(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の過程(i)〜(vi)を含む調製法によって得られるカルシウム塩結晶化抑制能を有する酵母菌由来タンパク質:
(i)  ケフィアから分離される酵母菌を温度５〜５５℃およびpＨ５〜７の条  件下で培養し、
(ii) 培養菌体をトリス塩酸緩衝液を用いて処理し、
(iii)回収菌体をＥＤＴＡ水溶液に懸濁させた状態での細胞破砕処理に付し、
(iv) 該細胞破砕処理物の上澄み液を核酸除去処理に付し、
(v)  該核酸除去処理物の上澄み液を透析処理に付し、次いで
(vi) 該透析処理物を濃縮処理に付す。
【請求項２】
５〜１５mＭのトリス塩酸緩衝液を用いる請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
０．３〜０．６ＭのＥＤＴＡ水溶液を用いる請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
細胞破砕処理を超音波破砕機またはフレンチプレスを用いておこなう請求項１記載のタンパク質。
【請求項５】
核酸除去処理を硫酸ストレプトマイシンとＥＤＴＡ水溶液を用いておこなう請求項１記載のタンパク質。
【請求項６】
透析処理を蒸留水を用いておこなう請求項１記載のタンパク質。
【請求項７】
濃縮処理をポリエチレングリコール６０００を用いておこなう請求項１記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項１から７いずれかに記載の酵母菌由来タンパク質を有効成分とする膵臓結石症処置剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明はカルシウム塩結晶化抑制能を有する酵母菌由来タンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人体等の動物体を構成する無機質のうち最も多い成分はカルシウムであり、その約９９％は骨や歯の構成要素であり、残りの約１％は各種酵母の活性や細胞の興奮沈静化等の生命維持作用において重要な役割を果たしている。後者の場合、特定の器官内でカルシウム塩が結晶化して形成される結石が分泌腺等を閉塞すると生体が死に到ることになるが、正常な生体内ではカルシウム塩結晶化抑制能を有する特殊なタンパク質が作り出されるために該結晶化は効果的に抑制されている。
例えば、ヒトの膵臓から小腸管腔内へ分泌される膵液は多種の消化酵素以外に過飽和状態の炭酸カルシウムを含有しているが、該カルシウム塩の結晶化は膵液中に含まれるＰＳＰ(Ｐancreatic  Ｓtone  Ｐrotein; 水性アミノ酸を豊富に含む糖リンタンパク質の１種)によって適切に抑制されている[Ａ．デ・カロら、Ｂiochem．Ｊ．、第２２２巻、第６６９頁(１９８４年)参照]。
しかしながら、このバランスが何んらかの原因(例えば、加齢に伴うＰＳＰの濃度低下等)によってくずれると、カルシウム塩が結晶化してカルサイト(方解石)状の結石を膵管内に形成するという問題をもたらす。
【０００３】
このような問題の１つの解決策はこのような結石で患う患者にＰＳＰを生体外から投与する方法であるが、ＰＳＰを実用的な臨床的規模で調製する方法は知られていない。このため、ＰＳＰの代替薬としてカルサイトと結合し得る各種のキレート化剤が市販されているが、副作用があるために一般的に使用されるには到っていないのが実情である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
この発明は当該分野の上記の実情に鑑み、副作用のないＰＳＰ代替薬を実用的な臨床的規模で提供するためになされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
即ち、この発明は下記の過程(i)〜(vi)を含む調製法によって得られるカルシウム塩結晶化抑制能を有する酵母菌由来タンパク質に関する:
(i)  ケフィアから分離される酵母菌を温度５〜５５℃およびpＨ５〜７の条  件下で培養し、
(ii) 培養菌体をトリス塩酸緩衝液を用いて処理し、
(iii)回収菌体をＥＤＴＡ水溶液に懸濁させた状態での細胞破砕処理に付し、
(iv) 該細胞破砕処理物の上澄み液を核酸除去処理に付し、
(v)  該核酸除去処理物の上澄み液を透析処理に付し、次いで
(vi) 該透析処理物を濃縮処理に付す。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において用いる酵母菌はケフィアから分離される自体公知のZygosaccharomyces属の酵母菌である。この酵母菌は、常套の分離法によって容易に分離することができる。
【０００７】
ケフィアから分離される上記酵母菌の培養用培地は特に限定的ではなく、この種の酵母菌の培養に常用されているものを適宜使用すればよいが、好適なものとしては蒸留水に酵母エキス２〜５ｇ、麦芽エキス２〜５ｇ、ペプトン３〜８ｇおよびグルコース１０〜１５ｇ溶解させた培地が例示される。
培地のpＨは通常は５〜７の範囲内に調製する。pＨがこの範囲から外れると菌の成育が低下するだけでなく、最終的に得られるタンパク質のカルシウム塩結晶化抑制能が低下するので好ましくない。
培養温度と培養時間は特に限定的ではないが、通常は５〜５５℃、好ましくは２０〜４０℃(特に、２５〜３０℃)および１２〜４８時間(好ましくは１４〜３６時間)である。
また、培養雰囲気としては通常好気条件を採用する。
【０００８】
培養した菌体は遠心分離処理によって分離する。遠心分離は通常４０００〜６０００×ｇで０〜５℃において１０〜２０  分間おこなう。
分離された菌体は、例えば、５〜１５mＭのトリス塩酸緩衝液(pＨ８．０〜９．０)を用いて１回または数回処理する。
処理後の菌体は遠心分離処理に付すことによって回収する。遠心分離は通常２５０００〜３００００×ｇで０〜５℃において１０〜２０分間おこなう。
回収された菌体は約０．５〜３．０倍容量の、例えば、０．３〜０．６ＭのＥＤＴＡ(pＨ８．０〜９．０)水溶液に懸濁させた状態での細胞破砕処理に付す。細胞破砕処理は常法に従い、例えば、超音波破砕機またはフレンチプレス等を用いておこなう。この細胞破砕処理は通常０〜５℃において１０〜２０分間おこなう。
【０００９】
上記の細胞破砕処理物を遠心分離処理に付して得られる上澄み液は核酸除去処理に付する。この場合の遠心分離は通常２５０００〜３００００×ｇで０〜５℃において１０〜２０分間おこなう。また、核酸除去処理は常法に従い、例えば、硫酸ストレプトマイシンと０．３〜０．６ＭのＥＤＴＡ水溶液(pＨ８．０〜９．０)を用いて０〜４℃においておこなう。
核酸除去処理後の上澄み液は適当な透析手段を用いる透析処理に付す。例えば、該上澄み液を透析チューブ[例えば、「ダイアライシスメンブラン２０」(ＷakoＣhem．ＵＳＡ．Ｉnc．製)]に入れ、０〜５℃において蒸留水を３〜４時間間隔で交換しながら１８〜３６時間透析をおこなう。
透析物を適当な濃縮剤、例えば、ポリエチレングリコール６０００を用いて濃縮することによって本発明によるカルシウム塩結晶化抑制能を有する酵母菌由来タンパク質が得られる。
【００１０】
本発明による酵母菌由来タンパク質の特性を明らかにするために、上記の調製法で得られる高分子物質を超遠心分離処理(１０５,０００×ｇ; ４℃; ２時間)に付した後、硫安分画処理(４０〜８０％)に付すことによって精製した。
この精製試料に対する種々の酵素の影響を検討するために、該精製試料のカルシウム塩結晶化抑制能を表１に示す種々の酵素を用いて３０〜３７℃でpＨ６．０〜８．０の条件下で処理した後で測定し、結果を表１に示す。
【００１１】
【表１】
0004148483.tif 000002
【００１２】
カルシウム塩結晶化抑制能は次の様にして評価した。即ち、炭酸水素ナトリウムの２０mＭ水溶液(pＨ８．７)１．５mlに試料水溶液３０μlを添加した後、塩化カルシウムの２０ml水溶液(pＨ８．７)１．５mlを添加し、系の温度を２５℃に維持しながら次式で表される反応をおこない、反応系の波長５７０nmにおける吸光度(Ａ570)またはpＨを分光光度計またはpＨ測定計を用いて経時的に測定する:
【化１】
0004148483.tif 000003
【００１３】
上記の反応系に試料溶液として蒸留水３０μｌを添加したときのＡ570の経時変化を図１に示す。吸光度は約２０秒後から急激に増大し、約２００秒後にほぼ最大値に達し、反応はほぼ完了する。また、図１に対するpＨの経時変化を図２に示す。
従って、試料によるカルシウム塩結晶化抑制能(％)は２００秒後のＡ570を測定し、次式から算出するのが簡便である:
【数１】
0004148483.tif 000004
【００１４】
表１から明らかなように、本発明による酵母菌由来タンパク質のカルシウム塩結晶化抑制能(相対活性: １００％)はプロテイナーゼＫを用いる処理によって大幅に低下すると共に、β−ガラクトシダーゼを用いる処理によってかなり低下する。
このことは本発明による酵母菌由来タンパク質が糖タンパク質の１種である可能性を示唆するものである。
【００１５】
上記の精製試料のカルシウム塩結晶化抑制能を１０℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、５０℃または６０℃で６０分間処理した後で測定し、その結果(熱安定性)を図３に示す。
【００１６】
ケフィアから分離した酵母菌をＹＭ培地(pＨ６．０)中、好気条件下において３０℃で振盪培養させた時の増殖曲線および種々の培養時間後に得られた本発明による酵母菌由来タンパク質のカルシウム塩結晶化抑制能をそれぞれ図４および図５に示す。なお、図４には培地のpＨの経時変化も示す。これらの図の比較から明らかなように、対数増殖期の初期の酵母菌に由来するタンパク質は特に高いカルシウム塩結晶化抑制能を示す。
【００１７】
本発明による酵母菌由来タンパク質は実質的な副作用を伴うことなく、カルシウム塩の結晶化を有効に抑制するので、種々の用途が期待されるが、特に膵臓結石症の処置剤として特に有用である。
従って、本発明の別の観点によれば、前述の酵母菌由来タンパク質を有効成分とする膵臓結石症処置剤が提供される。
【００１８】
本発明による膵臓結石症処置剤は経口投与に適した形態に調製するのが一般的である。このような形態としてはタブレット、トローチ、ドロップ、水性もしくは油性懸濁液、分散性の粉末もしくは顆粒、エマルション、硬質もしくは軟質カプセル、シロップおよびエリキシル等が例示される。これらの経口投与用処置剤は薬剤組成物の製造分野において既知のいずれかの方法によって調製すればよく、また、該処置剤には甘味剤、香味剤、着色剤および防腐剤から選択される１種または２種以上の添加剤を適宜配合してもよい。
【００１９】
なお、タブレットには有効成分と共にタブレットの製造に適した非毒性の賦形剤、例えば、不活性希釈剤(例えば、炭酸ナトリウムやラクトース等)、造粒剤や崩壊剤(例えば、コースターチ、アルギン酸等)、結合剤(例えば、デンプン、ゼラチン等)および潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク等)等を適宜配合すればよいが、既知の遅延剤(例えば、モノステアリン酸グリセリン、ジステアリン酸グリセリン等)を用いて被覆することによって胃腸管内の崩壊と吸収を遅延させて有効成分が長時間にわたって徐放されるようにしてもよい。
【００２０】
本発明による膵臓結石症処置剤は注射可能な無菌の水性もしくは油性懸濁液の形態に調製してもよい。この種の注射用懸濁液は適当な分散剤もしくは潤滑剤および沈澱防止剤を使用し、既知の方法によって調製すればよい。この場合の懸濁媒体としては、水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液、合成のモノグリセリドやジグリセリドおよびオレイン酸等が例示される。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって説明する。
実施例１
酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、ペプトン５ｇおよびグルコース１０ｇを蒸留水１０００mlに溶解させた培地(pＨ６．０)を用いて３０℃で前培養したケフィアから分離した酵母菌の培養液(ＯＤ660＝０．１)１mlを坂口フラスコ(５００ml)に１００mlずつ分注して１２１℃で２０分間高圧滅菌した後で冷却した該培地へ添加し、３０℃で１２０rpmの条件下で２４時間培養した。
菌体を遠心分離し(５０００×ｇ; ４℃; １５分間)、１０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ８．７)を用いて２回処理した。得られた菌体にその約２倍容量の０．５ＭのＥＤＴＡ水溶液(pＨ８．０)を添加した懸濁液を超音波破砕機を用いる４℃での細胞破砕処理に３０秒間隔で１５分間付した後、遠心分離処理(２７７００×ｇ; ４℃; １５分間)に付した。上澄み液を透析チユーブ(「ダイアライシスメンブラン２０」)に入れ、蒸留水を２〜３時間間隔で交換しながら透析処理を一昼夜おこなった。透析物をポリエチレングリコール６０００を用いる濃縮処理に付すことによって酵母菌由来タンパク質を得た。
【００２２】
得られた酵母菌由来タンパク質(濃度: １．５μg／ml、２．１μg／mlまたは６．１μg／ml)のカルシウム塩結晶化抑制能を前述の方法に準拠して調べた。結果を図６(Ａ570の経時変化)および図７(pＨの経時変化)に示す。
酵母菌由来タンパク質の濃度をさらに変化させることにより、カルシウム塩の結晶化を完全に抑制する該タンパク質の最低濃度は約３μg／mlであることが判明した。
【００２３】
比較例１
表２に示す成分のカルシウム塩結晶化抑制能を前述の方法に準拠して測定した。結果を表２に示す。
【表２】
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【００２４】
表３に示す細菌または酵母を所定の培地で培養した後、実施例１と同様の処理に付し、得られた微生物由来タンパク質(１．４μg／ml)のカルシウム塩結晶化抑制能を前述の方法に準拠して測定した。結果を表３に示す。
【表３】
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【００２５】
【発明の効果】
本発明による酵母菌由来タンパク質は食品ケフィアに由来する酵母菌を入手源とするので副作用がないだけでなく、カルシウム塩の結晶化を有効に抑制するので種々の用途が期待されるが、特に膵臓結石症で患う患者の処置剤(治療剤および予防剤)および食品用高カルシウム吸収剤等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＮaＨＣＯ3−ＣaＣl2反応系における酵母菌由来タンパク質の不存在下でのＡ570の経時変化を示すグラフである。
【図２】  ＮaＨＣＯ3−ＣaＣl2反応系における酵母菌由来タンパク質の不存在下でのpＨの経時変化を示すグラフである。
【図３】  酵母菌由来タンパク質の処理温度とカルシウム塩結晶化抑制能に関する相対活性との関係を示すグラフである。
【図４】  ケフィアから分離した酵母菌の増殖曲線と培地のpＨの経時変化を示すグラフである。
【図５】  種々の培養時間後に得られた酵母菌由来タンパク質のカルシウム塩結晶化抑制能を示すグラフである。
【図６】  ＮaＨＣＯ3−ＣaＣl2反応系における酵母菌由来タンパク質(実施例１で調製した試料)の存在下または不存在下でのＡ570の経時変化を示すグラフである。
【図７】  ＮaＨＣＯ3−ＣaＣl2反応系における酵母菌由来タンパク質(実施例１で調製した試料)の存在下または不存在下でのpＨの経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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