(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のペプチド１、２および３を含むことを特徴とする、ＨＣＭＶに対する抗体と特異的に反応するペプチド混合物。
（１）下記のアミノ酸配列で示されるペプチドから選択されるペプチド１
【化１】
0004173204.tif 000018
【化２】
0004173204.tif 000019
（２）下記のアミノ酸配列で示されるペプチドから選択されるペプチド２
【化３】
0004173204.tif 000020
（３）下記のアミノ酸配列で示されるペプチド３
【化４】
0004173204.tif 000021
【請求項２】
ペプチドが、化学的に合成されたものである、請求項１に記載のペプチド混合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチド混合物を用いる、ＨＣＭＶ抗体の検出および／または測定のための免疫化学的方法。
【請求項４】
ペプチドが支持体に結合している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
支持体が、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミドおよび他の合成ポリマー、セルロースのような天然ポリマー、および酢酸セルロースおよびニトロセルロースのような天然ポリマー誘導体、並びにガラス、特にガラス繊維、から成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
支持体がポリスチレンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
エピトープ結合抗体の検出および／または測定を、下記の抗体を用いて行う、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
エピトープ結合抗体に対する酵素標識した抗体、
エピトープ結合抗体に対する螢光標識した抗体、
エピトープ結合抗体に対する化学ルミネセンス標識した抗体、
エピトープ結合抗体に対するビオチン標識した抗体、または
エピトープ結合抗体に対する放射能標識した抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に特異的な抗体およびＨＣＭＶ抗原の免疫化学的測定のためのペプチドおよびこの方法に好適な薬剤、およびその使用に関する。
【０００２】
ＨＣＭＶの免疫状態を検査するための診断において、今日までのところ、例えば酵素イムノアッセイが用いられてきている。このアッセイでは、特異的にＨＣＭＶに向けられた抗体が検出された。用いられた抗原は、通常は複雑な細胞培養中でヒト線維芽芽細胞上で生長し、プロセシングの後に、診断に利用可能な表面、たとえばＥＬＳＡマイクロタイタープレートに付着しウイルス物質であった。
【０００３】
細胞培養物から抗体の検出のためにＨＣＭＶ抗原を得ることは、一般に極めて時間が掛かり且つ経費が嵩むものであり、それに携わる人々には感染の危険性が伴うものである。この抗原を免疫学的診断法に用いるためには、ウイルスを細胞培地または細胞自身から得なければならず、或いは少なくとも、免疫学的反応を可能にする形態で存在しなければならない。生化学的方法によるこの物質のそれ以上の精製は極めて複雑であり、大きな損失を伴うものであり、例えば細胞結合ウイルス物質は超音波処理によってのみ遊離するのであり、例えば希釈してマイクロタイタープレートをコーティングした後に直接用いられるのである。この場合には、これはマイクロタイタープレートウェルの表面に結合しているウイルス特異的構造物のみならず、かなりの程度が細胞特異的タンパク質でもある。また、後者は、ある種の病気、例えば自己免疫疾患では、偽陽性の結果が得られ易く、したがって誤診を招きやすい。それ故、偽陽性の徴候の数を決定するためには、一般的には感染していない細胞培養物からの検討材料をコントロールとして用いるのである。これがために、このアッセイの複雑さおよび試料当たりの経費が必然的に倍加するのである。
【０００４】
前記の方法は、異種系、例えば大腸菌(Escherichia coli)において高収率で調製することができる組換えタンパク質を使用することによって、明らかに改良される。ＨＣＭＶの感染の可能性は、一般的にはウイルスの画定された領域のクローニングおよび発現によって除外される。更に、特異的なウイルスタンパク質に向けられた識別的な診断が可能である。しかしながら、免疫学的アッセイにおいて組換えタンパク質を用いるには、宿主細胞の混入成分が、血清試料と偽陽性反応を生じないようにしなければならない。この場合には、この品質を達成するには、特異的で、通常は極めて複雑な精製法が必要である。
【０００５】
更に、組換えタンパク質は、免疫状態を明確に画定し且つ診断的妥当性または保護状態（ワクチン）の産生のための妥当性を有する免疫学的反応性エピトープを有していなければならない。ほとんどの場合には、これらのエピトープは、用いられる発現系のほとんどについて異種タンパク質を表わし、タンパク質分解反応を速やかに受けるので、これらを組換え法によっては本来の形態で調製することができない。このため、それらは、発現生成物を安定化させる融合パートナーとして宿主タンパク質、例えば大腸菌の場合にはβ‐ガラクトシダーゼと共に通常はハイブリッドタンパク質として発現される。しかしながら、この融合体の外来部分は、下記の精製段階のために、組換えタンパク質の診断使用を妨害する偽陽性反応を生じることがある。
【０００６】
一般的にＨＣＭＶに対する免疫状態を測定するのに好適なタンパク質が同定されている。このタンパク質については、タンパク質ｐｐ１５０、完全なＤＮＡ配列並びに１６２個のアミノ酸の長さの断片（プラスミドとしてクローニングされたｐＸＰ１と呼ばれるＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ制限フラグメント）が知られており、明確な診断に適切な配列を含んでいる（ジャン・ジー(Jahn, G.)ら、（１９８７年）、J. Virol. 61, 1358-1367 ）。
【０００７】
ジェイ・ノバック(J. Novak)ら（ジェイ・ノバック(J. Novak)ら（１９９１年）、J. Gen. Virol. 72, 1409-1413）は、合成的に調製したペプチドを用いて、完全なｐｐ１５０タンパク質について、３個だけの免疫反応性領域であってその内の２個の領域が制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＰｓｔＩの開裂部位の間（ＸＰ１領域、第１表（表１））に位置している領域を見出した。
【０００８】
アミノ酸は、第１表では、下記のキーにしたがった単一文字コードとして再現される：Ａｌａ＝Ａ、Ａｒｇ＝Ｒ、Ａｓｎ＝Ｎ、Ａｓｐ＝Ｄ、Ｃｙｓ＝Ｃ、Ｇｌｎ＝Ｑ、Ｇｌｕ＝Ｅ、Ｇｌｙ＝Ｇ、Ｈｉｓ＝Ｈ、Ｉｌｅ＝Ｉ、Ｌｅｕ＝Ｌ、Ｌｙｓ＝Ｋ、Ｍｅｔ＝Ｍ、Ｐｈｅ＝Ｆ、Ｐｒｏ＝Ｐ、Ｓｅｒ＝Ｓ、Ｔｈｒ＝Ｔ、Ｔｒｐ＝Ｗ、Ｔｙｒ＝ＹおよびＶａｌ＝Ｖ。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の基礎となっている目的は、第一にできるだけ早期に且つ高い特異性でＨＣＭＶ感染を検出することが可能なアッセイを開発することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
意外なことには、ＸＰ１領域についてノバック(Novak) らによって見出された免疫反応性領域を確かめることはできず、この代わりにノバック(Novak) らのものとは異なる３個の免疫反応性領域を見出した。更に、免疫状態の実質的に完全な測定は、特にイムノアッセイにおける本発明による総ての３種類のエピトープを用いことにより可能であることも見出した。
【００１１】
それ故、本発明は、ＨＣＭＶに対する抗体と特異的に反応し、且つ下記のアミノ酸配列の少なくとも１つを含むペプチドに関する：
ASe -gly ala gly ala ala ile leu -BSm                     （ペプチド１）
CSn -arg ala trp ala leu -DSo                             （ペプチド２）
および／または
ESp -ala ser arg asp ala ala -FSq                         （ペプチド３）
但し、ＡＳ、ＢＳ、ＣＳ、ＤＳ、ＥＳおよびＦＳは、互いに独立に、任意の適当なアミノ酸であり、
ｅは、互いに独立に０〜２２の整数であり、
ｍは、互いに独立に０〜２５の整数であり、
ｎおよびｏは、互いに独立に０〜１８の整数であり、
ｐおよびｑは、互いに独立に０〜１１の整数である。
【００１２】
好ましいペプチドは、
ペプチド１について：
【化５】
0004173204.tif 000002
【化６】
0004173204.tif 000003
【００１３】
ペプチド２について：
【化７】
0004173204.tif 000004
【００１４】
ペプチド３について：
【化８】
0004173204.tif 000005
【００１５】
これらのうちで、下記のペプチドが特に好ましい。
ペプチド１について：
１．３、１．４、１．６、１．１１、１．１３。
ペプチド２について：
２．１、２．５、２．９および／または２．１０。
ペプチド３について：
３．２。
【００１６】
発現ペプチドおよびポリペプチドは、約８０個までのＡＡを有するペプチドおよびタンパク質と同等なものとして本発明の目的に用いられる。
【００１７】
免疫反応性ペプチドとは、一般的には少なくとも１個のエピトープを有するペプチドであって、そのペプチドの長さの最小値が通常は約６、好ましくは約８〜１０アミノ酸であるものを意味する。
【００１８】
ペプチドを、各種の方法、例えば１または２以上のアミノ酸、好ましくはシステインのアミノ末端またはカルボキシ末端付着によって誘導体形成させ、例えばペプチドを互いにまたは支持体と結合させるのが有利であることが多い。この伸長は、通常は１〜４０、好ましくは１〜２０、特に１〜１０個のアミノ酸を含んでいる。他の例は、例えばアンモニアまたはメチルアミンを用いるチオグリコール酸のアミド化、カルボキシ末端のアミド化である。これらのタイプのものを修飾すると、ポリペプチド上の真の電荷が変化することがあり、ペプチドの物理化学的特性が改良されまたはこのペプチドの固形支持体、キャリヤータンパク質またはもう一つのペプチドへの共有結合が促進される。
【００１９】
個々のアミノ酸を構造的に関連したアミノ酸で置換することによって、免疫反応性の変異体を生じさせることも可能である。例えば、アミノ酸ｖａｌをｌｅｕ、ｉｌｅまたはｎｖａのような天然には存在しないアミノ酸で置換することができる。
【００２０】
通常は、このタイプの修飾はペプチドの免疫反応性の方向を変更しないが、これらのペプチドの免疫学的特性を改良することはまったく可能である。例えば、メチオニンは自然酸化し易いが、これはノルロイシンによって置換することによって、ポリペプチドの抗原特性を本質的に変化させることなく防止することができる。
【００２１】
他のアミノ酸の置換は、例えば下記の群の内部で起こることができる：ｇｌｙ，ａｌａ；ｖａｌ，ｉｌｅ，ｌｅｕ；ａｓｐ，ｇｌｕ；ａｓｎ，ｇｌｎ；ｓｅｒ，ｔｈｒ；ｌｙｓ，ａｒｇ；ｐｈｅ，ｔｙｒ；ａｌａ，ｓｅｒ；ａｌａ，ｔｈｒ；ａｌａ，ｖａｌ；ａｌａ，ｐｒｏ；ａｌａ，ｇｌｕ；ｌｅｕ，ｇｌｎ；ｇｌｙ，ｐｈｅ；ｉｌｅ，ｓｅｒおよびｉｌｅ，ｍｅｔ。
【００２２】
それ故、本発明は、１または２以上のアミノ酸の置換、付加または欠失によって修飾された本発明のアミノ酸配列を有するペプチドにも関する。
【００２３】
約２〜２０個の疎水性アミノ酸を含む疎水性配列、例えばｐｈｅ  ａｌａ  ｐｈｅ  ａｌａ  ｐｈｅを付加することによって、支持体へのポリペプチドの吸着特性を改良することも、同様に有利であることがある。
【００２４】
本発明によるペプチドの混合物は、免疫化学的抗−ＨＣＭＶの検出のための単一のペプチドよりも良好な診断特性を有することがあることも見出した。
【００２５】
それ故、本発明は、本発明によるペプチドの混合物にも関する。
【００２６】
ペプチド１、２および３の混合物が特に好適であり、また下記の混合物が特に好ましい：１．６，２．１，３．２；１．１１，２．１，３．２；１．６，２．１０，３．２；１．１１，２．１０，３．２；１．６，２．７，３．２または１．１１，２．７，３．２。
【００２７】
しかしながら、混合物をペプチドから調製して、例えばマイクロタイタープレートをコーティングするのに用いる場合には、ペプチドは、物理的特性が異なるため表面への結合の効率が変化するため、コーティングが不均一になる危険性がある。
【００２８】
それ故、もう一つの態様では、前記のペプチドの２または３以上、好ましくは２〜１０、特に２〜４個のペプチドをスペーサーを用いてまたは用いることなく結合させる。これによって、マイクロタイタープレートのコーティングが均一になる。当業者に知られている方法によって２または３以上のペプチドの重合形態を調製して、多数の免疫関連エピトープが一つのペプチド上に存在するようにすることも可能である。前記のように、本発明によるペプチドを、例えばタンパク質またはラテックス粒子のようなキャリヤーに結合させることもできる。従って例えば、キャリヤーとして或いは架橋剤として特に好適なものは、ヒト血清アルブミンおよび／またはポリリシンである。
【００２９】
これらのタイプの修飾により、通常は、有益な方法での固相への受身吸着または共有結合の特性が変化し、結合法に有利な効果を及ぼし、またはペプチドに対する多クローン性抗体または単クローン性抗体の生成において一層強力に抗原として作用する。
【００３０】
それ故、本発明は、架橋剤を用いてまたは用いることなしに互いに結合し、またはキャリヤーに結合させることもできるペプチドにも関する。
【００３１】
前記の免疫反応性ペプチドは、合成または遺伝子操作により、好ましくは当業者に知られている方法による合成によって、調製することができる。
【００３２】
それらは、１個のペプチドの形態でも或いは重複または非重複合アミノ酸配列を有する複数の小さなペプチドの混合物の形態でも、合成することができる。
【００３３】
遺伝子操作によって調製されるポリペプチドには、融合部分が後で除去されてしまう融合タンパク質も包含する。それらは、例えばグリコシル化、アセチル化またはホスホリル化などにより適当な場合に修飾することができるポリペプチドも包含する。
【００３４】
固相合成、特にジー・ビー・フィールズ(G.B. Fields) およびアール・エル・ノーブル(R.L. Noble)のＦｍｏｃ法が、化学的ペプチド合成に好ましく用いられてきている。この方法を用いると、本発明によるペプチドは、例えばＦｍｏｃに好適なアンカーを用いて、ポリスチレン（１％ジビニルベンゼン）上で半自動的または完全自動的ペプチドシンセサイザー中で調製することができる。カルボキシルまたはカルボキサミド官能基（functionality ）を、例えばＣ末端に用いることができる。カルボキシル基の場合には、アルコキシベンジルアルコールを樹脂上でアンカーとして用いることが可能であり、好ましい。ペプチドアミドは、例えばブライポール(Breipohl)らの方法（ジー・ブライポール(G. Breipohl) 、ジェイ・クノール(J. Knolle) およびダブリュ・ステューバー(W. Stueber)、Int. J. Peptide, Protein Res. 34, 1989, 252-267 ）によって［（５−カルボキシラトエチル−２，４−ジメトキシフェニル）−４′−メトキシフェニル］メチルアミン樹脂上で合成することができる。樹脂の初期の充填量は、１ｇ当たりのアミノ官能基が０．２〜１．０ミリモル、好ましくは０．４〜０．６ミリモルであった。合成は、下記の一般的反応順序によって行った：
１．  例えば、ＤＭＦでの樹脂の洗浄。
２．  例えば、ピペリジン／ＤＭＦのような溶媒混合物での樹脂の処理。
３．  好ましくは、最初にＤＭＦ／イソプロパノールで、次いでＤＭＦでの樹脂の洗浄。
４．  樹脂と、活性化されたアミノ酸誘導体、例えばＦｍｏｃで活性化されたアミノ酸の１〜６倍、好ましくは２〜４倍、特に２．５〜３．５倍過剰量との反応。
アミノ酸誘導体は、ＤＩＣ／ＨＯＢｔまたはＤＭＦ中でＴＢＴＵ／ＤＩＰＥＡを用いて活性化した。
５．  反応段階３および４の繰り返し。
【００３５】
必要なペプチドを合成した後、ペプチドを、例えば９０％ＴＦＡ、５％エタンジチオール、５％レゾルシノールで、室温で処理することによって、樹脂から開裂させた。開裂したペプチドは、次いでエーテルから結晶化させ、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィまたはゲル浸透のような一般的方法によって精製した。ペプチドの組成は、アミノ酸分析および／またはマススペクトル分析法によってチェックすることができ、純度は、例えばＨＰＬＣによって試験することができる。
【００３６】
ブリッジ結合したペプチドも、同様に一般的に知られている方法によって調製した。下記の可能性は、とりわけブリッジ結合に対して存在する：
Ａ）  直接的アミド結合；
Ｂ）  １〜１０個、好ましくは１〜５個、特に１〜３個のアミノ酸を有するペプチドを介するブリッジ結合；
Ｃ）  チオエーテルまたはジスルフィド結合。
【００３７】
アミノ酸または短いペプチドでブリッジ結合したペプチドは、前記の方法によって合成することができる。好適な短いペプチドの例は、トリグリシンである。いわゆるスペーサーにより、特に疎水性スペーサーにより２つのペプチドを結合すると、前記のように、一般的にはマイクロタイタープレートの相互作用に有益な効果を及ぼす。ブリッジ結合要素として特に好ましいアミノ酸は、例えばε−アミノ−カプロン酸である。
【００３８】
チオエーテルまたはジスルフィド結合は、一つのペプチドのＮ末端にマレイミド官能基を合成し、他のペプチドのＣまたはＮ末端にスルフィドリル基を、好ましくはシステインの形態で導入した後、２つのペプチドを結合することによって得られる。この結合は、固形支持体上でも、溶液中でも生じさせることができる。
【００３９】
免疫化学的検出法は、通常は血清、血漿、唾液、脳脊髄液または尿のような体液中で抗原および／または抗体を測定することができる、ホモジニアス（溶液中）またはヘテロジニアス（固相を用いる）方法としての方法から成っている。これらは、イムノアッセイとも呼ばれ、例としてはエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノフルオレッセンスアッセイ（ＩＦＡ）、ラジオイムノ沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）または寒天ゲル拡散アッセイなどである。
【００４０】
これらの多数の極めて様々な方法は、特定の態様、検出または測定原理に用いられるマーカー（例えば光度測定法、放射能測定法、視覚的または凝集、散乱光または沈降挙動）、および固相が異なる。当業者は、結合したおよび遊離の試料である抗体または抗原の分離は、広く用いられているが、例えばいわゆるホモジニアス法には必ずしも必要ではないことを承知している。ヘテロジニアスイムノアッセイ、特にヘテロジニアスＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００４１】
免疫化学的検出法における抗体の検出には、操作中に試料を前記のペプチド配列と接触させて、関連した方法の特定の段階で抗原−抗体複合体を形成させるか、または好適な標識した試薬を加えることによって、競合および阻止アッセイにおいてその形成を防止する必要がある。
【００４２】
それ故、本発明は、本発明によるペプチドを用いるＨＣＭＶ抗体の検出および／または測定のための免疫化学的方法、およびそのためのアッセイキットにも関する。
【００４３】
直接法では、抗体を、固相に結合したペプチドまたは標識したペプチド或いは両方と接触させることができるが、基本的方法が、一、二または多段階法として、第二抗体のアッセイの原理または固相上のおよび検出のための液体試薬として同一または異なるペプチド（またはペプチド混合物）を有する免疫学的アッセイ設定（二重抗原サンドイッチ）に基づいており、且つ特異的ないわゆる捕獲（例えば、抗−ＩｇＭ）またはアフィニティ試薬（例えば、プロテインＡ）と関連しているかどうかは無関係である。
【００４４】
ペプチドは、固相に共有結合的に、吸着によってまたは特異的抗体または同様なアフィニティ法によって、例えばビオチン−アビジン複合体を介して結合することができるが、吸着が好ましい。
【００４５】
固相に対する支持体材料として好適なものは、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミドおよび他の合成ポリマーのようなプラスチック、セルロースのような天然ポリマー、および酢酸セルロースおよびニトロセルロースのような誘導体形成した天然ポリマー、並びにガラス、特にガラス繊維である。ポリスチレンが、支持体材料として好ましい。
【００４６】
支持体は、ビーズ、棒、管およびマイクロタイタープレートの形態であるか、または懸濁液、例えばラテックス粒子の形態を採ることができる。紙片、ディスクおよび膜のようなシート様構造も、同様に好適である。これらの支持体の表面は、水性溶液に対して透過性および不透過性のいずれにすることもできる。
【００４７】
好ましい支持体は、ビーズ、管、ウェル、微小粒子、紙片および膜である。特に好ましい支持体は、マイクロタイタープレート、ラテックス粒子、ポリスチレンビーズまたは磁力によって付着可能な粒子である。
【００４８】
この支持体をコーティングするためのペプチド濃度は、一般的には約０．０１〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、特に好ましくは２〜１０μｇ／ｍｌである。
【００４９】
純度が高く且つ抗原性が強いために用いる量が極めて少量、例えば０．０１〜２．０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜０．５μｇ／ｍｌでよい合成的に調製したポリペプチドを用いるのが特に有利である。特に、ポリスチレンを用いるときには、支持体の結合容量は、通常は飽和せず、複数の異なるポリペプチド、特に２〜５種類の、特に３〜４種類の異なるポリペプチドでコーティングすることが通常は可能であり、これは特に有利である。
【００５０】
ペプチドを、検出のための標識誘導体として用いるときには、当業者に知られている総ての結合手法が好適である。抗体が標識を有する予め形成したペプチド−抗体複合体のような多段階法、またはたとえばこれらの反応物の一つの標識を有するビオチン／アジビンのような高アフィニティ系を適用することも可能である。
【００５１】
用いることができるマーカーの例は、放射性同位元素、螢光または化学ルミネセンス染料である。用いることができるマーカーには、例えば発色性、発光性または螢光性基質系によりまたは次の増幅器系であって第一の酵素によって活性化される第二の酵素を有する系によって検出される酵素も用いることができる。
【００５２】
好ましく用いられるマーカーは、酵素、特にアルカリ性ホスファターゼおよび／または西洋ワサビペルオキシダーゼ、または化学発光性化合物、例えばアクリジニウムエステルである。
【００５３】
標識は、前記のマーカーについて当該技術分野に記載されている方法によって行われる。抗体のペルオキシダーゼによる標識の場合には、ナカネ(NAKANE)ら、１９７４年、J. Histochem. Cytochem. 22, 1084-1090 の過ヨウ素酸塩法またはイシカワ(ISHIKAWA)ら、１９８３年、J. Immunoassay 4, 209-327 の、パートナーを異種二機能性試薬によって結合する方法を用いることが可能である。
【００５４】
これらの方法の外に、好適な表面、例えばラテックスまたは赤血球を敏感にするペプチドを用いて、ペプチド特異性抗体によって誘発される物理化学的変化、例えば沈澱、凝集または光散乱を自動的にまたは視覚的に測定することも可能である。誘導体形成されていないペプチドを用いて、これらの測定原理並びに前記の方法を阻止することも可能であることが知られている。
【００５５】
抗原は、本発明によるペプチドまたはその誘導体を用いて調製される多クローン性または単クローン性抗体を用いる免疫診断法を用いて検出することができる。この検出法に好適な態様は、当業者に知られており、特定の段階における抗体−抗原複合体の形成または標識した抗原を添加することによる競合方法における複合体の形成の阻止を含んでいる。
【００５６】
それ故、本発明は、本発明によるペプチドに対する抗体を用いるＨＣＭＶ抗原の検出および／または測定のための免疫化学的方法、およびそのためのアッセイキットにも関する。
【００５７】
固相、マーカーまたは抗原アッセイの確立のための測定原理として好適なものは、対応する抗体測定のために説明した総ての可能性が挙げられ、競合原理および二重抗体サンドイッチ法が免疫化学的方法として特に好適である。これに関して、これらの方法が１、２または３段階法として設定されているかどうかは重要ではない。したがって多段階法は、標識されていない検出抗体であってそれらに向けられており適当に標識されているもう一つの抗体を用いて測定される検出抗体を用いて行うことができる。抗体を生じさせるためには、ペプチドを、それらの免疫原性が、例えば天然タンパク質、例えばガンマーグロブリンまたは血清アルブミンのような血清タンパク質、キーホールリンペット（keyhole limpet hemocyanin;ＫＬＨ）のようなヘモシアニンまたはジフテリアまたは破傷風トキソイドのようなトキソイドに結合させることによってできる限り改良するように修飾するのが有利である（ビー・エス・シャッフハウゼン(B.S. Schaffhausen) 、生科学および医学におけるハイブリドーマテクノロジー(Hybridoma Technologie in the Biosciences and Medicine) 、ティー・エイ・スプリンガー(T.A. Springer) 監修、ブレナム・プレス・ニューヨーク(Plenum Press NY) 、ロンドン、１９８５年）。
【００５８】
最後に、固相を含む免疫診断要素と必要な試薬の一部或いは総てを乾燥形態で用いるときにも、本発明を適用することができ、この場合にも、新規なペプチドは固相上または検出試薬中に或いは両方に存在し、抗体の測定、抗原の検出または他の分析との組み合わせを行うことができる。
【００５９】
本発明によるペプチドは、例えばマイクロタイタープレートをこのペプチドでコーティングすることによって試験することができる。コーティングは、通常は緩衝液、例えば炭酸塩、リン酸塩またはトリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液、好ましくは炭酸緩衝液中で行われる。コーティングの後に、プレートを血清試料と共に１：１〜１：２５０、好ましくは１：１〜１：１０、特に１：１．５〜１：２．５の希釈度でインキュベーションした。次いで、抗原−抗体複合体を前記の方法、例えば抗原−抗体複合体に対する標識第二抗体を用いて検出した（イムノアッセイ）。
【００６０】
本発明は、それぞれ異なる病原体に対する複数の異なる抗体特異性の検出および／または測定のための免疫化学的方法およびそのための組合せキットであって、本発明によるＨＣＭＶペプチドの１または２以上と他の病原体由来の１または２以上の免疫反応性ペプチドを支持体上に固定し、それらに対する抗体を識別的または非識別的な、好ましくは識別的な前記の方法によって検出するキットにも関する。
【００６１】
組合せアッセイにおいては、ＨＣＭＶに関連したウイルス種、例えばヘルペスウイルス単純ヘルペス１および／または２（ＨＳＶ１／２）、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）、水痘状帯状ウイルス（ＶＺＶ）またはヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）および／または関連のないウイルス種、例えば肝炎ウイルスＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはウイルスＨＩＶ１およびＨＩＶ２を用いることが可能である。特に、ＨＣＭＶペプチドと他の病原体の１つまたは２つ以上のペプチドおよび／または組換えタンパク質の混合物を組合せアッセイにおいて用いることが可能であり、この場合には、これらのペプチドは互いに任意の測定可能な交差反応性を有するべきではない。
【００６２】
本発明のペプチド、免疫反応性部分およびその変異体は、例えばＨＣＭＶの診断および予防接種に好適である。これらのペプチドは、酵素イムノアッセイ、磁性およびラテックス粒子、様々な方法で製造した試験片、フィルムおよび紙などの各種の表面と作用する各種の診断アッセイ系のコーティング抗原として用いることもできる。
【００６３】
本発明の免疫反応性ペプチドの一つの利点は、ＨＣＭＶ抗体の検出の感度および特異性が高いことであり、希釈試料の外に、希釈しないまたは若干希釈しただけの試料を用いることもできる。ペプチドのもう一つの利点は、それらの配列の長さが比較的短いために、それらを簡単に且つ高収率で化学的に合成することができることである。化学的合成は、合成ペプチドは細胞特異性タンパク質を含まないという利点を有する。
【００６４】
本発明は、本発明によるペプチドの少なくとも一つをコードするＤＮＡ配列にも関する。
【００６５】
本発明は、ＨＣＭＶの検出および／または測定のための分析的方法であって、特異的部分において本発明によるＤＮＡ配列の少なくとも一つに相補的である少なくとも１つの核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション反応を特異的段階として用いることを特徴とする方法にも関する。
【００６６】
本発明は、本発明によるペプチドの一つまたは二つ以上に対して向けられている多クローン性および／または単クローン性抗体にも関する。抗体は、一般に知られている方法によって本発明のペプチドを用いて好適なドナー、例えばウサギを免疫することによって得ることができる。
【００６７】
本発明は、また本発明のペプチドの少なくとも１個またはそれらに対する抗体を含むＨＣＭＶに対するワクチンに関する。
【００６８】
本発明は、また本発明のペプチドの少なくとも１個を含むイムノアッセイ、特にヘテロジニアスイムノアッセイに関する。
【００６９】
略語のリスト
ＤＩＣ      ジイソプロピルカルボジイミド、
ＤＩＰＥＡ  ジイソプロピルエチルアミン、
ＤＭＦ      ジメチルホルムアミド、
Ｂｏｐ      １−ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、
Ｆｍｏｃ    フルオレニルメトキシカルボニル、
ＨＯＢｔ    ヒドロキシベンゾトリアゾール、
ＴＢＴＵ    ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート。
【００７０】
下記の例は、本発明を詳細に説明するためのものであり、本発明をそれに制限するためのものではない。
【００７１】
【実施例】
例
１．    ｇｌｙ  ａｌａ  ｇｌｙ  ｖａｌ  ａｓｎ  ｖａｌ  ｐｒｏ  ａｌａ  ｇｌｙ  ａｌａ  ｇｌｙ  ａｌａ  ａｌａ  ｉｌｅ  ｌｅｕ  ｔｈｒ  ｐｒｏ  ｔｈｒ  ｐｒｏ  ｖａｌ  ａｓｎ  ｐｒｏ  ｓｅｒ  ｔｈｒ  ａｌａ  ｐｒｏ  ａｌａ  ｐｒｏ  ａｌａ  ｐｒｏ−アミド（ペプチド１．１１）の調製
Ｆｍｏｃ−アミドアンカー樹脂１．０６ｇを、完全に自動的なペプチドシンセサイザー（アドバンスト・ケムテク(Advanced ChemTech) R 、ルイスビル、ケンタッキー、アメリカ合衆国）中で、製造業者の使用説明書にしたがって反応させた。アミノ酸は３倍過剰量であった。アミノ酸誘導体当たりの反応時間は３０分間であった。第一のアミノ酸として、Ｆｍｏｃ−プロリン５０６mgをＨＯＢｔ２１３mgおよび（ＴＢＴＵの代わりに）Ｂｏｐ６９７mgと共に用いた。ジイソプロピルエチルアミン３ミリモルを、塩基として加えた。カルボキサミド官能基をトリチルで誘導体形成した。合成は、下記の反応順序によって行った（１ｇの樹脂について）：
１  各回ＤＭＦ１５mlで樹脂を３回洗浄、
２  ２０％ピペリジン／ＤＭＦ１５mlで樹脂を処理（３分）、
３  ２０％ピペリジン／ＤＭＦ１５mlで樹脂を処理（１０分）、
４  ＤＭＦ／イソプロパノールで交互に３回樹脂を洗浄、
５  ＤＭＦで２回樹脂を洗浄、
６  アミノ酸誘導体を３倍過剰量導入し、ＤＩＣ／ＨＯＢｔまたはＤＭＦ中でＴＢＴＵ／ＤＩＰＥＡを用いて活性化し、樹脂と共に３０分間振盪。
７  ＤＭＦ／イソプロパノールを用いて交互に２回樹脂を洗浄。
【００７２】
結合反応の最後に、ペプチド樹脂をメタノールおよびジエチルエーテルで洗浄し、高真空下にて乾燥した。ペプチド樹脂２．３６ｇを、トリフルオロ酢酸２７ml／レゾルシノール１．５ｇ／エタンジチオール１．５mlと共に室温で１．５時間撹拌し、ジエチルエーテル中で結晶化させた。粗製のペプチドをジエチルエーテルで洗浄し、高真空下にて乾燥した（収量１０９０mg) 。ペプチドをセファデックス(Sephadex)Ｇ−２５で０．５％酢酸中でクロマトグラフィを行い、ペプチド画分を凍結乾燥によって単離した（収量６５４mg）。この物質の純度をＨＰＬＣによって試験した。精確な組成はアミノ酸分析によって確かめた。ペプチド含量は８６％であった。
【００７３】
２．  ペプチドの試験
９６穴のマイクロタイタープレートに、合成したペプチドをコーティングした。このために、炭酸緩衝液１ml当たりペプチド２．５μｇの溶液を作成し、１００μｌずつウェルに導入してコーティングした。ペプチドを４℃で一晩表面に吸着させ、ペプチド溶液を除去した後、ウェルを洗浄用緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．２；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．２％ツイーン(Tween) ２０）で何回か洗浄した。次いで、個々のヒト血清試料を１：２に希釈したものを導入し、３７℃で１時間インキュベーションした。もう一つの洗浄段階の後、ヒトＩｇＧ抗体またはヒトＩｇＭ抗体に特異的で、ペルオキシダーゼで標識した複合抗体を加え、混合物を室温で０．５時間インキュベーションした。次いで、０．５Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、個々の試料の吸光度を光度計で４５０／６５０nmの波長で測定した。
【００７４】
３．  関連エピトープの局在化
免疫原性を試験するため、ＨＣＭＶタンパク質ｐｐ１５０の７１８から８８０までの完全なアミノ酸配列領域からの各種の長さのペプチド（第２表（表２〜４）および第３表（表５〜１０））を例１に記載したのと同様な方法で合成した。次いで、例２と同様に、マイクロタイタープレートを合成したペプチドでコーティングし、免疫学的反応性をアッセイした。一連のアッセイの結果は、総ての試験ＨＣＭＶ陽性の血清は特に３種類の特異的配列領域の少なくとも１個と反応したが、他の配列領域は弱い免疫学的反応しか示さなかった（第２表および第３表）。３種類の免疫学的に反応性のペプチドは、下記の配列を有する：
【００７５】
ASe -gly ala gly ala ala ile leu -BSm （ペプチド１）、
CSn -arg ala trp ala leu -DSo （ペプチド２）、
および／または
ESp -ala ser arg asp ala ala -FSq （ペプチド３）。
但し、ＡＳ、ＢＳ、ＣＳ、ＤＳ、ＥＳおよびＦＳは、互いに独立に、任意の適当なアミノ酸であり、
ｅは、互いに独立に０〜２２の整数であり、
ｍは、互いに独立に０〜２５の整数であり、
ｎおよびｏは、互いに独立に０〜１８の整数であり、
ｐおよびｑは、互いに独立に０〜１１の整数である。
【００７６】
この方法で、総てのまたは１もしくは２つの配列領域のみと反応する血清を区別することが可能であった。
【００７７】
ＨＣＭＶ陰性の血清は、３種類のペプチドとは反応しないことは明らかであった。
【００７８】
４．  本発明のペプチドの診断への使用
見出されたペプチドの免疫活性を試験するために、ペプチド１．１１、２．１０および３．２の混合物で、総濃度２．５μｇ／ml、混合比１：１：１（重量）のものを、例２と同様にマイクロタイタープレート中に抗原として導入し、そこに記載の方法でアッセイを行った。この場合に用いたものはＩｇＭおよびＩｇＧ反応性について通常のアッセイで既に分析されている画定され且つ予め試験された血清のグループであった。参考アッセイ：ＣＭＶエンチグノスト(Enzygnost) R ＩｇＭ−ＰＯＤおよびＣＭＶエンチグノスト(Enzygnost) R ＩｇＧ−ＰＯＤ、ベーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) 、マールブルク。示されたアッセイの形態は、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体検出のためのＨＣＭＶ免疫状態を診断するのに極めて好適である（第４表および第５表）。
【００７９】
５．  単クローン性抗体８７−５５／０２と、同定されたペプチドエピトープの一つとの反応
ＨＣＭＶタンパク質ｐｐ１５０とのおよび組換えタンパク質断片ｐＸＰ１との明確な免疫学的反応を行い、イムノブロットおよびＥＬＩＳＡ反応性として測定される単クローン性抗体を、第３表における各種の合成ペプチドを同じ濃度（０．２５μｇ／ウェル）でコーティングしたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート上で検討した。プレートの前記の抗体による展開の後、重要なエピトープとして予め同定しておいたペプチド２．７との反応は、極めて明らかであり顕著であった。単クローン性抗体を選択するための方法から、同定されたエピトープは、完全なタンパク質の変性によっても破壊されない極めて重要な構造を有していなければならないと結論された。これに対応して、この単クローン性抗体は、合成ペプチド２．７とも、ＨＣＭＶの組換えタンパク質ＸＰ１およびｐｐ１５０タンパク質とも反応する。
【００８０】
第１表
ＸＰ１のアミノ酸配列（ＨＣＭＶタンパク質ｐｐ１５０のアミノ酸７１８〜８８０）
【表１】
0004173204.tif 000006
【００８１】
第２表：  ＨＣＭＶタンパク質ｐｐ１５０のＸＰ１領域からの合成ペプチドの個々の反応性
合成ｐＸＰ１断片とＣＭＶのＩｇＧ陽性血清のアッセイされたグループとの個々の反応性を百分率で表わす。
【表２】
0004173204.tif 000007
【表３】
0004173204.tif 000008
【表４】
0004173204.tif 000009
【００８２】
第３表：  ＨＣＭＶタンパク質ｐｐ１５０のＸＰ１領域からの特に反応性のペプチドの個々の反応性
合成ｐＸＰ１断片とＣＭＶのＩｇＧ陽性血清のアッセイされたグループとの個々の反応性を百分率で表わす。
ペプチドＮｏ．１
【表５】
0004173204.tif 000010
【表６】
0004173204.tif 000011
【表７】
0004173204.tif 000012
ペプチドＮｏ．２
【表８】
0004173204.tif 000013
【表９】
0004173204.tif 000014
ペプチドＮｏ．３
【表１０】
0004173204.tif 000015
【００８３】
0004173204.tif 000016
【００８４】
0004173204.tif 000017