(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄酸化細菌を該細菌のための電子供与体を含有する培地中で培養するための培養部と、前記培地を定電位電解し、酸化された電子供与体を前記細菌が利用し得る元の電子供与体に還元するための定電位電解手段とを備えた電解槽と、前記細菌に増殖するために十分な量の酸素を培地中に供給するための酸素供給手段として、培地中に酸素を微小形態で吹き込む微小気泡発生装置を備えた通気槽と、電解槽内の培地を通気槽を経て電解槽に循環させる培地循環手段とからなり、電解槽がイオン交換膜で二つの区画に仕切られていて、一方の区画内に対極と参照極を配置し、他方の区画内に作用極を配置してなり、電解槽の対極と参照極が配置された区画が培地循環手段によって通気槽と接続されていることを特徴とする鉄酸化細菌の培養装置。
【請求項２】
電子供与体が第一鉄イオン（Ｆｅ2+）であって、定電位電解が培地中の第二鉄イオン（Ｆｅ3+）を還元して第一鉄イオン（Ｆｅ2+）とすることである請求項１記載の鉄酸化細菌の培養装置。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の装置を用いて鉄酸化細菌を培養する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は電位制御電解による好気性化学独立栄養細菌の培養方法および培養装置に関するものである。より詳しくは、本発明は、バクテリアリーチングや石炭の脱硫に有用な鉄酸化細菌等の好気性化学独立栄養細菌を高い増殖速度で高濃度まで培養する方法および該方法を適用して培養するための装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細菌等の微生物による物質生産は発酵法として医薬品工業、食品工業、発酵工業等のさまざまな分野に利用されている。しかし、この目的に主として使用されるのは、植物由来の有機物をエネルギー源として物質生産を行う従属栄養微生物であり、これらの微生物のエネルギー利用効率は太陽光を最初のエネルギー源として換算すると１％未満であり、非常に低い。一方、独立栄養微生物は光や還元性の化合物等からエネルギーを直接取りだし、微量元素と二酸化炭素とを利用して生育することができる。
【０００３】
太陽光を直接利用できる光独立栄養微生物（光合成微生物）はエネルギー利用効率が約５％と比較的高い。しかし、光合成微生物は増殖が遅く、光エネルギーの効率の良い供給が難しいため、物質生産に用いられることはほとんどない。また、人工的な培養の場合、夜間は電気エネルギーから光エネルギーを作り出して供給しなければならないため、光合成微生物を用いた物質生産全体のエネルギー利用効率は低下する。
【０００４】
太陽電池を用いた場合、太陽光を電気エネルギーに変換する際のエネルギー効率は１５〜２０％になる。従って、電気エネルギーを微生物の培養に利用できれば、エネルギー利用効率の高い微生物培養系または物質生産系が構築できる。
ここで、化学独立栄養細菌と呼称される一群の細菌は、無機物である硫化水素やその他の還元状態の硫黄化合物、アンモニア、亜硝酸、一酸化炭素、水素分子、第一鉄イオン等の酸化により生育できるものである。すなわち、化学独立栄養細菌は電子供与体と呼ばれる上記物質から電子を得てＡＴＰおよびＮＡＤＨ等の高エネルギー物質に変換し、生体エネルギーとして用いることにより二酸化炭素を還元し生育している。そのため、上記還元状態の無機物を電気化学的に生成させて、該還元状態の無機物を介して電気エネルギーを間接的に細菌に供給することが考えられる。また、そのような還元状態の無機物を介さずに電気エネルギーを直接菌体に供給できれば、エネルギー利用効率はより向上するものと考えられる。これら電気エネルギーを利用した細菌培養系または物質生産系が確立されれば、従来の発酵法に代わる細菌培養技術または物質生産技術とすることができる。
【０００５】
これまでに、電気エネルギーを使用して培養できる微生物として、水素細菌や鉄酸化細菌等の化学独立栄養細菌の培養が検討されてきた。水素細菌は、その菌体中のタンパク質含量が高いことから宇宙での長期間にわたる食糧供給源の候補として、米国航空宇宙局（ＮＡＳＡ）によりその培養に関する研究が始められたものであり、水素ガスをエネルギー源として増殖できるため、水素ガスを電気化学的に生成させることにより培養できる。しかし、培養時にスーパーオキシドや過酸化水素が発生し、細菌の増殖を妨げる等、解決しなければならない問題が多い。また、爆発の危険性の高い水素ガスの発生を必要とするため、電気的エネルギーを供給することによる大量培養や高濃度培養については何ら検討されていないのが現状である。
【０００６】
一方、鉄酸化細菌は、石炭脱硫や金、ウラン等の稀少金属の回収（バクテリアリーチング）に使用される有用な微生物である。この鉄酸化細菌はＦｅ2+をエネルギー源として用いて生育するが、これはＦｅ2+をＦｅ3+に酸化する際の電子（ｅ- ）をエネルギーとして取り出しているものである。しかし、培地中のＦｅ2+を濃度を高くすると基質阻害が起こる上、酸化後に生じるＦｅ3+により培地中に沈澱が生成され増殖阻害が起こるため、エネルギー源である培地中のＦｅ2+濃度を高めることができず、高濃度までの培養および大量培養が妨げられていた。
【０００７】
これまでに報告されている電気エネルギーを用いた鉄酸化細菌の培養は、電流制御および電圧制御により検討されているが、その中でBlake 等〔Appl. Environ. Microbiol. 60: 2704-2710 (1994)〕の方法による菌体生産性が最も高く、６０日間の培養時間で１０10細胞／ｍｌの高濃度培養ができることを報告している。しかし、Blake 等による報告では、短時間で増殖速度が低下しているため、１０10細胞／ｍｌの濃度まで到達するまでの培養時間が６０日間と非常に長く、菌体生産性もそれほど高くない。このため、Blake 等の方法を、鉄酸化細菌を工業的に利用するための培養に適用することは到底できない。
【０００８】
これに対し、本発明者等は、鉄酸化細菌等の化学独立栄養細菌に電気エネルギーを直接または間接的に供給し、利用可能とする培養方法を開発し先に出願した（特願平７−２０５２５６号）が、ある程度の増殖速度および増殖濃度は得られたものの、バクテリアリーチング等に工業的に利用し得る程度に高い増殖速度および菌体濃度までには至らなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況を考慮してなされたものであり、バクテリアリーチングや石炭の脱硫のために有用な鉄酸化細菌等を工業的に使用するために十分量で供給することを可能にする程度に、好気性化学独立栄養細菌を非常に高い増殖速度で十分に高濃度まで培養する方法およびそのような培養を行うための装置の提供を課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、好気性化学独立栄養細菌が増殖する際の律速要因を解明し、該要因を除去できれば、上記課題を解決し得ると考え、種々検討を重ねた結果、上記細菌が増殖のためのエネルギーとして利用する電子供与体および酸素が律速要因であることを解明し、それらの増殖を阻害しない様式で十分に供給することにより、十分に高い増殖速度で十分に高濃度まで上記細菌の培養が可能であることを見出し、さらに鋭意検討の末、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、好気性化学独立栄養細菌を該細菌のための電子供与体を含有する培地中で培養する際に、該培地を定電位電解して、酸化された電子供与体を前記細菌が利用し得る元の電子供与体に還元し、かつ、前記細菌が増殖するために十分な量の酸素を培地中に供給することを特徴とする好気性化学独立栄養細菌の培養方法に関する。
【００１２】
本発明において好気性化学独立栄養細菌とは、化学的暗反応により電子供与体を酸化してエネルギーを得、かつ増殖のために酸素を必要とするものであり、例えば鉄酸化細菌〔代表菌チオバチルス(Thiobacillus)〕、硫黄酸化細菌〔代表菌チオバチルス〕、脱窒細菌〔代表菌パラコッカス(Paracoccus)〕、水素細菌〔代表菌アルカリゲネス(Alcaligenes) 〕、アンモニア酸化細菌〔代表菌ニトロソモナス(Nitrosomonas)〕、亜硝酸酸化細菌〔代表菌ニトロバクター(Nitrobacter) 〕等を包含する。
【００１３】
また、本発明において電子供与体とは、好気性化学独立栄養細菌がエネルギー源として使用し得、それを酸化してエネルギーを獲得するための物質で、電気化学的に再生可能でなければならず、それぞれの好気性化学独立栄養細菌により異なる。例えば、鉄酸化細菌や硫黄酸化細菌にとっては第一鉄イオン（Ｆｅ2+）および／または還元性の硫黄分子であり、脱窒細菌や水素細菌にとっては水素分子（Ｈ2 ）であり、アンモニア酸化細菌にとってはアンモニウムイオン（ＮＨ4 + ）であり、亜硝酸酸化細菌にとっては亜硝酸イオン（ＮＯ2 - ）である。なお、上記以外の好気性化学独立栄養細菌のための電子供与体は当該分野の文献等に容易に見出すことができる。
【００１４】
本発明において使用される培地は、好気性化学独立栄養細菌のための上記それぞれの電子供与体を含有していれば、その他の成分は特に制限されず、培養する好気性化学独立栄養細菌の増殖に必要であり、かつ上記電子供与体の酸化・還元を阻害する等の悪影響を与えないものであれば、含有し得ることはいうまでもない。なお、上記培地は、培地の定電位電解が可能であり、培地中の電子供与体の自由な移動が妨げられないならば、固体と液体の混合状態でも、固体状のものであってもよいが、培地の製造性や使用性等の点から液体であることが好ましい。
【００１５】
また、本発明における好気性化学独立栄養細菌の培養の際の培地の定電位電解は、酸化された電子供与体を前記細菌が利用し得る元の電子供与体に還元する反応のみ実質的に起こる一定の電位を印加し培地を電解することを意味する。通常、電位の制御は、培地中に作用極、対極および参照極を配置し、作用極に特定の電位を印加して行われる。このとき、電子供与体の再酸化を防止するために、作用極と対極とはイオン交換膜で隔てて配置することが好ましい。また、上記各電極、特に作用極の材質等は培養する細菌に応じて、所望の電子移動が行われ得るように選択されることが好ましい。
印加される定電位は、使用する電極、それぞれの好気性化学独立栄養細菌およびその電子供与体等に応じて容易に決定し得る。例えば鉄酸化細菌の場合、通常１．０〜−１．０Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの範囲から選択され得る。
【００１６】
本発明の培養方法において、上記細菌が増殖に必要とする十分な量の酸素の強制的な供給が必須である。好ましくは、培地中の溶存酸素が上記細菌の増殖に必要な量以上となるように供給される。なお、必要な酸素量はそれぞれの好気性化学独立栄養細菌やその培養条件等に応じて異なるが、それぞれの場合において簡単な実験により決定することができる。また、この酸素供給は、慣用の送気管等を介して行われてもよいが、培地中の溶存酸素量をより効率的に増加させるために、微小気泡発生装置等により行われることが好ましい。
【００１７】
また、本発明に係る培養は、上記のように培地の定電位電解および酸素の強制的供給以外、適当なｐＨおよび温度の下、好ましくは上記細菌の至適条件下、一般の好気性化学独立栄養細菌の培養と同様に上記培地中で行われ得る。また、上記の条件を満足するものであれば、培養は回分式で行っても、連続式で行ってもよい。
【００１８】
本発明はまた、第一鉄イオン（Ｆｅ2+）を含有する培地中で鉄酸化細菌を培養する際に、該培地を定電位電解して、培地中の第二鉄イオン（Ｆｅ3+）を還元して第一鉄イオン（Ｆｅ2+）とし、かつ、鉄酸化細菌が増殖するために十分な量の酸素を培地中に供給することを特徴とする鉄酸化細菌の培養方法に関する。
【００１９】
ここで、鉄酸化細菌は上記のようにチオバチルス、例えばチオバチルス・フェロオキシダンス(Thiobacillus ferrooxidans) 等の他、シデロカプサ(Siderocapsa) 、シデロコッカス(Siderococcus)等が代表的なものである。
【００２０】
さらに、本発明は、好気性化学独立栄養細菌を該細菌のための電子供与体を含有する培地中で培養するための培養部と、前記培地を定電位電解し、酸化された電子供与体を前記細菌が利用し得る元の電子供与体に還元するための定電位電解手段と、前記細菌に増殖するために十分な量の酸素を培地中に供給するための酸素供給手段とからなることを特徴とする好気性化学独立栄養細菌の培養装置に関する。
【００２１】
本発明はまた、第一鉄イオン（Ｆｅ2+）を含有する培地中で鉄酸化細菌を培養するための培養部と、前記培地を定電位電解し、培地中の第二鉄イオン（Ｆｅ3+）を還元して第一鉄イオン（Ｆｅ2+）とするための定電位電解手段と、鉄酸化細菌が増殖するために十分な量の酸素を培地中に供給するための酸素供給手段とからなることを特徴とする鉄酸化細菌の培養装置に関する。
【００２２】
本発明の鉄酸化細菌等の好気性化学独立栄養細菌の培養装置において、培養部、定電位電解手段および酸素供給手段はそれぞれ独立して培養装置が構成されていても、また、２または全ての部分が一体化された構成を採ってもよい。また、例えば、定電位電解槽の形態にある定電位電解手段と、通気槽の形態にある酸素供給手段とからなり、上記両槽が連通して培地が循環され、かつ、上記両槽が同時に培養部を兼ねる構造の培養装置であってもよい。本発明の培養装置は、少なくとも培養部、好ましくは全体が一定温度に保持される。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明の電位制御電解による好気性化学独立栄養細菌の培養方法および培養装置を鉄酸化細菌の場合を例にとり説明する。約３０℃の恒温槽に浸された電解槽と通気槽とがあり、これらは連通路により連結されており、培地は上記２つの槽を循環するように構成され、それら両槽およびそれらの連通路はまた培養槽の役目も果たし、該培養槽、すなわち電解槽、通気槽およびそれらの連通路において鉄酸化細菌の増殖が起こる（図１参照）。電解槽では白金電極により十分な定電位電解が行われるが、この際の電極電位は培地中でのサイクリックボルタモグラムによりＦｅ3+のＦｅ2+への還元のみが起こる０．０Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌに設定される。また、通気槽では微小気泡発生装置により培地に十分な酸素供給が行われるようにしてある。培地のＦｅ2+濃度は細菌の酸素消費活性が最大であった１５０ｍＭに設定し、ｐＨは増殖速度が高く、かつ沈澱が生じない２．０とする。この結果、６日間の培養で１×１０10細胞／ｍｌ（菌濃度を表す単位であり、以下においてｃｅｌｌｓ／ｍｌとも記載する）に達する。上記の結果を図２に、上掲のBlake 等の方法と対比して示す（○が本発明の方法，●がBlake 等の方法）。
【００２４】
【実施例】
以下実施例に基づいて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：鉄酸化細菌の培養条件の検討
最初に本実施例で使用される材料および行われる試験の方法について説明し、次にその試験の結果について説明する。
Ａ．材料および方法
（１）鉄酸化細菌の培養
鉄酸化細菌はチオバチルス・フェロオキシダンス(Thiobacillus ferrooxidans) ＡＴＣＣ２３２７０を用いた。培養には、ｍ９Ｋ改変培地（ｍ９Ｋ＋ＣａＭｇ）を用いた。本培地は、脱イオン水５００ｍｌ中に（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ；３．０ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ；０．０５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ；０．５ｇ、Ｃａ（ＮＯ3 ）2 ・４Ｈ2 Ｏ；０．０１ｇを添加した溶液Ａと、脱イオン水５００ｍｌ中ににＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを２２．２ｇ添加した溶液Ｂをそれぞれオートクレーブで滅菌した後、混合したものである。該培地のｐＨはオートクレーブ前に硫酸を用いてそれぞれ０．５〜４．５に調整した。また、脱イオン水は純水製造器（ミリポア社製，商品名Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）により製造したものを用いた。培地のｐＨはガラス電極（コーニング社製，商品名ｐＨメーター２２０）を用い測定した。培養は温度３０℃、１リットル／分の通気下で行った。実験には、培養３〜４日後の定常期の菌体を接種源として用いた。
【００２５】
（２）培養条件の設定と測定項目
鉄イオンの電極反応における電気化学的な挙動、鉄酸化細菌の鉄酸化活性および増殖に対する、電極、ｐＨ、塩濃度、鉄イオン濃度に対する影響を検討した。
電極の種類による鉄イオンの電極反応の違いは、白金電極とグラッシーカーボン電極を用い、次項に示すサイクリックボルタンメトリー（以下、ＣＶと略す）によって評価した。すなわち、鉄イオンの還元電流のピーク電位と酸化電流のピーク電位の差（ピークセパレーション）により、電極反応に必要とする余分な過電圧から評価した。
ｐＨの影響については、硫酸を用い０．５〜４．５に調整した鉄を含まない培地を用い、電導度を測定した。また、同様にしてｐＨを調整した８０ｍＭのＦｅ2+を含む培地を用い、電導度、鉄イオンの電極反応、鉄酸化細菌の鉄酸化活性および増殖に対する影響を調べた。
塩濃度の影響については、Ｎａ2 ＳＯ4 を０〜１．０Ｍの濃度で調整した溶液を作成し、培地の電導度、鉄イオンの電極反応、鉄酸化細菌の鉄酸化活性および増殖に対する影響を調べた。
初期Ｆｅ2+濃度の影響については、培地中のＦｅ2+濃度が０〜７００ｍＭになるようにＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを添加し、鉄酸化細菌を培養し、鉄酸化活性および増殖効率に対する影響を調べた。
また、鉄酸化細菌の増殖に使った後の培地についても、鉄酸化活性に対する影響を調べた。すなわち、定常期の培養液を遠心分離して、菌体を除去した上澄み液（５０ｍｌ）を用い、同様の方法で鉄酸化活性を測定した。
【００２６】
（３）電導度の測定および電極反応の評価
培地の電導度は、温度補正付きの電気伝導率計（東亜電波社製，商品名ＣＭ−２０Ｓ）を用い測定した。電極反応の評価はＣＶにより行った。電導度に対する培地ｐＨの影響には、ｐＨを０．５〜４．５に調整した鉄を含まない培地、および８０ｍＭのＦｅ2+を含む培地を用いた。同様に塩濃度の影響には、Ｎａ2 ＳＯ4 を０〜１．０Ｍの濃度で調整した溶液を作成し、測定に用いた。
ＣＶは、電気化学測定器（ＢＡＳ社製，商品名ＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ）を用いて行った。作用極には、白金電極（直径；１．６ｍｍ，ＢＡＳ社製，商品名１１−２０１３）またはグラッシーカーボン電極（直径；３ｍｍ，ＢＡＳ社製，商品名１１−２０１２）、対極には白金線（ＢＡＳ社製，商品名５１−２２３３）、参照極には銀塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ，ＢＡＳ社製，商品名１１−２０２０）を用いた。
【００２７】
（４）鉄酸化活性の測定
鉄酸化活性は酸素電極（エイブル社製，商品名ＢＯ−Ｇ）を用いて測定した。酸素電極表面に鉄酸化細菌（３．２×１０9 細胞）を吸引固定したメンブランフィルター（アドバンテック製，ニトロセルロース膜，直径１３ｍｍ，孔径０．４５μｍ）をナイロンメッシュで固定し鉄酸化活性測定用電極を作成した。活性変化は酸素の定常還元電流の変化で評価した。すなわち、上記菌体による鉄酸化反応は最終電子伝達体が酸素分子であるため、Ｆｅ2+イオンの添加に伴って酸素濃度が減少することから、菌体の鉄酸化活性を評価することができる。なお、本電極の応答再現性は高く、応答時間は１５分、誤差１１％（０．１６ｍＭの場合）、室温放置で３日間は応答性が保たれることが確認された。
ｐＨに対する影響は、ｐＨを０．５〜４．５に調整した培地溶液Ａ（２０ｍｌ）に１６０ｍＭのＦｅ2+溶液を１００μｌ添加し、電流値の減少により評価した。
塩濃度の影響の測定には、本実施例で使用される培地に含まれている（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、ＭｇＳＯ4 、Ｃａ（ＮＯ3 ）2 の他にＫ2 ＨＰＯ4 、ＫＣｌ、ＮＨ4 Ｃｌ、ＣａＣｌ2 、Ｎａ2 ＳＯ4 を用いた。塩は最終濃度が、０．１Ｍおよび１．０Ｍとなるように培地溶液Ａ（２０ｍｌ）に添加した後、さらに１６０ｍＭのＦｅ2+溶液を２００μｌ添加し、同様に鉄酸化活性を測定した。
培地中のＦｅ2+濃度の影響は、培地溶液Ａ（２０ｍｌ）に１６０ｍＭのＦｅ2+溶液を順次２０μｌづつ添加し、鉄酸化活性を測定した。
【００２８】
（５）鉄酸化細菌の増殖に対する影響
鉄酸化細菌の増殖に対する培養条件の影響の測定には、ｐＨ０．５〜４．５および塩濃度（Ｎａ2 ＳＯ4 ）０〜１．０Ｍの培地を用いた。培地のＦｅ2+濃度は８０ｍＭに調整した。植菌量は１０％とし、他の培養条件は上記（１）と同様にした。培養は４日間行い、定常期の菌濃度をバクテリア計数盤を用いて測定した。
【００２９】
（６）鉄酸化細菌の増殖効率に対する初期Ｆｅ2+濃度の影響
培地中のＦｅ2+の濃度が０〜７００ｍＭになるようにＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを添加し、鉄酸化細菌を培養した。菌濃度は定常期に測定した。供給した電荷量（Ｃ；クーロン）あたりの菌体生成量である増殖効率（細胞／Ｃ）は以下の式：
増殖効率（細胞／Ｃ）＝〔定常期菌濃度（細胞／ｍｌ）−初期菌濃度（細胞／ｍｌ）〕／〔初期Ｆｅ2+濃度（モル／ｍｌ）×９６５００（Ｃ／モル）〕
により算出した。供給電荷量は１モルのＦｅ2+に対し、９６５００Ｃの電荷量を供給したものとして計算した。
【００３０】
Ｂ．結果
（１）電極の影響
白金電極（Ｐｔ）およびグラッシーカーボン電極（ＧＣ）を用い鉄イオンのＣＶを測定したところ、白金電極に比べ炭素電極を用いた場合では、酸化電位と還元電位のピークセパレーションが大きかった（図３）。ピークセパレーションが大きいと余分な過電圧を必要とするため、電気培養には白金電極を用いることとした。
【００３１】
（２）ｐＨの影響
まず、培地の電導度に対するｐＨの影響について検討したところ、ｐＨ２．０以下で電導度の急激な増加が確認された（図４）。これは硫酸添加によるイオン濃度の上昇によるものと推測される。さらに、電極反応に対する影響について検討したところ、図５に示すようにｐＨの上昇に伴ってピーク電位のセパレーションが大きくなることがわかった。すなわち、電気培養におけるＦｅ2+の電気化学的再生において、ｐＨが低いほど電導度が高く、過電圧を要しないため、エネルギー的に有利であることが判明した。
【００３２】
次に、酸素電極を用いて鉄酸化活性を検討したところ、ｐＨ２．０〜４．５で安定した活性を示す一方、ｐＨ２．０以下では活性が阻害され、ｐＨ１．０で活性は８０％以上阻害された（図６）。同様のｐＨにおいて、鉄酸化細菌の増殖との関係について検討したところ、図７に示すように、初期ｐＨ１．５以上では阻害は見られなかったものの、ｐＨ１．０以下で増殖はほぼ完全に阻害された。このときの比増殖速度を比較してみると、ｐＨ２．５が最も高かった（図８）。すなわち、鉄酸化細菌の増殖にはｐＨは１．５より高い必要があることがわかった。
【００３３】
上記のｐＨについての知見と、ｐＨ２．０以上では酸化状態の鉄イオン（Ｆｅ3+）が不溶性の沈澱を生じることを併せて考えると、比増殖速度は最大ではないがＦｅ2+の電気化学的再生および鉄酸化活性の阻害に基づく増殖阻害の起きないｐＨ１．５〜２．０が、電気培養を行うことができるｐＨ範囲であることが明らかとなった。
【００３４】
（３）塩の影響
塩の添加は、培地の電導度を上げる効果が予測され、電気培養における電極上で鉄イオンの還元反応を促進することが期待される。そこでまず、鉄酸化活性を阻害しない塩を検索した。ここでは、電極反応に関与しないと考えられ、一般的な細菌に対し殺菌等の影響を示さない、ＫＣｌ、ＮＨ4 Ｃｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 、ＣａＣｌ2 、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、ＭｇＳＯ4 （１．０Ｍ）、Ｎａ2 ＳＯ4 を用いた。
【００３５】
終濃度が０．１Ｍまたは１．０Ｍとなるように各塩を添加し、鉄酸化活性を測定したところ、表１に示すようにＫＣｌ（０．１Ｍ）、ＮＨ4 Ｃｌ（０．１Ｍ）、Ｋ2 ＨＰＯ4 （０．１Ｍ）、ＣａＣｌ2 （０．１Ｍ）を用いたとき活性が阻害され、一方、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 （０．１Ｍ，１．０Ｍ）、ＭｇＳＯ4 （１．０Ｍ）、Ｎａ2 ＳＯ4 を用いたときには阻害は起きなかった。このことから、阻害は、Ｃｌ- 、ＰＯ43- 等の陰イオンによることが示唆された。これは、鉄酸化酵素がＦｅ2+のＳＯ4 2-六配位錯体を認識しており、他の錯体は確認できないためと考えられる。
【００３６】
【表１】
0004099601.tif 000002
【００３７】
阻害活性を示さなかった（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、ＭｇＳＯ4 、Ｎａ2 ＳＯ4 について同様の濃度で、増殖に対する影響について検討したところ、表２に示すようにＮａ2 ＳＯ4 以外では０．１Ｍにおいても１５〜３５％の阻害を示したことから、以下の実験ではＮａ2 ＳＯ4 を用い、電極反応および増殖に対する濃度の影響について検討した。
【００３８】
【表２】
0004099601.tif 000003
【００３９】
まず、電極反応に対する影響をＣＶによって検討したところ、０．２Ｍ以上では塩濃度の上昇に伴いピークセパレーションが大きくなり、ピーク電流も減少した（図９）。すなわち、塩濃度の増加により鉄イオンの電極反応が阻害されることが示された。次に、増殖に対する影響について検討したところ、同様に０．２Ｍ以上で増殖が５０％以上阻害されることが明らかとなった（図１０）。酸素電極を用いた鉄酸化活性の測定では、塩濃度１．０Ｍでも活性は阻害されていないことから、増殖阻害は浸透圧変化など鉄酸化反応とは別の要因によると考えられる。
【００４０】
以上のことから、電気培養において増殖阻害を起こさず使用できる塩は０．１Ｍ以下のＮａ2 ＳＯ4 であることが明らかとなった。しかし、該塩の使用による細菌の増殖および電気化学的なメリットは見出されなかったことから、塩濃度の低下による電気化学反応への阻害が起きた場合のみ上記のような塩を添加するだけで十分であることが判明した。
【００４１】
（４）培地および鉄イオン濃度の影響
鉄イオンは、培地成分の中でも最も含量が高く、電気培養におけるエネルギー運搬体でもあることから菌体の増殖に大きく関与すると予測される。そこで、まず回分培養における増殖効率（増殖菌数／２価鉄イオン量）に対する初期２価鉄イオン濃度の影響について検討した。その結果、図１１に示すように、２価鉄イオンの濃度により増殖効率が異なり、１００ｍＭ前後で増殖効率が高いことがわかった。これは、初期２価鉄イオンが低濃度の場合、大部分の２価鉄イオンが菌体の増殖ではなく、維持に費やされているため、増殖効率が低下したものである。一方、高濃度の初期２価鉄イオンの場合の増殖効率の低下は、２価鉄イオン自身または菌体の増殖によって生成した高濃度の３価鉄イオンによる阻害効果である。
【００４２】
そこで次に、鉄酸化活性に及ぼす鉄イオン濃度の影響について、菌体を固定した酸素電極を用い検討した。Ｆｅ2+を順次添加したところ、電流値が階段状減少する応答を示し、Ｆｅ2+０．１６〜２．２４ｍＭまで鉄酸化活性に対する阻害が見られないことがわかった（図１２）。一方、高濃度の３価鉄イオン（約８０ｍＭ）を含む培養後の上澄みを用い鉄酸化活性を検討したところ、活性が１／３に減少した（図１３）。後記するように、電気培養による高濃度培養において、培地中に阻害性の有機物や栄養塩の減少による増殖阻害などが見られなかったことから、本阻害効果は３価鉄イオンによるものと結論づけることができる。電気培養における鉄イオンの濃度は１００ｍＭ前後、特に７０〜１３０ｍＭが望ましく、また、電気化学的還元により培地中の３価鉄イオンをできるだけ少なくする必要があることが明らかなった。
【００４３】
実施例２：電気培養による鉄酸化細菌の半連続生産
８０ｍＭの２価鉄イオンを含むｍ９Ｋ＋ＣａＭｇを用い、電気培養による鉄酸化細菌の半連続生産について検討した。作用極と対極を陰イオン交換膜で隔てた内容量２５０ｍｌの小型の電解槽を用い、慣用の送気管による通気下で、作用極に−０．６Ｖまたは０Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌのいずれかの定電位を印加し、培養した。電極には、白金網電極（８０メッシュ，１０×５ｃｍ）を用いた。培養は約５日毎に定期的に培養液を４／５取り出し、新しい培地を加え全量を２５０ｍｌとして３０日間継続した。
【００４４】
その結果、０Ｖの定電位の印加では、約１５０ｍＡの電流が定常的に流れ、図１４に示すように、約３．５×１０9 細胞／ｍｌの濃度まで半連続的に培養できることがわかった。このときの菌体生産速度は、同量の培地を用いた通常培養（電位制御なし）の約８．８倍（８．８×１０10細胞／日）であった。また、培養液あたりの生産性は、同様に通常培養の８．８倍であり、３．５×１０8 細胞／ｍｌ／日となった。
【００４５】
また、半連続培養における増殖効率を検討したところ、０Ｖのときが９．８×１０6 細胞／Ｃ（６３％）、−０．６Ｖのときが９．２×１０6 細胞／Ｃ（５９％）であり、０Ｖの方が増殖効率が若干高かった。これは、−０．６Ｖの場合の方が、生成菌体の対する消費電流が大きく、鉄イオン還元以外の副反応（酸素４電子還元等）が起きたためと推測される。このことから、Ｆｅ3+からＦｅ2+への還元は０Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの定電位の方が効率的であることが判明した。また、生産速度は電流（供給電気エネルギー量）および増殖効率に依存することから、以下の電気培養における菌体生産は０Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの定電位で行うこととした。
【００４６】
実施例３：電気培養による鉄酸化細菌の高濃度培養
電気培養による鉄酸化細菌の高濃度培養を検討するために、図１に示す電気培養装置１を用いた。該装置１は、定電位を印加し培地１３を電解するための電解槽２と、培地への酸素供給を効率よく行うための通気槽３と、電解槽２および通気槽３とを浸しそれらを一定温度に保持する恒温槽４と、電解槽２および通気槽３中の培地１３を一方から他方へ送る通路を形成する連通路ａ，ｂ，ｃとから概略構成される。電解槽２には、作用極５として白金網電極（８０メッシュ，１０×２５ｃｍ）、対極６としてカーボンファイバー、そして参照極７として銀塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）が備えられ、いずれの電極も電位制御装置８に連結されている。作用極５と対極６は陰イオン交換膜９で隔てられ、対極６でのＦｅ2+の再酸化が防止されている。通気槽３には、ｐＨ電極１０が備えられ、ｐＨを検知して一定値に維持し、そしてエアコンプレッサー１１から培地１３中に微小気泡の形態で酸素が供給される。電解された培地１３は連通路ａを介して電解槽２から通気槽３に送られ、通気槽３にて酸素が供給された後、連通路ｂ，ｃを介してポンプ１２により電解槽２に戻される。このように循環される培地１３中で鉄酸化細菌の増殖は進行する。
実施例２の場合の約２倍濃度のＦｅ2+（１５０ｍＭ）を含む６００ｍｌの培地中で１リットル／分の通気槽での通気条件下、３０℃の一定温度で、０Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの定電位を印加し電気培養を行った。この場合の電流は実施例２における半連続培養時の約１０倍（約１．５Ａ）になった。
【００４７】
上記培養装置１による電気培養の結果を図１５に示す〔本発明は（●）〕。菌体は早い増殖速度（倍加時間が１２時間以下）を維持し、通常培養〔２．５×１０8 細胞／ｍｌ，図中（○）〕の５０倍の菌濃度（１．２５×１０10細胞／ｍｌ）まで約６日間の高濃度培養を行うことができた。この結果は、現状での世界最高の増殖速度のデータであり、上掲のBlake 等による文献で報告された結果〔６０日間の培養時間で１０10細胞／ｍｌ，図中（△）〕に比べ、１０10細胞／ｍｌの濃度に達するまでの時間を１／１０に短縮できた。
上記の結果から本発明の場合とBlake 等による方法の場合とを培養６日目までの菌濃度の推移を抽出して示したのが図２である。本発明による増殖速度の顕著な向上が明らかである。
【００４８】
また、このときの菌体生産速度は半連続生産（実施例２）の約１６倍（１．４×１０12細胞／日）であり、培養液あたりの生産性は、半連続生産の約６．６倍、通常培養の５８倍である２．３×１０9 細胞／ｍｌ／日であった。さらに、増殖効率を検討したところ、１．４７×１０7 細胞／Ｃとなり、半連続培養時に比べ高い値を示した。
【００４９】
一方、培地成分（ＮＨ4 + ，Ｋ+ ，Ｍｇ2+，Ｃａ2+）の変化について調べたところ、表３に示すように、いずれの塩も減少していないことから、１．２５×１０10細胞／ｍｌ付近での増殖速度の低下は、栄養塩の減少によるものではなく、エネルギー供給速度（電流）が増殖速度に間に合わなかったためと結論づけることができる。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
実施例４：大型電気培養装置による鉄酸化細菌の大量生産
大量の培養液を得るために、大容量（１７リットル）、大電極面積（６０×７０ｃｍ）の大型電気培養装置を用い、菌体生産を行った。なお、該装置は全体が大型になったことを除いて、基本的には図１に示すものと同様のものを用いた。培地には鉄イオン濃度が８０ｍＭのｍ９Ｋ＋ＣａＭｇ培地を用いた。培養は、印加電圧０Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ、通気速度は１０リットル／分以上で行った。電極として工業的な適用を考慮して白金より安価なチタンメッシュに白金を蒸着したものを用いた。
【００５２】
上記大型電気培養装置において、電流が約１０〜１４Ａと半連続生産（実施例２）の約８０倍、高濃度培養装置（実施例３）の約８倍となり、生産速度は２．０×１０13細胞／日とそれぞれ約２３０倍および約１４倍となった。培地あたりの供給エネルギー量が低かったため、菌濃度は図１６に示すように５×１０9 細胞／ｍｌであり、培養液容量あたりの生産性は１．２×１０9 細胞／ｍｌ／日で、いずれも高濃度培養（実施例３）の約１／２に留まった。このように菌体生産性は高濃度培養装置に劣るものの、培養装置の単位体積あたりの電極面積を上げることで、さらに生産性を向上させ得ることが期待される。
また、増殖効率は培養期間により異なり、図１７に示すように１．０〜３．５１０7 細胞／Ｃとなった。これは、Ｆｅ2+濃度と相関があり、実施例３と同様の高濃度のＦｅ2+存在下で効率が高かったことが示された。すなわち、本実施例において培養後期における増殖効率の低下は、主にＦｅ3+イオン濃度が高くなったことによる阻害効果によるものであり、Ｆｅ3+からＦｅ2+への還元の重要性がここでも確認できた。
【００５３】
実施例５：菌体生産におけるエネルギー利用効率
鉄酸化細菌の生産における電気エネルギー利用効率を求めるために、鉄酸化細菌の乾燥重量あたりのエネルギーを調べた。ポンプカロリメーターを用いて分析した結果、乾燥重量あたりのエネルギーは４５６ｋｃａｌ／１００ｇとなった（財団法人・日本食品分析センター調べ）。クロレラの相当する値が５６０ｋｃａｌ／１００ｇであることから、上記の鉄酸化細菌に対する値は妥当と考えられる。これをもとに、乾燥菌体重量あたりの菌体数４．６×１０12細胞／ｇを参考に、菌体あたりに有するエネルギーを求めたところ、１．００×１０-12 ｋｃａｌ／細胞となった。
一方、電気培養における菌体あたりの生産エネルギー（Ｐｅ；ｋｃａｌ／細胞）は、以下の式：
Ｐｅ＝１細胞／Ｐｒ／１秒×Ｖｅ×（２．３８８５×１０-8）
で示される。ここで、１Ｗ秒＝２．３８８５×１０-8ｋｃａｌ、増殖効率（Ｐｒ；細胞／Ｃ）＝１．０〜３．５×１０7 細胞／Ｃ、槽電圧（Ｖｅ；Ｖ）を３Ｖとすると、Ｐｅ＝２．１〜７．２×１０11ｋｃａｌ／細胞となる。すなわち、電気培養における、現状での電気エネルギーの利用効率は１．４〜４．９％であり、太陽光をエネルギー源として換算した従属栄養微生物等の利用効率（０．２８〜０．９８％）に比し、かなり高い値であることがわかる。
【００５４】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明の好気性化学独立栄養細菌の培養方法は、定電位電解により培地中に常に一定濃度以上の電子供与体が前記細菌の利用し得る形態で存在し、しかも、増殖のために十分な量の酸素が培地中に供給されていることにより、これまで報告されたことのない、高い増殖速度で高濃度まで前記細菌の培養を可能とした。このように、本発明の方法は、従来報告されたことのない、好気性化学独立栄養細菌の培養系であり、電気エネルギーを効率よく利用して前記細菌の大量および高濃度培養を可能とするものである。
また、本発明は、好気性化学独立栄養細菌の一種である鉄酸化細菌が、６日間で１×１０10細胞／ｍｌの菌濃度まで培養され得ることを可能にした。このような高速での高濃度までの鉄酸化細菌の増殖はこれまで報告されたことがなく、これにより、バクテリアリーチングや石炭の脱硫に有用な鉄酸化細菌をより良好なエネルギー効率で、低コストで培養ができるようになった。
さらに、本発明は、上記の効果を奏する培養方法をより効率的に実施するための培養装置をも提供することを可能にした。
【００５５】
上記したように、本発明は、鉄酸化細菌や水素細菌等の好気性化学独立栄養細菌に電気エネルギーを供給することにより、高いエネルギー効率での前記細菌の大量および高濃度培養を可能とするものである。このため、本発明の培養方法によれば、菌体そのものを食糧として利用し得る水素細菌を電気エネルギーの利用により大量に供給することができ、また、石炭脱硫や稀少金属回収に有用な鉄酸化細菌を高いエネルギー効率で大量に低コストで提供することができる。さらには、好気性化学独立栄養細菌に慣用の遺伝子操作技術を適用して有用物質産生遺伝子を導入した後に、本発明の高効率の培養を行うことにより、二酸化炭素を原料として酵素や医薬品等の有用物質をエネルギー効率良く、低コストで製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において使用される電気培養装置を模式的に示す図面である。
【図２】本発明の培養方法により達成される菌濃度を従来の方法のものと対比して示すグラフである。（○）；本発明，（●）従来法。
【図３】電極素材が鉄イオンの電極反応に及ぼす影響を示すグラフである。（○）；グラッシーカーボン電極（ＧＣ），（●）；白金電極（Ｐｔ）。
【図４】電導度に対するｐＨの影響を示すグラフである。（●）；鉄イオンあり（８０ｍＭ），（○）；鉄イオンなし。
【図５】ｐＨが鉄イオンの電極反応に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】鉄酸化活性に対するｐＨの影響を示すグラフである。
【図７】菌濃度に対するｐＨの影響を示すグラフである。
【図８】比増殖速度に対する初期ｐＨの影響を示すグラフである。
【図９】（Ａ）はピーク電流に対するＮａ2 ＳＯ4 濃度の影響を示すグラフであり、そして（Ｂ）はピークセパレーションに対するＮａ2 ＳＯ4 濃度の影響を示すグラフである。（●）；酸化電流ピーク，（○）還元電流ピーク，＋は標準偏差。
【図１０】菌体増殖（菌濃度）に対するＮａ2 ＳＯ4 濃度の影響を示すグラフである。＋は標準偏差。
【図１１】細菌の増殖効率に対する鉄イオン濃度の影響を示すグラフである。
【図１２】鉄酸化活性に対するＦｅ2+濃度の影響を示すグラフである。
【図１３】鉄酸化活性に及ぼす培地の影響を示すグラフであり、（Ａ）は新しい培地中、（Ｂ）は培養後の培地中での鉄酸化活性の酸素電極での電流減少を測定した結果を示す。矢印はＦｅ2+の添加時点を示す（培地５０ｍｌに対して１６０ｍＭのＦｅ2+溶液を１００μｌ添加）。
【図１４】鉄酸化細菌の半連続培養の結果を示すグラフである。矢印は培地交換の時点を示す。
【図１５】鉄酸化細菌の高濃度培養の結果を示すグラフである。（●）；本発明（Ｆｅ；１５０ｍＭ，０Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ），（○）；通常培養（Ｆｅ；１５０ｍＭ），（△）Blake 等〔Appl. Environ. Microbiol. 60: 2704-2710 (1994)〕による電気培養（定電流制御）。
【図１６】大型電解培養装置による鉄酸化細菌の電気培養の結果を示すグラフである。
【図１７】大型電解培養装置による鉄酸化細菌の電気培養における２価鉄イオン（Ｆｅ2+）濃度と増殖効率の時間変化を示すグラフである。（●）；Ｆｅ2+濃度，（○）；増殖効率。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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