(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号：１若しくは２に示された塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１若しくは２において、１〜数個の残基の置換、欠失、又は付加を有する塩基配列、及び
（Ｃ）配列番号：１若しくは２に示された塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列、
からなる群より選ばれた１種の塩基配列を有するＤＮＡであって、かつ大腸菌又はバチルス属細菌において構成的プロモーター活性を呈する単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
外来遺伝子の上流に配置された場合、誘導物質の非存在下に該遺伝子を発現しうる、請求項１記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡと外来遺伝子とが、該外来遺伝子が発現可能な状態で配置されてなる組換えＤＮＡ。
【請求項４】
外来遺伝子が、タンパク質をコードする核酸、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸及びリボザイムをコードする核酸からなる群より選択された核酸である、請求項３記載の組換えＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１又は２記載のＤＮＡを少なくとも含有してなる遺伝子発現用ベクター。
【請求項６】
ベクターが、プラスミドベクター及びファージベクターからなる群より選択された１種である、請求項５記載の遺伝子発現用ベクター。
【請求項７】
配列番号：３又は４に示された塩基配列を有してなる、請求項５又は６記載の遺伝子発現用ベクター。
【請求項８】
請求項３又は４記載の組換えＤＮＡを含有してなる発現ベクター。
【請求項９】
ベクターが、プラスミドベクター及びファージベクターからなる群より選択された１種である、請求項８記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項３若しくは４記載の組換えＤＮＡ又は請求項８若しくは９記載の発現ベクターを保持してなる形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換細胞を培養して、得られた培養物からタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【請求項１２】
請求項１又は２記載のＤＮＡ又は請求項５〜７いずれかに１項に記載の遺伝子発現用ベクターを少なくとも含有してなる、タンパク質製造用キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、目的遺伝子の産物を簡便に、かつ安価に高発現させうる、新規なプロモーター、具体的には、該プロモーターの配列を有する単離ＤＮＡ、及び該ＤＮＡを用いたタンパク質の製造方法に関する。
背景技術
有用遺伝子産物を遺伝子工学的に製造する場合、目的に応じて、培養手法が確立された大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を宿主として用い、かかる宿主に適したプロモーターを利用した発現系が利用されている。なかでも、大腸菌を宿主とし、ｌａｃプロモーターやその誘導体等を用いた発現系は、その操作の容易性の観点から、よく使用されている系の１種である。
しかしながら、ｌａｃプロモーターやその誘導体を用いた発現系には、遺伝子産物の発現の際に、遺伝子発現の誘導を行なう必要があるため、工業的に不利であるという欠点を有する。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター等は、遺伝子発現の誘導に高価なＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を必要とするため、工業規模での実施には不利であるという欠点を有する。
一方、ファージλプロモーターの温度誘導を用いる発現ベクターも、一般的に使用されている。しかしながら、組換遺伝子産物の温度誘導された過剰発現は、（ａ）迅速な温度シフトアップを達成することの困難性、（ｂ）より高い培養温度での不溶性インクルージョンボディーの形成の可能性の増大、及び（ｃ）熱ショック時の大腸菌におけるいくつかのプロテアーゼの誘導等の点で不利な場合がある。
したがって、遺伝子発現を誘導しなくても、効率のよい発現が可能な手法が望まれている。
発明の開示
本発明は、誘導物質により遺伝子発現を誘導することなく、該遺伝子を高レベルで発現しうるプロモーターの配列を有するＤＮＡ、組換えＤＮＡ、遺伝子発現用ベクター、発現ベクター、及び形質転換細胞並びに操作が簡便であり、かつ安価に行ないうる、タンパク質の製造方法及びそのキットを提供することを目的とする。
本発明の要旨は、
〔１〕  （Ａ）配列番号：１若しくは２に示された塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１若しくは２において、少なくとも１残基の置換、欠失、又は付加を有する塩基配列、
（Ｃ）配列番号：１若しくは２に示された塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列、及び
（Ｄ）配列番号：１又は２に示される塩基配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列、
からなる群より選ばれた１種の塩基配列を有するＤＮＡ又はその断片であって、かつ大腸菌又はバチルス属細菌において構成的プロモーター活性を呈する単離されたＤＮＡ、
〔２〕  外来遺伝子の上流に配置された場合、誘導物質の非存在下に該遺伝子を発現しうる、前記〔１〕記載の単離されたＤＮＡ、
〔３〕  前記〔１〕又は〔２〕記載のＤＮＡと外来遺伝子とが、該外来遺伝子が発現可能な状態で配置されてなる組換えＤＮＡ、
〔４〕  外来遺伝子が、タンパク質をコードする核酸、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸及びリボザイムをコードする核酸からなる群より選択された核酸である、前記〔３〕記載の組換えＤＮＡ、
〔５〕  前記〔１〕又は〔２〕記載のＤＮＡを少なくとも含有してなる遺伝子発現用ベクター、
〔６〕  ベクターが、プラスミドベクター、ファージベクター及びウイルスベクターからなる群より選択された１種である、前記〔５〕記載の遺伝子発現用ベクター、
〔７〕  配列番号：３又は４に示された塩基配列を有してなる、前記〔５〕又は〔６〕記載の遺伝子発現用ベクター、
〔８〕  前記〔３〕又は〔４〕記載の組換えＤＮＡを含有してなる発現ベクター、
〔９〕  ベクターが、プラスミドベクター、ファージベクター及びウイルスベクターからなる群より選択された１種である、前記〔８〕記載の発現ベクター、
〔１０〕  前記〔３〕若しくは〔４〕記載の組換えＤＮＡ又は前記〔８〕若しくは〔９〕記載の発現ベクターを保持してなる形質転換細胞、
〔１１〕  前記〔１０〕記載の形質転換細胞を培養して、得られた培養物からタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法、並びに
〔１２〕  前記〔１〕又は〔２〕記載のＤＮＡ又は前記〔５〕〜〔７〕いずれかに１項に記載の遺伝子発現用ベクターを少なくとも含有してなる、タンパク質製造用キット、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明のＤＮＡは、バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＳＫ−１由来のＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼのＯＲＦの上流に局在し、かつプロモーター活性を呈するエレメント由来である。本発明は、前記ＤＮＡの下流に外来遺伝子（目的遺伝子ともいう）を配置した場合、発現誘導物質の非存在下で、目的遺伝子産物を全タンパク質量の少なくとも約３０〜５０％のレベルで発現することができるという、本発明者らの驚くべき知見に基づく。
本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号：１若しくは２に示された塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。より好ましくは、後述のように、大腸菌又はバチルス属細菌において構成的プロモーター活性を呈する単離されたＤＮＡである。
本明細書において、「プロモーター」とは、転写開始点（＋１）から２０〜３０塩基対上流にあって、正確な位置からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始させる機能を担っているＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡボックス類似の領域が含まれるが、必ずしもこれらの領域の前後に限定されるものではなく、この領域以外に、発現調節のためにＲＮＡポリメラーゼ以外のタンパク質が会合するために必要な領域を含んでいてもよい。また、本明細書中で「プロモーター領域」と記載する場合があるが、かかる用語は、本明細書におけるプロモーターを含む領域のことをいう。
本明細書において、「プロモーター活性」とは、プロモーターの下流に発現可能な状態で遺伝子を配置し、得られた構築物を宿主に導入した際、宿主内または宿主外において該遺伝子の発現産物を生産する能力及び機能を有することを示す。
一般的に、前記「プロモーター活性」は、下記：
▲１▼  定量または確認が容易なタンパク質をコードした遺伝子（以下、レポーター遺伝子ともいう）の上流に測定対象のＤＮＡを連結するステップ、
▲２▼  得られた構築物を宿主に導入するステップ、
▲３▼  得られた形質転換細胞を培養して、該タンパク質を発現させるステップ、及び
▲４▼  該タンパク質の発現量を測定するステップ
のプロセスにより、測定することができる。また、「プロモーター活性」の有無は、例えば、プロモーター配列を有すると思われる配列をレポーター遺伝子の上流に連結し、宿主に導入した際、宿主内または宿主外において該遺伝子の遺伝子産物の発現が確認することにより実施でき、ここで、発現が認められた場合、そのプロモーターは導入した宿主においてプロモーター活性を有することの指標となる。
本明細書において、「構成的プロモーター」とは、生育条件に無関係に常に一定レベルで転写を行なうプロモーターをいう。すなわち、「構成的プロモーター」は、ＩＰＴＧ等に代表される誘導物質を用いて誘導することなく、該プロモーターの下流に配置された遺伝子を発現させうる。
本発明のＤＮＡには、構成的プロモーター活性が認められるものであれば、前記配列番号：１又は２に示された塩基配列を有する単離されたＤＮＡの断片も含まれる。ここで、「断片」は、構成的プロモーター活性が認められる範囲内で適宜選択することができる。かかる断片は、前記ステップ▲１▼〜▲４▼のプロセスにより選択することができる。前記「断片」の長さは、例えば、５００塩基以下のものが例示される。
本発明のＤＮＡには、さらに、配列番号：１又は２の塩基配列において、少なくとも１塩基、具体的には、１又は複数個の塩基の置換、欠失、又は付加を有する塩基配列を有し、かつ構成的プロモーター活性を有するＤＮＡも含まれる。一般的に、短い配列を有するＤＮＡにおいて、少なくとも１塩基に変異（置換、欠失、又は付加）を有するＤＮＡは、その活性が変化することもあるが、前記ステップ▲１▼〜▲４▼のプロセスにより構成的プロモーター活性が認められた「変異を有するＤＮＡ」は、本発明に包含される。かかる変異は、天然由来の変異及び人為的に導入された変異のいずれであってもよい。
人為的な変異の導入方法としては、慣用の部位特異的変異導入法等が挙げられる。部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法［ギャップド・デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻、第９４４１〜９４５６頁（１９８４）］、ｄｕｔ（ｄＵＴＰａｓｅ）とｕｎｇ（ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ）遺伝子を欠損した宿主を利用する方法［クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、第８２巻、第４８８〜４９２頁（１９８５）］、アンバー変異を利用したＰＣＲによる方法（国際公開９８／０２５３５号パンフレット）等を用いることができる。
変異を有するＤＮＡの長さは、前記ステップ▲１▼〜▲４▼のプロセスにより構成的プロモーター活性が認められる長さであればよく、例えば、５００塩基以下のものが例示される。
また、本発明のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ構成的プロモーター活性を有するＤＮＡ（ａ）、又は本発明のＤＮＡを基に、例えば、常法により設計し化学的に合成したオリゴヌクレオチドプローブ若しくはプライマーを用いて得られたＤＮＡであって、かつ構成的プロモーター活性を有するＤＮＡ（ｂ）、好ましくは、大腸菌又はバチルス属細菌において構成的プロモーター活性を呈する単離されたＤＮＡも本発明に包含される。かかるＤＮＡは、例えば、前記ステップ▲１▼〜▲４▼のプロセスにより構成的プロモーター活性が認められたものを選択すればよい。該オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列には特に限定はないが、前記ＤＮＡ又は該ＤＮＡに相補的な塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下にハイブリダイズするものであればよい。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、以下の条件をいう。すなわち、前記（ａ）のＤＮＡの場合、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルト〔Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕と１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡとを含む溶液中、５０℃で一晩保温する条件等が例示され、前記（ｂ）のＤＮＡの場合、前記と同様の溶液中、用いるプローブのＴｍ−２５℃の温度で一晩保温する条件等が例示される。
また、プライマーの塩基配列にも特に限定はなく、通常のＰＣＲの反応条件において、前記ＤＮＡ又は該ＤＮＡに相補的な塩基配列を有するＤＮＡにアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を開始できるものであればよい。
オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーのＴｍは、例えば、下記式：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる。
また、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの鎖長が１８塩基より短い場合、Ｔｍは、例えばＡ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
上記のオリゴヌクレオチドプローブの鎖長は、特に限定されないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、好ましくは１５塩基以上であり、より好ましくは１８塩基以上であることが望ましい。
また、プライマーにおいても、鎖長は、特に限定されないが、例えば、１５〜４０塩基、好ましくは１７〜３０塩基であることが望ましい。前記プライマーは、ＰＣＲ法をはじめとする種々の遺伝子増幅法に使用することが可能であり、これによって、得られる構成的プロモーター活性を有するＤＮＡも本発明に包含される。
また、ハイブリダイゼーション操作の詳細は、例えば、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．）に記載されている。
前記（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡの長さは、前記ステップ▲１▼〜▲４▼のプロセスにより構成的プロモーター活性が認められる長さであればよく、例えば、５００塩基以下のものが例示される。
また、本発明のＤＮＡには、配列番号：１又は２に示される塩基配列に少なくとも８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ構成的プロモーター活性を有するＤＮＡも含まれる。より具体的には、配列番号：１に示される塩基配列に少なくとも８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％の配列同一性を有し、かつ構成的プロモーター活性を有するＤＮＡ、配列番号：２に示される塩基配列に少なくとも８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％の配列同一性を有し、かつ構成的プロモーター活性を有するＤＮＡ等が例示される。かかるＤＮＡは、例えば、前記ステップ▲１▼〜▲４▼のプロセスにより構成的プロモーター活性が認められるものであればよい。
前記「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチド間の残基の配列類似性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の塩基配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの塩基配列を比較することにより決定されうる。ここで、比較対象のポリヌクレオチドは、２つの配列の最適なアラインメントのための参考配列（例えば、コンセンサス配列など）と比べて、付加又は欠失（例えば、ギャップ、オーバーハングなど）を有していてもよい。
配列同一性の数値（パーセンテージ）は、両方の配列に存在する同一の核酸塩基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の塩基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけることにより、算出されうる。最適なアラインメント及びホモロジーを得るためのアルゴリズムとしては、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）らの局所ホモロジーアルゴリズム〔Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．、第２巻、第４８２頁（１９８１）〕、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）らのホモロジーアラインメントアルゴリズム〔ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第４８巻、第４４３頁（１９７０）〕、パールソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）らの相同性検索法〔プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  ジ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ）、第８５巻、第２４４４頁（１９８８）〕が挙げられる。より具体的には、ダイナミックプログラミング法、ギャップペナルテイ法、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｇｏｏｄ−Ｋａｎｅｈｉｓａアルゴリズム、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズム等が挙げられる。
核酸間の配列同一性は、例えば、配列解析ソフト、具体的には、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡなどを用いて測定される。前記ＢＬＡＳＴＮは、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において、ＦＡＳＴＡはホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般に利用可能である。
本発明のＤＮＡにより、さらに、前記ＤＮＡと外来遺伝子とが、該外来遺伝子が発現可能な状態で配置されてなる組換えＤＮＡが提供される。かかる組換えＤＮＡも本発明に含まれる。
本明細書において、外来遺伝子とは、本発明のＤＮＡの由来生物とは異なる起源の遺伝子；本発明のＤＮＡに対して異質である遺伝子；後述のように、適切な宿主に導入することにより本発明のＤＮＡを用いる場合には、該宿主にとって、異質である遺伝子のいずれをも含むことを意図する。
前記外来遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、タンパク質をコードする核酸、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸、リボザイムをコードする核酸等が挙げられる。かかる外来遺伝子の起源は、特に限定されないが、例えば、細菌類、酵母類、放線菌類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物；植物；昆虫；動物等が挙げられ、更に目的に応じ、人工的に合成した遺伝子も挙げられる。
タンパク質をコードする核酸としては、例えば、酵素、サイトカイン類、抗体等をコードする核酸が挙げられ、より具体的には、例えば、インターロイキン１〜１２遺伝子、インターフェロンα、β若しくはγ遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、コロニー刺激因子遺伝子、エリスロポエチン遺伝子、形質転換増殖因子−β遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子、ウロキナーゼ遺伝子、西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書でいう「リボザイム」とは、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するものをいい、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものをいう。リボザイムは特定のタンパク質をコードした遺伝子の配列より設計可能である。例えば、ハンマーヘッド型リボザイムは、フェブス  レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ）、第２２８巻、第２２８〜２３０頁（１９８８）に記載の方法を用いて作製されうる。また、ハンマーヘッド型リボザイムだけでなく、ヘアピン型リボザイム、デルタ型リボザイム等のリボザイムの種類に関わらず、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するもので、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれば、本明細書におけるリボザイムに含まれる。
本明細書において、「外来遺伝子が発現可能な状態」とは、該外来遺伝子が、本発明のＤＮＡにより発揮されるプロモーター活性の制御下にあることを意味する。
本発明のＤＮＡの取得方法としては、例えば、（１）後述の実施例に記載のように、生物から単離する方法；（２）配列番号：１又は２に示される塩基配列を基づく適切なプローブ又はプライマーを用いて、生物のゲノムＤＮＡから選抜する方法；（３）配列番号：１又は２に示される塩基配列を基に、化学合成する方法等が挙げられる。
化学合成により配列番号：１又は２に示される塩基配列からなるＤＮＡを作製する場合、例えば、慣用のホスホロアミダイト法等により、化学合成したオリゴヌクレオチドを酵素的に連結させることにより、前記ＤＮＡを合成しうる。具体的には、例えば、下記工程：
（１）配列番号：１又は２に示される塩基配列を網羅しうる数十種類のオリゴヌクレオチドＡｎ（ｎは、正の整数を示す）と、
該Ａｎの配列から３’側又は５’側に数塩基ずれた塩基配列に相補的な配列からなる該Ａｎと同鎖長のオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドＡｎのアニーリングにより、５’突出末端又は３’突出末端を有する二本鎖ＤＮＡを生じる相補鎖オリゴヌクレオチドａｎ（ｎは、正の整数を示す）とを、それぞれ、慣用の化学合成法により合成する工程；
〔例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを作製する場合、
前記Ａｎは、配列番号：１の塩基番号：１〜２０（Ａ１）、２１〜４０（Ａ２）、４１〜６０（Ａ３）、６１〜８０（Ａ４）、８１〜１００（Ａ５）、１０１〜１２０（Ａ６）、１２１〜１４０（Ａ７）、１４１〜１６０（Ａ８）、１６１〜１８０（Ａ９）、１８１〜２００（Ａ１０）及び２０１〜２２３（Ａ１１）のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドであり、
前記ａｎは、配列番号：１の塩基番号：１〜２３（ａ１）、２４〜４３（ａ２）、４４〜６３（ａ３）、６４〜８３（ａ４）、８４〜１０３（ａ５）、１０４〜１２３（ａ６）、１２４〜１４３（ａ７）、１４４〜１６３（ａ８）、１６４〜１８３（ａ９）、１８４〜２０３（ａ１０）、２０４〜２２３（ａ１１）のそれぞれからなるオリゴヌクレオチドの相補鎖である〕
（２）ＡＴＰと慣用のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとを用いて、前記工程（１）で得られた各オリゴヌクレオチドＡｎと対応する相補鎖オリゴヌクレオチドａｎとのそれぞれの５’末端をリン酸化する工程；
（３）前記工程（２）で得られた各オリゴヌクレオチドＡｎと対応する相補鎖オリゴヌクレオチドａｎとをアニーリングさせて、数十種類の「５’突出末端又は３’突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ（Ａｎａｎ）」を得る工程；
（４）前記工程（３）で得られた二本鎖ＤＮＡ（Ａｎａｎ）について、ｎの昇べきの順に、配列番号：１又は２に示される塩基配列に対応して、数ブロックに分け、各ブロックに対応するように、前記工程（３）で得られた二本鎖ＤＮＡ（Ａｎａｎ）を１つのチューブにまとめる工程；
〔例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを作製する場合、
オリゴヌクレオチドＡ１〜Ａ４と相補鎖ａ１〜ａ４とのチューブ、
オリゴヌクレオチドＡ５〜Ａ８と相補鎖ａ５〜ａ８とのチューブ、
オリゴヌクレオチドＡ９〜Ａ１１と相補鎖ａ９〜ａ１１とのチューブ、
を設定する〕
（５）前記工程（４）の各ブロックに対応するチューブ毎に、二本鎖ＤＮＡをライゲーションして、それにより、各ブロックに対応する二本鎖ＤＮＡを得る工程；
（６）前記工程（５）で得られた二本鎖ＤＮＡをゲル電気泳動に供し、各ブロックに対応する目的の鎖長を有する二本鎖ＤＮＡのバンドをゲルから抽出する工程；
（７）前記工程（６）で得られた各ブロックに対応する目的の鎖長を有する二本鎖ＤＮＡを１つにまとめ、ライゲーションする工程；
（８）前記工程（７）で得られたＤＮＡについて、ゲル電気泳動により鎖長を調べること、及び／又は塩基配列解析を行なうことにより、配列番号：１又は２に示される塩基配列からなるＤＮＡであることを確認する工程；
を行なうことにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。
本発明のＤＮＡは、遺伝子発現を誘導しなくても、該遺伝子を高レベルで発現することができるプロモーターであるため、特にタンパク質をコードする核酸である外来遺伝子の発現に好適である。
また、本発明のＤＮＡにより、ＤＮＡを少なくとも含有してなる遺伝子発現用ベクターが提供される。かかる遺伝子発現用ベクターも本発明に含まれる。
本発明の遺伝子発現用ベクターによれば、本発明のＤＮＡを含有しているため、目的遺伝子産物を、宿主が生産する全細胞内タンパク質量の少なくとも約３０〜５０％のレベルで構成的に発現することができ、かつ目的遺伝子産物をその使用目的等に応じて容易に発現させることが可能になる。
本発明の遺伝子発現用ベクターの具体例としては、ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）〔第５図〕、ｐＨＣＥ１９（ＩＩ）〔第７図〕が挙げられる。
なお、前記（プラスミドｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）として命名・表示され、平成１２年４月１４日（原寄託日）より、ブダペスト条約の下、日本国茨城県つくば市東１丁目１−１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５３５として寄託されている。また、前記プラスミドｐＨＣＥ１９（ＩＩ）で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＨＣＥ１９（ＩＩ）と命名・表示され、平成１２年４月１４日（原寄託日）より、ブダペスト条約の下、日本国茨城県つくば市東１丁目１−１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５３４として寄託されている。本発明の遺伝子発現用ベクターの１例であるｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）及びｐＨＣＥ１９（ＩＩ）は、かかる寄託大腸菌より入手することもできる。
本発明の遺伝子発現用ベクターにおいて、ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターが挙げられる。前記ベクターは、宿主として用いられる細胞により適宜選択することができる。
宿主として用いられうる細胞としては、大腸菌及びバチルス属細菌が挙げられる。具体的には、大腸菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５  α株、ＤＨ１０Ｂ株、ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲＦ’株、ＴＯＰ１０Ｆ株等が挙げられる。また、バチルス属細菌としては、バチルス  スピーシーズ（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、バチルス  サブチリス（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス  ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これら大腸菌又はバチルス属細菌を変異処理等を行ない、得られたものも宿主として用いることができる。
前記ベクターとしては、例えば、宿主が大腸菌である場合、プラスミドベクターとして、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＥＴ等が、ファージベクターとして、λｇｔ１０、λｇｔ１１等のラムダファージベクター等が挙げられる。
本発明の遺伝子発現用ベクターの構築には、前記モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル第２版等に記載の手法を利用することができる。例えば、第４図に示される構築の概略に従って、作製することができる。すなわち、前記好熱性バチルス・スピーシーズＳＫ−１のＤ−ＡＡＴ遺伝子の上流域の５’−プロモーターとＳＤ（Ｓｈｉｎｅ−ｄａｌｇａｎｏ）配列とを含むＤＮＡ断片（３５０ｂｐ）を、下記プライマー〔ｐｒｉｍｅｒ１（配列番号：５）及びｐｒｉｍｅｒ２（配列番号：６）〕：
0004079640.tif 000002
を用いたＰＣＲ法により増幅する。
ついで、増幅されたプロモーターを含む断片を、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍ  ＨＩとで消化し、精製する。得られた断片を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＢａｍ  ＨＩとで消化されたｐＵＣ１９の大きい方の断片に連結して、ｐＨＵＣ１９Ｔを作製する。ついで、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ由来の強い転写ターミネーターｒｒｎＢＴ１Ｔ２を含むＮｃｏＩ−ＳｃａＩ断片を、ｐＨＵＣ１９ＴのＮｃｏ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉ（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）部位に挿入して、遺伝子発現用ベクターｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）を得ることができる（第５図）。なお、ＤＮＡ塩基配列決定によって、プロモーター領域の配列を確認することができる。また、ｐｒｉｍｅｒ２の代わりに、下記ｐｒｉｍｅｒ３（配列番号：７）：
0004079640.tif 000003
を用いて、前記と同様に、ＳＤ配列とＮｃｏＩ部位との間の長さがｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）とは異なる遺伝子発現用ベクターｐＨＣＥ１９（ＩＩ）を得ることができる（第６図及び第７図）。
また、上記のｐＨＣＥ１９（ＩＩ）は、ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）のＳＤ配列とＮｃｏＩ部位の間の塩基配列：５’−ｇａｔａｔａ−３’を、公知の変異導入方法によって５’−ｇｃｔｇｇａａｃ−３’に変異させることによっても得ることができる。
本発明の遺伝子発現用ベクターは、ｒｒｎＢＴ１Ｔ等のターミネーター、選択可能なマーカー遺伝子等を含んでもよい。
選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられる。
また、本発明の遺伝子発現用ベクターは、目的遺伝子産物の使用目的に応じて、例えば、目的遺伝子の産物の単離操作の簡便化をはかるために、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の異種タンパク質との融合タンパク質として発現できるような配列、あるいはヒスチジンタグ等が付加されたタンパク質として発現できるようなタグ配列を含有してもよい。
本発明の遺伝子発現用ベクターは、例えば、配列番号：３又は４に示された塩基配列を有するベクターが挙げられる。
さらに、本発明により、前記組換えＤＮＡを含有した発現ベクターが提供される。かかる発現ベクターも本発明に含まれる。また、本発明の発現ベクターには、前記遺伝子発現用ベクターに目的遺伝子を組み込むことにより得られた構築物をも含まれる。
前記遺伝子発現用ベクターで挙げられたベクターと同様のベクターを使用できる。
本発明の発現ベクターは、（ａ）前記組換えＤＮＡを適当なベクターに組み込むこと、（ｂ）前記遺伝子発現用ベクターに目的遺伝子を組み込むこと、により作製することができる。
また、本発明の組換えＤＮＡ及び発現ベクターにより、さらに、前記組換えＤＮＡを保持してなる形質転換細胞、あるいは前記発現ベクターを保持してなる形質転換細胞も提供することができる。
宿主としては、前出「宿主として用いられうる細胞」と同様な細胞が挙げられる。
組換えＤＮＡの宿主への導入は、例えば、文献〔ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），第５２巻，第４５６頁（１９７３），モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），第７巻，第２７４５頁（１９８７），ジャーナル  オブ  ザ  ナショナル  キャンサー  インスティテュート（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ），第４１巻，第３５１頁（１９６８），エンボ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ），第１巻，第８４１頁（１９８２）〕記載の方法により行ないうる。
発現ベクターの宿主への導入は、例えば、リン酸カルシウム法［モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第７巻、第２７４５頁（１９８７）］、電気穿孔法［プロシーディングス  オブ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ、第８１巻、第７１６１頁（１９８４）］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［メソッズ  イン  ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２８３頁、カラムら編、ＣＲＣプレス、１９９１年発行］、リポソーム法［バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第６巻，第６８２頁（１９８９）］等により行なうことができる。
さらに、本発明の形質転換細胞によれば、形質転換細胞を培養して、得られた培養物からタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法が提供される。かかる「タンパク質の製造方法」も本発明に含まれる。
より具体的には、（Ｉ）ａ）本発明のＤＮＡの下流にタンパク質をコードする核酸が発現可能に配置された組換えＤＮＡ、又は
ｂ）該組換えＤＮＡを含有したベクター
を用いて、宿主細胞を形質転換する工程、
（ＩＩ）（Ｉ）で得られた形質転換細胞を、該タンパク質の発現に適した条件下に培養して、得られた培養物から該タンパク質を採取する工程、
により、タンパク質を製造することができる。
形質転換細胞の培養の条件は、宿主として用いられた細胞、発現対象のタンパク質の性質等により適宜選択することができる。
得られたタンパク質は、慣用のタンパク質の精製手段により精製することができる。かかる精製手段としては、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等が挙げられる。
また、本発明のタンパク質の製造方法には、本発明のＤＮＡ又は本発明の遺伝子発現用ベクターを含有した、タンパク質の製造用キットを使用することができる。かかるキットにより、より簡便にタンパク質の製造方法を行なうことができる。
以下、本発明を実施例により、詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
実施例１  Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ生産好熱性細菌のスクリーニングとキャラクタリゼーション
Ｄ−アミノ酸の酵素的合成及びＤ−アミノ酸の産業的生産に有用な生体触媒を得るため、韓国の土壌から単離された１，３００の好熱性細菌について、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｄ−ＡＡＴ）活性を解析した。
Ｄ−アラニンとα−ケトグルタル酸とからのピルビン酸形成の速度を測定することにより、Ｄ−ＡＡＴ活性を決定した。ピルビン酸の量は、乳酸デヒドロゲナーゼとのカップリング法またはサリチルアルデヒド法〔アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），第２７巻，第１６５９〜１６６０頁（１９９５）；メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），第１１３巻，第１０８頁（１９８５）〕により決定した。
活性測定には、１００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．５）中、５０ｍＭのピリドキサール−５’−リン酸と、１００ｍＭ  Ｄ−アラニンと１００ｍＭのα−ケトグルタル酸とを含んだ反応混合物を用いた。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）カップリングアッセイの場合、０．３ｍＭのＮＡＤＨと５ユニット／ｍｌ  ＬＤＨを含めた。酵素活性の１ユニットは、１分間に１ｍｍｏｌのピルビン酸の形成を触媒する酵素の量として定義した。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを使用するブラッドフォード〔アナリティカル  バイオケミストリー、第７２巻，第２４８〜２５４頁（１９７６）〕の方法によって決定した。
種々の環境から単離された好熱性細菌由来のＤ−ＡＡＴ活性を検索した結果、１１０株のＤ−ＡＡＴ生産株を得た。それらのほとんどは、好気条件で生育し、内性胞子形成するため、おそらくバチルス属の種に属していると考えられた。
ついで、Ｄ−ＡＡＴ生産菌株の酵素活性と熱安定性を比較した。その結果、Ｄ−アミノ酸生産のためのタンパク質生体触媒の生産菌株として４つの好熱菌：より高い比活性を有する２つの好熱性細菌、バチルス・スピーシーズＬＫ−１及びＬＫ−２、並びに前記Ｄ−ＡＡＴ生産株より高い熱安定性を有する２つの好熱性細菌、バチルス・ステアロサーモフィラスＫＬ−０１及びバチルス・スピーシーズＳＫ−１株を選択した。Ｄ−ＡＡＴ活性を呈した陽性株の中で、最も高い活性を示す２株ＬＫ１及びＬＫ２を分類学的同定に供し、ＹＭ１株と形態学的特徴及び生化学的特徴〔Ｋｏｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第２７巻，第１８４〜１９０頁（１９９９）〕に非常に類似していることがわかった。特に、前記２株は、ＹＭ１株のように６５℃で生育できなかった。異なるバチルス由来Ｄ−ＡＡＴのウエスタンブロット解析において、ＬＫ１とＬＫ２酵素は、ＹＭ１  Ｄ−ＡＡＴに対する抗体との強い相互作用を示し、単離された２つのＤ−ＡＡＴの移動距離は、ＹＭ１由来のＤ−ＡＡＴの移動距離（分子量：約３１ｋＤａ）と同じものであった（第１図）。
一方、６５℃で生育する好熱性バチルス株のＤ−ＡＡＴは、相対的に弱い免疫ブロットシグナルを示し、Ｄ−ＡＡＴの移動距離は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動解析（第１図）において３２〜３４ｋＤａの分子量を示すＹＭ１  Ｄ−ＡＡＴの移動距離とは明らかに異なっていた。６５℃で生育するバチルス株のＤ−ＡＡＴ活性は、０．０２ユニット／ｍｇタンパク質以下であり、ＬＫ１及びＬＫ２のＤ−ＡＡＴ活性の約５分の１であった〔Ｋｏｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第２７巻，第１８４〜１９０頁（１９９９）〕。６５℃で生育するバシラス群由来のＤ−ＡＡＴの特性を解明するために、本実験において、Ｄ−ＡＡＴの供与源としてＳＫ−１株を選択した。
実施例２  耐熱性Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを生産している好熱性バチルス・スピーシーズＳＫ−１のキャラクタリゼーション
単離されたバチルス・スピーシーズＳＫ−１は、シンビオバクテリウム・トエビ（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｏｅｂｉｉ）株と、絶対共生相互作用を有していた。前記ＳＫ−１株の諸性質を以下に示す：
菌学的性質
好気性、グラム陽性、運動性桿菌
ゲノムＤＮＡのＧＣ含量：４３．９モル％
至適生育条件
温度：４５〜７０℃（至適温度：６０℃）
ｐＨ：６．０〜９．０（至適温度：ｐＨ７．５）
細胞壁にメソ−ジアミノピメリン酸が存在
主要な細胞脂肪酸として、分枝脂肪酸ｉｓｏ−１５：０及びｉｓｏ−１７：０の存在
主要なイソプレノイド・キノン：ＭＫ−７
１６ＳリボソームＤＮＡの比較配列解析
バチルス・サーモグルコシダシウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）と密接な関係を有する
実施例３  好熱性バチルス・スピーシーズＳＫ−１由来の耐熱性Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの遺伝子クローニングとキャラクタリゼーション
１）菌株とプラスミド
バチルス・スピーシーズＳＫ−１を、ＭＹ培地〔組成：１．５％のポリペプトン、０．２％酵母エキス、０．２％肉エキス、０．２％グリセロール、０．２％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０２６％  ＮＨ４Ｃｌ（ｐＨ７．０）〕中、好気条件下に６０℃で培養した。Ｄ−ＡＡＴ遺伝子のクローニングのために、バチルス・スピーシーズＳＫ−１〔絶対共生の好熱性細菌シンビオバクテリウム・トエビ（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｏｅｂｉｉ）ＳＣ−１の共生細菌〕をＤＮＡ供与体として使用した。大腸菌ＷＭ３３５株〔ｌｅｕ，ｐｒｏ，ｈｉｓ，ａｒｇ，ｔｈｙＡ，ｍｅｔ，ｌａｃ，ｇａｌ，ｒｓｐＬ，ｈｓｄＭ，ｈｓｄＲ，ｍｕｒＩ〕（Ｄ−グルタミン酸栄養要求株）、遺伝子相補性方法〔ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），第１１４巻，第４９９〜５０６頁（１９７３）〕のための宿主株として使用した。必要に応じて、アンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）とＤ−グルタミン酸（１００ｍｇ／ｍｌ）とを補ったルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で前記バチルス・スピーシーズＳＫ−１を培養した。
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳについては、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社から購入し、プラスミドｐＵＣ１１８とｐＵＣ１１９とは宝酒造社から購入した。Ｄ−ＡＡＴ遺伝子のサブクローニングとシークエンスのための宿主株として、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ〔ストラタジーン社製〕を使用した。
２）バシラスｓｐ．ＳＫ−１由来Ｄ−ＡＡＴの遺伝子クローニング
バチルス・スピーシーズＳＫ−１のゲノムＤＮＡを、斎藤ら〔バイオキミカ  エ  バイオフィジカ  アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ）、第７２巻，第６１９〜６２９頁（１９６３）〕によって記述されたように調製し、ついで、得られたＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化した。ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）社製のＳＷ４０ローター中シュークロースグラジェント〔５〜４０％（ｗ／ｖ）〕での２５，０００ｒｐｍ、２０時間の遠心分離により、３〜１０ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離した。ついで、得られたフラグメントとＢａｍＨＩ消化ｐＵＣ１１８とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用いて、１２時間１６℃反応させて連結した。得られたライゲーション混合液を用いて、Ｄ−グルタミン酸−依存栄養要求株（大腸菌ＷＭ３３５）をエレクトロポレーションにより形質転換した。これにより、バチルス・スピーシーズＳＫ−１のゲノムＤＮＡライブラリーを得た。ゲノムＤＮＡライブラリーから、ＷＭ３３５の相補性により、３５個のＤ−グルタミン酸非依存性、アンピシリン耐性コロニーを得た。
ジェットスター２．０プラスミド・ミディ・ピュリフィケーションキット〔商品名：ＪｅｔＳｔａｒ  ２．０  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ，ゲノムド（Ｇｅｎｏｍｅｄ）社製〕を用いて、各コロニーのプラスミドＤＮＡを精製した。
単離プラスミドを用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を再形質転換した。その後、形質転換細胞を培養し、実施例１と同様の測定法により、Ｄ−ＡＡＴ活性をアッセイした。
Ｄ−ＡＡＴ活性を示す１２クローンの中で、最も高いＤ−ＡＡＴ活性〔３５ユニット／ｍｇタンパク質（０．０２のユニット／ｍｇタンパク質を示すバチルス・スピーシーズＳＫ−１の無細胞抽出液より１７５０倍高い活性である）〕の１クローン（ｐＤＳＫ２）は、３．６ｋｂの挿入断片を含んでいた。Ｄ−ＡＡＴ遺伝子のサブクローニングのために、プラスミドｐＤＳＫ２を制限解析に供した。その結果、ｐＤＳＫ２のＤ−ＡＡＴ活性は、１．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントに帰属していた（第２図）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳに前記１．７ｋｂのフラグメントをサブクローン化して、それぞれｐＤＳＫ２３１とｐＤＳＫ２３２とを構築した。ｐＤＳＫ２３１に逆方向で挿入断片を含むプラスミドｐＤＳＫ２３２は、同様のレベルのＤ−ＡＡＴ活性を生じ、本遺伝子がそれ自身のプロモーターによって構成的に発現されたことを示した。
バチルス・スピーシーズＳＫ−１由来のＤ−ＡＡＴ遺伝子の塩基配列については、ＰＲＩＳＭキット〔パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社製〕とアプライドバイオシステムズ３７３  Ａ  ＤＮＡシーケンサーとを用いて、両方のＤＮＡ鎖におけるプライマーウォーキング法により決定した。開始プライマーについては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫのユニバーサルプライマー及びリバースプライマーであり、内部配列に特異的なプライマーは、コリア・バイオテック社（韓国）で合成した。決定された配列を、ソフトウェア・ジェネティックス−マック（Ｓ．Ｄ．Ｓ社製）を使って分析した。
３）精製
１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地（１リットル）中、ｐＤＳＫ２を保持した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを１６時間３７℃で培養した。得られた菌体を遠心分離により回収し、ついで、回収された菌体を５０ｍｌの標準緩衝液〔終濃度０．０１％のβ−メルカプトエタノールと終濃度２０ｍＭのピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）とを含む３０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）〕に懸濁した。ソニファイヤー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）４５０〔ブラソンウルトラソニックス（Ｂｒａｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ）社製〕を用いて、氷上で２０％の効率で１０分間、得られた懸濁物を破砕した。１５０００ｒｐｍ、６０分間の遠心分離の後、上清を回収し、２０分間、６０℃で熱処理した。１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により、タンパク質凝集物を除去した。
得られた上清を、前記標準緩衝液で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ陰イオン交換カラム〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕にかけた。タンパク質を、０〜１Ｍ  ＮａＣｌリニアグラジェントで溶出した。Ｄ−ＡＡＴ活性を示す画分をプールし、限外濾過〔アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）社製〕によって濃縮した。得られたタンパク質溶液を、１．７Ｍ硫酸アンモニウムを含むように処理され、１．７Ｍ硫酸アンモニウムを含む標準緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅカラム〔ファルマシア社製（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）〕にかけた。タンパク質は、１．７〜０Ｍ硫酸アンモニウム濃度のリニアグラジェントによって溶出された。Ｄ−ＡＡＴ−活性画分を回収して、濃縮し、ついで得られた濃縮物を標準緩衝液に対して透析した。得られた画分をディープフリーザー（−８０℃）に保存した。全てのカラム手順は、室温でＦＰＬＣシステム〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕で行なった。
プラスミドｐＤＳＫ２を保持する大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ由来の画分は、分子量３４ｋＤａの非常に厚いタンパク質バンドを示した（第３図）。イメージアナライジングシステム〔バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）社製〕により３４ｋＤａ−バンドを定量した結果、発現タンパク質の量は、全大腸菌タンパク質の約６０％であった。
実施例４  構成発現系（遺伝子発現用ベクター）の構築
外来遺伝子を構成的に発現しうる遺伝子発現用ベクターの構築は、市販のゲル精製及びプラスミド精製用の酵素、ゲル精製用キット及びプラスミド精製用キットを用いた。また、特に明記しないかぎり、例えば、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル  第２版〔Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．）等に記載の慣用の技術により構築した。
第４図に遺伝子発現用ベクターｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）の構築の概略を示す。前記好熱性バチルス・スピーシーズＳＫ−１のＤ−ＡＡＴ遺伝子の上流域の５’−プロモーターとＳＤ（Ｓｈｉｎｅ−ｄａｌｇａｎｏ）配列とを含むＤＮＡ断片（３５０ｂｐ）を下記プライマー〔ｐｒｉｍｅｒ１（配列番号：５）及びｐｒｉｍｅｒ２（配列番号：６）〕：
0004079640.tif 000004
を用いたＰＣＲ法により増幅した。
増幅されたプロモーターを含む断片を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＢａｍ  ＨＩとで消化し、精製した。得られた断片を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＢａｍ  ＨＩとで消化したｐＵＣ１９の大きい方の断片に連結して、ｐＨＵＣ１９Ｔを作製した。ついで、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ由来の強い転写ターミネーターｒｒｎＢＴ１Ｔ２を含むＮｃｏＩ−ＳｃａＩ断片を、ｐＨＵＣ１９ＴのＮｃｏ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉ（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）部位に挿入して、遺伝子発現用ベクターｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）を得た（第５図）。なお、ＤＮＡ塩基配列決定によって、プロモーター領域の配列を確認した。
また、ｐｒｉｍｅｒ２の代わりに、下記ｐｒｉｍｅｒ３（配列番号：７）：
0004079640.tif 000005
を用いて、前記と同様に、ＳＤ配列とＮｃｏＩ部位との間の長さがｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）より２ｂ長い遺伝子発現用ベクターｐＨＣＥ１９（ＩＩ）を得た（第６図及び第７図）。
上記で作製した遺伝子発現用ベクターｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）の塩基配列を配列表の配列番号：３に示し、翻訳開始コドンＡＴＧより上流のプロモーター領域である２２３ｂｐを配列表の配列番号：１に示す。
また、同様にして作製した遺伝子発現用ベクターｐＨＣＥ１９（ＩＩ）の塩基配列を配列表の配列番号：４に示し、翻訳開始コドンＡＴＧより上流のプロモーター領域である２２５ｂｐを配列表の配列番号：２に示す。
実施例５  構成発現系を用いたトリプトファンインドールリアーゼの大量生産
本実施例において、前記ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）を用いて、好熱性細菌シンビオバクテリウム・トエビ（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｏｅｂｉｉ）ＳＣ−１由来のトリプトファンインドールリアーゼ（以下、ＴＮＡともいう）のクローン化ＴＮＡ遺伝子の大腸菌における大量生産を試みた。また、バッチ培養操作を用いて、ＴＮＡの生産を最大にするために、組換え大腸菌の培養条件を調べた。
１）ＴＮＡ遺伝子を有する構成発現ベクターの構築
第８図のストラテジーに示すように、前記ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）を用いて、シンビオバクテリウム・トエビＳＣ−１由来のＴＮＡ遺伝子を保持した構成発現ベクターｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡを作製した。
ＴＮＡ遺伝子を保持するｐＴＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法によりＴＮＡ遺伝子を増幅した。用いたプライマーは、下記：
0004079640.tif 000006
である。
増幅されたＴＮＡ遺伝子をＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、精製した。また、ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）をＮｃｏＩで消化し、クレノーフラグメントで末端修復し、ＨｉｎｄＩＩＩで再消化した。得られたＴＮＡ遺伝子をｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）の大きい方の断片に連結して、ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡを得た。
２）形質転換細胞の調製
ジーン・パルサー装置（バイオラッド社製（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を用い、宿主として大腸菌ＨＢ１０１〔ｓｕｐＥ４４，ｈｓｄ２０（ｒＢ−ｍＢ−），ｒｅｃＡ１３，ａｒａ−１４，ｐｒｏＡ２，ｌａｃＹ１，ｇａｌＫ２，ｒｐｓＬ２０，ｘｙｌ−５，ｍｔｌ−１，ｌｅｕＢ６，ｔｈｉ−１〕を前記ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡで形質転換した。
形質転換細胞は、１０ｇ／ｌのトリプトファン〔ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、５ｇ／ｌの酵母エキス〔ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕及び１０ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含むＬＢ培地で培養した。
３）酵素溶液の調製
前記２）の形質転換細胞を５，０００×ｇ２０分間の遠心分離により回収し、得られた菌体を５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した。得られた細胞を０．１ｍＭ  ＰＬＰと１０ｍＭ  ４−アミノフェニル−メタノスルフォニルフルオリドとを含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。得られた細胞をブランソン・ソニファイヤー〔ブランソン  ウルトラソニックス（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ）社製〕を用いて超音波破砕した。ついで、得られた細胞ライゼートを２０，０００×ｇ６０分間で遠心分離して細胞残渣を除去し、得られた上清を０．０５ｍＭ  ＰＬＰを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で透析した。透析後の溶液を６５℃、３０分間加熱して、大腸菌由来のトリプトファンインドールリアーゼを含む熱変性した大腸菌タンパク質を除去し、氷上で冷却した。タンパク質凝集物を５，０００×ｇ、２０分間の遠心分離により除去し、得られた上清を、酵素溶液とした。前記酵素溶液を、使用時まで−２０℃で保存した。
４）Ｌ−トリプトファン合成活性測定
２５ｍＭインドール、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム及び５００ｍＭ塩化アンモニウム（ｐＨ８．５）を含む混合物中で、ＴＮＡのＬ−トリプトファン合成活性を測定した。酵素溶液の添加により、反応を開始され、０．０５ｍｌの５Ｎ  ＨＣｌの添加により６５℃で２０分インキュベーションの後、反応を停止した。形成されたＬ−トリプトファンを、逆相カラム（ウォーターズ社製、商品名：μＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８）を充填したＨＰＬＣにより測定した。５％（ｖ／ｖ）メタノール、２％（ｖ／ｖ）酢酸及び０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を含む溶液を用い、流速１ｍｌ／分で溶出を行なった。タンパク質の検出は、２８０ｎｍで吸光度計により行なった。酵素の１ユニットは、前記条件下、１分間あたり１μｍｏｌのＬ−トリプトファンを合成する酵素量として定義した。比活性を酵素１ｍｇあたりのユニットとして表した。タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を標準物質としてブラッドフォード法により決定した。
５）Ｌ−トリプトファンの生産
攪拌槽型リアクターにより、Ｌ−トリプトファンの生産を行なった。基質インドールの酸化を阻害するため、、窒素ガスを酵素リアクターに充填した。反応温度は、ウォータージャケットを介して水循環させ、３７℃に制御した。基質の枯渇を防ぐために、インドールの濃度をＨＰＬＣにより決定した後、インドールとピルビン酸ナトリウムとを断続的に反応溶液に供給した。
６）細胞の生育曲線
細胞培養物の光学密度（ＯＤ）を吸光光度計〔商品名：ＢｉｏＣｈｒｏｍ４０６０、ファルマシア社製〕を用いて６００ｎｍで測定した。
７）ＴＮＡの大量生産
前記１）〜６）に従い、ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡを保持した大腸菌（ＨＢ１０１／ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡ）を用いてＴＮＡの生産を行なった。その結果、第９図に示すように、大腸菌の全細胞内タンパク質の約４０％の含有量で発現した。バッチ培養での高い細胞生育でのＴＮＡの大量生産を達成するために、大腸菌ＨＢ１０１／ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡを５０ｇ／ｌのグリセロールを含む複合培地で培養した。
２．５Ｌの発酵槽中３７℃における大腸菌ＨＢ１０１／ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡのバッチ培養プロファイルを第１０図に示す。図中、白丸は細胞の乾燥重量（ｇ／Ｌ）、白上三角はＴＮＡの合成活性（ユニット／ｍｌ）、白下三角はグリセロール濃度（ｇ／Ｌ）を示す。３時間培養後、ＴＮＡの生産は、細胞の生育にともない増加した。２０時間培養時点において、細胞生育速度とＴＮＡの生産率は、最大レベルに達した。最終細胞濃度は、２４時間で６００ｎｍの吸光度で７５に達し、ＴＮＡの最大活性は３．４５０ユニット／ｍｌに達した。かかるＴＮＡの生産レベルは、ｌａｃ系プロモーターを有するプラスミドを保持した細胞をＬＢ培地中ＩＰＴＧ誘導条件下に培養した場合の生産レベルの９．２倍量に増加した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質バンドをスキャニングデンシトメーターにより解析した結果、可溶性酵素の含有量は、大腸菌抽出物における全細胞内タンパク質の約４０％であると推定された。細胞に発現したＴＮＡの多くは、可溶型として生産された。
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡの粗抽出物のＬ−トリプトファン合成比活性は、約０．１５ユニット／ｍｇ細胞であった。この結果は、耐熱性トリプトファンインドールリアーゼを含む耐熱性酵素が構成的プロモーターにより効率よく発現されうることを示唆する。
実施例６  Ｌ−トリプトファンの生産における種々の反応条件の影響
１）温度
ＴＮＡの熱安定性を調べるために、ＴＮＡを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中、種々の温度で３０分間インキュベートし、残存活性を測定した。６０℃における無細胞抽出物の熱処理後に得られた酵素溶液を本実験の生体触媒として用いた。
第１１図に示すように、本酵素は、６０℃まで安定であり、熱処理後、酵素活性の９５％を維持した。ＴＮＡの安定性は、Ｌ−トリプトファン合成における生産性を決定する主要な因子であると考えられるため、ＴＮＡは酵素法を改良することに優れた可能性を有するものと思われる。また、Ｌ−トリプトファンの最大合成反応温度は６５℃であった。
２）ｐＨ
過剰塩化アンモニウム及びピルビン酸ナトリウムの存在下に、ＴＮＡによるＬ−トリプトファンの合成速度におけるｐＨの影響を調べた。種々のｐＨを有する各緩衝液中で反応を行なった。第１１図に示すように、ＴＮＡの合成活性に対するｐＨの影響は、かなり大きく、Ｌ−トリプトファン合成に対するＴＮＡの最大活性は、ｐＨ９．０に見られた。グリシン−ＮａＯＨ緩衝液は、酵素反応への著しい阻害が観察された。
３）アンモニウムドナー
Ｌ−トリプトファンの合成における最も好適なアンモニウムドナーを選択するため、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、リン酸水素２アンモニウム及び硫酸アンモニウムなどの種々のアンモニウム塩をそれぞれ反応混合物に用いられた。結果を表１に示す。
0004079640.tif 000007
表１に示すように、塩酸アンモニウムが、Ｌ−トリプトファンの合成において最も好適なアンモニウムドナーであることが見出された。酢酸アンモニウム及びリン酸水素２アンモニウムの場合、塩酸アンモニウムを用いた場合のＴＮＡノトリプトファン合成活性の約８０％であった。また、Ｌ−トリプトファンの合成における０〜１．５Ｍの濃度範囲の塩化アンモニウムの影響を第１２図パネル（Ａ）に示す。合成活性は、塩化アンモニウム濃度に高く依存し、１．０〜１．５Ｍ塩化アンモニウム濃度とほぼ同様のレベルであった。
４）インドール濃度
耐熱性酵素は、化学変性剤に対して安定である傾向があるため、生体触媒として酵素を用いたバイオテクノロジー工程において顕著な利点を提供する。ＴＮＡの安定性を評価するため、耐熱性ＴＮＡの生産性におけるインドール濃度の影響を調べた。第１２図パネル（Ｂ）に示すように、ＴＮＡのトリプトファン合成活性は、５ｍＭインドール濃度まで増加したが、該活性は、該濃度後、インドールの毒性のために段階的に減少した。同時に、大腸菌のＴＮＡは、３ｍＭのインドールで完全に不活化された。この結果は、シンビオバクテリウム・トエビが、大腸菌に比べ、インドールによる酵素不活化に対して相対的に高い安定性を有することを示す。
５）ピルビン酸ナトリウム濃度
第１２図パネル（Ｃ）は、０〜３００ｍＭの範囲の種々の濃度のピルビン酸ナトリウム濃度において、ＴＮＡによりＬ−トリプトファンの合成活性を調べた結果を示す。トリプトファン生産速度は、ピルビン酸ナトリウム濃度に比例して直線的に増加した。最大合成活性は、０．１Ｍピルビン酸濃度で得られた。前記濃度の後、トリプトファン合成速度は類似の値で安定した。
６）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）ＴＭＸ−１００
トリトンＸ−１００などのノニオン界面活性剤は、ミセルを形成してその内側にインドルを含み、Ｌ−トリプトファンの合成の酵素反応間、インドールのリザーバーとして機能する。したがって、トリトンＸ−１００のＬ−トリプトファン生産速度における影響を調べ、トリトンＸ−１００無しの反応混合物における生産速度と比較した。結果を第１３図に示す。３％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００を有する反応混合物においてＬ−トリプトファンの最大合成速度は５０ｍＭインドール濃度で得られ、かかる値は、トリトンＸ−１００無しの反応混合物より１０倍高かった。かかる濃度の後、Ｌ−トリプトファンの生産は、減少した。
７）Ｌ−トリプトファンの生産のための生体触媒の前処理の至適化
Ｌ−トリプトファンの生産における種々の生体触媒の効率を比較するため、無細胞抽出物、インタクト全細胞、透過細胞、及びアセトン乾燥細胞を含む生体触媒を５ｍＭまたは２５ｍＭインドールを含む反応混合物に添加した。透過細胞は、トルエンまたはメタノールにより全細胞を処理し、ついで遠心分離することにより調製された。アセトン乾燥細胞は、アセトンでの全細胞の処理後、気流による細胞の乾燥により得られた。ピルビン酸ナトリウムの濃度及び塩化アンモニウムの濃度は、それぞれ、２００ｍＭ及び１Ｍであった。
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表２に示すように、低濃度のインドール（５ｍＭ）で、Ｌ−トリプトファンは、全ての試験された生体触媒で効率よく合成された。同時に、高濃度のインドール（２５ｍＭ）で、インタクト細胞のみが高いＬ−トリプトファン合成活性を示した。この場合、より低い活性の他の生体触媒は、酵素と高濃度の局在インドールとの直接的な相互作用を介した酵素の阻害に起因するものと思われる。この結果は、全細胞がＬ−トリプトファンの効率のよい生産に最も適する生体触媒であることを示す。したがって、ＴＮＡを過剰生産した全細胞がＬ−トリプトファンの生産用の生体触媒として用いられた。
８）全細胞生体触媒によるＬ−トリプトファンの生産
基質としてのピルビン酸は、４５℃を超える温度では非常に不安定であり、かかる温度では、ピルビン酸は、乳酸デヒドロゲナーゼの存在下、ＮＡＤＨによる還元により推定された反応混合物において直ちに消失する。アンモニアによるイミン形成は、おそらく、ピルビン酸減少に応答しうる主要な反応であるが、さらなるピルビン酸の反応が起こることが除外できなかった。ピルビン酸の熱不安定性のため、合成反応は、６５℃での反応を安定に進行できず、そのため、大量のＬ−トリプトファンを生産できない。したがって、Ｌ−トリプトファンの生産は、３７℃の酵素リアクター中、１１の反応混合物により実施された。
開始反応混合物は、１．０Ｍ塩化アンモニウム、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、３０ｍＭインドール、０．１ｍＭ  ＰＬＰ、０．１％亜硫酸ナトリウム及び１０ｇ（乾燥重量）／１の大腸菌ＨＢ１０１／ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡ細胞を含有する。３％のトリトンＸ−１００を反応混合物に添加して、添加インドールを可溶化した。基質の枯渇を防ぐため、インドール及びピルビン酸ナトリウムを継続的に反応溶液に供給した。
第１４図は、酵素リアクターにおけるＬ−トリプトファンの生産の反応パターンを示す。Ｌ−トリプトファンの生産速度は、２７時間同様のレベルに維持され、その後、段階的に減少した。ＨＰＬＣによる反応混合物の解析により、このＬ−トリプトファンの生産速度の減少は、リアクターに高度に蓄積されたインドールの阻害に起因するものと思われた。反応３時間から、Ｌ−トリプトファンは、白色結晶として沈澱しはじめ、それにより、反応は、より効率よく進行した。反応２４時間後、３７℃で、約６６．２ｇ／ｌ（０．３２５Ｍ）のＬ−トリプトファンが、インドールから８５％の変換効率で生産された。
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）中のプロモーター領域の配列を示す。
配列番号：２は、ｐＨＣＥ１９（ＩＩ）中のプロモーター領域の配列を示す。
配列番号：３は、ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）の配列を示す。
配列番号：４は、ｐＨＣＥ１９（ＩＩ）の配列を示す。
配列番号：５は、バチラス・スピーシーズのＤ−ＡＡＴ遺伝子のプロモーターを増幅するためのオリゴヌクレオチドの配列の配列を示す。
配列番号：６は、バチラス・スピーシーズのＤ−ＡＡＴ遺伝子のプロモーターを増幅するためのオリゴヌクレオチドの配列の配列を示す。
配列番号：７は、バチラス・スピーシーズのＤ−ＡＡＴ遺伝子のプロモーターを増幅するためのオリゴヌクレオチドの配列の配列を示す。
配列番号：８は、シンビオバクテリウム・トエビＳＣ−１由来のＴＮＡ遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドの配列の配列を示す。
配列番号：９は、シンビオバクテリウム・トエビＳＣ−１由来のＴＮＡ遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドの配列の配列を示す。
産業上の利用可能性
本発明のＤＮＡによれば、目的遺伝子の産物を、誘導物質により誘導することなく、構成的に発現させうるプロモーターの配列を有するため、簡便に、かつ安価に高発現させうるという優れた効果を奏する。したがって、本発明のＤＮＡによれば、有用な遺伝子の発現産物の工業規模での生産が可能になる。また、本発明のタンパク質の製造方法により、有用な遺伝子の発現産物の工業規模での生産が可能になる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｄ−ＡＡＴ活性をスクリーニングした株についての粗酵素液及び精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す模式図である。
第２図は、バチルス・スピーシーズＳＫ−１のＤ−ＡＡＴ遺伝子の制限解析の結果を示す図である。
第３図は、バチルス・スピーシーズＳＫ−１のＤ−ＡＡＴ遺伝子産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。
第４図は、遺伝子発現用ベクターｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）の構築の概略図を示す。
第５図は、遺伝子発現用ベクターｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）を示す概略図である。
第６図は、遺伝子発現用ベクターｐＨＣＥ１９（ＩＩ）の構築の概略図を示す。
第７図は、遺伝子発現用ベクターｐＨＣＥ１９（ＩＩ）を示す概略図である。
第８図は、ＴＮＡを発現するための発現ベクターｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡの構築の概略図を示す。
第９図は、発現ベクターｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡを保持した大腸菌におけるＴＮＡの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果を示す図である。
第１０図は、大腸菌ＨＢ１０１／ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡの生育曲線、ＴＮＡの合成活性及び発現産物の解析結果を示す図であり、２．５Ｌの発酵槽中３７℃における大腸菌ＨＢ１０１／ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）−ＴＮＡの典型的なバッチ培養プロファイルを示す。
第１１図は、ＴＮＡの合成活性に対する温度及びｐＨの影響を示す図である。
第１２図は、ＴＮＡの合成活性に対する塩化アンモニウム、インドール濃度及びピルビン酸ナトリウム濃度の影響を示す図である。
第１３図は、ＴＮＡの合成活性に対するトリトンＸ−１００の影響を示す図である。
第１４図は、酵素リアクターにおけるＬ−トリプトファンの生産の反応パターンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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