(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の成長乃至広がりを遅延させ或いは抑制するための薬剤の製造のためにマイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）の死滅細胞を使用する方法。
【請求項２】
M. vaccaeの細胞がオートクレーブ処理により死滅させたものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
M. vaccaeが、1984年2月13日付で英国 ロンドン NW9 5HT コリンデール アベニュのナショナル コレクション オブ タイプ カルチャーズ（NCTC）セントラル パブリック ヘルス ラボラトリーに、NCTC番号11659として寄託されている菌株から得られたものである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
M. vaccaeが、薬剤中に単位投与量当たり107〜1010個の菌含まれる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
腫瘍が、乳腫瘍または気管支腫瘍である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）の死滅細胞を含有する、腫瘍の成長乃至広がりを遅延させ或いは抑制するための薬剤。
【請求項７】
M. vaccaeが、請求項２〜４のいずれかに記載されたものである請求項６に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
本発明は、腫瘍の成長を遅延させ或いは阻止するために有用な免疫治療剤に関する。
免疫系は、少なくとも幾つかのケースにおいては、腫瘍の成長を阻止し或いは遅延させることができると示唆されており、幾つかの研究は、この見解を支持する傾向にある。かくして、コーリー（Coley,W.B. 1894“Treatment of Inoperable Malignant Tumours with toxins of erysipelas and the bacillus prodigiosus”）は、結核に対するコッホの免疫治療により誘起される機構に類似の壊死機構（necrotizing mechanism）を誘起することにより、中胚葉起源の限られた範囲の腫瘍に対して有効であると思われる免疫治療方法を記述している。それ以来、ガンに対する免疫治療についての多くの試みは、コーリーにより幾つかのケースで達成されたそれに類似する急速な組織壊死を誘起することを目標としてきた。
ヘルパーＴ細胞の成熟には、TH1およびTH2と呼ばれる少なくとも２種のパターンがあることが知られている。前者は、インターロイキン２（IL2）、ガンマインターフェロン（IFN-γ）、細胞障害性Ｔ細胞（CTLs）、抗体産生の低下およびTH2細胞の産生のダウンレギュレーションと関連している。後者は、IL4，IL5を生産し、抗体の産生を促進し、TH1細胞をダウンレギュレートする（down-regulate）。恐らくはコーリーのトキシンにより誘起されるコッホ現象は、TH1＋TH2成熟細胞の混合の結果であると考えられる。
腫瘍の抑制に利用できる２つのカテゴリーの免疫反応性があり、両者は、バチルス  カルメット−ゲランワクチン（BCG）により誘発され得ることが見出された。その一つのメカニズムは、コッホおよびコーリーの免疫療法とTNFαによる腫瘍の免疫療法とにより例証され、恐らく、Ｔ細胞依存性のコッホ現象により適切に産生される炎症部位におけるサイトカイン媒介組織損傷を伴う。このメカニズムは、中胚葉起源の腫瘍に対して有効である様に見受けられる。腫瘍細胞自体の免疫認識に基づく第二のメカニズムは、如何なる起源の腫瘍に対しても、効果的であると思われる。非特異性TH1に基づく抗腫瘍機構の存在についての間接的な証拠は、実験的な癌において、強力なTH1誘導物質である組換えインターロイキン12の成功から得られている。
マイコバクテリアは、コッホ現象の誘導を回避する様に使用するならば、熱ショック蛋白質（HSP）エピトープおよび高度に保存された配列を有する他の蛋白のエピトープによりストレスを受けているオートロガス細胞の認識を開始することができ、その結果、選択的な腫瘍細胞破壊につながるかもしれないと考えられている。我々は、過去におけるBCG免疫療法の効果が種々変動していたのは、BCGは既に始まっている応答パターンを助長する傾向があることを認識していなかったことによるものと結論している。このことは、結核およびらい病に対する予防におけるBCGの効果についての研究から次第に明らかになってきている。
マイコバクテリアによる病気（結核およびらい病の双方）に対するワクチンとしてのBCGは、種々の研究において、80％防護から0％防護までと変動が極めて大きい。従って、出生時に与えられたBCGは、一般に、それが結核に対する防護となる地理的場所においてのみ小児白血病に対する保護作用を示す様に思われることは、意味深いことである（Grange,JM、Stanford JL. BCG vaccination and cancer. Tubercle.（1990）;71:61-64）。すなわち、BCGが組織壊死でなく、且つコッホ現象でもないマイコバクテリア性抗原に対する応答を引き起こす場所において、BCGは双方の状態に対する防護となる。
多くの腫瘍細胞は、その表面上にバクテリア類似の炭水化物抗原およびストレスタンパクのエピトープ並びにクラス１およびクラス２主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）に関連する他の高度に保持されたタンパクを提示する。高度の抗体産生条件下においては、元来バクテリアの糖に対し産生された抗-炭水化物抗体、恐らくはタイプとしてはIgAは、腫瘍細胞を覆って、細胞性の免疫攻撃からその表面成分をブロックすることができると推測される。
本発明者が、本発明者による国際出願PCT/GB93/00463において示した様に、M. vaccaeによる免疫療法は、圧倒的に、IFN-γによるマクロファージ活性化を伴う応答のTH1パターンを誘起し、抗体産生をほとんど起こさない。この様なTH1応答は、CTLsの発生を促すことが知られている。抗体産生の顕著な減少は、CTLs数の増大と相俟って、腫瘍細胞表面のバクテリア類似糖に結合された後に活性化されるマクロファージにより、またストレスタンパクとクラス１MHCにより提示される他の高度に保持されたタンパクエピトープとを認識するCTLsにより、腫瘍細胞が攻撃されやすい状態とする。コッホ現象を介しての組織壊死メカニズムは、M. vaccae由来の調製物の使用により大幅に抑制されると考えられる。
M. vaccaeによる免疫療法は、従って、乳腫瘍および気管支腫瘍を含む中胚葉、内胚葉および外胚葉起源の腫瘍に対して、その様な腫瘍の成長乃至広がりを妨げ或いは遅らせることにより、効果的であると期待される。
従って、本発明は、腫瘍の成長乃至広がりを遅延させ或いは抑制するに有用な薬剤の製造のために、マイコバクテリウム  バッカエ（Mycobacterium vaccae）から得られる抗原性および／または免疫調節性材料の使用を提供する。この様な材料は、腫瘍の成長乃至広がりを少なくとも遅らせ或いは防止するに十分な量を患者に投与することができる。
本発明による治療剤は、便宜上、従って好ましくは、M. vaccaeの死滅細胞からなり、最も好ましくは、オートクレーブ処理により死滅させた細胞を含んでいる。免疫治療剤は、通常希釈剤1ml当たり微生物を108個以上、好ましくは希釈剤1ml当たりM. vaccae死滅微生物を108〜1011個を含んでいる。本発明は、腫瘍の成長或いは広がりを遅延もしくは抑制するために、M. vaccae由来の抗原物質および／または免疫調節物質を治療に使用することをその範囲内に包含する。
希釈剤は、注射用として発熱物質を含まない生理食塩水のみ、あるいはpH8.0のホウ酸塩緩衝液がよい。希釈剤は、無菌である必要がある。適切なホウ酸塩緩衝液の一例は、以下の通りである：
Na2B4O7      3.63g
H3BO3               5.25g
NaCl                6.19g
Tween               0.0005%
蒸留水          全体を１リットルとする量
M. vaccaeの好ましい菌株は、中央ウガンダのランゴ（Lango）地方からの泥サンプルから分離されたR877Rと命名されたものである（J.L. Stanford and R.C. Paul, Ann. Soc. Belge Med, Trop. 1973, 53, 141-389）。この菌株は、安定したラフ変異株であり、生化学的および抗原的な基準によりM. vaccaeに属するものとして確認することができる（R. Bonicke, S.E.Juhasz., Zentr albl. Bakteriol. Parasitenkd. Infection skr. Hgy. Abt. 1, Orig.,1964, 192, 133）。
R877Rと命名された菌株は、1984年2月13日付で、英国ロンドン  NW9  5HT  コリンデール  アベニュのナショナル  コレクション  オブ  タイプ  カルチャーズ（NCTC）セントラル  パブリック  ヘルス  ラボラトリーに、NCTC番号11659として寄託されている。
免疫治療剤の製造のためには、微生物M. vaccaeを適当な固体培地上で成育させることができる。寒天で固体化した改良ソートン液体培地（modified Sauton′s liquid medium）が好ましい（S.V.Boyden and E.Sorkin, J.Immunol.,1955,75,15）。固体培地は、寒天1.3％を含むことが好ましい。
菌を接種した培地は、菌の成育を可能とするために、通常32℃で10日間、好気的に培養される。菌を収得し、計量し、希釈剤に懸濁させる。希釈剤は、緩衝されていない食塩水でも良いが、より好ましくはホウ酸塩で緩衝され、上記の様にTween80の様な界面活性剤を含む。懸濁液は、菌100mg/mlとなる様に希釈される。それ以上に希釈するためには、好ましくはホウ酸塩で緩衝された食塩水を使用して、懸濁液が希釈剤1ml当たり菌10mg湿重量を含む様にする。次いで、この懸濁液を5ml複数回投与バイアルに分割する。バイアル中の菌は、例えば60コバルトからの放射線を使用して2.5メガラドの照射量で、或いは他の任意の手段で、例えば化学的に死滅させても良いが、菌は、例えば、10psiで10分間（115-125℃）のオートクレーブ処理により死滅させることが好ましい。オートクレーブ処理によれば、放射線照射によるよりも、より効果的な薬剤が得られることが見出された。
免疫治療剤は、一般的には、0.1〜0.2mlの範囲の量で、より好ましくは0.1mlが皮内的に注射投与される。１回の投与量は、通常107〜1010個の死滅させたM. vaccae菌を含む。患者に対しては、108〜109個の死滅M. vaccae菌を含む１投与単位を与えることが好ましい。しかしながら、患者の容態に応じて、投与を繰り返しても良い。
免疫治療剤は、通常皮下注射により投与されるが、その他の経路、例えば、経口投与を採用しても良い。
本発明は、腫瘍を持つ対象者に対し、Mycobacterium vaccaeから得られた抗原性および／または免疫抑制性の物質を、腫瘍の成育或いは広がりを遅延若しくは阻止するのに有効な免疫応答を誘発させるに充分な量で投与する、腫瘍の成育乃至広がりを遅延若しくは抑制する方法をもその範囲内に包含する。
２種以上のM. vaccae菌株を使用すること、および／または治療剤に他のマイコバクテリア性の抗原を含有させることは、有益であり、本発明の範囲内に含まれる。ツベルクリンを含ませても良い。
治療剤は、その効果を促進させるために、BCG（Bacillus Calmette-Guerin）ワクチン、特に凍結乾燥させた形態のワクチンをさらに含んでいても良い。
治療剤は、さらにアジュバント、保存剤、安定化剤などの他の成分を含んでいても良い。治療剤は、無菌の注射可能な液体形態で、或いは使用前に液体状態に戻される無菌の凍結乾燥形態で供給できる。
本発明による治療剤を調製するためにM. vaccaeは、そのままの状態で、或いは抽出物として、或いは菌の分画部分として、使用できる。
本発明を以下に示す実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
M. vaccaeを1.3％寒天により固体化した修飾ソートン培地からなる固体培地上で成育させる。培地に菌を接種し、菌の成育が行われるように、32℃で10日間培養する。次いで、菌を収得し、計量し、希釈剤中に懸濁させて、希釈剤1ml当たり100mg微生物となる様にする。懸濁液を緩衝生理食塩水でさらに希釈して、希釈剤1ml当たり菌湿重量10mgを含む懸濁液を得た後、5ml複数回投与バイアルに分割する。次いで、生きた菌を含むバイアルを10psiで10分間オートクレーブ処理して菌を死滅させ、本発明の免疫治療剤を得る。これは、使用に際し、もし必要であれば、さらに希釈しても良い。
実施例２
M. vaccaeの注射液が、腫瘍患者数人に投与された。結果の幾例かを下記に示す。
乳ガン
１）  Mycobacterium vaccaeを免疫療法として使用する種々の研究が進行中のベトナム国ハノイの国立衛生および疫学研究所（National Institute of Hygiene and Epidemiology）において、複数のスタッフの一人が、腋窩二次腫瘍を伴う乳ガンを発症した。手術による切除の後、彼女は、BCG免疫治療を受けるよう助言された。他の患者におけるその様な治療方法を見ていたので、当該患者は、BCG治療を受けることを望まず、M. vaccaeによる治療を求めた。109個の死滅M. vaccae菌を含む標準注射が行われ、その後３年間患者は良好な状態で、他の腫瘍の兆候は認められない。
２）  持続性の粃糠疹の治療のためにM. vaccaeの注射を受けた数週間以内に、50才の女性が、通常の乳房X線検査により、乳房に塊があることが判明した。生検により、腫瘍は悪性であることが判明し、乳腺腫瘤摘出術により除去された。組織病理学検査は、腋窩リンパ節周辺の腫瘍の無い洞組織球増殖（sinus histiocytosis）を示した。約9ヶ月後、粃糠疹が再発し、２回目のM. vaccaeの投与が行われ、殆ど直ちに粃糠疹は軽減された。腫瘍の切除21ヶ月後にも、二次腫瘍の兆候は、認められない。
３）  70才台前半の女性は、数年前に乳腫瘍を切除されていた。この女性は、関節炎による背中痛を長年経験しており、これを緩和する目的でM. vaccaeの注射を受けた。その直ぐ後で、脊柱のX-線写真は、腫瘍の二次定着（secondary deposits）であると思われる多数の病変を示しており、放射線治療を受けるよう指示されていた。8週間後に、この女性は、放射線治療を受けるために現れたが、繰り返し行われたX-線検査において、二次定着の兆候は認められなかった；放射線治療は、中止された。２年半後にも、この女性は、腫瘍の再発もなく、健康であった。
４）  年齢55才の開業医が、急性乳腫瘍と思われる２日間の病歴を示した。切除手術により、塊が急速に成長しつつある腫瘍であり、すでに二次定着が腋窩に存在していた。直ちに切除が行われ、退院後直ちにM. vaccaeが注射で投与された。3ヶ月の間隔を置いてさらに2回の注射が行われた。手術傷は良好に治癒し、1年後に、病気の急速な進行が心配されていた患者に、二次定着の痕跡は認められなかった。
５）  1年間腰部に痛みを訴えていた50才の看護婦が、小さな乳ガンからの骨への二次腫瘍（secondaries）があると診断された。最初のM. vaccaeの注射後、この女性の状態は大きく改善され、化学療法に良く耐え、M. vaccaeの2回目の注射を受けた。現在この女性は、健康である。
肺ガン
１）  年齢55才の女性が、1993年10月に、肺に発生した幾つかの手術不可能な腫瘍によることが判明した息切れを発現した。これらは、所在不明の一次腫瘍からの二次定着であると思われた。腫瘍専門医の同意の下に、M. vaccaeが注射投与され、一連の化学療法と放射線療法とが開始された。患者は、極めて僅かの副作用を示すのみで、上記一連の治療に耐え、6ヶ月後にM. vaccaeの2回目の注射が提案された際に、これを希望しなかった。受診10ヶ月後、患者の容態が悪化し、化学療法が変更されたが、患者の予測される容態は芳しくなかった。1994年の10月始めにM. vaccaeの2回目の注射が行われ、その後患者の状態は改善された。その後1994年12月に１回、1995年3月１日に１回の合計２回の注射がさらに行われた。この患者の状態は、予期された以上に改善されたばかりではなく、何らの不都合を生じることなく、20回の化学療法に耐えている。
他の腫瘍
１）  悪性奇形腫による末期症状の30才の歯科医は、死を迎えるために自宅に送り返される直前に、M. vaccaeの注射を受けた。患者は、1〜2日後に改善の兆候を示し、3週間後には、肉眼で観察できる腫瘍の大きさが減少し始め、数週間来はじめて食事をとることができた。
２）  36才の女性は、ヘリコバクター  ピロリによる感染の結果生じた潰瘍周囲の胃の腺ガンを発病した。この女性は、化学療法にもかかわらず、数多くの転移する二次定着を持っていた。この女性は、M. vaccaeの1回目の注射を受けており、2ヶ月の間隔で注射を継続する予定である。
HIV-関連腫瘍
１）  複合カポシ肉腫症を伴う初期エイズ患者が、1993年11月にM. vaccaeの注射を受けた。患者は、それ以上の腫瘍を発症せず、またすでに存在する腫瘍も、消散の兆候を示した。患者がHIV-関連の二次感染を発症した後の1994年12月にM. vaccaeの第２回の注射を受けた。この患者は、2ヶ月毎に繰り返しM. vaccaeの注射を受けることになっている。
２）  CD+細胞を殆ど有しないが、目立ったエイズの兆候も示さない患者に対し、1994年6月にM. vaccaeを注射した。数週間後、一方の太股に直径約0.5cmの小さなKS病変を有していることが判明した。2ヶ月の間隔で引き続きM. vaccaeの注射が行われ、1995年3月の時点で、患者はそれ以外の病変を示しておらず、また当初の病変の寸法も大きくはなっていない。
３）  1994年6月に複合再発性の口腔咽頭癌腫症を持つ48才の男性にM. vaccaeを注射し、さらに2ヶ月の間隔で注射を行った。1995年3月まで腫瘍の再発はなかった。
以上の各実例は、M. vaccaeの注射による腫瘍治療の支持となるものである。M. vaccaeの使用は、どの様な副作用も伴わず、実際少なくとも２例の患者においては、化学療法の毒性効果を減少するのに役立っている。これらの早期の実用的観察は、理論的な予測を支持しており、価値の高い抗腫瘍活性を初めて示すものである。
実施例３
マウスの乳ガン株MM3により攻撃されたBalb/cマウスを使用して、予備的試験を行った。
それぞれマウス10匹からなる３つのグループをMM3細胞107個で攻撃した。１週間後第１のグループに107個のM. vaccaeを注射し、第２のグループに109個のM. vaccaeを注射し、第３のグループをコントロールとした。攻撃40日後マウスを屠殺し、腫瘍の進行を検査した。
0004135190.tif 000002