(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンガン酸化能を有し、リグニン分解能を有するロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）１５−６株（FERM P-17063）の培養物またはその処理物を用いてリグニンを処理することを特徴とするリグニンの分解方法。
【請求項２】
マンガン酸化能を有し、リグニン分解能を有するロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）１５−６株（FERM P-17063）の培養物またはその処理物を含むことを特徴とするリグニン処理剤。
【請求項３】
マンガン酸化能を有し、リグニン分解能を有するロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）１５−６株（FERM P-17063）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物を用いるリグニンの分解方法及びリグニン処理剤に関する。さらに詳しく言えば、マンガン酸化細菌を用いるリグニンの分解方法及びリグニン処理剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、木材、あるいはもみ殻、バガスなどの植物廃材料のバイオマスとしての有効利用が検討されている。しかし、一般に植物は、リグニンがセルロース繊維またはヘミセルロース繊維を結束することにより形成された非常に堅牢な高分子繊維を含んでおり、これによって体構造を維持している。リグニンによる木質化は、構造材料として用いる場合には有利であるが、バイオマスとしての利用を図る上では障害となる。具体的には、アルカリや酸による分解あるいは機械的な粉砕が必要となるなど、環境面あるいは処理コストの面で種々の問題が生じる。また、木材資源はパルプ原料としても重要であるが、クラフトパルプの製造プロセスでは塩素を用いたリグニンの分解・除去（漂白）処理が必要であり、有害な塩素の使用を低く抑える処理方法が求められている。
【０００３】
一方、生物圏において植物は有機物の重要な貯蔵場所として機能しており、天然の微生物の中には、これを分解・資化して炭素源・エネルギー源として利用する能力を有するものが存在する。なかでも、白色腐朽菌は、菌体外酵素を分泌することによってリグニンを分解し、生態系における炭素循環サイクル上、非常に重要な役割を担っていると考えられる。そこで、従来の化学的あるいは機械的な手法に代わる、リグニン分解菌の菌体外酵素を利用したリグニン分解法が注目されている。これらリグニン分解菌は菌体外にリグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）、ラッカーゼ等の酵素を分泌することでリグニンを分解している。中でも、白色腐朽菌のカワラタケやファネロケーテ・クリソスポリウム等が代表的な菌として注目され、研究開発されている。しかしながら、現在のところ強力なリグニン分解活性を有する菌は見つかっておらず、またこれらの菌は増殖能力が低く、培養などにも多大な時間を要し、実用化の上で大きな障害となっている。
【０００４】
これら分解菌によるリグニン分解の機能の詳細は明らかではないが、ＭｎＰについては、Ｈ2Ｏ2の存在下、Ｍｎ（II）をＭｎ(III)に酸化し、Ｍｎ(III)がリグニン、リグニン誘導体その他のフェノール類化合物の酸化分解に関与しているものと考えられている。
一方、マンガン酸化細菌は、Ｍｎ（II）をＭｎ(IV)に酸化する細菌として知られており（Leptothrix discophora等，Appl. Environ. Microbiol., 63, (7), 2502〜2506(1997)）、反応の途中でフリーのＭｎ(III)が一部できていると考えられる。従って、本発明者らはマンガン酸化細菌自体によっても、ＭｎＰの作用と同様にリグニンを分解できるのではないかと考えて検討した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、自然界に存在するマンガン酸化細菌の中からリグニン分解活性に優れたものを選出し、その細菌を用いたリグニンの分解方法及びリグニン処理剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、自然界からマンガン酸化能の強い微生物を選出し、さらにそれらについてフェノールオキシダーゼ生産によるグアヤコールの重合着色反応を利用してリグニン分解活性能との関係について検討すべく、北海道東部のマンガン鉱床地区より採取したマンガン酸化細菌について鋭意スクリーニングを行なった。その結果、マンガン酸化能の強い細菌がリグニン分解能にも優れていることを確認して本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のグニン分解方法、リグニン処理剤及びそれらに利用し得る新規な微生物に関する。
【０００７】
１）  マンガン酸化細菌の培養物またはその処理物を用いてリグニンを処理することを特徴とするリグニンの分解方法。
２）  マンガン酸化細菌がロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）に属する細菌である前記１に記載のリグニン分解方法。
３）  ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）に属する細菌が、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）１５−６株（FERM P-17063 ）である前記２に記載のリグニン分解方法。
４）  マンガン酸化細菌の培養物またはその処理物を含むことを特徴とするリグニン処理剤。
５）  マンガン酸化細菌がロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）に属する細菌である前記５に記載のリグニン処理剤。
６）  ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）に属する細菌がロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）１５−６株（FERM P-17063） である前記５に記載のリグニン処理剤。
７）  ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）１５− ６株（FERM P-17063）。
【０００８】
以下、本発明について詳述する。
（Ｉ）マンガン酸化細菌
本発明者らは、北海道東部のマンガン鉱床地区より採取した細菌について、まず、ＭｎＳＯ4(Ｍｎ2+）をＭｎＯ2(Ｍｎ4+）に酸化するマンガン酸化活性を指標として５５４株について一次スクリーニングを行なった。その結果５０株にマンガン酸化活性を認めた。その中の活性の強い７株について後述するフェノールオキシダーゼ生成によるグアヤコールの重合着色反応を用いたリグニン分解モデル反応により２次スクリーニングを行ない、リグニン分解活性の強い４株を選出した。
【０００９】
それらの菌株のＳＳＵ（１６Ｓ）ｒＲＮＡ（リボソームの小サブユニットの１６ＳＲＮＡ）遺伝子配列を遺伝子データ・ベースに登録されている公知菌株のデータと比較したところ、４株ともロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）ＮＣＩＭＢ１１５７６(FEMS Mivrobiol., Ltter, 112, 61〜66,(1993))の遺伝子データと97.3％一致した（４株間では１００％一致した。） 。
さらに、斎藤らによる近隣結合法（Saitou,N.,and M.Nei.1987,The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees, Mol.Bio.Evol.4:406-425）により系統解析して図１に示す結果を得た。
【００１０】
本菌株は分類学上、紅色非硫黄細菌Ｉ型の一種であるロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）に属する細菌であると考えらる。ロド シュードモナス・ブラスチカ属がマンガンを酸化することは従来知られていないこと、マンガン酸化細菌がリグニン分解活性をも有することは本発明者らが初めて見出したことから本菌株をロドシュードモナス・ブラスチカ１５−６（Rhodopseudomonas blastica 15-6）株と命名し工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（FERM P-17063）。
【００１１】
以上のように、マンガン酸化能に優れたロドシュードモナス・ブラスチカ１５−６（Rhodopseudomonas blastica 15-6）は、リグニン分解能を有することが確認された。本発明に使用する細菌はマンガン酸化能を有するものであればよく、上記のロドシュードモナス・ブラスチカ１５−６（Rhodopseudomonas blastica 15-6）に限定されるものではない。マンガン酸化能を有する細菌としてはレプトスリクス・ディスコホラ（Leptothrix discophora）、放線菌等が知られており 、これらの細菌をも使用することが出来る。
【００１２】
（II）培養条件
本発明においては、上記の菌株を好気的または嫌気的条件、好ましくは好気的条件下で培養する。
好気培養は、通常の中温菌の培養に準じ、振盪培養により行なえばよい。培養液のｐＨは２〜８、好ましくはｐＨ４〜８、さらに好ましくはｐＨ7.5である。
培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃である。培養を継続する時間は、目的とするリグニン含有物質中のリグニンを分解するのに十分な時間であればよく、通常は１〜２０日間、好ましくは１〜２週間程度である。
嫌気培養は、上記の好気培養に準じるが、静置培養を行う。
【００１３】
培地は、通常の微生物の培養に用いるものであれば特に制限されない。
例えば、ブイヨン培地、ペプトン水培地等が知られている。好ましくは、後述するタガ・ゾーベル（Taga−Zobell）培地（以下、ＴＺ培地と略する。）である。培地には、必要に応じて２価のマンガンイオン等を添加することができる。
培地には、さらに必要に応じて各種の炭素源あるいは窒素源を添加する。炭素源としては、ブドウ糖、ショ類、マルトース、サッカロース、上白糖、黒糖、糖蜜、廃糖蜜、マルツエキス等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、グルテンミール、大豆粉、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム塩、尿素等が挙げられる。その他、必要に応じて、ナトリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、カルシウム塩、リン酸塩等の無機塩類や、イノシトール、ビタミンＢ1塩酸塩、Ｌ−アスパラギン、ビオチン等のビタミ ン類を添加してもよい。
【００１４】
（III）リグニン分解方法
本発明によるリグニン分解方法は、上記した本発明のリグニン分解活性を有する細菌（の培養物またはその処理物）でリグニンを処理することにより行なわれる。例えば、上記の培養液にリグニン含有物質を添加するか、逆にリグニン含有物質に上記の培養液またはその抽出成分を添加して処理する。バッチ法、連続法、半連続法等のいずれをも用いることができる。また、本発明の菌を含有するものであれば、他のリグニン分解菌と共に用いてもよい。
培養液にリグニン含有物質を添加して処理する場合は、上述のリグニン分解活性を有する細菌の培養条件に準じて行なうことが出来る。
【００１５】
（IV）リグニン処理剤
本発明によるリグニン処理剤は液状であると固形化物であるとを問わない。すなわち、上記のリグニン分解活性を有する培養液自体をリグニン処理剤として用いることができる。また培養液を乾燥し製造助剤を加えて固形剤としたものを、処理するリグニン含有物質自体に、または処理媒体中に添加して使用することもできる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例により、本発明をより具体的に説明する。
実施例１：リグニン分解活性を有するマンガン酸化細菌の分離
（１）マンガン酸化細菌の分離
北海道東部のマンガン鉱床近傍より細菌を採取した（菌数は1.68×１０6個／ ｍｌ）。採取細菌群を、１ｍＭ硫酸マンガンを含む１／２濃度のＴＺ寒天培地（ポリペプトン（Daigo社製）2.5ｇ；バクト酵母抽出物（Difco社製）0.5ｇ；ＨＥＰＥＳ（同仁化学社製）4.77ｇ（終濃度２０ｍＭ）；バクトアガー（Difco社製 ）15.0ｇ；ケスターの人工海水（Kester's artificial seawater）２００ｍｌ；蒸留水８００ｍｌ，ｐＨ7.5）上に塗布し、２０℃で１４日間培養して５５４株 を分離した。
【００１７】
これらの菌株の中からマンガン酸化活性のある菌を以下の方法を用いて選出した。
Ｍｎ（II）存在下では無色であるが、Ｍｎ(IV)存在下では濃青色を呈する試薬ＴＭＢＺ・ＨＣｌ（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,dihydrochloride,dihydrate；同仁化学社製）（0.8％）を噴霧する。Ｍｎ（II）をＭｎ(IV)に酸化する活 性を有する菌株は青変する。また、上記と同寒天培地上に酸化マンガンＭｎＯ2 （Ｍｎ（IV))を塗布し、ＴＭＢＺ・ＨＣｌ試薬を噴霧して、この青色を陽性対照（Positive  control）とした。青変した菌株であるマンガン酸化活性を有する 株は５０株（全体の9.0％）であった。そのうち、特に活性の強い１４−１９株 、１５−６株、１５−９株、１５−１８株、１７−１４株、１８−１２株、１８−２５株の７株（全体の1.3％）を選出した。
【００１８】
（２）リグニン分解菌の分離
上記の７株に対して、リグニン分解活性のある菌を以下の方法を用いて選出した。
改変ＴＺ寒天培地（ポリペプトン（Daigo社製）2.5ｇ；バクト酵母抽出物（Difco社製）0.5ｇ；ＨＥＰＥＳ（同仁化学社製）4.77ｇ（終濃度２０ｍＭ）；バクトアガー（Difco社製）15.0ｇ；蒸留水1000ｍｌ，ｐＨ7.5）に0.02％グアヤコール（guaiacol）を添加し、さらに１ｍＭ硫酸マンガンの添加または無添加培地上で、前記で選出した７株を３０℃で１４日間培養した。その後、リグニン分解活性の検出には、リグニン分解菌がリグニン分解時に使用する酵素であるフェノールオキシダーゼを生産することによるグアヤコールの重合着色（赤変）反応を用いた（木材学会誌，34, 530〜536(1988)）。その結果、赤変したリグニン分解活性株は上記７株のうち１５−６株、１５−９株、１５−１８株、１８−２５株の４株であった。これら４株のうち、増殖能力の高い１５−６株、１５−９株の２株を選出した。
【００１９】
実施例２：マンガン酸化細菌によるβ−Ｏ−４型リグニンモデル化合物の分解
リグニンモデル化合物として、下記式
【化１】
0004129498.tif 000002
で示される、活性の定量測定に有用なグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテル（以下、ＧＧと略する。）を用い、実施例１で選出した１５−６株、１５−９株の２株による分解を試みた。ＧＧの分解率を、ＨＰＬＣにより検出した。
１／２濃度の改変ＴＺ培地（寒天マイナス）にＧＧを終濃度が２μＭとなるように添加し、培養用チューブに５ｍｌ入れる。各チューブに１５−６株、１５−９株をそれぞれ添加し、１２日間、３０℃で振盪培養した。
培養後、遠心処理により回収した菌を音波破砕処理し、酢酸エチル溶液による抽出を行なった。抽出液を濃縮乾固した後、メタノール２ｍｌに溶解し、うち１ｍｌに蒸留水１ｍｌを加え試料溶液とし、その１０μｌをＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣの条件としては、移動相として１０ｍＭリン酸（ｐＨ2.5）緩衝液：メタ ノール＝６：４の割合で調合されている溶液を用い、カラムにはμＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ（５μ，Ｃ１８，１００オングストローム，3.9×150ｍｍ）を用いた。流速は0.7ｍｌ／ｍｉｎ、検出は２８０ｎｍで行なった。その結果、ＧＧの分 解率は１５−６株が7.4％、１５−９株が4.0％であった。
【００２０】
実施例３：マンガン酸化細菌１５−６株のＳＳＵｒＲＮＡ遺伝子のシーケンス決定
実施例２で最もＧＣ分解率の高かったマンガン酸化細菌１５−６株について近隣結合法による系統解析を行なうため、ＳＳＵｒＲＮＡ遺伝子のシーケンスを決定し、シーケンス解析により微生物の属種の同定を行なった。
（１）ＤＮΑ抽出
１５−６株菌体からのＤＮＡ抽出は以下のように行なった。２週間、３０℃で培養した１／２ΤΖ改変寒天培地プレートより滅菌水とともにコロニーを回収して１ｍｌの菌液とした。その菌液を5,000ｒｐｍ、３分の遠心により集菌して菌 体を得た。菌体は３６μｌのＴΕ（１０ｍΜ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ8.0）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、凍結・融解を２回行なった。その後、４μｌの１ ０ｍｇ／ｍｌリゾチーム（最終濃度１ｍｇ／ｍ１）を加えて、５０℃で３０分インキュベートした。さらにｌ０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ プロテインキナーゼＫ（ 最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）と５０μｌのＢＬ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐΗ8.0）、１％ Ｔｗｅｅｎ２０、0.2％ Νｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、0.2ｍＭＥＤＴＡ）を加えてさらに３０分インキュベートした。９０℃、１０分のイン キュベーションでプロテインキナーゼＫを失活させた後、その１μｌを以下に示すΡＣＲ反応に用いた。
【００２１】
（２）ＰＣＲ増幅
ΡＣＲ反応はタカラ・ＰＣＲサーマルサイクルＭＰ（TakaraPCR Thermal Cycle MP；宝酒造社製）を用いて行なった。ＰＣＲに用いたプライマー・セットは真性細菌の小サブユニット・リボソーマルＦＬＮＡ（ＳＳＵ（１６Ｓ）ｒＲＮＡ）遣伝子のほぼ全長（１１−1511塩基部位）を特異的に増幅できるように設計したEub11 Ｆ３ＭＸ（５’−ＴＧＲＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＹΑＣ（配列番号１））ならびにEubl511 Ｒ１ΜＸ（５’−ΤＧＧＨＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ（配列番号２））を用いた。ＰＣＲのサイクル・プログラムは９５℃、２分のプレヒーティングの後に、２５サイクルのＰＣＲを行なった。１サイクルの構成は、変性ステップを９５℃、３０秒、アニーリング・ステップを５０℃、３０秒、伸長ステップを７２℃、１分として行なった。
得られたＰＣＲの増幅産物をｌ％のアガロースゲル電気泳動により生成量および長さを確認した後、スピン・カラム（QIA quick PCR Ρurification Kit，QIAGEN社製）によって精製してシーケンス用の鋳型ＤＮΑとした。
【００２２】
（３）シーケンス決定
シーケンスの決定はクロ−ニングを介さずにＰＣＲ増幅産物のダイレクト・シーケンスによって行なった。シ−ケンスの決定は増幅されたＳＳＵｒＲＮＡ遺伝子の約１／３にあたる９００−1400塩基部位付近について行なった。シーケンス・プライマーとしてはEub906Ｆ（５’−ΑΑＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡΑＴＴＧＲＣＧＧ（配列番号３））ならびにEub1405Ｒ（５’−ＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧ ＴＲＣＡ（配列番号４））を用い、シーケンスの決定はΑＢＩ３７７蛍光自動シーケンサー（パーキン・エルマー社製）を用い、シーケンス反応は専用キットであるビッグ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンス・キット（BigDye terminator Cycle sequence kit；パーキン・エルマー社製）を用いて行なった。その結果、配列番号５に示す配列を得た。
【００２３】
（４）系統解析
近隣結合法による系統解折は系統解析プログラムＰＨＹＬＩΡを用いて行なった。
前記で得た配列番号５のシーケンス・データをデータ・ベース（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ，ＥＭＢＬ，ＤＤＢＪ，ＲＤΡ）から集めた既に報告されているロドバクター（Rhodobacter）グループのＳＳＵｒＲＮＡ遺伝子配列とともにプログラム ・パッケージＣｌｕｓｔａｒ−Χを用いてアライメントした。
配列番号５のシーケンス・データは、一次的比較においてロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）ＮＣＩＭＢ１１５７６(FEMS Microbiol. Letter, 112, 61〜66,(1993))の遺伝子データと97.3％一致した。さらに 統計的処理で遺伝子レベルについて比較したところ９９％一致した。他のロドバクター（Rhodobacter）グループのＳＳＵｒＲＮＡ遺伝子配列と近隣結合法によ る遺伝子レベルで比較した系統樹を図１に示す。
以上の結果から本菌株１５−６株はロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）であると同定した。本菌株はロドシュードモナス・ブラ スチカ１５−６（Rhodopseudomonas blastica 15-6）として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（FERM P-17063）。
【００２４】
【発明の効果】
本発明はマンガン酸化細菌の培養物またはその処理物を用いてリグニンを処理することを特徴とするリグニンの分解方法及びリグニン処理剤を提供したものである。特に本発明者らが見出したロドシュードモナス・ブラスチカ１５−６（Rhodopseudomonas blastica 15-6）は、リグニン分解能を示し、バイオマスの有効利用、パルプ漂白などリグニン分解が必要となる産業各分野において利用し得る。さらに本細菌を用いたリグニンの生分解方法及びリグニン処理剤は、製紙工業、産業廃棄物処理工業、土壌改良などの分野で利用可能である。
【配列表】
0004129498.tif 000003
0004129498.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】  近隣結合法によるロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）１５−６のＳＳＵｒＲＮＡ遺伝子解析の系統樹である。図中 の目盛りの「0.01」は遺伝的近隣度を表わし、他の数値は統計処理によるＳＳＵｒＲＮＡ遺伝子の一致率である。
【図１】
0004129498.tif 000006