(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳海馬の長期持続型長期増強により誘導されるポリペプチドの存在下で、動物の脳に長期増強を誘導し、該長期増強状態から長期持続型長期増強が誘導されることを指標としてポリペプチドを選択することを特徴とする脳神経細胞可塑性増強活性を有するポリペプチドのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は脳神経細胞可塑性増強活性を有するタンパク質、あるいはその阻害物質を有効成分として含有する脳神経細胞可塑性調節剤等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
学習・記憶をはじめとするさまざまな脳機能は、シナプス可塑性などの脳神経細胞の可塑性により担われている。シナプス可塑性の代表例として最も良く研究されているのは、脳海馬の長期増強（Long-term potentiation；以下、これを「LTP」と称することがある：Bliss T.V.P. and Collingridge G.L., Nature 361, 31-39）である。LTPの成立が阻害された動物では、種々の学習・記憶能力の低下が認められることから、LTPと学習・記憶には共通の分子機構が働いていると考えられている（Nelson and Young, Neurosci. Biobehav. Rev., 22, 453-462 (1998））。
【０００３】
学習・記憶などの脳の高次機能や発達期の脳神経回路網の形成は、遺伝子の発現に依存している。すなわち、脳では神経活動に伴って様々な遺伝子の発現が上昇し、これらの誘導遺伝子は様々な脳機能に重要な役割を果たしていることが予想される。特に長期的な記憶の固定・維持には脳の神経細胞でのRNAやタンパク質の合成が必要である。記憶現象の細胞レベルのモデルである脳海馬のLTPにおいても、LTPの長期的な持続にはRNAやタンパク質の合成が必要であることが明らかとなり（Nguyen P.V. et al., Science 265, 1104-1107）、記憶との類似性が確認されてきた。その重要性にも関わらず、LTPに伴い発現が制御される遺伝子群についての知見は乏しい。そのため、新しいLTP誘導遺伝子を発見し、それらの構造と機能を調べることによって記憶などの脳機能を解明したり、神経疾患における病体メカニズムを解明、診断、治療しようとする試みがなされている。
【０００４】
一方、本発明者らは先に、ラットに海馬LTPを誘導し、これからmRNAを抽出後、PCR-differential display法により定常状態のものと比較解析し、ラット海馬LTPにおいて特異的に誘導される種々の遺伝子を取得した（Inokuchi et al., FEBS Lett., 382, 48-52, 1996; Inokuchi et al., BBRC, 221, 430-436, 1996; Kato et al., FEBS Lett., 412, 183-189, 1997; Matsuo et al., Neurosci. Lett., 244, 173-176, 1998；Matsuo, R. et al., J. of Neurochem., 74, 2239-2249 (2000); Yamazaki et al., J. Neurochem., 79, 192-199, 2001）。しかし、このように海馬LTPに伴って発現される遺伝子について、それぞれがコードするポリペプチドが、直接脳神経細胞可塑性を調節するか否かについては不明であった。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は、有用な脳神経細胞可塑性増強活性を有するタンパク質、あるいはその阻害物質を有効成分として含有する脳神経細胞可塑性調節剤等を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ラット海馬LTP誘導時に特異的に発現される遺伝子であるアクチビンの存在下で、ラット海馬にLTPを誘導したところ、該LTPが長時間維持されることを見出した。本発明はこられの知見に基づいて達成されたものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、
（１）脳海馬の長期増強により誘導されるポリペプチドの存在下で、動物の脳に長期増強を誘導し、該長期増強状態が持続する時間を指標としてポリペプチドを選択することを特徴とする脳神経細胞可塑性増強活性を有するポリペプチドのスクリーニング方法、
（２）上記（１）に記載の方法により得られるポリペプチドを有効成分として含有する脳神経細胞可塑性増強剤、
（３）脳神経細胞可塑性増強剤が、記憶・学習能力増強剤である上記（２）に記載の薬剤、
（４）上記（１）に記載の方法により得られるポリペプチドが、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに含まれるペプチドホルモンであることを特徴とする上記（２）または（３）に記載の薬剤、
（５）ペプチドホルモンが、アクチビンである上記（４）に記載の薬剤、
（６）上記（１）に記載の方法により得られるポリペプチドを阻害する物質を有効成分とする脳神経細胞可塑性減弱剤、
（７）上記（１）に記載の方法により得られるポリペプチドが、アクチビンであり、その活性を阻害する物質が、フォリスタチンである上記（６）に記載の薬剤、
が、提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
（１）LTP状態持続時間を指標とした脳神経細胞可塑性増強活性を有するポリペプチドのスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、LTPにより誘導されるポリペプチドの存在下で動物の脳にLTPを誘導し、該LTP状態が持続する時間を指標としてポリペプチドを選択することを特徴とするものである。ここで、LTPにより誘導されるポリペプチドは、例えば動物の海馬に長期持続型LTP（Late-LTP；以下これを「L-LTP」と称することがある）を誘導し、この海馬中でL-LTP誘導時に特異的に発現するタンパク質として同定し、分離取得することができる。また、脳海馬へのLTPを誘導するのと同様の効果を与えるものとして、痙攣誘発剤による刺激が挙げられる。痙攣誘発剤は、神経細胞の脱分極を引き起こし動物に痙攣を起こさせるものであれば如何なるものであってもよいが、例えば、GABA受容体のアンタゴニストや、グルタミン酸受容体アゴニスト等が挙げられ、好ましくは、グルタミン酸受容体アゴニストであるカイニン酸等が挙げられる。これらの痙攣誘発剤の投与量、および投与方法は、その種類や誘導する動物に応じて適宜選択される。本明細書中では、痙攣誘発剤等による刺激のように、LTPではないがLTPに似た効果を有する状態を誘導することを、「LTPを誘導する」と称することがある。
【０００９】
L-LTP、を誘導する動物としては特に制限はなく、具体的には、ラット、マウス、モルモット、ウサギ等が挙げられるが、このうちラットが好ましく用いられる。これらの動物にL-LTPを誘導する方法としては、例えばFEBS Lett., 382, 48-52(1996)等に記載の方法が挙げられるが、これらは用いる動物に応じて適宜改変して用いることができる。
【００１０】
L-LTPを誘導した海馬に特異的に発現するタンパク質を同定する方法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、ディファレンシャルディスプレイ法 (Liang and Pardee, Science, 257, 967-971 (1992))、マイクロアレイ、あるいは二次元電気泳動（O'Farrel, et al., J. Biol. Chem., 250, 4007-4021(1975)）と質量分析を用いる方法、サブトラクティブハイブリダイゼーション法（Sambrook and Russell, Molecular Cloning a laboratory manual, 3ed edition, 9.89-9.90, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.(2001)）、あるいはディファレンシャルスクリーニング法（Sambrook and Russell, Molecular Cloning a laboratory manual, 3ed edition, 9.89-9.90, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.(2001)）等が挙げられる。
【００１１】
ディファレンシャルディスプレイ法やマイクロアレイを用いる場合は、いずれも、まずL-LTPを誘導した場合と、定常状態にある動物のそれぞれの海馬からAcid guanidium thiocynate-phenol-chloroform method（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem., 162(1), 156-9 (1987)）等の適当な公知の方法によりRNAを抽出し、cDNAに逆転写した後、両方の該cDNAを網羅的に比較することにより行うことができる。また、ディファレンシャルディスプレイ法では市販のキットを用いることで簡便に行うこともできる。
【００１２】
上記で得られたDNA断片はこれを適当なベクターにクローニングした後、ベクターに適したプライマー等を用い、それ自体既知の方法により、シーケンスのためのDNA合成酵素反応を行い、市販のオートDNAシーケンサー等を用いて塩基配列を決定することができる。
得られた塩基配列はオープンリーディングフレーム（ORF）の全長を含んでいることを市販の塩基配列解析ソフト等を用いて解析することができる。ここで、得られたDNA断片がORFの全長を含んでいない場合は複数のクローンから得られる塩基配列をアライメントして、ORFの全長を同定したり、それ自体既知の５’-RACE、あるいは３’-RACE法等を用いてORFの全長、または３’非翻訳領域、および５’非翻訳領域を含むDNAを取得することもできる。
【００１３】
二次元電気泳動については、L-LTPを誘導した場合と、定常状態にある動物のそれぞれの海馬中に発現しているタンパク質を１つのスポットとして分離し、このスポットを比較し、L-LTPを誘導した海馬に特異的に発現するタンパク質についてその質量分析を行うこと等により同定するものである。二次元電気泳動は、等電点電気泳動とSDS-PAGEを組み合わせて行われ、このゲルをクマシーブリリアントブルー（CBB）、銅、あるいは銀等により染色することにより分離されたスポットを観察することができる。スポットの比較については目視によって行うこともできるが、市販の画像解析ソフト等を用いることもできる。L-LTPを誘導した海馬に特異的に見出されるスポットは、これを切り出し、適当な方法により抽出した後に質量分析を行うか、またはそのアミノ酸配列を解析することによって同定することができる。このようにして得られる海馬へのL-LTP誘導に伴って発現するポリペプチドとしては、例えばTGFβスーパーファミリーに含まれるペプチドホルモンであるアクチビンＡ（Inokuchi et al., FEBS Lett., 382, 48-52, 1996）、新規RINGフィンガータンパク質であるLIRF（J. of Neurochm., 74, 6, 2239-2249(2000)）、シナプス膜の裏打ちタンパク質であるVesl-1S (Kato et al., FEBS Lett., 412, 183-189, 1997)、Znフィンガー転写因子であるKrox-20 ( Inokuchi et al., BBRC, 221, 430-436, 1996)、アクチン結合タンパク質であるシナプトポーディン (Yamazaki et al., J. Neurochem., 79, 192-199, 2001)等が挙げられる。
【００１４】
これらのポリペプチドが、脳神経細胞可塑性増強活性を有することは、該ポリペプチドの存在下で海馬LTPを誘導し、該ポリペプチドのLTP維持時間への影響を解析することにより行うことができる。脳神経細胞可塑性増強活性を有するポリペプチドを選択する場合には、該ポリペプチドの存在下、および非存在下で動物に海馬LTPを誘導し、非存在下の場合と比べて該LTPの維持時間が長くなることを指標として選択することができる。
【００１５】
ポリペプチドの海馬への投与の方法としては、例えば、Phospate-Buffered Saline (PBS)等の適当な緩衝液にポリペプチドを溶解した後、マニュプレーター等に装着したシリンジに充填し、これを側脳室に投入する方法等が挙げられる。投入の速度としては、注入によって脳室内の圧力を急に高めたために注入液が逆流して外に漏れないような速度であれば如何なるものであってもよいが、例えば、１分間あたり０．１〜１μlの速度が好ましく用いられる。
【００１６】
投与するポリペプチドの量としては、ポリペプチドの種類によって適宜選択されるが、具体的には、例えば０．０５〜５μgの範囲の量を投与するのが好ましい。また、投与の時期は、ポリペプチドによるLTPの持続時間への影響が解析し得るものであればいつでもよいが、好ましくは、テスト刺激によって、シナプス電位のベースラインの波形を記録した後で、LTPを誘導する前に投与する。
【００１７】
海馬LTPの持続時間の測定方法としては、（FEBS Lett., 382, 48-52,(1996)）に記載の方法等を用いることができる。具体的には、例えば、麻酔下のラットを用いて本発明のスクリーニングを行う場合を例に詳細に説明する。まず、脳神経細胞可塑性増強活性を有するポリペプチドを選択する場合には、LTPを誘導するテタヌス刺激として、１０〜１００−pulse、１００ Hzの刺激を１回与え(刺激強度、0.1msec-duration, 0.1-2.0 mA)、これにより得られる興奮性シナプス後電位と集合スパイク電位を解析する。上記の弱いテタヌス刺激は、通常２時間から２４時間の間にテタヌス刺激を与える前のベースラインまで減衰するので、２〜２４時間の間に観測した波形がポリペプチド非存在下の同時期に測定した波形よりも高い値の場合、脳神経細胞可塑性が増強されたと判断することができる。このようにして選択されたポリペプチドとして、例えば、TGFβスーパーファミリーに属するペプチドホルモンであるアクチビンＡ、Ｂ、およびＡＢ等が挙げられる。
【００１８】
（２）選択されたポリペプチドを有効成分とする脳神経細胞可塑性増強剤
（１）のスクリーニング方法により選択されたポリペプチドは、これが脳神経細胞の可塑性を増強する活性を有することから、脳神経細胞可塑性増強剤として用いることができる。選択されたポリペプチドを上記薬剤の有効成分として用いる場合には、該ポリペプチドを単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
また、脳神経細胞可塑性は、記憶・学習能力に直接関連することが明らかであるので、上記の脳神経細胞可塑性増強剤は、記憶・学習能力増強剤として用いることもできる。
【００１９】
（３）選択されたポリペプチドの活性阻害物質による脳神経細胞可塑性増強活性の阻害
本発明のスクリーニング方法により選択されたポリペプチド（以下、これを「本発明のポリペプチド」と称することがある）の活性を阻害する物質によれば、脳神経細胞可塑性増強活性を阻害することができる。本発明のポリペプチドの活性を阻害する物質には、該活性を有する限り特に制限はないが、例えば該ポリペプチドをコードする塩基配列のアンチセンス配列を有するDNAや、該ポリペプチドをコードする塩基配列を有する２本鎖RNA等の該ポリペプチドの発現を阻害するもの、あるいは該ポリペプチドの抗体や糖タンパク質、適当な化合物等の該ポリペプチドと相互作用して該ポリペプチドが有する活性を阻害する物質等が挙げられる。
【００２０】
これらはいずれも、本発明のポリペプチドの活性を阻害し、脳神経細胞可塑性を減弱することを確認することにより最終的に取得することができる。この確認の方法としては、上記（１）に記載した本発明のポリペプチドの選択方法において、動物の脳内に該物質の存在下でLTPを誘導し、このLTP電位の解析を行い、LTP維持時間への影響を解析することにより行うことができる。
【００２１】
このようにして取得された、脳神経細胞可塑性増強活性を有するポリペプチドの阻害物質として、具体的に、例えば、アクチビンの阻害物質であるフォリスタチン（LTP杉野弘、中村隆範、生化学、68, 1405-1428 (1996）；Esch, F. S., et al., Mol. Endocrinol., 1, 849-855(1987)）等が挙げられる。
ここで取得された物質は、これが脳神経細胞の可塑性を増強する分子の活性を阻害することから、脳神経細胞可塑性減弱剤として用いることができる。選択された物質を上記薬剤の有効成分として用いる場合には、該物質を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００２２】
また、脳神経細胞可塑性は、記憶・学習能力に直接関連することが明らかであるので、上記の脳神経細胞可塑性減弱剤は、記憶・学習能力減弱剤として用いることもできる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
例１ ラット海馬におけるLTP特異的に発現が誘導される遺伝子の取得（PCR Differential Display Method）
（１）痙攣誘発剤処理したラット海馬からのcDNA調製
Wistarラット（6 週齢、オス、180〜220g）をFEBS Lett., 382, 48-52 (1996)の方法に従って痙攣誘発剤（カイニン酸）処理し、この海馬からAcid guanidium thiocyanate−phenol−chloroform method（Chomczynski,P. et al., Anal Biochem., 162(1), 156-9 (1987)）によりTotal RNAを調製した。調製したTotal RNAのうち0.5μgを、70℃、5分間ヒートディネーチャーした後に、MMLV reverse transcriptase（GibcoBRL社製）300U、RNase inhibitor 40U、アンカープライマー（配列番号１）2.5μM、dNTP  20μMを含む逆転写反応液に供して35℃、60分間インキュベートを行った。この逆転写反応液0.5μlを、dNTP  2μM、0.5U AmpliTaq DNA Polymerase（Perkin Elmer社製）、0.5μM [α−35S]dCTP（1200Ci／mmol：New England Nuclear社製）、アンカープライマー（配列番号１）1μM、及びアービトラリープライマー（配列番号２）0.5μMを含むPCR緩衝液（AmpliTaq DNA Polymeraseに添付）4.5μlに供し、PCRを行った。PCRは、94℃−30秒、40℃−2分、72度−30秒を40サイクル、さらに72℃−5分の条件で行った。
【００２４】
（２）LTP特異的に誘導される遺伝子の取得
上記（１）で得られたPCRにより増幅されたDNA断片を、6%ポリアクリルアミドシークエンスゲルにより分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。定常状態のラット海馬から上記（１）と同様にして得たDNA断片と比較し、痙攣が誘発されたラットの海馬にのみ観察されるDNA断片が含まれるゲルを切り出し、100μlの沸騰水中でDNAを抽出した。この抽出液に含まれるDNAを50μgのGlycogenを含むエタノールにて沈殿させ、これを10μlの水に溶解した。
このうち1μlをdNTP 25μM、2.5U AmpliTaq DNA Polymerase（Perkin Elmer社製）、アンカープライマー（配列番号１）1.0μM、及びアービトラリープライマー（配列番号２）0.5μMを含むPCR緩衝液（AmpliTaq DNA Polymeraseに添付）19μlに供し、PCRを行った。PCRは、94℃−30秒、40℃−2分、72度−30秒を35サイクル、さらに72℃−5分の条件で行った。このPCRにより増幅されたDNA断片が１種類のものであることを、1％ Synergelを含む0.5％アガロースゲルによる電気泳動で分離し確認した。
【００２５】
この増幅されたDNA断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にベクターに添付のマニュアルに準じてクローニングした。さらに、このDNA断片をNorthern blot analysis（FEBS Lett., 382, 48-52 (1996)）に供し、上記で行ったオリジナルのdifferential displayの発現パターンと同じであることを確認した。
ここで増幅されたDNA断片は220bpで、コーディング領域を含んでいなかったので、これをプローブとしてカイニン酸を投与したラット海馬由来のcDNAライブラリー（FEBS Lett., 382, 48-52 (1996)）をスクリーニングし、さらに選抜されたクローンに含まれるDNA断片をシーケンスした。得られた塩基配列をEMBL、及びGeneBankデータベースをホモロジー検索したところ、アクチビンβAサブユニット（Woodruff, T. K.,et al., Mol. Endocrinol., 1, 561-568(1987)）であることが明らかとなった。
LTP海馬に対してアクチビンβA cDNAをプローブとしてFEBS Lett., 382, 48-52 (1996)の方法に従いin situ hybridizationを行った。その結果、アクチビンβA遺伝子は海馬LTPに伴い海馬歯状回で発現が誘導されることが明らかになった。
【００２６】
例２ 海馬LTPの持続時間に対するアクチビンの影響の解析
（１）海馬に対する刺激、およびその反応の記録
Wistarラット（20〜24週齢、オス）をウレタン麻酔（1.5g/kg、腹腔内注射）した後、脳定位固定装置（成茂科学器械社製）によって頭部を固定した。ラットの体温は直腸温によってモニターし、動物用保温マット（室町機械社製：MK-900）によって体温が37℃に維持されるようにした。頭骨にドリルで孔をあけ、記録用電極、及び刺激用電極を挿入した。電極は、エポキシ樹脂で被覆したタングステン線（直径0.1mm）を用いた。先端部分の被覆を除去したそれぞれの電極をガラス管（直径1.0mm）に通して接着剤で固定した。記録用の単極性の電極を海馬の歯状回（以下、これを「DG」と称することがある）（脳座標：(A)-8.0、(L)4.0、(V)-3.0）に挿入した。刺激用の双極性の電極を貫通線維（以下、これを「PP」と称することがある）（脳座標：(A)-4.0、(L)2.6、(V)-3.0）に挿入した。
【００２７】
PPからのテスト刺激を30secに１回の割合で与え、ベースラインの波形を15分間記録した。テスト刺激の強度は集合スパイク電位（以下、これを「PS」と称することがある）の振れ幅の最大値を生じさせる刺激強度の60％に設定され（0.1msec duration, 0.8〜1.6mA）、実験中一定に保たれた。このテスト刺激によってDGから適切な波形を記録することを確認した。このPSと興奮性シナプス後電位（以下、これを「EPSP」と称することがある）の測定を始めた（図２）。
【００２８】
（２）アクチビン、およびコントロール溶液の投与
上記（１）に記載のラットに図１で示されるように刺激、およびその反応の記録を行っているのと同側の位置にマニュプレーターに装着したマイクロシリンジ（針直径27ゲージ）を側脳室に挿入した（脳座標：プレグマから後側 (A) -0.8mm、中心線より右側(L)1.5mm、脳表面より下側(V)-4.5mm）。アクチビン溶液（0.25 mg/mlアクチビン（北里大学の長谷川教授により豚の組織から精製されたものを徳島大学の杉野教授より分与された）、1.25 mg/ml  BAS（シグマ社製）／ PBS緩衝液）、あるいはコントロール溶液（1.25 mg／ml  BAS／PBS緩衝液）をマイクロシリンジに充填して、各々側脳室に１分間あたり0.5μlの速度で、合計２μl注入した。注入終了後、６分間そのままに留置した後、マイクロシリンジを引き上げた。
【００２９】
（３）アクチビン投与後の海馬LTPの持続時間の解析
アクチビン、あるいはコントロール溶液の脳室内投与を終了してから45分間経過した後、50−pulse train、100Hzのテタヌス刺激を１回、上記（１）で設置した刺激用電極により与えた。このテタヌス刺激は、海馬にLTPを誘導するが、この刺激によるLTPは５〜９時間でテタヌス刺激を与える以前のベースラインの波形に減衰するものである。テタヌス刺激後、PS、およびEPSPの記録波形は50kHzでデジタル化し、連続した３回の波形を平均化してパソコン（NEC PC9801 BX3）に保存した。典型的な記録波形を図２に示した。テタヌス刺激前のベースラインの各々の値を100として換算したPSの振れ幅とEPSPの傾きについて、コントロール溶液投与後の変化を図３に、またアクチビン投与後の変化を図４に示した（時間０の時にテタヌス刺激を与えた）。図３、４に示されるとおり、通常５〜９時間でベースラインに減弱するLTPの波形がアクチビン投与群では９時間後に減弱しなかった。このことは、アクチビンにLTPの持続時間を長期化する活性があることを示す。
【００３０】
アクチビンを投与した場合、LTP誘導後２４時間の波形はベースラインまで減弱していたが、この時点で100−pulse train、100Hzのテタヌス刺激を与える（図４のグラフ横軸に示した２番目の矢印）と、LTPが再び誘導されることを確認した。このことにより、LTPの減弱は海馬の機能の衰弱によるものでないことが確認された。また、アクチビンを上記に記載したとおり投与し、投与後４５分経過した後に、テタヌス刺激の代わりにテスト刺激を与えると、刺激後２４時間の測定期間中、PS振れ幅、EPSP傾きともに顕著な変化は見られなかった。このことから上記したアクチビンによる効果はLTP特異的に働くものであることが明らかとなった。
【００３１】
例３ アクチビン阻害物質による海馬LTP持続時間長期化の阻害
上記例２（２）に記載した方法と同様にして、アクチビンの阻害物質であるフォリスタチン溶液（0.25 mg／mlフォリスタチン（北里大学の長谷川教授により豚の組織から精製されたものを徳島大学の杉野教授より分与された）、1.25 mg/ml  BAS(シグマ社製)／PBS緩衝液）、あるいはコントロール溶液（1.25 mg/ml BAS（シグマ社製）／PBS緩衝液）の脳室内投与を行った。投与が終了してから45分間経過した後、400−pulse train、400Hzのテタヌス刺激を２分間隔で５回、上記（１）で設置した刺激用電極により与えた。このテタヌス刺激は、海馬にLTPを誘導するが、この刺激によるLTPは24時間後でもPS振れ幅、EPSP傾き共にテタヌス刺激前のベースラインを上回る値を示し、24時間持続するLTPを誘導するものである。
【００３２】
このテタヌス刺激後、PS、およびEPSPの記録波形は50kHzでデジタル化し、連続した３回の波形を平均化してパソコン（NEC PC9801 BX3）に保存した。テタヌス刺激前のベースラインの各々の値を100として換算したPSの振れ幅とEPSPの傾きについて、コントロール溶液投与後の変化を図５に、またアクチビン投与後の変化を図６に示した。図５、６に示されるとおり、強いテタヌス刺激によって通常２４時間維持されるLTPの波形がフォリスタチン投与により６〜９時間後にベースラインに減弱した。このことは、フォリスタチンにLTPの持続時間の長期化を阻害する活性があることを示す。
【００３３】
フォリスタチンを投与した場合、LTP誘導後24時間の波形はベースラインまで減弱していたが、この時点で100−pulse train、100Hzのテタヌス刺激を与える（図６のグラフ横軸に示した２番目の矢印）と、LTPが再び誘導された。このことにより、LTPの減弱は海馬の機能の衰弱によるものでないことが確認された。また、フォリスタチンを上記に記載したとおり投与し、投与後４５分経過した後に、テタヌス刺激の代わりにテスト刺激を与えると、刺激後２４時間の測定期間中、PS振れ幅、EPSP傾きともに顕著な変化は見られなかった。このことから上記したフォリスタチンによる効果はLTP特異的に働くものであることが明らかとなった。
【００３４】
【発明の効果】
海馬LTPは学習・記憶のニューロン機構の基盤として重要な役割を果たしていることがよく認められている（Nelson and Young, Neurosci. Biobehav. Rev., 22, 453-462, 1998）。遺伝子工学的手法等を用いて、海馬LTPの促進を引き起こすように処置された動物では、学習・記憶の向上が起こるという報告例（Tang et al., Nature, 401, 63-69, 1999; Ikegami and Inokuchi, Neuroscience, 98, 637-646, 2000）があり、脳神経細胞可塑性増強活性を有する本発明のポリペプチド、あるいはその阻害物質は、学習・記憶能力の調節等、脳機能を改善する医薬品や、痴呆等の治療薬、あるいは予防薬としての応用性がある。また、学習・記憶能力の阻害活性としては、外傷後ストレス障害（Post Traumatic Stress Disoder:PTSD）のような恐怖の記憶を緩和する精神疾患治療薬や、てんかん発作のような脳の異常な興奮性反応を抑制する脳疾患治療薬としての応用性もある。
【００３５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】生体脳における海馬歯状回のLTP実験モデルを示す図である。
【図２】ベースラインとLTP誘導時の記録波形を示す図である。
【図３】コントロール溶液を注入後、弱いテタヌス刺激を与えた時の海馬LTPの電位を示すグラフである。
【図４】アクチビン投与後に弱いテタヌス刺激を与えた時の海馬LTPの電位を示すグラフである。
【図５】コントロール溶液を注入後、強いテタヌス刺激を与えた時の海馬LTPの電位を示すグラフである。
【図６】フォリスタチン投与後に強いテタヌス刺激を与えた時の海馬LTPの電位を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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