(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸、核酸類似体、およびアミノ酸含有物質から選択された少なくとも分子性物質を、原核細胞またはヒトを除く真核細胞もしくは単離ヒト細胞に導入する方法であって、前記アミノ酸含有物質は、蛋白質、ペプチド、ペプチドホルモン、酵素、蛋白質ドメイン、糖蛋白質、またはリポ蛋白質であり、
−前記分子性物質と、原核生物のＨＵ蛋白質との複合体を形成するために、導入される前記分子性物質を、前記原核生物のＨＵ蛋白質と接触させる工程と、
−続いて、前記複合体を原核生物または真核生物の標的細胞内に導入するために、前記分子性物質と原核生物のＨＵ蛋白質との前記複合体を、前記原核細胞またはヒトを除く真核細胞もしくは単離ヒト細胞と接触させる工程と、を含む方法。
【請求項２】
核酸として、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、プラスミド形式のＤＮＡ、染色体断片、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＲＮＡ、ヌクレオチド、染色体ＤＮＡ、もしくはコードｍＲＮＡが導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸として、コード配列を備えたＤＮＡが使用され、それが標的細胞内で発現されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記使用された核酸が、コンパクト化されて、原核生物のＨＵ蛋白質と接触することにより分解から防護されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
核酸類似体として、ＰＮＡ（ペプチド核酸）が導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
核酸または核酸類似体と、原核生物のＨＵ蛋白質との複合体が、可逆性であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
植物細胞または動物細胞またはヒト細胞にＤＮＡを導入するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アミノ酸含有物質と原核生物のＨＵ蛋白質との複合体形成が、共有または非共有結合により起こることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アミノ酸含有物質として、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）が導入されることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記原核生物のＨＵ蛋白質が、好冷性、中温性、好熱性、または超好熱性生物に由来することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
原核生物のＨＵ蛋白質として、ＴｍＨＵ（Thermotoga maritime ＨＵ蛋白質）、Ｓｓｏ７ｄ（Sulfolobus solfataricus およびSulfolobus acidocaldarius 由来）、Ｓｓｈ７（Sulfolobus shibatae 由来）、Ｓａｃ７ｄ（Sulfolobus solfataricus およびSulfolobus acidocaldarius 由来）、ＢｓｔＨＵ（Bacillus stearothermophilus 由来）、ＨＵ（Escherichia coli由来）、ＩＨＦ（Escherichia coli由来）、ＢｓｕＨＵ（Bacillus subtilis 由来）、ＳａＨＵ（Sulfolobus acidocaldarius 由来）、ＢｂｕＨＵ（Borrelia burgdorferi由来）、ＢｇａＨＵ（Borrelia garinii由来）、ＢａｆＨＵ（Borrelia afzelii由来）、ＩＨＦ（Pseudomonas aeruginosa由来）、ＤＮＡ結合蛋白質（Chlamidia spp.）、Ｈｓａ（Staphylococcus aureus 由来）、ＲＩＨＵ（Rhizobium leguminosarum 由来）、ＨＳｌ（Streptomyces lividans 由来）、ＨＣｊ（Campylobacter jejuni由来）、ＨＵ（Bacillus caldolyticus 由来）、ＨＵ（Bacillus caldotenax 由来）、ＨＵ（Bacillus globigii 由来）、ＨＣｃ（Caulobacter crescentus由来）、ＤＮＡ結合蛋白質（Deniococcus radiodurans 由来）、ＨＳａ（Sulfolobus acidocaldarius 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Streptococcus gordonii由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Streptococcus mutans由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Streptococcus pygenes 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Streptococcus thermophilus由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Haemophilus influenzae Rd 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Listera monocytogenes 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Serratia marcescens 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Salmonella typhimurium由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Thermus aquaticus 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Rhizobium meliloti由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Pseudomonas putida由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Mycobacterium tuberculosis由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Mycobacterium leprae由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Zymomonas mobilis由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Yersinia pseudotuberculosis 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Mycobacterium bovis 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Mycoplasma hyopneumoniae由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Mycobacterium smegmatis由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Helicobacter pylori 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Aquifex aeolicus由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Agrobacterium tumefaciens 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Pseudomonas aeruginosa由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Helicobacter pylori 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Xanthomonas campestris由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Vibrio proteolyticus由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Streptomyces lividans 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Rickettsia prowazekii 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Streptomyces coelicolor 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Mycoplasma capricolum 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Borrelia burgdorferi由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Borrelia japonica 由来）、ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質（Borrelia andersonii 由来）、またはＨＴａ（Thermoplasma acidophilum由来）が使用されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記原核生物のＨＵ蛋白質が前記細胞標的の表面構造と結合するペプチドまたは蛋白質と融合されることにより、前記標的細胞への取込み効率の増加または改良が起こることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記原核生物のＨＵ蛋白質がエンドソーム放出を実行する蛋白質または核局在シグナル配列を有するペプチドと融合されることにより、導入された前記分子性物質の、標的細胞のエンドソームからの放出増加が達成されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記原核生物のＨＵ蛋白質が標的細胞の表面のレセプタ分子に結合する蛋白質または蛋白質ドメインに結合されることにより、前記分子性物質と前記原核生物のＨＵ蛋白質との前記複合体が標的細胞の表面のレセプタ分子と結合することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記分子性物質と前記原核生物のＨＵ蛋白質との前記複合体を標的細胞とインキュベーションする前に、リポソーム膜またはポリエチレングリコールによる前記複合体のラッピングが起こることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、核酸および／または核酸類似体、ならびに／もしくは核酸および／または核酸類似体および／またはアミノ酸含有物質（特に、プラスミド形式のＤＮＡ等の核酸）を、原核細胞および／または真核細胞に導入する方法に関する。
【０００２】
（発明の分野および現行技術）
トランスフェクションは、細胞内での遺伝子発現のために核酸（ヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または特にプラスミド形式のＤＮＡ、染色体、または染色体断片など）を導入することである。用語「導入」は、この場合の類似語であり、一般的な言語使用において用語「トランスフェクション」は、特に遺伝子導入のために用いられる。核酸の導入とは別に、追加の活性物質（蛋白質、ペプチド、治療薬、およびその他の分子性物質など）の低方向の効率的な導入は、大いに関心を集めている。その導入プロセスは、生物医学の基礎研究および製薬−生物工学業界の両方にとって、本質的意義がある。翻訳の後でも蛋白質を引き続き修飾する修飾機構は、原核生物内では大抵存在しないか、または著しく異なる方法であるため、一部の蛋白質（特に治療に関連するもの）は、真核細胞内で生産した時のみ正しく処理される。これに対して、その他の蛋白質は、大量に、経済的に、そして容易に生産することができるため、原核生物の宿主細胞内での生産が有利である。その上、一定の遺伝子のトランスフェクションおよび標的発現は、生物学的プロセスの特徴付けおよび分析のための細胞および分子生物学の重要なツールである。植物細胞のトランスフェクションは、新しい性質および成分を含む植物（形質転換植物）または除草剤耐性植物の生産に関する植物テクノロジーの重要な方法である。最後に、生物医学研究の枠組み内では、細胞は、エフェクタとして（例えば、いわゆるアンチセンス技術による蛋白質合成の特異的阻害物質として）細胞内で有効になる、一本鎖核酸（ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ）または核酸類似体（例えばペプチド核酸、ＰＮＡ）を適切にトランスフェクトされる。これらのプロセスおよび方法全てにより、関連の核酸を特異的に導入するトランスフェクションは、重要なプロセス工程である。
【０００３】
同様に、細胞内に蛋白質またはペプチドを直接輸送し得るプロセスが関連し、その最も重要な用途が治療である。例えば、細胞内抗体を用いて、細胞内の特異的病原を認識し、それを阻害することができる。これを達成する方法の１つが、標的細胞内への巨大分子のエレクトロポレーションであるが、この方法は、インビボでしか利用できず、効率が低く、細胞の損失率が比較的高い（E. J. Verspohl, I. Kaiserling-Buddemeier, A. Wienecke, Introducing specific antibodies into electro-permeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions, Cell. Biochem. Funct. Vol. 15, pp. 127-134, 1997を参照）。
【０００４】
核酸を細胞に導入するために、現行技術による方法が複数知られている。それらの中には、蛋白質の導入としてこれまで挙げたプロセスのように、電場に接続することにより細胞膜が穿孔されることでより大きな巨大分子が透過可能になるエレクトロポレーション等の物理学的プロセスがある。しかし、エレクトロポレーションは、感受性細胞では困難であることが多く、細胞生存率が低くなることが多い。真核細胞の場合、現行技術によれば、例えばリン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、または（例えばＤＥＡＥ−（ジエチルアミノエチル−）デキストランおよびＤＮＡからの）高分子複合体の形成（Y. W. Yang & J. C. Yang, ''Studies of DEAE-dextran-mediated gene transfer'', Biotechnol. Appl. Biochem. 1997, Vol.25, pp. 47-51 を参照）、またはＤＮＡによるデンドリマーの形成（J. F. Kukowska-Latallo, A. U. Bielinska, J. Johnson, R. Spindler, D. A. Tomalia, & J. R. Baker Jr., ''Efficient transfer of genetic material into mammalian cells using Starburst polyamidoamine dendrimers'', Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996, Vol. 93, pp4897-4902 を参照）等の化学的方法が用いられることが最も多い。これらのトランスフェクション試薬の根本原理は、第一に、長さが長く機械的に堅い核酸の鎖をコンパクト化することであり、そのようなコンパクト化は、ほとんどの場合、細胞内への核酸の有効な取込みを行う際の重要な必要条件である。任意選択で、これは、例えば純粋ポリリシンまたは修飾ポリリシンのようなポリカチオンにより達成される（例えば、ＰＣＴ国際公開第９８／０６８６９号を参照）。
【０００５】
医学−製薬学的適用では、カチオン脂質を基にしたリポソームベースの系が、トランスフェクションにとって好ましいことが多い。なぜなら、そのような系は、高効率という利点を有するためである。それにより、種々の供給源および組成のカチオンリポソーム内への核酸の封入が起こる（Invitrogenの市販品PerFect 、Roche のFuGene、Life Technologies のLipofectamine 、Biontex のPolyFection 、およびStrategene  のLipoTaxiを参照）。包括的な最新レビューを、R. J. Lee & L. Huang, ''Lipidic vector systems for gene transfer'', Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1997, Vol. 14, pp. 173-206に見出すことができる。主に使用リポソームの調製による差異が存在する、対応の国際出願が多数存在する。
【０００６】
しかし、上記の列挙した技術および試薬は、異なる特有の欠点を有する。一方で、（リポソームベースの製品以外の）既存の系は、かなり非効率的で、トランスフェクトされる細胞の収率がわずかしかない。他方で、特に有効な（リポソームベースの）試薬は、特に感受性のある真核生物に対する毒性が増加する。その他の不都合な性質も、記載されている（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランによる付着性真核生物のトランスフェクションの際、非常に弱く付着した細胞は、好ましくないことに細胞培養皿の底から分離する）。更に、細胞に直接毒性がないトランスフェクション剤は、トランスフェクション後の細胞に影響を及ぼす性質を示す可能性がある。加えて、デンドリマー（Qiagenの製品SuperFect ）のような既存の新世代薬剤は、一定の用途ではわずかしか毒性が無いが、製造にかなり手がかかり、このため高価となる。最後に、今日のトランスフェクションプロトコールの多くは、ユーザーによる操作を多く必要とし、このため使用が複雑で骨が折れるものである。これは、トランスフェクションアッセイの再現性に悪影響を及ぼす可能性がある。製造業者が指示するトランスフェクションの標準的プロトコールは、細胞種ごとに個別に修正し、かつ最大収率に達するよう毎回、再度最適化されなければならない。トランスフェクション剤は、二本鎖ＤＮＡの輸送にのみ適しており、一本鎖核酸にはほとんど適さず、例えば蛋白質またはペプチドのようなその他の分子性物質には決して実用的でない。大事なことをひとつ言い残したが、それぞれが１つまたは少数の分子種からなる通常のトランスフェクション剤は、そのために使用による変動性はあまりない。
【０００７】
技術の現状に従って以上に列挙した欠点を、排除または低減することが、本発明の課題である。そのため本発明によれば、核酸および／または核酸類似体、ならびに／もしくは核酸および／または核酸類似体および／またはアミノ酸含有物質を、原核細胞および／または真核細胞に導入する請求項１に記載の方法であって、
−核酸、核酸類似体、もしくは、核酸または核酸類似体またはアミノ酸含有物質と、原核生物の核酸結合蛋白質とから複合体を形成するために、導入される核酸、核酸類似体、もしくは核酸または核酸類似体またはアミノ酸含有物質を、核酸結合蛋白質と接触させる工程と、
−続いて、前記複合体を原核生物または真核生物の標的細胞内に導入するために、核酸、核酸類似体、および／もしくは核酸または核酸類似体またはアミノ酸含有物質と原核生物の核酸結合蛋白質との前記複合体を、前記細胞と接触させる工程と、から成る方法が提供される。
【０００８】
本発明の有利な適用形態は、以下の説明の従属請求項から得られる。
（説明）
本発明は、核酸、核酸類似体、および／もしくは、核酸または核酸類似体またはアミノ酸含有物質（特に、プラスミド形式のＤＮＡ等の核酸）を、原核細胞または真核細胞に導入する方法に関する。
【０００９】
これを達成するために、原核生物の核酸結合蛋白質が、適切なインキュベーション条件下で、導入物質に共有結合されるか、または導入核酸との非共有結合により結合され、この複合体は標的細胞に付加される。ＤＮＡ縮合に対する原核生物の核酸結合蛋白質の特性は、この場合ＤＮＡベースの活性物質の導入に著しく好適である。取込み制御および効率増大のために、原核生物の核酸結合蛋白質は、（例えば別の融合物の形式で）別の特徴を示してもよい。細胞は、それぞれが蛋白質および核酸である蛋白質と活性物質の複合体を、内部移行させる。異なる形式を、図１に概略的に示す。
【００１０】
導入では、好ましくは熱安定性生物由来、より好ましくは超好熱性生物由来の原核生物の核酸結合蛋白質が用いられる。導入すべき物質として核酸を用いる場合、その核酸結合蛋白質は、核酸と可逆的複合体を形成し、原核生物蛋白質は、核酸を縮合してコンパクト化する。これにより、複合体は、望まない効果（例えばヌクレアーゼによる分解）から防護される。そのようにして縮合された核酸分子は、各インキュベーション後に、真核細胞の細胞膜または原核細胞の細胞壁を通して、これらの細胞内に受動的または能動的に取り込むことができる。対応するＤＮＡ（例えばプラスミド）の形式のコード遺伝子が核酸として用いられる場合、続いて遺伝子を標的細胞内で発現することができる。他方、輸送される分子性物質として蛋白質またはペプチドが用いられる場合、導入される蛋白質またはペプチドと、導入する蛋白質との遺伝子技術レベルの融合が好適である。効率を増大させるために、核酸結合蛋白質を蛋白質またはペプチドを基にしたエフェクタと結合（融合）することができる。その上、その配列内で核のトランスロケーションの典型的特徴を示す蛋白質を使用することが、有利となり得る。
【００１１】
その上、脂質、ポリエチレングリコール、またはその他の分子による複合体のラッピングは、効率増大に、そして複合体の生物学的性質に有利となり得る。
核酸のトランスフェクションに重要な特徴は、該核酸の縮合である。核酸分子は、通常、溶液内ではほとんど可撓性を有さない長い不撓性構造を保有する。遺伝子の包括的コード長により、ＤＮＡは非常に長くなる可能性があり、これによりトランスフェクションに好適でない物理的性質を示す。本発明における縮合は、ＤＮＡ鎖の凝集により、好適でないＤＮＡ長／ＤＮＡ径の比を低下させること、または環状プラスミドをコンパクト構造に（即ち小さい容積に）縮小させることである。
【００１２】
最適な縮合は、ほぼ球状の構造を生成させることが特徴である。核酸の縮合は、縮合剤の存在を必要条件としており、この場合のこれらの縮合剤の通例的機能は、ＤＮＡおよびその他の核酸のポリリン酸バックボーンの負電荷を補うことである。
【００１３】
本発明の条件により、原核生物の核酸結合蛋白質は、有利には超好熱性生物、即ち７５℃を超える温度で存在する生物に由来する。これらの生物に由来する蛋白質の利点は、とりわけ、その特別な安定性により非常に容易に取扱うことができ、そして例えば精製および保存時に試薬を冷却する必要ない、という事実に存在する。その上、これらの生物に由来する蛋白質は、Escherichia coliでの組換え技術で容易に且つ高収率で製造および精製することができる。そのため、変性に対する安定性が高い蛋白質を用いて、かなり厳密な条件下で精製を実施することができ、このため（例えば、細菌のリポ多糖（エンドキシン）、ＤＮａｓｅ、プロテイナーゼ、ＲＮａｓｅによっても）、調製での可能な混入が回避され、とりわけ一般的分析方法の検出限界未満の最小限にまで混入を抑える。これを援助するのが、本発明で優先的に用いられ、分光分析では２６０〜３００ｎｍの波長範囲で透過性の、蛋白質ＴｍＨＵ（Thermotoga maritime ＨＵ蛋白質）の性質である。これにより核酸およびその他の蛋白質の混入を迅速に、高い感受性で容易に分光分析することができる。（特に、細菌エンドトキシンのみならずプロテイナーゼ、ＤＮａｓｅ、およびＲＮａｓｅの）混入は、導入の結果に影響を及ぼす可能性があるため、本発明による核酸、核酸類似体、および／またはアミノ酸含有物質は、再現性のある効率的な導入率を得るためには、導入試薬の純粋な調製物であることが好ましい。これは、特に導入効率の低いプロセスでは、感受性細胞にそれぞれ適用される。
【００１４】
ヒストンは、主に非特異的または完全に非特異的に核酸に結合する真核細胞核の蛋白質であり、その目的は主に、（例えば、該蛋白質に起因する、電荷中和および疎水性効果により）ＤＮＡをコンパクト化（縮合）することからなる。このためヒストンは、細胞核内のＤＮＡの有効な空間の要件を削減する。ヒストン様蛋白質は、現在の見識によると、単純構造の（核の無い）原核生物内で類似の任務を果たす。例えば、超好熱性生物Thermotoga maritima のＤＮＡ結合蛋白質（ヒストン様蛋白質）は、安定性に関してのみならず取扱い易さおよび構造複雑性の低さに関しても、真核生物ヒストンに由来するものより優れている。例えば、真核生物ヒストンは、８個以下の異なる蛋白質サブユニットの会合体であり、各サブユニットは全て別々に生成されて、ＤＮＡと共に１つの複合体に組立てられなければない。これは、インビトロでの障害であり、手がかかる。では、原核生物ヒストン様蛋白質（好ましくは超好熱性生物Thermotoga maritima に由来するＨＵ蛋白質のもの）が用いられる。
【００１５】
本願発明者により実施されたテストにより、意外にも、超好熱性真正細菌Thermotoga maritima （Thermotogales の種）からの原核生物ＤＮＡ結合ヒストン様蛋白質ＨＵ（以後ＴｍＨＵと呼ぶ）が、核酸と結合し、これを防護および縮合するのみならず、加えてこれらの核酸を異なる細胞種に極めて有効に輸送し得ることが示された。それにより、後の遺伝子発現の効率は、細胞毒性の認識信号を含まない同等に確証された薬剤よりも有意に高くなる。その導入プロトコールは、簡便且つ堅実で、導入の実行にかかる時間は非常に短い。
【００１６】
同様に、ＴｍＨＵに融合されたアミノ酸含有物質（例えば、蛋白質またはペプチド、好ましくは蛋白質）が、ＴｍＨＵの取込み効果により標的細胞に取り込まれることも示すことができた。
【００１７】
加えて、ヒストン様蛋白質が、組換え技術により細菌Escherichia coli内で非常に高収率で産生でき、容易に且つ費用効果的に分光分析的に純粋な形態で単離できるというその環境が、有利であることが立証されている。例えば、超好熱性源は、低温条件下での蛋白質の調製および保存を必要としない。加えて、洗浄の主な工程であるEscherichia coli宿主蛋白質の塊からのＨＵ蛋白質の分離は、簡便な熱沈降法により行われ、その場合ほとんどわずかな熱安定性ＴｍＨＵ蛋白質しか溶液に残留しない。
【００１８】
ＴｍＨＵ蛋白質が細胞のトランスフェクションに関する優れた性質を表すことが示された。この蛋白質は、核酸を安定な複合体にコンパクト化（縮合）する。これにより、ヌクレアーゼによる核酸の分解に対する完全な防護がもたらされる。その複合体は、細胞内に効率的に取り込まれる。
【００１９】
その上、ペプチドまたは蛋白質もまた、遺伝子技術によりＴｍＨＵ蛋白質に融合することができ、これは複合体の性質を変化させる。これにより、修飾ＴｍＨＵ蛋白質は、細胞内への取込み効率の増大または取込みの指向（定方向への方向付け）を可能にする。修飾としては、例えば、細胞表面構造と結合するペプチドを考えると、配列モチーフアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）を備えたペプチドが、好ましくは細胞表面に存在することが多いανβ3 またはανβ5 型のインテグリンに結合することが知られている。その他のペプチドモチーフでは、それらが両親媒性構造の性質により真核細胞膜に挿入させ、これにより細胞による分子の取込みを可能にすることが知られている。最後に、取込み効率の増大および細胞種の特定化は、エフェクタとして細胞表面レセプタに結合する蛋白質または蛋白質ドメインの使用によっても達成することができる。この例が、（一部の腫瘍細胞種で過剰発現された）上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）レセプタに非常に特異的に結合し得るＥＧＦである。これにより、ＴｍＨＵ／ＥＧＦ−ＤＮＡ−複合体の取込みは、そのような腫瘍細胞内へ特異的に行うことができる。しかし、細胞内での複合体の取込み後であっても、付着した機能的ドメインは、効率増大に寄与することができる。
【００２０】
例として、エンドソーム放出を実行する蛋白質およびＮＬＳ（ＮＬＳ：核局在シグナル）配列による真核細胞核への標的取込みのためのペプチドを挙げる。その環境から更に分離するため、そして適用可能ならばトランスフェクション効率を増大させるための、蛋白質／核酸複合体のラッピングを、リポソーム膜でラッピングすることにより達成することができる。現行の技術に基づけば、リポソームは容易に生成することができ、それによりリポソームへの蛋白質／核酸複合体の受動的封入が起こる。これらの構造は、生物内でのインビボ使用では免疫原性の低減という利点を有する。加えて、リポソームの包皮と細胞膜との融合により、細胞の取込み増大を起こすことができる。蛋白質／核酸複合体のキャプシド形成は、その他の分子性物質の使用によっても（例えば、分子量２０００Ｄａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００）によっても）起こり得る。現行の技術により、そのようなＰＥＧイニレーションがインビボ適用で免疫反応の有意な低下を導くことが、既に実証されている（例えば、M. D. Scott & K. L. Murad による要約''Cellular camouflage: fooling the immune system with polymers'', Curr. Pharm. Des. 1998, Vol. 4, pp. 423-438 を参照）。
【００２１】
細胞内の核酸、核酸類似体、および／またはアミノ酸含有物質の導入は、レポータ遺伝子のトランスフェクションのためのコードＤＮＡ配列の導入だけでなく標的細胞内での蛋白質（ＧＦＰ）の導入を利用して、以下の実施例それぞれに実証されている。原核生物蛋白質として、記載された方法に非常に適することが立証されたThermotoga maritima からのＨＵ蛋白質が、ここでは用いられている。ＨＵ蛋白質は、Robins, Dilworth, Laskey, and Dingwall, Cell 64, pp. 615-623, 1991によるトランスロケーション配列ＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫと同等に、真核細胞に蛋白質を導入することによる核のトランスロケーションのための典型的性質を２つ有しており、これによりそれに関連する蛋白質および分子性物質（ＤＮＡ、蛋白質）の核トランスロケーションが、９５％を超える確率で保証される（現行技術で用いられたコンピュータプログラムＰＳＯＲＴIIで確認された）。特に細胞内ＤＮＡの導入では、この核のトランスロケーションは、その方法での大きな効率に重大な意味を有する。しかし、以下の実施例８は、その蛋白質が細胞内ＤＮＡのみならず、ＴｍＨＵに結合した蛋白質にも導入できることを明瞭に示している。このように、その蛋白質は、真核細胞膜を通過する有利な性質も有している。
【００２２】
ＥＧＦのようなレセプタ結合モジュールの結合により（以下の実施例６を参照）、細胞内への定方向の取込みも、これにより達成することができる。
ＴｍＨＵ蛋白質の特別な利点は、以下に列挙した実施例における毒性の欠如と、付着細胞がトランスフェクション時に細胞培養器から剥離されないことである。この性質により、その蛋白質と、リポソームまたは合成化合物（デンドリマー）のような他のトランスフェクション剤とが区別される。同時に、超好熱性生物からの供給源に対するＴｍＨＵの性質は、そのシステムを使用するための特別な利点を構成する要素である。こうして、組換え産物は特に単純で、蛋白質調製物の純度が高いことが保証される。その蛋白質の熱安定性が極めて高いことにより、他の点で好ましくない環境条件下であっても長期間安定に保存することができる。特に、トランスフェクションに必要な蛋白質／核酸複合体を高温で生成することが可能である。ＤＮＡを適切な質量比でＴｍＨＵと混合して、約０．５〜１０分間という短時間高温（約９０℃）にする場合、高度のトランスロケーション効率に特に適した微細沈殿が、ＤＮＡおよびＴｍＨＵから形成される。そのような可能性は、超好熱性核酸結合蛋白質が用いられる場合しか得られない。通例の室温条件での核酸とＴｍＨＵ蛋白質とのインキュベーションは、０．５〜１８０分であり、６０分のインキュベーション時間があれば通常は十分である。核酸をＴｍＨＵで導入する際、複合体の生成時にＴｍＨＵ／ＤＮＡ混合物に複合体形成を加速するカルシウムを添加することが有利となることが立証されている。室温または高温のいずれかで形成した沈殿と標的細胞とのインキュベーションは、細胞種および適用例に応じて３０秒〜数日の範囲内である。
【００２３】
本発明に特に適するのは、上記のものに由来する好熱性生物（特に超好熱性原核生物）からの核酸結合蛋白質および蛋白質である。古生物のドメインのうち、特にCrenarchaeota （超好熱性古細菌）の代表例は、分類群Pyrodictiales 、Sulfolobales、Thermoproteales の代表例、または未分類Crenarchaeota （Aeropyrum Caldococcus 、Cenarchaeum 、Igneococcus 、Pyrolobus 、Sulfophobococcus、Thermodiscus、およびThermosphaera など）の代表例と共に、良好な候補である。特にeuryarchaeota では、ThermococcalesおよびThermoplasmales の分類綱からの蛋白質が関連する。しかし、好熱性および超好熱性真正細菌も、本発明による適用の枠組み内で用い得る核酸結合蛋白質を天然に有している。これに、例えばサーモスルホ細菌Aquificales 、Thermotogales の分類綱またはThermus/Deinococcus 菌の分類群の代表例を包含する。
【００２４】
超好熱性または好熱性生物由来の蛋白質の他に、（Escheria coli のＨＵ蛋白質を用いた）以下の実施例８のように、その他の原核生物の蛋白質を有効なトランスフェクションのために用いることもできる。この場合、核酸でのトランスフェクションに必要な原核生物蛋白質による複合体の効率的形成は、好ましくは適量のカルシウムを混合物へ添加することにより起こる。微細沈殿を生成する加熱工程は、この場合省かなければならない。それにより、その蛋白質は、古細菌または真正細菌界の中温性生物から単離するか、またはこれらの天然蛋白質の修飾の要素となることができる。古細菌の代表例として、Corarcheota およびEuryarchaeota の分類群が挙げられ、後者はArchaeoglobales 、Halobacteroales 、Methanobacteriales、Methanococcales 、Methanomicrobiales、Methanopyrales、Methanosarcinales 、Thermococcales、およびThermoplasmales の科を含む。これに関連して、主として非好熱性または非超好熱性生物をはじめとする真正細菌の分類群には、特に以下の群が属する：Aquificales 、Ch lamydiales／Verrucomicrobia の群、Coprothermobacteriaeの群、Cyanobacteriae、Cytophageles ／緑色硫黄細菌の群、Fibrobacteria ／Acidobacteria の群、Firmicutes、Flexitipesk の群、Fusobacteria、Holophaga の群、Nitrospiraの群、Planctomycetales、Proteobacteria、Spirochaetales、およびSynergistes 。
【００２５】
記述された導入技術のための標的細胞として原核生物細菌を用いる場合、好熱性または超好熱性生物の蛋白質が用いられれば、ＴｍＨＵ／ＤＮＡ混合物の短時間加熱による微細沈殿の形成により、トランスフェクション効率の増大がもたらされ得る。ＴｍＨＵ／ＤＮＡ複合体と原核細胞との簡単なインキュベーションにより起こるトランスフェクションとは別に、現行技術とＴｍＨＵ／ＤＮＡ複合体の援助によるエレクトロポレーションが有効となり得る。それにより、ＤＮＡは、ＴｍＨＵにより防護され、その構造内で安定化される。以下の実施例１では、高濃度のＴｍＨＵでも、Escherichia coliへの毒性がないことを実証することができた。同様に、原核細胞内での蛋白質またはその他の分子性物質の導入は、有効に実施することができる。
【００２６】
同時に、ＴｍＨＵ蛋白質は、インビボで核酸を酵素分解から防護する。組換え技術で生成した蛋白質は、そこに存在する核酸（プラスミドなど）に細菌細胞内で結合する。これに基づいて、ヌクレアーゼによる酵素分解の危険性を伴うことなく、経済的な条件で、高純度の核酸を大量に生成するのに適したシステムを製造することができる。
【００２７】
細胞内の分子性物質の導入に特に重要な適用分野は、標的細胞として植物細胞を用いることである。これらの植物細胞は、ほとんど透過することができない丈夫な細胞壁により特徴付けられ、このため現行の方法で植物細胞内の分子性物質（ＤＮＡまたは蛋白質など）の輸送で知られるものはほとんどない。しかし、極めて安定したＴｍＨＵ／ＤＮＡ蛋白質複合体は、現行技術（化学的トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはＴｍＨＵ／ＤＮＡ複合体の簡単なインキュベーションでも）による通例的方法で、植物細胞内への導入を達成するのに適切となり得る。更にそれにより、ＴｍＨＵ内に存在する核のトランスロケーション配列は、本発明に記載される方法が高い効率を達成する上で重要な役割を演じる。
【００２８】
例えば、植物の遺伝子技術の改変は、より良好な性質を備えた高収率の品種を栽培することにより、世界的食品供給の産業保護に本質的貢献を提供することができる。ヨーロッパ西部は、疾患、害虫、および雑草のせいで、少なくとも２０％の損失を有している。そのため、本発明の重要な用途は、植物細胞のトランスフェクションであってもよい。しかし今日では、植物細胞のトランスフェクションで知られる、非常に手がかかり不十分で高価な遺伝子導入プロセスが、わずかに存在するに過ぎない。これに関する最もポピュラーな方法は、細胞内にＤＮＡを運搬するため、根の頸領に腫瘍を形成する細菌Agrobacterium tumefaciens の使用である。しかし、この細菌は、双子葉植物のみを攻撃し、他方で単子葉植物（それらのうちの重要な作物）はトランスフェクトされない。その他、これまでの遺伝子導入で有効性が不十分で特に手がかかる可能性があるのは、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションである。その上、微粒子銃（マジックバレット）という方法は、有効に用いられることが多いが、かなり高価である。ＴｍＨＵおよび一定の分子性物質の使用は、効率および費用に関してはこれらのトランスフェクション法よりも有意に優れている可能性がある。それにより、特に蛋白質（例えば、ＴｍＨＵに融合された酵素により、部分的に低レベルで、かなり透過不能な植物細胞の細胞壁を破壊することが可能なもの）の修飾が利用され、こうしてＴｍＨＵ／ＤＮＡ複合体の適切な取込み経路が提供される。個々の適用例は、特に、栄養生理学の観点からより高収率またはより価値のある品種の開発（蛋白質、脂肪酸、香料、またはデンプンのような成分含量の改良または増加）；害虫攻撃の回避（遺伝子産物が個々の害虫に毒性があるような耐性遺伝子を導入）；植物疾患の回避に加え、雑草成長の阻害（除草剤耐性遺伝子による）、および植物内部で有効成分を生成するための外来ＤＮＡの導入、による収率増大という領域に存在する。これは、植物にプラスミドＤＮＡを導入させる原核生物の核酸結合蛋白質の本発明による適用により生じ得る。
【００２９】
医学的適用で輸送される分子性（治療性）物質として、例えば細胞内または細胞外で有効な蛋白質をコードするＤＮＡを用いることができる。それにより、一本鎖または二本鎖のいずれかの治療性ＤＮＡを細胞内に導入することができる。同様に、配列特異的オリゴヌクレオチドの原核生物蛋白質への結合は、治療性ｓｓＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより原核生物蛋白質との特異的複合体形成を参考に構想することができる。これにより、上記の非特異的核酸結合が、特異的結合に置換される。治療上の活性物質を導入する別の開始点は、病的状態に関連するＲＮＡへの特異的認識配列を有するリボザイムによる複合体形成である。このＲＮＡは、リボザイムの結合により触媒的に切断および非活性化される。
【００３０】
核酸の他に、細胞内へ導入された蛋白質またはペプチドにより治療を行うことができる。例えば、ＨＩＶ治療は、本発明により導入され、その後細胞内で天然ＨＩＶ蛋白質と競合し、これによりそれらの機能を阻害するトランスドミナント（修飾）蛋白質に基づくことができる。同様に、ペプチドまたは合成的に修飾されたペプチドは、一定のＨＩＶ蛋白質（例えばＨＩＶプロテアーゼ）の効果を阻害することができる。加えて、ＨＩＶプロテアーゼまたは細胞内プロテアーゼの認識配列が治療上の活性物質と原核生物輸送蛋白質の間に存在して、細胞内に（そして適切ならば感染細胞内で再度特異的に）蛋白質またはペプチドを放出するような様式で、蛋白質またはペプチドを原核生物蛋白質に直接融合することができる。これにより、用いた原核生物蛋白質が単に細胞内へ通過する輸送媒体を表す場合、一定の細胞種に対する（治療的）効果の特異性が測定される。
【００３１】
本発明の別の用途は、悪性疾患での抗腫瘍活性物質の使用である。この効果を達成するために、生成された複合体は、腫瘍組織内に活性物質を確実に輸送する成分を含有していなければならない。これは、腫瘍のタイプに応じて、例えば腫瘍細胞上だけに排他的に存在するか、または可能な限り広範に存在する腫瘍抗原に結合する活性物質／蛋白質複合体内で作られる抗体により生じる。固形腫瘍は、十分な血液供給を必要とし、これにより腫瘍組織内で新生血管の形成を開始する成長因子を分泌する。新生血管の上皮細胞は、血漿の膜結合インテグリンの発現を増加させる。これらのレセプタは、配列ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）を特異的に認識し、ＲＧＤ含有リガンドのレセプタを介したエンドサイトーシスを引き起こす。この性質を利用して、腫瘍組織に治療性物質を取り込ませる原核生物輸送蛋白質に、ＲＧＤを暴露したペプチドを融合することにより、腫瘍細胞と、腫瘍細胞に結合する上皮組織との問題に取り組むことができる。その他の腫瘍は、細胞表面で天然のＥＧＦレセプタを著しく強く提示する。この場合、以下の実施例６に記載されるように、原核生物輸送蛋白質へのＥＧＦドメインの融合により、本発明に記載される複合体の取込みの特異性を実行することが示唆される。組織特異性の改善とは別に、種々のレセプタ結合性の組合せにより、複数の腫瘍の領域を同時に攻撃し、活性成分に耐性がある細胞の形成を減少させる治療が実行される。活性成分として、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸が用いられてもよい。それらにコードされた蛋白質は、例えば、細胞内のシグナル伝達カスケードの各ポイントに関わることにより、細胞内でアポトーシスを開始させることができる。腫瘍特異性の拡大およびこれによるより大きな確実性のために、好ましくは腫瘍細胞内で活性のある転写プロモータを用いてもよい。同様に、輸送される分子性物質としてペプチドを使用して、マトリックスのメタロ−プロテイナーゼを阻害させてもよい。特にＭＭＰ−２およびＭＭＯ−９の阻害は、短いペプチド配列により顕著な効果を示すことができる。
【００３２】
原則として、ここに説明された本発明は、ＡＤＡ欠損症、血友病、デュシェンヌ筋ジストロフィー、および膵嚢胞性繊維症のような先天性遺伝子欠損の修正のために用いられてもよい。これらの疾患は、一因的であり、即ちそれらは、シグナル遺伝子の欠損を追跡することができる。この修正形態の遺伝子の導入は、概して、十分に疾患症状を取り除くか、または症状を低下させる。これらの用途では、安定したエピソームベクターまたは治療性ＤＮＡの細胞内染色体への組込みのいずれかにより、安定した遺伝子発現が達成されなければならない。このためには、導入される核酸は、組込みをより容易にする核酸配列を含有していてもよい。例えば、１本鎖ＤＮＡを用いて、それらの末端で、染色体組込みに寄与するアデノ関連ウイルスのＩＴＲ配列（逆方向末端反復配列）を運搬してもよい。加えて、治療性ＤＮＡまたはＲＮＡとは別に、組込み用の触媒（例えば、ＨＩＶインテグラーゼまたはアデノ関連ウイルスのＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８）として活発に作用する蛋白質を、共に細胞内に輸送してもよい。
【００３３】
理想的には、修正遺伝子の発現は、同時に調節の適応を確実にする天然プロモータの制御下で行われる。そのため、ＤＮＡと核酸結合原核生物蛋白質との複合体の細胞種に特異的なターゲティングは、多くの場合必要とならない。例えば、血友病患者の血液凝固カスケードの欠失因子は、筋組織内で生成することができ、そこで該因子は、その因子を細胞から分泌させて活性部位である血流に到達させる適切なシグナル配列と融合される。
【００３４】
以上の様々な実施例で議論される核酸とは別に、アポトーシスまたはネクローシスを惹起する蛋白質またはペプチドも導入することができる。例えば、適切なのは、細胞内での蛋白質生合成を高効率で阻害し、これによりネクローシスを惹起する細菌毒素（ジフテリア毒素、コレラ毒、ボツリヌス毒素他）の触媒ドメインである。これにより、細胞を死滅させるのに少量の分子しか必要とならないことが有利となり得る。別の治療開始点は、腫瘍細胞内での単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの輸送である。この酵素は、ヌクレオチドの基礎単位をリン酸化し、それにより細胞内キナーゼへの基質特異性の低下を示し、その結果Ganciclovir のような人工ヌクレオチドもリン酸化される。新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＤＮＡ複製の際、リン酸化されたGanciclovir も組み込まれ、細胞分裂を妨害する複製の終結を導く。
【００３５】
実際の適用の多くは、細胞内の輸送物質の効率的放出が必要となり、即ちその物質は、エンドソーム膜を有効に通過しなければならない。以下に列挙した実施例において、遺伝子発現または蛋白質（マーカー蛋白質としてのＧＦＰ。実施例７を参照）の輸送が通常は高い効率で行われるため、エンドソームの放出は無制限である。吸収された複合体のエンドソーム封入により制限が生じるはずであり、その後この機能を溶血素（特に、チオール活性化細胞溶解素、細菌毒素のトランスロケーションドメイン、または導入される複合体内に導入されるアデノウイルス性ペントン蛋白質などの一定のウイルス蛋白質）により実施することができる。加えて、この機能は、複合体に結合するようになるポリカチオンまたはデンドリマーのような化学物質によっても想定される。
【００３６】
インビボでの適用では、吸収される複合体の免疫原性を可能な限り低く保持することがしばしば求められる。複合体自身の体液免疫原性、ならびにマクロファージによる認識および排除は、以下の実施例９に示すように、ポリエチレングリコールでマスキングするか、または脂質二重層でラッピングすることにより達成することができる。例えばポリエチレンは、化学修飾することができ、その結果それは特異的ＳＨ基に共有結合する。治療用活性物質（即ち、直接導入された蛋白質、または転写および／若しくは翻訳された蛋白質）の免疫原性は、３５〜４０個のＧＡ（グリシン−アラニン）反復配列の融合により低下させることができる。ＧＡが豊富な配列は、ヒトエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ１蛋白質により自然発生し、該ウイルス蛋白質の細胞内プロテアソームによる分解、およびＭＨＣ−クラスＩレセプタに対する提示を防護する。この防護機能は、本発明の枠組み内で用いられる種々の蛋白質およびペプチドで実行することができる。
【００３７】
核酸、蛋白質、およびペプチドとは別に、本発明の細胞内への分子性物質の導入のために、上記に説明された方法に、その他の分子類を使用してもよい。こうして、ペプチド誘導体；ペプチド抗生物質；蛍光標識、アルキル化物、アセチル化物、ペプチド、またはペプチド抱合体のような修飾した側鎖を備えた、炭水化物成分、核酸成分、または脂質成分を含む蛋白質；および類似の修飾を、同様に複合体に組み込んでもよい。同様に、通例用いられるコード（二重鎖）プラスミドの他に、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、染色体ＤＮＡまたは染色体断片、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＲＮＡ、ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のような合成核酸、もしくはそれらのハイブリッドを、蛋白質の核酸結合部位との相互作用により、または化学的にも、原核生物輸送蛋白質と結合させてもよい。それらは、高効率での細胞内への取込みに適している。輸送される非核酸様物質（特に、抗体、抗体類似物質、蛋白質ドメイン、糖蛋白質、酵素、ペプチド、ペプチドホルモン、アミノ酸ベースの医薬有効成分、リポ蛋白質、加えて構造蛋白質のような蛋白質）は、本発明の枠組み内での適用が考えられる。
【００３８】
原核生物輸送蛋白質に輸送される物質の化合物は、異なる物理的相互作用の側面から考察することができる。これにより、疎水性効果が、複合体形成を左右する可能性がある。しかし、イオン性相互作用、イオン双極子相互作用、双極子−双極子相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、または分散力のような別の形態の相互作用が、化合物の形成に寄与する可能性がある。最後に、列挙した非共有結合性化合物の実施例とは別に、輸送される物質の共有結合化合物、および原核生物輸送蛋白質を生成することができる。それにより、遺伝子レベルでの融合が実施されるか、または相互作用パートナーの２原子間に、化学的に安定した原子結合が実施される。
【００３９】
要約すると、本発明の導入方法は、現行技術に比較すると以下の利点を示す：
・既存の方法によるものと同様に有意に高い効率；
・毒性が無いか極めて低い；
・インビボ適用で免疫原性が無いか非常に低い；
・費用効果的な生産および保存；
・複雑でなく迅速な利用性；
・いずれの化学種の核酸でも導入；
・蛋白質またはペプチドのようなその他の共有結合または非共有結合アミノ酸含有物質の導入；
・主として標的細胞に関する制限が無い（例えば本発明の導入方法は、真核動物細胞、真核植物細胞、および原核生物細胞に等しく適している）；
・種々の組成およびエフェクタの追加的付着（融合）の可能性、または細胞取込みに更に好適な性質を組み込むためのラッピングおよびさらなる可能性。
【００４０】
以下の実施例は、本発明の適用例を示しているが、それは本発明の保護範囲の制限を意味するものではない。
【００４１】
説明および実施例は、以下の図面を参照する。
図１は、核酸の輸送に関する本発明の可能な適用方法の概観を示している。ＴｍＨＵ蛋白質（Ｙ）は、直鎖状または環状核酸の縮合を表す。蛋白質／核酸複合体は、その後細胞に取り込まれる（左図）。別の形式として、例えばレセプタによる取込み（中図）または蛋白質／核酸複合体のラッピング（右図）を行うことができる。
【００４２】
図２は、Escherichia coli内で組換え技術により産生されたＴｍＨＵの精製の分析のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。レーン１は、E. coli の細胞抽出物の可溶性部分を示している。レーン２は、熱沈降後の上清を示している。レーン３は、分子量標準を示している（大きさは、図の左側に列挙している）。レーン４は、陽イオン交換カラムで精製した後の溶出液を示している。その蛋白質は、複雑でなく少ない精製工程で、非常に高純度で得ることができる。
【００４３】
図３は、天然および精製ＴｍＨＵの分光分析的特徴を示している。該蛋白質（０．５ｍｇ／ｍｌの濃度）のＵＶ吸収スペクトルは、外来蛋白質または核酸による混入の結論を導くことになる２８０または２６０ｎｍでの吸収を示さない。そのため、調製物は非常に純粋である。該蛋白質は、いずれのチロシンまたはトリプトファン残基も示さず、このため特異的ＵＶ範囲で分光分析的に透過性である。その蛋白質サブユニットの３つのフェニルアラニン残基は、予測通り２５７ｎｍでわずかな吸収を示している。
【００４４】
図４は、表面プラズモン共鳴の援助による様々なサイズのＤＮＡ断片に対するＴｍＨＵ化合物の測定を示している。（●）：５６ｂｐのｄｓＤＮＡ断片、（−）：計算したヒル式（ＫＤ＝７３ｎＭおよびヒル係数＝７．６）、（○）：２３ｂｐのｄｓＤＮＡ断片、（--- ）：計算したヒル式（ＫＤ＝７３ｎＭおよびヒル係数＝１．３）。ＤＮＡへの蛋白質の結合は、比較的強く、通常サイズ（＞＞２３ｂｐ）のＤＮＡ断片では協同性が高い。
【００４５】
図５は、ヌクレアーゼによる分解前のモデルＤＮＡの防護を示している。種々の濃度の異なる縮合剤を用いた。レーン１：サイズ標準、レーン２〜４：ＴｍＨＵ（０．３、３、および１５μｇ）、レーン５〜７：ヒストン（０．３、３、および３０μｇ）、レーン８：サイズ標準、レーン９〜１１：ＣＴＡＢ（５、１０、および１００μＭ）、レーン１２〜１４：スペルミジン（１０、１００、および２０００μＭ）。非常に厳密な要件の下では、防護していないＤＮＡは完全に分解され、そのためＣＴＡＢおよびスペルミジンは、この分解への防護をほとんど提供しない。ヒストンは、わずかに良好な防護を提供し、ＴｍＨＵは、この比較において、分解への最も良好な防護を提供する。
【００４６】
図６は、標準法（ＤＥＡＥ−デキストラン・トランスフェクション）と比較した、種々の細胞系でのＴｍＨＵのトランスフェクション効率を示している。左：ヒト２９３Ｔ細胞のＴｍＨＵによるトランスフェクションであり、トランスフェクション効率は、この場合約５０％である。中央：マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞のＴｍＨＵによるトランスフェクションであり、トランスフェクション効率は、この場合約３０％である。右：マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞のＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクションであり、トランスフェクション効率は、この場合約１０％以下である。
【００４７】
図７は、実施例５に記載されたプロトコールでのＮＩＨ３Ｔ３細胞でのＴｍＨＵの導入効率を示している。ここでは、細胞培養穴（cell culture cavity ）の異なる２つの切片部分が示されており、対物レンズの顕微鏡倍率は２０倍である。トランスフェクションでの収率は、この場合、用いたＤＮＡの１μｇ当たり陽性細胞約２５００個である。
【００４８】
図８は、細胞表面での腫瘍マーカーとしてＥＧＦレセプタを発現するヒトＡ４３１細胞内でのＴｍＨＵ−ＥＧＦ−融合蛋白質の取込みを立証するウエスタンブロット法を示している。左図：ＴｍＨＵ−ＥＧＦ融合蛋白質のインキュベーションおよび取込み後の細胞溶解産物の蛋白質のウエスタンブロット。レーン１：ＴｍＨＵ−ＥＧＦによるトランスフェクション、レーン２：ＴｍＨＵ−ＥＧＦ／ＤＮＡ複合体によるトランスフェクション、レーン３：抗ＥＧＦ抗体の特異性を制御するための非形質転換Ａ４３１細胞の溶解産物、レーン４：ＴｍＨＵ−ＥＧＦ融合蛋白質（標準）、レーン５：分子量標準のマーカー。右図：トランスフェクションの途中の細胞上清からのＴｍＨＵ−ＥＦＧ消失の時間経過（ウエスタンブロットにより立証）、レーン１〜７：トランスフェクトしたＤＮＡとのインキュベーション、レーンＡ〜Ｇ：トランスフェクトしたＤＮＡを含まないインキュベーション、レーン１：ＴｍＨＵ−ＥＧＦ比較標準、レーン２：０分、レーン３：３０分、レーン４：６０分、レーン５：９０分、レーン６：１２０分、レーン７：７時間、レーンＡ：０分、レーンＢ：３０分、レーンＣ：６０分、レーンＤ：９０分、レーンＥ：１２０分、レーンＦ：７時間。ＴｍＨＵ−ＤＮＡ複合体の形成により、ＴｍＨＵの細胞内への取込みが明らかに観察でき、この複合体形成を含まないものよりも十分な取込みが達成される。
【００４９】
図９は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクトした培養皿からの切片部分の位相差顕微鏡像（上図）および蛍光条件下での顕微鏡写真（下図）を示している。細胞を培地中で５時間インキュベートし、その後ＰＢＳで洗浄した。緑色蛍光細胞は、ＴｍＨＵ取込み機構により細胞内に取り込まれたＴｍＨＵ−ＧＦＰ−融合蛋白質を含有する。
【００５０】
図１０は、例として、リポソームでラッピングされたＴｍＨＵ／ＤＮＡ複合体によりトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞での２種の細胞培養を示している。沈積物は両者とも、レポータ遺伝子を発現する大量の陽性形質転換細胞が示され、このためテストアッセイでは青色を示す。
【００５１】
（実施例１）
Thermotoga maritima からの蛋白質ＨＵのクローニング、Escherichia coli内での組換え発現、および精製
現行技術により、原核生物の宿主細胞内のクローニングＤＮＡ配列の異種発現は公知である。生物Thermotoga maritima からのゲノムＤＮＡ上でオリゴヌクレオチドプライマーＴｍＨＵ−Ｎ（５' −ＧＧＧ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  Ｇ−３' ）およびＴｍＨＵ−Ｃ（５' −ＴＴＣ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  Ｃ−３' ）を用いた複製連鎖反応（ＰＣＲ）により３００ｂｐ断片を増幅して、標準的技術で原核生物発現ベクターｐＥＴ１１ａ（Novagen ）内にクローニングすることができる（Sambrook et al.,''Molecular Cloning. A Laboratory Manual'', 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照）。群ＢＬ２１（ＤＥ３）のE. coli 細胞内でのプラスミドの形質転換、およびアンピシリン耐性ＬＢ寒天プレートの選別の後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地の予備培養物を、単一コロニーで摂取して、３７℃で一晩振とうする。この予備培養物を、同様の培地種からなる主培養物に１：１００の比で希釈する。細菌懸濁液の吸光度が６００ｎｍの波長で１．０の値に達するまで、主培養物を３７℃の振とうインキュベータでインキュベートする。続いて、１ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により、Thermotoga maritima   ＨＵ遺伝子（ＴｍＨＵ）の発現が誘導される。
【００５２】
９０分の更なる増殖時間の後、細胞を遠心分離（６０００ｇ、１５分、４℃）により分離して、再懸濁緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中に混和して、その後高圧均質化（high-pressure homogenization）により破砕する。ＴｍＨＵは、細胞溶解産物の可溶性分画に完全に残存する。ベンゾナーゼ（Merk）の添加の後、宿主生物から余分な核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を酵素的に除去するために、細胞溶解産物を室温で１時間インキュベートする。
【００５３】
不溶性成分から可溶性成分を分離する遠心分離（５００００ｇ、１時間、４℃）の後、上清を８０℃で２０分間加熱する。それにより、宿主蛋白質の大部分は熱変性して、冷却後に不溶性沈殿として沈積する。温度安定性蛋白質ＴｍＨＵは、５００００ｇで再度遠心分離した後、上清中に高濃度で既にほぼ純粋な形態で存在する（図２）。
【００５４】
続く最終精製工程では、Poros HS型（Perseptive Biosystems ）のカラムでの陽イオン交換クロマトグラフィーにより、上清を更に精製する。再懸濁緩衝液の条件下では、ＴｍＨＵは、陽イオン交換カラムに強く結合する。３００〜２０００ｍＭ  ＮａＣｌの直線塩勾配の適用後、ＴｍＨＵを残留する混入物からクロマトグラフィーで別々に溶出することができる。図２は、１８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの援助による個々の精製工程の効率を示している。ここに提示した方法により、天然条件下でダイマーとして存在するＴｍＨＵを、分光分析的に純粋な形態で（＞９５％純度；図３）、E. coli 培養物１リットル当たり約２０ｍｇの収率で得ることができる（単純培養による）。
【００５５】
（実施例２）
ＴｍＨＵの核酸結合性の立証
５６ｂｐ  ＤＮＡ断片と２３ｂｐ断片を、２つのプライマーによりＰＣＲ技術で増幅し、それらの各々をビオチン化して、得られた二重鎖ＤＮＡをストレプトアビジンチップに固定する。BLACore 装置（Amersham Pharmacia Biotech）により測定された表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法により、それぞれ固定されたＤＮＡに対するＴｍＨＵ化合物を直接測定することができる（図４）。
【００５６】
それにより、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）および１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する緩衝液中の種々の濃度のＴｍＨＵを、ＤＮＡチップのフローセルに注入して、ＳＰＲシグナルを記録する。シグナルのプラトーは、ＴｍＨＵへの結合量に直接比例する。使用したＴｍＨＵの濃度に対するＳＰＲシグナルの適用は、ヒル式によりＳ字形曲線をもたらし（図４）、５６ｂｐ断片の場合、協同性の高い化合物の特徴を示している。解離定数ＫD の定義によると、曲線変化の中心点は、どちらの例でもＴｍＨＵ蛋白質濃度７３ｎＭに存在する。
【００５７】
（実施例３）
ヌクレアーゼによる分解に対する核酸の防護
試料緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ）１２０μｌ中の環状プラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、Clontech）１μｇを、３つの異なる濃度それぞれのＴｍＨＵ、ヒトヒストン（Sigma ）、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ、Amresco ）、またはスペルミジン（Sigma ）と混合して、室温で１時間インキュベートし、続いてベンゾナーゼ（Merck ）５単位を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、試料を０．５％ＳＤＳ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡの濃縮物に加え、核酸をフェノール／クロロホルムで抽出して、エタノールを用いて水相から沈殿させる。続いて、１％アガロースゲル上で感受性色素SYBR Gold （Molecular Probes）によりＤＮＡを標識した後、核酸のヌクレアーゼ分解からの防護を分析する（図５）。この実施例において、ＴｍＨＵがヌクレアーゼによる分解に対してＤＮＡをかなり防護することが明らかとなる。低分子物質（ＣＴＡＢおよびスペルミジン）は、ヌクレアーゼ分解に対する防護をわずかしか提供しない。この防護は、真核生物ヒストンにより著しく改善される（図５）。しかし、他の点で同等の試験条件では、原核生物ＴｍＨＵ蛋白質を使用した場合のみ、ヌクレアーゼ分解に対する核酸の著しい防護が達成される。防護していないＤＮＡは、その試験条件下で完全に分解される。
【００５８】
血清培地内と一部の標的細胞内では、核酸がヌクレアーゼによる分解にさらされるため、ヌクレアーゼが誘導する分解への防護は、導入効率の最適化にとって重要である。おそらく真核生物に特徴的な核酸−ヒストン複合体内に反復構造が欠如しているため、このことに関しては、原核生物蛋白質が真核生物ヒストンよりも有意に優れており、結合部位での切断に好適となり得ることが、この実施例で更に明らかとなる。分解に対するこの防護は、本発明に記載された方法にとって非常に好適な特徴である。それにより、この防護は、インビボでのプラスミドの生成に用いられ、例えば細菌内でのより良好な生成を達成することができる。
【００５９】
（実施例４）
真核細胞のトランスフェクション
ＴｍＨＵ溶液３００μｌ（０．５ｍｇ／ｍｌ）およびプラスミドＤＮＡ（マーカー蛋白質β−ガラクトシダーゼをコードされたｐＣＭＶ−β  ２４μｇ）６μｌを共に、室温で１時間インキュベートする。続いて、この混合物を、セミコンフルエントのマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞またはヒト２９３Ｔ細胞の培地（６０ｍｍ細胞培養皿）に加える。この皿を少し揺り動かし、３７℃および５％ＣＯ2 で２日間インキュベートする。この間、更なる培地交換は実施しない。それにより、付着細胞上に堆積した蛋白質および核酸から沈殿が形成する。この間、蛋白質／核酸複合体が細胞に取り込まれる。４８時間後に、β−ガラクトシダーゼ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を基質とする形質転換細胞への標識を実施して、非標識（非トランスフェクト）細胞に対する標識（トランスフェクト）細胞の比を測定する。これから、トランスフェクション効率を算出する。
【００６０】
この趣意で、更にトランスフェクション混合物にそれぞれ核酸またはＴｍＨＵのいずれかが不足する対照トランスフェクションを実施する（陰性対照）。有効性の測定結果の比較として、ＤＥＡＥデキストラン（Mammalian Transfection Kit, Stratagene）による最適化トランスフェクションを、製造業者の使用説明書に従って並行して実施する（陽性対照）。陰性対照は、予測通り各例に標識細胞が無く、そのためトランスフェクトされていないことを示している。陽性対照（ＤＥＡＥ／デキストラン−トランスフェクション）では、培養皿内に最大で１０％の細胞が標識されている（図６を参照）。これは、文献で知られるこの方法の効率の大きさの範囲内である。非常に弱く付着している細胞はトランスフェクション法により剥離されることになるため、ＤＥＡＥデキストラン法による２９３Ｔ細胞のトランスフェクションは、有効でない。これに対して、ＴｍＨＵによるトランスフェクションは、どちらの細胞系でも問題が無く可能である（２９３Ｔ細胞の剥離は、観察できない）。ＴｍＨＵベースのトランスフェクションの場合、トランスフェクション効率は、それぞれ３０％（マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞）、５０％（ヒト２９３Ｔ細胞）となる。結論として、標準的システムと比較して、細胞のトランスフェクション効率の明らかな増大が観察できる（図６を参照）。最適化によりこれらの収率を更に増大させ得ると思われる。Ｘ−Ｇａｌでの標識では、細胞の固定（死滅）に至るまで、細胞の生存および増殖に対するＴｍＨＵトランスフェクションの負の影響は観察できなかった。結論として、ＴｍＨＵには細胞への毒性が無い。
【００６１】
（実施例５）
真核細胞のトランスフェクションの別のプロトコール
リン酸緩衝液中のＴｍＨＵ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ（ｐＨ７．０）およびプラスミドＤＮＡ溶液（マーカー蛋白質β−ガラクトシダーゼをコードしたｐＣＭＶ−β  ４μｇ）１μｌを、２０ｍＭ  ＣａＣｌ2 溶液１０μｌと混合して、９５℃で４０分間加熱する。室温に冷却して更に２０分間インキュベートした後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地３５０μｌをその混合物に添加して、１２穴プレートの穴に入れる。その中には、１６時間前にＮＩＨ３Ｔ３細胞５００００個が播種されている。添加前に細胞上の培地を除去する。皿を少し揺り動かした後、３７℃および５％ＣＯ2 のインキュベータで１２時間インキュベートする。その後、その培地を新鮮な完全培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）１ｍｌと交換して、更に３６時間細胞をインキュベートする。ここで、実施例４に記載のβ−ガラクトシダーゼ発現のためのテストを実施して、グリッド接眼レンズ（grid ocular ）を用いて細胞を計数する。典型的には、この方法では、ウェル当たり陽性細胞１００００個を得ることができる（図７の実施例）。トランスフェクション混合物にＴｍＨＵを添加することなく、記載されたプロトコールを実行すると（比較として、標準的リン酸カルシウムトランスフェクションの効率のための対照）、収率はトランスフェクション細胞約１０個となり、１０3 倍低い収率となる。μｇＤＮＡ当たり陽性細胞約２５００個というこの実施例のトランスフェクションの収率は、ＤＥＡＥデキストラン−トランスフェクション（μｇＤＮＡ当たりほぼ３００〜４００回トランスフェクション）よりも約５〜１０倍高い。
【００６２】
（実施例６）
ＴｍＨＵ−ＥＧＦの例への修飾蛋白質の使用
ＴｍＨＵ−ＥＧＦは、ＴｍＨＵと、標的細胞（例えば、ここで使用するヒトＡ４３１細胞）を運搬する上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプタへの取込みを促進するヒトＥＧＦとの融合蛋白質である（E. J. Meuillet et al., ''Sialidase gene transfection enhances epidermal growth factor receptor activity in an epidermoid carcinoma cell line, A431''; Cancer Res. 1999, Vol. 59, pp. 234-240を参照）。実施例１に示した標準的方法に従って、実施例１に挙げたｐＥＴｌｌａ発現ベクターにＳａｃII制限部位をクローニングした後、融合蛋白質を生成する。ＴｍＨＵ−ＥＧＦ（０．５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを、ｐＣＭＶ−β−プラスミド８μｇと共に１時間インキュベートして、得られたＴｍＨＵ−ＥＧＦ／ＤＮＡの複合体を、実施例４の指示に従って、セミコンフルエントのＡ４３１細胞の培地に加える。対照として、更にＤＮＡを加えることなく、ＴｍＨＵ１００μｌを同等に処置した細胞に添加する。更に、陰性対照として、ＴｍＨＵ−ＥＧＦを加えていないセミコンフルエント細胞培養皿を準備する。
【００６３】
細胞をそれぞれ氷上で２時間インキュベートし、その後低温ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、その後３７℃で４５分間インキュベートする。細胞上の培地を除去して、まだ内部移行されていない複合体と付着細胞とを分離するためにトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加する。ＦＣＳ（ウシ胎児血清）含有培地の添加により、トリプシン消化を停止させて、再懸濁した細胞を低温ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄する。最後の洗浄工程の後、細胞をＰＢＳ緩衝液１００μｌに再懸濁させ、その後４％ＳＤＳおよび２ｍＭ  ＰＭＳＦ１００μｌと混合し、完全に混合して、直ちに９５℃で１０分間加熱した。こうして得られた細胞溶解産物を、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにアプライして、ウエスタンブロット法による電気泳動に従って分析する（初期抗体：ウサギポリクローナル抗ＥＧＦ、Santa Ceuz; 二次抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ共役体、BioRad）。
【００６４】
特異的ウエスタンブロット法において（図８の左）、蛋白質はＴｍＨＵ−ＥＧＦキメラとインキュベートした溶解産物中の特異的バンドとして確認することができる。しかし、ＴｍＨＵ−ＥＧＦとのインキュベーションを行わなかった溶解産物では、これらのバンドは現れない。これは、蛋白質ＴｍＨＵ−ＥＧＦがＡ４３１細胞に内部移行され、この吸収が特異的ウエスタンブロットにより確認できることを示している。この吸収は、この実験ではＤＮＡの存在に依存しないが、ＤＮＡの存在下ではより効率的である。これは、上記トランスフェクション実験と同様に実施した二番目の実験で裏付けられる（図８の右を参照）。この時、Ａ４３１標的細胞へのＴｍＨＵ−ＥＧＦキメラの取込みは、細胞上の培地の中のＴｍＨＵ量の減少により検出される。この時、ＤＮＡを備えたＴｍＨＵ−ＥＧＦが、ＤＮＡを含まない対照実験よりも、細胞残留物から有意に速く除去されることも明らかとなる。
【００６５】
（実施例７）
ＴｍＨＵ−ＧＦＰの例への修飾蛋白質の使用
ＴｍＨＵ−ＧＦＰは、ＴｍＨＵと、深海のクラゲAequorea victoria の緑色蛍光蛋白質との融合蛋白質であり、補因子がなくても（即ち三次構造のみに基づき）緑色蛍光の顕著な特徴を示す。ＧＦＰとの融合構造物は、天然蛋白質のこの蛍光を保持していることが多い。この実施例において、ＧＦＰは、リンカーペプチドを備えたＴｍＨＵにＣ末端で融合する。融合は、遺伝子技術の標準的方法を用いてＤＮＡレベルで実施し、これによりＧＦＰ遺伝子をリンカーと共にClontechのベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１から切断して、ＴｍＨＵ遺伝子の３' 末端に挿入した。ＴｍＨＵ−ＧＦＰの精製は、実施例１のＴｍＨＵのものに類似させて、陽イオン交換クロマトグラフィーにより行う。融合蛋白質は、溶液中で高収率で精製することができる。
【００６６】
ＴｍＨＵ−ＧＦＰは、まさしくＧＦＰそのものの緑がかった蛍光を保持する。同様に、高分子ＤＮＡが蛋白質溶液に添加され、続いて遠心分離されると、ＴｍＨＵ−ＧＦＰがＤＮＡと共に共沈して緑がかった発光複合体を示すため、その融合蛋白質のＤＮＡ化合物は、インタクトのままである。そのため、融合構造物の両方の部分が機能的にインタクトのままであると想定される。これは、「そのシステムが遺伝子レベルで容易に改変することができ、ＴｍＨＵの構造が融合構造物の形態の更なる変異体を作製するための安定した枠組みを提示する」ということの更なる証拠である。
【００６７】
この変異体ＴｍＨＵ−ＧＦＰを用いて、ここに吸収試験をインビボの（即ち、細胞を固定することなく）真核細胞内で実施することができる。この趣意で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を含む２ｃｍ培養皿を、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、その後ＰＢＳ緩衝液中のＴｍＨＵ−ＧＦＰ溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを添加する。皿を短時間揺り動かした後、３７℃および５％ＣＯ2 で５時間インキュベートし、続いてＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光顕微鏡およびディジタルカメラでＧＦＰ蛍光の写真を撮影する。図９において、蛍光で（下図）、そして比較として同じ切片部分の位相差顕微鏡像（上図）で、細胞の概観をはっきりと見ることができる。これらの結果は、「融合構造物は高い効率で細胞内に取り込まれること、そしてこれによりリソゾームのような個々の小胞は濃縮および蓄積されず、融合蛋白質が細胞質ゾル全体に存在すること」を示している。
【００６８】
この細胞吸収の性質は、ＧＦＰでは引き起こされないことが文献で知られており、そのため融合構造物のＴｍＨＵ部分を参照しなければならなかった。
そのためこの実施例から、ＴｍＨＵのような原核生物ヒストン様蛋白質が細胞に高い効率で取り込まれ、リソゾーム内には蓄積されず、細胞質ゾルに分散されることが実証される。この吸収性は、ＴｍＨＵの遺伝子導入効率が高いことを説明することができる。それにより、細胞内の効率的吸収に加え、エンドソームおよびその他の細胞内コンパートメントからの潜在的放出が、高度のトランスフェクション効率に寄与する。加えて、その実施例は、ＴｍＨＵに結合または融合した蛋白質を（例えば、治療に関連する蛋白質も）、ＴｍＨＵにより高い効率で真核細胞内に導入することができる。これによりＴｍＨＵは、細胞膜を通過する融合蛋白質の輸送媒体として働く。
【００６９】
（実施例８）
Eschericha coli 由来のＨＵ（Ｅｃｏ  ＨＵ）によるトランスフェクション
０．５ｍｇ／ｍｌ  ＥｃｏＨＵ溶液（Eschericha coli ）由来のＨＵ蛋白質）１００μｌを、プラスミド溶液（β−ガラクトシダーゼをコードしたもの４ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌと混合して、９５℃で４０分間加熱して、その後室温で２０分間インキュベートする。混合物をＤＭＥＭ３５０μｌおよび１０％ＦＢＳ（１％ＰＳを含む）で洗浄し、続いてＮＩＨ３Ｔ３細胞（１２穴プレートの穴に５００００個）にアプライする。２日後、細胞培養物のβ−ガラクトシダーゼの発現を調べる。これらの条件下では、細胞１０４個がβ−ガラクトシダーゼ発現を示す。これは、ＴｍＨＵを類似使用した場合（ほぼ６００個の陽性形質転換細胞）と同様に、有意に少ない収率である。この実施例は、本発明で設定された条件下でのトランスフェクションが、原則としてその他の細菌（この場合中温細菌）のヒストン様蛋白質でも可能であることを実証している。
【００７０】
（実施例９）
リポソームへのＴｍＨＵ−ＤＮＡ−複合体のパッケージング、およびそのリポソーム−ＴｍＨＵ−ＤＮＡ複合体によるトランスフェクション
真核細胞内への遺伝子導入のより新しい方法の１つは、カチオン脂質小胞内にＤＮＡをパッケージングすることからなり、そのカチオン脂質小胞はその後細胞膜と融合し、このようにしてＤＮＡを細胞内に導入する。しかし、これらの脂質小胞はエンドソーム内に蓄積され細胞質へのＤＮＡの導入が行われず、続いて細胞核内に輸送されるため、これらの方法は、細胞内への効率的吸収の後、最初の予測よりも小さな収率をもたらす。この実施例は、リポソームによるトランスフェクションおよびＴｍＨＵによるトランスフェクションを、相乗的に組み合せることができるかを調べる。
【００７１】
最初に、試薬Ｔｆｘ−５０（Promega ）によるトランスフェクションを、製造業者の仕様書に従って実施した。これにより、負電荷（ＤＮＡ）に対する正電荷（脂質）の電荷比２：１が、最も効率的であった（製造業者の仕様書による最適化）。その方法で、コンフルエントの播種ＮＩＨ３Ｔ３細胞の８０％が、プラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−β）１μｇ、Ｔｆｘ−５０−試薬３μｌ、およびＤＭＥＭ２００μｌでトランスフェクトされた。１時間インキュベートした後、完全培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）１ｍｌを添加する。μｇＤＮＡ当たり平均３３００個の陽性細胞が得られた。このトランスフェクション効率は、最適化ＴｍＨＵトランスフェクションの規模と同じ順序である（実施例５を参照）。
【００７２】
次の工程で、様々な脂質量を含む種々の量のＴｍＨＵを添加してトランスフェクションを実施した。最高のトランスフェクション結果は、ＴｍＨＵ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）１２．５μｌでＤＮＡ１μｇの１時間のインキュベーションと、電荷比４：１（脂質：ＤＮＡで）（脂質懸濁液４．５μｌ、ＴｍＨＵ溶液１２．５μｌ、およびトランスフェクション溶液２００μｌにＤＮＡ１μｌ）とにより達成された。用いたＤＮＡ（μｇ）当たりの陽性細胞量は、この時に平均１６０００個の形質転換細胞に増加する。こうして、組み合わせたＴｍＨＵ−リポフェクションの収率は、リポフェクションだけでなく、ＴｍＨＵ−トランスフェクション単独の最適化プロトコールよりも約５〜６倍高くなる。この型の形質転換細胞の２つの例を、図１０に示している。
【００７３】
この実験では、ＴｍＨＵによるトランスフェクションおよびリポフェクションが、各例で互いに並行して起こることを阻止できないが、その効率は、それぞれの寄与を合計したものよりも有意に高いため（特に、リポフェクションの観点だけでなく、ＴｍＨＵ−トランスフェクションの観点で挙げた実験では、最適作用条件よりも低いことが示されたため）、明らかにより相乗的な効果が注目される。そのため、高効率の最も有力な説明は、「生成したＴｍＨＵ−ＤＮＡ複合体が、少なくとも一部、リポフェクション剤の生成したリポソーム内に封入されている」ということである。リポソーム膜によるこのＴｍＨＵ−ＤＮＡ−複合体のラッピングも、ＤＥＡＥ−デキストラン・トランスフェクションのような標準的方法に比較して明らかにより高い効率を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】核酸の輸送に関する本発明の可能な適用方法の概観。
【図２】Escherichia coli内で組換え技術により産生されたＴｍＨＵの精製の分析のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図３】天然および精製ＴｍＨＵの分光分析的特徴。
【図４】表面プラズモン共鳴の援助による様々なサイズのＤＮＡ断片に対するＴｍＨＵ化合物の測定。
【図５】ヌクレアーゼによる分解前のモデルＤＮＡの防護。
【図６】標準法（ＤＥＡＥ−デキストラン・トランスフェクション）と比較した、種々の細胞系でのＴｍＨＵのトランスフェクション効率。
【図７】実施例５に記載されたプロトコールでのＮＩＨ３Ｔ３細胞でのＴｍＨＵの導入効率。
【図８】細胞表面での腫瘍マーカーとしてＥＧＦレセプタを発現するヒトＡ４３１細胞内でのＴｍＨＵ−ＥＧＦ−融合蛋白質の取込みを立証するウエスタンブロット法。
【図９】ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクトした培養皿からの切片部分の位相差顕微鏡像（上図）および蛍光条件下での顕微鏡写真（下図）。
【図１０】リポソームでラッピングされたＴｍＨＵ／ＤＮＡ複合体によりトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞での２種の細胞培養。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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