(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダン及び／又はその分解物を有効成分として含有する一酸化窒素産生誘導剤。
【請求項２】
フコイダンがガゴメ昆布由来フコイダンである請求項１記載の一酸化窒素産生誘導剤。
【請求項３】
一酸化窒素産生誘導剤の製造のためのフコイダン及び／又はその分解物の使用。
【請求項４】
フコイダンがガゴメ昆布由来フコイダンである請求項３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は水生生物由来の生理活性物質の医薬、食品、飲料又は飼料としての用途に関する。
背景技術
水生生物由来の生理活性物質としては、フコイダンが知られている。このフコイダンは藻類、棘皮動物等に含まれている硫酸化フコース含有多糖であり、硫酸化フコースを構成糖として含むものである。
フコイダンの生理作用としては癌増殖抑制活性、癌転移抑制活性、抗凝血活性、抗ウイルス活性等が知られており、医薬品としての用途開発が期待されている。
発明の開示
本発明はフコイダンの新たな生理作用を見出すことにあり、その目的はフコイダンのサイトカイン類産生調節作用等を利用した医薬、食品、飲料又は飼料を提供することにある。なお、本明細書において本発明の治療剤又は予防剤を医薬という場合がある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、フコイダン及び／又はその分解物を有効成分として含有することを特徴とするサイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤に関する。
本発明の第２の発明は、フコイダン及び／又はその分解物を含有してなるサイトカイン類産生調節用食品、飲料又は飼料、一酸化窒素産生誘導用食品、飲料又は飼料、或いは抗アレルギー用食品、飲料又は飼料に関する。
また本発明の一態様としては、サイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患を治療又は予防するためのフコイダン及び／又はその分解物の使用；サイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤の製造のためのフコイダン及び／又はその分解物の使用；或いはフコイダン及び／又はその分解物を用いるサイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患の治療又は予防方法に関する。
さらに本発明の一態様としては、フコイダン及び／又はその分解物を有効成分として含有するサイトカイン類産生調節剤、一酸化窒素産生誘導剤、抗アレルギー剤、又はＩｇＥ産生抑制剤に関する。
さらに本発明の一態様としては、サイトカイン類産生調節剤、一酸化窒素産生誘導剤、抗アレルギー剤、又はＩｇＥ産生抑制剤の製造のためのフコイダン及び／又はその分解物の使用に関する。
さらに本発明の一態様としては、サイトカイン類産生調節用食品、飲料又は飼料、一酸化窒素産生誘導用食品、飲料又は飼料、或いは抗アレルギー用食品、飲料又は飼料の製造のためのフコイダン及び／又はその分解物の使用に関する。
さらに本発明の一態様としては、フコイダン及び／又はその分解物を有効成分として使用するサイトカイン類産生調節方法、一酸化窒素産生誘導方法、アレルギー抑制方法、又はＩｇＥ産生抑制方法に関する。
さらに本発明の一態様としては、サイトカイン類産生調節、一酸化窒素産生誘導、アレルギー抑制又はＩｇＥ産生抑制のためのフコイダン及び／又はその分解物の使用に関する。
本発明のさらに好ましい態様として、フコイダン及び／又はその分解物は抗原感作時、例えば抗原提示細胞とＴ細胞の抗原伝達時におけるサイトカイン類産生調節に顕著な効果を有する。又、フコイダン及び／又はその分解物は抗原感作後のアレルギー性疾患の治療、特に抗原感作後の抗原特異的ＩｇＥ産生の抑制に著効を有する。なお、本発明において、サイトカイン類産生調節とは、サイトカイン類の産生増強、産生促進等により、サイトカイン類の産生量を調節することを含む。
従って、本発明の一態様としては、フコイダン及び／又はその分解物を有効成分として含有することを特徴とする抗原感作時にサイトカイン類産生調節を要する疾患、又は抗原感作後のアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤に関する。
また、本発明の一態様としては、フコイダン及び／又はその分解物を含有してなる抗原感作時のサイトカイン類産生調節用食品、飲料又は飼料、或いは抗原感作後の抗アレルギー用食品、飲料又は飼料に関する。
また本発明の一態様としては、抗原感作時にサイトカイン類産生調節を要する疾患、又は抗原感作後のアレルギー性疾患を治療又は予防するためのフコイダン及び／又はその分解物の使用；抗原感作時にサイトカイン類産生調節を要する疾患、又は抗原感作後のアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤の製造のためのフコイダン及び／又はその分解物の使用；或いはフコイダン及び／又はその分解物を用いる抗原感作時にサイトカイン類産生調節を要する疾患、又は抗原感作後のアレルギー性疾患の治療又は予防方法に関する。
さらに本発明の一態様としては、フコイダン及び／又はその分解物を有効成分として含有する抗原感作時のサイトカイン類産生調節剤、抗原感作後の抗アレルギー剤、又はＩｇＥ産生抑制剤に関する。
さらに本発明の一態様としては、抗原感作時のサイトカイン類産生調節剤、抗原感作後の抗アレルギー剤、又は抗原感作後のＩｇＥ産生抑制剤の製造のためのフコイダン及び／又はその分解物の使用に関する。
さらに本発明の一態様としては、抗原感作時のサイトカイン類産生調節用食品、飲料又は飼料、或いは抗原感作後の抗アレルギー用食品、飲料又は飼料の製造のためのフコイダン及び／又はその分解物の使用に関する。
さらに本発明の一態様としては、フコイダン及び／又はその分解物を有効成分として使用する抗原感作時のサイトカイン類産生調節方法、抗原感作後のアレルギー抑制方法、又は抗原感作後のＩｇＥ産生抑制方法に関する。
さらに本発明の一態様としては、抗原感作時のサイトカイン類産生調節、抗原感作後のアレルギー抑制又は抗原感作後のＩｇＥ産生抑制のためのフコイダン及び／又はその分解物の使用に関する。
本発明において使用するフコイダンに特に限定はないが、好ましくは藻類由来フコイダン又は棘皮動物由来フコイダンが例示される。
またフコイダンの分解物としては、例えばフコイダンの酸分解物、フコイダンの酵素分解物等が使用できる。
本発明に使用するフコイダン、フコイダンの分解物、例えばフコイダンの酸分解物、フコイダンの酵素分解物としては、サイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、又は抗アレルギー作用、例えばＩｇＥ産生抑制作用等を示すものであれば特に限定はなく、かかる作用等を指標として適宜調製することができる。
また、本明細書にいうサイトカイン類とは、特にフコイダン又はその分解物が産生調節作用を示し得るサイトカイン類をいい、例えばインターロイキン類（例えばインターロイキン−１２）、インターフェロン類（例えばインターフェロン−γ）が例示される。
さらに、抗アレルギー作用とは、フコイダン又はその分解物が示し得るアレルギー抑制作用をいい、ＩｇＥ産生抑制作用が例示される。
発明を実施するための最良の形態
本発明に使用するフコイダンとは硫酸化フコースを構成成分として含む多糖であり、サイトカイン類産生調節作用、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴ細胞との抗原伝達反応時におけるインターフェロン−γ産生調節作用、インターロイキン−１２産生調節作用；一酸化窒素産生誘導作用；又は抗アレルギー作用、例えばＩｇＥ産生抑制作用を有するものであれば特に限定はない。例えば、藻類であるガゴメ昆布、トロロ昆布、ヒバマタ、オキナワモズク、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、ジャイアントケルプ、レッソニア  ニグレセンス、アスコフィラム  ノドッサム等の昆布目、ながもつも目、ひばまた目等の海藻は特に本発明の使用に好適なフコイダンを多く含んでおり、原料として好適である。また、棘皮動物、例えばナマコ、ウニ、ヒトデ等由来のフコイダンを使用してもよい。
これらのフコイダンの調製はそれぞれ公知の方法で調製すれば良く、精製物又は当該フコイダン含有物等を本発明に使用することができる。
例えばガゴメ昆布からフコイダンを調製し、該フコイダンはさらにグルクロン酸含有フコイダン（Ｕ−フコイダンと称す）とグルクロン酸非含有フコイダン（Ｆ−フコイダンと称す）とに分離することができる。それらのフコイダンは、本発明の治療剤又は予防剤等の有効成分として使用することが出来る。また、ガゴメ昆布から硫酸化フコガラクタン（Ｇ−フコイダンと称す）を調製し使用することもできる。
Ｕ−フコイダン及びＦ−フコイダンは、ガゴメ昆布からフコイダンを調製後、陰イオン交換樹脂、界面活性剤等を用いて分離される。ガゴメ昆布由来のＵ−フコイダン及びＦ−フコイダンの存在比は重量比で約１：２であり、Ｕ−フコイダンはフコース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸等を含み硫酸含量は約２０重量％、Ｆ−フコイダンはフコースとガラクトースを含み、硫酸含量は約５０重量％、分子量は両物質共に約２０万を中心に分布している（第１８回糖質シンポジウム要旨集、第１５９頁、１９９６年）。
例えばガゴメ昆布から調製したフコイダン溶液をＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにアプライ後、ＮａＣｌ含有緩衝液にて濃度勾配法により溶出させることにより、Ｕ−フコイダンとＦ−フコイダンとに分離することができる。第１図にその１例を示す。すなわち第１図はＵ−フコイダンとＦ−フコイダンの分離を示す図であり、図中前ピークがＵ−フコイダン、後ピークがＦ−フコイダンである。
また、ガゴメ昆布由来フコイダンをアルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）が産生するＦ−フコイダン特異的分解酵素、及びフラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）が産生するＵ−フコイダン特異的分解酵素で分解し、分解物を除去することにより、前出Ｇ−フコイダンを精製することができる。
また例えばヒバマタ由来フコイダン、オキナワモズク由来フコイダン、ワカメ由来フコイダン、ワカメ  メカブ由来フコイダンもそれぞれ公知の方法で調製し、本発明に使用することができる。
本発明において好適に用いられる棘皮動物由来のフコイダンとしては、例えば特開平４−９１０２７号公報に記載のナマコに含有されるフコイダンを挙げることができ、当該公報記載の方法にてナマコより当該フコイダンを調製することができる。
また本発明に使用するサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を有するフコイダンの分解物は、酵素学的方法、化学的方法、物理的方法等の公知の方法にて、目的のサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を有する分解物を選択し、使用することができる。
かかるフコイダンの分解物の調製方法としては、例えば酸分解法があり、当該フコイダンを酸分解することにより、サイトカイン類産生調節作用、免疫賦活作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を有する分解物を調製することができる。
前記酸分解法における酸分解の条件は、サイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を有する分解物（以下、本発明の分解物と称す）が生成する条件であれば、特に限定はない。
例えばフコイダンを酸に溶解またはけん濁し、反応させることにより、本発明の分解物が生成する。また、反応時に加熱することにより、本発明の分解物の生成に必要な時間が短縮される。
フコイダンを溶解またはけん濁する酸の種類は、特に限定するものではないが、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、アスコルビン酸等の有機酸、また陽イオン交換樹脂、陽イオン交換繊維、陽イオン交換膜等の固体酸が使用可能である。
酸の濃度も特に限定はないが、好ましくは０．０００１〜５規定、より好ましくは０．０１〜１規定程度の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定はないが好ましくは０〜２００℃、より好ましくは２０〜１３０℃に設定すれば良い。
また、反応時間も特に限定するものではないが、好ましくは数秒〜数日に設定すれば良い。酸の種類と濃度、反応温度及び反応時間は本発明の分解物の生成量、分解物の重合度により適宜選択すれば良い。例えば、本発明の分解物の製造に際しては、好ましくは、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸を使用し、酸の濃度は数１０ｍＭ〜数Ｍ、加熱温度は５０〜１１０℃、より好適には７０〜９５℃、加熱時間は数分〜２４時間の範囲から適宜選択することにより、本発明の分解物を調製することができる。フコイダンの酸分解物としては、ガゴメ昆布由来フコイダンの酸分解物が例示され、当該分解物はサイトカイン類産生調節作用、特にＡＰＣとＴ細胞との抗原伝達反応時におけるインターフェロン−γ産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、及び抗アレルギー作用の強い新生理機能を有する食物繊維として使用することができる。
本発明の分解物はサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を指標として分画することができ、例えば酸分解物をゲルろ過法、分子量分画膜による分画法等によりさらに分子量分画することができる。
ゲルろ過法の例としては、セルロファインＧＣＬ−３００を使用し、例えば分子量２５０００超、分子量２５０００〜１００００超、分子量１００００〜５０００超、分子量５０００以下等の任意の分子量画分を調製でき、セルロファインＧＣＬ−２５を用い、例えば分子量５０００以下の画分を分子量５０００〜３０００超、分子量３０００〜２０００超、分子量２０００〜１０００超、分子量１０００〜５００超、分子量５００以下等の任意の分子量画分に調製することができる。
また、限外ろ過膜を用いて工業的に分子量分画を行うこともでき、例えばダイセル社製ＦＥ１０−ＦＵＳＯ３８２を用いることにより分子量３００００以下の画分を、若しくは同ＦＥ−ＦＵＳ−Ｔ６５３を使用することによって分子量６０００以下の画分を調製することができる。更にナノフィルター膜を用いることにより分子量５００以下の画分を得ることもでき、これらのゲルろ過法、分子量分画法を組み合せることにより、任意の分子量画分を調製することができる。
本発明で使用できるサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を有するフコイダンの分解物としては、下記の式（Ｉ）〜式（ＩＶ）で表される化合物が例示され、これらの化合物は国際公開第９７／２６８９６号パンフレット、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ９９／００６０６号明細書、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ００／００９６５号明細書に記載の方法で調製することができる。また、本発明のフコイダンの分解物としては、国際公開第９７／２６８９６号パンフレット、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ９９／００６０６号明細書、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ００／００９６５号明細書に記載のフコイダンの分解物も包含される。なお、式（Ｉ）で表される化合物の繰返し構造を有するフコイダン、及びオリゴ糖も本発明において好適に使用することができる。
0004202645.tif 000002
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
0004202645.tif 000003
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
0004202645.tif 000004
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
0004202645.tif 000005
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
なお、式（Ｉ）で表される化合物の例としては後述の式（Ｖ）で表される化合物が挙げられる。
式（Ｉ）で表される化合物は、例えば前記Ｆ−フコイダンを、アルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｆ−フコイダン特異的分解酵素）で処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（Ｉ）で表される化合物の多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
式（ＩＩ）で表わされる化合物、及び式（ＩＩＩ）で表される化合物は、それぞれ例えば前記Ｕ−フコイダンを、フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｕ−フコイダン特異的分解酵素）で処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（ＩＩ）で表される化合物の二重結合のない化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
式（ＩＶ）で表される化合物は、例えばフラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）より得られるＧ−フコイダンを特異的に分解するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｇ−フコイダン特異的分解酵素）をＧ−フコイダンに作用させることにより当該Ｇ−フコイダンの分解物を調製し、当該分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（ＩＶ）で表される化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
なお、フコイダン又はその分解物のサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、又は抗アレルギー作用は、例えば後述の実施例１、２、７及び８に記載の方法により検定する。被検対象であるフコイダン又はその分解物が、かかる作用を示す場合、それを指標として本発明に用い得るフコイダン又はその分解物を選択する。
本発明において、フコイダン又はその分解物により産生調節され得るサイトカイン類とは特に限定はないが、例えばインターロイキン（ＩＬ）−１〜１８、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、リンホトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球・コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）等が例示される。
これらのサイトカイン類は遅延型過敏反応や標的細胞障害をはじめ、種々の細胞性免疫反応の発現や調節に関与するもの（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β等）、抗体産生機構において、その調節機能に関与するもの（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６等）、腫瘍細胞に対して直接増殖抑制作用や破壊作用を示すもの（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ等）、骨髄における造血幹細胞や前駆細胞の増殖・分化を促進するもの（ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等）、炎症反応に関与するもの（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ等）、アレルギー反応に関与するもの（ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５等）、ＮＫ細胞活性を増強するもの（ＩＬ−１２）等がある。なお、本発明において使用するフコイダン及び／又はその分解物が有するサイトカイン類産生調節作用とは、ウイルス感染、或いは癌等、体内に排除すべき抗原が存在し、細胞性免疫の増強が必要なときのみに選択的に生じさせ得るサイトカイン類の産生調節作用、例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２の産生誘導作用や、それらの産生増強作用又は産生促進作用をいう。それゆえ、該フコイダン及び／又はその分解物は不必要な状態での免疫系の活性化やその増強を生じさせず、従ってアレルギー症状、自己免疫疾患等の疾病を惹起することがなく、極めて安全かつ有効な成分である。また、該フコイダン及び／又はその分解物は、例えばリンパ球の細胞傷害活性を増強し、細胞傷害性免疫の増強をももたらし得る。
従って、フコイダン及び／又はその分解物を使用し、これらのサイトカイン類の産生を調節することにより、サイトカイン類産生調節を要する疾患、例えば癌等の細胞性免疫反応の発現や調節を要する疾患、自己免疫症のような抗体産生の調節を要する疾患、貧血、糖尿病等の細胞の分化を要する疾患、敗血症性ショック、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ブドウ膜炎等の炎症の抑制を要する疾患の治療又は予防が可能となる。
本発明で使用するフコイダン及びその分解物はサイトカイン類産生調節能を有し、これらの化合物を有効成分としてサイトカイン類の産生調節を要する上記疾患の治療剤又は予防剤を製造することができる。
また、本発明で使用するフコイダン及びその分解物は一酸化窒素産生誘導作用を有し、これらの化合物を有効成分として使用し、一酸化窒素産生を要する疾患、例えば血管平滑筋の弛緩、栓球、顆粒球及び単球の血管壁への付着の抑制、分泌性平滑筋の細胞の増殖阻止等を要する動脈硬化症の治療又は予防が可能となる。また、該フコイダン及びその分解物はかかる作用を介した免疫賦活効果をも奏する。なお、一酸化窒素産生誘導作用には、誘導増強作用若しくは誘導促進作用も含む。
さらに、本発明で使用するフコイダン及びその分解物は、抗アレルギー作用、例えばＩｇＥ産生抑制作用を有し、これらの化合物を有効成分として使用し、アレルギー性疾患、例えばＩｇＥ産生により媒介されるか悪化する症状、例えばＩｇＥが起因となるアレルギー性疾患、例えば気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、じん麻疹、アナフィラキシーショック等を治療又は予防することができる。
なお、前記フコイダンの特定の分画物、特にＦ−フコイダン、Ｕ−フコイダン、Ｇ−フコイダンは、その基本構造が初めて明確となったフコイダン分画物であるという点において、各分画物に特異的に作用する酵素を用いて調製される各分解物、特にその分解物の分画物、例えば式（Ｉ）〜（ＩＶ）等の化合物は分子量も、フコイダンと比較し低分子であり、かつフコイダンと同等の生理活性を有するという点において、構造、組成、物性が不明確な単に分離されたフコイダン若しくはフコイダン含有物に比べて顕著に優れる。
本発明においては、かかるフコイダン及び／又はその分解物を有効成分として含有するサイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤を提供する。
特に、本発明のサイトカイン類産生調節を要する疾患の治療剤又は予防剤としては、有効性の観点から、好ましくはインターロイキン類又はインターフェロン類産生調節を要する疾患の治療剤又は予防剤であり、より好ましくはインターフェロンγ又はインターロイキン−１２産生調節を要する疾患の治療剤又は予防剤である。また、本発明のアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤は抗原感作後のＩｇＥ産生抑制作用を有すること、経口投与で抗原感作後のＩｇＥ産生抑制作用を有する点において極めて有用な抗アレルギー剤である。さらに、本発明のアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤は、特に花粉症の様に抗原感作された症状においての抗原特異的ＩｇＥ産生を経口投与で抑制し得るという点において顕著に優れる。従って、アレルギー性疾患の治療剤又は予防剤としては、ＩｇＥ産生抑制を要する疾患の治療剤又は予防剤が好ましい。
本発明の治療剤又は予防剤は、フコイダン及び／又はその分解物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化することにより得られる。当該製剤の製造は一般的には、フコイダン及び／又はその分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、一般液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることにより行う。また、使用直前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることもできる。
医薬用担体は、本発明の治療剤又は予防剤の投与形態及び剤型に応じて適宜選択することができる。
経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。
一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分であるフコイダン及び／又はその分解物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製することができる。
本発明の治療剤又は予防剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与することができる。また、投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。なお、かかる治療剤又は予防剤は、その有効性の観点から、経口用治療剤又は経口用予防剤とするのが好ましい。
本発明の治療剤又は予防剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではないが、一般には製剤中に含有されるフコイダン及び／又はその分解物の量で好ましくは成人１日当り０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇとなる量である。従って、本発明の治療剤又は予防剤におけるフコイダン及び／又はその分解物の含有量は、当該治療剤又は予防剤を投与することにより少なくとも前記範囲でフコイダン及び／又はその分解物が投与され得るように適宜決定すればよい。なお、投与量は種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の治療剤又は予防剤は、そのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。またフコイダン及び／又はその分解物をサイトカイン類産生調節用飲食品又は飼料、一酸化窒素産生誘導用飲食品又は飼料、抗アレルギー用飲食品又は飼料の原料として用いても良い。
また本発明の一態様として、サイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患を治療又は予防するためのフコイダン及び／又はその分解物の使用；或いはフコイダン及び／又はその分解物を用いるサイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患の治療又は予防方法を提供する。
サイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患の治療又は予防を行うには、例えばフコイダン及び／又はその分解物を前記例示する範囲で投与すればよく、例えば本発明の治療剤又は予防剤を適宜投与する。
さらに本発明の一態様として、フコイダン及び／又はその分解物を有効成分として含有するサイトカイン類産生調節剤、例えばＩＦＮ−γ産生調節剤、ＩＬ−１２産生調節剤；一酸化窒素産生誘導剤；又は抗アレルギー剤、例えばＩｇＥ産生抑制剤を提供する。これらの薬剤は上記治療剤又は予防剤に準じて製造され得る。例えばサイトカイン類産生調節剤は、サイトカイン類の機能研究、サイトカイン類が関連する疾病用医薬のスクリーニングに有用である。これらの薬剤の剤型、使用量等は、各用途に応じて当該薬剤により奏される所望の効果が得られるようであれば特に限定されるものではない。なお、前記例示する疾患等に対し適用することもできる。
さらに本発明の一態様として、サイトカイン類産生調節、一酸化窒素産生誘導、アレルギー抑制又はＩｇＥ産生抑制のためのフコイダン及び／又はその分解物の使用；又はフコイダン及び／又はその分解物を用いるサイトカイン類産生調節方法、一酸化窒素産生誘導方法、アレルギー抑制方法、又はＩｇＥ産生抑制方法を提供する。
サイトカイン類産生調節、一酸化窒素産生誘導、アレルギー抑制又はＩｇＥ産生抑制を行うには、例えば前記サイトカイン類産生調節剤、一酸化窒素産生誘導剤等を各用途に応じて所望の効果が得られるように使用すればよい。
本発明に使用されるフコイダン又はその分解物の推定される薬理作用を以下に説明する。
リンパ球からのＩＦＮ−γの産生誘導には、ＣｏｎＡ等のマイトジェンにおけるＴ細胞の直接刺激による誘導、および抗原感作時における抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴ細胞との細胞間相互作用による誘導が知られている。前者はマイトジェンのＴ細胞レセプターへの直接結合による誘導であり、後者はＡＰＣとＴ細胞との各レセプターの刺激、及びそれによりＡＰＣから産生されたＩＬ−１２による産生誘導である。ＩＬ−１２産生誘導に関与するレセプターの反応としてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）／主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の他、副刺激としてＴ細胞側のＣＤ４０ＬとＡＰＣ側のＣＤ４０、及びＴ細胞側のＣＤ２８とＡＰＣ側のＢ７の各反応が知られている。
従来、ラミナリア  ジャポニカ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｋａ）由来のフコイダンが、正常マウス由来の脾臓リンパ球からのＩＦＮ−γ産生を誘導し、ＮＫ細胞の活性化を増強する（中国海洋薬物雑誌、１９９５第３期、９〜１３）との報告があるが、これは静止期にあるナイーヴＴ細胞への直接刺激による誘導である。
一方、今回、本発明者らが確認したガゴメ昆布由来フコイダン、及びその画分のＩＦＮ−γの産生誘導作用に関しては、実施例に示すように、リンパ球の直接刺激、またはアロ抗原刺激時における誘導作用は認められず、感作リンパ球の抗原刺激下でのみＩＦＮ−γ産生を増強させた。さらにこのときＩＬ−１２の産生誘導も認められた。この抗原提示反応時におけるＩＦＮ−γ産生誘導作用は抗ＩＬ−１２抗体により産生されたＩＬ−１２を中和したときに約５０％が抑制され、抗ＣＤ４０抗体及び抗ＣＤ２８抗体でこれらのレセプターの反応を阻害したときには完全に抑制された。このことより、ガゴメ昆布由来フコイダン、及びその画分のＩＦＮ−γの産生誘導の作用機序に関して、抗原提示反応時においてＡＰＣに働いてＩＬ−１２産生を増強させたことによるもの、及びＡＰＣとＴ細胞との相互作用により活性化された状態にあるＴ細胞に働いて誘導した可能性が推測される。
静止期のＴ細胞に対する直接誘導作用を見ている前記報告に記載のフコイダンと本発明で使用するガゴメ昆布由来フコイダンは異なり、その結果は、全く異なる作用を示すものである。
また、抗原提示細胞の一つであるマクロファージの細胞株を用いた系で、フコイダン及びその分解物は、一酸化窒素産生を誘導し、その誘導により免疫賦活効果があることを示しているが、この系においても、フコイダン及びその分解物によるＩＦＮ−γの産生誘導は見られず、本発明に使用するフコイダン及びその分解物には、ＩＦＮ−γを直接産生誘導する活性はなく、一酸化窒素の産生増強とＩＬ−１２の産生増強がパラレルであると考えられることからも、本発明によるフコイダンおよびその分解物によるＩＦＮ−γの産生増強は、静止期Ｔ細胞の直接刺激による誘導ではなく、抗原提示反応時においてＡＰＣに働いてＩＬ−１２産生を増強させたことによるもの、及びＡＰＣとＴ細胞との相互作用により活性化された状態にあるＴ細胞に働いて誘導した可能性が推測される。この点からも本発明に使用されるフコイダン及びその分解物は直接誘導作用を見ている前記報告とは、全く異なる作用を示すものである。
なお、ＩＦＮ−γはＴ細胞（Ｔｈ１）のＴ細胞レセプターが抗原提示細胞（ＡＰＣ）等により刺激されたとき産生され、さらにＡＰＣから産生されるＩＬ−１２によって産生が増強される。ＩＦＮ−γはウイルス、真菌感染、および癌疾患等においてＮＫ細胞、マクロファージ等の細胞性免疫を活性化させ、生体防御能の増強に働く。
一方、ＩＦＮ−γは喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎等に代表されるアレルギー性疾患の発生の原因とされているＴｈ２細胞の活性化を抑制することが知られている。Ｔｈ２細胞は免疫グロブリンＥ抗体（ＩｇＥ）の産生を誘導する。産生されたＩｇＥはマスト細胞の細胞膜上のレセプターに結合し、マスト細胞からのケミカルメディエーターの放出を惹起する。この炎症性のメディエーターが直接の原因となりアレルギー症状が発症する。
本発明の抗アレルギー剤は抗原感作後の経口投与において、ＩｇＥ産生を抑制し、発症後の喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎等に代表されるアレルギー性疾患の症状改善に極めて有用である。
さらに、本発明はフコイダン及び／又はその分解物を含有してなるサイトカイン類産生調節用食品又は飲料、一酸化窒素産生誘導用食品又は飲料、或いは抗アレルギー用食品又は飲料を提供する。
特に、本発明のサイトカイン類産生調節用食品又は飲料としては、有効性の観点から、好ましくはインターロイキン類又はインターフェロン類産生調節用食品又は飲料であり、より好ましくはインターフェロンγ又はインターロイキン−１２産生調節用食品又は飲料である。
また、本発明の抗アレルギー用食品又は飲料は抗原感作後のＩｇＥ産生抑制作用を有すること、摂取により抗原感作後のＩｇＥ産生抑制作用を発揮する点において極めて有用な食品又は飲料である。従って、抗アレルギー用食品又は飲料としては、ＩｇＥ産生抑制用食品又は飲料が好ましい。
なお、後述の飼料についても、同様の観点から、これら作用を有する飼料が好ましい。
かかる食品又は飲料は、そのサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用により、フコイダン又はその分解物に感受性を示すサイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、アレルギー性疾患の症状改善、予防に極めて有用である。
なお、本発明の食品、飲料又は飼料、後述の化粧料にいう「含有」の語は、含有、添加、希釈の意を含むものであり、含有とは食品、飲料等に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、添加とは食品、飲料等の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、希釈とは本発明で使用される有効成分に、食品、飲料等の原料を添加するという態様をいうものである。
本発明の食品又は飲料の製造法は公知の方法に従えばよく特に限定はない。例えば、かかる製造法としては調理、加工及び一般に用いられている食品又は飲料の製造法を挙げることができ、製造された食品又は飲料にサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、及び抗アレルギー作用を有するフコイダン及び／又はその分解物が有効成分として含有されていれば良い。
本発明の食品又は飲料は特に限定はないが、フコイダン及び／又はその分解物を有効成分として含有する、例えば穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥又は濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（スープ等）、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。
本発明の食品又は飲料としては、サイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用等から選択される生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物が含有されており、その生理作用を発現するための必要量が含有されていれば特にその形状に限定はなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
フコイダン及び／又はその分解物の食品又は飲料における含有量は、その官能と生理活性の点から適宜選択すればよいが、例えば、食品１００重量部当たり１０−９重量部以上、好ましくは１０−７〜２重量部であり、例えば飲料１００重量部当たり１０−９重量部以上、好ましくは１０−７〜２重量部である。また、例えば、成人１日当たりフコイダン及び／又はその分解物が好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ／ｋｇとなるように摂取すればよい。
なお、サイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用等から選択される生理作用を有するフコイダン及びその分解物は、当該生理作用と食物繊維機能を合わせ持つ健康食品素材として、食品又は飲料の製造素材として極めて有用である。
さらに本発明により、サイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用等から選択される生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物を有効成分として含有してなる生物用の飼料が提供される。
また本発明の一態様として、当該生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物を生物に投与する生物の飼育方法が提供される。
また本発明の一態様として、当該生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物を含有する生物飼育用剤が提供される。
これらの発明において、生物とは例えば養殖動物、ペット動物等であり、養殖動物としては家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類又は貝類が例示される。
飼料としてはフコイダン及び／又はその分解物の生理作用に基づく体調改善用飼料が例示される。
生物飼育用剤としては浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤が例示される。
これらの発明において、当該生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物は、生物の飼育効率、例えば生存率、肥育率、産卵率、産仔率、離乳率等を向上させる効果を有する。
フコイダン及び／又はその分解物を生物に投与する生物の飼育方法においては、当該生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物を通常、対象生物の体重１ｋｇ、１日当たり好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ投与すればよい。投与は、例えばフコイダン及び／又はその分解物を人工配合飼料の原料中に添加、混合するか、人工配合飼料の粉末原料と混合した後、その他の原料に添加、混合することにより行うことができる。また、かかるフコイダン及び／又はその分解物の投与量が達成され得るように、本発明の飼料を投与してもよい。
当該生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物の飼料中の含有量は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、０．００１〜１５重量％の割合が好ましい。
人工配合飼料としては、魚粉、カゼイン、イカミールなどの動物性原料、大豆粕、小麦粉、デンプン、飼料用酵母などの植物性原料、タラ肝油、イカ肝油、などの動物性油脂、大豆油、菜種油等の植物性油脂、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸、抗酸化剤等を原料とする人工配合飼料が挙げられる。また魚肉ミンチ等の魚類用飼料が挙げられる。
又、機能性オリゴ糖、例えばフラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖等、食物繊維、例えばポリデキストロース、難消化性デキストリン、β−１，３−グルカン等、プロポリス、糖アルコール、例えばマルチトール、パラニチット、エリスリトール等、ＥＰＡ、γ−リノレン酸、ヘム鉄、クロレラ、スピルリナ、ホワイトベリーエキス、難う触性素材、例えばポリフェノール等の機能性食品素材を本発明の飼料の原料として使用しても良い。なお本発明において飼料としては、飼料添加剤、飼料用栄養補助食も包含される。
本発明の飼料の製造方法に特に限定は無く、製造された飼料中にサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用等から選択される生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物の有効量が含有されていればよい。
また当該生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物をプール、水槽、保持タンク又は飼育領域の水、海水等に直接添加し、対象生物を浸漬することにより、投与することもできる。この浸漬方法は対象生物の飼料摂取量が低下したときに特に有効である。
水又は海水中のフコイダン及び／又はその分解物の濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、０．００００１〜１重量％の割合が好ましい。
また当該生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物を含有する飲料を飼育用飲料として対象生物に摂取させても良い。
飲料中の当該生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物の濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、０．０００１〜１重量％の割合が好ましい。
当該生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物を有効成分とする生物飼育用剤、例えば浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤はそれ自体公知の方法で作製すれば良い。
本発明が適用できる生物としては限定はないが、養殖動物としては、馬、牛、豚、羊、山羊、らくだ、ラマ等の家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験動物、鶏、アヒル、七面鳥、舵鳥等の家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、アユ、サケ・マス類、トラフグ、ウナギ、ドジョウ、ナマズ等の魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウエビ、ガザミ等の甲殻類等、アワビ、サザエ、ホタテ貝、カキ等の貝類、ペット動物としてはイヌ、ネコ等が挙げられ、陸上・水中動物に広く適用できる。
サイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用等から選択される生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物を含有する飼料を摂取すること、又は当該フコイダン及び／又はその分解物の含有液に対象生物を浸漬することにより、家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類、貝類、ペット動物等の体調、健康、生体の恒常性、新陳代謝等が顕著に改善され、本発明は生物の老化防止に極めて有用である。
さらに、サイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用等から選択される生理作用を有するフコイダン及び／又はその分解物は化粧料の有効成分として有用であり、本発明の一態様として、フコイダン及び／又はその分解物を有効成分とするサイトカイン類産生調節用化粧料、一酸化窒素産生誘導用化粧料、抗アレルギー用化粧料等が提供される。
これらの化粧料等に含有されるフコイダン及び／又はその分解物の含有量は通常、好ましくは０．０００１〜２０重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％である。
本発明の化粧料は経皮的、経口的使用に有効であり本発明により経皮投与、経口投与で有効な化粧料が提供される。特に抗アレルギー用化粧料はその抗アトピー作用により、アトピー性皮膚炎の治療、予防に有用な化粧料である。なお、その投与量又は適用量は、所望の効果が得られるように適宜調節すればよい。
本発明の化粧料は常法に従って製造することができ、サイトカイン類産生調節用化粧料、一酸化窒素産生誘導用化粧料、抗アレルギー用化粧料として、例えばローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用洗剤、毛髪剤、育毛剤又は洗髪剤を製造することができる。
本発明に使用するサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を有するフコイダン及び／又はその分解物はラットに対する経口投与において１ｇ／ｋｇを経口単回投与しても死亡例は認められない。
実施例
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。なお、実施例における％は重量％を意味する。
参考例１
（１）ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物２０ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕した。
水道水９００リットルに塩化カルシウム二水和物（日本曹達社製）７．３ｋｇを溶解し、次にガゴメ昆布粉砕物２０ｋｇを混合した。液温１２℃から液温９０℃となるまで水蒸気吹込みにより４０分間昇温させ、次いでかくはん下９０〜９５℃に１時間保温し、次いで冷却し、冷却物１１００リットルを得た。
次いで固液分離装置（ウエストファリアセパレーター社製ＣＮＡ型）を用い、冷却物の固液分離を行い、約９００リットルの固液分離上清液を調製した。
固液分離上清液３６０リットルをダイセル社製ＦＥ１０−ＦＣ−ＦＵＳ０３８２（分画分子量３万）を用い、２０リットルまで濃縮した。次いで水道水を２０リットル加え、また２０リットルまで濃縮するという操作を５回行い、脱塩処理を行い、ガゴメ昆布由来の抽出液２５リットルを調製した。
該溶液１リットルを凍結乾燥し、ガゴメ昆布由来フコイダン乾燥物１３ｇを得た。
（２）参考例１−（１）記載のフコイダン乾燥物７ｇを、５０ｍＭの塩化ナトリウムと１０％のエタノールを含む２０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．０）７００ｍｌに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム（φ１１．４ｃｍ×４８ｃｍ）を同緩衝液にて平衡化し、遠心分離上清をアプライ後、同緩衝液で洗い、塩化ナトリウムの５０ｍＭから１．９５Ｍの濃度勾配により溶出させた（１フラクション：２５０ｍｌ）。フェノール硫酸法及びカルバゾール硫酸法にて、総糖量及びウロン酸含量を求め、溶出順にフラクション４３〜４９、フラクション５０〜５５、フラクション５６〜６７の画分を得た。次に、これらの画分を電気透析により脱塩後凍結乾燥し、フラクション４３〜４９よりＩ画分（３４０ｍｇ）、フラクション５０〜５５よりＩＩ画分（８７０ｍｇ）、フラクション５６〜６７よりＩＩＩ画分（２．６４ｇ）をそれぞれ調製した。
第１図にガゴメ昆布由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す。第１図において縦軸はカルバゾール硫酸法での５３０ｎｍの吸光度（図中黒丸）、フェノール硫酸法での４８０ｎｍの吸光度（図中白丸）、及び電導度（ｍＳ／ｃｍ：図中白四角）、横軸はフラクション番号を示す。
参考例２
（１）アルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）を、グルコース  ０．２５％、ペプトン  １．０％、酵母エキス  ０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分間）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２６時間培養して種培養液とした。ペプトン  １．０％、酵母エキス  ０．０２％、下記参考例２−（２）に記載の硫酸化多糖  ０．２％、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水ｐＨ８．０からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファメンターに入れて１２０℃、２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮後８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度の人工海水を含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、６００ｍｌの硫酸化多糖に選択的に作用するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｆ−フコイダン特異的分解酵素）液を調製した。
（２）乾燥したガゴメ昆布２Ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業社製）により粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間かくはんし、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、９５℃に加温した４０リットルの５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５に懸濁し、時々かくはんしながら９５℃で２時間処理し、硫酸化多糖を抽出した。
抽出液中の懸濁物を、ろ過し、ろ液を調製した後、ろ過残渣を３．５リットルの１００ｍＭ塩化ナトリウムにより洗浄し、更にろ液を得た。
両ろ液を合わせた後、３０℃まで温度を下げ、３０００Ｕのアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業社製）を添加後、エタノールを４リットル加え２５℃で２４時間かくはんした。次に遠心分離を行い、得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを備えた限外ろ過器により４リットルに濃縮し、更に、１０％のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムにより、着色性物質がろ過されなくなるまで限外ろ過を続けた。
非ろ過液中に生じた沈殿は遠心分離により除去し、この上清を５℃まで温度を下げ、０．５Ｎ塩酸によりｐＨを２．０とした後、生じたタンパク質等の沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を速やかに１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．０とした。
次に、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過器により限外ろ過を行い、２０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ８．０により完全に溶媒置換後、再度ｐＨを８．０として遠心分離後、凍結乾燥を行い、約９５ｇの硫酸化多糖を調製した。
（３）乾燥したガゴメ昆布２Ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミルにより粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間かくはんし、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、３０ｍｌの上記参考例２−（１）で調製したエンド型硫酸化多糖分解酵素、１０％のエタノール、１００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭの塩化カルシウム、及び５０ｍＭのイミダゾールを含む２０リットルの緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で４８時間かくはんした。この懸濁液を網目の直径３２μｍのステンレス金網でろ過し、残渣を５０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０％のエタノールで洗浄した。更にその残渣を１０リットルの５０ｍＭ塩化カルシウムを含む１０％のエタノール中に懸濁し、３時間かくはん後、ステンレス金網でろ過、洗浄した。更にその残渣を同条件で懸濁後、１６時間かくはんし、直径３２μｍのステンレス金網でろ過、洗浄した。
こうして得られたろ液及び洗浄液を集め、排除分子量３０００のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離した。
このろ過液をロータリーエバポレーターで約３リットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、この溶液に０．１Ｍとなるように酢酸カルシウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清をあらかじめ５０ｍＭの酢酸カルシウムにより平衡化させたＤＥＡＥ−セルロファイン（樹脂量４リットル）にかけ、５０ｍＭの酢酸カルシウム及び５０ｍＭの塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０ｍＭ〜８００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。この時の分取量は１本当り５００ｍｌで行った。分取した画分をセルロースアセテート膜電気泳動法［アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３７巻、第１９７〜２０２頁（１９７０）］により分析したところ塩化ナトリウム濃度が約０．４Ｍで溶出される硫酸化糖（フラクションナンバー６３付近）が均一であった。
そこで、まずフラクションナンバー６３の液を１５０ｍｌに濃縮後、濃度が４Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ４Ｍの塩化ナトリウムにより平衡化したＰｈｅｎｙｌ−セルロファイン（樹脂量２００ｍｌ）にかけ、４Ｍの塩化ナトリウムにより充分洗浄した。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液５０５ｍｌを得た。
得られた脱塩液のうち４０ｍｌを１０％のエタノールを含む０．２Ｍの塩化ナトリウムによって平衡化させたセルロファインＧＣＬ−９０のカラム（４．１ｃｍ×８７ｃｍ）にかけて、ゲルろ過を行った。分取は１フラクション当り９．２ｍｌで行った。
全フラクションに対して総糖量の分析をフェノール硫酸法〔アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２８巻、第３５０頁（１９５６）〕により行った。
この結果、硫酸化糖は１つのピークを形成したので、そのピークの中央部分、フラクションナンバー６３〜７０を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾燥し、１１２ｍｇの下記式Ｖで表される化合物の乾燥品を得た。
0004202645.tif 000006
参考例３
（１）乾燥ガゴメ昆布２Ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着したカッターミル（増幸産業社製）により破砕し、２０リットルの８０％エタノール中で２５℃、３時間攪拌後ろ過、洗浄した。得られた残渣を５０ｍＭの塩化カルシウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び参考例２−（１）で調製したアルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）エンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｆ−フコイダン特異的分解酵素）を１Ｕ含む２０リットルの３０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で２日攪拌し、次いで穴径３２μｍのステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残渣を１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び４ｇのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業製）を含む４０リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に懸濁し、２５℃、４日攪拌後、遠心分離し上清を得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化物を除去するため、排除分子量１０万のホロファイバーを装着した限外ろ過機により２リットルに濃縮後、１０％のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムで溶液交換した。この溶液に等量の４００ｍＭ酢酸カルシウムを添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しながら、１Ｎの塩酸でｐＨ２とした。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を１Ｎの水酸化ナトリウムによりｐＨ８．０とした。この溶液を限外ろ過により１リットルに濃縮後、１００ｍＭの塩化ナトリウムで溶液交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去した。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清に１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えて、１Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した３リットルのフェニルセルロファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、２０ｍＭの塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥物の重量は２９．３ｇであった。
（２）上記の凍結乾燥物１５ｇを４００ｍＭの塩化ナトリウム及び国際公開第９７／２６８９６号パンフレット記載のフラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）を培養し、参考例２−（１）と同様にして該培養物から得られたエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｕ−フコイダン特異的分解酵素）を９Ｕ含む１．５リットルの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に溶解し、２５℃で６日反応後、エバポレーターで約３００ｍｌに濃縮した。濃縮液を排除分子量３５００の透析チューブに入れて徹底的に透析し、透析チューブ内に残った液を、５０ｍＭの塩化ナトリウムで平衡化した４リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけ、５０ｍＭ塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０〜６５０ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。更に同カラムを６５０ｍＭの塩化ナトリウムで充分溶出させた。溶出画分のうち６５０ｍＭの塩化ナトリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分として集め、排除分子量１０万の限外ろ過機により濃縮後、１０ｍＭの塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾燥して硫酸化フコガラクタンの凍結乾燥物を０．８５ｇ得た。得られた硫酸化フコガラクタン（Ｇ−フコイダン）は、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比は、約２：１であった。
参考例４
市販のワカメ  メカブの乾燥物１Ｋｇを穴の径が１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミルにより破砕後、１０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。残渣を５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２０リットルに懸濁し９５℃で２時間処理した。処理液を３７℃まで冷却後、１０％となるようにエタノールを添加し、市販のアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業社製）を１２０００Ｕ添加後、室温で２４時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清を５℃に冷却後０．５Ｎの塩酸を添加してｐＨを２．０とした後３０分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清のｐＨを０．５Ｎの水酸化ナトリウムにより８．０とし、限外ろ過により溶液を２０ｍＭの塩化ナトリウムに置換した。溶液のｐＨを８．０に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、９０．５ｇのワカメ  メカブ由来フコイダンを得た。
参考例５
粉砕したヒバマタ（Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）の乾燥物１Ｋｇを、１０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。残渣を１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０リットルに懸濁し９５℃で２時間処理した。処理液を３７℃まで冷却後、１００ｇの活性炭を添加し３０分間攪拌した。市販のアルギン酸リアーゼＫを３０００Ｕ添加後、１０％となるようにエタノールを添加し室温で２４時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清に抽出液を加えながら限外ろ過し、色素を除去した。得られた非ろ過液を５℃に冷却後０．５Ｎの塩酸を添加してｐＨを２．０とした後３０分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清のｐＨを０．５Ｎの水酸化ナトリウムにより８．０とし、限外ろ過により溶液を２０ｍＭの塩化ナトリウムに置換した。溶液のｐＨを８．０に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、７１ｇのヒバマタ由来フコイダンを得た。
参考例６
参考例１−（１）記載の方法で調製したガゴメ昆布由来フコイダン２ｇを１００ｍｌの水に溶解し、そのｐＨをクエン酸にてｐＨ３に調整後、１００℃で３時間処理し、当該フコイダンの酸分解物を調製した。この酸分解物をセルロファインＧＣＬ−３００、又はセルロファインＧＣＬ−２５によるゲルろ過で分子量分画し、分子量２５０００超（Ａ画分）、２５０００〜１００００超（Ｂ画分）、１００００〜５０００超（Ｃ画分）、５０００〜２０００超（Ｄ画分）、２０００〜５００超（Ｅ画分）、５００以下（Ｆ画分）に分画した。更にこれらの画分及び酸分解物をそれぞれ脱塩後凍結乾燥を行い、酸分解物の各分画物及び酸分解物を調製した。
参考例７
マナマコを５ｋｇ解体し、内臓を除去し、体壁を集めた。体壁湿重量２００ｇ当り５００ｍｌのアセトンを加え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着色物質がなくなるまでアセトンで洗浄した。この残渣を吸引乾燥し、１４０ｇの乾燥物を得た。この乾燥物に０．４Ｍの食塩水２．８リットルを加え、１００℃で１時間処理後、ろ過し、残渣を０．４Ｍの食塩水で充分洗浄し、抽出液３．７リットルを得た。この抽出液に５％のセチルピリジニウムクロリドを沈殿が生じなくなるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈殿を０．４Ｍの食塩水に懸濁後再度遠心分離し、得られた沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加し、ホモジナイザーで処理後、かくはんしながら４リットルのエタノールを添加し、１時間かくはん後、ろ過し、沈殿を得た。この沈殿に対して、８０％エタノールに懸濁後ろ過という工程を上清の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。得られた沈殿を２リットルの２Ｍ食塩水に懸濁し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子量３万の膜を備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、完全に脱塩後、凍結乾燥し３．７ｇのナマコ由来フコイダンを得た。
参考例８
市販の塩蔵オキナワモズク６２５ｇを４３７５ｍｌの３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、ホモジナイザーにより８０００回転／分、５分処理後、９５℃、１時間処理し、遠心分離により上清を得た。得られた上清に１０ｇの活性炭を添加後３０分間攪拌し、遠心分離により上清を得た。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、２０ｍＭの塩化ナトリウムで溶液置換し、凍結乾燥して１０．９ｇのオキナワモズク由来のフコイダン画分の乾燥物を得た。
実施例１
１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有、フェノールレッド不含、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ライフテックオリエンタル社製、２５０３０−１４９）含有ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカー社製、１２−９１７Ｆ）にＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  ７１）を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁し、４８穴マイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で１２時間若しくは２４時間培養した。各ウェルに後述する試料の各水溶液を添加して前記規定時間培養した後、一酸化窒素（ＮＯ）が培地中で酸化されることによって生ずるＮＯ２−濃度の測定を行った。試料として用いた、参考例１−（２）記載のガゴメ昆布由来フコイダンのＩ画分、ＩＩ画分、及びＩＩＩ画分、参考例２−（３）記載の式Ｖで表される化合物（以下、７−１２ＳＦｄ−Ｆと称す）は、最終濃度が、１、１０、１００μｇ／ｍｌになるように添加した。また、対照は試料と同量の滅菌蒸留水を添加した。なお、陽性対照としては、リポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマ社製）を最終濃度が、１μｇ／ｍｌになるように添加した。
上記培養後、１００μｌの培地に１００μｌの４％グリース試薬（シグマ社製、Ｇ４４１０）を加え、室温で１５分間放置した後、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記培地に予め既知の濃度で溶解させたＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。測定はすべて３連で行った。
この結果、７−１２ＳＦｄ−Ｆ、ガゴメ昆布由来フコイダンのＩ画分、ＩＩ画分、及びＩＩＩ画分はどれもＮＯ産生誘導を促進し、免疫賦活作用があることが明らかになった。その結果を第２図〜第５図に示す。すなわち、第２図は７−１２ＳＦｄ−Ｆ、第３図はＩ画分、第４図はＩＩ画分、第５図はＩＩＩ画分を添加して培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。また第６図は陽性対照のＬＰＳを添加して培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。第２図〜第６図において横軸は培養条件を、縦軸はＮＯ２−濃度（μＭ）を示す。
これらの結果より、ガゴメ昆布由来フコイダンのＩ画分、ＩＩ画分、ＩＩＩ画分、及び７−１２ＳＦｄ−Ｆには、ＮＯ産生誘導作用、及び該作用を介した免疫賦活効果があることが明らかになった。
なお、各参考例に記載のその他のフコイダン及びその分解物も同様のＮＯ産生誘導作用を示した。
また、ＮＯ２−濃度を測定した培養液と同じ培養液中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）を用いて測定した。しかし、この系においてはガゴメ昆布由来フコイダンのＩ画分、ＩＩ画分、ＩＩＩ画分、７−１２ＳＦｄ−Ｆ、及びその他の各参考例に記載のフコイダン及びその分解物にＩＦＮ−γの産生誘導は見られなかった。
実施例２
（１）非刺激リンパ球からのＩＦＮ−γ産生誘導作用
ＩＣＲマウス（雌、７週齢、体重約２５ｇ）は日本ＳＬＣより購入し、１週間の予備飼育の後、実験に用いた。マウスより脾臓を摘出し、細かく粉砕して１０％牛胎児血清（ハイクローン社）を含んだＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ社）に懸濁して単細胞液を得た。接着性細胞をプラスチックシャーレに接着させて除き、非接着性細胞を脾臓リンパ球として用いた。脾臓リンパ球は１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁して２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、１８０μｌ／ウェルで９６穴マイクロタイタープレートに播種した。各試料は蒸留水に溶解して１００ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し、表示量の１０倍濃度に培地で希釈した。対照は試料と同量の培地を添加し、該対照群以外の各ウェルに各濃度（１０〜５００μｇ／ｍｌ）の参考例に記載の各フコイダン、ガゴメ昆布フコイダンのＩ画分、ＩＩ画分、ＩＩＩ画分、７−１２ＳＦｄ−Ｆまたは１００μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ；ナカライテスク社）溶液を２０μｇ／ｍｌ添加し３７℃、５％炭酸ガス培養器で２日間または４日間培養した。培養後、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）を用いて測定した。
その結果、参考例に記載の各フコイダン、ガゴメ昆布由来フコイダンのＩ画分、ＩＩ画分、ＩＩＩ画分、７−１２ＳＦｄ−Ｆには５００μｇ／ｍｌ以下の用量において非刺激リンパ球からのＩＦＮ−γ産生誘導作用は認められなかった。一方、ＣｏｎＡを添加した細胞では強いＩＦＮ−γの産生誘導が認められた。
（２）アロ抗原刺激下におけるＩＦＮ−γ産生誘導作用
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週齢、体重約２０ｇ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６週齢、体重約２０ｇ）は日本ＳＬＣより購入し、１週間の予備飼育の後、実験に用いた。Ｈ−２のハプロタイプの異なったマウス（ＢＡＬＢ／ｃ；Ｈ−２ｄ、Ｃ５７ＢＬ／６；Ｈ−２ｂ）より脾臓を摘出し、上記の方法により脾臓リンパ球を得た。各細胞浮遊液の細胞濃度を２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、１００μｌづつを９６穴マイクロタイタープレートに播種した。該対照群以外の各ウェルに各濃度（１０〜５００μｇ／ｍｌ）の参考例に記載の各フコイダン、ガゴメ昆布由来フコイダンのＩ画分、ＩＩ画分、ＩＩＩ画分、７−１２ＳＦｄ−Ｆまたは１０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡを実施例２−（１）と同様に添加した。また、対照は試料と同量の培地を添加した。これらを３７℃、５％炭酸ガス培養器で４日間培養した。培養後、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
その結果、参考例に記載の各フコイダン、ガゴメ昆布由来フコイダンのＩ画分、ＩＩ画分、ＩＩＩ画分、７−１２ＳＦｄ−Ｆには５００μｇ／ｍｌ以下の用量においてアロ抗原刺激状態のリンパ球に対するＩＦＮ−γ産生誘導作用は認められなかった。一方、ＣｏｎＡを添加した細胞では強いＩＦＮ−γの誘導が認められた。
（３）感作リンパ球の抗原刺激下におけるＩＦＮ−γ産生誘導作用
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６週齢、体重約２０ｇ）は日本ＳＬＣより購入し、１週間の予備飼育の後、実験に用いた。マウスの腹腔内に１×１０６ｃｅｌｌｓのＭｅｔｈ−Ａマウス肉腫細胞を接種して免疫した。腫瘍接種１４日後に脾臓を摘出し、上記の方法により脾臓リンパ球を得た。細胞浮遊液の細胞濃度を２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、１００μｌづつを９６穴マイクロタイタープレートに播種した。刺激細胞の調製のため、ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁して２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したＭｅｔｈ−Ａマウス肉腫細胞にマイトマイシンＣ（協和発酵社製）を５０μｇ／ｍｌの濃度で添加して３７℃で３０分間処理し、２回洗浄後、１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁して２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。調製した刺激細胞を１００μｌ／ウェルで脾臓リンパ球を加えたプレートの各ウェルに重層し、３７℃、５％炭酸ガス培養器で４日間培養した。試料として用いた、ガゴメ昆布由来フコイダンは１〜１００μｇ／ｍｌとなるよう、ガゴメ昆布由来フコイダンのＩ画分、ＩＩ画分、ＩＩＩ画分、７−１２ＳＦｄ−Ｆは各１０〜５００μｇ／ｍｌとなるように、また陽性対照にはＣｏｎＡを１０μｇ／ｍｌとなるように、実施例２−（１）と同様に調製、添加し培養した。また、対照は試料と同量の培地を添加した。培養後、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。同培養上清においてＩＬ−１２量をＥＬＩＳＡキット（ＥＮＤＯＧＥＮ社）を用いて測定した。
その結果を第７図、第８図に示す。すなわち第７図はフコイダン及びその分解物のＩＦＮ−γ産生誘導作用を示す図であり、図中縦軸はＩＦＮ−γ産生量（ｐｇ／ｍｌ）、横軸は各試料、及び添加量（μｇ／ｍｌ）を示す。
また第８図はフコイダン及びその分解物のＩＬ−１２産生誘導作用を示す図であり、図中縦軸はＩＬ−１２産生量（ｐｇ／ｍｌ）、横軸は各試料、及び添加量（μｇ／ｍｌ）を示す。
第７図、第８図に示すように、感作リンパ球の抗原刺激下において、ガゴメ昆布由来フコイダンは１〜１００μｇ／ｍｌの用量において、Ｉ画分、ＩＩ画分、ＩＩＩ画分、及び７−１２ＳＦｄ−Ｆは１０〜５００μｇ／ｍｌの用量において用量依存的なＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１２産生の増強作用を示した。またその他の各参考例に記載のフコイダンおよびその分解物も同様の作用を示した。
実施例３
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢、体重約２０ｇ）は日本ＳＬＣより購入し、１週間の予備飼育の後、実験に用いた。マウスより脾臓を摘出し、細かく粉砕して１０％牛胎児血清（ハイクローン社）を含んだＲＰＭＩ−１６４０培地（バイオウィッタカー社）に懸濁して単細胞液を得た。脾臓リンパ球は１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁して３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、Ｔ２５フラスコ（イワキ社）に１０ｍｌ加えた。フラスコは同じものを２つずつ用意し、一方には培地のみを、他方にはさらにガゴメ昆布由来フコイダンを１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
培養開始より１０日後に細胞を回収し、所定の濃度になるように１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、９６穴丸底マイクロプレートに１００μｌずつ分注した。
細胞の細胞傷害活性は、５１ＣｒでラベルしたＥＬ４胸腺腫瘍細胞（以下、ＥＬ４細胞という）をターゲットとし、培養上清中に遊離してくるγ線量を測定した。すなわち、ＥＬ４細胞にＣｈｒｏｍｉｕｍ−５１  Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ（ニューイングランドニュークリア社）１８５０ｋＢｑを加え３７℃で一時間培養し、遠心操作にてＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄した。１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ−１６４０培地に該細胞を懸濁して１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。これを上述の９６穴丸底マイクロプレートに１００μｌずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で５時間培養し、上清１００μｌを採取後、γシンチレーションカウンターにて遊離したγ線量を測定した。細胞傷害活性は次のように算出した。
細胞傷害活性（％）＝〔（実験値−対照値）／（総放射活性値−対照値）〕×１００
ここで、総放射活性値は、培養脾細胞の代わりに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００μｌを用いた場合のγ線量を示す。また、対照値は培養脾細胞の代わりに培地１００μｌを用いた場合のγ線量を、実験値は培養脾細胞を用いた場合のγ線量を示す。
その結果を第９図に示す。すなわち第９図はガゴメ昆布由来フコイダンのマウス脾臓リンパ球の細胞傷害性免疫増強作用を示す図であり、縦軸は細胞傷害活性（％）、横軸は対照のエフェクター細胞、及び参考例１記載のガゴメ昆布由来フコイダンを１０μｇ／ｍｌとなるように添加して培養して得られたエフェクター細胞（Ｅ）とターゲット細胞（Ｔ）との比（Ｅ／Ｔ  ｒａｔｉｏ）を示す。棒グラフは各群５匹の平均値と標準誤差を示す。
第９図に示すように、マウスの培養脾細胞（エフェクター細胞）は、ＥＬ４細胞（ターゲット細胞）に対して細胞傷害活性を示した（対照）。フコイダンを１０μｇ／ｍｌとなるように加えて培養した細胞では、ＥＬ４細胞に対する細胞傷害活性が増強されており、フコイダン添加群では低いエフェクター細胞とターゲット細胞との比にも拘らず、高い細胞傷害活性を示し、細胞傷害性免疫がフコイダンにより増強された。
また参考例に記載の他の各フコイダン、その分解物、Ｉ画分、ＩＩ画分、ＩＩＩ画分、及び７−１２ＳＦｄ−Ｆも同様の活性を示した。
実施例４
（１）非刺激リンパ球からのＩＦＮ−γ産生誘導作用
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６週齢、体重約２０ｇ）は日本ＳＬＣより購入し、１週間の予備飼育の後、実験に用いた。前記の方法により調製した脾臓リンパ球を播種したプレートの各ウエルに１０〜５００μｇ／ｍｌとなるよう参考例３−（２）で調製したＧ−フコイダンを添加し、３７℃、５％炭酸ガス培養器で４日間培養した。培養後、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
その結果、検討した用量においてＧ−フコイダンによるＩＦＮ−γ産生誘導作用は認められなかった。
（２）感作リンパ球の抗原刺激下におけるＩＦＮ−γ産生誘導作用
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６週齢、体重約２０ｇ）は日本ＳＬＣより購入し、１週間の予備飼育の後、実験に用いた。試料として参考例３−（２）で調製したＧ−フコイダンは蒸留水に溶解して１００ｍｇ／ｍｌに調製し、表示量の１０倍濃度に培地で希釈した。前記の方法により調製した脾臓リンパ球、及びＭｅｔｈ−Ａマウス肉腫細胞を播種したプレートの各ウエルに最終濃度が１０〜５００μｇ／ｍｌとなるよう調製したＧ−フコイダンを添加して３７℃、５％炭酸ガス培養器で４日間培養した。なお、対照は試料と同量の培地を添加し、培養した。培養後、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ量、及びＩＬ−１２量をＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
その結果を第１０図、第１１図に示す。すなわち第１０図はＧ−フコイダンのＩＦＮ−γ産生誘導作用を示す図であり、図中縦軸はＩＦＮ−γ産生量（ｐｇ／ｍｌ）、横軸は試料、及び添加量（μｇ／ｍｌ）を示す。また、第１１図はＧ−フコイダンのＩＬ−１２産生誘導作用を示す図であり、図中縦軸はＩＬ−１２産生量（ｐｇ／ｍｌ）、横軸は試料、及び添加量（μｇ／ｍｌ）を示す。第１０図、第１１図に示すように、感作リンパ球の抗原刺激下において、Ｇ−フコイダンは１０〜５００μｇ／ｍｌの用量において用量依存的なＩＦＮ−γ産生の増強作用が認められた。ＩＬ−１２についても５００μｇ／ｍｌの用量において顕著な産生増強作用が認められた。
実施例５
ガゴメ昆布由来フコイダンのＩＦＮ−γ産生誘導作用に対する抗ＩＬ−１２抗体及び抗副刺激レセプター（ＣＤ２８、ＣＤ４０）抗体の作用
前記の方法により調製したＣ５７ＢＬ／６マウス由来脾臓リンパ球及びＭｅｔｈ−Ａマウス肉腫細胞を混合して９６穴マイクロタイタープレートに播種し、全てのウエルに終濃度１００μｇ／ｍｌの参考例１−（１）で調製したガゴメ昆布由来フコイダンを添加した。さらに対照以外のウエルに終濃度１μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１２抗体（Ｒ＆Ｄ社）、又は終濃度１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体、若しくは抗ＣＤ４０抗体を添加して３７℃、５％炭酸ガス培養器で４日間培養した。培養後、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ量、及びＩＬ−１２量をＥＬＩＳＡにより測定した。その結果を第１２図に示す。すなわち第１２図はフコイダンのＩＦＮ−γ又はＩＬ−１２産生誘導作用に対する各種抗体の作用を示す図であり、図中左縦軸はＩＦＮ−γ産生量（ｐｇ／ｍｌ）、右縦軸はＩＬ−１２産生量（ｐｇ／ｍｌ）、横軸は用いた各抗体を示す。
第１２図に示すように、抗原提示反応時のガゴメ昆布由来フコイダンによるＩＬ−１２の産生誘導は抗ＩＬ−１２抗体、抗ＣＤ２８抗体、又は抗ＣＤ４０抗体により完全に抑制された。一方、感作リンパ球からのＩＦＮ−γ産生誘導は抗ＩＬ−１２抗体により約５０％が抑制され、抗ＣＤ２８抗体、又は抗ＣＤ４０抗体により完全に抑制された。
実施例６
各種フコイダンのＩＦＮ−γ産生誘導作用の比較
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭｅｔｈ−Ａマウス肉腫細胞を接種して免疫し、接種から２４日後に脾臓を摘出した。前記の方法により調製したＣ５７ＢＬ／６マウス由来脾臓リンパ球、及びＭｅｔｈ−Ａマウス肉腫細胞を混合して９６穴マイクロタイタープレートに播種した。試料として、参考例１で調製したガゴメ昆布由来フコイダン、参考例８で調製したオキナワモズク由来フコイダン、参考例５で調製したヒバマタ由来フコイダン、及び参考例４で調製したワカメ  メカブ由来フコイダンを用い、各フコイダンの最終濃度が１０〜５００μｇ／ｍｌとなるように実施例２−（１）と同様に調製し、添加して３７℃、５％炭酸ガス培養器で４日間培養した。なお、対照は試料と同量の培地を添加し、培養した。培養後、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
その結果を第１３図に示す。すなわち第１３図は各フコイダンのＩＦＮ−γ産生誘導作用を示す図であり、図中縦軸はＩＦＮ−γ産生量（ｐｇ／ｍｌ）、横軸は各試料、及び添加量（μｇ／ｍｌ）を示す。
第１３図に示すように、感作リンパ球の抗原刺激下におけるＩＦＮ−γ産生誘導能に関して、カゴメ昆布とヒバマタ由来フコイダンは同等、オキナワモズク、ワカメ  メカブはそれに比べ弱いＩＦＮ−γ産生誘導作用が認められた。
実施例７
１群４または５匹の５週令のウィスター系雄性ラット（日本ＳＬＣ社）に、卵白アルブミン（シグマ社）の０．０１％生理食塩水溶液１００μｌ及びアラム（商品名イムジェクト  アラム（Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ）；ピアス社製）１００μｌを腹腔内投与して感作し、その１４日後に腹大静脈より血液を採取した。
採取した血液は遠心分離（２０００ｒｐｍ，５分）後、血漿を分離し、ラットを用いた受身皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）反応で抗原特異的ＩｇＥ量を測定した。すなわち血漿の倍々希釈系列を２倍から６４倍まで、生理食塩水を用いて作製し、毛刈りした７週令のウィスター系雄性ラットの背部の皮内に０．１ｍｌずつ注射した。皮内注射の４８時間後、０．０５％卵白アルブミン及び０．５％エバンスブルー（ナカライテスク社製）の混液１ｍｌを尾静脈より注射した。尾静脈注射３０分後、ラットを断頭、放血死させ、背部に現れた青色スポットを観察し、直径５ｍｍ以上のスポットを陽性とし、最高希釈倍数をＩｇＥ力価として表した。
参考例１−（１）で調製したガゴメ昆布由来フコイダンの投与群は抗原感作日７日前から採血日まで０．１％または１％のガゴメ昆布由来フコイダンを給水瓶に入れ、自由摂取させた。また対照群では水道水を同様に与えた。その結果、卵白アルブミン感作による抗原特異的ＩｇＥ量の上昇は１％ガゴメ昆布由来フコイダンの飲水摂取により著明に抑制された。その結果を表１に示す。
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実施例８
実施例７と同様の方法により感作したラットに、初回感作から１９日後に同条件で追加免疫し、最終免疫から１４日後に腹大静脈より血液を採取した。採取した血液は前記同様ＰＣＡ反応で抗原特異的ＩｇＥ量を測定した。
参考例１−（１）で調製したガゴメ昆布由来フコイダンの投与群は追加免疫日から採血日まで０．１％または１％のガゴメ昆布由来フコイダンを給水瓶に入れ、自由摂取させた。また対照群では水道水を同様に与えた。その結果、卵白アルブミンによる抗原特異的ＩｇＥ量の上昇は１％ガゴメ昆布由来フコイダンの飲水摂取により著明に抑制された。このことより、フコイダンは予防的投与に加え、抗原感作時からの治療的投与においても有効であることが示された。その結果を表２に示す。
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実施例９
（１）１．５ｇ中に、フコイダンとしてガゴメ昆布由来フコイダン２０ｍｇ、ポリフェノールとして市販のリンゴ抽出物（商品名：アップルフェノン、ニッカウヰスキー（株）製）、ブドウ種子抽出物（商品名：グラヴィノール、キッコーマン（株）製）、甜茶抽出物（商品名：サンテンチャＳ、サントリー（株）製）の合計８２ｍｇ、残余がビーフエキス（大日本製薬（株）製）、ビール酵母（キリンビール（株）製）、乳糖、コーンスターチ（加藤化学（株）製）、還元麦芽糖（東和化成工業（株）製）となるように原料を配合し、本発明の飼料添加物（１ｍｍ径）を押し出し造粒機を用い製造し、一包１．５ｇとした。
（２）大型犬（体重：約３０ｋｇ）の場合は１日３包、中型犬（体重：約１０ｋｇ）の場合は１日２包、小型犬（体重：５ｋｇ）には１日１包各々の飼料に上記飼料添加剤を栄養補助食として添加した。
本発明の飼料添加剤の摂取により、大型犬、中型犬、小型犬共に活動が活発となり、食欲も増進した。また体調の改善効果により、毛並みが改善され、体臭、糞尿の臭いは軽減した。これらの効果は特に老犬において顕著に見られ、老犬の体調改善、健康回復、若返りに本発明の飼料は極めて有用であった。
寄託された生物材料
（１）寄託機関の名称
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
（２）寄託された微生物
（ｉ）アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）  ｓｐ．ＳＮ−１００９
原寄託日              ：  平成８年２月１３日
国際寄託への移管請求日：  平成８年１１月１５日
受託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７
（ｉｉ）フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  ｓｐ．ＳＡ−００８２
原寄託日              ：  平成７年３月２９日
国際寄託への移管請求日：  平成８年２月１５日
受託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２
産業上の利用可能性
本発明によりサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、及び抗アレルギー作用を示すフコイダン及び／又はその分解物を有効成分として含有するサイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患及びアレルギー性疾患に有効な医薬が提供される。該医薬は、生体内におけるインターロイキン類、インターフェロン類等の産生調節活性を有し、癌、免疫性疾患等のサイトカイン類の産生調節を必要とする疾患の治療剤又は予防剤として有用である。
また特にＩＦＮ−γ産生調節剤、ＩＬ−２産生調節剤、ＮＯ産生誘導剤としてこれらの薬剤の適用を要する疾患の治療剤として有用である。
不必要な状態での免疫系の活性化あるいは増強は、アレルギー、自己免疫疾患等の疾病を惹起する場合があるが、本発明の製剤によるサイトカイン類増強、免疫増強は選択的なものであり、ウイルス感染、あるいは癌等、体内に排除すべき抗原が存在し、細胞性免疫の増強が必要なときのみに起こることにより、本発明の製剤は生体防御に極めて有用である。
また本発明の製剤により過剰な体液性免疫の活性化が抑制され、本発明の製剤はアレルギーの抑制にも極めて有用である。
更に、サイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用及び抗アレルギー作用を有するフコイダン及び／又はその分解物を用いて飲食品又は飼料を製造することが可能になり、日常の飲食品として摂取することにより、サイトカイン類の産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、例えば動脈硬化症、アレルギー性疾患等の症状改善等が可能となる。
従って、フコイダン及び／又はその分解物を有効成分とする機能性飲食品又は飼料は、これらの生理作用により、生体の恒常性の維持に有用な機能性飲食品又は飼料である。
またサイトカイン類の産生調節剤も提供され、当該調節剤はサイトカイン類の機能研究、サイトカイン類が関連する疾病用医薬のスクリーニングに有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ガゴメ昆布由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す図である。
第２図は、７−１２ＳＦｄ−Ｆを添加して培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。
第３図は、Ｉ画分を添加して培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。
第４図は、ＩＩ画分を添加して培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。
第５図は、ＩＩＩ画分を添加して培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。
第６図は、陽性対照のＬＰＳを添加して培養した時の培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。
第７図は、フコイダン及びその分解物のＩＦＮ−γ産生誘導作用を示す図である。
第８図は、フコイダン及びその分解物のＩＬ−１２産生誘導作用を示す図である。
第９図は、ガゴメ昆布由来フコイダンのマウス脾臓リンパ球の細胞傷害性免疫増強作用を示す図である。
第１０図は、Ｇ−フコイダンのＩＦＮ−γ産生誘導作用を示す図である。
第１１図は、Ｇ−フコイダンのＩＬ−１２産生誘導作用を示す図である。
第１２図は、フコイダンのＩＦＮ−γ又はＩＬ−１２産生誘導作用に対する各種抗体の作用を示す図である。
第１３図は、各フコイダンのＩＦＮ−γ産生誘導作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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