという意味であると理解すべきである。
【００５２】
アミノ酸名および原子名（例えば、CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、C、など）は、IUPAC命名法に基づくProtein DataBank（PDB)(www.pdb.org）による定義に従って使用する（IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides（残基名、原子名など）、Eur.J.Biochem., 138, 9-37(1984)およびEur.J.Biochem., 152, 1(1985)に記載のその補正）。
【００５３】
「アミノ酸残基」という語は、アラニン（AlaまたはA）、システイン（CysまたはC）、アスパラギン酸（AspまたはD）、グルタミン酸（GluまたはE）、フェニルアラニン（PheまたはF）、グリシン（GlyまたはG）、ヒスチジン（HisまたはH）、イソロイシン（IleまたはI）、リジン（LysまたはK）、ロイシン（LeuまたはL）、メチオニン（MetまたはM）、アスパラギン（AsnまたはN）、プロリン（ProまたはP）、グルタミン（GlnまたはQ）、アルギニン（ArgまたはR）、セリン（SerまたはS）、スレオニン（ThrまたはT）、バリン（ValまたはV）、トリプトファン（TrpまたはW）およびチロシン（TyrまたはY）残基より成る群に含まれるアミノ酸残基を指す意味である。
【００５４】
アミノ酸の位置／置換を特定するために使用する用語を以下のように例示する：与えられたアミノ酸配列においてK174とは、配列番号2または4に示すアミノ酸配列において位置番号174がリジン残基によって占有されていることを示す。K174Sとは、この174位のリジン残基がセリン残基に置換されていることを示す。二者択一の置換は「／」で示し、例えば、K174S/Tは、174位のリジン残基がセリン残基またはスレオニン残基のいずれかで置換されていることを意味する。複数の置換は「＋」で示し、例えば、D172N+K174Sは、172位のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換され、且つ174位のリジン残基がセリン残基に置換されていることを意味する。さらなるアミノ酸残基の挿入は以下のやり方で示す：K174の後へのアラニン残基の挿入はK174KAで示す。アミノ酸残基の除去は星印で示す。例えば、174位のリジン残基の除去はK174*で示す。別途記載の無い限り、本明細書中で行うアミノ酸残基の番号付けは配列番号2または4のアミノ酸配列に比較して行う。
【００５５】
特定の突然変異に関連して使用する「異なる」または「とは異なる」という語は、特記したアミノ酸相違とは別にさらなる相違が存在し得ることを意図している。例えば、非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基の除去および／または導入に加えて、プロテインCポリペプチドは、係るアミノ酸残基の導入／除去に関係しない他の置換、挿入または除去を含むことができる。したがって、非ポリペプチド部分のための結合部位を除去および／または導入することを目的とする、本明細書に開示するアミノ酸変化に加えて、本発明に係るポリペプチドコンジュゲート体のアミノ酸配列は、所望により、結合部位の導入または除去に関係する必要のないその他の変化、即ち他の置換、挿入または除去を含み得ることが理解できるであろう。これらは、例えば1またはそれ以上のアミノ酸残基によるNおよび／またはC末端の切除、または、Nおよび／またはC末端への1またはそれ以上の余分の残基の付加、例えばN末端へのメチオニン残基の付加、ならびに「同類アミノ酸置換」、即ち、類似の性質を持つアミノ酸、例えば小型アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸および芳香族アミノ酸、の群内で行われる置換、を包含する。
【００５６】
本発明における同類置換の例は特に下の表に列挙した群から選択できる。
0004071105.tif 000004
【００５７】
本明細書の文脈で使用する「前駆体プロテインC」という語は、プロテインCのDNAコード化型を指し、即ちこれは、配列番号2に示す、シグナルペプチド（残基-42ないし-1）、軽鎖（残基1-155）、Lys-Argジペプチド（残基156-157）および、活性化ペプチド（残基158-169）を包含する重鎖（158-419）を包含する。
【００５８】
「二本鎖チモーゲンプロテインC」という語は、分泌された不活性型のプロテインCを指し、これは、配列番号4に示す、軽鎖（残基1-155）および、活性化ペプチド（158-169）を包含する重鎖（158-419）を包含する。
【００５９】
「一本鎖チモーゲンプロテインC」という語は不活性型のプロテインCを指し、これは、配列番号4に示す、軽鎖（残基1-155）、活性化ペプチド（158-169）を包含する重鎖（158-419）、およびLys-Argジペプチド（残基156-157）を包含する。
【００６０】
「チモーゲンプロテインC」という語を使用する場合は常に、一本鎖型と二本鎖型両方のチモーゲンプロテインCを指す。
【００６１】
「活性化プロテインC」、「活性化ヒトプロテインC」、「APC」または「ヒトAPC」という語は活性化チモーゲンについて使用し、配列番号4の軽鎖（残基1-155）および重鎖（活性化ペプチド無し）を包含する。後者のアミノ酸配列、即ち活性化プロテインCのアミノ酸配列は、時に本明細書では「配列番号4に示すアミノ酸配列のAPC部分」と称する。
【００６２】
「プロテインC」という語は、上に述べた全ての型のプロテインC、即ち「前駆体プロテインC」型、「チモーゲンプロテインC」型（一本鎖型および二本鎖型）および「活性化プロテインC型」を包含する。
【００６３】
「親」という語は、本発明に従って改良すべき分子を指す意味である。本発明によって修飾しようとする親ポリペプチドはいかなるプロテインCポリペプチドであってもよく、したがっていかなる起源、例えばヒト以外の哺乳動物起源であってもよいが、この親ポリペプチドはヒトプロテインC（即ち、ヒト前駆体プロテインC、ヒトチモーゲンプロテインCまたはヒト活性化プロテインC）またはその断片もしくは変異体であるのが好ましい。
【００６４】
断片は完全長ヒトプロテインC配列の一部、例えばそのC末端またはN末端切除型である。親プロテインCポリペプチド断片の具体例は、C末端の1-15アミノ酸残基が切除された、そして／またはN末端の1-3アミノ酸残基が切除されたヒトプロテインCを包含する。
【００６５】
上に述べたように、親プロテインCポリペプチドはヒトプロテインCの変異体であってもよい。ヒトプロテインCの変異体の具体例は、例えばN末端へのメチオニン残基の付加、および上に論じた1またはそれ以上の同類アミノ酸置換を含む変異体を包含する。変異体のその他の例は、プロテインCのGlaドメイン中の1またはそれ以上のアミノ酸が置換されている、またはプロテインCのGlaドメイン全体が別のGlaドメイン、例えばプロテインSのGlaドメインに置換されているヒトプロテインC変異体を包含する。
【００６６】
（親ポリペプチドの)「変異体」という語は、1またはそれ以上のアミノ酸残基、通常1-15アミノ酸残基（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミノ酸残基）、例えば1-10アミノ酸残基または1-5アミノ酸残基がその親ポリペプチドと相違しているポリペプチドの包含を意図している。
【００６７】
「突然変異」および「置換」という語は本明細書中互換的に使用する。
「ヌクレオチド配列」という語は、2またはそれ以上のヌクレオチド分子の連続部分を指す意味である。このヌクレオチド配列は、ゲノム、cDNA、RNA、半合成もしくは合成起源、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。
【００６８】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」という語は一般に、例えばUS4683195に記載のような、所望ヌクレオチド配列をインビトロで増幅する方法を指す。一般にPCR法は、鋳型核酸と選択的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、プライマー伸長合成の反復循環を含む。
【００６９】
「細胞」、「宿主細胞」、「セルライン」および「細胞培養」は本明細書中、互換的に使用し、係る用語は全て細胞の増殖または培養から生ずる子孫を包含すると解するべきである。
【００７０】
「形質転換」および「トランスフェクション」は互換的に使用し、DNAを細胞中に導入するプロセスを指す。
【００７１】
「作動可能に連結した」とは、酵素的ライゲーションまたはその他の手段によって、その配列の正常機能が遂行されるような相互の相対的配置で、2またはそれ以上のヌクレオチド配列が共有結合していることを指す。例えば、プレ配列または分泌リーダーをコードしているヌクレオチド配列は、これがポリペプチドの分泌に参加するプレ蛋白として発現されるならば、そのポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列と作動可能に連結している。プロモーターまたはエンハンサーは、これがその配列の転写に影響を及ぼすならば、コード化配列と作動可能に連結している。リボソーム結合部位は、これが翻訳を促進するように位置しているならば、コード化配列と作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」とは、連結しているヌクレオチド配列が連続している事、そして分泌リーダーの場合、連続し且つ読み取り相にある事を意味する。連結は都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成する。そのような部位が無い場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを標準組換えDNA法と共に使用する。
【００７２】
「導入」という語は主に、存在するアミノ酸残基の置換を意味することを意図しているが、付加的なアミノ酸残基の挿入をも意味する。
【００７３】
「除去する」という語は、除去しようとするアミノ酸残基の、別のアミノ酸残基への置換を意味することを意図しているが、除去しようとするアミノ酸残基の削除（置換無しで）をも意味する。
【００７４】
「機能的インビボ半減期」という語は通常の意味で使用し、即ち、そのポリペプチドまたはコンジュゲート体の生物活性の50%が依然として身体／標的臓器に存在する時間、または、そのポリペプチドまたはコンジュゲート体の活性が初期値の50%である時間である。機能的インビボ半減期の測定の代替物として、「血清半減期」、即ち、浄化される前にそのポリペプチドまたはコンジュゲート体分子の50%が血漿または血流中に循環している時間を測定できる。血清半減期の測定はしばしば機能的インビボ半減期の測定よりも単純であり、血清半減期の大きさは通常、機能的インビボ半減期の大きさの良好な指標となる。血清半減期に代わる語には「血漿半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」および「クリアランス半減期」が包含される。該ポリペプチドまたはコンジュゲート体は、1またはそれ以上の網内系（RES）、腎臓、脾臓もしくは肝臓の働きによって、または組織因子、SECレセプターもしくはその他のレセプター仲介排泄によって、または特異的もしくは非特異的蛋白分解によって浄化される。通常、クリアランスは、大きさ（糸球体濾過のカットオフに比した）、電荷、結合している炭水化物鎖、およびその蛋白に対する細胞レセプターの存在に依存する。保持すべき機能性は、通常、抗凝固、アミド分解またはレセプター結合活性から選択する。機能的インビボ半減期および血清半減期は当分野で既知の任意の適当な方法によって測定できる。
【００７５】
機能的インビボ半減期または血清半減期について使用する「増大した」という語は、該コンジュゲート体またはポリペプチドの関連半減期が、同等条件下で測定した、レファランス分子、例えばAPCの半減期に比して統計学的に有意に増大していることを示すために使用する。通常、機能的インビボまたは血清半減期は、該ポリペプチドのクリアランス、蛋白分解的分解および／または阻害が低下した場合に増大する。したがって、好ましいコンジュゲート体は、活性化型において、ヒトAPCに比して増大した機能的インビボ半減期または増大した血清半減期を有するようなコンジュゲート体である。特に好ましいコンジュゲート体は、該コンジュゲート体の血清半減期（または機能的インビボ半減期）とヒトAPCの血清半減期（または機能的インビボ半減期）の比が少なくとも1.25、より好ましくは少なくとも1.50、例えば少なくとも1.75、例えば少なくとも2、より好ましくは少なくとも3、例えば少なくとも4、例えば少なくとも5、最も好ましくは少なくとも6、例えば少なくとも7、例えば少なくとも8、少なくとも9または少なくとも10であるようなコンジュゲート体である。
【００７６】
本発明に係るポリペプチドまたはコンジュゲート体に関するクリアランス機構は、1またはそれ以上の網内系（RES）、腎臓、脾臓もしくは肝臓、レセプター仲介分解、または特異的もしくは非特異的蛋白分解を包含し得る。「腎クリアランス」という語はその通常の意味で使用し、腎臓によって、例えば糸球体濾過、尿細管排泄または尿細管除去によって起こる任意のクリアランスを示す。通常、腎クリアランスは、分子量、大きさ（糸球体濾過のカットオフに比した）、対称性、形状／硬直性および電荷を包含する該コンジュゲート体の物理的性質に依存する。通常、約67kDaの分子量が腎クリアランスのカットオフ値であると考えられる。腎クリアランスは任意の適当な検定、例えば確立されたインビボ検定によって測定できる。例えば、腎クリアランスは、標識した（例えば放射性標識または蛍光標識した）ポリペプチドコンジュゲート体を患者に投与し、この患者から集めた尿中の標識活性を測定することによって測定できる。腎クリアランスの低下はレファランス分子、例えばAPCと比較して決定する。
【００７７】
「活性」、「APC活性」または「活性化プロテインC活性」という語は、本発明に係るコンジュゲート体がその活性化型でAPCの本質的性質を保持することを示すことを意図している。
【００７８】
好適なインビトロAPC活性検定（「APCアミド分解検定」と称する）を本明細書の実施例9に記載する。したがって、より詳細には、本発明に係るコンジュゲート体は、活性化型の該コンジュゲート体が、本明細書の実施例9に記載の「APCアミド分解検定」で試験した場合にヒトAPC活性の少なくとも10%の活性を持っているならば、「APC活性」を有するとして分類する。好ましくは、該コンジュゲート体はヒトAPC活性の少なくとも20%、例えばヒトAPC活性の少なくとも30%を有し、より好ましくは該コンジュゲート体はヒトAPC活性の少なくとも40%、例えばヒトAPC活性の少なくとも50%を有し、さらに好ましくは該コンジュゲート体はヒトAPC活性の少なくとも60%、例えばヒトAPC活性の少なくとも70%を有し、最も好ましくは該コンジュゲート体はヒトAPC活性の少なくとも80%、例えばヒトAPC活性の少なくとも90%を有する。極めて興味深い態様では、本明細書の実施例9に記載の「APCアミド分解検定」で試験した場合、該コンジュゲート体は、ヒトAPCの活性と本質上同じまたはより高い活性を有する。本発明に係るコンジュゲート体と野生型ヒトAPCは同一条件下で検定すべきであり、即ち、本明細書の実施例9に記載のように検定する際、両者の蛋白濃度は等しくすべきであるという事が理解できるであろう。
【００７９】
別法として、「APC活性」は本明細書の実施例10に記載の「APC凝固検定」という名称のインビトロ検定で測定できる。より詳細には、本発明に係るコンジュゲート体は、活性化型の該コンジュゲート体が、本明細書の実施例10に記載の「APC凝固検定」で試験した場合にヒトAPC抗凝固活性の少なくとも5%の抗凝固活性を持っているならば、「APC活性」を有するとして分類する。好ましくは、該コンジュゲート体はヒトAPC抗凝固活性の少なくとも10%、例えばヒトAPC抗凝固活性の少なくとも20%、例えば少なくとも30%の抗凝固活性を有し、より好ましくは該コンジュゲート体はヒトAPC抗凝固活性の少なくとも40%、例えばヒトAPC抗凝固活性の少なくとも50%を有し、さらに好ましくは該コンジュゲート体はヒトAPC抗凝固活性の少なくとも60%、例えばヒトAPC抗凝固活性の少なくとも70%を有し、最も好ましくは該コンジュゲート体はヒトAPC抗凝固活性の少なくとも80%、例えばヒトAPC抗凝固活性の少なくとも90%を有する。極めて興味深い態様では、本明細書の実施例10に記載の「APC凝固検定」で試験した場合、該コンジュゲート体は、ヒトAPCの抗凝固活性と本質上同じまたはより高い活性を有する。典型的なPC活性の範囲の例は、例えばヒトAPC抗凝固活性の5-75%、例えばヒトAPC抗凝固活性の10-50%、例えばヒトAPC抗凝固活性の10-40%である。本発明に係るコンジュゲート体と野生型ヒトAPCは同一条件下で検定すべきであり、即ち、本明細書の実施例10に記載のように検定する際、両者の蛋白濃度は等しくすべきであるという事が理解できるであろう。
【００８０】
「α-1-抗トリプシンによる不活性化に対する耐性の増大」および「ヒト血漿による不活性化に対する耐性の増大」という語はそれぞれ、α-1-抗トリプシンまたはヒト血漿により、ヒトAPCよりも低い程度で阻害される本発明に係るコンジュゲート体を意味することを主に意図している。開発研究の初期段階で当業者が有効且つ好ましいコンジュゲート体を選択できるように、本発明者等は、問題のコンジュゲート体の性能を最初に評価するために当業者が実施できる、適切な予備試験を開発した。即ち、「α-1-抗トリプシン不活性化検定」（本明細書の実施例11に記載）、「ヒト血漿不活性化検定I」（本明細書の実施例12に記載）および「ヒト血漿不活性化検定II」（本明細書の実施例13に記載）を使用して、選択したコンジュゲート体の潜在能力を最初に評価できる。これらの試験の第一、第二、第三または全てを利用して、α-1-抗トリプシンおよび／またはヒト血漿のいずれかによる不活性化に抵抗する、選択されたコンジュゲート体の適当性を評価でき、その原理は、もし或るコンジュゲート体がα-1-抗トリプシンもしくはヒト血漿のいずれかまたは両者により強く阻害されたならば、通常、さらなる試験を実施する必要はないという事である。
【００８１】
故に、本明細書に記載の目的にとって特に興味深いコンジュゲート体は、インヒビター濃度16.6μMを用いて本明細書の実施例11に記載の「α-1-抗トリプシン不活性化検定」で試験した場合、活性化型において少なくとも20%の残存活性を持っているコンジュゲート体である。好ましくは、該コンジュゲート体は少なくとも30%の残存活性、例えば少なくとも40%の残存活性を持ち、より好ましくは該コンジュゲート体は少なくとも50%の残存活性、例えば少なくとも60%の残存活性を持ち、さらに好ましくは該コンジュゲート体は少なくとも70%の残存活性、例えば少なくとも75%の残存活性を持ち、最も好ましくは該コンジュゲート体は少なくとも80%の残存活性、例えば少なくとも85%の残存活性を持つ。
【００８２】
別法として、または上記試験に加えて、選択したコンジュゲート体の適当性は「ヒト血漿不活性化検定I」で試験できる。したがって、本明細書に記載の目的にとって特に興味深いコンジュゲート体は、本明細書の実施例12に記載の「ヒト血漿不活性化検定I」で試験した場合、活性化型において少なくとも20%の残存活性を持っているコンジュゲート体である。好ましくは、該コンジュゲート体は少なくとも30%の残存活性、例えば少なくとも40%の残存活性を持ち、より好ましくは該コンジュゲート体は少なくとも50%の残存活性、例えば少なくとも60%の残存活性を持ち、さらに好ましくは該コンジュゲート体は少なくとも70%の残存活性、例えば少なくとも75%の残存活性を持つ。
【００８３】
別法として、または上記試験に加えて、選択したコンジュゲート体の適当性は「ヒト血漿不活性化検定II」で試験できる。したがって、本明細書に記載の目的にとって特に興味深いコンジュゲート体は、本明細書の実施例13に記載の「ヒト血漿不活性化検定II」で試験した場合、活性化型の該コンジュゲート体のインビトロ半減期とヒトAPCのインビトロ半減期の比が少なくとも1.25、好ましくは少なくとも1.5、例えば少なくとも2、より好ましくは少なくとも3、例えば少なくとも4、さらに好ましくは少なくとも5、例えば少なくとも6、最も好ましくは少なくとも7、例えば少なくとも8、特に少なくとも9、例えば少なくとも10であるコンジュゲート体である。
【００８４】
「低下した免疫原性」という語は、同等条件下で測定した場合、そのコンジュゲート体が、レファランス分子、例えば野生型ヒトAPCまたは野生型ヒトプロテインCよりも或る程度低い免疫反応を生ずる事を指す事を意図している。免疫反応は細胞または抗体仲介反応であってよい（免疫原性のさらなる定義については、例えば、Roitt: Essential Immunology(8th Edition, Blackwell)を参照されたい）。通常、低下した抗体反応性が、低下した免疫原性の指標である。低下した免疫原性は、当分野で既知の任意の適当な方法を例えばインビボまたはインビトロで使用して測定できる。
【００８５】
「その側鎖の少なくとも25%が表面に露出している」、および「その側鎖の少なくとも50%が表面に露出している」という語は、算出などを詳細に記載した実施例1を参考に定義される。
【００８６】
本発明に係るコンジュゲート体
本発明に係るコンジュゲート体は、改良プロテインC分子の開発のための全体的に新しい戦略の所産である。より具体的には、非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基を除去および／または導入することにより、該ポリペプチドを、選択した非ポリペプチド部分とのコンジュゲーションに対して感受性をより高くし、コンジュゲーションパターンを最適化し（例えばプロテインC分子表面の非ポリペプチド部分の最適な分布および数を確保する）、そしてコンジュゲートさせようとする結合基のみが該分子に存在することを確実にするよう、特に適合させることが可能となり、そしてそれにより、APC活性および、今日得られるプロテインC分子に比してさらに1またはそれ以上の改良された性質を有する新しいコンジュゲート体分子を得ることが可能となる。例えば、選択した非ポリペプチドのための結合基を含むアミノ酸残基の総数が最適レベルよりも増加または減少した場合、このコンジュゲート体の腎クリアランスは、コンジュゲーションにより達成した該分子の形態、大きさおよび／または電荷の変化のため、典型的には著しく低下する。さらに、本発明者等は、ヒト血漿または或る種のインヒビター、例えばα-1-抗トリプシンによる不活性化が著しく低下するように、該コンジュゲート体のポリペプチド部の結合基に対する非ポリペプチド部分の結合を設計できることを見出した（下記参照）。
【００８７】
非ポリペプチド部分のための結合基を含む、除去または導入するアミノ酸残基は、選択した非ポリペプチド部分の性質に基づいて、そして殆どの例では、ポリペプチドと非ポリペプチド部分の間のコンジュゲーションを達成する方法に基づいて選択する。例えば、非ポリペプチド部分がポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキシド由来分子といったポリマー分子である場合、結合基を含むアミノ酸残基はリジン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、およびチロシンより成る群から選ぶことができ、好ましくはシステインおよびリジン、とりわけリジンである。非ポリペプチド部分が糖部分である場合、結合基は例えばインビボグリコシル化部位、好ましくはN-グリコシル化部位である。
【００８８】
非ポリペプチド部分のための結合基を、本発明に従うプロテインCポリペプチドに導入しまたはそこから除去しようとする場合には常に、修飾すべきポリペプチドの位置を以下のように選択するのが好都合である：
【００８９】
その位置は好ましくはプロテインCポリペプチドの表面に位置し、より好ましくは、その側鎖の25%以上が表面に露出しているアミノ酸残基、例えばその側鎖の50%以上が表面に露出しているアミノ酸残基によって占有されている。このような位置は、本明細書の方法の欄に記載のようにヒト野生型APC分子の3D構造の分析に基づいて同定されている。さらに、野生型ヒトプロテインCに対しホモローガスなアミノ酸配列を含む非ヒトAPCポリペプチド（その変異体を包含する）中のホモローガスな位置を、それぞれの配列の適切な並置または3D構造によって容易に決定できる。
【００９０】
結合基の最適な分布を決定するために、該ポリペプチド表面に位置するアミノ酸残基間の距離を、該ポリペプチドの3D構造に基づいて算出する。より詳細には、係る結合基を含むアミノ酸残基のCB間の距離、または、アミノ酸残基の官能基（リジンではNZ、アスパラギン酸ではCG、グルタミン酸ではCD、システインではSG）と、結合基を含む別のアミノ酸残基のCBとの距離を決定する。グリシンの場合、CBの代わりにCAを使用する。本発明に係るコンジュゲート体のポリペプチド部では、いかなる当該距離も、不均質なコンジュゲーションを回避または減少させるため、好ましくは8Å以上、特に10Å以上である。
【００９１】
例えば本明細書の後の項に記載するように、本発明に従って変化させるべきアミノ酸残基の総数は、（親プロテインC分子と比較して）典型的には15を超えない。導入すべきアミノ酸残基の正確な数および型は特に、所望の性質およびコンジュゲーションの程度に依存する（例えば、非ポリペプチド部分の実体、該ポリペプチドにコンジュゲートさせるためには幾つの非ポリペプチド部分が望ましいまたは可能であるか、ポリペプチドコンジュゲーションを遂行すべきまたは回避すべき場所、など）。好ましくは、本発明に係るコンジュゲート体のポリペプチド部または本発明に係るポリペプチドは、配列番号4に示すアミノ酸配列と、1-15アミノ酸残基が、例えば1-8または2-8アミノ酸残基が、例えば1-5または2-5アミノ酸残基が相違しているアミノ酸配列を含む。したがって、通常、本発明に係るコンジュゲート体のポリペプチド部またはポリペプチドは、配列番号4に示すアミノ酸配列と、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミノ酸残基が相違するアミノ酸配列を含んでいる。
【００９２】
好ましくは、本発明に係るコンジュゲート体は、増大した機能的インビボ半減期、増大した血清半減期、増大したインヒビターに対する耐性、低下した腎クリアランス、低下した免疫原性および／または増大したバイオアベイラビリティーを包含する、野生型ヒトAPCに比して改善された1またはそれ以上の性質を持っている。本発明に係るコンジュゲート体は、注射間のより長い持続時間、より少ない蛋白の投与、およびより少ない副作用を包含する、現在利用可能なAPC生成物を上回る幾つかの利点を提供すると思われる。さらに、低下した抗凝固活性は、APCコンジュゲート体の抗炎症効果を維持しつつ出血のリスクを減らすことにとって有益となり得る。この事は、該コンジュゲート体が延長した血漿半減期を有する場合特に重要となり得る。これらの新たな性質は、抗凝固活性に比して抗炎症効果を増強し、より有効且つ安全な治療を可能にするに相違ない。
【００９３】
典型的には、本発明に係るコンジュゲート体は、少なくとも約67kDa、好ましくは少なくとも約70kDaの分子量を持つが、より低い分子量でも低下した腎クリアランスを生じ得る。PEGのようなポリマー分子、または導入したグリコシル化部位は、該コンジュゲート体の分子量の調節にとって特に有用であることが判明している。
【００９４】
本発明に係るコンジュゲート体は、上に述べたプロテインCポリペプチドの望ましい性質の1またはそれ以上を改善するために、充分な数もしくは型の非ポリペプチド部分を含む。通常、本発明に係るコンジュゲート体は、1-10の第一非ポリペプチド部分、特に1-8または1-5の第一非ポリペプチド部分を含む。
【００９５】
本発明に係るコンジュゲート体はさらに、前記第一非ポリペプチド部分とは異なる第二非ポリペプチド部分を少なくとも1個含み得る。例えば本発明に係るコンジュゲート体は、1-10の第二非ポリペプチド部分、特に1-8または1-5の第二非ポリペプチド部分を含み得る。例えば、第一非ポリペプチド部分が糖部分、特にインビボで結合した糖部分である場合、目的とする第二非ポリペプチド部分はPEG型のポリマーとすることができる。インビボ結合糖部分は、該ポリペプチドの天然に存在するインビボグリコシル化部位、または導入された部位に結合できる。
【００９６】
本発明に係る非常に興味深い態様では、非ポリペプチド部分をプロテインCの活性部位の領域に導入するが、その原理は、プロテインC分子のこの特別な領域への非ポリペプチド部分（群）の導入は、実質的なAPC活性を維持しつつAPCへのインヒビター（例えばα-1-抗トリプシン）の結合を損なうという事である。一方この事は、肝臓のレセプターによるインヒビター／APC複合体の排除が回避されまたは少なくとも低下するため、このようなコンジュゲート体が、野生型ヒトAPCに比して著しく長い半減期を示すという結果を有する。プロテインCの活性部位領域に位置するアミノ酸残基の選択は、本明細書の実施例2に詳細を記載する。
【００９７】
本明細書中使用する「活性部位領域」という語は、本明細書の実施例2を参考に定義し、そこでは活性部位領域を構成する実際のアミノ酸残基を示す。
【００９８】
本発明の特に好ましい態様では、非ポリペプチド部分のための結合基を、その側鎖の少なくとも25%が表面に露出しているアミノ酸残基によって占有されている（本明細書の実施例3を参照されたい）活性部位領域の位置に導入し、即ち、非ポリペプチド部分のための結合基を、D172、D189、S190、K191、K192、K193、D214、E215、S216、K217、K218、L220、V243、V245、N248、S250、K251、S252、T253、T254、D255、L296、Y302、H303、S304、S305、R306、E307、K308、E309、A310、K311、R312、N313、R314、T315、F316、V334、S336、N337、M338、I348、L349、D351、R352、E357、E382、G383、L386、L387およびH388 (H211およびC384は除く）より成る群から選ばれる位置に導入する。好ましくは、導入する結合基は糖部分のための結合基、特にインビボN-グリコシル化部位である（「非ポリペプチド部分が糖部分である場合の本発明に係るコンジュゲート体」と題した部分を参照されたい）。
【００９９】
非ポリペプチド部分が糖部分である場合の本発明に係るコンジュゲート体
上に説明したように、好ましい態様では、本発明は、少なくとも1個の導入されたグリコシル化部位を含むコンジュゲート体、具体的には親プロテインCポリペプチド、特に配列番号4に示すアミノ酸配列またはその変異体と少なくとも1個の導入されたグリコシル化部位という点で相違するアミノ酸配列を含むプロテインCポリペプチドに共有結合したインビボN-グリコシル化部位を含むコンジュゲート体、に関する。
【０１００】
好ましくは、グリコシル化部位は、アミノ酸残基であってその側鎖の少なくとも25%が表面に露出している、例えばその側鎖の少なくとも50%が表面に露出している該アミノ酸残基、によって占有されている位置に導入する。このようなアミノ酸残基は本明細書の実施例1において同定している。「アミノ酸残基の側鎖の少なくとも25%（または少なくとも50%）が表面に露出している」という語をインビボN-グリコシル化部位の導入に関連して使用する場合、この語は、糖部分が実際に結合する位置におけるアミノ酸側鎖の表面アクセス可能性を指すという事を理解すべきである。多くの場合、糖部分が実際に結合するアスパラギン残基に関して+2位にセリンまたはスレオニン残基を導入する必要があり（無論、この位置が既にセリンまたはスレオニン残基で占有されていない限り）、セリンまたはスレオニン残基を導入した場合、これらの位置は覆い隠される、即ちそれらの側鎖の25%未満が表面に露出するようになる。
【０１０１】
APCへの、インヒビター、例えばα-1-抗トリプシンの結合を低下させるため、グリコシル化部位は、好ましくは活性部位領域（本明細書の実施例2に定義）内部であって且つその側鎖の少なくとも25%が表面に露出しているアミノ酸残基によって占有されている位置に導入する。即ち、導入されるインビボN-グリコシル化部位は好ましくは、D172N+K174S、D172N+K174T、D189N+K191S、D189N+K191T、S190N+K192S、S190N+K192T、K191N+K193S、K191N+K193T、K192N+L194S、K192N+L194T、K193N+A195S、K193N+A195T、D214N、D214N+S216T、E215N+K217S、E215N+K217T、S216N+K218S、S216N+K218T、K217N+L219S、K217N+L219T、K218N+L220S、K218N+L220T、L220N+R222S、L220N+R222T、V243N+V245S、V243N+V245T、V245N+P247S、V245N+P247T、S250N、S250N+S252T、K251N、K251N+T253S、S252N、S252N+T254S、T253N+D255S、T253N+D255T、T254N+N256S、T254N+N256T、D255N+D257S、D255N+D257T、L296N、L296N+T298S、Y302N、Y302N+S304T、H303N、H303N+S305T、S304N+R306S、S304N+R306T、S305N+E307S、S305N+E307T、R306N+K308S、R306N+K308T、E307N+E309S、E307N+E309T、K308N+A310S、K308N+A310T、E309N+K311S、E309N+K311T、A310N+R312S、A310N+R312T、R312N+R314S、R312N+R314T、T315N+V317S、T315N+V317T、F316N+L318S、F316N+L318T、V334N、V334N+S336T、S336N+M338S、S336N+M338T、V339S、V339T、M338N、M338N+S340T、I348N+G350S、I348N+G350T、L349N+D351S、L349N+D351T、D351N+Q353S、D351N+Q353T、R352N+D354S、R352N+D354T、E357N+D359S、E357N+D359T、G383N+G385S、G383N+G385T、L386N+H388S、L386N+H388T、L387N+N389S、L387N+N389T、H388N+Y390SおよびH388N+Y390Tより成る群から選択する。
【０１０２】
より好ましくは、導入するインビボN-グリコシル化部位は、S190N+K192S、S190N+K192T、K191N+K193S、K191N+K193T、D189N+K191S、D189N+K191T、D214N、D214N+S216T、K217N+L219S、K217N+L219T、K251N、K251N+T253S、S252N、S252N+T254S、T253N+D255S、T253N+D255T、Y302N、Y302N+S304T、S305N+E307S、S305N+E307T、E307N+E309S、E307N+E309T、S336N+M338S、S336N+M338T、V339S、V339T、M338N、M338N+S340T、G383N+G385S、G383N+G385T、L386N+H388SおよびL386N+H388Tより成る群から選択する。
【０１０３】
さらに好ましくは、導入するインビボN-グリコシル化部位は、D189N+K191T、K191N+K193T、D214N、K251N、S252N、T253N+D255T、Y302N、S305N+E307T、S336N+M338T、V339T、M338N、G383N+G385Tより成る群から選択し、そして最も好ましくは、導入するインビボN-グリコシル化部位は、D189N+K191T、K191N+K193T、D214N、T253N+D255T、S305N+E307T、S336N+M338T、M338N、G383N+G385TおよびL386N+H388Tより成る群から選択する。特に好ましい態様では、導入するN-グリコシル化部位は、D189N+K191T、D214NおよびL386+H388Tより成る群から選択する。
【０１０４】
上に説明したように、α-1-抗トリプシンおよび／またはヒト血漿による不活性化に対する増大した耐性は、本明細書に開示の「α-1-抗トリプシン不活性化検定」、「ヒト血漿不活性化検定I」または「ヒト血漿不活性化検定II」によって測定および評価できる。
【０１０５】
本発明に係るコンジュゲート体は単一のインビボグリコシル化部位を含むことができる（97、248、313および329位に既に存在するグリコシル化部位に加えて）。しかしながら、親ポリペプチド表面のプロテアーゼ開裂部位を効果的に保護するため、そして／またはインヒビターの結合を効果的に低下させるため、該コンジュゲート体のポリペプチド部は、1またはそれ以上の上記リストのいずれかに記載の置換によって導入された、1以上のインビボグリコシル化部位、特に2-5個の（さらなる）インビボグリコシル化部位、例えば2、3、4または5個の（さらなる）インビボグリコシル化部位を含むことがしばしば望ましい。
【０１０６】
さらに、上記のインビボN-グリコシル化部位修飾を少なくとも1個有するポリペプチドのアミノ酸配列は、上記の「システイン残基に結合した非ポリペプチド部分を有する本発明に係るコンジュゲート体」なる標題の項で明記したように、少なくとも1個のシステイン残基が導入されているという点で、または、上記の「非システイン残基に結合した非ポリペプチド部分を有する本発明に係るコンジュゲート体」なる標題の項で明記したように、少なくとも1個の非システイン残基が導入されているという点で、親ポリペプチドのアミノ酸配列と相違しているかもしれない。
【０１０７】
さらに本発明に係るコンジュゲート体のポリペプチド部は、有利であることが分かっているさらなる突然変異を含むことができる。例えば、上に論じたグリコシル化部位に加えて、該コンジュゲート体のポリペプチド部は、L194、A195、L228、Y249およびこれらの組み合わせより成る群から選ばれる位置での置換、特にL194S、L194S+T245SおよびL194A+T254Sを含むことができる（WO00/66754を参照されたい）。好ましいさらなる置換のその他の例は、蛋白分解を受け易いことが分かっている位置またはその近傍に1またはそれ以上のグリコシル化部位（群）を置換または導入することを包含する。蛋白分解を受け易いことが分かっている１つの位置は、野生型ヒトAPCのH10である（WO98/48822を参照されたい）。
【０１０８】
本発明のこの態様に従うコンジュゲート体を製造するために、該ポリペプチドは、糖部分をそのグリコシル化部位に結合させることのできる、グリコシル化を行う宿主細胞で発現されるか、さもなければインビトログリコシル化を受けねばならないことが理解できるであろう。グリコシル化を行う宿主細胞の例は下の「糖部分とのカップリング」なる標題の項に記載する。
【０１０９】
非ポリペプチド部分がシステイン残基に結合している本発明に係るコンジュゲート体
本発明のもう一つの態様では、本発明は、親プロテインCポリペプチド、特に配列番号4に示すアミノ酸配列またはその変異体と、少なくとも1個のシステイン残基が導入されたそして／または除去された、特に導入されたという点で相違するアミノ酸配列を含むプロテインCポリペプチドに共有結合した、少なくとも1個の非ポリペプチド部分、特にポリマー分子を含むコンジュゲート体に関するものである。したがって、本発明の興味深い態様では、この非ポリペプチド部分は結合基としてシステインを有する。好ましくは、このシステイン結合基は、その側鎖の少なくとも25%が表面に露出している、例えばその側鎖の少なくとも50%が表面に露出しているアミノ酸残基によって占有されている位置に導入する。このようなアミノ酸残基を本明細書の実施例1に明記する。これらの位置の中で特に興味深いのは、親ポリペプチド中の、TまたはS残基、好ましくはS残基により占有されている位置である。これに従い、興味深いシステイン修飾コンジュゲート体は、システイン残基が、S3、S11、S12、T37、S42、S61、T68、S75、S77、S82、S99、S119、S153、S190、S216、S252、T253、T268、S270、S281、S304、S305、T315、S332、S336、S340、S367、およびS416より成る群から、そしてより好ましくは、S3、S11、S12、S42、S61、S75、S77、S82、S99、S119、S153、S190、S216、S252、S270、S281、S304、S305、S332、S336、S340、S367およびS416より成る群から選ばれる少なくとも1個の位置に導入されるコンジュゲート体である。
【０１１０】
上記と同様に（「非ポリペプチド部分が糖部分である本発明に係るコンジュゲート体」なる標題の項を参照されたい）、システイン残基は、好ましくは、活性部位領域内部（本明細書の実施例2に定義）にある位置、およびその側鎖の少なくとも25%が表面に露出しているアミノ酸残基（本明細書の実施例3に定義）によって占有されている位置に導入する。即ち、システイン残基は好ましくはD172、D189、S190、K191、K192、K193、D214、E215、S216、K217、K218、L220、V243、V245、S250、K251、S252、T253、T254、D255、L296、Y302、H303、S304、S305、R306、E307、K308、E309、A310、R312、T315、F316、V334、S336、V339、M338、I348、L349、D351、R352、E357、G383、E385、L386、L387およびH388より成る群から選ばれる位置に導入する。より好ましくは、システイン残基はD189、S190、K191、D214、K217、K251、S252、T253、Y302、S305、E307、S336、V339、M338、G383およびL386より成る群から選ばれる位置に導入する。
【０１１１】
この態様に従うコンジュゲート体のポリペプチド部は典型的には、1-10個の導入されたシステイン残基、特に1-5または1-3個の導入されたシステイン残基、例えば1、2または3個の導入されたシステイン残基を含む。
【０１１２】
本発明のこの態様に従うコンジュゲート体の非ポリペプチド部分は、所定のコンジュゲーション法を用いる場合に結合基としてのシステイン残基を有する任意の分子であってよい（例えばポリマー部分、親油性基または有機誘導体形成物質）が、この非ポリペプチド部分は、ポリマー分子、例えば「ポリマー分子とのコンジュゲーション」なる標題の項に記載した任意の分子であることが好ましい。好ましくは、このポリマー分子は直鎖もしくは分枝ポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキシドより成る群から選ばれる。最も好ましくは、このポリマー分子はPEG、例えばVS-PEGである。ポリペプチドとポリマー間のコンジュゲーションは、任意の適当な方法、例えば「ポリマー分子とのコンジュゲーション」なる標題の項に記載のような方法によって、例えば一段階法または当該項で言及した段階的やり方によって達成できる。ポリペプチドがただ1個のコンジュゲート可能なシステイン残基を含む場合、これは、好ましくは、少なくとも約10kDaまたは少なくとも約15kDaの分子量、例えば約12kDa、約15kDaまたは約20kDaの分子量を持つ第一の非ポリペプチド部分に、直接コンジュゲートするか、または低分子量ポリマーを介して間接的にコンジュゲートする（WO99/55377に開示の通り）。コンジュゲート体が2またはそれ以上の第一非ポリペプチド部分を含む場合、通常これらの各々が約5kDa、約10kDaまたは約12kDaの分子量を有する。
【０１１３】
この態様に従うコンジュゲート体は少なくとも1個の第二非ポリペプチド部分、例えば1-10、1-8、1-5または1-3個の係る部分を含むことができる。第一非ポリペプチド部分がポリアルキレンオキシドまたはPEGから誘導したポリマーである場合、第二非ポリペプチド部分は好ましくは糖部分、特にインビボ結合した部分である。この糖部分は、親ポリペプチドに存在する1またはそれ以上の天然に存在するグリコシル化部位または導入されたグリコシル化部位に存在していてよい。好適な導入されたグリコシル化部位、特にN-グリコシル化部位は、「非ポリペプチド部分が糖部分である本発明に係るコンジュゲート体」なる標題の項に記載されている。
【０１１４】
さらに、本発明に係るコンジュゲート体のポリペプチド部は、有利であることが分かっているさらなる突然変異を含むことができる。例えば、上述の導入されたシステイン残基に加えて、該コンジュゲート体のポリペプチド部は、L194、A195、L228、Y249およびこれらの組み合わせより成る群から選ばれる位置における置換、特にL194S、L194S+T245SおよびL194A+T254Sを含むことができる（WO00/66754を参照されたい）。好ましいさらなる置換のその他の例は、蛋白分解を受け易いことが分かっている位置またはその近傍に1またはそれ以上のシステイン残基（群）を置換または導入することを包含する。蛋白分解を受け易いことが分かっている１つの位置は、野生型ヒトAPCのH10である（WO98/48822を参照されたい）。
【０１１５】
非ポリペプチド部分が非システイン部分に結合している、本発明に係るコンジュゲート体
本明細書の開示に基づき、当業者は、グリコシル化部位およびシステイン残基に関して上に説明したものと同じアプローチを用いて、その他の結合基を含むアミノ酸残基を、親ポリペプチド内への置換によって導入できる事を知るであろう。例えば、酸基を含む1またはそれ以上のアミノ酸残基（グルタミン酸またはアスパラギン酸）、チロシン、セリンまたはリジンを、上に論じた位置に導入できる（「非ポリペプチド部分が糖部分である、本発明に係るコンジュゲート体」および「非ポリペプチド部分がシステイン残基に結合している、本発明に係るコンジュゲート体」なる標題の項を参照されたい）。
【０１１６】
本発明に係るポリペプチド変異体
さらなる態様では、本発明は、親プロテインCポリペプチドの全体として新規な変異体に関するものである。この新規な変異体は本発明に係るコンジュゲート体の製造にとって重要な中間体化合物である。加えて、そして下の開示からそして本明細書に記載の実施例から明らかであるように、この変異体自身が興味深い性質を有する。
【０１１７】
したがって最も広い側面では、本発明は親プロテインCポリペプチドの新規な変異体に関するものであり、ここで該変異体は本発明に係るコンジュゲート体のポリペプチド部、より具体的にはAPC部分を構成する。本明細書に提供する実施例から自明であるように、1またはそれ以上のグリコシル化部位が導入されたものの利用されなかった幾つかの変異体は、特にα-1-抗トリプシンによる阻害に対する増大した耐性、およびヒト血漿による不活性化に対する増大した耐性に関して、興味深い性質を有することが判明した。これらの変異体は活性部位領域（本明細書の実施例2に定義の通り）に少なくとも1個の置換を含み、特にこれらは、活性部位領域に位置し且つその側鎖の少なくとも25%が表面に露出しているアミノ酸残基の置換を含む（本明細書の実施例3に定義の通り）。したがって、本発明のこの側面に従う好ましい変異体は、D172、D189、S190、K191、K192、K193、D214、E215、S216、K217、K218、L220、V243、V245、S250、K251、S252、T253、T254、D255、L296、Y302、H303、S304、S305、R306、E307、K308、E309、A310、R312、T315、F316、V334、S336、N337、M338、I348、L349、D351、R352、E357、E382、G383、L386、L387およびH388より成る群から選ばれる位置に置換を含み、但し、その置換はT254S、T254A、T254H、T254K、T254R、T254N、T254D、T254E、T254G、T254Q、Y302S、Y302A、Y302T、Y302H、Y302K、Y302R、Y302N、Y302D、Y302E、Y302G、Y302Q、F316S、F316A、F316T、F316H、F316K、F316R、F316N、F316D、F316E、F316GおよびF316Qより成る群からは選ばれない。
【０１１８】
活性部位領域に位置し、同時にその側鎖の少なくとも25%が表面に露出している上記の位置のリストから明らかなように、これらの位置のうちかなりの量が荷電アミノ酸残基で占有されている。プロテインCの、特に上に明記した領域の三次元構造を解析すると、少なくとも幾つかの荷電残基が互いに相互作用していることが観察できる。例えば、K251はD214と塩橋を形成すると考えられる。さらに、負に荷電したアミノ酸残基のクラスター（D214、E215およびE357）が存在することが分かる。いかなる特定の理論にも拘束されることなく、上に明記した領域内の荷電アミノ酸残基、またはこの領域内の荷電アミノ酸残基のうち少なくとも幾つかは、基質／インヒビターの捕捉および／または結合にとって重要であると考えられる。故に、本発明のこの側面に従う特に興味深いアミノ酸置換は、活性部位領域に位置し同時にその側鎖の少なくとも25%が表面に露出している荷電アミノ酸残基が、電荷を持たないアミノ酸残基、特に極性側鎖以外に電荷を持たないアミノ酸残基（Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、AsnまたはGln）で置換されているアミノ酸置換、および、活性部位領域に位置し同時にその側鎖の少なくとも25%が表面に露出している荷電アミノ酸残基が、逆の電荷を持つアミノ酸残基で置換されているアミノ酸置換、で構成されている。
【０１１９】
問題のアミノ酸残基の電荷が逆の電荷に変化しているアミノ酸置換の具体例は、D172K、D172R、D189K、D189R、K191D、K191E、K192D、K192E、K193D、K193E、D214K、D214R、E215K、E215R、K217D、K217E、K218D、K218E、K251D、K251E、D255K、D255R、R306D、R306E、E307K、E307R、K308D、K308E、E309K、E309R、R312D、R312E、D351K、D351R、R352D、R352E、E357K、E357R、E382KおよびE382R、例えばD214K、D214R、E215K、E215R、K251D、K251E、E357KおよびE357R、例えばD214K、D214R、K251DおよびK251Eを包含する。
【０１２０】
問題の荷電アミノ酸残基が極性側鎖を有するアミノ酸側鎖に置換されているアミノ酸置換のその他の具体例は、D172G/S/T/C/Y/N/Q、D189G/S/T/C/Y/N/Q、K191G/S/T/C/Y/N/Q、K192G/S/T/C/Y/N/Q、K193G/S/T/C/Y/N/Q、D214G/S/T/C/Y/N/Q、E215G/S/T/C/Y/N/Q、K217G/S/T/C/Y/N/Q、K218G/S/T/C/Y/N/Q、K251G/S/T/C/Y/N/Q、D255G/S/T/C/Y/N/Q、R306G/S/T/C/Y/N/Q、E307G/S/T/C/Y/N/Q、K308G/S/T/C/Y/N/Q、E309G/S/T/C/Y/N/Q、R312G/S/T/C/Y/N/Q、D351G/S/T/C/Y/N/Q、R352G/S/T/C/Y/N/Q、E357G/S/T/C/Y/N/QおよびE382G/S/T/C/Y/N/Q、例えばD214G/S/T/C/Y/N/Q、E215G/S/T/C/Y/N/Q、K251G/S/T/C/Y/N/QおよびE357G/S/T/C/Y/N/Q、例えばD214Q、E215Q、K251QおよびE357Q、特にK251Qを包含する。別の興味深い置換はK251N+T253Aである。
【０１２１】
興味深い置換のさらなる具体例は、「非ポリペプチド部分が糖部分である本発明に係るコンジュゲート体」および「非ポリペプチド部分がシステイン残基に結合している本発明に係るコンジュゲート体」なる標題の項に開示されている置換、特に、K251N、S252N、Y302NおよびS190+K192T、とりわけK251NおよびS252N、最も好ましくはK251Nを包含する。
【０１２２】
理解できるように、本発明に係るコンジュゲート体についての詳細および細目（例えば、プロテインCの活性化、置換の数、コンジュゲート体の調合、コンジュゲート体を使用できる適応、α-1-抗トリプシンおよびヒト血漿による不活性化に対する増大した耐性など）は、適宜、本発明の変異体の側面と同じまたは類似している。したがって、本発明に係るコンジュゲート体に関わる陳述および詳細は、本明細書に開示するプロテインC変異体に適宜必要な変更を加えて適用する。
【０１２３】
本発明に係るコンジュゲート体の非ポリペプチド部分
上記でさらに指摘したように、本発明に係るコンジュゲート体の非ポリペプチド部分は好ましくはポリマー分子、親油性化合物、糖部分（インビボグリコシル化による）および有機誘導体形成物質より成る群から選択する。これらの物質は全て該コンジュゲート体のポリペプチド部に望ましい性質、特に増大した機能的インビボ半減期および／または増大した血漿半減期を付与できる。該コンジュゲート体のポリペプチド部は通常ただ一つの型の非ポリペプチド部分とコンジュゲートするが、2またはそれ以上の異なる型の非ポリペプチド部分、例えばポリマー分子と糖部分、親油性基と糖部分、有機誘導体形成物質と糖部分、親油性基とポリマー分子などとコンジュゲートすることもできる。2またはそれ以上の異なる非ポリペプチド部分とのコンジュゲーションは同時にまたは連続的に実施できる。
【０１２４】
本発明に係るコンジュゲート体を製造する方法
以下の項「親油性化合物とのコンジュゲーション」、「ポリマー分子とのコンジュゲーション」、「糖部分とのコンジュゲーション」および「有機誘導体形成物質とのコンジュゲーション」において、特定の型の非ポリペプチド部分とのコンジュゲーションを記載する。一般に、本発明に係るポリペプチドコンジュゲート体は、適当な宿主細胞を該ポリペプチドを発現させる条件下に培養し、該ポリペプチドを回収する［ここで、a) 該ポリペプチドは少なくとも1個のN-またはO-グリコシル化部位を含み、且つ該宿主細胞はインビボグリコシル化を行うことのできる真核生物宿主細胞であり、そして／または、b) 該ポリペプチドはインビトロで非ポリペプチド部分とのコンジュゲーションに付される］ことによって生産できる。
【０１２５】
このコンジュゲーションは、結合した非ポリペプチド部分の数、係る分子の大きさおよび形態（例えば、それらが直鎖状であるか分枝状であるか）、ならびに該ポリペプチド中の結合部位に関して、最適な分子を産生するように設計すべきである。使用する非ポリペプチド部分の分子量は、例えば達成しようとする望ましい効果に基づいて選択できる。例えば、該コンジュゲーションの第一の目的が高分子量を持つコンジュゲート体（例えば腎クリアランスを低下させるため）を獲得することである場合、所望の分子量を得るために、できるだけ少ない高分子量非ポリペプチド部分をコンジュゲートさせるのが望ましい。高度の遮蔽を望む場合には、充分多数の低分子量非ポリペプチド部分を使用することによってこれが達成できる（例えば、約300Daないし約5kDaの分子量、例えば300Daないし2kDaの分子量を持つもの）。
【０１２６】
ポリマー分子とのコンジュゲーション
ポリペプチドとカップリングさせるポリマー分子は任意の適当なポリマー分子であってよく、例えば、天然または合成ホモポリマーまたはヘテロポリマー、典型的には、約300-100000Daの範囲、例えば約500-20000Da、より好ましくは約500-15000Daの範囲、さらに好ましくは約2-12kDaの範囲、例えば約3-10kDaの範囲の分子量を持つものであってよい。本明細書中で「約」という語を或る分子量に関連して使用する時、この「約」という単語は近似的な平均分子量を指し、所定のポリマー製造において、通常、幾らかの分子量のばらつきがあるという事実を反映している。
【０１２７】
ホモポリマーの例は、ポリオール（即ちポリ-OH）、ポリアミン（即ちポリ-NH2）およびポリカルボン酸（即ちポリ-COOH）を包含する。ヘテロポリマーは、異なるカップリング基、例えばヒドロキシ基およびアミン基を含むポリマーである。
【０１２８】
好適なポリマー分子の例は、ポリアルキレングリコール（PAG）を包含するポリアルキレンオキシド（PAO）、例えばポリエチレングリコール（PEG）およびポリプロピレングリコール（PPG）、分枝PEG、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリカルボン酸、ポリ-(ビニルピロリドン)、ポリエチレン-コ-マレイン酸無水物、ポリスチレン-コ-マレイン酸無水物、デキストラン（カルボキシメチルデキストランを包含する）、または、免疫原性を低下させそして／または機能的インビボ半減期および／または血清半減期を増大させるのに適当なその他任意の生体高分子より成る群から選ばれるポリマー分子を包含する。ポリマー分子の別の例は、ヒトアルブミンまたはその他の豊富な血漿蛋白である。一般に、ポリアルキレングリコールから誘導したポリマーは生体適合性であり、非毒性、非抗原性、非免疫原性であり、様々な水溶性を持ち、生体から容易に排泄される。
【０１２９】
PEGは、例えばデキストランのような多糖類と比較して架橋可能な反応基を殆ど持たないため、好ましいポリマー分子である。特に、一官能性PEG、例えばメトキシポリエチレングリコール（mPEG）は、そのカップリング化学が比較的単純である（ポリペプチド上の結合基とのコンジュゲートのためにただ1個の反応基が利用できる）ため、興味が持たれる。その結果、架橋の危険性が排除され、得られるポリペプチドコンジュゲート体がより均質となり、そしてポリマー分子とポリペプチドとの反応がより管理し易くなる。
【０１３０】
該ポリペプチドへのポリマー分子の共有結合を奏効させるため、ポリマー分子のヒドロキシ末端基は活性化型で、即ち反応性官能基（その例には、第一アミノ基、ヒドラジド（HZ）、チオール、スクシナート（SUC）、スクシンイミジルスクシナート（SS）、スクシンイミジルスクシンアミド（SSA）、スクシンイミジルプロピオナート（SPA）、スクシンイミジルブチラート（SBA）、スクシンイミジルカルボキシメチラート（SCM）、ベンゾトリアゾールカルボナート（BTC）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、アルデヒド、ニトロフェニルカルボナート（NPC）、およびトレシラート（TRES）が包含される）を伴って提供されねばならない。好適な活性化ポリマー分子は、例えばShearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA、またはPolyMASC Pharmaceuticals plc, UKから市販品が入手できる。
【０１３１】
別法として、このポリマー分子は例えばWO90/13540に開示のように、当分野で既知の常套法によって活性化できる。本発明に使用するための活性化した直鎖または分枝ポリマー分子の具体例は、Shearwater Polymers, Inc. 1997および2000カタログ（Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives、引用により本明細書の一部とする）に記載されている。
【０１３２】
活性化PEGポリマーの具体例は以下の直鎖PEG：NHS-PEG (例えば SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG、およびSCM-PEG)、およびNOR-PEG、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEGおよびMAL-PEG（そのmPEG型を包含する）、ならびに分枝PEG、例えばPEG2-NHS（そのmPEG型を包含する）、ならびにUS5932462およびUS5643575に開示のもの（いずれも引用により本明細書の一部とする）を包含する。さらに、以下の刊行物（引用により本明細書の一部とする）が有用なポリマー分子および／またはPEG化化学を開示している：US5824778、US5476653、WO97/32607、EP229108、EP402378、US4902502、US5281698、US5122614、US5219564、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO96/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140、WO96/40791、WO98/32466、WO95/06058、EP439508、WO97/03106、WO96/21469、WO95/13312、EP921131、US5736625、WO98/05363、EP809996、US5629384、WO96/41813、WO96/07670、US5473034、US5516673、EP605963、US5382657、EP510356、EP400472、EP183503およびEP154316。
【０１３３】
該ポリペプチドと活性化ポリマー分子とのコンジュゲーションは、例えば以下の参考文献（これらには適当なポリマー分子活性化法もまた記載されている）に記載のような任意の常套法を用いて実施する：R.F.Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S.Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Florida, USA; G.T.Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.。当業者は、使用する活性化法および／またはコンジュゲーション化学は、該ポリペプチドの結合基（その例はさらに上記に記載した）および該ポリマーの官能基（例えばアミン、ヒドロキシ、カルボキシ、アルデヒド、スルフヒドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンまたはハロアセタートである）に依存するということを知悉しているであろう。PEG化は、ポリペプチド上の利用できる全ての結合基とのコンジュゲーションに向けたものであってよく（即ち、ポリペプチドの表面に露出しているような結合基）、または、1またはそれ以上の特別な結合基、例えばUS5985265に記載のようなN末端アミノ基に向けたものであってもよい。さらに、コンジュゲーションは一段階で、または段階的に達成できる（例えばWO99/55377に記載のように）。
【０１３４】
PEG化は、結合するPEG分子の数、係る分子の大きさおよび形態（例えば、それらが直鎖状であるか分枝状であるか）、ならびに該ポリペプチド中の結合部位に関して、最適な分子を産生するように設計するという事が理解できるであろう。使用するポリマーの分子量は、例えば達成しようとする望ましい効果に基づいて選択できる。
【０１３５】
蛋白上のただ1個の結合基（例えばN末端アミノ基）とのコンジュゲーションに関して、このポリマー分子は直鎖状であっても分枝状であってもよいが、高い分子量、好ましくは約10-25kDa、例えば約15-25kDa、例えば約20kDaを有することが有利であるかも知れない。
【０１３６】
通常、このポリマーコンジュゲーションは、できるだけ多くの利用可能なポリマー結合基がポリマー分子と反応することをめざす条件の下で実施する。これは該ポリペプチドに比して適当なモル過剰のポリマーによって達成する。典型的には、ポリペプチドに対する活性化ポリマー分子のモル比は約1000-1まで、例えば約200-1まで、または約100-1までである。しかしながら幾つかの場合には、この比率は幾分低くてよく、最適反応を得るためには例えば約50-1、10-1、5-1、2-1または1-1までであってよい。
【０１３７】
本発明に従い、リンカーを介してポリマー分子をポリペプチドにカップリングさせることも考えられる。好適なリンカーは当業者に周知である。好ましい例は塩化シアヌルである（Abuchowski et al., (1977), J.Biol.Chem., 252, 3578-3581; US4179337; Shafer et al., (1986), J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed., 24, 375-378）。
【０１３８】
コンジュゲーションの後、残余の活性化ポリマー分子を当分野で既知の方法、例えば反応混合物への第一アミンの添加によりブロックし、生成した不活性化ポリマー分子を適当な方法で除去する。
【０１３９】
状況、例えば該ポリペプチドのアミノ酸配列、使用する活性化PEG化合物の性質、および、ポリペプチドに対するPEGのモル比を包含する個別的PEG化条件、に応じて、異なる程度のPEG化が達成でき、一般的にはポリペプチドに対するPEGの比率が高いほど高い程度のPEG化が得られるという事が理解できるであろう。しかしながら、与えられたいかなるPEG化プロセスから得られるPEG化ポリペプチドも、通常、PEG化の程度が僅かに異なる確率論的分布のポリペプチドコンジュゲート体を含むであろう。
【０１４０】
糖部分とのカップリング
1またはそれ以上のグリコシル化部位を含むプロテインC分子のインビボグリコシル化を達成するためには、該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、グリコシル化を行う真核生物発現宿主中に挿入せねばならない。この発現宿主細胞は、真菌（糸状菌または酵母）、昆虫もしくは動物細胞から、またはトランスジェニック植物細胞から選択できる。或る態様では、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えばCOS細胞、CHO細胞、BHK細胞またはHEK細胞、例えばHEK293細胞、または昆虫細胞、例えばSF9細胞、または酵母細胞、例えばS.cerevisiaeもしくはPichia pastoris、または後に述べる任意の宿主細胞である。
【０１４１】
ポリペプチドのアミノ酸残基への、糖部分（例えばデキストラン）のインビトロ共有結合もまた、例えばWO87/05330およびAplin et al., CRC Crit Rev. Biochem, pp.259-306, 1981に記載のように使用できる。蛋白におよびペプチドに結合したGln残基への糖部分またはPEGのインビトロカップリングは、トランスグルタミナーゼ（TGアーゼ）によって実施できる。トランスグルタミナーゼは、いわゆる架橋反応において、蛋白におよびペプチドに結合したGln残基へのドナーアミン基の移行を触媒する。このドナーアミン基は蛋白またはペプチドに結合していてよく、例えばLys残基中のε-アミノ基であるか、または小型または大型有機分子の一部であってよい。TGアーゼで触媒される架橋におけるアミノドナーとして機能する小型有機分子の例はプトレシン（1,4-ジアミノブタン）である。TGアーゼで触媒される架橋におけるアミノドナーとして機能する大型有機分子の例はアミン含有PEGである（Sato et al., 1996, Biochemistry 35, 13072-13080）。
【０１４２】
一般にTGアーゼは極めて特異的な酵素であり、蛋白表面に露出しているGln残基の全てが、アミノ含有物質に対するTGアーゼ触媒架橋に利用可能である訳ではない。それどころかTGアーゼ基質として本来機能するGln残基は殆ど無く、どのGln残基が良好なTGアーゼ基質であるかを決定する正確なパラメータは依然として未知である。したがって、蛋白をTGアーゼ触媒架橋反応を受け易くするためには、TGアーゼ基質として極めて良好に機能することが分かっているアミノ酸配列のつながりを、都合の良い位置に付加することがしばしば必要条件となる。幾つかのアミノ酸配列、例えばサブスタンスP、エラフィン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、α2-プラスミンインヒビター、α-カゼイン、およびβ-カゼインは、優れた天然のTGアーゼ基質であるかまたは同基質を含有することが知られている。
【０１４３】
有機誘導体形成物質とのコンジュゲーション
該ポリペプチドの共有結合的修飾は、該ポリペプチドの1またはそれ以上の結合基を有機誘導体形成物質と反応させることにより実施できる。好適な誘導体形成物質および方法は当分野で良く知られている。例えば、システイン残基は最も一般的にはα-ハロアセタート（および対応アミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応してカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成する。システイン残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(4-イミドゾイル)プロピオン酸、燐酸クロロアセチル、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロ水銀安息香酸、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応により誘導体化する。ヒスチジン残基はpH5.5-7.0でジエチルピロカルボナートとの反応により誘導体化するが、これは、この物質がヒスチジンの側鎖に対して比較的特異的であるためである。p-ブロモフェナシルブロミドもまた有用である。この反応は好ましくは0.1Mカコジル酸ナトリウム中pH6.0で実施する。リジンおよびアミノ末端残基は琥珀酸またはその他のカルボン酸無水物と反応する。これらの物質による誘導体化はリジン残基の電荷を逆転させる効果を持つ。α-アミノ含有残基を誘導体化するためのその他の適当な試薬は、イミドエステル類、例えばメチル ピコリンイミダート、燐酸ピリドキサル、ピリドキサル、水素化クロロ硼素、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソ尿素、2,4-ペンタンジオンおよびグリオキシラートを用いたトランスアミナーゼ触媒反応を包含する。アルギニン残基は1または幾つかの常套的試薬、なかでもフェニルグリオキサル、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpKaのため、アルカリ条件下で反応を実施する必要がある。
【０１４４】
さらに、これらの試薬はリジンの基およびアルギニングアニジノ基と反応することができる。カルボキシ側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（R-N=C=N-R'）[式中、RおよびR'は異なるアルキル基である］、例えば1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドとの反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０１４５】
親油性化合物とのコンジュゲーション
該ポリペプチドと親油性化合物は、直接またはリンカーを使用して相互にコンジュゲートさせることができる。この親油性化合物は、天然化合物、例えば飽和もしくは不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロチノイドもしくはステロイド、または合成化合物、例えばcarbon acid、アルコール、アミンおよび、1またはそれ以上のアルキル-、アリール-、アルケニル-またはその他の複数の不飽和化合物を伴うスルホン酸であってよい。所望によりリンカーを介したこのポリペプチドと親油性化合物の間のコンジュゲーションは、当分野で既知の方法、例えばBodanszkyのPeptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976およびWO96/12505に記載の方法に従って行うことができる。
【０１４６】
標識化ポリペプチドのコンジュゲーション
該ポリペプチドは標識、即ち典型的には1-30、例えば1-20のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列またはペプチドとの融合蛋白として発現され得る。迅速且つ容易な精製を可能にする他に、標識は、標識化ポリペプチドと非ポリペプチド部分間のコンジュゲーションを達成するための簡便な手段である。特に標識は、微量定量プレートまたは、その標識を介して標識化ポリペプチドを固定化できるその他の担体、例えば常磁性ビーズにおいてコンジュゲーションを達成するために使用できる。例えば微量定量プレートにおける標識化ポリペプチドとのコンジュゲーションは、その標識化ポリペプチドを培養ブロスから直接微量定量プレートに固定化し（原則として精製せずに）、コンジュゲーションに付すことができるという利点を有する。それにより、プロセス工程の総数（発現からコンジュゲーションまで）を減らすことができる。さらに、標識はスペーサー分子として機能し、コンジュゲートさせようとする固定化ポリペプチドに対するアクセス可能性の改善を確実とする。標識化ポリペプチドを用いるコンジュゲーションは、本明細書に開示する任意の非ポリペプチド部分に対するものであってよく、例えばPEGのようなポリマー分子に対するものであってよい。
【０１４７】
その標識が該ポリペプチドと共に発現され、適当な表面または担体材料上に固定化され得る限り、使用すべき具体的標識の実体は重要でない。幾つかの好適な標識が、例えばUnizyme Laboratories, Denmarkから商業的に入手できる。例えば、標識は以下の配列のうちいずれか：
His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln
または以下のもののうちいずれか：
EQKLI SEEDL (Mol. Cell. Biol. 5:3610-16, 1985に記載のC末端標識)
DYKDDDDK (CまたはN末端標識)
YPYDVPDYA
で構成され得る。
【０１４８】
上の標識に対する抗体は、例えばADI, Aves Lab and Research Diagnosticsから商業的に入手できる。
その後の、ポリペプチドからの該標識の開裂は、商業的に入手可能な酵素を使用して達成できる。
【０１４９】
本発明に係るポリペプチド変異体または本発明に係るコンジュゲート体のポリペプチド部を製造する方法
所望によりグリコシル化型であってよい、本発明に係るポリペプチド変異体または本発明に係るコンジュゲート体のポリペプチド部は、当分野で既知の任意の適当な方法によって製造できる。このような方法は、該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を組み立て、適当な形質転換またはトランスフェクトされた宿主でこの配列を発現することを包含する。好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物細胞のようなガンマカルボキシル化を行う宿主細胞である。しかしながら本発明に係るポリペプチドは、効率は低いものの、化学合成または化学合成の組み合わせまたは化学合成と組換えDNA技術の組み合わせによって製造できる。
【０１５０】
本発明に係るポリペプチド変異体またはコンジュゲート体のポリペプチド部をコードしているヌクレオチド配列は、親プロテインC、例えば配列番号2および4に示すアミノ酸配列を持つプロテインCをコードしているヌクレオチド配列を単離または合成し、その後このヌクレオチド配列を関連アミノ酸残基の導入（即ち挿入または置換）または除去（即ち削除または置換）を惹起するように変化させることにより組み立てることができる。
【０１５１】
該ヌクレオチド配列は、常法に従い位置指定突然変異誘発によって都合よく修飾する。別法として、該ヌクレオチド配列は化学合成によって製造でき、例えばオリゴヌクレオチド合成機を使用し［ここで、所望ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドを設計する］、そして好ましくはその組換えポリペプチドが産生されるであろう宿主細胞において好都合なコドンを選択することにより製造できる。例えば、所望ポリペプチドの一部をコードしている幾つかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、PCR、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応（LCR）によって組み立てることができる（Barany, PNAS 88:189-193, 1991）。個々のオリゴヌクレオチドは典型的には相補的組み立てのための5'または3'突出部を含んでいる。
【０１５２】
これに代わるヌクレオチド配列修飾法、例えばUS5093257に開示のようなホモローガス交差を含む方法、および、遺伝子シャフリング、即ち出発ヌクレオチド配列と比較した時に幾つかのヌクレオチド変化を有する新たなヌクレオチド配列を生ずる、2またはそれ以上のホモローガスヌクレオチド配列間の組換えを含む方法を、高スループットスクリーニングのためのポリペプチド変異体を調製するために利用できる。遺伝子シャフリング（DNAシャフリングとしても知られる）は、1またはそれ以上のサイクルのヌクレオチド配列の無作為断片化および再組み立て、ならびに所望の性質を持つポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を選択するためのその後のスクリーニングを含む。相同性に基づく核酸シャフリングを起こすために、ヌクレオチド配列の関連部分は、好ましくは少なくとも50%一致、例えば少なくとも60%一致、より好ましくは少なくとも70%一致、例えば少なくとも80%一致している。この組換えはインビトロまたはインビボで実施できる。
【０１５３】
好適なインビトロ遺伝子シャフリング法の例は、Stemmer et al. (1994), Proc.Natl.Acad.Sci.USA; vol.91, pp.10747-10751; Stemmer (1994), Nature, vol.370, pp.389-391; Smith (1994), Nature vol.370, pp.324-325; Zhao et al., Nat.Biotechnol. 1998, Mar; 16(3): 258-61; Zhao H. and Arnold,FB, Nucleic Acids Research, 1997, Vol.25. No.6 pp.1307-1308; Shao et al., Nucleic Acids Research 1998, Jan 15; 26(2): pp.681-83; およびWO95/17413に開示されている。
【０１５４】
好適なインビボシャフリング法の例はWO97/07205に開示されている。インビトロまたはインビボ組換えによる核酸配列の突然変異誘発のためのその他の技術は例えばWO97/20078およびUS5837458に開示されている。具体的なシャフリング技術の例は、「ファミリーシャフリング」、「合成シャフリング」および「in silicoシャフリング」を包含する。
【０１５５】
ファミリーシャフリングは、異なる種由来のホモローガス遺伝子のファミリーを1またはそれ以上のシャフリングおよびその後のスクリーニングまたは選択のサイクルに付すことを含む。ファミリーシャフリング技術は例えばCrameri et al. (1998), Nature, vol. 391, pp. 288-291; Christians et al. (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, pp. 259-264; Chang et al. (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, pp. 793-797;およびNess et al. (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, 893-896に開示されている。
【０１５６】
合成シャフリングは、例えば目的とするホモローガス遺伝子の配列並置に基づいて、部分重複する合成オリゴヌクレオチドのライブラリーを提供することを含む。合成によって作製したオリゴヌクレオチドの組換えを行い、得られた組換え核酸配列をスクリーニングし、所望によりさらなるシャフリングサイクルに利用する。合成シャフリング技術はWO00/42561に開示されている。
【０１５７】
in silicoシャフリングは、コンピューターシステムを用いて実施またはモデル作製するDNAシャフリング法を指し、それにより、核酸を物理的に操作する必要性を部分的にまたは全く回避できる。in silicoシャフリングのための技術はWO00/42560に開示されている。いったん組み立てられたならば（合成、位置指定突然変異誘発またはその他の方法による）、該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を組み替えベクター中に挿入し、所望の形質転換された宿主細胞でプロテインCを発現させるために必要な調節配列と作動可能に連結させる。
【０１５８】
全てのベクターおよび発現調節配列が等しく良好に機能して、本明細書に記載のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現する訳ではないという事は無論理解すべきである。全ての宿主が同じ発現系で等しく良好に機能する訳でもない。しかしながら当業者は、これらのベクター、発現調節配列および宿主から、不必要な実験を行うことなく選択を行うことができる。例えば、ベクターの選択において宿主を考慮せねばならず、何故ならそのベクターは宿主中で複製されねばならず、または染色体内部に統合され得るためである。ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、および該ベクターによりコードされている抗生物質マーカーのようなその他の蛋白の発現もまた考慮すべきである。発現調節配列の選択にあたり、様々な因子もまた考慮すべきである。これらは、例えば配列の相対的強さ、その被調節可能性、および、とりわけ可能性ある二次構造に関しての、該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列との適合性を包含する。宿主は、選択したベクターとの適合性、該ヌクレオチド配列がコードしている生成物の毒性、それらの分泌特性、該ポリペプチドを正しく折り畳む能力、発酵または培養要件、および該ヌクレオチド配列がコードしている生成物の精製し易さを考慮して選択すべきである。この組換えベクターは、自律複製ベクター、即ち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製とは独立しているベクター、例えばプラスミドであってよい。これに代わり該ベクターは、宿主細胞中に導入された時にその宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるベクターである。
【０１５９】
ベクターは好ましくは、本発明に係るポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の転写に必要なさらなるセグメントに作動可能に連結している、発現ベクターである。このベクターは典型的にはプラスミドまたはウイルスDNAから誘導する。本明細書に記載の宿主細胞での発現にとって好適な幾つかの発現ベクターは市販品が入手可能であるか、または文献に記載されている。真核生物宿主のための有用な発現ベクターは、例えば、SV40、牛乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現調節配列を含むベクターを包含する。具体的なベクターは、例えばpCDNA3.1(+)＼Hyg（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）およびpCI-neo（Stratagene, LaJola, CA, USA）である。酵母細胞のための有用な発現ベクターは、2μプラスミドおよびその誘導体、POT1ベクター（US4931373）、Okkels, Ann.New York Acad.Sci. 782, 202-207, 1996に記載のpJSO37ベクター、およびpPICZ A、BまたはC（Invitrogen）を包含する。昆虫細胞のための有用なベクターは、pVL941、pBG311 (Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986)）、pBluebac 4.5およびpMelbac（いずれもInvitrogenより入手可能）を包含する。細菌宿主のための有用な発現ベクターは、既知の細菌プラスミド、例えばpBR322、pET3aおよびpET12a（いずれもNovagen Inc., WI, USAより）を包含するE.coli由来のプラスミド、より広い宿主範囲のプラスミド、例えばRP4、ファージDNA、例えばファージλの多数の誘導体、例えばNM989、ならびにその他のDNAファージ、例えばM13および繊維状一本鎖DNAファージを包含する。
【０１６０】
本発明で使用するためのその他のベクターは、該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列のコピー数を増幅させるものを包含する。このような増幅可能なベクターは当分野で周知である。それらは、例えば、DHFR増幅によって（例えば、Kaufman、米国特許第4470461号、Kaufman and Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)を参照されたい) およびグルタミンシンセターゼ (「GS」) 増幅によって (例えばUS5122464およびEP338841を参照されたい）増幅させることのできるベクターを包含する。
【０１６１】
この組換えベクターはさらに、該ベクターを問題の宿主細胞中で複製することのできるDNA配列を含む。このような配列の例は（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）、SV40複製起点である。宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターを複製することのできる好適な配列は、酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1-3および複製起点である。
【０１６２】
さらにこのベクターは、選択マーカー、例えばその生成物が宿主細胞の欠陥を補完する遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）またはSchizosaccharomyces pombe TPI遺伝子（P.R.Russell, Gene 40, 1985, pp.125-130に記載されている）、または、薬物、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシンもしくはメソトレキサートに対する耐性を付与する遺伝子を含み得る。Saccharomyces cerevisiaeのためには、選択マーカーはura3およびleu2を包含する。糸状菌のためには、選択マーカーはamdS、pyrG、arcB、niaDおよびsCを包含する。
【０１６３】
「調節配列」という語は本明細書では、本発明に係るポリペプチドの発現にとって必要または有利な全ての成分を包含すると定義する。各々の調節配列は、該ポリペプチドをコードしている核酸配列に対して固有のまたは外来のものであってよい。係る調節配列は、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを包含するがこれらに限定される訳ではない。調節配列は、最小限、プロモーターを包含する。
【０１６４】
本発明には多岐にわたる発現調節配列を使用できる。このような有用な発現調節配列は、前記発現ベクターの構造遺伝子に付随する発現調節配列、および、原核生物もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが分かっている任意の配列、ならびにそれらの様々な組み合わせを包含する。
【０１６５】
哺乳動物細胞における転写を指令するための好適な調節配列の例は、SV40およびアデノウイルスの初期および後期プロモーター、例えばアデノウイルス2主要後期プロモーター、MT-1（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス即時初期プロモーター（CMV）、ヒト延長因子1α（EF-1α）プロモーター、ショウジョウバエ最小熱ショック蛋白70プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター、ヒトユビキチンC（UbC）プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、SV40またはアデノウイルスE1b領域ポリアデニル化シグナルおよびKozakコンセンサス配列（Kozak,M. J Mol Biol 1987 Aug 20;196(4):947-50）を包含する。
【０１６６】
哺乳動物細胞での発現を改善するため、該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の5'非翻訳領域に合成イントロンを挿入することができる。合成イントロンの一例は、プラスミドpCI-Neo（Promega Corporation, WI, USAより入手可能）由来の合成イントロンである。
【０１６７】
昆虫細胞での転写を指令するための好適な調節配列の例は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター、Autographa californica多角体病ウイルス塩基性蛋白プロモーター、バキュロウイルス即時初期遺伝子1プロモーターおよびバキュロウイルス39K遅延初期遺伝子プロモーター、ならびにSV40ポリアデニル化配列を包含する。酵母宿主細胞での使用のための好適な調節配列の例は、酵母α接合系のプロモーター、酵母燐酸トリオースイソメラーゼ（TPI）プロモーター、酵母解糖遺伝子またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーター、ADH2-4cプロモーター、ならびに誘導性GALプロモーターを包含する。糸状菌宿主細胞での使用のための好適な調節配列の例は、ADH3プロモーターおよびターミネーター、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ燐酸トリオースイソメラーゼまたはアルカリ性プロテアーゼ、A.niger α-アミラーゼ、A.nigerまたはA.nidulansグルコアミラーゼ、A.nidulansアセトアミダーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼまたはリパーゼをコードしている遺伝子から誘導したプロモーター、TPI1ターミネーターおよびADH3ターミネーターを包含する。細菌宿主細胞での使用のための好適な調節配列の例は、lac系、trp系、TACまたはTRC系のプロモーター、およびファージλの主要プロモーター領域を包含する。
【０１６８】
シグナルペプチドの存在または不在は、例えば、発現させようとするポリペプチドの産生に使用する発現宿主細胞（それが細胞内ポリペプチドであるか細胞外ポリペプチドであるか）および分泌を得ることが望ましいかどうかに依存するであろう。糸状菌での使用のためには、シグナルペプチドはAspergillus種のアミラーゼまたはグルコアミラーゼをコードしている遺伝子、Rhizomucor mieheiのリパーゼもしくはプロテアーゼまたはHumicola lanuginosaのリパーゼをコードしている遺伝子から誘導するのが好都合であるかも知れない。シグナルペプチドは好ましくはA.oryzae TAKAアミラーゼ、A.niger中性α-アミラーゼ、A.niger酸安定性アミラーゼ、またはA.nigerグルコアミラーゼをコードしている遺伝子から誘導する。昆虫細胞での使用のためには、シグナルペプチドは、昆虫遺伝子（WO90/05783を参照されたい）、例えばLepidopteran manduca sexta脂肪動員ホルモン前駆体（US5023328を参照されたい）、ミツバチのメリチン（Invitrogen）、エクジステロイドUDPグリコシルトランスフェラーゼ（egt）(Murphy et al., Protein Expression and Purification 4, 349-357(1993)）またはヒト膵臓リパーゼ（hp1)(Methods in Enzymology 284, pp.262-272, 1997）から簡便に誘導できる。哺乳動物細胞での使用のための好ましいシグナルペプチドは、hFVIIのシグナルペプチドまたはマウスIgκ軽鎖シグナルペプチド（Coloma,J(1992) J.Imm.Methods 152:89-104）である。酵母細胞での使用のための好適なシグナルペプチドは、S.cereviciae由来のα因子シグナルペプチド（US4870008を参照されたい）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L.A.Valls et al., Cell 48, 1987, pp.887-897を参照されたい）、酵母BAR1シグナルペプチド（WO87/02670）、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3（YAP3）シグナルペプチド（M.Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp.127-137）、および合成リーダー配列TA57（WO98/32867）であることが見出されている。E.coli細胞での使用のためには、好適なシグナルペプチドは、シグナルペプチドompA（EP581821）であることが見出されている。
【０１６９】
位置指定突然変異誘発、合成、PCR、またはその他の方法による製造の如何に拘わらず、プロテインCポリペプチド変異体をコードしている本発明に係るヌクレオチド配列は、所望によりシグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列を包含してよい。シグナルペプチドは、該ポリペプチドを、それが発現される細胞から分泌させようとする場合に存在する。このようなシグナルペプチドは、存在するとすれば、該ポリペプチドの発現のために選択した細胞によって認識されるものであるべきである。シグナルペプチドは、該ポリペプチドにとってホモローガス（例えば、ヒトプロテインCに通常付随するもの）もしくはヘテロローガス（即ち、ヒトプロテインC以外の供給源に起源を持つもの）であってよく、または宿主細胞にとってホモローガスもしくはヘテロローガス、即ち、その宿主細胞から通常発現されるシグナルペプチドであるか、または宿主細胞から通常発現されないものであってよい。したがって、シグナルペプチドは原核生物性、例えばE.coliのような細菌から誘導されたもの、または真核生物性、例えば哺乳動物もしくは昆虫もしくは酵母細胞から誘導されたものであってよい。
【０１７０】
細菌、真菌（酵母を包含する）、植物、昆虫、哺乳動物、またはその他の適当な動物細胞もしくはセルライン、ならびにトランスジェニック動物もしくは植物を包含する、任意の適当な宿主を使用して本発明に係るポリペプチドまたはコンジュゲート体のポリペプチド部を製造できる。細菌宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばBacillus、例えばB.brevisまたはB.subtilis、PseudomonasもしくはStreptomycesの菌株、またはグラム陰性細菌、例えばE.coliの菌株を包含する。細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えばプロトプラスト形質転換によって（例えば、Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115を参照されたい）、コンピテント細胞（例えば、Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829、またはDubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221を参照されたい）、電気穿孔（例えば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751を参照されたい）、またはコンジュゲーション（例えば、Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278を参照されたい）を使用して実施できる。好適な糸状菌宿主細胞の例は、Aspergillusの菌株、例えばA.oryzae、A.nigerもしくはA.nidulans、FusariumまたはTrichodermaを包含する。真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含むプロセスにより、自体既知の方法で形質転換できる。Aspergillus宿主細胞の形質転換のための適当な方法がEP238023およびUS5679543に記載されている。Fusarium種を形質転換させるための適当な方法はMalardier et al., 1989, Gene 78:147-156およびWO96/00787に記載されている。適当な酵母宿主細胞の例は、Saccharomyces、例えばS.cerevisiae、Schizosaccharomyces、Klyveromyces、Pichia、例えばP.pastorisもしくはP.methanolica、Hansenula、例えばH.PolymorphaまたはYarrowiaの菌株を包含する。酵母は、Becker and Guarenteによる、Abelson,J.N.およびSimon,M.I. Ed.、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp182-187, Academic Press,Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163; Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920に記載の、そしてClontech Laboratories,Inc., Palo Alto, CA, USA（Yeastmaker(登録商標) 酵母形質転換系キットのための製品プロトコル中）に開示の方法を用いて形質転換できる。好適な昆虫宿主細胞の例は、Lepidoptoraセルライン、例えばSpodoptera frugiperda（Sf9またはSf21）またはTrichoplusioa ni細胞（High Five）(US5077214）を包含する。昆虫細胞の形質転換およびそこでのヘテロローガスポリペプチドの産生はInvitrogenによる記載のように実施できる。好適な哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）セルライン（例えばCHO-K1; ATCC CCL-61）、ミドリザルセルライン（COS)(例えばCOS1（ATCC CRL-1650）、COS7（ATCC CRL-1651)); マウス細胞（例えばNS/O）、新生児ハムスター腎（BHK）セルライン（例えばATCC CRL-1632またはATCC CCL-10）、およびヒト細胞（例えばHEK293（ATCC CRL-1573）ならびに組織培養の植物細胞を包含する。さらなる好適なセルラインが当分野で知られており、American Type Culture Collection, Rockville, Marylandのような公的寄託機関から入手できる。また、CHO細胞のような哺乳動物細胞は、プロテインCポリペプチドのグリコシル化を改善するために、US5047335に記載のように修飾してシアリルトランスフェラーゼ、例えば1,6-シアリルトランスフェラーゼを発現させることができる。
【０１７１】
分泌を増加させるためには、エンドプロテアーゼ、とりわけPACE（対合塩基性アミノ酸変換酵素)(例えばUS5986079に記載のような）、例えばKex2エンドプロテアーゼ（例えばWO00/28065に記載のような）と共に本発明に係るポリペプチドを産生させることが特に興味深い。
【０１７２】
外因性DNAを哺乳動物宿主細胞中に導入する方法は、燐酸カルシウム仲介トランスフェクション、電気穿孔、DEAE-デキストラン仲介トランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、ウイルスベクター、およびLife Technologies Ltd, Paisley, UKにより記載されたLipofectamin 2000を用いるトランスフェクション法を包含する。これらの方法は当業者に周知であり、例えばAusbel et al.(eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USAに記載されている。哺乳動物細胞の培養は、例えば(Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Nigel Jenkins Ed., 1999, Human Press Inc, Totowa, New Jersey, USAおよびHarrison MA and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997)に開示されている、確立された方法に従って実施する。
【０１７３】
本発明に係る製造方法では、当分野で既知の方法を用いて該ポリペプチドの産生に好適な栄養培地で細胞を培養する。例えば、該ポリペプチドが発現されそして／または単離され得る条件下で、適当な培地中で実施される実験室または工業的発酵槽内での振盪フラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続、バッチ、給餌バッチ、または固体状態発酵を包含する）により、細胞を培養できる。この培養は、炭素および窒素源および無機塩類を含む適当な栄養培地中で、当分野で既知の方法を用いて実施する。好適な培地は商業的供給者から入手でき、または公開されている組成に従って製造できる（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログにおいて）。該ポリペプチドが栄養培地中に分泌されるならば、このポリペプチドを培地から直接回収することができる。該ポリペプチドが分泌されない場合は細胞溶菌液から回収できる。
【０１７４】
得られるポリペプチドは当分野で既知の方法によって回収できる。例えば、該ポリペプチドは、遠心分離、濾過、限外濾過、抽出または沈殿化を包含する（但しこれらに限定されない）常套的方法によって栄養培地から回収できる。
【０１７５】
該ポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば調製用等電点電気泳動）、差別的溶解度（例えば硫酸アンモニウム沈殿化）または抽出（例えばProtein Purification, J.-C.Janson and Lars Ryden Ed., VCH Publishers, New York, 1989を参照されたい）を包含する（但しこれらに限定されない）当分野で既知の様々な方法によって精製できる。
【０１７６】
医薬組成物および使用
さらなる態様では、本発明は、本発明に係るコンジュゲート体または本発明に係る変異体および製薬的に許容し得る担体または賦形剤を含む医薬組成物に関するものである。この文脈において、「製薬的に許容し得る」という語は、その担体または賦形剤が、使用される用量および濃度において、それらが投与される患者に望ましくないまたは有害な作用を惹起しないことを意味する。このような製薬的に許容し得る担体および賦形剤は当分野でよく知られている（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R.Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S.Frokjaer and L.Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000] ;およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A.Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]を参照されたい)。
【０１７７】
さらに別の態様では、本発明は、医薬として使用するための本発明に係るコンジュゲート体、本発明に係る変異体または本発明に係る医薬組成物に関するものである。より詳細には、本発明に係るコンジュゲート体、変異体または医薬組成物は、卒中；心筋梗塞；静脈血栓症後；汎発性血管内凝固症候群（DIC）；敗血症；敗血症性ショック；塞栓、例えば肺塞栓；移植、例えば骨髄移植；火傷；妊娠；大手術／外傷または成人呼吸窮迫症候群（ARDS）の治療、特に敗血症性ショックの治療のための医薬の製造に使用できる。
【０１７８】
本発明はさらに、卒中；心筋梗塞；静脈血栓症後；汎発性血管内凝固症候群（DIC）；敗血症；敗血症性ショック；塞栓、例えば肺塞栓；移植、例えば骨髄移植；火傷；妊娠；大手術／外傷および成人呼吸窮迫症候群（ARDS）より成る群から選ばれる疾病を治療または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、特に敗血症性ショックを治療または予防、特に治療するための、本発明に係るコンジュゲート体、本発明に係る変異体、または本発明に係る医薬組成物の有効量を、投与することを含む方法に関するものである。
【０１７９】
本発明の目的のための「患者」とは、人間およびその他の哺乳動物の両者を包含する。したがって本方法は人間の治療および獣医学的適応の両者に適用できる。
【０１８０】
本発明に係るポリペプチド変異体およびコンジュゲート体は有効用量を患者に投与する。本明細書中「有効用量」とは、それが投与される理由である状態に関して所望の効果を産むに充分な用量を意味する。正確な用量は、治療しようとする疾病に依存し、既知の技術を用いて当業者が確認できる。上に述べたように、重篤な敗血症の治療においては、24μg/kg/hのヒトAPCを96時間投与するが、これは体重約100kgの患者では約230mgの蛋白総量に相当する。本発明に係るコンジュゲート体および変異体は、それらの増大した血漿半減期のため、血漿中での作用時間の延長故の高い有効性を持つと考えられる。この増大した有効性は、例えば「ヒト血漿不活性化検定II」における曲線下面積（AUC）の算出によって、または血清半減期の測定によって推定できる。増大した有効性とは、特定の疾病について望ましい効果を得るのに必要な有効用量が、ヒトAPCの有効用量よりも小さい（投与すべき蛋白がより少なくてよい）事を意味する。加えて、増大した血漿半減期は、APC変異体またはコンジュゲート体を所定の周期で規則的に使用する治療を可能とする。したがって、これらの新たな性質は、本発明化合物の、低下させた量での使用および／またはより頻回でない投与、例えばボーラス注射の利用を可能にする。例えば、本発明化合物はボーラスまたは注入のいずれかによって、またはそれらの組み合わせとして、1μg/kg(体重）をボーラスとして2時間毎に数日間（例えば96時間）から1mg/kg(体重）をボーラスとして4日毎、までの範囲の用量で投与できる。好ましくは、できるだけ低い用量をできるだけ頻回でなく投与する。例えば、1-500μg/kg(体重）、好ましくは1-250μg/kg(体重）、例えば1-100μg/kg(体重）、より好ましくは1-50μg/kg(体重）を、ボーラスとして、4-96時間毎、例えば8-96時間毎、例えば16-96時間毎、24-96時間毎、40-96時間毎、48-96時間毎、56-96時間毎、76-96時間毎に投与する。
【０１８１】
好ましい本発明化合物は、本明細書の実施例13に記載の「ヒト血漿不活性化検定II」で試験した場合、活性型の該化合物のAUCとヒトAPCのAUCの比が少なくとも1.25であるような化合物である。好ましくはこの比率は少なくとも1.5、例えば少なくとも2、例えば少なくとも3であり、より好ましくはこの比率は少なくとも4、例えば少なくとも5、例えば少なくとも6であり、より好ましくはこの比率は少なくとも7、例えば少なくとも8、例えば少なくとも9であり、最も好ましくはこの比率は少なくとも10である。
【０１８２】
本発明に係るポリペプチド変異体またはコンジュゲート体は「現状のままで」そして／または塩の形態で使用できる。好適な塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムとの塩、ならびに例えば亜鉛塩を包含するが、これらに限定される訳ではない。これらの塩または錯体は結晶および／またはアモルファス構造として存在できる。
【０１８３】
本発明に係る医薬組成物は単独または他の治療物質と共に投与できる。これらの物質は同じ医薬組成物の一部として配合でき、または本発明に係るポリペプチドまたはコンジュゲート体とは別に、同時にまたは別の治療計画に従って投与できる。さらに、本発明に係るポリペプチド、コンジュゲート体または医薬組成物は、他の治療に対するアジュバントとして使用できる。
【０１８４】
本発明に係る医薬組成物は様々な形態、例えば液体として、ゲル、凍結乾燥して、または圧縮固体として調合できる。好ましい形態は治療される特定の適応に依存し、当業者により容易に決定できるであろう。
【０１８５】
本発明に係る調合物の投与は、経口、皮下、静脈内、脳内、鼻内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、腟内、直腸内、眼内を包含する（但しこれらに限定されない）様々な方法で、またはその他任意の許容し得る方法で実施できる。この調合物は、ポンプまたは移植といった当分野で周知の技術を用いて注入により連続的に投与できるが、ボーラス注射もまた許容できる。幾つかの例ではこの調合物は溶液またはスプレーとして直接適用できる。
【０１８６】
非経口組成物
医薬組成物の一例は非経口投与用に設計した溶液である。多くの場合、薬用溶液調合物は即時使用に適した液体形態で提供されるが、係る非経口調合物は凍結または凍結乾燥形態でも提供される。前者の場合、使用前にこの組成物を融解せねばならない。凍結乾燥調合物は一般に液体調合物より安定であるという事が当業者に認識されているため、より多岐にわたる貯蔵条件の下で該組成物中に含まれる活性化合物の安定性を増強するため、凍結乾燥形態がしばしば利用される。このような凍結乾燥製品は、注射用滅菌水または滅菌生理食塩水のような1またはそれ以上の適当な製薬的に許容し得る希釈剤の添加により、使用前に再構成する。
【０１８７】
非経口投与の場合、これらは、所望の純度を持つ該ポリペプチドを1またはそれ以上の当分野で典型的に使用される製薬的に許容し得る担体、賦形剤または安定剤（これらは全て「賦形剤」と称する）、例えば緩衝剤、安定剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤および／またはその他の様々な添加剤と適宜混合することにより、凍結乾燥調合物または水溶液として保存用に製造する。
【０１８８】
緩衝剤は生理的条件に近似する範囲のpHを維持する助けとなる。これらは典型的には約2mMないし約50mMの範囲の濃度で存在する。本発明に使用するための好適な緩衝剤は、有機および無機酸ならびにその塩、例えばクエン酸緩衝剤（例えばクエン酸一ナトリウム-クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸一ナトリウム混合物など）、琥珀酸緩衝剤（例えば琥珀酸-琥珀酸一ナトリウム混合物、琥珀酸-水酸化ナトリウム混合物、琥珀酸-琥珀酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝剤（例えば酒石酸-酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸-酒石酸カリウム混合物、酒石酸-水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝剤（例えばフマル酸-フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸-フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム-フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝剤（例えばグルコン酸-グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸-水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸-potassium glyuconate混合物など）、蓚酸緩衝剤（例えば蓚酸-蓚酸ナトリウム混合物、蓚酸-水酸化ナトリウム混合物、蓚酸-蓚酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝剤（例えば乳酸-乳酸ナトリウム混合物、乳酸-水酸化ナトリウム混合物、乳酸-乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝剤（例えば酢酸-酢酸ナトリウム混合物、酢酸-水酸化ナトリウム混合物など）を包含する。さらなる可能性は燐酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤およびTrisのようなトリメチルアミン塩である。保存剤は微生物の増殖を遅延させるために添加し、典型的には例えば約0.1%-2%(w/v)の量を添加する。本発明での使用に好適な保存剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば塩化、臭化または沃化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベンといったアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび3-ペンタノールを包含する。
【０１８９】
等張化剤は液体組成物の等張性を確保するために添加し、多価糖アルコール、好ましくは三価またはそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールを包含する。多価アルコールは他の成分の相対量を考慮に入れて0.1%および25%（重量）、典型的には1%ないし5%の量を存在させることができる。
【０１９０】
安定剤とは、機能の上で、増量剤から、治療薬を可溶化しまたは変性や容器壁への付着の防止を助ける添加物までの範囲の広い範疇の賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上に列挙）；アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、L-ロイシン、2-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えば乳糖、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシルトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなど（イノシトールのようなシクリトールを包含する）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α-モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（即ち＜10残基）；蛋白、例えばヒト血清アルブミン、牛血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；単糖類、例えばキシロース、マンノース、フルクトースおよびグルコース；二糖類、例えば乳糖、マルトースおよび蔗糖；三糖類、例えばラフィノース、ならびに多糖類、例えばデキストランであってよい。安定剤は典型的には活性蛋白重量を基準として0.1ないし10000重量部の範囲で存在する。
【０１９１】
非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤化剤」としても知られる）は、治療薬の可溶化を助けるため、そして治療用ポリペプチドを振動が誘発する凝集から保護するために存在させることができ、さらにこれは、調合物を、該ポリペプチドの変成をもたらすことなく剪断表面応力にさらすようにさせる。好適な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（20、80など）、ポリオキサマー（184、188など）、Pluronic(登録商標)ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（Tween(登録商標)-20、Tween(登録商標)-80など）を包含する。
【０１９２】
さらなるその他の賦形剤は、充填剤または増量剤（例えば澱粉）、キレート化剤（例えばEDTA）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE）および補助溶媒を包含する。
【０１９３】
活性成分はまた、例えばコアセルベート化技術または界面重合によって製造したマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ-(メチルメタクリラート)マイクロカプセル中に、またはコロイドドラッグデリバリーシステム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に捕捉できる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences、上記、に開示されている。
【０１９４】
インビボ投与に使用する非経口調合物は無菌でなければならない。これは例えば滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成できる。
【０１９５】
持続放出製剤
持続放出製剤の好適な例は、該ポリペプチドまたはコンジュゲート体を含有する疎水性固体ポリマーの半透性マトリックス、フィルムまたはマイクロカプセルのような適当な形態を持つマトリックスを包含する。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリラート)またはポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド、L-グルタミン酸とエチル-L-グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレンビニルアセタート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばProLease(登録商標)技術またはLupron Depot(登録商標)（乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドより成る注射可能なミクロスフェア）、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン-ビニルアセタートおよび乳酸-グリコール酸といったポリマーは100日間またはそれ以上の長期にわたる分子の放出を可能にするが、或る種のヒドロゲルは蛋白をより短期間放出する。カプセル化したポリペプチドが体内に長時間とどまる時、37℃で水分にさらされる結果これらは変性または凝集し、生物活性の喪失およびことによると免疫原性の変化を招くかも知れない。関与している機構に応じて、安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間S-S結合の形成であることが判明しているならば、スルフヒドリル残基の修飾により、そして酸性溶液からの凍結乾燥により、そして水分の調節により、そして適当な添加剤の使用により、そして特別なポリマーマトリックス組成物の開発により、安定化を達成できる。
【０１９６】
本方法を、以下の非限定的実施例によってさらに説明する。
方法
アクセス可能な表面積（ASA）
コンピュータープログラムAccess（B.Lee and F.M.Richards, J.Mol.Biol. 55:379-400(1971))バージョン2（(マルＣマーク)1983 Yale University）を使用してこの構造中の個々の原子のアクセス可能表面積（ASA）を計算する。この方法は、典型的には、プローブサイズ1.4Åを使用し、アクセス可能表面積（ASA）を該プローブの中心によって形成された面積と定義する。この計算に先立ち、全ての水分子および全ての水素原子を座標集合から取り除く。この蛋白に直接関係しないその他の原子もまた除去する。
【０１９７】
側鎖の断片的ASA
Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J.Mol.Biol. 220, 507-530に記載のように、延長したALA-x-ALAトリペプチドにおいて、側鎖の原子のASAの合計を、その残基型の側鎖原子のASAを表す値で除することにより、その側鎖原子の断片的ASAを算出する。この例では、CA原子は残りの残基ではなくグリシン残基の側鎖の一部と考える。以下の数値を側鎖のための標準100%ASAとして使用する：
【０１９８】
0004071105.tif 000005
【０１９９】
この構造中に検出されない残基は可撓性領域にあると考えられるため、それらは100%露出していると定義する。
【０２００】
原子間距離の測定
原子間の距離は分子グラフィクスソフトウェア、例えばInsightII v.98.0、MSI Inc.を用いて測定する。
【０２０１】
実施例
実施例1  −  表面露出アミノ酸の決定
野生型ヒトAPCのX線構造のための座標（Mather,T., Oganessyan,V., Hof,P., Huber,R., Foundling,S., Esmon,C., Bode,W., 1996)は、the Protein Data Bank (PDB) (Bernstein et.al. J.Mol.Biol. (1977) 112 pp.535)から入手でき、そしてThe Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDBの http://www.pdb.org/から、アクセスコード1AUTの下に電子的に入手できる。全ての水分子および共有結合したインヒビターを、アクセス可能表面積の算出を行う前にその構造から除去した。本実施例では、71位のβヒドロキシ-ASP（AP）を正常なASP残基として処理する。K156-R169の残基（Lys-Argジペプチドおよび活性化ペプチド）は計算に含めなかった。
【０２０２】
配列の番号付け
この実施例に使用した配列番号付けは、配列番号4のアミノ酸配列を有するチモーゲンプロテインCの配列番号付けと同一である。
【０２０３】
表面露出
APC分子上で断片的ASA算出を実施し、側鎖のアクセス可能性が0である以下の残基を得た：G67、C89、C98、G103、C105、H107、C109、Y124、G142、G173、V186、L187、A198、V199、I201、V206、L207、T208、A210、C212、V221、E235、I258、A259、L260、L261、L263、A267、V274、I276、L283、V297、C331、M335、A346、G361、M364、T371、F373、L374、G376、L377、V392、I403。
【０２０４】
以下の残基は、その側鎖の25%以上が表面に露出していることが判明した：Q49、L51、V52、P54、L55、E56、H57、P58、C59、A60、S61、G65、H66、T68、I70、D71、G72、I73、G74、S75、F76、S77、D79、R81、S82、G83、W84、E85、R87、F88、Q90、R91、E92、F95、L96、N97、S99、L100、D101、L110、E111、E112、V113、G114、W115、R117、S119、P122、G123、K125、G127、D128、D129、L130、L131、Q132、H134、P135、A136、V137、K138、R143、W145、K146、D172、K174、M175、R177、R178、D180、D189、S190、K191、K192、K193、H202、P203、H211、D214、E215、S216、K217、K218、L220、R229、R230、W231、K233、W234、L236、D237、D239、K241、E242、V243、F244、V245、P247、N248、S250、K251、S252、T253、T254、D255、A264、Q265、P266、T268、S270、Q271、D280、S281、G282、E285、R286、E287、Q290、A291、G292、Q293、E294、L296、Y302、H303、S304、S305、R306、E307、K308、E309、A310、K311、R312、N313、R314、T315、F316、F320、K322、P327、H328、N329、E330、S332、E333、V334、S336、N337、M338、S340、E341、I348、L349、G350、D351、R352、E357、S367、H369、G370、E382、G383、C384、L386、L387、H388、R398、D401、H404、G405、H406、R408、D409。これが表すように、活性部位ヒスチジン（H211）は表面に露出していることが判明した。しかしながらH211は本発明に従って修飾される候補対象ではない。さらに、上に挙げたシステイン残基は通常、本発明に従って修飾される候補対象ではない。
【０２０５】
以下の残基はその側鎖の50%以上が表面に露出していることが判明した：Q49、L51、V52、P54、L55、E56、A60、S61、G65、I70、D71、G72、I73、G74、S75、S77、D79、R81、S82、R87、R91、E92、F95、L96、N97、S99、E111、V113、G114, W115、R117、P122、K125、D128、D129、L130、Q132、H134、V137、K138、K146、D172、K174、R177、S190、K191、K192、K193、D214、E215、K217、K218、R229、R230、W231、K233、D239、K241、E242、P247、N248、K251、S252、Q265、P266、T268、Q271、S281、E285、Q290、G292、Y302、S305、R306、E307、K308、E309、A310、R312、N313、T315、K322、N329、E330、E333、S336、N337、M338、E341、I348、G350、R352、E357、G370、G383、H388、R398、D401、H404、G405、R408、D409.
【０２０６】
残基A1、N2、S3、F4、L5、E6、E7、L8、R9、H10、S11、S12、L13、E14、R15、E16、C17、I18、E19、E20、I21、C22、D23、F24、E25、E26、A27、K28、E29、I30、F31、Q32、N33、V34、D35、D36、T37、L38、A39、F40、W41、S42、K43、H44、V45、D46、G47、D48、R147、M148、E149、K150、K151、R152、S153、H154、L155、K410、E411、A412、P413、Q414、K415、S416、W417、A418、P419はこの構造には含まれず、本出願においては表面に100%露出しているとみなす。
【０２０７】
実施例2  −  活性部位領域の決定
活性部位領域の決定に際し、以下のアプローチに従った：プログラムModeller 98を用いて、活性部位で結合した第VIIa因子、組織因子およびBPTIの変異体の間の三成分複合体のX線構造上にAPCの重鎖（1AUT）を重ねることにより（PDBアクセスコード1FAK。Zhang,E., St Charles,R., Tulinsky,A.: Structure of Extracellular Tissue Factor Complexed with Factor Viia Inhibited with a Bpti Mutant J.Mol.Biol. 285 pp.2089 (1999)を参照されたい)、重ね合わせたBPTI分子から12Å以内の距離にある原子を有するAPC重鎖内の任意の残基として「活性部位領域」を定義することができた。さらに、目視検査により、この領域のすぐ外側のループ（残基306-314）もまた活性部位領域の一部を構成すると考えられた。
【０２０８】
このアプローチを用いて以下のアミノ酸残基が「活性部位領域」に含まれることが判明した：
L170、I171、D172、G173、Q184、V185、V186、L187、L188、D189、S190、K191、K192、K193、L194、A195、C196、G197、A198、T208、A209、A210、H211、C212、M213、D214、E215、S216、K217、K218、L219、L220、L228、I240、V243、V245、N248、Y249、S250、K251、S252、T253、T254、D255、N256、D257、I258、A259、L261、T295、L296、V297、T298、G299、W300、G301、Y302、H303、S304、S305、R306、E307、K308、E309、A310、K311、R312、N313、R314、T315、F316、I321、I323、P324、V326、C331、V334、M335、S336、N337、M338、V339、M343、L344、C345、A346、G347、I348、L349、D351、R352、Q353、D354、A355、C356、E357、G358、D359、S360、G361、G362、P363、M364、G376、L377、V378、S379、W380、G381、E382、G383、C384、G385、L386、L387、H388、N389、Y390、G391、V392、Y393およびT394。ここに列挙してはいるが、活性部位残基 (H211、D257およびS360）は、本発明に従って修飾される候補対象ではない。さらに、上に挙げたシステイン残基は通常、本発明に従って修飾される候補対象ではない。
【０２０９】
実施例3  −  活性部位領域内部の、表面に露出したアミノ酸の決定
側鎖の25%以上が表面に露出しているアミノ酸のリスト（実施例1より）を、活性部位領域に含まれるアミノ酸のリスト（実施例2より）と合することにより、以下のアミノ酸残基が、活性部位領域内にあり、且つ同時にその側鎖の少なくとも25%が表面に露出していることが判明した：
【０２１０】
D172、D189、S190、K191、K192、K193、D214、E215、S216、K217、K218、H211、L220、V243、V245、N248、S250、K251、S252、T253、T254、D255、L296、Y302、H303、S304、S305、R306、E307、K308、E309、A310、K311、R312、N313、R314、T315、F316、V334、S336、N337、M338、I348、L349、D351、R352、E357、E382、G383、C384、L386、L387およびH388。ここに列挙してはいるが、活性部位ヒスチジンは本発明に従って修飾される候補対象ではない。さらに、C384は通常、本発明に従って修飾される候補対象ではない。
【０２１１】
実施例4  −  プロテインC発現ベクターの組み立て
ヒトプロテインC前駆体をコードしている遺伝子を、Stemmer et al.(1995) Gene 164, pp.49-53に記載の方法と類似の方法を用いるPCRにより、合成オリゴヌクレオチドの組み立てによって構築した。天然プロテインCシグナル配列は、この遺伝子産物の分泌をさせるために維持した。この合成遺伝子は、5'末端にNheI部位を、そして3'末端にXbaI部位を持つように設計し、これらの部位を使用してpcDNA3.1/Hygro（Invitrogen）のCMVプロモーターの後ろにサブクローニングした。pCR4と命名された得られたプラスミド中のプロテインC前駆体配列を配列番号1に示す。
【０２１２】
さらに、より高い遺伝子発現について試験するために、この合成遺伝子を、該遺伝子の5'非翻訳領域にイントロンを含むpcDNA3.1/Hygro（pCI-Neo（Promega）より）のKpnI-XbaI部位にクローニングした。得られたプラスミドをpRC2と命名した。
【０２１３】
実施例5  −  位置指定突然変異誘発
プロテインCの突然変異体は全てQuick-Change（Stratagene）を使用して組み立てた。プライマーは、適当な突然変異を含めてTAG Technology（コペンハーゲン）から購入した。PCR反応を製造者のマニュアルに従って実施し、プラスミドをTG1コンピテント細胞中に導入した。プラスミドの製造を単一のクローンについて行い、DNAシークエンサー3100遺伝子分析機（ABI）を用いて配列を確認した。
【０２１４】
0004071105.tif 000006
0004071105.tif 000007
【０２１５】
実施例6  −  産生
野生型プロテインCおよびプロテインC変異体の一過性発現を、10%胎児血清、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび5μg/mlビタミンKを添加したDMEM（Gibco 21969-035）中で増殖させたCOS7細胞においてFugeneトランスフェクション試薬（Roche）を用いて実施した。トランスフェクションの日、トランスフェクションの4-5時間前に培地を新鮮な培地に取り換えた。トランスフェクションの翌日、この培地を、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1/500 Ex-cyte（serologicals）1/100ITSA（Gibco 51300-044）、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび5μg/mlビタミンKを添加したDMEM（Gibco 31053-028）に基づく無血清生産培地に取り換えた。2日間のインキュベーションの後、この培地を収穫し、発現された変異体を生産および活性について分析した（下の実施例9を参照されたい）。
【０２１６】
実施例7  −  精製
製造者の指示に従い、およそ15mgのCa特異的モノクローナル抗体を、Pharmacia製CNBr-活性化Sepharose FF 5mlとカップリングさせた。カップリングさせたマトリックスおよそ1mlをHR10カラムに詰め、緩衝液A（20mM Tris、0.3M NaCl、5mM CaCl2、pH7.5）を用いて流速1ml/分で洗浄した。無菌濾過した培養基およそ90mlを0.3M NaClおよび5mM CaCl2とし、同じ流速でカラムに適用した。溶出の前にこのカラムを20カラム体積の緩衝液Aで洗浄した。緩衝液B（20mM Trisおよび10mM EDTA、pH7.5）で溶出を実施し、1mlの画分で分画した。OD280、ウェスタンブロットおよびSDS-PAGEにより判定したプロテインCを含有する画分をプールし-80℃で保存した。上記の精製法は、プロテインCを精製する幾つかの可能な方法のうちの１つである（例えば、Kiesel,J. Clin.Invest. (1979) 64 pp.761-769を参照されたい）。
【０２１７】
精製した蛋白を活性化プロトコルを用いて活性化した（下の実施例8を参照されたい）。全ての蛋白の純度をポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）分析を用いて確認した。加えて、分子量の変化を監視することにより、これらのゲル分析からグリコシル化の程度を見積もった。野生型ヒトAPC分子に比して増大した見掛けの分子量は、このAPC変異体がグリコシル化されていることを証明する。
【０２１８】
野生型APCおよびAPC変異体の例は図1に見ることができる。蛋白はこのゲル上で、それぞれ見掛けの分子量41000および37000を持つ重鎖のα-およびβ-バンド、ならびに見掛けの分子量22000を持つ軽鎖に対応する3個の主要なバンドとして移動する。グリコシル化の程度もまたPAGE分析で調査した。図1は、導入されたグリコシル化部位でグリコシル化されている2個のAPC変異体を含んでいる。APC変異体D214NおよびM338Nの重鎖の移動は、より陰極側の位置にシフトし、これら2個の変異体がグリコシル化を受け、その部位が完全に利用されている事を示している。重鎖サブフォーム（αおよびβ）の移動度の調査から、各部位の炭水化物側鎖の分子量は約3000ないし4000である事が明らかである。
【０２１９】
実施例8  −  活性化
プロテインC変異体およびコンジュゲート体を毒液プロテインCアクティベーター、ACC-C（Nakagaki et al., Thrombosis Research 58:593-602, 1990）を用いて活性化した。チモーゲン型を、50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、5mM EDTA中、最終濃度1ng/mlのACC-Cを用いて37℃で約60分間インキュベートした。活性化プロセスをAPCアミド分解活性検定（下の実施例9を参照されたい）およびポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を用いて確認した。
【０２２０】
実施例9  −  アミド分解活性の測定
APCアミド分解検定
ヒトAPCおよび本発明化合物のアミド分解活性を、式H-D-Lys(γ-Cbo)-Pro-Arg-pNA.2AcOH（American Diagnostica Inc, 製品#336）を有する0.5mM最終濃度のペプチド基質SPECTROZYME PCaを用いて測定する。検定は50mM Tris-HCl（pH8.3）、100mM NaCl、5mM CaCl2中23℃で実施する。ヒトAPCおよび本発明化合物によるPCa基質の加水分解速度を、プレート読み取り機で、吸光度変化（単位／分）として405nmで3分間記録する。
【０２２１】
結果
全ての発現され且つ活性化されたコンジュゲート体および変異体を活性について分析した。細胞培養基4μl（未精製）を直前に記載のように検定した。得られた活性は、とりわけ発現レベルに依存しているため比活性を反映するものではなく、その蛋白が発現されたかどうか、そして活性を有していたかどうかを示す。
【０２２２】
以下の活性が得られた：
0004071105.tif 000008
*: SDS-PAGEから判断したところ、導入されたグリコシル化部位に結合した検出可能な糖部分は無かった。
【０２２３】
選択した候補物質を精製し、それらの特異的アミド分解活性を、30nMの蛋白濃度を用いて上の検定で測定した。以下の活性が見出された：
0004071105.tif 000009
*: SDS-PAGEから判断したところ、導入されたグリコシル化部位に結合した検出可能な糖部分は無かった。
【０２２４】
これが表すように、試験を行ったコンジュゲート体および変異体の特異的アミド分解活性は、野生型ヒトAPC分子と同レベルである。
【０２２５】
実施例10  −  抗凝固活性の測定
APC凝固検定
Nycoplastin（Nycomed、製品番号1002448）および正常止血レファランス血漿（American Diagnostica Inc.、カタログ番号258N）を使用する活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）検定で凝固時間の延長を監視することにより、抗凝固活性を評価する。凝固は、ヒトAPCまたは本発明化合物を含有するAPTT試薬を正常止血レファランス血漿と37℃で混合し、手動混合により凝固時間を測定することによって凝固を開始させる。ヒトAPCについての凝固時間を本発明化合物の凝固時間と比較し、ヒトAPC抗凝固活性に対するパーセンテージで表した抗凝固活性を算出する。
【０２２６】
結果
上の検定を用いて以下の抗凝固活性が見出された：
0004071105.tif 000010
*: SDS-PAGEから判断したところ、導入されたグリコシル化部位に結合した検出可能な糖部分は無かった。
【０２２７】
これらの結果は、本発明に係るコンジュゲート体および変異体の抗凝固特性が大部分保存されていることを示している。この事は、抗凝固活性を保持しつつ血漿中での阻害に対して著明な耐性の増大を伴うAPC変異体およびコンジュゲート体の設計が可能であることを明白に示している。
【０２２８】
実施例11  −  α-1-抗トリプシンによる不活性化
α-1-抗トリプシン不活性化検定
ヒトAPCまたは本発明化合物を、0.1% BSAを含有する10mM Tris-HCl（pH7.5）、150mM NaCl、5mM CaCl2中で37℃でヒトα-1-抗トリプシン（Sigma）16.6または42.3μMとインキュベートする。20時間のインキュベーションの後、インキュベートした混合物の試料15μlを、微量プレートに入れた110μlの50mM Tris-HCl（pH8.3）、100mM NaCl、5mM CaCl2に加え、「APCアミド分解検定」に記載のようにAPCアミド分解活性について検定する。α-1-抗トリプシンを欠くがその他の点では同一条件でインキュベートした試料で得られた活性で規格化することにより、残存活性を算出する。
【０２２９】
結果
上の検定を用いて以下の結果が得られた：
0004071105.tif 000011
*: SDS-PAGEから判断したところ、導入されたグリコシル化部位に結合した検出可能な糖部分は無かった。
【０２３０】
データを図2にも示す。この結果は、事実上全ての該コンジュゲート体がα-1-抗トリプシン阻害に対する増大した耐性を有することを示すものである。特に、D214NおよびD189N+K191Tは、最高濃度のα-1-抗トリプシンにおいてさえ、それらのアミド分解活性の70%以上を保持している。これら2つのコンジュゲート体を、グリコシル化を欠くD214AおよびD189N+K191Nと比較すると、これらの化合物のグリコシル化の効果が観察できる。これらの変異体はグリコシル化されたものよりも著明に阻害され、これは、グリコシル化がα-1-抗トリプシン阻害に対する耐性の改善にとって重要であることを示している。さらに、見たところ導入されたグリコシル化部位を利用しなかった（SDS-PAGEから判断）変異体K251N、S252N、Y302NおよびS190+K192Tは、野生型ヒトAPCに比してα-1-抗トリプシン阻害に対するそれらの耐性を著しく増大させていた事に注目すべきである。
【０２３１】
実施例12  −  ヒト血漿による不活性化
ヒト血漿不活性化検定I
50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、5mM CaCl2を含有する90%正常ヒト血漿（Sigma Diagnostics, Accuclot(登録商標)レファランス血漿）中、37℃でヒトAPCまたは本発明化合物をインキュベートする。200分後にアリコートを取り、「APCアミド分解検定」に記載のようにAPCアミド分解活性について検定する。200分後の残存APC活性を、実験開始時に測定したAPC活性のパーセンテージとして表す。
【０２３２】
結果
上の検定を用いて以下の結果が得られた：
【表６】
0004071105.tif 000012
*: SDS-PAGEから判断したところ、導入されたグリコシル化部位に結合した検出可能な糖部分は無かった。
【０２３３】
上の結果は、本発明に係るコンジュゲート体および変異体がヒト血漿における不活性化に対して極めて耐性であることを明白に示した。
【０２３４】
実施例13  −  ヒト血漿におけるインビトロ半減期
ヒト血漿不活性化検定II
50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM NaCl、5mM CaCl2を含有する90%正常ヒト血漿（Sigma Diagnostics, Accuclot(登録商標)レファランス血漿）中、37℃でヒトAPCまたは本発明化合物をインキュベートする。様々な時点でアリコートを取り、「APCアミド分解検定」に記載のようにAPCアミド分解活性について検定する。様々な時点での残存APC活性を、実験開始時に測定したAPC活性のパーセンテージとして表す。APC活性の50%が依然として存在する時間としてインビトロ半減期（分で表示）を算出する。
【０２３５】
結果
以下のインビトロ半減期が得られた：
【表７】
0004071105.tif 000013
*: SDS-PAGEから判断したところ、導入されたグリコシル化部位に結合した検出可能な糖部分は無かった。
【０２３６】
実験データの点を図3および4に示す。この結果は、APC変異体およびコンジュゲート体がヒト血漿において著しく増大したインビトロ半減期を有することを示している。特にD214NおよびL386N+H388Tコンジュゲート体は著しく増大したインビトロ半減期を示す（10倍以上増大）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、精製野生型ヒトAPCならびに本発明に係る種々のコンジュゲート体および変異体を示す。この蛋白は、各々見掛けの分子量41000および37000を有する重鎖のα-およびβ-バンド、ならびに見掛けの分子量22000を有する軽鎖、に対応する3個の主たるバンドとしてゲル上を移動する。グリコシル化の程度もまた、図1に示すゲルから、より陰極側の位置にシフトしたコンジュゲート体D214NおよびM338Nの重鎖の移動（導入されたグリコシル化部位を利用しなかったと思われる変異体K251NおよびS252Nとは逆に）として分析でき、これら2個の変異体がグリコシル化を受け、その部位が完全に利用されている事を示している。重鎖サブフォーム（αおよびβ）の移動度の調査から、各部位の炭水化物側鎖の分子量は約3000ないし4000である事が明らかである。
【図２】  図2は、異なる濃度のα-1-抗トリプシン（16.6μM(黒い棒)および42.3μM(白い棒))と共に37℃で20時間インキュベートした後の本発明に係る種々のコンジュゲート体および変異体の残存アミド分解活性を示す。詳細は本明細書の実施例11に示す。
【図３】  図3は、ヒト血漿中での、時間の関数としての、本発明に係る種々のコンジュゲート体および変異体の残存アミド分解活性を示す。算出されたヒト血漿中でのインビトロ半減期を包含する詳細は、本明細書の実施例13に示す。
【図４】  図4は、ヒト血漿中での、時間の関数としての、本発明に係る種々のコンジュゲート体および変異体の残存アミド分解活性を示す。算出されたヒト血漿中でのインビトロ半減期を包含する詳細は、本明細書の実施例13に示す。
【配列表】
0004071105.tif 000014
0004071105.tif 000015
0004071105.tif 000016
0004071105.tif 000017
0004071105.tif 000018
0004071105.tif 000019
0004071105.tif 000020
0004071105.tif 000021
0004071105.tif 000022
0004071105.tif 000023
0004071105.tif 000024
0004071105.tif 000025
0004071105.tif 000026
0004071105.tif 000027
0004071105.tif 000028
【図１】
0004071105.tif 000029
【図２】
0004071105.tif 000030
【図３】
0004071105.tif 000031
【図４】
0004071105.tif 000032