(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板保存用血漿賦形剤であって、生物活性血小板の保存時間を延長するのに有効な量のアミロライド、ニトロプルシッドナトリウム、アデノシン、ジピリダモール、キナクリン、チクロピジン及びヘパリンを含有することを特徴とする血漿賦形剤。
【請求項２】
血小板保存用血漿賦形剤であって、生物活性血小板の保存時間を延長するのに有効な量のアミロライド、ニトロプルシッドナトリウム、アデノシン、ジピリダモール、キナクリン、チクロピジン、ヘパリン及び凍結貯蔵剤を含有することを特徴とする血漿賦形剤。
【請求項３】
０．１ｍＭ〜１０ｍＭのアミロライド、２．５μＭ〜２５０μＭのニトロプルシッドナトリウム、１０μＭ〜１ｍＭのアデノシン、１０ｎＭ〜１μＭのキナクリン、２μＭ〜200μＭのジピリダモール、０．５ｍＭ〜５ｍＭのチクロピジン、及び５単位／ml〜200単位／mlのヘパリンを含有する請求項１又は２に記載の血漿賦形剤。
【請求項４】
前記凍結貯蔵剤が、０．５％〜１０％である、請求項２に記載の血漿賦形剤。
【請求項５】
前記凍結貯蔵剤が、０．５％〜６％のジメチルスルホキシドである、請求項２に記載の血漿賦形剤。
【請求項６】
前記凍結貯蔵剤が、濃度２％のジメチルスルホキシドである、請求項２に記載の血漿賦形剤。
【請求項７】
前記アミロライドの濃度が１ｍＭである、請求項１又は２に記載の血漿賦形剤。
【請求項８】
前記ニトロプルシッドナトリウムの濃度が２５μＭである、請求項１又は２に記載の血漿賦形剤。
【請求項９】
前記アデノシンの濃度が０．１ｍＭである、請求項１又は２に記載の血漿賦形剤。
【請求項１０】
前記キナクリンの濃度が０．１μＭである、請求項１又は２に記載の血漿賦形剤。
【請求項１１】
前記ジピリダモールの濃度が２０μＭである、請求項１又は２に記載の血漿賦形剤。
【請求項１２】
前記チクロピジンの濃度が１．５ｍＭである、請求項１又は２に記載の血漿賦形剤。
【請求項１３】
前記ヘパリンの濃度が２０単位／mlである、請求項１又は２に記載の血漿賦形剤。
【請求項１４】
以下の工程：請求項１〜１３のいずれか１項記載の血漿賦形剤を血漿相に添加して、血漿/血漿賦形剤混合物を形成する工程；
該血漿/血漿賦形剤混合物を血小板製剤と混合する工程；及び冷蔵する工程を含む、血小板の長期間の貯蔵のための方法。
【請求項１５】
ヒトの血液を加工する方法であって、以下の工程：
a.ヒトの新鮮血液から血小板を含有する血漿を単離する工程；
b.血漿から血小板の少なくとも一部を分離する工程；
c.分離した血漿に、分離した血漿中の血小板の凝集を阻害し得る請求項１〜１３のいずれか１項記載の血漿賦形剤を添加する工程；
d.阻害し、分離した血漿中に、分離した血小板を懸濁する工程；及び
e.懸濁した血小板を含有する得られた血漿を、選ばれた期間２〜８℃又は-２０〜-１３５℃で冷蔵する工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
ヒトの血液を加工する方法であって、以下の工程：
a．ヒトの全血液を遠心分離して、該血液から血小板に富む血漿を単離する工程；
b．血小板に富む血漿を遠心分離して、血小板に乏しい血漿と血小板ペレットとを形成する工程；
c．血小板に乏しい血漿と、請求項１記載の血漿賦形剤とを混合する工程；
d．血小板に乏しい血漿と前記血漿賦形剤との混合物に、血小板ペレットを静かに再懸濁する工程；及び
e．懸濁したペレットを含有する前記得られた混合物を、温度４℃で保存する工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
ヒトの血液を加工する方法であって、以下の工程：
a．ヒトの全血液を遠心分離して、該血液から血小板に富む血漿を単離する工程；
b．血小板に富む血漿を遠心分離して、血小板に乏しい血漿と血小板ペレットとを形成する工程；
c．血小板に乏しい血漿と、請求項２に記載の血漿賦形剤とを混合する工程；
d．血小板に乏しい血漿と前記血漿賦形剤との混合物に、血小板ペレットを静かに再懸濁する工程；及び
e．懸濁したペレットを含有する前記得られた混合物を、温度-８０℃で保存する工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
ヒトの新鮮血液から血小板を単離する方法であって、以下の工程：
a.血小板を含有する新鮮血液から血漿を分離する工程；
b.分離した血漿から血小板を分離して、血漿を含まない血小板分画及び血小板に乏しい血漿分画を形成する工程；
c.血小板に乏しい血漿に、請求項１〜１３のいずれか１項記載の血漿賦形剤を添加する工程；
d.前記血漿賦形剤を含有する血漿分画中に、血小板分画を懸濁する工程；及び
e.前記懸濁した血小板分画を含有する血漿分画を、温度４℃未満で冷却する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒトの血小板の貯蔵寿命を延長する方法に関する。本発明は特に、可逆的阻害剤系、及び、冷蔵温度（４℃）又は冷凍機温度（−８０℃）で保存する間血小板が生物的に活性化するのを阻害する一方、阻害剤系が一旦除去されると通常の活性が回復する能力を血小板に残しておくような方法に関する。本発明の組成物及び方法により、従来得られなかったレベルで機能の回復を維持しつつ血小板を凍結温度で保存することが可能となる。
背景技術
患者を治療するために血小板輸血が用いられることが多い。血小板輸血は、出血多量に苦しむ負傷による被害者のみならず、化学療法を受けている患者にも適用される。化学治療は患者の血小板数を減少させ、また機能的に欠陥のある状態で存在する血小板をもたらす。例えば、血小板減少症を患っている場合、骨髄抑制により患者の血小板の数が減少するのに対し、出血性心筋炎の患者の場合、化学治療により血小板の機能に欠陥が生じている。血小板輸血は、血小板の数を増加させて血小板減少症のような症状を治療するため、及び出血性心筋炎を治療する際に機能的に欠陥のある血小板を置換するために用いられる。
血小板は、代謝機能及び夾雑物の成長を抑制することが可能な低温で保存すべきである。現在のところ、血小板は、２２℃で５日間まで保存される。この保存期間は、無酸素代謝作用に関連するラクテートの増加に起因するｐＨの低下により制限される。２２℃での保存はまた、バクテリアの成長の可能性によっても制限される。冷蔵は、２２℃での保存に対して、代謝機能、夾雑物及びｐＨの安定性の点で利点がある。しかしながら、冷蔵保存は複数の固有の問題をもたらす。第１に、約２４時間冷蔵保存すると、血小板は円盤状から球状構造への変形を受ける。第２に、約２４〜４８時間冷蔵保存すると、自発的な凝集が増加する。第３に、４℃で保存された血小板は、保存期間の経過後に機能的活性を回復することができない。最後に、４℃での保存で損傷した血小板は、輸血後、脾臓により循環から除去されてしまう。
冷蔵血小板保存のゴールは、多数の血小板を維持し、血小板を維持することのできる時間を延長し、血小板の機能の完全性を保持し、かつ血小板のインビボでの循環寿命を通常の限界に近づけることを確実にすることにある。これは、本発明の阻害剤系を使用することにより達成されるものと考えられる。その理由は、該系が活性化に必須の経路を遮断し、それにより血小板が４℃で誘起される損傷を受けないこととなるからである。
新鮮な血小板の貯蔵寿命は２２℃（室温）でわずか３〜５日間であるため、血小板の貯蔵寿命を延長する方法は有益であると考えられる。残念ながら、数多くの血小板保存の最適化の試みがなされてきたにもかかわらず、細胞形状の著しい変化（生物学的不活性化につながる）及び凝集力による永久変形のため、血小板の保存は制限されたままである。更に、保存に伴って血小板の損傷は広がり、それにより、該血小板は輸血に続く第１回目の間に脾臓によって予め循環から除去されてしまう。ちなみに、人体中での正常な血小板の典型的な寿命は約８日間である。血小板を長期間保存する先行技術の試みによると、損傷変形した血小板を作り出すことになる。先行技術により保存した血小板の約８０％〜９０％が、数字上では保存後に再生可能であるが、脾臓を通過する第１回目の循環後になお活性であるものはわずか２０％〜３５％である。これは、脾臓が損傷変形した血小板を濾過により除去するためである。本発明の組成物及び方法によると、数字上では８０％〜９０％が再生される点は先行技術と同様であるが、損傷変形した血小板が作り出されることがないため、再活性化された血小板の６５〜８０％が、人体中で通常の時間生物学的に機能するはずである。
保存温度の低下、凍結保存技術、添加剤及び人工的な保存媒体等のいくつかの試みによれば、保存後に多数の血小板が得られる。しかしながら、これらの方法により再生された血小板の機能的な許容量及び循環における耐久性は、限定的なものである。保存後に多数の血小板が得られるのみならず、保存する間血小板が凝集するのを防ぎ、かつ一旦患者に輸血されると、循環中に維持され除去されないという血小板の能力を含む通常の反応能力を維持し続けることを可能にするような血小板保存システムが、血液銀行及び病院により非常に必要とされている。
血液銀行及び病院は、保存後に多数の血小板が得られる血小板保存システムを、非常に必要としている。これは、保存する間血小板が凝集するのを防ぎ、保存状態から取り出した後に血小板が通常の反応をする能力を取り戻すことを可能にし、かつ血小板が循環中に維持され脾臓により除去されないことを可能にするような血小板保存システムにより達成される可能性がある。
血小板活性阻害剤を使用する従来の試みは、非常に限定的にしか成功していない。その理由は主に、先行技術による教示が、血小板の機能を保持する試みにおける単一の阻害剤の使用に限定されていることにある。単一阻害剤系によれば、阻害剤が全くない場合よりも向上した結果が得られるが、本発明の組成物及び方法を用いることにより達成される予期せぬ結果に到達するものではない。単一阻害剤系の使用に関する従来の方法については、バレリ、ファインゴールド及びマーチオンニ、「ジメチルスルホキシドを用いたヒト血小板の簡単な冷凍方法及び−８０℃での保存」、『血液』、第４３巻、第１号（1974年１月）、及びボーデ、ホルメ、ヒートン及びスワンソン、「血小板活性阻害剤プロスタグランジンＥ及びテオフィリンを用いた人工媒体中での血小板の長期保存」、“Vox Sang”、第６０巻、105〜112頁（1991年）に説明されている。
発明の開示
本発明は、従来の方法に比べて、有利な効果及び技術的知識の点で大いなる飛躍となるものである。本発明の組成物及び方法を用いて処理した血小板の保存、再活性化、及び長期の機能的有効性は、従来は不可能であると考えられてきたものである。
本発明は、ヒトの血小板の貯蔵期間を延長する方法を提供する。該方法では、血小板が、長期保存中その円盤形状を維持し、かつその機能的完全性を保持することを可能にする阻害剤系を使用する。これは、通常の血小板の機能を阻害して、保存期間中血小板が生物学的に活性化しないようにしておくことにより達成される。
本発明の方法は、第二メッセンジャーエフェクターからなる阻害剤系を広く含む。この第二メッセンジャーエフェクター阻害剤系は、次の経路を通して機能する：環状アデノシン一リン酸（環状ＡＭＰ）、ナトリウムチャネル、環状グアノシン一リン酸（環状ＧＭＰ）、シクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、ホスホリパーゼ、カルシウムカスケード、プロテアーゼ及びプロテイナーゼ、及び膜改質剤。更に具体的には、各々の経路について、特定の薬剤又は薬剤の組合わせを使用してよい。例えば、アデノシン、イロプロスト、プロスタサイクリン及びＰＧＥ2は、環状ＡＭＰ経路の刺激を通して活性化を阻害するよう作用する。アミロライド及びアミロライド類縁体は、ナトリウムチャネルの阻害を通して活性化を阻害するよう作用する。ニトロプルシッドナトリウム及びＬ−アルギニンは、ＧＭＰ経路の刺激を通して活性化を阻害するよう作用する。アスピリン、ジピリダモール、フルビプロフェン及びチクロピジンは、シクロオキシゲナーゼ経路の阻害を通して活性化を阻害するよう作用する。アスピリン及びチクロピジンは、リポキシゲナーゼ経路の阻害を通して活性化を阻害するよう作用する。キナクリンは、ホスホリパーゼ経路の阻害を通して活性化を阻害するよう作用する。カルシウムは、カルシウムカスケード経路を通して血小板の活性化を促進するよう作用する。プロテアーゼ及び／又はプロテイナーゼは、表面受容体の変化の阻害を通して血小板の凝集を阻害するよう作用する。アマンタジン、アジョエン、ヘパリン、チクロピジン、及び／又はペントキシフィリンは、膜改質剤として作用する。
前記阻害剤系は、低温、即ち２〜８℃で保存している間作用する。零下の保存温度（−２０〜−135℃）を使用する場合には、凍結製剤化する前に、血小板に凍結保護剤を導入するのが有効である。例としては、ジメチルスルホキシド、マルトデキストリン類、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン及びグルコースがあるが、他の凍結保護剤を使用してもよい。凍結保護剤は個別に使用しても組み合わせて使用してもよい。
ヒトの血小板の貯蔵に好ましい方法は、静脈穿刺を通してヒトから抗凝固剤の入った排気試験管に全血を吸引する工程により始まる。該血液を遠心分離して、血液から血小板に富む血漿を単離する。血小板に富む血漿を遠心分離して、血小板に乏しい血漿を血小板ペレットから分離するが、該ペレットは血漿を遠心分離しデカントした後に残る濃縮された血小板である。次に、血小板に乏しい血漿に、阻害剤系を添加する。この阻害剤系は、血小板に乏しい血漿に添加され、次の濃度となるような、以下の物質を含む：0.1ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは約１ｍＭのアミロライドのジメチルスルホキシド（DMSO）溶液、約2.5μＭ〜約250μＭ、好ましくは約２５μＭのニトロプルシッドナトリウム（NaNP）のリン酸緩衝生理食塩水溶液、約１０μＭ〜約１ｍＭ、好ましくは約0.1ｍＭのアデノシンのリン酸緩衝生理食塩水溶液、約１０ｎＭ〜約１μＭ、好ましくは約0.1μＭのキナクリンのリン酸緩衝生理食塩水溶液、約２μＭ〜約200μＭ、好ましくは２０μＭのジピリダモールのDMSO溶液、約．５ｍＭ〜約５ｍＭ、好ましくは1.5ｍＭのチクロピジンのDMSO溶液、及び約５単位／ml〜約200単位／ml、好ましくは２０単位／mlのヘパリンのリン酸緩衝生理食塩水溶液。血小板に乏しい血漿／阻害剤系混合物中に、血小板ペレットを静かに再懸濁する。混合物を次いで血小板保存容器中に置き、振盪せずに２℃〜８℃で保存する。阻害剤を添加する他の方法には、DMSOを添加せずに上記阻害剤の懸濁液を作製する方法がある。該懸濁液を次いで凍結乾燥する。添加時に、阻害剤の凍結乾燥粉末を血小板に乏しい血漿で再水和し、次いで血小板ペレットに添加する。該方法の他の点及び阻害剤の濃度範囲は、上記の通りである。
２つの例外を除き、４℃での保存で使用するのと同様の工程を、−２０〜−135℃での血小板の保存に使用することができる。凍結貯蔵剤、即ちジメチルスルホキシドが、−２０〜−135℃での保存に用いる阻害剤系の一部をなし、かつ血小板保存容器は−２０〜−135℃での保存に適するものでなければならない。
保存の間の活性化は望ましくない。しかしながら、血小板を保存状態から取り出したときに、血小板が活性化する能力を維持し、輸血の目的に関して通常通り機能することが必要とされる。血小板を保存状態から取り出した場合には、本発明の阻害剤系を血小板から洗い流してもよく、これにより血小板の活性レベルはその通常レベルの非常に近くまで戻る。この洗浄工程は、インビトロでの機械的洗浄により行ってもよく、あるいは直接輸血での希釈化効果により行ってもよい。
保存後に血小板がその機能的能力を保持しているか否かを決定するために測定すべき３種類の血小板活性パラメータがある。これらのパラメータは、新鮮な血小板についての同様なパラメータと比較する場合に有用である。更に、異なる阻害剤混合物を用いて保存した血小板についての血小板活性パラメータを比較して、いずれの阻害剤の組合わせにより保存後により機能的な血小板が得られるかを決定することもできる。本発明により貯蔵された血小板の活性パラメータを測定するのに使用する試験は：血小板の数、低張応答、コラーゲン誘導凝集及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）誘導凝集である。更に、グラニュール放出の測定から、保存中の血小板の完全性についての重要な情報が得られる。
低張応答は、血小板が代謝活性を維持しているか否かを決定するのに用いる検定である。この検定は、低張溶液の添加に対抗する血小板の能力の測光測定である。この活性は、細胞の機能（即ち、機能的な膜水ポンプ）を反映しており、保存後の血小板の回復の指標である。低張応答は、輸血後に血小板が循環中に留まる能力の重要な指標であることが明らかにされている。従って、低張応答は、保存後の血小板の生化学を評価する重要なパラメータを表す。
凝集能力は、血小板が保存中にその機能の完全性を維持し得るか否かを示す他の特徴である。この能力は、ＡＤＰ及びコラーゲンを使用することにより凝集を誘導して測定される。作用薬は受容体に結合し、特定の反応を開始させる薬剤である。作用薬により誘導される凝集において、凝集（aggregation又はclumping）がその反応である。作用薬、即ちＡＤＰ及びコラーゲンは、凝集を誘導し、血小板がその凝集能力を維持しているか否かを決定するのに使用される。更に、凝集反応が起きる場合には、作用薬を添加することなく血小板が相互に癒着しあう自発的凝集の存在を検出することができる。自発的凝集の発生は、血小板の循環からの除去につながり、従って血小板の寿命は短い。
発明を実施するための最良の形態
Ａ．阻害剤系
本発明の阻害剤系は、特定の第二メッセンジャーエフェクターであって、血小板と相互作用し、４℃及び−８０℃での保存の間の活性及び機能的活性の損失に対抗できるよう細胞を安定化させるものの適用をベースとする。
７成分混合物
好ましい７成分阻害剤系を形成する特定の改質剤は、アミロライド、アデノシン、ニトロプルシッドナトリウム、キナクリン、ジピリダモール、チクロピジン及びヘパリンである。これらの改質剤を血小板ペレットに添加し、次いで（100倍〜の濃度に）自己由来の血小板に乏しい血漿で希釈する。これらの改質剤のそれぞれは、異なる特定の第二メッセンジャー経路に作用する。アミロライドはカリウム保存利尿剤であり、医薬としては高血圧の治療に使用される。本発明においては、アミロライドは、血小板のＮａ+−Ｈ+交換体の阻害剤として作用する。アデノシンは、医薬としては患者の正常な洞調律を回復させるのに使用される。本発明においては、アデノシンは、環状ＡＭＰの生成を刺激する。ニトロプルシッドナトリウムは平滑筋を弛緩させ、従って医薬としては血管拡張剤として投与される。本発明においては、ニトロプルシッドナトリウムは、環状ＧＭＰの生成を刺激する。ジピリダモールは、医薬としては血小板癒着阻害剤として使用される。本発明においては、ジピリダモールは、アラキドン酸カスケードのシクロオキシゲナーゼ及びリポキシゲナーゼ酵素の阻害剤として作用する。キナクリンは、腸条虫を根絶する治療に使用される。本発明においては、キナクリンは、ホスホリパーゼＡ2阻害剤として作用する。チクロピジンは、医薬としては血小板凝集阻害剤として血栓性卒中の危険性を低下させるのに使用される。本発明においては、チクロピジンは、アラキドン酸カスケードの阻害剤として使用される。ヘパリンは、医薬としては血液中の抗凝固剤として使用される。本発明においては、ヘパリンは、フィブリン結合を遮断するのに使用される。
これら全ての第二メッセンジャーエフェクターは、単独であるいは相互に組み合わせて、作用薬により誘導された凝集を阻害することが明らかにされた。更に重要なことには、該阻害剤は、血小板を洗浄することによりエフェクターを除去した後は可逆的である。該第二メッセンジャーエフェクターを、単独であるいは相互に組み合わせて添加すると、２〜８℃又は−２０〜−135℃での保存の間、血小板は保存による損傷を受けにくくなる。これらの細胞はまた、エフェクターを除去すると通常の生理学的凝集を示し、自発的凝集を示さず、高い低張応答を維持した。
血小板損傷阻害剤としての有用性が示されている化学物質について記載する場合に、実際に言及されている化学物質及び機能的に等価な物質はともに、本発明の範囲内のものであるとされることに留意すべきである。阻害剤としての有用性が知られ又は明らかにされているものについて、特に本願明細書に記載している。しかしながら、本願明細書の範囲は、機能的に有効な他の化学物質であって、既に存在している化学物質又は未だ見いだされていない化学物質にまで及ぶものである。
ナトリウムチャネルを通して作用する阻害剤について機能的に等価な物質であると考えられる特定の化学物質は、アミロライド、アミロライド類縁体、ベプリジル、フレカイナイド、サキシトキシン、ベンズアミル及びプラジュナリウムからなる群から選ばれるものである。ＧＭＰ経路を通して作用する阻害剤と機能的に等価であると考えられる物質は、ニトロプルシッドナトリウム、Ｌ−アルギニン、亜酸化窒素、ＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１Ａ、心房ナトリウム排出因子、バソプレッシン、オキシトシン及び三窒化グリセリルからなる群から選ばれる。シクロオキシゲナーゼ経路を通して作用する阻害剤について機能的に等価な物質は、アスピリン、ジピリダモール、フルビプロフェン、チクロピジン、ケトプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、スルフィンピラゾン、グアナベンツ、ウルソール酸及びベンゾヒドロキノンからなる群から選ばれる。リポキシゲナーゼ経路を通して作用する阻害剤成分について機能的に等価な物質は、アスピリン、チクロピジン、ウルソール酸、ウンベリフェロン、５，８，11，14−エイコサテトラエン酸及びエスクレチンからなる群から選ばれる。最後に、カルシウムカスケード経路を通して作用する阻害剤と機能的に等価な物質は、プロテインキナーゼＣエフェクター、カルシウムチャネル遮断剤、カルシウム濃度改良剤、カルモジュリンエフェクター、カルシウムイオノファ及びＡＴＰアーゼ刺激剤からなる群から選ばれる。
Ｂ．４℃での血小板の保存
本発明の阻害剤系を使用して、４℃で細胞を保存することにより、血小板の貯蔵寿命を延長することが可能であると考えられる。４℃で１０日間保存した血小板を、保存後の活性について分析した場合、新鮮な血小板の活性に比べて、細胞の活性の割合は以下の通りであった：ＡＤＰ誘導凝集７０％、コラーゲン誘導凝集８５％、低張応答６５％及び細胞数の再生＞９５％。これらの結果は、新鮮な血小板に比べてＡＤＰ誘導凝集５５％、コラーゲン誘導凝集８０％、低張応答５５％となる従来の２２℃で５日間の保存後の血小板の保存と比較して良好である。
４℃での実験を行う場合、米国血液銀行協会の手続及びプロトコルに規定されている通り、かつ血液調達機関が行う通り、静脈穿刺を通して抗凝固剤酸−クエン酸デキストロースの入った血液バッグに全血を吸引する。小スケールの実験を行う場合には、全血を６mlの排気試験管に吸引し、血液バッグの場合と同様のプロトコルにより加工することも可能である。血液バッグを2000×ｇで３分間遠心分離して、赤血球を血小板及び血漿から分離する。接続した血小板保存バッグに圧搾して血小板に富む血漿を単離し、次いで5000×ｇで５分間２回目の遠心分離をして血小板をペレット化する。血小板に乏しい血漿を血漿保存バッグに圧搾する一方、約５０〜６０mlの血漿を伴う得られた血小板ペレットを、血液銀行手続に規定されている通り２２℃に１時間放置した。温置後、血小板製剤を緩やかに振盪することにより残存血漿中に再懸濁する。６mlの試験管を用いた小スケールの実験の場合、等容積の血漿を血小板ペレット上に残し、血小板試料を再懸濁する。
阻害剤系溶液は、以下のように調製する：100ｍＭのアミロライド、150ｍＭのチクロピジン及び２ｍＭのジピリダモールを含むDMSOによる薬剤の溶液を調製する。2.5ｍＭのニトロプルシッドナトリウム、１０ｍＭのアデノシン、１０μＭのキナクリン及び2000単位／mlのヘパリンを含むリン酸緩衝生理食塩水による薬剤の溶液を調製する。これらの混合物中の阻害剤系薬剤の濃度は、４℃での有効な保存を達成するために血小板中に必要とされる最終濃度の100倍とする。阻害剤溶液を、血小板濃厚物に、全血小板製剤の１／100容積で、無菌ポートを通した直接注入により添加する。DMSO溶液及びリン酸緩衝生理食塩水溶液の添加の順序は、本発明の実施に本質的なものではないと思われる。血小板製剤中の阻害剤薬剤の最終濃度は、以下の通りである：アミロライド１ｍＭ、アデノシン0.1ｍＭ、ニトロプルシッドナトリウム２５μＭ、ジピリダモール２０μＭ、キナクリン0.1μＭ、チクロピジン1.5ｍＭ、及びヘパリン２０単位／ml。標準血小板保存バッグに入れた血小板製剤を、攪拌せずに４℃に静置する。阻害剤系を伴う血小板濃縮物は、保存後に直接輸血することが可能である。
あるいは、組合わせた阻害剤を、DMSOを使用せずに血小板ペレットに添加することも可能である。これは、２種類の方法により行うことができる。組合わせた阻害剤を音波処理により懸濁液に加工することが可能である。この音波処理した懸濁液を、次いで上記のように直接使用することができる。あるいは、音波処理した懸濁液を凍結乾燥し、凍結乾燥粉末として保存することもできる。使用に際して、該粉末を、適切な体積の血小板に乏しい血漿を用いて再水和化し、上記のように血小板ペレットに添加する。いずれの方法を用いる場合でも、（DMSOを使用しないことを除き）添加剤の最終濃度は上記と同様である。
Ｃ．凍結貯蔵による−２０〜−135℃での血小板の保存
本発明の第２の使用は、血小板を−２０〜−135℃で保存することを含む。本発明の阻害剤溶液系を血小板ペレットに添加することにより、血小板を有効に安定化させ、よって細胞を凍結貯蔵し、−２０〜−135℃で保存することが可能となる。
血小板を−２０〜−135℃で保存するには、凍結保護剤の添加が必要となる。本発明の方法の一部として、ジメチルスルホキシド（DMSO）を凍結保護剤として使用できる。DMSOは極性分子であり、細胞膜に浸透し、凍結調剤工程の間細胞活性を維持するのに役立つ。本発明において、DMSOは、血小板を安定化させ、−２０〜−135℃で保存した後に機能的に活性な血小板を得ることを可能にする。本発明の阻害剤系を用いて凍結貯蔵した血小板を長期間（＞100日）保存した後、再生した細胞の数及び血小板の機能的活性を、新鮮な血小板の場合と比較した。９５％を超える凍結貯蔵細胞が再生し、これらの血小板はＡＤＰ誘導凝集５５％、コラーゲン誘導凝集６５％及び低張応答５０％という機能的活性を示した。これらの結果は、従来の２２℃で５日間の保存後の血小板の保存と比較して良好である。更に、このプロトコルにおいて、他の凍結保護剤をDMSOの代わりに使用してもよい。このような凍結保護剤にはマルトデキストリン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン及びグルコースが含まれ、これらは単独であっても組み合わされていてもよい。
本発明の阻害剤保存系に使用することを目的として血小板を加工するため、血液銀行手続に規定されかつ４℃での保存について（Ｂ）節で詳細に記載したように、血小板濃厚物を作製する。阻害剤系溶液は、以下のように調製する：100ｍＭのアミロライド、150ｍＭのチクロピジン及び２ｍＭのジピリダモールを含むDMSOによる薬剤の溶液を調製する。2.5ｍＭのニトロプルシッドナトリウム、１０ｍＭのアデノシン、１０μＭのキナクリン及び2000単位／mlのヘパリンを含むリン酸緩衝生理食塩水による薬剤の溶液を調製する。これらの混合物中の阻害剤系薬剤の濃度は、血小板中に必要とされる最終濃度の100倍とする。阻害剤溶液を、血小板濃厚物に、全血小板製剤の１／100容積で、無菌ポートを通した直接注入により添加する。DMSO溶液及びリン酸緩衝生理食塩水溶液の添加の順序は重要ではないと思われる。血小板製剤中の阻害剤薬剤の最終濃度は、以下の通りである：アミロライドｌｍＭ、アデノシン0.1ｍＭ、ニトロプルシッドナトリウム２５μＭ、ジピリダモール２０μＭ、キナクリン0.1μＭ、チクロピジン1.5ｍＭ、及びヘパリン２０単位／ml。更に、DMSOを、無菌ポートを通した注入により血小板製剤に直接添加して、最終濃度を１％〜６％、好ましくは２％とする。−２０〜−135℃での保存に使用可能な血小板バッグを、標準冷凍カセット中に静置し、次いで−２０〜−135℃の冷凍機中に置く。本発明の阻害剤系を用いて血小板を−２０〜−135℃で保存した後、血小板製剤を−２０〜−135℃の冷凍機から取り出し、全製剤が溶解するまで３７℃のウォーターバス中に直接置く。阻害剤系を伴う血小板濃縮物は、溶解処理後に直接輸血することが可能である。あるいは、血小板製剤を遠心分離して血小板をペレット化し、それにより凍結貯蔵溶液のDMSO成分を除去することもできる。該血小板を次いで自己由来の血漿中に再懸濁し、直接輸血することが可能である。
本発明の組成物を当業者が製造することが可能となるように、以下に実施例を示す。これらの実施例は、本発明が認識された範囲を限定することを意図するものではない。測定条件を特徴付ける数値に関する精度を確かなものとするために努力を払ったが、実験的エラー及び偏差がいくらか存在する可能がある。
実施例
実施例１
本実施例は、４℃での長期保存を試験する実験に関する。肘前静脈の静脈穿刺を通して、酸−クエン酸デキストロース抗凝固剤の入った６mlの吸引排気試験管に、試験管６本の全血を吸引した。全血の入った試験管を250×ｇで１２分間遠心分離した。血小板に富む血漿を単離した。血小板に富む血漿を950×ｇで２０分間遠心分離した。全ての血小板に乏しい血漿をペレットから除去した。溶液を血小板に乏しい血漿に添加して、以下の最終濃度とした：アミロライド１ｍＭ、ニトロプルシッドナトリウム（NaNP）２５μＭ、アデノシンのリン酸緩衝生理食塩水溶液0.1ｍＭ、キナクリン0.1μＭ、ジピリダモール２０μＭ、チクロピジン1.5ｍＭ、ヘパリン２０単位／ml及びDMSO１％。該溶液を含有する血小板に乏しい血漿を血小板ペレットに戻し、元の血小板に富む血漿の体積の１／１０の体積とした。ペレットを緩やかに再懸濁し、混合物を血小板保存バッグに移した。混合物を入れた血小板バッグを、攪拌せずに４℃で保存した。
４℃で１０日間保存後の上記方法の結果
標準的な血小板保存バッグ中で４℃において１０日間保存した後、血小板を室温まで温め、自己由来の血漿で希釈して、元の血小板に富む血漿の体積とした。新鮮な血小板の活性との比較で、血小板の保存後の活性を分析した。活性の特徴についての結果は、以下の通りであった。
ＡＤＰ誘導凝集        ７０％
コラーゲン誘導凝集    ８５％
低張応答              ６５％
細胞数の再生          ９５％
実施例２
本実施例は、−８０℃での保存後の血小板の活性を試験する実験に関する。肘前静脈の静脈穿刺を通して、酸−クエン酸デキストロース抗凝固剤の入った６mlの吸引排気試験管に、試験管６本の全血を吸引した。全血の入った試験管を250×ｇで１２分間遠心分離した。血小板に富む血漿を単離した。血小板に富む血漿を950×ｇで２０分間遠心分離した。全ての血小板に乏しい血漿をペレットから除去した。溶液を血小板に乏しい血漿に添加して、以下の最終濃度とした：アミロライド１ｍＭ、ニトロプルシッドナトリウム（NaNP）２５μＭ、アデノシン0.1ｍＭ、キナクリン0.1μＭ、ジピリダモール２０μＭ、チクロピジン1.5ｍＭ、ヘパリン２０単位／ml及びジメチルスルホキシド６％。該溶液を含有する血小板に乏しい血漿を血小板ペレットに戻し、元の血小板に富む血漿の体積の１／１０の体積とした。ペレットを緩やかに再懸濁し、混合物を血小板保存バッグに移した。混合物を入れた血小板バッグを、−８０℃において、冷蔵用に設計した標準赤血球カセット中で保存した。
凍結貯蔵後の上記方法の結果
冷凍した血小板試料を３７℃のウォーターバス中に直接置いて溶解させた後、血小板を自己由来の血漿で希釈して、元の血小板に富む血漿の体積とした。新鮮な血小板の活性との比較で、血小板の保存後の活性を分析した。活性の特徴についての結果は、以下の通りであった。
ＡＤＰ誘導凝集        ５０％
コラーゲン誘導凝集    ７４％
低張応答              ７８％
細胞数の再生          ８５％
実施例３
本実施例は、全ユニットの血小板濃厚物を長期間４℃で保存することへの、本発明の阻害剤系の適用に関する。標準血液銀行手法に従って、湾岸地域血液銀行の静脈穿刺を通して、無菌市販血液収集システムに全血の全ユニットを吸引した。標準血液銀行手続に従って、全血の入った血液バッグを遠心分離し、得られた血小板に富む血漿の分画を標準血小板保存バッグに圧搾した。血小板に富む血漿を、次いで標準血液銀行プロトコルに従って遠心分離し、得られた血小板に乏しい血漿を標準血漿保存バッグに圧搾した。血小板保存バッグ中の得られた血小板ペレットには、なお約６０mlの血漿が残存していた。この血小板濃厚物を、攪拌せずに２２℃で１時間保存して、血小板を再懸濁させた。以下のものを含有する阻害剤溶液を調製した：100ｍＭのアミロライド、150ｍＭのチクロピジン及び２ｍＭのジピリダモールを含むDMSOによる薬剤の溶液。2.5ｍＭのニトロプルシッドナトリウム、１０ｍＭのアデノシン、１０μＭのキナクリン及び2000単位／mlのヘパリンを含むリン酸緩衝生理食塩水による薬剤の溶液。これらの混合物中の阻害剤系薬剤の濃度は、血小板製剤中に必要とされる最終濃度の100倍とした。阻害剤溶液を、血小板濃厚物に、全血小板製剤の１／100容積（約0.6ml）で、無菌ポートを通した直接注入により添加した。DMSO溶液及びリン酸緩衝生理食塩水溶液の血小板濃厚物への添加の順序は、重要ではないと思われる。血小板製剤中の阻害剤薬剤の最終濃度は、以下の通りである：アミロライド１ｍＭ、アデノシン0.1ｍＭ、ニトロプルシッドナトリウム２５μＭ、ジピリダモール２０μＭ、キナクリン0.1μＭ、チクロピジン1.5ｍＭ、及びヘパリン２０単位／ml。阻害剤溶液を伴う血小板濃厚物を、次いで攪拌せずに４℃で保存した。同時に、比較のため、以下のような従来の血液銀行の方法の下で血小板濃厚物ユニットを保存した：血小板濃厚物を１時間温置して再懸濁させた後、標準血液銀行手続に従って緩やかに攪拌しながら血小板製剤を２２℃で保存した。更に、阻害剤系を使用することなく、血小板濃厚物製剤を４℃で保存した。保存の様々な時点で、従来法で保存した製剤、４℃で保存した血小板、及び本発明の阻害剤溶液を使用して４℃で保存した血小板から、血小板のアリコートを採取した。これらの製剤からの血小板を、次いで細胞の活性及び機能的活性について分析した。この実験についての結果を、以下の表に示す。データは、採取した時間での新鮮な血小板の活性及び機能的活性に対する割合で表されている。
0004129292.tif 000002
活性及び機能的活性についての全ての試験において、本発明の阻害剤溶液を添加して４℃で保存した血小板濃厚物は、１０日目において、従来法で保存した５日目の血小板よりも高い回復を示した。従来の血液銀行の基準の下では、血小板の最長保存期間は２２℃では５日間である。
実施例４
本実施例は、全ユニットの血小板濃厚物を長期間凍結貯蔵により−８０℃で保存することへの、本発明の阻害剤系の適用に関する。標準血液銀行手法に従って、湾岸地域血液銀行の静脈穿刺を通して、無菌市販血液収集システムに全血の全ユニットを吸引した。標準血液銀行手続に従って、全血の入った血液バッグを遠心分離し、得られた血小板に富む血漿の分画を標準血小板保存バッグに圧搾した。血小板に富む血漿を、次いで標準血液銀行プロトコルに従って遠心分離し、得られた血小板に乏しい血漿を標準血漿保存バッグに圧搾した。血小板保存バッグ中の得られた血小板ペレットには、なお約６０mlの血漿が残存していた。この血小板濃厚物を、攪拌せずに２２℃で１時間保存して、血小板を再懸濁させた。以下のものを含有する阻害剤溶液を調製した：100ｍＭのアミロライド、150ｍＭのチクロピジン及び２ｍＭのジピリダモールを含むDMSOによる薬剤の溶液。2.5ｍＭのニトロプルシッドナトリウム、１０ｍＭのアデノシン、１０μＭのキナクリン及び2000単位／mlのヘパリンを含むリン酸緩衝生理食塩水による薬剤の溶液。これらの混合物中の阻害剤系薬剤の濃度は、血小板製剤中に必要とされる最終濃度の100倍とした。阻害剤溶液を、血小板濃厚物に、全血小板製剤の１／100容積（約0.6ml）で、無菌ポートを通した直接注入により添加した。DMSO溶液及びリン酸緩衝生理食塩水溶液の血小板濃厚物への添加の順序は、重要ではないと思われる。血小板製剤中の阻害剤薬剤の最終濃度は、以下の通りである：アミロライド１ｍＭ、アデノシン0.1ｍＭ、ニトロプルシッドナトリウム２５μＭ、ジピリダモール２０μＭ、キナクリン0.1μＭ、チクロピジン1.5ｍＭ、及びヘパリン２０単位／ml。更に、無菌ポートを通した注入により、DMSOを血小板濃厚物に添加して、最終濃度を６％とした。標準冷凍バッグに入れた血小板製剤を、冷凍カセットに入れ、−８０℃に置いた。同時に、従来の血液銀行の方法に従って、血小板濃厚物を凍結貯蔵した。即ち、６％のDMSOを血小板濃厚物に添加し、次いで血小板製剤を−８０℃で冷凍カセット中に置いた。−８０℃で２０日間保存した後、血小板製剤を−８０℃の冷凍機から取りだし、３７℃のウォーターバス中に直接置いた。血小板のアリコートを採取し、遠心分離してDMSOを除去した。血小板ペレットを自己由来の血漿中に再懸濁し、細胞の活性及び機能的活性を決定した。この実験についての結果を、以下の表に示す。データは、採取した時間での新鮮な血小板の活性及び機能的活性に対する割合で表されている。
0004129292.tif 000003
本発明の阻害剤系を使用して、−８０℃で凍結貯蔵することにより保存した血小板は、良好な活性及び機能的活性の回復を示しており、従って輸血後であっても有効であり得ると考えられる。