(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体媒質中のコントラスト増強有効量の気泡を含み、前記気泡は、ＣＨ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨＦＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＨ（ＣＦ3）2、ＣＨ3ＯＣＦ（ＣＦ3）2、ＣＨＦ2ＯＣＨ（ＣＦ3）2、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＯＣＨＦＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨＦＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＦ2ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）2ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）3ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）4ＯＣＦ3およびそれらの混合物からなる群から選択されるフルオロエーテルを含む超音波コントラスト増強用ガスエマルジョン。
【請求項２】
液体媒質中のコントラスト増強有効量の気泡を含み、前記気泡は、ペルフルオロジエチルエーテル、ペルフルオロジメチルエーテル、ペルフルオロジグリム、ペルフルオロメチルエチルエーテルおよびペルフルオロモノグリムからなる群から選択されるフルオロエーテルを含む超音波コントラスト増強用ガスエマルジョン。
【請求項３】
気泡がさらに空気または窒素を含む、請求の範囲第１又は２項に記載のガスエマルジョン。
【請求項４】
気泡が表面活性剤層で囲まれている、請求の範囲第１又は２項に記載のガスエマルジョン。
【請求項５】
表面活性剤層が、非イオン表面活性剤、中性表面活性剤、陰イオン表面活性剤、中性フッ素化表面活性剤、陰イオンフッ素化表面活性剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択される表面活性剤を含む、請求の範囲第４項に記載のガスエマルジョン。
【請求項６】
前記表面活性剤層が、非ニュートン性表面活性剤を含む、請求の範囲第４項に記載のガスエマルジョン。
【請求項７】
前記表面活性剤層が、リン脂質、脂肪酸、ブロックコポリマーおよび糖エステルからなる群から選択される、請求の範囲第４項に記載のガスエマルジョン。
【請求項８】
表面活性剤層が少なくとも第一表面活性剤と第二表面活性剤とを含み、第一表面活性剤は、少なくとも１０個の炭素原子を含む少なくとも１つのアシル鎖を有するリン脂質またはリン脂質混合物からなり、表面活性剤全体の少なくとも５％ｗ／ｗを占め、第二表面活性剤は第一表面活性剤より水溶性が高い、請求の範囲第４項に記載のガスエマルジョン。
【請求項９】
前記第二表面活性剤が、脂肪酸、脂肪酸の塩、脂肪酸の糖エステル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマー、非イオンアルキルグルコシド、ポリソルベートおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求の範囲第８項に記載のガスエマルジョン。
【請求項１０】
前記気泡が遊離気泡である、請求の範囲第１又は２項に記載のガスエマルジョン。
【請求項１１】
前記気泡がミクロスフェアをさらに含む、請求の範囲第１又は２項に記載のガスエマルジョン。
【請求項１２】
前記ミクロスフェアがタンパク質を含む、請求の範囲第１１項に記載のガスエマルジョン。
【請求項１３】
前記気泡がリポソームをさらに含む、請求の範囲第１又は２項に記載のガスエマルジョン。
【請求項１４】
前記気泡が、液体媒質と合わせたときに気泡の形成を促進するための空間を含有する、アルブミン、微細な糖の結晶、中空の噴霧乾燥させた糖、塩、中空の表面活性剤の球、乾燥させた多孔性のポリマーの球、乾燥させた多孔性のヒアルロン酸、置換されたヒアルロン酸の球、乾燥させたラクトースのミクロスフェアおよび変性タンパク質のミクロスフェアからなる群から選択される構造体の可溶化によって形成される、請求の範囲第１又は２項に記載のガスエマルジョン。
【請求項１５】
前記気泡が、水相と前記フルオロエーテルとを含む乳濁液体に対する圧力を変化させることによって形成される、請求の範囲第１又は２項に記載のガスエマルジョン。
【請求項１６】
前記微小気泡が超音波処理によって形成される、請求の範囲第１又は２項に記載のガスエマルジョン。
【請求項１７】
液体媒質と合わせたときにコントラスト増強有効量の気泡の形成を促進する、噴霧乾燥させたミクロスフェア、凍結乾燥粉末、凍結乾燥ケーキ、粉末化および粒状化した糖、タンパク質ミクロスフェアおよび乾燥させた多孔性ヒアルロン酸からなる群から選択される構造材料と表面活性剤と前記構造材料内に分散させた、ＣＨ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨＦＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＨ（ＣＦ3）2、ＣＨ3ＯＣＦ（ＣＦ3）2、ＣＨＦ2ＯＣＨ（ＣＦ3）2、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＯＣＨＦＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨＦＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＦ2ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）2ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）3ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）4ＯＣＦ3およびそれらの混合物からなる群から選択されるフルオロエーテルを含む気体または気体混合物を含む容器を提供するステップと、
前記容器に水性液体を添加するステップと、
前記容器内で前記構造材料、前記表面活性剤と前記水性液体とを混合して、表面活性剤の層で囲われた前記気体または気体混合物の気泡を含むガスエマルジョンを形成するステップとを含む、
ガスエマルジョンの製造方法。
【請求項１８】
液体媒質と合わせたときにコントラスト増強有効量の気泡の形成を促進する、噴霧乾燥させたミクロスフェア、凍結乾燥粉末、凍結乾燥ケーキ、粉末化および粒状化した糖、タンパク質ミクロスフェアおよび乾燥させた多孔性ヒアルロン酸からなる群から選択される構造材料と表面活性剤と前記構造材料内に分散させた、ペルフルオロジエチルエーテル、ペルフルオロジメチルエーテル、ペルフルオロメチルエチルエーテル、ペルフルオロモノグリムおよびペルフルオロジグリムからなる群から選択されるフルオロエーテルを含む気体または気体混合物を含む容器を提供するステップと、
前記容器に水性液体を添加するステップと、
前記容器内で前記構造材料、前記表面活性剤と前記水性液体とを混合して、表面活性剤の層で囲われた前記気体または気体混合物の気泡を含むガスエマルジョンを形成するステップとを含む、
ガスエマルジョンの製造方法。
【請求項１９】
前記構造材料が水溶性である、請求の範囲第１７又は１８項に記載の方法。
【請求項２０】
前記構造材料が表面活性剤を含む、請求の範囲第１７又は１８項に記載の方法。
【請求項２１】
前記表面活性剤が、リン脂質、ホスホコリン、リゾリン脂質、非イオン表面活性剤、中性表面活性剤、陰イオン表面活性剤、中性フッ素化表面活性剤、陰イオンフッ素化表面活性剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求の範囲第２０項に記載の方法。
【請求項２２】
前記材料が、液体媒質と合わせたときに気泡の形成を促進するための空間を含有する、アルブミン、微細な糖の結晶、中空の噴霧乾燥させた糖、塩、中空の表面活性剤の球、乾燥させた多孔性のポリマーの球、乾燥させた多孔性のヒアルロン酸、置換されたヒアルロン酸の球、乾燥させたラクトースのミクロスフェアおよび変性タンパク質のミクロスフェアからなる群から選択される構造体および可溶性の、液体媒質と合わせたときに気泡の形成を促進するための空間を形成する、噴霧乾燥粉末、粉末状または顆粒状の糖、変性タンパク質ミクロスフェアを含むタンパク質ミクロスフェア、凍結乾燥ケーキ、凍結乾燥粉末、塩、中空の表面活性剤の球、乾燥させた多孔性ポリマー球および乾燥させた多孔性ヒアルロン酸からなる群から選択される構造体からなる群から選択される、請求の範囲第１７又は１８項に記載の方法。
【請求項２３】
液体媒質と合わせたときにコントラスト増強有効量の気泡の形成を促進する、噴霧乾燥させたミクロスフェア、粉末化および粒状化した糖、凍結乾燥粉末、凍結乾燥ケーキ、タンパク質ミクロスフェアおよび乾燥させた多孔性ヒアルロン酸からなる群から選択される構造材料と、
前記構造材料内に分散されたＣＨ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨＦＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＨ（ＣＦ3）2、ＣＨ3ＯＣＦ（ＣＦ3）2、ＣＨＦ2ＯＣＨ（ＣＦ3）2、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＯＣＨＦＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨＦＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＦ2ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）2ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）3ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）4ＯＣＦ3およびそれらの混合物からなる群から選択されるフルオロエーテルを含む気体または気体混合物と、
表面活性剤とを含み、
前記材料、前記気体または気体混合物および前記表面活性剤が共に、容器に液体を添加した際に微小気泡を形成するようにされている、超音波コントラスト増強のための微小気泡前駆組成物。
【請求項２４】
液体媒質と合わせたときにコントラスト増強有効量の気泡の形成を促進する、噴霧乾燥させたミクロスフェア、粉末化および粒状化した糖、凍結乾燥粉末、凍結乾燥ケーキ、タンパク質ミクロスフェアおよび乾燥させた多孔性ヒアルロン酸からなる群から選択される構造材料と、
前記構造材料内に分散された、ペルフルオロジエチルエーテル、ペルフルオロジメチルエーテル、ペルフルオロメチルエチルエーテル、ペルフルオロモノグリムおよびペルフルオロジグリムからなる群から選択されるフルオロエーテルを含む気体または気体混合物と、
表面活性剤とを含み、
前記材料、前記気体または気体混合物および前記表面活性剤が共に、容器に液体を添加した際に微小気泡を形成するようにされている、超音波コントラスト増強のための微小気泡前駆組成物。
【請求項２５】
前記構造材料が水溶性である、請求の範囲第２３又は２４項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記構造材料が表面活性剤を含む、請求の範囲第２３又は２４項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記表面活性剤が、リン脂質、ホスホコリン、リゾリン脂質、非イオン表面活性剤、中性表面活性剤、陰イオン表面活性剤、中性フッ素化表面活性剤、陰イオンフッ素化表面活性剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求の範囲第２６項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記構造材料が、液体媒質と合わせたときに気泡の形成を促進するための空間を含有する、アルブミン、微細な糖の結晶、中空の噴霧乾燥させた糖、塩、中空の表面活性剤の球、乾燥させた多孔性のポリマーの球、乾燥させた多孔性のヒアルロン酸、置換されたヒアルロン酸の球、乾燥させたラクトースのミクロスフェアおよび変性タンパク質のミクロスフェアからなる群から選択される構造体および可溶性の、液体媒質と合わせたときに気泡の形成を促進するための空間を形成する、噴霧乾燥粉末、粉末状または顆粒状の糖、変性タンパク質ミクロスフェアを含むタンパク質ミクロスフェア、凍結乾燥ケーキ、凍結乾燥粉末、塩、中空の表面活性剤の球、乾燥させた多孔性ポリマー球および乾燥させた多孔性ヒアルロン酸からなる群から選択される構造体からなる群から選択される、請求の範囲第２３又は２４項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記構造材料が噴霧乾燥させたミクロスフェアを含み、前記噴霧乾燥させたミクロスフェアがでんぷん、誘導体化でんぷんおよび糖エステルからなる群から選択された化合物を含む、請求の範囲第２３又は２４項に記載の組成物。
【請求項３０】
生体適合性液体媒体にコントラスト増強有効量の微小気泡を含み、前記微小気泡は少なくとも一種の、ＣＨ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨＦＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＨ（ＣＦ3）2、ＣＨ3ＯＣＦ（ＣＦ3）2、ＣＨＦ2ＯＣＨ（ＣＦ3）2、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＯＣＨＦＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨＦＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＦ2ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）2ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）3ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）4ＯＣＦ3およびそれらの混合物からなる群から選択されるフルオロエーテルガス浸透圧調整剤と少なくとも一種の改変剤ガスを含む、イメージング用微小気泡組成物。
【請求項３１】
生体適合性液体媒体にコントラスト増強有効量の微小気泡を含み、前記微小気泡は少なくとも一種の、ペルフルオロジエチルエーテル、ペルフルオロジメチルエーテル、ペルフルオロメチルエチルエーテル、ペルフルオロモノグリムおよびペルフルオロジグリムからなる群から選択されるフルオロエーテルガス浸透圧調整剤と少なくとも一種の改変剤ガスを含む、イメージング用微小気泡組成物。
【請求項３２】
前記微小気泡がミクロスフェアをさらに含む、請求の範囲第３０又は３１項に記載の微小気泡組成物。
【請求項３３】
前記ミクロスフェアがタンパク質を含む、請求の範囲第３２項に記載の微小気泡組成物。
【請求項３４】
前記微小気泡がリポソームを含む、請求の範囲第３０又は３１項に記載の微小気泡組成物。
【請求項３５】
前記微小気泡が、液体媒質と合わせたときに気泡の形成を促進するための空間を含有する、アルブミン、微細な糖の結晶、中空の噴霧乾燥させた糖、塩、中空の表面活性剤の球、乾燥させた多孔性のポリマーの球、乾燥させた多孔性のヒアルロン酸、置換されたヒアルロン酸の球、乾燥させたラクトースのミクロスフェアおよび変性タンパク質のミクロスフェアからなる群から選択される構造体の可溶化によって形成される、請求の範囲第３０又は３１項に記載の微小気泡組成物。
【請求項３６】
前記微小気泡が、水相と前記フルオロエーテル浸透圧調整剤とを含む乳濁液体に対する圧力を変化させることによって形成される、請求の範囲第３０又は３１項に記載の微小気泡組成物。
【請求項３７】
前記微小気泡が超音波処理によって形成される、請求の範囲第３０又は３１項に記載の微小気泡組成物。
【請求項３８】
前記微小気泡が表面活性剤層をさらに含む、請求の範囲第３０又は３１項に記載の微小気泡組成物。
【請求項３９】
前記表面活性剤層が、非イオン表面活性剤、中性表面活性剤、陰イオン表面活性剤、中性フッ素化表面活性剤、陰イオンフッ素化表面活性剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を含む、請求の範囲第３８項に記載の微小気泡組成物。
【請求項４０】
前記表面活性剤層が非ニュートン表面活性剤を含む、請求の範囲第３８項に記載の微小気泡組成物。
【請求項４１】
前記表面活性剤層が、リン脂質、脂肪酸、ブロックコポリマーおよび糖エステルからなる群より選ばれる化合物を含む、請求の範囲第３８項に記載の微小気泡組成物。
【請求項４２】
前記改変剤ガスが酸素を含む、請求の範囲第３０又は３１項に記載の微小気泡組成物。
【請求項４３】
前記改変剤ガスが窒素を含む、請求の範囲第３０又は３１項に記載の微小気泡組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、超音波のコントラストを増強するなどの目的で使用する安定な長寿命ガスエマルジョンの製法および該製法で製造したエマルジョンの組成物を包含する。さらに、本発明は、このようなエマルジョンを製造するための前駆物質も包含する。
２．技術の背景
超音波技術は、イオン化放射線を使用するイメージング手法の重要でより経済的な代替法を提供する。多数の従来型のイメージング技術、たとえば磁気共鳴イメージング法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）およびポジトロン・エミッション断層撮影（ＰＥＴ）などが利用できるが、これらの手法の装置は非常に高価である。さらに、ＣＴおよびＰＥＴでは、イオン化放射線を使用する。これらの手法とは異なり、超音波イメージング装置は比較的安価である。さらに、超音波イメージング法ではイオン化放射線は使用しない。
超音波イメージング法では組織による音波の反射に影響を与える組織密度や組成の相違を利用している。画像は、組織界面などの、組織の密度または圧縮性に明確な差がある場所で特にはっきりしている。固体組織の界面、骨格系、種々の器官および／または腫瘍などは超音波で容易に画像化される。
従って、多くのイメージングの適用では、超音波はコントラスト増強剤を使用することなく好適に実施される。しかし、循環血の映像化などのその他の適用では、コントラスト増強剤の開発が進められている。このような造影剤の特に重要な用途は灌流イメージング法の分野である。このような超音波造影剤は心筋、腎臓、肝臓およびその他の組織の循環血の画像化を改善できる。このことは、画像化した組織に関連する研究、診断、手術および治療を容易にもする。血液プール用造影剤では血液含量（例えば、腫瘍や炎症組織）に基づく画像化も可能であり、母体の血液循環のコントラストを増強するだけで胎盤および胎児の映像化も容易になる。
種々の超音波コントラスト増強剤が提案されてきた。一般に、静脈注射可能な小さな気泡を分散させる方法がもっとも成功している。画像診断すべき生体の血流中に気泡を注射し、周囲の流体組織や血液と異なる密度を持ち、それらより圧縮性が非常に高いエマルジョンを循環血中に提供する。その結果、これらの気泡は超音波で容易に画像化される。
残念ながら、in vivoで有効な超音波散乱剤である気泡を作り出すのは難しかった。いくつかの説明が明らかである。まず、閉じ込められた気体が周囲の液体中に拡散されるため、このような気泡は急速に収縮する傾向がある。これは、空気や非常に水に溶けやすい（窒素などの）空気の成分気体を含む気泡では特に起こりやすい。単に気泡を大きくして、気泡が消失するまでに流出すべき気体を増やすことにより、気泡の寿命を改善できると期待されるかもしれない。しかし、直径が約１０μｍを超える気泡は肺で血流から除去され、さらに循環することが妨げられるため、この方法は不満足なものであることが明らかとなっている。さらに、それ以上大きな気泡は小さい血管や毛細血管中を循環することができない。
in vivoで満足な性能を有する微小気泡は有利な生物学的特性も持つ必要がある。先ず、微小気泡内部の気体を構成する化合物は生体親和性でなければならない。最終的には、気相を含有する微小気泡が崩壊し、その気相が溶解した気体として、または凝縮された液体のサブミクロンの液滴として血液中に放出される。従って、気体は主として、肺呼吸または呼吸とその他の細網内皮系の代謝経路の組み合わせによって、体外に除去される。動物またはヒトの循環系を何回か通過するのに十分気泡が維持される場合でも、肝臓の細網内皮系食細胞が微小気泡を取り込み、造影剤の効果を限定することがある。有害な免疫系反応もin vivoでの気泡の寿命を短縮する可能性があり、避ける必要がある。例えば、「裸の」微小気泡は補体系の活性化などの有害な反応を引き起こすことが示されている（例えば、K.A. Shastriら、（１９９１）Undersea Biomed. Res., 18,157参照）。しかし、当技術分野で公知のように、これらの望ましくない反応は適切な被包剤の使用により減少させることができる。
従って、微小気泡のin vivoでの寿命を改善するために、安定性を使用すること、すなわち、種々の被包材料の使用も試みられた。例えば、縣濁液中で先ず形成され、固化の間に気体を閉じ込めるゼラチンまたはアルブミンのミクロスフェアが使用された。Ｈｉｌｍａｎｎらの米国特許第４，４６６，４４２号およびＷｈｅａｔｌｙらの米国特許第５，３５２，４３６号に記載のように、気泡分散の安定剤として表面活性剤を使用することも検討された。Ｕｎｇｅｒの米国特許第５，３３４，３８１号およびＲｙａｎらの米国特許第４，９００，５４０号に記載のように、一部の表面活性剤含有コントラスト増強剤では、リポソームの水性コア内に気泡を封じ込める。
最近、封入された気体が気泡の寿命に与える影響が非常に注目されている。空気およびその成分のほかに、クリプトンやアルゴンなどの種々の貴ガスが使用されている。現在、水溶性の低い生体適合性のある気体が注目を集めている。溶解度の低さは気泡安定性の重要な要素であることが理論的に示されている。EpsteinおよびPlessetのOn the Stability of Gas Bubbles in Liquid-Gas Solutions,（1950）J. Chem. Phys. 18（11）, 1505-1509では、気泡の収縮速度は気体の密度、周囲の媒質への溶解度および分散性の関数として得られた。液液エマルジョンの安定性も、分散相の溶解度の低下に伴って上昇することが明らかとなった（KabalnovおよびShchukin、Ostwald Ripening Theory: Applications to Fluorocarbon Emulsion Stability, Advances in Colloid and Interface Science, 38: 69-97, 1992）。
単純化した仮定では、ＥｐｓｔｅｉｎおよびＰｌｅｓｓｅｔの式から、米国特許第５，３９３，５２４号明細書にＱｕａｙが記載した気泡の寿命（τ）の式：
τ∝ρ／ＤＣ                                                （１）
（式中、ρは閉じ込められた気体の密度であり、Ｄは周囲媒質への気体の分散性であり、Ｃは周囲媒質への気体の溶解度である）が得られる。この式に基づき、Ｑｕａｙは、大気圧および体温（３７℃）で気体であり、空気と比べて、水溶性が低く、密度が高く、溶液中への気体分散性が低いことに基づき選択した気体を使用して気泡を形成している。同じ状況で、ＳｃｈｎｅｉｄｅｒらはＥＰ０５５４２１３Ａ１で、水溶性が低く、分子量の大きいことにより選択した気体を開示している。具体的に開示された気体には、ＳＦ6およびＳｅＦ6並びに種々の過フッ素化された炭化水素を含んでいる。
（ＥｐｓｔｅｉｎおよびＰｌｅｓｓｅｔが当初予測したように）水溶性および分散性が低いことが、気体の気泡からの放出速度に影響する可能性があるが、ＱｕａｙおよびＳｃｈｎｅｉｄｅｒの気体選択の基準は、ある種の不適切気体を包含し、ある種のより適した気体を除外するという点で正確ではない。例えば、米国特許第５，３９３，５２４号で、Ｑｕａｙは提案した気体についてＱ値を計算して、微小気泡気体を選択することを示しており、Ｑ値は式：
Ｑ＝４×１０-7×ρ／ＤＣ                                      （２）
（式中、ρは気体の密度（ｋｇ／ｍ3）であり、Ｃは気体の水溶性（Ｍ）であり、Ｄは溶液への気体の分散性（ｃｍ2／ｓ）である）で計算する。Ｑｕａｙは、超音波コントラスト増強に使用できる気体であるには、Ｑ値は少なくとも３０でなければならないことを教示している。文献上の水溶性データ（E.  Wilhelm、R. BattinoおよびR.J. Wilcock、Chemical Reviews, 1977, v.77, p. 219）を使用した単純な推定は、ほとんどすべての公知の気体（水素およびヘリウムを除く）のＱ値はほぼこの値であるかこの値を超えることを示している。２５℃で、例えば、酸素のＱ値は２０であり、窒素のＱ値は３５である。従って、Ｑｕａｙの開示は効果的な微小気泡用の気体の選択についての指標はほとんど提供しない。
さらに、ＱｕａｙのＱ係数の基準はＥＰ０５５４２１３Ａ１に記載のＳｃｈｎｅｉｄｅｒの開示と同様、気泡収縮のある種の主要な原因、すなわち、気泡の表面張力、表面活性剤の作用、気体の浸透作用、充填気体が凝縮されて液体になる可能性を考慮していない。すなわち、充填気体の分圧は気泡内部の過剰のラプラス圧力に対するに十分高くなければならない。飽和蒸気圧が低い場合には、充填気体は凝縮されて液体になり、造影能が失われる可能性がある。従って、当技術分野では、生体適合性があり、容易に製造でき、超音波イメージング法でin vivoでのコントラスト増強が優れている安定なコントラスト増強剤が必要とされている。また、微小気泡の前駆物質やこのようなコントラスト増強剤の製造および使用法も必要とされている。
発明の概要
本発明は、オストワルド係数の低いフルオロエーテル化合物を使用し、超音波および磁気共鳴イメージング法のコントラスト増強用の微小気泡調製物を含む長時間持続型ガスエマルジョンを提供する。本発明の化合物を使用して微小気泡調製物を製造すると、それ以前に可能であったものより長期間にわたり、心臓その他の内臓のイメージが持続される。本発明では、飽和蒸気圧が非常に低下することなく、水溶性の低い（従って、オストワルド係数が驚くほど低い）、これまでに考慮されなかった種類の化合物を含むガスエマルジョンを開示する。高い蒸気圧は、充填気体が凝縮されて液体になるために生じるコントラストの消失を減少させるのにも役立つ。これらの化合物はフッ素化されたモノエーテルまたはポリエーテルである。ペルフルオロポリエーテルを炭素原子数が同じペルフルオロカーボン類似体と比較すると、エーテル酸素を添加しても蒸気圧に有意な影響は与えないが、水溶性は約２〜３分の１に低下する。このことは、炭化水素がエーテルに変換されると水溶性が有意に上昇するという点で予期しなかった、驚くべきことである。
従って、液体媒質中に多数の気泡を含み、前記気体がフルオロモノエーテルまたはフルオロポリエーテルまたはその混合物を含む超音波コントラスト増強用ガスエマルジョンが開示される。いくつかの態様では、気体は３７℃でオストワルド係数が約１００×１０-6未満の化合物を含み、特にin vivoで長時間コントラストを増強する。ペルフルオロジエチルエーテル、ペルフルオロジメチルエーテル、ペルフルオロメチルエチルエーテル、ペルフルオロモノグリム、ペルフルオロジグリム、Ｃ4Ｆ10Ｏ3、Ｃ5Ｆ12Ｏ4、Ｃ6Ｆ14Ｏ5が特に有利であることが明らかにされている。
本発明の気泡は表面活性剤層で囲まれていてよく、表面活性剤層は好ましくは第一の表面活性剤と第二の表面活性剤とを含み、第一の表面活性剤は本質的に、少なくとも炭素原子を１０個含むアシル鎖を少なくとも１つ有するリン脂質またはリン脂質混合物からなり、前表面活性剤の少なくとも約５重量％を占め、第二の表面活性剤は第一の表面活性剤より水溶性が高い。最も好ましくは、第一表面活性剤はアシル鎖を１つ以上有するホスファチジルコリンを含み、少なくとも１つのアシル鎖は炭素原子を１２〜１８個含み、前記第二表面活性剤はアシル鎖を１つ以上有するホスファチジルコリンを含み、少なくとも１つのアシル鎖は炭素原子を６〜１２個含む。
さらに、本発明の広範な面では、微小気泡の前駆物質およびガスエマルジョンを形成する方法を提供する。当業者には、本発明の微小気泡調製物は多数の異なる手法で製造できることは理解されよう。例えば、微小気泡は、開示のフルオロエーテル化合物と、粉末、タンパク質ミクロスフェア、噴霧乾燥ミクロスフェア、空間含有粒子、顆粒、リポソーム、飽和糖溶液等と共に使用して製造することができる。また、これらの構造材料を個々に使用して、フルオロエーテルをその中に分散させると、乾燥した微小気泡前駆物質が得られる。液体媒質、好ましくは水を添加すると、ガスエマルジョンが形成される。
好ましい態様では、生体適合性の膜形成材料を含有する液体組成物を噴霧乾燥させて、ミクロスフェアの粉末を形成し、このミクロスフェアを本明細書に開示のオストワルド係数の低いフルオロエーテル化合物と合わせ、水相を粉末と混合することにより製造する。ミクロスフェア粉末は実質的に水相に溶解し、微小気泡を形成する。好ましくは、微小気泡を単層の表面活性剤で被覆する。
さらに、本発明は、開示のガスエマルジョンを使用する、調波（harmonic）超音波イメージング法を含むイメージング法を提供する。
本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の図面と共に好ましい態様の例示を考慮すると、当業者には明らかであろう。図面は最初に簡単に説明する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の２つのフルオロエーテルガスエマルジョンと空気とを比較した、時間の関数として示すin vivoパルスドップラ信号強度のグラフである。
第２ａ図、第２ｂ図および第２ｃ図は、ウサギにガスエマルジョン造影剤を注射した後の時間に対する超音波信号の減衰を示すグラフである。各グラフは、フルオロエーテルを含む微小気泡調製物をフルオロカーボン類似体を含む従来技術の微小気泡調製物と比較するように並べてある。
第３ａ図、第３ｂ図および第３ｃ図は各々、気泡造影剤注射前の豚の心臓（第３ａ図、注射１分後の豚の心臓（第３ｂ図）および注射６分後の豚の心臓（第３ｃ図）の２つの超音波イメージを示す。図中、（対照イメージ以外の）上部に示したイメージはペルフルオロポリエーテルＣ5Ｆ12Ｏ4を含む微小気泡調製物を使用して得られたものであり、下部に示したイメージはペルフルオロヘキサンＣ6Ｆ14を含む微小気体調製物を使用して得られたものである。
発明の詳細な説明
Ｉ．一般的な説明
本明細書では、微小気泡（microbubble）とは、直径約０．５から３００μｍ、好ましくは直径約２００、１００または５０μｍ以下の、水性媒質中の気泡とする。微小気泡は気液界面に層またはコーティングを有していても、有していなくてもよい。コーティングが存在する場合には、１つ以上の分子の厚さであってよい。さらに、微小気泡は二分子層（単ラメラ・リポソームの場合などのように）に閉じ込められていても、数層の二重層（マルチラメラ・ベシクル）に閉じ込められていてもよい。本発明の微小気泡は変性タンパク質などの、より永続的なシェル型構造体で囲まれていてもよい。
エマルジョンとは、一般に表面活性剤界面で安定化された２つ以上の混合不能な流体の分散物であることを特徴とし、本発明の表面活性剤を含有する態様たは本質的にガスエマルジョンで、エマルジョンの非連続層は液体ではなく気体である。従って、本明細書で使用される「ガスエマルジョン」という用語は、表面活性剤界面を有するまたは有さない水性媒質中の多数の微小気泡の分散物を含む。すなわち、本発明のガスエマルジョンは、単純には、フルオロエーテルを含む微小気泡調製物である。
血管内で使用する場合、最適な気泡の大きさは２つの競合する因子により決定される。気泡が小さいと、小血管や毛細血管中の循環に有効であるが、超音波エコー生成能は気泡の大きさに大きく作用される。従って、血管の超音波コントラスト増強に適した微小気泡の直径は好ましくは約１〜１０μｍであり、３〜５μｍであると特に好ましい。
ＩＩ．微小気泡用の気体および気体の組み合わせの選択
多くの微小気泡調製物の寿命が短くなる一因は、気泡内の蒸気圧の上昇であり、その上昇は表面張力が気泡に作用することにより生じる。気泡の直径が小さくなるほど、この内部圧力が上昇する。内部蒸気圧が上昇すると、気泡の中の気体を溶解させ、その結果、気体が溶液に溶かされるに従って気泡が崩壊する。ラプラスの式ΔＰ＝２σ／ｒ（式中、ΔＰは気泡内で上昇した気体圧力であり、σは気泡フィルムの表面張力であり、ｒは気泡の半径である）は、周囲の気泡表面またはフィルムにより気泡にかけられる圧力を示している。ラプラス庄力は気体の半径に反比例する。従って、気泡が収縮すると、ラプラス圧力は上昇し、気泡から気体が拡散される速度および気泡が収縮する速度が上昇する。
気泡の寿命に関するＱｕａｙの式（式１）はこの因子を無視している。気泡のラプラス圧力の作用と、血液は自然に、ほぼ大気圧のときに窒素などのある種の気体を含んでいるという事実とを考慮すると、気体の好適性について異なる結論が得られる。さらに具体的には、窒素または空気または血液中に天然に大量に存在する別の気体などの「第一改変剤ガス（primary modifier gas）」と、水溶性が低く、蒸気圧が低い「気体浸透圧調整剤（gas osmotic agent）」と組み合わせた気体混合物により最適な気泡寿命が得られると結論される。このような気体混合物のいくつかの態様は同時係属出願である米国特許出願第０８／０９９，９５１、０８／２８４，０８３および０８／３９５，６８０に記載されており、これらは参照により本明細書に含めるものとする。
適切な気体の組み合わせの安定化作用は、水溶液中のある種の仮説的気泡についての検討を通してより容易に理解される。検討した気泡はすべて、表面張力を低下させる表面活性剤の層で囲まれていると考えられる。しかし、溶解度、表面活性剤膜層の透過性、および外部濃度の異なる気体または気体混合物を考慮する。
第一の改変剤ガスと第二の浸透圧調整剤と媒質との間の物理的相互作用を気泡の挙動の一般理論に取り入れることができる。第一改変剤ガスを（溶液中の気体浸透圧調整剤の濃度と比べて）比較的高い濃度含有する溶液中では、気泡の寿命は第二の気体浸透圧調整剤のある物理特性の関数として理論的に決定される。
２つの理想的な気体、空気（窒素）（ｎaモル）と浸透圧調整剤（ｎFモル）を含有する半径ｒの微小気泡を考えてみよう。微小気泡は、浸透圧調整剤を含まず、層無限に供給される空気で飽和された無限水媒質中にある。空気は水に非常に溶けやすく、微小気泡からすぐに拡散されて出てくる。微小気泡を半透膜と同様に取り扱うと、微小気泡中の空気の化学的ポテンシャルは無限時と等しく、微小気泡中のフルオロカーボンの化学ポテンシャルは無限時より高い。界面を横切る圧力の勾配に対する機械的平衡化は迅速であると仮定する。従って、微小気泡の寿命を決定するのは、微小気体からの浸透圧調整剤の拡散である。微小気泡中の圧力は空気分圧とフルオロカーボン分圧の総計である。
0004067116.tif 000002
空気は水媒質に非常に溶けやすく、気泡の内外へ迅速に拡散されるため、空気の正味質量流量は小さく、微小気泡内の空気分圧は水媒質にかかる大気圧とほぼ等しい。これは、浸透圧調整剤のみによりラプラス圧力が過剰になることを意味している。
0004067116.tif 000003
さらに、球状粒子から媒質中の濃度がゼロの媒質への浸透圧調整剤の定常状態の拡散質量流Ｊ（ｍｏｌ／ｓ）は、
0004067116.tif 000004
である。
ここで、Ｄは水中の浸透圧調整剤の拡散係数であり、ＣF,subsurfは平衡な表面下（subsurface）水中浸透圧調整剤濃度である。水中の表面下浸透圧調整剤濃度は微小気泡中のフルオロカーボンと平衡であると仮定する。蒸気は不飽和なので、微小気泡の浸透圧調整剤の表面下濃度はその飽和濃度より低く、内部浸透圧調整剤蒸気圧と以下の関係にある。
0004067116.tif 000005
式４，５，６から次の式が得られる。
0004067116.tif 000006
組み合わせ
0004067116.tif 000007
は無次元で、その中に飽和浸透圧調製剤蒸気圧と対応の平衡な浸透圧調整剤の水溶解度との比が含まれる。この比はオストワルド係数として知られている（Ｌと表すことが多い）。微小気泡の半径の二乗は気体浸透圧調整剤のオストワルド係数に比例した速度で時間と共に減少する。従って、オストワルド係数の低い気体浸透圧調整剤は優れた気泡寿命を提供する。気体浸透圧調整剤のオストワルド係数は好ましくは約５００×１０-6、１００×１０-6または５０×１０-6未満であり、最も好ましくは約４０×１０-6、３０×１０-6、２０×１０-6、１０×１０-6、５×１０-6または１×１０-6未満である。
0004067116.tif 000008
第１表はある種の生体適合性のフルオロカーボンを含む数種の化合物の溶解度、蒸気圧およびオストワルド係数を示している。第１表は、体温および大気圧で気体であり、ＱｕａｙおよびＳｔｈｎｅｉｄｅｒにより気泡用気体と考えられたペルフルオロブタンおよびペルフルオロペンタンのオストワルド係数は低く、従って、第一改変ガスと共に気体浸透圧調整剤として好適に作用することを示している。しかし、体温および大気圧で液体の候補化合物を考慮に入れることができるため、これまではまったく微小気泡調製物に適するとは考えられなかった、ある主の最適な低いオストワルド係数を有する化合物が選択できる。
式７は、気体の１つがすでに血流中に存在し、その気体（第一改変ガス）が気液界面を混合物中の他のガス（気体浸透圧調整剤）より非常に速く拡散できる気体混合物を含む気泡に有効であることを覚えておかなければならない。この場合のみ、気泡中の気体浸透圧調整剤の分圧が気泡内の総圧力ではなく、ラプラス圧力にのみ等しくなる。ラプラス圧力は１気圧未満の可能性がある（少なくとも気泡寿命の大部分で）ので、体温および大気圧で液体である気体浸透圧調整剤を使用することができる。このような化合物は、第一改変剤ガスが共存しなければ、まったく気泡を形成しない。
一方、気体浸透圧調整剤は体温で液体であってよいが、その飽和蒸気圧は、ラプラス圧力が気泡中の気体浸透圧調整剤を直ちに凝縮して液体にしないよう、十分大きくなければならない。気体浸透圧調整剤の飽和蒸気圧は好ましくは約１００トールより大きい。これまで微小気泡充填ガスと考えられていた過フッ素化炭化水素では一般に、水溶性と飽和蒸気圧が相関している。すなわち、水溶性の低いフルオロカーボンを選択することは飽和蒸気圧の低いフルオロカーボンを選択することも意味していた。
本発明では、水溶性は低いが、有意に低い飽和蒸気圧は持たない、これまで考慮に入れられなかった種類の化合物を開示しており、これらの化合物は驚くほど低いオストワルド係数を有している。これらの化合物はフッ素化モノエーテルおよびポリエーテルである。フッ素化モノエーテルおよびポリエーテルは安全で非毒性であることが知られている。当技術分野では、所与の炭素原子数のこれらの化合物で、蒸気圧が非常に高く、沸点が低いことも知られている（D.D. Lawson他、J. Fluorine Chem. 12, p. 221（1978））。従って、フッ素化ポリエーテルの沸点および飽和蒸気圧は、同じ炭素原子数のフルオロカーボン類似体とほぼ等しい。
しかし、フルオロエーテルの水に対する溶解度、すなわちオストワルド係数はフルオロカーボン類似体より低く、酸素原子が１つ増える毎にこの値は２〜３分の１に低下する。通常、水と水素結合できる酸素原子を追加すると、溶解度は上昇すると考えられる。気泡がフルオロモノエーテルまたはフルオロポリエーテルと混合した空気または窒素を含有している場合に、特に寿命の長いコントラスト増強用ガスエマルジョンが製造できることが実験的に発見された。従って、ペルフルオロジグリム、ＣＦ3（ＯＣＦ2ＣＦ2）2ＯＣＦ3、ペルフルオロモノグリム、ＣＦ3ＯＣＦ2ＣＦ2ＣＦ3、ペルフルオロジエチルエーテル、Ｃ2Ｆ5ＯＣ2Ｆ5、ペルフルオロエチルメチルエーテル、ＣＦ3ＯＣ2Ｆ5、ペルフルオロジメチルエーテル、ＣＦ3ＯＣＦ3並びにＣＦ3ＯＣＦ2ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）2ＯＣＦ3、ＣＦ3（ＯＣＦ2）3ＯＣＦ3およびＣＦ3（ＯＣＦ2）4ＯＣＦ3などのペルフルオロエーテルが特に好適な気体浸透圧調整剤であることが発見された。
広範なフッ素化エーテルが上記の特性を有しており、そのためガスエマルジョンを安定させる気体浸透圧調整剤として特に適している。炭素原子数により、フッ素化エーテルは体温および大気圧で、気体でも液体であってもよい。体温および大気圧で気体であるこれらのフッ素化エーテルはガスエマルジョン調製物の単独の気体成分としても有用である。第一改変ガスはすべてガス浸透圧調整剤から構成されたガスエマルジョンの有効性を改善するが、使用するフッ素化エーテルが体温および大気圧で気体である場合には必要ではない。さらに、有用なフッ素化エーテル浸透圧調整剤は完全にフッ素化されていても、部分的にのみフッ素化されていてもよい。本発明の気体浸透圧調整剤として有用な部分的に水素化されたフッ素化エーテルには以下のものが含まれる。
ＣＨ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＣＨ2ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨＦＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＨ（ＣＦ3）2、ＣＨ3ＯＣＦ（ＣＦ3）2、ＣＨＦ2ＯＣＨ（ＣＦ3）2、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨＦ2ＯＣＦ2ＣＨ2Ｆ、ＣＨＦ2ＯＣＨ2ＣＦ3、ＣＨＦ2ＯＣＨＦＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＨＦ2、ＣＨ3ＯＣＦ2ＣＦ3、ＣＦ3ＯＣＨ2ＣＦ3、およびＣＦ3ＯＣＨＦＣＦ3
オストワルド係数の低い好適な気体、好ましくはフッ素化エーテルを選択すると、この気体を含む微小気泡は、下記に詳述するように、シェルまたは表面活性剤の界面層を持つ形でも、持たない形でも、種々な方法で形成できる。
ＩＩＩ．微小気泡の形成および封入
微小気泡の製法には、Molecular Biosystems社の欧州特許出願第０，３５９，２４６号および第０，６３３，０３０号に記載のアルブミンまたはその他のタンパク質の超音波処理による粒状ミクロスフェアの形成、米国特許第４，４４６，４４２号に記載のテンシド（tenside）および粘度増強剤の使用、米国特許第４，６８４，４７９号に記載のような脂質被覆した非リポソーム微小気泡、米国特許第５，０８８，４９９号および第５，１２３，４１４号に記載の封入されたガスを有するリポソーム、米国特許第５，４４５，８１３号に記載の両親媒性化合物の使用、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／０８２３４に記載の脂質縣濁液の使用、米国特許第５，２７１，９２８号および第５，３８０，５１９号に記載の積層表面活性剤の使用、米国特許第４，４４２，８４３号、第５，１４１，７３８号および第４，６５７，７５６号に記載の微小顆粒の使用、米国特許第４，７１８，４３３号に記載のアルブミン粒状ミクロスフェアの使用がある。上記個々の特許および特許出願の開示は参照により本明細書に含めるものとする。
本発明のガスエマルジョンはフルオロエーテルを含む遊離の気体微小気泡の調製物を含むことは当業者には理解されよう。すなわち、選択された態様では、本発明のガスエマルジョンは、米国特許第５，３９３，５２４号および第５，０４９，６８８号に記載のように、表面活性剤を使用することなく形成することができる。これらの特許明細書は参照により本明細書に含めるものとする。
好ましい態様では、微小気泡調製物は超音波処理で製造することができる。超音波処理は多くの方法で実行できる。例えば、表面活性剤溶液を含み、頂部に気体を含むバイアルを薄膜を通して超音波処理することができる。膜の厚さは好ましくは約０．５ｍｍまたは０．４ｍｍ未満であり、より好ましくは約０．３ｍｍまたはさらに０．２ｍｍ未満であり、すなわち、物質中の超音波の波長より薄い。これは許容可能な伝達を可能にし、膜の加熱を最小に留めるためである。この膜は、ゴム、テフロン、マイラー、ウレタン、アルミ被覆フィルム、または任意その他の超音波透過性の合成または天然ポリマーフィルムまたはフィルム形成材料などの材料製であってよい。超音波処理は、膜に超音波プローブまたは焦点性超音波「ビーム」を接触させ、または押しつけることにより実施できる。超音波プローブは使い捨てであってもよい。どちらの場合も、プローブは膜に対しておくか、膜を通して液体に挿入する。超音波処理が終わったら、微小気泡溶液をバイアルから回収し、患者に分配する。
超音波処理は、インクジェットプリンタと同様の、低出力超音波振動吸引アセンブリーを持つシリンジ内でも実行できる。また、シリンジまたはバイアルを、容器内の一点にエネルギーが集中する低出力超音波浴に入れ、浴内で超音波処理することもできる。
微小気泡を機械的に形成することも考えられる。例えば、機械的高剪断バルブ（またはダブルシリンジ針）と二本のシリンジ、またはシリンジ上の吸引アセンブリで泡を形成することができる。単純な振とうも使用することができる。下記の縮小気泡法は超音波処理した気泡よりエネルギーインプットの低い機械的に形成された気泡に特に適している。このような気泡は一般に、最も望ましい生体適合性のある造影剤に比べ非常に大きな直径を有しており、本発明に従って適切な大きさまで縮小させることができる。
別の方法では、表面活性剤溶液中に高圧で改変剤ガスを導入して、過飽和とした液体浸透圧調整剤エマルジョンを使用して微小気泡を形成できる。この製法は、圧力を解除したときに気体が発泡し、気泡を形成するソーダポップの開栓と同様の作用である。
別の方法では、圧力が解除されたときに沸騰するペルフルオロブタン、フレオンまたはその他の類似物質を使用して、シェービングフォームと同様に、気泡を形成することもできる。しかし、この方法では、水相の過加熱や過飽和を避けられるように、乳化された液体が非常に低温で沸騰し、あるいは多数の気泡凝集部位を含んでいることが望ましい。この過飽和が起こると、所望の大量の小さな気層泡（液滴１つで１つの気泡）ではなく、少数の凝集部位で少数の大きな気泡が形成されることがある。
別の方法では、表面活性剤と、小さな孔または空間を持つ構造体で作製された増嵩剤との凍結乾燥ケーキを、滅菌溶液を入れ、頂部に浸透圧調整用ガス混合物を入れたバイアルに入れる。溶液を急速に凍結させて、微細な氷結晶構造を形成することができるため、凍結乾燥により微細な孔（氷の結晶が除去された後の空間）が形成される。
また、粉末または顆粒状の糖などの任意の溶解可能または可溶性の空間形成（void forming）構造または材料を使用できる。液体媒質添加前に、このような構造材料が複数の空間を画定する必要はない。さらに、空間形成構造体が表面活性剤を含むのが好ましいが、これは本発明の実施に必須ではない。この態様では、空間形成材料は表面活性剤からなるものでも、表面活性剤を含むものでもなく、表面活性剤と液体の両方を、上記構造体と所望の気体と共に、容器に入れる。再構成の際、これらの空間は浸透圧調整用気体を封入し、固体のケーキまたは粉末を溶かしながら、ガスを含む微小気泡を形成する。
別の方法では、好ましくは水性溶液中に迅速に溶解するまたは水和される乾燥した空間含有（void containing）粒子または（中空の球または蜂の巣状などの）他の構造体、例えば、アルブミン、微細な糖の結晶、中空の噴霧乾燥させた糖、塩、中空の表面活性剤の球、乾燥させた多孔性のポリマーの球、乾燥させた多孔性のヒアルロン酸、または置換されたヒアルロン酸の球、または市販の乾燥させたラクトースのミクロスフェアも、気体浸透圧調整剤で安定化させることができる。さらに、変性タンパク質のミクロスフェアは特に可溶性ではないが、本発明に適合し、本明細書の教示に従って空間含有構造体として使用できる。
従って、広義には、本発明は、
多数の空間を画定する構造材料と、
前記空間内に分散されたフルオロエーテルを含む気体または気体混合物と、
表面活性剤とを
含み、前記容器に液体を添加すると、前記構造材料、前記気体および気体混合物および前記表面活性剤が合わさって微小気泡を形成するようにされた微小気泡前駆組成物を提供する。
本明細書で使用される「構造材料（structural material）」とは、液体媒質と合わせたときに気泡の形成を促進する、多数の空間を画定する任意の材料を意味するものと理解されたい。このような構造材料は、空間含有構造体でも空間形成構造体でも、水性環境に可溶でも不溶でもよい。本発明に適合する構造材料の例には、噴霧乾燥粉末、粉末状または顆粒状の糖、変性タンパク質ミクロスフェアを含むタンパク質ミクロスフェア、凍結乾燥ケーキ、凍結乾燥粉末、塩、中空の表面活性剤の球、乾燥させた多孔性ポリマー球および乾燥させた多孔性ヒアルロン酸を含むが、これらに限定されるものではない。特に好ましい態様では、構造材料は表面活性剤を含む。
好ましくは、オストワルド係数の低い気体を含むガスエマルジョン組成物は、親水性モノマーまたはポリマーまたはその混合物を含有する水性分散液を噴霧乾燥させて製造する。この手順は同時係属出願である米国特許出願第０８／４０５，４７７号にも詳述されている。この場合、気泡形成組成物は、でんぷんなどの親水性部分の、好ましくは表面活性剤を含む水性分散液を乾燥させて、構造材料を形成させることにより形成する。さらに具体的には、厚さ約０．２μｍ、直径１〜１０μｍの、乾燥した、中空の、ほぼ微小球状の多孔性シェルを形成する。市販の噴霧乾燥器は当技術分野でよく知られており、任意特定のでんぷん／表面活性剤分散液に適した設定は、下記の実施例を参照して、標準的経験試験により容易に決定できる。形成後、ミクロスフェアをバイアル内に入れ、抜気し、空気を所望の気体または気体混合物で置換することにより構造材料または乾燥させたミクロスフェアに所望の気体を浸透させる。
噴霧乾燥させる溶液の親水性部分は、例えば、グルコース、ラクトースまたはでんぷんなどの炭水化物であってよい。ＰＶＡおよびＰＶＰなどのポリマーも企図される。種々のでんぷんおよび誘導体化でんぷんが特に適していることが判明している。微小気泡の形成に使用するのに特に好ましいでんぷんには、分子量が約５００，０００ダルトンより大きい、またはデキストロース当量（ＤＥ）が約１２未満のでんぷんが含まれる。ＤＥ値は、でんぷんポリマーの加水分解の程度を示す定量値であり、デキストロース標準物質の還元力を１００として求めた還元力の測定値である。ＤＥ値が高ければ高いほど、でんぷんの加水分解の程度が大きい。このような好ましいでんぷんには、食品業界で市販されている種類の食用植物でんぷんが含まれ、これには、National  Starch  and  Chemical社（Bridgewater、ニュージャージ）からＮ−ＬＯＫおよびＣＡＰＳＵＬＥの商標で市販されているものや、ヒドロキシエチルでんぷん（du  Pont  Pharmaceuticalsから商標ＨＥＴＡＳＴＡＲＣＨおよびＨＥＳＰＡＮとして、味の素（日本、東京）からM-Hydroxyethylstarchとして入手できる）などの誘導体化でんぷんが含まれる。しかし、特に優れた安定化特性があるため、分子量５００，０００以上のでんぷんが好ましい（短鎖でんぷんはよく噴霧乾燥され、本発明の微小気泡の製造にも使用できることに注意されたい）。親水性モノマーまたはポリマーは、前駆物質のこの実施態様中では、溶液の約０．１〜１０％ｗ／ｖ含まれ、約１〜５％ｗ／ｖであると特に適していることが判明している。
好ましくは、水性分散液は、溶液の約０．０１〜２０％ｗ／ｖの任意選択の表面活性剤または表面活性剤混合物も含んでいる。多数の表面活性剤および表面活性剤混合物が公知であり、使用できる。表面活性剤は、リン脂質、ホスホコリン、リゾリン脂質、非イオン表面活性剤、中性または陰イオン表面活性剤、中性または陰イオン性であってよいフッ素化表面活性剤、またはこれらの乳化剤または起泡剤の混合物からなる群から選択できる。表面活性剤のその他の具体的な例には、ポリオキシプロピレンとポリオキシエチレンのブロックコポリマー（この種の化合物の例はPluronic F-68などのPluronicである）、糖エステル、脂肪アルコール、脂肪族酸化アミン、ヒアルロン酸脂肪族エステル、ヒアルロン酸脂肪族エステル塩、ドデシルポリ（エチルレンオキシ）エタノール、ノニルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、誘導体化でんぷん、ヒドロキシエチルでんぷん脂肪酸エステル、脂肪酸の塩、市販の食用植物でんぷん、デキストラン脂肪酸エスチル、ソルビトール脂肪酸エステル、ゼラチン、血清アルブミンおよびその混合物が含まれる。ポリオキシエチレンステアレートなどのポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル、グリセロールポリエチレングリコールオキシステアレート、グリセロールポリエチレングリコールリシノレート、エトキシル化大豆ステロール、エトキシル化ひまし油およびそれらの水素添加誘導体も企図される。また、Ｔｗｅｅｎ(R)、Ｓｐａｎ(R)、Ｂｒｉｊ(R)などの非イオン性アルキルグルコシドも本発明の範囲に含まれる。Ｓｐａｎには、ソルビタンテトラオレエート、ソルビタンテトラステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリパルミテート、ソルビタントリオレエートおよびソルビタンジステアレートが含まれる。Ｔｗｅｅｎには、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエートが含まれる。Ｂｒｉｊには、別の有用な材料群が含まれ、この群にはポリオキシエチレン１０ステアリルエーテルが含まれる。陰イオン表面活性剤、特に炭素原子数６〜２４個の脂肪酸（またはその塩）も使用できる。好適な陰イオン表面活性剤の一例は、オレイン酸またはその塩のオレイン酸ナトリウムである。陽イオン表面活性剤および塩化ドデシルトリメチルアンモニウムなどのその塩も適している。
以上から、広範な表面活性剤を使用できることが理解されよう。実際、本発明では、ほとんどすべての表面活性剤（開発中のものを含む）または表面活性剤混合物を使用することができる。所与の用途に最も適した表面活性剤は不当な実験を必要としない経験的研究により決定できる。従って、当業者は主として生体適合性のような特性に基づいて表面活性剤を選択できる。
溶液が、第一の表面活性剤としての疎水性リン脂質と、少なくとも１つのその他のより親水性の強い第二の表面活性剤を含む表面活性剤混合物を含有すると特に適していることが明らかとなった。好ましくは、疎水性リン脂質は少なくとも１つのアシル基を有し、アシル基の炭素原子数の総数は少なくとも１０個である（例えば、ジデカノイルリン脂質）。いくつかの態様では、第一表面活性剤のリン脂質は炭素原子数約１０個または１４個から約２０個または２４個のアシル基を有している。例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（アシル基を２個含み、各アシル基が炭素原子を１６個含んでいる）が使用できる。アシル基は水素化またはフッ素化されていてもよい。その他のリン脂質のヘッド基も企図される。例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールまたはホスファチジルエタノールアミンは本発明に適した特性を有している。このようなリン脂質の組み合わせも、タマゴもしくは大豆のレシチンまたは肺表面活性物質などの天然のリン脂質製品のように“第一表面活性剤”を構成することができる。また、第一表面活性剤であるリン脂質にしょ糖ジ−、トリ−およびテトラ−エステルなどのその他の非常に水不溶性である表面活性剤を添加することもできる。コレステロールを第一表面活性剤に添加することができ、コレステロールとリン脂質の比が約０．０１〜０．５ｗ／ｗの範囲であると、安定性を高めるのに有用であることが判明している。リン脂質のアシル鎖は飽和であるのが好ましいが、不飽和アシル基も本発明の範囲に含まれる。第一表面活性剤は、好ましくは溶液の約０．００５〜２０％ｗ／ｖ、より好ましくは溶液の約０．０２〜１０％ｗ／ｖとなる。
比較的疎水性の長いアシル鎖を有するリン脂質と、第一のリン脂質より親水性の高いより短鎖のリン脂質とを含むリン脂質混合物を使用すると有利であることが認められている。具体例としては、炭素原子数１２個または１４個のアシル基を有する第一のリン脂質を、炭素原子数８個または１０個のアシル基を持つ共表面活性剤である第二のリン脂質と共に使用できる。
第一表面活性剤または第二表面活性剤のいずれかとして、炭素原子数１２個のアシル鎖を含むリン脂質を使用すると特に有利であることが発見された。例えば、炭素原子数１２個のアシル基を含むリン脂質が第一表面活性剤を構成してよく、糖エステルまたはＰｌｕｒｏｎｉｃ化合物が第二表面活性剤を構成してよい。別の選択肢としては、炭素原子数１６個のアシル鎖を有するリン脂質が第一表面活性剤を構成し、炭素原子数１２個のアシル鎖を有するリン脂質が第二表面活性剤を構成してよい。
膨張剤、好ましくは、Ｆｒｅｏｎ１１３などのフルオロカーボンを上記のでんぷん／表面活性剤溶液に分散させると、最終的に製造される噴霧乾燥製品はより効果的に気泡を形成する。膨張剤は、噴霧乾燥プロセスの間に気体になる任意の物質であってよい。膨張剤を、例えば、市販のマイクロフルイダイザを使用し、約５０００から１５０００ｐｓｉの圧力で、表面活性剤溶液中に分散させる。このプロセスにより、表面活性剤の単分子層で被覆された水と混合しないＦｒｅｏｎ（またはその他の膨張剤）のサブミクロンの液滴からなる従来のエマルジョンが形成される。この分散法およびその他の手法は一般的で、当技術分野でよく知られている。
噴霧乾燥させる溶液が膨張剤を含むと、より多数の中空のミクロスフェアが形成され、噴霧乾燥した粉末１ｇ当たりの超音波信号が大きくなる。噴霧乾燥機に流入する溶液の霧状の液滴が乾燥機内で熱い空気と混合する際、膨張剤はこれらの液滴内でスチーム気泡形成の核となる。好適な膨張剤は、乾燥中の液滴が高温（約１００℃）になった状態で、霧状の液滴内の溶液を気体または蒸気で過飽和にするものである。好適な膨張剤には次のものが含まれる。
１．室温で溶液を飽和させるのに使用する、水性溶液との混合性が限定された、溶解した低沸点（１００℃未満）の溶媒、例えば、塩化メチレン、アセトンおよび二硫化炭素。
２．室温および高圧（例えば３バール）で溶液を飽和する気体、例えば、ＣＯ2またはＮ2。液滴は、１気圧、１００℃でこの気体で過飽和になる。
３．非混合性低沸点（１００℃未満）液体のエマルジョン、例えば、Ｆｒｅｏｎ  １１３、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロブタン、ペンタン、ブタン、ＦＣ−１１、ＦＣ−１１Ｂ１、ＦＣ−１１Ｂ２、ＦＣ−１２Ｂ２、ＦＣ−２１、ＦＣ−２１Ｂ１、ＦＣ−２１Ｂ２、ＦＣ−３１Ｂ１、ＦＣ−１１３Ａ、ＦＣ−１２２、ＦＣ−１２３、ＦＣ−１３２、ＦＣ−１３３、ＦＣ−１４１、ＦＣ−１４１Ｂ、ＦＣ−１４２、ＦＣ−１５１、ＦＣ−１５２、ＦＣ−１１１２、ＦＣ−１１２１およびＦＣ−１１３１。
膨張剤は、表面活性剤溶液の約０．５％〜１０％ｖ／ｖの量となるように、でんぷん／表面活性座溶液に添加する。約３％ｖ／ｖの膨張剤は、好適な微小気泡を形成する噴霧乾燥粉末を製造することが明らかとなった。膨張剤は噴霧乾燥プロセスの間に実質的に蒸発し、従って、最終的な噴霧乾燥後の粉末では微量以上存在しない。
この溶液のその他の任意選択成分は、水相内の種々の塩またはその他の物質である。このような物質には、従来の粘度調整剤、燐酸バッファまたはその他の従来の生体適合性のバッファなどのバッファ、または酸または塩基などのｐＨ調整剤、（等張性、高張性、低張性を付与する）浸透圧調整剤を含むと有利でありうる。好ましい溶液はｐＨが約７で、等張である。これらの追加成分は各々、一般に溶液の５％ｗ／ｖ未満である。好適な塩の例には、リン酸ナトリウム（一ナトリウム塩および二ナトリウム塩）、塩化ナトリウム、リン酸カルシウムおよびその他の生理学的に許容される塩を含む。
噴霧乾燥後、ミクロスフェアの種々の各成分は、最終的な噴霧乾燥製品中で次の割合（重量％）となるのが好ましい。
親水性構造材料      １％〜１００％
表面活性剤          ０％〜９０％
塩、バッファ、等    ０％〜９０％
特に好ましい態様では、組成物は次の割合（重量％）を有する。
親水性構造材料      １０％〜６０％
表面活性剤          ０．１％〜１０％
塩、バッファ、等    １０％〜６０％
上記のように、ミクロスフェアをバイアルに入れ、所望の気体を乾燥させたミクロスフェアに浸透させる。すなわち、バイアルを真空チャンバに入れて抜気する。次に、空気を所望の気体または気体混合物で置換する。気体を次に球の空間内に拡散させる。圧力または真空のサイクルにより拡散を助けることができる。次に、バイアルをクリンプシールし、好ましくはガンマ線または加熱で滅菌する。
好ましくは、最初の第一改変剤ガス（空気または窒素などの空気の成分気体のいずれであってもよい）と第二の浸透圧調整用安定剤ガス（好ましくは、オストワルド係数が低い）が各々、約１：１００、１：７５、１：５０、１：３０、１：２０または１：１０から約１０００：１、５００：１、２５０：１、１００：１、７５：１または５０：１のモル比で存在する。特に好ましい態様では、気体は、２０℃でペルフルオロジグリムで飽和させた窒素である。
ＩＶ．包装および使用
本発明の微小気泡調製物の作製に使用するためのキットが製造できると理解されよう。これらのキットには、微小気泡を形成するための上記の気体、液体および表面活性剤を封入した容器を含むことができる。容器では、１つのチャンバに滅菌した乾燥成分と気体を入れ、第二チャンバに滅菌した水性の液体を入れることができる。また、表面活性剤は添加前に液体に溶解させてもよい。
従って、広義には、本発明はガスエマルジョンの製法を提供し、この方法は、
多数の空間を画定する構造材料と表面活性剤と前記空間内に分散させたフルオロエーテルを含む気体または気体混合物とを含む容器を提供し、
前記容器に水性の液体を添加し、
前記容器内で前記構造材料、前記表面活性剤および前記水性液体を混合して、表面活性剤層で囲われた前記気体または気体混合物の気泡を含むガスエマルジョンを形成することを含む。
好適な二チャンバ・バイアル容器が、例えばＷｈｅａｔｏｎ  Ｇｌａｓｓ社（Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ、ニュージャージー）からＷＨＥＡＴＯＮ  ＲＳ１７７ＦＬＷおよびＳ−１７０２ＦＬの商標で市販されている。別な例としては、Ｂ−Ｄ  ＨＹＰＡＫ  Ｌｉｑｕｉｄ／Ｄｒｙ  ５＋５ｍｌ  Ｄｕａｌ  Ｃｈａｍｂｅｒ予充填シリンジシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅ、ニュージャージー、米国特許４，６１３，３２６号に記載）がある。このシステムには次の利点がある。
１．簡便に使用できる。
２．水性不溶性ガスの浸透圧調整剤がチャンバ内に、一端では水性溶液のチャンバで、多端では針をシーリングする非常に面積の小さいエラストマで封入されている。
３．製造時に、Ｍｏｎｏｊｅｃｔ  ＃３０５（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ、セントルイス、ＭＯ）などの濾過針をシリンジに取り付けて、未溶解の固体の注入を確実に回避できる。
二チャンバシリンジを使用した微小気泡の形成は実施例ＶＩＩＩに記載する。
噴霧乾燥した粉末と水性溶液とを滅菌的に合わせることができるその他の二チャンバ再構成システムも本発明の範囲に含まれることは当業者には理解されよう。このようなシステムでは、水相を水不溶性の浸透圧調整用ガスと環境との間におくと、製品の有効期限を延長するのに特に有利である。微小気泡を形成するのに必要な物質が容器内にまだ存在していない場合、キットの他の成分と共に、キットの他の成分との容易な混合を助けるようにした形態または容器に包装することができる。
本発明の微小気泡の特殊な用途の例には、心臓、心筋組織の灌流イメージング、ストレスまたは運動試験中の心臓およびその組織の灌流特性の測定、または心筋梗塞による灌流の消失または変化の検査が含まれる。同様に、組織への血流量を増加させるように設計した薬剤を経口または静脈内投与した後、心筋組織を見ることもできる。また、冠状組織静脈グラフト、冠動脈形成、または血栓溶解剤（ＴＰＡまたはストレプトキナーゼ）などの種々の介入による変化またはそれらの介入の間の変化の映像化も増強することができる。これらの造影剤は末梢静脈から簡便に投与して、循環系全体の映像化を増強できるので、一般的な血管疾患の診断および胎盤組織の生存能の超音波モニタリングも容易にする。
特に好ましい態様では、本発明は、開示のガスエマルジョンを造影剤として使用した調波超音波イメージング法を提供する。本発明の気泡は特に、同時係属出願の米国特許出願０８／３１４，０７４に記載の方法などの調波イメージング法に有用である。開示の微小気泡が微小気泡に照射される超音波照射の（基本）周波数の変換能力を最適化することにより、画像化が増強される。従って、本発明は医学的に有用な超音波励起振幅で調和波を生成できる微小気泡の使用を提供する。
本発明は超音波イメージング法以外にも使用できることも強調すべきである。実際、本発明は、非生物学的用途を含むすべてのシステムでのリン脂質含有気体の使用を包含するに十分広範なものである。
本発明の微小気泡処方にはその他の成分も含みうることも理解されたい。例えば、浸透圧調整剤、安定剤、キレート形成剤、バッファ、粘度調整剤、空気溶解度改変剤、塩および糖を微小気泡縣濁液に添加して、寿命およびコントラスト増強強化を最大化することができる。滅菌性、等張性および生体適合性などを考慮し、注射可能な組成物にこのような従来の添加物を決定できる。このような物質の使用は当業者に理解されるであろうし、具体的な量、比および物質の種類は過度の実験をすることなく経験的に決定できる。
本発明の微小気泡調整物はすべて、トリやほ乳類などの脊椎動物に、脊椎動物の超音波イメージングする部分の造影剤として使用できる。好ましくは、脊椎動物はヒトであり、画像化する脊椎動物の部分は血管系である。この態様では、少量（例えば、脊椎動物の体重に対し０．１ｍｌ／Ｋｇ［噴霧乾燥粉末２ｍｇ／Ｋｇ］）を動物に血管内投与する。約０．００５ｍｌ／Ｋｇから約１．０ｍｌ／Ｋｇなどの他の量の微小気泡も使用できる。この手法を用い、心臓、動静脈、肝臓や腎臓などの血液の豊富な器官を超音波で画像化できる。
Ｖ．実施例
上記の説明は以下の実施例を参照してさらによく理解されよう。しかし、このような実施例は本発明を実施する好ましい方法の例示であって、本発明の範囲および添付の請求の範囲を限定するものではない。
実施例Ｉ
超音波処理による微小気泡の製造
表面活性剤として２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８および１％スクロースステアリン酸エステル、改変剤ガスとして空気、気体浸透圧調整剤としてペルフルオロヘキサンを含有する等張の水相を超音波処理して、数加重平均（average number weighted）サイズ５ミクロンの微小気泡を製造した。
この実施例では、０．９％ＮａＣｌ、２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８および１％スクロースステアリン酸エステルを含有する滅菌水溶液１．３ｍｌを２．０ｍｌのバイアルに入れた。バイアルの頂部の残存空間０．７ｍｌには最初、空気を含んでいた。２５℃においてペルフルオロヘキサン蒸気で飽和させた空気（空気５４０トール、ペルフルオロヘキサン２２０トール）をバイアルの頂部空間に流した。バイアルを薄い０．２２ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）の隔膜でシールした。バイアルを水平に倒し、Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓから入手できる５０ワットのソニケータ（ＶＣ５０型）に取り付けた１／８インチ（３ｍｍ）の超音波プローブを隔膜に静かに押しつけた。この位置で、隔膜によりプローブと溶液は離れていた。次に、プローブに電力を掛け、溶液を１５秒間超音波処理すると、細かく分割された微小気泡の白い溶液を形成された。この微小気泡のＨｏｒｉｂａ  ＬＡ−７００のレーザー光散乱粒子分析器で測定した数加重平均サイズは５ミクロンであった。
実施例ＩＩ
リン脂質含有溶液の噴霧乾燥
注射用の水にＭａｌｔｒｉｎ  Ｍ−１００マルトデキストリン（Ｇｒａｉｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社、Ｍｕｓｃａｔｉｎｅ、ＩＡ）２．０％ｗ／ｖ、塩化ナトリウム（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）０．９５％ｗ／ｖ、Ｓｕｐｅｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（Ｓｅｒｖａ、ハイデルベルグ、ドイツ）１．０％、Ｒｙｏｔｏ  スクロースステアレート  Ｓ−１６７０（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ−Ｋａｓｅｉ  Ｆｏｏｄ社、東京、日本）１．０％ｗ／ｖおよびＬｉｐｏｉｄ  Ｅ−１００−３水添リン脂質（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ）０．５％を含む溶液を１リットル製造した。
次に、この溶液を、
熱い空気の流速          ３９．５ＣＦＭ
入口の空気の温度        ２４５℃
出口の空気の温度        １００℃
アトマイザの空気流      ３５０リットル／分
液体供給速度            １リットル／時
の条件を使用し、二流体アトマイザを備えたＮｉｒｏ  アトマイザ・ポータブル・噴霧乾燥機（Ｎｉｒｏ  Ａｔｏｍｉｚｅｒ、コペンハーゲン、デンマーク）で噴霧乾燥させた。
乾燥した中空球状の生成物の直径は約１μＭから約１５μＭの間であり、この乾燥機に標準的なサイクロン・セパレータで回収した。粉末のアリコート（２５０ｍｇ）を１０ｍｌの管状バイアルに秤取し、抜気し、１３℃においてペルフルオロヘキサンで飽和した窒素を流し、密封した。窒素は、１３℃の水浴に浸漬したペルフルオロヘキサンを充填した気体洗浄ビン３本に通して、ペルフルオロヘキサンで飽和させた。
注射用の水５ｍｌで再構成すると、光学顕微鏡で、１〜２０ミクロンの大きさの気泡が多数観察された。長時間にわたり約１ミクロンの気泡が多数観察できたことは、非ニュートン粘弾性表面活性剤として処方中にリン脂質を追加したことにより安定性が上昇したことを示している。
実施例ＩＩＩ
しょ糖エステル／ポロキサマー表面活性剤を含有するペルフルオロジグリムガスエマルジョン
下記の注射用成分を使用し、下記の２つの溶液を１リットルずつ製造した。
溶液１：
３．９％ｗ／ｖ  ｍ−ＨＥＳヒドロキシエチルでんぷん（味の素、東京、日本）
３．２５％ｗ／ｖ  塩化ナトリウム  （Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
２．８３％ｗ／ｖ  リン酸ナトリウム、二塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
０．４２％ｗ／ｖ  リン酸ナトリウム、一塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
溶液２：
２．１１％ｗ／ｖ  Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐａｎｙ、ＮＪ）
０．３２％ｗ／ｖ  Ｒｙｏｔｏ  スクロースステアレート  Ｓ−１６７０（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ−Ｋａｓｅｉ  Ｆｏｏｄ社、東京、日本）
０．１６％ｗ／ｖ  Ｒｙｏｔｏ  スクロースステアレート  Ｓ−５７０（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ−Ｋａｓｅｉ  Ｆｏｏｄ社、東京、日本）
溶液２を高剪断ミキサーに入れ、氷浴で冷却した。１リットルの溶液２中に１，１，２−トリクロロトリフルオロエタン（Ｆｒｅｏｎ  １１３；ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ニュージャージー）の粗い懸濁液が３０ｍｌ形成された。この懸濁液を５℃、１００００ｐｓｉで、マイクロフルイダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、ＭＡ；Ｍ−１１０Ｆ型）に５回通して、乳化させた。得られた懸濁液を溶液１に加えた。次に、この混合物を、
熱空気の流速              ３１ＣＦＭ
入口の空気の温度          ３７０℃
出口の空気の温度          １２０℃
アトマイザの空気流        ２９０リットル／分
エマルジョン供給速度      １．５リットル／時
の条件で、二流体アトマイザを備えたＮｉｒｏ  アトマイザ・ポータブル噴霧乾燥機（Ｎｉｒｏ  Ａｔｏｍｉｚｅｒ、コペンハーゲン、デンマーク）で噴霧乾燥させた。
この乾燥した、中空の球状生成物は、約１μＭおよび約１５μＭの直径を有し、この乾燥機に標準のサイクロンセパレータで回収した。粉末のアリコート（２００ｍｇ）を１０ｍｌの管状バイアルに秤取し、２０℃においてペルフルオロジグリムで飽和した窒素を流し、密封した。２０℃の水浴に浸漬した３本のペルフルオロジグリムを充填した気体洗浄ビンに通し、窒素をペルフルオロジグリムで飽和させた。バイアル１本当たりのペルフルオロジグリム蒸気量は１２〜１４ｍｇであった。
水を注入したときの圧力を解放するための通気孔として１８ゲージ針を挿入した後、バイアルを注射用の水５ｍｌで再構成したところ、１ｍｌ当たり約６×１０8個の気泡が形成された。この気泡はin vitroで数日安定であった。
得られた微小気泡懸濁液１ｍｌを、ドップラ超音波信号をモニターする機械を頚動脈に装着した体重約３ｋｇのウサギに静脈注射した。システム６ドップラフローモジュール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、サンジエゴ、カリフォルニア）に接続した１０ＭＨｚのフローカフ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ＥＳ−１０−２０型）からＬｅＣｒｏｙ９４１０オシロスコープ（ＬｅＣｒｏｙ、Ｃｈｅｓｔｎｕｔ  Ｒｉｄｇｅ、ＮＹ）にＲＦドップラ信号を送った。オシロスコープで計算された信号の根平均二乗（root mean square，ＲＭＳ）電圧をコンピュータに送り、得られた曲線をプロットして、ピークのエコー生成信号強度と、血液中の微小気泡の半減期を求めた。コントラスト前の信号は０．１ボルトＲＭＳ未満であった。
注射６０秒後、信号強度は１．１Ｖｒｍｓで、減衰定数は約０．００８５９ｓ-1であった。
実施例ＩＶ
リン脂質／ポロキサマー表面活性剤を含むペルフルオロジグリムガスエマルジンョン
下記の注射用成分を使用し、下記の２つの溶液を１リットルずつ製造した。
溶液１：
３６ｇ  ｍ−ＨＥＳヒドロキシエチルでんぷん（味の素、東京、日本）
３０ｇ  塩化ナトリウム  （Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
２６ｇ  リン酸ナトリウム、二塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
３．９ｇ  リン酸ナトリウム、一塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
溶液２：
４．５ｇ  Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐａｎｙ、ＮＪ）
４．５ｇ  ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）
溶液２を高剪断ミキサーに入れ、氷浴で冷却した。１リットルの溶液２中に１，１，２−トリクロロトリフルオロエタン（Ｆｒｅｏｎ  １１３；ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ニュージャージー）の粗い懸濁液が３０ｍｌ形成された。この懸濁液を５℃、１００００ｐｓｉで、マイクロフルイダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、ＭＡ；Ｍ−１１０Ｆ型）に５回通して、乳化させた。得られた懸濁液を溶液１に加えた。次に、この混合物を、
熱空気の流速              ３１ＣＦＭ
入口の空気の温度          ３２５℃
出口の空気の温度          １２０℃
アトマイザの空気流        ２９０リットル／分
エマルジョン供給速度      １．５リットル／時
の条件で、二流体アトマイザを備えたＮｉｒｏ  アトマイザ・ポータブル噴霧乾燥機（Ｎｉｒｏ  Ａｔｏｍｉｚｅｒ、コペンハーゲン、デンマーク）で噴霧乾燥させた。
この乾燥した、中空の球状生成物は、約１μＭおよび約１５μＭの直径を有し、この乾燥機に標準のサイクロンセパレータで回収した。粉末のアリコート（２００ｍｇ）を１０ｍｌの管状バイアルに秤取し、２０℃においてペルフルオロジグリムで飽和した窒素を流し、密封した。２０℃の水浴に浸漬した３本のペルフルオロジグリムを充填した気体洗浄ビンに通し、窒素をペルフルオロジグリムで飽和させた。バイアル１本当たりのペルフルオロジグリム蒸気量は１２〜１４ｍｇであった。
水を注入したときの圧力を解放するための通気孔として１８ゲージ針を挿入した後、バイアルを注射用の水５ｍｌで再構成したところ、１ｍｌ当たり約３×１０8個の気泡が形成された。この気泡はin vitroで数日安定であった。
得られた微小気泡懸濁液１ｍｌを、ドップラ超音波信号をモニターする機械を頚動脈に装着した体重約３ｋｇのウサギに静脈注射した。システム６ドップラフローモジュール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、サンジエゴ、カリフォルニア）に接続した１０ＭＨｚのフローカフ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ＥＳ−１０−２０型）からＬｅＣｒｏｙ９４１０オシロスコープ（ＬｅＣｒｏｙ、Ｃｈｅｓｔｎｕｔ  Ｒｉｄｇｅ、ＮＹ）にＲＦドップラ信号を送った。オシロスコープで計算された信号の根平均二乗（ＲＭＳ）電圧をコンピュータに送り、得られた曲線をプロットして、ピークのエコー生成信号強度と、血液中の微小気泡の半減期を求めた。コントラスト前の信号は０．１ボルトＲＭＳ未満であった。
注射６０秒後、信号強度は０．４Ｖｒｍｓで、減衰定数は約０．０１８３５ｓ-1であった。
実施例Ｖ
リン脂質混合物表面活性剤を含むペルフルオロジグリムガスエマルジョン
下記の注射用成分を使用し、下記の２つの溶液を１リットルずつ製造した。
溶液１：
３６ｇ  ｍ−ＨＥＳヒドロキシエチルでんぷん（味の素、東京、日本）
３０ｇ  塩化ナトリウム（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
２６ｇ  リン酸ナトリウム、二塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
３．９ｇ  リン酸ナトリウム、一塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
溶液２：
４．８ｇ  ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）
３．４ｇ  ジオクタノイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）
溶液２を高剪断ミキサーに入れ、氷浴で冷却した。１リットルの溶液２中に１，１，２−トリクロロトリフルオロエタン（Ｆｒｅｏｎ  １１３；ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ニュージャージー）の粗い懸濁液が３０ｍｌ形成された。この懸濁液を５℃、１００００ｐｓｉで、マイクロフルイダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、ＭＡ；Ｍ−１１０Ｆ型）に５回通して、乳化させた。得られた懸濁液を溶液１に加えた。次に、この混合物を、
熱空気の流速              ３１ＣＦＭ
入口の空気の温度          ３２５℃
出口の空気の温度          １２０℃
アトマイザの空気流        ２９０リットル／分
エマルジョン供給速度      １．５リットル／時
の条件で、二流体アトマイザを備えたＮｉｒｏ  アトマイザ・ポータブル噴霧乾燥機（Ｎｉｒｏ  Ａｔｏｍｉｚｅｒ、コペンハーゲン、デンマーク）で噴霧乾燥させた。
この乾燥した、中空の球状生成物は、約１μＭおよび約１５μＭの直径を有し、この乾燥機に標準のサイクロンセパレータで回収した。粉末のアリコート（２００ｍｇ）を１０ｍｌの管状バイアルに秤取し、１３℃においてペルフルオロジグリムで飽和した窒素を流し、密封した。１３℃の水浴に浸漬した３本のペルフルオロジグリムを充填した気体洗浄ビンに通し、窒素をペルフルオロジグリムで飽和させた。バイアル１本当たりのペルフルオロジグリム蒸気量は１２〜１４ｍｇであった。
水を注入したときの圧力を解放するための通気孔として１８ゲージ針を挿入した後、バイアルを注射用の水５ｍｌで再構成したところ、１ｍｌ当たり約２×１０8個の気泡が形成された。この気泡はin vitroで数日安定であった。
得られた微小気泡懸濁液１ｍｌを、頚動脈にドップラ超音波信号をモニターする機械を装着した体重約３ｋｇのウサギに静脈注射した。システム６ドップラフローモジュール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、サンジエゴ、カリフォルニア）に接続した１０ＭＨｚのフローカフ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ＥＳ−１０−２０型）からＬｅＣｒｏｙ９４１０オシロスコープ（ＬｅＣｒｏｙ、Ｃｈｅｓｔｎｕｔ  Ｒｉｄｇｅ、ＮＹ）にＲＦドップラ信号を送った。オシロスコープで計算された信号の根平均二乗（ＲＭＳ）電圧をコンピュータに送り、得られた曲線をプロットして、ピークのエコー生成信号強度と、血液中の微小気泡の半減期を求めた。コントラスト前の信号は０．１ボルトＲＭＳ未満であった。
注射６０秒後、信号強度は０．２Ｖｒｍｓで、減衰定数は約０．００３８７ｓ-1であった。
実施例ＶＩ
長鎖リン脂質／短鎖リン脂質混合物から製造したガスエマルジョンの生体適合性
実施例ＩＩに記載のように、噴霧乾燥用の下記のエマルジョンを１リットル製造した。
３．６％ｗ／ｖ  ｍ−ＨＥＳヒドロキシエチルでんぷん（味の素、東京、日本）
３．０％ｗ／ｖ  塩化ナトリウム（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
２．６％ｗ／ｖ  リン酸ナトリウム、二塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
０．３９％ｗ／ｖ  リン酸ナトリウム、一塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
０．２２％ｗ／ｖ  ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｓｙｎｇｅｎａ社、ケンブリッジ、ＭＡ）
０．３１％ｗ／ｖ  ジオクタノイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）
３．０％ｖ／ｖ  １，１，２−トリクロロトリフルオロエタン（Ｆｒｅｏｎ  １１３；ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）
ジパルミトイルホスファチジルコリンとジオクタノイルホスファチジルコリンがこの比のとき、表面活性剤は混合ミセルのみを形成する。５ｍｌの水で再構成すると、１ｍｌ当たり約５１００万個の１〜２０ミクロンのガスエマルジョン液滴が観察された。ラットに５ｍｇ／ｋｇ投与すると、ガスエマルジョンのエコー発生信号の一次減衰定数は０．００２９ｓ-1であった。これは静脈内半減期４分に相当する。
Ｑｕｉｄｅｌ社（サンジエゴ、カリフォルニア）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃ３ａ診断キットで、ガスエマルジョンの補体活性化をアッセイした。ガスエマルジョンと陰性対照（食塩水）の間に差は認められず、ガスエマルジョンが補体を活性化しないことを示している。裸の微小気泡が補体を活性化することはよく知られている。
テストした試料                ［Ｃ３ａ］（ｎｇ／ｍｌ）
Ｚｙｍｏｓａｎ（陽性対照）        ４３４０３
食塩水（陰性対照）                    ６０４
ガスエマルジョン                      ４１２
ガスエマルジョンを２０ｍｇ／ｋｇ投与し、麻酔下イヌにおける血行力学の変化についてアッセイした。平均動脈圧および肺動脈圧に変化は認められなかった。これらの結果は、臨床用量の１０〜１００倍のガスエマルジョンで血行力学的作用は認められないことを示している。
0004067116.tif 000009
このように、同じガスエマルジョン処方で、優れた効果および生体適合性が得られた。
実施例ＶＩＩ
二チャンバ・バイアルを使用した微小気泡の形成
噴霧乾燥した粉末８００ｍｇを、２０ｍｌのＷｈｅａｔｏｎ  ＲＳ−１７７ＦＬＷ二チャンバ・バイアルの下部チャンバに秤取した。１３℃においてペルフルオロヘキサンで飽和した窒素をバイアルに流入させた後、チャンバ間シールを挿入した。上部チャンバに注射用滅菌水１０ｍｌを充填した。上部チャンバのストッパを挿入して、上部チャンバ中の気泡を全て排除した。上部ストッパを下げると、チャンバ間シールが下部チャンバの中に入れられ、水が下部チャンバに流入し、粉末を再構成した。光学顕微鏡で示されたように、多数の安定な微小気泡が形成された。この手順では、この型の包装が簡便で、水性相を粉末に添加するときに圧力上昇をなくすための通気孔を備える必要性がなくなることが示される。
実施例ＶＩＩＩ
二チャンバシリンジを使用する微小気泡の形成
噴霧乾燥した粉末１００ｍｇを、５ｍｌ＋５ｍｌのＨＹＰＡＫ  液体／乾燥物・二チャンバ・シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に秤取し、粉末（端が針になっている）チャンバに振り入れた。次に、チャンバ間シールをバイパス・チャンネルのすぐ上においた。次に、５μＭフィルタを有する針をシリンジに装着した。次に、アセンブリを真空チャンバに入れ、抜気し、１３℃において気体浸透圧調整剤であるペルフルオロヘキサンで飽和した窒素でチャンバを再充填することにより、粉末を含有するチャンバを気体浸透圧調整剤で充填した。フィルター針により、粉末含有チャンバの抜気および大気の再充填が可能になる。次に、シーリング針カバーを針の上に載せた。液体チャンバに４ｍｌの注射用の水を充填し、気泡を全部除去するために一時的な通気孔（ガラスシリンジバレルとプランジャの間に挿入した針金）を使用して、プランジャを取り付けた。
再構成するために、針シーリングカバーを取り外して、粉末チャンバの圧力の蓄積を除去した。次に、プランジャを押下げ、チャンバ間シールをバイパスの位置とし、チャンバ間シールの周囲の水を粉末含有チャンバ内に流入させた。すべての水が粉末チャンバに入ったら、プランジャを止めた。シリンジを振とうして、粉末を溶解させた。シリンジを保持して、針になった端を上げ、さらにプランジャを押下げて、過剰な気体と大きな気泡すべてを排除した。次いで、プランジャを一番下まで押下げて、（光学顕微鏡で観察して）多数の安定した微小気泡を含有する溶液をシリンジから押し出した。
実施例ＩＸ
フルオロエーテルを含有するガスエマルジョンと空気およびフルオロアルカンとを含有するガスエマルジョンのin vivoでの効果の比較
実施例ＩＩＩに記載のように分散液Ａの１リットルを製造し、噴霧乾燥し、実施例Ｖに記載のように分散液Ｂおよび分散液Ｃの１リットルを製造し、粉末乾燥させた。
Ａ．しょ糖エステル微小気泡処方（表中「ＡＦ０１４５」）
３６ｇ  ｍ−ＨＥＳヒドロキシエチルでんぷん（味の素、東京、日本）
３０ｇ  塩化ナトリウム（Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
２６ｇ  リン酸ナトリウム、二塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
３．９ｇ  リン酸ナトリウム、一塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
４．５ｇ  しょ糖エステル１１０２５００３（Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社、サンジエゴ、ＣＡ）
１９．５ｇ  Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐａｎｙ、ＮＪ）
３０ｍｌ  １，２，２−トリクロロトリフルオロエタン（Ｆｒｅｏｎ  １１３、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）
水（注射用）  ４９０ｍｌ
Ｂ．リン脂質混合物微小気泡処方（表中「２４ｂ］）
３６ｇ  ｍ−ＨＥＳヒドロキシエチルでんぷん（味の素、東京、日本）
３０ｇ  塩化ナトリウム  （Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
２６ｇ  リン酸ナトリウム、二塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
３．９ｇ  リン酸ナトリウム、一塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
４．５ｇ  ジミリストイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、アラバマ）
４．５ｇ  ジオクタノイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、アラバマ）
５．８％ｖ／ｖ  ペルフルオロヘキサン（３Ｍ）
水（注射用）４９０ｍｌ
Ｃ．リン脂質混合物微小気泡処方（表中「２４ｆ］）
３６ｇ  ｍ−ＨＥＳヒドロキシエチルでんぷん（味の素、東京、日本）
３０ｇ  塩化ナトリウム  （Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
２６ｇ  リン酸ナトリウム、二塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
３．９ｇ  リン酸ナトリウム、一塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
３．４ｇ  ジミリストイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、アラバマ）
４．８ｇ  ジオクタノイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、アラバマ）
５．８％ｖ／ｖ  ペルフルオロヘキサン（３Ｍ）
水（注射用）４９０ｍｌ
噴霧乾燥させた試料１００ｍｇを１０ｍｌのバイアルに入れ、３ウェイバルブを具備するシリンジ針を使用し、ペルフルオロエーテル空気混合物の抜気−気体供給サイクルを反復して気体を供給した。充填用気体として、ペルフルオロジメチルエーテル（８５％、Ｅｘｆｌｕｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、テキサス、オースチン）、ペルフルオロ（メチルエチルエーテル）（８０％、Ｅｘｆｌｕｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、テキサス、オースチン）、ペルフルオロ（ジエチルエーテル）（９０％、Ｓｔｒｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ、ＭＡ）、ｎ−ペルフルオロプロパンおよびｎ−ペルフルオロブタン（９７％、ＰＣＲ社）を使用した。１バイアル当たりのペルフルオロエーテルおよびフルオロカーボン蒸気の量は表に示す。水５ｍｌにより再構成した後で、気泡が形成された。この気泡はin vitroで数日間安定であった。in vivoでのエコー発生能を実施例ＩＩＩに記載のようにパルスドップラ信号増強ウサギモデルで評価した。気泡分散特性は下表にまとめた。
0004067116.tif 000010
すべてのペルフルオロエーテル試料は血流中への注射３００秒後まで有意な超音波信号を提供した。空気を充填した同じ調製物では注射５秒後にまったくエコー発生は認められなかった。さらに、ペルフルオロエーテルを充填した試料では、少量を使用した場合でさえ、同じ炭素原子数のフルオロカーボン類似体より２０〜３０％有効性が高かった。図には、上表に示した実験１および２について、時間の関数として、パルスされたドップラ信号をボルトで示す。
実施例Ｘ
フルオロエーテルガスエマルジョンまたはフルオロアルカン含有ガスエマルジョンを投与した後の心臓および肝臓のin vivoエコー発生の比較
実施例ＩＸの表に示した試料２および３をウサギの耳の静脈に注射し、超音波散乱信号を７ＭＨｚのトランスジューサを持つＡＣＵＳＯＮ  １２８ＸＰで測定した。注射直後、両方の組成物は血管および心臓を実質的にコントラストアウトした。このコントラストは徐々に（数分単位で）消失し、次に肝臓をコントラストアウトした。これはペルフルオロブタン（試料３）では１０分間、ペルフルオロ（メチルエチルエーテル）（試料２）では１５分間持続した。
本発明は、in vivoで気泡の寿命が長い超音波および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）用コントラスト増強剤として適した安定なガス分散液またはエマルジョンを提供する。一般的な超音波コントラスト増強剤は動脈系をほぼ１回通過する間、または数秒から１分間しかコントラスト増強能を示さない。従って、このような薬剤は静脈注射後、一般に患者で大動脈を通過して循環しない。比較すると、本発明により製造した安定な造影剤は静脈注射後、患者の循環系全体を複数回通過するのに十分な時間持続的にコントラストを増強する。in vivoでの数分間の気泡の寿命が容易に示される。超音波の際にこのようにコントラスト増強能が長いと非常に有利である。さらに、本発明のコントラスト増強剤は優れたイメージングを提供する。例えば、心臓、肝臓および腎臓を通る血液のはっきりした、鮮明で、明確なイメージが得られる。従って、本発明の組成物は少量の非毒性量を末梢静脈に投与し、全身のイメージを増強するのに使用できる。
実施例ＸＩ
ウサギモデルにおけるペルフルオロエーテル含有ガスエマルジョンとペルフルオロアルカン含有ガスエマルジョンのin vivoでの効果の比較
実施例Ｖに記載のように１リットルの分散液Ｄを製造し、噴霧乾燥した。
分散液Ｄの組成：
４３．２ｇ  ｍ−ＨＥＳヒドロキシエチルでんぷん（味の素、東京、日本）
３１．３２ｇ  リン酸ナトリウム、二塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
４．６８ｇ  リン酸ナトリウム、一塩基塩（Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
１．２ｇ  Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐａｎｙ、ＮＪ）
６ｇ  ジミリストイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）
６１．２ｇ  ペルフルオロヘキサン（３Ｍ）
４４．４ｇ  塩化ナトリウム（Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、セントルイス、ＭＯ）
水（注射用）９４５ｇ
噴霧乾燥させた粉末２００ｍｇを２０ｍｌのバイアルに入れ、１リットルのエアーバッグ中で予め製造した浸透圧調整剤と窒素の混合物のガスを注入した。粉末を入れたバイアルを繰り返し抜気し、総圧力１ａｔｍで浸透圧調整剤と窒素の混合物を充填した。浸透圧調整剤の分圧は０．１３±０．０３ａｔｍであった。検討した浸透圧調整剤を下記第ＩＩＩ表に示す。
0004067116.tif 000011
粉末を１０ｍｌの水で再構成後、気泡が形成された。この気泡のin vivoでのエコー発生能を、実施例ＩＩＩに記載のように、パルスドップラ信号増強ウサギモデルを使用して評価した。注射量を０．２ｍｌ（すなわち、ウサギ１ｋｇ当たり乾燥粉末約１ｍｇ）に減量した点が実施例ＩＩＩと異なった。第２ａ図、第２ｂ図および第２ｃ図は分圧の近い異なる充填ガスについて、超音波信号の経時的な減衰を比較している。データは、ペルフルオロエーテル（太線）を含む微小気泡調製物とそのペルフルオロカーボン類似体（細線）とを比較できるよう、対で示してある。グラフから、ペルフルオロエーテルを充填した気泡はそのフルオロカーボン類似体に比べ血中に長時間維持されることが明らかである。
実施例ＸＩＩ
ブタモデルにおけるペルフルオロエーテル含有ガスエマルジョンとペルフルオロアルカン含有ガスエマルジョンのin vivoの効果の比較
粉末Ｄを実施例ＸＩに記載のように製造し、ペルフルオロヘキサン−Ｎ2混合物（１バイアル当たり浸透圧調整剤２８ｍｇ、分圧０．１６ａｔｍ）およびＣ5Ｆ12Ｏ4−Ｎ2混合物（１バイアル当たり浸透圧調整剤２２ｍｇ、分圧０．１２ａｔｍ）を充填した。粉末を水１０ｍｌで再構成した後、気泡が形成された。
麻酔したブタ（１４〜１６ｋｇ）の大腿動脈、大腿静脈、頚静脈に、血行力学的モニタリングと造影剤投与のために、埋め込み式カテーテルを装着した。ＨＰ  Ｓｏｎｏｓ  ２５００超音波装置を使用し、三頭筋（capillary  mascle）のレベルで旁胸骨（parasternal）短軸方向の心臓イメージを得た。２ＭＨｚで放射し、４ＭＨｚで受信する広帯域リニアフェーズアレイプローブを使用し、第二調波モードでイメージを得た。イメージングは各心臓サイクルの最後の収縮期に間欠的に（ゲーティングした）、トリガした。再構成した造影剤０．５ｍｌを０．５ｍｌの滅菌食塩水で希釈し、頚動脈から１分間かけて注入した。
第３ａ図、第３ｂ図および第３ｃ図は、造影剤注入前（３ａ）、注射１分後（３ｂ）および注射６分後（３ｃ）の心臓のイメージを示している。
注射１分後には、両方の充填剤で心臓の実質的なコントラストが示されている（第３ｂ図）。しかし、６分後には、ペルフルオロエーテルを含む微小気泡調製物を使用して得たイメージの組織のコントラストはまだ非常に大きかったが（第３ｃ図）、ペルフルオロヘキサンを含む微小気泡調製物を使用して得たイメージのコントラストは顕著に低下している。これは、ペルフルオロポリエーテルを充填した微小気泡は長期間にわたり臨床的に有用なコントラストイメージを明確に提供することを示している。
以上の説明は本発明の好ましい態様を詳述しており、企図した最良の様式を示している。しかし、本明細書中に上記説明がいかに詳しく示されていても、本発明は多くの方法で実行でき、本発明は添付の請求の範囲およびその均等物に従って構成されるものであると理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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