(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子；
（ａ）配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗浄剤配合用酵素として有用な新規アルカリプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プロテアーゼは、工業用酵素として最も生産量が多く、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化補助剤あるいは消炎剤といった様々な用途、分野で利用されている。中でも洗剤用のアルカリプロテアーゼは、洗浄力の向上に不可欠な一成分として特に重要な役割を果たしている。
【０００３】
現在用いられている洗剤用アルカリプロテアーゼには、サビナーゼ、カンナーゼ、デュラザイム（ノボザイム）、マキサカル（ジェネンコア）、ブラップ（ヘンケル）及びＫＡＰ（花王）等があるが、これらはいずれもバチルス属細菌由来のものであり、ズブチリシンファミリーに属している（Class I−Ｓ２に分類：Siezenら, Protein Eng., 4, 719-737, 1991）。また、真性ズブチリシンとしては、ズブチリシンBPN’やCarlsbergなどが良く知られている（Class I−Ｓ１に分類）。
【０００４】
しかしながら、これらのアルカリプロテアーゼは、アルカリ耐性、界面活性剤耐性、酸化剤耐性、低温活性、耐熱性、洗浄性、低い基質特異性、キレート剤耐性、金属イオン耐性等において一長一短のあるものであり、洗浄用酵素としてより優れた性質を有するプロテアーゼが求められていた。
【０００５】
本発明は、従来のズブチリシンとはアミノ酸配列において相同性が低く、且つ有用な上記の性質を１以上有する、例えば界面活性剤に対する安定性に優れ、酸化剤存在下でも充分な機能を発揮するような性質を有する新規なアルカリプロテアーゼ並びにこれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、土壌中の微生物が産生する酵素について、種々検討したところ、界面活性剤に対する安定性が優れ、且つ酸化剤存在下でも充分な機能を発揮する新規なアルカリプロテアーゼ及びこれをコードする遺伝子を見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、
当該タンパク質をコード遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質（以下、「アルカリプロテアーゼ」ともいう）は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、本発明の遺伝子は、当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【０００９】
ここで、（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてアルカリプロテアーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
尚、当該等価のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡに、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法（例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[Mutan-super Express Km キット（Takara）]等を用いた変異導入手法）を利用して得られるＤＮＡを用いることにより調製することができる。
【００１０】
本発明の配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列と公知のアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列を比較した場合、成熟型アルカリプロテアーゼ部分（配列番号１の９８〜３７５番目に相当）のアミノ酸配列において、ズブチリシンBPN’と５８．７％、ズブチリシンCarlsbergとは５９．４％の相同性を示すにすぎない。さらに洗剤用酵素として用いられているサビナ−ゼとは５９．７％、エスペラーゼとは５６．３％、ＫＡＰ（Ｍ−プロテアーゼ）とは６０．１％の相同性を示すにすぎず、さらに他の公知のプロテアーゼとの相同性は非常に低い。また、プレプロ配列部分（配列番号１の１〜９７番目に相当）においては、２３％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有する公知のアルカリプロテアーゼは見当たらない。以上のことは、本発明のタンパク質は新規なアルカリプロテアーゼであることを示唆するものであり、従って、配列番号１の９８〜３７５番目のアミノ酸配列に相当する配列を適切にアライメントした場合に、最大６５％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼは本発明に包含され、７０％以上、更に８０％以上の相同性を有するものであるのが好ましい。
尚、ここでいう相同性の検索はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ(ソフトウェア開発)のサーチホモロジ−プログラムを用いて算出できる。
【００１１】
本発明の遺伝子は、上記の通り、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであればよいが、（ａ）配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子が好ましく、（ｂ）においては、特に配列番号２の２９２〜１２１５番目の塩基配列で示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものが好ましい。
【００１２】
ここで「ストリンジエントな条件下」とは、例えば「Molecular cloning - a Laboratory manual 2nd edition」(Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１３】
本発明のタンパク質であるアルカリプロテアーゼは、例えば下記の菌学的性質を有するバチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＬＤ１株の培養液から採取することにより生産することができるが、該アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いることにより大量に生産することができる。
【００１４】
Ａ．形態学的性質
（ａ）細胞の形及び大きさ      ：桿菌（０．７×２〜３．０μｍ）
（ｂ）細胞の多形性            ：なし
（ｃ）運動性                  ：なし
（ｄ）胞子                    ：有（０．６〜０．７×１．０〜１．２μｍ）
（ｅ）グラム染色              ：不定
【００１５】
Ｂ．各種培地での生育状態
（ａ）肉汁寒天培地での生育状態    ：円形、低凸状、全縁なめらかなコロニーを形成する。コロニーの表面は無光沢。クリーム色
（ｂ）肉汁液体培養                ：混濁する
（ｃ）肉汁ゼラチン穿刺培養        ：生育良好で液化する
（ｄ）リトマスミルク              ：生育しない
（ｅ）卵黄培地                    ：生育しない
（ｆ）チロシン寒天培地            ：生育しない
【００１６】
Ｃ．生理的性質
（ａ）硝酸塩の還元                ：陰性
（ｂ）ＭＲテスト                  ：陰性
（ｃ）ＶＰテスト                  ：陽性
（ｄ）硫化水素の生成              ：陰性
（ｅ）インドールの産生            ：陰性
（ｆ）澱粉の加水分解              ：陽性
（ｇ）クエン酸の利用              ：利用しない
（ｈ）ウレアーゼ                  ：陰性
（ｉ）オキシダーゼ                ：陽性
（ｊ）β−ガラクトシダーゼ        ：陽性
（ｋ）アルギニンヒドラーゼ        ：陰性
（ｌ）リシンデカルボキシラーゼ    ：陰性
（ｍ）オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性
（ｎ）トリプトファンデアミナーゼ  ：陰性
（ｏ）ゼラチナーゼ                ：陽性
（ｐ）カタラーゼ                  ：陽性
（ｑ）生育の温度範囲              ：５〜４０℃で生育可能
（ｒ）生育のpH範囲                ：pH７〜１０で生育良好
（ｓ）嫌気培養                    ：嫌気的条件で生育不能
（ｔ）糖類からの酸の生成（＋；生成する−；生成しない）
グリセロール                ：−
エリスリトール              ：−
Ｄ−アラビノース            ：−
Ｌ−アラビノース            ：−
リボース                    ：−
Ｄ−キシロース              ：−
Ｌ−キシロース              ：−
アドニトール                ：−
β−メチル−Ｄ−キシロース  ：−
ガラクトース                ：−
グルコース                  ：＋
フラクトース                ：＋
マンノース                  ：＋
ソルボース                  ：−
ラムノース                  ：−
ズノシトール                ：−
イノシトール                ：−
マンニトール                ：＋
ソルビトール                ：−
α−メチル−Ｄ−マンノース  ：−
α−メチル−Ｄ−グルコース  ：−
Ｎ−アセチルグリコサミン    ：−
アミグダリン                ：−
アルブチン                  ：−
エスクリン                  ：＋
サリシン                    ：＋
セロビオース                ：＋
マルトース                  ：＋
乳糖                        ：−
メリビオース                ：−
白糖                        ：＋
トレハロース                ：＋
イヌリン                    ：−
メレチトース                ：−
ラフィノース                ：−
澱粉                        ：＋
グリコーゲン                ：＋
キシリトール                ：−
ゲンチオビオース            ：−
Ｄ−ツラノース              ：−
Ｄ−リキソース              ：−
Ｄ−タガトース              ：−
Ｄ−フコース                ：−
Ｌ−フコース                ：−
Ｄ−アラビトール            ：−
Ｌ−アラビトール            ：−
グルコネート                ：−
２−ケトグルコン酸          ：−
５−ケトグルコン酸          ：＋
【００１７】
上記ＫＳＭ−ＬＤ１株は、その形態学及び生理学的性質について、「Bergey’ s Manual of Systematic Bacteriology」(Williams & Wilkins社、1984年)の記載に順じ検討したところ、バチルス属に属させることが妥当であるが、種については、既知のバチルス属の種の諸性質とは完全に一致しないため、新規な微生物として、本菌株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにバチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＬＤ１（Bacillus sp.KSM-LD1；ＦＥＲＭ  １８５７６）として寄託した。
【００１８】
本発明の遺伝子は、上述したアルカリプロテアーゼ産生菌、例えばBacillus属に属する微生物、好ましくはBacillus sp. KSM-LD1株(FERM 18576)等から、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いることよりクローニングすることができる。
【００１９】
本発明遺伝子を用いてアルカリプロテアーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリプロテアーゼ遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリプロテアーゼを採取すればよい。
培養は微生物が資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００２０】
かくして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００２１】
本発明のアルカリプロテアーゼの特徴としては、次のような性質が好ましい。即ち、分子量２９,０００±１，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、最適反応ｐＨを１０付近（ホウ酸緩衝液）、最適温度を６０℃〜７０℃に有し、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（ＬＡＳ）１．０％を含有する溶液中（pH１０．５）、５５℃で３０分間保存しても少なくとも５０％の活性が残存する。また、５００mmol／Ｌの過酸化水素水溶液中（pH１０．５）、３０℃で３０分間保存しても少なくとも３０％の活性が残存するという特徴を有するものである。Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｇ１＋イオンにより活性は阻害されないが、Ｈｇ２＋イオンでは活性が阻害される。
【００２２】
【実施例】
実施例１  アルカリプロテアーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌サンプル１ｇを生理食塩水（１０mL）に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理を行った後、以下に示した組成を有するプロテアーゼ生産菌液体集積培地へ接種し、２０℃で培養を行った。３回程度同培地で植え継ぎ集積を行った後、以下に示した組成を有するプロテアーゼ生産判定プレートに塗抹し、２０℃で５〜７日間培養した。生育した集落の周囲にスキムミルクの分解によって生じた透明帯を指標としてプロテアーゼ生産菌を分離した。その結果、アルカリプロテアーゼ生産菌としてBacillus sp. KSM-LD1株を得た。
【００２３】
【表１】
0004179797.tif 000002
【００２４】
実施例２  菌の培養法及びプロテアーゼの調製法
プロテアーゼ活性画分の調製は、実施例１で得られたBacillus sp. KSM-LD1株を３％ポリペプトンＳ(日本製薬)、０．５％酵母エキス、１％魚肉エキス（和光純薬）、０．１５％リン酸二カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水和物、マルトース４％（別滅菌）、炭酸ナトリウム０．５％（別滅菌）から成る培地に植菌し、３０℃で６０時間好気的に振盪培養を行った。得られた培養上清に９０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、タンパク質を塩析した。塩析で得られたサンプルを５mMの塩化カルシウムを含有する１０mMのトリス塩酸緩衝液（pH７．５）に溶解した後、同緩衝液にて一晩透析を行った。透析膜中の酵素液を５mMの塩化カルシウムを含有する１０mMのトリス塩酸緩衝液（pH７．５）で平衡化したＣＭ  Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ（バイオラッド）に添着し、非吸着のプロテアーゼ活性画分を回収した。更に活性画分を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ  Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ（バイオラッド）にアプライし、０〜５０mMの塩化ナトリウム溶液で溶出し、プロテアーゼ活性画分を得た。更にこの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、ほぼ均一な分子量約２９，０００のタンパク質としてプロテアーゼが得られていることを確認した。タンパク質濃度の測定はbovine serum albumin（バイオラッド）をスタンダードとして用いてＬｏｗｒｙら（J. Biol. Chem.,193,265-275,1989）の方法で行った。
【００２５】
実施例３  ＫＳＭ−ＬＤ１アルカリプロテアーゼの酵素学的性質
実施例２で得られた精製アルカリプロテアーゼの活性測定法は以下の２方法により行った。
（ａ）カゼイン法
１％（ｗ／ｖ）カゼイン（ハマーステイン：メルク社製）を含む５０mmol／Ｌ緩衝液１mLを３０℃で５分間保温した後、０．１mLの酵素溶液を添加し、３０℃で１５分間反応を行った。ＴＣＡ溶液（０．１１mol／Ｌトリクロロ酢酸：０．２２mol／Ｌ酢酸ナトリウム：０．３３mol／Ｌ酢酸）２mLを添加して反応を停止し、室温で１０分間放置した後、変性タンパク質を濾過（Ｎｏ．２濾紙：ホワットマン社製）した。濾液０．５mLにアルカリ性銅試薬[.１％（ｗ／ｖ）]酒石酸カリウム・ナトリウム：１％（ｗ／ｖ）硫酸銅：２％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウム、０．１mol／Ｌ水酸化ナトリウム＝１：１：１００（ｖ／ｖ）]２．５mLを添加し、３０℃、１０分間恒温した後、希釈フェノール試薬（フェノール試薬（関東化学社製）を脱イオン水で２倍希釈したもの）０．２５mLを加え、３０℃、３０分間恒温した後、６６０nmにおける吸光度を測定した。上記の酵素反応系に反応停止液を混合した後、酵素溶液を加えた系をブランクとした。酵素１単位（ＰＵ）は、上記の反応条件において１分間に１mmolのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離する酵素量とした。
【００２６】
（ｂ）合成基質法
０．９mLの１００mmol／Ｌホウ酸緩衝液（pH１０．０，２mmol／Ｌ塩化カルシウム含有）に５０mmol／Ｌ合成基質溶液（サクシニル−アラニル−アラニル−フェニル−ロイシン・パラニトロアニライド（Ｇｌｔ−ＡＡＰＬ−ｐＮＡ）をジメチルスルホキサイドに溶解）０．０５mLを混合し、３０℃で５分間恒温した後、０．０５mLの酵素溶液を加え、３０℃、１０分間反応を行った。５％（ｗ／ｖ）クエン酸溶液２mLを添加して反応を停止させ、４２０nmにおける吸光度を測定した。酵素１単位（Ｕ）は、上記の反応条件において１分間に１μmolのｐ−ニトロアニリンを遊離させるのに必要な酵素量とした。
【００２７】
（１）最適反応ｐＨ
基質として１％カゼインを含む各種緩衝液中（pH７〜１２）で３０℃、１５分間反応させ、酵素活性を測定した。本発明のプロテアーゼは、５０mmol／Ｌホウ酸緩衝液（pH１０．０）において最も高い活性を示した。
【００２８】
（２）ｐＨ安定性
２０mmol／Ｌのブリットン・ロビンソン緩衝液中（pH４〜１３）に酵素溶液を混合し、４０℃、３０分間の処理を行った。この処理液を氷冷後、カゼイン法により残存活性を測定した。  その結果、本発明のプロテアーゼは、４０℃、３０分間の処理ではpH５〜１２の広範囲で安定であった。また、塩化カルシウム（５mmol／Ｌ）の添加によって、ｐＨ安定性は殆ど影響を受けなかった。
【００２９】
（３）最適温度
５０mmol／Ｌホウ酸緩衝液（pH１０．０）１mL中に、酵素溶液０．１mLを添加し、３０〜８０℃までの各温度でカゼイン法により活性測定を行った。本発明プロテアーゼの最適温度は６０℃であった。
【００３０】
（４）耐熱性
５０mmol／Ｌホウ酸緩衝液（pH１０．０）中、酵素溶液を加え、各温度で１５分間熱処理を行った後、氷水中で急冷した。残存活性をカゼイン法にて測定した結果、本発明のプロテアーゼは、７０℃まで安定であった。
【００３１】
（５）金属イオンの影響
各金属塩（１mmol／Ｌ）を含む２０mmol／Ｌホウ酸緩衝液（pH１０．０）中に酵素溶液を添加し、３０℃、２０分間の処理を行った。その後、カゼイン法により活性測定を行った。その結果、本発明のプロテアーゼは、Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｇ１＋イオンに対しては非常に安定であったが、Ｈｇ２＋イオンにより強い阻害が認められた（残存活性２０％）。
【００３２】
（６）酸化剤（過酸化水素）の影響
５００mmol／Ｌ過酸化水素及び２mmol／Ｌ塩化カルシウムを含む１５０mmol／Ｌブリットン・ロビンソン緩衝液（pH１０．５）に酵素溶液を添加し、３０℃、３０分間恒温した。その後、過剰の過酸化水素をカタラーゼにより除去し、合成基質法を用いて残存活性を測定した。その結果、上記保存条件下において少なくとも３０％の活性が残存した。
【００３３】
（７）界面活性剤の影響
１％直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）を含む１００mmol／Ｌトリス−塩酸緩衝液（pH９．０）に酵素を添加し、５５℃、３０分の処理を行った。２mmol／Ｌ塩化カルシウムを含む５０mmol／Ｌホウ酸緩衝液（ｐH１０．０）により適当に希釈した処理液を用いて残存活性を測定した。その結果、本発明のプロテアーゼは、１％ＬＡＳ存在下５５℃、３０分処理をしても約５０％の残存活性を示した。
【００３４】
実施例４  ＫＳＭ−ＬＤ１アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の決定
実施例２で精製されたアルカリプロテアーゼをメタノールで処理したProsorb filter (パーキンエルマー)に吸着させ、アミノ酸シークエンサー（４７６Ａ型、アプライドバイオシステムズ）にてアミノ末端からのアミノ酸配列を決定した。その結果、アルカリプロテアーゼのアミノ末端からのアミノ酸配列はＡｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓであった。
【００３５】
実施例５  遺伝子のクローニング及び塩基配列の決定
実施例４にて得られたアルカリプロテアーゼのアミノ末端からのアミノ酸配列をもとに、プライマー１（配列番号３：５’−ＧＣＮＣＡＲＡＣＮＧＴＮＣＣＮＴＧＧＧＧＮＧＴＮＣ−３’）及びプライマー２（配列番号４：５’−ＣＮＣＡＹＧＴＮＣＡＲＧＧＮＡＣＮＧＡＹＧＣＮＣ−３’）を合成した。Bacillus sp. KSM-LD1株から斎藤と三浦の方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629, 1963）に準じ、ゲノムＤＮＡを調製し、HindIIIで部分分解を行った。ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｏｎｉｎｇ キット（Takara）中のHindIII カセットに上記HindIII分解断片を連結させ、プライマー１と付属のプライマーＣ１にてＰＣＲを行なった。ＰＣＲの反応条件はカセットに連結されたＤＮＡ断片０．１〜１．０ｎｇを鋳型にプライマー１０〜２０ｐｍｏｌを用い、５０μL反応系にて９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で４分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。その後、増幅ＤＮＡ断片を鋳型にプライマー２と付属のプライマーＣ２でＰＣＲを行ない増幅させた。反応条件は得られた増幅ＤＮＡ断片を１００００倍希釈したもの１μL、１０〜２０ｐｍｏｌのプライマーを用い、５０μL反応系で９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。増幅した断片の塩基配列をBigDye  Terminator  Cycle  Sequencingキット（パーキンエルマー）及びDNAシークエンサー（377型：アプライドバイオシステムズ）を用いて決定した。得られた塩基配列を基に上流及び下流方向の塩基配列決定に適したプライマーを合成し、先に調製したHindIIIカセットを鋳型にＰＣＲを行ない塩基配列を決定した。
【００３６】
実施例６  枯草菌形質転換体によるＫＳＭ−ＬＤ１アルカリプロテアーゼの生産実施例５にて決定したアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子をプライマー３（配列番号５：５’−ＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＴＡＡＴＴＡＧＡＧＴＡＴＡＣＴＴＧ−３、下線部は新たに付加したBglIIサイトを示す）、プライマー４（配列番号６：５’−ＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＡＣＴＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＡＴＴＴＣ−３、下線部は新たに付加したXbaIサイトを示す）各２０ｐｍｏｌを用い、０．１〜１．０ｎｇのBacillus sp. KSM-LD1株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ増幅断片をHigh Pure PCR Product Purification キット（ロッシュ）にて精製し、BglII、XbaIにて分解した後、同様に処理したベクターｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 2172-2175, 1995）に結合し、組換えプラスミドを調製した。これを用いてプロトプラスト法によりB.subtilisISW1214株を形質転換した。得られた形質転換株を３％(w/v)ポリペプトンＳ、０．５％魚肉エキス、０．１％酵母エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、３％マルトース(別滅菌)から成る培地にて３０℃、７２時間好気的に振盪培養を行なった。培養液当たりの生産量は２０−３０ＰＵ／Ｌであった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明のタンパク質であるアルカリプロテアーゼは、界面活性剤に対する安定性に優れ、酸化剤存在下でも充分な機能を発揮するような性質を有することから液体洗浄剤や酸化剤成分を含有する食器洗浄機用洗剤及び衣料用洗浄剤用の酵素として有用である。
【００３８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明プロテアーゼのpHプロファイルを示す図である。
【図２】本発明プロテアーゼの温度プロファイルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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