(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質において、３３７位のスレニオンのセリンへの置換及び３３８位のヒスチジンのリジンへの置換を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質において、２９３位のヒスチジンのグルタミンへの置換、２９４位のグルタミン酸のグルタミンへの置換、及び３０３位のグルタミン酸のリジンへの置換を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質において、２９３位のヒスチジンのグルタミンへの置換、２９４位のグルタミン酸のグルタミンへの置換、３０３位のグルタミン酸のリジンへの置換、３０７位のアスパラギンのセリンへの置換、及び３０８位のグルタミンからリジンへの置換を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
ヒアルロン酸合成酵素タンパク質の研究用キットであって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性の変化したキメラ又は変異型のヒアルロン酸合成酵素に関する。該タンパク質は、生化学的研究又は医薬開発の研究試薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」ともいう）は、高分子量のグリコサミノグリカンであり、関節軟骨などの細胞外マトリクスの主要構成分子である。ＨＡは、グルクロン酸がＮ−アセチルグルコサミンにβ−１，３結合した二糖単位（GlcUAβ1-3GlcNAc：GlcUAはグルクロン酸を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミンをそれぞれ表す）のβ−１，４結合による繰り返しから構成され、ヒアルロン酸合成酵素（以下、「ＨＡＳ」ともいう）により合成される。
【０００３】
ＨＡは、ＨＡ結合タンパク質とともに細胞表面受容体との相互作用により、細胞の接着、遊走、分化等のような多くの細胞の挙動を調節している。さらに、ＨＡは、形態形成、再生、創傷治癒、腫瘍浸潤、およびガン転移等の多くの現象に関与している。これらの機能は、ＨＡの濃度や鎖長のような多くの要因に依存している。例えば、高分子量のＨＡは高濃度で、内皮細胞の成長を抑制する一方、低分子量のＨＡは細胞成長を刺激し、血管形成を誘導することが示されている。同様に、高分子量のＨＡは高濃度で、滑膜細胞及びある種の線維芽細胞の成長を抑制するが、低分子量のＨＡは低濃度でこれらの細胞の成長を刺激する。
【０００４】
ＨＡの細胞制御機構を解明するのに有力な手段は、ＨＡ合成機構を解明し、ＨＡの合成制御法を開発することであると考えられる。しかし、哺乳動物におけるＨＡ合成機構の解明するために多くの研究がなされてきたが、ＨＡ合成に関与する活性型の酵素の単離が困難であったために、未だ明らかにされていない。
【０００５】
近年、高度に保存された構造を有する哺乳動物のＨＡＳ遺伝子、ＨＡＳ１（マウス：特開平９−２２４６７４号、ヒト：WO97/38113号国際公開パンフレット）、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３（Spicer, A.P., Augustine, M.L., and Mcdonald, J.A. (1996)J. Biol. Chem. 271, 23400-23406; Spicer, A.P., Olson, J.S. and Mcdonald, J.A.(1997) J. Biol. Chem. 272, 8957-8961; WO98/00551）が、相次いでクローニングされている。異なる酵素の存在により、ＨＡの合成機構および生物学的意義に関し、さらなる疑問が持ち上がっている。
【０００６】
ＨＡＳ２またはＨＡＳ３のｃＤＮＡをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトすると、粒子排除アッセイ（particle exclusion assay）によりＨＡコート（HA-coat）のデ・ノボ産生が検出され、これら２つの遺伝子産物はアイソザイムであることが示唆された。しかし、ＨＡＳ１と他の２種の機能の関係は不明である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記３種のＨＡＳ遺伝子産物は、構造的に類似しており、Ｎ末端疎水性領域、内部細胞内領域、およびＣ末端疎水性領域の３つの領域を有している。Ｎ末端及びＣ末端領域は、ＨＡＳタンパク質ファミリー間で相同性は低いが、高い相同性が内部細胞内領域で認められる。細胞内領域は、β−１，４−結合によるオリゴ糖の合成を触媒することが示唆されるアミノ酸モチーフ（Asp Asp Gln Arg Trp（配列番号７））を含んでおり、ＨＡ合成の触媒領域に関与している可能性がある。哺乳動物のＨＡＳ遺伝子がクローニングされてはいるが、ＨＡ生合成の調節機構、および酵素活性やＨＡの鎖長の決定に重要であるタンパク質ドメインの解明に有用な情報は得られていない。
【０００８】
本発明は、上記観点から、ＨＡ合成機構の解明およびＨＡ合成を制御することを目的としてなされたものであり、そのために有用なＨＡＳ改変タンパク質を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３のいずれかを、他の少なくとも１種又は２種の一部と置換して得られるキメラタンパク質、および特定の位置にアミノ酸を置換する変異を有する変異型ＨＡＳは、野生型ＨＡＳよりもＨＡ合成活性が低下又は増加することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、連続する３つの領域（Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域）からなり、配列番号２、配列番号４及び配列番号６に示すアミノ酸配列を有する３種のヒアルロン酸合成酵素タンパク質から選ばれる１種のタンパク質の前記３つの領域のうち１つ又は２つの領域を、残りの１種又は２種のヒアルロン酸合成酵素タンパク質の前記１つ又は２つの領域に相当する領域で置換した組換えタンパク質であり、好ましくはヒアルロン酸合成活性が低下又は増加したタンパク質である。
【００１１】
また本発明は、前記タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
さらに本発明は、活性が低下又は増加した変異型ヒアルロン酸合成酵素を提供する。
本発明はまた、ヒアルロン酸合成酵素タンパク質の研究用キットであって、上記タンパク質を含むキットを提供する。
【００１２】
本発明において「ヒアルロン酸合成活性」とは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンを基質として、ヒアルロン酸を合成する活性をいい、具体的には、一定の酵素濃度、基質濃度及び酵素反応条件における単位時間あたりのヒアルロン酸合成量として表すことができる。なお、ヒアルロン酸合成活性の低下、又は増加は、改変していないＨＡＳ（野生型ＨＡＳ）のヒアルロン酸合成活性に対する改変したＨＡＳ（ＨＡＳ改変タンパク質）のヒアルロン酸合成活性の低下又は増加を調べることにより、判定することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の第１のＨＡＳ改変タンパク質は、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３のいずれかにおいて、Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域のうち１つ又は２つの領域を、残りの１種又は２種のヒアルロン酸合成酵素タンパク質の前記１つ又は２つの領域に相当する領域で置換したタンパク質である。本発明のタンパク質は、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３よりも低下又は増加したＨＡＳ活性を有する。
【００１４】
ここで、Ｎ末端領域（以下、「Ａ」の記号で表すことがある）とは、ＨＡＳタンパク質のＮ末端に存在する疎水性領域であり、細胞膜を貫通する２つのトランスメンブレンドメインを有している。内部領域（以下、「Ｂ」の記号で表すことがある）は、ＨＡＳタンパク質の内部に存在し、ＨＡＳ酵素活性を有する活性ドメインを含み、細胞内ループを形成する。Ｃ末端領域（以下、「Ｃ」の記号で表すことがある）は、ＨＡＳタンパク質のＣ末端に存在する疎水性領域であり、細胞膜を貫通する複数のトランスメンブレンドメインを有している（以上、図１参照）。本発明において、Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域とは、便宜的に、概ね上記の構造によって分けられるものであり、厳密な境界を有するものではないが、例えば、ＨＡＳ１ではＡとＢとの境界はＮ末端から２２７番目〜２２８番目付近、ＢとＣの境界はＮ末端から４０９番目〜４２０番目付近に存在する。
【００１５】
本発明のＨＡＳ改変タンパク質として具体的には、以下に示すタンパク質が挙げられる。これらの中では、活性が低下している点では、（８）を除くものが好ましい。
【００１６】
（１）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜７１で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号４におけるアミノ酸番号５２〜３７９で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３で示されるアミノ酸配列。
【００１７】
（２）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜７１で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号５１〜３８３で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３で示されるアミノ酸配列。
【００１８】
（３）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜５１で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号７１〜４０９で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２で示されるアミノ酸配列。
【００１９】
（４）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜５１で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号５１〜３８３で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２で示されるアミノ酸配列。
【００２０】
（５）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜２２７で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号４におけるアミノ酸番号１９８〜３７９で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３で示されるアミノ酸配列。
【００２１】
（６）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜２２７で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２０１〜３８３で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３で示されるアミノ酸配列。
【００２２】
（７）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜１９７で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号２２８〜４０９で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２で示されるアミノ酸配列。
【００２３】
（８）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜１９７で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２０１〜３８３で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２で示されるアミノ酸配列。
【００２４】
（９）Ｎ末端領域および内部領域、並びにＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）、（Ｂ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４０９で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２で示されるアミノ酸配列。
【００２５】
（１０）Ｎ末端領域、並びに内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）、（Ｂ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜１９７で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号２２８〜５８３で示されるアミノ酸配列。
【００２６】
（１１）Ｎ末端領域および内部領域、並びにＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）、（Ｂ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜３７９で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号４１０〜５８３で示されるアミノ酸配列。
【００２７】
（１２）Ｎ末端領域、並びに内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）、（Ｂ）で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜２２７で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号４におけるアミノ酸番号１９８〜５５２で示されるアミノ酸配列。
【００２８】
（１３）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜２７５で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２８０〜３８３で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２で示されるアミノ酸配列。
【００２９】
（１４）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜１９６で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２０１〜２７９で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号２７６〜５５２で示されるアミノ酸配列。
【００３０】
（１５）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜３１８で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号３２３〜３８３で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３８０〜５５２で示されるアミノ酸配列。
【００３１】
（１６）Ｎ末端領域、内部領域およびＣ末端領域が、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号４におけるアミノ酸番号１〜２７５で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号６におけるアミノ酸番号２８０〜３２２で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号４におけるアミノ酸番号３１９〜５５２で示されるアミノ酸配列。
【００３２】
本発明の改変タンパク質をコードするＤＮＡ又はこれらのＤＮＡを発現させるための発現ベクターは、ＨＡＳ１（配列番号１）、ＨＡＳ２（配列番号３）およびＨＡＳ３（配列番号５）のｃＤＮＡを用いて、通常の組換えＤＮＡ手法により容易に作製することができる。
【００３３】
なお、ここで用いることができるｃＤＮＡは、配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列をコードしている限りにおいて特に限定されず、例えば配列番号１、３又は５が例示されるが、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有するｃＤＮＡであってもよい。
本発明の改変タンパク質をコードするＤＮＡには、当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はＲＮＡも包含される。さらに本発明の改変タンパク質をコードするＤＮＡは、本発明の改変タンパク質をコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖およびこれと相補的な塩基配列を有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖からなる二本鎖であってもよい。
【００３４】
発現ベクターとしては、通常用いられる発現用の細胞、特に動物細胞で発現可能なものであれば特に制限されないが、例えばｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクター（イーストマン・コダック社）、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲＣ／ＣＭＶ２（インビトロジェン社）等が挙げられる。またＨＡＳ発現ベクターを導入する細胞としては、ＣＯＳ−１細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞等が挙げられる。
【００３５】
本発明の第２のＨＡＳ改変タンパク質は、特定の位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたＨＡＳ１タンパク質、ＨＡＳ２タンパク質又はＨＡＳ３タンパク質である。
ＨＡＳ１タンパク質に導入する変異は、２４２位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基に置換する変異、３３７位のＴｈｒ残基をＳｅｒ残基に置換する変異、３３８位のＨｉｓ残基をＬｙｓ残基に置換する変異、３４４位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基に置換する変異、３８０位のＧｌｎ残基をＡｓｎ残基に置換する変異、３８３位のＡｒｇ残基をＬｙｓ残基に置換する変異、３８４位のＴｒｐ残基をＴｙｒ残基に置換する変異、または３１２位にＧｌｙ残基をＰｒｏ残基に置換する変異から選ばれる。
【００３６】
これらの変異の中で顕著にＨＡ合成活性が低下するものとしては、２４２位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基に置換する変異、３４４位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基に置換する変異、３８０位のＧｌｎ残基をＡｓｎ残基に置換する変異、３８３位のＡｒｇ残基をＬｙｓ残基に置換する変異、３８４位のＴｒｐ残基をＴｙｒ残基に置換する変異が挙げられ、かつ好ましい。
【００３７】
これらの変異の中で特に顕著にＨＡ合成活性が低下するものとしては、２４２位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基に置換する変異、３４４位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基へ置換する変異、または３８４位のＴｒｐ残基をＴｙｒ残基へ置換する変異が挙げられ、かつ特に好ましい。
【００３８】
また、上記の変異の中でＨＡ合成活性が増加するものとしては、▲１▼３３７位のＴｈｒ残基をＳｅｒ残基に置換する変異、並びに▲２▼３３７位のＴｈｒ残基をＳｅｒ残基に置換する変異及び３３８位のＨｉｓ残基をＬｙｓ残基に置換する変異が挙げられ、かつ好ましい。
これらの変異の中でも、特に顕著にＨＡ合成活性が増加するものとしては、３３７位のＴｈｒ残基をＳｅｒ残基に置換する変異及び３３８位のＨｉｓ残基をＬｙｓ残基に置換する変異が挙げられ、かつ特に好ましい。
【００３９】
また、ＨＡＳ３タンパク質に導入する変異は、２９７位のＧｌｎ残基をＨｉｓ残基に置換する変異、２９８位のＧｌｎ残基をＧｌｕ残基に置換する変異、３００位のＬｅｕ残基をＶａｌ残基に置換する変異、３０５位のＨｉｓ残基をＡｓｎ残基に置換する変異、３０７位のＬｙｓ残基をＧｌｕ残基に置換する変異、３０９位のＬｅｕ残基をＭｅｔ残基に置換する変異、３１１位のＳｅｒ残基をＡｓｎ残基に置換する変異、または３１２位のＬｙｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変異から選ばれる。
【００４０】
上記変異の中で顕著にＨＡ合成活性が低下するものとしては、２９７位のＧｌｎ残基をＨｉｓ残基に置換する変異、２９８位のＧｌｎ残基をＧｌｕ残基に置換する変異、３０７位のＬｙｓ残基をＧｌｕ残基へ置換する変異、または３１２位のＬｙｓ残基をＧｌｎ残基へ置換する変異が挙げられ、かつ好ましい。
これらの変異の中で特に顕著にＨＡ合成活性が低下するものとしては、２９７位のＧｌｎ残基をＨｉｓ残基に置換する変異が挙げられ、かつ特に好ましい。
【００４１】
また、ＨＡＳ２タンパク質に導入する変異は、▲１▼２９３位のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、及び２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、▲２▼２９３位のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、及び３０３位のＧｌｕ残基をＬｙｓ残基に置換する変異、▲３▼２９３位のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、３０３位のＧｌｕ残基をＬｙｓ残基に置換する変異、３０７位のＡｓｎ残基をＳｅｒ残基に置換する変異、及び３０８位のＧｌｎ残基をＬｙｓ残基に置換する変異、から選ばれる。
【００４２】
これらの変異の中で顕著にＨＡ合成活性が増加するものとしては、▲２▼２９３位のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に置換する変異及び３０３位のＧｌｕ残基をＬｙｓ残基に置換する変異、並びに▲３▼２９３位のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、３０３位のＧｌｕ残基をＬｙｓ残基に置換する変異、３０７位のＡｓｎ残基をＳｅｒ残基に置換する変異、及び３０８位のＧｌｎ残基をＬｙｓ残基に置換する変異が挙げられ、かつ好ましい。
【００４３】
上記変異を有するＨＡＳタンパク質は、ＨＡＳタンパク質をコードするＤＮＡに、所望の変異が生じるように部位特異的変異を導入し、ＣＯＳ−１細胞等の細胞で発現させることによって容易に取得することができる。
【００４４】
前記の第１及び第２の改変タンパク質により、ＨＡＳタンパク質研究用のキットを構成することができる。
本発明の改変タンパク質は、ＨＡＳ活性が低下又は増加している。本発明の改変タンパク質または、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに各種改変タンパク質、またはこれらのタンパク質をコードするＤＮＡを含むキットは、ＨＡの生合成機構の解明などの研究に有用である。また、ガン細胞の増殖、転移にはＨＡが関与していることから、活性の低下したＨＡＳは、ガン細胞の増殖、転移を抑制することが期待される。
【００４５】
また、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３により合成されるＨＡの平均分子量は、それぞれ２０００ｋＤａ、１４００ｋＤａ及び１００〜３００ｋＤａであることが明らかにされた。
これら本発明により、ＨＡの合成量、合成ＨＡの長さを制御する事が可能となり、特定の分子量を持つＨＡを効率的に生産する有用なツールとなり得る。更に、それら分子量の異なるＨＡ標品の生理機能、例えば、形態形成作用、器官再生効果や、細胞増殖の抑制あるいは促進作用、細胞浸潤促進あるいは抑制作用などから、腫瘍浸潤抑制作用、癌転移抑制作用、抗潰瘍作用、創傷治癒、関節炎治療、感染防止等の医薬品開発が期待される。また、本発明の改変タンパク質をコードするＤＮＡを生物体に取り込むことで、ＨＡ合成機能の促進、抑制、攪乱を行うことが可能となり、ＨＡ生合成に係わる疾患（例えば関節炎、炎症、繊維化、角質化、癌等）に対する遺伝子治療の可能性も期待される。
【００４６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４７】
＜１＞タグ標識ＨＡＳ発現ベクターの構築及びＣＯＳ−１細胞への導入
（１）マウスＨＡＳ１ ｃＤＮＡ発現ベクターの構築
マウスＨＡＳ１ ｃＤＮＡは、マウス１７日齢の胚ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙTMｃＤＮＡ、クロンテック社）からSpicer, A.P. et al. (1996) J. Biol. Chem., 271, 23400-23406に記載の方法に従ってクローン化した。
【００４８】
マウスＨＡＳ１ ｃＤＮＡ断片を、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）および配列番号８及び９に示す塩基配列を有するプライマーを用いた２０サイクルのＰＣＲ反応により増幅した。配列番号８に示す塩基配列は、ＢｇｌII部位及びＨＡＳ１の配列番号１０に示すアミノ酸配列（２〜９位）に相当する配列を含んでいる。また、配列番号９に示す塩基配列は、ＨＡＳＩの配列番号１１に示すアミノ酸配列（２０４〜３１１位）に相当する配列を含んでいる。
【００４９】
得られたＰＣＲ断片をＢｇｌIIおよびＢｓｐＨＩで切断して電気泳動により製し、ＢｓｐＨＩを含む断片を取り出した。同様に、３’末端側の断片は、ＨＡＳ１全長ｃＤＮＡからＢｓｐＨＩおよびＢｇｌIIで切断して電気泳動により精製することにより取り出した。これらのＨＡＳ１の２つの断片は、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクター（イーストマン・コダック）のＢｇｌII部位にサプクローン化し、ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ１を構築した。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターは、ＣＭＶプロモーター及び８アミノ酸からなるＦＬＡＧペプチドをコードする配列を含んでおり、クローン化断片がコードするペプチドは、ＦＬＡＧとの融合蛋白として該ベクターが導入された細胞内に分泌される。
【００５０】
（２）マウスＨＡＳ２ ｃＤＮＡ発現ベクターの構築
マウスＨＡＳ２ ｃＤＮＡは、マウス１７日齢の胚ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙTMｃＤＮＡ、クロンテック社）からSpicer, A.P. et al. (1996) J. Biol. Chem., 271, 23400-23406に記載の方法に従ってクローン化した。
【００５１】
マウスＨＡＳ２ ｃＤＮＡ断片を、配列番号１２及び１３に示す塩基配列を有するプライマーを用いて、上記と同様にしてＰＣＲにより増幅した。配列番号１２に示す塩基配列は、ＢｇｌII部位及びＨＡＳ２の配列番号１４に示すアミノ酸配列（２〜９位）に相当する配列を含んでいる。また、配列番号１３に示す塩基配列は、ＳｍａＩ部位及びＨＡＳ２の配列番号１５に示すアミノ酸配列（５４５〜５５２位）に相当する配列を含んでいる。
【００５２】
得られたＰＣＲ断片を電気泳動により精製し、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターのＢｇｌII及びＳｍａＩ部位にサプクローン化し、ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ２を構築した。
【００５３】
（３）マウスＨＡＳ３ ｃＤＮＡ発現ベクターの構築
マウスＨＡＳ３ ｃＤＮＡは、マウス１７日齢の胚ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙTMｃＤＮＡ、クロンテック社）からSpicer, A.P. et al. (1996) J. Biol. Chem., 271, 23400-23406に記載の方法に従ってクローン化した。
【００５４】
マウスＨＡＳ３ ｃＤＮＡ断片を、配列番号１６及び１７に示す塩基配列を有するプライマーを用いて、上記と同様にしてＰＣＲにより増幅した。配列番号１６に示す塩基配列は、ＥｃｏＲＩ部位及びＨＡＳ３の配列番号１８に示すアミノ酸配列（２〜９位）に相当する配列を含んでいる。また、配列番号１７に示す塩基配列は、ＥｃｏＲＩ部位及びＨＡＳ３の配列番号１９に示すアミノ酸配列（５４９〜５５４位）に相当する配列を含んでいる。
【００５５】
得られたＰＣＲ断片を電気泳動により精製し、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターのＥｃｏＲＩ部位にサプクローン化し、ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ３を構築した。
【００５６】
＜２＞ＨＡＳキメラｃＤＮＡの構築
ＨＡＳキメラｃＤＮＡを構築するために、各マウスＨＡＳｃＤＮＡを含むプラスミドｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ１、ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ２、およびｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ３を鋳型とするＰＣＲを行った。先ず、ＨＡＳ１及びＨＡＳ２のＣ末端領域を、５’側プライマーとして配列番号２５（F1-4）または配列番号３２（F2-4）に示す塩基配列を有するプライマーを、３’側プライマーとして配列番号３６に示すプライマー（C-CMV-24）を用いて、それぞれ増幅した。また、他の領域を、表１に示すプライマーを用いてそれぞれ増幅した。ＰＣＲは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（パーキン−エルマー社）を用いて、９４℃４５秒、６０℃４５秒、および７２℃４分の反応を２５サイクル行った。
【００５７】
表１中の記号Ａ、ＡS、Ｂ、ＢL等は、以下のとおりである。また、以下の記載において、各領域を表す記号の後に付された数字１、２、３は、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２またはＨＡＳ３の領域であることを示す。例えば、Ｃ１は、ＨＡＳ１のＣ末端領域を表す。
【００５８】
Ａ  ：Ｎ末端領域
ＡS ：Ｎ末端〜２番目のＮ末端トランスメンブレンドメインまでの領域
Ｂ  ：内部領域
ＢL ：酵素活性を有する細胞内ループドメイン
【００５９】
キメラ（Chim番号）１７〜２０においては、図３に記載されているように、内部領域を更に細分化しており、そのＢ領域に相当する部分は以下のようになる。Ｂａとは、ＨＡＳ２のアミノ酸配列（配列番号４）１９８番から２７５番と、ＨＡＳ３のアミノ酸配列（配列番号６）２８０番から３８３番より成る部分と、
Ｂｂとは、ＨＡＳ３のアミノ酸配列（配列番号６）２０１番から２７９番と、ＨＡＳ２のアミノ酸配列（配列番号４）２７６番から３７９番より成る部分と、
Ｂｃとは、ＨＡＳ２のアミノ酸配列（配列番号４）１９８番から３１８番と、ＨＡＳ３のアミノ酸配列（配列番号６）３２３番から３８３番より成る部分と、
Ｂｄとは、ＨＡＳ２のアミノ酸配列（配列番号４）１９８番から２７５番と、ＨＡＳ３のアミノ酸配列（配列番号６）２８０番から３２２番と、ＨＡＳ２のアミノ酸配列（配列番号４）３１９番から３７９番、
より成る部分を表している。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
Ｃ１断片をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌIIで消化し、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターにサブクローン化し、ｐＦＬＡＧ−Ｃ１を構築した。また、Ｃ２断片をＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化し、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターにサブクローン化し、ｐＦＬＡＧ−Ｃ２を構築した。さらに、Ａ１、ＡS１、Ａ２、ＡS２の各断片をＨｉｎｄIIIで消化し、ｐＦＬＡＧ−Ｃ１またはｐＦＬＡＧ−Ｃ２のＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏ４７III部位にサブクローン化し、ｐＦＬＡＧ−Ａ１Ｃ１、ｐＦＬＡＧ−Ａ１Ｃ２、ｐＦＬＡＧ−Ａ２Ｃ１、ｐＦＬＡＧ−Ａ２Ｃ２、ｐＦＬＡＧ−ＡS１Ｃ１、およびｐＦＬＡＧ−ＡS２Ｃ２を構築した。
【００６２】
各断片を連結後、新たなＥｃｏ４７III部位が、Ａ断片及びＣ断片の間に生成された。
Ｂ１断片を、ｐＦＬＡＧ−Ａ１Ｃ１、ｐＦＬＡＧ−Ａ１Ｃ２、ｐＦＬＡＧ−Ａ２Ｃ１、ｐＦＬＡＧ−Ａ２Ｃ２のＥｃｏ４７III部位にサブクローン化した。また、Ｂ２断片およびＢ３断片を、ｐＦＬＡＧ−Ａ１Ｃ１およびｐＦＬＡＧ−Ａ２Ｃ２のＥｃｏ４７III部位にサブクローン化した。さらに、ＢL１、ＢL２、およびＢL３断片を、ｐＦＬＡＧ−ＡS１Ｃ１およびｐＦＬＡＧ−ＡS２Ｃ２のＥｃｏ４７III部位にサブクローン化した。
【００６３】
ＨＡＳキメラｃＤＮＡは、さらに２段階ＰＣＲにより、重複する２つの分離したＰＣＲ産物を連結してより長い産物を得た。第一段階ＰＣＲでは、表１に示すプライマーおよびｐｆｕＤＮＡポリメラーゼを用い、Ｂドメインの５’断片および３’断片を得た。第二段階ＰＣＲでは、ゲル電気泳動で精製した重複する２つの断片を等量用い、プライマーを用いずに５サイクル反応を行った。反応後、Ｂドメインの両側に設定されたプライマーのセットを加え、ＰＣＲ反応を２０サイクル行った。プライマーは、Ｂ１断片にはＦ１−３及びＲ１−３を、Ｂ２断片にはＦ２−３及びＲ２−３を、Ｂ３断片にはＦ３−３及びＲ３−３を、それぞれ用いた。得られたキメラＢ断片を、ｐＦＬＡＧ−Ａ１Ｃ１およびｐＦＬＡＧ−Ａ２Ｃ２のＥｃｏ４７III部位にサブクローン化した。
【００６４】
上記で得られた全ての発現ベクターの構造は、塩基配列決定により確認した。これらの発現ベクターがコードするＨＡＳキメラタンパク質の構造を、図２および図３に模式的に示す。また、上記手順と図示したキメラ蛋白質との関係を表２に示す。尚、これらのタンパク質のうちＣｈｉｍ１およびＣｈｉｍ７は、ＨＡＳ１と同一の構造を有する。また、Ｃｈｉｍ５とＣｈｉｍ１１はＨＡＳ２と同一の構造を有する。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
＜３＞部位特異的変異ＨＡＳ発現ベクターの構築
Ｑｕｉｃｋ−ＣｈａｎｇｅTM 部位特異的変異キットを用い、ＨＡＳ１（ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ１）に、２４２位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基に置換する変異（Ａｓｐ２４２Ｇｌｕ）、３４４位のＡｓｐ残基をＧｌｕ残基に置換する変異（Ａｓｐ３４４Ｇｌｕ）、３８０位のＧｌｎ残基をＡｓｎ残基に置換する変異（Ｇｌｎ３８０ＡＳｎ）、３８３位のＡｒｇ残基をＬｙｓ残基に置換する変異（Ａｒｇ３８３Ｌｙｓ）、３８４位のＴｒｐ残基をＴｙｒ残基に置換する変異（Ｔｒｐ３８４Ｔｙｒ）、または３１２位にＧｌｙ残基をＰｒｏ残基に置換する変異（Ｇｌｙ３１２Ｐｒｏ）を導入した。
ＨＡＳタンパク質中における各変異の位置を、図４に示す。
さらに、ＨＡＳ１（ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ１）に、３３７位のＴｈｒ残基をＳｅｒ残基に置換する変異（Ｔ３３７Ｓ）、及び同変異に加えて３３８位のＨｉｓ残基をＬｙｓ残基に置換する変異（Ｔ３３７Ｓ，Ｈ３３８Ｋ）を導入した。
【００６７】
同様に、ＨＡＳ３（ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ３）に、２９７位のＧｌｎ残基をＨｉｓ残基に置換する変異（Ｑ２９７Ｈ）、２９８位のＧｌｎ残基をＧｌｕ残基に置換する変異（Ｑ２９８Ｅ）、３００位のＬｅｕ残基をＶａｌ残基に置換する変異（Ｌ３００Ｖ）、３０５位のＨｉｓ残基をＡｓｎ残基に置換する変異（Ｈ３０５Ｎ）、３０７位のＬｙｓ残基をＧｌｕ残基に置換する変異（Ｋ３０７Ｅ）、３０９位のＬｅｕ残基をＭｅｔ残基に置換する変異（Ｌ３０９Ｍ）、３１１位のＳｅｒ残基をＡｓｎ残基に置換する変異（Ｓ３１１Ｎ）、または３１２位のＬｙｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変異（Ｋ３１２Ｑ）を導入した。
また、ＨＡＳ２（ｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ２）に、▲１▼２９３位のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、及び２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に置換する変異（Ｈ２９３Ｑ，Ｅ２９４Ｑ）、▲２▼２９３位のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、及び２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、及び３０３位のＧｌｕ残基をＬｙｓ残基に置換する変異（Ｈ２９３Ｑ，Ｅ２９４Ｑ，Ｅ３０３Ｋ）、▲３▼２９３位のＨｉｓ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、及び２９４位のＧｌｕ残基をＧｌｎ残基に置換する変異、３０３位のＧｌｕ残基をＬｙｓ残基に置換する変異、３０７位のＡｓｎ残基をＳｅｒ残基に置換する変異、及び３０８位のＧｌｎ残基をＬｙｓ残基に置換する変異（Ｈ２９３Ｑ，Ｅ２９４Ｑ，Ｅ３０３Ｋ，Ｎ３０７Ｓ，Ｑ３０８Ｋ）、をそれぞれ導入した。
【００６８】
目的どおりの変異が導入されたことは、塩基配列決定により確認した。
【００６９】
＜４＞ＨＡ合成アッセイ
（１）ＦＬＡＧ−タグ標識ＨＡＳ発現ベクターのＣＯＳ−１細胞への導入
上記のようにして構築されたＦＬＡＧ−タグ標識ベクターを、ＣＯＳ−１細胞にエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。コントロールとして、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。エレクトロポレーションは、市販の装置（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ、バイオラッド社）を用い、装置のマニュアルに従って行った。トランスフェクトされた細胞は、１０％ウシ胎仔血清および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地で３７℃で３日間培養した。
【００７０】
（２）ＨＡ合成量の測定
培養した細胞から粗膜画分を調製し、０．２ｍｌの２５ｍＭ Ｈｐｅｐｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．１）、５ｍＭジチオスライトール、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（シグマ社）、０．１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＡ（Ｎａｋａｒａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）、および２．５μＣｉ ＵＤＰ−［14Ｃ］ＧｌｃＡ（２８．５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、デュポンＮＥＮ社）に懸濁させた。タンパク質量は、ＢＩＯ−ＲＡＤプロテインアッセイキット（バイオラッド社）を用いて定量した。ＨＡＳ活性は、  Ng, K.F. and Schwartzm, N.B. (1989) J. Biol. Chem., 264, 11776-11783に記載の方法を改変して測定した。すなわち、上記懸濁液を３７℃で１時間保温後、１ＴＲＵのストレプトマイセスヒアルロニダーゼ（生化学工業（株））を添加し、あるいは添加しないで、３７℃で１時間さらにインキュベートした。その後、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを添加して煮沸した。
【００７１】
放射活性を有するＨＡを、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０ｐｇ（ファルマシアバイオテック社）を用いたクロマトグラフィーにより分離した。溶出は、０．２Ｍ酢酸アンモニウムを用いて行い、１ｍｌづつ分画し、放射活性を測定した。ＨＡに取り込まれた放射活性を、ストレプトマイセスヒアルロニダーゼ感受性のカウントを計算することにより測定した。このＨＡに取り込まれた放射活性から、ＨＡＳ活性（ピコモル／分／μｇタンパク質）を算出した。Ｃｈｉｍ１〜Ｃｈｉｍ１６についての結果を図５に示す。また、Ｃｈｉｍ１７〜Ｃｈｉｍ２０、変異型ＨＡＳ２タンパク質、変異型ＨＡＳ３タンパク質、および、変異型ＨＡＳ１タンパク質のうちＨＡＳ１（Ｔ３３７Ｓ）及びＨＡＳ１（Ｔ３３７Ｓ，Ｈ３３８Ｋ）についての結果を図６に示す。さらに、残りの変異型ＨＡＳ１タンパク質についての結果を表３に示す。
【００７２】
【表３】
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細胞質ループ上にあるアミノ酸を別のアミノ酸に置換した変異型ＨＡＳタンパク質を用いた結果（表３、図６）において、変異型ＨＡＳタンパク質の野生型ＨＡＳタンパク質に対する相対活性が極端に低下していることにより、ＨＡＳの活性部位は、細胞質ループ上にあることが示された。
【００７３】
（３）ＨＡのアガロースゲル電気泳動
変異型ＨＡＳ１発現ベクターでトランスフェクトした細胞の溶解物を用いて合成された放射性標識ＨＡを、上記と同様にしてＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０ｐｇで分離した。放射活性ＨＡは、１ＴＲＵのストレプトマイセスヒアルロニダーゼ（生化学工業（株））を添加し、あるいは添加しないで、３７℃で１時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動で分画した。ＫｉｌｏＢａｓｅTM ＤＮＡマーカー（ファルマシアバイオテック社）を分子量マーカーに用いた。ゲルを乾燥させた後、放射活性ＨＡを、ＢＡＳ２０００II（富士フィルム社）で２日間露光後に検出した。結果を図７に示す。
キメラＨＡＳタンパク質及び変異型ＨＡＳタンパク質を用いて合成したＨＡを、上記と同様にして電気泳動し、分子量を測定した。その結果、ＨＡの分子量は、改変又は変異による合成活性の変化とは独立して、大きく異なっていた。
【００７４】
また、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２又はＨＡＳ３を用いて合成したＨＡを上記と同様にして電気泳動し、分子量を測定した。その結果、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３により合成されるＨＡの平均分子量は、それぞれ２０００ｋＤａ、１４００ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａであった。
【００７５】
【発明の効果】
本発明により、活性の低下又は増加したＨＡＳ改変タンパク質が得られる。
【００７６】
【配列表】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
0004173219.tif 000039
【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
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【００９９】
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【０１００】
0004173219.tif 000047
【０１０１】
0004173219.tif 000048
【０１０２】
0004173219.tif 000049
【０１０３】
0004173219.tif 000050
【０１０４】
0004173219.tif 000051
【０１０５】
0004173219.tif 000052
【０１０６】
0004173219.tif 000053
【０１０７】
0004173219.tif 000054
【０１０８】
0004173219.tif 000055
【０１０９】
0004173219.tif 000056
【０１１０】
0004173219.tif 000057
【０１１１】
0004173219.tif 000058
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨＡＳタンパク質構造と膜局在を示す模式図。
【図２】  ＨＡＳキメラタンパク質（Chim1〜16）の構造を示す模式図。
【図３】  ＨＡＳキメラタンパク質（Chim17〜20）の構造を示す模式図。矢印は、Ｂ領域間で置換されているフラグメントの両端を表す。
【図４】  変異型ＨＡＳタンパク質中の変異の位置を示す図。
【図５】  キメラタンパク質Ｃｈｉｍ１〜Ｃｈｉｍ１６のＨＡＳ活性を示すグラフ図。「ｍｏｃｋ」は、ブランクを表す。
【図６】  キメラタンパク質Ｃｈｉｍ１７〜Ｃｈｉｍ２０及び変異型ＨＡＳタンパク質のＨＡＳ活性を示すグラフ図。「ｍｏｃｋ」は、ブランクを表す。
【図７】  変異型ＨＡＳ１により合成されたＨＡの電気泳動の結果を示すオートラジオグラム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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