(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＥＧＦレセプターを発現し且つＥＧＦによって細胞分裂促進を刺激されるヒト腫瘍細胞をもつヒト癌患者に対する有効量の抗腫瘍剤及び有効量のモノクローナル抗体を有効成分として含み、該モノクローナル抗体が２２５ＩｇＧであることを特徴とするヒト腫瘍細胞の成長阻害用治療剤。
【請求項２】
各成分を個別投与する請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
製薬的に許容し得る担体をさらに含む請求項１又は２記載の治療剤。
【請求項４】
ヒトＥＧＦレセプターを発現し且つヒトＥＧＦによって細胞分裂促進を刺激されるヒト腫瘍細胞の成長を阻止するために有効な量のモノクローナル抗体を含む請求項１〜３のいずれか１項記載の治療剤。
【請求項５】
抗腫瘍剤がドキソルビシン又はシスプラチンである請求項１〜４のいずれか１項記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なハイブリッドセルライン、特にヒトＥＧＦレセプターを発現するヒト腫瘍細胞の成長（増殖）を阻止することができる上皮細胞成長因子（epidermal growth factor)（ＥＧＦ）に対するヒトレセプターに特異性をもつモノクローナル抗体の産生のためのハイブリッドセルライン及びそのようにして産生された抗体及びその抗体を有効成分として含有する医薬、そして特にそのＥＧＦレセプター抗体と抗腫瘍剤とを含有する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の生育は可溶性の成長因子と細胞膜レセプターとの相互作用により制御されている。
【０００３】
上皮細胞の細胞分裂刺激（mitogenic stimulation)の最初のステップは上皮細胞成長因子レセプター（ＥＧＦレセプター）として知られる膜のグリコプロティンに上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）が特異的に結合することである。（非特許文献１）。ＥＧＦレセプターは１，１８６個のアミノ酸からなっており、それは６２１個の残基からなる細胞外の部分と５４２個の残基からなる細胞質内の部分とに分けられ、それらは２３個の残基からなる単一の疎水性の細胞膜を横断するセグメントによって結合されている。（非特許文献２）。ＥＧＦレセプターの細胞外の部分は４個のドメインに分けることができる。最近、２個のシステインのドメインによってその側面を接した残基３３３から４６０のドメインIII がレセプターのＥＧＦ結合部分を含んでいるらしいことが示された。（非特許文献３）。ＥＧＦのドメインIII への結合は多面的発現反応（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を引き起こし、ＤＮＡ合成及び細胞増殖に導く。
【０００４】
【非特許文献１】Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４８，１９３−２１６（１９７９）
【非特許文献２】Ｕｌｌｒｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｃＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆｔｈｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ａ−４３１  Ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０９，４１８−４２５（１９８６）
【非特許文献３】Ｌａｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｙｊｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  ｆｏｒ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．８，１８３１−１８３４（１９８８）
【０００５】
ヒト腫瘍細胞がＥＧＦレセプターを過剰に発現していることが各種のヒト腫瘍細胞において見出されてきた。例えば膀胱の腫瘍の癌様の細胞は比較的多数のＥＧＦレセプターを持っていることが示されている。（非特許文献４）。乳癌細胞はＥＧＦレセプター密度と腫瘍の大きさとの間に正の相互関係を持ち、分化の程度とは負の相互関係を持つことを示している。（非特許文献５）；（非特許文献６）。異なったレベルのＥＧＦレセプターを有する無胸腺マウスにヒト外陰部類表皮癌（ｈｕｍａｎ  ｖｕｌｖａｌ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（Ａ４３１）のクローン化変異株を移植しての一連の腫瘍形成性の観察の結果、腫瘍形成性は直接にＥＧＦレセプターの発現レベルに相互関係を持つことが見出された。（非特許文献７）。こうして、ＥＧＦレセプターの過剰な発現は、癌細胞の腫瘍形成のもととなる役割をはたしているとされてきている。
【０００６】
【非特許文献４】Ｎｅａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎＨｕｍａｎ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆＩｎｖａｓｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  Ｔｕｍｏｒｓ，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．１，３６６−３６７（１９８５）
【非特許文献５】Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｏｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．１，３６４−３６６（１９８５）
【非特許文献６】Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓ  ａｎ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  Ｐｏｏｒ  Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．，Ｖｏｌ．３８，１２２５−１２２８；Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ−Ｇｒｏｗｔｈ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｔａｔｕｓ  ａｓ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  Ｅａｒｌｙ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｆｒｏｍ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．１，１３９８−１４００（１９８７））
【非特許文献７】Ｓａｎｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆ  Ａ４３１  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｄｅ  Ｍｉｃｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４６，４７０１−４７００（１９８６）
【０００７】
ＥＧＦレセプター密度の癌細胞の生物的なふるまいに及ぼす影響というものは、該レセプターとのリンガド  ―  すなわち、ＥＧＦまたはトランスホーミング成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＴＧＦ）との相互作用によって仲介されうる。大部分の細胞において、ＥＧＦがＥＧＦレセプターの特定の領域に結合した場合、細胞はその分裂刺激を受ける。腫瘍性の細胞の上皮細胞成長因子レセプターにモノクローナル抗体を結合させることによりヌードマウスに異種移植した腫瘍細胞Ａ４３１のｉｎ ｖｉｖｏでの生長阻害をなしたことを二つのグループが報告している。Ｍａｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．はＥｇＧ２ａ及びＩｇＧ１イソタイプの抗−ＥＧＦレセプターモノクローナル抗体による処置によって、無胸腺マウスに皮下移植されたＡ４３１細胞の腫瘍形成を完全に阻止したことを、その処理を腫瘍細胞の接種した日から始めて示めした。（非特許文献８）：（非特許文献９）。Ｒｏｄｅｃｋ，ｅｔ ａｌはＭａｓｕｉのＩｇＧ２ａのイソタイプのものと異なるモノクローナル抗体を使用し、それはＡ４３１細胞のＥＧＦレセプターに結合し、マウスに異種移植されたＡ４３１細胞の腫瘍の生育を完全に阻止した。（非特許文献１０）。
【０００８】
【非特許文献８】Ｍａｓｕｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｍｉｃｅ  ｂｙＡｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４４，１００２−１００７（１９８４年）
【非特許文献９】Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｉｓｏｔｙｐｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４６，５５９２−５５９８（１９８６）
【非特許文献１０】Ｒｏｄｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｃｅｌｌ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４７，３６９２−３６９６（１９８７）
【０００９】
しかしながら、現在までヒト口部類上皮癌（ｈｕｍａｎ  ｏｒａｌ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＫＢ）あるいはヒト乳房上皮細胞（ｈｕｍａｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）（１８４Ａ１Ｎ４及び１８４Ａ１Ｎ４−Ｔ  ―  併せて「１８４」という）のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでの生育を阻止することを誰一人としていない。ＫＢ及び１８４細胞は共にＥＧＦ−レセプターに関連した研究に用いられていた。
【００１０】
ＫＢ及び１８４細胞は実質的にＡ４３１細胞とは異なっている。特にそれらは上皮細胞成長因子に対する生育応答において異なっている。ＫＢ及び１８４細胞は高濃度の上皮細胞成長因子により生育刺激されるが、Ａ４３１細胞は高濃度の上皮細胞成長因子によっては生育の阻害を受ける。
【００１１】
これらの違い並びに抗−ＥＧＦ−レセプター抗体がｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍の生育を阻止するところのメカニズムの完全な理解がなされていないことは、Ａ４３１細胞のＥＧＦレセプターに結合し、そしてヌードマウスに異種移植されたＡＳ４３１細胞に抗腫瘍活性を示したモノクローナル抗体が同様にヌードマウスに異種移植されたＫＢ細胞あるいは１８４細胞に対し抗腫瘍活性を示すのかどうか正確に決定することをさまたげている。
【００１２】
加えて、ヒトの腫瘍細胞はまた上皮細胞成長因子によって生育刺激を受けることから、ＫＢ及び１８４細胞は、Ａ４３１細胞よりもよりＥＧＦに対する応答において代表的なパターンを提供するものであり、事実ＥＧＦレセプターを発現するヒト腫瘍細胞モデルとして使用されている。（非特許文献１１）。
【００１３】
【非特許文献１１】Ｗｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．９４，２０７−２１２（１９８２）
【００１４】
腫瘍治療の第一目標は腫瘍細胞をすべて殺すことである。細胞を殺してしまう治療用剤は、細胞毒（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）として定義されている。細胞を殺すというよりは単に細胞の増殖を妨害する治療用剤は、細胞増殖抑制剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ）として定義されている。
【００１５】
ＥＧＦレセプターに結合するモノクローナル抗体単独による処置は単に細胞が増えることを阻止しているだけで、これからもモノクローナル抗体は細胞増殖抑制剤として作用している。モノクローナル抗体の細胞増殖抑制作用を持つのみということを克服するため、ヒト上皮細胞成長因子レセプターの細胞外のドメインに特異性を有するモノクローナル抗体をマクロファージあるいはマウスの補体と組み合わせ、Ａ４３１細胞に対する細胞毒反応を得ている。（非特許文献１２）。
【００１６】
【非特許文献１２】Ｍａｓｕｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４６，５５９２−５５９８（１９８６）
【００１７】
それ自体投与して用いられる抗腫瘍剤あるいは化学療法剤は細胞毒剤として有用である。例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）及びシスプラチンのような抗腫瘍剤の利用は当該分野でよく知られている。しかしながらこれらのものは単独で用いた場合患者に対して毒性がある又は副作用があるような量でのみ効果がある。シスプラチンは４週間おきに１回１００ｍｇ／ｍ2 の量を静脈内に投与されそしてアドリアマイシンは２１日おきに１回６０−７５ｍｇ／ｍ2 の量を静脈内に投与される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、ヒトＥＧＦレセプターを発現し且つＥＧＦによって細胞分裂促進を刺激されるヒト腫瘍細胞をもつヒト癌患者に対する有効量の抗腫瘍剤及び有効量のモノクローナル抗体を有効成分として含み、該モノクローナル抗体が２２５ＩｇＧであることを特徴とするヒト腫瘍細胞の成長阻害用治療剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、新規なハイブリドーマセルライン（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）、ＡＴＣＣ  ＨＢ９７６３及び９７６４、に関し、それらはそれぞれその生育培地の上清液の成分として高い特異性を有するモノクローナル抗体、９６及び１０８を与える。セルラインＡＴＣＣ  ＨＢ９７６３及び９７６４は、１９８８年７月２５日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５２に寄託された。この寄託はブタペスト条約に基づいてなされた。該カルチャーは試料の分類に係る最新の請求のあった後すくなくとも５年間及びいかなる場合であってもこの寄託の日の後３０年間は継続して入手しうる。本発明は、ヒトＥＧＦレセプターを発現するヒト腫瘍細胞の細胞膜上に見出されるＥＧＦレセプターに特異的に結合することにより該腫瘍細胞の生育を阻止する新規なモノクローナル抗体を産生するセルラインを提供するものである。
【００２０】
更に、本発明は、
（ｉ）マウスをヒトＥＧＦレセプターを発現する細胞で免疫し；
（ｉｉ）該マウスから脾臓を取り出し、脾臓細胞の懸濁物を作成し；
（ｉｉｉ）融合促進剤の存在下該脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｍｏｕｓｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）とを融合せしめ；
（ｉｖ）融合しなかったミエローマ細胞が生育できない培地を含む分離ウエル中で融合細胞を希釈培養し；
（ｖ）ハイブリドーマを含有する各ウエル中の上清液中のヒトＥＧＦレセプターに対する抗体の存在を測定し；
（ｖｉ）ヒトＥＧＦレセプターの細胞外のドメインに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選別しクローン化し；
そして
（ｖｉｉ）該クローン上にある上清液から抗体を回収する
工程からなることを特徴とする
ヒトＥＧＦレセプターの細胞外のドメインに結合し、そしてヒトＥＧＦレセプターを発現すると共にＥＧＦにより細胞分裂刺激を受けるヒト癌細胞の生育を阻止することのできるモノクローナル抗体の製造法に関する。
【００２１】
本発明は、また上記した工程（ｖｉｉ）を省き、さらなる工程
（ｖｉｉｉ）該クローンをマウス腹腔内に移植し、
（ｉｘ）該マウスから腫瘍化した腹水または血清を採取し、そして該腹水または血清は所望の抗体を含んでいる
を含むことを特徴とするモノクローナル抗体の製造法に関する。
【００２２】
本発明はまた、ヒトＥＧＦレセプターを発現し且つヒトＥＧＦによって細胞分裂刺激を受けるヒト腫瘍細胞の生育を阻止するのに有効な量の新規モノクローナル抗体のいづれか一つと共に医薬担体を含んでなる治療用組成物及びその製造にも関する。
【００２３】
また、驚くべきことにモノクローナル抗体のいずれか一つとドキソルビシン又はシスプラチンのような抗腫瘍剤とを併用すると、ヒトＥＧＦレセプターを発現し且つヒトＥＧＦにより細胞分裂促進の刺激を受けるヒト癌細胞の成長（増殖）を阻止するという点で、抗腫瘍剤又はモノクローナル抗体を単独で用いるよりも著しく有効であることを発見した。本発明者らによる新規なモノクローナル抗体を用いてのこの配合しての処置法は、それが２種の抗癌剤を組み合わせたもので、それぞれは異なったメカニズムによって作用し、ヒトの腫瘍細胞に細胞毒性を発揮することから優れたものである。このような方法は、一方では薬物に対する抵抗性を増大させるとか、一方では腫瘍細胞を抗体に反応しないようにするその腫瘍細胞の抗原性における変化とかのような臨床上生起する問題を解決することができる。さらにまた、驚くべきことにその抗腫瘍剤はそれが単独で投与された時に治療に必要な量であるが患者にとって有毒なあるいは副作用のある量よりも実質的に少ない量で投与しうることが見出された。ドキソルビシンあるいはシスプラチン以外のタキソール、ゲムシタビン、ブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）及びシクロホスフアミドヒドロキシウレアのような抗腫瘍剤もまた新規モノクローナル抗体と一緒に使用することができる。上記であげたものは、単に例としてあげたものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【００２４】
本発明は、また有効量の抗腫瘍剤及び有効量の新規モノクローナル抗体のいづれか一つを、ヒトＥＧＦレセプターを発現し且つヒトＥＧＦにより細胞分裂刺激を受けるヒト腫瘍細胞を持つヒト癌患者に投与し、そしてそこで該抗体は腫瘍細胞のヒトＥＧＦレセプターの細胞外のドメインに結合して、抗原−抗体複合体を形成することからなる該腫瘍細胞の生育阻止方法を提供する。
【００２５】
次なるより詳細な説明を、添附された図面と一緒に参照して本発明をよりよく理解すれば本発明及び多くのそれに付随した利点のより完全な認識が容易に得られよう。
【００２６】
この記載は本発明を特定のものに限定するためと解すべきでなく、当業者がなしうるような変形も本発明の範囲内であると考えられるべきものである。
【実施例】
【００２７】
実施例Ｉ
モノクローナル抗体の産生
Ａ．免疫及び体細胞のハイブリッド化
Ｂａｌｂ／ｃマウスをＣＨ７１細胞またはＣＨ７１細胞膜調製物の腹腔内への注射により免疫した。ＣＨ７１細胞はＥＧＦ−Ｒ  ｃＤＮＡの切断されたかたちのもの（ＥＧＦ−Ｒの細胞内のドメインの大部分が欠失したもの）を有するプラスミドでトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞である。（Ｌｉｎｖｎｅｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６０，１２４９０（１９８６））。このトランスフェクトされた細胞は、ほぼ１０6 個の変異ＥＧＦ−Ｒ分子／細胞を発現する。ＣＨ−７１細胞を選ぶことにより、ＥＧＦ−Ｒの細胞外のドメインに対する抗体を分泌するハイブリドーマのみを最初のスクリーニング試験で選択できそしてヒトＥＧＦ−Ｒ分子に結合しているヒトに特異的な糖類に対して向けられた抗体を選択することを避けることができる。
【００２８】
マウスを第０日目、第１３日目及び第３２日目の３回免疫した。２匹の最も応答性の良いマウスそれぞれに３回ＣＨ７１細胞を３日続けて融合前に腹腔内注射して免疫を促進増強した。次に６５日目にマウスの脾臓細胞をＮＳ１ミエローマ細胞（比率５／１）と、融合剤としてＰＥＧ４０００（Ｍｅｒｃｋ）を用い、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの一般法に従って融合せしめた。（非特許文献１３）。
【００２９】
【非特許文献１３】Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．６，５１１−５１９（１９７６）
【００３０】
Ｂ．ハイブリドーマの選別及び生育
融合生成物をヒポキサンチン−アミノプリテン−チミジン（ＨＡＴ）選択培地の代わりにヒポキサンチン−アザセリン（ＨＡ）選択培地（非特許文献１４）で希釈し、９６ウエルプレートに分けて入れた。
【非特許文献１４】Ｇ．Ｂｕｔｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８１，２７−３６（１９７８）
【００３１】
最初にラジオイムノアッセイによって生育しているハイブリドーマのウエル中の培地の中に特異抗体があるか否か分析した。ＥＧＦレセプターを発現している細胞あるいはＥＧＦレセプターを発現していない細胞を９６ウエルプレート中に入れた。集密状態下、それらを１回結合培地（ＤＭＥＭ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，０．２％ＢＳＡ）で洗滌し、異なった生育ハイブリドーマから得られた１００μｌのカルチャーの上清と一緒にし室温で９０分間インキュベートした。次に細胞を結合培地で３回洗滌し、１００μｌのヨウ素化したヤギの抗マウス免疫グロブリン（２５０，０００ｃｐｍ／１００μｌ）液と共にさらに室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ（リン酸塩緩衝塩液、ｐＨ７．５）で３回洗った後、細胞をウエルからこすり取り、それらの表面に結合した放射活性をガンマ線カウンターを用いて測定した。抗体のＥＧＦレセプターを発現している細胞（ヒトＥＧＦ−Ｒ  ＤＮＡ構築物でトランスフェクトされたＡ４３１、ヒト繊維芽細胞またはマウス３Ｔ３細胞）の表面への特異的な結合能をこの方法で測定し、さらにＥＧＦ−Ｒを発現していない細胞（マウス３Ｔ３細胞の特定のクローン）への結合能と比較した。陽性のハイブリドーマを限界希釈をしてクローン化し、さらに異なった種（ヒト、マウス、ニワトリ）のセルラインのライゼートから得られた35Ｓメチオニンまたは32Ｐで標識されたＥＧＦ−Ｒを免疫沈殿させうるかどうかを測定して調べた。このために、ヤギ抗マウス免疫グロブリンを、プロテインＡ−セファロースに、ヤギ抗マウス抗体溶液とプロテインＡ−セファロースビーズとを室温で３０分間インキュベートすることにより結合させた。次にこれを３回２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４で洗った。次にさらにヤギマウスＩｇコートしたプロテインＡ−セファロースビーズを３０分間室温でハイブリドーマのカルチャーの上清液と共にインキュベートし、ＨＮＴＧ緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセロール）で３回洗滌し、そして、可溶化緩衝液（１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤としてアプロチニン、ロイペプチン及びＰＭＳＦ）でもって細胞の単層を溶菌化し、ライゼートを遠心して核ペレットを除去して得られたいろいろな細胞ライゼートと４℃で１時間インキュベートした。32Ｐで標識するため、免疫沈殿物をＨＮＴＧで３回洗い、次に１５分間32Ｐ  ＡＴＰ溶液（５ｍＭ  ＭｎＣｌ2 及び３μＣｉ／32Ｐ  ＡＴＰ試料を含むＨＮＴＧ）と共にインキュベートした。次に電気泳動試料用緩衝液を加え、７．５％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかける前に試料を１０分間９５℃で煮沸した。モノクローナル抗体１０８、９６及び４２はすべてヒトＥＧＦ−Ｒに対し特異性を持つことが見出された。これらの抗体はまたＥＧＦ−Ｒを発現している細胞の表面にヨウ素化されたＥＧＦが結合するのを阻害する能力について調べられた。これら３種の抗体はＥＧＦの該レセプターへの結合を阻害するが、その阻害の程度は９６＞１０８＞４２というものであった。
【００３２】
実施例ＩＩ
セルラインの培養
Ａ．ヒト口部類表皮癌細胞（ＫＢ細胞）の培養
口部類表皮癌から誘導されたＫＢ腫瘍セルラインはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手された。その細胞は、５６℃で３０分間インキュベートすることにより補体活性をなくした１０％ウシ胎児血清を補なったＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地中で生育させ、そしてグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びピルビン酸ナトリウム中３７℃、５％  ＣＯ2 ；９５％空気下に生育させた。
【００３３】
Ｂ．ヒト乳房上皮細胞（１８４細胞）及びヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−４６８細胞）の培養
１８４Ａ１Ｎ４及び１８４Ａ１Ｎ４−Ｔヒト乳房上皮細胞はＭａｒｔｈａ  Ｓｔａｍｐｆｅｒ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ．により提供された。１８４Ａ１Ｎ４細胞は、グルタミン（０．６ｍｇ／ｍｌ）、ウシ胎児血清（０．５％）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、インシュリン（５μｇ／ｍｌ）及びＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補なった１ＭＥＭ及び５％  ＣＯ2 中で３７℃で保持された。１８４Ａ１Ｎ４−Ｔは、グルタミン（０．６ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清を補なった１ＭＥＭ（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｒｉｌｌｅ，ＭＤ）及び５％  ＣＯ2 中３７℃で保持された。ＭＤＡ−４６８細胞は、１８４Ａ１Ｎ４−Ｔ細胞と同じ条件及び培地中で培養された。
【００３４】
Ｃ．９６ＩｇＭ及び１０８ＩｇＧ２ａハイブリドーマセルラインの培養
１０８ＩｇＧ２ａハイブリドーマセルラインはＥＧＦレセプターを発現しているＣＨ７１細胞でマウスを免疫して生成させ、ＫＢセルラインと同じ条件下に培養した。
９６ＩｇＭハイブリドーマセルラインは、１０８ＩｇＧ２ａハイブリドーマセルラインに対して記載したのと同じ方法で生成させた。
【００３５】
実施例ＩＩＩ
Ａ．動物からのモノクローナル抗体１０８の精製
１０８ＩｇＧ２ａハイブリドーマ細胞を注射した動物の腹水を４℃で１０分間ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で遠心して澄んだ液とした。４℃で飽和硫酸アンモニウムをゆっくりと添加してｐＨ７．５で２４時間かけて最後には４５％（Ｖ／Ｖ）の濃度までにしモノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を１５分間１０，０００ｇで遠心して集め、５０％Ｖ／Ｖの硫酸アンモニウム液、ｐＨ７．５、４℃で２回洗滌した。さらに０．１４Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０中のセファロースＣＬプロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、０．１Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ３．０で溶出し、次にＰＢＳに対して徹底的に透析してモノクローナル抗体１０８を得た。
【００３６】
Ｂ．動物からのモノクローナル抗体９６の精製
９６ＩｇＭハイブリドーマ細胞を注射した動物の腹水を４℃で１５分間３０００ＲＰＭでｌｏｗ  ｓｐｅｅｄ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で遠心して澄んだ液とした。４℃で飽和硫酸アンモニウム液をゆっくりと加え、ｐＨ７．５で２４時間かけて最後には４５％（Ｖ／Ｖ）の濃度までにしてモノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を１０，０００ｇで１５分間遠心して集め、ｐＨ７．５、４℃で５０％Ｖ／Ｖの硫酸アンモニウム液で２回洗滌した。次に沈殿を溶解し、５０ｍＭトリスｐＨ８、０．５Ｍ  ＮａＣｌに対して徹底的に透析した。５０ｍＭトリス、ｐＨ７．８、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中で平衡化したセファクリルＳ−３０００を使用してゲル濾過によってこのものを精製した。モノクローナル抗体ｍＡｂ  ９６を含有するピークをプールして、ＰＢＳに対して透析した。
【００３７】
実際例ＩＶ
モノクローナル抗体１０８のＦ（ａｂ）’2 及びＦ（ａｂ）’フラグメントの精製、比活性及び免疫反応性
モノクローナル抗体１０８（５ｍｇ／ｍｌ）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．９の溶液を３７℃で７時間４％Ｗ／Ｗペプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）存在下消化した。２ＭトリスでｐＨを８．０にあわせて消化を止め、次に４℃でＰＢＳに対して透析した。残りの未反応のＩｇＧ分子をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって除去した。Ｆｃ部及びより小さなフラグメントをセファロースＧ−１００のゲル濾過により除去した。単価Ｆａｂ’フラグメントを調製するため、Ｆ（ａｂ）’2 （２ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で１時間２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．２中で１０ｍＭジチオスレイトールで還元した。３７℃で３０分間４０ｍＭヨードアセトアミド液でアルキル化し、次に４℃でＰＢＳに対して徹底的に透析した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、第１図参照）によっていろいろなフラグメントの純度及び消化が完結していることを分析した。モノクローナル抗体１０８の 125Ｉ−標識化をクロラミンＴ法（非特許文献１５）によって行った。通常約３×１０6 ｃｐｍ／μｇ  ＩｇＧの比活性のものが得られた。 125Ｉ標識１０８のＫＢ細胞上に現われたＥＧＦレセプターへの結合と競合しうる点で天然のままのモノクローナル抗体１０８と比較してモノクローナル抗体１０８のＦ（ａｂ）’2 及びＦ（ａｂ）フラグメントは充分に免疫反応性を有していた（第２図参照）。
【００３８】
【非特許文献１５】Ｈｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ   131Ｉｏｄｉｎｅ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  ＨｕｍａｎＧｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｄ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．１９６，４６５−６，（１９６２）
【００３９】
実施例Ｖ
モノクローナル抗体１０８の結合性
Ａ．細胞表面ＥＧＦレセプターに対するモノクローナル抗体の結合活性
ハイブリドーマ１０８の上清液の抗体結合活性を間接螢光免疫分析法により測定した。ＫＢ細胞（試料当り２×１０6 個）をアッセイ前に２４時間トリプシン処理し、試験管（Ｆａｌｃｏｎ，ポリスチレン製丸底試験管）に入れた。アッセイ前に、ＫＢ細胞懸濁液を冷ＰＢＳで洗滌し、４℃で４５分間１０８ハイブリドーマの上清と共にインキュベートした。１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳで洗った後、４℃で４５分間フルオレツセイン標識したウサギ抗マウスＩｇＧと共にその細胞をインキュベートした。細胞試料をＰＢＳに懸濁し、螢光セルソーター（ＦＡＣＳ  ＩＩ、Ｂｅｃｔｉｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，Ｃａ，ＵＳＡ）でもって分析した（第３図参照）。レセプター発現の均一性を、ヒトＢ型肝炎ウイルスに対して作製されたハイブリドーマ（７Ｈ０１）の上清で観察された染色がないということと比較して少なくとも９６％の細胞において陽性の染色があることによって示した。４℃での抗体結合パラメーターのＳｃａｔｃｈａｒｄ分析は平均２×１０5 結合部位／細胞及び１．８×１０-9Ｍ-1のＫＤを示した。
【００４０】
Ｂ．上皮細胞成長因子とモノクローナル抗体及びそのフラグメントとの競合ラジオイムノアッセイ
ＫＢ細胞（２４ウエルプレート中の１０5 個／ウエル；ＮＵＮＣ）を２４時間生育させ、ＰＢＳで洗滌し、４℃、あるいは室温で１時間１％ウシ血清アルブミンを含有するＤＭＥＭ中天然のままの抗体またはそのフラグメントの各種の濃度のものと、 125Ｉモノクローナル抗体１０８（約１×１０6 ｃｐｍ／ｍｌ）存在下にインキュベートした。次に細胞を洗滌し、０．５Ｎ  ＮａＯＨ液で可溶化し、その放射活性をカウンター（Ｋｏｎｔｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定した。非特異的な結合は、１００倍過剰量の非標識モノクローナル抗体を加えて測定した。結果を、非標識抗体と共にインキュベートした細胞に結合した放射活性の、冷抗体を加えることなしにインキュベートした細胞に結合した放射活性に対するパーセンテイジとして表わした。
【００４１】
ＥＧＦは、最大で約７０％まで抗体のレセプターへの結合と競合している。（第２図参照）。
【００４２】
Ｃ．ｉｎ  ｖｉｖｏでの放射能標識されたモノクローナル抗体１０８の分布
ＫＢ細胞（４×１０6 個）をヌードマウス（５−６週令）の背部に皮下接種した。１４日後腫瘍が約１．２ｃｍの直径に達した時 125Ｉモノクローナル抗体１０８を静脈内あるいは腹腔内に注射した（５×１０6 ｃｐｍ：３×１０6 ｃｐｍ／μｇ）。コントロールとしてヒトＢ型肝炎ウイルスに対する 125Ｉ−モノクローナル抗体７Ｈ０１  ＩｇＧ２ａを用いた。抗体を投与して４日たってから動物を殺して、各種組織中の放射活性を測定した。少なくとも各群あたり４匹の動物の平均を示した。（第４図参照）。
【００４３】
標識化したモノクローナル抗体１０８の静脈及び腹腔内への投与では共に抗体は腫瘍部分に集まっていた。コントロールＩｇＧの投与の場合静脈内投与では腫瘍部では何らの濃度もなかったが、腹腔内投与の方では腫瘍の縁部に少し存在していた。静脈内投与後９６時間での腫瘍部に蓄積した投与物のパーセンテージはそれぞれモノクローナル抗体１０８で７．８±１．１、モノクローナル抗体７Ｈ０１（コントロール抗体）で０．８±０．１であり、腹腔内投与ではそれぞれモノクローナル抗体１０８で７．５＋０．４、モノクローナル抗体７Ｈ０１で１．８±０．２であった。
【００４４】
実施例ＶＩ
モノクローナル抗体９６の結合性
Ａ．上皮細胞生長因子とモノクローナル抗体９６との競合ラジオイムノアッセイ
２４−ウエルプレート中の洗滌され集密的ＭＤＡ−４６８細胞単層を４℃で２．５時間各種濃度の結合緩衝液（ＩＭＥＭ、０．１％  ＢＳＡ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ）中の抗体または非標識ＥＧＦと共にあるいはそれらなしにインキュベートした。〔 125Ｉ〕ＥＧＦ（Ｓ．Ａ．８０−１６０μＣｉ／μｇ、ＩＧＮ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＣＡ）を終濃度１ｎＭとなるよう加えた。インキュベーション後、単層細胞を洗滌し、溶菌用緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ、ｐＨ７．４）でもって可溶化し、放射活性をガンマ線カウンター（ＬＫＢ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて測定した。
【００４５】
４種の抗体すべて標識化したＥＧＦの結合を阻害することができたが、非特異的なＩｇＧまたはＩｇＭは無効であった。細胞の生長を阻害するのに最も有効であった２種の抗体（１２５ＩｇＭ及び２２５ＩｇＧ）もまた〔 125Ｉ〕ＥＧＦの結合を阻害するのに最も効果があった。これらの抗体は非標識ＥＧＦよりも多くの程度まで〔 125Ｉ〕ＥＧＦの結合を阻害することができた。（第１７図参照）
【００４６】
実施例ＶＩＩ
モノクローナル抗体１０８の有用性
Ａ．ＫＢ細胞のコロニー阻害アッセイ
ＫＢ細胞を２×１０2 細胞／皿の濃度でペトリ皿（５０×１５ｎＭ2 、ＮＵＮＣ）中にまいた。１６〜２４時間後、培地を、ＥＧＦを含むあるいは含まないモノクローナル抗体１０８の天然のものあるいはフラグメント化したものの各種濃度のものを含有する新鮮なもので置きかえた。６日目にカルチャーを上記の成分を含有する新鮮な培地に再び植えた。１５日目にＰＢＳで洗滌し、４％Ｖ／ＶホルムアルデヒドのＰＢＳ液で１５分間固定し、ヘマトキシリンで染色した。次に形成されたコロニー数（２５細胞）を測定した。
【００４７】
第４図はＫＢ細胞に及ぼす増加する濃度のＥＧＦ及びモノクローナル抗体１０８の効果を示している。ＫＢ細胞をＥＧＦ（１６０ｎＭ）にさらすと、その成長因子なしでインキュベートされた細胞に比較して植えた後１５日して（処理を開始してから１４日後）測定したコロニー数は１５０％まで増加していた。加えてＥＧＦはＫＢ細胞のコロニーの大きさを増加させた。同様の実験をモノクローナル抗体１０８（１．６μＭ）の存在下行なうと、細胞のコロニー数はコントロール値の３０％にまで減少させた。さらに、コロニー数を５０％増大させるような濃度のＥＧＦと共に１００倍過剰量のモノクローナル抗体１０８ではそのコロニー数をコントロール値の２０％にまで減少させた。同じ条件下では、モノクローナル抗体１０８のＦ（ａｂ）’2 フラグメントではＫＢのコロニー数に何の影響も与えなかった。しかし、ＥＧＦに対して１００倍過剰な量を用いた時、Ｆ（ａｂ）’2 フラグメントは形成されたコロニーの数に及ぼすＥＧＦの効果を打ち消すことができた（１５０％〜１０３％）。同じ濃度のジニトロフェニル（ＤＮＰ）に対するモノクローナル抗体とのインキュベートでは形成されたコロニー数に何らの影響もなかった。（第５図参照）。
【００４８】
Ｂ．ヌードマウスにおけるモノクローナル抗体１０８及びそのフラグメントの抗腫瘍活性
ＫＢ細胞（２×１０6 ）をヌードマウスに皮下注射し、次に腫瘍細胞の注射の後第１日目から始めて１回または数回間隔をおいたモノクローナル抗体１０８の投与を行なった。腫瘍パラメーターを週に２回カリパスでもって測定し、その容積を次式に従って計算した：
腫瘍容積（ｎＭ3 ）＝長さ×幅×高さ。
測定値を確認するため、動物を殺した時に腫瘍の容積と腫瘍の重量との相互関係を評価した。
【００４９】
ヌードマウスにおけるＫＢ細胞の生育の阻止能をその抗体について測定した。（第６図参照）。腫瘍接種後第１日目、第５日目、第１２日目及び第１８日目に動物は１ｍｇのモノクローナル抗体１０８あるいはコントロールのジニトロフェニルに対するモノクローナル抗体のいずれかを受けた。フラグメントＦ（ａｂ）’2 及びＦａｂ’は抗体と等価の量投与された。コントロールのモノクローナル抗体で処理された群と比較してモノクローナル抗体１０８で処理された群は顕著に腫瘍の拡大及び生育を阻害した（Ｐ＜０．０１７、スチューデントテスト）。Ｆ（ａｂ）’2 は腫瘍の生育に影響を及ぼすことが見出されたが、全抗体よりも効果が劣っていた（Ｐ＜０．０５、第１２日目、第１７日目、第２２日目及び第２５日目のスチューデントテスト）。Ｆａｂ’フラグメントは腫瘍の生育に何の影響も与えなかった。腫瘍細胞の注射後第１日目に天然のままのモノクローナル抗体１０８の２ｍｇの１回の投与は、腫瘍の接種後第１日目、第５日目、第１２日目及び第１８日目にそれぞれ１ｍｇづつ計４回処理されたものと同じ効果を有していることが見出された。別の実験において、動物を０．６６ｍｇのＦ（ａｂ）’2 フラグメントで１回投与処理した時、抗腫瘍効果はわずかに劣るけれども、コントロール群と処理群との間には顕著な差異がＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ分析法（第９日目、第１２日目、第１４日目、第１７日目でＰ＜０．０３）及びスチューデントテスト（ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔｅｓｔ）（第９日目、第１２日目でＰ＜０．０５）を用いて見出された。動物を殺した時に腫瘍は測定され、次に重量測定のため取り出された。腫瘍の容積と腫瘍の重量との間の関係係数は０．９５（Ｐ＜０．０００１）であった。
【００５０】
Ｃ．腹腔内での腫瘍の成長
転移形態のＫＢ腫瘍を細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）に注射することによって得ることができた。１．５×１０6 個のＫＢ細胞を注射されたマウスは、その移植後４−６週間で肺に腫瘍結節を作った。この腫瘍モデルは、腫瘍細胞で内部器官に浸透していくという臨床上の条件に似たものである。このことは癌治療の上での主要の問題点である。ＫＢ細胞の注射につづいて、その腫瘍の注射の後第６日目、第９日目及び第１３日目に．５ｍｇのモノクローナル抗体１０８を計３回静脈内注射した。実験の終りに、肺を取り出し、４％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに埋め込んだ。４−５μｍの厚さに連続してスライスし、ヘマトキシリンで染色した。肺を通るいろいろな深さの転移性の結節の数が光顕微鏡検査分析法により得られた。動物が有していた肺の腫瘍から３種の転移性細胞クローンを単離し、そのレセプターレベルをアッセイし、レセプターの発現があることがわかった。抗体による処理は肺の腫瘍の結節の数を、それぞれのコントロールの１５％にまで減少させた。（Ｐ＜０．０５  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ分析法）。（第８図参照）
【００５１】
実際例ＶＩＩＩ
モノクローナル抗体９６の有用性
Ａ．１８４Ａ１Ｎ４及びＭＤＡ−４６８細胞の生育の９６による阻止
１８４Ａ１Ｎ４及びＭＤＡ−４６８細胞を３本の２４−ウエルプレートのウエルの中に入れ（５，０００／ウエル）、抗体を加える前に付着させておいた。１８４Ａ１Ｎ４の生育培地は１ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及びＥＧＦと共に同時に生育培地中に加えられたいろいろな量のＥＧＦＲ抗体を含んでいた。ＭＤＡ−４６８の生育培地はどんなＥＧＦも含んでいなかった。生育培地を４８時間後に交換し、４日後に細胞を測定した。生育実験の最後に細胞をトリプシン−ＥＤＴＡでもって収穫し、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄａｔａセルカウンター（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄａｔａ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｍｈｕｒｓｔ，ＩＬ）を用いて測定した。コントロール細胞数％（平均±ＳＤ）で示した。９６ＩｇＭ（●）、４２ＩｇＭ（○）、非特異的なＩｇＭ（△）、２２５ＩｇＧ（■）、１０８ＩｇＧ（□）、非特異的なＩｇＧ（▲）。（第１３図参照）。
【００５２】
Ｂ．１８４Ａ１Ｎ４細胞に対する９６のコロニー阻止アッセイ
１８４Ａ１Ｎ４−Ｔ細胞を０．４％  Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＩＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及び処置を含有する半固体寒天培地中に懸濁した。細胞を３本の１ｍｌ  ＩＭＥＭ、０．６％寒天及び１０％ＦＢＳを含有する３５ｍｍ培養皿に入れた（１０，０００個／皿）。１０−１４日間３７℃で５％  ＣＯ2 中で２０ｎＭ  ａＥＧＦＲまたは２０ｎＭ非特異的な抗体の存在下そしてＥＧＦの濃度を大きくしながらその皿をインキュベートした。６０μｍより大きなコロニーの数を平均（±ＳＤ）で示した。Ａ）ＩｇＧ：２２５ＩｇＧ（●）、１０８ＩｇＧ（○）、非特異的なＩｇＧ（△）。Ｂ）ＩｇＭ：９６ＩｇＭ（○）、４２ＩｇＭ（●）、非特異的なＩｇＭ（△）。直径が６０μｍより大きな細胞のコロニーはＢａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂコロニーカウンターを用いて測定した。（第１５図参照）
【００５３】
Ｃ．ＭＤＡ−４６８細胞に対する９６のコロニー阻止アッセイ
ＭＤＡ−４６８細胞を０．４％  Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＩＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及び処置を含有する半固体寒天培地中に懸濁した。細胞を３本の１ｍｌ  ＩＭＥＭ、０．６％寒天及び１０％ＦＢＳを含有する３５ｍｍ培養皿中に入れた（１０，０００個／皿）。１０−１４日間３７℃で５％  ＣＯ2 中で２０ｎＭ  ａＥＧＦＲまたは２０ｎＭ非特異的な抗体の存在下そしてＥＧＦの濃度を大きくしながらその皿をインキュベートした。６０μｍより大きなコロニーの数を平均（±ＳＤ）で示した。Ａ）ＩｇＧ：２２５ＩｇＧ（●）、１０８ＩｇＧ（△）、非特異的なＩｇＧ（▲）、ＥＧＦ単独（○）。Ｂ）ＩｇＭ：９６ＩｇＭ（△）、４２ＩｇＭ（●）、非特異的なＩｇＭ（▲）、ＥＧＦ単独（○）。直径が６０μｍより大きな細胞のコロニーはＢａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂコロニーカウンターを用いて測定した。（第１６図参照）。
【００５４】
実施例ＩＸ
モノクローナル抗体１０８のドキソルビシンと共に投与した場合の有用性
ＫＢ細胞を注射して皮下に腫瘍をつくった。腫瘍を注射した後２４時間目及び３−４日の間隔を置いて３回、０．４５ｍｇのモノクローナル抗体１０８と３７．５μｇのドキソルビシン（アドリアマイシン）を計４回投与した。腫瘍の容積をコントロールと比較した：リン酸塩緩衝液、抗体単独あるいは薬剤単独。（第９図参照）
【００５５】
モノクローナル抗体１０８のシスプラチンと共に投与した場合の有用性
ａ）１．８ｍｇのモノクローナル抗体１０８及び１００μｇシスプラチンでもって皮下に２×１０6 個のＫＢ細胞を接種後２４時間して１回投与処理した。結果を第１０図に示す。
ｂ）腫瘍の移植後２０時間目に１．９ｍｇのモノクローナル抗体１０８と０．１μｇのシスプラチンを別々の注射器で静脈内に１回投与処理した。配合治療の場合にはそれぞれのもの単独による治療に比して顕著に優れていた（Ｐ＜０．０２、スチューデントテスト、Ｐ＜０．００７  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ分析法）。（第１１図参照）
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１はモノクローナル抗体の１０８のＦ（ａｂ）’2 及びＦ（ａｂ）調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。非還元条件下でゲル泳動はなされた。ａ）未処理モノクローナル抗体１０８、ｂ）未精製Ｆ（ａｂ）’2 フラグメント調製物、ｃ）精製Ｆ（ａｂ）’2 、ｄ）Ｆａｂフラグメント、ｅ）分子量マーカー、ＫＤ。
【図２】図２はＫＢ細胞への 125Ｉモノクローナル抗体１０８及びそのフラグメントとＥＧＦとの競合結合を示す。ＫＢ細胞は３×１０-9Ｍの 125Ｉモノクローナル抗体（１×１０6 ｃｐｍ／ｍｌ）の存在下、異なった濃度ＥＧＦ（●）、非標識モノクローナル抗体１０８（○）、そのＦ（ａｂ）’2 、フラグメント（▲）あるいはＦａｂ’フラグメント（■）の存在下に培養した。（３個の独立した測定値の平均）。
【図３】図３はモノクローナル抗体１０８のＫＢ細胞への結合をセルソーター分析したものである。
【図４】図４はヌードマウスに移植されたＫＢ細胞に対する 125Ｉモノクローナル抗体１０８の付着を示す。
【図５】図５はＫＢ細胞のコロニー形成におけるＥＧＦ及びモノクローナル抗体１０８の及ぼす効果を示す。コロニー形成のアッセイは実施例に記載されているようにして異なった濃度のＥＧＦ（●）及びモノクローナル抗体１０８（■）の存在下に行われた。
【図６】図６は、ヌードマウスに移植されたＫＢ細胞に対するモノクローナル抗体１０８及びそのフラグメントの抗腫瘍活性を示している。各群は少なくとも６匹のマウスからなっていた。マウスは腫瘍の接種の後第１日目、第５日目、第１２日目及び第１８日目にその静脈内に、１ｍｇのモノクローナル抗体１０８（■）、１ｍｇのＤＮＰに対するモノクローナル抗体（○）、０．６６ｍｇのモノクローナル抗体１０８のＦ（ａｂ）’2 、フラグメント（▲）、あるいはＦａｂ’フラグメント（◆）を投与して処理された。また、腫瘍細胞を注射した後１日に２ｍｇのモノクローナル抗体１０８で１回処理した（●）。
【図７】図７はヌードマウスの腹腔内に移植されたＫＢ細胞に対する１０８ｍＡｂの抗腫瘍活性を示すものである。７匹のマウスは腫瘍の接種の後第１日目、第４日目及び第７日目にその静脈内に０．５ｍｇのモノクローナル抗体１０８（−−−）またはＤＮＰに対する抗体（８匹のマウス）を投与して処理された。
【図８】図８はヌードマウスの静脈内に注射されたＫＢ細胞に対する１０８ｍＡｂの抗腫瘍活性を示すものである。ａ）微小転移巣を示している１．５×１０6 個のＫＢ細胞を静脈内に注射した後６日後の肺の組織：×２５０倍。ｂ）マウスは腫瘍の接種後第６日目、第９日目及び第１３日目に０．５ｍｇのモノクローナル抗体１０８を静脈内投与されて処置された。それぞれの点は、動物の肺を通して異なった深さ採取された一連の部分の分析を示している。
【図９】図９は、皮下に移植されたＫＢ細胞に対する１０８ｍＡｂのドキソルビシンと組み合わせた場合の抗腫瘍活性を示している。０．４５ｍｇのモノクローナル抗体１０８と３７．５μｇのドキソルビシンを４回すなわち、腫瘍の注入後２４時間して及び３〜４日の間隔をおいて３回これを繰り返して投与した。
【図１０】図１０は皮下に移植されたＫＢ細胞に対する１０８ｍＡｂのシスプラチンと組み合わせた場合の抗腫瘍活性を示している。図１０においては１．８ｍｇのモノクローナル抗体１０８及び１００μｍのシスプラチンを含有するもので１回投与処置された。各物質は別々に注射された。ＰＢＳ（●）、モノクローナル抗体（▲）、シスプラチン（■）、及びモノクローナル抗体＋シスプラチン（◆）。
【図１１】図１１は皮下に移植されたＫＢ細胞に対する１０８ｍＡｂのシスプラチンと組み合わせた場合の抗腫瘍活性を示している。図１１では、マウスは腫瘍の移植後２０時間して１回、静脈内に、１９ｍｇのモノクローナル抗体１０８及び０．１ｍｇのシスプラチン（Ａｂｉｃ，Ｒａｍａｔ−Ｇａｎ，Ｉｓｒａｅｌ）を投与処理された。各物質は別々に注射された。ＰＢＳ（●）、モノクローナル抗体（▲）、シスプラチン（■）、及びモノクローナル抗体＋シスプラチン（◆）。
【図１２】図１２は細胞の生育に及ぼすＥＧＦの効果を示している。Ａ）１８４Ａ１Ｎ４細胞。Ｂ）ＭＤＡ−４６８細胞。１８４Ａ１Ｎ４細胞は３本の２４−ウエルプレートのウエルに入れられ（５，０００個／ウエル）、ＥＧＦを加えられた。ＭＤＡ−４６８細胞は３本の２４−ウエルプレートのウエルに入れられ（５，０００個／ウエル）、１晩付着させておかれた。次の日にＥＧＦを加えた。培地を４８時間後に交換し、４日後に細胞を数えた。平均（±ＳＤ）細胞数を示した。
【図１３】図１３は、付着依存性の細胞の生育の抗−ＥＧＦレセプター抗体（ａＥＧＰＲ）の阻害を示すものである。１８４Ａ１Ｎ４細胞（Ａ及びＢ）及びＭＤＡ−４６８細胞（Ｃ及びＤ）は３本の２４−ウエルプレートのウエルに入れられ（５，０００個／ウエル）、抗体を加える前に付着させておかれた。１８４Ａ１Ｎ４の生育培地は１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含有していた。４８時間後生育培地を交換し、４日後に細胞を数えた。細胞数（平均±ＳＤ）のコントロールに対する％を示した。９６ＩｇＭ（●）、４２ＩｇＭ（○）、非特異的なＩｇＭ（△）、２２５ＩｇＧ（■），１０８ＩｇＧ（□）、非特異的なＩｇＧ（▲）。
【図１４】図１４は、ＥＧＦによる付着依存性の細胞の生育のａＥＧＦＲ阻害の逆転を示すものである。細胞は３本の２４−ウエルプレートのウエルの中に入れられた（５，０００個／ウエル）。１８４Ａ１Ｎ４細胞（Ａ及びＢ）はＥＧＦ及び抗体を加える前にＥＧＦを含まない培地中で４時間付着させておかれた。ＭＤＡ−４６８細胞（Ｃ及びＤ）は一晩置いておかれた。抗体を２０ｎＭの終濃度となるように加えた。培地を４８時間後交換し、４日後に細胞を数えた。細胞数を平均（±ＳＤ）で示した。９６ＩｇＭ（●）、４２ＩｇＭ（○）、非特異的なＩｇＭ（△）、２２５ＩｇＧ（■），１０８ＩｇＧ（□）、非特異的なＩｇＧ（△）。
【図１５】図１５は、モノクローナルａＥＧＦＲによる１８４Ａ１Ｎ４−Ｔのコロニー形成の阻害を示すものである。細胞は実施例ＶＩＩＩ（Ｂ）に記載したように軟寒天中で、２０ｎＭ  ａＥＧＦＲまたは２０ｎＭ非特異的な抗体の存在下ＥＧＦ濃度を増大させながら生育させた。６０μｍより大きいコロニーの数を平均（±ＳＤ）で示した。Ａ）ＩｇＧ：２２５ＩｇＧ（●）、１０８ＩｇＧ（○）、非特異的なＩｇＧ（△）。Ｂ）ＩｇＭ：９６ＩｇＭ（○）、４２ＩｇＭ（●）、非特異的なＩｇＭ（△）。
【図１６】図１６は、ＭＤＡ−４６８コロニーの形成に及ぼすａＥＧＦＲの効果を示すものである。細胞は実施例ＶＩＩＩ（Ｃ）に記載したように軟寒天中で、２０ｎＭのａＥＧＦＲまたは非特異的な抗体の存在下ＥＧＦ濃度を増大させながら生育させた。細胞はまたＥＧＦ単独下でも生育させた。６０μｍより大きいコロニーの数を平均（±ＳＤ）で示した。Ａ）ＩｇＧ：２２５ＩｇＧ（●）、１０８ＩｇＧ（△）、非特異的なＩｇＧ（▲）、ＥＧＦ単独（○）。Ｂ）ＩｇＭ：９６ＩｇＭ（△）、４２ＩｇＭ（●）、非特異的なＩｇＭ（▲）、ＥＧＦ単独（○）。
【図１７】図１７は、ＭＤＡ−４６８細胞に結合する〔 125Ｉ〕ＥＧＦに及ぼすａＥＧＦＲの効果を示すものである。２４−ウエルプレート中の集密的ＭＤＡ−４６８細胞をヨウ素化したＥＧＦ（１ｎＭ）及び非標識抗体またはＥＧＦの濃度を大きくしながら２．５時間４℃でインキュベートした。２または３つの別々の実験から二つの測定の平均（±ＳＤ）を示した。Ａ）２２５ＩｇＧ（△）、１０８ＩｇＧ（◇）、非特異的なＩｇＧ（▽）、ＥＧＦ単独（●）。Ｂ）ＩｇＭ：９６ＩｇＭ（●）、４２ＩｇＭ（△）、非特異的なＩｇＭ（▼）、ＥＧＦ単独（○）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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