(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロールに、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属由来であり、ピロール−２−カルボン酸の脱炭酸を触媒し、かつ炭酸イオンの存在下にピロールからピロール−２−カルボン酸の合成を触媒する能力を有する微生物または該処理物を作用させ、生成するピロール−２−カルボン酸を採取することを特徴とするピロール−２−カルボン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の作用によりピロールからピロール−２−カルボン酸を製造する方法に関する。ピロール−２−カルボン酸およびその誘導体は種々の医薬品等の原料として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
生体における酵素的脱炭酸反応は、アミノ酸やα−ケト酸に関して詳細に研究され、酵素的性質が明らかにされている。しかし、芳香族カルボン酸の非酸化的脱炭酸酵素については不明な点が多い状況にある。
【０００３】
微生物による芳香族カルボン酸の非酸化的脱炭酸反応としては、ヒドロキシ安息香酸をフェノールへと変換する反応が知られている（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．，２０，１０３，１９９０）。また、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌が没食子酸を脱炭酸し、ピロガロールを生成蓄積することが知られている（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，２５３９，１９８２）。
【０００４】
芳香族化合物への炭酸固定を触媒する微生物については、これまで、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌がフェノールの分解の第一段階として４−ヒドロキシ安息香酸へ変換することが知られている（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４８，２１３，１９８７）。また、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属由来の酵素については、詳細に性質が調べられており、４−ヒドロキシ安息香酸や３，４−ジヒドロキシ安息香酸の脱炭酸反応および逆反応による炭酸固定を触媒することが明らかにされている（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０，４１８２，１９９４）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
芳香族化合物への炭酸固定によるカルボン酸合成は、工業的利用価値が多大であるが、上記微生物および酵素による炭酸固定の活性は極めて弱く、実用的なものとはなり難い。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、芳香族化合物への炭酸固定を触媒する酵素に関して検討を行った結果、先に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のピロール−２−カルボン酸脱炭酸酵素が、効率よくピロールへの炭酸固定を行い、ピロール−２−カルボン酸を合成することを見いだした（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５３，４８０，１９９８）。
【０００７】
しかしながら、該酵素は、反応系に酢酸アンモニウム等の有機酸の共存が必要であり、生成物の単離等を考慮する場合には、不都合がある。
【０００８】
さらに、本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、Ｓｅｒｒａｔｉａ属に属する細菌由来のピロール−２−カルボン酸を脱炭酸する微生物が、有機酸アンモニウムの共存なしに、安定に反応を行うことを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明はピロールに、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属由来であり、ピロール−２−カルボン酸の脱炭酸を触媒し、かつ炭酸イオンの存在下にピロールからピロール−２−カルボン酸の合成を触媒する能力を有する微生物または該処理物を作用させ、生成するピロール−２−カルボン酸を採取することを特徴とするピロール−２−カルボン酸の製造法、である。
【００１０】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明における微生物は、Ｓｅｒｒａｔｉａ属由来であり、ピロール−２−カルボン酸の脱炭酸を触媒し、かつ炭酸イオンの存在下にピロールをピロール−２−カルボン酸に変換する活性を有するものである。具体的には、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ  ＩＦＯ１３５３７、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ＩＡＭ１２１４２、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｒｕｂｉｄａｅａ  ＩＦＯ１２９７３等の菌株を挙げることができる。
【００１２】
これらの微生物は公知であり、ＩＦＯ１３５３７およびＩＦＯ１２９７３菌株は財団法人発酵研究所から、ＩＡＭ１２１４２菌株は東京大学  分子細胞生物学研究所からそれぞれ容易に入手することができる。
【００１３】
本発明において細菌を培養するための培地としては、通常これらの細菌が生育し得るものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロースやマルトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸あるいはその塩、エタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて適宜添加される。また、高い酵素活性を得るために、ピロール−２−カルボン酸、安息香酸、アンスラニル酸やこれらの誘導体等を酵素産生の誘導物質として培地に添加することも有効である。
【００１４】
細菌の培養は常法に従って行えばよく、例えば、ｐＨ４〜１０、温度１５〜４０℃の範囲にて好気的に６〜９６時間培養する。
【００１５】
ピロール−２−カルボン酸の生産反応は、炭酸イオンの存在下、水または燐酸緩衝液、炭酸緩衝液、硼酸緩衝液等緩衝液中でピロールに上記微生物または該処理物、すなわち、細菌培養物、菌体またはその処理物（乾燥菌体、菌体破砕物、抽出酵素液、粗・精製酵素等）を接触させることにより行うことができる。
【００１６】
反応は、通常、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５〜９の範囲、温度０〜６０℃、好ましくは５〜５０℃の範囲で行えばよい。ピロールの濃度は、反応温度やｐＨによって異なるが、通常、５０〜３００ｍＭの範囲、また微生物等の使用量は基質に対して乾燥菌体換算で、通常、０．０１〜５重量％の範囲である。
【００１７】
炭酸イオンの供給源としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム等の炭酸塩が挙げられ、特に、炭酸水素アンモニウムや炭酸水素ナトリウム等が有効である。本反応は、平衡反応であるため、これらの塩に加えて炭酸ガス加圧下に反応を行うことにより、さらに反応収量を高めることもできる。
【００１８】
反応液からのピロール−２−カルボン酸の回収は除菌、濃縮、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化等の公知の方法によって行うことができる。
【００１９】
【実施例】
次に本発明を実施例により具体的に説明する。
【００２０】
参考例１
フマル酸ナトリウム１０ｇ／ｌ、ポリペプトン１０ｇ／ｌ、ピロール−２−カルボン酸１．５ｇ／ｌ、酵母エキス０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2 Ｏ  ０．５ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ／ｌおよび金属塩混合液５ｍｌ／ｌからなる培地３０ｍｌ（ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、１５分間加熱滅菌した後、表１に示す菌株を接種し、２８℃で２４時間振とう培養した。
【００２１】
尚、金属塩混合液は、Ｈ3ＢＯ4 ３００ｍｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ  ４００ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ４０ｍｇ／ｌ、ＫＩ  １００ｍｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ２００ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ４００ｍｇ／ｌ、Ｈ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ  ２００ｍｇ／ｌ、濃塩酸１０ｍｌ／ｌからなる。
【００２２】
培養終了後、遠心分離にて菌体を集菌し、培養液と同量の０．８５％ＮａＣｌ溶液で洗浄した後、１．５ｍｌの同溶液に菌体を懸濁した。
【００２３】
０．４Ｍピロール−２−カルボン酸溶液０．５ｍｌ、０．４Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌからなる反応液に上記菌体懸濁液０．５ｍｌを添加し、３０℃で１０分間振とうした後、０．５Ｎ  ＮａＯＨ溶液０．５ｍｌを加えて反応を停止させた。反応液から遠心分離にて除菌した後、高速液体クロマトグラフィーでピロールおよびピロール−２−カルボン酸の定量を行った。
【００２４】
結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
0004139502.tif 000002
実施例１
Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ  ＩＦＯ１３５３７を参考例１と同様に培養、菌体の洗浄を行い、培養液に対して１５培濃縮になるように、１ｍＭジチオスレイトールを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に菌体を懸濁し、超音波発生装置を用いて菌体の破砕を行った。この菌体破砕液を遠心分離して上清を取得し、常法に従って４０〜７０％飽和硫安画分を得た。これを２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析し、粗酵素液とした。
【００２６】
ピロール０．０１４２ｍｌ、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．２ｍｌ、ＮａＨＣＯ3  ０．２５２ｇ、０．２Ｍジチオスレイトール溶液０．２ｍｌ、蒸留水１．３８６ｍｌからなる反応液（ピロール２００ｍＭ）に上記粗酵素液０．２ｍｌを添加して３０℃にて１８０分反応を行った。
【００２７】
反応液について高速液体クロマトグラフィーでピロールおよびピロール−２−カルボン酸の定量を行を行った結果、ピロール−２−カルボン酸１４０ｍＭ（収率７０％）の生成が確認された。
【００２８】
【発明の効果】
従来の微生物に比べ、炭酸固定能が高く、また反応系に有機酸アンモニウムを共存させる必要がないため、生成物の単離が容易である。