(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドをコードする単離されたDNAであって、前記ポリペプチドがSEQ ID NO:2の残基-19から522、SEQ ID NO:2の残基１から522、SEQ ID NO:2の残基-19から310、SEQ ID NO:2の残基１から310、SEQ ID NO:4の残基-18から519、SEQ ID NO:4の残基１から519、SEQ ID NO:4の残基-18から307、及びSEQ ID NO:4の残基１から307からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記単離されたDNA。
【請求項２】
SEQ ID NO:2のアミノ酸残基１から310を含むポリペプチドをコードする、請求項１のDNA。
【請求項３】
SEQ ID NO:1のヌクレオチド１から1626、SEQ ID NO:1のヌクレオチド58から1626、SEQ ID NO:1のヌクレオチド１から985、SEQ ID NO:1のヌクレオチド58から985、SEQ ID NO:3のヌクレオチド381から1994、SEQ ID NO:3のヌクレオチド435から1994、SEQ ID NO:3のヌクレオチド381から1355、及びSEQ ID NO:3のヌクレオチド435から1355からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、DNA。
【請求項４】
SEQ ID NO:2の残基１から522、SEQ ID NO:2の残基１から310、SEQ ID NO:4の残基１から307及びSEQ ID NO:4の残基１から519からなる群から選択される配列において１つまたは数個のアミノ酸が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することができるポリペプチドをコードするDNA。
【請求項５】
ポリペプチドをコードするDNAであって、前記ポリペプチドが、以下の
ａ）SEQ ID NO:2の１から297及び299から522のアミノ酸、但し、前記ポリペプチドはSEQ ID NO:2の位置298の残基を欠いている；
ｂ）SEQ ID NO:2の１から297及び299から310のアミノ酸、但し、前記ポリペプチドはSEQ ID NO:2の位置298の残基を欠いている；
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含む、前記DNA。
【請求項６】
ポリペプチドをコードする単離されたDNAであって、前記DNAが非常に厳しい条件下で請求項３のDNAとハイブリダイズすることができるDNAの相補体であり、前記ポリペプチドがＮＦ−κＢの活性化を阻害することができる、前記単離されたDNA。
【請求項７】
SEQ ID NO:2の残基１から310の配列において１つまたは数個のアミノ酸が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することができるポリペプチドをコードするDNA。
【請求項８】
SEQ ID NO:2のアミノ酸残基１から310を含むポリペプチドの断片をコードするDNA。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項のDNAを含む発現ベクター。
【請求項１０】
ポリペプチドの発現を促進する条件下、請求項９のベクターで形質転換した宿主細胞を培養することを含む、ポリペプチドを調製する方法。
【請求項１１】
SEQ ID NO:2の残基-19から522、SEQ ID NO:2の残基１から522、SEQ ID NO:2の残基-19から310、SEQ ID NO:2の残基１から310、SEQ ID NO:4の残基-18から519、SEQ ID NO:4の残基１から519、SEQ ID NO:4の残基-18から307、及びSEQ ID NO:4の残基１から307からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項１２】
SEQ ID NO:2の残基１から310のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１３】
SEQ ID NO:2の残基１から522及びSEQ ID NO:4の残基１から519からなる群から選択される配列において１つまたは数個のアミノ酸が欠失、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、そしてＮＦ−κＢの活性化を阻害することができる、ポリペプチド。
【請求項１４】
以下の
ａ）SEQ ID NO:2の１から297及び299から522のアミノ酸、但し、前記ポリペプチドはSEQ ID NO:2の位置298の残基を欠いている；
ｂ）SEQ ID NO:2の１から297及び299から310のアミノ酸、但し、前記ポリペプチドはSEQ ID NO:2の位置298の残基を欠いている；
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含むポリペプチド。
【請求項１５】
請求項６のDNAによってコードされるポリペプチド。
【請求項１６】
SEQ ID NO:2の残基１から310の配列において１つまたは数個のアミノ酸が欠失、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、そしてＮＦ−κＢの活性化を阻害することができるポリペプチド。
【請求項１７】
ａ）SEQ ID NO:2の残基１から３１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び、
ｂ）ＮＦ−κＢの活性化を阻害することができる、上記ａ）に記載のポリペプチドの断片
からなる群から選択されるポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１１ないし１６のいずれか１項のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体である、請求項１８の抗体。
【請求項２０】
請求項１１ないし１６のいずれか１項のポリペプチド、及び適した希釈剤あるいは担体を含む薬剤組成物。
【請求項２１】
哺乳動物中のＮＦ−κＢの活性化を阻害する方法に使用される、請求項２０の薬剤組成物。
【請求項２２】
炎症状態にある哺乳動物中の炎症を軽減する方法に使用される、請求項２０の薬剤組成物。
【請求項２３】
請求項１８または１９に記載の抗体を含む、薬剤組成物。
【請求項２４】
炎症状態にある哺乳動物中の炎症を軽減する方法に使用される、請求項２３に記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
Ｉ型インターロイキン-1受容体（IL-1RI）は、前炎症性サイトカインであるインターロイキン-1の生物学的効果を仲介する（Sims et al．，Science 241：585-589，1988；Curtis et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：3045-3049，1989）。第二のインターロイキン-1受容体（II型IL-1RあるいはIL-1RIIと呼ばれる）はIL-1と結合するが、シグナル伝達を仲介しないとみられる（McMahan et al．，EMBO J．10：2821，1991；Sims et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90：6155-6159，1993）。IL-1RI及びIL-1RIIはそれぞれIL-1α及びIL-1βと結合する。
IL-1RI及びIL-1RIIは、著しい配列上の相同性を示すタンパク質ファミリーの一員である。このようなタンパク質の一つがIL-1Rアクセサリータンパク質（IL-1R Ac P）で、Greenfederらに記載されている（J．Biol．Chem．270：13757-13765，1995）。このタンパク質は、それ自体はIL-1と結合できないが、IL-1RI及びIL-1αあるいはIL-1βのいずれかと複合体を形成する。IL-1RIと共発現する場合、組換えIL-1R AcPはIL-1RIのIL-1βに対する結合親和性を増強する（上記Greenfederら）。
ST2、ST2L、T1あるいはFit-1と、様々な名称で知られているタンパク質もIL-1Rファミリーの一員であるが、IL-1と結合しない。このタンパク質の膜結合型及び分泌型をコードする、マウス及びラットのcDNAのクローニングが報告されている（Klemenz et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：5708，1989；Tominaga，FEBS LETTERS 258：301，1989；Yanagisawa et al．，FEBS LETTERS 318：83，1993；Bergers et al．，EMBO J．13：1176，1994）。ヒトST2のcDNA及びゲノムクローンも単離されている（Tominaga et al．Biochimica et Biophysica Acta 1171：215，1992）。
IL-1RIと著しい配列上の相同性を示す他のタンパク質は、マウスMyD88（Lord et al．，Oncogene 5：l095-1097，1990）、ヒトrsc786（Nomura et al．，DNA Res．1：27-35，1994）及び多数のショウジョウバエタンパク質であり、これらのうち最もよく特徴づけられているのはTollである（Hashimoto et al．，Cell 52，269-279，1988）。タバコＮ遺伝子（Whitham et al．，Cell 78：1101-1115，1994）は別のIL-1Rファミリー構成員の一つである。
MyD88、rsc786、Toll及びタバコＮ遺伝子の産物は、IL-1RIの細胞質ドメインと著しい相同性を示すドメインを含む。IL-1R AcP及びST2タンパク質は、IL-1RIと、その細胞外及び細胞質部位の両方において配列上の類似性を示す。ワクシニアウイルスのB16Rタンパク質（Goebel et al．，Virology 179：247，1990）は、IL-1RIIのウイルス相同体であるとみられる。
このファミリーの別の受容体を同定することが望まれている。このような受容体タンパク質を研究し、IL-1と結合するかどうか、そしてもしそうであるならその受容体はシグナル伝達の仲介において機能するかどうかを決定することができる。このファミリーの受容体に別の親和性変換サブユニットが存在し得ることも、検討され得る。
発明の概要
本発明は、2F1と呼ばれる新規受容体タンパク質を提供する。2F1の可溶型及び膜結合型の両方を本明細書中で開示する。本発明は、2F1タンパク質をコードする単離されたDNA、単離されたDNAを含む発現ベクター、及びこの発現ベクターにて形質転換した宿主細胞を2F1タンパク質の発現に適した条件下で培養することによって、2F1を作出する方法をも提供する。2F1に対して指向する抗体も開示する。2F1は、プロスタグランジン合成の阻害、及び炎症の軽減に有用である。
発明の詳細な説明
本発明に従い、2F1と呼ばれる新規受容体タンパク質をコードするDNAを単離した。2F1 DNAを含む発現ベクターを提供し、この発現ベクターを含む宿主細胞を2F1の発現に適した条件下で培養することによって、組換え2F1ポリペプチドを作出する方法、および発現された2F1タンパク質を回収する方法も提供する。細胞外ドメインを含むこのタンパク質の可溶型を含め、精製2F1も本発明に包含される。
本発明は、2F1、及び2F1に特異的な抗体を作出するために免疫原として使用し得る、2F1の免疫原性断片をも提供する。一態様において、この抗体はモノクローナル抗体である。
実施例１に記載するように、ヒト2F1クローンを単離した。ヒト2F1 DNA配列をSEQ ID NO:1に示し、それがコードするアミノ酸配列をSEQ ID NO:2に示す。そのタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸-19から-1）、それに引き続き細胞外ドメイン（アミノ酸１から310）、膜貫通領域（アミノ酸311から332）及び細胞質ドメイン（アミノ酸333から522）を含む。
実施例２に記載するように、種間交差ハイブリッド形成によりマウス2F1 cDNAを単離した。このマウス2F1 DNAの、DNA配列及びコードされるアミノ酸配列をSEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4に示す。SEQ ID NO:4のタンパク質はシグナルペプチド（アミノ酸-18から-1）、細胞外ドメイン（アミノ酸１から307）、膜貫通領域（アミノ酸308から330）及び細胞質ドメイン（アミノ酸331から519）を含む。マウス2F1とヒト2F1のアミノ酸配列は65％一致する。
2F1タンパク質のアミノ酸配列により、2F1がIL-1受容体ファミリーの一員であることが明らかである。既知のIL-1受容体ファミリーの構成員のなかで、2F1はIL-1Rアクセサリータンパク質（IL-1R AcP）、T1/ST2及びＩ型IL-1受容体（IL-1RI）と配列上の相同性が最も高い。SEQ ID NO:4のマウス2F1アミノ酸配列は、マウスIL-1R AcPのアミノ酸配列とは31％、完全長マウスT1/ST2のものとは30％、そしてマウスIL-1RIのものとは27％一致する。細胞質ドメインは、細胞外部位が示す（20％-27％）よりもわずかに高い配列保存を示す（36-44％）。
実施例３に記載の結合アッセイを行って、2F1がIL-1α、IL-1βあるいはIL-1受容体アンタゴニストと結合するかどうか決定した。IL-1受容体ファミリーの一員であるにもかかわらず、2F1は試した３つのタンパク質のいずれとも結合しなかった。
ヒト及びマウス2F1は本発明の範囲内にあり、同様にラット、ウシ、ブタあるいはヒト以外の様々な霊長類などの哺乳類の種を含む（しかしそれらに限定されない）他の生物由来2F1タンパク質も本発明の範囲内に含まれる。別の種に由来する、2F1タンパク質をコードするDNAを、種間交差ハイブリッド形成の手法によって同定することができる。様々な種類の細胞から単離したメッセンジャーRNAをノーザンブロットにて選別し、他の種から2F1 cDNAをクローニングする際に使用するのに適したmRNA源を決定し得る。
本明細書中で使用されている場合、“2F1”という用語は、天然の2F1タンパク質（例えばSEQ ID NO:2あるいは４のタンパク質）に十分に相同であり、かつ天然の2F1タンパク質の生物活性を示すポリペプチド類に対して適用される。本発明の2F1タンパク質には、膜結合タンパク質（細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞質ドメインを含む）、および望ましい特性を保持している、短縮されたタンパク質も含まれる。このような短縮されたタンパク質には、例えば、細胞外ドメインのみを含む可溶性2F1あるいはその断片が含まれる。天然の2F1タンパク質の変異体も含まれるが、それは変異体が天然の2F1の望ましい生物活性を保持している場合である。以下でこのような変異体についてより詳細に記載する。
2F1ポリペプチド、あるいはその断片または変異体を、適したあらゆるアッセイにおける生物活性について検討し得る。細胞質ドメインを改変する場合（例えば短縮する、あるいはアミノ酸残基の欠失、付加または置換によって改変する）、2F1ポリペプチドをシグナル伝達アッセイにおいて生物活性について検討し得る。このようなアッセイには以下の実施例５から７に記載のアッセイが含まれるが、それらに限定はされない。改変した細胞質ドメインをIL-1受容体の細胞外ドメインと融合させることができ、その結果得られるキメラ受容体を、NF-κB活性化によってIL-1に応答する能力（実施例５の手順参照）、IL-8プロモーター機能の誘導（実施例６）、あるいはプロスタグランジンE2合成の亢進（実施例７）について検討した。細胞外ドメインを含む2F1ポリペプチド（例えば、以下に記載の可溶性2F1）を、動物実験においてin vivoでプロスタグランジンE2合成を抑制する能力について検討し得る。2F1をin vivoで投与し、動物個体におけるプロスタグランジンE2レベルをあらゆる適した方法、例えばELISAで測定する（2F1投与の前後に、かつ対照の動物個体と比較して）。
本発明の一態様は、可溶性2F1ポリペプチドに対するものである。可溶性2F1ポリペプチドは天然の2F1の細胞外ドメインの全てあるいは一部分を含むが、細胞膜上にこのポリペプチドを保持させるであろう膜貫通領域を欠いている。最初に合成されたときには、可溶性2F1ポリペプチドは分泌を促進する天然の（あるいは異種の）シグナルペプチドを都合よく含むが、このシグナルペプチドは細胞から2F1が分泌される際に切断される。
可溶性2F1ポリペプチドの一つの用途は、2F1の生物活性を阻害することである。哺乳類の動物個体に投与すると、可溶性2F1はあらゆる内在性の2F1リガンドに結合し、それによりこれらのリガンドが2F1を含む内在性の受容体に結合するのを阻害する可能性がある。一様態において、以下でさらに詳細に検討するように、プロスタグランジン合成を阻害することにより痛みや炎症を治療するために、可溶性2F1ポリペプチドを投与する。
可溶性2F1は、望みのタンパク質を発現する無処置の細胞を培養液から遠心などで分離し、望みのタンパク質が存在するか培養液（上清）をアッセイすることにより、同定し得る（そして、その非可溶性膜結合型に相当するものと区別し得る）。培養液中に可溶性2F1が存在することは、そのタンパク質は細胞から分泌されたものであり、したがってそれは望みのタンパク質の可溶型であることを示している。可溶性2F1はこのタンパク質の天然に存在する形態であり得る。
2F1の可溶型を利用するのは、ある種の適用に都合がいい。可溶性タンパク質は宿主細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からタンパク質を精製するのは容易である。さらに、可溶性タンパク質は一般に静脈内投与するのにより適している。
可溶性2F1ポリペプチドの例には、天然の2F1タンパク質の完全な細胞外ドメインを含むものが含まれる。このようなポリペプチドの一つが、SEQ ID NO:2のアミノ酸１から310までを含む可溶性ヒト2F1である。別に、SEQ ID NO:4のアミノ酸１から307までを含む可溶性マウス2F1がある。最初に宿主細胞内に発現したときには、この可溶性ポリペプチドは、使用する宿主細胞内で機能する、以下に記載の異種シグナルペプチドの１つをさらに含み得る。あるいは、2F1がSEQ ID NO:2のアミノ酸-19から310まで、またはSEQ ID NO:4のアミノ酸-18から307までを含むように、このポリペプチドが天然のシグナルペプチドを含む可能性がある。可溶性2F1ポリペプチドは、望ましい生物活性を保持する細胞外ドメインの断片を含む。可溶性2F1ポリペプチドをコードするDNA配列は本発明に包含される。
可溶性ポリペプチドを含む2F1断片は、多数の常法のいずれによっても調製し得る。既知の手法を用いて望みのDNA配列を化学的に合成し得る。DNA断片を、クローン化された完全長のDNA配列を制限エンドヌクレアーゼ切断することによって作出し、アガロースゲル上の電気泳動で分離することもできる。DNA断片の5'あるいは3'末端を望ましい部分にまで再構築したオリゴヌクレオチドを合成し得る。このオリゴヌクレオチドは、望ましいコーディング配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を、そしてコーディング配列の5'末端に開始コドン（ATG）を含み得る。制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むリンカーを使用して、望みのDNA断片を発現ベクターに挿入することができる。あるいは、既知の変異誘発の手法を使用して、終始コドンを望ましい部分、例えば細胞外ドメインの最後のアミノ酸に対応するコドンのすぐ下流に挿入することができる。
別の選択として、よく知られているポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の手順を使用して、望ましいタンパク質断片をコードするDNA配列を単離することができる。望ましい断片の末端を明確にするオリゴヌクレオチドをその反応でプライマーとして使用する。PCRの手順は、例えばSaikiら（Science 239：487，1988）やRecombinant DNA Methodology（Wu et al．eds.，Academic Press Inc.，San Diego，1989，pp 189-196）に記載されている。
2F1タンパク質のシグナルペプチド及び様々なドメインについての上記検討に関して、このタンパク質のこのような領域の上記境界がおおよそのものであることを当業者は認めるであろう。例えば、シグナルペプチドの切断部位を予想するコンピュータープログラムは利用できるが、予想される部位とは別の部位で切断が起こり得る。さらに、シグナルペプチドは１つ以上の部位で切断されるため、タンパク質調製物が様々なＮ末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物を含み得ることも認められる。加えて、膜貫通領域の正確な境界はコンピュータープログラムの予想とは異なる場合がある。望ましい生物活性を保持するような2F1のこのような形態は、本発明の2F1ポリペプチドに含まれる。
本発明は、組換え体、非組換え体の両精製2F1ポリペプチドを提供する。望ましい生物活性を保持している、天然2F1タンパク質の変異体及び誘導体も本発明の範囲内にある。天然の2F1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を変異させることにより、2F1の変異体を得ることができる。本明細書中で適用するような2F1変異体は、天然の2F1に十分相同なポリペプチドであるが、１つあるいはそれ以上の欠失、挿入または置換のために天然の2F1のものとは異なるアミノ酸配列を有する。
変異体アミノ酸配列は、天然の2F1アミノ酸配列と、好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも90％一致する。例えば、Devereuxら（Nucl．Acids Res．12：387，1984）に記載され、ウイスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（UWGCG）から入手できるGAPコンピュータープログラム第６版を用いて配列情報を比較することにより、パーセント一致性を求め得る。GAPプログラムは、SmithとWaterman（Adv．Appl．Math 2：482，1981）が改訂したNeedlemanとWunsch（J．Mol．Biol．48：443，1970）のアラインメント方法を利用している。GAPプログラムに関する好ましいデフォルトパラメーターには以下のものが含まれる。すなわち、(1)ヌクレオチドに関する、単一要素から成る比較マトリックス（一致点に対して１という値、非一致点に対して０という値を含む）及び、SchwarzとDayhoff編、Atlas of Protein Sequence and Structure（National Biomedical Research Foundation，pp．353-358，1979）に記載されているような、GribskovとBurgess（Nucl．Acids Res．14：6745，1986）の加重比較マトリックス；(2)各不一致に対する3.0のペナルティーと、各不一致における各記号に対する0.10の追加ペナルティー；及び(3)末端の不一致に対するペナルティーなし、である。
本発明は、このような変異体をコードするDNAをも提供する。このようなDNA配列は、天然の2F1 DNA配列と好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも90％一致する。例えば上記GAPプログラムのような既知のコンピュータープログラムを用いて、パーセント一致性を求め得る。
天然のアミノ酸配列の改変は、多数の既知の手法のいずれによっても達成し得る。天然の配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位が隣接する、変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、変異を特定の座に導入し得る。ライゲーションのあと、得られた再構築済み配列は、望ましいアミノ酸挿入、置換あるいは欠失を有する類似体をコードする。
あるいは、オリゴヌクレオチドに対する部位特異的変異誘発の手法を用いて、必要とする置換、欠失または挿入に従って改変した特定のコドンを有する、改変された遺伝子を提供するすることができる。上に示す改変を起こす方法はWalderら（Gene 42：133，1986）；Bauerら（Gene 37：73，1985）；Craik（BioTechniques，January 1985，12-19）；Smithら（Genetic Engeineering：Principles and Methods．Plenum Press，1981）；Kunkel（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82：488，1985）；Kunkelら（Methods in Enzymol．154：367，1987）；及びアメリカ合衆国特許第4,518,584号及び第4,737,462号に開示されている。
変異体は保存的に置換した配列を含み、これは、天然の2F1の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が別の残基と取り換えられているが、保存的に置換した2F1ポリペプチドは天然のタンパク質の望ましい生物活性を保持しているということを意味している。保存的な置換の例には、タンパク質の二次または三次構造を改変しないような残基の置換が含まれる。
特定のアミノ酸を同様の物理化学的性質を有する残基で置換し得る。保存的な置換の例には、ある脂肪族残基と別の脂肪族残基、例えばIle、Val、Leu、またはAlaと別のものとの置換、あるいは、ある極性残基と別の極性残基、例えばLysとArg、GluとAsp、またはGlnとAsnの間での置換が含まれる。例えば、同様の疎水的性質を有する領域全体の置換に関するなどの他の保存的な置換がよく知られている。
例えば、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基及び同様のものなどの他の化学構造との共有結合性複合体あるいは凝集性複合体の形成により、2F1タンパク質を修飾して、2F1誘導体を創造することも可能である。2F1の共有結合性誘導体は、その化学構造を、2F1アミノ酸側鎖上、あるいは、2F1ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端あるいはその細胞外ドメインの官能基と結合させることによって調製し得る。本発明の範囲内にある他の2F1誘導体には、2F1と、他のタンパク質あるいはポリペプチド、例えば、組換えDNA技術により作出されるＮ末端またはＣ末端融合体などとの共有結合性または凝集性複合体が含まれる。例えば、この複合体は、2F1ポリペプチドのＮ末端に異種シグナルあるいはリーダーポリペプチド配列を含み得る。シグナルまたはリーダーペプチドは、翻訳に伴って、または翻訳後に、複合体をその合成部位から細胞膜あるいは細胞壁の内側または外側の部位へと運搬するのを指向する。
2F1ポリペプチド融合体は、2F1の精製及び同定を容易にするために加えられたペプチドを含み得る。これらのペプチドには、例えば、ポリHisあるいはアメリカ合衆国特許第5,011,912号及びHoppら（Bio/Technology 6：1204，1988）に記載されている抗原同定ペプチドが含まれる。このようなペプチドの一つがFLAG▲Ｒ▼ペプチド、Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DYKDDDDK）（SEQ ID NO:5）であり、これは非常に抗原性が高く、発現させた組換えタンパク質のすみやかなアッセイ及び容易な精製を可能にする特異的なモノクローナル抗体が、可逆的に結合するエピトープを提供する。FLAG▲Ｒ▼オクタペプチドを特定のタンパク質のＮあるいはＣ末端に融合させるのに有用な発現システムは、Eastman Kodak Co.，Scientific Imaging Systems Division，New Haven，CTから入手でき、これはこのオクタペプチドに結合するモノクローナル抗体である。
本発明はさらに、天然型のグリコシル化を受けた、あるいは受けていない2F1ポリペプチドを含む。酵母あるいは哺乳類発現システムにて発現させた2F1は、発現システムの選択に依存して、分子量及びグリコシル化の型の点で天然の2F1ポリペプチドと類似しているか、あるいは著しく異なる場合がある。大腸菌などの細菌発現システムにて2F1ポリペプチドを発現させると、グリコシル化されていない分子が提供される。
2F1の細胞外ドメイン中のN-グリコシル化部位は、グリコシル化できないように修飾し得る。真核生物のポリペプチド中のN-グリコシル化部位は、ＸがPro以外のあらゆるアミノ酸で、かつＹがSerあるいはThrである場合のアミノ酸の３つ組みAsn-X-Yによって特徴づけられる。ヒト2F1タンパク質の細胞外ドメインは、SEQ ID NO:2のアミノ酸72-74、83-85、131-133、149-151、178-180、184-186、217-219及び278-280にこのような３つ組を含む。マウス2F1タンパク質はSEQ ID NO:4のアミノ酸32-34、53-55、89-91、93-95、116-118、171-173、176-178、182-184、215-217、277-279及び460-462にこのような３つ組を含む。このような３つ組をコードするヌクレオチド配列に対する適切な修飾は、炭化水素残基がAsn側鎖に付着するのを妨げるような置換、付加あるいは欠失に帰着するだろう。Asnを別のアミノ酸に置き換えるように選択される、ヌクレオチドただ一つの改変で、例えばN-グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。タンパク質中のN-グリコシル化部位を不活性化するための既知の手順には、アメリカ合衆国特許第5,071,972号及びEP第276,846号に記載の手順が含まれる。
さらなる変異体は、生物活性に必須ではないシステイン残基を欠失、または他のアミノ酸に置換し、復元の際の不正確な分子内ジスルフィド結合形成を防ぐようにしたものである。他のIL-1Rファミリーの構成員と同様に、2F1の細胞外ドメインは、免疫グロブリン様（Ig）ドメインを３つ含む。ヒト2F1アミノ酸配列と他のファミリー構成員との対応に基づき、Igドメインの典型的なドメイン内ジスルフィド結合を形成すると予想されるシステインは、SEQ ID NO:2の位置121、166、218及び279に位置する。第一の（最もN-末端の）Igドメインは、このファミリーの他タンパク質に保存されている１組のうち、第一の（残基22）システインは含むが、第二のシステインは欠いている。従って、2F1の第一のIgドメインは、Igドメインに典型的なドメイン内ジスルフィド結合を欠いていると予想される。T1/ST2を除くすべてのIL-1R様タンパク質と同様に、マウス及びヒト2F1もまた、シグナルペプチド切断点からほんの数残基だけC-末端側にシステイン（SEQ ID NO:2の位置２及びSEQ ID NO:4の位置４のシステイン）を有する。2F1の断片及び変異体は、好ましくはこれらの保存されたシステインを含む。
隣接二塩基性アミノ酸残基の修飾により、他の変異体を調製し、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母システムでの発現を高める。EP第212,914号に、タンパク質中のKEX2プロテアーゼ修飾部位を不活性化するような部位特異的変異誘発の利用が開示されている。残基を欠失、付加あるいは置換することにより、KEX2プロテアーゼ修飾部位は不活性化し、Arg-Arg、Arg-Lys及びLys-Argの組みを改変してこれらの隣接塩基性残基の存在を除くようにする。ヒト2F1はSEQ ID NO:2のアミノ酸94-95、296-297、345-346、418-419及び448-449にこのようなKEX2プロテアーゼ修飾部位を含む。マウス2F1はSEQ ID NO:4のアミノ酸87-88、96-97、231-232、244-245、295-296、339-340、416-417、432-433及び446-447にKEX2プロテアーゼ修飾部位を含む。Lys-Lysの組み合わせはKEX2切断の影響を受けることがかなり少なく、Arg-LysあるいはLys-ArgをLys-Lysに変換するのは、KEX2部位の不活性化のための保存的かつ好ましいアプローチを示す。
本発明は、天然に存在する2F1変異体も包含する。このような変異体の例には、選択的mRNAスプライシング現象あるいは2F1タンパク質のタンパク質分解切断の結果生じるタンパク質があり、この場合、望ましい生物活性は保持されている。mRNAの選択的スプライシングにより、例えば天然に存在する、タンパク質の可溶型のような、短縮されてはいるが生物学的には活性な2F1タンパク質を得ることができる。翻訳後の修飾あるいはタンパク質分解による変異には、例えば様々な種類の宿主細胞で発現させる際のＮあるいはＣ末端における差異が含まれ、これは2F1タンパク質から一つあるいはそれ以上の末端アミノ酸（概して1-5個の末端アミノ酸）がタンパク質分解除去されることによる。
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列との差異が遺伝的多型（2F1タンパク質を生み出す個体間における対立遺伝子変異）による場合の2F1タンパク質も、本明細書中で企図されている天然に存在する変異体の一つである。SEQ ID NO:1に示すヒト2F1の配列は、末梢血リンパ球ライブラリー由来の３つのcDNAクローン及び、上皮性カルシノーマ株KB（実施例１参照）由来の４つのPCRクローンから得られたものである。アラニン298に対応するコドンは多型であり、PBLクローン及び２つのKBクローン中では存在し、他の２つのKBクローン中では存在しない。EL4  T細胞ライブラリーから得られた２つのマウスクローンでも、これは存在しない。従って、本発明は位置298のアラニン残基を含むもの、または欠くもののいずれかのヒト2F1タンパク質を提供する。
本発明は、本明細書中で開示する新規2F1ポリペプチドをコードする単離されたDNA配列を提供する。本発明に包含される、2F1をコードするDNAには、例えばcDNA、化学的に合成したDNA、PCRにより単離されたDNA、ゲノムDNA及びそれらの組み合わせが含まれる。ゲノム2F1  DNAは、例えばSEQ ID NO:1または３のDNA、あるいはその断片をハイブリッド形成の手順の際にプローブとして用いることにより、常法にて単離し得る。
本発明の特定の態様は、SEQ ID NO:1のヌクレオチド１から1626（コーディング領域全体）、SEQ ID NO:1のヌクレオチド58から1626（ヒト成熟2F1をコードする）、SEQ ID NO:3のヌクレオチド381から1994（コーディング領域全体）、あるいはSEQ ID NO:3のヌクレオチド435から1994（マウス成熟2F1をコードする）を含む単離されたDNAに対するものである。他の態様において、単離されたDNA配列は、例えば上に記載する可溶性ポリペプチドの１つのような2F1断片をコードする。このようなDNAには、SEQ ID NO:1のヌクレオチド１から985（SEQ ID NO:2のアミノ酸-19から310をコードする）、SEQ ID NO:1のヌクレオチド58から985（SEQ ID NO:2のアミノ酸１から310をコードする）、SEQ ID NO:3のヌクレオチド381から1355（SEQ ID NO:4のアミノ酸-18から307をコードする）、及びSEQ ID NO:3のヌクレオチド435から1355（SEQ ID NO:4のアミノ酸１から307をコードする）を含むDNAを含む。例えば2F1の変異体及び融合タンパク質のような、本明細書中で開示する2F1の様々な形態をコードするDNAは、本発明に包含される。
本発明の範囲内にある核酸配列には、本明細書中で開示する天然の2F1ヌクレオチド配列と、適度にあるいは非常に厳しい条件下でハイブリッド形成し、かつ生物学的に活性な2F1をコードする単離されたDNA及びRNAが含まれる。適度に厳しいハイブリッド形成条件は、例えばSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2 ed．Vol.1，pp．1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press，（1989）に記載されている条件を参照している。Sambrookらが定義するような適度に厳しい条件は、5 X SSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA（pH8.0）のプレ洗浄溶液を使い、約55℃にて5 X SSC中で一晩ハイブリッド形成し、続いて50-55℃にて2 X SSC、0.1％ SDS中で洗うことを含む。非常に厳しい条件は、より高いハイブリッド形成及び洗いの温度を含む。温度及び洗浄溶液の塩濃度は、プローブの長さなどの要因に従い必要に応じて調整し得ることを当業者は理解するだろう。一態様において、非常に厳しい条件は68℃にてハイブリッド形成し、続いて0.1 X SSC/0.1％ SDS中、68℃にて洗うことを含む。
１つより多くのコドンが同一のアミノ酸をコードし得るという、有名な遺伝暗号の縮重のため、あるDNA配列がSEQ ID NO:1または３に示されるものとは異なるが、それでもそれぞれSEQ ID NO:2または４のアミノ酸配列を有する2F1タンパク質をコードする可能性がある。このような変異DNA配列は、例えばPCR増幅の間に起こるサイレント変異の結果生じる可能性がある。あるいは、変異配列が、天然の配列を意図的に変異誘発した産物である可能性がある。
従って本発明は、生物学的に活性な2F1をコードし、(a)天然の哺乳類2F1遺伝子のコーディング領域から得られるDNA（例えば、SEQ ID NO:1または３に示すヌクレオチド配列のコーディング領域を含むDNA）；(b)適度に、あるいは非常に厳しい条件下で(a)のDNAとハイブリッド形成できるDNA；及び(c)(a)または(b)で定義されるDNAに対する遺伝暗号の結果として縮重しているDNAの中から選択される、単離されたDNAを提供する。このようなDNA配列がコードする2F1タンパク質は本発明に包含される。
SEQ ID NO:1または３の天然のDNA配列とは異なるDNAであって、この変異DNAが適度にあるいは非常に厳しい条件下で天然のDNAとハイブリッド形成する場合、このようなDNAがコードする2F1タンパク質の例には、不活性化されたN-グリコシル化部位あるいは不活性化されたKEX2プロテアーゼ修飾部位を含む、2F1断片または2F1タンパク質が含まれるが、これらに限定されるのではない。さらなる例として、他の哺乳類の種から得られるDNAであって、SEQ ID NO:1のヒトDNAあるいはSEQ ID NO:3のマウスDNAとハイブリッド形成するであろうDNAがコードする2F1タンパク質がある。
精製2F1タンパク質及びその利用
本発明は精製2F1ポリペプチドを提供するが、これらは以下に記載の組換え発現システムにより産生するか、あるいは天然に存在する細胞から精製することができる。タンパク質精製の常法を用いることができる。
望ましい精製の程度は、このタンパク質の意図する利用に依存し得る。このタンパク質を例えばin vivoで投与する場合は、比較的高い精製度が望ましい。好都合なことに、他の（2F1でない）タンパク質に対応するいかなるタンパク質のバンドもSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にて検出されないように、2F1ポリペプチドは精製される。上で議論したような、ディファレンシャルなグリコシル化、翻訳後修飾における差異などにより、2F1タンパク質に対応する複数のバンドがSDS-PAGEにて検出され得ることを、関連する分野の専門家は理解するだろう。最も好ましくは、SDS-PAGEによる解析の際に単一のタンパク質のバンドで示されるように、十分に均質となるまで2F1が精製される。このタンパク質のバンドは銀染色、クマシーブルー染色、あるいは（もしタンパク質が放射標識されているならば）オートラジオグラフィーにて可視化され得る。
2F1タンパク質を作出する一つの方法は、2F1をコードするDNA配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、2F1が発現するような条件下で培養することを含む。続いて、用いる発現システムにより培養液あるいは細胞抽出物から2F1タンパク質を回収する。当業者が理解するように、組換え2F1を精製する手順は用いる宿主細胞の種類、及び2F1が培養液中に分泌されるかどうかなどの要因によって変わるだろう。
例えば、組換えタンパク質を分泌するような発現システムを採用する場合には、培養液をまず始めに、例えばAmiconあるいはMillipore Pellicon限外濾過装置などの商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮し得る。濃縮の段階に続き、濃縮物をゲル濾過媒体などの精製マトリックスにアプライし得る。あるいは、例えば張り出した（pendant）ジエチルアミノエチル（DEAE）基を有するマトリックスまたは基質などの陰イオン交換樹脂を用い得る。このマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、あるいはタンパク質精製に一般的に用いられる他の種類であり得る。あるいは、陽イオン交換の段階を用い得る。適した陽イオン交換体には、スルフォプロピルあるいはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる。スルフォプロピル基が好ましい。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）媒体（例えば、張り出したメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いた、一つまたはそれ以上のRP-HPLCの段階を用いて、2F1をさらに精製することができる。前述の精製段階のいくつかまたはその全てを、様々な組み合わせで用いて、十分均一な組換えタンパク質を提供することができる。
2F1に結合する抗体を含むアフィニティーカラムを利用して、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより2F1ポリペプチドを精製することも可能である。免疫原として本発明の2F1タンパク質を用い、モノクローナル抗体を作成する手順を実施例８に記載する。
前述のクロマトグラフィーの手順は、組換え体あるいは非組換え体のいずれかの2F1を精製するのにも用い得る手順のうちの一つである。組換え細胞の培養により、例えばある種類の細胞表面など自然界で見いだされる際に2F1と通常会合する可能性のある、混入タンパク質が入っていないタンパク質を作出することが可能になる。
細菌培養中に産生される組換えタンパク質は、まず宿主細胞を破壊し、遠心し、不溶性ポリペプチドなら細胞ペレットから、あるいは可溶性ポリペプチドなら上清から抽出し、続いて１回またはそれ以上濃縮し、塩析、イオン交換、アフィニティー精製あるいはサイズ排除クロマトグラフィーを行うという行程により、通例単離される。最後に、最終精製段階としてRP-HPLCを用い得る。凍結融解の繰り返し、音波処理、機械による破壊、あるいは細胞可溶化剤の使用を含む、使いやすいあらゆる方法にて微生物細胞を破壊し得る。
好ましくは、2F1を分泌ポリペプチドとして発現させ精製を簡単にする。酵母宿主細胞発酵由来の分泌組換えポリペプチドを、Urdalら（J．Chromatog．296：171，1984）に開示されている方法に類似の方法によって精製することができ、その方法は連続した２つの逆相HPLCの段階を含む。
2F1ポリペプチドと検出可能な物質を含む複合体を本明細書中で提供する。この物質は、好ましくは2F1ポリペプチドに共有結合している。このような複合体は、例えばin  vitroアッセイで有用である。
適した物質には、放射性核種、発色団、蛍光性化合物、比色あるいは蛍光測定反応を触媒する酵素などが含まれるがそれに限定されず、その際、意図する利用に従って特定の媒体を選択する。適した放射性核種には123I、131I、99mTc、111In及び76Brが含まれるが、これらに限定はされない。
一般にこのような化合物をポリペプチドに結合させる、あらゆる従来からの方法を用いて、この物質を2F1に結合することができる。2F1のアミノ酸側鎖上の官能基は、望ましい物質上の官能基と反応して、例えば共有結合を形成し得る。アミド結合、ヒンダード（hindered）ジスルフィド結合、酸切断可能な結合などを介してこの物質を2F1に共有結合させることができ、これらは望ましい物質の構造などの要因によって選択され得る結合の一つである。あるいは、2F1または物質を誘導体化して、望ましい反応性のある官能基を生み出す、または付け加え得る。誘導体化は、様々な分子をタンパク質に結合させるために利用できる二価性結合試薬の一つ（Pierce Chemical Company，Rockford Illinois）の結合を必要とする可能性がある。タンパク質を放射標識する数々の方法が知られている。適した二価性キレート剤を用いて放射性核種金属を2F1に結合させることができるが、この物質の例はアメリカ合衆国特許第4,897,255号及び第4,965,392号に記載されている。
実施例７に記載するように、2F1のシグナリング（細胞質）ドメインはプロスタグランジンE2合成を促進する生物学的シグナルを伝達する。プロスタグランジンは、特に痛み及び炎症の仲介を含む生物学的効果を示す、天然に存在する長鎖ヒドロキシ脂肪酸である。
本発明の一態様は、プロスタグランジン合成を阻害するために可溶性2F1ポリペプチドを使用することに対するものである。in vivoにおいて、シグナル伝達は、未同定のリガンドが2F1を含む受容体に結合することにより開始され得る。可溶性2F1を哺乳類の動物個体に投与して、このようなリガンドを結合させ、これにより内在性の細胞表面2F1にリガンドが結合するのを阻害する。
可溶性2F1ポリペプチドを哺乳類の動物個体に投与し、プロスタグランジンが介する病気を治療する。ある病気が少なくとも部分的にはプロスタグランジンにより（直接または間接的に）引き起こされるか、あるいは悪化させられたものである場合、その病気を本明細書中ではプロスタグランジンが介すると言う。
このような病気には、関節炎を伴う炎症（特に、リウマチ様関節炎及び骨関節炎）、アレルギーあるいは喘息を伴う肺の炎症、成人呼吸困難症候群、炎症性腸疾患、及び損傷の結果起こる炎症（特に、関節の損傷）が含まれるが、これらに限定されるものではない。発熱、バーター症候群、糖尿病、動脈管開存症、及び月経困難症を治療するためにプロスタグランジンを阻害することの望ましさについては、Harrisons's Principles of Internal Medicine，13th Edition，Vol．1（Isselbacher et al．，Eds.，McGraw-Hill，Inc．New York，1994，pp 433-435）で検討されている。
プロスタグランジンE2（PGE2）は、リウマチ様関節炎及び歯周疾患を伴う骨吸収を含む骨吸収にも関係づけられている（上記Isselbacher et al．，Eds．の434ページ）。PGE2は血管透過性の亢進を引き起こすと報告されてきたが、これは、局所の浮腫を引き起こし得る炎症応答の一局面である（上記Isselbacher et al．，Eds．の435ページ）。プロスタグランジン及び炎症におけるその役割について、Pathophysiolosy：Clinical Concepts of Disease Processes，3rd Edition（Price and Wilson，Eds.，McGraw-Hill Book Company，New York，1986，pp 36-38）及びInflammation：Basic Principles and Clinical Correlates，Second Edition（Galin et al．，Eds.，Raven Press，New York，1992）でさらに検討されている。
プロスタグランジンは免疫応答の調節に機能を果たすと示唆されてきた。例えば、PGE2はマイトジェンによって誘導されるヒトリンパ球の刺激を抑制し得る。従って、細胞性免疫の低下が少なくとも部分的にはプロスタグランジンの作用のためであると考えられる患者においては、PGE2を抑制することが有益であり得る（上記Isselbacher et al．，Eds．の435ページ参照）。血管新生におけるPGE1及びPGE2の機能も示されてきた。
2F1のシグナリングドメインが転写因子NF-κBの活性化を引き起こすシグナルを伝達したことは、注目すべきことである（実施例５参照）。ある種の薬物（糖質コルチコイド）の抗炎症効果は、少なくとも部分的にはNF-κB活性化の阻害のためであると信じられている（Auphan et al．，Science 270：286-290，1995；Marx，Sceience 270：232-233，1995）。従って、2F1を介して伝達されるNF-κB活性化シグナルを阻害するのに可溶性2F1ポリペプチドを用いることができる。
NF-κBの活性化は、TNFによって誘導されるヒト免疫不全ウイルス（HIV）の、Ｔ細胞を含む感染細胞中での複製と結び付けられてきた（Howard et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90：2335-2339，1993）。2F1はＴ細胞上に発現しており、NF-κB活性化シグナルは2F1シグナリングドメインによって伝達される。従って、可溶性2F1を使用して、HIV感染細胞中でHIV発現を減少させることができる。2F1を介するシグナルの結果起こるNF-κB活性化を阻害するために、効果的な量の可溶性2F1をin vivoで投与する。このようなNF-κB活性化の結果起こったであろう、あらゆるHIV複製をこのようにして減少させる。
2F1の多量体型
2F1を含む二量体、三量体、あるいはさらに高度のオリゴマーなどのオリゴマーが本発明に包含される。このようなオリゴマーは、天然に存在し得るか、または組換えDNA技術などの方法によって作出され得る。
オリゴマーの中の2F1部分は、可溶性2F1ポリペプチドであり得る。ある態様において、オリゴマーは２つから４つの2F1ポリペプチドを含む。
オリゴマーは、例えば異なる2F1ポリペプチド上のシステイン残基間のジスルフィド結合、あるいは2F1ポリペプチド鎖間の非共有結合性相互作用により、形成され得る。他の態様においては、オリゴマーは、2F1ポリペプチドに融合したペプチド部分間の共有結合性または非共有結合性相互作用を介して結合する、複数の2F1ポリペプチドを含む。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、あるいはオリゴマーを促進する特性を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパー及び抗体に由来するある種のポリペプチドは、以下により詳細に記載するように、それに結合する2F1ポリペプチドのオリゴマーを促進し得るペプチドの１つである。
抗体由来のポリペプチド（Fcドメインを含む）の様々な部分に融合する異種のポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えばAshkenaziら（PNAS USA 88：10535，1991）；Byrnら（Nature 344：677，1990）；及びHollenbaughとAruffo（”Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”in Current Protocols in Immunology，Suppl．4，pages 10.19.1-10.19.11，1992）に記載されている。本発明の一態様においては、抗体（IgG1）のFc領域に2F1を融合させることにより、2F1二量体を作り出す。Fcポリペプチドは、好ましくは可溶性2F1のＣ末端と融合する。2F1/Fc融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。組換え発現ベクターにて形質転換しほぼ同じような抗体分子を組み立てるのようにさせた宿主細胞中で、2F1/Fc融合タンパク質を発現させるが、その際、鎖間ジスルフィド結合がFcポリペプチド間に形成され二価の2F1ができる。例えば、Fc部分を結合するプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの常法により、望ましい二量体を回収し得る。
本明細書中で使用されている場合、“Fcポリペプチド”という用語は、抗体のFc領域に由来するポリペプチドの天然及び変異形を含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含むこのようなポリペプチドの、短縮された形も含まれる。適したFcポリペプチドの一つが、本明細書中で参考文献として援用されるPCT出願WO93/10151に記載されている。このFcポリペプチドはＮ末端のヒンジ領域から天然のＣ末端まで及ぶ一本鎖ポリペプチドである（すなわち、本質的には完全長抗体のFc領域である）。別の有用なFcポリペプチドは、アメリカ合衆国特許第5,457,035号に記載されている。変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸19がLeuからAlaに変えられ、アミノ酸20がLeuからGluに変えられ、そしてアミノ酸22がGlyからAlaに変えられたこと以外は、WO93/10151に示す天然のFc配列のものと一致する。この変異体FcはFc受容体に対して減少した親和性を示す。FcあるいはFc変異体ポリペプチドを含む融合タンパク質を調製する手順はBaumらにさらに記載されている（EMBO J．13：3992-4001，1994）。
他の態様においては、抗体の重鎖あるいは軽鎖の可変部のかわりに2F1を用い得る。もし融合タンパク質が抗体の重鎖及び軽鎖の両方で作られているなら、４つもの2F1細胞外領域によって2F1オリゴマーを形成することが可能である。
オリゴマー2F1を調製する別の方法は、ロイシンジッパーの利用に関する。ロイシンジッパードメインは、それが見いだされるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。もともとはいくつかのDNA結合タンパク質中に同定されたものだが（Landschulz et al．，Science 240：1759，1988）、ロイシンジッパーはそれ以来様々なタンパク質の種類に見いだされてきた。有名なロイシンジッパーの一つに、二量体化あるいは三量体化する、天然に存在するペプチド及びその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例には、PCT出願WO94/10308に記載のものがある。都合よく三量体を形成するペプチドには、例えば、本明細書中で参考文献として援用されるHoppeら（FEBS Letters 344：191，1994）及びアメリカ合衆国特許出願第08/446,922号に記載されている、肺界面活性プロテインＤ（SPD）に由来するロイシンジッパーが含まれる。ロイシンジッパーペプチドに融合させた可溶性2F1ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を、適した宿主細胞に発現させ、その結果形成される可溶性オリゴマー2F1を培養上清から回収する。
さらなる選択としては、2F1部分間にペプチドリンカーによりまたはそれによらずに、組換え融合タンパク質として、オリゴマー2F1を発現させ得る。適したペプチドリンカーはこの技術分野では既知で、常法に従って使用され得る。適したペプチドリンカーの一つに、本明細書中で参考文献として援用されるアメリカ合衆国特許第4,751,180号及び第4,935,233号に記載されているものがある。あらゆる適した常法を用いて、望ましいペプチドリンカーをコードするDNA配列を、2F1をコードするDNA配列の中に同じ読み枠で挿入し得る。一態様においては、２つの可溶性2F1ポリペプチドをペプチドリンカーで結合させている。
上に記載のオリゴマーをタンパク質精製の常法にて精製し得る。例えば、2F1に対する抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。抗体由来のFcポリペプチドを含む多量体オリゴマーを、Fc部分と結合するプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにて精製し得る。
本発明は、免疫グロブリン由来のポリペプチドと融合した2F1ポリペプチドをコードする、単離されたDNA配列を提供する。このようなDNA配列は、例えば、抗体のFc領域のポリペプチドと融合した可溶性2F1をコードし得る。複数の2F1ポリペプチド部分を含む融合タンパク質をコードするDNA配列も、本発明に包含される。
2F1を含む組成物
本発明は、効果的な量の精製2F1ポリペプチド、及び適した希釈剤、賦形剤あるいは担体を含む組成物（薬剤組成物を含む）を提供する。好ましくはin vivoで投与される2F1ポリペプチドは、薬剤組成物の形態である。
本発明の組成物は、オリゴマー、変異体、誘導体及び生物学的に活性な断片を含む、本明細書中で記載のあらゆる形態で2F1タンパク質を含み得る。本発明の一態様において、この組成物は可溶性ヒト2F1タンパク質を含む。
薬学的に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法に従って、2F1タンパク質を処方し得る。薬剤の製剤中で一般的に用いられる成分には、Remington's Pharmaceutical Sciences，16th ed．（1980，Mack Publishing Company）に記載のものが含まれる。
好ましくは薬剤組成物中で用いられる2F1タンパク質は、2F1タンパク質が天然あるいは内在性起源の他のタンパク質を実質的に含まないように精製され、好ましくはタンパク質重量にして約１％以下の、産生過程で残留する混入物を含む。しかし、このような組成物は、安定剤、担体、賦形剤あるいは補助治療剤として加える他のタンパク質を含み得る。
この組成物の成分は、用いる用量及び濃度では患者に対して毒性が無いだろう。通例、このような組成物の調製には、哺乳類の2F1ポリペプチドあるいはその誘導体と、緩衝液、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約10残基以下の）ペプチド、タンパク質、アミノ酸、ブドウ糖、ショ糖、あるいはデキストランを含む炭水化物、EDTAなどのキレート剤、グルタチオン、あるいは他の安定剤及び賦形剤とを組み合わせることを伴う。中性に緩衝した塩類溶液は、適した希釈剤の一つである。
治療上の使用として、適応症状及び患者に対して適した方法及び用量にてこの組成物を投与する。連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、あるいは静脈内投与を含むがそれらに限定されない、あらゆる適した経路にて投与し得る。
2F1に特異的に結合する抗体
抗体を作りだすのに、本発明の2F1タンパク質あるいはその免疫原性断片を用い得る。従って、本発明は2F1に特異的に結合する抗体、すなわち（非特異的結合とは対照的に）抗体の抗原結合部位を介して2F1に結合する抗体を提供する。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を常法にて調製し得る。例えばMonoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biologocal Analyses（Kennet et al．（eds．），Plenum Press，New York（1980））；及びAntibodies：A Laboratory Manual（Harlow and Land（eds．），Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，（1988））参照。2F1と免疫反応性を持つモノクローナル抗体の作出は、以下の実施例８にてさらに例証する。
常法を用いて作出され得る、このような抗体の抗原結合断片も本発明に包含される。このような断片の例には、Fab、F(ab')、及びF(ab')2断片が含まれるが、これらに限定はされない。遺伝子工学的手法によって作出される抗体の断片及び誘導体をも提供する。
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えばマウスモノクローナル抗体のヒト化版などが含まれる。このようなヒト化された抗体は既知の手法によって調製され、ヒトに抗体を投与する際に免疫原性が低下しているというメリットを示す。一態様において、ヒト化されたモノクローナル抗体はマウス抗体の可変領域（あるいはその抗原結合部位だけ）及びヒト抗体に由来する定常領域を含む。あるいは、ヒト化された抗体断片はマウスモノクローナル抗体の抗原結合部位及びヒト抗体に由来する（抗原結合部位を欠いている）可変領域を含み得る。キメラ及びさらに処理したモノクローナル抗体には、Riechmannら（Nature 332：323，1988）、Liuら（PNAS 84：3439，1987）、Larrickら（Bio/Technology 7：934，1989）、及びWinterとHarris（TIPS 14：139，May，1993）に記載のものが含まれる。
この抗体の利用の一つに、2F1ポリペプチドの存在を検出するためのin vitroあるいはin vivoのいずれかのアッセイにおける利用がある。この抗体は免疫アフィニティークロマトグラフィーにて2F1を精製するのにさらに有用である。さらに2F1を介する生物学的シグナルの伝達を阻害し得るような抗体を使用して、このようなシグナル伝達が仲介する生物活性を阻害することができる。このようにして、2F1を介するシグナリングによって（直接あるいは間接的に）仲介あるいは悪化させられる異常が治療される。ある治療法は、2F1が介する望ましくない生物活性を阻害するのに効果的な量の抗体をin vivoで投与することに関する。このような抗体を投与してプロスタグランジン合成を阻害することができ、それにより例えば上に記載のプロスタグランジンが仲介する異常の１つを治療する。
2F1に対する抗体、及び適した希釈剤、賦形剤あるいは担体を含む薬剤組成物を、本明細書中で提供する。このような組成物の適した成分は、2F1タンパク質を含む組成物として上に記載する通りである。
上に記載の抗体を結合させた診断用（検出可能）物質あるいは治療剤を含む複合体を、本明細書中で提供する。一態様において、この物質は放射性核種あるいは薬物である。これらの物質を抗体と結合させる手法はよく知られている。
発現システム
本発明は、2F1の発現のための組換え発現システム、及び発現ベクターにて形質転換した宿主細胞を提供する。あらゆる適した発現システムを用い得る。ベクターは、例えば哺乳類、微生物、ウイルス、あるいは昆虫の遺伝子に由来するような適した転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に、作用可能に連結している2F1 DNA配列を含む。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、mRNAのリボソーム結合部位、及び転写と翻訳の開始及び終了を制御する適切な配列が含まれる。調節配列が2F1 DNA配列と機能的に関連している場合、ヌクレオチド配列は作用可能に連結している。従って、もしあるプロモーターが2F1 DNA配列の転写を制御しているなら、そのプロモーターは2F1 DNA配列に作用可能に連結している。望ましい宿主細胞中での複製能を与える複製開始点及び、形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般には発現ベクターに組み入れられている。
加えて、2F1遺伝子にはもともと備わっていない、適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターに組み入れ得る。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）に対応するDNA配列を、2F1配列の5'末端にインフレームで融合させ得る。意図する宿主細胞内で機能するシグナルペプチドは、2F1ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。細胞から2F1が分泌される際にはシグナルペプチドは2F1ポリペプチドから切断される。
2F1ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核細胞、酵母あるいはより高等な真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳類細胞宿主とともに使用するのに適切なクローニング及び発現ベクターは、例えばPouwelsらのCloning Vectors：A Laboratory Manual（Elsevier，New York，（1985））などに記載されている。無細胞翻訳システムを用いて、本明細書中に開示されているDNA構築物に由来するRNAを用いて2F1ポリペプチドを作出することができる。
原核細胞には、例えば大腸菌や桿菌などのグラム陰性あるいはグラム陽性生物が含まれる。形質転換に適した原核宿主細胞には、例えば大腸菌、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、及び一般のシュードモナス属、ストレプトミセス属及びブドウ球菌属の中の他の様々な種が含まれる。大腸菌などの原核宿主細胞内では、2F1ポリペプチドは、原核宿主細胞内での組換えポリペプチドの発現を促進するＮ末端のメチオニン残基を含み得る。Ｎ末端のMetは発現した組換え2F1ポリペプチドから切断され得る。
原核宿主細胞内で使用するための発現ベクターは、一般には表現型の選択が可能なマーカー遺伝子を一つあるいはそれ以上含む。表現型の選択が可能なマーカー遺伝子は、例えば抗生物質への耐性を与える、あるいは独立栄養要求物を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、クローニングベクターpBR322（ATCC 37017）などの商業的に入手可能なプラスミドに由来するものがある。pBR322はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、従って形質転換された細胞を同定する簡単な手段を提供する。適切なプロモーター及び2F1 DNA配列がpBR322ベクターに挿入されている。
組換え原核宿主細胞の発現ベクターに一般的に用いられるプロモーター配列には、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーターシステム（Chang et al．，Nature 275：615，1978；及びGoeddel et al．，Nature 281：544，1979）、トリプトファン（trp）プロモーターシステム（Goeddel et al．，Nucl．Acids Res．8：4057，1980；及びEP-A-36776）及びtacプロモーター（Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，p．412，1982）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現システムは、ファージλPLプロモーター及びcI857ts易熱性リプレッサー配列を用いている。λPLプロモーターの誘導体を組み込んだ、American Type Culture Collectionから入手可能なプラスミドベクターには、プラスミドpHUB2（大腸菌株JMB9（ATCC 37092）に内在）及びpPLc28（大腸菌RR1（ATCC 53082）に内在）が含まれる。
あるいは、酵母宿主細胞、好ましくはSaccharomyces属（例えばS．cerevisiae）に由来する細胞に2F1を発現させ得る。Pichia属あるいはKluyveromyces属などの酵母の他の属も用い得る。酵母ベクターにはしばしば２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ARS）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択可能なマーカー遺伝子が含まれるだろう。
酵母ベクターに適したプロモーター配列には、他に、メタロチオネイン、3-フォスフォグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al．，J．Biol．Chem．255：2073，1980）あるいは、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、フォスフォフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-フォスフォグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フォスフォグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Hess et al．，J．Adv．Enzyme Reg．7：149，1968；及びHolland et al．，Biochem．17：4900，1978）に対するプロモーターが含まれる。酵母発現で使用するのに適した他のベクター及びプロモーターは、Hitzeman，EPA-73,657にてさらに記載されている。別の選択肢は、Russellら（J．Biol．Chem．258：2674，1982）及びBeierら（Nature 300：724，1982）に記載のグルコース抑制可能なADH2プロモーターである。大腸菌中での選択及び複製のためのpBR322由来のDNA配列（Ampr遺伝子及び複製起点）を、上に記載の酵母ベクターに挿入することにより、酵母及び大腸菌の両方で複製できるシャトルベクターを構築することができる。
酵母α-因子のリーダー配列を用いて2F1ポリペプチドの分泌を管理できる。α-因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入される。例えばKurjan et al．，Cell 30：933，1982；Bitter et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81：5330，1984；アメリカ合衆国特許第4,546,082号；及びEP 324,274参照。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適した他のリーダー配列は、当業者には既知である。リーダー配列を、その3'末端の近傍で修飾して一つあるいはそれ以上の制限部位を含むようにし得る。これにより、リーダー配列と構造遺伝子の融合が容易になるだろう。
酵母形質転換のプロトコールは、当業者には既知である。このようなプロトコールの一つが、Hinnenら（Proc Natl．Acad．Sci．USA 75：1929，1978）に記載されている。Hinnenらのプロトコールでは、Trp+形質転換体を選択培地中で選別するが、この場合、選択培地は0.67％酵母窒素塩基、0.5％カザミノ酸、２％グルコース、10μg/mlアデニン及び20μg/mlウラシルを含む。
ADH2プロモーター配列を含むベクターにて形質転換した酵母宿主細胞を、発現を誘導するために“栄養豊富な（rich）”培地にて培養し得る。栄養豊富な培地の例として、80μg/mlアデニン及び80μg/mlウラシルを補充した、１％酵母抽出物、２％ペプトン、及び１％グルコースを含むものがある。ADH2プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地中から使い果たされたときに起こる。
哺乳類あるいは昆虫宿主細胞システムを使用して、組換え2F1ポリペプチドを発現することができる。異種タンパク質を昆虫細胞にて産生させるためのバキュロウイルスシステムが、LuckowとSummers（Bio/Technology 6：47（1988））により総説されている。哺乳類由来の確立されている細胞株も使用し得る。適した哺乳類宿主細胞株の例には、サル腎細胞由来のCOS細胞（例えば、ATCC CRL 1650のCOS-1細胞株あるいは、ATCC CRL 1651のCOS-7細胞株、Gluzman et al．，Cell 23：175，1981）、Ｌ細胞、C127細胞、3T3細胞（ATCC CCL 163）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、及びBHK（ATCC CRL 10）細胞株、及びMcMahanら（EMBO J．10：2821，1991）に記載されているようにアフリカミドリザル腎細胞株CVI（ATCC CCL 70）から得たCV-1/EBNA-1細胞株が含まれる。
哺乳類宿主細胞発現ベクター用の転写及び翻訳制御配列を、ウイルスゲノムから切り出し得る。一般的に用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス40（SV40）、及びヒトサイトメガロウイルスから得られる。例えばSV40起点、前期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位などのSV40のウイルスゲノムに由来するDNA配列を用いて、哺乳類宿主細胞中で構造遺伝子配列を発現させるための他の遺伝子エレメントを提供することができる。ウイルスの前期及び後期プロモーターは、両者ともウイルスの複製起点も含み得る断片としてウイルスゲノムから容易に得られるため、特に有用である（Fiers et al．，Nature 273：113，1978）。もし、SV40ウイルス複製起点部位内に位置する、Hind III部位からBgl Ｉ部位まで及ぶおよそ250bpの配列が含まれるならば、より小さなあるいはより大きなSV40断片も用い得る。
哺乳類宿主細胞中で使用するための発現ベクターは、OkayamaとBerg（Mol．Cell．Biol．3：280，1983）に開示されているように構築し得る。哺乳類cDNAがC127マウス乳上皮細胞中で安定で高水準に発現するのに有用なシステムは、実質的にCosmanら（Mol．Immunol．23：935，1986）に記載されているように構築し得る。Cosmanら（Nature 312：768，1984）に記載の有用な高発現ベクターであるPMLSVN1/N4は、ATCC 39890として寄託された。さらなる哺乳類発現ベクターには、pDC406（McMahan et al．，EMBO J．10：2821，1991）；HAV-EO（Dower et al．，J．Immunol．142：4314，1989）；pDC201（Sims et al．，Science 241：585，1988）；pDC302（Mosley et al．，Cell，59：335，1989）；及びアメリカ合衆国特許第5,350,683号に記載のものがある。他の適したベクターは、レトロウイルスから得ることができる。
天然のシグナル配列の代わりに、アメリカ合衆国特許第4,965,195号に記載のインターロイキン-7（IL-7）に対するシグナル配列；Cosman et al．，Nature 312：768（1984）に記載のインターロイキン-2受容体に対するシグナル配列；EP 367,566に記載のインターロイキン-4受容体シグナルペプチド；アメリカ合衆国特許第4,968,607号に記載のＩ型インターロイキン-1受容体シグナルペプチド；及びEP 460,846に記載のII型インターロイキン-1受容体シグナルペプチドなどの、異種シグナル配列を加え得る。
核酸及びその利用
本明細書中で開示する、2F1をコードするDNAは上で議論するように2F1ポリペプチドの作出に有用である。SEQ ID NO:1及び３に示すDNAと相補的なDNA及びRNAを、その一本鎖及び二本鎖の両方の形態も加えて、本明細書中で提供する。本明細書中で示す2F1ヌクレオチド配列の断片も有用である。このような断片は、SEQ ID NO:1あるいはSEQ ID NO:3に示す配列及びそれに相補的なもののうち、望ましくは少なくともおよそ17個連続したヌクレオチドを含む。
このような2F1核酸（断片を含む）の利用の一つがプローブとしての利用である。このようなプローブを種間交差ハイブリッド形成の手順に用いて、別の哺乳類の種から2F1 DNAを単離し得る。一例として、2F1の細胞外ドメインに対応するプローブを用い得る。このプローブは、in vitroアッセイ及び、ノーザン及びサザンブロットなどの手順にて2F1核酸の存在を検出するのにも利用される。2F1を発現する細胞の種類を同定し得る。このような手順はよく知られており、当業者は特定の意図する応用に応じて、適した長さのプローブを選択し得る。プローブは常法にて標識（例えば32Pを用いて）できる。
2F1核酸断片はプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）にも利用される。望ましい2F1DNAの末端に対応する5'及び3'プライマーを、従来からのPCRの手法を用いてこのDNAを単離し、増幅するのに使用し得る。
他の有用な2F1核酸の断片は、標的とする2F1 mRNA（センス）あるいは2F1 DNA（アンチセンス）に結合できる一本鎖核酸配列（RNA、DNAのいずれか）を含む、アンチセンスあるいはセンスオリゴヌクレオチドである。本発明に従い、アンチセンスあるいはセンスオリゴヌクレオチドは、2F1 cDNAのコーディング領域の断片を含む。このような断片は一般的には、少なくとも約14個、好ましくは約14から約30個のヌクレオチドを含む。特定のタンパク質に対応するcDNA配列に基づき、アンチセンスあるいはセンスオリゴヌクレオチドを作り出す能力については、例えばSteinとCohen（Cancer Res．48：2659，1988）及びvan der Krolら（BioTechniques 6：958，1988）に記載されている。
アンチセンスあるいはセンスオリゴヌクレオチドが標的とする核酸配列に結合すると、二本鎖（duplex）の分解促進、転写あるいは翻訳の成熟前終結を含むいくつかの方法のうちの１つによって、あるいは他の方法によって、翻訳（RNA）あるいは転写（DNA）を阻害する二本鎖を形成することになる。このようにして、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて2F1タンパク質の発現を阻害し得る。
アンチセンスあるいはセンスオリゴヌクレオチドは、修飾を加えた糖-フォスフォジエステル骨格（あるいは、WO91/06629に記載のものなどの他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、この場合、このような糖結合は内在性ヌクレアーゼに耐性である。耐性な糖結合を有するこのようなオリゴヌクレオチドはin vivoで安定（例えば、酵素的分解に耐えられる）だが、標的とするヌクレオチド配列に結合することができるという配列特異性は保持している。センスあるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、WO 90/10448に記載されているような有機構造、及び標的とする核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する、ポリ-（L-リジン）などの他の構造と共有結合しているオリゴヌクレオチドが含まれる。さらに、エリプティシンなどの挿入剤、及びアルキル化剤あるいは金属錯体をセンスあるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、標的とするヌクレオチド配列に対するアンチセンスあるいはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾し得る。
例えばCaPO4が介するDNA導入、エレクトロポレーションを含むあらゆる遺伝子移入方法によって、あるいはEpstein-Barrウイルスなどの遺伝子移入ベクターを用いて、アンチセンスあるいはセンスオリゴヌクレオチドを標的とする核酸配列を含む細胞に導入し得る。好ましくは、アンチセンスあるいはセンスオリゴヌクレオチドを適したレトロウイルスベクターに挿入し、それからその細胞を挿入配列を含むレトロウイルスベクターとin vivoあるいはex vivoのいずれかで接触させることによって、標的とする核酸配列を含む細胞にアンチセンスあるいはセンスオリゴヌクレオチドを導入する。適したレトロウイルスベクターにはマウスレトロウイルスM-MuLV、N2（M-MuLV由来のレトロウイルス）由来のもの、あるいはDCT5A、DCT5B及びDCT5Cという名の二倍コピーベクター（PCT出願WO90/13641参照）が含まれるが、これらに限定はされない。
WO 91/04753に記載されているようにリガンド結合分子と複合体を形成することによって、標的とする核酸配列を含む細胞にセンスあるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することもできる。適したリガンド結合分子には、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、あるいは細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定はされない。
あるいは、WO 90/10448に記載されているようにオリゴヌクレオチド-脂質複合体を形成することによって、標的とする核酸配列を含む細胞にセンスあるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し得る。センスあるいはアンチセンスオリゴヌクレオチド-脂質複合体は、好ましくは、内在性のリパーゼによって細胞内で解離される。
特定の態様を説明するのに以下の実施例を提供するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１
ヒト2F1をコードするcDNAの単離
ヒト2F1 DNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）にて単離した。反応に用いたプライマーは、Ｉ型IL-1Rの細胞質ドメイン内の２つの領域に基づく縮重オリゴヌクレオチドであった。これらの２つの領域はIL-1受容体ファミリー内で保存されているモチーフの１つである。
始めに、縮重プライマーを用いるPCR増幅に適切な条件を、ヒト及びマウスＩ型IL-1受容体及びマウスT1/ST2のcDNAクローンを鋳型として用いて決定した。これらのcDNAのそれぞれから増幅産物を得るために決定した条件を用い、500kbのヒト酵母人工染色体（YAC）を鋳型として用いてPCRを行った。CO2133と呼ばれるこのYACはヒト染色体2q12領域由来のDNAを含み、Ｉ型IL-1受容体、II型Il-1受容体の一部、及びST2を含むことがわかっている（Sims et al．，Cytokine 7：483-490，1995）。
ポリメラーゼ連鎖反応（20μl）では、Taq（Perkin-Elmer）及びVent（New England Biolabs）DNAポリメラーゼの16：１の混合液0.5μlを用い、200pmoleの各プライマー、200μMのdNTPs及びパルスフィールドゲルから抽出することにより部分精製した5-10μlのヒトYAC C02133 DNAを含んだ。サイクル条件は次の通りであった。すなわち、94℃にて５分、この間にDNAポリメラーゼ混合液を加えた；（94℃にて１分、35℃にて３分、72℃にて１分）を40サイクル；続いて72℃にて10分である。反応生成物を低融点アガロースゲル上の電気泳動にて分離した。長さにして90から150bpまでの物質を含むバンドを切り出し、融かし、５μlを２度目のPCRの際に鋳型として用いた。２度目の反応は、20サイクルだけ実行したことを除き、１度目と同様に行った。反応生成物をアガロースゲル上の電気泳動にて分離した。90-150bpの画分を溶出し、DNAをT4 DNAポリメラーゼにて平滑末端に変え、T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化し、10分間65℃で温め、エタノール沈殿し、制限酵素SrfIの存在下pCRScriptと呼ばれるベクター（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA）にライゲーションした。
大腸菌DH10細胞をライゲーション産物で形質転換した。白色のコロニーをXgalプレートから拾い、ベクタープライマーを用いてインサートをPCRで増幅し、ナイロンフィルターに少量をスポットした。続いてそのフィルターを、ヒト及びマウスＩ型IL-1Rに由来する32P標識したオリゴヌクレオチドプローブの混合物と、水溶性条件下、42℃にてハイブリッド形成させた。フィルターを0.3M NaCl中、50℃で洗った。このように、ハイブリッド形成は比較的低い厳しさの条件下で行った。
180のインサートのうち５つだけがハイブリッド形成した。ハイブリッド形成しなかったインサートのうちの９つを無作為にDNA配列決定したところ、それらが酵母DNAに由来することがわかった。ハイブリッド形成したインサート５つのうちの１つは強いハイブリッド形成シグナルを与え、DNA配列決定したところ、それはＩ型IL-1R遺伝子から増幅されたものであることがわかった。弱くハイブリッド形成したインサート４つのうち、３つは酵母DNAに由来し、１つは新規遺伝子であるとわかり、それを2F1と名付けた。
このようにして単離した2F1 DNA断片を用いて、完全長cDNAクローンの単離を試み、ヒト末梢血リンパ球（PBL）から調製したcDNAライブラリーをプローブした。ハイブリッド形成するクローンを同定し、PBLライブラリーから2F1 cDNAクローンを３つ単離した。ヒト上皮性カルシノーマ株KB（ATCC CCL 17）から、さらに2F1クローン４つをPCRにて単離した。
これらのクローンの配列決定することにより、ヒト2F1 DNA配列を解明した。コーディング領域のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:1に示し、それによりコードされるアミノ酸配列をSEQ ID NO:2に示す。SEQ ID NO:2のタンパク質はＩ型膜貫通タンパク質であり、Ｎ末端のシグナルペプチド（アミノ酸-19から-1）、続いて細胞外ドメイン（アミノ酸１から329）、膜貫通領域（アミノ酸330から351）及び細胞質ドメイン（アミノ酸352から541）を持つ。アラニン298に対応するコドンは遺伝的多型であって、PBLクローン及びKBクローンのうちの２つにはあるが、他のKBクローン２つにはない。
実施例２：マウス2F1 cDNAの単離
マウス2F1をコードするcDNAを、以下のように種間交差ハイブリッド形成によって単離した。胸腺腫細胞株EL4（ATCC TIB 39）のサブクローンである、EL46.1と呼ばれる細胞株（MacDonald et al．，J．Immunol．135：3944，1985）に由来するマウスcDNAライブラリーをスクリーニングするプローブとして、ヒト2F1 cDNAを用いた。ハイブリッド形成するクローンを単離した。このマウス2F1 cDNAのヌクレオチド配列及びそれによってコードされるアミノ酸配列を、SEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:4に示す。
SEQ ID NO:4のタンパク質はシグナルペプチド（アミノ酸-18から-1）、細胞外ドメイン（アミノ酸１から307）、膜貫通領域（アミノ酸308から330）、細胞質ドメイン（アミノ酸331から519）を含む。SEQ ID NO:4のマウス2F1アミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示すヒト2F1アミノ酸配列と65％一致する。
実施例３：結合アッセイ
上で述べたように、2F1はIL-1受容体ファミリーの一員である。2F1の細胞外ドメインはＩ型及びII型IL-1受容体のものと類似しているため、2F1の、IL-1ファミリーの構成分子に結合する能力を以下のように調べた。
IL-1α及びIL-1β（March et al．，Nature（Lond．）315：641，1985）だけでなく、IL-1受容体アンタゴニストタンパク質（Eisenberg et al．，Nature 343：341，1990；Hannum et al．，Nature 343：336，1990；及びCarter et al．，Nature 344：633，1990）に結合する能力についても、2F1を調べた。IL-1受容体アンタゴニスト（IL-1ra）はIL-1受容体に結合するが、シグナルを伝達しない。内在性のIL-1受容体への結合をIL-1と競合することによって、IL-1raはIL-1が仲介する生物学的効果を阻害する。
ヒトIgG1のFc領域と結合したヒト2F1細胞外ドメインを含む、2F1/Fcと呼ばれる可溶性融合タンパク質を、Baumら（EMBO J．13：3992-4001，1994）に記載されているのと類似する手順により作り出した。Fc領域のペプチドと融合させたＩ型IL-1Rの細胞外ドメインを含む、可溶性Ｉ型IL-1R/Fc融合タンパク質を陽性対照として用いるために調製した。
BIAcoreバイオセンサー（Pharmacia Biosensor AB，Piscataway，New Jersey）を用いて、ヒト2F1/Fc融合タンパク質に対するIL-1リガンドの結合を、本質的にはArendら（J．Immunol．153：4766-4774，1994）に記載されているような手順を使用して調べた。概略すると、ハイドロゲルチップのデキストランマトリックスに共有結合した、Fc領域に対するヤギ抗ヒトIgG血清（Jackson Immunoresearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA）を用いて、ヒト2F1/Fcタンパク質をとらえた。このようにして2F1/Fc融合タンパク質をBIAcoreチップ上に固定化した。いくつかの異なる濃度３つのIL-1リガンドを、とらえられたタンパク質と反応させ、単位面積あたりの重量の経時変化を測定した。
ヒトＩ型IL-1R/Fc融合タンパク質（陽性対照）に対するヒトIL-1α、IL-1β及びI1-1raの結合を容易に測定できることが、バイオセンサー分析により示された。しかし、2F1/Fc融合タンパク質に対するこの３つのIL-1タンパク質のいずれかの結合は全く検出されなかった。従って、配列上の著しい相同性にもかかわらず、2F1はIL-1受容体ではない。
実施例４：ノーザンブロット分析
様々な種類の細胞における2F1 mRNAの存在を、標準的な方法を用いてノーザンブロット分析により調べた。各レーンに２mgのヒトポリA+RNAを含む、Clontech，Palo Alto，Californiaより購入したNorthen blotsを32P標識アンチセンス2F1リボプローブを用いて、一晩、63℃、0.75M NaCl/50％フォルムアミド中でプローブし、63℃にて0.3M NaCl中で洗った。ロードの均一性およびrRNA除去の有効性を確認するために、フィルターを十分GAPDH及び28S rRNAについてプローブした。
28S rRNAと一緒に、あるいはそれよりわずかに速く移動する、ハイブリッド形成する単一のバンドが、脾臓、胸腺、白血球、肝臓、肺、心臓、小腸及び大腸、前立腺、及び胎盤に見いだされた。精巣及び卵巣に弱いシグナルが見られた可能性があるが、はっきりとはしない。ハイブリッド形成するバンドは、脳、骨格筋、腎臓及び膵臓では検出されなかった。
実施例５：シグナリングアッセイ
2F1細胞質ドメインのシグナル伝達能を以下のアッセイにて調べた。マウスＩ型IL-1受容体（IL-1RI）の細胞外及び膜貫通部分をヒト2F1の細胞質ドメインと融合させた、キメラ受容体をコードする発現ベクターを構築した。このベクターは、ヒト2F1のアミノ酸332から522と融合させたマウスIL-1RIのアミノ酸１から362をコードする。この構築物を調製する際、膜貫通領域のすぐ3'側でマウスIL-1RI DNAにBglII部位を導入した。この結果、マウスIL-1RIの位置361のバリンがイソロイシンに変えられたが、イソロイシンはヒトIL-1RIのこの位置にあるアミノ酸である。
キメラ受容体を使用することにより、既知のリガンド（IL-1）に対する応答をアッセイすることが可能になった。IL-1RIを発現する細胞がIL-1αあるいはIL-1βと接すると、転写因子NF-κBの核内局在の亢進を含む、数々の応答が誘導される（Thanos，D．and T．Maniatis，Cell 80：529-532，1995）。活性化されたNF-κB複合体は核に局在し、共通認識配列に結合する。
キメラ受容体をCOS-7細胞（ATCC CRL 1651）に発現させ、転写因子NF-κBを活性化するIL-1の能力を、NF-κBゲルアッセイにて調べた。ヒツジ抗ヒトIL-1RIポリクローナル抗血清（本明細書中ではP3と呼ぶ）を用いて、内在性の（交差反応性をもつ）サルIL-1Rを、導入したマウスIL-1RI/2F1キメラへのIL-1の結合には影響せずに阻害した。マウスIL-1RIの細胞外及び膜貫通部分をコードするが細胞質ドメインをコードしない発現ベクターを導入したCOS-7細胞を、陰性対照として用いた。陽性対照として、完全長のマウスIL-1RIをコードする発現ベクターをCOS-7細胞に導入した。
アッセイの手順は以下の通りである。COS-7細胞に受容体構築物を導入した。導入後２日目に細胞を阻害抗体にて処理し、ヒトIL-1αにて刺激した（30分、１ng/ml）。阻害及びIL-1刺激の直後に、本来Ostrowskiら（J．Biol．Chem．266：12722-33，1991）に記載されているように、核抽出物を細胞試料から調製した。免疫グロブリンκ軽鎖に由来するκBエンハンサーエレメントを含む二本鎖の合成オリゴヌクレオチドプローブを、［γ-32P］ATPでリン酸化することにより5'末端標識した。核抽出物（10μg）を32P標識したプローブと室温で20分間インキュベートし、そのあとタンパク質-DNA複合体を0.5 X TBE 10％ポリアクリルアミドゲル（Novex）中で電気泳動して解離させた。DNAと複合体を形成しているNF-κBは、NF-κB活性化を示す。
IL-1刺激に対してキメラ受容体分子が応答する際に、2F1細胞質ドメインはNF-κB DNA結合能を誘導することがわかった。この誘導は、マウスIL-1RI（陽性対照）を経由して仲介される誘導に大きさの点では匹敵した。
実施例６：シグナリングアッセイ
2F1のシグナリング能を、さらにインターロイキン-8（IL-8）プロモーター活性化アッセイにて調べた。Ｉ型IL-1Rを発現する細胞がIL-1と接すると、IL-8遺伝子の転写が亢進する（Mukaida et al．，J．Biol．Chem．265：21128-33，1990）。既知のリガンド（IL-1）に対する応答を調べられるように、実施例５に記載のIL-1R/2F1キメラ受容体をこのアッセイに用いた。
ヒトIL-2受容体アルファ鎖のコーディング領域と融合させたヒトIL-8プローモーターの一部を含む、pIL8pと呼ばれるレポータープラスミドを調製した。COS-7細胞（12ウェル組織培養プレートの各ウェルあたり、１ x 105個の細胞）に、1500ngのpIL8pと500ngのIL-1R/2F1キメラ受容体をコードする発現ベクターを一緒に導入した。導入後24時間目に、培養液を交換し、細胞に阻害抗体を触れさせ、そのあと１ng/mlのヒトIL-1αで刺激するか、あるいは刺激せずにそのままにした。阻害抗体は１：100に希釈したヒツジ抗ヒトIL-1RIポリクローナル血清P3（実施例５参照）であって、これはこの濃度ではIL-1が内在性COS-7細胞IL-1受容体に結合するのを阻害するが、IL-1が組換えキメラ受容体のマウスIL-1RI部分に結合するのには影響しない。
刺激後12から16時間目に、５％（w/v）無脂肪乾燥乳（５％ MBM）を含む結合培地にて細胞を２回洗い、２mlの５％ MBMにて室温で30分間ブロッキングした。その後、１μg/mlのIL-2Rαに対するマウスモノクローナル抗体2A3（Cosman et al．，Nanture 312：768-771，1984）を含む1.5mls/wellの５％ MBMにて、穏やかにゆすりながら室温で60-90分間、細胞をインキュベートした。細胞を５％ MBMにて洗い、その後、１：100に希釈した［125I］ヤギ抗マウスIgG（Sigma Chemical Company，St．Louis，Missouri）を含む１ml/wellの５％ MBMにて、室温で１時間インキュベートした。ウェルを５％ MBMにて４回、PBSにて２回洗い、続いて１mlの0.5M NaOHを加えてはがし、１分あたりのカウントを求めた。
IL-1R/2F1キメラ受容体は、IL-8プロモーター機能を誘導することによりIL-1αに応答することがわかった。IL-1R/2F1キメラをIL-1刺激することによって、受容体構築物の転写は、無処置のマウスＩ型IL-1Rが仲介する水準のおよそ半分にまで誘導された。
実施例７：プロスタグランジン合成
３番目のアッセイでは、IL-1R/2F1キメラ受容体をKBヒト上皮性カルシノーマ細胞（ATCC CCL 17）に発現させた。ヒトＩ型IL-1受容体を阻害するポリクローナル抗血清（実施例５参照）の存在下では、キメラ受容体をIL-1刺激した結果、プロスタグランジンE2が合成された。
実施例８：2F1に対して直接作用するモノクローナル抗体
この実施例では2F1タンパク質と免疫反応するモノクローナル抗体の調製について述べる。ヒト2F1をCOS-7あるいはCV-1/EBNA-1細胞などの哺乳類宿主細胞に発現させる。発現させた2F1を精製し、アメリカ合衆国特許第4,411,993号に記載されているような常法を用いて、モノクローナル抗体を作成する際に免疫原として用いる。代わりの免疫原には、2F1断片（例えば、細胞外ドメインを含む可溶性2F1）、可溶性2F1/Fc融合タンパク質、あるいは細胞表面上に組換え2F1を発現する細胞が含まれるが、これらに限定はされない。
簡単に述べると、完全フロイントアジュバントに乳化した2F1でマウスを免疫し、皮下にあるいは腹腔内に10-100μgの範囲の量を注入する。10から12日後に、不完全フロイントアジュバントに乳化した追加の2F1にて、免疫した動物個体を追加免疫（boost）する。その後、１週間ごとあるいは２週間ごとの免疫計画で、マウスを追加免疫する。ドットブロットアッセイあるいはELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）にて2F1抗体を調べるために、眼窩後血管出血あるいは尾の先端切除によって定期的に血清試料を得る。
適切な抗体力価の検出に続き、陽性の動物個体に対して、生理食塩水溶液中2F1の最後の静脈内注入を行う。３から４日後にその動物個体を屠殺し、脾細胞を回収して、例えばNS1あるいは好ましくはP3x63Ag8.653（ATCC CRL 1580）などのマウスミエローマ細胞株と融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生み出され、これを、融合していない細胞、ミエローマどうしのハイブリッド体、及び脾細胞どうしのハイブリッド体の増殖を阻害するためにHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）選択培地中、マルチプルマイクロタイタープレートにまく。
Engvallら（Immunochem．8：871，1971）及びアメリカ合衆国特許第4,703,004号に開示されている手法を改良して、精製2F1に対する反応性に関するELISAによってハイブリドーマ細胞をスクリーニングする。好ましいスクリーニング法は、Beckmannら（J．Immunol．144：4212，1990）に記載の抗体捕捉法である。陽性のハイブリドーマ細胞を同系のBALB/cマウスに腹腔内投与して、高濃度の抗2F1モノクローナル抗体を含む腹水を作出することができる。あるいは、様々な手法によってハイブリドーマ細胞をフラスコまたは回転瓶内でin vitro培養し得る。マウス腹水内に産生されるモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム沈殿し、ゲル排除クロマトグラフィーにかけることによって精製し得る。あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧへの抗体の結合に基づいたアフィニティークロマトグラフィーも、2F1への結合に基づいたアフィニティークロマトグラフィーと同様に用い得る。
配列表
(2)配列情報SEQ ID NO:1：
(i)配列の特性：
(A)長さ：1626塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vii)直接の起源：
(B)クローン名：hu2F1
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：CDS
(B)存在位置：1..1626
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：matペプチド
(B)存在位置：58..1623
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：sigペプチド
(B)存在位置：1..57
(xi)配列：SEQ ID NO:1：
0004082733.tif 000002
0004082733.tif 000003
0004082733.tif 000004
0004082733.tif 000005
0004082733.tif 000006
(2)配列情報SEQ ID NO:2：
(i)配列の特性：
(A)長さ：542アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：SEQ ID NO:2：
0004082733.tif 000007
0004082733.tif 000008
0004082733.tif 000009
(2)配列情報SEQ ID NO:3：
(i)配列の特性：
(A)長さ：2830塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vii)直接の起源：
(B)クローン名：mu2F1
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：CDS
(B)存在位置：381..1994
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：matペプチド
(B)存在位置：435..1991
(ix)特徴：
(A)NAME/KEY：sigペプチド
(B)存在位置：381..434
(xi)配列：SEQ ID NO:3：
0004082733.tif 000010
0004082733.tif 000011
0004082733.tif 000012
0004082733.tif 000013
0004082733.tif 000014
(2)配列情報SEQ ID NO:4：
(i)配列の特性：
(A)長さ：538アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：SEQ ID NO:4：
0004082733.tif 000015
0004082733.tif 000016
0004082733.tif 000017
(2)配列情報SEQ ID NO:5：
(i)配列の特性：
(A)長さ：8アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vii)直接の起源：
(B)クローン名：FLAGペプチド
(xi)配列：SEQ ID NO:5：
0004082733.tif 000018