(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞抽出液を含む無細胞タンパク質合成系において、鋳型ＤＮＡから１以上のｍＲＮＡを転写し、前記ｍＲＮＡから、翻訳して目的タンパク質若しくは目的ペプチドを合成するタンパク質またはペプチドの製造方法であって、
前記無細胞抽出液は、細菌の無細胞抽出液であり、
前記鋳型ＤＮＡが、前記目的タンパク質若しくは目的ペプチドのコード配列と相補的配列、ＳＤ配列に相補的な配列、及び、５〜５０ｎｔの範囲のポリｄＴ、ポリｄＣ、又はポリｄＡの塩基配列を有する環状一本鎖ＤＮＡであり、
ＲＮＡポリメラーゼ反応により、１つのｍＲＮＡに前記鋳型ＤＮＡの相補的配列を複数転写することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記鋳型ＤＮＡの塩基数が、３０〜１０００ｎｔの範囲である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記鋳型ＤＮＡが、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃＵＶ５、及びｔａｑからなる群から選択される少なくとも一つのプロモータ配列を有している請求項１又は２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質またはペプチドの製造方法、およびそれを用いて製造したタンパク質またはペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学の進歩により、目的タンパク質を大量に合成する方法として、形質転換体を用いた方法が一般的になってきている。このような形質転換体を用いた合成方法としては、例えば、目的タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをプラスミドに連結し、この組換え体を大腸菌に導入して大量培養する方法があげられる。しかしながら、このような方法は、例えば、▲１▼時間や手間がかかり、▲２▼発現産物に毒性がある場合に、大腸菌の生育低下に伴なってタンパク質の収率が低下する、▲２▼合成されたタンパク質の不溶化が起こり易い等の欠点も問題となっており、全てのタンパク質合成に適用することは困難であった。
【０００３】
このような従来の細胞系を用いた合成方法の問題を克服する新たなタンパク質合成方法として、近年、試験管内でタンパク質を合成する、いわゆる無細胞タンパク質合成系（生体外タンパク質合成系とも呼ばれる）が開発されている。この方法は、目的タンパク質をコードする鋳型ＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）等を加えて、生体のタンパク質合成系つまりセントラルドグマを試験管内で再現しようとするものであり、前述のような細胞系における問題を解消し、例えば、生細胞では生産できないタンパク質を合成できる等の利点がある。
【０００４】
現在、このような無細胞タンパク質合成方法について、より一層高い収率および優れた再現性でタンパク質を合成できることが望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、さらにタンパク質またはペプチドの合成効率に優れる無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質またはペプチドの製造方法の提供である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明のタンパク質またはペプチドの製造方法は、無細胞抽出液を含む無細胞タンパク質合成系において、ＤＮＡから１以上のｍＲＮＡを転写し、前記ｍＲＮＡから、翻訳して目的タンパク質若しくは目的ペプチドを合成するタンパク質またはペプチドの製造方法であって、前記ＤＮＡは、前記目的タンパク質若しくは目的ペプチドのコード配列と相補的配列を有し、ＲＮＡポリメラーゼ反応により、１つのｍＲＮＡに前記ＤＮＡの相補的配列を複数転写することを特徴とする。
【０００７】
前述のように、無細胞タンパク質合成系では、生細胞を用いたタンパク質合成に比べてタンパク質の合成収率が低いという問題があったため、これらの問題を回避すべく、近年では、ｍＲＮＡからタンパク質合成を行う翻訳工程を効率良く行なうための改良がなされていた。しかしながら、本発明者らは、従来とは全く異なり、前記翻訳工程ではなくＤＮＡからｍＲＮＡの転写工程に着目した。つまり、翻訳工程の効率を向上するのではなく、ｍＲＮＡの転写効率を向上させることによってＲＮＡの発現量を増加させ、これによってタンパク質の発現量を増加するべく鋭意研究を行なったのである。そして、前述のように前記ＤＮＡを鋳型として転写したｍＲＮＡは、一つのｍＲＮＡに、前記ＤＮＡに対する相補的配列を複数有するため、このようなｍＲＮＡを無細胞タンパク質合成系に用いれば、効率よく目的タンパク質やペプチドを発現できることを見出したのである。つまり、例えば、通常のプラスミド等の転写によって得られるｍＲＮＡは、鋳型ＤＮＡを一回転写すると一旦転写が終了するため、得られる複数のＲＮＡは、それぞれ、ＤＮＡに対する相補的配列を１つだけ有するものとなるが、これに対して、本発明における前記ｍＲＮＡは、図１に示すように、例えば、ＤＮＡを鋳型(同図において（−）鎖)として、転写が連続して行われて合成されるため、前記ＤＮＡに対する相補的配列（＋）を複数有するｍＲＮＡ（同図においてポリ（＋）鎖）となる。このように、本発明のｍＲＮＡが前記ＤＮＡに対する相補的配列を複数有することに起因して、必然的にタンパク質の合成量も増加するのである。したがって、本発明のｍＲＮＡを無細胞タンパク質合成系に用いれば、短時間でタンパク質合成の効率を向上することも可能になる。また、本発明の無細胞タンパク質合成系における製造方法は、生命体が用いている遺伝暗号（コドン−アンチコドン）を使用するため、短鎖のオリゴペプチドから、生体内で重要な遺伝子調節を行っているタンパク質等、様々なタンパク質の合成に適用可能である。さらに、前述のようなタンパク質の翻訳工程の効率向上に着目した従来の方法と組み合わせることによって、より一層タンパク質合成効率の向上を図る事も可能となる。前述の図１に示すように、ＤＮＡの相補的配列が連続したＲＮＡを転写する方法を、ローリング・シンクロナイゼーション法という。
【０００８】
なお、本発明において、前記ＤＮＡから１つ以上のｍＲＮＡが転写されてもよく、各々のｍＲＮＡが前記ＤＮＡの相補的配列を複数転写していればよい。
【０００９】
本発明の製造方法において、前記ＤＮＡは、環状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であることが好ましい。環状ｓｓＤＮＡであれば、前述のようにＲＮＡポリメラーゼ反応によって、１つのｍＲＮＡに前記ＤＮＡの相補的配列を複数転写することが容易だからである。
【００１０】
また、前記一つのｍＲＮＡには、前述のように前記ＤＮＡの相補配列が複数転写されるが、得られるｍＲＮＡは、前記ＤＮＡに対して相補的な配列を少なくとも２つ以上有していればよい。また、前記ｍＲＮＡにおける前記相補的配列の数の上限は、特に制限されず、例えば、ｍＲＮＡ合成における反応時間やＤＮＡの配列等に応じて変化すると考えられる。
【００１１】
本発明の製造方法において、前記ＤＮＡの塩基数は、３０〜１０００ｎｔの範囲であることが好ましい。
【００１２】
本発明の製造方法において、例えば、無細胞タンパク質合成系として大腸菌等の細菌由来の系を使用する場合、前記細菌由来のリボゾームがｍＲＮＡの開始を認識してタンパク質合成を確実に行うために、前記ＤＮＡは、ＳＤ配列に相補的な配列を有することが好ましい。
【００１３】
本発明の製造方法において、前記ＤＮＡは、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｃ）およびポリ（Ｔ）からなる群から選択された少なくとも一つの配列を有することが好ましく、この中でも好ましくはポリ（Ｔ）配列である。ＤＮＡとして環状ｓｓＤＮＡを使用する場合、例えば、このような配列を有するｓｓＤＮＡを用いれば、環化を容易に行って前記環状ｓｓＤＮＡを調製できるからである。また、これらの配列の塩基数は、例えば、５〜５０ｎｔの範囲であることが好ましい。
【００１４】
本発明の製造方法において、前記ＤＮＡは、プロモーター配列を有していてもよく、前記プロモーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、tacプロモーター、lac UV5プロモーター、taqプロモーター等がある。
【００１５】
本発明の製造方法において、前記ｍＲＮＡは予め別途調製してもよいが、例えば、前記ｍＲＮＡの転写と、目的タンパク質合成または目的ペプチド合成とを、同じ反応系で行うことが好ましい。このようにしてｍＲＮＡを合成すれば、そのままタンパク質等の合成を行なうことができるため、迅速かつ簡便に目的タンパク質等の製造を行うことができる。
【００１６】
次に、本発明のタンパク質またはペプチドは、前記本発明のタンパク質またはペプチドの製造方法により製造したタンパク質またはペプチドである。前述のような方法によれば、優れた効率でタンパク質を合成できるため、得られたペプチドやタンパク質を各種用途に供することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、例えば、目的タンパク質のコード配列と相補的配列を有する環状ｓｓＤＮＡを調製し、これを鋳型として無細胞タンパク質合成系において、ｍＲＮＡ合成（転写）およびタンパク質合成（翻訳）させることによって行うことができる。以下に本発明の製造方法の一例を示す。
【００１８】
（１）鋳型となる環状ｓｓＤＮＡの作製
転写の鋳型となる環状ｓｓＤＮＡは、例えば、前駆体となる直鎖状ｓｓＤＮＡを準備し、これを環化することによって調製できる。この環状ｓｓＤＮＡは、ｍＲＮＡ合成の鋳型となるため、所望のｍＲＮＡと相補的配列となるように設計する。
【００１９】
前記直鎖状ｓｓＤＮＡの長さは、環化に影響がなければ特に制限されず、例えば、３０〜１０００ｎｔの範囲が適当である。
【００２０】
そして、前記直鎖状ｓｓＤＮＡは、例えば、少なくとも発現させる目的タンパク質のコード領域の塩基配列（開始コドンおよび終結コドンを含む）に相補的な配列を有していればよい。前記コード領域に相補的な配列の長さは、目的タンパク質のアミノ酸残基数により異なり、適宜決定できる。
【００２１】
前記コード領域に相補的な配列は、例えば、従来公知のクローニング方法等によって自然界より単離してもよいし、既に公知となっているアミノ酸配列や塩基配列の情報を基に化学的に合成してもよい。前記配列情報に関しては、各種文献だけでなく、例えば、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により管理されている「ジェンバンク」等の各種データーベースを利用することもできる。
【００２２】
前記直鎖状ｓｓＤＮＡの配列は、さらに、前記コード領域に相補的な配列の他に、ｓｓＤＮＡの環状化を容易にする配列を含むことが好ましい。このような配列としては、例えば、ポリ（Ａ）配列、ポリ（Ｃ）配列およびポリ（Ｔ）配列のように同じ塩基から構成されたポリマー配列等があげられる。なお、これらの配列の存在によって、ｓｓＤＮＡが環状化し易くなることのメカニズムは不明である。
【００２３】
これらの配列の中でも、より好ましくは前記同じ塩基から構成されたポリマーであり、特に好ましくはポリ（Ｔ）配列である。例えば、ポリ（Ｔ）配列のように同じ塩基から構成されていれば、ｓｓＤＮＡを容易に環状化できるだけでなく、環状ｓｓＤＮＡに相補的なポリヌクレオチド配列の連続転写に影響を与えることもない。つまり、前記環状ｓｓＤＮＡの転写により合成された、前記ポリ（Ｔ）配列に相補的なｍＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡの二次構造に対する影響が非常に少なく、例えば、ステムループ構造を形成し難いため、ステムループ構造による転写終結の問題等が起こらない。そのため、前記環状ｓｓＤＮＡの転写が一回ごとに終結せず、連続的に行われ、前記環状ｓｓＤＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチド配列を複数有する長鎖のｍＲＮＡを形成できるのである。この長鎖ｍＲＮＡは、転写の回数（ｎ）だけ、前記ポリヌクレオチド配列（Ｘ）が連なった構造［（Ｘ）n］となる。
【００２４】
前記ｓｓＤＮＡの環状化を容易にするポリ（Ｔ）等の配列の長さは、特に制限されないが、例えば、５〜５０ｎｔの範囲が適当である。
【００２５】
さらに、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの配列は、例えば、プロモーター、エンハンサー等の転写効率に関与する配列や、Shine-Dalgano(ＳＤ)配列に相補的な配列等を有してもよい。これらの配列は、例えば、目的のタンパク質の種類や、後述する無細胞タンパク質合成系の種類等に応じて適宜決定できる。
【００２６】
前記プロモーターの種類としては、Ｔ７プロモーター、tacプロモーター、lac UV5プロモーター、taqプロモーター等が好ましく、これらの中でも特にＴ７プロモーターが好ましい。
【００２７】
一方、転写反応のＲＮＡポリメラーゼとして、例えば、Ｔ７ポリメラーゼや、E.coli ＲＮＡポリメラーゼを使用する場合には、プロモーターがなくても転写を開始できることから、プロモーター配列を含まなくともよく、特にこのような環状ｓｓＤＮＡの場合は、プロモーター配列を有していない方が、転写効率に優れ好ましい。
【００２８】
具体的には、無細胞タンパク質合成を、大腸菌等の細菌の無細胞抽出液を用いて行う場合、直鎖状ｓｓＤＮＡが、例えば、タンパク質のコード領域に相補的な配列の３’側下流に、前記ＳＤ配列に相補的な配列を有することが好ましい。これは、大腸菌等の細菌において翻訳が始まる際、リボソームが、ｍＲＮＡの開始コドン（ＡＵＧ）の５’側上流にあるＳＤ配列と塩基対相互作用することによって、前記開始コドン（ＡＵＧ）を認識する必要があるためである。このＳＤ配列に相補的な配列は、特に制限されず、従来公知のＳＤ配列をもとに設定できる。
【００２９】
また、この直鎖状ｓｓＤＮＡは、後述するように、その３’末端と５’末端とをライゲーションさせて環状化を行うが、環状ｓｓＤＮＡのどの配列部分を前記直鎖状ｓｓＤＮＡの両末端に設定するかは特に制限されない。具体例としては、例えば、図２に示すように、ＳＤ配列の相補配列の一部を直鎖状ｓｓＤＮＡの３’末端とし、残りの部分を５’末端として、後述するライゲーションによって完全にＳＤ配列に相補的な配列となるように設定してもよい。
【００３０】
このような直鎖状ｓｓＤＮＡは、例えば、従来公知の化学合成法等によって合成し、その５’末端をリン酸化して調製することができる。また、例えば、末端をビオチン化したプライマーと、リン酸化したプライマーとを用いてＰＣＲを行い、ビオチン−アビジン相互作用を用いて二本鎖を一本鎖にすることによって、直鎖状ｓｓＤＮＡを調製することもできる。
【００３１】
つぎに、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの環化は、例えば、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの両末端をＤＮＡリガーゼで結合することによって行うことができる。
【００３２】
前記ＤＮＡリガーゼは、特に制限されないが、例えば、T4 DNAリガーゼ、E.coli DNAリガーゼ、Pfu DNAリガーゼ等があげられ、これらの中でもT4  DNAリガーゼが好ましい。
【００３３】
前記DNAリガーゼによるライゲーション反応は、例えば、split DNAの存在下で行うことが好ましい。本発明において、前記split DNAとは、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの連結領域の数十塩基と二重鎖を形成できる相補的な配列からなるＤＮＡをいう。
【００３４】
split DNAを用いたライゲーション方法の一例を図３に基づいて説明する。同図（ａ）に示すように、直鎖状ｓｓＤＮＡを、その両端の塩基配列に相補的な配列を併せ持つsplit DNAの存在下で反応させる。すると、同図（ｂ）に示すように、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの両端と前記split DNAとが塩基対を形成し、この塩基対によって直鎖状ｓｓＤＮＡの環化状態が保持される。つまり、前記split DNAが、直鎖状ｓｓＤＮＡの環化のアダプターとしての役割を果たす。そして、同図（ｃ）に示すように、前記split DNAによって環化が保持された状態で、ＤＮＡリガーゼにより前記直鎖状ｓｓDNAの両末端がライゲーションされる。
【００３５】
前記split DNAの長さは、特に制限されないが、例えば、１０〜４０ｎｔの範囲が適当である。
【００３６】
前記ライゲーション反応の条件は、使用するＤＮＡリガーゼの種類や直鎖状ｓｓＤＮＡの濃度等に応じて適宜決定できるが、例えば、0.1〜10μM 直鎖状ssDNA、0.3〜30μM split DNA、20mM NaCl、1〜15mM MgCl2、10mMジチオトレイトール（ＤＴＴ）、10μM ATP、0.33U/μL DNA  リガーゼおよび2.5mM Tris-HCl（pH7.5）を含む反応溶液において、通常、温度２５℃で１〜１２時間で反応させればよい。また、前記反応溶液は、市販の製品を使用してもよい。なお、split DNAの濃度は、直鎖状ｓｓＤＮＡ濃度よりも高濃度であることが好ましい。
【００３７】
このように、split DNAを用いて環状ｓｓＤＮＡを作成した場合、前記図３（ｃ）に示すように部分的に二本鎖を含むこととなるが、例えば、これを変性アクリルアミドゲル電気泳動に供して精製することによって、前記split DNAを除去した環状ｓｓＤＮＡを得ることができる。
【００３８】
（２）環状ｓｓＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成
前記環状ｓｓＤＮＡを鋳型として、無細胞抽出液を含む反応溶液を用いた無細胞タンパク質合成系において目的タンパク質の合成を行う。このように無細胞タンパク質合成系において、鋳型としてＤＮＡを使用する場合には、同じ反応系においてｍＲＮＡ合成（転写）とタンパク質合成（翻訳）が行われる。なお、前記環状ｓｓＤＮＡからｍＲＮＡを予め合成しておき、このｍＲＮＡを鋳型として、無細胞タンパク質合成系に供することもできるが、これについては後述する。
【００３９】
前記無細胞抽出液としては、特に制限されないが、例えば、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球等の抽出液が使用でき、これらの抽出液は、例えば、材料に応じ従来公知の方法によって調製できる。具体的に、大腸菌の無細胞抽出液は、例えば、Ellmanらの方法（Methods  Enzymol.202:301-336（1991））の方法によって調製できる。
【００４０】
前記反応溶液は、前記無細胞抽出液および鋳型となる環状ｓｓＤＮＡの他に、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、タンパク質を構成する各種アミノ酸、各種緩衝剤、ATP、GTP、CTPおよびUTP等のエネルギー源、クレアチンリン酸、ホスホエノールピルビン酸、クレアチンキナーゼおよびピルビン酸キナーゼ等のＡＴＰ再生系、ジチオスレイトール(DTT)、スペルミンおよびスペルミジン等の安定化剤、ＲＮａｓｅ阻害剤等を添加することが好ましい。また、これらの添加量は、使用する鋳型の環状ｓｓＤＮＡの量等に応じて適宜決定できる。
【００４１】
前記ＲＮＡポリメラーゼの種類は特に制限されず、例えば、鋳型ｓｓＤＮＡにおけるプロモーターの種類に応じて適宜決定してもよい。具体的には、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、E.coli ＲＮＡポリメラーゼ等が使用できる。
【００４２】
また、このような無細胞タンパク質合成には、市販の無細胞タンパク質合成キットを使用することもできる。具体的には、例えば、商品名E.coli S30 Extract system(プロメガ社製)、E.coli T7 S30 Extract（プロメガ社製）、PROTEIN script-Pro(Ambion社製）等が使用できる。これらのキットは、それらの使用方法に準じた条件で使用できる。
【００４３】
タンパク質合成の反応条件は、特に制限されず、使用する無細胞抽出液や目的のタンパク質の種類等に応じて適宜決定できる。
【００４４】
このような方法によれば、前記環状ｓｓＤＮＡを鋳型とするｍＲＮＡ合成と、前記ｍＲＮＡを鋳型とするタンパク質合成とが、並行して同じ無細胞タンパク質合成系において進行する。
【００４５】
前記環状ｓｓＤＮＡを鋳型として使用すれば、前述のように、前記環状ｓｓＤＮＡに相補的なポリヌクレオチドが連続して転写され、前記ポリヌクレオチドを複数含む長鎖のｍＲＮＡを得ることができる。このように、１分子の環状ｓｓＤＮＡから前記ポリヌクレオチド配列を複数含むｍＲＮＡが合成されるため、鋳型ＤＮＡを一回転写する度にＲＮＡポリメラーゼが解離して転写が終結する従来の方法に比べて、極めて短時間で効率よく、複数の前記ポリヌクレオチド配列を合成できる。そして、このように目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を多く含むｍＲＮＡが合成されることによって、それだけタンパク質合成の鋳型が増加することになるため、タンパク質の合成効率も向上するのである。
【００４６】
このようにして合成された目的のタンパク質は、例えば、アフィニティーカラムクロマトグラフィー等の従来公知の方法によって精製すればよい。
【００４７】
また、前述のように、前記ｍＲＮＡ合成工程（転写工程）およびペプチド合成工程（翻訳工程）を同じ無細胞タンパク質合成系において同時に行うのではなく、予め調製したｍＲＮＡを鋳型として、無細胞タンパク質合成系において目的タンパク質を合成してもよい。
【００４８】
この場合は、ｍＲＮＡ合成は、前記環状ｓｓＤＮＡを鋳型として、前述のようなＲＮＡポリメラーゼによる転写反応によって行うことができる。
【００４９】
前記反応には、ＲＮＡポリメラーゼ以外に、通常、各種ＮＴＰ（ATP、GTP、CTP、UTP）、ＲＮａｓｅインヒビター、各種緩衝剤等を必要とする。また、反応条件は、使用するＲＮＡポリメラーゼの種類等に応じて適宜決定できるが、例えば、ｐＨ７．０〜８．５の範囲、温度３７℃、時間１〜１２時間の範囲が好ましい。
【００５０】
得られたｍＲＮＡを含む反応物は、例えば、そのまま次の工程に供してもよいし、各種カラムで精製してから使用してもよい。
【００５１】
そして、得られた前記ｍＲＮＡを鋳型として、前述の無細胞タンパク質合成を行う。なお、使用する無細胞抽出物や条件等は同様である。
【００５２】
【実施例】
（実施例１）
（Ｈｉｓ）6のコード配列と相補的な配列を有する環状ｓｓＤＮＡを調製し、無細胞タンパク質合成系において（Ｈｉｓ）6の合成を行った。
【００５３】
（１）環状ｓｓＤＮＡの作製
（直鎖状ｓｓＤＮＡの作製）
環状化させる直鎖状ｓｓＤＮＡとして、配列番号１に示す配列（5'-CTGTTTCCT(T)20CTA(ATG)6CATAG-3'）（55nt）を設計し、これをＤＮＡ自動合成機（商品名ＤＮＡシンセサイザーModel391：アブライドバイオシステムズ社製）を用いたホスホロアミダイト法によって固相合成し、その５’末端をリン酸化用ホスホロアミダイト試薬（商品名化学リン酸化試薬：Glen Reseach社製）によってリン酸化した。なお、配列番号１において、５’末端の5'-CTGTTTCCTおよび３’末端のAG-3'が、ＳＤ配列の相補配列であり、CTA(ATG)6CATが、終始コドンおよび開始コドンを含むコード配列の相補配列である。
【００５４】
（直鎖状ｓｓＤＮＡの環状化）
まず、5× ligation buffer （75mM MgCl2、100mM NaCl、125mM Tris-HC1(pH77.5)）に、１μＭの前記環状化させるssDNAおよび３μＭのsplint DNA（配列番号２：5'-AGGAAACAGCTATGCATC-3'）を添加して、反応溶液を調製した。なお、反応溶液におけるMgCl2、NaClおよびTris-HC1の終濃度は、15mM MgCl2、20mM NaCl、25mM Tris-HC1である。そして、この反応溶液を９０℃で１０分間インキュベートした後、2時間かけて前記反応溶液の温度を室温まで戻した。つぎに、前記反応溶液に、最終濃度が10ｍM DTTおよび100μM ATPとなるように、1M DTTおよび100mM ATPを添加し、さらに、最終濃度がO.33units／μLとなるようにT4 DNA リガーゼ(400U／μL：New England Biolabs社製)を添加して、２５℃で１２時間、ライゲーション反応を行った。このsplit DNAおよびＤＮＡリガーゼを用いた環状ｓｓＤＮＡの生成反応を図４に示す。
【００５５】
（環状ｓｓＤＮＡの精製）
前記反応溶液を、透析チューブ(MWCO 1000：商品名Spectra-Por、Spectrum社製)を用いて透析し、透析後の溶液を凍結乾燥した。この凍結乾燥品を７Ｍ尿素水溶液に懸濁し、15% 変性ポリアクリルアミドゲルにアプライし、環状ｓｓＤＮＡ、直鎖状ｓｓＤＮＡ、splint DNA とを電気泳動により分離した。目的の環状ｓｓＤＮＡ画分のゲルを切り出し、これを細かく砕き、さらに０．２Ｎ ＮａＣｌ ５〜１０ｍＬを添加して、２５℃で１２時間シェイクし、環状ｓｓＤＮＡを抽出した。その後、フィルターを用いて前記ゲル断片を除去し、得られた溶液を再度前記透析チューブを用いて１２時間透析した後、透析溶液を凍結乾燥した。この凍結乾燥品を７Ｍ尿素水溶液に懸濁し、７Ｍ尿素を含む１５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果、図５の電気泳動図に示すように、直鎖状ｓｓＤＮＡ（レーン１）が環化されたことによって、環状ｓｓＤＮＡ（レーン２）が生成されていることが確認できた。
【００５６】
（２）  ペプチドの発現
調製した前記環状ssDNAを鋳型として転写・翻訳を行い、（Ｈｉｓ）6ペプチドを発現させた。無細胞タンパク質合成システム系としては、以下に示す組成の市販品：商品名E.coli S30 Extract system(Promega)を使用し、その使用方法に準じて反応（３７℃、２時間）を行った。
【００５７】
0004198387.tif 000002
【００５８】
なお、環状ｓｓＤＮＡを鋳型として使用した場合に、これに相補的なポリヌクレオチド配列を複数有する長鎖のｍＲＮＡが形成されるか否かを別途確認した。これは、まず、前記環状ｓｓＤＮＡについて、E.coli ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応（３７℃、３時間）を行い、得られた転写産物を、２％未変性アガロースゲル電気泳動に供した。前記反応液の組成は、環状ｓｓＤＮＡ １μＭ、５０Ｕ ＲＮＡポリメラーゼ、５００μM ＮＴＰｓ、１２．５U/mL ＲＮａｓｅ阻害剤（プロメガ社製）とした。電気泳動の結果、図６に示すように、転写産物のＲＮＡは、アガロースゲルのウェル付近に止まったことから、約1000nt以上の長鎖ｍＲＮＡが得られたことが確認できた（レーン２の矢印）。なお、同図においてレーン１は、分子量マーカー（726、427、311、249bp）である。
【００５９】
また、比較例１として、前記環状ｓｓＤＮＡの代りに、（Ｈｉｓ）6をコードする塩基配列を含むdsDNAを鋳型とした以外は、前記環状ssDNAと同様にしてペプチド発現を行った。この比較例のｄｓＤＮＡの配列は、配列番号３のセンス鎖を持つ、以下の配列となるように設計し、自動合成機により化学合成した。なお、アンチセンス鎖における 3'-dTTACTCGACAACTGTTAATTAGTAGGCCGAGCATATTACACACCTTの配列は、E.coli taq promoter配列である。
【００６０】
【化１】
0004198387.tif 000003
【００６１】
（３）合成ペプチドの精製
目的のペプチドを、前記無細胞タンパク質合成系における反応生成物からニッケルキレートカラム(商品名HiTrap Chelating: Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製した。まず、前記カラムを１ｍＭ Ｎｉ2+を含むＰＢＳ(Phosphate-bufferd saline：pH7.4)により平衡化した。そして、前記反応溶液２５μＬを前記ＰＢＳで計１ｍＬにボリュームアップして、平衡化した前記カラムにアプライし、さらに１０ｍＬの前記ＰＢＳを流した後、200mM イミダゾール溶液で溶出を行った。溶出液は１ｍＬのフラクションごとに回収した。各フラクションごとに透析チューブ（ＭＷＣＯ500：商品名Spectra-Pro：Spectrum社製）を用いて透析を行い、この透析液を必要に応じて凍結乾燥した。
【００６２】
（４）合成ペプチドの確認
合成ペプチドとして目的の（Ｈｉｓ）6が合成されているか否かを、商品名MALDI-TOF mass spectrometer（商品名Voyager：PerSeptive社製）を用いたマススペクトル（ＭＳ）によって確認した。ＭＳに使用するペプチド用マトリックスは、α-cyano-4-hydroxyclannamic acids(αCHCA：MW189.17)１０ｍｇに、アセトニトリル５００μＬ、水４９７μＬおよび０．１％ＴＦＡ３μＬを添加して調製した。合成ペプチドのサンプルは、約１０μmol／Ｌの濃度となるように調製した。そして、調製したサンプルと前記マトリックスとを１：４（体積比）の割合で混合して、測定に供した。なお、コントロールとしては、化学合成品である標品（Ｈｉｓ）6を使用した。
【００６３】
これらの結果を図７に示す。同図はペプチドのマススペクトルであり、同図（Ａ）が実施例の結果、同図（Ｂ）がコントロールの結果をそれぞれ示す。
【００６４】
（５）合成ペプチド発現量の確認
公知のオルト−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）法によって、合成ペプチドの発現量を確認した。ＯＰＡ法は、試料に水を添加して１０μＬとし、これに下記ＯＰＡ試薬１００μＬを混合して、室温で１５分放置後、さらに０．５Ｍ ＮａＣｌ １ｍＬを混合して、その蛍光を測定した。測定条件は、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４４０〜４５５ｎｍとした。
【００６５】
（ＯＰＡ試薬）
ＯＰＡ１２０ｍｇをエタノール１．５ｍＬに溶解し、１．０Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ１０．４）１００ｍＬに加え、さらに、３０重量％Ｂｒｉｊ３５を０．６ｍＬ添加した。そして、使用３０分前までに、前記混合液１ｍＬあたり３μＬの２−メルカプトエタノールを添加して、ＯＰＡ試薬を調製した。
【００６６】
これらの結果を図８に示す。同図は、合成ペプチドの発現量を蛍光強度で表わしたグラフである。
【００６７】
実施例１における合成ペプチドは、前記図７（Ａ）のマススペクトルに示すように、前記図７（Ｂ）のコントロール（Ｈｉｓ）6のピーク（m/z 882.76）と同様のピーク（m/z 882.98）を示している。このことから、実施例において環状ｓｓDNAを使用することによって、（Ｈｉｓ）6を合成できることが確認された。また、図７（Ａ）においては、前記（Ｈｉｓ）6のピーク以外に、二つのピークが見られるが、これらはそれぞれ（Ｈｉｓ）5（m/z 768.88）および（Ｈｉｓ）6Ｍｅｔ（m/z 1052.24）を示していると考えられる。
【００６８】
なお、実施例１における無細胞タンパク質合成により得られた合成ペプチド（Ｈｉｓ）6およびコントロールの化学合成ペプチド（Ｈｉｓ）6の化学式を以下に示す。
【００６９】
【化２】
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【００７０】
そして、実施例１において得られたペプチド（Ｈｉｓ）6の発現量として、蛍光強度を測定した結果、前記図８に示すように、dsDNAを用いた比較例に比べて、環状ssDNAを用いた実施例１によれば、非常に高い蛍光強度が得られた。具体的には、Fraction１において比較例の約４０倍、Ｆraction２において比較例１の約４０倍の蛍光強度を示しており、前記蛍光強度は、ペプチドの発現量と相関関係にあることからも、極めて優れた発現量でペプチドが合成されたといえる。このことから、実施例１における環状ssDNAによれば、ペプチドの発現量を増加でき、効率よくペプチド合成が行えることいえる。
【００７１】
【発明の効果】
このように、本発明の製造方法によれば、前記ＤＮＡを鋳型として転写したｍＲＮＡが、前記ＤＮＡに対して相補的な配列を複数有するｍＲＮＡであるため、効率よく目的タンパク質やペプチドを発現することができる。このような方法によれば、迅速かつ簡便に所望のタンパク質やペプチドを合成することができる。
【００７２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の製造方法における、環状ｓｓＤＮＡからｍＲＮＡの転写工程を示す概略図である。
【図２】本発明の実施形態において、環状ｓｓＤＮＡの前駆体となる直鎖状ｓｓＤＮＡの末端配列の一例を示す概略図である。
【図３】本発明の実施形態において、直鎖状ｓｓＤＮＡを環化して環状ｓｓＤＮＡを調製する工程の一例を示す概略図である。
【図４】本発明の一実施例において、直鎖状ｓｓＤＮＡを環化して環状ｓｓＤＮＡを調製する工程を示す概略図である。
【図５】前記実施例において、環状ｓｓＤＮＡの生成を確認した電気泳動図である。
【図６】前記実施例において、環状ｓｓＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの電気泳動図である。
【図７】前記実施例における合成したペプチドのマススペクトルであって、同図（Ａ）は、実施例のマススペクトル、同図（Ｂ）はコントロールのマススペクトルを示す。
【図８】前記実施例における合成ペプチドの発現量を蛍光強度で示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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