(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリグリセリドの２位の脂肪酸が炭素数16〜18の飽和脂肪酸であり、１及び３位の脂肪酸の少なくともひとつが、9,12,15-オクタデカトリエン酸 (α- リノレン酸；18：3,ω3）、6,9,12,15-オクタデカテトラエン酸 (ステアリドン酸；18：4,ω3）、11,14,17-エイコサトリエン酸 (ジホモ- α- リノレン酸；20：3,ω3）、8,11,14,17-エイコサテトラエン酸（20：4,ω3）、5,8,11,14,17-エイコサペンタエン酸（20：5,ω3）、7,10,13,16, 19-ドコサペンタエン酸（22：5,ω3）、4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸（22：6,ω3）、8,11,14-エイコサトリエン酸 (ジホモ- γ- リノレン酸；20：3,ω6）、5,8,11,14-エイコサテトラエン酸 (アラキドン酸；20：4,ω6）、7,10,13,16-ドコサテトラエン酸（22：4,ω6）、4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸（22：5,ω6）、6,9-オクタジエン酸（18：2,ω9）、8,11-エイコサジエン酸（20：2,ω9）及び5,8,11-エイコサトリエン酸 (ミード酸；20：3,ω9）からなる群から選ばれるω3、ω6又はω9系の不飽和脂肪酸であるトリグリセリドを製造する方法であって、トリグリセリドの２位の脂肪酸が炭素数16〜18の飽和脂肪酸であり、１及び３位の脂肪酸が中鎖脂肪酸である融点が45℃以下のトリグリセリドに、前記のω3、ω6又はω9系不飽和脂肪酸又はそのエステルの存在下で、1,3位特異的リパーゼを作用させてエステル交換反応によって目的のトリグリセリドを得ることを特徴とする当該トリグリセリドの製造方法。
【請求項２】
製造するトリグリセリドにおいて、トリグリセリドの２位の脂肪酸が炭素数１６〜１８の飽和脂肪酸であり、１及び３位の脂肪酸が同一のω3、ω6又はω9系の不飽和脂肪酸である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
製造するトリグリセリドにおいて、トリグリセリドの２位の脂肪酸が炭素数16〜18の飽和脂肪酸であり、１及び３位の脂肪酸が異なるω3、ω6又はω9系の不飽和脂肪酸である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
製造するトリグリセリドにおいて、トリグリセリドの２位の脂肪酸が炭素数16〜18の飽和脂肪酸であり、１及び３位の脂肪酸の一方が前記のω3、ω6又はω9系の不飽和脂肪酸であり、他方が炭素数４〜18の飽和脂肪酸である請求項１記載の方法。
【請求項５】
エステル交換反応のために用いる２位に炭素数16〜18の飽和脂肪酸が結合したグリセリドが、前記のω3、ω6及び／又はω9系不飽和脂肪酸をトリグリセリドの構成脂肪酸として生産する能力を有する微生物由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
エステル交換反応のために添加する前記のω3、ω6又はω9系の不飽和脂肪酸が、ω3、ω6又はω9系の不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするトリグリセリドの加水分解混合物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトリグリセリドの製造方法。
【請求項７】
トリグリセリドの２位の脂肪酸が、パルミチン酸またはステアリン酸である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
有機溶媒を使用しない反応系でエステル交換反応を行う、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
反応温度を45℃以下でエステル交換反応を行う、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新しいトリグリセリドの製造方法に関するもので、特にトリグリセリドの２位に炭素数１６〜１８の飽和脂肪酸を有し、１及び３位の少なくとも一方にω３、ω６及び／又はω９系の不飽和脂肪酸を有するトリグリセリドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
我々の摂取している脂質の大部分は中性脂肪であり、トリグリセリドの１, ２及び３位に種々の脂肪酸がエステル結合したトリグリセリドの混合物である。そして、脂肪酸の結合位置の違いにより、その生理活性が異なることが指摘されており、トリグリセリドの決まった位置に特定の脂肪酸を結合させた脂質（構造脂質）が、最近、特に注目されている。
【０００３】
例えば、特公平4-12920 には、トリグリセリドの２位に炭素数８〜１４の脂肪酸が結合し、１及び３位に炭素数が１８以上の脂肪酸が結合した消化吸収性の良いトリグリセリドが開示されている。また、２- モノグリセリドが人の生体に最も吸収され易い形態であると考えられていることから、特公平5-87497 には、２位に生理機能を有するω３又はω６系高度不飽和脂肪酸を結合させ、１及び３位に消化管の酵素により容易に加水分解される飽和脂肪酸を結合させたトリグリセリドが開示されている。
【０００４】
一方、脂肪酸の生理機能に目を向けると、近年、アラキドン酸及びドコサヘキサエン酸が注目されている。これら脂肪酸は、母乳中に含まれており、乳児の発育に役立つとの報告（「Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Research 」, Elsevier Science Publishers, 1993, pp.261-264 ）や、胎児の身長や脳の発育に重要であるとの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1073-1077 (1993), Lancet, 344, 1319-1322 (1994) ）がある。
【０００５】
そして、いくつかの公的機関から推奨摂取量が公表され（未熟児：アラキドン酸60、ドコサヘキサエン酸40；正常児：アラキドン酸20、ドコサヘキサエン酸20 mg/kg体重/ 日 (WHO-FAO (1994)）、ヨーロッパの数カ国では既にドコサヘキサエン酸と併せて醗酵生産したアラキドン酸をトリグリセリドとして配合した未熟児用調製乳が市販されている。しかし、調製乳に加えたトリグリセリドのアラキドン酸及び／又はドコサヘキサエン酸の結合位置に関しては考慮されていない。
【０００６】
人の母乳中のトリグリセリド構造は、トリグリセリドの２位にパルミチン酸（16:0）が結合する割合が高く、１及び３位に高度不飽和脂肪酸あるいは中鎖脂肪酸が結合する割合が高いと考えられている（Christie, W.W. (1986) The Positional Distribution of Fatty Acids in Triglycerids. Analysis of Oils and Fats in (Hamilton, R.J., and Russell, J.B., eds.) pp. 313-339, Elsevier Applied Science, London) 。
【０００７】
これに対し、前述の脂肪酸組成を母乳の組成に近付けるために調製乳に加えられる、醗酵法で生産されたアラキドン酸含有トリグリセリドの構造は、パルミチン酸を始めとする飽和脂肪酸が１及び３位に結合し、不飽和脂肪酸は２位に結合する割合が高く（J.J. Myher, A. Kuksis, K. Geher, P.W. Park, and D.A Diersen-Schade, Lipids  31, 207-215 (1996)）、人の母乳型と考えられているものとは明らかに異なっていた。
したがって、人の母乳型のトリグリセリド構造と考えられている構造脂質、つまり、トリグリセリドの２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸、１及び３位に高度不飽和脂肪酸又は中鎖脂肪酸が結合した、構造が明確に確認されている構造脂質の開発が強く望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、ヒト母乳型のトリグリセリド構造と考えられている構造脂質、つまり、トリグリセリドの２位が炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸であり、１及び３位に結合した不飽和脂肪酸の少なくともひとつがω３、ω６又はω９系不飽和脂肪酸である新規なトリグリセリド、もしくはトリグリセリドの２位が炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸であり、１及び３位の一方が炭素数が４〜１８の飽和脂肪酸であり、もう一方がω３、ω６又はω９系不飽和脂肪酸である新規なトリグリセリドの製造方法を提供しようとするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
１, ３位特異的リパーゼを用いたエステル交換反応によってトリグリセリドの２位に炭素数８〜１４の脂肪酸が結合し、１及び３位に炭素数が１８以上の脂肪酸が結合したトリグリセリドを製造する方法は、前述の特公平4-12920 に開示されている。しかし２位の脂肪酸が炭素数がさらに増加した炭素数１６〜１８の飽和脂肪酸からなるトリグリセリドを原料とし、１, ３位特異的リパーゼを用い、ω３、ω６又はω９系の不飽和脂肪酸とのエステル交換反応を行なうには、反応温度を５０℃以上にしなければならない。該反応は、固定化酵素を用いた反応であり、２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸が結合し、１, ３位にω３、ω６及び／又はω９系の不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを製造するには、反応温度が高くなると酵素の寿命が短くなることに加え、高度不飽和脂肪酸が変性する危険性を含んでいる。
【００１０】
そこで、本発明者等は上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸が結合しているグリセリドに、１, ３位のエステル結合に特異的に作用するリパーゼを作用させ、エステル交換反応によって１及び３位の少なくとも一方の脂肪酸がω３、ω６及び／又はω９系の不飽和脂肪酸となったトリグリセリドを製造するに際し、一旦、トリグリセリドの２位の脂肪酸が炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸であり、１及び３位の脂肪酸が中鎖脂肪酸である融点が４５℃以下のトリグリセリドを原料として用いるかまたはそれを中間体として経由させることよって、目的とするトリグリセリドを製造することが出来ることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、トリグリセリドの２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸が結合し、１及び３位の少なくとも一方にω３、ω６及び／又はω９系不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを、２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを基質として用い、ω３、ω６及び／又はω９系不飽和脂肪酸又はそのエステルの存在下で、１, ３位に特異的に作用するリパーゼによるエステル交換反応によって製造することができる。
【００１２】
２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドとしては、例えば、トリパルミチン（１, ２及び３位の全てがパルミチン酸（16:0））、トリステアリン（１, ２及び３位の全てがステアリン酸（18:0））を挙げることができるが、トリグリセリドの構成飽和脂肪酸の炭素数が１６以上の場合は、これに１, ３位特異的リパーゼとω３、ω６又はω９系不飽和脂肪酸とを、有機溶媒を含まない反応系中で、５０℃以下で反応させたとき、１, ３位でのエステル交換反応はほとんど進まず、目的とする構造を持ったトリグリセリドは得られない。
【００１３】
これは、リパーゼが液体状の油脂には作用するが、固体状の油脂にはほとんど作用しないという性質に起因している。したがって、トリグリセリドの構成飽和脂肪酸の炭素数が多くなると融点が高くなる分、これに応じて反応温度を高くする必要がある。例えば、トリパルミチンを使用する場合には、反応液組成によって異なるが反応は５０〜７０℃で行わなければならない。このため、酵素の失活とエステル交換のために添加した不飽和脂肪酸の変性が問題となる。
【００１４】
そこで、これら融点の高いトリグリセリドを基質原料として用いるときには、エステル交換で１及び３位の脂肪酸を目的とする不飽和脂肪酸に交換する前に、例えば、原料トリグリセリドの１及び／又は３位に結合している脂肪酸をカプリル酸のような炭素数８〜１２程度の中鎖脂肪酸又はオレイン酸、リノール酸などの融点の低い脂肪酸にエステル交換し、融点を４５℃以下に低下させたトリグリセリドを原料として使用すると良いことを明らかにした。
【００１５】
また、この方法では、一旦１位または３位に結合した高度不飽和脂肪酸は、その後にさらに１, ３位特異的リパーゼを作用させてもエステル交換を起こしにくく、中鎖脂肪酸が優先的にエステル交換されるため、反応を繰り返すことによって、目的の２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸が結合し、１及び／又は３位にω３、ω６及び／又はω９系不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドの収量を増加させることができることも明らかにした。
【００１６】
本発明の特徴を明確にするために、トリグリセリドに結合した脂肪酸がすべて同じで炭素数１６〜１８の飽和脂肪酸である場合を例に説明したが、トリグリセリドにエステル結合する脂肪酸はすべて同じである必要はなく、トリグリセリドの２位に炭素数１６〜１８の飽和脂肪酸が結合していれば、１及び３位には炭素数４〜１８のいかなる脂肪酸が結合していてもまたいかなる組み合わせでも良く、４５℃以下で反応を行うことのできるトリグリセリドを基質として用いることは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００１７】
また、２位に飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドとは、本発明の目的からして２位に炭素数１６〜１８の飽和脂肪酸が結合していれば、１及び３位のいずれかに、ω３, ω６又はω９系不飽和脂肪酸が結合していても構わず、これらの基質を用いた場合は不飽和脂肪酸の結合していない位置にω３, ω６又はω９系不飽和脂肪酸をエステル交換にて導入することができ、１及び３位に結合しているω３、ω６及び／又はω９系の不飽和脂肪酸の含量を高めることができる。
【００１８】
たとえば、２位が飽和脂肪酸で１及び３位のいずれかに不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドとして、クリプテコデニウム（Crypthecodenium ）属、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）属、シゾキトリウム（Schizochytrium）属、ウルケニア（Ulkenia ）属、ジャポノキトリウム（Japonochytorium ）属又はハリフォトリス（Haliphthoros）属の微生物を培養して得られた油脂が利用できる。
【００１９】
これらからは、例えば１, ２−ジパルミトイル−３−ドコサヘキサノイルトリグリセリドを単離することができ、このトリグリセリドを基質に１, ３位特異的リパーゼを作用させ、ω３、ω６又はω９系不飽和脂肪酸もしくはその脂肪酸エステルとエステル交換させると、前述のようにドコサヘキサエン酸はほとんどエステル交換されないため、１位のパルミチン酸のみがエステル交換される。不飽和脂肪酸としてアラキドン酸を用いた場合には、１及び３位の一方にドコサヘキサエン酸が結合し、他方にアラキドン酸が結合し、２位にパルミチン酸が結合したトリグリセリドが製造できる。
【００２０】
本発明には、トリグリセリドの１, ３位特異的リパーゼを触媒として用いることができ、特に限定されるものではないが、例えば、リゾプス（Rhizopus）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、ムコール（Mucor ）属、ペニシリウム（Penicillium ）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属、フミコーラ（Humicola）属、フザリウム（Fusarium）属などの微生物が生産するリパーゼ、ブタ膵臓リパーゼなどが挙げられる。かかるリパーゼについては、市販のものを用いることができる。
【００２１】
例えば、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）のリパーゼ（田辺製薬（株）製；タリパーゼ）、リゾムコール・ミイハイ（Rhizomucor miehei ）のリパーゼ（ノボ・ノルディスク（株）製；リボザイムIM）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）のリパーゼ（天野製薬（株）製；リパーゼA ）、フミコーラ・ランギノーサ（Humicola lanuginosa ）のリパーゼ（ノボ・ノルディスク（株）製；リポラーゼ）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus ）のリパーゼ（天野製薬（株）製；リパーゼM ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum ）のリパーゼ等が挙げられる。これらのリパーゼの使用形態はそのままで用いても良く、また、セライトやイオン交換樹脂、セラミックス担体などに固定化したリパーゼを用いてもよい。
【００２２】
本反応系に加える水分量は極めて重要で、水をまったく含まない場合はエステル交換が進行せず、また、水分量が多い場合は加水分解が起こり、トリグリセリドの回収率が低下したり、生成した部分グリセリドでは自発的なアシル基転移が起こり、２位の飽和脂肪酸が１位あるいは３位に転移する。従って、結合水を持たない固定化酵素を用いたとき、主反応を行う前に、まず、水を添加した基質を用いて酵素を活性化し、主反応では水を添加していない基質を用いると効果的である。バッチ反応で活性化するには、加えた酵素量の０〜１, ０００% （重量% ）の水を含む基質を用いて酵素を前処理し、またカラム法で活性化するには、水飽和の基質を連続的に流すとよい。
【００２３】
例えば、セライト又はセラミックス担体に固定化したリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）のリパーゼ（田辺製薬（株）製；タリパーゼ）を用いてバッチ反応で活性化する時の水分量は、加えた酵素量の１０〜２００% （重量% ）である。しかし、エステル交換反応の活性化に必要な水分量は用いる酵素の種類により大きく左右され、例えば、リゾムコール・ミイハイ（Rhizomucor miehei ）のリパーゼ（ノボ・ノルディスク（株）製；リボザイムIM）であれば、ほとんど水分を必要とせず、むしろ過剰の水を除去しなければならない。過剰水の除去は主反応を妨害しないトリグリセリドを基質として選択し、これを固定化酵素で加水分解するとよい。
【００２４】
バッチ反応におけるリパーゼの使用量は反応条件によって適宜決定すれば良く、特に制限されるものではないが、例えばセライトやセラミックス担体に固定化したリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）のリパーゼ、あるいはリゾムコール・ミイハイ（Rhizomucor miehei ）のリパーゼを用いたときには、反応混液の１〜３０% （重量% ）が適量である。
【００２５】
バッチ反応におけるエステル交換反応は、以下の方法により行う。すなわち、２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドに、ω３、ω６又はω９系不飽和脂肪酸あるいはその脂肪酸エステルを加える。脂肪酸エステルとしては、例えばメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステルなどを用いることができる。原料として用いるトリグリセリド／脂肪酸またはトリグリセリド／脂肪酸エステル比は１：０. ５〜２０が適量である。この基質に適当な量（通常５, ０００〜５０, ０００U/g ；ここでリパーゼ１Ｕとは、オリーブ油を基質として用い、１分間に１μmol の脂肪酸を遊離させる酵素量である）の活性化または脱水した１, ３位特異的リパーゼを加え、攪拌または振盪しながら４５℃以下、好ましくは３０℃付近で２〜１００時間エステル交換反応を行えばよい。
【００２６】
上記固定化酵素は繰り返し使用することができる。すなわち、反応後固定化酵素だけを反応器内に残し、反応液を新たに調製した基質と交換することにより反応を継続することができる。また、カラム法によるエステル交換反応は、酵素１g 当り、０. ０５〜２０ml/hr で基質を連続的に流すとよい。
また、エステル交換反応を繰り返して行うことにより、目的のトリグリセリド含量を高めることができる。すなわち、ω３、ω６又はω９系不飽和脂肪酸もしくはその脂肪酸エステルの存在下に、トリグリセリドの１, ３位特異的リパーゼを作用させて、１及び３位の脂肪酸がω３、ω６及び／又はω９系不飽和脂肪酸にエステル交換された反応液を得る。
【００２７】
次に、該反応溶液から後述する方法によりトリグリセリドを精製し、該精製トリグリセリドを原料として再度ω３、ω６又はω９系不飽和脂肪酸またはその脂肪酸エステルでエステル交換反応を行う。この繰り返しエステル化反応により目的のトリグリセリド含有量を飛躍的に高めることができ、繰り返し回数は２〜５回が好ましい。
【００２８】
従来の固定化リパーゼを用いたエステル交換反応では、副反応として起こる加水分解反応により生成した部分グリセリドの２位に結合していた脂肪酸のアシル基転移が誘発された。しかし、本発明では、加水分解反応をほぼ完全に抑えることができ、部分グリセリドの生成量は１% 程度であり、従来の問題点を解決することができた。また、基質に含まれている水分含量が数千ppm 以下であれば、副反応として起こる加水分解を無視することができ、基質中に含まれる水分量を精密制御する必要がないという特徴を有している。
【００２９】
さらに、従来の固定化酵素を用いた有機溶媒中での反応あるいは５０℃以上の反応では数回の使用で酵素活性が低下したのに対して、本発明では有機溶媒を用いない反応系で４５℃以下で反応を行うため酵素の失活が起こらず、バッチ反応で数十回以上、カラム反応で１００日以上連続して酵素を使用することも可能である。
【００３０】
本発明では、基質が単純であるために、反応により得られたトリグリセリドは数種の分子種から構成される。そこで、液体クロマトグラフィー、分子蒸留、流下膜蒸留、精密蒸留などの常法あるいはその組み合わせにより、目的のトリグリセリドを容易に単離することができる。本発明で製造する反応後のトリグリセリドは、１位及び／又は３位に不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドであり、該トリグリセリド、未反応原料、未反応の不飽和脂肪酸または脂肪酸エステル及びエステル交換されて生じた原料のトリグリセリドの１及び／又は３位に結合していた脂肪酸または該脂肪酸エステルとの混合物として存在している。
【００３１】
そこで、目的の１位及び／又は３位に不飽和脂肪酸が結合し、２位に炭素数が１６〜１８の飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドの精製は、アルカリ脱酸、水蒸気蒸留、分子蒸留、流下膜蒸留、真空精密蒸留、カラムクロマトグラフィー、溶剤抽出、膜分離のいずれか又はこれらを組み合わせることにより、上記のエステル交換された脂肪酸及び未反応の不飽和脂肪酸を除去することによって行うことができる。
【００３２】
本発明で得られるトリグリセリドの１及び３位を構成する脂肪酸はω３、ω６及び／又はω９系不飽和脂肪酸からなる。具体的には、ω３系不飽和脂肪酸としては、9, 12, 15-オクタデカトリエン酸 (α- リノレン酸) ［18：3,ω3 ］、6, 9, 12, 15- オクタデカテトラエン酸 (ステアリドン酸) ［18：4,ω3 ］、11, 14, 17- エイコサトリエン酸 (ジホモ- α- リノレン酸) ［20：3,ω3 ］、8, 11, 14, 17-エイコサテトラエン酸［20：4,ω3 ］、5, 8, 11, 14, 17- エイコサペンタエン酸［20：5,ω3 ］、7, 10, 13, 16, 19-ドコサペンタエン酸［22：5,ω3 ］、4, 7, 10, 13, 16, 19- ドコサヘキサエン酸［22：6,ω3 ］を挙げることができる。
【００３３】
また、ω６系不飽和脂肪酸としては、9, 12-オクタデカジエン酸 (リノール酸) ［18：2,ω6 ］、6, 9, 12- オクタデカトリエン酸 (γ- リノレン酸) ［18：3,ω6 ］、8, 11, 14-エイコサトリエン酸 (ジホモ- γ- リノレン酸) ［20：3,ω6 ］、5, 8, 11, 14- エイコサテトラエン酸 (アラキドン酸) ［20：4,ω6 ］、7, 10, 13, 16-ドコサテトラエン酸［22：4,ω6 ］、4, 7, 10, 13, 16, - ドコサペンタエン酸［22：5,ω6 ］を挙げることができる。さらに、ω９系不飽和脂肪酸としては、6, 9- オクタデカジエン酸［18：2,ω9 ］、8, 11-エイコサジエン酸［20：2,ω9 ］、5, 8, 11- エイコサトリエン酸 (ミード酸) ［20：3,ω9 ］挙げることができる。さらに、アシル基はヒドロキシル化、エポキシ化、又はヒドロキシエポキシ化されたアシル基であっても構わない。
本発明の新規なトリグリセリドの２位を構成する脂肪酸は、炭素数１６〜１８の脂肪酸からなる。例えば、パルミチン酸 (16：0 ）、ステアリン酸 (18：0 ）を挙げることができる。
【００３４】
【実施例】
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本実施例では、便宜的に脂肪酸およびトリグリセリドを次のような略号で示す。
まず、脂肪酸を表わす一文字略号には次のものを用いる。
８：カプリル酸、Ｐ：パルミチン酸、Ａ：アラキドン酸、Ｍ：ミード酸、Ｄ：ドコサヘキサエン酸。次に、トリグリセリドを、１位に結合している脂肪酸を表わす一文字略号、２位に結合している脂肪酸を表わす一文字略号、３位に結合している脂肪酸を表わす一文字略号により三文字で表記する。従って、トリグリセリドの構造は例えば次の例のように表記される。例：８Ｐ８（１位にカプリル酸、２位にパルミチン酸、３位にカプリル酸が結合したトリグリセリド）
【００３５】
実施例１．
トリパルミチン（ＰＰＰ）とカプリル酸の１：２（wt/wt ）混液を基質原料として使用し、基質混液１０．５g と固定化リゾムコール・ミイハイ（Rhizomucor miehei ）リパーゼ（ノボ・ノルディスク（株）製；リボザイムIM60）１．２g からなる反応液をねじ蓋付きバイアル瓶に入れ、５０℃で４８時間振盪（１４０回／分）しながらインキュベートした。反応後、固定化酵素だけを残して反応液を新しい基質混液と交換し、同じ条件下で反応を行った。固定化酵素を繰り返し使用しながら４回反応を行い、それぞれの反応液を回収した。
【００３６】
各反応液（１０．５g ）に７０mlの０．５N KOH 溶液（２０% エタノール溶液）を加え、１００mlのヘキサンでグリセリド画分を抽出後、エバポレーターにより溶剤を除去してグリセリドを回収した。イヤトロスキャン（ヤトロン（株）社製）でグリセリド組成を調べた結果、１回目のグリセリド中には８% のジグリセリドが含まれていたが、２回目以降のグリセリド中の部分グリセリド含量は１% 以下であった。２〜４回目のグリセリド画分の脂肪酸組成（モル% ）はカプリル酸４５．１% 、パルミチン酸５４．９% であった。
【００３７】
カプリル酸の交換率を高めるため、２〜４回目のグリセリド画分を原料として再度エステル交換した。上記の反応に使用したリボザイム IM60 （１．２g ）に、調製したグリセリド３．５g とカプリル酸７g を加え、３０℃で４８時間振盪しながら反応を行った（５回目）。反応後、反応液を新しい基質と交換して同じ条件下で反応を行った（６回目）。５、６回目の反応液からグリセリド画分をヘキサン抽出により回収した（合計４. ８g ）。得られたグリセリドの脂肪酸組成（モル% ）はカプリル酸６４．２% 、パルミチン酸３５．８% であった。このグリセリド中に含まれる部分グリセリドは１% 以下であり、アセトン／アセトニトリル（１：１, vol/vol ）を溶出溶媒としてＯＤＳカラム（Wakosil-II 3C18, 4.6 x 150mm, ２本）で分析した結果、８Ｐ８の純度は９３% であった。
【００３８】
得られた８Ｐ８（３．５g ）とアラキドン酸（純度９０% ）７g を原料とし、上記の反応に用いたリボザイム IM60 で３０℃で４８時間エステル交換反応を行い（７回目）、反応後の反応液をアルカリ条件下でヘキサン抽出し、グリセリド画分（４．８g ）を得た。グリセリドの脂肪酸組成を分析したところ、カプリル酸、パルミチン酸、γ- リノレン酸、アラキドン酸はそれぞれ３８．５、２３．１、２．４及び３４．０モル% であった。このグリセリドをアセトン／アセトニトリル（１：１, vol/vol ）を溶出溶媒としてＯＤＳカラム（SH-345-5, 20 x 500mm YMC（社）製）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより分画した結果、８ＰＡとＡＰＡがそれぞれ０．７２、０．４４g 得られた。
【００３９】
実施例２．
実施例１に記載した方法の１００倍の規模で反応を行って８Ｐ８を調製し、原料として使用した。
リゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）のリパーゼ（田辺製薬（株）製；タリパーゼ）をJ. Ferment. Bioeng., 81, 299-303 (1996) に従ってセラミックス担体 SM-10（日本ガイシ（株）製）に固定化した。固定化酵素１０g （３１, ０００U/g ）をカラムに充填した後、水飽和の大豆油：カプリル酸１：２（wt/wt ）混合液を３０℃、流速３ml/hr で１００ml流し固定化酵素を活性化した。
【００４０】
次いで水を加えていない大豆油５０mlを流して過剰水を除去した後、８Ｐ８とアラキドン酸エチルエステル（純度９０% ）の１：４（wt/wt ）混液を同じ条件で流しながらエステル交換反応を行った。反応液１００g を高真空下で蒸留してグリセリド画分を残査として回収した後、実施例１に従ってアルカリ条件下でヘキサン抽出した。エバポレーターにより溶媒を除去し、ヘキサン抽出物３５. ７g を得た。このヘキサン抽出物に含まれているトリグリセリドと脂肪酸エステルの組成比をイヤトロスキャンで分析したところ９１：９であった。また、脂肪酸組成を分析した結果、カプリル酸、パルミチン酸、γ- リノレン酸、ジホモ- γ- リノレン酸及びアラキドン酸は、それぞれ２４．４、３４．５、１．５、２．６及び３７．０モル% であった。
【００４１】
実施例３．
実施例１で用いた固定化リゾムコール・ミイハイ（Rhizomucor miehei ）リパーゼ（ノボ・ノルディスク（株）製；リボザイムIM60）に含まれている過剰の水を除去するために、該固定化酵素１２g 、ＳＵＮＴＧＡ- ２５（サントリー（株）製）６０g からなる反応混液を１００mlのねじ蓋付きバイアル瓶に入れ、３０℃で４８時間振盪しながら反応させた（１回目）。固定化酵素だけを反応器に残し、実施例２で作成した８Ｐ８（１２g ）とミード酸エチルエステル（純度９０% ）４８g を加えて十分窒素置換した後、３０℃で７２時間振盪しながらエステル交換反応を行った（２、３回目）。
【００４２】
反応後、２回目と３回目の反応混液を合わせ、そのうち１００g を実施例２と同様に、高真空下で蒸留してグリセリド画分を残査として回収した。次いで、実施例１に従ってアルカリ条件下でヘキサン抽出した後、エバポレーターによりヘキサンを除去し、２４．１g のグリセリド画分を得た。この中に含まれているトリグリセリドと脂肪酸エステルの組成比をイヤトロスキャンで分析したところ９２：８であった。実施例１に従って高速液体クロマトグラフィーを行い示差屈折計のピーク面積から脂肪酸エステルと各トリグリセリド成分を定量したところ、ＭＰＭは１２．０％であった。またこの画分の脂肪酸組成は、カプリル酸、パルミチン酸及びミード酸がそれぞれ３１．２、３５．７及び３３．１モル％であった。
【００４３】
エステル交換率を高めるために、得られたエステル交換トリグリセリドを再度ミード酸エチルエステルでエステル交換した。上記の固定化酵素にエステル交換トリグリセリド１２g とミード酸エチルエステル４８g を加えて３０℃で７２時間振盪しながら反応を行った（４回目）。反応後、反応液５５g を上述した方法で蒸留し、１２. ３g のグリセリド画分を得た。この画分の脂肪酸組成は、カプリル酸、パルミチン酸及びミード酸がそれぞれ５．２、３８．６及び５６．１モル％であった。
【００４４】
実施例４．
実施例１で用いた固定化リゾムコール・ミイハイ（Rhizomucor miehei ）リパーゼ（ノボ・ノルディスク（株）製；リボザイムIM60）に含まれている過剰の水を除去するために、該固定化酵素２g 、ＳＵＮＴＧＡ- ２５（サントリー（株）製）１０g からなる反応混液を２０mlのねじ蓋付きバイアル瓶に入れ、３０℃で４８時間振盪しながら反応させた（１回目）。固定化酵素だけを反応器に残し、実施例２で作成した８Ｐ８（１２g ）とＳＵＮＴＧＡ- ２５を加水分解して得られた脂肪酸混液８g を加えて十分窒素置換した後、３０℃で４８時間振盪しながらエステル交換反応を行った（２〜５回目）。反応後、２〜５回目の反応混液からヘキサン抽出したグリセリドを合わせ、再度のエステル交換反応の基質とした。
【００４５】
上記の固定化酵素の入った反応器にエステル交換トリグリセリド２g とＳＵＮＴＧＡ- ２５由来の脂肪酸混液１０g を加え、３０℃で４８時間振盪しながら反応させた（６、７回目）。６、７回目の反応混液からグリセリド画分を抽出し、再々度のエステル交換反応の基質とし、同様に反応を行った（８回目）。エステル交換反応を３回繰り返すことにより得られたトリグリセリドを構成する脂肪酸組成、トリグリセリドの１，３位および２位の各脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーにより分析した。この結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
0004079516.tif 000002
【００４７】
比較例１．
実施例２で作成した８Ｐ８と固定化酵素をそれぞれ原料および触媒として使用した。固定化酵素２ｇ、大豆油４ｇ、カプリル酸８ｇおよび水０．５ｇを２０ｍｌのバイアル瓶に入れ、３０℃で２４時間振盪しながらインキュベートすることにより固定化酵素を活性化した。活性化した酵素を反応器内に残し、これに水を含まない基質、アラキドン酸／８Ｐ８（４：１，wt/wt ）あるいは、アラキドン酸／ＰＰＰ（４：１，wt/wt ）を加え、前者の反応は３０℃で後者の反応は５０℃で振盪しながら行った。また反応は２４時間毎に反応液を新らしい基質と交換しながら繰り返し固定化酵素の安定性を比較した。
【００４８】
基質にＰＰＰを用いて５０℃で反応を繰り返したとき固定化酵素を７回使用した後ではアラキドン酸の取り込み量は最初の取り込み量の１０％以下に低下した（１回目と７回目のアラキドン酸の取り込み量はそれぞれ４７％と３％）。一方、基質に８Ｐ８を用いて３０℃で反応を繰り返したとき固定化酵素を５０回使用してもアラキドン酸の取り込み量はほとんど変わらなかった（１回目と５０回目のアラキドン酸の取り込み量はそれぞれ４１％と３８％）。