(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL−13受容体を有する腫瘍細胞にエフェクター分子を特異的にデリバリーするためのインビトロ方法であって：
IL−13、環状変更された（cp）IL−13又は抗IL−13受容体抗体から選ばれる標的指向分子に結合された前記エフェクター分子を含有するキメラ分子を提供し；そして
前記腫瘍細胞を前記キメラ分子と接触させる、
ことを含み；ここで前記キメラ分子が腫瘍細胞に特異的に結合する前記方法。
【請求項２】
前記標的指向分子がIL−13である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的指向分子が抗IL−13受容体抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的指向分子が環状変更されたIL−13である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記腫瘍細胞が癌腫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍細胞が、腎臓細胞癌腫細胞、神経膠腫細胞、髄芽細胞腫細胞、およびカポージ肉腫細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記エフェクター分子が、細胞毒、標識、放射性核種、医薬、リポソーム、リガンドおよび抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞毒がシュードモナス外毒素である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
キメラ分子が融合タンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記融合タンパク質がIL−13−PE38QQRである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記融合タンパク質がcpIL−13−PE38QQRである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
IL−13受容体を有する腫瘍細胞の増殖を低下させるためのインビトロ方法であって、該方法は：
ヒトIL−13、環状変更されたヒトIL−13、又はヒトIL−13受容体に特異的に結合する抗体から選ばれる標的指向分子；および
細胞毒、放射性核種、リガンドおよび抗体からなる群から選択されるエフェクター分子、
を含むキメラ分子を前記腫瘍細胞と接触させることを含み；ここで前記キメラ分子が腫瘍細胞に特異的に結合する前記方法。
【請求項１３】
前記標的指向分子がヒトIL−13受容体と特異的に結合する抗体である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的指向分子がヒトIL−13である、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的指向分子が環状変更されたヒトIL−13である、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
前記エフェクター分子が細胞毒である、請求項14又は15に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞毒が、シュードモナス外毒素、リシン、アブリンおよびジフテリア毒素からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
キメラ分子が一本鎖の融合タンパク質である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞毒がシュードモナス外毒素である、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
前記シュードモナス外毒素がPE38QQRである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍の有無を検出するためのインビトロ方法であって：
ヒトIL−13、環状変更されたヒトIL−13、又はヒトIL−13受容体に特異的に結合する抗体から選ばれる標的指向分子；および
検出可能な標識；
を含むキメラ分子を前記腫瘍と接触させ；
そして
前記標識の有無を検出する、
を含む前記方法。
【請求項２２】
ポリペプチドに結合されたIL−13または環状変更されたIL−13を含むキメラ融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターであって、当該キメラ融合タンパク質がIL−13受容体を有する腫瘍細胞に特異的に結合する前記ベクター。
【請求項２３】
前記核酸配列がIL−13−PE融合タンパク質をコードする、請求項22に記載のベクター。
【請求項２４】
前記核酸配列がcpIL−13−PE融合タンパク質をコードする、請求項22に記載のベクター。
【請求項２５】
前記核酸配列が、IL−13−PE38QQR、及びcpIL−13−PE38QQRからなる群から選択される融合タンパク質をコードする、請求項23又は24に記載のベクター。
【請求項２６】
ポリペプチドに結合されたIL−13または環状変更IL−13を含むキメラ融合タンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞であって、当該キメラ融合タンパク質がIL−13受容体を有する腫瘍細胞に特異的に結合する前記宿主細胞。
【請求項２７】
前記核酸配列がIL−13−PE融合タンパク質をコードする、請求項26に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記核酸配列が、IL−13−PE38QQR、及びcpIL−13−PE38QQRからなる群から選択される融合タンパク質をコードする、請求項27に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
IL−13，cpIL−13、及び抗IL−13受容体抗体から選ばれる標的指向分子に結合された、細胞毒、細胞毒性医薬、及び治療薬含有リポソーム又はミセルから成る群から選ばれる細胞毒分子を含むキメラ分子。
【請求項３０】
前記標的指向分子がヒトIL−13である、請求項29に記載のキメラ分子。
【請求項３１】
前記細胞毒が、シュードモナス外毒素、リシン、アブリンおよびジフテリア毒素からなる群から選択される、請求項29に記載のキメラ分子。
【請求項３２】
キメラ分子が一本鎖の融合タンパク質である、請求項30に記載のキメラ分子。
【請求項３３】
前記細胞毒がシュードモナス外毒素である、請求項32に記載のキメラ分子。
【請求項３４】
前記シュードモナス外毒素がPE38QQRである、請求項33に記載のキメラ分子。
【請求項３５】
IL−13受容体を有する腫瘍細胞の増殖を低下させるための医薬であって、（ｉ）IL−13、環状変更されたIL−13又は抗IL−13受容体抗体から選ばれる標的指向分子；及び（ii）細胞毒性エフェクター分子を含むキメラ分子を含み、ここで、当該キメラ分子は、IL−13受容体を発現する腫瘍細胞に特異的に結合する、前記医薬。
【請求項３６】
前記エフェクター分子は、細胞毒、放射性核種、細胞毒性医薬、及び治療剤含有リポソーム又はミセルから成る群から選ばれる、請求項35に記載の医薬。
【請求項３７】
前記細胞毒は、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン、及びジフテリア毒素から成る群から選ばれる、請求項36に記載の医薬。
【請求項３８】
前記細胞毒は、シュードモナス外毒素である、請求項36に記載の医薬。
【請求項３９】
前記キメラ分子は、一本鎖の融合タンパク質である、請求項35〜38のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項４０】
前記腫瘍細胞は、癌腫細胞である、請求項35〜39のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項４１】
前記癌腫細胞は、腎臓細胞癌腫細胞、神経膠腫細胞、髄芽細胞腫細胞、皮膚癌細胞、結腸直腸癌細胞、類表皮癌腫細胞、及びカポージ肉腫細胞から成る群から選ばれる、請求項40に記載の医薬。
【請求項４２】
前記腫瘍細胞は、神経膠腫細胞である、請求項35に記載の医薬。
【請求項４３】
前記腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞である、請求項36〜42のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項４４】
IL−13受容体を有する腫瘍の有無を検出するためのインビボ診断用医薬であって、IL−13、環状変更されたIL−13又は抗IL−13受容体抗体から選ばれる標的指向分子；及び検出標識を含むキメラ分子を含む前記医薬。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本願は、1995年３月15日付けで出願された米国特許願第08/404,685号（この出願は本明細書に援用するものである）の一部継続出願である。
発明の技術分野
本発明はエフェクター分子を腫瘍細胞に特異的に送達する方法に関する。詳しく述べると本発明は、IL−13受容体に特異的に結合するキメラ分子、および特定の活性を有する分子を、IL−13受容体を過剰に発現する腫瘍にデリバリーするそれらキメラ分子の用途に関する。
発明の背景
キメラ分子内には、未変性の状態では別々に存在している２種以上の分子が連結し、その構成分子全部の所望の機能を有する単一分子が生成している。キメラ分子の構成分子の一方が“標的指向分子（targeting molecule）”であることが多い。その標的指向分子とは、その対応する標的、例えば細胞表面における受容体に特異的に結合するリガンドまたは抗体などの分子である。したがって、例えば、標的指向分子が抗体の場合、キメラ分子はその抗体が指向するエピトープを有する（標的の）細胞と組織に特異的に結合する。
キメラ分子のもう一つの成分は“エフェクター分子”である。そのエフェクター分子は、キメラ分子が特異的に誘導される標的へ特異的に輸送される分子を意味する。そのエフェクター分子は、標的細胞に送達されることが望ましい特徴的活性を一般に有している。エフェクター分子としては、細胞毒類、標識類、放射性核種類、リガンド類、抗体類、医薬類、リポソーム類などがある。
特に、エフェクター成分が細胞毒である場合、そのキメラ分子は、特別の標的分子を有する細胞を標的として細胞毒を特異的に誘導する強力な殺細胞剤として作用する。例えば、シュードモナス外毒素（Pseudomonas extoxin）（PE）に融合させたインターロイキン４（IL−４）もしくはトランスフォーミング増殖因子（TGFα）、またはジフテリア毒素（DT）に融合させたインターロイキン２（IL−２）は、特異的に癌細胞を標的として指向して殺すことが報告されている（Pastanら、Ann．Rev．Biochem．61巻、331〜354頁、1992年）。
一般に、キメラ細胞毒の効力を高めるためには、その特異性と親和性を高めその交差反応性を低下させることが望ましい。キメラ分子がその標的（例えば腫瘍細胞）を優先的に選択してその標的に結合し、非標的（例えば健康な細胞）に結合しないならばそのキメラ分子の副作用は最小になる。あいにく、キメラ細胞毒が誘導される多くの標的（例えばIL−２受容体）は、腫瘍細胞上での発現が増大しているが、健康な細胞上にもかなりのレベルで発現されている。したがって、これらの標的に対して誘導されるキメラ細胞毒は、標的とされている受容体を発現する非標的細胞（例えば健康な細胞）に結合すると有害な副作用を示すことが多い。
発明の要約
本発明は、エフェクター分子を腫瘍細胞へ特異的に送達する方法と組成物を提供するものである。特に本発明は、腫瘍細胞を特異的に標的とし、従来技術で公知の他の類似のキメラ分子より健康な細胞に結合することが少ないキメラ分子を提供するものである。
本発明の改良された特異的な標的指向は、一つには、腫瘍細胞、特に腎細胞癌腫などの癌腫が極端に高いレベルでIL−13受容体を過剰に発現するということを発見したことに基づいている。標的の腫瘍細胞上にIL−13受容体が極端に高いレベルで発現すると、低投与量のキメラ分子を使用して用量のエフェクター分子を標的細胞に送達することができまた非腫瘍細胞への結合を減らすことができる。
好ましい一実施態様で、本発明は、IL−13受容体を有する腫瘍細胞にエフェクター分子を特異的に送達する方法を提供するものである。この方法は、IL−13受容体に特異的に結合する標的指向分子に結合されたエフェクター分子を含有するキメラ分子を提供し、そのキメラ分子に腫瘍を接触させてそのキメラ分子を腫瘍細胞に結合させる方法である。
標的指向分子としては、IL−13または環状変更を行った（circularly permuted）IL−13〔cpIL−13：特に、未変性のIL−13が残基43と44（それぞれGlyとMet）の間で開裂されてアミノ末端としてMet44を有しかつカルボキシル末端としてGly43を有するcpIL−13を生成する場合のcpIL−13〕のようなIL−13受容体に特異的に結合するリガンドまたは抗IL−13受容体抗体が好ましい。その標的指向分子は、エフェクター分子に接合できるか、または標的指向分子とエフェクター分子の両者がポリペプチドである場合、標的指向分子は、一つ以上のペプチド結合によってエフェクター分子に結合して融合タンパク質を生成することができる。適切なエフェクター分子としては細胞毒、標識、放射性核種、医薬、リポソーム、リガンドおよび抗体がある。特に好ましい一実施態様では、エフェクターは細胞毒であり、さらに具体的に述べると、PE38QQRまたはPE4Eのようなシュードモナス外毒素である。シュードモナス外毒素がIL13標的指向分子に融合される場合、好ましい融合タンパク質としては、限定されないが、IL−13−PE38QQR，IL−13−PE4E，cpIL−13−PE38QQRおよびcpIL−13−PE4Eがある。
別の一実施態様で、本発明は、IL−13受容体を有する腫瘍細胞、一層好ましくは充実性腫瘍の細胞の増殖を阻害する方法を提供するものである。この方法は、腫瘍を、細胞毒、放射性核種、リガンドおよび抗体からなる群から選択されるエフェクター分子を含有するキメラ分子と接触させて行われる。エフェクター分子は、ヒトIL−13受容体と特異的に結合する標的指向分子に結合させる。その標的指向分子としては、IL−13受容体に結合するリガンド（例えばIL−13）または抗IL−13受容体抗体が好ましい。好ましい細胞毒性エフェクター分子としては、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、リシン（ricin）およびアブリンがある。PE38QQRおよびPE4Eのようなシュードモナス外毒素類は特に好ましい。標的指向分子は、細胞毒のエフェクター分子にとって好ましい融合によって結合させることによって、エフェクター分子に接合または融合することができる。阻害される腫瘍の増殖はヒトの腫瘍増殖である。したがって本発明の方法には、さらに、キメラ分子をヒトに、静脈を通じて投与するかまたは体腔内もしくは器官内に投与することが含まれる。
さらに別の一実施態様で、本発明は腫瘍の存在の有無を検出する方法を提供するものである。この方法は、ヒトIL−13受容体に特異的に結合する標的指向分子に結合された検出可能な標識を含有するキメラ分子を腫瘍と接触させ次いでその標識の存在の有無を検出して行う。好ましい一実施態様で、標識は、放射性標識、酵素標識、高電子密度標識および蛍光標識からなる群から選択される。好ましい標的指向分子としては、限定されないがIL−13，cpIL−13および抗IL−13抗体がある。
また本発明は、第二ポリペプチドに結合されたIL−13またはcpIL−13を含有するキメラポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸配列を含んでなるベクターを提供するものである。そのキメラポリペプチド融合タンパク質はIL−13受容体を有する腫瘍細胞に特異的に結合する。好ましいベクターはIL−13−PEまたはcpIL−13−PEの融合タンパク質をコードし、一層好ましくはIL−13−PE38QQR，IL−13−PE4E，cpIL−13−PE38QQRまたはcpIL−13−PE4Eの融合タンパク質をコードする。
また本発明は、第二ポリペプチドに結合されたIL−13を含有してなるキメラポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸配列を含んでなる宿主細胞を提供するものである。好ましい宿主細胞は、IL−13−PEまたcpIL−13−PEの融合タンパク質、一層好ましくはIL−13−PE38QQR，IL−13−PE4E，cpIL−13−PE38QQRまたはcpIL−13−PE4Eの融合タンパク質をコードする核酸を含有している。そのコードされた融合タンパク質は、IL−13受容体を有する腫瘍細胞に特異的に結合する。特に好ましい宿主細胞は細菌の宿主細胞、特にイー・コリ（E．coli）の細胞である。
さらに別の一実施態様で、本発明は、IL−13受容体を有する腫瘍細胞に特異的に結合するキメラ分子を提供するものである。好ましい一実施態様で、そのキメラ分子は、IL−13に特異的に結合する標的指向分子に結合された細胞毒分子を含有している。その標的指向分子は、細胞毒分子に接合または融合される。好ましい一実施態様で、標的指向分子は細胞毒に融合されて一本鎖、融合タンパク質を生成する。特に好ましい標的指向分子は、IL−13，cpIL−13、またはIL−13受容体に特異的に結合する抗体である。好ましい細胞毒分子としては、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、リシンおよびアブリンがあるが、シュードモナス外毒素（特にPE38QQRまたはPE4E）が最も好ましい。
他の好ましい実施態様で、キメラ分子は、IL−13受容体に特異的に結合する抗体に結合されたエフェクター分子を含有している。エフェクター分子としては、細胞毒、標識、放射性核種、医薬、リポソーム、リガンドおよび抗体がある。そのエフェクター分子は、抗体に融合または接合されている。
さらに、本発明は、医薬として許容される担体、およびIL−13受容体に特異的に結合する標的指向分子に結合したエフェクター分子を含有するキメラ分子を含有してなる医薬組成物を提供するものである。その標的指向分子とエフェクター分子は互いに接合または融合されている。特に好ましい標的指向分子としては、IL−13，cpIL−13および抗IL−13受容体抗体があり、一方、好ましいエフェクター分子としては、細胞毒、標識、放射性核種、医薬、リポソーム、リガンドおよび抗体がある。好ましい医薬組成物は、IL−13−PE融合タンパク質を含有し、一層好ましくはIL−13−PE38QQR，IL−13−PE4E，cpIL−13−PE38QQR、またはcpIL−13−PE4Eの融合タンパク質を含有している。
諸定義
“特異的にデリバリーする”という用語は本明細書で用いる場合、分子が、特別の標的指向分子またはマーカーを有する細胞または組織と優先的に会合し、その標的分子が欠如している細胞または組織とは会合しないことを意味する。勿論、ある程度の非特異的相互作用が分子と非標的の細胞または組織との間に起こることは認められる。それにもかかわらず、特異的送達は、標的細胞の特異的認識よって仲介されるので区別することができる。一般に特異的デリバリーが行われると、送達された分子と標的分子を含有する細胞の間に、送達された分子と標的分子を欠いている細胞の間よりはるかに強い会合が行われる。一般に、特異的送達が、行われると、標的分子を有する細胞または組織に（単位時間当り）送達される分子の量が、標的分子またはマーカーが欠如している細胞または組織に比較して２倍以上になり、好ましくは５倍以上になり、一層好ましくは10倍以上になり、そして最も好ましくは100倍以上になる。
用語“残基”は本明細書で用いる場合、ポリペプチド中に組み込まれているアミノ酸を意味する。そのアミノ酸は天然に存在するアミノ酸でもよく、そして特にことわらない限り、天然に存在するアミノ酸と類似の方式で機能できる天然アミノ酸の公知の類似体を含まれる。
“融合タンパク質”という用語は、一方のポリペプチドのアミノ末端と他方のポリペプチドのカルボキシル末端の間に形成されたペプチド結合によって二つ以上のポリペプチドが連結して生成するポリペプチドを意味する。その融合タンパク質は、構成ポリペプチドの化学的結合によって生成するか、または単一隣接融合タンパク質（single contigaous fusion protein）をコードする核酸配列から単一ポリペプチドとして発現される。単一連鎖融合タンパク質は単一隣接ポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。
“スペーサー”という用語は、本明細書で使用する場合、融合タンパク質を含んでなるタンパク質を連結するペプチドを意味する。一般に、スペーサーは、諸タンパク質を連結するかまたはこれらタンパク質間のいくらかの最小距離などの空間関係を保持すること以外に特異的な生物活性をもっていない。しかしスペーサーの構成アミノ酸を選択して、分子の折りたたみ、実効電荷または疎水性などの分子のある種の特性に影響を与えることができる。
“リガンド”は本明細書で用いる場合、一般に、標的細胞上の受容体と反応可能か、さもなければ該受容体を認識可能であり、すなわち該受容体と結合できるすべての分子を意味する。具体的に述べると、リガンドの例としては、限定されないが、抗体類、リンホカイン類、サイトカイン類、CD４およびCD８のような受容体タンパク質類、可溶性CD４のような可溶化された受容体タンパク質類、ホルモン類、増殖因子類など、望ましい標的細胞に特異的に結合するものである。
“cpIL−13”という用語は、環状変更を行った（cp）IL−13を示すのに用いられる。環状変更は、直鎖分子を取り出しその両端を（直接にまたはリンカーによって）融合して環状分子を形成させ、次にその環状分子を異なる位置で切断して、異なる末端を有する新しい直鎖分子を作製することと機能上等しい。
詳細な説明
Ｉ．IL−13受容体を標的とするキメラ分子
本発明はエフェクター分子を腫瘍細胞へ特異的に送達する方法を提供するものである。この方法は、エフェクター分子に結合された標的指向分子を含んでなるキメラ分子を使用して実施される。本発明のキメラ分子は、腫瘍細胞を特異的に標的としているが、当該技術分野で公知の他の標的を指向するキメラ分子と比べて、非標的細胞との結合が少ない。
本発明の改良された特異的な標的指向は、一つには、充実性腫瘍、特に癌腫が極端に高いレベルでIL−13受容体を過剰発現するという発見に基づいている。IL−13受容体（IL−13Ｒ）は腫瘍細胞上に過剰発現するが、他の細胞（例えば単核細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞）上で発現はごくわずかのようである。したがって、本発明は、IL−13受容体を特異的に標的にすることによって、充実性腫瘍を特異的に指向するが他の細胞または組織を標的として指向することが最も少ないキメラ分子を提供するものである。
好ましい一実施態様で、本発明は、腫瘍の増殖を阻害する組成物および方法を提供するものである。その方法は、IL−13受容体に特異的に結合する標的指向分子に結合された細胞毒性エフェクター分子を含んでなるキメラ分子を提供して実施される。その細胞毒は、シュードモナス外毒素（PE）、ジフテリア毒素（DT）、リシン、アブリンなどのような未変性のまたは修飾された細胞毒である。
上記キメラ細胞毒は、腫瘍細胞を有する生物に投与され、キメラ分子がその腫瘍細胞に接触させる。キメラ分子の標的指向分子の成分は、腫瘍細胞上に過剰発現されるIL−13受容体に特異的に結合する。細胞毒性エフェクター分子は、細胞表面上のIL−13受容体に一旦結合すると、細胞内へのインターナリゼーションを仲介し、その細胞毒は細胞内が細胞の増殖を阻害するかまたは細胞を殺す。
細胞毒性エフェクター分子に結合された標的指向部分を含有してなるキメラ分子を使用して腫瘍細胞を標的にして殺すことは従来技術で公知である。例えば、シュードモナス外毒素（PE）に融合されたインターロイキン４（IL−４）もしくはトランスフォーミング増殖因子（TGFα）、またはジフテリア毒素（DT）に融合されたインターロイキン２（IL−２）を含むキメラ融合タンパク質は、癌細胞を特異的に標的として殺す性能について試験されている（Pastanら、Ann．Rev．Biochem．，61巻、331〜354頁、1992年）。
キメラIL−４−細胞毒分子は従来技術で公知でありかつIL−４の配列はIL−13の配列にいくらか類似しているが、IL−13受容体に対して特異的な部分によって標的に誘導される細胞毒が、IL−４受容体に誘導される、細胞毒と比べて著しく効力が増大することは、本発明の予想外の発見であった。特定の理論にしばられることなく、本発明のIL−13キメラが改良された効力を有しているのは少なくとも下記の３因子のためと考えられる。
第一に、IL−13受容体は、非腫瘍細胞（例えば、単核細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）上に発現したとしてもごく低レベルで発現される。したがってIL−13受容体に誘導される細胞毒は、他の細胞毒と比べて健康な細胞に結合して殺すことが少なくなる。
第二に、IL−13に特異的に結合する受容体成分は、IL−４に結合する受容体成分より、充実性腫瘍上に、著しく高いレベルで発現するようである。したがって、腫瘍細胞は、IL−４受容体に対して誘導される細胞毒性キメラ分子より高いレベルの、IL−13受容体に誘導される細胞毒キメラ分子と結合する。
最後に、IL−４受容体は、免疫系の細胞（例えばＴ細胞）が活性化されると増大する（up−regulated）このことは健康な細胞例えばＴ細胞とＢ細胞に起こるので、これら健康な細胞は、IL−４受容体に誘導される細胞毒に対して一層大きな感受性を示す。したがって、免疫応答（癌に対する免疫応答のような）が誘発されると、免疫系の細胞の治療剤に対する感受性が一層大きくなる。対照的に、IL−13受容体は活性化されたＴ細胞内では増大しないことが分かっている。したがってIL−13受容体を標的として誘導される細胞毒は活性化されたＴ細胞に対し大きな作用をしないので、免疫系の細胞に対する治療組成物の有害作用が最小になる。
また、他の一実施態様で、本発明は、腫瘍細胞の存在の有無を検出する組成物と方法を提供するものである。これらの方法は、エフェクター分子、すなわちIL−13受容体に特異的に結合する標的指向分子に結合させた検出可能な標識、を含有するキメラ分子を提供して実施される。IL−13受容体を標的として指向する分子によって、キメラ分子は腫瘍細胞に特異的に結合し、そのとき腫瘍細胞は検出可能な標識と会合することによってマークが付けられる。次いでその細胞に会合した標識が検出されれば腫瘍細胞が存在していることを示す。
さらに別の一実施態様で、そのエフェクター分子は、抗体、増殖因子またはリガンドのような他の特異的結合部分でもよい。この場合、キメラ分子は、特異性が高い二官能価のリンカーとして作用する。このリンカーは作用して、結合し、そして融合タンパク質が結合する細胞間または細胞成分間の相互作用を増大させる。したがって、例えばキメラ分子の“標的指向”成分がIL−13受容体に特異的に結合するポリペプチドを含有し、そして“エフェクター”成分が抗体または抗体断片（例えば抗体のFv断片）である場合、標的指向成分は癌細胞に特異的に結合し、一方、エフェクター成分は、免疫細胞の表面上の受容体（例えばIL−２またはIL−４の受容体）に結合する。したがってキメラ分子は作用して、標的の癌細胞に対する免疫応答を増大させかつ該標的に免疫応答を導く。
さらに別の一実施態様で、エフェクター分子は薬理学的薬剤（例えば医薬）または薬理学的薬剤を含有する賦形剤でもよい。これは致死的でない生体応答を起こすことだけが望ましい場合、特に適している。したがって、IL−13受容体に特異的に結合する部分は、ビンブラスチン、ドキシルビシン、ゲニステイン（チロシンキナーゼ阻害剤）、アンチセンス分子および当該技術分野の当業者にとって公知の他の薬理学的薬剤のような医薬に接合され、その結果、薬理学的薬剤が、IL−13受容体を過剰に発現する腫瘍細胞を標的として誘導される。
あるいは、標的指向分子は、治療組成物を含有する賦形剤に結合してもよい。このような賦形剤としては、限定されないが、リポソーム・ミセル、各種の合成ビーズなどがある。
当該技術分野の当業者は、本発明のキメラ分子は、単一のエフェクターに結合した多数の標的指向部分、または、逆に、単一の標的指向部分に結合した多数のエフェクター分子を含有していてもよいことが分かるであろう。さらに他の実施態様で、本発明のキメラ分子は多数の標的指向部分と多数のエフェクター分子の両者を含有している。したがって、例えば、本発明は、IL−13に特異的に結合する標的指向分子が細胞毒性分子に結合し、そして別の分子（例えば抗体または他のリガンド）が該毒素の他方の末端に結合している“二重に標的に対し指向させた（dual targeted）”細胞毒性キメラ分子を提供するものである。このような二重に標的指向させた細胞毒としては、PEのアミノ末端のドメインIaがIL−13で置換され、604位と609位のアミノ酸の間のドメインIIIに抗−TAC（Fv）が挿入されたものがある。他の抗体を適している。
II．標的指向分子
好ましい一実施態様で、本発明の標的指向分子はIL−13受容体に特異的に結合する分子である。“特異的に結合する”という用語は、本明細書で使用する場合、タンパク質またはポリペプチドに関連するとき、タンパク質などの生物製剤の不均一なポピュレーション中にタンパク質またはポリペプチドが存在していることを決定づける結合反応を意味する。したがって、選定された条件（例えば、抗体の場合の免疫検定条件）のもとで、その特定のリガンドまたは抗体は、その特別の“標的”タンパク質（例えばIL−13受容体タンパク質）に結合するので、試料中に存在する他のタンパク質またはリガンドもしくは抗体が生体内で接触する他のタンパク質には、大量に結合することはない。
各種の免疫検定法を用いて、IL−13受容体のタンパク質と特異的に免疫反応を行う抗体を選択することができる。例えば、固相ELISA免疫検定法は、タンパク質と特異的に免疫反応を行うモノクローナル抗体を選択するため日常的に使用されている（特異的な免疫反応性を測定するのに使用できる免疫検定法と条件について説明している、HarlowおよびLane著“Antibodies，A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Publications、ニューヨーク、1988年参照）。
同様に、リガンド（例えばIL−13，cpIL−13）とそれぞれの受容体の特異的結合を検出する検出法も当該技術分野で公知である。実施例１は、標識化IL−13のIL−13受容体による特異的な捕促を測定するための詳細なプロトコルを提供する。
IL−13受容体はIL−13を特異的に捕促する細胞表面受容体であり、IL−13を説明するとき以下に述べる各種の細胞型における各種の生理反応を仲介する。IL−13受容体は、細胞または他の試料を標識化IL−13と接触させ次に当該技術分野の当業者にとって公知の方法にしたがって、特異的に結合するIL−13の量を検出することによって確認することができる。標識化IL−13の結合によるIL−13受容体の検出は実施例１に詳細に記載してある。
あるいは、IL−13受容体を確認するのに、抗IL−13受容体抗体も使用することができる。この抗体はIL−13受容体に特異的に結合するので、この結合は、接合された標識の検出、または抗IL−13受容体抗体に結合する標識化第二抗体の検出によって検出することができる。
好ましい一実施態様で、IL−13受容体を標的として特異的に指向させるのに利用する部分は、IL−13受容体に特異的に結合する抗体（抗IL−13Ｒ抗体）または該受容体に特異的に結合する例えばIL−13もしくはcpIL−13などのリガンドである。
Ａ）IL−13
インターロイキン−13（IL−13）は、IL−４の多くの特性を共有していることが分かっている多面的なサイトカインである。IL−13はIL−４に対し約30％の配列同一性を有し、単核細胞類／マクロファージ類およびヒトＢ細胞類に対しIL−４様活性を示す（Mintyら、Nature，362巻、248頁、1993年；Mckenzieら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90巻、3735頁、1987年）。特に、IL−13は炎症反応と免疫反応の強力なレギュレーターのようである。IL−４と同様に、IL−13は、CD23およびMHCのクラスＩとクラスIIの抗原の単核細胞／マクロファージでの発現を増大させ、Fcrの発現を低下させ、そして抗体依存性細胞毒性を阻害することができる。また、IL−13はプロ炎症性サイトカイン類（例えばIL−１，IL−６，IL−８，IL−10およびIL−12）およびクモカイン類（MIP−１，MCP）の発現のみならず一酸化窒素の産生を阻害できるがIL−１の産生を促進する（Mintyの前掲報文；Mckenzieらの前掲報文；Zurawskiら、Immunol．Today，15巻、19頁、1994年；de Wall Malefytら、J．Immunol．，150巻、180A，1993年；de Wall Malefytら、J．Immunol．，151巻、6370頁、1993年；Dohertyら、J．Immunol．，151巻、7151頁、1993年；およびMintyら、Eur．Cytokine Netw．，４巻、99頁、1993年）。
組換えIL−13がいくつもの製造業者から市販されている（例えば、米国ミネソタ州ミネアポリス所在のＲ＆Ｄ Systems社および米国ペンシルベニア州Tervose所在のSanofi Bio−Industries，Inc．社参照）。あるいは、IL−13をコードする遺伝子またはcDNAを、プラスミドまたは他の発現ベクター中にクローン化し、次いで当該技術分野の当業者にとって公知の方法によっていくつもの任意の発現系で発現させてもよい。IL−13をクローン化し発現させる方法およびIL−13の核酸配列は公知である（例えば、Mintyら1993年の前掲報文およびMckenzie  1987年の前掲報文参照）。さらにキメラ分子の成分としてのIL−13の発現は実施例４で詳細に述べる。
当該技術分野の当業者は、IL−13を含有する類似体または断片もIL−13受容体に特異的に結合することが分かるであろう。例えば、未変性IL−13を含有する残基の同類置換を行うと（例えばアラニンのセリンによる置換またはグルタミン酸のアスパラギン酸による置換）、IL−13受容体に特異的に結合するIL−13類似体が提供される。したがって、用語“IL−13”は標的指向分子に関連して使用する場合、IL−13受容体に特異的に結合する断片、類似体またはペプチド擬似体（peptide mimetic）も含まれる。
Ｂ）抗IL−13受容体抗体
ｉ）抗体
当該技術分野の当業者は、IL−13以外の分子がIL−13受容体に特異的に結合することを知っているであろう。IL−13受容体に対して誘導されるポリクローナル抗体とモノクローナル抗体は、本発明のキメラ分子内の特に適切な標的指向分子を提供する。“抗体”という用語には、本明細書で使用する場合、各種の形態の修飾抗体または変容抗体が含まれ、例えば、完全な免疫グロブリン；Fv断片、軽鎖および重鎖の可変領域だけを含有するFv断片、ジスルフィド結合で結合されているFv断片（Brinkmannら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90巻、547〜551頁、1993年）、可変領域と不変領域の一部を含有するFabもしくは（Fab）’2の断片などの各種断片；一本鎖の抗体などがある（Birdら、Science，242巻、424〜426頁、1988年；Hustonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85巻、5877〜5883頁、1988年）。抗体は、動物（特にマウスもしくはラット）またはヒト由来のものでもよく、またはキメラ抗体でもよく（Morrisonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81巻、6851〜6855頁、1984年）、またはヒト化抗体でもよく（Jonesら、Nature，321頁、522〜525頁、1986年および公開されたUK特許願第8707252号）。本発明で使用するのに適した抗体の製造方法は、当該技術分野の当業者にとって公知であり、HarlowおよびLane著、“Antibodies：A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory 1988年およびAsai著、Methodsin Cell Biology Vol 37：Antibodies in Cell Biology，Academic Pres S．Inc．社ニューヨーク、1993年のような刊行物に記載されているのが見られる。
IL−13受容体に特異的に結合する抗体は、当該技術分野の当業者にとって公知のいくつもの方法で製造することができる。一般に、この方法は、IL−13受容体の抗原成分を抗原として使用して、生物（例えばヒツジ、マウス、ウサギなど）中に抗体の産生を誘発させる。当該技術分野の当業者は、抗原として用いるIL−13受容体の全体または成分を単離する方法がいくつもあることを知っている。例えば、２mMのスベリン酸ジスクシンイミジル（DSS）に暴露することによって、該受容体を標識化IL−13に架橋結合させて単離することができる。標識化受容体は、日常的な方法で単離され、そしてその単離された受容体は、下記のようにして、抗原として用いて抗IL−13受容体抗体を生成させることができる。IL−13受容体の成分の架橋と単離は、実施例３で説明する。
しかし好ましい一実施態様で、IL−13受容体はアフィニティークロマトグラフィーによって単離することができる。充実性腫瘍細胞がIL−13受容体を過剰発現するということは本発明の予想外の発見であった。IL−13受容体を過剰発現する細胞のこの発現によって該受容体の単離が著しく簡単になる。一般に約一億個の腎臓癌腫細胞が、標準法にて、プロテアーゼインヒビターを含有する界面活性剤で可溶化することができる。得られた溶液に、IL−13を含有するアフィニティーカラムを通過させる。受容体はカラム中のIL−13と結合するので該溶液から単離される。次にそのカラムを低pHの緩衝液で溶離して、IL−13リガンドとIL−13受容体から解離させ、IL−13受容体を単離する。次に、その単離された受容体を抗原として用いて、抗IL−13受容体抗体を生成させる。
ii）抗体の製造
ポリクローナル抗体の製造法は当該技術分野の当業者にとって公知である。簡単に述べると、免疫原すなわち好ましくは単離されたIL−13受容体もしくは受容体エピトープをアジュバントと混合し、その混合物で動物を免疫化する。免疫原の製剤に対する動物の免疫応答は、試験血液を採取し、対象のポリペプチドに対する反応性の力価を測定することによって監視する。免疫原に対する抗体の力価が適当に高くなったとき、血液と動物から採集し抗血清を調製する。所望により、上記抗血清をさらに分画して対象のポリペプチドに対し反応性の抗体の濃度を高くする（例えば、Coligan（1991年）著“Current Protocols in Immunology”，Wiley/Greene、ニューヨーク、およびHarlowおよびLane著“Antibodies：A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Press、ニューヨーク参照）。
モノクローナル抗体は当該技術分野の当業者にとって公知の各種の方法で得ることができる。このようなモノクローナル抗体の製造方法の説明は、例えばStitesら編、“Basic and Clinical Immunology（第４版）”、Lange Medical Publications、米国カリフォルニア州ロスアルトスおよびこれに引用されている文献；HarlowおよびLane（1988年）“Antibodies：A Laboratory Manual”CSH Press；Goding（1986年）“Monoclonal Antibodies：Principles and Practice（第２版）”、米国ニューヨーク州ニューヨーク；ならびにKohlerおよびMilstein，Nature，256巻、495〜497頁、1975年（この報文には特にモノクローナル抗体の一生成方法が考案されている）に見られる。
簡単に要約すると、この方法は、動物に免疫原を注射することによって行われる。次にその動物を殺し、その脾臓から細胞を取り出し、その細胞を骨髄腫細胞と融合させる（KohlerおよびMilstein，Eur．J．Immunol．，６巻、511〜519頁、1976頁参照）。得られるのはハイブリッド細胞すなわち“ハイブリドーマ”であり、これは生体外で複製することができる。
不死化された単個細胞から生じるコロニーを選別して、抗原に対して所望の特異性とアフィニティーを有する抗体を産生させ、次にこのような細胞が産生するモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物の宿主の腹腔内に注入することを含む各種の方法によって増大させる。あるいは、Huseら、Science，246巻、1275〜1281頁、1989年に記載されている一般的なプロトコルによってヒトＢ細胞由来のDNAライブラリーを選別することによって、モノクローナル抗体またはその結合断片をコードするDNA配列を単離してもよい。この方法の場合、得られる個々の抗体種は、免疫原物質上に認識された特異的部位に応答して生成した、免疫動物由来の不死化されクローン化された単個Ｂ細胞の産物である。
他の適切な方法は、ファージまたは類似のベクターの抗体のライブラリーを選別する方法である（Huseら、Science，246巻、1275〜1281頁、1989年；およびWardら、Nature，341巻、544〜546頁、1989年参照）。一般に、適切なモノクローナル抗体は、通常、ＫDが少なくとも約１mM、さらに一般的に少なくとも約300μＭ、そして最も好ましくは少なくとも約0.1μＭ以上である該抗体の標的エピトープに結合する。
Ｃ）環状変更（Circularly permuted）されたIL−13
別の実施態様で、標的指向部分は環状変更されたIL−13（cpIL−13）でもよい。環状変更法は、機能としては、直鎖分子を取り出し、その両端を融合し（直接にまたはリンカーによって）環状分子を作製し、次にその環状分子を異なる位置で切断して、異なる末端を有する新しい直鎖分子を製造することである（例えばGoldcnbergら、J．Mol．Biol．；165巻、407〜413頁、1983年およびPanら、Gene，125巻、111〜114頁、1993年参照）。したがって環状変更法は、タンパク質のアミノ酸の配列と同一性を特に保持する作用を有し、かつ異なる位置に新しい末端を生成する。
IL−13を環状変更する方法は、未変性のIL−13タンパク質を変化させて、変化した第一タンパク質の特異性と結合アフィニティーをその未変性型と比べて低下させることなく新しいカルボキシル末端とアミノ末端を生成させる方法である。新しい末端は活性（結合）部位から離れて位置しているので、IL−13の結合特異性および／または結合活性（avidity）が低下していたりまたは低下していない融合タンパク質中に環状変更されたIL−13を組み込むことができる。
環状変更法は、タンパク質の二つの末端をリンクし次いでその環状化されたタンパク質を切断することであると説明されているが、実際には、これらのステップは最終産物を製造するのに必要ではない。未変性タンパク質を環状変更したものに相当する配列を有するタンパク質を新規に合成することができる。したがって、用語“環状変更されたIL−13（cpIL−13）”は、その構築方法のいかんを問わず、未変性IL−13タンパク質を環状変更したものに相当する配列を有するすべてのIL−13タンパク質を意味する。
しかし、一般に、結合特異性および／または結合活性を（未変性IL−13と比べて）保持または改善する変更が好ましい。新しい末端が未変性タンパク質の重要領域を分断すると、結合特異性と結合活性が失われる。同様に、元の末端をリンクしたためIL−13の結合特異性と結合活性が破壊される場合は、その環状変更は不適である。したがって活性の環状変更タンパク質を作製するには下記の二つの必要条件がある。１）未変性タンパク質の末端は、結合が生じても結合特異性および／または結合活性を破壊しないよう好都合に配置されていなければならず、そして２）タンパク質の折りたたみと所望の結合活性を得るために重要な領域を破壊することなく新しい末端を形成することができる“オープニング部位（opening site）が存在していなければならない（例えばThortonら、J．Mol．Biol．，167巻、443〜460頁、1983年参照）。本発明によって、IL−13がこれらの基準を満たすことが確認され、結合特性が改良された環状変更IL−13が提供される。
IL−13を環状変更する場合、環状変更されていないかまたは未変性の分子に匹敵する末端間の間隔を保持するリンカーを使うことが望ましい。一般にリンカーは、各々、カルボキシル末端およびアミノ酸末端のアミノ酸とそれぞれ共有結合を形成できる二つの反応性部位を含有するヘテロ−もしくはホモ−の２官能価分子である。適切なリンカーは当該技術分野の当業者にとって公知であり、限定されないが、直鎖もしくは分枝鎖炭素のリンカー、複素環炭素のリンカーまたはペプチドリンカーがある。最も普通で単純な例は、一般に、未変性タンパク質の末端にペプチド結合で連結されたいくつかのアミノ酸からなるペプチドリンカーである。これらのリンカーは、末端アミノ酸にその側基を通じて連結することができる（例えばシステインに対するジスルフィド結合によって）。しかし好ましい一実施態様では、これらリンカーは、末端アミノ酸のα位炭素のアミノ基とカルボキシル基に結合される。
アミノ末端とカルボキシル末端のアミノ酸と共有結合を形成することができる官能基は、当該技術分野の当業者にとって公知である。例えば、末端アミノ基と結合できる官能基としては、無水物、カルボジイミド、酸塩化物、活性化エステルなどの基がある。同様に末端カルボキシル基と共有結合を形成できる官能基としてはアミン、アルコールなどの基がある。好ましい一実施態様で、リンカーはそれ自体ペプチドであり、ペプチド結合でタンパク質の末端に連結される。IL−13の環状変更を行うのに用いる好ましいリンカーはGly-Gly-Ser-Glyである。
好ましい一実施態様で、IL−13の環状変更を行って、新しい末端が形成されるためにIL−13受容体に特異的に結合する構造体を生成するのに重要な二次構造が分断されることがないように、オープニング（opening）が形成される。その三次元構造が末端との連結と両立しても、折りたたみの機構または未変性状態の安定性にとって重要な、限られた範囲の相互作用に参画する残基が切断によって分離すると、折りたたみの動力学と熱力学は環状変更によって大きく変化すると考えられる（Goldenberg，Protein Eng．，７巻、493〜495頁、1989年）。したがって切断部位の選択が、タンパク質の結合特異性および／または結合活性にとって重要である。
IL−13のオープニング部位の選択は、いくつもの因子によって決定される。好ましいオープニング部位は、高度に規則的な三次元構造を示さない領域に位置している。したがって、切断部位は、αらせん、プリーツシート、αβバレル構造などの二次構造を示さないタンパク質の領域内で選択することが好ましい。
アミノ酸配列に基づいて、IL−13の特定の二次構造の領域を確認する方法は当該技術分野の当業者にとって公知である（例えば、Cohenら、Science，263巻、488〜489頁、1994年参照）。配列のデータに基づいてタンパク質の折りたたみを予測するプログラムは多数存在している。いくつかの一層公知のソフトウェアパッケージとしては、MatchMaker（米国ミズーリ州セントルイス所在のTripos Associates社）、GCG（Genetics Computer Group）由来のFASMAN，PHD（ドイツ、ハイデルク所在のEuropean Molecular Laboratory社）などがある。さらに、IL−13のアミノ酸配列は公知であり、かつこのタンパク質は詳細に特性が解析されている（例えば国際特許願公開第WO94/04680号参照）。
あるいは、特定のアミノ酸の置換または特定のアミノ酸の側鎖の修飾を行ってもそのタンパク質の活性が変化しない場合、その修飾されたアミノ酸はタンパク質の活性にとって重要ではないと考えられる。したがって、修飾されやすいことが知られているかまたは実際に生体内で修飾されるアミノ酸は、切断部位として優れた候補である可能性が高い。
そのタンパク質が類縁タンパク質のファミリーのメンバーである場合、高度に保存された配列が生物活性にとって重要であるが可変領域は重要でないと推測することができる。好ましい切断部位は、そのタンパク質ファミリーの各種メンバー間で高度に保存された配列の同一性を示さないタンパク質の領域で選択する。あるいは、切断部位がタンパク質の保存領域内に確認されたならば、その同じ領域は、相同タンパク質の切断部位のすぐれた候補を提供する。
配列の同一性を決定する方法は当該技術分野の当業者にとって公知である。二つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列の比較は、“比較窓（comparison window）”上で二つの配列の配列を比較して、配列が類似している局所領域を確認し比較することによって一般に実施される。目標は、保存されていないごく局部的な配列領域を確認することであるから、比較窓はかなり小さく選択される。“比較窓”という用語は、本明細書で用いる場合、少なくとも約５個の、通常は約10〜約50個の、一層一般的には約15〜約40個の隣接ポジション（contiguous position）を有するセグメントを意味し、そのセグメントによって、配列は、二つの配列を最適に整列させた後、同数の隣接ポジションを有する基準配列と比較できる。
比較を行うための最適の、配列の整列は、Smithら、Adv．Appl．Math．，２巻、482頁、1981年の局部相同性アルゴリズム；Needlemanら、J．Mol．Biol．，48巻、443頁、1970年の相同性整列アルゴリズム；Pearsonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85巻、2444頁、1988年の類似点法のサーチ（search for similarity method）；これらアルゴリズムのコンピュータ化による実施〔Wisconsin Genetics Software Package中のGAP，BESTFIT，FASTAおよびTFASTA；米国ウイスコンシン州マディソン、サイエンスDr．575所在のGenetics Computer Group（GCG）〕；またはインスペクションによって実施することができる。
IL−13の好ましいオープニング部位は、hIL−13のMet−44の直前、すなわち環状変更されたIL−13に生じる推定の第二αらせんの開始部分にあり、その部分は、cpIL−13のアミノ末端に未変性IL−13の44位のメチオニンおよびcpIL−13の新しいカルボキシル末端に未変性IL−13の43位のグリシンを有している。このカルボキシル末端は第二タンパク質に直接またはスペーサーを通じて連結することができる。
環状変更されたIL−13は、当該技術分野の当業者にとって公知のいくつもの方法で製造することができる。これらの方法としては、化学合成、既存タンパク質の修飾、および組換えDNAを用いて行う環状変更タンパク質の発現がある。
環状変更IL−13は、後記IV（Ｂ）章で考察する標準の化学的ペプチド合成法を用いて合成することができる。リンカーがペプチドの場合、そのリンカーは合成中に組込むことができる。リンカーがペプチドでない場合、そのリンカーは、合成を行った後、ペプチドに連結することができる。
あるいは、環状変更IL−13は、未変性IL−13（例えば未変性ヒトIL−13）を化学的に修飾することによって製造することができる。これを行うには一般に、IL−13をリンカーの存在下で反応させて、リンカーと、タンパク質のカルボキシ末端およびアミノ末端との間に共有結合を形成させて環状タンパク質を形成させる必要がある。次に新しい末端を、他の場所でアミノ酸を結合しているペプチド結合を切断することによって形成させる。これは化学的にまたは例えばペプチダーゼを用いて酵素によって達成できる。
その切断反応が１個以上のペプチド結合を加水分解する傾向がある場合、反応は短時間で行う。二つ以上のペプチド結合を切断されたこれらの分子は、全長の環状変更分子より短いので、全長の環状変更分子は大きさによって選択を行うタンパク質精製法（例えばサイズ排除クロマトグラフィまたは電気泳動法）によって分離できる。あるいは、環状タンパク質の各種部位は、アミノ酸の側鎖を化学的に修飾して酵素の結合を阻害するかまたはペプチド結合に関与している攻撃されやすい基を化学的に保護することによって加水分解から保護することができる。
好ましい一実施態様で、環状変更されたIL−13または環状変更IL−13を含有している融合タンパク質は、組換えDNA法を用いて合成される。一般にこの方法は、環状変更増殖因子（または該増殖因子を含有する完全な融合タンパク質）をコードするDNA配列を製造し、そのDNAを、特定のプロモーターの制御下にある発現カセット中に入れ、該タンパク質を宿主内で発現させ、発現されたタンパク質を単離し、次に必要に応じてそのタンパク質を復元することによって行われる。本発明の融合タンパク質の組換え発現は、後記IV（Ｂ）章でより詳細に考察する。
環状変更増殖因子または環状変更増殖因子を含有する融合タンパク質をコードするDNAは、例えば適当な配列のクローン化と制限酵素による切断または以下に考察する方法による直接の化学合成を含む適切な方法で調製することができる。あるいは、サブ配列（subsequence）をクローン化し次に適当なサブ配列を適切な制限酵素を用いて切断してもよい。得られた断片を連結して所望のDNA配列を製造することができる。
好ましい一実施態様で、環状変更増殖因子をコードするDNAはDNA増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用して製造することができる。第一に、新しい末端の両側に未変性DNAのセグメントを別々に増幅させる。一方の増幅された配列の５’末端は、ペプチドのリンカーをコードし、一方、他方の増幅された配列の３’末端もペプチドのリンカーをコードしている。第一断片の５’末端は第二断片の３’末端と相補的であるから、これら二つの断片は（例えばLMPアガロース上で部分的に精製した後）、第三のPCR反応においてオーバーラップ鋳型として使用することができる。その増幅された配列は、コドン、オープニング部位のカルボキシ側のセグメント（今やアミノ配列を形成している）、リンカー、およびオープニング部位のアミノ側の配列（今やカルボキシル配列を形成している）を含有している。次にこの環状変更分子をプラスミドに連結し、以下に考察するように発現させる。
Ｄ）修飾IL−13
当該技術分野の当業者は、結合特異性および／または結合活性を破壊せず実際には結合特性を増大させる各種の方法で、IL−13を修飾できることは分かるであろう。いくつかの修飾を行って、環状変更増殖因子の融合タンパク質内でのクローン化、発現または組込みを容易に行えるようにすることができる。このような修飾は当該技術分野の当業者にとって公知であり、例えば、アミノ末端にメチオニンを加えて開始部位を提供したりまたは追加のアミノ酸を両方の末端に配置して好都合に制限部位または終止コドンを配置することが含まれる。
当該技術分野の当業者は、他の修飾を行えることが分かるであろう。したがって、例えば、環状変更タンパク質などの特異性または結合アフィニティーを増大するアミノ酸の置換を行うことができる。あるいは分子の非必須領域を短くするか全体を除いてもよい。したがって、それ自体、その分子の活性に関与していない分子の領域がある場合、その領域は除去するか、または分子の活性成分間の正しい空間関係を単に維持する働きをする短いセグメントで置換してもよい。
Ｅ）他の標的指向抗体
キメラ分子が一つ以上の標的指向分子（例えば二重の標的に誘導される細胞毒）を含有している場合、そのキメラ分子は、過剰発現されたIL−13受容体以外の腫瘍マーカーに誘導される標的指向抗体を含有していてもよい。かような抗体の数は知られており、融合タンパク質に組み込むのに適した形態に変換されている。これらの抗体としては、抗erbB2，B3，BR96，OVB3、抗トランスフェリン、Mik−β１およびPR１がある（Batraら、Mol．Cell．Biol．，11巻、2200〜2205頁、1991年；Batraら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89巻、5867〜5871頁、1992年；Brinkmannら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88巻、8616〜8620頁、1991年；Brinkmannら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90巻、547〜551頁、1993年；Chaudharyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87巻、1066〜1070頁、1990年；Friedmanら、Cancer Res．，53巻、334〜339頁、1993年；Kreitmanら、J．Immunol．，149巻、2810〜2815頁、1992年；Nichollsら、J．Biol．Chem．，268巻、5302〜5308頁、1993年；およびWellsら、Cancer Res．，52巻、6310〜6317頁、1992年それぞれを参照）。
III．エフェクター分子
上記のように、本発明のキメラ分子のエフェクター分子の成分は、その活性を、IL−13受容体を過剰発現している細胞に送達することが望ましい分子である。特に好ましいエフェクター分子としては、PEもしくはDTのような細胞毒、放射性核種、増殖因子のようなリガンド、抗体、蛍光標識または放射性標識のような検出可能な標識、およびリポソームおよび各種医薬のような治療用組成物がある。
Ａ）サイトカイン類
特に好ましいサイトカン類としてはシュードモナス外毒素、デフテリア毒素、リシンおよびアブリンがある。シュードモナス外毒素とジフテリア毒素が最も好ましい。
ｉ）シュードモナス外毒素（PE）
シュードモナス外毒素Ａ（PE）は、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonus aeruginosa）が分泌する極端に活性の単量体タンパク質（分子量66KD）であり、延長因子２（EP−２）のADP−リボシル化反応を触媒することによって（酸化されたNADのADPリボシル部分のEF−２上への移行を触媒する）、EP−２を不活性化して真核細胞のタンパク質合成を阻害する。
この毒素は、一斉に作動して毒性を生じさせる三つの構造ドメインを含有している。ドメインIa（１〜252位のアミノ酸）は細胞結合を仲介する。ドメインII（253〜364位のアミノ酸）はサイトゾルへの転位に関与し、そしてドメインIII（400〜613位のアミノ酸）は、延長因子２のADPリボシル化反応を仲介し、これによって、そのタンパク質が不活性化され細胞死が起こる。ドメインIb（365〜399位のアミノ酸）の機能は、不明確なままであるが、その大部分の365〜380位のアミノ酸は細胞毒性を失うことなしに除去することができる（Siegallら、J．Biol．Chem．，264巻、14256〜14261頁、1989年参照）。
標的指向分子（例えばIL−13）をPEに融合させる場合、好ましいPE分子は、ドメインIa（１〜252位のアミノ酸）が除去されそして365〜380位のアミノ酸がドメインIbから除去されたPE分子である。しかし、特に、これら除去される配列をGGGGSのようなリンキングペプチド（linking peptide）で置換すると、ドメインIb全部とドメインIIの一部（350〜394位のアミノ酸）を除去することができる。
その上、上記PE分子は、さらに当該技術分野で公知の部位特異的突然変異誘発法などの方法を用いて修飾し、特別の望ましい用途向けに分子を変化させることができる。ここで説明するPE分子が提供する機能上の利点に実質的に影響しない方式でPE分子を変化させる方法も使用することができ、そしてこのようにして得られる分子は本発明に含まれる。
好ましいPE分子の最大の細胞毒性を得るには、分子にいくつかの修飾を行うことが推奨される。組換え分子に適当なカルボキシル末端配列を入れることは、その分子を標識細胞のサイトゾル中に転位させるのに好ましい。有効であることが発見されたアミノ酸配列としては、REDLK（未変性PE中と同じ）REDL，RDELもしくはKDEL、これらの反復体、またはタンパク質と小胞体中に維持するかまたは再循環する働きをし、“内部原形質保持配列”と本明細書で呼ぶ他の配列がある（例えばChaudharyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87巻、308〜312頁およびSeetharamら、J．Biol．Chem．，266巻、17376〜17381頁、1991年参照）。
ドメインIbの365〜380位のアミノ酸の削除は活性を失うことなく行うことができる。さらに、280位のアミノ酸としてグリシンの代わりにメチオニンを用いてタンパク質の合成を開始させ、そして287位のアミノ酸としてシステインの代わりにセリンを用いて不適切なスルフィド結合が生成するのを防止することは有利である。
好ましい一実施態様で、標的指向分子がドメインIaに置換して挿入される。同様の挿入は、TGFα−PE40分子（TP40とも呼ばれている）として知られているものに行われた。この分子は、Heimbrookら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87巻、4697〜4701頁、1990年と米国特許第5,458,878号に記載されている。
好ましい形態のPEは253〜364位と381〜608位のアミノ酸を含有し、これに未変性の配列REDLK、または突然変異配列KDELもしくはRDELが続いている。590位と606位のリジン（Kysine）はグルタミンに変異させてもよくまたは変異させなくてもよい。
特に好ましい実施態様で、IL−13受容体を標的として誘導される本発明の細胞毒はPE38QQRと呼ばれるPE分子を含有している。このPE分子は、253〜364位と381〜608位のアミノ酸で構成された円錐台形のPEである。509位と606位のリジン残基はグルタミンで置換され、613位のリジン残基はアルギニンで置換されている（Debinskiら、Bioconj．Chem．，５巻、40頁、1994年）。
別の特に好ましい実施態様で、IL−13受容体を標的として誘導される本発明の細胞毒は、PE4Eと呼ばれるPE分子を含有している。PE4Eは、突然変異した不活性の結合ドメインを有する“全長”PEであり、該ドメインの57位、246位、247位および249位のアミノ酸がすべてグルタメードで置換されている（例えばChaudharyら、J．Biol．Chem．，265巻、16306頁、1995年参照）。
また、標的指向分子（例えばIL−13または抗IL−13Ｒ抗体）は、PE分子のドメインIII内の場所に挿入してもよい。その標的指向分子は、PE分子のほぼ607位と609位の間に融合させることが最も好ましい。このことは、標的指向分子がPE分子のほぼ607位の後に挿入され、PEの適当なカルボキシル末端が、標的指向分子の後にPEのほぼ604〜613位のアミノ酸を配置することによって復元される。したがって、その標的指向分子は、組換えPE分子内でほぼ607位のアミノ酸の後に配置され、これにドメインIIIの604〜613位のアミノ酸が続く。また標的指向分子はドメインIbに挿入して毒性にとって必要でない配列を置換してもよい（Debinskiら、Mol．Cell．Biol．，11巻、1751〜1753頁、1991年）。
好ましい実施態様で、PE分子が組換え法によって標的指向分子に融合される。タンパク質連鎖をコードする遺伝子は、当該技術分野の当業者にとって公知のクローン化法によって、cDNA中またはゲノム型中にクローン化することができる（例えば、Sambrookら、“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989年参照）。各種リガンドに融合されるPEをコードする遺伝子をクローン化する方法は、当該技術分野の当業者にとって公知である（例えばSiegallら、FASEB J．，３巻、2647〜2652頁、1989年；およびChaudharyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84巻、4538〜4542頁、1987年参照）。
当該技術分野の当業者は、本発明のキメラ分子またはIL−13受容体に向けて誘導されるキメラ分子をコードする核酸配列に追加の修飾、欠失、挿入などを行うことができることを知っているであろう。融合タンパク質の標的分子に対する細胞毒性を増大させるか、または抗体に対する抗原がない細胞に対する非特異的細胞毒性を減少させるために、特に、欠失または変更をPE中にまたは抗体遺伝子をPEに接続するリンカー中に行ってもよい。このような構築はすべて、当該技術分野の当業者にとって公知の遺伝子工学の方法で行うことができ（一般にSambrookらの前掲報文参照）、そして異なる特性のアフィニティー、特異性、安定性および毒性を有するタンパク質が産生され、これらの特性によってこれらのタンパク質は各種の臨床用途または生物学的用途に対して特に適したものになる。
ii）ジフテリア毒素（DT）
PEと同様に、ジフテリア毒素（DT）は、延長因子をADP−リボシル化してタンパク質合成を阻害することによって細胞を殺す。しかし、ジフテリア毒素はジスルフィド架橋によって連結されている二つの連鎖ＡとＢに分割されている。PEとは対照的に、DTの連鎖Ｂはカルボキシル末端上に位置し受容体との結合に関与しており、一方、連鎖Ａはアミノ末端上に存在し酵素活性を有している（Uchidaら、Science，175巻、901〜903頁、1972年；Uchidaら、J．Biol．Chem．，248巻、3838〜3844頁、1973年）。
好ましい一実施態様で、本発明の標的指向分子−ジフテリア毒素融合タンパク質は、ジフテリア毒素Ｂ連鎖を切り取って除いた未変性受容体結合ドメインを有している。特に好ましいのDT388であり、これは、残基389で始まるカルボキシル末端配列を除いたDTである（Chaudharyら、Bioch．Biophys．Res．Comm．，180巻、545〜551頁、1991年）。
PEキメラ細胞毒と同様に、DT分子はIL−13受容体を標的として指向する分子に化学的に接合してもよいが、好ましい一実施態様で、その標的指向分子は組換え法によってジフテリア毒に融合される。タンパク質連鎖をコードする遺伝子は、当該技術分野の当業者によって公知のクローン化法によって、cDNA中またはゲノム型中にクローン化することができる。各種のリガンドに融合されたDTをコードする遺伝子をクローン化する方法も当該技術分野の当業者にとって公知である（例えばWilliamsら、J．Biol．Chem．，265巻、11885〜11889頁、1990年参照）。
“ジフテリア毒（DT）という用語は、本明細書で使用する場合、全長の未変性DTまたは修飾されたDTを意味する。修飾には、Ｂ連鎖中の標的指向ドメインの除去が含まれており、より具体的にいえば、Ｂ連鎖中のカルボキシル領域の切取りが含まれている。
Ｂ）検出可能な標識類
本発明のキメラ分子のエフェクター分子成分として使用するのに適した検出可能な標識としては、分光法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、電気的方法、光学的方法、化学的方法で検出可能な組成物がある。本発明で有用な標識としては、磁気ビーズ〔例えばDynabeads（登録商標）〕、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、グリーン蛍光タンパク質など）、放射能標（例えば、3Ｈ，125Ｉ，35Ｓ，14Ｃまたは32Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどELISA法に通常用いられる酵素）、およびコロイド金、または着色したガラスもしくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズのような比色法標識がある。
このような標識を検出する方法は当該技術分野の当業者にとって公知である。したがって、例えば放射能標識は写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使って検出することができ、蛍光マーカーは光検出器を用いて発光照度を検出することによって検出される。酵素標識は、一般に、酵素に基質を加え次にその酵素の作用で基質に生成した反応生成物を検出することによって検出され、そして比色法標識は、着色した標識を単に視覚化することによって検出される。
Ｃ）リガンド類
上記のように、エフェクター分子はリガンドまたは抗体であってもよい。特に好ましいリガンドと抗体は免疫細胞上の表面マーカーに結合するリガンドと抗体である。かような抗体をエフェクター分子として利用するキメラ分子は、リガンドまたは抗体に対する結合パートナーを有する免疫細胞とIL−13受容体を過剰発現する腫瘍細胞との間の会合を樹立する二官能価リンカーとして作用する。適切な抗体と増殖因子は当該技術分野の当業者にとって公知であり、限定されないがIL−２，IL−４，IL−６，IL−７、腫瘍壊死因子（TNF）、抗Tac，TGFαなどがある。
Ｄ）他の治療用部分
他の適切なエフェクター分子としては、薬理学的薬剤または各種の薬理学的薬剤が入っているカプセル封入系がある。したがって、本発明のキメラ分子の標的指向分子は、腫瘍に直接デリバリーすべき医薬に直接結合してもよい。かような医薬は当該技術分野の当業者にとって公知であり、限定されないが、ドキシルビシン、ビンブラスチン、グニステイン、アンチセンス分子などが挙げられる。
あるいは、エフェクター分子は、医薬、核酸（例えばアンチセンス核酸）のような治療用組成物、または直接暴露されないように封入して循環系に送ることが好ましい他の治療用部分が入っているリポソームまたはミセルのようなカプセル封入系でもよい。抗体に結合させたリポソームの製造法は当該技術分野の当業者にとって公知である（例えば米国特許第4,957,735号；Connorら、Pharm．Ther．，28巻、341〜365頁、1985年参照）。
IV．標的指向分子のエフェクター分子への結合
当業者は、標的指向分子とエフェクター分子はいずれの順序で連結してもよいことが分かるであろう。したがって、標的指向分子がポリペプチドの場合、エフェクター分子は、標的指向分子のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれに連結してもよい。また、その連結がこれら分子それぞれの活性を妨害しない限り、標的指向分子はエフェクター分子の内部領域に連結してもよく、または逆にエフェクター分子を標的指向分子の内部領域に連結してもよい。
標的指向分子とエフェクター分子は、当該技術分野の当業者にとって公知のいくつかの方法のいずれかによって結合させることができる。一般にエフェクター分子は、直接にまたはリカンカー（スペーサー）を通じて、標的指向分子に接合される。しかしエフェクター分子と標的指向分子がともにポリペプチドの場合、キメラ分子を、一本連鎖の融合タンパク質として組換え法で発現させることが好ましい。
Ａ）エフェクター分子の標的指向分子への接合
一実施態様で、標的指向分子（例えばIL−13，cpIL−13、または抗IL−13Ｒ抗体）はエフェクター分子（例えば細胞毒、標識、リガンドまたは医薬もしくはリポソーム）に化学的に接合する。分子を化学的に接合する方法は当業者にとって公知である。
薬剤を、抗体もしくは他のポリペプチドの標的指向分子に結合させる方法は、薬剤の化学構造によって変化する。ポリペプチドは一般に各種の官能基、例えばカルボン酸基（COOH）また遊離アミン基（−NH2）を含有しているが、これらの基は、エフェクター分子の適切な官能基と反応させてポリペプチドにエフェクターを結合させるのに利用できる。
あるいは、標的指向分子および／またはエフェクター分子は、誘導体化して追加の反応性官能基を暴露もしくは結合させてもよい。誘導体化は、米国イリノイ州ロックフォード所在のPierce Chemical Company社が市販しているようなリンカー分子をいくつか結合させて実施する。
“リンカー”という用語は、本明細書で使用する場合、標的指向分子をエフェクター分子に連結するのに用いられる分子を意味する。このリンカーは、標的指向分子とエフェクター分子の両者と共有結合を形成することができる。適切なエフェクターは当該技術分野の当業者にとって公知であり、限定されないが、直鎖または分枝鎖炭素のリンカー、複素環炭素のリンカーまたはペプチドのリンカーが挙げられる。標的指向分子とエフェクター分子がポリペプチドの場合、リンカーは、構成アミノ酸にその側鎖を通じて連結することができる（例えばシステインに対してジスルフィド結合によって）。しかし好ましい一実施態様では、これらリンカーは、末端アミノ酸のα位炭素のアミノ基およびカルボキシル基に結合される。
特別の薬剤の基と反応性の一つの官能基および抗体と反応性のもう一つの基を有する二官能価リンカーを用いて所望のイムノコンジュゲートを製造することができる。あるいは誘導体化は標的指向分子の化学的処理を行って実施できる。例えば糖タンパク質の抗体の糖部分を過ヨウ素塩でグリコール分解させて遊離アルデヒド基を生成させることができる。抗体の遊離アルデヒド基は、薬剤の遊離アミン基またはヒドラジン基と反応させて薬剤を抗体に結合することができる（米国特許第4,671,958号参照）。抗体または抗体断片のようなポリペプチドに遊離スルフヒドリル基を生成させる方法も公知である（米国特許第4,659,839号参照）。
放射性核種の金属キレート化合物、毒素および医薬を含む各種化合物を、抗体のごときタンパク質に結合させるのに用いる多くの方法とリンカー分子は公知である（例えば、ヨーロッパ特許願第188,256号；米国特許第4,671,958号、同第4,659,839号、第4,414,148号、同第4,699,784号、同第4,680,338号、同第4,569,789号および同第4,589,071号；ならびにBorlinghausら、Canser Res．，47巻、4071〜4075頁、1987年参照）。特に各種免疫毒素の製造法は当該技術分野で公知であり、例えば“Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates：Aiming the Magic Bullet”；Thorpeら、“Monoclonal Antibodies in Clinical Medictine”，Academic Press，168〜190頁、1982年；Waldmann，Science，252巻、1657頁、1991年；米国特許第4,545,985号および同第4,894,443号に見られる。
場合によっては、キメラ分子がその標的部位に到達したときに、エフェクター分子を標的指向分子から遊離させることが望ましい。それ故、エフェクターを標的部位において遊離させたい場合、標的部位の近くで開裂可能な結合を有するキメラ接合体が用いられる。薬剤を抗体から遊離させるために行う結合の開裂は、その免疫接合体が標的細胞内または標的部位の近傍でさらされる酵素活性または条件によって促進される。標的部位が腫瘍の場合、腫瘍部位に存在する条件下で（例えば腫瘍関連酵素または酸性pHに暴露された場合）開裂可能なリンカーが用いられる。
いくつもの各種開裂可能なリンカーが当該技術分野の当業者にとって公知である（米国特許第4,618,492号、同第4,542,225号および同第4,625,014号参照）。薬剤をこれらリンカー群から遊離させる機序としては、例えば光に対して不安定な結合に対する光照射および酸触媒加水分解が挙げられる。例えば米国特許第4,671,958号には、患者の補体系のタンパク質分解酵素によって、生体内で、標的部位にて開裂されるリンカーを含有する免疫接合体が説明されている。各種の放射線診断用化合物、放射線治療用化合物、医薬、毒素および他の薬剤を抗体に結合するために報告されている多数の方法を考慮して、当該技術分野の当業者は、所定の薬剤を抗体などのポリペプチドに結合させる適切な方法を決定することができる。
Ｂ）融合タンパク質類の製造
標的指向分子および／またはエフェクター分子が比較的短い場合（すなわち約50個のアミノ酸より短い場合）、これら分子は標準のペプチド化学合成法を用いて合成することができる。これら両方の分子が比較的短い場合、キメラ分子は単一隣接ポリペプチド（singl contiguous polypeptide）として合成することができる。あるいは、標的指向分子とエフェクター分子は別々に合成し次に一方の分子のアミノ末端と他方の分子のカルボキシル末端を縮合することによってペプチド結合を形成させてもよい。あるいは標的指向分子とエフェクター分子を各々、ペプチドのスペーサー分子の一端と縮合させて隣接融合タンパク質を形成させてもよい。
配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に結合させ続けて配列の残りのアミノ酸を逐次付加する固相合成法は、本発明のポリペプチドを化学的に合成するのに好ましい方法である。その固相合成法は、BaranyおよびMerrifield，“The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology，Vol ２：Special Methods in Peptide Synthesis，PartA”のなかの３〜284頁の“Solid-phase Peptide Synthesis”；Merrifieldら、J．Am．Chem．Soc．，85巻、2149〜2156頁、1963年；およびStewartら、“Solid Phase Peptide Synthesis”第二版（1984年）、米国イリノイ州ロックフォード所在のPierce Chem．Co．社に説明されている。
好ましい一実施態様で、本発明のキメラ融合タンパク質は、組換えDNA法を使用して合成される。一般に、この方法は、融合タンパク質をコードするDNA配列を製造し、そのDNAを特定のプロモノターの制御下にある発現カセット内に入れ、該タンパク質を宿主内で発現させ、発現されたタンパク質を単離し次いで必要に応じて該タンパク質を復元して行われる。
本発明の融合タンパク質（例えばIL−13−PE38QQR）をコードするDNAは、例えばクローン化し次いで適切な配列に酵素で切断するか、またはホスホトリエステル法（Narangら、Meth．Enzymol．，68巻、90〜99頁、1979年）；ホスホジエステル法（Brownら、Meth．Enzymol．，68巻、109〜151頁、1979年）；ジエチルホスホルアミダイト法（Beaucageら、Tetra．Lett．，22巻、1859〜1862頁、1981年）；および固体支持体法（米国特許第4,458,066号）のような方法による直接化学合成法を含む適切な方法で製造することができる。
化学合成法は一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。この一本鎖ヌクレオチドは、相補的配列とハイブリッドを形成させるか、またはその一本鎖を鋳型として用いてDNAポリメラーゼで重合させることによって二本鎖DNAに変換させることができる。当業者は、DNAの化学合成は約100個の塩基の配列までに制限されるが、一層長い配列は短い配列を連結することによって得ることができる。
あるいはサブ配列をクローン化し次に適当なサブ配列を適当な制限酵素を用いて切断してもよい。次にこれら断片を連結して所望のDNA配列を得ることができる。
好ましい一実施態様で、本発明の融合タンパク質をコードするDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のようなDNA増幅法を用いてクローン化される。したがって、好ましい一実施態様で、IL−13の遺伝子は、NdeＩに対する制限部位を含有するセンスプライマーおよびHindIIIに対する制限部位を含有するアンチセンスプライマーを用いて、PCR増幅が行われる。特に好ましい一実施態様で、これらのプライマーは、Mckenzieら（1987年）の前掲報文に記載されているうに、19位で出発する核酸を増幅するよう選択される。このようにすると成熟IL−13の配列をコードしかつ末端制限部位を有する核酸が産生される。PE38QQR断片は、Debinskiら、Int．J．Cancer，58巻、744〜748頁、1994年およびDebinskiら、Clin．Res．，42巻、251Aアブストラクト、1994年にそれぞれ記載されているプラスミドpWDMH4-38QQRまたはプラスミドpSGC242FdN1から切り取ることができる。IL−13とPE38QQRの配列を連結しベクターに挿入すると、PE38QQRのアミノ末端（PEの253位）に連結されたIL−13をコードするベクターが生成する。これら二つの分子は、制限部位によって導入されたグルタミン酸、アラニンおよびフェニルアラニンからなる３アミノ酸連結部で連結されている。
これら２分子は好ましくは特に、ともに直接連結されているが、当業者は、これら分子は一つ以上のアミノ酸からなるペプチドスペーサーで隔てられていてもよいことが分かるであろう。一般にそのスペーサーは、これらタンパク質を連結するかまたはこれらタンパク質間にいくらかの最小距離などの空間関係を保持すること以外に特異的な生物活性を全く有していない。しかしスペーサーの構成アミノ酸は、折りたたみ、実効電荷または疎水性などの分子のある種の特性に影響を与えるように選択することができる。
本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列は、イー・コリ（E．coli）などの細菌宿主、酵母、ならびに各種の高等真核細胞例えばCOS，CHOおよびHela細胞系および骨髄腫細胞系を含む各種の宿主細胞で発現することができる。組換えタンパク質遺伝子は、各宿主の適当な発現制御配列に作動可能に連結される。イー・コリの場合、発現制御配列は、T7，trpまたはλプロモーターのようなプロモーター、リポソーム結合部位および好ましくは転写終止シグナルを有している。真核細胞の場合、その制御配列は、プロモーターと、好ましくは免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルスなど由来のエンハンサーおよびポリアデニル化配列を有し、そしてスプライスドナーとアクセプターの配列を含有していてもよい。
本発明のプラスミドは、イー・コリに対する塩化カルシウム形質転換法および哺乳類細胞に対するリン酸カルシウム処理されたエレクトロポレーションのような公知の方法で、選択された宿主細胞中に転移させることができる。プラスミドによって形質転換された細胞は、プラスミドに含まれている遺伝子、例えばamp，gpt，neoおよびhygの遺伝子によって付与される抗体に対する耐性によって選択することができる。
組換え融合タンパク質は、発現されれば、当該技術分野の標準法によって精製することができる。これらの方法としては、硫酸アンモニウム沈澱法、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法などがある（一般に、R．Scopes，“Protein Purification”，Springer-Verlag，N．Y．1982年；“Deutscher Methods in Enzymology Vol 182：Guide to Protein Purification”，Academic Press，Inc．N．Y．1990年参照）。少なくとも約90〜95％の等質性を有する実質的に純品の組成物が好ましく、そして医薬用には98〜99％以上の等質性が最も好ましい。所望どおりに部分的にまたは等質に精製されたならばそのポリペプチドは治療に使用することができる。
当該技術分野の当業者は、化学合成、生物学的発現または精製を行った後、IL−13受容体を標的として誘導される融合タンパク質は、構成ポリペプチドの未変成高次構造とは実質的に異なる高次構造を有していることが分かるであろう。この場合、そのポリペプチドは変性しそして還元し、次にそのペプチドを再生して好ましい高次構造にする必要がある。タンパク質を還元し変性し次に再生する方法は当該技術分野の当業者にとって公知である（Debinskiら、J．Biol．Chem．，268巻、14065〜14070頁、1993年；KreitmanおよびPastan，Bioconjug．Chem．，４巻、581〜585頁、1993年；およびBuchnerら、Anal．Biochem．，205巻、263〜270頁、1992年参照）。例えば、Debinskieらは、グアニジン−DTE内での封入体タンパク質の変性と還元について報告している。次にそのタンパク質は、酸化されたグルタチオンおよびＬ−アルギニンを含有するレドックス緩衝液中で再生される。
当業者は、IL−13受容体を標的として誘導される融合タンパク質に対し、その生物活性を低下させることなく修飾を行うことができることを知っているであろう。融合タンパク質中への標的指向分子のクローン化、発現または組込みを容易に行えるようにいくつかの修飾を行うことができる。これらの修飾は当該技術分野の当業者にとって公知であり、例えば開始部位を提供するためにアミノ末端に付加されるメチオニン、または好都合に配置された制限部位または終止コドンを作るために両方の末端に配置される追加のアミノ酸がある。
Ｖ）標的細胞の確認
腫瘍細胞がIL−13受容体を過剰発現することは、本発明の予想外の発見であった。特に癌腫の腫瘍細胞（例えば腎癌腫細胞）は、約2100部位／細胞〜150,000部位／細胞以上の範囲のレベルでIL−13受容体を過剰発現する。同様に、神経膠腫とカポジー肉腫もIL−13受容体（IL−13Ｒ）を過剰発現する。さらに、現在まで試験されたあらゆる癌型はIL−13受容体を過剰発現するようである。したがって、IL−13受容体の過剰発現は充実性腫瘍の新生細胞の一般的特性のようである。
したがって、本発明の方法は、エフェクター分子を、事実上あらゆる新生細胞を標的として誘導するのに使用できる。新組織形成は当該技術分野の当業者にとって公知であり、限定されないが、皮膚癌（例えば基底上皮細胞または扁平上皮細胞の癌腫、黒色腫、カポジー肉腫など）、生殖器系の癌（例えば精巣、卵巣、子宮頚の癌）、胃腸管の癌（例えば胃、小腸、大腸、結腸および直腸の癌など）、口腔および咽頭の癌（例えば食道、喉頭、中咽頭、上咽頭、口腔の癌など）、頭部と頚部の癌、骨癌、乳癌、肝臓癌、前立腺癌（例えば前立腺癌腫）、甲状腺癌、心臓癌、網膜癌（例えば黒色腫）、腎臓癌、肺癌（例えば中皮腫）、膵臓癌、脳癌（例えば神経膠腫、髄芽細胞腫、下垂体腺腫など）およびリンパ系の癌（例えばリンパ腫）が挙げられる。
特に好ましい一実施態様で、本発明の方法を用いて、エフェクター分子を、腎臓癌、結腸と直腸の癌（特に結腸と直腸の癌腫）、皮膚癌（特にカポジー肉腫）および脳癌（特に神経膠腫と髄芽細胞腫）を標的として誘導することができる。
当該技術分野の当業者は、他の細胞によるIL−13の過剰発現を確認するのに必要なことは公知の方法を用いて日常的な選別を行うことだけであることが分かるであろう。一般にこの方法は、IL−13受容体に特異的に結合する標識化分子を提供して行われる。次に対象の細胞をこの分子に接触させ次いで洗浄する。試験細胞と会合したままになっている標識の量を定量すると、細胞の表面に存在するIL−13受容体（IL−13Ｒ）の量が分かる。
好ましい一実施態様で、IL−13受容体は、125Ｉ標識化IL−13（125Ｉ−IL−13）の対象の細胞に対する結合量を測定することによって定量することができる。このような結合検定法の詳細は実施例１で述べる。
VI）医薬組成物
本発明のキメラ分子は、非経口、局所、経口または局部の投与を、予防および／または治療の処置のため、例えばエアゾールまたは経皮によって行うのに有用である。本発明の医薬組成物は、投与方法によって、各種の単位剤形で投与することができる。例えば経口投与に適した単位剤形としては、粉末薬、錠剤、丸剤、カプセルおよび口中錠がある。本発明の融合タンパク質と医薬組成物は、経口で投与される場合、消化されないように保護しなければならないことが分かっている。このことは一般に、本発明のタンパク質を一つの組成物を用いて複合体にして酸と酵素による加水分解反応に耐えるようにするか、または本発明のタンパク質をリポソームのような適当に耐性の担体内に包み込むことによって達成される。タンパク質を消化しないように保護する方法は当該技術分野で公知である。
本発明の医薬組成物は、静脈内投与または体腔内もしくは器官の内腔内への投与のような非経口投与を行うのに特に有用である。投与用組成物は通常、医薬として許容される担体、好ましくは水性担体に溶解したキメラ分子の溶液を通常含有している。各種の水性担体、例えば緩衝食塩水などを用いることができる。これらの溶液は滅菌溶液であるから、一般に望ましくない物質は含有していない。これらの組成物は、従来の公知の滅菌法によって滅菌することができる。これらの組成物は、pH調節剤および緩衝剤、毒性調節剤などのような、生理的条件に近づけるために必要な医薬として許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸カルシウムなどを含有していてもよい。これら配合物中のキメラ分子の濃度は、広範囲に変えることができ、選択される特定の投与モードおよび患者の生理的要求にしたがって、主として、流体容積、粘度、体重に基づいて選択される。
したがって、静脈内投与用の一般的な医薬組成物は、約0.1〜10mg／患者／日であろう。特に、医薬が血液流中ではなくて隔離された部位、例えば体腔中または器官の内腔中に投与される場合、0.1〜約100mg／患者／日の投与量を利用する。非経口投与用組成物を実際に調製する方法は、当該技術分野の当業者にとって公知かまたは明らかであり、Remington’s Pharmaceutical Science第15版（1980年）、米国ペンシルベニア州イーストン所在のMack Publishing Company社発行のような刊行物に、より詳細に記載されている。
本発明の融合タンパク質を含有する組成物またはその混合薬（cocktail）（すなわち他のタンパク質を含有している）は治療用に投与することができる。治療に用いる場合、組成物は、疾患がみられる患者に、その疾患とその合併症を治癒させるかまたは少なくとも一部分抑制するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、“治療上有効な投与量”と定義される。この用途に有効な量は、疾患の重篤度と患者の健康の一般的な状態によって決まる。
組成物を単回投与するかまたは多数回投与するかは、患者が必要としかつ耐えることができる一回投与量と頻度によって決まる。いずれにしても本発明の組成物は、患者を有効に治療するのに十分な量の本発明のタンパク質を提供しなければならない。
本発明の細胞毒性融合タンパク質の各種用途には、該タンパク質の毒作用によって排除することができる、特定のヒト細胞が起こす各種の症状が含まれている。一つの好ましい用途は、例えば細胞毒に結合させた、IL−13受容体を標的として指向する分子（例えばIL−13または抗IL−13Ｒ抗体）を用いて癌を治療する用途である。
キメラ分子が、リガンドに結合された、IL−13受容体を標的として指向する分子を含有している場合、その分子のリガンド部分は目的とする用途によって選択される。上記リガンドの標的として利用できる、Ｔ細胞の膜上のタンパク質としてはCD２（Ｔ11），CD３，CD４およびCD８がある。標的として利用できる、Ｂ細胞上に支配的に見られるタンパク質としてはCD10（CALLA抗原）、CD19およびCD20が挙げられる。CD45はリンパ系細胞上に広く存在する可能性がある標的である。リガンドエフェクターを有するキメラ分子のこれらおよび他の可能性がある標的であるリンパ球標的分子は、“Leukocyte TypingIII”，A．J．McMichael編集、Oxford University Press（1987年）に記載されている。当該技術分野の当業者は、上記のようなさらに別の種類の細胞上に発現される受容体、例えば表皮増殖因子の受容体などのような膜糖タンパク質、またはリガンドもしくはホルモンの受容体に結合するリガンドエフェクターを選択できることが分かるであろう。
余り血管が存在していないか、または血液流中に存在する巨大分子が入るのを減らすか防止する。しっかりした結合で結合された細胞および／または活性輸送機構で保護されているいくつもの領域があることは、当該技術分野の当業者には分かっているであろう。したがって例えば、神経膠腫などの脳癌を治療するために行う治療薬の全身投与は、くも膜下腔中に巨大分子が入るのを阻止する血液脳間門によって抑止される。
これらの例の場合、本発明の治療組成物は、腫瘍部位に直接投与できることは当該技術分野の当業者にとって明らかであろう。従って、例えば脳腫瘍（例えば神経膠腫）は、治療組成物を腫瘍部位に直接（例えば外科的に挿入されたカテーテルを通じて）投与することによって治療することができる。カテーテルを通じて流体を送達する場合、加圧されていると、小分子（例えば本発明の治療用粒子）は一般に腫瘍の周縁を越えて２〜３cmも浸透する。
あるいは、本発明の組成物は、持効性製剤に入れて、標的部位に配置してもよい。このような製剤としては例えば治療用組成物を含浸させた、生体適合性のスポンジまたは他の不活性のもしくは再吸収可能なマトリックス材、ゆっくり溶解する放出カプセルまたはマイクロカプセルなどがある。
一般にカテーテルまたは持効性製剤は、外科的方法の一部として腫瘍部位に配置される。したがって、例えば主な腫瘍塊が外科手術で除去された場合、潅流カテーテルまたは持効性製剤は補助療法として腫瘍部位に配置することができる。勿論、腫瘍塊を外科手術で除くことが望ましくないか、必要でないかまた不可能な場合、本発明の治療用組成物を送達することが主要な治療方式である。
VII．診断キット
別の一実施態様で、本発明は、腫瘍治療用のまたはIL−13受容体を過剰に発現する細胞を検出するためのキットを提供するものである。キットには一般に、本発明のキメラ分子（例えばIL−13−標識、IL−13−細胞毒、IL−13−リガンドなど）が含まれている。さらにキットには一般にキメラ分子の使用法（例えば細胞毒として、腫瘍細胞の検出のため、免疫応答を増大するためなど）を開示する説明資料が入っている。またキットには、キットが設計されている特定の用途に用い易くするための追加の要素も入っている。したがって、例えばキットに、エフェクター分子が検出可能な標識であるキメラ分子が入っている場合、そのキットには、さらに標識を検出する手段（例えば、酵素標識に対する酵素の基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、ヒツジ抗マウスHRPのような適当な二次標識など）が入っている。キットにはさらに、特定の方法を実施するため日常的に使用されている緩衝剤などの試薬が入っている。このようなキットと適当な内容物は当該技術分野の当業者にとって公知である。
実施例
以下の実施例は本発明を例示するために提供するものであり本発明を限定しない。
実施例１
IL−13を過剰発現する細胞の確認
組換えヒトIL−４とIL−13を、メーカーの説明書にしたがって、IODO−GEN試薬（米国イリノイ州ロックフォード所在のPierce社）を用いて、125Ｉ（米国イリノイ州アーリントンヘイツ所在のAmersham Reseach Products社）で標識化した。放射能で標識化したサイトカイン類の比活性を測定したところ20〜100μCi／μｇタンパク質の範囲であった。結合試験の場合、一般に、１×106個の腎臓細胞癌腫（RCC）の腫瘍細胞を、非標識化IL−13の濃度を500nMまで増大させたりまたはさせずに、125Ｉ−IL−13（100pM）とともに４℃にて２時間インキュベートした。いくつかの実験では、IL−13Ｒの発現を、すでに報告されているのと同様に行って（Obiriら、J．Clin．Invest．，91巻、88〜93頁、1993年）試験した。そのデータを、LIGANDプログラム（Munsonら、Anal．Biochem．，107巻、220〜239頁、1980年）で分析して、受容体の数と結合アフィニティーを求めた。
４種のヒト腎細胞癌腫（RCC）細胞系（WS−RCC，HL−RCC，PM−RCCおよびMA−RCC）は125Ｉ−IL−13と特異的に結合し、そしてIL−13Ｒの密度は、WS−RCC細胞の場合の2100部位／細胞からHL−RCC細胞の場合の150,000部位／細胞まで変化した（表１）。このことは、IL−13受容体の発現が、正常な免疫細胞に比べて15〜約500倍の範囲内で増大していることを示している。対照的に、癌に過剰発現したIL−４受容体は4000部位／細胞と高い濃度が報告されている。Scatchardの分析（Scatchard，Ann．N．Y．Acad．Sci，51巻、660〜663頁、1949年）によって、１アフィニティークラスの受容体だけが各細胞系に発現されていることが明らかになった。３種のRCC細胞系では、結合アフィニティー（Kd）は100pM〜400pMの範囲内であったが、HL−RCC細胞は低アフィニティーの受容体（Kd-3nM）を発現した。
ヒトの単核細胞、Ｂ細胞および前骨髄（TF−１）細胞内でのIL−13の応答性はすでに報告されているが（例えば、de Waal Malefytら、J．Immunol．，151巻、6370〜6381頁、1993年；de Waal Malefytら、J．Immunol．，144巻、629〜633頁、1993年参照）、IL−13Ｒの構造またはこれらの細胞内または他の細胞内でのIL−13Ｒの結合特性についてはほとんど分かっていなかった。本願のデータは、新しく単離したヒトの単核細胞、EBV形質転換Ｂ細胞系およびTF−１細胞系が、ヒトRCC細胞と比べて、非常に少数のIL−13結合部位（100〜300／細胞）しか発現しないことを示している（表１）。一方、H9T細胞、LAK細胞および休止PBLまたは、PHA活性化PBLに対する125Ｉ−IL−13の結合は全く観察されなかった。このことは、Ｔリンパ球内でのIL−13応答性が、観察されなかったこと（Punnonenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90巻、3730〜3734頁、1993年）と両立している。
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実施例２
IL−13とIL−14は異なる受容体と結合する
最近、IL−２Ｒγc受容体サブユニットがIL−13Ｒと会合するということ（例えば、Russellら、Science，262巻、1880〜1883頁、1993年；Kondoら、Science，262巻、1874〜1877頁、1993年；Noguchiら、Science，262巻、1877〜1880頁、1993年；Kondoら、Science，263巻、1453〜1454頁、1994年；Giriら、EMBO J．，13巻、2822〜2830頁、1994年参照）、およびIL−13ＲがIL−４Ｒと共通の成分を共有しているかもしれないこと（Zurawskiら、EMBO J．，12巻、2663〜2670頁、1993年；Aversaら、J．Exp．Med．，178巻、2213〜2218頁、1993年）が報告された。これらの可能性を直接検討するため、125Ｉ−IL−４または125Ｉ−IL−13を用い、どちらかのサイトカインが過剰に存在しているかまたは存在していない条件下、放射能−リガンド結合試験を、HL−RCC細胞とWS−RCC細胞について、実施例１に記載されているようにして実施した。
未標識化IL−４は、類似の条件下、125Ｉ−IL−４がRCC細胞と結合するのをIL−13より一層有効に阻害した。すなわち未標識化IL−４はWS−RCCおよびHL−RCCそれぞれの125Ｉ−IL−４との結合全体の84％と72％を置換し、そしてIL−13はWS−RCCおよびHL−RCCそれぞれの125Ｉ−IL−４との結合全体の61％と51％を置換した。一方、125Ｉ−IL−13の結合はIL−13によって有効に置換されたが（両細胞型の場合、全結合の約85％）、IL−４はごくわずかしか置換しなかった（WS−RCCの場合は全結合の12％でHL−RCCの場合は全結合の７％）。これらの試験結果は、IL−４とIL−13の両者はお互いの受容体と相互に作用するが、125Ｉ−IL−13の結合のIL−４による阻害が弱くかつ125Ｉ−IL−４の結合のIL−13による阻害が完全ではなかったのでその相互作用が同一でないことを示している。これらの試験結果は、IL−３がTF−１細胞に対して結合しているIL−４と競合することが発見されたという以前の観察結果と一致している（Zarawskiら、EMBO J．，12巻、2663〜2670頁、1993年）。しかしその報告では、逆の試験は行われなかった。したがって、これらのデータは、たとえIL−13はIL−14の結合と競合しても、IL−４はIL−13の結合と競合しなかったことを示している。
リンパ系のMLA144細胞とRAJI細胞系のIL−４結合部位に対する、IL−13の競合も試験した。これらの細胞を、過剰の未標識化IL−４もしくはIL−13ありまたはなしで、放射能標識化IL−４とともにインキュベートした。過剰の未標識化IL−４は、MLA144細胞とRAJI細胞に結合した標識化125Ｉ−IL−４を有効に置換したが、過剰のIL−13は上記結合と競合できなかった。この観察結果は、IL−13がIL−４の結合と競合したというRCC細胞について見られた結果と相違している。IL−13が、MLA144に対する125Ｉ−IL−４の結合と競合できないことは、IL−13が末梢血液Ｔ細胞（またはMLA144細胞）と結合しなかったという観察結果と矛盾しない。
実施例３
IL−13受容体とIL−４受容体のサブユニット構造
RCC細胞上でのIL−13Ｒのサブユニット構造を架橋法で試験した。細胞（５×106）を、過剰のIL−13またはIL−４が存在しているかまたは存在していない条件下、４℃で２時間、125Ｉ−IL−13または125Ｉ−IL−４で標識化した。結合したリガンドを、スベリン酸ジスクシンイミジル（DSS）（米国イリノイ州ロックフォード所在のPierce社）（最終濃度２mM）を用いて、30分間、その受容体と架橋させた。細胞を、１％  Triton X-100，１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、0.02mMロイペプチン、5.0μＭトリプシンインヒビター、10mMベンズアミジンHCl，１mMフェナントロリンヨードアセトアミド、50mMアミノカプロン酸、10μｇ／mlペプスタチンおよび10μｇ／mlアプロチニンを含有する緩衝剤に溶解した。その細胞溶液を、２−メルカプトエタノールを含有する緩衝液中で煮沸することによって透明にして、８％SDS／ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で分析した。次にそのゲルを乾燥しオートラジオグラフィーに付した。いくかの実験で、受容体／リガンド複合体を、Ｐ７抗hIL−４Ｒ抗体または抗−γc抗体とともにプレインキュベートしたプロテインＡセファロースビーズとともにインキュベートすることによって、一夜４℃で該溶液から免疫沈澱させ、次いで上記のようにして分析した。
標識化125Ｉ−IL−13は、４種のすべてのRCC細胞系上の一つの主要タンパク質と架橋し、その複合体は、68〜80KDaの範囲の単一の広いバンドとして泳動した。また一つの単一バンドが、ゲルをはかるに長時間露出したときのみ、ヒト前骨髄TF−１．Ｊ61細胞に観察された。IL−13の分子量（12KDa）を差引いて、IL−13結合タンパク質の大きさが56〜68KDaであると推定した。200倍のモル濃度の過剰IL−13の存在下で架橋させたとき125Ｉ−IL−13の架橋バンドは観察されなかった。その主要バンドに加えて、約45KDaの弱いバンドがHL−RCCとPM−RCCの細胞の場合にみとめられたが、MA−RCC細胞では観察されなかった。未標識化IL−13は125Ｉ−IL−13の結合と競合するので、上記のバンドはIL−13Ｒと特に関連しているようであった。このバンドは、IL−13Ｒ関連タンパク質かまたは前記の大きなバンドのタンパク質分解に関連する断片を示すものであろう。125Ｉ−IL−13の結合が未標識化IL−13によって置換されるのと対照的に、過剰の未標識化IL−４は、RCC細胞系の場合、IL−13Ｒのバンドが出現するのを防止しなかった。一方、IL−13は、WS−RCC細胞上の両主要タンパク質に結合する125Ｉ−IL−４と競合した。125Ｉ−IL−13架橋タンパク質は、MA−RCCの場合に見られるものに比べてTF−１．Ｊ61，WS−RCC，PM−RCCおよびHL−RCCの細胞系の場合、大きさがわずかに大きかったことは興味深い。翻訳後の修飾、例えばグリコシル化またはリン酸化を行えば上記の差異を説明するかもしれない。
実施例４
IL−13−PE融合タンパク質の構築
１）IL−13−PE38QQRをコードするプラスミドの構築
キメラ毒素を構築するため、ヒトインターロイキン13（hIL−13）遺伝子のコーディング領域（プラスミドJFE14−SRα）（Mintyら、Nature，362巻、248頁、1993年；Mckenzieら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90巻、3735頁、1987年）を、PEの変異形であるPE38QQRをコードする遺伝子に融合させ、キメラ分子をコードする構造体（phuIL−13−Tx）を製造した。具体的に述べると、ヒトIL−13をコードするDNAはプラスミドJFE14−SRαからPCRで増幅させた。NdeＩ部位を取り入れたセンスプライマーとHindIII部位を取り入れたアンチセンスプライマーをそれぞれ用いPCRによってhIL−13遺伝子の５’末端と３’末端に、制限エンドヌクレアーゼNdeＩとHindIIIの新しい部位を導入した。
hIL−13をコードするNdeＩ／HindIII断片を、プラスミドpWDMH4−38QQR（Debinskiら、Int．J．Cancer，58巻、744〜748頁、1994年）またはプラスミドpSGC242Fd N1（Debinskiら、Clin．Res．42巻、251A（アブストラクト）、1994年）をNdeＩとHindIIIで消化することによって得たベクター中に、サブクローン化して、プラスミドphuIL−13−Txを製造した。その遺伝子融合体の５’末端の配列を決定してhIL−13の正しいDNAを示した。
ヒトインターロイキン４（hIL−４）を、hIL−13と類似の方法で、PCR増幅用の鋳型としてプラスミドpWDMH4（Debinskiら、J．Biol．Chem．，268巻、14065〜14070頁、1993年）を用いて発現ベクター中にクローン化した。組換えタンパク質類は、T7後期プロモーター（Id）に制御されているイー・コリBL21（λDE３）中に発現させた。T7バクテリオファージ後期プロモーターに加えて、上記プラスミドは、そのタンパク質のオープンリーディングフレームの末端にT7転写ターミネータを有し、またf1複製起点およびアンピシリン耐性の遺伝子（Debinskiら、J．Clin．Invest．，90巻、405〜411頁、1992年）を有している。これらのプラスミドをイー・コリ（HB101またはDH５αの高効率形質転換）（BRL）内で増幅させ次にDNAをQiagen kit（米国カリフォルニア州チャッツワース）を用いて抽出した。
２）組換えタンパク質類の発現と精製
イー・コリBL21（λDE３）細胞を関連するプラスミドで形質転換し、次にスーパーブロス（Super broth）10ｌ中で培養した。発現した組換えヒトIL−13とヒトIL−13−PE38QQRを封入体中に入れた。その組換えタンパク質を、Debinskiら、J．Biol．Chem．，268巻、14065〜14070頁、1993年に記載されているようにして前記封入体から単離した。透析を行った後、ヒトIL−13 PE38QQRの再生タンパク質をＱ−Sepharose Fast FlowおよびSephacryl Ｓ−200HRを用いるサイズ排除クロマトグラフィー（米国ニュージャージー州ピスキャタウエイ所在のPharmacia社）で精製した。hIL−13またはhIL−４の精製の初期ステップは、SP−Sepharose Fast Flow（Pharmacia社）で実施した。
タンパク質の濃度は、標準としてBSAを用いてBradford検定法（米国イリノイ州ロックフォード所在Pierce社の“Plus”）で測定した。
ヒトIL−13とIL−13−PE38QQRは、全細胞抽出物のSDS−PAGEによる分析結果に見られるように、細菌中に高レベルで発現した。SP Sepharose（hIL−13）またはＱ−Sepharose（hIL−13−PE38QQR）による初期精製の後、再生組換えタンパク質を、Sephacryl Ｓ−200HR Pharmaciのカラムに加えた。ヒトIL−13とhIL−13−PE38QQRは非常に高い純度の最終生成物を示す単一の構成要素として出現た。そのキメラ毒素は、50KDaのプロテインＭの範囲として予想されるよりいくぶん低く泳動したが、これは分子の疎水性に関連するのかもしれない。そのrhIL−13の生物活性は市販のhIL−13と全く同じであった。
実施例５
ヒト癌腫細胞に対するIL−13PE融合タンパク質の活性
３）hIL−13−PE38QQRの細胞毒活性
hIL−13 PE38QQRなどのキメラ毒素の細胞毒活性を、タンパク質合成の阻害を測定することによって試験した。タンパク質合成は、１mlの培地中、24ウェル組織培養プレート内で約１×104の細胞を平板培養することによって検定した。細胞を平板に播いてから20〜28時間後に、各種濃度のキメラ毒素を添加した。キメラ毒素とともに20時間インキュベートした後、〔3Ｈ〕−ロイシンを４時間、細胞に添加し、細胞と会合した放射能を測定した。遮断（blocking）の試験を行うため、キメラ毒素を添加する30分前に、rhIL−２，４または13を細胞に添加した。データは２個の測定値の平均値から得た。そして検定は数回繰り返した。
いくかの確定癌細胞系に対してhIL−13−PE38QQRが細胞毒性であるかどうかを決定するための試験を行った。特に結腸、皮膚および胃由来の癌を試験した。これらの癌細胞は、１ng／ml以下〜300ng／ml（20pM〜6.0nM）の範囲内のID50値でhIL−13−PE38QQRに対して感受性であった（ID50は、擬似処理を行った細胞に比べてタンパク質合成が50％低下したときのキメラ毒素の濃度を示す）。結腸の腺癌細胞系のColo 201は高い応答を示し、IC50は１ng／mlであった。またA431類表皮癌腫細胞系もhIL−13毒素の作用に対し非常に感受性であり、hIL−13−PE38QQRに対するID50は６〜10ng／mlの範囲内であった。胃癌腫のCRL1739細胞系はhIL−13毒素に対し中位の応答を示しID50は50ng／mlであった。別の結腸癌腫細胞系のColo205は応答が少なくてID50は300ng／mlであった。
kIL−13−PE38QQRの細胞毒作用は、全細胞に対して10倍過剰のhIL−13で遮断されたとき特異的であった。これらのデータは、１スペクトルのヒト癌細胞がhIL−13結合部位を有しているのでこれらの細胞がhIL−13−PE38QQRキメラ毒素に対して感受性であることを示唆している。
hIL−13ＲはIL−２Ｒのγcサブユニットを共有していることが示唆されているので（Russelら、Science，262巻、1880〜1883頁、1993年）、A431細胞とCRL1739細胞すなわちキメラ毒素に対して異なる感受性を有する二つの細胞系に対するhIL−13−PE38QQRの作用の特異性をさらに調べた。これらの細胞を、rhIL−２の存在下または非存在下、1.0μｇ／mlまたは10μｇ／mlの濃度のhIL−13−PE38QQRで処理した。rhIL−２は、キメラ毒素の10,000倍の過剰モル濃度であっても、これら二つの細胞においてhIL−13−PE38QQRに対する遮断作用を全く示さなかった。この試験結果は、hIL−13−毒素による殺細胞作用はhIL−２の存在とは無関係であることを示している。
４）IL−４は、IL−２と異なりIL−13−PE38QQRの作用を遮断する
未変性hIL−４を細胞に加え、次にその細胞をhIL−13 PE38QQRで処理した。予想外のことに、hIL−４がhIL−13−毒素の細胞毒活性を阻害することが発見されたのである。この現象は、Colo201，A431およびCRL1739を含むすべての被検細胞系にみとめられた。hIL−13とhIL−４が同じ結合部位について競合するかもしれないという可能性を調べるため、これらの細胞をhIL−４ベースの組換え毒素のhIL−４ PE38QQR（Debinskiら、Int．J．Cancer，８巻、744〜748頁、1994年）で処理した。hIL−４−PE38QQRの細胞毒作用は、過剰のhIL−４によって遮断されるが過剰のhIL−２によっては遮断されないことはすでに報告されている（前記報文）。本実験では、hIL−13の効力がhIL−４−PE38QQRの細胞毒活性を強く遮断した。また別のhIL−４ベースのキメラ毒素であるhIL−４−PE4E（Debinskiら、J．Biol．Chem．，268巻、14065〜14070頁、1993年）のColo201細胞とA431細胞に対する作用は過剰のhIL−13によって遮断された。したがってhIL−13−PE38QQRの細胞毒性は過剰のhIL−13またはhIL−４によって遮断され、そしてhIL−４−PE38QQRの細胞毒作用も同じ２種の増殖因子によって遮断された。しかしIL−２は両者のキメラ毒の作用を遮断しない。これらの試験結果は、hIL−４とIL−13が共通の結合部位に対して親和性をもっていることを強く示唆している。
この結論は、一つのサイトカインが二つのキメラ毒素の混合物の作用を遮断するという観察結果によって支持された。A431細胞を、hIL−13−PE38QQRとhIL−４−PE38QQR両方のキメラ毒素とともにインキュベートすると、予想どおりに、付随して細胞毒作用が保持されかつ追加の作用がみとめられた。過剰のhIL−13は二つのキメラ毒素の混合物の作用を有効に遮断した。さらに、hIL−13−PE38QQRとTGFα−PE40で構成される別の混合物すなわちEGFRを標的として指向するキメラ毒素（TGFαベースのキメラ毒素、TGFα−PE−40）による殺細胞性を、hIL−13とhIL−４のどちらも遮断しなかった（Siegallら、FASEB J．，３巻、2647〜2652頁、1992年）。同じことがColo201細胞についてもみとめられた。
５）IL−13およびIL−４による、キメラ毒素の相互遮断は結合部位に対する競合が原因である
競合結合検定法で、ヒトIL−13の結合性をヒトIL−４−PE38QQRと比較した。Debinskiら、J．Clin．Invest．，90巻、405〜411頁、1992年に記載されているラクトペルオキシダーゼ法を用いて、組換えhIL−４−PE38QQRを125Ｉで標識化した。結合検定を、標準の飽和−置換曲線分析法によって実施した。A431類表皮癌腫細胞を、試験を行う24時間前、24ウェル組織培養プレートに105細胞／ウェルの数で接種した。これらプレートを氷の上において、前掲報文に記載されているように、0.2％ BSA中Ca++，Mg++を含有していない氷冷PBSで洗浄した。hIL−13またはhIL−４−PE38QQRの濃度を上げながら細胞に添加して30分間インキュベートし、次に一定量の125Ｉ−hIL−４−PE38QQR（比活性：6.2μCi／μｇタンパク質）を添加して２〜３時間インキュベートした。インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、0.1Ｎ NaOHで溶解し、次いで放射能をγ−カウンターでカウントした。
ヒトIL−４−PE38QQRは、125Ｉ−hIL−４−PE38QQRのA431細胞との結合と競合し、見掛けのID50は４×10-8Ｍであった。その上、hIL−13も、そのキメラタンパク質が示す効力に匹敵する効力で、125Ｉ−hIL−４−PE38QQRの結合部位に対して競合した。さらに広範な結合性の試験によって、hIL−13もヒト腎臓癌腫細胞系のhIL−４結合部位に対して競合することが分かった。
受容体が仲介する細胞内取込みのプロセスおよび結合後のPE細胞毒性ステップに対しhIL−13またはhIL−４が影響する可能性は、次の細胞類すなわち（ｉ）未変性PE（PEはα2−マクログロブリン受容体に結合する）、（ii）TGFα−PE40、および（iii）組換え免疫毒素C242γF（ab’）−PE38QQR（Debinskiら、Clin．Res．，42巻、251A（アブストラクト）、1994年）を添加することによって排除される。C242γF（ab’）−PE38QQRはシアリル化糖タンパク質である腫瘍関連抗原に結合する（Debinskiら、J．Clin．Invest．，90巻、405〜411頁、1992年）。これらの組換え毒素の予想される細胞毒作用が観察されかつhIL−13もhIL−４も、A431細胞とColo205細胞に対するこれらの作用を遮断しなかった。
６）hIL−４とIL−13は、癌腫細胞上の共通結合部位に対して競合するが異なる生物学的作用を起こす
たとえhIL−13とhIL−４が共通の結合部位に対して競合するとはいえ、異なる細胞作用を誘発する。A431類表皮癌腫細胞内のタンパク質合成は、hIL−４単独、またはhIL−４を含有するADP−リボシル化不全キメラ毒素（ADP-ribosylation deficient chimeric toxin）（Debinskiら、Int．J．Cancer，58巻、744〜748頁、1994年）によって、投与量依存方式で阻害された。hIL−４または酵素的に不十分なキメラ毒素（enzymatically deficient chimeric toxin）のこの作用は、インキュベーション時間を延長したとき（≧24時間）に最高にみとめられ、トリチウムの取込みを実質的に減少させるため、hIL−４の濃度は活性キメラ毒素の濃度の多数倍の濃度にする必要がある。しかし、A431細胞を各種の濃度のhIL−13が処理したところ、タンパク質合成の阻害（または刺激）は、10μｇ／mlと高いhIL−13の濃度で72時間インキュベートしても全く観察されなかった。hIL−13に対する応答の同様の欠如は腎細胞癌腫細胞PM−RCCについても見出された。したがって、hIL−13とhIL−４は、共通の結合部位をもっているかもしれないが、その共通部位を発現する癌腫細胞、例えばA431細胞およびPM−RCC細胞内に異なる方式でトランスデュース（transduce）するようである。
実施例６
IL−13はｐ140 IL−４レセプター鎖に対して独立にヒト腎細胞癌腫細胞の増殖を阻害する
ヒト腎細胞癌腫細胞（RCC）は多数の中程度〜高度のアフィニティーのIL−13レセプターを発現するので、RCC細胞のin vitro増殖に対するIL−13の作用を決定した。RCC細胞へのIL−13の結合およびRCC細胞の増殖のIL−13調節に対する抗IL−４抗体および抗IL−４抗体の作用を検査することによって、IL−13レセプターとIL−４レセプターとの間の相互作用を評価した。
１）IL−13によるRCC細胞の増殖の阻害
腎細胞癌腫細胞WS−RCCおよびPM−RCCを以前に記載されたように（Obirri，et al．，J．Clin．Invest．前掲）誘導し、そして10％胎仔ウシ血清（FBS）、グルタミン（２mM）、HEPES緩衝液（10mM）、ペニシリン（100Ｕ／ml）およびストレプトマイシン（100μｇ／ml）を補充した4.5ｇ／ｌのグルコースを含むDMEMから成る培地（CM）中で維持した。
増殖アッセイのために、RCC細胞を収穫し、洗浄し、CM中に再懸濁させ、ここでFBS含量は0.5％に減少された。10,000細胞を96ウェルのマイクロタイター組織培養プレートの各ウェルの中にプレートし、37℃において５％CO2環境中で一夜培養した。IL−13および／またはIL−４（０〜1000ng／ml）を添加し、さらに72時間インキュベートした。いくつかの培養物を抗IL−４抗体または抗IL−４Ｒ抗体（１〜10μｇ／ml）で同時に処理した。［3Ｈ］−チミジン（１μCi／ウェル）を最終の20時間のインキュベーションのために添加した。インキュベーションの終わりにおいて、細胞をトリプシンまたは急速／融解サイクルにより分解し、細胞収穫器を有するガラスフィルターマット（Skatron、ノールウェイ国リエル）上に収穫した。ベータプレート（Betaplate）シンチレーションカウター（LKB、マリイランド州ガイサーバーグ）により、［3Ｈ］−チミジンの吸収を測定した。
IL−13は、WS−RCCおよびPM−RCC細胞系において濃度依存的方法で細胞増殖を50％まで阻害した。0.1〜１ng／mlのIL−13は最大の阻害作用を引き起こすので、PM−RCC細胞系はIL−13に対していっそう感受性であった。他方の細胞系のWS−RCCは最大の作用を得るために100ng／ml程度に多いIL−13を必要とした。さらに、IL−13は10ng／mlの濃度においてHL−RCC細胞の増殖を33％だけ減少した。より高い濃度のIL−13（2000ng／mlまで）は追加の増殖阻害作用をもたなかった。このIL−13の増殖阻害作用は、ヒトRCC細胞についてIL−４で観測された作用に類似する。
RCC細胞の生活能力に対するIL−13の作用を検査するために、細胞を12ウェルの組織培養プレート中で５×104／MIにおいてIL−13（０〜100ng／ml）の存在下に培養した。72時間後、細胞をトリプシン／ヴェルセンで収穫し、洗浄し、そして細胞を計数するためにトリパンブルー中に希釈した。生活能力をトリパンブルーの排除により決定した。対照培養物において、生活能力（平均±４重反復実験の試料のSD）は95±10％であったが、10または100ng／mlのIL−13で処理した培養物における生活能力は、それぞれ、92.5±9.6および93±8.9であった。したがって、IL−13はRCC細胞に対して直接の細胞障害作用をもたなかった。
IL−13はIL−４の結合について競合し、そしてIL−４の成熟形態はIL−13およびIL−４の作用を阻害する（Zurawski，et al．，EMBO J．，12：2663（1993））ので、IL−４およびIL−13の双方の増殖阻害作用をブロックする抗IL−４抗体または抗IL−４Ｒ抗体の能力を決定した。この実験のために、WS−RCC細胞をIL−13またはIL−４単独で、またはhIL−４に対する中和性ポリクローナル抗体またはIL−４Ｒに対するモノクローナル抗体（Ｍ57）の存在においてIL−13またはIL−４で処理した。適当な抗hIL−13は容易に入手可能でないので、このアプローチを選択した。
IL−13処理培養物（処理において1913±364／対照において3222±458cpm）およびIL−４処理培養物（処理において2262±210／対照において3222±458cpm）において、［3Ｈ］−チミジンの吸収は有意に阻害された（ｐ＜0.005）。増殖のIL−４仲介阻害はポリクローナル抗IL−４抗体により阻害されたが、IL−13の阻害作用は抗IL−４抗体の添加により影響を受けなかった。さらに、IL−４の抗増殖作用は、また、Ｍ
57により阻害された。この抗体により、IL−４Ｒに対するモノクローナル抗体は影響を受けたが、IL−13の抗増殖作用は影響を受けなかった。
WS−RCC細胞をIL−４とIL−13との組み合わせで処理したとき、細胞増殖の生ずる阻害は、いずれかのサイトカイン単独で処理した培養において見られるものと有意に異ならなかった。したがって、IL−４およびIL−13はRCC細胞の増殖に対して同様な作用を発揮するが、それらの作用は２つのサイトカインを一緒に使用することによって増強することができなかった。
２）IL−13によるRCCコロニー形成の阻害
RCC腫瘍細胞の増殖の観察されたIL−13仲介阻害を確証するために、コロニー形成アッセイを使用して、RCC細胞の増殖に対するIL−13の作用を評価した。500RCC細胞を三重反復実験の100cm2組織培養の処理されたペトリ皿にプレートし、そして種々の濃度のIL−13で処理した。比較の目的で、RCC細胞をまたIL−４で同様に処理した。10日の培養期間後、対照グループおよびサイトカインで処理したグループにおいて形成したコロニーの百分率を比較した。
IL−13は、PM−RCCおよびWS−RCC細胞におけるコロニー形成を濃度依存的方法で阻害した。コロニー形成の最大34％の減少がWS−RCC細胞系において観察された。反復実験において、PM−RCC細胞において観察された最大阻害は13〜32％の範囲であった。WS−RCC細胞におけるコロニー形成の阻害の反応速度論は、PM−RCC細胞において観察されたものに類似した。比較すると、IL−４はIL−13と同程度に双方の細胞系におけるコロニー形成を阻害した。しかしながら、PM−RCC細胞はWS−RCC細胞よりもIL−４作用に対してわずかに感受性であるように思われる。
３）IL−13結合に対する抗IL−４Ｒ抗体の作用
上に説明したように、ヒトRCC細胞について、IL−13は125Ｉ−IL−４の結合について競合するが、IL−４は125Ｉ−IL−13について競合しない。IL−13によるIL−４結合の阻害に根元的なメカニズムを理解し、かつIL−13Ｒによるリガンド結合の忠実度を評価するために、IL−４ＲおよびIL−13Ｒの双方を発現する、PM−RCC細胞への125Ｉ−IL−13の結合に対する抗IL−４Ｒ抗体の作用を検査した。対照として、PM−RCC細胞への125Ｉ−IL−４の結合のこの抗体の作用をまた試験した。
製造業者の使用説明書に従いIODO−GEN試薬（Pierce Chem．Co．）を使用して、組換えヒトIL−４およびIL−13を125Ｉ（Amersham Corp．）で標識化した。比活性は125Ｉ−IL−４についての20〜80μCi／μｇから、125Ｉ−IL−13についての80〜120μCi／μｇまでの範囲であった。約１×106細胞を放射性標識化リガンド（0.64nM）と緩衝化培地単独中で、または過剰のサイトカイン（128nM）；ヒトIL−４Ｒに対して発生したモノクローナル抗体（Ｍ57）またはポリクローナル抗体（Ｐ２，Ｐ３，Ｐ７）の存在においてインキュベートした。抗体を１：64の最終希釈において使用した。インキュベーションを４℃において震盪水浴中で２時間実施した。放射性リガンドを結合した細胞を油勾配を通す遠心により結合しない細胞から分離し、そして結合した放射性をガンマカウンターにより測定した。
125Ｉ−IL−13および125Ｉ−IL−４の双方はPM−RCC細胞に特異的に結合した（それぞれ、181,650±3,182cpmおよび9,263±576cpm）。非標識化IL−13は125Ｉ−IL−13の結合についてよく競合したが、IL−４またはIL−４Ｒに対する３つの異なるポリクローナル抗体のいずれもPM−RCC細胞に対する125Ｉ−IL−13の結合について競合しなかった。同様に、IL−４Ｒに対するモノクローナル抗体（Ｍ57）はPM−RCC細胞への125Ｉ−IL−13の結合をブロックしなかった。対照的に、IL−４，IL−13および抗IL−４Ｒ抗体（Ｐ７）のすべてはこれらの細胞に対する125Ｉ−IL−４の結合について競合した。
この実施例は、IL−13がヒトRCC細胞の増殖を濃度依存的方法で阻害することを証明する。最大50％の増殖阻害が観察され、そしてIL−13のこの増殖阻害作用はコロニー形成アッセイの結果により支持される。同一濃度範囲のIL−13が双方のRCC細胞系におけるコロニー形成を阻害したことは注目に値する。同様な大きさの増殖阻害がIL−４について報告されたが、これはRCC細胞に対するIL−13の直接の抗腫瘍作用の最初の報告である。さらに、RCC細胞におけるコロニー形成に対するIL−４の阻害作用は従来報告されてきていない。
IL−13の抗腫瘍作用はIL−４に対して独立であり、そしてIL−４Ｒを含まなかった。これは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（IL−４に対するか、またはIL−４Ｒの140kDaのサブユニットに対する）がIL−13の増殖阻害作用に影響を与えるという事実により証明される。IL−４を使用して従来観察されたように、RCCの増殖に対するIL−13の阻害作用は細胞障害性よりもしろ細胞増殖抑制性であった。なぜなら、10、または100ng／mlのIL−13とともに培養した細胞における生活能力は72時間の処理後に対照培養物において観察されたものに類似したからである。
最近、IL−13は正常および白血病性Ｂ前駆体細胞の増殖をin vitroにおいて30％だけ直接阻害することが示された（Renard et al．，Blood，84：2253−（1994））。IL−13のこの増殖阻害作用は、IL−４Ｒの140kDaのサブユニットに対する抗体により阻害された。同様に、TF−１細胞に対するIL−13の増殖刺激作用は、また、IL−４Ｒに対する抗体によりブロックされることが示された（例えば、Tony et al．，Europ．J．Biochem．，225：659（1994））。しかしながら、この研究において、IL−４Ｒに対する３つの異なる抗体のいずれもIL−13の増殖阻害作用をブロックしなかった。これらの対照的な発見は、この研究において使用する抗体および他により使用される抗体がIL−４Ｒタンパク質の異なるエピトープに対して向けられていることを示唆する。我々が賛成する別の説明は、RCC上のIL−13Ｒがリンパ系細胞上で発現されるものと構造的に異なるということである。
RCC上で発現されたIL−４Ｒとリンパ系細胞上で発現されたものとの間の構造的差は同定された。これらは腫瘍細胞のIL−４ＲにおけるIL−２，４，７，９および15のレセプターの共通のガンマ鎖の非存在を包含するが、この鎖は免疫細胞のIL−４Ｒの中に存在する（Obiri et al．，Oncol．Res．６：419（1994））。
従来の研究において、IL−４Ｒに対する抗体はIL−13に対する細胞の応答をブロックすることが証明された（Tony et al．，Europ．J．Biochem．225：659（1994））。しかしながら、細胞への125Ｉ−IL−13の結合に対するこれらの抗体は研究されなかった。放射性標識化IL−４のそのレセプターへの結合を事実ブロックするIL−４Ｒに対するポリクローナル抗体が、放射性標識化IL−13のRCC細胞のそのレセプターへの結合をブロックすることができなかったことを、我々はここで報告する。これらのデータが示唆するように、RCC細胞において、IL−13とそのレセプターとの相互作用はIL−４Ｒの140kDaのサブユニットを含まず、そしてIL−13の作用は多分IL−４と共有しないレセプターにより仲介される。
それにもかかわらず、前述の実施例からの結果はIL−４ＲとIL−13Ｒとの間の多少の１または２以上の共通の因子を事実示唆する。例えば、IL−13は〜70kDaのタンパク質に結合し、そしてIL−４結合について競合するが、IL−４はRCC細胞においてIL−13の結合について競合しなかった。さらに、IL−４は〜70kDaのタンパク質ならびにその主要な140kDaの結合タンパク質に架橋する。総合すると、これらのデータは〜70kDaのタンパク質がIL−13およびIL−４の双方に結合することを示唆する。これにより示されるように、〜70kDaのタンパク質は、構成成分の１つがIL−13単独に結合するが、他の成分がIL−13およびIL−４の双方に結合する、ホモポリマーでありうる。さらに、データが示唆するように、それは〜70kDaのタンパク質の双方の推定上の成分に結合するので、IL−13はIL−４よりも高い結合アフィニティーを有し、IL−４は、多くて、IL−13レセプターの１つの成分に結合するように思われる。このような配置はIL−13が125Ｉ−IL−４について競合するという発見を説明するが、IL−４はこれらの細胞上の125Ｉ−IL−13の結合について競合しない。最後に、IL−４Ｒに対する抗体はIL−13の結合について競合せず、そしてIL−４Ｒからのｐ140に架橋する125Ｉ−IL−13はRCC細胞において検出されなかったので、IL−13は140kDaのIL−４結合サブユニットを利用しないように思われる。
IL−４とIL−13との組み合わせがいずれのサイトカインよりもよくRCC細胞の増殖を阻害しないという観察は、IL−４およびIL−13の抗増殖作用が共通のレセプターのサブユニットまたは共通のシグナル経路を通して伝達されることを示唆する。これは２つのサイトカインのために共有されたレセプターまたはレセプター成分の考えと一致し、そしてIL−13およびIL−４の双方がキナーゼのヤヌスファミリー（JAK１）の１メンバーならびにIL−４Ｒの140kDaのサブユニットをリン酸化し、そして異なる細胞型において転写（STAT６）タンパク質の同一のシグナルトランスジューサーおよびアクチベーターを活性化するという観察と一致する。
要約すると、IL−13は、IL−４と同様に、in vitroのRCCの増殖を直接阻害する。抗IL−４Ｒ抗体はIL−13のそのレセプターへの結合を阻害せず、かつRCC細胞に対するIL−13の作用を阻害しなかったので、IL−13の作用はIL−４に対して独立である。この発見が示唆するように、IL−13Ｒ特異的キメラ分子はRCCの管理に特に有効である。
実施例７
組換えIL−13−PE細胞毒素によるヒト腎細胞癌腫細胞上のインターロイキン−13レセプターのターゲッティング
１）IL−13−トキシン融合タンパク質の細胞障害性
IL４−トキシンの細胞障害性を前述したように試験した。典型的には、種々の濃度のIL−トキシンを含むか、または含まないロイシン不含培地中で104RCC腫瘍細胞または他の細胞を37℃において20〜22時間培養した。次いで１μCiの［3Ｈ］−ロイシン（NEN Research Products、米国デラウェア州ウィルミントン）を各ウェルに添加し、さらに４時間インキュベートした。細胞を収穫し、そして細胞の中に組込まれた放射能をベータプレートカウンター（Wallac−Lkb、米国マリイランド州ガイサーバーグ）により測定した。
ヒトRCC細胞は多数のIL−13を発現するために、４つの主要な細胞培養物（PM−RCC，WS−RCC，MA−RCCおよびHL−RCC）およびRCC細胞系の長期間の培養物（RC−２）を試験した（実施例１参照）。RCC細胞は、0.03ng／ml程度に低い〜350ng／mlまで（＜２fM〜１nM）の範囲のIC50を有するIL13−トキシンの細胞障害活性に対して感受性であった（表２）。我々の実験室において発生したRCC細胞のすべての４つの一次培養物は、長期間のRCC細胞系（CAKI−１）と比較してIL13−PE38QQRに対していっそう感受性であると思われた。過剰のIL−13はIL13−トキシンの細胞障害活性を中和するので、IL13−トキシンの細胞障害活性は特異的でありかつIL−13Ｒを通して伝達された。したがって、RCC細胞は独特に低い濃厚物のキメラタンパク質においてIL13−PE38QQRにより殺された。
0004202417.tif 000004
１）IL−13Ｒの発現とIL13−トキシンに対する感受性との間の相関
前述したように、主要なRCC細胞系、例えば、PM−RCC，WS−RCC，HL−RCC、およびMA−RCCは変化する数の高〜中程度のアフィニティーのIL−13Ｒを発現した。しかしながら、CAKI−１  RCC細胞系に対するIL−13結合特性は決定されず、したがって、これらのRCCについて［125Ｉ］−IL−13を利用してIL−13結合研究を実施した。
製造業者のインストラクションに従いIODOGEN試薬（Pierce、米国イリノイ州ロックフォード）を使用して、IL−13をヨウ素化した。放射性標識化IL−13の比活性は44〜128μCi／μｇの範囲であった。IL−13結合アッセイを前述したように実施した（実施例１参照）。簡単に述べると、RCC腫瘍細胞をヴェルセン（Biowhittaker）と短時間インキュベートした後、収穫し、ハックス平衡塩溶液中で３回洗浄し、結合緩衝液（RPMI1640＋１mMのHEPESおよび0.2％のヒト血清アルブミン）の中に再懸濁させた。IL−13置換アッセイのために、RCC（１×106／100μｌ）細胞を４℃において、増加する濃度のIL−13またはIL13−PE38QQRの存在または非存在下に、125Ｉ−IL−13（100〜200pM）とインキュベートした。２時間のインキュベーション後、フタレート油勾配を通して遠心することによって、放射性リガンドを結合した細胞を未結合細胞と分離し、そして放射能をガンマカウンター（Wallac）で測定した。
CAKI−１  RCC細胞系は放射性標識化IL−13によく結合せず、そしてわずかに＜100のIL−13結合部位／細胞を発現した（表１）。IL13−トキシンに対するこれらの細胞系の感受性は、また、IL−13結合部位の数／細胞に依存して変化した。CAKI−１  RCCは最小の感受性を示した。対照的に、HL−RCC細胞は極端に感受性であり、そして150,000のIL−13結合部位／細胞を発現した。
２）MA−RCCのin vivo継代はIL13−トキシンに対する感受性を減少しない
ヒトRCCに対するIL13−トキシンの抗腫瘍活性を決定するために、ヒトRCC細胞をヌードマウス、照射した（300ラド）ヌードマウス、およびSCIDマウスにおいて皮下腫瘍として増殖させた。しかしながら、これらのRCC細胞はこれらの免疫担当マウスのいずれにおいても首尾一貫して増殖しなかった。ある場合において、腫瘍は非常にゆっくり増殖したが、中央において壊死性となり、生活能力なRCC細胞の白色縁が存在した。
したがって、IL13−トキシンの抗腫瘍活性はin vivoにおいて評価されなかった。しかしながら、MA−RCCをヌードマウスにおいて継代し、そして継代腫瘍を使用して単細胞の懸濁液を調製した。これらの細胞は組織培養において事実増殖し、１〜３継代後、IL13−トキシンに対するそれらの感受性を測定した。
MA−RCCはIL13−トキシンに対する非常に感受性であり、そしてこれらのRCC細胞の継代はin vivoにおいてそれらの感受性を減少しなかった。これらのデータが示唆するように、IL−13ＲのレベルはRCC腫瘍細胞のin vivo継代により変化しない。
３）IL13−トキシンは免疫細胞、単球、骨髄誘導細胞、およびバーキットリンパ腫細胞に対して細胞障害性ではない
IL13−PE38QQRの細胞障害活性を、また、PHA活性化Ｔ細胞、CD４＋Ｔ細胞リンパ腫系統（Ｈ９）、正常骨髄細胞、EBV形質転換Ｂ細胞系統、２つのバーキットリンパ腫細胞系統、および前単球細胞系（Ｕ937）について検査した。実施例１において上に示したように、PHA活性化Ｔ細胞、Ｈ９細胞、およびＵ937細胞は検出可能なIL−13Ｒ細胞を発現しなかった。これらの観察と一致して、IL13−PE38QQRはこれらの細胞型のいずれに対しても細胞障害性ではなかった。EBV形質転換Ｂ細胞系統は事実約300のIL−13結合部位／細胞を発現したが、IL13−トキシンはそれらに対して細胞障害性ではなかった。IL−13Ｒの発現はヒト骨髄細胞またはバーキットリンパ腫細胞系統について試験しなかったが、IL13−トキシンに対するそれらの不感受性に基づいて、これらの細胞は、また、IL−13Ｒを発現しないか、または小さい数のこれらのレセプターを発現することが期待される。
４）クローン原生アッセイ
IL13−PE38QQRの抗腫瘍活性を、また、コロニー形成アッセイにより試験した。500のPM−RCC細胞を100mmのペトリ皿に中にプレートし、次の日に、三重反復実験のプレートにIL−13（20ng／ml）、IL13−PE38QQR（50ng／ml）または対照培地を供給した。細胞を37℃においてCO2インキュベーター中で10日間培養した。次いで培地を除去し、コロニーを固定し、そしてアルコール中の0.25％のクリスタルバイオレットで染色した。50またはそれ多い細胞を含有するコロニーを記録した。生存する画分を処理細胞および未処理細胞において形成したコロニーの数の比として計算し、そして生存率として表した。
ヒトPM−RCC細胞系は、500細胞をペトリ皿で培養したとき、コロニーを形成した。この数の細胞を使用すると、PM−RCC細胞系は35％のクローン原効率で175コロニーを形成した。これらの細胞をIL13−PE38QQRで10日間処理したとき、わずかに32コロニーが形成した（表３）。しかしながら、細胞を、それぞれ、組換えIL−13または培地単独で処理したとき、123または175コロニーが形成した。
0004202417.tif 000005
５）IL−４はRCC細胞に対するIL13−PE38QQRの細胞障害活性をブロックしない
IL−13はIL−４の結合部位について競合したが、IL−４はIL−13の結合部位について競合しなかった。しかしながら、他の癌細胞型において、IL−４はIL13−PE38QQRにより伝達される細胞障害性を中和した。したがって、RCC細胞に対するIL13−トキシンの細胞障害性を中和するIL−４の能力を試験した。IL−13のみがIL13−トキシンの細胞障害性をブロックしたが、IL−４は試験したすべての３つのRCC細胞系においてこの細胞障害性をブロックしなかった。
６）ヒトRCC細胞に対するIL13−トキシンの結合アフィニティー
次いでIL−13Ｒに対するIL13−PE38QQRの結合アフィニティーを検査した、HL−RCCまたはPM−RCC細胞をこの目的に利用した。これらの細胞を、種々のIL−13またはIL13−PE38QQRの存在または非存在下に、飽和濃度の放射性標識化IL−13とインキュベートした。HL−RCC細胞において、自然IL−13についてのIC50（［125Ｉ］−IL−13の結合の50％の置換が観察されるタンパク質濃度）は〜20×10-9Ｍであったが、これに対してIL13−PE38QQRでは〜180×10-9Ｍであった。したがって、IL13−トキシンはIL−13に比較して約８〜10倍低いアフィニティーでIL−13Ｒに結合した。
前述の実験が示すように、IL−13に基づくトキシンであるIL13−PE38QQRはヒト腎細胞癌腫細胞に対して高度に細胞障害性である。RCC細胞系におけるIC50は、0.03ng／mlより小から350ng／mlまでの範囲であった。IL13−トキシンの細胞障害性は特異的であり、そしてIL−13Ｒを通して伝達された。なぜなら、過剰のIL−13はIL13−PE38QQRの殺細胞活性を中和したからである。これらの結果は、IL13−トキシンによるコロニー形成の有意な阻害を証明するクローン原生アッセイにおいて発生したデータ確証する。
非活性化Ｔ細胞系統（Ｈ９）、EBV形質転換Ｂ細胞系統、および前単球（Ｕ937）細胞系を包含する休止ヒト細胞はIL13−トキシンの細胞障害作用に対して感受性でなかった。同様に、PHA活性化ヒトＴ細胞および正常な骨髄バイオプシーから得られた細胞は、また、IL13−PE38QQRの細胞障害性作用に対して不感受性であった。従来、血液学的子孫細胞系および新鮮な骨髄細胞は小さい数のIL−４レセプターを発現することが報告された（例えば、Lowenthal et al．，J．Immunol．140：456（1988））。しかしながら、これらの細胞上のIL−13Ｒの発現は決定されなかった。最近の研究において、IL−13が原始ネズミ造血子孫細胞の増殖および分化において直接の調節の役割を有することが報告され（Jacobsen et al．，J．Exp．Med．180：75（1994））これらの細胞上の多少のレベルのIL−13Ｒの発現を示している。しかしながら、この実施例はIL13−トキシンが新鮮な骨髄誘導細胞に対して細胞障害性でないことを示し、子孫細胞は多分は不十分な量のIL−13Ｒを発現するか、またはこれらの細胞上のレセプターはIL13−トキシンの細胞障害作用に対して感受性でないことを示す。
上記において、IL−13はIL−４の結合について競合するが、IL−４はRCC細胞上のIL−13の結合について競合しないことが示された（実施例２）。これらの結果と同様に、この実施例におけるデータは、IL−４がIL13−PE38QQRの細胞障害作用を中和しないことを示す。
従来、IL−４に基づく細胞毒素（IL−４−PE4E）はヒトRCC細胞に対する高度に細胞障害性であることが証明された。IL13−PE38QQRとIL−４−PE4Eとの間の比較を行わなかった。なぜなら、これらの２つのキメラタンパク質におけるPE部分は異なるからである。しかしながら、IL−13およびIL−４の双方はIL４−トキシンの細胞障害性と競合した。同様に、突然変異のIL−４タンパク質はIL−４およびIL−13が発生する増殖の応答をブロックした。これらのデータが示唆するように、IL−13およびIL−４のレセプターは１つの成分を共有する。
RCC細胞についてのデータは〜70kDaの１つの主要なタンパク質に架橋することを示し、このタンパク質はIL−４Ｒの２つのサブユニットのうちの小さいものに類似するように思われた。IL−４の結合部位についてのIL−13の競合は、〜70kDaのタンパク質がこれらの２つのレセプターの間で共有されていることを示唆する。また、IL−４およびIL−13はいくつかの癌腫細胞系上のインターナリゼートしたレセプターに対して相互的に競合する。最近のデータは、IL−４およびIL−13の双方が140kDaのIL−４結合タンパク質のリン酸化を引き起こしたことを証明する。さらに、140kDaのIL−４結合タンパク質に対する抗体はＢ細胞に対するIL−13の作用をブロックした。これらの研究は140kDaのIL−４結合タンパク質がこれらの２つのサイトカインレセプターの間で共有されることができることを示唆するが、［125Ｉ］−IL−４が140kDaのタンパク質に架橋してさえ、このタンパク質への［125Ｉ］−IL−13の架橋は観察されなかった。これらのデータが示唆するように、140kDaのIL−４結合タンパク質はIL−13Ｒと鎖を共有しないか、または140kDaのタンパク質はIL−13Ｒ系の非IL−13結合成分であり、これはIL−４がIL−13の結合について競合しない理由である。
IL13−トキシンはIL−13のそれに比較してより低いアフィニティーでIL−13レセプターに結合することに注目してみることは興味深いことである。PE分子はIL−13分子のＣ−末端に結合したので、これらのデータは、IL−４と同様に、IL−13がそのレセプターと主としてＣ−末端の残基を通して相互作用することができることを示唆する。さらに、これらのデータは、また、トキシン部分がＣ−末端の残基から離れた部位に結合しているキメラIL13−トキシン分子が癌細胞に対していっそう細胞障害性であろうことを示唆する。
要約すると、これらの結果が示すように、IL13−トキシンのIL13−PE38QQRは大きい数のIL−13Ｒを発現するヒトRCC細胞に対して高度に細胞障害性である。休止または活性化された免疫細胞または骨髄細胞はIL13−トキシンに対して感受性ではないので、データはこのトキシンが正常の免疫細胞に対して細胞障害性ではなくRCCの処理に有効であることを示す。
実施例８
ヒトグリオーム細胞はIL−13レセプターを過度に発現し、そしてIL−13PEキメラタンパク質に対して極端に感受性である
脳腫瘍に対する本発明のキメラ免疫トキシンの効能を評価するために、細胞障害性（タンパク質合成の阻害により評価した）および競合阻害アッセイを、後述するようにある数の脳腫瘍について実施した。
１）タンパク質合成の阻害アッセイ
キメラトキシン（例えば、hIL13−PE38QQR）の細胞障害活性を、脳腫瘍細胞系について試験した。細胞のこのグループはヒトグリオームにより代表され、そしてＵ−373MG，DBTRG−05MG，Ａ−172，Hs683，Ｕ−251MG，Ｔ−98Ｇ，SNB−19、およびSW−1088、およびまた１つのヒト神経芽細胞腫SK−Ｎ−MC細胞系を包含する。細胞系の大部分はATCCから得られそしてそれらはATCCにより推奨される条件下に維持された。SNB−19細胞系はナショナル・キャンサー・インスチチュート（Natinal Cancer Institute）／フレデリック・キャンサー・リサーチ・ファッシリティー（Frederick Cancer Research Facility）DCT腫瘍貯蔵所から入手した。SNB−19およびSW−1088の双方は神経膠由来である。
通常１×104細胞／ウェルを24ウェルの組織培養プレートにおいて１mlの培地中でプレートし、種々の濃度のキメラ免疫トキシンを01％のウシ血清アルブミン（BSA）／リン酸塩緩衝生理食塩水（PBS）中で希釈し、そして25μｌの各希釈物を１mlの細胞培地に添加した。免疫トキシンと20時間インキュベートした後、［3Ｈ］−ロイシンを細胞に３〜５時間添加し、、そしてベータカウンターを使用して細胞に関連する放射能を測定した。
ブロッキングの研究のために、（ｉ）組換えhIL13（rhIL13）または（ii）rhIL14をキメラトキシン（CTs）の添加前の20〜30分に細胞に添加した。データを二重反復実験の平均から取り、そしてアッセイを数回反復した。
癌細胞はhIL13−PE38QQRに対して感受性であり、IC50は0.1ng／mlより小から300ng／ml（２pM〜6.0nM）の範囲であった。（被験細胞系によるトリチウム化ロイシンの組込みの50％の阻害を引き起こす免疫トキシン濃度として、IC50を計算した。）細胞系はキメラ毒性に対するそれらの応答に従い３つのグループの中におおよそ含まれる。Ｕ−373MG，Ｕ−251MG，SNB−19、およびＡ−172から成る第１グループは最低の濃度のhIL13−PE38QQRにより殺され、IC50は0.1ng／mlより小から0.5ng／ml（２〜10pM）の範囲であった。特に、SNB−19およびＡ−172は約0.05ng／mlのIC50を有した。DBTRG MGおよびHs−683細胞から構成されたグリオーム細胞系の第２グループはhIL13−トキシンに対して非常によく応答し、IC50は１〜10ng／ml（20〜200pM）の範囲であった。Ｔ−98ＧおよびSW  1088により表されるグリオーム細胞系の第３グループは低い応答を示し、IC50は、それぞれ、300および＞1000ng／mlであった。試験した神経由来のヒト癌細胞系、SK−Ｎ−MC神経芽細胞腫細胞系のみは、キメラトキシンに対して比較的低い応答を示した。
hIL13−PE38QQRの細胞障害作用は、それが研究した細胞について10〜100倍過剰のhIL13によりブロックされたので、特異的であった。
２）グリオーム細胞における他のサイトカインに基づくキメラタンパク質の細胞障害活性
hIL13−PE38QQRの細胞障害作用を、他のインターロイキン、例えば、hIL４またはhIL６を含有するキメラトキシンのそれと比較した。いくつかのグリオーム細胞系をhIL４−PE4Eで殺すことができ、IC50は10ng／mlを超えることは既に示されている（Puri et al．，Int．J．Cancer，58：574−581（1994））。HIL13−PE38QQRは、Ｕ−251MG，Ｕ−373MGおよびDBTRG MG細胞系に対して細胞障害性であり、IC50は10ng／mlより低かった。細胞毒素hIL４−PE38QQR，hIL13−PE38QQRに類似するhIL４に基づくキメラトキシンはグリオーム細胞系を殺したが、その濃度はhIL13に基づくトキシンの濃度より10倍からほとんど1000倍高い範囲であった。
hIL４−PE38QQRについてのIC50は、キメラトキシンのhIL４−PE4E変異型を使用して見られるものよりも高かった（Debinski，et al．，J．Biol．Chem．，268：14065−14070（1993），Puri et al．，Int．J．Cancer，58：574−581（1994））これは他の成長因子に基づくキメラタンパク質を使用して行った観察と一致する（Siegall et al．，Cancer Res．，51：2831−2836（1991））。興味深いことには、hIL６−PE40は、また、いくつかのヒトグリオーム細胞に対して活性であり、そしてその活性はhIL４−トキシンのそれに類似するか、またはそれよりすぐれていた。しかしながら、hIL６−PE40はhIL13に基づくキメラタンパク質よりもなお活性が低かった。これらの結果が示すように、ヒトグリオーム細胞系はhIL13−PE38QQRに対して極端に感受性であり、そしてIL−13特異的細胞毒素の細胞障害活性は他のインターロイキンに基づくキメラトキシンのそれよりかなり優れる。
３）競合結合アッセイ
前の実施例が証明するように、いくつかの充実腫瘍細胞系に対するhIL13−PE38QQRの活性はhIL13特異的かつhIL４特異的である、すなわち、それはこれらの２つのサイトカインによりブロックされることができるが、IL２によりブロックされない。しかしながら、また、hIL４はhIL13結合部位について競合することができず（Obiri et al．，J．Biol．Chem．，270：8797−8804（1995））そしてそれはいくつかの他の癌細胞系に対するhIL13に基づくキメラタンパク質の細胞障害作用をブロックすることができない。したがって、グリオーム細胞におけるIL13−トキシンの細胞毒素をブロックするhIL４能力を決定した。
hIL４サイトカインは、Ｕ−251MGおよびＵ−373MGの双方の細胞系に対するhIL13−PE38QQRの細胞障害性の防止において無効であった。他方において、hIL13はhIL４−PE38QQRの細胞障害活性を事実ブロックした。したがって、hIL13−PE38QQRの細胞障害性は過剰のhIL13によりブロックされたが、過剰のhIL４によりブロックされず、そしてhIL４−PE38QQRの細胞障害作用はhIL13によりブロックされた。
４）ヒトグリオーム細胞系はIL−13のある数のレセプターを発現する
hIL13−PE38QQRの細胞障害活性が特異的でありかつhIL13レセプターにより伝達されることを確認するために、競合結合アッセイを実施した。以前に記載されたように、製造業者の使用説明書に従いIODO−GEN試薬（Pierce）を使用して、組換えhIL13を125Ｉ（Amersham Corp．）で標識化した（Obiri et al．，J．Biol．Chem．，270：8797−8804（1995））。放射性標識化サイトカインの比活性は、20〜10μCi／μｇタンパク質の範囲であることが推定された。結合実験のために、典型的には１×106の腫瘍細胞を４℃において増加する濃度（500nMまで）の非標識化サイトカインの存在または非存在下に125Ｉ−hIL13（100pM）とインキュベートした。データをLIGANDプログラム（Munson，et al．，Anal．Biochem．107：220−239（1980））で解析して、レセプターの数と結合アフィニティーを決定した。
非標識化hIL13はＵ−373MG細胞への125Ｉ−hIL13の結合について効率よく競合した。変位の実験のスキャッチャードプロット分析は、中間のアフィニティー（Kd＝1.8nM）のhIL13のための単一の結合部位を明らかにした。Ｕ−373MG細胞系上にhIL13のための約16,000の結合部位が存在した。また、他のヒトグリオーム細胞系におけるhIL13レセプターの存在を評価した。表４において見られるように、グリオーム細胞は500〜30,000分子／細胞の範囲のhIL13のレセプターを有した。ヒトグリオーム細胞において発現されたhIL13Ｒは、１〜２nMのKd範囲を有する中間のアフィニティーを有する。５つの研究した細胞系のうちの４つは非常に大きい数、すなわち、15,000分子／細胞以上、のIL−13Ｒを有した。
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まさに同一の細胞系が、また、hIL13−PE38QQRの作用に対して最も応答性であった（表１）。Ｔ−98Ｇ細胞系はhIL−13−トキシン3に対して低い応答を示し、そしてわずかに約500hIL−13結合部位／細胞を有することが見出された（表１）。したがって、特定のhIL−13Ｒがグリオーム細胞系において発現され、そしてそれらはhIL13−PE38QQRの細胞障害性を伝達する。
これらの実験において、ヒトグリオーム細胞系はサイトカイン、IL−13のための多数のレセプターを発現し、そしてIL13インターロイキンとPEの誘導体（例えば、PE38QQR）とから構成されたキメラトキシンでhIL−13Ｒをターゲッティングすることができることが確立された。hIL13−PE38QQRトキシンはいくつかのgcl1に対する極端に活性であり、そしてこれらの細胞系の大部分は１ng／mlより低い濃度（＜20pM）でおいて殺される。
グリオーム細胞へのhIL13−PE38QQRの作用はhIL13特異的に現れる。なぜなら、（ｉ）hIL13単独は研究した細胞系のすべてに対するキメラトキシンの細胞障害性をブロックする、そして（ii）rhIL４はＵ−251MGおよびＵ−373MGグリオーム細胞に対するhIL13−PE38QQRの細胞障害作用を妨害しないからである。後者の観察は皮膚、胃および結腸由来の腺癌についてなされた観察と異なる（Debinski et al．，J．Biol．Chem．，270：16775−16780（1995））。IL13−PE38QQRの作用は、これらの腺癌細胞系についてrhIL４により効率よくブロックされた。
IL４およびIL13のレセプターは複雑であり、そして種々の系、例えば、正常または悪性のヒト細胞において検出された、いくつかの共通の特徴を有する。しかしながら、Ｕ−251MG細胞系は標準的結合アッセイにおいて４℃でrhIL４に結合しなしか、hIL13の結合部位の数はこれらの細胞について高い。この現象は、rhIL４がこれらの細胞に対するhIL13−PE38QQRの作用をブロックしない理由をほとんど説明するであろう。したがって、グリオーム細胞におけるhIL13およびhIL４−PE38QQRのレセプターはいくつかの充実腫瘍細胞系において見出されるものと異なる。
hIL13−PE38QQR細胞毒素は、匹敵するIL４に基づくキメラトキシンよりもグリオーム細胞系に対してかなりいっそう活性である。細胞障害性におけるこの差は、グリオーム細胞が結合できるIL13およびIL４分子の数の差のためであると推定される。多数のヒトグリオーム細胞は15,000より多くかつ30,000までのIL13分子／細胞に結合するが、これらの細胞は3,000より小から非常にわずかのIL４分子／細胞に結合する。興味深いことには、いくつかのヒトグリオーム細胞は、また、hIL６を含有するキメラトキシンにより殺されることができる（Siegall et al．，Cancer Res．，51：2831−2836（1991））。しかしながら、hIL６−PE40キメラタンパク質の効力はhIL13−PE38QQRのそれより低い。
実施例９
増大した細胞障害性を有するキメラトキシン
IL−13−PE38QQRより高い特異的毒性を有する２つのキメラトキシンを製造した。第１細胞毒素はIL−13−PE4Eトキシンであり、ここでPE4Eは「全長の」PEであり、アミノ酸57，246，247、および249のすべてがグルタメートで置換されている、突然変異した結合ドメインおよび不活性の自然結合ドメインを有する。
第２融合タンパク質はPE38QQRに融合した環状変更されたヒトIL−13（cpIL−13）であった。特に、hIL−13の第２アルファーらせんのちょうど開始において、サイトカインの「新しい」Ｎ−末端として、ヒトhIL−13（hIL−13）の位置44においてメチオニン（Met）を選択することによって、環状変更されたIL−13を製造した。「古い」Ｎ−末端およびＣ−末端を配列Gly-Gly-Ser-Glyを有する短いペプチドにより接続されている。環状変更されたIL−13（cpIL−13）を、cpIL−13の「新しい」Ｃ−末端（野性型サイトカインにおけるGly-43）がPE38QQRのＮ−末端のGlyに融合されるような方法において、クローニングした。
cpIL−13−PE38QQRをコードするプラスミドを下記のようにして構築した：hIL13の114アミノ酸をコードするプラスミドphIL13（参照、例えば、Debinski et al．，J．Biol．Chem．，270：16775−16780（1995））は、hIL13の２つの別々の断片の増幅のための鋳型として働いた；それぞれ、アミノ酸１−43から成る断片およびアミノ酸44−114、すなわち、hIL13から成る断片。hIL13 １−43およびhIL13 44−114を、それぞれ、プライマーcp１／cp２およびcp３／cp４、の２組のプライマーを使用してPCR増幅により調製した（参照、表５、それぞれ、配列識別No．１，２，３および４）。プライマーcp１およびcp４はBamHＩ制限エンドヌクレアーゼのための新しいクローニング部位を導入した；プライマーcp２はHindIIIをコードし、そしてcp３はNdeＩ制限部位をコードした。hIL13 １−43（130塩基の長さ）をコードするPCR増幅したcDNAをBamHＩおよびHindIII酵素で切断し、そしてhIL13 44−114（210塩基の長さ）をNdeＩおよびBamHＩで切断した。DNAのこれらの２つの断片を３つの断片結合レセプター鎖においてhIL13−PE38QQR（同上）をコードするベクターに結合し、そしてNdeＩおよびHindIII制限酵素で切断した。
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生ずるプラスミド、pCP／hIL13−PE38QQRは環状変更されたhIL13のためのcDNAを有し、ここで新しいＮ−末端は野性型インターロイキン−13のMet44において開始する。４つの追加のアミノ酸（GlyGlySerGly）は、野生型hIL13の残基114と１との間に位置する。環状変更されたhIL13をPE38QQRの第１アミノ酸に結合した。cpIL−13−PE38QQRを大腸菌（E．coli）中で発現させ、そして均質に精製した。
hIL13−PE4EおよびcpIL−13−PE38QQRの双方は、hIL13−PE38QQRを使用して見られたよりも２〜10倍すぐれた細胞障害活性を示した。IC50はいくつかのグリオーム細胞系について＜0.1ng／ml（＜２pM）程度に低かった。新鮮なヒトグリオーム外植体細胞は、また、これらの低い濃度において殺された。データが示唆するように、IL13のレセプターはIL−13Ｒ特異的細胞毒素を使用するヒトグリオームの治療のためのきわめてすぐれた標的である。
実施例10
神経癌に対するIL−13Ｒ特異的細胞毒素の活性
２つのキメラトキシン（hIL13−PE38QQRおよびhIL13PE4E）の細胞障害性を、神経由来の癌細胞系について試験した。DAOY，TE671、およびＤ283髄芽細胞腫細胞系のすべてはPE4Eに融合したhIL−13に対して応答性であった。MTS比色細胞障害性アッセイにおいて記録されたIC50は、＜１ng／ml〜50ng／ml（それぞれ、＜20pM〜１nM）の範囲であった。さらに、髄芽細胞腫外植体細胞は、また、hIL13−PE4Eに対してよく応答した。
他方において、SK−Ｎ−MCおよびNeuro−２Ａ神経芽細胞腫細胞は低い応答性を示した（IC50＞４nM）。しかしながら、データが示唆するように、hIL−13のレセプターの過度の発現はグリオームに制限されず、それはニューロン誘導癌において観察することができる。
実施例11
IL−13Ｒ標的細胞毒素はカポージ肉腫に対して有効である
組換え免疫トキシンIL−13−PE38QQRを、また、カポージ肉腫細胞系（NCB59，KS248，KS220B，KS54A、およびARL−13）に対して試験した。細胞系のすべては細胞毒素感受性であり、ID50は約８ng／ml〜約180ng／mlの範囲であった。カポージ肉腫細胞系のすべては正常細胞よりも高いレベルでIL−13レセプターを発現したが、腎細胞癌腫またはグリオームにおいて見出されたIL−13Ｒの発現レベルよりも低かった。
本発明において記載する実施例および態様は例示のみを目的とし、それらに照らして種々の変更および変化は当業者にとって示唆され、そしてこの出願の精神および範囲および添付した請求の範囲に含まれることが理解されるであろう。本明細書において引用したすべての刊行物、特許、および特許出願は引用することによって本明細書の一部とされる。