(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン、ジヒドロクルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミン、ジヒドロキシテトラヒドロクルクミン、ヤクチノンＡ及びヤクチノンＢからなる群より選ばれた少なくとも１種のクルクミンまたはその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする内臓脂肪型肥満の予防・改善医薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体リガンド剤、及びペルオキシソーム増殖剤応答性受容体リガンド剤を有効成分として含有することを特徴とするインスリン抵抗性症候群（２型糖尿病、高インスリン血症、脂質代謝異常、肥満、高血圧、動脈硬化性疾患）の予防・改善用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（peroxisome proliferator-activated receptor：ＰＰＡＲ）は、脂質代謝を維持する遺伝子群の発現制御を担う転写制御因子として同定された核内受容体ファミリーに属するリガンド依存性転写制御因子である。哺乳動物ではＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ（ＰＰＡＲβ、ＮＵＣ−１、ＦＡＡＲ）、ＰＰＡＲγの３種のサブタイプの存在が知られており、ＰＰＡＲαは主に肝臓で、ＰＰＡＲδは普遍的に発現している。ＰＰＡＲγにはＰＰＡＲγ１とＰＰＡＲγ２の２種のアイソフォームが存在しており、ＰＰＡＲγ１は脂肪組織の他に免疫系臓器や副腎、小腸で発現している。ＰＰＡＲγ２は脂肪組織で特異的に発現しており、脂肪細胞の分化・成熟を制御するマスターレギュレーターである（河田照雄、医学のあゆみ，184, 519〜523, 1998）。
【０００３】
ＰＰＡＲγリガンドとしては、１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２やΔ１２−プロスタグランジンＪ２などのアラキドン酸代謝物、ω−３多価不飽和脂肪酸、α−リノレン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの不飽和脂肪酸、９−ヒドロキシオクタデカジエン酸や１３−ヒドロキシオクタデカジエン酸などのエイコサノイド類などが知られている（J. Auwerx, Diabetologia, 42, 1033〜1049, 1999）。また、共役トリエン構造または共役テトラエン構造を有する炭素数１０〜２６の共役不飽和脂肪酸などがＰＰＡＲγリガンドであることが開示されている（特開２０００−３５５５３８）。さらに、合成化合物では、トログリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾンなどのチアゾリジン誘導体がＰＰＡＲγリガンドであることが知られている。
【０００４】
ＰＰＡＲγリガンドであるチアゾリジン誘導体は、そのアゴニスト活性と血糖降下作用が相関することからインスリン抵抗性改善作用との関連が注目され、２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病：ＮＩＤＤＭ）に対するインスリン抵抗性改善薬として開発された。すなわち、ＰＰＡＲγリガンドであるチアゾリジン誘導体はＰＰＡＲγを活性化することにより、前駆脂肪細胞から分化した正常機能を有する小型脂肪細胞を増加させ、インスリン抵抗性を惹起するＴＮＦαや遊離脂肪酸の産生や分泌が亢進している肥大脂肪細胞をアポトーシスにより減少させることで、インスリン抵抗性を改善する（A. Okuno, et al., Journal of Clinical Investigation, 101, 1354〜1361, 1998）。またＰＰＡＲγリガンドは、インスリン抵抗性を改善することから、２型糖尿病だけでなく、高インスリン血症、脂質代謝異常、肥満、高血圧、動脈硬化性疾患といったインスリン抵抗性症候群（R. A. Degronze, et al., Diabetes Care, 14, 173〜194, 1991）の予防・改善にも有効である。肥満に対する効果としては、２型糖尿病患者にトログリタゾンを投与することにより内臓脂肪が減少することが報告されており（I. E. Kelly, et al., Diabetes Care, 22, 288〜293, 1999；Y. Mori, et al., Diabetes Care, 22, 908〜912, 1999）、内臓脂肪型肥満の予防・改善にも有効である。
【０００５】
クルクミン及びその誘導体は、ショウガ科多年生草ウコン（Curcuma longa）に代表される熱帯、亜熱帯系の植物群に含まれている成分である。ウコンは、一般的にはカレーのスパイスの一つであるターメリックとして知られているが、食用として利用されるだけでなく、食用及び衣料用の着色料としても利用され、また中国の漢方、インドのアーユルヴェーダ、インドネシアのジャムーなどの伝統療法では止血作用、健胃作用、抗菌作用、抗炎症作用があることから薬用としても利用されている。
【０００６】
クルクミンの生理作用として、抗酸化作用、胆汁分泌促進作用（利胆作用）、内臓（肝臓、膵臓）機能増強作用、発癌抑制作用、脂質代謝改善作用、美白作用などが明らかにされてきている。P. Suresh BabuとK. Srinivasanは、ストレプトゾトシンで誘導した糖尿病ラットにクルクミンを０．５％含有させた餌を与えると、血中コレステロール、トリグリセリド、リン脂質が低下すること（Molecular and Cellular Biochemistry, 166, 169〜175, 1997）、糖尿病に合併した腎臓障害が改善すること（Molecular and Cellular Biochemistry, 181, 87〜96, 1998）を報告している。また、特開平１１−２４６３９９号公報には、クルクミンを摂取したラットにおけるβ−酸化促進系酵素であるアシルＣｏＡオキシダーゼ活性の増強効果及び肝臓中トリグリセリドの蓄積抑制効果が開示されている。しかし、クルクミン及び／またはその誘導体がＰＰＡＲγリガンドであること、血糖降下作用または内臓脂肪低減作用を有することは未だ知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記に鑑み、ＰＰＡＲγリガンドはインスリン抵抗性を改善し、２型糖尿病をはじめ、高インスリン血症、脂質代謝異常、肥満（特に内臓脂肪型肥満）、高血圧、動脈硬化性疾患などのインスリン抵抗性症候群を予防・改善する効果を有する。よって本発明は、天然物由来のＰＰＡＲγリガンド、及びそれを有効成分として含有することを特徴とするインスリン抵抗性症候群、糖尿病、肥満または内臓脂肪型肥満の予防・改善剤を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ウコン抽出物が血糖降下作用を有することを見出し、さらに鋭意研究を行った結果、ウコンに含まれる特定成分がＰＰＡＲγリガンド活性を有し、その特定成分がクルクミン及びその誘導体であることを見出し、さらにその特定成分が血糖降下作用及び内臓脂肪低減効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、クルクミンまたはその誘導体からなるペルオキシソーム増殖剤応答性受容体リガンド剤に関する。
【００１０】
また本発明は、クルクミン及びその誘導体からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とするインスリン抵抗性症候群、糖尿病、あるいは肥満または内臓脂肪型肥満の予防・改善用組成物に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を詳しく説明する。本発明のＰＰＡＲγリガンド剤は、クルクミンまたはその誘導体である。また、本発明のクルクミン及びその誘導体からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有する組成物は、血糖降下作用及び内臓脂肪低減作用を有しており、インスリン抵抗性症候群、糖尿病、肥満または内臓脂肪型肥満の予防・改善用組成物として有用である。
【００１２】
本発明に用いるクルクミンは、１，７−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェルニ）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオンであり、またクルクミン誘導体（クルクミノイド）としては、例えば、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン、ジヒドロクルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミン、ジヒドロキシテトラヒドロクルクミン、ヤクチノンＡ、ヤクチノンＢなどが挙げられ、さらにこれらの化合物の塩、酸化体、還元体、配糖体、エステル化体などが挙げられる。これらは、植物由来の化合物、あるいは化学合成した化合物でも使用することができる。植物由来のクルクミン及び／またはその誘導体は、例えば、ショウガ科多年生草のウコン（Curcuma longa）、キョウオウ（春ウコン：Curcuma aromatica）、ガジュツ（紫ウコン：Curcuma zedoaria）、クスリウコン（Curcuma xanthorrhiza）などの他、マンゴージンジャー、インド産アロールート、黄色ガジュツ、黒色ガジュツ、ガランガールなどの植物から抽出することができる。
【００１３】
本発明に用いるクルクミン及びその誘導体を調製する方法は、特に限定されず、従来から公知の方法を採用できる。例えば、食品添加物であるウコン色素（主成分はクルクミン）の製法として、ウコンの根茎の乾燥品より、温時エタノールで、熱時油脂もしくはプロピレングリコールで、または室温時〜熱時ヘキサンもしくはアセトンで抽出する方法が挙げられる。また、特開２０００−２３６８４３号公報、特開平１１−２３５１９２号公報、特開平６−９４７９号公報、特表平１１−５０２２３２号公報、特表平９−５０３５２８号公報などに開示された方法も挙げられる。本発明では、クルクミン及びその誘導体から選ばれた少なくとも１種は、純粋な化合物を使用することができるが、これに限定されるものではなく、医薬品や食品として不適当な不純物を含有しない限り半精製または粗製のものを使用することもできる。
【００１４】
本発明のインスリン抵抗性症候群、糖尿病、肥満または内臓脂肪型肥満の予防・改善用組成物は、ＰＰＡＲγリガンドを含有する組成物であって、クルクミン及びその誘導体からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴としており、その形態は限定されず、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）や健康食品などの飲食品、医薬品、医薬部外品などとして用いることができる。
【００１５】
飲食品として用いる場合は、そのまま直接摂取することができ、また、公知の担体や助剤などを使用してカプセル剤、錠剤、顆粒剤など服用しやすい形態に成型して摂取することができる。これら成型剤における本発明のＰＰＡＲγリガンド剤の含有量は０．１〜１００重量％、好ましくは１０〜９０重量％がよい。さらに、飲食物材料に混合して、チューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ビスケット、クラッカーなどの菓子類、アイスクリーム、氷菓などの冷菓類、茶、清涼飲料、栄養ドリンク、美容ドリンクなどの飲料、うどん、中華麺、スパゲティー、即席麺などの麺類、蒲鉾、竹輪、半片などの練り製品、ドレッシング、マヨネーズ、ソースなどの調味料、マーガリン、バター、サラダ油などの油脂類、パン、ハム、スープ、レトルト食品、冷凍食品など、すべての飲食物に使用することができる。これら飲食用組成物を摂取する場合、その摂取量は本発明のＰＰＡＲγリガンドとして成人一人一日当たり０．１〜３０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜３００ｍｇ／ｋｇ体重がよい。また、家畜やペット用の飼料やペットフードとしても使用することができ、その摂取量は本発明のＰＰＡＲγリガンドとして一日当たり０．１〜３０００ｍｇ／ｋｇ体重が好ましい。
【００１６】
医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、注射剤、坐剤、貼付剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容される他の製剤素材、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。これら製剤の投与量としては、本発明のＰＰＡＲγリガンド換算で成人一人一日当たり０．１〜３０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜３００ｍｇ／ｋｇ体重を１回ないし数回に分けて投与する。また、家畜やペット用の医薬品としても使用することができ、その投与量は本発明のＰＰＡＲγリガンドで一日当たり０．１〜３０００ｍｇ／ｋｇ体重が好ましい。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
（実施例１）  ウコンからの化合物の抽出、単離
ウコンの粉末１．０ｋｇをエタノール８．０Ｌに浸し室温・遮光にて２日間抽出した後、濾過により抽出液を得た。その抽出液を減圧濃縮して溶媒を除去し、抽出物１１８ｇを得た。その抽出物を多孔質イオン交換樹脂ダイアイオンＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー（１６００ｍｌ）に付し、３０％メタノール、５０％メタノール、８０％メタノール（各１．５Ｌ）、メタノール、エタノール、酢酸エチル（各３Ｌ）にて順次溶出し、６つの画分を得た（画分１，２，３，４，５，６）。画分４（６３．５ｇ）から、シリカゲルカラムクロマトグラフィーＡ（溶出溶媒はヘキサン：アセトン＝２：１→３：２→４：３，ｖ／ｖ）及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーＢ（溶出溶媒はクロロホルム：アセトン＝９９：１→１９：１，ｖ／ｖ）を繰り返すことにより精製し、化合物１（６．４ｇ）、化合物２（１．２ｇ）、化合物３（１．１ｇ）を得た。
【００１９】
構造解析の結果、化合物１〜３は既知化合物であり、それぞれ化合物１はクルクミン（curcumin）、化合物２はデメトキシクルクミン（demethoxycurcumin）、化合物３はビスデメトキシクルクミン（bisdemethoxycurcumin）と同定した。なお、これらの化合物の構造同定にはM. Kuroyanagiらの報告（薬学雑誌，90, 1467〜1470, 1970）に記載されたスペクトルデータを参考にした。化合物１〜３の構造式を表１に示す。
【００２０】
【表１】
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（実施例２）  ＰＰＡＲγリガンド活性
ＣＶ−１細胞（雄性アフリカミドリザル腎臓由来の培養細胞）を９６穴培養プレートに６×１０3ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように植え込み、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。培地には、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１０ｍｌ／Ｌペニシリン・ストレプトマイシン溶液（それぞれ5000IU/ml、5000μg/ml、GIBCO社）、３７ｍｇ／Ｌアスコルビン酸（和光純薬工業株式会社）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium：GIBCO社）を用いた。細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（GIBCO社）で洗浄した後、ｐＭ−ｍＰＰＡＲγと４×ＵＡＳｇ−ｌｕｃをリポフェクトアミン・プラス（GIBCO社）を用いてトランスフェクションした。なお、ｐＭ−ｍＰＰＡＲγは酵母由来転写因子ＧＡＬ４遺伝子（アミノ酸配列１〜１４７）とマウスＰＰＡＲγリガンド結合部位遺伝子（アミノ酸配列１７４〜４７５）を結合したキメラ蛋白発現用プラスミドであり、４×ＵＡＳｇ−ｌｕｃはルシフェラーゼ遺伝子の上流にＧＡＬ４の応答配列（ＵＡＳｇ）を４回組み込んだレポーター・プラスミドである。トランスフェクションの約２４時間後、サンプルを含む培地に交換し（ｎ＝４）、２４時間培養した。サンプルはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したものを、無処置対照にはＤＭＳＯを用い、培地に１／１０００量添加した。細胞をＣａ，Ｍｇ含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ＋）で洗浄した後、ルックライト（Packard社）を添加し、トップカウント・マイクロプレートシンチレーション／ルミネッセンスカウンター（Packard社）にてルシフェラーゼの発光強度を測定した。
【００２１】
測定群と同様に、コントロール群としてｐＭ−ｍＰＰＡＲγの代わりにｐＭ（ＰＰＡＲγリガンド結合部位遺伝子を除去したプラスミド）を用いて測定した。各サンプルについて、測定群及びコントロール群の発光強度の平均値（ｎ＝４）の比（測定群／コントロール群）を算出し、無処置対照に対する比活性をサンプルのＰＰＡＲγリガンド活性とした。結果を表２に示す。
【００２２】
【表２】
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陽性対照としてトログリタゾン（三共株式会社）を用い、各化合物のＰＰＡＲγリガンド活性を比較した。表２から明らかなように、クルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミンに、濃度依存的にＰＰＡＲγリガンド活性が認められた。
【００２３】
（実施例３）  ２型糖尿病モデル・マウスにおける効果
遺伝的に肥満を呈し２型糖尿病を発症するモデル動物であるＫＫ−Ａｙマウスを用いて、クルクミンの効果を評価した。陽性対照には、糖尿病治療薬であるピオグリタゾンを用いた。
【００２４】
ＫＫ−Ａｙマウス（雌，６週齡）を３群（各群５匹）に分け、正常食（オリエンタル酵母株式会社、表３）を基本飼料として、無添加群（対照群）、ピオグリタゾン添加群、クルクミン添加群を自由摂取にて４週間与えた。ピオグリタゾンは、アクトス錠３０（１錠中ピオグリタゾン３０ｍｇを含有、武田薬品工業株式会社）をメノウ乳鉢にて粉砕し、ピオグリタゾン添加量が０．０４％となるように正常食に添加した。クルクミンは添加量０．５％となるように正常食に添加した。
【００２５】
【表３】
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給餌期間中１週間毎にマウス尾静脈より少量採血し、簡易式血糖測定器グルテストエース（株式会社三和化学研究所）を用いて、血糖値を測定した。
【００２６】
マウス体重を表４に示す。ピオグリタゾン添加群及びクルクミン添加群のマウス体重は無添加群（対照群）とほぼ同様に推移し、有意な差は認められなかった。
【００２７】
【表４】
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血糖値の測定結果を表５に示す。給餌開始時の血糖値は１３９〜１５１ｍｇ／ｄｌであり、いずれの群においても高血糖になっていなかった。無添加群（対照群）において、１週後から血糖値が上昇し、糖尿病の発症が確認された。無添加群（対照群）に比し、糖尿病治療薬であるピオグリタゾン添加群では血糖上昇が有意に抑えられており、強い血糖降下作用が認められた。クルクミン添加群においても血糖上昇が有意に抑えられており、血糖降下作用が認められた。
【００２８】
【表５】
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（実施例４）  食餌性肥満モデル・マウスにおける効果
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌，８週齢）に高脂肪・高糖分食（オリエンタル酵母株式会社、表６）を自由摂取にて８週間与え、食餌性の肥満状態にした。その後マウスを各群７匹に分け、正常食（オリエンタル酵母株式会社、表３）を基本飼料として、無添加群（対照群）及びクルクミン添加群（添加量０．５％）を自由摂取にて４週間与えた。一晩絶食したマウスをエーテル麻酔下で開腹し、腹大動脈から採血して屠殺した。その後、子宮周辺脂肪、腎臓周辺脂肪、腸間膜周辺脂肪を摘出し、重量を測定した。子宮周辺脂肪量、腎臓周辺脂肪量、腸間膜周辺脂肪量の和を腹腔内脂肪量とした。結果を表７に示す。
【００２９】
【表６】
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【００３０】
【表７】
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表７から明らかなように、無添加群（対照群）に比し、クルクミン添加群での摂餌量及び体重に有意な差は認められなかったが、子宮周辺脂肪量、腎臓周辺脂肪量、腸間膜周辺脂肪量、及び腹腔内脂肪量が有意に減少した。すなわち、高脂肪・高糖分食の摂取によって蓄積した内臓脂肪が、クルクミンを含有した飼料を摂取することにより低減することが判明した。
【００３１】
（実施例５）  クルクミン含有錠剤の調製
クルクミン            ４５重量部
乳糖                  ３５重量部
結晶セルロース        １５重量部
ショ糖脂肪酸エステル    ５重量部
上記組成で常法によりクルクミンを含有する飲食用錠剤を調製した。
【００３２】
（実施例６）  クルクミン含有ソフトカプセル剤の調製
クルクミン                ４０重量部
ゴマ油                    ５５重量部
グリセリン脂肪酸エステル    ５重量部
上記組成で常法によりクルクミンを含有する飲食用ソフトカプセル剤を調製した。
【００３３】
（実施例７）  クルクミン含有クラッカーの調製
クルクミン            １重量部
薄力粉            １２０重量部
食塩                  １重量部
ベーキングパウダー    ２重量部
バター              ３０重量部
水                  ４０重量部
上記組成で常法によりクルクミンを含有するクラッカーを調製した。
【００３４】
（実施例８）  クルクミン含有うどんの調製
クルクミン      １重量部
強力粉      １００重量部
薄力粉      １００重量部
食塩          １０重量部
水          １００重量部
上記組成で常法によりクルクミンを含有するうどんを調製した。
【００３５】
（実施例９）  クルクミン含有ドレッシングの調製
クルクミン    １０重量部
オリーブ油    ８０重量部
食酢          ６０重量部
食塩            ３重量部
コショウ        １重量部
レモン汁        ５重量部
上記組成で常法によりクルクミンを含有するドレッシングを調製した。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（ＰＰＡＲγ）リガンド、及びそれを含有する組成物が提供される。本発明の組成物は、インスリン抵抗性症候群、糖尿病、肥満または内臓脂肪型肥満の予防・改善剤として有用である。