(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−ロイシル−ｐ−ニトロアニリド、非イオン界面活性剤及び緩衝液を含有するロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用試薬を用いた測定方法であって、
検体に前記試薬を添加し終えた状態の非イオン界面活性剤の最終濃度が０．００５〜０．０１ｗ／ｖ％
であることを特徴とするロイシンアミノペプチダーゼ活性測定方法。
【請求項２】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン数=21）、ポリオキシエチレンドデシルエーテル（オキシエチレン数=23）、またはTriton X-100（登録商標）である請求項１記載のロイシンアミノペプチダーゼ活性測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は血清中の乳ビの影響を受けることなく、さらに溶血ヘモグロビンの影響も回避できるロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清中のロイシンアミノペプチダーゼ（以下、LAP と略する）は、ペプチドのＮ末端からロイシンを遊離させる酵素であり、各種閉鎖性黄疸、胆道癌、肝実質障害などに現れ、これらの疾患の診断に重要な要素の一つとして、従来から種々の測定法により測定されてきた。
LAP の測定法としては、基質として、Ｌ−ロイシル−ｐ−ニトロアニリドなどを用いる測定法が汎用されてきた。これらの酵素基質がLAP の作用により解離する発色化合物、すなわちｐ−ニトロアニリンは、通常、波長が400 〜450nm の吸光度を有する。この範囲の波長にて吸光度測定を行うと、血清中の乳ビにより、その測定結果が影響されることがしばしば生じる。
【０００３】
従来から吸光度により酵素活性を測定する試薬には、通常、試薬の溶解性または反応溶液の混濁を防止するために、界面活性剤が使用されている。しかしながら、時には予期しない測定干渉や妨害をもたらすことがよく見られる。それ故、臨床診断薬として使用される試薬には、安価でしかもタンパク質の変性を生じない非イオン界面活性剤を使用することが行われている。しかしながら、非イオン界面活性剤を通常の濃度範囲、0.02〜1.0w/v％の濃度で使用すると、自動酸化による劣化が生じて、測定値に影響を及ぼすことが経験されている。
【０００４】
さらに、非イオン界面活性剤を400 〜450nm の領域で吸光度測定を行う測定系では、非イオン界面活性剤の添加濃度が増加するにつれ、血清中に存在する溶血ヘモグロビンの負の影響を増大させることが問題となっている。
【０００５】
溶血ヘモグロビンの影響を回避するために、カチオン系界面活性剤または両性界面活性剤を使用することが公知である（特公平8-78号公報）。しかしながら、これらの界面活性剤を使用すると、反応中に存在するタンパク質の電荷がマイナスになっていると、該界面活性剤が結合して濁りを生じる。
【０００６】
また、界面活性剤の１種であるラウリル硫酸ソーダ、セチル硫酸ソーダ、ラウリルアミン酢酸塩、セチルアミン塩酸塩を使用することが公知である（特公平 3-58467号公報）。しかしながら、これらの界面活性剤を使用すると、やはり濁りを生じる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血清中の乳ビの影響を受けることなく、さらに溶血ヘモグロビンの影響も回避できるロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用試薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、種々検討したところ、非イオン界面活性剤を従来よりも少量添加することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は、ロイシンアミノペプチダーゼの作用により解離する発色化合物の吸光度が400 〜450nm である基質、最終濃度が0.005 〜0.01％w/v である非イオン界面活性剤および緩衝液を含有することを特徴とするロイシンアミノペプチダーゼ活性測定用試薬である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の基質は、LAP の作用により解離する発色化合物が、400 〜450nm の吸光度を有する化合物であり、例えばＬ−ロイシル−ｐ−ニトロアニリドである。
該化合物から解離されるｐ−ニトロアニリンは、特にLAP の測定において、負の結果を奏する程度が大きい。
【００１１】
本発明において使用する非イオン界面活性剤とは、親水性部分と疎水性部分を有し、親水性部分に糖またはポリオキシエチレン鎖を有する化合物である。糖鎖としてはグルコシド、チオグルコシドあるいはそれらの類似体がある。ポリオキシエチレン鎖としてはポリオキシエチレン系、フェニルポリオキシエチレン系、ポリオキシエチレンソルビタンエステル系などがある。
疎水性部分（基）としては、デシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、セチル、ステアリル、オレイル、セチル−ステアリル、ヘプチル、デカノイルなどのアルキル基、ｐ−オクチルフェニル、ｐ−イソオクチルフェニル、ｐ−ノニルフェニルなどのアルキルフェニル基などがある。
【００１２】
具体的には、オクチルグリコシド、ヘプチルグリコシド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ポリオキシエチレンデシルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘプタメチルへキシルエーテル、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ｐ−ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−モノラウリン酸ソルビタンなどが例示される。これらの中でも、HLB 値が12〜19である非イオン界面活性剤、特にポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン数=21 、HLB=19.0、商品名BL-21 ）、ポリオキシエチレンドデシルエーテル（オキシエチレン数=23 、HLB=15.3、商品名 Brij 35）、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（オキシエチレン数=9,10 、HLB=13.5、商品名Triton X-100）が好ましい。
【００１３】
本発明では上記非イオン界面活性剤の濃度は、試薬中、0.005 〜0.01w/v ％（最終濃度）であることが必要である。0.005w/v％未満であると、乳ビ等の疎水性物質の影響を受け、血清中で濁りを生じる危険性があり、0.01w/v ％を越えると、検体中に存在する溶血ヘモグロビンの影響が増大する危険性がある。
【００１４】
本発明の試薬は、緩衝液、例えばトリス緩衝液及び基質、例えばＬ−ロイシル−ｐ−ニトロアニリドを含む。トリス緩衝液の最終濃度は50〜100mM 、基質の最終濃度は 2〜10mMであることが好ましい。また、該試薬は液状試薬であることが好ましい。該試薬は１液系であっても、また２液系であってもよい。２試薬系では、第１試薬として非イオン界面活性剤を含む緩衝液を血清に添加してから、第２試薬として基質を含む水溶液を添加する。
【００１５】
本発明の試薬を用いて、血清中のLAP を測定するには、通常、検体、例えば血清に試薬を添加してから、37℃において、予備加温後、単位時間当たり、400 〜450nm の吸光度測定を行う。測定方法はレート法であることが好ましい。レート法とは、基質から解離した発色化合物の400 〜450nm 域での吸光度の経時的な変化（増加速度）を求め、その測定結果からLAP 活性値を算出する方法である。酵素活性１IU／l とは１分間に１μmol ／l の反応を触媒する酵素量と定義されており、吸光度（Ｅ）の経時的変化から酵素活性を求めるためには、吸光度の経時的変化（△Ｅ）から１分間当たりの吸光度変化（△Ｅ／分）を算出し、さらに次式に代入して酵素活性（IU／l ）とする。
【００１６】
0004129704.tif 000002
【００１７】
RV：測定に使用した試薬（溶液）の液量
SV：測定に使用した試料の液量
ε：吸光度を測定する物質の吸光係数
【００１８】
使用する酵素基質は、検体としての血清の条件、使用する基質の種類、その他の使用条件下における種々の要素により、適宜任意の至適濃度を決定すればよく、特に限定されることはない。好ましくは 2〜10mMである。
本発明の試薬の調製および該試薬を用いて酵素活性の測定法については、従来の慣用技術に従う。
【００１９】
【実施例】
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例１
下記試薬を調製した。
0004129704.tif 000003
【００２０】
検体は以下の方法により調製した。
（ａ）溶血ヘモグロビン濃度が異なる血清試料
管理血清Moni-Trol IX（国際試薬製）の血清９容と、ヘモグロビンを含まない水溶液または調製した溶血ヘモグロビン（干渉チェック：国際試薬製）の濃度が0 、1000、2000、3000、4000、5000mg／dlの水溶液をそれぞれ１容混合して、溶血ヘモグロビン濃度がそれぞれ、0 、100 、200 、300 、400 、500mg ／dlである血清試料を調製した。
（ｂ）イントラファット濃度が異なる血清試料
管理血清Moni-Trol IX（国際試薬製）の血清９容と、イントラファット（武田薬品製）を含まない水溶液または調製したイントラファット濃度が0 、20、40、60、80、100 ％の水溶液をそれぞれ１容混合して、イントラファット濃度がそれぞれ、0 、2 、4 、6 、8 、10％である血清試料を調製した。
【００２１】
測定操作は、以下の通りである。
検体８μl に第１試薬 250μl を加え、37℃で５分間予備加温した後、第２試薬 125μl を添加し、２分間撹拌した。次いで405nm （主波長）及び700nm （副波長）における単位時間あたりの吸光度の増加速度を測定した。LAP 活性値が既知である酵素溶液の吸光度増加速度を元に、各血清中の酵素活性を決定した。測定装置は自動分析装置（日立7150）を使用した。
【００２２】
上記試薬を用いて、上記検体中のLAP 活性を上記操作に従い、測定した結果を表１及び表２に示す。なお、表中の非イオン界面活性剤の濃度は第１試薬と第２試薬を添加し終えた状態の最終濃度である。
【００２３】
【表１】
0004129704.tif 000004
【００２４】
【表２】
0004129704.tif 000005
【００２５】
表１及び表２の結果を図１に示す。図１から明らかなように、BL-21 の濃度が、0.005 ％及び0.01％である試薬では、乳ビの影響を回避でき、さらに溶血ヘモグロビンの影響を回避することができる。BL-21 の濃度が0.1 ％であると、乳ビの影響を回避できても、溶血ヘモグロビンの影響を受ける。また、BL-21 を使用しないと乳ビの影響を受ける
【００２６】
実施例２
実施例１におけるBL-21 に代えて、 Brij 35（ポリオキシエチレンドデシルエーテル、オキシエチレン数=23 、HLB 値=15.3 ）を使用し、同様にしてLAP を測定した。その結果を表３及び表４に示す。なお、表中の非イオン界面活性剤の濃度は第１試薬と第２試薬を添加し終えた状態の最終濃度である。
【００２７】
【表３】
0004129704.tif 000006
【００２８】
【表４】
0004129704.tif 000007
【００２９】
また、表３及び表４の結果を図２に示す。図２から明らかなように、 Brij 35の濃度が、0.005 ％および0.01％である試薬では、乳ビの影響を回避でき、さらに溶血ヘモグロビンの影響を回避することができる。 Brij 35の濃度が0.1 ％であると、乳ビの影響を回避できても、溶血ヘモグロビンの影響を受ける。またBrij 35 を使用しないと乳ビの影響を受ける。
【００３０】
実施例３
実施例１におけるBL-21 に代えて、Triton X-100（ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、オキシエチレン数=9,10 、HLB 値=13.5 ）を使用し、同様にしてLAP を測定した。その結果を表５及び表６に示す。なお、表中の非イオン界面活性剤の濃度は第１試薬と第２試薬を添加し終えた状態の最終濃度である。
【００３１】
【表５】
0004129704.tif 000008
【００３２】
【表６】
0004129704.tif 000009
【００３３】
また、表５及び表６の結果を図３に示す。図３から明らかなように、Triton X-100の濃度が、0.005 ％および0.01％である試薬では、乳ビの影響を回避でき、さらに溶血ヘモグロビンの影響を回避することができる。Triton X-100の濃度が0.1 ％であると、乳ビの影響を回避できても、溶血ヘモグロビンの影響を受ける。またTriton X-100を使用しないと乳ビの影響を受ける。
【００３４】
【発明の効果】
本発明では非イオン界面活性剤の濃度を従来よりも少量、0.005 〜0.01w/v ％（最終濃度）使用することにより、乳ビの影響を回避でき、さらに溶血ヘモグロビンの影響を回避することができる。したがって検体が高脂血清であっても、正確にLAP を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  BL-21 の濃度増加による溶血ヘモグロビン及び乳ビの影響を示すグラフである。
【図２】  Brij 35 の濃度増加による溶血ヘモグロビン及び乳ビの影響を示すグラフである。
【図３】  Triton X-100の濃度増加による溶血ヘモグロビン及び乳ビの影響を示すグラフである。
【図１】
0004129704.tif 000010
【図２】
0004129704.tif 000011
【図３】
0004129704.tif 000012