(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）:
【化１】
0004198883.tif 000004
〔式中、Ｒ1は、Ｏ−グルコシド残基であり、Ｒ2は、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ又はＣ1−Ｃ6チオアルキルである〕の３−Ｏ−グリコシルコルヒコン化合物の調製方法であって、Ｒ1が、ＯＨ又はメトキシである化合物を、バシラスメガテリウム（Bacillus megaterium）を用いて生物学的に変換することを特徴とする方法。
【請求項２】
バシラスメガテリウム（Bacillus megaterium）株が、高濃度の変換されるコルヒコン基質の存在下での増殖能に基いて選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該濃度が、０．１〜３g/lの範囲である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
バシラスメガテリウム（Bacillus megaterium）を、固体又は液体培地中で培養する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該培地が、少なくとも１の有機窒素源を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
該有機窒素源が、肉エキス、ペプトン、トリプトン、カゼイン加水分解産物、コーンステップ水からなる群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
培地が、少なくとも１の炭素源を含む、請求項４記載の方法。
【請求項８】
該炭素源が、グルコース、フルクトース、グリセロールからなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該培地が、Ｋ+、Ｎａ+、Ｍｇ++、ＮＨ4+の無機塩の少なくとも１の源を含む、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
５〜８の範囲のpHで実施する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該pHが、６〜７の範囲である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
２０°〜４５℃の範囲の温度で実施する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該温度が、２８°〜４０℃の範囲である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
１分当たり、培地１リットル当たり、１〜２リットルの空気の最大通気レベル（vvm）で実施する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
該レベルが、１．５〜２vvmの範囲である、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、選択された微生物株を用いて行う、コルヒチノイド化合物のそれぞれの３−Ｏ−グリコシル誘導体への生物学的変換に関する。本発明の方法は、引用したコルヒコン化合物から出発して、高収率、高純度で、芳香環ＡのＣ−３のみがグリコシル化された化合物を提供する。
【０００２】
本発明の生物学的変換方法で得られる化合物、特にチオコルヒコソン（３−Ｏ−グルコシルチオコルヒコン、つまり式（Ｉ）において、Ｒ1＝−ＯＣＨ3であり、Ｒ2＝−ＳＣＨ3である）は、主に新規な抗腫瘍医薬の調製のための、著しい薬理学的重要性を有する活性な要素である。
【０００３】
発明の開示
一般式（Ｉ）の化合物及び関連するコルヒチノイド化合物の高度に特異的なグリコシド化を、化学反応又は生物学的変換の何れかにより行うために、多くの努力が払われてきた。
【０００４】
化学的経路は、一連の複雑で、非特異的な反応からなり、これは、異なる分子部位を非選択的に包含するため、グリコシド化誘導体の混合物が得られ、これらのうちあるものは、非活性である。したがって、芳香環のＣ−３において特異的にグリコシド化された有効な生成物への変換収率は、きわめて低い。
【０００５】
生物学的方法は、実質的には、コルヒチン及びチオコルヒチンなどのコルヒチノイド化合物（コルヒコン化合物とは直接は関連していない）の、芳香環のＣ−２及びＣ−３におけるモノグリコシド化誘導体への、Centella Asiaticaの培養株による生物学的変換に関しており、したがってこのような変換は、高度に選択的ではなく、十分な収率及び生産性は得られない（Solet, J.M., et al., Phytochemistry 33, 4, 817-820, 1993）。
【０００６】
コルヒチノイド化合物を生物学的に変換するためのその他の努力によっては、芳香環（Ｃ−２及びＣ−３）に結合したメトキシ基の脱メチル化が行われただけであり、いずれにしても収率と生産性が限られており、位置選択性も低いことが常に特徴的である。
【０００７】
このような理由から、Hufford C.D., et al., (J. Pharm. Sc., 68, 10, 1239-1242, 1979)は、Streptomyces griseus及び／又はStreptomyces spectabilisを用い、Bellet P. et al., (GB-923421, 1959)は、異なる菌株のStreptomyces と、その他の種の細菌及び真菌を用い、コルヒチン及びその誘導体を、対応する３−脱メチル化誘導体へ変換しようとした。これらの公知の方法の結果により、アルカロイド分子の例えばＣ−２、Ｃ−３又はＣ−１０において関連する微生物酵素の非選択性と関連して上述されたことが確認された。更に、該触媒系の生産性レベルは、低い変換収率、使用することができる基質濃度の低さ、及びトロポロン環の分解の頻度の高さのため、かなり低い。
【０００８】
より最近では、Poulev. et al., (J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33-38, 1995)は、細菌微生物を用いて特異的脱メチル化を達成したが、その収率及び生産性はまだ低いものであった。
【０００９】
上述したものと同様の微生物（Streptomyces、Bacillusなど）に由来する酵素活性が、メイタンシノイド（米国特許第4361650：Izawa, M., et al., J. Antibiotics, 34, 12, 1587-1590, 1981）などのその他の化合物の生物学的変換に応用された。この場合においても、触媒された反応は、脱メチル化のみからなり、変換収率と生産性の低さが特徴であった。
【００１０】
Bacillus megaterium株由来のα−アミラーゼのグリコシルトランスフェラーゼ活性が記載されており(Brumm., P.J., et al., Starch, 43, 8, 319-323, 1991)、受容体特異性（グルコース又はグルコシドのみ）は、特に高い。同じ微生物源によって産生されるシクロデキストリン−グルコシルトランスフェラーゼは、デンプンから出発して、ルブソシド（１３−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル−ステビオール  β−Ｄ−グルコシルエステル）のα−１，４−トランスグルコシル化を触媒する。この生物学的変換においても、トランスフェラーゼ反応の受容体は、基質グルシド画分である(Darise, M., et al., Agric. Bioel. Chem., 48, 10, 2483-2488, 1984)。シクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼは、以前、デンプンからのシクロデキストリンＧ６及びＧ８の調製のために使用された(Kitahata, S., Okada, S., Agric. Biol. Chem., 38, 12, 2413-2417, 1974)。
【００１１】
これらの例は、Bacillus megateriumにより発現されたグリコシルトランスフェラーゼ活性の高度な基質特異性を示すものであり、これは、グルコシル受容体のみに関与するため、異なる複雑な分子構造を有する、コルヒコンのような二次的代謝産物との何らかの反応を予想することはできない。事実、コルヒコン化合物の３−グリコシル誘導体への酵素による変換のために該微生物を使用する例は、知られていない。
【００１２】
高濃度のコルヒコン（Ｒ1＝−ＯＣＨ3、Ｒ2＝−ＯＣＨ3）、３−デメチル−コルヒコン、及びそれぞれのチオ誘導体の存在下で増殖可能なBacillus megaterium株が、該基質を、芳香環のＣ−３においてのみグルコシド化した誘導体に生物学的に変換する、非常に高度で、非常に特異的な活性を有することが今や認められた。このような生物学的変換は、非常に短時間で起き、驚くべきほど高い収率を特徴とする。
【００１３】
したがって、本発明は、式（Ｉ）:
【００１４】
【化２】
0004198883.tif 000002
【００１５】
〔式中、Ｒ1は、グリコシド残基、特にＯ−グリコシド残基であり、Ｒ2は、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ又はＣ1−Ｃ6チオアルキルである〕の３−Ｏ−グリコシルコルヒコン化合物の調製方法であって、Ｒ1が、ＯＨ又はメトキシである化合物を、Bacillus megateriumを用いて生物学的に変換することを特徴とする方法に関する。
【００１６】
Bacillus megateriumは、細胞直径が１．０μm以上のグラム陽性の胞子形成細菌であり、多数の培養培地上で好気的に増殖し、カタラーゼ陽性であり、ゼラチンを加水分解する。本発明により使用することができるBacillus megateriumの株は、増殖試験及び顕微鏡による分析によって証明されているように、十分に増殖することができ、高濃度のコルヒコン、チオコルヒコン（Ｒ1＝−ＯＣＨ3、Ｒ2＝−ＳＣＨ3）及びそれぞれの３−脱メチル誘導体（約２g/l）においても生存し続けることができることが認められた。Bacillus cereusのような同種類の種は、１g/lの基質濃度においてさえも、増殖困難であることを示している（コントロールの１０〜１５％の吸光度）。
【００１７】
生物学的変換の選択性及び有効性の高さは、驚くべきほどであり、異常である。その収率が７０〜９５％の範囲であるからである。
【００１８】
更に、生物学的変換において使用する微生物は、発酵工程を繰り返しても、触媒活性を永久に保持することができるため、流加培養及び連続法における特異的な生物学的変換を提供する。したがって、この方法により、高い生産性及び再現性レベルが提供される。
【００１９】
著しい反応位置選択性は、顕著な生産収率に加えて、得られる生成物の高い品質及び純度を確かにするものであり、この結果、簡単なダウンストリーム処理によって、生成物を純度１００％で得ることができる。
【００２０】
更に、生成物の精製及び回収の工程を減らすことができること、方法の経済性、並びに使用のアフィダビリティ（affidability）及び安全性が、重要な利点である。
【００２１】
本発明の方法において使用し得る操作の順序は、以下よりなる:
Ａ）  高濃度のコルヒコン基質の存在下で増殖しうるBacillus megateriumの培養株を、天然源又はコレクション株から出発して選択する。
Ｂ）  Ａ）から単離株を選択し、徐々に濃度を増大させながら投与した特異的基質による生物学的変換アッセイにより、対応する３−Ｏ−グリコシル誘導体への生物学的変換の触媒活性を評価する。
Ｃ）  Ｂ）において選択した株の微生物学的特徴づけをする。
Ｄ）  Ｂ）から得た細菌集団の標的特異的選択により、生物学的変換収率を徐々に高める。
Ｅ）  臨界的発酵パラメーターの検討及び最適化により、生物学的変換を最適化する。
Ｆ）  高度生産性培養株の保存法の検討及び最適化により、工業的スケールでの生産への適用のための安定で、均一な接種株を確実にする。
Ｇ）  発酵槽、回分培養、流加培養及び連続発酵における工程のスケールアップをする。
Ｈ）  ダウンストリーム処理及び生成物の回収方法を構築し、最適化する。
【００２２】
具体的には、本発明で使用しうる微生物は、菌株寄託センター又は各種起源の土壌試料、あるいはあらかじめ選択しておいた産業株から得られたコレクション培養物から出発して、有機窒素源（ペプトン、酵母エキス、肉エキス、アスパラギンなど）、炭素源（グリセリン、デンプン、マルトース、グルコースなど）を含む各種寒天培地、pH５〜８、好ましくは６〜７、における選択的回収により選択することができる。インキュベーション温度は、２０°〜４５℃、好ましくは２８°〜４０℃の範囲である。
【００２３】
変換するコルヒコン基質の有毒濃度の存在下での培養株の増殖能を、異なる寒天基質（その一部には、（大部分の微生物の増殖を阻害するために、）０．１〜３g/lの濃度のコルヒコン化合物（例えば３−デメチルチオコルヒコン）をあらかじめ加えてある）上でのスカラー希釈及び平行プレーティング技術により、評価する。
【００２４】
上述の条件下で増殖可能なコロニーを無菌状態で取り出し、異なる寒天培地上にプレーティングして、その純度及び増殖の均一性を調べる。
【００２５】
培養株の保存に使用する培養培地は、有機窒素源（ペプトン、酵母エキス、トリプトン、肉エキスなど）、炭素源（グルコース、マルトース、グリセリンなど）を含有する代表的な微生物基質（pH５〜８、好ましくは６〜７）である。インキュベーション温度は、２０°〜４５℃、好ましくは２８°〜４０℃の範囲である。
【００２６】
次に選択した微生物を、コルヒコン化合物の存在下、深部培養での増殖能、そしてコルヒコン化合物の対応する３−グリコシル誘導体への変換能について評価する。
【００２７】
この評価は、１以上の有機窒素源（酵母エキス、ペプトン、トリプトン、カゼイン加水分解産物、肉エキス、コーンステップリカーなど）、１以上の炭素源（グルコース、グリセロール、デンプン、サッカロースなど）、無機リン及び窒素源、並びに各種イオン（Ｋ+、Ｎａ+、Ｍｇ++、Ｃａ++、Ｆｅ++、Ｍｎ++など）の無機塩を含有する、異なる培地処方の液体培地２０mlを含有する１００mlフラスコ中で行った。
【００２８】
培養試料は、場合により通常の突然変異誘発技術（紫外線照射など）による突然変異誘発処理に付して、特異的な生物学的変換活性を有する突然変異体を誘導することができる（これは、上述と同一の操作により評価することができる）。
【００２９】
それぞれの生物学的変換アッセイから得た培養試料を分析して、ＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析により３−グリコシル誘導体の産生を評価した。
【００３０】
選択した微生物のコルヒコン基質のそれぞれの３−グリコシル誘導体への変換能を、フラスコ中の生物学的変換アッセイにより、３００mlのスケールで、選択工程において使用したのと同じ培養ブロス中で確認した。
【００３１】
陽性反応を示した微生物を、異なる培養ブロス中、３００mlのスケールで、生物学的変換の最適化のための試験に使用した。検討した主な培養及び発酵パラメーターは、有機窒素源、炭素源、鉱物塩、温度、撹拌−通気、pH、インキュベーション時間、接種比率、継代培養工程、変換する基質の添加の時間と形態である。本発明の生物学的変換を行うことができる、選択した細菌微生物は、１種以上の有機窒素源、好ましくは酵母エキス、肉エキス、ペプトン、トリプトン、カゼイン加水分解産物、コーンスティープリカーなどを含有する、固形及び液体培地基質の両方で増殖させることができる。増殖と生物学的変換に有用な炭素源は、グルコース、フルクトース、サッカロース、グリセロール、麦芽エキスなど、好ましくはグルコース、フルクトース、及びグリセリンである。培養培地には、更に無機リン源、及びＫ+、Ｎａ+、Ｍｇ++、ＮＨ4+などの塩を含有させる。
【００３２】
選択した微生物は、２０〜４５℃、好ましくは２８〜４０℃の温度で、５〜８、好ましくは６〜７の間のpHで増殖することができる。同じ条件下で、考慮した微生物は、コルヒコン化合物を対応する３−グリコシル誘導体に変換することができる。該変換は、深部培養においても、１５０〜２５０rpmで撹拌する、回転振とう機上でインキュベートするフラスコ中でも起きる。
【００３３】
微生物の増殖と関連する、この生物学的変換の特異的な動力学のため、生物学的変換の目的のための最適な条件は、増殖に最適である条件と同一の条件である。したがって、上述の有機及び無機成分に基くものなどの、良好な微生物の増殖を促進するのに有用な培養培地は、関連する基質の生物学的変換の良好な活性にも有用である。後者を、発酵の出発段階、又は発酵の開始時に開始する画分アリコートにおいて培地に加える。
【００３４】
本発明の生物学的変換は、酵素による変換に基くものであり、これは、指数増殖期の間に開始し、増殖と平行して持続する。３−グリコシル誘導体への変換の最大レベル（非常に高い；最高９５％）には、基質の添加時間に応じて、最初の４８〜７２時間以内に到達される。生物学的変換の位置選択性は、絶対である：培地試料中、２−グリコシル誘導体の存在は、まったく認められていない。得られた生成物は、細胞外性だけである。
【００３５】
変換する基質は、アセトン又はアルコール溶液、アルコール−水混合物、ジオキサン溶液などとして加えることができる。本発明の生物学的変換は、特に培養培地、温度及び処理時間に関して培養条件をそのままに維持して、発酵槽レベルまでスケールアップすることができる。良好な増殖を行うためには、適正なレベルの撹拌−通気が重要であり、特に１分間当たりの、培地１リットル当たり、１〜２リットルの空気の通気レベル（vvm）、好ましくは１．５〜２vvmの通気レベルが必要である。
【００３６】
生物学的変換によって得られる生成物を、上清の遠心分離と回収、又は透過物の微細濾過と回収による液体画分からのバイオマスの分離後に、培養ブロスから抽出する。生成物の最適な回収の観点から、培地をアルコールで処理することができる。
【００３７】
生物学的変換生成物の精製及び回収は、吸収樹脂上での分離、及びアルコール、好ましくはメタノールによる溶離のためのクロマトグラフィー技術を用いて行うことができる。生成物を含有するヒドロメタノール溶液は、親油性有機溶媒、好ましくは塩化メチレンで抽出することにより更に精製することができる。アルコール及び有機溶媒の混合物で更に処理後、得られたアルコール溶液から結晶化により生成物を純粋な状態で得ることができる。グリコシルトランスフェラーゼ活性を損失することなく、グルコースを、フルクトース又はガラクトースなどのその他の糖で置き換えることができる。
【００３８】
以下の実施例は、本発明を更に詳細に開示するものである。
実施例１
農業土壌から単離したBacillus megateriumの培養物のアリコートを、無菌食塩水２０mlに再懸濁し、１：１０，０００，０００の希釈ファクターまでスカラー希釈に付した。各種希釈の懸濁液を、それぞれチオコルヒコン又は３−デメチルチオコルヒコンを加えたＬＢ−Ａｇａｒ培養培地及びＬＢ−Ａｇａｒにプレートして、最終濃度２g/lとした（表を参照）。培養物を、暗所で、＋２８℃で３〜４日間インキュベートした。コルヒコン化合物を添加した選択培地上で増殖したコロニーを非選択培地上にプレートすることによって単離し、精製した。該試料を上述のように、但しもっと短時間（２４時間）インキュベートした。
【００３９】
次に培養物を、試験管中の同じ寒天培地に移し、上述のように２４時間インキュベートした。
【００４０】
上述のように選択した培養物のアリコートを用いて、培養培地ＳＴ（表）２０mlを含有し、チオコルヒコン又は３−デメチルチオコルヒコンを加えて０．４mg/mlの最終濃度とした、１００mlのエーレンマイヤーフラスコに接種した。該培養物を回転振とう機上、２００rpmで、２８℃で一晩インキュベートした。
【００４１】
コルヒコン基質の変換は、３〜４時間毎に採取した培養ブロスのアリコートを、アセトン:酢酸エチル：水５：４：１の溶離系による、シリカゲルでのＴＬＣにより分析することによりチェックした。
【００４２】
４日間のインキュベーション後、３−グリコシル誘導体に対して明らかな触媒活性を示した培養物のアリコートを、試験管中の新規接種物の調製のために、上述したようなスカラー希釈により、プレート上で回収した。フラスコ中での生物学的変換アッセイを、著しく高い最終濃度のチオコルヒコン及び３−デメチルチオコルヒコン（１mg/ml）を用いた以外は上述と同じ条件で繰り返した。最も活性である単一の培養物（７０％に等しいか、それ以上の基質変換）を、凍結管（frozen cryotubes）中の接種物の調製のために使用した。
【００４３】
【表１】
0004198883.tif 000003
【００４４】
実施例２
実施例１記載の方法を、Bacillus megaterium培養株から出発して、以下のコレクション株（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Germany）から誘導して、繰り返した：
ＤＳＭ      ９０
ＤＳＭ    ３２２
ＤＳＭ    ３３３
ＤＳＭ  １６６７
ＤＳＭ  １６７０
ＤＳＭ  １６７１
【００４５】
実施例１で選択し、チオコルヒコン（１mg/ml）を加えた培養物を、液体培地中、４日間インキュベートした。ＴＬＣ分析により、基質のチオコルヒコソンへの変換が、変換収率３０〜７０％で起きたことが認められた。
【００４６】
実施例３
上述の実施例で記載したように選択した、試験管中の培養物試料のアリコートを用いて、ブロスＳＴ２０mlを含有する１００mlのエーレンマイヤーフラスコを接種した。
【００４７】
ブロス培養物を、回転振とう機上、２００rpmで、＋３０℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、培養物にグリセロール無菌溶液を加えて、最終濃度２０％とした。次に培養物を２mlの凍結管に分散し、すぐに液体窒素に浸した。
【００４８】
数日後、培養物の１０％を３７℃ですばやく解凍した。各凍結管のアリコートを用いて、ＳＴ培地２０mlを含有する１００mlのエーレンマイヤーフラスコを接種し、これを次に＋２８℃で一晩、２００rpmでインキュベートした（予備培養）。インキュベート後、それぞれの予備培養物２mlを、1g/lの最終濃度になるように３−デメチルチオコルヒコンを添加した新鮮なＳＴ培地２０mlに、無菌で移した。生物学的変換を行わせ、実施例１に記載した条件でチェックした。分析の結果、３−グリコシル誘導体への基質の変換が、上述した定量的期間（７０％及びそれ以上）で起きることが認められ、凍結培養物の触媒安定性が証明された。
解凍後すぐにＬＢＡｇａｒ上にプレートしたブロス培養物の平行コントロールにより、凍結培養物の生存度、均一性、及び純度が確認された。
【００４９】
実施例４
解凍後、凍結管中の培養物のアリコートを用いて、ＳＴ培地（予備培養）５０mlを含有する３００mlのエーレンマイヤーフラスコを接種した。３０℃、２５０rpmで一晩インキュベートした後、予備培養物５mlを、３−デメチル−チオコルヒコンを加えて最終濃度１g/lとした同じ培地５０mlに移した。培養物を、上記と同じ条件で、４日間インキュベートした。
４日毎に試料を採取して、増殖レベル（６００nmで吸光度を測定）、チオコルチコソン産生（ＴＬＣ及びＨＰＬＣ）、無菌度（ＬＢＡｇａｒ上で）を評価し、顕微鏡による形態学検査も行った。
【００５０】
ＴＬＣによる分析を、実施例１に記載したように行った。ＨＰＬＣ分析のために、培養ブロスの１ml画分に、メタノール９mlを加え、１３，０００rpmで２分間遠心分離を行った。上清の３−グルコシル誘導体の含有量を、水：アセトニトリル８０：２０溶離系を用い、イソクラティック溶離による逆相ＨＰＬＣにより分析した。
【００５１】
ＨＰＬＣ分析により、７２〜９６時間後では、基質のチオコルチソンへの生物学的変換は、ほぼ完了したことが証明された。
【００５２】
生物学的変換によって得られた３−グリコシル誘導体の最終収率は、７０〜８５％の範囲であった。
【００５３】
実施例５
実施例４に記載した操作を繰り返したが、３−デメチルチオコルヒコンを培養物に２回に分けて加えた：開始時に０．２５g/l、及び２４時間後で０．７４g/l。
【００５４】
培養物の増殖及び産生反応は、実施例４で得られたものと似ており、チオコルチソン収率は約９０％であった。
【００５５】
実施例６
エーレンマイヤーフラスコ中のＳＴブロス１リットル（接種）に、凍結管培養物を接種した。フラスコを＋３０℃、２５０rpmで一晩インキュベートした。無菌ブロスＳＴＬ９リットルを含有する１４リットル発酵槽に、接種物を無菌で移した。３−デメチルチオコルヒコンを加えて、最終濃度１g/lとした（開始時に２５％、残りは２０時間後）。撹拌−通気を適当なレベルに保持しながら（最大９００rpmで撹拌；培養物の増殖に応じて、１〜１．５vvmの通気）、発酵を行った。
【００５６】
２時間毎に培養ブロスから試料を採取し、以下の分析に付した：
−  ６００nmで光学濃度、
−  株の無菌度及び純度の分析（ＬＢＡｇａｒ上）、
−  顕微鏡による形態（グラム染色）、
−  それぞれ実施例１及び４に記載したようにＴＬＣ及びＨＰＬＣによるチオコルチコソン含有量の分析。
【００５７】
約４８時間の発酵後、基質のチオコルチソンへの変換は、ほぼ完了した。最終収率は、約８５％であった。
【００５８】
実施例７
実施例６に記載の方法を繰り返したが、４８時間の発酵後に、培養ブロスの９０％ほどを回収し、生成物を抽出した（画分１）。残りの１０％に、無菌状態で、発酵槽中、３−デメチルチオコルヒコン１０ｇを含有する新鮮な無菌ＳＴ培地９リットルを加えた。発酵を、実施例６に記載したように行った。４８時間後、培養ブロスの９リットルを集め、抽出した（画分２）。残りの培養ブロスに、無菌状態で、新鮮な３−デメチルチオコルヒコン（１０ｇ）を含有する無菌の新鮮なＳＴ培地９リットル以上を加えた。発酵を上述のように行った。４８時間後、培養ブロスを完全に集め、抽出した（画分３）。株の生物学的変換活性は、３回のランのすべてで安定なままであり、変換収率は約８０％であった。
【００５９】
実施例８
発酵由来の最終培養ブロス（総量：約２７リットル）を真空下で濃縮して、柔らかい残渣を得、これをエタノールにとった。
【００６０】
濾過による分離後、水−エタノール画分を真空下で水になるまで濃縮し、塩化メチレンによる抽出を繰り返して精製した。水画分を濃縮し、水酸化ナトリウムでpHを１０になるように調節し、塩化メチレン−エタノール混合物で抽出した。
【００６１】
合わせた有機層を真空下で濃縮した。得られた懸濁液にエタノールを加え、濃縮し、結晶化させた。固体を塩化メチレン−エタノール混合物に更に再溶解する工程後に、エタノールによる２回目の結晶化を行った。