(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
5-ヒドロキシフラボンを有効成分として含有するアンドロゲン受容体作用阻害剤。
【請求項２】
請求項1記載のアンドロゲン受容体作用阻害剤を有効成分として含有する多毛症又は男性型脱毛症の予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンドロゲン受容体作用阻害剤に関する。本発明のアンドロゲン受容体作用阻害剤は、アンドロゲン依存性疾患、例えば、多毛症、ニキビ（尋常性ざ瘡）、男性型脱毛症等の予防および/または治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
アンドロゲン依存性疾患は、テストステロン等の男性ホルモン（5-αジヒドロテストステロン（5α-DHT））の過剰分泌が発症原因の一つとして知られている。したがって、男性ホルモンの過剰な作用を抑制することで、アンドロゲン依存性疾患を予防および/または治療できる。
【０００３】
5α-DHTの過剰な作用を抑制する方法の一つとして、テストステロンを活性型の5α-DHTに変換する酵素である５α-リダクターゼを阻害する物質の検討がなされてきた。その様な阻害剤としては、アンドロスタノン誘導体、ジクロヘプテノン誘導体、フェノキシブタン誘導体、トコフェリルキノン誘導体、トロポロン誘導体、ユビキノン等の他シソ科植物、キク科植物をはじめ多くの植物の抽出物が知られている。また、フラボン類に５α-リダクターゼ阻害作用があることも公知（特開平1-96126）である。
【０００４】
また、5α-DHTのアンドロゲン受容体への結合阻害剤としては、シプロテロン酢酸やスピロノラクトンが挙げられる。
【０００５】
しかしながら、上記の５α-リダクターゼ阻害剤やアンドロゲン受容体結合阻害剤の多くは、副作用が懸念されたり、製剤基剤中での安定性が悪かったり、作用が不充分であったりして、十分な抗アンドロゲン活性と安定性および安全性を充足するものは少なかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、高い抗アンドロゲン活性と安定性および安全性を有する、新規なアンドロゲン受容体作用阻害剤を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討した結果、5-ヒドロキシフラボンが高いアンドロゲン受容体作用阻害活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、5-ヒドロキシフラボンを有効成分として含有するアンドロゲン受容体作用阻害剤を提供する。また、本発明は、上記本発明のアンドロゲン受容体作用阻害剤を有効成分として含有する多毛症又は男性型脱毛症の予防及び／又は治療剤を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明のアンドロゲン受容体作用阻害剤は、5-ヒドロキシフラボン（別名プリムレチン）を有効成分として含有するものである。
【００１０】
5-ヒドロキシフラボン自体は周知であり、その製造方法も周知であり、市販もされている（例えば、Sigma社よりProduct No. H4280として市販）。本発明においては、このような市販品を用いることもできる。
【００１１】
本発明において、アンドロゲン受容体作用阻害とは、アンドロゲン受容体のリガンドである５α-ＤＨＴ、またはメチルトリエノロン（R1881）によるアンドロゲン受容体を介した転写を阻害するものを意味し、その阻害メカニズムはいかなるものであってもよい。阻害メカニズムとしては、例えば、阻害剤が5α-ＤＨＴやＲ1881よりも先にアンドロゲン受容体に結合する、阻害剤が5α-ＤＨＴやＲ1881に結合することでアンドロゲン受容体に5α-ＤＨＴやＲ1881が結合できなくなる等が考えられ、具体的には、競合的拮抗阻害薬、非競合的拮抗阻害薬といったアンタゴニストが考えられる。結果として、アンドロゲンの過剰なアンドロゲン受容体への作用が軽減されるようであれば良い。アンドロゲン受容体作用阻害剤は、アンドロゲン受容体のリガンドである5α-ＤＨＴやＲ1881のアンドロゲン受容体への作用を阻害することで、アンドロゲン依存性疾患の予防および/または治療剤になり得る。
【００１２】
本発明のアンドロゲン受容体作用阻害剤は、アンドロゲン依存性疾患の予防および/または治療剤として有用である。本発明のアンドロゲン受容体作用阻害剤により予防及び／又は治療が可能なアンドロゲン依存性疾患の例としては、多毛症、ニキビ（尋常性ざ瘡）、男性型脱毛症等を挙げることができるがこれらに限定されるものではなく、アンドロゲン受容体の作用の過剰発現により引き起こされるいずれの疾患も包含される。
【００１３】
本発明において、アンドロゲン受容体作用阻害剤は、経口または非経口に投与することができる。例えば、多毛症、ニキビ（尋常性ざ瘡）、男性型脱毛症等を予防および/または治療する場合には、非経口的に投与することが好ましい。製剤としては外用剤が好ましく、具体的な外用剤の製剤としては、エキス剤、硬膏剤、酒精剤、座剤、懸濁剤、チンキ剤、軟膏剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤等を挙げることが出来る。また、経口的に投与する製剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、内服液剤等の剤形を挙げる事が出来る。これらの製剤は、患者の年齢、症状等に応じて適当量を患部等に塗布または、噴霧すれば良い。また、シャンプー、リンス、コンデショナー、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアリキッド等の化粧料組成物に本発明のアンドロゲン受容体作用阻害剤を配合しても良い。
【００１４】
製剤化は、公知の製剤技術により行うことができ、製剤中には適当な製剤添加物を加えることが出来る。製剤添加物としては、賦形剤、懸濁化剤、乳化剤、保存剤および香料等を挙げることができる。以下に好ましい製剤例の組成及び調製方法を示す。
【００１５】
製剤例１  化粧水
0004173667.tif 000002
（調製方法）
（Ａ）の各成分を合わせ、室温下に溶解する。一方、（Ｂ）の各成分も室温下に溶解し、これを（Ａ）処方分に加えて溶解する。
【００１６】
製剤例２  塗布剤
0004173667.tif 000003
（調製方法）
（Ａ）の各成分を合わせ、加熱混合し７０℃とする。（Ｂ）の各成分を合わせ、７０℃にて加熱混合し、これに（Ａ）処方分を加え混合し、混合しながら冷却する。
【００１７】
製剤中における各成分の配合量は、適宜、使用目的、性別、症状等を考慮して検討すれば良いが、通常は１日1〜1000 mgを一回または、数回に分けて投与するのが好ましい。
【００１８】
以下に実施例等を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるべきものではない。
【００１９】
【実施例】
実施例1    アンドロゲン受容体作用阻害
（１）  ヒトアンドロゲン受容体作用安定発現株の取得
CV-1細胞にレポーター遺伝子発現ユニットを２個含有するレポータープラスミドpGL2-(GRE3-bG-luc)x2-Hyg(rev)(図１)とhAR発現プラスミドpCI-neo-BamX-AR（Gly23）(図２)を導入して、ヒトアンドロゲン受容体作用評価系に使用する安定発現株を作製した。
【００２０】
まず、pGL2-(GRE3-bG-luc)x2-Hyg(rev)とpCI-neo-BamX-AR（Gly23）を、細胞導入用に、Qiagen  Plasmid  Maxi  Kit(Qiagen社、 Cat. No. 1263)を用いて調製した。CV-1細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；日水製薬）に牛胎児血清（Intergen 社、カタログNo. 1020-90）を終濃度10%になるように添加し、さらに終濃度50  U/mlのペニシリンGと50 μg/mlの硫酸ストレプトマイシンを加えた培地（以下増殖用培地と称す）を用いて37℃にて5% CO2存在下で培養し、1.5ｘ106の細胞を直径約10 cmのシャーレに播種した。2日後、この細胞にリポフェクション法でpGL2-(GRE3-bG-luc)x2-Hyg(rev)とpCI-neo-BamX-AR（Gly23）を導入した。リポフェクション法の条件は、リポフェクトアミン（GIBCOBRL社、Cat.No. 26300-61）に添付されたマニュアルに従って、3 μg/シャーレのpGL2-(GRE3-bG-luc)x2-Hyg(rev)と3 μg/シャーレのpCI-neo-BamX-AR（Gly23）を添加し、16時間処理した後、増殖用培地に戻した。プラスミドを導入して2日後に、トリプシン処理により細胞をシャーレから剥がして回収し、増殖用培地の入ったシャーレに移した。プラスミドを導入して5日後に、終濃度500μg/mlのG418(CalBiochem社、Cat.No.345810)と終濃度400μg/mlハイグロマイシンB（和光純薬Cat.No.085-06153）が添加された増殖用培地の入ったシャーレに移し、培地を3から4日毎に新しい培地（終濃度500μg/mlのG418と終濃度400μg/mlハイグロマイシンBが添加された増殖用培地）に交換しながら約1ヶ月間培養した。細胞が1〜数mmのコロニーを形成した時点で、終濃度500μg/mlのG418と終濃度400μg/mlハイグロマイシンBが添加された増殖用培地の入った24ウエルプレートにコロニーを移し、更に培養した。細胞がほぼウエルの全面を占めるまで増殖したら、トリプシン処理により、細胞を剥がして、測定用に4/5の細胞を新しい24ウエルプレートの2ウエルに均等に移し、残り1/5の細胞を別の新しい24ウエルプレートに移し、マスタープレートとして培養を継続した。測定用の細胞は細胞がウエルの全面を占めるまで培養し、2ウエルのうち一方にはDMSOに溶解させた5α-ジヒドロテストステロン（5α-DHT; 和光純薬、Cat.No.045-26701）を終濃度が100 nM（DMSOの終濃度は0.1%）になるように添加したフェノールレッドフリーDMEM（GIBCOBRL社、Cat.No.11054-620）-10%活性炭・デキストラン処理牛胎児血清（HyClone社、Cat.No.SH30068.03)培地（以下測定用培地と称す）に、もう一方には終濃度が0.1％になるようDMSOを添加した測定用培地に置換し、37℃で24時間培養、細胞をPBSで洗浄した後、Reporter   Lysis  Buffer（Promega社、Cat.No.E3971）をウエル当たり100 μlずつ加えて室温で30分震盪した。細胞溶解液25μlを96ウエルプレート移し、100μlの基質液（Promega社、Cat.No.E1483）を自動分注し、ルミノメーターCT-9000D (Dia-iatron社）で、ルシフェラーゼ活性を測定した。薬剤耐性株125クローンの活性を測定し、5α-DHT添加系の方が、DHT非添加系よりも2倍以上高いルシフェラーゼ活性を示す細胞を選択した。
【００２１】
選択した細胞は、さらに、稀釈限界法によりリクローニングを行い、5α-DHT添加により高い誘導倍率を示し、かつ高いルシフェラーゼ活性を示す細胞をAR1047-3と名づけた。AR1047-3は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８０６３として、茨城県つくば市東１丁目１番３号の経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に平成１２年９月２９日より寄託されている。
【００２２】
（２）  アンドロゲン受容体作用阻害は、上記（１）で得られたヒトアンドロゲン受容体作用安定発現株AR1047-3を用いたレポータージーンアッセイ法によってフラボン類の抗アンドロゲン受容体作用を調べた。
【００２３】
即ち、AR1047-3をダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；日水製薬）に牛胎児血清（Intergen 社、カタログNo. 1020-90）を終濃度10%になるように添加し、さらに終濃度50  U/mlのペニシリンG、50 μg/mlの硫酸ストレプトマイシン、500μg/mlのG418(CalBiochem社、Cat.No.345810)、400μg/mlハイグロマイシンB（和光純薬、Cat.No.085-06153）を加えた培地を用いて37℃にて5% CO2存在下で培養後、約1.0 x 105細胞/ウエルずつ24ウエルプレートに播種した。翌日、ARのアゴニストR1881（NEN社、Cat.No.NLP-005：終濃度100 pM）に各サンプル（DMSOの終濃度は0.1%）を添加したフェノールレッドフリーDMEM（GIBCOBRL社、Cat.No.11054-620）-10%活性炭・デキストラン処理牛胎児血清（HyClone社、Cat.No.SH30068.03)培地（以下測定用培地と称す）に置換し、コントロールとしては、終濃度が0.1％になるようDMSOを添加した測定用培地に置換し、37℃で24時間培養、細胞をPBSで洗浄した後、Repoter  Lysis Buffer（Promega社、Cat.No.E3971）をウエル当たり100 μlずつ加えて室温で30分震盪した。細胞溶解液25μlを96ウエルプレートに移し、100μlの基質液（Promega社、Cat.No.E1483）を自動分注し、ルミノメーターCT-9000D(Dia-iatron社）で、ルシフェラーゼ活性を測定した。阻害活性の結果を表1に示した。尚、阻害活性は、以下の計算により求めた。
【００２４】
阻害活性（％）＝（1−（A−B）/（C−B））ｘ100
：A=100ｐM R1881と化合物添加時の活性、B=DMSOのみ添加時の活性）、C=100ｐM R1881添加時の活性
【００２５】
【表１】
表1
0004173667.tif 000004
＊
(1)  フラボン
(2)  プリムレチン(5-ヒドロキシフラボン）
(3)  フラボノール（3-ヒドロキシフラボン）
(4)  クリシン（5,7-ジヒドロキシフラボン）
(5)  アピゲニン（4',5,7-トリヒドロキシフラボン）
(6)  ケンフェロール（3,4',5,7-テトラヒドロキシフラボン）
(7)  7,8-ジヒドロキシフラボン
(8)  7,8-ジメトキシフラボン
【００２６】
表1に示した様に、5-ヒドロキシフラボン（化合物（2））は、アンドロゲン受容体作用阻害活性が報告されている、シプロテロン酢酸やスピロノラクトンを大きく上回る阻害活性を示した。
【００２７】
【発明の効果】
本発明のアンドロゲン受容体作用阻害剤の有効成分である5-ヒドロキシフラボンは非常に高いアンドロゲン受容体作用阻害活性を示す。また、5-ヒドロキシフラボンを包含するフラボノイド類は、食用に供される植物の組織中にも広範囲に含まれており、本発明のアンドロゲン受容体作用阻害剤は安全性が高い。このため、本発明のアンドロゲン受容体作用阻害剤は安全性が高く、多毛症、ニキビ（尋常性ざ瘡）、男性型脱毛症等のアンドロゲン依存性疾患の予防および/または治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において、アンドロゲン受容体作用阻害活性の評価に用いたアンドロゲン受容体作用安定発現株の作出に用いた、レポーター遺伝子発現ユニットを2個とハイグロマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドpGL2-(GRE3-bG-luc)x2-hyg(rev)のマップを示す。GRE3はアンドロゲン応答性領域GREが3個連結していることを表し、また、bGは、ラビットβグロビンプロモーター、lucはルシフェラーゼ遺伝子、Ampはアンピシリン耐性遺伝子、Hygrはハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。
【図２】本発明の実施例において、アンドロゲン受容体作用阻害活性の評価に用いたアンドロゲン受容体作用安定発現株の作出に用いた、ポリGly数が23からなるhAR発現プラスミドpCI-neo-BamX-AR(Gly23)のマップを示す。CMV I.E. Enhancer/Promoterは、サイトメガロウイルス極初期エンハンサー(Cytomegarovirus immediate-early enhancer)とプロモーター、AR(Gly23)はGly数が23からなるヒトアンドロゲン遺伝子、Neoはネオマイシン耐性遺伝子、Ampはアンピシリン耐性遺伝子を示す。
【図１】
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【図２】
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