(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
頚管粘液中のヒアルロン酸濃度および／またはヒアルロニーダーゼ活性を測定し、正常値と対比することを特徴とする切迫早産妊婦または頚管無力症妊婦の頚管粘液の鑑別法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、切迫早産妊婦または頚管無力症妊婦の頚管粘液の鑑別法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
妊娠に伴う異常として早産があり、その原因は、多岐にわたるが、主に上行感染、子宮内感染、絨毛羊膜炎や胎盤早期剥奪とされている。感染症や絨毛羊膜炎が原因の場合、母体血液中の血中C反応性蛋白（CRP）濃度や白血球数が増加するため、これらの測定により、早産の検査が実施されている。
【０００３】
しかしながら、CRP濃度や白血球数は血液由来であるため、早産以外の別の因子によっても上昇してしまい、早産にのみ特異的なものとは言い難い。また、CRPは血液中に微量にしか検出されず、測定の感度は低いという問題もある。従って、血液中のCRP濃度や白血球数の測定により、早産を早期に診断することは困難である。
【０００４】
これに対し、最近、血液中のインターロイキンー６（IL−６）の測定により流早産を診断する方法が報告されている（特開平５−２０９８８２号公報）。しかしながら、この方法においても、検体が母体血液であるため、感度や特異性などの点で充分満足できるものではない。
【０００５】
また、最近、頚管粘液中のサイトカインの測定により早産を診断する方法が報告されている（特開平７−３２５０８２号公報）。しかしながら、この方法においても、サイトカインの産生が他の疾患に起因することもあり、特異性などの点で充分満足できるものではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、早産の指標となる物質を検索し、その鑑別法を確立することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記実情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、次の様な知見を得た。すなわち、子宮頚部の熟化が局所における炎症反応に酷似していることが明らかにされつつあるが、基礎および臨床研究の両面から更に検討を重ねた結果、ヒアルロン酸およびヒアルロニーダーゼ活性が子宮頚部熟化に深く関与しているとの知見を得た。
【０００８】
本発明は、上記の知見を基に更に検討を重ねた結果、完成されたものであり、その要旨は、頚管粘液中のヒアルロン酸濃度および／またはヒアルロニーダーゼ活性を測定し、正常値と対比することを特徴とする切迫早産妊婦または頚管無力症妊婦の頚管粘液の鑑別法に存する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明においては、検体として頚管粘液を使用する。斯かる検体の採取方法は、膣や子宮頚管などにダメージを与えない方法であれば特に制限されない。膣などに綿棒を挿入し、当該綿棒に検体を吸収させて採取する方法が簡便であり好ましい。特に、ダクロン綿棒は、吸収効率に優れるため好適に使用される。綿棒により検体を採取する場合は、綿球などで膣内の不純物を取り除いた後、膣鏡で確認しながら綿棒を膣内に挿入して検体を採取するのが好ましい。
【００１０】
採取された検体は、そののまま測定に使用することも出来るが、頚管粘液の原液は、粘性が高く、また、ゾルであったりクロット化している場合が多いため、希釈または抽出した後に使用するのが好ましい。希釈または抽出処理には、ｐＨ６〜８（好ましくは７．２〜７．８）の緩衝液が好適に使用される。斯かる緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グット緩衝液などが挙げられる。
【００１１】
上記の希釈または抽出処理は次の様に行うのが好ましい。すなわち、例えば、綿棒により検体を採取する場合は、検体が吸収された綿棒を緩衝液に浸し、この綿棒で緩衝液を撹拌し、ゾル状またはクロット状の検体中のヒアルロン酸（ＨＡ）及びアルロニーダーゼを緩衝液中に抽出する。
【００１２】
ＨＡ濃度の測定方法としては、以下の公知の方法を採用することが出来る。例えば、ヒアルロン酸結合性蛋白を利用するバインディング・アッセイ法としては、サンドイッチ法、阻害法（競合法）等が知られている。そして、サンドイッチ法としては、ヒアルロン酸結合性蛋白と標識化ＨＡ結合性蛋白とにより検体中のＨＡを挟み込んでサンドイッチ状結合体を形成させ、当該結合体の標識物質を測定することによりＨＡ濃度を測定する方法（例えば特公平６−４１９５２号公報）、阻害法（競合法）としては、ヒアルロン酸結合性蛋白に対し、検体中のＨＡと標識化ＨＡとを競合させ、ヒアルロン酸結合性蛋白と結合した標識化ＨＡ又は結合しなかった標識化ＨＡの何れかを測定し、検体中のＨＡ濃度を測定する方法（例えば特開昭６３−１５０６６９号公報）を採用することが出来る。ヒアルロン酸結合性蛋白としては、ＨＡに特異的に結合する、ヒアルロン酸結合蛋白（ＨＡＢＰ）、ＣＤ４４、抗ヒアルロン酸抗体などが好適に使用される。特に、固相化ＨＡＢＰ又はＣＤ４４と標識化ＨＡＢＰを使用するサンドイッチ法が好ましい。
【００１３】
また、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による次の様な方法もＨＡを正確に測定できる点で好ましい。すなわち、ＨＡ分解酵素により検体中のＨＡを分解し、得られたヒアルロン酸オリゴ糖をＨＰＬＣにより分離分析する。この際、カラムとしては陰イオン交換カラム等が使用される。また、必要に応じ、ＨＰＬＣにおける感度を上げるため、蛍光標識化物質により標識化を行う。
【００１４】
上記の他、ＨＰＬＣの代わりに電気永動（キャピラリー電気永動、アセテート膜を使用した電気永動など）により分離分析を行う方法も好ましい。
【００１５】
一方、ヒアルロニーダーゼ活性の測定方法としては、（１）アルカリ条件下でＦｅ3+が糖の還元基により還元されたＦｅ2+を比色法により測定するPark-Johnson法、（２）ヒアルロニーダーゼでＨＡが分解されることにより生じる濁度の減少を吸光度で測定する濁度減少法の他、（３）放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質などで標識化したＨＡを基質として使用し、検体中のヒアルロニーダーゼによって分解された標識化ヒアルロン酸分解物を測定する方法などを採用することが出来る。特に、蛍光物質としてフルオレッセンアミンを使用した上記（３）の方法は、検体量が微量な場合にも感度に優れる点で好ましい。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００１７】
妊娠週齢数の異なる正常妊婦６０例、切迫早産と診断された妊婦１０例、頚管無力症と診断された妊婦７例の子宮頚管粘液を採取し、下記（２）の測定方法によってＨＡ濃度を測定した。また、上記と異なる次の妊婦、すなわち、正常妊婦５６例、切迫早産と診断された妊婦２２例の子宮頚管粘液を採取し、下記（３）の測定方法によってＨＡ濃度を測定した。更にまた、上記と異なる次の妊婦、すなわち、妊娠週齢数の異なる正常妊婦４５例、切迫早産と診断された妊婦７例、頚管無力症と診断された妊婦７例の子宮頚管粘液を採取し、下記（４）の測定方法によってヒアルロニーダーゼ活性を測定した。結果をまとめて下記（５）に記載する。
【００１８】
（１）検体の採取方法：
各妊婦の子宮頚管に綿棒を挿入して回転させながら子宮頚管粘液を綿棒に吸収させ、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に上記の綿棒を浸し、撹拌・震盪して綿棒に吸収された子宮頚管粘液を抽出し、各試料とした。なお、試料は必要に応じてＰＢＳで希釈して使用した。
【００１９】
（２）ＨＰＬＣによるＨＡ濃度の測定：
エッペンドルチューブに十分に撹拌した各試料１００μｌを採取し、５Ｕ／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業（株）製）２０μｌを添加し、軽く撹拌後、３７℃で２時間消化した。その後、５Ｕ／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＣII（生化学工業（株）製）２０μｌを添加し、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２０μｌを添加し、軽く撹拌後、３７℃で２時間消化した。この消化により、ＨＡは不飽和ニ糖（ΔＤｉ−ＨＡ）に分解される。消化終了後、分画分子量１万の遠心限外濾過チューブにより、消化液の全量を１２０００ｒｐｍの条件下で１５分間処理し、不飽和ニ糖を濾液側に回収した。そして、ＨＰＬＣで不飽和ニ糖を定量し、ＨＡの濃度を算出した。各試料は、綿棒に吸収された子宮頚管粘液を１ｍｌのＰＢＳで抽出して調製され、各試料の希釈倍率が一定でないため、各試料中のカルシウム濃度測定し、ヒト血清中のカルシウム濃度により各試料の希釈倍率を算出し、ＨＡの濃度補正を行った。なお、カルシウム濃度測定は、和光純薬社製「カルシウムＣ−テストワコー」を使用して行った。
【００２０】
（３）サンドイッチ法によるＨＡ濃度の測定：
市販のＨＡ測定キットを使用し、ＰＢＳで希釈した各試料についてサンドイッチ・プロテイン・バインディング法によりＨＡ濃度を測定した。上記のキットとしては、サンドイッチ法により高分子ＨＡを測定するキットとして市販されている中外製薬（株）製のヒアルロン酸「中外」（商品名）を使用した。
【００２１】
（４）ヒアルロニダーゼ活性の測定：
２本のエッペンドルチューブの各々に十分に撹拌した各試料２０μｌを採取した。一方の試料は１００℃で５分間処理して試料中のヒアルロニダーゼを失活させた。１００℃で処理した試料と未処理の各試料に１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）２０μｌとフルオレッセンアミンで標識したヒアルロン酸（ＦＡ−ＨＡ）（１００μｇ／ｍｌ）２０μｌとを添加し、３７℃で２４時間静置した。その後、０．４５μｍの遠心限外濾過チューブにより、各試料を１２０００ｒｐｍの条件下で１５分間処理した。そして、ＨＰＬＣでゲル濾過を行い、ＦＡ−ＨＡを蛍光検出器で検出し、各試料のＦＡ−ＨＡの保持時間の差（ΔTime）を算出した。ヒアルロニダーゼ活性が強いほどＦＡ−ＨＡが分解されてＨＡの分子量が小さくなるため、ΔTimeは大きくなる。
【００２２】
（５）結果：
＜切迫早産妊婦について＞
（ｉ）前記（２）の方法によるＨＡ濃度の測定結果は、正常妊婦（１２〜３６週）で２．４±１．２μｇ／ｍｌ、切迫早産妊婦（２１〜３０週）で３．９±３．７μｇ／ｍｌであった。また、前記（４）の方法によるヒアルロニダーゼ活性の測定結果は、正常妊婦で１．８±１．６ｍｉｎ．、切迫早産妊婦で２．６ｍｉｎ．であった。これらの結果から次のことが判る。すなわち、切迫早産と診断された妊婦の場合は、同時期（１２〜３６週）の正常妊婦の場合に比し、ＨＡ濃度およびヒアルロニダーゼ活性が高くなるため、子宮頚管粘液中のＨＡ濃度またはヒアルロニダーゼ活性の測定により、切迫早産妊婦の子宮頚管粘液を鑑別することが出来、切迫早産の診断が可能である。斯かる事実は、前記（３）の方法によるＨＡ濃度の測定結果（図１）からも明らかである。
【００２３】
＜頚管無力症妊婦について＞
（ii）頚管無力症妊婦の場合、前記（２）の方法によるＨＡ濃度の測定結果は１．８±０．６μｇ／ｍｌであり、前記（４）の方法によるヒアルロニダーゼ活性の測定結果は０．９±１．０ｍｉｎ．であった。これらの結果から次のことが判る。すなわち、頚管無力症と診断された妊婦の場合、同時期（１２〜３６週）の正常妊婦の場合に比し、ＨＡ濃度およびヒアルロニダーゼ活性が低くなるため、子宮頚管粘液中のＨＡ濃度またはヒアルロニダーゼ活性の測定により、頚管無力症妊婦の子宮頚管粘液を鑑別することが出来、頚管無力症の診断が可能である。
【００２４】
【発明の効果】
以上説明した本発明によれば、頚管粘液中のヒアルロン酸濃度および／またはヒアルロニーダーゼ活性を測定し、正常値と対比することにより、切迫早産妊婦または頚管無力症妊婦の頚管粘液の鑑別を行うことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】正常妊婦と切迫早産妊婦の頚管粘液中のヒアルロン酸濃度を比較したグラフ
【図１】
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