(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子内の１５８番目のリシン残基（Ｌｙｓ）にグルコースが結合した糖化型ビスホスホグリセリン酸ムターゼ（ＢＰＧＭ）。
【請求項２】
請求項１に記載の糖化型ＢＰＧＭを認識する抗体を使用すること、を特徴とする糖化型ＢＰＧＭの免疫測定方法。
【請求項３】
糖化型ＢＰＧＭの測定が糖尿病の判別用であること、を特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
検体が、赤血球又は赤血球含有物であること、を特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の糖化型ＢＰＧＭを認識する抗体を含有すること、を特徴とする糖化型ＢＰＧＭ測定キット。
【請求項６】
請求項１に記載の糖化型ＢＰＧＭを認識する抗体を含有すること、を特徴とする糖尿病判別キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分子内リシン残基（Ｌｙｓ）がグルコースにより糖化を受けた糖化型ビスホスホグリセリン酸ムターゼ（ＢＰＧＭ）、それに対する抗体を使用する糖化型ＢＰＧＭの測定、及び糖尿病診断への応用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物にはホスホグリセリン酸ムターゼ（Phosphoglycerate mutase: ＰＧＡＭ）アイソザイム群の内、赤血球に特異的に存在し、ＥＥホモダイマーから成るビスホスホグリセリン酸ムターゼ（Bisphosphoglycerate mutase: ＢＰＧＭ；ＥＣ５．４．２．４、かってはＥＣ２．７．５．４）が存在する。
ＢＰＧＭは、２，３−ビスホスホグリセリン酸（2,3-bisphosphoglycerate: 2,3-BPG）の合成・分解反応を触媒する。ＢＰＧＭのサブユニットＥは分子量約３万で、ＰＧＡＭのＢおよびＭのサブユニットと約５０％の相同性を有する。
【０００３】
２，３−ＢＰＧは、ＢＰＧＭ反応の補因子であると同時に、赤血球中では、ヘモグロビンの酸素親和性を調節する因子として重要な役割を果たしている。即ち、２，３−ＢＰＧは、ヒトや多くの哺乳動物の赤血球中に高濃度に存在し、ヘモグロビンと直接結合してその酸素親和性を下げ、組織への酸素の供給を促す働きをもつ。また、赤血球内のｐＨを下げることによっても、ヘモグロビンの酸素親和性を下げることが知られている。
【０００４】
一方、糖尿病は、現代の生活習慣上無視し難い疾病であって、その患者は増加の一途をたどっており、早期発見、早期治療が強く求められている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような技術の現状に鑑みてなされたものであって、高血糖が１〜２ケ月続くと、糖化が起こり、慢性疾患へとつながる。通常の血糖値測定法では、一過性の高血糖も検出してしまうが、糖化を見れば持続性で慢性化しているかが判別できることから、糖尿病の正確にして簡便且つ迅速な診断システムを新たに開発する目的でなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために各方面から検討を行った結果、従来のように血糖を直接測定するのではなく、発想をかえていわば分子レベルでの測定の必要性を認めた。そして鋭意研究の結果、糖尿病との関係については従来何も報告されておらず、常に２，３−ＢＰＧの合成を触媒するにすぎなかったＢＰＧＭにはじめて着目し、その生体内での動向の研究の過程において、糖尿病患者の赤血球には１５８番目のリジンがグルコースによって糖化された糖化型ＢＰＧＭ（Ｌｙｓ−１５８  ＢＰＧＭ）が新規物質であることも確認し、特異的に存在することをはじめて見出した。
【０００７】
そこで、この糖化型ＢＰＧＭを測定するシステムの開発という技術課題を改めて設定し、この新規技術課題を解決するために更に研究した結果、糖化型ＢＰＧＭを創製するのに成功し、この糖化型ＢＰＧＭを認識する抗体を使用することによって糖化型ＢＰＧＭの測定が可能であること、そしてその結果糖尿病の診断が可能であることをはじめて確認し、本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明について詳述する。
【０００８】
本発明において、糖化型ＢＰＧＭは、糖尿病患者の赤血球等から抽出して得ることができるが、本発明者らの研究の結果、ＢＰＧＭをグルコース又は各種の糖と保温することによりＢＰＧＭを糖化することができ、Ｌｙｓ−１５８  ＢＰＧＭのほか各種の糖化型ＢＰＧＭを得るのにはじめて成功するとともに、これら糖化型ＢＰＧＭが文献未載の新規物質であることも確認した。
【０００９】
また、ＢＰＧＭについても、これを生体成分から抽出して得ることができるほか、遺伝子操作によりヒト組換え型ＢＰＧＭを作成し、これを使用することもできる。後者の場合、例えば、トリプトファンプロモーターを持つ発現ベクターにヒトＢＰＧＭ遺伝子を挿入し、得られた発現プラスミドで微生物を形質転換して発現させて得ることができる（特開平９−２５２７７３）。ヒト組換え型ＢＰＧＭは、ヒト赤血球由来のＢＰＧＭときわめて類似しており、本発明において充分に使用可能である。
【００１０】
ＢＰＧＭのｉｎ  ｖｉｔｒｏ糖化は、組換え型ヒトＢＰＧＭ等ＢＰＧＭをグルコースと保温することによって行うことができる。具体的には、ＢＰＧＭ  ０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、好適には０．７〜１．０ｍｇ／ｍｌを糖化バッファー（例えば、食塩、アジ化ナトリウム、リン酸カリウム溶液）中で０．０１〜１Ｍ、好ましくは０．０５〜０．５Ｍのグルコースを共に３０〜４０℃に保温してインキュベートすればよい。
【００１１】
ＢＰＧＭのｉｎ  ｖｉｖｏ糖化は、健常なヒト成人の赤血球をグルコース含有培地中で、３％ＣＯ2、９７％空気の湿潤雰囲気下、保温することによって実施することができる。また、上記方法によれば、グルコースのほか各種の糖による糖化型ＢＰＧＭをｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで自由に調製することができる。本発明において、糖としては、フラクトース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、キシロース、ラムノース等の５糖類、６糖類等のほか、タリット、ソルビット、マンニット、イジット、ズルシット等のこれら糖類の糖アルコールも包含される。
【００１２】
本発明において使用する抗体は、次のようにして作製することができる。すなわち、天然由来又は組換え型の糖化型ＢＰＧＭ、その一部のアミノ酸配列を有するペプチド、糖尿病患者赤血球の培養物（その濃縮物、精製物等の処理物、又はそれから分離した蛋白質）から選ばれる少なくともひとつを免疫原として動物に免疫し、その血清中に糖化型ＢＰＧＭに反応性を有するポリクローナル抗体を得る。更に特異性の高い精製されたポリクローナル抗体を得るには、上記によって得られた抗血清をアフィニティクロマト処理等によって精製すればよい。あるいは、免疫を行った動物の脾臓を摘出し、その中に含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを作製し、クローニングすることで均一なモノクローナル抗体を多量に得ることができる。
【００１３】
また本発明においては、上記のほか糖化リシンを認識する抗体も使用することができるが、該抗体は、次のような免疫原を使用するほかは上記と同様にして作製することができる。
すなわち、Ｌｙｓ含有ペプチドを糖化して得た糖化ペプチドが免疫原として使用できる。Ｌｙｓ含有ペプチドとしては、ε−アミノ基を有するリシンのポリマーであるポリリシンのほか、リシンを有するとともに他のアミノ酸を有する各種ペプチド（リシンとグリシン、セリン、グルタミン酸等のランダムコポリマー）も使用することができる。Ｌｙｓ含有ペプチドの糖化は、上記した糖（アルコール）を用いて、ＢＰＧＭの糖化と同様に実施すればよい。
このような免疫原を用いて得た糖化リシンを認識する抗体も、本発明において使用することかできる。
【００１４】
免疫に際しては、上記した免疫原をそのまま使用できるほか、免疫応答を促進するために免疫原を各種アジュバントと混合したり、及び／又は、ＢＳＡ（Bovine Serum Alubumin）、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanine）等のキャリアタンパク質と架橋剤で結合したものを使用することもできる。
【００１５】
免疫に使用する動物については、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、ラット、マウス等の動物が挙げられるが、モノクローナル抗体を作製するためには融合に用いる骨髄腫細胞との相性の問題により、通常、マウスかラットが使用できる。
【００１６】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製は、（Koehler, G. and Milstein, C., Nature 258, 496 (1975) に準じて実施することができる。すなわち、免疫動物から抽出した脾臓細胞、リンパ節細胞又はＢリンパ球から選ばれる抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、ポリエチレングリコールの存在下で融合する。ＨＡＴ培地（１×１０-4ヒポキサンチン、４×１０-7アミノプテリン、１．６×１０-3Ｍチミジン含有）によるハイブリドーマを選択的に増殖させ、培養上清中への上記トランスフェクタントと特異的に結合する抗体の分泌が認められた細胞を限界希釈法によりクローニングする。
【００１７】
こうして作製されたハイブリドーマは、その培養上清や骨髄腫細胞の由来する動物に移植して得られる腹水よりモノクローナル抗体を生産することができる。
免疫動物の抗血清やハイブリドーマの培養上清、腹水より抗体を精製する方法としては、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等、既知の精製方法により行うことができる。
【００１８】
本発明においては、このようにして調製された糖化型ＢＰＧＭや糖化Ｌｙｓを認識する抗体を利用して、ヒトの糖化型ＢＰＧＭのイムノアッセイを行う。あるいは、ボロン酸カラムを用いるクロマトグラフィー（J. Biol. Chem., 262, 16969-16972）によって、糖化型ＢＰＧＭと非糖化型ＢＰＧＭを分離、測定してもよい。イムノアッセイは、免疫染色性、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法等常法が適宜利用できる。
【００１９】
これらの内、固相免疫測定法も有利に利用され、二抗体イムノアッセイ法、例えば固相化した糖化型ＢＰＧＭ  ＩｇＧと検体とを反応させた後、ビオチン化したＢＰＧＭ  ＩｇＧと反応させ、更にアビジン−ビオチン化した酵素を反応させ、酵素の反応値から糖化型ＢＰＧＭ量が求められる。
【００２０】
抗体の固相化は、酵素その他蛋白質を固相に結合する常法にしたがって適宜行うことができる。例えば、固相としてビーズ、マイクロプレート等を用い、物理吸着や化学結合等既知の固定化技術を適宜利用すればよい。
【００２１】
酵素標識抗体も、アビジン−ビオチン化法のほか、グルタルアルデヒド法やマレイミド法等常法にしたがって調製すればよい。標識酵素としては西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウシ小腸アルカリ性ホスファターゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等、ＥＩＡに常用される酵素が広く使用される。また、基質も既知のものが適宜使用され、例えばアルカリ性ホスファターゼを用いる場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を用いると好適である。
【００２２】
このようにして糖化型ＢＰＧＭを測定することができ、糖化型ＢＰＧＭを測定することによって糖尿病の診断をすることができる。また、糖化型ＢＰＧＭ蛋白質量のほかに全ＢＰＧＭ蛋白質量を測定してその比からインデックス（（糖化型ＢＰＧＭ蛋白／全ＢＰＧＭ蛋白）×１００）計算し、このインデックスから糖尿病の診断、その程度等を診断することもできるし、ＢＰＧＭ活性の測定によっても、同じく糖尿病の診断をすることができる。
例えば、糖尿病におけるＢＰＧＭの糖化の診断は、血中の膜に覆われた細胞である赤血球の中に存在するＢＰＧＭまでも糖化されていることを示すものであって、この場合、糖尿病の進行がすすんでいることの大きな指標となるものである。また、ＢＰＧＭは、それが損傷を受けるとアシドーシス（体液の酸性化）が生じ、種々の疾患を併発しやすいため、この点からしても、糖化型ＢＰＧＭの測定は重要である。
【００２３】
また本発明は、糖化型ＢＰＧＭの作成、その抗体を用いる糖化型ＢＰＧＭの測定方法、糖尿病の診断剤を新たに提供するだけでなく、抗ヒト糖化型ＢＰＧＭ抗体及び／又は糖化Ｌｙｓを認識する抗体、緩衝液、標準活性化試薬、その他必要な物質を含有するヒト糖化型ＢＰＧＭ測定用キットないし糖尿病診断用キットも提供するものである。
【００２４】
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２５】
【実施例１】
ヒト組換えＢＰＧＭの製造を、特開平９−２５２７７３にしたがい、次のようにして行った。
【００２６】
（１）ＢＰＧＭ発現プラスミドの構築
ヒトＢＰＧＭの遺伝子クローニング及びそのヌクレオチド配列は既に報告されている。ヒトＢＰＧＭをコードするＤＮＡはヒトＢＰＧＭ遺伝子の２つのエキソンを、ｍＰＣＲ法によって一度に連結して調製した。ヒト胎盤由来の染色体ＤＮＡを鋳型として下記したプライマー、Ｐ１〜Ｐ４を用いてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断してｐＴＲＰへ組込み、ＢＰＧＭ発現プラスミドｐＴＲＰ−ＢＰＧＭ１を構築した。なおプライマーＰ１（２９ｍｅｒ）、Ｐ２（３５ｍｅｒ）、Ｐ３（２０ｍｅｒ）、Ｐ４（２９ｍｅｒ）は、それぞれ次のとおりである：５′−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＴ−３′，５′−ＴＧＡＧＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＣＣＴＴＣＣＡＴＡＧＡＧＴＣＴＡＣＴＴＣ−３′，５′−ＧＴＡＴＣＴＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＴＣ−３′，及び５′−ＡＣＴＴＴＧＴＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＡＴＣＣＣＴＴＡＧＧＣＣＣ−３′。
【００２７】
発現ベクターｐＴＲＰは、次のようにして構築した。
【００２８】
ｉ）ｐＴＺ１９ＵをＳａｌＩとＥｃｏＲＩで切断後、ＤＮＡを平滑末端となるようにＴ４ＤＮＡポリメラーゼで修復し、ライゲーションにより再環化した。従って、得られたプラスミド、ｐＴＺ１９ｓｅはｐＴＺ１９ＵがもつＳａｌＩとＥｃｏＲＩ間のクローニング部位をもたない。
【００２９】
ii）Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｐプロモーターに対するジーンカセットとしてセンスおよびアンチセンスを混合し、ｐＴＺｓｅのＨｉｎｄIIIはＥｃｏＲＩ部位の間に挿入して、ｐＴＺｔｒｐを得た。
【００３０】
iii）ｐＴＺ１９ＵからＥｃｏＲＩとＰｓｔＩの間にクローニング部位もつＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ IIキット（ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．）で精製し、ｐＴＺｔｒｐのＥｃｏＲＩとＰｓｔＩの間の部位に挿入し、発現ベクターｐＴＲＰ（２９２８ｂｐ）を得た。ｐＴＲＰは外来遺伝子に対するクローニング部位としてＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩそしてＰｓｔＩをもつ。
【００３１】
ＰＣＲは既報の方法で行った。全てのプラスミド構築とＢＰＧＭ遺伝子の全遺伝子配列の忠実さは自動ＤＮＡ配列決定装置で行った。ｍＲＮＡの二次構造計測はＧＥＮＥＴＹＸプログラムを用いて計算した。
【００３２】
（２）Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換とその培養
Escherichia coli JM109 competent cellsをコントロールプラスミドおよびＢＰＧＭ遺伝子をもつ組換えプラスミドで形質転換し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で、３７℃で２４時間培養した。菌体からの粗抽出液は、界面活性剤としてdeoxycholic acidの代わりにLubrol PXを用いた以外、Marstonの方法で溶菌して調製した。
【００３３】
組換え型ヒトＢＰＧＭ精製用には、１６Ｌ New Brunswick Scientific Fermentor SF-116(Edison, NJ, USA）を用いて高密度培養を行った。温度（３７℃）、ｐＨ（７．４）、攪拌速度（８００ｒｐｍ）、通気量（１５ｍＬ／ｍｉｎ）の培養パラメータはＭＬ−４１００（multi-loop microprocessor controller）によって制御した。ｐＨの調整は１０％ammonia solutionを添加して行った。１晩前培養した培養液（２４０ｍＬ）を２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（８Ｌ）へ植菌して２時間培養を行い、その後１０時間目まで添加培地を連続的に合計２Ｌ加えながら培養を続けた。
【００３４】
添加培地は、１０％グルコース、１５％イーストエキストラクト、０．１％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．７５％Ｌ-グルタミン酸、０．７５％Ｌ-スレオニン、０．０４％Ｌ-チロシン、０．４％ヒスチジン、０．４％メチオニン（ｐＨ７．４）から成る。培地の添加は１００ｍＬ／ｈの速度で開始して、２時間ごとに２００ｍＬ／ｈ、３００ｍＬ／ｈ、４００ｍＬ／ｈの順で増加させて行った。集菌は１２時間目に遠心分離（１１，０００ｇ×２０ｍｉｎ）で行った。菌体の増殖は培養液の６００ｎｍでの吸光度を測定して調べた。
【００３５】
（３）ＢＰＧＭ活性の測定
ＢＰＧＭ活性はＣａｌｖｉｎらの方法に従って行った。反応混液（全量１ｍＬ）は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、７ｍＭ  １，６-bisphosphofructose、１ｍＭ  ＮＡＤ、２ｍＭ  ３-phosphoglycerate、０．３８ units/mL aldolase、１０ units/mL triosephosphate isomerase、０．８ units/mL glycerate-3-phosphatedehydrogenaseから成る。反応は５０μＬの酵素サンプルを添加して開始し、ＮＡＤＨのＡ340ｎｍの増加を測定した。酵素の１単位は３７℃で１分間当たりに１μｍｏｌＮＡＤＨを増加させる酵素量と定義する。ＮＡＤＨの定量は吸光度係数６．２×１０3ｌ／ｍｏｌｅ／ｃｍを用いて求めた。
【００３６】
（４）蛋白測定と分析
蛋白質は牛血清アルブミンを標準としてbicinchoninic acid法で行った。ＳＤＳ-poly acrylamide gel electrophoresis（ＰＡＧＥ）による蛋白分析は１０〜２０％勾配の市販ゲル（第一化学：８４ｍｍ高×９０ｍｍ巾×１ｍｍ厚）を用いてLaemmliの方法で行った。蛋白はCoomassie Brilliant Blue R-250（ＣＢＢＲ）で染色した。アミノ酸配列の決定は、ＨＰＬＣ  Ｍｏｄｅｌ１２０Ａ装置付ＡＢＩ社477A protein/peptide sequencerで行った。
【００３７】
（５）組換え菌体から粗抽出液の調製
ｐＴＲＰ−ＢＰＧＭ２で形質転換されたＪＭ１０９の菌体を３倍量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。菌体を破砕した後、１０％Lubrol PXを１／５０容量加え、遠心分離（２２，０００ｇ×３０ｍｉｎ、４℃）し、得られた上清を粗抽出液とした。菌体の破砕は DYNO-Laboratory mill type KDL (Willy A, Bachofen AG, Basel, Switzerland）で行った；６００ｍｌ grinding elements，３３．３ｍｌ／ｍｉｎ continuous operation，grinding beads ＭＫ−ＩＧＸ０．１−０．２ｍｍΦ。
【００３８】
（６）組換えＢＰＧＭの精製
粗抽出液を５５℃で３０分間熱処理し、その遠心上清を０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析を行った。次に、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化されたＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２．５×１７ｃｍ）を用いて、アフィニティクロマトグラフィを行った。溶出は、０．１Ｍ ＮａＣｌと２ｍＭ 2-phosphoglycerateを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で行った。
【００３９】
（７）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヒトＢＰＧＭアイソザイムの発現
ＢＰＧＭ発現プラスミドｐＴＲＰ−ＢＰＧＭ１はｔｒｐプロモーターの下流にヒトＢＰＧＭをコードするＤＮＡをもつ。この発現プラスミドによってＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ  １０９を形質転換して得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ｐＴＲＰ−ＢＰＧＭ１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６０として工技院生命研に寄託されている。）を培養し、得られた菌体抽出液のＢＰＧＭ活性を測定した。ｐＴＲＰ−ＢＰＧＭ１によって形質転換されていないＥ．ｃｏｌｉＪＭ  １０９（コントロール）ではＢＰＧＭ活性が検出されなかったのに対して、ＢＰＧＭ発現プラスミドによって形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ｐＴＲＰ−ＢＰＧＭ１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６０）ではＢＰＧＭ活性が検出された。Ｅ．ｃｏｌｉでのヒト酵素の発現量は、ｍＲＮＡの二次構造が影響することがよく知られている。発現プラスミドから合成されたＢＰＧＭのｍＲＮＡ中の５′領域の二次構造形成を予測し、これに基づいてアミノ酸置換がおきないようにヒトＢＰＧＭ遺伝子の５′−コーディング領域を再構築した。
【００４０】
先に示したプライマーＰ４及び下記Ｐ５（４５ｍｅｒ）５′−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＣＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴＡＡＧＡＣＡＴＧＧＡ−３′を用いて先と同様にＰＣＲを行い、ｐＴＲＰ−ＢＰＧＭ２を調製した。このプラスミドによってＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換して得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ｐＴＲＰ−ＢＰＧＭ２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６１として工技院生命研に寄託されている。）を培養し、培養後ＢＰＧＭ活性を測定した。ｐＴＲＰ−ＢＰＧＭ１を用いた場合と比較すると、ＢＰＧＭの発現量が活性レベルで約５倍増加した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの典型例から明らかなように、ＢＰＧＭのＥサブユニットの分子サイズに相当する約３０，０００の位置に濃いバンドが認められた。
【００４１】
（８）組換えヒトＢＰＧＭの精製
組換えヒトＢＰＧＭはＣａｌｖｉｎらの方法を改変し、熱処理（５５℃で３０分間）、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ｐＨ７．５）によるアフィニティクロマトグラフィによって、約２０倍に精製された；３５％の収率で比活性は１２．３Ｕ／ｍｇであった。生産量は菌体１ｋｇ（湿重量）当たり酵素蛋白１．０ｇであった。精製ＢＰＧＭはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子サイズ約３０，０００の位置に単一バンドを示した。
【００４２】
【実施例２】
（１）ヒト組換え型ＢＰＧＭの大腸菌からの調製
実施例１で得た、ヒトＢＰＧＭ遺伝子を含むｐＴＲＰベクターでの形質転換された大腸菌ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６１）を用い、次のようにしてヒト組換え型ＢＰＧＭの製造を行った。
【００４３】
形質転換体（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ｐＴＲＰ−ＢＰＧＭ２）：ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６１）を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１０Ｌ中で、３７℃、２４時間流加培養し、遠心により菌体５００ｇを得た。ダイノミルで破砕した菌体抽出液を５５℃、３０分間熱処理し、８０００ｘｇ、２０分間遠心した。この上清をブルーセファロースＣＬ−６Ｂカラム（２５０×２２４ｍｍ）にアプライした。溶出画分に１．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加え、１．５Ｍ  硫酸アンモニウムを含んだ０．１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したフェニル−トーヨーパール６５０Ｃカラム（６０×１１０ｍｍ）にアプライした。平衡化溶液を流してカラムの洗浄を行った。５％  イソプロパノールを含んだ０．１Ｍ  リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で濃度勾配をかけて溶出を行った。２０ｍＬずつ分取し、２，３−ＢＰＧ合成活性を含んだ溶出画分を集め、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％  アジ化ナトリウムを含んだ０．０５Ｍ  リン酸カリウム溶液（ｐＨ７．４）に対して透析を行い、溶媒置換を行った。限外濃縮し、蛋白濃度３ｍｇ／ｍＬの精製ＢＰＧＭ  ２００ｍｇを得た。蛋白質量の測定は２８０ｎｍにおける分子吸光係数Ｅ１％／ｃｍ＝１６．０で計算した。
【００４４】
（２）２，３−ＢＰＧ合成活性の測定
２，３−ＢＰＧ合成活性の測定は、実施例１に記載したようにＣａｌｖｉｎらの方法に従って行った。その結果、組換え型ＢＰＧＭの２，３−ＢＰＧ合成活性は、約１６単位であった。
【００４５】
（３）ヒト組換え型ＢＰＧＭの糖化
組換え型ＢＰＧＭを０．１Ｍ  グルコース、０．１Ｍ  フルクトース、０．１Ｍ  ソルビトールそれぞれと反応させた。糖化溶液の組成は、前述の各糖濃度と組換え型ＢＰＧＭ  ０．７ｍｇ／ｍＬ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、０．０５Ｍ  リン酸カリウム溶液（ｐＨ７．４）の条件で行った。０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌後、３７℃の恒温槽中に保存し、３、５、７日後に一部をサンプリングした。生体内では主としてグルコースが存在するが、比較として還元力の強いフルクトース、非還元糖であるソルビトールでの反応も行った。
【００４６】
ＢＰＧＭは、上記のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで糖化できるほか、ｉｎ  ｖｉｖｏでも糖化することができる。
すなわち、赤血球（９００×１０6／ｍｌ）を、グルコースを１００ｍＭ又は１０ｍＭ（コントロール）添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃、３〜７日間、培地を毎日交換しながらインキュベートして、赤血球中のＢＰＧＭのｉｎｖｉｖｏ糖化を行った。
【００４７】
グルコースで糖化した赤血球ＢＰＧＭについて、比活性及び糖化型を測定した。比活性の測定は、ＥＬＩＳＡ法によって測定したＢＰＧＭ蛋白（ｍｇ）当りの酵素活性（Ｕ）で表示し、糖化型は、ＥＬＩＳＡ法で測定した全ＢＰＧＭとボロン酸カラム上に回収した各フラクションとの比較によって計算した糖化パーセントである。
【００４８】
得られた結果を下記表４に示すが、その結果から明らかなように、血中濃度のグルコース濃度では、７日後でも糖化は起らなかったが、１０倍の１００ｍＭにした場合、７日目で１０％が糖化された。
【００４９】
【表４】
0004198248.tif 000002
【００５０】
（４）糖化したヒトの組換え型ＢＰＧＭの２，３−ＢＰＧ合成活性の測定
２，３−ＢＰＧ合成活性の測定を行い（３７℃、１００ｍＭ）、得られた結果を図１（Ａ）に示した。但し図中における各記号は、それぞれ次のものを表わす。●：未処理、○：ソルビトール、黒三角：グルコース、黒四角：フルクトース。
上記結果から次のことが分かる。すなわち、サンプリングした各ＢＰＧＭは、未処理のものも含めて２，３−ＢＰＧ合成活性は経時的に減少しており、グルコースの場合では７日後に約４５％が失活していた。グルコースより還元力の強いフルクトースの場合は反応３日でほぼ９５％が失活した。未処理、及び、非還元糖であるソルビトールの場合は失活は、ほとんど起きなかった。
【００５１】
（５）糖化Ｌｙｓを認識する抗体
０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解したポリＬ−リジン（シグマ社製）に、次の実施例の場合と同様に、１Ｍグルコースの糖化溶液を加えて３７℃で３日間反応せしめ、糖化した。得られたグルコース糖化ポリＬ−リシンをキャリア蛋白質（ＢＳＡ、ＫＬＨ、ＯＶＡ）と結合し、これを免疫原としてウサギを免疫し、免疫したウサギから抗血清を得た。このウサギ抗血清から、塩析、アフィニティクロマトグラフィー、及び／又は、ＩｇＧ結合性人工蛋白質、ｐＡ（ＡＢ）4カラムを用いてＩｇＧ画分を分離し、糖化リシンを認識するポリクローナル抗体を得た。同様にして、グルコースにかえて糖アルコールで糖化したポリＬ−リシンを免疫原とし、あるいは、先に調製した糖化型ヒト組換え型ＢＰＧＭ（２５ｍｇ）を用いてウサギを免疫し、糖化したヒトの組換え型ＢＰＧＭに対するポリクローナル抗体を得ることもできる。
【００５２】
（６）糖化Ｌｙｓを認識する抗体による反応
糖化反応を行った組換え型ＢＰＧＭの３、５、７日後にサンプリングしたものを、５０ｍＭ  トリス、１％  ＳＤＳ溶液に溶解し、Ｌａｅｍｌｉらの方法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ついで、ゲルからＰＶＤＦ膜に転写し、上記によって作成した、グルコースによって糖化されたＬｙｓを認識する抗体を用いたウエスタンブロッティングでモニターした。二次抗体には西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した抗マウスヤギＩｇＧを用い、ＯＰＤ溶液で発色させた。グルコースと反応させていないＢＰＧＭとソルビトール、フルクトースで反応させたＢＰＧＭの場合は全く発色を示さなかったが、グルコースと反応させたＢＰＧＭのレーンのみバンドが染色され、この発色は経時的に強くなった。この結果はＢＰＧＭがグルコースと結合し糖化反応を起こしていることを証明している。また、用いた抗体は結合したグルコースのみに特異的に反応していることも明らかとなった（図１（Ｂ）、（Ｃ））。
【００５３】
（７）糖化したヒトの組換え型ＢＰＧＭの糖化部位の解析
ｉ）ヒトＢＰＧＭのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示すが、それから明らかなように、２５８アミノ酸から成り、その内リジン残基（Ｌｙｓ）は１６個である。そして後記するように、これらの内、６個のＬｙｓが糖化サイトである。
【００５４】
ii）糖化は、主としてＮ−末端のα−アミノ基あるいはＬｙｓのε−アミノ基に対して起こること、糖化されたＬｙｓのＣ−末端側はリシルエンドペプチダーゼで切断を受けないこと、及び糖化されたＬｙｓはアミノ酸配列解析においてＰＴＨ（フェニルチオヒダントイン）−アミノ酸として検出されない。この手法を用いてＢＰＧＭの糖化の有無を以下のように実施して検証した。
【００５５】
iii）糖化量を短時間で最大にするために、グルコース濃度は１Ｍとし、３７℃で１日反応させたＢＰＧＭ、７日反応させたＢＰＧＭを用いた。０．７ｍｇのＢＰＧＭを、１Ｍ  グルコース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  アジ化ナトリウムを含んだ２５ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．４）溶液１ｍＬ中で糖化した。システインのジスルフィド結合を解離させるため、Ｃａｖｉｎらの方法によりｓ−ピリジルエチル化を行った。組換え型ＢＰＧＭ及び糖化した組換え型ＢＰＧＭ  ５００μｇを溶液中、２５℃で３０分間反応させた。４Ｍ  尿素を含んだ５０ｍＭ  炭酸水素アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）に対して透析を行い、さらに膜遠心濃縮により５００μＬとした。この溶液に１０μｇのリシルエンドペプチダーゼを添加し、室温で１５時間保存した。比較として糖化反応を行っていないＢＰＧＭも同様にして酵素切断した。
【００５６】
iv）反応した各溶液は、それぞれ、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化したＷａｋｏｓｉｌｌ−１１５Ｃ  １８（４×２５０ｍｍ）カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより分離し、各溶出ピークを分離した。溶出は０．１％トリフルオロ酢酸を含んだアセトニトリル溶液への１％溶離液／ｍｉｎのリニアグラジエントで行った。流速は０．７ｍＬ／ｍｉｎで、２１５ｎｍでモニターした。サイズの小さい断片がグラジエントが始まったと同時にかたまって溶出していたので、この画分を集めて、０．２８３％溶離液／ｍｉｎの緩やかなグラジエントで再分離を行った。
【００５７】
ｖ）糖化反応を行っていないＢＰＧＭの場合は１２本のピークが溶出し、Ｎ−末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（パーキンエルマー社、４７７Ａ−１２０Ａ）により解析した結果、そのうちの１本からは２種の断片が検出され、全部で１３種の断片が検出された。Ｎ−末端及びＣ−末端近傍に存在するＬｙｓは切断されていなかった。また、Ｌｙｓが接近して存在する箇所が１つあるが、そこでは片方のＬｙｓ部位が優先的に切断されていた。結果としてもう片方のＬｙｓは新たにできた断片のＮ−末端付近にきてしまうため、そこでの切断は起こっていなかった（図２：図中、小枠内は、「Ｉ」の画分を再度精密に逆相ＨＰＬＣにより分離したものを示す。）。
【００５８】
また、図２（未糖化のＢＰＧＭのリシルエンドペプチダーゼ消化後の逆相ＨＰＬＣパターン）の各ピーク成分のアミノ酸配列を分析し、得られた結果を下記表５に示す（なお、ピーク８には２成分が含有されていた。その結果、予想されるすべての断片のＮ末端配列が検出された。表中、上付のｃは、ｓ−ピリジルエチルシステインとして測定したものである。）。
【００５９】
【表５】
0004198248.tif 000003
【００６０】
出現するピークの理論値は１６本であり、その予想値は１２本（１２種の断片）であったが、上記から明らかなように、結果的には１２本のピーク（１３種の断片）が出現した（図２）。
上表の結果から明らかなように、Ｌｙｓは１６個存在するが、その内の１個はＣ末端に位置するため、切断を受けるのは１５個であるが、末端付近の４個（Ｃ末端Ｌｙｓは除く）は切断されなかった。したがって、理論的には１１箇所が切断されることになり、１２本のピーク（１２種の断片）が出現するものと予想されたが、実際は１３種の断片が出現した。その理由は、次のように推論される。すなわち、Ｐ−１１とＰ−１２には同一のシーケンス（Ａｒｇ−Ａｌａ）があるが、リシルエンドペプチダーゼはこのＡｒｇ−Ａｌａ結合を切断することがあるため、Ｐ−１１はＰ−１２のＡｒｇ−Ａｌａ結合が切断されたＮ末端側であると予想される。但し、Ｃ末端側はピークとしては検出されなかった。
【００６１】
糖化したＢＰＧＭのリシルエンドペプチダーゼ消化後の逆相ＨＰＬＣパターンを図３に示す。図中（Ａ）は糖化１日後（３７℃、１Ｍ）、（Ｂ）は糖化７日後（３７℃、１Ｍ）の場合をそれぞれ示す。その結果、次のことが明らかとなった。
【００６２】
図１と比較して、糖化１日後で（図３（Ａ））新しいピークＧ１〜Ｇ３が出現した。一方、糖化型ＢＰＧＭにおいて７日間糖化した場合には（図３（Ｂ））、糖化していないＢＰＧＭの場合の溶出パターンと比較して前述の１２本のピーク以外に、新たに５本のピークが出現した。すなわち、Ｇ１のほかに、特にＧ２、Ｇ３のピークは更に高くなり、新たにＧ４、Ｇ５も出現した。Ｎ−末端アミノ酸配列を調べた効果、Ｇ１には２種の断片が存在していたが、いずれも途中に現れるＬｙｓの部位を通り越して配列分析は継続した。このことはそのＬｙｓ部位がグルコースによる糖化を受け、リシルエンドペプチダーゼで切断を受けなかったことを示唆している。また、同時に、溶出したピークをそれぞれ９６穴マイクロタイタープレートに固相し、糖化Ｌｙｓを認識する抗体を用いたサイドイッチＥＬＩＳＡを行ったところ（図３（Ｂ）（ｂ）、新たに出現した５つのピークＧ１〜Ｇ５はそれぞれ反応した。
【００６３】
また、図３（糖化型ＢＰＧＭのリシルエンドペプチダーゼ消化後の逆相ＨＰＬＣパターン）のＧ１〜Ｇ５の各ピーク成分のアミノ酸配列を分析し、その結果を下記表６に示す（なお表中、上付のｃは、ブランクであって、フェニルチオヒダントイン誘導体が検出されなかったことを示し、上付のｄは、Ｓ−ピリジルシステインとして測定したものである。）。
【００６４】
【表６】
0004198248.tif 000004
【００６５】
vi）ＥＬＩＳＡの操作法
本発明において、ＥＬＩＳＡは、次のようにして行った。
【００６６】
（１．糖化型ＢＰＧＭの場合）
各サンプル１００μＬを２Ｌの５０ｍＭ  リン酸カリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に対し一晩透析して溶媒置換を行った。限外ろ過膜（アミコン社製、セントリコン３０、番号４２０８）で濃縮して１００μＬとし、９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製、番号４４２４０４）に移して４℃で一晩放置しプレートへの固相化を行った。ウェル内の抗原液を除去し０．１％ＢＳＡ溶液２００μＬを添加して室温で１時間放置してブロッキングを行った。このとき、何も固相化していない１ウェルにも０．１％ＢＳＡ溶液２００μＬを添加しておき、吸光度測定時のブランクとした。ついで、ＴＴＢＳ溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）２００μＬを添加し、軽く攪拌して除去することを５回繰り返してウェルの洗浄を行った。抗ｈｅｘｉｔｏｌ−Ｌｙｓ抗血清をＴＴＢＳ溶液で１０００倍希釈し、各ウェルに１００μＬずつ分注して室温で１時間反応させた。
【００６７】
抗ｈｅｘｉｔｏｌ−Ｌｙｓ抗血清は、先に述べたように、ｈｅｘｉｔｏｌ−Ｌｙｓ（ここでは１−ｇｌｕｃｉｔｏｌ−Ｌｙｓを使用、１−ｍａｎｎｉｔｏｌ−Ｌｙｓも同様に使用可能）にキャリア蛋白質（ＫＬＨ、ＯＶＡ又はＢＳＡ）を架橋剤（グルタルアルデヒド）を用いて結合し、これを免疫原として使用して調製した。すなわち、ｈｅｘｉｔｏｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ＫＬＨ  １ｍｇを完全アジュバントと共にウサギに７〜１０日ごとに計６回皮下投与してウサギを免疫し、その血清から抗ｈｅｘｉｔｏｌ−Ｌｙｓ抗血清を得た。同様にして抗ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｌｙｓ抗血清も調製することができる。
【００６８】
希望する場合、硫安沈澱、沈澱物のＰＢＳ溶液透析処理、ｈｅｘｉｔｏｌ−Ｌｙｓを固定した活性化ＣＨ−セファローズ  ４Ｂカラム等を用いるアフィニティクロマトグラフィー処理等既知の精製方法により、ウサギ抗血清から抗ｈｅｘｉｔｏｌ−Ｌｙｓ  ＩｇＧを分画することができる。
【００６９】
ついで、ＴＴＢＳ溶液２００μＬを添加し、軽く攪拌して除去することを５回繰り返してウェルの洗浄を行った。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ（バイオラッド社製、番号１７０−６５１５）をＴＴＢＳ溶液で２０００倍希釈し、各ウェルに１００μＬずつ分注して室温で１時間反応させた。ついで、ＴＴＢＳ溶液２００μＬを添加し、軽く攪拌して除去することを５回繰り返してウェルの洗浄を行った。ＰＯＤ錠（和光純薬製、番号１５４−０１６７３）を１０ｍＬの１００ｍＭ  リン酸二水素−ナトリウム（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに溶解し、さらに３μＬの３０％過酸化水素を添加して作製した発色液を各ウェルに１００μＬずつ分注し室温で１０分間発色させた。４Ｎ  ＨＣｌをさらに１００μＬずつ添加して反応を停止した。プレートリーダー（コロナ社製、ＭＴＰ−３２型）を用い、主波長４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍで吸光度の測定を行った。
【００７０】
（２．逆相ＨＰＬＣ後のピークの場合）
各ピーク画分の１／４量をエッペンドルフチューブ内で減圧乾固し、５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）１００μＬを加えて再溶解した。９６穴マイクロタイタープレートに全量を移し、４℃で一晩放置しプレートへの固相化を行った。以下の反応は、上記１の０．１％ＢＳＡ溶液のブロッキング反応からの操作と同じである。
【００７１】
vii）以上の結果から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件下では、少なくともＬｙｓ２、Ｌｙｓ４、Ｌｙｓ１７、Ｌｙｓ４２、Ｌｙｓ１５８、Ｌｙｓ１９６が糖化を受けていると結論付けられた。また、糖化を１日間行ったＢＰＧＭの場合では３本のみが新たに出現していたことから、Ｌｙｓ２、Ｌｙｓ１５８、Ｌｙｓ１９６がより速く糖化を受けていることも明らかとなった。（図４）
【００７２】
（８）糖化したヒトの組換え型ＢＰＧＭのアミノ酸組成分析
アミノ酸分析はＰＩＣＯ−ＴＡＧ法により行った。ＢＰＧＭと糖化された組換え型ＢＰＧＭ２０μｇをそれぞれ加水分解用のガラスチューブにとり、減圧乾燥した。６Ｎ  ＨＣｌ、１％フェノール  ２００μＬを加水分解用のバイアル中に入れ、さらに、減圧乾燥したガラスチューブを入れた。減圧下、窒素封入し、１０５℃、２４時間の加水分解を行った。室温に戻し、ガラスチューブを減圧乾燥した。２５％  トリエチルアミン、２５％  メタノール溶液  ２０μＬを入れ、攪拌した。ガラスチューブを減圧乾燥した。２５％  トリエチルアミン、２５％メタノール、２５％  フェニルイソチオシアネート溶液２０μＬを入れ、室温、暗所で２０分間ＰＩＴＣ化を行った。減圧乾燥を行った。サンプル希釈液１００μＬを入れ、攪拌し、そのうちの１０μＬをＰＩＣＯ−ＴＡＧカラムを用いた逆相クロマトグラフィーで分析した。
【００７３】
分析結果を下記表７、表８に示す。各アミノ酸量は、同時に分析した標準アミノ酸のピークの面積値をもとに計算した。なお、ＡｓｎはＡｓｐとして検出され、ＧｌｎはＧｌｕと検出され、Ｔｒｐは通常のアミノ酸分析法では分解されてしまうので検出できない。また、各組成比は下線の値を基準に計算した。その結果（糖化ＢＰＧＭのアミノ酸分析及びｎａｔｉｖｅ型との比較）から明らかなように、組換え型ＢＰＧＭのアミノ酸組成値は理論値とほぼ一致したが、糖化した組換え型ＢＰＧＭのアミノ酸組成値ではＬｙｓのみが約７５％に低下していた。
【００７４】
【表７】
0004198248.tif 000005
【００７５】
【表８】
0004198248.tif 000006
【００７６】
（９）糖尿病患者のＢＰＧＭの調製
糖尿病患者の赤血球破砕画分１Ｌ（１３．３ｇ／ｄＬ  Ｈｂ）を５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０２％  アジ化ナトリウムを含んだ５ｍＭ  リン酸カリウム溶液で４Ｌに希釈した。希釈したサンプルを５ｍＭＥＤＴＡ  １ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０２％  アジ化ナトリウムを含んだ５ｍＭ  リン酸カリウム溶液（ｐＨ７．２）で十分に平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（２５０×１００ｍｍ）にアプライし、さらに、平衡化溶液を十分に流して洗浄した。ついで、０．１Ｍ ＮａＣｌを含んだ平衡化溶液を濃度勾配をかけて溶出させた。
【００７７】
ＢＰＧＭ抗体と反応する画分を集めて１．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加え、１．５Ｍ  硫酸アンモニウムを含んだ０．１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したフェニル−トーヨーパール６５０Ｃカラム（６０×１１０ｍｍ）にアプライした。平衡化溶液を流してカラムの洗浄を行った。５％  イソプロパノールを含んだ０．１Ｍ  リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で濃度勾配をかけて溶出を行った。ＢＰＧＭ活性を含んだ溶出画分を集め、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０２％  アジ化ナトリウムを含んだ０．０５Ｍ  リン酸カリウム溶液（ｐＨ７．４）に対して透析を行い、溶媒置換を行った。限外濃縮し、蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬの精製糖尿病患者由来ＢＰＧＭを得た。２，３−ＢＰＧ合成活性を測定した結果、健常人から精製したＢＰＧＭの約２／３の比活性であった。
【００７８】
（１０）糖尿病患者のＢＰＧＭからの糖化型ＢＰＧＭの分離
精製した糖尿病患者由来ＢＰＧＭを、２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニルコエタンスルホン酸溶液であるＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）で十分に平衡したＢｏｒｏｎａｔｅ−５ＰＷカラム（東ソー、７．５×７５ｍｍ）にアプライした。カラムに結合しなかった素通りのピークの２８０ｎｍの面積値と溶出でのピークの２８０ｎｍの面積値から糖化型ＢＰＧＭの割合を測定した結果、８．４％が糖化されていることが判明した（図５）。
【００７９】
糖尿病患者及び正常人の赤血球中のＢＰＧＭの比活性及び糖化型ＢＰＧＭの割合を測定し、得られた結果を下記表９に示した。なお比活性（ＩＵ／ｍｇ）は、ＥＬＩＳＡ分析によって得たＢＰＧＭ蛋白質（ｍｇ）当りのＢＰＧＭ活性（ＩＵ）で表わし、糖化型ＢＰＧＭ（％）は、ＥＬＩＳＡ分析に基づく全ＢＰＧＭとボロン酸カラム上の各フラクションとの比較計算によるものである。
その結果から明らかなように、健常人の糖化型ＢＰＧＭの割合は０．６％であったが、患者の場合は約６倍の３６．％であった。Ｂｏｒｏｎａｔｅ−５ＰＷカラムで精製された糖尿病患者由来の糖化型ＢＰＧＭの２，３−ＢＰＧ合成活性を測定した結果、全く活性は検出されず、完全に失活していた。一方、糖化の指標となるヘモグロビン（Ｈｂ）の糖化は、患者は正常人に比べ約３倍程度であった。このように、ヘモグロビン（Ｈｂ）の糖化よりもＢＰＧＭの糖化の方が、糖化率は高いことが確認された。
【００８０】
【表９】
0004198248.tif 000007
【００８１】
（１１）糖尿病患者の糖化型ＢＰＧＭの糖化部位の解析
Ｂｏｒｏｎａｔｅ−５ＰＷカラムで精製された糖尿病患者由来の糖化型ＢＰＧＭに対して、組換え型ＢＰＧＭの場合と同様の手法でＬｙｓの糖化の有無を解析した。糖尿病患者由来の糖化型ＢＰＧＭ  １．７ｍｇをＳ−ピリジルエチル化し、リシルエンドペプチダーゼ処理後、消化断片を逆相ＨＰＬＣで分離してアミノ酸配列解析を行った（図６）。糖尿病患者から精製した糖化型ＢＰＧＭの場合は、ＨＰＬＣ上でＧ２に相当する１本の新しいピークのみが出現した。Ｎ−末端アミノ酸配列解析の結果、Ｇ２と同様に１５８番目のＬｙｓの位置でＰＴＨ−アミノ酸は検出されなかった。この結果から、糖尿病患者の中のＢＰＧＭは人口的な糖化を行ったＢＰＧＭと違って、１５８番目のＬｙｓただ１箇所が糖化されていると結論付けられた。
【００８２】
【発明の効果】
本発明によって、新規物質である糖化型ＢＰＧＭがはじめて明らかにされた。そして、ＢＰＧＭを糖化することによりその製造が可能となり、また、糖化型ＢＰＧＭを認識する抗体及び／又はボロン酸カラムクロマトグラフィーを用いることによって糖化型ＢＰＧＭを測定する方法も確立された。
【００８３】
更にまた、糖尿病患者のＢＰＧＭは、１５８番目のリシン残基がグルコースで糖化されていることを新たに見出し、この糖化型ＢＰＧＭも上記方法で測定できることを確認し、糖尿病の新しい診断システムを開発するのにも成功した。
【００８４】
【配列表】
本発明で用いるＢＰＧＭのアミノ酸配列を下記表１、表２、表３に示す。
【００８５】
【表１】
0004198248.tif 000008
【００８６】
【表２】
0004198248.tif 000009
【００８７】
【表３】
0004198248.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】ＢＰＧＭの糖化による失活と抗体反応による糖化型ＢＰＧＭの検出を示す。
【図２】未糖化のＢＰＧＭのリシルエンドペプチダーゼ消化後の逆相ＨＰＬＣパターンを示す。
【図３】糖化型ＢＰＧＭのリシルエンドペプチダーゼ消化後の逆相ＨＰＬＣパターンを示す。
【図４】組換え型ＢＰＧＭのアミノ酸配列及び糖化Ｌｙｓサイトを示す。
【図５】糖尿病患者赤血球中のＢＰＧＭからの糖化型ＢＰＧＭの分離を示す。
【図６】糖尿病患者赤血球中の糖化型ＢＰＧＭのリシルエンドペプチダーゼ消化物の逆相ＨＰＬＣパターンを示す。
【図１】
0004198248.tif 000011
【図２】
0004198248.tif 000012
【図３】
0004198248.tif 000013
【図４】
0004198248.tif 000014
【図５】
0004198248.tif 000015
【図６】
0004198248.tif 000016