(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（メタ）アクリル酸エステル架橋重合体からなる親水性多孔質粒子の表面が親水性高分子層で被覆されており、該親水性高分子層が官能基としてイオン交換基を有するイオン交換体が充填されたＰｒｏｔＥｘ−ＤＥＡＥ（商標  三菱化学株式会社製）に、高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質及び超低比重リポ蛋白質を含む溶液を送液させた後、溶離液によりこれらのリポ蛋白質を順次溶離することを特徴とする、液体クロマトグラフィーによるリポ蛋白質の分離方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によりリポ蛋白質を分離した後、該リポ蛋白質を酵素と反応させた後、蛍光検出法にて定量することを特徴とする高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質及び超低比重リポ蛋白質の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リポ蛋白質の分離方法及び定量方法に関するものである。詳しくは、液体クロマトグラフィーにより、高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）及び変性リポ蛋白質を短時間で高精度に分離定量することができる分離方法並びにその定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血漿や血清中にはコレステロール、リン脂質、中性脂肪（トリグリセリド）が含まれているが、これらの脂質のうち、コレステロールの定量は動脈硬化、肝疾患、糖尿病あるいは一時的な脂質代謝障害のスクリーニング検査として利用されており、また、中性脂肪の定量はコレステロールと共に脂質代謝異常の鑑別に不可欠な検査となって来ている。
これらの脂質は蛋白質と会合してリポ蛋白質の状態で存在しているが、リポ蛋白質は単一のものではなく、蛋白質の種類や脂質の含有比率などにより高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）等、いくつかの種類があり、これまでの研究により、それぞれのリポ蛋白質の量と疾病との関係が明らかとなりつつあることから、これらのリポ蛋白質を短時間にて高精度に分離定量する方法の開発が望まれている。
【０００３】
リポ蛋白質の分離には超遠心法が広く用いられているが、この方法では処理に長時間を要するばかりでなく、リポ蛋白質の性状がヒトとは異なるラットやマウスのような動物種においては、その正確な分画が困難である。高速液体クロマトグラフィーにより分離する方法では、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，  Ｖｏｌ．５７０，ｐ３８２−３８９，１９９１年に、分子サイズにより分画を行うサイズ排除クロマトグラフィーによる分離方法が報告されているが、精密な分離を行うには長時間を要し、その場合でも各リポ蛋白質分画の間に混合が生じ、サイズ排除クロマトグラフィー法では原理的に完全な分離は達成出来ないという問題があった。
【０００４】
また、特開平７−８９９８４号公報には、アニオン交換基を導入したグルコマンナンゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィーによる分離方法および定量方法が開示されており、また特開平９−１２６２９号公報には、水不溶性、親水性のマトリックスに陰イオン交換基が導入された陰イオン交換体からなるリポ蛋白質分離用樹脂が開示されている。
しかし、これらの特許に開示されている様な多孔質粒子の表面に直接官能基を導入したイオン交換体を用いた場合、分離対象物質であるリポ蛋白質が非常に高い疎水性を有するために多孔質粒子表面に存在する疎水性領域との相互作用が生じ、その結果としてリポ蛋白質が不可逆吸着する、各リポ蛋白質の分離が不充分となる、もしくは各リポ蛋白質の分離を所望のものとするための分離時間が４５分〜１時間の長時間になる等の問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述の如き問題を解決するため、高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）及び超低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）を短時間で高精度に分離、定量する方法を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、液体クロマトグラフィーによる分離方法につき種々検討した結果、特定構造のイオン交換体を使用することにより、これらのリポ蛋白質を短時間で高精度に分離し得ることを見いだし本発明に到達した。すなわち、本発明は、（メタ）アクリル酸エステル架橋重合体からなる親水性多孔質粒子の表面が親水性高分子層で被覆されており、該親水性高分子層が官能基としてイオン交換基を有するイオン交換体が充填されたＰｒｏｔＥｘ−ＤＥＡＥ（商標  三菱化学株式会社製）に、高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質及び超低比重リポ蛋白質を含む溶液を送液させた後、溶離液によりこれらのリポ蛋白質を順次溶離することを特徴とする、液体クロマトグラフィーによるリポ蛋白質の分離方法に存する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき詳細に説明する。
本発明に用いられるイオン交換体は、多孔質粒子の表面を被覆する親水性高分子層を有し、実質的に該高分子層のみに官能基を有するものである。例えば特開平１−３１０７４４号公報に開示される分離材料のうち、イオン交換基を有するポリマーを用いたもの、特開平３−１７９２５８号公報に開示される疎水性架橋重合体粒子の表面がカルボキシル基を持つ重合体で被覆された液体クロマトグラフィー充填剤、特開平３−１７９２５９号公報に開示される疎水性架橋重合体粒子の表面が水酸基を持つ重合体で被覆された液体クロマトグラフィー充填剤に対し、公知の方法でイオン交換基を導入したもの、特開平７−０８８３６６号公報に開示される分離剤のうち、イオン交換基を有する重合性ビニル単量体を用いたもの及びイオン交換基を後反応により導入可能である重合性ビニル単量体を用い、公知の方法でイオン交換基を導入したもの、および特開平７−１７１３８９号公報に開示される分離剤のうち、イオン交換基を有する重合性ビニル単量体を用いたもの及びイオン交換基を後反応により導入可能である重合性ビニル単量体を用い、公知の方法でイオン交換基を導入したもの等が挙げられる。
【０００８】
本発明のイオン交換体を構成する多孔質粒子としては親水性、疎水性の何れも用いうるが、リポ蛋白質はその疎水性が非常に高いために、多孔質粒子表面を被覆する親水性高分子層の種類および層の厚みによっては該多孔質粒子の疎水性の影響を受けうることから、多孔質粒子自体が親水性であることが好ましい。親水性の多孔質粒子としては、具体的には、デキストラン、セルロース、キトサン、グルコマンナン等の天然高分子系多孔質粒子や（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリルアミド等の親水性多孔質架橋共重合体粒子等が挙げられるが、特に短時間での分析を行う場合には高流速での通液が必要なことから、機械的強度に優れた（メタ）アクリル酸エステル親水性多孔質架橋共重合体粒子が好適に用いられる。
【０００９】
かかる多孔質粒子の表面に親水性高分子層を被覆する手段としては、例えば、上述の公報に記載の各方法が採用される。
本発明においてイオン交換体を液体クロマトグラフィー法にて用いる場合には、その粒径は１〜２０μｍの範囲にあることが好ましく、更にはその粒径分布が狭いことが好ましい。
また、本発明に用いられるイオン交換体は陰イオン交換体、陽イオン交換体の何れも用いうるが、ジメチルアミノエチル基、ジエチルアミノエチル基をはじめとする各種アミノ基、各種４級アンモニウム基等を有する陰イオン交換体が特に好ましく用いられる。導入される陰イオン交換基の量としては、乾燥樹脂重量１ｇあたり０．１〜１．５ミリ当量、好ましくは０．２〜１．２ミリ当量である。なお、陽イオン交換体を得るための官能基としては、カルボキシル基、スルホン酸基等が挙げられる。
【００１０】
また、分離された各リポ蛋白質の定量方法については、該リポ蛋白質中のコレステロールエステルを酵素反応を用いた蛍光検出法にて検出し、既知量のコレステロールを注入した場合の蛍光物質ピークの面積との検量線を用いることにより、該リポ蛋白質由来の総コレステロール量として求められる。
【００１１】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
親水性多孔質粒子としてメタアクリル酸エステル架橋共重合体粒子を用い、その表面を被覆する親水性高分子層を有し、実質的に該高分子層のみに官能基として陰イオン交換基であるジエチルアミノエチル基を有するイオン交換体が充填された高速液体クロマトグラフィー用充填カラム「ＰｒｏｔＥｘ−ＤＥＡＥ」（カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ５０ｍｍ、粒子径：５μｍ、交換容量０．３ｍｅｑ／ｇ、三菱化学株式会社製）を用い、図１に示す分離システムにより各種動物のリポ蛋白質を分離した。
【００１２】
図１は、本実施例で使用したリポ蛋白質分離試験法のシステムを示す概略図である。図１において、ポンプＡにより貯槽２より溶離液Ａとして１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を、またポンプＢにより貯槽３より溶離液Ｂとして１ｍＭのＥＤＴＡを含む５００ｍＭのＮａＣｌ水溶液を送液し、ミキサーにて混合することにより流速１．０ｍｌ／ｍｉｎでのステップワイズグラジエント送液を行った。
ミキサーにより混合された溶離液にオートサンプラー１を介して試料が注入さりたのち、恒温槽にて２５℃に保たれた充填カラム４に送液され、液体クロマトグラフィー法により分離される。充填カラム４からの溶離液に、貯槽６の酵素溶液（コレステロールオキシダーゼ０．４Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ７Ｕ／ｍｌ、コレステロールエステルヒドロラーゼ０．７Ｕ／ｍｌ、ホモバニリン酸５００ｍｇ／ｍｌおよび０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（界面活性剤）を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）から成り４℃に冷却されているもの）がポンプＣから流速０．５ｍｌ／ｍｉｎにて送液され、溶離液とミキサーにより混合された後、恒温槽にて４５℃に保たれた内径０．５ｍｍ×長さ１５ｍの反応コイル５を通過する間に、充填カラムにて分離された各リポ蛋白質中のコレステロールが酵素溶液中のコレステロールエステルヒドロラーゼ、次にコレステロールオキシダーゼと反応することにより溶離液中に過酸化水素が生成する。生成した過酸化水素は酵素溶液中のペルオキシダーゼの存在下、酵素溶液中のホモバニリン酸と反応する。
【００１３】
溶離液は次いでポンプＤから流速０．５ｍｌ／ｍｉｎにて送液される０．１ＮのＮａＯＨ水溶液とミキサーにより混合され、内径０．５ｍｍ×長さ５ｍの反応コイル８を通過する間に、過酸化水素とホモバニリン酸との反応化合物は蛍光物質に変化する。この蛍光物質を蛍光検出器９にて励起波長３２５ｎｍ、発光波長４２０ｎｍの条件下で検出する。
以下、図２〜図５に各種試料を分離した結果を示す。
【００１４】
１）図２；試料としてヒト血漿２０μｌを注入した場合のクロマトグラムおよびステップワイズグラジエント条件を示す。ＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬＤＬが分析時間２０分以内で完全分離されていることが分かる。
２）図３；試料として日本白色家兎血漿２０μｌを注入した場合のクロマトグラムおよびステップワイズグラジエント条件を示す。ＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬＤＬが分析時間２０分以内で完全分離されていることが分かる。
３）図４；試料としてＷｉｓｔｅｒ  ｒａｔ血漿２０μｌを注入した場合のクロマトグラムおよびステップワイズグラジエント条件を示す。ＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬＤＬが分析時間２０分以内で完全分離されていることが分かる。
４）図５；試料としてｄｄｙ  ｍｏｕｓｅ血漿２０μｌを注入した場合のクロマトグラムおよびステップワイズグラジエント条件を示す。ＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬＤＬが分析時間２０分以内で完全分離されていることが分かる。
以上より、本分離方法にて多種の動物血漿中のリポ蛋白質の分離定量が可能であることが分かる。
【００１５】
比較例１
メタアクリル酸エステル架橋共重合体からなる親水性多孔質粒子の表面に、陰イオン交換基としてジエチルアミノエチル基を直接導入して成るイオン交換体（特開昭５８−２４３５４号公報に開示される方法にて得られたイオン交換体）が充填された高速液体クロマトグラフィー用充填カラム（カラムサイズ：内径７．５ｍｍ×長さ７５ｍｍ）を用い、図１と同様のシステムにてリポ蛋白質分離試験を実施した。
試料として日本白色家兎血漿１０μｌを注入した場合のクロマトグラムおよびステップワイズグラジエント条件を図６に示す。多孔質粒子の表面に親水性高分子層の無いイオン交換体ではＨＤＬ，ＬＤＬおよびＶＬＤＬの分離が達成されないことが分かる。
【００１６】
【発明の効果】
本発明方法により、特定の構造を有するイオン交換体を用いる液体クロマトグラフィーにより、血漿や血清中のリポ蛋白質を短時間にて極めて精度良く分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるリポ蛋白質分離試験法のシステムを示す概略図
【図２】実施例１で得られたヒト血漿中のリポ蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
【図３】実施例１で得られた日本白色家兎血漿中のリポ蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
【図４】実施例１で得られたＷｉｓｔｅｒ  ｒａｔ血漿中のリポ蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
【図５】実施例１で得られたｄｄｙ  ｍｏｕｓｅ血漿中のリポ蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
【図６】比較例１で得られた日本白色家兎血漿中のリポ蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
【符号の説明】
１    オートサンプラー
２    溶離液Ａ貯槽
３    溶離液Ｂ貯槽
４    充填カラム
５    反応コイルＡ
６    酵素溶液貯槽
７    ＮａＯＨ水溶液貯槽
８    反応コイルＢ
９    蛍光検出器
１０    記録計
【図１】
0004179653.tif 000002
【図２】
0004179653.tif 000003
【図３】
0004179653.tif 000004
【図４】
0004179653.tif 000005
【図５】
0004179653.tif 000006
【図６】
0004179653.tif 000007