(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎを正の整数とし、ｎ塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列を４n個生成するステップと、
４n個の前記基本オリゴヌクレオチド配列の中から、グアニン及びシトシンの含有率が８０％以下で、自己相補的に形成される塩基対が５以下であり、かつ融解温度が４６℃から４８℃で、連続する同一塩基数が３以下のものを選択するステップと、
前記選択されたｎ塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列を組み合わせて、設計したいＤＮＡ構造体を作るために使用される一組のｎの整数倍の塩基からなるセグメントオリゴヌクレオチド配列を生成するステップと、
前記生成された一組のｎの整数倍の塩基からなるセグメントオリゴヌクレオチド配列に基づき、一組のｎの整数倍の塩基からなるセグメントオリゴヌクレオチドを合成するステップと、
前記一組のｎの整数倍の塩基からなる合成セグメントオリゴヌクレオチドを混合することにより高次のＤＮＡを組み立て上げるステップと
からなることを特徴とするＤＮＡ構造体の作成方法。
【請求項２】
前記一組のセグメントオリゴヌクレオチド配列を生成するステップは、前記選択されたｎ塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列の組み合わせ条件として、所望の配列以外との相補的な配列を有しないことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ構造体の作成方法。
【請求項３】
ｎを正の整数とし、ｎ塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列を４ｎ個生成するステップと、
４n個の前記基本オリゴヌクレオチド配列の中から、グアニン及びシトシンの含有率が８０％以下で、自己相補的に形成される塩基対が５以下であり、かつ融解温度が４６℃から４８℃で、連続する同一塩基数が３以下のものを選択するステップと、
前記選択されたｎ塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列を組み合わせて、設計したいＰＮＡ構造体を作るために使用される一組のｎの整数倍の塩基からなるセグメントオリゴヌクレオチド配列を生成するステップと、
前記生成された一組のｎの整数倍の塩基からなるセグメントオリゴヌクレオチド配列に基づき、一組のｎの整数倍の塩基からなるセグメントＰＮＡを合成するステップと、
前記一組のｎの整数倍の塩基からなる合成セグメントＰＮＡを混合することにより高次のＰＮＡを組み立て上げるステップと
からなることを特徴とするＰＮＡ構造体の作成方法。
【請求項４】
前記一組のセグメントオリゴヌクレオチド配列を生成するステップは、前記選択されたｎ塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列の組み合わせ条件として、所望の配列以外との相補的な配列を有しないことを特徴とする請求項３に記載のＰＮＡ構造体の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ナノ材料やナノデバイスとして利用可能なＤＮＡ構造体の作成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物はナノテクノロジー技術を駆使したマシンと言われ、近年、生体メカニズムを解明して、ナノアトムマシン構築に仕立てようとする研究が行われている。
人間をはじめ植物、動物などの生物は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：deoxyribo nucleic acid）に書き込まれた遺伝情報（４つの塩基、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）の組み合わせ）によって蛋白質→細胞→各器官が形成され、特徴ある各個体が生まれ、地球上に生存している。すなわち、生物は、ＤＮＡの遺伝情報を子孫に受け継ぐことによって生きながらえている。このように、ＤＮＡは４種類の部品分子を組み合わせて構成されたゲノム材料なのである。
【０００３】
しかしながら、見方を変えてＤＮＡをゲノム材料として捉えるのではなく、機能性材料や機能性デバイスの材料として捉えると、従来の無機材料では実現できない、ナノ材料やナノデバイスが実現できることが判明した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らは、オリゴヌクレオチドの塩基配列を、水素結合する塩基配列と水素結合しない配列とを適宜選択・設計し、ＤＮＡ構造体を設計・合成することにより新規なＤＮＡ構造体の作成方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の特徴は、ｎを正の整数とし、ｎ塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列を４ｎ個生成するステップと、ｎ塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列４ｎ個の中から予備選択するステップと、予備選択したｎ塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列を組み合わせて、設計したいＤＮＡ構造体を作るために使用される一組のｎの整数倍の塩基からなるセグメントオリゴヌクレオチド配列を生成するステップと、生成された一組のｎの整数倍の塩基からなるセグメントオリゴヌクレオチド配列に基づき、一組のｎの整数倍の塩基からなるセグメントオリゴヌクレオチドを合成するステップと、一組のｎの整数倍の塩基からなる合成セグメントオリゴヌクレオチドを混合することにより高次のＤＮＡを組み立て上げるステップからなるＤＮＡ構造体の作成方法である。
【０００６】
また、予備選択するステップは、予備選択のための条件として、自己を含む全ての基本オリゴヌクレオチド間の相補性及び融解温度を用いるとよい。さらに、予備選択のための条件として、基本オリゴヌクレオチドの連続する同一塩基数を用いるとよい。またさらに、相補性は、自己を含む全ての基本オリゴヌクレオチド配列間で、全体又は一部が相補的な配列であることとするとよい。
【０００７】
さらに、一組のセグメントオリゴヌクレオチド配列を生成するステップは、予備選択したｎ塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列の組み合わせ条件として、所望の配列以外との相補的な配列を有しないこととするとよい。
【０００８】
このようなＤＮＡ構造体によれば、オリゴヌクレオチドの塩基配列を、水素結合する塩基配列と水素結合しない配列とを適宜選択・設計し、ＤＮＡ構造体を設計・合成することにより新規なＤＮＡ構造体を作成することができる。これにより、従来の無機材料では実現できない、ナノ材料やナノデバイスを作成することが可能となる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
（本発明の要旨）
本発明のＤＮＡ構造体の作成方法は、ＤＮＡ構造体の基本単位となるセグメントオリゴヌクレオチドの配列を設計し、その配列設計に基づきセグメントオリゴヌクレオチドを合成して、その合成セグメントオリゴヌクレオチドを混合、組み合わせて様々なＤＮＡ構造体を組み立て上げていくものである。
【００１０】
本発明のＤＮＡ構造体の作成工程は、図１に示すように、基本的に次のように実施する。
【００１１】
（イ）ステップＳ１０１において、セグメントオリゴヌクレオチド配列を設計する。
【００１２】
（ロ）ステップＳ１０２において、配列設計したセグメントオリゴヌクレオチドを合成する。
【００１３】
（ハ）ステップＳ１０３において、一組の合成セグメントオリゴヌクレオチドからＤＮＡ構造体を作成する。
【００１４】
（ニ）ステップＳ１０４において、作成されたＤＮＡ構造体の可視化、計測を行う。
【００１５】
以上のように、４段階の工程からなる。
【００１６】
次に、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分は同一又は類似の符号を付している。ただし、図面は模式的なものであり、厚みと平面寸法との関係、各層の厚みの比率等は現実のものとは異なることに留意すべきである。従って、具体的な厚みや寸法は以下の説明を参酌して判断すべきものである。また図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【００１７】
（オリゴヌクレオチド配列の設計方法）
図２は、本発明の実施の形態に係るセグメントオリゴヌクレオチド配列の設計方法詳細を示すフローチャート図である。以下、各ステップを追って説明する。
【００１８】
（イ）まず、ステップＳ２００において、基本オリゴヌクレオチド配列の生成を行う。
【００１９】
オリゴヌクレオチドの塩基配列はアデニン（Ａ），チミン（Ｔ），グアニン（Ｇ），シトシン（Ｃ）の４つの塩基の組み合わせからなる１次元配列である。塩基の数をＮ（Ｎは正の整数）とすると、表現可能な配列の数は４Ｎ個である。例えば、塩基の数Ｎ＝２０とすると、表現可能な配列数は４２０≒１０１２個となる。このような長いオリゴヌクレオチド配列を一度に生成することは組み合わせ数が膨大になるため現実的ではない。そこで、生成したいオリゴヌクレオチド配列よりも短い単位長さの基本オリゴヌクレオチド配列の組を所定の条件の下、あらかじめ予備選択しておき、これらを組み合わせて長いオリゴヌクレオチド配列を生成するものとする。
【００２０】
基本オリゴヌクレオチド配列の予備選択のための条件は、
（１）融解温度（Ｔｍ）
（２）連続する同一塩基の数
（３）ＧＣ含有率（ＧＣ％）
（４）自己相補性
の４条件とする。ここで、（１）融解温度（Ｔｍ）は、任意のオリゴヌクレオチドの５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度であり、オリゴヌクレオチドとその相補鎖との間で形成されるＤＮＡハイブリッドの安定性を特徴づける。このＴｍ値は、オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ反応（アニーリング温度において）や、in situ ハイブリダイゼーション、サザンプロット、ノーザンブロット、ドットブロットなどプローブとして用いる場合において、最適温度を決定するのに重要となる。Ｔｍ値は、最近隣法により計算する。以下に、最近隣法によるＴｍ値の計算を説明する。
【００２１】
Ｔｍ={ΔH/((A+ΔS)+Rln(Ct/4))}273.15+16.6log[salt]
ここで、ΔＨ（Cal mole-1）は、ハイブリッド形成の隣接エンタルピー変化の合計（<0）を表し、Ａ（Ca K-1mole-1）は、らせん開始定数を表し、その値は自己相補的配列でない場合は、‐１０．８、自己相補鎖の場合は‐１２．４である。ΔＳ（Ca K-1mole-1）は、ハイブリッド形成の隣接エントロピー変化の合計（<0）を表し、Ｒは、モル気体定数（1.987 Ca K-1mole-1）を表し、Ｃｔは、オリゴヌクレオチドが自己相補的でない場合はその鎖のモル濃度の合計を、自己相補的である場合は、その濃度の４倍を表す。この計算式において、Ｔｍ値を左右する２つのパラメータは、塩濃度と１本鎖ＤＮＡの濃度になる。
【００２２】
また、（４）自己相補性は、基本オリゴヌクレオチドのホモダイマー形成を防ぐために導入したパラメータである。自己相補性の値は、図３に示すように、図３（１），（２），・・・，（ｎ）と塩基配列を１塩基づつずらしながら重なる塩基配列部分に塩基対が何対形成されるかを調べることにより、基本オリゴヌクレオチド配列での最大値をとる。
【００２３】
（ロ）次に、ステップＳ２１０において、ステップＳ２００で予備選択した基本オリゴヌクレオチド配列を組み合わせて、設計したいＤＮＡ構造体を作るために使用されるセグメントオリゴヌクレオチド配列を生成する。
【００２４】
基本オリゴヌクレオチド配列の組み合わせ条件は、ダイマー形成等の不要なハイブリダイゼーションを避けるため、部分的なものも含めて回文配列となる基本オリゴヌクレオチド配列、すなわち、自己相補的な配列及び所望の配列以外との相補的な配列を除くものとする。設計したいＤＮＡ構造体を形成するために使用されるオリゴヌクレオチド配列一組、ｎ本が決定するまで繰り返す。
【００２５】
（ハ）次に、ステップＳ２２０において、ステップＳ２１０で生成したセグメントオリゴヌクレオチド配列の配列チェックを行う。
【００２６】
配列チェックは、生成したセグメントオリゴヌクレオチド配列の組において、セグメントオリゴヌクレオチド１本自身とセグメントオリゴヌクレオチド複数間のハイブリダイゼーション性を調べる。上述した自己相補性の計算と同様の方法で、塩基配列を一塩基づつずらしながら両方の配列を比較し、何個塩基対を形成するかをすべての場合について調べる。すなわち、Ｎ塩基のセグメントオリゴヌクレオチドの場合には、２Ｎ−１回比較する。ここで、塩基対が連続する場合にはその塩基対配列の融解温度Ｔｍを計算する。もし１回の比較で連続する塩基対が複数含まれる場合には、それらの中で融解温度Ｔｍが最も高い塩基対配列とその融解温度Ｔｍを求める。
【００２７】
セグメントオリゴヌクレオチドが１本しかない場合には、ホモダイマーの形成を防ぐため、その融解温度Ｔｍが室温より十分低いことを確認する。セグメントオリゴヌクレオチドが複数本ある場合には、その中から任意のセグメントオリゴヌクレオチドを２本取り出すすべての組み合わせについて行う。すなわち、ｍ本の場合にはｍＣ２通りの組み合わせについて行う。この場合にも所定の位置（構造を形成するために必要な配列）以外での連続塩基対配列の融解温度Ｔｍが室温より十分低いことを確認する。
【００２８】
ステップＳ２３０において、所定の位置以外でハイブリダイゼーションする場合には（ＮＯ）、そのセグメントオリゴヌクレオチド配列を破棄し、ステップＳ２１０に戻り、新たなセグメントオリゴヌクレオチド配列を生成する。一方、所定の位置でハイブリダイゼーションする場合には（ＹＥＳ）、ステップＳ２４０に進む。
【００２９】
（ニ）次に、ステップＳ２４０において、ステップＳ２００〜Ｓ２３０の一連の処理により生成されたセグメントオリゴヌクレオチド配列に基づいて、セグメントオリゴヌクレオチドの合成を行う。
【００３０】
以上のようにして配列設計した一組の合成オリゴヌクレオチドを反応溶液中で等モル量混合することにより様々な形状のＤＮＡ構造体を組み立て上げていく。合成セグメントオリゴヌクレオチドのいくつかはヘアピン構造をとりやすいものがあるため、反応溶液を混合後熱処理を行う。
【００３１】
以下に本発明の実施の形態に係るＤＮＡ構造体の作成方法の実施例を示す。
【００３２】
基本オリゴヌクレオチド配列の生成：
基本オリゴヌクレオチド配列の塩基数をＮ＝１０とし、これにより表現可能な配列数４１０（≒１０６）個の中から、所定の条件の下、予備選択を行った。基本オリゴヌクレオチド配列の予備選択のための４条件の値を、以下の通りとした。
【００３３】
（１）融解温度（Ｔｍ）：４７±１℃
（２）連続する同一塩基の数：３以下
（３）ＧＣ含有率（ＧＣ％）：８０％以下
（４）自己相補性：５以下
この予備選択の４条件の値により、配列総数４１０（≒１０６）個の中から約２０００個の基本オリゴヌクレオチド配列が選択、生成された。
【００３４】
セグメントオリゴヌクレオチド配列の生成：
上記で生成された基本オリゴヌクレオチド配列約２０００個の中から後述するＩ字型のＤＮＡ構造体、Ｙ字型のＤＮＡ構造体、Ｔ字型のＤＮＡ構造体、ハニカム（honeycomb）構造のＤＮＡ構造体の形成に使用される基本オリゴヌクレオチド配列（１０塩基）を組み合わせて、セグメントオリゴヌクレオチド配列を生成した。Ｉ字型のＤＮＡ構造体、Ｙ字型のＤＮＡ構造体を形成するために使用される基本オリゴヌクレオチド配列は、共に１０塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列である。その１０塩基の基本オリゴヌクレオチド配列から、Ｉ字型では３０塩基のオリゴヌクレオチド配列、Ｙ字型では（３０＋Ｈ）塩基（Ｈはヒンジ、Ｙの交点部分の配列長さ）のセグメントオリゴヌクレオチド配列を生成した。Ｙ字型のＤＮＡ構造体を形成するために使用されるセグメントオリゴヌクレオチド配列一組、３本は、Ｙ字型ＤＮＡ構造体のヒンジ部分となる塩基配列をアデニン（Ａ）一塩基とし、予備選択した１０塩基の基本オリゴヌクレオチド配列を３個組み合わせて、合計３１塩基のセグメントオリゴヌクレオチド配列を生成した。Ｙ字型のＤＮＡ構造体に使用される基本オリゴヌクレオチド配列の組み合わせパラメータは、予備選択の場合のパラメータ（１）融解温度（Ｔｍ）：４７±１℃、（２）連続する同一塩基の数：３以下、（３）ＧＣ含有率（ＧＣ％）：８０％以下は、同様であるが、（４）自己相補性に関しては、“連続する”塩基対だけを対象とし、その最大値とするように変更し、その値を４以下とした。
【００３５】
Ｉ字型のＤＮＡ構造体、Ｙ字型のＤＮＡ構造体の形成に使用される１０塩基の基本オリゴヌクレオチドを組み合わせてできたセグメントオリゴヌクレオチド配列は３１種類ある。このセグメントオリゴヌクレオチド配列の一例を表１、表２、表３に示す。
【００３６】
【表１】
0004108347.tif 000002
【表２】
0004108347.tif 000003
【表３】
0004108347.tif 000004
表１において、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、Ｉ−５、Ｉ−６、Ｉ−７は、それぞれＩ字型のＤＮＡ構造体の形成に使用される１０塩基を組み合わせてできたセグメントオリゴヌクレオチド配列であり、表２、表３において、Ｙ−１、Ｙ−２、Ｙ−３、Ｙ−４、Ｙ−５、Ｙ−６、Ｙ−７は、それぞれＹ字型のＤＮＡ構造体の形成に使用される１０塩基と１塩基（ヒンジ部のアデニン（Ａ））を組み合わせてできたセグメントオリゴヌクレオチド配列である。例えば、セグメントオリゴヌクレオチド配列Ｉ−１の欄において、Ｉ１ｐ１ユニットは、１０塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列ＧＣＧＣＡＴＡＧＣＣ(配列番号１)を表し、Ｉ１ｐセグメントオリゴヌクレオチドは、Ｉ１ｐ１ユニット（ＧＣＧＣＡＴＡＧＣＣ：配列番号１)、Ｉ１ｐ２ユニット（ＣＡＡＡＴＴＣＧＣＣ：配列番号２)、Ｉ１ｐ３ユニット（ＧＡＡＴＴＴＧＣＣＧ：配列番号３)を組み合わせてできた３０塩基からなるオリゴヌクレオチド配列を表す。また、セグメントオリゴヌクレオチド配列Ｙ−１の欄において、Ｙ１ｐ１ユニットは、１０塩基からなる基本オリゴヌクレオチド配列ＧＧＣＴＡＴＧＣＧＣ(配列番号４８)を表し、Ｙ１ｐセグメントオリゴヌクレオチドは、Ｙ１ｐ１ユニット（ＧＧＣＴＡＴＧＣＧＣ：配列番号４８)、Ｙ１ｐ２ユニット（ＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣ：配列番号４９)、アデニン（Ａ）、Ｙ１ｐ３ユニット（ＧＣＧＣＡＧＧＡＴＧ：配列番号５０)を組み合わせてできた３１塩基からなるオリゴヌクレオチド配列を表す。
【００３７】
セグメントオリゴヌクレオチドの合成：
上記で配列生成したセグメントオリゴヌクレオチドの合成は、アマシャムファルマシアバイオテック（株）に外注した。合成セグメントオリゴヌクレオチドは、ＴＥ（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４），０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））バッファー液に溶解し、オリゴヌクレオチド濃度１００ｍＭに調製後、オリゴヌクレオチド濃度を分子吸光度計（ベックマン社製 DU 640 Spectrophotometer）で測定し、確認した。また、オリゴヌクレオチドの純度はＤＨＰＬＣ装置（トランスジェノミック社製 WAVE DNA Fragment Analysis System）で測定した。このときの泳動条件は、
バッファーＡ: 0.lM TEAA, バッファーＢ: 0.lM TEAA, 25% CH3CN
90‐40% Ａ,  10‐  60% Ｂ in 15min
40‐  0% Ａ,  60‐100% Ｂ in  1min
0‐90% Ａ, 100‐  10% Ｂ in  1min
90% Ａ,      10% Ｂ for 2min
測定温度８０℃
である。
【００３８】
ＤＮＡ構造体作製：
ＤＮＡ構造体は、配列設計した一組の合成セグメントオリゴヌクレオチドを反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．３），１０ｍＭ  ＭｇＣ１２，５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で等モル量（オリゴヌクレオチド濃度  ８０ｎＭ）混合し、熱処理を行った。熱処理は、８連チューブ0.2ml（バイオテクノロジー社製 ABgene）を用いて、ＰＣＲ装置（バイオメトラ社製 Tl Thermocycler）により室温から９５℃まで加熱後、１０分間保持し、その後２５℃まで徐冷した。熱処理後、ＤＮＡ構造体の確認をアガロースゲル電気泳動で行った。電気泳動は、ミニゲル泳動装置（アドバンス社製 Mupid）を用いて、３％ アガロースゲル（ギブコ社製 BRL UltraPUREアガロース）、TBE（45ｍＭ Tris‐borate,1ｍＭ EDTA）バッファー液で行った。電気泳動の条件は以下のとおりである。
【００３９】
泳動条件：
印加電圧  １００Ｖ／５０Ｖ
泳動温度  室温／４℃
アガロースゲル電気泳動を行った後、エチヂウムブロマイド染色を行い、UVイルミネーター（UVP社製 DUAL‐INTENSITY TRANSILLUMINATOR）で照射し、撮影装置（ATTA社製 CCDカメラ，イメージフリーザー TKIF‐66）を用いて写真撮影を行った。撮影画像は、ビデオプリンター（セイコー社製 VP1500）を用いて現像した。
【００４０】
ＤＮＡ構造体：
上述して得られたＤＮＡ構造体は、表１、表２、表３で示した合成ヌクレオチドが１つの構成単位であり、図４（Ａ）に示すようなＩ字型ＤＮＡ構造体や、図４（Ｂ）に示すようなＹ字型ＤＮＡ構造体が組み立て上げられた。
【００４１】
図４（Ａ）において、Ｉ字型ＤＮＡ構造体を構成しているユニットは、Ｉｑ１ユニット１ａ，Ｉｑ２ユニット１ｂ，Ｉｑ３ユニット１ｃ、Ｉｐ１ユニット２ａ，Ｉｐ２ユニット２ｂ，Ｉｐ３ユニット２ｃである。それぞれのユニットは、例えば、表１においてＩ字型のＤＮＡ構造体の形成に使用されるオリゴヌクレオチド配列Ｉ−１の、Ｉ１ｑ１ユニット（ＧＴＴＧＣＧＴＣＧＧ：配列番号５），Ｉ１ｑ２ユニット（ＣＧＧＣＡＡＡＴＴＣ：配列番号６），Ｉ１ｑ３ユニット（ＧＧＣＧＡＡＴＴＴＧ：配列番号７）、Ｉ１ｐ１ユニット（ＧＣＧＣＡＴＡＧＣＣ：配列番号１），Ｉ１ｐ２ユニット（ＣＡＡＡＴＴＣＧＣＣ：配列番号２），Ｉ１ｐ３ユニット（ＧＡＡＴＴＴＧＣＣＧ：配列番号３）に対応している。また、図４（Ａ）において、（Ｉｐ２）＝（Ｉｑ３）’は、Ｉｐ２ユニット２ｂとＩｑ３ユニット１ｃが相補的な塩基配列であることを意味している。（Ｉｑ２）＝（Ｉｐ３）’についても同様である。すなわち、図４（Ａ）に示されているＩ字型ＤＮＡ構造体は、この２つの定義を満たす設計ということになる。Ｉｑ１ユニット１ａ，Ｉｐ１ユニット２ａは、セグメントオリゴヌクレオチドを連結させるためのユニットであり、Ｉｑ２ユニット１ｂ，Ｉｑ３ユニット１ｃ、Ｉｐ２ユニット２ｂ、Ｉｐ３ユニット２ｃは、セグメントオリゴヌクレオチドを固定させるためのユニットである。つまり、Ｉｑ１ユニット１ａとＩｐ１ユニット２ａは配列設計上、結合しないことになっている。
【００４２】
また、図４（Ｂ）において、Ｙ字型ＤＮＡ構造体は、Ｙｐ，Ｙｑ，Ｙｒの３種類のセグメントオリゴヌクレオチドからなる。それぞれのセグメントオリゴヌクレオチドを構成しているユニットは、Ｙｐ１ユニット１０ａ，Ｙｐ２ユニット１０ｂ，Ｙｐ３ユニット１０ｃ、Ｙｑ１ユニット１１ａ，Ｙｑ２ユニット１１ｂ，Ｙｑ３ユニット１１ｃ、Ｙｒ１ユニット１２ａ，Ｙｒ２ユニット１２ｂ，Ｙｒ３ユニット１２ｃである。それぞれのユニットは、例えば、表２においてＹ字型のＤＮＡ構造体の形成に使用されるセグメントオリゴヌクレオチド配列Ｙ−１の、Ｙ１ｐ１ユニット（ＧＧＣＴＡＴＧＣＧＣ：配列番号４８），Ｙ１ｐ２ユニット（ＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣ：配列番号４９），Ｙ１ｐ３ユニット（ＧＣＧＣＡＧＧＡＴＧ：配列番号５０）、Ｙ１ｑ１ユニット（ＣＧＡＡＣＡＣＣＧＣ：配列番号５２），Ｙ１ｑ２ユニット（ＣＡＴＣＴＧＣＣＧＣ：配列番号５３），Ｙ１ｑ３ユニット（ＧＣＴＧＣＣＡＴＣＧ：配列番号５４）、Ｙ１ｒ１ユニット（ＧＣＧＴＴＣＣＧＴＧ：配列番号５６），Ｙ１ｒ２ユニット（ＣＡＴＣＣＴＧＣＧＣ：配列番号５７），Ｙ１ｒ３ユニット（ＧＣＧＧＣＡＧＡＴＧ：配列番号５８）に対応している。図４（Ｂ）に示すように、Ｙ字型ＤＮＡ構造体のそれぞれのユニットは、（Ｙｐ２）＝（Ｙｑ３）’，（Ｙｑ２）＝（Ｙｒ３）’，（Ｙｒ２）＝（Ｙｐ３）’という条件を満たし、さらにＹｐ２Ａ３，Ｙｑ２Ａ３，Ｙｒ２Ａ３という条件を満たしている。ここで、Ｙｐ２Ａ３は、Ｙｐ２ユニット１０ｂとＹｐ３ユニット１０ｃの間にアデニン（Ａ）がへリックス遮断部位（Helix interrupter）として組み込まれていることを意味している。
【００４３】
さらに、Ｉ字型ＤＮＡ構造体、Ｙ字型ＤＮＡ構造体を構成しているセグメントオリゴヌクレオチドを組み合わせることにより、図５（ａ）〜（ｈ）に示すような大型のＩ字型やＹ字型、Ｔ字型、ハニカム構造などのＤＮＡ構造体を作成することも可能である。
【００４４】
図６（ａ）は、Ｉ字型ＤＮＡ構造体を形成する３種類のセグメントオリゴヌクレオチド配列（３０塩基からなるオリゴヌクレオチド）、Ｉ４ｐセグメントヌクレオチド：ＣＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＡＴＧ（配列番号２７）、Ｉ４ｑセグメントヌクレオチド：ＧＧＴＧＴＴＣＧＣＧＣＡＴＴＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＴＣＧＣＧ（配列番号３１）、Ｉ５ｐセグメントヌクレオチド：ＣＧＣＧＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＴＡＣＧＣＧ（配列番号３５）と、１種類のセグメントオリゴヌクレオチド配列（２０塩基オリゴヌクレオチド）、Ｉ５ｑセグメントヌクレオチド：ＣＧＣＧＴＡＧＧＡＧＣＣＧＴＡＣＧＧＴＧ（配列番号２３）を示す。図６（ｂ）は、これら４種類のセグメントオリゴヌクレオチドを順番に合成してからアガロースゲル電気泳動によって解析したバンドパターンを示す。図６（ｂ）に示されるバンドパターンにより、図６（ｃ）に示すようなＩ字型４量体のＤＮＡ構造体が形成されたことが確認できる。
【００４５】
このＩ字型４量のＤＮＡ構造体は、それぞれのセグメントヌクレオチド単独（Ｉ４ｐ、Ｉ４ｑ、Ｉ５ｐ、Ｉ５ｑ）及びセグメントヌクレオチド２〜３個の組み合わせ（Ｉ４ｐ＋Ｉ５ｐ、Ｉ４ｐ＋Ｉ４ｑ＋Ｉ５ｑ等）では生じない。また、Ｉ４ｐセグメントヌクレオチド→Ｉ４ｑセグメントヌクレオチド→Ｉ５ｐセグメントヌクレオチド→Ｉ５ｑセグメントヌクレオチドの順にセグメントヌクレオチドを追加していくと順に伸びていく様子も確認できる。
【００４６】
図７（ａ）は、Ｙ字型ＤＮＡ構造体を形成する３種類のセグメントオリゴヌクレオチド配列（３１塩基からなるオリゴヌクレオチド）、Ｙｐセグメントオリゴヌクレオチド：ＧＧＣＴＡＴＧＣＧＣＣＧＴＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＣＡＴＧＡＧＣＧ（配列番号１２３）、Ｙｑセグメントオリゴヌクレオチド：ＧＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣＣＧＣＧＡＴＡＧＧＡＣＣＧＧＣＴＴＡＣＧ（配列番号１２４）、Ｙｒセグメントオリゴヌクレオチド：ＧＧＣＡＣＧＴＴＣＧＣＧＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＴＣＧＣＧＧ（配列番号１２５）を示す。図７（ｂ）は、これら３種類のセグメントオリゴヌクレオチドを種々の組み合わせにより混合してからアガロースゲル電気泳動によって解析したバンドパターンを示す。図７（ｂ）に示されるバンドパターンにより、図７（ｃ）に示すようなＹ字型３量体のＤＮＡ構造体が形成されたことが確認できる。このＹ字型３量体のＤＮＡ構造体は、セグメントヌクレオチド単独（Ｙｐ、Ｙｑ、Ｙｒ）及びセグメントヌクレオチド２個の組み合わせ（Ｙｐ＋Ｙｑ、Ｙｑ＋Ｙｒ、Ｙｒ＋Ｙｐ）では生じない。
【００４７】
図８（ａ）は、ハニカム構造のＤＮＡ構造体を形成する６種類のセグメントオリゴヌクレオチド配列（３１塩基からなるオリゴヌクレオチド）、Ｙｐセグメントオリゴヌクレオチド：ＧＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＣＣＧＣＴＣＧＣＡＡＴＧＣＣＧＧＧＴＧＣ（配列番号１２６）、Ｙｑセグメントオリゴヌクレオチド：ＴＧＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＧＣＧＣＧＧＡＴＧＣＧＡＧＣＧＧＧ（配列番号１２７）、Ｙｒセグメントオリゴヌクレオチド：ＣＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＣＧＧＣＡＡＣＣＧＣＧＣＣＴＣＡ（配列番号１２８）、Ｙ＾ｐセグメントオリゴヌクレオチド：ＣＣＧＣＣＧＴＴＧＣＴＣＧＧＡＣＧＣＧＧＡＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡ（配列番号１２９）、Ｙ＾ｑセグメントオリゴヌクレオチド：ＧＧＧＣＣＡＣＧＣＡＣＣＣＴＣＧＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＴＣＣＧＡ（配列番号１３０）、Ｙ＾ｒセグメントオリゴヌクレオチド：ＴＧＧＧＣＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＧＡＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧ（配列番号１３１）を示す。すなわち、ハニカム構造のＤＮＡ構造体は、２種類のＹ字型ＤＮＡ構造体を形成するセグメントオリゴヌクレオチド（Ｙｐ、Ｙｑ、ＹｒとＹ＾ｐ、Ｙ＾ｑ、Ｙ＾ｒ）から組み立て上げられる。これら６種類のセグメントオリゴヌクレオチドを組み合わせにて混合することにより図８（ｂ）に示すようなハニカム構造のＤＮＡ構造体が形成された。
【００４８】
図８（ｂ）は、これら６種類のセグメントオリゴヌクレオチドを種々の組み合わせにより混合してからアガロースゲル電気泳動によって解析したバンドパターンを示す。図８（ｂ）に示されるバンドパターンにより、図７（ｃ）に示すようなＹ字型３量体の２種類のＤＮＡ構造体が３種類のセグメントオリゴヌクレオチドの混合により形成され、それらがお互いにハイブリダイズして大きな網目構造を形成したことが確認できる。このハニカム構造のＤＮＡ構造体は、それぞれのセグメントヌクレオチド単独（Ｙｐ、Ｙｑ、Ｙｒ、Ｙ＾ｐ、Ｙ＾ｑ、Ｙ＾ｒ）及びセグメントヌクレオチド２個、３個、４個、５個の組み合わせでは生じない。
【００４９】
次に、本発明の実施の形態に係るＤＮＡ構造体の可視化・計測について説明する。
【００５０】
（イ）まず、合成されたＤＮＡ構造体溶液を熱処理する。熱処理の条件は、上述したＤＮＡ構造体の作成方法において行う熱処理の条件と同様である。
【００５１】
（ロ）次に、熱処理後のＤＮＡ構造体溶液を、走査型プローブ顕微鏡で画像化するために、走査型プローブ顕微鏡による観察用の基板上に固定化（アンカリング）する。固定化するための基板は、固定化されるＤＮＡの形状及び構造変化を著しく阻害しないものであれば、特に限定されず、シリコン基板、ガラス基板などの、走査型プローブ顕微鏡での観察に用いられ、なお且つＤＮＡ構造体の固定化を許容するものであればよく、好ましくは表面に劈開面を有するマイカ（雲母基板）を用いるとよい。
【００５２】
（ハ）上記のようにして得られるＤＮＡ構造体溶液を固定化した基板を可視化・計測する技術として、走査型プローブ顕微鏡を用いる。ここで、「走査型プローブ顕微鏡」とは、微細なプローブを対象物の表面に走査して原子レベルの分解能でその表面を観察する走査型顕微鏡の総称であり、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）が含まれる。ＡＦＭは斥力型、引力型およびタッピング型（「タッピング型」は、デジタルインスツルメント社の登録商標）等に大別される。この分野の研究は著しく進展している最中であり、摩擦力顕微鏡（ＬＦＭ）、マクスウエル応力顕微鏡、磁気力顕微鏡（ＭＦＭ）、フォトン走査型トンネル顕微鏡等の新しい顕微鏡が開発されつつある。本発明における走査型プローブ顕微鏡とは、その趣旨に鑑み、現在知られているものに限らず、原子レベルの分解能を有する顕微鏡であれば将来開発されるものをも含むものである。
【００５３】
以下に本発明の実施の形態に係るＤＮＡ構造体の可視化・計測の実施例を示す。
【００５４】
上述したＤＮＡ構造体溶液（Ｉ字型、Ｙ字型）を雲母基板（マイカ）の劈開面に、下記の２通りの方法でアンカリングした。
【００５５】
マグネシウム固定：
ＤＮＡ構造体溶液に、濃度１０ｍＭとなるように塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を混合し、その混合溶液をマイカの劈開面上にアンカリングした。５分間静置した後、純水１ｍｌ×５回洗浄後、窒素ガスでマイカ基板上に残った余分な水滴を飛ばし、真空オーブンを用いて４０℃、２０分の真空乾燥を行った。
【００５６】
スペルミン固定：
マイカの劈開面上にスペルミン１０μｇ／ｍｌを２０μｌ滴下し、５分間静置した後、窒素ガスで残留水を除去した。このようにしてスペルミンでコートされたマイカ基板上にＤＮＡ構造体溶液をアンカリングした。その後、純水１ｍｌ×５回洗浄を行い、窒素ガスでマイカ基板上に残った余分な水滴を飛ばし、真空オーブンを用いて４０℃、２０分の真空乾燥を行った。
【００５７】
生体分子可視化・計測装置としてＡＦＭ（デジタルインスツルメント社製 NanoScopeIIIa）を用いて、以下の使用条件により可視化・計測を行った。
【００５８】
ＡＦＭの使用条件：
測定モード：大気中タッピング・モードＡＦＭ
使用プローブ：シリコン単結晶・プローブ（Ｄ−ＮＣＨ・１０Ｖ）
カーボンナノチューブ
次に、ＡＦＭを使用したＤＮＡ構造体の可視化・計測結果について述べる。
【００５９】
図９は、Ｉ字型ＤＮＡ構造体の可視化像を示し、図１０及び図１１は、Ｙ字型ＤＮＡ構造体の可視化像を示す。
【００６０】
今回測定を行ったＩ字型ＤＮＡ構造体は、図６（ｃ）に示した構造で配列を伸ばし、設計上では長さ８０ｂｐの２本鎖とその片側に１０ｂｐの１本鎖を持つＩ５ｐセグメントオリゴヌクレオチドとＩ５ｑセグメントオリゴヌクレオチドが結合した形のＤＮＡ構造体を可視化した。
【００６１】
図９（ａ）は５００ｎｍ×５００ｎｍの範囲をスキャンした平面画像を示す。これによれば長さ３０ｎｍのワイヤー型１次元構造が出現しているのがわかる。１ｂｐが約０．３４ｎｍであることから、９０ｂｐは約３０．６ｎｍとなり、図９に示されているＤＮＡ構造体は、設計した８０ｂｐ＋１０ｂｐのＤＮＡ構造体のサイズに非常に近い大きさであることがわかる。図９（ｂ）は、図９（ａ）中の枠部分をさらに拡大し、３次元画像処理を行った画像を示す。これらの画像から、このＤＮＡ構造体はＩ字型構造であることがより明確にわかる。
【００６２】
次に、今回測定を行ったＹ字型ＤＮＡ構造体は、図７（ｃ）に示す構造で、Ｙ字型ＤＮＡ構造体を構成する３辺がそれぞれ３０ｂｐ、５０ｂｐ、９０ｂｐとなるように、図７（ｃ）の一辺２０ｂｐで設計されたＹ字型ＤＮＡ構造体にＩ字型ＤＮＡ構造体を結合させることによって、より大型のＹ字型ＤＮＡ構造体となるように設計したものである。
【００６３】
図１０（ａ）、図１１（ａ）は、３００ｎｍ×３００ｎｍの範囲をスキャンした平面画像を示す。これらの画像からＹ字型２次元構造が出現しているのがわかる。さらに図１０（ｂ）、図１１（ｂ）は、それぞれ図１０（ａ）、図１１（ａ）中の枠部分をさらに拡大して３次元画像処理を行った画像を示す。
【００６４】
図９〜図１１までの画像の高さ方向を表す色は、図１１中の中央に示したカラーバーにより示した。高さの最大値は２．０ｎｍで白で表され、最小値は０．０ｎｍで黒で表される。さらに、図１２（ａ）、図１２（ｂ）は、それぞれ図１０（ａ）、図１１（ａ）に示した２つのＹ字型ＤＮＡ構造体の各辺を測長した結果を示した。モデル図には設計値通りの値を示した。モデル図の各辺の長さは、長い辺から９０ｂｐ→約３０ｎｍ、５０ｂｐ→約１７ｎｍ、３０ｂｐ→約１０ｎｍとした。測長の結果は３回測定した値の平均値で表した。モデル図と同様に矢印をつけて測定した辺を指し、数値で示した。これによると、実際に可視化されたＹ字型ＤＮＡ構造体も設計した構造のサイズに近い値を示しており、Ｙ字型ＤＮＡ構造体が可視化されたことが確認できた。
【００６５】
なお、図９〜図１２の可視化したＤＮＡ構造体が、実際よりも太く、かつ、設計値から少しずれているのは、以下の理由によるものである。
【００６６】
ＡＦＭの分解能はカンチレバー端のプローブ先端の曲率半径によって左右される。すなわち、プローブ先端の曲率半径が大きいと実際よりもオリゴヌクレオチドは太く可視化される。また、可視化する際、マイカ基板をスペルミンで処理してＤＮＡ構造体をアンカリングするので、ＤＮＡ構造体が変形して固定されることもあり得る。これらの理由によって、可視化像が設計値からずれたものと考えられる。これらの問題点はプローブに単層カーボンナノチューブ等を用い、ＤＮＡ構造体の変形が少なくなるような基板処理を用いれば、解決可能である。
【００６７】
以上の実施例により、本発明の実施の形態に係るＤＮＡ構造体によれば、
１）２〜４個のオリゴヌクレオチドによって形成されるＩ字型、Ｙ字型、Ｔ字型等の構造単位を組み合わせることで、ナノスケールの任意の３次元高次構造を持つ分子を構築することが可能となる。
【００６８】
２）この構造単位及び高次ＤＮＡ構造体は、オリゴヌクレオチド同士の（部分）対合によって安定化されるので、各オリゴヌクレオチドを混合するだけで自律的に形成される。
【００６９】
３）各オリゴヌクレオチド同士の（部分）対合は、それを構成する２〜４個のブロック塩基配列間の配列相補性（連続した塩基対形成）によって決定される。
【００７０】
４）ｎ個の塩基からなる配列の可能性は４ｎ種類（ｎは正の整数）存在する。ｎ＝１０を１ブロックとすると約１００万種類のブロックが利用可能となる。３ブロックからなるオリゴヌクレオチド（３０塩基）を想定した場合、その配列の可能性は１０１８種類となる。従って、オリゴヌクレオチドは実質的に無限の配列可能性があり、複雑な高次ＤＮＡ構造体であっても、十分に特異的な配列を持つオリゴヌクレオチドを選別使用して構築することが可能である。
【００７１】
５）構造異性体をもつ構造単位を作成することが可能である。
【００７２】
また、上記のような特徴を以下に示すナノデバイスとして利用することも可能である。
【００７３】
１）走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）に用いるための分子プローブ
２）超微細ディスプレイの３種の発光素子の正確な空間配置のためのテンプレート
３）人工網膜の３種の受光体の正確な空間配置のためのテンプレート
４）構造異性体間の構造変化を利用したメモリー
５）構造異性体間の構造変化を利用した動く分子機械
６）任意の構造デザインが可能なことを利用したナノスケール回路設計
７）分子機械の骨組み
（その他の実施の形態）
以上、本発明者らによってなされた発明を上記実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述および図面はこの発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例および運用技術が明らかとなろう。
【００７４】
例えば、上記の実施の形態においては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を用いて、ＤＮＡ構造体の作成方法について説明したが、これをペプチド核酸（ＰＮＡ）に適用することも可能である。ペプチド核酸は、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）に代わる物質として開発された化学合成核酸アナログであり、ペプチド骨格に核酸塩基をもつ分子である。具体的には２−アミノエチルグリシンを骨格単位とし、これにメチレンカルボニル基を介して核酸塩基を結合させた構造をもった化合物で、核酸によく似た３次元構造を有する。このＰＮＡ分子は１本鎖ＤＮＡ及び２本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡに対し水素結合を介して塩基配列特異的に２本鎖、もしくは３本鎖を形成することが確認されている。このように、本発明の実施の形態に係るＤＮＡ構造体の代替物質として、ペプチド核酸を適用することは十分に可能である。
【００７５】
このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。したがって、本発明はこの開示から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ限定されるものである。
【００７６】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡ構造体の作成方法によれば、オリゴヌクレオチドの塩基配列を、水素結合する塩基配列と水素結合しない配列とを適宜選択・設計し、ＤＮＡ構造体を設計・合成することにより新規なＤＮＡ構造体を作成することができる。これにより、従来の無機材料では実現できない、ナノ材料やナノデバイスを作成することが可能となる。
【００７７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の実施の形態に係るＤＮＡ構造体の作成方法を示すフローチャート図である。
【図２】図２は、本発明の実施の形態に係るセグメントオリゴヌクレオチドの生成方法の詳細を示すフローチャート図である。
【図３】図３は、予備選択条件である自己相補性の値の決定方法を示す説明図である。
【図４】図４は、本発明の実施の形態に係るＤＮＡ構造体の模式図である。
【図５】図５は、本発明の実施の形態に係るＤＮＡ構造体の組み合わせにより生成される高次のＤＮＡ構造体の模式図である。
【図６】図６は、本発明の方法により、Ｉ字型のＤＮＡ構造体を形成メカニズムを示す説明図である。
【図７】図７は、本発明の方法により、Ｙ字型のＤＮＡ構造体を形成メカニズムを示す説明図である。
【図８】図８は、本発明の方法により、ハニカム構造のＤＮＡ構造体を形成メカニズムを示す説明図である。
【図９】図９は、図６（ｃ）の状態になったＩ字型ＤＮＡ構造体のＡＦＭ顕微鏡写真である。
【図１０】図１０は、図７（ｃ）の状態になった一つＹ字型ＤＮＡ構造体のＡＦＭ顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、図７（ｃ）の状態になったもう一つのＹ字型ＤＮＡ構造体のＡＦＭ顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、図１０図（ａ）および図１１（ａ）の状態になったＹ字型ＤＮＡ構造体のＡＦＭ測定で得られた情報の解析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0004108347.tif 000050
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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