(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非活性表面に対する生物分子の非共有結合による相互作用を削減または破壊するためのベタインまたはグリシンベタインの使用。
【請求項２】
前記ベタインまたはグリシンベタインが最終濃度として１から２．５Ｍの濃度で存在する請求項１に記載のベタインまたはグリシンベタインの使用。
【請求項３】
前記生物分子が巨大分子である請求項１または２に記載のベタインまたはグリシンベタインの使用。
【請求項４】
巨大分子が炭水化物、ポリ核酸、ポリペプチド、これらの組み合わせ、またはこれらの修飾物である請求項１〜３のいずれかに記載のベタインまたはグリシンベタインの使用。
【請求項５】
生物分子がペプチド、オリゴヌクレオチド、これらの組み合わせ、またはこれらの修飾物質である請求項１〜４のいずれかに記載のベタインまたはグリシンベタインの使用。
【請求項６】
前記ポリ核酸及び前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡである請求項４又は５に記載のベタインまたはグリシンベタインの使用。
【請求項７】
前記ポリ核酸及び前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである請求項４又は５に記載のベタインまたはグリシンベタインの使用。
【請求項８】
非活性表面がシリコン表面、シリコンウェーハ、ガラス表面、これらの組み合わせまたはこれらの化学修飾物である請求項１〜７のいずれかに記載のベタインまたはグリシンベタインの使用。
【請求項９】
ベタインまたはグリシンベタインの濃縮保存溶液と、
ベタインまたはグリシンベタインを含有する反応緩衝液調整物質と、
ベタインまたはグリシンベタインを含有した酵素調整物質と、を少なくとも含む、非活性表面に対する生物分子の非共有結合による相互作用の削減または破壊用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、非活性表面に対する生物分子の非共有結合相互作用（non-covalent interactions）を低減または阻害するための浸透物質の使用法に関する。さらに、本発明は、本発明による使用法に用いることのできるキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
新物質の開発は、現代技術の幅広い分野において大きな影響を与えている。例えば、過去の例としては、シリコン、ガリウム亜ヒ酸塩、または多結晶物質などの導入は半導体技術に根強く浸透した。現代生物学においても、同様の開発が認められている。すなわち、過去２０年にわたり、ＥＬＩＳＡなどの免疫計量（immunometric）法において、実験プロトコルの基準化及び実験結果のおける物質に基づく誤差率の最小化を実現する物質が確立された。また、これと同様に重要な別の開発としては、対象となる生物学的化合物を純化及び分離するために（カラム）クロマトグラフィーにおいて用いられる新規の担体物質の促進がある。
【０００３】
多くの生物学的な分析及び分離技術において科学者が直面する主な問題の一つとして、実験の精度及び生産収量が、背景問題または望ましくない可能性のある不特定相互作用の問題によって損なわれるという問題がある。かかる問題は、例えば、担体表面に対するタンパク質または他の生物学的な化合物の非共有結合により発生しうる。ＥＬＩＳＡ技術においてかかる問題を解決するためには、問題の化合物をテストする前に、ポリスチロール（polystyrrol）などの担体物質の自由結合サイトを異種構造タンパク質などの関連のない生物物質に対して「遮断」する。
【０００４】
最も最近において革命的な分子生物学の技術は、ＰＣＲ技術である。当然ながら、ＰＣＲの幅広い適用性に鑑み、この技術の様々な側面をさらに改良すべく多大な努力が現在までも、また現在でも行われている。これらの開発の一つとして、微少化されたＰＣＲチップ、すなわち、ＰＣＲ反応チャンバを形成するために平坦なガラス片に結合された微少化生成シリコンチップの開発がある（例えば、Shoffner el al.,"Chip PCR.I.Surface passivation of microfabricated silicon-glass chips for PCR", Nucl. Acids Res. 24(1996), 375-379参照のこと）。これまでＰＣＲチップの製造に用いられてきた天然シリコンがＰＣＲの阻害剤であることが判明した。そのために研究者たちはかかる阻害剤または背景問題によって損なわれることのない信頼できるＰＣＲの結果を得るための物質及び方法を調査し、その結果、この目標達成のために酸化シリコン（ＳｉＯ2）の使用を提案した。
【０００５】
このような功績を認めた上で、さらに、一般的に商業上の利用が可能な表面を修正せずに、あるいは適当な非活性表面のわずかな部分の使用のみに限定することなく、非活性表面と生物分子の不特定あるいは非共有相互作用を低減または削除する方法があれば、非常に望ましく効果的である。このような手段の開発が成功すれば、その使用はＰＣＲ技術に限定されることなく現代生物学において幅広く適用できる。例えば 、Ｖｏｌｋｍｕｔｈ及びＡｕｓｔｉｎにより、ＤＮＡ分子のmicro-electrophesis（微量電気泳動法）が開発された（Volkmuth and Austin, "DNA electrophoresis in microlithographic arrays", Nature 358(1992), 600-602)参照のこと）。このような技術は、ベタインなどの浸透物質を緩衝システムに含むという点からも効果がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このように、本発明の技術的課題は、上述の従来技術に関する問題を解決し、非活性表面に対する生物分子の望ましくない相互作用を低減または阻害するシステムを開発することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、非活性表面に対する生物分子の非共有相互作用を低減または阻害するための浸透物質の使用法を提供する。本発明によれば、適当な濃度の浸透物質を、生物分子を含む溶液に加えることにより、前記表面に対する前記分子の非共有結合相互作用が阻害されないまでも低減されるという驚くべき効果が得られる。
【０００８】
浸透物質（または浸透溶質）は、水による応力を与えられた（water-stressed）多種の原核生物及び真核生物有機体から得られる。ハロバクテリアを除くこれらすべての有機体において見られる浸透物質システムの３つの種類は、多価アルコール（グリセロール及びサッカロースなど）、遊離アミノ酸とそれらの誘導体（タウリン及びβアラニンなど）、及びメチルアミン（例えば、トリメチルアミンＮ酸化物（ＴＭＡＯ）、ベタイン、及びサルコシン）あるいはメチルアミンと尿素との組み合わせである（Yancey et al., "Living with water stress: evolution of osmolyte systems "Science 217 (1982), 1214-1222  参照のこと)。
【０００９】
本発明の主要な効果の一つとして、浸透物質をかかる溶液に加えるだけで、多種にわたる非活性表面に対する前記物質の相互作用を適当に低減または阻害することができる。よって、特定の実験設定または実験目的を得るために必要な表面を特別に設計もしくは選択する必要がない。本発明によるさらなる効果として、以前は困難であった様々な実験の設計を単純化できるため、関心のある研究者にとっては時間とコストの節減になる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本明細書において用いられる「生物分子」という用語は、有機体または生物細胞（living cell）の一部である有機分子、またはかかる分子の誘導体を意味する。これらの分子の起源は、天然でも合成でも半合成でもよい。
【００１１】
また、ここで用いられる「非活性（inert）」という用語は、「化学的反応能力を全くまたはわずかしか持たない」という意味である。したがって、この用語は、大気中において結合されない状態で発生する窒素に関する「不活性の性質（inertness）」と同義である。
【００１２】
本発明による使用法の好適な実施形態において、前記浸透物質は、両性イオン浸透物質である。
【００１３】
本発明の使用法にかかる非常に好適な実施形態では、前記両性イオン浸透物質は、以下の構造式（structural formula）を有する。
【００１４】
【化２】
0004113603.tif 000002
なお、Ｒ1，Ｒ2およびＲ3はＨ（水素），ＣＨ3，Ｃ2Ｈ5またはその他任意のアルキルであり、Ｒ’は任意のアミノ酸残基である。
【００１５】
本発明の使用法にかかるさらに好適な実施形態では、前記両性イオン浸透物質は、アミノ酸またはそのメチル化産物である。
【００１６】
本発明の使用法にかかるさらに別の好適な実施形態では、前記両性イオン浸透物質は、ベタイン及び好ましくはグリシンベタインである。
【００１７】
本発明のさらに好適な実施形態においては、前記浸透物質は、１〜２．５Ｍの最終濃度で存在する。
【００１８】
前記浸透物質の効果的な特性は、この物質が１Ｍ以下の濃度で反応混合物に含まれる場合に得られるが、浸透物質が１〜２．５Ｍの最終濃度で存在する場合に、特に効果的な結果が得られる。
【００１９】
本発明のさらに好適な実施形態においては、前記生物分子は、巨大分子（macromolecule）である。
【００２０】
「生物分子」に関する「巨大分子」という用語は、当該分野の技術者には明らかであり、ここで詳細な説明は必要でない。
【００２１】
本発明の使用にかかる好適な実施形態においては、前記巨大分子は、炭水化物、多核酸またはポリペプチド、またはそれらの混合物または修飾物である。前記混合物または修飾物は必ずしも生物学的な機能を持つ必要はない。実際には、その生物学的機能については（現在のところ）当該技術分野では知られていない（例えば、ペプチド核酸についての議論（Nielsen et al. Science 254 (1991), 1497-1500）を参照のこと）。しかしながら、前記修正された生物学的巨大分子は、誘導源である生物学的巨大分子と本質的に同一の物理化学的特性を有し、例えば分子生物学において同一または同様に適用できる可能性がある。
【００２２】
本発明のさらに好適な実施形態においては、前記生物分子は、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドまたはこれらの混合物または修飾物である。
【００２３】
本発明の好適な実施形態においては、前記多核酸またはオリゴヌクレオチドはＤＮＡである。
【００２４】
ここで用いられる「ＤＮＡ」という用語は、いかなるタイプのＤＮＡ、特にｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含む。
【００２５】
本発明のさらに好適な実施形態においては、前記多核酸またはオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡである。
【００２６】
本発明において用いられる「ＲＮＡ］という用語は、いかなるタイプのＲＮＡを含めることができるが、特にｍＲＮＡを意味する。
【００２７】
本発明の別の好適な実施形態においては、前記非活性表面はシリコン表面、シリコンウェーハ、ガラス表面、またはこれらの混合物または化学的修飾物である。
【００２８】
最も便宜的には、前記物質は製造されたシリコンであり、かかるシリコンは、例えば、フォトリソグラフィーなどの標準的な製造または処理技術によって得ることができる。
【００２９】
本発明は、さらに、
（ａ）前記のように規定された浸透物質の濃縮保存溶液と、
（ｂ）前記のように規定された浸透物質を含む反応緩衝調整剤と、
（ｃ）前記のように規定された浸透物質を含む酵素調整剤と、
の少なくともいずれか一つを含むキットに関する。
【００３０】
本発明によるキットの様々な成分は、好ましくは標準的な反応ガラス瓶（reaction vials）中で調整され、互いに独立している。本発明のキットに含まれる保存溶液に使用される濃度は、本発明において効果を発揮するよう浸透物質を適当に希釈するのに適した濃度である。本発明の緩衝剤の実施形態（ｂ）及び（ｃ）においては、浸透物質は好ましくは最終的な濃度で包含されている。前記最終濃度の範囲及び限定は、上述の通りである。
【００３１】
【実施例】
［実施例１］シリコン粒子及び両性イオン浸透物質の存在下でのポリメレース連鎖反応（ＰＣＲ）
本実施例では、核酸鋳型に依存したＰＣＲ反応における純粋なシリコン表面等の非活性表面による阻害効果がベタインなどの浸透物質の存在により低減されることを示す。なお、本実施例では、Ｓｉｇｍａ社から市販されているグリシンベタインを用いた。
【００３２】
シリコンは、半導体技術において非常に重要な材料であるばかりでなく、生物分野においても重要である。これはこの物質の取り扱いが容易であり、また、三次元の微小構造を迅速に形成することができることに由来する。そのため、ＰＣＲを初めとして、純粋なシリコンの存在下における種々の実験は、例えば、シリコン懸濁液を用いた生物学的プロセスの小型化モデルの確立という観点から、将来大変重要となる。純粋なシリコンは、種々の原因より一般にＰＣＲのような生物学的プロセスを阻害することが知られている。これらの原因の一つとして、例えば、微少な反応チャンバ内の極小さな容積に比して、かなり大きな表面と分子とが相互作用を行うことが考えられる。
【００３３】
ＰＣＲにおける純粋なシリコン表面の阻害効果を試験するために、モデルシステムとして、破砕したシリコン粒子の存在下、Ｍ１３ベクターに挿入された１．２ｋｂのヒト染色体ＤＮＡをＰＣＲにより増幅する実験を行った。
【００３４】
反応を行うに当たり、水（図１、レーン２から５）または１Ｍベタイン溶液（図１、レーン６から９）に懸濁された種々の量（１０、５０、７５）のシリコン粒子、０．２μＭ以下配列を有する２種のプライマー、１００μＭ各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 及び２．５ユニットＴａｑポリメレースを含有した１倍濃度の緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８及び５０ｍＭ  ＫＣｌ）に、１ｎｇのＭ１３ＤＮＡを懸濁し、最終容量を５０μｌとしたものを準備した。上記２種のプライマーの配列は、Ｍ１３−４０（２４塩基）が、５’−CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-３’（配列番号１）であり、また、Ｍ１３−Ｒｅｖ（２４塩基）が、５’−TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-３’（配列番号２）である。また、上記においてベタインを含有する反応液の場合には、必要な量の水と５Ｍベタインの保存溶液とを混合し最終反応容量の５０μｌに調整した。
【００３５】
なお、ここで用いたシリコン粒子は、約０．５ｍｍ  ｘ  ０．５ｍｍ  ｘ  ０．３ｍｍのものを用いた。
【００３６】
上記混合液を調整後、以下の条件下でＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃、２０秒間（変性）、５５℃、３０秒間（アニーリング）、７３℃、２分３０秒間（伸長）とし、これを３０サイクル繰り返した。反応後、５μｌの反応液に２μｌの電気泳動溶液（７０％グリセロール、０．０２ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）を混合し、アガロースゲル上で電気泳動を行った。尚、この際にサイズマーカとしてλ−ＢｓｔＥＩＩを前記ゲル上に同時に泳動した。
【００３７】
電気泳動の結果を図１に示す。なお、図１の各レーンには、以下のサンプルを泳動した。レーン１：λ−ＢｓｔＥＩＩマーカ；レーン２から５：水及び種々の量のシリコン粒子を用いてバッファ中で行ったＰＣＲ（５０μｌ）；レーン２：１０粒子；レーン３：５０粒子；レーン４：７５粒子；レーン５：対照粒子ゼロ；レーン６から９：１Ｍのベタイン及び種々の量のシリコン粒子を用いてバッファ中で行ったＰＣＲ（５０μｌ）；レーン６：１０粒子；レーン７：５０粒子；レーン８：７５粒子；レーン９：対照粒子ゼロ。
【００３８】
図１に示す通り、シリコン粒子の添加量の増加による阻害効果が、ＰＣＲバッファー中に添加された種々のモル濃度のベタインにおいて示された。
【００３９】
［実施例２］シリコン粉末及び両性イオン浸透物質の存在下でのＰＣＲに対する影響
上述したＳｈｏｆｆｎｅｒらにより、近年、ＰＣＲ反応へのシリコン粉末の阻害効果が示されている。本実施例は、ＰＣＲの反応バッファー中に浸透物質、例えば両性イオン浸透物質であるベタインを添加することにより、上記阻害効果を効果的に低減させることができることを示す。
【００４０】
ＰＣＲ実験は、モデルシステムとして、ヒト染色体ＤＮＡ由来の１．５ｋｂ断片が挿入されたＭ１３ベクターを用いて行った。シリコンを含有するＰＣＲ反応液は、４．６ｍｇシリコン粉末（Ｓｉｇｍａ社、３２５メッシュ、純度９９％、製品番号２１５６１−９）を最終容量として１００μｌに調整した。ここで純粋なシリコン粉末の濃度は、前記Ｓｈｏｆｆｎｅｒらにより示されたＰＣＲ反応を阻害する濃度とした。
【００４１】
ＰＣＲを行うに当たり、以下の反応液を調整した。すなわち、１倍濃度の緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８及び５０ｍＭ  ＫＣｌ）、水（図２、レーン２）あるいは４．６ｍｇシリコン粉末を含有する溶液（図２、レーン３から８）、１ｎｇＭ１３ＤＮＡ、０．３μＭ  Ｍ１３−４０プライマーＤＮＡ（２４塩基、５’−CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-３’（配列番号１））、０．３μＭ  Ｍ１３−ＲｅｖプライマーＤＮＡ（２４塩基、５’−TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-３’（配列番号２））、２００μＭ各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 及び１０ユニットＴａｑポリメレースを、最終容量として１００μｌに調整したものを準備した。前記４．６ｍｇシリコン粉末を含有する溶液は、水（図２、レーン３）、０．５Ｍベタイン溶液（図２、レーン４）、１Ｍベタイン溶液（図２、レーン５）、２Ｍベタイン溶液（図２、レーン６）を用いて調整した。また、上記においてベタインを含有する反応液の場合には、必要な量の水と５Ｍベタインの保存溶液とを混合して最終容量の１００μｌに調整した。
【００４２】
上記混合液調整後、以下の条件下でＰＣＲ反応を行った。すなわち、ＰＣＲの条件は、９４℃、２０秒間（変性）、５５℃、３０秒間（アニーリング）、７３℃、２分３０秒間（伸長）とし、これを３０サイクル繰り返した。反応後、５μｌの反応液に２μｌの電気泳動溶液（７０％グリセロール、０．０２ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）を混合し、アガロースゲル上で電気泳動を行った。尚、この際にサイズマーカとしてλ−ＢｓｔＥＩＩを前記ゲル上に同時に泳動した。
【００４３】
泳動結果を図２に示す。なお、図２における各レーンには、以下のサンプルを泳動した。レーン１：λ−ＢｓｔＥＩＩマーカ；レーン２：シリコン粉末を包含しない標準的なＰＣＲバッファ中で行ったＰＣＲ；レーン３から６：１００μｌのＰＣＲ量において４．６ｍｇのシリコン粉末を用いて行ったＰＣＲ反応；レーン３：水をベースにしたバッファ；レーン４；０．５Ｍベタイン溶液；レーン５：１ベタイン溶液；レーン６；２Ｍベタイン溶液。
【００４４】
図２に示す通り、モル濃度のベタインを用いたＰＣＲは、ＰＣＲを効果的かつ特定的に増幅し、シリコン表面の阻害効果を低減させることができることが示された。
【００４５】
【発明の効果】
以上の通り、本発明の浸透物質を用いることにより、非活性表面に対する生物分子の非共有結合による相互作用を削減または破壊することができる。この結果、種々の生物学的実験の効率を向上させることが可能となる。
【００４６】
【配列表】
0004113603.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】  シリコン粒子及び両性イオン浸透物質の存在下におけるＰＣＲ産物を電気泳動した際のパターンを示す図である。
【図２】  シリコン粉末及び両性イオン浸透物質の存在下におけるＰＣＲ産物を電気泳動した際のパターンを示す図である。
【図１】
0004113603.tif 000004
【図２】
0004113603.tif 000005