(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程(a)を含んでなる、冠動脈形成術後再狭窄のリスク検査方法、
(a)核酸試料における、以下の(1)〜(3)の多型を解析する工程、
(1)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の塩基番号-668位（配列番号１４の塩基配列において131番目の塩基）の多型、
(2)アポリポプロテインC-III遺伝子の塩基番号-482位（配列番号５の塩基配列において936番目の塩基）の多型、
(3)パラオキソナーゼ遺伝子の塩基番号584位（配列番号１５の塩基配列において584番目の塩基）の多型。
【請求項２】
以下の工程(i)〜(iii)を含んでなる、冠動脈形成術後再狭窄のリスク検査方法、
(i)核酸試料における、以下の(1)〜(3)の多型を解析する工程、
(1)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の塩基番号-668位（配列番号１４の塩基配列において131番目の塩基）の多型、
(2)アポリポプロテインC-III遺伝子の塩基番号-482位（配列番号５の塩基配列において936番目の塩基）の多型、
(3)パラオキソナーゼ遺伝子の塩基番号584位（配列番号１５の塩基配列において584番目の塩基）の多型、
(ii)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び
(iii)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求める工程。
【請求項３】
以下の(1)〜(3)の核酸を含んでなる冠動脈形成術後再狭窄のリスク検査用キット、
(1)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の塩基番号-668位（配列番号１４の塩基配列において131番目の塩基）の多型を解析するための核酸であって、多型部位を含む一定領域に相補的な配列を含み、前記領域に対して特異的にハイブリダイズする核酸、
(2)アポリポプロテインC-III遺伝子の塩基番号-482位（配列番号５の塩基配列において936番目の塩基）の多型を解析するための核酸であって、多型部位を含む一定領域に相補的な配列を含み、前記領域に対して特異的にハイブリダイズする核酸、
(3)パラオキソナーゼ遺伝子の塩基番号584位（配列番号１５の塩基配列において584番目の塩基）の多型を解析するための核酸であって、多型部位を含む一定領域に相補的な配列を含み、前記領域に対して特異的にハイブリダイズする核酸。
【請求項４】
以下の(1)〜(3)の核酸が不溶性支持体に固定されてなる冠動脈形成術後再狭窄のリスク検査用固定化核酸、
(1)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の塩基番号-668位（配列番号１４の塩基配列において131番目の塩基）の多型を解析するための核酸であって、多型部位を含む一定領域に相補的な配列を含み、前記領域に対して特異的にハイブリダイズする核酸、
(2)アポリポプロテインC-III遺伝子の塩基番号-482位（配列番号５の塩基配列において936番目の塩基）の多型を解析するための核酸であって、多型部位を含む一定領域に相補的な配列を含み、前記領域に対して特異的にハイブリダイズする核酸、
(3)パラオキソナーゼ遺伝子の塩基番号584位（配列番号１５の塩基配列において584番目の塩基）の多型を解析するための核酸であって、多型部位を含む一定領域に相補的な配列を含み、前記領域に対して特異的にハイブリダイズする核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は冠動脈形成術後の再狭窄に関連する遺伝子を利用した検出方法に関する。詳しくは冠動脈形成術後の再狭窄に関連する複数の遺伝子の多型を利用した検出方法及び該方法に用いられるキットに関する。冠動脈形成術後の再狭窄のリスク診断として本発明を利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
冠動脈形成術は冠動脈疾患の治療として広く行われているが、再狭窄が大きな問題である（McBride W, Lange RA, Hillis LD. Restenosis after successful coronary angioplasty. Pathophysiology and prevention. N Engl J Med 1998;318:1734-7.）。冠動脈内ステントの使用により再狭窄の頻度は減少したが、依然として10-20%の再狭窄が認められる（Serruys PW, de Jaegere P, Kiemeneij F, et al. A comparison of balloon-expandable-stent implantation with balloon angioplasty in patients with coronary artery disease. Benestent Study Group. N Engl J Med 1994;331:489-95.）。高血圧・糖尿病・高脂血症・不安定狭心症・高度冠動脈狭窄および長い狭窄病変などの多くの臨床所見・血管造影所見が冠動脈形成術後再狭窄のリスクを増加させることが報告されてきたが（Hirshfeld JW Jr, Schwartz JS, Jugo R, et al. Restenosis after coronary angioplasty: a multivariate statistical model to relate lesion and procedure variables to restenosis. The M-HEART Investigators. J Am Coll Cardiol 1991;18:647-56.; Weintraub WS, Kosinski AS, Brown CL 3rd, King SB 3rd. Can restenosis after coronary angioplasty be predicted from clinical variables? J Am Coll Cardiol 1993;21:6-14.; Stein B, Weintraub WS, Gebhart SP, et al. Influence of diabetes mellitus on early and late outcome after percutaneous transluminal coronary angioplasty. Circulation 1995;91:979-89.; Violaris AG, Melkert R, Serruys PW. Long-term luminal renarrowing after successful elective coronary angioplasty of total occlusions. A quantitative angiographic analysis. Circulation 1995;91:2140-50.）、再狭窄の分子メカニズムは未だ不明である。ヒトの血管内超音波による研究から、バルーン拡張術では慢性リモデリング（血管収縮）が主要なメカニズムであり（Mintz GS, Popma JJ, Pichard AD, et al. Arterial remodeling after coronary angioplasty: a serial intravascular ultrasound study. Circulation 1996;94:35-43.）、ステント内再狭窄では新生内膜の肥厚が最も重要なメカニズムであることが報告された（Hoffmann R, Mintz GS, Dussaillant GR, et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation 1996;94:1247-54.）。冠動脈形成術後再狭窄を予防するための一つの方法は再狭窄感受性遺伝子を同定することである。 今までにゲノム疫学的研究によりアンギオテンシン変換酵素（Amant C, Bauters C, Bodart J-C, et al. D allele of the angiotensin I-converting enzyme is a major risk factor for restenosis after coronary stenting. Circulation 1997;96:56-60.; Ribichini F, Steffenino G, Dellavalle A, et al. Plasma activity and insertion/deletion polymorphism of angiotensin I-converting enzyme: a major risk factor and a marker of risk for coronary stent restenosis. Circulation 1998;97:147-154.）、アンギオテンシノーゲン（Volzke H, Hertwig S, Rettig R, Motz W. The angiotensinogen gene 235T variant is associated with an increased risk of restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty. Clin Sci 2000;99:19-25.）、アポリポタンパクE（van Bockxmeer FM, Mamotte CDS, Gibbons FR, Taylor RR. Apolipoprotein ε4 homozygosity-a determinant of restenosis after coronary angioplasty. Atherosclerosis 1994;110:195-202.）、血小板糖タンパクIIIa（Walter DH, Schachinger V, Elsner M, Dimmeler S, Zeiher AM. Platelet glycoprotein IIIa polymorphisms and risk of coronary stent thrombosis. Lancet 1997;350:1217-1219.）、ストロメライシン-1（Humphries S, Bauters C, Meirhaeghe A, Luong L, Bertrand M, Amouyel P. The 5A6A polymorphism in the promoter of the stromelysin-1 (MMP3) as a risk factor for restenosis. Eur Heart J 2002;23:721-725.）などの遺伝子多型とバルーン拡張術後再狭窄あるいはステント内再狭窄との関連が報告されているが、再狭窄感受性遺伝子は未だ十分に同定されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、今までに数多くの遺伝子多型と冠動脈形成術後再狭窄との関連解析が行われてきた。しかし多くの研究についてはその意義について一定の見解は得られていない。その主な理由は多くの研究においては対象集団の大きさが十分でないことと、遺伝子多型のみならず環境因子が人種間で異なっていることに起因する。さらに、たとえ再狭窄との関連が認められたとしても、大規模集団における解析では相対危険度（オッズ比）が低いのが一般的である。
本発明は以上の背景に鑑みなされたものであって、その目的は高精度で予知確率の高い冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを診断する手段を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、以上の目的を達成するために数種類の公的データベースを用いて冠動脈硬化、冠動脈攣縮、高血圧、糖尿病、高脂血症などとの関連が推定される71遺伝子を抜粋し、遺伝子の機能変化との関連が予想されるものなどを中心に112多型を選択した。続いて、この71遺伝子112多型に関して心筋梗塞との関連解析を心筋梗塞445例と対照464例について行い、男性で19個、女性で18個の一塩基多型（SNP：single nucleotide polymorphism）が心筋梗塞発症と関連することを見出したが（Yamada Y, Izawa H, Ichihara S, et al. Genetic risk diagnosis system for myocardial infarction developed by a large acale association study of 112 gene polymorphisms in 5061 individuals(in press).）、それらの多型群の中には冠動脈形成術後再狭窄の候補遺伝子も含まれていた。そこで、これらのSNPと冠動脈形成術後再狭窄との関連について大規模関連解析を行った。その結果、冠動脈形成術後再狭窄と関連するSNPを男性で10個、女性で7個同定することに成功した。更に、これらの多型を組み合わせて解析することにより、多因子ロジスティック回帰分析のstepwise forward selection methodによって、冠動脈形成術後再狭窄の最大オッズ比が、バルーン拡張術後再狭窄においては男性で15.09、女性で44.54を呈し、ステント内再狭窄では男性で6.64、女性で117.83を呈し、過去に報告された関連解析の中で最大のオッズ比を示した。この結果から、これらのSNPの中から複数のSNPを選択し、各SNPを解析した結果を組み合わせて用いれば、信頼性が高く、予知確率の高い冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断が行えるとの知見が得られた。本発明は以上の知見に基づくものであって、次の構成を提供する。
[１]   以下の工程(a)を含んでなる、核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
（a）核酸試料における、以下の(1)〜(6)からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
(1)アポリポプロテインE遺伝子の塩基番号3932位の多型、
(2)グリコプロテインIa遺伝子の塩基番号1648位の多型、
(3)腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号-863位の多型、
(4)G-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位の多型、
(5)アポリポプロテインC-III遺伝子の塩基番号-482位の多型、及び
(6)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号-6位の多型。
[２]  以下の工程(b)を含んでなる、核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
（b）核酸試料における、以下の(7)〜(11)からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
(7)トロンボスポンジン4遺伝子の塩基番号1186位の多型、
(8)腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号-863位の多型、
(9)トロンボモジュリン遺伝子の塩基番号2136位の多型、
(10)トロンボポイエチン遺伝子の塩基番号5713位の多型、及び
(11)血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号994位の多型。
[３]  以下の工程(c)を含んでなる、核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(c)核酸試料における、以下の(12)〜(17)からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
(12)E-セレクチン遺伝子の塩基番号561位の多型、
(13)脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の塩基番号2445位の多型、
(14)グリコプロテインIbα遺伝子の塩基番号1018位の多型、
(15)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の塩基番号-668位の多型、
(16)パラオキソナーゼ遺伝子の塩基番号584位の多型、及び
(17)アポリポプロテインE遺伝子の塩基番号3932位の多型。
[４]  以下の工程(d)を含んでなる、核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(d)核酸試料における、以下の(18)〜(22)からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
(18)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の塩基番号-668位の多型、
(19)アポリポプロテインC-III遺伝子の塩基番号-482位の多型、
(20)パラオキソナーゼ遺伝子の塩基番号584位の多型、
(21)グリコプロテインIbα遺伝子の塩基番号1018位の多型、及び
(22)アポリポプロテインE遺伝子の塩基番号3932位の多型。
[５]  以下の工程(i)〜(iii)を含んでなる、冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断方法、
(i)核酸試料における、以下の(1)〜(6)からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
(1)アポリポプロテインE遺伝子の塩基番号3932位の多型、
(2)グリコプロテインIa遺伝子の塩基番号1648位の多型、
(3)腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号-863位の多型、
(4)G-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位の多型、
(5)アポリポプロテインC-III遺伝子の塩基番号-482位の多型、及び
(6)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号-6位の多型。
(ii)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び
(iii)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求める工程。
[６]  以下の工程(iv)〜(vi)を含んでなる、冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断方法、
(iv)核酸試料における、以下の(7)〜(11)からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
(7)トロンボスポンジン4遺伝子の塩基番号1186位の多型、
(8)腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号-863位の多型、
(9)トロンボモジュリン遺伝子の塩基番号2136位の多型、
(10)トロンボポイエチン遺伝子の塩基番号5713位の多型、及び
(11)血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号994位の多型。
(v)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び
(vi)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求める工程。
[７]  以下の工程(vii)〜(ix)を含んでなる、冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断方法、
(vii)核酸試料における、以下の(12)〜(17)からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
(12)E-セレクチン遺伝子の塩基番号561位の多型、
(13)脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の塩基番号2445位の多型、
(14)グリコプロテインIbα遺伝子の塩基番号1018位の多型、
(15)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の塩基番号-668位の多型、
(16)パラオキソナーゼ遺伝子の塩基番号584位の多型、及び
(17)アポリポプロテインE遺伝子の塩基番号3932位の多型、
(viii)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び
(ix)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求める工程。
[８]  以下の工程(x)〜(xii)を含んでなる、冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断方法、
(x)核酸試料における、以下の(18)〜(22)からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程、
(18)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の塩基番号-668位の多型、
(19)アポリポプロテインC-III遺伝子の塩基番号-482位の多型、
(20)パラオキソナーゼ遺伝子の塩基番号584位の多型、
(21)グリコプロテインIbα遺伝子の塩基番号1018位の多型、及び
(22)アポリポプロテインE遺伝子の塩基番号3932位の多型、
(xi)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び
(xii)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求める工程。
[９]  以下の(1)〜(6)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
(1)アポリポプロテインE遺伝子の塩基番号3932位の多型を解析するための核酸、
(2)グリコプロテインIa遺伝子の塩基番号1648位の多型を解析するための核酸、
(3)腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号-863位の多型を解析するための核酸、
(4)G-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位の多型を解析するための核酸、
(5)アポリポプロテインC-III遺伝子の塩基番号-482位の多型を解析するための核酸、及び
(6)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号-6位の多型を解析するための核酸。
[１０]  以下の(7)〜(11)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
(7)トロンボスポンジン4遺伝子の塩基番号1186位の多型を解析するための核酸、
(8)腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号-863位の多型を解析するための核酸、
(9)トロンボモジュリン遺伝子の塩基番号2136位の多型を解析するための核酸、
(10)トロンボポイエチン遺伝子の塩基番号5713位の多型を解析するための核酸、及び
(11)血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号994位の多型を解析するための核酸。
[１１]  以下の(12)〜(17)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
(12)E-セレクチン遺伝子の塩基番号561位の多型を解析するための核酸、
(13)脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の塩基番号2445位の多型を解析するための核酸、
(14)グリコプロテインIbα遺伝子の塩基番号1018位の多型を解析するための核酸、
(15)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の塩基番号-668位の多型を解析するための核酸、
(16)パラオキソナーゼ遺伝子の塩基番号584位の多型を解析するための核酸、及び
(17)アポリポプロテインE遺伝子の塩基番号3932位の多型を解析するための核酸。
[１２]  以下の(18)〜(22)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
(18)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の塩基番号-668位の多型を解析するための核酸、
(19)アポリポプロテインC-III遺伝子の塩基番号-482位の多型を解析するための核酸、
(20)パラオキソナーゼ遺伝子の塩基番号584位の多型を解析するための核酸、
(21)グリコプロテインIbα遺伝子の塩基番号1018位の多型を解析するための核酸、及び
(22)アポリポプロテインE遺伝子の塩基番号3932位の多型を解析するための核酸。
[１３]  以下の(1)〜(7)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
(1)アポリポプロテインE遺伝子の塩基番号3932位の多型を解析するための核酸、
(2)グリコプロテインIa遺伝子の塩基番号1648位の多型を解析するための核酸、
(3)腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号-863位の多型を解析するための核酸、
(4)G-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位の多型を解析するための核酸、
(5)アポリポプロテインC-III遺伝子の塩基番号-482位の多型を解析するための核酸、及び
(6)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号-6位の多型を解析するための核酸。
[１４]  以下の(7)〜(11)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
(7)トロンボスポンジン4遺伝子の塩基番号1186位の多型を解析するための核酸、
(8)腫瘍壊死因子α遺伝子の塩基番号-863位の多型を解析するための核酸、
(9)トロンボモジュリン遺伝子の塩基番号2136位の多型を解析するための核酸、
(10)トロンボポイエチン遺伝子の塩基番号5713位の多型を解析するための核酸、及び
(11)血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号994位の多型を解析するための核酸。
[１５]  以下の(12)〜(17)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
(12)E-セレクチン遺伝子の塩基番号561位の多型を解析するための核酸、
(13)脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の塩基番号2445位の多型を解析するための核酸、
(14)グリコプロテインIbα遺伝子の塩基番号1018位の多型を解析するための核酸、
(15)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の塩基番号-668位の多型を解析するための核酸、
(16)パラオキソナーゼ遺伝子の塩基番号584位の多型を解析するための核酸、及び
(17)アポリポプロテインE遺伝子の塩基番号3932位の多型を解析するための核酸。
[１６]  以下の(18)〜(22)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
(18)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の塩基番号-668位の多型を解析するための核酸、
(19)アポリポプロテインC-III遺伝子の塩基番号-482位の多型を解析するための核酸、
(20)パラオキソナーゼ遺伝子の塩基番号584位の多型を解析するための核酸、  (21)グリコプロテインIbα遺伝子の塩基番号1018位の多型を解析するための核酸、及び
(22)アポリポプロテインE遺伝子の塩基番号3932位の多型を解析するための核酸。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の第１の局面は核酸試料の遺伝子型を検出する方法に関し、その一態様は以下の(1)〜(6)からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程を含むことを特徴とする。他の態様としては、以下の(7)〜(11)からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程を含むことを特徴とする。更に他の態様としては、以下の(12)〜(17) からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程を含むことを特徴とする。更に他の態様としては、以下の(18)〜(22) からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程を含むことを特徴とする。尚、以上の工程の結果得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定することにより冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求めることができる。
(1)アポリポプロテインE（Apolipoprotein E）遺伝子の塩基番号3932位の多型：3932T→C（以下、「ApoE(3932T→C)多型」ともいう）
(2)グリコプロテインIa（Glycoprotein Ia）遺伝子の塩基番号1648位の多型：1648A→G（以下、「GPIa(1648A→G)多型」ともいう）
(3)腫瘍壊死因子α（Tumor necrosis factor-α）遺伝子の塩基番号-863位の多型：-863C→A（以下、「TNFα(-863C→A)多型」ともいう）
(4)G-プロテインβ3サブユニット（G-protein β3 subunit）遺伝子の塩基番号825位の多型：825C→T（以下、「G-プロテインβ3(825C→T)多型」ともいう）
(5)アポリポプロテインC-III（Apolipoprotein C-III）遺伝子の塩基番号-482位の多型：-482C→T（以下、「ApoC-III(-482C→T)多型」ともいう）
(6)アンギオテンシノーゲン（Angiotensinogen）遺伝子の塩基番号-6位の多型：-6G→A（以下、「AGT(-6G→A)多型」ともいう）
(7)トロンボスポンジン4（Thrombospondin 4）遺伝子の塩基番号1186位の多型：1186G→C（以下、「TSP4(1186G→C)多型」ともいう）
(8)腫瘍壊死因子α（Tumor necrosis factor-α）遺伝子の塩基番号-863位の多型：-863C→A（以下、「TNFα(-863C→A)多型」ともいう）
(9)トロンボモジュリン（Thrombomodulin）遺伝子の塩基番号2136位の多型：2136C→T（以下、「TM(2136C→T)多型」ともいう）
(10)トロンボポイエチン（Thotombopoietin）遺伝子の塩基番号5713位の多型：5713A→G（以下、「TPO(5713A→G)多型」ともいう）
(11)血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-activating factor acetylhydrolase）遺伝子の塩基番号994位の多型：994G→T（以下、「PAF-AH(994G→T)多型」ともいう）
(12)E-セレクチン（E-selectin）遺伝子の塩基番号561位の多型：561A→C（以下、「Eセレクチン(561A→C)多型」ともいう）
(13)脂肪酸結合タンパク質2（Fatty acid-binding protein 2）遺伝子の塩基番号2445位の多型：2445G→A（以下、「FABP2 (2445G→A)多型」ともいう）
(14)グリコプロテインIbα（Glycoprotein Ibα）遺伝子の塩基番号1018位の多型：1018C→T（以下、「GPIbα(1018C→T)多型」ともいう）
(15)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1（Plasminogen activator inhibitor-1）遺伝子の塩基番号-668位の多型：-668/4G→5G（以下、「PAI1(-668/4G→5G)多型」ともいう）
(16)パラオキソナーゼ（Paraoxonase）遺伝子の塩基番号584位の多型：584G→A（以下、「PON(584G→A)多型」ともいう）
(17)アポリポプロテインE（Apolipoprotein E）遺伝子の塩基番号3932位の多型：3932T→C（以下、「ApoE(3932T→C)多型」ともいう）
(18)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1（Plasminogen activator inhibitor-1）遺伝子の塩基番号-668位の多型：-668/4G→5G（以下、「PAI1(-668/4G→5G)多型」ともいう）
(19)アポリポプロテインC-III（Apolipoprotein C-III）遺伝子の塩基番号-482位の多型：-482C→T（以下、「ApoC-III(-482C→T)多型」ともいう）
(20)パラオキソナーゼ（Paraoxonase）遺伝子の塩基番号584位の多型：584G→A（以下、「PON(584G→A)多型」ともいう）
(21)グリコプロテインIbα（Glycoprotein Ibα）遺伝子の塩基番号1018位の多型：1018C→T（以下、「GPIbα(1018C→T)多型」ともいう）
(22)アポリポプロテインE（Apolipoprotein E）遺伝子の塩基番号3932位の多型：3932T→C（以下、「ApoE(3932T→C)多型」ともいう）
【０００６】
以上において3932T→Cのような表記は、当該塩基番号位置の多型が矢印の前又は後の塩基である二つの遺伝子型からなることを意味する。但し、-668/4G→5Gは塩基番号-668位から3'方向にG（グアニン）が連続して４個存在する遺伝子型と５個存在する遺伝子型からなる多型を意味する。
【０００７】
各遺伝子における塩基番号は公共のデータベースであるGenBank（NCBI）に登録されている公知の配列を基準として表される。尚、配列番号１の塩基配列（Accession No. M10065 J03053 J03054：Human apolipoprotein E (epsilon-4 allele) gene, complete cds）において3932番目の塩基がアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基に相当する。同様に配列番号２の塩基配列（Accession No. X17033 M28249：Human mRNA for integrin alpha-2 subunit）において1648番目の塩基がグリコプロテインIa遺伝子の1648位塩基に相当し、配列番号３の塩基配列（Accession No. L11698：Homo sapiens tumor necrosis factor alpha gene, promoter region）において197番目の塩基が腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基に相当し、配列番号４の塩基配列（Accession No. M31328：Human guanine nucleotide-binding protein beta-3 subunit mRNA, complete cds）において831番目の塩基がG-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位塩基に相当し、配列番号５の塩基配列（Accession No. X13367：Human DNA for apolipoprotein C-III 5'-flank）において936番目の塩基がアポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基に相当し、配列番号６の塩基配列（Accession No. X15323：H.sapiens angiotensinogen gene 5'region and exon 1）において463番目の塩基がアンギオテンシノーゲン遺伝子の-6位塩基に相当し、配列番号７の塩基配列（Accession No. Z19585：H.sapiens mRNA for thrombospondin-4）において1186番目の塩基がトロンボスポンジン4遺伝子の1186位塩基に相当し、配列番号８の塩基配列（Accession No. D00210：Homo sapiens gene for thrombomodulin precursor, complete cds）において2136番目の塩基がトロンボモジュリン遺伝子の2136位塩基に相当し、配列番号９の塩基配列（Accession No. L36051：Human thrombopoietin gene, complete cds）において5753番目の塩基がトロンボポイエチン遺伝子の5713位塩基に相当し、配列番号１０の塩基配列（Accession No. U20157：Human platelet-activating factor acetylhydrolase mRNA, complete cds）において996番目の塩基が血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の994位塩基に相当し、配列番号１１の塩基配列（Accession No. M24736：Human endothelial leukocyte adhesion molecule 1 (ELAM-1) mRNA, complete cds）において561番目の塩基がE-セレクチン遺伝子の561位塩基に相当し、配列番号１２の塩基配列（Accession No. M18079 J03465：Human, intestinal fatty acid binding protein gene, complete cds, and an Alu repetitive element.）において2445番目の塩基が脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の2445位塩基に相当し、配列番号１３の塩基配列（Accession No. J02940：Human platelet glycoprotein Ib alpha chain mRNA, complete cds）において524番目の塩基がグリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基に相当し、配列番号１４の塩基配列（Accession No. X13323：Human gene for plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) 5'-flank and exon 1）において131番目の塩基がプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の-668位塩基に相当し、配列番号１５の塩基配列（Accession No. M63012：H.sapiens serum paraoxonase (PON) mRNA, complete cds）において584番目の塩基がパラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基に相当する。
【０００８】
本発明において「多型を解析する」とは、解析対象の遺伝子多型について核酸試料がどのような遺伝子型を有するかを調べることを意味し、多型が存在する位置の塩基（塩基配列）を調べることと同義である。典型的には、ApoE(3932T→C)多型の解析を例に採れば、核酸試料におけるアポリポプロテインEの遺伝子型がCC（3932位塩基が両アレル共にCのホモ接合体）、TC（3932位塩基がTのアレルとCのアレルとのヘテロ接合体）、及びTT（3932位塩基が両アレル共にTのホモ接合体）の中のいずれであるかを調べることを意味する。
【０００９】
上記の(1)〜(6)の多型は、後述の実施例で示されるように、バルーン拡張術を受けた日本人男性を対象とした解析において冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクの判定に利用することが特に有効と認められた多型である。従ってこれらの多型を解析対象とすることは、冠動脈形成術としてバルーン拡張術を対象とし、被験者として男性（特に日本人男性）を採用するときに、より高精度で予知確率の高い診断を可能とする。
同様に、上記の(7)〜(11)の多型は、後述の実施例で示されるように、ステント挿入を行った日本人男性を対象とした解析において冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクの判定に利用することが特に有効と認められた多型である。従ってこれらの多型を解析対象とすることは、冠動脈形成術としてステント挿入を対象とし、被験者として男性（特に日本人男性）を採用するときに、より高精度で予知確率の高い診断を可能とする。
【００１０】
同様に、上記の(12)〜(17)の多型は、後述の実施例で示されるように、バルーン拡張術を受けた日本人女性を対象とした解析において冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクの判定に利用することが特に有効と認められた多型である。従ってこれらの多型を解析対象とすることは、冠動脈形成術としてバルーン拡張術を対象とし、被験者として女性（特に日本人女性）を採用するときに、より高精度で予知確率の高い診断を可能とする。
同様に、上記の(18)〜(22)の多型は、後述の実施例で示されるように、ステント挿入を行った日本人女性を対象とした解析において冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクの判定に利用することが特に有効と認められた多型である。従ってこれらの多型を解析対象とすることは、冠動脈形成術としてステント挿入を対象とし、被験者として女性（特に日本人女性）を採用するときに、より高精度で予知確率の高い診断を可能とする。
【００１１】
ここで、原則的には解析する多型の数の増加に比例して核酸試料の遺伝子型がより細かく分類され、これによって一層予知確率の高い冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクの診断を行うことができる。かかる見地から、上記の(1)〜(6)の多型の中でより多くの多型を解析して遺伝子型を検出することが好ましい。従って、(1)〜(6)のすべての多型を解析することが最も好ましい。五つ以下の多型を組み合わせて遺伝子型の検出を行う場合には、後述の実施例で示されるオッズ比の高い多型を優先的に選択して用いることが好ましい。例えば五つの多型を組み合わせて用いるのであれば、オッズ比が上位である五つの多型、即ち(1)、(2)、(3)、(4)、及び(5)を選択することが好ましい。同様に、例えば四つの多型を組み合わせて用いるのであれば(1)、(3)、(4)、及び(5)を選択することが好ましい。同様に、例えば三つの多型を組み合わせて用いるのであれば(1)、(3)、及び(4)を選択することが好ましい。
【００１２】
(7)〜(11)の多型から選択される二つ以上の多型を解析する場合も同様に、これらすべての多型、即ち五つの多型を解析することが最も好ましい。四つ以下の多型を組み合わせて遺伝子型の検出を行う場合には、後述の実施例で示されるオッズ比の高い多型を優先的に選択して用いることが好ましい。例えば四つの多型を組み合わせて用いるのであれば、オッズ比が上位である四つの多型、即ち(7)、(8)、(9)、及び(10)を選択することが好ましい。同様に、例えば三つの多型を組み合わせて用いるのであれば(7)、(8)、及び(9)を選択することが好ましい。同様に、例えば二つの多型を組み合わせて用いるのであれば(7)及び(8)を選択することが好ましい。
【００１３】
(12)〜(17)の多型から選択される二つ以上の多型を解析する場合も同様に、これらすべての多型、即ち六つの多型を解析することが最も好ましい。五つ以下の多型を組み合わせて遺伝子型の検出を行う場合には、後述の実施例で示されるオッズ比の高い多型を優先的に選択して用いることが好ましい。例えば五つの多型を組み合わせて用いるのであれば、オッズ比が上位である五つの多型、即ち(12)、(13)、(14)、(15)、及び(16)を選択することが好ましい。同様に、例えば四つの多型を組み合わせて用いるのであれば(12)、(13)、(14)、及び(15)を選択することが好ましい。同様に、例えば三つの多型を組み合わせて用いるのであれば(12)、(13)、及び(14)を選択することが好ましい。
【００１４】
(18)〜(22)の多型から選択される二つ以上の多型を解析する場合も同様に、これらすべての多型、即ち五つの多型を解析することが最も好ましい。四つ以下の多型を組み合わせて遺伝子型の検出を行う場合には、後述の実施例で示されるオッズ比の高い多型を優先的に選択して用いることが好ましい。例えば四つの多型を組み合わせて用いるのであれば、オッズ比が上位である四つの多型、即ち(18)、(19)、(20)、及び(21)を選択することが好ましい。同様に、例えば三つの多型を組み合わせて用いるのであれば(18)、(19)、及び(20)を選択することが好ましい。同様に、例えば二つの多型を組み合わせて用いるのであれば(18)及び(19)を選択することが好ましい。
【００１５】
各遺伝子多型を解析する方法は特に限定されるものではなく、例えばアリル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、PCR法による増幅、及び増幅産物の多型を蛍光又は発光によって解析する方法や、PCR(polymerase chain reaction)法を利用したPCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR-SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide：アレル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、又はTaqMan-PCR法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol.,34,2933(1996))、Invader法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法(Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7,378(1997))、RCA(rolling cycle amplification)法(Lizardi PM et al., Nat  Genet 19,225(1998))、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)）等、公知の方法を採用できる。さらに、解析対象の多型部分を直接シークエンスすることにより解析してもよい。尚、これらの方法を任意に組み合わせて多型解析を行ってもよい。
【００１６】
核酸試料が少量の場合には、検出感度ないし精度の面からPCR法を利用した方法（例えば、PCR-RFLP法）により解析することが好ましい。また、PCR法又はPCR法を応用した方法などの遺伝子増幅法により核酸試料を予め増幅（核酸試料の一部領域の増幅を含む）した後、上記いずれかの解析方法を適用することもできる。
一方、多数の核酸試料を解析する場合には、アリル特異的PCR法、アリル特異的ハイブリダイゼーション法、TaqMan-PCR法、Invader法、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法、RCA(rolling cycle amplification)法、又はDNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法等、多数の検体を比較的短時間で解析することが可能な解析方法を用いることが特に好ましい。
【００１７】
以上の方法では、各方法に応じたプライマーやプローブ等の核酸（本発明において、「多型解析用核酸」ともいう）が使用される。多型解析用核酸の例としては、解析対象の多型を含む遺伝子において、当該多型部位を含む一定領域（部分DNA領域）に相補的な配列を有する核酸を挙げることができる。また、解析対象の多型を含む遺伝子において、当該多型部位を含む一定領域（部分DNA領域）に相補的な配列を有し、当該多型部分を含むDNAフラグメントを特異的に増幅できるように設計された核酸（プライマー）を挙げることができる。このような核酸としては、例えばアポリポプロテインE遺伝子の3932位の多型が解析対象の場合には、3932位の塩基がT（チミン）であるアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は3932位の塩基がC（シトシン）であるアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸が該当する。
【００１８】
多型解析用核酸の他の具体例としては、解析対象の多型部位がいずれかの遺伝子型である場合にのみ、当該多型部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットを挙げることができる。より具体的には、解析対象の多型部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、多型部位がいずれかの遺伝子型であるアンチセンス鎖の当該多型部位を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーとセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーからなる核酸セットを例示することができる。このような核酸セットとしては、アポリポプロテインE遺伝子の3932位の多型が解析対象の場合には、アポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、3932位塩基がT（チミン）であるアポリポプロテインE遺伝子のアンチセンス鎖において3932位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーとセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーからなる核酸セット、又は3932位塩基がC（シトシン）であるアポリポプロテインE遺伝子のアンチセンス鎖において3932位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーとセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーからなる核酸セットが該当する。ここで、増幅される部分DNA領域の長さはその検出に適した範囲で適宜設定され、例えば50bp〜200bp、好ましくは80bp〜150bpである。より具体的には、例えばApoE(3932T→C)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。尚、以下の配列の下線部は多型に対応する部分を表す。また、配列中のNはA、T、C、及びGのいずれかであることを意味する。
アンチセンスプライマー
GGACATGGAGGACGTNCG：配列番号１６、又は
CGGACATGGAGGACGTNTG：配列番号１７
センスプライマー
CGCGGTACTGCACCAGGC：配列番号１８
【００１９】
同様に、GPIa(1648A→G)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
GAGTCTACCTGTTTACTATCAANAA：配列番号１９、又は
GAGTCTACCTGTTTACTATCAANGA：配列番号２０
アンチセンスプライマー
ACCAGTACTAAAGCAAATTAAACT：配列番号２１
【００２０】
同様に、TNFα(-863C→A)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
アンチセンスプライマー
GGCCCTGTCTTCGTTAANGG：配列番号２２、又は
ATGGCCCTGTCTTCGTTAANTG：配列番号２３
センスプライマー
CCAGGGCTATGGAAGTCGAGTATC：配列番号２４
【００２１】
同様に、G-プロテインβ3(825C→T)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
TCTGCGGCATCACGTNCG：配列番号２５、又は
TCTGCGGCATCACGTNTG：配列番号２６
アンチセンスプライマー
GAATAGTAGGCGGCCACTGA：配列番号２７
【００２２】
同様に、ApoC-III(-482C→T)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
CGGAGCCACTGATGCNCG：配列番号２８、又は
CGGAGCCACTGATGCNTG：配列番号２９
アンチセンスプライマー
TGTTTGGAGTAAAGGCACAGAA：配列番号３０
【００２３】
同様に、AGT(-6G→A)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
アンチセンスプライマー
CGGCAGCTTCTTCCCNCG：配列番号３１、又は
CGGCAGCTTCTTCCCNTG：配列番号３２
センスプライマー
CCACCCCTCAGCTATAAATAGG：配列番号３３
【００２４】
同様に、TSP4(1186G→C)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
CGAGTTGGGAACGCACNCT：配列番号３４、又は
CGAGTTGGGAACGCACNGT：配列番号３５
アンチセンスプライマー
GGTCTGCACTGACATTGATGAG：配列番号３６
【００２５】
同様に、TM(2136C→T)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
CCCGACTCGGCCCTTNCC：配列番号３７、又は
CCCGACTCGGCCCTTNTC：配列番号３８
アンチセンスプライマー
GTCACAGTCGGTGCCAATGT：配列番号３９
【００２６】
同様に、TPO(5713A→G)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
CCGACATCAGCATTGTCTNAT：配列番号４０、又は
CCGACATCAGCATTGTCTNGT：配列番号４１
アンチセンスプライマー
CTGCAGGGAAGGGAGCTGT：配列番号４２
【００２７】
同様に、PAF-AH(994G→T)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
TTCTTTTGGTGGAGCAACNGT：配列番号４３、又は
ATTCTTTTGGTGGAGCAACNTT：配列番号４４
アンチセンスプライマー
TCTTACCTGAATCTCTGATCTTCA：配列番号４５
【００２８】
同様に、Eセレクチン(561A→C)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
アンチセンスプライマー
ACATTCACCGTGGCCANTG：配列番号４６、又は
CATTCACCGTGGCCANGG：配列番号４７
センスプライマー
AGCTGCCTGTACCAATACATCC：配列番号４８
【００２９】
同様に、FABP2 (2445G→A)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
TCACAGTCAAAGAATCAAGNGC：配列番号４９、又は
ATTCACAGTCAAAGAATCAAGNAC：配列番号５０
アンチセンスプライマー
CAAAAACAACTTCAATGTTTCGA：配列番号５１
【００３０】
同様に、GPIbα(1018C→T)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
CCCAGGGCTCCTGNCG：配列番号５２、又は
CCCCAGGGCTCCTGNTG：配列番号５３
アンチセンスプライマー
TGAGCTTCTCCAGCTTGGGTG：配列番号５４
【００３１】
同様に、PAI1(-668/4G→5G)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
GGCACAGAGAGAGTCTGGACACG：配列番号５５
アンチセンスプライマー
GGCCGCCTCCGATGATACA：配列番号５６
【００３２】
同様に、PON(584G→A)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するものを例示できる。
センスプライマー
ACCCAAATACATCTCCCAGGANCG：配列番号５７、又は
AACCCAAATACATCTCCCAGGNCT：配列番号５８
アンチセンスプライマー
GAATGATATTGTTGCTGTGGGAC：配列番号５９
【００３３】
一方、プローブの具体例として以下のものを挙げることができる。
ApoC-III(-482C→T)多型解析用プローブとして
AGCCACTGATGCNCGGTCT：配列番号６０、又は
AGCCACTGATGCNTGGTCT：配列番号６１。
【００３４】
Eセレクチン(561A→C)多型解析用プローブとして
CACCGTGGCCANTGCAGGAT：配列番号６２、又は
CACCGTGGCCANGGCAGGAT：配列番号６３。
【００３５】
FABP2 (2445G→A)多型解析用プローブとして
GAATCAAGNGCTTTTCGAAACATT：配列番号６４、又は
GAATCAAGNACTTTTCGAAACATT：配列番号６５。
【００３６】
PAI1(-668/4G→5G)多型解析用プローブとして
TGGACACGTGGGGGAGTCAG：配列番号６６、又は
TGGACACGTGGGGAGTCAGC：配列番号６７。
【００３７】
以上の核酸プライマー、核酸プローブは単なる一例であって、核酸プライマーであれば目的の増幅反応を支障なく行える限度において、他方核酸プローブであれば目的のハイブリダイゼーション反応を支障なく行える限度において一部の塩基配列に改変が施されたものであってもよい。ここでの「一部の改変」とは、塩基の一部が欠失、置換、挿入及び／又は付加されていることを意味する。改変にかかる塩基数は、例えば1〜7個、好ましくは1〜5個、更に好ましくは、1〜3個である。尚、このような改変は、原則として多型部位に対応する塩基以外の部分において行われる。ただし、解析対象の多型がPAI1(-668/4G→5G)多型の場合には、多型部位に対応する塩基の一部を改変して得られる核酸をプライマー又はプローブとして用いることも可能である。
【００３８】
多型解析用核酸（プローブ、プライマー）には、解析方法に応じて適宜DNA断片又はRNA断片が用いられる。多型解析用核酸の塩基長はそれぞれの機能が発揮される長さであればよく、プライマーとして用いられる場合の塩基長の例としては10〜50bp程度、好ましくは15〜40bp程度、更に好ましくは15〜30bp程度である。
尚、プライマーとして用いられる場合には増幅対象に特異的にハイブリダイズし、目的のDNAフラグメントを増幅することができる限り鋳型となる配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。プローブの場合も同様に、検出対象の配列と特異的なハイブリダイズが行える限り、検出対象の配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、１〜数個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個である。
多型解析用核酸（プライマー、プローブ）はホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。尚、多型解析用核酸の設計、合成等に関しては成書（例えば、Molecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）を参考にすることができる。
【００３９】
本発明における多型解析用核酸を予め標識物質で標識しておくことができる。このような標識化核酸を用いることにより、例えば増幅産物の標識量を指標として多型の解析を行うことができる。また、多型を構成する各遺伝子型の遺伝子における部分DNA領域をそれぞれ特異的に増幅するように設計された２種類のプライマーを互いに異なる標識物質で標識しておけば、増幅産物から検出される標識物質及び標識量によって核酸試料の遺伝子型を判別できる。このような標識化プライマーを用いた検出方法の具体例としては、多型を構成する各遺伝子型のセンス鎖にそれぞれ特異的にハイブリダイズする２種類の核酸プライマー（アリル特異的センスプライマー）をフルオレセインイソチオシアネートとテキサスレッドでそれぞれ標識し、これら標識化プライマーとアンチセンス鎖に特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとを用いて多型部位を含む部分DNA領域を増幅し、得られた増幅産物における各蛍光物質の標識量を測定して多型を検出する方法を挙げることができる。尚、ここでのアンチセンスプライマーを例えばビオチンで標識しておけば、ビオチンとアビジンとの特異的な結合を利用して増幅産物の分離を行うことができる。
【００４０】
多型解析用核酸の標識に用いられる標識物質としては32Pなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、テキサスレッドなどの蛍光物質を例示でき、標識方法としてはアルカリフォスファターゼ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた5'末端標識法、T4 DNAポリメラーゼやKlenow断片を用いた3'末端標識法、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法（Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 9，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）などを例示できる。
【００４１】
以上の多型解析用核酸を不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる。固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、ビーズ状などに加工しておけば、これら固定化核酸を用いて多型の解析をより簡便に行うことができる。
【００４２】
核酸試料は、被験者の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。多型解析対象の遺伝子を含むものであれば、任意の長さのゲノムDNAを核酸試料として用いることができる。また、必ずしも解析対象の遺伝子のすべてが一の核酸上に存在する核酸試料を用いる必要はない。即ち、本発明の核酸試料としては、解析対象の遺伝子のすべてが一の核酸上に存在しているもの、解析対象の遺伝子が二以上の核酸上に分かれて存在しているもののいずれをも用いることができる。尚、核酸試料において解析対象の遺伝子が完全な状態（即ち、遺伝子の全長が存在する状態）でなくても、少なくとも解析される多型部位が存在している限りにおいて断片的、部分的な状態であってもよい。
【００４３】
各遺伝子多型の解析は遺伝子多型ごとに、又は複数若しくは全部を同時に行う。前者の場合としては、例えば被験者から得た核酸試料を解析対象の多型の数に合わせて分注し、各多型の解析を個別に行う。後者の場合としては、例えばDNAチップまたはマイクロアレイによって行うことができる。尚、ここでいう同時とは解析過程のすべての操作が同時に行われることのみを意味するのではなく、一部の操作（例えば、核酸増幅操作、プローブのハイブリダイズ、又は検出）が同時に行われる場合も含む。
【００４４】
解析対象の遺伝子の転写産物であるmRNAを利用して各遺伝子の多型を解析することもできる。例えば、被験者の血液、尿等から解析対象である遺伝子のmRNAを抽出、精製した後、ノーザンブロット法（Molecular Cloning, Third Edition,7.42,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、ドットブロット法（Molecular Cloning, Third Edition,7.46,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、RT-PCR法（Molecular Cloning, Third Edition,8.46,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、DNAチップ（DNAアレイ）を用いた方法などを実行することにより、mRNAを出発材料として多型解析を行うことができる。
【００４５】
さらに、上記の多型の中でアミノ酸の変化を伴うものについては、解析対象の遺伝子の発現産物を用いて多型解析を行うこともできる。この場合、多型部位に対応するアミノ酸を含んでいる限り、部分タンパク質、部分ペプチドであっても解析用試料として用いることができる。
【００４６】
このような遺伝子の発現産物を用いて解析する方法としては、多型部位のアミノ酸を直接分析する方法、又は立体構造の変化を利用して免疫学的に分析する方法などが挙げられる。前者としては、周知のアミノ酸配列分析法（エドマン法を利用した方法）を用いることができる。後者としては、多型を構成するいずれかの遺伝子型を有する遺伝子の発現産物に特異的な結合活性を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着定量法）、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫拡散法等などを用いることができる。
【００４７】
以上説明した本発明の検出方法を実行することにより得られる多型情報は、冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクの診断に利用することができる。即ち、本発明は以上の検出方法によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び決定された核酸試料の遺伝子型から遺伝的リスクを求める工程を含んでなる、冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断方法も提供する。ここでの遺伝子型の決定は、典型的には、検出対象の多型に関して核酸試料の両アレルがいずれの遺伝子型をそれぞれ有するかを決定することである。ApoE(3932T→C)多型が検出対象である場合を例に採れば、典型的には核酸試料におけるアポリポプロテインEの遺伝子型がTT（3932位塩基が両アレル共にTのホモ接合体）、CT（3932位塩基がTのアレルとCのアレルとのヘテロ接合体）、及びCC（3932位塩基が両アレル共にCのホモ接合体）の中のいずれであるかを決定することである。
【００４８】
後述の実施例で得られた結果を考慮すれば、高精度かつ予知確率の高い冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクの診断を可能とするために、例えばApoE(3932T→C)多型であれば核酸試料の遺伝子型がCC又はTCのいずれかであるか、それともTTであるかが決定される。同様に、GPIa(1648A→G)多型であればGGであるか、それともAG又はAAのいずれかであるか、TNFα(-863C→A)多型であればAA又はCAのいずれかであるか、それともCCであるか、G-プロテインβ3(825C→T)多型であればTTであるか、それともCT又はCCのいずれかであるか、ApoC-III(-482C→T)多型であればTT又はCTのいずれかであるか、それともCCであるか、或はTTであるか、それともCT又はCCのいずれかであるか、AGT(-6G→A)多型であればAA又はGAのいずれかであるか、それともGGであるか、TSP4(1186G→C)多型であればCC又はGCのいずれかであるか、それともGGであるか、TM(2136C→T)多型であればTT又はCTのいずれかであるか、それともCCであるか、TPO(5713A→G)多型であればGGであるか、それともAG又はAAのいずれかであるか、PAF-AH(994G→T)多型であればTT又はGTのいずれかであるか、それともGGであるか、Eセレクチン(561A→C)多型であればCC又はACのいずれかであるか、それともAAであるか、FABP2 (2445G→AであればAA又はGAのいずれかであるか、それともGGであるか、GPIbα(1018C→T)多型であればTT又はCTのいずれかであるか、それともCCであるか、PAI1(-668/4G→5G)多型であれば5G/5G又は4G/5Gのいずれかであるか、それとも4G/4Gであるか、PON(584G→A)多型であればAA又はGAのいずれか、それともGGであるかが決定される。
【００４９】
冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを診断することにより、冠動脈形成術後に再狭窄を生ずるおそれの程度（生じ易さ）が予測される。即ち、本発明の診断方法によって冠動脈形成術後に再狭窄を生ずるリスクの評価が行える。このような評価を行えることは、事前に適切な治療法の選択を可能とすることから臨床上極めて有意義である。
【００５０】
本発明で得られる再狭窄の発生に関連する遺伝情報を利用して、冠動脈形成術後の再狭窄発生率を低下させることができる。例えば、本発明の診断方法を実施した結果、解析対象の多型が再狭窄の発生リスクを高める遺伝子型であった場合に、当該多型について発症リスクの低い遺伝子型を有する遺伝子を生体内に導入すれば、当該遺伝子の発現によって再狭窄の発生リスクが低減することを期待できる。再狭窄発生リスクの高い遺伝子型を有する遺伝子のmRNAに対するアンチセンス鎖を導入し、当該mRNAの発現を抑制することによっても同様の効果が期待される。
【００５１】
このような遺伝子等の生体への導入は、例えば遺伝子導入用プラスミド又はウイルスベクターを用いた方法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、超音波マイクロバブル（Lawrie, A., et al. Gene Therapy 7, 2023-2027 (2000)）、リポフェクション(Felgner, P.L. et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann,M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976))等の方法により行うことができる。これらの方法を利用した遺伝子等の導入は生体に対して直接的（in vivo法）又は間接的（ex vivo法）に行うことができる。
また、予め遺伝子等をコーティングした（遺伝子導入用プラスミドやウイルスベクターに保持させたものなどをコーティングしてもよい）ステント等の器具を用いて冠動脈形成術と同時に、又は冠動脈形成後に以上のような遺伝子導入を行うこともできる。
【００５２】
本発明の第２の局面は、上述した本発明の検出方法又は診断方法に使用されるキット（遺伝子型検出用キット、又は冠動脈形成術後再狭窄診断用キット）を提供する。かかるキットには上記の(1)〜(6)の多型からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析するための核酸（多型解析用核酸）が含まれる。他の態様としては上記の(7)〜(11)の多型からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析するための核酸（多型解析用核酸）を含んでキットが構築される。更に他の態様としては上記の(12)〜(17)の多型からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析するための核酸（多型解析用核酸）を含んでキットが構築される。更に他の態様としては上記の(18)〜(22)の多型からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析するための核酸（多型解析用核酸）を含んでキットが構築される。
多型解析用核酸は、それが適用される解析方法（上述したアリル特異的核酸等を用いたPCR法を利用する方法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP、TaqMan-PCR法、Invader法等）において、解析対象の多型部分を含むDNA領域又はそれに対応するmRNAを特異的に増幅できるもの（プライマー）又は特異的に検出できるもの（プローブ）として設計される。以下に本発明において提供されるキットの具体例を示す。
【００５３】
以下の(1)〜(6)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
(1)3932位塩基がTであるアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は3932位塩基がCであるアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(2)1648位塩基がAであるグリコプロテインIa遺伝子の1648位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は1648位塩基がGであるグリコプロテインIa遺伝子の1648位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(3)-863位塩基がCである腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は-863位塩基がAである腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(4)825位塩基がCであるG-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は825位塩基がTであるG-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(5)-482位塩基がCであるアポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は-482位塩基がTであるアポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、及び
(6)-6位塩基がGであるアンギオテンシノーゲン遺伝子の-6位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は-6位塩基がAであるアンギオテンシノーゲン遺伝子の-6位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸。
以上では、(1)〜(6)からなるグループから二つ以上の核酸を選択してキットを構成しているが、(1)〜(6)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸を選択してキットを構成してもよい。例えば、(1)〜(5)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比とP値を考慮して選択される上位５位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸を選択してキットを構成したり、(1)、(3)、(4)、及び(5)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸）より二つ以上の核酸を選択してキットを構成することができる。
【００５４】
以下の(7)〜(11)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
(7)1186位塩基がGであるトロンボスポンジン4遺伝子の1186位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は1186位塩基がCであるトロンボスポンジン4遺伝子の1186位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(8)-863位塩基がCである腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は-863位塩基がAである腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(9)2136位塩基がCであるトロンボモジュリン遺伝子の2136位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は2136位塩基がTであるトロンボモジュリン遺伝子の2136位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(10)5713位塩基がAであるトロンボポイエチン遺伝子の5713位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は5713位塩基がGであるトロンボポイエチン遺伝子の5713位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、及び  (11)994位塩基がGである血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の994位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は994位塩基がTである血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の994位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸。
以上では、(7)〜(11)からなるグループから二つ以上の核酸を選択してキットを構成しているが、(7)〜(11)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸を選択してキットを構成してもよい。例えば、(7)〜(10)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(7)〜(9)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸）より二つ以上の核酸を選択してキットを構成することができる。
【００５５】
以下の(12)〜(17)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
(12)561位塩基がAであるE-セレクチン遺伝子の561位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は561位塩基がCであるE-セレクチン遺伝子の561位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(13)2445位塩基がGである脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の2445位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は2445位塩基がAである脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の2445位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、  (14)1018位塩基がCであるグリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は1018位塩基がTであるグリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、  (15)-668位から3'方向に連続して4個のGが存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の該配列部分を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は-668位から3'方向に連続して5個のGが存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の該配列部分を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(16)584位塩基がGであるパラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は584位塩基がAであるパラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、及び
(17)3932位塩基がTであるアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は3932位塩基がCであるアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸。
以上では、(12)〜(17)からなるグループから二つ以上の核酸を選択してキットを構成しているが、(12)〜(17)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸を選択してキットを構成してもよい。例えば、(12)〜(16)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位５位までの多型を解析するための核酸）より二つ以上の核酸を選択してキットを構成したり、(12)〜(15)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの核酸）より二つ以上の核酸を選択してキットを構成することができる。
【００５６】
以下の(18)〜(22)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
(18)-668位から3'方向に連続して4個のGが存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の該配列部分を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は-668位から3'方向に連続して5個のGが存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の該配列部分を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸
(19)-482位塩基がCであるアポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は-482位塩基がTであるアポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(20)584位塩基がGであるパラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は584位塩基がAであるパラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(21)1018位塩基がCであるグリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は1018位塩基がTであるグリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、及び
(22)3932位塩基がTであるアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は3932位塩基がCであるアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸。
以上では、(18)〜(22)からなるグループから二つ以上の核酸を選択してキットを構成しているが、(18)〜(22)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸を選択してキットを構成してもよい。例えば、(18)〜(21)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(18)〜(20)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸）より二つ以上の核酸を選択してキットを構成することができる。
【００５７】
以下の(1)〜(6)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
(1)核酸試料中のアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基がTである場合にのみ、該アポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基がCである場合にのみ、該アポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(2)核酸試料中のグリコプロテインIa遺伝子の1648位塩基がAである場合にのみ、該グリコプロテインIa遺伝子の1648位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のグリコプロテインIa遺伝子の1648位塩基がGである場合にのみ、該グリコプロテインIa遺伝子の1648位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(3)核酸試料中の腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基がCである場合にのみ、該腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中の腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基がAである場合にのみ、該腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(4)核酸試料中のG-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位塩基がCである場合にのみ、該G-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のG-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位塩基がTである場合にのみ、該G-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(5)核酸試料中のアポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基がCである場合にのみ、該アポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のアポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基がTである場合にのみ、該アポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、及び
(6)核酸試料中のアンギオテンシノーゲン遺伝子の-6位塩基がGである場合にのみ、該アンギオテンシノーゲン遺伝子の-6位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のアンギオテンシノーゲン遺伝子の-6位塩基がAである場合にのみ、該アンギオテンシノーゲン遺伝子の-6位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット。以上では、(1)〜(6)からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、(1)〜(6)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば、(1)〜(5)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比とP値を考慮して選択される上位５位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(1)、(3)、(4)、及び(5)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００５８】
以下の(7)〜(11)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
(7)核酸試料中のトロンボスポンジン4遺伝子の1186位塩基がGである場合にのみ、該トロンボスポンジン4遺伝子の1186位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のトロンボスポンジン4遺伝子の1186位塩基がCである場合にのみ、該トロンボスポンジン4遺伝子の1186位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(8)核酸試料中の腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基がCである場合にのみ、該腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中の腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基がAである場合にのみ、該腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(9)核酸試料中のトロンボモジュリン遺伝子の2136位塩基がCである場合にのみ、該トロンボモジュリン遺伝子の2136位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のトロンボモジュリン遺伝子の2136位塩基がTである場合にのみ、該トロンボモジュリン遺伝子の2136位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(10)核酸試料中のトロンボポイエチン遺伝子の5713位塩基がAである場合にのみ、該トロンボポイエチン遺伝子の5713位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のトロンボポイエチン遺伝子の5713位塩基がGである場合にのみ、該トロンボポイエチン遺伝子の5713位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、及び
(11)核酸試料中の血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の994位塩基がGである場合にのみ、該血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の994位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中の血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の994位塩基がTである場合にのみ、該血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の994位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット。
以上では、(7)〜(11)からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、(7)〜(11)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば、(7)〜(10)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(7)〜(9)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００５９】
以下の(12)〜(17)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
(12)核酸試料中のE-セレクチン遺伝子の561位塩基がAである場合にのみ、該E-セレクチン遺伝子の561位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のE-セレクチン遺伝子の561位塩基がCである場合にのみ、該E-セレクチン遺伝子の561位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(13)核酸試料中の脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の2445位塩基がGである場合にのみ、該脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の2445位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中の脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の2445位塩基がAである場合にのみ、該脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の2445位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(14)核酸試料中のグリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基がCである場合にのみ、該グリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のグリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基がTである場合にのみ、該グリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(15)核酸試料中のプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子において-668位から3'方向にGが4個連続して存在する場合にのみ、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の該配列部分を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子において-668位から3'方向にGが5個連続して存在する場合にのみ、該プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の該配列部分を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(16)核酸試料中のパラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基がGである場合にのみ、該パラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のパラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基がAである場合にのみ、該パラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、及び
(17)核酸試料中のアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基がTである場合にのみ、アポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基がCである場合にのみ、該アポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット。
以上では、(12)〜(17)からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、(12)〜(17)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば、(12)〜(16)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位５位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(12)〜(15)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００６０】
以下の(18)〜(22)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
(18)核酸試料中のプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子において-668位から3'方向にGが4個連続して存在する場合にのみ、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の該配列部分を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子において-668位から3'方向にGが5個連続して存在する場合にのみ、該プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の該配列部分を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(19)核酸試料中のアポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基がCである場合にのみ、該アポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のアポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基がTである場合にのみ、該アポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(20)核酸試料中のパラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基がGである場合にのみ、該パラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のパラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基がAである場合にのみ、該パラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(21)核酸試料中のグリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基がCである場合にのみ、該グリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のグリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基がTである場合にのみ、該グリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、及び
(22)核酸試料中のアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基がTである場合にのみ、該アポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基がCである場合にのみ、該アポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット。
以上では、(18)〜(22)からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、(18)〜(22)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば、(18)〜(21)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(18)〜(20)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００６１】
以下の(1)〜(6)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
(1)アポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、3932位塩基がTであるアポリポプロテインE遺伝子において3932位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は3932位塩基がCであるアポリポプロテインE遺伝子において3932位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、アポリポプロテインE遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、
(2)グリコプロテインIa遺伝子の1648位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、1648位塩基がAであるグリコプロテインIa遺伝子において1648位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は1648位塩基がGであるグリコプロテインIa遺伝子において1648位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、グリコプロテインIa遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、  (3)腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、-863位塩基がCである腫瘍壊死因子α遺伝子において-863位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマー及び／又は-863位塩基がAである腫瘍壊死因子α遺伝子において-863位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、腫瘍壊死因子α遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、からなる核酸セット、
(4)G-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、825位塩基がCであるG-プロテインβ3サブユニット遺伝子において825位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は825位塩基がTであるG-プロテインβ3サブユニット遺伝子において825位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、G-プロテインβ3サブユニット遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、
(5)アポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、-482位塩基がCであるアポリポプロテインC-III遺伝子において-482位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は-482位塩基がTであるアポリポプロテインC-III遺伝子において-482位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、アポリポプロテインC-III遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、及び
(6)アンギオテンシノーゲン遺伝子の-6位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、-6位塩基がGであるアンギオテンシノーゲン遺伝子において-6位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマー及び／又は-6位塩基がAであるアンギオテンシノーゲン遺伝子において-6位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、アンギオテンシノーゲン遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、からなる核酸セット。
以上では、(1)〜(6)からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、(1)〜(6)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば、(1)〜(5)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比とP値を考慮して選択される上位５位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(1)、(3)、(4)、及び(5)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００６２】
以下の(7)〜(11)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
(7)トロンボスポンジン4遺伝子の1186位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、1186位塩基がGであるトロンボスポンジン4遺伝子において1186位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は1186位塩基がCであるトロンボスポンジン4遺伝子において1186位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、トロンボスポンジン4遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、
(8)腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、-863位塩基がCである腫瘍壊死因子α遺伝子において-863位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマー及び／又は-863位塩基がAである腫瘍壊死因子α遺伝子において-863位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、腫瘍壊死因子α遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、からなる核酸セット、
(9)トロンボモジュリン遺伝子の2136位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、2136位塩基がCであるトロンボモジュリン遺伝子において2136位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は2136位塩基がTであるトロンボモジュリン遺伝子において2136位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、トロンボモジュリン遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、
(10)トロンボポイエチン遺伝子の5713位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、5713位塩基がAであるトロンボポイエチン遺伝子において5713位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は5713位塩基がGであるトロンボポイエチン遺伝子において5713位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、トロンボポイエチン遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、及び
(11)血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の994位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、994位塩基がGである血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子において994位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は994位塩基がTである血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子において994位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット。
以上では、(7)〜(11)からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、(7)〜(11)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば、(7)〜(10)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(7)〜(9)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００６３】
以下の(12)〜(17)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
(12)E-セレクチン遺伝子の561位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、561位塩基がAであるE-セレクチン遺伝子において561位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマー及び／又は561位塩基がCであるE-セレクチン遺伝子において561位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、E-セレクチン遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、からなる核酸セット、
(13)脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の2445位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、2445位塩基がGである脂肪酸結合タンパク質2遺伝子において2445位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は2445位塩基がAである脂肪酸結合タンパク質2遺伝子において2445位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、
(14)グリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、1018位塩基がCであるグリコプロテインIbα遺伝子において1018位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は1018位塩基がTであるグリコプロテインIbα遺伝子において1018位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、グリコプロテインIbα遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、
(15)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の-668位における多型部分を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された一組のプライマーと、並びに-668位から3'方向にGが4個連続して存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子において該配列部分を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするプローブ及び／又は-668位から3'方向にGが5個連続して存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子において該配列部分を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするプローブと、からなる核酸セット、
(16)パラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、584位塩基がGであるパラオキソナーゼ遺伝子において584位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は584位塩基がAであるパラオキソナーゼ遺伝子において584位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、パラオキソナーゼ遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、及び
(17) アポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、3932位塩基がTであるアポリポプロテインE遺伝子において3932位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は3932位塩基がCであるアポリポプロテインE遺伝子において3932位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、アポリポプロテインE遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット。
以上では、(12)〜(17)からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、(12)〜(17)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば、(12)〜(16)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位５位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(12)〜(15)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００６４】
以下の(18)〜(22)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
(18)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の-668位における多型部分を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された一組のプライマーと、並びに-668位から3'方向にGが4個連続して存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子において該配列部分を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするプローブ及び／又は-668位から3'方向にGが5個連続して存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子において該配列部分を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするプローブと、からなる核酸セット、
(19)アポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、-482位塩基がCであるアポリポプロテインC-III遺伝子において-482位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は-482位塩基がTであるアポリポプロテインC-III遺伝子において-482位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、アポリポプロテインC-III遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、
(20)パラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、584位塩基がGであるパラオキソナーゼ遺伝子において584位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は584位塩基がAであるパラオキソナーゼ遺伝子において584位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、パラオキソナーゼ遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、
(21)グリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、1018位塩基がCであるグリコプロテインIbα遺伝子において1018位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は1018位塩基がTであるグリコプロテインIbα遺伝子において1018位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、グリコプロテインIbα遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、及び
(22)アポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、3932位塩基がTであるアポリポプロテインE遺伝子において3932位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は3932位塩基がCであるアポリポプロテインE遺伝子において3932位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、アポリポプロテインE遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット。
以上では、(18)〜(22)からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、(18)〜(22)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば、(18)〜(21)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(18)〜(20)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００６５】
以下の(1)〜(6)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
(1)3932位塩基がTであるアポリポプロテインE遺伝子のアンチセンス鎖において3932位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、3932位塩基がCであるアポリポプロテインE遺伝子のアンチセンス鎖において3932位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びアポリポプロテインE遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(2)1648位塩基がAであるグリコプロテインIa遺伝子のアンチセンス鎖において1648位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、1648位塩基がGであるグリコプロテインIa遺伝子のアンチセンス鎖において1648位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びグリコプロテインIa遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてグリコプロテインIa遺伝子の1648位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(3)-863位塩基がCである腫瘍壊死因子α遺伝子のセンス鎖において-863位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、-863位塩基がAである腫瘍壊死因子α遺伝子のセンス鎖において-863位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及び腫瘍壊死因子α遺伝子のアンチセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されて腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(4)825位塩基がCであるG-プロテインβ3サブユニット遺伝子のアンチセンス鎖において825位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、825位塩基がTであるG-プロテインβ3サブユニット遺伝子のアンチセンス鎖において825位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びG-プロテインβ3サブユニット遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてG-プロテインβ3サブユニット遺伝子の825位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(5)-482位塩基がCであるアポリポプロテインC-III遺伝子のアンチセンス鎖において-482位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、-482位塩基がTであるアポリポプロテインC-III遺伝子のアンチセンス鎖において-482位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びアポリポプロテインC-III遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてアポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、及び
(6)-6位塩基がGであるアンギオテンシノーゲン遺伝子のセンス鎖において-6位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、-6位塩基がAであるアンギオテンシノーゲン遺伝子のセンス鎖において-6位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びアンギオテンシノーゲン遺伝子のアンチセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてアンギオテンシノーゲン遺伝子の-6位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット。
以上では、(1)〜(6)からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、(1)〜(6)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば、(1)〜(5)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比とP値を考慮して選択される上位５位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(1)、(3)、(4)、及び(5)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００６６】
以下の(7)〜(11)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
(7)1186位塩基がGであるトロンボスポンジン4遺伝子のアンチセンス鎖において1186位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、1186位塩基がCであるトロンボスポンジン4遺伝子のアンチセンス鎖において1186位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びトロンボスポンジン4遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてトロンボスポンジン4遺伝子の1186位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(8)-863位塩基がCである腫瘍壊死因子α遺伝子のセンス鎖において-863位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、-863位塩基がAである腫瘍壊死因子α遺伝子のセンス鎖において-863位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及び腫瘍壊死因子α遺伝子のアンチセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されて腫瘍壊死因子α遺伝子の-863位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(9)2136位塩基がCであるトロンボモジュリン遺伝子のアンチセンス鎖において2136位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、2136位塩基がTであるトロンボモジュリン遺伝子のアンチセンス鎖において2136位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びトロンボモジュリン遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてトロンボモジュリン遺伝子の2136位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(10)5713位塩基がAであるトロンボポイエチン遺伝子のアンチセンス鎖において5713位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、5713位塩基がGであるトロンボポイエチン遺伝子のアンチセンス鎖において5713位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びトロンボポイエチン遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてトロンボポイエチン遺伝子の5713位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、及び
(11)994位塩基がGである血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子のアンチセンス鎖において994位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、994位塩基がTである血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子のアンチセンス鎖において994位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及び血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されて血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の994位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット。
以上では、(7)〜(11)からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、(7)〜(11)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば、(7)〜(10)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(7)〜(9)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００６７】
以下の(12)〜(17)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
(12)561位塩基がAであるE-セレクチン遺伝子のセンス鎖において561位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、561位塩基がCであるE-セレクチン遺伝子のセンス鎖において561位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びE-セレクチン遺伝子のアンチセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてE-セレクチン遺伝子の561位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(13)2445位塩基がGである脂肪酸結合タンパク質2遺伝子のアンチセンス鎖において2445位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、2445位塩基がAである脂肪酸結合タンパク質2遺伝子のアンチセンス鎖において2445位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及び脂肪酸結合タンパク質2遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されて脂肪酸結合タンパク質2遺伝子の2445位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(14)1018位塩基がCであるグリコプロテインIbα遺伝子のアンチセンス鎖において1018位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、1018位塩基がTであるグリコプロテインIbα遺伝子のアンチセンス鎖において1018位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びグリコプロテインIbα遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてグリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(15)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の-668位における多型部分を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された一組の核酸（第１核酸及び第２核酸）と、-668位から3'方向にGが4個連続して存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子を鋳型とし且つ前記一組の核酸を用いて増幅される核酸に対して特異的にハイブリダイズする第３核酸と、及び-668位から3'方向にGが5個連続して存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子を鋳型とし且つ前記一組の核酸を用いて増幅される核酸に対して特異的にハイブリダイズする第４核酸と、からなる核酸セット、
(16)584位塩基がGであるパラオキソナーゼ遺伝子のアンチセンス鎖において584位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、584位塩基がAであるパラオキソナーゼ遺伝子のアンチセンス鎖において584位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びパラオキソナーゼ遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてパラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、及び
(17)3932位塩基がTであるアポリポプロテインE遺伝子のアンチセンス鎖において3932位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、3932位塩基がCであるアポリポプロテインE遺伝子のアンチセンス鎖において3932位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びアポリポプロテインE遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット。
以上では、(12)〜(17)からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、(12)〜(17)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば、(12)〜(16)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位５位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(12)〜(15)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００６８】
以下の(18)〜(22)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
(18)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子の-668位における多型部分を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された一組の核酸（第１核酸及び第２核酸）と、-668位から3'方向にGが4個連続して存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子を鋳型とし且つ前記一組の核酸を用いて増幅される核酸に対して特異的にハイブリダイズする第３核酸と、及び-668位から3'方向にGが5個連続して存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子を鋳型とし且つ前記一組の核酸を用いて増幅される核酸に対して特異的にハイブリダイズする第４核酸と、からなる核酸セット、
(19)-482位塩基がCであるアポリポプロテインC-III遺伝子のアンチセンス鎖において-482位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、-482位塩基がTであるアポリポプロテインC-III遺伝子のアンチセンス鎖において-482位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びアポリポプロテインC-III遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてアポリポプロテインC-III遺伝子の-482位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(20)584位塩基がGであるパラオキソナーゼ遺伝子のアンチセンス鎖において584位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、584位塩基がAであるパラオキソナーゼ遺伝子のアンチセンス鎖において584位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びパラオキソナーゼ遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてパラオキソナーゼ遺伝子の584位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(21)1018位塩基がCであるグリコプロテインIbα遺伝子のアンチセンス鎖において1018位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、1018位塩基がTであるグリコプロテインIbα遺伝子のアンチセンス鎖において1018位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びグリコプロテインIbα遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてグリコプロテインIbα遺伝子の1018位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、及び
(22)3932位塩基がTであるアポリポプロテインE遺伝子のアンチセンス鎖において3932位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、3932位塩基がCであるアポリポプロテインE遺伝子のアンチセンス鎖において3932位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びアポリポプロテインE遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸／又は前記第２核酸とともに使用されてアポリポプロテインE遺伝子の3932位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット。
以上では、(18)〜(22)からなるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成しているが、(18)〜(22)の二つ以上を任意に選択してグループとし、かかるグループから二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成してもよい。例えば、(18)〜(21)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位４位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成したり、(18)〜(20)からなるグループ（後述の実施例においてオッズ比が上位３位までの多型を解析するための核酸セット）より二つ以上の核酸セットを選択してキットを構成することができる。
【００６９】
以上のキットにおいては、キットの使用方法に応じた一又は二以上の試薬（バッファー、反応用試薬、検出用試薬など）などを組み合わせてもよい。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【００７０】
【実施例】
＜実施例１＞  遺伝子多型の選択
PubMed[National Center for Biological Information (NCBI)], Online Mendelian inheritance in Men (NCBI), Single Nucleotide Polymorphism (NCBI)などの数種類の公的データベースを用いて、今までに報告された遺伝子の中から血管生物学、血小板・白血球生物学、凝固線溶系、脂質・糖・その他の代謝因子などの総合的側面から冠動脈硬化、冠動脈攣縮、高血圧、糖尿病、高脂血症などとの関連が推定される71遺伝子を抜粋した。さらにこれらの遺伝子に存在する多型の中でプロモーター領域やエクソンに存在するもの、あるいはスプライスドナー部位やアクセプター部位に位置し、遺伝子産物の機能変化との関連が予想されるものを中心に112多型を選択した（図１及び図２）。
【００７１】
＜実施例２＞  遺伝子多型の決定
対象は1998年7月から2001年12月の間に冠動脈形成術（バルーン拡張術またはステント挿入）のために入院した日本人1869例（男性1313例、女性556例）である。バルーン拡張術を行った冠動脈狭窄病変1390箇所（男性910箇所、女性480箇所）およびステント挿入を行った1001箇所（男性710箇所、女性291箇所）について検討した。経過観察の冠動脈造影は冠動脈形成術後6か月で行った。バルーン拡張術後の急性閉塞あるいは亜急性ステント内血栓を生じた冠動脈狭窄病変は解析から除外した。定量的冠動脈計測は拡張末期で行い、再狭窄は冠動脈形成術を行った部位の最小血管内径狭窄が50%以上と定義した。
【００７２】
それぞれの対象から静脈血7mLを50mmol/L EDTA-2Naを含むチューブに採血し、ゲノムDNAをDNA抽出キット（Qiagen, Chatsworth, CA）を用いて抽出した。一塩基多型の遺伝子型の決定は蛍光・発光法によるアリル特異的プライマー・プローブ測定システム（東洋紡ジーンアナリシス、敦賀、日本）により行った（図３及び図４を参照）。多型部位を含むDNA断片は5'末端にフルオレセインイソチオシオネート（fluorescein isothiocyanate：FITC）またはテキサスレッド（Texas red：TxR）で標識した2種類のアリル特異的センス（またはアンチセンス）プライマーと5'末端をビオチンで標識したアンチセンス（またはセンス）プライマーを用いてpolymerase chain reaction (PCR) により増幅した。また別法として、多型部位を含むDNA断片は2種類のアリル特異的センス（またはアンチセンス）プライマーと5'末端をビオチンで標識したアンチセンス（またはセンス）プライマーを用いて、またはセンスプライマーと5'末端をビオチンで標識したアンチセンスプライマーを用いてPCRにより増幅した。反応溶液 (25mL) には20ngのDNA、5pmolの各プライマー、0.2mmol/Lの各デオキシヌクレオシド三リン酸、1-4 mmol/Lの塩化マグネシウム、 1UのDNAポリメラーゼ（rTaq or KODplus; 東洋紡、大阪、日本）を含み、それぞれのDNAポリメラーゼ緩衝液を用いた。増幅プロトコールは初期変性が95℃で5分、35-45サイクルで変性が95℃で30秒、 アニーリングが55-67.5℃で30秒、伸展が72℃で30秒、そして最終伸展が72℃で2分とした。
【００７３】
蛍光法による遺伝子型の決定では、増幅したDNA を96穴プレートの各ウェルでストレプトアビジン結合磁気ビーズを含む溶液中で室温インキュベートした。このプレートを磁気スタンド上に置き、各ウェルから上清を採取し、0.01M NaOHを含む96穴プレートの各ウェルに移した後、マイクロプレートリーダーによりFITCは励起・蛍光波長が485nmと538nm、TxRは励起・蛍光波長が584nmと612 nmで蛍光を測定した。また発光法による遺伝子型の決定では、増幅したDNA を0.3M NaOHで変性させ、96穴プレートの各ウェルの底面に固定したいずれかのアリル特異的補足プローブと35-40 %ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液で37℃、30分間ハイブリダイゼーションを行った。ウェルを十分に洗浄した後、アルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジンを各ウェルに加え、プレートを37℃、15分間振騰した。ウェルを再度洗浄し、0.8mM 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium (monosodium salt)と0.4mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine saltを含む溶液を加えた後、450nmでの吸光度を測定した。
本方法による遺伝子型決定の精度を確認するために、50人のDNAサンプルを無作為に選びPCR-制限酵素断片長多型法またはPCR産物の直接塩基配列決定法を行った。いずれのサンプルにおいてもアリル特異的プライマー・プローブ測定システムにより決定された遺伝子型はPCR-制限酵素断片長多型法またはDNA塩基配列決定法によって決定されたものと同一であった。
【００７４】
尚、以下の関連解析における統計解析は次のように行った。臨床データは再狭窄病変と非再狭窄病変との間でunpaired Student's t test または Mann-Whitney U testを用いて比較した。定性的データは chi-square testで検定した。アリル頻度は gene counting methodにより推定し、Hardy-Weinberg平衡から逸脱しているかどうかはchi-square test によって検定した。本発明者らは危険因子を補正した多項ロジスティック回帰分析を行った。再狭窄を従属因子とし、年齢、body mass index (BMI)、喫煙状況 (0=非喫煙,1=喫煙)、代謝因子 (0=糖尿病・高コレステロール血症・高尿酸血症の経歴なし、1=経歴あり)、各多型の遺伝子型を独立因子とした。それぞれの遺伝子型はdominant（優性）、recessive（劣性）、additive（付加）遺伝モデルで解析し、P値、オッズ比、95%信頼区間を算出した。組み合わせ遺伝子型解析では、ロジスティック回帰分析のstepwise forward selection method によりそれぞれの遺伝子型についてのオッズ比を算出した。
【００７５】
＜実施例３＞  冠動脈形成術後再狭窄に関連する多型の選択、及び冠動脈形成術後再狭窄診断方法の開発
本発明者らは先の報告において71候補遺伝子112多型と心筋梗塞との関連解析を男性451例（心筋梗塞219例、対照232例）と女性458例（心筋梗塞226例、対照232例）について行った（Yamada Y, Izawa H, Ichihara S, et al. Genetic risk diagnosis system for myocardial infarction developed by a large acale association study of 112 gene polymorphisms in 5061 individuals(in press).）。この研究により男性で19個、女性で18個の一塩基多型が心筋梗塞発症と関連することを見出したが、それらの多型群の中には冠動脈形成術後再狭窄の候補遺伝子も含まれていた（図１、図２、図５を参照）。本実施例ではこれらの一塩基多型とバルーン拡張術後再狭窄あるいはステント内再狭窄との関連について2391冠動脈病変の大規模関連解析を行った。
【００７６】
検討した全2391冠動脈病変（男性1620病変、女性771病変）の背景データを図６と図７に示す。男性では、バルーン形成術においては、高血圧と糖尿病の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に高く、年齢が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に低かった。ステント挿入においては、喫煙、糖尿病と高尿酸血症の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に高く、年齢が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に低かった（図６）。女性では、バルーン形成術においては、年齢、喫煙と糖尿病の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に高かった。ステント挿入においては、年齢、糖尿病の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に高く、喫煙、高血圧と高尿酸血症の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に低かった（図７）。また女性においては、バルーン形成術においては、右冠動脈の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に高く、左回旋枝の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に低かった。ステント挿入においては、左前下行枝の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に高かった（図７）。
【００７７】
男性19多型、女性18多型と冠動脈形成術後再狭窄との関連解析において、年齢、BMI、および喫煙、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症、高尿酸血症の頻度を補正した多項ロジスティック回帰分析により男女それぞれにバルーン拡張術で6個、ステント挿入で5個の多型が再狭窄と有意な関連を示した(dominantまたはrecessive遺伝モデルのいずれかがP<0.05) (図８は男性例、図９は女性例のデータを示す)。
本発明者らは多項ロジスティック回帰分析のstepwise forward selection methodを行った(図１０、図１１)。本法では、図８と図９に示したそれぞれの多型の冠動脈形成術後再狭窄との関連におけるP値（より低いP値）に基づいてdominantまたはrecessive遺伝モデルを採用した。これらの遺伝子の染色体上の遺伝子座を図１０と図１１に示す。腫瘍壊死因子α遺伝子と血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ遺伝子の遺伝子座は近接しているが、両者の多型における遺伝子型の分布には関連を認めなかった。同様に、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１遺伝子とパラオキソナーゼ遺伝子の遺伝子座は近接しているが、両者の多型における遺伝子型の分布には関連を認めなかった。Stepwise forward selection methodにより算出した組み合わせ遺伝子型によるバルーン拡張術またはステント挿入後再狭窄のオッズ比を、男性については図１２、図１３と図１６Aに、女性については図１４、図１５と図１６Bに示す。男性では、5個の多型の組み合わせ遺伝子型（ApoE(3932T→C)多型、GPIa(1648A→G)多型、TNFα(-863C→A)多型、G-プロテインβ3(825C→T)多型、及びApoC-III(-482C→T)多型）により、バルーン拡張術後再狭窄の最大オッズ比が10.55となった（図１２、図１６A）。さらにもう一つの多型（AGT(-6G→A)多型）を加えた6個の多型の組み合わせ遺伝子型により、バルーン拡張術後再狭窄の最大オッズ比が15.09となった（図１６A）。同じく男性では、5個の多型の組み合わせ遺伝子型（TSP4(1186G→C)多型、TNFα(-863C→A)多型、TM(2136C→T)多型、TPO(5713A→G)多型、及びPAF-AH(994G→T)多型）により、ステント内再狭窄の最大オッズ比が6.64となった（図１３、図１６A）。女性では、5個の多型の組み合わせ遺伝子型（Eセレクチン(561A→C)多型、FABP2 (2445G→A)多型、GPIbα(1018C→T)多型、PAI1(-668/4G→5G)多型、及びPON(584G→A)多型）により、バルーン拡張術後再狭窄の最大オッズ比が37.43となった（図１４、図１６B）。さらにもう一つの多型（ApoE(3932T→C)多型）を加えた6個の多型の組み合わせ遺伝子型により、バルーン拡張術後再狭窄の最大オッズ比が44.54となった（図１６B）。同じく女性では、5個の多型の組み合わせ遺伝子型（PAI1(-668/4G→5G)多型、ApoC-III(-482C→T)多型、PON(584G→A)多型、GPIbα(1018C→T)多型、及びApoE(3932T→C)多型）により、ステント内再狭窄の最大オッズ比が117.83となった（図１５、図１６B）。
【００７８】
以上のように、多項ロジスティック回帰分析により男女共に6個の一塩基多型がバルーン拡張術後再狭窄と、5個の一塩基多型がステント内再狭窄と関連した。即ち、本発明者らは男性で19個、女性で18個の一塩基多型と冠動脈形成術後再狭窄との関連について2391冠動脈病変について大規模関連解析を行い、男女それぞれにおいてバルーン拡張術後再狭窄と関連する多型を6個、ステント内再狭窄と関連する多型を5個同定した。さらに、多項ロジスティック回帰分析のstepwise forward selection methodにより最大オッズ比が男性のバルーン拡張術後再狭窄では15.09、ステント内再狭窄では6.64、女性のバルーン拡張術後再狭窄では44.54、ステント内再狭窄では117.83を呈する組み合わせ遺伝子型を用いた冠動脈形成術後再狭窄の遺伝子リスク診断法を開発した。
【００７９】
バルーン拡張術再狭窄の主要な原因は冠動脈の慢性リモデリングであり、ステント内再狭窄の主要な原因は新生内膜肥厚である（Mintz GS, Popma JJ, Pichard AD, et al. Arterial remodeling after coronary angioplasty: a serial intravascular ultrasound study. Circulation 1996;94:35-43.; Hoffmann R, Mintz GS, Dussaillant GR, et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation 1996;94:1247-54.）。本発明者らは血管生物学、血小板・白血球生物学、線溶系、脂質・糖・その他の代謝因子などの包括的視点に基づいて男性19個、女性18個の一塩基多型と冠動脈形成術後再狭窄との関連について検討した。実際、再狭窄と関連した遺伝子群はその病態において多彩な役割を有していた。バルーン拡張術後再狭窄と関連した遺伝子は血管生物学（G-プロテインβ3サブユニット及びE セレクチン）、血管の炎症（腫瘍壊死因子）、高血圧（アンギオテンシノーゲン）、脂質代謝（アポリポプロテインE、アポリポプロテインC-III、脂肪酸結合タンパク質2、及びパラオキソナーゼ）、血小板機能（グリコプロテインIa、及びグリコプロテインIbα）、線溶系（プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1）などに役割を有していた。また、ステント内再狭窄と関連した遺伝子は血管生物学（トロンボスポンジン4）、血管の炎症（腫瘍壊死因子α、及び血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ）、脂質代謝（アポリポプロテインE、アポリポプロテインC-III 、及びパラオキソナーゼ）、血小板機能（トロンボモジュリン、トロンボポイエチン、及びグリコプロテインIbα）、線溶系（プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1）などに役割を有していた。男性においては1個の多型（腫瘍壊死因子α遺伝子）がバルーン拡張術後再狭窄とステント内再狭窄の両者に関連し、女性においては4個の多型（プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1遺伝子 、パラオキソナーゼ遺伝子、グリコプロテインIbα遺伝子、及びアポリポプロテインE遺伝子）がバルーン拡張術後再狭窄とステント内再狭窄の両者に関連した。本発明の遺伝子リスク診断方法は冠動脈形成術後再狭窄の最大オッズ比が、バルーン拡張術再狭窄においては男性で15.09、女性で44.54を呈し、ステント内再狭窄では男性で6.64、女性で117.83を呈し、今までに報告された関連解析の中で最大のオッズ比を示した。
【００８０】
冠動脈形成術後再狭窄と関連した15個の多型のうち、アポリポプロテインE（van Bockxmeer FM, Mamotte CDS, Gibbons FR, Taylor RR. Apolipoprotein ε4 homozygosity-a determinant of restenosis after coronary angioplasty. Atherosclerosis 1994;110:195-202.）、アンギオテンシノーゲン（Volzke H, Hertwig S, Rettig R, Motz W. The angiotensinogen gene 235T variant is associated with an increased risk of restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty. Clin Sci 2000;99:19-25.）、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1（Ortlepp JR, Hoffmann R, Killian A, Lauscher J, Merkelbach-Brese S, Hanrath P. The 4G/5G promoter polymorphism of the plasminogen activator inhibitor-1 gene and late luminal loss after coronary stent placement in smoking and nonsmoking patients. Clin Cardiol 2001;24:585-591.）、及びEセレクチン（Rauchhaus M, Gross M, Schulz S, et al. The E-selectin SER123ARG gene polymorphism and restenosis after successful coronary angioplasty. Int J Cardiol 2002;83:249-257.）の遺伝子多型については再狭窄との関連が今までに報告されている。グリコプロテインIa遺伝子（von Beckerath N, Koch W, Mehilli J, et al. Glycoprotein Ia C807T polymorphism and risk of restenosis following coronary stenting. Atherosclerosis 2001;156:463-468.）とG-プロテインβ3サブユニット（von Beckerath N, Kastrati A, Koch W, et al. G protein β3 subunit polymorphism and risk of thrombosis and restenosis following coronary stent placement. Atherosclerosis 2000;149:151-155.）遺伝子は再狭窄の機序において重要であると考えられるが（Matsuno H, Kozawa O, Niwa M, Uematsu T. Inhibition of von Willebrand factor binding to platelet GP Ib by a fractionated aurintricarboxylic acid prevents restenosis after vascular injury in hamster carotid artery. Circulation 1997;96:1299-304.; Iaccarino G, Smithwick LA, Lefkowitz RJ, Koch WJ. Targeting Gβγsignaling in arterial vascular smooth muscle proliferation: a novel atrategy to limit restenosis. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:3945-50.）、本発明者らの結果とは逆に、以前の報告ではそれらの多型と再狭窄との関連は認められなかった。その他の9個の多型については、冠動脈形成術後再狭窄と関連については検討されていない。それらの多型の中で、腫瘍壊死因子α（Clausell N, de Lima VC, Molossi S, et al. Expression of tumor necrosis factor ? and accumulation of fibronectin in coronary artery restenotic lesions retrieved by atherectomy. Br Heart J 1995;73:534-9.） とグリコプロテインIbα（Gawaz M, Neumann FJ, Ott I, May A, Rudiger S, Schomig A. Changes in membrane glycoproteins of circulating platelets after coronary stent implantation. Heart 1996;76:166-72.） は再狭窄の病態において重要な役割を有すると考えられる。
【００８１】
本実施例で検討した多型のいくつかは、その近傍に存在する冠動脈形成術後再狭窄と真に関連する遺伝子の多型と連鎖不平衡にある可能性がある。しかしながら、本発明者らの結果は男性で10個、女性で7個の遺伝子が日本人の冠動脈形成術後再狭窄感受性遺伝子座であることを示した。さらに、これらの遺伝子多型の組み合わせ遺伝子型はバルーン拡張術後再狭窄またはステント内再狭窄の遺伝的リスク診断に有用であることも示した。本発明の遺伝子リスク診断方法は冠動脈形成術後再狭窄の予知および最も適切な治療法の選択に有用な情報を提供することにより、冠動脈疾患患者の生活の質の改善のみならず医療費の削減に貢献できると考えられる。
【００８２】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００８３】
【発明の効果】
本発明によれば冠動脈形成術後の再狭窄に関連する遺伝子多型が解析され、そして核酸試料の遺伝子型が検出される。この遺伝子型の検出によって得られる多型情報を用いることにより、冠動脈形成術後の再狭窄について高精度で予知確率の高いリスク診断を行うことができる。即ち、本発明は特定の冠動脈形成術を施した後に再狭窄が生ずるリスクを事前に知る有効な手段となる。従って、本発明は最適な治療法を選択するための有用な情報を提供することとなり、適切な治療法の選択を可能とし、もって高い治療効果の実現、及び冠動脈疾患患者の生活の質の向上を図ることができる。更には、不適切な治療を繰り返すことによる治療費の増大といった問題を解決することができ、即ち医療経済への多大な貢献が期待される。一方で本発明は、再狭窄が生ずるメカニズムを解明する上での有用な情報を提供することから、再狭窄の予防法の確立にとって極めて重要な一手段ともなる。
【００８４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例におけるスクリーニング関連解析において検討した112遺伝子多型をまとめた表である。
【図２】図２は同じく実施例におけるスクリーニング関連解析において検討した112遺伝子多型をまとめた表である。
【図３】図３は実施例において遺伝子型を決定するために使用されるプライマー（上から順に配列番号３１、３２、３３、２８、２９、３０、１６、１７、１８、４６、４７、４８、４９、５０、５１、２５、２６、２７、１９、２０、２１、５２、５３、５４、５７、５８、５９、５５、５６）、プローブ（上から順に配列番号６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７）及びその他の条件をまとめた表である。図中、FITCはフルオレセインイソチオシアネートを、TxRはテキサスレッドを、Biotinはビオチンをそれぞれ表す。
【図４】図４は同じく実施例において遺伝子型を決定するために使用されるプライマー（上から順に配列番号４３、４４、４５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、３４、３５、３６、２２、２３、２４）及びその他の条件をまとめた表である。図中、FITCはフルオレセインイソチオシアネートを、TxRはテキサスレッドを、Biotinはビオチンをそれぞれ表す。
【図５】図５は実施例の関連解析において検討した一塩基多型をまとめた表である。
【図６】図６は実施例における関連解析の対象とした男性1620病変の背景データをまとめた表である。各データは平均±標準偏差、又は％で表される。表中、*1はP<0.0001（再狭窄なしに対して）を、*2はP<0.001（再狭窄なしに対して）を、*3はP<0.05（再狭窄なしに対して）を、*4はP<0.005（再狭窄なしに対して）をそれぞれ表す。
【図７】図７は実施例における関連解析の対象とした女性771病変の背景データをまとめた表である。各データは平均±標準偏差、又は％で表される。表中、*1はP<0.005（再狭窄なしに対して）を、*2はP<0.05（再狭窄なしに対して）を、*3はP<0.0001（再狭窄なしに対して）を、*4はP<0.001（再狭窄なしに対して）をそれぞれ表す。
【図８】図８は関連解析の対象とした遺伝子多型と多項ロジスティック回帰分析の結果（男性例）をまとめた表である。
【図９】図９は関連解析の対象とした遺伝子多型と多項ロジスティック回帰分析の結果（女性例）をまとめた表である。
【図１０】図１０は冠動脈形成術後再狭窄と関連のある遺伝子多型における多項ロジスティック回帰分析のstep forward selection methodを行った結果（男性例）を示す表である。
【図１１】図１１は冠動脈形成術後再狭窄と関連のある遺伝子多型における多項ロジスティック回帰分析のstep forward selection methodを行った結果（女性例）を示す表である。
【図１２】図１２は男性における５個の組合せ遺伝子多型を用いたバルーン拡張術後再狭窄の遺伝的リスク診断を行った結果を示す表である。
【図１３】図１３は男性における５個の組合せ遺伝子多型を用いたステント挿入後再狭窄の遺伝的リスク診断を行った結果を示す表である。
【図１４】図１４は、女性における５個の組合せ遺伝子多型を用いたバルーン拡張術後再狭窄の遺伝的リスク診断を行った結果を示す表である。
【図１５】図１５は女性における５個の組合せ遺伝子多型を用いたステント挿入後再狭窄の遺伝的リスク診断を行った結果を示す表である。
【図１６】図１６は冠動脈形成術後再狭窄の累積オッズ比と一塩基多型の数の関連を表したグラフである。バルーン拡張術後再狭窄は（○）で、ステント挿入後再狭窄は（●）で表され、（A）は男性、(B)は女性における関連を示す。(A)のバルーン拡張術後再狭窄における各SNPは、SNP1:ApoE(3932T→C)多型、SNP2:GPIa(1648A→G)多型、SNP3:TNFα(-863C→A)多型、SNP4:G-プロテインβ3(825C→T)多型、SNP5:ApoC-III(-482C→T)多型、SNP6:AGT(-6G→A)多型である。同様にステント挿入後再狭窄における各SNPは、SNP1:TSP4(1186G→C)多型、SNP2:TNFα(-863C→A)多型、SNP3:TM(2136C→T)多型、SNP4:TPO(5713A→G)多型、SNP5:PAF-AH(994G→T)である。（B）のバルーン拡張術後再狭窄における各SNPは、SNP1:Eセレクチン(561A→C)多型、SNP2:FABP2 (2445G→A)多型、 SNP3: GPIbα(1018C→T)多型、SNP4:PAI1(-668/4G→5G)多型、SNP5:PON(584G→A)多型、SNP6:ApoE(3932T→CPAI1)多型である。同様にステント挿入後再狭窄における各SNPは、SNP1:PAI1(-668/4G→5G)多型、SNP2:ApoC-III(-482C→T)多型、SNP3:PON(584G→A)多型、SNP4:GPIbα(1018C→T)多型、SNP5:ApoE(3932T→C)多型である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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