(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
0004058243.tif 000030
｛式中、Ｒ１はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、低級アルキルチオ基、アシル基、カルボキシル基、メルカプト基、または置換基を有していてもよいアミノ基を示し；Ｒ２は２つの低級アルコキシ基（この低級アルコキシ基は、１〜５個のハロゲン原子で置換されていてもよい）または−Ｏ−Ｚ−Ｏ−基（式中、Ｚは１〜１０個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキレン基を示す）が同一炭素上に置換されている低級アルキル基を示し；Ｒ３はアリール基（このアリール基は、低級アルキル基またはアミノ基（このアミノ基は、さらに低級アルキル基を有していてもよい）を有している）を示し；Ｒ４は−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子あるいはアリール基（このアリール基は、低級アルキル基またはアミノ基（このアミノ基は、さらに低級アルキル基を有していてもよい）を有している）で表される基を示し；Ｘ，Ｙは同一でも異なっていてもよく、−ＣＨ２−または−ＮＨ−を示し、ｎは０を示す｝で表される化合物またはその塩を有効成分とすることを特徴とする軟骨形成促進剤。
【請求項２】
前記Ｒ２が一般式（ＩＩ）
【化２】
0004058243.tif 000031
（式中、Ｒ１０，Ｒ１１は同一でも異なっていてもよく、それぞれ１〜５個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキル基を示す）
または一般式（ＩＩＩ）
【化３】
0004058243.tif 000032
（式中、Ｚは１〜１０個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキレン基を示す）で表される基である請求項１記載の軟骨形成促進剤。
【請求項３】
前記Ｒ１０，Ｒ１１の少なくとも一方が１〜５個のハロゲン原子を有する低級アルキル基である請求項２項記載の軟骨形成促進剤。
【請求項４】
前記Ｒ２が２，２−ジエトキシエチル基、２，２−ジメトキシエチル基、２，２−ジイソプロポキシエチル基、２，２−ビス（２−フルオロエトキシ）エチル基、または２，２−ビス（２−クロロエトキシ）エチル基であり、前記Ｘが−ＮＨ−であり、前記Ｙが−ＣＨ２−である請求項２記載の軟骨形成促進剤。
【請求項５】
前記Ｒ３が４−メチルフェニル基、前記Ｘが−ＮＨ−であり、前記Ｙが−ＣＨ２−である請求項２記載の軟骨形成促進剤。
【請求項６】
前記Ｒ４が−ＮＨＲ７（式中、Ｒ７は４−メチルフェニル基、４−エチルフェニル基、または４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル基であり、前記Ｘが−ＮＨ−であり、前記Ｙが−ＣＨ２−である請求項２記載の軟骨形成促進剤。
【請求項７】
前記Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の組み合わせが、
Ｒ２が２，２−ジエトキシエチル基、Ｒ３が４−メチルフェニル基、Ｒ４が−ＮＨＲ７（Ｒ７は４−メチルフェニル基）；
Ｒ２が２，２−ジエトキシエチル基、Ｒ３が４−メチルフェニル基、Ｒ４が−ＮＨＲ７（Ｒ７は４−エチルフェニル基）；
Ｒ２が２，２−ジエトキシエチル基、Ｒ３が４−メチルフェニル基、Ｒ４が−ＮＨＲ７（Ｒ７は４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル基）；
Ｒ２が２，２−ジメトキシエチル基、Ｒ３が４−メチルフェニル基、Ｒ４が−ＮＨＲ７（Ｒ７は４−メチルフェニル基）；
Ｒ２が２，２−ジイソプロポキシエチル基、Ｒ３が４−メチルフェニル基、Ｒ４が−ＮＨＲ７（Ｒ７は４−メチルフェニル基）；
Ｒ２が２，２−ビス（２−フルオロエトキシ）エチル基、Ｒ３が４−メチルフェニル基、Ｒ４が−ＮＨＲ７（Ｒ７は４−メチルフェニル基）；または
Ｒ２が２，２−ビス（２−クロロエトキシ）エチル基、Ｒ３が４−メチルフェニル基、Ｒ４が−ＮＨＲ７（Ｒ７は４−メチルフェニル基）；
のいずれかである請求項２記載の軟骨形成促進剤。
【請求項８】
請求項１記載の化合物の光学活性体、またはその塩を有効成分とする軟骨形成促進剤。
【請求項９】
請求項１記載の軟骨形成促進剤を有効成分とする軟骨修復剤。
【請求項１０】
請求項１記載の軟骨形成促進剤を有効成分とする骨折修復促進剤。
【請求項１１】
請求項１記載の軟骨形成促進剤を含有する、軟骨の生物学的、物理学的、または化学的研究用の試薬。
【請求項１２】
下記一般式（ＩＶ）
【化４】
0004058243.tif 000033
（式中、Ｒ１２は低級アルコキシ基（この低級アルコキシ基は、１〜５個のハロゲン原子で置換されている）が２つ同一炭素上に置換されている低級アルキル基を示す）で表されるインドリン−２−オン誘導体またはその塩。
【請求項１３】
前記Ｒ１２が一般式（Ｖ）
【化５】
0004058243.tif 000034
（式中Ｒ１３，Ｒ１４は同一でも異なっていてもよく、それぞれ１〜５個のハロゲン原子で置換されている低級アルキル基を示す）で表される基である請求項１２記載のインドリン−２−オン誘導体またはその塩。
【請求項１４】
前記Ｒ１３，Ｒ１４が同一でも異なっていてもよく、それぞれハロゲン原子で置換されているエチル基である請求項１３記載のインドリン−２−オン誘導体またはその塩。
【請求項１５】
前記Ｒ１２が２，２−ビス（２−フルオロエトキシ）エチル基または２，２−ビス（２−クロロエトキシ）エチル基である請求項１３記載のインドリン−２−オン誘導体またはその塩。
【請求項１６】
請求項１記載の軟骨形成促進剤と軟骨細胞とを共存させて培養させることにより、軟骨細胞の増殖した軟骨細胞を得る、ｅｘ  ｖｉｖｏ条件下での軟骨細胞の増殖方法。
【請求項１７】
軟骨細胞の増殖と共に軟骨細胞外基質の合成がされた軟骨細胞を得る請求項１６記載の軟骨細胞の増殖方法。
【請求項１８】
請求項１記載の軟骨形成促進剤と未分化間葉系細胞とを共存させて培養させることにより、前記未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化を促進させて軟骨細胞を得る、ｅｘ  ｖｉｖｏ条件下での軟骨細胞の生産方法。
【請求項１９】
未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化と共に軟骨細胞外基質の合成がされた軟骨細胞を得る請求項１８記載の軟骨細胞の生産方法。
【請求項２０】
未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化を促進させてなる前記軟骨細胞は、軟骨細胞移植に用いるためのものである請求項１８記載の軟骨細胞の生産方法。
【請求項２１】
前記軟骨細胞移植が、自家軟骨細胞移植である請求項２０記載の軟骨細胞の生産方法。
【請求項２２】
請求項１６記載の軟骨細胞の増殖方法により得られた軟骨細胞を含む培養物。
【請求項２３】
請求項１７記載の軟骨細胞の増殖方法により得られた軟骨細胞を含む培養物。
【請求項２４】
請求項１８記載の軟骨細胞の生産方法により得られた軟骨細胞を含む培養物。
【請求項２５】
請求項１９記載の軟骨細胞の生産方法により得られた軟骨細胞を含む培養物。
【請求項２６】
軟骨細胞増殖能を有する請求項１記載の軟骨形成促進剤。
【請求項２７】
細胞外基質合成能を有する請求項１記載の軟骨形成促進剤。
【請求項２８】
未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化促進能を有する請求項１記載の軟骨形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医薬として有用なインドリン−２−オン誘導体またはその塩、およびインドリン−２−オン誘導体またはその製薬学的に許容される塩を含有する軟骨形成促進剤、軟骨修復剤または軟骨研究用試薬に関する。
背景技術
軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）は、生体において、一般に、特殊化した結合組織の一つである軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、繊維細胞、およびこれらを埋め込んだ無定形・ゲル状の礎質からなり、生体の支持組織の一部をなすものである。
軟骨は、ヒトを始めとする温血動物においては、骨格、関節、気管、耳介、鼻などを形成している。すなわち、軟骨は成長時の骨の鋳型（成長軟骨）、円滑な関節の運動（関節軟骨）、呼吸（気管軟骨、鼻軟骨）、聴覚（耳介軟骨）など、温血動物の生存上不可欠な機能において中心的役割を果たしている。したがって、これらの軟骨が変性あるいは破壊された場合、変性あるいは破壊の部位ないし程度に応じて、生体に種々の障害がもたらされることとなる。
例えば、軟骨が関与する上記した機能（成長、関節、呼吸、聴覚等）の中でも、特に、円滑な関節の運動は、慢性関節リウマチや変形性関節症などの疾患において関節軟骨が変性あるいは破壊されることで損なわれる傾向がある。この関節軟骨の変性あるいは破壊は、これらの疾患による歩行困難の重要な原因であると考えられている。
他方、慢性関節リウマチや変形性関節症などの疾患の治療法として、関節の変性・破壊の抑制や、軟骨形成の促進が採用可能であることが指摘されている（Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．２２（１），Ｓｕｐｐｌ．４３：１３６〜１３９，１９９５，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７８（２）：１３３〜１４２）。
軟骨形成を促進、あるいは軟骨細胞を増殖する効果がある物質としては、種々の生体由来物質ないし低分子物質が知られている。従来より、例えば、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β）などの成長因子、ＢＭＰ−２（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．７９−Ａ（１０）：１４５２〜１４６３，１９９７）、レクチンの１種であるコンカナバリンＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１０１２５〜１０１３１，１９９０）、あるいはオステオゲニン（ＢＭＰ−７）、ビタミンＤ誘導体（１α，２５−Ｄ３）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：５４３５〜５４４２，１９８９）、ビタミンＡ誘導体（レチノイン酸）（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１３０：７６７〜７７３，１９８８）、ヴァナデート（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０４：３１１〜３１９，１９８７）、ベンズアミド（Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．，８５：１６３〜１７５，１９８５）、ベンジル  β−Ｄ−キシロサイド（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２２４：９７７〜９８８，１９８４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１１：４６２〜４６８，１９８２）、プロスタグランジン誘導体（ＰＧＥ２，Ｕ４４０６９）（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ，１９：３９１〜４０６，１９８０）、ｄｂｃＡＭＰ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｌ．，１００：６３〜７６，１９７９）、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｌ．，１００：６３〜７６，１９７９）等の低分子物質が、軟骨形成促進効果を有することが報告されている。
上記した生体由来物質ないし低分子物質のうち、最も有用な治療薬となることが期待されたＴＧＦ−βに関して、ＴＧＦ−βのアイソフォームの一つであるＴＧＦ−β１は、これを関節内に投与した際に軟骨形成を促進することが報告されている（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１（２）：２７９〜２９０，１９９４）。また、このＴＧＦ−β１は、実験的に関節炎を生じさせたモデル動物において、関節炎による関節軟骨のプロテオグリカンの消失を抑制する、換言すれば、関節内投与時の関節軟骨への同化的作用により関節軟骨の破壊を抑制するため、リウマチなどの関節疾患の有用な治療薬としての可能性が示唆されている（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７８（２）：１３３〜１４２，１９９８）。
しかしながら、このように最も有用な治療薬となることが期待されたＴＧＦ−βにおいても、該物質は軟骨形成を促進する一方で顕著な滑膜炎を惹起することが報告されており、前述した軟骨疾患の治療薬として大きな問題点を有しているため（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ，７１（２）：２７９〜２９０，１９９４）、該疾患の治療薬として実用化されるに至っていない。すなわち、軟骨形成の促進に基づく実用的な治療薬は、現在のところ存在しない。
発明の開示
本発明の目的は、上記した従来技術の欠点を解消し、軟骨形成を促進あるいは軟骨細胞を増殖させることが可能な軟骨形成促進剤ないし軟骨修復剤を提供することにある。
本発明の他の目的は、軟骨を生物学的、物理学的ならびに化学的に研究する際に有用な、軟骨形成促進作用を有する試薬を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、軟骨形成促進剤等として有用なインドリン−２−オン誘導体を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、骨折修復促進剤として有用なインドリン−２−オン誘導体を提供することにある。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、特定の構造を有するインドリン−２−オン誘導体が、軟骨形成促進作用を有することを見いだし、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の軟骨形成促進剤は、一般式（Ｉ）
0004058243.tif 000002
｛式中、Ｒ１はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、低級アルキルチオ基、アシル基、カルボキシル基、メルカプト基、または置換基を有していてもよいアミノ基を示し；Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよい複素環基を示し；Ｒ３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよい複素環基を示し；Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、−ＯＲ５、−ＳＲ５、または−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、低級アルコキシ基、または置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ６，Ｒ７は一緒になって−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｌＮＲ８（ＣＨ２）ｋ−（式中ｋ，ｌ，ｍはそれぞれ１〜８の整数を示し、Ｒ８は水素原子または低級アルキル基を示す）で表される基を構成してもよい）で表される基を示し；Ｘ，Ｙは同一でも異なっていてもよく、−ＣＨ２−、−ＮＨ−または−Ｏ−を示し、ｎは０〜４の整数を示す。｝で表される化合物、またはその塩を有効成分とするものである。
また、本発明の軟骨修復剤は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を有効成分とするものである。
更にまた、本発明の軟骨の生物学的、物理学的、または化学的研究用の試薬は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含有するものである。
更にまた、本発明のインドリン−２−オン誘導体は、下記一般式（ＩＶ）
0004058243.tif 000003
（式中、Ｒ１２は低級アルコキシ基（この低級アルコキシ基は、１〜５個のハロゲン原子で置換されていてもよい）が２つ同一炭素上に置換されている低級アルキル基を示す）で表されるものである。
更にまた、本発明のインドリン−２−オン誘導体は、前記Ｒ１２が一般式（Ｖ）
0004058243.tif 000004
（式中Ｒ１３，Ｒ１４は同一でも異なっていてもよく、それぞれ１〜５個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキル基を示す）で表されるものである。
発明を実施するための最良の形態
以下、必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明する。以下の記載において量比を表す「部」および「％」は、特に断らない限り重量基準とする。
本発明の軟骨形成促進剤および軟骨修復剤は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を有効成分とするものである。
本発明にかかる一般式（Ｉ）で表される化合物は、国際公開９４／１９３２２号公報に記載されており、同公報にはこの化合物がＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体拮抗薬であることが記載されている。これに対して、本発明者は、一般式（Ｉ）で表される化合物が、意外にも軟骨形成促進作用をも有することを見出し、かかる知見に基づき本発明を完成した。本発明にかかる一般式（Ｉ）で表される化合物は、上記した国際公開公報に記載された方法に加えて、後述する実施例に記載された方法によっても得ることができる。
本発明においてハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。
本発明において低級アルキル基とは、直鎖または分岐鎖状の、炭素数１〜６のアルキル基を示し、たとえばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等があげられる。
低級アルケニル基とは、直鎖または分岐鎖状の炭素数２〜６のアルケニル基を示し、たとえばビニル基、アリル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等があげられる。
低級アルキニル基とは、直鎖または分岐鎖状の炭素数２〜６のアルキニル基を示し、たとえばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等があげられる。
低級アルコキシ基とは、直鎖または分岐鎖状の炭素数１〜６のアルコキシ基を示し、たとえばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペントキシ基、ヘキソキシ基等があげられる。
アシル基とは水素原子や置換基を有していてもよい、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アミノ基等で置換されたカルボニル基を示し、たとえばアセチル基、プロピオニル基、ピバロイル基、シクロヘキサンカルボニル基等のアルキルカルボニル基およびベンゾイル基、ナフトイル基、トルオイル基等のアリールカルボニル基があげられる。
アリール基とは、芳香族炭化水素から水素原子１個を除いた１価の基を示し、たとえばフェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基などがあげられる。
低級アルキレン基とは直鎖または分岐鎖状の、炭素数１〜６のアルキレン基を示し、たとえばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基等があげられる。
シクロアルキル基とは、炭素数３〜８の環状飽和炭化水素基を示し、たとえばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基などがあげられ、置換基を有するシクロアルキル基としてはメンチル基、アダマンチル基などがあげられる。
複素環基とは、１個以上のヘテロ原子を有する芳香族複素環基を示し、たとえばピリジル基、フリル基、チエニル基、イミダゾリル基、ピラジニル基、ピリミジル基などがあげられる。
上記した低級アルキル基、低級アルケニル基、アルキニル基、低級アルコキシ基、アシル基、アリール基、シクロアルキル基、複素環基は、必要に応じて、１以上の種々の置換基により置換されていてもよい。このような置換基の例としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、水酸基、低級アルコキシ基（この低級アルコキシ基は、ハロゲン原子で置換されていてもよい）、アリールオキシ基、低級アルキルチオ基、複素環基、ホルミル基（このホルミル基はアセタールとして保護されていてもよい）、低級アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、アミノ基（このアミノ基は、低級アルキル基等を有していてもよい）、イミノ基、チオアセタール基、ニトロ基、ニトリル基、トリフルオロメチル基などがあげられる。
次に、本発明の軟骨形成促進剤および軟骨修復剤の有効成分である化合物（前記一般式（Ｉ）で表されるインドリン−２−オン誘導体）について、より詳しく説明する。
Ｒ１はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、低級アルキルチオ基、アシル基、カルボキシル基、メルカプト基、または置換基を有していてもよいアミノ基を示し、中でもＲ１はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、またはニトロ基であることが好ましい。
ｎは０〜４の整数を示す。ｎは０または１であることが好ましく、特に０であることが好ましい。
Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよい複素環基を示す。
Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、または置換基を有していてもよいアリール基であることが好ましく、軟骨形成促進剤ないし軟骨修復剤としての活性の点からは、更には置換基（この置換基は、ハロゲン原子で置換されていてもよい）を有していてもよい低級アルキル基であることが好ましい。
中でも、Ｒ２は２つの低級アルコキシ基（この低級アルコキシ基は、１〜５個のハロゲン原子で置換されていてもよい）または−Ｏ−Ｚ−Ｏ−基（式中、Ｚは１〜１０個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキレン基を示す）が同一炭素上に置換されている低級アルキル基であることが好ましく、更には一般式（ＩＩ）
0004058243.tif 000005
（式中、Ｒ１０，Ｒ１１は同一でも異なっていてもよく、それぞれ１〜５個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキル基を示し、少なくとも一方は１〜５個のハロゲン原子を有する低級アルキル基であることが好ましい）、
または一般式（ＩＩＩ）
0004058243.tif 000006
（式中、Ｚは１〜１０個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキレン基を示す）で表される基であることが好ましい。
このようなＲ２としては、より具体的には、２，２−ジエトキシエチル基、２，２−ジメトキシエチル基、２，２−ジイソプロポキシエチル基、２，２−ビス（２−フルオロエトキシ）エチル基、または２，２−ビス（２−クロロエトキシ）エチル基が好ましく、中でも、２，２−ジエトキシエチル基、または２，２−ビス（２−フルオロエトキシ）エチル基がより好ましく、２，２−ジエトキシエチル基が特に好ましい。
Ｒ３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよい複素環基を示す。Ｒ３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、または置換基を有していてもよいアリール基であることが好ましく、中でも置換基を有していてもよいアリール基がより好ましい。このような置換基としては、低級アルキル基（好ましくは、メチル基、エチル基；より好ましくはメチル基）または低級アルキル基を有していてもよいアミノ基が好ましく、前記Ｒ３としては、４−メチルフェニル基が好ましい。
Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、−ＯＲ５、−ＳＲ５、または−ＮＲ６Ｒ７を示す。ここに、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、低級アルコキシ基、または置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ６，Ｒ７は一緒になって−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｌＮＲ８（ＣＨ２）ｋ−（式中ｋ，ｌ，ｍはそれぞれ１〜８の整数を示し、Ｒ８は水素原子または低級アルキル基を示す）で表される基を構成してもよい。
Ｒ４は、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、−ＯＲ５、または−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は前記と同義）で表される基であることが好ましく、更には−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子または置換基を有していてもよいアリール基を示す）で表される基であることがより好ましい。
中でも、Ｒ４が−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、あるいはアリール基（このアリール基は、低級アルキル基またはアミノ基（このアミノ基は、さらに低級アルキル基を有していてもよい）を有している）で表される基であることが好ましく、更には−ＮＨＲ７（式中、Ｒ７は４−メチルフェニル基、４−エチルフェニル基、または４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル基）で表される基であることが特に好ましい。
Ｘ、Ｙは同一でも異なっていてもよく、それぞれ−ＣＨ２−、−ＮＨ−または−Ｏ−を示し、Ｘが−ＣＨ２−、−ＮＨ−または−Ｏ−、Ｙが−ＣＨ２−または−ＮＨ−をそれぞれ示すことが好ましい。中でも、軟骨形成促進剤ないし軟骨修復剤としての活性の点からは、Ｘ，Ｙは同一でも異なっていてもよく、−ＣＨ２−または−ＮＨ−を示すことがより好ましく、Ｘは−ＮＨ−、Ｙが−ＣＨ２−であることが特に好ましい。
また、本発明にかかるインドリン−２−オン誘導体は、製薬学的に許容される塩の形態として使用してもよい。このような塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、りん酸塩等の無機塩類、コハク酸塩、マロン酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、安息香塩、サリチル酸塩等の有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩等の金属塩が挙げられる。
更に、本発明にかかるインドリン−２−オン誘導体は、その光学活性体であってもよい。光学活性体である場合には、その３位の絶対配置がＲ配置であるものが好ましい。
本発明のインドリン−２−オン誘導体の具体的な化合物の例としては、たとえば国際公開９４／１９３２２号公報の実施例に記載されている化合物、ないしは特開平７−４８３４９号公報の実施例に記載されている化合物、すなわち下記（表１）〜（表９）に示す化合物番号１〜２０１の化合物があげられる。
下記の（表１）〜（表９）中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｘ、Ｙおよびｎは、前記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。
0004058243.tif 000007
0004058243.tif 000008
0004058243.tif 000009
0004058243.tif 000010
0004058243.tif 000011
0004058243.tif 000012
0004058243.tif 000013
0004058243.tif 000014
0004058243.tif 000015
また、本発明の軟骨形成促進剤ないし軟骨修復剤のより好適な具体的化合物の例として、下記の各化合物を挙げることができる。
（化合物Ａ）
0004058243.tif 000016
（化合物Ｂ）
0004058243.tif 000017
（化合物Ｃ）
0004058243.tif 000018
（化合物Ｄ）
0004058243.tif 000019
（化合物Ｅ）
0004058243.tif 000020
（化合物Ｆ）
0004058243.tif 000021
（化合物Ｇ）
0004058243.tif 000022
また、化合物Ａの生体内代謝物の例として、下記の化合物ＨおよびＩを挙げることができる。
（化合物Ｈ）
0004058243.tif 000023
（化合物Ｉ）
0004058243.tif 000024
表１〜９に記載の化合物は、特開平７−４８３４９号公報記載の方法により合成することができる。また、上記した化合物Ａ〜Ｇのうち、化合物Ａ〜Ｄは、特開平７−４８３４９号公報記載の方法に従い合成することができる。
また、上記化合物Ｅ、化合物Ｆ、及び化合物Ｇは、特開平７−４８３４９号公報に記載された方法に従い合成した、本願実施例記載のアルデヒド中間体を原料として、例えば、下記の反応経路Ａ（特開平７−４８３４９号公報の「反応経路６」に相当する）に従い合成することができる。
（反応経路Ａ）
0004058243.tif 000025
上記化合物Ｈは特開平７−４８３４９号公報に記載されている「反応経路７」に従い合成することができる。また、上記化合物Ｉはラセミ体もしくは光学活性体として次のような方法により得ることができる。
すなわち、化合物Ｉのラセミ体は、ヒドロキシ基を適当な保護基（例えば、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基等の置換シリル基）で保護したイソシアナートを用い、例えば、下記の反応経路Ｂ（特開平７−４８３４９号公報の「反応経路５」に相当する）に従い合成できる。
また、化合物Ｉの光学活性体はヒドロキシ基を適当な保護基（例えば、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基等の置換シリル基）で保護したイソシアナートを用い、例えば、下記の反応経路Ｂ（特開平７−４８３４９号公報の「反応経路７」に相当する）に従い合成するか、化合物Ｉの立体異性体混合物を当業者に周知の方法（例えば、光学活性カラムを用いる方法）により光学分割して得ることができる。
得られた化合物の同定および構造決定、純度は、通常の方法（ＮＭＲ，ＩＲ等の分光学的方法、および高速液体クロマトグラフィー等）により行うことができる。
（反応経路Ｂ）
0004058243.tif 000026
本発明の軟骨形成促進剤は、該薬剤の軟骨形成促進効果が有効に利用可能な限り、種々の用途に特に制限なく使用可能であるが、特に、軟骨の変性・破壊による軟骨機能不全を伴う軟骨疾患、外傷や手術による軟骨の損傷・切除、先天的な軟骨の低形成や奇形の治療に有用である。このような軟骨疾患の例としては、例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、離断性骨軟骨炎、外傷による関節軟骨の損傷、椎間板ヘルニアなどがあげられる。また先天的な軟骨の低形成や奇形の例としては、例えば、無耳症、小耳症などがあげられる。
本発明の化合物を含有する薬剤は、経口的にまたは非経口的に投与することができるが、投与した部位以外での、必要でない軟骨形成促進を回避する点、もしくは効果の点からは、非経口投与が好ましい。投与に際しては、それぞれの投与方法に適した製剤に調製することができる。
本発明化合物を有効成分とする医薬組成物は、通常の製剤化技術を用いて製剤化することができる。該医薬組成物は、その用途に応じてカプセル剤、顆粒剤、クリーム剤、散剤、シロップ剤、錠剤、注射剤、および軟膏剤等の、固体および液体の種々の製剤として使用することができる。製剤用の担体や賦形剤としては、固体または液体状の物質が挙げられる。これらの例としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、スターチ、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、エチレングリコールなどやその他、常用のものが例示される。
かかる製剤中の本発明化合物の含有量は、その剤型によって異なるが、一般に０．００００１〜８０重量％の濃度で含有していることが望ましい。本発明化合物の医薬組成物は、対象とするヒトをはじめとする温血動物の種類、症状の軽重、医師の診断などに応じて、広範囲に変えることができるが、一般に有効成分として、経口投与の場合は１日あたり０．０１〜２ｇ／ｋｇ、非経口投与の場合は１日あたり０．００００００１〜０．０１ｇ／ｋｇである。また、上記投与量は、１〜７日あたり１回または数回に、まとめて又は分けて投与することができ、症状の軽重、医師の判断により、適宜変更することができる。
以下の実施例に示したように、本発明の薬剤はラットに対して経口的または非経口的に投与した場合、軟骨形成促進作用を有することが確認された。この事実は、本発明の薬剤の関節疾患の治療薬としての有用性を示したものである。
また、経口投与した時に認められた、一般式（Ｉ）で表される化合物による気管軟骨、椎間板、耳介軟骨、胸骨の軟骨形成促進は、一般式（Ｉ）で表される化合物が、これらの軟骨の軟骨の欠損や変性・破壊などを示す疾患における修復剤としても有用な治療薬となることを示したものである。
さらに、未分化な間葉系細胞（ＣＬ−１）または軟骨細胞を、一般式（Ｉ）で表される軟骨形成促進剤で処理することで、軟骨細胞（軟骨細胞を処理した場合はより多くの軟骨細胞）、その細胞外基質または軟骨様組織を得ることができる。これらの本願軟骨形成促進剤を用いて、軟骨細胞の細胞外基質代謝や軟骨細胞への分化の機構（以上が生物学的項目）、細胞外基質の構成成分の分析（化学的項目）、粘弾性などの物性（物理的項目）の解析に用いることができる。
またさらに、本発明の一般式（Ｉ）で表される軟骨形成促進作用を有するインドリン−２−オン誘導体は、場合によっては、その軟骨形成促進作用による石灰化軟骨形成の促進が起こり得るため、その場合、最終的に該化合物の軟骨内骨化を介した骨折治療促進作用を想起することができる。すなわち、該化合物は骨折の修復促進剤としても有用となることが期待できる。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
（実施例）
合成例１
化合物Ａ、ＣおよびＤは、以下の方法により合成した。
化合物Ａ
特開平７−４８３４９号公報の「実施例１７４（２）」に記載されている方法により合成した。該化合物のラセミ体は、同公報の「実施例７１」に記載されている方法により合成した。
化合物Ｃ
特開平７−４８３４９号公報の「実施例１８０」に記載されている方法により合成した。
化合物Ｄ
特開平７−４８３４９号公報の「実施例１００」に記載されている方法により合成した。
合成例２
化合物Ｂ、Ｅ、ＦおよびＧは、以下の方法により合成した。
化合物Ｂ
（３Ｒ）−１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−（４−エチルフェニル）アミノカルボニルメチル−３−（Ｎ’−（４−メチルフェニル）ウレイド）インドリン−２−オン
（＋）−１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−ヒドロキシカルボニルメチル−３−（Ｎ’−（４−メチルフェニル）ウレイド）インドリン−２−オン（特開平７−４８３４９号公報の「実施例１７４（１）」に記載された化合物、１８２ｍｇ）をジクロルメタン（１０ｍＬ）に溶かし、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（９６ｍｇ）、及びパラエチルアニリン（６１ｍｇ）を加えた。得られた混合物を１５〜３０℃で１５時間撹拌した。
得られた反応混合物を１Ｎ−希塩酸と飽和重曹水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥（１５〜３０℃）した後、減圧下で溶媒を除去し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で精製し、１４５ｍｇの標題化合物を白色粉末として得た（収率６５％）。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２７０ＭＨｚ）
δ  ８．４８（ｂｒｓ，１Ｈ），７．３７〜６．８２（ｍ，１４Ｈ），４．７７（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｄｄ，Ｊ＝５．８，１３．７Ｈｚ，１Ｈ），３．８０〜３．４２（ｍ，５Ｈ），３．００（ｄ，Ｊ＝１４．７Ｈｚ，１Ｈ），２．６６（ｄ，Ｊ＝１４．７Ｈｚ，１Ｈ），２．５３（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ），１．２０〜１．０５（ｍ，９Ｈ）．
アルデヒド中間体
（３Ｒ）−１−（ホルミルメチル）−３−（（４−メチルフェニル）アミノカルボニルメチル）−３−（Ｎ’−（４−メチルフェニル）ウレイド）インドリン−２−オン
（＋）−１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−（（４−メチルフェニル）アミノカルボニルメチル）−３−（Ｎ’−（４−メチルフェニル）ウレイド）インドリン−２−オン（特開平７−４８３４９号公報の「実施例１７４（２）」に記載された化合物、６１０ｍｇ）のアセトン（３０ｍＬ）溶液に、水（１０ｍＬ）と濃塩酸（３ｍＬ）を加え、混合物を２時間加熱還流した。反応液を放冷した後減圧下で溶媒を除去し濃縮した。残留物にジクロロメタンを加え、食塩水で２回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥（１５〜３０℃）後、減圧下濃縮し、５２９ｍｇの標題化合物を粗生成物として得た。
ＮＭＲ（  ＣＤＣｌ３、２７０ＭＨｚ  ）
δ  ９．７１（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｓ，１Ｈ），７．３８〜６．９０（ｍ，１１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），４．７６（ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．４０（ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ，１Ｈ），２．９８（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，１Ｈ），２．５５（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ），２．３０（ｓ，３Ｈ），２．２３（ｓ，３Ｈ）．
化合物Ｅ
（３Ｒ）−１−（２，２−ジイソプロポキシエチル）−３−（（４−メチルフェニル）アミノカルボニルメチル）−３−（Ｎ’−（４−メチルフェニル）ウレイド）インドリン−２−オン
上記で得たアルデヒド中間体（６０ｍｇ）をイソプロパノール（１０ｍＬ）に溶解し、パラトルエンスルホン酸（１０ｍｇ）を加え、混合物を４時間加熱還流した。反応液を放冷した後減圧下で溶媒を除去し濃縮した。残留物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥（１５〜３０℃）した後、減圧下濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製して４６ｍｇの標題化合物を得た（収率６２％）。
ＮＭＲ（  ＣＤＣｌ３、２７０ＭＨｚ  ）
δ  ８．３７（ｓ，１Ｈ），７．３９〜６．９０（ｍ，１３Ｈ），６．７９（ｓ，１Ｈ），４．８４（ｄｄ，  Ｊ＝４．９，４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．９４〜３．７３（ｍ，４Ｈ），３．００（ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，１Ｈ），２．５８（ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，１Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），１．１８（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ），１．１１〜１．０４（ｍ，６Ｈ）．
化合物Ｆ
（３Ｒ）−１−（２，２−ビス（２−フルオロエトキシ）エチル）−３−（（４−メチルフェニル）アミノカルボニルメチル）−３−（Ｎ’−（４−メチルフェニル）ウレイド）インドリン−２−オン
上記したアルデヒド中間体（５０ｍｇ）を２−フルオロエタノール（１ｍＬ）に溶解し、カンファースルホン酸（５ｍｇ）を加え、混合物を５時間加熱還流した。反応液を放冷後、トルエンを加えて過剰の２−フルオロエタノールを共沸除去しながら減圧下濃縮した。残留物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥（１５〜３０℃）後、減圧下濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製して２５ｍｇの標題化合物を得た（収率４１％）。
ＮＭＲ（  ＣＤＣｌ３、２７０ＭＨｚ  ）
δ  ７．７９（ｓ，１Ｈ），７．３２〜６．９３（ｍ，１３Ｈ），６．７６（ｓ，１Ｈ），５．０１〜４．９６（ｍ，１Ｈ），４．６２〜４．５３（ｍ，２Ｈ），４．４５〜４．３５（ｍ，２Ｈ），４．１１（ｄｄ，Ｊ＝６．６，１４．３Ｈｚ，１Ｈ），４．００〜３．７２（ｍ，５Ｈ），２．８８（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，１Ｈ），２．４９（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，１Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ），２．２３（ｓ，３Ｈ）．
化合物Ｇ
（３Ｒ）−１−（２，２−ビス（２−クロロエトキシ）エチル）−３−（（４−メチルフェニル）アミノカルボニルメチル）−３−（Ｎ’−（４−メチルフェニル）ウレイド）インドリン−２−オン
上記アルデヒド中間体（５０ｍｇ）を２−クロロエタノール（１ｍＬ）に溶解し、カンファースルホン酸（５ｍｇ）を加え、混合物を９０℃で５時間攪拌した。反応液を放冷後、トルエンを加えて過剰の２−クロロエタノールを共沸除去しながら減圧下濃縮した。残留物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥（１５〜３０℃）後、減圧下濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製して１５ｍｇの標題化合物を得た（収率２３％）。
ＮＭＲ（  ＣＤＣｌ３、２７０ＭＨｚ  ）
δ  ７．８８（ｓ，１Ｈ），７．３２〜６．９３（ｍ，１３Ｈ），６．７９（ｓ，１Ｈ），４．９６〜４．９１（ｍ，１Ｈ），３．９７〜３．４６（ｍ，１０Ｈ），２．９８（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，１Ｈ），２．４９（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，１Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ），２．２３（ｓ，３Ｈ）．
合成例３
化合物Ｈ、化合物Ｉのラセミ体および化合物Ｉの光学活性体は、以下の方法により合成した。
化合物Ｈ
（３Ｒ）−１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−（４−ヒドロキシメチルフェニル）アミノカルボニルメチル−３−（Ｎ’−（４−メチルフェニル）ウレイド）インドリン−２−オン
（＋）−１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−ヒドロキシカルボニルメチル−３−（Ｎ’−（４−メチルフェニル）ウレイド）インドリン−２−オン（特開平７−４８３４９号公報の「実施例１７４（１）」に記載された化合物、３００ｍｇ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶かしｐ−アミノベンジルアルコール（１００ｍｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（１５１ｍｇ）を順次加え混合物を１５〜３０℃で１８時間攪拌した。反応液に水を加え酢酸エチルで抽出し有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を留去した。得られた反応混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を３２４ｍｇ得た（収率８８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）
δ  ８．８３（ｓ，１Ｈ），７．４０〜６．８４（ｍ，１４Ｈ），４．７８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５１（ｓ，２Ｈ），３．９９（ｄｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８３〜３．４５（ｍ，５Ｈ），２．９０（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），２．６７（ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ），２．６０（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），１．１５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．１０（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）．
ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）
３３３０，２９８０，１７０８，１６７１，１６１０，１５３３，１４７８，１４６４，１４１２，１３７５，１３１０，１２４８，１２０９，１１２５，１０５９，８１８，７５１，４７５．
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）
ｍ／ｅ＝５６０（Ｍ＋），５１４，４８６，４５３．
ウレア中間体
３−（Ｎ’−（４−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチルフェニル）ウレイド−１−（２，２−ジエトキシエチル）インドリン−２−オン
１５〜３０℃にてトリホスゲン（６８１ｍｇ）のジクロロメタン溶液にｐ−アミノベンジル−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（１．６３ｇ）のジクロロメタン溶液をゆっくり滴下し、続いてトリエチルアミン（１．９２ｍＬ）のジクロロメタン溶液を加え１時間攪拌しイソシアナート体のジクロロメタン溶液を調製した。
１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−（ヒドロキシイミノ）インドリン−２−オン（特開平７−４８３４９号公報の実施例２８の中間体として記載された化合物、２．０１４ｇ）をメタノールに溶解し１０％Ｐｄ炭素を加え水素雰囲気下１５〜３０℃にて４時間攪拌した。反応混合物をろ過しＰｄ炭素を除去したのちろ液を濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶かしあらかじめ調製しておいたイソシアナート体のジクロロメタン溶液に氷冷下加えた。同温度で１時間攪拌ののち反応液に水を加えジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸水素ナトリウム上で乾燥後溶媒を留去した。反応混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し標題化合物を２．４５４ｇ得た（収率６８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）
δ  ７．５８（ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ），７．４４〜６．９５（ｍ，９Ｈ），６．０３（ｂｒｏａｄ  ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．２１（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），４．７０（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．６３（ｓ，２Ｈ），３．９６（ｄｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１３．７Ｈｚ，１Ｈ），３．８３〜３．４２（ｍ，５Ｈ），１．１５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ），０．９４（ｓ，９Ｈ），０．０９（ｓ，６Ｈ）．
アミド中間体
３−（Ｎ’−（４−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチルフェニル）ウレイド−１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−（（４−メチルフェニル）アミノカルボニルメチル）インドリン−２−オン
３−（Ｎ’−（４−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチルフェニル）ウレイド）−１−（２，２−ジエトキシエチル）インドリン−２−オン（１ｇ）をジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）に溶解し１５〜３０℃にてカリウム−ｔ−ブトキシド（２３７ｍｇ）を加え混合物を１分間攪拌ののちＮ−パラトリル−２−ブロモアセトアミド（４６０ｍｇ）を加えた。１５分間攪拌ののち水を加え酢酸エチルで抽出し，有機層を無水硫酸水素ナトリウム上で乾燥し溶媒を留去した。この反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し標題化合物を９３９ｍｇ得た（収率７３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）
δ  ８．５２（ｓ，１Ｈ），７．４０〜６．９２（ｍ，１４Ｈ），４．７８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），４．０２（ｄｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、１４．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８７〜３．４６（ｍ，５Ｈ），３．００（ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，１Ｈ），２．６７（ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，１Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ），１．１７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．１３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），０．９２（ｓ，９Ｈ），０．０６（ｓ，６Ｈ）．
化合物Ｉ（ラセミ体）
１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−（Ｎ’−（４−ヒドロキシメチルフェニル）ウレイド）−３−（（４−メチルフェニル）アミノカルボニルメチル）インドリン−２−オン
３−（Ｎ’−（４−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチルフェニル）ウレイド）−１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−（（４−メチルフェニル）アミノカルボニルメチル）インドリン−２−オン（３０８ｍｇ）をエタノール（１５ｍＬ）に溶かし濃硫酸（１０ｍｇ）を加え１５〜３０℃にて１時間攪拌した。反応液に水を加え酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸水素ナトリウム上で乾燥し溶媒を留去した。この反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し標題化合物２２５ｍｇを得た（収率８８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２７０ＭＨｚ）
δ  ８．１３（ｓ，１Ｈ），７．３７〜６．９０（ｍ，１４Ｈ），４．７９（ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ），４．５０（ｓ，２Ｈ），４．０１（ｄｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１４．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８６〜３．４６（ｍ，６Ｈ），２．９６（ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．５３（ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ），１．１６（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ），１．１１（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）．
ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）
３３６５，３０００，１７１７，１７０２，１６２１，１５４５，１５２１，１４９８，１４８０，１４２０，１３８８，１３２１，１２６３，１１３７，１０６９，８３１，７６３，５１５，４８４．
ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）
ｍ／ｅ＝５６０（Ｍ＋），５１５，３９２，３６５，３０６，２９２．
エステル中間体
１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−（Ｎ’−（４−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチルフェニル）ウレイド）−３−（（Ｌ−メントキシ）カルボニルメチル）インドリン−２−オン
窒素気流、及び氷冷下、３−（Ｎ’−（４−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチルフェニル）ウレイド）−１−（２，２−ジエトキシエチル）インドリン−２−オン（９３６ｍｇ）の乾燥テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）溶液に１当量（１．６８Ｍ、１．０ｍＬ）のｎ−ブチルリチウムのヘキサン溶液をゆっくり加え、この混合物を同温度で１０分間撹拌後、ブロモ酢酸（Ｌ−メンチル）（５４２ｍｇ）の乾燥テトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）溶液を滴下した。この混合物を０℃で８時間撹拌したのち、食塩水中に注ぎ酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥後濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１で溶離）で精製し、さらにメタノール水から再結晶して３５７ｍｇの標題化合物を得た（収率２８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２７０ＭＨｚ）
δ  ７．３０〜６．９７（ｍ，８Ｈ），６．８１（ｂｒｓ，１Ｈ），６．７６（ｂｒｓ，１Ｈ），４．７４（ｄｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．６９〜４．６１（ｍ，３Ｈ），３．９４（ｄｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８６〜３．４９（ｍ，５Ｈ），２．９９（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５９（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），１．９２〜１．９０（ｂｒｓ，１Ｈ），１．２１〜１．１０（ｍ，６Ｈ），０．９２（ｓ，９Ｈ），１．３６〜０．６５（ｍ，１８Ｈ），０．０６５（ｓ，６Ｈ）．
化合物Ｉ（光学活性体）
１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−（Ｎ’−（４−ヒドロキシメチルフェニル）ウレイド）−３−（（４−メチルフェニル）アミノカルボニルメチル）インドリン−２−オン
１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−（Ｎ’−（４−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチルフェニル）ウレイド）−３−（（Ｌ−メントキシ）カルボニルメチル）インドリン−２−オン（２９３ｍｇ）のエタノール（８ｍＬ）溶液に１５〜３０℃で水酸化カリウム水溶液（１Ｎ、１．３６ｍＬ）を加え、混合物を７０℃で４時間攪拌後、濃縮した。残留物に水を加えクロロホルムで洗浄した後、これに２Ｎ塩酸を加えることにより酸性にした。生成した不溶物を酢酸エチルで抽出し、有機層を食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥、濃縮して２３４ｍｇの１−（２，２−ジエトキシエチル）−３−ヒドロキシカルボニルメチル−３−（Ｎ’−（４−ヒドロキシメチルフェニル）ウレイド）インドリン−２−オン（カルボン酸中間体）を粗生成物として得た。
このカルボン酸中間体（２３４ｍｇ）をジクロルメタン（１０ｍＬ）に溶かし、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（１３１ｍｇ）、パラトルイジン（７３ｍｇ）を順次加えた。混合物を１５〜３０℃で１８時間撹拌し、濃縮した。残留物を酢酸エチルで希釈し、希塩酸と飽和重曹水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１で溶離）で精製し２０４ｍｇの白色粉末を得た（９０％ｅｅ、エステル中間体からの収率８０％）。この粉末のうち１４０ｍｇを光学活性カラムを用い分取用高速液体クロマトグラフィーで精製し、Ｒ体（１１７ｍｇ、［α］Ｄ２６＝９４°  Ｃ＝１．０１４／ＭｅＯＨ）とＳ体（７ｍｇ）を得た。
＜分取条件＞
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−４８００
直径２０ｍｍ×長さ２５ｃｍ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
流速：２０ｍＬ／分
溶媒：ヘキサン／１，２−ジクロロエタン／メタノール＝７５／２２／３
保持時間：Ｓ体  ２４分，Ｒ体  ４０分
実施例１（正常ラットに対する経口投与時の軟骨形成促進作用）
６週令の雄性ＳＤ系ラット（日本エスエルシー社製−日本チャールス・リバー社製）に、上記合成例１で得た「化合物Ａ」を３％アラビアゴム溶液に懸濁して、２ｇ／ｋｇ／日の用量で４週間経口投与した。
その後該ラットを剖検し、耳介、気管、胸骨、大腿骨・下腿骨の膝関節部、腰椎（椎間板）を２０％中性緩衝ホルマリン（和光純薬社製）に１週間浸漬して固定し、胸骨、大腿骨・下腿骨の膝関節部、腰椎（椎間板）は２０％ＥＤＴＡ４ナトリウム溶液（ｐＨ７．４、和光純薬社製）で２週間脱灰し、観察部位を剃刀（フェザー社製）で切り出した。耳介、気管は脱灰せずに剃刀で観察部位を切り出した。
これらの切り出した部位を、自動包埋装置（サクラ社製）およびパラフィン（国産化学社製とフィッシャーサイエンティフィック社製品の等量混合物）を用いて、パラフィン包埋ブロックとした。この際には、パラフィン自動分注器包埋センター（Ｍｉｌｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、組織標本用カセット（ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ社製）に、パラフィンブロックを固定した。
このパラフィンブロックをミクロトーム（大和光機社製）およびミクロトーム用ナイフ（フェザー社製）を用いて厚さ２μｍの切片を作成し、スライドガラス（松浪硝子社製）に貼り付け、乾燥した。乾燥後、切片をキシレンに漬けてパラフィンを除去し、エタノールから水までの段階希釈系列に漬けて水中に保存した。その切片を０．２％ヘマトキシリンおよび０．１％エオジン（いずれもメルク社製）で染色し、封入剤（武藤化学社製）およびカバーガラス（松浪硝子社製）で封入し、顕微鏡（日本光学社製、倍率：対物レンズ１０倍）で観察した。大腿骨の切片は、硝子軟骨の形成促進を組織化学的に解析するため０．３％サフラニンＯ（メルク社製）染色を施し、同様に顕微鏡（倍率：対物レンズ１０倍）で観察した。結果を図１Ａ〜５Ａおよび図１Ｂ〜５Ｂの写真に示した。
染色後の顕微鏡写真から明らかに、溶媒対照群（３％アラビアゴム溶液のみをラットに経口投与）では軟骨形成促進が認められなかったのに対し（図１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａ）、上記「化合物Ａ」を投与した群では、いずれの臓器でも硝子軟骨形成が促進されていた（図１Ｂ、２Ｂ，３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂ）。
これらの実験事実により、化合物Ａがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて軟骨形成促進作用を示すことが確認された。
実施例２（ラットに対する膝関節内投与時の軟骨形成促進作用）
１０週令の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールス・リバー社製）の右膝関節内に１ｍｍｏｌ／Ｌの上記「化合物Ａ」（５０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）−生理食塩水溶液に溶解；該ＤＭＳＯは純正化学社製、生理食塩水は大塚製薬社製）を１日あたり５０μＬ、２７Ｇ注射針および１ｍＬシリンジ（いずれもテルモ社製）を用いて３週間投与した。
溶媒対照として、５０％ＤＭＳＯ−生理食塩水溶液（それぞれ純正化学社製、大塚製薬社製）を同様に投与する実験群を設けた。
３週間の連日反復投与後ラットを剖検し、大腿骨の左右の側副靭帯付着部間距離をノギス（ミツトヨ社製）で測定し、大腿骨膝関節の幅を測定した。その後、実施例１と同様の方法で組織標本を作製し、０．３％サフラニンＯ水溶液（メルク社製）で染色して顕微鏡下（日本光学社製；倍率：対物レンズ１０倍）で観察した。結果を図６、図７Ａおよび７Ｂに示した。
図６に示したように、大腿骨膝関節の幅は、化合物Ａを投与した群では溶媒対照群に対して有意に大きくなった。また、図７Ａおよび７Ｂに示したように、組織学的にサフラニンＯ陽性の軟骨組織の形成促進が認められた。
これらの実験事実により、化合物Ａが関節内などの局所投与によっても軟骨形成促進作用を示すことが確認された。
実施例３（ラット初代培養関節軟骨細胞に対する化合物Ａの作用）
６週令の雄性ＳＤ系ラット（日本エスエルシー社製）の大腿骨膝関節より関節軟骨細胞をメスで切り出し、０．３％コラゲナーゼ（ＷＯＲＴＨＩＮＧＴＯＮ社製）で消化して分離培養した（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．１９：１７９〜１８７，１９７５）。
分離した関節軟骨細胞を用いて、軟骨基質なかでもグリコサミノグリカン合成を測定するため、３５Ｓ標識硫酸（アマシャム社製）のグリコサミノグリカンへの取り込み量を測定した。具体的には関節軟骨細胞を、細胞培養用の９６穴プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に、一穴あたり１００００個の細胞密度で培養した。培地はウシ胎児血清（最終濃度１０％）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（明治製菓社製）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（萬有製薬社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏのＭＥＭとＨａｍ  Ｆ−１２の等量混合培地（いずれもＧＩＢＣＯ社製）を用いた。
軟骨細胞がコンフルエントに達した時点で血清濃度を０．３％にした培地に交換して一晩培養し、化合物Ａを１０μｍｏｌ／Ｌ含有する同培地に交換し、その３時間後に３５Ｓ標識硫酸（アマシャム社製）を一穴あたり０．５μＣｉ添加し、２４時間培養した。その後、培地を２４穴プレートに回収して４度で保存した。細胞層は、２ｍｇ／ｍＬのアクチナーゼＥ（科研製薬社製）を穴あたり０．１ｍＬ添加して、３７℃で一晩（１６時間）消化した。翌日消化した細胞層と、保存しておいた培地とを合一し、０．１ｍｇ／ｍＬコンドロイチン硫酸Ｃ（Ｓｉｇｍａ社製）０．１ｍＬ，２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４（和光純薬社製）０．５ｍＬ，０．２ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ社製）  ０．５ｍＬ，１％
セチルピリジニウムクロライド（２０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液に溶解、和光純薬社製）０．５ｍＬを添加し、３７度で２時間静置した。その後、この試料をガラス繊維濾紙（東洋濾紙社製）で濾過し、濾紙を１％  セチルピリジニウムクロライド（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）の２ｍＬで３回洗浄し、液体シンチレーションカウンター用バイアル（ＰＡＣＫＡＲＤ社製）に１枚ずつ入れ、シンチレータ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社製）を１０ｍＬ注ぎ、液体シンチレーションカウンター（ＰＡＣＫＡＲＤ社製）で放射活性を測定した。
また、細胞増殖の測定として３Ｈ標識チミジン（アマシャム社製）の取り込み量を測定した。この測定のために、分離した関節軟骨細胞を細胞培養用の９６穴プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に一穴あたり１００００個の細胞密度で培養した。培地は、ウシ胎児血清（最終濃度１０％）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（明治製菓社製）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（萬有製薬社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏのＭＥＭとＨａｍ  Ｆ−１２の等量混合培地（いずれもＧＩＢＣＯ社製）を用いた。細胞が６０〜７０％のコンフルエントに達した後、培地を０．３％ウシ胎児血清を含むものに交換し、一晩培養した。翌日、同培地に最終濃度０．１，１．０，１０μｍｏｌ／Ｌの化合物Ａを含む０．３％ウシ胎児血清を含む培地に交換した。その２４時間後に、３Ｈ標識チミジン（アマシャム社製）を穴あたり１μＣｉ添加し、４時間培養した後に培地を捨て、細胞回収装置（ＳＫＡＴＲＯＮ社製）を用いて細胞層をシンチレーションカウンタ用のガラス繊維濾紙（Ｗａｌｌａｃ社製）に回収した。この濾紙にプラスチックシンチレータ（Ｗａｌｌａｃ社製）を染み込ませ、シンチレーションカウンタ（Ｗａｌｌａｃ社製）で放射活性を測定した。結果を図８、９のグラフに示した。
３５Ｓ標識硫酸の取り込み量は、１０μｍｏｌ／Ｌの化合物Ａの添加により溶媒対照である培地中最終濃度１％エタノールに対して有意な増加を示した。３Ｈ標識チミジンの取り込み量も、１０μｍｏｌ／Ｌの化合物Ａにより溶媒対照に対して有意な増加を示した。
これらの結果により、化合物Ａが軟骨基質合成および軟骨細胞増殖を増加させる作用を有することが確認された。また、一般式（Ｉ）で表される軟骨形成促進剤は自家軟骨細胞移植など軟骨細胞移植において、移植前および移植後の軟骨細胞の細胞外基質合成能または増殖能を促進させる薬剤として利用することができる。
実施例４（マウス由来軟骨細胞および脂肪細胞の共通前駆細胞株（ＣＬ−１）の軟骨細胞への分化に対する化合物Ａの作用）
正常成熟マウスより樹立した軟骨細胞および脂肪細胞株ＣＬ−１（国際公開９８／３９４１４）を５０００個／ｃｍ２の細胞密度で４穴のチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社製）に培養した。培地には１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（明治製菓社製）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（萬有製薬社製）および１０％ウシ胎児血清（ＩＮＴＥＲＧＥＮ社製）を含むα−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いた。ＣＬ−１がコンフルエントに達した時、化合物Ａを最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌになるように添加し、週３回の培地交換時にも添加して７日間培養した。
溶媒対照として培地中の最終濃度が１％になるようにエタノール（純正化学社製）を添加したスライドも設けた。コンフルエント後７日後、これらのプレートを回収して、ＣＬ−１細胞層をアルシアンブルーおよびオイルレッドＯの２重染色し、それぞれ軟骨細胞または脂肪細胞への分化を観察した。培養終了後、細胞層は４％パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬社製）で室温で１時間固定後、０．１Ｎ塩酸で洗浄して１％アルシアンブルー（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）水溶液（ｐＨ１．０）で一晩染色した。その後０．１Ｎ−塩酸および蒸留水で洗浄し、８５％プロピレングリコール（ナカライデスク社製）水溶液で１分間処理し、０．５％オイルレッドＯ（メルク社製）プロピレングリコール溶液に３０分間染色した。８５％プロピレングリコール水溶液で洗浄後、蒸留水で洗浄した。その後０．３％ケルンエヒトロート（メルク社製）水溶液で５分間、核を染色した。結果を図１０Ａおよび１０Ｂの写真に示した。ＣＬ−１の軟骨細胞および脂肪細胞への分化は、同細胞がコンフルエントに達した後に始まり、通常の培養状況では、およそ７０％の細胞がオイルレッドＯ陽性の脂肪細胞に、およそ３０％の細胞がアルシアンブルー陽性の軟骨細胞に分化する。図１０Ａおよび１０Ｂにおいて、黒点はオイルレッドＯ陽性の脂肪内脂肪滴を、濃灰色の部分はアルシアンブルー陽性の軟骨基質を表す。
図１０Ｂの染色後の顕微鏡写真から明らかなように、溶媒対照（図１０Ａ）に比較して、化合物ＡはＣＬ−１の軟骨細胞への分化を明らかに促進し、脂肪細胞への分化は明らかに抑制した。
実施例５（マウス由来軟骨細胞および脂肪細胞の共通前駆細胞株（ＣＬ−１）の３５Ｓ標識硫酸取り込みに対する化合物Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇの作用）
前述の細胞株ＣＬ−１を、液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）用の９６穴細胞培養用プレート（Ｗａｌｌａｃ社製）に一穴あたり１０００個の細胞密度で培養した。培地には１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（明治製菓社製）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（萬有製薬社製）および１０％  ウシ胎児血清（ＩＮＴＥＲＧＥＮ社製）を含むα−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いた。ＣＬ−１がコンフルエントに達した時点で１０μｍｏｌ／Ｌの化合物Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇを含む培地に交換し、２４時間後に３５Ｓ標識硫酸を穴あたり０．５μＣｉ添加し、継続して培養した。化合物Ａ，Ｆについては、１および５μｍｏｌ／Ｌの濃度の培地も設定した。その２４時間後に、培地を捨て、細胞層を０．４％セチルピリジニウムクロライド（和光純薬社製）を含む５％パラホルムアルデヒド０．２ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、いずれも和光純薬社製）で室温で２時間固定した。固定液を捨てた後、同液で１回洗浄し、洗浄した液を捨てた。細胞層にシンチレーター（Ｗａｌｌａｃ社製）を０．１ｍＬ添加し、攪拌の後シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）で放射活性を測定した。結果を図１１，１２に示した。
この結果は、化合物Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，ＧがＣＬ−１に対して軟骨細胞への分化を明らかに促進し、脂肪細胞への分化は明らかに抑制したことを示したものである。同時にこの結果は、一般式（Ｉ）で表される軟骨形成促進剤を、多分化能を有する未分化間葉系細胞（例えばＣＬ−１に類似の分化状態を有する細胞）を軟骨細胞に分化させる薬剤として、軟骨細胞移植などの軟骨疾患の治療において利用できることを示すものである。
実施例６（ラット関節全層欠損モデルに対する化合物Ａの軟骨修復効果）
１０週齢の雄性ＣＤ系ラット（日本チャールズリバー社製）の右側大腿骨膝外面に直径２．４ｍｍのキルシュナー鋼線（瑞穂医科機械社製）を用いて骨髄に達する、深さ２．５ｍｍの欠損部を作製した。術後７日から、溶媒である５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）生理食塩水溶液（ＤＭＳＯ：純正化学社製、生理食塩水：大塚製薬社製）、あるいは１．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物Ａ溶液の５０μＬを１日１回、右側膝関節内に３週間連日投与した。化合物Ａの一日あたりの投与量は、８１．７μｇであった。
投与最終日の翌日、右側大腿骨を採取し、２０％中性緩衝ホルマリン（和光純薬社製）で１週間浸漬して固定し、２０％ＥＤＴＡ４ナトリウム溶液（ｐＨ７．４、和光純薬社製）で２週間脱灰し、欠損部を剃刀（フェザー社製）で切り出した。切り出した部位を、自動包埋装置（サクラ社製）およびパラフィン（国産化学社製とフィッシャーサイエンチフィック社製の等量混合物）を用いて、パラフィンブロックとした。この際には、パラフィン自動分注器包埋センター（Ｍｉｌｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、組織標本用カセット（ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ社製）に、パラフィンブロックを固定した。
このパラフィンブロックをミクロトーム（大和光機社製）およびミクロトーム用ナイフ（フェザー社製）を用いて厚さ２μｍの切片を作製し、スライドガラス（松浪硝子社製）に貼り付け、乾燥した。乾燥後、切片をキシレンに漬けてパラフィンを除去し、エタノールから水までの段階希釈系列に漬けて水中に保存した。その切片を０．３％サフラニンＯ（メルク社製）染色を施し、顕微鏡（倍率：対物レンズ１０倍）で観察し、Ｗａｋｉｔａｎｉらの方法（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．７６−Ａ，５７９−５９２，１９９４）を改変した方法で組織学的スコアを採取した。
組織学的スコアは、以下の表１０に示した基準に基づき、溶媒対照群と化合物Ａ投与群を比較した。化合物Ａのみを投与した群では、溶媒のみを投与した群に対して、Ｃｅｌｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙおよびＴｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ（図１３Ａ）、またＴｏｔａｌ  ｓｃｏｒｅ（図１３Ｂ）が有意に低下した。また、図１４Ａおよび１４Ｂに示したように、欠損部はサフラニンＯ陽性の軟骨様組織による修復が確認された。これらの実験事実により、化合物Ａが欠損などの関節軟骨の損傷に対して軟骨修復効果を示すことが確認された。
0004058243.tif 000027
実施例７（ウサギ変形性関節症モデルに対する化合物Ａの病態抑制効果）
１２週齢の雄性ＮＺＷ系ウサギ（北山ラベス社製）を用いて、ｃｏｌｏｍｂｏらの方法（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２６（７）：８７５−８８６，１９８３）に従い右側関節半月の部分切除、外側側副靭帯および種子骨切除を行い、ウサギ変形性関節症モデルを作製した。術後７日から溶媒である５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）生理食塩水溶液（ＤＭＳＯ：純正化学社製、生理食塩水：大塚製薬社製）、あるいは３．０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物Ａ溶液の５００μＬを１日１回、右側膝関節内に３週間連日投与した。化合物Ａの一日あたりの投与量は、８１６．８μｇであった。
投与最終日の翌日、右側大腿骨遠位部および下腿骨近位部を採取し、大腿骨は、２％パラホルムアルデヒド−２．５％グルタールアルデヒド固定液（いずれも和光純薬社製）に一昼夜浸漬して固定し、下腿骨は２０％中性緩衝ホルマリン（和光純薬社製）に１週間浸漬して固定した。
大腿骨遠位部は１％オスミウム溶液（和光純薬）で後固定したあと、上昇エタノール系列に漬けて脱水した後、酢酸イソアミルで置換した後に臨界点乾燥装置（日立社製）にて乾燥した。乾燥した組織表面をイオンスパッタコーティング装置（Ｅｉｋｏ社製）を用いて金によるコーティングを施し、走査型電子顕微鏡（日立製作所社製）を用いて大腿骨外顆軟骨表面を観察した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。この電子顕微鏡像について、関節軟骨の損傷部の面積を以下の表１１に示した基準に基づき、画像解析ソフトＩＰＡＰ（住化テクノサービス社製）を用いて測定した。図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃに示したように、化合物Ａのみを投与した群では、溶媒のみを投与した群に対し、Ｍｅｄｉｕｍな病変部面積および病変部総面積に関して有意に関節軟骨損傷部面積が減少した。
0004058243.tif 000028
下腿骨近位部はバンドソー（ＥＸＡＫＴ社製）で切り出した後に２０％ＥＤＴＡ４ナトリウム溶液（ｐＨ７．４、和光純薬社製）で４週間脱灰した。切り出した部位を、自動包埋装置（サクラ社製）およびパラフィン（国産化学社製とフィッシャーサイエンチフィック社製の等量混合物）を用いて、パラフィンブロックとした。この際には、パラフィン自動分注器包埋センター（Ｍｉｌｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、組織標本用カセット（ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ社製）に、パラフィンブロックを固定した。
このパラフィンブロックをミクロトーム（大和光機社製）およびミクロトーム用ナイフ（フェザー社製）を用いて厚さ２μｍの切片を作製し、スライドガラス（松浪硝子社製）に貼り付け、乾燥した。乾燥後、切片をキシレンに漬けてパラフィンを除去し、エタノールから水までの段階希釈系列に漬けて水中に保存した。その切片を０．３％サフラニンＯ（メルク社製）染色を施し、顕微鏡（倍率：対物レンズ１０倍）で観察し、Ｋｉｋｕｃｈｉらの方法（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ４，９９−１１０，１９９６）を改変した以下の基準（表１２）にもとづき組織学的スコアを採取した。
0004058243.tif 000029
化合物Ａのみを投与した群では、溶媒のみを投与した群に対し、Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｌａｙｅｒをのぞく全ての組織学的スコアが有意に低下した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。これらの実験事実により、化合物Ａが変形性関節症などの軟骨変成疾患に対して抑制効果を示すことが確認された。
産業上の利用可能性
上述したように本発明によれば、特定の構造を有するインドリン−２−オン誘導体またはその塩を有効成分とする軟骨形成促進剤ないし軟骨修復剤が提供される。該軟骨形成促進剤は、ヒトを始めとする温血動物において軟骨形成を促進して、リウマチや変形性関節症、または外傷による軟骨損傷などの軟骨疾患の優れた治療薬となることが期待される。
更に、本発明の軟骨形成促進作用を有するインドリン−２−オン誘導体は、軟骨の生物学的、物理学的ならびに化学的な研究のための試薬としても有用である。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、ラットに溶媒対照（３％アラビアゴム）を４週間経口反復投与した際の耳介のヘマトキシリン・エオジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真であり、図１Ｂは、ラットに化合物Ａ（２ｇ／ｋｇ）を４週間経口反復投与した際の耳介のヘマトキシリン・エオジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図２Ａは、ラットに溶媒対照（３％アラビアゴム）を４週経口反復投与した際の気管のヘマトキシリン・エオジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真であり、図２Ｂは、ラットに化合物Ａ（２ｇ／ｋｇ）を４週経口反復投与した際の気管のヘマトキシリン・エオジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図３Ａは、ラットに溶媒対照（３％アラビアゴム）を４週間経口反復投与した際の胸骨剣状突起のヘマトキシリン・エオジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真であり、図３Ｂは、ラットに化合物Ａ（２ｇ／ｋｇ）を４週間経口反復投与した際の胸骨剣状突起のヘマトキシリン・エオジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図４Ａは、ラットに溶媒対照（３％アラビアゴム）を４週間経口反復投与した際の大腿骨・下腿骨の膝関節部のヘマトキシリン・エオジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真であり、図４Ｂは、ラットに化合物Ａ（２ｇ／ｋｇ）を４週間経口反復投与した際の大腿骨・下腿骨の膝関節部のヘマトキシリン・エオジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図５Ａは、ラットに溶媒対照（３％アラビアゴム）を４週間経口反復投与した際の腰椎（椎間板）のヘマトキシリン・エオジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真であり、図５Ｂは、ラットに化合物Ａ（２ｇ／ｋｇ）を４週間経口反復投与した際の腰椎（椎間板）のヘマトキシリン・エオジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図６は、化合物Ａ（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）または溶媒対照（５０％  ＤＭＳＯ生理食塩水溶液）をラット膝関節内に一日あたり５０μｌを３週間反復投与した際の大腿骨膝関節の幅を示したグラフである。
図７Ａは、溶媒対照（５０％ＤＭＳＯ生理食塩水溶液）をラット膝関節内に一日あたり５０μｌを３週間反復投与した際の大腿骨膝関節部の０．３％サフラニンＯ染色組織標本を示した顕微鏡写真であり、図７Ｂは、化合物Ａ（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）をラット膝関節内に一日あたり５０μｌを３週間反復投与した際の大腿骨膝関節部の０．３％サフラニンＯ染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図８は、ラット初代培養関節軟骨細胞に化合物Ａまたは溶媒対照（培地中最終濃度が１％のエタノール）を添加した際の、３５Ｓ標識硫酸のグリコサミノグリカンへの取り込み量を示したグラフである。
図９は、ラット初代培養関節軟骨細胞に化合物Ａまたは溶媒対照（培地中最終濃度が１％のエタノール）を添加した際の、３Ｈ標識チミジンの取り込み量を示したグラフである。
図１０Ａは、コンフルエントに達したＣＬ−１に、溶媒対照（培地中最終濃度が１％のエタノール）を添加して７日間培養した際の、アルシアンブルーとオイルレッドＯの二重染色した顕微鏡写真であり、図１０Ｂは、コンフルエントに達したＣＬ−１に、化合物Ａ（培地中最終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加して７日間培養した際の、アルシアンブルーとオイルレッドＯの二重染色した顕微鏡写真である。
図１１は、コンフルエントに達したＣＬ−１に化合物Ａ，Ｆを最終濃度１，５，１０μｍｏｌ／Ｌ、化合物Ｂ，Ｅを最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌまたは溶媒対照の最終濃度１％のエタノールを含む培地で４８時間培養した際の、最後の２４時間の３５Ｓ標識硫酸のＣＬ−１への取り込み量を示したグラフである。
図１２は、コンフルエントに達したＣＬ−１に化合物Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｇを最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌまたは溶媒対照の最終濃度１％のエタノールを含む培地で４８時間培養した際の、最後の２４時間の３５Ｓ標識硫酸のＣＬ−１への取り込み量を示したグラフである。
図１３Ａおよび図１３Ｂは、ラット大腿骨膝蓋面に骨髄に達する欠損部を作成し、その７日後から化合物Ａ（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）または溶媒対照（５０％ＤＭＳＯ生理食塩水溶液）を１日あたり５０μＬ、３週間反復投与した際の、欠損部の軟骨修復を組織学的に検討した結果を示すグラフである。なお、図１３Ａは、Ｃｅｌｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，Ｍａｔｒｉｘ−ｓｔａｉｎｉｎｇ，Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅのスコアを、図１３ＢはＴｏｔａｌ  ｓｃｏｒｅのスコアを示すものである。
図１４Ａは、ラット大腿骨膝蓋面に骨髄に達する欠損部を作成し、その７日後から溶媒対照（５０％ＤＭＳＯ生理食塩水溶液）を１日あたり５０μＬ、３週間反復関節内投与した際の、欠損部の０．３％サフラニンＯ染色標本の顕微鏡写真であり、図１４Ｂは、ラット大腿骨膝蓋面に骨髄に達する欠損部を作成し、その７日後から化合物Ａ（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を１日あたり５０μＬ、３週間反復関節内投与した際の、欠損部の０．３％サフラニンＯ染色標本の顕微鏡写真である。
図１５Ａは、ウサギの関節半月を部分切除し、その７日後から溶媒対照（５０％ＤＭＳＯ生理食塩水溶液）を１日あたり５００μＬ、３週間反復関節内投与した際の走査型電子顕微鏡像であり、図１５Ｂは、ウサギの関節半月を部分切除し、その７日後から化合物Ａ（３．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を１日あたり５００μＬ、３週間反復関節内投与した際の走査型電子顕微鏡像である。なお、図１５Ａおよび図１５Ｂのいずれも６例の個体を示す。
図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃは、ウサギの関節半月を部分切除し、その７日後から化合物Ａ（３．０ｍｍｏｌ／Ｌ）または溶媒対照（５０％ＤＭＳＯ生理食塩水溶液）を１日あたり５００μＬ、３週間反復関節内投与した際の走査型電子顕微鏡像での損傷した関節軟骨表面の面積を示すグラフである。なお、図１６ＡはＭｉｌｄな病変部の面積の平均値を、図１６ＢはＭｅｄｉｕｍな病変部の面積の平均値を、図１６ＣはＭｉｌｄとＭｅｄｉｕｍの面積を和した病変部総面積の平均値をそれぞれ示す。
図１７Ａおよび図１７Ｂは、ウサギの関節半月を部分切除し、その７日後から化合物Ａ（３．０ｍｍｏｌ／Ｌ）または溶媒対照（５０％ＤＭＳＯ生理食塩水溶液）を１日あたり５００μＬ、３週間反復関節内投与した際の病変部の０．３％サフラニンＯ染色標本を、組織学的に検討した結果を示すグラフである。なお、図１７Ａは、Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｌａｙｅｒ，Ｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｅｒｏｓｉｏｎ，Ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎのスコアを、図１７Ｂは、Ｇｌｏｂａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔのスコアを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
0004058243.tif 000043
【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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