(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃腸管受容体ＨＰＴ１（配列番号１７８）に特異的に結合するタンパク質であって、前記タンパク質が配列番号５２および配列番号５５からなる群より選択されるアミノ酸配列またはＨＰＴ１との結合を介在する前記アミノ酸配列の一部を含む、タンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が配列番号５２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が配列番号５５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
40アミノ酸長以下の請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
30アミノ酸長以下の請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
20アミノ酸長以下の請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
精製されたものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記一部が第二のタンパク質の抗原性または免疫原性を示し、第二のタンパク質のアミノ酸配列は配列番号５２からなる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記一部が第二のタンパク質の抗原性または免疫原性を示し、第二のタンパク質のアミノ酸配列は配列番号５５からなる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記一部に、前記第二のタンパク質に対する抗体が結合することができる、請求項８または９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記一部が、配列番号５２のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続アミノ酸である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記一部が、配列番号５５のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続アミノ酸である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記タンパク質が、第二のタンパク質のアミノ酸配列に共有結合により融合された融合タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質が、造影剤、薬剤、および抗原からなる群より選択される有効成分を含む物質に結合した請求項１〜３または１１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質を含む組成物。
【請求項１５】
前記物質が前記有効成分を含む粒子である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記物質が前記有効成分を含む持続放出性デバイスである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記有効成分が薬剤である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記タンパク質が、ヒトまたは動物の胃腸組織を介する有効成分の輸送を容易にする、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
治療上有効量の請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の組成物および製薬上許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜３または１１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質を含むナノ粒子またはミクロ粒子。
【請求項２１】
投与により、有効成分を被験者にin vivo送達する医薬の製造のための、請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項２２】
前記投与が経口投与である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記被験者がヒトである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
前記有効成分がインスリンである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２５】
請求項１に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
本出願は、米国の暫定出願第60/046,595号（1997年5月15日出願）に対して優先権を主張するものである。また、同出願の内容全体を、本明細書に参考として組み込むものとする。
１．はじめに
本発明は、一般的には、胃腸管（GIT）輸送受容体に特異的に結合しうるランダムペプチドに関する。より詳細には、本発明は、組織、たとえば、胃腸管（GIT）の管腔側を覆う上皮細胞を通じての薬剤の送達や輸送を促進するペプチドの配列およびモチーフ、ならびにその誘導体に関するものである。本発明は、ペプチド、誘導体、抗体の製造方法も提供する。本発明は、さらに、薬剤組成物、処方、ならびに関連した方法にも関するものである。
２．発明の背景
２．１  ペプチドライブラリー
ランダムペプチドライブラリーを構築するにあたっては、２つの異なるアプローチが採用されてきた。一方のアプローチでは、ペプチドを、いくつかのフォーマットでin vitroで化学合成する。こうした化学合成ライブラリーの例としては、以下のものがある。Fodor,Sら，1991,Science 251:767-773;Houghten,Rら，1991,Nature 354:84-86;Lam,Kら，1991,Nature 354:82-84。
ランダムペプチドライブラリーを構築するにあたっての第２のアプローチでは、M13ファージ、特にM13のタンパク質pIIIが使用されてきた。ウイルスキャプシドタンパク質であるM13のタンパク質III（pIII）は、細菌への感染に関与している。長さが406アミノ酸のpIIIキャプシドタンパク質は、２つのドメインを有していることが、幾人かの研究者の突然変異分析によって見いだされている。pIIIのＣ末端は、このタンパク質をウイルスのコートに固定し、pIIIのＮ末端は、このタンパク質が大腸菌のピリンタンパク質と相互作用するうえで不可欠である（Crissman,J.W.およびSmith,G.P.,1984,Virology 132:445-455）。pIIIのＮ末端については、ウイルス感染の際に必須であることが示されているものの、成熟タンパク質のＮ側最末端は、変更を行うことができる。1985年に、Smithが、ウイルスのコート表面で異質なタンパク質を発現する実験系として、バクテリオファージM13のpIIIタンパク質を使用することを報告する実験を発表した（Smith,G.P.,1985,Science 228:1315-1317）。その後、２つのグループによって、M13ファージのPIII遺伝子のディスプレーシステムが、抗体のエピトープをマッピングするうえで有用である可能性が別々に確認された（De la Cruz,V.ら，1988,J.Biol.Chem.263:4318-4322;Parmley,S.F.およびSmith G.P.,1988,Gene 73:305-318）。
Parmleyら（Parmley,S.F.およびSmith G.P.,1989,Adv.Exp.Med.Biol.251:215-218）は、pIII遺伝子にクローニングした短い合成ＤＮＡセグメントが、エピトープのライブラリーとなる可能性を示唆した。Parmleyらは、線状エピトープは、長さが約６アミノ酸であることが多いので、ランダムな組換えDNAライブラリーを使用してあらゆる可能なヘキサペプチドを発現させることによって、抗体に結合するエピトープを単離しうるはずであると論じた。Scottら（Scott,J.K.およびSmith,G.P.,1990,Science 249:386-390）は、ヘキサペプチドからなる「エピトープライブラリー」を構築し、M13の表面で発現させることを記載している。Cwirlaら（Cwirla,S.Eら，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382）も、M13fdファージの遺伝子pIII融合体として発現されるヘキサペプチドからなる類似したライブラリーを記載している。Dower及びCwirla（Dowerら）のPCT出願（WO 91/19818、1991年12月26日公開）は、ペンタマーからオクタマーまでのランダムなアミノ酸配列からなる同様のライブラリーを記載している。Devlinら（Devlinら，1990,Science,249:404-406）は、ＳがＧまたはＣであるようなオリゴヌクレオチドの合成に（ＮＮＳ）コーディングスキームを使用して生成した約１５残基のペプチドライブラリーを記載している。Cristianらは、デカペプチドを発現するファージ・ディスプレー・ライブラリーを記載している（Cristian,R.B.ら，1992,J.Mol.Biol.227:711-718）。
他の研究者は、ファージ粒子表面に非ウイルス性ＤＮＡを発現させるにあたって、もっと別のウイルスキャプシドタンパク質を使用している。たとえば、Cesareniら（Cesareni,G.,1992,FEBS Lett.307:66-70）は、主要キャプシドタンパク質pVIIIを使用した。ペプチドライブラリーの構築には、M13以外のバクテリオファージも使用されている。プラスモディウム・ファルキパルム（Plasmodium falciparum）の主要表面抗原の各種のセグメントに対応する４アミノ酸及び６アミノ酸の配列がクローニングされ、線維状のバクテリオファージfdで発現されている（Greenwood,J.ら，1991,J.Mol.Biol.220:821-827）。
Kayら（Kay,1993,Gene 128:59-65）は、従来のいずれのライブラリーよりも長い完全にランダムな配列のペプチドをコードするペプチドライブラリーの構築方法を開示している。Kayに開示されたライブラリーは、長さが約２０アミノ酸以上の完全に合成のランダムペプチドをコードしている。こうしたライブラリーは、スクリーニングを行って、各種のリガンドに対する結合特異性を有するようなペプチド、ポリペプチド、および／または他のタンパク質を識別することができるので有利である（米国特許第5,498,538（1996年3月12日）ならびにPCT公開番号WO 94/18318（1994年8月18日）も参照のこと）。
各種のペプチドライブラリーについての包括的なレビューに関しては、Gallopら（Gallopら，1994,J.Med.Chem.37:1233-1251）を参照されたい。
ペプチドライブラリーのスクリーニングは、リガンドとして抗体を使用することによって実施されることが多かった（ParmleyおよびSmith,1989,Adv.Exp.Med.Biol.251:215-218;Scott,およびSmith,1990,Science 249:386-390）。多くの場合、スクリーニングの目的は、ライブラリーから、抗体が結合するエピトープに似たペプチドを識別することであった。利用可能な抗体が決まれば、ペプチドライブラリーは、その抗体のエピトープあるいはエピトープ様分子を識別するうえで優れたソースとなる（Yanonら，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10643-10647）。
McCaffertyら（McCaffertyら，1990,Nature 348:552-554）は、ＰＣＲを使用してイムノグロブリンの可変（V）領域の遺伝子を増幅し、増幅した遺伝子をファージ発現ベクターにクローニングした。McCaffertyらは、V領域，多様性（D）領域、結合性（J）領域のファージライブラリーが、抗原でスクリーニング可能なことを示唆している。抗原と結合したファージは、抗体遺伝子の抗原結合性ループに突然変異を生じさせ、再度スクリーニングすることができる。この過程を数回繰り返せば、抗原と強固に結合するファージを最終的に得ることができる。
Marksら（Marksら，1991,J.Mol.Biol.222:581-597）も、ＰＣＲを使用してイムノグロブリンの可変（V）領域の遺伝子を増幅し、増幅した遺伝子をファージ発現ベクターにクローニングした。
Kangら（Kangら，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4363-4366）は、抗原に対して特異的な抗体の重鎖と軽鎖の可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）領域を発現させるために使用できるファージミドベクターを作製した。重鎖と軽鎖のＶ-Ｃ領域を操作することにより、ペリプラスムで結合し、機能的な抗原結合性部位を有する抗体様分子が生成されるようになっている。このファージミドを有する細胞にヘルパーファージを感染さると、ファージミドＤＮＡを有するファージの表面に、抗体様分子が導入された。その結果、抗原でスクリーニングすることによって、これらのファージを識別し、濃縮することが可能となった。濃縮されたファージを対象として、突然変異及びさらなるスクリーニングを行うことによって、抗原に対してさらに強固に結合しうる抗体様分子を単離しうることが示唆された。
Hoogenboomら（Hoogenboomら，1991,Nucleic Acids Res.19:4133-4137）は、ナイーブ抗体の遺伝子を、ファージ・ディスプレー・ライブラリーにクローニングしうることを示唆した。これが可能であれば、クローニングした抗体遺伝子にランダムな変異を誘発して、アフィニティの高い変異体を生成することができる。
Bassら（Bassら，1990,Proteins:Struct.Func.Genet.8:308-314）は、ヒト成長ホルモン（hGH）を、ファージfdの遺伝子IIIタンパク質のカルボキシ末端に融合した。この融合タンパク質を、ファージミドベクターに組み込んだ。このファージミドを有する細胞にヘルパーファージを感染させたところ、生成したファージ粒子の約１０％が、表面に融合タンパク質を発現した。これらのファージ粒子を、hGH受容体でコーティングしたビーズを使用したスクリーニングによって濃縮した。このシステムは、受容体結合特性の変化したhGH変異体を開発する際に使用しうるものであることが示唆された。
Lowmanら（Lowmanら，1991,Biochemistry 30:10832-10838）は、上述のBassらのシステムの改良法を使用して、hGH受容体に対して例外的に高いアフィニティを有する変異hGHタンパク質を選択した。Lowmanらは、受容体の結合に際して重要であることがすでに特定されているhGHの１２アミノ酸に近い部位で、hGH-pIII融合タンパク質の突然変異をランダムに誘発した。
Balassら（Balassら，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10638-10642）は、ファージ・ディスプレー・ライブラリーを使用して、ニコチン性アセチルコリン受容体のコンフォメーション依存性エピトープに似た線状ペプチドを単離した。単離にあたっては、コンフォメーション依存性エピトープに特異的なモノクローナル抗体によるライブラリーのスクリーニングを行った。使用したモノクローナル抗体は、アセチルコリン受容体の、アセチルコリン受容体の天然のリガンドであるアセチルコリンに対する結合部位に対して特異的であると考えられた。
２．２  ドラッグ・デリバリー・システム
治療用薬剤を投与する際の一般的なルートとしては、経口摂取による投与経路と、非経口（静脈、皮下、筋肉）の投与経路がある。静脈内薬剤投与には、（i）高濃度の薬剤が急速に蓄積されることによる副作用の危険性がある、（ii）繰り返し注射するので、患者の不快感を生じかねない、（iii）反復注射部位から感染の危険性がある、といった数多くの制約がある。皮下注射は、多量の薬剤や刺激性の薬剤を投与するのには、一般に不向きである。経口投与の方が、一般には好都合であるものの、治療用物質が胃腸管によって効率的に吸収されない場合には、経口投与を用いることはできない。これまでのところ、ペプチド、タンパク質、マクロ分子を効率的に送達できる経口処方剤を開発するという目標は、達成されないままである。不十分な膜透過性、酵素に対する不安定性、分子サイズが大きいこと及び親水特性の４つが、ペプチド及びタンパク質を処方する際に障壁となってきた主たる要因である（Fix,J.A.,1996,J.Pharmac.Sci.85:1282-1285のレビューによる）。有効な経口処方剤を開発するためには、ペプチドを胃腸管（GIT）の酵素環境から保護し、経細胞輸送を生じるのに十分な濃度のペプチドを、吸収性上皮細胞の障壁と接触させ（Fix,J.A.,1996,J.Pharmac.Sci.85:1282-1285）、そして可能であれば、ペプチドを、上皮細胞障壁の頂面側から基底側面側まで「そっと持ち込む」（”Smuggled”）必要がある。
部位特異的なドラッグ・デリバリー又はドラッグ・ターゲティングは、（i）特定の器官への一次ターゲティング、（ii）その器官内の特定の種類の細胞への二次ターゲティング、（iii）特定の細胞内構造（たとえば、遺伝子の場合の核）にドラッグを送達する三次ターゲティングといった各種のレベルで達成することができる（DavisおよびJllumによるレビュー、1994、Gregoriadis、McCormack、およびPoste編、Targeting of Drugs 4,183-194に所収）。現在、ドラッグ・デリバリー・システム（DDS）の領域では、相当量の研究が進行中であり、その多くが、（i）ターゲティング・デリバリー、（ii）マクロ分子、ペプチド、タンパク質、バイオテクノロジー産業で得られた生成物を体内に非侵襲的に送達する方法の開発に向けられている（Evers,P.,1995,Developments in Drug Delivery:Technology and Markets,Financial Times Management Report）。ある種の疾患、特に癌の治療を改善するうえでは、ターゲティングされたドラッグ・デリバリーが不可欠であることが一般に認められており、ターゲティングされたドラッグ・デリバリーの多くの開発努力が癌の領域に向けられているのも驚くにはあたらない。多くの抗癌剤は、悪性細胞に対してばかりでなく、からだに対しても毒性を有している。もし、薬剤又はデリバリー・システムを改良して、薬剤が腫瘍を「まっしぐらにめざす」ようにできれば、疾患部位の薬剤濃度を最大化することによって、抗癌効果をフルに活用することが可能となり、しかも、毒性を大幅に低下させることも可能となる。腫瘍には、抗原が含まれており、この抗原は、生体を誘導して、抗原に付着して抗原を破壊するような抗体を産生させる。モノクローナル抗体は、腫瘍細胞をターゲティングする際の送達ベヒクルとして（Pietersz,G.A.,1990,Bioconjugate Chem.1:89-95のレビューによる）、また、薬剤分子を運搬するためのイメージング物質又は腫瘍表面のイメージング物質として利用されている。
２．３  輸送経路
胃腸管（GIT）の管腔側を覆う上皮細胞は、経口投与した薬剤のドラッグ・デリバリーに際して大きな障害となっている。しかし、ドラッグ・デリバリーや輸送を促進する際に利用しうる輸送経路として、以下の４つの輸送経路、すなわち、経細胞輸送経路、傍細胞輸送経路、担体媒介経路及びトランスサイトーシス経路が認められている。通常の薬剤、ペプチド、タンパク質、マクロ分子、またはナノ若しくはマイクロ粒子系がこうした輸送経路のいずれかと「相互作用」する能力を有していると、その薬剤又は粒子のGITからGIT下の循環系へのデリバリーが促進される。
受容体仲介輸送経路、担体仲介輸送経路又はトランスサイトーシス輸送経路の場合については、取り込み信号のいくつかが識別されている。こうした信号としては、中でも葉酸塩受容体と相互作用する葉酸、及び内因子と相互作用するコバラミンがある。さらに、ロイシン若しくはチロシン系のペプチド選別モチーフ、またはインターナリゼーション配列、たとえばYSKV,FPHL,YRGV,YQTI,TEQF,TEVM,TSAF,YTFR（それぞれ配列番号203,204,205,206,207,208,209,210）も存在しており、これらは、特異的な膜受容体又は結合部位を使用して、その受容体または結合部位と特異的に結合するペプチドを識別することによって、タンパク質の取り込み又はターゲティングを促進する。
特定のリガンドを発見するための非受容体系のアッセイも使用されている。たとえば、Fongら（Fongら，1994,Drug Development Research 33:64-70）には、細胞の機能に変化をもたらすペプチドを識別するための戦略が開示されており、この方法では、ファージ・ディスプレー・ライブラリーを用いて、全細胞をスキャニングする。しかし、この方法では、ファージ・ディスプレー・ライブラリーをスクリーニングする際に、無傷の組織あるいは極性化培養ではなく、全細胞を使用しているので、極性化細胞層を通しての輸送に影響を及ぼす機能を主要な機能として有しているような配列に関する情報は得られない。
また、Stevensonら（Stevensonら，1995,Pharmaceutical Res.12（9）,S94）は、合成トリペプチドのコンビナトリアル・ライブラリーを、ジペプチドまたはトリペプチドの透過性についての情報に関してスクリーニングする際に、Caco-2単層培養を使用することを開示している。
ヒトまたは動物の組織を通しての活性物質の輸送を許容ないし促進するペプチドを特定する方法が開発されている（米国特許出願第08/746,411号（1996年11月８日出願）を参照のこと。なお、この出願の全内容を、本明細書に参考として組み込むものである）。ランダム・ファージ・ライブラリーのファージを、in vitro、in vivo、またはin situの組織サンプルまたは極性組織細胞培養の第一の側、好ましくは頂面側に接種、すなわち接触させる。組織の第一の側とは反対側の第二の側、好ましくは基底側面側まで輸送されたファージを集め、輸送されたファージを選び出す。この輸送されたファージを宿主中で増幅させるサイクルを（最後のサイクルで得られた輸送ファージを使用して）繰り返して、第一の側から第二の側まで輸送されうるファージを含む選択ファージライブラリーを得る。
参考文献についての以上での議論や言及内容については、以上での記載内容が本発明の従来技術を意味するものであるとして理解すべきではない。
３．発明の概要
本発明は一般に、GIT輸送受容体に特異的に結合することができるランダムペプチドおよびペプチドモチーフに関する。このようなタンパク質は、任意のランダムペプチドライブラリー、例えば化学合成されたペプチドライブラリーまたは生物学的に発現させたペプチドライブラリーを用いて同定することができる。生物学的ペプチド発現ライブラリーを使用する場合、選択したリガンドに結合するペプチドをコードする核酸を回収して配列決定し、そのヌクレオチド配列を配列決定することができ、これにより、結合を媒介するアミノ酸配列を導き出すことができる。あるいは、化学合成されたペプチドを含むペプチドライブラリーより選択したペプチドのアミノ酸配列を直接決定することにより、適当な結合ドメインのアミノ酸配列を決定することができる。これほど好ましいわけではないが、生物学的ペプチド発現ライブラリーより選択した結合ペプチドのアミノ酸配列を直接配列決定することも可能である。
特に、本発明は、ヒトまたは動物の胃腸組織への有効成分の輸送を容易にすることが可能なタンパク質（たとえばペプチド）およびその誘導体（例えば断片）や類似体、ならびにこれらのタンパク質および誘導体をコードするヌクレオチド配列に関する。
好ましくは、輸送が容易となる組織は、十二指腸、空腸、回腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、または骨盤結腸の組織である。この組織は最も好ましくはGITの管腔側に並んでいる上皮細胞である。
本発明のタンパク質は、GITの管腔側から全身血液系への有効成分の輸送を容易するのに、および／または有効成分をGITにターゲティングするのに、使用される。従って、例えば経口投与した薬剤に本発明のタンパク質を（共有もしくは非共有）結合させることによって、ヒト胃腸管において機能することが知られている特定の受容体部位または輸送経路に薬剤をターゲティングすることにより、該薬剤の全身系への吸収を容易にすることができる。
また本発明は、機能的に活性な、すなわち全長ペプチドが関与する１以上の既知の機能的活性を示すことが可能な本発明の誘導体および類似体にも関する。このような機能的活性には抗原性（抗-GIT輸送受容体抗体に結合するためのGIT輸送受容体結合ペプチドに結合もしくは競合する能力）、およびGIT輸送受容体に結合するための全長ペプチドに結合もしくは競合する能力が含まれるが、これらに限定されない。
さらに本発明は、GIT輸送受容体結合ペプチドの１以上のモチーフを含むGIT輸送受容体結合ペプチドの断片（およびその誘導体や類似体）に関する。
さらに、GIT輸送受容体結合ペプチドならびにGIT輸送受容体結合ペプチド誘導体および類似体に対する抗体も提供される。
GIT輸送受容体結合ペプチド、誘導体、断片および類似体の製造方法、例えば組換え法による製造方法も提供される。
また本発明は、GIT輸送受容体結合ペプチドに基づく治療方法、医薬組成物および製剤に関する。本発明の製剤には、GIT輸送受容体結合ペプチドもしくはモチーフおよびその誘導体（断片を含む）；これらに対する抗体；および有効成分に関わるGIT輸送受容体結合ペプチドもしくは誘導体をコードする核酸が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、有効成分は薬剤または薬剤含有ナノ粒子もしくはミクロ粒子である。
本発明のGIT輸送受容体結合ペプチドは、サンプル中のGIT輸送受容体に結合することによりそのレベルを測定するために使用することもできる。
また、このGIT輸送受容体結合タンパク質は、結合に導く条件下で候補テスト分子に接触させることにより、または生じるあらゆる結合を検出することにより、これに結合する分子を同定するために使用することもできる。
４．図面の説明
図1。図１は、アミノ酸391〜573の細胞外ドメイン（Fei et al.,Nature 368:563（1994））を含む、ヒトPEPT1（配列番号：176）をコードするcDNAクローンの配列（Liang R.et al.J.Biol.Chem.270（12）:6456-6463（1995））より決定されたヒトPEPT1推定アミノ酸配列を表わす。
図2A-2C。図2A-2Cは、ヒト腸ペプチド関連トランスポーターHPT1をコードするcDNAのDNA配列およびこれに対応する推定アミノ酸配列（塩基1〜3345;Medline:94204643）（それぞれ配列番号:177および178）を表わす。
図3A-3B。図3A-3Bはヒトスクラーゼ-イソマルターゼ複合体（配列番号:179）をコードするcDNAクローンの配列から決定した推定ヒトスクラーゼ-イソマルターゼ複合体（hSI）アミノ酸配列を表わす（Chantret I.,et al.,Biochem.J.285（Pt3）:915-923（1992））。
図4A-4B。図4A-4Bは、ヒトD2HトランスポーターのD2Hヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号:180および181）を表わす（Wells,R.G.et al.,J.Clin.Invest.90:1959-1963（1993））。
図5A-5C。図5Aは、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーより選択したファージの第III遺伝子に存在するDNAインサートの、発現ベクターpGex-4T-2へのクローニングを概略的に表わしたものである。遺伝子インサートをフランキングするDNAプライマー（このDNAプライマーは、その最も5’端側に特異的制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含んでいた）を用いてファージの第III遺伝子中の遺伝子インサートをPCRで増幅した。あるいは、ファージの第III遺伝子中のDNAインサートの特定の領域を増幅する特異的プライマーであって、その最も５’端側に特異的制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含んでいたプライマーを使用して、PCR増幅実験を行った。遺伝子インサートを増幅した後、増幅されたPCR断片を制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびNotIで消化した。同様に、レポータータンパク質であるグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）をコードするプラスミドpGex-4T-2を制限エンドヌクレアーゼSalIおよびNotIで消化した。T4 DNAリガーゼを用いて、この消化したPCR断片を、消化したプラスミドpGex-4T-2にライゲーションし、ライゲーション産物をコンピテントな大腸菌に形質転換し、選択用抗生物質を含む寒天プレート上で形質転換体の選択を行った。選択されたクローンを培養し、プラスミドを回収してプラスミド中のDNAインサートのin-frame配列をDNA配列決定により確認した。つぎに正しいクローンを使用して、GST-融合タンパク質（配列番号:182）を発現させた；図5Bは、GSTとの融合タンパク質として発現した以下のものを表わす：一連の全長P31（P31で示す）（配列番号：43）およびP31に由来するトランケートされたペプチド（クローン# 101、102、103および119）（それぞれ配列番号：183、184、185および186）；全長PAX2（PAX2で示す）（配列番号：55）およびPAX2に由来するトランケートされたペプチド（クローン# 104,105,106）（それぞれ配列番号：170、187および188）；ならびに全長DCX8（DCX8）（配列番号：23）およびDCX8に由来する一連のトランケートされたペプチド（クローン# 107、108、109）（それぞれ配列番号：189、190および191）。これらのGST-融合タンパク質の構築は、図5Aに表わされている。図5Cは、GSTとの融合タンパク質として発現した以下のものを表わす：一連の全長P31（P31で示す）（配列番号：43）およびP31に由来するトランケートされたペプチド（それぞれクローン# 103、110、119、111および112）（それぞれ配列番号:185、192、193、194および195）；全長PAX2（PAX2で示す）（SEQ ID NO：55）およびPAX2に由来するトランケートされたペプチド（クローン# 106、113、114、115）（それぞれ配列番号：188、196,197および198）；ならびに全長SNi10（SNi10で示す）（配列番号：4）およびSNi10に由来する一連のトランケートされたペプチド（クローン#116、117、118）（配列番号:それぞれ199,200および201）。これらのGST-融合タンパク質の構築は図5Aに示されている。（図５Ａ〜図５Ｃでは配列の方向を下線および太線で示してある）。
図6A-6B。図6A-6Bは、ELISAアッセイにより検出された、組換えhSIおよび固定されたC2BBe1固定細胞へのGSTおよびGST-融合タンパク質の結合を表わす。図6Aは、組換えhISに対する、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、ならびにSNi10に由来するGST-融合タンパク質（GST-SNi10で示す）およびSNi34に由来するGST-融合タンパク質（GST-SNi34で示す）の結合を表わす。図6Bは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、ならびにSNi10に由来するGST-融合タンパク質（GST-SNi10で示す）およびSNi34に由来するGST-融合タンパク質（GST-SNi34で示す）の、固定されたC2BBe1細胞への結合を表わす。
図7A-7M。図7A-7Mは、対照GSTタンパク質およびGST-融合タンパク質の濃度を増加させて（X-軸にμg/mlで表わす）ELISAアッセイで検出した、固定されたCaco-2細胞、固定されたC2BBe1細胞、および固定されたA431細胞への、または組換えGIT輸送受容体D2H、HPT1、hPEPT1、またはBSAへの、GSTペプチドおよびトランケートされた融合タンパク質の結合を表わす。図7Aは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、およびP31に由来する一連のGST-融合タンパク質（全長P31ペプチドとの融合体（P31で示す）（配列番号：43）、およびP31とクローン#101との融合体（P31、101で示す）、クローン#102との融合体（P31、102で示す）、クローン#103との融合体（P31、l03で示す）を含む）の結合を表わす。図7Bは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、ならびにPAX2に由来する一連のGST-融合タンパク質（全長PAX2ペプチドとの融合体（PAX2で示す）、およびPAX2とクローン#104との融合体（PAX2、l04で示す）、クローン#105との融合体（PAX2、105で示す）、クローン#106との融合体（PAX2、l06で示す）（それぞれ配列番号：55、170、187および188）を含む）の結合を表わす。図7Cは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、およびDCX8に由来する一連のGST-融合タンパク質（全長DCX8ペプチドとの融合体（DCX8で示す）、およびDCX8とクローン#107との融合体（DCX8、l07で示す）、クローン#108との融合体（DCX8、108で示す）、クローン#109との融合体（DCX8、109で示す）（それぞれ配列番号：23、189、190および191）を含む）の結合を表わす。図7Dは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、ならびにDCX8に由来するGST-融合タンパク質（GST-DCX8で示す）およびDCX11に由来するGST-融合タンパク質（GST-DCX11で示す）の、組換えD2Hへの結合を表わす。図7Eは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、ならびにDCX8に由来するGST-融合タンパク質（GST-DCX8で表わす）およびDCX11に由来するGST-融合タンパク質（GST-DCX11で示す）の、固定されたC2BBe1細胞への結合を表わす。図7Fは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、ならびにP31に由来するGST-融合タンパク質（GST-P31で示す）および5PAX5に由来するGST-融合タンパク質（GST-5PAX5で示す）の、組換えhPEPT1への結合を表わす。図7Gは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、ならびにP31に由来するGST-融合タンパク質（GST-P31で示す）および5PAX5に由来するGST-融合タンパク質（GST-5PAX5で示す）の、固定されたC2BBe1細胞への結合を表わす。図7Hは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、ならびにHAX42に由来するGST-融合タンパク質（GST-HAX42で示す）およびPAX42に由来するGST-融合タンパク質（GST-PAX42で示す）の、組換えHPTlへの結合を表わす。図7Iは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、ならびにHAX42に由来するGST-融合タンパク質（GST-HAX 42で示す）およびPAX2に由来するGST-融合タンパク質（GST-PAX2で示す）の、固定されたC2BBe1細胞への結合を表わす。図7Jは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、ならびにP31に由来するGST-融合タンパク質（GST-P31で示す）（トランケートされた誘導体であるクローン#101との融合体（GST-P31-101で示す）、トランケートされた誘導体であるクローン#102との融合体（GST-P31-l02で示す）およびトランケートされた誘導体であるクローン#103との融合体（GST-P31-l03で示す）を含む）の、組���えhPEPT1またはBSAへの結合を表わす。図7Kは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、ならびにP31に由来するGST-融合タンパク質（GST-P31で示す）、トランケートされた誘導体であるクローン#101との融合体（GST-P31-101で示す）、トランケートされた誘導体であるクローン#102との融合体（GST-P31-l02で示す）およびトランケートされた誘導体であるクローン#l03との融合体（GST-P31-l03で示す）を含む）の、固定されたC2BBe1細胞へのまたは固定されたA431細胞への結合を表わす。図7Lは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、ならびにPAX2に由来するGST-融合タンパク質（GST-PAX2で示す）（トランケートされた誘導体であるクローン# 104との融合体（GST-PAX2-l04で示す）、トランケートされた誘導体であるクローン#105との融合体（GST-PAX2-105で示す）およびトランケートされた誘導体であるクローン#106との融合体（GST-PAX2-l06で示す）を含む）の、組換えhPEPT1へのまたはBSAへの結合を表わす。図7Mは、対照タンパク質GST（融合ペプチドを含まない）、およびPAX2に由来するGST-融合タンパク質（GST-PAX2で示す）（トランケートされた誘導体であるクローン#106との融合体（GST-PAX2-l06で示す））の、固定されたCaco-2細胞へのまたは固定されたA431細胞への結合を表わす。
図8A-8D。図８は、ELISAアッセイで検出した、分極化Caco-2細胞を通り抜ける頂端側から側底側へのGSTまたはGST-ペプチド融合誘導体の輸送を、時間（1〜4時間）の関数として表わす。図8Aは、分極化Caco-2細胞の頂端側培地にタンパク質を最初に投与した後の、GST、全長P31ペプチド（配列番号：43）とのGST融合体（P31で示す）、GSTクローン誘導体であるクローン#103との融合体（P31.l03で示す）のいずれかの、分極化Caco-2細胞の頂端側から側底側への輸送を、時間（時間）の関数として表わす。「タンパク質無し」と記されたラインは対照アッセイに対応する。対照アッセイは、分極化Caco-2細胞の頂端側培地に対照緩衝液を加えた後に時間（時間）の関数として側底側培地のサンプリングを行い、ELISAアッセイによりGSTのアッセイを行った。図8Bは、分極化Caco-2細胞の頂端側培地にタンパク質を最初に投与した後の、GST、全長PAX2ペプチドとのGST融合体（PAX2で示す）、GSTクローン誘導体であるクローン#106との融合体（PAX2.l06で示す）のいずれかの、分極化Caco-2細胞内における頂端側から側底側への輸送を、時間（時間）の関数として表わす。「タンパク質無し」と記したラインは対照アッセイに対応する。対照アッセイでは、分極化Caco-2細胞の頂端側培地に対照緩衝液を加えた後に時間（時間）の関数として側底側培地のサンプリングを行い、ELISAアッセイによりGSTのアッセイを行った。図8Cは、タンパク質を分極化Caco-2細胞の頂端側培地に最初に投与した後の、GST、全長DCX8ペプチドとのGST融合体（DCX8で示す）（GSTクローン誘導体であるクローン# 107との融合体（DCX8.l07で示す）およびクローン#109との融合体（DCX8.l09で示す））のいずれかの、分極化Caco-2細胞を通り抜ける頂端側から側底側への輸送を、時間（時間）の関数として示す。「タンパク質無し」と記したラインは対照アッセイに対応する。対照アッセイでは、分極化Caco-2細胞の頂端側培地に対照緩衝液を加えた後に、時間（時間）の関数として側底側培地のサンプリングを行い、ELISAアッセイによりGSTアッセイを行った。図8Dは、分極化Caco-2細胞の頂端側培地においてELISAアッセイで検出した、上記パネルA-Cで示した実験で使用したGSTおよびGST-融合タンパク質（P31、P31-l03、PAX2、PAX2.l06、DCX8、DCX8-l07、DCX8-l09とのGST融合体）の量を表わす。
図9A〜9B。図9A〜9Bは、GST-P31の濃度を0.015μMに一定に保ったままま競合体（competitor）の濃度を変化させた場合の、GST-P31のC2BBe1固定細胞への結合の阻害を表わす;ペプチド競合体は、ZElan024（P31（配列番号：43）のダンシル化ペプチド）、ならびにZElan044、ZElan049およびZElan050（トランケートされたP31（配列番号：43）のダンシル化断片）である。データは（O.D.）対（ペプチド濃度）（図9A）、および（GST-P31結合の阻害％）対（ペプチド濃度）（図9B）で示される。
図10A〜10C。図10A-10Cは、（GST-P31,GST-PAX2,GST-SNi10およびGST-HAX42）対（固定されたC2BBe1細胞上の列挙したダンシル化ペプチド）の競合ELISA試験の結果の編集を表わす（「Z」は、ε-アミノダンシルリシンを指す）。ダンシル化ペプチドのpIも含まれる。推定IC50値はμMで表わし、（あれば）IC50範囲は複数のアッセイの結果を表わす。IC50値を決定できなければ、記号「＞」または「＜」を使用する。GST/C2BBe1の列は、固定されたC2BBe1細胞に結合するGSTタンパク質を表わす。
図11A〜11B。図11Aは、0、0.5、2および4時間後にELISAアッセイにより検出された、分極化Caco-2細胞内を通り抜ける頂端側から側底側方向への、GSTまたはGST-ペプチド融合誘導体の輸送を表わし、本明細書に詳細に記載されている。アッセイに使用したタンパク質には、GST、GST-P31融合体、GST-5PAX5融合体、GST-DCX8融合体、GST-DCX11融合体、GST-PAX2融合体、GST-HAX42融合体、GST-SNi34融合体およびGST-SNi10融合体が含まれる。「タンパク質無し」と記した列は、対照実験（細胞の頂端側培地に緩衝液を加え、これらの細胞の対応する側底側培地について、緩衝液を加えた0、0.5、2および4時間後に、ELISAアッセイを行った）を示す。図11Bは、分極化Caco-2の頂端側培地にGSTまたはGST-融合タンパク質誘導体を投与した後に、トランスウェルから細胞を回収してこの回収した細胞溶解物の中のGSTまたはGST融合体をELISAアッセイにより検出した、分極化Caco-2細胞内へのGSTまたはGST-ペプチド融合誘導体の取り込み（internalization）を表わす（本明細書中に詳細に記載される）。このアッセイに使用したタンパク質には、GST、GST-P31融合体、GST-5PAX5融合体、GST-DCX8融合体、GST-DCX11融合体、GST-PAX2融合体、GST-HAX42融合体、GST-SNi34融合体およびGST-SNi10融合体が含まれる。「タンパク質無し」と記した列は、対照実験（細胞の頂端側培地に緩衝液を加え、これらの細胞の対応する細胞溶解物について、実験の最後にELISAアッセイを行った）を示す。
図12。図12は、固定化Caco-2細胞に対する、GSTおよびGST-融合タンパク質の結合、ならびにプロテアーゼトロンビン（GST部分とGST融合タンパク質の融合ペプチド部分との間の認識部位を切断する）で消化した後の対応するタンパク質の結合を表わす。記号「−」は、結合アッセイで使用する前にトロンビンで消化されなかったタンパク質、および「+」は結合アッセイで使用する前にトロンビンで消化されたタンパク質を表わす。固定されたCaco-2細胞へのタンパク質の結合は、ELISAアッセイで検出した。
図13A〜13B。図13A〜13Bは、固定されたCaco-2細胞へのペプチド被覆ナノ粒子の結合を表わす。
図14A〜14B。図14A〜14Bは、（A）精製されたhSI受容体およびBSAへのダンシル化ペプチドSNi10の結合、および（B）固定されたC2BBe1細胞への、ダンシル化ペプチドおよびペプチド負荷（loaded）インシュリン含有PLGSミクロ粒子の結合を表わす。図14Bは、P31（配列番号:43）、PAX2、HAX42およびSNi10に対応するダンシル化ペプチドの固定化C2BBe1細胞への結合、およびこれらの各ペプチドを吸着させたインシュリン含有PLGA粒子を表わす。データはバックグラウンドを差し引いて表わされている。
図15A〜15B。図15は、Caco-2細胞から収穫したA）S100分画およびB）P100分画への、ペプチド被覆粒子の結合を表わす。1:2〜1:64の連続希釈は、0.0325〜0.5μg/ウェルの粒子濃度を表わす。データはバックグラウンドを引いて表わされている。これらの粒子は以下のように識別する：939、ペプチド無し；1635、混合（scrambled）PAX2;1726、P31 D-Arg 16-mer（ZElan053）;1756、HAX42;1757、PAX2;1758、HAX42/PAX2。
図16A〜16B。図16は、Caco-2細胞から収穫したP100分画へのダンシル化ペプチドの結合を表わす。ペプチドは0.0032〜2.5μg/ウェルの範囲でアッセイした。データはバックグラウンドを差し引いて表わされる。A）HAX42、P31 D-型（XElan 053）および混合PAX2;B）PAX2、HAX42および混合PAX2。
図17A〜17B。図17Aおよび17Bは、（A）全身血中グルコースおよび（B）対照（PBS）を腸内投与したあとのインシュリンレベル；インシュリン溶液；インシュリン粒子；全8ペプチド混合粒子および本発明の試験群のペプチド粒子（100iuインシュリン添加量（loading））を表わす。
図18A〜18B。図18Aおよび18Bは、（A）全身血中グルコースおよび（B）対照（PBS）を腸内投与したあとのインシュリンレベル；インシュリン溶液；インシュリン粒子および本発明の試験群のペプチド粒子（300iuインシュリン添加量）を表わす。
図19。図19は、ロイプロリドを負荷したP31（配列番号：43）およびPAX2被覆ナノ粒子を投与したあとのロイプロリドの血漿レベルの増大を、皮下注射と比較して表わす。グループ1には、酢酸ロイプロリド（12.5μg）を皮下注射した。グループ2には、被覆していない酢酸ロイプロリド粒子（600μg；1.5ml）を十二指腸内に投与した。グループ3には、PAX2（600μg；1.5ml）で被覆した酢酸ロイプロリド粒子を十二指腸内に投与した。グループ4には、P31（配列番号：43）（600μg、1.5ml）で被覆した酢酸ロイプロリド粒子を十二指腸内に投与した。
図20。図20には、P31（配列番号：43）の既知のタンパク質相同性が列挙されている。
図21A〜21C。図21A〜21Cには、DCX8の既知のタンパク質相同性が列挙されている。
図22。図22には、DAB10の既知のタンパク質相同性が列挙されている。
図23。図23は、グルタチオンS-トランスフェラーゼのDNA配列（配列番号：211）およびこれに対応するアミノ酸配列（配列番号：212）を表わす（Smith and Johnson,1988,Gene 7:31-40）。
５．発明の詳細な説明
本発明は、GIT輸送受容体に結合するタンパク質（例えばペプチド）およびかかるタンパク質をコードする核酸に関する。本発明はさらに、前記タンパク質の断片およびその他の誘導体に関する。そのような断片または誘導体をコードする核酸も本発明の範囲に含まれる。本発明はさらに、GIT輸送受容体結合性ペプチドの1個以上のドメインを含むGIT輸送受容体結合性ペプチドの断片（ならびにその誘導体および類似体）に関する。
本発明は、機能的に活性な本発明のGIT輸送受容体結合性タンパク質および類似体の誘導体にも関し、すなわちそれらは全長GIT輸送受容体結合性ペプチドに関連した1個以上の既知の機能的活性を示す能力を有する。そのような機能的活性としては、限定するものではないが、GIT輸送受容体への結合能、抗原性［抗GIT輸送受容体結合性ペプチド抗体への結合能（または結合についてのペプチドとの競合能）］、免疫原性（GIT輸送受容体結合性ペプチドに結合する抗体の産生能）などが挙げられる。
例えば組換え法による前記のタンパク質および誘導体の製造も提供される。
GIT輸送受容体結合性タンパク質、誘導体および類似体に対する抗体がさらに提供される。
また、本発明は、GIT輸送受容体結合性ペプチドおよび核酸に基づいた治療および診断方法ならびに組成物にも関する。
本発明を下記で例を挙げて説明する。
開示を明確にし、限定しないようにするために、本発明の詳細な説明を下記の小項目に分割する。
5.1. ＧＩＴ輸送受容体結合性ペプチド、誘導体および類似体
本発明は、GIT輸送受容体を結合するペプチドならびにその誘導体（限定するものではないが断片など）および類似体に関する。本発明の特定の実施形態においては、GIT輸送受容体に結合するそのようなペプチドとしては、限定するものではないが、実質的に表7に記載されたようなアミノ酸配列（配列番号１〜55）の全部または一部を一次アミノ酸配列として含むものが挙げられる。そのようなペプチド、誘導体およびペプチド類似体をコードする核酸も提供される。一つの実施形態においては、GIT輸送受容体結合性ペプチドは、下記の表8に記載されたヌクレオチド配列（配列番号56〜109）を有する核酸によりコードされる。アミノ酸配列が配列番号１〜55またはGIT輸送受容体への結合を媒介するその一部を含むか、あるいはそれからなるタンパク質が提供される。
GIT輸送受容体結合性ペプチドに関連する誘導体および類似体の製造および使用は本発明の範囲に含まれる。特定の実施形態においては、誘導体または類似体は機能的に活性であり、すなわち全長GIT輸送受容体結合性ペプチドに関連した1個以上の機能的活性を示す能力を有する。例えば、所望の免疫原性または抗原性を有するそのような誘導体または類似体は、イムノアッセイにおいて、免疫感作のためなどに使用され得る。特定の実施形態は、抗GIT輸送受容体結合性ペプチド抗体が結合し得るGIT輸送受容体結合性ペプチド断片に関する。好ましい態様においては、誘導体または類似体はGIT輸送受容体への結合能を有する。GIT輸送受容体結合性ペプチドの誘導体または類似体は、当技術分野で公知の手順によって、in vitroでのGIT輸送受容体ドメインまたはCaco-2細胞への結合、またはin vivoでの腸管組織への結合などの所望の活性について試験され得る（下記の実施例を参照されたい）。
特に、誘導体は、GIT輸送受容体結合性ペプチド配列を、機能的に等価な分子を生じさせる置換、付加または欠失により変更することによって製造することができる。本発明の実施においては、ヌクレオチドコード配列の縮重により、実質的に同一のアミノ酸配列をコードするその他のヌクレオチド配列が使用され得る。これらには、限定するものではないが、サイレント変化が生じるように配列内の機能的に等価なアミノ酸残基をコードする種々のコドンを置換することによって変更されるヌクレオチド配列が挙げられる。同様に、本発明のGIT輸送受容体結合性ペプチド誘導体としては、限定するものではないが、サイレント変化が生じるように配列内の残基を機能的に等価なアミノ酸残基で置換することにより変更された配列などの、一次アミノ酸配列としてGIT輸送受容体結合性ペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を含むものが挙げられる。例えば、配列内の1個以上のアミノ酸残基を機能的等価物として作用する同様の極性の別のアミノ酸で置換してサイレント変更を生じさせることができる。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスのその他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
本発明の特定の実施形態においては、全長GIT輸送受容体結合性ペプチドの少なくとも５、10、15、20、25、30または35個の（連続）アミノ酸からなるGIT輸送受容体結合性ペプチドの全てまたは断片からなる、またはそれを含むタンパク質が提供される。特定の実施形態においては、そのようなタンパク質は長さがせいぜい20、30、40、50、または75アミノ酸である。GIT輸送受容体結合性ペプチドの誘導体または類似体としては、限定するものではないが、GIT輸送受容体結合性ペプチドまたはその断片に実質的に相同な領域（例えば少なくとも50％、60％、70％、80％または90％の同一性）（例えば、同一サイズの配列に関して、または当技術分野で公知のコンピューター相同性プログラムにより配列がなされた配列と比較した場合）を含む分子、またはそのコード核酸がコードGIT輸送受容体結合性ペプチド配列にストリンジェント条件下、中度のストリンジェント条件下、または非ストリンジェント条件下でハイブリダイズする能力を有する分子が挙げられる。
特定の実施形態においては、本発明のGIT輸送受容体結合性誘導体は、本発明のGIT輸送受容体結合性ペプチドまたはその一部に相同な公知のタンパク質ではない。
本発明のGIT輸送受容体結合性ペプチド誘導体および類似体は、当技術分野で公知の種々の方法により製造することができる。それらを産生せしめる操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで起こり得る。例えば、クローン化GIT輸送受容体結合性ペプチド遺伝子配列は、当技術分野で公知の多数の戦略（Maniatis,T.,1990,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第２版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,ニューヨーク）のいずれかによって改変され得る。配列は、制限エンドヌクレアーゼにより適当な部位で切断され得るものであり、その後さらに所望により酵素的改変を行い、単離され、in vitroで連結され得る。GIT輸送受容体結合性ペプチドの誘導体または類似体をコードする遺伝子の作製においては、所望のGIT輸送受容体結合性ペプチド活性がコードされている遺伝子領域において、改変された遺伝子が翻訳停止シグナルによって中断されない同一の翻訳リーディングフレーム内に確実に残るように注意を払うべきである。
さらに、GIT輸送受容体結合性ペプチドをコードする核酸配列を、in vitroまたはin vivoで突然変異させることにより、翻訳、開始、および／または終結配列を創出および／または破壊するか、コード領域における変異を創出するか、および／または新規の制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、先に存在する部位を破壊することによりさらなるin vitro改変を容易にすることができる。限定するものではないが、化学的突然変異、in vitro部位特異的突然変異誘発（Hutchinson,C.ら，1978,J.Biol.Chem.253:6551）、TAB（登録商標）リンカー（Pharmacia）の使用、増幅に使用するための突然変異を含むPCRプライマーの使用などの、当技術分野で公知の突然変異誘発のための任意の技術を用いることができる。
GIT輸送受容体結合性ペプチド配列の操作は、タンパク質レベルでも行われ得る。本発明の範囲には、翻訳または化学合成の間または後に、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子またはその他の細胞リガンドへの結合などによって特異的に改変されるGIT輸送受容体結合性ペプチド断片またはその他の誘導体もしくは類似体が含まれる。多数の化学的改変のどれもが、例えば（限定するものではないが）臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成などの公知の技術により行われ得る。特定の実施形態においては、アミノ−および／またはカルボキシ−末端が改変される。
さらに、GIT輸送受容体結合性ペプチドならびにその類似体および誘導体は化学的に合成することができる。例えば、所望のドメインを含むか、in vitroで所望の活性を仲介するGIT輸送受容体結合性ペプチドの全部または一部に対応するペプチドは、ペプチド合成装置を用いることにより合成することができる。さらに、所望により、非古典的なアミノ酸または化学的アミノ酸類似体を、GIT輸送受容体結合性ペプチド配列への置換または付加のように導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定するものではないが、通常のアミノ酸のD-異性体、α−アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、ならびにβ-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸およびアミノ酸類似体一般などのデザイナー（designer）アミノ酸が挙げられる。さらに、上記アミノ酸はD（右旋性）であってもよいしL（左旋性）であってもよい。
特定の実施形態においては、GIT輸送受容体結合性ペプチド誘導体はキメラ、または融合ペプチドであり、異なるペプチドのアミノ酸配列に結合したペプチドを介してそのアミノ−またはカルボキシ−末端に結合したGIT輸送受容体結合性ペプチドもしくはその断片（好ましくは、GIT輸送受容体結合性ペプチドの少なくとも１個のドメインまたはモチーフ、またはGIT輸送受容体結合性ペプチドの少なくとも６、10、15、20、25、30個または全アミノ酸もしくはその結合部分からなる）を含むものである。一つの実施形態においては、そのようなキメラペプチドは該タンパク質をコードする核酸（インフレームで異なるタンパク質のコード配列に結合した輸送受容体コード配列を含む）の組換え発現によって作製される。そのようなキメラ産物は、所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列を当技術分野で公知の方法により適正なコードフレーム内で互いに連結し、当技術分野で一般的に公知の方法によってキメラ産物を発現させることによって製造することができる。また、そのようなキメラ産物はタンパク質合成技術、例えばペプチド合成装置の使用によって製造し得る。任意の異種タンパク質コード配列に融合したGIT輸送受容体の部分を含むキメラ遺伝子を構築してもよい。特定の実施形態は、少なくとも6個のアミノ酸からなるGIT輸送受容体結合性ペプチドの断片を含むキメラタンパク質に関する。
別の特定の実施形態においては、GIT輸送受容体結合性ペプチド誘導体は、GIT輸送受容体結合性ペプチドと相同な領域を含む分子である。一例として、種々の実施形態いおいては、第1のタンパク質領域のアミノ酸配列が、第1のタンパク質領域に含まれる数と等しい数のアミノ酸からなる第2の領域における任意の配列と比較した場合、または当技術分野で公知のコンピューター相同性プログラムによって配列された第2の領域の配列（aligned sequense）と比較した場合に、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、または95％同一である場合、第1のタンパク質領域は第2のタンパク質領域に「相同である」とみなされ得る。例えば、分子は、GIT輸送受容体結合性ペプチドドメイン（下記参照）またはその一部に相同な1個以上の領域を含み得る。
本発明のGIT輸送受容体結合性タンパク質およびその誘導体は、下記の実施例に記載されたようにして、および／または当業者に知られているようにして適当なin vivoまたはin vitroアッセイによって結合活性についてアッセイすることができる。
誘導体および類似体についてのその他の特定の実施形態は、下記の小項目および下記の実施例の節に記載されている。
5.2. GIT輸送受容体結合性タンパク質の1個以上のドメインを含むGIT輸送受容体結合性ペプチドのモチーフ／誘導体
特定の実施形態においては、本発明は、GIT輸送受容体結合性ペプチド誘導体および類似体、特にGIT輸送受容体結合性ペプチド断片およびかかる断片の誘導体であって、GIT輸送受容体結合性ペプチドの1個以上のドメインを含むか、あるいはその1個以上のドメインからなるものに関する。特に、そのようなドメインの例は下記の実施例で同定されている。
5.3. ペプチドの合成
本発明のペプチドおよび誘導体は、化学的に合成されるか、組換えDNA技術を用いて合成され得る。
5.3.1 固相合成方法
ペプチドは、当技術分野で公知の方法によって化学的に調製され得る。例えば、簡単に言うと、固相ペプチド合成は、C-末端アミノ酸のカルボキシル基を樹脂にカップリングし、連続的にN-α保護アミノ酸を付加することからなる。保護基は当技術分野で公知の任意のものであり得る。新たなアミノ酸をそれぞれ伸長鎖に付加する前に、それより前に該鎖に付加されたアミノ酸の保護基を除去する。適当な樹脂へのアミノ酸のカップリングは、Rivierらの米国特許第4,244,946号に記載されている。そのような固相合成は、例えば、Merrifield,1964,J.Am.Chem.Soc.85:2149;Valeら，1981,Science 213:1394-1397;Markiら，1981,J.Am.Chem.Soc.103:3178、ならびに米国特許第4,305,872号および4,316,891号に記載されている。好ましい態様においては、自動ペプチド合成装置が用いられる。
一例として、しかし限定するものではないが、ペプチドはApplied Biosystems Inc.（「ABI」）モデル431A自動ペプチド合成装置にて、ABIによって提供されている「Fastmoc」合成プロトコルを用いて合成することができ、これはカップリング剤として2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（「HBTU」）（R.Knorrら，1989,Tet.Lett.,30:1927）を用いるものである。合成は、市販の4-（2’,4’-ジメトキシフェニル-（9-フルオレニル-メトキシカルボニル）-アミノメチル）-フェノキシポリスチレン樹脂（Advanced ChemTech製の「Rink樹脂」）（H.Rink,1987,Tet.Lett.28:3787）0.25mmol上で行うことができる。Fmocアミノ酸（１mmol）をFastmocプロトコルにしたがってカップリングさせる。下記の側鎖保護Fmocアミノ酸誘導体が用いられる：FmocArg（Pmc）OH;FmocAsn（Mbh）OH;FmocAsp（tBu）OH;FmocCys（Acm）OH;FmocGlu（tBu）OH;FmocGln（Mbh）OH;FmocHis（Tr）OH;FmocLys（Boc）OH;FmocSer（tBu）OH;FmocThr（tBu）OH;FmocTyr（tBu）OH（略語：Acm、アセトアミドメチル；Boc、tert-ブトキシカルボニル；tBu、tert-ブチル；Fmoc、9-フルオレニルメトキシカルボニル；Mbh、4,4’-ジメトキシベンズヒドリル；Pmc、2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル；Tr、トリチル）。
合成は、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解したHBTUとともに溶媒としてN-メチルピロリドン（NMP）を用いて行われる。Fmoc基の脱保護は、ピペリジンの約20％NMP溶液を用いて行われる。各合成の最後に、存在するペプチドの量を紫外線分光法により評価する。乾燥ペプチド樹脂からなる試料（約３〜10mg）を計量し、次いでピペリジンの20％DMA溶液（10ml）を加える。30分間音波処理した後、ジベンゾフルベン−ピペリジン付加物（N-末端Fmoc基の切断により形成されたもの）のUV（紫外線）吸光度を301nmで記録する。ペプチド置換（mmol g-1）は方程式：
0004129298.tif 000002
［式中、Ａは301nmにおける吸光度であり、vはピペリジンの20％DMA溶液の容量（ml）であり、7800はジベンゾフルベン−ピペリジン付加物の吸光係数（mol-1dm3cm-1）であり、wはペプチド−樹脂試料の重量（mg）である。］
によって計算することができる。
最後に、N-末端Fmoc基をピペリジンの20％DMA溶液を用いて切断し、次いで無水酢酸とピペリジンのDMA溶液を用いてアセチル化する。ペプチド樹脂をDMA、CH2Cl2、そして最後にジエチルエーテルで徹底的に洗浄する。
5.3.2. 切断および脱保護
一例として、しかし限定するものではないが、切断および脱保護は下記のようにして行うことができる。空気乾燥したペプチド樹脂を、95％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液を添加する前にエチルメチルスルフィド（EtSMe）、エタンジチオール（EDT）、およびチオアニソール（PhSMe）で約20分間処理する。これらの試薬をペプチド樹脂１グラム当たり合計50mlの容量で用いる。下記の比率で用いる：TFA:EtSMe:EDT:PhSMe（10:0.5:0.5:0.5）。混合物をN2雰囲気下で室温にて3時間攪拌する。混合物を濾過し、樹脂をTFAで洗浄する（２×３ml）。濾液を一つにまとめて減圧濃縮し、この黄色／橙色樹脂に無水ジエチルエーテルを加える。得られた白色の沈殿物を濾過により単離する。種々の切断方法に関してはKingら，1990,Int.J.Peptide Protein Res.36:255-266を参照されたい。
5.3.3. ペプチドの精製
合成されたペプチドの精製は、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティ、およびサイジングカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC））、遠心分離、示差溶解性などの標準的な方法、または任意のその他の標準技術によって行うことができる。
5.3.4. 生物学的ペプチドライブラリー
生物学的ペプチドライブラリーを用いることにより、GIT輸送受容体に結合するペプチドを発現させ、同定することができる。組換えDNA技術を含むこの第2のアプローチによれば、ペプチドを、例えば、可溶性融合タンパク質またはウイルスキャプシドタンパク質のような生物学的系で発現させることができる。
5.3.4.1. バインダーを同定するための方法：ライブラリーの構築
特定の実施形態においては、GIT輸送受容体に特異的に結合する本発明のペプチドは、ランダムペプチドライブラリーをHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSI（または本質的にその細胞外ドメインまたはそのドメインの断片からなる分子）から選択されるリガンドに接触させ、該リガンドに特異的に結合するライブラリーのメンバーを同定することにより該ライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。
特定の実施形態においては、本発明のペプチドを同定するための方法は、当技術分野で周知の方法によって構築された組換えベクターのライブラリーを利用するものであり、例えば近づきやすいベクターの表面構造タンパク質に結合した細胞外GIT輸送受容体ドメインをコードする挿入された合成オリゴヌクレオチド配列を発現する組換えベクターのライブラリーをスクリーニングしてHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSIに結合するペプチドを産生するメンバーを単離することを含む。単離されたベクターの挿入合成オリゴヌクレオチドの核酸配列を決定し、コードされるアミノ酸配列を推定することにより選り抜きのリガンド（例えばHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSI）を結合する結合ドメインを同定することができる。
本発明は、HPT1、hPEPT1、D2H、またはhSIから選択されるリガンドに結合するペプチドを同定する方法であって、ランダムペプチドのライブラリーを該リガンド（またはその細胞外ドメインもしくは断片）を用いてリガンド結合に導く条件下でスクリーニングし、該リガンドに結合するペプチドを単離することを含む前記方法を包含する。また、本発明の方法はさらに同定されたペプチドの結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を決定して該結合ドメインのアミノ酸配列を推定することを含む。
5.3.4.2. 細胞外ドメインリガンドの調製
特定の実施形態においては、本質的に所望のGIT輸送受容体の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの断片からなる分子を用いてそれに対する結合についてランダムペプチドライブラリーをスクリーニングする。好ましくは、細胞外ドメインをコードする核酸をクローニングし、組換え発現させ、次いで該ドメインを使用のために精製する。GIT輸送受容体は好ましくはHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSIから選択される。
5.3.4.3. バインダーを同定するための方法：ライブラリーのスクリーニング
適当なランダムペプチドライブラリーを構築したら（あるいは取得したら）、そのライブラリーをスクリーニングしてGIT輸送受容体、例えばHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSIに対して結合親和性を有するペプチドを同定する。好ましい態様においては、このライブラリーはTSARライブラリー（1996年3月12日付けの米国特許第5,498,538号および1994年8月18日付けのPCT国際公開公報WO94/18318を参照されたい。両方とも参照により本明細書に含まれるものである。）である。ライブラリーのスクリーニングは、当業者に公知の種々の方法のいずれによっても行うことができる。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する、下記の参考文献を参照されたい:ParmleyおよびSmith,1989,Adv.Exp.Med.Biol.251:215-218;ScottおよびSmith,1990,Science 249:386-390;Fowlkesら，1992,BioTechniques 13:422-427;Oldenburgら，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5393-5397;Yuら，1994,Cell 76:933-945;Staudtら，1988,Science 241:577-580;Bockら，1992,Nature 355:564-566;Tuerkら，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6988-6992;Ellingtonら，1992,Nature 355:850-852;米国特許第5,096,815号、米国特許第5,223,409号および米国特許第5,198,346号（すべてLadnerら）；ならびにRebarおよびPabo,1993,Science 263:671-673。また、1994年8月18日付けのPCT国際公開公報WO94/18318も参照されたい。
当業者であれば、適当な変更を加えることにより、下記のスクリーニング法が広範な生物学的発現ライブラリーに適することがわかるであろう。
ライブラリーが構築、あるいは取得されたら、そのライブラリーをスクリーニングすることにより、好ましくはHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSIから選択されるGIT輸送受容体についてのリガンドに対して特異的結合親和性を有する結合性分子を同定する。
ライブラリーのスクリーニングは、当業者に公知の種々の方法のいずれによっても行うことができる。代表的なスクリーニング法は、Fowlkesら，1992,BioTechniques,13:422-427に記載されており、これはベクターを固定化した標的リガンドと接触させ、前記リガンドに結合するベクターを採取することを含む。そのような有用なスクリーニング法は「パンニング」法と呼ばれる。本ライブラリーをスクリーニングするのに有用なパンニング法においては、標的リガンドはプレート、ビーズ（磁気ビーズなど）、セファロース、カラムに用いられるビーズなどに固定され得る。所望により、固定化された標的リガンドを、例えばFACS選別するために、例えばビオチン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンなどの標識を用いて「タグ付け」することができる。パンニング法はParmley,S.F.およびSmith,G.P.,1988,Gene 73:305-318にも開示されている。
本発明の特定の実施形態においては、ライブラリーは組換え受容体ドメインを用いてスクリーニングすることができる。別の実施形態においては、ライブラリーは受容体ドメインを用いて、次いでCaCO-2細胞上で逐次的にスクリーニングすることができる。
in vitroでのペプチドライブラリーのスクリーニングについては、スクリーニングに関与する溶媒に要求される条件は水性溶媒に限定されず、よってin vivoで見出されるものとは異なる非生理学的結合相互作用および条件を利用することができる。
ライブラリーのスクリーニングは、下記のような第1の「富化（enrichment）」工程および第2のフィルターリフト（lift）を含む方法を用いて行うことができる。下記の記載は一例として示したものであり、限定するものではない。
所与のリガンドへの結合能を有する（「陽性」の）発現したライブラリー（例えばファージ内）由来のバインダーを、最初に１または２サイクルのパンニング法またはアフィニティクロマトグラフィーにより富化する。マイクロタイターウェルをリガンド（例えば100μl中約10μg）で受動的に被覆する。次いでウェルをBSAの溶液でブロックし、ライブラリーのファージのプラスチック表面への非特異的付着を防止する。例えば、その後ペプチドを発現する約1011個のファージ粒子をウェルに加え、数時間インキュベートする。未結合ファージをプレートを繰り返し洗浄することにより除去し、特異的に結合したファージを酸性グリシン-HCl溶液またはその他の溶離緩衝液を用いて溶離される。溶出したファージ溶液をアルカリで中和し、例えばE.coliに感染させ、ルリア肉汁（LB）を加えた寒天を含む大きなシャーレで平板培養することにより増幅させる。次いで結合性ペプチドを発現する増幅培養物を力価測定し、このプロセスを繰り返す。あるいはまた、リガンドを市販の活性化ビーズ試薬を用いてアガロースまたはアクリルアミドビーズに共有結合されてもよい。次いでファージ溶液を結合ビーズマトリックスを含む小さいカラムに簡単に通し、その後徹底的に洗浄し、酸またはその他の溶離液を用いて溶離させる。どちらの場合においても、目標は陽性物を約1/105よりも高い頻度まで富化することである。
富化後、フィルターリフトアッセイを行う。例えば、特異的バインダーをファージ内で発現させる場合、約１〜２×105個のファージを500μlの対数期E.coliに加え、肉汁液中に0.7％のアガロースを含む大きなルリア肉汁−アガロースプレート上で平板培養する。アガロースを固化し、ニトロセルロースフィルター（例えば0.45μ）をアガロース表面に置く。滅菌針で一連の位置合わせマークをつけて下記のように成長後にフィルターおよびプレートを再度置き換える。ファージプラークを37℃で一晩インキュベートすることにより成長させる（フィルターの存在はこのプロセスを阻害しない）。次いでフィルターを、in situで付着した個々のプラーク由来のファージを有するプレートから除去する。次にフィルターをBSAの溶液またはその他のブロッキング剤に１〜２時間曝して、リガンド（または「プローブ」）の非特異的結合を防止する。
プローブ自体は、例えば、ビオチン化（市販のNHS-ビオチンを用いる）、または、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼによる直接酵素標識化によって標識する。この様式で標識化したプローブはいつまでも安定であり、数回再使用することができる。ブロックしたフィルターをプローブの溶液に数時間曝すことにより、プローブをフィルター上のファージにin situで結合させてプローブへの有意な親和性を有するペプチドを表示させる。次いで、フィルターを洗浄して未結合プローブを除去し、その後酵素基質溶液に曝すことによって発色させるか（直接標識化プローブの場合）、またはさらに酵素標識化アビジンの溶液に曝す（ビオチン化プローブの場合）。陽性ファージプラークは、オリジナルプレート上のプラークに対応するフィルター上の着色酵素切断産物の局所的析出によって同定される。発色させたフィルターを、位置合わせマークを用いて単純にプレートに再度置き直し、「陽性」プラークをアガロースから抜き取ってファージを回収する。オリジナルプレート上のプラークは高密度なので、最初の一回でプレートから単一のプラークを単離することは困難であるかもしれない。したがって、最初の抜き取り物（core）から回収したファージを低密度で再平板培養することができ、このプロセスを繰り返すことにより個々のプラークの単離が可能になり、よってファージの単一クローンの単離が可能になる。
３ラウンドの連続スクリーニングを用いることにより満足すべきスクリーニング実験が最適に行われる。次いで回収した細胞を低密度で平板培養して個々の分析に対して単離コロニーを得る。個々のコロニーを選択し、アンピシリンを含むLB培養培地への接種に用いる。37℃で一晩培養した後、培養物を遠心分離によって分離させる。次に、個々の細胞アリコートをビーズに結合した標的リガンドに対する結合について再試験する。関連性のないリガンドを結合したその他のビーズへの結合を陰性対照として用いることができる。
ライブラリーのスクリーニングの一つの態様は溶出である。下記の考察は、ランダムペプチドが表面融合分子上で発現される任意の系に適用可能である。ファージの回収中にペプチド−標的相互作用を妨害する条件は、ファージ上で発現した複数のタンパク質由来の全ての所与のペプチド配列に特異的であると考えられる。例えば、ある相互作用は、酸性pHによって妨害され得るが塩基性pHでは妨害されず、またその逆もありうる。したがって、種々の溶出条件（限定するものではないが、pH２〜３、pH12〜13、競合における過剰標的、界面活性剤、温和なタンパク質変性剤、尿素、温度の変更、光、金属イオンの存在の有無、キレート剤など）を試験し、各条件セットについて回収したファージ上で発現した結合性タンパク質の一次構造を比較することにより各リガンド／結合性タンパク質の組み合わせに適した溶出条件を決定することが望ましくあり得る。これらの溶出条件のいくつかは殺菌性であり、透析（すなわち透析バッグ、Centricon/Amiconマイクロ濃縮器）により除去することが必要であるので、ファージ感染に不適合であり得る。
好ましい実施形態においては、ランダムペプチドのファージ表示ライブラリーをスクリーニングすることによりGIT輸送受容体に結合するペプチドを発現するファージを選択する。好ましくは、第1の工程は予備選択したファージライブラリーを単離することである。「予備選択したファージライブラリー」とは、ファージ表示ライブラリーのサブ集団からなるライブラリーである。このサブ集団は、標的GIT輸送受容体に特異的に結合するファージのサブ集団を選択することができるように該受容体（またはそのドメイン）に対して最初にスクリーニングすることによって形成され得るものである。あるいはまた、サブ集団は、胃腸管の標的細胞もしくは標的細胞型または標的組織もしくは標的組織バリアに特異的に結合するか、またはin situもしくはin vivoで標的細胞もしくは標的細胞型または標的組織もしくは標的組織バリアに結合する、および／またはそれらを横切って（またはそれらの間に）輸送されるファージのサブ集団を選択することができるように、標的細胞もしくは細胞型または組織型もしくは組織バリアに対してスクリーニングすることによって形成され得るものである。この予備選択されたファージライブラリーまたは選択されたファージのサブ集団は、標的GIT輸送受容体に対しても再スクリーニングされ得るものであり、GIT輸送受容体または標的細胞もしくは標的細胞型または標的組織もしくは標的組織バリアに結合するか、またはin situもしくはin vivoで標的細胞、標的組織または標的組織バリアに結合する、および／またはそれらを横切って輸送されるファージのサブ集団をさらに選択することができる。そのような再スクリーニングは０〜30回繰り返すことができ、それぞれの連続する「予備選択されたファージライブラリー」はさらなる予備選択されたファージライブラリーを生み出すものである。
好ましい実施形態においては、好ましくはHPT1、hPEPT1、D2H、またはhSIから選択されるGIT輸送受容体であるリガンドを結合する予備選択されたファージライブラリーは、上記のin vitroスクリーニング工程により得られるものであり、次いでファージは、場合によっては、ファージを目的の受容体ドメインまたはCaco-2細胞に直接結合させることからなるin vitroアッセイ、またはin vivoアッセイを用いてさらに特性付けされる。別の好ましい実施形態においては、腸組織による、またはGITによるファージの取り込みを測定するin vivoアッセイが用いられる。別の実施形態においては、そのようなさらなるin vitroまたはin vivoアッセイは最初のスクリーニング工程として用いることができる。
用い得るin vivoアッセイを下記の実施例に記載する。
5.4. GIT輸送受容体結合性ペプチドおよびその誘導体に対する抗体の作製
本発明によれば、GIT輸送受容体結合性ペプチド、その断片またはその他の誘導体、またはその類似体を免疫原として用いることにより、そのような免疫原を免疫特異的に結合する抗体を産生させ得るものである。かかる抗体としては、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーが挙げられる。
当技術分野で公知の種々の操作がGIT輸送受容体結合性ペプチドまたは誘導体もしくは類似体に対するポリクローナル抗体の産生に用いられ得る。抗体の産生のために、種々の宿主動物、例えば（しかし限定するものではないが）ウサギ、マウス、ラット、ニワトリなどを、天然GIT輸送受容体結合性ペプチド、またはその合成タイプ、または誘導体（例えば断片）の注射により免疫感作することができる。宿主種に応じて、例えば（しかし限定するものではないが）フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの表面活性物質、ならびにBCG（カルメット−ゲラン杆菌）およびCorynebacterium parvumのような潜在的に有用なヒトアジュバントなどの種々のアジュバントを用いることにより、免疫応答を増大させることができる。
GIT輸送受容体結合性ペプチドまたはその類似体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養物中の連続細胞系による抗体分子の産生を生じさせる任意の技術が用いられ得る。例えば、もともとKohlerおよびMilstein（1975,Nature 256:495-497）によって開発されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら，1983,Immunology Today 4:72）、ならびにヒトモノクローナル抗体を産生させるためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら，1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96）。本発明のさらなる実施形態においては、モノクローナル抗体を、最新技術（PCT/US90/02545）を利用して無菌動物において産生させることができる。本発明によれば、ヒト抗体が用いられ得るものであり、これはヒトハイブリドーマを用いることによって（Coteら，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2026-2030）、またはin vitroでヒトB細胞をEBVウイルスで形質転換することによって（Coleら，1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,pp.77-96）得ることができる。本発明によれば、GIT輸送受容体結合性ペプチドに特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子ならびに適当な生物活性のあるヒト抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Morrisonら，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851-6855;Neubergerら，1984,Nature 312:604-608;Takedaら，1985,Nature 314:452-454）を用いることができる。
本発明によれば、一本鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第4,946,778号）をGIT輸送受容体結合性ペプチド特異的一本鎖抗体の作製に適合させることができる。本発明のその他の実施形態は、Fab発現ライブラリーの構築について記載された技術（Huseら，1989,Science 246:1275-1281）を利用することにより、GIT輸送受容体結合性ペプチド、誘導体、または類似体に対して所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速且つ容易な同定を可能にするものである。
上記分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは公知の技術により作製することができる。例えば、かかるフラグメントとしては、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生され得るF（ab’）2フラグメント；F（ab’）2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生じ得るFab’フラグメント、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生じ得るFabフラグメント、ならびにFvフラグメントが挙げられる。
抗体の作製においては、所望の抗体のスクリーニングは、当技術分野で公知の技術、例えばELISA（固相酵素免疫検定法）によって行うことができる。例えば、GIT輸送受容体結合性ペプチドの特定のドメインを認識する抗体を選択するために、かかるドメインを含むGIT輸送受容体結合性ペプチド断片に結合する産物に対して生じたハイブリドーマをアッセイすることができる。
GIT輸送受容体結合性ペプチドのドメインに特異的な抗体も提供される。
前述の抗体は、本発明のGIT輸送受容体結合性ペプチド配列の局在化および活性に関する当技術分野で公知の方法、例えばこれらのペプチドのin vivo投与後の画像化（例えば治療効率を監視するため）、適当な生理学的試料におけるそのレベルの測定、診断方法などにおいて使用することができる。例えば、GIT輸送受容体結合性ペプチドのドメイン、またはペプチドに導入されたダンシル基または何らかのその他のエピトープのようなペプチドの誘導体に特異的な抗体または抗体フラグメントを用いることにより、1）ナノ粒子またはその他の基質におけるペプチドの存在を確認すること；2）ナノ粒子におけるペプチドの量を定量すること；3）適当な生理学的試料におけるペプチドのレベルを測定すること；4）組織試料における免疫組織学を行うこと；5）ペプチドをin vivo投与後に画像化すること；6）イムノアフィニティカラムを用いて混合物からペプチドを精製すること、または7）ナノ粒子の表面にペプチドを結合もしくは固定することができる。この最後の用途は、抗体（または抗体のフラグメント）を薬剤添加ナノ粒子またはその他の基質の表面に結合させ、次いでこの結合体をペプチドとともにインキュベートすることを想定したものである。この方法により一定の決まった方向にペプチドの結合が生じ、ペプチドが十分活性であるように抗体に結合されたペプチドを含む粒子が生じる。
GIT輸送受容体結合性ペプチドのドメインまたはペプチドに導入されたダンシル基もしくは何らかのその他のエピトープのようなペプチドの誘導体に特異的なアブチド（abtides）［すなわち、抗原結合性ペプチド（Antigen binding peptides）］は、抗体について上記で確認したのと同じ７つの目的に用いることができる。
5.5.GIT輸送受容体結合性ペプチド、誘導体および類似体のアッセイ
GIT輸送受容体結合性ペプチド、誘導体および類似体の機能的活性は種々の方法によってアッセイすることができる。
好ましい実施形態においては（これは、GIT輸送受容体への結合をアッセイするもの）、この結合は下記の実施例に記載されたようなin vivoまたはin vitroアッセイ、または当技術分野で公知のその他の方法によってアッセイすることができる。
別の実施形態においては（これは、抗GIT輸送受容体結合性ペプチド抗体への結合について全長GIT輸送受容体結合性ペプチドと結合または競合する能力についてアッセイするもの）、当技術分野で公知の種々のイムノアッセイ、例えば限定するものではないが、ラジオイムノアッセイ、ELISA（固相酵素免疫検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ（例えばコロイドゲル、酵素または放射性同位体標識を使用）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Aアッセイ、免疫電気泳動アッセイのような技術を用いる競合的および非競合的アッセイ系などを用いることができる。一つの実施形態においては、抗体結合は一次抗体における標識を検出することによって検出される。別の実施形態においては、一次抗体は一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらに別の実施形態においては、二次抗体が標識化される。イムノアッセイにおいて結合を検出するためには多くの方法が当技術分野で公知であり、それらは本発明の範囲に含まれるものである。
その他の方法が当業者には公知であり、それらは本発明の範囲に含まれるものである。
5.6 用途
本発明は有効成分を含む材料に結合させた本発明のGIT輸送受容体結合タンパク質からなる組成物を提供する。そのような組成物は、GITに有効成分をターゲットすることおよび/またはGITの管腔を経由しての有効成分の全身循環への移送を可能とすることに用いる。有効成分が造影剤である場合には、組成物はin vivoでGIT（あるいはGITの特定の輸送受容体）を造影するために投与することができる。その他の有効成分としては次のものが挙げられるが、それらに限定されない：任意の薬剤もしくは抗原、またはヒトもしくは動物の体内で生物学的応答を引き出すことのできる任意の薬剤もしくは抗原を負荷した、または薬剤もしくは抗原を被包したナノ粒子、ミクロ粒子、リポゾーム、もしくはミセル体。薬剤もしくは抗原を負荷した、または薬剤もしくは抗原を被包した製剤の例としては、有効成分が生物分解性のナノ粒子もしくはミクロ粒子などのナノ粒子もしくはミクロ粒子中に被包されたもしくは負荷したものであり、そのナノ粒子もしくはミクロ粒子の表面上にGIT輸送受容体結合タンパク質もしくはその誘導体もしくは類似体が、吸着され、コートされ、または直接連結するかもしくは連結部分を介して結合するなどで共有結合されたものである。さらに、そのタンパク質、誘導体、もしくは類似体はナノ粒子もしくはミクロ粒子それ自体を形成することができ、またはそのタンパク質、誘導体、もしくは類似体は生物分解性のナノ粒子もしくはミクロ粒子、または薬剤を負荷した、もしくは薬剤を被包したナノ粒子もしくはミクロ粒子の製造の際に用いられるポリマーまたは複数のポリマーに共有結合によって付着させることができ、またはペプチドを直接的に有効成分とコンジュゲートさせることができる。そのような有効成分とのコンジュゲーションとしては、融合タンパク質があり、その融合タンパク質を製するには、治療用ペプチドもしくはタンパク質をコードしている遺伝子もしくはcDNAに前記ペプチドをコードしているDNA配列をフレーム内で融合させ、改変された遺伝子が組換え融合タンパク質をコードするようにする。
好ましい実施形態においては、本発明は治療用化合物（ここでは「治療薬」と呼ぶ）投与による各種の疾患および障害の治療を提供する。そのような「治療薬」としては次のものが挙げられるがそれらに限定されない：GIT輸送受容体と結合するGIT輸送受容体結合タンパク質、およびその類似体および誘導体（断片を含む）（例えば上述のものなど）であって、疾病もしくは障害（好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトの疾病もしくは障害）の治療もしくは予防に有用な有効成分と結合したもの。治療薬としては、治療用もしくは予防用の有効成分と結合したGIT輸送受容体結合タンパク質、類似体、もしくは誘導体をコードする核酸も挙げられるがそれに限定されない。有効成分は好ましくは薬剤である。
治療もしくは予防される疾病もしくは障害の如何により、および薬剤が投与される被験者のタイプの如何により、当業界で知られているいかなる薬剤をも用いることができる。ここで用いられている「薬剤」という用語は、製薬上有効ないかなる成分をも包含し、限定されない。代表的な薬剤としては、ペプチドもしくはタンパク質、ホルモン、鎮痛剤、抗偏頭痛剤、抗凝固剤、制吐剤、心血管剤、抗高血圧剤、麻薬拮抗剤、キレート剤、抗狭心症剤、化学療法剤、鎮静剤、制癌剤、プロスタグランディン、および抗利尿剤が挙げられるがそれらに限定されない。典型的な薬剤としてはインシュリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子調節タンパク質、心房性ナトリウム利尿タンパク質、コロニー刺激因子、ベータセロン、エリスロポエチン（EPO）、α、β、もしくはγインターフェロンなどのインターフェロン、ソマトロピン、ソマトトロピン、ソマトスタチン、インシュリン様成長因子（ソマトメジン）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（TPA）、成長ホルモン放出ホルモン（GHRH）、オキシトシン、エストラジオール、成長ホルモン、酢酸ロイプロリド、第VIII因子、インターロイキン-2などのインターロイキン、およびそれらの類似体などのペプチド、タンパク質もしくはホルモン；フェンタニール、スフェンタニール、ブトルファノール、ブプレノルフィン、レボルファノール、モルヒネ、ヒドロモルホン、ヒドコドン、オキシモルホン、メサドン、リドカイン、ブピバカイン、ジクロフェナク、ナプロキセン、パベリン、およびそれらの類似体などの鎮痛剤；ヘパリン、ヒルジン、およびそれらの類似体などの抗偏頭痛剤；スコポラミン、オンダンセトロン、ドンペリドン、エトクロプラミド、およびそれらの類似体などの抗凝固剤；ジルチアゼム、クロニジン、ニフェジピン、ベラパミル、イソソルビド5−モノ硝酸、有機硝酸、心臓障害に用いられる薬剤およびそれらの類似体などの心血管剤、抗高血圧剤および血管拡張剤；ベンゾジアゼピン、フェノチアジン、およびそれらの類似体などの鎮静剤；ナルトレキソン、ナロキソン、およびそれらの類似体などの麻薬拮抗剤；デフェロキサミンおよびその類似体などのキレート剤；デスモプレッシン、バソプレッシン、およびそれらの類似体などの抗利尿剤；ニトログリセリンおよびその類似体などの抗狭心症剤；5-フルオロウラシル、ブレオマイシン、およびそれらの類似体などの抗癌剤；プロスタグランディンおよびその類似体；ならびにビンクリスチンおよびその類似体などの化学療法剤が挙げられる。
代表的な薬剤としては、また、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子、遺伝子補正ハイブリッドオリゴヌクレオチド（gene correcting hybrid oligonucleotide）、リボザイム、アプタマー性（aptameric）オリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、シグナル伝達経路阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、およびDNA改変剤なども挙げられるがそれらに限定されない。薬剤として用いることの出来るものとしてはまた、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、シンドビスウイルスなどの治療用遺伝子送達のためのウイルス系、リポゾーム、陽イオン性脂質、デンドリマー（dendrimers）、および酵素などの遺伝子治療薬を含有する系をも含むがそれらに限定されない。例えば、そのターゲッティングペプチドを遺伝子送達ウイルスの表面上で発現させ、標的とする遺伝子送達ができるように改変することができる。
好ましい実施形態においては、治療薬はヒト患者に治療的にもしくは予防的に投与される。
追加説明および本発明に従って用いることのできる治療薬の出所については本明細書の各節に記載されている。
5.7 治療的/予防的投与、組成、および製剤
本発明は、本発明の治療薬の有効量を対象に投与することによる治療（および予防）方法を提供する。好ましい態様においては、治療薬は実質的に精製されたものである。対象は好ましくは動物であり、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌその他が含まれるがそれらに限定されず、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
今後明らかとなるように、ある薬剤をin vivoに全身的に提供することもしくはin vivoでGITに薬剤をターゲットすること（本発明のGIT輸送受容体結合タンパク質、その誘導体、類似体との結合によって）に応答するような疾病もしくは障害のいかなるものも、本発明の治療薬の投与によって治療もしくは予防することができる。そのような疾病としては高血圧、糖尿病、骨粗鬆症、血友病、貧血、癌、偏頭痛、および狭心症など、挙げたものは少数であるが、それらに限定されない。
当業界で知られているいかなる投与経路も用いることができ、それらには経口、経鼻、局所、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜、くも膜下腔内、筋肉内などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは投与経路は経口である；そのような実施形態においては本発明のGIT輸送受容体結合タンパク質、その誘導体もしくは類似体は、治療用有効成分のGIT管腔を経由しての全身循環への輸送が容易となるように有利に働く。
本発明はまた治療用組成物/製剤を提供する。本発明のある特定の実施形態においては、対象のGIT輸送受容体結合ペプチドまたはモチーフは、治療的もしくは予防的に有効な成分、好ましくは薬剤もしくは薬剤を含有するナノ粒子もしくはミクロ粒子と会合している。より好ましくは薬剤を被包している、もしくは薬剤を負荷した、生物分解性のナノ粒子もしくはミクロ粒子などのナノ粒子もしくはミクロ粒子であり、それらの粒子ではペプチドが物理的に吸着されているか、コートされているかあるいは直接連結しているかあるいは連結部分を介するなどで共有結合で結合されて、ナノ粒子もしくはミクロ粒子の表面上に結びつけられている。あるいはまた、ペプチドをナノ粒子もしくはミクロ粒子そのものとなるように形成させることもでき、または直接的に有効成分とコンジュゲートを形成させることもできる。そのようなコンジュゲーションとしては融合タンパク質があり、その融合タンパク質を製するには、治療用ペプチドもしくはタンパク質をコードしている遺伝子もしくはcDNAに前記ペプチドをコードしているDNA配列をフレーム内で融合させ、改変された遺伝子が組換え融合タンパク質をコードするようにし、その組換え融合タンパク質内では「ターゲッティング」ペプチドが治療用ペプチドもしくはタンパク質に融合されており、「ターゲッティング」ペプチドはその融合タンパク質のGITからの吸着を増加させる。好ましくは粒子のサイズは200-600nmの範囲である。
従って、ある特定の実施形態においては、GIT輸送受容体結合タンパク質は薬剤を含有させた徐放性（放出制御性）の仕組みのものと結合させることができる。ある特定の実施形態においてはポリマー性材料を用いることができる（放出制御の医学的応用（Medical Applications of Controlled Release）,LangerとWise編，CRC Pres.,Boca Raton,米国フロリダ州（1974）；制御された薬剤のバイオアベイラビリティー、薬剤製剤のデザインおよび性能（Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance）,SmolenとBall編，Wiley,米国ニューヨーク州（1984）；RangerとPeppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61（1983）を参照されたい；また、Levyら，Science 228:190（1985）；Duringら，Ann.Neurol.25:351（1989）；Howardら，J.Neurosurg.71:105（1989）をも参照されたい）。
本発明は、医薬組成物をも提供する。そのような組成物は治療上有効な量の治療薬および製薬上許容しうる担体を含んでなる。ある特定の実施形態においては、「製薬上許容しうる」という用語は連邦または州政府の薬事部署によって承認されている、または米国薬局方もしくはその他の一般的に認められている動物、より特定すればヒトに用いるための薬局方に記載されているものをいう。「担体」という用語は溶剤、アジュバント、賦形剤、もしくはビヒクルであってそれとともに治療薬が投与されるものを意味する。そのような医薬担体には水や油などの無菌の液剤を用いることができ、その油としては石油に含まれるもの、動物、植物もしくは合成物を起源とするもので、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油、および類似のものなどがある。医薬組成物が静脈内に投与される場合には水が好ましい担体である。食塩溶液、ブドウ糖水溶液およびグリセロール溶液も液体担体として、特に注射用液として用いることができる。医薬賦形剤として適当なものとしてはデンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、および類似のものが挙げられる。所望により、組成物は少量の湿潤剤、乳化剤、もしくはpH緩衝剤を含有させることができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、徐放性製剤、および類似のものの形態をとることができる。その組成物は、従来から用いられているトリグリセリドなどの結合剤および担体を用いて坐剤とすることができる。経口用製剤には医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含有させることができる。適当な医薬担体の例についてはE.W.Martin著の“Remington’s Pharmaceutical Sciences”に述べられている。そのような組成物は、治療上有効な量の治療薬、好ましくは精製された形での治療薬を、適当な量の担体とともに含むことによって患者への投与に適した形態のものを提供することとなる。
本発明の治療薬は中性もしくは塩の形態とすることができる。製薬上許容される塩としては塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などと遊離アミノ基とで形成する塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどと遊離カルボキシル基とで形成される塩が挙げられる。
特定の障害もしくは病状の治療に有効であるような本発明の治療薬の量はその障害もしくは病状の性質によって変わるものであり、標準的な臨床手法によって定めることができる。さらに、in vitroアッセイ法も最適投与量の範囲を定めるために用いうる。ある製剤において使用すべき正確な量については投与経路、およびその疾病もしくは障害の重篤度によっても変わり、実施する医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。
6. 実施例
6.1  GIT受容体ターゲットの選択
HPT1、hPEPT1、D2HおよびhSI受容体を、いくつかの判断基準に基づきGIT受容体ターゲットとしてクローニングするために選択した。その判断基準は：（1）消化管（GIT）の上皮細胞の表面に発現される；（2）小腸の長軸方向に沿って発現される（HPT1、hPEPT1、D2H）；（3）局所的に高濃度で発現する（hSI）；（4）大きな推定上の細胞外ドメインがGITの管腔に面している；および（5）ターゲッティング粒子によるアクセスおよび生物接着が容易となるような細胞外ドメインがあるということである。
ペプチドライブラリーでスクリーニングされた4種の組換え受容体部位はさらに次のような特徴を有する：
0004129298.tif 000003
図1-4（それぞれ配列番号176,178,179,および181）はそれぞれ、hPEPT1、HPT1、hSI、およびD2Hの予測アミノ酸配列を示す。
6.2. 選択された受容体部位の細胞外ドメインのクローニング
下記の受容体ドメインをクローン化し、標準的な手法によりHis-タグ融合タンパク質として発現させた。
受容体 ドメイン（アミノ酸残基）
hPEPT1a         391-571
HPT1b           29-273
hSIc            272-667
D2Hd            387-685
a  Liangら，1995,J.Biol.Chem.270:6456-6463
b  Dantzigら，1994,カドヘリンスーパーファミリー関連タンパク質と腸内ペプチド輸送との関連Association of Intestinal Peptide Transport with a Protein Related to the Cadherin Superfamily
c  Chantretら，Biochem.J.285:915-923
d  Bertranら，J.Biol.Chem.268:14842-14949
受容体タンパク質はHis-タグ融合タンパク質として発現させ、尿素もしくは塩酸グアニジンを用いた変性条件下でNi-NTAアガロースに対するpET His-タグ金属キレートアフィニティーを用いて精製した（Hochuli,E.,金属キレート吸着剤を用いた組換えタンパク質の精製（Purification of recombinant proteins with metal chelate adsorbent）,Genetic Engineering,Principals and Methods（J.K.Setlow編）,Plenum Press,米国ニューヨーク州,Vol.12（1990）,pp.87-98）。
6.3 ファージライブラリー
M13中でＮ末端pIII融合を発現しているDC8、D38、およびDC43の3種のファージライブラリーをGIT受容体に結合するペプチドを同定するために用いた。D38およびDC43ライブラリーは、それぞれ37と43のランダムなアミノ酸ドメインからできており、既に述べられている（McConnellら，1995,Molecular Diversity,1:165-176）。DC8ライブラリーは、ランダム挿入物がアミノ酸8個の長さで末端がそれぞれシステイン残基に隣接している（すなわちCX8C）ことを除いては他の2種のライブラリーと類似している。
6.4  バイオパニング（Biopanning）
GIT受容体についてバイオパニングをほぼ標準的な方法（McConnellら，1995,Molecular Diversity,1:165-176）によって、DC8（1 X 1010pfu）、D38およびDC43（1X1011pfu）ファージライブラリーの混合物を用いて3ラウンド行った。パニングの各ラウンド後、回収されたファージのパーセンテージを測定した。最初の2ラウンドのパニング後、溶出したファージを一晩増幅させた。3回目のパニングから得たファージをプレートから取り出し、100個のプラークを取り、一晩増幅させ、関連の受容体およびBSAとの結合をELISAでアッセイしてスクリーニングした。データの分析後、ELISAアッセイで高い吸収を示すおよび/またはBSAとの結合に比べてターゲットとの結合率の良いファージクローンを同定した。インシュリン分解酵素（IDE）および組換えヒト組織因子（hTF）を関係のない対照として用いた。標準的なパニング技法に下記に述べるいくつかの変更を加えて行った。選択またはパニング方法は、２つの方策のうちの1つに従って行った。第一の方策は混合したライブラリーを固体表面に吸着させた特定のGIT受容体上でパニングすることである。第二の方策はライブラリーをGIT受容体に対して2回パニングし、次いでCaco-2細胞（PetersonとMooseker,1992,J.Cell Science 102:581-600）に対してパニングするものである。選択方法はクローンの命名法に反映しており、それは下記のとおりである。
SはそのクローンがhS1受容体ドメインに結合することによって同定されたものであることを示している。
DはそのクローンがD2H受容体ドメインに結合することによって同定されたものであることを示している。
PはそのクローンがPEPT1受容体ドメインに結合することによって同定されたものであることを示している。
HはそのクローンがHPT-1受容体ドメインに結合することによって同定されたものであることを示している。
Niと示されたファージは、標準的な方法にNi-NTA Agarose（Qiagen,Chatworth,米国カリフォルニア州）を加えた方法を用いたGIT受容体パンの固相バンドから得たものである。受容体をコートしたプレートを、160μlのNi-NTAアガロースを含有する0.5％ BSA/PBSでブロックし、50μlのNi-NTAアガロースの存在下でライブラリーをパニングした。受容体タンパク質はHis-タグ融合タンパク質として発現された。His-タグはNi-NTAアガロースに高いアフィニティーを有している。プレートをブロックし、Ni-NTAアガロースの存在下でパニングすることにより、ファージの組換え受容体のHis-タグ部分への結合を最小限にすることができる。
AXと示されたファージは酸及び第Ｘa因子で溶出させた。ファージはまず最初に標準的な酸溶出を行い、次いで第Ｘa因子（New England Biolabs,Beverly,米国マサチューセッツ州：300μlの20mM Tris-HCl,100mM NaCl,2mM CaCl2の中に1μgのプロテアーゼ）をパニングプレートに添加し、2時間インキュベートした。2つの方法で溶出させたファージをプールし、次いでプレーティングした。
ABと示したファージは酸及び塩基で溶出させた。最初に標準的な酸溶出により、次いで100mMトリエチルアミン（pH12.1）をパニングプレートに添加して10分間ファージを溶出させた。2つの方法で溶出させたファージをプールし、次いでプレーティングした。
Cと示したファージは受容体上でパニングした後、Caco-2細胞によってパニングしたものである。第一および第二ラウンドのパニングは受容体上で行い、第三ラウンドのパニングはCaco-2細胞のsnapwell上で行った。2回のパニングをD2H受容体、第三のパニングをCaco-2細胞上で行うことによってDCX11,DCX8,およびDCX33を同定した。第3ラウンドの、Caco-2細胞からの第Ｘa因子による溶出物をD2H、BSAおよび固定Caco-2細胞上でELISAでスクリーニングを行った。HCA3については最初の2ラウンドのパニングはHPT-1受容体上で行い、第三のパニングはCaco-2細胞のsnapwell上で培養させた単層上で行った。
5PAXと示したファージは5ラウンドのパニングを行い、その後、ELISAスクリーニングの前に多数のファージの配列を調べた。
6.5 選択されたファージの配列決定
受容体ドメインおよび/またはCaco-2細胞に対する結合とバックグラウンドのBSAに対する結合との比率が良い比率であることが示されたファージ挿入物のアミノ酸配列を、ウイルスゲノム中の適切な領域のDNA鎖の双方の配列を調べて（Sequenase▲Ｒ▼,U.S.Biochemical Corp.,Cleveland,米国オハイオ州）得られたヌクレオチド配列から推定した。第3ラウンドの酸溶出物をELISAでHPT-1、BSA、およびCaco-2固定細胞上でスクリーニングした。5PAXと示したファージは5ラウンドのパニングを行い、その後、ELISAスクリーニングの前に多数のファージの配列を調べた。
24ウエルのプレートの1つのウエルを10μg/mlのGIT受容体でコートし、そのプレートを一晩4℃でインキュベートした。そのプレートを0.5％ BSA-PBSで1時間ブロックした。DC8、D38、DC43ファージライブラリーの混合物をプレートに添加し、プレートを室温で回転機上で2-3時間インキュベートした。ウエルを1％ BSAプラス0.05％ Tween 20をPBS中に含むもので10回洗い、ウエルを0.05mグリシン、pH2で溶出させた。次いでファージを0.2M NaPO4で溶出させた。溶出したファージを寒天プレート上で力価を測定した。残りのファージは一晩増幅させた。翌日増幅させたファージを第二のコートしたプレートに添加し、パニング手順を上述のとおり繰り返した。2回目のパニングから溶出させたファージおよび1回目のパニングから増幅させたファージの力価を寒天プレート上で測定した。2回目のパニングから得たファージを一晩増幅させた後、パニング手順を上述のとおり繰り返した。3回目のパニングから溶出させたファージおよび2回目のパニングから増幅させたファージの力価を寒天プレート上で一晩測定した。単離したファージコロニーをELISAアッセイに用いる前に一晩増幅させた。
6.6 受容体ELISA操作法
96ウエルのプレートをGIT受容体、BSA、および任意でIDE（インシュリン分解酵素、無関係のHis-融合タンパク質）もしくはhTFを用いて、一晩コートした。プレートを0.5％ BSA-PBSで1時間ブロックした。清澄化した後、増幅したファージを1％ BSAプラス0.05％ Tween 20を含むPBSで1:100に希釈し、プレートに添加した。回転機上で1-2時間プレートをインキュベートした後、プレートを1％ BSAプラス0.05％ Tween 20を含むPBSで5回洗った。希釈した抗M13-HRPコンジュゲート（抗M13抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）と連結したもの）をすべてのウエルに添加し、プレートを回転機上で1時間インキュベートした。プレートを上述のとおり5回洗った後、TMB基質をウエルに添加した。プレートの吸光度を650nmで読み取った。
受容体ELISAの結果：
下記はhSI受容体上でパニングされたファージの、hSIおよびBSAをコートしたマイクロタイタープレートへの結合を評価したELISAアッセイの結果である。表1はODの結果およびhSIとの結合のBSAとの結合との比を示している。
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下記はD2H受容体上でパニングされたファージの、D2HおよびBSAをコートしたマイクロタイタープレートへの結合を評価したELISAアッセイの結果である。表2はODの結果およびD2Hとの結合のBSAとの結合との比を示している。
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下記はD2H受容体上でのパニングを2ラウンド、次いで第3ラウンドのパニングをCaco-2 snapwell上で行ったファージの結合を評価したELISAアッセイの結果である。固定Caco-2細胞、D2HおよびBSAとの結合を調べた。表3はODの結果およびD2Hとの結合のBSAとの結合との比を示している。
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下記はhPEPT1受容体上でパニングされたファージの、hPEPT1およびBSAへの結合を評価したELISAアッセイの結果である。表4はODの結果およびhPEPT1との結合のBSAとの結合との比を示している。
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表5はHPT-1受容体上でパニングされたファージのHPT-1およびBSAへの結合を評価したELISAの結果を示している。この表はODの結果およびHPT-1との結合のBSAとの結合との比を示している。
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表6はHPT-1受容体上でのパニングを2ラウンド、次いで第3ラウンドのパニングをCaco-2 snapwell上で行ったファージの結合を評価したELISAの結果を示している。固定Caco-2細胞、HPT-1、およびBSAへの結合を調べた。この表はODの結果およびHPT-1との結合のBSAとの結合との比を示している。
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細胞ELISA操作法
ファージELISAは上述の方法に下記の変更を加えて用いた。希釈液および洗浄用バッファーは、1％ BSAおよび0.05％ Tween 20を含有するPBSを用い、プレートは各洗浄ステップで5回洗った。感染した細菌の培養液の上清を1:100に希釈し、タンパク質をコートしたプレートとともに2-3時間緩徐に動かしつつインキュベートした。抗M13西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート（Pharmacia,Piscataway,米国ニュージャージー州）は1:8000に希釈した。
固定Caco-2、C2BBel、およびA431細胞のプレートを組織培養処理マイクロタイタープレート上で細胞を増殖させることによって調製した。細胞がコンフルエントになった時に、プレートを10％ホルムアルデヒドで固定し、PBSで2回洗い、0.5％BSA-PBSで−20℃で保存した。アッセイ当日に、融解したプレートを0.1％フェニルヒドラジンを含有するPBSで1時間37℃で処理し、次いでPBSで2回洗い、0.5％BSA-PBSで1時間ブロックした。この時点では標準的なELISA操作法に従って行った。
GIT受容体に特異性を示したファージをさらにELISAで種々の組換えタンパク質上で特徴を調べた。GIT受容体への特異性を示し続けたファージの配列を調べた。
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ペプチドモチーフ
GIT受容体に結合するクローンのアミノ酸配列の比較により、いくつかの配列の類似性すなわち「モチーフ」が確認された。これらのモチーフはしばしば、標的への結合にとって重要な配列の一部となることがある。表９は、GIT結合ペプチド内で同定された配列類似性の領域または配列モチーフ（太字）を示す（対応する配列番号を表７に示す）。
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Caco-2細胞へのファージの結合
予測されるGIT結合ペプチドインサートを発現するファージはまた、以下のように固定化Caco-2またはC2BBel細胞についてELISAにより測定した。細胞を培地100μlに１×105細胞／ウェルで塗布し、30℃で５％二酸化炭素中で一晩インキュベートした。各ウェルに100μlの25％ホルムアルデヒドを15分間加えた。プレートを転倒してウェルの内容物を除去した。次にプレートをDPBSで３回洗浄した。各ウェルに0.1％フェニルヒドラジンDPBS溶液を加え、37℃で１時間インキュベートした。プレートを転倒して、３回洗浄した。プレートを0.5％BSA-DPBSで室温で１時間ブロックした。プレートを転倒して、１％BPT（１％BSAと0.05％ツイーン20を含有するPBS）で３回洗浄した。１％BPTで希釈したファージを、固定化細胞を含有するウェルに加えた。ファージを加えないウェルを使用して、HRP結合体のバックグランド結合を測定した。プレートを室温でローター上で２〜３時間インキュベートした。プレートを前記したように洗浄した。プレートを１％BPT中の希釈抗M13-HRP抗体で室温で１時間インキュベートした。洗浄後、TMB基質を加え、プレートの吸光度を650nmで読んだ。表10は、ペプチドをコードするファージの固定化Caco-2細胞への相対的結合を示す。
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in vivoファージ選択：
GITに結合するかまたはGITを輸送することができるペプチドを発現するファージのさらなる選択は、以下のように行なった。精製ライブラリーをTBSまたはPBSのような緩衝液に再懸濁し、組織バリアーの片側（例えば、十二指腸、空腸、回腸、大腸または他のin vivoの動物部位）に、例えばクローズドループモデルまたはオープンループモデルを使用して導入した。注入後、組織バリアーを横断して存在する体液サンプル（例えば、門脈循環および／または全身性循環のサンプル）をあらかじめ決められた時点（例えば、０〜90分および／または２〜６時間またはそれ以上）で採取した。ファージの存在を確認するために、宿主（例えば、大腸菌（E.coli））を直接感染するのに、採取したサンプル（例えば、血液）のアリコートを使用した。残りのサンプルをインキュベート（例えば37℃で攪拌しながら大腸菌（E.coli）と一晩インキュベート）した。培養物中に存在する増幅したファージは個々に配列決定して、ファージによりコードされるペプチドの本体を決定するか、またはさらに濃縮が所望であればPEGを使用して沈殿させPBS中に再懸濁してもよい。次にPEGを使用してファージをさらに沈殿させるか、またはクローズドもしくはオープンGITループモデル系を使用して別の動物に投与するために直接使用することができる。門脈血または全身血サンプルを採取し、次にこのような循環系に輸送されたファージを増幅する。こうして、動物のGITにファージ表示ライブラリーを投与（所望であれば増幅したファージを繰り返し投与）すると、GITから動物の門脈および／または全身性循環に輸送されたファージの選択が可能になった。
所望であれば動物モデルの組織バリアー（例えば、GIT）へのファージ表示ライブラリーの投与後に、組織バリアーの対応する領域を上記方法の最後に回収することができる。この回収された組織を適当な緩衝液（例えばプロテアーゼインヒビターを含有するPBS）中で繰り返し洗浄して、例えばプロテアーゼインヒビターを含有するPBS中でホモジナイズすることができる。ホモジネートを使用して宿主（例えば大腸菌（E.coli））を感染させ、こうして組織バリアー（例えば、小腸組織）に強く結合するファージを増幅することができる。あるいは回収した組織を適当なPBS緩衝液中でホモジナイズし、繰り返し洗浄し、最終的組織ホモジネート中に存在するファージを大腸菌（E.coli）中で増幅することができる。このアプローチにより、組織バリアー（例えば、小腸組織）に強く結合するファージまたは組織バリアーの細胞（例えば、小腸組織の上皮細胞）中に取り込まれるファージの増幅（および以後の関連ペプチドが同定）が可能になる。この組織に結合するかまたは組織により取り込まれるファージの選択アプローチは繰り返すことができる。
ファージ表示集団による動物組織バリアーのin vivoの処理
精製したファージ表示ライブラリー（ランダムまたはあらかじめ選択された）を500μlのPBS緩衝液に希釈し、クローズド（またはオープン）小腸ループモデル（例えば、ラット、ウサギまたは他の種）中に注入した。時間０でおよび注入後の連続的時点に、門脈循環または全身性循環のサンプルを採取した。採取した血液のアリコートを大腸菌（E.coli）とともにインキュベートし、次にファージプラーク形成または形質導入単位のために、またはファージがテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性をコードするコロニーについて試験するために、プレートに塗布した。採取した血液サンプル（150μlまで）の残りを250μlの大腸菌（E.coli）および５mlのLB培地もしくは他の適当な増殖培地とインキュベートした。大腸菌（E.coli）培養物を、振盪台の上で37℃で一晩インキュベートした。他の時点（例えば、15分、30分、45分、60分、最大６時間）で採取した血液サンプルを同様に処理して、これらの時点で大腸菌（E.coli）中の門脈または全身性循環中に存在するファージが増幅された。増幅後、増幅ファージをPEG沈殿により回収し、PBS緩衝液またはTBS緩衝液中に再懸濁した。PEG沈殿前後の増幅ファージの力価を測定した。増幅したPEG沈殿したファージを、既知のファージ力価（一般的に108〜1010ファージまたはプラーク形成単位（p.f.u.）／ml）まで希釈し、動物クローズド（またはオープン）ループモデルのGIT中に注入した。種々の時点で門脈および／または全身性循環から血液サンプルを採取し、血液サンプル中に輸送されたファージを、最初のサイクルについて前記したように大腸菌（E.coli）中で増幅した。次にファージをPEG沈殿し、再懸濁し、力価測定し、希釈し、動物クローズド（またはオープン）ループモデルのGIT中に注入した。このファージ注入の操作と以後の門脈および／または全身性血液サンプルの採取とこれらの血液サンプル中に輸送されるファージの増幅は、例えば10回まで繰り返すことができ、GITから門脈および／または全身性循環中に優先的に輸送されるファージを選択することができる。
6.7.  門脈および全身性循環へのラットルーメンからのファージの輸送
ランダムファージ表示ライブラリーからのファージならびに対照ファージを、ラット胃腸管のルーメン（in situのラットクローズドループモデル）中に注入した。全身性循環または門脈循環からの血液を経時的に採取し、循環中に輸送されたファージの数を、大腸菌（E.coli）の血液サンプルを力価測定することにより決定した。
この試験で使用されるファージ表示ライブラリーは、D38とDC43であり、ここでは第III遺伝子はそれぞれ38量体および43量体ペプチドをコードする。陰性対照として、第III遺伝子が「ランダム」ペプチド配列をコードしない同一のファージM13mp18を使用した。大腸菌（E.coli）からライブラリーファージD38とDC43の両方を調製し、一緒に混合し、PBSに対して透析し、PEG/NaClを使用して沈殿させ、PBS緩衝液に再懸濁した。M13mp18対照を同様に処理した。各ファージサンプルの力価を測定し、ほぼ同じ力価になるようにPBSで希釈した後ラットクローズドループモデル中に注入した。
全身性循環からのサンプリングのために、ウィスターラットの十二指腸の約15cmを縛って血行を止め（クローズドループモデル）、約0.5mlのファージ溶液をクローズドループ中に注入し、血液（0.4ml）を種々の時間に尾静脈からサンプリングした。使用した時点（分）は、０、15、30、45、60、90、120、180、240、および300分である。門脈循環からのサンプリングのために、門脈にカテーテルを挿入し、十二指腸の約15cmを縛って血行を止め（クローズドループモデル）、0.5mlのファージ溶液をクローズドループ中に注入し、血液を種々の時間に門脈カテーテルからサンプリングした。門脈サンプリングは微妙なため、サンプリング時間は可能な場合15、30、45および60分に限定した。各動物中に注入されたファージの容量は以下の通りである：
動物（15）    注入されたファージの容量
R1-R3              0.50ml
R4                 0.43ml
R5-R15             0.45ml
各動物に注入された容量の差を補正するために（標準容量として0.5mlを使用して）、輸送されたファージの予測される数を調整した。
全身性循環中への輸送を調べるために、動物R1、R2、およびR3に対照ファージM13mp18を投与し、動物R4、R5、R6、およびR7には試験ファージD38/DC43ミックスを投与した。門脈循環への輸送を試験するために、動物R8、R9、およびR10に対照ファージM13mp18を投与し、動物R11、R12、R13、およびR14には試験ファージD38/DC43ミックスを投与した。動物R4〜R7（表11を参照）からの１日目に全身性循環から採取し、大腸菌（E.coli）で増幅し、PEG沈殿させ、PBSに再懸濁したファージサンプルを組合せたものを、動物R15*に投与した。以後の分析において、このファージの力価は、動物R8〜R14について使用した他のファージサンプルより100倍以上高いことがわかった。従って動物R15*について提示したデータを下げて補正した。
各モデル系で各時点に約0.4mlの血液を採取した。採取した血液（全身性）30μlを100μlの調製した大腸菌（E.coli）株K91Kanと混合し、37℃で30分インキュベートし、LBプレート上でTop Agaroseを使用してプラーク形成させるために塗布した。種々の陰性対照を力価測定実験に含めた。翌日プラーク形成単位数を測定した。同様に30μlの採取血液（門脈）とその連続希釈物（1:100、1:1000）を、100μlの調製した大腸菌（E.coli）株K91Kanと混合し、37℃で30分インキュベートし、LBプレート上でTop Agaroseを使用してプラーク形成させるために塗布した。翌日プラーク形成単位数を測定した。
さらに各時点で採取した血液（全身性および門脈）の約300μlを５mlの調製した大腸菌（E.coli）株K91Kanと、５mM MgCl2/MgSO4を含有する修飾増殖培地中で37Cで一晩攪拌（ファージ増幅を可能にするため）しながらインキュベートした。サンプルを遠心分離し、細胞ペレットを捨てた。ファージ上清のサンプルを採取し、TBS緩衝液で連続的に希釈（10-2、10-4、10-6、10-8）し、塗布してプラークについて調べ、増幅ファージサンプル中に存在するプラーク形成単位数を測定した。
さらに試験動物R4〜R7から得られた「増幅した」上清（各時点からのサンプルを使用した）からファージのアリコートを取り、一緒にし、PEGを使用して２時間沈殿させた。沈殿したファージをPBS緩衝液中に再懸濁し、動物R15*のクローズドループモデル中に注入し、次に門脈サンプリングを行なった。
クローズドループモデルから全身性循環中に輸送されるファージの数を、下記表11に示す。クローズドループモデルから門脈循環中に輸送されるファージの数を、下記表12に示す。これらの数は、ファージ投入量の差および容量投入量の差について補正されている。門脈サンプル中には全身性サンプル中に存在するファージより多くのファージが存在し、全身性循環中での肝性もしくはRESクリアランスおよび／またはファージ不安定性を示していることは明らかである。さらにGITから門脈循環へのファージの取り込みは非常に迅速であり、多数のファージが15分以内に検出される。門脈サンプリング実験からの結果はまた、D38/DC43ライブラリーからのファージの取り込み速度は、対照ファージより速いことを示している。すなわちGITから門脈循環への、ランダムペプチド配列をコードするファージの優先的取り込みがあるかも知れない。動物R13、R14、およびR15*の場合、限られた時間枠（それぞれ、30、45および15分）以内に力価測定された血液サンプル中に輸送されるファージの％は、それぞれ0.13％、1.1％、および0.013％と推定された。
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動物R1、R2、およびR3には対照ファージM13mp18を投与した。
動物R4、R5、R6、およびR7には試験ファージD38/DC43ミックスを投与した。
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動物R8、R9、およびR10には対照ファージM13mp18を投与した。
動物R11、R12、R13、およびR14には試験ファージD38/DC43ミックスを投与した。
動物R15*には、１日目に動物R4〜R7（表11を参照）からの全身性循環からサンプリングし、次にPEG沈殿させPBS中に懸濁した、組合せファージサンプルを投与した。次に分析すると、このファージの力価は動物R8〜R14について使用した他のファージサンプルより100倍高かった。すなわち動物R15*の門脈循環中へのファージの輸送を測定したデータは下げて調整した。
これらの試験は、大腸菌（E.coli）中で血液に輸送されたファージを力価測定することにより証明されるように、対照ファージとD38/DC43ファージともにGITのルーメンから門脈循環および全身性循環に経時的に輸送されることを示した。対応する対照ファージサンプルより多くのファージが試験ファージサンプルから門脈循環に輸送された。さらに門脈循環への試験ファージの輸送速度は、対照ファージのそれより速いようであった。異なる動物（R4〜R7）の全身性循環中に現れたD38/DC43ライブラリーからのファージをプールし、大腸菌（E.coli）中で増幅し、沈殿させ、GITのルーメンに再適用し、次に門脈循環中で採取し、大腸菌（E.coli）中で力価測定した。これらの選択されたファージはまた、GITのルーメンから門脈循環中に輸送された。このin situループモデルは、GITから循環中へのファージと粒子の輸送を促進するペプチド配列を同定するための魅力的なスクリーニングモデルであるかも知れない。
このスクリーニングモデル系を使用して、現在多くのあらかじめ選択されたファージライブラリーが存在し、例えば動物R4〜R7からのワンパス全身性ファージライブラリー、動物R11〜R14からのワンパス門脈ライブラリー、および動物R15*からのツーパスの迅速輸送全身性−門脈ファージライブラリーSP-2がある。
6.8.  門脈循環および全身性循環へのラットルーメンからのあらかじめ選択されたファージライブラリーのファージの輸送
GIT中のHPT1、HPEPT1、D2H、およびhSI受容体または結合部位を使用してランダムファージ表示ライブラリーD38とDC43をスクリーニングしてあらかじめ選択したファージをプールすることにより、４つのあらかじめ選択されたファージライブラリーGI-D2H、GI-hSI、GI-HPT1およびGI-hPEPT1を作製した。ファージプール、あらかじめ選択されたファージライブラリーを表13に示す。PAX2、HAX1、HAX5、HAX6、HAX10、H10およびHAX44についての配列は同じであることに注意されたい。またHAX40の配列はH44の配列と同じである。対応する配列番号を表７に示す。
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本明細書で前記した方法と同様に、３つのあらかじめ選択されたファージライブラリーを陰性対照ファージM13mp18とともに、ラットクローズドループモデル（あらかじめ選択したファージライブラリーについて６匹の動物）に注入し、門脈静脈を介して門脈循環から経時的に血液を採取し、実験の最後に尾静脈から全身の血液サンプルを採取し、クローズドループからの小腸組織領域を採取した。
特にGIT中に存在する各受容体または結合部位に対してin vitroで選択されたファージを大腸菌（E.coli）中で増幅させ、PEG沈殿させ、TBSに再懸濁し、前記のように大腸菌（E.coli）中でプラークを形成させることにより各ファージサンプルの力価を測定した。次に各受容体部位について同数の各ファージ（８×108ファージ）を、陰性対照ファージM13mp18とともにあらかじめ選択されたファージライブラリー中にプールし、各あらかじめ選択したファージライブラリーを、ライブラリー当たり６匹のウィスターラットに投与した（ラット１〜６；GI-D2H、ラット７〜12；GI-hSI、ラット13〜18；GI-hPEPT1、およびラット19〜24；GI-HPT1）。前記のin situループモデルを使用して、0.5mlのあらかじめ選択したファージライブラリー溶液を、十二指腸／空腸の縛った部分に注入した。門脈静脈から０、15、30、45および60分に、血液をヘパリン化チューブ中に加えた。実験の最後に全身性循環から血液サンプルを取った。同様にファージ注入のために使用した十二指腸／空腸の部分を取った。
採取した門脈血（希釈なし、10-2、10-4、10-6希釈）30μlを、30μlの大腸菌（E.coli）K91Kan細胞（一晩培養物）に添加し、37℃で10分インキュベートした。次に３mlのtopアガロースを加え、サンプルを塗布してプラークを形成させた。採取した門脈血液100μlを100μlの大腸菌（E.coli）K91Kanに加えた。次に５mlのLB培地を加え、回転微生物インキュベーター中でサンプルを37℃で一晩インキュベートした。遠心分離して大腸菌（E.coli）を除去し、増幅したファージ上清サンプルを直接力価測定したか、またはPEG沈殿させ、TBSに再懸濁し力価測定した。増幅したファージの力価測定後に、各セットの動物からのファージを含有するサンプルを合わせ、各サンプルの力価を同じ力価に調整し、LB寒天プレート（22cm2平方プレート）上でプラークを形成させるために塗布した。12,000または24,000ファージをプラーク形成のために塗布した。
採取した全身血液（希釈なし、10-2、10-4、10-6希釈）30μlを、大腸菌（E.coli）K91Kan細胞に添加し、37℃で10分インキュベートした。次に３mlのトップ（top）アガロースを加え、サンプルを塗布してプラークを形成させた。採取した全身血液100μlを100μlの大腸菌（E.coli）K91Kanに加え、37℃で10分インキュベートした。次に５mlのLB培地を加え、回転微生物インキュベーター中でサンプルを37℃で一晩インキュベートした。遠心分離して大腸菌（E.coli）を除去し、増幅したファージ上清サンプルを直接力価測定したか、またはPEG沈殿させ、TBSに再懸濁して力価測定した。増幅したファージの力価測定後に、各セットの動物からのファージを含有するサンプルを合わせ、各サンプルの力価を同じ力価に調整し、LB寒天プレート（22cm2平方プレート）上でプラークを形成させるために塗布した。12,000または24,000ファージをプラーク形成のために塗布した。
各クローズドループ中で使用した小腸組織部分を切り出した。組織を小片に切り、次にプロテアーゼインヒビターを含有する無菌PBS中で３回洗浄し、Ultra thorexホモジナイザーでホモジナイズした（Int-Dサンプル）。あるいは組織（プロテアーゼインヒビターを補足したPBS中）をUltra Thorexホモジナイザーでホモジナイズし、プロテアーゼインヒビターを含有するPBS中で３回洗浄し、プロテアーゼインヒビターを含有するPBS中に再懸濁した（Int-Gサンプル）。各場合に組織ホモジネートの連続希釈物（希釈なし、10-2、10-4、10-6希釈）を大腸菌（E.coli）中で力価測定した。さらに組織ホモジネートのアリコート（100μl）を100μlの大腸菌（E.coli）K91Kanに加え、37℃で10分インキュベートし、次に５mlのLB培地を加え、回転微生物インキュベーター中で37℃で一晩インキュベートした。
門脈血液、全身血液、および小腸組織から増幅したファージを、プラーク形成させるために塗布した。プラークをHybond-N Nylonフィルターに移し、変性（1.5Ｍ NaCl、0.5Ｍ NaOH）させ、中和（0.5Ｍトリス−塩酸、pH7.4、1.5Ｍ NaCl）し、２×SSC緩衝液中で洗浄した。フィルターを空気乾燥し、DNAをフィルターに架橋させた（UV架橋：２分、高の設定）。フィルターをプレハイブリダイゼーション緩衝液（６×SSC、５×デンハルト溶液、0.1％SDS、20μg/ml酵母tRNA）中で40℃〜45℃で少なくとも60分インキュベートした。
あらかじめ選択したファージライブラリーを作成するために使用した受容体または結合部位をコードする領域に相補的な合成オリゴヌクレオチド（22量体）を合成した（以下の表14を参照）。
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オリゴヌクレオチド（５pmol）を32P-ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼで5’末端標識し、約2.5pmolの標識オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション試験に使用した。ハイブリダイゼーションは40〜45℃で６×SSC、５×デンハルト溶液、0.1％SDS、20μg/ml酵母tRNAおよび放射能標識合成オリゴヌクレオチドを含有する緩衝液中で一晩行ない、次に以下の緩衝液で洗浄した（40〜45℃で20〜30分）：（i）２×SSC／0.1％SDS、（ii）１×SSC／0.1％SDS、（iii）0.1×SSC／0.1％SDS。フィルターを空気乾燥し、オートラジオグラフィーのために15時間、24時間、または72時間感光させた。
ハイブリダイゼーションデータは、すべてのオリゴヌクレオチドプローブが、明らかに標識されなかったHAX9プローブを除いて、そのファージ標的に特異的に結合することを示した。M13mp18 DNAのみにハイブリダイズした陰性対照プローブは、試験したすべてのサンプル中で弱〜負のシグナルを示した（データは示していない）。
各受容体群のラットからのプールのハイブリダイゼーションデータをまとめた。表15、16、17および18は、HSI、D2H、HPT1、およびhPEPT1受容体群の代表的オートラジオグラフィーシグナルの編集を示す。これらの表は、クローズドループGITモデルから門脈および全身性循環へのファージ吸収と取り込み、および小腸組織へのファージ吸収／インターナリゼーションを示す。これらの表において、Int-Gは、洗浄と回収の前にホモジナイズされた小腸組織を示し、Int-Dはホモジナイゼーションとファージ回収前に洗浄した小腸組織を示す。すべての場合で、２匹以上の動物に主要なファージ候補が存在した。
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0004129298.tif 000028
0004129298.tif 000029
HAX9に対する合成オリゴヌクレオチドとは別に、対応するファージ標的へのハイブリダイゼーションにより測定されるように、すべてのオリゴヌクレオチドはまず放射能標識されていることを確認した（例えば、ファージS15はオリゴヌクレオチドS15にハイブリダイズした）。さらに使用した実験条件下で、これらのオリゴヌクレオチドは基本的に陰性対照ファージ鋳型M13mp18にハイブリダイズしなかった。ファージM13mp18に２つのオリゴヌクレオチドを合成した：（1）M13mp18と各GIT受容体またはGIT結合部位選択ファージの両方の保存された配列とハイブリダイズする陽性オリゴヌクレオチド［M13（陽性）と呼ぶ］；および（2）ファージM13mp18の複数のクローニング部位にユニークな配列とのみハイブリダイズし、GIT受容体またはGIT結合部位選択ファージのいずれにもハイブリダイズしない陰性オリゴヌクレオチド。
ファージのhSIプールの場合、クローズドループモデルから門脈循環に４つのファージ（ファージS15、SNi-10、SNi-34およびSNi-38）のみが輸送された。他のファージ（S21、S22、SNi-28、SNi-45、SNiAX-2、SNiAX-6およびSNiAX-8）はGITから門脈循環中に輸送されなかった。さらにファージSNi-10、および程度は少し小さいがファージS15とS22は、小腸サンプルまたは画分中に見つかり、他のファージは見つからなかった。Int-Gサンプル中にはファージM13mp18がほんのわずか（<0.1％）存在した。これらの結果は、あらかじめ選択されたライブラリーからファージがさらに選択され、これがGITクローズドループから門脈循環中に輸送されるファージ、または小腸組織に結合するかもしくはインターナライズされるファージの同定を可能にすることを示す。
ファージのD2Hプールの場合は、GITクローズドループモデルから門脈循環にファージが輸送されるランク順位があり、ファージDCX11とDAB10が優先的に輸送され、次にファージDCX8、DAB30、DAB3およびDAB7が輸送された。このプールからの多くのファージは門脈循環中に輸送されなかった（ファージDAB18、DAB24、DAX15、DAX24、DAX27、DCX26、DCX36、DXC39、DCX42、DCX45を含む）。GITから門脈循環への非常に低レベルのファージDAX23の輸送がある。同様に一部のファージのみが小腸サンプルまたは画分中にみつかった（ファージDAB30、DCX33、DAB7、DCX11、DCX45を含有し、はるかに弱い程度にファージDAB3、DAB10、DCX8、DCX39、DCX42を含む）。あるファージは小腸サンプル中に見つからなかった（ファージDAB18、DAB24、DAX15、DAX24、DCX26、およびDCX36を含む）。Int-Gサンプル中にはファージM13mp18がほんのわずか（<0.1％）存在した。これらの結果は、あらかじめ選択されたライブラリーからファージがさらに選択され、これがGITクローズドループから門脈循環中に輸送されるファージ、または小腸組織に結合するかもしくはインターナライズされるファージの同定を可能にすることを示す。
ファージのHPT1プールの場合は、GITクローズドループモデルから門脈または全身性循環にファージが輸送されるランク順位があった。ファージPAX2（これはこのプール中の他のファージに対して４×濃度で使用された）次にファージHAX42が門脈および全身性循環中に見つかり、ファージh40は全身性循環のみに見つかった。このプール中のいずれのファージも小腸サンプルまたは画分中に見つからなかった。ファージM13mp18は小腸画分または全身性循環中には見つからず、門脈循環中にはほんのわずか（<0.001％）に存在した。これらの結果は、あらかじめ選択されたライブラリーからファージがさらに選択され、これがGITクローズドループから門脈および／または全身性循環中に輸送されるファージ、または小腸組織に結合するかもしくはインターナライズされるファージの同定を可能にすることを示す。
ファージのhPEPT1プールの場合は、このプールにファージPAX2とH40も含めた。このプールから多くのファージが門脈循環中に見つかった（ファージP31（配列番号43）、PAX46、PAX9、H40、PAX17、PAX40、PAX2、PAX14、5PAX3および5PAX12を含む）。門脈血液中には多くのファージは見つからなかった（陰性対照ファージM13mp18、PAX15、PAX16、PAX18、PAX35、PAX38、PAX43、PAX45、P90、5PAX5および5PAX7を含む）。全身性循環中に見つかったファージはファージ5PAX5とP31（配列番号43）のみであった。さらに小腸への一部のファージの優先的結合があった（ファージ5PAX12、5PAX7、5PAX3、H40、P31（配列番号43）、PAX9、およびより程度は小さいがPAX38とPAX15を含む）。あるファージは小腸サンプル中には見つからなかった（陰性対照ファージM13mp18、およびファージPAX2、PAX14、PAX16、PAX18、PAX35、PAX45、PAX46、P90および5PAX5を含む）。これらの結果は、あらかじめ選択されたライブラリーからファージがさらに選択され、これがGITクローズドループから門脈および／または全身性循環中に輸送されるファージ、または小腸組織に結合するかもしくはインターナライズされるファージの同定を可能にすることを示す。
選択配列のさらなる性状解析
ファージ表示ライブラリーを用いて胃腸管組織の４つの組換え受容体部位（hPEPT1、HPT1、D2H、hSI）の最初のスクリーニング後、陰性対照タンパク質であるBSAタンパク質および組換えタンパク質である組換えヒト組織因子（hTF）（これは胃腸管組織の組換え受容体のように、そのアミノ末端にポリヒスチジン標識を含有した）と比較して、各標的受容体部位に優先的結合を示した一連のファージを単離した。以後の実験で各標的受容体部位に結合する選択ファージの同じ力価を一緒にして１つのプールとした（すなわち、HPT1結合ファージの１つのプール、hPEPT1結合ファージの１つのプール、D2H結合ファージの１つのプール、およびhSI結合ファージの１つのプール）。各プールは、等しい力価の陰性対照ファージM13mp18で補足された。これらのファージプールを、ラット小腸組織のクローズド十二指腸ループ領域に注入し、次に、小腸組織に結合および保持されたおよび／または小腸ループから門脈および／または全身性循環に吸収されたファージを採取し回収した。さらに標的組換え受容体部位に結合する初期のファージの選択を、固定化Caco-2細胞への結合および／または固定化C2BBel細胞への結合について分析した。最終的リードペプチド配列の選択は、（1）陰性対照タンパク質BSAおよび／またはhTFsに対するその結合よりも、in vitroで標的組換え受容体部位に結合する、（2）陰性対照ファージM13mp18よりも、ラット小腸組織のクローズド十二指腸ループへの注入後にラット小腸組織に結合する、（3）陰性対照ファージM13mp18よりも、ラット小腸組織のクローズド十二指腸ループへの注入後に、ラット小腸組織から門脈および／または全身性循環に吸収される、および（4）陰性対照ファージM13mp18よりも、ファージ結合試験において固定化Caco-2細胞または固定化C2BBel細胞に結合する、ペプチド配列をコードするファージの能力を基礎にした。また化学合成の容易さを考慮してペプチドを選択した。
6.9.  GIT標的ペプチドのGST融合タンパク質
GI標的ペプチドのGST融合タンパク質の作製
GI標的ペプチドの融合タンパク質をコードするグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）ベクターを、ベクターpGEX4T-2（供給源、Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ）中で作製した。簡単に説明すると、目的のクローンから１本鎖DNAをポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。増幅したDNAを次に、制限酵素XhoIとNotIで切断し、次にSalI／NotI切断したpGEX4T-2中に連結した。形質転換後、各構築物のDNA配列を配列決定により証明した。
次に、挿入配列が45塩基対より小さいGST融合タンパク質の末端切断型の構築のために、付着SalIとNotI末端を含有し目的の配列をコードする重複オリゴヌクレオチドをアニーリングし、次に直接SalI／NotI切断したpGEX4T-2中に連結した。形質転換後、各構築物のDNA配列を配列決定により証明した。
合成された種々のGST融合タンパク質構築物の模式図を図5A〜5Cに示す。
GST融合タンパク質の発現と精製
GST融合タンパク質構築物を含有する大腸菌（Escherichia coli）BL21細胞を、100μg/mlアンピシリン（2X YT/amp）を含有する2X YT培地中で一晩増殖させた。一晩培養物を2X YTブロス（100ml）で1:100希釈し、細胞をＡ600が0.5になるまで30℃で増殖させ、１mMイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドで誘導し、さらに３時間増殖させた。遠心分離して細胞を採取し、プロテイナーゼインヒビター（Boehringer/Mannheim）の混合物を含有するPBS５ml中に再懸濁した。細胞を氷上で超音波処理し、細胞溶解物を12,000×ｇで４℃で10分遠心分離した。上清画分をグルタチオン−セファロース（登録商標）4Bの50％スラリー２mlと室温で30分反応させ、1.5mlのPBSで３回洗浄（室温で）し、結合したGST融合タンパク質を、３×１mlの10mM還元グルタチオネイン50mMトリス塩酸（pH8.0）で室温で10分反応させて溶出した。タンパク質をBio-Radプロテインアッセイで定量し、次にSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により性状解析した。
GST融合ペプチドのELISA
標準的ELISA法を以下のように修飾した。GSTタンパク質を、１％BSAと0.05％ツイーン20を含有するPBS（１％BPT）中で適当な濃度に希釈し、力価測定し、室温で１時間インキュベートした。５回洗浄後、抗GSTモノクローナル抗体（Sigma、セントルイス、クローンGST-2、１％BPT中で1:10,000に希釈）を加え、１時間インキュベートした。さらに５回洗浄後、ヤギ抗マウスIgG2b-HRPを加え（Southern Biotechnology Associates Inc.,Birmingham,AL、１％BPT中で1:4,000に希釈）、１時間インキュベートした。５回洗浄後、プレートをTMBペルオキシダーゼ基質（Kirkegard and Perry,Gaithersburg,MD）で発色させた。すべてのデータはバックグランド結合を引いて示す。
図６は、hSI受容体と固定化C2BBel細胞へのGST-SNi10、GST-SNi34およびGST単独の結合を示す。
選択されたGITターゲティングペプチドのGST融合タンパク質
結果は、GST対照結合と比較して、GST-DXB8、GST-PAX2、GST-P31、GST-SNi10およびGST-SNi34が固定化Caco-2またはC2BBel細胞（図７と８）に結合することを示す。GST-HAX42、GST-5PAX5はすべて、GST対照に比較して弱〜中程度の結合を示した。
興味深いことにP31末端切断型103-GST融合タンパク質はほとんど完全長P31（配列番号43）のように、固定化Caco-2細胞に結合した（Ａ）。これは、P31配列（配列番号43）の結合に関与する部分がこの部分にあることを示唆する。PAX2.107は完全長PAX2と同様に結合した。従ってこの部分は、結合に関与するアミノ酸配列を含有する可能性が最も高い（Ｂ）。予備アッセイにおいて、DCX8末端切断型のいずれも完全長DCX8と同様にCaco-2細胞には結合せず、結合領域はこれらの部分の２つ以上にわたっていることを示唆している。
合成ペプチドによる結合の阻害
固定化C2BBel細胞へのGST-P31の結合
標準的ELISA法を以下のように修飾した。GST融合タンパク質とペプチドを、１％BSAと0.05％ツイーン20を含有するPBS中で適当な濃度に希釈した。ペプチドを力価測定し、力価測定したペプチドに一定濃度の希釈GSTタンパク質を加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。５回洗浄後、抗GSTモノクローナル抗体（Sigma、セントルイス、クローンGST-2、１％BPT中で1:10,000に希釈）を加え、１時間インキュベートした。さらに５回洗浄後、ヤギ抗マウスIgG2b-HRPを加え（Southern Biotechnology Associates Inc.,Birmingham,AL、１％BPT中で1:4,000に希釈）、１時間インキュベートした。５回洗浄後、プレートをTMBペルオキシダーゼ基質（Kirkegard and Perry,Gaithersburg,MD）で発色させた。すべてのデータはバックグランド結合を引いて示す。
図９Ａと９Ｂは、C2BBel固定化細胞へのGST-P31の結合の阻害を示す。ペプチド競合物質は、P31（配列番号43）のダンシル化ペプチドであるZElan024、およびP31（配列番号43）の末端切断型ダンシル化物であるZElan044、ZElan049、およびZElan050である。データは、O.D.対ペプチド濃度、およびGST-P31結合の阻害パーセント対ペプチド濃度として示す。競合のないGST-P31結合を100％結合と見なした。IC50値は、阻害パーセントグラフ上の50％線を使用する推定値である。
GST-P31とGST-PAX2は、競合アッセイで使用した0.5μg/ml濃度でZElan024（P31）（配列番号43）とZElan018（PAX2）に対して交差反応結合を示さなかった。GST-HAX42は、競合アッセイで使用した0.5μg/ml濃度でZElan018（PAX2）とZElan021（HAX42）に対して交差反応結合を示した。
図10A〜10Cは、固定化C2BBel細胞上のGST-P31、GST-PAX2、GST-SNi10およびGST-HAX42対種々のダンシル化ペプチドの競合ELISAにより作成したデータのまとめである。IC50値はμMで示し、複数のアッセイで決定した範囲を含む。GST/C2BBel欄は、固定化C2BBel細胞へのGSTタンパク質の結合の要約である。
固定化Caco-2細胞への結合
Caco-2細胞を固定化し、フェニルヒドラジンで処理し、前記したようにブロックした。合成ペプチド（100μg/ml）を二重測定でCaco-2細胞に適用し、96ウェルプレートに沿って連続的に希釈した。対応するGST−ペプチド融合タンパク質（10μg）を各ウェルに加え、プレートを攪拌しながら室温で２時間インキュベートした。細胞へのGST−ペプチド融合タンパク質の結合を、上記ELISA法を使用して測定した。GST−P31結合は、ZElan024、ZElan028およびZElan031ならびに２つのＤ型であるZElan053とZElan054により阻害された。GST-PAX2結合は、ZElan032、ZElan033、およびZElan035により阻害された。GST-HAX42結合は、ZElan021（完全長HAX42）により阻害されなかったが、ZElan018（PAX2）とZElan026およびZElan038（混合PAX2ペプチド）により阻害された。
生きたCaco-2細胞へのGST−ペプチド融合体の輸送と取り込み
HBSS緩衝液中で４hrかけて培養して分極化（polarized）したCaco-2単層を介するGST−ペプチド融合体および欠失誘導体の輸送と取り込みを、抗GST ELISA測定法を使用して調べた。別の実験で、GST−ペプチド融合体および無血清培地（SFM）中で24hrかけて培養した分極化Caco-2単層を介する欠失誘導体の輸送と取り込みを、抗GST ELISA測定法を使用して調べた。
材料
緩衝化ハンクス平衡塩類溶液（bHBSS）＝0.011Ｍグルコース（１g/l）、25mMヘペス（15mMの酸（3.575g/l；Sigma CN.H3375）；10mM塩基（2.603g/l；Sigma CN.H1016）］を補足した１×HBSS（Gibco CN.14065-031）。
クロロキン：10mM水溶液として作成した［Sigma CN C6628］
溶解緩衝液：30mMトリス−塩酸（pH8.0）；１mM EDTA
無血清培地（SFM）は血清を含まない普通の培地である。
方法
a）4時間HBSS試験：スナップウェル上で増殖させたCaco-2単層（継代33；23日令）を介する経上皮電気フラックス（TER）を測定して、単層の完全性を確認した後実験を開始した。培地を除去し、細胞をbHBSSで１回洗浄した。100μMクロロキンを含有するbHBSSを加え、細胞を37℃で２時間インキュベートした。bHBSS＋クロロキンをGST−ペプチド融合体（100μg/ml）を含有する0.5ml bHBSSで交換し、細胞を前記したようにインキュベートした。以下の時間に側底側（basolateral）のサンプルを取った：０、0.5時間、２時間、および４時間。４時間日にTERを測定し、頂端側（apical）の培地をサンプリングし、頂端側のリザーバーをHBSSで６回洗浄した。細胞を氷上で溶解緩衝液中で１時間溶解させ、次に溶解サンプルを採取した。すべてのサンプルを、抗GST ELISAで測定するまで−70℃で保存した。分析の前に、BioRadプロテインアッセイを使用してサンプルを互いにタンパク質含量について標準化した。
ｂ）24時間SFM試験：スナップウェル上で増殖させたCaco-2単層（継代33；23日令）を介する経上皮電気フラックス（TER）を測定して、単層の完全性を確認した後実験を開始した。培地を除去し、細胞をSFMで１回洗浄した。GST−ペプチド融合体（100μg/ml）を含有するSFMを細胞に加え、これを５％二酸化炭素で37℃で24時間インキュベートした。24時間後、TER読み値を取り、側底側および頂端側のリザーバーからサンプルを取った。頂端側のリザーバーをPBSで６回洗浄した。細胞を氷上で溶解緩衝液中で１時間溶解させ、次に溶解サンプルを採取した。すべてのサンプルを、抗GST ELISAで測定するまで−70℃で保存した。分析の前に、BioRadプロテインアッセイを使用してサンプルを互いにタンパク質含量について標準化した。
結果
試験したすべてのGST−ペプチド融合体と対照は、生きたCaco-2単層を介して輸送された。完全長GST-P31とGST-DCX8（しかしこれらの分子の末端切断型は含まない）はGST単独より高いフラックスを有した。
極性化Caco-2細胞へのGST−ペプチド融合体のインターナリゼーションを、２つの実験で調べた。実験１では、15μgのGST−ペプチド融合体をbHBSSで適用し、インターナライズされたGST−ペプチドを、細胞を４時間溶解することにより回収した。実験２では、10μgのGST−ペプチドを、ａ）bHBSS（４時間後に回収された溶解物）、またはｂ）無血清培地（24時間後に回収された溶解物）中で適用した。
図11Aは、極性化したCaco-2単層を介するGST−ペプチドの完全な輸送を説明し、必ずしもインターナリゼーションではなく、すなわちスナップウェルの側底側リザーバーからGST−ペプチドが回収されたが、タンパク質は傍細胞の経路によりバリアを横断した可能性があることを示す。
GSTペプチド融合物の固定化Caco-2細胞への結合におけるトロンビン切断の効果
完全なGSTペプチド融合物とトロンビン切断GSTペプチド融合物の固定化Caco-2細胞への結合を比較した。完全な融合物に対しトロンビン切断GSTペプチド融合物の結合が低下したことにより、GSTドメインではなく融合物のペプチド成分が結合に介在することが示される。
方法
PBS中の0.1%BSAでブロッキングする前に、96-ウェルプレート（p38）中で増殖させたCaco-2密集単層を固定化し、0.1%フェニルヒドラジンで処理した。各GSTペプチド30μgを20mM Tris-HCl pH8.0,150mM NaCl,2.5mM CaCl2中、室温で18時間、ウシトロンビン（1μ/ml;0.4 NIH単位;Sigma CN.T9681）で処理した。対照はトロンビンを添加せずに同様に処理した。各GSTペプチド融合物10μgをPAGE解析用に取り出し、5倍連続希釈（1%BPT希釈液）の前に、融合物10μgを２連で固定化Caco-2細胞へ添加した。この融合物を室温で1時間結合させた。1%BPTで6回洗浄した後、結合をELISAによりアッセイした。
結果
結果を図12に示す。
結論:
PAGE解析により、トロンビンがGSTペプチド融合物を効果的に切断することが確認された。トロンビンによる切断により、GST-P31.103、GST-PAX2.106、GST-DCX8、GST-SNi10の固定化Caco-2細胞への結合の検出が有意に減少し、GSTドメインではなくペプチド成分が結合を媒介することが示される。
6.10.ペプチドの合成
6.10.1.固相合成法
ペプチドは当該技術分野で公知の方法により調製してよい。例えば簡潔に記載すると、固相ペプチド合成は、C末端アミノ酸のカルボキシル基の樹脂への結合およびN-α保護アミノ酸の連続的な付加からなる。保護基は当該技術分野で公知のいずれのものであってもよい。各々の新しいアミノ酸を生長鎖（growing chain）に付加する前に、鎖へ付加した前記アミノ酸の保護基を除去する。アミノ酸の適当な樹脂への結合については、Rivierら、米国特許第4,244,946号により記載される。かかる固相合成については、例えばMerrifield,1964,J.Am.Chem.Soc.85:2149;Valeら，1981,Science 213:1394-1397;Markiら，1981,J.Am.Chem.Soc.103:3178および米国特許第4,305,872号および同第4,316,891号により記載されている。好ましい態様では、自動ペプチドシンセサイザーを使用する。
限定されるものでないが例示すれば、ペプチドはABIにより提供される“Fastmoc”合成プロトコールを用い、Applied Biosystems社（“ABI”）モデル431A自動ペプチドシンセサイザーで合成可能であり、これはカップリング剤として、2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（“HBTU”）（R.Knorrら，1989,Tet.Lett.,30:1927）を使用する。この合成は市販の4-（2’,4’-ジメトキシフェニル-（9-フルオレニル-メトキシカルボニル）-アミノメチル）-フェノキシポリスチレン樹脂（Advanced ChemTechからの“Rink resin”）（H.Rink,1987,Tet.Lett.28:3787）0.25mmolで行うことができる。Fmocアミノ酸（1mmol）はFastmocプロトコールに従って結合させる。以下の側鎖保護Fmocアミノ酸誘導体：
FmocArg（Pmc）OH;FmocAsn（Mbh）OH;FmocAsp（tBu）OH;
FmocCys（Acm）OH;FmocGlu（tBu）OH;FmocGln（Mbh）OH;FmocHis（Tr）OH;
FmocLys（Boc）OH;FmocSer（tBu）OH;FmocThr（tBu）OH;
FmocTyr（tBu）OH
が使用される。［略語：Acm、アセトアミドメチル；Boc、t-ブトキシカルボニル；tBu、t-ブチル；Fmoc、9-フルオレニルメトキシカルボニル；Mbh、4,4’-ジメトキシベンズヒドリル；Pmc、2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル；Tr、トリチル］
合成は、溶媒としてN-メチルピロリドン（NMP）を用い、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解させたHBTUを加えて行う。Fmoc基の脱保護はNMP中の約20%ピペリジンを用いて達成される。各々の合成の終了時にペプチドの存在量を紫外線分光によりアッセイする。乾燥ペプチド樹脂サンプル（約3-10mg）を秤量し、次いでDMA（1ml）中の20%ピペリジンを添加する。30分音波処理した後、ジベンゾフルベン-ピペリジン付加生成物（N末端Fmoc基の切断により形成される）のUV（紫外線）吸光度を301nmにて記録する。ペプチド置換（mmol g-1）は式：
0004129298.tif 000030
（式中、Aは301nmにおける吸光度、vはDMA中の20%ピペリジン容量（ml）、7800はジベンゾフルベン-ピペリジン付加生成物の吸光係数（mol-1dm3cm-2）、およびwはペプチド樹脂サンプルの重量（mg）である）
に従って算出できる。
最後に、N末端Fmoc基をDMA中の20%ピペリジンを用いて切断し、次いでDMA中の無水酢酸およびピリジンを用いてアセチル化する。ペプチド樹脂はDMA、CH2Cl3および最後にジエチルエーテルで十分に洗浄する。
6.10.2.切断および脱保護
限定されるものではないが例示すれば、切断および脱保護は以下のように行うことができる：95%トリフルオロ酢酸水溶液（TFA）の添加に先立ち、風乾したペプチド樹脂をエチルメチル-スルフィド（EtSMe）、エタンジチオール（EDT）およびチオアニソール（PhSMe）で約20分間処理する。ペプチド樹脂グラム当たり全容量約50mlのこれら試薬を使用する。以下の比率：TFA:EtSMe:EDT:PhSMe（10:0.5:0.5:0.5）を使用する。この混合物をN2雰囲気下、室温で3時間攪拌する。混合物を濾過し、樹脂をTFAで洗浄する（2x3ml）。混合した濾液を真空蒸発させ、無水ジエチルエーテルを黄／橙色の残渣へ添加する。得られた白色沈殿を濾過により単離する。種々の切断法については、Kingら，1990,Int.J.Peptide Protein Res.36:255-266を参照。
6.10.3.ペプチドの精製
合成されたペプチドの精製はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC））、遠心分離、示差溶解性、または他の標準的な技術のいずれかを含む標準的な技術により行うことができる。
6.10.4.ペプチドの他の分子への結合
本発明のペプチドは、当該技術分野で周知の方法により他の分子（例えば、本発明の種々の実施形態に従う検出可能な標識、固相支持体への吸着を促進する分子、または毒素）と結合させてもよい。かかる方法としては、ホモ二官能価およびヘテロ二官能価架橋分子の使用が挙げられる。
ホモ二官能価分子は少なくとも2つの反応性官能基を有し、それらは同一のものである。ホモ二官能価分子における反応性官能基としては、例えばアルデヒド基および活性エステル基が挙げられる。
アルデヒド基を有するホモ二官能価分子としては、例えばグルタルアルデヒドおよびスバルアルデヒドが挙げられる。架橋剤としてのグルタルアルデヒドの使用については、Poznanskyら，1984,Science 223:1304-1306により開示されている。
少なくとも2つの活性エステル単位を有するホモ二官能価分子としては、ジカルボン酸およびN-ヒドロキシスクシンイミドのエステルが挙げられる。かかるN-スクシンイミジルエステルのいくつかの例としては、スベリン酸ジスクシンイミジルおよびジチオ−ビス−（プロピオン酸スクシンイミジル）、ならびにそれらのナトリウムおよびカリウム塩などの可溶性ビススルホン酸およびビススルホン酸塩が挙げられる。これらのホモ二官能価試薬はPierce、Rockford、Illinoisより入手可能である。
ヘテロ二官能価分子は少なくとも2つの異なる反応性官能基を有する。反応性ジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能価試薬のいくつかの例としては、3-（2-ピリジルジチオ）プロピオン酸N-スクシンイミジル（Carlssonら，1978,Biochem J.173:723-737）、S-4-スクシンイミジロキシカルボニル−α−メチルベンジルチオ硫酸ナトリウム、および4-スクシンイミジロキシカルボニル−α−メチル−（2-ピリジルジチオ）トルエンが挙げられる。3-（2-ピリジルジチオ）プロピオン酸N-スクシンイミジルが好ましい。チオール基と反応する二重結合を有する反応性基を含んでなるヘテロ二官能価試薬のいくつかの例としては、4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボン酸スクシンイミジルおよびm-マレイミド安息香酸スクシンイミジルが挙げられる。
他のヘテロ二官能価分子としては、3-（マレイミド）プロピオン酸スクシンイミジル、4-（p-マレイミド−フェニル）酪酸スルホスクシンイミジル、4-（N-マレイミドメチル−シクロヘキサン）-1-カルボン酸スルホスクシンイミジル、マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシ−スクシンイミドエステルが挙げられる。m-マレイミド安息香酸スクシンイミジルのスルホン酸ナトリウム塩が好ましい。前記のヘテロ二官能価試薬およびそれらのスルホン酸塩の多くはPierceより入手可能である。
他の多官能価試薬はもちろん、これらの製造および使用方法についてのさらなる情報は下記刊行物または当該技術分野で入手可能な他のもの：
Carlssonら，1978,Biochem.J.173:723-737;Cumberら，1985,Methods in Enzymology 112:207-224;Jueら，1978,Biochem.17:5399-5405;Sunら，1974,Biochem.13:2334-2340;Blattlerら，1985,Biochem.24:1517-152;Liuら，1979,Biochem.18:690-697;YoulsおよびNeville,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5483-5486;Lernerら，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:3403-3407;JungおよびMoroi,1983,Biochem.Biophys.Acta 761:162;Caulfieldら，1984,Biochem.81:7772-7776;Staros,1982,Biochem.21:3950-3955:Yoshitakeら，1979,Eur.J.Biochem.101:395-399;Yoshitakeら，1982,J.Biochem.92:1413-1424;PilchおよびCzech,1979,J.Biol.Chem.254:3375-3381;Novickら，1987,J.Biol.Chem.262:8483-8487;LomantおよびFairbanks,1976,J.Mol.Biol.104:243-261;HamadaおよびTsuruo,1987,Anal.Biochem.160:483-488;Hashidaら，1984,J.Applied Biochem.6:56-63
より入手できる。
さらに、架橋方法については、MeansおよびFeeney,1990,Bioconjugate Chem.1:2-12により概説されている。
6.10.4.1.ペプチドのビオチニル化
ペプチドをビオチニル化する方法は、当該技術分野では周知である。本発明の実施においてはいずれの常法を用いてもよい。例えば、下記手法を使用した。ペプチド10μgを0.1%酢酸100μlに溶解させた。PBS（900μl）およびビオチン-LC-NHS（Pierce,Rockford,IL）3.3mgを添加した。室温で30分間インキュベートした後、ビオチニル化ペプチドをSuperose12カラム（Pharmacia,Piscataway,NJ）で精製した。
6.10.5.合成ペプチド
表19、20および21では、本発明の実施において作製された種々の合成ペプチドの一次構造を提供する。
0004129298.tif 000031
0004129298.tif 000032
0004129298.tif 000033
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0004129298.tif 000038
GITペプチドのGST融合タンパク質を表21に示す。
0004129298.tif 000039
0004129298.tif 000040
6.10.6.ペプチドの安定性
ZElan031、ZElan053およびZElan054の相対的安定性を模擬腸液（SIF）中で決定した。SIFは、パンクレアチン（Sigma cat#P-1625,lot# 122H0812）100mgをリン酸貯蔵液8.4mlに溶解させ、0.2N NaOHでpH7.5に調整し、水で容量を10mlに調整することにより作製した。
ペプチド（3.25mg）を37℃で10,000倍希釈SIF溶液3.25mlに溶解させた。次いでアリコート（0.7ml）の消化溶液を＜1分、1時間、3時間、21時間または24時間で回収した。このサンプルを迅速にシリンジフィルター（Millipore Millex-GV 0.22μm,part# SLGV025LS,lot# H2BM95250）に通し、濾過した溶液300μlを直ちに、C-8カラム（Applied Biosystemsカラムおよびガードカラム：カラム-p/n 0711-0023 Spheri-5 ODS 5μm,220x4.6mm）を装備したHewlett-Packard HPLCシステムへ注入した。生成物はアセトニトリル−水勾配を用い、1.5ml/分で溶出させた。主要な蛍光ピークを採取し、凍結乾燥して、MS解析により同定した。
使用したHPLC勾配は：
時間（分） 溶媒混合物
0     95% H2O-5% アセトニトリル（0.1%TFA）
5     95% H2O-5% アセトニトリル（0.1%TFA）
35    85% H2O-15% アセトニトリル（0.1%TFA）直線的溶媒変化
40    0% H2O-100% アセトニトリル（0.1%TFA）    〃
45    95% H2O-5% アセトニトリル（0.1%TFA）     〃
52    95% H2O-5% アセトニトリル（0.1%TFA）     〃
であった。
表22で示されるように、3種のペプチドの（SIFに対する）相対的安定性は、ZElan053＞ZElan054＞ZElan031であった。ペプチドの酵素切断は期待されたようにアルギニンおよび／またはリジンで起こることがわかった。1-アミノ酸をそれらのD-アミノ酸類似体と置換することにより、これら残基におけるタンパク質分解率は有意に低下した。
0004129298.tif 000041
7.ペプチド被覆粒子の特性決定
ペプチド被覆PLGAナノ粒子の固定化Caco-2細胞への結合
標的化ペプチドで被覆したナノ粒子の固定化Caco-2細胞への結合を、抗体と、ペプチドに存在するダンシル部分との反応に基づくELISAアッセイを用いて調べた。選択した合成ペプチドの等電点は表23に示されている（対応する配列番号は表7に示される）。対応するダンシル化合成GIT結合ペプチドを表24に示す。
0004129298.tif 000042
0004129298.tif 000043
方法：
PBS中の0.1%BSAでブロッキングする前に、96-ウェルプレート（p38）で増殖させたCaco-2密集単層を固定化し、0.1%フェニルヒドラジンで処理した。対照およびダンシルペプチド被覆ナノ粒子を10mg/mlで滅菌水中に再懸濁させ、室温で1時間磁石で攪拌した。サンプルは、（1）ブランクナノ粒子対照、（2）スクランブルしたPAX2被覆ナノ粒子、（3）PAX2被覆ナノ粒子、（4）HAX42被覆ナノ粒子、（5）PAX2/HAX42被覆ナノ粒子、および（6）8ペプチド被覆ナノ粒子からなった。
ナノ粒子を1%BSA-PBS（このアッセイではTween80は使用しない）100μl中に10mg/mlで細胞に添加し、さらに2倍連続希釈した。96-ウェルプレートを室温で1時間インキュベートした。このプレートを1%BSA-PBSで5回洗浄し、ウェル当り抗ダンシル抗体（Cytogen DB3-226.3;0.5μg/ml;batch May 1997）100μlを添加して、プレートを室温で1時間インキュベートした。ウェルを1%BSA-PBSで5回洗浄し、ウェル当りヤギ抗マウスλ:HRP抗体（Southern Biotechnology CN.1060-05;1:10,000）を添加して、さらにプレートを室温で1時間インキュベートした。1%BSA-PBSで5回洗浄した後、TMBペルオキシダーゼ基質（KPL CN.50-76-00）100μlをウェルに添加し、15分後、650nmにて光学密度を測定した。
図13A-Bで示されるように、漸減量のナノ粒子を固定化Caco-2細胞に適用する場合、PAX2、HAX2、PAX2+HAX2、および8つの標的化ペプチドの混合物で被覆したナノ粒子に関しては抗ダンシルELISA応答の低下が見られた。ブランクナノ粒子またはスクランブル型のPAX2ペプチドで被覆したナノ粒子には濃度の影響は見られなかった。PAX2、HAX2、PAX2+HAX2、および8つのペプチド混合物で被覆したナノ粒子は、ブランクナノ粒子またはスクランブル型のPAX2ペプチドで被覆したナノ粒子に比例して応答の増加を示した。このOD値は通常固定化Caco-2細胞に結合しているGSTペプチド融合物に認められるものより低かった。
下記表25はインスリン効力および組成1の粒子（下記に示されたコアセルベーション法による組成物）に対する粒子上に被覆されたペプチドのレベル（蛍光性により測定される）を示している。
0004129298.tif 000044
ダンシル化ペプチドおよびインスリン被覆PLGA粒子のELISA
標準的なELISA手法を次のように変更した。ペプチドおよび粒子を1%BSAを含有するPBSで好適な濃度まで希釈し（粒子を音波処理して均一な溶液にした）、滴定して室温で1時間インキュベートした。1%BSAを含有するPBSで5回洗浄した後、自家IgG1λ抗ダンシルモノクロナール抗体を添加し（1%BSA-PBSで1μg/mlに希釈）、プレートを1時間インキュベートした。さらに5回洗浄した後、ヤギ抗マウスλ-HRPを添加し（Southern Biotechnology Associates Inc.,Birmingham,AL,1%BSA-PBSで1:10,000希釈）、プレートを1時間インキュベートした。5回洗浄した後、プレートをTMBペルオキシダーゼ基質（Kirkegard and Perry,Gaithersburg,MD）で顕色させた。データはすべて差し引かれるバックグラウンド結合とともに示されている。このアッセイにインスリン被覆PLGA粒子が含まれる場合は、Tween20を希釈液または洗液に添加しなかった。
図14A-14Bはダンシル化ペプチドSNi10のhSIおよびBSAへの結合を示す。
8.合成ペプチドおよびペプチド被覆粒子のCaco-2細胞由来S100およびP100画分への結合
8.1.膜（p100）およびサイトソル（S100）画分への結合の検出
Caco-2細胞膜（P100）およびサイトソル（S100）画分はKinsella,B.T.,O’Mahony,D.J.およびG.A.FitzGerald,1994,J.Biol.Chem.269（47）:29914-29919に記載される方法の変法を用いて調製した。Caco-2密集細胞単層（75cm2フラスコ内で37℃および5%CO2で1週間増殖させた）をダルベッコのPBS（DPBS）で2回洗浄し、10mM EDTA-DPBSでの処理後、細胞を1000rpmでの遠心分離により回収した。この細胞をDPBSで3回洗浄し、最終の細胞ペレットを3容量の氷冷HEDバッファー（20mM HEPES（pH 7.67），1mM EGTA,0.5mM ジチオトレイトール，1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF））中に再懸濁させた。細胞は30秒間のホモジナイズに先立ち氷上で5分間膨潤させた。このホモジネートを4℃で45分間、40,000rpmで遠心分離した。上清（S100）を除去し、ペレット（P100）をHEDGバッファー（20mM HEPES（pH 7.67）,1mM EGTA,0.5mM ジチオトレイトール，100mM NaCl，10% グリセロール,1mM PMSF）中に再懸濁させた。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイ（Bradford,M.M.,1976,Anal.Biochem.72:248-254）を用いて測定した。
ペプチドおよび／またはペプチド被覆PLGA粒子の膜（P100）およびサイトソル（S100）画分への結合をペプチド内に組み込まれるダンシル部分の検出により評価した。Costar96ウェルELISAプレートをS100およびP100画分（0.05M NaHCO3中100μg/ml）で4℃で一晩被覆した。プレートを室温で1時間、DPBS中の0.5%ウシ血清アルブミンでブロックし、1%BSA-DPBSで3回洗浄した。ペプチド被覆粒子またはペプチドを同一のバッファー中に分散させ、0.325-0.5mg/ウェルの範囲の濃度でプレートへ添加した。室温で1時間後、プレートを1%BSA-DPBSで5回洗浄し、ウェル当たり抗ダンシル抗体（Cytogen DB3-226.3;0.5μg/ml）100μlを添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。ウェルを1%BSA-DPBSで3回洗浄し、ウェル当たりヤギ抗マウスIgGλ:HRP抗体（Southern Biotechnology 1060-05;1:10,000）100μlを添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。1%BSA-DPBSで3回洗浄した後、TMB基質（3,3’,5’,5-テトラメチルベンジジン；Microwell Peroxidase Substrate System（Kirkegaard and Perry Laboratories 50-76-00）100μlを添加し、種々の時間間隔で650nmにて光学密度を測定した。
8.2.  ペプチド被覆PLGA粒子の結合
新規のアッセイ系はペプチド被覆PLGA粒子と、Caco-2生細胞由来の膜（P100）およびサイトソル（S100）画分との結合の検出のための本発明により提供される。このアッセイ系を用いて得られる吸光度の読み取り値は実質上、固定化Caco-2細胞において同様のペプチド被覆PLGA粒子濃度を用いて得られるものより高かった。この高い感受性ならびにCaco-2生細胞由来のS100およびP100画分の導出により、このアッセイがペプチド被覆PLGA粒子結合の検出のために選択されたアッセイ系であろうことが示唆される。アッセイは濃度に依存し、ペプチド／粒子の相互関係は特異的および非特異的結合間の相互作用の識別を可能にした。
ペプチド被覆PLGA粒子の結合は、前記のCaco-2生細胞由来のS100およびP100画分を用いて評価した。画分は0.05M NaHCO3中10μg/ウェルで96-ウェルプレートへ被覆し、ELISAによりペプチド被覆PLGA粒子を0.0325-0.5mg/ウェルの範囲の濃度でアッセイした。
図15Aおよび15Bにより、ペプチドなし、スクランブルしたPAX2（対照）、P31D-Arg 16-マー（ZElan053）、HAX42、PAX2およびHAX42/PAX2それぞれで被覆した粒子に対してS100およびP100画分で得られたでデータを示す。粒子濃度0.0325-0.5mg/ウェルを用いた場合、すべての試験ペプチド被覆PLGA粒子はスクランブルしたPAX2被覆対照粒子より強いS100およびP100両画分への結合を示した。P31 D-Arg 16マー（ZElan053）を除くすべての粒子はS100画分よりP100画分へ強い結合を示した。P31 D-Arg 16マー（ZElan053）被覆粒子のS100画分への強い結合は、P31ペプチド（配列番号43）のD-Arg修飾による非特異的結合を示すものであろう。
0.05-5.0mg/gの範囲の種々の濃度のPAX2ペプチドで被覆したPLGA粒子の結合は、a）固定化Caco-2細胞（P35）およびb）S100およびP100画分（Caco-2 P33）を用いて評価した。粒子を0.03125-0.0625mg/ウェルの範囲の濃度でアッセイした。
0.0625mg/ウェルの範囲の粒子濃度を用いた場合、0.05mg/gで被覆したものを除くすべてのPAX2被覆粒子はスクランブルしたPAX2被覆対照粒子より強い固定化Caco-2細胞への結合を示した。Caco-2細胞の結合を向上させる漸増するPAX2ペプチド濃度（0.05-1.0mg/gの範囲）による濃度の影響があることが明らかである。しかしながら、吸光度の読み取り値はいずれも低く、PAX2（5mg/g）の結合はこのパターンに一致しなかった。
0.03125-0.0625mg/ウェルの粒子濃度を用いた場合、PAX2（0.05mg/g）を除くすべての試験ペプチド被覆粒子はスクランブルしたPAX2被覆対照粒子と同等か、またはより強いS100およびP100両画分への結合を示した。すべての粒子はS100画分よりP100画分へ強い結合を示した。S100およびP100両画分への結合はその粒子のPAX2ペプチド濃度に直接的に比例していた。このアッセイ系を用いて得られる吸光度の読み取り値は実質上、固定化Caco-2細胞において得られるものより高かった。
ペプチド被覆PLGA粒子のP100画分（Caco-2 P35）への結合におけるブロッキング溶液の効果を1%ウシ血清アルブミン（BSA）およびバックグラウンド結合を評価するための1%粉乳ブロッキング溶液を用いて評価した。下記の粒子：ペプチドなし；スクランブルしたPAX2；および5-0.05mg/gのペプチド濃度を有するPAX2被覆粒子を0.03125-0.0625mg/ウェルの範囲の濃度を用いてアッセイした。これまでに1%BSAを用いて観察されたように、0.05mg/gで被覆したPAX2を除くすべての試験ペプチド被覆粒子はスクランブルしたPAX2被覆対照粒子と同等か、またはより強いP100画分への結合を示した。P100画分への結合は、その粒子のPAX2ペプチド濃度に直接的に比例していた（この場合、PAX2（5mg/g）はPAX2（1mg/g）よりわずかに弱い結合を示した）。1%粉乳および0.0625mg/ウェルの粒子濃度を用いた場合にも同様の傾向が見られた。しかしながら、1%粉乳を用いた場合、吸光度の読み取り値はいずれも低く、0.0625mg/ウェルの濃度の粒子を用いた場合には結合パターンが検出できなかった。
ペプチド被覆PLGA粒子のプラスチックへの非特異的結合もまた、1%BSAおよび1%粉乳ブロッキング溶液を用いて評価した。BSAを用いた場合、前記で見られた結合パターンが検出できた；しかしながら、吸光度の読み取り値は実質的に低く、粒子PAX2（0.1および0.05mg/g各々）の結合は検出できなかった。1%粉乳を用いた場合、吸光度に読み取り値はいずれも低く、検出可能な結合パターンはなかった。次のアッセイのブロッキング用にはBSAを選択した。
8.3.P100画分へ結合するペプチド被覆粒子と合成ペプチドの比較
ダンシル化ペプチドのP100画分への結合を評価して、ペプチド結合によりペプチド被覆粒子結合が推定可能であるかを調べた。図16はダンシル化ペプチドA）HAX42,P31 D型およびスクランブルしたPAX2およびB）PAX2、HAX42およびスクランブルしたPAX-2について得られたデータを示す。
連続した２つのアッセイは、吸光度読み取り値に実質的変化をもたらした。最初、HAX42ペプチドはスクランブルしたPAX-2対照と比較した場合、強い結合を示した。P31 D型ペプチド（ZElan053）は最大希釈でのみ結合を示した。反復アッセイでは、HAX42もまたスクランブルしたPAX-2対照と比較して有意な結合を示した。しかしながら、スクランブルしたPAX-2対照およびHAX42は、前記のアッセイで得られたものと比較して高い吸光度値であった。PAX2ペプチドはスクランブルしたPAX-2対照と区別がつかなかった。ペプチド／粒子結合相互関係を下記表26に要約する：
0004129298.tif 000045
ペプチド／粒子結合はHAX42ペプチドに対して十分な相互関係があった。これに対し、P31 D型（ZElan053）ペプチドに対して検出され得る相互関係はなかった。P31 D型ペプチド被覆粒子はP100画分よりS100画分へ強い結合を示した（他の試験ペプチドとは異なる）ため、粒子結合相互作用は非特異的であり、またはいくつかの他の分子はS100画分ではなく、P100画分への結合に対して競合していたようである。かくして、ペプチド／粒子アッセイ相関性は特異的および非特異的結合相互作用間の識別に有用であろう。PAX2結合相互関係の評価は困難であったため、スクランブルしたPAX2対照は様々な結果をもたらした。
8.4.HAX42およびPAX2結合モチーフ配列の決定
HAX42、PAX2および種々の誘導体のペプチドおよびGST融合タンパク質をCaco-2細胞由来のP100膜画分に対するペプチドELISAを用いてアッセイした。GST-PAX2タンパク質およびPAX2ペプチドデータにより、コア結合モチーフがアミノ酸配列TNAKHSSHNRRLRTR（配列番号）、そうでなければGST-106およびZElan033にあることが示される。同様に、HAX42ペプチドデータにより、HAX42のコア結合モチーフがアミノ酸配列PGDYNCCGNCNSTG（配列番号）、そうでなければZElan091にあることが示唆される。
ペプチドおよびタンパク質を、96ウェルプレートを0.05M炭酸バッファー pH9.6中、4℃で一晩100μl/ウェルの被覆タンパク質（通常100μg/ml P100膜画分）で被覆するダンシル化ペプチドELISA法により解析した。非特異的結合は、ダンシル化ペプチドとのインキュベーションに先立ち、37℃で2時間、200μl/ウェル、2% Marvel／PBSを用いてブロックした。一連の各インキュベーション工程の後、このプレートをPBS/0.05% Tween20で3回洗浄した。ペプチドは開始濃度100μg/mlでブロッキング溶液に希釈し、1:2の下方希釈して100μl/ウェルとし、次いで正確に室温で１時間のインキュベーションした。バッファーブランク対照には、プラスチックへのバックグラウンド結合がアッセイ系で用いる抗体によるものではないことを保証するという含意がある。ダンシル化ペプチドを検出するため、ブロッキングバッファー溶液で1:1340希釈および100μl/ウェルのマウス抗ダンシル抗体（DB3 Cytogen Corp.）を添加し、次いで室温で1時間インキュベートした。さらに、プレートをブロッキング溶液で1:10,000希釈、100μl/ウェルの抗マウスλ-HRP複合抗体（Southern Biotech 1060-05）とともに室温で1時間インキュベートした。プレートを75μl/ウェル Bionostics TMB基質を用いて発色させ、約10分間インキュベートした。発色反応をBionostics Red Stop溶液（25μl/ウェル）を用いて停止させ、650nmにおいてプレートの光学密度を読み取った。
GST-PAX2ペプチド−P100画分への相対結合
P100結合値からプラスチックへのGSTペプチド結合を差し引いた後、GST-PAX2ペプチドの結合を任意の値1.00を示すP100に対するGST-HAX42結合の比率として表した。下記の比率は、ペプチド濃度20μg/mlにおけるGSTペプチドのP100への結合から決定した。太字はP100膜画分への正の結合を示す。
0004129298.tif 000046
0004129298.tif 000047
PAX2ペプチド−P100画分への相対結合
ZElan021、すなわち全長HAX42は、シグナル対ノイズ比データから決定される所与のペプチド濃度におけるP100への結合の任意の値を1.00とした。PAX2およびその誘導体はHAX42値の比率として示され、表29に示されるCaco-2細胞系由来のP100膜画分へのそれらの結合能力を表す。表30では太字で正の結合ペプチドを示すPAX2ペプチドの一覧を提供する。GST-PAX2ペプチドとPAX2ペプチドデータは、一致し、このことは結合モチーフがアミノ酸配列TNAKHSSHNRRLRTR（GST-106およびZElan033）中にあることを実証するものである。
0004129298.tif 000048
0004129298.tif 000049
HAX42ペプチド−P100画分への相対結合
ZElan021、すなわち全長HAX42は、シグナル対ノイズ比データから決定される所与のペプチド濃度におけるP100への結合の任意の値を1.00とした。HAX42およびその誘導体はHAX42値の比率として示され、表31に示されるCaco-2細胞系由来のP100膜画分へのそれらの結合能力を表す。表32では太字で正の結合ペプチドを示すHAX42ペプチドの一覧を提供する。コア結合モチーフはアミノ酸配列PGDYNCCGNCNSTG（ZElan091）中にあると思われる。
0004129298.tif 000050
0004129298.tif 000051
9.処方
コアセルベート粒子の一般調製法
本明細書で定義される治療薬を含有する固体粒子をコアセルベート法を用いて調製した。この粒子はポリマーから形成し、約10nm〜500μm、最も好ましくは50〜800nmの粒子サイズを有する。さらに、この粒子はいくつかの方法を用いて粒子に組み込まれるターゲティングリガンドを含む。
前記に示された一般法の有機相（B）ポリマーは可溶性、浸透性、非浸透性、生物分解性または胃保持性であってよい。ポリマーはポリマーまたはコポリマーの混合物からなり、天然または合成ポリマーであってよい。典型的な生物分解性ポリマーとしては、限定されるものではないが、ポリグリコリド；ポリラクチド；DL、LおよびD型を含むポリ（ラクチド−co−グリコリド）；コポリオキサレート；ポリカプロラクトン；ポリエステルアミド；ポリオルトエステル；ポリアンヒドリド；ポリアルキルシアノアクリレート；ポリヒドロキシブチレート；ポリウレタン；アルブミン；カゼイン；キトサン誘導体；ゼラチン；アラビアゴム；セルロース；ポリサッカライド；アルギン酸；ポリペプチドなど、そのコポリマー、その混合物およびその立体異性体が挙げられる。典型的な合成ポリマーとしては、アルキルセルロース；ヒドロキシアルキルセルロース；セルロースエーテル；セルロースエステル；ニトロセルロース；アクリル酸およびメタアクリル酸のポリマーおよびそのエステル；デキストラン；ポリアミド；ポリカーボネート；ポリアルキレン；ポリアルキレングリコール；ポリアルキレンオキシド；ポリアルキレンテレフタレート；ポリビニルアルコール；ポリビニルエーテル；ポリビニルエステル；ポリビニルハライド；ポリビニルピロリドン；ポリシロキサンおよびポリウレタンおよびそのコポリマーが挙げられる。
典型的には、粒子は以下の一般法を用いて形成される：
ポリマー、界面活性剤、界面安定剤もしくは変性剤または塩、あるいは界面活性剤好ましくはポリビニルアルコール（PVA）または加水分解率50-100%、分子量域500-500,000、最も好ましくは加水分解率80-100%、分子量10,000-150,000の誘導体の水溶液（A）を容器に入れる。混合物（A）を低い剪断条件下で10-2000rpm、好ましくは100-600rpmで攪拌する。この溶液のPHおよび／またはイオン強度は塩、バッファーまたは他の変性剤を用いて改質してもよい。この溶液の粘度はポリマー、塩類、または他の増粘剤または変性剤を用いて改質してもよい。
ポリマー、好ましくはポリ（ラクチド−co−グリコリド）、ポリラクチド、ポリグリコリドまたはその組合せ、またはいずれかの鏡像体、もしくはターゲティングリガンドを有するこれらのポリマーの共有結合体を水混和性有機溶媒に溶解させ、有機相（B）を得る。最も好ましくは、アセトンおよびエタノールの組合せを、用いるポリマーにもよるが、0:100アセトン：エタノール〜100:0アセトン：エタノールまでの比の範囲で用いる。
さらにポリマー、ペプチド糖、塩、天然／生物学的ポリマーまたは他の薬剤をこの有機相（B）に添加し、得られる粒子生成物の物理的および化学的特性を改質してもよい。
薬剤または生物活性物質を水相（A）または有機相（B）のいずれかに入れてもよい。またターゲティングリガンドをこの時点で水相（A）または有機相（B）のいずれかに入れてもよい。
有機相（B）を一貫した速度で攪拌した水相（A）に加える。溶媒は、好ましくは周囲より温度を上昇させ、および／または真空ポンプの使用により蒸発させる。ここで粒子は懸濁液（C）と表す。この時点で攪拌した懸濁液にターゲティングリガンドを入れてもよい。
この工程でポリマー、ペプチド糖、塩、天然／生物学的ポリマーまたは他の薬剤の第2層をいずれかの好適な方法により予備形成粒子コアへ付着させてもよい。次いで、粒子（D）を標準的なコロイド分離技術、好ましくは高「g」力での遠心分離、濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたは電荷分離技術により懸濁液（C）から分離する。この上清は廃棄し、粒子（D）を洗浄液（E）、好ましくは水、塩水、バッファーまたは有機溶媒に再懸濁させる。粒子（D）を前記と同様に洗浄液から分離し、通常2回再洗浄する。ターゲティングリガンドは、最終洗浄工程で洗浄液（E）に溶解させてもよく、これを使用して粒子（D）を洗浄してもよい。
次いで、この粒子を乾燥すればよい。その後、粒子にさらに処理し、例えば錠剤化したり、カプセル封入したり、噴霧乾燥してもよい。
上記のように形成された粒子の放出プロフィールは、使用するおよび／または所望の処方にもよるが、即時放出から徐放または遅延放出まで多様であってよい。
薬剤添加量（drug loading）は0-90%w/wの範囲内であってよい。ターゲティングリガンドの添加量（loading）は0-90%w/wの範囲内であってよい。
具体的な実施例として、次の実施例が挙げられる：
実施例1:最終洗浄工程で添加されるペプチド
生成物：ウシインスリンをロードしたナノ粒子
目的：ペプチドZElan018を添加し、理論添加量50mg/gでウシインスリンをロード（load）したナノ粒子2gバッチの調製。
処方詳細
RG504H（ロット番号 250583）                     2.0g
アセトン                                        45ml
エタノール                                      5ml
PVA（水 5%w/v）                                 400ml
ウシインスリン（ロット番号 86H0674）            100mg
ペプチド：PAX2（ZElan018）                      10mg/50ml dH2O
試験詳細：
5%w/v PVA溶液は、水を沸点付近まで加熱し、PVAを添加して、さらに冷却するまで攪拌することにより調製した。有機相は、アセトン45mlおよびエタノール5mlをともに添加して調製した。ポリマー溶液は、RG504H 2gを有機相に添加し、溶解するまで攪拌して調製した。IKA（商標）反応器を整備し、すべての封止部に油を差し、温度を25℃に設定した。PVA溶液400mlを反応器に添加し、400rpmで攪拌した。
ウシインスリン 100mgを攪拌したPVA溶液に添加した。ポリマー溶液は清浄なチューブおよび未焼付針（green needle）を用い、40に設定した蠕動ポンプにより、ゆっくりと攪拌PVA溶液へ滴下した。開口して分散液を一晩400rpmで攪拌することで溶媒を蒸発させた。
この懸濁液を、スイングアウトローターを装備したBeckman Ultracentrifuge（商標）で12,500rpm、4℃にて遠心分離した。上清はデカンテーションして廃棄した。粒子の「ケーク」を粉砕し、dH2O（200ml）を添加して粒子を洗浄した。遠心分離および洗浄工程を2回繰り返した。
ペプチド溶液、（ZElan018、dH2O 50ml中10mg）を調製し、最終洗浄工程の間に粒子へ添加した。この懸濁粒子を前記のように遠心分離した。上清をデカンテーションし、粉砕した「ケーク」および粒子を真空オーブンで乾燥させた。
粒子を粉砕し、セクリテナー（securitainer）に入れ、解析に送った。回収された粒子の重量は1.45gであった。走査型電子顕微鏡により、300-500nmのサイズの適度に球状の独立粒子であることが示された。有効性は49.2mg/g（ラベルクレイムの98.0%）であった。ペプチドの添加量は2.42μg/mg（ラベルクレイムの48.4%）であった。
実施例2:製造開始時に添加されるペプチド
生成物：ウシインスリンをロードしたナノ粒子
目的：製造開始時にペプチドZElan018を添加し、理論添加量50mg/gでインスリンをロードしたナノ粒子2gバッチの調製。
処方詳細
RG504H（ロット番号 250583）                     2.0g
アセトン                                        45ml
エタノール：                                    5ml
PVA（水 5%w/v）                                 400ml
ウシインスリン（ロット番号 65H0640）            100mg
ペプチド：PAX2（ZElan018ii）                    10mg
試験詳細：
5%w/v PVA溶液は、水を沸点付近まで加熱し、PVAを添加して、さらに冷却するまで攪拌して調製した。有機相は、アセトン45mlおよびエタノール5mlをともに添加して調製した。ポリマー溶液は、RG504H（ポリアクチド−co−グリコリド、Boehringer Ingelheim）2gを前記工程で調製した有機相に添加し、溶解するまで攪拌して調製した。IKA（商標）反応器を整備し、すべての封止部に油を差し、温度を25℃に設定した。PVA溶液400mlを反応器に添加し、400rpmで攪拌した。
ウシインスリン 100mgを攪拌したPVA溶液に添加した。PAX2（ZElan018ii、10mg）を攪拌したPVA溶液に添加した。ポリマー溶液は清浄なチューブおよび未焼付針を用い、40に設定した蠕動ポンプにより、ゆっくりと攪拌PVA溶液へ滴下した。開口して分散液を一晩400rpmで攪拌することで溶媒を蒸発させた。懸濁液は、スイングアウトローターを装備したBeckman Ultracentrifuge（商標）で12,500rpm、4℃にて遠心分離した。上清はデカンテーションして廃棄した。
粒子の「ケーク」を粉砕し、dH2O（200ml）を添加し、粒子を洗浄した。遠心分離および洗浄工程を2回繰り返した。「ケーク」を粉砕し、粒子を真空オーブンで乾燥させた。
粒子を粉砕し、セクリテナー（securitainer）に入れ、解析に送った。回収された粒子の重量は1.6gであった。有効性は47.3mg/g（ラベルクレイムの94.6%）であった。ペプチドの添加量は1.689μg/mg（ラベルクレイムの33.8%）であった。
実施例3:遠心分離１時間前に添加されるペプチド
生成物：ウシインスリンをロードしたナノ粒子
目的：遠心分離１時間前にペプチドZElan018を添加し、理論添加量50mg/gでインスリンをロードしたナノ粒子1gバッチの調製。
処方詳細
RG504H（ロット番号 250583）                     1.0g
アセトン                                        22.5ml
エタノール：                                    2.5ml
PVA（水 5%w/v）                                 200ml
ウシインスリン（ロット番号 65H0640）            50mg
ペプチド：PAX2（ZElan018）                      5mg
試験詳細：
5%w/v PVA溶液は、水を沸点付近まで加熱し、PVAを添加して、さらに冷却するまで攪拌して調製した。有機相は、アセトン22.5mlおよびエタノール2.5mlをともに添加して調製した。ポリマー溶液は、RG504H 1gを前記で調製した有機相に添加し、溶解するまで攪拌して調製した。IKA（商標）反応器を整備し、すべての封止部に油を差し、温度を25℃に設定した。PVA溶液200mlを反応器に添加し、400rpmで攪拌した。
ウシインスリン 50mgを攪拌したPVA溶液に添加した。ポリマー溶液は清浄なチューブおよび未焼付針を用い、40に設定した蠕動ポンプにより、ゆっくりと攪拌PVA溶液へ滴下した。開口して分散液を一晩400rpmで攪拌することで溶媒を蒸発させた。
PAX2（ZElan018 5mg）を攪拌した粒子懸濁液に添加した。1時間後、懸濁液をスイングアウトローターを装備したBeckman Ultracentrifuge（商標）で12,500rpm、4℃にて遠心分離した。上清はデカンテーションして廃棄した。粒子の「ケーク」は粉砕し、dH2O（200ml）を添加し、粒子を洗浄した。遠心分離および洗浄工程を2回繰り返した。
「ケーク」を粉砕し、粒子を真空オーブンで乾燥させた。粒子を粉砕し、セクリテナー（securitainer）に入れ、解析に送った。有効性は20.75mg/g（ラベルクレイムの41.5%）であった。ペプチド添加量は1.256μg/mg（ラベルクレイムの25.12%）であった。
実施例4:ロイプロリド（Leuprolide）をロードしたナノ粒子
目的：ペプチドZElan024を添加し、理論添加量20mg/gでロイプロリド−アセテートをロードしたナノ粒子3gバッチの調製。
処方詳細
RG504H（ロット番号 271077）                     3.0g
アセトン                                        67.5ml
エタノール：                                    7.5ml
PVA（水 5%w/v）                                 600ml
ロイプロリド−アセテート（ロット番号 V14094）   60mg
ペプチド：P31（ZElan024）                       15mg/50ml dH2O
試験詳細：
PVA溶液を調製し、有機相は、アセトン67.5mlおよびエタノール7.5mlをともに添加して調製した。ポリマー溶液は、RG504H 3gを前記で調製した有機相に添加し、溶解するまで攪拌して調製した。IKA（商標）反応器を整備し、すべての封止部に油を差し、温度を25℃に設定した。PVA溶液600mlを反応器に添加し、400rpmで攪拌した。
ロイプロリドアセテート 60mgを攪拌したPVA溶液に添加した。ポリマー溶液は清浄なチューブおよび未焼付針を用い、40に設定した蠕動ポンプにより、ゆっくりと攪拌PVA溶液へ滴下した。開口して分散液を一晩400rpmで攪拌することで溶媒を蒸発させた。懸濁液をスイングアウトローターを装備したBeckman Ultracentrifuge（商標）で15,000rpm、4℃にて遠心分離した。上清はデカンテーションし、解析用に確保した。
粒子の「ケーク」は粉砕し、dH2O（200ml）を添加し、粒子を洗浄した。遠心分離および洗浄工程を2回繰り返した。
ペプチド溶液（P31（配列番号43）、dH2O 50ml中 15mg）を調製し、最終洗浄工程で粒子に添加した。懸濁した粒子を前記のように遠心分離した。上清液をデカンテーションし、粒子を真空オーブンで乾燥させた。
粒子を粉砕し、セクリテナー（securitainer）に入れ、解析に送った。回収された粒子の重量は1.87gであった。走査型電子顕微鏡により、300-500nmサイズ範囲の適度に球状の、独立粒子であった。有効性は4.7mg/g（ラベルクレイムの23.4%）であった。ペプチドの添加量は1.76μg/mgであった。
実施例5:ポリマー−ペプチド結合体により「スパイキング」ポリマー相を添加したペプチド
生成物：ウシインスリンをロードしたナノ粒子
目的：ポリマー−ペプチド結合体PLGA-ZElan019を添加し、理論添加量50mg/gでインスリンをロードしたナノ粒子3gバッチの調製。
処方詳細
RG504H（ロット番号 271077）             2.85g
RG504H-ZElan019結合体                   0.15g
（5PAX5-結合体）
アセトン                                67.5ml
エタノール：                            7.5ml
PVA（水 5%w/v）                         600ml
ウシインスリン（ロット番号 86H0674）    150mg
試験詳細：
5%w/v PVA溶液は、水を沸点付近まで加熱し、PVAを添加して、さらに冷却するまで攪拌して調製した。有機相は、アセトン67.5mlおよびエタノール7.5mlをともに添加して調製した。ポリマー溶液は、RG504Hおよびポリマー−ペプチド結合体を有機相に添加し、溶解するまで攪拌して調製した。
IKA（商標）反応器を整備し、すべての封止部に油を差し、温度を25℃に設定した。PVA溶液400mlを反応器に添加し、400rpmで攪拌した。
ウシインスリン 100mgを攪拌したPVA溶液に添加した。ポリマー溶液は清浄なチューブおよび未焼付針を用い、40に設定した蠕動ポンプにより、ゆっくりと攪拌PVA溶液へ滴下した。開口して分散液を一晩400rpmで攪拌することで溶媒を蒸発させた。
懸濁液は、スイングアウトローターを装備したBeckman Ultracentrifuge（商標）で12,500rpm、4℃にて遠心分離した。上清はデカンテーションして廃棄した。粒子の「ケーク」は粉砕し、dH2O（200ml）を添加し、粒子を洗浄した。遠心分離および洗浄工程を2回繰り返した。
「ケーク」を粉砕し、粒子を真空オーブンで乾燥させた。粒子を粉砕し、セクリテナー（securitainer）に入れ、解析に送った。回収された粒子の重量は2.8gであった。有効性は53.1mg/g（ラベルクレイムの106.2%）であった。ペプチドの添加量は4.02μg/mg（ラベルクレイムの80.4%）であった。
10．動物研究
研究 1
試験溶液を回腸内へ直接注入するオープンループ研究を行った。ウィスターラット（300-350g）を4時間絶食させ、ケタミン溶液［ケタミン（100mg/ml）0.525mlおよびマレイン酸アセプロマジン-BP ACP（2mg/ml）0.875ml］を加えた試験溶液の投与に先立ち、15〜20分の筋肉注射により麻酔をかけた。次いで、ラットに試験溶液を幽門下方2-3cmで十二指腸内に注入した（注入容量：1.5ml PBS）。この試験溶液は、前記で提供されたコアセルベーション手法または前記で提供される「スパイク」手法のいずれかによりターゲティングペプチド有りまたは無しで作製したPLGA粒子を含有した。インスリン（即時作用 ウシ；28.1 iu/mg）を合計で100iuインスリン（70mg粒子）または300iuインスリン（210mg粒子）につき薬剤添加量5%で粒子に混合した。ラットの血中グルコース値は、Glucometer（商標）（Bayer;0.1〜33.3m/mol/L）を用いて測定し；血漿インスリン値は、Phadeseph RIAキット（商標）（Upjohn Pharmacia;3〜240μU/ml-全く同一にアッセイ）を用いて測定した。全身血（systemic blood）および門脈血をサンプルとした。
研究群としては、以下の表33に示されるペプチドで被覆した粒子を含有する試験溶液を投与した動物が挙げられる。
0004129298.tif 000052
対照群としては、1）PBS対照（1.5ml）オープンループ；2）インスリン溶液（1iu/0.2ml）皮下；3）インスリン粒子−ペプチドなし（1iu/0.2ml）皮下；4）インスリン粒子／すべての8ペプチド混合物（1iu/0.2ml）皮下；5）粒子にロードしたインスリン／ペプチド対照（混合5PAX5）（100iu/1.5ml）オープンループ；6）粒子にロードしたインスリン／ペプチド対照（混合5PAX5）（300iu/1.5ml）オープンループ；7）対照粒子（インスリンなし）／すべての8ペプチド混合物（100iu/1.5mlと等価）オープンループ；および8）対照粒子（インスリンなし）／すべての8ペプチド混合物（300iu/1.5mlと等価）オープンループが挙げられる。
下記は300iu添加量に対する薬物速度論を記載する：
0004129298.tif 000053
図17Aおよび17Bは対照（PBS）;インスリン溶液;インスリン粒子;すべての8ペプチド混合粒子および研究群ペプチド-粒子（100iu）の腸内投与の後の全身血中グルコースおよびインスリンレベルを示している。図18Aおよび18Bは対照（PBS）;インスリン溶液;インスリン粒子および研究群ペプチド-粒子（300iu）の腸内投与の後の全身血中グルコースおよびインスリンレベルを示している。
インスリンの皮下注射におけるインスリンの送達については、HPT1標的ペプチド被覆粒子により最も効果的に高まり、スパイクしたhPEPT1＞混合PAX2＞mix-8＞hPEPT1＞D2H＞非被覆粒子＞hSI＞溶液の順であった。反復研究において、インスリンを含有する非被覆粒子では類似したプロフィールが得られたが、HPT1-ペプチド標的粒子では減少したプロフィールが得られた（3倍）。インスリンを含まないPLGA粒子およびすべての8混合粒子では、インスリンまたはグルコースの基礎レベルへの効果は示さなかった。HPT1ターゲティング粒子、スパイクしたPEPT1ターゲティング粒子、およびPEPT1ターゲティング粒子もまた誘導されたインスリンが生物活性であることを示す血中グルコースレベルを減少させた。他のターゲティング粒子もまたHPT1粒子およびスパイクしたPEPT1粒子と同じレベルまでではないが、血中グルコースレベルを減少させることも示された。評価した処方のいずれに対しても、小腸内に認められる組織構造的な差はなかった。
研究 2
第2のオープンループ研究は、前記の研究1と同様に、表34に示す以下の処理群により行った。
0004129298.tif 000054
ウシインスリンの皮下用量に対する漸増する応答では、1〜20iuの範囲を越えては直線的増加が認められないため、投与後のインスリン有効性は、1および20iu皮下用量について評価した。大部分の動物に対し、投与後3時間までのデータを入手できた。従ってまずベースライン差し引きデータから評価される個々のAUC（0-3時間）データ（これに対し3時間までのデータが入手できる）を用いて有効性を評価した。
高い応答をする数種の動物は3時間生存せず、それゆえ解析から除外したため、このアプローチでは有効性が過小評価される可能性がある。可能な限り早い時点で認められたこれらの高い応答を捕らえる試みでは、平均ベースライン差し引き血漿濃度データを用い各群のAUCを評価した。表35はこの第2アプローチに基づいた結果（平均血漿濃度データより算出したAUC（0-3時間））を示す。
0004129298.tif 000055
第3群（インスリン非被覆粒子）のデータはラット43有りおよび無しで示される。この動物はこれらのインスリン非被覆粒子に対し、不規則な高い応答を有し、それゆえこの群に対するデータに偏りが生じたと考えられる。
このデータより、ペプチド被覆粒子（HAX42/PAX2または5PAX5/P31）を組合せても、個々のペプチドで被覆した粒子より高い有効性は認められないことが判る。さらに、ペプチド被覆粒子はペプチド非被覆より高い有効性を有する。40量体PAX2ペプチドの混合で生物学的利用能の低下は起こらなかった。この低下は幾分ペプチドサイズの縮小によると思われるが、PAX2ペプチドの混合および19量体へのサイズの縮小により生物学的利用能の低下が起こった。ペプチドサイズの縮小により生物学的利用能の低下が起こった。P31（ZElan053）のD型では、ペプチド分解に対する高い耐性のために生物学的利用能が増大した。ペプチドの競合過剰により生物学的利用能の低下が起こり、さらに凍結乾燥により生物学的利用能の低下が起こった。例として、血中グルコースレベルの測定により、HAX42、PAX2、P31 D型（配列番号43）およびP31（ZElan053）を含むHPT1およびhPEPT1ターゲティング粒子が送達されたインスリンが、生物活性であることを示す血中グルコースレベルを低下させたことが示された。
さらなる研究では、インスリンを、粒子形成後のターゲティング粒子より溶解させて取り出し、非変性ドデジル硫酸ナトリウム（SDS）ポルアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）での電気泳動により解析した。非変性SDS-PAGEおよびまた膜へ転移させ、次いでインスリンに対する抗体でスクリーニングするウエスタンブロットによるインスリンの解析により、インスリンが完全なものあること、すなわち粒子形成工程間に分解、二量体化または凝集の形跡がないことが示された。
研究3
ウィスターラット（300-350g）で十二指腸内オープンループモデル研究を行った。第1群には酢酸ロイプロリド（12.5μg）を皮下注入した。第2群には非被覆酢酸ロイプロリド粒子（600μg、1.5ml）を十二指腸内注入した。第3群にはPAX2を被覆した酢酸ロイプロリド粒子（600μg、1.5ml）を十二指腸内注入した。第4群にはP31（配列番号43）を被覆した酢酸ロイプロリド粒子（600μg、1.5ml）を十二指腸内注入した。図19はこれら第4群への投与後のロイプロリド血漿濃度を示す。十二指腸内投与したP31（配列番号43）およびPAX2被覆ロイプロリド粒子両者では皮下注入に対しロイプロリドの血漿レベルが高まった。
既知のタンパク質に対するGIT運搬体結合ペプチド相同体は図20、21A-Fおよび22A-Dに示されている。
本発明は本明細書に記載の具体的な実施形態にその範囲が限定されるものではない。実際、当業者ならば前記の記載および添付の図面より本明細書に記載のものの他、本発明の種々の変形や変更が明らかであろう。かかる変形や変更も添付の請求の範囲内にあると考えられる。
種々の刊行物が本明細書で引用されているが、それらの記載はすべて参照により本明細書に組み入れられる。
配列表
（2）配列番号１
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000056
（2）配列番号２
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000057
（2）配列番号３
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000058
（2）配列番号４
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000059
（2）配列番号５
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000060
（2）配列番号６
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:41アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000061
（2）配列番号７
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000062
（2）配列番号８
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000063
（2）配列番号９
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000064
（2）配列番号10
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000065
（2）配列番号11
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:38アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000066
（2）配列番号12
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000067
（2）配列番号13
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000068
（2）配列番号14
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000069
（2）配列番号15
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000070
（2）配列番号16
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:38アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000071
（2）配列番号17
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000072
（2）配列番号18
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000073
（2）配列番号19
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000074
（2）配列番号20
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000075
（2）配列番号21
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000076
（2）配列番号22
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:36アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000077
（2）配列番号23
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000078
（2）配列番号24
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000079
（2）配列番号25
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000080
（2）配列番号26
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000081
（2）配列番号27
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000082
（2）配列番号28
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:37アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000083
（2）配列番号29
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000084
（2）配列番号30
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000085
（2）配列番号31
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:38アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000086
（2）配列番号32
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000087
（2）配列番号33
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000088
（2）配列番号34
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000089
（2）配列番号35
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000090
（2）配列番号36
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000091
（2）配列番号37
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000092
（2）配列番号38
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000093
（2）配列番号39
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000094
（2）配列番号40
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000095
（2）配列番号41
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000096
（2）配列番号42
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:38アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000097
（2）配列番号43
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000098
（2）配列番号44
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000099
（2）配列番号45
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000100
（2）配列番号46
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000101
（2）配列番号47
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000102
（2）配列番号48
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000103
（2）配列番号49
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000104
（2）配列番号50
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000105
（2）配列番号51
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000106
（2）配列番号52
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000107
（2）配列番号53
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000108
（2）配列番号54
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:38アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000109
（2）配列番号55
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000110
（2）配列番号56
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000111
（2）配列番号57
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000112
（2）配列番号58
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000113
（2）配列番号59
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000114
（2）配列番号60
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000115
（2）配列番号61
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:168塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000116
（2）配列番号62
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:135塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000117
（2）配列番号63
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000118
（2）配列番号64
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000119
（2）配列番号65
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000120
（2）配列番号66
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:159塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000121
（2）配列番号67
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000122
（2）配列番号68
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000123
（2）配列番号69
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:176塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000124
（2）配列番号70
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000125
（2）配列番号71
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:159塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000126
（2）配列番号72
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000127
（2）配列番号73
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000128
（2）配列番号74
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000129
（2）配列番号75
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000130
（2）配列番号76
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000131
（2）配列番号77
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:152塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000132
（2）配列番号78
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000133
（2）配列番号79
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000134
（2）配列番号80
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000135
（2）配列番号81
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000136
（2）配列番号82
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000137
（2）配列番号83
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:156塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000138
（2）配列番号84
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:178塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000139
（2）配列番号85
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000140
（2）配列番号86
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000141
（2）配列番号87
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:159塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000142
（2）配列番号88
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000143
（2）配列番号89
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:160塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000144
（2）配列番号90
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000145
（2）配列番号91
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000146
（2）配列番号92
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000147
（2）配列番号93
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000148
（2）配列番号94
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000149
（2）配列番号95
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000150
（2）配列番号96
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000151
（2）配列番号97
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000152
（2）配列番号98
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:159塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000153
（2）配列番号99
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000154
（2）配列番号100
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000155
（2）配列番号101
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000156
（2）配列番号102
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000157
（2）配列番号103
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000158
（2）配列番号104
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000159
（2）配列番号105
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:162塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000160
（2）配列番号106
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000161
（2）配列番号107
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000162
（2）配列番号108
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:177塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000163
（2）配列番号109
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:158塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000164
（2）配列番号110
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:708アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000165
0004129298.tif 000166
0004129298.tif 000167
（2）配列番号111
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000168
（2）配列番号112
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000169
（2）配列番号113
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000170
（2）配列番号114
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000171
（2）配列番号115
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000172
（2）配列番号116
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000173
（2）配列番号117
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000174
（2）配列番号118
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000175
（2）配列番号119
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000176
（2）配列番号120
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000177
（2）配列番号121
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000178
（2）配列番号122
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000179
（2）配列番号123
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000180
（2）配列番号124
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000181
（2）配列番号125
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000182
（2）配列番号126
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000183
（2）配列番号127
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000184
（2）配列番号128
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000185
（2）配列番号129
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000186
（2）配列番号130
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000187
（2）配列番号131
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000188
（2）配列番号132
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000189
（2）配列番号133
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000190
（2）配列番号134
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000191
（2）配列番号135
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000192
（2）配列番号136
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000193
（2）配列番号137
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000194
（2）配列番号138
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000195
（2）配列番号139
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000196
（2）配列番号140
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000197
（2）配列番号141
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000198
（2）配列番号142
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000199
（2）配列番号143
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000200
（2）配列番号144
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000201
（2）配列番号145
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000202
（2）配列番号146
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000203
（2）配列番号147
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000204
（2）配列番号148
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000205
（2）配列番号149
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000206
（2）配列番号150
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000207
（2）配列番号151
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000208
（2）配列番号152
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000209
（2）配列番号153
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000210
（2）配列番号154
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000211
（2）配列番号155
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000212
（2）配列番号156
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000213
（2）配列番号157
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000214
（2）配列番号158
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000215
（2）配列番号159
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000216
（2）配列番号160
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000217
（2）配列番号161
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000218
（2）配列番号162
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000219
（2）配列番号163
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000220
（2）配列番号164
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000221
（2）配列番号165
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:17塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000222
（2）配列番号166
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:21塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（xi）配列
0004129298.tif 000223
（2）配列番号167
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:37アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000224
（2）配列番号168
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000225
（2）配列番号169
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:41アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000226
（2）配列番号170
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:20アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000227
（2）配列番号171
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:29アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000228
（2）配列番号172
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:19アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000229
（2）配列番号173
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:９アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000230
（2）配列番号174
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:14アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000231
（2）配列番号175
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000232
（2）配列番号176
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:708アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000233
0004129298.tif 000234
（2）配列番号177
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:3345塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:１本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号：Coding Sequence
（B）存在位置:88...2583
（D）他の情報:
（xi）配列
0004129298.tif 000235
0004129298.tif 000236
0004129298.tif 000237
0004129298.tif 000238
（2）配列番号178
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:832アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:タンパク質
（xi）配列
0004129298.tif 000239
0004129298.tif 000240
0004129298.tif 000241
（2）配列番号179
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:1827アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000242
0004129298.tif 000243
0004129298.tif 000244
0004129298.tif 000245
（2）配列番号180
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:2284塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号：Coding Sequence
（B）存在位置:45...2099
（D）他の情報:
（xi）配列
0004129298.tif 000246
0004129298.tif 000247
0004129298.tif 000248
（2）配列番号181
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:685アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:タンパク質
（xi）配列
0004129298.tif 000249
0004129298.tif 000250
（2）配列番号182
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:54アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000251
（2）配列番号183
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:19アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000252
（2）配列番号184
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000253
（2）配列番号185
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:19アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000254
（2）配列番号186
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:11アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000255
（2）配列番号187
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000256
（2）配列番号188
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:19アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000257
（2）配列番号189
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:24アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000258
（2）配列番号190
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:26アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000259
（2）配列番号191
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000260
（2）配列番号192
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000261
（2）配列番号193
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:39アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000262
（2）配列番号194
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000263
（2）配列番号195
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:９アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000264
（2）配列番号196
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:９アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000265
（2）配列番号197
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000266
（2）配列番号198
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000267
（2）配列番号199
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:19アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000268
（2）配列番号200
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000269
（2）配列番号201
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:19アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000270
（2）配列番号202
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:40アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000271
（2）配列番号203
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000272
（2）配列番号204
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000273
（2）配列番号205
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000274
（2）配列番号206
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000275
（2）配列番号207
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000276
（2）配列番号208
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000277
（2）配列番号209
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000278
（2）配列番号210
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000279
（2）配列番号211
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:717塩基対
（B）配列の型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:ＤＮＡ
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号：Coding Sequence
（B）存在位置:1...714
（D）他の情報:
（xi）配列
0004129298.tif 000280
（2）配列番号212
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:238アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:タンパク質
（xi）配列
0004129298.tif 000281
（2）配列番号213
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:282アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000282
（2）配列番号214
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:282アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000283
（2）配列番号215
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:279アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000284
（2）配列番号216
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:277アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000285
（2）配列番号217
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:277アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000286
（2）配列番号218
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000287
（2）配列番号219
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000288
（2）配列番号220
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000289
（2）配列番号221
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:247アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000290
（2）配列番号222
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:258アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000291
（2）配列番号223
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:257アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000292
（2）配列番号224
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:267アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000293
（2）配列番号225
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:277アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000294
（2）配列番号226
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:277アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000295
（2）配列番号227
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:257アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000296
（2）配列番号228
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:259アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000297
（2）配列番号229
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:257アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000298
（2）配列番号230
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000299
（2）配列番号231
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000300
（2）配列番号232
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:247アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000301
（2）配列番号233
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:249アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000302
（2）配列番号234
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:277アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000303
（2）配列番号235
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:258アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000304
（2）配列番号236
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:259アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000305
（2）配列番号237
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:257アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000306
（2）配列番号238
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:247アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000307
（2）配列番号239
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000308
（2）配列番号240
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:248アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000309
（2）配列番号241
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:282アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000310
（2）配列番号242
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:257アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000311
（2）配列番号243
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:259アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000312
（2）配列番号244
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:257アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000313
（2）配列番号245
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:282アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000314
（2）配列番号246
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:262アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000315
（2）配列番号247
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:264アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000316
（2）配列番号248
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:259アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000317
（2）配列番号249
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:44アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000318
（2）配列番号250
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:40アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000319
（2）配列番号251
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:21アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000320
（2）配列番号252
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:23アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000321
（2）配列番号253
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:11アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:１
（D）他の情報:XaaはSerまたはThr
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:３
（D）他の情報:XaaはArgまたはLys
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:４
（D）他の情報:XaaはLysまたはArg
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:６
（D）他の情報:XaaはSerまたはLeu
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:７
（D）他の情報:XaaはArg、Ile、ValまたはSer
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:８
（D）他の情報:XaaはSer、Tyr、PheまたはHis
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:10
（D）他の情報:XaaはPhe、HisまたはArg
（xi）配列
0004129298.tif 000322
（2）配列番号254
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:８アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:２
（D）他の情報:XaaはSer、AlaまたはGly
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:４
（D）他の情報:XaaはValまたはGln
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:７
（D）他の情報:XaaはPro、GlyまたはSer
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:８
（D）他の情報:XaaはTrpまたはTyr
（xi）配列
0004129298.tif 000323
（2）配列番号255
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（ix）配列の特徴
（A）配列の特徴を表す記号:Modified Site
（B）存在位置:７
（D）他の情報:XaaはAlaまたはPhe
（A）配列の特徴を表す記号：Modified Site
（B）存在位置:８
（D）他の情報:XaaはArgまたはHis
（xi）配列
0004129298.tif 000324
（2）配列番号256
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:11アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000325
（2）配列番号257
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:11アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000326
（2）配列番号258
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:10アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000327
（2）配列番号259
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:11アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000328
（2）配列番号260
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:８アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000329
（2）配列番号261
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:８アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000330
（2）配列番号262
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:８アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000331
（2）配列番号263
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:４アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000332
（2）配列番号264
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:12アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000333
（2）配列番号265
（i）配列の特色
（A）配列の長さ:11アミノ酸
（B）配列の型:アミノ酸
（C）鎖の数:
（D）トポロジー:不明
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列
0004129298.tif 000334
【図１】
0004129298.tif 000335
【図２Ａ】
0004129298.tif 000336
【図２Ｂ】
0004129298.tif 000337
【図２Ｃ】
0004129298.tif 000338
【図３Ａ】
0004129298.tif 000339
【図３Ｂ】
0004129298.tif 000340
【図４Ａ】
0004129298.tif 000341
【図４Ｂ】
0004129298.tif 000342
【図５Ａ】
0004129298.tif 000343
【図５Ｂ】
0004129298.tif 000344
【図５Ｃ】
0004129298.tif 000345
【図６Ａ】
0004129298.tif 000346
【図６Ｂ】
0004129298.tif 000347
【図７Ａ】
0004129298.tif 000348
【図７Ｂ】
0004129298.tif 000349
【図７Ｃ】
0004129298.tif 000350
【図７Ｄ】
0004129298.tif 000351
【図７Ｅ】
0004129298.tif 000352
【図７Ｆ】
0004129298.tif 000353
【図７Ｇ】
0004129298.tif 000354
【図７Ｈ】
0004129298.tif 000355
【図７Ｉ】
0004129298.tif 000356
【図７Ｊ】
0004129298.tif 000357
【図７Ｋ】
0004129298.tif 000358
【図７Ｌ】
0004129298.tif 000359
【図７Ｍ】
0004129298.tif 000360
【図８Ａ】
0004129298.tif 000361
【図８Ｂ】
0004129298.tif 000362
【図８Ｃ】
0004129298.tif 000363
【図８Ｄ】
0004129298.tif 000364
【図９Ａ】
0004129298.tif 000365
【図９Ｂ】
0004129298.tif 000366
【図１０Ａ】
0004129298.tif 000367
【図１０Ｂ】
0004129298.tif 000368
【図１０Ｃ】
0004129298.tif 000369
【図１１Ａ】
0004129298.tif 000370
【図１１Ｂ】
0004129298.tif 000371
【図１２】
0004129298.tif 000372
【図１３Ａ】
0004129298.tif 000373
【図１３Ｂ】
0004129298.tif 000374
【図１４Ａ】
0004129298.tif 000375
【図１４Ｂ】
0004129298.tif 000376
【図１５Ａ】
0004129298.tif 000377
【図１５Ｂ】
0004129298.tif 000378
【図１６Ａ】
0004129298.tif 000379
【図１６Ｂ】
0004129298.tif 000380
【図１７Ａ】
0004129298.tif 000381
【図１７Ｂ】
0004129298.tif 000382
【図１８Ａ】
0004129298.tif 000383
【図１８Ｂ】
0004129298.tif 000384
【図１９】
0004129298.tif 000385
【図２０】
0004129298.tif 000386
【図２１Ａ】
0004129298.tif 000387
【図２１Ｂ】
0004129298.tif 000388
【図２１Ｃ】
0004129298.tif 000389
【図２２】
0004129298.tif 000390
【図２３】
0004129298.tif 000391