(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取された腹膜透析の透析液排液である検体中から第１および第２の指標物質を検出する指標物質の検出方法であって、
前記第１の指標物質は、前記検体を採取した生物において、少なくとも腹膜炎の発症時に、検出され、もしくは濃度の増大が確認されるマトリックスメタロプロテイナーゼ９であり、
前記第２の指標物質は、前記検体を採取した生物において、少なくとも腹膜肥厚の発症時に、検出され、もしくは濃度の増大が確認されるマトリックスメタロプロテイナーゼ２であり、
前記第１の指標物質と前記第２の指標物質とを分離して検出することのできる検出手段を用いることを特徴とする指標物質の検出方法。
【請求項２】
前記第１および第２の指標物質は、前記検体を採取した生物の腹膜のD/D0グルコース値と相関性を有するものである請求項１に記載の指標物質の検出方法。
【請求項３】
前記D/D0グルコース値が減少した場合には、前記第１および第２の指標物質の濃度は増加する傾向を有する請求項２に記載の指標物質の検出方法。
【請求項４】
前記第１および第２の指標物質は、体積が１mL以下の検体から検出可能である請求項１ないし３のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【請求項５】
前記腹膜透析の透析液排液は、腹膜透析の排液容器に回収された排液のサンプリング液である請求項１ないし４のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【請求項６】
採取した前記検体の濃度を調整してから前記第１および第２の指標物質の検出を行う請求項１ないし５のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【請求項７】
採取した前記検体の温度を調節してから前記第１および第２の指標物質の検出を行う請求項１ないし６のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【請求項８】
採取した前記検体の温度を常温またはそれ以下の温度に調節してから前記第１および第２の指標物質の検出を行う請求項１ないし７のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【請求項９】
前記第１および第２の指標物質の検出において、前記第１および第２の指標物質の分離とその可視化とを行う請求項１ないし８のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【請求項１０】
前記第１および第２の指標物質の検出は、電気泳動法により行う請求項１ないし９のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【請求項１１】
前記電気泳動に用いられるゲルは、前記第１および第２の指標物質を可視化するための基質を有する請求項１０に記載の指標物質の検出方法。
【請求項１２】
前記基質はゼラチンである請求項１１に記載の指標物質の検出方法。
【請求項１３】
前記第１および第２の指標物質の検出は、ザイモグラフィー法により行う請求項１ないし１２のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、採取した検体中の指標物質を検出する指標物質の検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
腎機能が低下もしくは喪失した患者に対して、人工透析が広く行われている。この人工透析は、本来腎臓が果たしている血液浄化作用を、腎臓に代わって行うものである。
【０００３】
人工透析としては、ダイアライザを含む血液体外循環回路を用いた血液透析の他に、腹膜透析が知られている。
【０００４】
腹膜透析では、腹膜で囲まれた腹腔内に浸透圧の高い腹膜透析液を貯留することによって、生体内の余分な水と老廃物を取り除く。すなわち、腹膜透析においては、腹腔内に貯留した腹膜透析液と体液との間に生じる浸透圧格差により、腹膜毛細血管から腹腔内の腹膜透析液に、生体内の余分な水が移動することにより、生体内の余分な水と老廃物が取り除かれる。
【０００５】
ところで、腹膜炎や、腹膜硬化症、腹膜線維症、硬化性腹膜炎、硬化性被嚢性腹膜炎（ＳＥＰ）等の疾病が、腹膜透析を行っている患者にみられることがある。
【０００６】
例えば、腹膜硬化症、腹膜線維症、硬化性腹膜炎、ＳＥＰ等が発症すると、腹膜肥厚が起き、除水能の低下が生じる場合がある。このような場合、透析効果が低下するおそれがある。
【０００７】
腹膜硬化症、腹膜線維症、硬化性腹膜炎、ＳＥＰ等が発症した場合には、患者の安全のためにも、病状が進行する前に、なるべく早期に的確な診断を行うことが好ましい。
【０００８】
例えば、ＳＥＰが発症した場合には、臨床的に、食欲不振、悪心、嘔気、嘔吐、低栄養による痩せ、腹痛、下痢、便秘、腸管蠕動音低下などの腸閉塞症状を示すことが知られている。また、剖検時所見では、小腸は、癒着して塊状になり、膠原性線維に富む肥厚した腹膜で包まれることが知られている。
【０００９】
現在、ＳＥＰの診断は、臨床症状の所見のほか、腹部の触診（塊状物の触知）により行われている。
【００１０】
しかし、かかる方法において、適切な診断を行うための客観的基準が確立されていないのが現状である。このため、かかる方法で適切に診断を行うためには、多くの経験を必要とし、経験豊富な医者以外の人間が適切に診断を行うことは困難である。また、診断の精度も低い。
【００１１】
また、一部では画像解析による診断も行われているが、コスト的にも時間的にも非経済的であり、あくまで補助診断の域を出ていない。
【００１２】
さらには、上記臨床症状が確認されるＳＥＰにおいてさえ、病状が進行した場合でも、典型的症状を起こさない場合がある。
【００１３】
一方、腹膜透析は、血液透析とは異なり、自宅や職場で行うことができ、通院の頻度が少なくてすむので、患者の社会復帰に貢献している。しかも、腹膜透析は、血液透析に比べて、循環系や生体内部環境へ与える影響が少ないといった利点を持っている。
【００１４】
したがって、腹膜硬化症、腹膜線維症、硬化性腹膜炎、ＳＥＰ、そして腹膜炎や腹膜肥厚等を早期かつ確実に診断できれば、腹膜透析をより安全に施行することができ、腎機能が低下もしくは喪失した患者に対して計り知れない利益をもたらすことができる。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、腹膜機能の検査、さらには腹膜炎や、例えば腹膜硬化症、腹膜線維症、硬化性腹膜炎、ＳＥＰ等に代表される腹膜肥厚などの診断を容易、的確に行えるようにする指標物質の検出方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
このような目的は、下記（１）〜（１３）の本発明により達成される。
【００１７】
（１）  採取された腹膜透析の透析液排液である検体中から第１および第２の指標物質を検出する指標物質の検出方法であって、
前記第１の指標物質は、前記検体を採取した生物において、少なくとも腹膜炎の発症時に、検出され、もしくは濃度の増大が確認されるマトリックスメタロプロテイナーゼ９であり、
前記第２の指標物質は、前記検体を採取した生物において、少なくとも腹膜肥厚の発症時に、検出され、もしくは濃度の増大が確認されるマトリックスメタロプロテイナーゼ２であり、
前記第１の指標物質と前記第２の指標物質とを分離して検出することのできる検出手段を用いることを特徴とする指標物質の検出方法。
【００１９】
（２）前記第１および第２の指標物質は、前記検体を採取した生物の腹膜のD/D0グルコース値と相関性を有するものである上記（１）に記載の指標物質の検出方法。
【００２０】
（３）  前記D/D0グルコース値が減少した場合には、前記第１および第２の指標物質の濃度は増加する傾向を有する上記（２）に記載の指標物質の検出方法。
【００２１】
（４）  前記第１および第２の指標物質は、体積が１mL以下の検体から検出可能である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【００３１】
（５）  前記腹膜透析の透析液排液は、腹膜透析の排液容器に回収された排液のサンプリング液である上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【００３２】
（６）  採取した前記検体の濃度を調整してから前記第１および第２の指標物質の検出を行う上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【００３３】
（７）  採取した前記検体の温度を調節してから前記第１および第２の指標物質の検出を行う上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【００３４】
（８）  採取した前記検体の温度を常温またはそれ以下の温度に調節してから前記第１および第２の指標物質の検出を行う上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【００３５】
（９）  前記第１および第２の指標物質の検出において、前記第１および第２の指標物質の分離とその可視化とを行う上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【００３６】
（１０）  前記第１および第２の指標物質の検出は、電気泳動法により行う上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【００３７】
（１１）  前記電気泳動に用いられるゲルは、前記第１および第２の指標物質を可視化するための基質を有する上記（１０）に記載の指標物質の検出方法。
【００３８】
（１２）  前記基質はゼラチンである上記（１１）に記載の指標物質の検出方法。
【００３９】
（１３）  前記第１および第２の指標物質の検出は、ザイモグラフィー法により行う上記（１）ないし（１２）のいずれかに記載の指標物質の検出方法。
【００４０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を好適実施例に基づいて詳細に説明する。
【００４１】
本発明は、検体を採取し、次いで該検体中から所定の指標物質を検出することを特徴とする。
【００４２】
本発明における指標物質とは、検体を採取した生物の腹膜機能の低下に関連して検出され、もしくは濃度の増大が確認される物質である。すなわち、本発明における指標物質とは、検体を採取した生物の腹膜の機能の低下に関連して、検体中から検出される物質、もしくは検体中において濃度の増大が確認される物質である。
【００４３】
腹膜機能の低下は、種々の原因によって起こるが、例えば、腹膜炎または腹膜肥厚を発症した際に起こる。
【００４４】
ここで、腹膜炎とは、腹膜の炎症のことをいい、本明細書で用いられる腹膜炎は、広く一般的に用いられている腹膜炎と同義である。
【００４５】
また、本明細書で用いられる腹膜肥厚とは、腹膜硬化症、腹膜線維症、硬化性被嚢性腹膜炎、硬化性腹膜炎等の腹膜疾患の総称であり、このような腹膜肥厚の発症時には、例えば、腹膜の厚さが増大する現象が観察される。
【００４６】
本発明者は、腹膜の機能が低下した生物から採取した検体について、調査、研究を重ねたところ、腹膜の機能が低下した時に、特に、腹膜炎または腹膜肥厚を発症したときに、検体中から特異的に検出される物質、および、検体中で濃度が増大する物質が存在することを発見した。
【００４７】
したがって、検体中からこのような物質、すなわち指標物質を検出し、同定することにより、腹膜の機能を調べることができ、さらには、腹膜炎や腹膜肥厚を診断するための客観的な判断材料を得ることができる。
【００４８】
本発明者は、腹膜の機能が低下した生物（特に腹膜炎や腹膜肥厚を発症した生物）から採取した検体について、多方面から調査、研究を重ねたところ、種々の指標物質を発見した。
【００４９】
このような指標物質の一例としては、タンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、例えば、プロテイナーゼ、ヌクレアーゼ、リガーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、フォスファターゼ、転写因子（例えばリプレッサー、アクチベーター、プロモーターなど）等の酵素、細胞増殖因子、サイトカインおよびそれらの受容体、免疫グロブリン（抗体）、細胞外マトリックス（フィブロネクチンなど）などが挙げられる。これらの中でも、検出の容易さと感度の観点からは、酵素、その中でも特に、各種のプロテイナーゼ、例えば、マトリックスプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼ、セリンプロテイナーゼ（プラスミン、トリプシン、ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ、カリクレイン等）、システインプロテイナーゼ（カテプシンＢ、Ｈ等）、アスパルティックプロテイナーゼ（カラプシン−Ｄ等）などが好ましい。
【００５０】
また、このような指標物質の一例としては、前述したようなタンパク質をコードする遺伝子（例えばｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ＤＮＡなど）、かかる遺伝子のオペレーター領域やプロモーター領域を含む遺伝子などの各種遺伝子が挙げられる。
【００５１】
また、このような指標物質の一例としては、前述したようなタンパク質（特に酵素）の活性を調節するエフェクター、前述したようなタンパク質（特に酵素）の活性を阻害するインヒビター（阻害物質）などの各種リガンド、前記プロテイナーゼにより切断分解された基質物質の断片が挙げられる。
【００５２】
また、このような指標物質の一例としては、プラスミノーゲンアクテベーターインヒビター（ＰＡＩ）、ティッシュインヒビターオブＭＭＰｓ（ＴＩＭＰ）などが挙げられる。
【００５３】
また、指標物質は、検体を採取した生物の腹膜組織の細胞外マトリックスの破壊もしくは再構築に関与している物質であることが好ましい。
【００５４】
例えば腹膜炎や腹膜肥厚の発症により腹膜機能が低下した時、その中でも特に腹膜肥厚の発症時には、腹膜組織において、細胞外マトリックスの破壊と新しい細胞外マトリックスの形成が行われることにより、腹膜組織の再構築が行われると考えられる。
【００５５】
このため、検体を採取した生物の腹膜組織の細胞外マトリックスの破壊もしくは再構築に関与している物質を指標物質とすると、腹膜機能を検査することができ、さらには、腹膜炎や腹膜肥厚の診断を行うことができる。しかも、このような物質を指標物質とすることにより、腹膜機能の低下のより詳細な原因を調べること、例えば、腹膜炎と腹膜肥厚のうち、どちらが発症したのかを調べることも可能となる。
【００５６】
さらには、指標物質は、検体を採取した生物の腹膜のD/D0グルコース値と相関性を有するもの、特にD/D0グルコース値の低下に先立って検出されるものであることが好ましい。ここで、D/D0グルコース値とは、所定のグルコース濃度D0（例えば２．５ W/V％）のグルコース含有腹膜透析液を生物の腹腔内に注液し、注液してから一定時間経過後（例えば９０分経過後）の腹膜透析液のグルコース濃度をD としたときに、D をD0で除した値をいう。
【００５７】
このような物質を指標物質として用いると、検体を採取した生物の腹膜機能をより簡便に検査することができ、さらには、腹膜組織に疾病等の異常が存在する場合には、その症状を判断する際の判断材料となる。しかも、このような物質を指標物質として用いると、腹膜炎や腹膜肥厚の診断を的確に行うことができるようになる。
【００５８】
その中でも特に、指標物質は、D/D0グルコース値が減少した場合には、指標物質の濃度は増加する傾向を有するものであることが好ましい。このような物質を指標物質として用いると、腹膜機能をより正確に行うことができ、さらには、腹膜炎や腹膜肥厚等の疾病の診断をより的確に行うことができるようになる。
【００５９】
このような観点を総合して考慮すると、指標物質としては、上述したものの中でも特に、マトリックスプロテイナーゼが好ましい。マトリックスプロテイナーゼは、腹膜機能の低下に関連して、特に、腹膜炎や腹膜肥厚の発症時に顕著に増大し、検出が特に容易である。しかも、この物質は、腹膜組織の細胞外マトリックスの破壊に関与していると考えられ、さらには、D/D0グルコース値が減少した場合には、それに先立って検体中でその濃度の増加を確認しやすい。したがって、指標物質としてマトリックスプロテイナーゼを用いることにより、腹膜機能の検査、さらには、腹膜炎や腹膜肥厚の診断をより簡単に行うことができる。
【００６０】
マトリックスプロテイナーゼとしては、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ７）、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）等のマトリックスメタロプロテイナーゼなどが挙げられる。
【００６１】
また、指標物質は、腹膜機能の低下の由来に応じた複数種の指標物質を含むこと（検体を採取した生物の腹膜の疾病に対応する指標物質を複数種類含んでいること）が好ましい。すなわち、指標物質は、腹膜において特定の疾病が発症したときに、検出、もしくは濃度の増大が確認される傾向を有する指標物質を複数種類含んでいることが好ましい。これにより、腹膜で発生した疾病の種類の判断が容易となる。
【００６２】
特に、指標物質は、少なくとも腹膜炎の発症時に、検出され、もしくは濃度の増大が確認される指標物質と、少なくとも腹膜肥厚の発症時に、検出され、もしくは濃度の増大が確認される指標物質とを含んでいることが好ましい。指標物質がこのような物質を含んでいると、検体を採取した生物で、腹膜炎、腹膜肥厚のうちのどちらが発症したのかを、指標物質を検出するだけで区別することが可能になる。しかも、指標物質がこのような物質を含んでいると、腹膜炎や腹膜肥厚について、より正確で詳しい診断をすることが可能となる。
【００６３】
少なくとも腹膜炎の発症時に、検出され、もしくは濃度の増大が確認される指標物質としては、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ９、約５０kDa のマトリックスメタロプロテイナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ２の二量体と考えられるものなどが挙げられる。なお、「約５０kDa のマトリックスメタロプロテイナーゼ」とは、例えば、後述するザイモグラフィー法（特にゼラチンザイモグラフィー法）により指標物質の検出を行った場合に、５０kDa 近傍にバンドとして検出されるプロテイナーゼをいい、また、「マトリックスメタロプロテイナーゼ２の二量体と考えられるもの」とは、例えば、後述するザイモグラフィー法（特にゼラチンザイモグラフィー法）により指標物質の検出を行った場合に、マトリックスメタロプロテイナーゼ２のほぼ２倍の分子量を示す位置に、バンドとして検出されるプロテイナーゼをいう（図３参照）。
【００６４】
少なくとも腹膜肥厚の発症時に、検出され、もしくは濃度の増大が確認される指標物質としては、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ２、マトリックスメタロプロテイナーゼ２よりもやや大きい分子量を有するプロテイナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ９よりも大きい分子量を有するプロテイナーゼなどが挙げられる。なお、「マトリックスメタロプロテイナーゼ２よりもやや大きい分子量を有するプロテイナーゼ」とは、例えば、後述するザイモグラフィー法（特にゼラチンザイモグラフィー法）により指標物質の検出を行った場合に、マトリックスメタロプロテイナーゼ２より少し高い分子量を示す位置に、バンドとして検出されるプロテイナーゼをいい、また、「マトリックスメタロプロテイナーゼ９よりも大きい分子量を有するプロテイナーゼ」とは、例えば、後述するザイモグラフィー法（特にゼラチンザイモグラフィー法）により指標物質の検出を行った場合に、マトリックスメタロプロテイナーゼ９より高い分子量を示す位置に、バンドとして検出されるプロテイナーゼをいう（図７参照）。
【００６５】
また、指標物質は、体積が１mL以下の検体から検出可能であることが好ましく、体積が０．１mL以下の検体から検出可能であることがより好ましく、体積が０．０１mL以下の検体から検出可能であることがさらに好ましい。このような物質を指標物質として用いると、少ない検体の量で指標物質の検出を行うことができる。これにより、本発明を行うに際して、採取する検体の量を少なくすることができる。
【００６６】
本発明に用いられる検体は、特に限定されないが、例えば、血液、リンパ液等の体液、尿等の排泄物、腹膜透析、血液透析等の透析液排液などが挙げられる。その中でも、本発明に用いられる検体は、透析液排液、特に、腹膜透析の透析液排液が好ましい。本発明者は、このような検体中から指標物質が特に検出されやすいことを発見した。したがって、このようなものを検体として用いると、指標物質の検出が容易となる。
【００６７】
腹膜透析の透析液排液としては、腹膜透析の排液容器（排液バッグ）に回収された排液から一部をサンプリングしたものを用いることが好ましい。排液容器は、腹膜透析を行っている患者の腹部に接続されたカテーテルから分離され、流路の閉鎖により遮蔽されるので、検体を採取するときに、当該患者の体内に細菌等が進入することがなく、かかる患者に感染症等が誘発することをより確実に防止することができる。
【００６８】
なお、検体を採取する方法は、公知のいずれの方法を用いてもよいが、腹膜透析の排液容器に回収された排液の一部をサンプリングする場合には、例えば、排液容器に設けられたサンプリングチューブから採取する方法、排液容器に連通するチューブの一部を融着により封止、切断して、かかるチューブ内に残存した排液を採取する方法などが挙げられる。
【００６９】
指標物質を検出する操作を行う前には、指標物質の検出を的確に行うため、検体量の調整を行うことが好ましい。特に、検体量の調整は、検体の体積を正確に秤量できる器具（例えばピペットマン、シリンジ等）を用いて行うことが好ましい。これにより、指標物質の検出をより正確に行うことができ、腹膜機能の検査、さらには、腹膜炎や腹膜肥厚等の診断をより正確に行うことができるようになる。
【００７０】
採取した検体から、指標物質を検出する際には、検体中から指標物質の分離とその可視化とを行うこと、すなわち、指標物質を検出する際には、指標物質を分離する操作と、指標物質を可視化する操作とを行うことが好ましい。これにより、検体中に不純物が多数存在する場合でも、指標物質を容易に検出することが可能となるとともに、指標物質をより正確に検出することができるようになる。したがって、指標物質の分離とその可視化とを行うことにより、腹膜機能の検査、さらには、腹膜炎や腹膜肥厚の診断をより正確に行うことができるようになる。
【００７１】
このような指標物質の検出方法（分離方法）としては、例えば、電気泳動法、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を用いたクロマトグラフィー法、指標物質を沈殿させる方法、マススペクトルを測定する方法、ＥＬＩＳＡ法等の各種免疫学的手法などが挙げられる。
【００７２】
この中でも特に、指標物質がタンパク質または遺伝子の場合には、電気泳動法を用いて指標物質の分離を行うと、少ない検体の量で、簡易かつ正確に指標物質の分離を行うことができる。
【００７３】
また、電気泳動に用いられるゲルは、指標物質がタンパク質の場合には、ポリアクリルアミドを含有していることが好ましい。電気泳動に用いられるゲルがポリアクリルアミドを含有していると、指標物質の分離能が向上する。
【００７４】
また、電気泳動に用いられるゲルは、指標物質がタンパク質の場合には、ＳＤＳ等の界面活性剤を含有していることが好ましい。これにより、指標物質の検出をより正確に行うことができる。
【００７５】
指標物質を可視化する方法としては、例えば、指標物質を染色する方法、指標物質を蛍光物質でラベルして蛍光を確認する方法、指標物質を発色基質（アルカリフォスファターゼ、ＨＰＲ等）を用いてラベルして確認する方法、指標物質を放射性物質でラベルして放射線の有無を確認する方法、指標物質の可視光、紫外線または赤外線等の吸収を測定する方法、指標物質の活性を測定する方法、指標物質のマススペクトルを測定する方法などが挙げられる。さらには、指標物質を可視化する方法としては、例えば、前述したような方法で可視化可能な物質を、指標物質に吸着、結合または反応させることにより指標物質を可視化する方法などが挙げられる。
【００７６】
さらには、指標物質を含む物質群だけが可視化される方法により指標物質の検出を行うと、指標物質を好適に検出することができる。特に、指標物質の検出を電気泳動法により行う場合には、電気泳動に用いられるゲルは、指標物質を可視化するための基質、特に、指標物質の可視化を促し、指標物質以外の物質の可視化を起こりにくくするような基質を含んでいることが好ましい。これにより、電気泳動後、指標物質の可視化を行った際に、指標物質の確認が容易となる。このため、腹膜機能の検査、さらには、腹膜炎や腹膜肥厚をより正確に診断できるようになる。
【００７７】
例えば、指標物質がマトリックスプロテイナーゼ等のプロテイナーゼの場合には、電気泳動法を利用するザイモグラフィー法により指標物質の分離とその可視化を行うと、好適に検出を行うことができる。これは、ザイモグラフィー法によりプロテイナーゼの検出を行うと、プロテイナーゼ以外の不純物が検出されにくいので、より正確に指標物質を検出することができることによる。
【００７８】
ザイモグラフィー法に用いられるゲルは、前記と同様の理由から、ポリアクリルアミドを含有していることが好ましい。また、ザイモグラフィー法に用いられるゲルは、前記と同様の理由から、ＳＤＳ等の界面活性剤を含有していることが好ましい。
【００７９】
また、ザイモグラフィー法に用いられるゲルは、プロテイナーゼの検出をより好適に行うため、例えば、ゼラチン、カゼイン、エラスチン、フィブリンなどの指標物質を可視化するための基質を含有していることが好ましい。
【００８０】
なお、指標物質がプロテイナーゼであり、その検出を電気泳動法またはザイモグラフィー法により行う場合で、かつ、かかる方法に用いられるゲルが、指標物質を可視化するための基質を含有している場合には、かかる基質の濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１ W/V％程度が好ましく、０．０５〜０．５ W/V％程度がより好ましい。基質の濃度をこの範囲とすると、指標物質の検出をより好適に行うことができる。
【００８１】
また、指標物質がマトリックスプロテイナーゼであり、その検出を電気泳動法またはザイモグラフィー法により行う場合で、かつ、かかる方法に用いられるゲルがポリアクリルアミドを含有している場合には、ポリアクリルアミドの含有量は、２〜３０ W/V％程度であることが好ましく、５〜１５ W/V％程度であることがより好ましい。ポリアクリルアミドの含有量がこの範囲内であると、マトリックスプロテイナーゼの検出をより正確に行うことができる。
【００８２】
また、指標物質がマトリックスプロテイナーゼであり、その検出を電気泳動法またはザイモグラフィー法により行う場合で、かつ、かかる方法に用いられるゲルが界面活性剤を含有している場合には、かかる界面活性剤の含有量は、０．０００１〜１５ W/V％程度であることが好ましく、０．０１〜５ W/V％程度であることがより好ましい。界面活性剤の含有量がこの範囲内であると、マトリックスプロテイナーゼの検出をより正確に行うことができる。
【００８３】
また、指標物質がＤＮＡの場合には、ＤＮＡの増幅を行ってから、指標物質の検出を行ってもよい。ＤＮＡを増幅する方法としては、例えば、ＰＣＲ法、ＤＮＡをクローニングする方法などが挙げられる。
【００８４】
また、指標物質がｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等のＲＮＡの場合には、逆転者酵素を用いてＲＮＡのｃＤＮＡを合成し、かかるｃＤＮＡを検出してもよい。
【００８５】
なお、指標物質の検出を行う際には、採取した検体の濃度を調整してから指標物質の検出を行ってもよい。これにより、指標物質の検出に適した条件に検体を調整することができ、指標物質の検出をより正確に行うことができる。
【００８６】
検体の濃度を調整する方法としては、例えば、検体を希釈する方法、検体を濃縮する方法などが挙げられる。
【００８７】
検体を希釈する場合には、希釈に用いる液は、検体の検出に適したｐＨに調整しておくことが好ましい。これにより、検体をより正確に検出することができる。
【００８８】
このようなｐＨとしては、特に限定されないが、指標物質がプロテイナーゼの場合、３〜１１程度が好ましく、５〜９程度がより好ましい。
【００８９】
また、指標物質がタンパク質であり、かつ、指標物質の検出を電気泳動法またはザイモグラフィー法により行う場合で、かつ、かかる検出を行う前に検体を希釈する場合には、希釈に用いる液は、ＳＤＳ等の界面活性剤を含有していることが好ましい。これにより、指標物質の検出をより正確に行うことができる。
【００９０】
また、かかる場合には、界面活性剤の含有量は、０．０００１〜２０ W/V％程度であることが好ましく、０．０１〜１０ W/V％程度であることがより好ましい。界面活性剤の含有量がこの範囲内であると、指標物質の検出をより正確に行うことができる。
【００９１】
なお、指標物質の検出を行う際には、採取した検体の温度を所定の温度に調節してから指標物質の検出を行ってもよい。その利点は種々あるが、指標物質の検出に適した条件に調整することができ、指標物質の検出をより正確に行うことができるという利点が大きい。
【００９２】
例えば、採取した検体の温度を常温またはそれ以下の温度（例えば０〜２５℃）に調節しておいてから指標物質の検出を行うことにより、指標物質の検出をより正確に行うことができる。
【００９３】
【実施例】
以下の実施例における濃度を示す「％」は、特に明示のない限り W/V％を意味する。
【００９４】
１．指標物質と腹膜炎および腹膜機能との相関
［１．１］腹膜炎の発症
【００９５】
実験動物に、腹膜炎を発症させた。
まず、実験動物として、SPF/VAF ラット（Crj:CD (SD) IGS 、６週齡、n=4 、オス）を用意した。
【００９６】
次に、ラットにエーテル麻酔を施した後、腹部に腹膜透析液を注排液できるように、シリコンカテーテルを留置した。
【００９７】
次に、腹膜透析を行った。このとき、ラットには、腹膜透析液を、ラット体重当たり５０mL/kg 注液した。また、腹膜透析液は１日１回、留置したシリコンカテーテルを介して交換した。なお、腹膜透析液には、ペリトリック１３５（テルモ社製）を使用した。また、本実験中、ラットへは、餌および水を十分量供給した。
【００９８】
腹膜透析を継続的に行った結果、腹膜透析開始１０日目位から、全てのラットがカテーテル部位におけるトンネル感染によって、腹膜炎を発症した。腹膜炎の発症は、透析排液中の顆粒球の著しい増加により判断した。腹膜炎の原因を解明するため、透析排液中の細菌検査をした結果、Pseudomonas maltophilia が同定された。本菌が腹膜炎の原因である可能性が高いと考えられる。
【００９９】
腹膜炎発症後３日目から、抗生物質であるビクシリン（商品名：明治製菓（株）製）を腹膜透析液に混ぜて腹膜透析を続けた。
【０１００】
さらに腹膜炎発症後２０日目に、ラットの壁側腹膜をサンプリングした。採取した腹膜を１０％ホルマリン中性緩衝液で固定した後、パラフィン包埋し、病理解析を行った。この結果、腹膜炎発症後２０日が経過しても腹膜肥厚は認められず、軽度の腹膜中皮細胞の増殖と極軽度の腹膜中皮細胞の立方化のみが観察された。このときの腹膜のパラフィン切片病理像を、図1に示す。
【０１０１】
［１．２］腹膜機能評価試験
腹膜炎発症時の腹膜機能を解析するため、上記［１．１］の実験において、腹膜透析開始１日目、および、腹膜炎発症後５日目に、ラットの腹膜機能を調べた。
【０１０２】
腹膜機能は、腹膜におけるグルコース透過性、すなわち、D/D0グルコース値にて評価した。D/D0グルコース値を算出するための試験は以下のようにして行った。
【０１０３】
まず、ラット体重当たり５０mL/kg の２．５％グルコース含有腹膜透析液（テルモ社製：「ペリトリックＰ２５０」）をラットの腹腔内に注液し、次いで、０分後、３０分後、６０分後、１２０分後、２４０分後に、腹腔内に注液した腹膜透析液を０．５mLずつ採取した。
【０１０４】
次に、採取した各試料のグルコース濃度（D ）を求め、これを腹腔内注液時の腹膜透析液中のグルコース濃度（D0）で除することにより、D/D0グルコース値を算出した。なお、グルコース濃度はムロターゼ酵素法により測定した。
この結果を図２に示す。
【０１０５】
図２に示すように、腹膜炎発症後５日目には、ラットの腹膜のグルコース透過性が著しく亢進していた。これにより、腹膜炎発症後５日目には、腹膜機能が低下していることが確認された。
【０１０６】
［１．３］透析液排液中からの指標物質の検出
上記［１．１］の実験で得られた透析液排液を検体として、指標物質の検出を行った。
【０１０７】
指標物質を検出するために、上記［１．１］の実験で得られた腹膜炎が発症した初日および発症後１、３、５日目の透析液排液に対して、ゼラチンザイモグラフィー法（電気泳動法）を行った。また、比較例として上記［１．１］の実験で得られた腹膜炎発症前の透析液排液に対しても、ゼラチンザイモグラフィー法を行った。その方法を以下に詳述する。
【０１０８】
まず、上記［１．１］の実験で得られた透析液排液（排液容器に回収した）からサンプリングした検体を、常温（２０℃）の電気泳動用緩衝液（０．０９Ｍトリス塩酸（pH６．８）／３％ＳＤＳ／１０％グリセロール／ブロムフェノールブルー）で１００倍希釈した。これにより、検体の温度は常温に調節された。また、比較例についても同様に検体を調整し、以下の実験を本実施例と同様に行った。
【０１０９】
次に、この電気泳動用緩衝液で希釈した透析液排液をピペットマンで１０μL 採取し、これをポリアクリルアミドゲル（１４％ゼラチン／０．１％ＳＤＳ／１０％ポリアクリルアミド）にて電気泳動を行った。電気泳動用緩衝液（ランニングバッファー）は、０．０２５Ｍトリス塩酸／０．１９Ｍグリシン／０．００１％ＳＤＳの組成で調製した。
これにより、指標物質が分離された。
【０１１０】
電気泳動終了後、５０mMトリス塩酸（pH７．５）／０．１Ｍ塩化ナトリウム／２．５％Triton X-100溶液（リナチュレーションバッファー）に泳動済みのゲルを浸し、４５回／分で１．５時間振盪した。
【０１１１】
次に、このゲルを蒸留水で３回洗浄し、続いて５０mMトリス塩酸（pH７．５）／１０mM塩化カルシウム溶液（リアクションバッファー）に浸し、３７℃で１８時間反応させた。
【０１１２】
反応終了後、このゲルを蒸留水で３回洗浄したのち、染色液（１．２５％クマシーブリリアントブルーR-250 ／４５％エタノール／１０％酢酸水溶液）に２０分間浸して染色を行った。
【０１１３】
染色後、第１の洗浄液（２５％エタノール／８％酢酸水溶液）でゲルを洗浄し、次いで第２の洗浄液（５％エタノール／７．５％酢酸水溶液）でゲルを洗浄し、最後に蒸留水でゲルを洗浄した。
【０１１４】
これにより、指標物質がゲル（ザイモグラフィー）内で可視化された。
得られたザイモグラフィー法による結果を図３に示す。
【０１１５】
得られたザイモグラフィーを観察した結果、図３に示すように、腹膜炎の発症時にはマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）の濃度の著しい増加が見られた。さらに、腹膜炎発症前には全く確認されなかった約５０kDa のマトリックスメタロプロテイナーゼも全ての個体で腹膜炎を発症した当日に観察された。また、ＭＭＰ９よりも高分子のプロテイナーゼ等も見られた。この物質も指標物質となり得る。
【０１１６】
これに対して、腹膜炎が発症しても、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）の濃度は、ほとんど変化しなかった。
【０１１７】
２．指標物質と腹膜肥厚および腹膜機能との相関
［２．１］腹膜肥厚の発症
【０１１８】
［２．１．１］腹膜肥厚の発症方法
次の［２．１．２］に記載の実験を説明するに先立って、腹膜肥厚の発症方法（腹膜肥厚を発症させる方法）について、まず説明する。
【０１１９】
この腹膜肥厚の発症方法は、実験動物の腹腔内に腹膜肥厚を誘発させる誘発物質を投与することにより腹膜肥厚を発症させるものである。これにより、実験動物に腹膜肥厚を人為的に発症させることができる。
【０１２０】
誘発物質としては、例えば、タルク等の鉱物（ケイ酸塩鉱物）、グルコン酸クロルヘキシジン等の糖酸化物誘導体などが挙げられる。
【０１２１】
誘発物質の投与量は、腹膜肥厚のみを高確率で発生させる観点からは、実験動物の体重あたり、鉱物の場合０．００１〜１０g/kg程度が好ましく、０．０１〜１g/kg程度がより好ましく、糖酸化物誘導体の場合０．０００１〜１g/kg程度が好ましく、０．００１〜０．１g/kg程度がより好ましい。
【０１２２】
なお、誘発物質は、腹腔内に、直接投与してもよいし、腹膜透析液等に添加して、腹膜透析を行いつつ投与してもよい。
【０１２３】
［２．１．２］腹膜肥厚の発症
実験動物に、腹膜肥厚を発症させた。
【０１２４】
まず、実験動物として、SPF/VAF ラット（Crj:CD (SD) IGS 、８週齡、n=4 、オス）を用意した。
【０１２５】
このラットを複数の群、具体的には、７％ＧＳＰ投与群と、感染症群と、グルコン酸クロルヘキシジン投与群と、タルク投与群と、コントロール群とに分けた。
そして、この分けた各群に対し、以下のような操作を行った。
【０１２６】
７％ＧＳＰ投与群には、７％グルコースを含む腹膜透析液（電解質組成はテルモ社製「ペリトリック」と同様）１５mLを、ラットの腹腔内に投与した。
【０１２７】
感染症群には、Pseudomonas maltophilia をＬＢ培地（１％バクトトリプトン／５％イーストエキストラクト／１％塩化ナトリウム／pH７．２）で一晩培養おこなった後、回収した菌体を１５mLの生理食塩水（テルモ社製）に懸濁したもの（1／100希釈）をラットの腹腔内に投与した。
【０１２８】
グルコン酸クロルヘキシジン投与群には、０．１％グルコン酸クロルヘキシジン／１５％エタノール水溶液３mLをラットの腹腔内に投与した。
【０１２９】
タルク投与群には、１ｇのタルクを１５mLの生理食塩水（テルモ社製）で懸濁したした後、これをラットの腹腔内に投与した。
【０１３０】
これらの投与群は、タルク投与群を除き、５日間連続投与／２日間休息のスケジュールで３週間連続投与を行った。タルク投与群は、投与後６日間休息させるサイクルで３サイクル行った。なお、上記物質のラットの腹腔内への投与は、注射筒を用い、注射により行った。また、本実験中、ラットへは、餌および水を十分量供給した。
また、コントロール群として無投与群を設けた。
【０１３１】
そして、各群ともに、実験開始後２２日目に壁側腹膜を採取し、腹膜病理解析を行った。すなわち、採取した腹膜を、前記と同様にして、ホルマリン緩衝液で固定した後、パラフィン包埋し、腹膜の組織像の解析を行った。
【０１３２】
解析を行った壁側腹膜病理切片像を図４、５に示す。なお、図４、５において、矢印は、腹膜の厚さを表している。また、図４中ａは７％ＧＳＰ投与群の、図４中ｂはグルコン酸クロルヘキシジン投与群の、図５中ｃはタルク投与群の、図５中ｄは感染症群の壁側腹膜病理切片像をそれぞれ示している。
【０１３３】
この解析を行った結果、図４、５に示すように、グルコン酸クロルヘキシジン投与群、およびタルク投与群にのみ線維性マトリックスに富んだ著しい腹膜肥厚が確認された。同時に、マクロファージ等の浸潤も観察された。
【０１３４】
特に、グルコン酸クロルヘキシジン投与群のラットの壁側腹膜では、腹膜中皮細胞の脱落がみられ、腹膜硬化を起こしていた。さらに詳しく調べたところ、このラットでは、腸管や肝臓は、肥厚した腹膜に癒着して包まれており、被嚢性腹膜硬化を起こしていた。
【０１３５】
一方、７％ＧＳＰ投与群、感染症群およびコントロール群では、腹膜肥厚はみられなかった。
【０１３６】
［２．２］腹膜機能評価試験
腹膜肥厚発症時の腹膜機能を解析するため、上記［２．１．２］の実験において、実験開始２２日目に、ラットの腹膜機能を調べた。
【０１３７】
腹膜機能は、腹膜におけるグルコース透過性、すなわち、D/D0グルコース値にて評価した。D/D0グルコース値を算出するための試験は以下のようにして行った。
【０１３８】
１７mLの２．５％グルコース含有腹膜透析液（テルモ社製：「ペリトリックＰ２５０」）をラットの腹腔内に、前記と同様に投与し、次いで、９０分後に腹腔内に注液した腹膜透析液を０．５mL採取した。
【０１３９】
なお、グルコース濃度およびD/D0グルコース値の算出は上記［１．２］と同様にして行った。
この結果を図６に示す。
【０１４０】
図６に示すように、７％ＧＳＰ投与群では、コントロール群に比べて腹膜機能が若干低下しており、感染症群では、腹膜機能がさらに低下していた。
【０１４１】
さらに、腹膜肥厚が観察されたグルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群では、７％ＧＳＰ投与群、感染症群、コントロール群に比べて著しく腹膜機能が低下していた。
【０１４２】
［２．３］排液中からの指標物質の検出
上記［２．２］の実験で腹腔から得られたそれぞれのラットの腹膜透析液の排液を検体として、指標物質の検出を行った。
【０１４３】
指標物質を検出するために、上記［２．２］の実験で、実験開始２２日目の各ラットの腹腔内から採取した試料（腹膜透析液）に対して、ゼラチンザイモグラフィー法（電気泳動法）を行った。その方法を以下に詳述する。
【０１４４】
まず、上記［２．２］の実験で得られた試料を、前記［１．３］と同様の電気泳動用緩衝液で２００倍希釈した。これにより検体の温度は常温に調節された。
【０１４５】
次に、この電気泳動用緩衝液で希釈した試料をピペットマンで１０μL 採取し、これを前記［１．３］と同様にしてポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。
これにより、指標物質が分離された。
【０１４６】
次に、前記［１．３］と同様にして指標物質の可視化を行った。
得られたザイモグラフィー法による結果を図７に示す。
【０１４７】
得られたザイモグラフィーを観察した結果、図７に示すように、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群では、７％ＧＳＰ投与群、感染症群およびコントロール群に比べて、顕著にマトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）が増加していた。すなわち、腹膜肥厚を起こした群では、ＭＭＰ２の著しい増加が確認された。
【０１４８】
また、これら腹膜肥厚を示した群ではＭＭＰ２以外にも特異的なマトリックスプロテイナーゼがみられたが、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）はほとんど確認されなかった。
【０１４９】
３．まとめ
以上の結果から、腹膜炎を発症し、腹膜機能が低下したときには、マトリックスメタロプロテイナーゼ９の増加が見られることが確認された。
【０１５０】
また、腹膜肥厚を発症し、腹膜機能が低下したときには、マトリックスメタロプロテイナーゼ２の増加が見られることが確認された。
【０１５１】
さらには、検体を採取した生物のD/D0グルコース値が低下したときには、マトリックスプロテイナーゼが増大する傾向を有することが確認された。
【０１５２】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、検体を採取した生物の腹膜機能を容易に検査することができる。
【０１５３】
しかも、本発明によれば、指標物質の検出を行うだけでよいので、かかる検査を簡単に行うことができ、その精度も高い。
【０１５４】
さらには、本発明によれば、腹膜炎、腹膜肥厚等の腹膜に発症した疾病を診断するに際し、客観的な判断材料を得ることができる。
【０１５５】
特に、指標物質が、検体を採取した生物の腹膜の疾病の状態に対応する指標物質を複数含んでいると、腹膜に発症した疾病の種類を特定することが容易となる。
【０１５６】
例えば、指標物質にマトリックスメタロプロテイナーゼ２とマトリックスメタロプロテイナーゼ９とを用いることにより、腹膜炎と腹膜肥厚とを区別して診断することが可能となる。
しかも、これらの疾病の早期診断が可能となる。
【０１５７】
また、本発明によれば、検体が少量の場合でも指標物質を検出することができる。
【０１５８】
また、透析液排液を検体とすれば、指標物質を採取するために特別な操作を行う必要がなく、しかも、検体を採取する生物に対し、特別の処置を施す必要がないので、検体を採取する生物への負荷も少ない。特に、腹膜透析の透析液排液を検体とすれば、患者等が自ら、自宅等で検体を採取することも可能となり、検体の採取が非常に容易となる。
【０１５９】
さらには、検体として、腹膜透析の排液容器に回収された排液をサンプリングすれば、患者へ感染症等を引き起こす恐れもない。
【０１６０】
また、電気泳動法またはザイモグラフィー法により指標物質を検出することにより、指標物質の検出がより簡易かつ正確となる。
【０１６１】
以上のような利点を本発明は有しているので、本発明を用いることにより、腹膜透析を行う際には、その安全性を高めることができ、腎機能が低下もしくは喪失した患者に対して計り知れない利益をもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】生物の形態を示す写真である。
【図２】本発明の実施例におけるD/D0グルコース値の経時変化を示すグラフである。
【図３】ザイモグラフィーの写真である。
【図４】生物の形態を示す写真である。
【図５】生物の形態を示す写真である。
【図６】本発明の実施例におけるD/D0グルコース値を示すグラフである。
【図７】ザイモグラフィーの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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