(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソラフェンＡ（ｓｏｒａｐｈｅｎ  Ａ）阻害に耐性である酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子からなる単離されたＤＮＡ分子であって、前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、
ａ）アミノ酸位置７７におけるセリンをチロシンに変換する変異、
ｂ）アミノ酸位置５０におけるバリンをフェニルアラニンに、そして、アミノ酸位置７３におけるリジンをアルギニンに変換する変異、
ｃ）アミノ酸位置５３におけるヒスチジンをアルギニンに、そして、アミノ酸位置５７におけるスレオニンをアラニンに変換する変異、又は、
ｄ）アミノ酸位置７７におけるセリンをチロシンに、アミノ酸位置５０におけるバリンをフェニルアラニンに、そして、アミノ酸位置５３におけるヒスチジンをアルギニンに変換する変異、
からなる群から選択される変異からなるＤＮＡ分子。
【請求項２】
変異が優性である請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
遺伝子がビオチンカルボキシラーゼドメイン内で変異されている請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
遺伝子がシングルポイント変異を発現する請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
変異が、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのリン酸化又は脱リン酸化を阻害する請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
ソラフェンＡ阻害に耐性である精製された酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼであって、前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、
ａ）アミノ酸位置７７におけるセリンをチロシンに変換する変異、
ｂ）アミノ酸位置５０におけるバリンをフェニルアラニンに、そして、アミノ酸位置７３におけるリジンをアルギニンに変換する変異、
ｃ）アミノ酸位置５３におけるヒスチジンをアルギニンに、そして、アミノ酸位置５７におけるスレオニンをアラニンに変換する変異、又は、
ｄ）アミノ酸位置７７におけるセリンをチロシンに、アミノ酸位置５０におけるバリンをフェニルアラニンに、そして、アミノ酸位置５３におけるヒスチジンをアルギニンに変換する変異、
からなる群から選択される変異からなるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ。
【請求項７】
請求項６に記載のソラフェンＡ阻害に耐性である酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを精製する方法であって；
（ａ）酵母細胞のホモジネート化；
（ｂ）タンパク質の沈澱；及び
（ｃ）沈澱したタンパク質のアビジンアフィニティクロマトグラフィーからなる方法。
【請求項８】
請求項６に記載のソラフェンＡに耐性である精製した組換え酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを製造する方法であって；
（ａ）請求項６に記載のソラフェンＡ耐性酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている組換えＤＮＡで、宿主有機体を形質転換し；そして
（ｂ）宿主有機体又はその培養上澄液から、タンパク質を単離することからなる方法。
【請求項９】
宿主有機体が、細菌、酵母そして昆虫細胞からなる群から選択される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ソラフェンＡ阻害に耐性である酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼが精製される請求項７ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項６に記載のソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤を確認するためのアッセイであって；
（ａ）請求項６に記載のソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼとその基質からなる１番目の試料をインキュベートし；
（ｂ）段階（ａ）におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの反応性を測定し；
（ｃ）酵素の活性を阻害する疑いのある化合物を含有する試料の存在下で、ソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼとその基質からなる２番目の試料をインキュベートし；
（ｄ）段階（ｃ）におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの反応性を測定し；そして；
（ｅ）段階（ａ）と（ｃ）におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの反応性を比較することからなる方法。
【請求項１２】
請求項６に記載のソラフェンＡ耐性である酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤を確認するための検定法であって；
（ａ）ソラフェンＡに耐性である酵母の１番目の培養物を生育して生育曲線を記録し；
（ｂ）ソラフェンＡに耐性であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの反応性を阻害すると疑われている化合物を含有する試料の存在下で、ソラフェンＡに耐性である酵母の２番目の培養物を生育しそして生育曲線を記録し；そして
（ｃ）そして段階（ａ）と（ｂ）で記録した生育曲線を比較することからなる検定法。
【請求項１３】
請求項６に記載のソラフェンＡ耐性であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの変異からできたものである、単離した、ソラフェンＡに耐性である酵母株。
【請求項１４】
請求項１３記載の単離した酵母株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ソラフェンＡ阻害に耐性であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子；これらの遺伝子を単離する方法；精製した、ソラフェンＡ阻害に耐性であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ及びソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤を確認するための検定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１８員環のマクロライド：ソラフェンＡは、粘液細菌Sorangium cellulosum, So ce 26株の第２次代謝物である。ソラフェンＡの化学構造式を式（Ｉ）に示す。
【化１】
0004103096.tif 000002
今まで、６０種以上のソラフェンＡの天然変種株を単離できた（"Wissenschaftlicher Ergebnisbericht“の中の36-40 頁,Augustiniak et al, "Chemische Arbeiten“, GBF Braunschweig,1989)。ソラフェンＡは殺カビ剤として強い活性を示すが、その一方細菌には影響がない。その一つの例として、それが、脂肪酸生合成で重要な酵素であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを阻害することが示された(Prizun, "Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus von Soraphen A“,Technische Unversitaet Braunschweig, 博士学位論文) 。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題と課題を解決するための手段】
本発明は、ソラフェンＡ（ｓｏｒａｐｈｅｎ  Ａ）阻害に耐性である酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子からなる単離されたＤＮＡ分子であって、前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、
ａ）アミノ酸位置７７におけるセリンをチロシンに変換する変異、
ｂ）アミノ酸位置５０におけるバリンをフェニルアラニンに、そして、アミノ酸位置７３におけるリジンをアルギニンに変換する変異、
ｃ）アミノ酸位置５３におけるヒスチジンをアルギニンに、そして、アミノ酸位置５７におけるスレオニンをアラニンに変換する変異、又は、
ｄ）アミノ酸位置７７におけるセリンをチロシンに、アミノ酸位置５０におけるバリンをフェニルアラニンに、そして、アミノ酸位置５３におけるヒスチジンをアルギニンに変換する変異、
からなる群から選択される変異からなるＤＮＡ分子に関する。
また本発明は、変異が優性である前記ＤＮＡ分子に、遺伝子がビオチンカルボキシラーゼドメイン内で変異されている前記ＤＮＡ分子に、遺伝子がシングルポイント変異を発現する前記ＤＮＡ分子に、そして、変異が、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのリン酸化又は脱リン酸化を阻害する前記ＤＮＡ分子に関する。
さらに本発明は、ソラフェンＡ阻害に耐性である精製された酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼであって、前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、
ａ）アミノ酸位置７７におけるセリンをチロシンに変換する変異、
ｂ）アミノ酸位置５０におけるバリンをフェニルアラニンに、そして、アミノ酸位置７３におけるリジンをアルギニンに変換する変異、
ｃ）アミノ酸位置５３におけるヒスチジンをアルギニンに、そして、アミノ酸位置５７におけるスレオニンをアラニンに変換する変異、又は、
ｄ）アミノ酸位置７７におけるセリンをチロシンに、アミノ酸位置５０におけるバリンをフェニルアラニンに、そして、アミノ酸位置５３におけるヒスチジンをアルギニンに変換する変異、
からなる群から選択される変異からなるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼに関する。
また本発明は、前記ソラフェンＡ阻害に耐性である酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを精製する方法であって；
（ａ）酵母細胞のホモジネート化；
（ｂ）タンパク質の沈澱；及び
（ｃ）沈澱したタンパク質のアビジンアフィニティクロマトグラフィーからなる方法。
さらに本発明は、前記ソラフェンＡに耐性である精製した組換え酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを製造する方法であって；
（ａ）請求項６に記載のソラフェンＡ耐性酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている組換えＤＮＡで、宿主有機体を形質転換し；そして
（ｂ）宿主有機体又はその培養上澄液から、タンパク質を単離することからなる方法に関する。
そして本発明は、宿主有機体が、細菌、酵母そして昆虫細胞からなる群から選択される、前記方法に、また、ソラフェンＡ阻害に耐性である酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼが精製される、前記方法に関する。
また本発明は、前記ソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤を確認するためのアッセイであって；
（ａ）請求項６に記載のソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼとその基質からなる１番目の試料をインキュベートし；
（ｂ）段階（ａ）におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの反応性を測定し；
（ｃ）酵素の活性を阻害する疑いのある化合物を含有する試料の存在下で、ソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼとその基質からなる２番目の試料をインキュベートし；
（ｄ）段階（ｃ）におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの反応性を測定し；そして；
（ｅ）段階（ａ）と（ｃ）におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの反応性を比較することからなる方法に関する。
さらに本発明は、前記ソラフェンＡ耐性である酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤を確認するための検定法であって；
（ａ）ソラフェンＡに耐性である酵母の１番目の培養物を生育して生育曲線を記録し；
（ｂ）ソラフェンＡに耐性であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの反応性を阻害すると疑われている化合物を含有する試料の存在下で、ソラフェンＡに耐性である酵母の２番目の培養物を生育しそして生育曲線を記録し；そして
（ｃ）そして段階（ａ）と（ｂ）で記録した生育曲線を比較することからなる検定法に関する。
そして本発明は、前記ソラフェンＡ耐性であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの変異からできたものである、単離した、ソラフェンＡに耐性である酵母株、並びに前記した単離した酵母株に関する。
本発明の主な目的は、ソラフェンＡ耐性遺伝子を提供することであって、その遺伝子は、その遺伝子を持つ宿主有機体にソラフェンＡ耐性を付与することができる。今や驚くべきことに、真菌のモデルシステムである酵母中で単離される範囲の全てのソラフェンＡ耐性遺伝子は、単一の遺伝子中で変異されていることが見出された。その遺伝子は酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのそれであると確認され、そのＤＮＡ塩基配列は既知である（Al-Feel et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4534-4538,1992）。かくして、ソラフェンＡに耐性である酵母株は単一の遺伝子、即ちアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの変異からできたものである。変異は、ヘテロ接合体二倍体株では、優性、半優性又は劣性の表現型である。
【０００４】
本発明の変異遺伝子は、組換えソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを生産するのに使用でき、それは翻って、変異アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの活性に及ぼすソラフェンＡ誘導体又は他の化合物の阻害作用を決定するためのin vitro  アッセイに使用できる。これらのアッセイは、ソラフェンＡに対するカビの耐性の減少を誘導する改善されたソラフェンＡ誘導体又は抗−耐性ストラテジーに有用である化合物を確認するのを可能にする。
【０００５】
本発明はソラフェンＡ阻害に耐性であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子からなるＤＮＡ分子に第一に関するが、特に、真菌の、好ましくは酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子を包含する分子に関する。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは脂肪酸生合成に係わる段階を触媒し、長鎖脂肪酸の合成のための二炭素ユニットのドナーであるマロニル−Ｃｏ−Ａを生産する。高級又は低級の真核生物では、その酵素は多機能ポリヘプチドであって、ビオチン結合、ビオチンカルボキシル化及びトランスカルボキシル化のためのドメインからなるテトラマを形成している。酵母、ニワトリそしてネズミのカルボキシラーゼは、３４％の全配列同一性を持っている。
【０００６】
酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、約２５０ｋＤの計算分子量を持ちそして約２２００個のアミノ酸からなる。遺伝子のヌクレオチド塩基配列は、Al-Feel et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4534-4538,1992 により決定されている。ビオチン結合部位とビオチンカルボキシラーセのドメインは酵母タンパク質のＮ−末端側の半分により包含されるが、その他方トランスカルボキシラーゼドメインはＣ−末端側の半分により包含される。ソラフェンＡ耐性を付与する耐性は、好ましくは酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのＮ−末端側半分内に位置している。Ｎ−末端側半分の変異そして好ましくはビオチンカルボキシラーゼドメイン内の優性変異が好ましく、それはビオチンをカルボキシル化する酵素能をブロックすると考えられている。かくして本発明は、第一に、遺伝子の変異、そして特にビオチンカルボキシラーゼドメイン内の変異からなる、ソラフェンＡ阻害に対して耐性のあるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子に関する。別の方法としては、テトラマ形成を阻害する変異が好ましい。
【０００７】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼにそして好ましくは酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼにソラフェンＡ耐性を付与する変異は、優性又は劣性であり、それらは１点又は多点変異、欠失又は挿入変異である。好ましくは、変異は点変異であって、それは非極性アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン）、極性アミノ酸（セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン、グルタミン）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）及び酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）からなる群から選択されたアミノ酸をコードしているコドンを変更する。変異の好ましいターゲットであるコドンは、バリン、セリン、スレオニン、ヒスチジン及びリシンである。極性アミノ酸のためのコドンの間では、変異はタンパク質のリン酸化又は脱リン酸化を阻害する変異が好ましい。本発明の好ましい実施態様では、変異は下記の変異からなる群から選択される：アミノ酸位置５０におけるバリンをフェニルアラニンに変更するもの、アミノ酸位置５３におけるヒスチジンをアルギニンに変更するもの、アミノ酸位置７３におけるリシンをアルギニンに変更するもの、アミノ酸位置に７７におけるセリンをチロシンに変更するもの。最も好ましい変異は、アミノ酸位置７７におけるセリンをチロシンに変更するそれである。
【０００８】
本発明の別の目的は、ソラフェンＡ阻害に耐性である真菌のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子を単離する方法を提供することである。本発明の一つの実施態様では、本発明の方法は；
(a) ソラフェンＡに耐性である真菌株、好ましくは酵母株を選択、単離し；
(b) 上記耐性である株のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限断片を精製し；
(c) 細菌中で制限断片をクローニングし；
(d) 野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子から得られる制限断片の存在についてクローンをプローブし；
(e) ソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子を単離次いで塩基配列決定し；そして
(f) １個又は２個以上の変異を確認する
ことからなる。
【０００９】
例えばソラフェンＡ耐性酵母株を選択するためには、本発明の好ましい実施態様内では、酵母細胞１０4 ないし１０10個そして好ましくは１０6 ないし１０9 個を、ソラフェンＡ０．１ないし５０μｇ／ｍｌそして好ましくは１ないし１０μｇ／ｍｌ含有する固化した培地上に置く。得られた酵母株の交配、接合子の単離、胞子形成及び四分子分析は下記の文献に記載されている方法に従って実施できる["Methods of Enzymology“,vol 194,1991 年出版の中, Guthrie and Fink, "Guide to Yeat Genetics and Molecular Biology“ ]。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変異体を含有する交雑からの胞子の生存性は、ＹＰＤ−ＦＡの一滴と共に胞子を生育することにより増加できる。更に培養した後、変異株は、完全な又は部分的な制限切断からできるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限断片を精製するために使用される。酵母からのゲノムＤＮＡの又はＲＮＡの製造と、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、酵母遺伝子技術でよく知られている技術を構成する。ＤＮＡの制限切断は、制限酵素と共に支給される製造者による指針に従って実施される。好ましくは制限断片は、野生型のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子内で切断しないことが知られている制限酵素例えばＳａｃＩのような酵素を用いる制限切断から得られる。精製された制限断片は、次いで、既知の選択できるＤＮＡベクター分子中にスプライスされ、そして得られたプラスミドは大腸菌(E.Coli)，桿菌又はStreptomycesのような細菌を形質転換するのに使用される。形質転換とネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン又はテトラマイシンのような抗生物質による選択後のクローンコロニーは、野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子から得られる制限酵素についてのコロニーハイブリッド形成によりプローブされる。細菌コロニーをプローブするための技術は、下記の文献に詳細に記載されている：Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labolatory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989。この文献の関連する部分は引用により本明細書に包含される。そのようなＤＮＡ分子を持つ細菌コロニーを単離し、それらのプラスミドＤＮＡを製造しそしてソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を塩基配列決定する。所望により、単離されたＤＮＡ分子は、塩基配列決定の前に、それらがソラフェンＡ耐性を付与できるかどうかを試験するために酵母中へ形質転換してよい。得られた塩基配列を野生型遺伝子の塩基配列と比較しそして変異を確認する。ソラフェンＡ耐性を付与する変異を確認するための完全遺伝子の塩基配列決定を回避するために、当技術で知られている組換えＤＮＡ技術を使用して、野生型と変異体との間で制限断片をシャフル(shuffle) することも可能である。キメラ遺伝子は、酵母中の形質転換によりそれらがソラフェンＡ耐性を付与することができるかできないかを試験することができる。これは、耐性に関与するＤＮＡ領域を狭めるのを可能にする。
従って、酵母のための上で例示した方法は、ソラフェンＡ阻害に耐性である株を単離できる別の種類の真菌にも応用できる。
【００１０】
この方法によって得られるソラフェンＡ耐性遺伝子は、優性、半優性又は劣性である。
【００１１】
ソラフェンＡ阻害に耐性である真菌のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子を単離するための別の方法は、
(a) ソラフェンＡ耐性の真菌株、そして好ましくは酵母株を選択、単離し；
(b) 上記耐性株のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限断片を精製し；
(c) 相補性により真菌中の制限断片をクローニングし；
(d) ソラフェンＡ耐性の形質転換体を単離し；
(e) ソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子を単離次いで塩基配列決定し；そして
(f) １個又は２個以上の変異を確認することからなる。
【００１２】
相補性により真菌中、しかし特に酵母中の制限断片をクローンするためには、制限断片は、プロモータと終末信号を含むアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている全遺伝子、又はアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの既知の野生型配列のいずれかからなり、遺伝子はプロモータと終末配列の中間の断片のスプライシングが真菌、しかし特に酵母中で活性である遺伝子の特定の制限断片を選択するのに使用される。精製した制限断片を、酵母中で選択できる好ましくはマーカー遺伝子を含有する既知のＤＮＡベクター分子中にスプライスし、そして得られたプラスミドは欠損アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを持つ株を形質転換するのに使用される。これらの株は、脂肪酸に対して栄養要求性でありそして脂肪酸を補給した培地中で生育できる。培地には、好ましくは、０．００５％ないし１％そして更に好ましくは０．０１％ないし０．１％のパルミチン酸が補給されている。ソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子で形質転換された株は、最早、脂肪酸に対して栄養要求性でなく、例えばパルミチン酸を補給してない培地上で生育できない。所望によりそれらは、酵母中で選択できるマーカー遺伝子の発現により確認できる。この方法により得られたソラフェンＡ耐性遺伝子は、優性、半優性又は劣性であり得る。好ましくは、この方法は優性対立遺伝子を得るのに使用される。
【００１３】
更に別の、ソラフェンＡ阻害に耐性である真菌のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子を単離するための方法は、
(a) ソラフェンＡに耐性である真菌株、そして好ましくは酵母株を選択、単離し；
(b) 上記耐性株からのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを調製し；
(c) 野生型のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列と相補的であるプライマーを使用するポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）複製のテムプレートとして上記ＤＮＡを使用し；
(d) 複製生成物を単離次いで塩基配列決定し；そして
(e) １個又は２個以上の変異を確認する
ことからなる。
【００１４】
ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）複製は、Saiki et al,Science 239:487-491, 1988 に記載されているとおりに実施できる。このin vitroの方法では、野生型のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列に対して相補的である、１０bpないし４０bp、そして好ましくは２０bpないし３０bp長の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドであって、複製されるべきＤＮＡ配列の末端まで完成するために設計されているオリゴヌクレオチドが使用される。適当な条件下では、変性により生成した標的のＤＮＡ一本鎖上の相補的領域とのオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成が生じる。この方法で生成した二本鎖領域は次のポリメラーゼ反応のプライマーとして使用される。そして変性、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成とＤＮＡの合成が１５ないし４０回、好ましくは２０ないし３０回繰り返される。この方法では、大腸菌（E.coli) からのＤＮＡポリメラーゼに加えて、特に好熱細菌、例えば Thermus aquaticus  からの熱安定性ポリメラーゼを使用してもよい。
複製生成物は、ゲル電気泳動の後で確認されそして直接又はＤＮＡベクター分子中へのスプライシングと大腸菌（E.coli) のような微生物中でのクローニングの後のいずれかで塩基配列決定され得る。通常は、変異したアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは単一の断片としてではなる幾つかの重複した断片として複製される。従って、この方法はソラフェンＡ耐性遺伝子に変異されたと期待されるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子配列を選択的に単離するのにも使用できる。
【００１５】
本発明は、精製した、ソラフェンＡ阻害に耐性である真菌のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼであるが、特に精製したソラフェンＡ阻害に耐性である酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ及びソラフェンＡ阻害に耐性である上記のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを精製する方法に関していて；その方法は
(a) 真菌細胞のホモジネーション；及び
(b) タンパク質のアビジンアフィニティクロマトグラフィー
からなる。
【００１６】
タンパク質の精製のために、真菌細胞を遠心分離により集め、次にプロテアーゼインヒビターを含有する適当な緩衝液中でホモジネートする。細胞破片を遠心分離及び／又は超遠心分離により除きそして例えば硫安を使用してタンパク質を沈澱するのが好ましい。最後にタンパク質をアビジン−アガロースゲルカラム上に適用しそして溶離する。２８０ｎｍで最大吸光度を示すフラクションが集められる。精製したタンパク質の貯蔵のために、例えば合わせたフラクションを硫安により沈澱しそしてグリセリンを含有する緩衝液中にタンパク質を再溶解すると−７０℃で貯蔵できる。
【００１７】
ソラフェンＡ耐性のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている遺伝子を、一度、確認して単離すれば、精製されたタンパク質は上記ＤＮＡのトランスジェニック異種発現から得られる：換言すれば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を示すタンパク質をコードしているＤＮＡ配列からなる組換えＤＮＡを適当な細菌、酵母又は他の細胞発現系中へ置くことによる発現から得られる。
ソラフェンＡに耐性である精製した組換え真菌アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを製造する方法は、
(a) ソラフェンＡ耐性である真菌のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている組換えＤＮＡで、宿主有機体を形質転換し；そして
(b) 宿主有機体又はその培養上澄液から、タンパク質を単離する
ことからなる。
【００１８】
適当な宿主は、大腸菌と桿菌を包含する。他の適当な発現系宿主は、培地中で生育した昆虫細胞を包含する。これらの昆虫は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するバキュロウイルス(baculovirus) で感染してよい。
【００１９】
別法として、バキュロウイルス(baculovirus) を、発現宿主系として使用されている生存昆虫、そして昆虫細胞を感染するのに使用してもよい。そしてその発現系宿主は、発現上澄液を生産する。これは、発現上澄液から酵素を単離することによる大量の精製した組換えアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの生産を容易にする。
【００２０】
そして、精製したアセチルＣｏＡカルボキシラーゼはソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤を確認するためのアッセイに使用でき、そのアッセイは、
(a) ソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼとその基質からなる１番目の試料をインキュベートし；
(b) 段階(a) におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの反応性を測定し；
(c) 酵素の活性を阻害する疑いのある化合物を含有する試料の存在下で、ソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼとその基質からなる２番目の試料をインキュベートし；
(d) 段階(c) におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの反応性を測定し；
そして；
(e) 段階(a) と(c) におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの反応性を比較する
ことからなる。
【００２１】
上述のアッセイのための適当なアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、本発明の精製方法を使用して得られる。適当な基質は、アセチルＣｏＡ又はその構造類似体であって、その酵素とＨＣＯ3- によりカルボキシル化される能力があり、好ましい基質はアセチルＣｏＡとＮａＨＣＯ3 である。アセチルＣｏＡの濃度は、好ましくは約０．１ｍＭないし１０ｍＭ、更に好ましくは約０．１ｍＭないし１ｍＭ、そして最も好ましくは約０．５ｍＭである。
【００２２】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼと適当な基質に追加して、反応混合物は適当な緩衝剤、適当な補因子と補因子としての適当な２価の陽イオンを含有してもよい。適当な緩衝剤は、酵素の反応要求性に伝導できるｐＨで緩衝能のあるいずれかの適当な生理学的緩衝剤を包含する。緩衝剤は、好ましくは７ないし９のｐＨ範囲内、更に好ましくは７．５ないし８．５のｐＨ範囲内、そして最も好ましくは約８．０での緩衝能を持ち、例えばｐＨ８．０における５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌである。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのための好ましい補因子は、ＡＴＰ、好ましくは約０．５ｎＭないし約１００ｎＭ、更に好ましくは約３．７５ｎＭである。二価の陽イオンは、好ましくは二価の金属陽イオン、更に好ましくはマグネシウムである。反応混合物の追加成分は、例えばＢＳＡとＥＤＴＡであってよい。反応を進行させるために、反応は適当な温度で実施される。そのような適当な温度は、約４℃ないし約４０℃、更に好ましくは約室温から約３５℃、そして最も好ましくは約３０℃である。最も好ましい反応混合物は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ，７．５ｇ／ｌのＢＳＡ，３．７５ｎＭ  ＡＴＰ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，14Ｃ標識−ＮａＨＣＯ3 （比活性５２．４μＣｉ／μｍｏｌで試料当り１０μＣｉ）及び異なる量のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼである。好ましくは、反応はアセチルＣｏＡの添加により開始する。
【００２３】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害されていない活性は、適当な基質だけが存在する場合のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性のいずれかの尺度である。酵素活性の尺度は、当業者に一般に知られており、平衡定数、反応生成物又は反応基質の消費の見かけの反応速度、反応速度論、反応熱力学、反応生成物の分光解析、標識化反応成分の検出、等々を含む：一般的に下記の文献を参照；Segel,"Biochemical Calculations“, 第２版，John Wiley and Sons,New York(1976); Suelter,"A Pracitical Guide to Enzymology“,John Wiley and Sons,New York(1985) 。酵素活性を測定するための好ましい方法は、シンチレーションにより、14Ｃ標識−ＮａＨＣＯ3 から取り込まれた14Ｃの量を測定することである。
【００２４】
適当な阻害化合物は、上述の方法を使用して確認される。阻害された活性は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤を添加する以外は、阻害されていない活性と同じ方法で測定される。阻害剤の濃度は、阻害活性によって変えてよいが、概して約１０ｎＭないし約２００ｍＭ、更に好ましくは約０．１ｍＭないし約１００ｍＭ、そして最も好ましくは約１ｍＭないし約１０ｍＭの範囲の量である。概して、アセチルＣｏＡ又は他の基質は、酵素と阻害剤を含有する混合物に添加されそして酵素活性は上述のようにして測定される。
【００２５】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害された活性を阻害されていない活性と比較することは、酵素活性の有意な減少が、阻害されていない活性と比較される阻害した活性に観察されるかどうかを測定することからなる。有意な減少とは、測定技術に内在する誤差限界より大きい、酵素活性の減少、好ましくは阻害剤がない場合の活性の約５０％の減少、更に好ましくは約９０％の減少、そして最も好ましくは殆ど検出できない酵素活性のレベルへの減少である。
【００２６】
ソラフェンＡに耐性である真菌のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤を確認する他の検定法は、
(a) ソラフェンＡ耐性真菌の１番目の培養物を生育して生育曲線を記録し；
(b) ソラフェンＡ耐性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの反応性を阻害すると疑われている化合物を含有する試料の存在下で、ソラフェンＡに耐性の真菌の２番目の培養物を生育しそして生育曲線を記録し；そして
(c) そして段階(a) と(b) で記録した生育曲線を比較する
ことからなる。
【００２７】
例えば酵母の培養物の生育曲線を記録するためには、リットル当り１０4 ないし１０8 個の濃度でそして好ましくは１０6 ないし１０7 個の酵母細胞濃度で、培養培地を接種する。次いで培養物を、連続攪拌下、２０℃と４０℃の間の温度、好ましくは約３０℃で生育する。間隔をおいて試料を取り出し、それらの光学濃度を測定する。好ましくは６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ600 ）を測定する。ＯＤ600 の値は、細胞密度と相関しそして培養開始点からの時間に対してプロットする。別法では、培養物の試料滴を取り出し、細胞数を顕微鏡下で計測して測定する。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを阻害すると疑われている化合物の存在下記録された生育曲線は、阻害化合物の不在下記録された生育曲線と比較される。阻害した生育曲線の傾斜が、阻害されていない培養物と比較して、５０％以上、好ましくは８０％以上そして最も好ましくは９５％以上減少した場合は、その化合物は有意な阻害効果を発揮していると考察される。
【００２８】
【実施例】
本発明を、下記の実施例を参照して更に記述する。これらの実施例は説明の目的だけのために記載されたものであって、限定することを意図していない。
【００２９】
実施例１：培地と株
１．１．培地
＊基礎培養培地は、バクト酵母(Bacto-yeast) 抽出物（Difco 製)1％，バクトペプトン(Bacto-pepton)（Difco 製) ２％及びグルコース（Merk製) ２％を含有するＹＰＤである。
＊ＹＰＤ−ＳＯＲ−１０は、１０μｇ／ｍｌのソラフェンＡを補給したＹＰＤである。
＊ＹＰＤ−ＦＡは、脂肪酸（パルミチン酸０．０３％，Fluka 製) とＴｗｅｅｎ４０（Fluka 製) １％を補給したＹＰＤである。
＊合成最小培地ＳＤＨＬは、アミノ酸なしの酵母窒素基（Difco)０．６７％、要求されるアミノ酸及びグルコース２％  を含有する。ＳＤＨＬＳ培地は、電気穿孔法による酵母形質転換のために使用され、ソルビトール１Ｍが補給されているＳＤＨＬである。
＊平板法のために、培地は２％バクト寒天(Bacto-Agar)（Difco 製) で固化される。
【００３０】
１．２．株
Saccharomyces cerevisiae株ＹＳ１８（ＭＡＴα；his 3-11,3-15; leu 2-3,2-112; ura 3-△5; canR ;cir+ ) が野生型として選択される。ＹＨＶ１８（ＭＡＴａ；his 3-11,3-15; leu 2-3,2-112; ura 3-△5; canR ;cir+ ) が、ＹＳ１８の接合型スイッチの後単離されるので、相同ゲノムである。
【００３１】
実施例２：接合型スイッチ
ＹＳ１８を、Klebe(Klebe et al, Gene 25:333-341,1983)の方法に従って、プラスミドｐＧＡＬ−ＨＯで形質転換する；そしてプラスミドｐＧＡＬ−ＨＯは、ＧＡＬプロモータの制御下の接合型配列−特異のエンドヌクレアーゼのための遺伝子ＨＯとＵＲＡ３マーカ遺伝子を含有する。ｐＧＡＬ−ＨＯは、スイス国，バーゼル市，バイオセンター，Ｐ．Ｌｉｎｄｎｅｒ博士から提供された。ＨＯ遺伝子は、グルコースの代わりにガラクトース２％を含有する完全培地上で２時間にわたり形質転換体を生育することによりスイッチオンされる。培養物をＹＰＤ平板上に載せ、適当な「α」接合テスター株を使用して「ａ」接合型コロニーをスクリーニングする。次に、ＧＡＬ−ＨＯプラスミドを５−フルオロ−オロチン酸(Pharmacia) を使用して不稔化する。プラスミドの喪失は、サザン解析又はＰＣＲにより確定される。テスター株との交雑の後、細胞の約８０％は３日後に胞子化する；胞子の生存率は９５％以上である。
【００３２】
実施例３：変異体の単離
相同ゲノム株ＹＳ１８とＹＨＶ１８の各々をＹＰＤ５ｍｌ中で後期対数増殖期まで生育する。培養物を１０4 倍に希釈して培養物Ａにし、その生存細胞数を測定する。各々がＹＰＤ５ｍｌを含有する２０個の試験管に、培養物Ａの１０μｌ（これは約１０個の細胞に相当する。）を接種し、１０7 細胞／ｍｌの密度に到達するまでインキュベートする。各々の試験管の１ｍｌ滴を、ＹＰＤ−ＳＯＲ−１０上に置きそして平板を３０℃で３日間にわたりインキュベートする。２０個のＹＰＤ−ＳＯＲ−１０平板の各々からの独立した変異体の単離を保証するために、異なる形状又は大きさのコロニーだけを選択する。変異体のコロニーを、−７０℃でグリセリン貯蔵培地培養物として貯蔵する前に、ＹＰＤ上に再ストリークする。
培養物の培養の開始時におけるソラフェンＡ耐性変異体の存在を排除するために、培養物Ａの残りをＹＰＤ−ＳＯＲ−１０上に載せ、３日間にわたり３０℃でインキュベートする。コロニーの生育は観察されなかった。
【００３３】
このプロトコールを使用して５２種の変異体が単離される。激しい生長を示す各々の接合型の８個の変異体（ＹＨＶ  １８から誘導された、ＹＣＩ１０１，ＹＣＩ１０３，ＹＣＩ１０５，ＹＣＩ１１５，ＹＣＩ１１９，ＹＣＩ１２６，ＹＣＩ１３８及びＹＣＩ１４１、及びＹＳ  １８から誘導されたＹＣＩ１，ＹＣＩ２，ＹＣＩ１０，ＹＣＩ１６，ＹＣＩ３７，ＹＣＩ３９，ＹＣＩ４３及びＹＣＩ５１）を更に解析するために選択する。
最初の段階では、変異体の全てを対立接合型の野生型と戻し交雑し、二倍体を胞子形成させ、そして子嚢を四分子分析する。各々の交雑から少なくとも６個の完全な四分子を検討しそしてそれらの全てがソラフェンＡ耐性とソラフェンＡ感受性について２：２に分離していることを見出す。これは、変異は単一の遺伝子座で変異していることを示している。
他の段階では、戻し交雑からの二倍体のＭＩＣを測定する。どの二倍体も、野生型株程にはソラフェンＡに対して感受性がない。その代わりに、半優性又は優性の表現型が０．３５μｇ／ｍｌないし５４μｇ／ｍｌの範囲のＭＩＣを持っていることが見出される。
最後に一つの接合型の８個の変異体を、他の接合型の一つの変異体に対して交雑させる。胞子形成と四分子分析の後、各々の四分子の全ての４胞子はソラフェンＡ耐性である。四分子の若い数については期待されてとおり遺伝子転換は観察されていない。各々の交雑からの少なくとも６個の完全な四分子がチェックされる。結果は、全ての変異は同じ遺伝子座に位置することを示している。
【００３４】
実施例４：生育曲線
５００ｍｌフラスコ中の１００ｍｌのＹＰＤ培地に約１０7 個のＹＳ１８酵母細胞／ｍｌを接種し、３０℃、１８０ｒｐｍでインキュベートして生育する。時点０のソラフェンＡの添加前に、細胞は既に１時間にわたりインキュベートされている。対照は、ソラフェンＡを添加しない以外は同様に処理される。全細胞数を、ＯＤ600 を測定することによりモニタする。"titer“ と呼ばれる生存細胞の数は、ＹＰＤ平板上に載せることにより測定される。ソラフェンＡ耐性細胞の数は、フラスコ中と同じソラフェンＡ濃度を含有するＹＰＤ−ＳＯＲ上に載せることより計数される。
【００３５】
ソラフェンＡの存在下、完全な生育阻害は約４０時間にわたり観察される；その後、生育は、ソラフェンＡ耐性変異体に因って回復する。生存細胞計数は、初めの２０時間の間、大規模な細胞死滅が起きていることを示している。生育曲線から決定されるように最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、０．１μｇ／ｍｌである。
【００３６】
実施例５：最小阻害濃度（ＭＩＣ）の測定
酵母コロニーを、ＹＰＤ平板上、２日にわたり３０℃で生育し、それのレプリカをＹＰＤ−ＳＯＤ平板のセット上で生育する。下記のソラフェンＡ濃度を使用する：０μｇ／ｍｌ，０．３５μｇ／ｍｌ，０．７６μｇ／ｍｌ，１．５μｇ／ｍｌ，３．１３μｇ／ｍｌ，６．７μｇ／ｍｌ，１５．４５μｇ／ｍｌ及び５４．５μｇ／ｍｌ。３０℃での２４時間にわたる生育の後、平板を生育について検査する。
【００３７】
この方法を利用して、ソラフェンＡ耐性酵母株の戻し交雑からの二倍体についてのＭＩＣを、０．３５μｇ／ｍｌないし５４μｇ／の範囲で測定する。
【００３８】
実施例６：クローニング技術
制限酵素切断とリゲーション反応を、「"Maniatis et al, "Molecular Cloning: A Labolatory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989“ 」に記載されているようにして実施する。脱リン酸化されたクローニングベクターは、下記の方法で製造される：１０μｌベクターＤＮＡ（約１μｇ／μｌ），２μｌ制限酵素，２μｌ  １０×制限緩衝液と６μｌの水を約２時間にわたり３７℃でインキュベートする。次いで、追加の制限酵素２μｌを添加し、同じ試料を３７℃で更に２時間にわたりインキュベートする。ウシのアルカリホスファターゼ（１５０単位／μｌ，米国，メリーランド，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）３μｌ，１０×脱リン酸化緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８，０．５Ｍ  ＮａＣｌ）３μｌ及び水２μｌを添加し、試験管を１時間にわたり６５℃でインキュベートする。直線状にし且つ脱リン酸化したベクターを０．７％ＴＡＥアガロースゲル上で精製する。次いでＤＮＡをジーン・クリーンキット(BIO101,Clifornia,USA)を使用して、ゲルスライスから単離する。
【００３９】
大腸菌(E.coli)は、電気穿孔法により形質転換され(Dower et al, Nucleic Acid Res.16:6127-6145)そして大腸菌(E.coli)からのプラスミドＤＮＡは「Qiagen Midiprep Kit(Qiagen Inc.,California,USA) 」又は「Magic Miniprep Kit(Promega, Wisconsin,USA)」を使用して単離される。
【００４０】
実施例７：大腸菌(E.coli)中のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのための遺伝子バンクの製造とスクリーニング
変異株の４０μｇのクロモゾームＤＮＡは、SacI  ５０単位により、１時間にわたり３７℃で切断される。１時間後に制限酵素５０単位を添加し、インキュベーションを更に１時間継続する。切断したＤＮＡを０．８％ＴＡＥゲル上で電気泳動し、７．５ｋｂないし９ｋｂの断片を単離する。ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅＫＳ＋（Stratagene) の脱リン酸化されたSacI部位中へクローンし、大腸菌(E.coli)中へ形質転換する。得られた形質転換体を、既知のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ野生型遺伝子を包含するＤＮＡでプローブするコロニーハイブリッド形成によりスクリーニングする。
【００４１】
実施例８：コロニーハイブリッド形成
全アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードしている領域を包含する  Dig-標識SacI制限断片を、Dig-標識キットを使用して(Boering Mannheim)、製造者のプロトコールに従って製造する。コロニーは、５分間接触させる市販のナイロン濾紙上に載せたレプリカである。次いで、その濾紙を「Whatman 3M」濾紙上に載せ、次の溶液で次々に浸漬する；０．５ＭＮａＯＨ（５分間），１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（２×  １分間）；０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（１分間）；及び１．５ＭＮａＣｌ（５分間）。風乾した後、濾紙を２５４ｎｍの紫外線で３分間にわたり架橋する。濾紙のハイブリッド形成とポジチブなコロニーの検出を「DIG Luminescence Detection Kit(Boeringer Mannheim)」を使用して実施する。濾紙の最緊縮洗浄を、０．１％ＳＤＳと０．１×ＳＳＣ  中、５８℃で実施する。
【００４２】
実施例７に記載されているようにして製造した遺伝子バンクのスクリーニングの後、７個のクローンを得た：ｐＣＩ２（ＹＣＩ２），ｐＣＩ１０（ＹＣＩ１０），ｐＣＩ３９（ＹＣＩ３９），ｐＣＩ４３（ＹＣＩ４３），ｐＣＩ１０１（ＹＣＩ１０１），ｐＣＩ１３８（ＹＣＩ１３８），ｐＣＩ１４１（ＹＣＩ１４１）。
【００４３】
実施例９：酵母中のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのための遺伝子バンクの製造とスクリーニング
変異株のゲノムＤＮＡ４０μｇを０．８単位のＢａｍＨＩで（実験的に決められた）２５分間にわたり３７℃で切断する。部分的に切断されたＤＮＡを０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、そして６ｋｂないし１０ｋｂの断片を単離する。ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ−切断しそして脱リン酸化したｐＲＳ３１６（ＣＥＮ６，ＡＲＳＨ４，ＵＲＡ３，Ａｍｐr ，ｏｒｉ； Sikorski et al, Genetics 122:19-27, 1989)中にクローンし、そして大腸菌(E.coli)中へ形質転換する。得られた形質転換体を、各々が約１０００個の単独クローンを含有する１０個のプールに分ける。各々のクローンプールを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地１００ｍｌ中で一度増殖しそしてプラスミドＤＮＡを得る。遺伝子バンクを、各々のプールからのＤＮＡの固定量で酵母ＹＳ１８を形質転換することによりスクリーニングする。得られたＳＤＨＬＳ平板は、ＹＰＤ−ＳＯＲ−１０上に２回載せたレプリカである。二次的ソラフェンＡ変異体の選択を回避するために、両方のソラフェンＡを含有する平板上で耐性を示すコロニーのみを、ＳＤＨＬＳ平板から単離する。
【００４４】
この方法を使用して、変異体ＹＣＩ３７株のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を単離する。その遺伝子は、形質転換して野生型株にソラフェンＡ耐性を復元させることができる。
【００４５】
実施例１０：電気穿孔を使用する酵母形質転換
宵越しの培養物５ｍｌを、ＹＰＤ  ９５ｍｌ中に希釈しそして約３時間にわたり震盪機上で１８０ｒｐｍ、３０℃で生育する。下記の全ての段階を４℃で又は氷上で実施する。培養物を２本の試験管に分け、５分間にわたり３０００ｒｐｍで遠心分離する。細胞を、５０ｍｌの滅菌水５０ｍｌで３回洗浄しそして１Ｍソルビトット２０ｍｌで１回洗浄する。最後に細胞を滅菌した１Ｍソルビット２００μｌ中に再けん濁し、０．４ｃｍ間隔キュベット中で２．５ｋＶ，２００オームと２５μＦで、細胞４０μｌを５μｌまでの滅菌水中の５μｇまでのＤＮＡと混合した後に、形質転換する。パルスの後、細胞を直ちに１Ｍ氷冷ソルビトール１ｍｌで希釈する。細胞１００μｌないし１ｍｌをＳＤＨＬＳ寒天上に載せそして３０℃で２−３日にわたりインキュベートする。
【００４６】
実施例１２：制限断片シャフリング
若干数の制限断片を、ＹＳ１８から得た野生型のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子ＹＳ１８と変異体遺伝子ｐＣＩ１０１の間にシャフル(schuffle)する。得られた構造は、ＹＳ１８中へ形質転換されそしてソラフェンＡ耐性を付与するそれらの能力が検討される。このデータに基づいて、ｐＣＩ１０１の変異は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのＮ−末端部とそのプロモータからなる１．９ｋｂのSacI/NheI 断片に位置付けられる。
【００４７】
実施例１３：ＤＮＡ塩基配列決定
ＤＮＡは、サンガーのジデオキシチェーンターミネータ法[Sanger et al, Procl. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977]  を使用し、テンプレートとして二本鎖プラスミドＤＮＡを使用して、塩基配列決定される。オリゴノヌクレオチドプライマーは、「Applied Biosystems Model 380A Synthesizer 」上で合成される。
【００４８】
実施例１２でｐＣＩ１０１により付与されるソラフェンＡ耐性について原因であると示されている１．９ｋｂＤＮＡ断片の完全なＤＮＡ塩基配列が決定される。単一の塩基変化が、アミノ酸位置７７におけるセリンのチロシン残基による置換を起こしていることが見出されている。同じ変異が、ＹＣＩ３７酵母株のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子について見出されている。ｐＣＩ１４１もこの変異を含むがこれに加えて、アミノ酸位置５０におけるバリンをフェニルアラニンに、そしてアミノ酸位置５３におけるヒスチジンをアルギニンに変換する変異を含む。ｐＣＩ４３に見出された変異は、アミノ酸位置５０におけるバリンをフェニルアラニンへ、そしてアミノ酸位置７３におけるリジンをアルギニンへ変換している。ｐＣＩ３９については変異が、アミノ酸位置５３におけるヒスチジンをアルギニンに、そしてアミノ酸位置５７におけるスレオニンをアラニンに変換することが見出されている。
【００４９】
実施例１４：アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの精製
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを、ＹＰＤ培地中、３０℃で一夜生育した細胞１５リットルから、アビジン−アフィニティクロマトグラフィーにより、豊富化する。細胞を遠心分離により集めそして単離緩衝液（２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５；５ｍＭ  β−メルカプトエタノール；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１００ｇ／ｌ  グリセリン；２００μＭ  ＰＭＳＦ；１μＭ  ロイペプチン；１μＭ  ペプスタチンＡ；０．６６μＭ  アンチパイン；０．５μＭ  トリプシンインヒビター（ダイズ）；２００μＭＤ  ＴＰＣＫ；１００μＭ  ＴＬＣＫ）に再けん濁して３００ｍｌの最終体積にする。次いで５２０ｍｌのガラスビーズ（０．２５−０．５ｍｍ径）を添加し、細胞をビーズミル中で５分間にわたりホモジナイズする。細胞破片を遠心分離により除き、そして上澄液を、１０００００ｇ，４℃における超遠心分離に先立って、ガラスウールを通過してろ過する。超遠心分離の後、上澄液を再びガラスウールを通過してろ過し、次いで硫酸アンモニウム２４３ｇ／ｌをゆっくり添加してタンパク質を沈澱させる。沈澱したタンパク質をペレットにし、２４ｍｌのカラム用の緩衝液（２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５；１５ｍＭ  β−メルカプトエタノール；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；５００ｍＭ  ＫＣｌ；３．１ｍＭ  Ｎａ3 Ｎ；１００ｇ／ｌ  グリセリン；２００μＭ  ＰＭＳＦ；１μＭ  ロイペプチン；１μＭ  ペプスタチンＡ；０．６６μＭ  アンチパイン；０．５μＭ  トリプシンインヒビター（ダイズ）；２００μＭ  ＴＰＣＫ；１００μＭ  ＴＬＣＫ  ）２４ｍｌに再けん濁する。試料を、上述のカラム用緩衝液と平衡させた１０ｍｌのモノマーアビジン−アガロースゲルを付けたＣ１６カラム（直径１６ｍｍ）上に適用する。実施した流速は１ｍｌ／分である。次いでこのカラムを上述のカラム用緩衝液で、溶離液のＯＤ280 が０．０１以下になるまで洗浄する。２８０ｎｍで最大吸光度を示すフラクションを合わせ、次いでタンパク質を硫酸アンモニウム２４３ｇ／ｌをゆっくり添加することにより沈澱させる。沈澱したタンパク質をペレット状にし、硫酸アンモニウムで飽和した上述のカラム用緩衝液で洗浄し、次に貯蔵緩衝液（２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５；５ｍＭ  β−メルカプトエタノール；２００ｇ／ｌ  グリセリン）３ｍｌに再けん濁する。分割した酵素溶液を−７０℃で貯蔵する。タンパク質の濃度は、ブラドフォード(Bradford, Anal. Biochem 72:248-254,1976) に従って測定される。
【００５０】
実施例１５：アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの酵素アッセイ
野生型株と変異株の豊富化フラクション中の酵素アッセイは二つの異なる方法で実施できる。
【００５１】
実施例１５．１．放射性標識重炭酸塩の取込み
一つの方法では、酸性溶液中でのＨＣＯ3- とマロニルＣｏＡの異なる安定性の違いにより、取り込まれたＨＣＯ3- を取り込まれていないＨＣＯ3- から識別する。ＨＣＯ3- は酸に不安定であって、窒素の連続流下で試料を６０℃に加熱することにより除去される。残る放射能は、マロニルＣｏＡとして存在しており、アセチルＣｏＡの活性を測定するために定量化される。
アッセイのためには、下記の成分を試験管中で合わせる：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ；７．５ｇ／ｌ  （脂肪酸を含まない）ＢＳＡ；３．７５ｎＭ  ＡＴＰ；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ；酵素溶液、野生型１０μｌ又は変異型２５μｌそしていろいろの濃度（０μｇ／ｍｌ，１５０μｇ／ｍｌ，１．５μｇ／ｍｌ，０．０１５μｇ／ｍｌ，）のソラフェンＡ。14Ｃ−標識ＮａＨＣＯ3 は、５２．４μＣｉ／μｍｏｌの比活性で試料当り１０μＣｉの濃度で添加される。試料を水で２００μｌにし、３分間にわたりで３０℃で前インキュベートする。そしてアセチルＣｏＡ  ０．５ｍｌの添加により反応を開始する。８分後に反応を、５ＮＨＣｌ  ５０μｌの添加により中止する。試料２００μｌを６０℃で窒素下乾燥し、水３００μｌに溶解する。シンチレーション溶液５ｍｌを添加し、残りの放射能をシンチレーションカンターで測定する。Ｈ14ＣＯ3- の非特定取込みのための対照として、反応をアセチルＣｏＡの添加なしに実施する。次いで、結果を非特定取込みについて補正する。
【００５２】
１５．２：アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性についての分光学的アッセイ
この方法では、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ反応の副生成物ＡＤＰを測定する：ＡＤＰとホスホエノールピルベートをピルベートキナーゼによりピルベートに変換し、次にそれをＮＡＤＨを酸化するラクテートデヒドロゲナーゼによりラクテートにする。ＮＡＤＨの酸化速度は、３４０ｎｍで定量的に測定できる（Matsuhashi in:"Methods of enzymology“,14:3-6) 。
アッセイは、プラスチック製キュベット中、下記の反応混合物を使用して実施できる：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ；３．７５ｎＭ  ＡＴＰ；２５ｍＭ  ＫＨＣＯ3 ；１．０ｍＭ  ホスホエノールピルベート；０．６ｍｇ  ＢＳＡ；４単位のピルベートキナーゼ；４．５単位のラクテートデヒドロゲナーゼ；６０μｌ酵素溶液及び所望のいろいろの濃度（０μｇ／ｍｌ，１５０μｇ／ｍｌ，１．５μｇ／ｍｌ，０．０１５μｇ／ｍｌ）のソラフェンＡ。水を添加して０．８ｍｌの最終体積にする。反応を、０．１μＭのアセチルＣｏＡの添加により開始する。ＯＤ340 を反応の開始後最初の５分間にわたりモニターする。このアッセイを使用する場合、一緒に精製したピルベートカルボキシラーゼはアッセイを妨害し１５％のバックグランドを与えるたろうことを考慮に入れなければならない。