(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−スレオニン及びＬ−イソロイシンから選ばれるＬ−アミノ酸の生産能力を有する微生物を培地中に培養し、その培地中に該Ｌ−アミノ酸を生成蓄積させ、該Ｌ−アミノ酸を採取することを含む、Ｌ−スレオニン及びＬ−イソロイシンから選ばれるＬ−アミノ酸の製造法において、前記微生物のホスホエノールピルビン酸の生産能を野生株と比べて上昇させることを特徴とするＬ−スレオニン及びＬ−イソロイシンから選ばれるＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項２】
前記微生物はＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有するスレオニンオペロンを保持する請求項１に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項３】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである請求項２に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項４】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−イソロイシンであり、前記微生物はＬ−イソロイシンによるフィードバック阻害が解除されたスレオニンデアミナーゼをコードする遺伝子または同遺伝子を含むilvGMEDAオペロンをさらに保持する請求項２に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項５】
微生物がエシェリヒア属細菌である請求項１〜４のいずれか一項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項６】
微生物がコリネ型細菌である請求項１〜４のいずれか一項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項７】
微生物のホスホエノールピルビン酸生産能を上昇させる手段が、微生物細胞内のホスホエノールピルビン酸合成酵素活性を上昇させるものである請求項１〜６のいずれか一項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項８】
微生物のホスホエノールピルビン酸生産能を上昇させる手段が、微生物細胞内のホスホエノールピルビン酸合成酵素遺伝子の発現量を上昇させるものである請求項１〜６のいずれか一項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項９】
微生物のホスホエノールピルビン酸生産能を上昇させる手段が、微生物細胞内のホスホエノールピルビン酸合成酵素遺伝子のコピー数を上昇させるものである請求項１〜６のいずれか一項に記載のＬ−アミノ酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−アミノ酸の製造方法に関し、詳しくは、甘味料アスパルテームの原料（Ｌ−フェニルアラニン）、飼料添加物（Ｌ−トリプトファン、Ｌ−スレオニン）、輸液等の医薬品原料（Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニン及びＬ−イソロイシン）として需要が急増しているアミノ酸を効率よく製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物を利用したアミノ酸の製造方法は多数知られている。
たとえば、Ｌ−フェニルアラニンの製造法としては、組換え体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli (E. coli)）を用いるものに、特公平２−４２７６号、特表平４−５０１８１３号、特開平５−２４４９５６号、国際公開ＷＯ８７／００２０２がある。
【０００３】
またＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンの製造法としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属の変異株を用いるものに、特開昭６１−１２８８９７号があり、組換え体コリネバクテリウムを用いるものに、特開昭６０−３４１９７号、特開昭６０−２４１９２号、特開昭６１−２６０８９２号、特開昭６１−１２４３７５号が知られている。
【０００４】
Ｌ−トリプトファンの製造法としては、組換え体エシェリヒア・コリを用いるものに、特開昭５７−７１３９７号、米国特許４３７１６１４号があり、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）の変異株を用いるものに特公昭５３−３９５１７号、同６２−３４３９９号があり、組換え体バチルス・ズブチリスを用いるものに、特開昭６１−１０４７９０号、特開平１−６７１７９号があり、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属の変異株を用いるものに、特開昭５７−１７４０９６号があり、更に組換え体ブレビバクテリウム属を用いるものに特開昭６２−５１９８０号が報告されている。
【０００５】
Ｌ−スレオニンの製造法としては、エシェリヒア属細菌の変異株を用いるものに特開平５−３０４９６９号があり、組換え体エシェリヒア・コリを用いるものに特公平１−２９５５９号、特開平２−１０９９８５号、特開昭５６−１５６９６号、および特表平３−５０１６８２号がある。コリネバクテリウム属細菌の変異株を用いるものには、特開昭６２−２３９９９６号があり、組換え体コリネバクテリウム属細菌を用いるものには特開昭６１−１９５６９５号が報告されている。
【０００６】
また、Ｌ−イソロイシンの製造法としては、エシェリヒア・コリを用いるものに特開平５−１３０８８２号があり、エシェリヒア・コリの組換え体を用いるものには特開平２−４５８号がある。また、コリネバクテリウム属細菌の変異株を用いるものとしては特公平３−６２３９５号があり、コリネバクテリウム属の組換え体を用いるものには特公平５−４７１９６号が報告されている。
【０００７】
これらのアミノ酸の製造法において用いられてきた微生物の育種は、主として各種アミノ酸生合成の共通経路、及びそれに続く各々のアミノ酸の生合成の固有の経路における反応を触媒する酵素の増強、あるいは、最終産物等による調節（フィードバック阻害や抑制）を回避することにより行われてきた。具体的には、微生物への栄養要求性の付与、薬剤耐性の付与、組換えＤＮＡ手法による生合成系酵素遺伝子の増幅や調節解除を目的とした変異の導入などが行われてきた。
【０００８】
芳香族アミノ酸生合成の共通経路の最初の反応を司る酵素は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロン酸−７−リン酸（ＤＡＨＰ）合成酵素（ＤＳ）である。エシェリヒア・コリのＤＳには、３種類のアイソザイムが存在し、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨと呼ばれる遺伝子にコードされ、それぞれＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンによるフィードバック阻害を受ける。これらのうち、酵素活性の高いａｒｏＦ、ａｒｏＧ由来の脱感作型酵素（フィードバック阻害を実質的に受けない酵素）をコードする遺伝子と、Ｌ−トリプトファン生合成固有系の脱感作型アントラニル酸合成酵素（ＡＳ）をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンとを組合せてエシェリヒア・コリに導入することによって、芳香族アミノ酸の生産性を向上させる技術が知られている。
【０００９】
ＤＡＨＰの合成反応では、ホスホエノールピルビン酸（以下、「ＰＥＰ」ともいう）とＤ−エリスロース ４−リン酸（Ｅ４Ｐ）が基質として用いられている。このＰＥＰは、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン等の生合成前駆体でもある。これらの基質は、解糖経路やペントースリン酸経路を経て、グルコース等の炭素源から供給されるが、これまでアミノ酸生産菌株の育種においては、これらの基質の供給能力を高め、アミノ酸の生産性を改善した例は、知られていない。
【００１０】
ホスホエノールピルビン酸合成酵素（以下、「ＰＰＳ」と略すことがある）は、微生物に広く見い出されている酵素であり、糖新生におけるピルビン酸からのＰＥＰの供給に重要な役割を果たしている。エシェリヒア属細菌であるエシェリヒア・コリでは、ＰＰＳをコードする遺伝子（ｐｐｓ）のクローニング、該遺伝子の塩基配列の決定、及び酵素の機能解析が行われてきた他、デヒドロキナ酸合成酵素欠損株でのｐｐｓ遺伝子及びトランスケトラーゼ遺伝子との同時増幅により、ＤＡＨＰが理論収率に近い値で生成することが報告されている（Patnaik, R. et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol.60, No.11, 3903-3908 (1994)）。しかしながら、ｐｐｓ遺伝子の増幅が、芳香族アミノ酸やその他のアミノ酸の生産性を高めた例は知られていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、芳香族アミノ酸をはじめとする種々のアミノ酸を高収率で、安価に製造する方法を提供することを課題とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｌ−アミノ酸生成能を有する微生物細胞中のホスホエノールピルビン酸生産能を高めることにより、Ｌ−アミノ酸の生産性を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、Ｌ−アミノ酸生産能力を有する微生物を培地中に培養し、その培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該Ｌ−アミノ酸を採取することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造法において、
前記微生物のホスホエノールピルビン酸の生産能を上昇させることを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法である。
【００１４】
上記製造法により製造されるＬ−アミノ酸としては、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンが好適なものとして挙げられる。
【００１５】
Ｌ−アミノ酸生産能力を有する微生物としては、エシェリヒア属細菌、又はコリネ型細菌が挙げられる。ここでいうコリネ型細菌とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）を含み、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。
【００１６】
微生物のホスホエノールピルビン酸生産能を上昇させる手段としては、微生物細胞内のＰＰＳ活性を上昇させることが挙げられる。また、微生物細胞内のＰＰＳ活性を上昇させる手段としては、微生物細胞内のｐｐｓ遺伝子の発現量を上昇させることの他、比活性の高いＰＰＳをコードする遺伝子を細胞に導入する等の方法がある。
【００１７】
微生物細胞内のｐｐｓ遺伝子の発現量を上昇させる手段として具体的には、微生物細胞内のｐｐｓ遺伝子のコピー数を上昇させることの他、ｐｐｓ遺伝子のプロモーターの転写活性を高めること等が挙げられる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
本発明において好適に利用される微生物としては、その微生物において、プラスミドの複製開始起点を含むＤＮＡ断片が取得されていて、ｐｐｓ遺伝子が機能し、ｐｐｓ遺伝子のコピー数を上昇させることが可能な微生物であって、かつＬ−アミノ酸生産能力を有する微生物（例えば、Ｌ−フェニルアラニンの場合は、Ｌ−フェニルアラニンアナログ耐性等の付与によりＬ−フェニルアラニン生産性を獲得したもの）であれば、エシェリヒア属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、シュードモナス属等に属する微生物等、特に制限されない。これらの中では、エシェリヒア属細菌及びコリネ型細菌が好ましい。
【００１９】
具体的には、Ｌ−トリプトファンの場合は、エシェリヒア・コリAGX17(pGX44)〔NRRL B-12263〕及びAGX6(pGX50)aroP〔NRRL B-12264〕（いずれも米国特許第 4,371,614号参照）、ブレビバクテリウム・フラバムAJ11667（特開昭５７−１７４０９６参照）が、
Ｌ−フェニルアラニンの場合は、エシェリヒア・コリ AJ 12604（FERM BP-3579)(欧州特許出願公開第 488,424号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12637（FERM BP-4160)(フランス特許出願公開第 2,686,898号参照）が、
Ｌ−チロシンの場合は、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11655(FERM P-5836)（特公平２−６５１７参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12081(FERM P-7249)（特開昭６０−７００９３参照）が、
Ｌ−スレオニンの場合はエシェリヒア・コリ VKPM B-3996(RIA 1867)(米国特許第5,175,107号参照）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,949号参照）等が、
Ｌ−イソロイシンの場合はエシェリヒア・コリKX141（VKPM B-4781）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・フラバム AJ12149（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参照）等が挙げられる。
【００２０】
上記のような微生物のＰＥＰ生産能を上昇させる手段としては、微生物細胞内のＰＰＳ活性を上昇させることが挙げられる。
ＰＰＳ活性を上昇させる手段としては、微生物細胞内のｐｐｓ遺伝子の発現量を上昇させることが挙げられる。また、ｐｐｓ遺伝子を改変し、活性の上昇したＰＰＳを創造することも、ＰＰＳ活性を上昇させる手段の一つである。
【００２１】
微生物細胞内のｐｐｓ遺伝子の発現量を上昇させる手段には、微生物細胞内のｐｐｓ遺伝子のコピー数を上昇させることが挙げられる。ｐｐｓ遺伝子のコピー数を上昇させるには、同遺伝子を含むＤＮＡ断片が必要である。ところで、エシェリヒア属細菌として、エシェリヒア・コリではｐｐｓ遺伝子がクローニングされ、塩基配列が決定されている（Mol. Gen. Genet., 231, 332 (1992)）。そこで、同遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製は、上記文献に開示されている方法を用いて達成される。また、上記塩基配列を参考にして作製した合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、あるいは同塩基配列を参考にして作製した合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）法を用いて所望のＤＮＡ断片を取得することができる。ｐｐｓ遺伝子を含むＤＮＡ断片を目的微生物で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結して同微生物に導入すればｐｐｓ遺伝子のコピー数を上昇させることができる。
【００２２】
ＰＣＲ法を用いてエシェリヒア属細菌よりｐｐｓ遺伝子をクローニングする時に使用するＤＮＡプライマーとしては、例えばエシェリヒア・コリにおいて既知となっている配列（Mol. Gen. Genet., 231, 332 (1992)）を基にして適宜作製できる。具体的には、ｐｐｓ遺伝子を含む約３．３ｋｂの領域を増幅できる、5'-CCCGTCGACGGATCCAGTTTCATCTCTTG-3'（配列番号１）、5'-CCCGTCGACGATCATGCGCTTATGTCGTG-3'（配列番号２）の２種のプライマーが適当である。これらのプライマーは、両末端にＳａｌＩ切断末端を有する形でｐｐｓ遺伝子を増幅することができる。このようにしてＰＣＲ産物の末端に制限酵素切断末端を導入すると、増幅されたＤＮＡ断片をこれらの制限酵素を用いてクローニングしたり、さらに他のベクターＤＮＡに移し代えるときに便利である。プライマーＤＮＡの合成は、例えば、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製ＤＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法（Tetrahedron Letters,22,1859(1981)参照）法に従って行うことができる。ＰＣＲ反応は、例えば、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００２３】
ｐｐｓ遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、エシェリヒア属細菌以外の微生物からも取得することができる。その取得方法として、前記文献（Mol. Gen. Genet., 231, 332 (1992)）が開示する塩基配列を参考にして作製した合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、同塩基配列を参考にして作製した合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ法が挙げられる。ハイブリダイゼーション法に用いるＤＮＡプローブも、ＰＣＲ法に使用するＤＮＡプライマーと同様に、既知の配列を基にして適宜作製できる。各微生物ごとに遺伝子の塩基配列は異なっていることが予想されるため、各微生物由来のＰＰＳ間で保存されている箇所と対合する合成ＤＮＡを準備することが望ましい。
【００２４】
ＰＣＲ法により増幅されたｐｐｓ遺伝子は、エシェリヒア属細菌に導入する場合にはエシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続され、エシェリヒア属細菌細胞に導入される。
【００２５】
取得されたｐｐｓ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、エシェリヒア属細菌以外の微生物に導入するには、同ＤＮＡ断片を同ＤＮＡ断片が導入される微生物細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続し、同細胞に導入する。
【００２６】
本発明において用いるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤＮＡが好ましく、遺伝子が導入される微生物がエシェリヒア・コリの場合には、例えばpTWV228、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。ＰＰＳの発現を効率的に達成するために、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰL等の微生物内で働くプロモーターを用いてもよい。尚、ｐｐｓ遺伝子のコピー数を上昇させるには同遺伝子を含むＤＮＡをトランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)）を用いた方法で染色体に組み込んでもよい。
【００２７】
本発明において用いるベクターＤＮＡとして、遺伝子が導入される微生物がコリネ型細菌の場合には、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドベクター、例えばｐＡＭ３３０（特公平１−１１２８０号公報参照）や、ｐＨＭ１５１９（特開昭５８−７７８９５号公報参照）等がある。
【００２８】
本発明のＤＮＡ配列を上記ベクターに挿入して得られる組換えベクターで大腸菌を形質転換するには、例えば細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を高める方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1977)）等、通常大腸菌の形質転換に用いられる方法を用いることができる。
【００２９】
また、バチルス属の形質転換法としては、細胞がＤＮＡを取込可能な特定の成長時期に取り込む方法（Duncan, C. H. et al.によるバチルス・ズブチリスに関する報告）がある。さらに、プラスミドＤＮＡを容易に取り込むＤＮＡ受容体のプロトプラストまたはスフェロプラストを成形することによって細菌細胞内に取り込むことが可能である。これらは、バチルス・ズブチリス、アクチノマイセス及び酵母について知られている（Chang, S. et al. Molec. Gen. Genet., 168, 111, (1979)、Bibb et al., Nature, 274, 398, (1978)、Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)）。
【００３０】
また、高電圧の電気パルスにより細胞壁に瞬間的に穴を生じさせＤＮＡを取り込ませるエレクトロポレーション法（Hanahan, D. et al., Plasmid Transformation of Escherichia coli and other bacteria, Meth. Enzymol., 204, 63 (1991)）も広範囲の微生物細胞に有効である。その他、特開平２−２０７７９１号公報にコリネ型細菌のエレクトロポレーション法による形質転換法が開示されている。
【００３１】
ｐｐｓ遺伝子が導入された可能性のある候補ベクターの中から実際にｐｐｓ遺伝子が組み込まれたベクターを選択するためには、例えばＰＰＳ欠損株を用いた相補性試験を行えばよい。ＰＰＳ欠損株はピルビン酸を炭素源とする最小培地で生育できないので、この培地で生育可能となった形質転換体を選択すればよい。エシェリヒア・コリのＰＰＳ欠損株としてはAT2572-1株（J. Bacteriol., 96, 2185 (1968)参照）が挙げられる。AT2572-1株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州ニューヘブン(New Haven)06511-7444、エール大学生物学 部オズボーン記念研究所（Yale University, Dept. Biology, Osborn Memorial Labs.）、P.O.Box 6666、菌株番号：CGSC5242）から入手できる。
【００３２】
また、ＰＰＳ活性が上昇した可能性のある候補株の中から、実際にＰＰＳ活性が上昇した株を選択するためには、例えば既知の方法（Cooper,R.A.and H.L.Kornberg, Meth. Enzymol., 13, 309 (1969)）を用いてＰＰＳの酵素活性の上昇を確認する方法がある。
【００３３】
本発明に用いる微生物は、もともとＬ−アミノ酸生産能を有する微生物のＰＥＰ生産能を上昇させたものでもよく、また、ＰＥＰ生産能を上昇させた後に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与したものでもよい。さらに、もともとＬ−アミノ酸生産能を有する微生物であっても、ＰＥＰ生産能を上昇させることに加えて、そのアミノ酸生合成の固有の経路を司る酵素遺伝子の増強、あるいはフィードバック阻害を受ける酵素の脱感作型（阻害解除型）酵素をコードする遺伝子あるいはオペロンを導入すると、一層Ｌ−アミノ酸生産能が向上する場合がある。
【００３４】
このような遺伝子あるいはオペロンとしては、例えば、Ｌ−フェニルアラニンやＬ−チロシンの場合は脱感作型コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ（ＣＭ−ＰＤＴ）遺伝子（特開平５−２３６９４７号、特開昭６２−１３０６９３号公報参照）、脱感作型ＤＳ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ）遺伝子（特開平５−２３６９４７号、特開昭６１−１２４３７５号公報参照）が、
Ｌ−トリプトファンの場合には脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロン（特開昭５７−７１３９７号、特開昭６２−２４４３８２号、米国特許第4,371,614）が、
Ｌ−スレオニンの場合にはＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有するスレオニンオペロン（特公平１−２９５５９号公報）、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（特開昭６０−０１２９９５号）、又はホモセリンキナーゼ及びホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（特開昭６１−１９５６９５号）が、
Ｌ−イソロイシンの場合には前記スレオニンオペロン、及びＬ−イソロイシンによるフィードバック阻害が解除されたスレオニンデアミナーゼをコードする遺伝子（特開平２−４５８号公報）又は同遺伝子を含むilvGMEDAオペロン等が挙げられる。
【００３５】
また、芳香族アミノ酸（Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−チロシン）については、ＰＰＳに加えて、細胞中のトランスケトラーゼ（ＴＫ）の生産能を上昇させることにより、一層生産性を向上させることができることが期待される。微生物のＴＫ生産能を上昇させる手段としては、微生物細胞内のＴＫ活性を上昇させることが挙げられる。ＴＫ活性を上昇させる手段としては、微生物細胞内のトランスケトラーゼ遺伝子（ｔｋｔ）の発現量を上昇させることが挙げられる。また、ｔｋｔ遺伝子を改変し、活性の上昇したＴＫを創造することも、ＴＫ活性を上昇させる手段の一つである。
【００３６】
微生物細胞内のｔｋｔ遺伝子の発現量を上昇させる手段には、微生物細胞内のｔｋｔ遺伝子のコピー数を上昇させることが挙げられる。ｔｋｔ遺伝子のコピー数を上昇させるには、同遺伝子を含むＤＮＡ断片が必要である。ところで、エシェリヒア属細菌として、エシェリヒア・コリではｔｋｔ遺伝子がクローニングされ、塩基配列が決定されている（Biochim. Biophys. Acta., 1216, 367 (1993) ）。そこで、同遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製は、上記文献に開示されている方法を用いて達成される。また、上記塩基配列を参考にして作製した合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、あるいは同塩基配列を参考にして作製した合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）法を用いて所望のＤＮＡ断片を取得することができる。ｔｋｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片を目的微生物で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結して同微生物に導入すればトランスケトラーゼ遺伝子のコピー数を上昇させることができる。
【００３７】
ＰＣＲ法を用いてエシェリヒア属細菌よりトランスケトラーゼ遺伝子をクローニングする時に使用するＤＮＡプライマーとしては、例えばエシェリヒア・コリにおいて既知となっている配列（Biochim. Biophys. Acta., 1216, 307 (1993) ）を基にして適宜作製できる。具体的には、ｔｋｔ遺伝子を含む約２．２ｋｂの領域を増幅できる、5'-AGAGGATCCAGAGATTTCTGAAGC-3'（配列番号３）、5'-TCTGGATCCGCAAACGGACATTATCA-3'（配列番号４）の２種のプライマーが適当である。これらのプライマーは、両末端にＢａｍＨＩ切断末端を有する形でｔｋｔ遺伝子を増幅することができる。このようにしてＰＣＲ産物の末端に制限酵素切断末端を導入すると、増幅されたＤＮＡ断片をこれらの制限酵素を用いてクローニングしたり、さらに他のベクターＤＮＡに移し代えるときに便利である。プライマーＤＮＡの合成は、例えば、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製ＤＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法（Tetrahedron Letters,22,1859(1981)参照）法に従って行うことができる。ＰＣＲ反応は、例えば、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型を用い、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００３８】
ｔｋｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、エシェリヒア属細菌以外の微生物からも取得することができる。その取得方法として、前記文献（Biochim. Biophys. Acta., 1216, 367 (1993)）が開示する塩基配列を参考にして作製した合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、同塩基配列を参考にして作製した合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ法が挙げられる。ハイブリダイゼーション法に用いるＤＮＡプローブも、ＰＣＲ法に使用するＤＮＡプライマーと同様に、既知の配列を基にして適宜作製できる。各微生物ごとに遺伝子の塩基配列は異なっていることが予想されるため、各微生物由来のＴＫ間で保存されている箇所と対合する合成ＤＮＡを準備することが望ましい。
【００３９】
上記のような各々の遺伝子を微生物に導入する際に、それらの遺伝子は、ｐｐｓ遺伝子と同じく宿主の染色体上に存在しても、同一のプラスミド上に存在してもよい。また、各々別個のプラスミド上に存在してもよい。
【００４０】
以上の方法で取得したｐｐｓ遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、培養液に目的のアミノ酸を生成蓄積せしめ、これを採取することにより、目的のアミノ酸を製造することができる。
【００４１】
培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、スクロースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００４２】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００４３】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、ビタミンＢ６などの要求物質を必要に応じて、または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。
これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００４４】
培養は、用いる微生物に応じた条件で行えばよいが、具体的には、好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜７に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００４５】
発酵液からのＬ−アミノ酸の採取は、通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００４６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４７】
【実施例１】
エシェリヒア・コリのｐｐｓ遺伝子の取得
エシェリヒア・コリ K-12由来のW3110株から、斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）により染色体ＤＮＡを抽出した。一方、ｐｐｓ遺伝子をＰＣＲ法により染色体ＤＮＡから増幅するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーを、公知のｐｐｓ遺伝子の塩基配列（Mol. Gen. Genet., 231, 332 (1992)）に基づいて合成した。
【００４８】
(1)5'-CCCGTCGACGGATCCAGTTTCATCTCTTG-3'（配列番号１）
(2)5'-CCCGTCGACGATCATGCGCTTATGTCGTG-3'（配列番号２）
【００４９】
上記のプライマーは、それぞれｐｐｓ遺伝子の上流側及び下流側の配列に相同あるいは相補的な配列を含むと共に、ＰＣＲ産物のクローニングを容易にするために、ＳａｌＩ認識配列を含んでいる。
【００５０】
上記の染色体ＤＮＡ及びプライマーを用いて、エルリッチの方法（PCR Technology, Stockton press (1989)）に従ってＰＣＲ反応を行った。反応条件は、熱変成９３℃１分、アニーリング５５℃１．５分、ポリメラーゼ反応７２℃３分とし、この反応サイクルを３０回繰り返した。
【００５１】
ＰＣＲ反応により得られた３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで切断した後、プラスミドベクターｐＴＷＶ２２８（アンピシリン耐性(Ａｐr)、宝酒造（株）製）のＳａｌＩ部位にＤＮＡリガーゼを用いて連結した。このリガーゼ反応混合物を用いて、エシェリヒア・コリのＰＰＳ欠損株AT2572-1（J. Bacteriol., 96, 2185 (1968)参照、E. coli Genetic Stock Center（所在地前掲）より入手）を形質転換した。形質転換株をアンピシリンを含むプレートにまき、生育したアンピシリン耐性株を選択し、その中から、最小培地上でピルビン酸を炭素源として生育可能な株を選択し、その株から組換えプラスミドＤＮＡを抽出し、得られたプラスミドをｐＴＷＶ−ｐｐｓと命名した。
【００５２】
上記のようにして得られたｐＴＷＶ−ｐｐｓの挿入ＤＮＡ断片の制限酵素切断地図及び得られた形質転換体のＰＰＳ活性を測定した結果から、このＤＮＡ断片がｐｐｃ遺伝子を含んでいることを確認した。
【００５３】
【実施例２】
Ｌ−フェニルアラニンの製造
＜１＞Ｌ−フェニルアラニン生産菌の創製
Ｌ−フェニルアラニン生合成固有系の脱感作型コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ（ＣＭ−ＰＤＴ）遺伝子を含有するＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４（Ｃｍr）のＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入して得たプラスミドｐＡＣＭＡＢプラスミド（クロラムフェニコール耐性(Ｃｍr)、特開平５−２３６９４７号公報参照）をＳａｌＩで切断し、これとｐＴＷＶ−ｐｐｓからＳａｌＩで切り出したｐｐｓ遺伝子断片とをＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐＡＣＭＡＢ−ｐｐｓ（８．９ｋｂ）を得た。
【００５４】
一方、脱感作型ＤＳ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ）遺伝子（ａｒｏＧ４）を含有するＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入して得たプラスミドｐＢＲ−ａｒｏＧ４（Ａｐr、特開平５−２３６９４７号公報参照）でエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）株を形質転換し、さらにこの形質転換株に上記ｐＡＣＭＡＢ−ｐｐｓを導入し、Ａｐr及びＣｍrを示す形質転換体を選択してＷ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＡＣＭＡＢ−ｐｐｓ，ｐＢＲ−ａｒｏＧ４を得た。
【００５５】
尚、ｐＢＲ−ａｒｏＧ４及びｐＡＣＭＡＢで形質転換したエシェリヒア・コリのｔｙｒＡ欠損株Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）（ＡＪ１２６０４と命名されている）は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１１９７５として寄託されている。ｐＢＲ−ａｒｏＧ４及びｐＡＣＭＡＢは、この株から通常の方法によって取得することができる。
【００５６】
＜２＞Ｌ−フェニルアラニン生産性の評価
上記で得られたエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＡＣＭＡＢ−ｐｐｓ，ｐＢＲ−ａｒｏＧ４株を、Ｌ−フェニルアラニン生産用培地（グルコース２０ｇ、リン酸水素２ナトリウム２９．４ｇ、リン酸２水素カリウム６ｇ、塩化ナトリウム１ｇ、塩化アンモニウム２ｇ、クエン酸ナトリウム１０ｇ、グルタミン酸ナトリウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム７水和物３ｇ、塩化カルシウム０．２３ｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇ、Ｌ−チロシン１００ｍｇを水１Ｌに含む。ｐＨ＝７．０）を用いて、３７℃で４０時間培養した。対照として、Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＡＣＭＡＢ，ｐＢＲ−ａｒｏＧ４株を同様にして培養した。培地中のＬ−フェニルアラニンを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
0004032441.tif 000002
【００５８】
【実施例３】
Ｌ−トリプトファンの製造
＜１＞Ｌ−トリプトファン生産菌の創製
脱感作型ＤＳ遺伝子（ａｒｏＧ４）及びカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７のＸｈｏＩ部位をＥｃｏＲＩに改変したプラスミドｐＡＣＹＣ１７７Ｅに挿入して得たプラスミドｐＡＣＫＧ４（アンピシリン及びカナマイシン耐性(Ａｐr、Ｋｍr)、６．４ｋｂｐ、特開平５−２３６９４７号 公報参照）を、ＨｉｎｄＩＩＩで部分消化し、ＤＮＡポリメラーゼ・クレノーフラグメントを用いて平滑末端化した。一方、実施例１で得られたｐｐｓ遺伝子を含む３．３ｋｂｐのＳａｌＩ断片を同様に平滑末端化し、上記ｐＡＣＫＧ４断片と連結した。この連結反応液を用いてエシェリヒア・コリのＰＰＳ欠損株を形質転換し、Ａｐr、Ｋｍr及びｐｐｓ+を示す形質転換体を選択し、この形質転換体から組換えプラスミドを抽出し、ｐＡＣＫＧ４−ｐｐｓ（９．４ｋｂ）と命名した。
【００５９】
Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン要求性の形質を有する菌株エシェリヒア・コリ ＡＧＸ１７（ｐＧＸ４４）株（宿主ＡＧＸ１７株自体は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン及びＬ−トリプトファン要求性）から、プラスミドｐＧＸ４４を脱落させ、ＡＧＸ１７を得た。一方、トリプトファンオペロンを担うプラスミドｐＧＸ５０（Ａｐr）を保有するエシェリヒア・コリＫ−１２のＡＧＸ６（ｐＧＸ５０）ａｒｏＰ株（米国特許４３７１６１４号記載、寄託番号；ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４）からｐＧＸ５０を抽出し、上記ＡＧＸ１７株に導入し、Ａｐr及びＴｒｐ+を指標として形質転換体を選択した。この形質転換体にさらにｐＡＣＫＧ４−ｐｐｓを導入し、Ａｐr及びＫｍrを指標として形質転換体を選択し、ＡＧＸ１７／ｐＧＸ５０，ｐＡＣＫＧ４−ｐｐｓと命名した。
一方、上記ＡＧＸ１７にｐＧＸ５０とｐＡＣＫＧ４を、Ａｐr、Ｔｒｐ+及びＫｍrを指標に導入して、ＡＧＸ１７／ｐＧＸ５０，ｐＡＣＫＧ４を得た。
【００６０】
＜２＞Ｌ−トリプトファン生産性の評価
ＡＧＸ１７／ｐＧＸ５０，ｐＡＣＫＧ４−ｐｐｓを、Ｌ−トリプトファン生産用培地（グルコース４０ｇ、硫酸アンモニウム１６ｇ、リン酸一カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硫酸第一鉄７水和物０．０１ｇ、塩化マンガン４水和物、０．０１ｇ、酵母抽出物２ｇ、炭酸カルシウム４０ｇ、Ｌ−フェニルアラニン１００ｍｇ、Ｌ−チロシン１００ｍｇを水１Ｌ中に含む。ｐＨ＝７．０）を用いて、３１℃で４８時間培養した。対照として、ＡＧＸ１７／ｐＧＸ５０，ｐＡＣＫＧ４を同様にして培養した。培地中のＬ−トリプトファンを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
0004032441.tif 000003
【００６２】
【実施例４】
Ｌ−スレオニンの製造
＜１＞Ｌ−スレオニン生産菌の創製
Ｌ−スレオニン生産菌エシェリヒア・コリ VKPM B-3996株（米国特許５１７５１０７号記載、USSR アンチバイオティクス・リサーチ・インスティテュート（the USSR Antibiotis Research Institute）の微生物培養寄託機関に登録番号1867のもとに寄託されている）に、実施例１で得たｐＴＷＶ−ｐｐｓを導入し、形質転換体をＳｍr及びＡｐrで選択し、B-3996／ｐＴＷＶ−ｐｐｓを得た。尚、VKPM B-3996株は、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有するスレオニンオペロンを含むプラスミドpVIC40（ストレプトマイシン耐性(Ｓｍr)）を保持している。
【００６３】
＜２＞Ｌ−スレオニン生産性の評価
B-3996株及びB-3996／ｐＴＷＶ−ｐｐｓを、Ｌ−スレオニン生産培地（グルコース４０ｇ、硫酸アンモニウム１６ｇ、リン酸一カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硫酸第一鉄７水和物０．０１ｇ、塩化マンガン４水和物０．０１ｇ、酵母抽出物２ｇ、炭酸カルシウム４０ｇを水１Ｌ中に含む。ｐＨ＝７．０）を用いて３７℃で２４時間培養した。培地中のＬ−スレオニンを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表３に示す。
【００６４】
【表３】
0004032441.tif 000004
【００６５】
【実施例５】
Ｌ−イソロイシンの製造
＜１＞Ｌ−イソロイシン生産菌の創製
（１）スレオニンオペロン及びｐｐｓ遺伝子を含むプラスミドの構築
Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有するスレオニンオペロンを含むプラスミドpVIC40（米国特許５１７５１０７号記載）をＢａｍＨＩで切断し、クレノーフラグメントを用いて平滑末端化した。一方、実施例１で得られたｐｐｓ遺伝子を含む３．３ｋｂｐのＳａｌＩ断片を同様に平滑末端化し、上記pVIC40断片と連結した。この連結反応液を用いてエシェリヒア・コリのＰＰＳ欠損株を形質転換し、Ｓｍr及びｐｐｓ+を示す形質転換体を選択し、この形質転換体から組換えプラスミドを抽出し、ｐＶＩＣ４０−ｐｐｓ（１７．９ｋｂ）と命名した。
【００６６】
（２）ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むプラスミドの構築
エシェリヒア・コリＭＩ１６２株より、染色体ＤＮＡを抽出した。該染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した。ｉｌｖＧＭ遺伝子を含むＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片は４．８ｋｂの長さであることが判明している。そこで４．８ｋｂ前後の長さを有するＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片と、プラスミドベクターｐＢＲ３２２（宝酒造（株）より購入）をＨｉｎｄIIIで切断して得られるＤＮＡ断片とを連結した。
【００６７】
得られたＤＮＡ連結反応混合物を、アセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損株であるエシェリヒア・コリＭＩ２６２（CGSC5769）株に導入した。形質転換されてアセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損の形質が相補された株を選択し、その株が保有するプラスミドを単離した。同プラスミドの構造を解析した結果、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII部位にｉｌｖＧＭ遺伝子及びｉｌｖＥ遺伝子の５’末端側の一部を含む４．８ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されていた。同プラスミドをｐＢＲＧＭ７と命名した。
【００６８】
Gene 97, 21, (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 922, (1981) と J. Bacteriol. 149, 294, (1982) に報告されているｉｌｖＧＭ遺伝子の塩基配列を参考にして、配列表配列番号６と配列番号７に記載した合成オリゴヌクレオチドを合成した。ｉｌｖＧＭ遺伝子の塩基配列のうち、プロモーター、アテニュエーター、及びｉｌｖＧ遺伝子コード領域を含む配列を、コード領域のアミノ酸配列とともに配列番号５に示す。前記の両オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＭＩ１６２株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法にてＤＮＡの増幅を行った。増幅されるＤＮＡ断片は配列表配列番号５に記載される塩基配列のうち２５番目から９５２番目の配列を有するＤＮＡ断片である。同断片を断片（Ａ）とする。
【００６９】
同様にして、Gene 97, 21, (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 922, (1981) と J. Bacteriol. 149, 294, (1982) に報告されている塩基配列を参考にして、配列表配列番号８と配列番号９に記載した合成オリゴヌクレオチドを合成した。両ＤＮＡをプライマーとして、ＭＩ１６２株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法にてＤＮＡの増幅を行った。増幅されるＤＮＡ断片は配列表配列番号５に記載される塩基配列のうち1161番目から2421番目の配列を有するＤＮＡ断片である。同断片を断片（Ｂ）とする。
【００７０】
断片（Ａ）をＳｍａＩで消化して得られる大断片と、ベクターｐＵＣ１８（宝酒造）をＳｍａＩで消化して得られるＤＮＡ断片とを連結してプラスミドｐＵＣＡを作製した。断片（Ｂ）をＫｐｎＩで消化して得られる大断片と、ｐＨＳＧ３９９（宝酒造）をＨｉｎｃII及びＫｐｎＩで消化して得られる大断片とを連結してプラスミドｐＨＳＧＢを作製した。
【００７１】
プラスミドｐＵＣＡをＫｐｎＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメント（クレノーフラグメント）を用いて切断端を平滑末端化し、さらにＰｓｔＩで消化し、最終的に断片（Ａ）を含むＤＮＡ断片を単離した。プラスミドｐＨＳＧＢをＨｉｎｄIIIで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメント（クレノーフラグメント）を用いて切断端を平滑末端化し、さらにＰｓｔＩで消化し、最終的に断片（Ｂ）を含むＤＮＡ断片を単離した。両ＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＨＳＧＳＫを作製した。
【００７２】
ｐＨＳＧＳＫに搭載される、断片（Ａ）及び断片（Ｂ）に由来するＳｍａＩ−ＫｐｎＩ断片を断片（Ｃ）と命名した。断片（Ｃ）は、ｉｌｖＧＭ遺伝子を含む４．８ｋｂのＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII断片をＳｍａＩとＫｐｎＩで切断して得られる断片に相当し、プロモーター、ＳＤ配列及びｉｌｖＧ遺伝子上流域を含むが、リーダー配列からアテニュエーター領域に至る配列約０．２ｋｂを欠いている。以上、ｐＨＳＧＳＫを構築する手順を図１にまとめた。
【００７３】
プラスミドｐＨＳＧＳＫをＳｍａＩとＫｐｎＩで消化することにより断片（Ｃ）を得、プラスミドｐＢＲＧＭ７をＳｍａＩとＫｐｎＩで消化することにより大ＤＮＡ断片を得、両者を連結した。得られたプラスミドをｐｄＧＭ１と命名した。ｐｄＧＭ１に搭載される、ｉｌｖＧＭ遺伝子を含む４．６ｋｂのＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄIII断片は、アテニュエーションに必要な領域を欠いている。アテニュエーションに必要な領域を欠いたｉｌｖＧＭ遺伝子を、本実施例及び図面において「ΔａｔｔＧＭ」と表現する。以上、ｐｄＧＭ１を構築する手順を図２にまとめた。
【００７４】
特開平２−４５８号公報に記載されているプラスミドｐＤＲＩＡ４は、エシェリヒア属細菌で自律複製可能でありかつブレビバクテリウム属細菌で自律複製可能なシャトルベクターｐＤＲ１１２０と、E. coli K-12由来のスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子及びｉｌｖＤ遺伝子の３’末端側の一部を含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片とが結合されて調製される。なお同ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片は、特開平２−４５８号公報では、２．３ｋｂと記載されているが、現在では２．７５ｋｂであることが判明している。プラスミドｐＤＲＩＡ４はブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１２３５８（ＦＥＲＭ  Ｐ−９７６４）あるいはブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１２３５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−９７６５）の染色体ＤＮＡ外に存在する。これらの株から常法によりプラスミドｐＤＲＩＡ４を調製できる。
【００７５】
プラスミドｐＤＲＩＡ４上のＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ ２．７５ｋｂのＤＮＡ断片中、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含むＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片を調製し、ベクターｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）をＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩで切断して得られるＤＮＡ断片と連結した。こうして作製されたプラスミドをｐＭＷＡ１と命名した。
【００７６】
プラスミドｐＭＷＡ１をＨｉｎｄIIIで切断して得られるＤＮＡ断片と、プラスミドｐｄＧＭ１をＨｉｎｄIIIで切断して得られるｉｌｖＧＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片とを連結した。プラスミド上に存在する制限酵素認識部位の位置を解析することによって、ｉｌｖＧＭ遺伝子の転写方向とｉｌｖＡ遺伝子の転写方向とが同方向となったものを選択し、これをプラスミドｐＭＷＧＭＡ２と命名した。ｐＭＷＧＭＡ２は、アテニュエーターを除去されたｉｌｖＧＭ遺伝子、ｉｌｖＥ遺伝子の５’末端側の一部、及びｉｌｖＤ遺伝子の３’末端側の一部を有している。以上、ｐＭＷＧＭＡ２を構築する手順を図３にまとめた。
【００７７】
エシェリヒア・コリＭＩ１６２株の染色体ＤＮＡを調製し、これをＳａｌＩ及びＰｓｔＩで切断してＤＮＡ断片混合物を調製した。一方、ベクターｐＵＣ１９（宝酒造社）をＳａｌＩ及びＰｓｔＩで切断してＤＮＡ断片を調製した。ＤＮＡ断片混合物とｐＵＣ１９が切断されて得られるＤＮＡ断片とを連結し、ＤＮＡ混合物を得た。同ＤＮＡ混合物を、トランスアミナーゼＢ欠損株であるＡＢ２０７０株（J. Bacteriol. 109, 703, 1972、エシェリヒア・コリ ジェネティックス トックセンターから分譲。ＣＧＳＣ２０７０）に導入し、形質転換されて分岐鎖アミノ酸要求性が回復した株を選択した。同株よりプラスミドを調製したところ、プラスミドｐＵＣ１９がＳａｌＩ及びＰｓｔＩで切断して得られるＤＮＡ断片と、ｉｌｖＥ遺伝子を含むＳａｌＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片が連結されていた。このプラスミドをｐＵＣＥ１と命名した。ｐＵＣＥ１は、ｉｌｖＭ遺伝子の３’末端側の一部、ｉｌｖＥ遺伝子、及びｉｌｖＤ遺伝子の５’末端側の一部を有している。
【００７８】
ｐＭＷＧＭＡ２をＨｉｎｄIIIで部分消化してＤＮＡ断片混合物を調製した。一方、ｐＵＣＥ１をＨｉｎｄIIIで切断し、ｉｌｖＥ遺伝子の一部とｉｌｖＤ遺伝子の５’末端側の一部とを含む１．７ｋｂのＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片を調製した。両者を連結して得られるＤＮＡ混合物を用いてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ遺伝子産物）欠損株ＡＢ１２８０株を形質転換し、形質転換された株のうち分岐鎖アミノ酸要求性が消失したものを選択した。同形質転換株から、プラスミドを調製したところ、ｐＭＷＧＭＡ２がΔａｔｔＧＭとｉｌｖＡとの間に存在するＨｉｎｄIII部位でのみ切断されて得られるＤＮＡ断片と、ｐＵＣＥ１に由来するｉｌｖＥ遺伝子の一部とｉｌｖＤ遺伝子の一部とを含む１．７ｋｂのＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片が連結されており、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが再生されていた。こうして得られるプラスミドをｐＭＷＤ５と命名した。以上、ｐＭＷＤ５を構築する手順を図４にまとめた。
【００７９】
以上の様にして得られたプラスミドｐＭＷＤ５（Ａｐr）は、ｐＭＷ１１９をベクターとしており、アテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを搭載したプラスミドである。
【００８０】
（３）Ｌ−イソロイシン生産菌の創製
エシェリヒア・コリ VNIIGenetika TDH-6（前記エシェリヒア・コリ VKPM B-3996株よりプラスミドｐＶＩＣ４０を脱落させた宿主菌がTDH-6株である。）にｐＶＩＣ４０−ｐｐｓを導入し、Ｓｍrを指標として形質転換体を選択し、さらに、ｐＭＷＤ５を導入して、Ｓｍr及びＡｐrを示す形質転換体TDH-6／ｐＶＩＣ４０−ｐｐｓ，ｐＭＷＤ５を得た。一方、上記TDH-6にｐＶＩＣ４０とｐＭＷＤ５を、Ｓｍr及びＡｐrを指標に導入して、TDH-6／ｐＶＩＣ４０，ｐＭＷＤ５を得た。
【００８１】
＜２＞Ｌ−イソロイシン生産性の評価
TDH-6／ｐＶＩＣ４０−ｐｐｓ，ｐＭＷＤ５をＬ−イソロイシン生産用培地（グルコース４０ｇ、硫酸アンモニウム１６ｇ、リン酸一カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硫酸第一鉄７水和物０．０１ｇ、塩化マンガン４水和物、０．０１ｇ、酵母抽出物２ｇ、炭酸カルシウム４０ｇを水１Ｌ中に含む。ｐＨ＝７．０）培地を用いて、３７℃で２４時間培養した。対照として、TDH-6／ｐＶＩＣ４０，ｐＭＷＤ５を同様にして培養した。培地中のＬ−イソロイシンを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表４に示す。
【００８２】
【表４】
0004032441.tif 000005
【００８３】
【発明の効果】
本発明により、芳香族アミノ酸をはじめとする種々のアミノ酸、特にＬ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニン及びＬ−イソロイシンを高収率で製造することができる。また、これらのＬ−アミノ酸の生産性が高い微生物に本発明を適用することにより、さらにその生産性を高めることができる。
【００８４】
【配列表】
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【００８５】
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【００８６】
0004032441.tif 000008
【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  プラスミドｐＨＳＧＳＫを構築する手順を示す図である。
【図２】  プラスミドｐｄＧＭ１を構築する手順を示す図である。
【図３】  プラスミドｐＭＷＧＭＡ２を構築する手順を示す図である。
【図４】  プラスミドｐＭＷＤ５を構築する手順を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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