(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなる変異型逆転写酵素。
【請求項２】
配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有することを特徴とするＤＮＡフラグメント。
【請求項３】
配列番号２に記載されるヌクレオチド配列を含む請求項２記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項４】
請求項２または３に記載のＤＮＡフラグメントをベクターに挿入したことを特徴とするＤＮＡ組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載のＤＮＡ組換えベクターを用いて形質転換されたことを特徴とする組換え宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である請求項５記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
請求項５または６に記載の組換え宿主を培養し、培養液から逆転写酵素を採取することを特徴とする変異型逆転写酵素の製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載の変異型逆転写酵素を用い、かつＲＮＡを鋳型とすることを特徴とするｃＤＮＡの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は伸長性特に高温域での伸長性に優れた逆転写酵素、該逆転写酵素をコ−ドする遺伝子および該遺伝子を使用する該逆転写酵素の製造方法ならびに該逆転写酵素を利用したｃＤＮＡの合成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来からレトロウイルス、特にモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）やヒト後天性免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、トリ骨髄芽症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素については多くの研究がなされ、様々な機能、性質が知られてきている。加えて、ＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することができるという特徴的な性質により、多くの分子生物学的手法、例えばｃＤＮＡライブラリーの構築、ＲＴ−ＰＣＲなどに用いられている。ｍＲＮＡの塩基配列は、発現されている蛋白質のアミノ酸配列を反映していることから、その解析の意義は遺伝子産物の機能を知る上で非常に大きい。
【０００３】
一方、これまでに報告されているレトロウイルス由来の逆転写酵素の多くが、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖のＲＮＡを分解する活性、すなわちＲＮａｓｅＨ活性を有することが知られている。この活性の存在は、ｃＤＮＡを合成する際に鋳型−プライマー複合体の鋳型を分解し、その分解位置がプライマーの３’端に近い場合は、鋳型−プライマー複合体が解離されるため伸長性が低下するという結果を招く。このような問題を排除するため、実質的にＲＮａｓｅＨ活性を有していない逆転写酵素が開発されてきた。
【０００４】
モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素は、そのアミノ酸配列の相同性および様々な機能解析から、その蛋白質のＣ末端側約２００残基がＲＮａｓｅＨ活性を担うドメインであることが知られている（Reversetranscriptase, Cold Spring Habor Monograph 第１３５〜１６２頁、１９９３年）。現在、ＲＮａｓｅＨ活性を欠失したＭＭＬＶ由来の逆転写酵素としては、ＲＮａｓｅＨドメインのアミノ酸を削除したデリーション型が東洋紡績から、アミノ酸の置換により機能を欠失した点変異型がスーパースクリプトIIという商品名でライフテクノロジー社から入手することが可能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの逆転写酵素をもってしても完全長のｃＤＮＡが取得できない場合がある。その理由としては、鋳型ＲＮＡの配列に起因する高次構造のため逆転写酵素の結合が阻害される、あるいは合成途上のＤＮＡ鎖の３’末端に鋳型ＲＮＡと相補的でないヌクレオチドが取り込まれ伸長反応が阻害されるといったことが考えられている。そのため、従来のものよりも、より高い温度域において反応できる伸長性の高い逆転写酵素の開発が待ち望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
これまで報告されている逆転写酵素のアミノ酸配列はいくつかの共通の保存領域を有するが、その中でもＴｙｒ（タイロシン）−Ｘ−Ａｓｐ（アスパラギン酸）−Ａｓｐ（アスパラギン酸）で表される配列はほとんどの逆転写酵素に存在する。Ｘについては様々なバリエーションがあり、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）カリフラワーモザイクウイルス（ＣＡＭＶ）ではバリン、ヒト後天性免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）ではメチオニンなどである。この領域は結晶構造解析などから２価金属イオンの結合部位として機能することが知られており、酵素活性の発現に重要な役割を果たしている（Structure 第１５巻、第８７９〜８９２頁、１９９５年）。
【０００７】
さらに最近になって、Ｘのアミノ酸の種類がＨＩＶ由来の逆転写酵素の伸長性に大きく関与しているという報告がなされた。すなわち、ＨＩＶ由来の逆転写酵素の野生型はＸの位置にメチオニンをもつが、これをバリンあるいはスレオニンに変換すると、鋳型に対して誤ったヌクレオチドが取り込まれた（ミスインコーポレーションされた）伸長鎖の３’端を伸長する能力が低下するという現象が報告されている（Nucleic Acids Research  第２５巻、第３２１２〜３２１７頁、１９９７年）。
【０００８】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討の結果、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素にポイントミューテーションによる改良を加えることにより、野生型の該逆転写酵素に比して伸長性、耐熱性を向上することができることを見出し、本発明に到達した。その具体的な例としてには、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素の５８４番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換するアミノ酸変異を加え、ＲＮａｓｅＨ活性を欠失したものに、さらに上述の保存領域のＸに相当する２２４番目のバリンをメチオニンに置換するアミノ酸変異を加えることにより、ｃＤＮＡ合成の伸長性が、従来の反応温度領域である４２℃から従来は反応性に乏しかった６０℃の間で向上せしめるものである。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）野生型に比して伸長性が向上したことを特徴とする変異型逆転写酵素。
（２）伸長性が４２〜６０℃の範囲で向上した（１）の変異型逆転写酵素。
（３）ＲＮａｓｅＨ活性を実質的に有していない（１）または（２）の変異型逆転写酵素。
（４）Tyr Met Asp Asp で表されるアミノ酸配列を含む（１）〜（３）のいずれかの変異型逆転写酵素。
（５）モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に由来する（１）〜（４）のいずれかの変異型逆転写酵素。
（６）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなる（５）の変異型逆転写酵素。
（７）配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有することを特徴とするＤＮＡフラグメント。
（８）配列番号２に記載されるヌクレオチド配列を含む（７）のＤＮＡフラグメント。
（９）（７）または（８）のＤＮＡフラグメントをベクターに挿入したことを特徴とするＤＮＡ組換えベクター。
（１０）（９）のＤＮＡ組換えベクターを用いて形質転換されたことを特徴とする組換え宿主細胞。
（１１）宿主細胞がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である（１０）の組換え宿主細胞。
（１２）（１０）または（１１）の組換え宿主を培養し、培養液から逆転写酵素を採取することを特徴とする変異型逆転写酵素の製造方法。
（１３）（１）〜（６）いずれかの変異型逆転写酵素を用い、かつＲＮＡを鋳型とすることを特徴とするｃＤＮＡの合成方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明における変異型逆転写酵素は、野生型に比してｃＤＮＡ合成の伸長性が向上したことを特徴とするものである。特に４２〜６０℃の範囲において、すなわち、従来の反応温度領域である４２℃から、従来は反応性に乏しかった６０℃までの間で向上したものである。ここで、逆転写酵素の伸長性とは、より長いｃＤＮＡを合成する能力のことをいう。また、変異型逆転写酵素とは、野生型逆転写酵素に対しアミノ酸の置換、欠失、挿入等の変異操作を行うことにより得られるものをいう。
【００１１】
本発明における変異型逆転写酵素は、好適にはＲＮａｓｅＨ活性を実質的に有していない。ここで、ＲＮａｓｅＨ活性を実質的に有していないとは、逆転写活性１ユニットにつきＲＮａｓｅＨ活性１０-6ユニット以下のものをいう。
【００１２】
本発明における逆転写酵素の好適な例としては、Tyr Met Asp Asp で表されるアミノ酸配列を含んでいる。該アミノ酸配列を有する逆転写酵素は、例えば、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素にアミノ酸変異を導入することにより得ることができる。本発明においてアミノ酸変異の導入は、当業者がなし得る方法であればいかなる方法でもよい。例えば、サイトディレクテッドミュータジェネシス法が挙げられる（Methods Enzymol.  第１５４巻、第３８２頁、１９８７年）。
【００１３】
本発明のＤＮＡフラグメントは、伸長性の向上した変異型逆転写酵素をコードするＤＮＡであり、該ＤＮＡフラグメントの一例は配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する。また、このようなＤＮＡは配列番号２記載される塩基配列またはその一部分を含有する。
【００１４】
さらに本発明のＤＮＡ組換えベクターは、上記ＤＮＡフラグメントをベクターに挿入することにより得られるものである。該ベクターは、変異型逆転写酵素のクローニング及び発現を可能とするものであればいかなるものでもよく、例えばファージ及びプラスミドが挙げられる。プラスミドとしてはｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＬＥＤ−Ｍ１、ｐ７３、ｐＧＷ７、ｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ８ｃなどが挙げられる。一方、ファージとしては例えばλｇｔ１１、λＺＡＰIIなどが挙げられる。
【００１５】
また本発明の組換え宿主細胞は、上記ＤＮＡ組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られるものである。該宿主細胞としては、大腸菌、酵母などが挙げられが、特に大腸菌が好ましい。大腸菌としては、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＰＲ１、ＨＳ６４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）などが挙げられる。すなわち、本発明においては、上記の伸長性の向上した変異型逆転写酵素をコードする遺伝子を上記ベクターに挿入してＤＮＡ組換えベクターとし、さらに該組換え発現ベクターにて宿主細胞を形質転換する。
【００１６】
また、本発明における変異型逆転写酵素の製造方法は、上記組換え宿主細胞を培養し、培養液から逆転写酵素を採取することを特徴とする。該組換え宿主細胞の培養に使用する培地ならびに条件は常法に従う。具体例としては、伸長性の向上した変異型逆転写酵素遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を、例えばＴＢ培地にて培養することにより、該変異型逆転写酵素を得ることができる。
【００１７】
上記変異型逆転写酵素の精製方法としては、例えば、（ａ）組換え宿主を集めた後、破砕して、細胞抽出物を調製し、（ｂ）宿主細胞由来の不純蛋白質を除去する工程を含む。組換え宿主細胞より産出された伸長性の向上した変異型逆転写酵素は、宿主菌体を培地で培養後、培養液から遠心分離等にて分離・回収する。該菌体を緩衝液に再懸濁した後、超音波処理、ダイノミル・フレンチプレンス等により菌体を破砕する。
【００１８】
次いで、カラムクロマトグラフィーを実施し、伸長性の向上した変異型逆転写酵素を回収する。カラムクロマトグラフィーは、陽イオン交換体、例えばフォスフォセルロース、あるいは疎水性吸着体、例えばブチルセファロース、あるいはアフィニティー吸着体ヘパリンセファロースなどが好ましい。
【００１９】
上記のようにして取得した伸長性の向上した変異型逆転写酵素の分子量は、好ましくは約７４ＫＤａである。
【００２０】
本発明における変異型逆転写酵素を用いることにより、ＲＮＡを鋳型とし、より長いｃＤＮＡを合成することを可能とする。本発明における変異型逆転写酵素を用いて合成可能なｃＤＮＡの長さは、その反応条件等によっても異なるが、少なくとも９．４ｋｂ以上の伸長が可能であり、条件次第では従来の逆転写酵素を用いては実現出来なかった１４ｋｂ以上の伸長も可能とする。本発明の変異型逆転写酵素を用いた場合、同一の条件で従来の野性型の逆転写酵素を用いた場合とその伸長性を対比した場合、２倍以上の伸長性を増大することができる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００２２】
実施例１  ＭＭＬＶ逆転写酵素への点突然変異の導入
野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素発現プラスミドｐＲＴ３０−２はコロンビア大学・ゴッフ教授より分譲入手した。
【００２３】
点突然変異の導入はトランスフォーマーキット（クロンテック製）を用い、説明書の指示に従って行った。２種の制限酵素選択プライマーおよび２種の変異導入プライマー（配列番号３、４、５、６）を合成した。配列番号３はベータラクタマーゼ遺伝子中のＳｃａＩ部位をＭｌｕＩに変換するプライマーである。配列番号４は上記で変換されたベータラクタマーゼ遺伝子中のＭｌｕＩ部位をＳｃａＩに変換するプライマーである。配列番号５はＭＭＬＶ逆転写酵素遺伝子中の６７０番目のグアニンをアデニンに変換する（すなわち、アミノ酸配列の２２４番目のバリンをメチオニンに変換する）プライマーである。配列番号６はＭＭＬＶ逆転写酵素遺伝子中の１７５０番目のグアニンをアデニンに変換する（すなわち、アミノ酸配列の５８４番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変換する）プライマーである。
【００２４】
それぞれのプライマー２００ｐｍｏｌを１ｍＭ  ＡＴＰ、５ユニット  ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績製）を含むキナーゼバッファー中、３７℃で３０分間インキュベートし、５’末端をリン酸化した。その後、７５℃で１５分間インキュベートしてポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。
【００２５】
ｐＲＴ３０−２  ０．１μｇ、５’末端をリン酸化した配列番号３および６のプライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌ、上記キット添付のアニーリングバッファー２μｌを含む２０μｌの溶液を、１００℃で３分間インキュベートした後、直ちに５分間氷冷した。
【００２６】
これに蒸留水５μｌ、キット添付のシンセシスバッファー３μｌ、Ｔ４リガーゼ１μｌ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした後、７５℃で１５分間インキュベートし酵素を失活させた。これにＨバッファー３μｌ、ＳｃａＩ２０ユニットを加え３７℃で２時間インキュベートした。
【００２７】
このうち１μｌをエシェリヒア・コリＢＭＨ７１−１８株コンピテントセル１００μｌに加え、３０分間氷冷した後、４２℃で３０秒間インキュベートし、９００μｌのＳＯＣ培地を加え３７℃で１時間インキュベートした。これに５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌを加え、３７℃で一晩インキュベートした。
【００２８】
上記のようにして得られた菌体から定法によりプラスミドを抽出し、そのうち５０ｎｇにＳｃａＩ１０ユニット、Ｈバッファー２μｌを加え全量を２０μｌとし，３７℃で２時間インキュベートした。この反応液２μｌをエシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセルに加えて、定法に従い形質転換した。
【００２９】
上記のようにして得られたコロニーをＬＢ培地２．５ｍｌに懸濁し、一晩培養した後、定法に従いプラスミドを抽出した。このプラスミドがＭｌｕＩで切断されるものについて塩基配列をサンガー法で確認し、ＭＭＬＶ逆転写酵素遺伝子中の１７４７番目のグアニンがアデニンに変換されている（すなわち、アミノ酸配列の５８４番目のアスパラギン酸がアスパラギンに変換されている）プラスミドｐＤ５８４Ｎを取得した。
【００３０】
上記と同様にして、配列番号５のプライマーを用い、ＭＭＬＶ逆転写酵素遺伝子中の６７０番目のグアニンがアデニンに変換されている（すなわち、アミノ酸配列の２２３番目のバリンがメチオニンに変換されている）プラスミドｐＶ２２４Ｍを取得した。
【００３１】
また、ｐＤ５８４Ｎをもとに配列番号４および５のプライマーを用い１７５０番目のグアニンがアデニンに変換され（すなわち、アミノ酸配列の５８４番目のアスパラギン酸がアスパラギンに変換されている）、かつ６７０番目のグアニンがアデニンに変換されている（すなわち、アミノ酸配列の２２４番目のバリンがメチオニンに変換されている）プラスミドｐＤＮＶＭを取得した。
【００３２】
実施例２  形質転換体の作製
実施例１で得られた各プラスミド１ｎｇをエシェリヒア・コリＤＨ５α１００μｌに加え、３０分間氷冷した後、４２℃で３０秒間インキュベートし、９００μｌのＳＯＣ培地を加え３７℃で１時間インキュベートした。これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にて３７℃で一晩インキュベートし、形質転換体を得た。
【００３３】
実施例３  形質転換体の培養
実施例２で得られた各形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地１００ｍｌに懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。得られた菌体を１２，０００回転／分で５分間遠心分離することにより回収した。
【００３４】
実施例４  ＭＭＬＶ逆転写酵素の精製
実施例３で得られたそれぞれの菌体について以下の操作を行った。菌体１０ｇをバッファー１（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、１００ｍＭ塩化ナトリウム）２０ｍｌに懸濁した。これを超音波破砕機で破砕し、１２０００回転／分で１０分間遠心分離することにより沈殿を分離した。得られた上清に０．６％ポリエチレンイミン溶液を０．４ｍｌ添加し、３０分間攪拌した。これを１２０００回転／分で１０分間遠心分離することにより沈殿を分離し、上清を回収した。この液に硫酸アンモニウムを４．５６ｇ加え、３０分間攪拌した。これを１２０００回転／分で１０分間遠心分離することにより沈殿を分離し回収した。
【００３５】
得られた沈殿をバッファー２（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０％グリセロール）５ｍｌに溶解し、１００ｍｌのバッファー２に対して透析した。これをＤＥＡＥセファロースカラム（５ｍｌ）にチャージし、非吸着画分を回収した。これをフォスフォセルロースカラム（５ｍｌ）にチャージし、１０ｍｌのバッファー２で洗浄後、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌのグラジェントバッファー２  ４０ｍｌで溶出した。
【００３６】
得られたフラクションのうち、逆転写酵素活性を含みＲＮａｓｅＨ活性を有していない画分をプールした。次いで、これをヘパリンセファロースカラム（３ｍｌ）に供し、０〜１Ｍ  ＮａＣｌのグラジェントバッファー２により溶出し、逆転写酵素活性を含む画分を回収した。以上の操作により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてほぼ単一なバンドを示す１０ｍｇの蛋白質を得た。ｐＤ５８４Ｎを有する菌体から得られた蛋白質をＤ５８４Ｎ、ｐＶ２２４Ｍを有する菌体から得られた蛋白質をＶ２２４Ｍ、ｐＤＮＶＭを有する菌体から得られた蛋白質をＶ２２４Ｍ＋Ｄ５８４Ｎとした。
【００３７】
実施例５  ｃＤＮＡ合成伸長能力の比較
下記の組成物を調製した。
蒸留水                                        １２μｌ
５×1st strand synthesis buffer               ２．０μｌ（LifeTech製）
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                            ２．０μｌ
（α−３２Ｐ）ｄＴＴＰ（３７０ｋＢｑ／μｌ）  １．０μｌ
ＲＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ                          ０．５μｌ（LifeTech製）
１００ｐｍｏｌ／μｌ（ｄＴ）３０              １．０μｌ
ＲＮａｓｅインヒビター（２０units ／μｌ）    ０．５μｌ
逆転写酵素（１０units ／μｌ）                １．０μｌ
【００３８】
比較のため、逆転写酵素は野生型、ＲＮａｓｅＨ欠失型（東洋紡績製）、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII（ＬｉｆｅＴｅｃｈ製）および実施例４で得られたＶ２２３Ｍ＋Ｄ５８３Ｎを用いた。これを４２℃，５０℃、５５℃、６０℃で１時間インキュベートした。停止液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ＢＰＢ、２０％グリセロール）を４μｌ加えて反応終了後、アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。ゲルドライヤーにてゲルを乾燥した後、オートラジオグラフィーを行った。その結果、Ｖ２２４Ｍ＋Ｄ５８４Ｎで合成を行ったものは４２℃から６０℃の間で他の酵素に比べ、より長いｃＤＮＡの伸長が観察された。
【００３９】
実施例６  ＲＴ−ＰＣＲによるｃＤＮＡ合成伸長能力の比較
ヒトジストロフィンのｍＲＮＡは約１４ｋｂの長さを持つことが知られている。配列番号７に示されるオリゴヌクレオチドはこのｍＲＮＡの３’端に相補的に結合するように設計されている。このプライマーを用いてｃＤＮＡ合成反応を行った後、配列番号８および９に示されるプライマーセットを用いＰＣＲを行った。このプライマーセットはｍＲＮＡの５’端約４００ｂｐを増幅するように設計されており、ｃＤＮＡ合成が５’端まで到達していれば増幅が確認できる。
【００４０】
ｃＤＮＡ合成反応は以下の反応液を調製し、４２℃で３０分インキュベートすることにより行った。
【００４１】
蒸留水                                      １１μｌ
５×1st strand synthesis buffer             ４．０μｌ（東洋紡績製）
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                          ２．０μｌ
ヒト骨格筋polyＡ＋ＲＮＡ（０．１μｇ／μｌ）１．０μｌ（CloneTech 製）
プライマー配列番号７（１０ｐｍｏｌ／μｌ）  １．０μｌ
逆転写酵素（１００units ／μｌ）            １．０μｌ
【００４２】
ＰＣＲは以下の反応液を調製し、９８℃で３０秒、６８℃で３０秒の熱サイクルを３０回繰り返すことにより行った。
【００４３】
蒸留水                                        ７．０μｌ
１０×ＫＯＤ  ｄａｓｈ  buffer                ２．０μｌ（東洋紡績製）
ｃＤＮＡ合成反応液                            ８．０μｌ
プライマー配列番号８（１０ｐｍｏｌ／μｌ）    １．０μｌ
プライマー配列番号９（１０ｐｍｏｌ／μｌ）    １．０μｌ
ＫＯＤ  ｄａｓｈ（２．５units ／μｌ）        １．０μｌ（東洋紡績製）
【００４４】
熱サイクル終了後、反応液５μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物を検出した。その結果、図２に示されるようにＶ２２４Ｍ＋Ｄ５８４ＮでｃＤＮＡ合成を行ったものは増幅産物が確認され、約１４ｋｂのｃＤＮＡが合成されていることが示唆されたが、野生型およびスーパースクリプトIIにおいては増幅産物が観察されなかった。これよりＶ２２４Ｍ＋Ｄ５８４Ｎはこれらの酵素に比べて、より長いｃＤＮＡの伸長が可能であることが示唆された。
【００４５】
【発明の効果】
上述したように、本発明における伸長性の向上した変異型逆転写酵素は、４２〜６０℃の間で野生型および従来のＲＮａｓｅＨ欠失型の逆転写酵素に比べて、伸長性が向上しており、完全長ｃＤＮＡを合成するのに適した酵素である（図１参照）。
【００４６】
【配列表】
0004193079.tif 000002
0004193079.tif 000003
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
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【００５３】
0004193079.tif 000013
【００５４】
0004193079.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【図１】  野生型、従来のＲＮａｓｅＨ欠失型、スーパースクリプトIIおよびＶ２２４Ｍ＋Ｄ５８４ＮのｃＤＮＡ合成反応における伸長性を示した図である。
【図２】  ジストロフィンｍＲＮＡを標的とした、ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の電気泳動図である。
【図１】
0004193079.tif 000015
【図２】
0004193079.tif 000016