(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一または複数の下記構造式：
0004067562.tif 000035
（式中、Ｒ1及びＲ2は水素、ヒドロキシ（低級）アルキル、（低級）アシルオキシ（低級）アルキル、低級アルキル、低級アルケニルからなる群から独立に選ばれ、またはＲ1及びＲ2はそれらの環炭素と一緒になって、必要により１個以上のアミノ基、ハロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよいＣ6−Ｃ10芳香族縮合環であってもよく、
Ｚは水素またはアミノ基であり、
Ｙはアミノ、
式  −ＣＨ2Ｃ（=Ｏ）Ｒ
（式中、Ｒは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基またはＣ6−Ｃ10アリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロ基、ジ（低級）アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい）
の基、
式  −ＣＨ2Ｒ’
（式中、Ｒ’は水素、または低級アルキル基、低級アルキニル基、もしくはＣ6−Ｃ10アリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上のハロ基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またジ（低級）アルキルアミノ基により置換されていてもよい）
の基、または
式  −ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ″）Ｒ″'
（式中、（a）Ｒ”は水素であり、かつＲ″'は必要によりＣ6−Ｃ10アリール基により置換されていてもよい低級アルキル基、またはＣ6−Ｃ10アリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、ハロ基、または（低級）アルコキシルカルボニル基により置換されていてもよく、または（b）Ｒ”及びＲ″'は両方とも低級アルキル基である）の基であり、
Ｘは医薬上許容される陰イオンであり、及び
前記アルキル基、アルキニル基またはアルコキシ基は一又は複数のハロ基、アミノ基、または低級アルキルアミノ基で置換されていることができる）
（ただし、上記化合物から、３−（２−［３’−メトキシフェニルト２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド、及び３−（２−［４’−メチルフェニル］−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミドを除く）
の化合物の医薬組成物の製造における使用であって、該医薬組成物がヒト又はヒトを除く動物における（i）糖尿病を治療するための、若しくは（ii）糖尿病の有害な後遺症（ただしＹが−ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ″）Ｒ″'の化合物を除く）、（iii）腎臓障害、（iv）血管障害、（v）高血圧、（vi）網膜症、（vii）末梢神経障害（ただしＹが−ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ″）Ｒ″'の化合物を除く）、（viii）白内障、（ix）皮膚の弾性の低下及び皮膚のしわ、（x）糸球体硬化症、（xi）動脈硬化、（xii）卒中、（xiii）アテローム性動脈硬化症、（xiv）骨関節炎、（xv）関節周囲の硬直、（xvi）腎炎、（xvii）関節の強直、（xix）抹消血疾患、（xx）アルツハイマー病、（xxi）赤血球の変形、（xxii）水晶体タンパク質へのダメージ、（xxiii）骨形成、又は（xxiv）歯の変色、を治療または予防するための組成物である、上記使用。
【請求項２】
Ｒ1及びＲ2は水素、ヒドロキシ（低級）アルキル、（低級）アシルオキシ（低級）アルキル、低級アルキル、低級アルケニルからなる群から独立に選ばれ、またはＲ1及びＲ2はそれらの環炭素と一緒になって、必要により１個以上のアミノ基、ハロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよいＣ6−Ｃ10芳香族縮合環である、請求の範囲第１項に記載の使用。
【請求項３】
糖尿病又は糖尿病の有害な後遺症のための医薬組成物の製造における請求の範囲第２項に記載の使用。
【請求項４】
（iii）腎臓障害を治療するための医薬組成物の製造における請求の範囲第２項に記載の使用。
【請求項５】
（iv）血管障害を治療するための医薬組成物の製造における請求の範囲第２項に記載の使用。
【請求項６】
Ｙが式  −ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）Ｒ（Ｒは請求の範囲第１項で定義したとおりである）である請求の範囲第２項に記載の使用。
【請求項７】
ＲがＣ6−Ｃ10アリール基である請求の範囲第６項に記載の使用。
【請求項８】
糖尿病又は糖尿病の有害な後遺症のための医薬組成物の製造における請求の範囲第７項に記載の使用。
【請求項９】
（iii）腎臓障害を治療するための医薬組成物の製造における請求の範囲第７項に記載の使用。
【請求項１０】
（iv）血管障害を治療するための医薬組成物の製造における請求の範囲第７項に記載の使用。
【請求項１１】
化合物が３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムまたはその生物学上若しくは医薬上許される塩である請求の範囲第１項に記載の使用。
【請求項１２】
一又は複数の下記化合物：
３−アミノチアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−アミノ−４，５−ジメチルアミノチアゾリウムメシチレンスルホネート、
２，３−ジアミノチアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、
３−アミノ−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−５−メチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−５−メチルチアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］−５−メチルチアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムブロミド、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムブロミド、
３，４−ジメチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムヨージド、
３−エチル−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−ベンジル−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムクロリド、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−（カルボキシメチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，３−（ジアミノ）ベンゾチアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−５−メチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムブロミド、
３−アミノ−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−（２−メチル−２−オキソエチル）チアゾリウムクロリド、
３−アミノ−４−メチル−５−（２−アセトキシエチル）チアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−アセトキシエチル）チアゾリウムブロミド、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−アセトキシエチル）チアゾリウムブロミド、
２−アミノ−３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド、
２−アミノ−３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
２−アミノ−３−（２−アミノ−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド、
２−アミノ−３−（２−アミノ−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−メトキシフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（２’，４’−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−フルオロフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（２’，４’−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ジエチルアミノフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−プロパルギル−チアゾリウムブロミド、
３−プロパルギル−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−プロパルギル−５−メチルチアゾリウムブロミド、
３−プロパルギル−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、
３−プロパルギル−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（２−［３’−メトキシフェニル］−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（２−［３’−メトキシフェニル］−２−オキソエチル）−ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，３−ジアミノ−４−クロロベンゾチアゾリウムメシチレンスルホネート、
２，３−ジアミノ−４−メチル−チアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−アミノ−４−メチル−５−ビニル−チアゾリウムメシチレンスルホネート、
２，３−ジアミノ−６−クロロベンゾチアゾリウムメシチレンスルホネート、
２，６−ジアミノ−ベンゾチアゾールジヒドロクロリド、
２，６−ジアミノ−３−［２−（４’−メトキシフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，６−ジアミノ−３−［２−（３’−メトキシフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，６−ジアミノ−３−［２−（４’−ジエチルアミノフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，６−ジアミノ−３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，６−ジアミノ−３−（２−（２−フェニル−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，６−ジアミノ−３−［２−（４’−フルオロフェニル−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−アセトアミド−４−メチル−５−チアゾリル−エチルアセテートメシチレンスルホネート、
２，３−ジアミノ−５−メチルチアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−［２−（２’−ナフチル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（２’，６’−ジクロロフェネチルアミノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−ジブチルアミノ−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−４’−カルボエトキシアニリノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（２’，６’−ジイソプロピルアニリノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−アミノ−４−メチル−５−［２−（２’，６’−ジクロロベンジルオキシ）エチル］−チアゾリウム塩、
３−［２−（４’−カルボメトキシ−３’−ヒドロキシアニリノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
２，３−ジアミノ−４，５−ジメチルチアゾリウム塩、
２，３−ジアミノ−４−メチル−５−ヒドロキシエチル−チアゾリウム塩、
２，３−ジアミノ−５−（３’，４’−トリメチレンジオキシフェニル）−チアゾリウム塩、
３−［２−（１’，４’−ベンゾジオキサン−６−イル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，４’−トリメチレンジオキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（２−［１’，４−ベンゾジオキサン−６−イル］−２−オキソエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，４’−トリメチレンジオキシフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−５−メチル−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−４，５−ジメチル−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ｎ−ペンチルフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリニウムブロミド、
３−［２−（４’−ｎ−ペンチルフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ジエチルアミノフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリニウムブロミド、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４−メチル−５−ビニル−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−ビニル−チアゾリウムブロミド、
３−（２−tert−ブチル−２−オキソエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（２−tert−ブチル−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（３’−メトキシベンジル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムクロリド、
３−（２’，６’−ジクロロベンジル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムクロリド、
３−（２’−ニトロベンジル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−クロロフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−クロロフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、及び
３−［２−（４’−メトキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
の医薬組成物の製造における使用であって、該医薬組成物がヒト又はヒトを除く動物における（i）糖尿病を治療するための、若しくは（ii）糖尿病の有害な後遺症（ただしＹが−ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ″）Ｒ″'の化合物を除く）、（iii）腎臓障害、（iv）血管障害、（v）高血圧、（vi）網膜症、（vii）末梢神経障害（ただしＹが−ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ″）Ｒ″'の化合物を除く）、（viii）白内障、（ix）皮膚の弾性の低下及び皮膚のしわ、（x）糸球体硬化症（xi）動脈硬化、（xii）卒中、（xiii）アテローム性動脈硬化症、（xiv）骨関節炎、（xv）関節周囲の硬直、（xvi）腎炎、（xvii）関節の強直、（xix）抹消血疾患、（xx）アルツハイマー病、（xxi）赤血球の変形、（xxii）水晶体タンパク質へのダメージ、（xxiii）骨形成、又は（xxiv）歯の変色、を治療または予防するための組成物である、上記使用。
【請求項１３】
一または複数の下記構造式：
0004067562.tif 000036
（式中、Ｒ1及びＲ2は水素、ヒドロキシ（低級）アルキル、（低級）アシルオキシ（低級）アルキル、低級アルキル、低級アルケニルからなる群から独立に選ばれ、またはＲ1及びＲ2はそれらの環炭素と一緒になって、必要により１個以上のアミノ基、ハロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよいＣ6−Ｃ10芳香族縮合環であってもよく（ただしＲ1とＲ2がそれらの環炭素と一緒になってＣ6芳香族縮合環を形成する場合を除く）、
Ｚは水素またはアミノ基であり、
Ｙはアミノ、
式  −ＣＨ2Ｃ（=Ｏ）Ｒ
（式中、Ｒは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基またはＣ6−Ｃ10アリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロ基、ジ（低級）アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい）
の基、
式  −ＣＨ2Ｒ’
（式中、Ｒ’は水素、または低級アルキル基、低級アルキニル基、もしくはＣ6−Ｃ10アリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上のハロ基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはジ（低級）アルキルアミノ基により置換されていてもよい）
の基、または
式  −ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ″）Ｒ″'
（式中、（a）Ｒ”は水素であり、かつＲ″'に必要によりＣ6−Ｃ10アリール基により置換されていてもよい低級アルキル基、またはＣ6−Ｃ10アリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、ハロ基、または（低級）アルコキシルカルボニル基により置換されていてもよく、または（b）Ｒ”及びＲ″'は両方とも低級アルキル基である）の基であり、
Ｘは医薬上許容される陰イオンであり、
前記アルキル基、アルキニル基またはアルコキシ基は一又は複数のハロ基、アミノ基、または低級アルキルアミノ基で置換されていることができる）
の化合物（ただし、３−［２−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムブロミドを除く）、及び局所投与に適する医薬上許容される担体を含む、局所用医薬組成物。
【請求項１４】
前記化合物が３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムまたはその生物学上若しくは医薬上許される塩である請求の範囲第13項に記載の局所用医薬組成物。
【請求項１５】
一または複数の下記構造式：
0004067562.tif 000037
（式中、Ｒ1及びＲ2は水素、ヒドロキシ（低級）アルキル、（低級）アシルオキシ（低級）アルキル、低級アルキル、低級アルケニルからなる群から独立に選ばれ、またはＲ1及びＲ2はそれらの環炭素と一緒になって、必要により１個以上のアミノ基、ハロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよいＣ6−Ｃ10芳香族縮合環であってもよく（ただしＲ1とＲ2がそれらの環炭素と一緒になってＣ6芳香族縮合環を形成する場合を除く）、
Ｚは水素またはアミノ基であり、
Ｙはアミノ、
式  −ＣＨ2Ｃ（=Ｏ）Ｒ
（式中、Ｒは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基またはＣ6−Ｃ10アリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロ基、ジ（低級）アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい）
の基、
式  −ＣＨ2Ｒ’
（式中、Ｒ’は水素、または低級アルキル基、低級アルキニル基、もしくはＣ6−Ｃ10アリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上のハロ基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはジ（低級）アルキルアミノ基により置換されていてもよい）
の基、または
式  −ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ″）−Ｒ″'
（式中、（a）Ｒ”は水素であり、かつＲ″'は必要によりＣ6−Ｃ10アリール基により置換されていてもよい低級アルキル基、またはＣ6−Ｃ10アリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、ハロ基、または（低級）アルコキシルカルボニル基により置換されていてもよく、または（b）Ｒ”及びＲ″'は両方とも低級アルキル基である）の基であり、
Ｘは医薬上許容される陰イオンであり、
前記アルキル基、アルキニル基またはアルコキシ基は一又は複数のハロ基、アミノ基、または低級アルキルアミノ基で置換されていることができる）
の化合物（ただし、３−［２−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムブロミドを除く）、及び眼への投与に適する医薬上許容される担体を含む、眼への投与に適合した組成物。
【請求項１６】
前記化合物が３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムまたはその生物学上若しくは医薬上許される塩である請求の範囲第15項に記載の組成物。
【請求項１７】
下記構造式：
0004067562.tif 000038
（式中、Ｒ1及びＲ2は独立に水素、ヒドロキシ（低級）アルキル、（低級）アシルオキシ（低級）アルキル若しくは低級アルキルであり、
Ｚは水素またはアミノ基であり、
Ｙはアルキニルメチル基であり、及び
Ｘは生物学上又は医薬上許容される陰イオンである）
の化合物。
【請求項１８】
下記構造式：
0004067562.tif 000039
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素、ヒドロキシ（低級）アルキル、（低級）アシルオキシ（低級）アルキル、若しくは低級アルキルであり、
Ｚは水素またはアミノ基であり、
Ｙは２−アミノ−２−オキソエチル基であり、及び
Ｘの生物学上又は医薬上許容される陰イオンである）
の化合物。
【請求項１９】
化合物が３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムまたはその生物学上若しくは医薬上許される塩である請求の範囲第18項に記載の化合物。
【請求項２０】
請求の範囲第17項または18項に記載の化合物及び医薬上許される担体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
医薬上許容される塩が、ハライド、トシレート、メタンスルホネートまたはメシチレンスルホネートである、請求の範囲第1項に記載の使用。
【請求項２２】
医薬上許容される塩が、ハライド、トシレート、メタンスルホネートまたはメシチレンスルホネートである、請求の範囲第13項に記載の組成物。
【請求項２３】
医薬上許容される塩が、ハライド、トシレート、メタンスルホネートまたはメシチレンスルホネートである、請求の範囲第15、17または18項に記載の化合物。
【請求項２４】
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムまたはその生物学上若しくは医薬上許容される塩が、３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムクロリドである請求の範囲第11項に記載の使用。
【請求項２５】
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムまたはその生物学上若しくは医薬上許容される塩が、３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムクロリドである請求の範囲第14または16項に記載の組成物。
【請求項２６】
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムクロリド。
【請求項２７】
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムクロリドの医薬有効量と医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２８】
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムクロリドを含む局所投与用組成物。
【請求項２９】
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムクロリドを含む眼への投与用組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は一般にタンパク質とグルコース及びその他の還元糖の反応から生じるタンパク質の老化、更に特別には非酵素グリコシル化タンパク質の反応の抑制及び進行性（advanced）グリコシル化（グリケーション（glycation））最終生成物の生成後に形成された架橋の分解に関する。
グルコースとタンパク質の反応はかなり長い間にわたって知られていた。その最も速い顕在化は食品の調理中の褐色色素の出現であり、これがMaillardにより1912年に同定され、彼はグルコースまたはその他の還元糖がアミノ酸と反応して一連の脱水及び転移を受ける付加物を生成して安定な褐色色素を生成することを観察した。更なる研究は、貯蔵され、熱処理された食品がグルコースとポリペプチド鎖の反応の結果として非酵素褐変を受け、その結果としてタンパク質が架橋され、それに応じて減少された生物利用能を示すことを示唆していた。
還元糖と食品タンパク質のこの反応はin vivoでその類似反応を有することがわかった。こうして、アマドリ生成物として知られる安定な１−デオキシケトシル付加物を生成するグルコースとタンパク質の遊離アミノ基の非酵素反応はヘモグロビンにより生じることが示され、この場合、グルコースとの反応によるヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端の転移がヘモグロビンAlcとして知られている付加物を生成する。また、その反応は種々のその他の生体タンパク質、例えば、水晶体、コラーゲン及び神経タンパク質により生じることがわかった。Bucalaら，“Advanced Glycosylation; Chemistry, Biology, and Implications for Diabetes and Aging”Advances in Pharmacology, 23巻, 1-34頁, Academic Press（1992）を参照のこと。
更に、後期マイラード生成物のスペクトル特性及び蛍光特性に似たスペクトル特性及び蛍光特性を有する褐色色素がまた老化個体からの幾つかの長命タンパク質、例えば、水晶体タンパク質及びコラーゲンと関連してin vivoで観察されていた。色素の年齢に関係した線形の増加が20才〜90才のヒト硬膜コラーゲン中に観察された。重要なことに、コラーゲンの老化はグルコースにより誘発された架橋によりin vitroで模擬でき、また観察されたコラーゲンによるその他のタンパク質の捕獲及び付加物の生成は架橋反応により生じることが理論化され、腎臓基底膜中のアルブミン及び抗体の観察された蓄積を説明するものと考えられる。
米国特許第4,758,583号明細書に、標的タンパク質とグルコースの初期反応から生じる初期グリコシル化生成物と反応させることにより進行性グリコシル化最終生成物の生成を抑制するのに利用できる方法及び関連薬剤が開示された。それ故、抑制が起こるものと仮定された。何となれば、インヒビターと初期グリコシル化生成物の反応が架橋された後期生成物を生成するグリコシル化タンパク質と付加的なタンパク質物質のその後の反応を停止することが明らかであったからである。インヒビターとして同定された薬剤の一種はアミノグアニジンであり、更なる試験の結果がこれに関してその効力を実証した。
アミノグアニジン及び同様の化合物で達成された成功は有望であるが、この潜在的活性の利用可能性そしておそらくその範囲並びにその診断上及び治療上の実用性を広くする付加的なインヒビターを同定し、開発することの要望が絶えず存在する。この反応及びその結果を抑制するだけでなく、既存の進行性グリコシル化最終生成物の結果として形成された架橋を分解し、それによりその得られる作用を反転することができる薬剤を見出すことの更なる要望が存在する。
発明の要約
本発明によれば、タンパク質の進行性グリコシル化の形成（タンパク質老化）の抑制のため、かつ進行性グリコシル化（グリケーション）最終生成物（AGE）間またはAGEとその他のタンパク質の間に形成する架橋を分解するための方法及び組成物が開示される。進行性グリコシル化（グリケーション）最終生成物及びin vivoまたは食品中に存在するその他の反応性糖（リボース、ガラクトース及びフラクトースを含む）により生じる架橋がまた本発明の方法及び組成物により阻止され、反転されるであろう。
特に、組成物は前生成される進行性グリコシル化（グリケーション）最終生成物の生成を抑制し、その最終生成物を反転し、その後の架橋を分解するための薬剤を含む。いかなる理論により束縛されることを願わないが、前生成された進行性グリコシル化（グリケーション）最終生成物及び架橋の分解は進行性グリコシル化最終生成物中に存在するαジカルボキシルをベースとするタンパク質架橋の開裂の結果であると考えられる。こうして、本発明の方法及び組成物は、このような開裂を行うそれらの能力により、前生成された進行性グリコシル化最終生成物及び架橋、並びにin vitro及びin vivoの両方のそれらの得られる有害な作用を分解するのに利用し得る薬剤に関する。
本発明に有益な薬剤の或るものはチアゾリウムとして知られている化合物のクラスの員である。
薬剤は下記の構造式を有するチアゾリウム化合物及びこれらの混合物、並びにそのキャリヤーを含む。
0004067562.tif 000002
（式中、Ｒ1及びＲ2は水素、ヒドロキシ（低級）アルキル、アセトキシ（低級）アルキル、低級アルキル、低級アルケニルからなる群から独立に選ばれ、またはＲ1及びＲ2はそれらの環炭素と一緒になって、必要により１個以上のアミノ基、ハロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい芳香族縮合環であってもよく、
Ｚは水素またはアミノ基であり、
Ｙはアミノ、式
0004067562.tif 000003
（式中、Ｒは低級アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基またはアリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい）
の基、
式
−ＣＨ2Ｒ’
（式中、Ｒ’は水素、または低級アルキル基、低級アルキニル基、もしくはアリール基である）
の基、または
式
0004067562.tif 000004
（式中、Ｒ”は水素であり、かつＲ"'は必要によりアリール基により置換されていてもよい低級アルキル基、またはアリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、ハロ基、またはアルコキシルカルボニル基により置換されていてもよく、またはＲ”及びＲ"'は両方とも低級アルキル基である）の基であり、
Ｘはハロゲン化物イオン、トシレートイオン、メタンスルホン酸イオンまたはメシチレンスルホン酸イオンである）
本発明に使用される化合物、及びそれらの組成物は初期グリコシル化生成物と反応し、それによりそれが架橋をもたらし、それにより分子量またはタンパク質老化及びその他の不利な分子結果をもたらす進行性グリコシル化最終生成物を後に生成することを阻止する。更に、それらは既に生成された進行性グリコシル化最終生成物と反応してこのような生成物の量を減少する。
また、本発明は初期グリコシル化生成物の段階の初期グリコシル化分子を或る量の一種以上の本発明の薬剤、またはそれを含む組成物と接触することによるタンパク質老化及びその他の不利な分子結果の抑制方法、及び進行性グリコシル化最終生成物中に存在するα−ジカルボニルをベースとする架橋を開裂することにより既に生成された進行性グリコシル化最終生成物を分解してこのような生成物の量を減少する方法に関する。本発明の方法が工業上の適用を有する場合、一種以上の薬剤は、例えば、タンパク質抽出物の場合にタンパク質の混合物への導入により、または進行性グリケーション及び架橋を受け易い食品への適用もしくは導入により当該タンパク質に適用されてもよく、その全てが特別な食品の早期熟成及び腐敗を阻止し、かつ既に生成された進行性グリコシル化最終生成物の作用を反転する。
進行性グリコシル化最終生成物の生成を抑制し、かつ生体中に既に生成された進行性グリコシル化生成物を反転する能力は、進行性グリケーション及び同時の分子架橋が重大な損傷であるあらゆる適用においてそれにより重要な意味を有する。こうして、例えば、食品技術の分野において、食品腐敗の遅延は限界安定性の或る食品をそれ程腐り易くないようにし、それ故消費者に有用にすることにより明らかな経済上かつ社会上の利益を与えるであろう。腐敗が減少され、同様に検査、除去、及び交換の費用が減少され、かつ食品の延長された利用可能性が市場におけるそれらの価格を安定化することを助けることができるであろう。同様に、タンパク質の腐り易さが問題であるその他の工業上の適用において、このようなタンパク質を含む組成物中の本発明の薬剤の混合物はそれの延長された有効寿命を促進するであろう。現在使用される食品防腐剤及び変色防止剤、例えば、動物にアレルギー及び喘息を含む毒性を生じることが知られている二酸化硫黄が本明細書に記載された化合物のような化合物で置換し得る。
本発明は、マイラードプロセスが生体中の重要なタンパク質物質の幾つか、中でも、コラーゲン、エラスチン、水晶体タンパク質、及び腎臓糸球体基底膜に急に影響するような特別な治療用途を有する。これらのタンパク質は年齢とともに劣化し（それ故、“タンパク質老化”という用語の適用）、また糖尿病の結果として劣化する。それ故、進行性グリコシル化最終生成物の生成を遅延し、または実質的に抑制し、かつ生体中で進行性グリコシル化最終生成物とその他のタンパク質の間に形成された架橋の量を減少する能力は、例えば、糖尿病の合併症及び老化の治療に有望であり、それにより動物及びヒトの寿命の性質そして、おそらく、期間を改善する。
また、本発明の薬剤は身の回りの外観及び衛生の分野に有益である。何となれば、それらは抗プラーク特性を有するカチオン系の抗菌剤、例えば、クロルヘキシジンによる歯の汚れを阻止し、反転するからである。
更に、本発明は非酵素最終生成物の“分解”またはその生成の反転の測定のための新規な分析方法を含む。これに関して、本発明は更に進行性グリケーションの結果としてin vitro及びin vivoで形成する分子架橋の有意な数を与えると考えられる新規な架橋構造の同定及び使用に及ぶ。更に特別には、架橋構造は糖由来α−ジカルボニルセグメントまたは部分、例えば、ジ求核性（dinucleophilic）のチアゾリウム様化合物により開裂できるジケトンを含む。詳しくは、架橋構造は式：
0004067562.tif 000005
（式中、Ａ及びＢは独立に生物分子の求核性原子への付着の部位である）
により表されるものであってもよい。
それ故、本発明の主目的は、進行性グリコシル化最終生成物の生成及び分子の広範囲の架橋の抑制方法、及び進行性グリコシル化最終生成物の生成を適当に抑制し、既に生じた進行性グリコシル化媒介架橋を分解することによる、グルコース及びその他の反応性糖とのタンパク質の如き感受性分子の反応の結果として生じる、既存の進行性グリコシル化最終生成物から形成された架橋の分解方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は初期グリコシル化生成物として同定された初期グリコシル化タンパク質との反応を特徴とする前記方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は前記進行性グリコシル化最終生成物を生成する前記初期グリコシル化生成物の転移及び架橋を阻止する前記方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は前記方法において前記初期グリコシル化生成物との反応に関与することができる薬剤を提供することである。
本発明の更に別の目的は、進行性グリコシル化最終生成物中に存在するα−ジカルボニルをベースとするタンパク質架橋を開裂することにより前記進行性グリコシル化反応順序の結果として生成された進行性グリコシル化最終生成物を分解または反転する薬剤を提供することである。
本発明の更に別の目的は前記方法及び薬剤に頼ることにより分子の不利な結果またはタンパク質老化を処理する治療方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は前記方法及び薬剤に頼ることにより歯の変色を抑制し、反転する方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は、全て本発明の薬剤を含む、医薬組成物を含む組成物を提供することである。
本発明の更に別の目的は本発明の方法及び組成物に使用するための新規な化合物、並びにそれらの調製方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は非酵素グリコシル化最終生成物の生成及びそれらのその後の架橋を“分解”または反転する能力を有する化合物を検出するのに利用し得る新規なアッセイを提供することである。
本発明の更に別の目的は本明細書に示された進行性グリコシル化最終生成物を分解し、またはその生成を反転する薬剤により開裂することができる架橋構造、及び前記架橋構造に特異性の抗体、並びにその診断上及び治療上の使用を提供することである。
その他の目的及び利点は下記の図面を参照して進行する以下の説明を考慮して当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の３−（２−フェニル−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド（ALT-766と称される）と一緒のインキュベーション後の正常なラット及び糖尿病ラットからの尾部腱コラーゲンのCNBrrペプチドマップを示すSDS-PAGEゲルである。
図２は本発明の化合物である３−（２−フェニル−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミドによる架橋されたAGE-BSAの分解の物理的証拠を示すSDS-PAGEゲルである。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明によれば、動物物質及び植物物質の両方に存在する、特にタンパク質を含む、幾つかの標的分子中の進行性グリコシル化最終生成物の生成を抑制し、かつ既に生成された進行性グリコシル化最終生成物を反転すると考えられる、薬剤、前記薬剤を含む医薬組成物を含む組成物及び関連方法が開発された。特に、本発明は進行性グリコシル化最終生成物中に存在するα−カルボニルをベースとする分子架橋の開裂を行う能力を有する化合物を含む一種以上の薬剤を含んでもよい組成物に関する。例えば、有益な薬剤は構造式：
0004067562.tif 000006
を有する化合物及びこれらの混合物、並びにそのキャリヤーを含む。
（式中、Ｒ1及びＲ2は水素、ヒドロキシ（低級）アルキル、アセトキシ（低級）アルキル、低級アルキル、低級アルケニルからなる群から独立に選ばれ、またはＲ1及びＲ2はそれらの環炭素と一緒になって、必要により１個以上のアミノ基、ハロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい芳香族縮合環であってもよく、
Ｚは水素またはアミノ基であり、
Ｙはアミノ、式
0004067562.tif 000007
（式中、Ｒは低級アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基またはアリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい）
の基、
式
−ＣＨ2Ｒ’
（式中、Ｒ’は水素、または低級アルキル基、低級アルキニル基、もしくはアリール基である）
の基、または
式
0004067562.tif 000008
（式中、Ｒ”は水素であり、かつＲ"'は必要によりアリール基により置換されていてもよい低級アルキル基、またはアリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、ハロ基、またはアルコキシルカルボニル基により置換されていてもよく、またはＲ”及びＲ"'は両方とも低級アルキル基である）の基であり、
Ｘはハロゲン化物イオン、トシレートイオン、メタンスルホン酸イオンまたはメシチレンスルホン酸イオンである）
上記低級アルキル基は１〜６個の炭素原子を含み、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、及びこれらの相当する分岐鎖異性体を含む。低級アルキニル基は２〜６個の炭素原子を含む。同様に、低級アルコキシ基は１〜６個の炭素原子を含み、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ、及びヘキソキシ、並びにこれらの相当する分岐鎖異性体を含む。これらの基は必要により１個以上のハロ基、ヒドロキシ基、アミノ基または低級アルキルアミノ基により置換されていてもよい。
上記式により含まれる低級アシルオキシ（低級）アルキル基は、そのアシルオキシ部分が２〜６個の炭素原子を含み、かつその低級アルキル部分が１〜６個の炭素原子を含む基を含む。典型的なアシルオキシ部分は、例えば、アセトキシまたはエタノイルオキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、ヘキサノイルオキシ、及びこれらの相当する分岐鎖異性体である。典型的な低級アルキル部分は前記のとおりである。
上記式により含まれるアリール基は、６〜10個の炭素原子を含むアリール基、例えば、ナフチル、フェニル及び低級アルキル置換フェニル、例えば、トリル及びキシリルであり、必要により１〜２個のハロ基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはジ（低級）アルキルアミノ基により置換されていてもよい。好ましいアリール基はフェニル基、メトキシフェニル基及び４−ブロモフェニル基である。
上記式中のハロ原子はフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードであってもよい。
本発明の目的のために、式（I）の化合物は生物学上かつ医薬上許される塩として生成される。有益な塩形態はハライド、特にブロミド及びクロリド、トシレート塩、メタンスルホネート塩、及びメシチレンスルホネート塩である。同様に無毒性の生物学上かつ医薬上許される陰イオンを使用して、その他の関連塩が生成し得る。
式Ｉにより含まれる化合物の或る置換基が好ましい。例えば、Ｒ1またはＲ2が低級アルキル基である化合物が好ましい。また、Ｙがアミノ基、２−アミノ−２−オキソエチル基、２−フェニル−２−オキソエチル基または２−［置換フェニル］−２−オキソエチル基である化合物が非常に好ましい。
本発明の代表的な化合物は、
３−アミノチアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−アミノ−４，５−ジメチルアミノチアゾリウムメシチレンスルホネート、
２，３−ジアミノチアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、
３−アミノ−４−メチルチアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−５−メチルチアゾリウムブロミド、
３−（３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−５−メチルチアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］−５−メチルチアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムブロミド、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムブロミド、
３，４−ジメチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムヨージド、
３−エチル−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−ベンジル−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムクロリド、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−（カルボキシメチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，３−（ジアミノ）ベンゾチアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−５−メチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムブロミド、
３−アミノ−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−（２−メチル−２−オキソエチル）チアゾリウムクロリド、
３−アミノ−４−メチル−５−（２−アセトキシエチル）チアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド、
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−アセトキシエチル）チアゾリウムブロミド、
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−アセトキシエチル）チアゾリウムブロミド、
２−アミノ−３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド、
２−アミノ−３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
２−アミノ−３−（２−アミノ−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド、
２−アミノ−３−（２−アミノ−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−メトキシフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（２’，４’−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−フルオロフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（２’，４’−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ジエチルアミノフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−プロパルギル−チアゾリウムブロミド、
３−プロパルギル−４−メチルチアゾリウムブロミド、
３−プロパルギル−５−メチルチアゾリウムブロミド、
３−プロパルギル−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、
３−プロパルギル−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（２−［３’−メトキシフェニル］−２−オキソエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（２−［３’−メトキシフェニル］−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（２−［３’−メトキシフェニル］−２−オキソエチル）−ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，３−ジアミノ−４−クロロベンゾチアゾリウムメシチレンスルホネート、
２，３−ジアミノ−４−メチル−チアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−アミノ−４−メチル−５−ビニル−チアゾリウムメシチレンスルホネート、
２，３−ジアミノ−６−クロロベンゾチアゾリウムメシチレンスルホネート、
２，６−ジアミノ−ベンゾチアゾール二塩酸塩、
２，６−ジアミノ−３−［２−（４’−メトキシフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，６−ジアミノ−３−［２−（３’−メトキシフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，６−ジアミノ−３−［２−（４’−ジエチルアミノフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，６−ジアミノ−３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，６−ジアミノ−３−（２−（２−フェニル−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、
２，６−ジアミノ−３−［２−（４’−フルオロフェニル−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、
３−アセトアミド−４−メチル−５−チアゾリル−エチルアセテートメシチレンスルホネート、
２，３−ジアミノ−５−メチルチアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−［２−（２’−ナフチル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（２’，６’−ジクロロフェネチルアミノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−ジブチルアミノ−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−４’−カルボエトキシアニリノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（２’，６’−ジイソプロピルアニリノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−アミノ−４−メチル−５−［２−（２’，６’−ジクロロベンジルオキシ）エチル］−チアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−［２−（４’−カルボメトキシ−３’−ヒドロキシアニリノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
２，３−ジアミノ−４，５−ジメチルチアゾリウムメシチレンスルホネート、
２，３−ジアミノ−４−メチル−５−ヒドロキシエチル−チアゾリウムメシチレンスルホネート、
２，３−ジアミノ−５−（３’，４’−トリメチレンジオキシフェニル）−チアゾリウムメシチレンスルホネート、
３−［２−（１’，４’−ベンゾジオキサン−６−イル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，４’−トリメチレンジオキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（２−［１’，４−ベンゾジオキサン−６−イル］−２−オキソエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，４’−トリメチレンジオキシフェニル）−２−オキソエチル］４−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−５−メチル−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−４，５−ジメチル−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−ベンゾチアゾリウムブロミド、
１−メチル−３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−イミダゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−ｎ−ペンチルフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリニウムブロミド、
３−［２−（４’−ｎ−ペンチルフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリニウムブロミド、
３−［２−（４’−ジエチルアミノフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリニウムブロミド、
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４−メチル−５−ビニル−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（３’，５’−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−ビニル−チアゾリウムブロミド、
３−（２−tert−ブチル−２−オキソエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（２−tert−ブチル−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−（３’−メトキシベンジル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムクロリド、
３−（２’，６’−ジクロロベンジル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムクロリド、
３−（２’−ニトロベンジル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−クロロフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、
３−［２−（４’−クロロフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、及び
３−［２−（４’−メトキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミドである。
式Ｉにより表される化合物の或るものは本発明の更に別の実施態様に相当する新規化合物である。これらの化合物は式
0004067562.tif 000009
により表される。
（式中、Ｒ1及びＲ2は水素、ヒドロキシ（低級）アルキル、アセトキシ（低級）アルキル、低級アルキル、低級アルケニルからなる群から独立に選ばれ、またはＲ1及びＲ2それらの環炭素と一緒になって、必要により１個以上のアミノ基、ハロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい芳香族縮合環であってもよく、
Ｚは水素またはアミノ基であり、
Ｙはアミノ、式
0004067562.tif 000010
（式中、Ｒは低級アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基またはアリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい）
の基、
式
−ＣＨ2Ｒ’
（式中、Ｒ’は水素、または低級アルキル基、低級アルキニル基、もしくはアリール基である）
の基、または
式
0004067562.tif 000011
（式中、Ｒ”は水素であり、かつＲ"'は必要によりアリール基により置換されていてもよい低級アルキル基、またはアリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、ハロ基、またはアルコキシルカルボニル基により置換されていてもよく、またはＲ”及びＲ"'は両方とも低級アルキル基である）の基であり、
但し、Ｙ及びＺの少なくとも一つがアミノ基であることを条件とし、更にＹがアミノであり、Ｒ2及びＺが両方とも水素である場合には、Ｒ1が低級アルキル基以外であることを条件とし、かつ
Ｘはハロゲン化物イオン、トシレートイオン、メタンスルホン酸イオンまたはメシチレンスルホン酸イオンである）
その他の新規化合物は式
0004067562.tif 000012
の化合物である。
（式中、Ｒ1及びＲ2は水素、ヒドロキシ（低級）アルキル、アセトキシ（低級）アルキル、低級アシルオキシ（低級）アルキル、低級アルキルからなる群から独立に選ばれ、またはＲ1及びＲ2はそれらの環炭素と一緒になって芳香族縮合環であってもよく、
Ｚは水素またはアミノ基であり、
Ｙはアルキニルメチル基、または式
0004067562.tif 000013
（式中、Ｒ”は水素であり、かつＲ"'は必要によりアリール基により置換されていてもよい低級アルキル基、またはアリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、ハロ基、またはアルコキシルカルボニル基により置換されていてもよく、またはＲ”及びＲ"'は両方とも低級アルキル基である）の基であり、かつ
Ｘはハロゲン化物イオン、トシレートイオン、メタンスルホン酸イオンまたはメシチレンスルホン酸イオンである）
上記化合物は、例えば、タンパク質を含む標的分子の進行性グリコシル化最終生成物の生成を抑制することができるだけでなく、このようなタンパク質の既に生成された進行性グリコシル化最終生成物を分解または反転することができる。進行性グリコシル化最終生成物の生成によるタンパク質の架橋はその他のタンパク質の閉じ込めに寄与し、皮膚の低下した弾性及びしわ形成、或る腎臓疾患、アテローム性動脈硬化症、骨関節炎等の如き症状のin vivoの発生をもたらす。同様に、非酵素褐変を受ける植物物質は劣化し、食品の場合には、損傷され、または堅くされるようになり、その結果、食用できず、非嗜好性または非栄養性になる。こうして、本発明に従って使用される化合物はこの後期マイラード作用を抑制し、上記の有害な変化に介入し、タンパク質物質中に既に存在する進行性グリコシル化最終生成物のレベルを減少する。
本発明の原理的説明は、後グリコシル化工程、例えば、蛍光発色団及び架橋の形成（その存在は糖尿病及び老化の不利な後遺症と関連し、またそれをもたらす）を阻止するだけでなく、反転する薬剤を使用することである。理想的な薬剤はこのような発色団及びタンパク質ストランド間の架橋の形成並びに動脈及び腎臓中で生じるようなその他のタンパク質へのタンパク質の閉じ込めを阻止し、かつ既に存在するこのような架橋形成のレベルを反転するであろう。
本発明の化合物が反応すると考えられる初期グリコシル化生成物の化学的性質は変化してもよく、従って本明細書に使用される“一種以上の初期グリコシル化生成物”という用語はその範囲内にありとあらゆるこのような変化を含むことが意図されている。例えば、進行性グリコシル化最終生成物の生成に関与し、かつ本発明の化合物との反応により阻止し得るカルボニル部分を含む初期グリコシル化生成物が仮定された。実施態様において、初期グリコシル化生成物はアマドリ生成物またはそれらの更なる縮合生成物、脱水生成物及び／または転移生成物の反応性カルボニル部分を含んでもよいことが考えられ、これらは縮合して進行性グリコシル化最終生成物を生成し得る。別のシナリオでは、一つ以上のカルボニル部分を含む反応性カルボニル化合物（例えば、グリコールアルデヒド、グリセルアルデヒドまたは３−デオキシグルコソン）がアマドリまたはその他の初期グリコシル化最終生成物の開裂から生成するかもしれず、そしてアミンまたはアマドリ生成物とのその後の反応により、アルキルホルミル−グリコシルピロールの如きカルボニルを含む進行性グリコシル化生成物を生成するかもしれない。
幾人かの研究者らは進行性グリコシル化生成物生成のメカニズムを研究していた。Ebleら，（1983），“Nonenzymatic Glucosylation and Glucose-dependent Cross-linking of Protein”, J.Biol.Chem., 258:9406-9412によるin vitro研究は、グルコースの不在下のグリコシル化されていないタンパク質によるグリコシル化タンパク質の架橋に関するものであった。Ebleらはマイラード反応ひいては、モデル系として行われたRNaseの調節された初期グリコシル化のメカニズムを解明しようと探究し、次いでこれが種々の条件下で調べられた。一つの局面において、グリコシル化タンパク質物質が単離され、グルコースを含まない環境に置かれ、それにより観察されて架橋の程度を測定した。
Ebleらはそれにより架橋がグリコシル化タンパク質だけでなく、同様にグリコシル化されていないタンパク質により起こり続けることを観察した。Ebleらにより注目された観察の一つは、グリコシル化タンパク質とタンパク質物質の反応がタンパク質のアミノ酸側鎖の位置で起こることが明らかであることであった。これに関してEbleらにより行われた確認実験は、遊離リシンがグリコシル化タンパク質の結合についてRNaseのリシンと競合することを実証した。こうして、リシンが進行性グリコシル化のインヒビターとして利用し得ることがこれらのデータから推論し得る。しかしながら、この結論及びそれをもたらす基礎となる観察が、Ebleらにより調製され、試験されたモデル系の比較的制限された状況のもとに解釈されるべきである。明らかに、Ebleらは、in vitro及びin vivoの両方のタンパク質の進行性グリコシル化の抑制に関して、本発明の基礎である発見を理解していないし、またその発見の示唆もない。
Ebleらの実験は、グルコースが常に存在する進行性グリコシル化最終生成物のin vivo生成における反応性開裂生成物メカニズムまたはその他のメカニズムを示唆していない。実際に、その他の研究者らはこのメカニズムを支持してin vivoの進行性グリコシル化最終生成物の生成を説明する（例えば、Hayaseら，J.Biol.Chem., 263:3758-3764（1989）; Sell及びMonnier, J.Biol.Chem., 264:21597-21602（1989）; Oimomiら，Agric.Biol.Chem., 53（6）:1727-1728（1989）;及びDiabetes Research and Clinical Practice, 6:311-313（1989）を参照のこと）。それ故、Ebleらのモデル系におけるインヒビターとしてのリシンの使用はin vivoのグルコースの存在下の進行性グリコシル化最終生成物生成の抑制、及び糖尿病及び老化の合併症の回復における本発明の化合物の実用性に関係がない。
本発明の化合物が既に生成された進行性グリコシル化最終生成物を反転するメカニズムについていかなる特別な理論により束縛されたくないが、可能なメカニズムを解明する研究が体系化された。in vivoのアマドリ生成物（AP）の運命を調べる初期の研究は共有結合のグルコース誘導タンパク質架橋の形成をもたらし得る一つの可能な経路を同定した。この経路は下記のスキームＡにより示されるような連続のβ−脱離を経由してAPの脱水により進行する。こうして、AP（1）の４−ヒドロキシの損失は１，４−ジデオキシ−１−アルキルアミノ−２，３−ヘキソジウロース（AP−ジオン）（2）を生じる。アミノ−１，４−ジデオキシオソンの構造を有するAP-ジオンはモデルAPをAGE-インヒビターアミノグアニジンで閉じ込めることにより単離された。５−ヒドロキシルのその後の脱離が１，４，５−トリデオキシ−１−アルキルアミノ−２，３−ヘキスロス−４−エン（AP−エン−ジオン）（3）を生じ、これがその１，２−エノール形態のトリアセチル誘導体として単離された。アマドリ−ジオン、特にAP−エン−ジオンはタンパク質中に存在するアミン（LysまたはHis）またはスルフヒドリル（Cys）をベースとする求核試薬の付加の標的として利用できることによりタンパク質架橋反応に対して高度に反応性であり、それにより形態（4）の安定な架橋を生じると予想されるであろう。
0004067562.tif 000014
（3）の線状AP−エン−ジオン及び（4）の安定な架橋は環化して５−または６−員ラクトール環を形成し得るが、６員環変異体のみが上記スキームＡに示されることに注目されたい。
グルコース誘導架橋形成の主要経路がAP-エン-ジオン中間体を介して進行する可能性が、in vivoのこの経路の発生を試験するだけでなく、得られるα−ジカルボニルをベースとするタンパク質架橋の特異的開裂を行うように設計された実験により研究された。こうして、本発明のチアゾリウム化合物は、特に、生理条件下で下記のスキームＢに示されるような架橋の二つのカルボニルの間の炭素−炭素分解反応を行うように設計された、新規な“二座”求核試薬として作用するものと考えられる。このスキームはAP-エン-ジオン誘導架橋との式Ｉのプロトタイプα−ジオン開裂剤、Ｎ−フェナシルチアゾリウムブロミドの反応を示す。
0004067562.tif 000015
この反応を解明するための更に別の実験は１−フェニル−１，２−プロパンジオンとの式Ｉの化合物、Ｎ−フェナシルチアゾリウムブロミドの反応を伴って予想された分断生成物、安息香酸を生じる。Ｎ−フェナシルチアゾリウムブロミドと１−フェニル−１，２−プロパンジオンの反応は迅速であり、容易に進行し、この可能なメカニズムを確認した。
一旦初期に、グルコース誘導付加生成物がタンパク質に生成すると、更なる反応が続いて共有結合のタンパク質−タンパク質架橋反応を行い得る。これに関して、式Ｉの化合物、Ｎ−フェナシルチアゾリウムブロミドは、AGE-修飾BSA（AGE-BSA）が未修飾の天然コラーゲンと反応させられる時に形成するAGE-架橋と反応させられた。これは前生成されたAGE-媒介複合体からのBSAの濃度依存性放出をもたらした。再度、この研究は、実験条件下に形成するAGE-架橋の有意な部分が生理条件下で式Iの化合物の有利な二座型分子による開裂を受け易いα−ジケトンまたは関連構造からなることを確かめた。
同状況がin vivoで発生することを確かめるために、32週にわたって糖尿病であったラットの尾部腱から単離されたコラーゲンがシアン化臭素消化及び電気泳動分析の前に式Ｉの化合物、Ｎ−フェナシルチアゾリウムブロミドで処理された。その後の電気泳動は、処理されたコラーゲンが糖尿病動物から典型的に単離されるAGE-修飾された、高度に架橋された消化耐性コラーゲンとは著しく対照的に未処理の非糖尿病（対照）コラーゲンとは区別できないことを明らかにした。
同様に、本発明は進行性グリコシル化最終生成物の生成を抑制する方法、及び既に生成された進行性グリコシル化最終生成物のレベルを反転する方法に関するものであり、これらは標的分子を本発明の組成物と接触させることを含む。標的タンパク質が食品（植物源または動物源を問わない）中に含まれる場合、これらの食品は本発明の薬剤を含む組成物を種々の手段によりそれらに適用し得る。
食品工業において、亜硫酸塩が何年も前にマイラード反応を抑制することがわかり、加工食品及び貯蔵食品に普通に使用されている。しかしながら、最近、食品中の亜硫酸塩は喘息の場合に重度かつ更には致命的な反応に関与していた。その結果、新鮮な果物及び野菜の亜硫酸塩処理は禁止された。そのアレルギー反応のメカニズムは知られていない。それ故、本発明の組成物及び薬剤はこのような食品の処理において亜硫酸塩の無毒性の代替物を与える。
本発明の環境の説明から明らかであるように、本発明の方法及び組成物は動物及び植物の両方中の主要タンパク質の老化を静止し、或る程度まで反転し、同時にその結果として経済上及び医療上の両方の利益を与える見込みを保持する。食品の場合、本発明の組成物の投与は食品の腐敗を遅延し、それにより食品を増大された貯蔵寿命にし、消費者に大いに利用し易くすることの見込みを保持する。本発明の更なる利点は、無毒性の生体適合性化合物による、ヒトにアレルギー及び喘息を生じることが知られている二酸化硫黄の如き現在使用されている防腐剤の置換である。
本発明の治療上の意味は、先に示されたように、進行性グリコシル化及び架橋による主要タンパク質の老化において同定され、例示された老化プロセスの静止、及び或る程度までの反転に関する。こうして、生体タンパク質、及び特に構造生体タンパク質、例えば、コラーゲン、エラスチン、水晶体タンパク質、神経タンパク質、腎臓糸球体基底膜及びその他の血管外基質成分が本発明の実施からそれらの寿命及び作用にあらゆる恩恵を受けるであろう。こうして、本発明は架橋された標的タンパク質によるタンパク質の閉じ込めを伴う病気、例えば、網膜障害、白内障、糖尿病性腎臓疾患、糸球体硬化症、末梢血疾患、動脈硬化、末梢神経障害、卒中、高血圧、アテローム性動脈硬化症、骨関節炎、間接周囲の硬直、皮膚の弾性の損失及びしわ形成、関節の強直、腎炎等の発生率を低下する。同様に、これらの症状の全てがこの高血糖症の結果としての真性糖尿病で冒された患者で目立ち、加速された速度で生じる傾向がある。こうして、本発明の治療方法は高齢の患者または上記病気の一つを患っている患者のこれらの症状及び関連症状の治療に妥当である。
進行性グリコシル化生成物生成による分子架橋は血管壁中のコラーゲンの如き構造タンパク質の溶解性を低下することができ、またリポタンパク質の如き血清タンパク質をコラーゲンに閉じ込めることができる。また、これは内皮の増大された透過性ひいては内皮下の基質中の血管外遊出血漿タンパク質の共有結合閉じ込め、並びに酵素による生理的分解に対する血漿及び基質の両方の感受性の低下をもたらし得る。この理由のために、慢性高血糖症により誘発された糖尿病性血管の進行性閉塞が糖誘導架橋、特にグルコース誘導架橋の過度の形成により生じることが仮定された。このような糖尿病性微小血管変化及び微小血管閉塞は、本発明の組成物及び方法を使用して進行性グリコシル化生成物生成の化学的抑制及び反転により有効に阻止でき、また反転し得る。
研究は、標的臓器中の慢性糖尿病的損傷の発生が主として高血糖症に関連し、その結果、タイトな代謝調節が遅延し、または更には最終臓器損傷を阻止することを示す。Nichollsら，Lab.Invest.; 60, 4号, 486頁（1989）を参照のこと。この文献はマウスの糖尿病性腎症における島移植及びアミノグアニジンの効果を説明する。更に、これらの研究は、アミノグアニジンが糖尿病ラット中の大動脈壁タンパク質架橋を減少することを証明し、糖尿病の合併症のこの付加的な標的臓器に関するBrownleeら，Science, 232:1629-1632（1986）による先の研究を確認する。また、付加的な研究はアミノグアニジンによる腎臓中の免疫グロブリン閉じ込めの減少を示した（Brownleeら，Diabetes, 35（1）:42A（1986））。
アミノグアニジン投与が糖尿病性腎症の発生に介入するというストレプトゾトシン−糖尿病ラットモデルにおける更なる証拠が、糖尿病性腎臓疾患の特徴である腎臓の形態学的変化に関してBrownleeら（1988，上記文献）により提供された。これらの研究者らは、糖尿病性腎臓疾患の特徴の主要な構造上の異常である増大された糸球体基底膜の厚さがアミノグアニジンで防止されることを報告した。
これらのデータは、一緒にされると、本発明の教示による、進行性グリコシル化最終生成物（AGE）の生成の抑制及び反転が糖尿病による構造の外傷、並びにAGEの生成により引き起こされる老化中の変化を後に、また早期に阻止し、同様に或る程度まで反転し得ることを強く示唆する。
更に硬質の細胞膜をもたらす、赤血球の変形の糖尿病誘発変化が架橋の別の顕在化であり、アミノグアニジンがそれをin vivoで阻止することが示された。このような研究において、誘発された長期糖尿病を有するニュージーランド白ウサギが赤血球（RBC）変形（df）に関する試験化合物の効果を研究するのに使用される。試験化合物は糖尿病のウサギに経口栄養剤により100mg/kgの割合で投与される。
糖尿病の更なる結果は慢性糖尿病と通常関連する低下された骨形成をもたらす高血糖症誘発基質骨分化である。動物モデルにおいて、糖尿病は基質誘発骨分化を70％低下する。
本発明の組成物がin vivoの目的または治療目的で使用される場合、ここに使用される化合物または薬剤は生体適合性であることが注目し得る。医薬組成物が本発明の治療有効量の薬剤または化合物で調製されてもよく、またこの目的に使用される既知の物質から選ばれた医薬上許される担体を含んでもよい。このような組成物は投与の方法に応じて種々の形態で調製し得る。また、式Ｉの化合物の種々の医薬上許される付加塩が使用し得る。
液体形態は、投与が静脈内注射、筋肉内注射または腹腔内注射による場合に使用されるであろう。適当な場合には、固体投薬形態、例えば、錠剤、カプセル、または液体投薬形態、例えば、溶液及び懸濁液等が経口投与に調製し得る。皮膚または眼への局所適用または皮膚適用について、ローションまたは軟膏が、おそらく皮膚または眼への浸透を助けるための担体を含む、適当なビヒクル、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール中の薬剤で製剤化し得る。例えば、局所製剤は約10％までの式Ｉの化合物を含むことができる。その他の生体組織への投与のためのその他の好適な形態がまた意図されている。
本発明が治療用途を有する場合、治療に意図される動物宿主は好適な医薬形態の一種以上の薬剤の或る量をそれに投与し得る。投与は既知技術、例えば、経口技術、局所技術及び非経口技術、例えば、皮内注射、皮下注射、静脈内注射または腹腔内注射だけでなく、その他の通常の手段により行い得る。薬剤の投与は、例えば、約30mg/kgまでの投薬レベルで延長された期間にわたって行い得る。
先に注目されたように、本発明はまた口腔中の非酵素褐変により生じる歯の変色を抑制し、反転する方法に及び、その方法はこのような治療を要する被験者への進行性グリコシル化最終生成物の生成を抑制し、反転するのに有効な量の構造式Ｉの薬剤を含む組成物の投与を含む。
口腔中で起こる非酵素褐変反応は歯の変色をもたらす。現在使用される抗プラーク剤はこの非酵素褐変反応及び更には歯の汚れを加速する。最近、著しい抗プラーク特性を有するカチオン系抗菌剤のクラスが口中のバクテリアを死滅させるのに規則的に使用するための経口リンス中で製剤化された。これらの薬剤、カチオン系防腐薬はアレキシジン、セチルピリジニウムクロリド、クロルヘキシジングルコネート、ヘキセチジン、及びベンザルコニウムクロリドの如き薬剤を含む。
クロルヘキシジン及びその他の抗プラーク剤による歯の汚れはマイラード反応の増進により生じることが明らかである。Nordbo, J.Dent.Res., 58:1429（1979）は、クロルヘキシジン及びベンザルコニウムクロリドがin vitroで褐変反応を触媒することを報告した。糖誘導体及びアミノ基の源を含む混合物に添加されたクロルヘキシジンは、マイラード反応に起因した増大された着色を受けた。また、クロルヘキシジンの使用は増大された歯の外皮をもたらすことが知られている。Nordboはクロルヘキシジンが二つの方法で、第一に、多くのアミノ基を含む外皮の形成を増大することにより、第二に、着色生成物をもたらすマイラード反応の触媒作用により歯の汚れをもたらすことを提案した。
この方法によれば、式Ｉの化合物は口腔中の使用に適した組成物に製剤化される。特に好適な製剤は活性薬剤を含む経口リンス及び歯ペーストである。
本発明の実施に際して、通常の製剤化技術がこのような経口リンス及び歯ペーストの製剤化に公知である量及び組み合わせで典型的に使用される無毒性の医薬上許される担体とともに使用される。
式Ｉの薬剤は進行性グリコシル化最終生成物の生成を抑制し、反転するのに有効な量で組成物中で製剤化される。この量は、勿論、使用される特別な薬剤及び特別な投薬形態により変化するが、典型的には特別な製剤の0.01重量％〜1.0重量％の範囲である。
式Ｉにより含まれる化合物は当業界で公知の化学合成により合成良く調製される。式Ｉにより含まれる化合物の或るものは薬品供給ハウスから容易に入手し得る公知化合物であり、かつ／またはそれについて特別に公表された合成方法により調製し得る。例えば、３，４−ジメチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムヨージド、３−エチル−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムクロリド、３−ベンジル−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムクロリド及び３−（カルボキシメチル）ベンゾチアゾリウムブロミドはアルドリッチ・ケミカル社から入手できる。
化学文献及び特許文献に記載された化合物またはその中に記載された方法により直接調製でき、式Ｉにより含まれる化合物は、３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４−メチルチアゾリウムブロミド及び３−ベンジル−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムクロリド［Pottsら，J.Org.Chem.,41:187-191（1976）］の如き化合物である。
式（I）の化合物の或るものは当業界で従来知られていなかった新規化合物である。これらの化合物は式Iaにより表される。
0004067562.tif 000016
（式中、Ｒ1及びＲ2は水素、ヒドロキシ（低級）アルキル、アセトキシ（低級）アルキル、低級アルキル、低級アルケニルからなる群から独立に選ばれ、またはＲ1及びＲ2はそれらの環炭素と一緒になって、必要により１個以上のアミノ基、ハロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい芳香族縮合環であってもよく、
Ｚは水素またはアミノ基であり、
Ｙはアミノ、式
0004067562.tif 000017
（式中、Ｒは低級アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基またはアリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基またはアルキレンジオキシ基により置換されていてもよい）
の基、
式
−ＣＨ2Ｒ’
（式中、Ｒ’は水素、または低級アルキル基、低級アルキニル基、もしくはアリール基である）
の基、または
式
0004067562.tif 000018
（式中、Ｒ”は水素であり、かつＲ"'は必要によりアリール基により置換されていてもよい低級アルキル基、またはアリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、ハロ基、またはアルコキシルカルボニル基により置換されていてもよく、またはＲ”及びＲ"'は両方とも低級アルキル基である）の基であり、但し、Ｙ及びＺの少なくとも一つがアミノ基であることを条件とし、更にＹがアミノであり、かつＲ2及びＺが両方も水素である場合には、Ｒ1が低級アルキル基以外であることを条件とし、かつ
Ｘはハロゲン化物イオン、トシレートイオン、メタンスルホン酸イオンまたはメシチレンスルホン酸イオンである）
その他の新規化合物は、Ｙが低級アルキニルメチル基または式
0004067562.tif 000019
（式中、Ｒ”は水素であり、かつＲ"'は必要によりアリール基により置換されていてもよい低級アルキル基、またはアリール基であり、前記アリール基は必要により１個以上の低級アルキル基、ハロ基、またはアルコキシルカルボニル基により置換されていてもよく、またはＲ”及びＲ"'は両方とも低級アルキル基である）の基である式Ｉの化合物である。
Ｙが式
0004067562.tif 000020
（式中、Ｒは低級アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基またはアリール基である）
の基、または
式
−ＣＨ2Ｒ’
（式中、Ｒ’は水素、または低級アルキル基、低級アルキニル基、もしくはアリール基である）
の基であり、
Ｘがハロゲン化物イオン、トシレートイオン、メタンスルホン酸イオンまたはメシチレンスルホン酸イオンである式Ｉの化合物はPottsら，J.Org.Chem.,41:187（1976）及びPottsら，J.Org.Chem.,42:1648（1976）により記載された方法または下記のスキームＩに示されたような方法に従って調製し得る。
0004067562.tif 000021
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｚ、及びＲは先に定義されたとおりであり、かつＸはハロゲン原子である）
反応スキームＩにおいて、Ｒ1、Ｒ2及びＺが先に定義されたとおりである式IIの適当な置換チアゾール化合物が、Ｒ及びＸが先に定義されたとおりである式IIIの適当なハロ化合物と反応させられて、Ｒ1、Ｒ2、Ｚ、Ｒ及びＸが先に定義されたとおりである式Ｉの所望の化合物を得る。
典型的には、この反応は約１〜３時間にわたって還流温度で行われる。典型的には、エタノールの如き極性溶媒が反応の誘導に使用される。
Ｙがアミノ基である式Ｉの化合物はTamuraら，Synthesis, 1（1977）に記載された方法、または以下にスキームIIに示されたような方法に従って調製し得る。
0004067562.tif 000022
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＺは先に定義されたとおりである）
典型的には室温で無水極性溶媒中で行われるスキームIIに示された反応において、典型的な反応温度は室温から還流までの範囲であり、典型的な時間は１時間から約４時間まで変化する。この反応はメシチレンスルホネートを与え、次いでこれが必要により典型的な交換反応によりその他のチアゾリウム塩に変換し得る。
また、本発明はAGE架橋タンパク質からのAGE（進行性グリコシル化最終生成物）部分の分解を検出することにより既に生成された進行性グリコシル化最終生成物を“分解”または反転する試験化合物の能力を確かめるのに使用される新規なサンドイッチ酵素イムノアッセイに関する。このアッセイは、
a）37℃の温度で２〜６時間の期間にわたるミクロタイタプレートのコラーゲン被覆ウェルによるAGE修飾ウシ血清アルブミン（AGE-BSA）のインキュベーション、
b）PBS-Tweenによるウェルの洗浄、
c）工程ｂの洗浄されたウェルへの試験化合物の適用、
d）約37℃の温度で更に12〜24時間にわたる洗浄されたウェルに適用された試験化合物のインキュベーション、及び
e）AGE-リボヌクレアーゼに対し産生された抗体を使用するAGE-分解またはBSAの抗体による架橋分解の検出
を含む。
下記の実施例は本発明の例示である。
実施例１
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−チアゾリウムブロミド
チアゾール（850mg、10ミリモル）、メチルブロモアセテート（1.52、10ミリモル）及び無水エタノール（50ml）を２時間還流させた。冷却後に、塩を分離し、無水エタノールで再結晶して標題化合物（1.59g）、融点189〜190℃（分解）を得た。
実施例２
３−アミノ−４，５−ジメチルチアゾリウムメシチレンスルホネート
乾燥ジクロロメタン（15ml）中の４，５−ジメチルチアゾール（2.26g、20ミリモル）の氷冷溶液を乾燥ジクロロメタン（15ml）中のｏ−メシチレンスルホニルヒドロキシルアミン（4.3g、20ミリモル）の溶液で滴下して処理した。室温で２時間攪拌した後、無水エーテル（10ml）を添加した。冷却後に、標題化合物、３−アミノ−４，５−ジメチル−チアゾリウムメシチレンスルホネートの無色の針状結晶を分離した（3.48g）。融点165〜168℃。
実施例３
実施例１及び２に上記された操作を使用して、下記の化合物を調製する。
３−アミノ−チアゾリウムメシチレンスルホネート、融点102〜104℃
２，３−ジアミノ−チアゾリウムメシチレンスルホネート、融点173〜175℃（分解）
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、融点184〜185℃（分解）
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチルチアゾリウムブロミド、融点149〜151℃（分解）
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４−メチルチアゾリウムブロミド、融点218〜220℃（分解）
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、融点212〜213℃（分解）
３−アミノ−４−メチル−チアゾリウムメシチレンスルホネート、融点143〜144℃
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−５−メチル−チアゾリウムブロミド、融点193〜194℃（分解）
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−５−メチル−チアゾリウムブロミド、融点193〜194℃
３−（２−［４’−ブロモフェニル］−２−オキソエチル）−チアゾリウムブロミド、融点269〜270℃（分解）
３−（２−［４’−ブロモフェニル］−２−オキソエチル）−４−メチル−チアゾリウムブロミド、融点248〜249℃（分解）
３−（２−［４’−ブロモフェニル］−２−オキソエチル）−５−メチル−チアゾリウムブロミド、融点216〜217℃
３−（２−［４’−ブロモフェニル］−２−オキソエチル）−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、融点223〜224℃（分解）
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点137〜138℃
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点180〜181℃
３−（２−［４’−ブロモフェニル］−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムブロミド、融点251〜252℃（分解）
３，４−ジメチル−５−（２−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムヨージド、融点85〜87℃
３−エチル−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムブロミド、融点84〜85℃
３−ベンジル−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムクロリド、融点144〜146℃
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−ベンゾチアゾリウムブロミド、融点144〜145℃（分解）
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−ベンゾチアゾリウムブロミド、融点240〜241℃（分解）
３−（２−［４’−ブロモフェニル］−２−オキソエチル）−ベンゾ−チアゾリウムブロミド、融点261〜262℃（分解）
３−（カルボキシメチル）−ベンゾチアゾリウムブロミド、融点250℃（分解）
２，３−ジアミノ−ベンゾチアゾリウムメシチレンスルホネート、融点212〜214℃（分解）
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−チアゾリウムブロミド、融点205〜206℃
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４−メチル−チアゾリウムブロミド、融点220〜222℃
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−５−メチル−チアゾリウムブロミド、融点179〜180℃
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４，５−ジメチル−チアゾリウムブロミド、融点147〜148℃
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−ベンゾチアゾリウムブロミド、融点222〜223℃
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムブロミド、融点182〜183℃
３−アミノ−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチル−チアゾリウムメシチレンスルホネート、融点94〜95℃（分解）
３−（２−メチル−２−オキソエチル）チアゾリウムクロリド、融点178〜179℃
３−アミノ−４−メチル−５−（２−アセトキシエチル）チアゾリウムメシチレンスルホネート、融点118〜120℃
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド、融点217〜218℃
３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−アセトキシエチル）チアゾリウムブロミド、融点217〜218℃
３−（２−アミノ−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２−アセトキシエチル）チアゾリウムブロミド、融点233〜234℃
２−アミノ−３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド、融点191〜192℃
２−アミノ−３−（２−メトキシ−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、融点236〜237℃
２−アミノ−３−（２−アミノ−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド、融点209〜210℃
２−アミノ−３−（２−アミノ−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、融点234〜235℃
３−［２−（４’−メトキシフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリニウムブロミド、融点248〜249℃（分解）
３−［２−（２’，４’−ジメトキシフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリニウムブロミド、融点214〜216℃（分解）
３−［２−（４’−フルオロフェニル−２−オキソエチル］−チアゾリニウムブロミド、融点209〜210℃（分解）
３−［２−（２’，４’−ジフルオロフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリニウムブロミド、融点226〜228℃（分解）
３−［２−（４’−ジエチルアミノフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリニウムブロミド、融点233〜235℃（分解）
３−プロパルギル−チアゾリウムブロミド、融点64〜66℃
３−プロパルギル−４−メチルチアゾリウムブロミド、融点213〜215℃
３−プロパルギル−５−メチルチアゾリウムブロミド、融点127〜129℃
３−プロパルギル−４，５−ジメチルチアゾリウムブロミド、融点198〜200℃
３−プロパルギル−４−メチル−５−（２−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点132〜134℃
３−（２−［３’−メトキシフェニル］−２−オキソエチル）−チアゾリウムブロミド、融点224〜225℃
３−（２−［３’−メトキシフェニル］−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点164〜165℃
３−（２−［３’−メトキシフェニル］−２−オキソエチル）−ベンゾチアゾリウムブロミド、融点215〜217℃
２，３−ジアミノ−４−クロロベンゾチアゾリウムメシチレンスルホネート、融点228〜230℃
２，３−ジアミノ−４−メチル−チアゾリウムメシチレンスルホネート、融点204〜205℃
３−アミノ−４−メチル−５−ビニル−チアゾリウムメシチレンスルホネート、融点145〜147℃
２，３−ジアミノ−６−クロロベンゾチアゾリウムメシチレンスルホネート、融点244〜246℃
２，６−ジアミノ−ベンゾチアゾール二塩酸塩、融点318〜320℃（分解）
２，６−ジアミノ−３−［２−（４’−メトキシフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、融点243〜245℃（分解）
２，６−ジアミノ−３−［２−（３’−メトキシフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、融点217〜218℃（分解）
２，６−ジアミノ−３−［２−（４’−ジエチルアミノフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、融点223〜225℃（分解）
２，６−ジアミノ−３−［２−（４’−ブロモフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、融点258〜259℃（分解）
２，６−ジアミノ−３−（２−（２−フェニル−２−オキソエチル）ベンゾチアゾリウムブロミド、融点208〜210℃（分解）
２，６−ジアミノ−３−［２−（４’−フルオロフェニル）−２−オキソエチル］ベンゾチアゾリウムブロミド、融点251〜252℃（分解）
３−アセトアミド−４−メチル−５−チアゾリル−エチルアセテートメシチレンスルホネート、融点  シロップ物質
２，３−ジアミノ−５−メチルチアゾリウムメシチレンスルホネート、融点149〜152℃
３−［２−（２’−ナフチル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点219〜220℃
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点206〜207℃
３−［２−（２’，６’−ジクロロフェネチルアミノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点193〜195℃
３−［２−ジブチルアミノ−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点78〜80℃
３−［２−（４’−カルボエトキシアニリノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点204〜206℃
３−［２−（２’，６’−ジイソプロピルアニリノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点166〜168℃
３−アミノ−４−メチル−５−［２（２’，６’−ジクロロベンジルオキシ）エチル］−チアゾリウムメシチレンスルホネート、融点164〜166℃
３−［２−（４’−カルボメトキシ−３’−ヒドロキシアニリノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点222〜223℃
２，３−ジアミノ−４，５−ジメチルチアゾリウムメシチレンスルホネート、融点166〜168℃
２，３−ジアミノ−４−メチル−５−ヒドロキシエチル−チアゾリウムメシチレンスルホネート、融点132〜134℃
２，３−ジアミノ−５−（３’，４’−トリメチレンジオキシフェニル）チアゾリウムメシチレンスルホネート、融点224〜226℃
３−［２−（１’，４’−ベンゾジオキサン−６−イル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点196〜198℃
３−［２−（３’，４’−トリメチレンジオキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点164〜166℃
３−（２−［１’，４−ベンゾジオキサン−６−イル］−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、融点238〜239℃
３−［２−（３’，４’−トリメチレンジオキシフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、融点246〜248℃（分解）
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、融点
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−チアゾリウムブロミド、融点226〜228℃（分解）
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−５−メチル−チアゾリウムブロミド、融点210〜211℃
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−４，５−ジメチル−チアゾリウムブロミド、融点243〜244℃（分解）
３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−ベンゾチアゾリウムブロミド、融点239〜294℃（分解）
１−メチル−３−［２−（３’，５’−ジ−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−イミダゾリウムブロミド、融点148〜150℃
３−［２−（４’−ｎ−ペンチルフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリニウムブロミド、融点218〜220℃（分解）
３−［２−（４’−ｎ−ペンチルフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリニウムブロミド、融点178〜180℃（分解）
３−［２−４’−ジエチルアミノフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリニウムブロミド、融点184〜186℃（分解）
３−（２−フェニル−２−オキソエチル）−４−メチル−５−ビニル−チアゾリウムブロミド、融点176〜177℃
３−［２−（３’，５’−tert−ブチル−４’−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−ビニル−チアゾリウムブロミド、融点208〜209℃
３−（２−tert−ブチル−２−オキソエチル）−チアゾリウムブロミド、融点211〜212℃
３−（２−tert−ブチル−２−オキソエチル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点186〜187℃
３−（３’−メトキシベンジル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムクロリド、融点135〜136℃
３−（２’，６’−ジクロロベンジル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムクロリド、融点192〜194℃
３−（２’−ニトロベンジル）−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点215〜216℃
３−［２−（４’−クロロフェニル）−２−オキソエチル］−チアゾリウムブロミド、融点239〜241℃（分解）
３−［２−（４’−クロロフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点240〜251℃（分解）及び
３−［２−（４’−メトキシフェニル）−２−オキソエチル］−４−メチル−５−（２’−ヒドロキシエチル）−チアゾリウムブロミド、融点229〜231℃（分解）
実施例４
0004067562.tif 000023
その化合物、澱粉の一部及びラクトースを合わせ、澱粉ペーストで湿式グラニュール化する。湿潤グラニュールをトレイの上に置き、45℃の温度で一夜乾燥させる。乾燥グラニュールを微粉砕機中で約20メッシュの粒子サイズに微粉砕する。ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸及び澱粉の残部を添加し、全混合物を好適な錠剤プレスによる圧縮の前にブレンドする。4kgの硬度を有する11/32”パンチを使用して錠剤を232mgの重量で圧縮する。これらの錠剤はUSP XVIに記載された方法に従って0.5時間以内に崩壊するであろう。
実施例５
ローション mg/g
式Ｉの化合物                        1.0
エチルアルコール                  400.0
ポリエチレングリコール400         300.0
ヒドロキシプロピルセルロース        5.0
プロピレングリコール                1.0gにする量
実施例６
経口リンス
式Ｉの化合物                        1.4 ％
クロルヘキシジングルコネート        0.12％
エタノール                         11.6 ％
ナトリウムサッカリン                0.15％
FD＆C ブルーNo.1                    0.001 ％
ペパーミントオイル                  0.5 ％
グリセリン                         10.0 ％
Tween 60                            0.3 ％
水                                100 ％にする量
実施例７
歯ペースト
式Ｉの化合物                        5.5 ％
ソルビトール、水中70％             25 ％
ナトリウムサッカリン                0.15％
ラウリル硫酸ナトリウム              1.75％
Carbopo1 934、６％の分散液         15 ％
スペアミントの油                    1.0 ％
水酸化ナトリウム、水中50％          0.76％
二塩基性リン酸カルシウム二水和物   45 ％
水                                  100 ％にする量
実施例８
架橋抑制アッセイ
以下の方法を使用して、ラット尾部腱コラーゲン被覆96ウェルプレートへのグリケーション化ウシ血清アルブミン（AGE-BSA）の架橋を抑制する本発明の化合物の能力を評価した。
200mg/mlの濃度のBSAを0.4Mのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4中で200mMのグルコースとともに37℃で12週間にわたってインキュベートすることによりAGE-BSAを調製した。次いでグリケーション化BSAを、更に５回の緩衝液交換によりリン酸塩緩衝液（PBS）に対し48時間にわたって徹底的に透析した。ラット尾部腱コラーゲン被覆プレートを最初にスーパーブロック・ブロッキング緩衝液（Pierce#37515x）300μlで１時間にわたってブロックした。そのブロッキング溶液を、NUNC-マルチプローブまたはDynatech ELISA-プレートウォッシャーを使用してプレートをPBS-Tween20溶液（0.05％のTween20）で洗浄することによりウェルから除去した。ラット尾部腱コラーゲン被覆プレートへのAGE-BSA（AGE-BSAのバッチに応じてウェル当たり１〜10μｇ）の架橋を、PBSまたは試験化合物の溶液中で希釈されたAGE-BSAの夫々50μlの添加により所望の濃度でPBS緩衝液、pH7.4に溶解した試験化合物を用いて、または用いないで37℃で４時間にわたって行った。試験化合物を含み、または含まないPBS緩衝液中の未褐変BSAをブランクとして別のウェルに添加した。次いで架橋されなかったAGE-BSAを、ウェルをPBS-Tween緩衝液で３回洗浄することにより除去した。次いでAGE-RNaseに対し産生されたポリクローナル抗体を使用して、尾部腱コラーゲン被覆プレートに架橋されたAGE-BSAの量を定量した。１時間のインキュベーション期間後に、AGE抗体をPBS-Tweenで４回洗浄することにより除去した。
次いで結合されたAGE抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ接合二次抗体--ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンの添加及び30分間のインキュベーションにより検出した。２，２−アジノージ（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）（ABTSクロモーゲン）（Zymed#00-2011）の基質を添加した。その反応を更に15分間行い、吸光度をDynatechプレートリーダーで410nmで読み取った。
夫々の試験化合物の抑制率（％）を以下のようにして計算した。
抑制率（％）＝
｛［光学密度（化合物を使用しない）−光学密度（化合物を使用する）］／光学密度（化合物を使用しない）}x 100％
試験化合物による種々の濃度におけるIC50値または抑制率は以下のとおりである。
0004067562.tif 000024
0004067562.tif 000025
0004067562.tif 000026
0004067562.tif 000027
0004067562.tif 000028
上記実験は、この型の薬剤治療がタンパク質の進行性グリコシル化と関連する病気及びタンパク質とその他の巨大分子の間の架橋の形成を減少するのに利益を有し得ることを示唆する。薬剤治療は糖尿病及び老化（これは後遺症、例えば、網膜損傷、及び血管外の腱、靱帯及びその他の関節への損傷をもたらす）において生じるタンパク質の増大された閉じ込め及び架橋を阻止するのに使用し得る。この治療は糖尿病及び老化により生じるアテローム性動脈硬化症及び結合組織変化を遅延し得る。治療を局所及び全身の両方に与えるための局所経路、経口経路及び非経口経路が意図されている。
実施例９
架橋分解アッセイ
既に生成された進行性グリコシル化最終生成物を“分解”または反転する本発明の化合物の能力を確かめるために、AGE-架橋タンパク質からのAGE（進行性グリコシル化最終生成物）の分解を検出する新規なサンドイッチ酵素イムノアッセイを開発した。そのアッセイは市販されているコラーゲン被覆96ウェル・ミクロタイタプレートを使用する。例えば、上記実施例８で調製されたAGE-修飾タンパク質（AGE-BSA）を４時間にわたってコラーゲン被覆ウェル上でインキュベートし、PBS-Tweenでウェルから洗浄し、試験化合物の溶液を添加する。16時間（37℃）のインキュベーション期間後に、AGE-リボヌクレアーゼに対し産生された抗体を使用し、またはBSAの抗体を用いて架橋分解を検出する。このアッセイの陽性結果は、架橋を分解し、放出された物質をその後の洗浄工程でフラッシすることによりコラーゲンに既に架橋されたAGE-BSAの量を減少することができる化合物を示す。アッセイの詳細は以下のとおりである。
物質
免疫薬品及び薬品
ウシ血清アルブミン（型Ｖ）、（BSA）Calbiochem
デキストロース
スーパーブロック、Pierce,Inc.
ウサギ抗ウシ血清アルブミン
ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）-ヤギ-抗ウサギ）、Zymed
HRP基質緩衝液、Zymed
ABTSクロモーゲン、Zymed
食塩加リン酸緩衝液
Tween20、Sigma
装置
ELISAプレートウォッシャー、Dynatech
ELISAプレートリーダー、Dynatech
精密水浴
コーニング・デジタルpHメーター
ガラス容器及びプラスチック容器
フィネペット・マルチチャンネル・ピペッター、Baxter
エッペンドルフ・ピペット、Baxter
エッペンドルフ・リピーター・ピペット、Baxter
フィネペッター用ピペッターチップ、Baxter
エッペンドルフ用ピペッターチップ、Baxter
ガラス試験管、13x100mm、Baxter
96ウェルプレート用マイラー・シーリング・テープ、Corning
バイオコート・セルウェア・ラット尾部コラーゲン型１被覆96ウェルプレート、Collaborative Biomedical Products
方法
溶液及び緩衝液の調製
１．AGE-BSA原液を以下のようにして調製した。一塩基性リン酸ナトリウム6gを蒸留水100mlに溶解し、二塩基性リン酸ナトリウム（0.4M）7gを蒸留100mlに溶解し、二塩基性溶液のpHを一塩基性溶液で7.4に調節することによりリン酸ナトリウム緩衝液（0.4M）を調製した。アジ化ナトリウム（0.02g）を100mlの容積当たりに添加してバクテリア増殖を抑制した。BSA溶液を以下のようにして調製した。型Ｖ BSA（ウシ血清アルブミン）400mgをリン酸ナトリウム緩衝液（上記）夫々１mlに添加した。デキストロース7.2gをリン酸ナトリウム緩衝液（上記）100mlに溶解することにより400mMのグルコース溶液を調製した。BSA溶液及びグルコース溶液を1:1で混合し、12週間にわたって37℃でインキュベートした。インキュベーション混合物のpHを毎週監視し、必要によりpH7.4に調節した。12週間後に、AGE-BSA溶液を48時間にわたって４回緩衝液を交換して夫々溶液対透析緩衝液の1:500の比でPBSに対し透析した。タンパク質濃度をミクロ−ローリイ方法により測定した。AGE-BSA原液をアリコートにし、-20℃で貯蔵した。AGE-BSAの希薄な溶液は-20℃で貯蔵された時に不安定であった。
２．架橋及び分解の研究用の作用液を以下のようにして調製した。試験化合物をPBSに溶解し、必要によりpHをpH7.4に調節した。AGE-BSA原液をPBS中で希釈して最大架橋を測定し、また化合物の抑制活性を試験するためにインヒビター溶液中で希釈した。最高の感度を得るのに必要なAGE-BSAの濃度をAGE-BSAの夫々のロットの初期の滴定により測定した。
３．洗浄緩衝液（“PBS-Tween”）を以下のようにして調製した。下記の塩を蒸留水１リットルに溶解することによりPBSを調製した。NaCl、8g、KCl、0.2g、KH2PO4、1.15g、NaN3、0.2g。Tween-20を0.05％（vol/vol）の最終濃度まで添加した。
４．二次抗体結合の検出用の基質を、HRP基質緩衝液を蒸留水中で1:10に希釈し、使用直前にABTSクロモーゲンと1:50で混合することにより調製した。
アッセイ操作
１．バイオコートプレートを“スーパーブロック”300μlでブロックした。プレートを室温で１時間ブロックし、試験試薬の添加前にDynatechプレートウォッシャーでPBS-Tweenで３回洗浄した。
２．夫々の実験を下記の方法で設定した。バイオコートプレートの最初の三つのウェルを試薬ブランクに使用した。AGE-BSA溶液50μlを三重反復試験で試験ウェルに添加し、ブランクウェルにはPBSのみを添加した。プレートを37℃で４時間インキュベートし、PBS-Tweenで３回洗浄した。PBS50μlを対照ウェルに添加し、試験“AGE架橋ブレーカ”化合物50μlを試験ウェル及びブランクに添加した。プレートを“AGE架橋ブレーカ”化合物とともに一夜（約16時間）インキュベートし、続いて一次抗体（下記）の添加前にPBS中で洗浄した。
３．一次抗体、抗BSAまたは抗RNaseの夫々のロットを、連続希釈液（1:500〜1:2000）を調製し、夫々の希釈液50μlをバイオコートプレートのウェルに塗布することによりこのアッセイで最適結合能について試験した。最適の一次抗体を飽和速度論から測定した。初期滴定により測定された適当な希釈の一次抗体50μlを添加し、室温で１時間インキュベートした。次いでプレートをPBS-Tweenで洗浄した。
４．プレートを二次抗体、HRP-（ヤギ-抗ウサギ）とともにインキュベートし、これをPBS中で1:4000に希釈し、最終二次抗体として使用した。インキュベーションを室温で30分間行った。
５．最大架橋及びAGE架橋の分解の検出を以下のようにして行った。HRP基質（100μl）をプレートの夫々のウェルに添加し、37℃で15分間インキュベートした。読みをDynatech ELISA-プレートリーダーで行った。サンプルフィルターを“1”にセットし、基準フィルターを“5”にセットした。
標準作業操作
予備工程
１．表４に記載されたAGE-BSA製剤の夫々の新しいロットを滴定し、飽和速度論からELISAアッセイに最適のAGE-BSA濃度を測定する。
２．開始の日に、プレートウォッシャーヘッドを熱水でフラッシし、蒸留水及び50％のエタノールですすぐ。プレートウォッシャーの緩衝液溜にPBS-Tween（0.05％）を入れ、その系を使用前に３回パージする。
３．下記の“アッセイ構成”、＃２に記載された実験を計画するためにアッセイ鋳型を調製する。
アッセイ構成
１．スーパーブロック試薬を37℃に温める。スーパーブロック300μlをバイオコートプレートの夫々のウェルに添加し、37℃で60分間放置する。ウェルをPBS-Tween（0.05％）で３回洗浄する。プレートを180°回転させ、この洗浄サイクルを繰り返す。
２．希釈サンプル50μlが上記の初期滴定により測定して最小の架橋及びピマゲジン（アミノグアニジン）による抑制に必要なAGE-BSAの量を含むようにAGE-BSAをPBS中で希釈する。未褐変BSAをAGE-BSAと同じ濃度でPBSに溶解することにより陰性対照を調製する。50μlのAGE-BSAまたはBSAを鋳型に関して“AGE-BSA”標識及び“BSA”標識に相当する夫々のウェルに添加する。
３．試験化合物を予備評価のために30mMの濃度でPBSに溶解する。pHをチェックする必要があり、必要な場合に7.4に調節する。コラーゲン被覆プレートをAGE-BSAで前処理して最大架橋を得る。BSAをAGE-BSAについて使用した濃度と同じタンパク質濃度で抑制溶液に溶解することにより抑制実験用の陰性対照を調製する。夫々、鋳型に関して“ALT#+AGE-BSA”及び“ALT#ブランク”に相当するウェルに50μlのインヒビター溶液中AGE-BSAまたはBSAを添加する。プレートを37℃で４時間インキュベートする。プレートへのAGE-BSAの共有結合後に、プレートを検出反応の調製（下記）においてPBS-Tweenで洗浄する。
４．バイオコートプレートへの一次抗体の結合を以下のようにして行う。４時間のインキュベーションの終了時に、ウェルをPBS-Tweenで洗浄する。ウサギ−抗AGE-RNaseまたはウサギ−抗BSA抗体の適当な希釈液（初期滴定により測定）をPBS中で調製し、50μlを夫々のウェルに添加し、プレートを室温で60分間放置する。
５．二次抗体結合ウェルをPBS-Tweenで洗浄し、PBS中で1-4000に希釈された50μlのHRP（ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）（ヤギ抗ウサギ血清）を夫々のウェルに添加する。プレートを室温で30分間放置する。
６．発色を以下のようにして行う。プレートを上記工程４のようにして洗浄する。HRP-希釈緩衝液を水中で1:10に希釈する。ABTS溶液200μlを添加し、良く混合し、この試薬100μlを夫々のウェルに添加する。プレートを37℃で15分間インキュベートする。光学密度を“1”にセットされたサンプルフィルター及び“5”にセットされた基準フィルターを用いてDynatech ELISAプレートリーダーで410nmで読み取る。化合物による抑制率（％）を上記のようにして計算する。免疫反応性の量を減少することが見られる化合物は、それらが進行性グリコシル化最終生成物のレベルを反転し、減少する限り、治療上有益であると考えられる。
0004067562.tif 000029
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実施例10
ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラット中の循環赤血球に架橋されたIgGの量を減少する本発明の化合物の能力を確かめるために、下記のアッセイにより測定した。試験化合物を試験動物に経口または腹腔内に投与し、血液サンプルを回収し、投与後の種々の時間、例えば、４日、７日または19日で試験して効力を評価する。
RBC-IgGアッセイに関するプロトコル
Ａ．赤血球の調製
血液をヘパリン処理した管中でラットから回収し、2000 x gで10分間回転させ、血漿を慎重に除去する。次いで、血液１ml当たり約５mlのPBSを添加し、穏やかに混合し、次いで再度回転させる。次いで上澄みを吸引により除去する。次いで洗浄をもう２回繰り返す。次いで、ピペットを使用して濃縮RBC 0.2〜0.3mlを管の底から取り出し、PBSに添加して１対10希釈液をつくる。次いでこの希釈液をPBS中で1:25及び1:50に更に希釈する。
Ｂ．アッセイ構成
１．スーパーブロックを37℃に温める。
２．マルチスクリーンHA、0.45uセルロースエステル膜シール96ウェルプレート（Millipore MAHAS45）のプレートを取る。
３．ウェルをPBS 100μlで湿らす。
４．スーパーブロック300μlを夫々のウェルに添加し、37℃で１時間インキュベートする。
５．プレートをミリタイタ・バキューム・ホルダーに置き、真空にし、プレートをしっかりと保持するために下に１回プレスする。ウェル中の液体を吸引して除く。ウェルを300μlのPBS−Tween 0.05％で洗浄する。
６．真空を解除し、PBS 100μlを夫々のウェルに添加する。
７．RBCサンプルを穏やかに攪拌し、プロトコルシートに従ってウェルに50μlをピペットで入れる。最初に三つのウェルを試薬ブランクのために残す。別の三つのウェルを抗体ブランクのために残す。
８．液体を上記のようにして吸引して除き、RBCをPBSで２回洗浄する。
９．AP（Rb-抗ラット）（Sigma A-6066）をPBS中で1:25000に希釈する。
10．50μlをウェルに添加し、室温で２時間放置する。
11．液体を上記のようにして吸引して除き、RBCをPBSで２回洗浄する。
12．ウェル当たり100μlのpNPP基質（DEA緩衝液中1mg/ml）を添加する。
13．37℃で２時間にわたって発色させる。
14．96ウェルコーニングミクロメータープレートを真空チャンバーに入れる。
15．サンプルプレートを真空マニホルドに入れる。プレートの底が完全に乾燥していることを確実にする。
16．真空を約５分間適用する。PBS 100μlを全てのウェルに添加し、再度真空を約５分間適用する。プレートを軽く持ち上げ、液滴がプレートの底に垂れていないことを確実にする。必要により、真空を更に二三分適用する。コーニングプレート中に回収した溶液のODをDynatechプレートリーダーサンプルフィルター１及び基準フィルター４で読み取る。
17．分解率（％）：100*（OD410対照−OD410処理）/OD410対照を計算する。
10mg/kg体重の割合で経口投与された動物における抑制率（％）は以下にリストされるとおりである。
0004067562.tif 000034
これらの研究で観察された架橋の反転の広範囲の程度は出願人による二つの重要な結論を強調する。第一に、in vivoで形成された架橋の大きな％はジ求核性の本発明のチアゾリウムをベースとする化合物による攻撃及び開裂を受け易く、こうして、推論により、これらの架橋はスキームＡ及びＢに示されたモデルと一致するα−ジケトンセグメントを含む。第二に、本発明の架橋分解剤は、本発明の単一のジ求核性の本発明のチアゾリウムをベースとする分子が一つより多いグリケーション架橋を攻撃し、その開裂を生じることができる意味で触媒的に作用し得る。
実施例11
この実施例は式Ｉの化合物、即ち、３−（２−フェニル−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド（ALT766）による処理後に正常な動物及び糖尿病の動物からのラット産の腱コラーゲンのCNBrペプチド地図の作成を記載する。ランドPBS中60℃で１時間水和されたストレプトゾトシン糖尿病ラット及び年齢適合対照動物からのコラーゲン繊維（5mg）、可溶性コラーゲンを除去し、ペレットをPBSで数回洗浄し、次いで30mMの濃度の３−（２−フェニル−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミドで16時間処理した。インキュベーション後に、ペレットを遠心分離し、洗浄し、30℃で48時間にわたってCNBr（ギ酸中40mg/ml）で処理した。CNBr消化産物を繰り返して凍結乾燥してCNBr及び酸を除去し、次いで還元条件下でSDS-PAGE（20％アクリルアミド）にかけた（レーン１、２及び９、MWS；レーン３、４及び５、非糖尿病動物からの尾部腱コラーゲン、３及び５を３−（２−フェニル−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミドで処理し、４をPBSで処理した；レーン６、７及び８、糖尿病動物からのコラーゲン、６及び８を３−（２−フェニル−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミドで処理し、７をPBSで処理した）。生じるゲルは図１に示されるとおりである。
実施例12
AGE-BSA及び架橋AGE-BSAの調製
下記の溶液を調製する。
１．緩衝液：0.4Mのリン酸ナトリウムpH7.4
NaH2PO4 : 6g/100ml
Na2HPO4 : 7g/100ml
一塩基性リン酸ナトリウムのpHを二塩基性リン酸ナトリウムアキシド（axide）で7.4に調節し、緩衝液100mlに添加した。
２．BSA溶液
BSA: Calbiochem型Ｖ；緩衝液１中400mg/ml。全容積を50g/125mlに調製した。0.45uフィルターで無菌の１リットルのコーニングフラスコに濾過した。
３．グルコース溶液400uM
グルコース：400mM 9g/125mlの緩衝液。0.45uフィルターで無菌の１リットルのコーニングフラスコに濾過した。
反応構成：
BSA及びグルコース溶液（夫々100ml）を１リットルの無菌のコーニングフラスコ中で混合し、しっかりとスクリュー−キャップし、振とうしないで56℃でインキュベートした。びんを週に一度開放して試験用アリコートを除去した。反応を９週間にわたって続け、その時AGE-BSAポリマー生成を観察した。
ポリマーの分解：
タンパク質が上澄み中に浸出されなくなるまで、AGE-BSAゲルの片をPBSで洗浄し、ペーパータオルでふいて乾燥させた。洗浄されたゲル約50mgを37℃で一夜にわたってPBSまたは10mmの３−（２−フェニル−２−オキソエチル）チアゾリウムブロミド（ALT766）とともにインキュベートした。上澄みをSDS-PAGEにより分析し、クーマシーブルーで染色した。得られるゲルを図２に示す。
実施例13
歯の表面で生じるような表面のタンパク質の変色を阻止する本発明のAGE架橋抑制剤及び反転剤の能力を更に研究するために、下記の表面褐変実験を行う。外皮被覆歯表面の代替物として、露出されておらず、現像された写真紙を使用して紙裏材に固定されたタンパク質（ゼラチン、即ち、コラーゲン）表面を得る。５mmの円形をパンチし、３mMのアジ化ナトリウムを含む0.5Mのリン酸塩緩衝液、pH7.4中の100mMのグルコース−６−ホスフェートの溶液中に50℃で１週間にわたって浸漬する。グルコース−６−ホスフェートはグルコースよりも速い速度で非酵素褐変に関与することができる糖である。グルコース−６−ホスフェートの他に、クロルヘキシジン及び／または式Ｉの化合物が含まれる。インキュベーション後に、ゼラチン／紙ディスクを水ですすぎ、褐色について観察し、写真に撮る。
グルコース−６−ホスフェート単独中のディスクのインキュベーションは緩衝液単独に浸軟されたディスクに対しわずかな褐色を示す。クロルヘキシジン（0.04％のクロルヘキシジンの最終濃度のPeridex▲Ｒ▼の形態）の混入は有意な褐変を示す。クロルヘキシジンへの式Ｉの化合物の添加は、クロルヘキシジンの不在下の式Ｉの化合物の混入と同様に、ゼラチンの褐変を完全に抑制する。
ゼラチン表面単独にグルコース−６−ホスフェートの作用により形成されたわずかな褐色及び式Ｉの化合物によるその阻止は、歯表面の非酵素褐変を阻止することにおける本発明の実用性を実証する。クロルヘキシジンの存在下で増進された褐変及び式Ｉの化合物によるその阻止は、クロルヘキシジンにより生じる抗プラーク剤増進非酵素褐変を阻止することにおける本発明の実用性を実証する。
実施例14
医療上妥当な生物分子中の望ましくない架橋を分解する本発明の化合物の全般の実用性の実証として、本件出願人はアルツハイマー病のアミロイドペプチドを用いて下記の実験を行った。この14kダルトンのペプチドはアルツハイマー病患者の脳柔組織内に形成する大きなプラークのような凝集物の主成分を含む。その他の異常な特徴、例えば、脈管周囲のアミロイド及び神経繊維タングルと一緒のこのようなアミロイドプラークの次第の蓄積はこの痴呆の神経毒性プロセス及びその他の病変プロセスの或るものを説明するものと考えられ、これは不可避に致命的であり、現在治癒できない。アルツハイマーのアミロイドペプチドはin vivoでAGE修飾を蓄積し、in vivoの生理的に妥当な濃度のグルコースへの露出後に、そのグリケーションがアルツハイマーのアミロイドプラークを連想させるペプチドの不溶性凝集物の形成を増進することが知られている。
合成により調製され、かつアルツハイマー病の典型的なプラーク中に見られるβ−アミロイドペプチドに配列上一致する可溶性β−アミロイドペプチドのアリコートを、β−ペプチドがグリケーション基質としてBSAに代えて使用された以外はAGE-BSAの調製について一般に上記されたようにして３ケ月にわたって中性の緩衝されたグルコース溶液中でインキュベートすることにより、AGE-β-ペプチドを調製した。in vivoでグルコースへのこの延長された露出後にグリケーションされ、架橋された、AGE-β-ペプチドをサイズ排除クロマトグラフィー（例えば、PFD-10カラムによる）により低分子量反応体から分離し、通常の方法によりヨウ素標識して下記の操作に従って分子AGE分解活性について化合物を試験またはスクリーニングするのに有益な所望の放射能標識試薬として125I-AGE-β-ペプチドを得た。125I-AGE-β-ペプチドのアリコートを、所定濃度（例えば、k 10mMの化合物766）の本発明の試験化合物を添加して、または添加しないで所定時間（例えば、一夜）にわたってインキュベートし、その後にインキュベーション混合物のサンプルを変性ゲル電気泳動（SDS-PAGE）のために調製し、公知操作に従って分析して見掛分子量を測定した。
得られる電気泳動ゲルで露出されたオートラジオグラムを、見掛分子量（SDS含有緩衝液中の電気泳動移動度）の関数としての放射能を記録するのに使用されるデジタルラジオグラフィック画像形成、分析系にスキャンした。この実験の結果の精査は、125I-AGE-β-ペプチドが本発明の“AGEブレーカー”化合物に露出されない場合、それが高分子量（>40kダルトン）バンドを溶離することを示し、そのグリケーションが凝集及び安定な共有結合架橋の形成により伴われることを示唆した。しかしながら、125I-AGE-β-ペプチドが最初に本発明のAGE架橋分解剤の溶液中でインキュベートされた場合、125I-AGE-β-ペプチドは最終ラジオグラム中の低分子量（>18kダルトン）のヨウ素標識物質の出現により示されるように有意に離解された。この実験は、本発明のジ求核性チアゾリウム様薬剤がタンパク質ストランド間の共有結合AGE媒介架橋を加水分解するのに使用し得ることを示唆するだけでなく、AGEのこのような抑制及び反転がヒト疾患に関係があるタンパク質のAGE蓄積の不利な分子結果を反転し得ることを示唆する。
実施例15
また、本発明の架橋構造及び関連化合物は、それに特異的に誘導される抗体を誘導するための抗原またはハプテンとして実用性がある。同様に、本発明のこのような抗体は順に本発明のAAA構造を同定するのに有益である。本発明の抗架橋構造抗体を使用するイムノアッセイを構築することにより、例えば、タンパク質がこのような架橋により修飾される程度が測定し得る。先に説明されたように、またこうして修飾されたタンパク質の半減期に依存して、ヘモグロビンの如きタンパク質サンプルに関する架橋エピトープの免疫化学的測定が最近のAGE形成のインデックスを与える。同様に、循環タンパク質及び／または組織タンパク質に関する架橋エピトープの免疫化学的検出が本発明の薬剤（これらの薬剤は進行性グリケーションの抑制及び分解のために指示される）による治療の経過を監視するのに使用し得る。
免疫原として使用するための架橋修飾BSAは、カルボジイミドのようなEDCの如き幾つかの公知の２価カップリング剤を使用して架橋構造をウシ血清アルブミン（BSA）とカップリングすることにより調製し得る。本明細書に詳しく記載されたものを限定しないで含む、本発明の架橋構造に相当する種々のその他のハプテン、抗原、及び接合免疫原は、インキュベーション混合物からの単離または直接の合成アプローチにより都合良く調製し得る。次いでこの架橋構造は特定のエピトープまたはその分子特徴を認識する種々の抗体を産生するための免疫原として使用されてもよい。
好ましい実施態様において、架橋構造それ自体はハプテンと考えられ、これは、当業界に広く行きわたっているプロトコルに従って、EDCの如き２価カップリング試薬を使用して、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、チログロビン、及び最も好ましくは、ウシ血清アルブミン（BSA）を含む、幾つかの好ましいキャリヤータンパク質のいずれかに同様にカップリングされる。
架橋構造（単独またはキャリヤータンパク質にカップリングされているかを問わない）は架橋構造の分子特徴に関する抗体の特異性のために幾つかの用途に有益である抗体及び関連免疫学的試薬を生成するための良く認められた免疫化プロトコルに使用し得る。
好ましいプロトコルに従って、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、及びニワトリを含む、幾つかの動物種のいずれかが免疫されて架橋構造−タンパク質接合体に対し誘導されるポリクローナル抗血清を産生し得る。前記動物種の最初の三つがハプテン特異性モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマのその後の産生に特に望ましい選択である。免疫動物の脾臓細胞からの前記ハイブリドーマの産生は当業界で広く実施されている幾つかのプロトコルのいずれかにより都合良く行われ、これらのプロトコルは適当な細胞系、例えば、ミエローマ細胞系との融合による免疫された脾臓細胞の不死化に適した条件を記載している。また、ハイブリドーマを生産するための前記プロトコルは免疫脾臓細胞／ミエローマ細胞ハイブリドーマを選択し、クローニングするための方法及び一つ以上の所望のエピトープに対し誘導される抗体を安定に分泌するハイブリドーマクローンを同定する方法を提供する。ウサギ及びヤギの如き動物種がポリクローナル抗血清の産生に普通に使用されるが、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体のいずれが最終的に所望されるかにかかわらず、ハプテン修飾キャリヤータンパク質は典型的には完全フロイントアジュバントの如きアジュバントと一緒に最初に投与される。免疫化は幾つかの経路、典型的には腹腔内、筋肉内または皮膚内のいずれかにより投与し得る。或る経路が免疫すべき種及び最終的に産生されるべき抗体の型に従って当業界で好ましい。続いて、ブースター免疫化が一般にミョウバンまたは不完全フロイントアジュバントの如きアジュバントと一緒に投与される。ブースター免疫化は初期免疫化後の或る間隔で投与される。一般に１ケ月が好適な間隔であり、血液サンプルが夫々のブースター免疫化の１週〜２週後に採取される。また、種々の所謂過免疫化スケジュール（これらは時間上一緒に近く隔置されたブースター免疫化を特徴とする）が抗キャリヤータンパク質抗体よりも優先的に抗ハプテン抗体を産生しようと努めて時々使用される。
後ブースト血液サンプルの抗体力価が、例えば、オクタロニー拡散ゲル及び直接ELISAプロトコルを含む幾つかの都合の良いフォーマットのいずれかのハプテン特異性免疫力価と比較し得る。典型的な直接ELISAにおいて、特定抗原がアッセイウェル表面、典型的には96ウェルまたはミクロタイタ・プレートフォーマットで固定され、続いてアッセイウェル表面のすすぎにより分離された一連のインキュベーションが行われて未結合の結合パートナーを除去する。非限定例として、アッセイプレートのウェルはハプテン／キャリヤー接合体の希薄な緩衝された水溶液を受け取ってもよく、好ましくはキャリヤータンパク質は試験すべき抗体産生動物を免疫するのに使用されたものとは異なる。例えば、AAA/KLH接合体免疫された動物からの血清が固定されたAAA/BSA接合体で装飾されたアッセイウェルに対し試験し得る。また、アッセイ表面はハプテン単独と一緒のインキュベーションにより装飾されてもよい。一般に、アッセイウェルの表面はその後にカゼインの如き無関係のタンパク質の溶液に露出されてプラスチック表面の占有されていない部位をブロックする。非特異的相互作用を最小にするための塩及び洗剤を典型的に含む中性緩衝液ですすいだ後に、ウェルはその後に関係する血液サンプルから調製された血清（一次抗血清）の連続希釈液の一つと接触される。再度すすいだ後に、所望のハプテンまたはハプテン／キャリヤー接合体との相互作用によりアッセイウェルに固定された試験抗体の程度が市販の酵素−抗体接合体と一緒のインキュベーションにより推測でき、この二次接合体の抗体部分が一次抗血清を産生するのに使用された種に対して誘導される。例えば、一次抗血清がウサギ中で産生された場合、ヤギ中で産生され、ホースラディッシュペルオキシダーゼの如き幾つかの酵素の一種に接合された抗ウサギ抗体の市販の製剤が二次抗体として使用し得る。製造業者により明記された操作に従って、この二次抗体の量がその後に比色アッセイにおける関連接合体酵素の活性により定量的に推測し得る。多くの関連のELISAプロトコルまたはラジオイムノメトリックプロトコル、例えば、競合ELISAまたはサンドイッチELISA（これらの全てが当業界で公知である）が必要により代替されて高力価の所望の抗血清、即ち、高希釈（例えば、1/1000より大きく、更に好ましくは1/10,000より大きい）で真の陽性結果を生じる特別な抗血清を同定し得る。
同様のイムノメトリックプロトコルが免疫された動物の脾臓細胞から調製されたハイブリドーマからの培養上澄み中の抗体の力価を推測するのに使用し得る。こうして抗血清またはハイブリドーマ上澄みを特性決定する際に、例えば、異なるキャリヤータンパク質、関連するが、構造上異なるハプテンまたは抗原と一緒の種々の対照インキュベーションを使用し、そしてアッセイ中の非特異的シグナルを最小にし、かつ偽陽性結果及び偽陰性結果から抗体特異性及び力価の信頼できる測定を同定するためにイムノメトリック操作中に種々の試薬を排除することが望ましい。これに関して使用する対照インキュベーションの型は公知である。また、同じ一般的なイムノメトリックプロトコルが続いて使用されてもよく、抗血清が高力価であり、生物学的サンプル、食品もしくはその他の食物、または関係するアミン含有物質及び生物分子の架橋構造中の特定の構造決定基に対し誘導されると上記操作により同定される。所望の抗アルデヒド修飾アマドリ生成物抗体（ポリクローナルまたはモノクローナルを問わない）のこの後者の適用は、指示及び必要によりその他の有益な試薬及び希釈剤（限定しないで、架橋構造の分子標準物質の組を含む）と一緒に、作業者の便宜のためにキット形態で提供し得る。
本発明はその精神または必須の特徴から逸脱しないでその他の形態で具体化されてもよく、またはその他の方法で行われてもよい。それ故、本開示は全ての点で例示と考えられるべきであり、限定と考えられるべきではなく、本発明の範囲は請求の範囲により示され、均等物の意味及び範囲内にある全ての変化がその中に含まれることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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