(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
含水試料のための試料ホルダにおいて、該試料ホルダが、
（ａ）伝熱性の材料からなる第１中空円筒体（１、７）を有し、
（ｂ）試料（６）を受容するための円筒形内部スペースを有し、
（ｃ）上記試料は、切断可能な材料からなる第２中空円筒体（３、１０）内に配され、
（ｄ）第２中空円筒体（３、１０）と第１中空円筒体（１、７）の内壁との間のスペースには、室温において液状の層（４）が充填されていることを特徴とする試料ホルダ。
【請求項２】
第２中空円筒体が、ポリマー材料からなるパイプ片（３）であることを特徴とする請求項１の試料ホルダ。
【請求項３】
第２中空円筒体が、多孔質ポリマー材料からなる毛管（１０）であることを特徴とする請求項１の試料ホルダ。
【請求項４】
第１中空円筒体（１、７）が、その双方の端面に、それぞれ、導管を接続するための凹み（２）を有することを特徴とする請求項１に記載の試料ホルダ。
【請求項５】
該試料ホルダが、金属材料から加工され中空円筒体の形状を有するケーシング（８）を有し、上記中空円筒体自体は、第１中空円筒体（１、７）を受容するための軸線方向ボアを有するよう且つまた半径方向へ配置されたスリットの形の中空スペース（９）を中心範囲に有するよう構成されていることを特徴とする請求項１に記載の試料ホルダ。
【請求項６】
該試料ホルダが、双方の端面に、それぞれ、第１中空円筒体（１、７）の受容に役立つが、第１中空円筒体（１、７）を全長にわたっては囲まない中空円筒体（１１）を有することを特徴とする請求項１に記載の試料ホルダ。
【請求項７】
前記層（４）が、水に不溶な物質からなることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の試料ホルダ。
【請求項８】
第１中空円筒体は、０．１〜０．５ｍｍの範囲の内径および０．３〜０．５ｍｍの範囲の肉厚を有する金属製毛管（７）として構成されることを特徴とする請求項１に記載の試料ホルダ。
【請求項９】
第２中空円筒体は、多孔質ポリマー材料からなりかつ０．１〜０．５ｍｍの範囲の内径および０．０１〜０．１ｍｍの範囲の肉厚を有する毛管（１０）として構成されることを特徴とする請求項１に記載の試料ホルダ。
【請求項１０】
試料ホルダを使用し加圧下で含水試料を凍結する方法において、
（ａ）第２中空円筒体（３、１０）に含水試料（６）を充填し、
（ｂ）第１中空円筒体（１、７）の円筒形内部スペースに室温で液状の物質（４）を充填し、
（ｃ）試料（６）を充填した第２中空円筒体（３、１０）を手操作で第１中空円筒体（１、７）の内部スペースに導入し、
（ｄ）試料装填した第１中空円筒体（１、７）を高圧凍結装置の高圧伝達循環路の対応する受容装置に接続し、
（ｅ）試料（６）を、加圧し、
（ｆ）第１中空円筒体（１、７）内の試料（６）を、冷却して凍結させ、
（ｇ）第１中空円筒体（１、７）内の試料（６）を再び大気圧下に置き、
（ｈ）第１中空円筒体（１、７）内の試料（６）を凍結層（４）が融解する温度とし、
（ｉ）対応する寸法の器具を第１中空円筒体（１、７）の端面に導入することによって、第２中空円筒体（３、１０）内にある試料（６）を第１中空円筒体（１、７）から押出し、
（ｊ）この状態において以降の加工箇所に供給する
ことを特徴とする凍結方法。
【請求項１１】
第２中空円筒体が、多孔質ポリマー材料からなる毛管（１０）であり、毛管力によって試料（６）を毛管（１０）に充填することを特徴とする請求項１０の方法。
【請求項１２】
第２中空円筒体が、多孔質ポリマー材料からなる毛管（１０）であり、吸引によって試料（６）を毛管（１０）に充填することを特徴とする請求項１０の方法。
【請求項１３】
第１中空円筒体（１、７）の内部スペース内の液体（４）が、水と混和しない炭化水素または低融点のハロゲン化炭化水素であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
選択した圧力値を０．１〜５０ｍｓｅｃの範囲の時間にわたって試料（６）内に構成することを特徴とする請求項１０〜１３いずれかに記載の方法。
【請求項１５】
試料（６）内の圧力が、１０００〜３０００ｂａｒの範囲内にあることを特徴とする請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
第１中空円筒体は、金属製毛管（７）として構成され、金属製毛管（７）の表面において、５０００〜百万°Ｋ／ｓｅｃの冷却速度を達成し、−９０〜−１９６℃の試料（６）の温度を達成することを特徴とする請求項１０〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
液体窒素によって−１８０℃の温度に予冷した低沸点の炭化水素を冷媒として使用することを特徴とする請求項１０〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
凍結操作後、試料ホルダ（１２）を−９０〜−１４０℃の範囲の温度として充填液体の凍結層（４）を融解することを特徴とする請求項１０〜１７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、含水試料のための試料ホルダおよび、好ましくは、高圧下の凍結のためのその使用法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高圧下で含水試料を急速凍結する方法は、ドイツ特許第１８０６７４１号から公知である。常圧と対比した高圧下凍結の利点を以下に説明する：冷却中、約２０００ｂａｒの圧力を試料に加えると、冷凍保存（Ｖｉｔｒｉｆｉｋａｔｉｏｎ氷結晶形成はない、偏析はない）に必要な冷却速度は数百分の１に減少され、従って、最大２００μｍの厚さのディスク状試料を冷凍保存することが可能である。更に、高圧下で氷が万一生じた場合、偏析パタンの網目寸法が、著しく減少され、即ち、２０００ｂａｒで凍結した場合、約２００μｍの厚さの含水試料が、超微細構造的に最適に得られるということが判明している（ＳＴＵＤＥＲら、Ｖｉｔｒｉｆｉ−ｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅｂｙ  ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ，Ｊ．ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  １７９（１２９５），３１２−３３２）。現在まで、比較的厚い試料（２ｍｍ近辺の試料厚さ）の高圧下凍結の利点は知られていない。偏析パタンの網目寸法の減少によって、光学顕微鏡においてこの種の試料を最適に観察できるようである。なぜならば、μｍ範囲の偏析は見えないからである。
【０００３】
ドイツ特許第１８０６７４１号に記載の試料ホルダは、凍結試料の以降の処理には適さない。これは、片側を閉鎖し上端を濾斗状に拡張した薄肉の、例えば、銅製の、パイプ状容器である。上記試料容器内の試料は、圧力伝達液体（例えば、水）を使用して液圧系によって加圧され、外部からの冷媒の噴射によって冷却される。この装置の場合、凍結後に試料を更に処理することは、ほぼ不可能である。予定破断箇所を設置することによって、少なくとも、いわゆる、凍結エッチング技術（ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｅｔｃｈｉｎｇ）を使用できる。この技術によって、実験のための薄い金属版を作製する。
【０００４】
市販されている先行技術に係る高圧凍結装置の特性を以下に説明する：上記装置は、圧力伝達媒体および冷媒として約−１５０℃未満の液体窒素を使用する。その温度は、常圧では−１９６℃であり、２０００ａｔｍおよび上記温度では、液体窒素は固体である。圧力伝達媒体および冷媒として液体窒素を使用するこの種の装置の装置的欠点は、下記の点にある：装置が、比較的大きく（約０．８×１．６×１．５ｍ3）且つ重い（＞６００ｋｇ）。その使用は、作業者の事故の危険性に結びつく。２０００ｂａｒにおいて１００ｍｌよりも多量の液体窒素を噴射するには、高圧チャンバに比較的大きいボアが必要であり、従って、高圧チャンバは、極めて堅牢に構成しなければならない。事故は知られている；現在まで、人身事故は生じていないが、物的損失は、極めて高い（５−２０ｋＦｒ）。上記装置のコストは、相変わらず、比較的高い（１５０−３００ｋＦｒ）。なぜならば、上記装置は、材料費が高く且つ生産数が少数であるからである。
【０００５】
この種の装置の場合、生物学的試料は、２つの鋼板の間に固定された２つの薄肉の金属製シェル半部（いわゆる、アルミニウム・サンドウィッチ：外径３ｍｍ、内径２ｍｍ、１００−６００μｍの可変の中空スペース厚さ）内に受容される。上記鋼板自体は、堅牢な鋼製ピストン（試料ホルダ）にネジ止めされている。この試料ホルダは、試料とともに高圧チャンバ内に導入され、堅牢な横方向ボルトによって拘束される。高圧チャンバは、試料ホルダの密封Ｏ−リングによって閉鎖される。
【０００６】
上記装置の凍結サイクルの推移を以下に説明する：昇圧および冷却を正しく関連づけするため、昇圧および冷却を修正できるよう、高圧チャンバに、まず、約３０ｍｓの間、エタノールを充填する。次いで、高圧シリンダによって、約１００−１６０ｍｌの低温の液体窒素を３００−６００ｍｓで高圧チャンバを介して導入する。高圧チャンバは、供給管路よりも本質的に径の小さい排気口を有する。圧力は、上記排気口における堰止めによって形成される。上述の如く予め高圧チャンバにエタノールを充填してない場合は、試料は、加圧される前に凍結される。高圧チャンバ内のエタノールは、昇圧および冷却の正しい調和のために必要である。この場合、エタノールが試料中に拡散し、試料中に異物（アーチファクト）を形成するという欠点が生ずる。更に、上述の方法の場合、しばしば、サスペンションが金属製シェル半部から噴出される。
【０００７】
１−ヘキサデセンに浸漬したシェル半部に生物学的試料を装填すれば、再現性の良い結果が得られる。１−ヘキサデセンは、水溶液に比して下記利点を有する：試料のほかに、氷結晶は生じない。小さい表面張力によって、シェル半部の間の気泡が避けられる。この種の気泡は、圧力形成時に消失する。１−ヘキサデセンは、水と混和しないので、調製中、含水試料は変化しない。凝固点は、４℃であるが、高圧下（２０００ａｔｍ）では約２５℃に上昇し、かくして、固体であるが剛ではない“シェル”が含水試料のまわりに形成される。この“シェル”は、高圧下の冷却操作中に試料を喪失しないために重要である。なぜならば、窒素流は、４０ｍ／ｓよりも大きい速度を有するからである（ＳＴＵＤＥＲら、Ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｃｏｍｅｓ  ａｇｅ，Ｓｃａｎｎ−ｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３，Ｖｏｌ．１８９，ｐ２５３−２６９）。
【０００８】
もちろん、サスペンションの形の生物学的試料は、１−ヘキサデセンを使用する上記技術によっては処理し難くい。従って、生物学的試料の受容のためには、約２ｍｍの長さに切断して金属製シェル半部の間に設置し、容易に固定できる、内径約２００μｍで多孔質壁の肉厚が１０−１５μｍのセルロース毛管を使用するのが好ましい。上記セルロース毛管は、試料ホルダ内において１−ヘキサデセンによって囲まれる。先行技術の場合、試料は、既述の如く、高圧チャンバ内で凍結され、凍結後、試料ホルダとして役立つ薄肉の金属製シェル半部から手操作で引出すことができる（ＨＯＨＥＮＢＥＲＧら、Ｈｉｇｈ−  ｐｒｅｓｓｕｒｅｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｕｂｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉ−ｃｒｏｓｃｏｐｙ  １７５（１２９４），３４−４３，特に、図１、ｐ３５）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
金属製シェル半部からなるこの種の試料ホルダの欠点は、凍結試料の操作、特に、固体の１−ヘキサデセンからの試料の取出が、難しく、しばしば、試料の損傷またはロスを招くという点にある。更に、この種の試料ホルダは、そのジオメトリにもとづき、圧力伝達液体のための別個の循環路（例えば、ドイツ特許第１８０６７４１号参照）による試料への装置的に簡単で、従って、安価な圧力伝達には不適である。
【００１０】
従って、本発明の課題は、圧力伝達媒体および冷媒の別個の循環路を有する高圧凍結装置の枠内における使用に適し、特に、試料ホルダからの取出時に、凍結試料の容易で確実な操作を保証する、特に、セルロースまたは別の材料からなる毛管に、含水試料を受容するための試料ホルダを構成することにある。この目的のため、
（−）高い冷却速度を試料に伝達し、
（−）作業者の事故の危険性なく高圧下で急速な凍結を可能とし、
（−）セルロースまたは別の材料からなる毛管を簡単に装着でき、
（−）試料ホルダからの毛管除去時に凍結試料の容易で確実な操作を可能とする試料ホルダを構成する必要がある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この課題は、本発明の第１の視点において請求項１の特徴記載部分に記載の試料ホルダ、および第２の視点において請求項１０の特徴記載部分に記載の使用法によって解決される。なお、各請求項に付記した図面参照符号は、専ら理解を助けるためであり、本発明を図示の態様に限定することを意図しない。
第１の視点によれば、含水試料のための（特に、加圧（高圧）下で凍結するための）試料ホルダにおいて、該試料ホルダは、
（ａ）伝熱性の材料（好ましくは、金属材料）からなる第１中空円筒体を有し、
（ｂ）試料を受容するための円筒形内部スペースを有し、
（ｃ）上記試料は、切断可能な材料からなる中空円筒体内に配され、
（ｄ）第２中空円筒体と第１中空円筒体の内壁との間のスペースには、室温において液状の層が充填されていることを特徴とする。
第２の視点によれば、試料ホルダを使用して加圧下で含水試料を凍結する方法において、
（ａ）第２中空円筒体に含水試料を充填し、
（ｂ）第１中空円筒体の円筒形内部スペースに室温で液状の物質を充填し、
（ｃ）試料を充填した第２中空円筒体を手操作で第１中空円筒体の内部スペースに導入し、
（ｄ）このように試料装填した第１中空円筒体を高圧凍結装置の高圧伝達循環路の対応する受容装置に接続し、
（ｅ）試料を、加圧し、
（ｆ）第１中空円筒体内の試料を、冷却して凍結させ、
（ｇ）第１中空円筒体内の試料を再び大気圧下に置き、
（ｈ）第１中空円筒体内の試料を凍結層が融解する温度とし、
（ｉ）対応する寸法の器具を第１中空円筒体の端面に導入することによって、第２中空円筒体内にある試料を第１中空円筒体から押出し、
（ｊ）この状態において以降の加工箇所に供給することを特徴とする。
【００１２】
本発明に係る試料ホルダは、凍結試料の以降の処理が不良であるという欠点を除去する。この試料ホルダによって、凍結試料を公知のすべての以降の処理法（凍結エッチング、凍結乾燥、凍結置換、凍結切断、ｅｔｃ．）に提供できる。
【００１３】
本発明に係る試料ホルダは、ドイツ特許第１８０６７４１号に対応して圧力伝達媒体および冷媒の別個の循環路を有する装置に使用するのに適する。従って、比較的小さく安価な高圧凍結用装置における使用が可能である。かくして、高圧凍結の運転危険性が著しく減少される。なぜならば、先行技術の試料ホルダを有し圧力伝達媒体および冷媒として液体窒素を使用する装置は、少なくとも１００ｍｌの圧力媒体を必要とするが、上記の小形の装置の圧力伝達媒体の容積は、１ｍｌよりも小さいからである。従って、圧力伝達媒体および冷媒の別個の循環路を有する装置に本発明に係る試料ホルダを使用した場合、事故時、圧力伝達媒体および冷媒として液体窒素を使用する装置の場合よりもほぼ１／１００の量の圧力媒体が遊離されるに過ぎず、従って、生ずる損傷も極めて僅かである。
【００１４】
本発明に係る試料ホルダによって、医学および生物学において光学顕微鏡および電子顕微鏡のために試料を高圧下凍結する前提条件が得られる。本発明に係る試料ホルダによって高圧下において妥当のコストで極めて多様な試料を凍結できることにもとづき、自然科学における高圧凍結法の使用可能性（超微細構造の記述）を更に本質的に拡張できる。比較的厚い試料の高圧凍結は、病理学における使用に特に有利である。なぜならば、より厚い試料のための試料ホルダによって、組織学的に良好な診断用プレパラートを極めて短時間で、場合によっては手術中に、作製できるからである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
各従属請求項の対象は、好適な発明の実施態様を示すが、以下実施の形態について略述する。
第２中空円筒体が、ポリマー材料からなるパイプ片であること、または、多孔質ポリマー材料（好ましくは、多孔質セルロース）からなる毛管であることが好ましい。
第１中空円筒体は、その双方の端面に、それぞれ、導管（好ましくは、圧力伝達管路）を接続するための凹みを有することが好ましい。
該試料ホルダは、金属材料から加工され中空円筒体の形状を有するケーシングを有し、上記中空円筒体自体は、第１中空円筒体を受容するための軸線方向ボアを有するよう且つまた半径方向へ配置されたスリットの形の中空スペースを中心範囲に有するよう構成されていることが好ましい。
試料ホルダは、双方の端面に、それぞれ、第１中空円筒体の受容に役立つが、第１中空円筒体を全長にわたっては包含しない中空円筒体を有することが好ましい。
液体の介在充填層は、水に不溶な物質（好ましくは、凝固点の低い炭化水素）からなることが好ましい。
第１中空円筒体は、０．１〜０．５ｍｍの範囲の内径および０．３〜０．５ｍｍの範囲の肉厚を有する金属製毛管として構成されることが好ましい。
第２中空円筒体は、多孔質ポリマー材料からなり０．１〜０．５ｍｍの範囲の内径および０．０１〜０．１ｍｍの範囲の肉厚を有する毛管として構成されることが好ましい。
以下、特に第２の視点に関して、第２中空円筒体が、多孔質ポリマー材料（好ましくは、多孔質セルロース）からなる毛管であれば、毛管力によって試料を毛管に充填することができる。
第２中空円筒体が、多孔質ポリマー材料（好ましくは、多孔質セルロース）からなる毛管であれば、吸引によって試料を毛管に充填することができる。
第１中空円筒体の内部スペース内の充填液体そしては、水と混和しない炭化水素または低融点のハロゲン化炭化水素を用いることができる。
選択した圧力値を０．１〜５０ｍｓｅｃの範囲の時間（好ましくは、２０ｍｓｅｃよりも短時間）にわたって試料内に構成することが、目的に適う。
試料内の圧力としては、１０００〜３０００ｂａｒ（好ましくは、１６００〜２０４５ｂａｒ）の範囲内とすることが好ましい。
第１中空円筒体は、金属製毛管として構成され、金属製毛管の表面において、５０００〜百万°Ｋ／ｓｅｃの冷却速度を達成し、−９０〜−１９６℃の試料の温度を達成することが好ましい。
液体窒素によって−１８０℃の温度に予冷した低沸点の炭化水素を冷媒として使用することができる。
凍結操作後、試料ホルダを−９０〜−１４０℃の範囲の温度とし、かくして、充填液体の凍結層を融解することができる。
【００１６】
【実施例】
図面を参照して、以下に、本発明に係る試料ホルダの好ましい実施例およびその使用を説明する。
【００１７】
図１の試料ホルダは、堅牢で伝熱性の良い金属パイプ１（好ましくは、銅パイプ、好ましくはｍｍ範囲の内径、内径に対応する肉厚、要件に応じて約１０〜２０ｍｍの範囲の長さ）を有する。このパイプ１は、双方の端面に、例えば、円錐形に構成でき、圧力伝達媒体の接続を受容するのに役立つ凹み２を有する。上記パイプ１内には、伝熱性が比較的良い材料（好ましくは、適切なポリマー）からなり、好ましくはパイプ１の長さに対応する長さを有し、試料の以降の加工に慣用の工具によって切断できる極めて薄肉の第２パイプ３が挿入されている。ポリマーパイプおよび金属パイプは、水と混和しない凝固点が極めて低い（＜−１２０℃）物質、好ましくは、炭化水素（例えば、１−ペンテン、１−クロロブタン等）の極めて薄い層４によって分離されている。この層４は、比較的“厚い”含水試料をパイプ片（ないし細管）３に装入し、次いで、上記パイプ片を液体（例えば、炭化水素４）に浸漬し、パイプ１に導入することによって、形成される。過剰な炭化水素は、パイプ１の反対側に流出し、この反対側で手で拭取ることができる。高圧凍結操作中、試料５はポリマーパイプ片３中にある。
【００１８】
図２の試料ホルダは、最大０．３ｍｍの範囲の径を有する“薄い”円筒形試料６に適する。この試料ホルダは、好ましくは、０．１〜０．５ｍｍの範囲の（好ましくは、０．３ｍｍの）内径および、好ましくは、０．３〜０．５ｍｍの範囲の肉厚を有する伝熱性の良い金属製（好ましくは、銅製）の毛管７を有する。この毛管７は、双方の端面に、例えば、圧力伝熱媒体の導管（高圧導管）の接続を受容するための凹み、例えば、円錐形凹み２をそれぞれ備えている。中空円筒体の形のケーシング８は、上記毛管７を囲み、試料ホルダの一体の構成部分をなす。上記ケーシングは、不銹鋼から作製するのが好ましく、中央部に、主軸線に直角なスロット９の形の切欠き（凹み）を有し、半径方向へ、毛管７の外径に対応する径のボアを有する。毛管７は、形状結合状態でケーシング８に押込まれる（圧嵌される）。このケーシング８は、試料ホルダの簡単な操作を可能とし、高圧凍結装置に固定する際に薄い金属製毛管の座屈を阻止し、凍結サイクルの終了後に装置から試料を問題なく除去することを可能とする。なぜならば、変形した毛管端による固結が、確実に阻止されるからである。
【００１９】
高圧凍結中、多孔質ポリマー材料からなる毛管１０に充填された薄い含水試料６は金属製毛管７の内部にある。ポリマー材料は、一方では、多孔質であるべきであり、他方では、生物学的試料の以降の加工に慣用の工具によって切断できるべきである。例えば、血液透析ユニットに使用される如き多孔質セルロースからなる毛管は、上記双方の基準を満足する。好ましい実施例の場合、この種の毛管１０は、０．１〜０．５ｍｍの範囲の内径および０．０１〜０．１ｍｍの範囲の肉厚を有する。多孔質材料製毛管１０は、水と混和しない凝固点の低い（＜−１２０℃）液体（好ましくは、炭化水素またはハロゲン化炭化水素（例えば、１−ペンテン、１−クロロブタン等）に浸漬後、金属製毛管７に導入される。かくして、多孔質材料製毛管１０および金属製毛管７は、物質４（好ましくは、炭化水素）の薄い層によって相互に分離される。
【００２０】
使用が好ましいセルロース製毛管は、例えば、血液透析ユニットから得られる。上記毛管は、多様に使用でき、小さい生体（例えば、線虫類）、単細胞、微生物、組織の生検試料（脳、肝臓、ｅｔｃ．）、ゲル、サスペンションなどを高圧下で凍結できる。
【００２１】
図３の試料ホルダは、同じく、最大０．３ｍｍの範囲の径を有する比較的薄い円筒形試料６に適し、端面に、それぞれ、圧力伝達媒体の接続を受容するための、例えば、円錐形の凹み２を備えた伝熱性の良い金属製（好ましくは、銅製）毛管７からなる。
【００２２】
図２の試料ホルダとは異なり、毛管７の双方の端面は、好ましくは不銹鋼からなり、試料ホルダの一体の構成部分をなし、試料ホルダとともに操作される中空円筒体１１で囲まれている。図２のケーシング８との差異は、試料の冷却は効果的であるが、試料ホルダの安定性が総体的に低いという点にある。金属製毛管７内部の含水試料６は、上述の種類の多孔質ポリマー材料製毛管１０に充填される。金属製毛管および多孔質材料製毛管は、図１、２の試料ホルダの場合と同様、極めて低い凝固点（＜−１２０℃）を有し試料６と金属製毛管７との間の最適の伝熱を保証する水と混和しない物質４（好ましくは、炭化水素またはハロゲン化炭化水素（例えば、１−ペンテン、１−クロロブタン等）の層によって分離されている。
【００２３】
含水試料の高圧凍結のための本発明に係る試料ホルダの使用法は、下記の操作工程を有する。図１の比較的“厚い”試料について、同一の方法を使用するが、寸法が大きいので、操作の実施はより簡単である。
【００２４】
含水試料６（好ましくは、生物学的材料）は、下記の如く、多孔質毛管１０および金属製毛管７に導入する。好ましくは多孔質セルロースからなる毛管１０を合成樹脂製ピペット先端（いわゆる、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ＝商標）・マイクロピペットの先端）に適切な接着剤で接着する。対応する寸法のピペット上に上記先端を載せることによって、ステレオルーペで観察しながら、毛管力を利用してまたは僅かに吸引して試料を多孔質毛管１０内に充填する。現用の生検針の場合、吸引前に、生検した微小組織をカミソリの刃または他の適切な器具によって縦方向へ分割しなければならない。
【００２５】
液体４（好ましくは、水と混和しない低融点の炭化水素またはハロゲン化炭化水素）を充填したペトリシャーレ内にステレオルーペで観察しながら試料を置く。かくして、金属製毛管７内に液体が充填される。ペトリシャーレの底面に置かれた濾紙は、試料６を充填した多孔質材料製毛管１０の表面の過剰の試料液体を除去するのに役立つ。このように過剰の試料液体を除去した毛管１０を２つのピンセットまたは他の適切な器具を使用して手操作で金属製毛管７に導入する。この場合、多孔質毛管１０の長さは、金属製毛管７の長さに対応する。これは重要である。なぜならば、凍結サイクルによって、多孔質毛管１０内の試料６のうち良好に凍結されるのは、ケーシング８；１１によって囲まれていない金属製毛管７の範囲内にある試料範囲のみであるからである。試料６に対する外部因子をできる限り少なくするため、試料６を試料ホルダに装着するのに要する時間は数秒でなければならない。装着した試料ホルダは速やかに凍結される。
【００２６】
高圧下で本発明に係る試料ホルダを凍結する方法を図３の試料ホルダ１２について図４を参照して説明するが、この方法は、図１、２に示した試料ホルダにも適切に適用される。図４に示した如く、試料ホルダ１２は、公知の構造の試料ホルダ受け１３に挿入して、Ｏ−リング１４によって固定する。次いで、充填された試料ホルダ受け１３は、このために高圧凍結装置に調心状態に設けたボア１５に導入する。この場合、試料ホルダ１２の双方のケーシング１１は、調心されたボア１５にはめ込まれる。試料ホルダ１２の中央部は、金属製毛管７の囲まれてない部分に対応し、円筒形案内１７のスリットから形成された中空スペース１６内にある。この中空スペースは、単位時間当りできる限り大容積の冷媒を試料ホルダ１２当てるために必要である。
【００２７】
次いで、試料ホルダを圧力伝達媒体の循環路に接続する。試料ホルダ１２の金属製毛管７の一端は、堅牢な円錐体１８によって、例えば、圧搾空気シリンダ１９によって形成される所定の力（Ｆ）で高圧導管２０の円錐形開口に押圧される。かくして、試料６は、このように固定された試料ホルダ１２を介して、高圧系、即ち、円錐形に尖った高圧導管２０に密封結合され、ボア１５に固定される。圧力伝達媒体、例えば、作動油２１が充填され圧力発生器２２に結合された高圧導管２０は、所望の時点に、選択された高圧に試料を置き、次いで、試料は凍結される。
【００２８】
冷媒は、中空スペース１６を完全に囲む堅牢な供給導管（図示してない）によって金属製毛管７へ、短時間、方向変更される。冷媒方向変更操作と高圧ピストン２３のロックの開始操作とを機械的に連結することによって、試料内に、０．１０〜５０ｍｓｅｃの範囲、好ましくは、２０ｍｓｅｃ以下（例えば、１０ｍｓｅｃ）の時間内に１０００〜３０００ｂａｒの範囲（好ましくは、１６００〜２０４５ｂａｒの範囲）の圧力値が達成される。これと同期して、金属製毛管７の表面に５０〜百万°Ｋ／ｓｅｃ（好ましくは、数千°Ｋ／ｓｅｃ）の冷却が達成される。かくして、試料６内に−９０〜−１９６℃の範囲の温度が得られ、かくして、試料は凍結される。図１に示した比較的“厚い”試料は、好ましくは、より小さい冷却速度（５０００°Ｋ／ｓｅｃ未満）でも凍結させることができる。冷却には、液体窒素で外部から約−１８０℃の温度に予冷した金属製タンクに貯蔵した市販の冷媒、好ましくは、低沸点の炭化水素（例えば、プロパン）を使用する。
【００２９】
試料６の凍結直後に、圧搾空気シリンダ１９の圧搾空気ピストン２４を引もどし、試料ホルダ１２内の試料６を試料ホルダ受け１３の取手２５によって高圧凍結装置から引出し、大気圧下で液体窒素中に直ちに浸漬する。液体窒素中で、ピンセットを使用して手操作で試料ホルダを試料ホルダ受け１３から取出す。試料ホルダ１２は、試料６の以降の処理まで、液体窒素中に保存する。
【００３０】
かくして凍結された試料６を下記の如く試料ホルダ１２から取出す。試料ホルダ１２を液体窒素中で冷却器に装入する。冷却器の温度（−９０〜−１４０℃の範囲、例えば、−１２０℃）において、セルロース製毛管１０を囲む炭化水素４（例えば、融点−１６５℃の１−ペンテン）が溶融する。かくして、（−１２０℃の近辺に）冷却されたシリンダ、好ましくは、金属器具（例えば、対応する径のドリル）を使用して、ステレオルーペで観察しながら、凍結された多孔質ポリマー材料製毛管１０を金属製中空シリンダ７から手操作で引出すことができる。このように取出した、試料６を含む毛管１０は、再び液体窒素中に保存するか、更に処理できる。次いで、毛管１０内の試料６をそれ自体は公知の方法にもとづき以降の処理箇所に供給する。この場合、多孔質ポリマー材料（好ましくは、多孔質セルロース）からなる毛管１０は、妨害とはならず、特に、試料切断の障害とはならない。
【００３１】
比較的“厚い”試料５の操作についても同様なことが云える。図１の試料ホルダの薄肉のポリマーパイプ片３は、同じく、すべての種類の以降の処理を可能とする。
【００３２】
【発明の効果】
本発明に係る試料ホルダ及び凍結方法は、凍結試料の以降の処理における不良の発生を解消する。本発明によって、凍結試料を公知のすべての以降の処理法（凍結エッチング、凍結乾燥、凍結置換、凍結切断等）に提供できる。
また、本発明に係る試料ホルダは、比較的小さく安価な高圧凍結用装置における使用が可能である。かくして、高圧凍結の運転危険性が著しく減少される。即ち圧力伝達媒体および冷媒の別個の循環路を有する装置に本発明に係る試料ホルダを使用した場合、事故時、圧力伝達媒体および冷媒として液体窒素を使用する装置の場合よりもほぼ１／１００の量の圧力媒体が遊離されるに過ぎず、従って、万一損傷が生じても極めて僅かである。
さらに、本発明に係る試料ホルダによって、医学および生物学において光学顕微鏡および電子顕微鏡のために試料を高圧下凍結する前提条件が得られる。本発明に係る試料ホルダによって高圧下において妥当のコストで極めて多様な試料を凍結できることにもとづき、自然科学における高圧凍結法の使用可能性（超微細構造の記述）を更に本質的に拡張できる。比較的厚い試料の高圧凍結は、病理学における使用に特に有利である。なぜならば、より厚い試料のための試料ホルダによって、組織学的に良好な診断用プレパラートを極めて短時間で、場合によっては手術中に、作製できるからである。
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）伝熱性の良い堅牢な金属パイプからなる試料ホルダの縦断面図である。
（Ｂ）図１−Ａの線Ｂ−Ｂに沿う試料ホルダの拡大横断面図である。
（Ｃ）図１−Ａの部分Ｃの拡大詳細図出ある。
【図２】（Ａ）薄い円筒形試料のための、０．３ｍｍの範囲の内径の試料ホルダの縦断面図である。
（Ｂ）図２−Ａの線Ｂ−Ｂに沿う試料ホルダの横断面図である。
（Ｃ）図２−Ａの部分Ｃの拡大詳細図である。
【図３】（Ａ）薄い円筒形試料のための、０．３ｍｍの範囲の内径の試料ホルダの縦断面図である。
（Ｂ）図３−Ａの線Ｂ−Ｂに沿う試料ホルダの横断面図である。
（Ｃ）図３−Ａの部分Ｃの拡大詳細図である。
【図４】（Ａ）薄い円筒形試料のための試料ホルダを挿入した高圧凍結装置の冷却チャンバの略横断面図である。
（Ｂ）図４−Ａの部分Ｂの拡大詳細図である。
【符号の説明】
１、７  第１中空円筒体
３、１０  第２中空円筒体
４  層（液体）
５、６  試料
８、１１  ケーシング
１２  試料ホルダ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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