(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中において複数の候補細菌種の中から一種類の細菌種の存在を検出し、該細菌種を同定する方法であって、
−  サンプルを２種類以上の異なった増幅用プライマー対と接触させ、ここで、（ｉ）該プライマー対は該細菌種に種特異的かつ遍在的なＤＮＡ断片由来であり、（ｉｉ）該プライマーは全て多重ＰＣＲ増幅し得るように選択され、
−  多重ＰＣＲ増幅により増幅を進行させ、
−  各プライマー対のいずれかによって産生された増幅産物の存在または量を検出し、それをサンプル中に存在する細菌種の存在の指標とし、
前記の具体的な細菌種が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎａｏｓａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｔｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびモラキセラ・カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）から選択されることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
いずれかの細菌種の核酸の存在または量を測定するためのユニバーサル増幅プライマーの使用を更に含み、前記多重ＰＣＲ増幅の条件と同一の条件下で当該ユニバーサル増幅プライマーを用いた増幅を実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗生物質耐性遺伝子の核酸の存在または量を測定するための増幅用プライマーの使用を更に含み、抗生物質耐性遺伝子の検出を前記多重ＰＣＲ増幅の条件と同一条件下で実施することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記の具体的な細菌種が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎａｏｓａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｔｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびモラキセラ・カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）から選択される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌａrem，ｂｌａrob，ｂｌａshv，ａａｄＢ，ａａｃＣ１，ａａｃＣ２，ａａｃＣ３，ａａｃＡ４，ｍｅｃＡ，ｖａｎＡ，ｖａｎＨ，ｖａｎＸ，ｓａｔＡ，ａａｃＡ−ａｐｈＤ，ｖａｔ，ｖｇａ，ｍｓｒＡ，ｓｕｌおよびｉｎｔから選択される請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
該ＤＮＡ断片が、
−  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の存在または量を測定するための配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７およびそれらの相補配列、
−  クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の存在または量を測定するための配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列、
−  シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎａｏｓａ）の存在または量を測定するための配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０およびそれらの相補配列、
−  プロテウス・ミラビリス（Ｐｔｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）の存在または量を測定するための配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５およびそれらの相補配列、
−  ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の存在または量を測定するための配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３５およびそれらの相補配列、
−  スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の存在または量を測定するための配列番号３７およびそれらの相補配列、
−  スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の存在または量を測定するための配列番号３６およびそれらの相補配列、
−  エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）の存在または量を測定するための配列番号１、配列番号２およびそれらの相補配列、
−  スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）の存在または量を測定するための配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４およびそれらの相補配列、
−  ヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の存在または量を測定するための配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７およびそれらの相補配列、ならびに
−  モラキセラ・カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の存在または量を測定するための配列番号２８、配列番号２９およびそれらの相補配列から選択される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
患者、動物、環境または食物から得られたサンプルに直接実施することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
１以上の細菌コロニーを含むサンプルに直接実施することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
各増幅サイクルにつき、具体的に伸長工程を実施する時間を設定することなく、５５℃におけるわずか１秒間のアニーリング工程および９５℃におけるわずか１秒間の変性工程を行うことによって、該産物の存在の測定を達成する請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
試験サンプル中の該細菌種の存在または量を検出する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、前記増幅および検出が、
（ａ）少なくとも１２ヌクレオチドの長さを有する複数のオリゴヌクレオチドプライマーを含む水溶液で該サンプルを処理する工程（該プライマーの一方は、細菌種ＤＮＡの２本の相補鎖のうちの１本であって標的配列を含む該細菌種の存在または量を測定するための前記断片のいずれか１つと選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該相補鎖のうちの他方とハイブリダイズでき、これによって鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成する）
（ｂ）標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅し、
（ｃ）該試験サンプル中の該細菌種の存在または量の指標として前記の増幅された標的配列の存在または量を検出することを含む前記方法。
【請求項１１】
前記の増幅された標的配列の存在または量の測定の工程（ｃ）が同配列をプローブとハイブリダイズさせることによって行われる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記の２対以上のプライマーが、
大腸菌検出用の
−  配列番号４２および配列番号４３、
−  配列番号４６および配列番号４７、
−  配列番号５５および配列番号５６、ならびに
−  配列番号１３１および配列番号１３２；
モラキセラ・カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）検出用の
−  配列番号１１２および配列番号１１３、
−  配列番号１１８および配列番号１１９、ならびに
−  配列番号１６０および配列番号１１９；
シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎａｏｓａ）検出用の
−  配列番号８３および配列番号８４、ならびに
−  配列番号８５および配列番号８６；
スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）検出用の
−  配列番号１４５および配列番号１４６、ならびに
−  配列番号１４７および配列番号１４８；
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）検出用の
−  配列番号１４９および配列番号１５０、
−  配列番号１４９および配列番号１５１、ならびに
−  配列番号１５２および配列番号１５３；
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）検出用の
−  配列番号７８および配列番号７９、
−  配列番号１５６および配列番号１５７、ならびに
−  配列番号１５８および配列番号１５９；
エキソトキシンＡ遺伝子ｓｐｅＡを有する細菌種検出用の
−  配列番号１４３および配列番号１４４；
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）検出用の
−  配列番号１４１および配列番号１４２；
エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）検出用の
−  配列番号３８および配列番号３９、ならびに
−  配列番号４０および配列番号４１；
クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）検出用の
−  配列番号６１および配列番号６２、
−  配列番号６７および配列番号６８、
−  配列番号１３５および配列番号１３６、ならびに
−  配列番号１３７および配列番号１３８；
プロテウス・ミラビリス（Ｐｔｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）検出用の
−  配列番号７４および配列番号７５、ならびに
−  配列番号１３３および配列番号１３４；
スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）検出用の
−  配列番号９８および配列番号９９、ならびに
−  配列番号１３９および配列番号１４０；または
ヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）検出用の
−  配列番号１５４および配列番号１５５
から選択される少なくとも一対のプライマーを含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該プローブが；
大腸菌検出用の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４およびそれらの相補配列；
プロテウス・ミラビリス（Ｐｔｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）検出用の配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７６、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２およびそれらの相補配列；
クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）検出用の配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９およびそれらの相補配列；
スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）検出用の配列番号９６、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４およびそれらの相補配列；
モラキセラ・カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）検出用の配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７およびそれらの相補配列；
シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎａｏｓａ）検出用の配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５およびそれらの相補配列；
ヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）検出用の配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７およびそれらの相補配列；ならびに
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）検出用の配列番号１２０、１２１およびそれらの相補配列；
から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
増幅用プライマーが、少なくとも１２ヌクレオチドの長さを有し以下に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つとハイブリダイズし得ることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ｂｌａremが介在するβ−ラクタム抗生物質に対する細菌の耐性を検出するための配列番号１６１またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ｂｌａrobが介在するβ−ラクタム抗生物質に対する細菌の耐性を検出するための配列番号１６２またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ｂｌａshvが介在するβ−ラクタム抗生物質に対する細菌の耐性を検出するための配列番号１６３またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ａａｄＢが介在するアミノグリコシドに対する細菌の耐性を検出するための配列番号１６４またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣ１が介在するアミノグリコシド抗生物質に対する細菌の耐性を検出するための配列番号１６５またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣ２が介在するアミノグリコシド抗生物質に対する細菌の耐性を検出するための配列番号１６６またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣ３が介在するアミノグリコシド抗生物質に対する細菌の耐性を検出するための配列番号１６７またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ａａｃＡ４が介在するアミノグリコシド抗生物質に対する細菌の耐性を検出するための配列番号１６８またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ｍｅｃＡが介在するβ−ラクタム抗生物質に対する細菌の耐性を検出するための配列番号１６９またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ｖａｎＨ，ｖａｎＡおよびｖａｎＸが介在するバンコマイシンに対する細菌の耐性を検出するための配列番号１７０またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ｓａｔＡが介在するストレプトグラミンＡ（ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ  Ａ）に対する細菌の耐性を検出するための配列番号１７３またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ａａｃＡ−ａｐｈＤが介在するアミノグリコシド抗生物質に対する細菌の耐性を検出するための配列番号１７４またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ｖａｔが介在するバージニアマイシンに対する細菌の耐性を検出するための配列番号１７５またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ｖｇａが介在するバージニアマイシンに対する細菌の耐性を検出するための配列番号１７６またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ｍｓｒＡが介在するエリスロマイシンに対する細菌の耐性を検出するための配列番号１７７またはその相補配列；
細菌性抗生物質耐性遺伝子ｉｎｔが介在するβ−ラクタム、アミノグリコシド、クロラムフェニコールまたはトリメトプリムに対する細菌の耐性を検出するための配列番号１７１またはその相補配列；および
細菌性抗生物質耐性遺伝子ｓｕｌが介在するβ−ラクタム、アミノグリコシド、クロラムフェニコールまたはトリメトプリムに対する細菌の耐性を検出するための配列番号１７２またはその相補配列。
【請求項１５】
いずれかの細菌種を検出するためのユニバーサルプローブを更に含み、該プローブが、少なくとも１２ヌクレオチドの長さを有し、いずれかの細菌種および配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０およびそれらの相補配列の少なくとも１つとハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む少なくとも１種類の一本鎖核酸を含むことを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ユニバーサルプローブが配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０およびそれらの相補配列から成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ユニバーサルプライマーが少なくとも１種類の一本鎖核酸を含み、そのヌクレオチド配列は少なくとも１２ヌクレオチドの長さを有し、いずれかの細菌種および配列番号１２６および配列番号１２７ならびにそれらの相補配列の少なくとも１つとハイブリダイズし得ることを特徴とする請求項２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
プライマーが配列番号１２６および１２７を含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
細菌の古典的同定
細菌は、古典的には、ＡＰＩ２０ＥTMシステムのごとき生化学検査の使用を通じて炭素源および窒素源としての異なる基質を利用するその能力によって同定される。グラム陰性桿菌の感受性検査は微量希釈検査法まで進歩した。ＡＰＩおよび微量希釈システムはコスト的に有利であるが、検体から細菌を単離し同定するのに２晩連続してインキュベーションする必要があるため、予備的結果を得るのに少なくとも２日必要である。高性能で高価な装置を用いるいくつかのより迅速な検出方法が開発されてきた。例えば、最も速い同定システム、ａｕｔｏＳＣＡＮ−Ｗａｌｋ−ＡｗａｙTMシステムは、２時間で、単離された細菌コロニーからのグラム陰性およびグラム陽性菌を共に同定し、わずか７時間で抗生物質に対する感受性パターンを同定する。しかしながら、このシステムは、特に腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）以外の細菌種に関し、許容されない誤差限界を有する（Ｙｏｒｋら、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：２９０３−２９１０）。それにも拘わらず、この最も迅速な方法でさえ純粋培養体として細菌を一次単離する必要があり、このプロセスは、もし純粋培養体があれば少なくとも１８時間を要し、あるいはもし混合された培養体があれば、２〜３日要する。
尿検体
細菌同定のために日常的に診断微生物検査室で受容される検体の主体（４０−５０％）は尿検体である（Ｐｅｚｚｌｏ，１９８８，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１：２６８−２８０）。尿管感染（ＵＴＩ）は極めて一般的であり、女性の２０％までが罹り、入院患者のなかで罹患率が高くまた死亡率の増大が報告されている（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＳｔａｍｍ，１９８９；Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．  １１１：９０６−９１７）。ＵＴＩは細菌性病因の一般的なものであって、抗微生物薬療法を要する。グラム陰性桿菌大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、断然、最も普通の尿病原体であって、ＵＩＴの５０〜６０％と見積もられている（Ｐｅｚｚｌｏ，１９８８，前掲）。「Ｃｅｎｔｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ  ｄｅ  ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｌａｖａｌ（ＣＨＵＬ）」で最近観察された尿検体から単離された細菌病原体に対する罹患率を表１および表２に示した。
尿検体における通常の病原体同定
尿検体中の病原体の検査は日常的微生物検査室で圧倒的に多く実施されるので、膨大な検査法が開発されてきた。その中心的方法（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）は依然として古典的な半定量的平板培養方法であり、この方法では、１検量ループの尿を平板上に画線し、１８−２４時間インキュベートする。次いで、コロニーを計数して、尿１リットル当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数を決定する。細菌性ＵＴＩは、通常、尿中の≧１０7ＣＦＵ／Ｌの細菌数に関連している。しかしながら、尿中１０7未満のＣＦＵ／Ｌでの感染も、特に、病気の発症率の高い患者やカテーテル処置した患者では可能である（ＳｔａｒｋおよびＭａｋｉ，１９８４，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ３１１：５６０−５６４）。重要な点は、検査した尿検体の８０％近くが陰性であることである（＜１０7ＣＦＵ／Ｌ；表３）。
細菌病原体についての正確で迅速な尿スクリーニング方法は、陰性結果のより迅速な判定と患者のより効果的な臨床診断を可能とするであろう。いくつかの迅速な判定方法（ＵｒｉｓｃｒｅｅｎTM，ＵＴＩｓｃｒｅｅｎTM，Ｆｌａｓｈ  ＴｒａｃｋTM  ＤＮＡプローブ等）が最近、細菌病原体の培養に基づいたより遅い標準的生化学法と比較されている。かなり速いのであるが、これらの迅速テストは、感度が低くかつ特異性が低いうえに、偽陰性および偽陽性結果の数も多い（Ｋｏｅｎｉｎｇら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３０：３４２−３４５；Ｐｅｚｚｌｏら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３０：６４０−６８４）。
培養によって陽性であることが分かった尿検体はさらに、細菌病原体を同定するために標準的な生化学検査法を用いて特徴付けられ、また抗生物質に対する感受性について検査される。
臨床検体
本明細書中で具体例として使用された尿検体に関しては、本出願人のプローブおよび増幅用プライマーは任意の他の臨床検体に対しても適用できる。本発明で提供されるＤＮＡを主体とする検査法は、迅速性および正確さの点で、日常的診断で現在使用されている標準的方法よりも優れている。高パーセンテージの尿検体が陰性である一方、多くの他の臨床検体では、９５％を超える培養体が陰性である（表４）。これらのデータはさらに、陰性の臨床検体をスクリーニングするための普遍的プローブの使用を支持する。ヒト以外の生物（例えば、他の霊長類、哺乳動物、農場動物または家畜）からの臨床検体も使用できる。
迅速なＤＮＡ主体の診断検査法の開発
迅速な診断検査法は感染の管理に対して重要な影響を与えるべきである。臨床試料中の病原体および抗生物質耐性遺伝子の同定については、ＤＮＡプローブおよびＤＮＡ増幅技術が常法よりも優れたいくつかの利点を提供する。継代培養をする必要がなく、従って、生物を臨床試料で直接的に検出でき、それにより、病原体の単離に伴うコストおよび時間を減少させる。ＤＮＡを主体とする技術は、臨床微生物検査室において特定の利用者に極めて有用である。例えば、臨床検体中の病原体の直接的検出のためのハイブリダイゼーションプローブまたはＤＮＡ増幅の使用に基づく栄養条件の面倒な生物の検出用キットは、商業的に入手可能である（Ｐｅｒｓｉｎｇら，１９９３，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｅｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。
本発明は、日常的診断のために病院の臨床微生物検査室および私的な診療所で使用される通常の培養同定方法に対する有利な代替法である。かなり速いという以外に、ＤＮＡ主体の診断検査法は、診断に現在使用されている標準的な生化学検査法よりもより正確である。何故ならば、細菌の遺伝子型（例えば、ＤＮＡレベル）は細菌表現型（例えば、生化学的特性）よりもより安定だからである。本発明の独創性は、通常遭遇する細菌病原体の１２種に特異的なゲノムＤＮＡ断片（少なくとも１００塩基対のサイズ）をゲノムライブラリーまたはデータバンクから選択した。ゲノムライブラリーからまたは選択したデータバンク配列からハイブリダイゼーションによって同定された種特異的ＤＮＡ断片の配列に共に由来する増幅プライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ（共に長さが１００ヌクレオチド未満）を診断検査法を開発するためのベースとして使用する。一般的に遭遇し臨床的に重要な細菌耐性遺伝子の検出用のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーも含まれる。例えば、ＡｎｎｅｘＩおよびＩＩには、すべてゲノムライブラリーまたはデータバンク配列から選択された種特異的ＤＮＡ断片に由来する適当なオリゴヌクレオチドプローブおよびＰＣＲプライマーのリストがある。当業者は、Ａｎｎｅｘ１および２にリストされたもの以外の前記細菌種の特異的検出に適するオリゴヌクレオチド配列を種特異的断片または選択されたデータバンク配列から得ることが明らかに可能であろう。例えば、オリゴヌクレオチドは、本出願人が選択したものよりも短くても長くてもよく、また、同定された種特異的配列または選択されたデータバンク配列のいずれの他のところからも選択できる。あるいは、オリゴヌクレオチドはＰＣＲ以外の増幅方法での使用のために設計することもできる。したがって、本発明の核心部分は、細菌ゲノムＤＮＡライブラリーからの種特異的ゲノムＤＮＡ断片の同定、および種特異的かつ遍在的オリゴヌクレオチド源として使用されるデータバンク配列からのゲノムＤＮＡ断片の選択である。種特異的断片の配列または選択されたデータバンク配列からの診断目的に適したオリゴヌクレオチドの選択はかなり努力を要するが、当業者には、本出願人の見出した断片または選択したデータバンク配列から、本出願人が選択し具体例としてテストしたもの（ＡｎｎｅｘＩおよびＩＩ）とは異なる適当なオリゴヌクレオチドを選び出すのは全く可能である。
なかには、本出願人がその種特異的配列を同定した細菌病原体のいくつかについてそれらの検出および同定のためのＤＮＡ主体の検査法を開発した者もいる（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９３／０３１８６号）。しかしながら、それらの戦略は高度に保存された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅、およびその後の内部種特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに基づくものであった。本発明の戦略はかなり簡単でより迅速であるが、これは、種特異的細菌ゲノムＤＮＡ断片に由来するオリゴヌクレオチドを用いて種特異的標的の直接的増幅を可能とするからである。
臨床検体の高パーセンテージは陰性であるので、臨床検体で恐らくは遭遇するすべての細菌病原体を検出して、臨床検体が感染されているか否かを判定するために、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを高度に保存的な１６Ｓまたは２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子から選択した。この戦略は、細菌学的検査に付された多数の陰性臨床検体の迅速なスクリーニングを可能とする。
本出願人はさらに、一般的に遭遇し臨床的に関連する細菌耐性遺伝子を標的化することによって、細菌同定を同時に行い、抗生物質に対する推定感受性を迅速に測定するために、他のＤＮＡ主体検査法を開発している。選択された抗生物質耐性遺伝子からの配列が利用でき、それを用いてそれらの検出のためのＤＮＡ主体の検査法が開発されてきたが（ＥｈｒｌｉｃｈおよびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，１９９４，  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  Ｍｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；  Ｐｅｒｓｉｎｇら、１９９３，  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）、本出願人のアプローチは細菌の培養に基づく現在の「中心的方法たる」診断法よりも優れた主要な改良を示す点で革新的である。何故なら、１時間以内で直接的に臨床検体から、特異的細菌病原体の存在の迅速な同定および抗生物質に対するその感受性の評価を可能にするからである。
本出願人は、本出願人が開発して細菌培養に基づかない迅速で単純な診断検査法が病院の臨床微生物検査室および個人的診療所で現在使用されている時間のかかる通常の細菌同定方法と徐々に置き換わるであろうと信じている。本出願人の意見では、ひどくかつ通常の細菌病原体および抗生物質耐性についてのこれらの迅速なＤＮＡ主体診断検査法は（ｉ）治療を最適化することによって生命を救い、（ｉｉ）広域スペクトル抗生物質の使用を減少させることによって抗生物質耐性を低減させ、（ｉｉｉ）入院をなくしまたは短期間とすることによって総健康費用を低減させるであろう。
発明の概要
本発明により、臨床検体中の通常に遭遇する細菌病原体（すなわち、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ）、シュウドモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびモラキセラ・カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ））の検出に特異的である、ゲノムライブラリーまたはデータバンクからハイブリダイゼションによって選択されたゲノムＤＮＡ断片（配列表に記載した全部又は少なくとも１００塩基対のサイズ）からの配列が提供される。これらの細菌種は、尿管感染の約９０％に、および敗血症、髄膜炎、肺炎、腹腔内感染、皮膚感染および多くの他の重症呼吸器管感染の高パーセンテージに関連する。総じて、前記細菌種は、日常的微生物検査室で単離された細菌病原体の８０％までを占める。
ハイブリダイゼーション（プローブ）またはＤＮＡ増幅（プライマー）のための合成オリゴヌクレオチドは、前記種特異的ＤＮＡ断片（０．２５〜５．０キロベース対（ｋｂｐ）のサイズ範囲）または選択されたデータバンク配列（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）に由来するものであった。そのオリゴヌクレオチドプローブおよび増幅プライマーのいくつかが、選択されたデータバンク配列に由来する細菌種は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびシウドモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。当業者ならば、本発明の重要な革新部分が、ハイブリダイゼーションによって細菌ゲノムライブラリーから、またはデータバンク配列から選択された種特異的ＤＮＡ断片の同定であることが分かるだろう。診断目的に適したこれらの断片からのオリゴヌクレオチドの選択も革新的であることが分かるだろう。実際にテストされたものとは異なる特異的かつ普遍的オリゴヌクレオチドは本発明の具体例とみなされる。
臨床検体からの病原体の検出用のハイブリダイゼーション（断片またはオリゴヌクレオチドプローブを使用する）またはＤＮＡ増幅プロトコルの開発は非常に迅速な細菌同定を可能にする。これは、臨床検査室において病原体の同定に現在必要とされている時間を大いに短縮する。これらの技術は、細菌ＤＮＡを放出させるための任意の生物学的検体の前処理が最小であって、臨床検体から直接細菌の検出および同定に適用できるからである。１００％特異的であることに加えて、プローブおよび増幅プライマーは直接的に、臨床検体から、あるいは単離したコロニーから細菌種の同定を可能にする。ＤＮＡ増幅アッセイは、ハイブリダイゼーションアッセイよりも速くかつ感度が良いというさらなる利点を有する。それらのアッセイは、細菌ゲノムからのＤＮＡの標的セグメントの迅速で指数的なイン・ビトロ複製を可能とするからである。いずれの細菌病原体の検出も可能とする、細菌間で高度に保存された１６Ｓ又は２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子から選択された普遍的プローブおよび増幅プライマーは、診断検査室で受容された多数の陰性臨床検体をスクリーニングする手法として供されるであろう。一般的に遭遇し臨床的に重要な耐性遺伝子を同定するための抗生物質耐性をコードする特徴付けられた細菌遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーも本発明の範囲内にある。
発明の詳細な説明
種特異的ＤＮＡプローブの開発
以下の細菌種：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ）、シウドモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびモラキセラ・カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）についてＤＮＡ断片プローブを開発した。（エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）およびストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）については、オリゴヌクレオチド配列は、絶対的に、選択されたデータバンク配列に由来した）。これらの種特異的断片を、種々のグラム陽性およびグラム陰性細菌種からのＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって細菌ゲノムライブラリーから選択した（表５）。
プローブが求められる各細菌種からの染色体ＤＮＡは標準的な方法を用いて単離した。Ｓａｕ３ＡＩのごとき頻繁に切断する制限酵素でＤＮＡを消化し、次いで、適当な制限エンドヌクレアーゼ消化によって線状化した細菌プラスミドベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した。次いで、組換えプラスミドを用いて、コンピテントな大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αを形質転換し、それにより、ゲノムライブラリーを得た。標準的な方法を用いて形質転換細菌細胞のプラスミド含量を分析した。０．２５〜５．０キロベース対（ｋｂｐ）のサイズ範囲の標的細菌のＤＮＡ断片を、種々ののエンドヌクレアーゼでの組換えプラスミドの消化によってベクターから切り出した。アガロース電気泳動によってインサートをベクターから分離し、低融点アガロースゲル中で精製した。次いで、細菌ゲノムＤＮＡの精製断片の各々を特異性テストのためのプローブとして用いた。
各与えられた種につき、コーディング可能性が未知のゲル精製制限断片を、ランダムプライミング標識反応によってＤＮＡ断片に取り込まれた放射性ヌクレオチドα−32Ｐ（ｄＡＴＰ）で標識した。標識として使用するために、非放射性の改変されたヌクレオチドもこの方法によってＤＮＡに取り込むことができた。
次いで、各ＤＮＡ断片プローブ（すなわち、ゲノムライブラリーからランダムに選択されたクローンから切り出した少なくとも１００ｂｐ長さの細菌ゲノムＤＮＡのセグメント）を、種々の細菌種からのＤＮＡとのハイブリダイゼーションによってその特異性についてテストした（表５）。二本鎖標識ＤＮＡプローブを熱変性して、標識された一本鎖ＤＮＡが得られ、これを次いで固体支持体に固定化されたまたは溶液中のいずれかの一本鎖標的ＤＮＡにハイブリダイズさせることができた。標的ＤＮＡは、臨床試料で見い出された細菌種の列からの全細胞ＤＮＡよりなるものであった（表５）。各標的ＤＮＡを細菌細胞から遊離させ、常法によって変性し、次いで、固体支持体（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース膜）に不可逆的に固定し、あるいは溶液中に遊離させた。次いで、固定した一本鎖標的ＤＮＡを一本鎖プローブとハイブリダイズさせた。プレ−ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよびポスト−ハイブリダイゼーション条件は以下の通りであった：（１）プレ−ハイブリダイゼーション；１Ｍ  ＮａＣｌ＋１０％デキストラン硫酸＋１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）＋１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃１５分、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション；標識したプローブを含有する新鮮なプレ−ハイブリダイゼーション溶液中、６５℃一晩、（ｉｉｉ）ポスト−ハイブリダイゼーション；１％ＳＤＳを含有する３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウムである）中で２回、および０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中で２回洗浄；全ての洗浄は６５℃において１５分間であった。洗浄したフィルターのオートラジオグラフィーは、選択的にハイブリダイズしたプローブの検出を可能とした。特異的標的ＤＮＡとプローブのハイブリダイゼーションは、これらの２のＤＮＡのヌクレオチド配列間の高度の類似性を示した。
０．２５〜５．０ｋｂｐのサイズ範囲の種々の細菌ゲノムライブラリーから選択した種特異的ＤＮＡ断片を、前記したごとくに行った種々の細菌からの染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて、１０種の通常の細菌病原体（表６）につき単離した。テストした細菌種のすべて（表５にリストした６６種）は通常の感染に関連した病原体または臨床検体から単離できる可能な夾雑物のようであった。ＤＮＡ断片プローブは、それを単離した病原体のみにハイブリダイズした場合のみ、特異的とみなされた。特異的であることが判明したＤＮＡ断片プローブを、引き続いて、目的とする種の約１０〜８０種の臨床単離体からの細菌ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによってその遍在性につきテストした（すなわち、遍在性プローブは標的種のほとんどの単離体を認識した）（表６）。ＤＮＡを変性し、ナイロン膜に固定し、前記したごとくにハイブリダイズさせた。
種特異的断片プローブの配列決定
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）またはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて行ったジデオキシヌクレオチド終止配列決定法を用いて、単離された種特異的ＤＮＡ断片（表６）の全体または一部のヌクレオチド配列を決定した。これらのヌクレオチド配列を配列表に示す。また、データバンク（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）から選択した配列を、大腸菌、エンテロコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびシウドモナス・アエルギノーサ用の診断目的でオリゴヌクレオチド源として用いた。この戦略では、データバンクから選択した種々のゲノムＤＮＡ断片（１００ｂｐを超えるサイズ）に由来する適当なオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブの列を、後記するごとく、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションアッセイにおいてそれらの特異性および普遍性につきテストした。データバンク配列は、利用できる配列情報に応じて種特異的であるそれらの可能性に基づいて選択されたことに注意するのが重要である。種特異的オリゴヌクレオチドが由来するデータバンク配列のみが本発明に含まれる。
ゲノムライブラリーからまたはデータバンク配列から選択された種特異的断片に由来するオリゴヌクレオチドプローブおよび増幅用プライマーを、自動ＤＮＡ合成装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて合成した。合成に先立ち、すべてのオリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーション用のプローブおよびＤＮＡ増幅用のプライマー）を、標準的なプログラム（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）およびＯｌｉｇｏTM４．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いるコンピューター解析によるポリメラーゼ連鎖反応によって、ハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ増幅についてのそれらの適性につき評価した。また、ＰＣＲプライマー対の可能な適性も、１ヌクレオチドの長いストレッチ、３’末端における高い割合のＧまたはＣ残基、および３’−末端Ｔ残基のごとき望まない特徴の不存在を確認することによって合成に先立ち評価した（Ｐｅｒｓｉｎｇら、１９９３，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｌｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）。
オリゴヌクレオチドプライマーとのハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション実験では、オリゴヌクレオチド（１００ヌクレオチド未満のサイズ）は、大量調製の容易性、バッチ間の結果の一致性、および化学的安定性のごとき、細菌検出用のＤＮＡ断片プローブとしてのいくつかの利点を有する。簡言すれば、ハイブリダイゼーションでは、オリゴヌクレオチドはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて放射性ヌクレオチドγ32Ｐ（ＡＴＰ）で５’−末端標識した。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０カラムを通して標識一本鎖オリゴヌクレオチドを通過させることによって取り込まれなかった放射性ヌクレオチドを除去した。別法として、オリゴヌクレオチドをビオチンで、酵素的にそれらの３’末端にて標識し、またはジゴキシゲニンで、それらの５’末端にて合成の間に直接的に取り込んだ。当業者ならば、３つの前記標識以外の標識手段が使用できることを認識するであろう。
標的ＤＮＡを変性し、固体支持体に固定し、ＤＮＡ断片プローブにつき前記したごとくにハイブリダイズさせた。プレ−ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションについての条件は前記した通りである。ポスト−ハイブリダイゼーション洗浄条件は以下の通りである：１％ＳＤＳを含有する３×ＳＳＣ中で２回、１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ中で２回、および１％ＳＤＳを含有する１×ＳＳＣ中で２回（これらの洗浄の全ては６５℃において１５分間）、および２５℃で１５分間の１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中での最終洗浄。放射性標識で標識したプローブについては、ハイブリッドの検出は前記したオートラジオグラフィーによった。非放射性標識については、検出は比色または化学発光法によった。
オリゴヌクレオチドプローブは二本鎖ＤＮＡのいずれかの鎖に由来するものでよい。プローブは塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴまたは類似体よりなるものでよい。プローブは任意の適当な長さでよく、ゲノムライブラリーからまたはデータバンク配列から選択された種特異的ゲノムＤＮＡ断片内の全ての場所から選択できる。
ＤＮＡ増幅
広く使用されるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）方法によるＤＮＡ増幅については、プライマー対は、配列決定した種特異的ＤＮＡ断片から、またはデータバンク配列からのいずれかに由来するものであり、あるいは、オリゴヌクレオチドプローブの短縮バージョンである。合成に先立ち、ＯｌｉｇｏTM４．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるこによって潜在的なプライマー対を分析して、それらがＰＣＲ増幅用の候補であるかを確認した。
ＰＣＲによるＤＮＡ増幅の間に、各々が細菌ゲノムからの変性二本鎖標的ＤＮＡの各鎖に結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＤＮＡの変性、プライマーのアニーリングおよび各サイクルにおける新しい標的の合成を行う連続的熱サイクルによってイン・ビトロにて標的ＤＮＡを指数的に増幅させた（Ｐｅｒｓｉｎｇら、１９９３，  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）。簡言すると、ＰＣＲプロトコルは以下の通りである。５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．４μＭの２つのプライマーの各々、２００μＭの４のｄＮＴＰの各々、および１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含有する５０μＬＰＣＲ反応混合物に、臨床的検体または細菌コロニーを直接添加した。次いで、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ４８０TMサーマルサイクラーを用いて、ＰＣＲ反応を熱サイクル（９５℃で３分、続いて９５℃で１秒および５５℃で１秒の３０サイクル）に付し、続いて、標準的なエチジウムブロミド−染色アガロースゲル電気泳動によって分析した。日常的診断についてのより速くより実用的であり得る、特異的増幅産物の検出用の他の方法を使用できるのは明らかである。かかる方法は、増幅後の蛍光（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒからのＴａｑＭａｎTMシステムまたはＢｉｏｔｒｏｎｉｃｓからのＡｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒTM）または特異的増幅産物の内部配列に結合するオリゴヌクレオチドプローブとの液体ハイブリダイゼーションの検出に基づくものであってよい。これらの新規プローブは本出願人の種特異的断片プローブから作成することができる。蛍光の検出に基づく方法は、特に、非常に迅速で定量的かつ自動化できるので、日常的診断での利用に有望である。
ＰＣＲ効率を確実とするために、グリセロールまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または他の関連溶媒を用いて、ＰＣＲの感度を増加させ、高いＧＣ含量または強い二次構造を伴う標的での増幅に関連する問題を克服することができる。グリセロールおよびＤＭＳＯについての濃度範囲は、各々、５−１５％（ｖ／ｖ）および３−１０％（ｖ／ｖ）である。ＰＣＲ反応混合物については、増幅プライマーおよびＭｇＣｌ2についての濃度範囲は、各々、０．１−１．０μＭおよび１．５−３．５ｍＭである。外部およびネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー（すなわち、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ）を用いる、あるいは１を超えるプライマー対（すなわち、多重ＰＣＲ）を用いる標準的なＰＣＲプロトコルの改良型を用いることもできる（Ｐｅｒｓｉｎｇら、１９９３，  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）。ＰＣＲプロトコルおよびアンプリコン検出方法についてのより詳細は、実施例７および８を参照されたい。
ＤＮＡ増幅の当業者は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写−ベース増幅システム（ＴＡＳ）、自己保持配列複製（３ＳＲ）、核酸配列−ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）のごとき他の迅速な増幅手法の存在を知っているであろう（Ｐｅｒｓｉｎｇら，１９９３，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）。本発明の範囲はＰＣＲによる増幅の使用に限定されず、むしろ、検査の迅速性および感度を増加させるのに使用できるいずれの迅速な核酸増幅方法またはいずれの他の手法の使用も含む。ＰＣＲ以外のアプローチによる核酸の増幅に適し、本明細書に含まれる種特異的断片からの、および選択された抗生物質耐性遺伝子配列から由来のオリゴヌクレオチドも本発明の範囲内にある。
オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーについての特異性および遍在性テスト
配列決定した種特異的断片またはデータバンク配列のいずれかに由来するオリゴヌクレオチドプローブの特異性を、前記した表５にリストした細菌種の列からのＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによってテストした。特異的であることが判明したオリゴヌクレオチドを、ひき続いて、断片プローブにつき前記したごとく標的種の約８０の単離体からの細菌ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによってそれらの遍在性につきテストした。プローブが単離体の少なくとも８０％からのＤＮＡと特異的にハイブリダイズした場合にプローブを遍在性とみなした。オリゴヌクレオチドプローブについての特異性および遍在性テストの結果は表６にまとめた。増幅プライマー対の特異性および遍在性は、同一細菌株の培養体（実施例７参照）から直接テストした。特異性および遍在性テストについては、ＰＣＲアッセイは、標的種の約８０の単離体の細菌コロニーから直接行った。結果を表７にまとめた。調べた１２の細菌種の各々についてのすべての特異的および普遍的オリゴヌクレオチドプローブおよび増幅用プライマーを、各々、ＡｎｎｅｘＩおよびＩＩにリストする。配列決定したＤＮＡ断片において分岐（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）が起こり得、これらの配列またはその一部の分岐がプローブまたは増幅用プライマーの特異性に影響しない限り、細菌ＤＮＡ変異体は本発明の範囲内にある。
普遍的細菌検出
日常的微生物検査室においては、細菌同定のために送られた臨床検体は高パーセンテージで陰性である（表４）。例えば、２年以上の期間にわたり、「Ｃｅｎｔｅｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ  ｄｅ  ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｌａｖａｌ  （ＣＨＵＬ）」の検査室が受け取った尿検体の約８０％が陰性であった（すなわち、＜１０7ＣＦＵ／Ｌ）（表３）。特異的同定に先立って、細菌の存在につき検出し、多数の陰性検体をスクリーニングするための、普遍的プローブまたは普遍的増幅プライマーで臨床試料を検査することは、したがって、コストを節約し、患者の臨床的管理を迅速に方向づけるので有用である。従って、データバンクで入手できる細菌１６Ｓまたは２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列の高度に保存された部分から、いくつかのオリゴヌクレオチドおよび増幅プライマーを合成した（Ａｎｎｅｘ  ＩＩＩおよびＩＶ）。ハイブリダイゼーションテストにおいて、７つのオリゴヌクレオチドのプール（Ａｎｎｅｘ  Ｉ；表６）が表５にリストしたすべての細菌種からのＤＮＡに強くハイブリダイズした。放射性ヌクレオチドまたは任意の他の改変ヌクレオチドで標識した普遍的プローブのこのプールは、したがって、尿試料中の細菌の検出で非常に有用であり、≧１０7  ＣＦＵ／Ｌの感度範囲である。また、これらのプローブは他の臨床試料における細菌検出に適用することもできる。
やはり高度に保存されたリボソームＲＮＡ遺伝子の配列に由来する増幅プライマーを、直接臨床検体から普遍的細菌を検出するための代替戦略として使用した（Ａｎｎｅｘ  ＩＶ；表７）。検査の感度および迅速性を増大させるために、ＤＮＡ増幅戦略を開発した。この増幅は普遍的である。というのは、臨床検体で遭遇する２３の異なる細菌種からのＤＮＡを特異的に増幅したからである。
リボソームＲＮＡ遺伝子以外のよく保存された細菌遺伝子も直接的な臨床検体からの普遍的細菌検出についての良好な候補である。かかる遺伝子は細菌生存に必須の過程（例えば、蛋白質合成、ＤＮＡ合成、細胞分裂またはＤＮＡ修復）に関連し得、従って、進化の間に高度に保存されたのであろう。本出願人は、直接臨床検体から細菌を普遍的に検出するための新しい迅速な検査法を開発するためにこれらの候補遺伝子について研究をしている。
抗生物質耐性遺伝子
抗微生物耐性は治療を複雑化し、しばしば、治療の失敗に導く。さらに、抗生物質の過剰使用は不可避的に細菌耐性の出現に導く。本出願人の目標は、１時間以内に、臨床医に必要な情報を提供して、最適の治療を可能にすることにある。遍在性細菌検出用のＤＮＡ主体の検査での陰性臨床検体の迅速な同定および特異的細菌検出用のＤＮＡ主体の検査で陽性検体における特異的病原体の存在の同定に加え、臨床医は、細菌病原体が抗生物質治療に抵抗する能力についてのタイムリーな情報も必要とする。本出願人は、抗微生物剤に対する細菌耐性を迅速に評価する最も効果的な戦略は、臨床検体から最も普通で重要な抗生物質耐性遺伝子を直接検出すること（すなわち、抗生物質耐性遺伝子の検出用のＤＮＡ主体の検査）であると感じる。最も重要で普通の細菌の抗生物質耐性遺伝子からの配列はデータバンクから入手できるので、本出願人の戦略は、全遺伝子または一部からの配列を用いて、迅速なＤＮＡ主体の検査の開発用のベースとして使用される特異的オリゴヌクレオチドを設計することである。その臨床的罹患率（すなわち、高い発症率および重要性）に基づいて選択した細菌抗生物質耐性遺伝子からの配列を配列表に示す。表８は選択した抗生物質耐性遺伝子のいくつかの特徴をまとめたものである。
実施例
以下の実施例は本発明の種々の方法および化合物を説明することを意図したものである。
実施例１
断片の単離およびクローニング
大腸菌株ＡＴＣＣ２５９２２、クレブシェラ・ニューモニエ株ＣＫ２、シウドモナス・アエルギノーサ株ＡＴＣＣ２７８５３、プロテウス・ミラビリス株ＡＴＣＣ３５６５７、ストレプトコッカス・ニューモニエ株ＡＴＣＣ２７３３６、スタフィロコッカス・アウレウス株ＡＴＣＣ２５９２３、スタフィロコッカス・エピデルミディス株ＡＴＣＣ１２２２８、スタフィロコッカス・サプロフィティカス株ＡＴＣＣ１５３０５、ヘモフィラス・インフルエンザ参照株Ｒｄおよびモラキセラ・カタルハリス株ＡＴＣＣ５３８７９からのゲノムＤＮＡを標準的な手法を用いて調製した。細菌ゲノムＤＮＡは前記したもの以外の株から単離してもよいことは理解されるであろう（エンテロコッカス・フェカリスおよびストレプトコッカス・ピオゲネスについては、オリゴヌクレオチド配列は専らデータバンクに由来した）。Ｓａｕ３ＡＩのごときＤＮＡをしばしば切断する制限酵素で各ＤＮＡを消化した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクター（ｐＧＥＭ３Ｚｆ）に連結して、組換えプラスミドを得、コンピテントな大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞（ＤＨ５α）に形質転換した。ベクターおよび対応するコンピテント細胞は特に例示した前記のものに限定されないことは理解されるであろう。組換えプラスミドおよび形質転換細胞を得る目的は、プローブとして有用なＤＮＡ断片を容易に再生できる供給源として供することにある。従って、挿入された断片が標的細菌ＤＮＡに対して特異的で選択的である限り、いずれの組換えプラスミドおよび対応する形質転換宿主細胞も本発明の範囲内のものである。形質転換細菌細胞のプラスミド含量は標準的な方法を用いて分析した。０．２５〜５．０ｋｂｐのサイズ範囲の標的細菌からのＤＮＡ断片を、種々の制限エンドヌクレアーゼでの組換えプラスミドの消化によってベクターから切り出した。インサートをアガロースゲル電気泳動によってベクターから分離し、低融点アガロースゲル中で精製した。次いで、精製断片の各々を特異的テストのために使用した。
ＤＮＡ断片プローブの標識化
使用した標識はα32Ｐ（ｄＡＴＰ）であり、これは、二本鎖ＤＮＡ分子に酵素的に取り込むことができる放射性ヌクレオチドである。９５℃で５分間加熱することによって目的の断片をまず変性し、次いで、ランダムプライマーの混合物を断片の鎖にアニールさせた。これらのプライマーは、一旦アニールされると、ＤＮＡ合成のための開始点を提供する。ＤＮＡポリメラーゼ、通常はクレノウ断片を４つのヌクレオチドに沿って供し、そのうちの１つは放射性である。反応を停止させたら、新しいＤＮＡ分子の混合物を再度変性して放射性の一本鎖ＤＮＡ分子（すなわち、プローブ）を供する。前記したごとく、他の改変ヌクレオチドを用いてプローブを標識することもできる。
ＤＮＡ断片プローブについての特異性および遍在性テスト
０．２５〜５．０ｋｂｐのサイズ範囲の種特異的ＤＮＡ断片を、種々の細菌からの染色体に対するハイブリダイゼーションに基づいて１０種の通常の細菌病原体（表６）につき単離した。表５にリストした各細菌株についての全細胞ＤＮＡの試料を、ドットブロット装置を用いてナイロン膜に移し、不可逆的に固定する前に洗浄し変性した。ハイブリダイゼーション条件は前記した通りである。ＤＮＡ断片プローブは、それが単離された病原体のみにハイブリダイズした場合にのみ特異的とみなした。次いで、標的細菌種に対してのみ特異的にハイブリダイズする（すなわち、特異的である）標識ＤＮＡ断片を、前記したごとくに、目的の種の約１０〜８０単離体からのＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによってそれらの遍在性につきテストした。プレ−ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよびポスト−ハイブリダイゼーションについての条件は前記した通りである。オートラグオグラフィー（または使用した非放射性標識に適した他の検出手段）の後、各個々のプローブの特異性を決定することができる。特異的であること（すなわち、それが単離された細菌種からのＤＮＡに対してのみハイブリダイズすること）および普遍的であること（すなわち、標的種のほとんどの単離体にハイブリダイズすること）が判明した各プローブをさらなる実験のために保存した。
実施例２
株のテストがコロニーハイブリダイゼーションによる以外は実施例１に同じ。細菌株を、栄養寒天上に置いたナイロン膜に接種した。該膜を３７℃で２時間インキュベートし、次いで、細菌の溶解およびＤＮＡ変性を標準的な方法に従って行った。ＤＮＡハイブリダイゼーションは前記したごとくに行った。
実施例３
細菌を直接臨床試料から検出した以外は実施例１に同じ。いずれの生物学的試料も直接ドットブロット装置にロードし、細胞を細菌検出のためにイン・サイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）溶解させた。ドットブロット装置への便利なローディングを妨げる凝固を回避するために、血液試料はヘパリン処理すべきである。
実施例４
ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列決定
特異的および普遍的であることが判明した各断片の全部または一部のヌクレオチド配列（実施例１）を、ジデオキシヌクレオチド終止配列決定法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７）を用いて決定した。これらのＤＮＡ配列を配列表に示す。オリゴヌクレオチドプローブおよび増幅用プライマーはこれらのヌクレオチド配列から選択するか、あるいは、選択したデータバンクから選択し、次いで、ホスホアミダイト化学を用いて、自動Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ合成装置（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅTM）で合成した。
オリゴヌクレオチドの標識化
前記したごとくに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって、各オリゴヌクレオチドをγ32Ｐ−ＡＴＰで５’末端標識した。標識は非放射性であってもよい。
オリゴヌクレオチドプローブについての特異的テスト
前記したごとくに、種々のグラム陽性およびグラム陰性細菌種からのＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって、すべての標識したオリゴヌクレオチドプローブをそれらの特異性につきテストした。種特異的プローブは、それが単離された細菌種からのＤＮＡに対してのみハイブリダイズするものであった。特異的であることが判明したオリゴヌクレオチドプローブを以下のごとくに遍在性テストに供した。
オリゴヌクレオチドプローブについての遍在性テスト
次いで、異的オリゴヌクレオチドプローブを、標的種の約８０株につき遍在性テストで用いた。単離体からの染色体ＤＮＡをナイロン膜に移し、特異性テストにつき前記したごとくに標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。各標的種について構築した約８０の単離体群は参照ＡＴＣＣ株ならびに種々の供給源から得られた臨床単離体を含む。普遍的プローブは、標的種の臨床的単離体群からのＤＮＡの少なくとも８０％にハイブリダイズするものであった。特異的および普遍的オリゴヌクレオチドプローブの例はＡｎｎｅｘ１にリストする。
実施例５
細菌同定のために特異的オリゴヌクレオチドプローブのプールを用いて、（ｉ）感度を増加させ、１００％遍在性を確実とし、あるいは（ｉｉ）１を超える細菌種を同時に同定する。細菌同定は単離コロニーから、あるいは直接臨床検体から行うことができた。
実施例６
ＰＣＲ増幅
ＰＣＲの技術を用いてテストの感度および迅速性を増加させた。使用したＰＣＲプライマーはしばしばハイブリダイゼーションアッセイにつき従前に開発したオリゴヌクレオチドの広範なセットのより短い誘導体であった（表６）。プライマーセットを、直接細菌コロニーまたは細菌懸濁液から行ったＰＣＲアッセイでテストして（実施例７参照）、それらの特異性および遍在性を測定した（表７）。特異的および普遍的ＰＣＲプライマー対の例をＡｎｎｅｘＩＩにリストする。
増幅プライマーについての特異性および遍在性テスト
すべての選択されたＰＣＲプライマーの特異性を、オリゴヌクレオチドプライマーをテストするのに使用したグラム陰性およびグラム陽性菌群に対してテストした（表５）。次いで、各種につき特異的であることが判明したプライマー対をそれらの遍在性につきテストして、プライマーの各セットが標的種の約８０の単離体群からのＤＮＡの少なくとも８０％を増幅できることを確認した。各種につき構築した単離体群は参照ＡＴＣＣ株および各種についての臨床的多様性に代表的な種々の臨床単離体を含む。
偽陽性ＰＣＲ結果を回避するための標準的注意を払うべきである。ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼによる不活性化のごときＰＣＲ増幅産物を不活性化する方法を用いてＰＣＲ持ち込し（ｃａｒｒｙｏｖｅｒ）を制御することができる。
実施例７
細菌コロニーまたは懸濁液からの直接的増幅
ＰＣＲアッセイを、細菌コロニーまたは細菌懸濁液から直接的に行ったが、後者は標準ＭｃＦａｒｌａｎｄ０．５に調整した（１．５×１０8細菌／ｍＬに対応）。コロニーからの直接増幅の場合、プラスチックロッドを用いて、該コロニーの一部を直接５０μＬ  ＰＣＲ反応混合物（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭトリスｐＨ８．３、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、各０．４μＭの２つのプライマー、各２００μＭの４つのｄＮＴＰおよび１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含有）に移した。細菌懸濁液については、４μＬの細胞懸濁液を４６μＬの同一ＰＣＲ反応混合物に添加した。両戦略につき、反応混合物に５０μＬの鉱油を重層し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ４８０TMサーマルサイクラーにて、９５℃における３分間の最初の変性工程、続いての９５℃における１秒間の変性工程および５５℃における１秒間のアニーリング工程からなる３０サイクルを行った。次いで、標準的なアガロースゲル（２％）電気泳動によってＰＣＲ増幅産物を分析した。増幅産物を、２５４ｎｍの紫外線下で、２．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロミドを含有するアガロースゲル中で可視化した。全ＰＣＲアッセイは約１時間内に完了することができる。
また、「ホットスタート（ｈｏｔ  ｓｔａｒ）」プロトコルを用いる以外は前記と同様にして、細菌培養からの増幅を行った。その場合、標的ＤＮＡ、プライマーおよびｄＮＴＰを含有する最初の反応混合物を、ＰＣＲ反応混合物の他の成分の添加に先立って、８５℃で加熱した。すべての試薬の最終濃度は前記した通りである。引き続いて、前記したごとくにＰＣＲ反応物をサーマルサイクルおよび分析に付した。
実施例８
臨床検体からの直接的増幅
尿検体からの増幅には、４μＬの非希釈または希釈（１：１０）尿を前記ＰＣＲ反応混合物４６μＬに直接添加し、前記したごとくに増幅した。
細菌細胞溶解を改良し、臨床検体のＰＣＲ阻害作用を排除するために、試料を、界面活性剤を含有する溶解緩衝液にルーチン的に希釈した。続いて、溶解物をＰＣＲ反応混合物に直接添加した。ＤＮＡ増幅に先立って、サーモサイクラーまたはマイクロ波オーブンを用いる溶解物の加熱処理を行って、細胞溶解の効率を増加させることもできた。
１つの戦略は、臨床検体のＰＣＲ阻害作用を排除し、細菌細胞を溶解させて、直接的に種々の生物学的試料からＤＮＡ増幅を行うための迅速で簡便なプロトコルを開発することである。ＰＣＲは粗製ＤＮＡ調製物に適合するという利点を有する。例えば、血液、脳脊髄液および血清を、簡単な加熱処理の後にＰＣＲアッセイで直接使用することができる。本出願人は、かかる迅速で簡便な戦略を使用して、種々の臨床検体からのＤＮＡ増幅用の迅速なプロトコルを開発することを意図する。
実施例９
抗生物質耐性遺伝子の検出
頻繁に遭遇し臨床的に重要な特異的抗生物質耐性遺伝子の存在は、前章に記載したＰＣＲ増幅またはハイブリダイゼーションプロトコルを用いて同定される。ＤＮＡ主体の検査のベースとして使用される特異的オリゴヌクレオチドは抗生物質耐性遺伝子配列から選択される。これらの検査は直接的に臨床検体からまたは細菌コロニーから行うことができ、特異的細菌同定についての診断用検査を補完するべきである。
実施例１０
多重ＰＣＲによって（すなわち、単一ＰＣＲ反応における数個の対のプライマーを用いて）アッセイを行って、（ｉ）特異的標的病原体につき１００％の遍在性に到達するか、または（ｉｉ）細菌病原体のいくつかの種を同時に検出する以外は実施例７および８に同じ。
例えば、大腸菌の検出は、１００％の遍在性を確認するには３対のＰＣＲプライマーを要する。従って、それらのプライマー対での（「ホット−スタート」プロトコル（実施例７）を用いる）多重ＰＣＲアッセイを開発した。また、この戦略を、１００％の遍在性に到達するのに要する１を超えるプライマー対についての他の細菌病原体で用いた。
また、多重ＰＣＲアッセイを用いて、（ｉ）いくつかの細菌種を同時に測定し、あるいは、（ｉｉ）直接に臨床検体からまたは細菌コロニーから、細菌病原体を同時に同定し、特異的抗生物質耐性遺伝子を検出した。
これらの適用については、アンプリコン検出方法を適用して、生じた種々のアンプリコンを区別すべきである。標準的なアガロースゲル電気泳動はそれらのサイズに基づいてアンプリコンを区別するので、それを用いることができた。この目的でもう１つの有用な戦略は、各々が、増幅の間に分解して発蛍光団を放出する蛍光クエンチャーに結合した特異的オリゴヌクレオチドとカップリングする、異なる波長で放射する種々の発蛍光団（例えば、ＴａｑＭａｎTM、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いる検出である。
実施例１１
増幅産物の検出
当業者ならば、標準的なアガロースゲル電気泳動（実施例７）以外の別法を増幅産物の解明に使用できることを認識するであろう。かかる方法は、増幅後の蛍光（例えば、ＡｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒTM，Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃｓ；  ＴａｑＭａｎTM）またはビオチンのごとき他の標識（ＳＨＡＲＰ  ＳｉｇｎａｌTM，Ｄｉｇｅｎｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の検出に基づくものであり得る。これらの方法は定量的であって、容易に自動化される。種特異的断片プローブに由来するアンプリコンに特異的な増幅プライマーまたは内部オリゴヌクレオチドプローブの１つを発蛍光団または任意の他の標識とカップリングさせる。蛍光の検出に基づく方法は、迅速で、異なる波長を放射する発蛍光団をフレキシブルに利用できる（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）ので、診断用検査に特に適する。
実施例１２
種特異的、普遍的および抗生物質耐性遺伝子増幅用プライマーを、検査の感度を増加させるために、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベース増幅システム（ＴＡＳ）、自己保持配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）またはいずれかの他の方法のごとき他の迅速な増幅手法で用いることができる。増幅は、単離した細菌コロニーからまたは直接に臨床検体から行うことができる。従って、本発明の方法は、ＰＣＲの使用に限定されず、むしろ検査の迅速性および感度を増加させるのに使用できる、細菌ＤＮＡを特異的に同定するための任意の手法を含む。
実施例１３
検査キットは、各細菌に特異的なプローブのセットならびに普遍的プローブのセットを含有する。該キットは、非放射性標識で標識した普遍的プローブのセットならびに特異的臨床試料中の目的の各細菌の検出用の標識特異的プローデよりなる、検査成分の形態で提供される。該キットは、プレ−ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄工程およびハイブリッド検出を行うのに必要な検査試薬も含む。最終的に、公知の抗生物質耐性遺伝子（またはそれからの誘導体）の検出用の検査成分が含まれる。勿論、該キットは、各ハイブリダイゼーション検査用の陰性および陽性対照として使用される標準的試料を含むであろう。
キットに含めるべき成分は各検体の種類に適合させ、その種類の検体で通常遭遇する病原体を検出する。また、細菌の普遍的検出用の試薬も含まれるであろう。感染の部位に基づき、病原体の特異的検出のための以下のキットを開発できる：
細菌ゲノムの高度に保存された領域に特異的なプローブのセットを含有する、ほとんどの臨床検体からの細菌病原体の普遍的検出用のキット、
８つの特異的検査成分（大腸菌、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシェラ・ニューモニエ、プロテウス・ミラビリス、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、スタフィロコッカス・アウレウスおよびスタフィロコッカス・エピデルミディスの検出用のプローブセット）を含有する、尿試料からの細菌病原体の検出用のキット、
７つの特異的検査成分（ストレプトコッカス・ニューモニエ、モラキセラ・カトルハリス、ヘモフィラス・インフルエンザ、クレブシェラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびスタフィロコッカス・アウレウスを検出するためのプローブセット）を含有する呼吸器系病原体の検出用のキット、
１１個の特異的検査成分（ストレプトコッカス・ニューモニエ、モラキセラ・カトルハリス、ヘモフィラス・インフルエンザ、プロテウス・ミラビリス、クレブシェラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、大腸菌、エンテロコッカス・フェカリス、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびスタフィロコッカス・エピデルミディスの検出用のプローブセット）を含有する、血液試料からの病原体の検出用のキット、
４つの特異的検査成分（ヘモフィラス・インフルエンザ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、大腸菌およびシュードモナス・アエルギノーサの検出用のプローブセット）を含有する、髄膜炎を引き起こす病原体の検出用のキット、
細菌耐性に関連する１９個の以下の遺伝子：ｂｌａtem、ｂｌａrob、ｂｌａshv、ａａｄＢ、ａａｃＣ１、ａａｃＣ２、ａａｃＣ３、ａａｃＡ４、ｍｅｃＡ、ｖａｎＡ、ｖａｎＨ、ｖａｎＸ、ｓａｔＡ、ａａｃＡ−ａｐｈＤ、ｖａｔ、ｖｇａ、ｍｓｒＡ、ｓｕｌおよびｉｎｔの少なくとも１つの特異的検出のためのプローブセットを含有する臨床的に重要な抗生物質耐性遺伝子の検出用のキット、
皮膚、腹部負傷からの病原体の検出に適した他のキットまたはいずれかの他の臨床的に重要なキット、
が開発される。
実施例１４
検査キットがＤＮＡ増幅アッセイを行うための全ての試薬および対照を含有する以外は実施例１３に同じ。診断用キットは、直接的に臨床検体または細菌コロニーから行うＰＣＲ（または他の増幅方法）による増幅に適する。普遍的細菌検出、細菌同定および抗生物質耐性遺伝子検出に必要な成分が含まれる。
試験管中、または多数のウェルを有するミクロ滴定プレート中にて、増幅アッセイを行うことができた。プレートにおけるアッセイでは、ウェルは、特異的増幅プライマーおよび対照ＤＮＡで被覆され、増幅産物の検出は自動化されるであろう。普遍的細菌検出のための試薬および増幅用プライマーは、直接的に臨床検体から行う検査用キットに含まれる。細菌同定および抗生物質耐性遺伝子検出に要する成分は、直接的にコロニーから検査するためのキット、ならびに直接的に臨床検体から検査するためのキットに含まれる。
該キットは、ハイブリダイゼーション−ベース診断キットのための実施例１３に記載した各種の検体での使用に適するであろう。
実施例１５
細菌の検出および同定用の本発明で記載したプローブおよび増幅用プライマーの使用は、臨床的微生物への適用に限定されない。事実、本出願人は、他の分野もこれらの新しい技術から恩恵を受け得ると感じている。例えば、これらの検査は、食品、水、医薬品、その他微生物抑制を必要とする他の製品の品質管理のための産業において使用できるであろ。また、これらの検査法を使用して、ヒト以外の生物（例えば、他の霊長類、哺乳動物、農場動物および家畜）からの生物学的試料中の細菌を検出し同定し得る。また、これらの診断手段は、臨床試験および疫学的研究を含めた研究目的でも非常に有用であろう。
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【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１８１７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000030
0004176146.tif 000031
配列番号：２
配列の長さ：２２７５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000032
配列番号：３
配列の長さ：２２７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000033
配列番号：４
配列の長さ：２７８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000034
配列番号：５
配列の長さ：１５９６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000035
配列番号：６
配列の長さ：２７０３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000036
0004176146.tif 000037
0004176146.tif 000038
配列番号：７
配列の長さ：１３９１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000039
配列番号：８
配列の長さ：２３８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000040
配列番号：９
配列の長さ：３８５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000041
配列番号：１０
配列の長さ：４６２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000042
配列番号：１１
配列の長さ：７３０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000043
配列番号：１２
配列の長さ：２２５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000044
配列番号：１３
配列の長さ：４０２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000045
配列番号：１４
配列の長さ：１５７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000046
配列番号：１５
配列の長さ：１３４８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000047
配列番号：１６
配列の長さ：２１６７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000048
0004176146.tif 000049
配列番号：１７
配列の長さ：１８７２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000050
配列番号：１８
配列の長さ：３４５１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000051
0004176146.tif 000052
0004176146.tif 000053
配列番号：１９
配列の長さ：７４４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000054
配列番号：２０
配列の長さ：２７６０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000055
0004176146.tif 000056
配列番号：２１
配列の長さ：１７２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000057
配列番号：２２
配列の長さ：１５５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000058
配列番号：２３
配列の長さ：１４５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000059
配列番号：２４
配列の長さ：２６６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
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配列番号：２５
配列の長さ：８４５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
配列
0004176146.tif 000061
配列番号：２６
配列の長さ：１５９８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
配列
0004176146.tif 000062
配列番号：２７
配列の長さ：９１００
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
配列
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0004176146.tif 000064
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配列番号：２８
配列の長さ：５２５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000069
配列番号：２９
配列の長さ：４６６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000070
配列番号：３０
配列の長さ：６３１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000071
配列番号：３１
配列の長さ：３７５４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000072
0004176146.tif 000073
0004176146.tif 000074
配列番号：３２
配列の長さ：１１３７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ
配列
0004176146.tif 000075
配列番号：３３
配列の長さ：１８３７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ
配列
0004176146.tif 000076
配列番号：３４
配列の長さ：８４１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000077
配列番号：３５
配列の長さ：４５００
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000078
0004176146.tif 000079
0004176146.tif 000080
0004176146.tif 000081
配列番号：３６
配列の長さ：７０５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
配列
0004176146.tif 000082
配列番号：３７
配列の長さ：４４２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
配列
0004176146.tif 000083
配列番号：３８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000084
配列番号：３９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000085
配列番号：４０
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000086
配列番号：４１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000087
配列番号：４２
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000088
配列番号：４３
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000089
配列番号：４４
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000090
配列番号：４５
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000091
配列番号：４６
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000092
配列番号：４７
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000093
配列番号：４８
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000094
配列番号：４９
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000095
配列番号：５０
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000096
配列番号：５１
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000097
配列番号：５２
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000098
配列番号：５３
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000099
配列番号：５４
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000100
配列番号：５５
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000101
配列番号：５６
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000102
配列番号：５７
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000103
配列番号：５８
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000104
配列番号：５９
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000105
配列番号：６０
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000106
配列番号：６１
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000107
配列番号：６２
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000108
配列番号：６３
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000109
配列番号：６４
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000110
配列番号：６５
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000111
配列番号：６６
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000112
配列番号：６７
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000113
配列番号：６８
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000114
配列番号：６９
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000115
配列番号：７０
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000116
配列番号：７１
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000117
配列番号：７２
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000118
配列番号：７３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000119
配列番号：７４
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000120
配列番号：７５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000121
配列番号：７６
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000122
配列番号：７７
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000123
配列番号：７８
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000124
配列番号：７９
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000125
配列番号：８０
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000126
配列番号：８１
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000127
配列番号：８２
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000128
配列番号：８３
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000129
配列番号：８４
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000130
配列番号：８５
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000131
配列番号：８６
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000132
配列番号：８７
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000133
配列番号：８８
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000134
配列番号：８９
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000135
配列番号：９０
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000136
配列番号：９１
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000137
配列番号：９２
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000138
配列番号：９３
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000139
配列番号：９４
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000140
配列番号：９５
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
配列
0004176146.tif 000141
配列番号：９６
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000142
配列番号：９７
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000143
配列番号：９８
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000144
配列番号：９９
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000145
配列番号：１００
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｙｌｏｃｇｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000146
配列番号：１０１
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000147
配列番号：１０２
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000148
配列番号：１０３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000149
配列番号：１０４
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000150
配列番号：１０５
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
配列
0004176146.tif 000151
配列番号：１０６
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
配列
0004176146.tif 000152
配列番号：１０７
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
配列
0004176146.tif 000153
配列番号：１０８
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000154
配列番号：１０９
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000155
配列番号：１１０
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000156
配列番号：１１１
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000157
配列番号：１１２
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000158
配列番号：１１３
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000159
配列番号：１１４
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000160
配列番号：１１５
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000161
配列番号：１１６
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000162
配列番号：１１７
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000163
配列番号：１１８
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000164
配列番号：１１９
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000165
配列番号：１２０
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000166
配列番号：１２１
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000167
配列番号：１２２
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004176146.tif 000168
配列番号：１２３
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004176146.tif 000169
配列番号：１２４
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004176146.tif 000170
配列番号：１２５
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004176146.tif 000171
配列番号：１２６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004176146.tif 000172
配列番号：１２７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004176146.tif 000173
配列番号：１２８
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004176146.tif 000174
配列番号：１２９
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004176146.tif 000175
配列番号：１３０
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004176146.tif 000176
配列番号：１３１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000177
配列番号：１３２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
配列
0004176146.tif 000178
配列番号：１３３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000179
配列番号：１３４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000180
配列番号：１３５
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000181
配列番号：１３６
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000182
配列番号：１３７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000183
配列番号：１３８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000184
配列番号：１３９
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000185
配列番号：１４０
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
配列
0004176146.tif 000186
配列番号：１４１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ
配列
0004176146.tif 000187
配列番号：１４２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ
配列
0004176146.tif 000188
配列番号：１４３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ
配列
0004176146.tif 000189
配列番号：１４４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ
配列
0004176146.tif 000190
配列番号：１４５
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
配列
0004176146.tif 000191
配列番号：１４６
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
配列
0004176146.tif 000192
配列番号：１４７
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
配列
0004176146.tif 000193
配列番号：１４８
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
配列
0004176146.tif 000194
配列番号：１４９
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
配列
0004176146.tif 000195
配列番号：１５０
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
配列
0004176146.tif 000196
配列番号：１５１
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
配列
0004176146.tif 000197
配列番号：１５２
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
配列
0004176146.tif 000198
配列番号：１５３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
配列
0004176146.tif 000199
配列番号：１５４
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
配列
0004176146.tif 000200
配列番号：１５５
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
配列
0004176146.tif 000201
配列番号：１５６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000202
配列番号：１５７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000203
配列番号：１５８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000204
配列番号：１５９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｈｅｕｍｏｎｉａｅ
配列
0004176146.tif 000205
配列番号：１６０
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
起源：
生物名：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
配列
0004176146.tif 000206
配列番号：１６１
配列の長さ：８６１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000207
配列番号：１６２
配列の長さ：９１８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000208
配列番号：１６３
配列の長さ：８６４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000209
配列番号：１６４
配列の長さ：５３４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000210
配列番号：１６５
配列の長さ：４６５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000211
配列番号：１６６
配列の長さ：８６１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000212
配列番号：１６７
配列の長さ：８１６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000213
配列番号：１６８
配列の長さ：４９８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000214
配列番号：１６９
配列の長さ：２００７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000215
0004176146.tif 000216
配列番号：１７０
配列の長さ：２６０７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000217
0004176146.tif 000218
0004176146.tif 000219
配列番号：１７１
配列の長さ：１２８８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000220
配列番号：１７２
配列の長さ：１６５０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000221
配列番号：１７３
配列の長さ：６３０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000222
配列番号：１７４
配列の長さ：１４４０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000223
配列番号：１７５
配列の長さ：６６０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000224
配列番号：１７６
配列の長さ：１５６９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000225
配列番号：１７７
配列の長さ：１４６７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列
0004176146.tif 000226