(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブレビバクテリウム・フラバムまたはコリネバクテリウム・グルタミカムの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遺伝子を相同組換えにより破壊し、ＬＤＨ活性が１０分の１以下になったブレビバクテリウム・フラバムまたはコリネバクテリウム・グルタミカムに属する細菌の菌体反応によりコハク酸を製造するに当たり、菌体の生育を当該細菌の生育至適温度で処理し、定常期に達した以降の反応温度を当該細菌の生育至適温度より２〜１０℃高い温度とすることを特徴とするコハク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌を用いた有機酸の製造に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
コハク酸などを発酵により生産する場合、通常、アネロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）属、アクチノバチルス（Actinobacillus）属等の嫌気性細菌が用いられ検討されている。
嫌気性細菌を用いた場合は、生産物の収率が高いが、一方で増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬなどの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源の多量の添加は培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。
【０００３】
また、好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、これを静止菌体として用い、酸素を通気せずに有機酸を生産する方法も知られている。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする有機酸の生成量や菌体当たりの生産速度は未だ不十分であり、より優れた方法の確立が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決使用とする課題】
本発明の課題は、より発酵効率の高い有機酸の製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、菌体の生育が定常期に達した以降の反応温度を特定の温度にすることにより有機酸の生産速度が高まることをを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、細菌の菌体反応により有機酸を製造するに当たり、菌体の生育が定常期に達した以降の反応温度を当該細菌の生育至適温度より高い温度とすることを特徴とする有機酸の製造方法又は細菌の菌体反応により有機酸を製造するに当たり、当該細菌の生育至適温度±２℃の温度で処理した後に、引き続き該温度より高い温度で反応を行うことを特徴とする有機酸の製造方法に存する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、発明を詳細に説明する。
本発明に使用される細菌は、有機酸の生産能を有すれば特に限定されないが、このうち、バチルス（Bacillus）属、リゾビウム（Rizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物等の好気性細菌が好ましい。
【０００７】
上記好気性細菌のうち好ましくはコリネ型細菌であり、該コリネ型細菌として好ましくは、コリネバクテリウム属に属する微生物、ブレビバクテリウム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム  フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウムアンモニアゲネスＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する微生物が挙げられる。
【０００８】
上記微生物の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム  フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム  アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）  ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）  ＡＴＣＣ３１８３１、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９が挙げられる。
【０００９】
本発明の製造方法において用いられる上記微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。尚、上記遺伝子組み換え株の宿主としては、形質転換可能な微生物であれば、親株と同じ属種であっても良いし、属種の異なるものであっても良いが、上述のような好気性細菌を宿主とするのが好ましい。
【００１０】
このうち、本反応においては、乳酸脱水素酵素の欠如した変異株を用いるとより有効である。コリネ型細菌の乳酸脱水素酵素の欠如した変異株の具体的な製造方法としては、特開平１１−２０５３８５号公報に記載されている方法が挙げられ、これに準じて簡単に作成できる。
本反応に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。
【００１１】
これらの細菌を培養するために使用される培地の主炭素源としては、本微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましい。
【００１２】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。
上記炭素源の使用濃度は特に限定されないが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、３０％（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくは２５％（Ｗ／Ｖ）未満、より好ましくは２０％（Ｗ／Ｖ）以下とする。
【００１３】
一方で、原料糖質の濃度が低すぎると、工業生産時の釜効率の点で好ましくないため、通常、５％（Ｗ／Ｖ）以上、好ましくは１０．５％以上、より好ましくは１１％（Ｗ／Ｖ）以上で反応を行う。
また、反応の進行に伴う上記炭素源の減少にあわせ、上記炭素源の追加添加をするのも生産物の蓄積量の向上のためには好ましい。
【００１４】
窒素源としては、本微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。
無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。
【００１５】
また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。
また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
培養液のｐＨは、通常、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６．５〜８．５に調整し、反応中も必要に応じて培養液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
【００１６】
好気性細菌を用いて本反応を行う場合、菌体の生育に酸素が必要となる。本反応においては、培養液と菌体を接触させた後、まず菌体が対数増殖した後に定常期を迎える。従って、対数増殖期か定常期かで必要とする酸素量も変化するので、反応のスケールや羽形状の違いによる攪拌効率の違いを考慮した上で、通気量や攪拌量を調整する必要がある。
【００１７】
本発明の方法においては、菌体の生育が定常期に達した以降の反応温度を当該細菌の生育至適温度より高い温度、好ましくは２℃以上高い温度とする。ここで、温度をあげすぎると、かえって酵素活性を低下させる可能性があるため、通常、当該温度より１０℃高い温度までの範囲で適宜、選択される。
また、生育至適温度は、有機酸の生産に用いられる条件において最も生育速度が速い温度のことを言う。この生育至適温度は、培地の種類、通気量、攪拌速度などの有機酸の生産時の諸条件によって変化するので、各反応条件に応じて、予め、生育至適温度を確認しておく必要がある。
【００１８】
また、上記対数増殖期の温度を菌体の生育至適温度±２℃の温度とし、定常期に達した以降に該温度より温度を上昇させて反応を行うことが好ましい。
本反応に用いる微生物の生育至適温度は、通常、２５℃〜３５℃である。
本反応は、通常、培養液中のグルコース等の主原料が消費された時点で反応終了とする。このとき、反応液中には、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸等の有機酸が生成している。このうち、コハク酸がもっとも蓄積度が高く生産物としては好ましい。
【００１９】
このようにして培養液中に蓄積した有機酸は常法に従って、培養液より分離・精製される。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより有機酸を分離・精製することができる。
【００２０】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
実施例１
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＡＢ―４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）から特開平１１−２０６３８５に従い、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の欠如した株を調整した。すなわち、ＭＪ２３３ＡＢ―４１株より常法により抽出した全ＤＮＡを鋳型として当該特許に配列番号５及び６として記載された２つのプライマーを用いて、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片についてＰＣＲ反応を行った。得られた反応液３μｌとＰＣＲ産物用のクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）１μｌとを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔｓの各成分を添加し、４℃で１５時間反応させ、結合させた。得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地（トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解）に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを調整した。このプラスミドＤＮＡ２０μｌに、５０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａｌＩ  １ｕｎｉｔの各成分を添加し、３７℃で１時間反応させた。得られたＤＮＡ溶液からＧｅｎｅ  ＣｌｅａｎII（フナコシ社製）を用いて３００ｂｐ断片の回収を行い、該ＤＮＡ溶液１０μｌと、クロラムフェニコール耐性のクローニングベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造製）１μｌのＳｐｈＩ及びＳａｌＩ分解物と混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔｓの各成分を添加し、４℃で１５時間反応させ、結合させた。得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地（トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解）に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液より上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片である約３００ｂｐの断片が導入されたプラスミドＤＮＡを調整した。該プラスミドを電気パルス法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＡＢ―４１に導入し、クロラムフェニコール５ｍｇを含む培地（尿素：２ｇ、硫酸アンモニウム：７ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解）に塗布した。この培地上で生育してきた菌株の内、相同組み換えにより該遺伝子が破壊された株として、ＬＤＨ活性が１０分の１以下になった株を選抜した。
【００２１】
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍｌの培地を１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍｌ、無菌濾過した０．１％クロラムフェニコール水溶液を５ｍｌ添加し、前述のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。
【００２２】
尿素：８ｇ、硫酸アンモニウム：２８ｇ、リン酸１カリウム：１ｇ、リン酸２カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、酵母エキス２ｇ、カザミノ酸２ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍｌ及び蒸留水：１５０００ｍｌの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した４０％グルコース水溶液を５０ｍｌ添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、３０℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸ナトリウムで８．０に保ち、通気は毎分４００ｍＬ、攪拌は毎分３００回転で反応を行った。反応開始後１５時間後に菌体の生育が定常期に達したので、反応温度を３７℃に上昇させ反応を続けたところ、２５時間後にグルコースがほぼ消費されており、コハク酸が３３g/L蓄積していた。
【００２３】
実施例２
反応開始後１５時間後以降の温度を４０℃に変えた以外は実施例１と同様に行ったところ、２６時間後にグルコースがほぼ消費されており、コハク酸が３３g/L蓄積していた。
比較例１
反応温度を３０℃で一定に保った以外は実施例１と同様に行ったところ、３１時間後にグルコースがほぼ消費されており、コハク酸が３１g/L蓄積していた。
【００２４】
比較例２
反応温度を３７℃で一定に保った以外は実施例１と同様に行ったところ、４０時間後にグルコースがほぼ消費されており、コハク酸が２９g/L蓄積していた。
【００２５】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、細菌を用いた有機酸の製造において、高い反応速度及び収率で目的物を得ることができる。