(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
屠畜卵巣組織内に針状ノズルを刺入して該ノズルから高圧液体を屠畜卵巣組織内に高圧噴射注入し、高圧液体の注入によって屠畜卵巣組織から遊離した卵子を採取することを特徴とする卵子採取法。
【請求項２】
前記屠畜卵巣組織内に刺入された針状ノズルから、針状ノズル軸線方向に交差する方向に高圧液体を高圧噴射注入することを特徴とする請求項１に記載された卵子採取法。
【請求項３】
前記高圧噴射注入中に屠畜卵巣組織とノズルとを相対的に回転させることを特徴とする請求項１又は２に記載された卵子採取法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載された卵子採取法において、
コラーゲン分解酵素を含む高圧液体を前記針状ノズルから屠畜卵巣組織内に高圧噴射注入することを特徴とする卵子採取法。
【請求項５】
請求項４に記載された卵子採取法において、
前記コラーゲン分解酵素を含む高圧液体を屠畜卵巣組織内に高圧噴射注入した後に該屠畜卵巣を予め定められた温度域で予め定められた時間放置して、２次以下の卵子を遊離させることを特徴とする卵子採取法。
【請求項６】
屠畜卵巣組織内に刺入される針状ノズルと、該針状ノズルに穿設された噴射口へコラーゲン分解酵素を含む高圧液体を供給する高圧液体発生手段と、前記噴射口からの高圧液体の噴射又は停止を制御する噴射制御手段とを備えたことを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載された卵子採取法に使用する高圧液体注入装置。
【請求項７】
前記針状ノズルの噴射口が針状ノズル軸側方に設けられたことを特徴とする請求項６に記載された高圧液体注入装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は例えば屠体卵巣から卵子を採取する方法及びそれに使用する高圧液体注入装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
国内での肉用牛等の生産能率は低く現在の生産コストでは安い輸入肉に対して品質によって国内の市場を確保しているにすぎず、良質で安価な牛肉の生産のためには黒毛和種等の優良肥育素牛の大量供給が必要である。
【０００３】
肉用牛等の低コスト大量繁殖に関する研究では、体外成熟卵子を利用し体外受精した低コスト受精卵の生産を図っている。これには、屠場で廃棄されている「屠畜卵巣」から未成熟卵子を採取し体外成熟、体外受精及び受精卵の培養を行うことが有効である。
【０００４】
体外受精とは、本来卵管内で起きる卵子と精子の合体（受精）を体外で起こさせることである。最近注目を浴びてきている体外受精は、生きている牛に性線刺激ホルモンを投与して発育させた成熟卵を採取して行う体外受精ではなく、屠場（食肉処理場）で捨て去られるはずの卵巣から未成熟卵子を採取して行う体外受精のことである。
【０００５】
その体外受精の技術のプロセスの概要は次の通りである。
(1) 卵巣の採取と未成熟卵子の採取
(2) 卵子の体外成熟
(3) 精子の受精能獲得誘起処理と媒精（受精）
(4) 受精卵の移植可能ステージまでの培養
【０００６】
この体外受精プロセスでの卵子の採取方法には、注射器吸引法、小卵胞切開法、卵巣細切法の３つの方法が現在行われているが、ほとんど３次卵子の採取が対象である。各採取方法の概要は下記通りである。
【０００７】
(1) 注射器吸引法
小さな卵胞に注射針を刺して、中身を軽く吸引するだけ。採卵前にぺ一パータオルで表面の生食水をふきとり、１８〜２０ゲージの針をつけた５〜１０mlの注射器に、牛血清アルブミンを３mg/ml加えたリン酸緩衝液（ＰＢＳ）をあらかじめ吸引しておく。小卵胞に針を刺し吸引し、吸引した卵胞の内容液は試験管に集めておく。卵巣１対から５〜１０個の卵子が得られる。
【０００８】
(2) 小卵胞切開法
メスで卵胞を切開した後に小さなさじ状の道具で卵胞の内容をかきとりだすもの。小さじによってすくいとった内容物はＰＢＳを入れた試験管の中に洗い落とす。このＰＢＳには２００μl/dlほどの濃度のヘパリンを加えておき、かきとって集めた組織片の凝固を防ぐ。この方法は、作業的には１０頭程度を２人で処理するのに約１時問を要するが、採取できる卵子は卵巣１対から１０〜１５個と比較的多く得られる利点がある。
【０００９】
(3) 卵巣細切法
数枚のメスを組み合わせて卵巣の表面を軽く細切する方法。この方法は２〜４mm間隔で４〜６枚のメスあるいはカミソリの刃を並べた道具を用いる。まず、卵巣を自由縁から切り開き平たくする。ついで、メスで表面を縦あるいは横方向に切ることによってサイの目状に卵巣の表面を切り刻む。この際にあまり多く縦あるいは横方向に切り刻まない方が良い結果を生む。切れ目を入れた卵巣は、１００〜２００mlのＰＢＳに入れたビーカーにひたし、よくふりながら洗い落とす。この方法では卵子とともに多くの組織片がでるので、卵子を探しだす時には金属製篩を使って、大きな組織と小さな組織を除いてから行うのが便利である。卵巣１対から注射器吸引法の２倍ほどの１５〜２０個の卵子が得られる。
【００１０】
より具体的には、３次卵子採取の場合には、主に注射器吸引法により卵子を採取し、２次以下の卵子を採取する場合は、主に卵巣細切法によって行っている。詳しくは、卵巣の表皮下１mm程度の深さまでの部分をメスで剥離し、剥離片を細切してコラーゲン分解酵素液に浸し、恒温器で３８℃に保ち９０分から１２０分間コラゲナーゼ反応を行う。その後、細切片を洗浄してコラゲナーゼを洗い流し、ピペット等で細片を吸引・排出することを繰り返して細片をほぐし、卵子を細片から遊離する。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
２次以下の卵子を採取する場合、卵巣から表皮下１mmをメスで剥離する際、卵巣の弾力性やメス刃の切れ具合等により、熟練を要することや、コラゲナーゼ反応後にピペット等による吸引・排出を繰り返す作業を１０分間以上行わなくてはならないため、１卵巣の全表皮を細片にする場合には、かなりの時間を要する。
【００１２】
また、この作業は大気下で行っているため、大気中の雑菌も卵子に影響を与える。３次卵子を吸引採取する際は、吸引時の負圧により卵子の回りを覆う卵丘細胞を剥離させることが多く、卵子の培養に悪影響を与える場合もあった。
【００１３】
本発明は、３次卵子のみならず２次以下の卵子の大量採取を可能とした新規な卵子採取法及びそれに使用する高圧液体注入装置を得ることを目的とする。
【００１４】
具体的には、３次卵子を採取する場合には、夾雑物の洗い出しが可能で採取時の夾雑物を減らすことができ、卵丘の剥離を防ぐことができ、不良率を低減することができ、採取率を向上できる採取法及び注入装置を得ることを目的とする。
【００１５】
更に、２次以下の卵子を採取する場合には、メスにより卵巣表皮を剥離させる作業、ピペットによる細片をほぐす作業を省くことができ、２次以下の卵子の大量採取を可能とし、雑菌汚染を回避できる採取法及び注入装置を得ることを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本請求項１に記載された発明に係る卵子採取法は、屠畜卵巣組織内に針状ノズルを刺入して該ノズルから高圧液体を屠畜卵巣組織内に高圧噴射注入し、高圧液体の注入によって屠畜卵巣組織から遊離した卵子を採取する方法である。
【００１７】
本請求項２に記載された発明に係る卵子採取法は、請求項１に記載された屠畜卵巣組織内に刺入された針状ノズルから、針状ノズル軸線方向に交差する方向に高圧液体を高圧噴射注入する方法である。
【００１８】
本請求項３に記載された発明に係る卵子採取法は、請求項１又は２に記載された高圧噴射注入中に屠畜卵巣組織とノズルとを相対的に回転させる方法である。
【００１９】
本請求項４に記載された発明に係る卵子採取法は、請求項１〜３の何れかに記載された卵子採取法において、
コラーゲン分解酵素を含む高圧液体を前記針状ノズルから屠畜卵巣組織内に高圧噴射注入する方法である。
【００２０】
本請求項５に記載された発明に係る卵子採取法は、請求項４に記載された卵子採取法において、
前記コラーゲン分解酵素を含む高圧液体を屠畜卵巣組織内に高圧噴射注入した後に該屠畜卵巣を予め定められた温度域で予め定められた時間放置して、２次以下の卵子を遊離させる方法である。
【００２１】
本請求項６に記載された高圧液体注入装置は、請求項１〜５の何れかに記載された卵子採取法に用いる高圧液体注入装置であって、屠畜卵巣組織内に刺入される針状ノズルと、該針状ノズルに穿設された噴射口へコラーゲン分解酵素を含む高圧液体を供給する高圧液体発生手段と、前記噴射口からの高圧液体の噴射又は停止を制御する噴射制御手段とを備えたものである。
【００２２】
本請求項７に記載された高圧液体注入装置は、請求項６に記載された針状ノズルの噴射口が針状ノズル軸側方に設けられたものである。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明においては、卵巣組織内に針状ノズルを刺入して該ノズルから高圧液体を卵巣組織内に高圧噴射注入し、高圧液体の注入によって卵巣組織から遊離した卵子を採取する方法であるため、３次卵子のみならず２次以下の卵子の大量採取を可能な新たな卵子採取法を得ることができる。
【００２４】
特に、卵巣組織内に刺入される針状ノズルによって、針状ノズル軸線方向に交差する方向に高圧液体を卵巣組織内に高圧噴射注入する方法では、噴射注入された高圧液体が刺入されたノズルに沿って卵巣外に逆流し難く、良好な卵巣組織の膨化及び卵子の遊離が得られる。
【００２５】
この場合、高圧噴射注入中に卵巣組織とノズルとを相対的に回転させながら高圧噴射注入することにより、卵巣組織全域にわたって高圧液体を行き渡らせ、卵巣組織を膨化させ、卵子を遊離させることが可能となる。
【００２６】
本発明の卵子採取法では、３次卵子を主に採取する場合と、２次卵子を主に採取する場合とで若干の相違がある。より具体的には、３次卵子を主に採取する場合には、高圧液体として、通常用いられている卵子採取用リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を前記針状ノズルから卵巣組織内に高圧噴射注入して、３次卵子を遊離させる。
【００２７】
即ち、３次卵子は卵巣組織外壁近傍にある程度成熟した状態で存在するため、卵巣内部から卵子採取用リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を高圧にして噴射することにより、卵胞内で３次卵子が容易に遊離し、噴射後卵巣を切開したり、卵巣内部を液と共に吸引する等すれば、容易に３次卵子が採取される。この場合、高圧液体で卵巣組織を膨化させるため、３次卵子が存在する卵胞の破壊や卵丘の剥離を防ぐことができ、採取率を向上することができる。また、３次卵子採取時には高圧液体注入により卵巣の血管内からの血液の流出があるため、夾雑物の洗い出しが可能で採取時の夾雑物を減らすこともできる。
【００２８】
これに対して、２次以下の卵子では、卵巣組織外壁近傍に未成熟のままあるため、単に高圧液体を卵巣内部に高圧噴射注入しても２次以下の卵子の膨化・遊離は難しい、そのため、コラーゲン分解酵素を含む高圧液体を前記針状ノズルから卵巣組織内に高圧噴射注入して、２次以下の卵子をも遊離させる。
【００２９】
即ち、２次以下の卵子は、卵巣組織外壁近傍に控えている卵子であるから、コラーゲン分解酵素によって、２次以下の卵子と卵巣組織との結合をほどいて、遊離しやすくする。２次以下の卵子を採取する場合は、従来のメスにより卵巣表皮を剥離させる作業、ピペットによる細片をほぐす作業を省くことができる。また、卵巣内に存在する卵子の殆ど全てを処理できるため、２次以下の卵子の大量採取が可能となる。更に、一連の作業は卵巣内において卵子と卵巣組織との結合をほどく反応及び卵子の遊離が行われるため雑菌汚染を回避できる。
【００３０】
この２次以下の卵子の採取では、針状ノズルを卵巣組織内中心部あたりに無造作に刺入し、コラーゲン分解酵素を含む高圧液体を卵巣組織内に高圧噴射注入することにより、卵巣組織の血管又はリンパ管を通じて卵巣組織の全域にコラーゲン分解酵素を含む高圧液体を行き渡らせることができ、作業時間を短縮することができる。
【００３１】
更に、コラーゲン分解酵素を含む高圧液体を卵巣組織内に高圧噴射注入した後に、この卵巣を予め定められた温度域で予め定められた時間放置して、２次以下の卵子を遊離させることにより、コラーゲン分解酵素が良好に卵巣組織内のコラーゲンを分解し、大量の２次以下の卵子を採取することができる。より具体的には、恒温器で３８℃に保ち、９０〜２４０分間保持する。
【００３２】
本発明の卵子採取法を簡便に行うには、卵巣組織内に刺入される針状ノズルと、該針状ノズルに穿設された噴射口へ高圧液体を供給する高圧液体発生手段と、前記噴射口からの高圧液体の噴射又は停止を制御する噴射制御手段とを備えた卵子採取用高圧液体注入装置を用いるのが好適である。
【００３３】
卵巣組織内に噴射注入される高圧液体は、卵巣組織を膨化させるに充分な圧力で尚且つ卵巣組織内の卵子を損傷することの少ない圧力で卵巣組織内に噴射注入される。このため、好ましい噴射圧を得るためには、ノズルへの高圧液体を吐出するポンプの吐出圧を、２〜３ＭＰａとする。
【００３４】
特に、針状ノズルの噴射口が針状ノズル軸側方に設けられたものでは、針状ノズルを卵巣への刺入した後の噴射注入の際に、高圧液体が刺入されたノズルに沿って逆流し難く、良好な卵巣組織の膨化が得られる。
【００３５】
更に、針状ノズルから噴射される高圧液体が、コラーゲン分解酵素を含む高圧液体では、２次以下の卵子を良好に卵巣組織内で膨化遊離させることができる。
【００３６】
【実施例】
図１は本発明の卵子採取法の操作工程を示す説明図である。ａ図に示す通り、屠体卵巣(11)に針状ノズル(12)を刺入する。この時、針状ノズルを卵巣組織内中心部あたりに刺入すると、卵巣組織の血管又はリンパ管を通じて卵巣組織の全域にコラーゲン分解酵素（コラゲナーゼ）を含む高圧液体を行き渡らせることができる。
【００３７】
ｂ図に示す通り、針状ノズル(12)の先端部の側壁に穿設された噴射口(13)から卵巣(11)内へコラゲナーゼ液（卵子採取用リン酸緩衝液（ＰＢＳ）にコラゲナーゼを添加した液）を卵巣を針状ノズル(12)を中心にして回転させながら、噴射注入する。尚、本実施例では２次以下の卵子をも採取する方法を記載したが、３次卵子のみを採取するのであれば、コラゲナーゼを添加しない液や生理食塩水を用いても良い。
【００３８】
噴射口(13)は針状ノズル(12)の側壁に穿設されているため、コラゲナーゼ液の噴射はノズル軸線方向に交差する方向に噴射される。このため、コラゲナーゼ液の卵巣外への逸出が少なくなる。
【００３９】
ｃ図に示す通り、卵巣(11)内にコラゲナーゼ液を注入した後、恒温器内で３８℃に保ち９０〜２４０分間保持して、コラゲナーゼ反応を行い、卵巣内の卵子(14)を充分に遊離させた。
【００４０】
ｄ図に示す通り、充分に卵子(14)が遊離された卵巣(11)をメス(15)で切開して遊離された卵子(14)を、逸出するコラゲナーゼ液と共にシャーレ(16)に受け止める。得られた卵子(14)は、３次卵子ばかりではなく、２次以下の卵子も含まれていた。
【００４１】
図２は図１に示した採取法に好適な本発明の卵子採取用高圧液体注入装置の構成を示す説明図である。図に示す通り、コラゲナーゼを含む卵子採取用リン酸緩衝液又は含まない卵子採取用リン酸緩衝液を満たす卵子採取液槽(22)に連通し、該採取液を２〜３ＭＰａの吐出圧に加圧する高圧液体発生手段としての吐出ポンプ(21)がある。この吐出ポンプ(21)から高圧ホース(23)を介して噴射制御手段としてのハンドピース(24)が連通されている。
【００４２】
ハンドピース(24)は、先端部の側壁に穿設された噴射口(13)を備えた針状ノズル(12)が先端に装着されており、握り柄と、加圧された卵子採取液の噴射口(13)からの噴射・停止を制御する引き金状の噴射停止スイッチ(25)とを備える。
【００４３】
本実施例の針状ノズル(12)では、先端部の側壁に穿設された噴射口(13)により噴射方向を横方向としたため、軸方向に放射されるノズルに比べて、ノズルに沿って刺入側への液の戻りが少なくなった。また、膨潤する領域も格段に広がった。特に、噴射時に試料とノズルとを相対的に回転させることにより全域にわたって液を膨潤させることが可能となった。
【００４４】
また、卵巣中心部に高圧液体を注入噴射することにより、卵子が存在している表層付近にまで液が到達することが確認された。高圧液体を墨汁にして到達領域を検証した墨汁注入実験によると、卵胞周辺に伸びている毛細血管やリンパ管等を通じて液が達しているものと考えられた。
【００４５】
図２に示す卵子採取用高圧液体注入装置を用いて、図１に示す操作で３次卵子採取を行った。詳しくは、３次卵子吸引採取前に卵巣内に卵子採取液を注入し、卵胞内に液を浸透させ卵胞内で卵丘に覆われた卵子を剥離し吸引時に採取液とも吸引した。３次卵子採取のための卵子採取液の注入は、無注入と比較して卵巣内血液が洗い出され、白色化し、吸引した卵子の培養・受精・胚生産に影響がないことが確認された。
【００４６】
同様に、図２に示す卵子採取用高圧液体注入装置を用いて、図１に示す操作で２次以下の卵子採取を行った。詳しくは、卵巣内にコラゲナーゼを含んだ卵子採取液を注入し、卵巣内に浸透させコラゲナーゼ反応を恒温器で１卵巣全てにおいて行い、反応後卵巣を切開し卵子を流出させた。
【００４７】
コラゲナーゼの注入された卵巣内での反応時間が長いほど、サイズの大きな卵子が遊出してくる傾向があった。卵巣へのコラゲナーゼ注入量にバラツキがあったが、９０〜２４０分間の反応で２次卵胞を確認した。ウォータージェットにコラゲナーゼ液を使用した場合、卵巣内部で結合組織が軟化することが明らかになった。また、軟化した卵巣を切開すると、切開面から卵子が流出することも確認された。
【００４８】
以上のように、２次以下の卵子を採取する場合はメスにより卵巣表皮を剥離させる作業、ピペットによる細片をほぐす作業を省くことができることと、卵巣表皮全てを処理できるため２次以下の卵子の大量採取が可能となる。一連の作業は卵巣内での反応及び卵子の遊離が行われるため雑菌汚染を回避できる。また、３次卵子採取時には液注入により卵巣内からの血管内の血液の流出があるため、夾雑物の洗い出しが可能で採取時の夾雑物を減らし、卵胞内に注入した液と卵子とを同時に吸引採取するため卵丘の剥離を防ぐことができ、不良率を低減することができ、採取率を向上できる。
【００４９】
【発明の効果】
本発明は以上説明したとおり、３次卵子のみならず２次以下の卵子を大量に採取することを可能とした新規な卵子採取法及びそれに使用する高圧液体注入装置を得ることができる。具体的には、３次卵子を採取する場合には、夾雑物の洗い出しが可能で採取時の夾雑物を減らすことができ、卵丘の剥離を防ぐことができ、不良率を低減することができ、採取率を向上できる採取法及びシステムを得ることができる。更に、２次以下の卵子を採取する場合には、メスにより卵巣表皮を剥離させる作業、ピペットによる細片をほぐす作業を省くことができ、２次以下の卵子の大量採取が可能とし、雑菌汚染を回避できる採取法及びシステムを得ることができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の卵子採取法の操作工程を示す説明図である。
【図２】本発明の卵子採取用高圧液体注入装置の構成を示す説明図である。
【符号の説明】
(11)…屠体卵巣、
(12)…針状ノズル、
(13)…噴射口、
(14)…卵子、
(15)…メス、
(16)…シャーレ、
(21)…吐出ポンプ、
(22)…卵子採取液槽、
(23)…高圧ホース、
(24)…ハンドピース、
(25)…噴射停止スイッチ、
【図１】
0004079391.tif 000002
【図２】
0004079391.tif 000003