(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
予めＤＮＡを変異させ、該変異による損傷ＤＮＡと検体の細胞抽出液とを接触させ、形成された損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を遠心分離により沈殿させ、該沈殿物を回収し、回収した沈殿物にＤＮＡ末端結合反応溶液を添加して反応させ、反応産物におけるＤＮＡ末端結合反応の程度又はＤＮＡとタンパク質との凝集化の程度を調べることによって、該損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析することを特徴とする損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法。
【請求項２】
損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を、直鎖状ＤＮＡ、開環状ＤＮＡ、及び一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡの組み合わせを用いて分析することを特徴とする請求項１記載の損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法。
【請求項３】
損傷ＤＮＡがヒト由来のＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は２記載の損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法。
【請求項４】
検体が刺激されることにより形成された損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を採取し、得られた損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を遠心分離により沈殿させ、該沈殿物を回収し、回収した沈殿物にＤＮＡ末端結合反応溶液を添加して反応させ、反応産物におけるＤＮＡ末端結合反応の程度又はＤＮＡとタンパク質との凝集化の程度を調べることによって、該損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析することを特徴とする損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法。
【請求項５】
刺激に感受性又は抵抗性を示す検体由来の損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析することを特徴とする請求項４記載の損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法。
【請求項６】
損傷ＤＮＡがヒト由来のものであることを特徴とする請求項４又は５記載の損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法。
【請求項７】
検体に被検物質を投与した後、該検体を刺激し、検体を刺激することにより形成された損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を採取し、得られた損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を遠心分離により沈殿させ、該沈殿物を回収し、回収した沈殿物にＤＮＡ末端結合反応溶液を添加して反応させ、反応産物におけるＤＮＡ末端結合反応の程度又はＤＮＡとタンパク質との凝集化の程度を調べることによって、該損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析し、被検物質非投与のものと比較・評価することを特徴とする損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復作用物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
損傷ＤＮＡと細胞抽出液を反応させる際に、該反応液に被検物質を投与し、得られた損傷ＤＮＡ−蛋白質複合体を遠心分離により沈殿させ、該沈殿物を回収し、回収した沈殿物にＤＮＡ末端結合反応溶液を添加して反応させ、反応産物におけるＤＮＡ末端結合反応の程度又はＤＮＡとタンパク質との凝集化の程度を調べることによって、該損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析し、被検物質非投与のものと比較・評価することを特徴とする損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復作用物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内において想定される遺伝的な変異・損傷に関わる反応を試験管内で模倣し、多数のタンパク質が引き起こす複雑な相互作用、関連分子の動態とそれを成立させる条件などに焦点を当てた、損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法や、損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復作用物質のスクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝的傷害（損傷）に対処する個人の生理的特質について、これまで有効な評価方法はなかった。遺伝的にその効力が変質している個人の峻別には、例えば、放射線治療の際に予備的に照射を行うことで検討したり、抗癌剤（一部はＤＮＡ作用原）の使用の中で副作用の状況を観察しながら経験的に知ることが常套であった。被験者の負担の軽減とより正確な評価を目指して、ゲノム情報を基にしたオーダーメード医療（診断）の確立が期待されているが、大量のデータの取扱いに伴う困難や有効なマーカー選定における知識の未熟さ等、技術、知識、さらにはコスト面の克服すべき問題がいまだ多い。たとえそれらが克服されたとしても、当面ゲノム情報は生体機能の変化について可能な説明の一つを提供するに過ぎず、その可能性をより確実とするためには別の視点に立ったさらなる情報が求められる（相変わらず予備的な照射や投薬が行われる）。従って、薬物使用等の医学的な行為に対するヒトの感受性や個人の特異な体質の判定には、今後も生理的な応答性を指標とした検査法が重要な役割を果たすはずである。遺伝的損傷の関わる病の評価に特に求められるのは、適切な治療方針の決定に繋がる、生物的な根拠に裏打ちされた方法論である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
生体内で想定される遺伝的な損傷に関わる反応は、多数のタンパク質が引き起こす複雑な相互作用の系であるが、それを単一因子あるいは関連性が未知の独立した複数の事象をもってして理解することには限界がある。本発明の課題は、医療現場において、遺伝子（あるいはそれを含む染色体）の傷に対する生理的な応答性を知ることができ、原理及び操作が簡便で、生体反応を多数の因子間の相互作用として理解することができる、損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法や、損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復作用物質のスクリーニング方法等を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
細胞がＤＮＡ再生能力を有するにもかかわらず、非特異的な拡散と分解に対する部位が生体内で制御されていることから（Science 280, 590-592, 1998）、損傷ＤＮＡも同様の形で構築因子により構成されているのではないかと本発明者は考え、鋭意研究した結果、多成分に依存する生体反応系を試験官内で模倣し、関連分子の動態とそれを成立させる条件に焦点を当てた検査法、より具体的には、遺伝子ＤＮＡに損傷が生じたときに、一群のタンパク質がその部位に選択的に会合し、高次のＤＮＡ−タンパク質複合体を形成するという生体反応を試験官内で再構成した系を見い出し、遺伝子の構造変化ではなく、タンパク質の分子集合性や酵素的反応という機能面の変化に着目することにより、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明の方法は、二本鎖切断や一本鎖切断、一本鎖領域を含む各種のＤＮＡを損傷ＤＮＡのモデル基質として用い、ヒト培養細胞に由来する細胞核抽出液と混和し、反応を行った後、遠心分離により損傷ＤＮＡとタンパク質の高次複合体を回収し、かかる複合体を調べたところ、かかる複合体は、細胞核内の機能構造を一部反映しており安定でしかも反応性に富んでおり、ＤＮＡの特異構造に依存した反応が起こることを見い出した。例えば、放射線により誘発される二本鎖切断タイプのＤＮＡ損傷は、それを含む蛋白質複合体形成後、ＡＴＰの添加によって、切断末端の再結合反応が非常に効率よく再現された。これはＤＮＡ二本鎖切断修復反応を再構成したことを意味しており、実際にその複合体にはその修復系に関与するタンパク質が複数含まれることを見い出した。放射線感受性を示すある細胞株では、由来を同じくする放射線抵抗性の細胞株と比較して、会合成分の欠失と二本鎖切断再結合の反応効率の低さが認められ、また、ヒト由来胎盤組織より調製した細胞核抽出液においてもその活性は培養細胞と同様に検出できることを見い出した。これらの結果は本発明の基本概念が、細胞のＤＮＡ代謝特性を反映することと、幅広い細胞株や組織に適用可能であることを示している。
【０００６】
すなわち本発明は、（１）予めＤＮＡを変異させ、該変異による損傷ＤＮＡと検体の細胞抽出液とを接触させ、形成された損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を遠心分離により沈殿させ、該沈殿物を回収し、回収した沈殿物にＤＮＡ末端結合反応溶液を添加して反応させ、反応産物におけるＤＮＡ末端結合反応の程度又はＤＮＡとタンパク質との凝集化の程度を調べることによって、該損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析することを特徴とする損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法や、（２）損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を、直鎖状ＤＮＡ、開環状ＤＮＡ、及び一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡの組み合わせを用いて分析することを特徴とする上記（１）記載の損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法や、（３）損傷ＤＮＡがヒト由来のＤＮＡであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法や、（４）検体が刺激されることにより形成された損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を採取し、得られた損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を遠心分離により沈殿させ、該沈殿物を回収し、回収した沈殿物にＤＮＡ末端結合反応溶液を添加して反応させ、反応産物におけるＤＮＡ末端結合反応の程度又はＤＮＡとタンパク質との凝集化の程度を調べることによって、該損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析することを特徴とする損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法や、（５）刺激に感受性又は抵抗性を示す検体由来の損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析することを特徴とする上記（４）記載の損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法や、（６）損傷ＤＮＡがヒト由来のものであることを特徴とする上記（４）又は（５）記載の損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法に関する。
【０００７】
また本発明は、（７）検体に被検物質を投与した後、該検体を刺激し、検体を刺激することにより形成された損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を採取し、得られた損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を遠心分離により沈殿させ、該沈殿物を回収し、回収した沈殿物にＤＮＡ末端結合反応溶液を添加して反応させ、反応産物におけるＤＮＡ末端結合反応の程度又はＤＮＡとタンパク質との凝集化の程度を調べることによって、該損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析し、被検物質非投与のものと比較・評価することを特徴とする損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復作用物質のスクリーニング方法や、（８）損傷ＤＮＡと細胞抽出液を反応させる際に、該反応液に被検物質を投与し、得られた損傷ＤＮＡ−蛋白質複合体を遠心分離により沈殿させ、該沈殿物を回収し、回収した沈殿物にＤＮＡ末端結合反応溶液を添加して反応させ、反応産物におけるＤＮＡ末端結合反応の程度又はＤＮＡとタンパク質との凝集化の程度を調べることによって、該損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析し、被検物質非投与のものと比較・評価することを特徴とする損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復作用物質のスクリーニング方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法としては、予めＤＮＡを変異させ、該変異による損傷ＤＮＡと検体の細胞抽出液とを接触させ、形成された損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析する方法や、検体が刺激されることにより形成された損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を採取し、得られた損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析する方法等を挙げることができるが、本発明の損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復の程度を評価する方法を行う際、検体が刺激されることにより形成された損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体の分析結果を、刺激に感受性又は抵抗性を示す検体由来の損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体の分析結果と比較評価することが好ましい。予めＤＮＡを変異させる方法としては、紫外線や放射線等の物理的刺激や、制限酵素、アルキル化剤等の化学物質による化学的刺激により欠失、置換、付加等の変異を生じさせる方法等が挙げられる。損傷したＤＮＡとしては、上記ＤＮＡの変異方法により生じた直鎖状ＤＮＡ、開環状ＤＮＡ、又は一本鎖ＤＮＡ等の損傷ＤＮＡや、これらＤＮＡから選ばれる１又は２以上のＤＮＡを含む損傷ＤＮＡを具体的に挙げることができる。
【０００９】
本発明における損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体とは、上記損傷ＤＮＡと、検体の細胞抽出液、特に核画分におけるタンパク質とが接触することにより形成される複合体をいう。また、検体としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル等の哺乳動物を具体的に挙げることができるがこれらに限定させるものではなく、上記以外の動物、植物、昆虫、細菌なども例示することができる。上記損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析する方法としては、損傷ＤＮＡに対する生理的な反応を分析できる方法であれば特に制限されるものではないが、例えば、複合体におけるタンパク質の分子集合性や酵素的反応を分析する方法、すなわち、複合体形成や反応の進行に伴う結合因子の量的、質的変化をアガロースゲル電気泳動法等によってモニターする方法などを挙げることができる。
【００１０】
本発明の損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復作用物質のスクリーニング方法としては、検体に被検物質を投与する前後に、かかる検体を紫外線や放射線等の物理的刺激や、制限酵素、アルキル化剤等の化学物質による化学的刺激により刺激し、検体を刺激することにより形成された損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を採取し、得られた損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析し、被検物質非投与のものと比較・評価する方法や、検体から得られる組織、器官、又は細胞と被検物質とを接触する前後に、かかる組織、器官、又は細胞を上記物理的刺激や化学的刺激により刺激し、かかる組織、器官、又は細胞を刺激することにより形成された損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を採取し、得られた損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体を分析し、被検物質非投与のものと比較・評価する方法や、損傷ＤＮＡと細胞抽出液を反応させる際に、該反応液に被検物質を投与し、得られた損傷ＤＮＡ−蛋白質複合体を分析し、被検物質非投与のものと比較・評価する方法などを例示することができるが、これらに限定されるものではない。上記損傷ＤＮＡ−タンパク質複合体の分析方法としては、損傷ＤＮＡに対する生理的な反応を分析できる方法であれば特に制限されるものではなく、複合体における主要タンパク質の存在や、主要タンパク質の分子集合性や、酵素的反応を分析する方法、すなわち、複合体形成や反応の進行に伴う結合因子の量的、質的変化をアガロースゲル電気泳動法等によってモニターする方法などが挙げられる。なお、上記スクリーニング方法により得られる損傷ＤＮＡの修飾ならびに修復作用物質としては、損傷ＤＮＡを凝集させるコファクターや、マグネシウムイオン等の複合体の形成及び活性を促進させる物質や、塩、界面活性剤、プロテインキナーゼ阻害剤（ウォルトマンニン，LY294002）等の複合体の形成および機能阻害剤が挙げられるが、従来知られているＡＴＰ等のコファクターなど修飾ならびに修復作用物質は除かれる。
【００１１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
ＤＮＡ損傷によるタンパク質凝集体を検出するため、下記に記載の方法により、直鎖状二本鎖、開環状（ニック）、及び一本鎖環状（ｓｓ）型を含む損傷ＤＮＡの組み合わせを用いて生体内で競合的測定法を行った。文献（J. Mol. Biol. 210, 573-585, 1989, Embo. J. 8, 3887-4006, 1989）記載の方法と同様に、遠心分離により沈澱させ、ＤＮＡと結合したタンパク質の複合体を単離し、ＤＮＡ及びタンパク質のサイズ分析（size-based analysis）を、ゲル電気泳動により行った。ヒトリンパ芽球様細胞株ＷＩ−Ｌ２−ＮＳから得られた核画分を用いた結果、直鎖状ＤＮＡ（linear）、開環状ＤＮＡ（nc）、及び一本鎖ＤＮＡ（ssc）に対する凝集沈澱は蛋白質画分量に依存して生じ（図２ａ；レーン７−１０）、かかる凝集体はタンパク質−ＤＮＡ複合体を意味すると考えられた。
【００１２】
複合体形成の役割を明確にするため、二本鎖損傷（ＤＳＢｓ）の修復メカニズムの特徴であるＤＮＡ末端結合反応が起こるかどうかを調べた（Trends Biochem. Sci. 23, 394-398, 1998）。直鎖状ＤＮＡを凝集させるためにコファクターとしてＡＴＰを補ったところ、ＤＮＡ末端の分子間結合は低いイオン強度下で著しく促進され（５０ｍＭのＮａＣｌ；図３ａ）、また、明確さにやや劣るものの、生理的イオン強度下でも反応が促進されることが確認できた（１５０ｍＭのＮａＣｌ）。他方、同一画分をＤＮＡ基質と単に混合する従来の方法では、他の報告と同様にＤＮＡ末端の結合は限られたものであった（Proc. Natl. Acad. USA 95, 14066-14070, 1998）。従って複合体形成により、ＤＳＢ修復因子の効果的な集合、ＤＮＡ末端間の有効な配置、又は抑制因子の除去が可能となると考えられる。核タンパク質−ＤＮＡ凝集体におけるその活性は、放射線感受性を有する二つのリンパ芽球様細胞株ＴＫ６（ＷＩ−Ｌ２−ＮＳの同系細胞株）と、血管拡張性失調症（Ａ−Ｔ）患者由来のＡＴ１−１や、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、胎盤組織等の各種ヒト由来細胞の核画分において確認できた（図３ｂ）。凝集体での活性は文献（Nucleic Acids Res 18, 6205-6210, 1990, Mutat Res 385, 21-29, 1997）に記載された結果を再確認した。すなわち、ＴＫ６はＷＩ−Ｌ２−ＮＳよりも低い活性を示し、ＷＩ−Ｌ２−ＮＳ及びＨｅＬａ Ｓ３のような通常の放射線感受性を有する細胞と同様に比較的高い活性をＡＴ１−１は示し、これらの結果は、ＤＮＡ凝集体同士の末端結合反応が各種ヒト由来細胞において広く適用できること、ならびに確認されたことから、また、放射線感受性の原因が、構造的要因であるのか酵素的要因であるかを区別しうる可能性を示している。
【００１３】
ＤＮＡ凝集体形成において不可欠な因子と、ＤＮＡ末端結合反応に責任のある因子を分離するために、変性ＤＮＡ結合アフィニティーカラムと陰イオン交換カラム（ｍｏｎｏＱ）を用いて液体クロマトグラフィー法により粗精製の分画を行った（図１）。各カラムに吸着した画分は粗精製画分と同様の活性を示した（図２、図３ａ、図４ａ）。上記カラム画分における異なったタンパク質（図５におけるレーン２とレーン３を比較構成）は、末端構造への特異性に違いがある可能性を予測させた。同様の条件で凝集させた場合５′−オーバーハング、３′−オーバーハング及び平滑末端の凝集性の相違は示されなかった（図４ａ）。ＤＮＡ末端結合反応の場合、変性ＤＮＡ結合アフィニティーカラム又はｍｏｎｏＱカラムに結合した画分はいずれも、５′−オーバーハングは最も反応性が高く、３′−オーバーハングも比較的反応性が高いことがわかった。一方、平滑末端の反応性は変性ＤＮＡ結合アフィニティーカラムに結合した画分は反応性が最も低かったが、ｍｏｎｏＱ結合画分は３′−オーバーハングのものと同様に高かった（図４ａのレーン１４とレーン２９を比較）。以上のことから、ｍｏｎｏＱカラムクロマトグラフィーにより、末端結合因子を高濃縮できることや、部位特異性を決定する因子からさらなる分離を行うことが可能であることが明らかとなった。
【００１４】
直鎖状ＤＮＡ、ニックＤＮＡ、及び一本鎖のＤＮＡ（図５のレーン６〜８）を完全に凝集させる条件下で、ｍｏｎｏＱカラム結合画分におけるＤＮＡと共沈澱するタンパク質を調べ、損傷の種類に関わらず、凝集体には分子サイズで４７０ｋ、１８０ｋ、１７０ｋ、１２０ｋ、９５ｋ、８６ｋ、７０ｋ、及び３０ｋのタンパク質が含まれていた。直鎖状ＤＮＡ及びニックＤＮＡの凝集体においては、上記以外に２８ｋ、２０ｋ、及び１８ｋのポリペプチドが含まれていた。ｓｓＤＮＡの集合には、４７０k、８６k、及び７０ｋのタンパク質以外に、９５ｋ及び８０ｋのタンパク質の著しい蓄積が著しく確認された。一方、非損傷基質として閉環状二本鎖ＤＮＡの弛緩型を用いると、タンパク質の共沈澱はほとんどみられなかった。損傷ＤＮＡを含む凝集体における構成要素をＰＶＤＦ膜に移し、個々のバンドを切り出し、エドマン分解法により一次構造を決定した。Ｎ−末端配列より、上記９５ｋ、８６ｋ、８０ｋ、２０ｋ、１８ｋのタンパク質はヌクレオリン、Ｋｕ８６、Ｎ−末端欠失ヌクレオリン（ヌクレオリン△）、ＨＭＧ１、及びＨＭＧ２タンパク質として同定された。さらに、トリプシン処理によるポリペプチド断片の配列から、４７０ｋ、１２０ｋ、及び７０ｋのタンパク質が、それぞれＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＳＡＦ−Ａ（ｈｎＲＮＰ Ｕ）及びＫｕ７０であることがわかった。ペプチドマッピング及びタンパク質配列により、ＤＮＡ構造の違いにかかわらずゲル中における同じサイズのポリペプチドが同一蛋白質であることが確認された。また、ＤＮＡ末端に特異的に結合するタンパク質群は、ニックＤＮＡと共通であり、その一部はｓｓＤＮＡにも結合していることがわかった。損傷の種類に関わらず主な構成要素であるＤＮＡ−ＰＫｃｓ、１８０ｋ、１７０ｋ、ＳＡＦ−Ａ、ヌクレオリン、Ｋｕ８６、及びＫｕ７０タンパク質は、凝集体の主要な構成要素であった。（図５）。ヒストンＨ１は、全てのＤＮＡの凝集体に含まれていた。
【００１５】
ニックＤＮＡ及び一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡは、凝集体形成時に直鎖状ＤＮＡと競合しており（図２）、これらの凝集体における主な構成要素を共有していることから（図５）、ニックＤＮＡ及びｓｓＤＮＡが、直鎖状ＤＮＡの末端結合を妨げるかどうかを調べてみた。下記に記載の末端結合反応と同じ条件下でニックＤＮＡの末端結合反応を行ったところ、ニックＤＮＡは電気泳動において移動できない産物に一部変化した（図４ｂ、レーン６）。ニックＤＮＡのその反応性は、直鎖状ＤＮＡの末端結合と競合することが確認された。結果として、直鎖状ＤＮＡの末端結合反応の阻害が起こり、末端結合産物の反応の低下、即ち反応産物の低分子量かがみられた（レーン６における反応物の収率はレーン１０のものと変化しないものの、レーン１０における反応物には低サイズの断片が分離された（図４ｂ、レーン１０））。ｍｏｎｏＱカラム結合画分はｓｓＤＮＡの移動性に影響を与えることはなく、ｓｓＤＮＡの存在は直鎖状ＤＮＡの分子間結合を選択的に抑制するが、ニックＤＮＡの反応性を抑制しなかった（図４ｂ、レーン７−９）。すなわち、代替ＤＮＡ基質により特異的な因子を制限したため、ニックＤＮＡ及びｓｓＤＮＡを含む凝集体形成は、直鎖状ＤＮＡの末端連結反応を著しく抑制することになったと考えられる。したがって、３つの標的ＤＮＡの凝集化に関わる共有因子の量的条件は、ヒトの抽出物における末端結合活性に重要であり、Ｔ４ ＤＮＡリカーゼの単純な反応性とは区別される（図４ｂ、レーン１１−１６）。
【００１６】
ＤＮＡと高い割合で相互作用することから、ＤＮＡ損傷による凝集体に関与する候補因子は比較的豊富なタンパク質であると考えられる。ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＳＡＦ−Ａ、ヌクレオリン、ヌクレオリン△、Ｋｕ（ｐ８６／ｐ７０のヘテロダイマーとして）、ヌクレオフォスミン（Ｂ２３）、ＨＭＧ１、及びＨＭＧ２等を含むｍｏｎｏＱカラムに結合した画分中の主要な因子を、クロマトグラフィーによって精製した。細胞核抽出物における先の実験と同様に、生理的な陰イオン強度を用いた場合、それらタンパク質によるＤＮＡの凝集沈澱は検出されなかった。しかし、３つのファクター（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＳＡＦ−Ａ、及びヌクレオリン）は、反応混合物における塩濃度を１５０ｍＭから５０ｍＭに減らすことにより、ＤＮＡと選択的に相互作用することが見い出された。ヌクレオリンはｓｓＤＮＡに選択的に集合するが、いかなる二重鎖ＤＮＡに対しても凝集性はなかった。この相互作用には、コファクターとしてのＭｇ2+が必要であった。興味深いことに、ヒトリンパ芽球様細胞のほとんどで産生されるヌクレオリン△がＤＮＡの凝集活性を欠失していることから、ヌクレオリンのＮ−末端領域が凝集活性に不可欠であることが推定された。同様に、比較的制限された量でインキュベーションすると、ＤＮＡ−ＰＫｃｓはｓｓＤＮＡの凝集化を活発に促進した。ＤＮＡに対してタンパク質の割合が高い場合、ニックＤＮＡ及び直鎖状ＤＮＡとも相互作用するが、スーパーコイルＤＮＡとは相互作用しないことが確認された。また、このＭｇ2+はタンパク質−ＤＮＡ相互作用を促進することがわかった。ＳＡＦ−Ａは低濃度の場合、各種ＤＮＡのうちｓｓＤＮＡと優先的に反応したが、過剰に加えた場合は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓと同様にニックＤＮＡ及び直鎖状ＤＮＡに対する凝集体を示した。Ｍｇ2+の存在下では、この相互作用はわずかに抑制された。塩及びデタージェントの条件を変えた場合でも、Ｋｕ、ヌクレオフォスミン、ＨＭＧ１、及びＨＭＧ２はいずれもＤＮＡと凝集会合しなかった。一方、スーパーコイル型を含む全ての基質に対してヒストンＨ１は沈澱凝集体を誘導するが、これは、タンパク質分析においてすべてのタイプのＤＮＡと凝集していた結果と一致する（図６）。高塩濃度におけるヌクレオリン、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＳＡＦ−ＡによるＤＮＡ凝集体の不安定化や、単離されたＫｕ、ＨＭＧ１、及びＨＭＧにおける活性の欠如は、ＤＮＡ上での多成分間の相互作用が、安定した凝集体を形成する上で必須であることを示唆している。
【００１７】
ＤＮＡ凝集体におけるＤＮＡ−ＰＫｃｓとＫｕの機能的な協同作用は、注目すべき点である。その理由として、ＤＮＡ−ＰＫｃｓとＫｕは共通の経路に寄与し、また、生体内においてＤＮＡ末端で会合し、さらに、ＤＮＡ−ＰＫｃｓのタンパク質キナーゼ活性がＫｕによって特異的に促進されるからである（Genes Dev. 13, 916-936, 1999）。蛋白質−ＤＮＡ凝集体上におけるこの関係についての知見を得るため、ＤＮＡ−ＰＫｃｓの活性をＫｕの存在下で調べてみた。ＤＮＡ−ＰＫｃｓがニックＤＮＡ又はｓｓＤＮＡと特異的に相互作用する条件で、Ｋｕをさらに加えると２００〜１３５０ｂｐのサイズの直鎖状ＤＮＡの凝集性を著しく誘導した（図７ａ左図）。しかし、ニックＤＮＡ及びｓｓＤＮＡが選択的に集合するように調製した場合、Ｋｕを用いても直鎖状ＤＮＡ上へのＳＡＦ−Ａの特異的会合を促進しなかった（図７ａ、右図）。また、その他の精製した因子による影響も同様に認められなかった。以上のことから、ＫｕはＤＮＡ−ＰＫｃｓのＤＮＡ末端への凝集会合に特異的に働くと考えられる。
【００１８】
ＤＮＡ−ＰＫｃｓのタンパク質キナーゼ活性が、ＤＮＡ凝集体においてＤＮＡ末端結合反応に関連するかどうかを、ＤＮＡ−ＰＫ抑制剤ウォルトマンニンを使用して調べてみた（Cell 82, 849-856, 1995）。ウォルトマンニン濃度を変えて、ｍｏｎｏＱカラムに結合した画分をインキュベーションしたところ、抑制剤によるＤＮＡ凝集活性への影響は認められなかった（図７ｂ、レーン２〜５）。ＤＮＡの凝集後ＡＴＰを加えて末端結合反応を行ったところ、結合した生成物の収率は抑制剤処理により、特に多重結合において大幅に減少することが確認された（図７ｂ、レーン７〜１０）。興味深いことに、抑制剤を用いてインキュベーションしておいた凝集体に、精製したＤＮＡ−ＰＫｃｓを加え続けると、かなりの程度のウォルトマンニンの効果を抑制することができた（図７ｂ、レーン１１）。これらのことから、ＤＮＡ−ＰＫｃｓによるタンパク質のリン酸化は、凝集体形成時における末端結合に必要であることがわかった。また、上記の結果は凝集体非存在下で行った以前の報告と一致している（Proc. Natl. Acad. USA 95, 14066-14070, 1998, J. Biol. Chem. 274, 7848-7856, 1999）。
【００１９】
上記実施例の無細胞反応試験系の結果から、細胞構築タンパク質がＤＮＡの変化を認識し、その過程に関与していることが明らかになった。また、核ＭＡＲ／ＳＡＲ関連タンパク質ＳＡＦ−Ａ（Embo. J. 11, 3431-3440, 1992）、ヌクレオリン（Mol. Cell. Biol. 15, 456-465, 1995）、ヌクレオソーム関連タンパク質ＨＭＧ１やＨＭＧ２（Bioessays 20, 584-588, 1998)のみならず、ＤＳＢ修復因子であるＤＮＡ−ＰＫｃｓやＫｕもＤＮＡの変化を認識し、その過程に関与することがわかった。ＤＮＡ−ＰＫが核マトリックスや関連因子に相互作用するという報告（Int. J. Radiat Biol. 66, 531-536, 1994, Intl. J. Radiat. Biok. 65, 185-192, 1994, Genes Dev. 12, 2188-2199, 1998）とともに、修復因子や核マトリックス関連因子に共通する活性がみられたという本実施例の結果は、高次レベルでの核機能の解明に今後光を当てるものになるであろう。損傷が引き金となり、核マトリックス等の核内構造と相互作用した標的ＤＮＡに修復因子を会合組織化することで、結果として修復に有効な核タンパクのネットワークを形成させるというシナリオが規定される。本実施例ではこの過程で想定される、ＤＮＡ修復が終了するまでの間の特異的部位の構造化、部分的にはＫｕ（又はＤＮＡ−ＰＫ）によるＤＮＡ末端間の橋渡し（Embo. J. 17, 609-614, 1998, Cancer Res. 57, 1412-1415, 1997）のメカニズムを生体外で「遠心分離」によって代用することができた。生体内ではその構造形成の一部は、ＤＳＢ部位と機能的に関連するＳＩＲ（silent information regulator）複合体のようなヘテロクロマチン因子の作用により補佐されていると考えられる（Cell 97, 609-620, 1999, Cell 97, 621-633, 1999）。核タンパク質のネットワークという概念は、クロマチン因子、ヒストンＨ２Ａ．ＸのＤＳＢ部位での集合を示す最近の報告（J. Biol. Chem. 273, 5857-5868, 1998, Curr. Biol. 10, 886-895, 2000）と一致している。放射線を照射した細胞に誘発されるＨ２Ａ．Ｘのリン酸化には、損傷部位に対する修復構成要素を補充することが不可欠であることが細胞生物学的な分析により明確になった。このことは損傷過程の初期段階における重要な側面を示している。（１）リン酸化により付随した必須の段階が存在すること、及び（２）損傷部位の付近における分子集団のグローバルな変化である。かかる特徴は、核タンパク質の高い産生量及び酵素活性と相関関係があると考えられる。
【００２０】
以下に上記実施例において用いた材料及び方法について記載する。
１．細胞
ヒトリンパ芽球様細胞株を以下の方法で入手した。ＷＩ−Ｌ２−ＮＳ（ＣＲＬ８１５５）は日本癌研究リサーチリソースバンクから購入した。ＴＫ６及びＡＴ１−１は、マサチューセッツ工科大学のＷ．Ｇ．Ｔｈｉｌｌｙ博士（ケンブリッジ）及び北海道大学の大里博士（日本）からそれぞれ供与していただいた。ＨｅＬａ Ｓ３（ＲＣＢ０１９１）は理研細胞バンクから購入した。ヒト胎盤組織は２４才の健康人から提供していただいた。
【００２１】
２．ＤＮＡ基質
前記実施例は、ＤＮＡ凝集退形成試験において、φＸ１７４ファージ（BioLabs社製）由来の一本鎖環状ＤＮＡ、スーパーコイルＤＮＡ、切れ目の入った（ニック）ＤＮＡ、Hae IIIで消化することにより得られた直鎖状ＤＮＡ、及びＴ４ＤＮＡリガ−セを用いて上記ニックの入ったＤＮＡを修復した弛緩型閉環状ＤＮＡを用いた。ＤＮＡ末端結合試験においては、制限酵素EcoR I、Pst I、Sca I（Takara社製）を用いて消化し調製した直鎖状pUC18を選択的基質として用いた。
【００２２】
３．細胞抽出液及びタンパク質
細胞（２ｘ１０9細胞）を３倍量の氷冷した緩衝液Ａ［１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及び０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）］で腫脹することにより処理した。腫脹した細胞をDounce homogenizerのB-pestleで２０回ストロークすることにより破砕した。胎盤組織については、繊維質を減少させるために３００ｇの凍結した切片を細かく破砕した後、得られた細胞画分を、タンパク質分解阻害剤（２μｇのアプロチニン、０．５μｇのロイペプチン、０．７μｇのペプスタチン、５０μｇのキモスタチン、及び１０μｇのＥ−６４）を含んだ緩衝液Ａにより破砕した。２５００ｇで１０分間遠心分離することにより得られた細胞核を洗浄した後、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．９、０．５ＭのＮａＣｌ、２５％のグリセロール、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２ｍＭのＥＤＴＡ，０．５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ）に懸濁し、氷上で３０分間インキュベーションした後、核抽出物を２５００ｇで遠心分離した。遠心分離後、上澄み液を回収し、０．５ＭのＮａＣｌを加えた緩衝液Ｒ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ，１ｍＭの２−メルカプトエタノール）により、ＤＥＡＥセファロース樹脂のカラムに適用し、未吸着成分を核画分として回収した。ＷＩ−Ｌ２−ＮＳ細胞から得られた核抽出物を変性ＤＮＡセルロース樹脂のカラム（Amercham Pharmacia社製）に通し、吸着したタンパク質を回収した後、さらにmono Q HR5/5カラム（Amercham Pharmacia社製）を用いて分離精製を行った。なお、タンパク質のロードは０．１ＭのＮａＣｌを添加した緩衝液Ｒで行い、タンパク質の溶出は、かかるタンパク質を活性試験に用いる場合には、０．５ＭのＮａＣｌで、個々のタンパク質を精製する場合には、緩衝液Ｒによる０．１〜１．０ＭのＮａＣｌグラジエントで行った。タンパク質精製操作では、７つの主要なピークが得られ、それぞれをmini Q PC 3.2/3カラム（Amercham Pharmacia社製）に適用した。緩衝液Ｒによる０．１〜１．０ＭのＮａＣｌグラジエントでカラムから各タンパク質を溶出した。最後に０．３ＭのＮａＣｌを添加した緩衝液Ｒにより、Superdex 200 PC 3.2/30カラム（Amercham Pharmacia社製）を用いてゲル濾過を行い、タンパク質を単離した。ヒストンＨ１は、ｔＲＮＡが結合したセファロースカラムを用いて変性ＤＮＡ結合画分から分離回収し、さらに、Superdex 200 PCカラムから０．３ＭのＮａＣｌを添加した緩衝液Ｒによりサイズ分画して精製した。上記により得られた溶出液及びタンパク質は、使用時まで−８０℃で保存した。
【００２３】
４．タンパク質配列決定
タンパク質の一次構造は、Applied Biosystems 492 model sequencerで決定した。
【００２４】
５．ＤＮＡ凝集体の測定法
文献（J. Mol Biol. 210, 573-585, 1989）記載の方法に改良を加え、大きな核タンパク質−ＤＮＡ複合体の分析を行った。１５０ｍＭ又は５０ｍＭのＮａＣｌと、０．１％のジギトニンとを含む緩衝液Ｒ，２０μｌ中で反応を行った。方法３に記載の方法により得られた細胞画分又は単離されたタンパク質を、１０ｍＭのＭｇＣｌ2の非存在下又は存在下で適切なＤＮＡ基質とともに２５℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後、かかる混合物をmicro-centrifugeにより４℃で１０分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、回収した沈澱物に反応溶液（１００μｌ）を加え、沈澱物を再び遠心分離した。ＤＮＡ分析を行うため、再度沈澱物を洗浄した後、ＳＤＳ及びプロテアーゼＫによりタンパク質を除去し、アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウムを用いて染色した。また、タンパク質を分析するため、上記３にてＳＤＳと還元剤を含む電気泳動緩衝液にて上記沈澱物を熱変性し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クーマシー・ブル−で染色した。
【００２５】
６．ＤＮＡ末端結合
上記分離された抽出物又はこれらが誘導する凝集体による直鎖状ＤＮＡの末端結合反応（２０μｌ）を、２５℃で一定の時間、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１％のジギトニンを含む緩衝液Ｒで行った。また、ＳＤＳ及びプロテイナーゼＫで反応させた後、得られた生成物をＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭのＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ７．８、１ｍＭのＥＤＴＡ）による１％アガロースゲル電気泳動で分離した。臭化エチジウムを用いてＤＮＡを染色し、視覚化した。なお、Ｔ４ ＤＮＡリガ−ゼ（Takara社製）を対照標準として用いた。
【００２６】
７．タンパク質キナーゼ抑制剤の効果
ｍｏｎｏＱによって得られたタンパク質画分をＤＮＡ−ＰＫｃｓの抑制剤であるウォルトマンニン（Sigma社製）により２５℃で１０分間前処理し、上記記載のＤＮＡ凝集体及びＤＮＡ末端結合反応を行った。また、ウォルトマンニンにより阻害された末端結合反応において、精製したＤＮＡ−ＰＫｃｓの添加による補足的な効果を調査した。
【００２７】
【発明の効果】
本発明は、生物学の基礎的研究を踏まえ、関連分子の活性や動態に則ってデザインされていることから、将来得られた知識の蓄積によって遺伝子ＤＮＡ（またはそれを取り巻く構造体）の変化がもたらす様々な障害（がんや老化を含む）やある種の遺伝病の診断へと対象を広げうることが期待される。本発明の実施においては、分析対象である損傷ＤＮＡとタンパク質の複合体を、遠心分離後の沈澱物として回収するので反応条件（反応液の交換等）の設定が容易であり、また結果的に関連因子の濃縮（あるいは抑制因子の除去）を達成することになるので、細胞粗抽出液をほとんど前処理することなく検体として使用しうる利点がある。ＤＮＡ基質を標識することで、反応産物の高感度な測定が可能であり、貴重なサンプルの分析にも指摘化しうる。同時に、質量分析計等のタンパク質分析ツールによって、複合体形成や反応の進行に伴う会合因子の量的、質的変化をモニターすることで、遺伝子損傷に絡む生化学的反応に特化したタンパク質プロフィールを取得できる。この点は、機能解析と連係していない従来の発現量のみを探索するプロテオーム解析と比較して、情報の質、量共に優れる。一連の手順を自動化する場合、既存の反応ロボット、遠心分離器、分析／検出装置の技術転用により、技術開発面での傷害は少ない。製造コストとランニング・コストは、分析方法及び検出方法に依存する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡ集合活性の精製の概要を示す図である。
【図２】ヒトリンパ芽球様細胞であるＷＩ−Ｌ２−ＮＳの核抽出物におけるＤＮＡ凝集活性と、ｍｏｎｏＱカラムに結合したＤＮＡ−タンパク質複合体によるＤＮＡ凝集活性の結果（ａ）、及び抽出物と直鎖状ＤＮＡとの凝集体の精製結果（ｂ）を示す図である。
ａ．ＤＮＡ基質はφＸ１７４ファージＤＮＡの４つの損傷ＤＮＡ型、０．０５μｇのHae IIIで消化した直鎖状ＤＮＡ、０．０５μｇの一本鎖環状ＤＮＡ（ssc）、０．０５μｇの開環状ＤＮＡ（nc）型を含むスーパーコイルＤＮＡ（sc）を混合したものを用いた（レーン４）。タンパク質の量の増加に伴い沈降させたＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動により分析した。エチジウムブロマイドにより染色したＤＮＡを視覚化した。抽出物に伴う核酸をＤＮＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより分離した（＊）。また、ヒトリンパ芽球様細胞であるＷＩ−Ｌ２−ＮＳの核抽出物と、ｍｏｎｏＱカラムに結合したＤＮＡ−タンパク質複合体のインキュベーションの間、開環状ＤＮＡ中にスーパーコイルＤＮＡを添加したものは不安定な状態であった。
ｂ．遠心分離によって得られた沈澱物（ppt.）と上澄み液（sup.）を１％アガロースゲル電気泳動により分析した。核抽出物５．４μｇとｍｏｎｏＱカラムにより得られた精製物０．７μｇを用いて、PUC18のプラスミドをEcoR Iにより消化したＤＮＡ凝集体を最大０．１μｇの投入した。
【図３】ＤＮＡ−タンパク質複合体に関わる末端結合活性を示す図である。
ａ．核画分又は遠心分離によって得られた沈澱物と、直鎖状ＤＮＡとの凝集体の末端結合活性の比較を示す。図２ｂが示すように、凝集体を全て調製した。インキュベーション時間による活性値を調べた。反応によってダイマー、トリマー、さらにマルチマーを生み出した。レーンＳに注入した基質を示す。
ｂ．ＷＩ−Ｌ２−ＮＳ，ＴＫ６、ＡＴ１−１、又はＨｅＬａＳ３細胞から得られた細胞画分、又は胎盤組織から得られた細胞画分における末端結合活性を調べた。核画分（−）又は直鎖状ＤＮＡを有する沈澱物を用いてＤＮＡ末端結合活性を調べてみた。完全に沈澱することができる直鎖状ＤＮＡ（０．1μｇ）を用いて、２５℃で２時間反応させた。通常の条件下では、胎盤抽出物はＤＮＡとプロテイアーゼ耐性複合体を形成し、完全に末端結合を抑制した。
【図４】ＤＮＡ凝集体に対する末端結合の特徴を示す図である。
ａ．末端結合反応によるＤＮＡ末端構造の特異性。３つのタイプ（５′−オーバーハング、３′−オーバーハング、又は平滑末端）の直鎖状ＤＮＡ（０．１μｇ）を、変性ＤＮＡカラム（１．０μｇ）とｍｏｎｏＱカラムを用いて精製した画分（０．７μｇ）といっしょにインキュベーションした。同じ条件下で行ったＴ４ ＤＮＡリカーゼ（2 Weiss Unit）は分子内結合だけでなく、分子間の結合も促進していた。その一部はこの結果におけるモノマーのサイズより移動性が早く、分析された。
ｂ．EcoR Iで消化したpUC18の末端結合によるφＸ１７４由来の開環状ＤＮＡ（０．１μｇ）及びｓｓＤＮＡ（０．１μｇ）の競合効果を示す。直鎖状ＤＮＡ（０．１μｇ）のモノマーからマルチマーに変化させるのに十分な画分量（１．４μｇ）を加えることにより反応を行った。
【図５】境界画分の抽出物における核タンパク質組成と、ＤＮＡ構造による凝集体の結果を示す図である。
核抽出物（レーン１）、変性ＤＮＡ結合アフィニティーカラムに結合した画分（レーン２）、ｍｏｎｏＱに結合した画分（レーン３）を含むクロマトグラフィーの各ステップについて調べた。ｍｏｎｏＱカラムにより得られたＤＮＡ−タンパク質凝集体（７．０μｇ）を、ＤＮＡの非存在下、又は、φＸ１７４から作製した弛緩型二本鎖ＤＮＡ（レーン５）、EcoR Iにより消化した直鎖状ＤＮＡ（レーン６）、開環状ＤＮＡ（レーン７）、若しくは一本鎖ＤＮＡ（レーン８）を含む損傷したＤＮＡ（１．０μｇ）とインキュベーションした結果を示す。タンパク質の配列を決定することにより同定されたタンパク質を図に示す。
【図６】精製蛋白質による標的ＤＮＡの凝集体の選択を示す図である。
Ｍｇ2+の存在下又は非存在下で、ＤＮＡ（０．１５μｇ）を用いて蛋白質のインキュベーションを行った。イオン強度が低い（５０ｍＭのＮａＣｌ）ことを除いては、図３ｂと同様の条件で行った。ヌクレオリン（０．１０、０．２０、０．４０、０．８０μｇ）、ヌクレオリン△（０．１０、０．２０、０．４０、０．８０μｇ）、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ（０．３０、０．６０、１．２、２．４μｇ）、ＳＡＦ−Ａ（０．０７０、０．１４、０．２８、０．５６μｇ）、Ｋｕ（０．１２、０．２４、０．４８、０．９６μｇ）、ヌクレオフォスミン（０．１０、０．２０、０．４０、０．８０μｇ）、ＨＭＧ１（０．１０、０．２０、０．４０、０．８０μｇ）、ＨＭＧ２（０．１０、０．２０、０．４０、０．８０μｇ）、及びヒストンＨ１（０．１０、０．２０、０．４０、０．８０μｇ）のタンパク質を使用して実験を行った。レーンＣは基質ＤＮＡを示す。
【図７】ＤＮＡ−ＰＫｃｓ存在下での直鎖状ＤＮＡの凝集に対するＫｕの関わりを調べた結果（ａ）、及びＤＮＡ凝集と末端結合におけるＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の効果（ｂ）を示す図である。
ａ．ＤＮＡ−ＰＫｃｓ（１．２μｇ）又はＳＡＦ−Ａ（０．２８μｇ）を用いて、ＤＮＡ（０．１５μｇ）を５分間インキュベーションした後、段階的に量を増加させたＫｕ（０．１２、０．２４、０．４８、０．９６μｇ）をかかる混合物に添加した。（ ］ ）で示したように、ＤＮＡ−ＰＫｃｓの存在下でのみ、直鎖状ＤＮＡを含む沈澱物が認められた。
ｂ．ＤＮＡを用いたインキュベーションの前に、ｍｏｎｏＱカラムに結合した画分を各種濃度のウォルトマンニンで前処理した。かかる画分をＤＮＡと混合し、反応を開始させた。２５℃で１０分間インキュベーションした後、蛋白質ＤＮＡ凝集複合体を遠心分離により回収した。末端結合過程において、ＡＴＰを使用してかかる凝集体を２５℃で１時間さらにインキュベーションした。レーン１１により、精製したＤＮＡ−ＰＫｃｓを添加することで、１．０μＭのウォルトマンニンで処理された画分における末端結合作用が回復することがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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