(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡ：
（１）配列表の配列番号：３又は配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；及び
（２）配列表の配列番号：３又は配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡがコードするタンパク質。
【請求項３】
下記のいずれかのタンパク質：
（１）配列表の配列番号：３又は配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；及び
（２）配列表の配列番号：３又は配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項４】
下記のいずれかのＤＮＡ：
（１）配列表の配列番号２又は配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（２）配列表の配列番号２又は配列番号５に記載の塩基配列を含むＤＮＡ；
（３）配列表の配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；及び
（４）（１）又は（３）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡがコードするタンパク質。
【請求項６】
請求項１又は請求項４記載のＤＮＡを発現する発現プラスミド。
【請求項７】
請求項６記載の発現プラスミドによって形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を、請求項６記載の発現プラスミドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組換えタンパク質の生産方法。
【請求項９】
請求項２、請求項３又は請求項５記載のいずれかのタンパク質に対する抗体。
【請求項１０】
請求項２、請求項３又は請求項５記載のいずれかのタンパク質を用いることを特徴とする、セマフォリンＺ阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項２、請求項３又は請求項５記載のタンパク質の少なくとも一つを含有することを特徴とする、末梢神経の伸長抑制剤。
【請求項１２】
請求項１又は請求項４記載のＤＮＡのいずれかを人為的に染色体中に挿入したか、あるいはいずれかをノックアウトさせたトランスジェニック非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、セマフォリンファミリーに属する新規なセマフォリン、セマフォリンＺおよび該セマフォリンＺの医薬・研究用試薬への利用に関する。さらに詳しくは、神経の伸長に対して抑制的に作用するセマフォリンＺ及びその遺伝子、または該セマフォリンＺ遺伝子にハイブリダイズする他のセマフォリン、さらには該セマフォリンＺの改変タンパク質、部分ペプチド、抗体、該セマフォリンＺ遺伝子に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ、或いはこれらの物質の医薬・診断薬あるいは研究用試薬への利用に関する。
従来の技術
ヒトなど高等生物では中枢神経は一度傷害を受けると再生する能力がないことが広く知られている。このため交通事故などで脊髄の損傷を受けた人は、半生を半身不随として過ごさなければならない。一方、末梢神経はこれらの高等生物においても旺盛な再生能が保持されており、手足の神経は一度切断されても徐々に再生し、それに伴って機能も回復することが知られている。
1980年代初期にAguayoらのグループは、損傷を与えた高等生物の中枢神経中に実験的に末梢神経を移植することにより中枢神経の軸索伸長が誘導されることを見出し、それまで再生能力はないと一般に考えられていた高等生物の中枢神経が、周囲の環境さえ整えば軸索を再生することを明らかにした（Nature,284,264-265（1980）、Science,214,931-933（1981））。この報告は、高等生物の中枢神経系には「中枢神経再生阻止因子」とでも呼べるような因子が存在しており、この因子が中枢神経の再生を抑制している可能性、そしてその抑制を解除することにより中枢神経が再生する可能性を示唆しており、中枢神経再生治療への道を開いた。
1988年になりSchwabらのグループは、中枢神経系のミエリン由来のタンパク質の中に、上記中枢神経再生阻止因子が存在していることを明らかにした。そして、該中枢神経再生阻止活性を有するタンパク質を部分的ながら精製することに成功し、このタンパク質画分をNI35/250と名付けた（Annu.Rev.Neurosci.,16,565-595（1993））。しかし、その単離・同定及び遺伝子クローニングは未だに成功していない。また、彼らは粗精製したNI35/250を動物に免疫し、中和活性を有する抗体（IN-1）を取得することにも成功している。この抗体はウエスタンブロットでNI35/250のバンドを認識し、免疫染色でNI35/250が分布していると考えられる部位を染めることができる。そして、実験的に脊髄を損傷させた動物にこの抗体を投与すると、２−３週間後には脊髄の神経が部分的ながら再生すること、更に２〜３か月後には機能も回復することを明らかにしている（Nature,343,269-272（1990）、Nature,378,498-501（1995））。これは、まさに前記Aguayoらにより示唆された中枢神経再生阻止因子の存在、及び該因子の活性を阻止することによる中枢神経の再生を実験的に証明したものであり、その価値は大きい。しかし該抗体はヒト型ではなくラット型NI35/250に対する抗体であり、また安定性、特異性も低い。また上述のように該抗体の投与により再生が認められたものの、その効果は部分的かつ不完全であり、全ての運動機能が回復したわけではない。従ってこれら問題点の解決策として、NI35/250あるいはこれに相当する中枢神経再生阻止因子の遺伝子の実体を明らかにし、分子生物、神経科学等の知見に基づいて、中枢神経再生阻止活性をより効果的に阻害する阻害物質を開発すること、あるいは該再生阻止因子の遺伝子の発現抑制方法を開発することが不可欠であると考えられる。
ところで中枢・末梢を問わず神経系がその主な機能である情報伝達・処理を正確に行うためには、発生過程、すなわち胚あるいは胎児の段階において、神経細胞間あるいは神経細胞と末梢の受容器・効果器との間に複雑な神経ネットワークを形成しなければならない。神経ネットワーク形成のためには、伸長する神経突起を遠く離れた標的部位に正確に導く（ガイドする）巧妙な機構が必要である。
これまでは、神経ネットワークの形成には突起伸長促進因子・突起誘引因子と言った神経の突起伸長を正に制御する因子が主な役割を果たしているものと考えられてきた。しかしそれとは逆の、つまり伸長阻止活性を持った負の因子が正確なガイダンスには重要であることが、ネットワーク形成メカニズムに関する最近の研究から明らかになりつつある（Cell,78,353-356（1994））。
このような伸長阻止活性を有する因子の代表が、「セマフォリン」と呼ばれるタンパク質である。最初に発見されたセマフォリンはバッタから発見されたファシクリンIVであり、その後、ニワトリからコラプシン（後にコラプシンＩと命名）が発見され（Cell,75,217-227（1993）;Neuron,9,831-845（1992））、ショウジョウバエ、カブトと言った昆虫からヒトまたはウイルスにまで広く、10以上のセマフォリンファミリーに属する遺伝子が報告されている（Cell,81,471-474（1995））。これらのセマフォリンは、そのアミノ酸配列上にセマフォリンドメインと呼ばれるおよそ500アミノ酸からなるある一定の構造を有するのが特徴である（Neuron,14,941-948（1995）、Cell,75,1389-1399（1993））。しかし、セマフォリン遺伝子相互の間でセマフォリンドメインのアミノ酸一次配列上の相同性は80%-20%であり、必ずしも高くはない。
これらのセマフォリンの中で機能が確認されているものはバッタのファシクリンIV、ショウジョウバエのセマフォリンI,II、ニワトリのコラプシン、そしてほ乳類におけるコラプシンであるセマフォリンIIIなどごく一部であり、これらは全て神経突起の伸長、シナプス形成に対して抑制的に機能することが知られている。中でもセマフォリンIIIは、in vitroにおいて培養神経の成長円錐を短時間に退縮させる活性（成長円錐退縮活性）をも有することが報告されている（Neuron,14,941-948（1995）、Neuron,14,949-959（1995）、Cell,81,631-639（1995）、Cell,75,1389-1399（1993）、Cell,75,217-227（1993）、Neuron,9,831-845（1992））。
以上のようにセマフォリンは発生段階において成長円錐退縮活性及び神経突起の伸長抑制活性を有し、神経の正確なガイダンスを行う役割を担っていることが明らかになりつつあるが、これらセマフォリンが発生段階のみならず、成体においても何らかの機能を有しているのか否かは現在のところ明らかにされていない。ましてやセマフォリンが、成体における中枢神経の再生阻止因子としての役割を担っているか否かは全く不明である。勿論、セマフォリンは神経突起伸長を抑制する負のガイダンス因子であることが明らかにされているため、該セマフォリンを中枢神経の再生阻止因子の候補として考えることもできなくはない（Nature,378,439-440（1995））。しかし、高等生物で唯一機能解析がなされているセマフォリンIII（Sema III）は、末梢神経である感覚神経あるいは交感神経に対しては突起伸長阻止活性を示すが、中枢神経である網膜神経に対しては作用しないことがin vitroの実験結果により明らかにされている（Cell,75,217-227（1993））。加えて、本発明者らがSemaIIIの成体における発現分布をノーザン解析により調べた結果、主に末梢組織で発現していることが判明している（後述の参考例２参照）。従って、このようなSemaIIIが「中枢神経再生阻止因子」としての機能を有しているとは考え難い状況にある。
発明が解決しようとする課題
本発明が解決しようとする課題は、神経の伸長に対し抑制的に作用する新規なセマフォリン、セマフォリンＺ及びその遺伝子を提供することにより、神経疾患に関わる医薬、中でも中枢神経の再生に関わる医薬、又は診断薬あるいは研究用試薬を提供することにある。本発明のセマフォリンＺの発見に伴い、該セマフォリンＺ遺伝子にハイブリダイズする他のセマフォリン、該セマフォリンＺの改変タンパク質、部分ペプチド、抗体、該セマフォリンＺ遺伝子に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ、該セマフォリンＺを用いたセマフォリンＺ阻害物質のスクリーニング方法、該スクリーニング法により得られるセマフォリンＺ阻害物質、そしてセマフォリンＺ又はその阻害物質を含有する医薬組成物、或いは該セマフォリンＺについてのトランスジェニック動物等をも提供するものである。またセマフォリンＺの発見に伴い、当該分野における研究用試薬をも提供するものである。
課題を解決するための手段
「従来の技術」の項でも述べたように、成体において中枢神経の再生が常に阻止された状態にあるのならば、この中枢神経の再生を阻止する因子を同定することが中枢神経の再生治療にとって最も重要な課題であり、また該因子の同定なくしては中枢神経の再生治療は有り得ないと思われる。
本発明者らは、前述のNI35/250と負のガイダンス因子であるセマフォリンとのin vitro活性の類似性、すなわちNI35/250はin vitroで成長円錐退縮活性及び神経の突起伸長抑制活性を有しているのに対し（J.Neurosci.,8,2381-2393（1988）、Science,259,80（1993））、既知のセマフォリンも突起伸長抑制活性を有しており、中でもセマフォリンIIIは成長円錐退縮活性も有しているという点に着目し、未だ同定されていない未知のセマフォリンの中に、中枢神経の再生阻止因子としての機能を有するものが存在している可能性を考えた。すなわち、1）成体の中枢神経系で強く発現しており、2）神経の伸長が抑制されていない成体の末梢組織や胎児等ではあまり発現していない、といった特徴を有するセマフォリンは未だ知られていないが、そのような特徴を有する未知のセマフォリンを同定することができれば、該セマフォリンこそが中枢神経の再生阻止因子として機能しているのではないかと考えた。
そこでまず、これまで報告されているセマフォリン遺伝子相互の間で比較的保存されているアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を、ＥＳＴ（Expressed Sequence Tags）データベースにより検索したところ、セマフォリン間で非常に良く保存されている８個のアミノ酸からなる配列（Gln（またはArg）-Asp-Pro-Tyr（またはHis）-Cys-Ala（またはGly）-Trp-Asp）に近い配列（Gln-Asp-Pro-Tyr-Cys-Gly-Trp-Ala）を一部配列としてコードするＤＮＡ断片配列、T08532を見い出した。
このT08532配列中には解読されていない塩基が存在しており、またオープンリーディングフレームを決定することもできなかった。またこのT08532配列中、上記アミノ酸配列以外の部分からはセマフォリンと思われる配列をほとんど見出すことができなかった。従って、このT08532が「セマフォリン」をコードする遺伝子の一部に該当するとは、この段階では結論することができなかった。さらにこのT08532が、胎児や成体の組織でどのような発現分布をとるのかも全く不明であり、「中枢神経再生阻止因子」としての機能を有するセマフォリン遺伝子の一部に該当するものとは到底予測することができなかった。
そこでまず、このT08532の配列情報を基にしてＤＮＡプライマーを合成し、ヒトの海馬のｃＤＮＡライブラリーから調製したｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、このT08532に対応する領域をクローニングして塩基配列を決定した（配列番号：７）。次にこのクローニングした断片を基にしてラット及びヒトのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果、クローニングされたラット及びヒト型の遺伝子はセマフォリンに特有の配列を有する新規セマフォリン遺伝子であることが判明した。我々は、この新規セマフォリンを「セマフォリンＺ」と命名した。
解析の結果、本発明のセマフォリンＺは成体の中枢神経系では強く発現しているが、その他では脾臓以外ではほとんど発現していないことが見出され、さらに、胎児期における発現は成体における発現より相当弱いという、まさに「中枢神経再生阻止因子」と考えられる発現分布を示すことが明らかとなった。
さらに本発明のセマフォリンＺは神経の伸長に対し抑制作用を有することも、本発明者らは明らかにした。また、該セマフォリンＺに対して相補的な配列を有する遺伝子が、該セマフォリンＺの発現を抑制することも明らかにした。
以上のように本発明のセマフォリンＺは中枢神経系で強く発現し、また神経の伸長に対し抑制的に作用することから、成体における中枢神経の再生阻止因子であると考えられる。該セマフォリンＺを用いてセマフォリンＺの阻害物質をスクリーニングすることが可能であり、そのようなスクリーニング系により見出された阻害物質は、中枢神経の再生を促進することができる。また上述のように、セマフォリンＺに対して相補的な配列を有する遺伝子が該セマフォリンＺの発現を抑制したことから、このような相補的遺伝子を中枢神経の再生治療に適用することができる。
さらに、上述のように本発明のセマフォリンＺは神経の伸長に対し抑制的に作用することから、末梢組織に対して投与された場合、末梢神経の伸長を抑制することによりアトピー性皮膚炎などの免疫疾患及び疼痛等の治療薬・診断薬に適用することができる。また該セマフォリンＺはセマフォリンファミリーに属する新規セマフォリンであることから、セマフォリンの研究分野における重要な研究材料、研究試薬となるものである。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
即ち本発明の要旨は、
（１）  配列表の配列番号：１又は配列番号：４に記載の塩基配列からなるセマフォリンＺＤＮＡ、
（２）  配列表の配列番号：２又は配列番号：５に記載の塩基配列からなるセマフォリンＺオープンリーディングフレーム、
（３）  配列表の配列番号：３又は配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるセマフォリンＺタンパク質、
（４）  配列表の配列番号：７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、セマフォリンドメインを有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（５）  前記（４）に記載のＤＮＡがコードするタンパク質、
（６）  前記（１）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（７）  中枢神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質をコードする、前記（６）に記載のＤＮＡ、
（８）  前記（６）又は（７）に記載のＤＮＡがコードするタンパク質、
（９）  前記（３）に記載のタンパク質において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されている、神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（１０）  中枢神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質をコードする、前記（９）に記載のＤＮＡ、
（１１）  前記（９）又は（１０）に記載のＤＮＡがコードするタンパク質、
（１２）  前記（３）に記載のタンパク質において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されている、中枢神経の伸長に対して促進的に作用するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（１３）  前記（１２）に記載のＤＮＡがコードするタンパク質、
（１４）  ヒトｃＤＮＡライブラリー又はヒトゲノムライブラリーからクローニングされるＤＮＡであって、前記（１）に記載のＤＮＡの少なくとも一部、又はその相補鎖の少なくとも一部からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（１５）  前記（１）、（２）、（４）、（６）、（７）、（９）、（１０）、（１２）又は前記（１４）に記載のＤＮＡのいずれかを発現する発現プラスミド、
（１６）  前記（１５）に記載の発現プラスミドによって形質転換された形質転換体、
（１７）  前記（１６）に記載の形質転換体を、前記（１５）に記載の発現プラスミドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組換えタンパク質の生産方法、
（１８）  前記（３）、（５）、（８）、（１１）又は（１３）に記載のいずれかのタンパク質の、少なくとも６アミノ酸以上の部分よりなるポリペプチド、
（１９）  中枢神経の伸長に対して促進的に作用する、前記（１８）に記載のポリペプチド、
（２０）  配列表の配列番号：６に記載のアミノ酸配列の第２０３位のアスパラギン酸、あるいは該アスパラギン酸の位置に相当するアミノ酸を含有することを特徴とする、前記（１８）に記載のポリペプチド、
（２１）  前記（１）、（４）、（６）、（７）又は（１４）に記載のいずれかのＤＮＡと相補的な配列を有する、８塩基以上からなるＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはそれらの化学的修飾体、
（２２）  前記（３）、（５）又は（８）に記載のいずれかのタンパク質の発現を抑制することを特徴とする、前記（２１）に記載のＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはそれらの化学的修飾体、
（２３）  前記（３）、（５）、（８）、（１１）、（１３）に記載のいずれかのタンパク質又は前記（１８）から（２０）に記載のいずれかのポリペプチドに対する抗体、
（２４）  前記（３）、（５）、（８）又は（１１）に記載のいずれかのタンパク質を用いることを特徴とする、セマフォリンＺ阻害物質のスクリーニング方法、
（２５）  前記（２４）に記載のスクリーニング方法を用いて得られるセマフォリンＺ阻害物質、
（２６）  前記（１３）に記載のタンパク質、前記（１９）又は（２０）に記載のポリペプチド、あるいは前記（２３）に記載の抗体からなる、前記（２５）に記載のセマフォリンＺ阻害物質、
（２７）  前記（２２）に記載のＤＮＡ又はＲＮＡあるいはそれらの化学的修飾体、前記（２５）又は（２６）に記載のセマフォリンＺ阻害物質の少なくとも一つを含有することを特徴とする、中枢神経の再生促進剤、
（２８）  前記（３）、（５）、（８）又は（１１）に記載のタンパク質の少なくとも一つを含有することを特徴とする、末梢神経の伸長抑制剤、並びに
（２９）  前記（１）、（４）、（６）、（７）、（９）、（１０）又は（１２）に記載のＤＮＡのいずれかを人為的に染色体中に挿入したか、あるいはいずれかをノックアウトさせたトランスジェニック動物、に関する。
発明の実施の形態
本発明の第１の態様は、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列からなるラットセマフォリンＺのｃＤＮＡあるいは配列番号：４に記載の塩基配列からなるヒトセマフォリンＺのｃＤＮＡである。これらＤＮＡは、例えば実施例１に記載したように、配列番号：７の配列を有するＤＮＡをプローブに用いて中枢神経系の組織由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。これらクローニングの個々の技術は、例えばMolecular Cloning 2nd Edt.（Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））等の基本書を参照することにより行うことができる。クローニングされたＤＮＡの塩基配列の決定も、市販のシークエンスキット等を用いる通常の方法により行うことができる。
なお、上述の如きクローニング法によらなくとも本発明のラット及びヒト型セマフォリンＺｃＤＮＡの塩基配列の公開に伴い、当業者ならば該ｃＤＮＡの一部をプローブあるいはプライマーに用いて、ラット及びヒト型セマフォリンＺの全長を容易にクローニングすることができる。
本発明の第２の態様は、配列表の配列番号：２に記載の塩基配列からなるラットセマフォリンＺのオープンリーディングフレーム、あるいは配列番号：５に記載の塩基配列からなるヒトセマフォリンＺのオープンリーディングフレームである。
本発明の第３の態様は、配列表の配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるラットセマフォリンＺタンパク質（以下、単にラットセマフォリンＺと略す）、あるいは配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるヒトセマフォリンＺタンパク質（以下、単にヒトセマフォリンＺと略す）である。
該セマフォリンＺはセマフォリンに特徴的な構造であるセマフォリンドメインを有するが、これは配列番号：３に記載のアミノ酸配列の第４９位から第５８０位までに、また配列番号：６に記載のアミノ酸配列の第４８位から第５７８位までに相当する。
また該セマフォリンＺはＮ末端にシグナル配列を有するが、これは配列番号：３に記載のアミノ酸配列の第１位から第２６位までに、また配列番号：６に記載のアミノ酸配列の第１位から第２５位までに相当すると予想される。該シグナル配列は膜に移行する際にプロセシングを受けて除去される。
次に該セマフォリンＺの調製法であるが、たとえばクローニングされたセマフォリンＺｃＤＮＡを、ｐＥＴ、ｐＣＤＭ８等の公知の発現ベクターに連結した後、適当な宿主に導入することにより発現・生産することができる。宿主としては、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれでもよく、例えば大腸菌株や動物細胞株は既に広く普及しており入手は可能である。例えば動物細胞宿主としては、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ細胞等が挙げられる。
発現プラスミドを用い適当な動物細胞宿主を形質転換するには、例えばDEAEデキストラン法（F.M.Ausubelらの編纂によるCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons（1987））等の公知の方法を用いればよい。実施例７にて確認したように、本発明のセマフォリンＺは細胞膜画分に局在しており、この細胞膜画分はそのまま種々のアッセイに使用され得る程度のセマフォリンＺを含んでいる。従って、この細胞膜画分を用いてセマフォリンＺの種々の活性測定を容易に行うことができる。
なお該細胞膜画分は、後述の実施例７に記載したようにセマフォリンＺ発現細胞をホモゲナイズした後、遠心によって分離、精製することにより容易に調製することができる。
またセマフォリンＺは、後述の本発明の第２３態様のセマフォリンＺ認識抗体を用いたアフィニティー精製、あるいは通常のカラムクロマトグラフィー等の方法により精製することができる。
本発明の第４の態様は、配列表の配列番号：７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、セマフォリンドメインを有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
ここで「配列表の配列番号：７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ」とは、セマフォリン間でよく保存された８アミノ酸からなる配列（Gln（またはArg）-Asp-Pro-Tyr（またはHis）-Cys-Ala（またはGly）-Trp-Asp）に近い配列（Gln-Asp-Pro-Tyr-Cys-Gly-Trp-Ala）を一部配列としてコードするＤＮＡ「T08532」の配列情報をもとにＰＣＲによりｃＤＮＡよりクローニングした断片であり、配列表の配列番号：１に記載されたラットセマフォリンＺの塩基配列の第1510位から第1685位に、また配列表の配列番号：４に記載されたヒトセマフォリンＺの塩基配列の第1524位から第1699位に相当するＤＮＡである。
また、ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」ＤＮＡとは、例えば実施例１に記載されているように、ホルムアミド濃度：45%（v/v）、塩濃度：5×SSPE、温度：42℃程度の条件下でハイブリダイズさせ、塩濃度：2×SSPE、温度：42℃程度の条件下で洗浄した場合において、配列番号：７のＤＮＡとハイブリダイズするようなＤＮＡを指す。
これらＤＮＡは、配列番号：７のＤＮＡとのハイブリダイゼーション等によりクローニングされるものであるが、具体的には、例えばTINS,15,319-323（1992）およびこの引用文献記載の方法によって行うことができ、さらに具体的には例えば以下の方法により行うことができる。
即ち、配列番号：７に記載の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、各種動物の組織から調製したｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより行うことができる。スクリーニング方法としては、例えば実施例１に示したような方法が挙げられる。また、ｃＤＮＡライブラリーとしては成人の中枢神経系の組織由来のｃＤＮＡライブラリーを用いることが好ましく、更に好ましくは海馬、線条体、小脳由来のｃＤＮＡライブラリーを用いる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば前述のように実施例１に示した条件、あるいはTINS,15,319-323（1992）およびこの引用文献等に記載されている条件が挙げられる。
また、本発明の第４態様のＤＮＡは「セマフォリンドメインを有するタンパク質をコードするＤＮＡ」でもある。ここで「セマフォリンドメイン」とは、例えばCell,75,1389-1399（1993）またはNeuron,14,941-948（1995）に記載された既知の10個のセマフォリン（G-Sema I,T-Sema I,D-Sema II,H-Sema III,C-Collapsin,Sem A,Sem B,Sem C,Sem D,Sem E）のいずれか１つのセマフォリンドメインを構成するアミノ酸と20％以上が一致する300-600のアミノ酸残基からなる配列で構成されるドメインをいう。特に好ましいものとしては、30％以上のアミノ酸が一致するセマフォリンドメインを有するものが挙げられる。ここで、アミノ酸の一致は、例えば日立ソフトウェアーエンジニアリング社製のＤＮＡＳＩＳ Ver.2.0を、ktup=1,cutoff=1の条件で比較することでなされる。さらに好ましくは、既知の10個のセマフォリンのセマフォリンドメインにおいて保存されている13個のシステイン（このシステインは例えばNeuron,14,941-948（1995）の942頁図１においてマークされているものが挙げられる）のうち、10個以上が保存されたものが挙げられ、特に12個以上が保存されたものが好ましい。
このような本発明の第４の態様のＤＮＡの具体例としては、配列表の配列番号：７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする未知のセマフォリン遺伝子、あるいは哺乳類、鳥類の全てのセマフォリンＺ遺伝子が挙げられる。哺乳動物間あるいは哺乳類と鳥類の間では相同な遺伝子なら配列は非常に似ており、通常７５％以上、多くは９０％以上の塩基配列が共通である。従って、該哺乳類、鳥類全てのセマフォリンＺ遺伝子は、本発明の第４態様のＤＮＡに該当する。
本発明の第５の態様は、本発明の第４態様のＤＮＡがコードするタンパク質である。すなわち、配列表の配列番号：７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、かつセマフォリンドメインを有するものである。これらタンパク質の発現及び精製は、本発明の第３態様のタンパク質と同様の手法により行うことができる。
なお、これら本発明の第４態様のＤＮＡ及び本発明の第５態様のタンパク質は、本発明の核心をなすセマフォリンＺの発見があって初めて見出されるものである。そしてセマフォリンＺの発見さえあれば、後は上述の如き従来法により容易に本発明の第４態様のＤＮＡをクローニングし、本発明の第５態様のタンパク質を発現できる状況にある。従って、セマフォリンＺの発見に付随して見出される本発明の第４態様のＤＮＡ及び第５態様のタンパク質もまた、本発明の本質を保持するものとして本発明の範疇に含まれる。
本発明の第６の態様は、本発明の第１態様のＤＮＡ（ラット及びヒト型セマフォリンＺＤＮＡ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質をコードするＤＮＡである。
該ＤＮＡは、配列表の配列番号：１又は配列番号：４に記載のＤＮＡにハイブリダイズするものであるが、具体的には、たとえば配列番号：１又は配列番号：４に記載のＤＮＡの一部又は全部をプローブに用いて各種動物の組織から調製したｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによりクローニングすることができる。具体的なスクリーニング方法等は、本発明の第４態様のＤＮＡと同様にして行うことができる。また、「ストリンジェントな条件」も、本発明の第４態様のＤＮＡと同様の条件を使用することができる。
「神経の伸長に対して抑制的に作用する」とは、例えば実施例８にて確認されたような神経の成長円錐に対する退縮活性を有すること、あるいは神経の伸長阻害活性を有することを指す。該作用は、例えば本発明の第３態様のタンパク質と同様の手法により該ＤＮＡを発現させた発現産物を用い、例えば以下のようにして測定することができる。
実施例７にて確認されたようにセマフォリンＺは膜タンパク質であるため、セマフォリンＺ遺伝子で形質転換された細胞の細胞膜画分を材料に使うことでセマフォリンＺの活性を容易に測定することができる（実施例８参照）。
セマフォリンＺの活性は種々の方法で測定が可能であるが、代表的な方法としては、神経の成長円錐に対する退縮活性（M.Igarashi et al,Science,vol.259,pp77-79（1993））、あるいは神経の伸長阻止活性（J.A.Davies et.al.,Neuron,vol.2,pp11-20（1990）やM.Bastmeyer,J.Neurosci.,vol.11,pp626-640（1991）など）などがある。成長円錐退縮活性の測定方法は文献（M.Igarashi et al,Science,vol.259,pp77-79（1993））に詳しく述べられているが、簡単には、セマフォリンＺを発現する細胞をホモゲナイズし、細胞膜の画分を含むホモジェネートを用いる方法、あるいは精製した膜画分を用いる方法（E.C.Cox et.al.,Neuron,vol.2,pp31-37（1990））、あるいは膜画分から抽出した蛋白質をリポソームに再構成したものを材料にする方法（C.E.Bandtlow,Science,vol.259,pp80-84（1993））などが可能である。これらを材料にして実際に成長円錐の退縮活性を測定するには、ラミニンやコラーゲン、ポリリジン、ポリオルニチンといったような神経突起の伸長と成長円錐の形成を促進する物質をコーティングした容器の中で通常の条件で培養した神経細胞（Bankerらの編纂によるCulturing,Nerve Cells,MIT Press（1991）など）に対し、先に述べたような形状のセマフォリンＺ蛋白質を添加することによって行う。添加後、成長円錐の退縮が起こるのに充分な時間（通常添加後３０分から１時間）が経過した時点でこの神経細胞を1％グルタルアルデヒドなどで固定し、顕微鏡下で退縮を起こした成長円錐の数を計数する。このときセマフォリンＺを発現していない細胞を出発材料にしてセマフォリンＺ発現細胞を用いたときと全く同様にして調整した試料を対照として観察することが重要である。通常、試料の平均化は試料内に含まれる総蛋白量によって行う。一方、突起伸長阻害活性を測定するには上記と同様にして調整したセマフォリンＺをマイクロポアフィルターやガラスやプラスティック製の培養容器の表面の一部分にコーティングし、通常の条件で培養した神経細胞が、このコーティング面上では接着できないこと、突起の伸長速度が非常に低下すること、あるいはコーティング面の外からコーティング面に向かって伸長する神経突起がコーティング面との境界に達しても、停止したり、回避したりしてその面内に侵入できないことなどを指標とする。コラーゲンゲル中でセマフォリンＺを発現する細胞の塊と神経細胞とを同時に培養した場合には、伸長する神経突起がセマフォリンＺ発現細胞の塊の中に侵入できないことも指標とできる（A.Sophia et.al.,Cell,vol.81,pp621-629（1995））。
このような本発明の第６態様のＤＮＡの具体例としては、本発明の第７態様のＤＮＡと同様、ほ乳類・鳥類全てのセマフォリンＺ遺伝子等が挙げられる。
本発明の第７の態様は、本発明の第６態様のＤＮＡのうち中枢神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質をコードするものである。
ここで「中枢神経の伸長に対する抑制的な作用」とは、本発明のセマフォリンＺの有する作用であり、該作用は中枢神経をアッセイ用細胞に用いて本発明の第６態様に記載の測定系に供することにより測定することができる。
なお「従来の技術」の項で述べたように、哺乳類の成体の中枢神経系には元々再生（伸長）阻止因子が大量に存在しているため、in vivoで中枢神経の伸長に対する抑制作用を測定することは非常に困難であり、通常、本発明の第６態様の項に記載の如きin vitroの方法を用いて測定を行う。これらはin vitroの方法であるため各々に特徴があり、従って複数の方法を用いて活性を確認することが好ましい。また、該作用の測定に用いる神経細胞は脊髄や大脳皮質運動野の運動神経などの中枢神経が好ましいが、中枢神経再生阻止因子として知られているNI35/250が末梢神経である上頸神経節や後根神経節の神経細胞に対しても突起伸長阻止や成長円錐退縮などの活性を有することが判明しているため（J.Cell Biol.,106,1281-1288（1988）、Science,259,80-83（1993））、該末梢神経を用いることができる。
本発明の第８の態様は、本発明の第６又は第７態様のＤＮＡがコードするタンパク質である。すなわち、本発明の第１態様のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、かつ神経の伸長に対して抑制的に作用するか、さらには中枢神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質である。これらタンパク質の発現及び精製は、本発明の第３態様のタンパク質と同様の手法により行うことができ、また具体的な活性の測定法は、本発明の第６及び第７態様の項に記載した方法で行うことができる。
なお、これら本発明の第６及び第７態様のＤＮＡ及び本発明の第８態様のタンパク質も、本発明の核心をなすセマフォリンＺの発見があって初めて見出されるものである。そしてセマフォリンＺの発見さえあれば、後は上述の如き従来法により容易に本発明の第６及び第７態様のＤＮＡをクローニング、発現させ、上述の如き活性測定系に供することにより、該作用を有する本発明の第８態様のタンパク質を選び出すことができる。従って、セマフォリンＺの発見に付随して容易に見出される本発明の第６及び第７態様のＤＮＡ及び第８態様のタンパク質もまた、本発明の本質を保持するものとして、本発明の範疇に含まれる。
本発明の第９の態様は、本発明の第３態様のラット及びヒト型セマフォリンＺにおいて１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されている、神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質をコードするＤＮＡである。また、本発明の第１０の態様は、本発明の第９態様のＤＮＡのうち、中枢神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質をコードするものである。
ここで、「１もしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換」は、例えば部位特異的突然変異誘発（Methods in Enzymology,100,448-（1983））やＰＣＲ法（Molecular Cloning 2nd Edt.15章,Cold Harbor Laboratory Press（1989）、“PCR A Practical Approach”IRL Press 200-210（1991））により、当業者ならば容易に行うことができる。また神経の伸長に対する抑制的な作用は、本発明の第６及び第７態様に記載の方法により測定することができる。
既知のセマフォリンの構造を比較すると、保存されたアミノ酸は大部分セマフォリンドメイン内に位置し、セマフォリンの活性発現にはこれら保存されたアミノ酸が重要であると考えられる。さらに、本発明者らがSema IIIのセマフォリンドメイン内の第１９８位のアスパラギン酸がグリシンに置換されたタンパク質の成長円錐退縮活性を測定したところ、該タンパク質は活性を有していなかった（後述の参考例１参照）。従ってSema IIIにおいては、第１９８位のアスパラギン酸が活性発現に重要であると考えられる。既知のセマフォリンにおけるこの位置に相当するアミノ酸は非常に良く保存されており、一部のセマフォリンにおいてグルタミン酸である以外は全てアスパラギン酸である。従って、Sema III以外のセマフォリンにおいても、この位置のアミノ酸が活性発現に重要であると考えられる。本発明のセマフォリンＺにおいてSema IIIの第１９８位に相当するアミノ酸は、配列表の配列番号：３に記載のラットセマフォリンＺのアミノ酸配列中第２０４位のアスパラギン酸であると予想され、また配列番号：６に記載のヒトセマフォリンＺのアミノ酸配列中、第２０３位のアスパラギン酸であると予想される。
以上の知見より、セマフォリンＺの有する活性を、その改変タンパク質（本発明の第９及び第１０態様のＤＮＡがコードするタンパク質）においても残存させるためには、上記アミノ酸の挿入、欠失もしくは置換は、セマフォリン間で保存されたアミノ酸以外の部分で行うことが望ましい。特に、配列番号：３のラットセマフォリンＺの第２０４位のアスパラギン酸、あるいはヒトセマフォリンＺの第２０３位のアスパラギン酸は改変しないことが望ましい。一方セマフォリン間で保存されたアミノ酸を置換しかつセマフォリンＺの活性を残存させる場合は、類似の側鎖を有するアミノ酸に置換することが望ましい。このように保存されたアミノ酸を類似の側鎖を有するアミノ酸に置換することによって、セマフォリンＺの有する活性をさらに増強させた改変タンパク質を作製することが可能である。このような活性の増強した改変タンパク質は、後述の本発明の第２８態様の項に記載の如き末梢神経の伸長抑制剤として非常に好適である。
なお、本態様において「保存されたアミノ酸」とは、Cell,75,1389-1399（1993）の図２、もしくはNeuron,14,941-948（1995）の図１において、50%以上のセマフォリン遺伝子においてアミノ酸が同一となるような位置に存在するアミノ酸を言う。
本発明の第１１の態様は、本発明の第９又は第１０態様のＤＮＡがコードするタンパク質である。すなわち、本発明の第３態様のタンパク質において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換された、いわゆる”改変タンパク質”であり、かつ神経の伸長に対して抑制的に作用するか、さらには中枢神経の伸長に対して抑制的に作用するタンパク質である。これらタンパク質の発現及び精製は、本発明の第３態様のタンパク質と同様の手法により行うことができ、また活性の測定は、本発明の第６及び第７態様の項に記載した方法で行うことができる。
なお、これら本発明の第９及び第１０態様のＤＮＡ及び本発明の第１１態様のタンパク質も、本発明の核心をなすセマフォリンＺの発見があって初めて見出されるものである。そしてセマフォリンＺの発見さえあれば、後は上述の如き従来法により適宜アミノ酸の挿入、欠失あるいは置換を施したタンパク質を調製し、上述の如き活性測定系に供することにより本発明の第１１態様のタンパク質を選び出すことができる。従ってセマフォリンＺの発見に付随して容易に見出されるものである本発明の第９及び第１０態様のＤＮＡ及び第１１態様のタンパク質もまた、本発明の本質を保持するものとして、本発明の範疇に含まれる。
本発明の第１２の態様は、本発明の第３態様のラット又はヒトセマフォリンにおいて１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されている、中枢神経の伸長に対して促進的に作用するタンパク質をコードするＤＮＡである。
これらＤＮＡにおける挿入、欠失及び置換は、本発明の第９態様のＤＮＡと同様の手法により行うことができる。また中枢神経の伸長に対する促進的な作用は、例えば本発明の第６及び第７態様の項に記載の活性測定系に被験物質（すなわち候補となるセマフォリンＺ改変タンパク質）を添加することにより容易に測定することができる。詳しくは本発明の第２４態様の項を参照されたい。
これらタンパク質の具体例として、セマフォリンＺの有する中枢神経の伸長抑制作用を消失させた改変タンパク質が考えられる。活性を有さない改変タンパク質がセマフォリンＺの受容体、あるいはセマフォリンＺそのものに結合することなどによってセマフォリンＺの受容体への結合を阻害することにより、上述の中枢神経の伸長促進作用を発揮すると考えられる。本発明の第９態様の項に記載したように、セマフォリンの活性部位はセマフォリンドメイン内に、そしてラットセマフォリンＺにおいては第２０４位のアスパラギン酸に、またヒトセマフォリンＺにおいては第２０３位のアスパラギン酸に、おそらく存在しているものと示唆されている。従って、セマフォリンＺ活性を、その改変タンパク質において消失させるためには、上記アミノ酸の挿入、欠失もしくは置換は、該セマフォリンドメイン内の保存されたアミノ酸に対して、好ましくはラットセマフォリンＺの第２０４位のアスパラギン酸に対して、またヒトセマフォリンＺの第２０３位のアスパラギン酸に対して行うのが望ましい。その際、もとのアミノ酸と異なった性質の側鎖を有するアミノ酸への置換が望ましい。
以上のように本発明の第１２態様のＤＮＡがコードするタンパク質は、中枢神経の伸長に対して促進的に作用するものであるため、後述の本発明の第２７態様の項に記載の如き中枢神経の再生促進剤となるものである。
本発明の第１３の態様は、本発明の第１２態様のＤＮＡがコードするタンパク質である。すなわち、本発明の第３態様のタンパク質において１もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ中枢神経の伸長に対して促進的に作用するタンパク質である。これらタンパク質の発現及び精製は、本発明の第３態様のタンパク質と同様の手法により行うことができ、また中枢神経の伸長促進作用の測定は、本発明の第１２態様の項に記載した方法で行うことができる。
なお、これら本発明の第１２態様のＤＮＡ及び本発明の第１３態様のタンパク質も、本発明の核心をなすセマフォリンＺの発見があって初めて見出されるものである。そしてセマフォリンＺの発見さえあれば、後は上述の如き従来法により挿入、欠失あるいは置換を施した改変タンパク質を適宜調製し、上述の如き中枢神経の伸長促進作用の測定系（スクリーニング系）に供することにより、該活性を有する改変タンパク質を容易に選び出すことができる。従ってセマフォリンＺの発見に付随して容易に見出されるものである本発明の第１２態様のＤＮＡ及び第１３態様のタンパク質もまた、本発明の本質を保持するものとして、本発明の範疇に含まれる。
本発明の第１４の態様は、ヒトｃＤＮＡライブラリー又はヒトゲノムライブラリーからクローニングされるＤＮＡであって、本発明の第１態様のラット又はヒトセマフォリンＺＤＮＡの少なくとも一部、又はその相補鎖の少なくとも一部からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである。
クローニングの方法は、例えばMolecular Cloning 2nd Edt.Cold Harbor Laboratory Press（1989）等に詳しく述べられており、具体的には、ハイブリダイゼーションを用いる方法、ＰＣＲを用いる方法等が挙げられる。ライブラリーとしては、ここではヒト由来のゲノム性ライブラリーを用いることが好ましく、成人の中枢神経由来のｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。ハイブリダイゼーションを用いる方法の場合は、例えばTINS,15,319-323（1992）及びこの引用文献等に従い行うことができる。またＰＣＲ法を用いる場合は、McPhersonらの編纂によるPCR（1991）IRL Press等に従い行うことができる。
クローニングされるＤＮＡはヒトセマフォリンＺの遺伝子であるが、その全長のＤＮＡに限らず、そのうちの200塩基以上からなる断片ＤＮＡも含む。本発明の第１４態様のＤＮＡの具体例としては、アミノ酸をコードする領域は言うに及ばず、5’、3’転写調節領域、エキソンのノンコーディング配列、イントロンなどを含む染色体ＤＮＡも挙げられる。これらアミノ酸をコードしない配列も、後述のアンチセンス技術を用いて薬剤を開発する場合などに非常に有用である。
なお、これら本発明の第１４態様のＤＮＡもまた、本発明のセマフォリンＺの発見に付随して容易に見出されるものであるため本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。
本発明の第１５の態様は、本発明の第１、第２、第４、第６、第７、第９、第１０、第１２又は第１４態様のＤＮＡのいずれかを発現する発現プラスミドである。また、本発明の第１６の態様は、該発現プラスミドによって形質転換された形質転換体である。また本発明の第１７の態様は、該形質転換体を、該発現プラスミドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする組換タンパク質の生産方法である。これら発現プラスミド及び形質転換体の作製方法、あるいは組換タンパク質の生産方法は、本発明の第３の態様の項に記載したように、全て当業者にとって周知の方法である。
本発明の第１８の態様は、本発明の第３、第５、第８、第１１又は第１３態様のいずれかのタンパク質の、少なくとも６アミノ酸以上の部分よりなるポリペプチドである。ここで、「少なくとも６アミノ酸以上」との限定は、安定な構造をとり得る最小のサイズが６アミノ酸であることによるが、１０〜２０個程度のアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。１０〜２０個程度の短いものであればペプチド合成装置により合成することができるし、長いものであれば通常の遺伝子工学的手法により調製されたＤＮＡを、前述の動物細胞等により発現させることにより得ることができる。なお、このようにして作製されたポリペプチドを、通常の方法により修飾することも可能である。
これらポリペプチドは、後述の第１９、第２０態様の項に記載の医薬への応用が可能である他、抗体作製のためにも使用することができる。
本発明の第１９の態様は、本発明の第１８態様のポリペプチドのうち、（中枢神経の伸長に対して促進的に作用するものである。該ポリペプチドの作製は上記本発明の第１８態様の項に記載の方法で行うことができる。また中枢神経の伸長に対する促進的な作用は、本発明の第１２態様の項に記載の如く、本発明の第６及び第７態様の項に記載の活性測定系に被験物質（すなわち候補となるセマフォリンＺのポリペプチド）を添加することにより容易に測定することができる。詳しくは本発明の第２４態様の項を参照されたい。
これらポリペプチドの具体例として、セマフォリンＺの有する中枢神経の伸長抑制作用を消失させたポリペプチドが考えられる。活性を有さないポリペプチドがセマフォリンＺの受容体、あるいはセマフォリンＺそのものに結合することによってセマフォリンＺの受容体への結合を阻害することにより、中枢神経の伸長促進作用を発揮すると考えられる。このようなポリペプチドは、後述の本発明の第２７態様の項に記載のように、中枢神経の再生促進剤となることができる。
本発明の第２０の態様は、本発明の第１８態様のポリペプチドのうち、配列表の配列番号：６に記載のアミノ酸配列の第２０３位のアスパラギン酸、あるいは該アスパラギン酸の位置に相当するアミノ酸を含有することを特徴とするポリペプチドである。該ポリペプチドは、本発明の第１８態様の項に記載の方法で作製することができる。
本発明の第９態様の項に記載したように、配列番号：６に記載のヒトセマフォリンＺのアミノ酸配列の第２０３位のアスパラギン酸（ラットでは２０４位のアスパラギン酸）は、セマフォリンＺの活性発現に重要であると考えられるアミノ酸である。従ってこのアミノ酸は、セマフォリンＺとセマフォリンＺ受容体との結合に関与している可能性があり、それゆえ該アミノ酸を含有する本発明の第２０態様のポリペプチドがセマフォリンＺの受容体、あるいはセマフォリンＺそのものに結合することによってセマフォリンＺの受容体への結合を阻害することにより、セマフォリンＺの有する中枢神経の伸長抑制作用を阻害する（すなわち中枢神経の伸長を促進する）ことが可能である。このような作用を有するポリペプチドは、後述の本発明の第２７態様の項に記載のように中枢神経の再生促進剤となることができる。なお該中枢神経の伸長促進活性は、本発明の第１２態様の項に記載の如く、本発明の第６及び第７態様の項に記載の活性測定系に被験物質（すなわち候補となるセマフォリンＺのポリペプチド）を添加することにより容易に選び出すことができる。詳しくは本発明の第２４態様の項を参照されたい。
本態様中「該アスパラギン酸の位置に相当するアミノ酸」とは、本発明の第５、第８、第１１又は第１３態様のタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６に記載のアミノ酸配列と最も一致するように並べた場合、ヒトセマフォリンＺの第２０３位に相当する位置にあるアミノ酸を指す。従って、「該アスパラギン酸の位置に相当するアミノ酸を含有することを特徴とするポリペプチド」とは、このヒトの第２０３位に相当する位置にあるアミノ酸を有し、かつその前後のアミノ酸からなるポリペプチドを指す。
本発明の第２１の態様は、本発明の第１、第４、第６、第７又は第１４態様のいずれかのＤＮＡと相補的な配列を有する、８塩基以上からなるＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはそれらの化学的修飾体である。
ここで、「・・・相補的な配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ」（以下、該ＤＮＡ又はＲＮＡを「アンチセンスヌクレオチド」と称す）とは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、もしくは、アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡなどと呼ばれるものを指し、合成機を用いて人工的に合成したり、後述の実施例９に記載したように通常と逆の向き（すなわちアンチセンスの向き）に遺伝子を発現させることなどによって得ることができる。詳しくは、本発明の第２７態様の項を参照されたい。
これらアンチセンスヌクレオチドは、後述の第２２態様の項に記載したようなセマフォリンＺの発現を抑制する目的で使用される他、in situハイブリダイゼーション等の研究用試薬としても有用である。また、本態様において「化学的修飾体」とは、具体的にはアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内への移行性または細胞内での安定性を高めることができる化学的修飾体を表し、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデート等の誘導体（”Antisense RNA and DNA”WILEY-LISS刊1992 P.1-50、J.Med.Chem.,36,1923-1937（1993））が挙げられる。この化学的修飾体は、同文献等に従って調製することができる。
本発明の第２２の態様は、本発明の第３、第５又は第８態様のいずれかのタンパク質の発現を抑制することを特徴とする、本発明の第２１態様のＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはこれらの化学的修飾体である。
通常の遺伝子の転写によって生産されるmRNAはセンス鎖であるが、アンチセンスヌクレオチドであるアンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはこれらの化学的修飾体は、細胞内でセンス鎖mRNAに結合し、該遺伝子の発現を抑制することができる。従って、該アンチセンスヌクレオチド、あるいはその化学的修飾体は、本発明の第３態様のセマフォリンＺ等の発現を抑制することができ、該発現を抑制することによりセマフォリンＺの有する活性を抑制することができる。このような効果を有するアンチセンスヌクレオチド、あるいはその化学的修飾体は、後述の本発明の第２７態様の項に記載の如く、中枢神経の再生促進剤となる。
作製したアンチセンスヌクレオチド、あるいはこれらの化学的修飾体が目的の抑制効果を有しているか否かは、セマフォリンＺを発現する細胞に外からアンチセンスオリゴヌクレオチドそのものを直接導入するか、或いは後述の実施例１１に記載のように、転写によって該アンチセンスＲＮＡを生成する遺伝子を導入し、該セマフォリンＺの発現量が減少するか否かを指標にして容易に見い出すことができる。
この抑制効果を有するアンチセンスヌクレオチドとしては、上記各態様のセマフォリンｃＤＮＡのコーディング部分、5’、3’ノンコーディング部分のいずれの部分に相補的な配列であってもよいが、好ましくは転写開始部位、翻訳開始部位、５’非翻訳領域、エクソンとイントロンとの境界領域もしくは5’CAP領域に相補的配列であることが望ましい。なお実施例１１に記載の如く、本発明のセマフォリンＺのアンチセンスＲＮＡは該セマフォリンＺの発現を抑制することが確認されている為、後述の本発明の第２７態様の中枢神経再生促進剤となり得るものである。
本発明の第２３の態様は、本発明の第３、第５、第８、第１１、第１３態様のいずれかのタンパク質又は本発明の第１８から第２０態様のいずれかのポリペプチドに対する抗体である。該抗体は、請求項１７に述べた組換型セマフォリンＺ蛋白や請求項１８に述べるペプチドを、例えばカレント  プロトコルズ  インイムノロジー2.4.1-2.6.6頁（1992刊、ジェー・イー・コリガン編集）に記載された方法を用いてマウスやウサギを免疫することにより、容易に作製することができる。また前記参考書に述べられている手法を用いることで、容易にモノクローナル抗体を作製することも可能である。該抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、医薬・診断薬・実験用試薬等が挙げられる。該抗体のなかにはセマフォリンＺに対する中和活性を有するものが存する。これら中和抗体は、本発明の第１２態様の項に記載の如く、本発明の第６及び第７態様の項に記載の活性測定系に被験物質（すなわち候補となるセマフォリンＺの抗体）を添加することにより容易に選び出すことができる。そして、該中和抗体は、本発明の第２７態様の項に記載の如く中枢神経の再生促進剤となることができる。
なお、上述の如き本発明の第１８〜第２０態様のポリペプチド、本発明の第２１又は第２２態様のＤＮＡ又はＲＮＡあるいはその化学的修飾体、本発明の第２３態様の抗体はいずれも、本発明のセマフォリンＺの発見さえあれば当業者にとっては容易に作製することが可能であり、かつこれらの物質が中枢神経の伸長促進作用等の特定の機能を有するか否かについても上述の如く、当業者であれば容易に確認できる技術状況であるため、これらの物質は全て本発明の範疇に含まれるものである。
本発明の第２４の態様は、本発明の第３、第５、第８又は第１１態様のいずれかのタンパク質を用いることを特徴とする、セマフォリンＺ阻害物質のスクリーニング方法である。ここで、「セマフォリンＺ阻害物質」とは、例えばセマフォリンＺの有する中枢神経の伸長抑制作用を阻害する物質を指す。
該スクリーニングは、本発明の第６及び第７態様の項に述べたセマフォリンＺ活性測定系に被験物を添加することによって行う。即ち、セマフォリンＺ活性測定実験において培養の期間を通して或いはその一時期だけ被験物を培養液に添加することによってセマフォリンＺの活性が阻害されることを指標とする。また、同濃度の被験物単独では神経細胞の生存、突起伸長などに対して影響しないことを確認することも重要である。この両者が満たされた場合、この被験物をセマフォリンＺ阻害物質と認定することができる。被験物はあらかじめ水溶液であることが好ましいが、ＤＭＳＯなどの有機溶媒を溶媒として用いることもできる。いずれの場合も神経細胞に対する溶媒の影響を除くために、加える体積は最小限にすることが大切であり、具体的には培養液に対して等量以下、好ましくは1/10以下、更に好ましくは1/100以下になるようにする。このようにして得られたセマフォリンＺ阻害物質は、後述の本発明の第２７態様の項に記載したように、中枢神経の再生促進剤として用いることができる。
本発明の第２５の態様は、本発明の第２４態様のスクリーニング方法を用いて得られるセマフォリンＺ阻害物質である。該阻害物質は、セマフォリンＺの活性を阻害する物質であればその構造・形状等は問わない。
本発明の第２６の態様は、本発明の第１３態様のタンパク質、第１９又は第２０態様のポリペプチド、あるいは第２３態様の抗体からなる、第２５態様のセマフォリンＺ阻害物質である。すなわち、本発明の第１３態様のタンパク質、第１９又は第２０態様のポリペプチド、第２３態様の抗体のうち、セマフォリンＺの有する活性を阻害する効果を有するものである。これら阻害物質は、本発明の第２４態様のスクリーニングに供することにより、容易に選び出すことができるものであり、選び出された該阻害物質は、後述の本発明の第２７態様に記載の如き中枢神経の再生促進剤として用いることができる。
本発明の第２７の態様は、本発明の第２２態様のＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはそれらの化学的修飾体、第２５又は第２６態様のセマフォリンＺ阻害物質の少なくとも一つを含有することを特徴とする、中枢神経の再生促進剤である。本態様は「中枢神経の再生促進」という用途に係わるものであるため、以下、具体的な用法・容量等につき説明する。
１）アンチセンスヌクレオチド又はその化学的修飾体
本発明の第２２態様の項に記載したように、本発明の第２２態様のアンチセンスヌクレオチドまたはその化学的修飾体を用いてセマフォリンＺ遺伝子の発現を抑制することができるため、セマフォリンタンパク質の存在量を減らし、中枢神経の再生を促進することができると思われる。治療方法としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体をそのまま投与する方法、およびアンチセンスＲＮＡを細胞内で生産する方法がある。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体をそのまま投与する方法において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドの好ましい長さとしては、例えば８−２００塩基のものが挙げられ、さらに好ましくは８−２５塩基が挙げられ、特に好ましくは１２−２５塩基のものが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を安定化材、緩衝液、溶媒などと混合して製剤化した後、投与時には抗生物質、抗炎症剤、麻酔薬などと同時に用いることもできる。こうして調製された製剤は様々な方法で投与可能であるが、好ましくは神経の障害の著しい部位に局所的に投与される。神経の再生は通常数日から数カ月を要するものであり、その間、投与は連日または数日から数週間おきになされる。また、この様な頻回の投与を避けるために徐放性のミニペレット製剤を調製し患部近くに埋め込むことも可能である。あるいはオスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与することも可能である。通常投与量は作用部位における濃度が0.1nM-10μMになるように調製する。
一方、アンチセンスＲＮＡを細胞内で生産する方法において、このアンチセンスＲＮＡの好ましい長さとしては、例えば１００塩基以上が挙げられ、好ましくは３００塩基以上が挙げられ、さらに好ましくは５００塩基以上が挙げられる。
アンチセンスＲＮＡを産生する遺伝子の患者への導入方法としては直接生体内の細胞に遺伝子を導入するin vivo法、及び体外である種の細胞に遺伝子を導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法がある（日経サイエンス，1994年4月号、20-45頁、月刊薬事、36（1）、23-48（1994）、実験医学増刊、12（15）、（1994）、およびこれらの引用文献等）が、in vivo法がより好ましい。
in vivo法としては、組換えウイルスを用いる方法及びその他の方法（日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁、月刊薬事、36（1）、23-48（1994）、実験医学増刊、12（15）、全頁（1994）、及びこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
組換えウイルスを用いる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のウイルスゲノムにセマフォリン遺伝子を組み込んで生体内に導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、リポソーム法、リポフェクチン法等が挙げられ、特にリポソーム法が好ましい。
ex vivo法としては上記方法以外にマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等も用いることができる。
患者への投与方法は、治療目的の疾患、症状などに応じた適当な投与経路により投与される。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与するか、または神経などの疾患の対象部位に直接投与することができる。例えば、脊髄に感染させると脊髄で特異的にセマフォリン遺伝子の発現が抑制される。通常、本願のアンチセンスＲＮＡの発現は数日から数カ月持続し、この１回の感染で神経の再生が十分に起こる。発現が弱いときは、再感染することもできる。in vivo方法により投与される場合は、製剤形態（例えば、液剤など）をとりうるが、一般的には有効成分であるセマフォリン遺伝子を含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体等を加えても良い。また、セマフォリン遺伝子を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（HVJ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中のセマフォリン遺伝子の含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、通常セマフォリン遺伝子として、0.0001-100mg、好ましくは0.001-10mgであり、これを数日ないし数カ月に1回投与するのが好ましい。
２）セマフォリンＺの改変タンパク質
本発明の第１２及び第１３態様の項に記載したように、セマフォリンＺの有する中枢神経伸長抑制作用を消失させた改変タンパク質を作製することができ、該改変タンパク質を生体内に投与することにより、該セマフォリンＺ改変タンパク質がセマフォリンＺの受容体、あるいは該セマフォリンＺそのものに結合し、その結果、セマフォリンＺの活性が抑制され、中枢神経の再生が促進されることが考えられる。
治療においては該セマフォリンＺの改変タンパク質を安定化剤、緩衝液、希釈液と共に製剤化して患者に投与する。投与は様々な方法で可能であるが、好ましくは病巣部位に局所的に投与する。神経の再生には通常数日から数カ月を要するので、その間セマフォリンＺの活性を抑制するために１回もしくは２回以上投与する。２回以上投与するときは連日あるいは適当な間隔をおいて繰り返し投与することが望ましい。注射によって中枢神経系、例えば脊髄内に投与するときは、一回当たり数百μgから２g、好ましくは数十mg以下を用いる。投与回数を減らすために徐放性製剤を利用したり、オスモティックポンプなどで長期間に渡って少量ずつ投与する方法も可能である。あるいは該セマフォリンＺ改変タンパク質を発現する細胞を生体内に移植することによっても可能である。
３）セマフォリンＺのポリペプチド
本発明の第１９又は第２０態様のペプチドは、セマフォリンＺの受容体への結合を阻害することによって、セマフォリンＺの有する中枢神経の伸長抑制作用を抑制し、その結果、中枢神経の再生を促進することができる。このような効果を有するポリペプチドとして、例えば本発明の第２０態様の項に記載したように、配列番号：６のヒトセマフォリンＺの第２０３位のアスパラギン酸、或いは該アスパラギン酸に該当するアミノ酸を含有することを特徴とするポリペプチドが挙げられる。なお阻害の様式は、競争阻害、非競争阻害、不競合阻害、アロステリック阻害のいずれの様式であるかを問わない。
これらポリペプチドの製剤化、投与法、投与量については上記「２）セマフォリンＺの改変タンパク質」の項を参照されたい。
４）セマフォリンＺの抗体
セマフォリンＺの活性を中和する中和抗体を生体内に投与することにより、セマフォリンＺの活性が阻害され、中枢神経の再生が促進されることが考えられる。
該中和抗体の製剤化、投与法、投与量については上記「２）セマフォリンＺの改変タンパク質」の項に記載の通りであるが、別の方法として、Nature,343,269-272（1990）に記載されているように、モノクローナル抗体を産生する細胞を直接中枢神経系に移植する方法なども可能である。
なお、上記本発明の第２４態様のスクリーニング法は、中枢神経の伸長に対して抑制的に作用する本発明の代表的なタンパク質、セマフォリンＺの発見に伴って初めて可能になったことである。そしてセマフォリンＺの発見さえあれば、後は、上述の如き手法により容易にスクリーニングが実施できる状況にある。またスクリーニングの実施により、セマフォリンＺの有する中枢神経伸長抑制作用を阻害する本発明の第２５又は第２６態様のセマフォリンＺ阻害物質を容易に選別することができる。そして該阻害物質、あるいは前述の如きセマフォリンＺの発現を制御するアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ又はその化学的修飾体を医薬成分として製剤化を行うことにより、本発明の第２７態様の中枢神経の再生促進剤を調製することができる。従ってこれらは全てセマフォリンＺの発見に付随して見出されるものであり、従って本発明の範疇に含まれる。
本発明の第２８の態様は、本発明の第３、第５、第８又は第１１態様のタンパク質の少なくとも一つを含有することを特徴とする、末梢神経の伸長抑制剤である。これら各態様のタンパク質は、中枢神経の伸長に対して抑制的に作用するものであるが、同時に末梢神経にもセマフォリンＺに対する受容体が発現している可能性があること、また、他のセマフォリンに対する受容体がセマフォリンＺに対しても反応する可能性があることなどから、末梢神経に対してもその伸長を抑制することが予想される。従って末梢神経の伸長を抑制することにより、アトピー性皮膚炎などの免疫疾患、あるいは疼痛等の治療薬となることが考えられる。
これらタンパク質の製剤化、投与法、投与量については上記「２）セマフォリンＺの改変タンパク質」の項を参照されたい。
本発明の第２９の態様は、本発明の第１、第４、第６、第７、第９、第１０又は第１２態様のＤＮＡのいずれかを人為的に染色体中に挿入したか、あるいはいずれかをノックアウトさせたトランスジェニック動物である。
本発明のセマフォリンＺの遺伝子情報を持ってすれば、以下の文献（ビー＝ホーガンらの編纂によるマニピュレーションオブマウスエンブリオ、1986年、コールドスプリングハーバーラボラトリー、相澤慎一著、ジーンターゲッティング、1995年、羊土社、など）で明らかなように、現在の技術レベルでは当該領域の研究者にとって本発明の第１、第４、第６、第７、第９、第１０又は第１２態様の遺伝子を染色体中に挿入したトランスジェニック動物を作製することはいとも簡単であり、こうして得られるトランスジェニック動物も当然のこととして本発明に含まれるものである。このようにして得られたトランスジェニック動物は、例えば医薬品開発のためのモデル動物として、あるいは医薬品のスクリーニング用の動物として非常に有用である。さらに、本発明の第１、第６、第７態様の遺伝子を染色体レベルで欠失したいわゆるノックアウト動物は当該遺伝子を有しないのが特徴であるが、文献に述べられているようにあるいは当該領域の研究者の常識として、本発明のセマフォリンＺの遺伝子情報を利用して初めて作成が可能なものであり、従って本発明に含まれることは言うまでもない。
なお、上に述べたようにセマフォリンＺは中枢神経の伸長抑制に関する生体内の重要な機能を担っているが、一方で、セマフォリン遺伝子はそれ以外の免疫抑制作用などの未知の機能を有している可能性も指摘されており（Cell,75,1389-1399（1993））、該セマフォリンＺの遺伝子発現、蛋白の分布、機能などを調べることは当該領域の研究にとって、あるいは神経疾患などの患者の診断にとって非常に重要であり、本発明はかかる目的のために利用可能な遺伝子プローブ、抗体、組換タンパク質、トランスジェニック動物なども提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１：成体ラット組織におけるセマフォリンＺの発現分布を示すノーザン解析の結果の電気泳動写真。
成体ラットの種々の組織からRNAを抽出し、アガロースゲル電気泳動で分離後、フィルターにブロッティングし、32P標識したプローブでハイブリダイズした。上はそのオートラジオグラム。下は、電気泳動後のゲルの臭化エチジウム染色像。28S,18SrRNAのバンドの位置を図の左側に、セマフォリンＺmRNAのバンドの位置を図の右側に示した。各レーン、15μgRNAを泳動した。
図２：中枢神経組織におけるセマフォリンＺの発現分布を示すノーザン解析の結果の電気泳動写真。
成体ラットの中枢神経組織の9部位からRNAを抽出し、アガロースゲル電気泳動で分離後、フィルターにブロッティングし、32P標識したプローブでハイブリダイズした。上はそのオートラジオグラム。下は、電気泳動後のゲルの臭化エチジウム染色像。28S,18SrRNAのバンドの位置を図の左側に、セマフォリンＺmRNAのバンドの位置を図の右側に示した。各レーン、15μgRNAを泳動した。
図３：胚から成体にかけてのセマフォリンＺの発現量の変化を示すノーザン解析の結果の電気泳動写真。
種々の令数のラットの組織からRNAを抽出し、アガロースゲル電気泳動で分離後、フィルターにブロッティングし、32P標識したプローブでハイブリダイズした。上はそのオートラジオグラム。下は、電気泳動後のゲルの臭化エチジウム染色像。胎生12日では胚全体から、胎生15、18日及び新生仔では頭部と胴体のそれぞれから、成体では全脳からRNAを調製した。28S,18SrRNAのバンドの位置を図の左側に、セマフォリンＺmRNAのバンドの位置を図の右側に示した。各レーン、15μgRNAを泳動した。
図４：大腸菌によるセマフォリンＺ細胞外ドメイン（rSZexII）の発現を示すSDS-PAGEの電気泳動写真。
左図は、セマフォリンＺ部分ペプチド発現プラスミド（pRSZexII）で形質転換した大腸菌BL21（DE3）pLysSでの細胞外ドメイン（rSZexII）の発現誘導を示す。この大腸菌を培養し、菌液の濁度（O.D.600）が0.4-0.6に達した時点でIPTGを1mMになるように添加し、発現を誘導した。図の上部の数字は、IPTG添加後の時間を示す。各時間に一部の菌液をサンプリングし、遠心で集めた菌体をSDS-PAGEサンプルバッファーに懸濁、熱変性後、SDS-PAGEで分離した。rSZexII（矢印）は誘導後１時間で発現が認められ、その後、発現量の増加が認められた。右図は、ニッケルアフィニティーカラムで精製後のrSZexIIのSDS-PAGE像である。図中のMは、分子量マーカーを泳動したものであり、図の左に位置する数字は、マーカーのそれぞれのバンドに対応する分子量（kD：キロダルトン）を表す。
図５：大腸菌によるセマフォリンＺ細胞内ドメイン（rSZinc）の発現を示すSDS-PAGEの電気泳動写真。
左図は、セマフォリンＺ部分ペプチド発現プラスミド（pRSZinc）で形質転換した大腸菌BL21（DE3）pLysSでのセマフォリンＺ細胞内ドメイン（rSZinc）の発現誘導を示す。この大腸菌を培養し、菌液の濁度（O.D.600）が0.4-0.6に達した時点でIPTGを1mMになるように添加し、発現を誘導した。図の上部の数字は、IPTG添加後の時間を示す。各時間に一部の菌液をサンプリングし、遠心で集めた菌体をSDS-PAGEサンプルバッファーに懸濁、熱変性後、SDS-PAGEで分離した。rSZinc（矢印）は誘導後４時間で発現が認められ、12時間後には発現量の増加が認められた。右図は、ニッケルアフィニティーカラムで精製後のrSZincのSDS-PAGE像である。図中のMは、分子量マーカーを泳動したものであり、図の左に位置する数字は、マーカーのそれぞれのバンドに対応する分子量（kD：キロダルトン）を表す。
図６：COS細胞で発現させたセマフォリンＺ蛋白質のウエスタンブロッティングによる解析の結果の電気泳動写真。
左図、COS細胞に（A）アンチセンスセマフォリンＺ遺伝子発現プラスミドpUCSRαSZ（-）または（S）セマフォリンＺ発現プラスミド（pUCSRαSZ）をトランスフェクションし、2日後に膜画分と細胞質画分に分離後SDS-PAGEを行ない続いて抗セマフォリンＺ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。（C）はモックトランスフェクション。セマフォリンＺ蛋白質のバンドの位置を図の左に示した。右図、同様に調製した膜画分を糖鎖分解酵素、N-グリコシダーゼ-F、で処理した（+）のち左図と同様にウエスタンブロティングで解析した。（-）は酵素を入れなかった以外は全く同様の処理を行ったもの。セマフォリンＺのバンドの位置を図の右に示した。MWは分子量マーカー。
図７：セマフォリンZ発現細胞抽出物の成長円錐退縮活性を示すグラフ。
セマフォリンＺ発現プラスミド（pAx1CAsemaZ-L）を導入したCOS7細胞から調製した抽出物（図中の+SemaZ）をNGFあるいはNT-3存在下で培養したニワトリ胚後根神経節神経に与え、成長円錐の退縮した神経突起の割合（%）を調べた。対照には、アンチセンス-セマフォリンＺ遺伝子を発現するプラスミド（pAx1CAsemaZ-R）を導入した細胞から得た抽出物を用いた。グラフに示した値は、神経節８個から得られた数値の平均値であり標準偏差も付加した。
図８：アンチセンス-アデノウイルス感染細胞におけるアンチセンス-セマフォリンＺmRNAの発現を示す電気泳動写真。
COS7細胞にアンチセンス-セマフォリンＺ遺伝子発現アデノウイルス（アンチセンス-アデノウイルス：Ax1CAsemaZ-R）またはセマフォリンＺ遺伝子を持たないアデノウイルス（コントロール-アデノウイルス：Ax1CAwt）を感染させ、２日後に全RNAを調製した。5μgの全RNAを1%寒天-ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動し、膜フィルターにブロッティング後、32Pで標識したセンス（左図）またはアンチセンス（右図）cRNAプローブでハイブリダイズし、オートラジオグラフィーを行った（上図：オートラジオグラム）。各図のレーン１にはコントロール-アデノウイルス、レーン２にはアンチセンス-アデノウイルスを感染させた細胞から調製したRNAを泳動した。アンチセンス-セマフォリンＺmRNAは、センスプローブによりアンチセンス-アデノウイルスを感染させた細胞でのみ検出された（左図中の矢印：anti-sense semaZ）。各図の下部分は、電気泳動後のゲルの臭化エチジウム染色像。図の左端に28S、18SリボゾームRNAの位置を示した。
図９：アンチセンスセマフォリンＺ遺伝子によるセマフォリンＺ蛋白質の発現抑制を示すウエスタンブロッティングの結果の電気泳動写真。
セマフォリンＺ発現プラスミド（SemaZ発現プラスミド，pAX1CASemaZ-L）、アンチセンスセマフォリンＺ発現プラスミド（アンチセンスプラスミド，pAx1CASemaZ-R）、セマフォリンＺ遺伝子を持たないアデノウイルス（コントロール−アデノウイルス，AX1CAwt）、アンチセンスセマフォリンＺ遺伝子発現アデノウイルス（アンチセンス−アデノウイルス，Ax1CASemaZ-R）を図に示したような様々な組み合わせで、COS細胞に導入し、一定時間後に細胞を回収し膜画分を調製した。その膜画分をSDS-PAGEで分離後、抗セマフォリンＺ抗体でウエスタンブロッティングを行った。セマフォリンＺ発現プラスミドをトランスフェクションした時点を0時間とし、細胞の回収は、12時間後、24時間後に行った。アデノウイルスの感染はプラスミドのトランスフェクションの24時間前に行った。セマフォリンＺのバンドの位置をゲルの写真の左側に示し、さらに、該当する各レーンの横の三角印でも示した。
図１０：ノーザン解析による生体組織でのセマフォリンIIIの発現分布を示す電気泳動写真。
成体マウスの種々の組織から全ＲＮＡを抽出し、１％寒天−ホルムアミドゲル中で電気泳動し、フィルターにブロッティング後、32Pで標識したマウスセマフォリンIII ＤＮＡプローブでハイブリし、セマフォリンIII ｍＲＮＡ発現分布を調べた。各レーン15μgのＲＮＡを泳動した。上図、オートラジオグラムの結果。18S,28SリボゾームＲＮＡの位置を図の左端に示した。下図、ゲルの臭化エチジウム染色像。上、下の２本のバンドは、それぞれ、28S,18SのリボゾームＲＮＡ。
実施例
基本的な実験方法はManiatisらによって編纂されたMolecular Cloning 2nd Edt.（Cold Harbor Laboratory Press,1989）、Ausubelらによって編纂されたCurrent Protocols in Molecular Biology（John Wiley & Sons,1987）および東京大学医科学研究所制癌研究部編纂の細胞工学実験プロトコール（秀潤社、1991）などの多くの出版物に詳しく記載されている。尚、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものでなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。
実施例１
ラットセマフォリンＺ遺伝子のクローニング
（１）新規セマフォリン遺伝子のデーターベースからの検索
ナショナルセンター  フォー  バイオテクノロジー  リサーチ（アメリカ合衆国メリーランド州ベセスダ）のディービーイーエスティー（dbEST）データベースを用い、既知のセマフォリン遺伝子において比較的保存されているアミノ酸配列をコードしており、しかも胎児のcDNAからは得られず生後脳のcDNAのみから得られる配列を検索した。その結果、ファイル番号ティー08532（T08532）の塩基配列が既知のセマフォリン遺伝子に共通している8個のアミノ酸配列（Gln（またはArg）-Asp-Pro-Tyr（またはHis）-Cys-Ala（またはGly）-Trp-Asp）に近い配列（Gln-Asp-Pro-Tyr-Cys-Gly-Trp-Ala）をコードすることを発見した。しかし、T08532の配列情報は176塩基と既知のセマフォリン遺伝子のcDNAと比較して非常に短く、しかもその中で既知のセマフォリンと共通の配列に翻訳できるのは全体のわずか10％前後の領域だけであったこと、更にこのT08532の配列が確定された配列でない為アミノ酸への読み枠も決定できなかったなどの理由から、この配列が新規セマフォリン遺伝子の一部であることは結論できなかった。そこでまず、この配列を有する遺伝子が成体の脳で発現しているという本発明の目的にかなうものであることを確認した上で、この配列を含むcDNAの全長をクローニングして遺伝子の構造を決定し、新規セマフォリンであるかどうかを判断することとした。
（２）脳におけるT08532の配列を有する遺伝子の発現の確認
成人ヒト中枢神経系でこの遺伝子が発現していることを確認するため、T08532の両端の塩基配列を基にして２本のＤＮＡプライマー（5’-AAGATGCAGGAGCCGTCG-3’（配列番号：８）、5’-CAGCGGCTGCTGAGCTTG-3’（配列番号：９））を合成し、ヒト海馬のｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン社製）から調製したｃＤＮＡを鋳型にして通常の条件でＰＣＲを行った。その結果、T08532の全長とほぼ等しい約170bpの断片が増幅された。次に、その断片がT08532と同じ塩基配列を有していることを確認するため、DNAをpCRII（インビトロジェン社製）にインビトロジェン社のプロトコールに従ってクローニングし、全塩基配列を決定した。その結果得られた配列（配列番号：７）はT08532と95％以上一致していたため、T08532の配列を含む遺伝子が成人ヒト脳において発現していることが確認できた。
（３）ラットセマフォリンＺ遺伝子の単離
続いてこの遺伝子の全長をクローニングし、新規セマフォリンであるかどうかを検討することにした。遺伝子全長クローニングに関しては、今後研究を進める際にヒトよりサンプル調整が容易であると期待されるラットの遺伝子を先にクローニングすることにした。具体的なクローニングの手順を以下に示す。
まず上記（２）で得られた176bpのｃＤＮＡ断片（配列番号：７）をプローブとしてｃＤＮＡライブラリーを以下のようにスクリーニングした。すなわち、まずラット脳から通常の方法で調整されたｍＲＮＡとラムダザップツー（λZapII）ｃＤＮＡライブラリー作製キット（ストラタジーン社製）とを用いて上記実験書に紹介されている通常の方法で作製されたｃＤＮＡライブラリーを用い、約１５万プラークを作製した。このプラークをナイロン膜（日本ポール社製）に写し、ＤＮＡの変性、中和を行った後、0.6J/cm2の紫外線で固定し、ハイブリダイゼーションに用いた。ハイブリダイゼーションは、ナイロン膜とプローブとなる32Ｐでラベルした176塩基のＤＮＡ断片（アマーシャム社製メガプライムＤＮＡラベリングシステムを使用）をハイブリダイゼーション溶液（45%（v/v）ホルムアミド、5×SSPE溶液（ここで1×SSPEとは0.15M塩化ナトリウム、10mMリン酸二水素ナトリウム、1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムの混合物をpH7.0に調製したものを表す）、2×デンハルト溶液（和光純薬製）、0.5%（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、20μg/mlサケ精子ＤＮＡ（和光純薬製））に入れ42℃48時間反応させた。反応後、ナイロン膜を室温で2-3回2×SSPE、0.5%（w/v）SDS中で10分間洗浄した後、更に、42℃で2-3回2×SSPE、0.5%（w/v）SDS中で10分間洗浄した。こうして得られたフィルターをBAS2000バイオイメージアナライザー（富士フィルム製）で解析し、４個の陽性シグナルを得た。陽性シグナルの位置にあるプラークを寒天プレートから切り出し、20μlクロロフォルムを添加した500μlエスエム（SM）バッファー（100mM塩化ナトリウム、15mM硫酸マグネシウム、50mMトリス（pH7.5）、0.01%ゼラチン）に入れた後、4℃一晩放置し、ファージを溶出した。こうして得られた組換ラムダファージを先と同様の手順で２次スクリーニングし、単一プラークを分離した。得られたファージを以下に示すようにストラタジーン社のプロトコールに従って処理し、ｃＤＮＡインサートを持つファージミドのインビボ切り出しを行った。すなわち、二次スクリーニングから得られた４個のシングルプラークを含む寒天ゲルをそれぞれ500μlのＳＭバッファーに入れ20μlのクロロホルムを加えた後４℃一晩静置した。このファージ溶液250μlと、OD600=1.0になるように10mM塩化マグネシウム中に懸濁した大腸菌XL-1BlueMRF’200μl、更に、１μlのエックスアシスト（ExAssist）ヘルパーファージ（＞1x106pfu/ml）とを混ぜ、37℃15分間培養した。続いて、3mlのエルビー培地（0.5%（w/v）塩化ナトリウム、1%（w/v）バクトトリプトン（ディフコ社製）、0.5%（w/v）イーストエキストラクト（ディフコ社製）を混合後5M水酸化ナトリウムでpH7.0に調製）を加えて37℃で2-3時間振とう培養した。2000×g 15分間遠心して菌体を除去し上清を70℃15分処理した。その後、再び2000×g 15分間遠心し、上清をｃＤＮＡインサートを持ったファージミドの保存液として回収した。このファージミドの保存液10-100μlを200μlの大腸菌SOLR（OD600=1.0）に混合し、15分間37℃で培養した後、アンピシリンプレートに10-50μlまき37℃一晩培養し目的の遺伝子断片の挿入された2本鎖ファージミドを持つ大腸菌株を取得した。
（４）ＤＮＡシーケンシング
得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列をパーキンエルマー社の377型ＤＮＡシーケンサーを用いて解析し、全塩基配列を決定した。なお、反応にはプリズムダイターミネーションキット（パーキンエルマー社製）を用いた。決定したＤＮＡ塩基配列（3692塩基）を配列番号：１に、また推定されるオープンリーディングフレーム（2664塩基）を配列番号：２に、またアミノ酸配列（887アミノ酸）を配列番号：３に示す。
この遺伝子の配列を既知のデータベース上の配列と比較した結果、この遺伝子は新規遺伝子であることが判明した。更に、そのアミノ酸配列の第４９位から第５８０位がいわゆるセマフォリンドメイン配列と相同性を有しており、またセマフォリン遺伝子間で良く保存されている１３個のシステイン中１２個が保存されていたことから、確かにセマフォリンファミリーに属する新規タンパク質であることが確認された。そこで、このタンパク質をセマフォリンＺと名付けた。
実施例２
ヒトセマフォリンＺ遺伝子のクローニング
実施例１で得られたラットセマフォリンＺの塩基配列を基にプライマー（5’-TACTTCAATGTACTGCAGGCT-3’（配列番号：１０）、5’-AAGATGCAGGAGCCATCGGGG-3’（配列番号：１１））を合成し、ヒト前頭葉皮質ｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン社製）より調製したｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行いヒトセマフォリンＺに相当するｃＤＮＡ断片を増幅した。この増幅断片をpCRII（インビトロジェン社製）にクローニングし、実施例１と同様にして塩基配列を決定した。ＰＣＲ反応中の間違いを除去するために独立な４個のクローンの塩基配列を比較し、正しい配列を決定した。
他方、ヒトセマフォリンＺのDNA配列をコードするESTクローンを見つける目的で、ホモロジー解析プログラムblastnを用いてラットセマフォリンＺの配列とESTデータベース（dbEST）の配列とを比較した。その結果、z45909がラットセマフォリンＺと非常に似た配列をコードしていることが明らかになったため、この配列を含んでいるESTクローン（ID#184382）を米国ジェノムシステムズ社より購入し、実施例１に記載の方法で全塩基配列を決定した。
このような２種の方法によっても配列決定がなされなかった塩基配列部分については、相当する領域のラットセマフォリン遺伝子断片をプローブにしてヒト前脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを繰り返すことにより、最終的にヒトセマフォリンＺの全長をコードする塩基配列を決定した。決定したＤＮＡ塩基配列（3524塩基）を配列番号：４に、また推定されるオープンリーディングフレーム（2667塩基）を配列番号：５に、アミノ酸配列（888アミノ酸）を配列番号：６に示す。この配列番号６のアミノ酸配列は、配列番号：３のラットセマフォリンＺのアミノ酸配列と89％の一致を示したため、この配列がヒト型セマフォリンＺに相当することが明らかとなった。
実施例３
ノーザン解析によるセマフォリンＺの組織特異的遺伝子発現
（１）ＲＮＡの調製
ラットの様々な組織を切り出し、エージーピーシー法（辻孝、中村敏一；実験医学1991年９巻、1937-1940頁、エフ・エム・アウスベルら編、カレントプロトコルズインモレキュラーバイオロジー1989年、4.2.4-4.2.8頁（グリーンアソシエイツアンドウィリー−インターサイエンス社））でＲＮＡを調製した。簡単に述べると、切り出した組織1g当たり10mlの変性溶液（4Mグアニジンチオシアン酸、25mMクエン酸ナトリウム（pH7.0）、0.5%サルコシル、0.1M2-メルカプトエタノール）を加えポリトロンホモゲナイザーを用いて素早くホモゲナイズした。その後、0.1容の2M酢酸ナトリウム（pH4.0）、一容の水飽和フェノール、0.2容のクロロホルムーイソアミルアルコール（49:1）を加えて激しく撹拌した後、遠心して水層を分取し、イソプロピルアルコールを等容加えて-20℃で1時間放置した。遠心で沈殿を回収し、再び1g組織当たり2-3mlの変性溶液に溶解、等容のイソプロピルアルコールを加え-20℃1時間静置した後、ＲＮＡを遠沈した。75%のエチルアルコールで沈殿を洗い、軽く乾燥させた後適当な体積の水に溶解した。
（２）ＲＮＡの電気泳動とノーザンブロッティング
ＲＮＡの電気泳動とノーザンブロッティングはマニアティスらによって編纂されたMolecular Cloning 2nd Edt.,Cold Harbor Laboratory Press（1989）に従って行った。簡単に述べると、様々な組織から調製したＲＮＡをホルムアルデヒドを含む1%アガロースゲル中で電気泳動した。そのゲルを50mMNaOHで20分間振とうした後、10×SSPE中で40分間振とうした。その後、ＲＮＡを毛細管現象を利用してナイロン膜（バイオダインＢ、日本ポール社製）にブロッティングし、スタラタジーン社のUVクロスリンカーを用いて固定した（0.6J/cm2）。
（３）ハイブリダイゼーション
２本のプライマー（5’-CAGGAACACGAACCACAC-3’（配列番号：１２）、5’-GTATGCAAGAATGATGTG-3’（配列番号：１３））を用いてラットセマフォリンＺｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、775bpの断片を取得した。このＤＮＡ断片を、実施例１と同様の方法で32Ｐで標識し、プローブとした。ハイブリダイゼーション反応は、ＲＮＡをブロッティングしたナイロン膜とプローブＤＮＡを実施例１と同様のハイブリダイゼーション溶液中で42℃16-24時間放置し行った。反応後、ナイロン膜を2×SSPE、0.5%（w/v）SDS中で室温、10分間2-3回洗浄した後、更に、65℃の2×SSPE、0.5%SDS（w/v）中で20分間2-3回洗浄した。こうして得られたフィルターをオートラジオグラムにとって解析した。
（４）結果
図１に示したように、セマフォリンＺのmRNAは成体の中枢神経系（大脳、小脳）では強く発現している一方、末梢組織では脾臓以外の組織ではほとんど発現していなかった。また図２に示したように、本発明のセマフォリンＺは中枢神経系の組織全般において広く発現しており、中でも小脳、海馬、線条体に強い発現が認められた。また図３に示したように、胎生期では本発明のセマフォリンＺのmRNAの発現は非常に弱く特に12日令の胚、新生ラットではほとんど発現が認められなかった。
以上のように本発明のセマフォリンＺは、１）成体の中枢神経系全般で強く発現し、かつ２）神経の伸長が抑制されていない成体の末梢組織や胎児等ではあまり発現しない、という特徴を有しており、まさに「中枢神経再生阻止因子」と考えられる発現分布を示すことが明らかとなった。
実施例４
大腸菌によるセマフォリンＺの発現
以下に示すように細胞内ドメインと細胞外ドメインとに分けて、セマフォリンＺの発現を行った。
まず、セマフォリンＺcDNA（配列番号：１）を制限酵素AatIIとEcoRIとで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行い、1.9kbの断片を調製した。その1.9kb断片を、XhoI-EcoRI部位で開裂した発現プラスミドpRSETc（インビトロジェン社製）とアダプターDNA（5’TCGAGATCTGCAGCTGACGT3’/5’CAGCTGCAGATC3’）とともにライゲーションし、細胞内ドメイン発現用プラスミド:pRSZincを得た。
次に、セマフォリンＺcDNA（配列番号：１）をBstBIとXhoIとで切断しアガロースゲル電気泳動によって0.86kbp断片を分離・調製し、二つのアダプター（5’TCGAGCTGTGACTGGTGTGGTGACGGTTCCCG3’/5’GGCCGCCAAGGCTCACCACACCAGTCACAGC3’,5’CCTGATAATAGTT3’/5’CGAACTATTATCAGGACGT3’）とともにXho I-BstBIで開裂したpRSETcとライゲーションすることによって、細胞外ドメイン発現用プラスミド:rSZexIIを得た。
このようにして得られたプラスミド、pRSZincまたはpRSZexIIを用いて大腸菌BL21（DE3）pLysS（ストラタジーン社製）を形質転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLBプレート上で一夜培養し、形質転換体を得た。形質転換体が目的の構造のプラスミドを有していることは塩基配列の解析によって確認した。この形質転換体をアンピシリン50μg/mlを含むLB培地中、37℃で振とう培養し、OD600=0.5になった時点でIPTGを終濃度1mMになるように添加し、更に12時間培養した。続いて、培養液を5000g、15分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体の総蛋白をSDS-PAGEで解析し、目的のタンパク、すなわちrSZinc（セマフォリンＺの細胞内ドメイン部分）及びrSZexII（セマフォリンＺの細胞外ドメイン部分）が産生されていることを分子量により確認した。結果を図４及び図５に示す。
実施例５
セマフォリンＺの精製
大腸菌で発現させた上記rSZinc及びrSZexIIを、これらタンパク質のアミノ末端側にあるヒスチジンタグとニッケルNTAレジンとの親和性を利用することによりアフィニティー精製した。方法はニッケル・NTAレジン（キアエクスプレッショニスト）に添付のキアゲン社のプロトコールに詳しく書かれているが、簡単には、実施例４に記載の方法によりrSZinc及びrSZexIIを発現させた大腸菌各1gに対して5mlの割合でＡ液（6Mグアニジン塩酸、0.1Mリン酸ナトリウム、0.01Mトリス塩酸pH=8.0）を加えてよく懸濁し、室温で一時間以上撹拌して可溶化を行った。続いてこの溶液を、あらかじめＡ液で平衡をとったニッケル-NTAレジンと混合し、２時間以上室温で穏やかに撹拌することにより目的のタンパク質をレジンに結合させ、その後このレジンをカラムに充填した。このカラムを10倍量のＡ液で洗い、続いて5倍量のＢ液（8M尿素、0.1Mリン酸ナトリウム、0.01Mトリス塩酸pH=8.0）で、更に5倍量のC液（8M尿素、0.1Mリン酸ナトリウム、0.01Mトリス塩酸pH=6.3）で洗った後、2倍量のD液（8M尿素、0.1Mリン酸ナトリウム、0.01Mトリス塩酸pH=5.9）で結合しているタンパクを溶出し、さらにE液（8M尿素、0.1Mリン酸ナトリウム、0.01Mトリス塩酸pH=4.5）で溶出した。溶出の際には溶出液を1カラム体積ごとに分取し、SDS-PAGEでタンパクの溶出を確認した後、目的の画分を濃縮し、使用時まで-20℃で保存した。
このようにして得られた精製rSZinc及びrSZexIIのＮ末端のアミノ酸配列を分析し、目的のタンパクであることを確認した。これら精製rSZinc及びrSZexIIのSDS-PAGEの結果を図４及び図５に示す。
実施例６
抗セマフォリンＺ抗体の作製
実施例５にて得られた精製rSZinc及びrSZexIIをSDS-PAGE（6％ポリアクリルアミドゲル）で分離後、CBBで染色し、目的のバンドを切り出した。切り出したゲル片を細かく切り刻んだのち、蛋白量にして0.4mg分をフロイド完全アジュバントと混合後、ウサギの皮下に免疫を施した。以後、２週間毎に3回にわたり、0.2mgをフロイドの不完全アジュバントと混合し、皮下に免疫した。最後の免疫の１週間後に全採血を行った。その後、プロテインＡカラム、rSZincあるいはrSZexIIアフィニティーカラムを用いて通常の方法で精製を行い、精製ポリクローナル抗体を得た。
この抗体は、後述の実施例７のウエスタンブロットにおいて本発明のセマフォリンＺを認識したこと、さらにあらかじめ抗原のrSZincあるいはrSZexIIで吸収した抗体がセマフォリンＺを認識しなくなることを確認したことから、確かにセマフォリンＺに特異的に反応する抗体であることが確認された。
実施例７
ほ乳動物細胞によるセマフォリンＺの発現
ほ乳動物細胞用の発現ベクターpUCSRαのEcoRI部位にセマフォリンＺcDNA（配列番号：１）を挿入し、発現プラスミドpUCSRαSZを作製した。このpUCSRαSZをDEAEデキストラン法（F.M.Ausubelらの編纂によるCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons（1987））でCOS7細胞にトランスフェクションし、48時間後にセルスクレーパーを用いて細胞を回収した。回収した細胞を、蛋白分解酵素阻害剤を含むＡ液（10mM HEPES pH7.4、1mM EDTA、50μMロイペプチン、2μMペプスタチン、0.5mM PMSF、7.8mTIU/mlアプロチニンを含むハンクス生理食塩水）の存在下でホモジェナイズし、12000g、10分間の高速遠心で沈殿物と上清に分離した。上清にもまだかなりの膜画分が含まれているため、更に100000g、30分間超遠心した後、上清を回収し、これを細胞質画分とした。得られた細胞質画分は使用まで-80℃で保存した。高速遠心の沈殿物はＡ液で2回洗った後、2倍量の2.25Mしょ糖/PBSに懸濁し、2.25Mしょ糖/PBS液上に重層し、更にその上に0.8Mしょ糖/PBS液を重層した後、12000g、20分間遠心した。下側の界面から膜画分を回収し、その後更に２回洗い、使用時まで-80℃で保存した。
得られた細胞質画分と膜画分とをSDS-PAGE（10%-20%濃度こう配ゲル）の後、後述の実施例１１記載の方法でウエスタンブロッティングし、本発明のセマフォリンＺが産生されていること、及び産生されたセマフォリンＺが膜画分のみに存在していることを確認した。結果を図６に示す。図６から明らかなように、本実施例にて発現させたセマフォリンＺは、見かけの分子量が110〜150kDaであった。そして、該セマフォリンＺをN型糖鎖分解酵素で処理すると、分子量110-130kDa前後となり（図６）、アミノ酸配列からの予想値である93kDaに近い値となった。
以上の結果より、本発明のセマフォリンＺは膜に存在する糖蛋白であることが明らかとなった。なお、本実施例ではモックトランスフェクション、及びアンチセンスセマフォリンＺ発現プラスミドpUCSRαSZ（-）トランスフェクションをほどこしたCOS7細胞から上記と全く同様にして調製したサンプルを対照とした。
実施例８
セマフォリンＺの成長円錐退縮活性の測定
ほ乳類細胞用の発現ベクターpUCSRαのEcoRI部位にセマフォリンＺcDNA（配列番号：１）をセンスまたはアンチセンスの向きに挿入し、発現プラスミドpUCSRαSZ（+）とpUCSRαSZ（-）を作製した。これら発現プラスミドを実施例７に記載のDEAEデキストラン法でCOS7細胞にトランスフェクションし、48時間後にセルスクレーパーを用いて細胞を回収した。回収した細胞を実施例７と同様蛋白分解酵素阻害剤の存在下で、ダウンスホモジェナイザー（タイトタイプ）でホモジェナイズ（２０ストローク）し、12000g×5minの高速遠心で沈殿物を除いたものを細胞ホモジェネートとした。このホモジェネートの蛋白濃度をビーシーエー法（ピスス社製）で測定した。
ニワトリ8日胚から後根神経節（DRG）を取り出し、ポリLリジンーラミニンコーティングを施したチャンバースライド中で、20ng/ml NGFまたはNT-3を含むF12培地/10％FCS中で5%のOS2存在下、37℃、13時間培養したものを成長円錐退縮活性の測定に供した。成長円錐退縮活性の測定法についてはNeuron,2,11-20（1990）,Neuron,2,21-29（1990）,Neuron,2,31-37（1990）に詳しいが、簡単には以下の手順に従った。まず培養した後根神経節が入っているチャンバーに培地の1/4倍量の上記細胞ホモジェネートを加え、37℃、1時間培養した後、1％グルタールアルデヒド/PBSを加え、15分間固定した。一度PBSで洗った後、マウント剤（マウントクイック、大同産業社製）を用いてプレパラートを作製した。マウント剤が固化したのを確認後、退縮を起こした成長円錐の数を顕微鏡下で計数した。各々のサンプルにつき、２個の後根神経節を入れた４つの別々のチャンバーで培養を行い平均値と分散を求めた。退縮の判定は、Neuron,2,21-29（1990）にも指摘されているように、個々の後根神経節について約50の最も長く伸びた突起に対して実施した。
その結果、図７に示したように、セマフォリンＺ（semaZ）発現COS細胞抽出物は、NGF、NT-3依存性DRG神経成長円錐に対して、有意に高い（各々p＜0.001,p＜0.01）成長円錐退縮活性を有していた。
実施例９
セマフォリンＺの組換えアデノウイルスの作製
アデノウイルスの作成方法は、実験医学増刊vol.12,#15（1994）に詳しく述べられているが、簡単には以下の方法によって、セマフォリンＺｃＤＮＡをアンチセンス方向に発現する組換えアデノウイルスを作製した。セマフォリンＺｃＤＮＡ（配列番号：１）のEcoRI-MluI断片を調製し、DNAポリメラーゼクレノー断片を用いて末端を平滑化し、SwaIで切断したアデノウイルスカセットコスミドpAx1CAwtとライゲーションの後、試験管内でパッケージングし、大腸菌DH5αに感染させた。得られた形質転換体からコスミドDNAを調製し、制限酵素切断パターンからセマフォリンＺｃＤＮＡがアンチセンスの向きに挿入されていることを確認した。このコスミドをpAx1CASemaZ-Rと名付けた。なお、全く同様にして得られたセマフォリンＺ発現コスミドをpAx1CASemaZ-Lと名付けた。このpAx1CASemaZ-Rを野生型アデノウイルス5型DNAとともにリン酸カルシウム法によって293細胞にトランスフェクションし、翌日この293細胞を無処置の293細胞と混ぜて96ウェルプレートにまき直し、以後毎日、細胞変性の状態を観察した。10日目以降に細胞変性が始まり、続いてその3〜5日後にウェル内の全細胞が溶解したクローンを選択し、次の感染に供した。この選択したクローンを25cm2フラスコにまいた293細胞に再度感染させ、細胞が全て溶解するまで培養をした後、細胞ごとに培養液を集め、一部をとってDNAを調製し、セマフォリンＺｃＤＮＡがアンチセンスの向きに挿入されていることを確認した。正しく挿入されていることが確認されたクローンについて更に2回、293細胞への感染をくり返してウイルスを増幅させた後、精製し、使用まで10％グリセロール/PBS（-）中、-80℃で保存した。
実施例１０
組換えアデノウイルスによるアンチセンスセマフォリンＺmＲＮＡの発現
サブコンフルエントに培養したCOS7細胞２X106から培地を除き、0.3ml組換えアデノウイルス（moi）=10を加えて1時間放置し、続いて4.7mlの培地を加えて２日間培養した後、イソゲン（日本ジーン社）を用いて全RNAを抽出した。10ugのRNAを実施例３と同様の方法でノーザンブロッティングし、得られたフィルターをセマフォリンＺｃＤＮＡのセンス鎖あるいはアンチセンス鎖を特異的に32Pで標識したRNAプローブを用いて実施例３の方法でハイブリダイズさせた。その結果、図８に示したように、センスプローブを用いたときのみ強いシグナルが確認され、この組換アデノウイルスAx1CAsemaZ-RはアンチセンスセマフォリンＺｍＲＮＡを選択的に強く発現していることが確認できた。なお、ここで用いたRNAプローブの作製はMolecular Cloning 2nd Edt.（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）に詳しいが、例えばセンスプローブの合成について簡単に述べると以下のようになる。先ず最初に、２本のプライマー（5’-CAGGAACACGAACCACAC-3’（配列番号：１２）、5’-GTATGCAAGAATGATGTG-3’（配列番号：１３））を用いてラットセマフォリンＺｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、775bpの断片を取得した。このＤＮＡ断片をpCRII（インビトロジェン社製）にクローニングし、断片の挿入方向を確認した。このプラスミドをSpeIで切断し、プローブの作製の鋳型に用いた。標識反応は0.5ugの鋳型と、2ul 10xバッファー、4ul 2.5mM rATP,rGTP,rCTP、2.4ul 100uMrUTP、5ul［α32P］rUTP、1ul（20unit）T7ポリメラーゼ、1ul RNエースインヒビター及び蒸留水を加えて全量を20μlとし、37℃で1時間反応し、ＤＮエースI 2ulを加え更に15min反応することにより得た。アンチセンスプローブは鋳型をSpeIの代わりにEcoRVで切断し、T7ポリメラーゼの代わりにSP6ポリメラーゼを用いた以外は全く同様の方法により行った。
実施例１１
組換えアデノウイルスによるセマフォリンＺの発現抑制
コラーゲン（タイプＩ）コートされた培養面積25cm2の細胞培養フラスコ（住友ベークライト）に1x106個のCOS7細胞を撒き、5mlの培地（DMEM+10%FCS）中で37℃、5%CO2の条件下で約１日培養した後、2x108pfuの組換えアデノウイルス（アンチセンスセマフォリンＺまたはコントロール用のセマフォリンＺ遺伝子を含まないウイルス）を含む培地0.3mlに交換し、これをさらに１時間培養することで細胞にアデノウイルスを感染させた。感染の際、細胞の乾燥を防ぐために15分に１回程度フラスコを振とうした。その後、培養液4.7mlを加え、さらに１日培養した後、細胞にセマフォリンＺ発現プラスミド（pAx1CASemaZ-L）３μgをトランスフェクタム（Bio Sepra Inc.）を用いて導入した。発現プラスミドを含むDNA溶液の調製は、添付のプロトコールに従い、細胞とDNA溶液との接触時間は４時間とした。発現プラスミドを導入して12時間後及び24時間後に、細胞を以下の方法で回収した。細胞を培地存在下においてセルスクレーパーを用いて剥離し、遠心（1000rpm、5分間、4℃）によって集め、PBSで洗浄した後、100μlのリシスバッファー（10mM HEPES pH7.4、1mM EDTA、50μMロイペプチン、2μMペプスタチン、0.08TIU/mlアプロチニン、0.5mM PMSFを含むハンクス生理食塩水）に懸濁した。続いて細胞を凍結融解によって破壊し、遠心（12000rpm、5分間、4℃）によって可溶性画分と不溶性画分に分離した。不溶性画分を変性溶液（100mM Tris-HCl pH6.8、2%SDS、5%2-メルカプトエタノール）に懸濁し、100℃で10分加熱することで変性、溶解させた。試料の280nmの吸光度を測定することで試料間の蛋白量の相対比を算定し、以下に示すウェスタンブロット解析に用いた。各試料から一定の蛋白量を含む分量を取り、試料と等量の1×SDS-PAGEサンプルバッファー（0.0625M Tris-HCl pH6.8、2%SDS、5%2-メルカプトエタノール、10%グリセロール）を加え、100℃で５分加熱した。この蛋白試料をSDS-PAGE（10%アクリルアミド）にて分画した後、Immobilonフィルター（ミリポア）に電気泳動的（25mM Tris-HCl、192mMグリシン、20%メタノール中、100V、１時間）にトランスファーした。このフィルターを抗体の非特異的吸着を防ぐためにブロッキング溶液中（2%スキムミルク、1%BSA）で１時間振とうした後、１次抗体として実施例６で得られた抗セマフォリンＺ抗体1／100容量と0.1%BSAを含むPBSに置き換え、4℃で一晩放置した。翌日、フィルター上の過剰の抗体を0.05%Tween20を含むPBSで洗浄除去（５分間、３回）し、続いて２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギIgG抗体（BIOSOURCE）1／1000容量と0.1%BSAを含むPBSで１時間振とうした。その後、フィルターを前記と同様に洗浄し、発色液（0.3mg/ml NBT、0.15mg/ml BCIP、100mM Tris-HCl pH9.5、0.5mM MgCl2を添加した。目的のバンドが検出された時点で蒸留水に置換し、発色反応を停止させた。
その結果、図９に示したように、発現プラスミド導入の24時間後に回収した細胞で、コントロール−アデノウイルスを感染させたものはセマフォリンＺタンパクの発現が認められたが、アンチセンス−アデノウイルスを感染させたものでは認められなかった。すなわち、アンチセンス−アデノウイルスの感染でセマフォリンＺタンパクの発現が抑制された。
参考例１
セマフォリンIIIを用いたセマフォリン活性必須部位の同定
Neuron,14,941-948（1995）に記載のセマフォリンIIIの配列情報をもとにPCR反応を行い、発現プラスミドpUCSRαにセマフォリンIIIの構造遺伝子を組み込んだ。この発現プラスミドをDEAEデキストラン法でCOS7細胞に導入し、２日後に培養上清に含まれるセマフォリンIIIの活性を、Cell,75,217-227（1993）に記載の方法と同様の方法にてニワトリ後根神経節神経の成長円錐退縮活性を指標に調べたところ、全く活性を示さないクローンが1つ発見された。そこで、このクローンの塩基配列を決定したところ、198番目のアスパラギン酸がグリシンに変化していた。この198番目を含む前後の領域を他の既知の動物のセマフォリンと比較すると、この領域はセマフォリンドメイン内では際だって保存されている領域ではなかったが、このアスパラギン酸に相当する部位だけは一部のセマフォリンでグルタミン酸になっている以外では非常に良く保存されていた。このことから、このアスパラギン酸が活性発現に必須であることが示唆された。次にこの遺伝子に通常の方法で部位特異的突然変異を導入し、このグリシンをアスパラギン酸に修復したところ強い退縮活性が回復したため、この発現プラスミドのこれ以外の領域は正常に機能することを確認した。以上より、セマフォリンIIIの198番目のアスパラギン酸がセマフォリンの機能発現に必須であると考えられる。なおこのアスパラギン酸に相当するのが配列番号３のラットセマフォリンＺのアミノ酸配列では第204位のアスパラギン酸であり、配列番号６のヒトセマフォリンＺのアミノ酸配列では第203位のアスパラギン酸である。
参考例２
ノーザン解析によるセマフォリンIIIの組織特異的遺伝子発現
マウスの組織におけるセマフォリンIII遺伝子の発現分布を調べるために成体マウスの種々の組織からＲＮＡを調製し、ノーザン解析を行った。ＲＮＡの調製、ブロッティング、ハイブリダイゼーションは、実施例１と同様の方法によって行った。プローブには参考例１に記載したマウスセマフォリンIII ＤＮＡの560bpのMspI断片を用いた。その結果、図１０に示したように、成体におけるセマフォリンIIIの発現は、末梢器官である肺において非常に強い一方、中枢神経系ではむしろ弱いことが分かった。
発明の効果
本発明によって神経の伸長に対して抑制的に作用する新規セマフォリンＺの遺伝子、またはこの遺伝子とハイブリダイズする他のセマフォリン遺伝子、それらの遺伝子と相補的な配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ、セマフォリンＺ遺伝子を発現することによって得られるタンパク質、または部分ペプチドあるいは改変した遺伝子を発現することによって得られる改変タンパク質、あるいはこれらに対する抗体、さらにセマフォリンＺを用いたセマフォリンＺ阻害物質のスクリーニング系、この系から分離されるセマフォリンＺ阻害物質などを提供することができる。これらを用いることによって、主として中枢神経の再生促進効果を有する医薬品、あるいはセマフォリンＺに関する医学・生物学の研究に有用な試薬が提供される。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：3692
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：ラット（Rattus norvegicus）
株名：Wistar
組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号：5’UTR
存在位置：1..18
特徴を決定した方法：E
特徴を表す記号：CDS
存在位置：19..2682
特徴を決定した方法：E
特徴を表す記号：3’UTR
存在位置：2683..3653
特徴を決定した方法：E
特徴を表す記号：polyA site
存在位置：3654..3692
特徴を決定した方法：E
配列
0004129992.tif 000002
0004129992.tif 000003
0004129992.tif 000004
配列番号：２
配列の長さ：2664
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：ラット（Rattus norvegicus）
株名：Wistar
組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..2664
特徴を決定した方法：E
配列
0004129992.tif 000005
0004129992.tif 000006
0004129992.tif 000007
配列番号：３
配列の長さ：887
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ラット（Rattus norvegicus）
株名：Wistar
組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号：peptide
存在位置：1..887
特徴を決定した方法：P
配列
0004129992.tif 000008
0004129992.tif 000009
0004129992.tif 000010
0004129992.tif 000011
0004129992.tif 000012
0004129992.tif 000013
配列番号：４
配列の長さ：3524
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：ヒト（Homo sapiens）
組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号：5’UTR
存在位置：1..38
特徴を決定した方法：E
特徴を表す記号：CDS
存在位置：39..2702
特徴を決定した方法：E
特徴を表す記号：3’UTR
存在位置：2706..3524
特徴を決定した方法：E
配列
0004129992.tif 000014
0004129992.tif 000015
0004129992.tif 000016
配列番号：５
配列の長さ：2667
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：ヒト（Homo sapiens）
組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..2667
特徴を決定した方法：E
配列
0004129992.tif 000017
0004129992.tif 000018
0004129992.tif 000019
配列番号：６
配列の長さ：888
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ヒト（Homo sapiens）
組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号：peptide
存在位置：1..888
特徴を決定した方法：P
配列
0004129992.tif 000020
0004129992.tif 000021
0004129992.tif 000022
0004129992.tif 000023
0004129992.tif 000024
0004129992.tif 000025
配列番号：７
配列の長さ：176
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：ヒト（Homo sapiens）
組織の種類：脳海馬組織
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..176
特徴を決定した方法：E
配列
0004129992.tif 000026
配列番号：８
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：Yes
起源
生物名：ヒト（Homo sapiens）
組織の種類：脳海馬組織
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..18
特徴を決定した方法：E
配列
0004129992.tif 000027
配列番号：９
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：ヒト（Homo sapiens）
組織の種類：脳海馬組織
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..18
特徴を決定した方法：E
配列
0004129992.tif 000028
配列番号：１０
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：ラット（Rattus norvegicus）
株名：Wistar
組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..21
特徴を決定した方法：E
配列
0004129992.tif 000029
配列番号：１１
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：Yes
起源
生物名：ラット（Rattus norvegicus）
株名：Wistar
組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..21
特徴を決定した方法：E
配列
0004129992.tif 000030
配列番号：１２
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：Yes
起源
生物名：ラット（Rattus norvegicus）
株名：SD
組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..18
特徴を決定した方法：E
配列
0004129992.tif 000031
配列番号：１３
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：No
起源
生物名：ラット（Rattus norvegicus）
株名：SD
組織の種類：脳組織
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..18
特徴を決定した方法：E
配列
0004129992.tif 000032
【図１】
0004129992.tif 000033
【図２】
0004129992.tif 000034
【図３】
0004129992.tif 000035
【図４】
0004129992.tif 000036
【図５】
0004129992.tif 000037
【図６】
0004129992.tif 000038
【図７】
0004129992.tif 000039
【図８】
0004129992.tif 000040
【図９】
0004129992.tif 000041
【図１０】
0004129992.tif 000042