(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシカルボン酸および希釈剤を含む予防上有効量の抗菌性濃縮組成物を毎日乳牛に付与する、乳牛における毛状疣贅病抑制方法。
【請求項２】
ペルオキシカルボン酸が過酢酸を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペルオキシカルボン酸が、Ｃ2−Ｃ18過カルボン酸またはその混合物を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗菌性濃縮組成物が、
約２〜２５重量％のペルオキシカルボン酸、
約１〜４５重量％の過酸化水素、
約１〜７０重量％の対応カルボン酸、及び差引残量分の水
を含有する請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、乳牛における足の疾病予防療法に関するものである。更に詳しくは、本発明は乳牛の毛状疣贅病を引き起こす生物の抑制のためにペルオキシカルボン酸の使用に関するものである。
【０００２】
発明の背景
毛状疣贅病は、乳頭腫性肚皮膚炎（Papillomatus Digital Dermatltis（PDD））、伝染性牛趾間皮膚炎（Infectious Bovine Interdigital Dermatitis（IDD））、趾皮膚炎（Digital Dermatitis（DD））、又は家畜趾間腐爛（Stable Foot Rot（SFR））とも呼ばれており、動物間で伝播する伝染病である。この疾病の影響は、趾行、体重減少、健康全般における減退に見られ、乳牛の場合には、牛乳生産量の低下、及び、その結果生じる酪農業者の経済的損失に見られる。動物の生命を守るため、介在手術を必要とする場合も有り得る。
【０００３】
この病気は、フソバクテリウム−メクロホルム（Fusobacterium mecrophorum）、ジケロバクテル−ノドーサス（Dichelobacter nodosus）、及びバクテロイデス−メラニノゲニカス（Bacteroides melaninogenicus）に起因するものと考えられる。全て嫌気性スピロヘータであり、腸管溝（intestinal track）に生存し、最長１０ヶ月間肥料／糞尿中に生存することが報告されている。
【０００４】
現在の治療としては、硫酸銅、硫酸亜鉛、ホルムアルデヒド、テトラサイクリン、並びに、苛性ソーダ及び次亜塩素酸ソーダを含む混合物を含有する足浴が挙げられる。テトラサイクリンのみ有効であることが報告されており、しかも、一般に、テトラサイクリンで治療した感染部位に包帯を施すことを含め、何らかの外科医療技術と組み合わせた場合である。従って、毛状疣贅病を抑制する上で現在入手可能な製品よりも更に効果的な製品に対する需要が存在し、これは、特に米国における酪農場乳牛群全体にこの病気が広がっているという報告により、この病気が酪農製品製造者の面している最も大きな問題の一つとなっているからである。
【０００５】
例えば、消毒剤、抗菌剤、及び殺菌剤として、抗菌性組成物におけるペルオキシカルボン酸の使用が報告されている。特に、過酢酸は、バクテリア及びウイルスの抑制が重要要素である場合、一般的殺菌剤として家禽飼育場での適用において使用されている。伝染病を治療するために動物に直接ペルオキシカルボン酸を使用することは報告されていない。
【０００６】
発明の簡単な説明
本発明は、乳牛の毛状疣贅および／又は関連の足の疾病に対する、ペルオキシカルボン酸化合物の新規使用に関するものである。本発明に含まれるペルオキシカルボン酸生成物は、動物の予防プログラム、つまり、予防療法に有効である事が分かっている。
【０００７】
前記予防プログラム、つまり予防療法においては、全動物群を一日単位で、液体に浸からせる足浴を用いる。または、動物群において、伝染している可能性のある部位に前記生成物をスプレーするか又は泡状物を付与することにより一日単位で治療してもよい。前記生成物には、予防上有効量のペルオキシカルボン酸を使用する。推奨する適用量としては、希釈剤、例えば水１ガロンにつき０．５〜１０オンス（１４．８〜２９０．６ｍｌ）、好ましくは、濃縮物０．５〜３オンス（１リッターにつき１４．８〜８８．７ｍｌ）を使用する。更に好ましくは、１．５ガロンにつき１オンス（６．６Ｌにつき２９．６ｍｌ）を使用する。
【０００８】
一選択肢として、感染した動物の直接的療法としては、希釈剤中の治療上有効量のペルオキシカルボン酸をスプレーすることが挙げられる。推奨する適用量は、希釈剤１ガロンにつき濃縮物１〜１０オンス（１リッターにつき２９．６〜２９０．６ｍｌ）である。得られた溶液を、３〜１０日間感染部位に直接スプレーする。病状が深刻な場合には、濃縮物を希釈せず使用することもできる。
【０００９】
従って、第一の態様における本発明は、ペルオキシカルボン酸と希釈剤を含む予防上有効量の抗菌性濃縮組成物を乳牛に毎日塗る、乳牛における毛状疣贅病の抑制方法である。
【００１０】
詳細な説明
乳牛における毛状疣贅病の予防処置は、ペルオキシカルボン酸含有溶液を塗付することにより行われる。前記ペルオキシカルボン酸は、抗菌性濃縮組成物に含まれ、前記組成物は、対応する前駆体カルボン酸、過酸化水素、及び差引残分量の水を含んでいてもよい。この濃縮物は、乳牛への付与に先立って、希釈剤、好ましくは、水で希釈し、その後、予防のために乳牛の蹄又は乳牛の他の感染している可能性のある部位にスプレーするか又は泡状物を付与するか、若しくは、別の方法で付与する。他の予防方法では、乳牛群用の足浴に前記溶液を使用する。
【００１１】
抗菌性濃縮組成物
前記濃縮組成物は、ペルオキシカルボン酸、その対応カルボン酸、過酸化水素、及び水の平衡混合物を含む。前記濃縮物は、安定剤、カップラー等下記に述べるような他の成分を含んでいても良い。
【００１２】
前記抗菌性濃縮組成物中の上記成分の中で、本発明はカルボン酸を含有する。一般に、カルボン酸は式Ｒ-ＣＯＯＨを有し、Ｒは脂肪族基、脂環式基、芳香族基、複素環基を含むあらゆる数の様々な基を示し、それら全てが飽和していても不飽和であってもよく、また置換されていてもいなくてもよい。カルボン酸は、一、二、三、又はそれ以上のカルボキシル基を有することもある。
【００１３】
カルボン酸は、水性組成物を酸性化する傾向がある。酸系において、カルボン酸は抗菌作用も発揮し得る。
【００１４】
前記組成物に含まれるペルオキシカルボン酸成分は、抗菌剤として作用する。更に、本発明におけるペルオキシカルボン酸成分及びその母体カルボン酸（parent carboxylic acid）は、前記組成物を酸性ｐＨに保つ。
【００１５】
過カルボン酸（percarboxylic acid）は一般に、式Ｒ（ＣＯ3Ｈ）nを有し、Ｒは脂肪族基、脂環式基、芳香族基、複素環基を含むあらゆる数の様々な基を示し、それら全てが飽和していても不飽和であってもよく、また置換されていてもいなくてもよい。このように、Ｒは、例えば、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、芳香族基又は複素環基であってもよく、また、ｎは１、２、又は３であり、その母体となる酸（parent acid）に過（per）又はペルオキシ（peroxy）の接頭辞を付けることにより命名する。
【００１６】
ペルオキシカルボン酸は、その対応カルボン酸よりも化学的安定性において劣るが、その安定性は一般に分子量の増加と共に向上する。これら酸は一般に、遊離基及び非ラジカル経路（path）により、光分解又は遊離基誘発（radical-induced）分解により、加水分解又は解離により、或いは、金属イオン又は錯体の作用により分解できる。ペルオキシカルボン酸は、１０〜９８重量％の過酸化水素とカルボン酸との直接的酸触媒作用による平衡作用により、アルデヒドの自動酸化または加過水分解（perhydrolysis）により、またはカルボン酸ハライド、水素を有するカルボン酸無水物、過酸化ナトリウムまたはその他過酸化水素のその場の源（sources）から作ってもよい。
【００１７】
本発明において有用なペルオキシカルボン酸は、例えば、過酢酸、過プロピオン酸、過酪酸、過ヘキサン酸、過ヘプタン酸、過オクタン酸、過ノナン酸、過デカン酸、過安息香酸、過グリコール酸、過グルタル酸、過コハク酸、過乳酸、過クエン酸、過ラウリン酸、過アジピン酸、過リンゴ酸、過フマル酸、過酒石酸、またはそれらの混合物のようなＣ2−Ｃ18ペルオキシカルボン酸を含む。これらのペルオキシカルボン酸は水性溶液中安定性の良い優れた抗菌作用を提供することが分かっている。
【００１８】
過酢酸、過オクタン酸、および過デカン酸に加えて、特に好ましい過カルボン酸には、過プロピオン酸、過酪酸、過グリコール酸、過乳酸、および過クエン酸がある。
【００１９】
前記抗菌性濃縮組成物には、ペルオキシカルボン酸の混合物を使用してもよい。好ましいのは、過酢酸と他の過カルボン酸、好ましくは上述したもので、特に過オクタン酸との組み合わせである。このペルオキシカルボン酸の組み合わせは、好ましい抗菌効力および安定性を提供することが分かっている。一般に過オクタン酸の過酢酸に対する割合は、約１：１〜１：９の範囲内である。
【００２０】
本発明による前記抗菌性濃縮組成物のもっとも好ましい形態においては、過酢酸を使用する。過酢酸は、下記式
ＣＨ3ＣＯＯＯＨ
を有するペルオキシカルボン酸である。
【００２１】
一般に、過酢酸は、より高い濃度で刺激臭を有する液体であり、水、アルコール、エーテルおよび硫酸に自在に溶解する。過酢酸は、酢酸コバルトの存在の下アセトアルデヒド及び酸素からの製造を含め、当技術分野における当業者にとって周知となっているあらゆる数の手段により製造できる。過酢酸の５０％溶液は、無水酢酸、過酸化水素および硫酸を組み合わせることにより得ることもできる。過酢酸の他の形成方法としては、米国特許第2,833,813号明細書に開示されているものがあり、参考文献として本明細書に援用する。
【００２２】
本発明におけるペルオキシカルボン酸の他の形成方法としては、米国特許第4,051,058号明細書、第4,051,059号、第5,200,189号、第5,314,687号、および第5,437,868号明細種に記載されているものがあり、参考文献として本明細書に援用する。
【００２３】
過酸化水素
本発明の抗菌性濃縮組成物は、過酸化水素成分を含んでいてもよい。前記ペルオキシカルボン酸との組み合わせにおいて、過酸化水素は、微生物に対し驚くべきレベルの抗菌作用を提供する。更に、過酸化水素を付与するあらゆる表面を洗浄する発泡作用を提供するものであってもよい。過酸化水素は、一旦付与すると、機械的洗浄作用と共に作用し、適用部位の表面を更に清浄にする。過酸化水素の更なる利点は、使用および分解に際してのこの組成物の食料との併用可能性（food compatibility）である。例えば、過酢酸と過酸化水素を組み合わせることにより、分解の際、酢酸、水、および酸素になり、それらは全て食料製品と併用可能（food product compatible）である。
【００２４】
多くの酸化剤を使用してもよいが、多数の理由から過酸化水素が一般には好ましい。Ｈ2Ｏ2／過酢酸殺菌剤の適用後、残った残渣は、水と酸性成分のみを含むものである。乳牛の脚や蹄といった適用部位の表面上にこれら生成物が付着しても、有害反応を引き起こすことはない。
【００２５】
過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）の分子量は、３４．０１４であり、弱酸性で、澄んだ無色の液体である。四つの原子が、無極性Ｈ-Ｏ-Ｏ-Ｈ構造で共有結合している。一般に、過酸化水素の融点は０．４１℃、沸点は１５０．２℃、２５℃での密度は１．４４２５ｇ／ｃｍ3、および粘度は２０℃で１．２４５センチポアズである。
【００２６】
一般に、本発明の方法において使用する前記組成物に含まれる過酸化水素の濃度は、約１重量％〜約５０重量％、好ましくは、約３重量％〜約４０重量％、最も好ましくは、約５重量％〜約３０重量％の範囲内である。
【００２７】
過酸化水素のこれらの濃度は、本発明の範囲内であれば低下または増加させてもよい。
【００２８】
助剤（Adjuvants）
本発明の抗菌性組成物は、助剤をいくつ含んでいてもよい。特に、本発明の組成物は、前記組成物に添加してもよい多くの成分の中で、安定化剤または湿潤剤を含んでいてもよい。
【００２９】
安定化剤を本発明の組成物に添加し、過酸および過酸化水素を安定化してもよい。一般に、キレート化剤または金属イオン封鎖剤が本発明において安定化剤として有用であり、数ある中でもＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸及び塩、例えば、テトラナトリウム塩）のようなアルキルジアミンポリ酢酸（polyacetic acid）系キレート化剤、アクリルおよびポリアクリル酸系安定化剤、ホスホン酸およびジホスホン酸、ホスホン酸塩系キレート化剤がある。好ましい金属イオン封鎖剤には、１-ヒドロキシエチリデン-１、１-ジホスホン酸（ＣＨ3Ｃ（ＰＯ3Ｈ2）2ＯＨ）、アミノ［トリ（メチレンホスホン酸）］、２-ホスフェンブタン（ｐｈｏｓｐｈｅｎｅｂｕｔａｎｅ）-１，２，４-トリカルボン酸を含むホスホン酸及びホスホン酸塩、並びに、アルキル金属塩、アンモニウム塩、又は、モノ、ジ、又はトリエタノールアミン塩のようなアルキロイル（alkyloyl）アミン塩がある。安定化剤は、前記組成物の約０重量％〜約２０重量％、好ましくは前記組成物の約０．１重量％から約１０重量％、最も好ましくは前記組成物の約０．２重量％〜５重量％の範囲内の濃度で使用される。
【００３０】
湿潤剤もまた、本発明の前記組成物において有用である。湿潤剤は、本発明の抗菌性組成物の浸透作用を向上させる働きをし、当技術分野において周知となっているあらゆる成分が挙げられ、本発明の前記組成物の表面エネルギーを低下させる。
【００３１】
更に、湿潤剤は、脂肪酸及びペルオキシ脂肪酸の溶解を助け、泡の形成を促進し、且つ、前記濃縮組成物の貯蔵安定性を高める。
【００３２】
本発明の組成物は、湿潤剤として、水性液体中で脂肪酸及び短鎖ペルオキシ脂肪酸双方の混合を可能にする界面活性剤ヒドロトロープ性（hydrotrope）カップリング剤又は可溶化剤を含有してもよい。機能面から言うと、使用できる適切なカップラーは、非毒性であり、水性溶液中の前記脂肪酸及びペルオキシ脂肪酸を、前記溶液が放置されるあらゆる使用状態において保存する。
【００３３】
本発明において使用できる好ましい分類の湿潤剤又はヒドロトロピー性（hydrotropic）カップリング剤或いは可溶化剤には、アルキルベンゼンスルホン酸塩の前記アルキル中６〜１８の炭素原子を有するもの、アルキル硫酸塩及び／又はアルカンスルホン酸塩（それぞれアルキル又はアルカン基に８〜２２の炭素原子を有する）のようなスルホン酸塩及び硫酸塩タイプのアニオン界面活性剤がある。使用できるアルキルベンゼンスルホン酸塩としては、６〜１８の炭素原子、好ましくは８〜１５の炭素原子のアルキルラジカルを含むものが好ましい。前記アルキルベンゼンスルホン酸塩の代わりに、鎖長が８〜１８炭素原子のアルキル又はアルカンラジカルを有するアルキル硫酸塩又はアルカンスルホン酸塩が使用できる。必要であれば、上記アニオン界面活性剤の混合物も使用できる。
【００３４】
非イオン界面活性剤も本発明において有用であり、例えば、エチレンオキシド成分、プロピレンオキシド成分、及びそれらの混合物、並びにエチレンオキシド−プロピレンオキシド成分をヘテロ又はブロック形態のいずれかで含むものがある。また、本発明において有用なのは、アルキルエチレンオキシド化合物、アルキルプロピレンオキシド化合物、及びそれらの混合物、並びにアルキルエチレンオキシド−プロピレンオキシド化合物を含む非イオン界面活性剤があり、その際、前記エチレンオキシドプロピレンオキシド成分は、ヘテロ又はブロック形態のいずれかである。更に、本発明において有用なのは、アルキル鎖に結合したエチレンオキシド−プロピレンオキシド成分のあらゆる混合物又は結合体を有する非イオン界面活性剤で、その際、前記エチレンオキシド及びプロピレンオキシド成分はいかなるランダムな又は規則的なパターンであってもよく、また、いかなる特有の長さのものでもよい。本発明において有用な非イオン界面活性剤には、ブロック及びヘテロエチレンオキシドプロピレンオキシドのランダムなセクション（randomized section）又はエチレンオキシド−プロピレンオキシドもある。
【００３５】
一般に、本発明において使用される界面活性剤の濃度は、組成物の約０重量％〜約５重量％、好ましくは、前記濃縮組成物の約０重量％〜約２重量％、最も好ましくは、前記組成物の約０重量％〜約１重量％の範囲内である。
【００３６】
本発明は、用途の要求に応じて、当技術分野の当業者にとって周知となっており、本発明の作用を促進する他の成分をいくつ含んでいてもよい。
【００３７】
本発明において使用される前記濃縮組成物は、下記成分を含んでいてもよい。
0004198193.tif 000002
【００３８】
過酸の生成
本発明の方法は、過酸濃縮組成物を使用することにより着手してもよい。そのような場合、前記ペルオキシカルボン酸は、自然に生成されてもよいし、ここに参考文献として援用するロケスモエ等（Lokkesmoe et al.）の１９９２年６月１６日発行の米国特許第5,122,538号明細書に記載されている方法のような使用を考慮したカルボン酸濃縮物と過酸化水素濃縮物の組合せによって生成されてもよい。そのような場合、前記組成物は、下記表に示すような、様々なレベルの過酸化水素及び安定剤を含む過酸化水素濃縮物から作成してもよい。
【００３９】
0004198193.tif 000003
【００４０】
カルボン酸と組み合わせた場合、前記二つの濃縮物により、ペルオキシカルボン酸が生じる。一般に、前記カルボン酸濃縮物は、下記表に示すようにカルボン酸又はそれと水とからなる。
【００４１】
0004198193.tif 000004
【００４２】
毛状疣贅病の抑制
乳牛に既にできている疣贅（wart）の直接的治療法は、希釈剤、例えば、水１ガロンにつき濃縮物約１〜１０オンスの上述したような抗菌性濃縮組成物を、一日に一度又は３〜１０日間搾乳時ごとに感染部位にスプレーにより塗付することにより実施できる。または、病状が深刻な場合には特に、前記抗菌性濃縮組成物を、希釈剤を使用せず、感染部位にスプレー、泡立て、又は別の方法で付与してもよい。この処置の後、疣贅（wart）が除去されるまで搾乳時ごとに１ガロンの希釈剤につき濃縮物約０．５〜３オンス、好ましくは１．５オンスで更なる治療を続けてもよい。
保護／防止又は予防療法は、希釈剤１ガロンにつき濃縮物約０．５〜１０オンス（１リッターにつき１４．８〜２９０．６ｍｌ）の抗菌性濃縮組成物を使用して、スプレー又は足浴の使用いずれかにより実施できる。好ましい適用量は、１ガロンにつき０．５〜３オンス（１リッターにつき１４．８〜８８．７ｍｌ）、更に好ましくは、１ガロンにつき１．５オンス（１リッターにつき４４．４ｍｌ）である。足浴を用いる場合、かなりの汚れ（有機質及び／又は無機質）の混入によりペルオキシカルボン酸が極端に減少した場合、再度補充する。前記足浴は、当日の全搾乳時において一杯にしておく。スプレーによる付与は、問題の発病度に応じて一日に一度又は搾乳時ごとに行う。
【００４３】
実施例１において開示している過酢酸配合濃縮物を用いて、使用した濃縮物中の活性ＰＯＡＡ（過酢酸）濃度は以下の通りである。
【００４４】
0004198193.tif 000005
を用いた。
【００４５】
疣贅（wart）へのスプレー用
有用なＰＯＡＡ濃度          ２５０〜６０，０００ｐｐｍ
好ましい                    ５００〜６０，０００ｐｐｍ
最も好ましい            １，５００〜  ５，０００ｐｐｍ
【００４６】
上記方法は、この病気に対する予防プログラムにおいて有効であることが分かっている。このように、例えば、２７．５重量％の過酸化水素、５．８重量％の過酢酸を含有し水で０．５重量％に希釈した抗菌性濃縮組成物を使用することにより、インビトロでテストした場合、ジケロバクター（バクテロイデ）ノドーサス（Dichelobacter（Bacteroides）nodosusu）に対し＞９９．７７８％バクテリアが減少し、フソバクテリウム−ネクロフオルムに関しては＞９９．９９９％減少した。これらのバクテリアは、毛状疣贅病を引き起こす原因であると考えられる。
【００４７】
実施例
本発明を、下記例を参照しながら更に詳細に説明する。これらの例における単なる適切な構成は、非制限的な説明用の具体例として本発明の様々な配合物、安定性、及び適用を示しているものである。
【００４８】
実施例１
濃縮過酢酸（すなわち、「ＰＯＡＡ」）の原液を記載のテストに使用するために調製した。下記成分を平衡濃度で含んでいた。
【００４９】
成分 重量％
過酢酸            ５．８
過酸化水素      ２７．５
酢酸              ８．０
ＨＥＤＰa         ０．９
ＬＡＳb           １．０
Ｈ2Ｏ           差引残分量
a...ＨＥＤＰとは、１−ヒドロキシエチリデン−1、1−ジホスホン酸（安定剤）（モンサント−デケスト（Monsanto-Dequest）（登録商標）2010）である。
b...ＬＡＳとは、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（アニオン界面活性剤）である。
【００５０】
下記インビトロテストを上記ＰＯＡＡ濃縮物を用いて実施した。
【００５１】
テスト生物：ジケロバクター（バクテロイデ）ノドーサス（Dichelobacter（Bacteroides）nodosusu）（ATCC 27521）、培養培地：５％の血液とトリプシン性大豆寒天培地（Tryptic Soy Agar）
テスト生物：フソバクテリウム−ネクロフォルム（ATCC 27852）、培養培地：５％の血液とトリプシン性大豆寒天培地（Tryptic Soy Agar）
【００５２】
この研究において使用した微生物は、アメリカ型微生物株保存機関（メリーランド州ロックビル）（American Type Culture Collection、Rockville、Maryland）から得た。
【００５３】
継代培養培地：５％の血液寒天平板（Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ  Ｐｌａｔｅ）とトリプシン性大豆寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ）
原液中和剤：０．５％チオ硫酸ナトリウム
放置時間：１５秒
放置温度：２５℃
方法：AOAC分析公定法（Official Methods of Analysis of the AOAC）、第15版、1990年。
【００５４】
殺菌剤使用−希釈
前記ＰＯＡＡ濃縮物を、その成生物の用途のための指示に従って調製した。０．５％溶液を２．５ｍｌのＰＯＡＡ濃縮物と４９７．５ｍ１の無菌脱イオン水を用いて作成した。生成物は溶液の状態で、調製した当日に使用した。
【００５５】
細菌培養培地
三（3）血液寒天平板（Blood Agar Plate）にフソバクテリウム−ネクロフォルムを植込み、5血液寒天平板にジケロバクター（バクテロイデ）ノドーサス（Dichelobacter（Bacteroides）nodosusu）を植込んだ。前記血液寒天平板を、３５〜３７℃で四日間嫌気性雰囲気中において培養した。増殖した細菌を、２ｍｌのリン酸緩衝液希釈水を用いて各血液寒天平板から洗い流した。各生物体に対して、増殖懸濁液（growth suspension）を吸引させ、無菌容器において一緒にプールした。各生物体のプールした懸濁液を渦流混合（vortex mixed）し、テストに使用した。
【００５６】
手順
テストされる濃度の生成物９９ｍｌを、二つの２５０ｍｌ広口三角フラスコのそれぞれに添加し、２５±２℃のウォーターバスに配置した。
【００５７】
「初期数」の対照試験（control）用に使用するため、９９ｍｌの無菌リン酸緩衝液希釈水を含む同様のフラスコを準備した。各フラスコに１ｍｌの培養懸濁液を、以下のようにして添加した。
ａ）前記フラスコを回転させ、前記懸濁液を添加する直前に停止させ、液体残留する動き（residual motion）を十分生じさせテスト水との接触時に懸濁液がプールすることを防いだ。
ｂ）懸濁液をテスト溶液にわずかに浸したピペットの先端で、表面の中央と端部の途中に添加した。（添加中、フラスコの首又は側面へのピペットの接触は避けた）。
【００５８】
継代培養培地の植込み
テストサンプル
懸濁液を添加してから正確に１５秒後、放置した培養菌１ｍｌを９ｍ１の中和剤ブランク（neutralizer blanks）に添加した。混合した後、１．０ｍｌ及び０．１ｍｌ各四つのアリコートを、分散培養平板技術を用いて、それぞれ血液寒天平板に移した。フソバクテリウム−ネクロフォルム回収平板（recovery plate）は、３日間の間３５〜３７℃で培養した後生存菌の数を数えた。ジケロバクター（バクテロイデ）ノドーサス（Dichelobacter（Bacteroides）nodosusu）回収平板（recovery plate）は、６日間の間３５〜３７℃で培養した後生存菌の数を数えた。
【００５９】
数のコントロール（Number Control）
「初期数」フラスコの培養液1ｍｌを９９ｍｌのリン酸緩衝液希釈水に添加した（希釈液１）。１ｍｌの希釈液１を完全に混合した後、９９ｍｌのリン酸緩衝液希釈水に移した（希釈液２）。三番目の希釈液は、９９ｍｌのリン酸緩衝液希釈水中に１．０ｍｌの希釈液２を用いて作成した（希釈液３）。希釈液３から１ｍｌ及び０．１ｍｌ各四つのアリコートを個々のペトリ皿に移した。血液寒天培地１５〜２０ｍｌを各平板に添加し、寒天を冷却し凝固させた。前記平板を、テストにおけると同様に回転させ培養した。初期懸濁液における数を数え、ｃｆｕ／ｍｌの数を確認した。
【００６０】
0004198193.tif 000006
中和コントロールサンプル１ｍｌ及び０．１ｍｌのアリコート（放置した培養液１ｍｌを用いて植込んだ９ｍｌの中和剤ブランク管（neutralizer blank tube））を血液寒天平板に移した。テスト生物体懸濁液１ｍｌをＮＣ血液寒天平板及び無菌血液寒天コントロール平板上に添加した。前記血液寒天平板は、テストにおけると同様にして培養した。前記血液寒天平板において、前記寒天表面上のコロニーの存在を調べ、前記血液寒天コントロール平板の表面上のコロニーと比較した。
【００６１】
ジケロバクター（バクテロイデ）ノドーサス：
中和接種物：ＴＮＴＣ CFU/mlを含む１．０ｍｌジケロバクター（バクテロイデ）ノドーサス懸濁液
0004198193.tif 000007
前記中和コントロールは増殖を示し、テスト系において増殖しない原因である静菌を除去している。
フソバクテリウム−ネクロフォルム：
中和接種物：ＴＮＴＣ CFU/mlを含む１．０ｍｌフソバクテリウム−ネクロフォルム懸濁液
0004198193.tif 000008
前記中和コントロールは増殖を示し、テスト系において増殖しない原因である静菌を除去している。
ＴＮＴＣ＝無数
ＢＡＰ＝血液寒天平板
【００６２】
テスト結果：１５秒間の接触時間後
ジケロバクター（バクテロイデ）ノドーサス
非処理コントロール                        ４．５×１０3cfu/ml
０．５％生成物（２９０ｐｐｍ ＰＯＡＡ）   ＜１cfu/ml
％削減量                                  ＞９９．９７８％
フソバクテリウム−ネクロフォルム
非処理コントロール                        ２８．３×１０6cfu/ml
０．５％生成物（２９０ｐｐｍ  ＰＯＡＡ）  ＜１cfu/ml
％削減量                                  ＞９９．９９９％
cfu/ml＝1ミリリットル当たりのコロニー形成単位
注釈：
１）結果は、二組の四つの平板セットの平均である。全ての場合において、処理サンプルにおいては１cfu/ml未満であった。
２）使用した生成物：実施例１０．５％に希釈した場合、使用溶液中ＰＯＡＡの濃度は２９０ｐｐｍであった。
【００６３】
計算
前記％削減量を計算する。
0004198193.tif 000009
【００６４】
上記明細事項、実施例及びデータにより、本発明の組成物の製造及び使用方法を完全に記載している。本発明の精神及び範囲を超えることなく多くの実施例が作成可能であるため、本発明はここに添付したクレームに内在するものである