(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジベンゾチオフェン分解酵素をコードする遺伝子と酸化還元酵素をコードする遺伝子とがプロモーターの下流側に共発現可能に導入されたベクターであって、プロモーターがロドコッカス属微生物由来のｄｓｚプロモーターであって、ジベンソチオフェン分解酵素をコードする遺伝子が、ロドコッカス属微生物由来の遺伝子ｄｓｚＡ、ｄｓｚＢ及びｄｓｚＣであり、酸化還元酵素をコードする遺伝子が、ロドコッカス・エリスロポリスＫＡ２−５−１株由来の遺伝子ｄｓｚＤ又はペニバチルス・ポリミキサＡ−１株由来の遺伝子ｆｌｖであることを特徴とする、上記ベクター。
【請求項２】
ロドコッカス属微生物がロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株、ロドコッカス・エリスロポリスIGTS8株、ロドコッカス・エリスロポリスD-1株、ロドコッカス・エリスロポリスH-2株、ロドコッカス・エリスロポリスN1-36株、ロドコッカス・エリスロポリスI-19株、ロドコッカス・エスピーECRD-1株、ロドコッカス・エスピーB1株、ロドコッカス・エスピーSY-1株、又はロドコッカス・エスピーUM3株若しくはUM9株である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のベクターを含有するロドコッカス属微生物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のベクターをロドコッカス属に属する宿主微生物に導入することを特徴とする、ジベンゾチオフェンを分解できる微生物の作出方法。
【請求項５】
請求項４に記載の微生物の休止菌体とジベンゾチオフェンとを接触させることを特徴とする、ジベンゾチオフェンの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を利用するチオフェン系化合物を分解する機能を有する酵素をコードする遺伝子と、これらと共役してNADHを酸化しFMNを還元する機能を有する酵素をコードする遺伝子とを微生物内で共発現するベクターを用いて、脱硫反応を行う微生物を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
石油のような炭化水素燃料から硫黄を除去する脱硫のための方法としては、アルカリ洗浄や溶剤脱硫などの方法も知られているが、現在では水素化脱硫が主流となっている。水素化脱硫は、石油留分中の硫黄化合物を触媒の存在下で水素と反応させ、硫化水素として除去して製品の低硫黄化を図る方法である。触媒としては、アルミナを担体としてコバルト、モリブデン、ニッケル、タングステンなどの金属触媒が使用される。モリブデン担持アルミナ触媒の場合には、触媒性能を向上させるために、通常コバルトやニッケルが助触媒として加えられる。金属触媒を用いた水素化脱硫は、現在世界中で広く使用されているきわめて完成度の高いプロセスであることは疑いのないことである。しかし、より厳しい環境規制に対応した石油製品を作るためのプロセスという観点からは、いくつかの問題点がある。以下にその例を簡単に記載する。
【０００３】
金属触媒は、一般にその基質特異性が低く、このため多様な種類の硫黄化合物を分解し、化石燃料全体の硫黄含量を低下させる目的には適しているが、特定のグループの硫黄化合物、すなわちベンゾチオフェンやジベンゾチオフェン（DBT）のような複素環式有機硫黄化合物及びそれらのアルキル誘導体類に対してはその脱硫効果が不十分となることがあると考えられる。たとえば、脱硫後の軽油中にはなおも種々の複素環式有機硫黄化合物が残存している。このように金属触媒による脱硫効果が不十分となる原因の一つは、これらの有機硫黄化合物中の硫黄原子の周囲に存在する置換基による立体障害が考えられる。これらの置換基のうち、メチル置換基の存在が水素化脱硫における金属触媒の反応性に及ぼす影響は、チオフェン、ベンゾチオフェン、DBTなどについて検討されている。それらの結果によると、一般的には置換基の数が増すほど脱硫反応は減少するが、置換基の位置が反応性に及ぼす影響もきわめて大きいことが明らかである。メチルDBT類の脱硫反応性を比較し、置換基による立体障害が金属触媒の反応性に及ぼす影響が非常に大きいことを示した報告は、たとえば、Houalla, M., Broderick, D.H.,Sapre, A.V., Nag, N.K., de Beer, V.H., Gates, B.C., Kwart, H.J., Catalt., 61, 523-527(1980)に見られる。実際、これらのDBTの種々のアルキル化誘導体が軽油中にかなりの量存在することが知られている（たとえば、Kabe, T., Ishihara, A.及びTajima, H. lnd. Eng. Chem. Res., 31, 1577-1580(1992)）。
【０００４】
上記のように水素化脱硫に抵抗性を示す有機硫黄化合物を脱硫するためには、現在用いられている脱硫法よりも高い反応温度や圧力が必要とされ、また、添加する水素の量も非常に増大すると考えられている。このような水素化脱硫プロセスの改良は、ばく大な設備投資と運転コストを必要とすることが予想される。このような水素化脱硫に抵抗性を示す有機硫黄化合物を主たる硫黄化合物種として含むものとしては、たとえば、軽油があり、軽油のより高度な脱硫（超深度脱硫）を行う場合には上記のような水素化脱硫プロセスの大幅な改良が要求される。
【０００５】
一方、生物が行う酵素反応は比較的穏和な条件下で進行し、しかも酵素反応の速度自体は、化学触媒を用いた反応の速度と遜色のないという特徴を有している。さらに、生体内で起こる多種多様の生物反応に適切に対応する必要があるため、非常に多くの種類の酵素が存在し、それらの酵素は一般的に非常に高い基質特異性を示すことが知られている。このような特徴は、微生物を用いて化石燃料中に含まれる硫黄化合物中の硫黄の除去を行ういわゆるバイオ脱硫反応においても活かされるものと期待されている（Monticello, D.J., Hydrocarbon Processing39-45(1994)）。
【０００６】
このような背景から、微生物を用いて軽油から複素環式有機硫黄化合物を分解する方法についても多数検討されている。原油や石炭のみならず硫黄を含んだモデル化合物を分解し、ヘテロ原子である硫黄を選択的に除去して、硫酸塩や水酸化化合物を産生する微生物類が報告されている。現在まで知られている複素環式有機硫黄化合物分解菌の多くは、DBTあるいはアルキルDBTを分解するものである。このタイプの反応は、その代謝産物の構造から考えて、硫黄化合物中のC-S 結合を特異的に切断して、その結果硫黄を硫酸塩の形で遊離する反応であると考えられる。
【０００７】
このようなC-S結合切断型のDBT分解反応を行う微生物は、いくつかの属の細菌で知られている。例えば、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）IGTS8株(ATCC53968) (Kilbane,J.J. Resources, Conservation and Recycling, 3, 69-70 (1990))はよく研究されたDBT分解菌株であり、DBTの硫黄原子に酸素原子を付加し、ジベンゾチオフェンスルホキシド（DBTO）からジベンゾチオフェンスルホン（DBTO2）を生成し、次いで2'-ヒドロキシビフェニル-2-スルフィン酸塩を経て2-ヒドロキシビフェニル（2-HBP）を生成する反応を行う。その他、C-S結合切断型のDBT分解反応を行う微生物としては、例えば、コリネバクテリウム・エスピー（Corynebacterium sp.）SY-1株（Ohmori, T., Monna,L.,Saiki, Y.及びKodama,T. Appl.Environ. Microbiol.,58,911-915, 1992）、ブレビバクテリウム・エスピー（Brevibacterium sp.）DO株（van Afferden, M.,Schacht, S., Klein, J.及びTruper,H.G.,Arch. Microbiol.,153, 324-328,1990）や、アルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）K3b株（Dahlberg, M.D.(1992) Third International Symposium on the Biological Processing of Coal, May4-7, ClearwaterBeach,FL,pp.1-10.Electric Power Research Institute, PaloAlto, CA.）、ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株（特開平11-9293号公報）などが知られている。
【０００８】
C-S 結合切断型の脱硫反応を起こすことが知られている細菌で、そのDBT分解反応に関与する酵素活性をコードする遺伝子が同定され、その塩基配列が決定されているものとして、例えば、ロドコッカス・エリスロポリス IGTS8 株のdsz遺伝子（Denome, S., Oldfleld., C., Nash, L.J.及びYoung, K. D. J.Bacteriol., 176:6707-6716, 1994; Piddington, C.S., Kovacevich, B.R.及びRambosek, J. Appl.Environ. Microbiol., 61:468-475, 1995）、スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas sp.）AD109株のdsz遺伝子（米国特許第6,133,016号）、並びにペニバチルス・エスピー（Paenibacillus sp.）A11-2株のtds遺伝子（Y. Ishii, J. Konishi, H. Okada, K. Hirasawa, T. Onaka, M. Suzuki., Biochem. Biophy. Res. Comm., 2000）が挙げられる。ロドコッカス・エリスロポリス IGTS8株によるDBT分解反応は、DBTからDBTOを経てDBTO2への変換を触媒するDszC、DBTO2から2-(2'-ヒドロキシフェニル)ベンゼンスルフィン酸への変換を触媒するDszA、及び2-(2'-ヒドロキシフェニル)ベンゼンスルフィン酸から2-HBPへの変換を触媒するDszBの３つの酵素により触媒される（Denome, S., Oldfield., C., Nash, L.J.及びYoung,K.D. J.Bacteriol.,176:6707-6716, 1994; Gray, K.A., Pogrebinshy, O.S., Mrachko, G.T., Xi, L. Monticello, D.J.及びSquires, C.H. Nat Biotechnol., 14:1705-1709, 1996;並びにOldfield, C., Pogrebinsky, O., Simmonds, J., Olson, E.S.及びKulpa, C.F., Microbiology, 143:2961-2973, 1997）。上記それぞれの酵素をコードする遺伝子はdszC、dszA、及びdszBと呼ばれている。
【０００９】
DszCとDszAはモノオキシゲナーゼで、両者ともその酸素添加反応にはNADH-FMN酸化還元酵素活性の共存を必要とすることが知られている（Gray, K.A., Pogrebinsky, O.S., Mrachko, G.T., Xi, L. Monticello, D.J.及びSquires, C.H. Nat Biotechnol., 14:1705-1709, 1996; Xi, L. Squires, C.H., Monticello, D.J.及びChids, J.D. Biochem. Biophys. Res Commun., 230:73-76, 1997）。ロドコッカス・エリスロポリス IGTS8株由来のNADH-FMN酸化還元酵素活性を有する酵素はDszDと呼ばれ、その遺伝子配列がGray, K.A.らにより報告されている（米国特許第5,804,433号、又は米国特許第5,811,285号）。
【００１０】
種々のNADH-FMN酸化還元酵素からDszC、DszAに最適なものを選ぶことにより、脱硫活性を向上させることが期待される。NADH-FMN酸化還元酵素は非脱硫細菌にも広く分布しており、本発明者らは天然界から広くDBT酸化を促進するNADH-FMN酸化還元酵素生産菌をスクリーニングした結果、ペニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）A-1株を土壌から分離し、それからDBT酸化反応を促進する酸化還元酵素Flvをコードする遺伝子flvの単離に成功した（特開2000-245478号公報）。flvの塩基配列は、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）HB8株のNADHデヒドロゲナーゼ及びビブリオ・フィスケリ（Vibrio fischeri）の主要なNAD(P)H-フラビンオキシドレダクターゼ（FraseI）などと相同性が高かった。また、本発明者らはペニバチルス・ポリミキサA-1株とロドコッカス・エリスロポリスD-1株の酸化還元酵素のDszC及びDszAに対する活性の違いを比較した。その結果、ペニバチルス・ポリミキサA-1株をもちいたカップリングアッセイの場合、DszCで4倍、DszAで5倍の活性が得られた。しかしながら、脱硫活性を向上させるためには、より効率性の高い方法の開発が望まれる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、遺伝子工学的手法を用いて、ジベンゾチオフェン類分解酵素遺伝子及びそれと共役する酸化還元酵素遺伝子とを共発現させることにより、効率的に炭化水素燃料中の硫黄含量を低減させる手段を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ロドコッカス・エリスロポリス KA2-5-1株に、ジベンゾチオフェン（DBT）類分解酵素遺伝子及び非脱硫微生物由来のNADH-FMN酸化還元酵素遺伝子を導入したところ、得られる形質転換株のDBT類を分解する能力、すなわち脱硫活性が向上することを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
（１）ジベンゾチオフェン分解酵素をコードする遺伝子と酸化還元酵素をコードする遺伝子とがプロモーターの下流側に共発現可能に導入されたベクターであって、プロモーターがロドコッカス属微生物由来のｄｓｚプロモーターであって、ジベンソチオフェン分解酵素をコードする遺伝子が、ロドコッカス属微生物由来の遺伝子ｄｓｚＡ、ｄｓｚＢ及びｄｓｚＣであり、酸化還元酵素をコードする遺伝子が、ロドコッカス・エリスロポリスＫＡ２−５−１株由来の遺伝子ｄｓｚＤ又はペニバチルス・ポリミキサＡ−１株由来の遺伝子ｆｌｖであることを特徴とする、上記ベクター。
（２）ロドコッカス属微生物がロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株、ロドコッカス・エリスロポリスIGTS8株、ロドコッカス・エリスロポリスD-1株、ロドコッカス・エリスロポリスH-2株、ロドコッカス・エリスロポリスN1-36株、ロドコッカス・エリスロポリスI-19株、ロドコッカス・エスピーECRD-1株、ロドコッカス・エスピーB1株、ロドコッカス・エスピーSY-1株、又はロドコッカス・エスピーUM3株若しくはUM9株である、上記（１）に記載のベクター。
（３）上記（１）又は（２）に記載のベクターを含有するロドコッカス属微生物。
（４）上記（１）又は（２）に記載のベクターをロドコッカス属に属する宿主微生物に導入することを特徴とする、ジベンゾチオフェンを分解できる微生物の作出方法。
（５）上記（４）に記載の微生物の休止菌体とジベンゾチオフェンとを接触させることを特徴とする、ジベンゾチオフェンの分解方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、同一又は異なるベクターにDBT類分解酵素遺伝子とNADH-FMN酸化還元酵素遺伝子とを組み込んで両遺伝子を共発現させ、共発現によって得られた発現産物である酵素をジベンゾチオフェン類の分解に利用しようとするものである。
【００１６】
（１）本発明の組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターにDBT類分解酵素遺伝子、NADH-FMN酸化還元酵素遺伝子、及びこれらの遺伝子を共発現させるのに必要な配列を連結（挿入）することにより得ることができる。共発現とは、２つの異なるタンパク質をコードする遺伝子が、同じか又は異なるプロモーターに作動可能に結合されており、同時に発現されることを意味する。したがって、共発現が可能であるならば、目的遺伝子を同一のベクターに組み込んでもよいし、又は、異なるベクターに組み込んでバイナリーベクターとして使用してもよい。
【００１７】
本発明で使用するDBT類分解酵素遺伝子は、DBT類から相当するヒドロキシビフェニル体を生成する一連の酵素遺伝子であれば特に限定されない。例えば、ロドコッカス属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、ペニバチルス（Penibacillus）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ゴルドナ（Gordona）属、バチルス（Bacillus）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属などに属する微生物由来の分解酵素遺伝子を使用することができる。ロドコッカス属に属する微生物としては、ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株、ロドコッカス・エリスロポリス IGTS8株（C.S. Piddinton, B.R. Kovacevich and J. Rambosek, Appl. Environ. Microbiol. 61, 468-475 (1995)）、ロドコッカス・エリスロポリス D-1株（Izumiら、Appl. Environ. Microbiol. 60, 223-226 (1994)）、ロドコッカス・エリスロポリス H-2株（Ohshiro.T.ら、FEMS Microbiol. Lett. 142, 65-70 (1996)）、ロドコッカス・エリスロポリス N1-36株（Wang P.ら、Arch. Microbiol., 161, 266-271 (1994)）、ロドコッカス・エリスロポリス I-19株（Folsom B.R.ら、Appl. Environ. Microbiol. 65, 4967-4972 (1999)）、ロドコッカス・エスピー ECRD-1株（Grossman M.J.ら、Appl. Environ. Microbiol. 65, 181-188 (1999)）、ロドコッカス・エスピー B1株（Denis-Larose C.ら、Appl. Environ. Microbiol. 63, 2915-2919 (1997)）、ロドコッカス・エスピー SY1株（Omori T.ら、Appl. Environ. Microbiol. 59, 1195-1198 (1995)）、又はロドコッカス・エスピー UM3株若しくはUM9株（Purdy R.F Curr. Microbiol. 27, 219-222 (1993)）、スフィンゴモナス属に属する微生物としては、スフィンゴモナス・エスピーAD109株（WO98/45446号）、ペニバチルス属に属する微生物としては、ペニバチルス・エスピーA11-1株及びA11-2株（特願平10-310545号公報）、アグロバクテリウム属に属する微生物としては、アグロバクテリウム・エスピーMC501株（Constanti M. Enzyme Microb. Technol. 19, 214-219 (1996)）、マイコバクテリウム属に属する微生物としては、マイコバクテリウム・エスピーG3株（Nekodzuka S.ら、Biocatalysis Biotransformation 15, 21-27 (1997)）、ゴルドナ属に属する微生物としては、ゴルドナ・エスピーCYKS1株（Rhee S.ら、Appl. Environ. Microbiol. 64, 2327-2332 (1998)）、バチルス属に属する微生物としてはバチルス・ズブチリスWU-S2B株（Kirimura K. J. Biosci. Bioeng. 91, 262-266 (2001)）、アルスロバクター属に属する微生物としてはアルスロバクター・エスピーDS7株（Serbolisca L.ら、Appl. Microbiol, Biotechnol. 52, 122-126 (1999)）等が挙げられる。これらの菌株のうち、代表的な菌株の寄託番号は下記の通りである。
・ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株
寄託先：独立行政法人産業技術研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）、寄託番号FERM P-16277
・ロドコッカス・エリスロポリス IGTS8株
寄託先：ATCC、寄託番号53968
・スフィンゴモナス・エスピー AD109株
寄託先：ATCC、寄託番号55954
・ペニバチルス・エスピー A11-1株
寄託先：独立行政法人産業技術研究所  特許生物寄託センター、寄託番号FERM BP-6025
・ペニバチルス・エスピー A11-2株
寄託先：独立行政法人産業技術研究所  特許生物寄託センター、寄託番号FERM BP-6026
【００１８】
また、以上の菌株由来の遺伝子のほか、これらの菌株の変異株由来の遺伝子も使用することができる。本発明で使用しうる「変異株」とは、天然又は人為的に変異した株であるが、本発明に必要なDBT類分解の機能を有する酵素をコードする遺伝子を有するものを意味する。
【００１９】
本発明で使用するNADH-FMN酸化還元酵素遺伝子は、NADHを酸化しFMNを還元する酵素遺伝子であれば特に限定されない。DBT類分解酵素遺伝子と共に使用するために最適なものは、非脱硫微生物由来の酸化還元酵素遺伝子、特にペニバチルス・ポリミキサA-1株（寄託先：独立行政法人産業技術研究所  特許生物寄託センター、寄託番号FERM P-17274）由来の酸化還元酵素Flvをコードするflvである。
【００２０】
上記遺伝子は、該遺伝子の配列が公知である場合、その配列に基づいてプライマーを作製しポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に用いて、別途調製又は購入された生物細胞、組織由来のcDNAライブラリー若しくはゲノムライブラリーから目的の遺伝子を増幅し、精製することによって得ることができるし、あるいは、該遺伝子の配列が明らかでない場合、先ず対応するタンパク質を精製してその部分配列を決定し、その配列に基づき放射性標識プローブを作り、これを用いてcDNAライブラリー若しくはゲノムライブラリーから目的の遺伝子を含むクローンをスクリーニングし、必要に応じて再クローン化することによって該遺伝子を得ることができる。遺伝子クローニング及びスクリーニングの手法については、例えば、Sambrook, J.,Fritsch, E., F.及びManiatis, T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.に記載される方法を使用することができる。
【００２１】
本発明で使用するベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。
プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpRSET、pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２２】
宿主として大腸菌を使用する場合には、以下のようなベクターを使用するのが好ましい：強力なプロモーターとしてlac、lacUV5、trp、tac、trc、λpL、T7、rrnBなどを含むpUR系、pGEX系、pUC系、pET系、pT7系、pBluescrIpt系、pKK系、pBS系、pBC系、pCAL系など。
ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００２３】
本発明のベクターに必要な遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、DBT類分解酵素遺伝子、NADH-FMN酸化還元酵素遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２４】
本発明で使用するベクターの構成要素に関して、例えば、ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株を宿主とした場合には、複製必須領域、選択マーカー及び大腸菌複製領域が必要である。複製必須領域としてはロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）IFO3338株由来の内在性プラスミドpRC4（Y.Hashimoto, M.Nishiyama, F.Yu, I.Watanabe, S.Horinouchi及びT.Beppu, J.Gen.Microbiol.138,1003-1010(1992)）を利用しうる。選択マーカー及び大腸菌複製領域としてpHSG298（S.Takeshita, M.Sato, M.Toba, W.Masahashi及びT.Hashimoto-Gotoh,Gene61,63-74(1987)）を利用しうる。これらの構成要素を用いて融合プラスミドシャトルベクターpRHK1を作製することができる。このベクターpRHK1に、ロドコッカス・エリスロポリス KA2-5-1株由来のアルキルジベンゾチオフェン分解酵素遺伝子dszA、dszB及びdszC、並びにペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子flvを挿入することによって、共発現可能なベクターpRH112を作製することができる。
【００２５】
共発現可能な遺伝子の組み合わせとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
・ロドコッカス・エリスロポリス KA2-5-1株由来のDBT類分解酵素遺伝子（dszA、dszB及びdszC）と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・ロドコッカス・エリスロポリス IGTS8株由来のDBT類分解酵素遺伝子（dsz遺伝子）と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・スフィンゴモナス・エスピー AD109株由来のDBT類分解酵素遺伝子（dsz遺伝子）と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・ペニバチルス・エスピー A11-1株及び／又はペニバチルス・エスピー A11-2由来のDBT類分解酵素遺伝子（tds遺伝子）と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・ロドコッカス・エリスロポリス D-1株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・ロドコッカス・エリスロポリス H-2株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・ロドコッカス・エリスロポリス N1-36株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・ロドコッカス・エリスロポリス I-19株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・ロドコッカス・エスピー ECRD-1株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・ロドコッカス・エスピー B1株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・ロドコッカス・エスピー SY1株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・ロドコッカス・エスピー UM3株及び／又はUM9株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・アグロバクテリウム・エスピー MC501株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・マイコバクテリウム・エスピー G3株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・ゴルドナ・エスピー CYKS1株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）
・バチルス・ズブチリス WU-S2B株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）。
・アルスロバクター・エスピー DS7株由来のDBT類分解酵素遺伝子と、ペニバチルス・ポリミキサA-1株由来の酸化還元酵素遺伝子（flv）。
【００２６】
ベクター中に導入する上記組み合わせの遺伝子の方向及び順序は、それぞれの遺伝子が発現され、発現されたタンパク質が酵素として機能しうるのであれば、任意に配列及び選択してよい。この場合、DBT類分解酵素遺伝子は、dszA、dszB及びdszCの３種類を連結する必要があるが、その順序は任意でよく、方向も任意である。例えば、dszA、dszB、dszCの順に連結することも、dszB、dszC、dszAの順に連結することもできる。さらに、上記遺伝子の間に酸化還元酵素が連結されてもよく、またこれらの遺伝子は必ずしも隣接していなくてもよい。
【００２７】
（２）本発明の遺伝子組換え微生物の作出方法
本発明の遺伝子組換え微生物は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主として使用する微生物は、DBT類を分解する能力を有する微生物に限定されず、DBT類分解酵素遺伝子及び酸化還元酵素遺伝子を共発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、ロドコッカス・エリスロポリス等のロドコッカス属、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属に属する微生物が挙げられる。本発明で使用する宿主としては、ロドコッカス属又はエッシュリヒア属に属する微生物が好ましい。例えば、ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株が好適に用いられる。この菌株は、独立行政法人産業技術研究所、特許生物寄託センターに受託番号FERM P-17268として寄託されている。また、他に宿主として使用できるDBT類を分解する能力を有する微生物としては、ロドコッカス・エリスロポリス IGTS8株を例示することができる。この菌株は、ATCCに寄託番号53968として寄託されている。
【００２８】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２９】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12、DH1などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
【００３０】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N.ら(1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114)、エレクトロポレーション法、電気パルス法、コンピテントセル法、接合伝達法、プロトプラスト法などが挙げられる。例えば、ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株を宿主としてpRH112又はpRH114を導入する場合には電気パルス法が用いられる。形質転換体は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、pRH112又はpRH114により形質転換したロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株はカナマイシン硫酸を約100mg/L含む寒天LB培地で選択することが可能である。
【００３１】
以上のようにして作出された微生物の培養は、微生物の通常の培養法にしたがって行われる。培養の形態は固体培養でも液体培養でもよいが、液体培養が好ましい。培地の栄養源としては通常用いられているものが広く用いられる。炭素源としては利用可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、コハク酸、クエン酸、酢酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物などの有機栄養物質が使用される。脱硫反応に影響を与える可能性のある硫黄化合物を含まない培地で培養するのが望ましい場合には、塩化アンモニウムのような無機窒素化合物も使用することができる。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン類などが必要に応じて用いられる。培養は、微生物が生育可能である温度、pHで行われ、使用する微生物の最適培養条件で行うのが好ましい。一般的には、培地のpHを適当なpH、例えばpH６〜８とし、また、適当な温度、例えば約30℃にて、振盪又は通気条件下で好気的に行われる。
【００３２】
（３）本発明の微生物によるジベンゾチオフェン類の分解方法
本発明のDBT類の分解方法は、上記の微生物を利用して行うことを特徴とするもので、具体的には、上記微生物の休止菌体とDBT類を接触させる方法である。この方法は、例えば以下のようにして行われる。
【００３３】
なお、ジベンゾチオフェン類としては、ジベンゾチオフェン（DBT）、2-メチルジベンゾチオフェン（2-M-DBT）、3-メチルジベンゾチオフェン（3-M-DBT）、2,4-ジメチルジベンゾチオフェン（2,4-DM-DBT）、2,4-ジエチル-ジベンゾチオフェン（2,4-DE-DBT）などを例示することができる。
【００３４】
まず、休止菌体を調製する。新鮮な培地に種菌を適当量、例えば１〜２容量％接種する。種菌としては、対数増殖期初期から定常期までのいずれかの状態の菌を用いればよく、好ましくは対数増殖期後期のものを用いる。種菌の量は必要に応じて増減することができる。その後、pH６〜９、約30℃にて１〜２日間往復又は回転振盪培養する。また、本発明で使用する培地としてはA培地（Izumi Y.,Ohshiro T.,Ogino H.,Hine及びY.,Shimao M., Applied and Environmental Microbiology, 223-226 (1994)）を用いるのが好適である。次いで、菌体を分離集菌し、洗浄することにより休止菌体が得られる。休止菌体とは、分裂能力を保持するが、一時的に分裂しない状態にある菌体を指す。集菌は、培養菌体が対数増殖期初期から定常期までのいずれの状態にある時に行ってもよいが、対数増殖期中期から後期の状態にある時に行うのが好ましい。また、集菌は、遠心分離の他、濾過、沈降分離等のいかなる方法で行ってもよい。菌体の洗浄には、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等のいかなる緩衝液を使用してもよく、また、水を用いて菌体を洗浄することもできる。
【００３５】
休止菌体による分解は、休止菌体を適当な緩衝液に懸濁して調製した菌懸濁液に基質であるDBT類を添加して反応させることにより行う。緩衝液としては種々の緩衝液を使用できる。緩衝液のpHは特に限定されないが、pH６〜７が好適である。また、緩衝液の代わりに、水や培地等を使用することもできる。菌体懸濁液の濃度は、ＯＤ660が１〜10の間が好適であり、必要に応じて増減できる。基質の濃度は、1〜10,000ppm が好適であるが、必要に応じて増減できる。反応は30℃で行うのが好適であるが、そのほかの適当な温度でもよく、また反応時間は１〜２時間が好適であるが、必要に応じて増減できる。また、基質を添加する前に反応温度と同じ温度に反応液を予備加熱してもよい。
【００３６】
また、休止菌体による反応は、n-テトラデカン等の有機溶媒を添加した油水２相系で行うこともできる。この場合、使用可能な有機溶媒としては、n-テトラデカンの他、Ｃ8〜Ｃ20のn-パラフィンやケロシン、軽油、重油などが挙げられる。また、必要に応じて反応液上方の気相を酸素で置換封入してもよい。
分解率の測定は、ガスクロマトグラフィー（GC）、ガスクロマトグラフィー／質量スペクトル分析（GC/MS）などを使用して行うことができる。また、必要に応じて他の分析方法を併せて利用してもよい。
【００３７】
本発明の微生物を利用することにより、石油等の化石燃料中に含まれるベンゾチオフェンやDBT類及びこれらの置換体、又はそれらの誘導体中の硫黄を遊離させることができるので、石油・石炭等の化石燃料の燃焼により空気中に拡散する硫黄を、化石燃料中から容易に除去することができるようになる。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
【００３９】
実施例中の遺伝子操作に関連した実験は、主にManiatisらの成書（Sambrook, J.,Fritsch, E., F.及びManiatis, T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.)に詳述されている方法に従って行った。
【００４０】
〔実施例１〕  DBT類分解酵素遺伝子を含む組み換えプラスミドの作製
ロドコッカス・ロドクロウス IFO3338株より抽出精製したプラスミドpRC4をClaI消化し平滑化したものと、宝酒造(株)より入手したベクターpHSG298をStuIで消化し脱リン酸化処理したものとをライゲーションし、ロドコッカス-大腸菌シャトルベクターpRHK1を構築した(特開2001-029065号公報)。
【００４１】
ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株からプラークハイブリダイゼーション法によりDBT類分解酵素遺伝子dszA、dszB及びdszCを含む約11kbのDNA断片をクローン化した。これをPvuIで消化して生成した約4.5kbのDNA断片を平滑化し、pBluescriptIIKS(+) SmaIサイトに組み込み、プラスミドpBKPP及びpBKPPRを構築した。pBKPP及びpBKPPRをEcoRI及びXbaIで消化し、シャトルベクターpRHK1のEcoRI-XbaI消化物とライゲーションし、分解遺伝子を含むプラスミドpRKPP及びpRKPPRを構築した(特開2001-029065号公報)。
【００４２】
ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株から調製した染色体DNAから、dszA、dszB及びdszCを含む断片をPCR法により増幅し、pBluescript SK+のEcoRI-HindIII部位にクローニングした(pSKEXH)。PCR法の条件を下記に示す。
【００４３】
以下に示すようなPCR用プライマーを作製した：
センスプライマー：5'-ACCATATGACTCAACAACGACAAAGCA-3'（配列番号１）
アンチセンスプライマー：5'-TCAGGAGGTGAAGCCGGGAAT-3'（配列番号２）
これらのセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて、ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株から調製したKA2-5-1株DNA を鋳型として用いて行ったPCR の条件は以下の通りである。
0004129494.tif 000002
【００４４】
上記の条件でPCRを行った結果、アニーリング温度が46〜54℃の時、約3,600bpの増幅フラグメントを与えることが確認された。このPCR産物を、Bluescript SK(+)ベクターを用いて大腸菌 JM109株にクローン化した。クローニング断片の塩基配列はdszA、dszB及びdszCと一致した。
【００４５】
〔実施例2〕  DBT類分解酵素遺伝子及びペニバチルス・ポリミキサA-1株の酸化還元酵素遺伝子を含む組み換えプラスミドの作製
ペニバチルス・ポリミキサA-1株から調製した染色体DNAから下記のプライマーを用いて酸化還元酵素をコードするflvを増幅した：
センスプライマー：5'- .GGGAAGCTTGAAATTAGGAGTGTGCCCAGAATGTC-3'（配列番号３）
アンチセンスプライマー：5'- GGGAAGCTTTTAGAAGCTGCCTTTTACAACAACGTC -3'（配列番号４）
PCRの条件は上記と同じである。
【００４６】
この断片をpSKEXHのHindIII 部位にクローニングした(pSKEXHflv)。クローニングの向きはdszA、dszB、dszCと同じ方向である。
pSKEXHflvをSphI-ClaIで切断しdszCの一部分及びflv全長を含む断片を回収した。PPRをSphI-ClaIで切断し、この部分にpSHEXHflvのSphI-ClaI断片をクローニングした(pPRflv)。次にpPRflvをXbaI-ClaIで切断しT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した後、dszプロモーター、dszA、dszB、dszC及びflvを含む断片を回収した。PRHK1をEcoRIで切断し、平滑末端化した部位にこの断片をクローニングした(pRH112)（図１）。
【００４７】
〔実施例 3〕  DBT類分解酵素遺伝子及びロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株の酸化還元酵素遺伝子を含む組み換えプラスミドの作製
ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株から調製した染色体DNAから以下に示すプライマーにより酸化還元酵素をコードするdszDを増幅した：
センスプライマー：5'- GGGAAGCTTGGAGGATTCCCGATGTCT-3'（配列番号５）
アンチセンスプライマー：5'- GGGAAGCTTTGTAACTTGCTGTGCGCCTTTA-3'（配列番号６）。
【００４８】
この断片をpSKEXHのHindIII 部位にクローニングした(pSKEXHD)。クローニングの向きはdszA、dszB、dszCと同じ方向である。pSKEXHDをSphI-ClaIで切断しdszCの一部分及びdszD全長を含む断片を回収した。PPRをSphI-ClaIで切断し、この部分にpSHEXHDのSphI-ClaI断片をクローニングした(pPRD)。pPRDをXbaI-ClaIで切断しT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した後、dszプロモーター、dszA、dszB、dszC及びdszDを含む断片を回収した。pRHK1をEcoRIで切断し、平滑末端化した部位にこの断片をクローニングした(pRH114)（図２）。PPPRをXbaI-ClaIで切断し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した後にdszプロモーター、dszA、dszB及びdszCを含む断片を回収した。pRHK1をEcoRIで切断後、平滑末端化した部位にこの断片をクローニングした(pRH110)。
【００４９】
〔実施例4〕pRH110, pRH112, pRH114, pRHK1のロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1CS株への形質転換
ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株をニトロソグアニジン処理してジベンゾチオフェン類分解酵素遺伝子をもつプラスミドを欠失した変異株を取得した(Rhodococcus erythropolis KA2-5-1CS株)。ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1CS株を5mlのA培地（1%ペプトン、1%グルコース、0.7%肉エキス、0.5%酵母エキス、0.3%塩化ナトリウム）を入れた18mm試験管に植菌し、2日間、30℃で往復振とう培養し前培養液を作った。次いで100mlのA培地を入れた1L坂口フラスコに、前培養液1mlを加え、２日間、30℃で往復振とう培養を行った。得られた菌体を遠心分離（8,000×g、４℃、10分）で回収後、滅菌水にて2回洗浄し、測定波長660nmでの濁度が40になるように10％グリセロール水溶液に懸濁した。
【００５０】
該懸濁液80μlにpRH110, pRH112, pRH114及び pRHK1の遺伝子溶液1μlを添加し、Biorad社ジーンパルサーIIを用いて25μF、400Ω、1.5kV/cmの条件で処理した。処理液にSOC培地0.42mlを添加し、30℃、3時間培養を行った。得られた培養液をカナマイシン硫酸塩100mg/l及び寒天末15 g/lを含むLB培地（LBAK培地）に塗末し、30℃、48時間培養した。LBAK培地においてコロニーを形成した菌を再度新鮮なLBAK培地に画線することによって菌体を純化し、pRH110/ KA2-5-1CS株, pRH112/ KA2-5-1CS株, pRH114/ KA2-5-1CS株, pRHK1/ KA2-5-1CS株とした。
【００５１】
pRH110/ KA2-5-1CS株, pRH112/ KA2-5-1CS株, pRH114/ KA2-5-1CS株, pRHK1/ KA2-5-1CS株はDenis-Laroseらの方法(Appl.Environ.Microbiol.63:2915-2919(1997))に従ってプラスミドDNAを菌体より抽出、精製し、制限酵素の切断パターンから、それぞれ、pRH110, pRH112, pRH114及び pRHK1により形質転換されていることを確認した。
【００５２】
〔実施例5〕  pRH110/ KA2-5-1CS株、pRH112/ KA2-5-1CS株及びpRH114/ KA2-5-1CS株の培養
DBT25ppm（N,N-ジメチルホルムアミド溶液）を含むA培地 (Izumi Yら、Applied and Environmental Microbiology, 223-226 (1994)) 2mlに、1白菌耳量のpRH110/ KA2-5-1CS株, pRH112/ KA2-5-1CS株又はpRH114/ KA2-5-1CS株を植菌し、30℃で72時間培養した。A培地中には培地成分として硫黄源が全く含まれていないことから、上記培地において該菌株の増殖が認められる場合は、DBTを唯一の硫黄源として増殖していることが示唆される。得られた培養液の660nmにおける吸光度(OD660)を測定したところ、それぞれ2.5, 3.6, 3.3であった。
【００５３】
〔実施例 6〕pRH110/ KA2-5-1CS株及びpRH112/ KA2-5-1CS株の脱硫休止菌体反応によるDBT類の分解
DBT25ppm（N,N-ジメチルホルムアミド溶液）を含むA培地100mlに、1白菌耳量のpRH110/ KA2-5-1CS株又はpRH112/ KA2-5-1CS株を植菌し、30℃で72時間培養した。得られた培養液を4℃、8,000rpm,5minの条件で遠心分離し、沈殿をpH7.5の1/15M リン酸緩衝液にて2回洗浄し、同緩衝液に懸濁して反応用菌体とした。
【００５４】
pRH112/ KA2-5-1CS株及びpRH114/ KA2-5-1CS株の脱硫酵素活性を以下の方法で測定した。pRH112/ KA2-5-1CS株又はpRH114/ KA2-5-1CS株の培養菌体をリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）100mM にOD660nm=10になるよう懸濁した後、DBT 0.24mMを添加し、総体積1 mlで、30℃で2時間振とう反応を行った後、50μlの1M塩酸を加えて反応を停止後、1mllの酢酸エチルを加えた。これを遠心分離し、その上清をガスクロマトグラフィーに注入し、生成2HBPを定量した。図3に、ロドコッカス・エリスロポリスKA-2-5-1 CS株におけるdsz遺伝子及び酸化還元酵素遺伝子の共発現の結果を示す。その結果、flvとdszA、dszB及びdszCとを共発現させたpRH112はpRH110に比較して5倍の脱硫活性が得られた。
【００５５】
〔実施例 7〕pRH112/ KA2-5-1CS株及びpRH114/ KA2-5-1CS株の脱硫休止菌体反応によるDBT類の分解
実施例６に記載の方法と同様の方法によって、pRH114/ KA2-5-1CS株の脱硫休止菌体反応を測定し、pRH112/ KA2-5-1CS株と比較した。その結果を図3に示す。Flvを導入しジベンゾリオフェン類分解酵素と共発現させたpRH112/ KA2-5-1CS株は、dszDをDBT類分解酵素と共発現させたpRH114/ KA2-5-1CS株に比較して、1.2倍の脱硫休止菌体活性が得られた。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、微生物を利用することによりDBT類を穏和な条件で効率的に分解することができる。また、DBT類は化石燃料中に存在する硫黄化合物であるので、本発明はこれらの化石燃料の脱硫法としても利用することができる。
【００５７】
【配列表】
0004129494.tif 000003
0004129494.tif 000004
0004129494.tif 000005
【００５８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株からdszA、dszB及びdszCを含む断片を増幅するためのPCR用センスプライマー。
配列番号２：ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株からdszA、dszB及びdszCを含む断片を増幅するためのPCR用アンチセンスプライマー。
配列番号３：ペニバチルス・ポリミキサA-1株からflvを含むを増幅するためのPCR用センスプライマー。
配列番号４：ペニバチルス・ポリミキサA-1株からflvを含む断片を増幅するためのPCR用アンチセンスプライマー。
配列番号５：ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株からdszDを含む断片を増幅するためのPCR用センスプライマー。
配列番号６：ロドコッカス・エリスロポリスKA2-5-1株からdszDを含む断片を増幅するためのPCR用アンチセンスプライマー。
【図面の簡単な説明】
【図１】ロドコッカス-大腸菌シャトルベクターpRH112の構築方法を示す図である。
【図２】ロドコッカス-大腸菌シャトルベクターpRH114の構築方法を示す図である。
【図３】  pRH110/ KA2-5-1CS株、pRH112/ KA2-5-1CS株、pRH114/ KA2-5-1CS株及びpRHK1/ KA2-5-1CS株の脱硫休止菌体反応によるDBT類の分解活性を示す図である。
【図１】
0004129494.tif 000006
【図２】
0004129494.tif 000007
【図３】
0004129494.tif 000008