(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
底面と側壁とを有し、該底面に0.01〜0.2mlの容積を有する凹部が設けられてなる精子選択採取用シャーレ。
【請求項２】
前記凹部は、シャーレの底面中央部に設けられ、底面の直径が2〜10mmであり、深さが2〜10mmである円柱形状を有する請求項１記載の精子選択採取用シャーレ。
【請求項３】
前記シャーレは、直径30〜120mmの円形底面と高さ3〜10mmの側壁とを有する、請求項１または２記載の精子選択採取用シャーレ。
【請求項４】
前記シャーレの底面には、前記凹部の縁からの距離を示す目盛りが付けられてなる、請求項１〜３のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ。
【請求項５】
底面と側壁とを有し、該底面が段階的に深くなる形状を有し、その最深部が0.01〜0.2mlである容積を有する凹部である、請求項１記載の精子選択採取用シャーレ。
【請求項６】
底面と側壁とを有し、該底面に第一凹部が設けられ、該第一凹部の底面に0.01〜0.2mlの容積を有する第二凹部が設けられてなる、請求項５記載の精子選択採取用シャーレ。
【請求項７】
前記第一凹部は、シャーレの底面中央部に設けられ、底面の直径が20〜80mmであり、深さが2〜5mmであり、前記第二凹部は、該第一凹部の底面中央部に設けられ、底面の直径が2〜10mmであり、深さが2〜10mmである円柱形状を有する、請求項６記載の精子選択採取用シャーレ。
【請求項８】
前記シャーレは、直径30〜120mmの円形底面と高さ3〜10mmの側壁とからなる、請求項６または７記載の精子選択採取用シャーレ。
【請求項９】
前記第一凹部の底面には、前記第二凹部の縁からの距離を示す目盛りが付けられてなる、請求項６〜８のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、精子懸濁液から運動精子を、顕微鏡下にて選択的に採取するために用いられる精子選択採取用シャーレに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生殖補助技術（ＡＲＴ）の中でも、重度の精液所見不良例などを対象とする顕微授精（ＩＣＳＩ）は、精子が雌性生殖路を遡上し、卵と受精、融合するまでの全ての過程を体外で行う方法である。この体外受精によれば、射精精液中に精子が極端に少ない症例や、精液中の精子が自力で卵子に侵入する能力（受精能）に欠けた症例であっても、理論的には１個の精子と１個の卵が存在すれば受精が可能となる。ここで用いる精子は、射精精子、精巣上体精子または精巣精子のいずれであってもよい。
【０００３】
従来、ＡＲＴにおいては、精液より取り出された形態的に正常な運動精子を受精に用いることが重要とされている。該運動精子は、密度勾配体を用いる密度勾配遠心分離法により精液を濃縮し精漿を除去した後、精子を含有する密度勾配体（以下、精子懸濁液と呼ぶ）を1〜5mlの培養液中に静置し、自身の運動性により培養液中を上昇（swim up）した精子を回収する方法（swim up法）によって得られる。しかし、ＩＣＳＩの対象となる精液所見不良例は、精液中の精子数が少ない場合や、精子の運動率が低い場合が多く、このようなswim up法では十分な運動精子を回収することができない。
【０００４】
そこで、ＩＣＳＩにおける運動精子の回収には、1〜10mlの精液を密度勾配遠心分離法により10〜50μlに濃縮した精子懸濁液と、50〜100μlの培養液が予め導入されているシャーレとを用い、該培養液中に精子懸濁液を注入した後静置して、該懸濁液中でswim upした運動精子を回収する方法が用いられる。この方法においては、使用する精子懸濁液および培養液が少量であるため、運動精子の回収は顕微鏡下で行うことができる。
しかし、前記ＩＣＳＩにおける運動精子回収方法において用いられるシャーレは、底面が平滑であるため、シャーレ底面に導入した培養液に精子懸濁液を注入すると、自然拡散により該懸濁液が培養液全体に広がるため、運動精子と非運動精子を分離する操作は非常に困難である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記事情に鑑み、本発明は自然拡散による影響を抑え、運動精子のみを効率よく選択採取することが可能なシャーレを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々鋭意検討した結果、従来のシャーレの底面に、ＩＣＳＩに用いるために濃縮された精子懸濁液を収容しうる内容積を有する凹部を形成したことにより、該懸濁液の自然拡散による影響を受けることなく運動精子のみの採取を可能とするシャーレを提供できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、底面と側壁とを有し、該底面に0.01〜0.2mlの容積を有する凹部が設けられてなる精子選択採取用シャーレである。
また、本発明は、底面と側壁とを有し、該底面が段階的に深くなる形状を有し、その最深部が0.01〜0.2mlである容積を有する凹部である精子選択採取用シャーレである。
【０００８】
【作用】
本発明のシャーレは、底面に設けられた凹部に精子懸濁液を注入するため、該懸濁液が培養液中に自然拡散することを抑制し、かつ、自身の運動性により凹部から進出した運動精子のみを選択採取することが容易に行える。また、凹部から進出した運動精子はシャーレの凹部以外の底面上に存在するため、顕微鏡下での識別が容易で、効率よく運動精子を採取することができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明のシャーレを添付図面に示す好適な実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの説明に限定されるものではない。
図１は本発明のシャーレの一実施例を示す側面図および断面図であり、図２は本発明のシャーレの他の実施例を示す側面図および断面図である。
【００１０】
本発明の一実施形態を図１を用いて説明する。図１に示すシャーレ１は、底面２と側壁３とからなり、好ましくは円形の底面２を有し、底面２の直径に対してはるかに小さい高さを有する側壁３とからなる有底筒体である。該シャーレ１は、予め精子の生存性を維持するための培養液を収容し、そこに濃縮された精子含有液（後述する精子懸濁液）を注入して、ＩＣＳＩに用いられる運動精子の選択採取を行うものである。したがって、該シャーレ１は前記培養液および精子懸濁液の収納を可能とする内容積を有するものであり、その好ましい寸法は、底面２の直径が30〜120mmであり、側壁３の高さが3〜10mmである。該側壁３の高さが低いほど、内容積が小さくなるが、精子懸濁液の注入および運動精子の採取の動作が行いやすくなる。
前記シャーレ１は、電子線滅菌が可能で、ポリスチレンやポリエチレン、ポリアミドなどの透明性の高い材料で形成されたものであることが好ましい。
【００１１】
前記シャーレ１の底面２には、凹部４が設けられてなる。該凹部４は、ＩＣＳＩ用の運動精子の選択採取に際し、密度勾配体を用いる密度勾配遠心分離法などにより濃縮された、精子を含有する密度勾配体（精子懸濁液と呼ぶ）を収容しうる内容積を有するものである。具体的には、該凹部４の内容積は0.01〜0.2mlであり、好ましくは40〜80μlである。該凹部４の形状は特に限定されないが、好ましくは直径2〜10mm、深さ2〜10mmの有底筒体である。
該凹部４は、シャーレ１の底面２に厚みをもたせて該底面２に埋没するように設けられてもよいし、図１に示すように底面２から下方へ突出するように設けられてもよい。後者の場合、シャーレ１の側壁３は、凹部４の底面よりも下方へ突出する脚部５を形成するものであれば、シャーレ１の戴置が安定して行えてより好ましい。
前記凹部４は、シャーレ１の底面２のどの位置に設けられてもよいが、シャーレ１の成形上および精子濃縮液の注入操作上、底面２のほぼ中央部に設けられることが好ましい。
【００１２】
本発明の他の実施形態を図２を用いて説明する。本発明のシャーレは、底面が段階的に深くなる形状を有するものであってもよく、好ましくは図２に示すような２段階で深くなる底面を有するシャーレ１１である。該シャーレ１１は、底面１２と側壁１３とからなり、好ましくは円形の底面１２を有し、底面１２の直径に対してはるかに小さい高さを有する側壁１３とからなる有底筒体である。該シャーレ１の寸法や材料は図１に示すシャーレ１と同じものが適用される。
該シャーレ１１の底面２には、第一凹部１４１が設けられ、該第一凹部１４１の底面１４２には第二凹部１４３が設けられてなる。該第二凹部１４３は図１に示すシャーレ１における凹部４と同じ役割を果たすものであり、好ましい寸法および形状も同様に規定される。
前記シャーレ１１の底面１２に設けられる第一凹部１４１は、より運動性の高い精子を選択するためのものである。該第一凹部１４１の容積はシャーレ１１の容積よりも小さく、具体的には、底面１４２の直径が20〜80mmであり、深さが2〜5mmである。該第一凹部１４１は有底筒状、すなわち側壁１４４が底面１４２に対して垂直である必要はなく、むしろ側壁１４４が底面１４２に対して角度を有するすり鉢状であることが、精子の選択採取操作上好ましい。
【００１３】
また、前記第一凹部１４１および第二凹部１４３は、シャーレ１１の底面１２に厚みを持たせて該底面１２に埋没するように設けられてもよいし、図２に示すように底面１２から下方へ突出するように設けられてもよい。後者の場合、シャーレ１１の側壁１３は、底面１２よりも下方へ突出する脚部１５を形成するものであればより好ましい。
前記第一凹部１４１および第二凹部１４３は、シャーレ１１の底面１２のどの一に設けられてもよいが、シャーレ１と同様、底面１２のほぼ中央部に設けられることが好ましく、底面１２，第一凹部１４１および第二凹部１４３のそれぞれの底面が全て同心円であることがより好ましい。
【００１４】
次に、本発明のシャーレの使用方法を、図１に示すシャーレ１１を用いて説明する。
まず、シャーレ１の凹部４周辺にＨＴＦ（Human Tubal Fluid Medium）やHuecm（ニプロ社製、登録商標）などの培養液を約50〜100μl導入し、さらに該培養液の蒸発を防止するために、該培養液表面をミネラルオイルなどで被覆する。次いで、密度勾配遠心分離法などの公知の方法により濃縮された精子懸濁液10〜50μmを、注射針、ガラスキャピラールなど先の細い管状の器具を用いて該凹部４内に注入し、静置する。
凹部４内に注入された精子懸濁液は、従来のシャーレを用いた場合と比較して、培養液との接触面積がはるかに小さいため、自然拡散により培養液中に移動する精子の割合も格段に低くなる。一方、精子濃縮液中の運動精子は、自身の運動性により凹部４内の濃縮液中より底面２上の培養液中へと進出し、さらに底面２上を側壁１３へ向かって移動する。
30〜60分静置後、倒立顕微鏡または実体顕微鏡などを用い、底面２上に移動した運動精子のみを採取針などで採取する。このとき、滅菌された器具により培養液を部分的に遮断すると、培養液表面のミネラルオイルが遮断された部分に侵入して培養液を分割する。したがって、この操作により目的の運動精子の存在する培養液を部分的に分割して、より確実に該運動精子のみを採取することがかのうである。また、底面２上に凹部４の縁からの距離を示す目盛りが付けられていれば、精子の運動性の高低を明らかに認識でき、より好ましい。
【００１５】
図２に示すようにすり鉢状の第一凹部１４１が形成されたシャーレ１１を用いれば、第二凹部１４３に注入された精子懸濁液から培養液表面までの深さがより深くなるため、より運動性の高い運動精子のみが培養液表面へ移動することになる。したがって、より運動性の高い運動精子のみを採取することが可能となる。
【００１６】
【発明の効果】
本発明のシャーレは、底面に設けられた凹部に精子懸濁液を注入することにより、該懸濁液中に含まれる精子の培養液への自然拡散を抑制することができるため、運動精子のみを確実に採取することが可能となる。また、２段階で深くなるの凹部を設けることにより、本発明のシャーレはより運動性の高い精子のみを選択採取することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の本発明のシャーレの一実施例を示す側面図および断面図である。
【図２】  本発明の本発明のシャーレの他の実施例を示す側面図および断面図である。
【符号の説明】
１、１１  シャーレ
２，１２  底面
３、１３  側壁
４  凹部
１４１  第一凹部
１４３  第二凹部
【図１】
0004129722.tif 000002
【図２】
0004129722.tif 000003