(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオチップの製造方法であって、
プローブ溶液を準備する工程、
基板を準備する工程、
前記基板に、前記プローブ溶液を配置する工程、および、
配置された前記プローブ溶液中のプローブを前記基板に固定する工程を含み、
前記プローブ溶液が、疎水性鎖と前記基板に吸着する官能基とを有する分子、および、プローブを含むバイオチップの製造方法。
【請求項２】
前記疎水性鎖が、ハロアルキル鎖である請求項１に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項３】
前記疎水性鎖が、フルオロアルキル鎖である請求項１または２に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項４】
前記基板に吸着する官能基が、ＯＨ，ＮＨ2，ＳＨ，ＳＳ，ＣＯＯＨ，ＳｉＯＨ，Ｓｉ（ＯＲ）（Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。）、および、Ｓｉ［（Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）m−ＯＲ］（ｍは、１〜１０の自然数であり、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。）からなる群から選択される官能基である請求項１から３のいずれかに記載のバイオチップの製造方法。
【請求項５】
前記フルオロアルキル鎖と前記基板に吸着する官能基とを有する分子が、下記一般式（１）もしくは（２）で表される化合物、または、これらの加水分解物である請求項４に記載のバイオチップの製造方法。
ＣＦ3（ＣＦ2）nＣ2Ｈ4ＳｉＲ3-x（ＯＹ）x                    （１）
ＣＦ3（ＣＦ2）nＣ2Ｈ4Ｓｉ［（Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）m−ＯＲ］3    （２）
上記一般式（１）において、ＲおよびＹは、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基である。ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜３の自然数である。ｘ＝１の時、Ｒは２個存在するが、これらは同じものでもよく異なったものでも良い。
上記一般式（２）において、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基であり、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｍは、１〜１０の自然数である。
【請求項６】
前記プローブ溶液の基板への配置が、滴下またはインクジェット法による吐出により行われる請求項１から５のいずれかに記載のバイオチップの製造方法。
【請求項７】
さらに、前記プローブを前記基板上に固定した後、前記基板を液体で洗浄する工程を含む請求項１から６のいずれかに記載のバイオチップの製造方法。
【請求項８】
前記プローブが、核酸、タンパク質、糖、細胞、およびこれらの修飾物からなる群から選択される少なくとも１つに由来するプローブである請求項１から７のいずれかに記載のバイオチップの製造方法。
【請求項９】
バイオチップのプローブ溶液であって、疎水性鎖と極性基とを有する分子、および、プローブを含むプローブ溶液。
【請求項１０】
前記疎水性鎖が、ハロアルキル鎖である請求項９に記載のプローブ溶液。
【請求項１１】
前記ハロアルキル鎖が、フルオロアルキル鎖である請求項１０に記載のプローブ溶液。
【請求項１２】
前記極性基が、ＯＨ，ＮＨ2，ＳＨ，ＳＳ，ＣＯＯＨ，ＳｉＯＨ，Ｓｉ（ＯＲ）（Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。）、および、Ｓｉ［（Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）m−ＯＲ］（ｍは、１〜１０の自然数であり、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。）からなる群から選択される極性基である請求項９から１１のいずれかに記載のプローブ溶液。
【請求項１３】
前記フルオロアルキル鎖と極性基とを有する分子が、下記一般式（１）もしくは（２）で表される化合物、または、これらの加水分解物である請求項１２に記載のプローブ溶液。
ＣＦ3（ＣＦ2）nＣ2Ｈ4ＳｉＲ3-x（ＯＹ）x                    （１）
ＣＦ3（ＣＦ2）nＣ2Ｈ4Ｓｉ［（Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）m−ＯＲ］3    （２）
上記一般式（１）において、ＲおよびＹは、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基である。ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜３の自然数である。ｘ＝１の時、Ｒは２個存在するが、これらは同じものでもよく異なったものでも良い。
上記一般式（２）において、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基であり、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｍは、１〜１０の自然数である。
【請求項１４】
前記プローブが、核酸、タンパク質、糖、細胞、およびこれらの修飾物からなる群から選択される少なくとも１つに由来するプローブである請求項９から１３のいずれかに記載のプローブ溶液。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれかに記載のバイオチップの製造方法により、または、請求項９から１４のいずれかに記載のプローブ溶液を用いて製造されたバイオチップ。
【請求項１６】
基板と、
前記基板に吸着する官能基と疎水性鎖とを有する分子からなり、前記基板上の互いに分離した複数の領域に形成された単分子膜と、
前記単分子膜が形成された領域内の基板上に固定されたプローブと、
を有するバイオチップであって、
前記疎水性鎖が、ハロアルキル鎖である、バイオチップ。
【請求項１７】
前記疎水性鎖が、フルオロアルキル鎖である請求項１６に記載のバイオチップ。
【請求項１８】
前記プローブが、核酸、タンパク質、糖、細胞、およびこれらの修飾物からなる群から選択される少なくとも１つに由来するプローブである請求項１６または１７のいずれかに記載のバイオチップ。
【請求項１９】
前記基板上の前記単分子膜とプローブが形成されていない領域は親水性である、請求項１６から１８のいずれかに記載のバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオチップの製造方法、プローブ溶液、および、バイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップは、ＤＮＡ、タンパク質、糖鎖等のバイオ分子、あるいは細胞等を支持体（基板）上に固定化し、固定化された前記バイオ分子や細胞等（以下、プローブと呼ぶ。）と、バイオ分子あるいはそれ以外の化合物（以下、ターゲットと呼ぶ。）とを接触させ、生じた特異的な相互作用を検出することを大量かつ同時並行的に行うことを可能にしたものをいう。バイオチップのなかでも、ＤＮＡチップは、数千〜数万種類のＤＮＡ断片や合成オリゴヌクレオチド（以下、これらをＤＮＡプローブと呼ぶ。）を、数センチメートル四方のガラス基板やシリコン基板などの所定の位置に、それぞれ、固定したものである。ＤＮＡチップは、例えば、多数の遺伝子が発現する様子を同時に測定することや、特定の遺伝子の存在を検出することを目的とした遺伝子検査方法等に使用される。
【０００３】
ＤＮＡチップを用いた前記遺伝子検査方法は、例えば、以下のような工程で行うことができる。
１．検体の細胞や血液からメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)を取り出す。
２．前記ｍＲＮＡから相補性ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)を逆転写・複製した後、これらを断片化し、蛍光色素を結合して標識化しターゲットを調製する。
３．標識化した前記ｃＤＮＡ（ターゲット）をＤＮＡチップにふりかけ、基板上のＤＮＡプローブと結合させる。ターゲットのｃＤＮＡはそれと相補的なＤＮＡプローブと結合する。
４．前記ＤＮＡチップを洗浄し、ＤＮＡプローブと結合していないターゲットを除去する。
５．蛍光顕微鏡を用いて蛍光色素の発色を観測することで、ターゲットのＤＮＡチップ基板上での位置と量とを検出する。
【０００４】
ＤＮＡチップの製造方法は、大別すると、２種類の方法に分けることができる。第１の方法は、半導体製造技術で用いられるフォトリソグラフィー法を応用した方法であって、ＤＮＡの構成単位である４種類のモノヌクレオチドを、それぞれ、基板上の所定の位置で、所定の順番に化学結合させてオリゴヌクレオチドを形成する方法である（例えば、特許文献１参照）。ここで、オリゴヌクレオチドとは、数個から数十個のヌクレオチドが重合したものであって、例えば、天然の核酸等の重合度の高いポリヌクレオチドが断片化したものや、ポリヌクレオチドに比べて分子量が小さいものである。
【０００５】
第２のＤＮＡチップの製造方法は、固定するオリゴヌクレオチドが溶解した液体を予め用意し、これを基板上の所定の位置に微小滴下して固定する方法である。前記オリゴヌクレオチドを前記基板へ固定する方法には、化学結合を用いる方法や、物理吸着を用いる方法等があり、前記微小滴下には、インクジェット法を利用することができる（例えば、特許文献２参照）。前記インクジェット法とは、ノズル板上に形成された直径が数十μｍの多数の孔から液滴を基板に向けて吐出し、基板の所定の位置に前記液を配置する方法であって、インクジェット式プリンタの印刷方法として、広く使用されている方法である。
【０００６】
インクジェット法を利用したＤＮＡチップの製造方法は、前記第１の製造方法と比較して簡単に、かつ、低コストでＤＮＡチップを製造できるため、今後のＤＮＡチップの製造方法として期待されている。一方、この製造方法における問題点としては、下記２点があげられる。
（１）基板上の所定の位置へ液滴を配置する精度。
（２）インクジェット法で吐出された溶液の基板上での拡がりやにじみ。
【０００７】
上記問題点（１）の配置の精度は、ＤＮＡチップの品質における重要な要素の一つであるが、高精度の印刷が可能なインクジェット式吐出装置を開発することで、その精度の向上が可能である。現在市販されているインクジェット式プリンタは、数十μｍ径の液滴を、±３０μｍの位置精度で基板上に配置することが可能である。今後の装置の改良により、液滴の微小化および位置精度は、飛躍的に向上するものと考えられる。
【０００８】
上記問題点（２）の基板上で溶液が拡がりやにじみは、基板上のＤＮＡプローブ領域の配置密度を制限するものである。すなわち、ＤＮＡプローブ領域の密度を高くするためには、各ＤＮＡプローブ溶液を基板上に狭い間隔で配置する必要があるが、溶液の拡がりやにじみにより溶液同士が重なることとなる。溶液同士の重なりを無くすためには各溶液の間隔を広くすれば良いが、その場合、プローブの密度が低下してしまう。
【０００９】
図５に、インクジェット法により吐出されたＤＮＡプローブ溶液の基板上での拡がりの様子を模式的に示す。なお、図５の各図において、同一部分には同一符号を付している。図５Ａ〜図５Ｃは、インクジェット法により基板に向けて吐出されたＤＮＡプローブ溶液が基板上で拡がらない場合の模式図であって、図５Ａは、ＤＮＡプローブ溶液５１が、インクジェット法により基板５３に向けて矢印５２方向に吐出される様子を示し、図５Ｂは、ＤＮＡプローブ溶液５４が、基板５３に接触した直後の様子を示し、図５Ｃは、前記接触後、時間が経過した後のＤＮＡプローブ溶液５５の基板５３上での様子を示す。図５Ａ〜図５Ｃに示すとおり、基板５３に接触した直後の溶液５４の接触面積（図５Ｂ）は、その後の溶液５５と基板５３との接触面積（図５Ｃ）とほとんど変化なく、ＤＮＡプローブ溶液が基板５３上で拡がることはない。対照的に、図５Ｄ〜図５Ｆは、ＤＮＡプローブ溶液が基板上で拡がる場合の模式図であって、図５Ｄは、ＤＮＡプローブ溶液５１が、インクジェット法により基板５３に向けて矢印５２方向に吐出される様子を示し、図５Ｅは、ＤＮＡプローブ溶液５６が、基板５３に接触した直後の様子を示し、図５Ｆは、前記接触後、時間が経過した後のＤＮＡプローブ溶液５７の基板５３上での様子を示す。図５Ｄ〜図５Ｆに示すとおり、基板５３に接触した直後の溶液５６の接触面積（図５Ｅ）は、経時的に大きくなり、溶液５７が基板５３上で拡がることとなる（図５Ｆ）。
【００１０】
図６は、ＤＮＡプローブ溶液固定前のＤＮＡチップ用基板と、ＤＮＡプローブ溶液をインクジェット法で吐出した後の前記基板の様子を示す平面模式図であり、図６の各図において、同一部分には同一符号を付している。図６Ａは、ＤＮＡプローブ溶液を固定領域６２に固定する前のＤＮＡチップ用基板６１を示し、図６Ｂは、吐出されたＤＮＡプローブ溶液６３が、基板６１上で拡がらない場合のＤＮＡチップ用基板６１を示し、図６Ｃは、吐出されたＤＮＡプローブ溶液６４が、基板６１上で拡がる場合のＤＮＡチップ用基板６１を示す。ＤＮＡプローブ溶液が基板上で拡がらない場合には、図６Ｂに示すように、溶液６３は、所定の領域６２に配置されるが、ＤＮＡプローブ溶液が拡がる場合には、図６Ｃに示すように、隣同士の溶液６４が混じりあってしまう。このようなＤＮＡプローブ溶液の重なりを無くすためには、それぞれの溶液同士の間隔（ＤＮＡプローブ領域の間隔）を広くする必要があるが、その間隔を広くすると、基板上でのＤＮＡプローブ領域の密度が低下し、一枚のＤＮＡチップ上に配置できるＤＮＡプローブの種類が制限されることとなる。
【００１１】
インクジェット法におけるＤＮＡプローブ溶液の基板上での拡がりやにじみのしやすさは、ＤＮＡプローブと基板との固定方法に起因するところが多い。前述のとおり、ＤＮＡプローブと基板との固定方法としては、化学結合や物理吸着があげられるが、これらの固定方法は、いずれも、ＤＮＡプローブ中の極性基を利用する方法である。したがって、ＤＮＡプローブを固定する基板表面には、ＤＮＡプローブの極性基と化学反応する極性基、または、ＤＮＡプローブの極性基とイオン結合や水素結合を形成する極性基が存在することとなる。極性基を有する基板表面は、その表面エネルギーが高く、液体に対する濡れ性がよい。そのため、ＤＮＡチップ用基板は、一般的に表面エネルギーが高く、インクジェット法で吐出したＤＮＡプローブ溶液が基板上で拡がりやにじみが生じやすくなるのである。
【００１２】
ＤＮＡプローブ溶液の基板上での拡がりやにじみの問題を解決する方法として、ＤＮＡプローブを固定する領域を親水性とし、その周りを撥水性とすることにより、前記固定領域からのＤＮＡプローブ溶液の拡がりを防止する方法が開示されている（特許文献３参照）。この方法は、未処理状態では撥水性であり、光または熱で処理することで親水性となる表面を有する基板の表面を、例えば、メタルマスク等を通した光照射処理により撥水性と親水性のパターン形成を行った後、親水性領域に、インクジェット法によりＤＮＡプローブを含む溶液を吐出することで、ＤＮＡチップを製造する方法である。
【特許文献１】米国特許第５４０５７８３号明細書
【特許文献２】特開２００１−６６３０５号公報
【特許文献３】特開２００３−２８８６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、前記製造方法は、ＤＮＡプローブ溶液が基板上で拡がらないためＤＮＡプローブ領域を高密度に配置ができるという利点がある一方、基板表面のパターン形成に手間がかかるという問題がある。さらに、パターン形成した基板の親水性領域のみにＤＮＡプローブ溶液を正確に吐出描画するためには、前記親水性領域を検出する手段をインクジェット装置に設けるか、または、基板をインクジェット装置に正確に設置する必要があるため、製造コストがかかったり、製造工程が多くなるという問題もある。
【００１４】
また、ＤＮＡチップを含むバイオチップは、一般的に、その表面に有機物等が付着して汚染されると、試料検体であるターゲットと基板上に固定されたプローブとの結合がしにくくなり、バイオチップを用いた前記遺伝子検査方法の検出感度が低下するという問題を有している。そのため、バイオチップは、汚染されないように厳密に保管しておく必要があり、使い勝手が良くないという問題もある。
【００１５】
そこで、本発明は、バイオチップの製造方法であって、プローブ溶液を用いてプローブを基板上に固定する際に、前記基板上における前記プローブ溶液の拡がりやにじみを簡単に抑制できるので、プローブ領域の高密度の集積が可能であり、かつ、製造されたバイオチップが有機物等による汚染がされにくいバイオチップの製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明のバイオチップの製造方法は、プローブ溶液を準備する工程、基板を準備する工程、前記基板に前記プローブ溶液を配置する工程、および、配置された前記プローブ溶液中のプローブを前記基板に固定する工程を含み、前記プローブ溶液が、疎水性鎖と前記基板に吸着する官能基とを有する分子、および、プローブを含む製造方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明者らは、ＤＮＡチップ等のバイオチップを製造する際、インクジェット法によりプローブ溶液を基板上に吐出した場合に生じる前記溶液の前記基板上での拡がりやにじみをより簡便に抑制する方法について、溶液の拡がりやにじみの起因の一つである前記基板表面の表面エネルギーに着目して鋭意研究を重ねた。その結果、前記プローブ溶液中に疎水性鎖と前記基板に吸着する官能基とを有する分子を溶解させれば、前記プローブ溶液を前記基板に配置させた際に、前記分子が前記官能基を介して基板上に吸着して単分子膜を形成し、前記単分子膜により前記基板の表面エネルギーが低下し、これにより前記プローブ溶液の拡がりやにじみを抑制できることを見出した。さらに、本発明者らは、前記プローブが固定された領域に、前記単分子膜が形成されると、前記領域が有機物等により汚染されにくくなることを見出し、本発明に到達した。
【００１８】
本発明のバイオチップの製造方法によれば、例えば、プローブが固定された領域が疎水性であり、プローブ領域以外の基板表面が親水性である本発明のバイオチップを製造できる。このバイオチップによれば、例えば、ターゲット分子（標的分子）を含む試料溶液がバイオチップ上のプローブと再現性よく効率的に反応できるので、より高精度の測定が可能となる。
【００１９】
通常、バイオチップ上に固定されたプローブとターゲット分子とを反応させるために、ターゲット分子が溶解した溶液をバイオチップ全体に滴下するか、試料溶液中にバイオチップを浸漬する方法が用いられる。しかし、例えば、プローブが存在する領域が親水性でそれ以外が撥水性の従来のバイオチップを用いて上記方法でプローブとターゲット試料溶液とを反応させる場合、以下の問題が生じる。すなわち、ターゲット試料溶液を前記バイオチップに滴下する方法の場合、バイオチップの基板面の法線が鉛直方向（重力が働く方向）から少しでも傾いていると、バイオチップ表面が撥水性なので液滴は玉状となってバイオチップ上からほとんどの溶液が転がり落ち、ターゲット分子とプローブが効率よく反応できなくなる。また、ターゲット試料溶液に前記バイオチップを浸漬する方法の場合、注意深く浸漬しないと、撥水性領域に気泡がつきこの気泡がプローブ領域を覆ってしまい、ターゲット分子とプローブとが反応できなくなる。これに対し、本発明のバイオチップであれば、プローブが固定されていない領域を親水性とすることができるので、ターゲット試料溶液を基板に滴下した時に基板面の法線が鉛直方向から傾いていても、試料溶液が本発明のバイオチップ表面から転がり落ちることが抑制される。また、ターゲット試料溶液に本発明のバイオチップを浸漬する場合も、撥水性の領域がプローブ領域に制限されているため、本発明のバイオチップ表面に気泡が付くことがほとんどなく、ターゲット分子とプローブとが、効率よく反応することが可能である。従って、本発明のバイオチップは、従来に比べて、ターゲット分子とプローブが効率よく反応するので、精度良くターゲット分子を測定することが可能となる。
【００２０】
さらに、本発明のバイオチップの製造方法によれば、例えば、基板上に親水性および疎水性領域のパターン形成等の工程を経ることなく、簡単に、基板上のプローブ溶液の拡がりやにじみを抑制できるから、プローブ領域が高密度に配置されたバイオチップを簡便に製造でき、例えば、安価なバイオチップの製造が可能となる。さらに、本発明の製造方法によれば、汚染されにくいバイオチップを製造できるから、例えば、バイオチップの保存や取扱い等の使い勝手を向上でき、例えば、ＤＮＡチップ等を用いた遺伝子研究や遺伝子診断をより簡単・手軽なものにできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明のバイオチップの製造方法において、疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子の前記疎水性鎖としては、例えば、炭化水素鎖があげられ、これらの中でも、好ましくは、炭化水素鎖の一つ以上の水素原子をハロゲン原子と置換したハロアルキル鎖であり、フルオロアルキル鎖がより好ましい。
【００２２】
本発明のバイオチップの製造方法において、疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子の前記官能基としては、例えば、ＯＨ，ＮＨ2，ＳＨ，ＳＳ，ＣＯＯＨ，ＳｉＯＨ，Ｓｉ(ＯＲ)（Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。）、および、Ｓｉ［（Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）m−ＯＲ］（ｍは、１〜１０の自然数であり、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。）が好ましい。
【００２３】
本発明のバイオチップの製造方法において、前記フルオロアルキル鎖と前記官能基を有する分子は、下記一般式（１）もしくは（２）で表される化合物、または、これらの加水分解物であることが好ましい。
ＣＦ3（ＣＦ2）nＣ2Ｈ4ＳｉＲ3-x（ＯＹ）x                    （１）
ＣＦ3（ＣＦ2）nＣ2Ｈ4Ｓｉ［（Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）m−ＯＲ］3    （２）
上記一般式（１）において、ＲおよびＹは、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基である。ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜３の自然数である。ｘ＝１の時、Ｒは２個存在するが、これらは異なったものでも良い。
上記一般式（２）において、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基であり、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｍは、１〜１０の自然数である。
【００２４】
本発明のバイオチップの製造方法において、前記プローブ溶液の基板への配置は、滴下またはインクジェット法による吐出により行われることが好ましい。
【００２５】
本発明のバイオチップの製造方法は、さらに、前記プローブを前記基板上に固定した後、前記基板を液体で洗浄する工程を含むことが好ましい。
【００２６】
本発明のバイオチップの製造方法において、前記プローブは、核酸、タンパク質、糖、細胞、およびこれらの修飾物からなる群から選択される少なくとも１つに由来するプローブであることが好ましい。
【００２７】
本発明のプローブ溶液は、バイオチップのプローブ溶液であって、疎水性鎖と極性基とを有する分子、および、プローブを含むプローブ溶液である。本発明のプローブ溶液は、本発明のバイオチップの製造方法に用いることができる。
【００２８】
本発明のプローブ溶液において、前記疎水性鎖と極性基とを有する分子の疎水性鎖としては、例えば、炭化水素鎖があげられ、これらの中でも、好ましくは、炭化水素鎖の一つ以上の水素原子をハロゲン原子と置換したハロアルキル鎖であり、フルオロアルキル鎖がより好ましい。
【００２９】
本発明のプローブ溶液において、前記疎水性鎖と極性基とを有する分子の極性基としては、例えば、ＯＨ，ＮＨ2，ＳＨ，ＳＳ，ＣＯＯＨ，ＳｉＯＨ，Ｓｉ(ＯＲ)（Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。）、および、Ｓｉ［（Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）m−ＯＲ］（ｍは、１〜１０の自然数であり、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。）が好ましい。
【００３０】
本発明のプローブ溶液において、前記フルオロアルキル鎖と極性基とを有する分子は、下記一般式（１）もしくは（２）で表される化合物、または、これらの加水分解物であることが好ましい。
ＣＦ3（ＣＦ2）nＣ2Ｈ4ＳｉＲ3-x（ＯＹ）x                    （１）
ＣＦ3（ＣＦ2）nＣ2Ｈ4Ｓｉ［（Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）m−ＯＲ］3    （２）
上記一般式（１）において、ＲおよびＹは、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基である。ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜３の自然数である。ｘ＝１の時、Ｒは２個存在するが、これらは異なったものでも良い。
上記一般式（２）において、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基であり、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｍは、１〜１０の自然数である。
【００３１】
本発明のプローブ溶液において、前記プローブは、核酸、タンパク質、糖、細胞、およびこれらの修飾物からなる群から選択される少なくとも１つに由来するプローブであることが好ましい。
【００３２】
本発明のバイオチップは、本発明のバイオチップの製造方法により製造されたバイオチップ、または、本発明のプローブ溶液を用いて製造されたバイオチップであって、前記プローブが固定されている前記基板上の領域に、前記官能基を介して前記基板に吸着した前記分子の単分子膜が形成されているバイオチップであることが好ましい。
【００３３】
また、その他の態様として、本発明のバイオチップは、基板と、前記基板に吸着する官能基と疎水性鎖とを有する分子からなり前記基板上の互いに分離した複数の領域に形成された単分子膜と、前記単分子膜が形成された領域内の基板上に固定されたプローブとを有するバイオチップである。前記疎水性鎖を有する分子の疎水性鎖は、例えば、炭化水素鎖があげられ、これらの中でも、好ましくは、炭化水素鎖の一つ以上の水素原子をハロゲン原子と置換したハロアルキル鎖であり、フルオロアルキル鎖がより好ましい。前記プローブは、例えば、核酸、タンパク質、糖、細胞、およびこれらの修飾物等が使用できる。本発明のバイオチップは、プローブ領域の基板表面が撥水性であり、プローブ領域以外の領域が親水性であることが好ましい。
【００３４】
まず、本発明のバイオチップの製造方法において、基板上に配置された本発明のプローブ溶液の拡がりやにじみが抑制されるメカニズムを図１を用いて説明する。図１は、基板上に滴下されたプローブ溶液の経時的変化の一例を示した模式図であり、図１の各図において、同一部分には同一符号を付している。図１Ａは、プローブ溶液１が、基板２に滴下された直後の様子を示し、図１Ｂは、プローブ溶液１と基板２との接触部分である表面３の表面エネルギーが低下した様子を示し、図１Ｃは、基板２の表面エネルギーが低下した表面３により収縮したプローブ溶液４の様子を示す。
【００３５】
図１Ａに示すように、プローブと疎水性鎖と前記基板に吸着する官能基とを有する分子とが溶解したプローブ溶液１を基板２と接触させると、図１Ｂに示すように、前記溶液１と前記基板２との接触部分の基板表面３に、前記疎水性鎖と前記基板に吸着する官能基とを有する分子が吸着して、前記基板表面３の表面エネルギーが低下する。そのため、図１Ｃに示すように、プローブ溶液４は、基板２の表面上で弾かれて収縮し、この結果、基板２上に滴下されたプローブ溶液４は、基板上で拡がりやにじみをすることなく、前記基板２上の所定の位置に正確に配置されることとなる。
【００３６】
さらに、プローブ溶液の基板上での振る舞いを、図２を用いて、分子レベルで説明する。図２は、本発明の一例としてＤＮＡプローブを使用した場合の、基板上に滴下されたプローブ溶液の分子レベルの経時的変化の一例を示した模式図であり、図２の各図において、同一部分には同一符号を付している。図２Ａは、ＤＮＡプローブ２２および疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子２３を含むプローブ溶液２１が、基板２４に滴下された直後の様子を示し、図２Ｂは、プローブ溶液２１と基板２４との接触部分に、疎水性鎖と前記基板に吸着する官能基とを有する分子２３の単分子膜２５、および、ＤＮＡプローブ２２が基板上に固定されたもの２６が形成される様子を示し、図２Ｃは、表面エネルギーが低下した基板２４上で収縮したプローブ溶液２７の様子を示し、図２Ｄは、プローブ溶液の溶媒が蒸発した後の基板２４上の単分子膜２５、基板上に固定されたＤＮＡプローブ２６、ならびに、前記単分子膜２５に吸着した疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子２８およびＤＮＡプローブ２９を示し、図２Ｅは、図２Ｄの基板を洗浄した後の基板２４の様子を示す。
【００３７】
図２Ａに示すように、プローブ溶液２１が、基板２４に滴下されると、図２Ｂに示すように、疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子２３は、基板２４に吸着して単分子膜２５を形成し、ＤＮＡプローブ２２も、基板２４に固定されたＤＮＡプローブ２６を形成する。疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子２３は、図２Ｆに示すように、有機分子と化学反応に乏しい疎水性鎖を含む基３０と、基板に吸着する官能基２０とを含み、この官能基２０を介して、前記分子２３は、基板２４に吸着される。ＤＮＡプローブ２２の基板２４への固定の仕方は、使用する基板２４とＤＮＡプローブ２２の種類により、後述するように、化学結合よる場合や、物理吸着による場合があるが、いずれの場合も、ＤＮＡプローブ２２の一端が基板２４に固定され、他端は自由に運動できる状態になっている。前記単分子膜２５により、基板２４の表面エネルギーは低下し、その結果、図２Ｃに示すとおり、プローブ溶液２７は、基板２４に弾かれ収縮することとなる。その後、図２Ｄに示すように、プローブ溶液２７の溶媒が蒸発すると、分子２３およびＤＮＡプローブ２２のプローブ溶液濃度が単分子膜を形成するために必要な濃度よりも大きい場合には、プローブ溶液２７中に残存した分子が、前記単分子膜２５に吸着した分子２８およびＤＮＡプローブ２９として、単分子膜２５に積層される。これらの分子は、図２Ｅに示すように、洗浄することで除去することができる。
【００３８】
基板表面に滴下されたプローブ溶液が、前記基板の表面エネルギーの低下により図１および図２に示したように経時的に収縮する原因は、ｙｏｕｎｇの式を用いて説明できる。図７に示すとおり、一般に、基板７２上の液体７１の形は、液体７１と基板７２との界面エネルギーを示すベクトル７４と、液体７１と基板７２との接触部における液体表面の接線方向７３の液体７１の表面張力を示すベクトル７６とが成す角である接触角７７によって定義することができ、基板７２の表面エネルギーを示すベクトル７５との関係について、下記の関係式（３）が成り立つ。
ｃｏｓθ＝（γS−γLS）／γL                                （３）
上記式（３）において、θは、接触角７７の角度を表し、γSは、基板の表面エネルギ
ーを示すベクトル７５の大きさを表し、γLSは、界面エネルギーを示すベクトル７４の大きさを表し、γLは、液体７１の表面張力を示すベクトル７６の大きさを表す。
【００３９】
ここで、前記界面エネルギーγLSは、前記表面エネルギーγSが減少するとともに減少するが、その減少量は、前記γSの減少量よりも小さい（D.K.Kaelble、J.Adhesion、2巻、1970年、P66-81）。したがって、基板の表面エネルギーγSが減少すると、上記式（３）の右辺が減少し、その結果、接触角θが増大する。すなわち、基板７２上の表面エネルギーの低下に従って、接触角θが増大するから、液体７１は経時的に縮小するのである。
【００４０】
次に、本発明のバイオチップの製造方法について説明する。本発明において、バイオチップは、例えば、プローブ溶液を調製して準備する工程と、基板を準備する工程と、前記プローブ溶液を前記基板に配置する工程と、前記基板上に配置された前記プローブ溶液中のプローブを前記基板に固定する工程とを含む製造方法により製造できる。以下に、本発明のバイオチップの製造方法の一例として、ＤＮＡプローブを用いたＤＮＡチップの製造方法を具体的に説明する。しかしながら、本発明がこれらに限定されないことはいうまでもない。
【００４１】
（プローブ溶液の調製）
本発明のバイオチップの製造方法に使用するプローブ溶液の調製にあたり、まず、前記プローブ溶液に含まれる疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子について説明する。
【００４２】
前記疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子の疎水性鎖としては、特に制限されず、例えば、炭化水素鎖があげられ、これらの中でも、好ましくは、炭化水素鎖の一つ以上の水素原子をハロゲン原子と置換したハロアルキル鎖であり、フルオロアルキル鎖がより好ましい。前記フルオロアルキル鎖は、化学的に安定で、ほとんどの有機分子と化学反応しない。また、フルオロアルキル鎖は、他の有機分子と、イオン結合や水素結合は形成せず、ファンデルワールス力のみで結合し、この結合力は、有機分子の中で最も小さい。このため、フルオロアルキル鎖を有する分子の単分子膜上には、より一層、有機分子が付着しにくく、たとえ付着しても、例えば、水洗等により簡単に除去できる。一方、前記基板に吸着する官能基としては、例えば、ＯＨ，ＮＨ2，ＳＨ，ＳＳ，ＣＯＯＨ，ＳｉＯＨ，Ｓｉ(ＯＲ)（Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。），Ｓｉ[(Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2)m−ＯＲ]（ｍは、１〜１０の自然数であり、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。）があげられ、好ましくは、Ｓｉ(ＯＲ)（Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。），Ｓｉ[(Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2)m−ＯＲ]（ｍは、１〜１０の自然数であり、Ｒはメチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基である。）である。
【００４３】
本発明における疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子としては、下記一般式（１）もしくは（２）で表される化合物、または、これらの加水分解物であることが好ましい。ここでいう加水分解物とは、（１）もしくは（２）で表される化合物で、Ｓｉに結合しているＯＹもしくは(Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2)m−ＯＲの一部または全てがＯＨになった状態をいう。
ＣＦ3（ＣＦ2）nＣ2Ｈ4ＳｉＲ3-x（ＯＹ）x                    （１）
ＣＦ3（ＣＦ2）nＣ2Ｈ4Ｓｉ［（Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）m−ＯＲ］3    （２）
上記一般式（１）において、ＲおよびＹは、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基である。ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜３の自然数である。ｘ＝１の時、Ｒは２個存在するが、これらは異なったものでも良い。
上記一般式（２）において、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基であり、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｍは、１〜１０の自然数である。
【００４４】
上記一般式（１）もしくは（２）で表される化合物もしくはこれらの加水分解物は、活性水素と素早く反応してシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ）を形成するので、基板表面に活性水素がある場合、プローブ溶液と基板とが接触すると、即座にシロキサン結合で固定されたフルオロアルキル鎖を有する分子の単分子膜が形成されて表面エネルギーが低下し、プローブ溶液をよく弾くことができるため、好ましい。
【００４５】
上記一般式（１）において、ｎは、４〜１０であることが好ましい。ｎが、前記範囲の場合、上記一般式（１）で表される分子は、基板上に配向した単分子膜をより形成しやすく、基板の表面エネルギーもより小さくなりやすいからである。また、上記一般式（１）において、ｘは、大きいことが好ましく、より好ましくは、３である。上記一般式（１）で表される分子の基板の活性水素との反応性がより高くなり、基板の表面エネルギーがより低下するからである。また、上記一般式（１）において、Ｙは、メチル基であることが好ましい。上記一般式（１）で表される分子の基板の活性水素との反応性がより高くなり、基板の表面エネルギーがより低下するからである。
【００４６】
上記一般式（２）の(Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2)m−ＯＲ基は、極性基であり、水溶液に溶解しやすいという利点がある。特に、ほとんどのプローブは水溶液であるため、プローブ溶液に溶解させる分子として好ましい。
【００４７】
次に、本発明のバイオチップの製造方法に使用するプローブ溶液に含まれるプローブについて説明する。前記プローブとしては、特に制限されず、核酸、タンパク質、糖、細胞、およびこれらの修飾物からなる群から選択される少なくとも１つに由来するプローブを使用でき、例えば、生物由来のＤＮＡを用いてもよく、合成したポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いてもよい。また、基板への固定を化学結合により行う場合、必要に応じて、前記プローブの一端に官能基を結合させてもよい。基板との固定に用いることができる官能基としては、例えば、ＮＨ2，ＣＯＯＨ，ＯＨ，ＰＯ3Ｈ，および、ＳＨ等があげられ、その結合方法は、特に制限されず、従来公知の方法を適用できる。
【００４８】
本発明のバイオチップの製造方法に用いるプローブ溶液は、例えば、前記疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子および前記プローブを溶解することで調製できる。前記プローブ溶液における前記疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子の濃度としては、例えば、０．０１〜２０ｗｔ％であって、０．０１〜５ｗｔ％が好ましく、より好ましくは０．０１〜１ｗｔ％である。このより好ましい濃度は、プローブ分子を変性させたり凝集させることなく、かつ、プローブ溶液を弾く疎水性鎖を有する単分子膜を基板に形成することのできる値である。
【００４９】
前記プローブ溶液の溶媒としては、例えば、純水、塩類を含む水溶液、純水と極性有機溶媒の混合液、または、純水、極性有機溶媒、塩類の混合液等が使用でき、これらの中でも、前記極性有機溶媒としては、例えば、アルコールを用いることが好ましく、前記アルコールとしては、例えば、エタノールが好ましい。前記プローブ溶液のｐＨは、プローブを変性させない範囲であればよく、一般的には５〜１０が好ましく、より好ましくは６〜８である。
【００５０】
（基板の準備）
次に、バイオチップの基板を準備する。本発明のバイオチップの製造方法に使用する基板としては、特に制限されず、例えば、前記疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子を前記官能基を介して固定するための活性水素を表面に有する基板、ガラス、プラスチック、金属、セラミックス等を用いることができる。また、基板の表面状態は、平滑な場合でも凹凸があってもよく、多孔質であっても良い。さらに、基板は剛性を持っていても良く、剛性を持たず柔軟性のあるものでも良い。基板表面に存在する前記活性水素としては、特に制限されないが、例えば、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＮ等が挙げられる。プローブ密度の高いバイオチップを作製する場合は、平滑で剛性を有するガラスや金属薄膜を形成したガラス基板を用いることが好ましい。
【００５１】
前記基板は、化学結合および物理吸着の少なくとも一方によりプローブを固定できることが好ましく、そのために、例えば、前記基板の表面を、プラズマ処理、紫外線照射、オゾン処理、ＮＨ2，ＣＯＯＨ，ＯＨ，ＳＨを有するシランカップリング剤やメルカプタン化合物による表面修飾、または、これらの組み合わせた処理等を施すことが好ましい。
【００５２】
（プローブ溶液の基板への配置）
次に、前述のように調製したプローブ溶液を、前述のように準備した基板へ配置する。この工程は、例えば、プローブ溶液を滴下することで行うことができるが、インクジェット法を用いた吐出装置により、前記プローブ溶液を前記基板に吐出して行うことが好ましい。付着させるプローブ溶液量の微量化や位置精度に優れるからである。
【００５３】
前記インクジェット式吐出装置は、例えば、インクジェット式プリンタとして、一般的に使用されているものを使用できる。前記インクジェット式プリンタの一例を図３を用いて説明する。図３は、インクジェット式プリンタの全体の概略図である。同図のインクジェット式プリンタ３１は、圧電素子の圧電効果を利用して記録を行うインクジェットヘッド３２を備え、このインクジェットヘッド３２から吐出されたインク滴を、例えば、紙等の記録媒体３３に着弾させて記録を行うものである。インクジェットヘッド３２は、主走査方向Ｘに配置したキャリッジ３５に搭載されており、キャリッジ３５がキャリッジ軸３４に沿って往復運動するのに応じて、インクジェットヘッド３２が主走査方向Ｘに往復運動する。さらに、インクジェット式プリンタ３１は、インクジェットヘッド３２の幅方向（Ｘ方向）と垂直な方向である副走査方向Ｙに、記録媒体３３を相対的に移動させる複数個のローラー（移動手段）３６を備える。インクジェットヘッド３２は、例えば、インクを吐出するノズル孔を備えたノズル板と、前記ノズルからインクを吐出させる駆動部分、および、ノズルにインクを供給する部分から構成される。前記インクジェットヘッドの一例を図４を用いて説明する。図４は、インクジェットヘッドの模式図であり、各図において、同一部分には同一符号を付している。図４Ａは、インクジェットヘッドのノズル孔４６とその近傍の断面図であり、ノズル孔４６は、圧力室４３に通じており、圧力室４３の上部には、振動板４２と圧電素子４１とがこの順で形成されている。圧力室４３にはインクが満たされており、前記インクは、インク流路４５からインク供給孔４４を通って圧力室４３に供給される。圧電素子４１に電圧を印加すると圧電素子４１とともに振動板４２がたわみ、圧力室４３の圧力が上昇しノズル孔４６からインクが吐出する。インクがノズル孔４６から一定の方向に吐出されるように、ノズル孔４６の表面には撥水処理が施されることが好ましい。図４Ｂは、図４Ａの一点鎖線４０を通って紙面に垂直な面で切断した時の立体図である。図４Ｂにおいては、およそ２個のノズル孔４６近傍の構造のみを示すが、このようなノズル構造の数は、特に制限されることはなく、２個以上であってもよい。同図は、左側の圧電素子４７および振動板４２がたわみ、ノズル孔４６からからインク４８が矢印４９方向に吐出される様子を示す。このようなインクジェットヘッドを用い、インクに代えて前記プローブ溶液を使用することで、基板上にプローブ溶液を配置することが可能である。
【００５４】
（プローブの固定）
最後に、基板上に配置したプローブ溶液中のプローブを基板上に固定することで、バイオチップを製造できる。例えば、物理吸着によりプローブを固定する場合、プローブ溶液の溶媒を乾燥させるだけで固定することができる。前記乾燥の方法としては、例えば、室温での常温乾燥、乾燥ガスによるブロー、４０〜８０℃のオーブン中での乾燥等の方法があげられる。また、化学結合によりプローブを結合する場合も、それぞれに応じた処置をすることができる。
【００５５】
具体的には、例えば、プローブ分子に存在するＮＨ2，ＣＯＯＨ，ＯＨ，ＳＯ3Ｈ，またはＳＨのいずれかと、基板表面に存在するＮＨ2，ＣＯＯＨ，ＯＨ，ＳｉＯＨのいずれかとの間で化学反応を起こして共有結合を形成する。プローブに基板と共有結合できる適当な官能基が無い場合は、あらかじめ官能基をプローブに付与しておく。例えば、プローブと基板がともにＮＨ2を有する場合、基板をあらかじめ１〜３ｗｔ％のグルタルアルデヒド水溶液に浸漬、水洗、乾燥し、その後プローブ溶液を基板に滴下すれば、プローブは基板に共有結合により固定される。プローブと基板がともにＣＯＯＨを有する場合は、基板を１〜５ｗｔ％の１-(３-ジメチルアミノプロピル)-３-エチルカルボジイミドが溶解した水溶液に浸漬、水洗、乾燥後、プローブ溶液を基板滴下すれば、プローブは基板に共有結合によって固定される。また、基板が金、銅、銀、等のように、ＳＨやＳＳ基を有する分子と結合する性質を有するものであれば、プローブ分子にあらかじめＳＨ基やＳＳ基を付与しておけばよい。
【００５６】
以上のようにして本発明のバイオチップの製造方法で製造されたバイオチップは、プローブが固定される領域に、例えば、図２Ｃ〜Ｅ等に示すように、疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子から形成された単分子膜２５が存在するので、前記領域に有機汚染物が付着しにくく、また、汚染物が付着しても簡単に除去できるので、従来のバイオチップに比べて汚染されにくい。
【００５７】
また、前述したように、疎水性鎖と基板に吸着する官能基とを有する分子やプローブのプローブ溶液含有量が、単分子膜の形成やプローブの固定に必要な量よりも大きい場合、前記分子やプローブが、基板上の単分子膜に積層されることとなる（例えば、図２Ｄ参照）。単分子膜に積層した前記分子は、基板上に固定されたプローブを覆い隠し、バイオチップの検出感度を低下させる原因となることがある。このような場合には、プローブを固定した後、基板を液体で洗浄することが好ましい。
【００５８】
前記洗浄をすることで、前記単分子膜に吸着していた前記疎分子およびプローブを除去できる（例えば、図２Ｅ参照）。なお、前記洗浄の後でも、本発明の製造方法により製造されたバイオチップのプローブ領域には記疎水性鎖と前記基板に吸着する官能基とを有する分子の単分子膜が形成されているので、汚染されにくいという優れた効果は失われない。
【００５９】
前記洗浄に用いる液体は、バイオチップを変性しない液体ならばどのような液体でも良く、例えば、純水、緩衝溶液等が用いられる。特に、アルコールを少量含む水溶液は、フルオロアルキル鎖を有する分子等の疎水性鎖と前記基板に吸着する官能基とを有する分子を溶解しやすく好ましい。前記洗浄用液体として、水とアルコールとの混合溶液を使用する場合、アルコールの濃度としては例えば、１〜８０ｗｔ％であって、１０〜７０ｗｔ％が好ましく、より好ましくは、３０〜５０ｗｔ％である。
【００６０】
次に、本発明のプローブ溶液について説明する。本発明のプローブ溶液は、バイオチップのプローブ溶液であって、疎水性鎖と極性基とを有する分子、および、プローブを含むプローブ溶液である。本発明のプローブ溶液は、前述した本発明のバイオチップの製造方法に使用できる。
【００６１】
本発明のプローブ溶液において、疎水性鎖と極性基とを有する分子における極性基としては、特に制限されないが、例えば、バイオチップの製造に用いる場合には、バイオチップの基板に吸着できる官能基であることが好ましい。本発明のプローブ溶液における、前記疎水性鎖と極性基とを有する分子、および、プローブの態様については、前述の通りである。
【００６２】
次に、本発明のバイオチップについて説明する。本発明のバイオチップは、基板と、前記基板に吸着する官能基と疎水性鎖とを有する分子からなり前記基板上の互いに分離した複数の領域に形成された単分子膜と、前記単分子膜が形成された領域内の基板上に固定されたプローブとを有するバイオチップである。前記疎水性鎖を有する分子の疎水性鎖は、例えば、炭化水素鎖があげられ、これらの中でも、好ましくは、炭化水素鎖の一つ以上の水素原子をハロゲン原子と置換したハロアルキル鎖であり、フルオロアルキル鎖がより好ましい。前記プローブは、例えば、核酸、タンパク質、糖、細胞、およびこれらの修飾物等が使用できる。本発明のバイオチップは、プローブ領域の基板表面が撥水性であり、プローブ領域以外の基板表面が親水性であることが好ましい。本発明のバイオチップは、前述した本発明のバイオチップの製造方法、および／または、本発明のプローブ溶液を用いて製造できる。
【００６３】
本発明のバイオチップは、本発明の製造方法を用いれば、簡単に、プローブ領域が高密度に配置されたバイオチップとすることができ、また、安価なバイオチップとすることができる。さらに、本発明のバイオチップは、汚染されにくく、試料溶液と再現性良く効率的に反応する。したがって、本発明のバイオチップによれば、例えば、その保存や取扱い等の使い勝手や、測定感度、測定精度を向上させ、例えば、ＤＮＡチップを用いた遺伝子研究や遺伝子診断をより簡単・手軽なものにできる。本発明のバイオチップは、例えば、個人の遺伝子発現の様子が分かる遺伝子検査に使用でき、個人の遺伝的特性が解明されるものと期待される。その結果、例えば、各個人に適した病気の治療を行うことや、ガンの早期発見および早期治療が可能となる。
【００６４】
以下に、本発明の実施例について説明する。
【実施例１】
【００６５】
基板の準備
大きさ１０ｍｍ×１０ｍｍ、厚み１ｍｍの硼珪酸ガラスを界面活性剤中で超音波洗浄した後、純水で流水洗浄した。その後、窒素ブローで基板上の水分を除去した後、１１０℃のオゾン雰囲気中で紫外線を照射して基板表面に残存する有機汚染物を除去した。
【００６６】
フルオロアルキル鎖を有する分子の調製
フルオロアルキル鎖を有する分子として、特許文献（米国特許第５５５０１８４号明細書）に開示されるものを用いた。具体的には、以下のようにして調製した。
【００６７】
５００ｍｌの丸底フラスコに、２００ｍｌのヘプタンと、２０ｍｌのＣＦ3(ＣＦ2）7Ｃ2Ｈ4ＳｉＣｌ3とを入れて混合した。この操作は、乾燥窒素ガスで満たされたグローブボックス中で行った。この丸底フラスコには、ガスの導入口と導出口とが設置されている。次に、前記丸底フラスコのガス導入口から乾燥窒素ガスを導入してフラスコ内を乾燥雰囲気に保ち、フラスコ内の溶液を攪拌子で攪拌しながら、２０ｍｌのＣＨ3ＯＣ2Ｈ4ＯＣ2Ｈ4ＯＨを少しずつ滴下した。滴下終了後、８０℃のオイルバスでフラスコを保温し還流しながら１２時間攪拌を続けた。その後、真空エバポレータを用いて、フラスコ内のヘプタンを蒸発除去した。この結果、純度がほぼ１００％のＣＦ3(ＣＦ2)7Ｃ2Ｈ4Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ4ＯＣ2Ｈ4ＣＨ3)3を得た。
【００６８】
次に、２.４ｗｔ％の塩化ｎ-ヘキサデシルトリメチルアンモニウム水溶液を攪拌しながら、合成した前記ＣＦ3(ＣＦ2)7Ｃ2Ｈ4Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ4ＯＣ2Ｈ4ＣＨ3)3を溶解して、その濃度を８ｗｔ％とした。約３０分間攪拌をした後、２４時間攪拌せずに放置し、その結果、ＣＦ3(ＣＦ2)7Ｃ2Ｈ4Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ4ＯＣ2Ｈ4ＣＨ3)3、および、その加水分解物が溶解した水溶液を得た（以下、撥水液Ａと呼ぶ）。なお、塩化ｎ-ヘキサデシルトリメチルアンモニウムは、ＣＦ3(ＣＦ2)7Ｃ2Ｈ4Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ4ＯＣ2Ｈ4ＣＨ3)3およびその加水分解物を水に溶解することを促進する役割を果たす。
【００６９】
ＤＮＡプローブ
ＤＮＡプローブは、下記配列（配列番号１）からなる１０塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを用いた（和光純薬製）。
ＡＴＴＣＡＧＡＣＴＧ（配列番号１）
【００７０】
プローブ溶液の調製
２０ｗｔ％の前記ＤＮＡプローブと、０.５ｗｔ％の前記撥水液Ａとが溶解した水溶液を調製し、これをプローブ溶液とした。
【００７１】
ＤＮＡチップの作製
インクジェット装置に前記プローブ溶液を充填し、４ｐｌの液滴（液滴の直径は、およそ２０μｍ）を、一滴ずつ５００μｍ間隔でマトリックス状に基板に吐出して配置した。前記液滴の配置は、前記インクジェット装置を固定し、前記基板を動かしながら、所定の位置に溶液が吐出されるようにコンピュータで制御した。プローブ溶液の吐出後、前記基板を約１時間放置して乾燥させた。なお、前記インクジェット装置は、図４の模式図で示されるインクジェットヘッドを備えるものであり、前記インクジェットヘッドが、５００μｍ間隔で一列１００個のノズル孔を備えるものを使用した。前記ノズル孔は、直径２０μｍとした。前記インクジェットヘッドにおいて、振動板は、厚み３μｍの銅を使用し、圧電素子は、厚み３μｍのチタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）を使用した。前記ＰＺＴは、真空スパッタリング法で形成し、膜の垂直方向に（００１）配向させた。プローブ溶液の吐出は、前記圧電素子に１０ｋＨｚの周波数、振幅２０Ｖの電圧を印加することで行った。
【００７２】
ハイブリダイゼーション反応と評価方法
前記ＤＮＡプローブと相補的な塩基配列からなる一本鎖オリゴヌクレオチドの５'末端にローダミンが結合したもの（これが、ターゲットとなる。）を、１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  リン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７.０）に、最終濃度１μＭとなるように溶解した。この溶液に、ＤＮＡチップを３時間浸漬させ、その後、前記ＤＮＡチップを１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  リン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７.０）で洗浄し、ハイブリダイゼーション反応をしていないターゲットオリゴヌクレオチドを除去した。なお、ＤＮＡチップの溶液への浸漬は、ＤＮＡチップ基板の端をピンセットでつかみ、溶液にゆっくり浸すことにより行った。
【００７３】
なお、前記ハイブリダイゼーション反応は、前述のように作製したＤＮＡチップをそのまま使用する場合と、ＤＮＡチップ作製後に２日間室内で放置し、その後、純水で洗浄するという前処理をしてからハイブリダイゼーション反応を行う場合の２通りの方法を用いた。
【００７４】
ＤＮＡチップ上のターゲットの蛍光量の測定は、画像解析装置（商品名ＡＲＧＵＳ５０：浜松ホトニクス社製）を用いて行った。ハイブリダイゼーション反応後のＤＮＡチップを倒立式の蛍光顕微鏡に設置し、ＤＮＡプローブの配置した領域から発せられる蛍光を顕微鏡のＣＣＤカメラに取り込み、これを前記画像解析装置で評価した。ここで、この蛍光はローダミンによるものであるので、ＤＮＡプローブ配置領域で、前記ＤＮＡプローブと前記ターゲットとが結合していることが確認できた。
【００７５】
作製したＤＮＡチップの評価は、（１）蛍光を発する領域、および、（２）蛍光強度の２項目について、ＤＮＡプローブを配置した基板上の領域２００点を無作為に選択し、これらの点における上記（１）および（２）の値の平均値を求めることにより行った。その結果、上記（１）については、ハイブリダイゼーション前の前処理の有無によらず、蛍光領域は、約４０μｍの真円内に存在し、基板上の各蛍光領域は全て、それぞれ、５００μｍ離れており、空間的に孤立していた。また、上記（２）について、ハイブリダイゼーション前の前処理を行ったＤＮＡチップの蛍光強度は、前記前処理がなかった場合に比べて、８０％であった。これは、２日放置したＤＮＡチップ上に残存する汚れが、ターゲットのハイブリダイゼーション反応を阻害したためであると推測された。
【００７６】
（比較例１）
プローブ溶液に、前記撥水液Ａを使用しない他は、実施例１と同様にしてＤＮＡチップの作製およびその評価を行った。その結果を、実施例１の結果と併せて、下記表１に示す。
【００７７】
【表１】
0004202391.tif 000002
【００７８】
上記表１の示すとおり、比較例１のＤＮＡチップの蛍光領域は、実施例１の蛍光領域に比べて大きく、その形状・大きさは、様々であった。また、比較例１の各蛍光領域のほとんどは、空間的に孤立しておらず重なり合っていた。プローブ溶液は、前述のとおり、それぞれ、５００μｍの間隔で基板上に吐出されたにもかかわらず各蛍光領域の重なりが生じたのは、プローブ溶液が前記基板上で拡がり、各溶液が互いに接触したためであると考えられた。
【００７９】
また、ハイブリダイゼーション前に室内で２日間放置する前処理を行った場合、比較例１のＤＮＡチップの蛍光強度は、前処理を行わなかった場合の１／３倍になった。前記前処理による蛍光強度の減少量は、実施例１のＤＮＡチップのものに比べて、比較例１のＤＮＡチップのものが大きかったことから（上記表１参照）、実施例１のＤＮＡチップは、比較例１のＤＮＡチップに比べて汚れにくいことが示された。
【００８０】
ハイブリダイゼーション前の前処理をしなかった場合における蛍光強度は、実施例１のＤＮＡチップの方が、比較例１のＤＮＡチップよりも小さかった（上記表１参照）。これは、実施例１のＤＮＡプローブ溶液に含まれる撥水液Ａのフルオロアルキル鎖を有する分子の影響で、基板上のＤＮＡプローブ配置領域内におけるＤＮＡプローブ密度が低下するためであると推測される（例えば、図２参照）。しかしながら、実施例１のＤＮＡチップの蛍光強度は、充分なものであった。
【実施例２】
【００８１】
ＤＮＡチップの作製後、ＤＮＡチップ基板を純水とエタノールの混合溶液（体積比８：２）で洗浄した他は、実施例１と同様にしてＤＮＡチップの作製およびその評価を行った。
【００８２】
この結果、実施例２のＤＮＡチップは、実施例１のＤＮＡチップと同様に、基板上でプローブ溶液の拡がりやにじみがなくＤＮＡプローブが固定され、かつ、汚染に対しても強いＤＮＡチップであることが示された。さらに、実施例２のＤＮＡチップの蛍光強度は、ハイブリダイゼーション前の前処理の有無に関わらず、実施例１のＤＮＡチップそれぞれに対して約１０％大きかった。これは、純水とエタノールの混合溶液による洗浄によって、単分子膜上に吸着したフルオロアルキル鎖を有する分子が除去され、ターゲットとＤＮＡプローブがハイブリダイゼーションしやすくなったためであると推測された。
【実施例３】
【００８３】
プローブ溶液として、０.３ｍｌのＣＦ3(ＣＦ2)5Ｃ2Ｈ4Ｓｉ(ＯＣＨ3)3を、１００ｍｌのエタノールと純水の混合溶液（体積比７：３）に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨを５.０に調整した溶液に、前記ＤＮＡプローブを２０ｗｔ％となるように溶解した溶液を用いた他は、実施例１と同様にして、実施例１と同様にしてＤＮＡチップの作製およびその評価を行った。
【００８４】
この結果、実施例３のＤＮＡチップは、実施例１のＤＮＡチップと同様に、基板上でプローブ溶液の拡がりやにじみがなくＤＮＡプローブが固定され、かつ、汚染に対しても強いＤＮＡチップであることが示された。
【実施例４】
【００８５】
プローブ溶液として、０.３ｍｌのＣＦ3(ＣＦ2)5Ｃ2Ｈ4Ｓｉ(ＯＣＨ3)3を、１００ｍｌのエタノールと純水の混合溶液（体積比７：３）に溶かし、ＮａＯＨを用いてｐＨを９.０に調整した溶液に、前記ＤＮＡプローブを２０ｗｔ％となるように溶解した溶液を用いた他は、実施例１と同様にして、実施例１と同様にしてＤＮＡチップの作製およびその評価を行った。
【００８６】
この結果、実施例４のＤＮＡチップは、実施例１のＤＮＡチップと同様に、基板上でプローブ溶液の拡がりやにじみがなくＤＮＡプローブが固定され、かつ、汚染に対しても強いＤＮＡチップであることが示された。
【実施例５】
【００８７】
実施例１と同様の方法でＤＮＡチップを作製し評価した。ただし、本実施例では、ハイブリタイゼーション反応を行うための基板の溶液中への浸漬の仕方を変え、その影響を調べた。すなわち、ディッピング装置を用いて、ＤＮＡチップ基板の面方向が試料溶液の液面に対して垂直になるように基板を液中に所定の速度（０．１ｍｍ／ｓ〜１０ｍｍ／ｓ）で侵入させた。基板が全て溶液に浸漬された後３時間液中で放置しバイオチップ上のＤＮＡプローブと試料溶液中のターゲット分子のハイブリタイゼーション反応を行った。その後、１０ｍｍ／ｓの速度で基板を液中から引き上げ洗浄した。ＤＮＡチップの評価は、実施例１と同様に、（１）蛍光を発する領域、および、（２）蛍光強度の２項目について行った。その結果を、下記比較例２の結果とともに、下記表２に示す。
【００８８】
（比較例２）
また、比較例２として、実施例５のＤＮＡチップに代えて、ＤＮＡプローブが固定された領域以外が撥水性のＤＮＡチップを作製し使用した他は、実施例５と同様に評価した。このＤＮＡチップは、インクジェット法によるＤＮＡプローブ溶液滴下時の滲み防止策とし従来から提案されている方法を利用して作製した。このＤＮＡチップの製造方法を以下に示す。
【００８９】
実施例１と同様の方法で洗浄したソーダガラス基板上に、フォトリソグラフィー法で、直径４０μｍの円形のポジ型レジストパターンを５００μｍ間隔でマトリックス状に配列した。次に、この基板を、ＣＦ3（ＣＦ2）7Ｃ2Ｈ4Ｃｌ3が１ｖｏｌ％溶解したｎ−ヘキサデカンとクロロホルムの混合溶液（体積比で４：１）に１時間浸漬後、クロロホルムで洗浄した。この操作は、乾燥窒素雰囲気のグローブボックス中で行った。この操作によって、レジストの形成されていない基板上にＣＦ3（ＣＦ2）7Ｃ2Ｈ4Ｃｌ3が化学結合して単分子膜が形成される。その後、基板をアセトンで洗浄してレジストを剥離した。この結果、基板上には、間隔５００μｍでマトリックス状に並んだ直径４０μｍの親水性の円形領域と、この円形領域を囲む撥水性領域が形成された。次に、実施例１と同様に、インクジェット法により、親水性領域にＤＮＡプローブ溶液配置した。配置に当たっては、あらかじめ、親水性領域のみに溶液が滴下されるように、基板とインクジェットヘッドの位置を調整し、コンピュータによって、基板とヘッドの相対位置の変化に合わせて溶液を吐出した。その後、基板を約１時間室温で放置して乾燥した。
【００９０】
実施例５及び比較例２の結果を下記表２に示す。
【００９１】
【表２】
0004202391.tif 000003
【００９２】
上記表２に示すとおり、実施例５では、全ての浸漬速度（０．１ｍｍ／ｓ〜１０ｍｍ／ｓ）において、蛍光を発する領域は直径４０μｍの円内に存在し、それぞれが５００μｍ離れて空間的に孤立していた。また、それぞれの円領域から発する蛍光強度は同じ値であった。さらに、平均蛍光強度は浸漬速度によらず一定であった。
【００９３】
比較例２でも、全ての浸漬速度において、蛍光を発する領域は直径４０μｍの円内に存在し、それぞれが５００μ、離れて空間的に孤立していた。これは、プローブを形成する領域以外が撥水性であるため、この領域に滴下したプローブ溶液が撥水性領域に拡がったり滲んだりすることが無いためだと推測できる。浸漬速度が０．５ｍｍ／ｓ以下の場合は、それぞれの円領域から発生する蛍光強度は同じ値であった。また、浸漬速度によらず平均蛍光強度は一定であった。平均蛍光強度は実施例５に比べて大きかった。これは、比較例２では、円内領域にはフルオロアルキル鎖を有する分子が無いためプローブの密度が実施例５の場合に比べて大きく、ハイブリタイゼーションしたターゲット分子の量が大きくなったためだと考えられる。一方、浸漬速度が２ｍｍ／ｓ以上になると、それぞれの円内領域から発生する蛍光強度の値は基板の場所によって異なった。そして、浸漬速度が増加するに従い、蛍光強度の平均値は減少する傾向にあった。このことは、浸漬速度の増加に従い、ＤＮＡチップ上でハイブリタイゼーションするターゲット分子の量が少なくなったことを意味する。
【実施例６】
【００９４】
基板の試料溶液への浸漬速度が増加しても、実施例５のＤＮＡチップでは、ハイブリタイゼーションする分子の量が変化しなかったが、比較例２のＤＮＡチップでは、ハイブリタイゼーションする分子の量が減少した。その原因を調べるために、実施例５及び比較例２のＤＮＡチップについて、溶液に浸漬された基板の表面状態を目視で観察した。
【００９５】
実施例５のＤＮＡチップの場合、どの浸漬速度においても、溶液への浸漬前と浸漬されている状態の基板表面の間には変化は観察されなかった。比較例２で浸漬速度が０．５ｍｍ／ｓ以下の場合も変化は観測されなかった。一方、比較例２で浸漬速度が２ｍｍ／ｓ以上の場合、溶液に浸漬した基板表面には多数の気泡が吸着していることが観察された。そして、この気泡の数と大きさは、浸漬速度が増大するにつれて増大した。これらの結果から以下のことが推測できる。すなわち、比較例２では、浸漬速度が早い場合、基板に付着した気泡の一部がＤＮＡプローブを覆い、そこではプローブとターゲット分子のハイブリタイゼーションが起こりにくくなる。浸漬速度が大きくなるにつれて付着する気泡の数と大きさが増大するため、気泡で覆われるプローブ領域も増大し、ハイブリタイゼーションできなくなるプローブの領域が増大する。このため、上記表２で示したように、比較例２では、浸漬速度が増大するに従い、平均蛍光強度は減少したものと推測できる。また、気泡はまばらに基板に不均一に付着するので、ハイブリタイゼーション反応が行われる箇所と行われない箇所が不均一にでき、蛍光強度が場所によって異なったものと推測できる。
【００９６】
このように、実施例５では浸漬速度が大きくてもＤＮＡチップ基板表面に気泡が付着しないのに対し、比較例２では浸漬速度が大きい場合には気泡が付着するのは、両者において基板全体に占める撥水領域の面積の割合が異なることに原因があるものと推測できる。ＤＮＡチップ基板上で、プローブが固定されている領域占める面積はそれ以外の面積に比べて少ない。従って実施例５ではＤＮＡチップ基板の大部分が親水性であるのに対し、比較例２では大部分が撥水性である。従って、基板を試料溶液に浸漬するときには、比較例２の方が実施例５よりも気泡が付着しやすくなったものと推測できる。
【００９７】
以上、本実施例のバイオチップは、ＤＮＡプローブが形成されていない領域が親水性なので、基板を試料溶液へ入れる際に基板表面に気泡がつきにくく、再現性良くターゲット分子とハイブリタイゼーション反応が起こり、再現性良くターゲット分子を検出することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
以上に説明したとおり、本発明の製造方法によれば、基板上でプローブ溶液の拡がりやにじみを抑制してＤＮＡプローブを固定して、プローブ領域が高密度に配置されたバイオチップを簡便に製造できるから、例えば、安価なバイオチップの製造が可能となる。さらに、本発明の製造方法で製造されたバイオチップは、汚染されにくく、試料溶液と再現性良く効率的に反応するので、その保存や取扱い等の使い勝手が良く、測定感度や精度が高い。すなわち、本発明によれば、例えば、バイオチップのより一層の普及が可能となる。このように、本発明は、例えば、バイオチップを用いた遺伝子研究、遺伝子診断、遺伝子治療、基礎医学、臨床医学など、幅広い分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、基板上に滴下されたプローブ溶液の経時的変化の一例の模式図である。
【図２】図２Ａ〜Ｆは、基板上に滴下されたプローブ溶液の分子レベルの経時的変化の一例の模式図である。
【図３】図３は、インクジェット式プリンターの一例を示す模式図である。
【図４】図４Ａ及びＢは、インクジェットヘッドの一例を示す模式図である。
【図５】図５Ａ〜Ｆは、基板上に吐出された溶液の拡がりの様子を示す模式図である。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、基板上に吐出された溶液の拡がりの様子を示す平面模式図である。
【図７】図７は、基板上に滴下された溶液の接触角θとＹｏｕｎｇの関係式を説明するための模式図である。
【符号の説明】
【０１００】
１    プローブ溶液
２    基板
３    表面エネルギーの低下した基板
４    基板表面で弾かれ収縮するプローブ溶液
２０  基板と吸着する官能基
２１  プローブ溶液
２２  ＤＮＡプローブ
２３  フルオロアルキル鎖を有する分子
２４  基板
２５  基板上に形成されたフルオロアルキル鎖を有する分子の単分子膜
２６  基板上に固定されたＤＮＡプローブ
２７  基板の表面エネルギー低下に伴い収縮するプローブ溶液
２８  単分子膜上に吸着したフルオロアルキル鎖を有する分子
２９  単分子膜上に吸着したＤＮＡプローブ
３０  フルオロアルキル鎖を有する基
３１  インクジェットプリンタ全体像
３２  インクジェットヘッド
３３  記録媒体
３４  キャリッジ軸
３５  キャリッジ
３６  ローラ
４０  一点鎖線
４１  圧電素子
４２  振動板
４３  圧力室
４４  インク供給孔
４５  インク流路
４６  ノズル孔
４７  電圧印加により変形した圧電素子
４８  吐出したインク
４９  インクの飛翔方向
５１  インクジェット法で吐出したＤＮＡプローブ溶液
５２  吐出方向を示すベクトル
５３  基板
５４  基板に接触した直後のＤＮＡプローブ溶液
５５  拡がらないＤＮＡプローブ溶液
５６  基板に接触した直後のＤＮＡプローブ溶液
５７  拡がった後のＤＮＡプローブ溶液
６１  ＤＮＡチップ用基板
６２  ＤＮＡプローブ固定箇所（波線円内）
６３  理想的に配置されたＤＮＡプローブ溶液
６４  基板上で拡がり、隣同士が接触したＤＮＡプローブ溶液
７１  液体
７２  基板
７３  液体と基板との接触部における液体表面の接線
７４  基板と液体との界面エネルギーを示すベクトル
７５  基板の表面エネルギーを示すベクトル
７６  液体の表面張力を示すベクトル
７７  接触角
【配列表フリーテキスト】
【０１０１】
配列番号１  ＤＮＡチップ用ＤＮＡプローブ
【図１】
0004202391.tif 000004
【図２】
0004202391.tif 000005
【図３】
0004202391.tif 000006
【図４】
0004202391.tif 000007
【図５】
0004202391.tif 000008
【図６】
0004202391.tif 000009
【図７】
0004202391.tif 000010
【配列表】
0004202391000001.app