(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識物質よりなるラベル部と、ピューロマイシンまたは3’-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシドの化学構造骨格を有し、翻訳タンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物よりなるアクセプター部とから構成されるラベル化試薬の存在下、プロモーター領域の制御下にある、終止コドンが削除されたコーディング領域からなるDNAから転写された産物を鋳型として無細胞翻訳系または生細胞中でタンパク質合成を行わせることを特徴とする、Ｃ末端がラベル化されたタンパク質の製造方法。
【請求項２】
コーディング領域が５０−３，０００アミノ酸残基に対応する長さからなるDNAである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ラベル化試薬のラベル部が、蛍光性物質、放射性物質、または非放射性標識物質である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
無細胞翻訳系が小麦胚芽抽出液またはウサギ網状赤血球抽出液を使用する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質のC末端をラベル化試薬により効率的にラベル化する方法に関する。本発明のラベル化試薬によるタンパク質のC末端ラベル化法は、種々の無細胞翻訳系や生細胞で発現するタンパク質の検出および同定に有効であり、ゲノム解析によって集積する遺伝子の機能解析において、対応する機能を保持したタンパク質の同定，特に核酸ータンパク質相互作用やタンパク質ータンパク質相互作用のようなタンパク質の機能解析を効率化、自動化する上で極めて有効な手段を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
無細胞翻訳系や生細胞で発現させたタンパク質のラベル化には、35S, 3H, 14Cといった放射能元素でラベルしたアミノ酸を翻訳産物に取り込ませる放射能ラベル化法が一般的である。この場合、放射能を利用するため安全管理上、特別な施設等が必要とされる。このため、放射性化合物を使用しない方法として下記する方法が知られている。この方法によれば、まず、アミノ酸のリジンのε-アミノ基にビオチンを共有結合させ、これをリジンのアンチコドンをもつtRNAにエステル結合させたもの（ビオチン-リジン-tRNA)を合成し、無細胞翻訳系に投入し、翻訳産物をビオチン化する。翻訳産物は、電気泳動後、メンブレンに移し、アルカリフォスファターゼとストレプトアビジンの融合タンパク質によって、翻訳産物をアルカリフォスファターゼにより化学発光させる。これを、X線フィルム等を使って、翻訳産物を同定する（Promega社、（1993) Technical Bulletin, No.182, p2)。この方法は、合成したビオチン-リジン-tRNAが極めて不安定（ー７０℃で６ヵ月）であり、高価であるという欠点を有する。さらに、同定までの処方が繁雑で時間がかかるという問題点もある。したがって、この方法は，大量の試料処理のための自動化には極めて不利である。さらに、翻訳されたタンパク質は、複数のリジン側鎖がビオチンで修飾されているために、機能および構造が本来のものと変化している可能性がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、無細胞翻訳系および生細胞における翻訳タンパク質のラベル化において、１）効率的である、２）簡便である、２）経済的である、３）ラベル化試薬が長期間安定である、４）翻訳産物の機能、構造が影響を受けない、５）安全性などの条件を満たした、Ｃ末端がラベル化されたタンパク質の製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、標識物質よりなるラベル部と、タンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物よりなるアクセプター部とから構成されるラベル化試薬の存在下、プロモーター領域の制御下にある、終止コドンが削除されたコーディング領域からなるDNAから転写された産物を鋳型として無細胞翻訳系または生細胞中でタンパク質合成を行わせると、タンパク質のＣ末端の機能を損なうことなく高分子量のタンパク質のC末端が効率的にラベル化されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）標識物質よりなるラベル部と、ピューロマイシンまたは3’-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシドの化学構造骨格を有し、翻訳タンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物よりなるアクセプター部とから構成されるラベル化試薬の存在下、プロモーター領域の制御下にある、終止コドンが削除されたコーディング領域からなるDNAから転写された産物を鋳型として無細胞翻訳系または生細胞系中でタンパク質合成を行わせることからなる、Ｃ末端がラベル化されたタンパク質の製造方法、
（２）コーディング領域が５０−３，０００アミノ酸残基に対応する長さからなるDNAである上記（１）に記載の方法、
（３）ラベル化試薬のラベル部が、蛍光性物質、放射性物質、または非放射性標識物質である上記（１）または（２）に記載の方法、
（４）無細胞翻訳系が小麦胚芽抽出液またはウサギ網状赤血球抽出液を使用する上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の方法、
に存する。
本発明の特徴は、無細胞翻訳系または生細胞系にプロモーター領域の制御下にある、終止コドンが削除されたコーディング領域からなるDNAから転写された産物(加工mRNA)を鋳型として加え、最終濃度15〜50μMのピューロマイシンまたはピューロマイシン誘導体などのラベル化試薬の存在下でタンパク質合成を行わせると、翻訳タンパク質のC末端にラベル化物質が効率よく結合し、Ｃ末端がラベル化された高分子量のタンパク質が得られることにある。ピューロマイシンにフルオレセイン等の蛍光物質を化学結合させた化合物は、ピューロマイシンと同様、タンパク質のＣ末端の機能を損なうことなく翻訳タンパク質のC末端に結合するため、放射能物質を使用することなくタンパク質の同定が可能であることがわかった。すなわち、無細胞翻訳系に蛍光化ピューロマイシン等のラベル化試薬を加え反応後、その反応生成物を電気泳動し、ゲルをそのまま蛍光イメージアナライザーで読み取ることにより、容易に翻訳タンパク質を同定できる。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質のC末端がラベル化されたタンパク質は、加工されたDNAの転写産物(加工mRNA)を無細胞翻訳系または生細胞系に鋳型として加え、標識物質よりなるラベル部と、タンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物よりなるアクセプター部とから構成されるラベル化試薬の存在下でタンパク質合成を行わせることによって製造される。
【０００６】
プロモーター領域の制御下にある、終止コドンが削除されたコーディング領域からなるDNAから転写された産物（加工されたmRNA）は、プロモーター領域と、終止コドンが削除されたコーディング領域とからなるDNAからRNAポリメラーゼを用いて転写することによって得られる。コーディング領域の長さは、５０−３，０００アミノ酸残基に対応する長さのDNAであるのが好ましい。すなわち，本発明の方法によれば、高分子量のタンパク質であっても効率よくそのＣ末端をラベル化できるので、ゲノム解析で得られるタンパク質の同定やその機能解析にきわめて有用である。
【０００７】
本発明の方法では、ラベル化試薬によりタンパク質のＣ末端がラベル化される。ラベル化試薬は，ラベル部とアクセプター部とから構成される。ラベル部は、通常、蛍光性物質、放射性物質および非放射性標識物質から選択される。ラベル部の蛍光物質としては、フルオレセイン系列以外にも、フリーの官能基（例えばカルボキシル基、水酸基、アミノ基など）をもち、スペーサーを介してピューロマイシンまたはピューロマイシン様化合物などのヌクレオチド誘導体に連結可能な種々の蛍光色素（例えば、ローダミン系列、エオシン系列、NBD系列など）であれば如何なるものであってもよい。
【０００８】
その他、ラベル部としては、33P、32P、35Sのような放射性標識物質、ビオチンのような補酵素、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコールなどの非放射性標識物質、あるいはラベル化可能な化合物であれば、その化合物の種類、大きさを問わない。
【０００９】
ラベル化試薬を構成する別の成分であるアクセプター部としては、通常、核酸または核酸誘導体が使用される。核酸誘導体としては、核酸とアミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質が化学的に結合した化合物を用いることができる。代表的な化合物として、アミド結合を有するピューロマイシン（Puromycin）、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside、 PANS-アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのPANS-Gly、バリンのPANS-Val、アラニンのPANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するPANS-全アミノ酸化合物が挙げられる。また、化学結合として3'-アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside,AANS-アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのAANS-Gly、バリンのAANS-Val、アラニンのAANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するAANS-全アミノ酸化合物が利用できる。また、ヌクレオシドあるいはヌクレオチドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格および塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質とを化学的に結合可能であれば、そのようにして結合した化合物は、すべて使用できる。
【００１０】
上記したピューロマイシン（第１図のIの化合物）は細菌（Nathans,D. (1964)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,51,585-592; Takeda,Y. et al. (1960) J.Biochem. 48,169-177）および動物細胞（Ferguson,J.J. (1962) Biochim.Biophys.Acta 57,616-617; Nemeth,A.M. & de la Haba,G.L. (1962)J.Biol.Chem. 237,1190-1193）のタンパク質合成を阻害することが知られている。
ピューロマイシンの構造はアミノアシルtRNAの構造と類似しているため、リボソーム上のAサイトに入り、Ｐサイトに存在しているペプチジルtRNAと反応し、ペプチジルピューロマイシンとしてリボソームから遊離する（Harris, R.J. (1971)Biochim.Biophys.Acta 240,  244-262）。
【００１１】
タンパク質合成系において、終止コドンをもたない切断されたmRNAを鋳型に用いた場合、タンパク質合成が停止することが知られている。このように、mRNAに対応するコドンがない場合は、アミノアシル-tRNAや終止因子はリボソーム上のAサイトに入ってもペプチド転移反応で触媒されない。一方、このような状態でもピューロマイシンや本発明の誘導体は、リボソーム上のAサイトでリボソームのペプチド転移反応により触媒され、タンパク質のC末端に効率よく結合できることがわかった。
【００１２】
これを確かめるには、終止コドンをもつmRNAと終止コドンをもたないmRNAを作成し、蛍光性のピューロマイシン誘導体、たとえばフルオレセニルピューロマイシン（Fluorpur）（図１のIIの化合物）と共に無細胞翻訳系に加え、タンパク質のC末端の蛍光ラベル化の効率を調べる必要がある。
【００１３】
タンパク質としては標準的な分子量をもつβ-ラクタマーゼ（分子量 32 kDa）の終止コドンのないものと、あるもののmRNAを調製するために、図２に示したような5'側からT7プロモーター、Kozak配列（コザック配列）、β-ラクタマーゼのコーディング領域、それと終止コドンのないもの(A)とあるもの(B)の 遺伝子DNAを作成した。
【００１４】
蛍光性のピューロマイシン誘導体としては、ラベル部としてフルオレセイン、アクセプター部としてピューロマイシンを選び、両者を化学結合で連結した蛍光性のラベル化化合物、例えばFluorpur(第１図のIIの化合物)を化学合成した。
【００１５】
真核生物の無細胞転写翻訳系、例えばウサギ網状赤血球抽出液（Nuclease treated Rabbit reticulocyte lysate）や小麦胚芽抽出液の翻訳系において、上記のT7プロモーター、Kozak配列、β-ラクタマーゼのコーディング領域、それと終止コドンのないものとあるもののDNAからの転写産物(加工mRNA）を鋳型として加え、Fluorpur存在下でタンパク質合成を行わせ、タンパク質の蛍光ラベル化について調べると、β-ラクタマーゼの全長タンパク質のＣ末端にFluorpurが、16μMの濃度で明確に結合していることがわかった(図３A)。Fluorpur によるβ-ラクタマーゼの全長タンパク質の蛍光ラベル化は、大腸菌の無細胞転写翻訳系でも確認された。特に、小麦胚芽抽出液の無細胞翻訳系を用いた場合、終止コドンのないmRNAの方（図３のレーン１）が終止コドンのあるmRNA（図３のレーン３）に比べ、１０倍程度ラベル化効率が増大することが確認された。
【００１６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
【００１７】
実施例１
真核細胞の無細胞翻訳系（小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液）を使ったβ-ラクタマーゼのC末端蛍光ラベル化
＜１＞転写用DNAの構築とmRNAの作成
材料：β-ラクタマーゼ遺伝子の載ったpBR322プラスミド(Sutcliffe, J. G. (1978) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,3737-3741)は、石坂正道氏（九州大学、三菱化学生命科学研究所）より供与された。 E.coli pARベクター(Rosenberg, A.H. et.al. (1987) Gene 56,125-135)のT7プロモーターとKozak共通配列を含むDNAは日本製粉（株）で合成された。PCR用DNAプライマーはエスペックオリゴサービス、DNA/RNAプライマーは日本ジェンセットによってそれぞれ合成された。各種酵素、試薬等は市販のものを用いた：RNA分解酵素Ribonuclease A (シグマ)  ；核酸修飾酵素  T4 DNA Polynucleotide Kinase (NEB), T4 DNA ligase (NEB)  ；耐熱性DNA合成酵素  Gold Taq. Polymerase (Perkin-Elmer)  ；RNA合成酵素キット  Ribomax Large Scale RNA Production System (Promega) ；キャップアナログ  RNA capping Analog (Gibco BRL) ；無細胞翻訳系キット：ウサギ網状赤血球抽出液 (Rabbit Reticulocyte Lysate Systems, Nuclease Treated, Promega), 小麦胚芽抽出液 (Wheat Germ Extract, Promega) ；電気泳動試薬  アクリルアミド、アクリルアミドービス、SDS、等はすべてナカライテスク製。プライマー除去剤Primer Remover はEdgeより購入した。
【００１８】
方法：転写効率の高い大腸菌ウイルスT7のRNAポリメラーゼによって認識されるDNA配列（T7プロモーター配列）と翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されやすい配列（Kozak コンセンサス配列)をもったDNA（図２）を次のようにして構築した。まず、上記の配列をもつ領域とβ-ラクタマーゼ遺伝子をもつ領域を独立に作成する。 T7プロモーター配列とKozakコンセンサス配列を含む１本鎖DNA（配列番号１）を化学合成し、DNAプライマー（配列番号２）とDNA/RNAプライマー（配列番号３）によってPCRを行う。一方、β-ラクタマーゼ遺伝子の載ったpBR322プラスミドを鋳型としてDNA/RNAプライマー（配列番号４）と DNAプライマー（配列番号５）でPCRすることにより、β-ラクタマーゼ遺伝子DNA領域を増幅する。これらをRRR法(Nishigaki, K. et al.(1995) Chem. lett. 131-132)に従って、それぞれのPCR反応液にリボヌクレアーゼ Aを加え、６０℃で３０分反応させることにより、 DNA/RNAプライマー（配列番号３と配列番号４）のRNAの3'側のリン酸ジエステル結合を切断して突出末端を作る。これらをフェノール抽出後、プライマー・リムーバー（Primer Remover）によってプライマーおよび切断されたDNA断片を除去しエタノール沈殿させる。乾燥後、T4 DNA リガーゼ用バッファーに溶解しT4 DNA ポリヌクレオチド・キナーゼ（Polynucleotide Kinase）を加えて４５℃、３０分反応後、さらに３０分かけて徐々に１６℃に温度を下げてからT4 DNA リガーゼを加え、上述の２つのDNA領域を結合させた。この反応液の一部を採取し、 DNAプライマー（配列番号２および配列番号５）を使って再度、PCRで増幅し、転写用に図２の(A)を作成した。
【００１９】
一方、終止コドンをもつβ-ラクタマーゼ遺伝子からなる転写用DNA（図２のB）は、上記の方法においてDNAプライマー（配列番号５）の代わりに別のDNAプライマー（配列番号６）を用いることにより作成した。
上記の方法で作成した２つのDNAは、RNA合成キット Ribomax Large Scale RNA Production System (Promega)を使って転写した。合成効率を上げるためにキャップアナログ  RNA capping Analog (Gibco BRL)を使い、mRNAの５'側を修飾した。キャップアナログおよび過剰のNTPを除去するためにプライマー・リムーバーを使ってエタノール沈殿を行なった。
【００２０】
＜２＞蛍光レベル化試薬Fluorpurの調製
材料：ピューロマイシン（puromycin）はシグマから、フルオレダイト(6-N-carboxy-di-O-pivaloyl-fluorescein-hexyl-O-(2-cyanoethyl)-(N,N'-diisopropyl)-phosphoramidite)は日本パーセプティブから、テトラゾールは日本ミリポアから、クロマト用シリカゲルはメルクからそれぞれ購入した。
【００２１】
方法：ピューロマイシン（26 mg、48 μmol）を3 mlの乾燥ピリジンに溶かし、減圧下で蒸発させ、脱水させる。この操作を３回繰り返す。これに5 mlの4%テトラゾール/アセトニトリル溶液とフルオレダイトを加え、室温で撹拌させる。反応はシリカゲルの薄層クロマトグラフィー（TLC、展開溶媒：クロロフォルム：メタノール=9:1）でモニターする。通常、反応は2時間で終了する。反応後、溶媒を減圧下で追い出し、これに0.1 Mのヨウ素をテトラヒドロフラン/ピリジン/水=80:40:2に溶かした溶液 2 mlを加え、室温で撹拌させながら生成したホスファイト-トリエステルを酸化させる。１時間半後、溶媒を減圧下で除去し、残部をクロロフォルムで抽出する。抽出液は無水硫酸マグネシウム存在下で乾燥させた後、減圧下で溶媒を除去する。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロフォルム/メタノール=90:10で溶出させる。保護基のついたFluorpurはシリカゲルTLC（展開溶媒：クロロフォルム：メタノール=9:1）でRf 0.26のところに溶出される。次に保護基の脱保護を行う。保護基のついたFluorpurを濃アンモニア水/エタノール=2:1の混合溶液 1 ml に加え、β-シアノエチル基を除去するとFluorpur（図１のII）が7mg得られる。合成品がFluorpurであることは、そのpH 9の溶液の紫外可視吸収スペクトルが272 nm（ピューロマイシン部由来）と494 nm（フルオレセイン部由来）に現われることと、MALDI/TOFマススペクトロメトリーで[M+H]+の分子イオンがm/z 1010に現われることから同定された。
【００２２】
＜３＞タンパク質の蛍光ラベル化
作成したmRNAは、（１）ウサギ網状赤血球無細胞翻訳系Rabbit Reticulocyte Lysate Systems, Nuclease Treated (Promega)および（２）小麦胚芽無細胞翻訳系Wheat Germ Extract (Promega)の２種類の翻訳系においてFluorpurの最終濃度が16μMになるように加え、それぞれの至適反応温度（ウサギ網状赤血球無細胞翻訳系；３０℃、小麦胚芽無細胞翻訳系；２５℃）で６０分反応させた。
【００２３】
＜４＞タンパク質のラベル化の確認
フルオレセニルピューロマイシン(Fluorpur)でラベル化されたタンパク質の確認は、上記の無細胞翻訳産物をサンプルとしてSDS-PAGEで２０V定電圧、９０分泳動したゲルを蛍光イメージング装置（FluorImager 595, Molecular Dynamics)で直接読み取ることにより行った。最も効率よく蛍光ラベルされた全長β-ラクタマーゼ（分子量 ３２kDa)は、小麦胚芽系無細胞翻訳系を用い、終止コドンのないDNA（図２のA）から転写したmRNAを使って、Fluorpurが最終濃度１６μMになるように加えた場合に得られた（図３Aのレーン１)。しかし、同じ小麦胚芽系無細胞翻訳系を用いて、 Fluorpurが最終濃度１６μMであっても終止コドンのあるDNA（図２のB）から転写したmRNAを使用した場合には、その蛍光ラベル化の効率は終止コドンのないDNAの場合に比べ１０分の１以下であった（図３Bのレーン３)。また、ウサギ網状赤血球の無細胞翻訳系においても、終止コドンのないDNAから転写したmRNAを使って翻訳させた系（図３Aのレーン５）では、終止コドンのあるDNAから転写したmRNAを使った場合（図３Aのレーン６）に比べ３〜４倍ラベル化効率が上昇した。比較のため、従来のタンパク質の蛍光染色法(SYPRO Orange)で同じゲルを染色したものが図３Bに示してある。SYPRO Orangeで染色した場合、投入したmRNAによって翻訳されたタンパク質（β-ラクタマーゼ）は、無細胞翻訳系由来のタンパク質の中に埋もれて確認することができなかった。以上のことから、本発明の方法によるタンパク質のラベル化がSDS-PAGEによる合成タンパク質の同定において有効であることが確認された。
【００２４】
【発明の効果】
本発明により、原核細胞と真核細胞とを問わず無細胞翻訳系および生細胞を利用して翻訳合成されたタンパク質のC末端を効率よく蛍光等によりラベル化することが可能になった。本発明は、遺伝子から発現されるタンパク質の同定と、それらの相互作用などの機能解析をより迅速に、安全かつ経済的に実施することを可能にする。その他、本発明の方法で得られるＣ末端がラベル化されたタンパク質は、該タンパク質と結合するかあるいは相互作用し、その活性を阻害または活性化する化合物の同定にも有用である。すなわち、本発明の方法で得られるＣ末端がラベル化されたタンパク質を、スクリーニングしようとする化合物と結合ないし相互作用した結果、残存または消失する該タンパク質のＣ末端ラベルを検出する等の方法により該化合物をも同定できる。
【配列表】
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【配列表フリーテキスト】
配列番号１−６：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】ピューロマイシンおよびその誘導体の化学構造。Iはピューロマイシン(puromycin)、IIはフルオレセニルピューロマイシン(Fluorpur)である。
【図２】β-ラクタマーゼの遺伝子DNAの構築図。Aは終止コドンのない遺伝子DNA、Bは終止コドンのある遺伝子DNA である。
【図３】β-ラクタマーゼのC末端へのFluorpurの結合を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動写真(A)とそれをSYPRO Orangeで蛍光染色したポリアクリルアミドゲル電気泳動写真(B)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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