(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳ガン腫に近接するヒト被験体における組織の、悪性になる危険性を決定するための方法であって、該組織のサンプル中の染色体3p24でのヘテロ接合性消失（LOH）を決定する工程を包含し、ここで該サンプル中の染色体3p24でのLOHが、ヒト患者における該組織が悪性になる増加された危険性を示し、該ガン腫は、腺管ガン腫インサイチュ（DCIS）または浸潤性ガン腫から選択される、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記組織が、良性の過形成性組織である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記組織が、正常な乳房組織である、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、サンプルに存在するガン腫から、サンプル中の非悪性組織を実質的に単離する工程をさらに包含する、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法であって、前記3p24遺伝子座からの染色体DNAを増幅する工程、および増幅されたDNAが多型であるか否かを決定する工程を包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記決定する工程が、制限フラグメント長多型（RFLP）またはテトラヌクレオチドについて、増幅されたDNAを分析する工程を包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記分析する工程は、増幅されたDNAをHindIIIおよびMspIからなる群より選択される制限ヌクレアーゼで消化する工程を包含する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記サンプルの非悪性組織からDNAを単離する工程、および該サンプルのLOHを決定する前に核酸を該サンプルDNAにアニーリングさせる工程をさらに包含し、ここで該核酸は3p24遺伝子座を認識する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記核酸は、前記サンプルDNAの増幅のためのプライマーである、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、前記サンプルにおける染色体DNAの3p24遺伝子座を増幅する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、前記増幅のためのプライマーは、
0004145358.tif 000011
からなる群より選択される核酸配列である、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記サンプルは、前記ガン腫にすぐ隣接しているものである、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記サンプルは、前記ガン腫に隣接する小葉由来である、方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、SPORE助成金IP59CA58207からの基金で、一部基金供給された。政府は一定の権利を本発明に対して有し得る。
説明
関連出願の相互参照
本出願は、1995年10月18日に出願された、米国仮出願第60/005,543号に優先権を主張する。
技術分野
本発明は、正常なまたは過形成性乳房細胞が、新形成に進行する尤度を予測するにおいて使用するための予後の方法に関する。この方法は、ガン研究者が乳ガン、および良性の、過形成性の、乳房状態の処置において用いられる、攻撃性の程度を決定することを可能にする。
背景
乳ガンは、最も一般的なガンの１つであり、そして米国においてガンによる死を導く第３の原因であり、約182,000人の新しい症例およびほぼ50,000人の死亡の年間指数を有する。先進国において、８人の女性のうち、約１人が、その生涯において乳ガンを発症することが予測され得る。乳ガンの死亡率は、1930年から変化しないままである。死亡率は、年あたり平均0.2％増加しているが、65歳未満の女性において、年あたり平均0.3％ずつ減少している。予備的なデータは、乳ガンの死亡率は、おそらく、局在化したガンおよびガン腫インサイチュの診断の増加の結果として、減少しはじめたことを示唆する。概説のために、Marchant（1994）Contemporary Management of Breast Disease II：Breast Cancer：Obstetrics and Gynecology Clinics of North America 21：555-560；およびColditz（1993）Cancer Suppl. 71：1480-1489を参照のこと。
乳ガンの病因論は解明されていないが、ある非悪性の増殖性の疾患を介して、正常な上皮からガン腫（腺管または小葉のいずれか）インサイチュに、原発性の浸潤性のガンに、そして最終的には転移性のガンに、発展することが仮説されている。正常な細胞から悪性腫瘍への進行におけるある点で、腫瘍イニシエーションが生じる。腫瘍イニシエーションおよび進行の初期の段階は、必ずしも細胞を悪性にせず、事実、この細胞は組織学的に正常であるようであり得る。今日までに、腫瘍イニシエーションを受けているが、未だ腫瘍性でない乳房細胞を検出する方法はない。
認識され得る、乳ガン腫の最も初期かつ最も好ましい形態は、上皮内（すなわち非浸潤性）の段階である。その初期の検出は、マモグラフィーによって大いに増大されてきた。ガン腫インサイチュは、乳房小葉および主要な乳汁分泌管を内層する上皮細胞の悪性の形質転換によって特徴づけられるが、侵襲する基底膜を越えて、周囲の間質へのこれらの悪性の細胞の侵襲を伴わない。概説のために、Frykbergら（1994）W.J.Surg. 18：45-57を参照のこと。
いくつかの遺伝子マーカーが、乳ガンと関連している。これらのうちの１つにおける特定の変異である、BRCA1は、特定の人種群、Ashkenazi Jewと関連することが、最近見出され、これは乳ガンの特に高い発症率を有する。多くの他の腫瘍マーカー（例えばmyc、p53、erbB2、bek、およびflg）が、乳ガンと関連する。Adnaneら（1991）Oncogene 6：659-661. erbB2遺伝子（HER-2/neuとしても知られる）は、上皮増殖因子レセプターに相同な185KDaの膜増殖因子をコードする。erbB2遺伝子は、最近の測定において試験された283個の腫瘍のうち61個（22％）で増幅される。Adnaneら（1991）。
乳ガンについての元来の治療は、徹底的な乳房切除法に限定されたが、より保存的な、乳房を保存する手術が、現在、しばしば利用可能である。また、広範に多様なアジュバント療法が現在利用可能であり、ホルモン療法、放射線療法、化学療法が挙げられる。概説のために、Posnerら（1995）Int. Surg. 79：43-47を参照のこと。より徹底的でない処置レジメの利用可能性は、腫瘍再発を発症することが運命付けられている患者を同定する方法を必要とする。いくつかの有望な予後因子（例えば、DNA倍数性、S期解析、カテプシンＤ、erbB2ガン遺伝子発現、および上皮増殖因子発現）が同定されているが、これらの因子に基づいて処置レジメを設計することは、「未完成」であると考えられている。Posnerら（1995）。
ガン、特に浸潤性乳ガンの別のマーカーは、ヘテロ接合性消失（LOH）である。概説のために、O’Conncll（1994）Breast Cancer Res.Treat. 32：5-12を参照のこと。特定のLOHは、インサイチュから浸潤性挙動への変化と明確に（positively）関連することが示されている。Strattonら（1995）J.Pathol. 175：195-201。乳ガンにおいて、LOHは、多様な対立遺伝子で示されている。LOHの高い発生率が、非家族性の乳ガンインサイチュ、浸潤性腫瘍細胞、および悪性腫瘍細胞において、染色体11q23上に見出されている。Korethら（1995）J. Pathol. 176:11-18；およびTomlinsonら（1995）J. Clin. Pathol. 48:424-428。LOHは、顕微解剖した浸潤性乳ガンの67％で、および浸潤性乳ガンインサイチュのガン腫の分集団で、染色体11q23上に見出されている。Zhuangら（1995）Cancer Res. 55:467-471。LOHは、乳ガンにおける嚢内乳頭状ガン腫において、染色体16q上で見出されており、そして悪性の表現型の獲得に関与すると考えられる。Tsudaら（1994）Jpn.J.Cancer Res. 85:992-996。LOHはまた、乳ガンにおける染色体3pの２つの別々の領域；3p13-14および3p24-26上で検出されている。Chenら（1994）Cancer Res. 54:3021-3024。
いくつかの乳ガンが、乳房の局所領域内で、複数の経路から生じ得るという状況証拠が、文献にある。最近、浸潤性のガン、ならびに関連の前侵襲および前悪性の成分（例えば、腺管ガン腫インサイチュ（DCIS）および非定型的過形成）を、種々の常染色体の遺伝子座で、LOHについて試験した。前悪性の成分および浸潤性の成分が悪性の進行の２つの独立した経路から生じたという結果と一致するLOHのパターンが示された、いくつかの場合があった。O’Connellら（1994）。
LOHはまた、広範に多様な腫瘍において見出されている。１つの例のみにおいて、特定のLOH、3p21.3が、腫瘍、非小細胞肺ガン腫において見出され、そして正常な、近接する、組織において見出されている。Siegfriedら（1995）Proc.Am.Assoc.Cancer Res. 36:545（アブストラクト、3247）。
本明細書中、上述および下述の両方で引用される全ての参考文献は、参考として本明細書中に援用される。
本発明の開示
本発明は、ガン腫組織に近接する良性の過形成性乳房組織または正常な乳房組織の、悪性になる尤度を決定するための方法を包含する。この方法は、組織を実質的に単離する工程；およびこの組織中の染色体3p24での、ヘテロ接合性消失（LOH）の存在を測定する工程を包含する。染色体3p24でのLOHは、組織が悪性になり得るという予後指標である。
【図面の簡単な説明】
図１は、正常なヒト上皮におけるアンドロゲンレセプター遺伝子のＸ染色体の不活性化パターンを示す、一連の電気泳動パターンである。図１は、実施例１において考察される。
図２は、組織切片からの近接する正常な細胞の顕微解剖を示す、一連の顕微鏡写真である。図２Ａは、顕微解剖の前の組織学的切片を示す。図２Ｂは、間質組織の除去後のスライドを示す。図２Ｃは、正常な細胞の除去後のスライドを示す。
図３は、erbB2を発現する乳ガン細胞のヘマトキシリン−エオシン染色を示す顕微鏡写真である。
図４は、PCR産物のLOHアッセイを示す。図４Ａは、サンプルH21からのDNAを示す。図４Ａにおいて、一番上のDNAバンドは、１つの対立遺伝子および２つのより低い分子量のバンドを表す。レーン１は皮膚からのLOH、レーン２は遠位の正常組織からのLOH、レーン３〜６は近接した正常組織の４つの異なる領域であり、レーン７はDCISであり、そしてレーン８は浸潤性ガン腫である。図４Ｂは、サンプルH12のオートラジオグラフを示す。図４Ｂにおいて、レーン１は皮膚からのLOHであり、レーン２は近接した正常組織からのLOHであり、レーン３はDCISであり、そしてレーン４は浸潤性ガン腫である。
本発明を実施するための態様
Ｘ染色体の不活性化の分析を、女性の患者におけるいくつかの種類の腫瘍（白血病、直腸結腸腫瘍、膀胱腫瘍、および卵巣腫瘍を含む）のクローン性（colonality）を、測定するために使用した。Gillilandら（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:6848-6852；Fearonら（1987）Science 238:193-197；Sidranskyら（1992）N.Engl.J.Med. 326:737-740；およびJacobsら（1992）J.Natl.Cancer.Inst. 84:1793-1798。これらの研究は、Ｘ染色体の不活性化が、発生の着床前で生じるという事実に依存し、父方または母方のＸ染色体のいずれかのランダムな不活性化によって細胞子孫の永続的なマーキングを生じる。組織のクローン性は、Ｘ連鎖遺伝子上の多型DNAマーカーのメチル化状態を分析することによって、評価され得る。これは、広範囲にわたる新たなメチル化が、それらの永続的な不活性化と関連するからである。
上記のいくつかの研究は、腫瘍がクローン性であることを示したが、クローン性の観点からの正常な組織の組成には、ほとんど注意が払われなかった。初期の研究は、毛胞、胃上皮、および女性の膀胱尿路上皮において、0.2〜1.0mm2のサイズの範囲のモノクローナルな正常細胞の大規模なパッチの存在を示した。Linderら（1965）Am.J.Hum.Genet. 17:212-220；Gartlerら（1971）Ann.Hum.Genet.London. 35:1-7；Schmidtら（1988）Devel. 103:785-790；およびTsaiら（1995）J.Urol. 153:1697-1700。ヒト乳房におけるＸ染色体の不活性化の以前の研究において、正常な乳房組織は、高メチル化されたＸ染色体上の対立遺伝子がそれによって不活性化された対立遺伝子のいずれかを有した細胞のランダムな分散をともなう性質を有するポリクローナルであることが結論された。Noguchiら（1994）Cancer 74:872-877。
前悪性のおよび浸潤性の成分が、独立した経路から生じることを示す結果は、ジレンマを示す：なぜ、悪性の進行を導く１つ以上のおそらく稀な事象が、乳房の局所化された領域に同時に生じるのか？ 患者が変異された原因遺伝子を遺伝によって受け継いだ場合、多中心疾患が、いずれかの乳房において任意の場所に生じることが予測される。事実、左右対称性は、家族性乳ガンの特徴である。Andersonら（1985）Cancer 56:383-387；およびAndersonら（1989）Cancer 63:349-353。悪性の進行の通常のモデルは、イニシエーションされた細胞の増殖が、その後の進行に関連する変異の獲得のための標的集団を提供することを示唆する。しかし、その後のホルモンの変化が、乳房樹（tree）の広範囲にわたる増殖を誘導するときに、幹細胞が、乳腺分化の前に腫瘍イニシエーションを受けている場合、イニシエーションされた細胞は、乳房の単一の局在領域を占め得る。この領域（ここでは、全ての細胞が、同一の不活性化されたＸ染色体を有する）は、増大したガンの危険性にある。
腫瘍イニシエーションが乳腺の分化の前におこる場合、これは、標的細胞集団を増加し、理論的に、成人における乳ガンの増大した発生率を生じる。イニシエーション化剤として放射を用いる、増大した乳ガン発生率についての広範囲にわたる疫学的証拠は、この仮説を支持する。Hildrethら（1989）N.Engl.J. Med. 321:1281；Millerら（1989）N.Engl.J.Med. 321:1285；Modanら（1989）Lancet 1:629、およびTokunagaら（1984）Radiation Carcinogenesis Epidemiology and Biological Significance、Boice & Fraumeni（編）45-46頁、New York、Raven Press。乳ガンの危険性の最高増大は、肺結核症の治療技術のために複数の蛍光透視法で処置された14歳よりも若い個体において、および原子爆弾照射への曝露時に、10歳以下であった女性において、見られた。Tokunagaら（1984）。
Ｘ染色体の不活性化は、正常な乳房組織の管および小葉を試験することによりヒト乳房の形態形成の理解に適用された。Noguchiら（1994）によって行われた研究において、上皮は特に単離されなかったので、以前の研究で使用された顕微解剖された正常な乳房組織は、間質成分および上皮成分の両方を含んだ。乳房の上皮および間質は、異なる幹細胞から生じ得、本明細書中に提供される実施例は、正常な乳房上皮のクローン性の再評価の結果を記載する。
本明細書中に示されるデータは、ヒト乳房における乳房上皮が、全ての細胞が同一の不活性なＸ染色体を有する別々の領域へ組織化されることを確立する。従って、複数の腫瘍が、境界を引かれる細胞パッチ内（これは、同一の不活性Ｘ染色体を含有する）で、独立した悪性腫瘍に進行するイニシエートされた細胞から生じ得る。従って、腫瘍における単一のＸ染色体の不活性化は、腫瘍についてのクローンの起源を示し得るが、クローンの進行の問題を取り組まない。
本発明者らは、浸潤性の乳ガンで頻繁に見られることが知られている染色体3p24で、LOHの研究を行った。比較として、本発明者らはまた、３つの他の遺伝子座（染色体11p15.5、13q13、および17p13.1（p53遺伝子）（ここでは、LOHはまた、浸潤性の乳ガンで頻繁に検出される））でのLOHの存在を測定した。浸潤性ガン腫、腺管ガン腫インサイチュ（DCIS）、および腫瘍に近接する正常な小葉からのDNAを、これらの４つの遺伝子座でのLOHについて試験した。近接する正常な小葉において、13q13でのLOHを伴う例は見られなかった。11p15.5および17p13.1については、それぞれ、16の有益な例のうちの１例、および19の有益な例のうちの１例が、近接する正常な小葉がLOHを含んだ。最も驚くべき結果は、近接する正常な小葉において、3p24で比較的頻繁なLOHが存在したことであり、LOHは17の有益な例のうちの６例（35％）で検出された。さらに、近接する正常組織における3p24のLOHは、これが3p22に拡張されないという点で、比較的区別された。従って、腫瘍進行が継続する場合、LOHは増加し得る。この知見は、3p24でのLOHが、乳ガンのイニシエーションについての初期の事象であることを示した。従って、この遺伝子座でのLOHは、初期の診断、予後、または乳ガンのイニシエーションに関与する遺伝子（単数または複数）のクローニングについて、マーカーとして有用である。
従って、本発明は、ガン腫インサイチュおよび最終的に浸潤性のガン腫に進行する種々の標的組織（例えば、良性および正常な乳房組織）の尤度を決定するための方法を包含する。良性の組織は、通常、過形成であるとして特徴づけられ、そしてしばしば、嚢腫または非定型性を伴わない増殖性の疾患と呼ばれる。正常な乳房組織はガン腫組織に近接する組織を含む。乳房組織の上皮がクローン性であり得ることを示す、本明細書中に表される結果を考慮すると、ガン腫に近接する組織は、ガン腫と同じ幹細胞に由来し、従ってガン腫を導くイニシエーション事象を受け得るという尤度が存在する。近接する組織の他の正常な組織学的プロフィールであるにもかかわらず、これは当てはまる。従って、近接する組織は、ガン腫組織にすぐ近接する上皮組織である。
方法は、標的組織における染色体3p24でのLOHを測定する工程を包含する。LOHは、当該分野において公知の任意の方法において測定され得る。好ましくは、本明細書中に記載される方法が使用される。LOH分析は、実質的に単離された組織に対して行われる。良性の過形成性組織の場合において、組織は、近接する正常な組織から容易に単離される。周囲の間質組織から上皮細胞を単離するために、全ての場合で注意が払われなくてはならない。ガン腫細胞に近接する正常な組織の場合、本明細書中で記載されるような顕微解剖技術が、好ましい。ガン腫組織は、任意の乳ガン腫であり得、間質性インサイチュガン腫、腺管インサイチュガン腫、および浸潤性のガン腫を含むが、これらに制限されない。
染色体3p24でのLOHが、標的組織において見出されるべきであり、より攻撃的な処置レジメが行われ得る。例えば、より大きな切除または乳房切除が行われ得、そしてアジュバント化学療法が与えられ得る。以下の実施例は、説明することを意味するが、請求される本発明を制限することを意味しない。
実施例１
乳房組織におけるＸ染色体の不活性化
単一の正常な小葉または大きな管を、２つの乳房縮小形成および１つの乳房切除からの非悪性乳房上皮からの個々のヘマトキシリン−エオシン染色した４ミクロンの切片から、注意深く顕微解剖した。顕微解剖を、本質的に、Tsaiら（1995）によって改変されるように、Spruckら（1993）Cancer Res. 53:1162-1166によって記載されるように行った。簡潔には、単一の正常な管を、100倍の拡大を用いて、ヘマトキシリン−エオシン染色されたスライド（標準の４ミクロン切片）から、外科用小刀で顕微解剖した。周囲の間質を、注意深く削り落とした後、単離された管を新しい刀を用いて収集し、そしてエッペンドルフチューブに移した。４つの連続的なスライドからの同じ組織学的領域を、顕微解剖し、そしてプールして、Ｘ染色体の不活性化研究のために十分な細胞を得た。煮沸工程を省略して、その後の酵素学的分析のためにDNAを２本鎖の形態に維持した以外は、Allenら（1992）Am.J.Hum.Genet. 51:1229−1239によって記載される方法に従って、DNAをプロテイナーゼＫを用いて抽出した。プロテイナーゼＫ活性を、１mM最終濃度のフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）で、阻害した。
ヒトアンドロゲンレセプター遺伝子のエクソン１は、多型CAG反復領域の５’の100bp以内に、３つのHhaIおよび２つのHpaIIの制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。CAG反復多型を、有益な女性における２つのＸ染色体対立遺伝子を区別するために使用した。HhaIおよびHpaII制限エンドヌクレアーゼ部位のメチル化が、不活性なＸ染色体上の遺伝子発現の欠損と関連したので（Allenら（1992））、メチル化に感受性の制限エンドヌクレアーゼの、HhaIおよびHpaIIを用いる切断を、活性な遺伝子と不活性な遺伝子とを区別するために使用した。PCR増幅の前に、DNAをHhaIおよびHpaIIで消化した。この制限エンドヌクレアーゼ消化は、切断される、メチル化されていない活性なＸ染色体上の制限部位を生じたが、不活性なＸ染色体上の部位は、無傷の（intact）ままであった。
消化後、アンドロゲンレセプター遺伝子のエクソンＩに特異的なネスティッドプライマーを用いる、２つのPCR反応によってサンプルを増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーの２つのセットを、CAG反復とともにメチル化感受性の制限酵素部位の両方に隣接するように設計した。それゆえ、PCR増幅によって、切断されていない（不活性な）Ｘ染色体からのみの産物が生じた。それゆえ、1つのみのバンドが、ゲルにおいて存在した。対照的に、どちらかの対立遺伝子がランダムに不活性化された細胞から抽出されたDNAのPCR増幅（または消化されていないDNAコントロールのPCR増幅）によって、活性なＸ染色体および不活性なＸ染色体の両方からの産物が生じた。
上述のスキームを用いるＸ不活性化分析を、Jacobsら（1992）によって記載される方法に従って行った。簡潔には、各顕微解剖された領域からのDNA溶液を、２つのアリコートに分け、そしてそれぞれ１〜２ユニットのHhaIおよびHpaIIでの二重消化、または製造業者によって提供される制限酵素緩衝液での模擬消化のいずれかに供し、そして90分間、37℃でインキュベートした。一次PCRを、外側のプライマー1Aおよび1B（1A：５’-GTGCGCGAAGTGATCCAGAA-３’；および1B：５’-TCTGGGACGCAACCTCTCTC-３’）を用いて、25Tlの標準反応容量において行い、そして94℃で１分間、55℃で１分間、72℃で1.5分間の17サイクルからなった。２次PCRを、内側のプライマー2Aおよび2B（2A、５’-AGAGGCCGCGAGCGCAGCACCTC-３’；および2B、５’-GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT-３’）、鋳型として0.8Tl〜1.0Tlの１次PCR産物、２TCiの[I-32P]dCTPを用いて行い、そして94℃で１分間、66℃で１分間、および72℃で1.5分間の28サイクルからなった。両方のPCR反応において、最初の変性工程および最後の伸張工程を、それぞれ、２分および３分に延ばした。放射性標識された、２次PCR産物を、５％の変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって分析し、そしてオートラジオグラフィーに供した。得られた結果を、図１に示す。図１において、奇数の番号のレーンは、模擬消化されたコントロールを示し、偶数の番号のレーンは、HhaI／HhaIIで消化されたサンプルを示す。図１Ａは、乳房縮小形成の例１から得られた結果を示し、ここでは全ての３つの小葉は異なり、および同じ区分にあった；レーン１および２は、小葉１からであり、レーン３および４は、小葉２からであり、ならびにレーン５および６は、小葉３からであった。図１Ｂは、乳房縮小形成例２から得られた結果を示し、ここでは小葉１〜３は、１つの区分にあり、小葉４〜６は、異なるブロックからの１つの区分にあった；レーン１および２は、小葉１からであり、レーン３および４は、管２からであり、レーン５および６は、小葉３からであり、レーン７および８は小葉４からであり、レーン９および10は、小葉５からであり、ならびにレーン11および12は、小葉６からであった。
顕微解剖された領域のサイズは、0.08〜0.45mm2の範囲であった。乳腺において、単一の不活性化されたＸ染色体を有するパッチはまた、１つの乳房縮小形成（例２）において、および周辺の乳房切除組織（例３）において、組織ブロック内の切開された全ての領域において、わずか１つの高メチル化対立遺伝子が見出されたので、有意により大きくあり得る。これらの結果を表１に表す。乳房の異なる領域を示す複数のブロックは、例２について利用可能であり、そしてこれらは不活性化された対立遺伝子が異なった。顕微解剖された領域のいくつかは、各対立遺伝子の等価な保持を示し（図１b、レーン11および12、ならびに表１）、このことは、いくつかの管および／または小葉は、ポリクローナルであり得ることを示唆するか、または混入した間質が、ポリクローナルなパターンに寄与したことを示唆する。
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図１Ａおよび図１Ｂならびに表１に示される結果は、試験された通常の乳房縮小形成、およびガン腫の周辺の非悪性の乳房組織の両方において、単一の不活性化されたＸ染色体を伴う、細胞の別々のパッチが検出された。図１において、各対立遺伝子は、主要なバンドおよびいくつかのより弱いバンドによって示される。これらのより弱いバンドは、CAG反復を有するその鋳型に沿って合成される、DNA鎖のずれに起因して、PCRの間に生じる。
実施例２
第３染色体の短腕上でのヘテロ接合性消失
これらの変化、特に腫瘍イニシエーション（初期の事象）に関連する遺伝子異常型を理解することは、乳ガンの初期の診断、患者の処置、および危険性の高い集団の効果的な治療技術に寄与する。LOHは、腫瘍形成の抑制において役割を果たし得る遺伝子（腫瘍抑制遺伝子）の変異対立遺伝子を曝露する事象である。従って、LOHは、腫瘍イニシエーションまたは進行についての重要なマーカーを考慮される。腫瘍イニシエーションは、乳腺分化の前に生じることが仮説される。これが事実である場合、ガン腫に近接する形態学的に正常な乳房小葉におけるガン腫の初期の段階と関連する遺伝子変化を、見出すことが可能であり得る。先に示したように、乳房組織は、天然でクローン性であり得、異なる管および小葉系は、異なる幹細胞から生じる。以下に示す結果は、第３染色体の短腕上でのLOHが、乳ガンに近接する正常な上皮において、頻繁に検出されたことを示す。この知見は、乳房腫瘍イニシエーション理論を支持する。
正常な小葉、DCIS、および浸潤性の腫瘍の選択された領域を、光学顕微鏡下、個々のヘマトキシリン−エオシン染色された、４ミクロンの厚さの切片から顕微解剖した。本質的に、顕微解剖は、実施例１に記載されるように行った。図２は、顕微解剖技術の工程を示す。周囲の組織を外科用小刀で注意深く削り落とした後、単離された領域を、新しい刀を用いて収集し、そしてエッペンドルフチューブに移した。DNAを、以下の手順に従って、顕微解剖した組織から単離した。組織を、100Tlのキシレン（Fisher試薬等級）で抽出して、パラフィンを除去し、そして100Tlの95％エタノールで処理した。風乾後、組織ペレットを、20〜50Tlの溶液（0.1M Tris-HCl、pH８、１mM EDTA、0.5％Tween 20（Fisher）、および0.1mg/mlプロテイナーゼＫを含有する）で、50℃、一晩、消化した。消化混合物を、95℃で５分間加熱し、プロテイナーゼＫを不活性化し、10mM Tris-HCl、pH８、１mM EDTA緩衝液を含有する緩衝液で、100〜500Tlに希釈し、そして-20℃にて使用するまで保存した。
次いで、DNAサンプルを、染色体3p24、11p15.5、13q13、および17q13.1に位置する多型プライマー（表２）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅した。PCRを、以下の手順に従って行った：４TlのDNAを、50Tlの溶液（10mM Tris-HCl、pH8.3、50mM KCl、２mM MgCl2、0.01％ゼラチン、200TM各dATP、dGTP、dCTP、およびdTTP、0.1TM上流プライマーおよび下流プライマー、１％DMSO、0.44Tg Taq抗体（Clontech）、ならびに２ユニットのTaqポリメラーゼを含有する）において、PCRによって増幅した。PCRを、変性（94℃、１分間）、アニーリング（56〜66℃、１分間）、および鎖伸張（72℃、1分間）の45サイクルについてプロセスした。各対のプライマーのアニーリングの温度を、表２に列挙した。PCR後、５TlのPCR産物を、表２に示す制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして消化されたフラグメントを、４％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。マイクロサテライト多型遺伝子座（非-RFLP）（CA反復およびテトラヌクレオチドを含む）のいくつかについて、PCRを、１TCi[I-32P]dCTPを反応混合液に添加し、および４デオキシヌクレオチド三リン酸を20TMに減少した以外は、上述のように行った。１TlのPCR産物と、３Tlの配列決定停止溶液（United States Biochemicals）とを混合し、加熱によって変性し、そして６％の配列決定ゲル上で電気泳動した。PCR産物の各対立遺伝子を、エチジウムブロマイド染色したゲルをネガフィルムで写真撮影した後、またはゲルに対してＸ線フィルムを感光した後に、デンシトメーターを用いて光学密度を読み取ることによって測定した。異なる組織についての、２つの対立遺伝子の比率（消化されなかった対立遺伝子／消化された対立遺伝子、または頂部の対立遺伝子／底部の対立遺伝子）を算定した。結果を表２に表す。表２において、REは、制限エンドヌクレアーゼを表し、DNA配列を、５’〜３’に示し、そしてRFLPは、制限フラグメント長多型を表す。２つの対立遺伝子の比率が、正常な皮膚についての比率に比べて30％よりも高い変化を示す、浸潤性の腫瘍、DCIS、または正常な小葉サンプルは、LOHとして考慮された。
図４は、サンプルH21（A）およびH12（B）の正常な小葉、DCIS、および浸潤性の腫瘍における、遺伝子座3p24でのLOHを示す。図４Ａにおいて、皮膚および遠位の正常な組織は、染色体3p24でヘテロ接合性である（ゲル上の３つのバンド）が、近接する正常な組織、DCIC、および浸潤性のガン腫の４つの異なる領域はすべて、染色体3p24でLOHを示す（ゲル上の１本のみのバンド）。図４Ｂにおいて、近接する正常な組織（normal）、DCIS、および浸潤性のガン腫における上部のバンドの、皮膚と比較した密度における差異は、試験サンプルにおけるLOHを示す。
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乳ガンの種々の成分における、４つの染色体遺伝子座でのLOHの発生率を、表３にまとめる。
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3pでのLOHが、全ての正常な乳房上皮の特性であったのか、またはガン腫に近接する正常な小葉においてのみ見られたのかを決定するために、ガン腫から遠隔で採集されたブロックからの正常な小葉を評価した。近接する正常な小葉における3pでLOHを有する６つの例のうち、遠隔のブロックは、そのうちの４つについて利用可能であった。全ての４つの例において、遠隔の小葉は、LOHを示さなかった（表４）。これらの例のうちの１つ（H21）において、完全なLOHが存在し、このことは全ての小葉の上皮がLOHを有したことを示す。他の３つの例は、部分的なLOHのみを示した。しかし、正常な小葉の最も注意深い切開であってでさえ、いくつかの混入する間質細胞を含む。それゆえ、小葉中の細胞のいくつかのみがLOHを有するか否か、または部分的な消失が間質細胞の混入に起因したか否かを区別することは不可能である。
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これらの実験に続いて、多くのコントロール実験を行って、潜在的な人工産物を排除した。これらの人工産物は、以下の２つの型のものであった：１）技術が不安定であり、そして再現可能でなかった、および２）解剖に選択された正常な小葉が、DCIS細胞のPagetoid拡張の伸長に起因してガン細胞を実際に含んだ。
本発明者らは、アッセイの再現性を評価するための多くの実験を行った。同じDNA調製物を用いて、本発明者らはアッセイを、数回反復した（表５）。特に、部分的な消失のみを有する例について、消失の割合にいくらかの差異があった。しかし、LOHが記録された場合のどのアッセイにおいても、全ての例において、各反復アッセイにおいて、同じ対立遺伝子が消失した。LOHが、アッセイ方法論のランダムな人工産物に起因する場合、反復実験において、どちらかの対立遺伝子の消失をランダムに有することが予測される。
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人工産物がDNA調製物に関連する可能性を排除するために、１つの例を、４つの個々の小葉を解剖し、そしてDNAを別々に抽出することによって評価した。さらに、各近接する小葉において、同じ対立遺伝子が消失した（表６および図４）。
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第２の潜在的な人工産物、すなわち、近接する小葉がガン細胞を含んだ人工産物を、３つのアプローチによって排除した。第１に、解剖された小葉に近接する切片の光学顕微鏡写真は、完全に正常な組織学を有するようであった。第２に、多くの例において、正常な小葉に近接するDCISおよび浸潤性の成分は、3p24以外のさらなるLOHを有し、これは正常な小葉においてみられなかった（表７）。例えば、例H12（表７）の正常な近接する小葉からのDNAは、3p24でLOHを示したが、17p13.1では、DCISおよび浸潤性の成分が両方の遺伝子座でLOHを有したにもかかわらず、示さなかった。表７はまた、正常な小葉が、それぞれ11p15.5および17p13.1で、LOHを有した例をまとめ、これはさらに、正常な細胞からのDNAは、DCISおよび浸潤性のガンのDNAとは異なることを示す。
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正常な小葉が腫瘍細胞を含む可能性を排除するために使用した第３の方法は、erbB-2タンパク質に対する抗体での免疫染色によった。浸潤性の腫瘍およびDCIS成分が、それぞれ、erbB-2について免疫ポジティブな、少なくとも30％の細胞を有した場合において、正常な小葉におけるポジティブな細胞は存在しなかった。結果を図３および表８に示す。図３において、矢印は、染色された細胞を指す。
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上述の本発明は、明瞭化および理解の目的のために、例示および実施例によって詳細に記載されたが、特定の変化および改変が実施され得ることは、当業者に明らかである。それゆえ、説明および実施例は、本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきではなく、本発明の範囲は、添付の請求の範囲によって描写される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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