(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）結合部位を有する特異的細胞を認識して殺傷する標的キメラ毒素であって、
細胞ターゲティング部位及び細胞殺傷部位を含み、
前記細胞ターゲティング部位と前記細胞殺傷部位とが、遺伝子工学技術を用いてｃＤＮＡレベルで融合され、
前記細胞ターゲティング部位が、ＧｎＲＨ、又は、ＧｎＲＨ結合部位に結合可能なＧｎＲＨ類似体であり、
前記細胞殺傷部位が、シュードモナスエキソトキシンＡ（ＰＥ）からなる標的キメラ毒素。
【請求項２】
前記ＧｎＲＨ結合部位を有する特異的な細胞が、悪性の癌腫細胞、良性の分散型子宮筋腫細胞、子宮内膜の島細胞、及び下垂体腫瘍腺腫細胞から選ばれる請求項１に記載の標的キメラ毒素。
【請求項３】
前記細胞ターゲティング部位が、ＧｎＲＨ結合部位に結合可能な１０のアミノ酸配列からなるＧｎＲＨ類似体であり、
前記細胞殺傷部位が、全長ＰＥの変異型（ＰＥ６６）であって、
前記ＧｎＲＨ類似体と前記ＰＥ６６とが融合したタンパク質ＧｎＲＨ−ＰＥ６６をコードする融合遺伝子を用いて製造された請求項１又は２に記載の標的キメラ毒素。
【請求項４】
前記細胞ターゲティング部位が、ＧｎＲＨ結合部位に結合可能な１０のアミノ酸配列からなるＧｎＲＨ類似体であり、
前記細胞殺傷部位が、ＰＥのドメインＩＩ及びＩＩＩ（ＰＥ４０）であって、
前記ＧｎＲＨ類似体と前記ＰＥ４０とが融合したタンパク質ＧｎＲＨ−ＰＥ４０をコードする融合遺伝子を用いて製造された請求項１又は２に記載の標的キメラ毒素。
【請求項５】
前記ＧｎＲＨ類似体のアミノ酸配列が、Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙである請求項１から４のいずれか一項に記載の標的キメラ毒素。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の標的キメラ毒素を製造する方法であって、ＰＥ６６をコードする塩基配列の上流に、前記１０のアミノ酸配列からなるＧｎＲＨ類似体をコードするオリゴヌクレオチドを融合させることを含む製造方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載の標的キメラ毒素を製造する方法であって、ＰＥ４０をコードする塩基配列の上流に、前記１０のアミノ酸配列からなるＧｎＲＨ類似体をコードするオリゴヌクレオチドを融合させることを含む製造方法。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項に記載の標的キメラ毒素を活性成分として含む、癌治療用組成物。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか一項に記載の標的キメラ毒素を活性成分として含む、悪性の癌腫瘍又は良性の腫瘍の治療用組成物。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれか一項に記載の標的キメラ毒素を活性成分として含む、子宮内膜症の治療用組成物。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれか一項に記載の標的キメラ毒素を活性成分として含む、子宮筋腫の治療用組成物。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれか一項に記載の標的キメラ毒素を活性成分として含む、下垂体腺種の治療用組成物。
【請求項１３】
請求項１から５のいずれか一項に記載の標的キメラ毒素を活性成分として含む、ＢＰＨ（前立腺肥大症）の治療用組成物。
【請求項１４】
請求項１から５のいずれか一項に記載の標的キメラ毒素を活性成分として含む、多嚢胞性乳房疾患の治療用組成物。
【請求項１５】
請求項１から５のいずれか一項に記載の標的キメラ毒素をコードするＤＮＡ分子と機能可能なように結合されたプロモーターを含むプラスミド。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般的に、癌の標的治療、さらに、乳癌、結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、腎臓癌等の悪性の癌腫の治療、並びに子宮の良性腫瘍、過形成、子宮内膜症、前立腺肥大症、多嚢胞性乳房疾患、及び下垂体腺腫の治療に特に有用な治療薬に関する。
特に、前記発明は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン結合部位を有する腫瘍細胞をねらったシュードモナスエキソトキシン系のキメラ毒素に関する。さらに、本発明は、活性成分として前記腫瘍細胞標的キメラ毒素を含む薬剤組成物に関する。さらに、本発明は、前記キメラ毒素の製造方法に関する。本発明によるこれらのキメラタンパク質は、好ましくは、細菌毒素シュードモナス エキソトキシンＡからなる、性腺刺激ホルモン放出ホルモン結合部位を有する腫瘍細胞を認識して破壊するための、細胞殺傷部分と結合した性腺刺激ホルモン放出ホルモンホモロジーを含む。
「標的とする」とは、化学的治療薬の特異細胞集団への選択的輸送を表す言葉である。細胞を標的とするドメインと細胞毒素ドメインとを有するキメラ分子を作ることが可能である。これらのキメラ分子は、細胞を選択的に標的とし、次いで、その毒素成分を介して、細胞を殺傷することができることから、細胞選択的毒として機能する。そのようなキメラタンパク質を作るのに使用される細菌毒素であるシュードモナス エキソトキシン（以下ＰＥと呼ぶ）は、真核細胞におけるタンパク質合成を不可逆的に阻止し、細胞死を引き起こす。
本発明における「性腺刺激ホルモン放出ホルモンホモロジー」という語は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン自身、もしくはその類似体及び拮抗体を表す。本発明には、前記キメラタンパク質の塩類も含まれる。「塩類」という語は、カルボキシ基の塩類とタンパク質分子のアミノ基の酸添加塩類の両方を含む。さらに、本発明は、薬学的に受け入れられる不活性担体とともに前記キメラタンパク質を含む薬剤組成物に関する。本発明のタンパク質は、タンパク質の投与の技術において公知の方法によって投与できる。
発明の背景
性腺刺激ホルモン放出ホルモン（以下ＧｎＲＨと呼ぶ）は、ヒトの生殖の視床下部−脳下垂体生殖腺コントロールに関与する。数例の癌腫で、ＧｎＲＨの関与が証明されており、また、ＧｎＲＨ類似体治療は、乳房、前立腺、膵臓、子宮内膜及び卵巣の癌に適用されている（カダー ティー．（Kadar T.）他著、プロステート（Prostate）12：229-307, 1988）。これらの類似体は、生体外及び生体内での腫瘍細胞の成長を抑制する。該当する悪性細胞及びよく確立された細胞ラインにおいて、ＧｎＲＨ結合部位の存在が明らかにされた（エモンス ジー．（Emons G.）他著、ジャーナル オフ クリン．エンドクリノル．メタボ．（J.Clin.Endocrinol.Metab.）77: 1458-1464, 1993）、しかし、予備的結果として、関与するＧｎＲＨ受容体が、既に証明された受容体とは異なるかもしれないことが示唆されている（カダー他著、バイオケミ．バイオフィジ．レス．コミュ．（Biochem.Biophs.Res.Comm.）189:289-295,1992）。
ＧｎＲＨ結合部位は、多くの固体腫瘍及びホルモン依存組織から主として誘導される様々な癌腫細胞ラインにおいて証明されてきたが、結腸もしくは腎臓の癌腫にそれらが存在するということは、以前には証明されていなかった。結腸、乳房、前立腺、卵巣、子宮内膜、腎臓及び肝臓の癌腫における特異的なＧｎＲＨ結合部位の存在をここに示す。驚いたことに、結腸癌、腎細胞癌、及び肝臓腫瘍の細胞のマークされた殺傷によって示されるように、特異的なＧｎＲＨ結合部位は、ホルモン依存組織に限定されない。
ＷＯ特許Ｎｏ．93/15751は、合成有機化学の技術を用いて調製され、動物の脳下垂体の生殖腺刺激ホルモン放出細胞を殺傷することによって、動物を生殖不能にするために使用されるＧｎＲＨの様々な接合体、結合基、及びシュードモナス トキシンＡを記載している。
本発明は、ＧｎＲＨ結合部位を有する腫瘍細胞を標的とすることを目的とされたＰＥ系キメラ毒素の、遺伝子工学の技術による構成を記載する。本発明のキメラ毒素は、融合タンパク質であり、そのため、（前記特許に示されているような）化学的結合基を含まず、したがって、それらは、ＷＯ特許に記載されている分子とは全く異なる。
異なる種類の標的部分を使用して、過去２０年間に、化学的結合技術やＤＮＡ組換え技術によって、多数の免疫毒素が生成された。これらの標的部分の大きさは広範囲であり、大きな抗体から、小さな成長因子、サイトカインや抗体断片にわたる。
本発明に記載のＧｎＲＨ−ＰＥの構造のように、大きなキメラタンパク質が、非常に小さな部分のポリペプチド（本発明の標的部分として使用されているような１０のアミノ酸のペプチド）を介して細胞を標的とすることができ、しかも、それらの元来の機能、すなわち、結合及び内在化を保つことができることで、標的免疫毒素を作る新たな可能性が開ける。
ヒトに発生する４つの主な悪性腫瘍のうちの３つである結腸、乳房、及び前立腺癌は、卵巣、子宮、腎臓及び肝臓の癌腫とあわせると、癌関連死の５０％を超える。これらの癌全てにおいて特異的なＧｎＲＧ結合部位が存在するということは、悪性の過程で、ＧｎＲＨ及び／またはＧｎＲＨ様ペプチド類が、より一般的な役割を果たすことを示唆し得る。
集合的に、これらの結果は、これらの悪性成長のアキレス腱であると考えられ得るもの、癌との闘いにおける新たな展望を切り開き得る１つの発見を開示する。
前記癌細胞の効果的な成長阻止、及び標的でない細胞に関するそれらの特異性に鑑みて、新規なＧｎＲＨ−ＰＥキメラ毒素は、癌治療の有力な候補である。
発明の要旨
本発明は、特に、腫瘍細胞を認識して破壊するための、細胞を標的とする部分と細胞殺傷部分を含む腫瘍細胞標的キメラ毒素であって、前記細胞を標的とする部分は、性腺刺激ホルモン放出ホルモンホモロジーからなり、前記細胞殺傷部分は、シュードモナス エキソトキシンＡからなる腫瘍細胞標的キメラ毒素に関する。さらに、本発明は、これらの腫瘍細胞標的キメラ毒素を、活性成分として含む薬剤組成物、及びこれらのキメラ毒素の製造方法に関する。また、前記発明は、癌治療、悪性の癌腫及び、子宮筋腫細胞、過剰な子宮内膜の島細胞をはじめとした良性の過形成、前立腺及び乳房の良性の過形成、及び下垂体腫瘍腺腫細胞を、上記キメラ毒素を用いて治療するための方法に関する。
発明の詳細な説明
本発明は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）類似体（６番目のアミノ酸としてグリシンのかわりにトリプトファンをもつ塩基配列をコードするＧｎＲＨ）の１０のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを、突然変異形態のＰＥ（ドメインＩ（突然変異）、ＩＩ，及びＩＩＩ）の上流に結合し、それによって、ＧｎＲＨ−ＰＥ６６を生成することによって構成されたシュードモナスエキソトキシンＡ（ＰＥ）系のキメラ毒素、並びにＰＥのドメインＩＩ及びＩＩＩに結合され、それによってＧｎＲＨ−ＰＥ４０タンパク質を生成する１０のアミノ酸合成ＧｎＲＨオリゴマー（６番目のアミノ酸としてグリシンにかわってトリプトファンをもつ塩基配列をコードするＧｎＲＨ）を記載する。
本発明のキメラタンパク質の実用性、可能性のあるマーケット、及び商業上の利点を列挙する。２つの主要な実用性としては：
１）悪性の癌腫：
乳房、結腸、肝臓、卵巣及び腎臓の癌腫は、全て、ＧｎＲＨ−ＰＥ介在細胞毒性に感受性がある。したがって、最初のラインの治療として、または、他の治療方法が奏効しなかった患者のための治療として、この新しいキメラタンパク質の可能性のあるマーケットは、全ての癌患者を含む。
２）子宮の良性腫瘍及び過形成：
このグループの病理所見には、ＧｎＲＨに感受性があることが既知の様々な組織が含まれる。したがって、ＧｎＲＨ−ＰＥキメラタンパク質の標的となり得る。
ａ．子宮−分散型子宮筋腫は、女性における最も一般的な良性腫瘍である。子宮筋腫は、多数のＧｎＲＨ受容体を持つことがわかっている。ＧｎＲＨ類似体は、これらの筋腫の下降調節及び収縮のために臨床的に使用される。ＧｎＲＨ類似体の欠点は、これらの化合物を長期間使用することができないこと、及び治療を中断すると筋腫が元の大きさに戻ることである。筋腫を破壊するためにＧｎＲＨ−ＰＥを使用することで、いわゆるイミナント（iminant）子宮摘出術、また、同様にこれらの患者が使用する止血剤を適用しなくてすむようにし得る。任意のマーケットとしては、子宮類線維腫の女性が含まれる。
ｂ．子宮内膜症−子宮内膜腫：子宮には内膜組織が存在するため、子宮内膜症と呼ばれる疾患が起こる。それは、不妊、腹痛を引き起こし、緊急手術を必要とすることさえある。
子宮内膜の島は、ホルモンの変化に非常に敏感であることが知られている。臨床的効果があると判明している治療方法の１つは、ＧｎＲＨ類似体である。ＧｎＲＨ−ＰＥを使用すると、これらの島の子宮内膜活性を阻止することができる。これによって、不妊の夫婦、また、同様に子宮内膜の島の切除術のために開腹術を受ける女性を助ける。分散型筋腫及び子宮内膜症の治療は、全身投与によって、または、超音波、もしくは腹腔鏡下誘導注射のいずれかによる子宮内膜腹膜腔への局所投与によって、または、子宮腔への徐放によって投与することができる。
ｃ．良性の前立腺肥大症（ＢＰＨ）：
前立腺細胞は、ＧｎＲＨ受容体を発現することが知られており、前立腺癌は、今日ＧｎＲＨアゴニストによる治療が奏効している。ＢＰＨは、排尿障害（dissuria）、残尿の重篤な症状を引き起こし、また、前立腺切除によってしか治療できないこともある。したがって、ＧｎＲＨ−ＰＥの使用は、悪性でない前立腺肥大に対して行われてきた全ての前立腺切除の処置に取って代わることができる。
その可能性のあるマーケットは、有症性前立腺肥大に苦しむ全ての高齢男性である。ＧｎＲＨ−ＰＥキメラタンパク質は、全身投与でもよいし、トランスウテラリー（trans uterally）投与でもよい。
ｄ．多嚢胞性乳房疾患：
乳腺細胞もまた、ＧｎＲＨ受容体を発現することが知られている。ＢＰＨの場合と同様、多嚢胞性乳房疾患も有症性であり、痛みを伴い、乳癌に似ていることもある。ＧｎＲＨ−ＰＥの使用によって、多数の検診や不必要なマンモグラフィの必要がなくなり、そして、胸の痛みや乳癌の*****に苦しむ女性を助ける。
可能性のあるマーケットとしては、多嚢胞性乳房疾患と診断された多くの女性である。ＧｎＲＨ−ＰＥは、全身投与し得る。
ｅ．下垂体腺腫：下垂体腺腫には、性腺刺激細胞から誘導されるものがある。下垂体腺腫は、悪性ではないが、生命器官（目、脳幹）の局所的圧迫を引き起こすことによって、重大な予後が生じる得る。下垂体腺腫に適用される経蝶形骨の手術は、再発や神経学的な後遺症をはじめとした多くの欠点がある。ＧｎＲＨ−ＰＥは、下垂体腺腫の他の機能を傷つけることなく、直接的に性腺刺激細胞をねらうことができる。ＧｎＲＨ−ＰＥキメラ毒素は、髄腔内投与し得る。
商業的利点
１．ＧｎＲＨ−ＰＥキメラタンパク質に反応する多様な腫瘍。
２．大きな治療範囲を可能とする高い選択性。
３．ＧｎＲＨが生理学的役割をもたない閉経後の多数の女性を本治療の完全な候補として残す、標的ペプチドとしてのＧｎＲＨの使用。
４．その高い特異性が、局所的効果とあわせて、全身投与を可能とする。
５．自身を害することのない組織の中の小さな細胞集団を根絶する能力。
本発明のタンパク質は、タンパク質の投与の技術において公知の方法によって、投与し得る。また、記載されているキメラタンパク質の塩類も本発明の範囲に含まれる。この「塩類」という語は、カルボキシ基の塩類とタンパク質分子のアミノ基の酸添加塩類の両方を含む。カルボキシ基の塩類は、この技術において公知の方法によって形成され、無機塩類と有機塩基をもつ塩類の両方を含む。さらに、本発明は、上記のキメラタンパク質を、薬学的に受け入れられた不活性担体とともに含む薬剤組成物に関する。その薬剤組成物は、注射（静脈内、骨関節内、皮下、筋肉内、腹膜内）による局所投与、経口投与、徐放、または、経腸ルートを含む他のルートによって投与できる。
以下の実験及び図面を用いて、本発明をさらに詳しく説明する。これらの実験及び図面は、発明の範囲を限定することを目的としているのでなく、それを証明し、明確にすることだけを目的とする。
図面の説明
図１：ＧｎＲＨ−ＰＥ６６キメラ毒素の構成と発現
Ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
Ｂ：ＴＧｎＲＨ−ＰＥ６６プラスミド発現の免疫ブロッティング分析。溶融されたバクテリアの細胞抽出物全体（レーン１）。可溶性画分（レーン２）。不溶性画分（レーン３）。
Ｃ：ＴＧｎＲＨ−ＰＥ６６プラスミドの構成。
0004067123.tif 000002
番号は、該当するアミノ酸を表す。
図２：ＧｎＲＨ−ＰＥ６６の濃度上昇が様々な細胞ラインに及ぼす効果。
Ａ：■ ＳＷ−４８結腸癌、● ＨｅｐＧ２ 肝臓癌、▲ Ｃａｃｏ２ 結腸癌
0004067123.tif 000003
図３：ＧｎＲＨ−ＰＥ６６が様々な一次培養に及ぼす効果。
Ａ：患者３例から得た結腸癌の一次培養
Ｂ：腎細胞癌の一次培養
Ｃ：患者４例から得た乳癌の一次培養
Ｄ：患者２例から得た卵巣癌の一次培養
Ｅ：Ａ，Ｃ及びＤに同じシンボルで表された該当する患者から得た転移の一次培養。● 結腸癌転移、
0004067123.tif 000004
Ｆ：対照細胞：＃ 白血球、▲ 骨髄、● 線維芽細胞、▽ 結腸
図４：一次培養の組織病理学的診断
Ａ：結腸一次培養の抗ケラチン陽性染色
Ｂ：結腸一次培養の抗デスミン陰性染色
図５：ＳＷ−４８細胞膜に結合した［125Ｉ］ＧｎＲＨの変位。〇 ＧｎＲＨ−ＰＥ６６。■ ＧｎＲＨ類似体（ｄｅｓ−ｇｌｙ10、［ｄ−Ａｌａ6］−ＬＨＲＨ）
図６：ＧｎＲＨ−ＰＥ６６の精製
１−タンパク質マーカー。２−細胞抽出物全体。３−可溶性画分。４−再生後の不溶性画分。５−DEAE−セファロース（Sepahrose）カラム後。６−セファアリル（Sepharyl）Ｓ−２００ＨＲカラム後。
図７：ＧｎＲＨ−ＰＥ４０の精製
１−タンパク質マーカー。２−細胞抽出物全体。３−可溶性画分。４−再生後の不溶性画分。５−DEAE−セファロース（Sepharose）カラム後。６−セファアリル（Sepharyl）Ｓ−２００ＨＲカラム後。
図８：ＧｎＲＨ−ＰＥキメラタンパク質のＳＷ−４８結腸癌細胞ラインに及ぼす影響：
■ 再生後のＧｎＲＨ−ＰＥ６６不溶性画分
▲ ＧｎＲＨ−ＰＥ６６精製タンパク質
● ＧｎＲＨ−ＰＥ４０精製タンパク質
実験
１．ＧｎＲＨ−ＰＥ６６キメラ毒素の構成
突然変異した全長ＰＥ遺伝子（ｐＪＹ3Ａ1136-1, 3）を運ぶプラスミドベクター（シャンダリー ヴィー．、ジンノ ワイ．、ゴール エム．、フィッツジェラルド ディー．、パットサン ティー．（Chandhary V., Jinno Y., Gall M., Fitzgerald D., Patsan T.）共著、ジャーナル オフ バイオロ．ケミ．（J. Biol Chem.)256, 16306-16310, 1990）を、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断した。6番目のアミノ酸として、グリシンの代わりにトリプトファンを持つＧｎＲＨコード塩基配列からなる３６塩基対合成オリゴマーが挿入物であり、これは、ＮｄｅＩ（５末端）及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ（3末端）制限部位によって切断した。得られたＴＧｎＲＨ−ＰＥ６６プラスミドを、制限エンドヌクレアーゼ分解及びＤＮＡ塩基配列分析によって確認した（図１ｃ）。
２．ＧｎＲＨ−ＰＥ４０キメラ毒素の構成
ＧｎＲＨ−ＰＥ４０タンパク質（ＰＥのＧｎＲＨ−ドメインＩＩ及びＩＩＩ）を構成するために、ＴＧｎＲＨ−ＰＥ６６プラスミドベクター（図1ｃ）をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで分解し、プラスミドＰＨＬ−９０６からＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ７５０ｂｐ断片に結合させ（フィッシュマン エイ．、バー-カーナ ワイ．、スタインバーガー アイ．、オーバーバウム-ガルスキー エイチ．（Fishman A., Bar-Kana Y., Steinberger I.、Lorberboum-Galski H.）共著、バイオケミストリー（Biochemistry）33, 6235-6243, 1994）、あわせて、第6番目のアミノ酸として、グリシンの代わりにトリプトファンをもつＧｎＲＨコード塩基配列からなる３６塩基対合成オリゴマーの挿入物を、ＮｄｅＩ（5末端）及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（３末端）制限部位によって切断した。得られたＴＧｎＲＨ−ＰＥ４０プラスミドを、制限エンドヌクレアーゼ分解及びＤＮＡ塩基配列分析によって確認した。
３．タンパク質の発現
記載のない限り、タンパク質の発現方法は、ＧｎＲＨ−ＰＥ４０とＧｎＲＨ−ＰＥ６６は同様である。プラスミドＴＧｎＲＨ−ＰＥ６６をもつエシェリヒア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地内で成長させ、プラスミドＧｎＲＨ−ＰＥ４０をもつエシェリヒア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、アンピシリン（５０μｇ/ｍｌ）を含むスーパーＬＢ培地で成長させた。Ａ６００値が１．５〜１．７に達した後、ＧｎＲＨ−ＰＥ６６については、９０分間、ＧｎＲＨ−ＰＥ４０については、一晩、それぞれの培溶液を温度３７℃、かつ、１ｍＭのイソプロピル−ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いた条件で誘導した。遠心分離によって、細胞を回収し、そのペレットを−７０℃で数時間インキュベートした。
凍結されたペレットを解凍し、リシス緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及びリゾチーム０．２ｍｇ/ｍｌ）中に懸濁させ、その後超音波処理（３×３０秒）、及び３５，０００×ｇで、３０分遠心分離を行った。その上澄み（可溶性画分）を除去し、ペレット（不溶性画分）をキメラタンパク質及びそれらの精製のためのソースとした。
ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル電気泳動法による不溶性画分の分析によって、キメラタンパク質に対応する、予測された６７ｋＤａの分子量をもつ大きなバンド（７０％）、並びに４２ｋＤａ及び２８ｋＤａの２つの大きな無関係の細菌タンパク質（図１ａ）があらわれた。ＰＥに対するポリクローナル抗体を用いた免疫ブロッティングによって、これらのデータを確認した（図１ｂ）。
４．ＧｎＲＨ−ＰＥ６６キメラタンパク質が様々な細胞ラインに及ぼす影響
下記の実験において、細胞を発現するイー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の不溶性画分をＧｎＲＨ−ＰＥ６６キメラタンパク質のソースとして用いた。
ＧｎＲＨ−ＰＥ６６の細胞毒活性を、確立された様々な細胞ラインでテストした：ＳＷ−４８ 結腸癌、ＨｅｐＧ２ 肝臓癌、Ｃａｃｏ２ 結腸癌、ＯＶＣＡＲ３ 卵巣癌、Ｈｅｌａ 子宮頸部腺腫、ＭＤＡ 乳癌、ＨＴ−２９結腸癌。記載のない限り、全ての細胞ラインは、ＲＰＭＩ １６４０培地で保存し、１００ｍｍペトリ皿で５％ＣＯ2／９５％空気の湿潤雰囲気で、３７℃で培養した。ＨｅｐＧ２及びＣａｃｏ２は、イーグルの最小必須培地で保存し、Ｈｅｌａ細胞は、ダルベッコの修正イーグル培地で保存した。全ての培地に、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを追加した。０日目、細胞（０．２ｍｌ培地中に１０4個）を９６ウェル組織培養マイクロプレートにシードし、２４時間後、様々な濃度のＧｎＲＨ−ＰＥ６６を添加した。２４時間のインキュベーション後、さらに２４時間、［3Ｈ］ロイシン［各ウェル５μＣｉ］を添加した。３日目、そのプレートを−７０℃で数時間保存し、続いて３７℃で急速解凍した。細胞をフィルター上に集め、組込まれている放射能を、ベータカウンターを用いて測定した。そのキメラタンパク質は、ＨｅｐＧ２ 肝臓癌、ＳＷ−４８及びＣａｃａ２ 結腸癌の強い反応（図２ａ）から、卵巣癌ＯＶＣＡＲ３の１つ、乳癌ＭＤＡ ＭＢ−２３１、結腸癌 ＨＴ−２９及び子宮頸部腺腫Ｈｅｌａの中程度の反応（図２ｂ）まで、細胞ライン間でかなりのばらつきをもって、用量依存的に細胞を殺傷することがわかった（表１）。アミノ酸組込みの阻止によって細胞毒性を測定したが、細胞死は、キメラタンパク質添加後２４時間の細胞数及び／または細胞壊死に反映されていた。
ＧｎＲＨ−ＰＥ６６活性の特異性を確認するために、同じ条件のもとで発現し、抽出された、他の２つのＰＥ系組換えタンパク質を対照として使用した。突然変異した全長ＰＥ遺伝子によってコードされたＰＥ６６４Ｇｌｕによっても、ＰＥ６６４Ｇｌｕに融合された無関係の８０ｂｐである、ＰＩＳ２によっても、実質的な成長阻止は認められなかった。１５μｇ／ｍｌのＰＥ６６４Ｇｌｕ、またはＰＩＳ２を添加したとき、タンパク質合成は、培地の違いによって、僅かな上昇から、２０％阻止の範囲内となった。２つのタンパク質のうちの１つを用いた治療によって引き起こされる成長阻止は、特異性がないと考えられた。
結果を、細胞がタンパク質に曝されなかった対照実験に対するパーセントとして表した（結果は、表１及び図５に集計した）。
0004067123.tif 000005
５．ＧｎＲＨ−ＰＥ６６が様々な一次培養に及ぼす効果
生体内腫瘍のオリジナルとできるだけ類似した細胞上での、キメラタンパク質の細胞毒効果を評価し、ＧｎＲＨ−ＰＥ６６細胞毒性が、長期間経過した細胞により発現された特徴であるという可能性を排除するために、一次培養を確立した。
新鮮な組織標本は、治療的デバルキング（debulking）処置を受けている様々な癌患者から得た。対照標本は、ドナー、または、非悪性疾患の診断もしくは治療を受けている患者から得た。全ての組織標本をライボヴィッツ（Leibovitz）（Ｌ１５）培地で数回洗い、広範囲にわたってメスで切断した。その後、その調製物を、３７℃で２時間、コラゲナーゼI型（２００u／ｍｌ）、ヒアルロニダーゼ（１００u／ｍｌ）、ペニシリン（１０００u／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）、アンホテリシンB（2.5μｇ／ｍｌ）、及びゲンタマイシン（８０μｇ／ｍｌ）を含むライボヴィッツ培地中でゆっくりと振とうしながら、酵素的にタンパク質分解した。その組織調製物を２００×ｇで１０分間、遠心分離し、そのペレットをRPMI１６４０培地中に懸濁させ、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００u／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を追加し、１００ｍｍペトリ皿中においた。細胞は、１〜３週間で密度８×１０6個に成長した。そして、組織病理学的診断及び細胞毒素的アッセイを行った。細胞毒性的アッセイのための末梢血の正常な白血球や骨髄吸引液は、血液全体を１体積の酢酸塩で緩衝された塩で希釈することによって得た。希釈されたサンプルを、等体積のフィスコール−ペーク（Ficoll-Paqeu）上に置き、２００×ｇで１０分間、遠心分離した。その細胞を再び懸濁し、２０％のウシ胎児血清、４ｍMの１-グルタミン、５０μMのβメルカプトエタノール、非必須アミノ酸、１ｍMのナトリウムピルベート、ペニシリン（１００ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中においた。
キメラタンパク質の細胞毒的効果は、異なる患者を起源とする結腸、乳房、卵巣一次培養（それぞれ、表３ａ，ｃ，ｄ）で観察されたＩＤ５０において、最高３倍の違いのばらつきがあった（表２）。
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転移生検も得ることができた場合、転移に伴う一次腫瘍の培養をＧｎＲＨ−ＰＥ６６細胞毒性について試験した。転移細胞は、同様に反応した。そして、それらのＩＤ５０は、一次腫瘍のそれより下がりさえした。これは、一次培養と比べて、転移培養が高い均質性を有するということによって説明し得る。
また、ＧｎＲＨ−ＰＥ６６を、健常ドナーからの良性の結腸末梢血骨髄及び皮膚線維芽細胞の培地上でテストした。キメラタンパク質１５μｇ／ｍｌまでの添加では、測定可能な用量依存的殺傷は起こらなかった（図３ｆ）。
６．一次培養の組織病理学的診断
一次培養アッセイの正確性に関する基本的な疑問は、細胞の上皮オリジンに関する。一次培養における細胞が上皮的形態を失う傾向があることが数例の癌で述べられている。「混入している」線維芽細胞の実質的な量の欠落を確認するために、鑑別染色を行った。
細胞を下記のように染色した：10,000個の細胞を、サイトスピン（cytospin）を用いて、顕微鏡のスライドの上に置き、室温で数分インキュベートした。乾燥したスライドを、−２０℃の冷メタノールに１５分間、及び−２０℃の冷アセトン中に数秒間浸漬することによって固定した。染色されるまで、−２０℃でスライドを保存した。抗デスミン及び抗ケラチン抗体を用いて染色を行い、線維芽細胞と上皮細胞をそれぞれ区別した。この染色は、大多数の細胞、a980-100％が、培溶液が線維芽細胞のような形状を示す場合でさえも、実際には上皮であることが判明した（図４）。
さらに、癌の種類に応じた特異的な抗体腫瘍マーカー抗原を用いて染色することによって確認した。オリジナルの腫瘍のホルマリン固定部分と一次培養細胞は、同じパターン及び染色強度を示した。
７．ＧｎＲＨ−ＰＥ６６による特異的結合
結腸癌細胞ライン及び一次培養が、ＧｎＲＨ−ＰＥ６６の標的とされ、殺傷され得るという所見を裏付けるため、結腸癌細胞ラインからの血漿膜画分が特異的にＧｎＲＨと結合する能力を調べた。濃度を上昇させたＧｎＲＨ−ＰＥ６６キメラ毒素を添加した結果、これらの膜に結合する125Ｉ−ＧｎＲＨは、用量依存的に変位した。セミコンフルエント（semiconfluent）１００ｍｍ皿のＳＷ−４８結腸癌細胞ラインを洗浄し、その細胞をゴムポリスマンを用いて、プレートからすり落とした。回収した細胞を氷冷アッセイ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．６、１ｍＭ ジチオトレイトール、０．１５％ウシ血清アルブミン、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で均質化し、２５０×ｇで、１５分間（４℃）遠心分離した。得られたペレットを捨て、その上澄みを20,000×ｇで３０分間（４℃）遠心分離した。その血漿膜ペレットを、冷アッセイ緩衝液中で再び懸濁した。最終体積１００μｌ中に７０μｇの血漿膜タンパク質を含む部分を、２時間、氷の上で６×１０-6Ｍ（240,000ｃｐｍ）の125Ｉ−ＧｎＲＨを用いて、１０-4〜１０-10Ｍ）非標識のＧｎＲＨ真正ペプチド及び類似体（ｄｅｓ-Ｇｌｙ、［ｄ−Ａｌａ］-ＬＨＲＨ）、もしくは（２．５×１０-5〜１０-9Ｍ）ＧｎＲＨ−ＰＥ６６キメラ毒素の存在下で、または、非存在下でインキュベートした。インキュベーション後、１０ｍｌの冷アッセイ緩衝液を用いて、サンプルをファットマン（Whatman）GF/Cフィルターを通して洗浄し、ガンマカウンターで数えた。
濃度の上昇したＧｎＲＨ−ＰＥ６６キメラ毒素を添加した結果、これらの膜に結合した125Ｉ−ＧｎＲＨは、用量依存的に変位した。非標識の真性ＧｎＲＨペプチド及び類似体ｄｅｓ-Ｇｌｙ１０［ｄ−Ａｌａ６］-ＬＨＲＨは、類似の結果をもたらした。図５からわかるように、標識されたＧｎＲＨのＳＷ−４８結腸細胞ラインへの結合は、特異的であった。そして、ＧｎＲＨ−ＰＥ６６キメラ毒素による変位は、ＧｎＲＨ類似体ペプチドによるそれと同等の効果を示した。３７％の非特異的結合があった。
８．ＧｎＲＨ−ＰＥ４０及びＧｎＲＨ−ＰＥ６６の精製
不溶性画分のペレットを懸濁し、変性緩衝液（６Ｍ グアニジウム塩酸、０．１Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．６ １ｍＭ ＥＤＴＡ ０．０５Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＤＤＴ）中で氷上で攪拌した。さらに遠心分離した後、減少し、変性したタンパク質を、再生緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５Ｍ Ｌ−アルギニン及び５ｍＭ ＤＴＴ）中で、１：１００に希釈し、４℃で、４８時間保存した。再生されたタンパク質溶液を、ＴＥ２０緩衝液（２０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で、８ｍＳに希釈した。DEAEセファロース（Sepharose)を添加し、４℃で１．５時間攪拌し、その後、カラムにつめた。ＧｎＲＨ−ＰＥ６６については、ＴＥ２０緩衝液で、８０ｍＭ ＮａＣｌを用いて、また、ＧｎＲＨ−ＰＥ４０については、ＴＥ２０緩衝液中で、５０ｍＭ ＮａＣｌを用いて、カラムの洗浄を行った。０．０８〜０．３５Ｍ ＮａＣｌの２×２００ｍｌの直線勾配を用いて、ＴＥ２０（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液中で溶出を行った。ピーク画分をプールし、０．５Ｍ Ｌ−アルギニンを添加し、攪拌した細胞を濃縮するために使用した（図２、図３）。イオン交換カラムからの３ｍｌのプールされた画分を、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍ Ｋ−リン酸緩衝液、ｐＨ６．０中で，セファクリル（Sephacryl）S-200HRゲルろ過カラム上においた。ピーク画分をプールし、リン酸塩緩衝液に透析し、小分けして−２０℃で保存した。ＧｎＲＨ−ＰＥ６６及びＧｎＲＨ−ＰＥ４０の精製によって、図６及び７の結果がそれぞれ証明された。
９．高度に精製されたＧｎＲＨ−ＰＥキメラタンパク質がＳＷ−４８結腸癌細胞ラインに及ぼす効果
精製されたＧｎＲＨ−ＰＥ６６及びＧＮＲＨ−ＰＥ４０のＳＷ−４８結腸癌細胞ライン上での細胞毒活性を、タンパク質合成の阻止を測定することによって評価した。キメラタンパク質は、用量依存的に細胞を殺傷することがわかった。精製されたＧｎＲＨ−ＰＥ６６キメラ毒素のＩＤ５０は、再生された不溶性画分よりも２〜３倍低かった。精製されたＧｎＲＨ−ＰＥ４０タンパク質のＩＤ５０は、精製されたＧｎＲＨ−ＰＥ６６よりも３〜４倍低かった（図８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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