(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）recEおよびrecT遺伝子を発現する能力を有し、かつ、recETに依存する機構を介して相同組換えを実行する能力を有する原核宿主細胞を準備する工程、
ｂ）該宿主細胞中で複製され得る環状である第１DNA分子と、第１DNA分子上の領域と配列相同な領域を少なくとも２個含む第２DNA分子とを、recETに依存する機構を介する第１および第２DNA分子間の相同組換えに好適な条件下で、該宿主細胞中で接触させる工程、ならびに
ｃ）該第１および第２DNA分子間の相同組換えが生じた宿主細胞を選択する工程、
を含み、
第２DNA分子はさらなる改変を行うことなく組換えを可能にする形態で宿主細胞中に導入される、原核細胞中でDNA分子をクローニングする方法。
【請求項２】
recEおよび／またはrecT遺伝子の発現が調節性プロモーターの制御下にある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
recE遺伝子が、
（ａ）図７Ｂに記載の位置1320(ATG)から2159(GAC)までの核酸配列、
（ｂ）図１３Ｂに記載の位置1320(ATG)から1998(CGA)までの核酸配列、
（ｃ）遺伝コードの縮重範囲内にある、（ａ）もしくは（ｂ）の核酸配列がコードするポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに／または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／もしくは（ｃ）の核酸配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む核酸分子から選択され、
かつ／あるいは、
recT遺伝子が、
（ｅ）図７Ｂに記載の位置2155(ATG)から2961(GAA)までの核酸配列、
（ｆ）図１３Ｂに記載の位置2086(ATG)から2868(GCA)までの核酸配列、
（ｇ）遺伝コードの縮重範囲内にある、（ｅ）もしくは（ｆ）の核酸配列がコードするポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに／または
（ｈ）（ｅ）、（ｆ）および／もしくは（ｇ）の核酸配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む核酸分子から選択される、
請求項２記載の方法。
【請求項４】
大腸菌株がJC8679およびJC9604から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
recBCインヒビター遺伝子が、
（ａ）図１３Ｂに記載の位置3588(ATG)から4002(GTA)までの核酸配列、
（ｂ）遺伝コードの縮重範囲内にある、（ａ）の核酸配列がコードするポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに／または
（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）の核酸配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列
を含む核酸分子から選択され、宿主細胞がさらにrecBCインヒビター遺伝子を発現する能力を有する請求項４記載の方法。
【請求項６】
第２DNA分子が、２つの配列相同性領域の間に配置されたマーカー遺伝子を少なくとも１つ含有し、かつ、該マーカー遺伝子の発現によって相同組換えを検出する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞中で複製され得る環状第１DNA分子を該原核宿主細胞中に導入する工程、ならびに
該第１DNA分子上の第３および第４領域にそれぞれ配列相同な第１および第２領域を含む第２DNA分子を該原核宿主細胞中に導入する工程、
を含んでなる、組換えDNA分子を作製するための請求項１記載の方法であって、
該宿主細胞が、組換えDNA分子を形成するようにrecETに依存する機構を介した相同組換えを実行する能力を有し、かつ
該組換えDNA分子は、第３領域と第４領域との間の配列が第２DNA分子の第１領域と第２領域との間の配列と置換されている第１DNA分子を含み、第２DNA分子はさらなる改変を行うことなく組換えを可能とする形態で該宿主細胞中に導入されることを特徴とする、
上記方法。
【請求項８】
染色体上に第１DNA分子を含む原核宿主細胞中に、該宿主染色体上の第１DNA分子の第３および第４領域とそれぞれ配列相同な第１および第２領域を含む第２DNA分子を導入する工程を含んでなる、組換えDNA分子を作製するための請求項１記載の方法であって、
該宿主細胞が、組換えDNA分子を形成するようにrecETに依存する機構を介した相同組換えを実行する能力を有し、かつ
該組換えDNA分子は、第３領域と第４領域との間の配列が第２DNA分子の第１領域と第２領域との間の配列と置換されている染色体上の第１DNA分子を含み、第２DNA分子はさらなる改変を行うことなく組換えを可能とする形態で該宿主細胞中に導入されることを特徴とする、
上記方法。
【請求項９】
環状である第１DNA分子と、第１DNA分子上の領域と配列相同な領域を少なくとも２個含む第２DNA分子とを組換えること、および、該第２DNA分子は、さらなる改変を行うことなく組換えを可能とする形態で宿主細胞中に導入されることを特徴とする、recETに依存する機構を介する相同組換えを含むクローニング方法のための宿主細胞としての、recEおよびrecT遺伝子を発現する能力を有する原核細胞の使用。
【請求項１０】
環状である第１DNA分子と、第１DNA分子上の領域と配列相同な領域を少なくとも２個含む第２DNA分子とを組換えること、および、該第２DNA分子は、さらなる改変を行うことなく組換えを可能とする形態で宿主細胞中に導入されることを特徴とする、recETに依存する機構を介する相同組換えを含むクローニング方法のための、原核宿主細胞中での、recEおよびrecT遺伝子を発現する能力を有するベクター系の使用。
【請求項１１】
（ａ）recETに依存する機構を介して相同組換えを実行する能力を有する原核宿主細胞、
（ｂ）recEおよびrecT遺伝子を発現する能力を有するベクター系を含む該宿主細胞中でのrecEおよびrecT遺伝子の発現のための手段、ならびに
（ｃ）第１DNA分子上の領域と配列相同な領域を少なくとも２個含む第２DNA分子と組換えることができる環状第１DNA分子である、該細胞中で複製され得るレシピエントクローニングビヒクル、
を含む、クローニングのための試薬キット。
【請求項１２】
第１および第２DNA増幅プライマーをさらに含んでおり、第１DNA増幅プライマーが環状レシピエントクローニングビヒクル上の第３領域に配列相同な第１領域を含み、かつ、第２DNA増幅プライマーが環状レシピエントクローニングビヒクル上の第４領域に配列相同な第２領域を含む、請求項１１記載のクローニングのための試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つのDNA分子間での相同組換え機構を使用する、DNA分子をクローニングするための新規な方法に関する。さらに、DNAクローニングに好適な新規な試薬キットが提供される。
【０００２】
細菌細胞中での外来DNAのクローニングのための現行の方法は、通常、好適な細菌ベクターを準備し、このベクターを制限酵素で切断し、そのベクター中に外来DNA断片をin vitroで挿入するステップを含む。次に、生成した組換えベクターを使用して細菌を形質転換する。こうしたクローニング方法は約20年間使用されて成功しているが、これにはいくつかの欠点がある。これらの欠点として、特に、ベクター中に外来DNAを挿入するために必要とされるin vitroステップが、その外来DNA上またはベクター上で好適な制限部位が利用できない場合、非常に複雑で時間がかかることが多い点である。
【０００３】
さらに、現行の方法は通常、外来DNA断片を配置するベクター中の好適な制限酵素切断部位の存在に依拠している。このことは最終クローニング産物について２つの制限を与えることになる。第１に、外来DNA断片はベクター中で通常１個または複数のこうした制限部位の位置にしか挿入することができない。したがって、クローニング産物は好適な制限部位の配置によって限定され、また好適な制限部位がないベクターの領域中へのクローニングは困難であり、不正確なことが多い。第２に、制限部位は典型的には長さが４から８塩基対であるので、使用するDNA分子のサイズが増加するにつれて、多大な倍数で出現する。これは、大部分の現行のクローニング技術によって操作することができるDNA分子のサイズの実用上の制限を意味している。特に、コスミド、BAC、PACおよびP1などのベクター中にクローン化された比較的大きなサイズのDNAを、制限酵素に基づく技術によって直接操作するのは通常実現不能である。したがって、先行技術の欠点が少なくとも部分的に除去された新しいクローニング方法を提供する必要性がある。
【０００４】
本発明において、recEおよびrecT遺伝子またはredαおよびredβ遺伝子あるいはファージP22組換え系などの機能的に関連する遺伝子の産物を発現する能力がある細菌宿主細胞中で、２つのDNA分子間での効果的な相同組換え機構が使用可能な頻度で生じることが発見された（Kolodnerら、Mol.Microbiol.11(1994)23-30；Fenton,A.C.and Poteete,A.R.,Virology 134(1984) 148-160；Poteete,A.R.and Fenton,A.C.,Virology 134(1984) 161-167）。DNA断片のクローニングのこの新規な方法を「ETクローニング」と命名する。
【０００５】
大腸菌 RecEおよびRecTタンパク質の同定および特性決定についてGillenら（J.Bacteriol.145(1981),521-532）およびHallら（J.Bacteriol.175(1993),277-287）が記載している。HallおよびKolodner（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994),3205-3209）は、RecTタンパク質によって推進される、線状２本鎖DNAおよび相同性環状１本鎖DNAのin vitro相同的対形成および鎖交換を開示している。細胞中でのDNA分子のクローニングのためのこの方法の使用に対する引用はその中に見出だすことができない。
【０００６】
大腸菌中の遺伝子組換えのrecET経路は知られている（Hall and Kolodner(1994),上記；Gillenら(1981),上記）。この経路は２つの遺伝子、recEおよびrecTの発現を必要とする。これらの遺伝子のDNA配列は公開されている（Hallら、上記）。RecEタンパク質はλエクソまたはλRedαなどのバクテリオファージタンパク質に類似している（Gillenら、J.Mol.Biol.113(1977),27-41；Little,J.Biol.Chem.242(1967),679-686；Radding and Carter,J.Biol.Chem.246(1971),2513-2518；Joseph and Kolodner,J.Biol.Chem.258(1983),10418-10424）。RecTタンパク質はλβタンパク質またはλRedβなどのバクテリオファージタンパク質に類似している（Hallら、(1993),上記；Muniyappa and Radding,J.Biol.Chem.261(1986),7472-7478；Kmiec and Hollomon,J.Biol.Chem.256(1981),12636-12639）。上記の報文の内容を参照により、本明細書に組み入れる。
【０００７】
Olinerら（Nucl.Acids Res.21(1993),5192-5197）は線状PCR産物および線状化プラスミドベクター間の分子間相同組換えによる、大腸菌中のPCR産物のin vivoクローニングについて記載している。原核生物中での相同組換えに基づく新規なクローニング方法を開発するためのその他の従来の手法もまた、ベクターを線状化するための制限酵素の使用（Bubeckら、Nucleic Acids Res.21(1993),3601-3602；Olinerら、Nucleic Acids Res.21(1993),5192-5197；Degryse,Gene 170(1996),45-50）または宿主特異的recA依存組換え系（Hamiltonら、J.Bacteriol.171(1989),4617-4622；Yangら、Nature Biotech.15(1997),859-865；Dabert and Smith,Genetics 145(1997),877-889）に依拠していた。これらの方法は適用性が非常に限定されており、実際上はほとんど使用されていない。
【０００８】
本発明に従うDNAクローニングの新規な方法は制限酵素またはDNAリガーゼによるin vitro処理を必要とせず、したがってDNAクローニングの標準的な方法論とは基本的に差異がある。この方法はrecEおよびrecT遺伝子産物、またはredαおよびredβ遺伝子産物、あるいは機能的に等価な遺伝子産物が関与する、大腸菌中の相同組換えの経路に依拠している。この方法はクローン化しようとするDNA断片である、好ましくは線状でかつ好ましくは染色体外DNA断片１個をエピソームまたは内在性宿主染色体若しくは染色体群のいずれかである第２の好ましくは環状DNAベクター分子と共有結合させるものである。したがって、これは２つの線状DNA断片または異なる組換え経路のいずれかの使用に依拠する相同組換えによる大腸菌中のクローニングについての従来の記載とは差異がある。
【０００９】
本発明は、完全な＞75 kbプラスミドおよび大腸菌染色体を含む大きなDNA分子を工学操作するための相同組換えを使用する、適応力がある方法を提供する。すなわち、ターゲットの選択について、サイズまたは部位のいずれについても現実的に制限がない。したがって、高コピープラスミドからゲノムまで、宿主細胞中のどんなレシピエントDNAでも正確な変更を受けやすい。大きなDNA分子の工学操作の他に、本発明はDNA設計のための新規な、制限酵素に依存しない手法を大要とする。例えば、オリゴヌクレオチドの相同なアームを選択することによって、ターゲットエピソーム中の任意の２つの選択された塩基対間の欠失させることができる。同様に、選択されたDNA配列を選択された塩基対の位置に挿入して、例えば変更したタンパク質リーディングフレームを作製することができる。挿入および欠失の協奏的組合せならびにポイント突然変異もまた可能である。これらの戦略の適用は複雑で困難なDNAの構築、例えば真核細胞、例えばマウス胚性幹細胞中の相同組換えを意図する場合に特に適切である。さらに、本発明は所望のターゲット部位に正確に部位特異的組換え位置を定める簡単な方法を提供する。これは植物およびマウスなどのその他の生体系中の部位特異的組換えへの適用を単純化することとなる。
【００１０】
本発明の主題の１つは、ａ）相同組換えを実行する能力がある宿主細胞を準備し、ｂ）該宿主細胞中で複製され得る第１DNA分子と、第１DNA分子上の領域と配列相同な領域を少なくとも２個含む第２DNA分子とを、該第１および第２DNA分子間の相同組換えに好適な条件下で接触させ、そしてｃ）該第１および第２DNA分子間の相同組換えが生じた宿主細胞を選択する、ステップを含む、細胞中でのDNA分子のクローニング方法である。
【００１１】
本発明の方法において、相同組換えは好ましくはrecET機構を介して生じる。すなわち、相同組換えが好ましくは大腸菌遺伝子recEおよびrecTから選択されるrecEおよびrecT遺伝子、またはファージλredαおよびredβ遺伝子などの機能的に関連する遺伝子の遺伝子産物によって仲介される。
【００１２】
本発明の方法に好適な宿主細胞は好ましくは細菌細胞、例えばグラム陰性細菌細胞である。さらに好ましくは、宿主細胞はSalmonella、KlebsiellaまたはEscherichiaなどの腸内細菌細胞である。最も好ましくは、宿主細胞は大腸菌細胞である。しかし、本発明のクローニング方法は菌類、植物または動物細胞などの真核細胞についても好適であることに留意すべきである。
【００１３】
好ましくは、相同組換えおよびクローン化したDNAの増殖のために使用する宿主細胞は、例えばその中でrecEおよびrecT、またはredαおよびredβ遺伝子の産物が発現される再菌株などのあらゆる細胞とすることができる。宿主細胞はrecEおよびrecT遺伝子をその宿主細胞の染色体上、または非染色体DNA、好ましくはベクター、例えばプラスミド上に位置させて含むことができる。好ましい事例において、RecEおよびRecT、またはRedαおよびRedβ遺伝子産物は２つの別の調節性プロモーター、アラビノース誘導性BADプロモーター若しくはlacプロモーターなど、または非調節性プロモーターから発現される。あるいは、recEおよびrecT、またはredαおよびredβ遺伝子は１個の調節性または非調節性プロモーターからのポリシストロン性mRNA上で発現される。好ましくは、その発現は調節性プロモーターによって制御される。
【００１４】
recEまたはredα遺伝子が調節性プロモーターの１つによって発現される実施形態もまた特に好ましい。ここでは、システムの組換え能力は必要な場合にのみ誘発され、その他の時点では可能な所望しない組換え反応が制限される。他方において、recTまたはredβ遺伝子はrecEまたはredαに対して過剰発現されるのが好ましい。これは強力な構成性プロモーター、例えばEM7プロモーターの使用、および／またはrecE若しくはredα遺伝子よりも高コピー数のrecT若しくはredβの使用によって達成することができる。
【００１５】
本発明の目的のためには、第１および第２DNA分子の相同組換えが、DNAでトランスフェクトした細胞10９中で１個よりも多い細胞中に組換え産物をもたらすのに十分な効力を持つ限り、どんなrecEおよびrecT遺伝子でも適している。recEおよびrecT遺伝子はあらゆる細菌株またはバクテリオファージから誘導することができ、あるいはそれらの突然変異体または変異型でもよい。好ましいのは大腸菌または大腸菌バクテリオファージから誘導されるrecEおよびrecT遺伝子であり、ラムダ型ファージ、例えばバクテリオファージλからのredαおよびredβ遺伝子などである。
【００１６】
さらに好ましくは、recEまたはredα遺伝子が以下のものを含む核酸分子から選択される：
（ａ）図７Ｂに記載の位置1320(ATG)から2159(GAC)までの核酸配列、
（ｂ）図１４Ｂに記載の位置1320(ATG)から1998(CGA)までの核酸配列、
（ｃ）遺伝コードの縮重範囲内にある、同一のポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに／または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／若しくは（ｃ）からの核酸配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列。
【００１７】
さらに好ましくは、recTまたはredβ遺伝子が以下のものを含む核酸分子から選択される：
（ａ）図７Ｂに記載の位置2155(ATG)から2961(GAA)までの核酸配列、
（ｂ）図１４Ｂに記載の位置2086(ATG)から2868(GCA)までの核酸配列、
（ｃ）遺伝コードの縮重範囲内にある、同一のポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに／または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／若しくは（ｃ）からの核酸配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列。
【００１８】
本発明は既定の配列の突然変異体および変異型、例えば天然に存在する突然変異体および変異型、または遺伝子工学操作によって取得される突然変異体および変異型をも包含することに留意すべきである。さらに、図７Ｂに示すrecE遺伝子は天然タンパク質のアミノ酸位置588-866をコードする、すでに切断された遺伝子であることに留意すべきである。突然変異体および変異型は、好ましくは図７Ｂおよび１３Ｂに示すrecEおよびrecT配列、ならびに図１４Ｂに示すredαおよびredβ配列に少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％の核酸配列相同性を有する。
【００１９】
本発明において、ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは好ましくは下記のSambrookら（1989）にしたがって定義されるもので、0.1ｘSSC、0.5％SDS中、55℃、好ましくは62℃、そしてさらに好ましくは68℃で30分の洗浄後、検出し得るハイブリダイゼーションシグナルを含む。
【００２０】
好ましい事例において、recEおよびrecT遺伝子は大腸菌K12株中に存在する相当する内在性遺伝子およびその誘導体から、またはバクテリオファージから誘導される。特に、sbcA突然変異を保有する株が好適である。こうした菌株の例はJC8679およびJC9604である（Gillenら(1981)、上記）。あるいは、相当する遺伝子をラムダ型ファージまたはファージP22などのその他のコリファージから取得してもよい。
【００２１】
JC8679およびJC9604の遺伝子型はSex（Hfr,F+,F-,またはF'）：F-である。JC8679は以下の突然変異を含む：recBC21,recC22,sbcA23,thr-1,ara-14,leuB6,DE(gpt-proA)62,lacY1,tsx-33,gluV44(AS),galK2(Oc),LAM-,his-60,relA1,rpsL31(strR),xylA5,mtl-1,argE3(Oc)およびthi-1。JC9604は同一の突然変異およびさらに突然変異recA56を含む。
【００２２】
さらに、recEおよびrecT、またはredαおよびredβ遺伝子を第１のドナー源、例えばドナー細菌細胞から単離して、第２の受容体源、例えば受容体細菌若しくは真核細胞中に形質転換し、そこで組換えDNA手法によって発現させることができることも留意すべきである。
【００２３】
本発明の１実施形態において、使用する宿主細胞はsbcA突然変異を有する細菌株、例えば上記の大腸菌株JC8679およびJC9604の１つである。しかし、本発明の方法はsbcA突然変異を有する宿主細胞または類似の細胞に限定されるものではない。驚くべきことに、本発明のクローニング方法がsbcA突然変異を持たないrecBC+またはrecBC-細胞中、例えば大腸菌recBC+細胞などの原核recBC+宿主細胞中でも機能することが発見された。この事例において、好ましくはその中でrecBC型エキソヌクレアーゼインヒビター遺伝子の産物が発現する宿主細胞を使用する。好ましくは、そのエキソヌクレアーゼインヒビターは宿主のrecBCシステムまたはその等価物を阻害する能力があるものである。こうしたエキソヌクレアーゼインヒビター遺伝子の好適な例はλredγ遺伝子（Murphy,J.Bacteriol.173(1991),5808-5821）およびそれぞれその機能的等価物、例えばファージP22（Murphy,J.Biol.Chem.269(1994),22507-22516）などの別のコリファージから取得することができるものである。
【００２４】
さらに好ましくは、エキソヌクレアーゼインヒビター遺伝子が以下のものを含む核酸分子から選択される：
（ａ）図１４Ａに記載の位置3588(ATG)から4002(GTA)までの核酸配列、
（ｂ）遺伝コードの縮重範囲内にある、同一のポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに／または
（ｄ）（ａ）および／若しくは（ｂ）からの核酸配列と（上記の定義の）ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列。
【００２５】
驚くべきことに、recBC+およびrecBC-両株中でのエキソヌクレアーゼインヒビター遺伝子の発現の結果、クローニング効率が顕著に改善することが発見された。
【００２６】
本発明に従うクローニング方法は第１DNA分子および第２DNA分子間の相同組換えを利用する。第１DNA分子は宿主細胞中で機能し得る複製起点、例えば大腸菌複製起点を保有するあらゆるDNA分子が可能である。さらに、第１DNA分子は宿主細胞中で複製される得る形態で存在する。この第１DNA分子、すなわちベクターはその宿主細胞中で機能し得る複製起点を含有するあらゆる染色体外DNA分子が可能であり、例えば単一の、低、中若しくは高コピープラスミドを含むプラスミド、またはコスミド、P1、BAC若しくはPACベクター技術を基礎とするその他の染色体外環状DNA分子である。こうしたベクターの例は例えばSambrook ら（Molecular Cloning,Laboratory Manual,2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press）およびLoannouら（Nature Genet.6(1994),84-89）またはそれらの中に引用された参照中に記載されている。第１DNA分子は宿主細胞染色体、特に大腸菌染色体でも可能である。好ましくは、第１DNA分子は２本鎖DNA分子である。
【００２７】
第２DNA分子は好ましくは線状DNA分子で、第１DNA分子上の領域と相同な配列、好ましくは同一の配列領域を少なくとも２つ含む。これらの相同または同一領域はそれぞれ好ましくは少なくとも15ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも20ヌクレオチド、最も好ましくはそれぞれ少なくとも30ヌクレオチドである。長さが約40またはそれ以上、例えば60またはそれ以上のヌクレオチドの配列相同領域を使用した場合、特に良好な結果が得られた。２つの配列相同領域は線状DNA分子上に１つが一方の末端、そしてもう１つが他方の末端になるように配置することができるが、内部に配置することもできる。好ましくは、第２DNA分子も２本鎖DNA分子である。
【００２８】
２つの配列相同領域は実験による設計にしたがって選択される。第１DNA分子のどの領域を第２DNA分子上に配置する２つの配列相同領域として選択するかについては、相同組換え現象が第１DNA分子の複製起点を欠失させてはならないこと以外には、制限はない。相同組換え反応のために十分な配列相同性が維持されている限り、配列相同領域が非同一配列領域によって遮断されていてもよい。ターゲット部位に対して非相同配列領域を有する配列相同アームを使用することによって、置換、例えばポイント突然変異、挿入および／または欠失などの突然変異をETクローニングによってターゲット部位に導入することができる。
【００２９】
細菌細胞中にクローン化しようとする第２の外来DNA分子はあらゆる起源から誘導することができる。例えば、第２DNA分子をPCRなどの核酸増幅反応によって合成してもよい。この場合、増幅のためのプライマーとして作用する3'末端の配列の他に、増幅を開始させるために使用するDNAオリゴヌクレオチドの両方が２つの相同領域の一方または他方を含有する。この設計のオリゴヌクレオチドを使用する場合、DNA増幅産物は増幅に好適な任意のDNA配列が可能であり、この他に各末端に配列相同領域の１つを有することになる。
【００３０】
第２DNA分子の作製の特定の例は、ある表現型の差異、特に抗生物質耐性を細菌宿主細胞に与えるように作用する遺伝子の増幅である。この操作法の単純な変形として、PCRプライマー配列および配列相同領域の他に別の配列を含むオリゴヌクレオチドの使用を含む。また別の単純な変法は増幅産物を作製するための増幅プライマーの３以上の使用である。また別の単純な変法は増幅産物を作製するための増幅反応の２以上の使用である。さらに別の変法はPCR以外の方法によって、例えばエンドヌクレアーゼまたは制限酵素切断によって任意のDNA起源からの断片を線状化して取得されるDNA断片の使用である。
【００３１】
第２DNA分子は必ずしも単一の種類のDNA分子である必要はないことに注意すべきである。異種集団の第２DNA分子の使用、例えばゲノムなどのDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーの作製ももちろん可能である。
【００３２】
本発明の方法に第１および第２DNA分子のin vivoでの接触を含ませてもよい。本発明の１実施形態において、あらかじめ第１ベクターDNA分子を保有させてある細菌株中に第２DNA断片を形質転換させる。別の実施形態において、第２DNA分子および第１DNA分子を細菌宿主中に同時形質転換する前に in vitroで混合する。本発明のこの２つの実施形態を図１に図式的に示す。その形質転換の方法は当技術分野で知られている任意の方法とすることができる（例えばSambrookら、上記）。しかし、好ましい形質転換または同時形質転換の方法はエレクトロポレーション法である。
【００３３】
ETクローニング機構を介する第１および第２DNA分子間の相同組換えに好適な条件下で第１および第２DNA分子を接触させた後、該第１および第２DNA分子間の相同組換えが生じた宿主細胞を選択する。この選択操作はいくつかの異なる方法で実施することができる。次の３つの好ましい選択方法を図２に示し、以下に詳細に記載する。
【００３４】
第１の選択方法において、配列相同な２つの領域の間に配置するマーカーのための遺伝子を保有する第２DNA断片を利用し、そのマーカー遺伝子の発現によって相同組換えを検出可能にする。マーカー遺伝子は宿主中または第１DNA分子から発現されない表現型マーカーのための遺伝子とすることができる。ETクローニングによる組換えに際し、第２DNA断片の確実な獲得によって与えられる宿主株の表現型における変化からETクローニング産物を同定する。
【００３５】
好ましい事例において、表現型マーカーは抗生物質に対して耐性を与える遺伝子、特にカナマイシン、アンピリシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、または使用する細菌株に対して殺菌または静菌効果を示すあらゆるその他の物質に耐性を与える遺伝子である。
【００３６】
単純な変法は使用する細菌宿主株内に存在するある欠失を補足する遺伝子の使用である。例えば、宿主株がある代謝補充物がないと増殖できないように突然変異させる。この補充物が存在しないとき、第２DNA断片上の１遺伝子が突然変異による欠損を補足して増殖を可能にする。ETクローニングステップの結果、この目的のDNA再編成を有するエピソームを含有する細胞のみが増殖することになる。
【００３７】
別の例において、宿主株は、コドンの１つがオープンリーディングフレームを切断する停止コドンとなるように突然変異させた表現型マーカー遺伝子を保有する。この表現型マーカー遺伝子からの全長タンパク質の発現には、発現されるとその停止コドンを認識して全オープンリーディングフレームの翻訳を可能にする、サプレッサーtRNA遺伝子の導入を必要とする。ETクローニングステップによってこのサプレッサーtRNA遺伝子が導入され、その表現型マーカー遺伝子の発現についての選択または同定によって、成功した組換え体を同定する。これらの場合、ETクローニングステップの結果、この目的のDNA再編成を有する細胞のみが増殖することになる。
【００３８】
さらに別の単純な変法は、コロニーの色または形態に容易に検出し得る変化を与えるリポーター遺伝子の使用である。好ましい１事例において、緑色蛍光タンパク質（GFP）を使用して、GFPの蛍光放出によってETクローニング産物を保有するコロニーを同定することができる。別の好ましい事例において、lacZ遺伝子を使用して、培地にX-galを添加したときのコロニーの青色の発色によってETクローニング産物を保有するコロニーを同定することができる。
【００３９】
第２の選択方法において、ETクローニングによる第２DNA断片の第１DNA分子中への挿入が第１DNA分子上に存在するマーカーの発現を変更する。この実施形態において、第１DNA分子は配列相同な２つの領域の間に少なくとも１個のマーカー遺伝子を含有し、変更された発現、例えばそのマーカー遺伝子の発現の欠如によって相同組換えを検出することができる。
【００４０】
好ましい適用例において、第１DNA分子上に存在するマーカーはsacB、ccdBまたはテトラサイクリン耐性遺伝子などの対抗選択性遺伝子産物である。これらの場合、第２DNA断片による形質転換または第２DNA断片および第１DNA分子の同時形質転換後、ETクローニングによって改変されなかった第１DNA分子を保有する細菌細胞を培地上に接種したとき、対抗選択性マーカーの発現が宿主に対して毒性または静菌性効果をもたらす。ETクローニングステップの結果、この目的のDNA再編成を有する第１DNA分子を含有する細菌細胞のみが増殖することになる。
【００４１】
別の好ましい適用例において、第１DNA分子がコロニーの色または形態を容易に検出し得る変化を与えるリポーター遺伝子を保有する。好ましい１事例において、第１DNA分子上に緑色蛍光タンパク質（GFP）を存在させて、GFPの蛍光放出の差異によって、ETクローニング産物を持つかまたは持たない第１DNA分子を保有するコロニーを識別することができる。別の好ましい事例において、lacZ遺伝子を第１DNA分子上に存在させて、培地にX-galを添加したときの青色または白色といったコロニーの色によってETクローニング産物を持つかまたは持たない第１DNA分子を保有するコロニーを識別することができる。
【００４２】
第３の選択法において、ETクローニングによる第２DNA断片の第１DNA分子への組み込みにより、部位特異的なリコンビナーゼに対する標的部位が取り除かれる。本明細書中では該標的部位をRT（リコンビナーゼの標的の意）と言い、該部位は配列が相同的な二つの領域間の第１DNA分子上に存在する。相同組換え事象は、標的部位の除去によって検出され得る。
【００４３】
ETクローニング産物非存在下では、RTは対応する部位特異的リコンビナーゼによる使用のために利用できる。このRTが存在するかしないかの差はETクローニング産物の選択における基盤となる。このRTおよび対応する部位特異的リコンビナーゼの存在下では、部位特異的リコンビナーゼはこのRTにおける組換えを媒介して宿主の表現型を変化させ、容易に観察できる表現型が増殖または存在できないようにする。このRTの非存在下では、対応する部位特異的リコンビナーゼは組換えを媒介できない。
【００４４】
好ましい事例においては、第２DNA断片が標的とする第１DNA分子は２つのRTを含む。そのうちの１つは抗生物質耐性遺伝子に隣接するがその一部ではない。第２DNA断片は、このRTを取り除くように設計される。対応する部位特異的リコンビナーゼにさらされると、ETクローニング産物を担持しない第１DNA分子は、抗生物質耐性遺伝子を取り除くRT間での部位特異的組換え反応を受ける。そのため第１DNA分子は、対応する抗生物質に対する耐性を伝達できない。ETクローニング産物を含む第１DNA分子、または他の原因で部位特異的組換えを受けなかった第１DNA分子のみが、抗生物質耐性を伝達する。
【００４５】
別の好ましい事例においては、第２DNA断片のETクローニングによって取り除かれるRTは、使用する宿主株に存在する欠損を補う遺伝子に隣接する。別の好ましい事例では、第２DNA断片のETクローニングによって取り除かれるRTは、コロニーの色または形態における容易に検出可能な程度の変化を伝達するレポーター遺伝子に隣接する。
【００４６】
別の好ましい事例においては、第２DNA断片のETクローニングによって取り除かれるRTは、第１エピソームDNA分子上のどこにでも存在し、該エピソームは宿主ゲノムに組み込まれると細菌宿主細胞の生存とは両立しない複製起点を持つ。この場合、宿主ゲノムは第２のRTを担持しており、そのRTは対応する部位特異的リコンビナーゼが宿主ゲノム中に位置するRTにそのRTを介してエピソームを組み込み得るような突然変異を受けたRTであってもそうでなくてもよい。その他の好ましいRTとして、リゾルベース/トランスポザーゼ・クラスの部位特異的リコンビナーゼに対するRTが挙げられる。RTには、部位特異的組換えの従来の実施例に記載されたもの、それらの天然のまたは突然変異を受けた変種も含む。
【００４７】
好ましい部位特異的リコンビナーゼは、Cre、FLP、Kwまたはインテグラーゼ・クラスのいかなる部位特異的リコンビナーゼをも含む。その他の好ましい部位特異的リコンビナーゼには、リゾルベース/トランスポザーゼ・クラスの部位特異的リコンビナーゼがある。
【００４８】
宿主細胞中での部位特異的リコンビナーゼの発現法には制限がない。好ましい方法では、部位特異的リコンビナーゼの発現を、ETクローニング効率の最適化に従って発現が誘導および停止されるように調節する。この場合、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を、宿主ゲノムに組み込むかまたはエピソーム上に担持させてもよい。別の好ましい事例では、宿主細胞から除去されるように部位特異的リコンビナーゼを条件的複製起点を持つエピソームから発現させる。
【００４９】
別の好ましい事例では、上記の３つ選択方法の内の少なくとも２つを組合せる。特に好ましい事例は、上記の第１の選択方法の２工程に続いて第２の選択方法を使用するものである。この組合せの使用においては最も簡単なことだが、クローニングされるDNA断片が、表現型変化の獲得によって正確なETクローニング産物を第１工程において同定できるような遺伝子または遺伝子群を含む必要がある。第２工程では、第２周期のETクローニング産物が同定可能なように、第１工程で導入された遺伝子また遺伝子群の発現を変化させる。好ましい実施例では、使用する遺伝子はテトラサイクリン耐性遺伝子であり、第１工程のETクローニング産物はテトラサイクリン耐性の獲得によって同定される。第２工程では、テトラサイクリン遺伝子発現の減失は、塩化ニッケル、フザリン酸またはテトラサイクリン遺伝子が発現したときに宿主細胞に対して毒性を有する他のあらゆる薬剤に対する感応性の減失によって同定される。この２工程の工程は、第１に宿主の表現型変化をもたらす遺伝子の組み込みにより、第２に関連する表現型の変化の減失により、もっとも単純には第１工程で組み込まれたいくつかのDNA配列の除去により、ETクローニング産物の同定を可能にする。この方法によって、ETクローニング産物の同定のために使用する遺伝子は挿入され、続いて取り除かれ、これらの遺伝子を含まないETクローニング産物が残る。
【００５０】
本発明の他の実施形態では、ETクローニングを以下の工程を含む遺伝子組み換え法に用いてもよい。すなわちａ）RecEおよびRecTまたはRedαおよびRedβタンパク質の供給源の提供、ｂ）適当な宿主細胞中で複製され得る第１DNA分子と該第１DNA分子上の領域と配列相同性を持つ領域を少なくとも二つ含む第２DNA分子との、該第１および第２DNA分子間の相同組換えに好ましい条件下での接触、そしてｃ）該第１および第２DNA分子間で相同組換えがなされたDNA分子の選択、である。
【００５１】
RecEおよびRecT、またはRedαおよびRedβタンパク質の供給源は、精製されたまたは部分的に精製されたRecEおよびRecTもしくはRedαおよびRedβタンパク質、またはRecEおよびRecTもしくはRedαおよびRedβタンパク質を含む細胞抽出物のいずれかでよい。
【００５２】
本実施形態における相同組換え事象はin vitroで起こり得る。例えば、相同組換え事象に必要な他の成分を含む細胞抽出物を提供するときである。しかしながら相同組換えはin vivoでも起こり得る。例えば、RecEおよびRecTもしくはRedαおよびRedβタンパク質、または抽出物を宿主細胞（recET陽性であってもなくてもよく、またredαβ陽性であってもなくてもよい）中に導入し、宿主細胞中のDNA分子に接触させることによる。組換えがin vitroで生じるとき、DNA分子の選択は、組換え混合物を適した宿主細胞中に形質転換し、陽性クローンを前記のように選択することにより達成される。組換えがin vivoで生じるとき、上記選択法を直接利用できる。
【００５３】
本発明の更なる主題は、相同組換えを含むクローニング法のための宿主細胞として、細胞、好ましくは細菌細胞、最も好ましくはrecEおよびrecTまたはredαおよびredβ遺伝子を発現し得る大腸菌細胞の使用である。
【００５４】
依然として、本発明の更なる主題は宿主細胞中のrecEおよびrecTまたはredαおよびredβ遺伝子を発現し得るベクター系および該ベクターの相同組換えを含むクローニング法への使用である。好ましくは、ベクター系は上述のように、例えばλredγ遺伝子などへのエキソヌクレアーゼ阻害遺伝子をも発現し得る。該ベクター系は少なくとも一つのベクターを含みうる。recEおよびrecTまたはredαおよびredβ遺伝子は、好ましくは単一ベクター上に位置し、より好ましくは両方の遺伝子と同一であり得る調節可能なプロモーター、またはそれぞれの遺伝子に対する単一のプロモーターの制御下にある。特に好ましいのは、recEまたはredα遺伝子に対してrecTまたはredβ遺伝子を過剰に発現し得るベクター系である。
【００５５】
依然として本発明の更なる主題は、相同組換えを含むクローニング法におけるRecEおよびRecTまたはRedαおよびRedβタンパク質の供給源の使用である。
【００５６】
本発明の更に別の主題は、
(a)宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞、
(b)宿主細胞中のrecEおよびrecTまたはredαおよびredβ遺伝子の発現手段、例えばベクター系を含むもの、ならびに
(c)レシピエントクローニングビヒクル、例えば、上記細胞中で複製され得るベクター、
からなる試薬キットである。
【００５７】
一方、本発明の方法における第１DNA分子に対応するレシピエントクローニングビヒクルは、細菌細胞中に既に存在し得る。他方、それは細菌細胞と離れた状態でも存在し得る。
【００５８】
別の実施形態では試薬キットは、
(a)RecEおよびRecT、またはRedαおよびRedβタンパク質の供給源、ならびに
(b)宿主細胞中で増殖し得るレシピエントクローニングビヒクル、ならびに
(c)任意に、前記レシピエントクローニングビヒクルの増殖に適した宿主細胞、からなる。
【００５９】
試薬キットはさらに、特にレシピエントETクローニング産物が少なくとも一つの部位特異的リコンビナーゼ標的部位を有するときに、宿主細胞中で部位特異的リコンビナーゼを発現する手段を含むことが好ましい。さらに、試薬キットはETクローニングに使用する線状DNA断片の供給源としての使用に適したDNA分子を含んでいても良い。好ましくは、該DNA分子は、線状断片のPCR増殖のための鋳型として、また制限酵素分解により線状DNA断片を放出する特別に設計されたDNAベクターとして、また陽性対照またはその他の役割で使用するためにキット中に含まれる調製された線状断片として提供される。さらに試薬キットは、前記ベクターに相同的な領域を含む核酸増幅プライマーを含んでいてもよい。好ましくは、この相同的な領域は核酸増幅プライマーの５'末端に位置する。
【００６０】
本発明をさらに次の配列表、図、実施例によって例示する。
【００６１】
図および実施例
配列番号１は、プラスミドpBAD24-recET（図７）の核酸配列を示す。
【００６２】
配列番号２／３は、pBAD24-recETの位置1320〜2162に存在する末端切断型(truncated)recE遺伝子(t-recE)の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【００６３】
配列番号４／５は、pBAD24-recETの位置2155〜2972に存在するrecT遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【００６４】
配列番号６／７は、pBAD24-recETの位置974〜996に示される配列に対する相補鎖上に存在するaraC遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【００６５】
配列番号８／９は、pBAD24-recETの位置3493〜4353に存在するbla遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【００６６】
配列番号１０は、プラスミドpBAD-ETγ（図13）の核酸配列を示す。
【００６７】
配列番号１１は、遺伝子redα(1320〜2000)、redβ(2086〜2871)およびredγ(3403〜3819)をコードする領域と同様に、プラスミドpBAD-αβγ（図14）の核酸配列を示す。
【００６８】
配列番号１２-１４は、Redα、RedβおよびRedγタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ示す。redγ配列はpBAD-ETγ(図13)およびpBAD-αβγ（図14）のそれぞれに存在する。
【００６９】
1.方法
1.1.直鎖断片の調製
直鎖ＤＮＡ断片を増幅するために、標準的なPCR反応の条件を用いた。用いたプライマーの塩基配列は表１に示した。
【００７０】
表１
pJP5603(Penfold and Pemberton, Gene 118(1992), 145-146)由来のTn5-neo遺伝子が、オリゴペアであるa/bとc/dを用いて増幅された。pMAK705(Hashimoto-Gotoh and Sekiguchi, J.Bacteriol.131(1977), 405-412)由来のクロラムフェニコール(cm)耐性遺伝子が、プライマーペアであるe/fとn/pを用いて増幅された。FRTまたはloxP部位にはさまれたTn5-新遺伝子はpKaZまたはpKaX(http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/stewart)からオリゴペアi/h, g/h,およびj/kを用いて増幅されたものである。pIB279(Blomfield et al., Mol.Microbiol.5(1991),1447-1457)由来のsacB-neoカセットはオリゴペアl/mを用いて増幅された。pSVpaZ11(Buchholz et al., Nucleic Acids Res.24(1996), 4234-4262)由来のlacZ遺伝子断片はオリゴペアl*/m*を用いて増幅された。PCR産物は、QIAGEN PCR Purification Kitを用いて精製し、H2O2にて溶出した後に、Dpn Iにより残りの鋳型DNAをすべて消化した。消化後、PCR産物をフェノール：CHCl3により一度抽出し、そしてエタノール沈殿後、H2O中に約0.5μg/μlの濃度で再懸濁した。
【００７１】
1.2コンピテント細胞の調製とエレクトロポレーション
一晩培養した飽和状態の培養物をLB培地にて50倍に希釈し、OD600が0.5となるまで増殖させ、氷中で15分間冷却した。細菌細胞を０℃、7000rpmで10分間遠心した。ペレットを氷冷10％グリセロール中に再懸濁し、再度遠心した（7000rpm、-５℃で10分）。この操作をさらに２回繰り返し、細胞ペレットを等量の氷冷10%グリセロールに懸濁した。50μlのアリコートを液体窒素中で冷凍し、-80℃で保存した。細胞を氷上で解凍し、1μlDNA溶液（同時形質転換のために、0.3μgのプラスミドと0.2μgのPCR産物；または形質転換のために、0.2μgのPCR産物を含む）を添加した。エレクトロポレーションは、氷冷したキュベットとBio-Rad Gene Pulserを200オームに設定したPulse Controllerとともに25μFD、2.3kVの設定で用いて行った。エレクトロポレーションののち、LB培地（1ml)を添加した。細胞を37℃にて１時間振とうしながらインキュベートし、抗生物質プレート上に塗布した。
【００７２】
1.3 RecEおよびRecT発現の誘導
pBAD24-recETを保有する大腸菌JC5547を、0.2%グルコース、100μg/mlアンピシリンを含むLB培地中で一晩培養した。1/100接種により、１つ（０）は0.2%グルコースを含むようにして、計５本のLBを平行して始めた。培養物を37℃で振とうしながら４時間インキュベートし、回収の3, 2, 1, または1/2時間前に0.1%L-アラビノースを添加し、続いて前述のように処理した。回収の直前に、100μlを採取し、10%SDS-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。回収の９０分前に、Hoxa-P1とpBAD-ETγを保有する大腸菌NS3145を0.1%L-アラビノースにより誘導した。
【００７３】
1.4 FLPおよびCre発現プラスミドの一時的形質転換
FLPおよびCre発現プラスミドである、pSC101温度感受性オリジンをベースとする705-Creおよび705-FLP(Buchholz et al, Nucleic Acids Res. 24(1996), 3118-3119)を、塩化ルビジウムコンピテント細菌細胞中に形質転換した。細胞を、25μg/mlクロラムフェニコールプレート上に塗布し、30℃で２日間増殖させた。そこから、コロニーを採り、抗生物質を含まないL-アガープレートに再度塗布し、40℃で一晩インキュベートした。単一コロニーについて、さまざまな抗生物質プレート上で分析したところ、そのすべてが期待どおりクロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性を欠失していた。
【００７４】
1.5 sacB発現のスクロース対抗選択
図11に記載されているように調製された大腸菌JC9604lacZ株を、sacB-neoPCR断片およびpSVpaX1(Buchholz et al, Nucleic Acids Res, 24(1996), 4256-4262）により同時形質転換した。100μg/mlアンピシリン、50μg/mlカナマイシンプレート上で選択した後、pSVpaX-sacB-neoプラスミドを単離し、pSVpaX1からプライマーl*/m*を用いて増幅されたPCR断片とともに、新鮮なJC9604lacZ細胞に同時形質転換した。オリゴm*はBamH1部位を生じるサイレントな点突然変異を保持していた。細胞を、7％スクロース、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml X-galを含むプレート上に塗布し、28℃で２日間インキュベートした。スクロースプレート上で増殖させた青色コロニーと白色コロニーを計数し、さらに制限酵素による分析を行った。
【００７５】
1.6 他の方法
DNA調製およびサザン分析は、標準的な手順に従って行った。ハイブリダイゼーションプローブは、Tn5 neo遺伝子(PvuII), Hoxa3遺伝子(両方のHindIII断片), lacZ遺伝子(pSVpaX1由来のEcoR1およびBamH1断片）、cm遺伝子(pMAK705由来のBstB1断片）およびP1ベクター断片（P1ベクター由来の2.2kb EcoR1断片）より単離された断片のランダムなプライミングにより作製した。
【００７６】
2. 結果
2.1 大腸菌における組換え現象の確認
大腸菌におけるフレキシブルな相同組換え反応を確認するために、直鎖DNAと環状DNA間の組換えに基づくアッセイを設計した（図1, 図3)。Tn5カナマイシン耐性遺伝子（neo)をもつ直鎖DNAはPCRにより調製した（図3a)。はじめに、neoのPCR増幅に用いられたオリゴヌクレオチドは、5'末端にプラスミド中の選択した領域と相同の42ヌクレオチドを、3'末端にPCRプライマーとして提供するための18ヌクレオチドを有する60量体であった。直鎖DNAおよび環状DNAは等モルの比で混合し、さまざまな大腸菌宿主に同時形質転換した。相同組換えはsbcA大腸菌宿主のなかでのみ検出された。アンピシリン/カナマイシン両耐性のコロニー（図3b)の95%以上が期待された相同組換えプラスミドを含んでいることが、制限酵素消化と塩基配列決定によって示された。neo遺伝子のゲノムへの組み込みによる、カナマイシン耐性の低いバックグラウンドのみがみられた（結果示さず）。
【００７７】
直鎖および環状の組換え反応は２つの方法で特色づけられた。相同的アームの長さと組換え効率の関係は単純であり、長さが長いほど効率が良かった（図3c)。効率は、試した範囲内で、60bpまで増加した。レシピエント側のプラスミド中の二つの選択された相同部位間の距離の効率を調べた（図3d)。同一の左相同的アームをさまざまな右相同的アームと組ませることで８つのPCR断片のセットを作製した。右相同的アームは、プラスミド塩基配列から、左から0-3100bpとなるように選択した。挿入産物(0)はほとんど有効でないが、あとはすべてのケースから、４倍未満の差異はあるものの、正しい産物が容易に得られた。相同的アームが片方しかないPCR断片は反応しないので、正しい産物をえるには相同的アームの両方が存在することも必要であった。
【００７８】
2.2RecEとRecTの含有
宿主の遺伝子型およびこの相同組換え反応の間の関係は、種々の組換え要素の欠損した大腸菌株の一覧を利用してさらに系統的に調べた(表２)。
【００７９】
表２
２つのsbcA株, JC8679およびJC9604のみが意図した組換え産物を有し、RecAは必要ではなかった。sbcA株では、RecEとRecＴの発現は活性化されている。JC8679とJC8691の比較から、recEへの依存性が推論される。特筆すべきことに、JC9387中では組換え産物が見出されず、これは、sbcBCバックグラウンドでは、50ヌクレオチドの相同的アームに基づく相同組換えを起こすには至らないことを示唆する。
【００８０】
RecEおよびRecTが含まれることを示すために、recETオペロンの一部を誘導性発現ベクター中にクローン化し、pBAD24-recETを作製した（図6a)。このときRecEの最初の588アミノ酸は無くてもよいので、recE遺伝子のN末端を切断した。recBC株、JC5547をpBAD24-recETで形質転換し、コンピテント細胞の回収の前に、培地に、種々の時点でアラビノースを加えてRecE/RecTの誘導を経時的に行った。回収されたコンピテント細胞のバッチは、ゲル電気泳動によりタンパク質発現について評価し（図６ｃ）、直鎖DNA断片と内因性pBAD24-recETプラスミドとの間の組換えについて評価した。RecE/RecT発現の増加に従って組換えも増加したが、RecE/RecTの誘導がなければ、組換え産物は見出されなかった。この実験はまた、直鎖DNAおよび環状DNAの同時形質転換は必ずしも必要でなく、環状のレシピエントは宿主中に内在するものでもよいことを示した。図３、６および表２に示された結果から我々はRecEおよびRecTがrecBC大腸菌において、とても有用な相同組換え反応を、有用な頻度で仲介するとの結論を導いた。RecEとRecTが含まれるので、我々は、この直鎖DNAおよび環状DNAの組換え法を"ETクローニング”と呼ぶ。
【００８１】
2.3 ETクローニングの大型標的DNAへの応用
大型DNAエピソームが大腸菌中で操作できることを示すために、インタクトなマウスHoxa複合体の少なくとも59kbを含む（DNA配列決定およびサザンブロッティングにより確認された）、a > 76kbのP1クローンを、sbcAバックグラウンドをもつ大腸菌株(JC9604)に導入し、２周期の”ETクローニング”に供した。第一周期では、P1ベクター上のTn903カナマイシン耐性遺伝子をアンピシリン耐性遺伝子に置き換えた（図４）。第２周期では、Hoxa3とa4遺伝子間を標的とし、これは、Hoxa3の近位配列プロモーターの上流の２塩基対間にneo遺伝子を挿入するか、Hoxa3とa4遺伝子の間の6203bpを削除することによって行った（図8a）。挿入および削除を行ったETクローニング産物は容易に得られ（図8b, レーン2, 3および5）、２周期のETクローニングが、この大型大腸菌エピソームにおいて、明瞭な予想外の組換えを起こすことなく、正確に行われたことを示した。
【００８２】
大腸菌染色体中の遺伝子を標的とすることで、 ETクローニングの一般的な応用の可能性をさらに調べた（図9a）。正しい組換え産物と正しくない組換え産物の比がβ-ガラクトシダーゼ発現を評価することにより決定できるように、JC9604のβガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子を選択した。標準的条件（0.2μg PCR断片；50μlコンンピテント細胞）で、24個の１次コロニーができ、β-ガラクトシダーゼ発現（図9b）とDNA分析（図9c, レーン3-6）によりそのうちの20個が正しかった。
【００８３】
2.4 操作配列を除去するための２次的な組換え反応
上記のETクローニングの産物は、選択マーカー遺伝子を含んでいなければならないという点で、制約がある。この制約を取り除くためのさらなる組換え工程を利用する２つの異なる方法を開発した。第一の方法では、FlpまたはCreリコンビナーゼにより仲介される、部位特異的組換えを採用した。図８および９の実験で、Flp組換え標的部位(FRT)またはCre組換え標的部位(loxP)が、直鎖基質中のneo遺伝子をはさむように包含された。FRTまたはloxP間の組換えは、部位特異的組換えののち、温度を変えることでプラスミドの単純な消去ができるように、pSC101温度感受性複製起点(Hashimoto-Gotoh and Sekiguchi, J.Bacteriol.131(1977), 405-412)をもつプラスドにより発現される、FlpまたはCreを用いてなされた。ETおよびFlp組換えののち、正しく組み換えられたHoxa P1ベクターを、他の組換え産物の出現をみずに回収した(図８, レーン４および６）。同様に、Creリコンビナーゼも標的となったlacZ対立遺伝子（図９、レーン７〜１０）を正しく組換えた。このように部位特異的組換えは、容易にETクローニングと組み合わせることができ、これにより、操作上の一連の過程を省略することができ、またDNA操作の点において、34bpの部位特異的組換え標的部位を残すことが可能である。選択マーカー遺伝子を除去する第２の方法では、いかなる操作上の過程をも経ていないDNA産物を残すために、ポジティブおよび対抗選択の過程組み合わせた２周期のETクローニングを用いた。
【００８４】
さらにこの実験は、ETクローニングが操作された領域内でフレームシフトや点突然変異などの小規模の突然変異を促進するかどうかを、β-ガラクトシダーゼ活性にもとづく機能テストによって評価できるように設計した。第１の周期で、pSVpaX1のlacZ遺伝子は、neoおよびB. subtilis sacB（Blomfieldら, Mol. Microbiol. 5 (1991), 1447-1457)遺伝子を含む3.3kbのPCR断片により分断されたことが、カナマイシン耐性に対する選択によって確かめられた（図10a）。他のポジティブに選択された組換え産物に対して上に記載したように、現実に、選択されたコロニーはすべて白色であって（図10b）、LacZの分断に成功していることを示しており、DNA分析によって、17個中17個が正しい組換え体であることが確かめられた。第２周期ではlacZを修復するように設計された1.5kb PCR断片がsacB遺伝子に対する対抗選択により導入された。lacZの修復はBamH1制限部位を生じるサイレントな点突然変異を含んでいた。スクロース耐性コロニーのうち約４分の１がβ-ガラクトシダーゼを発現し、分析された（17個中17個；図10c）すべてがBamH1点突然変異とともに、修復されたlacZ遺伝子を保有していた。スクロース耐性コロニーの残りの４分の３はβ-ガラクトシダーゼ発現せず、分析されたすべて（17個中17個；図10c）がさまざまな大規模な突然変異を起こしていて、そのうちには、ETクローニング産物に類似のものはみられなかった。このように２周期の、lacZ遺伝子を標的とするETクローニングにおいて、小規模の突然変異によるβ-ガラクトシダーゼ活性の阻害はみられず、RecE/RecT 組換えが高度な正確さをもって進行することが示唆された。対抗選択の工程でみられた不正確な産物の有意な存在は、対抗選択遺伝子の発現を阻止するいかなる突然変異をも選択されてしまうことによる、対抗選択の利用に随伴する限界であるといえる。周知の通り、すべての不正確な産物は広範囲の突然変異によるものであるから、正確なET産物とはDNA解析により容易に区別できた。またべつの実験で（図５）我々は、ccdB遺伝子に対する対抗選択による、pZero2.1(In Vitro Gen)へのETクローニングにより、バックグラウンドの少ない不正確な産物（８％）が得られることを観察しており、これはETクローニング効率に影響するものとは異なる要因により、対抗選択のバックグラウンドがばらつくことを示唆していた。
【００８５】
2.5 大腸菌宿主間のETクローニングの転移
上記の実験は、sbcA突然変異がrecBCのサプレッサーとして同定さていたことから(Barbourら, Proc.Natl. Acad.Sci USA 67 (1970), 128-135; Clark,Genetics 78(1974), 259-271)、recBC大腸菌宿主中で行った。しかしながら、多くの有用な大腸菌株はP1, BAC,またはPACエピソームの増殖に通常使用される株も含めたrecBC+である。recBC+株へのETクローニングの転用を行うために、我々は、pBAD-ETγおよびpBAD-αβγを開発した（図13, 14）。これらのプラスミドはETクローニングの可動性に重要な３つの特徴を有する。第一は、RecBCが大腸菌の主要なエクソヌクレアーゼであり、導入された直鎖状の断片を分解する。それゆえにRecBC阻害剤のRedγ(Murphy, J.Bacteriol. 173(1991), 5808-5821)を保有させた。第２に誘導可能なプロモーターのもとにrecEまたはredαを配置することで、RecE/RecTまたはRedα/Redβの組換え能力を制御した。その結果、必要なときに、ETクローニングを誘導でき、他のときには、望まない組換え現象は制限される。第３にrecEまたはRedαではみられないが、RecTまたはRedβが過剰に発現されるときに、ETクローニング効率が上昇することを観察した。それゆえに我々はrecTまたはredβを強力な構成要素であるEM7プロモーターの下流に配置した。
【００８６】
pBAD-ETγを初期のHoxa P1エピソームを保持する、NS3145大腸菌中に、形質転換した(図11a)。P1ベクター主鎖中の領域はnおよびp相同的アームにはさまれたクロラムフェニコール耐性遺伝子(cm)のPCR増幅標的とされた。ポジティブに選択されたETクローニング反応について上述したように、ほとんど（＞90％）のクロラムフェニコール耐性コロニーが正確であった。周知のように、形質転換された直鎖状のDNAに関しては、sbcA宿主JC9604中の同じエピソームを標的とする類似の単純な実験に比べた場合、pBAD-ETγを利用したETクローニング全体の効率は、３倍近く上昇した。これは、RecTの過剰発現によりETクローニング効率が上昇するという我々の観察と一致する。
【００８７】
recA-. recBC+大腸菌株DK1において、pBAD-ETγから発現されたRecE/RecT、およびpBAD-αβγから発現されたRedα/Redβに仲介されたETクローニング効率を比較した（図１２）。pBAD-ETγまたはpBAD-αβγによる大腸菌DK1の形質転換ののち、図6a, c,に示したと同様、pBADベクターのbla遺伝子をクロラムフェニコール遺伝子と入れ替えるための実験を行った。pBAD-ETγまたはpBAD-αβγはいずれも、RecEおよびRedαのアラビノースによる誘導に対する反応、および目的とされた多くの事象に関して、同様のETクローニング効率を示した。
【００８８】
【表１】
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【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ETクローニングに好ましい方法をダイアグラムによって示す。クローニングする線状DNA断片を、レシピエントエピソーム中の配列およびPCR反応のプライミングのための配列、にマッチする(match)ように選んだ左の相同的アーム、ならびにレシピエントエピソーム中の別の配列およびPCR反応のプライミングのための配列にマッチするように選択した右の相同的アームを含むオリゴムクレオチドプライマーを用いるPCRで合成する。PCR反応の産物は、本明細書中では選択マーカー遺伝子(sm1)であるが、結果として左右の相同的アームに隣接し、同時形質転換の前にin vitroでエピソームと混合し得る。また、標的エピソームを持っている宿主細胞中に形質転換し得る。宿主細胞はrecEおよびrecT遺伝子の産物を含む。ETクローニング産物はレシピエントエピソーム上の２つの選択マーカーsm1およびsm2の組み合わせによって同定する。
【図２】  ETクローニング産物の３つの同定法を示す。１つ目は（図の左）、ETクローニングによる、宿主に表現型の違いをもたらす遺伝子の獲得を示す。該遺伝子は、ここでは選択マーカー遺伝子（sm）である。２つ目は（図の中央）、ETクローニングによる宿主に表現型の違いをもたらす遺伝子の欠失を示す。該遺伝子はここでは、対抗選択マーカー遺伝子(counter-sm)である。３つ目はETクローニングによる部位特異的リコンビナーゼ（SSR）に対する標的部位（RT、環状エピソーム上に三角形で示す）の欠失を示す。この場合、正しいETクローニング産物は、SSRが選択マーカー遺伝子(sm)を欠失させるのに必要な標的部位の１つを欠失する。SSRが該sm遺伝子を欠失できなかったことにより、正確なETクローニング産物を同定する。
【図３】  ETクローニングの簡単な実施例を提示する。
(a)上のパネル−PCRによってカナマイシン耐性遺伝子を増幅するように、およびレシピエントベクターに存在する相同的アームに隣接するように図１に記載のとおりに設計されたオリゴヌクレオチドから合成されたPCR産物（左レーン）をin vitroでレシピエントベクター（第２レーン）と混合し、recET + 大腸菌宿主中に同時形質転換した。レシピエントベクターはアンピシリン耐性遺伝子を担持する。(b)PCR産物単独(0.2μg)またはベクター単独（0.3μg）によるsbcA大腸菌株JC9604の形質転換はアンピシリンおよびカナマイシンによる2重選択（amp+kan）に対する耐性を伝達しない。しかしながら、PCR産物とベクターの両方を同時形質転換すると、２重耐性コロニーが産生される。これらのコロニーの95％より多くが、相同的アームの選択によりカナマイシン遺伝子がレシピエントベクターに正確に導入されている正確なETクローニング産物を含む。(a)の右側の2レーンは、ETクローニング前後のレシピエントベクターのPvu II制限酵素消化を示す。(c)ｂと同様、ただし６つのPCR産物（それぞれ0.2μg）を、pSVpaZ11(それぞれ0.3μg)でJC9604中に同時形質転換し、Amp＋KanプレートまたはAmpプレート上にプレーティングしたことを除く。結果を、組換え産物を表すAmp+Kan耐性コロニー数をコンピテント細胞調製物のプラスミド形質転換率を表すAmp-耐性コロニー数で割って106をかけてプロットした。PCR産物は、相同的アームの長さが異なることを除いてa-b PCR産物と同じであった。結果は、コンピテント細胞およびDNAの同じ群を用いた5回の実験から得られたものである。エラーバーは標準偏差を示す。(d)50bpの相同的アームに隣接する8つの産物を、pSVpaZ11とともにJC9604中に同時形質転換した。8つのPCR産物のすべてが、同一の左相同的アームおよび増幅されたneo遺伝子を含有していた。右の相同的アームは、(O)に隣接するpSVpaZ11配列から、またはより離れた（7〜3100bp）左の相同的アームから選択した。4回の実験から結果を得た。
【図４】  選択マーカーを交換するためのおよそ100kb P1ベクター中のETクローニング
カナマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして用い、少なくとも70kbのマウスHox a遺伝子クラスターを含むP1クローンを使用した。ETクローニングの前に、このエピソームはカナマイシン耐性（上のパネル、左上）をアンピシリン感受性の（上のパネル、右上）宿主大腸菌に伝達する。カナマイシン耐性遺伝子をアンピシリン耐性遺伝子に置き換えるように設計した線状DNA断片を図１で概要を示したようにPCRで作製し、レシピエントHox a/P1ベクターが常在する大腸菌宿主細胞中に形質転換した。ETクローニングの結果、カナマイシン耐性遺伝子は欠失し、カナマイシン感受性は回復した（上のパネル、左下）。そして、アンピシリン耐性を獲得した（上のパネル、右下）。DNA組換えが正確になされたことは、ETクローニング前後で単離されたDNAを制限酵素分解、およびサザンブロット分析することよって確認した（下のパネル）。
【図５】  対抗選択マーカー除去のためのETクローニング
図１および２に概要を示したようにカナマイシン耐性遺伝子を含むように作製した PCR断片（上のパネル、左、第3レーン）はその選択された相同的アームによって、ベクターpZero-2.1に存在する対抗選択ccdB遺伝子を欠失させるように指令される。recE/recT＋大腸菌宿主中に形質転換する前に、PCR産物とpZeroベクターをin vitroで混合した（上のパネル、左、第1レーン）。pZero-2.1単独で形質転換しカナマイシン選択培地上にプレーティングすると、コロニーは殆ど増殖しなかった（下のパネル、左）。pZero-2.1とPCR産物を同時形質転換すると、PvuII消化（上のパネル、右）によって視覚化したとき、意図した分子事象が起こったことを示すETクローニング産物が現われた（下のパネル、右）。
【図６】  エピソームからのrecEおよびrecTの誘導発現によって媒介されるETクローニング
RecE/RecTは、線状および環状DNA分子間の相同組換えを媒介する。(a)プラスミドpBAD24-recETを大腸菌JC5547中に形質転換した。そして続いて回収の前にL-アラビノースを示した回数加えることによってRecE/RecT発現を誘導した後、コンピテント細胞群を調製した。PCR産物をオリゴヌクレオチドeおよびｆを用いてpMAK705のクロラムフェニコール耐性遺伝子（cm）およびpBAD24-recETのアンピシリン耐性遺伝子（bla）と隣接するように選択された50bp相同的アームを含むように作製し、続いて形質転換し、組換え体をクロラムフェニコールプレートで同定した。(b)アラビノースを、pBAD24-recETで形質転換したJC5547の培養物に、コンピテント細胞調製のために回収する直前に、種々の回数で直接加えた。タンパク質発現の総量はSDS-PAGEおよびクマシーブルー染色で分析した。(c)形質転換およびアリコートのKanプレートへのプレーティングの際に、５pgのpZero2.1を含むこと、カナマイシン耐性を伝達することにより決定される形質転換率につて、PCR産物1μgあたりのクロラムフェニコール耐性コロニーの数を対照に対して規準化した。
【図７】  Aには、プラスミドpBAD24-recETをダイアグラムで示す。該プラスミドは、誘導性のBADプロモーター（PBAD）制御下で、遺伝子recE(末端切断型形態で)およびrecTを含む。このプラスミドはさらに、アンピシリン耐性遺伝子（Ampｒ)およびaraC遺伝子を含む。
Bには、pBAD24-recETの核酸配列およびタンパク質をコードする部分を示す。
【図８】  複数の組換え工程による大きな大腸菌エピソームの遺伝子操作
a. 組換え反応のスキーム。JC9604に常在するマウスHoxa複合体のP1クローンをneo遺伝子および2つのFlp組換え標的（FRT）を含むPCR産物で組換えて改変した。２つのPCR産物は、１つがgおよびh相同的アームに隣接し（挿入）、もう１つがiおよびh相同的アームに隣接する（欠失）ことを除いて、同じであった。第２工程では、neo遺伝子がFRT間のFlp組み換えによって、温度感受性起点（ts ori）pSC101をベースとするFlp発現プラスミドの一時的な形質転換によって、取り除かれた。b上のパネル；各工程における３つの独立したコロニーから得たP1 DNA調製物のEcoR1による消化を示すエチジウムブロミドで染色したアガロースゲル。真ん中のパネル；neo遺伝子プローブにハイブリダイズした上のパネルのサザンブロット。下のパネル；組換え部位を視覚化するためにHoxa3プローブにハイブリダイズした上のパネルのサザンブロット。レーン１；大腸菌株NS3145中で増殖した起源(original)Hoxa3P1クローン。レーン2；該P1ベクターに常在するTn903カナマイシン耐性遺伝子のアンピシリン耐性遺伝子との置換により、8.1kbバンド（レーン1）が9.0kbに増加した。レーン3；Tn5-neo遺伝子をHoxa3の上流のg-h相同的アームと共に挿入すると、6.7kbのバンド（レーン1,2）が、9.0kbに増加した。レーン4、Flpリコンビナーゼはg-h neo遺伝子を欠失させ、9.0kbのバンド（レーン3）が6.7kbのバンドまで減少した。レーン５、Hoxa3-4遺伝子間の6kbのDNAをi-hneo遺伝子と置き換えることで欠失させると、6.7kbバンド（レーン2）が4.5kbに減少した。レーン6、Flpリコンビナーゼがi-h neo遺伝子を欠失させ、4.5kbバンドが2.3kbバンドに減少した。
【図９】  大腸菌染色体の遺伝子操作。A. 組換え反応のスキーム。大腸菌染色体の7.8'にあるJC9604の内因性lacZ遺伝子は（関連するAva I部位および座標とともに展開した形で示される）、示すように、相同的アームjおよびk、およびloxP部位に隣接するneo遺伝子を含むPCR断片の標的となった。neo遺伝子を組み込むとAvaI部位を含むほとんどのlacZ遺伝子が取り除かれ、1443および3027bpバンドが3277bpバンドに変化した。第2工程では、pSC101温度感受性起点（ts ori）に基づくCre発現プラスミドの一時的な形質転換によるloxP間のCre組換えによって、neo遺伝子が取り除かれた。Creリコンビナーゼによるneo遺伝子の除去によって3277バンドが2111bpに減少した。ｂ. βガラクトシダーゼ発現をX-Galプレート上の線条接種コロニーによって評価した。最上列の3つの条班は宿主JC9604株内のβ-ガラクトシダーゼ発現を示し（w.t.）、下の3つの条班は（Km）は24の独立した最初のコロニーを示す。そのなかの20は意図した組換え事象を表すβ-ガラクトシダーゼ発現の減失を表す。ｃ. AvaIで消化した大腸菌染色体DNAの、全lacZコード領域から作製したランダムプライムプローブを用いたサザン分析；レーン1,2、 w.t.；レーン3〜6、j-k neo遺伝子挿入後の独立した４つの白色コロニー；レーン7〜10、Cre発現プラスミドで一時的に形質転換した後の同一の4つのコロニー。
【図１０】  点突然変異を導入するための2周期のETクローニング
a 組換え反応のスキーム。pSVpaX1のlacZ遺伝子を図9の実験で作製された株JC9604lacZ中で分断し、plB279に対するPCRによって合成されかつｌおよびｍ相同的アームに隣接するsacB-neo遺伝子カセットによって、内因性lacZ遺伝子の発現を除去し、競合する配列を取り除いた。pSV-sacB-neoと称する組換え体をAmp+Kanプレート上で選択した。そして、pSV-sacB-neoのlacZ遺伝子を、完全なlacZ遺伝子から作製したPCR断片によりl*およびm*相同的アームを用いて修復した。m*相同的アームは、BamH１部位を創るCからGへのサイレント変化を含有した。pSVpaX1*と称する組換え体を７％スクロースを用いてsacB遺伝子に対する対抗選択によって同定した。ｂ. pSVpaX1からのβ-ガラクトシダーゼの発現はpSV-sacB-neo中では中断し、pSVpaX1*中では復活した。発現をX-galプレート上で分析した。pSV-sacB-neoおよびpSVpaX1*それぞれの３つの独立したコロニーを示す。ｃ スクロースによる対抗選択後に採取した独立コロニーから調製したDNAをBamH1で消化したもののエチジウムブロミド染色アガロースゲル。すべてのβ-ガラクトシダーゼ発現コロニー（青色）は、導入されたBamH1制限部位を有した（上のパネル）。すべての白色コロニーは大規模な再配列(rearrangement)を表し、特徴的な1.5kbのBamH1制限断片を有する産物はなかった（下のパネル）。
【図１１】  大きなエピソームを改変するためのETクローニングのrecBC+宿主への転換
a. 移動性ET系を有するプラスミドpBAD-ETγのスキームおよびHoxa P1エピソームを標的とするのに使用するストラテジー。pBAD-ETγはpBAD24をベースとしており、(i)アラビノース誘導性PBADプロモーター下の末端切断型(truncated)recE遺伝子(t-recE)、(ii)EM7プロモーター下のrecT遺伝子、および(iii)Tn5プロモーター下のredγ遺伝子、を含む。pBAD-ETγはHoxa P1エピソームを含むrecA大腸菌株、NS3145中に形質転換された。アラビノース誘導後、コンピテント細胞を調製し、nおよびp相同的アームに隣接するクロラムフェニコール耐性遺伝子(cm)を有するPCR産物で形質転換した。nおよびpは、P1ベクターのセグメントと組換えられるように選択した。ｂ. 組換え標的部位を視覚化するためにP1ベクターから作製したプローブ（上のパネル）およびクロラムフェニコール耐性遺伝子から作製したプローブ（下のパネル）、とハイブリダイズしたDNAをPvu IIで消化したもののサザンブロット。レーン1、ETクローニングの前にHoxaP1エピソームを有する細胞から調製したDNA。レーン2〜17、16個のクロラムフェニコール耐性コロニーから調製したDNA。
【図１２】  pBAD-ETγ内のrecE/recT遺伝子を用いたときとpBAD-αβγ内のredα/redβ遺伝子を用いたときのETクローニングの比較
示したプラスミドpBAD-ETγまたはpBAD-αβγを、大腸菌recA-、recBC+株、DK1中に形質転換し、図6に記載のようにクロラムフェニコール遺伝子の標的として、ETクローニング効率を評価した。アラビノースによるタンパク質発現誘導は1時間だった。
【図１３】  Ａは、プラスミドpBAD-ETγをダイアグラムにより示す。
Ｂは、pBAD-ETγの核酸配列およびタンパク質コード部分を示す。
【図１４】  Ａは、プラスミドpBAD-αβγをダイアグラムにより示す。このプラスミドはrecEおよびrecT遺伝子がredαおよびredβ遺伝子に置き換わっていることを除いて図13に示すプラスミドと実質的に一致する。
Ｂは、pBAD-αβγの核酸配列およびタンパク質コード部分を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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