(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：Ｈ-ｉＤ-Glu-Ｄ-Trp-ＯＨから成るペプチド。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は医薬に関するものであり、特に医薬、獣医薬および生化学実験で利用可能な免疫調節特性を有する生物活性物質の製造方法に関するものである。
従来技術
免疫不全に起因して進行する病気、例えば悪性新生物、セプシス、慢性および潜在性の感染症の発生、増加を止める毒性の無い新規な免疫調節特性を有するペプチドの開発の重要性は当該分野の多くの研究によって証明されている。
新規なペプチドを単離する最も一般的な方法は、組織抽出物から活性ペプチド画分を単離し、分別し、精製し、各物質を単離・同定する工程から成る（SU N1600047,SU N1638849,SU N1737798）。
実際には、胸腺抽出物、例えばサイモシン画分（thymosine fraction）５｛ゴールドスタイン（Goldstein）A.L.，ギュナ（Guna）A.，ラッツ（Latz）M. M.，ハーディ（H.A）.，ホワイト（White）A.｝Thyamalin（CH.N 659586）が免疫調節剤として広く用いられている。この抽出物はポリペプチド種で構成されるが、その製造法は複雑で、活性物質の収量が少なく、物理化学的および生物学的特性が一定しないため、天然資源からの収量は限られる。また、天然の胸腺調製物に存在するバラスト（ballast）成分は副作用を起こすことがあるため、合成ペプチドに対する必要性が起っている。現在では免疫調節特性を有するペプチドがいくつか合成されている：PCT WO 089/06134，SU N1541821，SU N1518956，EP N230052，EP N406931，米国特許第5021551号，米国特許第5013723号。これらの各合成ペプチドは必要な特性の組合せに絞ったもので、高活性で、毒性が低く、副作用が無いため、医薬での利用に適している。
発明の開示
本発明の目的は免疫調節特性を備えた生物活性を有する下記配列を有する新規なペプチドを合成することにある：
X-A-D-Trp-Y
［ここで、
AはD-Glu，iD-Gluであり、
XはHまたはGly，Ala，Leu，Ile，Val，NVal，Pro，Tyr，Phe，Trp，D-Ala，D-Leu，D-Ile，D-Val，D-NVal，D-Pro，D-Tyr，D-Phe，D-Trp，γ-アミノ酪酸，ζ-アミノカプロン酸であり、
YはGly，Ala，Leu，Ile，Val，NVal，Pro，Tyr，Phe，Trp，D-Ala，D-Leu，D-Ile，D-Val，D-NVal，D-Pro，D-Tyr，D-Phe，D-Trp，γ-アミノ酪酸，ζ-アミノカプロン酸，-OH，または置換アミド（C1-C3）］である」
本発明の他の対象は医薬の製造で重要な上記構造を有するペプチドを高い収量および最少の段階で容易に製造するための全く新しいペプチドの合成方法を提供することにある。
本発明の新規なグルタミル含有ペプチドの製造方法は、対応するD-Trp-Y誘導体を用いてtert-ブチルオキシカルボニルグルタミン（DまたはL）の内部無水物を開き、次いで、クロマトグラフィーでα-およびγ-異性体を分離する。さらに、tert-ブチルオキシカルボニルアミノ酸の活性エーテルを用いてペプチド鎖を成形してさらに合成を行った。
表１は新規な類似ペプチドのR f1値（クロロホルム-メタノール-32％酢酸＝60:45:20）およびR f2値（ブタノール-ピリジン-水-酢酸＝5:5:4:1）を表す。
0004082522.tif 000002
0004082522.tif 000003
0004082522.tif 000004
本発明の好ましい実施例
以下、本発明の実施例を説明する。
実施例H-D-Glu-D-Trp-OHと、H-iD-Glu-D-Trp-OH
1.  Boc-D-Glu-OHの合成
14.7g（0.1mol）のH-D-Glu-OHを200mlの蒸留水に溶解した。1MのKOHを用いてpHを10.2に調節し、33.0g（0.3M）のBOC2ジオキサン溶液を強く混合しながら添加した。pHはpH-スタットを用いて監視した。反応完了時に混合物を分液漏斗に移し、3×150mlのエチルアセテートを用いてアルカリ媒体から抽出し、0.2％硫酸溶液を水相に徐々に添加してpHを3.0に調節した。Boc-D-Glu-OHを有機相（3×200ml）に抽出した。有機層を3×200mlのNa2SO4飽和溶液を用いて洗浄してpHを中性にし、Na2SO4を用いて乾燥し、真空下でオイルに蒸発した。収量＝16.7g（68％）。
2.  Boc-D-Glu-Trp-OHとBoc-iD-Glu-D-Trp-OHとの混合物の合成
16.7g（0.068M）のBoc-D-Glu-OHを200mlのジメチルホルムアミドに溶解し、0℃に冷却した。この溶液を混合しながら、20.6g（0.1M）のN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドを溶解した100mlのジメチルホルムアミド溶液を添加する。混合物を+4℃で4時間攪拌し、次いで8時間室温に放置した。析出したジシクロヘキシルカルバミドを濾過分離し、2×50mlのジメチルホルムアミドを用いて洗浄した。濾液を真空下、蒸発して1/2の濃度に濃縮した。この溶液に、24.3g（0.1M）のH-D-Trp-OHを+4℃に冷却しながら激しく攪拌しながら添加する。溶液を室温まで加熱した。反応終了はBoc-D-Glu酸の内部無水物のスポットが消失することをクロロホルム:エチルアセテート:メタノール=6:3:1系でTLCで管理した。ジヘキシルカルバミドの残留物は濾過分離した。ジメチルホルムアミドは真空蒸発した。オイル状の残留物に200mlの酢酸エチルと、200mlの0.2％硫酸を添加した。有機層を分離し、Na2SO4飽和溶液で洗浄してpHを中性にし、Na2SO4を用いて乾燥した。酢酸エチル溶液を真空蒸発した。生成したオイル状の析出物はBoc-D-Glu-Trp-OHとBoc-iD-Glu-D-Trp-OHとの混合物であった。全収量＝25.4g（70％）。
3.  H-D-Glu-D-Trp-OHと、H-iD-Glu-D-Trp-Ohの合成
25.4gの上記混合物（0.048M）を200mlのギ酸に溶解し、得られた溶液を40℃で1時間攪拌し、溶媒を真空蒸発して濃化油にした。ペプチドを0.01-0.2M濃度勾配を付けたピリジン  アセテート緩衝液のセファデックスカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーで分離・精製した。
収量＝5.7g（35％）のH-D-Glu-D-Trp-OHおよび5.7g（35％）のH-iD-Glu-D-Trp-OH。
ペプチドの物理化学特性は下記の通り:
一次構造：        -H-D-Glu-D-Trp-OHおよびH-iD-Glu-D-Trp-OH
実験式：          -C16-H20N3O5
分子量：          334.35
外観：            黄色がかった白色粉末または灰色粉末。
溶解性            水に容易に溶解し、アルコールに溶解するが、クロロホルムには全く溶解しない。
UV                250〜300nmの範囲のスペクトルは最大280±2mm、肩は287±2mm
この新規なペプチドの生物活性をBalb/cマウスを用いて調べた。マウスの脾細胞を2mlのグルタミンおよび5％の不活化胎児血清を用いてRPMI1640媒体中に懸濁した。次いで、平底プレートに分配した:ウエル当たり100mcl（200,000セル）。研究対象の調製物は培養の開始時に添加した。concanavallin Aをミトゲンとしてウエル当たり2mcgの最終濃度で使用した。プレートを37℃、5％CO2中で48時間培養した。培養終了の24時間前に5mcg/mlの量で添加した3H-チミジンを混和して細胞の増殖を評価した。シンチレーション計数計を用いて、１分当たりの計数（CPM）で表記した。結果は表２に示す。
0004082522.tif 000005
この新規なペプチドは脾細胞の増殖を抑止することが分かった。
ペプチドの安全性を試験するために急性毒性試験を実施した。毒性試験は薬物学委員会RFの勧告「新規な医薬物質の一般毒性の臨床前研究に対する要求事項」M.,1985年に従って実施した。
実験の結果、1/1000量を体内注入してもペプチドは全く急性毒性が無く、LD50は検出されないことが分かった。
商業的使用
生物活性を有する上記ペプチドは医薬および獣医薬で広く使用できる。