(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列を含む予め選択されたＲＮＡ標的のサンプル中での存在を検出する核酸ハイブリダイゼーション検定法において、
ａ．該サンプルを、標的配列に相補的な一組のＲＮＡバイナリ・レポーター・プローブとともにインキュベートして、レポーター・プローブ-標的ハイブリッドを形成する工程であって、ここで前記プローブは、一方のプローブの３’末端が他方のプローブの５’末端と隣り合うようにハイブリダイズする工程、
ｂ．レポーター・プローブ−標的ハイブリッドをＴ４ ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌ＤＮＡリガーゼとインキュベートして、ＲＮＡレポーター分子を形成する工程、および、
ｃ．前記標的の存在を指示するものとして前記ＲＮＡレポーター分子を検出する工程
を含む核酸ハイブリダイゼーション検定法。
【請求項２】
前記一組のバイナリ・プローブの一方が標的を固体表面に固定するために働き、他方の前記バイナリ・プローブが検出し得るものである、請求項１記載の検定法。
【請求項３】
前記レポーター分子が、ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼの鋳型であって、さらに前記レポーター分子をＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼとインキュベートする工程を含む、請求項１記載の検定法。
【請求項４】
さらに工程ａの後でかつ工程ｂの前にリバーシブル標的捕捉の工程を有する、請求項３記載の検定法。
【請求項５】
前記バイナリ・プローブの両方が、前記標的配列とのハイブリダイズに寄与する少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項３記載の検定法。
【請求項６】
前記バイナリ・プローブの両方が、前記標的配列とのハイブリダイズに寄与する少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１記載の検定法。
【請求項７】
標的配列を含有する予め選択されたＲＮＡ標的の、サンプルにおける存在を検出する、核酸ハイブリダイゼーションバイナリ・プローブ検定法であって、
ａ．サンプルを、固体表面に標的を固定するキャプチャー・プローブおよび固定されたレポーター・プローブ−標的ハイブリッドを形成する第一および第二ＲＮＡバイナリ・プローブとインキュベートし、ここで前記第一および第二ＲＮＡバイナリ・プローブは、一方のプローブの３’末端が他方のプローブの５’末端と隣り合うようにハイブリダイズし、
ｂ．固定されたプローブ−標的ハイブリッドを洗浄し、
ｃ．レポーター・プローブ−標的ハイブリッドを、増幅されるレポーター分子を形成するＴ４ ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌ＤＮＡリガーゼとインキュベートし、
ｄ．前記レポーター分子を、ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼとインキュベートして、増幅された生成物を形成し、および
ｅ．前記標的の存在を示すものとして前記増幅された生成物の存在を検出する工程を有する検定法。
【請求項８】
前記バイナリ・プローブの両方が、前記標的配列とのハイブリダイズに寄与する少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項７記載の検定法。
【請求項９】
前記ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼが、Ｑβレプリカーゼである、請求項８記載の検定法。
【請求項１０】
工程ｂとｃとの間に、キャプチャー・プローブから、レポーター・プローブ−標的ハイブリッドを切断して、放出する工程を有する、請求項８記載の検定法。
【請求項１１】
標的配列を含有する予め選択されたＲＮＡ標的のバイナリ・プローブハイブリダイゼーション検定法を行うための試薬類のキットであって、
ａ．前記標的配列に相補的な一組のＲＮＡバイナリ・プローブであって、一方のプローブの３’末端が他方のプローブの５’末端と隣り合うようにハイブリダイズするプローブ、
ｂ．Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌ＤＮＡリガーゼ、および
ｃ．検定法を行うためのインストラクション
を有するキット。
【請求項１２】
前記バイナリ・プローブの両方が、前記標的配列とのハイブリダイズに寄与する少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
前記バイナリ・プローブが連結された生成物を指数的に増幅することのできるＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼをさらに含有する、請求項１１記載のキット。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼが、Ｑβレプリカーゼである請求項１３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、国立保健機構（National Institutes of Health）により審査され、許可番号ＨＬ−４３５２１として、政府の補助の基になされた。合衆国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
本発明は、ＲＮＡを検出するための核酸ハイブリダイゼーション検定法に関する。このような検定法は、ヒトまたは動物の病気または状態の診断、生物学的サンプルにおける病原体の検定法、及び食品、農産物または環境における生物体またはウイルスの検定法といった広範な応用を有する。
発明の背景
種々のタイプの核酸ハイブリダイゼーション検定法が、知られている。一対のＤＮＡプローブと、このプローブをＤＮＡリガーゼで連結する段階（この連結反応は、前記プローブが標的上に互いに隣接してハイブリダイズすることを必要とする）とを利用した、いくつかの検定法がある。本出願では、核酸標的に互いに隣接してハイブリダイズした一対のプローブを連結する段階を有する一般的な検定法を指すために“バイナリ・プローブ検定法”という用語を使用する。一対のプローブが、標的に隣接してハイブリダイズする必要性は、連結反応が“標的依存”であること意味する。この一対のプローブを“バイナリ・レポーター・プローブ”または“バイナリ・プローブ”と称する。
バイナリ・プローブ検定法の一つは、リガーゼチェーン反応（“ＬＣＲ”）である（Barany, 1991）。ＬＣＲにおいては、第一組のＤＮＡバイナリ・プローブが、ＤＮＡ標的の一つの相補鎖にハイブリダイズし、そこでＤＮＡ向けＤＮＡリガーゼにより連結されて第一連結生成物を形成し、第二組のＤＮＡバイナリ・プローブが第一連結生成物にハイブリダイズし、同様に連結されて第二連結生成物を形成する。反応温度を循環させて、融解、プローブのアニーリングおよび連結反応の段階を繰り返し、指数的に増幅された生成物、すなわち連結されたプローブを生成し、これを検出する。ときとして、プローブそのものと区別するために、連結されたプローブを“レポーター分子”と称する。
ＤＮＡ標的に対する他のバイナリ・プローブ検定法は、一対のＤＮＡバイナリ・プローブを利用し、その一方が固体表面に標的を固定し、かつその他方が放射性原子または蛍光物質を含有する（Landegrenら., 1988）。この検定法は、ＲＮＡ標的に適用するという報告があるが（ＤＮＡバイナリ・プローブを使用）、一つの実施例も報告されていない（LandegrenとHood, 1991）。
ＤＮＡ標的に対する第三の検定法は、一対のＤＮＡバイナリ・プローブを利用し、その一方が固体表面に標的を固定し、そこでレポーター分子が、バクテリオファージＱβレプリカーゼ等のＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼによって指数的に増幅される鋳型（テンプレート）とされる（Martinelliら., 1992）。このレポーター分子は、それ自身がＱβレプリカーゼの鋳型とされるＤＮＡ分子であってもよく（直接的増幅）、Ｑβレプリカーゼ用のＲＮＡ鋳型を生成する、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写の鋳型とされてもよい（間接的増幅）。
上述の検定法は、ここに関係するいくつかの欠点を有している。そのほとんどは、例えば、ＤＮＡを標的とすることである。これが欠点とされるのは、検出に適したＲＮＡ標的が、ほとんどの場合に、サンプル中に、それと対応するＤＮＡ標的より非常に豊富にあるためである。全ての上記検定法が、ＤＮＡバイナリ・プローブを使用している。ＬＣＲは、増幅のために温度循環およびサーモサイクラー必要とし、ゲル電気泳動等の生成物検定法を必要とする。Landegrenら., 1988およびLandegrenとHood, 1991によるＤＮＡバイナリ・プローブ検定法は、増幅を含まないため感度のよい検定法ではない。Ｑβレプリカーゼによる指数的増幅を用いる検定法において（Martinelliら，1992）、ＤＮＡプローブを使用することは、感度を制限してしまう：コストを増大させ、さらに時間を要し、かつ感度がより低い、転写という付加的な段階を必要とする、あるいは、感度が低いＤＮＡレポーター分子を直接増幅する必要があり、これはＤＮＡがＱβレプリカーゼの本来の鋳型ではないことから、非常に効率が悪い。
P. Lizardi, 本出願人，U. Landegren, F. KramerおよびJ. Szostakによって本出願と同日に出願された、ＲＮＡバイナリ・プローブおよびリボザイムリガーゼを使用したＲＮＡの診断検定法に関する米国特許出願第０８／００５８９３号に、ＲＮＡバイナリ・プローブとリボザイムリガーゼを用いたＲＮＡ標的の検出に関する核酸ハイブリダイゼーション検定法が記載されており、DoudnaとSzostak, 1989に記載されたようなＲＮＡ分子が記載されている。前記出願に開示されたリボザイムリガーゼを利用した検定法は、いくつかの欠点を備えている。ＳｕｎＹリボザイムリガーゼは、不正確にハィブリダイズしたプローブを許容してしまうことが開示されている。テトラヒメナのリボザイムリガーゼは、９個以下のハイブリダイゼーション長（プローブ切片）を有する一つのプローブを必要とし、このため検定法の特異性を減少させがちなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を必要とする。本発明は、リボザイムリガーゼを使用しない。
本発明の目的は、ＤＮＡバイナリ・プローブを用いた既存のバイナリ・プローブ検定法の限界を克服することである。
本発明の他の目的は、両方がその標的に対して高度に特異的とされた一対のＲＮＡプローブの使用を可能にすることである。
本発明のさらなる目的は、連結された場合に、ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼを用いたインキュベーションにより直接的かつ効率的に増幅されるレポーター分子を形成する、高度に特異的なバイナリ・プローブの使用を可能にすることである。
本発明の上記および他の目的は、以下の記載に明確にする。
発明の概要
本発明の検定法は、ＲＮＡバイナリ・プローブと、特異的かつ効率的なＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼタンパク質とを用いた、ＲＮＡ標的用の核酸ハイブリダイゼーション検定法である。
好ましい実施態様は、シグナル生成用に単一の温度での指数的増幅を含む検定法であって、Ｑβレプリカーゼ等のＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼによって最も好ましく増幅される（Lizardiら，1988; Lomeliら，1989）。
好ましい実施態様は、サンドウィッチハイブリダイゼーション検定法である（Syvanenら，1986）。
また、好ましい実施態様は、例えば、リバーシブル標的キャプチャーのようなバックグラウンドを減少させる技術を使用する（Morrisseyら，1989; Hunsakerら，1989）。
特に好ましい実施態様は、本出願人，U. Landegren, P. LizardiおよびF. Kramerによって本出願と同日に出願された、感度のよい核酸サンドウィッチハイブリダイゼーション検定法およびキットに関する、米国特許出願第０８／００６０７８号（以下、Tyagiらの米国特許出願第０８／００６０７３号）に開示されたバックグラウンド減少技術を利用する。
本発明の検定法において効率的なＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼとして機能する、あるタンパク質を見いだした。好ましいＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼは、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼである。これは、標的依存性であって、標的が欠如する場合には低い結合反応効率を有し；誤ったハイブリッド、特に連結反応の接合点における誤りに対して許容しないと考えられ；標的配列に対する特異性が確かな長いプローブ配列を有する両方のプローブを許容し；十分に効率的、すなわち極端に敏感な検定法を可能にする。本発明の検定法に有用なリガーゼであるタンパク質は、実施例１の検定法において、１０００００標的分子の検出を行うものである。
候補のタンパク質を素早く同定する簡単な試験を開発した。
本発明は、一対のＲＮＡバイナリ・プローブ、タンパク質であるリガーゼ、および本発明に基づいた検定法を行う手段を含んだ、予め選択された標的に対する診断キットをも含んでいる。より好ましいキットの中に、他の薬剤が含まれていてもよい。
特に好ましい実施態様を含む、本発明の好ましい実施態様に関する詳細な説明は、次の詳細な説明に記載されている。詳細な説明も実施例も、本発明もしくは添付の請求の範囲の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１の検定法を表す。
図２は、実施例１のプローブの配列を示す。
図３は、実施例１のバイナリ・プローブの調製を表す。
図４は、候補のリガーゼ、すなわちＴ４ ＤＮＡリガーゼに関する実施例１に基づく試験検定法の結果を示す。
図５は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いた実施例１に基づく感染細胞の検定結果を示す。
図６は、既知の量の感染した細胞に対する実施例１に基づく他の検定で得られた結果を示す。
図７は、実施例２に基づくスクリーニング試験の結果を示すオートラジオグラムである。
詳細な説明
本発明に基づく検定法に、潜在的に使用できるタンパク質を同定するための確かなスクリーニング試験を開発した。この試験は、以下の実施例２に記載されている。これは、ＲＮＡ標的と、両方が標的に対して高度に特異的で、特異性が保証されている一対のＲＮＡバイナリ・プローブとを利用する。一つの試験の結果、すなわち試験生成物のオートラジオグラムを、図７に示す。この試験は、ＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼとして試験される一つのタンパク質（またはいくつかのタンパク質）だけでなく、リガーゼが使用されていない比較例も含んでいる。もしオートラジオグラムによって、リガーゼを含まない比較例の反応より、特定のタンパク質を含む反応で、裸眼で識別できるような十分に増幅された生成物が示されるなら、そのタンパク質は、本発明の検定法においてリガーゼとして使用できるかどうかを調べる次の試験のための候補とされる。
図７は、二つのタンパク質、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよび大腸菌ＤＮＡリガーゼが、リガーゼを含まない比較例より十分に生成を行うことを示している。これらは、次なる試験に対して十分に効率的である。しかしながら、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼも、Thermus aquaticusＤＮＡリガーゼも、スクリーニング試験において見込みを示さなかった。これらは、次の試験の候補ではない。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、視覚的に、大腸菌ＤＮＡリガーゼより効率的であり、より好ましいと考えて、実施例１の検定法に使用した。
もし、スクリーニング試験からあるタンパク質が候補のリガーゼであることが分かれば、“効率的なリガーゼ”すなわち本発明の検定法で使用されるものであるかどうかを決定するために、実施例１の検定法に用いることができる。添付された請求の範囲を含む本発明の目的のために、効率的なリガーゼを、実施例１の検定法で１０００００の標的分子を検出するものと定義する。実施例１の検定法で一定の数の標的分子を検出する能力は、タンパク質の標的依存連結反応効率と、バックグラウンドを増大させる標的依存連結反応に対するタンパク質の傾向の両方によって決まる。好ましいリガーゼは、実施例１の検定法で１０００の標的分子を検出するものである。最も好ましいリガーゼは、実施例１の検定法で１００分子を検出するものである。Ｔ４ ＤＮＡは、最も好ましいリガーゼである。これは、実施例１の検定法で１００の標的分子を検出する。この検定法において、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、１０±２％の連結反応効率を有すると評価している。もちろん、特定のタンパク質が効率的なリガーゼであるかどうかを直接的に決定するために、実施例１の検定法を用いて、実施例２に基づくスクリーニング試験を省いてもよい。
本発明の検定法は、ＲＮＡ標的用である。これらは、ＲＮＡバイナリ・プローブと、効率的なＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼであるタンパク質を必要とする。このような制限の範囲で、任意の適切な検定法のプロトコルを用いることができる。ここでＲＮＡ“レポーター分子”と称される連結された生成物は、ＤＮＡバイナリ・プローブを用いた既知の検定法に類似した検定法で、それ自身で、すなわち増幅されずに検定することもできる（Landegrenら，1988; LandegrenとHood, 1991）。他には、ＲＮＡバイナリ・プローブを、連結反応によって生成したレポーター分子が、増幅され得るように、すなわちＱβレプリカーゼ等のＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼ用の鋳型となるように設計してもよい（適切なＲＮＡ分子としては、Lizardiら，1988; Lomeliら，1989; PritchardとStefano, 1991; Martinelliら，1992を参照）。
本発明の検定法は、上記文献のいくつかと同様に、ＤＮＡプローブに対して行ったような、固体表面に標的分子を固定するＲＮＡバイナリ・レポーター・プローブの一つを利用してもよい。
本発明に係る好ましい検定法は、双方が標的に対して“高度に特異的”なバイナリ・プローブを利用するものであって、これはプローブが、標的配列に対してハイブリダイズする少なくとも１５個の核酸のプローブ切片を有することを意味する。
本発明に係る好ましい検定法は、上述したようなＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡレポーター分子の指数的増幅を利用する。さらに、本発明に係る検定法の好ましい実施態様は、例えばリバーシブル標的キャプチャー等の、バックグラウンドを減少する技術を利用する（Morrisseyら，1989; Hunsaker, 1989）。
本発明に係る検定法の最も好ましい実施態様は、特にＱβレプリカーゼによるレポーター分子の指数的複製と併せて、ここに参照として取り込まれたTyagiらの米国特許出願第０８／００６０７３号に開示されたバックグラウンド減少技術を利用する。バックグラウンド減少技術は、別のキャプチャー・プローブを使用することであり、このキャプチャー・プローブは、バイナリ・レポーター・プローブがハイブリダイズする標的配列とは別の部位で標的にハイブリダイズし、キャプチャー・プローブ-標的-レポーター・プローブハイブリッドを形成し、このハイブリッドの固定化し、およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）等によって、切断されてキャプチャー・プローブからレポーター・プローブ-標的ハイブリッドを放出する。実施例１は、最も好ましいと考えられる検定法を開示する。
ＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼタンパク質は、例えば、核酸構成成分の全てがＲＮＡであるリガーゼチェーン反応のような、増幅段階としてリガーゼチェーン反応を含む検定法にも有用である。タンパク質が、熱安定性でない場合には、タンパク質をＬＣＲサイクルごとに添加する必要がある。
上述したように、本発明は、この発明に係る検定法を行うためのキットも含んでいる。好ましいキットは、以下の項目のいくつかまたは全てを含有することができる。
１．臨床サンプル中の細胞の溶解のための５Ｍのグアニジンチオシアナート（ＧｕＳＣＮ）バッファー；
２．予め選択されたＲＮＡ標的に対するＲＮＡバイナリ・レポーター・プローブ、好ましくは高度に特異的なバイナリ・プローブ、および好ましくはＤＮＡキャプチャー・プローブを含む混合物；
３．ストレプトアビジンを共有結合させた計量棒、反応管、または常磁性粒子のような固体；
４．磁気分離装置；
５．ヌクレオチド；
６．本発明で使用できる効率的なリガーゼ、好ましくはＴ４ ＤＮＡリガーゼ；
７．ＲＮアーゼＨおよびＱβレプリカーゼ；
８．リゲーション及び増幅のためのバッファー；
９．放射活性アルファ-Ｐ32-シチジン三リン酸またはヨウ化プロピジウム（propidium iodide）のような、増幅したレポーターを検出する試薬；
１０．本発明の検定法を実施するインストラクション。
基本となるキットは、項目２、６および１０のみを含有するものとすることができる。より完全なキットは、少なくとも項目１、３および７も含有するものである。少なくとも項目１−２及び５−１０を含み、固体が計量棒または反応管であるキットは、設備の整った研究所の外で実施される検定に特に有効である。
実施例
実施例１：ＲＮＡ標的、ＲＮＡバイナリ・プローブ、ＤＮＡキャプチャー・プローブ、リボヌクレアーゼＨ切断剤およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを採用したこの実施態様は、ＲＮＡ標的、ここでは、ヒト免疫不全ウイルス（“ＨＩＶ”）ＲＮＡによって例示するが、その検出に対して図１に一般的に示したような非常に高感度の検定法を導く。標的１の標的配列２は、ＨＩＶ ＲＮＡのインテグラーゼ領域に位置する。検定は、サンプルを５Ｍのグアニジンチオシアナート（ＧｕＳＣＮ）に溶解することから始める。次いで、４つの異なる核酸プローブの混合物をサンプルに加える。これらのプローブは、図１に示したように、ＨＩＶ ＲＮＡにハイブリダイズする。プローブのうちの２つは、ＤＮＡからなるキャプチャー・プローブ３、４である。各キャプチャー・プローブは、その３’末端にハイブリダイゼーション配列５または６を有し、これらは標的１に相補的である。また、キャプチャー・プローブ３、４は、その５’末端にビオチン分子７を有している。他の２つのプローブ８、９は、ＲＮＡからなる高度に特異的なバイナリ・レポーター・プローブである。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリッドはストレプトアビジン１１で被覆された常磁性粒子１０の表面に捕捉され、ストレプトアビジン１１は、キャプチャー・プローブのピオチン分子７に強く結合する。次いで、常磁性粒子１０は強力に洗浄されてハイブリダイズしていないバイナリ・プローブが除去される。両方のバイナリ・プローブが高度に特異的であるため、１ＭＧｕＳＣＮ等のより希釈された溶液よりも、２ＭのＧｕＳＣＮを用いた厳しい洗浄を使用することができる。次に、キャプチャー・プローブにハイブリダイズしている領域において標的ＲＮＡを切断するために、ＲＮアーゼＨを添加する。標的ＲＮＡの切断によって、バイナリ・プローブ−標的ハイブリッド１２（図１に連結反応後のものが示されている）がキャプチャー・プローブから自由になる。
開裂放出過程は、定量的であり特異的である。ＤＮＡキャプチャー・プローブまたは常磁性粒子の表面（即ち、バックグラウンドシグナルの源）に非特異的に結合したバイナリ・プローブは、この切断によって放出されない。常磁性粒子１０は廃棄される。
上澄み中において、標的上に互いに隣接して正確にハイブリダイズしたバイナリ・プローブの対は、リガーゼタンパク質、ここではＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用した標的に依存した方法で互いに連結される。連結されたプローブ１３は、次いでＱβレプリカーゼとインキュベートすることにより増幅される。増幅されたシグナルは、標的の存在に厳密に依存しており、時間の関数としての信号レベルは、最初のサンプル中にあるＨＩＶ ＲＮＡの分子数の定量的な決定に用いられる。
Ａ．プローブの合成
この実施例で使用されるキャプチャー・プローブ（図２）は、３つの機能部分を有している。予め選択された標的にハイブリダイズする４０−５０ヌクレオチドのヘッド、およそ４ヌクレオチドのスペーサー、及び固体表面に強く結合するテイルである。我々は、テイルにビオチン分子を選び、それを各キャプチャー・プローブの５’末端に共有結合させた。ビオチン分子は、キャプチャー・プローブの３’末端及び内部を含むあらゆる位置に結合させることが可能である。テイルは、ホモポリヌクレオチドのような他の親和性試薬から形成してもよい。
図１は、キャプチャー・プローブ３、４が標的１に結合する方法を示している。捕捉の効率を上げ、バイナリ・プローブ−標的複合体の放出の厳重さを向上させるために、１つではなく２つの異なるキャプチャー・プローブを使用した。二つのキャプチャー・プローブ３、４は、標的１に、バイナリ・プローブが結合する標的配列２の両側において結合する。キャプチャー・プローブ３のハイブリダイゼーション配列５は、ＨＩＶゲノムＲＮＡの４４１５−４４５８領域に対して相補的であり、キャプチャー・プローブ４のハイブリダイゼーション配列６は、ＨＩＶゲノムＲＮＡの４８０８−４８５２領域に対して相補的である。図２は、この実施例で用いた２つのキャプチャー・プローブ３、４の配列を示している。下線は、標的ＲＮＡに相補的なハイブリダイゼーション配列５、６を示す。両方のキャプチャー・プローブが、ＤＮＡ合成器で調製された。
この特別な実施態様で望まれるレポーター分子は、図１に示すように、２つのバイナリ・プローブのリゲーションを必要とする。バイナリ・プローブを使用することは、好ましい実施態様である。図１は、高度に特異的なバイナリ・レポーター・プローブ８、９の設計を例示している。プローブ８の５’末端１４は、我々の以前の研究（Lomeli等，1989）で使用したＨＩＶに対して複製可能なプローブの最初の６９ヌクレオチドからなる。次の２３ヌクレオチドは、プローブ配列１５であり、ＨＩＶゲノムＲＮＡの４５９６−４６１８領域に相補的である。プローブ９の５’末端は、１９ヌクレオチドのプローブ配列１７からなり、ＨＩＶゲノムＲＮＡの４５７７−４５９５領域に相補的である。プローブ９の残りの部分（remainder）１６は、我々の以前の研究（Lomeli等，1989）で使用したＨＩＶに対して複製可能なプローブのヌクレオチド９５−２８０に相当する。図２は、バイナリ・プローブ８、９の配列を示す。下線は、標的配列に相補的な、ハイブリダイゼーション配列１５、１７を示す。ハイブリダイゼーション配列１５、１７の両方が、長さにして少なくとも１５ヌクレオチドであるため、プローブ８、９は、本発明でいう“高度に特異的”である。これらの分子は、Ｑβレプリカーゼとインキュベートするときは、いずれも良好なレプリケーターではないが、互いに連結されれば、指数的に複製可能なレポーター分子を形成する。
バイナリ・プローブ８、９は、図３に示すポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）で生成されたＤＮＡ鋳型から転写された。Lomeli等1989の１８２７頁に記載されたプラスミド２０を我々はｐＴ７ＭＤＶＨＩＶ２０と呼んでいるが、これをＰＣＲ反応におけるＭＤＶ配列の源として用いた。プラスミドの関連部分を図３に示した。これは、当然に二本鎖である。４つのＰＣＲプライマー２１、２２、２３及び２４は、プラスミド２０には存在しないが必要とされるＰＣＲ生成物２７、２８への付加的配列に貢献するように設計された。ＰＣＲ生成物２７は、プライマー２１、２２から生成された。ＰＣＲ生成物２８は、プライマー２３、２４から生成された。プライマー２２は、プローブ８の鋳型に末端の２３のヌクレオチド２５を与える。プライマー２３は、プローブ９の鋳型の５’末端にＴ７プロモーター２６を与える。（プラスミド２０は、プライマー２１の領域にＴ７プロモーターを与える。）プローブ８は、通常の方法で、そのＰＣＲ鋳型から転写されるが、プローブ９の合成は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写の条件下での修飾を必要とする。連結反応におけるリン酸基のドナーは、プローブ９の場合、その５’末端に単一のリン酸を有していなければならない。転写によって調製されたＲＮＡ分子は、通常その５’末端に三リン酸を有している。５’末端に単一のリン酸基を有するプローブ９を調製するために、ヌクレオシド５’-三リン酸の１０倍過剰なグアノシン５’-一リン酸を転写反応に含んだ。これにより、プローブ９の第１位に、グアノシン５’-一リン酸を組み入れることができる。結果として、プローブ９のコピーは、その５’末端に、必要とされる一リン酸を有する。転写の後、各バイナリ・プローブＲＮＡ８、９を、合成したポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。ＲＮＡを、そのゲル切片から、２Ｍのグアニジンチオシアナート（ＧｕＳＣＮ）溶液中に直接溶離した。
この実施例を行うことにより、我々は、上述のように１０倍過剰ではなく、２０倍過剰のグアノシン５’-一リン酸を用いることにより、プローブ９がさらに改善されることを見い出した。さらに過剰量を用いると、ＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼとしてＴ４ＤＮＡリガーゼを用いた連結反応の効率が、１０％から３０％に、３倍になった。
Ｂ．ハイブリダイゼーション、捕捉、洗浄、及び放出
本実施例の検定法は、既知量のＨＩＶ ＲＮＡ分子を含むサンプルに対して実施した。この検定法は、ある特定のタンパク質が、本発明に係る検定法に使用できる“効率的なリガーゼ”であるか否かを確かめるために用いられる。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの試験について記載する。ＨＩＶのインテグラーゼ遺伝子のｍＲＮＡに相当するＲＮＡを、モデル標的として用いた。このＲＮＡは、我々の実験室で調製した、線形化した（linearized）プラスミドｐＧＥＭ−インテグラーゼから転写することによって調製した。異なる量、例えば、１０００００００、１００００００、１０００００、１００００、１０００、１００、１０及び０分子のインテグラーゼＲＮＡを含む５０マイクロリットルの２ＭのＧｕＳＣＮを入れた８本のチューブを、厳格な希釈によって用意した。各キャプチャー・プローブの１０13分子と、各バイナリ・プローブ２×１０10分子とを含む２ＭのＧｕＳＣＮ溶液（５０マイクロリットル）を、各チューブに添加した。ハイブリッド形成は、摂氏３７度で１時間インキュベートすることによって行った。次いで、ストレプトアビジンで被覆された常磁性粒子の懸濁液（Promega）３００マイクロリットルを、このハイブリダイゼーション混合液に添加した。摂氏３７度で１０分間インキュベートすることにより、プローブ−標的ハイブリッドを、常磁性粒子表面に捕捉した。その粒子を、２ＭのＧｕＳＣＮで４回、３００ｍＭのＫＣｌで３回、そして最後に、ｌＸリガーゼバッファー（６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ）で２回洗浄した。洗浄後、５０マイクロリットルのｌＸリガーゼバッファーに溶解した１単位の大腸菌  ＲＮアーゼＨ（Pharmacia）を添加した。摂氏３７度で１０分間インキュベートすることにより、バイナリ・プローブ−標的ハイブリッドは、常磁性粒子表面から放出された。この混合物を含むチューブを、磁性分離装置によって与えられた磁場に移し、常磁性粒子を試験管の壁面に引き寄せた。次いで、アスピレーションによって上澄みを常磁性粒子から分離し、新しいチューブに入れた。
標的に正確にハイブリダイズしたバイナリ・プローブを連結させるために、プローブ−標的ハイブリッドを、候補のタンパク質であるＴ４ＤＮＡリガーゼとともにインキュベートした。リゲーションは、４０マイクロリットルの上澄み中で、４０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、このタンパク質にとって適切とされる摂氏３７度で１時間インキュベートすることにより行った。
また、本実施例の検定法は、既知量のＨＩＶ感染した細胞を含むサンプルに対してもＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて実施した。臨床的サンプルでこの検定法の特異性及び感度を示すために、ヒト末梢リンパ球をＨＩＶに感染させた。これらの感染した細胞は、未感染のヒト末梢リンパ球で厳密に希釈した。異なる量、例えば、６０００００、６００００、６０００、６００、６０、６、０及び０個の感染した細胞を含む８本のチューブを用意した。これらのチューブは、すべて同じ数、例えば６０００００個の細胞を含んでいる。チューブを遠心分離して、上澄みを除去した。各チューブに、２４０マイクロリットルの５ＭのＧｕＳＣＮを添加した。次いで、細胞を溶解するために、各チューブを３７℃で２時間インキュベートした。溶解した後、各チューブから４０マイクロリットルずつを検定した。４つすべてのプローブを含む６０マイクロリットルの溶液を、溶解産物に添加した。この溶液の添加は、溶解産物中のＧｕＳＣＮの濃度を２Ｍまで低下させた。ハイブリダイゼーション及び引き続くすべての反応は、前の段落に記載したのと同様に行った。
Ｃ．増幅
連結したバイナリ・プローブからなるレポーター分子は、次いで、Ｑβレプリカーゼとインキュベートすることによって増幅された。増幅に先立って、レポーター分子−標的ハイブリッドを解離する必要はない。複製反応のすべての成分を含む混合物を、８本のチューブ各々に添加した。最終反応混合物（１２０マイクロリットル）は、４５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、４００マイクロモルのＡＴＰ、４００マイクロモルのＧＴＰ、４００マイクロモルのＵＴＰ、４００マイクロモルのアルファ-Ｐ32-ＣＴＰ、及び１ミリリットル当たり５０マイクログラムのＱβレプリカーゼを含む。各反応は、摂氏３７℃でインキュベートされ、各反応から、インキュベーションの１０分から３１分の間、１分間隔で４マイクロリットルずつのサンプルを取り出した。各サンプルを、４５マイクロリットルの停止溶液（１２０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍｌ当たり３マイクログラムのプロテイナーゼＫ）と混合した。この溶液は、必要なマグネシウムイオンを隔離することによって複製を停止させる。停止溶液は、サンプルに添加する前に、タイタープレート（titerplates）に準備した。各停止した反応液中のＲＮＡは、ＲＮＡを酸性溶液（３６０ｍＭリン酸、２０ｍＭピロリン酸ナトリウム、及び２ｍＭのＥＤＴＡ）中で沈降させ、その沈降物をブロッティング膜（ゼータ・プローブ（Zeta probe）、バイオラド（Biorad））に捕捉し、その膜を酸性溶液で洗浄することにより、組み込まれていないヌクレオシド三リン酸から分離した。ブロットのＲＮＡをオートラジオグラフィーで観察した。
Ｄ．結果
結果は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが、本発明に係る検定法で使用するのに“効率的リガーゼ”であることを示している。図４は、ＨＩＶインテグラーゼＲＮＡ分子の一連の希釈液に対する上述した検定法の典型的な結果を示す図である。図４はオートラジオグラムである。各行は、示されているように、経時的な与えられたサンプルのからのシグナルを示している。図４における各ドットの強度は、サンプルを取り出したときにチューブ内に存在するＲＮＡ量に比例している。オートラジオグラムに最初にＲＮＡが見られる時間は、存在する標的の数に依存している。標的の数が増えるに従って、シグナルが現れるのが早くなる。標的の数が１／１０になるごとに、少なくとも２分の遅れが生ずる。１００個の標的までは明瞭なシグナルを発する。１０標的分子または標的無しでは、さらに８分間インキュベーションしてもシグナルを発しなかった（図示せず）。ＨＩＶ  ＲＮＡ標的の１００分子は、明らかに検出可能であり、それ以下ではシグナルを発しなかった。
上述したように、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いた検定法における検出可能な標的の最小数は１００分子である。他の実験から、連結反応の効率は１０±２％であると判断した。我々の実験と図７に基づいて、この検定法における大腸菌ＤＮＡリガーゼの連結反応効率が約１％であると評価したが、他の実験でその効率を判断していない。連結反応効率を３倍にする、上述のプローブ９の合成における改良は、さらにこの検定法の感度を改良するが、候補のリガーゼが、本発明に係る検定法で使用できる“効率的なリガーゼ”であるか否かを決定するために、この実施例で実際に使用されたプローブを、使用することができる。
図５及び６は、ＨＩＶ感染したヒト末梢リンパ球を含有するサンプルに対する、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いた本実施例に係る検定法の結果を示す。図５及び６は、図４について示したようなオートラジオグラムである。２つの実験結果をまとめて考慮すると、１０００００個の未感染細胞を含むサンプル中の１つの感染細胞が検出でき、感染細胞を含まないサンプルではシグナルが得られないことが示された。これらの実験において、各サンプルは、合計１０００００個の細胞を含んでいる。最初の実験（図５）における結果によると、サンプル中の感染細胞の数と、シグナルが現れる時間との間には明瞭な関係が見られる。感染細胞の数が増加すると、シグナルの出現が早くなる。よって、この検定法は定性的でも定量的でもある。各々１０００００個の未感染細胞を含む（感染細胞を含まない）２つの比較例は、シグナルを発しなかった。しかし、１個の感染細胞を含むチューブもまたシグナルを与えなかった。我々は、溶菌の後、サンプルは完全に混合されないと仮定した。溶菌されたサンプルは（細胞ＤＮＡの存在によって）極度に粘性が高く、２４０マイクロリットル容の溶解産物中に約６個の感染細胞しか存在しないので、検定のためにサンプルから取り出される４０マイクロリットルのサンプル中にＨＩＶ  ＲＮＡをサンプリングしない可能性が高い。そのような可能性をなくすために、次の実験に使用する前に、サンプルを冷凍し、解かし、次いで強力に撹拌した。これらの良く撹拌したサンプルについても検定を繰り返した。結果は、図６の下側の６サンプルに示したように、我々の仮説が正しく、適当な撹拌の後では、約１個の感染細胞からの核酸を含むチューブでも適当な遅延時間をおいて強いシグナルを発することが示された。
第２の実験の他の目的は、各感染細胞中のＨＩＶ  ＲＮＡ分子の数を見積もることである。この目的のために、２つの標準を用意した。第１の標準チューブである標準１は、１００００００個のＨＩＶインテグラーゼｍＲＮＡ転写物を含む。第２の標準チューブである標準２は、１０００００個の未感染細胞からの溶解産物及び１００００００分子のＨＩＶインテグラーゼｍＲＮＡ転写物を含む。実験結果は、図６の上側の２つのサンプルに示したように、未感染細胞からの溶解産物の存在は、わずかなクエンチング効果を有することが示された。この内部標準から得られたシグナルから、我々は、各感染細胞が約３０００のＨＩＶ標的分子を含むことを見積もることができる。
注意書きは規則通りである。我々の実験室は、空気によって運ばれる汚染源となる傾向を有する複製可能なＲＮＡ分子についての研究に使用されている。上記の検定法の試験において、ひとつのチューブにおいて異常なシグナルを得た。増幅したＲＮＡの電気泳動分析により、それはレポーターではないことが示された。Ｑβレプリカーゼは、多くのＲＮＡを増幅し、我々のサンプルは汚染されてしまった。
実施例２：適切なリガーゼの選択
候補のタンパク質のＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼ活性を同定するための、極めて感度のよいスクリーニング方法を開発した。この方法で、ＲＮＡ向けＲＮＡ連結反応を触媒する少なくとも二つのタンパク質を同定した。以下は、このスクリーニング方法についての記載である。
１００億のＨＩＶインテグラーゼｎＲＮＡ分子を、大過剰のＲＮＡバイナリ・プローブとＤＮＡキャプチャー・プローブにハイブリダイズさせた。次いで、実施例１に記載したような方法で、レポーター・プローブ−ハイブリッドを捕捉し、洗浄して、ＲＮアーゼＨとインキュベートしてキャプチャー・プローブから放出させた。放出させた物質は、５つのアリコートに分注した。候補のタンパク質を４つの各アリコートに添加したので、５つのアリコートは、リガーゼを含まないもの、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、および好熱性生物Thermus aquaticusから単離したＤＮＡリガーゼを含有する。また、最後の二つのリガーゼの反応混合物は、必要とされる補助因子である、１ｍＭのＮＡＤも含有する。最初の４つの反応を、摂氏３７度でインキュベートしたが、最後の反応は、摂氏５５度でインキュベートした。全ての反応を、１時間インキュベートした。連結反応後、連結されたバイナリ・プローブを、摂氏３７度で１５分間Ｑβレプリカーゼとインキュベートして増幅した。生成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画した。
図７は、得られたオートラジオグラムである。これは、各アリコートの増幅されたレポーター分子に対応するゲルフラクション５０を示している。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、十分に効率的であり、本発明で使用するための候補とされる。これは、最大量の連結された生成物の合成を触媒する。大腸菌ＤＮＡリガーゼもよく作用し、候補と見なされた。T. aquaticus由来のＤＮＡリガーゼは、リガーゼを含まない比較例と視覚的に区別できない結果をもたらした。これは、作用せず、少なくとも本発明で使用する候補としては十分に効率的とは言えなかった。
本発明で使用する候補リガーゼとして見なされるために、上述したように、タンパク質は結果、すなわち増幅された生成物５０を与えなければならず、リガーゼのない比較例の生成物（バックグラウンド）より多いことを、裸眼で容易に調べることができる。この極端に感度のよい方法に基づいて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを我々の検定法に使用する候補として選択した。これを実施例１の検定法に用いて、本発明に基づく検定法に使用できる“効率的なリガーゼ”であることを見いだした。実際に、１００分子の検出を行う最も好ましいリガーゼであることがわかった。また、このリガーゼは、ＲＮＡ標的にハイブリダイズしたＤＮＡバイナリ・プローブの連結反応に特に“効率的”であることも分かった。
参考文献
Barany, F.（1991）「クローンした熱安定性リガーゼを用いた遺伝子疾患の検出及びＤＮＡの増幅（Genetic Disease Detection and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase.）」Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.; 88, 189-193.Doudna, J.A., Szostak, J.W.（1989）「相補鎖ＲＮＡのＲＮＡ触媒合成（RNA-Catalyzed Synthesis of Complementary-Strand RNA.）」Nature 339, 519-522.
Hunsaker, W.R., Badri, H., Lombardo, M. とCollins, M.L.（1989）「ｄＡテイルを持つキャプチャー・プローブを用いた核酸ハイブリダイゼーション検定法ＩＩ．改良した多重捕捉法（Nucleic Acid Hybridization Assays Employing dA-Tailed Capture Probes. II. Advanced Multiple Capture Methods.）」Anal. Biochem. 181, 360-370.
Landegren, U., Kaiser, R., Sanders, J., Hood, L.（1988）「リガーゼ媒介された遺伝子検出技術（A Ligase-mediated Gene Detection Technique．）」Science, 241, 1077-1080.
Landegren, U., Hood, L.（1991）「核酸におけるヌクレオチドの変化を検出する方法（Method of Detecting a Nucleotide Change in NucleicAcids.）」米国特許第４９８８６１７号.
Lizardi, P., Guerra, C.E., Lomeli, H., Tussie-Luna, I., Kramer, F.R.（1988）「組換えＲＮＡハイブリダイゼーションプローブの指数的増幅（Exponential Amplification of Recombinant-RNA Hybridization Probes.）」Biotechnology, 6, 1197-1202.
Lomeli, H., Tyagi, S., Pritchard, C.G., Lizardi, P.M., Kramer, F.R.（1989）「複製可能なハイブリダイゼーションプローブの使用に基づく定量的検定法（Quantitative Assays Based on the Use of Replicatable Hybridization Probes.）」Clin. Chem. 35, 1826-1831.
Martinelli, R.M., Donahue, J.J., Unger, J.T.（1992）「ミジバリアントＤＮＡ鋳型の増幅（Amplification of Midivariant DNA Templates.）」欧州特許公開第０４３１７０４号公報.
Morrisey, D.V., Lombardo, M., Eldredge, J.K., Keaney, K.R., Goody, E.P.とConins, M.L.（1989）「ｄＡテイルを持つキャプチャー・プローブを用いた核酸ハイブリダイゼーション検定法Ｉ．多重捕捉法（Nucleic Acid Hybridization Assays Employing dA-Tailed Capture Probes: I. Multiple Capture Methods.）」Anal. Biochem. 81, 345-359.
Pritchard, C.G., Stefano, J.E.（1991）「Ｑβレプリカーゼ増幅によるウイルスの核酸の検出（Detection of Viral Nucleic Acids by Qβ Replicase Amprification.）」Medical Virology 10（de la Maza, L.M., and Peterson, E.M., eds）,pp 67-80, Plenum Press, New York.
Syvanen, A.C., Lambsonen, M.とSoderlund, H.（1986）「親和性に基づくハイブリッド収集による核酸ハイブリッドの高速定量（Fast Quantification of Nucleic Acid Hybrids by Affinity-based Hybrid Collection.）」Nucleic Acids Res. 14, 5037-5048.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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