(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
0004179878.tif 000243
（式中、Ｒ１は、下記式：
【化２】
0004179878.tif 000244
から選択される基
（上記式中、Ｒ８は、
【化３】
0004179878.tif 000245
Ｒ９は、水素原子を表す。）を表す。
Ｒ２は、水素原子を表す。
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１１、を表す。
ここで、ｍは、１〜６の整数を表す。
Ｒ１１は、−ＣＯＮＨ２を表す。
Ｒ４は、水素原子を表す。
Ｒ５は、−ＣＨ２−Ｒ１３
（ここで、Ｒ１３は、下記式；
【化４】
0004179878.tif 000246
から選択される基であり、上記式中、Ｒ１５は、置換基を有していてもよいアリール基；炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基；アリールカルボニル基を表し；
Ｒ１７は、水素原子；炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基；または
【化５】
0004179878.tif 000247
（ここで、Ｒ１９は、水素原子、カルボキシル基を表す。）；
を表す。
Ｒ１８は、水素原子を表す。）
を表す。
Ｒ６は、水素原子を表す。
Ｒ７は、−ＳＯ２−Ｒ１４（ここで、Ｒ１４は、置換基を有していてもよい炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表す。）を表す。）
で示される化合物、その互変異性体、光学異性体、またはこれらの水和物もしくは薬学的に許容し得る塩。
【請求項２】
一般式（１）において、
Ｒ７が、−ＳＯ２−Ｒ１４
（ここで、Ｒ１４は、
（１）置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基（アルキル基の置換基としては、カルボキシル基である。）、または、
（２）−ＣＨ２−Ｒ２３である。Ｒ２３は、置換基を有していてもよいフェニル基である。）、
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
一般式（１）において、
Ｒ３が、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１１
（ここで、ｍは１〜３の整数であり、Ｒ１１は、−ＣＯＮＨ２である。）
である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
一般式（１）において、
Ｒ１が、下記式：
【化６】
0004179878.tif 000248
から選択される基であり（上記式中、Ｒ８は、
【化７】
0004179878.tif 000249
である。ここで、Ｒ９は、水素原子である。）；
Ｒ２が、水素原子であり；
Ｒ３が、−（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２、であり；
Ｒ４が、水素原子であり；
Ｒ５が、−ＣＨ２−Ｒ１３であり（ここで、Ｒ１３は、下記式
【化８】
0004179878.tif 000250
から選択される基である。上記式中、
Ｒ１５は、メトキシ基；ベンゾイル基；または、フェニル基である。
Ｒ１７は、水素原子、メチル基、炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝状のアルコキシ基、ベンジルオキシ基、または３−カルボキシベンジルオキシ基、である。
Ｒ１８は、水素原子である。）；
Ｒ６が、水素原子であり；
Ｒ７が、−ＳＯ２−Ｒ１４（ここで、Ｒ１４は、３−カルボキシベンジル基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基（ここで、アルキル基の置換基としては、カルボキシル基である。）である。）
である、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
化合物が、
【化９】
0004179878.tif 000251
から選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物を含有する医薬組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物を含有する抗血栓剤。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物を含有する血液凝固ＶＩＩａ因子阻害剤。
【請求項９】
ヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子と一般式（１）
（式中の置換基の定義は、請求項１におけると同じ意味を表す。）
で示される化合物である低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の結晶。
【請求項１０】
以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、ヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子と分子量１０００以下の低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の結晶を製造する方法：
（ｉ）低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との結晶化が可能なヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子を調製する工程、
（ｉｉ）低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤を加え、結晶化用濃縮試料を調製する工程、
（ｉｉｉ）低分子不可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤又は低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶を種として添加し、（ｉｉ）で得られた結晶化用濃縮試料からヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子と低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の結晶を得る工程。
【請求項１１】
低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤が一般式（１）
（式中の置換基の定義は、請求項１におけると同じ意味を表す。）
で示される化合物である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、血液凝固ＶＩＩａ因子に対して阻害活性を有するペプチド誘導体に関する。
背景技術
血液凝固反応は、血管損傷や異物刺激に応答して惹起される生体防御反応である。血液凝固反応には、血漿中の１２種のタンパク質性の凝固因子、それにカルシウムイオン、組織因子、リン脂質（血小板由来）を加えて１５種の因子が関与している。この反応は、損傷部位で凝集する血小板や損傷内皮細胞の膜上で、プロテアーゼの活性化の連鎖反応が次々に起こるカスケード機構からなる。
血液凝固カスケードは、内因系と外因系に分けられる。血液凝固が起こる際に、組織中の組織因子の関与がある場合を外因系血液凝固とよび、関与のない場合を内因系の血液凝固とよぶ。
内因系の血液凝固は、血漿中の血液凝固ＸＩＩ因子が陰性荷電を有する固相などの表面に接触することによって始まる。ＸＩＩ因子は表面に吸着されると限定分解され活性型プロテアーゼである活性化ＸＩＩ因子（ＸＩＩａ）になる。ＸＩＩａはＸＩ因子を限定分解して、活性型プロテアーゼである活性化ＸＩ因子（ＸＩａ）にする。このようなプロテアーゼの活性化が次々に起こって、最終的に生成したトロンビンが、フィブリノーゲンを限定分解してフィブリンにして血液凝固が終了する。ＸＩ因子の活性化以降の反応では、複数の凝固因子が複合体を形成することにより、止血局所への凝固因子の濃縮と、効率の高い活性化反応が進行する。即ち、リン脂質、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｃａ２＋からなるテンナーゼ複合体、さらにリン脂質、Ｖａ因子、Ｘａ因子、プロトロンビン、Ｃａ２＋からなるプロトロンビナーゼ複合体が形成され、プロトロンビンの活性化反応を著しく促進する。
外因系の血液凝固は、ＶＩＩａ因子が組織因子と複合体を形成することにより開始する。このＶＩＩａと組織因子の複合体は、Ｘ因子、およびＩＸ因子を活性化する段階で内因系と合流する。
病態時の凝固亢進や生理的凝固においては、一般に、外因系の血液凝固が重要であるといわれている。
抗凝固薬としては、ヘパリンなどのトロンビン阻害剤や、ワーファリンなどが知られている。しかし、トロンビン阻害剤は、血液凝固カスケードの下流に作用するため、過剰の凝固抑制が起こるとトロンビン生成に至る凝固因子の消費を抑制しないので、臨床では出血傾向があることが問題となっている。また、ワーファリンは、多くの血液凝固因子の産生を阻害するため、臨床においては、トロンビン阻害剤と同様、出血傾向があることが問題となっている。
ＶＩＩａ因子は、前述のように外因系経路の上流に位置するため、ＶＩＩａ因子に対する阻害剤は、内因系凝固の経路の機能を残すことができる、即ち、出血に対する抵抗性を残すことができると考えられる。このことから、ＶＩＩａ因子阻害剤は、既存の抗凝固薬の副作用である出血傾向を軽減することが期待される。したがって、ＶＩＩａ因子阻害剤は、外因系の凝固反応が関与する病態の予防または治療、例えば、慢性の血栓症（さらに具体的には、術後深部静脈血栓症、ＰＴＣＡ後の再狭窄、ＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群：ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）、心由来血栓塞栓、心筋梗塞、脳梗塞）などの予防または治療に有用であることが期待される。
これまで、ＶＩＩａ因子阻害剤として、いくつかの化合物が報告されている（ＷＯ００／４１５３１号公報、ＷＯ００／３５８８６号公報、ＷＯ９９／４１２３１号公報、ＥＰ９２１１１６Ａ号公開公報、ＷＯ００／１５６５８号公報、ＷＯ００／３０６４６号公報、ＷＯ００／５８３４６号公報など）。
しかし、これらは、いずれもＶＩＩａ因子に対する阻害活性、または、外因系血液凝固に対する選択的な阻害活性において十分とはいえず、さらに優れた前記阻害活性または選択的な阻害活性を有する薬剤の創製が望まれる。
最近の酵素阻害薬研究においては、Ｘ線結晶構造解析等に基づく酵素の三次元モデルをコンピュータを用いて画面上に表示し、阻害作用を有すると考えられる化合物を考案したり、あるいはコンピュータ上で仮想スクリーニングをするなどの手法が活用されている。ＶＩＩａ因子（以下、「ＦＶＩＩａ」とも称す。）についても、単独の形や可溶型組織因子との複合体（以下、ＶＩＩａ因子と可溶型組織因子との複合体を「ＶＩＩａ因子／可溶型組織因子」、または「ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ」とも称す。）、および蛋白質阻害剤との複合体の形で立体構造がＸ線構造解析により決定されている（Ｎａｔｕｒｅ  ３８０巻、４１−４６、１９９６年；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２８５巻、２０８９−２１０４、１９９９年；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９６巻、８９２５−８９３０；Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．１２７巻、２１３−２２３、１９９９年；Ｎａｔｕｒｅ  ４０４巻、４６５−４７０、２０００年）。
しかしながら、現状のコンピュータによる仮想的なドッキングの予測は完全ではなく（Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、１２９−１３３、１９９６年、ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ）、また、阻害剤の結合により誘導適合と呼ばれる酵素側の構造変化もしばしば見られることから（Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、１３３−１３４、１９９６年、ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ）、コンピュータを使って阻害剤をデザインするにあたっては、個々の阻害剤もしくはこれらと構造的に類似した阻害剤について酵素との複合体の形でＸ線構造解析を行い、その結合様式の詳細を原子レベルで解明することが最も望ましい。しかし、これまで報告されたＶＩＩａ因子を含む結晶ではいずれも阻害剤の結合サイトとなりうる活性部位に不可逆的阻害剤や蛋白質阻害剤が占めており、低分子、例えば分子量１０００以下の可逆的阻害剤との複合体のＸ線結晶構造解析には使用できない。一般に蛋白質の結晶化にあたっては高い純度が必要だが、このような高純度の蛋白を精製するにあたっては混在するプロテアーゼによる分解が問題となることが多い（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、３４、１９９２年、ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ）。特にＶＩＩａ因子のようなプロテアーゼの精製および結晶化にあたっては自分自身による自己分解が問題となる。このため精製および結晶化の際に不可逆的阻害剤が使われるケースが見られる。不可逆的阻害剤は一度結合すると離れることがなく、精製や結晶化中の自己分解を完全に避けることができるためである。しかしながら、低分子の可逆的阻害剤との複合体の結晶化の場合には、自己分解が完全に抑えられる保証は無く、技術的困難を伴う。実際、ＶＩＩａ因子と低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の結晶ならびにその立体構造についてこれまでに報告された例はない。
発明の開示
本発明の目的は、血液凝固ＶＩＩａ因子に対する阻害活性を有し、または、外因系血液凝固に対する選択的阻害作用に優れた、医薬として有用なペプチド誘導体を提供することである。
さらに、本発明の目的は、ＶＩＩａ因子／可溶型組織因子と低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の立体構造解明のため、Ｘ線結晶解析に用いることができる結晶を提供すること、およびその結晶を作製する方法を提供することである。また、該複合体結晶の立体構造情報を用いてＶＩＩａ因子に対して優れた特異的または選択的阻害活性を有する新たな低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤をデザインする方法、及びその方法によりデザインされた低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤を提供することも目的とする。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、一般式（１）によって示されるペプチド誘導体が、ＶＩＩａ因子に対する阻害活性を有し、または、外因系血液凝固に選択的な阻害作用を示し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、一般式（１）
0004179878.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、下記式：
0004179878.tif 000003
から選択される基
（上記式中、Ｒ８は、アミノ基、アミノメチル基、または、
0004179878.tif 000004
、を表す。
Ｒ９は、水素原子、アミノ基、水酸基、アシル基、アルキル部分が置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルであるアルコキキシカルボニル基を表す。Ｒ１０は、アミノ基を表す。Ｘ、Ｙは、いずれか一方が＝ＣＨ−を表し、他方が＝Ｎ−を表す。）を表す。
Ｒ２は、水素原子、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表す。
Ｒ３は、
0004179878.tif 000005
、または
・−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１１、を表す。
ここで、ｍは、１〜６の整数を表す。
Ｒ１１は、
−ＣＯＮＨ２、
0004179878.tif 000006
（ここで、Ｒ１２は、水素原子または炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表す。）、または、
0004179878.tif 000007
、を表す。
Ｒ４は、水素原子、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表す。
Ｒ５は、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、または、
−ＣＨ２−Ｒ１３（ここで、Ｒ１３は、置換基を有していてもよいアリール基、または、置換基を有していてもよい複素環基を表す。）
を表す。
Ｒ６は、水素原子、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表す。
Ｒ７は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、または、−ＳＯ２−Ｒ１４（ここで、Ｒ１４は、置換基を有していてもよい炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表す。）を表す。）で示される化合物、その互変異性体、光学異性体、またはこれらの水和物もしくは薬学的に許容し得る塩を提供するものである。
また、本発明は、一般式（１）で示される化合物を含有する医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、上記化合物を含有する抗血栓剤を提供する。また、本発明は、上記化合物を含有する血液凝固ＶＩＩａ因子阻害剤を提供する。
また、本発明は、ヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子と低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の結晶を提供する。また、低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤が一般式（１）（式中の置換基の定義は、前記におけると同じ意味を表す。）で示される化合物である前記複合体の結晶も提供する。
さらに、本発明は、以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、ヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子と低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の結晶を製造する方法を提供する：
（ｉ）低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との結晶化が可能なヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子を調製する工程、
（ｉｉ）低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤を加え、結晶化用濃縮試料を調製する工程、
（ｉｉｉ）低分子不可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤又は低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶を種として添加し、（ｉｉ）で得られた結晶化用濃縮試料からヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子と低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の結晶を得る工程。さらに、低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤が一般式（１）（式中の置換基の定義は、前記におけると同じ意味を表す。）で示される化合物である、前記複合体製造方法も提供する。
また、本発明は、前記のヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子と低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の結晶をＸ線結晶構造解析することにより得られるヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子と低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の立体構造の座標データの全部又は一部を記録した媒体を提供する。
さらに前記座標データを利用してコンピュータ上で低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤をデザインする方法を提供する。また、デザインされる低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤が、ヒトＶＩＩａ因子Ｈ鎖のＡｓｐ６０側鎖、Ｔｙｒ９４側鎖及びＴｈｒ９８主鎖の少なくとも一つと相互作用する置換基を有する低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤である、前記デザイン方法を提供する。また、デザインされる低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤が、ヒトＶＩＩａ因子Ｈ鎖のＬｙｓ１９２側鎖と相互作用する置換基を有する低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤である、前記デザイン方法も提供する。デザインされる低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤が、ヒトＶＩＩａ因子Ｈ鎖のＶａｌ１７０Ｅ、Ｇｌｙ１７０Ｆ、Ａｓｐ１７０Ｇ、Ｓｅｒ１７０Ｈ、Ｐｒｏ１７０ＩおよびＧｌｎ２１７の少なくとも一つと相互作用する置換基を有する低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤である、前記デザイン方法も提供する。また、デザインされる低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤が、ヒトＶＩＩａ因子Ｈ鎖のＳ４サイトからＳ４サブサイトに通じる孔を通してＳ４サブサイトと相互作用する置換基を有する低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤である、前記デザイン方法も提供する。
さらに、上記デザイン方法によりデザインされた低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤を提供する。また、ヒトＶＩＩａ因子のＳ２サイトと相互作用する部分構造として下記群［Ａ−１］または［Ａ−２］中に示される部分構造のいずれかを含有する、前記低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤も提供する。
［Ａ−１］群：
0004179878.tif 000008
（ここで、Ｘ１は、ＯまたはＮＨを示し、  Ｘ２は、水素原子またはメチル基を示す。）
［Ａ−２］群：
0004179878.tif 000009
（ここで、Ｒ２３は、ヘテロ原子を有する芳香族６員環、５員環を示す。）
さらに、ヒトＶＩＩａ因子のＳ１サブサイトと相互作用する部分構造として下記群［Ｂ−１］、［Ｂ−２］、［Ｂ−３］または［Ｂ−４］中に示される部分構造のいずれかを含有する、前記低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤も提供する。
［Ｂ−１］群：
0004179878.tif 000010
［Ｂ−２］群：
0004179878.tif 000011
［Ｂ−３］群：
0004179878.tif 000012
（ここで、Ｒ２４は、［Ｂ−２］群と同一である。Ｒ２５は、ヘテロ原子を有する芳香族６員環、５員環を示す。）
［Ｂ−４］群：
0004179878.tif 000013
（ここで、Ｒ２７は、炭素数１〜３のアルキレン基を示す。Ｒ２４は、［Ｂ−２］群と同一である。Ｒ２６は、［Ｂ−３］群と同一である。）
また、ヒトＶＩＩａ因子のＳ４サイトと相互作用する部分構造として下記群［Ｃ−１］または［Ｃ−２］中に示される部分構造のいずれかを含有する、前記低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤も提供する。
［Ｃ−１］群：
0004179878.tif 000014
（ここで、Ｘ３は、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、Ｒ２８は、ヘテロ原子を有する芳香族６員環もしくは５員環を示す。）
［Ｃ−２］群：
0004179878.tif 000015
（ここで、Ｘ４は、ＮＨ、Ｓ、またはＯを示す。  Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、独立して、ＮまたはＣＨを示す。）
さらに、ヒトＶＩＩａ因子のＳ２サイトと相互作用する部分構造として上記群［Ａ−１］または［Ａ−２］中に示される部分構造のいずれかを含有し、かつ、Ｓ１サブサイトと相互作用する部分構造として上記群［Ｂ−１］、［Ｂ−２］、［Ｂ−３］または［Ｂ−４］中に示される部分構造のいずれかを含有し、かつ、Ｓ４サイトと相互作用する部分構造として上記群［Ｃ−１］または［Ｃ−２］中に示される部分構造のいずれかを含有する、低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤である。
発明を実施するための最良の形態
一般式（１）で示される化合物の定義において、
Ｒ１における、基
0004179878.tif 000016
としては、
0004179878.tif 000017
が好ましい。
ここで、Ｒ８としては、
0004179878.tif 000018
が好ましい。
上記Ｒ８における、基
0004179878.tif 000019
のＲ９の定義中のアシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、カプロイル基、フェニルアセチル基などのアルキルカルボニル基、アクリロイル基、プロピオロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基などのアルケニルカルボニル基、ベンゾイル基などのアリールカルボニル基などが挙げられ、アルキル部分が炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルカルボニル基が好ましく、なかでも、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、イソバレリル基が好ましい。
上記Ｒ８における、基
0004179878.tif 000020
のＲ９の定義中の、アルキル部分が置換基を有していてもよい炭素数１〜６直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルであるアルコキシカルボニル基としては、アルキル部分が置換基を有していてもよい炭素数１〜４直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルであるアルコキシカルボニル基が好ましく（ここで、置換基としては、フェニル基などが挙げられる。）、なかでも、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基が好ましい。
なお、本発明において、「置換基を有していてもよい」という場合、あるいは、複数個の置換が可能な場合は、全て１個もしくは２個以上の置換基で置換されていてもよいことを意味する。
上記Ｒ８における、基
0004179878.tif 000021
のＲ９としては、水素原子、アミノ基、水酸基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、イソバレリル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基が好ましい。
Ｒ１における、基
0004179878.tif 000022
としては、
0004179878.tif 000023
が好ましい。
Ｒ１における、基
0004179878.tif 000024
としては、
0004179878.tif 000025
が好ましい。
Ｒ１における、基
0004179878.tif 000026
としては、
0004179878.tif 000027
が好ましい。
Ｒ１における、基
0004179878.tif 000028
としては、
0004179878.tif 000029
が好ましい。
Ｒ１における、基
0004179878.tif 000030
としては、
0004179878.tif 000031
が好ましい。
Ｒ１における、基
0004179878.tif 000032
としては、
0004179878.tif 000033
が好ましい。
Ｒ２における炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基としては、炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基が好ましく、なかでも、メチル基が好ましい。
Ｒ３における基
0004179878.tif 000034
としては、
0004179878.tif 000035
が好ましい。
Ｒ３における基
−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１１のｍとしては、１〜３の整数が好ましく、特に２であることが好ましい。
Ｒ３における基
−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１１のＲ１１としては、−ＣＯＮＨ２、
0004179878.tif 000036
が好ましい。ここで、Ｒ１２としては、水素原子または炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基であり、特にメチル基が好ましい。
Ｒ４における、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基としては、炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
Ｒ５における、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基としては、炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基が好ましい。
Ｒ５における、基−ＣＨ２−Ｒ１３のＲ１３における、
置換基を有していてもよいアリール基としては、
0004179878.tif 000037
（ここで、Ｒ１５としては、水素原子、置換基を有していてもよいアリール基（ここで、アリール基としてはフェニル基、ナフチル基などが挙げられ、フェニル基が好ましい。また、置換基としては、炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、ニトロ基、アミノ基などが挙げられる）、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基、ハロゲン原子、アリールカルボニル基（ここでアリール基としてはフェニル基、ナフチル基などが挙げられ、フェニル基が好ましい。）、アルキル部分が炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基であるアルキルカルボニル基、ニトロ基、または、アミノ基、が好ましく、なかでも、水素原子、ｔ−ブチル基、メトキシ基、臭素原子、塩素原子、ベンゾイル基、または、メトキシ基もしくはトリフルオロメチル基もしくはニトロ基もしくはアミノ基で置換されていてもよいフェニル基が好ましい）、および、
0004179878.tif 000038
（ここで、Ｒ１６としては、水素原子、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基が好ましく、特に好ましくは水素原子である。）、
が好ましい。
Ｒ５における、基−ＣＨ２−Ｒ１３のＲ１３における、置換基を有していてもよい複素環基の複素環には、環構成原子として少なくとも１つの窒素原子、酸素原子、および／または硫黄原子を含む５〜１０員の単環もしくは縮合環が含まれ、例えば、フラン、チオフェン、ピラン、ピロール、ピリジン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾピラン、ベンゾチオピランなどが挙げられる。置換基を有していてもよい複素環基の置換基としては、例えば、下記のＲ１７、Ｒ１８に例示される基などが挙げられる。
Ｒ５における、基−ＣＨ２−Ｒ１３のＲ１３における、置換基を有していてもよい複素環基としては、
0004179878.tif 000039
が好ましい。ここで、
Ｒ１７としては、水素原子；水酸基；炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基；炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（ここで、ｎは１〜５の整数を表す。）；−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ（ここで、ｐは１〜５の整数を表す。）；−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ２（ここで、ｑは１〜５の整数を表す。）；
0004179878.tif 000040
（ここで、Ｒ１９は、水素原子、水酸基、カルボキシル基、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、ハロゲン、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基、または、アルキル部分が炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルであるアルコキシカルボニル基を表す。）；または、−ＯＳＯ２−Ｒ２０（ここで、Ｒ２０は炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、またはベンジル基を表す）が好ましい。
Ｒ１７としては、なかでも、水素原子、水酸基、メチル基、炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝状のアルコキシ基、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（ここで、ｎは１〜３の整数を表す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ（ここで、ｐは１〜３の整数を表す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ２（ここで、ｐは１〜３の整数を表す。）、−ＯＳＯ２−Ｒ２０（ここで、Ｒ２０としては、特に、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基またはベンジル基が好ましい。）、ベンジルオキシ基、３−もしくは４−ヒドロキシベンジルオキシ基、または、３−もしくは４−カルボキシベンジルオキシ基、が好ましい。
Ｒ１８としては、水素原子、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアリールスルホニル基（ここで、アリール基としてはフェニル基が好ましい。また、置換基としては、炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、ニトロ基、アミノ基などが挙げられる。）が好ましく、なかでも、水素原子、メチル基、メタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基が特に好ましい。
Ｒ６における、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基としては、炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基が好ましい。
Ｒ７における、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基の置換基としては、カルボキシル基、アミノ基、アルキル部分が炭素数１〜６のアルキルであるモノ−もしくはジ−置換アルキルアミノ基、アルキル部分が炭素数１〜６のアルキルであるアルキルカルボニルアミノ基などが挙げられる。
Ｒ７における、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基のアルキル部分としては、炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基が好ましい。
Ｒ７における、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基としては、炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、
0004179878.tif 000041
（ここで、ｋは、０〜３の整数である。Ｒ２１は、水素原子、−ＮＨＲ２２である。Ｒ２２は、炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、または、アルキル部分が炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルであるアルキルカルボニル基である。）、が好ましい。
特に、基
0004179878.tif 000042
においては、特に、ｋは０〜２の整数であることが好ましい。また、Ｒ２１は、水素原子、−ＮＨＲ２２（ここで、Ｒ２２は、メチル基、アセチル基である）が好ましい。
Ｒ７の定義における、−ＳＯ２−Ｒ１４のＲ１４の置換基を有していてもよい炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基の置換基としては、（ａ）カルボキシル基、（ｂ）アルキル部分が炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルであるアルコキシカルボニル基、（ｃ）カルボキシル基などで置換されていてもよいフェニル基などが挙げられる。
Ｒ１４の定義における置換基を有していてもよい炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基のアルキル部分としては、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基が好ましい。
Ｒ１４の定義における置換基を有していてもよい炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基としては、（ａ）置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基（アルキル基の置換基としては、カルボキシル基、アルキル部分が炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基であるアルコキシカルボニル基である。）、および、（ｂ）−ＣＨ２−Ｒ２３（ここで、Ｒ２３は、置換基を有していてもよいフェニル基である。ここで、置換基としては、カルボキシル基などである。）が好ましい。
Ｒ１４としては、ベンジル基、２−、３−もしくは４−カルボキシベンジル基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基（ここで、アルキル基の置換基としては、カルボキシル基、または、アルキル部分が炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルであるアルコキシカルボニル基である）が特に好ましい。
Ｒ１としては、下記式：
0004179878.tif 000043
から選択される基（上記式中、Ｒ８は、
0004179878.tif 000044
である（ここで、Ｒ９は、水素原子、アミノ基、水酸基、アシル基、または、アルキル部分が置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルであるアルコキシカルボニル基である。））が好ましい。
なかでも、Ｒ１としては、特に、下記式：
0004179878.tif 000045
から選択される基（上記式中、Ｒ８は、
0004179878.tif 000046
、である。ここで、Ｒ９は、水素原子、アミノ基、水酸基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、イソバレリル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、またはベンジルオキシカルボニル基である。）であることが好ましい。
Ｒ２としては、水素原子、または炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基が好ましく、特に、水素原子またはメチル基が好ましい。
Ｒ３としては、
0004179878.tif 000047
−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１１（ここで、ｍは１〜３の整数であり、Ｒ１１は、−ＣＯＮＨ２、
0004179878.tif 000048
、である。）、が好ましい。
また、Ｒ３が、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、または、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１１（ここで、ｍおよびＲ１１は、前記と同じ意味を表す。）、である化合物が好ましい。
また、Ｒ３が、
0004179878.tif 000049
であり、かつ、Ｒ７が、−ＳＯ２−Ｒ１４（ここで、Ｒ１４は前記と同じ意味を表す。）である化合物が好ましい。
Ｒ３としては、特に、
0004179878.tif 000050
−（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２、
0004179878.tif 000051
、または、
0004179878.tif 000052
、が好ましい。
Ｒ４としては、水素原子、または炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基が好ましく、なかでも水素原子、メチル基が好ましい。
Ｒ５としては、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、または、−ＣＨ２−Ｒ１３（ここで、Ｒ１３は、下記式
0004179878.tif 000053
から選択される基である。上記式中、
Ｒ１５は、水素原子；置換基を有していてもよいアリール基；ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜３のアルキル基；炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基；ハロゲン原子；アリールカルボニル基；アルキル部分が炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基であるアルキルカルボニル基；ニトロ基；または、アミノ基、を表す。
Ｒ１６は、水素原子、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表す。
Ｒ１７は、水素原子；水酸基、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基；炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（ここで、ｎは１〜５の整数を表す。）；−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ（ここで、ｐは１〜５の整数を表す。）；−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ２（ここで、ｑは１〜５の整数を表す。）；
0004179878.tif 000054
（ここで、Ｒ１９は、水素原子、水酸基、カルボキシル基、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、ハロゲン、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基、または、アルキル部分が炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルであるアルコキシカルボニル基を表す。）；または、−ＯＳＯ２−Ｒ２０（ここで、Ｒ２０は炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、またはベンジル基を表す）を表す。
Ｒ１８は、水素原子、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルスルホニル基、または、置換基を有していてもよいアリールスルホニル基を表す。）が好ましい。
Ｒ５としては、特に、炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、または、−ＣＨ２−Ｒ１３が好ましい（ここで、Ｒ１３は、下記式
0004179878.tif 000055
から選択される基である。上記式中、
Ｒ１５は、水素原子；ｔ−ブチル基；メトキシ基；臭素原子；塩素原子；ベンゾイル基；または、メトキシ基もしくはトリフルオロメチル基もしくはニトロ基もしくはアミノ基で置換されていてもよいフェニル基である。
Ｒ１７は、水素原子、水酸基、メチル基、炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝状のアルコキシ基、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（ここで、ｎは１〜３の整数を表す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ（ここで、ｐは１〜３の整数を表す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ２（ここで、ｑは１〜３の整数を表す。）、−ＯＳＯ２−Ｒ２０（ここで、Ｒ２０はエチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基またはベンジル基である。）、ベンジルオキシ基、３−もしくは４−ヒドロキシベンジルオキシ基、または、３−もしくは４−カルボキシベンジルオキシ基、である。
Ｒ１８は、水素原子、メチル基、メタンスルホニル基、または、ベンゼンスルホニル基である。）。
Ｒ６としては、水素原子、または炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基が好ましく、特に、水素原子、メチル基が好ましい。
Ｒ７としては、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、
0004179878.tif 000056
（ここで、ｋは、０〜３の整数である。Ｒ２１は、水素原子、−ＮＨＲ２２である。Ｒ２２は、炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、または、アルキル部分が炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基であるアルキルカルボニル基である。）、または
・−ＳＯ２−Ｒ１４
（ここで、Ｒ１４は、
▲１▼置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基（アルキル基の置換基としては、カルボキシル基、アルキル部分が炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基であるアルコキシカルボニル基である。）、または、
▲２▼−ＣＨ２−Ｒ２３である。Ｒ２３は、置換基を有していてもよいフェニル基である。）、
が好ましい。
なかでも、Ｒ７としては、特に、
・炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、
0004179878.tif 000057
（ここで、ｋは、０〜２の整数である。Ｒ２１は、水素原子、−ＮＨＲ２２である。Ｒ２２は、メチル基、または、アセチル基である。）、または
・−ＳＯ２−Ｒ１４（ここで、Ｒ１４は、ベンジル基、２−、３−もしくは４−カルボキシベンジル基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基（ここで、アルキル基の置換基としては、カルボキシル基、または、アルキル部分が炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルであるアルコキシカルボニル基である。）である。）、
が好ましい。
一般式（１）の定義の各置換基は以上のような定義を有するが、一般式（１）で表される化合物としては、
Ｒ１が、下記式：
0004179878.tif 000058
から選択される基であり（上記式中、Ｒ８は、
0004179878.tif 000059
、である。ここで、Ｒ９は、水素原子、アミノ基、水酸基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、イソバレリル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、またはベンジルオキシカルボニル基である。）；
Ｒ２が、水素原子またはメチル基であり；
Ｒ３が、
0004179878.tif 000060
−（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２、
0004179878.tif 000061
Ｒ４が、水素原子またはメチル基であり；
Ｒ５が、炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、または、
−ＣＨ２−Ｒ１３であり（ここで、Ｒ１３は、下記式
0004179878.tif 000062
から選択される基である。上記式中、
Ｒ１５は、水素原子；ｔ−ブチル基；メトキシ基；臭素原子；塩素原子；ベンゾイル基；または、メトキシ基もしくはトリフルオロメチル基もしくはニトロ基もしくはアミノ基で置換されていてもよいフェニル基である。
Ｒ１７は、水素原子、水酸基、メチル基、炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝状のアルコキシ基、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（ここで、ｎは１〜３の整数を表す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ（ここで、ｐは１〜３の整数を表す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ２（ここで、ｑは１〜３の整数を表す。）、−ＯＳＯ２−Ｒ２０（ここで、Ｒ２０はエチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基またはベンジル基である。）、ベンジルオキシ基、３−もしくは４−ヒドロキシベンジルオキシ基、または、３−もしくは４−カルボキシベンジルオキシ基、である。
Ｒ１８は、水素原子、メチル基、メタンスルホニル基、または、ベンゼンスルホニル基である。）；
Ｒ６が、水素原子またはメチル基であり；
Ｒ７が、
・炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、
0004179878.tif 000063
（ここで、ｋは、０〜２の整数である。Ｒ２１は、水素原子、−ＮＨＲ２２である。Ｒ２２は、メチル基、または、アセチル基である。）、または
・−ＳＯ２−Ｒ１４（ここで、Ｒ１４は、ベンジル基、２−、３−もしくは４−カルボキシベンジル基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基（ここで、アルキル基の置換基としては、カルボキシル基、または、アルキル部分が炭素数１〜３の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキルであるアルコキシカルボニル基である。）である。）、
である化合物が好ましい。
なかでも、下記化合物群
0004179878.tif 000064
から選択される化合物が好ましい。
一般式（１）で示される化合物には、光学異性体が存在するが、それぞれの光学異性体、およびそれらの混合物は全て本発明に含まれる。なかでも、一般式（１）において、Ｒ３の結合する炭素原子についてＳ配置、Ｒ５の結合する炭素原についてＲ配置である化合物が好ましい。
本発明の化合物は水和物として得ることもできる。
塩を形成する酸としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、燐酸などの無機酸、および酢酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トロフルオロ酢酸などの有機酸が挙げられる。
一般式（１）で示される化合物は、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む薬学的組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
本発明化合物の投与量は、患者の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができるが、例えば、経口投与の場合には、一般に１〜１０００ｍｇ／ｄａｙ／ｐｅｒｓｏｎの用量で使用され、非経口投与（静注、筋注、皮下注）の場合には、一般に０．１〜１００ｍｇ／ｄａｙ／ｐｅｒｓｏｎの用量で使用される。
一般式（１）で示される化合物は、下記反応スキーム１〜６に図示されている方法によって製造することができる。
反応スキーム１
0004179878.tif 000065
反応スキーム２
0004179878.tif 000066
反応スキーム３
0004179878.tif 000067
反応スキーム４
0004179878.tif 000068
反応スキーム５
0004179878.tif 000069
反応スキーム６
0004179878.tif 000070
反応スキーム１〜６において、置換基Ｒ１、Ｒ２、・・、Ｒｎは、それぞれ、前述の定義どおりであり、Ｒ１’、Ｒ２’・・、Ｒｎ’は、それぞれ対応するＲ１、Ｒ２、・・、Ｒｎの保護体を表し、保護基としては、例えば、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年、丸善発行）などのほかＰＲＯＴＥＣＴＩＮＧ  ＧＲＯＵＰ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＳＥＣＯＮＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ  １９９１）などに記載されている保護基（例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）など）である。
また、Ｐはそれぞれ通常使われる保護基を示し、たとえば、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年、丸善発行）などの他、ＰＲＯＴＥＣＴＩＮＧ  ＧＲＯＵＰ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＳＥＣＯＮＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ  １９９１）などに記載されている保護基である。
また、Ｘはクロライド、ブロマイドまたはヨージドなどのハロゲン原子を表わす。
各反応工程式中の出発原料は、それ自体公知であるか、または公知の方法により製造することができる。
各反応工程中の反応はすべて公知の方法により行なうことができる。
また、本発明における他の出発物質および各試薬は、それ自体公知であるかまたは公知の方法により製造することができる。
以下に本発明化合物の製造方法を上記反応スキームに沿ってより具体的に説明する。
反応スキーム１
中間体（３）は、出発原料（１）及び試薬２（表Ａ−１〜表Ａ−３４に例示される。本試薬は、商業的に入手可能であるか、または、公知の合成法により容易に合成可能である。）の縮合反応を行うことにより得られる。
ここで用いられる縮合反応としては、例えば通常用いられる活性エステル法、酸無水物法、アジド法、酸クロライド法、各種縮合剤等、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年、丸善発行）に示された方法が挙げられる。用いられる縮合剤としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＩ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ），Ｂｏｐ試薬、Ｐｙｂｏｐ試薬、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ），２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボーレート（ＴＢＴＵ）、２−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロフォスフェート（ＨＡＴＵ）等、ペプチドシンセシスハンドブック（１９９８年、ノババイオケム発行）等に記載される通常用いられる試薬があげられる。反応は常法に従い、適当な溶媒、たとえばジメチルホルムアミド、ジクロロメタンなどを用い、冷却下あるいは室温ないし加温して行われる。
中間体（４）は、中間体（３）に適当なアミノ脱保護反応を行うことにより得られる。例えば、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年、丸善発行）に示された方法が挙げられる。反応は常法に従い、無溶媒あるいは、適当な溶媒、たとえばジクロロメタン、ジメチルホルムアミドなどを用い、冷却下あるいは室温ないし加温して行われる。
中間体（６）は、中間体（４）及び試薬５（表Ａ−１〜表Ａ−３４に例示される。本試薬は、商業的に入手可能であるか、または、公知の合成法により容易に合成可能である。）の、上記に示したような縮合反応を行うことにより得られる。
中間体（７）は、中間体（６）に上記に示したようなアミノ脱保護反応を行なうことにより得られる。反応は常法に従い、無溶媒あるいは、適当な溶媒、たとえばジクロロメタン、ジメチルホルムアミドなどを用い、冷却下あるいは室温ないし加温して行われる。
中間体（９）は、中間体（７）に試薬８（表Ａ−１〜表Ａ−３４に例示される。本試薬は、商業的に入手可能であるか、または、公知の合成法により容易に合成可能である。）を用い、通常用いられうるアルキル化反応、アシル化反応、スルホニル化反応を行うことにより得られる。反応は常法に従い、適当な溶媒、たとえばジメチルホルムアミド、ジクロロメタンなどを用い、冷却下あるいは室温ないし加温して行われる。
化合物（１０）および中間体（１１）は、中間体（９）を、たとえば、日本特許公表公報平９−５０９９３７、ザ  ケミストリー  オブ  アミジンズ  アンド  イミデーツ（１９９１年、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ発行）等に記載されている一般に知られている方法により導くことができる。
たとえば、化合物（１０）は、中間体（９）を強酸に付した後、アンモニウム塩類またはアンモニアを反応させることによって得られる。反応は常法に従い、適当な溶媒、たとえばメタノール、エタノールなどを用い、冷却下あるいは室温ないし加温して行われる。
化合物（１０）は、中間体（１１）に適当な脱保護反応を行なうことにより得られる。例えば、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年、丸善発行）に示された方法が挙げられる。反応は常法に従い、無溶媒あるいは、適当な溶媒、たとえばジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、水、エタノールなどを用い、冷却下あるいは室温ないし加温して行われる。
反応スキーム２
中間体（１４）は、出発原料（１２）に試薬１３（本試薬は、商業的に入手可能であるか、または、公知の合成法により容易に合成可能な、アルキルハライド、アシルクロライド、スルホニルクロライドである。）を用い、通常用いられうるアルキル化反応、アシル化反応、スルホニル化反応を行うことにより得られる。反応は常法に従い、適当な溶媒、たとえばジメチルホルムアミド、ジクロロメタンなどを用い、冷却下あるいは室温ないし加温して行われる。
中間体（１６）は、中間体（１４）、及び試薬１５（本試薬は、商業的に入手可能であるか、または、公知の合成法により容易に合成可能な、天然アミノ酸または非天然アミノ酸である。）の、上記に示したような縮合反応を行うことにより得られる。
中間体（１７）は、中間体（１６）に適当な脱保護反応を行うことにより得られる。反応は常法に従い、適当な溶媒、たとえば水、メタノール、エタノールなどを用い、冷却下あるいは室温ないし加温して行われる。
中間体（１９）は、中間体（１７）に試薬１８（表Ａ−２７に例示される。本試薬は、商業的に入手可能であるか、または、公知の合成法により容易に合成可能である。）を用い、および化合物（２０）は、中間体（１７）に試薬１８を用い、上記に示したような縮合反応を行なうことにより得られる。
化合物（２０）は、中間体（１９）に適当な脱保護反応を行なうことにより得られる。
反応スキーム３
化合物（２１）は、中間体（９）に適当な脱保護反応を行なうことにより得られる。
化合物（２３）は、中間体（２１）に試薬２２（表Ａ−２８〜２９に例示される。本試薬は、商業的に入手可能であるか、または、公知の合成法により容易に合成可能である。）を反応させることにより得られる。反応は常法に従い、適当な溶媒、たとえば、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、水、テトラヒドロフランなどを用い、冷却下あるいは室温ないし加温して行われる。
中間体（２４）および化合物（２５）は上記に示したようなアミジノ化を行なうことにより得られる。
中間体（２５）は、中間体（２４）に適当な脱保護反応を行なうことにより得られる。
反応スキーム４
中間体（２６）は中間体（９）を用いて公知の方法、たとえばＬｅｅらの方法（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８６９−８７６，６，１９９８）に従い得られる。
中間体（２８）は中間体（２６）と試薬２７（本試薬は、一般式ＮＨ２−Ｒ９（Ｒ９は前述の定義のとおり）で示される化合物であり、商業的に入手可能であるか、公知の合成法により容易に合成可能である。）より公知の方法、たとえばＬｅｅらの方法（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８６９−８７６，６，１９９８）に従い得られる。
中間体（３０）は中間体（９）と試薬２９（本試薬は、一般式ＮＨ２−Ｒ９（Ｒ９は前述の定義のとおり）で示される化合物であり、商業的に入手可能であるか、公知の合成法により容易に合成可能である。）より公知の方法、たとえばＴｒｕｃｋｅｒらの方法（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６０１−６１６，８，２０００）に従い得られる。
中間体（３２）は中間体（１１）と試薬３１（本試薬は、Ｂｏｃ基、Ｃｂｚ基などのアミン保護基を表す。）よりペプチド合成の基礎と実験（１９８５年、丸善発行）などのほかＰＲＯＴＥＣＴＩＮＧ  ＧＲＯＵＰ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＳＥＣＯＮＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ  １９９１）などに記載されている方法に従い得られる。ここで試薬（３１）とは、例えばターシャリーブチルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、アセチル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基などが挙げられる。反応は常法に従い、適当な溶媒、たとえば、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミドなどを用い、冷却下あるいは室温ないし加温して行われる。
化合物（３３）は中間体（２８）、中間体（３０）、中間体（３２）に適当な脱保護反応を行なうことにより得られる。
反応スキーム５
中間体（３４）は上記の中間体（９）と同様にして得られる。
中間体（３６）は中間体（３４）と試薬３５（表Ａ−３０〜３１に例示される。本試薬は、商業的に入手可能であるか、または、公知の合成法により容易に合成可能である。）より、例えばＥｌｌｍａｎらの方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１７１−１１１７２，１６１，１９９４）に従い、パラジウムを触媒とする、Ｓｕｚｕｋｉ反応により得ることが出来る。本反応に用いられる溶媒としては通常のＳｕｚｕｋｉ反応に用いられる溶媒、例えばエーテル系の溶媒や芳香族炭化水素系の溶媒、アセトニトリル、ジメチルホムアミドまたはこれらの溶媒と水との混合溶媒が用いられ、好ましくはテトラヒドロフランさらに好ましくはテトラヒドロフランと水との混合溶媒があげられる。用いられる試薬としてはパラジウム試薬としてテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、酢酸パラジウム、ジクロロビス（ベンゾニトリル）パラジウム、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウムなどがあげられ、好ましくはテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウムがあげられる。
化合物（３７）は中間体（３６）に上記で示したアミジノ化反応を行なうことにより得られる。
反応スキーム６
中間体（３８）は、上述の反応スキーム１により得られる。
中間体（４０）は中間体（３８）に試薬３９（表Ａ−３２〜３４に例示される。）を用い、通常用いられうるアルキル化反応を行うことにより得られる。反応は常法に従い、適当な塩基、たとえば水素化ナトリウム、炭酸セシウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウムなどを用い、適当な溶媒、たとえばジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランなどを用い、冷却下あるいは室温ないし加温して行われる。
中間体（４１）は中間体（４０）に上記に示したような脱保護反応を行なうことにより得られる。
中間体（４２）は中間体（４１）に試薬（８）を用い、上記に示したようなアルキル化反応、アシル化反応、スルホニル化反応を行うことにより得られる。
中間体（４３）は中間体（４２）に上記に示したようなアミジノ化を行なうことにより得られる。
化合物（４４）は、中間体（４３）に適当な脱保護反応を行なうことにより得られる。
本発明において、低分子ＶＩＩａ因子阻害剤とは、ＶＩＩａ因子に対して阻害活性を有する薬剤をいい、かかる性質を有するあらゆる化合物が含まれるが、特に、分子量１０００以下の合成または天然の低分子化合物やペプチド誘導体などが挙げられる。ＶＩＩａ因子に対する阻害活性は、例えば、本願明細書の試験例に記載の方法により測定することができる。
不可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とは、ＶＩＩａ因子と反応する基を有し、ＶＩＩａ因子と共有結合することにより結合するＶＩＩａ因子阻害剤のうち、一度形成された共有結合が解離しないものをいう。ＶＩＩａ因子のようなセリンプロテアーゼの場合、これと反応する基としてクロロメチルケトンなどの基が使われ、酵素中の活性中心となるＳｅｒ残基と共有結合を形成することで不可逆的に阻害をする。可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とは、ＶＩＩａ因子との結合が不可逆的でないＶＩＩａ因子阻害剤をいう。低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とは、ＶＩＩａ因子との結合が不可逆的でない低分子ＶＩＩａ因子阻害剤をいう。
本発明者らは、課題解決のため低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶を作成する方法を確立した。得られた結晶を用いてＸ線結晶構造解析を行うことにより低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＶＩＩａ因子の結合状態についての正確な立体構造情報を得ることができる。この立体構造情報から、コンピュータを用いて低分子可逆的阻害剤とＶＩＩａ因子との結合の様子を視覚的、数値的に表現することが可能となる。これはＶＩＩａ因子との結合に重要な相互作用の評価を行うにあたり有用である。
さらにＸ線構造解析により得られた低分子可逆的ＶＩＩａ阻害剤とＶＩＩａ因子との複合体の構造を出発とし、仮想的に阻害剤分子に修飾を施すことでＶＩＩａ因子に対する特異性に優れた低分子可逆的阻害剤を設計することが可能となる。コンピュータを使った仮想的な評価は、現実の化合物合成に較べはるかに短時間で済むため、低分子可逆的阻害剤の分子設計の効率化に有用である。
また、低分子可逆的ＶＩＩａ阻害剤とＶＩＩａ因子との結合様式とＶＩＩａ因子阻害活性、選択性との関係を分析することでＶＩＩａ因子への特異性を向上させるのに重要な相互作用が得られるサイトを正確に特定できる。このようにして確かめられたＶＩＩａ因子との特異性に重要な相互作用の情報を基にすることで、Ｘ線結晶構造解析やコンピュータモデリングによりＶＩＩａ因子または構造的に類似したｔｈｒｏｍｂｉｎ、ｔｒｙｐｓｉｎ、Ｘａ因子等のセリンプロテアーゼとの結合様式が解明または推測された低分子可逆的阻害剤分子に対し、ＶＩＩａ因子との特異性に重要な相互作用を持たせるようコンピュータ上で分子を修飾することが可能となる。阻害剤と酵素の相互作用は非常に複雑な過程であり、現在利用可能なコンピュータでの仮想的な評価単独ではその精度に限界があるが、このように実験的に有効性が確認された相互作用を使うことで、さらに効率の良い分子設計が可能となる。
［ヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子と低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の結晶］
これは、ヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子および低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤から構成される結晶で、斜方晶系に属し、空間群Ｐ２１２１２１、格子定数ａ＝７１．４Å±５％、ｂ＝８２．５Å±５％、ｃ＝１２３．３Å±５％，α＝β＝γ＝９０°で非対称単位にヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子および可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤１個を含むものをさす。
このような複合体結晶としては、低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤が一般式（１）（式中の置換基の定義は、前記におけると同じ意味を表す。）で示される化合物である複合体結晶が好ましい。
［ヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子と可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体を結晶化する方法］
結晶化のためのヒトＶＩＩａ因子については、ヒトＶＩＩ因子をコードするベクターを組み込んだ細胞を使ってヒトＶＩＩ因子として発現させ、カラムクロマトグラフィー法による精製後、活性体のＶＩＩａ因子に変換し、再度カラムクロマトグラフィー法により精製したものを用いることができる。この代わりにヒトＦＶＩＩａ製剤（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｐｈａｒｍａ  Ｌｔｄ．）をカラムクロマトグラフィー法により精製したものも使用できる。
結晶化のためのヒト可溶型組織因子については、ヒト組織因子の細胞外ドメインをコードするベクターを組み込んだ適当な細胞、菌体、特に大腸菌をつかって発現後、カラムクロマトグラフィー法により精製したものが使用できる。
調製したヒトＶＩＩａ因子とヒト可溶型組織因子をヒト可溶型組織因子が過剰になるようベンズアミジン存在下で混ぜ合わせた後、ベンズアミジン無しの緩衝液を使いゲル濾過カラムクロマトグラフィー法により精製することでヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子複合体を得ることができる。これに構造解析を目的とする低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤を０．５ｍＭ程度になるよう、溶解性が低い場合は飽和濃度になるよう加え、限外濾過法により濃縮、結晶化用濃縮試料とする。
結晶は、結晶化用濃縮試料に対し、温度２５度、１００ｍＭ  カコジル酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ５．０、６−７．５％  ＰＥＧ４０００、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５％  グリセロール溶液を使った蒸気拡散法（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、８２−９０、１９９２年、ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ）を適用することで得られる。その際、低分子不可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤または低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶を１００ｍＭ  カコジル酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ５．０、９％  ＰＥＧ４０００、５ｍＭ  ＣａＣｌ２中でホモジナイザーにより砕き希釈した種溶液を添加する必要がある。約１か月ほどで最大で長さ１．０ｍｍ×太さ０．０５ｍｍ程度の柱状の低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶を得る。なお、結晶化方法や溶液条件については上の条件に限定されるわけではない。例えば、結晶化方法としては、蒸気拡散法以外にも、静置バッチ法、自由界面拡散法、透析法などの方法なども用いることができる。
また、このような複合体結晶化方法としては、低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤が一般式（１）（式中の置換基の定義は、前記におけると同じ意味を表す。）で示される化合物である方法が好ましい。
［ヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子と低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の立体構造の座標全体およびその一部を保存した媒体］
低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の座標は、この複合体の結晶の立体構造を、立体構造決定方法の一つであるＸ線結晶構造解析を用いて解析することにより得られる。結晶に単色化されたＸ線に当てることにより得られる回折斑点の強度データを測定し、そのデータを使って結晶単位中での電子密度を計算することで各原子の位置を特定する。作成した構造から計算される回折強度データＦｃと観測した回折強度データＦｏの差が小さくなるよう各原子の３次元上の位置ならびに温度因子とよばれる原子の熱振動を表す変数を修正し、最終的な座標データが得られる。上記手法を本明細書中に開示されている低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤の例である以下の化合物について適用することにより、これら化合物とＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶を得、Ｘ線結晶構造解析により化合物とＶＩＩａ因子との結合様式を明らかにした例を示す。
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化合物（１）とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の座標を本分野で一般に用いられる蛋白質の３次元の構造座標の表記方法であるＰＤＢフォーマットに従って示したものを表３６に示す。表３６中、最初の行は結晶の格子形状や対称性を示したものである。第２行目以降は構造座標データを示し、左から順に、原子番号、原子名、アミノ酸残基名、ｃｈａｉｎＩＤ、アミノ酸残基番号、Ｘ、Ｙ、Ｚ、占有率、温度因子、ｓｅｇｍｅｎｔＩＤ（ここではｃｈａｉｎＩＤと同じ）、原子の種類を示す。座標の単位はÅ。なお、アミノ酸残基番号については、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０巻、４１−４６項、１９９６年の記載に従って対応するキモトリプシンのアミノ酸残基番号を基準にしている。また、ＶＩＩａ因子は２つのポリペプチド鎖からなり、ここでは、長い方をＨ鎖、短い方をＬ鎖と呼ぶ。表３６中、ｃｈａｉｎ  ＩＤは、Ｈ；ＶＩＩａ因子Ｈ鎖、Ｌ；ＶＩＩａ因子Ｌ鎖、Ｔ；可溶型組織因子、Ｃ；カルシウムイオン、Ｗ；水分子、Ｉ：低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤を示す。
本発明において、座標データの一部とは、Ｘ線結晶構造解析より得られた構造座標の一部、特に低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤およびその周囲の残基、を３次元表記で表現したものである。表３７は、化合物（２）とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体のＸ線結晶構造解析により得られた座標のうち、化合物（２）から特に１０Å以内の残基についてＰＤＢフォーマットに従って示したものである。
座標データの全部又は一部を含む媒体とは、ＰＤＢフォーマットに従って示された座標データの全部又は一部或いはこれらと同等な内容を含む情報を保存したコンピュータのメモリーや各種ディスク装置をいう。
［解析された座標データを利用してコンピュータ上で新たな低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤をデザインする方法］
蛋白質等の分子の３次元構造を表示するコンピュータプログラムは多数存在しており、これらのソフトとＸ線結晶構造解析により得られた構造座標を用いることで、低分子可逆的ＶＩＩａ阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体構造、特に低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤の周囲の構造をコンピュータ上で視覚的に表現することができる。これにより低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＦ．ＶＩＩａとの間でどのような相互作用が働いているか視覚的に認識できる。図１はヒトＶＩＩａ因子の活性部位ポケットに化合物（１）が結合した様子を立体的に表現したものである。残基化合物（１）を含む本件発明のペプチド化合物はヒトＶＩＩａ因子と４つのサイトで結合しており、ここではそれぞれ、Ｓ１サイト、Ｓ２サイト、Ｓ４サイト、Ｓ１サブサイトと名付ける。なお、活性部位ポケットはいずれもヒトＶＩＩａ因子Ｈ鎖のアミノ酸残基で構成されている。以後、活性部位を構成するアミノ酸残基の特定にあたっては、Ｈ鎖であることは特に示さない。図２はその結合様式を模式的に表し、各サイトを構成する主なヒトＶＩＩａ因子のアミノ酸残基を示したものである。化合物（１）を含む本件発明のペプチド化合物は、これら残基と水素結合、イオン結合、ならびにファンデルワールス相互作用を形成することにより結合している。ここで水素結合とはＸ−Ｈ基（Ｘは電気陰性基）と非共有電子対を有する他の電気陰性基Ｙとの間で水素を間にはさむ形Ｘ−Ｈ．．．．Ｙで生じる電気双極子−電気双極子間相互作用である。また、生理学的ｐＨで一方が正または負電荷をもつようなイオン−双極子相互作用も含む。典型的にはＸ、ＹがＮ、Ｏのときに生じる。イオン結合とはカルボン酸のように生理学的ｐＨで負電荷を有する基とアミジノ基やアミン基のように正電荷を有する基との間で生じる静電相互作用のことをいう。ファンデルワールス相互作用とは任意の原子の間に生じる相互作用で適当な距離では弱い引力として働くが、ある距離を越えて近づくと逆に強い斥力として働く。各原子種ごとにファンデルワールス半径と呼ばれる値があり、２つの原子間の距離がファンデルワールス半径の和であるときにもっとも強い引力が働く。
また、これらのソフトにおいては、阻害剤分子の構造を仮想的に修正することが可能であり、また、分子力場エネルギーと呼ばれる値を計算することで阻害剤分子に修正を加えた際の結合に対する影響をエネルギーの形で粗く見積もることもできる。Ｘ線結晶構造解析により決定された構造座標を出発とし、このようなプログラムを使って阻害剤に仮想的に修正を加えていくことで、ヒトＶＩＩａ因子との結合が強くなるように新たな阻害剤を設計できる。この方法は、現実に化合物を合成するのに較べ、はるかに短時間で評価できるので、ＶＩＩａ因子に特異的な低分子可逆的阻害剤を設計するうえで有用である。これらのコンピュータプログラムとしては、ＱＵＡＮＴＡ、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ、ＣＨＡＲＭＭ、Ｄｉｓｏｖｅｒ、Ｌｕｄｉ（以上Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ）、Ｓｙｂｙｌ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ）等が目的にあったプログラムの例であるが、これらのプログラムに限定されるわけではない。
上述の方法により、立体構造を使用して阻害剤を仮想的に修正し評価することが可能であるが、阻害剤と酵素の結合は複雑な過程であり、現在おこなわれている仮想的な評価ではその精度に限界がある。そこで複数の低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤についてＸ線結晶構造解析で決定された結合様式とヒトＶＩＩａ因子阻害活性や特異性との相関を探ることでヒトＶＩＩａ因子との結合や特異性に重要なサイトならびに相互作用を特定することができる。また、コンピュータ上でそれらのサイトおよび相互作用を利用したヒトＶＩＩａ因子に特異的な低分子可逆的阻害剤の設計をすることもできる。このように実験的に確かめられた結合様式に関する情報を利用することでコンピュータ上での仮想的な結合活性評価における精度の問題を解決できる。
表４１は、化合物（１）とヒトＶＩＩａ因子Ｓ２サイト部分との水素結合を示したものである。化合物（１）は、Ｓ２サイトと結合する位置にアミド基を持ち、そのアミノ基はＡｓｐ６０側鎖カルボン酸、Ｔｙｒ９４側鎖水酸基、Ｔｈｒ９８主鎖カルボニル酸素と水素結合を形成している。さらに表３８のデータから、Ｓ２サイトにおいてこれらのアミノ酸残基と水素結合を形成しうる低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤は、水素結合を形成しえないＶＩＩａ因子阻害剤にくらべｔｈｒｏｍｂｉｎとの選択性に優れていることがわかる。以上により、かかる水素結合の獲得はヒトＶＩＩａ因子に対する特異性を獲得するのに有用であることがわかる。また、Ａｓｐ６０は生理的条件で負電荷を持つことからイオン結合の獲得もＶＩＩａ因子に対する特異性を獲得するのに有用である。
以上からＡｓｐ６０側鎖カルボン酸、Ｔｙｒ９４側鎖水酸基、Ｔｈｒ９８主鎖カルボニル酸素の全て若しくはその一部、特にＡｓｐ６０側鎖と水素結合またはイオン結合を形成しうる位置にアミド基、アミジノ基、グアニジノ基、アニリン、アミン等の水素を有する窒素原子、水酸基等の水素を有する酸素原子が来るように阻害剤構造を修正することでヒトＶＩＩａ因子への特異性が高い阻害剤を効率よくデザインすることが可能となる。分子設計にあたっては、導入する置換基の水素結合可能な原子がＡｓｐ６０側鎖の酸素原子、Ｔｙｒ９４側鎖の酸素原子、Ｔｈｒ９８主鎖酸素原子の少なくとも一つから２．５−３．５Åの位置に来るようにするとよい。イオン結合の導入にあたっては導入する置換基の正電荷を持つ原子とＡｓｐ６０側鎖酸素原子との距離が２．５−４．５Åの位置にくるようにするとよい。また、修正したい分子と、ＶＩＩａ因子もしくはこれに構造的に類似したｔｈｒｏｍｂｉｎ、ｔｒｙｐｓｉｎ、Ｘａ因子等のセリンプロテアーゼとの結合モデルの座標ならびにＸ線結晶構造座標に対し、化合物（１）または（２）とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の構造座標をＶＩＩａ因子部分が最も良く重なるよう動かした後、化合物（１）または（２）のアミド基と水素結合可能な原子が重なるよう修正したい分子に置換基を導入してもよい。
表４２および４３は、それぞれ、化合物（１）および（２）とヒトＶＩＩａ因子Ｓ１サブサイト部分との水素結合、イオン結合の様子を示したものである。これらの阻害剤はＳ１サブサイトと結合する位置にスルフォンアミド基やカルボン酸を持ち、いずれもＬｙｓ１９２側鎖アミン基と水素結合もしくはイオン結合を形成している。さらに表３９のデータから、Ｓ１サブサイトにおいてこれらアミノ酸残基と水素結合またはイオン結合を形成しうるＶＩＩａ因子阻害剤、特にカルボン酸を有するＶＩＩａ因子阻害剤はｔｈｒｏｍｂｉｎとの選択性に優れていることがわかる。以上より、かかる水素結合またはイオン結合の獲得はヒトＶＩＩａ因子に対する特異性を獲得するのに有用であることがわかる。
以上からＬｙｓ１９２側鎖アミノ基と水素結合またはイオン結合を形成しうる位置にカルボン酸または、スルフォン酸、スルフォンアミド、スルフォンウレア、テトラゾール等のカルボン酸の生物学的等価体が来るように阻害剤構造を修正することでヒトＶＩＩａ因子への特異性が高い阻害剤を効率よくデザインすることが可能となる。分子設計にあたっては、導入する置換基の水素結合可能な原子とＬｙｓ１９２側鎖の窒素原子との距離が２．５−３．５Åの位置に来るようにするとよい。イオン結合の導入にあたっては導入する置換基の負電荷を持つ原子とＬｙｓ１９２側鎖窒素原子との距離が２．５−４．５Åの位置にくるようにするとよい。また、修正したい分子と、ＶＩＩａ因子もしくはこれに構造的に類似したｔｈｒｏｍｂｉｎ、ｔｒｙｐｓｉｎ、Ｘａ因子等のセリンプロテアーゼとの結合モデルの座標ならびにＸ線結晶構造座標に対し、化合物（１）または（２）とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の構造座標をＶＩＩａ因子部分が最も良く重なるように動かした後、化合物（２）のスルフォンアミド基や化合物（１）のカルボン酸部分と水素結合またはイオン結合可能な原子が重なるよう修正したい分子に置換基を導入してもよい。また、Ｌｙｓ１９２の位置は結合する化合物の構造により変化することから、化合物（１）または（２）の構造を重ね合わせたときのＬｙｓ１９２の位置に対し、水素結合やイオン結合を形成するように分子を修正してもよい。さらにＬｙｓ１９２の可動性を考慮し、その側鎖位置を分子力場エネルギーで見て無理の無い位置に動かした構造について上の方法を利用してもよい。
表４４および４５は、それぞれ、化合物（１）および（２）とヒトＶＩＩａ因子Ｓ４サイト部分とのファンデルワールス相互作用を示したものである。これらの化合物はＳ４サイトのうち、Ｔｒｐ２１５側鎖，Ｇｌｙ２１６主鎖、Ｇｌｎ２１７側鎖、Ｖａｌ１７０Ｅ側鎖、Ｇｌｙ１７０Ｆ主鎖、Ａｓｐ１７０Ｇ主鎖、Ｓｅｒ１７０Ｈ主鎖及び側鎖、Ｐｒｏ１７０Ｉ側鎖とファンデルワールス相互作用および疎水相互作用を形成している。さらに表４０データから、化合物（１）および（２）は、上記アミノ酸残基と相互作用する部分を小さくした化合物と比較してｔｈｒｏｍｂｉｎとの選択性に優れていることがわかる。以上から、かかるアミノ酸残基、特にＶａｌ１７０Ｅ、Ｇｌｙ１７０Ｆ、Ａｓｐ１７０Ｇ、Ｓｅｒ１７０Ｈ、Ｐｒｏ１７０Ｉ、Ｇｌｎ２１７とのファンデルワールス相互作用および疎水相互作用の獲得はヒトＶＩＩａ因子に対する特異性の獲得に有用であることがわかる。ここで、疎水相互作用とは、水中においてアルキル基、ベンゼン環などの非極性基が会合する現象を指す。非極性基の周りの水分子はエントロピーの低い状態に置かれるため、エネルギー的に不安定となる。このため非極性基同士が会合し、水との接触表面積が小さくなるよう相互作用が働く。
以上から、これらのアミノ酸残基とファンデルワールス相互作用および疎水相互作用を形成しうる位置にＢｉ−Ｐｈｅ基、Ｎａｐｔｈｙｌ基、インドール基等の疎水性の高い基が来るように阻害剤構造を修正することでヒトＶＩＩａ因子に対する特異性が高い阻害剤を効率よくデザインすることが可能となる。分子設計にあたっては、導入する置換基の原子と上述のアミノ酸残基中の原子との距離が３．５−４．２Åの位置に来るようにするとよい。また、修正したい分子と、ＶＩＩａ因子もしくはこれに構造的に類似したｔｈｒｏｍｂｉｎ、ｔｒｙｐｓｉｎ、Ｘａ因子等のセリンプロテアーゼとの結合モデルの座標ならびにＸ線結晶構造座標に対し、化合物（１）または（２）とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の構造座標をＶＩＩａ因子部分が最も良く重なるように動かした後、化合物（１）のインドール部分や、化合物（２）のビフェニル部分と疎水性原子が重なるよう修正したい分子に置換基を導入してもよい。
図３は、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトンが結合した際のＶＩＩａ因子のＳ４サイト部分の分子表面の様子（Ｎａｔｕｒｅ  ３８０巻、４１−４６、１９９６、ＰＤＢ＝１ＤＡＮ）、および化合物（１）が結合した際のＶＩＩａ因子のＳ４サイト部分の分子表面の様子を示したものである。化合物（１）の結合の際には、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトンの結合時には無いＳ４サイト下の空間まで到達可能な孔が生じることがわかる。かかる孔が生じること、およびかかる孔を生じさせる化合物は、これまで報告された例はない。この動きは、化合物（１）のインドール環部分がＳ４サイトの特定の位置に結合し、その際、Ｇｌｎ２１７の側鎖が位置を変えることにより起こる。この孔の下には、Ｃｙｓ１６８側鎖、Ｓｅｒ１７０Ｂ側鎖、Ｉｌｅ１７６側鎖、Ｃｙｓ１８２側鎖、Ｔｒｐ２１５側鎖、Ｇｌｙ２１６主鎖、Ｇｌｎ２１７主鎖、側鎖、Ｈｉｓ２２４主鎖、側鎖、Ｐｈｅ２２５主鎖、側鎖、Ｇｌｙ２２６主鎖、Ｖａｌ２２７側鎖からなる空間が存在しており、以下Ｓ４サブサイトという。この孔を使い、Ｓ４サイトとの結合部分から置換基を出すことで、これらＳ４サブサイトの残基と水素結合、ファンデルワールス相互作用および疎水相互作用を獲得できる。既知のｔｈｒｏｍｂｉｎを含む血液凝固に関連したセリンプロテアーゼの立体構造と比較するとＳ４サブサイトに相当する空隙をもつものは無く、Ｓ４サブサイトとの相互作用の獲得はヒトＶＩＩａ因子に対する特異性の獲得に有用である。例えば、化合物（１）を分子設計の初期モデルとするのであれば、インドール部分の５位から置換基を出すことで、この孔を通してＳ４サブサイトの方向に置換基を出すことができる。
以上から、化合物（１）のインドール環に相当する位置にベンゼン環等の疎水性基が来るように化合物の構造を修正し、Ｓ４サブサイトへ通じる孔を開かせることが可能である。さらにこの孔を通るように置換基を導入することで、Ｓ４サブサイトと水素結合、ファンデルワールス相互作用および疎水相互作用を形成できる。これによりヒトＶＩＩａ因子への特異性が高い阻害剤をデザインすることが可能となる。
以上より、ヒトＶＩＩａ因子のＳ２サイト、Ｓ１サブサイト、Ｓ４サイト、およびＳ４サブサイトのいずれか１つ以上のサイトと相互作用する低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤が好ましいが、具体的には、下記群［Ａ−１］、［Ａ−２］、［Ｂ−１］、［Ｂ−２］、［Ｂ−３］、［Ｂ−４］、［Ｃ−１］または［Ｃ−２］中に示される部分構造の少なくとも一つ以上を有する低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤が好ましい。
（Ａ）Ｓ２サイトと相互作用する部分構造としては下記［Ａ−１］または［Ａ−２］群に示される部分構造が好ましい。
［Ａ−１］群：
0004179878.tif 000072
（ここで、Ｘ１は、ＯまたはＮＨを示し、  Ｘ２は、水素原子またはメチル基を示す。）
［Ａ−２］群：
0004179878.tif 000073
（ここで、Ｒ２３は、ヘテロ原子を有する芳香族６員環、５員環を示す。）
［Ａ−２群］においては、特に、Ｒ２３がベンゼン環、ピリジン環、イミダゾール環である場合が好ましい。
（Ｂ）Ｓ１サブサイトと相互作用する部分構造としては下記［Ｂ−１］、［Ｂ−２］、［Ｂ−３］または［Ｂ−４］群に示される部分構造が好ましい。
［Ｂ−１］群：
0004179878.tif 000074
［Ｂ−２］群：
0004179878.tif 000075
［Ｂ−３］群：
0004179878.tif 000076
（ここで、Ｒ２４は、［Ｂ−２］群と同一である。Ｒ２５は、ヘテロ原子を有する芳香族６員環、５員環を示す。）
Ｒ２５としては、ベンゼン環が好ましい。
［Ｂ−４］群：
0004179878.tif 000077
（ここで、Ｒ２７は、炭素数１〜３のアルキレン基を示す。Ｒ２４は、［Ｂ−２］群と同一である。Ｒ２６は、［Ｂ−３］群と同一である。）
（Ｃ）Ｓ４サイトと相互作用する部分構造としては下記［Ｃ−１］または［Ｃ−２］群に示される部分構造が好ましい。
［Ｃ−１］群：
0004179878.tif 000078
（ここで、Ｘ３は、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、Ｒ２８は、ヘテロ原子を有する芳香族６員環もしくは５員環を示す。）
［Ｃ−１］群としては、Ｒ２８がベンゼン環である部分構造が好ましい。
［Ｃ−２］群：
0004179878.tif 000079
（ここで、Ｘ４は、ＮＨ、Ｓ、またはＯを示す。  Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、独立して、ＮまたはＣＨを示す。）
具体的には、（１）Ｓ２サイトと相互作用する部分構造として上記群［Ａ−１］または［Ａ−２］中に示される部分構造のいずれかを含有し、かつ、Ｓ１サブサイトと相互作用する部分構造として上記群［Ｂ−１］、［Ｂ−２］、［Ｂ−３］または［Ｂ−４］中に示される部分構造のいずれかを含有する低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤、（２）Ｓ２サイトと相互作用する部分構造として上記群［Ａ−１］または［Ａ−２］中に示される部分構造のいずれかを含有し、かつ、Ｓ４サイトと相互作用する部分構造として上記群［Ｃ−１］または［Ｃ−２］中に示される部分構造のいずれかを含有する、低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤、（３）Ｓ１サブサイトと相互作用する部分構造として上記群［Ｂ−１］、［Ｂ−２］、［Ｂ−３］または［Ｂ−４］中に示される部分構造のいずれかを含有し、かつ、Ｓ４サイトと相互作用する部分構造として上記群［Ｃ−１］または［Ｃ−２］中に示される部分構造のいずれかを含有する、低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤が好適である。
また、特に好適には、Ｓ２サイトと相互作用する部分構造として上記群［Ａ−１］または［Ａ−２］中に示される部分構造のいずれかを含有し、かつ、Ｓ１サブサイトと相互作用する部分構造として上記群［Ｂ−１］、［Ｂ−２］、［Ｂ−３］または［Ｂ−４］中に示される部分構造のいずれかを含有し、かつ、Ｓ４サイトと相互作用する部分構造として上記群［Ｃ−１］または［Ｃ−２］中に示される部分構造のいずれかを含有する、低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤である。
実施例
以下、本発明を実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、本発明化合物の有用性を説明するために、本発明化合物の代表的化合物のＦＶＩＩａ阻害作用等に関する試験結果を試験例に示す。
なお、以下の実施例においては次に示すような慣用略号を用いる：
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＨＯＢｔ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＥＤＣＨＣｌ＝１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド  塩酸塩、Ｂｏｃ＝第３ブトキシカルボニル、Ａｃ＝アセチル、Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル、ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー。
また、物性値におけるＮＭＲは核磁気共鳴スペクトルを意味し、数字は通常化学シフトを表示するのに用いられるδ（デルタ）値であり単位はｐｐｍである。内部標準物質は未使用または、ＴＭＳ（テトラメチルシラン）を用いた。なお、δ値の次に表示したカッコ内の数字は水素原子の数であり、それに続く表示はｓが単一線、ｄが二重線、ｔが三重線、ｑが四重線、ｍが多重線、ｂｒが巾広い吸収ピークを意味する。また、Ｊはカップリング定数を表わす。
ＭＳは質量分析を表わし、ＦＡＢ、ＥＳＩはそれぞれ、イオン化法を表わし、ＦＡＢは高速原子衝突イオン化法、ＥＳＩはエレクトロスプレーイオン化法を表わす。
実施例１
Ｎ１−４−シアノベンジル−Ｎ２−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタマミド
４−シアノベンジルアミン１．６ｇ（１２．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍｌ）溶液に、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミン２．０ｇ（８．１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ１．４ｇ（８．９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ  ＨＣｌ  １．７ｇ（８．９ｍｍｏｌ）を加え、窒素気流下、室温にて攪拌する。１２時間後、反応液に水を加え酢酸エチルにて抽出する。酢酸エチル層を１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥する。硫酸マグネシウムを濾去し、濾液を減圧下に濃縮してＮ１−４−シアノベンジル−Ｎ２−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタマミド２．９ｇ（８．１ｍｍｏｌ：収率１００％）を得た。
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．４２（９Ｈ，ｓ），１．８７−２．５５（４Ｈ，ｍ），４．１４−４．２７（１Ｈ，ｍ），４．４９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），５．４７−６．０２（２Ｈ，ｍ），７．３８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
実施例２
Ｎ１−４−シアノベンジル−Ｌ−グルタマミド
Ｎ１−４−シアノベンジル−Ｎ２−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタマミド２．９ｇ（８．１ｍｍｏｌ）に、４Ｎ塩酸−酢酸エチル溶液（２０ｍｌ）を加え、窒素気流下、室温にて攪拌する。１時間後、減圧下で溶媒を留去し、残留物をカラムクロマトグラフィー（富士シリシアＮＨ−ＤＭ−１０２０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝１：１）に付し、Ｎ１−４−シアノベンジル−Ｌ−グルタマミド２．１ｇ（８．１ｍｍｏｌ：収率１００％）を得た。
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．７７−２．１２（２Ｈ，ｍ），２．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），３．２９−３．４５（４Ｈ，ｍ），４．４９（２Ｈ，ｓ），７．５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．７１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
実施例３
１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド
Ｎ１−４−シアノベンジル−Ｌ−グルタマミド３００ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトファン６０６ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）溶液にＨＯＢｔ１７６ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ  ＨＣｌ  ２２１ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加え、窒素気流下、室温にて攪拌する。１２時間後、反応液に水を加え析出するＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミドを濾取し、水洗乾燥する。得られたＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミドをジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解し、ピペリジン（１０ｍｌ）を加え、窒素気流下、室温にて攪拌した。５分後、減圧下で溶媒を留去し、残留物をカラムクロマトグラフィー（富士シリシアＮＨ−ＤＭ−１０２０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝１：０，１０：１）に付し、１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−ジアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド６５０ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ：収率１００％）を得た。
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．６７（９Ｈ，ｓ），１．８０−２．４９（４Ｈ，ｍ），３．１３−３．３３（２Ｈ，ｍ），３．７０−３．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４，９Ｈｚ），４．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），４．３９−４．５５（１Ｈ，ｍ），５．６２（１Ｈ，ｂｒｓ），６．１４（１Ｈ，ｂｒｓ），７．２０−７．６７（９Ｈ，ｍ），８．０７−８．１７（２Ｈ，ｍ）
実施例４
Ｎ−（エチルスルホニル）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド
１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド３００ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン１６２ｍｇ（１．６ｍｍｏｌ）、エタンスルホニルクロライド２０６ｍｇ（１．６ｍｍｏｌ）を加え、窒素気流下、室温にて攪拌した。１２時間後、減圧下で溶媒を留去し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）に付し、Ｎ−（エチルスルホニル）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド１３５ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ：収率３８％）を得た。
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．０８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．７０（９Ｈ，ｓ），１．６０−２．１２（４Ｈ，ｍ），２．７５−３．３４（４Ｈ，ｍ），４．１３−４．５５（４Ｈ，ｍ），７．２４−７．７８（９Ｈ，ｍ）
実施例５
Ｎ−（エチルスルホニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−アミジノベンジル）−Ｌ−グルタマミド
0004179878.tif 000080
Ｎ−（エチルスルホニル）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド１３５ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）を飽和塩化水素ーエタノール溶液１０ｍｌに溶解し、室温にて２０時間放置する。減圧下で溶媒を除去し、得られたＮ−（エチルスルホニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−エトキシイミノカルボニルベンジル）−Ｌ−グルタマミドをエタノール（８ｍｌ）に溶解し酢酸アンモニウム５００ｍｇ（６．４ｍｍｏｌ）、飽和アンモニアーエタノール溶液１．３ｍｌに溶解し加熱還流した。１時間後減圧下で溶媒を留去し、残留物をカラムクロマトグラフィー（富士シリシアＮＨ−ＤＭ−１０２０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝１：１）に付し、４−アミジノ−［（Ｓ）−Ｎ−［（Ｒ）−Ｎ’−エチルスルホニルトリプトフィル］グルタミニル］アミノメチルベンゼン９４ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ：収率８１％）を得た。
ＥＳＩ＋５５６（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．６５−２．０３（２Ｈ，ｍ），２．４８−３．５４（６Ｈ，ｍ），４．１２−４．４３（４Ｈ，ｍ），６．７０−７．７５（９Ｈ，ｍ），７．９５（１Ｈ，ｂｒｓ），８．４３（２Ｈ，ｂｒｓ）
実施例６
Ｎ−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］スルホニル｝−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド
１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド３５０ｍｇ（０．６４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン１９４ｍｇ（１．９ｍｍｏｌ）、［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］スルホニルクロライド４７７ｍｇ（１．９ｍｍｏｌ）を加え、窒素気流下、室温にて攪拌した。１２時間後、減圧下で溶媒を留去し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）に付し、Ｎ−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］スルホニル｝−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド４０７ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ：収率８４％）を得た。
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．７０（９Ｈ，ｓ），１．７５−２．１５（４Ｈ，ｍ），２．６５−３．４２（２Ｈ，ｍ），３．９２（３Ｈ，ｓ），３．８８−４．５４（６Ｈ，ｍ），７．２３−８．２１（１３Ｈ，ｍ）
実施例７
Ｎ−［（３−（カルボキシベンジル）スルホニル］−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−アミジノベンジル）−Ｌ−グルタマミド
0004179878.tif 000081
Ｎ−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］スルホニル｝−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド４０７ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）を飽和塩化水素ーエタノール溶液１５ｍｌに溶解し、室温にて２０時間放置した。減圧下で溶媒を除去し、得られた粗生成物をエタノール（１６ｍｌ）に溶解し酢酸アンモニウム１ｇ（１２．８ｍｍｏｌ）、飽和アンモニアーエタノール溶液２．４ｍｌに溶解し加熱還流した。１時間後減圧下で溶媒を留去し、残留物をカラムクロマトグラフィー（富士シリシアＮＨ−ＤＭ−１０２０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝４：１，１：１）に付し、Ｎ−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］スルホニル｝−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−アミジノベンジル）−Ｌ−グルタマミド及び、Ｎ−｛［３−（エトキシカルボニル）ベンジル］スルホニル｝−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−アミジノベンジル）−Ｌ−グルタマミドを混合物として得た。上記混合物をエタノール（２ｍｌ）に溶解し、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２ｍｌ）を加え、室温にて攪拌する。１時間後、反応液を１Ｎ塩化水素水溶液でｐＨ＝６とした後、沈殿物を濾取した。得られた粗生成物を分取用ＨＰＬＣ（ＹＭＣ−ｐａｃｋ  ＯＤＳ：ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｏｆ  ９５％  Ａ／Ｂ  ｔｏ  ４５％  Ａ／Ｂ  ｏｖｅｒ  ２５ｍｉｎ，Ａ＝０．１％  ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ，Ｂ＝０．１％  ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ）に付し、Ｎ−［（３−カルボキシベンジル）スルホニル］−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−アミジノベンジル）−Ｌ−グルタマミド  トリフルオロ酢酸塩６８ｍｇ（０．０８８ｍｍｏｌ：収率１６％）を得た。
ＥＳＩ＋６６２（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．６４−２．０２（４Ｈ，ｍ），２．９０−３．２１（２Ｈ，ｍ），３．８９−４．４１（６Ｈ，ｍ），６．７５−７．９５（１３Ｈ，ｍ）
実施例８
Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシン
Ｄ−イソロイシン３ｇ（２２．９ｍｍｏｌ）のジオキサン（１８４ｍｌ）溶液に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２３ｍｌ）を加え、ついで、ベンジルスルホニルクロライド６ｇ（３４．４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。３時間後、反応液を２Ｎ塩化水素水溶液でｐＨ＝２とした後、酢酸エチルにて抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥する。硫酸マグネシウムを濾去し、濾液を減圧下に濃縮して残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝１０：１，４：１）に付し、Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシン６．３ｇ（２２．２ｍｍｏｌ：収率９７％）を得た。
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．７８−１．０２（６Ｈ，ｍ），１．０５−１．６０（２Ｈ，ｍ），１．６８−１．９２（１Ｈ，ｍ），３．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４，７Ｈｚ），４．２２−４．３８（２Ｈ，ｍ），５．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），５．９７（１Ｈ，ｂｒｓ），７．２６−７．４８（５Ｈ，ｍ）
実施例９
Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−メチオニン  メチルエステル
Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシン６．３ｇ（２２．２ｍｍｏｌ）、Ｌ−メチオニン  メチルエステル塩酸塩６．７ｇ（３３．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１００ｍｌ）溶液にＨＯＢｔ４．１ｇ（２６．６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ  ＨＣｌ  ５．１ｇ（１．２ｍｍｏ）、Ｎ−メチルモルホリン３．４ｇ（３３．３ｍｍｏｌ）を加え、窒素気流下、室温にて攪拌した。１２時間後、反応液に水を加え酢酸エチルにて抽出した。酢酸エチル層を１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥する。硫酸マグネシウムを濾去し、濾液を減圧下に濃縮して残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０：移動相；ジクロロメタン）に付し、Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−メチオニン  メチルエステル６．４ｇ（１４．９ｍｍｏｌ：収率６７％）を得た。
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：０．９２−１．０２（６Ｈ，ｍ），１．１８−１．３６（１Ｈ，ｍ），１．６２−１．８８（２Ｈ，ｍ），２．００−２．２８（２Ｈ，ｍ），２．１２（３Ｈ，ｓ），２．５１−２．７７（２Ｈ，ｍ），３．７１（３Ｈ，ｓ），３．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），４．３２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝１３Ｈｚ），４．６８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５，９Ｈｚ），７．３２−７．５１（５Ｈ，ｍ）
実施例１０
Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−アミノベンジル）−Ｌ−メチオニナミド
0004179878.tif 000082
Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−メチオニン  メチルエステル６．４ｇ（１４．９ｍｍｏｌ）のエタノール（３０ｍｌ）溶液に、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３０ｍｌ）を加え、室温にて攪拌した。１時間後、反応液を２Ｎ塩化水素水溶液にてｐＨ＝２とした後、酢酸エチルにて抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。硫酸マグネシウムを濾去し、濾液を減圧下に濃縮してＮ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−メチオニン６．２ｇ（１４．９ｍｍｏｌ：収率１００％）を得た。
Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−メチオニン１００ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）、４−アミノベンジルアミン５９ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５ｍｌ）溶液にＨＯＢｔ４４ｍｇ（０．２９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ  ＨＣｌ５６ｍｇ（０．２９ｍｍｏｌ）を加え、窒素気流下、室温にて攪拌した。１２時間後、反応液を減圧下に濃縮し、残渣に水を加え沈殿物を濾取し、水洗乾燥した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（富士シリシアＮＨ−ＤＭ−１０２０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）に付し、Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−アミノベンジル）−Ｌ−メチオニナミド１０８ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ：収率８６％）を得た。
ＥＳＩ＋５２１（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：０．８７−１．００（６Ｈ，ｍ），１．０９−１．２８（１Ｈ，ｍ），１．５７−１．８３（２Ｈ，ｍ），１．８６−２．２６（２Ｈ，ｍ），２．０９（３Ｈ，ｓ），２．４３−２．６９（２Ｈ，ｍ），３．７１（３Ｈ，ｓ），４．１３−４．３２（４Ｈ，ｍ），４．５０−４．６８（２Ｈ，ｍ），６．６４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．３２−７．４９（５Ｈ，ｍ）
実施例１１
Ｎ−（プロピルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−３−（メチルアミノ）−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−アラニナミド
Ｎ−（プロピルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−３−［（ｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ］−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−アラニナミド１．６ｇ（３ｍｍｏｌ）に、トリフルオロ酢酸（１０ｍｌ）を加え、窒素気流下、室温にて攪拌した。１時間後、反応液を減圧下に濃縮し残渣をカラムクロマトグラフィー（富士シリシアＮＨ−ＤＭ−１０２０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝１：０、４：１）に付し、Ｎ−（プロピルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−３−（メチルアミノ）−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−アラニナミド１．３ｇ（２．９ｍｍｏｌ：収率９６％）を得た。
ＥＳＩ＋４５２（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．７９−１．２３（１０Ｈ，ｍ），１．４６−１．９５（４Ｈ，ｍ），２．４１（３Ｈ，ｓ），２．５２−３．８１（４Ｈ，ｍ），４．３３−４．５２（４Ｈ，ｍ），７．３６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
実施例１２
Ｎ−（プロピルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−３−［（アミノカルボニル）（メチル）アミノ］−Ｎ１−（４−アミジノベンジル）−Ｌ−アラニナミド
0004179878.tif 000083
Ｎ−（プロピルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−３−（メチルアミノ）−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−アラニナミド５００ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）の水（１．３ｍｌ）−テトラヒドロフラン（３ｍｌ）溶液に、５０℃攪拌下にて、シアン酸カリウム２４３ｍｇ（３ｍｍｏｌ）を加えそのまま攪拌した。３時間攪拌後、反応液に水を加え、酢酸エチルにて抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。硫酸マグネシウムを濾去し、濾液を減圧下に濃縮してＮ−（プロピルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−３−［（アミノカルボニル）（メチル）アミノ］−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−アラニナミド４３０ｍｇ（０．８７ｍｍｏｌ：収率８７％）を得た。
得られた生成物を飽和塩化水素ーエタノール溶液１０ｍｌに溶解し、室温にて２０時間放置した。減圧下で溶媒を除去し、得られた粗生成物を飽和アンモニア−エタノール（１０ｍｌ）に溶解し室温にて２０時間放置した。減圧下で溶媒を留去し、残留物を分取用ＨＰＬＣ（ＹＭＣ−ｐａｃｋ  ＯＤＳ：ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｏｆ  ９５％  Ａ／Ｂ  ｔｏ  ２５％  Ａ／Ｂ  ｏｖｅｒ  １０ｍｉｎ，Ａ＝０．１％  ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ，Ｂ＝０．１％  ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ）に付し、Ｎ−（プロピルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−３−［（アミノカルボニル）（メチル）アミノ］−Ｎ１−（４−アミジノベンジル）−Ｌ−アラニナミド  トリフルオロ酢酸塩２７ｍｇ（０．００４ｍｍｏｌ：収率５％）を得た。
ＥＳＩ＋５１２（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：０．８７−１．１０（９Ｈ，ｍ），１．１２−１．８８（５Ｈ，ｍ），２．９２（３Ｈ，ｓ），２．８７−３．１２（２Ｈ，ｍ），３．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４，１５Ｈｚ），３．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），３．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９，１４Ｈｚ），４．４３−４．６７（３Ｈ，ｍ），７．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
実施例１３
Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｎ１−｛４−［イミノ（メチルチオ）メチル］ベンジル｝−Ｌ−メチオニナミド
Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−メチオニナミド１００ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）をピリジン５ｍｌ、トリエチルアミン０．５ｍｌに溶解し、５分間硫化水素ガスを通気下後、２４時間攪拌した。反応混合物に酢酸エチルを加え、０．５Ｎ塩酸、飽和炭酸水素水、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残留物をアセトニトリルに溶解しヨウ化メチル０．１４ｍｌ（０．９４ｍｍｏｌ）を加え２時間、窒素雰囲気下で加熱還流した。減圧下で溶媒を留去し、残留物をシリカゲルカラム（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）で精製し、Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｎ１−｛４−［イミノ（メチルチオ）メチル］ベンジル｝−Ｌ−メチオニナミド１０９ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ：収率１００％）を得た。
ＥＳＩ＋５７９（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：０．８５−０．９０（６Ｈ，ｍ），２．０３（３Ｈ，ｓ），２．４０（３Ｈ，ｓ），３．６９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ），４．５０−４．６０（１Ｈ，ｍ），７．２１−７．３９（８Ｈ，ｍ），７．６０−７．６４（１Ｈ，ｍ）
実施例１４
Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｎ１−｛４−［ヒドラジノ（イミノ）メチル］ベンジル｝−Ｌ−メチオニナミド
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Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｎ１−｛４−［イミノ（メチルチオ）メチル］ベンジル｝−Ｌ−メチオニナミド４９ｍｇ（０．０８４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２ｍｌおよびメタノール２ｍｌに溶解しヒドラジン０．０２０ｍｌ（０．６２４ｍｍｏｌ）を加え１８時間攪拌した。減圧下で溶媒を留去し、残留物を分取用ＨＰＬＣで精製し、Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｎ１−｛４−［ヒドラジノ（イミノ）メチル］ベンジル｝−Ｌ−メチオニナミド２９ｍｇ（０．０５１ｍｍｏｌ：収率６１％）を得た。
ＥＳＩ＋５６３（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：０．８５−０．９０（６Ｈ，ｍ），１．５８−１．７８．（２Ｈ，ｍ），２．４２−２．５８（２Ｈ，ｍ），３．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），４．２１（２Ｈ，ｓ），４．５３（１Ｈ，ｂｒｓ），７．２５−７．５７（９Ｈ，ｍ）
実施例１５
Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｎ１−［４−（Ｅ）−アミノ（ハイドロキシイミノ）メチル］ベンジル］−Ｌ−メチオニナミド
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Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−メチオニナミド１００ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）をエタノール６ｍｌおよびピリジン０．６ｍｌに溶解しハイドロキシアミン塩酸塩１２０ｍｇを加え１６時間攪拌した。減圧下で溶媒を留去し、残留物をエタノールに溶解しろ過後、分取用ＨＰＬＣで精製し、Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｎ１−［４−（Ｅ）−アミノ（ハイドロキシイミノ）メチル］ベンジル］−Ｌ−メチオニナミド１．６ｍｇ（０．００００３ｍｍｏｌ：収率１．５％）を得た。
ＥＳＩ＋５６４（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：０．８５−０．９０（６Ｈ，ｍ），１．５０−１．７０（２Ｈ，ｍ），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．４３−２．６０（２Ｈ，ｍ），３．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），４．２０（１Ｈ，ｓ），７．２５−７．４５（９Ｈ，ｍ）
実施例１６
Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｎ１−［４−（（Ｅ）−アミノ｛［（ｔ−ブチルオキシ）カルボニル］イミノ｝メチル）ベンジル］−Ｌ−メチオニナミド
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Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｎ１−｛４−［アミノ（イミノ）メチル］ベンジル｝−Ｌ−メチオニナミド２０ｍｇ（０．０３２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．５ｍｌに溶解しトリエチルアミン０．０１８ｍｌ（０．１３ｍｍｏｌ）およびジ−ターシャリーブチルカルボナート１４ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ）を加え１６時間攪拌した。反応混合物に酢酸エチルを加え水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残留物をプレパラティブＴＬＣ（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）で精製しＮ−（ベンジルスルホニル）−Ｄ−イソロイシル−Ｎ１−［４−（（Ｅ）−アミノ［［（ｔ−ブチルオキシ）カルボニル］イミノ］メチル）ベンジル］−Ｌ−メチオニナミド１６ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ：収率７６％）を得た。
ＥＳＩ＋６４８（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：０．８５−０．９０（６Ｈ，ｍ），１．５０（９Ｈ，ｓ），２．０３（３Ｈ，ｓ），３．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），４．２０（２Ｈ，ｓ），７．２０−７．３８（７Ｈ，ｍ），７．６４−７．７０（２Ｈ，ｍ）
実施例１７
Ｎ−（エチルスルホニル）−３，５−ビス（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド
４−ブロモ−Ｎ−（エチルスルホニル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド３０ｍｇ（０．０５２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン４ｍｌおよび水０．４ｍｌに溶解し、次いで３，５−ビストリフルオロメチルフェニルボロン酸４０．２ｍｇ（０．１５６ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム５０ｍｇ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム３０ｍｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、２時間加熱還流した。反応混合物に酢酸エチルを加え、水で洗浄した後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残留物をプレパラティブＴＬＣ（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）で精製した後、分取用ＨＰＬＣで精製しＮ−（エチルスルホニル）−３，５−ビス（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド２４ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ：収率６５％）を得た。
ＥＳＩ＋７１２（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．１０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．７５−１．８７（２Ｈ，ｍ），１．８８−２．０７（２Ｈ，ｍ），２．８２−３．１０（４Ｈ，ｍ），４．１０−４．３０（２Ｈ，ｍ），４．４０−４．５０（２Ｈ，ｍ），７．１０−７．６２（９Ｈ，ｍ），８．１０（１Ｈ，ｓ）
実施例１８
Ｎ−（エチルスルホニル）−３，５−ビス（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｎ１−｛４−アミジノベンジル｝−Ｌ−グルタマミド
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出発物質としてＮ−（エチルスルホニル）−３，５−ビス（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｎ’−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミドを用いて実施例５と同様にして目的化合物を得た。
ＥＳＩ＋７２９（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．０５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．７５−１．８５（２Ｈ，ｍ），１．９７−２．０５（２Ｈ，ｍ），２．８２−３．１０（４Ｈ，ｍ），４．１５−４．２２（２Ｈ，ｍ），４．４５（１Ｈ，ｓ），７．４０−７．５１（４Ｈ，ｍ），７．６２−７．７０（３Ｈ，ｍ），７．９０（１Ｈ，ｓ），８．１３（２Ｈ，ｓ）
実施例１９
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−５−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］オキシ｝−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−５−ヒドロキシ−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド３２７ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）のアセトン（４ｍｌ）溶液に３−（メトキシカルボニル）ベンジルブロマイド２６７ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム３７８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加え、窒素気流下、加熱還流にて攪拌する。４時間後、反応液をろ過し濾液を減圧下に濃縮した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）に付し、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−５−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］オキシ｝−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド３４７ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ：収率８４％）を得た。
ＥＳＩ＋７１１（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：１．３０（９Ｈ，ｓ），１．５０−２．０８（４Ｈ，ｍ），３．０２−３．２２（２Ｈ，ｍ），３．９３（３Ｈ，ｓ），４．０２−４．２７（２Ｈ，ｍ），４．３９−４．５５（１Ｈ，ｍ），５．２０（２Ｈ，ｓ），６．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，９Ｈｚ），７．１２（１Ｈ，ｓ），７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．４２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．６６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），７．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），８．１７（１Ｈ，ｓ）
実施例２０
５−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］オキシ｝−Ｎ−（エチルスルホニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−５−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］オキシ｝−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド３４７ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍｌ）溶液に、トリフルオロ酢酸（１０ｍｌ）を加え、窒素気流下、室温にて攪拌した。１時間後、減圧下で溶媒を留去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（富士シリシアＮＨ−ＤＭ−１０２０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝１：１）に付し、５−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］オキシ｝−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド２７７ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ：収率９３％）を得た。
５−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］オキシ｝−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド（０．４５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン１３７ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ）、エタンスルホニルクロライド１７４ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ）を加え、窒素気流下、室温にて攪拌した。２時間後、減圧下で溶媒を留去し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝８：１）に付し、５−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］オキシ｝−Ｎ−（エチルスルホニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド１５８ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ：収率５０％）を得た。
ＥＳＩ＋７０３（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．６０−２．０８（４Ｈ，ｍ），２．５８−３．３０（４Ｈ，ｍ），３．９１（３Ｈ，ｓ），４．０２−４．２７（２Ｈ，ｍ），４．３５−４．４８（２Ｈ，ｍ），５．２０（２Ｈ，ｓ），６．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，９Ｈｚ），７．１２（１Ｈ，ｓ），７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），７．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．４２−７．５３（３Ｈ，ｍ），７．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），７．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），８．１６（１Ｈ，ｓ）
実施例２１
５−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］オキシ｝−Ｎ−（エチルスルホニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−｛４−［アミノ（イミノ）メチル］ベンジル｝−Ｌ−グルタマミド
５−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］オキシ｝−Ｎ−（エチルスルホニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−（４−シアノベンジル）−Ｌ−グルタマミド１５８ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のピリジン（１０ｍｌ）、トリエチルアミン（２ｍｌ）溶液に硫化水素ガスを吹き込んだ。３０分後ガスの吹込みをやめ、そのまま放置した。１２時間後反応液に水−酢酸エチルを加え、水層を２Ｎ塩化水素水溶液にてＰＨ＝４とした後、抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。硫酸マグネシウムを濾去し、濾液を減圧下に濃縮した。
残留物をアセトン（１０ｍｌ）に溶解し、ヨウ化メチル３１２ｍｇ（２．２ｍｍｏｌ）を加え５０℃にて、窒素気流下撹拌した。１時間後反応液を減圧下に濃縮した。
残留物のメタノール（１０ｍｌ）溶液に酢酸アンモニウム１７０ｍｇ（２．２ｍｍｏｌ）を加え窒素気流下に加熱還流した。４時間後減圧下で溶媒を留去し、残留物をカラムクロマトグラフィー（富士シリシアＮＨ−ＤＭ−１０２０：移動相；ジクロロメタン：メタノール＝４：１、２：１）に付し、５−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］オキシ｝−Ｎ−（エチルスルホニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−｛４−［アミノ（イミノ）メチル］ベンジル｝−Ｌ−グルタマミド１２４ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ：収率７８％）を得た。
ＥＳＩ＋７２０（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．６４−２．１０（４Ｈ，ｍ），２．５５−３．３０（４Ｈ，ｍ），３．８９（３Ｈ，ｓ），４．０８−４．４２（４Ｈ，ｍ），５．１８（２Ｈ，ｓ），６．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，９Ｈｚ），７．１５（１Ｈ，ｓ），７．２０−７．７６（８Ｈ，ｍ），７．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），８．１４（１Ｈ，ｓ）
実施例２２
５−［（３−カルボキシベンジル）オキシ］−Ｎ−（エチルスルホニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−｛４−［アミノ（イミノ）メチル］ベンジル｝−Ｌ−グルタマミド
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５−｛［３−（メトキシカルボニル）ベンジル］オキシ｝−Ｎ−（エチルスルホニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−｛４−［アミノ（イミノ）メチル］ベンジル｝−Ｌ−グルタマミド１２４ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）のエタノール（３ｍｌ）溶液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３ｍｌ）を加え、室温にて撹拌した。２時間後、反応液に１Ｎ塩化水素水溶液を加えて、ＰＨ＝６とした後、減圧下に濃縮した。残留物を分取用ＨＰＬＣ（ＹＭＣ−ｐａｃｋ  ＯＤＳ：ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｏｆ  ９５％  Ａ／Ｂ  ｔｏ  ２５％  Ａ／Ｂ  ｏｖｅｒ  １０ｍｉｎ，Ａ＝０．１％  ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ，Ｂ＝０．１％  ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ）に付し、５−［（３−カルボキシベンジル）オキシ］−Ｎ−（エチルスルホニル）−Ｄ−トリプトフィル−Ｎ１−｛４−［アミノ（イミノ）メチル］ベンジル｝−Ｌ−グルタマミド８５ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ：収率６１％）を得た。
ＥＳＩ＋７０６（Ｍ＋＋１）
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．５９−２．０７（４Ｈ，ｍ），２．５５−３．２８（４Ｈ，ｍ），３．８９（３Ｈ，ｓ），４．１０−４．５４（４Ｈ，ｍ），５．１９（２Ｈ，ｓ），６．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，９Ｈｚ），７．１６（１Ｈ，ｓ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），７．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．５０−８．００（７Ｈ，ｍ），８．１６（１Ｈ，ｓ）
実施例２３〜実施例１８２
上記実施例１〜２２に記載の製法、および前記反応スキームに記載の製法にしたがい、実施例化合物２３〜１８２を得た。これら化合物の構造式および機器データを表１〜３４に示した。表中、試薬２、試薬５、中間体９、などは、前記反応スキームに示した試薬、中間体に相当する。
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実施例１８３
［ヒトＶＩＩａ因子の発現と精製］
ヒトＶＩＩ因子のｃＤＮＡについてはヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）よりＰＣＲにより得た。使用したプライマー配列は、以下の通り。
ＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧ
ＴＧＴＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＡＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡ
ヒトＶＩＩ因子遺伝子をＤｏｕｂｌｅ  Ｏｎｅ発現ベクター（ＩＤＥＣ社）に組み込み、サブクローニング後、制限酵素ＳｓｐＩで消化し、直鎖状にしたものをＣＨＯ細胞株ＤＧ４４細胞にエレクトロポレーションにより導入、ヒトＶＩＩ因子発現細胞株を作成した。さらに５ｎＭ  Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）中で培養をおこなうことで遺伝子増幅をおこない、得られたＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ耐性ヒトＶＩＩ因子発現細胞株を５ｎｍｏｌ／Ｌ  Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、０．５μｇ／ｍｌ  ｖｉｔａｍｉｎｅ  Ｋ（Ｓｉｇｍａ）を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）で培養しヒトＶＩＩ因子を発現させた。
ヒトＶＩＩ因子発現ＣＨＯ細胞株の培養上清を中空糸型人工腎臓（ＰＡＮ−１３０Ｆ、旭メディカル（株））により濃縮し、終濃度５ｍＭベンズアミジンを添加し凍結保存した。ヒトＶＩＩａ因子の精製にあたってはこの凍結保存した培養上清を適宜用いた。精製にあたってはＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８０巻、２２８−２３７項、１９８１年およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７巻、７７８５−７７９３項、１９８８年を参考にした。培養上清の濃縮液を５ｍＭ  ベンズアミジン及び５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液，ｐＨ８．０で１０倍希釈し、同緩衝液で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに添加し、同緩衝液中ＮａＣｌ濃度を段階的（０．１、０．２、０．３Ｍ）に上げてカラムに吸着した蛋白を溶出した。ヒトＶＩＩ因子を含む０．３Ｍ  ＮａＣｌ画分を限外濾過により濃縮し、これを５ｍＭ  ベンズアミジン及び５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液，ｐＨ８．０で１０倍希釈し、同緩衝液で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに添加した。同緩衝液でカラムを洗浄後、ＣａＣｌ２濃度を５０ｍＭまで直線的に上げてヒトＶＩＩ因子をカラムから溶出した。得られた画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、ヒトＶＩＩ因子を含む画分を集め、室温で２日間放置することにより自己消化によるヒトＶＩＩａ因子への活性化を行った。反応液を２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．０で１０倍希釈し、同緩衝液で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに添加した。同緩衝液中ＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭから３５０ｍＭまで直線的に上げてヒトＶＩＩａ因子を溶出し、得られた画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、ヒトＶＩＩａ因子を含む画分を集め、ヒトＶＩＩａ精製画分を得た。
実施例１８４
［ヒト可溶型組織因子の発現と精製］
ヒト可溶型組織因子（１−２１８アミノ酸）をコードする遺伝子断片をｔａｃプロモーターとＭ１３シグナルペプチドシークエンスの下流に挿入した分泌発現型ベクターを大腸菌ＪＭ１０９にトランスフォームした。得られたトランスフォーマントを培養し、ヒト可溶型組織因子の培養上清への発現をおこなった。
精製にあたってはＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１巻、３９９８−４００３項、１９９２年を参考に改良を加えた方法でおこなった。培養上清を限外濾過で濃縮後、６５％飽和濃度硫酸アンモニウムにより目的蛋白を沈殿させた。遠心操作（１８０００ｇ，１０分）により得た沈殿物をＰＢＳで溶解し、２５ｍＭ  酢酸緩衝液，ｐＨ５．２を外液に用いて透析した。透析した溶液を遠心操作（８０００ｇ，２０分）により不溶物を除去した後、その上清を２５ｍＭ  酢酸緩衝液，ｐＨ５．２で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに添加し、同緩衝液中ＮａＣｌ濃度を５００ｍＭまで直線的に上げてヒト可溶型組織因子をカラムから溶出した。得られた画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、ヒト可溶型組織因子を含む画分を集め、２５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５を外液に用いて透析した。透析した画分を２５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに添加し、同緩衝液中ＮａＣｌ濃度を５００ｍＭまで直線的に上げてヒト可溶型組織因子をカラムから溶出し、ヒト可溶型組織因子の精製画分を得た。
実施例１８５
［ヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子の種結晶の作製］
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２２巻、４１９−４２５項、１９９５年の方法を参考にＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトンにより不可逆的に阻害したヒトＶＩＩａ因子とヒト可溶型組織因子複合体の結晶化を行った。本結晶は可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子複合体の結晶を得る際の種結晶として必要である。精製したヒトＶＩＩａ因子に１０倍のモル比のＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＢＡＣＨＥＭ社）を加え、４度にて３時間静置した。これに過剰量の精製したヒト可溶型組織因子を加え、３７度にて３０分間静置後、限外濾過により濃縮した。濃縮した画分を５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５で平衡化したゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５）に添加し、同緩衝液によりＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトンにより不可逆的に阻害したヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子複合体の精製画分をカラムから溶出した。結晶化のために限外濾過により濃縮し、蛋白濃度１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＣａＣｌ２のサンプルを作製し、これをハンギングドロップ蒸気拡散法を使ってリザーバー条件  １００ｍＭ  カコジル酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ５．０、２４％ＰＥＧ４０００、５ｍＭ  ＣａＣｌ２とし、温度２０度に静置したところ、針状結晶多数が得られた。
実施例１８６
［ヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子結晶化サンプルの作製］
精製したヒトＶＩＩａ因子に１／１０容量の１Ｍ  ベンズアミジンを添加後、精製したヒト可溶型組織因子をモル比で過剰になるよう加えた。これを限外濾過により濃縮し、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５で平衡化したゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５）に添加した。同緩衝液によりヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子複合体をカラムから溶出し、ヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子複合体の精製画分を得た。
実施例１８７
［低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶化］
精製したヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子に化合物（１）または（２）を加え、結晶作成のために限外濾過により濃縮、蛋白濃度１２−１３ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＣａＣｌ２のサンプルを作製した。この際、化合物（１）〜（２）の添加濃度は表３５の通りであった。
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低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体については自発的には結晶を形成しないので結晶化を行う際に種結晶を加える必要がある。種結晶は以下の方法で用意した。１００ｍＭ  カコジル酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ５．０、９％  ＰＥＧ４０００、５ｍＭ  ＣａＣｌ２の溶液を使い、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトンにより不可逆的に阻害したヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子の複合体結晶をマイクロホモジナイザーで砕き、これを希釈、×１０〜×１０６希釈溶液（×１０刻み）を作製した。なお、低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶も種結晶として使用できた。
結晶化はハンギングドロップ蒸気拡散法によりおこなった。温度は２５℃、リザーバー条件は、１００ｍＭ  カコジル酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ５．０、６％−７．５％  ＰＥＧ４０００、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５％グリセロールを使用した。低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体サンプル：リザーバー：種母液希釈溶液＝１．５μｌ：１．５μｌ：０．５μｌで混ぜ合わせ結晶化ドロップとした。約１ヶ月ほどで最大で長さ１．０ｍｍ×太さ０．０５ｍｍ程度の柱状の低分子可逆阻害剤とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子の複合体の結晶を得ることができた。
実施例１８８
［Ｘ線回折データの測定］
（Ａ）化合物（１）とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶
結晶を１００ｍＭ  カコジル酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ５．０、９％  ＰＥＧ４０００、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０％グリセロール溶液に漬し、グリセロール濃度を順次５％ずつ上げ、最終的に３０％までグリセロール濃度を上げた溶液に漬けた。この結晶をナイロン性のループ（ｃｒｙｏ−ｌｏｏｐ，Ｈａｍｐｔｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で外液ごとすくいとり、−１７０℃の窒素気流中で凍結させた。なお、測定中は常に−１７０℃の窒素気流中に置いた。Ｘ線回折データの測定はＲ−ａｘｉｓＩＶイメージングプレートディテクター（リガク）により収集した。Ｘ線は出力４４ｋＶ×１００ｍＡ、ファインフォーカスフィラメントを使用した回転対陰極型Ｘ線発生装置（Ｕｌｔｒａｘ１８、リガク）により発生させたＣｕＫα線をＯＳＭＩＣ  Ｘ線集光ミラー（リガク）で集光し、使用した。格子定数、結晶方位の決定、ならびに回折斑点の指数付け、および回折データの処理には、プログラムＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（マックサイエンス社）を使用し、２．２Åまでの回折強度データを得た。本結晶は、プロテインデータバンクのＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトンにより不可逆的に阻害したヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子複合体（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ：１ＤＡＮ）と同型で、空間群Ｐ２１２１２１、格子定数ａ＝７１．４０Å、ｂ＝８２．２２Å、ｃ＝１２３．４７Å、α＝９０．０°、β＝９０．０°、γ＝９０．０°であった。
（Ｂ）化合物（２）とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶
結晶を１００ｍＭ  カコジル酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ５．０、９％  ＰＥＧ４０００、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０％グリセロール溶液に漬し、グリセロール濃度を順次５％ずつ上げ、最終的に３０％までグリセロール濃度を上げた溶液に漬けた。この結晶をナイロン性のループ（ｃｒｙｏ−ｌｏｏｐ，Ｈａｍｐｔｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で外液ごとすくいとり、−１７０℃の窒素気流中で凍結させた。なお、測定中は常に−１７０℃の窒素気流中に置いた。Ｘ線回折データの測定はＲ−ａｘｉｓＩＶイメージングプレートディテクター（リガク）により収集した。Ｘ線は出力４０ｋＶ×１００ｍＡ、ファインフォーカスフィラメントを使用した回転対陰極型Ｘ線発生装置（Ｕｌｔｒａｘ１８、リガク）により発生させたＣｕＫα線をエールミラー（リガク）で集光し、使用した。格子定数、結晶方位の決定、ならびに回折斑点の指数付け、および回折データの処理には、プログラムＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（マックサイエンス社）を使用し、２．２Åまでの回折強度データを得た。本結晶は、プロテインデータバンクのＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトンにより不可逆的に阻害したヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子複合体（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ：１ＤＡＮ）と同型で、空間群Ｐ２１２１２１、格子定数ａ＝７１．２８Å、ｂ＝８２．３２Å、ｃ＝１２３．３８Å、α＝９０．０°、β＝９０．０°、γ＝９０．０°であった。
実施例１８９
［構造解析］
（Ａ）化合物（１）とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶
プロテインデータバンクのＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトンにより不可逆的に阻害したＶＩＩａ因子／組織因子複合体（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ：１ＤＡＮ）から水分子、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン除いたモデルを初期モデルとし、プログラムＣＮＸ２０００．１（Ａｃｃｅｒｌｙｓ  Ｉｎｃ）を用いて構造の精密化をおこなった。まず剛体精密化およびエネルギー最小化による精密化を実施、実験的に決定された構造因子Ｆｏと構造から計算された構造因子Ｆｃに対し２Ｆｏ−Ｆｃ、Ｆｏ−Ｆｃを係数とするフーリエマップを計算、ＱＵＡＮＴＡ上で表示したところＶＩＩａ因子の触媒活性付近に連続的な電子密度ピークを与えた。この電子密度ピークに化合物（１）の原子モデルを適合させ、シミュレイティッドアニーリングおよびエネルギー最小化による精密化を数度おこなった。その後、２Ｆｏ−Ｆｃ、Ｆｏ−Ｆｃを係数とするフーリエマップをもとにした水分子の位置決定とシミュレイティッドアニーリングおよびエネルギー最小化による精密化を繰り返し、最終的な構造座標を得た。精密化したパラメータは各原子のｘｙｚ座標ならびに等方的温度因子で各原子の占有率はすべて１．０とした。最終的に分解能３０．０−２．２Åの反射、３４７７５個を用い、５１４２原子（内蛋白４６８８原子、イオン９原子、水分子４０４原子、阻害剤４１原子）に対し、結晶学的信頼度因子Ｒ値は２２．５９％に低下した。また、このときＦｒｅｅ  Ｒ値は２６．７２％（２６２７個の反射データを使用）となった。
（Ｂ）化合物（２）とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶
プロテインデータバンクのＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトンにより不可逆的に阻害したＶＩＩａ因子／組織因子複合体（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ：１ＤＡＮ）から水分子、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン除いたモデルを初期モデルとし、プログラムＣＮＸ２０００．１を用いて構造の精密化をおこなった。まず剛体精密化およびエネルギー最小化による精密化を実施、実験的に決定された構造因子Ｆｏと構造から計算された構造因子Ｆｃに対し２Ｆｏ−Ｆｃ、Ｆｏ−Ｆｃを係数とするフーリエマップを計算、ＱＵＡＮＴＡ上で表示したところＶＩＩａ因子の触媒活性付近に連続的な電子密度ピークを与えた。この電子密度ピークに化合物（２）の原子モデルを適合させ、シミュレイティッドアニーリングおよびエネルギー最小化による精密化を数度おこなった。その後、２Ｆｏ−Ｆｃ、Ｆｏ−Ｆｃを係数とするフーリエマップをもとにした水分子の位置決定とシミュレイティッドアニーリングおよびエネルギー最小化による精密化を繰り返し、最終的な構造座標を得た。精密化したパラメータは各原子のｘｙｚ座標ならびに等方的温度因子で各原子の占有率はすべて１．０とした。最終的に分解能３０．０−２．２Åの反射、３３７０８個を用い、５１９３原子（内蛋白４６８８原子、イオン９原子、水分子４５４原子、阻害剤４２原子）に対し、結晶学的信頼度因子Ｒ値は２１．１３％に低下した。また、このときＦｒｅｅ  Ｒ値は２５．０８％（２５３０個の反射データを使用）となった。
実施例１９０
［構造座標］
（Ａ）化合物（１）とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶構造座標
全原子の座標をＰＤＢフォーマットで表３６（明細書末尾に掲載）に示した。
（Ｂ）化合物（２）とヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子との複合体の結晶構造座標
化合物（２）および化合物（２）から１０Å以内のアミノ酸残基の座標をＰＤＢフォーマットで表３７（明細書末尾に掲載）に示した。
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試験例：生物活性試験
方法
１．ＦＶＩＩａ阻害活性測定
反応には９６穴のマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｎｏ．３０７２）を使用し、すべて室温で行った。
本発明化合物の１０ｖｏｌ％  ＤＭＳＯ溶液２０μＬに、４０μＬ  Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ登録商標Ｓ（５０ｍｇ／ｍＬ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，ＧＴＳ−２００Ａ）、２０μＬ  Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ登録商標ｆＶＩＩａ（５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ．，＃２１７Ｌ）、２０μＬトリス緩衝液（５００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２）、８０μＬ蒸留水を加え、攪拌した。２０μＬ  ＦＶＩＩａ（２０ｎｍｏｌ／Ｌ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＨＦＶＩＩａ）を加え反応を開始し、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｒａｄ，Ｍｏｄｅｌ  ３５５０）を用いて４０５ｎｍの吸光度を経時的に測定し反応初速度を求めた。本発明化合物の代わりに１０ｖｏｌ％  ＤＭＳＯのみを加えたときの反応初速度を１００％として、本発明化合物によるＦＶＩＩａ阻害作用の濃度反応曲線を作成し、反応初速度を５０％抑制する検体濃度を算出してＩＣ５０値とした。
２．Ｔｈｒｏｍｂｉｎ阻害活性測定
反応には９６穴のマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｎｏ．３０７２）を使用し、すべて室温で行った。
本発明化合物の１０ｖｏｌ％  ＤＭＳＯ溶液２０μＬに、４０μＬトリス緩衝液（２００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．０）、２０μＬ  ＮａＣｌ溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）、２０μＬ  ＦＶＲ−ｐＮａ（２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＳＩＧＭＡ，Ｂ  ７６３２）、８０μＬ蒸留水を加え、攪拌した。２０μＬヒトｔｈｒｏｍｂｉｎ（５Ｕ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ，Ｔ  １０６３）を加え反応を開始し、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｒａｄ，Ｍｏｄｅｌ  ３５５０）を用いて４０５ｎｍの吸光度を経時的に測定し反応初速度を求めた。本発明化合物のＩＣ５０値の算出はＦＶＩＩａ阻害活性測定の場合と同様にして行った。
結果
結果を表４６に示す。
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産業上の利用の可能性
本発明の化合物は、優れたＦＶＩＩａ阻害活性、または、外因系血液凝固に対する選択的な阻害活性を示し得る。このことから、出血傾向などの副作用の少ない、安全性に優れた抗血栓剤などの医薬として有用性が期待される。特に、外因系の凝固反応が関与する病態の予防または治療に有用性が期待される。具体的には例えば、術後深部静脈血栓症、ＰＴＣＡ術後再狭窄、慢性ＤＩＣなどの慢性の血栓症、心由来血栓塞栓、心筋梗塞、脳梗塞などの治療剤または予防剤として有用であることが期待される。
また、ヒトＶＩＩａ因子／ヒト可溶型組織因子と低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤との複合体の立体構造解析のため、Ｘ線結晶構造解析に用いることができる結晶を提供することが可能になるとともに、Ｘ線結晶構造解析によって得られるデータを利用してコンピュータ上で低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤をデザインすることが可能となった。したがって、かかるデザインの手法によって低分子可逆的ＶＩＩａ因子阻害剤を提供することが可能となった。
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【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトＶＩＩａ因子と化合物（１）との結合部分の立体構造を示す図である。
図２は、ヒトＶＩＩａ因子と化合物（１）との結合部分の模式図である。
図３は、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｃｍｋ結合時のヒトＶＩＩａ因子のＳ４サイト部分の様子（左）および化合物（１）結合時のヒトＶＩＩａ因子のＳ４サイト部分の様子（右）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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