(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象となる特定の遺伝子に対して発現時に検出が可能となるマーカーを予め組み込み、該マーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え体よりなるマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体をμｍの分解能で一定の方向に順次押し出す第１のステップと、
前記第１のステップにおいて押し出された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を、前記第１のステップの押し出し毎に順次に連続して切断する第２のステップと、
共焦点レーザー顕微鏡を用い、前記第２のステップの切断毎に、前記第２のステップにおいて切断された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に光を集光させ、前記光を集光させた切断面からの反射光によって前記切断面の２次元画像を連続して撮像し、該撮像した前記切断面の２次元画像のそれぞれを順次記録手段に記録させる第３のステップと、
前記第１のステップ、前記第２のステップ、前記第３のステップを順次繰り返す第４のステップと、
前記第４のステップの後に、前記第３のステップにおいて記録された２次元画像データを前記記録手段から取り出して２次元画像群から立体画像の構築を行い、前記マーカーにより前記観察対象となる特定の遺伝子の発現を検出可能で、前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体における生体内発現遺伝子の微細３次元局在を観察可能な３次元的な前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察を行う第５のステップと
を有することを特徴とする生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察方法。
【請求項２】
観察対象となる特定の遺伝子に対して発現時に検出が可能となるマーカーを予め組み込み、該マーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え体よりなるマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体をμｍの分解能で一定の方向に順次押し出す押し出し手段と、
前記押し出し手段によって押し出された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を、前記押し出し手段の押し出し毎に順次に連続して切断する切断手段と、
共焦点レーザー顕微鏡を用い、前記切断手段による切断毎に、前記切断手段によって切断された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に光を集光させ、前記光を集光させた切断面からの反射光によって前記切断面の２次元画像を連続して撮像する共焦点撮像手段と、
前記共焦点撮像手段によって撮像された２次元画像に基づいて立体画像の構築を行い、前記マーカーにより前記観察対象となる特定の遺伝子の発現を検出可能で、前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体における生体内発現遺伝子の微細３次元局在を観察可能な３次元的な前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察の処理を行う画像処理手段と
を有することを特徴とする生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察装置。
【請求項３】
請求項２に記載の生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察装置において、
前記共焦点撮像手段は、
複数のピンホールを有するニポウディスクと、
前記ニポウディスクのピンホールに対応する位置に複数のマイクロレンズアレイを有するマイクロレンズアレイディスクと、
前記ニポウディスクと前記マイクロレンズアレイディスクとを一体的に回転させる回転装置と
を有し、
レーザー光を複数の前記マイクロレンズアレイにより対応するそれぞれの前記ピンホールに集光する
ものであることを特徴とする生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察装置。
【請求項４】
観察対象となる特定の遺伝子に対して発現時に検出が可能となるマーカーを予め組み込み、該マーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え体よりなるマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体をμｍの分解能で一定の方向に順次押し出す第１のステップと、
前記第１のステップにおいて押し出された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を、前記第１のステップの押し出し毎に順次に連続して切断する第２のステップと、
前記第２のステップの切断毎に、マイクロレンズアレイディスクの複数のマイクロレンズアレイによりニポウディスクの対応するそれぞれのピンホールに集光し、前記ピンホールを通過した光を対物レンズで前記第２のステップにおいて切断された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に集光させ、前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面から反射された光をＣＣＤカメラで撮像することにより、前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の複数の点からの反射光を同時に検出して、前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の２次元画像を連続して撮像する第３のステップと、
前記第３のステップにおいて撮像した２次元画像に基づいて立体画像の構築を行い、前記マーカーにより前記観察対象となる特定の遺伝子の発現を検出可能で、前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体における生体内発現遺伝子の微細３次元局在を観察可能な３次元的な前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察を行う第４のステップと
を有し、
前記ニポウディスクと前記マイクロレンズアレイディスクとを一体的に高速回転して、光の焦点を前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面全体に走査する
ことを特徴とする生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察方法。
【請求項５】
請求項４に記載の生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察方法において、
前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料のマーカーとして光により励起されて発光または発色する物質を用いる場合には、前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料のマーカーへ光を照射するための光源と、前記第３のステップにおいて前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の２次元画像を撮像するために前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に集光させる光の光源とを共用化する
ことを特徴とする生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察方法。
【請求項６】
観察対象となる特定の遺伝子に対して発現時に検出が可能となるマーカーとして蛍光物質を予め組み込み、該マーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え体よりなるマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体をμｍの分解能で一定の方向に順次押し出す押し出し手段と、
前記押し出し手段によって押し出された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を、前記押し出し手段の押し出し毎に順次に連続して切断する切断手段と、
前記切断手段によって切断された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に対して、前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料のマーカーたる前記蛍光物質を励起するための特異的な波長の光を出射する光源と、
複数のピンホールを有するニポウディスクと、前記ニポウディスクの対応するそれぞれの前記ピンホ−ルに前記光源から出射された光を集光する複数のマイクロレンズアレイを有するマイクロレンズアレイディスクと、前記ニポウディスクと前記マイクロレンズアレイディスクを一体的に回転させ前記光源から出射された光の焦点を前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面全体に走査可能とする回転装置と、前記ニポウディスクの前記ピンホールを通過した光を前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に集光させる対物レンズと、前記対物レンズによって光を集光させた前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面から反射された光が入射し前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の複数の点からの反射光を同時に検出して前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の２次元画像を連続して撮像するＣＣＤカメラとを有する共焦点撮像手段と、
前記共焦点撮像手段により撮像された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の２次元画像を記憶する画像記録手段と、
前記画像記録手段に記録された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の２次元画像に対する画像処理を行って立体画像の構築を行い、前記マーカーたる前記蛍光物質の発光により前記観察対象となる特定の遺伝子の発現を検出可能で、前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体における生体内発現遺伝子の微細３次元局在を観察可能な３次元的な前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察の処理を行う画像処理手段と、
前記画像処理手段により処理された処理画像を表示する表示手段と
を有し、
前記光源を、前記共焦点撮像手段の光源として共用化する
ことを特徴とする生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察装置。
【請求項７】
請求項６に記載の生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察装置において、
前記光源は、ハロゲン光源と光学フィルターを用いたキセノン水銀光源とであり、
前記共焦点撮像手段は、前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の前記ハロゲン光源による白色光観察と、前記キセノン水銀光源および前記光学フィルターによるＶ・Ｂ・Ｇ励起の蛍光観察との同時観察が可能な構成を有し、
前記画像記録手段は、前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の同一の切断面に関して、白色光における観察を示す前記切断面の２次元画像をはじめに記録し、次ぎに蛍光における観察を示す前記切断面の２次元画像を記録し、
前記画像処理手段は、前記画像記録手段に記録された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の２次元画像を画像処理することにより、白色光の観察時における３次元的な前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察の処理と蛍光の観察時における３次元的な前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察の処理とを行なう
ことを特徴とする生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察装置。
【請求項８】
観察対象となる特定の遺伝子に対して発現時に検出が可能となるマーカーとして発光する物質を予め組み込み、該マーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え体よりなるマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体をμｍの分解能で一定の方向に順次押し出す押し出し手段と、
前記押し出し手段によって押し出された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を、前記押し出し手段の押し出し毎に順次に連続して切断する切断手段と、
前記切断手段によって切断された前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に光を集光させ、前記光を集光させた切断面からの反射光によって前記切断面の２次元画像を連続して撮像する共焦点撮像手段と、
前記共焦点撮像手段によって撮像された２次元画像に基づいて立体画像の構築を行い、前記マーカーたる前記発光する物質の発光により前記観察対象となる特定の遺伝子の発現を検出可能で、前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体における生体内発現遺伝子の微細３次元局在を観察可能な３次元的な前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察の処理を行う画像処理手段と
を有し、
前記共焦点撮像手段は、
複数のピンホールを有するニポウディスクと、
前記ニポウディスクのピンホールに対応する位置に複数のマイクロレンズアレイを有するマイクロレンズアレイディスクと、
前記ニポウディスクと前記マイクロレンズアレイディスクとを一体的に回転させる回転装置と
を有し、
レーザー光を複数の前記マイクロレンズアレイにより対応するそれぞれの前記ピンホールに集光し、前記回転装置により前記ニポウディスクと前記マイクロレンズアレイディスクとを一体的に高速回転して、レーザー光の焦点を前記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面全体に走査する
ものである生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察方法およびその装置に関し、さらに詳細には、動物や植物などの生体内において各種遺伝子の発現状況を観察する際に用いて好適な生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察方法およびその装置に関する。
【０００２】
【発明の背景】
従来、生体内部で発現した遺伝子、即ち、生体内発現遺伝子の局在を観察するにあたっては、試料となる生体（本明細書においては、「試料となる生体」を「生体試料」と適宜に称することとする。）を切片化し、切片化した生体試料を観察することにより、生体試料内における発現遺伝子の２次元配置を観察するという手法がとられていた。
【０００３】
また、上記したような観察手法を行う際に、観察対象となる遺伝子に対して発現時に検出が可能となるマーカー（標識）を組み込み、このマーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え生体試料を観察するようにして、生体試料内部における特定の遺伝子の発現部位を分別することが可能になってきている。
【０００４】
なお、マーカーとしては、蛍光物質、発光物質あるいは色素などを用いることができ、具体的には、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ルシフェリン、メラニン色素などがある。
【０００５】
こうした観察を行う際において、微細な領域を観察するミクロ観察を行う場合には、共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察手法が用いられているが、その観察可能な範囲は、生体試料の厚さ方向では当該生体試料の表面から１００μｍ程度までと小さいものであった。
【０００６】
このため、生体一個体全体における生体内発現遺伝子の３次元局在を観察することが極めて困難であるという問題点があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記したような従来の技術の有する問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、生体一個体全体を観察の対象領域とし、かつ、その観察の対象領域内で細胞１つレベルでの微細な領域における生体内発現遺伝子の局在を観察することを可能にした生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察方法およびその装置を提供しようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明による生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察方法あるいはその装置においては、特定の遺伝子の発現時に検出が可能となるマーカーを有する遺伝子組み換え生体試料を連続して切断し、当該切断毎に共焦点撮像により得られた断面の画像たる断面画像を観察することを繰り返して、生体試料内部の３次元構造を再構築することにより生体試料体内での発現遺伝子の微細３次元局在を観察するようにしたものである。
【０００９】
即ち、本発明のうち請求項１に記載の発明は、観察対象となる特定の遺伝子に対して発現時に検出が可能となるマーカーを予め組み込み、該マーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え体よりなるマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体をμｍの分解能で一定の方向に順次押し出す第１のステップと、上記第１のステップにおいて押し出された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を、上記第１のステップの押し出し毎に順次に連続して切断する第２のステップと、共焦点レーザー顕微鏡を用い、上記第２のステップの切断毎に、上記第２のステップにおいて切断された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に光を集光させ、上記光を集光させた切断面からの反射光によって上記切断面の２次元画像を連続して撮像し、該撮像した上記切断面の２次元画像のそれぞれを順次記録手段に記録させる第３のステップと、上記第１のステップ、上記第２のステップ、上記第３のステップを順次繰り返す第４のステップと、上記第４のステップの後に、上記第３のステップにおいて記録された２次元画像データを上記記録手段から取り出して２次元画像群から立体画像の構築を行い、上記マーカーにより上記観察対象となる特定の遺伝子の発現を検出可能で、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体における生体内発現遺伝子の微細３次元局在を観察可能な３次元的な上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察を行う第５のステップとを有するようにしたものである。
また、本発明のうち請求項２に記載の発明は、観察対象となる特定の遺伝子に対して発現時に検出が可能となるマーカーを予め組み込み、該マーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え体よりなるマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体をμｍの分解能で一定の方向に順次押し出す押し出し手段と、上記押し出し手段によって押し出された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を、上記押し出し手段の押し出し毎に順次に連続して切断する切断手段と、共焦点レーザー顕微鏡を用い、上記切断手段による切断毎に、上記切断手段によって切断された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に光を集光させ、上記光を集光させた切断面からの反射光によって上記切断面の２次元画像を連続して撮像する共焦点撮像手段と、上記共焦点撮像手段によって撮像された２次元画像に基づいて立体画像の構築を行い、上記マーカーにより上記観察対象となる特定の遺伝子の発現を検出可能で、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体における生体内発現遺伝子の微細３次元局在を観察可能な３次元的な上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察の処理を行う画像処理手段とを有するようにしたものである。
また、本発明のうち請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の発明において、上記共焦点撮像手段は、複数のピンホールを有するニポウディスクと、上記ニポウディスクのピンホールに対応する位置に複数のマイクロレンズアレイを有するマイクロレンズアレイディスクと、上記ニポウディスクと上記マイクロレンズアレイディスクとを一体的に回転させる回転装置とを有し、レーザー光を複数の上記マイクロレンズアレイにより対応するそれぞれの上記ピンホールに集光するようにしたものである。
【００１０】
また、本発明のうち請求項４に記載の発明は、観察対象となる特定の遺伝子に対して発現時に検出が可能となるマーカーを予め組み込み、該マーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え体よりなるマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体をμｍの分解能で一定の方向に順次押し出す第１のステップと、上記第１のステップにおいて押し出された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を、上記第１のステップの押し出し毎に順次に連続して切断する第２のステップと、上記第２のステップの切断毎に、マイクロレンズアレイディスクの複数のマイクロレンズアレイによりニポウディスクの対応するそれぞれのピンホールに集光し、上記ピンホールを通過した光を対物レンズで上記第２のステップにおいて切断された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に集光させ、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面から反射された光をＣＣＤカメラで撮像することにより、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の複数の点からの反射光を同時に検出して、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の２次元画像を連続して撮像する第３のステップと、上記第３のステップにおいて撮像した２次元画像に基づいて立体画像の構築を行い、上記マーカーにより上記観察対象となる特定の遺伝子の発現を検出可能で、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体における生体内発現遺伝子の微細３次元局在を観察可能な３次元的な上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察を行う第４のステップとを有し、上記ニポウディスクと上記マイクロレンズアレイディスクとを一体的に高速回転して、光の焦点を上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面全体に走査するようにしたものである。
【００１１】
また、本発明のうち請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の発明において、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料のマーカーとして光により励起されて発光または発色する物質を用いる場合には、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料のマーカーへ光を照射するための光源と、上記第３のステップにおいて上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の２次元画像を撮像するために上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に集光させる光の光源とを共用化するようにしたものである。
【００１２】
また、本発明のうち請求項６に記載の発明は、観察対象となる特定の遺伝子に対して発現時に検出が可能となるマーカーとして蛍光物質を予め組み込み、該マーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え体よりなるマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体をμｍの分解能で一定の方向に順次押し出す押し出し手段と、上記押し出し手段によって押し出された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を、上記押し出し手段の押し出し毎に順次に連続して切断する切断手段と、上記切断手段によって切断された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に対して、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料のマーカーたる上記蛍光物質を励起するための特異的な波長の光を出射する光源と、複数のピンホールを有するニポウディスクと、上記ニポウディスクの対応するそれぞれの上記ピンホ−ルに上記光源から出射された光を集光する複数のマイクロレンズアレイを有するマイクロレンズアレイディスクと、上記ニポウディスクと上記マイクロレンズアレイディスクを一体的に回転させ上記光源から出射された光の焦点を上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面全体に走査可能とする回転装置と、上記ニポウディスクの上記ピンホールを通過した光を上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に集光させる対物レンズと、上記対物レンズによって光を集光させた上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面から反射された光が入射し上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の複数の点からの反射光を同時に検出して上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の２次元画像を連続して撮像するＣＣＤカメラとを有する共焦点撮像手段と、上記共焦点撮像手段により撮像された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の２次元画像を記憶する画像記録手段と、上記画像記録手段に記録された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の２次元画像に対する画像処理を行って立体画像の構築を行い、上記マーカーたる上記蛍光物質の発光により上記観察対象となる特定の遺伝子の発現を検出可能で、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体における生体内発現遺伝子の微細３次元局在を観察可能な３次元的な上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察の処理を行う画像処理手段と、上記画像処理手段により処理された処理画像を表示する表示手段とを有し、上記光源を、上記共焦点撮像手段の光源として共用化するようにしたものである。
【００１３】
また、本発明のうち請求項７に記載の発明は、請求項６に記載の発明において、上記光源は、ハロゲン光源と光学フィルターを用いたキセノン水銀光源とであり、上記共焦点撮像手段は、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の上記ハロゲン光源による白色光観察と、上記キセノン水銀光源および上記光学フィルターによるＶ・Ｂ・Ｇ励起の蛍光観察との同時観察が可能な構成を有し、上記画像記録手段は、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の同一の切断面に関して、白色光における観察を示す上記切断面の２次元画像をはじめに記録し、次ぎに蛍光における観察を示す上記切断面の２次元画像を記録し、上記画像処理手段は、上記画像記録手段に記録された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面の２次元画像を画像処理することにより、白色光の観察時における３次元的な上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察の処理と蛍光の観察時における３次元的な上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察の処理とを行なうようにしたものである。
また、本発明のうち請求項８に記載の発明は、観察対象となる特定の遺伝子に対して発現時に検出が可能となるマーカーとして発光する物質を予め組み込み、該マーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え体よりなるマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体をμｍの分解能で一定の方向に順次押し出す押し出し手段と、上記押し出し手段によって押し出された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を、上記押し出し手段の押し出し毎に順次に連続して切断する切断手段と、上記切断手段によって切断された上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面に光を集光させ、上記光を集光させた切断面からの反射光によって上記切断面の２次元画像を連続して撮像する共焦点撮像手段と、上記共焦点撮像手段によって撮像された２次元画像に基づいて立体画像の構築を行い、上記マーカーたる上記発光する物質の発光により上記観察対象となる特定の遺伝子の発現を検出可能で、上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の生体一個体全体における生体内発現遺伝子の微細３次元局在を観察可能な３次元的な上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の観察の処理を行う画像処理手段とを有し、上記共焦点撮像手段は、複数のピンホールを有するニポウディスクと、上記ニポウディスクのピンホールに対応する位置に複数のマイクロレンズアレイを有するマイクロレンズアレイディスクと、上記ニポウディスクと上記マイクロレンズアレイディスクとを一体的に回転させる回転装置とを有し、レーザー光を複数の上記マイクロレンズアレイにより対応するそれぞれの上記ピンホールに集光し、上記回転装置により上記ニポウディスクと上記マイクロレンズアレイディスクとを一体的に高速回転して、レーザー光の焦点を上記マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断面全体に走査するようにしたものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、添付の図面に基づいて、本発明による生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察方法およびその装置の実施の形態の一例を詳細に説明するものとする。
【００１５】
図１には、本発明による生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察装置の実施の形態の一例を示す概念構成説明図が示されている。
【００１６】
この本発明による生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察装置（以下、「本装置」と適宜に称する。）は、観察対象の試料たる生体試料として、特定の遺伝子の発現時に検出が可能となるマーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え体を用いる。
【００１７】
ここで、上記した特定の遺伝子の発現時に検出が可能となるマーカーを有する遺伝子組み換え体を作出するにあたっては、例えば、卵細胞に組み換えＤＮＡをインジェクションする手法を用いてもよいし、また、集合キメラにより組み換え遺伝子体を作出する手法を用いてもよい。
【００１８】
即ち、本発明において生体試料として用いられる遺伝子組み換え体は、どのような手法により作出されたものでもよく、本発明はその作出の手法に制限されるものではない。
【００１９】
また、マーカーとしては、従来より公知の蛍光物質、発光物質あるいは色素などを用いることができ、具体的には、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ルシフェリン、メラニン色素などを用いればよい。しかしながら、マーカーについても、上記したものに限定されるものではなく、特定の遺伝子の発現時に検出が可能となるものであるならば、上記以外の物質を適宜に用いることができる。
【００２０】
なお、マーカーの検出にあたっては、例えば、電磁波を用いるようにすればよい。具体的には、電磁波として白色光を用いる場合には、幅広い波長の光を当てて反射してきた特定の波長を検出するものであるため、マーカーとして色素を用いる場合には白色光での観察が可能となる。即ち、マーカーとして色素を用いる場合には、非特異的な波長の電磁波を照射して、特異的な波長の電磁波を受けて検出する。
【００２１】
また、マーカーとして発光する物質を用いる場合には、電磁波を照射する必要はなく、特異的な波長の電磁波を受けて検出する。
【００２２】
さらに、マーカーとして蛍光色素を用いる場合には、特異的な波長の電磁波を照射して、特異的な波長の電磁波を受けて検出する。
【００２３】
図１に示す本装置は、生体内で発現したときに所定の波長の光を照射すると励起されることにより発光したり発色したりして他の遺伝子と異なる振る舞いをするマーカーを組み込んだ遺伝子を有する遺伝子組み換え体よりなる生体試料（以下、「マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料」と適宜に称する。）を切断手段としてのナイフにより切断して、当該マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の断面を作成する断面作成装置（スライサ）１０と、断面作成装置１０により作成されたマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の断面に対して、当該マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料のマーカーを励起するための所定の波長の光を照射する光源としてのレーザー１２と、断面作成装置１０に作成されるとともにレーザー１２によって所定の波長の光を照射されたマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の断面の画像を撮像するＣＣＤカメラ１４を有する共焦点撮像手段としての共焦点撮像装置などにより構成される撮像手段としての断面画像観察部と、断面画像観察部により撮像されたマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の断面の画像を記憶する画像記録装置１６と、断面作成装置１０ならびに画像記録装置１６の動作を制御するための制御信号を出力するパーソナルコンピュータなどにより構成される制御装置１８と、画像記録装置１６に記録されたマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の断面の画像に対する画像処理を行って任意の断面や立体画像（３次元画像）などの処理画像を生成する画像処理手段としての画像処理装置（グラフィックワークステーション）２０と、画像記録装置１６に記録されたマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の断面の画像や画像処理装置２０により処理された任意の断面や立体像（３次元像）などの処理画像を表示するモニタ２２とを有し、観察者２４はモニタ２２を監視することにより、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料におけるマーカー組み込み遺伝子の発現状態を観察する。
【００２４】
なお、マーカーとして、発光物質などを用いる場合には、マーカーを励起するための光を照射する光源としては、本装置に光源１２を設ける必要はない。
【００２５】
ここで、断面作成装置１０、断面画像観察部、画像記録装置１６、制御装置１８、画像処理装置２０ならびにモニタ２２としては、例えば、本願発明者らが特願２０００−３４７３９８号「３次元内部構造の解析方法及び装置」として提案した装置を用いることができる。
【００２６】
上記出願に開示された装置は、観察対象の試料を切断して、その断面の断面画像を観察することを繰り返して試料内部の３次元構造を再構築する装置である。
【００２７】
より詳細には、断面作成装置１０は、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を切削希望量だけ上方へ送り、当該マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切削希望量だけ、当該マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の上方を回転するナイフで切削するという処理を自動的に繰り返すものである。
【００２８】
ここで、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を切削希望量だけ上方へ送る処理を実行する押し出し手段としての装置は、例えば、ステッピングモータとボールネジとを用いた直動装置により構成し、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を一定の方向（図２おいては上向きである。）に順次押し出すようにすればよい。なお、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の押し出しの分解能は、例えば、最小０．５μｍとすることができる。
【００２９】
また、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を切断する切断手段としては、ナイフを駆動装置などにより水平回転させ、押し出されたマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を順次切断するように構成すればよい。
【００３０】
図２には、断面画像観察部の共焦点撮像装置を中心に示す概略構成説明図が示されている。
【００３１】
ここで、共焦点撮像装置は、複数のピンホール１００ａを有するニポウディスク１００と、ニポウディスク１００のピンホ−ル１００ａに対応する位置に複数のマイクロアレイレンズ１０２ａを有するマイクロアレイレンズディスク１０２と、ニポウディスク１００とマイクロアレイレンズディスク１０２を一体に回転させる回転装置１０４と、レーザー１２から出射されたレーザー光をマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の断面に集光させる対物レンズ１０６と、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料からの反射光を水平に反射するダイクロイックミラー１０８と、ダイクロイックミラー１０８により水平に反射された光を集光してＣＣＤカメラ１４へ入射する接眼レンズ１１０と有している。
【００３２】
この構成により、共焦点撮像装置においては、レーザー１２から出射されたレーザー光を複数のマイクロアレイレンズ１０２ａにより対応するそれぞれのピンホール１００ａに集光し、複数のピンホール１００ａを通過したレーザー光を対物レンズ１０６でマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料のナイフで切断した断面に集光させる。そして、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の断面から反射された光をダイクロイックミラー１０８で水平に反射し、接眼レンズ１１０を通してＣＣＤカメラ１４で撮像するすることにより、断面の複数の点からの反射光を同時に検出する。
【００３３】
さらに、回転装置１０４によりニポウディスク１００とマイクロアレイレンズディスク１０２とを高速回転させるだけで、レーザー光の焦点を切断した断面全体に走査することができ、断面全体の２次元画像を短時間で得ることができる。
【００３４】
以上の構成において、本装置においては、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を凍結などで固定して包埋しする。
【００３５】
次いで、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を一定の方向に順次押し出す押し出しステップと、押し出されたマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を順次切断する切断ステップと、切断したマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の断面にレーザー１２から出射されたレーザー光を集光させ、その反射光から断面の２次元画像を撮像する共焦点撮像ステップとを順次行う。
【００３６】
この結果、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の断面の連続断面画像が得られる。さらに、この連続断面画像を画像処理装置２０で処理して、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の３次元内部構造をモニタ２２により表示する。
【００３７】
こうした本装置によれば、共焦点撮像装置によりマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断した断面にのみにレーザー光を集光させてその反射光を観察するので、例えば、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の透けなどような、その焦点位置以外の光の影響をほとんど排除することができ、撮像した２次元画像の解像度を高め、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の内部構造を高精密に再構築できる。
【００３８】
また、マーカーとして光により励起されて発光したり発色したりする物質を用いる場合には、レーザー１２をマーカーへ光を照射するための光源と共焦点撮像装置の光源として共用化することができる。
【００３９】
なお、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断した断面に照射してマーカーを励起する光源は、上記したようなレーザーに限られるものではなく、例えば、ハロゲン光源やキセノン水銀光源などを、適宜にフィルターなどを組み合わせて用いることができる。即ち、上記した光源から照射される光としては、白色光や蛍光などを適宜に設定するようにしてもよい。
【００４０】
即ち、光源としてハロゲン光源と光学フィルターを用いたキセノン水銀光源とを用いるようにすると、ハロゲン光源による白色光観察とキセノン水銀光源および光学フィルターによるＶ・Ｂ・Ｇ励起の蛍光観察との同時観察が可能となる。
【００４１】
ここで、断面作成装置１０は、例えば、「１５ｍｍ×１２ｍｍ×１２０ｍｍ〜１８０ｍｍ×１５０ｍｍ×２００ｍｍ」の大きさのマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を、最小１０μｍの厚さで切断することができる。
【００４２】
断面画像観察部は、断面作成装置１０がマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料を切断する毎に、その断面に光源１２から照射された光を照射することにより観察する。この断面画像観察部は、例えば、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の断面はハロゲン光源による白色光観察と、キセノン水銀光源および光学フィルターによるＶ・Ｂ・Ｇ励起の蛍光観察との同時観察が可能であるように構成することができる。
【００４３】
画像記録装置１６においては、観察した断面の断面画像を記録する際に、同一の断面に関して、白色光における観察を示す断面画像をはじめに記録し、次ぎに蛍光における観察を示す断面画像を記録するように、画像処理装置２０により制御することができる。
【００４４】
画像処理装置２０は、画像記録装置１６に記録した断面画像を画像処理することにより、白色光の観察時における任意の断面の画像や立体画像あるいは蛍光の観察時における任意の断面の画像や立体画像を示すデータをモニタ２２に出力し、モニタ２２は出力されたデータに基づいて画像を映し出すことができる。
【００４５】
次ぎに、上記した本装置によって行った実験結果について説明すると、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料として、維管束に特異的に発現する遺伝子ＯｓＴｒｘｈのプロモーターの制御下でＧＦＰを発現する遺伝子組み換えイネを用い、その発現部位の３次元構造をＧＦＰの蛍光により観察した。
【００４６】
マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料は、人工光条件下にて栽培し、種子ができた時点でその茎および根と茎の移行部をナイフにて切り出し、凍結包埋剤を用いて凍結包埋した。
【００４７】
観察条件は、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の切断の厚さを２μｍとし、切断に用いる断面作成装置１０のナイフの回転数９０ｒｐｍとし、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の温度を「−４５℃」とした。
【００４８】
なお、断面作成装置１０のナイフとしては、ミクロトーム用ナイフを用い、レーザー１２の出力を１５０ｍｗで照射した断面を観察した。
【００４９】
図３乃至図４には、共焦点撮像装置を用いない従来の断面画像観察部による観察結果を示し、図３は落射蛍光で５倍の対物レンズ１０６を使用して観察したイネの茎の断面画像であり、図４は落射蛍光で２０倍の対物レンズ１０６で観察したイネの茎の断面画像である。
【００５０】
図３乃至図４において、やや色の薄い部位（実際には、青色に発色している。）が自家蛍光を示し、最も色の薄い部位（実際には、緑色に発色している。）がＧＦＰによる発現遺伝子を示している。
【００５１】
落射蛍光では、下層の透けがあるために、ＧＦＰ発現部位がぼやけており、大まかな局在はわかるが、詳細な局在を観察することはできない。
【００５２】
また、図５乃至図６には、共焦点撮像装置を用いた本発明における断面画像観察部による観察結果を示し、図５は共焦点撮像装置で５倍の対物レンズ１０６を使用して観察したイネの茎の断面画像であり、図６は共焦点撮像装置で２０倍の対物レンズ１０６で観察したイネの茎の断面画像である。
【００５３】
上記した図５乃至図６により、維管束の周囲でＧＦＰが特異的に発現していることがわかる。また、維管束を構成しているいくつかの細胞で強く発現していることがわかる。
【００５４】
以上のことより、共焦点撮像装置を用いた本発明における断面画像観察部を用いることにより、マーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料内における発現遺伝子の３次元局在を観察することができた。
【００５５】
その際に、後から染色するのではなく、生体の発現遺伝子が発色することから、試料内部での染色のムラがなく、試料の大きさの影響を受けない。
【００５６】
即ち、本発明は、共焦点撮像装置による下層の透けのない観察と、断面作成装置１０を用いた深さ方向に制限のない観察との利点を併せ持つものである。
【００５７】
また、本発明による観察手法は、対象とするマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料に依存するものではないので、幅広い対象の対象のマーカー組み込み遺伝子組み換え生体試料の微細３次元局在を得ることができる。
【００５８】
なお、共焦点撮像装置は、上記した構成に限られるものではなく、例えば、共焦点顕微鏡を用いるようにしてもよい。
【００５９】
【発明の効果】
本発明は、以上説明したように構成されているので、生体一個体全体を観察の対象領域とし、かつ、その観察の対象領域内で細胞１つレベルでの微細な領域における生体内発現遺伝子の局在を観察することができるようになるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による生体内発現遺伝子の微細３次元局在の観察装置の実施の形態の一例を示す概念構成説明図である。
【図２】断面画像観察部の共焦点撮像装置を中心に示す概略構成説明図である。
【図３】共焦点撮像装置を用いない従来の断面画像観察部による観察結果を示し、落射蛍光で５倍の対物レンズを使用して観察したイネの茎の断面画像である。
【図４】共焦点撮像装置を用いない従来の断面画像観察部による観察結果を示し、落射蛍光で２０倍の対物レンズを使用して観察したイネの茎の断面画像である。
【図５】共焦点撮像装置を用いた本発明によるの断面画像観察部による観察結果を示し、落射蛍光で５倍の対物レンズを使用して観察したイネの茎の断面画像である。
【図６】共焦点撮像装置を用いた本発明によるの断面画像観察部による観察結果を示し、落射蛍光で２０倍の対物レンズを使用して観察したイネの茎の断面画像である。
【符号の説明】
１０        断面作成装置（スライサ）
１２        レーザー
１４        ＣＣＤカメラ
１６        画像記録装置
１８        制御装置
２０        画像処理装置（グラフィックワークステーション）
２２        モニタ
２４        観察者
１００        ニポウディスク
１００ａ      ピンホール
１０２        マイクロアレイディスク
１０２ａ      マイクロアレイレンズ
１０４        回転装置
１０６        対物レンズ
１０８        ダイクロイックミラー
１１０        接眼レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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