(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状真菌において、αアミラーゼプロモーターによる発現を制御する転写因子であって、ここで当該転写因子は
（１）配列番号３のアミノ酸配列；又は
（２）配列番号３のアミノ酸配列の類似配列であって、配列番号３のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列；又は
（３）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
からなる転写因子。
【請求項２】
請求項１記載の転写因子をコードする配列番号１のDNA配列又はその類似配列からなるDNA構成体であって、ここで当該類似配列は
（１）配列番号１のDNA配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は
（２）配列番号１のDNA配列において１もしくは数個のヌクレオチドが置換、欠失もしくは付加された配列
からなる、DNA構成体。
【請求項３】
請求項２記載のDNA構成体を含んでいる、組換え発現ベクター。
【請求項４】
請求項２記載のDNA構成体、又は請求項３記載の組換え発現ベクターを含んでいる、細胞。
【請求項５】
請求項１記載のαアミラーゼプロモーターの制御下に存在する核酸によりコードされる注目のポリペプチドを生産する方法であって、請求項１記載の転写因子及び当該注目のポリペプチドの生産を誘導する条件下に、請求項４記載の細胞を増殖させ、そして当該注目のポリペプチドを回収することを含んでなる、方法。
【請求項６】
前記注目のポリペプチドが医薬用ポリペプチド又は工業用酵素である、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、糸状真菌、特にアスペルギルス属（Aspergilli）の真菌に見いだされる転写因子、前記因子をコードするDNA配列、これによる真菌宿主体の形質転換およびこれの発現、並びに、この様な宿主における、前記宿主によって生産される注目のポリペプチド発現を増加させるための、前記因子の使用に関する。
発明の背景
転写因子は、転写開始に関与する周知のタンパク質である。これらは、多くの異なる生物において徹底的に研究されていて、また真菌のものも記載されている。最近、Dhawale and Lane（NAR（1993）21,5537-5546）によって、糸状真菌を含む真菌の転写因子に関する書物が編集された。
多くの転写因子は、制御タンパク質である。これらは、細胞への刺激に反応して、プロモーターDNAに結合して、転写を活性化または抑制する。
A.オリゼ（A.oryzae）のαアミラーゼ遺伝子の発現は、利用できる炭素源に反応して制御されている。この生物がデンプンまたはマルトース中で増殖する時に、この遺伝子の発現は最大になる（Lachmund et al.（1993）Current Microbiology 26,47-51;Tada et al.（1991）Mel.Gen.Genet.229,301-306）。Lachmund et al.（前出）が明らかにした様に、αアミラーゼの発現は、転写レベルで制御される。このことは、転写因子がこの制御に関与していることを強く示唆するが、これまで、この様な因子の遺伝子は同定されていない。
αアミラーゼ遺伝子のプロモーターは、欠失分析（deletion analysis）によって研究されてきた（Tada et al.（1991）Agric.Biol.Chem.55,1939-1941;Tsuchiya et al.（1992）Biosci.Biotech.Biochem.56,1849-1853;Nagata et al.（1993）Mel.Gen.Genet.237,251-260）。これらの論文の著者は、このプロモーター内の特異的配列が、マルトース誘導の原因であると提唱している。Nagata et al.（前出）は、この配列をプローブとして用いてゲルシフト実験を行い、A.ニデュランス（A.nidulans）の核抽出物中のいずれかのタンパク質が、プロモーターの本配列に結合できるかどうか調べた。この様なタンパク質が３つ見いだされたが、これらのタンパク質は、発現に関与していなかった。他の方法でも、この様なタンパク質は、精製または同定されていない。これらの遺伝子も同様に知られていない。
発明の概略
本発明は、糸状真菌における、αアミラーゼプロモーターによる発現を制御する転写因子に関する。
従って、本発明の第一点は、本発明の転写因子をコードするDNA配列を含んでいるDNA構成体に関し、ここで前記DNA配列が、
a）大腸菌ToC1058，DSM10666に存在するプラスミドpToC320内にクローン化されているDNA配列内の、転写因子をコードする部分であるか、または
b）i）a）に定義されたDNA配列に少なくとも60％相同であるか、または
ii）a）に定義されたDNA配列と同じであるヌクレオチドプローブによってハイブリダイズされるか、または
iii）a）に定義されたDNA配列を含んでいるDNA配列によってコードされる転写因子に対して、少なくとも50％相同である転写因子をコードするか、または
iv）a）に定義されたDNA配列によってコードされる精製された転写因子に対する抗体と、免疫反応する転写因子をコードするか、または
v）本DNA配列によって形質転換されると、ToC879の変異が補完される、すなわちToC879が、シクロデキストリン中で増殖でき、且つリパーゼを生産できる様になる、a）に定義されたDNA配列の類似体である、
前記DNA構成体に関する。
転写因子をコードする完全長のゲノムDNA配列が、糸状真菌アスペルギルス・オリゼの菌株から得られていて、大腸菌ToC1058，DSM10666に存在するプラスミドpToC320内にクローン化されている。
DSM10666内のプラスミドpToC320に挿入された、前記転写因子をコードするDNA配列は、配列番号１および配列番号２の配列内のものと同じ配列を有する。従って、DSM10666内に存在するプラスミドpToC320にクローン化されたDNA配列内の、転写因子をコードする部分を意味する場合は常に、配列番号１および配列番号２のDNA配列の、転写因子をコードする部分もまた意味する。
従って、語句「DSM10666に存在するプラスミドpToC320にクローン化されたDNA配列内の、転写因子をコードする部分」および語句「配列番号１および配列番号２のDNA配列内の、転写因子をコードする部分」は、交換して用いることができる。
本発明の別の点は、本発明のDNA構成体を含んでいる発現ベクター、前記DNA構成体または前記発現ベクターを含んでいる細胞、および転写因子活性を示すペプチドを生産する方法で、転写因子が生産される条件下に、前記細胞を培養することを含んでなる方法を提供することである。
この様な本発明の転写因子は、典型的には糸状真菌由来である。
用語「糸状真菌」は、分類群としての藻菌類（Phycomycetes）、接合菌類（Zygomycetes）、子嚢菌類（Ascomycetes）、担子菌類（Basidiomycetes）および不完全真菌類（fungi imperfecti）、例えば不完全糸状菌類（Hyphomycetes）、例えばアスペルギルス属、ペニシリウム属（Penicillium）、トリコデルマ属（Trichoderma）、フサリウム属（Fusarium）およびヒュミコラ属（Humicola）を意味する。
本発明はまた、糸状真菌宿主細胞を作成する方法で、この様ないずれかの因子をコードするDNA断片を糸状真菌に導入することを含んでなる方法に関し、前記因子を前記真菌に発現させることによって、αアミラーゼプロモーターまたは共同的に制御されるプロモーター（co-regulated promoter）によって、注目のポリペプチドの発現を制御する。
本発明の別の点は、ペプチドの発現が、αアミラーゼプロモーターまたは共同的に制御されるプロモーターによって制御される、注目のポリペプチドを生産する方法で、前記因子および注目の前記ポリペプチドの生産を誘導する条件下に、前記の糸状真菌宿主細胞を増殖させ、そして注目の前記ポリペプチドを回収することを含んでなる方法に関する。
最後に、本発明は、糸状真菌において注目のポリペプチドの発現を制御するための、前記因子の使用に関する。
本文において、制御とは、本発明の因子が活性を有する条件に変えることを意味する。これは、異なるpH、基質、様式（regimes）などであり、注目のタンパク質の発現を改善する効果を有する条件を意味する。
さらに、制御とはまた、転写因子が活性を有する真菌増殖相において発生する事象を含んでいる。環境条件に依存して、因子が活性化されている相を進行および／または延期させることによって、発現および収量を増加させることができる。
さらに、当業界に既知の標準の方法を用いて、転写因子の結合に関する特異的DNA配列を同定することができ、よって、この様な配列を、通常はこの因子によって制御されていない他のプロモーターに挿入でき、よって、このプロモーターを、前記因子の制御下に置くことができる。
表と図の簡単な説明
図において、
図１は、プラスミドpMT1657の構造を示し、この構成体を例１に記載する。
図２は、プラスミドpToC316の構造を示し、この構成体を例１に記載する。
図３は、プラスミドpToC320の構造を示し、この構成体を例１に記載する。
図４は、プラスミドpToC342およびpToC359の構造を示し、この構成体を例３に記載する。
図５は、プラスミドpToC298の構造を示し、この構成体を例４に記載する。
図６は、２％グルコース
0004198753.tif 000002
または10％グルコース
0004198753.tif 000003
を含んでいるYP培地中で培養したA.オリゼIF04177の形質転換体p960によるリパーゼの生産と、２％グルコース
0004198753.tif 000004
または10％グルコース
0004198753.tif 000005
を含んでいるYP培地中で培養したToC1075のリパーゼの生産とを比較した結果を示していて、これを例４に記載する。
図７は、２％グルコース
0004198753.tif 000006
または10％グルコース
0004198753.tif 000007
を含んでいるYP培地中で培養したToC1139によるリパーゼの生産と、２％グルコース
0004198753.tif 000008
または10％グルコース
0004198753.tif 000009
を含んでいるYP培地中で培養したToC1075のリパーゼの生産とを比較した結果を示していて、これを例４に記載する。
図８は、次の制限酵素によって切断した、A.ニガーのDNAのオートラジオグラフの結果を示す：レーン２XbaI；レーン３XmaI；レーン４Sal I；レーン５HindIII；レーン６EcoRI；レーン７Bgl II；レーン８BamHI；レーン１および９、BstEIIで切断した32Ｐ標識DNA。この実験を例５に記載する。
本発明の詳細な説明
本発明の第一点は、αアミラーゼプロモーターを制御する転写因子をコードするDNA配列を含んでいるDNA構成体に関し、ここで前記DNA配列が
a）大腸菌ToC1058，DSM10666に存在するプラスミドpToC320内にクローン化されているDNA配列内の、転写因子をコードする部分であるか、または
b）i）a）に定義されたDNA配列に少なくとも60％相同であるか、または
ii）a）に定義されたDNA配列と同じであるヌクレオチドプローブによってハイブリダイズされるか、または
iii）a）に定義されたDNA配列を含んでいるDNA配列によってコードされる転写因子に対して、少なくとも50％相同である転写因子をコードするか、または
iv）a）に定義されたDNA配列によってコードされる精製された転写因子に対する抗体と、免疫反応する転写因子をコードするか、または
v）本DNA配列によって形質転換されると、ToC879の変異が補完される、すなわちToC879が、シクロデキストリン中で増殖でき、且つリパーゼを生産できる様になる、a）に定義されたDNA配列の類似体である、
前記DNA構成体に関する。
大腸菌ToC1058，DSM10666に存在するプラスミドpToC320内にクローン化されているDNA配列内の、転写因子をコードする部分に類似のDNA配列とは、αアミラーゼプロモーターを制御する転写因子をコードし、且つ前記（i）-（v）に引用した特性を１つ以上有する、いずれかのDNA配列を意味すると定義する。
この類似DNA配列は、本転写因子を生産する糸状真菌の菌株A.オリゼ、または別の菌株、または関連する生物から単離してよく、よって例えば、DSM10666に存在するプラスミドpToC320内にクローン化されているDNA配列内の、転写因子をコードする部分の対立遺伝子または特別な変異体であってもよい。
あるいは、この類似配列を、配列番号１および配列番号２の、転写因子をコードする部分のDNA配列を基にして作成することができ、例えば、そのサブ配列であってもよく、および／または、コードされる転写因子のアミノ酸配列が異ならない様に、転写因子を生産させようとする宿主体のコドン使用様式（codon usage）に合わせて、DNA配列にヌクレオチド置換を導入することによって、またはアミノ酸配列が異なる様にするヌクレオチド置換の導入によっても作成することができる。
ヌクレオチド置換を行う場合、アミノ酸残基変化は、性質変化が少ないのが好ましく、これは、タンパク質の折り畳み構造または活性に有意な影響を与えない保存的アミノ酸残基置換であり、小さな欠失、典型的には１から約30のアミノ酸残基の欠失であり、アミノまたはカルボキシル末端の小さな伸長である。
保存的置換の例には、塩基アミノ酸（例えばArg,Lys,His）、酸性アミノ酸（例えばGlu,Asp）、極性アミノ酸（例えばGln,Asn）、疎水性アミノ酸（例えばLeu,Ile,Val）、芳香族アミノ酸（例えばPhe,Trp,Tyr）、および小さいアミノ酸（例えばGly,Ala,Ser,Thr,Met）のグループ内の置換がある。ヌクレオチド置換に関する概説として、例えばFord et al.（1991）Protein Expression and Purification 2,95-107を見よ。
当業者に明らかなように、この様な置換は、本分子の機能に必須である領域の外において、そして依然として転写因子活性を有する様に行うことができる。本発明のDNA構成体によってコードされる転写因子の活性に必要なアミノ酸は、従って置換しない方が好ましいアミノ酸は、当業界に周知な方法、例えば部位特異的（site-directed）突然変異誘発またはアラニンスキャニング（alanine-scanning）突然変異誘発によって同定することができる（例えばCunningham and Wells（1989）Science 244,1081-1085を参照する）。後者の技法においては、突然変異を分子内の全ての残基に誘発して、生じた変異分子の生物活性（すなわちαアミラーゼプロモーターを制御する転写因子）を調べ、本分子の活性に必須なアミノ酸残基を同定する。
前記の（i）の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され、そして一つの配列がもう一つの配列から派生していることを示す。この相同性は、当業界に既知のコンピュータプログラム、例えばGCGプログラムのGAPによって、適切に決定することができる（Needleman,S.B.and Wunsch,C.D.（1970）Journal of Molecular Biology 48,443-453）。DNA配列の比較のために、GAPクリエーションペナルティを5.0およびGAPエクステンションペナルティを0.3に設定したGAPによって決定すると、DNA配列のコード領域は、配列番号１および配列番号２に示されたDNA配列内の、転写因子をコードする部分に対して、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の同一性を示す。
前記（ii）のハイブリダイゼーションは、以下の材料と方法のセクションに詳細に記載されているある特定の条件下に、類似DNA配列が、本転写因子をコードするDNA配列と同じであるプローブにハイブリダイズすることを意味する。用いるオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１もしくは配列番号２に示されたDNA配列の、転写因子をコードする部分またはその断片に相当するDNA配列である。
前記（iii）の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され、そして最初の配列が２番目の配列から派生していることを示す。この相同性は、当業界に既知のコンピュータプログラム、例えばGCGプログラムのGAPによって、適切に決定することができる（Needleman,S.B.and Wunsch,C.D.,前出）。転写因子の配列比較のために、GAPクリエーションペナルティを3.0およびGAPエクステンションペナルティを0.1に設定したGAPによって決定すると、類似DNA配列によってコードされる転写因子は、配列番号１および配列番号２に示されたDNA配列内の、転写因子をコードする部分を含んでいるDNA構成体によってコードされる転写因子、例えば配列番号３のアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、特には少なくとも95％の同一性を示す。
特性（iv）に関して、免疫反応性を、以下の材料と方法のセクションに詳細に記載されている方法によって決定できる。
特性（v）に関して、補完の方法は、本文の例１に記載されている。
本発明の転写因子をコードするDNA配列を、アスペルギルス・オリゼIFO4177の菌株から、例えばSambrook,et al.（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,NYに記載されている様に、標準の方法によって単離できる。
一般的なRNAおよびDNAの単離方法は、WO93/11249およびWO94/14953にも記載されていて、この内容を引用して本文に組み込む。補完の方法の詳細は、本文の例１に記載されている。
あるいは、本発明の転写因子をコードするDNAを、周知の方法に従って、適当な起源、例えば以下に記載したいずれかの生物から、本明細書に開示したDNA配列を基にして調製した合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、都合良く単離できる。例えば、配列番号１のヌクレオチド配列内の、転写因子をコードする部分もしくはその適当ないずれかの配列を基にするか、または配列番号３のアミノ酸配列を基にして、適当なオリゴヌクレオチドプローブを調製することができる。
本発明は、特に、糸状真菌における、αアミラーゼプロモーターによる発現を制御する転写因子に関し、例２に示した様に、この因子は他の遺伝子の発現さえ制御し得る。
本文において、語句「糸状真菌」は、分類群としての藻菌類（Phycomycetes）、接合菌類（Zygomycetes）、子嚢菌類（Ascomycetes）、担子菌類（Basidiomycetes）および不完全真菌類（fungi imperfecti）、例えば不完全糸状菌類（Hyphomycetes）、例えばアスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、フサリウム属およびヒュミコラ属を含むことを意味する。
本文において、語句「αアミラーゼプロモーター」は、αアミラーゼ遺伝子のすぐ上流の塩基配列で、RNAポリメラーゼが認識して結合し、αアミラーゼをコードする遺伝子の転写を促進する配列を意味する。
すでに指摘したように、転写因子は、多くの生物のものが知られている。よって、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ペニシリウム属、フサリウム属およびヒュミコラ属などの他の真菌に由来して、これらの属のいずれかの真菌において、アミラーゼプロモーターの制御下にあるポリペプチドの発現を促進する効果を有する、類似または相当する因子を見いだすことができるだろう。
αアミラーゼプロモーターを制御する転写因子は、カンジダ（Candida）のグルコシダーゼを制御する転写因子（CASUCI）、およびKelly and Kwon-Chung（1992）J.Bacteriol.174,222-232で開示されているサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のMAL63に対して、コードDNA配列の比較から、ある程度相同性があることが示された。
本発明の転写因子に相同である転写因子をコードするDNA配列、すなわち類似DNA配列を、他の微生物から得ることができる。例えば、このDNA配列を、別の微生物、例えばアスペルギルス属、サッカロミセス属、エルウイニア属（Erwinia）、フサリウム属またはトリコデルマ属のcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることによって、得ることができる。
発明者は、特許手続きを目的とした微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条約に従って、DSM（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig,DEUTSCHLAND）に、本発明の転写因子をコードする遺伝子が不活性化されているA.オリゼの単離菌株を寄託した。
寄託日付：1996年５月６日
寄託物の参考番号：ToC879=NN049238
DSM指定名：アスペルギルス・オリゼDSM No.10671
寄託されたアスペルギルス・オリゼ菌株DSM No.10671を用いて、以下に記載する補完によって、本発明の転写因子を有するアスペルギルス・オリゼおよびその他の真菌のいずれかの菌株から、この遺伝子を単離することができる。
本発明の転写因子をコードする完全長のゲノムDNA配列を含んでいる発現プラスミドpToC320によって、大腸菌株を形質転換して、菌株ToC1058を作成した。発明者は、これを、特許手続きを目的とした微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条約に従って、DSM（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg Ib,D-38124 Braunschweig,DEUTSCHLAND）に寄託した。
寄託日付：1996年５月６日
寄託物の参考番号：ToC1058=NN049237
DSM指定名：大腸菌DSM No.10666
本発明においては、A.オリゼ、A.ニガー、A.アワモリ（A.awamori）などの種、特にA.オリゼIF04177に由来する本タイプの因子が好ましい。
本発明の因子は、αアミラーゼプロモーターの制御だけではなく、またA.オリゼのグルコアミラーゼプロモーターの制御にも関与することが見いだされている。
特に、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列の１つもしくは複数の断片、またはこれらの断片の組み合わせを含んでいるアミノ酸配列を有する、いずれかの因子を含んでいる。
転写因子の短縮型（truncated forms）もまた活性があるだろう。短縮型とは、Ｎ末端の断片、Ｃ末端の断片、または１つもしくは複数の内部断片が除去されている、転写因子の修飾体を意味する。
本発明の別の点は、これらのいずれかの因子をコードするDNA配列に関する。
この点において、本発明は、特に、配列番号３のアミノ酸配列の１つまたは複数の断片をコードする、いずれかのDNA配列を含んでいる。
より詳しく記載すると、本発明は、配列番号１および配列番号２のDNA配列の１つもしくは複数の断片、またはこれらの断片の組み合わせを含んでいるDNA配列に関する。
本発明の別の点は、糸状真菌宿主細胞を作成する方法で、前記のいずれかのDNA断片を糸状真菌に導入すること含んでなる方法に関し、前記因子を前記真菌に発現させることによって、αアミラーゼプロモーターまたは共同的に制御されるプロモーター（co-regulated promoter）によって、注目のポリペプチドの発現を制御する。
前記DNA断片の導入は、糸状真菌にDNAを導入するための周知のいずれかの標準的方法によって、例えば、以下に記載する発現ベクターおよび宿主細胞を用いて、行うことができる。
よって本発明はまた、本発明のDNA構成体を含んでいる組換え発現ベクターも提供する。
本発明の発現ベクターは、組換えDNA技法で都合良く操作できるいかなる発現ベクターでもよく、そして選択されるベクターは、多くの場合導入される宿主細胞に依存する。
よってベクターは、自律複製するベクター、すなわち染色体外に存在して、染色体の複製と独立して複製するベクター、例えばプラスミドであってよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるベクターであってもよい。
本発現ベクターでは、本転写因子をコードするDNA配列は、通常転写因子に連関する発現シグナルを有するか、または適当なプロモーターもしくはターミネーター配列に作用可能に連結される必要がある。プロモーターは、選択される宿主細胞において転写活性を示すいかなるDNA配列でもよく、そして宿主細胞に対して同種または異種性である遺伝子から得ることができる。転写因子、プロモーターおよびターミネーターをコードする各々のDNA配列を連結する方法は、当業者に良く知られている（Sambrook et al.前出を参照する）。
糸状真菌宿主細胞において用いる適当なプロモーターの例には、A.ニデュランスのADH3のプロモーター（McKnight,et al.（1985）The EMBO J.4,2093-2099）またはtpiAプロモーターがある。その他の有用なプロモーター例は、A.オリゼのαアミラーゼ、A.ニガーの中性αアミラーゼ、A.ニガーの酸に安定なαアミラーゼ、A.ニガー、A.アワモリまたはA.オリゼのグルコアミラーゼ（gluA）、A.オリゼのアルカリ性プロテアーゼ（alp）、A.オリゼの硝酸還元酵素（niaD）、A.オリゼのトリオースリン酸イソメラーゼ（tpi）、もしくはA.ニデュランスのアセトアミダーゼをコードする遺伝子から得られたもの、またはアスペルギルス属のアミノ酸生合成遺伝子、例えばargBのプロモーターである。
本発明のさらに別の点は、本発明のDNA構成体および／または本発明の組換え発現ベクターを含んでいる宿主細胞を提供することである。
好ましくは、本発明の宿主細胞は、真核生物細胞であり、特に真菌細胞、例えば酵母または糸状真菌の細胞である。特に、この細胞は、トリコデルマ属の種、好ましくはT.ハジアナム（T.harzianum）もしくはT.イエセイ（T.Yeesei）、またはアスペルギルス属の種、最も好ましくはA.オリゼまたはA.ニガーである。真菌細胞を、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生からなる周知の工程によって、形質転換することができる。宿主微生物としてのアスペルギルス属の使用は、EP238023（Novo Nordisk A/S）に記載されていて、その内容を引用して本文に組み込む。宿主細胞はまた、酵母細胞、例えばサッカロミセス属（Saccharomyces）の種の菌株、特にS.セレビシエ（S.cerevisiae）、S.クルベリ（S.kluyveri）もしくはS.ウバルム（S.uvarum）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）の種の菌株、例えばS.ポンベ（S.pombe）、ハンセヌラ属（Hansenula）の種の菌株、ピキア属（Pichia）の種の菌株、ヤロウイア属（Yarrowia）の種の菌株、例えばY.リポリチカ（Y.lipolytica）、またはクルベロミセス属（Kluyveromyces）の種の菌株、例えばK.ラクチス（K.lactis）でもよい。
宿主細胞の内在性amyR遺伝子を欠失させるか、または他の方法によって不活性化させてもよい。異種性プロモーターによるamyRの制御を導入すると、αアミラーゼプロモーターの完全に新しい制御機構が形成される。例えば、もしamyRをA.オリゼのniaDのプロモーターに連結すると、αアミラーゼプロモーターは、硝酸によって誘導される様になる。もし、niaDのプロモーターの代わりに、a palC制御性（palC-regulated）プロモーターを用いると、αアミラーゼプロモーターの活性は、pHによって制御される様になる。
本発明はまた、注目のポリペプチドを生産する方法で、前記因子および注目の前記ポリペプチドの生産を誘導する条件下に、前記宿主細胞を増殖させて、そして注目の前記ポリペプチドを回収するという方法を含んでいる。
形質転換された宿主細胞を培養するために用いる培地は、問題の宿主細胞の増殖に適する通常のいずれの培地でもよい。発現される注目のポリペプチドは通常培地中に分泌され、そしてこれを、周知の方法によって回収することができる。この方法には、遠心または濾過によって培地から細胞を分離すること、硫酸アンモニウムなどの塩によって培地中タンパク質成分を沈殿させること、これに続きクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィーなどを行うことが含まれる。
本発明の方法を、注目のポリペプチドとしての医薬用ポリペプチド、特に成長ホルモン、インスリン、および血液凝固因子などの医薬用ポリペプチドを生産するために、用いることができる。
また本発明の方法を、工業用酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、オキシドレダクターゼ、カルボヒドラーゼ、カルボニルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エステラーゼなどの生産のために、用いることができる。
本発明の別の点として、前記転写因子を、糸状真菌、例えばアスペルギルス属、トリコデルマ属、ペニシリウム属、フサリウム属およびヒュミコラ属などの真菌、特にA.オリゼ、A.ニガー、A.アワモリなどの種、そして特にはA.オリゼにおいて、注目のポリペプチドの発現を促進させるために、用いることができる。
よって本発明の転写因子を用いて、医薬用ポリペプチド、例えば成長ホルモン、インスリン、および血液凝固因子などの発現を促進させることができる。
また本発明の転写因子を用いて、工業用酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、オキシドレダクターゼ、カルボヒドラーゼ、カルボニルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エステラーゼなどの発現を促進させることができる。
また本転写因子を用いて、αアミラーゼプロモーター内の転写因子結合配列を同定することができる。これは、例えば、以下の様にして行うことができるだろう。AmyRのDNA結合ドメイン、例えばジンクフィンガー（zinc finger）を融合させたGST-融合タンパク質を作成して、大腸菌に生産させる。この様な融合タンパク質を、市販のキット、例えばPharmacia社のGST Gene Fusion Kitを用いて便利に作成することができる。それから、精製したGST-融合タンパク質を用いて、インビトロでおこなう通常の技法、例えばゲルシフトアッセイまたはDNAフットプリント分析を行うことができる（Kulmburg,P.et al.（1992）Molecular and Cellular Biology 12,1932-1939;Lutfiyya,L.L.and Johnston,M.（1996）Molecular and Cellular Biology 16,4790-4797）。AmyRの結合部位を同定することによって、通常はAmyRによって制御されていない他のプロモーターに、これらの配列を挿入できる様になるだろう。
材料と方法
ハイブリダイゼーション：
ヌクレオチドプローブと本発明の類似DNA配列との間のハイブリダイゼーションを決定するために適するハイブリダイゼーション条件は、以下に記載するとおりでよい。用いるオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１のDNA配列の、転写因子コード部分に相当するDNA配列であり、すなわち配列番号１のヌクレオチド1691..2676+2743..3193+3278..3653、またはその断片、例えば配列番号１のヌクレオチド1770-1800である。
ハイブリダイゼーション条件：
ヌクレオチドプローブと相同なDNAまたはRNA配列との間のハイブリダイゼーションを決定するために適するハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイズするDNA断片またはRNAを転写したフィルターを、5x SSC（標準クエン酸塩生理食塩水）中に、前もって10分間浸すこと、5x SSC,5xデンハルト溶液，0.5% SDSおよび100μg/ml変性分断サーモン精子DNAからなる溶液（Sambrook,et al.前出参照）中で、フィルターをプレハイブリダイゼーションすること、続けてランダムプライマーで32P-dATPラベルしたプローブ（比活性>1x109cpm/μg）（Feinberg,A.P.and Vogelstein,B.（1983）Anal.Biochem.132,6-13）を含んだ同溶液中で、12時間、約65℃でハイブリダイゼーションすること、を含んでいる。それからフィルターを、2x SSC,0.5% SDS中で、30分間２回、好ましくは50℃以下、より好ましくは55℃以下、より好ましくは60℃以下、より好ましくは65℃以下、さらにより好ましくは70℃以下、特には75℃以下で洗う。
これらの条件下で、ヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子を、Phospho Image detectorで検出する。
免疫交差反応性：
免疫交差反応性を決定するために用いる抗体を、精製した転写因子を用いて調製することができる。より詳しく述べると、N.Axelsen et al.,A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis,Blackwell Scientific Publications,1973,Chapter 23またはA.Johnstone and R.Thorpe,Immunochemistry in Practice,Blackwell Scientific Publications,1982,pp.27-31に記載された方法によって、ラビットまたは齧歯類を免疫して、本発明の転写因子に対する抗血清を作ることができる。例えば、塩析（硫酸アンモニウム）を行い、続いて透析して、そしてイオン交換クロマトグラフィー、例えばDEAEセファデックスにかけて、抗血清から精製したイムノグロブリンを得ることができる。タンパク質の免疫化学的特性を、オクタロニー二重拡散分析法（O.Ouchterlony,Handbook of Experimental Immunology（D.M.Weir,ed.）,Blackwell Scientific Publications,1967,pp.655-706）、交差免疫電気泳動法（N.Axelsen et al.前出Chapters 3 and 4）、またはロケット免疫電気泳動法（N.Axelsen et al.前出Chapter 2）によって決定することができる。
実施例
実施例１
A.オリゼからのamyRの転写因子のクローニング：
両方ともTAKAアミラーゼプロモーターの調節下にある２つの異なるタンパク質の発現が不可能になったA.オリゼの変異株の補完から、amyRをクローニングした。TAKAプロモーターの調節下にある、リパーゼ（HLL）をコードするcDNA、および自身のプロモーターから転写されるTAKAアミラーゼ遺伝子１コピーを含んでいる菌株SRe440を突然変異誘発して、A.オリゼの変異株ToC879を作成した。
アミラーゼ陰性の表現型（amylase-）を示す変異体から、続けてリパーゼ陰性の表現型（lipase-）を示す変異体を同定単離した。
菌株ToC879は、両方の発現カセットの完全なコピーを含んでいる。アミラーゼ陰性表現型によって、ToC879は、唯一の炭素源として１％シクロデキストリンを含んでいるプレート上で増殖できなくなり、一方親株のSRe440は、このプレート上で増殖する。
ToC879をDSMに寄託した（DSM No.10671）。
A.オリゼのコスミドライブラリー、および、自律複製するpHelp1を基にして作成した、glufosinate耐性を付与するストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）のbar遺伝子を保持しているプラスミド（D.Gems,I.L.Johnstone and A.J.Clutterbuck（1991）Gene 88,61-67）を用いて、ToC879を同時形質転換することによって、amyRを単離した。唯一の炭素源としてシクロデキストリンを含んでいるプレート上での選択性が回復した形質転換体を、同時にリパーゼ陽性表現型への回復に関してスクリーニングした。
この形質転換を引き起こしたDNAを、シクロデキストリンのプレート上で増殖したコロニーから回収した。これをサブクローニングして、ToC879の両表現型を補完することができる4.3kb DNA断片を単離した。この断片上の当該遺伝子を、amyRと名付けた。
pHelp1の誘導体であるpMT1657の作成：
次の４つの断片を連結することによってプラスミドpMT1612を作成して、その後大腸菌DH5αを形質転換した。
i）SphI/XbaIで切断した大腸菌ベクターpToC65（EP531372に記載されている）
ii）SphI/BamHIで切断した、A.ニデュランスのamdSのプロモーターを有するPCR断片
iii）pBP1TをBamHI/XhoIで切断して得た、bar遺伝子を有する0.5kbの断片（B.Staubinger et al.（1992）Fungal Genetics Newsletter 39,82-83）、および
iv）pIC AMG/Term（EP Application No.87103806.3）をXhoI/XbaIで切断して得た、A.ニガーのグルコアミラーゼの転写ターミネーターを有する0.7kbの断片
amdSのプロモーターを有するPCR断片は、鋳型DNAとしてプラスミドpMSX-6B1（M.E.Katz et al.（1990）Mol.Gen.Genet.220,373-376）、プライマーとして２つのオリゴヌクレオチド、4650（配列番号４）および4561（配列番号５）を用いて作成した。
0004198753.tif 000010
pMSX-6B1は、amdSプロモーターのアップ変異（up mutation）I666を有する。
HindIIIで切断して、脱リン酸化したpMT1612を、pHelp1からHindIIIで切断して得た、AMA1配列を有する5.5kb断片に連結した。できたプラスミドpMT1657は、アスペルギルス属において自己複製でき、そして増加したglufosinate耐性によって選択することができる。図１にpMT1657を示すが、ここでPamdSは、前記ii）のamdSプロモーターの断片、barは、前記iii）の断片、そしてTamgは、前記iv）の断片を表す。
コスミドライブラリーの作成：
SuperCos1 cosmid vector kit（Stratagene Cloning Systems,LaJolla CA,USA）を用いて、この取扱説明書に従って、A.オリゼのコスミドライブラリーを作成した。
標準の方法によって（Christensen,T.et.al.（1988）Biotechnology 6,1419-1422）作成したプロトプラストから、A.オリゼIF04177のゲノムDNAを調製した。
プロトプラストを分離してから、LabofugeT（Heto）によって2500rpmで５分間遠心して、これをペレットにした。次にこのペレットを、前記キットの説明書の記載どおり10mM NaCl，20mMトリス塩酸（pH8.0），1mM EDTA，100μg/mlプロテイナーゼＫおよび0.5% SDSに縣濁した。その後、この説明書に従ってDNAを調製した。
CHEFゲル装置（Bio-Rad Laboratories,Hercules CA,USA）を用いて、１％アガロースゲル内で、10-50秒間の200ボルトのパルスをかけて、20時間電気泳動を行い、ゲノムDNAのサイズを決定した。ゲルをエチジンブロマイドで染色し、写真を撮った。DNAのサイズは、50-100kbであった。このDNAをSau3Aで部分的に切断した。前記と同じにCHEFゲル分析を行ったところ、切断したDNAのサイズは20-50kbであった。塩化セシウム勾配にかけ、バンドになったSuperCos1ベクターを、説明書に従い調製した。説明書どおりに、ライゲーションおよびパッケージングを行った。
ライブラリーの力価を決定した後、パッケージング混合液すべてを、宿主細胞XL1-BlueMRにトランスフェクションして、そして50μg/mlアンピシリン含有のLBプレート上にまいた。約3800コロニーが得られた。10コロニーから調製したコスミド調製品は、全て予想したサイズの挿入断片を有することがわかった。個別に拾ったコロニーを、100μl LB（100μg/mlアンピシリン含有）が入ったマイクロタイタープレートのウエルに接種して、37℃で一晩放置した。各ウエルに、50％グリセロール100μｌを加え、全ライブラリーを−80℃で凍結した。合計3822コロニーを保存した。
これは、A.オリゼのゲノムの約4.4倍を示す。コロニーを拾った後に、プレートをかきとり、かきとったものをプールした。そしてこの全ライブラリーをまた４つのプールに分けて、凍結グリセロール保存した。この４つのプールを、ToC901-ToC904とした。
マイクロタイタープレートの半分に合わせた６列８ピンの多重ピン装置を用いて、個別に凍結したライブラリーのコロニーを、LBプレート（100μg/mlアンピシリン含有）に接種した。ライブラリーの全クローンから、コロニーを接種したプレートを作成した。
プレートを37℃で一晩放置した。ペトリ皿のサイズに切って、滅菌したワットマン540フィルターを、コロニーの上にのせて、さらに２時間37℃で放置した。このフィルターを、200μg/mlクロラムフェニコールを含有したLBプレートに転写し、このプレートを37℃で一晩放置した。
翌日、フィルターを、0.5M NaOHで５分間２回、それから0.5Mトリス塩酸（pH7.4）で５分間２回、それから2x SSCで５分間２回洗った。フィルターをエタノールに浸し、空気中で乾燥させた。
amyRクローンの選択：
ToC901-904からコスミドDNAを調製して、これをpMT1657と一緒に導入して、ToC879を同時形質転換した。形質転換の方法は、EP Application No.87103806.3に記載されている。約8700の形質転換体を、浸透圧安定化のための1Mスクロース、および10mM（NH4）2SO4を含んだ最小培地プレート（Cove D.J.（1966）BBA113,51-56）において、1mg/ml glufosinateに対する耐性から選択した。
ランダムに選択した10個の形質転換体を、同タイプのプレート上でもう一度分離した。この10個の形質転換体からの分生子（conidiospores）を、1mg/ml glufosinateを含んだ最小培地に接種し、DNA調製に十分な菌糸体が集められるまで、30℃で生育した。T.Christensen et al.（前出）の方法で、DNAを調製した。
切断していないDNAを、0.7%アガロースゲルにのせて電気泳動し、続いてサザンブロットを行った。SuperCos1に特異的な、32Ｐ標識したDNA断片を用いて、このブロットをハイブリダイズした。10個の各形質転換体は、直鎖の染色体DNAより大きな移動度のバンドを示した。各バンドはまた、pHelp1特異的なプローブにもハイブリダイズした。このことは、コスミドライブラリーの同時形質転換頻度は100%に近く、そしてコスミドは、自律複製ベクターpHelp1内に組み込まれたことを示した。
この形質転換体は、pHelp1による形質転換体から予測されたように、不安定であった。glufosinate耐性のコロニーから得られた分生子の10％未満が、glufosinate耐性の子孫を生じた。
全形質転換体から分生子を集め、８個のプールに分け、1mg/ml glufosinate,10mM（NH4）2SO4および1%b-シクロデキストリン（Kleptose from Roquette Freres,62136 Lestem,France）を含んだ最小培地プレート（Cove D.J.前出）にまいた。
１つのプールから４コロニーを、別の１つのプールから１コロニーを得た。最初のプールからの２コロニーを、同タイプのプレート上で再度分離した。
再分離したコロニーの分生子を、炭素源としてグルコースまたはシクロデキストリンを含んだプレート、およびglufosinateを含んだプレート上にまいた。glufosinate耐性およびシクロデキストリン中での増殖能の表現型は、どちらも同程度に不安定であった。これは、形質転換体において、シクロデキストリン中での増殖能を付与する遺伝子は、物理的にpMT1657に連結されていることを示した。
再分離したプレートからコロニーを切り出して、抗HLLリパーゼ抗体を用いて、ロケット免疫電気泳動（RIE）で分析した。これらの形質転換体は、この抗体に対して明らかに反応したが、マルトース中で増殖するToC879は、反応しなかった。このことから、アミラーゼの発現（すなわちシクロデキストリン中での増殖）およびリパーゼの発現（すなわち抗体との結合）の両方が、これらの形質転換体において回復していたことが結論された。この表現型を起こす原因遺伝子を、amyRと名付けた。
amyR遺伝子の単離：
２つの異なる方法を用いて、アミラーゼ陽性およびリパーゼ陽性を示す、ToC879の形質転換体から、amyR遺伝子を回収することに成功した。
炭素源としてシクロデキストリンを含んだ最小培地中で増殖させた菌糸体からDNAを調製した。
最初の方法では、総DNAから元のコスミドを回収するために、Stratagene社のGigapack▲Ｒ▼ II kitを用いて、DNAをラムダヘッド（λ-heads）にパッケージングした。キットに明記された条件で、パッケージング反応液を、大腸菌XL1-BlueMRに混ぜた。この大腸菌を、50μg/mlアンピシリンを含んだLBプレートにまいた。プレート上に２つのコロニーが出現した。それらが保持するコスミドは同一で、このコロニーをToC1012と名付けた。
２番目の方法では、総DNAを用いて、コンピテントな大腸菌DH5a細胞を形質転換した。16コロニーが単離されて、異なる６プラスミドが含まれていることが、制限酵素切断の結果から示された。各プラスミドをEcoRIで切断して、サザンブロット分析を行った。32Ｐ標識したpMT1657およびSuperCos1の混合物をプローブとして、これらのベクターのいずれの部分でもないDNA断片を同定した。長さ約0.7kbおよび1.2kbの２つのEcoRI断片は、これらのいずれのプローブにもハイブリダイズしなかった。1.2kb断片を単離し、32Ｐで標識した。これをプローブとして用い、当該形質転換体が得られたコスミドライブラリー部分を転写したフィルターを、ハイブリダイズした。約1000クローンが含まれているToC904プールから、６コスミドがハイブリダイズした。
制限酵素切断の結果から、このうちのいくつかは同一であることが示されたので、異なる４コスミドを単離した。
全てのコスミドは、少なくとも同様にTAKAアミラーゼ遺伝子の部分を含んでいた。この４つのコスミドおよびコスミドToC1012を、pMT1623と一緒に用いて、ToC879を同時形質転換した。pMT1623は、pUCを基にしたプラスミドで、A.オリゼのtpiプロモーターの調節下にbar遺伝子を保持している。各々の同時形質転換から、glufosinate耐性によって、15個の形質転換体を単離し、そしてシクロデキストリン中での増殖能をテストとした。
ToC1012から得られた８個の形質転換体、および他の１つのコスミド41B12から得られた３個の形質転換が、増殖可能であった。他のコスミドからの形質転換体は、いずれも増殖しなかった。ToC1012および41B12からの形質転換体の全てが増殖しないことは、各実験の同時形質転換頻度を反映していると思われる。シクロデキストリン中で増殖した形質転換体のコロニーを、ロケット免疫電気泳動（RIE）によって分析したところ、これらは全てリパーゼを生産することがわかった。
コスミドからamyRをサブクローン化するために、41B12をBglII、HindIIIまたはPstIによって切断し、得られたDNA断片をpUC19にクローン化した。このサブクローンを用いてToC879を形質転換し、この形質転換体について、前記どおりに、シクロデキストリン中での増殖能およびリパーゼ生産能を分析した。１つのプラスミド、pToC316（図２）が、約９kbのHindIII断片を含んでいて、これにamyRが含まれていることが確認された。
これをサブクローニングして、4.3kb HindIII/SacI断片を含んでいるプラスミドpToC320を作った。これを図３に示す。続いてサブクローニングおよびプライマー歩行を行い、ABI社のDNAシークエンサーでこのDNA配列を決定した。
配列番号１に、amyR遺伝子を含んでいる3980bpのDNA配列を示す。推定したアミノ酸配列を、配列番号３に示す。アミノ酸28-54間には、Gal4タイプのジンクフィンガー（zinc finger）配列が確認された。この配列は、DNAに結合することが知られている（Reece,R.J.and Ptashne,M.（1993）Science 261,909-910）。
amyRが、アミラーゼ特異的DNA断片を含んでいるコスミドから単離されたことから、IFO4177では、amyRは、３つのアミラーゼ遺伝子の中の１つの近くにあることがわかる。コスミドのマッピングから、αアミラーゼ遺伝子とamyRとは、5-6kb離れていることが示された。ゲノムDNAのサザンブロット分析から、IFO4177には、amyRは１コピーあるだけで、それは１つのアミラーゼ遺伝子の近くにあることが確認された。
amyRのcDNA分析：
Wahleithner,J.A.et al.（1996,Curr.Genet.29,395-403）の方法によって、αアミラーゼの生産に有利な条件下で、マルトース含有培地中で増殖させたA.オリゼの培養から、mRNAを調製した。
標準の方法によって作成した二本鎖cDNAを鋳型として、次のプライマーを用いてPCR反応した。
0004198753.tif 000011
プライマー20866および23087をPCR反応から、約1.1kbの断片が得られた。EcoRIおよびHindIII（プライマーに、これらの制限部位を組み込んでいた）によってこの断片を切断し、同酵素で切断したベクターpUC19にクローン化した。
このプラスミド内の挿入断片の配列を決定したところ、当該遺伝子のこの配列部分にイントロンがあることがわかった。このイントロンは、配列番号２に示されている。
オリゴdTプライマーおよびプライマー20866を用いた別のPCR反応からは、明確な断片が得られなかった。この反応液の一部を鋳型として、オリゴdTプライマーおよびプライマー20865を用いて、新たに反応を行い、約1.1kbの断片を得た。この断片を、EcoRIおよびHindIIIで切断してpUC19にクローン化した。
決定した配列から、この断片は、amyRの3’部分を含むこと、およびもう一つのイントロンがあることが示された。これも、配列番号２に示されている。3’末端について、３つの独立のプラスミドの配列を決定した。２つのポリＡ付加部位が、塩基3827および塩基3927に位置することが確認された。
実施例２
amyR陰性株における、グルコアミラーゼ合成の定量：
A.オリゼは、glaA遺伝子にコードされるグルコアミラーゼを生産する。これは、αアミラーゼの場合と同じ物質によって制御されている（Y.Hata et al.（1992）Curr.Genet.22,85-91）。amyRが、glaAの制御にも関与するかどうか見るために、amyR陰性株ToC879および、ToC879の直接の親株であるamyR野生型株SRe440を、グルコアミラーゼが誘導される条件下に培養して、その合成を測定した。
各菌株の分生子を、YPM（2%マルトース含有YP）10mlに接種して、30℃で４日間増殖させた。上清を集め、グルコアミラーゼによって切断されると黄色に変わる基質であるp-ニトロフェニルαD-グルコピラノシドと混ぜて、グルコアミラーゼ含有量を測定した。この方法では、発酵ブロス0.5mlを、1mg/mlの基質を含む0.1M酢酸ナトリウム（pH4.3）1mlと混ぜる。サンプルを室温で３時間放置した後、0.1M Na2B4O7 1.5mlを加えた。黄色を、分光光度計にて400nmの吸光で測定した。対照のサンプルは、最初に上清をほう酸塩と混ぜてから、基質溶液と混ぜることで作った。この結果（反応サンプル値−対照サンプル値（OD units））を以下に示す。
SRe440：0.655
ToC879：0.000
ToC879から得たサンプルでは、全く吸光が観察されなかった。このことは、A.オリゼにおいて、グルコアミラーゼの合成には、AmyR転写因子の発現が必要であることを示す。
実施例３
AmyRの過剰発現：
A.オリゼのtpi遺伝子のプロモーターと連結したamyRのコード領域および3’非コード配列を含んでいる、プラスミドpToC342を作成した。tpi遺伝子は、トリオースリン酸イソメラーゼをコードしていて、これは構成的に発現されていて、基本代謝に関与する酵素である。A.オリゼのtpi遺伝子を、McKnight,G.L.et al（1986,Cell 46,143-147）の方法に従って、A.ニデュランスのcDNAクローンとのクロスハイブリダイゼーションによって単離した。配列を決定して、構造遺伝子を同定した。プロモーターとして、コード領域の直上流の約700bpの断片を用いた。pToC342は、ToC879の変異を補完することができた。さらにA.オリゼのpyrG遺伝子を、pToC342に導入し、プラスミドpToC359を作成した。できたプラスミドによって、JaL228のpyrG変異株であるJaL250を形質転換した。前記変異株は、特許出願DK1024/96（Filing date1996-09-19）に記載されている。pToC359の多重コピーを有する菌体では、グルコアミラーゼの合成レベルが増加していることがわかった。
pToC342およびpToC359の作成：
鋳型としてpToC320、および以下のプライマーを用いて、PCR反応を行った。
0004198753.tif 000012
できた断片をEcoRI/ApaIで切断し、生じた約180bpの断片を、EcoRI/ApaIで切断したpToC320にクローン化した。できたプラスミドpToC336の配列を決定して、PCR断片が完全であることを確認した。pToC336の2.6kbのBamHI/SacI断片は、amyRのコード領域および3’非コード配列を含み、この断片と、tpiプロモーターを含有する約700bpのEcoRI/BamHI断片とを、EcoRI/SacIで切断したpUC19にクローン化した。tpiプロモーターの下流のBamHI部位は、インビトロに作成導入されたもので、一方EcoRI部位は、元々のtpiクローンに内在しているものである。できたプラスミドpToC342をHindIIIで切断した後、脱リン酸化して、これをA.オリゼのpyrG遺伝子を含有する1.8kbのHindIII断片に連結した。できたプラスミドをpToC359と名付けた。pToC342およびpToC359の両方の構造を、図４に示す。ここで、Ptpiは、tpiプロモーターを表し、そしてTamyRは、amyRの3’非コード領域を表す。pyrG遺伝子のクローニングは、WO95/35385に記載されている。
A.オリゼJaL250における発現
JaL250は、5-フルオロオロト酸耐性によって選択された、JaL228のpyrG変異体である。JaL228は、特許出願DK1024/96（Filing Date1996-09-19）に記載されている。標準の方法でpToC359によって形質転換し、ウリジン要求性からの回復に関して選択して、JaL250を得た。この形質転換体を、分生子を経て、２回再選択して、それから2%マルトース含有のYP培地中で、４日間30℃で増殖させた。分泌されたグルコアミラーゼを、p-ニトロフェニルαD-グルコピラノシドを切断する能力によって測定した。この形質転換体の発酵ブロスでは、5-31の任意グルコアミラーゼ単位/mlを示したが、JaL228では、2-3単位/mlであった。最良の形質転換体を、ToC1200と名付けた。サザン分析の結果、pToC359の多重コピーが、ToC1200のゲノム内に組み込まれていることが明らかにされた。αアミラーゼプロモーターを有する発現プラスミドにとって、ToC1200を、宿主株として用いることは有利であるだろう。
実施例４：
炭素代謝産物による、TAKAアミラーゼプロモーターの抑制
TAKAアミラーゼのプロモーターは、炭素代謝産物によって抑制を受ける。アスペルギルス属では、炭素代謝産物による抑制は、少なくとも部分的には、転写抑制因子CreAによって仲介される。これは、S.セレビシエのMIG1の相同物である。CreAによって調節されるプロモーターのDNA結合部位は、GCに富み、表面的にはS.セレビシエのMIG1部位と同一であることが知られている。TAKAアミラーゼのプロモーターには、いくつかの潜在的CreA結合部位がある。このプロモーターが、炭素代謝産物による抑制に関与しているかどうか決めるために、３つのこの部位を変異させたが、炭素代謝産物による抑制の解除は部分的であった。これとは対照的に、レポーター遺伝子に共役させたこの修飾プロモーターを含んでいる菌体に、構成的に発現するAmyRのコピーを導入すると、レポーターの抑制は、完全に解除された。
CreA部位を欠失したTAKAアミラーゼのプロモーターの作成：
TAKAアミラーゼのプロモーターでは、既知のCreA部位とMIG1部位との比較から、３つの部位が、潜在的なCreA結合部位として同定された。これらの部位は、次の配列を有する。
0004198753.tif 000013
下線の塩基をＡに変えた。この変異は、MIG1結合部位を、機能しなくすることが知られている。標準的な部位特異的突然変異誘発法によって、置換を行った。この修飾プロモーターと、A.ニガーのグルコアミラーゼの3’非翻訳配列とを有する発現ベクターpToC297を作成した。pToC297は、プロモーターの変異以外は、WO91/17243に記載されているpToC68と同一である。両プラスミドは、プロモーターとターミネーターとの間に、唯一のBamHI部位を有する。
CreA陰性TAKAアミラーゼプロモーターによって制御されるリパーゼの発現：
ヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）のリパーゼをコードするcDNAを有する約950bpのBamHI断片を、pToC297にクローン化した（H.ラヌギノサのリパーゼのクローニングおよび発現は、以前にEP305216に記載されている）。できたプラスミドpToC298と、A.ニデュランスのamdS遺伝子との同時形質転換によって、A.オリゼIF04177を形質転換した。この構造を図５に示す。ここで、Ptaka-creAは、CreA結合部位を欠失したTAKAアミラーゼプロモーターを表す。形質転換体を、分生子を経て２回再単離して、この中からリパーゼを生産する１つの形質転換体ToC1075を、次の評価のために選択した。
ToC1075、および、野生型TAKAアミラーゼプロモーターに連結されたリパーゼを含んでいるIF04177のp960形質転換体（以前EP 305 216に記載されている）を、２％または10％グルコースを含んでいるYP培地10ml中で、30℃で増殖させた。発酵ブロスから、毎日サンプルを取り、リパーゼの分析を行った。精製したリパーゼに対するポリクローナル抗体を用いて、ロケット免疫電気泳動によって、リパーゼ含有量を測定した。A.オリゼIF04177の発酵ブロスは、この抗体と反応しなかった。発酵ブロス中のグルコース含有量を、同様にして毎日、Lilly社のTes-tapeを用いて測定した。
１日目、全ての培養においてグルコースが検出された。しかし２日目では、元々10％含んでいる培養においてのみ、グルコースが検出された。リパーゼ生産の結果を図６に示す。これから、野生型プロモーターは、グルコースがなくなるまで、抑制されることが示唆される。よってグルコースが使い尽くされた時に、リパーゼの蓄積が始まる。図６からまた、10％グルコース中で発酵する場合に、この修飾プロモーターは厳密には制御されないで、グルコース存在下に低レベルのリパーゼが生産されることが示される。すなわち、ToC1075では、部分的なグルコース抑制が見られる。
ToC1075における炭素代謝産物によるリパーゼの抑制の、pToC342による解除：
pToC342と、bar含有プラスミドpMT1623との同時形質転換によって、ToC1075を形質転換した。pToC342の多重コピーを含んでいて、そしてリパーゼの発現カセットを保持する菌株を、サザンブロット分析によって同定した。この様な１つの菌株をToC1139と名付けた。ToC1075およびToC1139を、２％または10％グルコースを含んだYP培地10ml中で、30℃で増殖させて、そしてサンプルのリパーゼおよびグルコースを、毎日分析した。パラニトロフェニル酪酸の切断によって、リパーゼを測定した。Lilly社のTes-tapeによって、グルコース含有量を測定した。結果を図７に示す。これから、前記同様、ToC1075では、グルコースによる抑制の解除は部分的であり、一方ToC1139によるリパーゼ生産は、グルコースの存在に無関係であることが示される。
実施例５
A.ニガーのamyR遺伝子のサザン分析：
A.ニガーにおいて、αアミラーゼおよびグルコアミラーゼの合成は、A.オリゼの場合と同様、炭素源によって制御される。よって、A.ニガーもまた、amyR遺伝子を含んでいると思われる。A.オリゼのamyR遺伝子と、A.ニガーの染色体DNAとの間のクロスハイブリダイゼーションを調べることによって、この仮説を検証した。
通常の方法によって、A.ニガーからDNAを調製した。このDNAを、BamHI，BglII，EcoRI，HindIII，SalI，XmaIまたはXbaIによって切断し、生じたDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した。DNAを、ニトロセルロース膜に転写し、そしてA.オリゼのamyRの構造遺伝子の部分を32Ｐ標識したプローブによってハイブリダイズした。このプローブは、pToC320をPCRで増幅して作られたもので、そして、配列番号１の塩基1683から塩基2615までのものである。ハイブリダイゼーションは、10xデンハルト溶液，5x SSC，10mM EDTA，1% SDS，0.15mg/ml polyA，0.05mg/ml酵母tRNA中で、50℃で一晩行った。ハイブリダイゼーション後、ストリンジェント性（stringency）を増加させながら、膜を洗い、そして膜の放射活性をPhospho Imagerで解析した。膜を2x SSC，0.1% SDS中で、58℃で洗った場合の結果を、図８に示す。いくつかの制限酵素を用いた場合に、単一バンドが見られる。よって、このクロスハイブリダイゼーションの結果に基づいて、A.ニガーのamyR遺伝子をクローン化することができる。
引用文献リスト
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DK1024/96
WO 95/35385
WO 91/17243
EP 305 216
配列表
（１）一般情報
（ii）発明の名称：転写因子
（iii）配列数：９
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：3980塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ゲノムDNA
（iii）仮定：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）起源
（Ａ）生物：アスペルギルス・オリゼ
（xi）配列記載：配列番号１：
0004198753.tif 000014
0004198753.tif 000015
0004198753.tif 000016
（２）配列番号２の情報：
（Ａ）長さ：3980塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ゲノムDNA
（iii）仮定：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）起源
（Ａ）生物：アスペルギルス・オリゼ
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：エキソン
（Ｂ）位置：1691..2676
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：イントロン
（Ｂ）位置：2677..2742
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：エキソン
（Ｂ）位置：2743..3193
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：イントロン
（Ｂ）位置：3194..3277
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：エキソン
（Ｂ）位置：3278..3653
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）位置：（1691..2676,2743..3193,3278..3653）の接合体
（xi）配列記載：配列番号２：
0004198753.tif 000017
0004198753.tif 000018
0004198753.tif 000019
0004198753.tif 000020
0004198753.tif 000021
0004198753.tif 000022
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：604アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列記載：配列番号３：
0004198753.tif 000023
0004198753.tif 000024
0004198753.tif 000025
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：26塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：プライマー4650
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列記載：配列番号４：
0004198753.tif 000026
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：26塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：プライマー4651
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列記載：配列番号５：
0004198753.tif 000027
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：30塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：プライマー
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列記載：配列番号６：
0004198753.tif 000028
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：29塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：プライマー
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列記載：配列番号７：
0004198753.tif 000029
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：29塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：プライマー
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列記載：配列番号８：
0004198753.tif 000030
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：41塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）ストランド：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：プライマー
（iii）仮定：あり
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列記載：配列番号９：
0004198753.tif 000031
【図１】
0004198753.tif 000032
【図２】
0004198753.tif 000033
【図３】
0004198753.tif 000034
【図４】
0004198753.tif 000035
【図５】
0004198753.tif 000036
【図６】
0004198753.tif 000037
【図７】
0004198753.tif 000038
【図８】
0004198753.tif 000039