(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチビンＡＢを有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
【請求項２】
下記の何れかの蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
［ａ］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質；
［ｂ］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上５以下のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質；
［ｃ］配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上５以下のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質；または
［ｄ］配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上５以下のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上５以下のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質：
【請求項３】
糖尿病の治療および／または予防のための医薬が、膵臓機能改善作用を有するものである請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
糖尿病の治療および／または予防のための医薬が、膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を有するものである請求項１または２に記載の医薬。
【請求項５】
アクチビンＡＢを有効成分として含有する、インスリン分泌促進剤。
【請求項６】
アクチビンβA鎖をコードするＤＮＡおよびアクチビンβB鎖をコードするＤＮＡを含有する、糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤。
【請求項７】
下記の何れかのＤＮＡを含有する、糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤。
［ａ］配列番号１および配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
［ｂ］配列番号１および２で表されるアミノ酸配列において１以上１０以下のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ；または
［ｃ］配列番号３および４で表される塩基配列を含むＤＮＡ：
【請求項８】
糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤が、膵臓機能改善作用を有するものである請求項６または７に記載の遺伝子治療剤。
【請求項９】
糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤が、膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を有するものである請求項６または７に記載の遺伝子治療剤。
【請求項１０】
アクチビンβA鎖およびアクチビンβB鎖をコードするＤＮＡを含有する、インスリン分泌促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オーファン受容体ＡＬＫ７、該受容体のリガンド蛋白質であるアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、該受容体をコードするＤＮＡ、または該リガンド蛋白質コードするＤＮＡを含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬および診断薬に関する。また、該受容体、該リガンド蛋白質、該受容体をコードするＤＮＡ、または該リガンド蛋白質コードするＤＮＡを利用した糖尿病の治療および／または予防のための医薬のスクリーニング方法、該スクリーニング方法により得られる医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は先進諸国において最も大きな問題となっている生活習慣病の一種である。
糖尿病は膵臓β細胞から分泌されるホルモンであるインスリンの絶対的不足（１型糖尿病）、あるいは相対的不足・作用不足（２型糖尿病）に起因する疾患である。２型糖尿病の病態は、β細胞からのインスリン分泌不全とインスリン標的細胞でのインスリン作用障害（インスリン抵抗性）の二者で構成され、複数の遺伝因子・環境因子が複雑に関与する他因子疾患であることが知られている。ヒト２型糖尿病では、健常人と比較して膵β細胞が約６０％に減少しているとの報告もあり〔Tohoku J. Exp. Med., 129, 273-283, (1979)〕、β細胞数の低下が１型のみならず２型糖尿病患者においても病態と関連することが示唆されている。
【０００３】
インスリン分泌能を根本的に回復させる一方法として膵移植が1960年代から行われているが、ドナー・移植材料の確保が困難であることに加え、膵移植は非常に高度な技術を必要とする移植であることが問題とされている〔Nature Med., 6, 250-251, 2000〕。
【０００４】
一方、近年、膵移植と比較すると技術的には容易な膵ランゲルハンス氏島移植が試みられるようになってきたが、１年正着率が２７％と低い点、および個体の膵臓から十分な数のランゲルハンス氏島を取得し難いことが問題とされている。
【０００５】
膵ランゲルハンス氏島はインスリンを分泌するβ細胞のみならずグルカゴンを産生するα細胞、PPを産生するPP細胞、ソマトスタチンを産生するδ細胞の４種から成る。これら膵内分泌細胞は高度に最終分化した細胞であり、成体における新生現象はほとんど観察されず細胞分裂能も極めて低い。しかし非常に特殊な状況下、特に膵破壊・ランゲルハンス氏島破壊を伴う状況においてはβ細胞の再生が観察されることが主に動物モデルで証明されている〔Diabetes, 45, 941-945 (1996)、Diabetes, 46, 1281-1290 (1997)、Endocrinology, 138, 1750-1762 (1997)、Development, 118, 33-46, (1993)〕。よって、少なくともげっ歯類においては成体の膵臓にも内分泌細胞を増殖・再生させる潜在能力が存在し、特に膵導管に成体膵幹細胞が存在すると考えられている。
【０００６】
ヒトにおいては、上述したげっ歯類で観察されるような成体β細胞の再生現象は観察されていないが、糖尿病でない死者の剖検で、膵導管付近に数個以内の細胞から成るインスリン陽性細胞（single beta cell unit）が高頻度で観察されると報告されている。このsingle beta cell unitはランゲルハンス氏島を形成するβ細胞と比較し形態が小さいことから、より未分化なβ細胞であると考えられ、ヒト成体においてもβ細胞の再生が起こる可能性が示唆されている〔Diabetologia, 41, 629-633 (1998)〕。
【０００７】
膵移植に替わるβ細胞補充法として、ある特定の物質を投与することでin vivoでβ細胞の増殖・新生を誘導する物質としては、ポリADPリボースシンテターゼインヒビターであるニコチンアミド〔Biomed. Res., 18, 171 (1997)、Diabetes Res. Clin. Pract., 41, 1 (1998)〕、Reg蛋白質〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3589 (1994)〕の報告がある。しかし、ニコチンアミドは、糖尿病発症後の経口投与については、インスリン分泌能がある程度保たれている症例に約1年間に限りインスリン分泌持続効果があるのみであり〔Molecular Medicine, 38, 62-67 (2001)〕、またRegを過剰発現させたトランスジェニックマウスでは、β細胞数が減少し、インスリン含量が減少した。その結果、耐糖能障害がみられ３８％が糖尿病を発症した。その後１００週齢までに死亡したマウスの死因のほとんどは、膵導管、卵巣での悪性腫瘍、リンパ腫の形成であった〔2000年、日本糖尿病学会要旨集〕。reg遺伝子の発現が癌化に関連していることを示す報告もあり〔Brit. J. Cancer, 83, 188-1(2000)〕、ニコチンアミド、Reg蛋白質ともヒト糖尿病治療への利用は難しいと考えられる。
【０００８】
近年、成体のあらゆる組識において成体幹細胞の存在が明らかにされ、種々の臓器不全、疾患に対する再生療法の可能性が期待されている。上述したような成体の膵臓、主に膵導管に潜むと考えられる膵成体幹細胞を、インスリンを分泌するβ細胞へと効率的に分化誘導することができれば、１型のみならず２型糖尿病患者における膵β細胞数の低下および機能低下を補い、糖尿病の根治治療へ繋がると考えられが、そのような技術は確立していない。
【０００９】
一方、近年の膵臓発生初期過程の解析において、アクチビン受容体様キナーゼ 7（ＡＬＫ７）が特異的に膵臓細胞に発現されていることが明らかにされてきた〔Biochem. Biophys. Res. Comm., 254, 707-712 (1999)〕。ＡＬＫ７はＴＧＦ−β受容体ファミリーに属する分子で〔Mol. Cell Neurosci., 7, 467-478 (1996); J. Biol. Chem., 271, 30603-30609 (1996)〕、Ｉ型受容体に分類されているがそのリガンドはこれまで明らかにされていない。
【００１０】
一般にＴＧＦ−β受容体ファミリーに属する受容体の機能は、Ｉ型、II型の異なる分子により担われていることが明らかにされており、リガンドはII型受容体にまず結合し、リガンドとII型受容体の複合体がＩ型受容体と複合体を形成し、Ｉ型受容体が活性化されることにより細胞内にシグナルが伝達される〔Endocrinol., 141, 2281-2284 (2000) 〕。
【００１１】
特表平10-510143には、ラット由来のＡＬＫ７が取得され、該ＡＬＫ７のアミノ酸およびｃＤＮＡの配列が示されており、また該ＡＬＫ７ ｍＲＮＡのラットの各臓器における発現分布の解析により、該ＡＬＫ７は神経疾患の治療に有効と推定しているが、該ＡＬＫ７のリガンドについては、具体的に特定、取得したとの記載はない。
【００１２】
一方、アクチビン類はTGF-βスーパーファミリーに属するサイトカインであり、ＴＧＦ−β等と同様に二量体構造を有するが、それを構成するサブユニット（βサブユニットと呼ばれる）は５種類が知られており、哺乳類では、βＡ、βＢの他にβＣ、βＥが存在することが明らかにされている〔Biochem. Biophys. Res. Commun., 228, 669-674 (1996); Biochim. Biophys. Acta., 1307, 145-148 (1996)〕。これまでに哺乳動物生体内で蛋白質として発現が確認されているアクチビン類は、アクチビンＡ（βＡ−βＡ）、アクチビンＡＢ（βＡ−βＢ）、アクチビンＢ（βＢ−βＢ）である。アクチビン類（アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ）の受容体構成は、上記したようにＴＧＦ−β受容体ファミリーの典型であり、II型受容体（ActRIIAあるいはActRIIB）に結合し、その複合体がＩ型受容体（ＡＬＫ４）を活性化することによりシグナルが伝達されるものと考えられている〔Endocrinol., 141, 2281-2284 (2000)〕。また、現在の知見ではアクチビンＡ、ＡＢ、Ｂの間に明確な活性の相異は認められていない。
【００１３】
酵素活性を欠損した変異型II型アクチビン受容体遺伝子や、構成活性型Ｉ型アクチビン受容体遺伝子導入マウスの解析から、アクチビン類が膵臓β細胞の機能分化に重要である点は指摘されているが〔J. Clin. Invest., 102, 294-301 (1998)〕、他のＴＧＦ−βファミリーに属する分子との機能の重複性の影響が判別されず、アクチビン類の機能の詳細は明らかにされておらず、また、アクチビン類の機能上の相異も示唆されていない。これまでに、βＢの発現は下垂体、卵巣などβＡに比較して比較的限局されていることが明らかにされてきた〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 247-251(1988)〕。その後、βＡ、βＢ共に膵臓で発現していることも報告されているが〔Endocrinology, 133, 624-630 (1993); FEBS Letters, 319, 217-220 (1993); J. Gastrointest. Surg., 4, 269-275 (2000)〕、これらの検討結果はｍＲＮＡ発現に関する検討を示すのみであり、アクチビンＡ、ＡＢ、Ｂに機能上の相異があるとは指摘されていない。
【００１４】
この様に、アクチビン類に関しては、膵臓機能等に何らかの作用を有することが示唆されてはいるが、各分子種間において機能上の差異を窺わせる知見は存在せず、アクチビンＡ、ＡＢ、Ｂの間に膵臓の発生・分化並びに機能制御等に異なる機能が担われているとは予想されていない。
以上の様に、膵臓再生因子の探索は新規膵臓機能改善作用を有する治療薬として注目されているが、実際の医療に応用可能な分子は特定されていない。また、ＡＬＫ７は膵臓β細胞で発現されていることが明かにされており、膵臓の機能制御等に何らかの役割を担うことが示唆されてはいるがその具体的機能、およびそのリガンドに関しては知られていない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
成体の膵臓に存在すると考えられる成体膵幹細胞を、インスリンを分泌し機能的に成熟した膵β細胞へと分化誘導することができれば、１型および２型糖尿病患者における膵β細胞数の低下および機能低下を補い糖尿病の根治治療へと繋がる。こうした活性を有する分子の特定とそれを利用した膵臓機能を改善する薬剤の開発が望まれている。
【００１６】
即ち、本発明は、グルコース依存性のインシュリン分泌の促進作用を示す物質を糖尿病の治療および／または予防のための医薬として提供することを解決すべき課題とした。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究し、膵臓β細胞で特異的に発現していることが知られているＴＧＦ−β受容体ファミリーのタイプＩ型受容体に属するＡＬＫ７のリガンドが公知のアクチビンＡＢおよびＢであることを同定した。さらに、膵臓β細胞で発現するタイプＩ型受容体ＡＬＫ７とタイプII受容体ActRIIAを介して情報を伝達することを明らかにした。さらにアクチビンＡＢを膵臓β細胞様のモデル細胞に投与することでグルコース依存性のインシュリン分泌の促進作用を示すことを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（３５）を提供するものである。
【００１８】
（１）  アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７からなる群より選ばれる蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
（２）  下記の何れかの蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
［ａ］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質；
［ｂ］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質；
［ｃ］配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質；または
［ｄ］配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質：
【００１９】
（３）  下記の何れかの蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
［ａ］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質；
［ｂ］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質；または
［ｃ］配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質：
【００２０】
（４）  下記の何れかの蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
［ａ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡによりコードされる蛋白質；または
［ｂ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビンＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての機能を有する蛋白質：
【００２１】
（５）  下記の何れかのポリペプチドを有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
［ａ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
［ｂ］配列番号１または２において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチド；
【００２２】
（６）  糖尿病の治療および／または予防のための医薬が、膵臓機能改善作用を有するものである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬。
（７）  糖尿病の治療および／または予防のための医薬が、膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を有するものである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬。
（８）  糖尿病の治療および／または予防のための医薬が、膵外分泌細胞および膵内分泌細胞の再生を促進する作用を有するものである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬。
（９）  アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７からなる群より選ばれる蛋白質を有効成分として含有する、インスリン分泌促進剤。
【００２３】
（１０）アクチビンβA鎖、アクチビンβB鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを含有する、糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤。
（１１）下記の何れかのＤＮＡを含有する、糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤。
［ａ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ；または
［ｃ］配列番号３および４で表される塩基配列を含むＤＮＡ：
【００２４】
（１２）  下記の何れかのＤＮＡを含有する、糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤。
［ａ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質をコードするＤＮＡ；または
［ｂ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビンＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ：
【００２５】
（１３）  糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤が、膵臓機能改善作用を有するものである上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の遺伝子治療剤。
（１４）  糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤が、膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を有するものである上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の遺伝子治療剤。
（１５）  糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤が、膵外分泌細胞および膵内分泌細胞の再生を促進する作用を有するものである上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の遺伝子治療剤。
（１６）  アクチビンβA鎖、アクチビンβB鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを含有する、インスリン分泌促進剤。
【００２６】
（１７）  以下の［ａ］〜［ｃ］のいずれかに記載のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体を含有する糖尿病の診断薬。
［ａ］アクチビンβA鎖、アクチビンβB鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡ、またはそれらＤＮＡの部分断片であるＤＮＡ；
［ｂ］配列番号３または４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、またはそれらＤＮＡの部分断片であるＤＮＡより選ばれるＤＮＡ
［ｃ］配列番号３または４で表される塩基配列、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列において、連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体
【００２７】
（１８）  アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、ＡＬＫ７からなる群より選ばれる蛋白質を認識する抗体を含有する糖尿病の診断薬。
（１９）  上記（１７）に記載のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体、または上記（１８）に記載の抗体を含有する、糖尿病の診断キット。
【００２８】
（２０）  （i）以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質を発現する細胞での該ポリペプチドまたは蛋白質の発現量と、（ii）該ポリペプチドまたは蛋白質を発現する細胞と被験試料を接触させた場合の該ポリペプチドまたは蛋白質の発現量とを比較し、被験試料より以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質の発現量を増大させる化合物を選択することを特徴とする、糖尿病の治療および／または予防のための医薬のスクリーニング方法。
［ａ］アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７より選ばれる蛋白質；
［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質より選ばれるポリペプチドまたは蛋白質；
［ｃ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチド；または
［ｄ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビンＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての活性を有する蛋白質：
【００２９】
（２１）  （i）以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質を発現する細胞の機能と、（ii）該ポリペプチドまたは蛋白質を発現する細胞と被験試料を接触させた場合の細胞の機能とを比較し、被験試料より細胞の機能を制御する活性を有する化合物を選択することを特徴とする、糖尿病の治療および／または予防のための医薬のスクリーニング方法。
［ａ］アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７より選ばれる蛋白質；
［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質より選ばれるポリペプチドまたは蛋白質；
［ｃ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチド；または
［ｄ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビンＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての活性を有する蛋白質：
【００３０】
（２２）  細胞が、II型アクチビン受容体を発現している細胞である、上記（２０）または（２１）に記載のスクリーニング方法。
（２３）  細胞が、膵臓β細胞種細胞である上記（２０）〜（２２）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（２４）  以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝子の転写を制御する領域の下流にレポーター遺伝子が連結されたＤＮＡを含むＤＮＡで形質転換された形質転換体と被験試料を接触させ、被験試料より以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝子の発現を増大させる化合物を選択することを特徴とする、糖尿病の治療および／または予防のための医薬のスクリーニング方法。
［ａ］アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７より選ばれる蛋白質；
［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質より選ばれるポリペプチドまたは蛋白質；
［ｃ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチド；または
［ｄ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビンＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての活性を有する蛋白質
【００３１】
（２５）  糖尿病の治療および／または予防のための医薬が膵臓機能改善作用を有する化合物である（２０）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）  糖尿病の治療および／または予防のための医薬が膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を有する化合物である上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２７）  糖尿病の治療および／または予防のための医薬が膵外分泌細胞または膵内分泌細胞の再生を促進する作用を有する化合物である上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２８）  上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の方法によって得られる化合物、またはその薬理学的に許容される塩。
【００３２】
（２９）  上記（２８）に記載の化合物、またはその薬理学的に許容される塩を含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
（３０）  ＡＬＫ７を認識する抗体と上記（２８）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩とを結合して得られる、糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
（３１）  膵臓機能改善作用を有する医薬である、上記（２９）または（３０）に記載の糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
（３２）  膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を有する医薬である上記（２９）または（３０）に記載の糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
（３３）  膵外分泌細胞または膵内分泌細胞の再生を促進する作用を有する医薬である上記（２９）または（３０）に記載の糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
【００３３】
（３４）  ＡＬＫ７を認識する抗体とＡＬＫ７に作用する糖尿病の治療および／または予防のための医薬とを結合して得られる融合抗体を膵臓へ選択的に蓄積させることを特徴とする、糖尿病の治療および／または予防のための医薬の輸送方法。
（３５）  糖尿病の治療および／または予防のための医薬が、上記（２８）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記（３４）に記載の方法。
【００３４】
本発明のさらに別の側面によれば、治療および／または予防に有効量の上記（１）から（５）の何れかに記載の蛋白質またはポリペプチドを、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、糖尿病の治療および／または予防のための方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、糖尿病の治療および／または予防のための医薬の製造における、上記（１）から（５）の何れかに記載の蛋白質またはポリペプチドの使用が提供される。
【００３５】
本発明のさらに別の側面によれば、治療および／または予防に有効量の上記（１０）から（１２）の何れかに記載のＤＮＡを、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、糖尿病の治療および／または予防のための方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤の製造における、上記（１０）から（１２）の何れかに記載のＤＮＡの使用が提供される。
【００３６】
【発明の実施の形態】
本発明の医薬に含有される蛋白質としては、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、ＡＬＫ７を挙げることができる。アクチビンＡＢ、アクチビンＢは、ＡＬＫ７のリガンド蛋白質としての活性を有する蛋白質であれば、天然物由来の蛋白質でも、遺伝子工学的手法により製造された蛋白質であってもよく、例えば天然由来の該蛋白質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７のリガンド蛋白質を挙げることができる。
アクチビンＡＢの具体的例としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドより構成される二量体蛋白質を挙げることができ、アクチビンＢの具体的例としては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより構成される二量体蛋白質を挙げることができる。
ＡＬＫ７は、ＡＬＫ７としての活性、すなわちアクチビンＡＢまたはアクチビンＢで活性化され、細胞のインスリン分泌を促進する活性を有する蛋白質であれば天然物由来の蛋白質でも、遺伝子工学的手法により製造された蛋白質であってもよく、例えば天然由来の該蛋白質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７を挙げることができる。
ＡＬＫ７の具体的例としては、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。
【００３７】
また、本発明の医薬に含有される蛋白質としては、
（ａ）配列番号1で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドより構成される二量体蛋白質でありかつＡＬＫ７リガンドとしての活性を有する蛋白質、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドより構成される二量体蛋白質でありかつＡＬＫ７リガンドとしての活性を有する蛋白質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドにより構成される二量体蛋白質でありかつＡＬＫ７リガンドとしての活性を有する蛋白質、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドにより構成される二量体蛋白質でありかつＡＬＫ７リガンドとしての活性を有する蛋白質、
（ｅ）配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質でありかつＡＬＫ７の活性を有する蛋白質、も挙げられる。
【００３８】
また、本発明の医薬に含有されるポリペプチドとしては、アクチビンβＡ鎖、およびアクチビンβＢ鎖を挙げることができる。具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをあげることができる。さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドでありかつ、アクチビンＡＢとしての活性を有する蛋白質を構成するポリペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドでありかつ、アクチビンＡＢまたはアクチビンＢとしての活性を有する蛋白質を構成するポリペプチドも、本発明の医薬に含有されるポリペプチドとして挙げられる。
【００３９】
さらには、上記蛋白質またはポリペプチドに様々なポリペプチドを付加した上記蛋白質またはポリペプチドとの融合蛋白質も本発明の医薬に含有される蛋白質またはポリペプチドである。融合蛋白質の例としては、マルトース結合蛋白質、オリゴ・ヒスチジン、抗体ペプチドエピトープ、ヒト免疫グロブリン定常領域、プロテインＡなどを結合した融合蛋白質を挙げることができる。また、融合蛋白は公知の手法により特異的に切断可能な配列を有することもできる。
【００４０】
配列番号１または２で表されるアミノ酸配列、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７としての活性を有する蛋白質、またはアクチビンＡＢまたはアクチビンＢとしての活性を有する蛋白質を構成するポリペプチドは、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) 等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００４１】
欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１以上であり上限は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００４２】
本発明の医薬に含有される蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および／または付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-アルギニン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、L-システインなどが挙げられる。
【００４３】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【００４４】
また、本発明の医薬に含有される蛋白質またはポリペプチドが、アクチビンＡＢまたはアクチビンＢとしての活性を有する蛋白質またはアクチビンＡＢまたはアクチビンＢとしての活性を有する蛋白質を構成するポリペプチドであるためには、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の同一性を有していることが好ましい。また、本発明の医薬に含有される蛋白質がＡＬＫ７としての活性を有するためには、配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の同一性を有していることが好ましい。
【００４５】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST〔Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)〕やFASTA〔Methods Enzymol., 183, 63 (1990)〕を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている〔J. Mol. Biol., 215, 403(1990)〕。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
【００４６】
本発明の医薬に含有される蛋白質又はポリペプチドが、ＡＬＫ７のリガンドとしての活性を有しているか否を確認する方法としては、例えば、II型アクチビン受容体とＡＬＫ７とを発現する組換え細胞と該蛋白質とを接触させたときの細胞の応答を測定する方法、または膵臓β細胞の形質を保有する培養細胞と該ポリペプチドまたは蛋白質を接触させたときの該培養細胞からのインスリン分泌量を測定する方法などをあげることができる。
【００４７】
細胞の応答の例としては、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下、細胞増殖活性、メラニン色素の凝集または拡散、またはレポーター遺伝子の発現量などをあげることができる。
【００４８】
本発明の医薬に含有される蛋白質が、ＡＬＫ７としての活性を有しているか否かを確認する方法としては、II型アクチビン受容体と該蛋白質とを発現させた組み換え細胞とアクチビンＡＢまたはアクチビンＢを接触させたときの該細胞の応答又は該細胞からのインスリン分泌量を測定する方法などを挙げることができる。細胞応答の例としては上記の応答をあげることができる。
【００４９】
１．アクチビンＡＢ、アクチビンＢおよびＡＬＫ７の取得方法
アクチビンＡＢおよびアクチビンＢのように、完全長ｃＤＮＡが公知である場合、該完全長ｃＤＮＡをもとに、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
【００５０】
ヒトＡＬＫ７のように、完全長ｃＤＮＡが公知でない場合、配列番号１０で表される塩基配列を有するラット由来のＡＬＫ７遺伝子、または公知のヒトＡＬＫ７のＥＳＴ（expressed sequnece tag）をプローブに用いて、例えばヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトＡＬＫ７をコードするｃＤＮＡを単離することができる。得られたｃＤＮＡが全長ｃＤＮＡでない場合は、このクローンをプローブとしたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングや、ＲＡＣＥ法〔rapid amplification of cDNA ends; Frohman MA et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988)〕により全長のｃＤＮＡを取得することができる。
【００５１】
得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列をＤＮＡシークエンサー等を用いて決定し、その塩基配列について各フレームでアミノ酸配列に翻訳した後、公知のラット由来のＡＬＫ７のアミノ酸配列と比較することにより、取得されたｃＤＮＡがヒトＡＬＫ７をコードするＤＮＡであるかを確認することができる。取得されたヒトＡＬＫ７をコードするＤＮＡを用いて、上記したように必要に応じて適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
【００５２】
該ＤＮＡ断片、あるいは完全長ｃＤＮＡを発現ベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、該蛋白質の組換発現ベクターを作製する。具体的には、例えば、配列番号1または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、あるいは配列番号５および６で表される塩基配列を含む完全長ｃＤＮＡが挿入された発現ベクターを作製する。あるいは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡと配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡとが独立のプロモーターにより発現調節されるように配置された同一の発現ベクター内に挿入されていても良い。
【００５３】
該組換発現ベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞内に導入する。
宿主細胞としては、目的とするＤＮＡを発現できるものは全て用いることができ、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、バチルス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属等に属する細菌、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Shizosaccharomyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオミセス（Schwanniomyces）属等に属する酵母や動物細胞、昆虫細胞等を用いることができる。
【００５４】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００５５】
細菌を宿主細胞として用いる場合は、該ＤＮＡ組換発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ポリペプチドのＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換発現ベクターであることが好ましい。ベクターにはプロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００５６】
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、pKK233-2（Amersham Pharmacia Biotech社製）、pSE280（Invitrogen社製)、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pKYP10〔特開昭58-110600〕、pKYP200〔Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK(-)（Stratagene社製）、pGEX（Amersham Pharmacia Biotech社製）、pET-3（Novagen社製）、pTerm2(USP4686191、USP4939094、USP5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕等を例示することができる。
【００５７】
発現ベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したものを用いることが好ましい。
【００５８】
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター、T7プロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、letIプロモーター〔Gene, 44, 29(1986）〕、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００５９】
アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７をコードする部分のＤＮＡの塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように置換することにより、目的とするポリペプチドまたは蛋白質の生産率を向上させることができる。
上記ポリペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００６０】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等を挙げることができる。
【００６１】
組換発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法〔特開昭63-248394〕、またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等を挙げることができる。
【００６２】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
【００６３】
プロモーターとしては、酵母中で機能するものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等を挙げることができる。
【００６４】
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）等を挙げることができる。
【００６５】
組換発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. in Enzymol., 194, 182 (1990)、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163 (1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)に記載の方法等を挙げることができる。
【００６６】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pｃＤＮＡ１．１(Invitrogen社製)、ｐＣＤＭ８（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979；Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem., 101, 1307(1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
【００６７】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００６８】
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７〔特開昭63-299〕等をあげることができる。
【００６９】
組換発現ベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法〔Cytotechnology, 3, 133  (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413  (1987)、Virology, 52, 456(1973)〕等を用いることができる。
【００７０】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ，ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーサプルメント１−３８(1987-1997)、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、ポリペプチドまたは蛋白質を発現することができる。
【００７１】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドまたは蛋白質を発現させることができる。
遺伝子導入用ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃIII（ともにInvitrogen社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
【００７２】
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual、W.H.Freeman and Company，New York，(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（Invitrogen社製）等を用いることができる。
【００７３】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法〔特開平2-227075〕、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84,7413 (1987)〕等をあげることができる。
【００７４】
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング  第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドまたは蛋白質を得ることができる。
【００７５】
該蛋白質のＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に目的ポリペプチドまたは目的蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドまたは蛋白質を採取することにより、目的ポリペプチドまたは目的蛋白質を製造することができる。
アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７を製造するための形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００７６】
上記形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母等の真核生物を宿主細胞とする場合、これら形質転換体を培養する培地は、該宿主細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機物等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００７７】
炭素源としては、それぞれの宿主細胞が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。
【００７８】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
【００７９】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００８０】
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８１】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質転換体を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００８２】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Science, 122, 501 (1952)〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
【００８３】
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８４】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Pharmingen社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Life Technologies社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもJRH Biosciences社製）、Grace's Insect Medium〔Grace, T.C.C.,Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８５】
形質転換体の培養物から、目的ポリペプチドまたは目的蛋白質を単離精製するには、通常のポリペプチドまたは蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、ポリペプチドまたは蛋白質が、細胞内に溶解状態で産生した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のポリペプチドまたは蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(Amersham Pharmacia Biotech社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、ポリペプチドまたは蛋白質の精製標品を得ることができる。
【００８６】
また、ポリペプチドまたは蛋白質が細胞内に不溶体を形成して産生した場合は、細胞を回収後破砕し、遠心分離することにより、沈殿画分としてポリペプチドまたは蛋白質の不溶体を回収する。
回収したポリペプチドまたは蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
可溶化液を希釈あるいは透析して、可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、ポリペプチドまたは蛋白質の構造を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドまたは蛋白質の精製標品を得る。
【００８７】
ポリペプチドまたは蛋白質あるいはその糖修飾体等が細胞外に分泌された場合には、培養上清から、該ポリペプチドまたは蛋白質あるいはその糖修飾体等を回収することができる。即ち、培養物から遠心分離等の手法により培養上清を回収し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００８８】
このようにして取得されるポリペプチドまたは蛋白質として、例えば、配列番号１および２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１および２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドから構成される二量体蛋白質、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドから構成される二量体蛋白質および配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質等をあげることができる。
【００８９】
また、該ポリペプチドまたは蛋白質を、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、米国Advanced ChemTech社製、Perkin-Elmer社製、Amersham Pharmacia Biotech社製、米国Protein Technology Instrument社製、米国Synthecell-Vega社製、米国PerSeptive社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
【００９０】
２．アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７を特異的に認識する抗体の作製
上記１で取得されるポリペプチドまたは蛋白質の部分断片精製標品、あるいは配列番号１または２で表されるアミノ酸配列、配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質のアミノ酸配列を用いて、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７を認識する抗体を作製することができる。
【００９１】
（１）ポリクローナル抗体の作製
アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７または該蛋白質の部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいは該蛋白質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
【００９２】
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
【００９３】
該抗原の投与は、1 回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)〕等で確認する。
【００９４】
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
【００９５】
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産生細胞の調製
免疫に用いた蛋白質の部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
【００９６】
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
【００９７】
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(以下、Ｐ３−Ｕ１と略す)〔Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978)、Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)〕、SP2/0-Ag14(SP-2)〔Nature, 276, 269 (1978)〕、P3-X63-Ag8653(653)〔J. Immunol., 123, 1548 (1979)〕、P3-X63-Ag8(X63)〔Nature, 256, 495 (1975)〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５mmol/l）、２−メルカプトエタノール（５×１０-5mol/l）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０7個以上用いる。
【００９８】
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
【００９９】
得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０8抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。
【０１００】
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０-4mol/l）、チミジン（１．５×１０-5mol/l）およびアミノプテリン（４×１０-7 mol/l）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
【０１０１】
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
【０１０２】
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)〕等に述べられている酵素免疫測定法により、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７の部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
【０１０３】
酵素免疫測定法の具体例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いたアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７の部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行い、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７に特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
【０１０４】
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。
【０１０５】
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０6細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
【０１０６】
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
【０１０７】
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。ポリペプチド量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【０１０８】
３．アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを用いたアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７遺伝子のｍＲＮＡの検出方法
該検出方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番号３または４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、もしくはそれらから得られるＤＮＡ断片等が挙げられる。以下、これらを本発明に用いるＤＮＡとも称する。
該遺伝子のｍＲＮＡの発現量や構造変化を検出する方法としては、例えば（１）ノーザンブロット法（２）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、（３）定量的ＰＣＲ法、（４）デファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、（５）ＤＮＡチップ法、（６）ＲＮａｓｅ保護アッセイ法などの方法等があげられる。
【０１０９】
上記方法による分析に供する検体としては、糖尿病患者ならびに健常者より取得した膵臓組織、血清、唾液等の生体試料、あるいは該生体試料から細胞を取得して試験管内の適当な培地中で培養した初代培養細胞試料から取得したｍＲＮＡあるいは全ＲＮＡが用いられる（以後、該ｍＲＮＡおよび全ＲＮＡを検体由来ＲＮＡと称する）。また、生体試料から取得した組織を、パラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いることもできる。
【０１１０】
ノーザンブロット法では、検体由来ＲＮＡをゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルター等の支持体に転写し、本発明に用いるＤＮＡより調製した標識プローブを用いて、ハイブリダイゼーションならびに洗浄を行うことで、該遺伝子ｍＲＮＡに特異的に結合したバンドを検出することにより、該遺伝子ｍＲＮＡの発現量ならびに構造の変化を検出することができる。ハイブリダイゼーションを行う際には、プローブと検体由来ＲＮＡ中の該遺伝子ｍＲＮＡが安定なハイブリッドを形成する条件でインキュベーションする。偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼーションならびに洗浄工程は高ストリンジェントな条件で行うことが望ましい。この条件は、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、およびホルムアミド濃度等の多数の因子により決定される。これらの因子は、例えば、モレキュラー・クローニング  第２版に記載されている。
【０１１１】
ノーザンブロット法に用いる標識プローブは、例えば、公知の方法(ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングまたはキナージング)により放射性同位体、ビオチン、蛍光基、化学発光基等を、本発明に用いるＤＮＡあるいは該ＤＮＡの配列から設計したオリゴヌクレオチドに取り込ませることで調製することができる。標識プローブの結合量は該遺伝子ｍＲＮＡの発現量を反映することから、結合した標識プローブの量を定量することで該遺伝子ｍＲＮＡの発現量を定量することができる。また、標識プローブ結合部位を分析することで、該遺伝子ｍＲＮＡの構造変化を知ることができる。
【０１１２】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、上記標識プローブと、生体から取得した組織をパラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄の工程を行うことにより、該遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出する方法である。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で、偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼーションならびに洗浄工程は高ストリンジェントな条件で行うことが望ましい。この条件は、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、およびホルムアミド濃度等の多数の因子により決定される。これらの因子は、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載されている。
【０１１３】
定量的ＰＣＲ法、デファレンシャル・ハイブリダイゼーション法またはＤＮＡチップ法等の該遺伝子のｍＲＮＡの検出法は、検体由来ＲＮＡに、オリゴｄＴプライマーあるいはランダムプライマーおよび逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成することに基づいた方法で行うことができる（以後、該ｃＤＮＡを検体由来ｃＤＮＡと称する）。検体由来ＲＮＡがｍＲＮＡの場合は、上記いずれのプライマーも用いることができるが、該検体由来ＲＮＡが全ＲＮＡである場合は、オリゴｄＴプライマーを用いる。
【０１１４】
定量的ＰＣＲ法では、検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとし、アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、該遺伝子のｍＲＮＡ由来のＤＮＡ断片を増幅する方法である。増幅ＤＮＡ断片の量は該遺伝子のｍＲＮＡの発現量を反映することから、アクチンやG3PDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)等をコードするＤＮＡを内部コントロールとして置くことで該遺伝子のｍＲＮＡの量を定量することが可能である。また、増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動により分離することで、該遺伝子のｍＲＮＡの構造の変化を知ることもできる。本検出法では、標的配列を特異的にかつ効率的に増幅する適当なプライマーを用いることが望ましい。適当なプライマーは、プライマー間の結合やプライマー内の結合を起こさず、アニーリング温度で標的ｃＤＮＡと特異的に結合して、変性条件で標的ｃＤＮＡからはずれる等の条件に基づき設計することができる。増幅ＤＮＡ断片の定量は増幅産物が指数関数的に増加しているＰＣＲ反応の内に行うことが必要である。このようなＰＣＲ反応は、各反応ごとに生産される該増幅ＤＮＡ断片を回収してゲル電気泳動で定量分析することで知ることができる。
【０１１５】
デファレンシャル・ハイブリダイゼーション法〔Trends in Genetics, 7, 314-317(1991)〕やＤＮＡチップ法〔Genome Research, 6, 639-645(1996)〕は、検体由来ｃＤＮＡをプローブとして、本発明に用いるＤＮＡを固定化させたフィルターまたはスライドガラスあるいはシリコンなどの基板に対して、ハイブリダイゼーションならびに洗浄を行うことにより、該遺伝子ｍＲＮＡの発現量の変動を検出する方法である。いずれの方法もフィルターまたは基板上に、アクチンやＧ３ＰＤＨなどの内部コントロールを固定化することで、対照検体と標的検体の間での該遺伝子のｍＲＮＡの発現の違いを正確に検出することができる。また対照検体と標的検体由来のＲＮＡを基にそれぞれ異なる標識ｄＮＴＰを用いて標識ｃＤＮＡ合成を行い、フィルターまたは基板に二つの標識ｃＤＮＡプローブを同時にハイブリダイズさせることにより正確な該遺伝子のｍＲＮＡの発現量の定量を行うことができる。
【０１１６】
ＲＮａｓｅ保護アッセイ法は、以下の方法により行う。まず、本発明に用いるＤＮＡの３’末端にＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどのプロモーター配列を結合し、ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏの転写系により標識したｒＮＴＰを用いて、標識したアンチセンスＲＮＡを合成する。該標識アンチセンスＲＮＡを検体由来ＲＮＡと結合させて、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させた後、ＲＮａｓｅで消化し、消化から保護されたＲＮＡ断片をゲル電気泳動によりバンドを形成させ検出する。得られたバンドを定量することで、該遺伝子のｍＲＮＡの発現量を定量することができる。
【０１１７】
４．アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的検出または定量方法
アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）を用いて、微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の細胞内あるいは細胞外に発現したアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法〔単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック）（１９８７）、続生化学実験講座５  免疫生化学研究法（東京化学同人）（１９８６）〕などが挙げられる。
【０１１８】
蛍光抗体法とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質でラベルした抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
【０１１９】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
【０１２０】
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
【０１２１】
免疫細胞染色法、免疫組織染色法などの免疫組織化学染色法とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
【０１２２】
ウェスタンブロッティング法とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動〔Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, （1988）〕で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、確認する方法である。
【０１２３】
ドットブロッティング法とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜にアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、確認する方法である。
【０１２４】
免疫沈降法とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体と反応させた後、プロテインＧ−セファロース等イムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体で、抗原認識部位の異なる２種類の抗体のうち、あらかじめ一方の抗体をプレートに吸着させ、もう一方の抗体をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素で標識しておき、抗体吸着プレートに、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液を反応させた後、標識した抗体を反応させ、結合した標識物質により検出を行う方法である。
【０１２５】
５．アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの変異同定方法
当該方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、もしくはそれらから得られるＤＮＡ断片等があげられる。
【０１２６】
アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７遺伝子座中に存在する糖尿病の原因となる変異の存在の有無を評価するための最も明確な試験は、対照集団からの遺伝子と糖尿病患者からの遺伝子とを直接比較することである。
【０１２７】
具体的には糖尿病患者ならび健常人から、膵臓組織、血清、唾液等のヒト生体試料あるいは、該生体試料から樹立した初代培養細胞由来の試料を集め、該生体試料ならびに該初代培養細胞由来試料中からＤＮＡを抽出する（以後、該ＤＮＡを検体由来ＤＮＡと称する）。該検体由来ＤＮＡは、直接あるいは配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いて増幅したアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを試料ＤＮＡとして用いることができる。別法として、該検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーによりＰＣＲを行うことで増幅したＤＮＡ断片を試料ＤＮＡとして用いることができる。
【０１２８】
アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡに糖尿病の原因となる変異があるかどうかを検出する方法として、野生型対立遺伝子を有するＤＮＡ鎖と変異対立遺伝子を有するＤＮＡ鎖とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法を用いることができる。
【０１２９】
ヘテロ二本鎖を検出する方法としては、（１）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法〔Trends Genet., 7, 5 (1991)〕、（２）一本鎖コンフォメーション多型解析法〔Genomics, 16, 325-332 (1993)〕、（３）ミスマッチの化学的切断法（CCM, chemical cleavage of mismatches）[Human Genetics (1996), Tom Strachan and Andrew P. Read, BIOS Scientific Publishers Limited]、（４）ミスマッチの酵素的切断法〔Nature Genetics, 9, 103-104 (1996)〕、（５）変性ゲル電気泳動法〔Mutat. Res., 288, 103-112 (1993)〕 等の方法をあげることができる。
【０１３０】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法は、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いたＰＣＲによって、２００ｂｐよりも小さい断片としてアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの断片を増幅し、該増幅ＤＮＡ断片を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、変異を有さないホモ二本鎖と泳動度を比較する方法である。アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの変異によりヘテロ二本鎖が形成された場合は、変異を持たないホモ二本鎖よりもゲルの移動度が遅く、それらはホモ二本鎖と異なるバンドとして検出することができる。該電気泳動には、市販のゲル〔Ｈｙｄｒｏ−ｌｉｎｋ，ＭＤＥ（ＦＭＣ社製）など〕を用いることもできる。また、２００ｂｐよりも小さいＤＮＡ断片を用いたヘテロ二本鎖検出法では、１塩基の挿入、欠失および置換を検出可能である。ヘテロ二本鎖解析は、次に述べる一本鎖コンフォメーション多型解析と組み合わせた１枚のゲルで行うことが望ましい。
【０１３１】
一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＰ解析；single strand conformation polymorphism analysis）は、検体由来ＤＮＡまたは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いたＰＣＲにより、２００ｂｐよりも小さい断片として増幅したアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを変性後、未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動する方法である。ＤＮＡの増幅を行う際にプライマーを放射性同位体あるいは蛍光色素で標識するか、または未標識の増幅産物を銀染色することにより、増幅したアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡをバンドとして検出することができる。野生型の泳動パターンとの相違を明らかにするために、コントロールの検体も同時に電気泳動すると、塩基配列に変異を持った断片を移動度の違いから検出することができる。
【０１３２】
ミスマッチの化学的切断法（ＣＣＭ法）は、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーでアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡ断片を増幅させ、該増幅ＤＮＡ断片と配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡに放射性同位体あるいは蛍光色素をとり込ませた標識ＤＮＡとをハイブリダイズさせ、四酸化オスミウムで処理することでミスマッチしている場所のＤＮＡの一方の鎖を切断させ塩基配列の変異を検出する方法である。ＣＣＭ法は最も感度の高い検出法の１つであり、キロベースの長さの検体にも適応できる。
【０１３３】
上記、四酸化オスミウムの代わりにＴ４ファージリゾルベースとエンドヌクレアーゼＶＩＩのような細胞内でミスマッチの修復に関与する酵素とＲＮａｓｅＡと組み合わせることで、酵素的にミスマッチを切断することもできる。
【０１３４】
変性ゲル電気泳動法（denaturing gradient gel electrophoresis：DGGE法）は、検体由来ＤＮＡまたは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡ断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを用いて電気泳動する方法である。増幅したＤＮＡ断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで移動し、変性後は移動しなくなる。アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡに変異がある場合とない場合では増幅したＤＮＡのゲル内での移動度が異なることから、変異の存在を検出することが可能である。ＰＣＲに使用するそれぞれのプライマーにポリ（Ｇ：Ｃ）端末を付けて検出感度を上げることもできる。
【０１３５】
糖尿病の原因遺伝子を検出する別の方法として、蛋白質短縮試験（protein truncation test：ＰＴＴ法）〔Genomics, 20, 1-4 (1994)〕がある。該試験により蛋白質の欠損を生み出すフレームシフト突然変異、スプライス部位突然変異、ナンセンス突然変異を特異的に検出することができる。ＰＴＴ法は、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの５’末端にＴ７プロモーター配列と真核生物翻訳開始配列をつないだプライマーを設計し、該プライマーを用いて検体由来ＲＮＡより逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法でアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするｃＤＮＡを作製する。該ｃＤＮＡを用い、in vitro転写、翻訳を行うと蛋白質が生産される。該蛋白質をポリアクリルアミド電気泳動して、該蛋白質の泳動位置が完全長蛋白質に相当する位置にあれば欠損を生み出す変異は存在せず、該蛋白質に欠損がある場合は、完全長蛋白質より短い位置に該蛋白質は泳動され、該位置より欠損の程度を知ることができる。
【０１３６】
検体由来ＤＮＡおよび検体由来ｃＤＮＡの塩基配列を決定するために配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡに基づいて設計したプライマーを用いることが可能である。決定された塩基配列を解析することにより、検体由来ＤＮＡまたは検体由来ｃＤＮＡに糖尿病の原因となる変異があるか否かを判別することができる。
【０１３７】
アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７遺伝子のコード領域以外の変異は、該遺伝子の付近またはその中のイントロンおよび調節配列などの、非コード領域を検査することによって検出することができる。非コード領域中の変異に起因する糖尿病は、上記に記載した方法と同様の方法により検出することができる。
【０１３８】
このようにして非コード領域における変異の存在が示唆された該遺伝子については、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡをハイブリダイゼーションのプローブとして用いることにより、クローン化することができる。非コード領域における変異は上述のいずれかの方法に準じて探索することができる。
【０１３９】
見出された変異は、Handbook of Human Genetics Linkage. The John Hopkins University Press, Baltimore(1994)に記載された方法に従い統計処理を行うことで、糖尿病との連鎖があるＳＮＰｓ(シングル・ヌクレオチド・ポリモルフィズム）として同定することができる。また、糖尿病の病歴を持つ家族から、先に示した方法に従いＤＮＡを取得し、変異を検出することで、糖尿病の原因遺伝子を同定することができる。
【０１４０】
６．アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを用いた糖尿病の診断方法
上記方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、もしくはそれらから得られるＤＮＡ断片等があげられる。
糖尿病の原因は、ヒトのいずれかの組織における遺伝子の変異を検出することによって確認することができる。例えば、生殖細胞系に変異がある場合、当該変異を遺伝した個人は、糖尿病を発症し易い傾向である可能性がある。当該変異は、該個人の体のいずれかの組織から抽出したＤＮＡを試験することによって検出することができる。例えば、ヒトから採血した血液の細胞からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを用いて、遺伝子の変異を検出することにより、糖尿病を診断することができる。また、胎児細胞、胎盤細胞または羊膜細胞を採取してＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを用いて、遺伝子の変異を検出することにより、出生前の糖尿病診断を行うことができる。
【０１４１】
また糖尿病を発症した患者の、病巣部位の生体組織からＤＮＡを取得し、遺伝子の変異を検出することにより、糖尿病の種類を診断し、投与する薬物の選択などに利用することができる。生体組織からのＤＮＡは、周囲の正常組織から遊離した病巣部位の組織を単離してトリプシンなどで処理し、得られた細胞を適当な培地で培養し、培養した細胞から染色体ＤＮＡならびにｍＲＮＡを抽出することにより取得することができる。
【０１４２】
以下、診断を目的としてヒト検体から上記いずれかの方法で取得したＤＮＡを診断検体由来ＤＮＡと称する。また、診断を目的としてヒト検体から上記いずれかの方法で取得したＲＮＡより合成したｃＤＮＡを診断検体由来ｃＤＮＡと称する。
配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、および診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡを用い、上記５のアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの変異を検出する方法に準じた方法により糖尿病の診断を行うことができるが、上記５の方法により、糖尿病との因果関係が見出された変異を診断検体由来ＤＮＡまたは診断検体由来ｃＤＮＡが有しているか否かを診断する方法としては、（１）制限酵素部位の検出、（２）対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを利用する方法（ASO：allele specific oligonucleotide hybridization）、（３）対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ（ARMS：amplification refractory mutation system）、（４）オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（OLA：oligonucleotide ligation assay）、（５）PCR-PHFA法（PCR-preferential homoduplex formation assay）、（６）オリゴＤＮＡアレイを用いる方法〔蛋白質核酸酵素、43, 2004-2011 (1998)〕等の方法が挙げられる。
【０１４３】
制限酵素部位の検出は、以下に記載の方法に従い行うことができる。すなわち、単一塩基の変化により制限酵素部位が消失または発生する場合は、診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡを、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてPCRで増幅したのち、制限酵素で消化し、得られた制限酵素切断ＤＮＡ断片を正常人の場合と比較することで簡便に変異を検出することができる。さらに詳細に塩基の変化を診断する方法としては、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列情報ならびに上記５の方法により同定された変異の情報を組合せることでオリゴヌクレオチドプロ−ブを設計し、該オリゴヌクレオチドプローブをフィルターに結合させてハイブリダイズを行うリバースドットブロット法で変異を検出する方法を挙げることができる。
【０１４４】
対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（ＡＳＯ）を利用する方法は、短い合成ＤＮＡプローブが、完全に対合する塩基配列とのみハイブリダイズする特徴を利用した方法で、１塩基の変異を容易に検出することができる。具体的には、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列と、上記５で同定された塩基の変異に基づき設計したオリゴヌクレオチドをフィルターに結合させ、診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして用い、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列を用いて設計したプライマーと標識したｄＮＴＰを用いたＰＣＲにより得られる増幅ＤＮＡ断片をプローブに用いてハイブリダイズを行うリバースドットブロット法をあげることができる。
【０１４５】
リバースドットブロットとは、スライドガラスまたはシリコンなどの基盤に直接、測定対象とするＤＮＡに対応する変異のないＤＮＡの塩基配列と別途同定された該ＤＮＡの変異に基づき設計したオリゴヌクレオチドを合成して、高密度のアレイであるＤＮＡチップを用いて、少量の診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡを反応させて多様な変異をより簡便に検出する方法である。本方法は、大規模な診断目的に適した変異検出法である。
【０１４６】
塩基の変異は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）法によって以下に示す方法によっても検出できる。
調べようとするアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの変異部位をその３’末端に有する２０塩基程度のオリゴヌクレオチド、および該変異部位に続く２０塩基程度のオリゴヌクレオチドを配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計、合成する。このとき、例えば前者のオリゴヌクレオチドの５’末端にはビオチンを、後者のオリゴヌクレオチドの３’末端にはジゴケシゲニンなどの異なる標識体を付加しておく。次に診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用い、ＰＣＲによりアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを増幅する。次に該増幅ＤＮＡ断片と上記２本のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後、ＤＮＡリガーゼで２本のオリゴヌクレオチドを連結させる。連結反応後、2本鎖ＤＮＡを熱変性させて得られるビオチン標識一本鎖ＤＮＡを、例えばアビジンに結合するＤＮＡとして回収する。変位部位を有する増幅ＤＮＡ断片とハイブリダイズした上記２種類のオリゴヌクレオチドは上記連結反応により連結しているので、その３’末端にジゴケシゲニンを有するＤＮＡとして得られ、該結合ＤＮＡを簡単に検出することができる。よって、変位を有するアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを迅速、簡便に検出可能である。ＯＬＡは電気泳動や遠心分離操作が不要なために、多数のサンプルを効果的に短期間で診断するのに適した変異検出法である。
【０１４７】
また、以下のPCR-PHFA法により微量な変異遺伝子を定量的かつ容易に検出することができる。
PCR-PHFA法は、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）、非常に高い特異性を示す液相でのハイブリダイゼーション、およびELISAと同様の操作でＰＣＲ産物を検出するED-PCR(enzymatic detection of PCR product)の３つを組み合わせた方法である。dinitrophenyl(DNP)標識およびビオチン標識したプライマーセットを用いて、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行い、両末端標識増幅ＤＮＡ断片を調製する。次に、標識プライマーと同じ塩基配列を有する未標識プライマーセットを用いて、診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに増幅して得られる非標識増幅ＤＮＡ断片を、該標識増幅ＤＮＡ断片と混合する。このとき非標識増幅ＤＮＡ断片は標識増幅ＤＮＡ断片に対し、２０〜１００倍の大過剰量を用いる。そして該混合物を熱変性処理後、１℃／５分〜１０分間程度の緩やかな温度勾配で冷却し、完全な相補鎖を優先的に形成させる。こうして再形成された標識ＤＮＡは、ビオチンを介してストレプトアビジン固定化ウエルに捕獲吸着させ、ＤＮＰを介して酵素標識抗ＤＮＰ抗体を結合させて酵素による発色反応により検出する。検体中に標識ＤＮＡと同じ配列の遺伝子が存在しない場合は、元の２本鎖の標識ＤＮＡが優先的に再形成されて発色を示す。これに対し、同じ塩基配列の遺伝子が存在する場合は、相補鎖の置換がランダムに生じるため再形成される標識ＤＮＡは減少するので、発色は著しく低下する。これにより、既知の変異・多型遺伝子の検出・定量が可能となる。
【０１４８】
７．アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を用いた糖尿病の診断方法
ヒト生体試料ならびヒト初代培養細胞での、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質の発現量の変化ならびに発現している蛋白質の構造変化を同定することは、糖尿病を発症する危険性や既に発症した膵臓機能低下の原因を知る上で有用である。
【０１４９】
アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質の発現量や構造変化を検出して診断する方法としては、上記４に記載した蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などがあげられる。
【０１５０】
上記方法による診断に供する検体としては、患者より取得した膵臓病巣部位の組織、血液、血清、尿、便、唾液などの生体試料そのものあるいは、該生体試料から取得した細胞ならびに細胞抽出液が用いられる。また、生体試料から取得した組織を、パラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いることもできる。
【０１５１】
８．アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、または該蛋白質のいずれかを認識する抗体を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法に用いられる蛋白質としては、アクチビンＡＢ、アクチビンＢおよびＡＬＫ７を挙げることができる。アクチビンＡＢ、アクチビンＢは、ＡＬＫ７のリガンド蛋白質としての活性を有する蛋白質であれば、天然物由来の蛋白質でも、遺伝子工学的手法により製造された蛋白質であってもよく、例えば天然由来の該蛋白質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７のリガンド蛋白質を挙げることができる。
アクチビンＡＢの具体的例としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドより構成される二量体蛋白質を挙げることができ、アクチビンＢの具体的例としては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより構成される二量体蛋白質を挙げることができる。
ＡＬＫ７は、ＡＬＫ７としての活性、すなわちアクチビンＡＢまたはアクチビンＢで活性化され、細胞のインスリン分泌を促進する活性を有する蛋白質であれば天然物由来の蛋白質でも、遺伝子工学的手法により製造された蛋白質であってもよく、例えば天然由来の該蛋白質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７を挙げることができる。
ＡＬＫ７の具体的例としては、配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられるＤＮＡとしては、アクチビンＡＢ、アクチビンＢおよびＡＬＫ７をコードするＤＮＡを挙げることができる。該ＤＮＡは、上記本発明のスクリーニング方法に用いられる蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよい。
アクチビンＡＢ、またはアクチビンＢをコードするＤＮＡの具体的例としては、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。またＡＬＫ７をコードするＤＮＡの具体的例としては、配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、配列番号１０で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
本発明のスクリーニング方法に用いられる抗体としては、上記本発明のスクリーニング方法に用いられる蛋白質、またはそのポリペプチド断片を認識する抗体をあげることができる。
【０１５２】
（１）アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質に特異的に作用する化合物のスクリーニング
ＡＬＫ７蛋白質をII型アクチビン受容体と共に発現するように形質転換した微生物、動物細胞、または昆虫細胞、および精製したアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質は、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質に特異的に作用する化合物をスクリーニングするために有用である。II型アクチビン受容体としては、II型アクチビン受容体としての活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、例えばCell, 65, 973-982(1991)に記載されているActRIIA等を挙げることができる。スクリーニングにより得られた化合物は、糖尿病治療薬として有用である。
【０１５３】
上記スクリーニングの１つの方法は、ＡＬＫ７蛋白質とII型アクチビン受容体を生産するように形質転換した動物細胞（以後、探索用形質転換体と称する）において、ＡＬＫ７の活性化を特異的に誘導する化合物を選択することである。ＡＬＫ７の活性化を検出する方法としては、該探索用形質転換体の細胞応答を測定する方法を挙げることができる。
【０１５４】
具体的な細胞の応答としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下、細胞増殖活性、メラニン色素の凝集または拡散、またはレポーター遺伝子の発現変動などをあげることができる〔J. Biol. Chem., 271, 1857 (1996)、Science, 268, 98 (1995) 、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 275, 1274 (1995)、J. Biol. Chem., 272, 1822 (1997)、 Journal of Receptor and Signal Transduction Research, 17, 57 (1997)、Endocrinology 138, 1400 (1997)、Endocrinology 138, 1471 (1997)、 Nat. Biotechnol., 16, 1334 (1998)、Biochem. Biophys. Res. Commun., 251, 471 (1998)、Brit. J. Pharmacol., 125, 1387 (1998)、Trends Biotechnol., 15, 487 (1997)、Anal. Biochem., 252, 115 (1997)、Nature, 358, 325 (1992)、Nature, 393, 272 (1998)、Cell, 92, 573 (1998)、J. Biol. Chem., 272,27497 (1997)、Trends Pharmacol. Sci., 18, 430 (1997)、Trends Pharmacol.Sci., 20, 370 (1999)、WO98/46995〕。
【０１５５】
レポーター遺伝子を用いて細胞の応答をモニターする場合は、例えば、該探索用形質転換体に、ＡＬＫ７の活性化により発現が誘導される遺伝子のプロモーター配列の下流に適当なレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを導入することにより、ＡＬＫ７の活性化をレポーター遺伝子の発現で測定することができる。該プロモーターとしては、例えばＩＣＡＭ−１遺伝子のプロモーター、ｃ−ｆｏｓのプロモーター、Ｋｒｏｘ−２４のプロモーター〔Biochem. J., 320, 145 (1996)〕、インスリン遺伝子のプロモーター、コリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター、チロシンハイドロキシラーゼ遺伝子のプロモーターなどが利用できる。また、該プロモーターは、適当な転写因子の結合配列と基本プロモーターからなる人工プロモーターでもよい。転写因子の結合配列としては、例えばＣＲＥ（CREB binding element）、ＴＲＥ（TPA responsive element）、ＳＲＥ（serum responsive element）、ＳＢＥ−ｌｕｘプロモーター〔J. Biol. Chem., 273, 21145-21152 (1998)〕などが利用できる。レポーター遺伝子としては、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子などが利用できる。
【０１５６】
また、精製したアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質、または該蛋白質の一部を構成するポリペプチドは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質に特異的に結合する標的化合物を選択するのに用いることができる。例えば、該蛋白質を固相担体等に固定しておき、被験試料を接触させた後、十分に該プレートを洗浄し、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質に結合している化合物を該蛋白質から遊離させることにより、標的化合物を選択することができる。
【０１５７】
上記スクリーニングのもう１つの方法としては、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質の一部を構成するペプチドを多数、プラスチックピンまたはある種の固体支持体上で高密度に合成し、該ペプチドに選択的に結合する化合物あるいは蛋白質を効率的にスクリーニングする方法がある（ＷＯ84/03564）。
【０１５８】
（２）アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの転写あるいは翻訳を調節する化合物のスクリーニング方法
膵臓由来の細胞株で、アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のｍＲＮＡあるいはアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質の発現を促進する活性を有する化合物も、糖尿病治療薬として有用である。膵臓由来の細胞株としては、マウス膵臓β細胞種ＭＩＮ６細胞［Endocrinology, 127, 126-132（1990）］、マウスインスリノーマ細胞ＮＩＴ−１細胞 （ATCC CRL-2055）、マウス膵臓α細胞種αＴＣ１細胞（ATCC CRL-2350）、ラット膵管上皮細胞ＡＲＩＰ細胞（ATCC CRL-1674）などを挙げることができる。
【０１５９】
膵臓由来の細胞株と種々の被験試料を接触させた場合と、被験試料を接触させない場合での該細胞株におけるアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定、比較することでアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子の転写を抑制または促進する物質をスクリーニングすることができる。アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、上記３のＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＲＮase保護アッセイ法により検出することができる。
【０１６０】
また、膵臓由来の細胞株と種々の被験試料を接触させた場合と、被験試料を接触させない場合での該細胞株におけるアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質の発現量を測定、比較することでアクチビンＡＢ、アクチビンＢならびにＡＬＫ７遺伝子の転写もしくは翻訳を抑制または促進する物質をスクリーニングすることができる。アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質の発現量は、上記４のアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を用いた蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定することができる。
【０１６１】
さらに、アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結した組換え体ＤＮＡで形質転換された動物細胞と種々の被験試料を接触させた場合と、被験試料を接触させない場合での該動物細胞における該レポーター遺伝子の発現量を測定、比較することでアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子の発現を抑制または促進する物質をスクリーニングすることができる。アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のプロモーターは、該プロモーターの塩基配列が公知である場合は、該配列に従い設計、合成することができるオリゴヌクレオチドを用いて動物由来の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにて取得することができる。プロモーター配列が公知でない場合は、上記遺伝子のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドをプローブとして、公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）〕を用いて、該遺伝子のプロモーター領域を取得することができる。
【０１６２】
細胞中のレポーター遺伝子の発現量は公知の方法〔東京大学医科学研究所 制癌研究部編, 新細胞工学実験プロトコール, 秀潤社 (1993)、Biotechniques, 20, 914 (1996)、J. Antibiotics, 49, 453 (1996) 、Trends in Biochemical Sciences, 20, 448 (1995)、細胞工学, 16, 581 (1997)〕を用いて測定することができる。
【０１６３】
レポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子等をあげることができる。
【０１６４】
上記の方法により取得した化合物は、NOD(Non-Obese Diabetes)マウスなどの糖尿病モデル動物に薬剤として投与し、該動物のインスリン分泌量ならびに血糖値などを公知の方法に従って測定することにより、該化合物のその糖尿病への治療効果を評価することが可能である。
【０１６５】
９．アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬
アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質は、膵機能低下を原因とする種々の糖尿病において、膵臓の構造ならびに機能を再構築することならびに膵臓からのインスリン分泌を促進することに用いることができる。
【０１６６】
上記アクチビンＡＢ、アクチビンＢは、ＡＬＫ７のリガンド蛋白質であれば天然由来のものでも、遺伝子工学的手法によって製造された組み換え蛋白質であってもよい。天然由来のＡＬＫ７のリガンド蛋白質としては、例えばヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、マウス、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７リガンド蛋白質をあげることができるが、ヒト糖尿病の治療および／または予防のための医薬、すなわち膵臓機能改善剤、膵臓再生促進剤として用いる場合は、ヒト由来のＡＬＫ７リガンド蛋白質とアミノ酸配列が一致する蛋白質を用いることが好ましい。
【０１６７】
アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬は、有効成分として該蛋白質のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
【０１６８】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、あるいは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
【０１６９】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０１７０】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該ポリペプチドそのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該ポリペプチドを微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該ポリペプチドおよび用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１７１】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり10μｇ/kg〜８mg/kgである。
【０１７２】
１０．アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７を特異的に認識する抗体を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬
アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７を特異的に認識する抗体を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬は、該有効成分を単独で投与することも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましい医薬製剤形態、および投与方法等は、上記９のとおりである。
【０１７３】
１１．上記８のスクリーニング方法により得られた化合物を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬
上記８のスクリーニング方法により得られた化合物を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬は、該有効成分を単独で投与することも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましい医薬製剤形態等は、および投与方法等は、上記９のとおりである。
【０１７４】
１２．アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７蛋白質をコードするＤＮＡを含有する糖尿病用遺伝子治療剤
アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７蛋白質をコードするＤＮＡを糖尿病の遺伝子治療薬とてして用いる方法としては、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記９に記載した常法に従って製剤化、処方および投与する方法、あるいは非ウイルス遺伝子移入法により投与する方法をあげることができる。
【０１７５】
組換えウイルスベクターは、以下に記載の方法に従い作製することができる。
アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７蛋白質の完全長ｃＤＮＡをもとに、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、あるいは完全長ｃＤＮＡをウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスベクターを造成する。
【０１７６】
ＲＮＡウイルスベクターの場合には、アクチビンＡＢ、アクチビンＢの完全長ｃＤＮＡに相同なＲＮＡ断片を調製し、それらをウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスを造成する。ＲＮＡ断片は、２本鎖のほか、ウイルスベクターの種類に応じて、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のどちらか一方の鎖を選択する。例えば、レトロウイルスベクターの場合は、センス鎖に相同なＲＮＡを、センスウイルスベクターの場合には、アンチセンス鎖に相同なＲＮＡを選択する。
【０１７７】
該組換えウイルスベクターを、該ベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。
パッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要な蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクターの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいかなるものでもよい。例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３などを用いることができる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなど、レンチウイルスベクターの場合はＨＩＶウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆなど、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂなど、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５，ｐ１９，ｐ４０）、Ｖｐ（Ｃａｐ）などの蛋白質があげられる。
【０１７８】
ウイルスベクターとしては、上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞でアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはＭＦＧ[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,6733-6737 (1995)]、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ[Nucleic Acids Res., 18, 3587-3596 (1990)]、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ[Journal of Virology, 72, 8150-8157(1998)]、ｐＡｄｅｘ１[Nucleic Acids Res., 23, 3816-3821(1995)]等が用いられる。プロモーターとしては、ヒト組織中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法〔特開平2-227075号公報〕、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
【０１７９】
また、上記組換えウイルスベクターの投与方法としては、上記９の方法に加え、リポソームデリバリーを用いる直接的イン・ビボ(in vivo)遺伝子移入と組み合わせることにより、膵臓病巣にウイルスベクターを指向させるようにすることもできる。
すなわち、適当なサイズのアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン-コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。
【０１８０】
アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７遺伝子のＤＮＡは、非ウイルス遺伝子移入法によっても病巣に輸送することができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法[Virology, 52, 456-467 (1973)；Science, 209, 1414-1422 (1980)]、マイクロインジェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 5399-5403 (1980)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 7380-7384 (1980)；Cell, 27, 223-231 (1981)；Nature, 294, 92-94 (1981)]、リポソームを介した膜融合-介在移入法[Proc. Natl.Acad. Sci. USA，84, 7413-7417 (1987)；Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989)；J. Biol. Chem., 264, 12126-12129 (1989)；Hum. Gene Ther., 3, 267-275,(1992)；Science, 249, 1285-1288 (1990)；Circulation, 83, 2007-2011 (1992)]あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体-媒介ＤＮＡ移入法[Science, 247,1465-1468 (1990)；J. Biol. Chem., 266, 14338-14342 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 3655-3659 (1991)；J. Biol. Chem., 264, 16985-16987 (1989)；BioTechniques, 11, 474-485 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 3410-3414 (1990)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88, 4255-4259 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 4033-4037 (1990)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88, 8850-8854 (1991)；Hum. Gene Ther., 3, 147-154 (1991)]等をあげることができる。
【０１８１】
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能であることが腫瘍に関する研究において報告されている[Hum. Gene Ther.3, 399-410 (1992)]。したがって同様の効果が膵臓病巣でも期待される。ＤＮＡを膵臓病巣に直接標的化するには、直接ＤＮＡ取り込み技術が好ましい。受容体-媒介ＤＮＡ移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドにＤＮＡ(通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる)をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド-ＤＮＡコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびＤＮＡ-蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮＡの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
【０１８２】
１３．ＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を用いて膵臓に特異的に薬物を輸送する方法（ドラッグデリバリー方法）
当該ドラッグデリバリー方法に用いられる抗体は、ＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体であればいずれでも良いが、特にヒト化抗体を用いることが望ましい。
【０１８３】
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型CDR（Complementary Determining Region;相補性決定領域；以下、CDRと記す）移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はH鎖として、可変領域はV領域としてHVまたはVHとも称す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はL鎖としてLVまたはVLとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はC領域としてCHとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、CLとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【０１８４】
ＡＬＫ７蛋白質に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、VHおよびVLをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体CHおよびヒト抗体CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。
【０１８５】
ヒト型キメラ抗体のCHとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、hIgと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、更にhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のCLとしては、hIgに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【０１８６】
ヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列をヒト抗体のVHおよびVLの適切な位置に移植した抗体を意味する。
ヒト型CDR 移植抗体は、ＡＬＫ７蛋白質に反応し、ＡＬＫ７蛋白質に結合する、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDR 配列で任意のヒト抗体のVHおよびVLのCDR 配列をそれぞれ置換したV 領域をコードするcＤＮＡを構築し、ヒト抗体のCHおよびヒト抗体のCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型CDR 移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
【０１８７】
ヒト型CDR移植抗体のCHとしては、hIgに属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、更にhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型CDR移植抗体のCLとしては、hIgに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【０１８８】
ヒト抗体は、元来、ヒトの体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
【０１８９】
ヒトの体内に存在する抗体は、例えば、以下の方法により取得することができる。
ヒト末梢血リンパ球を単離し、EBウイルス等を感染させ不死化させた後、クローニングする。得られた目的とする抗体を産生するリンパ球を培養し、培養物中より該抗体を取得することができる。
【０１９０】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトB細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することにより、Fab、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、完全型ヒト抗体へ変換することができる。
【０１９１】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスES細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ES細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法としては、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させる方法があげられる。
【０１９２】
抗体断片としては、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（dsFv）、CDRを含むペプチドなどがあげられる。
Fabは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（H鎖の224番目のアミノ酸残基で切断される）、H鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Fabは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。また、該抗体のFabをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現させることによりFabを取得することができる。
【０１９３】
F(ab')2は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（H鎖の234番目のアミノ酸残基で切断される）、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
F(ab')2は、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。また、該抗体のF(ab')2をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現させることにより、F(ab')2を取得することができる。
【０１９４】
Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Fab'は、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。また、該抗体のFab'断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現させることにより、Fab'を取得することができる。
【０１９５】
一本鎖抗体（以下、scFvとも称す）は、一本のVHと一本のVLとを適当なペプチドリンカー（以下、Pと称す）を用いて連結した、VH−P−VLないしはVL−P−VHポリペプチドを示す。本発明で使用されるscFvに含まれるVHおよびVLは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体から由来したものを用いることができる。
【０１９６】
一本鎖抗体は、以下の方法により取得できる。
ＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体のVHおよびVLをコードするｃＤＮＡを取得後、一本鎖抗体をコードするＤＮＡを構築する。該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現させることにより、一本鎖抗体を取得することができる。
【０１９７】
ジスルフィド安定化V領域断片（以下、dsFvとも称す）は、VHおよびVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はReiterらにより示された方法［Protein Engineering, 7, 697 (1994)］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるdsFvに含まれるVHおよびVLはＡＬＫ７に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体から由来したものを用いることができる。
【０１９８】
ジスルフィド安定化V領域断片(dsFv)は、以下の方法により取得することができる。
ＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体のVHおよびVLをコードするｃＤＮＡを取得後、dsFvをコードするＤＮＡを構築する。該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現させることにより、dsFvを取得することができる。
CDRを含むペプチドは、Fmoc法、tBoc法等の化学合成法によって製造することができる。
【０１９９】
ＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体から調製される融合抗体は、膵臓の病巣へ特異的に薬剤や蛋白質を運ぶ、ドラッグデリバリーに用いることができる。
融合抗体は、ＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体およびそれらの抗体断片に、蛋白質、低分子化合物等の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体をいう。
該融合抗体は、ＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体および抗体断片のH鎖或いはL鎖のN末端側或いはC末端側、抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体および抗体断片中の糖鎖に、蛋白質、低分子化合物等の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させることにより製造することができる。
【０２００】
低分子化合物としては、上記８のスクリーニング方法によって得られた化合物をあげることができる。該化合物は化学的手法〔抗体入門（金光修著、１９９４年、地人書館）〕により上記抗体に結合させることができる。
蛋白質としては、膵臓の機能を亢進する活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトベーターセルリン、ヒトアクチビンＡＢ、ヒトアクチビンＢ、ヒトHGF(Hepatocyte Growth Factor)等があげられる。
【０２０１】
蛋白質との融合抗体は、以下の方法により取得できる。
抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させて、融合抗体をコードするＤＮＡを構築する。該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物などの宿主細胞へ導入し、該ＤＮＡを発現させることにより、融合抗体を取得することができる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【０２０２】
【実施例】
実施例１：ＡＬＫ７過剰発現細胞におけるリガンド依存性の転写活性の解析
内因性にＡＬＫ７を発現していない、ヒト腎上皮細胞HEK293細胞（ATCC CRL-1573）を１０％ウシ胎児血清、２mmol/L グルタミン、1g/Lグルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、12ウェル細胞培養用プレートに6×104細胞/ウェルになるように播き、炭酸ガスインキュベーター内（５％炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で培養した。翌日、（１）ラットＡＬＫ７の全長ｃDNAを含むプラスミド［Mol. Cell Neurosci., 7, 467-478（1996）］のＳｍａＩ−ＸｂａＩ断片と動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ１（インビトロジェン社製）のＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ断片とをライゲーションすることにより作成されたプラスミド［Mol. Cell Neurosci., 7, 467-478（1996）］1.5μg、（２）マウスのII型アクチビン受容体ActRIIAｃＤＮＡを含むプラスミド［Cell, 65, 973-982（1991）］を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し平滑末端化したＤＮＡ断片と、公知の動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＬＳＲ−α［Mol. Cell. Biol., 8, 466-472（1988）］をＸｈｏＩで消化し平滑末端化したＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより作成されたプラスミド［J. Biol. Chem., 272, 13835-13842（1997）］300ng、（３）SBE-luxルシフェラーゼレポータープラスミド［J. Biol. Chem., 273, 21145-21152（1998）、Ludwig Institute for Cancer Research より譲渡］500ng、（４）ベータ・ガラクトシダーゼが動物細胞中でＣＭＶプロモーターの制御下で発現するように設計されているプラスミドｐＣＭＶβ（クロンテック社製）300ngをそれぞれリン酸カルシウム法により上記培養で得られた細胞に遺伝子導入し、更に10％ウシ胎児血清、2mmol/L グルタミン、1g/Lグルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地を用いて炭酸ガスインキュベーター内において３７℃で培養し、形質転換細胞を得た。翌日、PBS緩衝液で該形質転換細胞を洗浄し、上記培地に懸濁後、J. Biol. Chem., 267, 16385-16389（1992）に従ってウシ卵胞液より精製された20ng/mlのアクチビンＡ、ＡＢまたはＢを添加した。炭酸ガスインキュベーター内において37℃で16時間培養した後、PBS緩衝液で該形質転換細胞を洗浄後、100μLの細胞溶解液（1%TritonX-100、15mmol/L 硫酸マグネシウム、4mmol/L EGTA、1mmol/L ジチオスレイトール、25mmol/L グリシルグリシン、ｐH7.8）に懸濁し、50μLをルシフェラーゼアッセイに、40μLをベータ・ガラクトシダーゼアッセイに使用した。
【０２０３】
ルシフェラーゼの活性測定は、上記の50μＬの細胞を溶解した溶解液と5μLの30mmol/L ATP溶液、100μLの0.5mmol/L luciferin溶液とを混合し、ルミノメーター（ベルトルド社）により発光量を測定することにより行い［Anal. Biochem., 171, 404-408（1988）］、ベータ・ガラクトシダーゼの活性測定は、o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside（ONPG）を基質として用いることにより、既報に従って行った［Bitechniques, 7, 576-579（1989）］。ルシフェラーゼの活性値はベータ・ガラクトシダーゼの活性値で標準化した［Endocrinology, 136, 5493-5503（1995）］。
【０２０４】
図１に示すように、アクチビンＡＢ、アクチビンＢによりＡＬＫ７遺伝子導入HEK293細胞で転写活性の顕著な上昇が観察された。
【０２０５】
実施例２：内因性ＡＬＫ７発現膵臓β細胞におけるリガンド依存性の転写活性の解析
内因性にＡＬＫ７を発現している細胞株を検索する為、配列番号７および８で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、マウス膵臓β細胞種MIN6細胞［Endocrinology, 127, 126-132（1990）］、ヒト腎上皮細胞ＨＥＫ２９３細胞（ATCC CRL-1573）、マウスインスリノーマ細胞ＮＩＴ−１細胞 （ATCC CRL-2055）、マウス膵臓α細胞種αＴＣ１細胞（ATCC CRL-2350）、ラット膵管上皮細胞ＡＲＩＰ細胞（ATCC CRL-1674）などから調製した全ＲＮＡを元に作成した一本鎖ＤＮＡを鋳型としてPCR反応を行った。その結果、マウス膵臓β細胞のモデル系として使用されているMIN6細胞で他の細胞よりも高い発現が認められた。
【０２０６】
次にこの細胞を用いて、転写活性の測定、マウスのドミナントネガティブＡＬＫ７受容体ｃＤＮＡ導入によるシグナル伝達の抑制効果を検討した。
マウス膵臓β細胞種細胞であるMIN6細胞を10％ウシ胎児血清、2mmol/L グルタミン、4.5g/Lグルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、12ウェル細胞培養用プレートに8×104細胞/ウェルになるように播き、炭酸ガスインキュベーター内において37℃で培養した。翌日、（１）SBE-luxルシフェラーゼレポータープラスミド1μg、（２）ｐＣＭＶβ500ngをそれぞれリポフェクション法により上記培養で得られた細胞に遺伝子導入し、更に炭酸ガスインキュベーター内において37℃で培養することで形質転換細胞を得た。翌日、PBS緩衝液で該形質転換細胞を洗浄し、上記培地に懸濁後、60ng/mlのアクチビンＡ、ＡＢまたはＢを添加した。炭酸ガスインキュベーター内において37℃で16時間培養した後、PBS緩衝液で該細胞を洗浄後、100μLの細胞溶解液に懸濁し、50μLをルシフェラーゼアッセイに、40μLをベータ・ガラクトシダーゼアッセイに使用した。ルシフェラーゼの活性値はベータ・ガラクトシダーゼの活性値で標準化した。
【０２０７】
次に、配列番号７および８で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、配列番号１０で表される塩基配列を有するラットＡＬＫ７ｃＤＮＡを含むプラスミド［Mol. Cell Neurosci., 7, 467-478（1996）］を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。続いて該反応産物中の増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて消化した。反応終了後、該反応産物をアガロース電気泳動により分離し、約５００塩基対のＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片とプラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片とをＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応物を用いて大腸菌をトランスフォームし、アンピシリンを含む寒天プレート上で37℃にて培養し、アンピシリン耐性を獲得したクローンを選択した。出現したコロニーをアンピシリンを含む培地にて培養した後、プラスミドを回収し、挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を確認し、目的の塩基配列を有するクローンを選択した。
【０２０８】
以上の操作により、細胞内のキナーゼ領域を欠損し、Ｎ末端より１６７個のアミノ酸残基をコードするドミナントネガティブ型ＡＬＫ７受容体ＤＮＡを含むプラスミドを取得した。
【０２０９】
マウス膵臓β細胞種細胞であるMIN6細胞を10％ウシ胎児血清、2mmol/L グルタミン、4.5g/Lグルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、12ウェル細胞培養用プレートに8×104細胞/ウェルになるように播き、炭酸ガスインキュベーター内において37℃で培養した。翌日、（１）SBE-luxルシフェラーゼレポータープラスミド1μg、（２）ベータ・ガラクトシダーゼが動物細胞中でＣＭＶプロモーターの制御下で発現するように設計されているプラスミド（クロンテック社製）500ng、（３）上記で作製したドミナントネガティブ型ＡＬＫ７受容体ＤＮＡ3μgをそれぞれリポフェクション法によりＭＩＮ６細胞に遺伝子導入し、炭酸ガスインキュベーター内において37℃で培養することで形質転換株を得た。翌日、PBS緩衝液で該形質転換細胞を洗浄し、上記培地に懸濁後、60ng/mlのアクチビンＡ、ＡＢ、またはＢを添加した。炭酸ガスインキュベーター内において37℃で16時間培養した後、PBS緩衝液で該形質転換細胞を洗浄後、100μLの細胞溶解液に懸濁し、50μLをルシフェラーゼアッセイに、40μLをベータ・ガラクトシダーゼアッセイに使用した。ルシフェラーゼの活性値はベータ・ガラクトシダーゼの活性値で標準化した。
【０２１０】
図２に示すように、アクチビンＡＢ、アクチビンＢにより内因性ＡＬＫ７発現MIN6細胞で転写活性の上昇が観察され、ドミナントネガティブＡＬＫ７ｃＤＮＡの導入により転写活性の上昇は阻害された。
【０２１１】
実施例３：マウス膵臓β細胞種細胞からのインシュリン分泌の促進
内因性ＡＬＫ７受容体を発現し、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＢに反応性を有することが確認されたMIN6細胞を10％ウシ胎児血清、2mmol/L グルタミン、4.5g/Lグルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、24ウェル細胞培養用プレートに7×104細胞/ウェルになるように播き、炭酸ガスインキュベーター内において37℃で培養した。二日後にPBS緩衝液で細胞を洗浄し、40または80ng/mlのアクチビンＡＢを加えた培養液300μLに該細胞を懸濁した。更に二日間炭酸ガスインキュベーター内において３７℃で培養し、培養終了後上清を回収して、上清30μLを用いて市販インスリン測定キット（森永生化学研究所）を用いてELISA法によりインスリン分泌量を測定した。
図３に示すように、アクチビンＡＢにより内因性ＡＬＫ７発現MIN6細胞でインスリンの分泌亢進が認められた。
【０２１２】
【発明の効果】
本発明により、アクチビンＡＢ、アクチビンＢおよびアクチビン受容体様キナーゼ７（ＡＬＫ７）より選ばれる蛋白質を有効成分として含有する糖尿病治療剤、該蛋白質をコードするＤＮＡを有効成分として含有する糖尿病治療剤、該蛋白質または該ＤＮＡを利用した糖尿病治療剤のスクリーニング方法、該ＤＮＡまたは該蛋白質を特異的に認識する抗体を用いた糖尿病の診断薬および診断用キット、ならびＡＬＫ７を特異的に認識する抗体を用いた糖尿病の治療および／または予防のための医薬の腎臓への輸送方法が提供される。
【０２１３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【０２１４】
【配列表】
0004086492.tif 000002
【０２１５】
0004086492.tif 000003
【０２１６】
0004086492.tif 000004
【０２１７】
0004086492.tif 000005
【０２１８】
0004086492.tif 000006
【０２１９】
0004086492.tif 000007
0004086492.tif 000008
【０２２０】
0004086492.tif 000009
【０２２１】
0004086492.tif 000010
【０２２２】
0004086492.tif 000011
【０２２３】
0004086492.tif 000012
0004086492.tif 000013
0004086492.tif 000014
【０２２４】
0004086492.tif 000015
0004086492.tif 000016
0004086492.tif 000017
0004086492.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＡＬＫ７過剰発現細胞におけるリガンド依存性の転写活性の解析結果を示す図である。（−）はアクチビン無添加を示し、ＡＬＫ７（−）はＡＬＫ７遺伝子を導入していない細胞株を、ＡＬＫ７（＋）はＡＬＫ７遺伝子導入株を示す。
【図２】  内因性ＡＬＫ７発現膵臓β細胞におけるリガンド依存性の転写活性の解析結果を示す図である。塗りつぶしカラムはＭＩＮ６細胞、白抜きカラムはドミナントネガティブＡＬＫ７発現ＭＩＮ６細胞を用いた結果を示す。また（−）はアクチビン無添加を示す。
【図３】  アクチビン添加によるマウス膵臓β細胞腫細胞からのインシュリン分泌量を測定した結果を示す図である。
【図１】
0004086492.tif 000019
【図２】
0004086492.tif 000020
【図３】
0004086492.tif 000021