(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非性的に、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオンおよび亜鉛イオンのいずれにも依存する凝集する性質を有する分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）変異株。
【請求項２】
凝集する性質がガラクトースにより阻害される凝集性である、請求項１に記載の変異株。
【請求項３】
非性的凝集性を有する分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）ＡＲＣ０２７株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９８９）。
【請求項４】
非性的凝集性を有する分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）ＡＲＣ０２８株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９９０）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）の凝集変異株に関する。
【０００２】
【従来の技術】
出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)において構成的に凝集する変異株はＦＬＯ変異株と呼ばれ近年解析が進められてきている（Teunissen,A.W.R.H. and Steensma,H.Y.,Yeast,11,1001-1013(1995) ）。ＦＬＯ変異株はビール製造において最も重要であり、かつ菌体と培養液との分離工程での手間のかかる作業がきわめて容易に行えるために、盛んに利用されている。
【０００３】
培養後に酵母が凝集して発酵タンクの底に自然に沈んでくることは、ビール醸造にとって都合の良い現象であり、ビール醸造所はこの酵母の凝集という現象を、機構は不明のまま安価な酵母の分離方法として利用してきた。近年の遺伝学および分子生物学的手法を用いた解析から、その凝集に関する遺伝子（ＦＬＯ）が同定され解析がなされるようになり、一層注目されている。
【０００４】
これまでにＦＬＯ遺伝子の中で凝集素（フロッキュリン）をコードする遺伝子としてＦＬＯ１、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０が同定されている。これら遺伝子のコードするタンパク質はきわめて類似した構造を有し、すべてマンノースを特異的に認識するマンノース特異的レクチン活性を有している。また細胞表層への局在にはＣ末端部分にＧＰＩアンカーが結合していることが明らかにされている。このようにサッカロミセス・セレビシエにおける凝集のメカニズムは細胞表層に局在する凝集素が細胞表層のマンナンを含む複合糖質に結合することにより起こることが、明らかになってきた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）［以下、Ｓ．ポンベという］は出芽酵母サッカロミセス・セレビシエとは系統進化的にきわめて異なる酵母であり、細胞増殖機構、染色体構造、ＲＮＡスプライシング機構、糖蛋白質糖鎖へのガラクトース残基の付加等の諸性質が複雑で動物細胞と類似している利点がある。そのため醸造以外に、遺伝子工学的手法による異種タンパク質の生産のための良き宿主として近年注目されてきている[Giga-Hama,Y. and Kumagai,H. eds.,Foreign gene expression in fission yeast Schizosaccharomyces pombe.1997,Springer-Verlag,Germany]。
【０００６】
目的タンパク質の生産に際し、培養液と菌体との分離工程は、菌体内タンパク質および培地中に分泌されるタンパク質のどちらの生産においても必要なものであり、生産規模が増すに従いその効率化が求められる。しかし、Ｓ．ポンベにおいては性的凝集に関する現象については古くから解析が行われているが、非性的に凝集する変異株については全く報告がない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＳ．ポンベの非性的に凝集する変異株を取得し、その株の持つ性質、変異遺伝子の同定、産業用利用などを検討することを目的に、変異株の取得を行った。その結果、非性的に凝集するＳ．ポンベの変異株を取得するに至った。本発明は、非性的に、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオンおよび亜鉛イオンのいずれにも依存する凝集する性質を有する分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）変異株、である。また本発明は、その非性的に凝集する性質が、ある種の金属イオンに依存し、またある種の糖によって阻害される性質を有する変異株である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において、「非性的に、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオンおよび亜鉛イオンのいずれにも依存する凝集する性質」（以下、非性的凝集性という）とはＳ．ポンベが本来有する性的に凝集する性質（性的凝集性）とは異なる凝集性を有する性質をいう。しかし、本来有する性的凝集性が失われていることを意味するものではない。また、「構成的凝集性」とは非性的凝集性と同一の性質をいうが、特に増殖過程において増殖と同時に（非性的に）凝集する性質を指していう。
【０００９】
Ｓ．ポンベは本来フェロモンで誘導される性的凝集性を有する。たとえば、増殖過程において栄養不足をきたすと性的凝集を生じやすい。しかし、タンク培養などによる人工的大量培養においては通常充分な量の栄養を有する培養液中で培養が行われることより性的凝集を起こすことは少ない。一方、本発明の変異株では充分な量の栄養を有する培養液中で培養が行われても増殖とともに凝集（構成的凝集）を起こす。これは、この変異株が非性的凝集性を有することによる。
【００１０】
このように本発明の変異株はタンク培養などにおいて菌体を凝集させることができ、それにより菌体と培養液を容易に分離できる。したがって、たとえば遺伝子工学的手法によって蛋白質を生産する場合に本発明変異株を宿主として用いることにより、繁雑な工程である遠心分離や濾過などによる菌体と培養液の分離工程を格段に容易に行うことができる。
【００１１】
本発明変異株はたとえば人工的突然変異手段により非性的凝集性を有しない通常のＳ．ポンベから取得できる。すなわち、非性的凝集性を有しないＳ．ポンベを突然変異誘発物質で処理し、処理されたＳ．ポンベから非性的凝集性を有する菌を選択し、さらに選択された菌から非性的凝集性が優性変異であるものを選択することにより作成できる。
【００１２】
後述実施例において、以下に示す具体的作成手段により本発明変異株を取得するとともに、その性質を決定した。
（１）Ｓ．ポンベとしてＴＰ４−１Ｄ株やＴＰ４−５Ａ株［ともに、登田  隆博士（Imperial Cancer Research Fund ）より供与された］などの株を以下の実験に用いる。
（２）上記Ｓ．ポンベをメタンスルホン酸エチル（以下、ＥＭＳという）などの突然変異誘発物質で処理した後、ＹＰＤ液体培地などの培養液にて生育させる。
（３）培養後、容易に菌体が沈殿する画分を分取する。
（４）分取した菌体をＹＰＤプレートなどに塗布して培養する。
（５）コロニーの形状から凝集株を選別する。
（６）選別した変異株（ｈ+ ）株を野生株の（ｈ- ）株とかけあわせ、ランダムスポアー法によりハプロイドを取得する。
（７）カルシウムイオン存在下、非存在下での凝集の有無を決定する。
（８）凝集を阻害する糖の種類を決定する。
（９）細胞表層やその他の糖鎖を含有する構成成分に凝集を阻害する糖を含まない変異株と上記凝集変異株との凝集の様子を比較観察する。
【００１３】
その結果、得られた変異株は目的とする非性的に（かつ構成的に）凝集する性質を有するＳ．ポンベ変異株であった。また、この変異株は、ガラクトースによりその非性的凝集性が阻害される性質を有していた。同様に、１−メチルアルファガラクトシド、１−メチルベータガラクトシド、ラクトース、メリビオースおよびラフィノースによりその非性的凝集性が阻害される性質を有していた。一方、マンノース、グルコース、フルクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびガラクトサミンではその非性的凝集性は阻害されなかった。
【００１４】
さらに、得られた上記変異株の非性的凝集性はカルシウムイオン依存性を有していた。すなわち、カルシウムイオン非存在下では非性的凝集性は見られなかった。同様に、この非性的凝集性はリチウムイオン、マンガンイオン、銅イオンおよび亜鉛イオンのいずれの存在にも依存し、これらのイオンの非存在下では非性的凝集性は見られなかった。このように、上記変異株が非性的に凝集するためには上記のような陽イオンのいずれかが存在する必要がある。
【００１５】
【実施例】
［例１］
分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe ）ＴＰ４−１Ｄ株をＭＭ液体培地１００ｍｌに接種し、ＯＤ６００＝０．２〜０．５まで２７℃で培養した。培養液を５０ｍｌのディスポ遠心管を用いて４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌し、次いでＯＤ６００＝５となるように新しいＭＭ液体培地を加えた。
【００１６】
この菌体溶液に濃度が２ｗｔ％となる量のＥＭＳを添加し、３０℃で３時間、穏やかに振盪培養した。室温、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して集菌し、ＭＭ液体培地で３回洗浄した。廃液は５０ｗｔ％チオ硫酸ナトリウム水溶液で処理した。
【００１７】
得られた菌体にＯＤ６００＝０．０１となる量のＭＭ液体培地を加え、それをＭＭ液体培地でさらに１００倍、５００倍、および１０００倍希釈し、それぞれの希釈液をＹＰＤプレート( １ｗｔ％のイーストエキストラクト、２ｗｔ％のペプトンおよび２ｗｔ％のグルコースを含む３ｗｔ％寒天プレート）に蒔いた。
【００１８】
２７℃で３〜４日培養し、生育してきたコロニーをＥＭＳ処理菌とした。この菌体をＹＰＤ液体培地にて生育させた。培養して容易に菌体が沈殿する画分を分取し、さらにＹＰＤプレートに塗布して２８℃で４日間培養を行った。分裂酵母の凝集する変異株はＹＰＤプレートのコロニーの形状から［野生株の性的凝集は椀状に凝集するのに対しこの変異株は円錐状に凝集する］、比較的容易に選別できる。このような方法で数株の凝集変異株を取得した。
【００１９】
取得した凝集変異株の中で凝集の程度が強い変異株（ｈ+ ）株１つを選びそれを野生株（ｈ- ）とかけあわせ、ランダムスポアー法（Alfa,C.,Fantes,P.,Hyams,J.,McLeod,M.,Warbrick,E.,Experiments with Fission Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1993) ）によりハプロイドを取得した（この変異株をＡＲＣ０２７株と名付けた［受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９８９］）。この操作を３回行った後の変異株をＡＲＣ０２８株と名付けた［受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９９０］。このＡＲＣ０２８株を野生株とかけあわせたところ、２倍体においても凝集特性を示したことから優性変異であることがわかった。この変異をＧＳＦ１（for Galactose Specific Flocculation ）変異と名付けた。
以下の試験はＡＲＣ００２８株を用いて行った。なお、ＡＲＣ００２７株も同じ性質を有していた。
【００２０】
［例２］
ＡＲＣ００２８株の凝集の陽イオン依存性について調べた。
ＡＲＣ００２８株をＹＰＤ液体培地にて３２℃で２日間培養した結果、菌体が構成的に凝集して培養器底部に沈殿した。次にこの菌体を２５０ｍＭのＥＤＴＡ水溶液にて菌体を洗浄した。その結果、菌体の凝集は完全に解離し、ＥＤＴＡ水溶液中に均一に分散した。さらにこの分散液に２５０ｍＭとなる量の塩化カルシウムを添加したところ、菌体は再び凝集し培養器底部に沈殿した。このことより、この変異株の凝集はカルシウムイオン依存性であること（すなわち、凝集にはカルシウムイオンが必要であること）がわかった。
カルシウムイオン以外の陽イオンについて同様な実験をした結果、この変異株の凝集性はリチウムイオン、マンガンイオン、銅イオンおよび亜鉛イオンに依存していることがわかった。
【００２１】
［例３］
次にＡＲＣ００２８株の凝集の糖特異性について調べた。
ＡＲＣ００２８株をＹＰＤ液体培地にて３２℃で２日間培養した結果、菌体が構成的に凝集して培養器底部に沈殿した。次にこの菌体を２５０ｍＭのＥＤＴＡ水溶液で菌体を洗浄し菌体の凝集を解離させた。この分散液に、２Ｍとなる量のガラクトースを添加して撹拌し、その後２５０ｍＭとなる量の塩化カルシウムを添加した。その結果、菌体の凝集は起こらず、菌体は分散状態のままであった。このことより、この変異株の凝集性はガラクトースにより阻害されることがわかった。
【００２２】
ガラクトースの添加量を変えて同様の試験を行い、凝集阻害を起こさせるガラクトースの濃度を測定した。その結果を図１に示す。図１はガラクトース濃度（ｍＭ）と凝集率（％）との関係を示すグラフである。図１より５０％凝集阻害をもたらすガラクトース濃度は約８ｍＭであった。
【００２３】
他の糖で同様の凝集阻害実験を行った結果、１−メチルアルファガラクシド、１−メチルベータガラクトシド、ラクトース、メリビオースおよびラフィノースが凝集阻害活性を有していた。一方、マンノース、グルコース、フルクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびガラクトサミンは凝集阻害活性を有していなかった。
【００２４】
以上の結果からＡＲＣ００２８株の持つ凝集活性はガラクトース特異的であり、その糖の特異性は単糖の場合はＣ−４、Ｃ−６およびＣ−２位を厳しく認識していることがわかった。さらに糖鎖の場合は非還元末端にガラクトースがあればアグリコンの特性は低いことがわかった。
【００２５】
［例４］
Ｓ．ポンベはその糖鎖構成成分としてガラクトースを生産することが知られている（Font de Mora,J.,Valentin,E.,Herrero,E.,J.Gen.Microbiol.,136,2251-2259(1990) ）。本発明者らはすでに糖鎖の構成成分としてガラクトース鎖が全く付加されないｇｍｓ１変異株を取得している（Tabuchi,M.,Tanaka,N.,Iwahara,S.,Takegawa,K.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,232,121-125(1997) ）。そこでｇｍｓ１+ 遺伝子破壊株をガラクトース鎖を含まないマーカー菌として、共凝集性（co-flocculation ）を野生株と比較した。
【００２６】
混合した菌をＥＤＴＡ水溶液で処理してＡＲＣ００２８株の凝集を解除した。その後、カルシウムイオンを添加して、共凝集性を調べた。その結果ＡＲＣ００２８株と野生株の混合した場合は、ＡＲＣ００２８株は野生株と共凝集するために上澄みは透明になった。一方、ＡＲＣ００２８株とｇｍｓ１+ 遺伝子破壊株を混合した場合には完全に共凝集することなく上澄みに凝集しない菌体が認められた。
【００２７】
【発明の効果】
本発明者は、非性的に（かつ構成的に）凝集する分裂酵母Ｓ．ポンベ変異株を見い出した。この凝集変異株は、その凝集性がガラクトースなどの特定の糖で阻害され、またカルシウムイオンなどの特定の陽イオン依存性である変異株であり、Ｓ．ポンベ細胞表層のガラクトースを認識して凝集するものであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】凝集の程度とガラクトースの濃度との関係を示すグラフ。
【図１】
0004129606.tif 000002