(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御用コンピュータを介してシステムパラメータの調整を行う、共焦点レーザスキャニング顕微鏡のシステムパラメータの調整方法において、以下のステップ：
ａ）利用者との対話型利用者ガイドを提示すること
ｂ）少なくとも１つの物体パラメータ、少なくとも１つの選択可能なシステムパラメータ、少なくとも１つの、撮像に関する定義可能な問題設定が利用者により入力されること、
ｃ）撮像に関する、更なるシステムパラメータ、最適化経路および撮像ストラテジを（複数）提案すること、但し、該提案は、少なくとも１つの物体パラメータ、少なくとも１つの選択可能なシステムパラメータ、及び少なくとも１つの、撮像に関する定義可能な問題設定に関連して行われること、
ｄ）利用者により１つの提案が選択されること、
ｅ）選択されたシステム調整又は撮像ストラテジに関するシステムパラメータを自動的に調整すること
を特徴とする調整方法。
【請求項２】
少なくとも１つの次のパラメータ：撮像されるべき物体の寸法、撮像されるべき物体の範囲、撮像されるべき光学的断面の数、撮像されるべき物体の性質及び検出方法を、入力することにより規定される
ことを特徴とする請求項１に記載の調整方法。
【請求項３】
前記検出方法は、蛍光法又は反射法の何れかの使用である
ことを特徴とする請求項２に記載の調整方法。
【請求項４】
前記提案のステップは、最大の分解能を達成するためできるだけ大きい開口数を有する好適な対物レンズの使用に該当すること、
利用者に、選択された対物レンズに関し達成可能な最大の分解能が提示されること、
前提的に規定された及び既に調整されたシステムパラメータに基づいて実際の分解能が提示されること、
利用者に、像面当たりの画素数が提案されること
を特徴とする請求項１に記載の調整方法。
【請求項５】
求められるべき物体の性質が最適な照射強度を求めるために利用されること、及び最適な照射強度が利用者に提案されること
を特徴とする請求項２に記載の調整方法。
【請求項６】
ディテクションピンホールの直径を調整するために、利用者に、撮像の分解能が撮像の許容しうるＳ／Ｎ比において最大になるよう最適化された値が提案される
ことを特徴とする請求項１に記載の調整方法。
【請求項７】
前記利用者ガイドの提示は、少なくとも１つのシステムパラメータを選択するとき、該選択により影響を受け、かつ１つのシステムパラメータの選択に基づいて可能な範囲で最良の質に関しどの程度の撮像が実現可能かについて同様に利用者に提案される、全てのシステムパラメータを利用者に提示することである
ことを特徴とする請求項１に記載の調整方法。
【請求項８】
前記利用者ガイドにより、予設定された問題状況に対する支援手段又は解答が提供される
ことを特徴とする請求項１に記載の調整方法。
【請求項９】
前記問題状況は、以下の問題：
−「試料があまりにも著しく「漂白」（滅光）すること（蛍光物体の場合）」及び／又は
−「画像データに雑音が混入すること」及び／又は
−「測定時間が長すぎること」及び／又は
−「分解能が小さすぎること」
である
ことを特徴とする請求項８に記載の調整方法。
【請求項１０】
少なくとも部分的に互いに依存しあうシステムパラメータが、アルゴリズムにより求められる
ことを特徴とする請求項１に記載の調整方法。
【請求項１１】
前記システムパラメータは、予設定を顧慮して、データバンクに収容（記憶）されたエキスパートシステムから呼び出される
ことを特徴とする請求項１に記載の調整方法。
【請求項１２】
前記システムパラメータは、予設定を顧慮して、ファジイ論理のもとで求められ、そして選択に従って又は自動的に調整される
ことを特徴とする請求項１に記載の調整方法。
【請求項１３】
利用者のための前記利用者ガイドは、最適な−物体及び／又は問題特異的な−システム調整及び／又は撮像ストラテジのために活性化可能でありかつ指導ガイドを行う学習プログラムを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の調整方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザスキャニング顕微鏡、好ましくは共焦点レーザスキャニング顕微鏡のシステムパラメータの調整方法に関する。システムパラメータの調整は、制御用コンピュータを介して行われる。
【０００２】
【従来の技術】
本発明は、レーザスキャニング顕微鏡の分野、とりわけ共焦点レーザスキャニング顕微鏡の分野に関するが、レーザスキャニング顕微鏡は、数年来実務上既知である。これについては単にその一例としてドイツ特許公開DE196 54 211 A1が挙げられる。共焦点レーザスキャニング顕微鏡を使用するには、当該レーザスキャニング顕微鏡の操作について、即ち、相互に依存するが、しばしば背反ないし排斥しあうこともあるシステムパラメータの調整のため十分な知識が必要とされる。それにはピンホールの直径、光電子倍増管（PMT）の電圧、レーザ出力等が含まれる。システムパラメータを、とりわけ物体（被検対象物）に特有の性質を顧慮して、適切に調整するために、利用者は、そのようなレーザスキャニング顕微鏡の取り扱いに関する自分の経験に頼らなければならない。いずれにせよこれまでは、広範囲にわたる関連する知識ないし経験なしで好適な評価ないし観察結果を得ることは、利用者にとって殆ど不可能であった。
【０００３】
とりわけ定量的（quantitativ）共焦点レーザ顕微鏡については、撮像された画像データのデータの質に関する評価は、重要な基準である。データ撮影の質に関する評価の指標は、例えば、Ｓ／Ｎ比（信号対雑音比）又は得られた分解能でありうる。それゆえ好適なデータ評価方法は、定量的共焦点レーザスキャニング顕微鏡を広範囲にわたって有効に使用するための必須条件である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
共焦点レーザスキャニング顕微鏡を調整する場合の前述の複雑さのため、利用者の誰もがレーザスキャニング顕微鏡の作動ないしシステムパラメータを最適に制御できるというわけではない。とりわけ共焦点レーザスキャニング顕微鏡の種々の光学的及び電子的境界パラメータ（Randparameter）の部分的に極めて複雑な関係に関する知識の欠如により、これまで操作が不十分なものとなっていた。しかしこのようなレーザスキャニング顕微鏡は最適に制御されないと、撮像してもその画像の質は低いものにとどまるか、或いは本来の撮像の前にあまりにも長すぎる調整手順を踏まなければならない。しかし本来の撮像の前の長すぎる調整段階は、このような顕微鏡の効率を悪化させ、大抵はレーザ光源及び／又はレーザ光線をうける光ファイバは過度に消耗し、並びに場合によっては試料が損傷することになる。
【０００５】
これまで実務上既知であったレーザスキャニング顕微鏡は、とりわけ初心者が（操作法を）習得する場合に問題がある。というのは、熟練した利用者が常に指導ないしサポートする必要があるからである。いずれにせよこれまでは、レーザスキャニング顕微鏡の最適な使用法を独習で習得することは困難であった。それどころか従来のレーザスキャニング顕微鏡は、熟練した利用者による極めて長時間にわたる指導が必要不可欠である。
【０００６】
従来の実務上の更なる問題点は、極めて長時間の調整作業の間に多数の蛍光物体が消光（滅光：ausbleichen）してしまうことである。しかし長時間の調整作業は大抵は回避することができないので、これまで実務上既知のレーザスキャニング顕微鏡は、とりわけ生物学的試料の場合に限定的にしか使用されず、その点で問題がある。それゆえ最適な調整のための時間を大幅に低減することが原則的に重要である。
【０００７】
上述の問題点に鑑み、本発明の課題は、レーザスキャニング顕微鏡、好ましくは共焦点レーザスキャニング顕微鏡のシステムパラメータの調整方法を提供することである。その際システムパラメータの調整は、制御コンピュータにより行われる。この方法により、レーザスキャニング顕微鏡の確実かつ再現可能な調整を、更には予設定可能なシステム／物体パラメータを考慮した上でも、可能とするべきである。
【０００８】
この課題は、本発明の方法によれば、請求項１の特徴により解決される。即ち、制御用コンピュータを介してシステムパラメータの調整を行う、共焦点レーザスキャニング顕微鏡のシステムパラメータの調整方法において、以下のステップ：
ａ）利用者との対話型利用者ガイドを提示すること
ｂ）少なくとも１つの物体パラメータ、少なくとも１つの選択可能なシステムパラメータ、少なくとも１つの、撮像に関する定義可能な問題設定が利用者により入力されること、
ｃ）撮像に関する、更なるシステムパラメータ、最適化経路および撮像ストラテジを（複数）提案すること、但し、該提案は、少なくとも１つの物体パラメータ、少なくとも１つの選択可能なシステムパラメータ、及び少なくとも１つの、撮像に関する定義可能な問題設定に関連して行われること、
ｄ）利用者により１つの提案が選択されること、
ｅ）選択されたシステム調整又は撮像ストラテジに関するシステムパラメータを自動的に調整すること
を特徴とする。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明により確認されていることは、最適な調整に必要な時間の低減は、利用者のガイドが付属物ないしアタッチメント（Anhang）からの物理的関係ないし公式を基礎として対話において行われる場合にのみ、−合理的かつ再現可能に−可能であると言うことである。換言すれば、制御コンピュータは、対話形式で利用者ガイドを提供する対応ソフトウエアを持っている。少なくとも１つの物体パラメータ及び／又は少なくとも１つの選択可能なシステムパラメータの入力により、利用者に残りのシステムパラメータの調整（機会ないし調整の選択肢）を提案する。選択に従い又は−同様に選択的に−自動的に、残りのシステムパラメータは、ソフトウエアプログラムによる提案を基礎として調整される。その際本質的なことは、基本的に対話形式でシステムパラメータのほぼ最適な調整が提案されるということである。個々のシステムパラメータ又は複数のシステムパラメータの選択に応じて、その他のシステムパラメータは、実行された選択に適合され、１つ又は複数の予設定（Vorgabe）の範囲内で更なる最適化が行われる。同じことが物体パラメータの場合についても当てはまる。
【００１０】
有利には、本発明の方法は、少なくとも１つの物体パラメータ及び／又は１つの場合により選択可能なシステムパラメータ及び／又は撮像に関する及び／又は撮像されるべき物体に関する少なくとも１つの規定可能な問題状況（ないし問題点）を入力することにより、システム調整及び／又は撮像ストラテジのための最適化経路が提案（提示）される。その限りにおいて、利用者ガイドは、個々の物体／システムパラメータに関する予設定又は特定の問題状況に関する予設定に応じて、システム調整ないし撮像ストラテジを提案する準インテリジェントシステムないし対応するデータバンクを包含する。その場合、利用者は、その予設定に基づいて自らの要求に最適な撮像ストラテジ（戦略・方針）を選択することができる。
【００１１】
選択されたシステム調整又は撮像ストラテジの予設定可能なシステムパラメータ（複数）は、利用者ガイドを介して−選択的に−自動的に、しかも好ましくは利用者により入力されるべき確認に従って、調整することができる。この場合、確実に入力されたか否かを確認する照会（ステップ）を備えることも可能である。
【００１２】
対話の際には、多数の物体／システムパラメータを（予）選択することができる。これには、例えば撮像されるべき物体の寸法、撮像されるべき物体の範囲、物体の内部におけるないし物体を貫通する光学的断面（断層面：optischen Schnitte）の数、撮像されるべき物体の性質、検出方法等が含まれる。問題となる検出方法としては、蛍光法と反射法の使用が考えられる。ここで注意すべきことは、前述のパラメータに関する予設定は、任意的な入力により又は予め定められたないし利用者により拡張可能なメニューからの選択により行うことができる。
【００１３】
更に、対話の際に、装置に関するパラメータを選択又は予設定することもできる。そのため最大の分解能を得るためにできるだけ大きい開口数の好適な対物レンズを、しかも既に選択されてあるシステム／物体パラメータに基づいて、使用することも可能であろう。更に、対話の際に、選択された対物レンズにより到達し得る最大の分解能を提示することも可能であろう。既に選択されたないし提示された及び場合によっては既に調整されたシステムパラメータに基づいて、現実に達成可能な分解能を提示することも可能であろう。これはつまり予設定されたシステムパラメータに基づいたこの分解能が実際にも十分なものであるか否かを点検するためである。この限りで利用者ガイドは、即ちより大きい分解能を実現するための、択一的ないし選択的な、予調整を提供できるであろう。
【００１４】
対話の際に、像面当たりの画素数を提案することも考えられる。
【００１５】
対話の際に入力されるべき又は選択されるべき物体の性質（特性）は、最適照射強度（これは対話の際にも同様に調整のために提案される）を求めるために利用される。最適照射強度ないしレーザ出力−同様に予設定可能なシステム／物体データに基づいている−は、対話の際に同様に提案される。更に、最適な照射強度ないしレーザ出力を自動的に−場合によっては利用者による許可（ないし解除）（Freigabe）に従って−調整することも考えられる。
【００１６】
検出（ディテクション）ピンホールの直径を調整するために、対話の際に、なおも使用可能な（ないし許容可能な）撮像のＳ／Ｎ比において撮像の分解能が最大となる最適値が提案される。ディテクションピンホールの直径を調節するために、対話の際に、なおも使用可能な（ないし許容可能な）撮像の分解能において撮像のＳ／Ｎ比が最大となる最適値を提案することも同様に考えられる。
【００１７】
前述の通り、本発明の方法により提供される利用者ガイドは、著しい利点と容易化を提供する。例えば更に有利な方法では、対話の際に、少なくとも１つのシステムパラメータを予設定又は変更する場合、当該予設定又は変更により影響を受ける全てのシステムパラメータを提示することも可能である。利用者ガイドにより、パラメータの予設定又は変更に基づいて画像の質が可能な範囲で最良の撮像をどの程度実現できるかについて、対話の際に提示することも可能である。この限りで、利用者は種々の最適化手段を、それも予設定された物体／システムパラメータに基づいて及び変更された物体／システムパラメータに基づいて、選択することができる。
【００１８】
とりわけ有利な方法において、とりわけ特別な撮像技術の観点ないし所定の使用（応用）の観点から、とりわけ有利なことは、当該撮像ないし使用にとって重要な少なくとも１つの基準がその最適化のために予設定可能である場合である。その場合、この予設定に基づき、利用者ガイドの範囲内でさらなるシステムパラメータが対話の際に提案及び／又は−場合によっては照会及び利用者の確認に従って−自動的に調整される。予設定される基準としては、例えば目標とするＳ／Ｎ比が考えられる。他の基準の予設定も同様に可能であり、その際残りのシステムパラメータの適合化が−それに応じて−行われる。
【００１９】
利用者ガイドにより、対話の際に、予設定された問題状況に対する助言（ヘルプ）等又は解答が提供されうるであろう。問題状況は種々の問題事例でありうるが、例えば以下のような問題事例でありうる。即ち試料（蛍光物体の場合）があまりに著しく「漂白」（消光ないし滅光）する場合、画像データの「雑音」が著しい場合、測定時間が長すぎる場合、又は撮像の分解能が小さすぎる場合である。これらの問題状況に対応して、対話の際に、利用者により予調整されたシステムパラメータを基礎として選択可能な助言ないし解答が提供される。対話の際に提供される助言に基づいて、最適化が−対話の際に−可能となる。
【００２０】
少なくとも部分的に互いに依存又は互いに背反するシステムパラメータをアルゴリズムによりないし対応する方程式に基づいて求めることも同様に可能である。これらは、付属物ないしアタッチメント（Anhang）による方程式でありうる。
【００２１】
更に、システムパラメータを互いに排他的な（ないし背反する）性質ないし調整に基づいて提案しそして選択、場合により更に確認に従って自動的に調整することも考えられる。これらの互いに影響しあう又はそれどころか互いに背反する性質は、図１に「質の三角形」として描かれている。互いに背反するないし互いに排斥する要因（ファクタ）は、最大分解能、最大明るさ（Helligkeit）及び最大撮像速度である。
【００２２】
とりわけ有利な方法では、システムパラメータは、予設定を考慮して、データバンクに記憶（ないし収容）されたエキスパートシステムから呼び出される。このときエキスパートシステムは、一方では経験的価値（ないし知識）を、他方では質の三角形に基づいたアルゴリズムを包含しうる。更にシステムパラメータを、予設定を考慮して、ファジィ論理を利用して求めること、そして選択に従って又は自動的に−場合によっては利用者による確認に従って−調整することも考えられる。この場合ファジィ論理による処理（処理手順）をエキスパートシステムに組み込むことができる。
【００２３】
更に利用者ガイドは、以下のように構成することも可能であろう。即ち、少なくとも１つのシステムパラメータを予設定及び／又は変更をする場合、対話の際に、撮像の性質の観点から、例えば分解能、サンプリング等の観点から撮像が影響を受けること、及び肯定（影響あり）の場合には撮像がどのように影響を受けるかを提示するように構成することである。この限りで、利用者ガイドのために「先見の明のある」システムが問題となり、これにより質に関する影響
（効果）が提示される。更に有利なのは、撮像前、撮像中及び撮像後に達成されるべき撮像の質に関する情報を利用者に提示する場合である。つまりこれは画像の質が一方では選択されたシステムパラメータに基づいて、他方ではシステムにより予設定されたシステムパラメータに基づいて十分なものであるか否かを点検できるようにするためである。
【００２４】
利用者により調整ないし変更された撮像ないしシステムパラメータは、撮像プログラムにより解析することができるであろう。１つの又は複数のシステムパラメータが利用者により「誤」って調整された場合は、そのプログラムは、最適なシステム調整を再び回復することを目的として、自動的かつ自発的に利用者を対話へと導くことができる。このためにそのプログラムの「クオリティ−デーモン−モジュール（Qualitaets-Daemon-Modul）」（全てのシステムパラメータを背後において監視するプログラムの部分（サブルーチン）が利用の間中実際のシステムパラメータを分析しそして調整が最適でない場合には対話モジュールを自動的に呼び出さなければならないであろう。
【００２５】
最後に利用者ガイドはとりわけ有利な方法において、とりわけ初心者を指導するために、学習プログラムを対話に導入することができるであろう。これにより当該初心者は、最適な撮像ストラテジの指導を、それも物体又は問題特有のシステム調整に基づいて、受けることができるであろう。対話に導入された学習プログラムは、既に経験のある利用者に対するトレーニングプログラムとしても構成することができるであろう。これは蛍光顕微鏡を操作する利用者の作業の質を向上できるようにするためである。
【００２６】
図１に示した共焦点レーザスキャニング顕微鏡についての３つの指標（即ち、最大撮像速度、最大分解能及び最大明るさ（Helligkeit）は、互いに背反する。利用者が例えば大きな位置分解能を得ようとする場合、スキャニング時間は長くなる。この場合得られた信号は、大抵著しく弱められている。このことは、図１に描かれた「質の三角形」に示された他の値（大きさ）についても同様である。
【００２７】
共焦点レーザスキャニング顕微鏡の場合、当該装置の利用者は、原則的に以下の問題設定（問題点）に直面する。
−試料が、蛍光物体の場合、著しく消光（滅光）［漂白］する、
−画像データには「ノイズが混入」している、
−測定時間が長すぎる、
−撮像の分解能が低すぎる。
【００２８】
本発明の方法を使用することにより、利用者には、利用者ガイドないしコンピュータ対話が提供される。これにより、具体的使用（操作）に応じて最適なシステム調整が可能となり、それに対応するいくつかの撮像ストラテジが提案されかつ利用者により選択可能となる。いずれにせよ、最適化の際には、図１に記載の「質の三角形」が取り入れられうる。
【００２９】
さらに利用者には、本発明の方法により支援手段が提供される。この支援手段は、コンピュータ支援型利用者ガイドの形式で、想定される問題点全て、とりわけ前述の極めてよく現れる４つの問題点、について解答を、しかも選択可能な予調整に基づいて、提案できるようなものである。利用者ガイドにエキスパートシステムが組み込まれている場合は、利用者は、極めて多くの顕微鏡の使用法及び疑問点に関する経験的数値を利用することができる。その際またしても考えうることは、学習型システム、即ち肯定的に回答された撮像に関して−自動的に又は利用者の明確な確認に応じて−拡大するファイル、を実現することである。ファジィ論理のような方法を補充的に利用することができ、これによりシステム制御はさらに最適化することができる。
【００３０】
【実施例】
方法（手順）の経過及びそこで行われる最適化に関し、本発明の実施例を図２を参照して説明する。
【００３１】
特許請求される教示を明確に説明するために、以下に、具体的な実施例について説明するものとする。それによると既知のシステムで自由に使用されている調整能力に限定（して説明）される。使用された試料は、フルオレセインで着色されたキイロショウジョウバエ（Drosophila）の胚（Embryo）である。この胚の寸法は、幅が凡そ２００μｍ、軸方向（長さ）が凡そ１００μｍである。着色剤（色素）の最大分子密度ρ及び使用された着色剤の性質（例えば、消光（ないし滅光：Bleich［漂白］）速度Λ、励起されたシングレット又はトリプレット状態の寿命τＳ又はτＴ、トリプレット状態への遷移確率ＷＴ、有効断面積（Wirkungsquerschnitt）σ並びに発光（エミッション）波長λＥｍ及び励起波長λＥｘ）は、以下のごとく十分よく知られている：
λＥｍ＝５２０ｎｍ              λＥｘ＝４９０ｎｍ
τＴ  ＝１０−６ｓ                τＳ  ＝４．５・１０−９ｓ
Λ  ＝３・１０−５              ＷＴ  ＝０．０３
ρ  ＝２００μｍ−３            σ  ＝３．０６・１０−１６ｃｍ２
【００３２】
検査されるべき試料及び利用者の要求にシステムを最適化するために、以下の処理手順が実行される：
１．使用されるべき対物レンズを選択する。これは検査されるべき試料の寸法から直ちに得られる。最小横（lateral）分解能から、像面当たりの調整されるべき画素数が得られる。
２．撮像時間及び蛍光分子の性質から合焦時における最適照射強度を求める。
３．合焦面及び合焦時における最適照射強度から調節されるべきレーザ出力を計算する。
４．期待分解能と期待Ｓ／Ｎ比とを勘案（妥協）してディテクションピンホールの半径を求める。光学的断面（断層面：Schnitt）の数は軸方向（axial）分解能から得られる。
５．光電子倍増管の電圧を画像の期待されるべきＳ／Ｎ比に適合させる。
【００３３】
具体的実施例のために、以下の情報が与えられる。
【００３４】
１．  対物レンズの最大結像尺度（ないし範囲：Abbildungsmassstab）は、５０（１０ｍｍ／２００μｍ）を越えるべきではなく、かつその作動（観察）距離（Arbeitsabstand）は、試料の厚さ（０．１ｍｍ）の寸法範囲にあるべきであるものとする。開口数（ＮＡ）は、これらの（前提）条件のもとで最大となるものを選択すべきである。以下の対物レンズが例示される：
Ｍ＝４０，  ＷＤ＝８０μｍ，  ＮＡ＝１．０。
【００３５】
顕微鏡の横分解能は、選択された対物レンズに依存し、前述の蛍光剤分子のエミッション波長（２１０〜３２０ｎｍ）が顧慮される。その正確な値は、調節されたピンホールの半径に依存する。ナイキストの定理を顧慮すると、走査線（Zeile）毎に記録されるべき画素数ｎｌは：
0004139566.tif 000002
となり、その値は、１２６０〜１９２０の間にある。使用したシステムでは、画像内の画素数は、２５６２、５１２２又は１０２４２の中から選ぶこと（調整）ができる。本実施例では、最大の画素数１０２４２を選択することができる。この数は、ナイキストの基準に基づいて求められる値より小さいので、画像内にアーチファクトが現れうる。この場合は、スキャン領域をズームを用いて小さくするか、或いはより小さい開口数の対物レンズを使用するかしなければならない。
【００３６】
２．  画素当たり撮像時間は、像面当たりの撮像時間と像面当たりの画素数とから求められる。ここで注意すべきことは、各走査線後のスキャニングミラーの戻り（リターン）過程により、ディテクションのための撮像時間の凡そ半分のみが、用いられるということである。像面当たりの撮像時間が凡そ２秒間の場合、画素当たりの撮像時間は凡そ１μｓであり、消光（ないし滅光）にとって重要な画素当たりの照射時間は凡そ２μsである。
【００３７】
最適照射強度は、以下のように求められる：
0004139566.tif 000003
又は、
0004139566.tif 000004
【００３８】
トリプレット状態が無視できるために、この具体的実施例では、ファクタ（Faktor）８だけ大きい（ＥＴより８倍大きい）最適照射強度ＥＳが得られる。この無視（近似）は、画素当たりディテクション時間がトリプレット状態の寿命よりも短い場合、一般に妥当である。ディテクション時間がトリプレット状態の寿命の範囲にある場合は、当該実施例のように、最適照射強度を計算する場合、トリプレット状態の寿命は顧慮されるべきである。
【００３９】
上記２つの値は、エミッション（放射）率が蛍光分子の励起率に等しいとき、最も良い画像のＳ／Ｎ比が得られるという知見に基づいた値であることが顧慮されるべきである。原則的には、この系（システム）は、この（上記両率間の）平衡に指数関数的に近づく。ＥＳは、トリプレット状態の存在を無視し、かつ励起されたシングレット状態と基底状態との間の平衡を仮定して求められる。ＥＴは、上記３つの状態の全ての間で直ちに平衡に到達することを仮定して求められる。照射時間全体にわたって励起率とエミッション（放射）率との間の平衡を維持するためには、照射強度は、この時間内にＥＳからＥＴへ指数関数的に変化しなければならない。この２つの値は、いずれにせよそれなりに良い近似である。
【００４０】
３．  ４８８ｎｍの波長を使用する場合、光子は凡そ４・１０−１９Ｊのエネルギーをもつ。合焦面積ＦＦｏｋｕｓ＝π・ｒＡｉｒｙ２は凡そ２.８・１０−１３ｍ２である。このため以下の放射束（Strahlungsfluss）Φが維持される：
0004139566.tif 000005
【００４１】
接続される放射束の凡そ１０％しか対物レンズにより合焦されないので、レーザの出力は凡そ１ｍＷに調節されるべきである。トリプレット状態が無視できるために−従って撮像時間が短い場合に−フルオレセインについては、レーザ出力は凡そ８ｍＷに調節されるべきである。
【００４２】
４．  必要な光学的断面（断層面）の数は、試料の厚さ、軸分解能及びナイキストの定理から求められる。ディテクションピンホールを８光学単位を超えて調節すると画像の質の悪化を招くので、軸分解能を０．６〜１.８μｍの間でとる。このため光学的断面の数は、作動（観察）距離全体を十分に使った上で、９０〜２７０の間にある。ただ１つの孔（ピンホール）のみによってディテクションが行われるので、記録（撮像）されるデータセットの大きさは、９０〜２７０メガバイトの間にある。場合によっては、光学的断面の数は、データセットの大きさの代わりに、実用上システムの作動記憶装置により制限されうる。
【００４３】
一般的に、利用者は、軸分解能を最大にしようと努める。その際、Ｓ／Ｎ比は所定の限界値を下回るべきではない。
【００４４】
ディテクションピンホールの半径を凡そ２光学単位に調節する場合、顕微鏡の軸分解能はほぼ最大になる。横分解能は、凡そ２６０ｎｍになる。
【００４５】
軸分解能ｚｒｅｓ、試料の厚さ及びナイキストの定理から撮像されるべき断面（断層面）（Schnitt）の数ｎｚが得られる：
0004139566.tif 000006
【００４６】
合焦面が楕円形状であると仮定すると、軸分解能と横分解能から、検出される画素体積ＶＰｉｘｅｌが得られる：
0004139566.tif 000007
【００４７】
蛍光分子の最大密度ρは、２００分子／μｍ３である。このため合焦における分子数ＮＦｏｋｕｓは：
0004139566.tif 000008
となる。
【００４８】
照射強度を最適に調節した場合、エミッション（放射）率Ｅｍは、励起率に等しい。即ち、動的平衡において、分子のうち半数は基底状態にあり、残りの半数は励起状態にある。前述の例では、トリプレット状態は無視することはできない。このため分子毎のエミッション（放射）率は次のようになる：
0004139566.tif 000009
【００４９】
そのためディテクション時間が１μｓの場合、画素当たり凡そ５１０個の光子が放出される。このシステムで使用された対物レンズは、放出された光子のうち凡そ１％しか検出しないので、検出される信号量は、画素当たり凡そ５個の光子による値のものが得られる。これは凡そ２.３のＳ／Ｎ比に相当する。
【００５０】
この値が利用者により予設定される限界値未満であるならば、（高い）分解能は断念しなければならない。そのため検出される画素体積、従って画素当たりに検出される光子数は増加する。その上撮像されるべき断層面（Schicht）の数は減少し、そのため試料の消光（滅光）も低下する。
【００５１】
より良いＳ／Ｎ比を考えないで分解能を断念するなら、光学的断面数は２７０にとどまる。これは、試料面全体が、上で求めた照射強度に２μｓの間２７０回晒される、ということを意味する。その後もまだ消光（滅光）されていない分子の比率ｎ／ｎ０は：
0004139566.tif 000010
となる。
【００５２】
画像切片（断層面）を増加しつつ撮像時間を向上する可能性は、使用されたシステムでは想定されておらず、またその実現も技術的に困難であるので、試料の消光（滅光）により、最後に撮像される層の明るさは、最初に撮像される層の明るさの凡そ８０％になる。Ｓ／Ｎ比は凡そ２に減じられる。
【００５３】
５．  このＳ／Ｎ比は利用者に受け入れらるものであれば、後は光電子倍増管の電圧を画素当たり凡そ５個の光子数という想定される最大の信号量に適合させるだけである。画素当たりの所定の撮像時間に対しては、光電子倍増管の電圧は凡そ７２０Ｖである。
【００５４】
ここで顧慮すべきことは、使用される試料は、比較的大きい蛍光分子密度を持つと言うことである。実際には、試料（の蛍光分子密度）は、μｍ３当り１０分子未満にすることが可能である。撮像の質を十分に良好にするためには、そのような場合、何度も測定を行わなければならない。
【００５５】
トリプレット状態の寿命は、例えば酸素の存在により短くすることができ、或いは、既に独立（孤立）した状態にある多くの色素の場合、フルオレセインのトリプレット状態の寿命以下にある。前述の実施例の場合は、トリプレット状態の寿命の短縮化により、最適照射強度は向上し、エミッション（放射）率はより大きくなり、従って画像のＳ／Ｎ比も改善される。尤も、試料は撮像中、より大きい照射負荷により消光（滅光）［漂白］の程度が一層大きくなる。
【００５６】
消光（滅光）率のスペクトルは、種々の色素について広範に亘っており−これは（色素）分子の周囲条件に依存するが−かつ固体試料の場合、抗漂白（滅光）剤により大幅に小さくするすることができる。フルオレセインの漂白（滅光）率は、大体中間的な値である。
【００５７】
最後にとりわけ注意すべきことは、上述の処理手順及び実施例は、好ましい実施の態様を示したものに過ぎず、本発明は、特許請求（クレーム）される方法に関しこの実施例に限定されるものではない。処理手順全体は、請求項１により特許請求される思想に関連して、独立した形式で実施することもでき、さらにはその他の請求項による従属した形式で実施することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  質の三角形（Qualitaetsdreieck）。
【図２】  システムパラメータの調整方法のフローチャート。
【図１】
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【図２】
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