(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列：
Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thrから成るペプチドを唯一の医薬活性成分として含んでなる、HLA-DR2ハプロタイプを有する患者における多発性硬化症の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
前記のペプチドおよび医薬として許容されるキャリアーから成る請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
静脈内、鞘内又は両者の組み合わせで投与される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
単位投与形で１mg/kg体重〜10mg/kg体重のペプチドの投与量で静脈内投与することが出来るのに十分なペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
単位投与形で１mg〜100mgの投与量で鞘内投与することが出来るのに十分なペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記HLA-DR2ハプロタイプがDRB1*1501又はDRB1*15021を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記患者が慢性進行性多発性硬化症を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、選択されたポリペプチド類及びヒトミエリン塩基性タンパク質に対する抗体の免疫調節へのそれらの使用に関する。本発明はまた、それらの選択されたポリペプチドを含む新規医薬組成物、及び多発性硬化症の治療のためへのそれらのペプチドの使用方法にも関する。
背景及び従来技術
多発性硬化症（Multiple Sclerosis）（MS）は、炎症に関連するヒト中枢神経系（CNS）の多病巣性脱髄病（multifocol demyelinating disease）である。高められた血液−脳バリヤー内（BBB内）IgG合成がMSの顕著な特徴である（Tourtelotte, W. W., J Neurol Sci 10: 279-304, 1970; Link, H. and Tibbling, G., Scand J Clin Lab Invest 37: 397-401, 1977; Tourtelotte, W. W. and Ma, B., Neurology 28: 76-83, 1978; Walsh, J. M. and Tourtelotte, W. W., In: Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds. Multiple sclerosis. Baltimore. Williams & Wilkins, 1982: 275-358; 及びWarren, K. G., and Catz, I. Ann Neurol 17: 475-480, 1985）。
BBB内でのIgG合成は一般的に、活性又は不活性疾病を伴って、臨床学的に明確なMS患者において高められる（Schumacher, G. A., Beebe, G., Kibler R. E., など., Ann. NY Acad Sci 15: 266-272, 1965）。CNS IgGの大部分の特異性は未知である。小割合が抗ウィルス活性を有し、又は脳抗原、核酸、赤血球もしくは平滑筋抗原に対して反応するが、その非特異的部分がＢ−細胞のポリクローナル活性化を表わすことができる（Tourtelotte, W. W., and Ma, B., Neurology 28: 76-83, 1978）。過去10年間、特定のミエリンタンパク質に対する抗体の研究に相当の興味が払われて来た。
ミエリン塩基性タンパク質（MBP）を抗原性成分として含む循環性免疫複合体の検出（Dasgupta, M. K., Catz, I. Warren, K. G. など., Can J Neurol Sci 10: 239-243, 1983）に続いて、MBPに対する高力価の抗体（抗−MBP）が活性形MSを有する患者の脳脊髄液（CSF）に観察された（Warren, K. G. and Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986）。臨床学的に、MSは、疾病活性、たとえば急性再発又は慢性進行の期間により、及び臨床学的緩解の期間により特徴づけられる。活性形MSは高められたレベルの鞘内生成された抗−MBPに関連している（Warren, K. G. and Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986;及びCatz, I. and Warren, K. G., Can J Neurol Sci 13: 21-24, 1986）。それらの抗体は、急性再発の間、遊離（Ｆ）形で、及び疾病が潜行的に進行性である場合、結合された（Ｂ）形で主に見出される（Warren, K. G. and Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986）。急性再発の間、CSF抗−MBP力価は、疾病活性と相互関係している（Warren, K. G. and Catz, I., Ann Neurol 21: 183-187, 1987）。抗−MBPレベルはまた、視神経炎の最初の攻撃を有する患者において、及びMSの最初の攻撃を経験しているほとんどの患者において高められた（Warren, K. G., Catz, I., and C. Ann Neurol 23: 297-299, 1988; Warren, K. G. and Catz, I., J Neurol Sci 91: 143-151, 1989）。
急性再発に続く回復期に入っている患者におけるCSF抗−MBPレベルの長期間の動態研究は、Ｂ画分における進行性上昇と共にＦ抗−MBP力価の徐々の低下を示した（Warren, K. G. and Catz, I., J Neurol Sci 91: 143-151, 1989; Warren, K. G. and Catz, I., J. Neurol Sci 88: 185-194, 1988）。緩解期においては、MSの不活性期に関連する抗−MBPの中和を示すCSF抗−MBPが検出できなくなる（Warren, K. G. and Catz, I., J Neurol Sci 88: 185-194, 1988）。対照的に、長期間にわたっての高められた抗−MBPの存続により特徴づけられる慢性−進行性MSは、抗−MBP中和の阻害に関連していた（Warren, K. G. and Catz, I., J Neurol Sci 88: 185-194, 1988）。最近、MS患者のCSFから精製されたIgG画分に同定されるミエリン塩基性タンパク質抗体カスケドは、抗−MBP、抗−MBPを中和する抗体、及び抗−MBP中和を阻害する抗体を含んだ（Warren, K. G. and Catz, I., J Neurol Sci 96: 19-27, 1990）。
本発明者のこれまでの研究は、少なくとも２種の別個のMS形が存在するＢ−細胞自己免疫の観点から示しており、すなわちミエリン塩基性タンパク質に対する自己抗体（抗−MBP）を有する大部分の患者及びタンパク脂質タンパク質に対する抗体（抗−PLP）を有する少ない数の患者が存在する（Warren, K. G. など., Ann. Neurol. 35, 280-289, 1994）。抗−MBP関連MSにおいては、急性再発は、高められた（１以上）遊離（Ｆ）／結合された（Ｂ）抗−MBP比に関連しているが、慢性進行性期は１に等しいか又はそれ以下のＦ／Ｂ抗−MBP比により特徴づけられ、そして緩解の患者は適度に高められたＢ抗−MBP力価を有する（Warren, K. G. and Catz, I., J. Neurol. Sci. 88, 185-194, 1989）。
MS患者における増殖性Ｔ−細胞のいくらかがMBPに対して向けられ（Allegrettaなど., Science, 247, 718-721, 1990）、そしてヒトＴ−細胞が分子上の複数のエピトープを認識できる（Richertなど., J. Neuroimmun 23, 55-66, 1989）ことが示されている。MBPはまた、抗原提示細胞の関与なしに、いくらかのＴ−細胞を活性化できると思われる（Altmanなど., Eur. J. Immun. 17, 1635-1640, 1987）。MBPの小さなペプチドが、存在する細胞の表面上のクラスII主要組織適合性抗原を結合するそれらの能力のみにより、細胞内プロセッシングのための必要性なしに、Ｔ−細胞により認識され得ると思われる。
実験的なアレルギー性脳脊髄炎（EAE）、すなわちMSの許容される動物モデルは、フロイント完全アジュバントと共にMBP又はPLPのいずれかにより許容できるゲッ歯動物を接種することによって誘発されるので、MS脱髄の過程は、自己免疫機構を有することができる（Fritz, R. B.など., J. Immunol. 130, 1024-1026, 1983; Trotter, J. L. など., J. Neurol. Sci. 79, 173-188, 1987）。Ｂ−細胞自己抗体の観点から、疾病過程により標的化されたMBPエピトープは、残基80〜100の間の領域側のtri−Prolil配列（残基−99−100−101−）に隣接して位置している（Warren, K. G. など., Am. Neurol. 35. 280-289, 1994）。このＢ−細胞エピトープは、MBPに対して反応性のＴ細胞のための免疫優性エピトープとオーバーラップし、これらは、MS脳損傷に見出される（Oksenberg, J. R. など., Nature, 362, 68-70, 1993）。
これまでの研究は、抗−MBPがMBPにより中和されることを示している。しかしながら、異種MBPの筋肉内又は皮下投与によりMSを治療するこれまでの試みは成功してはいない（Campbell, B., Vogel, R. J., Fisher, E. and Lorenz, R., Arch Neurol 29: 10-15, 1973; Gonsette, R. E., Delmotte, P. and Demonty, L., J Neurol 216: 27-31, 1977; 及びRomine, J. S. and Salk, J., In: Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds. Multiple sclerosis. Baltimore, Williams & Wikins, 1982: 621-630）。生来のMBPを用いることに関する問題は、２重である。第１に、そのタンパク質はヒト脳サンプルから調製され、そして従って、潜伏する神経ウィルスがサンプルに存在する可能性ある危険性が存在する。第２に、可溶性MBPは、通常は免疫原でないが、変更された免疫系を有する個人に投与される場合、可溶性MBPが抗原として作用し、そしてMBPに対する抗体の生成を引き起こすと思われる。
従って、本発明は、MS患者のCSFから精製された抗−MBPがヒトMBP（ｈ−MBP）の選択された可溶性ペプチドにより中和され得るかどうかを決定する。このためには、ｈ−MBPの全長をカバーする可溶性合成ペプチドが、それらの患者から得られた抗−MBPを中和するｈ−MBPに対する可能なエピトープ範囲を決定するために使用された。従って、抗−MBPの中和を示す選択された可溶性ペプチドが、完全な分子よりも、より効果的にMSを治療するために使用され得る。それらの可溶性ペプチドは合成的に生成され、そして神経ウィルスの可能性ある脅威がそれ自体、存在しない。さらに、それらの小さな大きさのために、それらのペプチドは免疫原として作用しないであろう。従って、MSのための処理としての選択されたペプチドの使用は、生来のタンパク質を用いることに関する問題を克服するであろう。
さらに、本発明のペプチドは、インビボでのMS抗−MBPの結合、又は生成の調節におけるそれらの有効性を決定するために研究された。
発明の要約
本発明によれば、ヒトミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸配列の一部に対して配列的に実質的に相同であるペプチドが提供される。それらのペプチドは、抗−MBPを中和し、又はその生成を調節することができる。
本発明によれば、前記ペプチドは、下記式：
R1-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R2
〔式中、Ｒ1及びＲ2は、水素、ヒドロキシ、アミノ酸の残基、及びポリペプチドの残基から成る群から独立して選択され；但し、Ｒ1及びＲ2は両者が同時に水素又はヒドロキシであることはない〕で表わされるペプチド及びその塩である。前記ペプチドは、抗−MBPの中和又はその生成の調節の機能をそのペプチドが維持する限り、その置換、欠失又は付加を含むことができる。
前記ペプチドの例は、下記から選択される：
MBP75-95
Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
MBP64-78
Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly
MBP61-75
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys
MBP69-83
Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu
MBP80-97
Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg
MBP91-106
Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly
MBP84-93
Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile
MBP85-94
Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val
MBP86-95
Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
MBP87-96
Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro
MBP82-98
Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr
さらに、本発明によれば、上記ペプチドを活性成分として、単独で又は組合せて、医薬的に許容できるキャリヤーと混合して含んで成る医薬組成物が提供される。
さらに、本発明によれば、多発性硬化症を治療するための方法が提供され、ここで前記方法は、抗−ヒトミエリン塩基性タンパク質を効果的に中和し、又はその生成を調節するのに有効な量の上記ペプチドを、単独で又は組合して投与することを含んで成る。
【図面の簡単な説明】
図１は、無傷の（intact）ヒト−MBP分子に対する18個の合成ペプチド（小さな数字）の配置を示す。ペプチドは、MBP分子上のそれらの対応する領域の次に配置される垂直な棒により示される。大きな数字は、ヒトMBP上のアミノ酸残基を示す。
図２は、ヒトMBP及びMBP−ペプチドによる、10人の異なった多発性硬化症患者から精製され、そしてプールされた抗−MBPの阻害曲線を示す。
図３は、ヒトMBP及びペプチド80−97；MBP91−106及びMBP75−95による、個々の多発性硬化症患者から単離された抗−MBPの中和を示す。
図４−慢性進行性MSを有する患者におけるCSF抗−MBP力価の長期的モニターリング：
抗−MBPのＦ（遊離の）及びＢ（結合された）レベルは、1983年から1993年の11年間にわたって26回サンプリングされる場合、持続的に高められた。
cpm：計数／分；
0004173557.tif 000002
空白の円：CSF免疫複合体の酸加水分解の後に決定された結合された（Ｂ）抗−MBP。
黒の円：遊離（Ｆ）抗−MBP。
図５−対照患者：２人の“時間対照”（図５Ａの１Ｆ56、及び図５Ｂの３Ｍ66）並びに２人の“時間−塩溶液対照”（図５Ｃの４Ｍ45、及び図５Ｄの５Ｍ59）におけるCSF抗−MBPレベル。すべての４人の患者において、Ｆ及びＢ抗−MBPは、CSFが最初の２時間の間30分ごとに、及び24時間後にサンプリングされる場合、基線レベルで一定して存続した。記号は図４における通りである。
図６−患者間のペプチド研究：上昇する量（それぞれ、１，２，５，５、及び10mg）の非結合、対照合成ペプチドMBP35−58を投与された４人の患者のグループ（10Ｆ38、図６Ａ；13Ｆ43、図６Ｃ；５Ｍ59、図６Ｄ；及び３Ｍ66、図６Ｇ）、並びに上昇する量（それぞれ１，2.5，５及び10mg）の抗−MBP結合合成ペプチドMBP75−95を投与された４人の他のMS患者の対合グループ（６Ｆ53、図６Ｂ；８Ｍ41、図６Ｄ；４Ｍ45、図６Ｆ；及び１Ｆ56、図６Ｈ）におけるCSF抗−MBPレベル。CSF Ｆ抗−MBPはペプチドMBP75−95により用量−依存性態様で結合され、そしてそれは、ペプチドMBP35−58と反応しなかった。結合された抗−MBPは実質的に影響されないまま存続した。
図７−患者内のペプチド研究：MS患者が“時間対照”（１Ｆ56、図７Ｃ；及び３Ｍ66、図７Ｄ）又は“時間−塩溶液対照”（５Ｍ59、図７Ａ；及び４Ｍ45、図７Ｂ）のいづれかである場合、又は粒子が非結合、対照ペプチドMBP35−58（５Ｍ59及び３Ｍ66）を投与される場合、それらのＦ及びＢ CSF抗−MBPレベルは、影響されないまま存続した。対照的に、同じ患者４Ｍ45，１Ｆ56及び３Ｍ66が後に、５〜10mgの抗−MBP結合ペプチドMBP75−95を投与された場合、それらのＦ抗−MBPは、７日間までの間、検出不可能になり、そして10〜21日の間で基線レベルに戻った。
図８−鞘内合成ペプチドの反復注入：慢性進行性MSを有する患者は、CSF中に直接的に接種された10mgのMBP75−95の週１回、10回の注入を受け；抗−MBPのＦ及びＢ力価が、個々の接種の前（丸）及び30分後（四角）に測定された。Ｆ抗−MBP（黒丸及び四角）は10週間、検出できなくされ、ところが、Ｂ抗体は実質的に未変化のまま存続した（白丸及び四角）。
図９−静脈内合成ペプチド投与：500mgのMBP75−95の一回の静脈内注入に続くCSF抗−MBPレベル；Ｆ及びＢ抗−MBPの両レベルは、注入の10，16及び30日後に試験される場合、有意に低下した。記号は図４における通りである。
図10−残基61と110との間の領域をカバーする一組の41個のデカペプチドを用いてのMS抗−MBPのためのMBPエピトープのさらなる精製：
説明：・棒グラフは％阻害率を表わす＝100−放射能単位。
・MBP及びペプチドMBP75−95が、正の対照として使用され、そしてＦ及びＢ抗体の完全な（100％）阻害を生じさせた。
・ペプチドMBP51−60及びMBP111−120が、負の対照として使用され、そしてＦ及びＢ抗−MBPの有意性のない阻害率（０〜10％）を生じさせた。
・Ｆ及びＢ抗体の最大阻害率（90〜100％）を生じさせる、デカペプチドMBP84−92，MBP85−94，MBP86−95及びMBP87−96は、MBPエピトープに非常に関連する。
・点線：阻害アッセイの95％信頼限界。
図11ａは、４週離れて、50mgのpMBP86-95の２回の注入（it＃１及びit＃２）を鞘内に受けた、片側視神経炎を有する患者における遊離の（Ｆ）（−●）及び結合された（Ｂ）（−○）CSF抗−MBPを示す；ｗ＝週の数。
図11ｂは、再発の最初の週の間、50mgのpMBP82−98の複数回の鞘内注入（it＃１，it＃２，it＃３，it＃４及びit＃５）を受けた完全な片側視神経数を有する患者における遊離の（Ｆ）（−●）及び結合された（Ｂ）（−○）CSF抗−MBPのレベルを示す。
図11ｃは、50mgのpMBP82−98の５回の毎日の鞘内注入（it＃１，it＃２，it＃３，it＃４及びit＃５）を受けた偽アテローム症を有する患者における遊離の（Ｆ）（−●）及び結合された（Ｂ）（−○）CSF抗−MBPのレベルを示す。
図11ｄは、再発の最初の週の間、２〜３日ごとに、50mgのpMBP86−95の４回の鞘内注入（it＃１，it＃２，it＃３，及びit＃４）、及び疾病が進行性期に再び入る場合、400mgのpMBP86−95の１回の静脈内注入（IV）を受けた再発進行性MSを有する患者における遊離の（Ｆ）（−●）及び結合された（Ｂ）（−○）CSF抗−MBPのレベルを示す。
図12は、50mgのpMBP86−95の合計７回の鞘内注入を受けた多発性症候性再発を有する患者における遊離及び結合されたCSF抗−MBPレベルを示す。CSFサンプルは、it＃２の後30分で得ず；CSFサンプルは24時間後に得た。記号は、図11における通りである。
図13は、pMBP86−95の鞘内（it＃１，it＃２，及びit＃３）及び静脈内（IV＃１及びIV＃２）注入の両者を受けた再発性進行性MSを有する患者における遊離の及び結合されたCSF抗−MBPのレベルを示す。CSFサンプルは、it＃２の前又は後で得なかった。記号は図11における通りである。
図14は、pMBP86−95及びpMBP82−98の静脈内（IV＃１，IV＃２及びIV＃３）並びに鞘内（it＃１〜it＃９）注入を受けた再発性進行性MSを有する患者における遊離の及び結合されたCSF抗−MBPのレベルを示す。記号は図11における通りである。
図15は、400mgのpMBP86−95及びpMBP82−98の２回の静脈内注入（IV＃１及びIV＃２）を受けた再発性進行性MSを有する患者における未来の再発を防ぐための試みを示す。CSFサンプルは、最初の再発の間、すなわちIV＃１の後３ヵ月で得た。自然な再発レートが、攻撃の月に対応する矢印により上部に示される。ボックス領域は、実験の時間を示す。記号は11における通りである。
図16は、pMBP86−95の２回の鞘内（it＃１及びit＃２）及び１回の静脈内注入（IV）を受けた再発性進行性MSを有する患者における未来の再発を防ぐための試みを示す。●は高い用量の静脈内メチルプレジニソロンである。自然な再発レートが、攻撃の月に対応する矢印により上部に示される。ボックス領域は実験の時間を表わす。記号は図11における通りである。
図17は、慢性進行性MS患者のCSFへのMBP特異的自己抗体の鞘内及び静脈内ペプチド投与の効果を示し；ここで図17ａにおいては、pMBP75−95がCSF中に直接的に注入され（塩溶液５ml中2.5mg）、そしてMBP特異的自己抗体が異なった時点（注入に続いて0.5時間〜７日）で固相ラジオイムノアッセイにより測定された。ペプチド注入は遊離抗−MBPの一時的な中和をもたらしたが（黒丸）、しかし結合された抗−MBPに影響を与えなかった（白丸）。自己抗体は、１及び２時間で検出できず、そして注入に続いて、12〜24時間で基線値に戻り始めた。類似する観察が７人の他の慢性進行性MS患者において行なわれた。図17ｂにおいては、図17ａに示される鞘内ペプチド注入に続いて13カ月、500mgのpMBP75−95が塩溶液50ml中で静脈内注入され、そしてCSF中のMBP特異的自己抗体が３カ月間にわたって測定された（平均±標準偏差）。
図18は、pMBP75−95（２人の患者）又はpMBP86−95（11人の患者）の静脈内注入（食塩溶液中、体重kg当たり５〜６mgのIV＃１）を与えられた慢性進行性MSを有する13人の患者におけるCSF抗−MBPレベルを示し；遊離の及び結合された抗−MBPの両者（それぞれ、黒丸及び白丸）が測定された。自己抗体レベルは、それらが基線レベルに戻り始める場合、IV＃１の後、１〜４カ月間、低いか又は検出できなかった。IV＃１の後６〜10カ月間、すべての患者は、同じ用量（IV＃２）でpMBP82−98の第２の静脈内注入を受けた。
発明の詳細な記載
本発明は、ヒトミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸配列の一部に対して実質的に相同である（substantially homologous）選択されたペプチドに向けられる。“実質的に相同である”とは、ヒトミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸配列とペプチドとの間のいくらかの差が存在することができるが、但し該ペプチドは、アミノ酸配列における差異を伴って、それらの意図された使用において、すなちヒトミエリン塩基性タンパク質に対する抗体（抗−MBP）の生成をダウンレギュレートするためにまだ機能することを意味する。本発明の教示によれば、ペプチドの機能に影響を及ぼさないで、選択されたペプチドの配列にいかなる変更が行なわれ得るかを実験的に決定することが当業者に明らかであろう。
一連の41個のデカペプチドを用いての競争阻害アッセイに基づいての本発明に関するさらなる研究に基づけば、MS抗−MBPのためのMBPエピトープが精製され、そしてアミノ酸86とアミノ酸95との間の領域に位置した。Ｂ−抗MBPの最高レベルの阻害率（95％に等しいか又はそれ以上の）に基づけば、MS抗−MBPのためのMBPエピトープはアミノ酸86とアミノ酸95との間に存在する。効果的デカペプチドの最小の共通領域はアミノ酸87〜アミノ酸93である。従って、本発明によれば、ペプチドは、次の式：
R1-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R2
〔式中、Ｒ1及びＲ2は、水素、ヒドロキシ、アミノ酸の残基、及びポリペプチドの残基から成る群から独立して選択され；但し、Ｒ1及びＲ2は両者が同時に水素又はヒドロキシであることはない〕で表わされるペプチド及びその塩である。
アミノ酸位置87〜93に及ぶ７個のアミノ酸はたぶん、抗−MBPを効果的に結合するのに十分、大きくはない。従って、Ｒ1及びＲ2は同時に、両者とも水素ではなく、又は両者ともヒドロキシではあり得ない。
Ｒ1又はＲ2がアミノ酸である場合、そのアミノ酸は天然に存在するアミノ酸から選択され得る。Ｒ1又はＲ2は、配列番号１に示されるように、ヒトミエリン塩基性タンパク質におけるVal87及びIle93の上流又は下流に存在するアミノ酸に限定されない。Ｒ1及びＲ2の上流及び下流の配列における置換、付加又は欠失を包含する種々の修飾が使用され得る。さらに、置換、付加又は欠失を包含する修飾は、配列−Val−His−Phe−Phe−Lys−Asn−Ileに対して行なわれ得るが、但しそのようにして生成されるペプチドはそれらの意図された使用において、すなわちミエリン塩基性タンパク質に対する抗体を中和し、又はその生成を調節するようまだ機能する。
用語“ポリペプチドの残基”又は“ポリペプチド残基”とは、異なったサイズのポリペプチド、たとえばタンパク質又はそのフラグメントを包含することを意味する。上記のように、Ｒ1又はＲ2がポリペプチド残基である場合、Ｒ1又はＲ2はヒトミエリン塩基性タンパク質におけるVal87及びIle93の上流又は下流に存在するペプチドに制限されない。
本発明の１つの態様において、Ｒ1は、配列番号１のアミノ酸残基61〜アミノ酸残基86の範囲のペプチドの群から選択されたペプチドであり得る。前記ペプチドの長さは、単一のアミノ酸残基から26個のアミノ酸残基の範囲であり得る。
本発明のさらなる態様においては、Ｒ2は配列番号１のアミノ酸残基94〜アミノ酸残基106の範囲のペプチドの群から選択されたペプチドであり得る。前記ペプチドの長さは、単一のアミノ酸残基から13個のアミノ酸残基の範囲であり得る。
Ｒ1及び／又はＲ2は、配列−Val−His−Phe−Phe−Lys−Asn−Ileの反復体、又は置換、付加又は欠失を包含するその修飾体であり得る。従って、ペプチドは、抗−MBP結合部位（エピトープ）の複数コピーを含むことができる。
本発明の化合物は、ポリペプチドを合成する広く許容できる方法に従って調製され得る。組換えDNA技法により生成されるペプチドは、用語“ペプチド”の範囲内にまた含まれる。本発明に開示されるように、選択されたペプチドの配列を知れば、選択されたアミノ酸配列をコードするであろう適切なDNA配列を決定することは、本発明の範囲内である。適切なDNA配列は、DNA配列を合成する従来の既知方法により生成され得る。そのようにして生成されるDNA配列は、適切なクローニングビークル中にクローン化され、そしてそれを用いて、組換えペプチドを生成するために適切な宿主が形質転換される。上記に言及されるすべての方法論は、従来のものであり、そして当業者に良く知られている。
本発明のペプチドは、ヒトミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸配列の一部の配列に対して実質的に相同である。“アミノ酸配列の一部”とは、アミノ酸配列が抗−ヒトミエリン塩基性タンパク質の生成をダウンレギュレートするよう機能するのに十分な長さであるが、しかしMBPペプチドが多発性硬化症のインビボ処理のために使用される場合、従来技術の問題をもたらす長さのものではない限り、前記配列は、いづれの長さのものでもあり得ることを意味する。本発明によれば、ペプチドは少なくとも10個の長さのアミノ酸であり得る。本発明の１つの例においては、ペプチドは、約10個のアミノ酸残基〜約25個のアミノ酸残基であり得る。本発明のペプチドが融合タンパク質の一部として使用される場合、ペプチドの全体の大きさは、より大きくあり得る。
本発明の１つの態様によれば、ｈ−MBPのアミノ酸配列に実質的に対応する選択されたペプチドは抗−MBPの生成をダウンレギュレートすることにおいて効果的であることが決定された。それらのペプチドは、約残基61〜約106のｈ−MBPのアミノ酸配列に対応する。１つの例においては、それらのペプチドは、そのペプチドが遊離抗−MBPの中和のために使用される場合、残基75〜約残基106のｈ−MBPのアミノ酸配列に対応する。さらなる例においては、それらのペプチドは、そのペプチドがＦ抗−MBPの中和、又はＦ及びＢ抗−MBPの合成のダウンレギュレーションのために使用される場合、約残基82〜約残基99のｈ−MBPのアミノ酸配列に対応する。従って、ペプチドは、配列番号１に示される配列内の連続したアミノ酸配列から取られる、10個のアミノ酸残基〜25個のアミノ酸残基から選択されるが、但し、前記配列は抗−ミエリン塩基性タンパク質を中和し、又はその生成を調節することができる。
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ペプチドの例は下記から成る群から選択される：
MBP61-75
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys
MBP64-78
Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly
MBP69-83
Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu
MBP75-95
Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
MBP80-97
Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg
MBP91-106
Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly
本発明の１つの態様においては、ペプチドは、下記式：
R1-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R2
〔式中、Ｒ1及びＲ2は水素、ヒドロキシ、アミノ酸の残基、及びポリペプチドの残基から成る群から独立して選択されるが、但しＲ1及びＲ2は両者が同時に水素又はヒドロキシであることはない〕及びその塩により表わされる。ペプチドは、その置換、欠失又は付加を含むことができるが、但し、前記ペプチドは、抗−MBPの中和又はその生成の調節のその機能を維持する。
ペプチドの例は、下記から選択される：
MBP84-93
Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile
MBP85-94
Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val
MBP86-95
Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
MBP87-96
Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro
MBP82-98
Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr
ペプチドMBP82−98は、このペプチド中の５個の追加の親水性残基のために、本発明に使用される他のペプチドよりも改良された溶解性を有する。従って、このペプチドの使用は、本発明に開示される他のペプチドよりも好ましい。
MSの病因における抗−MBPの可能性ある役割が探索され続けられる。活性MSを有する患者における高められた抗−MBP力価が、テンジクネズミMBPによる固相ラジオイムノアッセイを用いるPanitchなど（Panitch, H. S., Hooper, C. S., and Johnson, K. P., Arch Neurol 37: 206-209, 1980）により初めに報告された。急性MS再発を有する患者は主に遊離形で抗−MBPを通常高めるが、ところが臨床学的緩解でのいくらかの患者は検出できない抗−MBPレベルを有する。急性再発から緩解への移行相の間、遊離抗−MBPの力価は数週〜数カ月間にわたって前進的に低下するが、ところが抗体の結合された画分はそれらの所期値に比較して上昇する。緩解における他の患者においては、遊離の及び結合された抗−MBPの低い力価を、通常１以下のＦ／Ｂ比を伴って観察することが可能であり、このことは、抗−MBP中和抗体が抗−MBPに結合されることを示唆する。時として、臨床学的に明確なMSの基準を満たす患者、又は神経病理学的に確かめられたMSを有する患者は、それらの疾病の活性相の間、検出できない抗−MBPを有した。そのような患者は他のミエリンタンパク質に対する抗体を有することが可能である。特異的抗体モデルの不在は、大部分のMS患者における脱髄の機構において抗−MBPの可能性ある重要性を否定しない。
最近、MBP抗体カスケードがMS CSFから精製されたIgG画分において観察されている（Warren, K. G. and Catz, I., J Neurol Sci 96: 19-27, 1990）。遊離の及び結合された形でのMBPに対する一次抗体は活性疾病に関連して生じ；Ｆ／Ｂ比は急性再発を有する患者において１以上であり、そして慢性進行性疾病を有する患者においては１以下である（Warren, K. G. and Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; Catz, I. and Warren, K. G, Can J Neurol Sci 13: 21-24, 1986; 及びWarren, K. G. and Catz, I., Ann Neurol 21: 183-187, 1987）。抗−MBPを中和する二次抗体が、疾病が不活性になる場合に出現する。疾病が臨床学的に進行性であり、そして不活性にならない場合、抗−MBP中和を阻害する三次抗体が存在する。MBP抗体カスケードがMSの別個の相に関連している事実は、この疾病の自然な病歴に関するその可能な重要性を示す。
抗−MBPは活性MSを有する患者のCSF中で検出され得るが、脱髄の病因におけるそれらの直接的な役割が確かめられたに過ぎない。MSの機構における抗−MBPの関与は、インビボでのそれらのダウンレギュレーションにより、たぶん、選択されたペプチドの投与、及び疾病の臨床学的経路のモニターリングにより、最良に決定され得る。抗−MBPがMSにおける脱髄に関与する唯一の一次抗体である場合、抗−MBPをダウンレギュレートし、そしてMBPに対する耐性をその場で促進するであろう選択されたMBPペプチドの鞘内及び／又は静脈内投与によりこの過程をブロックすることが可能である。他のヒトミエリンタンパク質もまた、MSにおける脱髄にも関与しており、そして従って、その対応する抗体をダウンレギュレートするためにそれらの他のミエリンタンパク質のアミノ酸配列の一部の配列に対して実質的に相同のペプチドを使用することは、本発明の範囲内である。異種MBPの筋肉内又は皮下投与によりMSを治療するためのこれまでの試みは完全には成功してはいないが（Campbell, B., Vogel. R. J., Figher, E. and Lorenz, R., Arch Neurol 29: 10-15, 1973; Gonsette, R. E., Delmotte, P. and Demonty, L. J Neurol 216: 27-31, 1977;及びRomine, J. S. and Salk, J., In: Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds. Maltiple Sclorosis. Baltimore. Williams & Wilkins, 1982: 621-630）、本発明に従って、抗−MBPを中和し、又はその生成をダウンレギュレートするMBPペプチドの鞘内及び／又は静脈内投与がより有益な結果を示した。
MSの動物モデル、すなわち実験的なアレルギー性脳脊髄炎がＴ細胞介在された脱髄疾病である。EAEは、影響されたマウスへのMBP合成ペプチド腹腔内接種により改善され得る（Gaur, A.など., Science 258, 1491-1494, 1992）。さらに、高い用量のMBPペプチドの投与は、マウスにおける自己反応性Ｔ細胞を除去し、そしてEAEの臨床学的及び病理学的徴候を排除した（Critchfield, J. M.など., Science 263, 1139-1143, 1994）。MBPの経口投与でさえ、末梢耐性を誘発することによってEAEを調節した（Chen, W.など., Science. 265, 1237-1240, 1194）。静脈内及び／又は鞘内路により投与されるそれらの抗原の合成ペプチド又はミエリン抗原の組合せが、MS患者ににおけるミエリンの破壊に関与するＴ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージを調節するために必要とされる。
従って、本発明はまた、医薬的に許容できるキャリヤーと混合して、上記のようなペプチドを活性成分として、単独で又は組合せて含む医薬組成物にも関する。医薬的に許容できるキャリヤーの例は、当業界において良く知られており、そしてたとえば、通常の塩溶液を包含する。
本発明のペプチドは、多発性硬化症の処理又は調節のためにヒトに投与され得る。MSの処理のためへの静脈内投与のための治療的用量は、約1.0mg／kg体重〜約10.0mg／kg体重であり；鞘内投与に関しては、合計用量は約１〜約100mgであり得る。本発明の１つの例においては、ペプチドは、静脈内もしくは鞘内、又は組合せて投与される。ペプチドは、必要に応じ、一回の又は連続的な用量として投与され得る。
本発明によれば、静脈内投与は遊離の及び結合された抗−MBPの両者をダウンレギュレートすることが見出され；他方、鞘内投与は遊離抗−MBPの中和又は調節においてのみ効果的であった。
本発明の１つの態様においては、MBPペプチドの連続的な鞘内投与がＦ抗−MBPを減じ、そしてペプチドが単徴候性再発を有する患者に注入された後、数カ月間、その低レベルを維持することが見出された。この態様の１つの例においては、MBPのペプチド50mgが４〜５日間、毎日、患者に投与される。さらにもう１つの例においては、追加の用量が、初期注入に続いて、１〜２週後に投与され得る。
本発明は特にその好ましい態様に関して詳細に記載されて来たが、次の例は、例示目的であって、本発明を限定するものではない。
例１．抗−ヒトミエリン塩基性タンパク質のインビトロ中和
図１は無傷の（intact）MBP分子に関する研究に使用されるｈ−MBPの18個のペプチドの配置を示す。生来のMBPを非−MS脳組織から単離し（Diebler, G. E., Martenson, R. E., Kies, M. W., Prep Biochem 2: 139-165, 1972）、そしてさらに、ゲル濾過及び逆相高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）により精製した。最終抗原調製物を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により純度について調べた。18.5KDの分子量で移動した唯一の調製物をさらなる研究のために使用した。精製されたMBPを、抗原−特異的親和性クロマトグラフィー、中和研究及び固相抗−MBPラジオイムノアッセイに使用した。
ｈ−MBPの長さをカバーし、そして８〜25個のアミノ酸残基を含む18個のペプチドを、Groome, N. P., Dawkos, A., Barry, R.など. J Neuroimmun 19: 305-315, 1988に記載のようなFmoc方法により合成した。ペプチド純度を、Ｃ18カラム及び水／アセトニトリルグラジエント（0.1％TFA）による逆相HPLCにより調べた。ペプチドのアミノ酸分析をまた、標準の分析を用いて実施した。この研究に使用されるペプチドの多くは、それらがフロイントアジュバントと共に免疫原として機能するよう製造されるので、天然でないシステイン残基を含んだ。これは本発明に影響を及ぼしそうもない。
脳脊髄液（CSF）を、急性MS再発を有する35人の患者から、徴候の開始か１週間以内で得、そしてIgGレベルを比濁法により決定した。本発明に使用されるCSFサンプルを、最初に高い絶対IgGレベル（20.080ｇ／ｌ）、及び抗−MBPの高められた力価（Ｆ／Ｂ比＞1.0）を有するよう選択した。すべてのMS患者は、臨床学的に明確な疾病を有した。
IgGを、Warren, K. G. and Catz, I., J Neurol Sci 96: 19-27, 1990に記載のようにしてプロテインＡ−Sepharose（PharmaciaTM）親和性クロマトグラフィーにより、急性MSを有する患者の濃縮されたCSFから精製した。個々のIgG調製物の純度を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動により調べた。精製されたIgGからの高められた抗−MBPレベルがMBPによりゼロに吸収される場合、その吸収後の上清液は、残留IgGを含み、このことは、抗−MBPが高められたIgGの画分のみを表わすことを示す。
精製されたMBPを、CNBr−活性化されたSepharose ４Ｂ（PharmaciaTM）に、製造業者の説明書に従って結合せしめた。急性MS再発を有する35人の患者からの高められた抗−MBPレベルを含む精製されたCSF IgGを用いて、MBP−Sepharose親和性クロマトグラフィー（Warren, K. G. and Catz, I., J Neuro Sci 103: 90-96, 1991）により抗−MBPを単離した。精製された抗−MBPサンプルを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により初期IgG源と比較した。精製された抗−MBPサンプルがMBPによりゼロに吸収される場合、その吸収後の上清液は、残留IgGを含まず、抗−MBPの純度が示された。
一定量の抗−MBP（尺度拡張目的のために100に対応する15放射能結合単位＝％０）を、上昇する量のｈ−MBP（０〜1000ng）又はMBPの個々のペプチド（０〜10,000ng）と共に液相アッセイにおいてインキュベートし、そして1.5時間のインキュベーションの後、遊離抗−MBPレベルをすべての混合物において決定した。７人の個々のMS患者から単離された抗−MBP、又は10人のMS患者からのプールされた抗−MBPを中和実験に使用した。ウシ胸腺ヒストン及びヒト血清アルブミンを、負の抗原対照として使用した（範囲：10〜1000ng）。ペプチドMBP64−78に対する１つのモノクローナル抗体、及びペプチドMBP１−８に対するポリクローナルウサギ抗血清を、正の抗体対照として使用した（Groome, N., Harland, J., and Dawkes, A., Neurochem Int 7: 309-317, 1985; Barry, R., Payton, M., and Groome, N., Neurochem Int 2: 291-300, 1991）。エピトープ45−50に対するもう１つのマウスモノクローナル抗体を負の抗体対照として使用した。
抗−MBPレベルをヒトMBPによる固相ラジオイムノアッセイにより決定した（Warren, K. G. and Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; Warren, K. G. and Catz, I., Ann Neurol 21: 183-187, 1987;及びWarren, K. G. and Catz, I., J Neurol Sci 91: 143-151, 1989）。遊離抗−MBPレベルを、親和性クロマトグラフィーからのすべての画分において、及びすべての中和混合物において測定した。すべての個々のサンプルを、アッセイ間の変動性を最小にするために、同じヨウ素化された材料を用いて、四重反復して実施した。
精製された抗−MBPは、MBPにより、並びにペプチドMBP80−97，MBP91−106及びMBP75−95により完全に中和され、そしてペプチドMBP64−78，MBP69−83及びMBP61−75により部分的に中和された（表１及び図２）。残る12個のペプチドは、精製された抗−MBPを中和せず、そしてそれらのカイネティック曲線は図２に示されるストリップ領域内に存在した。ウシ胸腺ヒストン及びヒト血清アルブミンは1000ngの高い濃度でさえ、精製された抗−MBPと反応しなかった。ペプチドMBP64−78に対するMAbはペプチドMBP64−78によってのみ阻害され、そしてペプチドMBP１−８に対するMAbはペプチドMBP１−８によってのみ阻害された。MAbペプチドMBP45−50はMBP又はペプチドのいづれとも反応しなかった（図を明確にするために、対照のデータは示されていない）。対照サンプルは、個々の対照抗体が予測されるペプチドにより完全に中和され、そして他のペプチドのどれによっても中和されなかったので、中和アプローチの有効性が示された。これは、高いペプチド濃度（10,000ng）でさえ、認識の特異性が観察されたことを示す。
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７人の個々のMS患者から精製された抗−MBPは、ｈ−MBP、並びにペプチドMBP80−97，MBP91−106及びMBP75−95により完全に中和された（例示的な例として図３を参照のこと）。個々のMS患者から得られた限定された量の抗体について、抗−MBPは残る15種のペプチドとは反応されなかった。
前で示したように、抗−MBPは、アミノ酸残基61〜アミノ酸残基106に及ぶペプチドにより中和された。抗−MBPを中和しなかったペプチドは、ｈ−MBPのアミノ（残基１〜63）及びカルボキシル（残基117〜162）の両末端をカバーする。MBPの異なった非オーバーラップ領域からのペプチドは同じ抗体を中和すると思われる。これは、抗体が異なった領域からのアミノ酸を含む不連続（アセンブルされた）エピトープを認識する場合、説明され得る。類似する現象がHrubyなど（Hruby, S., Alvord, E. C., Groome, N. P. など, Molec Immun 24: 1359-1364, 1987）によりこれまで観察されており、ここで彼は、ラットモノクローナル抗体がMBP配列112−121において主要エピトープを有するが、しかしペプチド39−91におけるもう１つのエピトープとは強い交差反応性を有することを示した。これは、抗体が不連続エピトープを形成しなかった２種の完全に異なった配列と交差反応性である可能性よりもよりもっともらしい（Hruby, S., Alvord, E. C., Martenson, R. E., など., J Neurochem 44: 637-650, 1985）。中和のデータは、異なった抗体アミノ酸側鎖と相互作用することによって抗体結合ポケットをそれぞれ部分的に占有する、MBPの異なったセクションからのペプチドの能力により説明され得た。この説明は、完全な阻害を与えるペプチド（MBP８−97，MBP91−106及びMBP75−95）が阻害を引き起こす時点で、無傷のMBPよりも、モル基準で約100分の１の効果しかないとする観察に適合する。上記仮説によれば、これは、もとのMBPエピトープの結合エネルギーを達成できない個々のペプチドクローンによるものである。
例２．抗−ヒトミエリン塩基性タンパク質のインビボ中和又はその生成の調節
患者の選択及び対照の研究
この研究プロジェクトに参加する患者は、University of Alberta, Edmonton, canadaのMultiple Sclerosis Patient Care and Research Clinicに見られた。患者は、脳の磁気共鳴像及びCSF免疫化学プロフィールにより確かめられるSchumacher基準（1965）により臨床学的に明確な多発性硬化症を有するものとして診断されている。慢性進行性MSにおいて、抗−MBPが長期間、すなわち数カ月〜数年間にわたって持続的に高められることを示すために、患者は、Ｆ及びＢ抗−MBPのモニターリングを伴って、腰椎穿刺を反復された。慢性進行性MSを有する患者においては、自己抗体が11年もの長い間、持続的に高められたまま続続し、そして抗−MBPレベルの自発的低下が生じなかったことが観察された（図４は例示的な例である）。
最初に高められたCSF抗−MBPレベルが24時間にわたって比較的一定して存続したことを決定するために、２人の患者（１Ｆ56及び３Ｍ66）は、Ｆ及びＢ抗−MBPモニターリングを伴って、２時間30分ごとに、及び24時間後、反復したCSFサンプリングを受けた（それぞれ、図５Ａ及び５Ｂ）。患者１Ｆ56及び３Ｍ66は“時間対照”として機能した。Ｆ及びＢ抗−MBPレベルは、CSFが２時間、30分ごとに、及び24時間後にサンプリングされる場合、一定に高められたまま存続した。
さらに、CSF中への５ccの通常の塩溶液の接種の効果を、２人の他の患者において、同様にして決定した（４Ｍ45及び５Ｍ59；それぞれ図５Ｃ及び５Ｄ）。それらの患者は“時間−塩溶液対照”として機能した。５ccの通常の塩溶液が鞘内注入される場合、Ｆ及びＢ抗−MBPレベルは、CSFが上記のようにサンプリングされる場合、基線レベルで高められたまま存続し、従って、抗−MBP力価対する“希釈効果”は無視できることを示す。
抗−MBPレベルを、Immulonマイクロタイターウェル上に被覆されたヒトMBPによる固相ラジオイムノアッセイにより決定した。Immulonマイクロタイターウェルを、10μｇ／mlのMBP 100μｌにより被覆し（１μｇ／ウェル）、そして37℃で一晩インキュベートした。ウシ血清アルブミン（BSA）及び３回の水による洗浄によりクエンチングした後、ウェルを室温で貯蔵した。0.010ｇ／ｌに希釈された100μｌのCSF又は組織抽出物のサンプル（0.01Ｍのバルビトール緩衝溶液（BBS）（pH6.9〜7.1）、0.5％BSA及び0.05％のTween20と共に）を、室温で１〜２時間、MBP−被覆されたウェルにおいてインキュベートした。５回の緩衝液による洗浄の後（0.01ＭのBBS, 0.5％のBSA及び0.05％のTween 20による）、ウェルをヤギ抗−ウサギIgG−Fc（0.01ＭのBBS,0.05％のTween 20,0.5％のBSAにおける）と共に、室温で１時間インキュベートし、そして次に上記のようにしてすすいだ。最終的に、125Ｉ−プロテインＡ（又は125Ｉ−プロテインＧ）を添加し、そして室温で１時間インキュベートした。125Ｉ−プロテインＧがトレーサーとして使用される場合、アッセイ緩衝液における及びクエンチングのためのBSAをオボアルブミンにより置換した。３回の最終洗浄の後、ウェルを個々に計数した。結果は次のようにして定義される放射能で表わされる：（サンプルの計数−ブランクの計数）÷合計放射能の計数−ブランクの計数）。すべてのサンプルは10度反復して行なわれ、そして計数時間はいづれの正のサンプルに関しても10,000計数以上を集めるために、10分である。
アッセイされる前、すべてのCSF及び／又は組織サンプルを、0.010ｇ／ｌの最終IgG濃度まで希釈した。Ｆ抗−MBPをCSF又は組織抽出物において直接的に検出し、そして抗体のＢレベルを、グリシンHCl緩衝液（pH2.2）による免疫複合体の酸加水分解に従って決定した。非特異的結合を、被覆されていないウェルにおいて、個々のサンプルのために実施した。エピトープ位置決定のために、合成ペプチドをまず、液相競争アッセイにおいて、精製された抗体と反応せしめ、そして次に、抗−MBPをすべての得られる上清液においてラジオイムノアッセイにより決定した。組合された競争結合アッセイ及びラジオイムノアッセイの結果を、100−放射能単位として定義される合成ペプチドの％阻害率として表わした。サンプリングを10度、反復して行ない、そしてLKB1275 Minigammaカウンターにより、それぞれ10分間、計数した。組織精製された抗−MBPのプールを、正の対照として５つの前もって確立された希釈度で使用した。非神経学的疾病を有する患者からのプールされたCSFを、負の対照として使用した。アッセイ内で再生度は３〜５％であり、そしてアッセイ間の変動率は７％以下であった。
対照（時間対照及び希釈剤対照）として参加する患者における高められた及び一定のレベルでのCSF抗−MBPの持続性は、この研究の次の段階を可能にした。
二重盲検ペプチド制御された相１実験−鞘内注入
CSF抗−MBPのＦ及びＢ力価に対する合成ペプチドMBP75−95の効果を決定するための相１実験を実施した。Uninensity of AlbertaのResearch Ethics Broardの許可を受けた後、このプロジェクトを、臨床学的に明確なMS（Schumacherなど., Ann. N. Y. Acad. Sci., 122, 552-568, 1965）を有する患者、重度に無能力にされた患者、及び進行した進行性疾病を有する患者において実施した。インホームドコンセントを得た後、114人の患者がこの研究のために志願し；８人の患者が、抗−MBPをインビトロで結合したペプチドMBP75−95又は非結合対照ペプチドMBP35−58のいづれかの１回の鞘内注入を受けるために、Ｆ CSF抗−MBP（８以上の放射能単位）（表２）のそれらの初期力価に基づいて選択された（Warren and Catz, 19936）。実験は、研究者も患者も接種の性質の知識を有さないよう二重盲検態様で行なわれた。すべての患者は７桁のランダムに生成された数字により医師によってコードされた。５ccの通常の塩溶液に溶解され、そして腰椎穿刺によりCSF中に注入される対合されたペプチドを、１，2.5，５及び10mgの上昇する用量で投与した。CSFを、注入の前（基線）、注入の後、30分間隔で２時間、24時間後、及び抗−MBPレベルが基線に戻るまで、３〜４週間、週間隔で、サンプリングした。細胞計数、合計タンパク質、グルコース、IgG及びアルブミンレベルを、得られるすべてのCSFサンプルにおいて決定した。Ｆ及びＢ抗−MBPレベルを、上記のようにして、ラジオイムノアッセイにより決定した。
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表２：MBP合成ペプチドの１回の鞘内注入の相１研究に参加した、慢性進行性MSを有する14人の患者の臨床学的データ及びCSF抗−MBPレベル。最初に高いＦ抗−MBP（８以上の放射能単位）が有意な注入後変化を達成するために必要であるので、14人の患者のうちわずか８人がこの研究のために選択された。
それらの研究に使用されるすべてのペプチドは、Procyon Inc. (London, Ontario, Canada）によるFmoc（９−フルオレニルメトキシカルボニル）法を用いて、“良好な製造製品”（GMD）コード下で合成された。ペプチド純度を、Ｃ18カラム及び0.1％のTFAを含む水−アセトニトリルグラジエントを用いての逆相高圧液体クロマトグラフィーにより調べた。液量分光法及びアミノ酸分析を標準の方法により実施した。接種の前、すべてのペプチドを、発熱性（Vancouver General Hospital, Vancouver, Canada）、無菌性（Provincial Laboratory for Public Health for Northern Alberta, Edmonton, Canada）及び急性毒性（Health Sciences Laboratory Animal Services, University of Alberta, Edmonton, Canada）について調べ、そしてそれらが、“ヒトへの投与のために適切である”ことを宣言された。適切な量のコードされた合成ペプチドを、５ccの通常の無菌塩溶液（0.9％塩化ナトリウム注射USP、非発熱性、Baxter Corp, Toronto, Canada）に溶解し、0.22μｍの殺菌フィルターユニット（Millex-GX, Millipore Corp., Bedford, MA, USA）を通して２度濾過し、そして腰椎穿刺の手段によりCSF中に投与した。
患者間のペプチド研究
患者６Ｆ53，８Ｍ41，４Ｍ45及び１Ｆ56は、インビトロで抗−MBPを結合できる合成ペプチドMBP75−95を投与され、そして患者10Ｆ36，13Ｆ43，５Ｍ59及び３Ｍ66は、それぞれ１，2.5，５及び10mgの上昇する量で、“対照”の非結合合成ペプチドMBP35−58を投与された（図６）。１mgのMBP75−95を投与された患者６Ｆ53（図６Ｂ）においては、Ｆ抗−MBPの75％の低下、続く、基線レベルへのその即時の復帰が観察され；2.5mgのMBP75−95を投与された患者８Ｍ41（図６Ｄ）はＦ抗−MBPの完全な結合−中和、続く、24時間以内での基線レベルへのその復帰を示し；５mgのMBP75−95を投与された患者４Ｍ45（図６Ｆ）においては、完全なＦ抗−MBP結合−中和が生じ、そして７日間持続し、２日後サンプリングされる場合、その初期値に戻り；10mgのMBP75−95を投与された患者１Ｆ56（図11６Ｈ）においては、また、Ｆ抗−MBPの完全な結合−中和が生成され、これは７日間持続し、そして14日及び28日後にサンプリングされる場合、基線値に戻っていた。抗−MBPの結合されたレベルは、MBP75−95の１回の鞘内接種により有意に変更されなかった。それぞれ、１，2.5，５及び10mgの“対照”の非結合ペプチドMBP35−58を投与された患者10Ｆ38，13Ｆ43，５Ｍ59及び３Ｍ66においては、CSF抗−MBPのＦ及びＢレベルは、24時間の実験の間、初期の高い基線レベルから変化しないまま存続した（それぞれ、図６Ａ，６Ｃ，６Ｅ及び６Ｇ）。MSにおける炎症の典型的なCSFパラメーター、たとえば細胞計数、合計タンパク質、IgG及びアルブミンの絶対レベル、オリゴクローンバンド、IgG指数及びCNS IgG合成は、ペプチド投与の前及び後で、未変化のまま存続した。
患者内ペプチド研究
患者内実験を、患者間変動性を最少にするために実施した。“時間−対照”であるか又は５mgの非結合ペプチドMBP35−58を投与された患者５Ｍ59においては、Ｆ抗−MBPレベルは、両実験の間、基線レベルで上昇したまま存続した（図７Ａ）。患者４Ｍ45は最初、“希釈対照”を投与され、そして２カ月後、５mgのMBP75−95を投与された。前記患者のＦ抗−MBPは“希釈”実験の間に集められたすべてのサンプルにおいて高められたまま一定して存続し、そしてそれはMBP75−95の投与の後、検出できなくなった（図７Ｂ）。類似する結果が、“時間−対照”実験の間、持続的に高められたレベルのＦ抗体を有した患者１Ｆ56において得られ、そして10mgのMBP75−95の投与の後、Ｆ抗−MBPは検出できなくなった（図７Ｃ）。完全な研究が患者３Ｍ66において実施された。Ｆ抗−MBPレベルは、“時間−対照”実験の間又は10mgのMBP35−58が投与される場合、持続的に高められ；しかしながら、10mgのMBP75−95が注入される場合、Ｆ抗−MBPは完全に中和され、そして７日間、検出されないまま存続した（図７Ｄ）。
合成ペプチドMBP75−95の反復投与
ペプチドMBP75−95が７日以上の間、Ｆ抗−MBPをインビボで中和することを決定した後、10mgのMBP75−95を、10週間、毎週、脊髄液中に反復して接種するために、それを選択した。この実験は、単一のペプチド注入プロジェクトに参加せず、そしてこの研究のために志願した慢性進行性MSを有する３人の異なった患者において実施された。Ｆ及びＢ抗−MBPを、最初の接種の１〜２週前、10回の注入の前及び10回の個々の注入に続いて30分で、及び再び、最後の注入の後１カ月で測定した。細胞計数、合計タンパク質、グルコース、IgG及びアルブミンレベルを、10回の注入の個々の前に得られたすべてのCSFにおいて測定した。最初の注入の前及び最後の注入の後、血液を得、そして電解質、クレアチニン、心臓及び肝臓酵素及び血液学的パネルについて分析した。
慢性進行性疾病を有するMS患者が、10週間までの期間、週間隔で10mgのMBP75−95の反復された鞘内注入を受ける場合、それらの初期の高いＦ抗−MBPは、ペプチドが投与される限り、検出できなくなり；ペプチドがもはや投与されない場合、Ｆ抗−MBPは１カ月以内で基線レベルに戻った（図８）。Ｂ抗体の力価は実験を通して一定に高められたまま存続し、このことは、それらの患者において、抗−MBPの合成が持続し、そして鞘内ペプチド投与がＦ抗−MBPの“モッピング効果”のみを生成したことを示唆する。
単一の合成ペプチド注入又は反復された毎週の注入のいづれかを受けた患者は、進行された程度の神経学的疾病を伴って、慢性進行性多発性硬化症を有した。それらの患者は、鞘内ペプチド投与に続くそれらの神経学的徴候又はMS悪化を報告しておらず、そして細胞応答はCSFにおいて進行しなかった。MBP75−95の反復接種を受けるMS患者が、全身性合併症、たとえば電解質変化及び心臓−肝臓−腎臓機能不全、並びに血液学的変化についてモニターされ、そして悪い合併症は生じなかった。悪影響は観察されなかった。
MBP75−95の静脈内投与
ペプチドMBP75−95の鞘内投与がＢ抗体のレベルを変えないで、Ｆ抗−MBPの完全な結合−中和を生じさせることの決定に続いて、Ｆ及びＢ抗−MBPのCSF力価に対する同じペプチドの静脈内投与の効果を測定することが決定され；500mgのMBP75−95を100ccの食塩溶液に溶解し、そして最初の２時間のあいだ30分ごとに、18時間後に、及び10，16及び30日後に、モニターしながら、CSF抗−MBPを有する患者８Ｍ41中に30分間にわたって静脈内注入した。血液を、注入の前、並びに16及び30日後に採血し、そして電解質、クレアチニン、心臓及び肝臓酵素、並びに血液学的パネルについて分析した。脊髄液を、細胞計数、全タンパク質、グルコース、IgG及びアルブミンレベルについてモニターした。悪影響は観察されなかった。
図８に示されるように、500mgのMBP75−95の静脈内投与は、最初の２時間以内でCSF抗−MBPのＦ及びＢレベルの力価にいづれの変化も生成しなかった。CSF抗−MBPの30％の低下が18時間後に観察された。CSFが10，16及び30日後に再サンプリングされる場合、両Ｆ及びＢ抗−MBPは11の放射能単位のそれらの初期レベルから、それぞれ４，２、及び１の放射能単位に低下した。
MBP75−95により鞘内処理されたすべての患者における反復された観察では、高レベルの結合された抗体が持続性であり、他方Ｆ抗−MBPは用量−応答態様で検出できなくなった。これは、MBPに対する自己抗体の合成が、MBP75−95の鞘内投与の間及びそれに続いて、活性のまま存続したことを示した。この観察の結果として、MBP75−95を、ペプチドの一回の鞘内注入を前もって受けている患者に静脈内投与した。静脈内投与の後、Ｆ及びＢの両レベルのCSF抗−MBPは、１カ月までの期間モニターされる場合、有意な低下を示した。MBP75−95の静脈内投与に続くCSF抗−MBPのＦ及びＢレベルの低下は、この投与路が、抗−MBPの合成を担当する自己免疫炎症過程のダウンレギュレーションを生成したことを示唆する。日時を定めるための引続いての研究においては、抗−MBPレベルは、最初の静脈内注入の後、４〜６カ月で上昇を開始し；同じペプチドの第２の静脈内注入（追加免疫）は、慢性進行性MSを有する約70人の異なった患者において、２年間までの間、抗−MBP合成のダウンレギュレーションを生成した。
MS抗−MBPのためのMBPエピトープ
MS抗−MBPのためのMBPエピトープをさらに位置決定するために、CSF及びMS脳組織から親和性クロマトグラフィーにより精製されたＦ及びＢ抗−MBP（Warren, K. G. など., Ann. Neurol. 35, 280-289, 1994）を、ヒトMBPの残基61〜110間の領域をカバーする等しい長さ（それぞれ10個の残基であり、そして９個の残基により隣接する残基とオーバラップする）の41の連続したMBP合成ペプチドと、競争阻害アッセイにおいて反応せしめた。最大の阻害性を生成するペプチドが、抗体結合部位と最とも高く関連していると思われた。
MS脳組織からの精製された両Ｆ及びＢ抗−MBPの最大阻害率（280％）は、４種のデカペプチド、すなわちMBP84−93,MBP85−94,MBP86−95及びMBP87−96により生成され、これは、MS抗−MBPのためのMBPエピトープが残基84〜96間に位置することを示す。共通するアミノ酸残基の最小領域は、残基87〜残基93である。Ｂ抗−MBPは、Ｆ抗体よりもより制限された範囲を有した。
MS脱髄の病因における抗−MBP抗体の役割は、解明されておらず、そして抗−MBPをインビボで調節し、そして続いて、臨床学的及び病理学的結果を観察することによって単に決定され得る。たとえば、MSの急性再発の間、Ｆ／Ｂ抗体比が１以上である場合、Ｆ抗−MBPを結合することが知られているペプチドが、遊離循環抗体を結合し、そして急性再発の臨床学的効果を止めるために、鞘内接種され得；毎週の投与が、緩解が生じるまで必要とされる。慢性進行性疾病及びスーパーインポーズド（super imposed）急性再発を有するMS患者においては、鞘内及び静脈内投与が、抗−MBPを生成する炎症機構をダウンレギュレートするために必要とされ得る。
例３．急性再発患者における鞘内投与されるpMBP86−95又はpMBP82−98の適切な用量
MS再発は、CSFにおける結合された抗体よりも高いレベルの遊離抗体のために、1.0より高いＦ／Ｂ抗−MBP比と関連している。一般的に、３カ月の期間以上で、再発は続く回復／緩解相に入るので、Ｆ抗−MBPレベルは徐々に低下し、そして生物学的緩解が完結する場合、Ｆ及びＢ抗−MBPは一般的にCSFに検出できなくなる。
次の実験に参加した患者は、再発−緩解又は再発−進行性MSのいづれかを有した。
この及び次の例においては、pMBP86−95又はpMBP82−98のいづれかを使用した。pMBP86−95は、それが４個の親水性残基及び６個の疎水性残基を含むので、通常の塩溶液において非常に低い溶解性を有した。他方では、pMBP82−98は、５個の追加の親水性残基の結果として、通常の塩溶液において高められた溶解性を有する。
２人の患者が、Ｆ抗−MBPをすぐに検出できないレベルに減めるであろう、鞘内投与されるpMBP86−95又はpMBP82−98の適切な量量を決定するために研究された。１人の患者は歩行運動失調及び動脈幹異常平衡化の急性再発を有した。攻撃の開始で、この患者は10mgのpMBP86−95の１回の鞘内注入を受け；Ｆ及びＢ抗−MBPレベルが、注入の前及び１時間後、及び次の３カ月の間、５回以上測定した。この投与量はＦ抗−MBPを部分的にのみ抑制し、そして抗体回収曲線は天然の推移に近づき；この患者は進行性痙性不全対麻痺及び運動失調を有し続けた。10mgのpMBP86−95の１回の鞘内注入はＦ抗−MBPを十分に抑制し、そしてその回復速度を変えるためには不適切であることが結論づけられた。
50mgのpMBP86−95の１回の鞘内注入を受けた急性視神経炎を有する、18才の女性である他の患者は、注入の前及び30分後にこの測定されたＦ及びＢ抗体レベルを有した。注入の30分後、Ｆ抗体は検出できなくなった。患者は、続く腰椎穿刺に用意しなかった。従って、少なくとも50mgの投与量が、少なくとも30分間、CSFにおけるＦ抗−MBPを結合し、そして中和するために必要とされることが結論づけられた。
例４．単徴候性再発を有する患者における投与の頻度及び持続期間
この例においては、より長い期間、低いか又は検出できないＦ抗体レベルを維持するpMBPの投与の頻度及び持続期間を決定した。このグループにおいて研究された４人の患者は、攻撃の開始から１週間以内に、合成ペプチドを投与された。
最初の２人の患者は、急性片側視神経炎の攻撃を有していた。それらの患者の１人（図11ａ）は、４週離れて50mgのpMBP86−95を２回、鞘内に注入（it＃１，it＃２）された。個々の注入の後、Ｆ抗−MBPは１時間以内で検出できなくなった。最初の注入の１週間後測定される場合、Ｆ抗−MBPは上昇し、そして４週間後、そのＦ抗体は有意に高かった。この時点で、患者は第２の鞘内注入（it＃２）を受け、そしてＦ抗−MBPは30分後に検出できなくなったが、しかしそれは続いて、24時間モニターされなかった。この頻度は不適切であり、そして攻撃の最初の週の間、複数回の注入が無視できる抗体レベルを維持するためには要求されることが結論づけられた。
完全な片側視神経炎を有する第２の患者は、攻撃の最初の週の間、50mgのpMBP82−98の次の複数回の鞘内ペプチド注入を受けた：４回の毎日の注入（図11ｂ：it＃１，it＃２，it＃３，it＃４）及び１週間後の５番目の注入（it＃５）。この患者の抗−MBPプロフィールは、７日間にわたっての一定の急速な低下を示した。より重要なことには、it＃５の後７週及び６カ月で、CSF抗−MBPレベルは検出できないまま存続し、そして患者は、視神経炎の再発も他タイプのMS再発も経験しなかった。さらに、視神経炎に続く片側失明も十分に回復した。
次に、50mgのpMBP82−98の毎日の鞘内注入の同じスケジュールが異なったタイプの単一徴候性再発を有するMS患者に投与された。図11ｃは、攻撃の第２週に50mgのpMBP82−98の５回の毎日の注入（it＃１，it＃２，it＃３，it＃４，it＃５）を鞘内に受けた、左手の急性偽アテトーシスを有する患者の抗−MBPプロフィールを示す。Ｆ抗体レベルは４日以内で検出できない値に低下し、そして11日及び１カ月後に評価される場合、検知できないまま存続した。この患者は左手の機能を着実に回復し、その結果、再びバイクに乗ることができ、そしてギターを引くことができた。
最後の患者は、慢性進行性MSにスーパーインポーズド（super imposed）急性左片麻痺の攻撃を有した。この患者は、50mgのpMBP86−95の４回の鞘内注入を２〜３日ごとに受けた。抗−MBPを、個々の注入の前及び30分後（図11ｄ：it＃１，it＃２，it＃３，it＃４）、並びに最初の注入の10日後に測定した。最初に上昇されたＦ抗−MBPは、患者が初期の慢性進行性状態に臨床学的及び生化学的に戻る場合、７日以内で検出できなくなり、そしてすぐにその後、彼は400mgのpMBP86−95を静脈内に受けた。これは、i．v．注入後、４カ月間、結合された抗体レベルを抑制した。しかしながら、静脈内注入後8.5カ月での彼の最後の腰椎穿刺の後、疾病は、臨床学的に及び生化学的に慢性進行性パターンに戻った。
例５．多徴候性再発を有する患者における投与の頻度及び持続期間
次に、同じMBPペプチドが、CNSの複類領域に影響を及ぼす多徴候性攻撃を有する患者に注入された。このグループは、次の３種の患者から成った：再発−緩解を有する１つのグループ及び再発−進行性疾病を有する２つのグループ。
最初の患者は重度の多徴候性再燃を有した。再発の最初の週の間、患者は１，３及び７日目、50mgのpMBP86−95の３回の注入を受けた（図12：it＃１，it＃２及びit＃３）。抗−MBPを、個々の注入の前及び30分後に測定した。それらの３回の注入を受けた後、Ｆ抗−MBPは、ほとんど検出できないレベルに抑制された。１カ月後に測定される場合、Ｆ抗−MBPは上昇し、そして1.5カ月までには、再発が再び臨床学的に活性になり、そして生化学的に確かめられた。この時点で、患者は、再発の45，48，49、及び50日目、50mgのpMBP86−95の第２の４回の鞘内注入を受けた（it＃４，it＃５，it＃６及びit＃７）。抗−MBPを個々の注入の前、及び30分後、及び続く２カ月間でさらに３度、測定した。再び、Ｆ抗−MBPは少なくとも２週間、抑制されたが、しかし患者は再び再発し、そしてこの時点で、Ｆ抗体レベルは初期の前再発レベルに戻った。明確には、Ｆ抗−MBPの低いか／検出できないレベルを長期間、維持するためには、合成ペプチドのより維持された鞘内投与が必要とされる。
第２の患者は再発−進行性MSを有した（図13）。最初に、進行性形（Ｆ＝Ｂ）で、患者は500mgのpMBP86−95（IV＃１）を静脈内に受けた。両Ｆ及びＢ抗体レベルは、I．V．注入後、１カ月、９週で幾分低められたが、患者は非常に高められたＦ抗−MBPレベルに関連する多徴候性臨床学的再発を経験した。この時点で、患者は、再発の１，３及び12日目で、50mgのpMBP86−95の３回の鞘内注入を受け（it＃１，it＃２及びit＃３）、そして抗−MBPが、最初の及び第３回目の注入の前、30分後、及び24時間後に測定された。１カ月後に試験される場合、患者は、２週間以内で、患者が500mgのpMBP86−95の第２の静脈内注入（IV＃２）を受ける場合の進行性痙性不全対麻痺の初期臨床学的及び生化学的状態に戻った。現在までのところ、次の26カ月間、連続的にモニターされるＦ及びＢ CSF抗−MBPレベルは、基線レベルに比較される場合、抑制されたまま存続した。
進行性相（Ｆ＝Ｂ）において初め、MSを有するこのグループにおける最後の患者（図14）は、500mgのpMBP86−95の静脈内注入を受けた（IV＃１）。CSF抗−MBPを、９日後、次にIV＃１の後、２カ月及び4.5カ月間、毎日測定した。この注入に続いて、Ｆ及びＢ抗−MBPレベルは、２カ月間抑制され；IV＃１後4.5カ月で、患者は、慢性進行性疾病と一致する高められた抗体レベルにより臨床学的及び生化学的に確かめられる上昇する虚弱の病苦を訴えた。次の月内に、患者は500mgのpMBP82−98の第２の静脈内注入を受けた（IV＃２）。その第２の注入の直前に取られたサンプルのCSF分析は、急性再発パターン（Ｆ＞Ｂ）を示し、そして次の日、患者は、左側方直筋不全麻痺のために急性複視を進行せしめた。この時点で、患者は、次の4.5カ月間にわたって持続した臨床学的及び生化学的急性再発を経験した。患者の高められたＦ抗−MBPを低めるための努力においては、この患者は２つの経路のpMBP82−98を鞘内に受けた。再発の開始から4.5カ月で開始された第１の経路の間、患者は50mgのpMBP82−92を５日間、毎日受け（it＃１，it＃２，it＃３，it＃４及びit＃５）、そして個々の注入の前、及び30分後に測定された抗−MBPレベルは、適度に高められたまま存続した。再発が持続し、そしてひじょうに無力であったので、第２経路のより高い用量のペプチドをより高い頻度でさらに投与することが決定され、そして患者は100mgのpMBP82−98を、２日間、毎日２度、受けた（19及び20日目：it＃６，it＃７，it＃８及びit＃９）。抗−MBPを、個々の注入の前、及び30分後に測定した。この高められた用量及び頻度に続いて、Ｆ抗−MBPは無視できるレベルまで抑制され、そして１週間後（28日目）に試験される場合、患者のCSFプロフィールは、ゆっくりと進行する疾病に一致した（Ｆ／Ｂ抗−MBP＝1.0）。この時点で、患者は、より一層の抗−MBP生成をダウンレギュレートしない、500mgのpMBP82−98の第３回目の静脈内注入を受けた（IV＃３）。
例６．未来の再発を妨げる試みにおけるMBPペプチドの静脈内投与
時おりの再発を有した、再発−進行性MSを有する２人の患者が、この投与路がさらなる攻撃を妨げるかどうかを決定するために、pMBP86−95又はpMBP82−98のいづれかにより静脈内注入された。
最初の患者は、４年間、１年当たり２〜３回の再発を経験しており、そして痙性不全対麻痺の段階的進行を有している（図15）。患者は、６カ月離れて２回の静脈内注入を受け、１回目は400mgのpMBP86−95であり（IV＃１）そして２回目は400mgのpMBP82−98であり（IV＃２）；臨床学的モニターリング及びCSF分析を毎月実施した。図15は、９カ月間にわたっての抗−MBPレベルを示す（上方のボックス領域）。最初の静脈内注入は、約２カ月間、抗−MBP合成をダウンレギュレートした。注入の後、３カ月目の間、この患者は臨床学的再発を経験し；不運なことには、CSFはこの時点で得られなかった。続く２〜３カ月の間、再発が慢性進行性相に再び入ったことを決定した後、この患者は第２の静脈内注入を受けた（IV＃２）。CSF抗−MBPレベルは再び、２カ月間、抑制されたが、しかし第２の注入の３カ月後、患者は著しく上昇したＦ抗−MBPに関連するもう１つの再発を有した。過去４年間、患者が有した再発に類似して、この患者は、pMBP86−95及びpMBP82−98の２種の静脈内注入を受けるにもかかわらず、１年当たり２〜３回の再発を経験し続けた。
過去10年間、１年当たり１〜４回の急性再発を経験した第２の患者（図16）（上方の縮尺）は、重度に障害のある対麻痺性になり、そして車椅子を必要とした。11年目の間、患者は再び、４回の再発を経験したが（上方のボックス領域）、但しMBP合成ペプチドを鞘内に及び静脈内に受けた。最初の再発の間、１日及び６日目、50mgのpMBP86−95の２回の鞘内注入を受けた後（it＃１，it＃２）、患者のＦ抗−MBPレベルは実質的に低められ；６日目、患者はまた、続いて、次の３カ月間、Ｆ及びＢ抗体の両者を抑制する300mgのpMBP86−95（IV）を静脈内に受けた。静脈内注入の４カ月後、この患者は、ちょうど良い時に悪化し続けるもう１つの臨床学的再発を経験し；CSF抗体レベルはひじょうに高められ、そしてIV注入の6.5カ月後、患者は、50mgのpMBP82−98の４回の毎日の注入を受け（it＃３，it＃４，it＃５及びit＃６）、これらはＦ抗体レベルを抑制し、そして臨床学的再発を解決するのには失敗した。
例７．ペプチド投与の異なった経路の比較
最初の研究において、合成MBPペプチドを８人の慢性進行性MS患者に投与した。患者はMBP結合ペプチドMBP（75−95）又は対照の非結合ペプチドMBP（35−58）のいづれかを、５mlの塩溶液中、１〜10mgの上昇する用量で鞘内に受け；対照の非結合ペプチド（MBP35−58）を始めに受けた４人の患者は、後で、結合MBP（75−95）ペプチドを受けた。
CSF中へのMBP（75−95）の注入はＦ MBP特異的抗体の一時的な中和をもたらし；結合された自己抗体は影響されなかった。その効果の持続期間は、１時間（１mgのペプチド）、24時間（2.5mgのペプチド）又は７日間（５〜10mgのペプチド）続いた。鞘内ペプチド投与の効果は不完全であり（Ｂ抗−MBPは高められたまま存続する）、そして比較的短い生存性を有するので、この投与経路を、静脈内注入と比較した。鞘内投与と比較して、遊離及び結合されたMBP自己抗体の両者は、500mgのMBP（75−95）の１回の静脈内注入の後、１カ月で検出できなくなり、そして３カ月間、低レベルで存続し、そして追加注入の後、26カ月までの間、低レベルで存続した（図17）。類似する観察が、MBP結合ペプチド、たとえばMBP75−95，MBP86−95，MBP82−98により静脈内注入された慢性進行性MSを有する約70人の患者において今日までに実施された。10〜50mlの食塩溶液中、500mg（５mg／kg体重）の用量が、CSFに対する多量の血液（因子15）及び腎臓を通しての血流からのペプチドの急速なクリアランスのために、選択され；それらの所定の用量に対応するペプチド用量は、そのような容量がCSF中に注入され得ないので、鞘内投与はされなかった。要約すれば、それらの患者において試験される用量範囲での鞘内投与は、抗−MBP合成をダウンレギュレートした静脈内注入、すなわち長期続く耐性を誘発する一回の静脈内注入に比較して、Ｆ抗−MBPのみの一時的な“モッピング”をもたらした。
例８．MBPペプチドの静脈内投与に続く耐性の持続期間
それらの結果に基づいて、MBPに対する耐性（tolerance）の動態学が、MBP（75−95），MBP（86−95）又はMBP（82−98）の複数回の静脈内注入に続いて、２年以上の間、追跡された慢性−進行性MSを有する約70人の患者において、今日までに試験されている。ペプチドを、５〜６mg／kg体重（256〜500mg）で投与し、そして塩溶液10〜50ml中において、静脈内注入した。静脈内ペプチド投与の前、すべての13人の患者は高レベルの遊離及び結合されたMBP抗体をCSFに有した（図18、表３）。ペプチド投与に続いて１カ月後、MBP特異的抗体は実質的に検出できなくなり、そして一般的に３〜４カ月間、低レベルで存続し、この時点で、抗体レベルは再び上昇し始め；何人かは、８カ月までに、それらの初期レベルに戻った。IV＃１に続いて６〜10カ月後、すべての患者は、10mlの塩溶液中、275〜500mg（５〜６mg／kg体重）のMBP（82−98）の追加注入（IV＃２）を受けた。第２の注射のために選択されるより長いペプチドは、より溶解性であり、そして溶解され、そしてより少ない量で投与された。全体としてこのグループにおいては、CSF抗−MBPレベルは、注入から６週〜２カ月以内に劇的に低下し、そしてより長い時間（26カ月まで）、検出できないまま存続した。約70人の患者の全グループのうち、１人が肺動脈塞栓及びさらなる腰椎穿刺を妨げる続く凝固防止剤療法のために、研究を完結することができず、そしてもう１人は、高い用量の静脈内コルチコステロイドを投与されたので、追跡調査から排除された。それぞれ、約70人の患者のうち、約63人は検出できない抗−MBPレベルを、追加注入の後、18〜26カ月で有した。
例９．HLA−DR２ハプロタイプを有する患者における長命耐性
MS患者のHLA−DRハプロタイプを、ゲノムDNAの分子分類により決定した（表３）。研究を完結された11人の患者のうち４人は、疾病関連のDR２ハプロタイプ（DRB１* 1501又はDRB１* 15021）を担持し；それらの患者のすべては、２回目の静脈内MBPペプチド注入の後、１年で、低いか又は検出できない自己抗体を有した。MBPペプチドはHLA−DR２に対して高い親和性で結合し、そしてHLA−DR２制限されたMBP特異的Ｔ細胞に対して免疫優性である。HLA−DR４（DRB１* 0401）及びHLA−DR７（DRB１* 0701）は投与されたMBPペプチドを結合し；結合研究は患者Ｋ（Ｍ）により担持されるDR分子（DRB１* 0407，DRB１* 0801）に対しては行なわれていない。MBPペプチドは、HLA−DR３（DRB１* 03011）によっては結合されず；研究の最後で高められた抗−MBPを有した２人の患者はDRB１* 03011ハロタイプを担持した（表３）。それらのデータは、MBPに対する耐性の持続期間は、患者のHLA−DRハロタイプに依存することを示す。耐性は、MBP特異的Ｔ細胞及びＢ細胞の両者が耐性を付与される場合、より長命化され得る。
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例10．皮下ペプチド投与は耐性（tolerance）を誘発しない
ペプチド投与の最適な経路を、33人のMS患者のグループにおいて、塩溶液中、MBP（82−98）の皮下注射によりさらに調査した。26人のMS患者においては、上昇する量（１〜100mg）のMBP（82−98）の１回の皮下注射はMBPに対するCSF自己抗体レベルに影響を及ぼさずデータは示されていない）；それらの患者の８人は続いて静脈内ペプチド注入を受け、そして２カ月以内に、CSF抗体レベルは検出できなくなった（表４Ａ）。他の５人の患者においては、900〜1000mgの合計用量（５×100mg、５日間の連続した日、毎日、続いて400又は500mgのもう１回の皮下注射）が、CSFにおけるMBP抗体の適度な低下を単にもたらした（表４Ｂ）。投与の異なったスケジュールがより効果的であるかどうかを試験するために、２人の患者は１カ月離れて、250mgのMBP（82−98）の２回の皮下注射を受けた（表４Ｃ）。再び、自己抗体レベルは影響されなかった。ひとまとめにして考えると、それらのデータは、MBPペプチドの静脈内投与のみが、この研究において試験されたペプチド用量で、MBPに対する長命の耐性を誘発することを示す。
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Ａ．８人の患者が、MBP自己抗体レベルに対して影響を有さないMBP（82−98）（塩溶液１〜５ml中、５〜100mg）の１回の皮下注射を受けた。対照的に、4.5〜８カ月後に投与される同じペプチドの１回の静脈内注入（400〜500mg）は、検出できないCSF自己抗体レベルをもたらした。
Ｂ．高い用量のMBP（82−98）（５日連続した日、100mg／日）の反復された皮下注射はCSF抗−MBPレベルに対して中程度の効果を有し；最初の組の注射の後２週間で皮下投与される追加の高い用量（400又は500mg）のMBP（82−98）は自己抗体レベルをさらに減じなかった。
Ｃ．高い用量のMBP（82−98）の２回の皮下注射（１カ月間隔で２×250mg）は、CSFにおけるMBP自己抗体に対して効果を有さなかった。ひとまとめに考えると、それらのデータは、静脈内投与路のみがMBPに対する耐性の誘発において効果的であることを示す。
種々の変更が、本発明の範囲内で実施され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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