(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写酵素反応における、ＲＮＡに結合する試薬による、天然の供給源から単離された又は人工的に合成されたＲＮＡの阻害効果を中和する方法であって、前記ＲＮＡ及び前記試薬を含む組成物への硫酸アンモニウムの添加を含む（但し、組成物中の硫酸アンモニウムの最終濃度は、５−６４ｍＭである）、前記方法。
【請求項２】
組成物が、ＲＮＡ結合試薬から選択される夾雑物質を更に含む、請求項１の方法。
【請求項３】
組成物が、カチオン系界面活性剤を更に含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
組成物が、夾雑物質として、臭化エチジウムを更に含む、請求項１−３のいずれか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、生化学における技術に関し、より詳しくは、リボ核酸精製のための技術に関する。
【０００２】
発明の背景
蛋白質、スペルミン、スペルミジン、カチオン系界面活性剤(cationic detergents)、臭化エチジウム、SybrGreen（商標）、アクチノマイシン等のような、多くの分子が、ＲＮＡに結合して、その機能および分析を妨げ得ることがよく知られている。ほとんどの阻害物質のＲＮＡへの結合形式は、イオン性、親水性相互作用によって安定化されたイオン性、または、親油性相互作用によって安定化されたイオン性である。多くの場合、分子とＲＮＡリガンドとの相互作用は、非常に強いので、ＲＮＡと阻害分子との間の相互作用を少なくするために、非常に厳しい条件（例えば、変性剤、カオトロピック剤、界面活性剤、フェノール等）が必要とされる。厳しい条件であっても、相互作用を止めない場合もある。他の場合には、厳しい条件が、ＲＮＡの下流での適用を妨げる。従って、ＲＮＡへの阻害分子の相互作用を和らげるが、ＲＮＡの機能および分析を妨げない方法が必要とされる。
【０００３】
ＲＮＡ−リボースのアニオンＯＨ-または２’−ＯＨ基のような求核試薬が、触媒および二価カチオンの存在下で、ＲＮＡを開裂するために働き得ることも、よく知られている。ＲＮＡの開裂は、ＲＮＡ分子の機能および分析を妨げる。開裂試薬の中和は、しばしば、精製によってのみ可能である。様々な分子の開裂効果(cleavage effects)を阻害する方法が必要とされている。
【０００４】
発明の要約
本発明は、ＲＮＡを含む環境への、（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加を記載する。最終濃度は、２０ｇ／１００ｍｌ（１．５１Ｍ）を超えない。その環境への（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、ＲＮＡへ結合するか、またはＲＮＡを開裂する試薬の阻害効果を中和する。そのような試薬は、カチオン系界面活性剤（例えば、カトリモックス(CATRIMOX)、および臭化セチルトリメチルアンモニウム=CTAB、例えば、ヨーロッパ特許出願  EP 1031626 A1参照)、蛋白質、臭化エチジウム、SybrGreen、ポリアミン(例えば、スペルミン、スペルミジン、プトレセイン(putresceine)等)、帯電した多糖類、糖蛋白質、求核試薬、塩基、等を含む。その環境内に（ＮＨ4）2ＳＯ4が存在すれば、ＲＮＡに結合する試薬の阻害性または開裂性は、その環境またはその中に含まれるＲＮＡの機能および分析を妨げない。
【０００５】
図面の簡単な説明
図１：逆転写酵素反応中のカチオン系界面活性剤の阻害効果。
【０００６】
図２：カチオン系界面活性剤を含んでいたＲＮＡは、カチオン系界面活性剤によって阻害される。カチオン系界面活性剤によって阻害されるＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、阻害効果を中和する。
【０００７】
図３：カチオン系界面活性剤なしの純粋なＲＮＡは、ＲＴの効率(RT-performance)の非常に弱い増加のみを示した。
【０００８】
図４：カチオン系界面活性剤なしの古典的な方法によって調製されたか、または、カチオン系界面活性剤によって調製されたＲＮＡの分析。カチオン系界面活性剤によって調製されたＲＮＡは、閾値サイクル(threshold-cycle)の増加を示した。１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液による、カチオン系界面活性剤によって調製されたＲＮＡの溶出、および、６５℃での変性は、カチオン系界面活性剤の阻害効果を中和する。各棒グラフ(bar)の閾値サイクルは、６つの独立の値を反映する。
【０００９】
図５：古典的な方法（Ｃ）によって調製されたか、または水中での溶出によるか（Ｂ）、または５ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4中での溶出により、カチオン系界面活性剤によって調製されたＲＮＡ。アプライド・バイオシステム(Applied Biosystem)のGAPDH PDARを、TaqMan RT-PCRのために使用した。図は、３人の別々の血液ドナーの分析の要約である。
【００１０】
図６：古典的な方法（Ｃ）によって調製されたか、または水中での溶出によるか（Ｂ）、または５ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4中での溶出により、カチオン系界面活性剤によって調製されたＲＮＡ。アプライド・バイオシステム(Applied Biosystem)のＴＮＦアルファＰＤＡＲを、TaqMan RT-PCRのために使用した。図は、３人の別々の血液ドナーの分析の要約である。
【００１１】
図７：逆転写酵素反応中のスペルミンの阻害効果。
【００１２】
図８：SybrGreenを含んでいたＲＮＡの逆転写は、スペルミンのＲＮＡへの結合によって阻害される（レーン２）。スペルミンによって阻害されたＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、阻害効果を中和する(レーン３)。レーン１は、対照として役立つ。
【００１３】
図９：逆転写酵素反応中のSybrGreenの阻害効果。逆転写酵素反応中の最終濃度を示す。ｃＤＮＡ合成を定量するために、ＰＣＲを行った。
【００１４】
図１０：SybrGreenを含んでいたＲＮＡの逆転写は、SybrGreenのＲＮＡへの結合によって阻害される（レーン２）。スペルミンによって阻害されたＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、阻害効果を中和する(レーン１)。レーン３は、対照として役立つ。
【００１５】
図１１：ＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4イオンの強固な結合は、ＲＮＡバックボーン(backbone)へ結合する臭化エチジウムの減少、および、負に帯電したＲＮＡバックボーンの強い単離を示す電気泳動の移動性の低下によって示される。
【００１６】
図１２：（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加による、２６０ｎＭでのＲＮＡの淡色効果(Hypochromic effect)。
【００１７】
図１３：示した異なるｐＨ、および、１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１時間、３７℃でのＲＮＡのインキュベーション。
【００１８】
図１４：異なる（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度の溶液に溶解したＲＮＡを使用する逆転写酵素の相対活性。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、ＲＮＡを含む環境への（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加に関する。最終濃度は、２０ｇ／１００ｍｌ（１．５１Ｍ）を超えない。環境への（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、ＲＮＡに結合するか、またはＲＮＡを開裂する試薬の阻害効果を中和する。そのような試薬は、カチオン系界面活性剤（例えば、カトリモックス(CATRIMOX)、および臭化セチルトリメチルアンモニウム=CTAB、例えば、ヨーロッパ特許出願  EP 1031626 A1参照)、蛋白質、臭化エチジウム、SybrGreen、ポリアミン(例えば、スペルミン、スペルミジン、プトレセイン(putresceine)等)、帯電した多糖類、糖蛋白質、求核試薬、塩基、等を含む。その環境内に（ＮＨ4）2ＳＯ4が存在すれば、ＲＮＡに結合する試薬の阻害性または開裂性は、その環境またはその中に含まれるＲＮＡの機能および分析を妨げない。
【００２０】
本発明をより詳細に説明する前に、いくつかの定義を規定する。
【００２１】
定義：
リボ核酸（ＲＮＡ）：
ＲＮＡは、当業者(practitioner)に既知または未知の、何らかの対象のリボ核酸として定義される。ＲＮＡは、天然の供給源から単離することができ、または、化学的もしくは酵素的反応において、人工的に合成することもできる。ＲＮＡは、修飾されているか、または修飾されていないヌクレオチドを含むこともできる。ＲＮＡは、タグされていない(untagged)こともでき、または、既知もしくは未知のタグによってタグされる(tagged)こともできる。
【００２２】
ＲＮＡの機能：
ＲＮＡの機能は、それらに限定されることなく、コード機能（例えば、ゲノムＲＮＡ）、酵素的機能（例えば、リボザイム機能）、結合機能（例えば、ハイブリダイジング機能、アプタマー機能等）、鋳型機能、基質機能、構造的機能、センサー機能等を含む、ＲＮＡが有し得る、何らかのインビボまたはインビトロの機能として定義される。
【００２３】
ＲＮＡの分析：
ＲＮＡの分析は、分析されるべきＲＮＡの何らかの性質を決定するために、何らかの生物学的分析法、生化学的分析法、生物物理学的分析法、化学的分析法、または物理学的分析法（例えば、質量分析法）によって行われ得る。典型的な性質は、それらに限定されることなく、サイズ、構造、電荷、ｐＨ、修飾、量、数、溶解性、安定性、濃度、等を含む。
【００２４】
しばしば使用される生物学的分析法は、ウイルス、ファージ、古細菌、細菌、真菌、植物、動物、および地球外生物のような、何らかの生物におけるインビボ法を含む。
【００２５】
しばしば使用される生化学的分析法は、インビトロ法、例えば、ハイブリダイゼーション、ＲＴ−反応、RT-PCR、RT- および RT-PCR を介する(mediated)分析法、配列決定、線形および指数的等温増幅反応(linear and exponential isothermal amplification reactions) (NASBA、TMA、3SR)、リガーゼ・チェーン反応 (LCA)、オリゴヌクレオチド・リガーゼ・アッセイ (OLA), インベーダー(Invader)（商標）、分岐DNA、プライマー伸長アッセイ、保護アッセイ、結合アッセイ、機能アッセイ等を含む。
【００２６】
しばしば使用される化学的、生物物理学的、および物理学的分析法は、何らかのタイプの分光分析、クロマトグラフィー、結晶化、イオン化、光度測定等を含む。
【００２７】
プライマー：
ＲＮＡの分析に有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、２つ以上のヌクレオチド長の、何らかのオリゴヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、ターゲット核酸の領域にハイブリダイズしてターゲット核酸を分析するために、または、相補的な核酸の重合を促進するために、使用される。
【００２８】
逆転写酵素反応（ＲＴ−反応）：
ＲＴ−反応（ｃＤＮＡ合成反応）は、オリゴヌクレオチドプライマーに依存するＤＮＡ合成反応である。ＤＮＡポリメラーゼを使用する、特異的かつ効率的なｃＤＮＡ合成のための、特異的な開始(primed)反応は、ＲＮＡ依存性(RNA-directed)および／またはＤＮＡ依存性(DNA-directed)ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われ得る。ここで、ｃＤＮＡ合成は、２つの段階：（ａ）多くの適用（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲに依存する工程等）に十分な、第一鎖ｃＤＮＡ合成；および、（ｂ）ほとんどのクローニングの目的のために必要とされる、第二鎖合成、を含む。
【００２９】
ｃＤＮＡ合成は、以下の段階を含む：
（１）第一鎖ｃＤＮＡ合成のために、オリゴヌクレオチドプライマーＰ１を、ターゲット核酸の相補的な配列にハイブリダイズさせ、次いで、デオキシリボヌクレオチドおよびＲＮＡ依存性、またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーＰ１を伸長することによって、ターゲット核酸と相補的なＤＮＡ第一鎖の合成が行われる。ここで、前記ターゲット核酸は、デオキシリボ核酸（ＲＮＡ）である；
（２）第二鎖ｃＤＮＡ合成のために、ＤＮＡ第一鎖から、ターゲット核酸を、酵素的、化学的、もしくは熱的に除去し、次いで、ＤＮＡ第一鎖の相補的な配列に、第二オリゴヌクレオチドプライマーＰ２をハイブリダイズさせることにより、または、ＤＮＡ第一鎖のヘアピンループ(hairpin-loop)を用いて、次いで、前記オリゴヌクレオチドプライマーＰ２もしくはＤＮＡ第一鎖の前記ヘアピンループを、デオキシリボヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長することによって、ＤＮＡ第一鎖と相補的なＤＮＡ第二鎖の合成を行うことができる。ここで、ＤＮＡ第二鎖は、ＤＮＡ第一鎖と相補的である；
（３）ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーＰ１は、その３’−末端に、ターゲット核酸とハイブリダイズする配列を有する；
（４）ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーＰ１は、その３’−末端に、ＤＮＡ第一鎖とハイブリダイズする配列を有する；
（５）ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーＰ１およびＰ２は、それらの５’−末端に、別の機能的なハイブリダイズしていない配列を有することができる。
【００３０】
逆転写酵素−ポリメラーゼ−チェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）：
ＲＴ−ＰＣＲにおいて、反応は、２つの部分からなり(bipartite)、ＲＴ−反応およびＰＣＲを含む。両反応（ＲＴ−反応およびＰＣＲ）は、２つの独立した装置において（二段階ＲＴ−ＰＣＴ）、または、１つの装置において（一段階ＲＴ−ＰＣＲ）、連続的に行うことができる。
【００３１】
ＲＴ−ＰＣＲ（一段階ならびに二段階ＲＴ−ＰＣＲ）のために、ＲＴ−反応中に、第一鎖ｃＤＮＡ合成のみが行われる。第一鎖ｃＤＮＡは、通常、以下の段階を含む、ＰＣＲ中の増幅段階のために使用される：
（１）ターゲット核酸の初期変性
（２）相補的な配列への、プライマーＰ２の配列に依存するハイブリダイゼーション
（３）デオキシリボヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼを使用する、プライマーＰ２の伸長、ここで、合成されたＤＮＡは、ｃＤＮＡ第一鎖と相補的である、
（４）生成された二本鎖の変性
（５）相補的な配列への、プライマーＰ１およびＰ２の配列に依存するハイブリダイゼーション
（６）デオキシリボヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼを使用する、プライマーＰ１およびＰ２の伸長、ここで、合成されたＤＮＡ鎖は、ｃＤＮＡ第二および第一鎖と相補的である；
（７）および、伸長生成物は、再び、数回繰り返される段階（４）、（５）および（６）のためのターゲットＤＮＡである
（８）ここで、前記プライマーＰ１およびプライマーＰ２は、第一および第二鎖ターゲット核酸と、（少なくとも一部が）相補的である。
【００３２】
ＲＴ−反応の成分は、典型的には、そこから相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が転写される、ＲＮＡ鋳型；ターゲット核酸とハイブリダイズするプライマー；ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す核酸ポリメラーゼ；および、核酸合成のために必要とされる適当なヌクレオチド構成要素(nucleotide building blocks)、を含む。
【００３３】
ＲＮＡ鋳型の少なくとも一部と相補的なＤＮＡ分子の合成を可能にするのに十分な温度で、まず混合物をインキュベートする。成分
【００３４】
等温増幅反応
等温核酸増幅（指数的）：
NASBA(核酸配列に基づく増幅(Nucleic Acid Sequence Based Amplification))、3SR(自立的配列複製(Self-Sustained Sequence Replication))、2SR(３SRに類似した自立的配列複製)、TMA(転写を介する増幅(Transcription-mediated Amplification))、および類似の方法のような、インビトロ転写に基づく等温指数的核酸増幅中の使用のための、特異的な開始ＤＮＡ合成反応は、配列特異的オリゴヌクレオチドプライマー、ＲＮＡ依存性、および、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して行われ得る。ここで、前記方法は、以下の段階を含む：
（１）ターゲット核酸、第一オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、第二の第一オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドプライマーＰ２、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む試薬を含む、単一の反応培地を提供すること；
（２）増幅サイクルが維持されるような条件を提供すること、ここで、
（３）ターゲット核酸の相補的な配列へ、オリゴヌクレオチドプライマーＰ１をハイブリダイズさせ、次いで、デオキシリボヌクレオチドおよびＲＮＡ依存性、またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーＰ１を伸長することにより、ターゲット核酸と相補的なＤＮＡ第一鎖の合成が行われる。ここで、前記ターゲット核酸は、デオキシリボ核酸（ＲＮＡ）またはリボ核酸（ＤＮＡ）である；
（４）ＤＮＡ第一鎖から、ターゲット核酸を、酵素的、化学的、または熱的に除去し、次いで、ＤＮＡ第一鎖の相補的な配列へ、第二オリゴヌクレオチドプライマーＰ２をハイブリダイズさせ、次いで、デオキシリボヌクレオチドおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記オリゴヌクレオチドプライマーＰ２を伸長することによって、ＤＮＡ第一鎖と相補的なＤＮＡ第二鎖の合成が行われる。ここで、ＤＮＡ第二鎖は、ＤＮＡ第一鎖と相補的である；
（５）ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーＰ１は、その３’−末端に、ターゲット核酸とハイブリダイズする配列を有する（Ｐ１）；
（６）ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーＰ２は、その３’−末端に、第一鎖ＤＮＡとハイブリダイズする配列を有する；
（７）ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーＰ１またはオリゴヌクレオチドプライマーＰ１およびオリゴヌクレオチドプライマーＰ２は、その５’−末端に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有する；
（８）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチドプライマーＰ１およびオリゴヌクレオチドプライマーＰ２の伸長によって（段階３および４）生成された前記ＤＮＡ鋳型を、インビトロでＲＮＡへ転写すること。
【００３５】
等温核酸増幅（線形）
インビトロ転写に基づく等温線形核酸増幅中の使用のための、特異的な開始ＤＮＡ合成反応は、少なくとも１つの配列特異的オリゴヌクレオチドプライマー、ＲＮＡ依存性、および、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて行われ得る。ここで、前記方法は、以下の段階を含む：
（１）ターゲット核酸、第一オリゴヌクレオチド  オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、第二の第一オリゴヌクレオチド  オリゴヌクレオチドプライマーＰ２、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド、およびデオキシリボヌクレオチドを含む試薬を含む、単一の反応培地を提供すること；
（２）増幅サイクルが維持されないような条件を提供すること、ここで、
（３）オリゴヌクレオチドプライマーＰ１を、ターゲット核酸の相補的な配列とハイブリダイズさせ、次いで、デオキシリボヌクレオチドおよびＲＮＡ依存性、またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーＰ１を伸長することによって、ターゲット核酸と相補的なＤＮＡ第一鎖の合成が行われる。ここで、前記ターゲット核酸は、デオキシリボ核酸（ＲＮＡ）またはリボ核酸（ＤＮＡ）である；
（４）ＤＮＡ第一鎖から、ターゲット核酸を、酵素的、化学的、または熱的に除去し、次いで、第二オリゴヌクレオチドプライマーＰ２を、ＤＮＡ第一鎖の相補的な配列とハイブリダイズさせることにより、または、ＤＮＡ第一鎖のヘアピンループを使用し、次いで、デオキシリボヌクレオチドおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、前記オリゴヌクレオチドプライマーＰ２もしくはＤＮＡ第一鎖の前記ヘアピンループを伸長することにより、ＤＮＡ第一鎖と相補的なＤＮＡ第二鎖の合成が行われる。ここで、ＤＮＡ第二鎖は、ＤＮＡ第一鎖と相補的である；
（５）ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーＰ１は、その３’−末端に、ターゲット核酸とハイブリダイズする配列を有する（Ｐ１）；
（６）ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーＰ２は、その３’−末端に、第一鎖ＤＮＡとハイブリダイズする配列を有する；
（７）ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーＰ１またはオリゴヌクレオチドプライマーＰ１およびオリゴヌクレオチドプライマーＰ２は、その５’−末端に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有する；
（８）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチドプライマーＰ１およびオリゴヌクレオチドプライマーＰ２の伸長によって（段階３および４）生成された前記ＤＮＡ鋳型を、インビトロでＲＮＡへ転写すること。
【００３６】
本発明：
リボ核酸（ＲＮＡ）は、生物学的および合成的に合成される物質である。ＲＮＡは、情報分子(information molecule)、反応基質、反応触媒、認識要素(recognition element)、構造要素(structural element)等を含む、多くの機能を果たす。しかし、ＲＮＡ自体、または分析ツールとしてのＲＮＡに関するほとんどの分析方法および機能のためには、ＲＮＡの純度が重要である。それは、例えば、ＲＮＡと結合する他の分子が、ＲＮＡ分子の／ＲＮＡ分子を用いる、分析／機能を妨げ得るか、または、ＲＮＡ分子の構造を破壊し得ることを意味する。このため、ＲＮＡと結合する分子の阻害または破壊機能を排除することが重要である。
【００３７】
更に、ＲＮＡの安定な二次構造は、しばしば、機能および分析の質を低下させる。二次構造は、ＲＮＡ分子の環境に依存する。
【００３８】
本発明は、情報分子、反応基質、反応触媒、認識要素、構造要素等として採取されるべきＲＮＡと結合する分子の阻害または破壊効果を排除するために、溶液中のＲＮＡへの、硫酸アンモニウム（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加を提供する。更に、（ＮＨ4）2ＳＯ4は、ＲＮＡを、反応および分析に、より利用できるようにするために、ＲＮＡの二次構造を溶解する。
【００３９】
１つの態様では、本発明は、ＲＮＡを含む環境への、（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加に関し、そこでは、好ましい態様では、最終濃度は、２０ｇ／１００ｍｌ（１．５１Ｍ）を超えない。環境への（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、ＲＮＡに結合するか、またはＲＮＡを開裂する試薬の阻害効果を中和する。そのような試薬は、カチオン系界面活性剤（例えば、カトリモックス(CATRIMOX)、および臭化セチルトリメチルアンモニウム=CTAB、例えば、ヨーロッパ特許出願  EP 1031626 A1参照)、蛋白質、臭化エチジウム、SybrGreen、ポリアミン(例えば、スペルミン、スペルミジン、プトレセイン(putresceine)等)、帯電した多糖類、糖蛋白質、求核試薬、塩基、等を含む。その環境内に（ＮＨ4）2ＳＯ4が存在すれば、ＲＮＡに結合する試薬の阻害性または開裂性は、その環境またはその中に含まれるＲＮＡの機能および分析を妨げない。
【００４０】
【実施例】
以下の実施例により、本発明を説明するが、本発明は、それらに限定されるものではない。
【００４１】
実施例１
カチオン系界面活性剤を含むＲＮＡ試料の阻害効果の中和
カチオン系界面活性剤は、ＲＮＡ試料による反応を阻害し得る
ＲＮＡの逆転写中に、カチオン系界面活性剤は、最終濃度０．００６４％以上において、阻害性を有する。このことを、図１に示す。
【００４２】
実施例２
逆転写酵素反応を阻害するＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、逆転写の効率(performance)を高める
鋳型としてＲＮＡを使用する酵素反応は、クローニングおよび発現分析に、非常に重要である。特に、逆転写酵素反応（ＲＴ−反応）において、ＲＮＡは、機能的および定量的に分析される。
逆転写酵素は、ＲＮＡと結合するカチオン系界面活性剤を置換することができない。ＲＮＡはマスクされ、鋳型としての機能を果たさない。従って、ＲＮＡは、定量的に分析され得ない。逆転写酵素ポリメラーゼ・チェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）中のカチオン系界面活性剤の結合により、非常に弱いシグナル強度のみが得られた。ＲＮＡの変性段階（６５℃で５分、氷上で急冷(shock cool)）は、ＲＮＡとカチオン系界面活性剤との複合体を溶解しない。最終濃度５−３２ｍＭへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加および氷上での急冷を伴う６５℃での５分間の試料の変性は、ＲＴ−ＰＣＲのシグナルを、顕著に高める（図２）。逆転写酵素は、３２ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4の最終濃度まで、阻害されない。
【００４３】
実験の構成(set-up)：
カチオン系界面活性剤を含む、ヒト血液ＲＮＡを、１０μｌの水または最終濃度５−６４ｍＭの１０μｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液に溶解した。溶液を、６５℃で５分間変性させ、氷上で冷却した。全溶液を、２０μｌのＲＴ−反応物(RT-reaction)に移した。ＲＴ−反応を、３７℃で行った。ＲＴ−反応が終了した後、２μｌのＲＴ−反応物(RT-reaction)を、２０μｌのＰＣＲに移した。β−アクチン特異的プライマーによって、ヒトβ−アクチン配列の１７００ｂｐフラグメントが検出された。
【００４４】
実施例３
ＲＮＡ試料への（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、阻害性のＲＮＡによる反応にのみ影響を及ぼし、非阻害性のＲＮＡ試料による反応には影響を及ぼさない
カチオン系界面活性剤によって阻害されるＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、逆転写中の効率を、約１０倍以上増加させる。対照的に、カチオン系界面活性剤によって阻害されないＲＮＡは、ＲＴ−反応の効率の非常に低い増加（１．６倍）のみを示した（図３）。
【００４５】
実験の構成：
カチオン系界面活性剤を含むＨｅｌａ細胞からの全ＲＮＡ（ＲＮＡ＋カチオン系界面活性剤）を、カチオン系界面活性剤を含まないＨｅｌａ細胞からの全ＲＮＡ（ＲＮＡ−カチオン系界面活性剤）と比較した。異なる濃度の（ＮＨ4）2ＳＯ4の存在によって、何倍増加したかを決定するために、ＲＮＡ（カチオン系界面活性剤あり、および、なし）を、１０μｌの水または最終濃度５−３０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液１０μｌに溶解した。溶液を、６５℃で５分間変性させ、氷上で冷却した。全溶液を、２０μｌのＲＴ−反応物(RT-reaction)へ移した。ＲＴ−反応を、３７℃で行った。合成されたｃＤＮＡの量を決定するために、２μｌのＲＴ−反応物(RT-reaction)を、２０μｌのＰＣＲへ移し、β−アクチン特異的プライマーによって、ヒトβ−アクチン配列の１７００ｂｐフラグメントを検出した。
【００４６】
実施例４
カチオン系界面活性剤を含むＲＮＡ試料の阻害効果の中和
カチオン系界面活性剤を含むＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲの効率を高めない
カチオン系界面活性剤を含むＲＮＡによるＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲは、効率が悪い（閾値サイクルがより遅い(later threshold-cycle)）。逆転写酵素ポリメラーゼ・チェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）中のカチオン系界面活性剤の結合により、高い閾値サイクルのみが得られた。最終濃度１０ｍＭへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加および氷上での急冷を伴う、６５℃での５分間の試料の変性は、閾値サイクルを顕著に低下させる（図４）。
【００４７】
実験の構成：
ヒト血液ＲＮＡを、カチオン系界面活性剤を用いて、または、カチオン系界面活性剤なしの古典的な方法によって、調製した。ＲＮＡを、水または１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4で溶出した。１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む溶出液を、６５℃で５分間変性させ、氷上で冷却した。各溶出液のアリコートを、ＧＡＰＤＨのシングルチューブ(single-tube)ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲに移した。反応の成分は、アプライド・バイオシステム(Applied Biosystem)（ＰＤＡＲ ＧＡＰＤＨ）によって供給される。
【００４８】
実施例５
ＲＮＡ試料の阻害効果の中和は、長時間(over time)安定である
カチオン系界面活性剤を含むＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、長時間、ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲの効率を高めない
カチオン系界面活性剤のＲＮＡへの結合は、長時間（ＮＨ4）2ＳＯ4を添加することによって中和され得る。長時間（少なくとも３週間）、カチオン系界面活性剤の阻害効果を中和するためには、たった１つの初期変性（６５℃で５分、氷上で急冷）が必要である。（ＮＨ4）2ＳＯ4の存在下では、カチオン系界面活性剤とＲＮＡとの再結合は得られない。
【００４９】
実験の構成：
ヒト血液ＲＮＡを、カチオン系界面活性剤を用いて（ＡおよびＢ）、または、カチオン系界面活性剤なしの古典的な方法によって（Ｃ）、調製した。水（ＢおよびＣ）または１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4（Ａ）によって、ＲＮＡを溶出した。１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む溶出液を、最初に６５℃で５分間変性させ、氷上で冷却した。各溶出液のアリコートを、ＧＡＰＤＨ（図５）またはＴＮＦアルファ（図６）のシングルチューブＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲに移した。他のアリコートを、１〜３週間、−２０℃で保存した。これらのアリコートを、更なる変性段階なしで、更なるＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲ分析に移した。それらの値を、古典的な方法によって調製されたＲＮＡ（Ｃ）によって得られた閾値サイクルに標準化した。
【００５０】
実施例６
スペルミンを含むＲＮＡ試料の阻害効果の中和
スペルミンは、ＲＮＡ試料による反応を阻害することができる
スペルミンは、最終濃度１ｍＭで、逆転写酵素反応中、４倍までの減少を引き起こす（図７）。
【００５１】
実験の構成：
０ｍＭ（レーン１）、０．１２５ｍＭ（レーン２）、０．２５ｍＭ（レーン３）、０．５ｍＭ（レーン４）および１ｍＭ（レーン５）のスペルミンを含む逆転写酵素反応を行った。ＲＴ−反応後に生成されたｃＤＮＡを定量するために、２μｌのＲＴ−反応物を、２０μｌのＰＣＲに移した。ゲル電気泳動によって、特異的なフラグメントを分析した（図７）。
【００５２】
実施例７
逆転写酵素反応を阻害するスペルミンを含むＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、逆転写の効率を高める
逆転写酵素は、ＲＮＡに結合するスペルミンを置換することができない。ＲＮＡはマスクされ、鋳型として機能しない。従って、ＲＮＡは、定量的に分析され得ない。スペルミンのＲＮＡへの結合により、逆転写酵素ポリメラーゼ・チェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）中、非常に弱いシグナル強度のみが得られた。ＲＮＡの変性段階（６５℃で５分、氷上で急冷）は、ＲＮＡとスペルミンとの複合体を溶解しない。最終濃度５ｍＭへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加、および、氷上での急冷を伴う、６５℃での５分間の試料の変性は、ＲＴ−ＰＣＲのシグナルを、顕著に高める（図８）。
【００５３】
実験の構成：
５ｍＭのスペルミンを含む全ＲＮＡを、２μｌの水（レーン２）、または、２μｌの５ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液（レーン１）に溶解した。レーン３では、スペルミンなしの全ＲＮＡを、２μｌの５ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液に溶解した。溶液を、６５℃で５分間変性させ、氷上で冷却した。全溶液を、２０μｌのＲＴ−反応物(RT-reaction)に移した。ＲＴ−反応を、３７℃で行った。ＲＴ−反応の終了後、２μｌのＲＴ−反応物を、２０μｌのＰＣＲへ移した。ゲル電気泳動によって、特異的フラグメントを分析した。
【００５４】
実施例８
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮを含むＲＮＡ試料の阻害効果の中和
SybrGreenは、RNA試料による反応を阻害し得る
SybrGreenは、最終濃度１００ｘで、ｃＤＮＡ合成を完全に失わせる（図９）。
【００５５】
実験の構成：
０ｘ、０．００１ｘ、０．０１ｘ、０．１ｘ、１ｘ、１０ｘおよび１００ｘのＳｙｂｒＧｒｅｅｎを含む逆転写酵素反応を行った。ＲＴ−反応後に生成されたｃＤＮＡを定量するために、２μｌのＲＴ−反応物(RT-reaction)を、２０μｌのPCRへ移した。ゲル電気泳動によって、特異的フラグメントを分析した。
【００５６】
実施例９
逆転写酵素反応を阻害するＳＹＢＲＧＲＥＥＮを含むＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、逆転写の効率を高める
逆転写酵素は、ＲＮＡと結合するＳｙｂｒＧｒｅｅｎを置換することができない。ＲＮＡは、マスクされ、鋳型として機能しない。従って、ＲＮＡは、定量的に分析され得ない。ＳｙｂｒＧｒｅｅｎのＲＮＡへの結合により、逆転写酵素ポリメラーゼ・チェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）中、非常に弱いシグナル強度のみが得られた。ＲＮＡの変性段階（６５℃で５分、氷上で急冷）は、ＲＮＡとＳｙｂｒＧｒｅｅｎとの複合体を溶解しない。最終濃度５ｍＭへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加、および、氷上での急冷を伴う、６５℃での５分間の試料の変性は、ＲＴ−ＰＣＲシグナルを、顕著に高める（図１０）。
【００５７】
実験の構成：
ＳｙｂｒＧｒｅｅｎを含む全ＲＮＡを、２μｌの水（レーン２）または２μｌの５ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液（レーン１）に溶解した。レーン３では、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎなしの全ＲＮＡを、２μｌの５ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液に溶解した。溶液を、６５℃で５分間変性させ、氷上で冷却した。全溶液を、２０μｌのＲＴ−反応物(RT-reaction)へ移した。ＲＴ−反応を、３７℃で行った。ＲＴ−反応の終了後、２μｌのＲＴ−反応物を、２０μｌのＰＣＲへ移した。ゲル電気泳動によって、特異的シグナルを分析した。
【００５８】
実施例１０
ＲＮＡバックボーンおよび塩基への（ＮＨ4）2ＳＯ4イオンの強固な結合
ＲＮＡバックボーンへの（ＮＨ4）2ＳＯ4イオンの強固な結合により、競合および電気泳動の移動性の低下が引き起こされる
臭化エチジウムは、ＲＮＡのバックボーンに結合し、ならびに、二本鎖ＲＮＡへ挿入される。変性条件（例えば、変性ゲル電気泳動）下では、一本鎖ＲＮＡのみが存在する。次いで、変性条件下で、臭化エチジウムは、イオン性相互作用によって、ＲＮＡバックボーンに結合する。臭化エチジウムとＲＮＡとの間の、このイオン性相互作用は、（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加によって競合され得て、このことは、（ＮＨ4）2ＳＯ4とＲＮＡとの強固な相互作用を示唆する（図１１）。この臭化エチジウム置換アッセイは、（ＮＨ4）2ＳＯ4とＲＮＡとの間の強固な結合を示した。
【００５９】
実験の構成：
２．６μｇの全ＲＮＡを、水に溶解し、または、２．３μｇの全ＲＮＡを、５ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4へ溶解した。ホルムアルデヒドおよびホルムアミドを含む変性ローディング(loading)バッファーの添加後、試料を６５℃で変性させ、図１１に示すように、変性ホルムアルデヒドゲル上に載せた。
【００６０】
実施例１１
（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加により、電気泳動の移動性の遅延（retardation）が起こり、このことは、（ＮＨ4）2ＳＯ4による、負に帯電したＲＮＡバックボーンの強い単離を示唆する（図１２）。淡色効果の測定により、ＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の強固な結合、および、その後の電気的単離が更に示される。塩基の複素環は、２６０ｎＭで光を吸着（吸収）する。淡色効果は、ダブルヘリックスの平行な配列におけるそれらのスタッキングによって可能となる、塩基の電子系間の相互作用によって生じる。複式(duplex)状態からの何らかの減少は、この効果の増加によって、即ち、２６０ｎＭでの光学濃度の増加によって、直ちに反映される（図１２）。
【００６１】
実験の構成：
ＲＮＡ（２２μｇ／ｍｌ）を、異なる濃度の（ＮＨ4）2ＳＯ4に溶解する。図１２に示すように、２６０ｎＭでの光学濃度を測定した。
【００６２】
実施例１２
ＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4イオンの強固な結合により、求核試薬を含む環境におけるより良好な安定性がもたらされる
ＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4イオンの強固な結合により、アルカリ性の環境におけるより良好な安定性がもたらされる
ＲＮＡは、アルカリ性ｐＨの環境において、求核的なＯＨ-イオンによる塩基性加水分解により、迅速に分解する。アルカリ性の環境におけるＲＮＡへの硫酸アンモニウムの添加は、ＲＮＡを安定化し、かつ、アルカリ加水分解から、ＲＮＡを保護する。
【００６３】
実験の構成：
１μｇの０．２４−９．５ｋｂのＲＮＡラダー(ladder)（ＬＴＩ）を、異なるｐＨ（８．３−１１）で、10 mM (NH4)2SO4、2 mM MgCl2、40 mM NaClおよび50 mM Tris-バッファーを含むバッファー中で、３７℃で１時間インキュベートした。変性ゲルローディングバッファーの添加後、試料を、６５℃で変性させ、変性ホルムアミドゲル上に載せた。ゲルを、図１３に示す。
【００６４】
実施例１３
（ＮＨ4）2ＳＯ4中に溶解したＲＮＡの下流分析は、影響を受けない
逆転写酵素の活性は、（ＮＨ4）2ＳＯ4を含むＲＮＡ試料による影響を受けない
図１４に示すように、逆転写酵素は、（ＮＨ4）2ＳＯ4による影響を受けない。３種の異なる逆転写酵素を、異なる濃度の硫酸アンモニウムを含むか、または含まない活性アッセイにおいて比較した。硫酸アンモニウムなしの逆転写酵素の活性を、１．０とした（図１４）。
【００６５】
実験の構成：
異なる（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度（０−３０ｍＭ）の溶液中のＨｅｌａ細胞からの全ＲＮＡ１０μｌ量を、ＲＴ−反応物(RT-reactions)内へスパイクした(spiked)。水中の１０μｌのＲＮＡと比べた相対活性を決定した。すべてのＲＮＡ試料を、６５℃で５分間変性させ、氷上で冷却した。結果を、図１４に示す。
【００６６】
実施例１４
その生成物がマイクロアレイのために使用される標識反応のためのＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加
逆転写酵素は、ＲＮＡと強固に結合した阻害物質または二次構造の強固な塩基対と置換することができない。それ故、阻害物質または安定な二次構造の結合は、マイクロアレイによる転写の分析に影響を及ぼし得る。氷上での急冷を伴う、６５℃、５分間の５ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む溶液中のＲＮＡの変性段階により、マイクロアレイでのプラスのシグナルの数およびシグナル強度が増加する。
【００６７】
実験の構成：
１０μｇの全ＲＮＡを、２０μｌの５ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液へ溶解し、６５℃で５分間変性させた。溶液を、氷上で急冷した。別の実験では、（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む溶液中で、ＲＮＡを変性させなかった。両ＲＮＡを、標識としてシアニン−５−ｄＣＴＰを用いて、オムスクリプト(Omnscript)逆転写酵素によって、逆転写させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムでの標識されたｃＤＮＡの精製後、真空によってｃＤＮＡ含有溶液の量を減少させた。マイクロアレイによる精製されたｃＤＮＡの１／５のハイブリダイゼーションを、一晩、標準的なハイブリダイゼーションバッファー中で行った。マイクロアレイの洗浄のために、標準的な洗浄バッファーを使用した。
【００６８】
結果：
標識反応前の（ＮＨ4）2ＳＯ4含有溶液中でのＲＮＡの変性により、（ＮＨ4）2ＳＯ4含有溶液中でのＲＮＡの変性なしの標準的な標識工程（Ａ）と比べて、より多くのシグナルが観察でき、かつ、より高いシグナル強度が得られた（Ｂ）。
【００６９】
前述から、ここでは、説明のために、本発明の特定の態様を記載したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な修正が行われ得ることが、理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】逆転写酵素反応中のカチオン系界面活性剤の阻害効果。
【図２】カチオン系界面活性剤を含んでいたＲＮＡは、カチオン系界面活性剤によって阻害される。
【図３】カチオン系界面活性剤なしの純粋なＲＮＡは、ＲＴの効率の非常に弱い増加のみを示した。
【図４】カチオン系界面活性剤なしの古典的な方法によって調製されたか、または、カチオン系界面活性剤によって調製されたＲＮＡの分析。
【図５】古典的な方法（Ｃ）によって調製されたか、または水中での溶出によるか（Ｂ）、または５ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4中での溶出により、カチオン系界面活性剤によって調製されたＲＮＡ。
【図６】古典的な方法（Ｃ）によって調製されたか、または水中での溶出によるか（Ｂ）、または５ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4中での溶出により、カチオン系界面活性剤によって調製されたＲＮＡ。
【図７】逆転写酵素反応中のスペルミンの阻害効果。
【図８】SybrGreenを含んでいたＲＮＡの逆転写は、スペルミンのＲＮＡへの結合によって阻害される（レーン２）。スペルミンによって阻害されたＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、阻害効果を中和する(レーン３)。レーン１は、対照として役立つ。
【図９】逆転写酵素反応中のSybrGreenの阻害効果。
【図１０】SybrGreenを含んでいたＲＮＡの逆転写は、SybrGreenのＲＮＡへの結合によって阻害される（レーン２）。スペルミンによって阻害されたＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加は、阻害効果を中和する(レーン１)。レーン３は、対照として役立つ。
【図１１】ＲＮＡへの（ＮＨ4）2ＳＯ4イオンの強固な結合は、ＲＮＡバックボーンへ結合する臭化エチジウムの減少、および、負に帯電したＲＮＡバックボーンの強い単離を示す電気泳動の移動性の低下によって示される。
【図１２】（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加による、２６０ｎＭでのＲＮＡの淡色効果。
【図１３】示した異なるｐＨ、および、１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１時間、３７℃でのＲＮＡのインキュベーション。
【図１４】異なる（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度の溶液に溶解したＲＮＡを使用する逆転写酵素の相対活性。
【図１５】実施例１４の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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