(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
0004120713.tif 000004
［式中Ｒはフェニル環上に低級アルコキシ基を有することのあるベンゾイル基を示す。カルボスチリル骨格の３位と４位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
で表わされるカルボスチリル誘導体及び／又はその塩を有効成分とする多発性硬化症治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、医薬上有用な下記一般式（１）で表わされるカルボスチリル誘導体及び／又はその塩を有効成分とする多発性硬化症治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多発性硬化症は、原因不明の中枢神経系の脱髄疾患で、主に若年成人を侵し、脳、脊髄、視神経などの中枢神経組織に多巣性に脱髄病変が多相性に生じるため、多彩な神経症状が再発と寛解を繰り返して起こる、即ち時間的・空間的多発性を特徴とする進行性神経難病疾患である。
臨床症状としては、中枢神経のどこの障害でも来し得るが、視神経と脊髄障害に基づく視力障害、運動麻痺、歩行障害、しびれ感、異常感覚、感覚麻痺、眼痛等が見られる。その他、脳幹部の障害では複視、小脳病変では失調を来すことがある。好発年齢は、２０−４０歳である。該多発性硬化症の病因は、現在まで不明であり、自己免疫説とウイルス説があるが、いずれの説も確定的になるまでに至っていない。
【０００３】
該多発性硬化症の診断は、上記のようには病因が不明であり、また特異的な検査異常がないため、主に臨床的特徴に頼っているのが現状である。現在よく用いられている診断基準としては、厚生省特定疾患「多発性硬化症」調査研究班による多発性硬化症（ＭＳ）診断基準と、ポーザ（Poser, C. M.,(1983)）らのＭＳ診断基準が知られている。また、最近ではＭＲＩによる診断が有用とされ、本症の所見としては、Ｔ2強調画像で楕円形で辺縁が比較的明瞭な高信号域の病変(プラーク)が大脳白質や脳幹に見られるというものである。。
【０００４】
多発性硬化症の治療は、病因に対する治療法と多彩な中枢神経症状に対する対症療法に分けられる。前者は病因が現在のところ不明であるため、その治療には免疫抑制薬や抗炎症薬などが使用されているが、効果の判定が困難な状況である。急性期には、副腎皮質ステロイド剤が使用され、より症状が急性で重篤な場合には、ステロイド剤のパルス療法が施行されている。慢性期の治療には、神経障害の対症療法とリハビリテーションが主体となっている。
【０００５】
最近、再発の予防療法・難治例に対する治療法として、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）による治療が、多発性硬化症の再発回数を減少させると報告され、米国において該ＩＦＮ−βが治療に供された例もあるが、依然として多発性硬化症に対する治療法は確立されたわけではなく、該多発性硬化症の再発予防及び各種臨床症状に対する治療効果を有する薬剤の開発が斯界で望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は斯界で望まれている多発性硬化症の再発予防及び各種臨床症状に対する治療効果を有する薬剤を開発することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的により鋭意研究を重ねた結果、以前に強心剤有効成分として開発した下記一般式（１）で表わされるカルボスチリル誘導体及び／又はその塩が、多発性硬化症治療剤として有効であるという事実を見出し、ここに本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は下記一般式(1)で表わされるカルボスチリル誘導体及び／又はその塩を有効成分とする多発性硬化症治療剤、殊に上記カルボスチリル誘導体が６−[４−(３，４−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３，４−ジヒドロカルボスチリルである上記多発性硬化症治療剤を提供するものである。
【０００９】
【化２】
0004120713.tif 000002
【００１０】
［式中Ｒはフェニル環上に低級アルコキシ基を有することのあるベンゾイル基を示す。カルボスチリル骨格の３位と４位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明において有効成分として用いられるカルボスチリル誘導体は、例えば特公平１−４３７４７号公報及び米国特許番号ＵＳ４，４１５，５７２号公報に記載される通り、強心剤として有用であることが既に公知である。該カルボスチリル誘導体及び／又はその塩の中の一つは、また、うっ血性心不全の患者において、血行力学的指標と運動耐用量の改善が証明されている〔Inoue et al., Heart Vessels, 2, 166-171(1986); Sasayma et al., Heart Vessels, 2, 23-28(1986); Feldman et al., Am. Heart J., 116, 771-777(1988)〕。上記カルボスチリル誘導体の変力作用に関連したメカニズムは、カリウム電流の低下〔Iijima et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 240, 657-662(1987)〕、フォスフォジエステラーゼの軽度の抑制とカルシウム電流の内向きの流れの上昇〔Yatani et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 13, 812-819(1989); Taira et al., Arzneimittelforshung, 34, 347-355(1984)〕を含んでいる。
【００１２】
上記カルボスチリル誘導体は、更にリポポリサッカライド（LPS）刺激した末梢血単核球の細胞（PBMC）によるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２やＩＦＮ−γを含む種々のサイトカインの産生を抑制することが報告されている〔Busch, F. et al., Eur. J. Clin. Pharmacol., 42, 629-634(1992); Maruyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commu., 195, 1264-1271(1993); Shioi, T. et al., Life Sciences, 54(1), PL11-16(1994); Matsumori, A. et al., Circulation, 89(3), 955-958(1994)〕。
【００１３】
更に上記カルボスチリル誘導体は、ウイルス誘導された心筋傷害の改善と該心筋傷害の改善時におけるナチュラル・キラー細胞(NK Cell)の抑制作用を有することも報告されている〔Matsui S., et al., J. Clin. Invest., 94, 1212-1217(1994)〕。上記作用に加えて、該カルボスチリル誘導体は、アポトーシス調整作用を有することも報告され、該作用に基づく、癌の治療及び癌転移の抑制、自己免疫疾患、ウイルス疾患等への有用性も報告されている〔ヨーロッパ特許公開EP0552373; Nakai et al., Jpn. J. Cancer Res., abstruct, and Proc. Jpn. Cancer Assoc., 581(1993); Maruyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 195, 1264-1271(1993)〕。
【００１４】
しかして、上記一般式（１）で表わされるカルボスチリル誘導体及び／又はその塩が、前記したように多発性硬化症の臨床症状の抑制作用を有する報告は、未だない。
【００１５】
本発明の多発性硬化症治療剤において、殊に好ましい上記カルボスチリル誘導体としては、６−［４−（３，４−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３，４−ジヒドロカルボスチリルを例示できる。
【００１６】
本発明薬剤の有効成分とするカルボスチリル誘導体を表わす上記一般式（１）において示される各基としては、より具体的にはそれぞれ次の各基を例示できる。
【００１７】
即ち、低級アルコキシ基としては、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、tert−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ基等の炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状アルコキシ基を例示することができる。
【００１８】
フェニル環上に置換基として低級アルコキシ基を有することのあるベンゾイル基としては、例えばベンゾイル、２−メトキシベンゾイル、３−メトキシベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、２−エトキシベンゾイル、３−エトキシベンゾイル、４−エトキシベンゾイル、３−イソプロポキシベンゾイル、４−ブトキシベンゾイル、２−ペンチルオキシベンゾイル、３−ヘキシルオキシベンゾイル、３，４−ジメトキシベンゾイル、２，５−ジメトキシベンゾイル、３，４，５−トリメトキシベンゾイル基等の、フェニル環上に置換基として炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状アルコキシ基の１〜３個を有することのあるベンゾイル基を例示することができる。
【００１９】
また上記一般式（１）で表されるカルボスチリル誘導体の塩には、薬理学的に許容される酸付加塩が包含される。該塩を形成する酸性化合物としては、具体的には例えば硫酸、リン酸、硝酸、塩酸、臭化水素酸等の無機酸、蓚酸、マレイン酸、フマール酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸等の有機酸を例示することができる。
【００２０】
本発明薬剤の有効成分である一般式（１）で表わされるカルボスチリル誘導体及び／又はその塩は、通常、一般的な医薬製剤の形態で用いられる。かかる製剤は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、潤沢剤等の希釈剤乃至賦形剤を用いて調製される。この医薬製剤としては各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）、点眼剤等を例示できる。
【００２１】
錠剤の形態に形成するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を例示できる。更に錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることもできる。
【００２２】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナランカンテン等の崩壊剤等を使用できる。
【００２３】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を使用できる。
【００２４】
注射剤として調製される場合には、液剤、乳剤、懸濁剤などは殺菌され且つ血液と等張であるのが好ましく、これらの液剤、乳剤、懸濁剤などの形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているものを全て使用できる。その例としては例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。尚、この場合等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を医薬製剤中に含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。更に必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を医薬製剤中に含有させてもよい。
【００２５】
本発明薬剤中に有効成分として含まれる一般式（１）の化合物の量は、特に限定されず広範囲より適宜選択されるが、通常全組成物中約１〜７０重量％、好ましくは約１〜３０重量％程度の範囲とするのが適当である。
【００２６】
かくして得られる本発明多発性硬化症治療剤の投与方法は特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾患の程度に応じて決定される。例えば、注射剤形態の医薬製剤は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与などにより投与され得る、これは必要に応じてブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与することもできる。錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤などの固剤形態や経口投与用液剤形態の本発明医薬製剤は、経口投与又は経腸投与され得る。坐剤は直腸内投与できる。また点眼剤は目に適用できる。
【００２７】
本発明薬剤の投与量は、広範囲から適宜選択でき、特に限定されるものではないが、通常の臨床利用に際しては、一般式（１）のカルボスチリル誘導体（及びその塩）が、１日当り体重１ｋｇ当り約０．５〜３０ｍｇ程度となる量の範囲から選択されるのがよく、前記投与単位形態中には有効成分が約１〜１０００ｍｇ含有されるのが適当である。また本発明薬剤の投与は、１日１回又は１日３〜４回に分けることもできる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の多発性硬化症治療剤は、多発性硬化症の各種臨床症状の改善や、多発性硬化症の再発予防及び治療に有効である。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため製剤例及び薬理試験例を挙げる。
【００３０】
【製剤例１】
0004120713.tif 000003
１錠中、上記組成物の錠剤を製造した。
【００３１】
【製剤例２】
６−〔４−（３，４−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル〕−３，４−ジヒドロカルボスチリル                                        １５０ｇ
アビセル（商標名、旭化成株式会社製）                            ４０ｇ
コーンスターチ                                                  ３０ｇ
ステアリン酸マグネシウム                                          ２ｇ
ヒドロキシプロピルメチルセルロース                              １０ｇ
ポリエチレングリコール−６０００                                  ３ｇ
ヒマシ油                                                        ４０ｇ
メタノール                                                      ４０ｇ
上記有効成分化合物、アビセル、コーンスターチ及びステアリン酸マグネシウムを混合研磨後、糖衣Ｒ１０ｍｍのキネで打錠する。得られた錠剤をヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール−６０００、ヒマシ油及びメタノールからなるフィルムコーティング剤で被覆を行ない、フィルムコーティング錠を製造した。
【００３２】
【製剤例３】
６−〔４−（３，４−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル〕−３，４−ジヒドロカルボスチリル                                    １５０．０ｇ
クエン酸                                                      １．０ｇ
ラクトース                                                  ３３．５ｇ
リン酸二カルシウム                                          ７０．０ｇ
プルロニックＦ−６８                                        ３０．０ｇ
ラウリル硫酸ナトリウム                                      １５．０ｇ
ポリビニルピロリドン                                        １５．０ｇ
ポリエチレングリコール（カルボワックス１５００）              ４．５ｇ
ポリエチレングリコール（カルボワックス６０００）            ４５．０ｇ
コーンスターチ                                              ３０．０ｇ
乾燥ラウリル硫酸ナトリウム                                    ３．０ｇ
乾燥スタアリン酸マグネシウム                                  ３．０ｇ
エタノール                                                    適  量
上記有効成分化合物、クエン酸、ラクトース、リン酸二カルシウム、プルロニックＦ−６８及びラウリル硫酸ナトリウムを混合した。
【００３３】
上記混合物をＮｏ．６０スクリーンにて篩別し、ポリビニルピロリドン、カルボワックス１５００及びカルボワックス６０００を含むアルコール性溶液で湿式粒状化した。必要に応じてアルコールを添加し、粉末をペースト状塊にした。コーンスターチを添加し、均一な粒子が形成されるまで混合を続けた。Ｎｏ．１０スクリーンを通過させ、トレイに入れ、１００℃のオーブンで１２〜１４時間乾燥し、乾燥粒子をＮｏ．１６スクリーンで篩別し乾燥ラウリル硫酸ナトリウム及び乾燥ステアリン酸マグネシウムを加え、混合し、打錠機で所望の形状に圧縮成形した。
【００３４】
上記芯部をワニスで処理し、タルクを散布して湿気の吸収を防止した。芯部の周囲に下塗り層を被覆した。内服用のために充分な回数のワニス被覆を行なった。錠剤を完全に丸く且つ滑らかにするために、更に下塗り層及び平滑被覆を適用した。所望の色合いが得られるまで着色被覆を行ない、乾燥後、被覆錠剤を磨いて均一な光沢の錠剤を調製した。
【００３５】
【薬理試験例１】
供試化合物として６−［４−（３，４−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３，４−ジヒドロカルボスチリル（以下「化合物１」という）を用いて、以下の通り、多発性硬化症の動物モデルとされている実験的アレルギー性脳脊髄炎（experimental allergic encephalomyelitis;ＥＡＥ：Paterson,P.Y., Fed. Proc., 41, 2569-2576(1982); Paterson, P.Y.,Immunological Diseases, 3rd edn., Little, Brown & Co., Boston, MA. pp.1400-1435(1978); Alvord,E.C.Jr., Progress in Clinical and Biological Research, 148. Alan R. Liss, New York, NY, pp.523-537(1984)）を作製し、臨床スコアに対する供試化合物の抑制効果をコォーら（Koh, C.S.,et al., Cell Immunology, 107, 52-63(1987)）の方法に準じて評価した。
【００３６】
上記ＥＡＥ動物モデルは、動物に中枢神経組織（例えば、モルモット脊髄）とアジュバントで感作することによりＥＡＥを引き起こすことができる。まず、免疫後９−１０日目に尾及び下肢の麻痺などを伴った症状が発現し、その後、モルモット脊髄（Guinea-Pig Spinal Cord; GPSC）ホモジネートと高用量の結核死菌（Mycobacterium Tuberculosis; MT）を含むアジュバントを用いた場合は、免疫後約４０日間にわたり２−３回の発症、回復を繰り返す慢性進行型の多発性硬化症に対するモデルとなるとされている（Chabannes, D., et al., J. Autoimmunity, 5, 199-211(1992)）。
【００３７】
（１）動物及び実験材料の調製
１）コントロールとして０．５％−ＣＭＣ溶液（カルボキシ・メチル・セルロース溶液）を用いた。該溶液の調製は、ＣＭＣ（セロゲンＦ−ＳＢ(ロット番号１５４４５５)、第一工業製薬社製）を電子天秤（ＥＲ−１８２Ａ；ザルトリウス社製）で５．０ｇ秤量後、メスシリンダーに移し、注射用蒸留水（大塚製薬工場社製）にて４℃で一昼夜撹袢溶解し、最終濃度０．５％になるように調製した後、オートクレーブで滅菌後、使用まで４℃にて保存した。
【００３８】
２）化合物１（ロット番号５Ｄ９６Ｍ）の原末を秤量後、メノウ鉢に移し、少量の０．５％ＣＭＣ溶液で均一に懸濁した後、目的とする濃度になるよう０．５％ＣＭＣ溶液にて希釈調製し、化合物１の最終濃度が６０ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう調製し、滅菌遠心チューブに分注し、使用まで４℃にて遮光保存した。
【００３９】
３）免疫原として用いるモルモット脊髄（ＧＰＳＣ）ホモジネートは、９−１０週齢（５００−６００ｇ）の雄性ハートレー系モルモット（日本チヤールズリバー社製より購入）２０匹全匹を使用した。モルモットを軽エーテル麻酔下に頚椎脱臼により安楽死させ、脊髄から髄膜と血管を剥離し、氷冷したシャーレに摘出した脊髄を移した。摘出した脊髄１０匹分位の量をまとめて秤量し、ポッター型ホモジナイザー中にＧＰＳＣ１ｇに対して１ｍｌの冷生理食塩水（大塚製薬工場社製）を加え、ホモジネート調製用ローター（池本理科工業社製）を用いて、氷冷下でホモジネートを作製した（ＧＰＳＣ濃度として５００ｍｇ／ｍｌ）。３〜４ｍｌずつＰＰＰチューブに分注し、−２０℃にて凍結保存した。
【００４０】
４）結核死菌（ＭＴ）アジュバントの調製は、市販の結核死菌含有完全アジュバント溶液（ＭＴ，Ｈ３７Ｒａ濃度１ｍｇ／ｍｌ；カタログ番号３１１３−６０−５：ディフコ社製）１０ｍｌ／瓶に、更に結核死菌Ｈ３７Ｒａ(カタログ番号３１１４−３３−８:ディフコ社製)を１５ｍｇ添加し、パラフィルムでシーリング後よく転倒混和した後、均一に懸濁させ、最終ＭＴ濃度２．５ｍｇ／ｍｌに調製した。
【００４１】
５）上記３）及び４）で調製したＧＰＳＣホモジネートと結核死菌含有アジュバント溶液を、三方活栓に接続した２本のガラスシリンジに１：１の割合で移し、均一なエマルジョンが形成されるまで繰り返し混和して調製し、得られたエマルジョン溶液を免疫エマルジョンとして使用した。
【００４２】
６）実験のための動物として、雌性ルイス（Lewis）系ラット（ＳＰＦ：日本チャールズリバー社より購入）の１０週齢を使用した。９週齢で１００匹購入し、１週間飼育馴化後、体重を指標に層別無作為抽出により、各群２０匹／４ケージＸ３群の全６０匹を本試験のために抽出した。
【００４３】
（２）多発性硬化症の動物モデルの作成
雌性ルイス系ラット体重１８０−２００ｇの１０週齢を試験に供した。ラットには水及び普通飼料を経口にて自由摂取させた。
【００４４】
多発性硬化症の動物モデルとしての実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の作成は、次の通り行なった。即ち、上記（１）−５）で調製した免疫エマルジョンを軽エーテル麻酔下のラット両足フットパッドに２３ゲージの注射針と１．０ｍｌのガラスシリンジを用いて０．１ｍｌずつ合計０．２ｍｌ、ＧＰＳＣとして５０ｍｇ＋ＭＴとして２５０μｇ／体、皮内注射した。免疫後、飼育は５匹／ケージで行なった。該ラットは免疫後、１０日前後にてアレルギー性脳脊髄炎症状が発症し、ヒト臨床症状と同じく、症状の再発と寛解が繰り返され、従って多発性硬化症の動物モデルとなる。
【００４５】
（３）本発明化合物１の多発性硬化症治療効果及び再発予防効果の検討
１）  （１）−２）で調製した本発明化合物１の懸濁液をラットへ投与する直前にチューブをよく転倒混和した後、１ｍｌ又は２．５ｍｌのテルモシリンジに取り、ラット用経口ゾンデを用いて、ラットの体重１００ｇ当たり０．５ｍｌを強制経口投与した。尚、投与量は、コンピューターに自動入力した当日の体重によって１匹毎に決定した。コントロール群としての０．５％ＣＭＣ溶媒投与群も同様な方法で投与した。
【００４６】
多発性硬化症の動物モデルに対する実験は、コントロール群(ＣＭＣ溶媒群)、免疫後１−９日目まではＣＭＣ溶媒を投与し、ＥＡＥ発症日の１０日目より化合物１の３００ｍｇ／ｋｇ／日を投与した群（第１の症状発症直後より投与した群）及び免疫後１−１６日目まではＣＭＣ溶媒を投与し、症状が一旦回復後、再び悪化し始める頃の１７日目より化合物１の３００ｍｇ／ｋｇ／日を投与した群（第２の症状発症直前より投与した群）の３群にて、１群それぞれ２０匹を用いて、免疫後３７日まで、１日１回連日経口投与を行なった。
【００４７】
２）  体重、血球測定、胸腺重量、脾臓重量測定及び症状観察(スコア判定)
試験開始日（免疫日）から試験終了日（解剖日）まで、１日１回体重と症状の観察(スコア判定)を行なった。体重は、電子天秤（Sartorius; LC-4200:ザルトリウス社製）にて測定し、接続したパーソナル・コンピュータ（TOSHIBA J3100:東芝製）に自動入力し、同時に個体毎の投与量も決定表示させた。
【００４８】
症状のスコア判定は、コォー（Koh）らの評価基準（Koh, C.-S., et al., Cell Immunology, 107, 52-63 (1987)）に従って、毎日各群のラットの症状を観察し、ラット尾部と両後肢のそれぞれに対してスコア判定し、その合計をスコア記録シートに記載した。スコア判定は、尾部については、無症状を０、途中まで弛緩を０．２５、尾部全体の完全な弛緩を０．５とし、また後肢については、無症状を０、歩行障害を１．０、両後肢の不完全麻痺及び片側後肢の完全麻痺を２．０及び両後肢の完全麻痺を３．０として評価した。尚、試験中の死亡例はスコア判定の統計処理から除外した。
【００４９】
３）  統計処理法
全ての統計学的分析は、ＳＡＳシステム(SAS Institute Japan, Ver.6.11)により行なった。
【００５０】
体重は、コントロール群を対照として、第一アタック以降化合物１投与群、第二アタック以降化合物１投与群について、実測値を用い、繰り返し測定に基づく分散分析(Repeated Mesurements)により経時的な反応の違いを検定し、有意水準を５％及び１％で実施した。
【００５１】
症状観察(症状のスコア判定)
試験期間全体をコントロール群の臨床スコアの推移によって、前半と後半の２つに分割した。即ち、スコアの上で２回のピーク（Chabannes, D., et al., J. Autoimmunity, 5, 199-211 (1992)）の間の一番回復した時点で、前半と後半に分け、全期間、前半、後半の３つの期間で解析を行なった。より具体的には、それぞれの期間における各個体の症状のスコア判定結果を積算し、各群において平均積算臨床スコア(Integrated Clinical Score)を求め（Branisteanu, D.D., et al., J. Neuroimmunology, 61, 151-160 (1995); Martin, D., et al., J. Neuroimmunology, 61, 241-245 (1995)）、一元配置分散分析後、コントロール群を対照として両側ダネット−テスト(Dunnett-test)にて検定し、有意水準を５％及び１％で実施した。尚、スコアは、平均スコアと標準誤差で表わた。
【００５２】
血球測定、胸腺重量及び脾臓重量については、一元配置分散分析後、コントロール群を対照として両側ダネット−テストにて検定し、有意水準を５％及び１％で実施した。
【００５３】
症状のスコア判定結果と体重の推移を図１、図２及び図３にそれぞれ示す。
【００５４】
図１において、縦軸は、平均臨床スコアを、横軸は免疫後の投与期間（日）を示し、（１）はコントロール(ＣＭＣ溶媒のみ)群の結果、（２）は化合物１の３００mg/kg/日を免疫後１７日目より投与開始した群の結果、（３）は化合物１の３００mg/kg/日を免疫後１０日目より投与開始した群の結果を、それぞれ示す。
【００５５】
図２において、縦軸は平均積算臨床スコア（０−３８日までの臨床スコアの積算の平均）を、横軸は（１）：コントロール(ＣＭＣ溶媒のみ)群、（２）：化合物１の３００mg/kg/日を免疫後１７日目より投与開始した群及び（３）：化合物１の３００mg/kg/日を免疫後１０日目より投与開始した群を、それぞれ示す。
【００５６】
図３において、縦軸は毎日の体重の推移を、横軸は（１）：コントロール(ＣＭＣ溶媒のみ)群、（２）化合物１の３００mg/kg/日を免疫後１７日目より投与開始した群及び（３）：化合物１の３００mg/kg/日を免疫後１０日目より投与開始した群を、それぞれ示す。
【００５７】
上記の結果から、次のことが明らかである。即ち、図２から確認されるように化合物１投与群はコントロール群と比較して、いずれも平均積算臨床スコアの有意な低下(P<0.01)、即ち症状の改善効果が観察された。また、体重の推移は、図３に示されるように、図１における症状のスコア判定の推移とよく対応して、化合物１投与群では、コントロール群と比較して、改善傾向が認められた。更に、図１に示されるように、化合物１は、第１の症状発症直後の投与によりその症状を改善し、第２の症状の発症を抑制していることが分かる。また第２の症状発症直前より化合物１を投与した群は、その症状の再発を抑制していることから、臨床において治療困難な再発・回復型及び慢性進行性多発性硬化症の再発予防及び各種臨床症状に対する治療効果が期待できることが判る。
【図面の簡単な説明】
【図１】薬理試験例１に従う試験の結果を示すグラフである。
【図２】薬理試験例１に従う試験の結果を示すグラフである。
【図３】薬理試験例１に従う試験の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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