(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含有する複数のサンプルから核酸成分を流出口を介して連続的に抽出可能な、フリーフロー電気泳動及び／又はキャピラリー電気泳動である核酸抽出手段と、
該核酸抽出手段によって抽出された前記核酸成分中に含まれ得る所望の核酸を前記流出口から所定のサンプルカップに回収し、回収された核酸を反応セルに分注し、特異的に増幅するための核酸増幅手段と、
該核酸増幅手段によって増幅された前記所望の核酸を検出するための核酸検出手段と、
を備えた自動核酸検査装置。
【請求項２】
前記核酸抽出手段によって抽出された前記核酸成分を含有する溶液を濃縮し、及び／又は前記増幅手段によって増幅された前記所望の核酸を変性するためのヒートブロックをさらに備えた請求項１に記載の自動核酸検査装置。
【請求項３】
前記核酸増幅手段が、複数の反応セルを具備する収容部と、前記収容部を交換するための搬送手段をさらに備えたことを特徴とする請求項１に記載の自動核酸検査装置。
【請求項４】
前記核酸増幅手段が、前記核酸成分と、耐熱性ポリメラーゼと、前記所望の核酸中の部分配列を有するプライマーとをPCR溶液を加熱及び冷却するためのPCR反応装置であることを特徴とする請求項１に記載の自動核酸検査装置。
【請求項５】
前記核酸検出手段が楕円偏光解析であることを特徴とする請求項１に記載の自動核酸検査装置。
【請求項６】
請求項４に記載の自動核酸検査装置を用いた自動核酸検査方法において、前記PCR溶液を入れるための容器として、加熱体を備えた容器を用いることを特徴とする自動核酸検査方法。
【請求項７】
請求項１〜５の何れか１項に記載の自動核酸検査装置を用いた自動核酸検査方法において、前記所望の核酸と相補的な核酸を含む核酸群が固相された反応素子に、増幅された前記所望の核酸をハイブリダイズせしめた後、前記検出手段によって前記所望の核酸のハイブリダイゼーションを検出することを特徴とする自動核酸検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、自動核酸検査装置に関する。より具体的には、サンプルから核酸成分を抽出する工程、抽出した核酸成分を増幅する工程、及び増幅した核酸を検出する工程が全て自動化された自動核酸検査装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸同士の相補的な結合は、抗原抗体反応と比べても高度に特異的であるため、所望の核酸を特異的に増幅、検出する技術は、遺伝的疾患の検査や法医学的な鑑定などに極めて有用である。
【０００３】
このような検査の主な工程は、(i)サンプルからの核酸成分の抽出、(ii)核酸の増幅、(iii)増幅した核酸の検出であり、これらの工程を全て自動的に行い得る自動核酸検査装置が既に市販されている。
【０００４】
しかしながら、現在の自動核酸検査装置は、上記各工程に以下のような問題点を有している。
【０００５】
まず、核酸抽出操作としては、手動の場合、エタノール等の有機溶媒による抽出後に遠心分離を行うのが最も一般的であり、特開平6-327476に開示されている自動遺伝子解析装置は、かかる操作を採用している。
【０００６】
しかし、このような操作によってサンプルから核酸を抽出するには、試料混合手段、遠心分離手段の他、サンプル容器の蓋を開閉する機構も設置しなければならないため、装置が大型化し、構成の複雑化も避けられない。また、遠心処理に伴いサンプル容器の交換などを要するので、連続的な処理を行い難い。
【０００７】
一方、特開平9-19292、特開平8-62224は、自動核酸検査装置用に適した新たな核酸抽出工程として、ガラス表面への核酸の非特異的吸着を利用した分離、抽出方法を開示している。
【０００８】
該方法では、タンパク質を分解する物質を予めサンプルに加えた後、ガラスコートされたフェライト磁石ビーズを添加する。核酸成分は、該ビーズのガラス部分に吸着するので、ビーズを磁石に吸い付ければ、核酸成分のみを抽出することができる。
【０００９】
しかしながら、該方法も洗浄操作と抽出操作とを要するため、そのための手段を要し、抽出・分離の工程は10〜12分かかる。また、該方法では、mLレベルの検体から核酸を抽出することは困難である。それ故、多数の検体を短時間で検査し得る装置に適用するには、該方法も完全とはいえない。また、検体毎に別々の容器を必要とするので、連続的な処理を行い難い。
【００１０】
次に、増幅工程において改良すべき点としては、PCRを行うときの液温の調整が挙げられる。該工程においてGC含量の多い核酸を用いた場合、93℃では核酸の変性が起こらないが、94℃では核酸の変性が起こることもあるので、自動化においても、とりわけ液温の厳密な制御が課題となる。
【００１１】
この点、従来のPCR反応装置では、加熱したヒートブロックの中に、PCR反応液及びサンプルを加えた縦長のカップ状容器を挿脱させるように収容することによって、PCR反応液及びサンプルを間接的に加熱するので、加熱にタイムラグが生じ、正確な温度制御が困難であるという欠点を有している。
【００１２】
最後に、PCR増幅産物の検出工程においても、操作時間、染色溶液が環境に与える問題等が残っている。
【００１３】
例えば、上記特開平6-327476は、PCR産物を分離、検出するために簡易なゲル電気泳動装置を組み込んだ自動遺伝子解析装置を開示している。しかしながら、電気泳動を用いた検出は、少なくとも60分程度の時間を要するのみならず、一度の操作で扱い得る検体数は限られている。従って、ゲル電気泳動を用いた自動核酸検査装置は、多数の検体を短時間で分析しなければならない臨床検査に用いるには全く適していない。また、染色やラベリングに用いる種々の色素、例えば蛍光色素は、遺伝的毒性も有しているので、廃棄物としての取り扱いに注意しなければならない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術に存する上記課題を解決するためになされたものであり、(i)サンプルからの核酸成分の抽出、(ii)抽出した核酸の増幅、(iii)増幅した核酸の検出工程のうちの少なくとも一つが自動操作に適するように改良された自動核酸検査装置を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明は、
核酸を含有する複数のサンプルから核酸成分を連続的に抽出可能な核酸抽出手段と、
該核酸抽出手段によって抽出された前記核酸成分中に含まれ得る所望の核酸を特異的に増幅するための核酸増幅手段と、
該核酸増幅手段によって増幅された前記所望の核酸を検出するための核酸検出手段と
を備えた自動核酸検査装置を提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、(i)サンプルからの核酸成分の抽出、(ii)抽出した核酸の増幅、(iii)増幅した核酸の検出からなる工程のうち少なくとも一つが自動操作に適するように改良された自動核酸検査装置を提供する。
【００１７】
従って、本発明の装置によれば、従来の同種の装置に比べて、多数のサンプルを短時間に検査することができる。より具体的には、96個のサンプルを5〜6時間で検査することが可能であり、これは従来の装置に比べて、およそ3分の1の所要時間である。
【００１８】
かかる効果を達成するために、本発明の装置においては、核酸抽出手段としてフリーフロー電気泳動又はキャピラリー電気泳動、PCR増幅容器として加熱体一体型核酸増幅容器、及び核酸検出手段として楕円偏光解析を使用する。本発明の装置では、多数の検体を自動検査するのに適したこれらの核酸抽出手段、PCR増幅容器、及び核酸検出手段を一以上組み合わせて使用し得るが、最大の効果を得るためには、これらの核酸抽出手段、PCR増幅容器、及び核酸検出手段を同時に使用することが好ましい。
【００１９】
以下、実施例によって、本発明をさらに詳細に記載するが、いかなる意味においても、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００２０】
［実施例１］
図１は、本実施例の自動核酸検査装置内部の上面図である。以下、図１を参照しながら、本発明の自動核酸検査装置を詳細に説明する。
【００２１】
自動核酸検査装置１０１は、核酸の抽出・増幅・検出工程を全て自動的に行うことができ、前記各工程は、それぞれ自動核酸検査装置１０１の内部に配置された核酸抽出手段１１１、ＰＣＲ反応装置１１９、及び核酸検出手段１３２によって、この順序で実施される。
【００２２】
従って、自動核酸検査装置１０１によれば、検査者は、試料を添加したサンプル管をサンプル立て（図示せず）にセットした後、自動核酸検査装置１０１を始動させるだけで核酸検査を行うことができる。
【００２３】
自動核酸検査装置１０１を始動させると、前記サンプルは、吸入装置（図示せず）によって吸入された後、核酸抽出手段１１１に移送される。
【００２４】
核酸抽出手段１１は、特開平6-327476、特開平9-19292、及び特開平8-62224に開示された抽出手段を含む任意の抽出手段であり得るが、処理の迅速性、構成の簡易さ故に、フリーフロー電気泳動又はキャピラリー電気泳動を用いるのが極めて好ましい。
【００２５】
一般的に、サンプルが少量の場合にはキャピラリー電気泳動が適しており、検体中に目的核酸数が少ない場合（1000個未満）にはフリーフロー電気泳動が適しているであろう。
【００２６】
フリーフロー電気泳動は、典型的には、図２に示された構造を有しており、それ自体公知である（特開平１０―３１８９８２参照）。フリーフロー電気泳動のための素子は、厚さ0.1〜5mm、好ましくは0.5〜2mmの二枚のガラス板２０１ａ及び２０１ｂと、両ガラス板の間に挟持されたシリコン板２０２ａ及び２０２ｂ、一対の延在する電極２０６ａ（陽極）と２０６ｂ（陰極）から構成されている。ガラス板２０１ａ、２０１ｂとシリコン板２０２ａ、２０２ｂによって偏平な中空状の間隙が形成されているので、サンプル注入口２０５からサンプル溶液を注入すると、サンプルは緩衝液流入口２０３から緩衝液流出口２０４へ（図中矢印の方向）流れる。
【００２７】
電極２０６ａと２０６ｂは電界を形成しているので、核酸のように負の電荷を有する物質は、陽極２０６ａの方向に移動しながら泳動される。従って、図中、緩衝液流出口２０４の右側で流出液を収集すれば、核酸成分を抽出することができる。
【００２８】
２枚のガラス板２０１ａ、２０１ｂの間隔は、サンプルと緩衝液が互いに拡散して混じり合わないように、5μm〜150μmとするのが好ましい。電極には、腐食されにくい白金、金を使用することが好ましい。ガラス板２０１ａと２０１ｂの間隔が狭い場合には、印加電圧は数kVまで上げることができるが、適宜設定できる。
【００２９】
フリーフロー電気泳動に使用し得る緩衝液としては、種々の緩衝液が知られており、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
フリーフロー電気泳動素子のサイズは、縦（流速方向）1〜30cm、横1〜30cm、好ましくは縦2〜10cm、横2〜10cm、最も好ましくは縦3〜5cm、横3〜5cmであり得る。フリーフロー電気泳動のサイズは、分離能、サンプルの容量、分離時間等に応じて適切なサイズを選択すればよい。フリーフロー電気泳動を用いて、1mL程度のサンプルから核酸成分を抽出する場合の標準的な分離時間は、概ね1分以内であり、良好な条件を選択することで30秒以内にもなり得、極めて短時間且つ連続的に核酸成分を抽出することができる。
【００３１】
さらに、フリーフロー電気泳動には大量のサンプルを負荷することが可能である。これは、サンプル中に所望の核酸が微量（ある場合には一分子）しか含まれておらず、大量のサンプルを全て核酸抽出手段に供する必要がある場合には、特に有用な特徴である。
【００３２】
キャピラリー電気泳動には、極微量のサンプルを負荷することが可能であり、極微量サンプルの検査を行うのに有効である。キャピラリー電気泳動用の素子は、毛管力を生じるような中空の細長い円筒管路と、この管路のサンプル流入側とサンプル流出側とに一対の電極（陽極と陰極）を接続し、電荷を与えることによって、注入側から流出側へと核酸成分を移動させるものであり、概ね２分以内、好適な条件、特にキャピラリー長を短くすることで１分以内の分離が可能となる（特開平９−８９８４０等参照）。従って、好ましくは、核酸抽出手段１１にフリーフロー電気泳動とキャピラリー電気泳動装置の両方を設けて、選択的にサンプルの注入と電圧の印加を行うように構成することによって、サンプル量に応じた抽出を行わせることができる。このような選択的な核酸抽出の指示は、ユーザーインターフェース１３６に設けた入力手段によってオペレーターが指定するか、あるいはサンプル量やＩＤをコード化したバーコードをサンプルカップの外壁に設けて適宜の読取り手段によって自動的に入力指示するようにすればよい。
【００３３】
核酸抽出手段１１１によって抽出された核酸含有画分は、上記素子の流出口から落下させるか適宜の吸引手段で吸引させて検体毎にサンプルカップ中に回収するようにする。サンプルカップには、サンプルカップストッカー１１５に収納されているものが使用される。従って、核酸抽出手段１１１で抽出された核酸含有画分を抽出するために、遅くとも核酸含有画分抽出時点までに、サンプルカップを所定の位置に搬送する操作が自動的に行われる。核酸は全体として負の電荷を帯びているので、核酸抽出手段１１１としてフリーフロー電気泳動を用いる場合には、サンプルカップは、緩衝液流出口２０４の右側（陽極２０６ａが存在している側）の適切な位置に配置される。
【００３４】
サンプルカップの搬送は、カップ搬送ハンド１０６によって行われる。カップ搬送ハンド１０６は、ロボットアーム１０２に沿って図中Ｘ軸方向に移動し得るロボットアーム１０３に係合されたロボットアーム１０４に取り付けられている。さらに、カップ搬送ハンド１０６は、Ｚ軸方向（紙面垂直方向）に延出するロボットアーム１０５上を自由に移動し得る。従って、カップ搬送ハンド１０６は、ロボットアーム１０３とロボットアーム１０４の存在位置によって決定される図中ＸＹ平面上の任意の位置に移動させることができる。その後ロボットアーム１０４に沿ってＺ軸方向に下降させれば、ロボットアーム１０２〜１０４の垂直位置の下方に配置されているサンプルカップを握持することが可能となる。
【００３５】
なお、ロボットアーム１０３及び１０４には、カップ搬送ハンド１０６の他に、PCRモジュール搬送ハンド１０８、及び反応トレー搬送ハンド１０９が取り付けられており、以下で詳述する備品や試薬等をある地点から別の地点に移動させる各種の操作は、全てこれらのハンドで行われる。但し、各種のロボットアームがベルトコンベア上との同じ容器、モジュール、トレー等の移し換えのみを行って、ベルトコンベアが長距離ないし長時間の搬送を行うように変更してもよい。
【００３６】
前記サンプルカップ中に核酸含有画分を抽出した後、サンプルカップは再びカップ搬送ハンド１０６によって握持され、サンプル濃縮用ヒートブロック１１２の上面に形成されているサンプル収納孔に収納される。
【００３７】
通常は、全てのサンプル収納孔にサンプルカップが収納されるまで、前述した核酸抽出操作と、サンプル濃縮用ヒートブロック１１２へのサンプルカップの収納からなる上記操作を繰り返す（図１では８回繰り返されることになる）。
【００３８】
サンプル濃縮用ヒートブロック１１２は、例えば、サンプルカップ中の核酸含有画分を加熱して液体成分を蒸発せしめるといった適宜の濃縮技術を採用することによって核酸含有画分を濃縮し得る。サンプル濃縮用ヒートブロック１１２は、熱伝導性の良好な材質、例えば金属からなることが好ましく、この種の目的で使用される一般的なヒートブロックである。加熱温度は、任意の温度に設定し得るが、60〜100℃の温度範囲が好ましい。
【００３９】
サンプルの濃縮は、続いて行われるPCR増幅ステップに使用するために、サンプル容量を減少せしめたい場合だけ行えばよいので、該工程は省略することもできる。しかしながら、核酸抽出手段１１１として、フリーフロー電気泳動を使用する場合には、濃縮操作が必要となることが多いであろう。
【００４０】
前記核酸含有画分、好ましくは濃縮された核酸含有画分は、ポンプ１０７の作用によって、ピペット手段（図示せず）に吸引される。該ピペット手段には、ピペットチップ容器１２３に収納されているピペットチップが自動的に取り付けられる。ピペットチップは通常使用されているものであり得る。
【００４１】
前記核酸含有画分が吸引除去された後、ヒートブロック１１２に収納されているサンプルカップは、カップ搬送ハンド１０６で握持され廃棄箱１１３に廃棄される。
【００４２】
前記ピペット手段は、前記ロボットアーム１０２〜１０４によって、PCR試薬カップストッカー１１６に並立された容器まで移動され、該容器中に前記核酸含有画分、好ましくは濃縮された核酸含有画分を吐出する。
【００４３】
該容器には、核酸含有画分を吐出した後又は吐出する前に、PCR増幅試薬１１４が分注される。核酸含有画分を吐出する前に、予めPCR増幅試薬１１４を分注しておけば検査時間の短縮を図り得るであろう。なお、PCR増幅試薬１１４は、ポンプ１１０の作用によって、前記ピペット手段から吸引され、PCR試薬カップストッカー１１６に並立された容器に吐出される。また、ピペットチップは、各操作毎及び各検体毎に交換され、使用済みのピペットチップは廃棄箱１１３に廃棄される。
【００４４】
PCR増幅試薬１１４は、所定の配列を有するプライマー、Taqポリメラーゼ等の耐熱性ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸(dTTP、dATP、dCTP、dGTP)、緩衝液等のPCRに必要な物質を含有している。PCRには、極めて多くの変法が開発されているので、PCR増幅試薬１１４は、適用するPCR手法に応じた様々な試薬を２種類以上含有し得る。
【００４５】
PCR増幅試薬１１４と混合された前記核酸含有画分（以下PCR混合液という）は、PCR反応装置１１９の上に予め載置されたPCRモジュール１２０上の試料注入口に注入される。PCRモジュール１２０への注入も、ポンプ１１０及び前記ピペット手段によって行われる。
【００４６】
以下、図３〜７を参照しながら、PCRモジュール１２０の好ましい構造及びPCRモジュール１２０への試料の注入操作を説明する。
【００４７】
好ましいPCRモジュール１２０は、図３（上面図）、図４（断面図）、図５（図４の拡大図）に示された構造の第一の基板と図６（上面図）に示された構造の第二の基板を有する。
【００４８】
図４に示されているように、第一の基板は、PCR混合液を注入するための反応セル３０２が少なくとも一つ形成された平滑な基板３０１と、前記反応セル３０２が形成された表面と対向する表面に接着されている樹脂膜３０３を具備する。
【００４９】
基板３０１の材料としては、半導体工学で成形方法が確立されているシリコンウェハを使用し得る。
【００５０】
基板３０１の材料としてシリコンウェハを使用するときには、反応セル３０２はエッチングによって平滑な底面を有するように成形し得る。エッチングの精度を向上させて各反応セルの深さを均一に揃え、各反応セル中のPCR混合液の温度にばらつきが生じないようにするためには、シリコンウェハの両表面のうち反応セルを成形しない表面にホウ素原子をドープすることが好ましい。
【００５１】
反応セル３０２の形状及び大きさは、上述した構成に則って、任意のものであり得るが、底面が平坦で略偏平な空間を有しているのが好ましい。また、PCR混合液の容量は通常100μL以下であるため、例えば、図のように形状が矩形の場合には、1辺が2〜50mm、深さが0.1〜1.0mmであることが好ましい。
【００５２】
図３及び図４には、反応セル３０２の個数が８個の基板が示されているが、反応セルの個数は、1以上の任意の個数であり得る。反応セルの個数を多くすれば、多数の検体を同時に測定できるので好ましいであろう。
【００５３】
図５に図示されているように、樹脂膜３０３には、加熱体３０４と温度検出部５が埋設されている。このような構造のPCRモジュールを用いれば、反応セルの底部が平坦なので伝熱効率が良好である。また、加熱体と温度検出部が反応セルの底部に一体的に配置されており、反応セル３０２の中のPCR混合液が直接、加熱されるので、PCR混合液の温度を厳格に調節できる。PCRの成否は、反応温度によって大きな影響を受け得るので、ヒートブロックを介してPCRモジュールを間接的に加熱する態様に比べて、加熱体が埋設されたPCRモジュールによる加熱は、良好な結果をもたらす。このように、加熱効率を向上させた反応セルを用いることで、核酸増幅を短時間で実施し得る。また、別個の反応セル３０２を複数個形成したことで、同一又は異なるサンプルを同時に処理できる。
【００５４】
反応セル３０２が形成された凹部において、基板３０１の強度は著しく減弱するので、樹脂膜３０３は基板１の凹部に強度を与えるという極めて重要な役割も果たしている。従って、樹脂膜３０３の材質は、強い強度を有し、非水溶性であり、少なくとも0〜100℃の温度範囲で耐熱性がある材質でなければならない。具体的には、テフロン等のフッ素樹脂、ポリイミド樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン樹脂、塩化ビニル樹脂等であり得る。
【００５５】
強度及び熱伝導性の双方が満たされるように、樹脂膜３０３の厚さは1μm以上200μm以下であることが望ましい。
【００５６】
加熱体３０４は、炭化ケイ素、チタン、ニッケル−クロム合金等のある程度の電気抵抗を有する材質によって構成され得る。加熱体３０４の一部は、樹脂膜３０４の底面に連通しており、通電するための電気的接点を成し、通電によって反応セル３０２の中のPCR混合液が加熱される。
【００５７】
温度検出部３０５は、0〜100℃の温度範囲において抵抗率が直線状に変化する金属、例えば白金、チタン等からなり得る。温度検出部３０５の一部も、樹脂膜３０３の底面に連通しており、通電するための電気的接点を成している。
【００５８】
図６に示されているように、第一の基板の上には、試料出入口４０１が設けられた第二の基板４０２が接合される。試料出入口４０１は、第一の基板４０３の各反応セル４０４の両端部に夫々対応するように１対ずつ配置されており、各反応セル内にPCR混合液を注入及び排出するための小孔である。第二の基板３０２は、反応セル内のPCR混合液が蒸発するのを防止するように気密な構成になっている。
【００５９】
第一の基板と第二の基板が接合されてなるPCR反応槽５０１は、図７に示されているような基板部材５０２の上に載置固定され、枠部材５０３が被せられている。枠部材５０３には、前記図６に記載の１対の試料出入口４０１に対応して気密に合接可能な１対の試料注入口５０４が設けられており、中央部は中空となっていて、適宜反応槽内のモニタリングが可能となっている。
【００６０】
自動核酸検査装置においては、図７の試料注入口５０４にピペットの先端が挿入され、該試料注入口５０４を通じて、前記図６に記載の反応セル４０４の中にPCR混合液が加えられる。
【００６１】
PCRモジュールストッカー１２１中には、複数のPCRモジュール１２０が重層されており、PCRハンド１０８によって、PCR反応装置１１９の上に搬送される。
【００６２】
PCRモジュール１２０がPCR反応装置１１９の上に搬送された後、PCRモジュール１２０内部の各反応セルに、PCR試薬カップストッカー１１６に収容された容器中のPCR混合液が分注される。該分注も前記ピペット手段によってなされる。PCRモジュール１２０上に配列されている試料注入口（図７参照）に、ピペット手段に取り付けたピペットチップの先端部を挿入した後、PCR混合液を吐出する。吐出されたPCR混合液はPCRモジュール１２０内部の反応セル内に達する。PCR混合液の容量は、100μL以下であることが好ましい。ここで、PCR後の反応セルは、洗浄で再使用するよりも新たに交換する方がコンタミネーションも無く、正確な検査を実施できるので、上記のように交換式のモジュールにした利点は大きい。
【００６３】
PCR反応装置１２１は、PCRモジュール１２０の加熱体に通電して、PCRモジュール１２０の各反応セル内のPCR混合液を加熱する機能、及び加熱されたPCR混合液を冷却する機能を有する通常のPCR増幅装置である。
【００６４】
PCR反応装置１２１には、従来型のモジュール（例えば特開平１０−１１７７６４参照）も装着して使用し得るように適宜の位置決め手段や加熱手段を設けたり、共通の枠体を設けた構造となっているので、汎用性に優れている。
【００６５】
PCRの反応サイクルは、典型的には、熱変性ステップ、アニーリングステップ、及び伸長反応ステップの繰り返しからなり、ＰＣＲ反応装置１２１によって、各ステップに適した温度になるように加熱・冷却を行う。これらの操作は、当業者には周知のものであり、温度、反応時間、サイクル数の設定は、検査者によって、宜選択され得る。冷却の方式は、コンプレッサー方式、ペルティエ方式を含む任意の方式であり得る。
【００６６】
PCR反応が終了した後、増幅された核酸を含むPCR混合液は、ピペット手段によって濃縮用ヒートブロック１１２にセットされたサンプルカップに移され、ディネーチャー反応が行われる。サンプルカップには、PCR混合液を加える前又は加えた後に、好ましくはPCR混合液を加える前に、ディネーチャー溶液収納部１２４に収納されているディネーチャー溶液が添加される。ディネーチャー溶液は、グアニジウム塩、尿素、界面活性剤等を含む周知の核酸変性液である。
【００６７】
濃縮用ヒートブロック１１２は、好ましくは90〜95℃に加熱され、増幅された核酸は変性して一本鎖になる。加熱は、3〜5分程度行えばよいであろう。
【００６８】
核酸増幅工程において、非対称PCR反応、すなわちプライマー対の一方のみ過剰に加えたPCR反応を行えば、ディネーチャー工程は省略することも可能である。
【００６９】
このような変性処理を施したPCR混合液は、ポンプ１０７とピペット手段によって、予めハイブリダイゼーション試薬カップストッカー１１８に収納されている各サンプル管に移される。該サンプル管には、ピペット手段によって、ハイブリダイゼーション試薬１１７が予め添加されている。ピペット手段に取り付けられたチップは、廃棄箱１１３に廃棄される。
【００７０】
ハイブリダイゼーション試薬１１７は、5×SSC(NaCl、クエン酸ナトリウム混合液)、10% SDS、10×Denhardt)を含む溶液であり得る。
【００７１】
ハイブリダイゼーション試薬１１７を添加した後、PCR混合液は検体毎に、反応部１２８にセットした反応トレイ１２６中に載置されている各反応素子１２５上に分注される。分注されるPCR混合液の容量は、典型的には数十μLである。
【００７２】
反応素子１２５は、ロボットアーム１０５によって、反応トレイ１２６の少なくとも一面に形成された、反応素子１２５を収容するための反応素子収容孔８０２（図８）の中に載置される。
【００７３】
反応トレイ１２６は、自動化に適するように、図８〜１０に示した構造を有するトレイを使用することが好ましい。
【００７４】
図８は、好ましい構造を有する反応トレイ８０１の上面図である。反応トレイ８０１は伝熱性の良い部材、例えばアルミ、真ちゅう、銅等を成形したものであり、反応トレイ８０１の一面には、反応素子収容孔８０２が８個設けられている。反応素子収容孔８０２は、１以上の任意の個数であり得る。
【００７５】
図９は、反応素子収納孔８０２を拡大した上面図であり、図１０は、図９の線A-A'での断面図である。
【００７６】
反応素子収納孔８０２は、開口部方向に拡幅する傾斜部分８０３、傾斜部分８０３の下部に連続して設けられた垂直部分８０４、底面上に配設された突起８０５、及び反応素子収納孔８０２の一隅に形成された陥入部８０６を具備する。
【００７７】
垂直部分８０４は、収容すべき反応素子が動かないように、小型の反応素子のサイズと適合するような大きさであるために、垂直部分８０４の内部には、反応素子を握持するためのロボットアーム１０５を挿脱する際の位置決めが難しい。このため、反応素子収容孔８０２は、ロボットアーム１０５を挿入するための空間として傾斜部分８０３を備えている。もし、傾斜部分８０３がなければ、開口部分の大きさは反応素子とほぼ同じ大きさとなるため、反応素子収納孔８０２に反応素子を出し入れすることが極めて困難となる。傾斜部分８０３の開口部の大きさは、反応素子を握持したロボットアーム１０５を挿入し得る任意の大きさであり得る。
【００７８】
反応素子収納孔８０２の内部において、反応素子は突起８０５の上に載置される。反応素子収納孔８０２には、サンプル及び洗浄液等の液体が添加されるので、突起８０５がなければ、反応素子収納孔８０２の底面と反応素子の間に液体が浸潤し、反応素子の取り出しが困難となる。反応素子を安定に載置し得るように、各突起の高さは、同じであることが好ましく、２つ以上、好ましくは４つ以上配設することが好ましく、突起８０５の位置は反応と測定を行う領域、例えば中央部分を避けた領域に設けるのが好ましい。
【００７９】
陥入部８０６は、反応素子収納孔８０２の底面と略同一の深さで且つ突起８０５より低位置の深さを有しており、洗浄・乾燥装置１２９に取り付けられたノズル１３０を最適な位置に移動させることを可能にする程度に十分に反応素子収納孔８０２の対角線方向に延在させた空間である。すなわち、陥入部８０６が存在すれば、ノズル１３０を陥入部８０６の内部に移動させることができるので、ノズル１３０が移動し得る領域が増大し、洗浄液等を最適な位置に吐出又は吸引することができる。陥入部８０６は、１以上設けてもよく、開口部の周縁に設置してもよい。
【００８０】
なお、図９の陥入部８０６以外の３つの小さな陥入部は、精密に反応素子収納孔８０２を形成する上で予め設けられるものであって、材質や製法によっては必須な部分ではない。
【００８１】
反応トレイ１２６は、反応前には、反応トレイ収納箱に収納されており、反応時に、ロボットアーム１０４によって、反応部１２８に移される。
【００８２】
反応トレイ１２６上の反応素子収納孔８０２の中に載置される反応素子１２５は、所望の核酸が高密度に固相されており、一般にDNAチップ又はマイクロアレーと称されるものである。
【００８３】
反応素子の材質は、表面形状が平坦で微細加工に適した任意の材質であり得る。従って、該反応素子の材質は、ガラス、シリコン単結晶板、石英、パイレックス等の非晶質、アルミニウム、ステンレス等の金属、フッ素樹脂、ポリプロピレン等のプラスチックであり得る。シリコン単結晶板は、周知の半導体プロセス技術により容易に加工できるので最も好ましい。
【００８４】
反応素子１２５は、加工の容易さから矩形状であることが好ましいが、例えば、菱形、六角形及び八角形等の多角形、円形、楕円形のような任意の形状であり得る。
【００８５】
反応素子１２５は、任意の大きさであり得るが、形状が長方形である場合、長辺が0.1〜15cm、短辺が0.1〜15cmであることが好ましい。反応素子１２５の厚さは、0.01〜0.5cmであり得る。
【００８６】
反応素子１２５に核酸分子を固相する方法は公知であり、例えばScience 251:767-773(1991)に開示されている。
【００８７】
該方法の概略は、
▲１▼シリコン基板上にシラン処理を施すことにより、該基板上にアミノ基を形成し、各アミノ基に光保護分子を結合させる、
▲２▼マスクを用いることにより、所望の位置に選択的に紫外線を照射し、該所望の位置の光保護分子を外して、該位置のアミノ基のみを露出せしめる、
▲３▼露出したアミノ基のみに、光保護分子を連結させた所望の核酸塩基を結合させる、
▲４▼ ▲２▼ 及び▲３▼の工程を繰り返し、核酸分子を伸長させるというものである。
【００８８】
また、国際公開WO93／09668号（特表平7-506561号）、国際公開WO99/11754号にも核酸分子を固相化するための他の改良法が開示されており、当業者に公知の任意の方法を用いて核酸分子を固相化し得る。
【００８９】
一般的には、1cm2の反応素子１２５に、数千種類以上の核酸分子を固相化することができる。従って、反応素子１２５を用いれば、多項目の検査を同時に実施することが可能となる。
【００９０】
反応素子１２５に、核酸に代えて、又は核酸とともに核酸以外の物質を固相化してもよい。核酸以外の物質としては、抗体を含むタンパク質が含まれる。反応素子１２５に抗体を固相化すれば、免疫検査が可能である。
【００９１】
反応素子を用いると、多項目の検査を短時間で実施し得るので、本発明の自動核酸検査装置には反応素子を適用することが極めて好ましいが、反応素子を使用しない方法も可能である。このような方法としては、古典的なゲル電気泳動法の他、プラズモン共鳴検出法を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９２】
反応素子１２５上に固相されている核酸と、ハイブリダイゼーション試薬１１７を添加した前記PCR混合液中の被増幅核酸との反応は、下方に図示せぬヒーターを配備した反応・洗浄・乾燥装置１２９上で行われる。加熱温度及び反応時間の目安は、それぞれ40〜50℃、30〜120分程度であるが、所望の核酸の塩基組成に応じて適宜設定すればよい。
【００９３】
キャリブレーションの目的で使用する標準トレイは、標準品収納部１３１に収納されている。キャリブレーションを行うことによって、楕円偏光測定（反射強度）結果から、ハイブリダイゼーション後の反応素子の厚さ、密度変化等を定量化できる。
【００９４】
ハイブリダイゼーション反応を行った後、反応トレイ１２６は、この反応・洗浄・乾燥装置１２９によって、引き続き洗浄乾燥される。ノズル１３０は反応素子１２５上に洗浄液を吐出するための洗浄液吐出ノズル、洗浄液と混合されたPCR混合液を吸引するための試料吸引ノズル、及び反応素子１２５を乾燥するための空気吹付ノズルを具備し得る。これらのノズルは、自動吐出及び自動吸引を行う目的で用いられる一般的なノズルであり、例えば細い金属であり得る。各ノズル間の切り替えは、例えば電磁バルブによって行われる。
【００９５】
ハイブリダイゼーション反応、洗浄、及び乾燥が終了した後、反応素子１２５は、核酸検出手段１３２に移動され、反応トレー１２６は反応トレー回収部１２７に移送し回収される。
【００９６】
反応素子１２５は壊れやすく、且つ核酸検出手段１３２への装着は精度良く行わなければならないので、反応素子１２５の移動はロボットアーム１０５に取り付けられた空気吸引機構（図示せず）によって行うことが好ましい。空気吸引機構は、反応素子の周辺部（すなわち、検出領域以外の部分）等に、エアポンプ等の空気吸引手段が接続された吸引口を近づけ、前記空気吸引手段によって作り出された陰圧を利用して前記吸引口に反応素子１２５を吸い付け得る装置である。反応素子１２５は、吸引孔に吸い付けられた状態で、核酸検出手段１３２の所定部位まで移動される。
【００９７】
核酸検出手段１３２は、蛍光検出手段、比色計、化学発光検出手段を含む任意の検出手段であり得るが、PCR増幅工程での蛍光ラベル操作等が一切不要であり、且つ多項目を同時に測定し得るので、楕円偏光解析によって検出することが極めて好ましい。
【００９８】
ここで、「楕円偏光解析」とは、膜の光特性を解析することを意味し、より具体的には膜圧と屈折光を測定することを意味する。楕円偏光解析自体は公知であり、典型的には、半導体の膜圧を測定する目的で使用されているが、核酸分析の分野で使用されたことはない。
【００９９】
楕円偏光解析を用いれば、ハイブリッドを形成した部分の厚さの変化（1Å以上）又は密度の変化を検出でき、検出操作は、およそ１分で終了する。
【０１００】
使用し得る楕円偏光解析装置には、比較楕円偏光解析装置、又は折返し光路型比較楕円偏光解析装置が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
楕円偏光解析装置としては、特開平６１−２５８１０４、特開平５―２０３５６４等を参照にした構造を採用することができる。
【０１０２】
核酸検出手段１３２による検出終了後、使用済みの反応素子１２５は、反応素子廃棄箱１３３（ロボットアーム１０３の直下、点線部）に廃棄されるとともに、反応トレー１２６は使用済み反応トレー収納箱１３４に移される。
【０１０３】
核酸検出手段１３２の測定結果は、コンピューター等の情報処理手段１３５で処理された後、ユーザーインターフェース１３６に設けた出力装置（プリンター、好ましくは表示画面）によって出力される。
【０１０４】
以上の工程が、一組のサンプル（図１では８サンプル）の自動検査を行う工程の概要であるが、本発明の主題の範囲の範囲内で、抽出・増幅・検出手段等に多くの修飾又は変更を行い得ることは当業者に自明であろう。例えば、核酸抽出手段としてのフリーフロー電気泳動素子及び／又はキャピラリー電気泳動素子は複数並設して処理能力を高めてもよい。
【０１０５】
一組のサンプルの検査が終了した後には、引き続き次の組のサンプルの検査を実行し得る。検査時間を短縮するためには、一組のサンプルの検査が終了する前に、次の組のサンプルの検査を開始することも有用である。
【０１０６】
【発明の効果】
本発明の自動核酸検査装置によれば、短時間で、正確に、多数の検体について核酸検査を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の自動核酸検査装置内部の上面図。
【図２】本発明の自動核酸検査装置に使用し得るフリーフロー電気泳動を示す図。
【図３】本発明の自動核酸検査装置に使用し得るPCRモジュールを構成する基板の上面図。
【図４】本発明の自動核酸検査装置に使用し得るPCRモジュールを構成する基板の側面図。
【図５】加熱体及び温度検出部が埋設されたPCRモジュールを構成する基板の側面図。
【図６】本発明のPCRモジュールの構成を示す図。
【図７】本発明のPCRモジュールを示す図。
【図８】複数の反応素子収納孔を備えた反応トレーを示す図。
【図９】反応素子収納孔を拡大した上面図。
【図１０】反応素子収納孔を拡大した側面図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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