(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物質を捕獲できるリガンドを保持させた反応固相が吸収材上で移動可能に形成されたフロースルータイプの生物学的特異反応装置を用い、反応固相に発生したシグナルを測定する生物学的特異反応測定法において、試料液を前記反応固相に供給する工程と、試料液が供給された当該反応固相に、標識化されており且つ被測定物質と生物学的特異反応に基づいて結合し得る物質の液を供給する工程と、当該反応固相を吸収材上で移動させる工程と、標識に基づいて発生したシグナルを測定する工程と、を備えたことを特徴とする生物学的特異反応測定法。
【請求項２】
前記測定工程において、シグナル測定を計器的測定で行うことを特徴とする請求項１の生物学的特異反応測定法。
【請求項３】
前記移動工程と測定工程の間に、前記反応固相にシグナル発生物質液を供給する工程をさらに備えたことを特徴とする請求項１記載の生物学的特異反応測定法。
【請求項４】
前記標識が酵素であり、前記シグナル発生物質液が化学発光基質液であることを特徴とする請求項３記載の生物学的特異反応測定法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の生物学的特異反応測定法に用いられ、反応固相が吸収材上で移動可能に形成されていることを特徴とする生物学的特異反応測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的特異反応による試料中の物質の測定方法及び測定装置に関するものである。このような測定方法及び装置はとりわけ臨床検査や食品検査等の分野に利用される。
【０００２】
【従来の技術】
被測定物質を特異的に捕獲できるリガンドを保持させた反応固相、例えば多孔質マトリックスを用い、被測定物質をフロースルータイプで測定する生物学的特異反応測定法は、特表昭６１−５０２２１４号、特開平４−３１８４６２号、特開平６−５０９７３号等に示されているように公知である。このような測定法に使用される装置としては、通常、上部開口部を有するコンテナーに吸収材を収容すると共に当該吸収材の上方に被測定物質と特異的に反応するリガンドを固定化した多孔質マトリックスを設けた装置が用いられる。係る装置を用いた被測定物質の測定は、例えば被測定物質が抗原の場合、上部開口部に被測定物質（即ち、抗原）液を加えて、被測定物質と特異的に反応するリガンド（即ち、抗体）を固定化した多孔質マトリックスを通過させ、抗原を捕獲させる。次いで、上部開口部に、標識（例えば、酵素）を結合させた抗体液を添加することにより、当該抗体をマトリックス上に捕獲された抗原と結合させ、更に標識に基づくシグナル（例えば、発光、放射能等）を測定することにより抗原の測定が行われる。なお、多孔質マトリックスを通過した各液は、前記の吸収材に吸収される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述の被測定物質を特異的に捕獲できるリガンドを保持させた反応固相（以下、便宜上、反応マトリックスと称する）を用い、被測定物質をフロースルータイプで測定する生物学的特異反応測定法によれば、簡便に被測定物質の測定を行うことができるという効果を奏する。しかし、コンテナー内の吸収材においても標識に基づくシグナル（非特異的シグナル）が発生する。そのため、反応マトリックスのシグナルを測定する際に、吸収材からの非特異的シグナルの影響を受けることになり、反応マトリックスのシグナルを高精度で測定することができなくなるという問題がある。係る問題を解消するための手段として、例えば、吸収材から透過してくる非特異的光シグナルを低減させることを目的として、吸収材と反応マトリックスの間に透過光低減要素を装着した装置が提案されている（特開平８−５０６４２０号）。係る装置によれば、吸収材からの透過光をある程度は低減することができるが、その影響を完全に排除することは困難であった。
【０００４】
係る問題点を解消するために、本発明者等は、反応マトリックスを用いるフロースルータイプの生物学的特異反応測定装置を用いて被測定物質を測定をする方法において、吸収材からの非特異的シグナルの影響を排除し得る方法を検討した結果、標識物を反応後、反応マトリックスを移動させ、標識物を吸収していない吸収材上でシグナル発生物質液（例えば、酵素標識に対する基質液等）を添加すれば、吸収材内での非特異的シグナルの発生を防止でき、反応マトリックスのみのシグナルを測定することが可能となるので、より感度の高い測定ができることを見出し本発明を完成した。
本発明は係る知見に基づいてなされたもので、本発明は、臨床検査の分野で通常行われる血清、血漿及びその他の体液中の成分をフロースルータイプの生物学的特異反応測定方法及びその装置において、吸収材からの非特異的シグナルの影響を排除でき、測定精度を著しく高めることのできる測定方法及び測定装置を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明の要旨は、被測定成分を捕獲できるリガンドを保持させた反応固相（即ち、反応マトリックス）を用いるフロースルータイプの生物学的特異反応測定において、反応マトリックスを吸収材上で移動させ、その後にシグナル発生物質液を添加することによって、吸収材内での非特異的シグナルの発生を防止し、反応マトリックスのみのシグナルを測定することからなる生物学的特異反応測定法及び反応マトリックスが吸収材上を移動可能に形成されていることからなる生物学的特異反応測定装置である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は上記の構成からなり、本発明の測定法及び装置の基本的原理であるフロースルータイプの生物学的特異反応測定法及び装置は前述のように公知であり、反応マトリックス、吸収材、コンテナー等については前掲の文献を参照することができる。
本発明は、標識物を反応後、反応マトリックスを移動させ、その後にシグナル発生物質液を添加することを特徴とするものであり、係る測定に使用される装置の一例を図面に基づいて説明する。
【０００７】
図１は本発明の測定法に使用される装置の一例を示す図であり、（Ａ）は側面概略図、（Ｂ）は平面概略図、（Ｃ）は（Ｂ）のＸ−Ｘ線断面概略図、（Ｄ）は（Ｂ）のＹ−Ｙ線断面概略図である。また、図２は、当該装置の使用状態を示す断面概略図である。更に、図３は本発明の測定法に使用される装置の他の例の使用状態を示す断面概略図である。
図１及び２に示される反応装置は、プラスチック等からなるコンテナー１に、２つの吸収材２−１及び２−２（例えば、ガラス繊維等）が仕切り板３を介して収容されている。コンテナー１の上部には蓋体４が設けられており、蓋体４は、吸収材２−１に対向する位置に開口部５を有し、開口部５には反応マトリックス６が固定されたマトリックス保持部材７が嵌め込まれている。蓋体４は、コンテナー１の側面に設けられた溝８に嵌合するように形成された突起部材９を有し、当該突起部材９と溝８により、蓋体４はコンテナー１に結合されていると共にコンテナー１上を移動することが可能となっている。即ち、蓋体４をコンテナー１上で移動させると、蓋体４に設けられた反応マトリックス６を、吸収材２−１上から吸収材２−２上に移動させることが可能なようになっている。
【０００８】
上記の装置には、必要に応じて、前処理フィルター１０を設けてもよく、前処理フィルター１０を設けることにより試料中の夾雑物を除去することができるので、反応マトリックス６の目詰まりが防止され、測定精度・分析感度の向上が図れる。前処理フィルター１０は、蓋体４の開口部５に適合するように作製されたフィルター保持部材１１に固定されている。当該前処理フィルター１０は、試料中の夾雑物を除去できるものであれば特に限定はされないが、フィルターの表面で夾雑物を捕獲するスクリーンフィルターと、フィルターの内部で夾雑物を捕獲するデプスフィルターが例示される。前処理フィルター１０の好ましい態様としては、保留粒子径の異なる２種以上のデプスフィルターで構成され、より好ましくは反応マトリックス６に対応する側から順に、保留粒子径が０．２〜０．４μｍのデプスフィルターと１μｍ以上のデプスフィルターで構成される。更に必要に応じて、保留粒子径の異なる他のデプスフィルターやスクリーンフィルターを組み合わせてもよい。
【０００９】
係る構成からなる反応装置を使用して被測定物質を測定する本発明の方法の一例として被測定物質である抗原を測定する例の概略を図２に基づいて説明する。まず、前処理フィルター１０が固定されたフィルター保持部材１１を、蓋体４の開口部５に嵌合させる(Ａの状態)。その後、被測定物質である抗原を含有する試料液を前処理フィルター１０に供給する。前処理フィルター１０で濾過された試料液は、抗体(モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体)を保持(感作)させた反応マトリックス６を通過し、抗原は当該反応マトリックス６に捕獲されると共に通過した試料液は吸収材２−１に吸収される。次いで、標識化された抗体を前処理フィルター１０を介して供給し、標識化された抗体を反応マトリックス６に捕獲された抗原と結合させる(Ｂの状態)。その後、フィルター保持部材１１を取り除き、開口部５から適当な洗浄液を供給し、反応マトリックス６を洗浄する。
ついで、蓋体４を移動させることにより、洗浄された反応マトリックス６が吸収材２−２上にくるように移動させる(Ｃの状態)。その後、開口部５からシグナル発生物質液を供給することによりシグナルを発生させ、反応マトリックス６のシグナルをシグナル測定装置により測定することにより抗原（被測定物質）を測定（定量又は定性）することができる。なお、反応マトリックス６を通過したシグナル発生物質液は吸収材２−２に吸収される。
この方法では、吸収材２−２には前記の標識化された抗体が吸収されていないので、シグナル発生物質を吸収してもシグナルを発生することがない。従って、非特異的シグナルの影響を受けることなく、反応マトリックス６のシグナルを測定することができ、測定精度を著しく高めることが可能となる。
【００１０】
図３は、本発明の測定法に使用される装置の他の例の使用状態を示す断面概略図である。この装置では、コンテナー１内に３つの吸収材（２−３、２−４、２−５）が仕切り板３を介して収容されている。なお、図１及び２の装置と同じ部材には同じ符号を付してある。
図３に示される装置を用いた本発明の方法を、被測定物質である抗原を測定する例をもって説明する。
まず、図２の（Ａ）と同様にして、前処理フィルター１０が固定されたフィルター保持部材１１を、蓋体４の開口部５に嵌合させる（Ａの状態）。その後、被測定物質である抗原を含有する試料液を前処理フィルター１０に供給する。前処理フィルター１０で濾過された試料液は、抗体(モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体)を保持(感作)させた反応マトリックス６を通過し、抗原は当該反応マトリックス６に捕獲されると共に通過した試料液は吸収材２−３に吸収される。次いで、標識化された抗体を前処理フィルター１０を介して供給し、標識化された抗体を反応マトリックス６に捕獲された抗原と結合させる。その後、フィルター保持部材１１を取り除く。
ついで、蓋体４を移動させることにより、反応マトリックス６が吸収材２−４上にくるように移動させる(Ｂの状態)。この状態で、開口部５から適当な洗浄液を供給し、反応マトリックス６を洗浄する。反応マトリックス６を通過した洗浄液は吸収材２−４に吸収される。
上記の洗浄後、更に蓋体４を移動させることにより、洗浄された反応マトリックス６が吸収材２−５上にくるように移動させる(Ｃの状態)。その後、開口部５からシグナル発生物質液を供給することによりシグナルを発生させ、反応マトリックス６のシグナルをシグナル測定装置により測定することにより抗原（被測定物質）を測定（定量又は定性）することができる。なお、反応マトリックス６を通過したシグナル発生物質液は吸収材２−５に吸収される。
この方法では、標識化された抗体は吸収材２−３に吸収されており、そして中間に洗浄液のみを吸収した吸収材２−４が存在するので、シグナル発生物質液を吸収した吸収材２−５でのシグナル発生を実質上完全に防止することができる。従って、非特異的シグナルの影響を受けることなく、反応マトリックス６のシグナルを測定することができ、測定精度を一層高めることが可能となる。
【００１１】
上記のシグナル測定としては、例えば、化学発光測定、蛍光測定、比色測定等が例示される。なお、当該測定は、測定法に応じて計器的測定、目視的測定の何れであってもよい。また、標識として酵素、蛍光物質等が利用できること；シグナル発生物質（化学発光基質、蛍光源物質、色原物質等）により標識に基づく光シグナルを発生させること及びその光学的測定法等はこの分野で周知である。
なお、上記の測定法及び装置において、試料の性状によっては、前処理フィルター１０での濾過工程は省略することもできる。また、上記の例では、吸収材は仕切り板３により複数の吸収材（２−１と２−２及び２−３、２−４と２−５）に分離されているが、吸収材の種類及び充填量によっては、仕切り板３を設けることなく実施することもできる。更に、反応終了後、コンテナー１から蓋体４を取り外すことにより、シグナルが発生した反応マトリックス６を保存することもできる。また、蓋体４の移動を容易にするため、蓋体４の表面に凹凸部を設けて蓋体４を掴みやすくしてもよい。このように、本発明は適宜変更して実施することができる。
【００１２】
本発明の測定法は、生物学的特異反応に基づいて被測定物質を測定する方法であれば何れの方法にも適用でき、このような例として、抗原−抗体反応、核酸のハイブリダイゼーション、糖鎖−レクチンの反応、酵素−基質又は阻害剤との反応、生理活性物質−受容体反応、ビオチン−アビジン反応等が挙げられる。従って、本発明の方法及び装置の測定対象となる物質としては、例えば、抗原、抗体、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、酵素及びその阻害剤、生理活性物質及びその受容体、ビオチン化物質、アビジン化物質等が例示できる。
【００１３】
【発明の効果】
本発明方法及び装置によれば、吸収材からの非特異的シグナルの影響を完全に排除することができるので、分析感度・測定精度を著しく高めることができるという効果を奏する。
【００１４】
【実施例】
以下、具体的な例を挙げて本発明を説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１
▲１▼反応装置の作製
図１に示すように、０．４５μｍの孔径を持つニトロセルロースメンブラン上に抗ＨＢｓ抗原モノクローナル抗体を感作させた感作メンブラン（反応マトリックス６）を反応マトリックス保持部材７に保持し、その下方に吸収材２−１及び２−２を備えた反応装置を作製した。
▲２▼ＨＢｓ抗原の測定
上記の装置を用いてＨＢｓ抗原の免疫測定を行った。即ち、当該装置の開口部５にＰＢＳ緩衝液１００μｌを添加した後、４倍希釈調製した試料２００μｌを添加し、３分後にペルオキシダーゼ標識した抗ＨＢｓ抗原モノクローナル抗体液１００μｌを添加した。ＰＢＳ緩衝液を主成分とする洗浄液２００μｌを２回添加して洗浄した後、化学発光基質液１００μｌを添加して発光測定器にて発光シグナルを測定することにより免疫測定を行った。なお、上記の測定において、試料として、ＨＢｓ抗原を５ ＩＵ／ｍｌとなるように１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中に調製した陽性コントロール試料（ＰＣ）と、ＨＢｓ抗原を含まない１％ＢＳＡ−ＰＢＳのみの陰性コントロール試料（ＮＣ）を用いて実施した。
免疫測定は、標識抗体液を添加し、洗浄を行った後、吸収材２−１上にあった反応マトリックス６を吸収材２−２上に移動させ、化学発光物質を添加する本発明の方法（スライド型）と、同一の吸収材上で標識抗体液及び化学発光物質を添加する方法（固定型）とで行い、発光カウントを測定した。その結果を表１に示す。表１に示されるように、スライド型で得られる陽性コントロール（ＰＣ）と陰性コントロール（ＮＣ）のシグナルを比較すると、明らかにスライド型の方が比が大きく、スライド型での測定の方が高感度であることが判明した。
【００１５】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る装置の一例を示す概略図である。図中、（Ａ）は側面概略図、（Ｂ）は平面概略図、（Ｃ）は（Ｂ）のＸ−Ｘ線断面概略図、（Ｄ）は（Ｂ）のＹ−Ｙ線断面概略図である。
【図２】図１の装置の使用状態を示す断面概略図である。
【図３】本発明に係る装置の他の例の使用状態を示す断面概略図である。
【符号の説明】
１  コンテナー
２−１〜２−５  吸収材
３  仕切り板
４  蓋体
５  開口部
６  反応マトリックス
７  反応マトリックス保持部材
８  溝
９  突起部材
10  前処理フィルター
11  フィルター保持部材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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