(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２又は４に示されるアミノ酸配列を有する脂肪酸エポキシゲナーゼポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２】
配列番号：２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有する脂肪酸エポキシゲナーゼポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
配列番号：２又は４に示されるアミノ酸配列に対しておいて少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する脂肪酸エポキシゲナーゼポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
配列番号：１又は３に示されるヌクレオチド配列を有する核酸と高緊縮条件下でハイブリダイズし、そして脂肪酸エポキシゲナーゼポリペプチドをコードする核酸。
【請求項５】
配列番号：２又は４に示されるアミノ酸配列を有する脂肪酸エポキシゲナーゼポリペプチド。
【請求項６】
配列番号：２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有する脂肪酸エポキシゲナーゼポリペプチド。
【請求項７】
配列番号：２又は４に示されるアミノ酸配列に対しておいて少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する脂肪酸エポキシゲナーゼポリペプチド。
【請求項８】
配列番号：１又は３に示されるヌクレオチド配列を有する核酸と高緊縮条件下でハイブリダイズる核酸によりコードされる脂肪酸エポキシゲナーゼポリペプチド。
【請求項９】
プロモーター配列に作用可能に結合している請求項１〜４のいずれか１項記載の単離した核酸分子を含む遺伝的な構築物であって、前記核酸分子が、天然のエポキシゲナーゼ遺伝子の生体内転写の方向に対してセンス又はアンチセンスの方向に転写されることのできるものである遺伝子的な構築物。
【請求項１０】
細胞、組織、器官、生物体又は微生物体内におけるエポキシ脂肪酸のレベルを変える方法であって、請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸を、細胞、組織、器官又は生物体に導入し、前記細胞を、前記核酸の発現を生じさせるために十分な時間及び条件下に培養することを含む方法。
【請求項１１】
前記核酸を導入する段階が、細胞、組織、器官又は生物体を前記核酸により安定的に形質転換することを含む請求項10記載の方法。
【請求項１２】
細胞内で、酵素的に活性である組換えエポキシゲナーゼポリペプチドを生産する方法であって、請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸を含む細胞を、発現を生じさせるために十分な時間及び条件下に培養することを含む方法。
【請求項１３】
細胞を単離した核酸分子で形質転換する追加の第一段階を含む請求項12記載の方法。
【請求項１４】
細胞内で、酵素的に活性である組換えエポキシゲナーゼポリペプチドを生産する方法であって、
（i）前記細胞内で前記遺伝的な構築物を発現させるプロモーター及び任意に発現エンハンサー要素の制御下に作用可能に配置した請求項１〜４のいずれか１項記載の単離した核酸分子を含む遺伝的な構築物をつくり：
（ii）前記遺伝的な構築物を前記細胞に形質転換し；そして
（iii）前記遺伝子配列によりコードされた機能できるエポキシゲナーゼを高レベルで発現する形質転換体を選ぶことを含んで成る方法。
【請求項１５】
遺伝子導入植物内で、酵素的に活性である組換えエポキシゲナーゼポリペプチドを生産する方法であって、
（ｉ）種子に特異性のあるプロモーター及び任意に発現エンハンサー要素の制御下に作用可能に配置した請求項１〜４のいずれか１項記載の単離した核酸分子を含む遺伝子的な構築物を作り、ここで前記遺伝子配列は転写ターミネーター配列の上流にも配置され；
（ii）前記遺伝的な構築物により前記植物の細胞又は組織を形質転換し；そして
（iii）前記遺伝子配列によりコードされた機能できるエポキシゲナーゼを種子中に高レベルで発現する形質転換体を選ぶことを含んで成る方法。
【請求項１６】
前記植物が、高レベルのリノール酸を正常に生産する脂肪種子の種である請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記植物が、特にリノーラ（Linola商標名）亜麻、菜種、ひまわり、サフラワー、大豆、亜麻仁、ゴマ、綿実、落花生、オリーブ及びパームを含むリストから選ばれる請求項15又は16記載の方法。
【請求項１８】
細胞、組織、器官又は生物体でエポキシ化脂肪酸を生産する方法であって、請求項５〜８のいずれか１項記載のポリペプチドを発現する細胞、組織、器官又は生物体を、脂肪酸基質と共に、前期基質の少なくとも１つの炭素結合がエポキシ基に転換されるために十分な時間及び条件下に培養することを含む方法。
【請求項１９】
前記脂肪酸基質が不飽和脂肪酸であり、エポキシ化される前記基質の炭素結合が炭素二重結合である請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記脂肪酸基質が、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、９，15−オクタデカジエノン酸及びアラキドン酸を含むリストから選ばれる請求項18又は19記載の方法。
【請求項２１】
エポキシ化される炭素結合が、Δ６炭素結合、Δ９炭素結合、Δ12炭素結合又はΔ15炭素結合である請求項18−20のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
エポキシ化される炭素結合が、Δ12炭素結合である請求項21記載の方法。
【請求項２３】
生産されたエポキシ化される脂肪酸が、ベルノール酸である請求項18〜22のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
細胞、組織、器官あるいは生物体を、組換えエポキシゲナーゼ又はその同族体、類縁体又は誘導体をコードする核酸分子により形質転換又はトランスフェクトする追加の第一段階を含む請求項18〜23のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
組換えエポキシナーゼが発現する細胞、組織、器官又は生物体が、細菌、酵母、菌類、カビ、昆虫、植物、鳥又は哺乳類に由来する請求項18〜24のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
細胞、組織、器官又は生物体が、酵母、植物、菌類又はカビに由来する請求項25記載の方法。
【請求項２７】
酵母、植物、真菌又はカビが、油性酵母、植物、菌類又はカビである請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記植物が、組換えエポキシゲナーゼを通常高レベルで発現しない脂肪種子植物である請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記脂肪種子植物が、特にリノーラ（Linola商標名）亜麻、菜種、ひまわり、サフラワー、大豆、亜麻仁、ゴマ、綿実、落花生、オリーブ及びパームを含むリストから選ばれる請求項28記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸で形質転換した植物、又はそれに由来する細胞、組織もしくは器官、あるいは前記核酸分子も含む前記植物の子孫。
【請求項３１】
請求項５〜８のいずれか１項記載のポリペプチドを発現しうる形質転換された植物、それに由来する細胞、組織もしくは器官、又は前記組換えポリペプチドを発現することもできる前記植物の子孫。
【請求項３２】
リノーラ（Linola商標名）亜麻、菜種、ひまわり、サフラワー、大豆、亜麻仁、ゴマ、綿実、落花生、オリーブ又はパームであるか又はこれらに由来する請求項30又は31に記載の植物、あるいは細胞、組織又は器官、又はその子孫。
【請求項３３】
アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）であるか又はこれに由来する請求項30又は31に記載の植物、あるいは細胞、組織もしくは器官、又はその子孫。
【請求項３４】
リヌム・ウシタチシマム（Linum usitatissimum）であるか又はこれに由来する請求項30又は31に記載の植物、又はそれに由来する細胞、組織もしくは器官、あるいはその子孫。
【請求項３５】
請求項５〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドに結合することが出来る抗体分子。
【請求項３６】
形質転換前の植物の種子中のエポキシ脂肪酸のレベルに比べて、種子の脂質中のエポキシ脂肪酸のレベルが高められている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸が導入されている植物であって、前記エポキシ脂肪酸が12，13−エポキシ−９−オクタデセン酸、12，13−エポキシ−9，15−オクタデカジエン酸、又は両者の混合物である遺伝子導入植物。
【請求項３７】
前記12，13−エポキシ−９−オクタデセン酸のレベルが、合計種子脂肪酸含量の0.7％（w/w）以上である請求項36記載の遺伝子導入植物。
【請求項３８】
前記12，13−エポキシ−９−オクタデセン酸のレベルが、合計種子脂肪酸含量の0．９％〜15.8％（w/w）である請求項36記載の遺伝子導入植物。
【請求項３９】
前記エポキシ脂肪酸が、12，13−エポキシ−9，15−オクタデカジエン酸である請求項36記載の遺伝子導入植物。
【請求項４０】
前記遺伝子導入植物が、植物脂肪酸Δ−12エポキシゲナーゼをコードする核酸により形質転換されている請求項36記載の遺伝子導入植物。
【請求項４１】
前記植物が、アラビドプシス・タリアナ、亜麻、菜種、ひまわり、トウモロキシ、サフラワー、大豆、亜麻仁、ゴマ、綿実、落花生、オリーブ又はパームである請求項36記載の遺伝子導入植物。
【請求項４２】
前記植物が亜麻、ひまわり、トウモロコシ又はサフラワーである請求項36記載の遺伝子導入植物。
【請求項４３】
前記植物が亜麻であり、そして前記亜麻がリヌム・ウシタチシマムである請求項41又は42記載の遺伝子導入植物。
【請求項４４】
前記植物がその種子の脂質に２％以下のリノレン酸を含む亜麻植物である請求項41又は42記載の遺伝子導入植物。
【請求項４５】
請求項36記載の植物の遺伝子導入種子。
【請求項４６】
請求項37記載の植物の遺伝子導入種子。
【請求項４７】
請求項39記載の植物の遺伝子導入種子。
【請求項４８】
請求項41記載の植物の遺伝子導入種子。
【請求項４９】
請求項42記載の植物の遺伝子導入種子。
【請求項５０】
請求項43記載の植物の遺伝子導入種子。
【請求項５１】
請求項36記載の遺伝子導入植物の生成方法であって、
ａ）種子−特異的プロモーターの制御下で植物脂肪酸Δ−12エポキシゲナーゼをコードする請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸により、植物の細胞又は組織を形質転換し；そして
ｂ）遺伝子導入植物を生成するために前記形質転換された細胞又は組織を再生することを含んで成る方法。
【請求項５２】
前記植物が、アラビドプシス・タリアナ、亜麻、菜種、ひまわり、サフラワー、大豆、亜麻仁、ゴマ、綿実、落花生、オリーブ又はパームである請求項51記載の方法。
【請求項５３】
前記植物が亜麻、ひまわり、トウモロコシ又はサフラワーである請求項51記載の方法。
【請求項５４】
12，13−エポキシ−９−オクタデセノン酸又は12，13−エポキシ−9，15−オクタデカジエン酸の生成方法であって、
ａ）請求項36記載の植物を獲得し；
ｂ）前記植物から種子を分離し;そして
ｃ）前記種子から12，13−エポキシ−９−オクタデセノン酸又は12，13−エポキシ−9，15−オクタデカジエン酸を含んで成る脂質を抽出し、それにより12，13−エポキシ−９−オクタデセノン酸又は12，13−エポキシ−9，15−オクタデカジエン酸を生成する方法。
【請求項５５】
前記植物が、アラビドプシス・タリアナ、亜麻、菜種、ひまわり、サフラワー、大豆、亜麻仁、ゴマ、綿実、落花生、オリーブ又はパームである請求項54記載の方法。
【請求項５６】
前記植物が亜麻、ひまわり、トウモロコシ又はサフラワーである請求項54記載の方法。
【請求項５７】
12，13−エポキシ−９−オクタデセノン酸又は12，13−エポキシ−9，15−オクタデカジエン酸の生成方法であって、
ａ）請求項45記載の種子を獲得し；そして
ｂ）前記種子から12，13−エポキシ−９−オクタデセノン酸又は12，13−エポキシ−9，15−オクタデカジエン酸を含んで成る脂質を抽出し、それにより12，13−エポキシ−９−オクタデセノン酸又は12，13−エポキシ−9，15−オクタデカジエン酸を生成する方法。
【請求項５８】
前記植物が、アラビドプシス・タリアナ、亜麻、菜種、ひまわり、サフラワー、大豆、亜麻仁、ゴマ、綿実、落花生、オリーブ又はパームである請求項57記載の方法。
【請求項５９】
前記植物が亜麻、ひまわり、トウモロコシ又はサフラワーである請求項57記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般的に、脂肪酸エポキシゲナーゼ酵素をコードする新規の遺伝子配列に関する。特に、本発明は、本明細書に定義されるような脂肪酸Δ12−エポキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子配列に関する。より特定には、本発明は、植物脂肪酸エポキシゲナーゼ、好ましくはクレピシ  パラエスチナ（Crepis palaestina）又はユーホルビア  ラガスカエ（Euphorbia lagascae）Δ12−エポキシゲナーゼをコードするcDNA及びゲノム遺伝子配列を供給する。本発明の遺伝子配列は、脂肪酸代謝が、不飽和脂肪酸を、エポキシ化された脂肪酸に転換するために、生物、たとえば酵母、カビ、細菌、昆虫、鳥、哺乳類及び植物において変更され、又は操作され得る手続を提供する。本発明は、対象遺伝子配列により形質転換された遺伝子的に修飾された油−蓄積生物及びそれに由来する油に及ぶ。このようにして生成された油は、中でも、被膜、樹脂、接着剤、プラスチック、界面活性剤及び滑剤の効果的牲成への使用のための費用効率の良い原料のための手段を提供する。
続く本明細書及び請求の範囲を通して、特にことわらない限り、用語“含んで成る”とは、言及された完全体又は完全体グループの包含を意味するが、しかしいづれか他の完全体又は完全体グループの排除を意味するものではないことを理解するであろう。
本明細書において著者により言及される出版物の詳細は、この記載の最後に集められている。本明細書に言及されるヌクレオチド及びアミノ酸配列についての配列番号は、参考文献の後に定義される。
発明の背景
非回復性石油化学からよりもむしろ回復性植物源から産業用使用のための化学供給原料、たとえば脂肪酸を生成することに、相当な興味がある。この概念は、資源保存に基づいて製造者及び消費者に広いアピールを有し、そして農業のための新しい産業収穫物を開発するための有意な機会を付与する。
天然においては種々のまれな脂肪酸が存在し、そしてそれらは十分に特徴づけられている（Badam & Patil, 1981; Smith, 1970）。それらのまれな脂肪酸の多くは産業的可能性を有し、そしてこれは、特定の脂肪酸の農業的生産を可能にするそのような種を明らかにすることに興味を導びいて来た。
特に興味ある１つの種類の脂肪酸は、２つの隣接する炭素結合がエポキシ橋により結合されるアシル鎖から成る、エポキシ−脂肪酸である。それらの高い反応性のために、それらは、被膜、樹脂、接着剤、プラスチック、界面活性剤及び滑剤の生成に相当適用できる。それらの脂肪酸は現在、植物油、主にダイズ油及び亜麻油の化学的エポキシ化により生成されるが、しかしながら、この方法は複数形及び異性形の混合物を生成し、そして有意な加工費用を包含する。
エポキシ脂肪酸を含むいくつかの野生植物（たとえば、ユーホルビナラガスカエ（Euphorbia lagascae）、ベリノニアガラメンシス（Vernonia galamensis））を、それらの商業的油源に開発する試みが、他により行なわれている。しかしながら、農業経済学的適合性及び低い収率可能性に関する問題が、従来の植物育種及び栽培アプローチの商業的利用性を非常に制限する。
組換えDNA技法の急速に高まる高度知識が、新規表現型を付与するために、第２生物又は種における第１生物又は種から単離された遺伝子の発現により、商業的に重要な産業工程の効率を非常に促進する。より特定には、従来の産業方法が、組換えDNA技法の適用により、より効果的に又はより費用効率的にされ得、単位費用当たり、より高い収率をもたらす。
さらに、興味ある遺伝子配列の発現のための宿主生物の適切な選択は、高い収率及び純度で、宿主により通常、生成されず、又は合成されない化合物の生成を提供する。
しかしながら、組換えDNA技法の一般的な有効性にもかかわらず、脂肪酸代謝において重要な酵素をコードする遺伝子配列、特に、中でも、１２，１３−エポキシ−９−オクタデセン酸（ベルノール酸）及び１２，１３−エポキシ９，１５−オクタデカジエン酸の生成を担当する脂肪酸Δ12−エポキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の単離が、それらの脂肪酸を生成する遺伝子的に構築された生物の開発に主な障害を生成している。
本発明まで、脂肪酸エポキシゲナーゼ酵素、特に、Δ12−エポキシゲナーゼの性質を示す、わずかな制限された生化学データが存在した。しかしながら、ユーホルビナラガスカエにおいては、リノール酸からの１２，１３−エポキシ−９−オクタデセン酸（ベルノール酸）の形成は、シトクロム−P40−依存性Δ12−エポキシゲナーゼ酵素により触媒されると思われる（Baforなど., 1993; Bleeなど., 1994）。さらに、亜麻植物の成長種子は、内因性Δ15デサチュラーゼにより、添加されたベルノール酸を１２，１３−エポキシ−９，１５−オクタデカジエン酸に転換する能力を有する（Engeseth and Stymne, 1996）。エポキシ−脂肪酸はまた、植物組織において、過酸化物−依存性ペルオキシゲナーゼによっても生成され得る（Bleeand Schuber, 1990）。
本発明までを導びく研究において、本発明者は、エポキシ−脂肪酸、たとえば１２，１３−エポキシ−９−オクタデセン酸（ベルノール酸）又は１２，１３−エポキシ−９，１５−オクタデカジエン酸の生成のために重要である遺伝子をコードする遺伝子配列を単離し、そしてそれらの配列を、高い生産性の商業的脂肪種子植物及び／又は他の油蓄積生物中にトランスファーすることを探求した。
発明の要約
本発明の１つの観点は、脂肪酸エポキシゲナーゼをコードする単離された核酸分子をコードし、又はその分子に対して相補的である単離された核酸分子を提供する。
本発明の第２の観点は、少なくとも低い緊縮条件下で、配列番号１、３、５、19又は20の少なくとも20個の隣接したヌクレオチド、又はそれに対する相補的配列にハイブリダイズする単離された核酸分子を提供する。
本発明のさらなる観点は、配列番号１、３又は５に対して少なくとも65%同一であり、又は配列番号19又は20における少なくとも200個の隣接したヌクレオチドに対して少なくとも75%同一である、ヌクレオチドの配列、又はそれに対して相補的な配列を含んで成る単離された核酸分子を提供する。
本発明のさらなる観点は、プロモーター配列と操作可能的に連結して、センス又はアンチセンスのいづれかの配向で、前記単離された核酸分子を含んで成る遺伝子構造体を提供する。
本発明のさらなる観点は、細胞におけるエポキシ脂肪酸のレベルを変更するための方法を提供し、ここで前記方法は、前記細胞における単離された核酸分子を含んで成るセンス、アンチセンス、リボザイム又は同時−抑制分子を、エポキシ脂肪酸のレベルを高め、又は低めるのに十分な時間及び条件下で発現することを含んで成る。
本発明のさらなる観点は、細胞において酵素的に活性的なエポキシゲナーゼ、ポリペプチドを生成するための方法を提供し、ここで前記方法は、前記細胞において、単離された核酸分子を、前記コードされるエポキシゲナーゼを生成するのに十分な時間及び条件下で発現することを含んで成る。
本発明のさらなる観点は、細胞において、酵素的に活性的な組換えエポキシゲナーゼポリペプチドを生成するための方法を提供し、ここで前記方法は：
（ｉ）前記細胞において、遺伝子配列に対して発現を付与することができるプロモーターの制御下で操作可能的に配置される、単離された核酸分子、及び任意には、発現エンハンサー要素を含んで成る遺伝子構造体を生成し；
（ii）前記遺伝子構造体により前記細胞を形質転換し；そして
（iii）前記遺伝子配列によりコードされる機能的エポキシゲナーゼを高レベルで発現する形質転換体を選択する段階を含んで成る。
本発明のさらにもう１つの観点は、トランスジェニック植物において酵素的に活性的な組換えエポキシゲナーゼポリペプチドを生成するための方法を提供し、ここで前記方法は：
（ｉ）種子−特異的プロモーターの制御下で操作可能的に配置される、単離された核酸分子、及び任意には、発現エンハンサー要素を含んで成る遺伝子構造体を生成し、こで前記遺伝子配列はまた、転写ターミネーター配列の上流に配置されており；
（ii）前記遺伝子構造体により前記植物の細胞又は組織を形質転換し；そして
（iii）前記遺伝子配列によりコードされる機能的エポキシゲナーゼを種子において高レベルで発現する形質転換体を選択する段階を含んで成る。
本発明のさらなる観点は、組換えエポキシゲナーゼポリペプチド又は機能的酵素分子を提供する。
本発明のさらなる観点は、配列番号２、４、又は６、又はそれに対して少なくとも約50%同一であるその相同体、類似体、又は誘導体のいづれか１つに示されるアミノ酸の配列を含んで成る組換えエポキシゲナーゼを提供する。
本発明のさらにもう１つの観点は、細胞、組織、器官又は生物において、エポキシ化された脂肪酸を生成するための方法を提供し、ここで前記方法は、酵素的に活性的な組換えエポキシゲナーゼを発現する細胞、組織、器官又は生物を、脂肪酸基質及び好ましくは、不飽和脂肪酸基質と共に、前記基質の少なくとも１つの炭素結合、好ましくは炭素二重結合がエポキシ基に転換されるのに十分な時間、及び十分な条件下でインキュベートすることを含んで成る。
本発明のさらなる観点は、本明細書に記載される組換えエポキシゲナーゼポリペプチドに結合する免疫学的に相互作用性の分子、又はその相同体、類似体又は誘導体を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、切断されたナピンプロモーター（FP1:右側の細かい平行線を引かれたボックス）の制御下に操作可能的に配置され、そしてNOSターミネーター配列（右側のストライプのボックス）の上流に配置されたエポキシゲナーゼ構造遺伝子を含んで成る発現プラスミドの線状表示である。エポキシゲナーゼ遺伝子配列は、右側の空白の長方形ボックスにより示される。この構造体はまた、NPTII遺伝子（左側の空白のボックス）の発現を駆動し、そしてNOSターミネーター配列（左側のストライプのボックス）の上流に配置されるNOSプロモーター（左側の細かな平行線を引かれたボックス）を含んで成る。アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の左及び右側境界配列もまた示される。
図２は、クレピスパラエスチナ（Crepis palaestina）のエポキシゲナーゼポリペプチドのアミノ酸配列（Cpal2:配列番号２）、高レベルのベルノール酸を生成する、C.パラエスチナ以外のクレピスsp．に由来する追加のエポキシゲナーゼのアミノ酸配列（CrepX;配列番号４）、ベルノニアガラメンシスに由来するエポキシゲナーゼの部分アミノ酸配列（Vgal1;配列番号６）、クレピスアルピナ（Crepis alpina）のΔ12アセチレナーゼのアミノ酸配列（Crep1;配列番号８）、A.タリアナのΔ12デサチュラーゼ（L26296; 配列番号９）、ブラシカジュンセア（Brassica Juncea）（X91139, 配列番号10）、グリシンマックス（Glycine max）（L43921; 配列番号11）、サラナムコメルソニ（Salanum commersonii）（X92847; 配列番号12）及びグリシンマックス（L43920; 配列番号13）、並びにリシナスコミュニス（Ricinus communis）のΔ12ヒドロキシラーゼ（U22378; 配列番号14）を示す略図である。下線は、非ヘム−含有の混合された機能のモノオキシゲナーゼに保存される３種のヒスチジンに富むモチーフである。
図３は、配列番号１により例示されるクレピスパラエスチナエポキシゲナーゼ遺伝子の種子−特異的発現を示すノザンブロットハイブリダイゼーションの写真表示のコピーである。クレピスパラエスチナの葉（レーン１）及び成長種子（レーン２）からの全RNAのノザンブロット分析。全RNA 15μgをノザンゲル上で走行し、そして製造業者の説明書に従って、AmershamからのHybond N+膜上にブロットした。ブロットを、配列番号１の３’未翻訳領域から製造されたプローブにより60℃でハイブリダイズした。ブロットを、２×SSC（NaCl−クエン酸ナトリウム緩衝液）により室温で10分間、次に0.1×SSCにより60℃で20分間、２度洗浄した。
図４は、本明細書に記載されるユーホルビアラサスカエエポキシゲナーゼ遺伝子を単離するために使用される変性PCRプライマー（５’→３’の方向）のヌクレオチド配列を示す略図である。
図５は、ベルノール酸を生成しない植物に比較して、ベルノール酸を生成する植物において配列番号３で例示されるエポキシゲナーゼ遺伝子の発現を示すRNAドットブロットハイブリダイゼーションの写真表示のコピーである。全RNA １μgを特定の組織から単離し、そして製造業者の説明書に従って、AmershamからのHybond N+膜上にドットブロットした。ブロットを、配列番号３から製造された相当する32P−ラベルされたプローブにより、50%ホルムアミドにおいて42℃で16時間、ハイブリダイズせしめた。ブロットを、２×SSC（NaCl−クエン酸ナトリウム緩衝液）により室温で、次に0.5×SSCにより55℃で20分間、２度洗浄した。オートラジオグラフを、一晩の照射の後に得た。パネルＡは、ユーホルビアラガスカエ（1）、ユーホルビアシパリサス（Euphorbia cyparissus）（2）、ベルノニアガラメンシス（3）、及び亜麻（リナムウシタチシマム（Linum usitaticsimum））（4）の生長種子からの全RNAを示す。パネルＢは、生長種子（1）、根（2）及び葉（3）を包含する、ユーホルビアアガスカエの種々の組織からの全RNAを示す。
図６は、本明細書に記載されるユーホルビアラガスカエエポキシゲナーゼ遺伝子を単離するために使用される減法ハイブリダイゼーション（subtractive hybridization）を示す略図である。＋6cDNAプールは主に、種子貯蔵タンパク質様配列から成った。15のそのような配列のプールをビオチニル化し、そしてさらに、＋6cDNAから引き算した。LH＝長いハイブリダイゼーション−20時間; SH＝短いハイブリダイゼーション−３時間。
図７は、ベルノール酸を生成しない植物に比較して、ベルノール酸を生成する植物において配列番号20で例示されるエポキシゲナーゼ遺伝子の発現を示すRNAドットブロットハイブリダイゼーションの写真表示のコピーである。全RNA １μgを特定の組織から単離しそして製造業者の説明書に従って、AmershamからのHybond N+膜上にドットブロットした。ブロットを、配列番号20から製造された相当する32P−ラベルされたプローブにより、50%ホルムァミドにおいて42℃で16時間、ハイブリダイズせしめた。ブロットを、2×SSC（NaCl−クエン酸ナトリウム緩衝液）により室温で、次に0.5×SSCにより55℃で20分間、２度洗浄した。オートラジオグラフを、一晩の照射の後に得た。パネルＡは、ユーホルビアラガスカエ（1）、ユーホルビアシパリサス（Euphorbia cyparissus）（2）、ベルノニアガラメンシス（3）、及び亜麻（リナムウシタチシマム（Linumusitaticsimum））（4）の生長種子からの全RNAを示す。パネルＢは、生長種子（1）、根（2）及び葉（3）を包含する、ユーホルビアアガスカエの種々の組織からの全RNAを示す。
図８は、ノパリンシンダーゼプロモーター（NP）及びノパリンシンダーゼターミネーター（NT）配列に操作可能的に連結されるカナマイシン耐性遺伝子NPTIIの他に、それらの間のBamHIクローニング部位と共に、切断されたナピン種子−特異的プロモーター（Napin）及びノパリンシンターゼターミネーター（NT）を含んで成る発現カセットを含む二元プラスミドベクターの略図である。前記発現カセットは、T-DNA左−境界（LB）及び右−境界（RB）配列を両端に有する。
図９は、ノパリンシンターゼプロモーター（NP）及びノパリンシンターゼターミネーター（NT）配列に操作可能的に連結されるカナマイシン耐性遺伝子NPTIIの他に、切断されたナピン種子−特異的プロモーター（Napin）の制御下に及びノパリンシンターゼターミネーター（NT）の上流に操作可能的に配置される配列番号１を含んで成る発現カセットを含む二元プラスミドベクターの略図である。前記発現カセットは、T-DNA左境界（LB）及び右境界（RB）配列を両端に有する。この構造体を生成するためには、配列番号１を、図８に示される二元ベクターのBamHI部位に挿入される。
図10は、形質転換されていないアラビドプシスタリアナ（Arabidopsis thaliana）植物〔パネル（a）〕、又は図９に示される遺伝子構造体を用いて配列番号１により形質転換されたA.タリアナ植物（トランスジェニック系Cpal-17）〔パネル（b）及び（c）〕の油種子から調製された脂肪酸メチルエステルのガス−クロマトグラフィー追跡のグラフ表示である。パネル（a）及び（b）においては、脂肪酸メチルエステルが、充填カラム分離を用いて分離された。パネル（c）においては、脂肪酸メチルエステルは、細管カラム分離を用いて分離された。ベルノール酸の溶離位置が示される。
図11は、ガスクロマトグラフィーを用いて決定されるような、Cpal2−形質転換されたアラビドプシスタリアナ植物のT1植物上の自家供給された種子におけるエポキシ脂肪酸のジョイント分布を示すグラフである。ノルノール酸（x−軸）及び１２，１３−エポキシ−９，１５−オクタデカジエン酸（y−軸）の両レベルを決定し、そしてお互いに関してプロットした。データは、トランスジェニック植物におけるそれらの脂肪酸のレベル間での正の相互関係を示す。
図12は、ラベルされた基質供給の間、亜麻子葉の脂質抽出から得られたクロロホルム相中への14C−ラベルの組込みを示すグラフである。使用される記号：◆、[14C]オレイン酸供給；■、[14C]ベルノール酸供給。
図13は、ラベルされた基質供給の間、亜麻子葉のホスファチジルコリン中への14C−ラベルの組込みを示すグラフである。使用される記号：◆、[14C]オレイン酸供給；■、[14C]ベルノール酸供給。
図14は、ラベルされた基質供給の間、亜麻子葉のトリアシルグリセロール中への14C−ラベルの組込みを示すグラフである。使用される記号：◆、[14C]オレイン酸供給；■、[14C]ベルノール酸供給。
好ましい態様の詳細な記載
本発明の１つの観点は、脂肪酸エポキシゲナーゼをコードする単離された核酸分子をコードし、又はその分子に対して相補的である単離された核酸分子を提供する。
本発明の単離された核酸分子がアラキドン酸の直接的なエポキシ化に関与される酵素をコードする場合、その対象の核酸分子は非哺乳類源に由来することが特に好ましい。
本明細書において使用される場合、“由来する”とは、特定の完全体、又は完全体のグループが特定種に起源するが、しかし特定源から直接的に得られる必要は必ずしもないことを示すために使用されるであろう。
用語“非哺乳類源”とは、哺乳類又はそれに由来する組織又は細胞以外のいづれかの生物を言及する。
本発明において、用語“非哺乳類源に由来する”とは、特定の完全体又は完全体のグループが細菌、酵母、鳥、両生類、ハ虫類、昆虫、植物、菌類、カビ及び藻類又は他の非哺乳類に由来したことを示すために使用されるであろう。
本発明の好ましい態様においては、生物源は、エポキシ脂肪酸を合成する遺伝子能力を有するいづれかのそのような生物である。より好ましくは、生物源は、中でも、クリソンテマムspp.（Chrysonthemum spp.）、クレピシspp.（Crepis spp.）、ユーホルビアspp.（Euphorbia spp.）及びベルノニアspp.（Vernonia spp.）であるが、但しそれらだけには限定されない。
さらにより好ましくは、生物源は、クレピシビエニス（Crepis biennis）、クレピシアウレア（Crepis aurea）、クレピシコンイザエホリア（Crepis conyzaefolia）、クレピシインテルメジア（Crepis intermedia）、クレピシオキシデンタリス（Crepis occidentalis）、クレピシパラエスチナ（Crepis palaestina）、クレピシベシカリア（Crepis vesicaria）、クレピシキサシンタ（Crepis xacintha）、ユーホルビアラガスカエ（Euphorbia lagascae）及びベルノニアガラメンシス（Vernonia galamensis）を含んで成る列挙から選択される。さらなる種は排除されない。
本発明の特に好ましい態様においては、生物源は、高レベルのベルノール酸を含むクレピシsp.、たとえば中でも、クレピヒパラエスチナ、又は他方では、ベルノニアガラメンシス又はユーホルビアラガスカエである。
本発明の単離された核酸分子がΔ６−エポキシゲナーゼ又はΔ９−エポキシゲナーゼ酵素、又はΔ12−エポキシゲナーゼ又はΔ15−エポキシゲナーゼ酵素をコードし、又はアラキドン酸の直接的なエポキシ化に関与しない酵素を少なくともコードする場合、対象核酸分子は前記酵素を生成するいづれかの源、たとえば酵母、カビ、細菌、昆虫、鳥、哺乳類及び植物（但し、それらだけには限定されない）に由来することができる。
前記態様のいづれかに従っての本発明の核酸分子は、一本鎖又は二本鎖のいづれにもかかわらず、及び特にことわらない限り、いづれの二次構造特徴にも関係なく、DNA、たとえば遺伝子、cDNA分子、RNA分子又は合成オリゴヌクレオチド分子であり得る。
本明細書において、“遺伝子”とは、その最とも広い範囲を言及し、そして、
（ｉ）転写及び／又は翻訳調節配列、及び／又はコード領域及び／又は非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’−及び３’−未翻訳配列）から成る従来のゲノム遺伝子；又は
（ii）前記遺伝子のコード領域（すなわちエキソン）及び５’−及び３’−未翻訳配列に対応するmRNA又はcDNAを包含する。
用語“遺伝子”はまた、機能的生成物のすべて又は一部をコードする所望する合成又は融合分子を記載するためにも使用される。本発明の好ましいエポキシゲナーゼ遺伝子は、標準の組換え技法により、天然に存在するエポキシゲナーゼ遺伝子から誘導され得る。一般的に、エポキシゲナーゼ遺伝子は、１又は複数のヌクレオチド置換、欠失及び／又は付加を生成するために突然変異誘発にゆだねられ得る。
ヌクレオチド挿入誘導体は、単一又は複数のヌクレオチドの５’及び３’末端融合及び配列内挿入を包含する。挿入ヌクレオチド配列変異体は、１又は複数のヌクレオチドがヌクレオチド配列における予定された部位中に導入されているが、但し、ランダム挿入がまた、得られる生成物の適切なスクリーニングにより可能である変異体である。
欠失変異体は、配列からの１又は複数のヌクレオチドの除去により特徴づけられる。
置換ヌクレオチド変異体は、配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが除去され、そして異なったヌクレオチドがその場所に挿入されている変異体である。そのような置換は、その置換がコドンにより定義されるアミノ酸を変更しないことで、“サイレント”であり得る。他方では、置換は、１つのアミノ酸を、もう１つの類似する作用性アミノ酸、又は同様の電荷、極性又は疎水性のアミノ酸により変更するよう企画される。
本発明においては、用語“脂肪酸エポキシゲナーゼ”とは、脂肪酸の炭素結合をエポキシ基に転換することによって、好ましくは不飽和脂肪酸の炭素二重結合をエポキシ基に転換することによって、エポキシ化された脂肪酸の生合成を触媒する、いづれかの酵素、又はその機能的同等体又は酵素的活性誘導体を言及するために使用されるであろう。本発明を制限するものではないが、脂肪酸エポキシゲナーゼは、中でも、１２，１３−エポキシ−９−オクタデカン酸（ベルノール酸）、１２，１３−エポキシ−９，１５−オクタデカジエン酸、１５，１６−エポキシ−９，１２−オクタデカジエン酸、９，１０−エポキシ−１２−オクタデセン酸、及び９，１０−エポキシ−オクタデカン酸から成る列挙から選択されたエポキシ脂肪酸の生合成を触媒することができる。
用語“エポキシ”、“エポキシ基”及び“エポキシ残基”は、次のように、単結合により結合される２個の炭素原子及び酸素原子から成る３員環を言及することが、当業者により知られている：
0004108765.tif 000002
従って、用語“エポキシド”は、前記に定義されたような少なくとも１つのエポキシ基を含んで成る化合物を言及する。
当業者は、脂肪酸命名法が、炭素鎖の長さ及びその炭素鎖内の不飽和炭素原子の位置に基づかれていることを知っている。従って、脂肪酸は、短縮表示法を用いて表示される：
炭素合計：二重結合合計二重結合（Δ）位置、
ここで、二重結合は、特にことわらない限り、シスである。たとえば、パルミチン酸（ｎ−ヘキサデカン酸）は、飽和の16−炭素脂肪酸（すなわち、16:0）であり、オレイン酸（オクタデセン酸）はC-9とC-10との間に１つの二重結合を有する不飽和の18−炭素脂肪酸（すなわち、18:1Δ9）であり、そしてリノール酸（オクタデカジエン酸）は、C-9とC-10との間及びC-12とC-13との間に２つの二重結合を有する不飽和の18−炭素脂肪酸（すなわち、18:2Δ9.12）である。
しかしながら、本発明において、エポキシゲナーゼ酵素は、エポキシ基へのいづれかの炭素結合の転換、又は他方では、エポキシ基への不飽和脂肪酸基質におけるいづれかの二重結合の転換を触媒することができる。これに関しては、高等生物のほとんどの単一不飽和脂肪酸は18−炭素の不飽和脂肪酸（すなわち、18:1Δ9）であり、そして高等生物に由来するほとんどの多不飽和脂肪酸はC-9とC-10との間に位置する少なくとも１つの二重結合を有する18−炭素脂肪酸であることが、当業者により十分に知られている。さらに、細菌はまた、C16−単不飽和脂肪酸を有する。さらに、本発明のエポキシゲナーゼは、１つ以上の脂肪酸基質分子に対して作用することができ、そして結果として、本発明は、対象のエポキシゲナーゼ酵素が作用する基質分子の性質により制限されるものではない。
好ましくは、本発明のエポキシゲナーゼのための基質分子は、少なくとも１つの二重結合を含む不飽和脂肪酸である。
さらに、エポキシゲナーゼ酵素は、いづれか１つの基質分子におけるいづれかの数の炭素原子に対して作用することができる。たとえば、それらは、中でも、Δ６−エポキシゲナーゼ、Δ９−エポキシゲナーゼ、Δ12−エポキシゲナーゼ又はΔ15−エポキシゲナーゼとして特徴づけられ得る。従って、本発明は、エポキシゲナーゼ酵素が作用することができる基質における炭素原子の位置により制限されない。
用語“Δ６−エポキシゲナーゼ”とは、本明細書において使用される場合、脂肪酸基質のΔ６炭素結合のΔ６エポキシ基への転換を触媒し、そして好ましくは、少なくとも１つの不飽和脂肪酸のΔ６二重結合のΔ６エポキシ基への転換を触媒するエポキシゲナーゼ酵素を言及するために用いられるであろう。
用語“Δ９−エポキシゲナーゼ”とは、本明細書において使用される場合、脂肪酸基質のΔ９炭素結合のΔ９エポキシ基への転換を触媒し、そして好ましくは、少なくとも１つの不飽和脂肪酸のΔ９二重結合のΔ９エポキシ基への転換を触媒するエポキシゲナーゼ酵素を言及するために用いられるであろう。
用語“Δ12−エポキシゲナーゼ”とは、本明細書において使用される場合、脂肪酸基質のΔ12炭素結合のΔ12エポキシ基への転換を触媒し、そして好ましくは、少なくとも１つの不飽和脂肪酸のΔ12二重結合のΔ12エポキシ基への転換を触媒するエポキシゲナーゼ酵素を言及するために用いられるであろう。
用語“Δ15−エポキシゲナーゼ”とは、本明細書において使用される場合、脂肪酸基質のΔ15炭素結合のΔ15エポキシ基への転換を触媒し、そして好ましくは、少なくとも１つの不飽和脂肪酸のΔ15二重結合のΔ15エポキシ基への転換を触媒するエポキシゲナーゼ酵素を言及するために用いられるであろう。
本発明は、中でも、前記に列挙されたエポキシゲナーゼ酵素のすべてをコードする遺伝子配列に明白に拡張する。
本発明の１つの好ましい態様においては、単離された核酸分子は、パルミトレイン酸（16:1Δ9）、オレイン酸（18:1Δ9）、リノール酸（18:2Δ9,12）、リノレン酸（18:3Δ9,12,15）、又はアラキドン酸（20:4Δ5,8,11,14）における少なくとも１つの炭素結合を、エポキシ結合に転換する脂肪酸エポキシゲナーゼ酵素をコードする。好ましくは、炭素結合は、炭素二重結合である。
より好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、リノール酸における１又は２つの二重結合をエポキシ結合に少なくとも転換する脂肪酸エポキシゲナーゼ酵素をコードする。この態様によれば、リノール酸のΔ９及びΔ12二重結合の両者をエポキシ基に転換するエポキシゲナーゼは、前記エポキシゲナーゼが前記に定義されたように、Δ９−エポキシゲナーゼ及び／又はΔ12−エポキシゲナーゼであるよう、お互い独立して、そのような転換を触媒することができる。
もう１つの好ましい態様においては、本発明の脂肪酸エポキシゲナーゼは、前記で定義されたように、Δ12−エポキシゲナーゼ、Δ15−エポキシゲナーゼ、又はΔ９−エポキシゲナーゼである。
より好ましくは、本発明の脂肪酸エポキシゲナーゼは、前記に定義されたように、Δ12−エポキシゲナーゼである。
特に好ましい態様においては、リノレエートΔ12−エポキシゲナーゼをコードする単離された核酸分子が供給され、前記酵素は、リノール酸のΔ12二重結合をΔ12−エポキシ基に少なくとも転換し、それにより、１２，１３−エポキシ−９−オクタデセン酸（ベルノール酸）を生成する。
本発明を制限するものではないが、本発明のΔ12−エポキシゲナーゼの好ましい源は、植物、特にクレピシパラエスチナ、又はさらに、C.パラエスチナとは異なるが、しかし高レベルのベルノール酸を含むクレピシsp.、ベルノニアガラメンシス又はユーホルビアラガスカエである。
本発明によれば、Δ12−エポキシゲナーゼは、中でも、次の転換を触媒することができる：９，１０−エポキシ−パルミチン酸へのパルミトレイン酸の転換、及び／又は９，１０−エポキシ−ステアリン酸へのオレイン酸の転換、及び／又は９，１０−エポキシ−１２−オクタデセン酸又は１２，１３−エポキシ−９−オクタデセン酸又は９，１０，１２，１３−ジエポキシ−ステアリン酸のいづれか１つ又は複数へのリノール酸の転換、及び／又は９，１０−エポキシ−１２，１５−オクタデカジエン酸又は１２，１３−エポキシ−９，１５−オクタデカジエン酸、又は１５，１６−エポキシ−オクタデカジエン酸、又は９，１０，１２，１３−ジエポキシ−１５−オクタデセン酸、又は９，１０，１５，１６−ジエポキシ−１２−オクタデセン酸又は１２，１３，１５，１６−ジエポキシ−９−オクタデセン酸、又は９，１０，１２，１３，１５，１６−トリエポキシ−ステアリン酸のいづれか１つ又は複数へのリノレン酸の転換、及び／又は５，６−エポキシ−８，１１，１４−テトラコサトリエン酸、又は８，９−エポキシ−５，１１，１４−テトラコサトリエン酸、又は１１，１２−エポキシ−５，８，１４−テトラコサトリエン酸、又は１４，１５−エポキシ−５，８，１１−テトラコサトリエン酸、又は５，６，８，９−ジエポキシ−１１，１４−テトラコサジエン酸、又は５，６，１１，１２−ジエポキシ−８，１４−テトラコサジエン酸、又は５，６，１４，１５−ジエポキシ−８，１１−テトラコサジエン酸、又は８，９，１１，１２−ジエポキシ−５，１４−テトラコサジエン酸、又は８，９，１４，１５−ジエポキシ−５，１１−テトラコサジエン酸、又は１１，１２，１４，１５−ジエポキシ−５，８−テトラコサジエン酸、又は５，６，８，９，１１，１２−トリエポキシ−１４−テトラコセン酸、又は５，６，８，９，１４，１５−トリエポキシ−１１−テトラコセン酸、又は５，６，１１，１２，１４，１５−トリエポキシ−８−テトラコセン酸、又は８，９，１１，１２，１４，１５−トリエポキシ−５−テトラコセン酸のいづれか１つ又は複数へのアラキドン酸の転換。
当業者は、前記列挙されるすべての基質のすべては、天然源に由来できるものではないが、しかしこれにもかかわらず、化学的合成手段により生成され得ることを知っている。天然に存在する及び化合物に合成された不飽和脂肪酸の両者のエポキシ脂肪酸への転換は本発明の範囲内であり、本明細書に記載されるような本発明の核酸分子が前記転換を触媒することができる酵素又はその機能的部分をコードすることが唯一の必要条件である。
前述の議論によれば、当業者は、脂肪酸エポキシゲナーゼが、中でも、シトクロム−P450−依存性モノオキシゲナーゼ酵素又は混合された機能のモノオキシゲナーゼ酵素、又は他方では、ペルオキシド−依存性ペルオキシゲナーゼ酵素であり得ることを気づくであろう。しかしながら、本発明は、混合された機能のモノオキシゲナーゼ酵素であるそれらのエポキシゲナーゼ酵素、及びそれらの酵素をコードする核酸分子、並びにそれらの用途に特に向けられる。従って、本発明の核酸分子が、混合された機能のモノオキシゲナーゼ酵素である脂肪酸エポキシゲナーゼをコードすることが特に好ましい。
本発明の態様において、用語“混合された機能のモノオキシゲナーゼ酵素”は、脂肪酸分子における炭素結合又は炭素二重結合のエポキシ化を触媒するいづれかの酵素を言及するために使用され、ここで前記酵素はさらに、次のような３種のヒスチジンに富んでいる領域を含むアミノ酸の配列を含んで成る：
（ｉ）His-（Xaa）3-4-His;
（ii）His-（Xaa）2-3-His-His;及び
（iii）His-（Xaa）2-3-His-His、
ここで、Hisはヒスチジンを示し、Xaaは本明細書の表１に示されるようないづれかの天然に存在するアミノ酸残基を表わし、（Xaa）3-4は３又は４個のXaaの反復体を含んで成るアミノ酸の配列を言及し、そして（Xaa）2-3は２又は３個のXaaの反復体を含んで成るアミノ酸の配列を言及する。
用語“混合された機能のモノオキシゲナーゼ酵素様”とは、前記に列挙される３種のヒスチジンに富んでいる領域を含んで成るいづれかの酵素を言及するために用いられるであろう。
本明細書に記載される本発明の例示において、本発明者は、本明細書に提供されるクレピシパラエスチナアミノ酸配列が、前記に定義されたような混合された機能のモノオキシゲナーゼ酵素の特徴的なアミノ酸配列モチーフを包含するΔ12−エポキシゲナーゼ酵素を含んで成ることを示している。他の混合された機能のモノオキシゲナーゼ、たとえばデサチュラーゼ及びヒドロキシラーゼのアミノ酸配列と比較して、C.パラエスチナΔ12−エポキシゲナーゼ酵素（配列番号２）、と本明細書に提供されるような、同定されていないクレピシsp.及びベルノニアガラメンシスに由来するポリペプチドのアミノ酸配列との間の密接したアミノ酸配列同一性は、前記クレピシsp.及びV.ガラメンシスのアミノ酸配列がまた脂肪酸エポキシゲナーゼ酵素であり、そしてΔ12−エポキシゲナーゼ酵素であることを示唆する。これに関して、本明細書に例示されるベルノニアガラメンシスのアミノ酸配列は、わずか１つの完全な、ヒスチジンに富んでいるモチーフ（すなわちHis-Arg-Asn-His-His）、及び最初のヒスチジンに富んでいるモチーフの部分配列（すなわち、それはHis-Glu-Cys-Gly-His-Hisモチーフの最後の２つのヒスチジン残基を含んで成る）を含んで成る部分配列である。なぜならば、前記アミノ酸配列をコードするその対応するヌクレオチド配列は、この第１のヒスチジンに富んでいるモチーフに対する第１プライマー及び第３のヒスチジンに富んでいるモチーフ（すなわちHis-Val-Met-His-His）の上流の領域に企画される。第２の増幅プライマーを用いて、部分cDNA配列としてポリメラーゼ鎖反応により増幅されたからである。さらに、V.ガラメンシス配列が第１のヒスチジンに富んでいるモチーフに対して特異的なプライマーを用いて増幅された事実は、その対応する十分な長さの配列がまた、このモチーフを含んで成ることを示す。
従って、特に好ましい態様においては、本発明の核酸分子は、混合された機能のモノオキシゲナーゼ  エポキシゲナーゼ酵素、又はクレピシssp.、たとえばクレピシパラエスチナに由来し、又は他方では、ベルノニアガラメンシスに由来する同様の酵素をコードする。この態様によれば、対象のエポキシゲナーゼは、次のような３種又はそれ以上のヒスチジンに富んでいる領域を含むアミノ酸の配列、又はその相同体、類似体又は誘導体を少なくとも含んで成り：
（ｉ）His-Glu-Cys-Gly-His-His（配列番号15）;
（ii）His-Arg-Asn-His-His（配列番号16）;及び
（iii）His-Val-Met-His-His（配列番号17）、
ここで、Hisはヒスチジンを示し、Gluはグルタメートを示し、Cysはシステインを示し、Glyはグリシンを示し、Argはアルギニンを示し、Asnはアスパラギンを示し、Valはバリンを示し、そしてMetはメチオニンを示す。
本発明は明らかに、他の種に由来するエポキシゲナーゼ、たとえば、中でもクリソンテマムspp.及びユーホルビアラガスカエに由来するエポキシゲナーゼ遺伝子に拡張する。
好ましい態様においては、本発明を限定するものではないが、本発明により包含される他の種のエポキシゲナーゼ遺伝子は、混合された機能のモノオキシゲナーゼ酵素をコードする。本発明はさらに、そのような遺伝子によりコードされる、単離された又は組換えポリペプチド、及び前記遺伝子及びポリペプチドの使用にも及ぶ。
この態様に従って記載される本発明は、本明細書に定義されるようなエポキシゲナーゼ活性以外の酵素活性、特に、中でも、類似するヒスチジンに富んでいるモチーフを含むことが知られている、アラビドプシスタリアナ（Arabidopsis thaliana）、ブラシカジュンセア（Brassica juncea）、ブラシカナパス（Brassica napus）又はグリシンマックス（Glycine max）に由来するΔ12−デサチュラーゼ酵素をコードする核酸分子を包含しない。
本明細書において、アミノ酸配列の“相同体”とは、本発明のポリペプチド、酵素又はタンパク質に由来し、又は他方では、いづれかの天然に存在するアミノ酸の置換、付加又は欠失にもかかわらず、前記に列挙されるアミノ酸配列に実質的に対応する、それらのアミノ酸配列又はペプチド配列を言及する。
たとえば、アミン酸は、α−らせん構造又はβ−シート構造、等を形成し又は破壊するために、類似する性質、たとえば疎水性、親水性、疎水性モーメント、抗原性、傾向を有する他のアミノ酸によって置換され得る。他方では、又はさらに、相同アミノ酸配列のアミノ酸は、類似する性質、たとえば疎水性、親水性、疎水性モーメント、電荷、又は抗原性、等を有する他のアミノ酸により置換され得る。
本明細書に企画される天然に存在するアミノ酸残基は、表１に記載される。
アミノ酸配列の相同体は、当業者に知られているいづれかの方法、たとえばFmoc化学を用いることによって生成される合成ペプチドであり得る。
他方では、アミノ酸配列の相同体は、天然源、たとえば本発明のポリペプチド、酵素又はタンパク質と同じか又は他の種から誘導され得る。前記列挙されるアミノ酸配列の相同体の好ましい源は、本明細書において企画されるいづれかの源を包含する。
アミノ酸配列の“類似体”とは、いづれかの天然に存在しないアミノ酸類似体の発生にもかかわらず、前記列挙されるアミノ酸配列に対して実質的に同一であるそれらのアミノ酸配列を包含する。
本明細書において企画される好ましい天然に存在しないアミノ酸は、下記表２に列挙される。
アミノ酸配列に関する用語“誘導体”とは、上記列挙されるアミノ酸配列の変異体、一部、フラグメント又はポリペプチド融合体をこの後、言及するために使用されるであろう。誘導体は、リガンド、たとえば炭水化物、酵素、タンパク質、ポリペプチド、又はレポーター分子、たとえば放射性核種又は螢光化合物がそこに含まれる１又は複数のアミノ酸残基に結合されている、修飾されたアミノ酸配列又はペプチドを包含する。対象ペプチドのグリコシル化された、螢光、アシル化された又はアルキル化された形もまた、本発明により包含される。さらに、誘導体は本明細書に開示されるアミノ酸配列のフラグメント又は一部を含んで成り、そして対象配列の複数のコピーを含んで成るホモポリマー又はヘテロポリマーとして、本発明の範囲内にある。
ペプチドを誘導体化するための方法は、当業界において良く知られている。
置換は、アミノ酸が異なった天然に存在するか又は非従来のアミノ酸残基により置換されているアミノ酸変更を包含する。そのような置換は、“保存性”として分類され得、この場合、アミノ酸残基が次のように、類似する特性のもうつ１の天然に存在するアミノ酸により置換される：
0004108765.tif 000003
本発明により包含される置換はまた、“非保存性”でもあり得、ここでリプレッサーポリペプチドに存在するアミノ酸残基が、異なった性質を有するアミノ酸、たとえば異なったグループからの天然に存在するアミノ酸（たとえば、アラニンにより荷電された又は疎水性アミノ酸を置換されている）により置換され、又は他方では、天然に存在するアミノ酸が非従来のアミノ酸により置換される。
アミノ酸置換は典型的には、単一の残基の置換であるが、しかし複数の残基、たとえばクラスター又は分散された残基の置換でもあり得る。
アミノ酸欠失は通常、約１〜10個の程度のアミノ酸残基の欠失であり、ところが挿入はいづれの長さの挿入でもあり得る。欠失及び挿入は、Ｎ−末端、Ｃ−末端、又は内部欠失又は挿入に対して行なわれ得る。一般的に、アミノ酸配列内の挿入は、アミノ−又はカルボキシル−末端融合よりも小さく、そして１〜４個の程度のアミノ酸残基の挿入であろう。
本発明は、エポキシゲナーゼ遺伝子の内因性細胞補体への付加として細胞のゲノム中に組込まれる場合、対象の単離された核酸分子に明らかに及ぶ。他方では、宿主細胞がエポキシ脂肪酸生合成のために必要とされる酵素を通常コードしない場合、本発明は、内因性細胞ゲノムへの付加として前記細胞のゲノム中に組込まれる場合、対象の単離された核酸分子に及ぶ。
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本発明の第２の観点は、配列番号１、３、５、19又は20、又はそれに対して相補的な配列のいづれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はその相同体、類似体又は誘導体を含んで成る単離された核酸分子を提供する。
命名のためには、配列番号１で示されるヌクレオチド配列は、クレピシパラエスチナに由来し、そして配列番号２に示される、混合された機能のモノオキシゲナーゼ配列又は混合された機能のオキシゲナーゼ様配列をコードする。本明細書に例示されるように、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、エポキシゲナーゼ活性、より特定には、Δ12−エポキシゲナーゼ活性を有する。
配列番号３で示されるヌクレオチド配列は、高レベルのベルノール酸を含むC.パラエスチナ以外のクレピシsp.に由来するcDNAに対応する。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号３で提供されるクレピシsp.エポキシゲナーゼ遺伝子の誘導されたアミノ酸配列に対応する。
配列番号５で示されるヌクレオチド配列は、混合された機能のモノオキシゲナーゼのコンセンサス配列、たとえば本発明のクレピシspp.エポキシゲナーゼ遺伝子配列に由来する増幅プライマーを用いて、ベルノニアガラメンシスから誘導された、増幅されたDNAに対応する。その増幅されたDNAは、混合された機能のモノオキシゲナーゼ酵素の特徴を示すヒスチジンに富んでいるモチーフHis-Arg-Asn-His-Hisをコードすることができるヌクレオチド配列を包含する、部分エポキシゲナーゼ遺伝子配列を含んで成る。配列番号６に示されるアミノ酸配列は、配列番号５で提供されるベルノニアガラメンシスエポキシゲナーゼ遺伝子の誘導されたアミノ酸配列に対応する。
配列番号７で示されるヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子を単離するためにプローブとして使用されたクレピシアルピナアセチレナーゼ遺伝子の部分配列に関係する。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、C.アルピナアセチレナーゼ遺伝子の前記部分配列の誘導されたアミノ酸配列に対応する。
本明細書において使用される場合、用語“アセチレナーゼ”とは、脂肪酸基質分子における炭素二重結合の炭素三重結合への転換を触媒することができ、又は他方では、脂肪酸分子における炭素三重結合の形成を触媒することができる酵素を言及するために用いられるであろう。
配列番号18に示されるヌクレオチド配列は、推定上のユーホルビナラガスカエエポキシゲナーゼ遺伝子配列を増幅するために使用される変性増幅プライマーに対応する。これに関して、配列番号18で示されるヌクレオチド残基は、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推薦される残基であり、ここで、Ａはアデニンを表わし、Ｃはシトシンを表わし、Ｇはグアニンを表わし、Ｔはチミンを表わし、Ｙはピリミジン残基を表わし、Ｒはプリン残基を表わし、Ｍはアデニン又はシトシンを表わし、Ｋはグアニン又はチミンを表わし、Ｓはグアニン又はシトシンを表わし、Ｗはアデニン又はチミンを表わし、Ｈはグアニン以外のヌクレオチドを表わし、Ｂはアデニン以外のヌクレオチドを表わし、Ｖはチミン以外のヌクレオチドを表わし、Ｄはシトシン以外のヌクレオチドを表わし、そしてＮはいづれのヌクレオチド残基でも表わす。
配列番号19で示されるヌクレオチド配列は、ユーホルビナラガスカエに由来し、そして推定上のシトクロムP-450-依存性モノオキシゲナーゼ配列又はシトクロムP-450-依存性モノオキシゲナーゼ様配列をコードする。
配列番号20で示されるヌクレオチド配列は、ユーホルビナラガスカエに由来し、そして推定上のシトクロムP-450-依存性モノオキシゲナーゼ配列又はシトクロムP-450-依存性モノオキシゲナーゼ様配列をコードする。
本発明は明らかに、配列番号１、３、５、19又は20のいづれか１つに例示されるcDNA分子のゲノム遺伝子同等物にも及ぶ。
特に最とも好ましい態様においては、本発明は、配列番号１、３、５、19、又は20のいづれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記ヌクレオチド配列のゲノム遺伝子同等物を含んで成る単離された核酸分子、又はその相同体、類似体又は誘導体を提供する。
本発明のためには、ヌクレオチド配列の“相同体”とは、配列内での１又は複数のヌクレオチドの置換、挿入、欠失又は再配列の発生にもかかわらず、本発明の核酸分子又はその相補的配列と実質的に同じである単離された核酸分子を言及するために用いられるであろう。
本明細書において示されるヌクレオチド配列の“類似体”とは、単離された核酸分子に通常存在しないいづれかのヌクレオチド成分、たとえば炭水化物、放射性化学物質、たとえば放射性ヌクレオチド、レポーター分子、たとえばDIG、アルカリホスファターゼ、又はホースラディッシュペルオキシダーゼ（但し、それらだけには限定されない）の発生にもかかわらず、本発明の核酸分子又はその相補的ヌクレオチド配列と実質的に同じである単離された核酸分子を言及するために用いられるであろう。
本明細書に示されるヌクレオチド配列の“誘導体”とは、前記配列又はその一部に対しての有意な配列類似性を含むいづれかの単離された核酸分子を言及するために用いられるであろう。
一般的に、本発明の核酸分子の相同体、類似体又は誘導体は、合成手段により生成され、又は他方では、天然に存在する源から誘導される。たとえば、本発明のヌクレオチド配列は、前記に示されるように、単一又は複数のヌクレオチド置換、欠失及び／又は挿入を生成するために突然変異誘発にゆだねられ得る。
本発明の１つの態様において、配列番号１、３、５、19、又は20のいづれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれに対する相補的配列の好ましい相同体、類似体又は誘導体は、免疫学的に活性的な又は酵素学的に活性的なポリペプチドをコードする。
本明細書において使用される場合、“免疫学的に活性的な”とは、哺乳類における免疫応答、特に、抗体分子、たとえばIgM又はIgG分子、又は前記抗体分子を含む完全な血清（但し、それらだけには限定されない）を生成するのに十分な免疫応答を誘発するポリペプチド分子の能力を言及するために用いられるであろう。用語“免疫学的に活性的な”とはまた、モノクローナル抗体、抗体分子の合成Fabフラグメント、一本鎖抗体分子、又は他の免疫相互作用性分子の生成のための十分な免疫応答を誘発するポリペプチドの能力にも及ぶ。
本明細書において使用される場合、用語“酵素学的に活性的な”とは、酵素反応、特に、脂肪酸基質分子における炭素結合のエポキシ化を包含する酵素反応を触媒するポリペプチド分子の能力を言及するために用いられるであろう。より特定には、本発明を限定するつもりではないが、用語“酵素的に活性的な”とはまた、脂肪酸基質分子、たとえばリノール酸又はベルノール酸におけるΔ９又はΔ-12のエポキシ化を触媒するポリペプチド分子の能力を言及することができる。
他の態様においては、配列番号１、３又は５のいづれか１つに示されるヌクレオチド配列又はそれに対する相補的配列の好ましい相同体、類似体又は誘導体は、クレピシsp.アセチレナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列以外の、少なくとも20個の隣接したヌクレオチドに対して少なくとも65%同一であるヌクレオチドの配列を含んで成る。
より好ましくは、配列番号１、３又は５のいづれか１つに対する%同一性は、少なくとも約85%である。さらにより好ましくは、配列番号１、３又は５の相同体、類似体又は誘導体は、少なくとも100、250、500又は1000個の隣接したヌクレオチドに対して少なくとも約90%同一であり、そしてさらにより好ましくは、約95%同一である。
配列番号19又は20、又はそれに対する相補的配列に対する%同一性は、少なくとも約200個の隣接したヌクレオチドに対して、少なくとも約75%、さらにより好ましくは、少なくとも約80%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、及びさらにより好ましくは少なくとも約95%、最とも好ましくは、少なくとも約99%である。配列番号19又は20における少なくとも約400個の隣接したヌクレオチドに対して少なくとも65%の同一性のヌクレオチド配列もまた、本発明の範囲内である。
複数のヌクレオチド又はアミノ酸配列間の%同一性又は%類似性は、当業者により知られているいづれかの標準のアルゴリズムを用いて決定される場合、一列のヌクレオチド又はアミノ酸配列における同一又は類似する残基の数を言及するために用いられるであろう。特に、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性及び類似性は、残基適合の数を最大にし、そして配列ギャップの数を最少にするために、Needleman and Wunsch（1970）のアルゴリズムを用いるGapプログラムを用いて、計算され得る。そのGapプログラムは、sequence and Analysis Software Package of the Computer Genetics Group Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin, United States of America（Devereuxなど., 1984）の一部である。
さらなるもう１つの態様においては、配列番号１、３、５、19又は20のいづれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれに対する相補的配列の好ましい相同体、類似体又は誘導体は、少なくとも低い緊縮条件下で、前記配列に由来する少なくとも20個の隣接したヌクレオチドに対してハイブリダイズする。
より好ましくは、ハイブリダイゼーションの緊縮性は、少なくとも中位の緊縮性であり、さらにより好ましくは、少なくとも高い緊縮性である。緊縮性のレベルを定義するためは、当業者は、いくつかの異なったハイブリダイゼーション条件が使用され得ることを知っているであろう。たとえば、低い緊縮性は、６×SSC緩衝液、0.1%（w/v）のSDSにおいて28℃で実施されるハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を包含する。中位の緊縮性は、２×SSC緩衝液、0.1%（w/v）のSDSにおける45℃〜65℃でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を包含する。高い緊縮性は、0.1×SSC緩衝液、0.1%（w/v）のSDSにおいて、少なくとも65℃の温度で実施されるハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を包含する。
一般的に、緊縮性は、SSC緩衝液の濃度を低め、そして／又はハイブリダイゼーション緩衝液又は洗浄緩衝液におけるSDSの濃度を高め、そして／又はハイブリダイゼーション及び／又は洗浄が実施される温度を高めることによって高められる。ハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件は、当業者に十分に理解されている。核酸分子間のハイブリダイゼーションに影響を及ぼすパラメーターを明らかにするためには、引用により本明細書に組込まれるAusubelなど．（1987）の2.10.8〜2.10.16ページを参照のこと。
本明細書に開示される単離された核酸分子は、当業者に知られている多くの手段のいづれか１つの手段を用いて、他の細胞、組織又は器官タイプから、又はもう１つの種の細胞、組織又は器官から、その相同体、類似体又は誘導体を単離し、又は同定するために使用され得る。
たとえば、ゲノムDNA、又はmRNA、又はcDNAは、少なくとも低い緊縮ハイブリダイゼーション条件又は同等の条件下で、配列番号１、３、５、19又は20のいづれか１つに示されるヌクレオチド配列、又はそれに対して相補的な配列、又はその機能的部分を含んで成る、ハイブリダイゼーション有効量の単離された核酸分子により構成され得、そしてそのハイブリダイゼーションは検出手段を用いて検出され得る。
検出手段は、本発明の単離された核酸分子に共有結合される同定可能なシグナル（たとえば、放射性同位体、たとえば32P又は35S、又はビオチニル化された分子）を付与することができるレポーター分子であり得る。
他の方法においては、検出手段は、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）のいづれか既知の形式である。この方法によれば、約15〜50個の長さのヌクレオチドの核酸“プライマー分子”の変性プールが、配列番号１、３、５、19又は20に示されるヌクレオチド配列、又はそれに対する相補的配列に基づいて企画される。その相同体、類似体又は誘導体（すなわち、“鋳型分子”）が前記２種のプライマー分子にハイブリダイズされ、ここで、第１プライマーが鋳型分子の１つの鎖上の領域にハイブリダイズし、そして第２プライマーがその相補的配列にハイブリダイズし、ここで前記第１及び第２プライマーは鋳型分子の同じか又はオーバラップする領域内でハイブリダイズされず、そして個々のプライマーは、他のプライマーが反対鎖上でハイブリダイズされる位置に対して、５’→３’の配向で位置を定められる。鋳型分子の特定の核酸分子コピーが、ポリメラーゼ鎖反応、すなわち当業者に良く知られている技法により酵素的に増幅される。
プライマー分子は、いづれかの天然に存在するヌクレオチド残基（すなわち、アデニン、シチジン、グアニン、チミジン）を含んで成り、そして／又はポリヌクレオチド分子中に組込まれ得る、イノシン、又はその機能的類似体又は誘導体を含んで成る。核酸プライマー分子はまた、他の核酸プライマー分子の水性混合物にも含まれ得、又は実質的に純粋な形で存在し得る。
検出される配列は、ウィルス粒子、バクテリオファージ粒子、酵母細胞、動物細胞又は植物細胞において、組換え形で存在し得る。好ましくは、関連する遺伝子配列は、もうつ１の植物種に起因する。
本発明の第３の観点は、配列番号２、４、又は６のいづれか１つに示されるアミノ酸配列、又はその相同体、類似体又は誘導体をコードする単離された核酸分子を提供する。
本明細書において企画される１つの態様においては、配列番号２、４、又は６に示されるアミノ酸配列の好ましい相同体、類似体又は誘導体は、上記で定義されたように、免疫学的に活性的な又は酵素的に活性的なポリペプチドである。
本発明のもう１つの態様においては、配列番号２、４又は６のいづれか１つに示されるアミノ酸配列の好ましい相同体、類似体又は誘導体は、クレピシsp.アセチレナーゼポリペプチド以外の、少なくとも60%同一であるアミノ酸の配列を含んで成る。より好ましくは、本発明により包含される、配列番号２、４又は６の相同体、類似体又は誘導体は、少なくとも約85%同一であり、さらに好ましくは、少なくとも約90%同一であり、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約95%同一であり、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約99%〜100%同一である。
配列番号２、４又は６のいづれか１つの相同体、類似体又は誘導体は、上記で定義されたようなヒスチジンに富んでいる領域をさらに含んで成る。さらにより好ましくは、対象エポキシゲナーゼは、下記のような、３又はそれ以上のヒスチジンに富んでいる領域を含む、アミノ酸の配列、又はその相同体、類似体又は誘導体を少なくとも含んで成る：
（ｉ）His-Glu-Cys-Gly-His-His（配列番号15）;
（ii）His-Arg-Asn-His-His（配列番号16）;及び
（iii）His-Val-Met-His-His（配列番号17）。
このもう１つの態様に従って記載される発明は、中でも、アラビドプシスタリアナ、ブラシカジュンセア、ブラシカナパス又はグリシンマックスに由来するΔ12−デサチュラーゼ酵素を包含しない。
本発明の単離された核酸分子は、センス分子を含んで成る遺伝子構造体を開発するために有用であり、ここで前記遺伝子構造体は、前記核酸分子を通常発現しない細胞における発現のために、又は前記核酸分子を通常発現する細胞における前記核酸分子の過剰発現のために企画される。
従って、本発明のさらなる観点は、プロモーター配列に操作可能的に連結されるセンス配列を含んで成る遺伝子構造体を提供する。
用語“センス分子”とは、本明細書において使用される場合、脂肪酸エポキシゲナーゼをコードする単離された核酸分子をコードするか、又はそれに対して相補的である単離された核酸分子を言及するために用いられ、ここで前記核酸分子は、前記センス分子がトランスフェクション又は形質転換により宿主細胞中に導入される場合、組換えポリペプチドを生成するためにその発現のために適切な形式で提供される。
当業者は、遺伝子構造体が細胞を“トランスフェクトする”ために使用されることを気づくであろうし、この場合、その遺伝子構造体は細胞のゲノム中への組込みを伴わないで、前記細胞中に導入される。他方では、遺伝子構造体は、細胞を“形質転換する”ために使用され得、この場合、その遺伝子構造体は前記細胞のゲノム中に安定して組込まれる。
脂肪酸エポキシゲナーゼ遺伝子配列、又はその相同体、類似体、又は誘導体に対応するセンス分子は、前記細胞のトランスフェクション又は形質転換のためのいづれかの既知方法を用いて、細胞中に導入され得る。細胞が本発明の遺伝子構造体により形質転換される場合、完全な生物が、当業者に知られているいづれかの方法を用いて、単一の形質転換された細胞から再生され得る。
従って、本明細書に記載されるエポキシゲナーゼ遺伝子は、トランスフェクトされた又は形質転換された細胞が由来する属又は種と同じ属又は種に属する野生又は天然に存在する生物により通常、生成されないエポキシ脂肪酸を合成する単一の細胞又は完全な生物を開発するために、又はそのような野生又は天然に存在する生物に通常見出されるレベル以上にそのような脂肪酸のレベルを高めるために、使用され得る。
もう１つの好ましい態様においては、本発明の単離された核酸分子は、適切なプロモーター配列の制御下で、アンチセンス配向に、又はリボザイム又は同時−抑制分子として、細胞において発現される場合、その細胞におけるエポキシ脂肪酸のレベルを低めることができる。
同時−抑制は、内因性遺伝子の１又は複数のコピー、又は実質的に類似する遺伝子の１又は複数のコピーが細胞中に導入される場合に生じる、その内因性遺伝子の発現の低下である。本発明はまた、本明細書に記載されるように、エポキシゲナーゼ遺伝子の発現を阻害するためへの同時−抑制の使用にも及ぶ。
本発明の態様においては、アンチセンス分子は、ポリペプチドに翻訳され得る“センス”mRNA分子を生成するために通常、転写されるRNA分子に、核遺伝子の相補的鎖から転写されるRNA分子である。従って、アンチセンス分子は、センスmRNA又はその一部に対して相補的である。本発明のアンチセンス分子の作用をいづれかの特定の機構に制限するものではないが、アンチセンスRNA分子は、センスmRNAと対合する塩基により二本鎖mRNAを形成する能力を有し、これが、センスmRNAの翻訳、及びポリペプチド遺伝子生成物の続く合成を妨げることができる。
リボザイムは、２つの領域、すなわち標的センスmRNAにおける少なくとも５個の隣接したヌクレオチド塩基の個々に対して相補的なハイブリダイズする領域を含んで成る合成RNA分子である。さらに、リボザイムは、標的センスmRNAを自動触媒的に切断する高い特異性のエンドリボヌクレアーゼ活性を有する。リボザイムの機能の完全な記載は、Haseloff and Gerlach（1988）により示されており、そして国際特許出願番号WO89/05852に含まれる。本発明は、本明細書に記載されるエポキシゲナーゼポリペプチドをコードするセンスmRNAを標的化するリボザイムに及び、それにより、前記センスmRNAにハイブリダイズし、そしてそれを切断し、その結果、それは機能的ポリペプチド生成物を合成するために、もはや翻訳され得ない。
この態様によれば、本発明は、本明細書に記載されるエポキシゲナーゼをコードするセンスmRNAと共に、水素−結合された複合体を形成し、前記mRNAの翻訳を低めることができる隣接したヌクレオチド塩基の配列を含んで成る、リボザイム又はアンチセンス分子を提供する。好ましいアンチセンス及び／又はリボザイム分子は標的分子の少なくとも約10〜20個のヌクレオチドに対してハイブリダイズするけれども、本発明は、少なくとも約50〜100個の長さのヌクレオチド塩基にハイブリダイズすることができる分子、又は十分な長さの又は実質的に十分な長さのエポキシゲナーゼmRNAにハイブリダイズすることができる分子に及ぶ。
中でも、ヌクレオチド置換を包含する一定の修飾が、エポキシゲナーゼ遺伝子の発現の阻害におけるアンチセンス及び／又はリボザイム分子の効能を破壊しないで、その本発明の前記分子に対して行なわれ得ることは、当業界において理解されている。従って、前記遺伝子のいづれかのヌクレオチド配列変異体、相同体、類似体又はフラグメントを包含することは、本発明の範囲内であり、その唯一の必要条件は、前記ヌクレオチド配列変異体が、転写される場合、前記センスmRNA分子にハイブリダイズすることができるアンチセンス及び／又はリボザイム分子を生成することである。
本発明は、細胞におけるエポキシ脂肪酸のレベルを変更することができる、センス分子、アンチセンス分子、リボザイム分子、又は同時−抑制分子の発現を促進するために企画された遺伝子構造体に及ぶ。
特に好ましい態様において、植物又は他の生物由来の細胞のエポキシ脂肪酸組成を変えることができる、センス分子、アンチセンス分子、リボザイム分子、同時−抑制分子、又は遺伝子標的化分子は、配列番号１、３、５、19又は20のいづれか１つに及びより好ましくは、配列番号１、３又は５のいづれか１つに、及びさらにより好ましくは、配列番号１に示されるヌクレオチドの配列又はその相補的鎖、相同体、類似体、又は誘導体を含んで成る。
当業者はまた、センス、アンチセンス、リボザイム又は同時−抑制分子の発現が、プロモーター配列と操作可能的に連結して配置される本発明の核酸分子を必要とすることを気づくであろう。本発明のためのプロモーターの選択は、必要とされるセンス分子の発現のレベル、及び／又は宿主細胞が由来する種、及び／又は必要とされるセンス分子の発現の組織−特異性又は発生−特異性に依存して変化することができる。
本明細書において、“プロモーター”に関する言及は、その最とも広い情況下で取られ、そして従来の真核生物のゲノム遺伝子の転写調節配列、たとえばCCAATボックス配列を伴って又は伴わないで、正確な転写開始のために必要とされるTATAボックス、及び発生及び／又は外部刺激に応答して、又は組織特異的態様で遺伝子発現を変える追加の調節要素（すなわち、上流の活性化配列、エンハンサー、及びサイレンサー）を包含する。本発明においては、用語“プロモーター”はまた、従来の原核生物の遺伝子の転写調節配列を包含し、この場合、それは−35ボックス配列及び／又は−10ボックス転写調節配列を含む。
本発明において、用語“プロモーター”はまた、細胞における前記センス分子の発現を付与し、活性化し、又は増強する、合成又は融合分子、又は誘導体を説明するためにも使用される。好ましいプロモーターは、センス分子の発現をさらに増強し、そして／又は前記センス分子の空間的発現及び／又は一時的な発現を変えるために、１又は複数の特定の調節要素の追加のコピーを含むことができる。たとえば、銅−応答性調節要素は、銅誘発性発現を付与するためにセンス分子の発現を駆動する異種プロモーター配列に連接して配置され得る。
プロモーター配列の調節制御下へのセンス、アンチセンス、リボザイム又は同時−抑制分子の配置は、発現がそのプロモーター配列により制御されるよう前記分子を位置決定することを意味する。プロモーターは、通常、それが調節する核酸分子の上流又は５’側に配置されるが、しかし必ずしも必要ではない。さらに、プロモーターを含んで成る調節要素は通常、センス、アンチセンス、リボザイム又は同時−抑制分子、又はそれらを含んで成るキメラ遺伝子の転写の開始の２kb以内に配置される。異種プロモーター／構造遺伝子の組合せの構成においては、プロモーターと、それがその天然の設定下で制御する遺伝子、すなわちプロモーターが由来する遺伝子との間の距離とほぼ同じである、遺伝子転写開始部位から一定の距離でプロモーターを配置することが一般的に好ましい。当業界において知られているように、この距離におけるいくらかの変動は、プロモーター機能の損失を伴わないで実施され得る。同様に、その制御下に配置される異種遺伝子に関しての調節配列要素の好ましい位置決定は、その天然の設定下での要素、すなわちそれが由来する遺伝子の位置決定により定義される。再び、当業界において知られているように、この距離におけるいくらかの変動がまた発生し得る。
本発明の遺伝子構造体への使用のための適切なプロモーターの例は、単離された細胞又はそれから再生される完全な生物において機能することができる、ウィルス、酵母、カビ、細菌、昆虫、鳥、哺乳類、及び植物の遺伝子に由来するプロモーターを包含する。プロモーターは、中でも、発現が生じる組織に関して、又は発現が生じる発生段階に関して、又は外部刺激、たとえば生理学的ストレス、病原体又は金属イオンに応答して、センス、アンチセンス、リボザイム又は同時−抑制分子の発現を、構成的又は特異的に調節することができる。
プロモーターの例は、CaMV 35Sプロモーター、NOSプロモーター、オクトピンシンターゼ（OCS）プロモーター、アラビドプシスタリアナSSU遺伝子プロモーター、ナピン種子−特異的プロモーター、P32プロモーター、BK5-T immプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、ファージラムダλL又はλRプロモーター、CMVプロモーター（アメリカ特許第5,168,062号）、T7プロモーター、lac UV5プロモーター、SV40初期プロモーター（アメリカ特許第5,118,627号）、SV40後期プロモーター（アメリカ特許第5,118,627号）、アデノウィルスプロモーター、バキュロウィルスP10又はポリヘドリンプロモーター（アメリカ特許第5,243,041号、第5,242,687号、第5,266,317号、第4,745,051号及び第5,169,784号）、及び同様のものを包含する。本明細書において同定される特定のプロモーターの他に、いわゆるハウスキーピング遺伝子のための細胞プロモーターが有用である。
この態様に従っての好ましいプロモーターは、酵母、カビ又は植物細胞において機能することができるそれらのプロモーターである。より好ましくは、この態様に従って使用するために適切なプロモーターは、油性酵母、油性カビ、又は脂肪種子収穫植物、たとえば商標Linola▲Ｒ▼として市販されている亜麻（この後、“Linola▲Ｒ▼亜麻”として言及される）、ヒマワリ、べに花、大豆、亜麻仁、ゴマ、綿種子、ラッカセイ、オリーブ、又はギネアアブラヤシに由来する細胞において機能することができる。
Linola▲Ｒ▼は、Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation（CSIRO）, Australiaの登録商標である。
より好ましい態様においては、プロモーターは、エポキシゲナーゼ酵素をコードするゲノムクローンに由来し、好ましくは、クリソンテマムspp.,クレピシspp.たとえばC.パラエスチナ又は他のクレピシsp.,ユーホルビアラガスカエ又はベルノニアガラメンシス（本明細書において言及される）に由来するエポキシゲナーゼ遺伝子のゲノム遺伝子同等物に由来する。
より好ましい態様においては、プロモーターは、高度に発現された種子遺伝子、たとえば、中でもナピン遺伝子に由来することができる。
本発明の遺伝子構造体は、さらにターミネーター配列を含むことができ、そして適切な宿主中に導入され、ここでそれは、組換えポリペプチド遺伝子生成物、又は他方では、リボザイム又はアンチセンス分子を生成するために発現され得る。
用語“ターミネーター”とは、転写の終結を知らせる転写ユニットの最後でのDNA配列を言及する。ターミネーターは、一次転写物の３’−末端へのポリアデニレート配列の付加を促進するポリアデニル化シグナルを含む３’−非翻訳DNA配列である。ウィルス、酵母、カビ、細菌、昆虫、鳥、哺乳類、及び植物に由来する細胞において活性的なターミネーターが知られており、そして文献に記載されている。それらは、細菌、菌類、ウィルス、動物及び／又は植物から単離され得る。
本発明の遺伝子構造体への使用のために特に適切であるターミネーターの例は、中でも、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンターゼ（NOS）遺伝子ターミネーター、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）35S遺伝子のターミネーター、ゼアメイズ（Zea mays）からのzein遺伝子ターミネーター、Rubisco小サブユニット（SSU）遺伝子ターミネーター配列、サブクローバースタントウィルス（SCSV）遺伝子配列ターミネーター、いづれかのrho−依存性E.コリターミネーターを包含する。
当業者は、本発明の実施への使用のために適切である追加のプロモーター配列及びターミネーター配列を知っているであろう。そのような配列は、いづれの過度の実験も伴わないで、容易に使用され得る。
本発明の遺伝子構造体は、前記遺伝子構造体が前記細胞においてエピソーム遺伝子要素（たとえば、プラスミド又はコスミド分子）として維持されることが必要とされる場合、特定の細胞系、たとえば細菌細胞において複製のために必要とされる、複製配列の起点をさらに含むことができる。
複製の好ましい起点は、複製のf1-ori及びcolE1起点を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
遺伝子構造体はさらに、前記遺伝子構造体が導入される細胞において機能的である選択マーカー遺伝子を含んで成る。
本明細書において使用される場合、用語“選択マーカー遺伝子”とは、それが、本発明の遺伝子構造体又はその誘導体によりトランスフェクトされるか、又は形質転換される細胞の同定及び／又は選択を促進するために発現される細胞に対して表現型を付与するいづれかの遺伝子を包含する。
本明細書において使用される適切な選択マーカー遺伝子は、中でも、アンピシリン耐性遺伝子（Ampγ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Tcγ）、細菌カナマイシン耐性遺伝子（Kanγ）、ホスフィノトリシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（nptII）、ヒグロマイシン耐性遺伝子、β−グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子及びルシフェラーゼ遺伝子を包含する。
本発明のさらなる観点は、本明細書に記載されるような、組換えエポキシゲナーゼ、ポリペプチド、又はリボザイム、アンチセンス又は同時−抑制分子、又はその相同体、類似体又は誘導体を発現する、トランスフェクトされた又は形質転換された細胞、組織、器官又は完全な生物を提供する。
好ましくは、単離された核酸分子は、本明細書に記載されるような遺伝子構造体内に含まれる。本発明の遺伝子構造体は、当業者に知られている種々の技法により細胞中に導入され得る。使用される技法は、特定の生物について既知の好結果をもたらす技法に依存して変化することができる。
細菌細胞、酵母細胞、又は植物、昆虫、菌類（カビを包含する）、鳥類、又は哺乳類組織又は細胞中に組換えDNAを導入するための技法は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：CaCl2を用いての形質転換及びその変法、特にHanahan（1983）により記載される方法、プロトプラスト中への直接的なDNA摂取（Krensなど、1982; Paszkowskiなど、1984）、プロトプラスト中へのPEG−介在性摂取（Armstrongなど、1990）、微小粒子衝撃、エレクトロポレーション（Frommなど、1985）、DNAのマイクロインジェクション（Crosswayなど、1986）、組織外植体又は細胞の微小粒子衝撃（Christonなど、1988; Sanford, 1988）、核酸による組織の真空−浸潤、又は植物の場合、Anなど、（1985）、Herrera-Estrellaなど．（1983a, 1983b, 1985）により実質的に記載されるような、植物組織へのアグロバクテリウムからのT-DNA-介在性トランスファー。
細胞の微小粒子衝撃に関しては、微小粒子が、形質転換された細胞を生成するために、細胞中に推進される。いづれかの適切な衝撃性細胞形質転換方法論及び装置が、本発明を実施するために使用され得る。典型的な装置及び方法は、Stompなど.（アメリカ特許第5,122,466号）及びSanford and Wolf（アメリカ特許第4,945,050号）により開示されている。衝撃性形質転換方法を用いる場合、遺伝子構造体は、形質転換されるべき細胞において複製できるプラスミドを組込むことができる。
そのようなシステムへの使用のために適切な微小粒子の例は、１〜５μmの金球体を包含する。DNA構造体が、いづれかの適切な技法により、たとえば沈殿法により、微小粒子上に沈着され得る。
特に好ましい態様においては、遺伝子構造体が、“センス”分子を含む場合、それから生成される組換えエポキシゲナーゼポリペプチドは酵素的に活性であることが特に好ましい。
他方では、細胞が多細胞生物に由来し、そして適切な技法が利用できる場合、完全な生物が、当業界において広く知られている方法に従って、形質転換された細胞から再生され得る。
当業者はまた、他のタイプの細胞、たとえば菌類細胞を形質転換し、再生し、そして増殖するための方法も知っているであろう。
植物の場合、続くクローン増殖できる植物組織が、器官発生か又は胚発生かのいづれにかかわらず、本発明の遺伝子構造体により形質転換され、そして完全な植物がそれから再生される。選択される特定の組織は、利用できるクローン増殖システムに依存して変化し、そして最良に適合されて、特定の種が形質転換される。典型的な組織標的物は、葉ディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、存在する分裂組織（たとえば、先端分裂組織、葉腋芽、及び根の分裂組織）、及び誘発された分裂組織（たとえば子葉分裂組織及び胚軸分裂組織）を包含する。
用語“器官発生”とは、本明細書において使用される場合、苗条及び根が分裂組織中心から連続的に成長せしめられる工程を意味する。
用語“胚発生”とは、本明細書において使用される場合、苗条及び根が、体細胞又は配偶子からにかかわらず、協調された態様（連続的ではない）で、一緒に成長する工程を意味する。
再生される、形質転換された植物は、種々の手段により、たとえばクローン増殖、又は従来の育種技法により繁殖され得る。たとえば、第１世代（又はT1）の形質転換された植物がホモ接合性第２世代（又はT2）の形質転換体を付与するために自家授粉され、そしてT2植物が従来の育種技法を通してさらに繁殖される。
本発明において企画される、再生される形質転換された生物は、種々の形を取ることができる。たとえば、それらは、形質転換された細胞と形質転換されていない細胞とのキメラ；クローン形質転換体（たとえば、発現カセットを得るために形質転換されたすべての細胞）；形質転換された及び形質転換されていない組織の移植体（たとえば、植物においては、形質転換されていない若枝に接木される形質転換された根台木）であり得る。
本発明のさらなる観点は、細胞、組織、器官又は生物におけるエポキシ脂肪酸のレベルを変えるための方法を提供し、ここで前記方法は、前記細胞において、本明細書に記載されるような、センス、アンチセンス、リボザイム又は同時−抑制分子を、エポキシ脂肪酸のレベルを高め又は低めるのに十分な時間及び十分な条件下で、発現せしめることを含んで成る。
好ましい態様においては、本発明の方法は、センス、アンチセンス、リボザイム又は同時−抑制分子により、細胞、組織、器官又は生物を形質転換する追加の第１段階を含んで成る。
上記で論じられたように、単離された核酸分子は、遺伝子構造体内に含まれ得る。
この態様によれば、対象のセンス、アンチセンス、リボザイム又は同時−抑制分子が発現される、細胞、組織、器官又は生物は、細菌、酵母、菌類（カビを包含する）、昆虫、植物、鳥又は哺乳類に由来する。
組換えエポキシゲナーゼポリペプチドは再生された形質転換体において及びエクスビボで生成され得るので、本発明の１つの他の好ましい態様は、細胞において酵素的活性の組換えエポキシゲナーゼポリペプチドを生成するための方法を提供し、ここで、前記方法は：
（ｉ）前記細胞において本発明のcDNA又はゲノムエポキシゲナーゼ遺伝子配列の発現を付与することができるプロモーター、及び任意には発現エンハンサー要素の制御下で、操作可能的に配置される前記本発明の遺伝子配列を含んで成る遺伝子構造体を生成し；
（ii）前記遺伝子構造体により前記細胞を形質転換し；そして
（iii）前記遺伝子配列によりコードされるエポキシゲナーゼを高レベルで発現する形質転換体を選択する段階を含んで成る。
本発明の特に好ましい態様は、トランスジェニック植物において、酵素的活性の組換えエポキシゲナーゼポリペプチドを生成する方法を提供し、ここで前記方法は：
（ｉ）種子−特異的プロモーター及び任意には、発現エンハンサー要素の制御下で、操作可能的に配置される、本発明のcDNA又はゲノムエポキシゲナーゼ遺伝子配列を含んで成る遺伝子構造体を生成し、ここで前記遺伝子配列がまた、転写ターミネーター配列の上流に配置されており；
（ii）前記遺伝子構造体により、前記植物の細胞又は組織を形質転換し；そして
（iii）前記遺伝子配列によりコードされるエポキシゲナーゼを、種子において高レベルで発現する形質転換体を選択する段階を含んで成る。
さらに特に好ましい態様においては、植物は、通常、有意なレベルのリノール酸を生成する脂肪種子種、たとえば、中でもLinola▲Ｒ▼亜麻、脂肪種子ナタネ、ヒマワリ、ベニ花、大豆、亜麻、ゴマ、ラッカセイ、オリーブ又はギネアアブラヤシである。
さらに特に好ましい態様においては、植物は、通常、有意なレベルのリノール酸を生成する脂肪種子種、たとえば、中でもLinola▲Ｒ▼亜麻、ヒマワリ又はベニ花である。
本明細書に記載される酵素的活性組換えエポキシゲナーゼは、不飽和脂肪酸基質からのエポキシ化された脂肪酸の生成のために特に有用である。本発明は特に、特定のエポキシ化された脂肪酸を通常生成しない、細胞又は再生された、形質転換された生物においてのその特定のエポキシ化された脂肪酸の生成を企画する。
従って、本発明のさらなる観点は、細胞、組織、器官又は生物においてエポキシ化された脂肪酸を生成するための方法を提供し、ここで前記方法は、本発明の酵素的活性の組換えエポキシゲナーゼを発現する細胞、組織、器官又は生物を、脂肪酸基質分子、好ましくは不飽和脂肪酸基質分子と共に、前記基質の少なくとも１つの炭素結合がエポキシ基に転換されるのに十分な時間及び十分な条件下でインキュベートすることを含んで成る。
もう１つの態様においては、対象の方法は、前記に記載されたように、前記組換えエポキシゲナーゼをコードする核酸分子、又はその相同体、類似体又は誘導体により、細胞、組織、器官又は生物を形質転換し又はトランスフェクトする追加の第１段階をさらに含んで成る。上記で論じられたように、単離された核酸分子は、遺伝子構造体内に含まれ得る。
この態様によれば、対象のエポキシゲナーゼが発現される細胞、組織、器官又は生物は、細菌、酵母、菌類（カビを包含する）、昆虫、植物、鳥、又は哺乳類に由来する。より好ましくは、前記細胞、組織、器官又は生物は、酵母、植物又は菌類、さらにより好ましくは油性酵母、又は植物又は菌類、又は本発明の組換えエポキシゲナーゼを通常発現しない脂肪種子植物に由来する。
本明細書において企画される主な経済的脂肪種子植物の中で、亜麻、ヒマワリ、トウモロコシ及びベニ花の高リノール遺伝子型が好ましい標的物である。大豆及び菜種はもう１つの標的物であるが、しかしそれらの低レベルのリノール酸基質、及びリノール酸基質に対してエポキシゲナーゼと競争する活性Δ15−デサチュラーゼの存在のために、最大のエポキシ脂肪酸合成のためには、不適切である。
もう１つの態様は、本発明のエポキシゲナーゼによるLinola▲Ｒ▼（＝低リノレン酸亜麻）の形質転換である。Linola▲Ｒ▼亜麻は通常、約70%のリノールを含み、そしてこのうち非常に少量（2%以下）が続いて、Δ15−デサチュラーゼによりリノレン酸に転換される（Green, 1986）。
本明細書において企画される好ましい不飽和脂肪酸基質は、中でもパルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
高レベルのベルノール酸を天然において含む植物種においては、Δ12−エポキシゲナーゼは、リノール酸のエポキシ化のためには、非常に効果的である。結果的に、本発明は特に、高レベルのベルノール酸を生成するために、種子油合成の間、トランスジェニック脂肪種子において、ユーホルビアラガスカエ、ベルノニアspp.及びクレピシspp.に由来する組換えΔ12−エポキシゲナーゼを高レベルで発現することを企画する。
従って、リノール酸は、本発明の態様によれば、特に好ましい基質である。追加の基質は排除されない。
上記に列挙される基質分子の生成物は、過度の実験を伴わないで、当業者により容易に決定されるであろう。本発明に従って生成される、特に好ましいエポキシ脂肪酸は、中でも１２，１３−エポキシ−９−オクタデセン酸（ベルノール酸）、及び１２，１３−エポキシ−９，１５−オクタデカジエン酸を包含する。
基質分子の存在下で組換えエポキシゲナーゼを発現する細胞、組織、器官又は生物のインキュベーションについての条件は、細胞、組織、器官又は生物中への基質の摂取、及び選択された特定の環境下での基質分子へのエポキシゲナーゼの親和性に少なくとも依存して、変化するであろう。最適な条件は、当業者により容易に決定され得る。
本発明は明らかに、エポキシ脂肪酸を含む単離された油、及び／又は本明細書に記載されるようにして生成された、単離された脂肪酸自体に、及びそれに由来するいづれかの生成物、たとえば、中でも被膜、樹脂、接着剤、プラスチック、界面活性剤、及び滑剤にも及ぶ。
本発明者は、触媒機能、たとえば不飽和化、アセチル化、ヒドロキシル化及び／又はエポキシ化を実施する、混合された機能のモノオキシゲナーゼ（MMO）が、相当のヌクレオチド及びアミノ酸配列類似性を共有する遺伝子ファミリーを形成することをさらに示している。たとえば、類似する鎖長及びいづれかの炭素二重結合（存在するなら）の位置に対して作用する、デサチュラーゼ、アセチレナーゼ、ヒドロキシラーゼ及び／又はエポキシゲナーゼ酵素は、他の基質に対して作用する酵素に対してよりも、お互いに対して、より密接に関連しており、そして“ファミリー”として考慮され得る。
いづれの理論又は作用の態様にも関係しないが、いづれかの遺伝子ファミリーのメンバー間の配列類似性は、関与する基質の同一性、及び修飾反応の間、標的炭素結合で生じる反応現象の生化学的類似性にその基礎を有し、このことは、ファミリー内の分岐配列が、ファミリーメンバーの特定の触媒性質に寄与する、触媒決定基、又は少なくともその機能的一部を含んで成ることを示唆する。
ファミリーの１つの例は、リノール酸のΔ12位置の不飽和化、アセチル化、ヒドロキシル化及び／又はエポキシ化を触媒する、デサチュラーゼ、アセチレナーゼ、ヒドロキシラーゼ及び／又はエポキシゲナーゼ酵素である（この後、“C18Δ12-MMOファミリー”として言及される）。本発明者は、Δ12位置で代わりの触媒機能の決定基（この後、“推定上の触媒決定基”として言及される）を、潜在的に含んで成る、その分岐領域を決定するために、C18Δ12-MMOファミリーのメンバーのヌクレオチド及びアミノ酸配列を比較した。
さらに、脂肪酸修飾MMOのそのようなファミリーの存在が、他の脂肪酸鎖長及び二重結合位置に関して、予期される。たとえば、C18Δ15−デサチュラーゼは、C18脂肪酸基質におけるΔ15位置を不飽和、アセチル化、ヒドロキシル化及び／又はエポキシ化できる関連する酵素のファミリー、すなわちC18Δ15-MMOファミリーに属することが予期される。
それらの触媒決定基が相互交換されている（“ドメイン交換”として言及される）合成遺伝子を生成することによって、１つの触媒機能をコードする遺伝子を、他の触媒機能をコードする遺伝子に転換することが可能である。たとえば、本発明のΔ12エポキシゲナーゼは、クレピシアルピナΔ12セアチレナーゼからのドメインにより、そのＣ−末端及びＮ−末端配列の部分を置換することによって、Δ12アセチレナーゼに転換され得る。同様に、逆のドメイン交換がまた、実施され得る。
さらなる改良として、触媒機能におけるそのような機能は同様に、特定の触媒機能を決定するために決定的である個々のドメイン内のそれらのアミノ酸のみに対して特定の変更（たとえば、付加、置換、又は欠失）を行なう（たとえば、特定部位の突然変異誘発により）ことによりもたらされ得る。
従って、本発明のさらなる観点は、本明細書に記載されるようなエポキシゲナーゼ遺伝子に由来するヌクレオチドの配列を含んで成る合成脂肪酸遺伝子に関し、ここで前記合成脂肪酸遺伝子はエポキシゲナーゼ、アセチレナーゼ、ヒドロキシラーゼ又はデサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ここで前記ポリペプチドは天然に存在するエポキシゲナーゼ、アセチレナーゼ、ヒドロキシラーゼ又はデサチュラーゼ酵素とは異なるアミノ酸配列を含んで成り、又は前記ポリペプチドは、天然に存在するエポキシゲナーゼ、アセチレナーゼ、ヒドロキシラーゼ又はデサチュラーゼ酵素とは異なる触媒性質を示し、又は前記ポリペプチドは、配列番号２、４、６の一部、又は前記一部の相同体、類似体又は誘導体に対して少なくとも約60%同一であるアミノ酸の配列を含んで成る。
好ましくは、本発明の合成脂肪酸遺伝子は、Δ12エポキシゲナーゼ遺伝子に由来する。
１つの態様において、本発明の合成脂肪酸遺伝子は、融合ポリペプチドをコードし、ここでは、配列番号２、４、又は６のいづれか１つのＮ−末端及び／又はＣ−末端アミノ酸が同じファミリーの異なったメンバーのアミノ酸配列により、読取り枠を整合して置換されている。
特に好ましい態様においては、配列番号２、４又は６のＮ−末端及び／又はＣ−末端アミノ酸が、図２に示されるアセチレナーゼ、デサチュラーゼ、又はヒドロキシラーゼポリペプチドのその対応する領域により置換される。より好ましくは、配列番号２、４又は６のいづれか１つのＮ−末端及び／又はＣ−末端領域からの少なくとも約30個のアミノ酸が、図２に示されるアセチレナーゼ、デサチュラーゼ又はヒドロキシラーゼポリペプチドのその対応する領域により、読取り枠を整合して置換される。
他の態様においては、本発明の合成脂肪酸遺伝子は融合ポリペプチドをコードし、ここでは、脂肪酸アセチレナーゼ、又は脂肪酸ヒドロキシラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼのＮ−末端及び／又はＣ−末端アミノ酸が、配列番号２、４又は６のいづれか１つのＮ−末端及びＣ−末端領域により、読取り枠を整合して置換されている。
特に好ましい態様においては、脂肪酸アセチレナーゼ、又は脂肪酸ヒドロキシラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼのＮ−末端及び／又はＣ−末端アミノ酸が、配列番号２、４、又は６のいづれか１つのＮ−末端及び／又はＣ−末端領域により、読取り枠を整合して置換される。さらにより好ましくは、脂肪酸アセチレナーゼ、又は脂肪酸ヒドロキシラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼが、図２に示される列挙から選択される。
さらにより好ましくは、脂肪酸アセチレナーゼ、又は脂肪酸ヒドロキシラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼのＮ−末端及び／又はＣ−末端領域の少なくとも約30個のアミノ酸残基が、配列番号２、４又は６のいづれか１つのＮ−末端及び／又はＣ−末端領域により、読取り枠を整合して置換される。
従って、本発明は、本明細書に言及されるエポキシゲナーゼ酵素のいづれかの変異体にも及び、ここで前記変異体は、本明細書に記載されるようなエポキシゲナーゼポリペプチドに由来し、そして明白なアセチレナーゼ又はヒドロキシラーゼ又はデサチュラーゼ活性を示し、そして天然に存在するアセチレナーゼ、ヒドロキシラーゼ又はデサチュラーゼ酵素とは異なるアミノ酸配列を含んで成り、又は天然に存在するアセチレナーゼ、ヒドロキシラーゼ、又はデサチュラーゼ酵素とは異なる触媒性質を示し、又は配列番号２、４又は６のいづれか１つに対して少なくとも約60%同一であるアミノ酸の配列を含んで成る。
本発明の他の観点に関しては、本明細書に記載される変異体は、対象の合成遺伝子が適切な宿主細胞中に導入され、そしてそこにおいて発現されると、組換えポリペプチドとして、又はトランスジェニック生物において生成され得る。
本明細書に記載される組換えポリペプチド、又はその相同体、類似体、又は誘導体はまた、免疫学的に活性的な分子でもあり得る。
本発明のもう１つの観点は、本発明の組換えエポキシゲナーゼポリペプチドに結合することができる免疫学的に相互作用性の分子を提供する。
好ましくは、免疫学的に相互作用する分子が結合できる組換体エポキシゲナーゼポリペプチドは配列番号２，４または６のいずれかに記されたアミノ酸配列、あるいはその相同体、類縁体または誘導体を含む。
実施態様の一つでは、免疫学的に相互作用する分子は抗体分子である。抗体分子はモノクローナルまたはポリクローナルである。モノクローナルまたはポリクローナル抗体はエピトープまたはペプチド断片、あるいは組換体遺伝子の産物に由来する合成エポキシゲナーゼペプチドに対する天然に生まれる抗体より選択することができ、あるいは特に組換体エポキシゲナーゼあるいはその相同体、類縁体もしくはその誘導体に対し作ることができる。
ポリクローナルとモノクローナル抗体は共に適当な遺伝子産物、またはエピトープあるいは遺伝子産物のペプチド断片で免疫感作し得ることができる。あるいは、抗体断片、例えばFab断片を利用することができる。本発明は組換体や合成抗体、そして抗体ハイブリッドに及ぶ。本発明に於ける”合成抗体”とは抗体の断片とハイブリッドを含むと考えられる。
本発明で想定する抗体は、本発明の実施態様に包含される関連エポキシゲナーゼポリペプチドを表す遺伝子配列を特定するのに利用できる。
関連遺伝子配列をうまく検出するために求められることは、該遺伝子配列を発現して抗体により認識されるエピトープを少なくとも１つ作り出すことだけである。好ましくは、検出を促進する発現を得る目的のために、関連遺伝子配列を、例えば細菌lacプロモーターの様なプロモーター配列の後に作動可能な状態に配置する。この好適な実施態様によれば、抗体は関連エポキシゲナーゼを発現するプラスミドまたはバクテリオファージの存在検出に利用できる。従って、抗体分子はまた関連エポキシゲナーゼを発現するプラスミドまたはバクテリオファージの精製にも有用である。
本抗体分子はまた、発明の組換体エポキシゲナーゼまたは天然に産する同等物あるいは相同体の精製にも利用できる。
本発明は、以下の非限定的実施例を引用しさらに詳細に記述される。
実施例１
Euphorbia lagascaeとCrepis sppのエポキシ脂肪酸の特徴
野生種のEuphorbia lagascaeと各種Crepis種の種子について、エポキシ脂肪酸の存在をガス液クロマトグラフィーでスクリーニングした。
表３に見られるように、Euphorbia lagascaeはその種子油の中に高いレベルのエポキシ脂肪酸ベルノール酸を含んでいる。Crepis palaestinaの種子は全脂肪酸の61.4重量%のベルノール酸と0.71%重量%のアセチレン脂肪酸クレペニン酸を含むことが分かる。
0004108765.tif 000010
実施例２
Euphorbia lagaseaeとCrepis palaestinaのリノレエートの生化学特性
酵素リノレエート△12−エポキシゲナーゼはリノール酸からベルノール酸を合成する。Euphorbia lagascaeとCrepis palaestinaに由来するリノレエート△12−エポキシゲナーゼはミクロソーム内に局在する。これらの種の酵素は少なくとも、発生中の種子より調整された膜（ミクロソーム）分画中では活性を維持できる。
Euphorbia lagascaeからの膜の調整ならびにそのエポキシゲナーゼ活性のアッセイはBaforら（1993）の記載の様に、表４記載なき限りNADPHを含む反応で実施した。実質的にKohnら（1994）とBaforら（1993）記載の如くに脂質抽出、分離、メチル化、GLCならびにラジオ−GLC分離を行った。
Crepis alpinaとCrepis palaestinaからの膜調整は次のようにして行った。Crepis alpinaとCrepis palaestinaの植物体を温室内で育て、発生中期（開化後17-20日）に種子を集めた。子葉因子を種皮から絞り出し、モータ付と乳棒で0.33Mショ糖、4mM NADH、2mM CoASH、1mgのウシ血清アルブミン／mlと4,000単位のカタラーゼ／mlを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.2中でホモジェナイズした。ホモジェナイトを10分間、18,000×gで遠心分離し、得られた上清を60分間、150,000×gで遠心分離してミクロソーム沈殿を得た。
Crepis種のミクロソーム膜による標準的なデサチュラーゼ、アセチレナーゼとエポキシゲナーゼのアッセイは、0.2mgのミクロソーム蛋白懸濁液に相当する新鮮なホモジェナイゼーション緩衝液中のミクロソーム調整体と、10nmolの[I-14C]18:1-CoAまたは[I-14C]18:2-CoA（特異活性85,000d.p.m/nmol）で、25℃、合計用量360μl中に行った。NADPHを補還元剤としれ利用する時は、NADHをNADPHに置き換えたホモジェナイゼーション緩衝液に膜を再懸濁した。
Euphorbia lagascaeとCrepis palaestina由来のミクロソームリノレエート△12−エポキシゲナーゼを生化学に特徴付けし、得られたデータをCrepis alpinaのミクロソーム調整物に由来するオレエート△12−デサチュラーゼとリノレエート△12−アセチレナーゼ酵素の生化学的特性と比較した（表４）。
表４に見られるように、Crepis palaestinaリノレエート△12−エポキシゲナーゼは、Crepis alpinaに由来するリノレエート△12−アセチレナーゼとオレナート△12−デナチュラーゼに対する同様の生化学特性を有し、３種類の酵素は共にO2を必要とし、NADHまたはNADPHと同等によく補還元剤として働き、シアン化物により阻害されるが一酸化炭素では阻害されない。さらに、これら酵素はいずれもチトクロームp450還元酵素に対するモノクローナル抗体により阻害されない。
表４のデータは、Crepis palaestinaリノレエート△12−エポキシゲナーゼがCrepis alpinaミクロソームオレエート△12−デサルナーゼとリノレエート△12−アセチレナーゼと同様の酵素分類に属することを示唆している。
逆に、Euphorbia lagascaeリノレエート△12−エポキシゲナーゼは補還元剤としてNADPHを必要とし、シアン化物により阻害されないが、一酸化炭素により阻害される（表４）。さらに、発明者はEuphorba lagascaeリノレエート△12−エポキシゲナーゼがチトクロームP450還元酵素に対し作成したモノクローナル抗体により阻害されることを見いだしている。これらのデータは、Euphorbia lagascaeリノレエート△12−エポキシゲナーゼがチトクロームP450に分類される蛋白に属し、従ってCrepis palaestinaリノレエート△エポキシゲナーゼとは生化学的に関係しないことを示している。
0004108765.tif 000011
実施例３
Crepis palaestinaエポキシゲナーゼ遺伝子クローニングの進め方
Crepis palaestinaエポキシゲナーゼ遺伝子のクローニングは前実施例記載のC.palaestinaとC.alpina酵素の特徴に基づく。
特に、ポリ（A）+RNAはCrepis palaestinaの発生中の種子よりQuickPrep微量mRNA精製キット（Pharmacia Biotechnology）を利用し単離し、これを利用してオリゴサッカライドd（T）プライム二本鎖cDNAを合成した。二本鎖cDNAをEcoRI/NotIアダプター（Pharmacia Biotechnology）に連結し、ZAP-cDNAGigapakクローニングキット（Stratagene）を利用しcDNAライブラリーを構築した。
発生中のCrepis alpinaの種子に由来するmRNAから、標準的な方法により単鎖cDNAを調整した。D12V（配列番号７）と命名されたPCR断片を、植物体混合機能モノオキシゲナーゼに推測されているアミノ酸配列に基づくプライマーを利用し、単鎖cDNAを増幅して得た。
続いて、D12V断片をランダムラベルし、これを利用してメーカー記載の標準的なハイブリダイゼーション条件下にAmersham製Hybond N+メンブレンフィルター上でCrepis palaestina cDNAライブラリーをスクリーニングした。この方法により、Cpa12と命名された組換体バクテリオファージが精製された。
Cpa12のcDNAにおヌクレオチド配列を決定し、配列番号１に記載した。
Cpa12のcDNAは全長と考えられた。Cpa12のcDNAを含む発現ベクターの模式図を図１に示す。本明細書記載の遺伝的構築体は、該エポキシゲナーゼを発現するトランスジェニック植物の製造を目的とした、植物材料への導入を目的に設計される。当業者は、Cpal2cDNAを他の構造遺伝子配列で置き換えることで実験を行うことなく同様の発現ベクターを作ることが可能であり、また本発明の遺伝的配列のいずれかを発現するトランスジェニック植物の製造に利用できることを認識するだろう。
図２に見られる様に、Crep1 cDNA配列は少なくともC.alapinaのアセチレナーゼの酵素についてアミン酸レベルで非常に関連したポリペプチドをコードしていた（Baforら、1997；国際特許出願第PCT/SE97/00247号）。
pCpa12からの1.4kbの挿入体の配列を決定し（配列番号１）、長さ374アミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む事が示されている。Cpa12の推定アミノ酸配列は、Crepis alpinaの△12−アセチレナーゼと81%の同一性と92%の類似性を示し、植物ミクロソーム△12−デサチュラーゼ蛋白とは約60%の同一性と80%の類似性を示した（図２）。しかし、Cap12によりコードされたポリペプチドをエポキシゲナーゼ以外の酵素と比べると、アミノ酸配列に大きな違いが認められる。特に、Cpa12は全てのミクロソーム△12デサチュラーゼに比べた場合には５’末端域に６個の連続するアミノ酸を欠損しており、またCrep1△12アセチレナーゼと比較すると３’末端域に２個の連続するアミノ酸を欠損している（図２）。
膜鬱号型脂肪酸デナチュラーゼ遺伝子は限定した配列相同性しか示さなかったが、これらは全て次の様な保存されたヒスチジンに富むモチーフ域を３個含んでいた：
（i）    His-（Xaa）3-4-His;
（ii）   His-（Xaa）2-3-His-His;と
（iii）  His-（Xaa）2-3-His-Hisで、
該式中のHisはヒスチジンを、Xaaは本書表１記載の天然アミノ酸残基のいずれかを示し、カッコ（Xaa）3-4はXaaの３個または４個繰り返しから成るアミノ酸配列を意味し、カッコ（Xaa）2-3はXaaの２個または３個繰り返しから成るアミノ酸配列を意味している。これらヒスチジンに富んだ領域は、該酵素の活性中心部分であることが示唆されている（Shanklinら、1994）。
Cpa12のcDNAによりコードされたアミノ酸は、３個の同様のヒスチジンに富んだモチーフを有するが、△12−デサチュラーゼ酵素のヒスチジンに富むモチーフと同一では無い。これらのデータは、Cpa12 cDNAは混合型機能モノオキシゲナーゼに分類される酵素に属する酵素をコードしていることを示唆している。
上記実施例１記載の脂肪酸の解析は、ベルノール酸は少なくともCrepis palaestina中に存在していることを示していた。この酵素は実際にC.palaestinaにもっぱら存在するだろう。Cpa12 cDNAクローンの３’非翻訳域をハイブリダイゼーションプローブに利用し、C.palaestinaの発生中種子と葉から得たmRNAをノーザンブロットしてCpa12遺伝子の発現を調べた。図３に示すように、Cpa12遺伝子は発生中種子には多く発現していたが、葉では発現は検出されなかった。これらデータはこれら組織に於けるC.palaestinaリノレエート△12−エポキシゲナーゼの酵素活性プロフィールと一致した。
実施例４
Euphorbia lagascaeエポキシゲナーゼ遺伝子のクローニングの進め方
Euphorbia lagascaeエポキシゲナーゼ遺伝子のクローニングは、先実施例記載のE.lagascae酵素の特徴に基づく。
Euphorbia lagascaeエポキシゲナーゼ遺伝子のクローン化の一つのアプローチはでは、RNAをベルノール酸合成が活発な時期のEuphorbia lagascaeの未熟胚から採取し、これを利用してcDNAライブラリーを構築する。cDNAライブラリーは先実施例の記載の如くLambda Zap IIベクター（Stratagene）中に構築するが、cDNAインサートをラムダベクターに組み込まれたプラスミドベクターのEcoRI-XhoIサイト内に、方向を定めてクローン化される点は異なる。
図４に記載の変性PCRプライマー（配列番号18）を合成し、これを利用してEuphorbia lagascae cDNAライブラリーからp450酵素配列をコードするヌクレオチド配列を増幅する。PCR増幅反応では、cDNAライブラリーの一部100μlをフェノール：クロロフォルム[1:1（v/v）]で抽出し、２倍量のエタノールを加えてDNAを沈殿し、最後に100μlの水に再懸濁した。再懸濁DNAの一部（1μl）をPCR増幅反応の鋳型として利用した。PCR反応は200μMの各dTNP、10pmolの変性プライマー、1pmolのT7ポリメラーゼプロモータープライマーと0.4単位のTaqIポリメラーゼを含むTaqIポリメラーゼ緩衝液10μlの中で行った。
増幅条件は94℃で２分、48℃１分、続いて72℃２分、続いて93℃、30秒からなるサイクルを５回、その後55℃、30秒、続いて72℃90秒、続いて93℃30秒からなるサイクルを28回、そして最後に55℃30秒、続いて72℃10分、さらに25℃、１分から成るサイクルを１回行うものであった。
PCR産物は精製され、EcoRIとXhoIで切断され、それからBluescriptベクターで配列特徴に基づきサブクローニングされた。PCRクローンの内の１つがP450配列をコードしていることが判明し、これをプローブに利用して完全長のcDNAクローンを分離した。このヌクレオチド配列は配列番号19に記した。配列番号19はp450遺伝子の2Cファミリーの他のメンバーと類似している。特に、配列番号19は、BLASTプログラムによればヒトおよびラットのアラキドン酸エポキシゲナーゼの配列と平均40%の同一性を示した。
さらに、配列番号19の転写体は、Euphorbia lagascaeの種子では発現しているが、根や葉では発現していないことが示された（図5B）。配列番号19の転写体はVernonia galamensisの種子では検出されたが、E.cyparissisの種子または亜麻では検出されず、これら２種はエポキシ脂肪酸を産生しない（図5Aと5B）。
Euphorbia lagascaeエポキシゲナーゼ遺伝子のクローン化に取られた別の方法では、サブトラクティブハイブリダイゼーション法を利用しエポキシ脂肪酸を高いレベルで産している生体中に特に発現している遺伝子を単離する。
特に図６に記したサブトラクティブハイブリダイゼーション法を利用し、高いレベルのエポキシ脂肪酸、ベルノール酸（実施例１）を産するEuphorbiaに特異的に発現し、ベルノール酸を産生しない近い関係にある種のEuphorbia cyparissusでは発現していないエポキシゲナーゼ遺伝子を単離した。
この場合、ベルノール酸を活発に合成している時期のEuphorbia lagascaeの発生中の胚からmRNAを単離し、これを利用して”テスター”と呼ぶcDNAを作る。さらに、mRNAをE.cyparissis（E.lagascaeと同様の発生段階にある）の発生中の胚からmRNAを単離し、これを用いて”ドライバー”と呼ばれるcDNAを作る。
サブトラクティブハイブリダイゼーション法を用いて、Euphorbia lagascaeに専ら発現している配列を濃縮したライブラリーが得られる。このライブラリーからのクローンを配列解析し、少なくとも２種類の配列が、データベースにある他のp450配列との類似性よりP450蛋白をコードしていることが判明した。これら２種類のP450PCRクローンをプローブとして利用し、先に参照したcDNAライブラリーから全長のcDNAに相当するクローンを分離した。
分離されたP450cDNAのうちの１つ、配列番号20に記載のヌクレオチド配列を含むものはEuphorbia lagascae（図7B）の組織中に発現し、エポキシ脂肪酸を産しない種であるE.cyparrisusまたは亜麻の種子組織中には相同転写体は検出されないことが明らかにされた。配列番号20の推定アミノ酸配列は、配列番号20により増幅されたcDNAがエポキシゲナーゼ、例えばリノール酸をベルノール酸に転換するリノレエート△12−エポキシゲナーゼをコードしているらしいことを示唆している。
実施例５
エポキシゲナーゼ活性の表現
発明を例示するcDNAクローンがエポキシゲナーゼ活性をコードしているか、エポキシ脂肪酸、特にベルノール酸を産しないArabidopsis thalianaを各候補クローンで形質転換し、形質転換した組織について元来産しないエポキシ化された脂肪酸が存在するか、あるいは内因性のエポキシドヒドラーゼの作用によりエポキシ化された脂肪酸が代謝され形成されたヒドロキシ脂肪酸（BleeとSchuber, 1990）が存在するか調べ、確認した。
配列識別NO:1からなるエポキシゲナーゼcDNAを、第８図に記載するバナリーベクター構築物の中にクローニングした。簡単に述べると、pCpa12をEcoRIで消化し、T4DNAポリメラーゼ酵素を使用して制限フラグメントを末端充填することによって、cDNA配列をpCpa12プラスミド（第１図）からバナリープラスミドの中にサブクローニングした。BamHIを使用してバナリーベクター（第８図）を線状化し、また、T4DNAポリメラーゼを使用して末端充填した。末端充填反応のために、100mMの各dNTPおよび0.1mg/mlのBSAおよび３単位のT4DNAポリメラーゼを補充した50μlのT4DNAポリメラーゼ緩衝含液（33mMのTris−酢酸塩pH7.9、66mMの酢酸カリウム、10mMの酢酸マグネシウムおよび5mMのDDT）の中に、１μgのcDNAインサートまたは線状化バナリーベクターDNAを再懸濁させ、37℃において６分間インキュベートした。75℃に10分間加熱することによって、反応を停止させた。T4DNAリパーゼおよびプロメガ（Promega）により推奨される標準的結合条件を使用して、平滑末端のcDNAおよびバナリーベクターDNAを結合した。配列識別NO:1配列がナピンプロモーターの背後にセンス向きに挿入され、これによりエポキシゲナーゼのポリペプチドの発現を可能とするクローンを選択した。トランケートナピンプロモーターの制御下に配列識別NO:1をセンス向きに作用可能に収容するバナリープラスミドを、第９図に概略的に表示する。
第９図に記載するバナリープラスミドをエレクトロポレーションによりアグロバクテリウム（Agrobacterium）AGLI株の中に形質転換し、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）を形質転換するために使用した。Valvekens et al.（1988）およびDolferus et al.（1994）が記載する方法に従い、トランスジェニックアラビドプシス・タリアナ（A.thaliana）を得た。
トランスジェニック植物および非形質転換（すなわち、対照）植物を成熟に成長させた。標準的技術により、各植物の成熟した種子を脂肪酸組成について分析した。一次形質転換体（T0）植物を確立し、各植物からT1種子を収穫し、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成について分析した。12のT0植物はベルノール酸をそれらのT1種子の脂質中に総脂肪酸の0.9%〜15.8%の範囲の濃度で含有ことが示されたが、非形質転換対照植物はベルノール酸を含有しなかった（表５）。最高の発現性植物系統はCpal-17であり、それについてのGLC溶離プロフィル（充填カラムおよび毛管カラムの分析から）を第10図に表す。また、非形質転換対照についての充填カラムからのGLC溶離プロフィルを第10図に示す。
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また、またはさらに、リヌム・ウシタリシムム（Linum usitarissimum）（アマ）およびアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）の中に、本明細書において記載する推定上の脂肪酸エポキシゲナーゼ配列の各々をナピン種子特異的プロモーターの制御下に形質転換させる。トランスジェニックアマおよびアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）植物を、発育する種子の油中のエポキシ脂肪酸の存在について検査する。以前の研究において、エポキシ脂肪酸が発育するアマの胚に供給される場合、エポキシ脂肪酸はトリフリセリドの中に組込まれることが示された（実施例10）。
さらに、酵母をまた本発明のエポキシゲナーゼのクローンで形質転換し、エポキシ脂肪酸の産生についてアッセイする。
実施例６
一次T0トランスジェニック植物上で生まれたT1Arabidopsis種子中のエポキシ脂肪酸の顕微鏡検査の確認
Cpal2−形質転換されたアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）植物のT1種子の脂質から製造されたメチルエステルのガスクロマトグラフィーは、非形質転換対照に比較して、２つの追加の脂肪酸の存在を明らかにした。これらの化合物の第１は、ベルノール酸標準のそれに等しい保持時間を有した。第２化合物はより長い保持時間を有し、推定的に１２，１３−エポキシ−９，１５−オクタデカジエン酸、ベルノール酸の期待した誘導体、として同定され、これは内因性Arabidopsis thaliana△15−デサツラーゼによる△15位置における脱飽和から生じた。
Cpal2−形質転換植物から誘導されたエポキシ脂肪酸の画分から調製されたジオールの質量分析により、２つのピークの正確な同一性が確証された。これらのジオールをさらにトリメチルシリルエーテルに変換し、融合シリカの毛管カラム（Hewlett Packerd 5989 AMSにカップリングされたHewlett-Packerd 5890 II GC、70eV15において作動する）上のGC-MS DB23により分析した。全体のイオンクロマトグラムは、次のような２つのピークを示した：
（ｉ）第１の溶離ピークは質量73、172、275、および299の際立ったイオンを有し、エポキシ基がC18脂肪酸のC-12に位置し、そして二重結合がエポキシ基とカルボキシル末端との間で起こったことを示した。この質量スペクトルは純粋なベルノール酸（１２，１３−エポキシ−９−オクタデセノン酸）から製造されたジオールのトリメチルシリルエーテル誘導体のスペクトルと同一であった；および
（ii）第２の溶離ピークは質量73、171、273、および299の際立ったイオンを有し、１２，１３−エポキシ−９，１５−オクタデカジエン酸の質量スペクトルと一致する、２つの二重結合およびC18脂肪酸のC-12におけるエポキシ基の位置の存在を示した。
実施例７
Cpal2トランスジェニックArabidopsis植物の脂肪酸分析
ナピンプロモーターの制御下にCpal2 cDNAクローンを発現する形質転換されたArabidopsis thaliana植物から誘導されたT1種子を発芽させ、そしてT1植物を５つのT0系統（No.4、８、13、17および21、表５）から確立させた。T2種子を各T1植物から収穫し、脂肪酸組成について分析した。形質転換体No.4、８、13および21（表５）の子孫はベルノール酸の存在について期待されたように分離し、それらの植物は3.1%までの範囲のベルノール酸を含有した（表６）。
ベルノール酸（すなわち、エポキシ18:1、表６）を含有する、すべてのT1植物は、また、１２，１３−エポキシ−９，１５−オクタデカジエン酸（すなわち、エポキシ18:2、表６；また、第11図参照）を含有し、これによりCpal2エポキシゲナーゼにより合成されたベルノール酸のいくつかが内因性△15−デサツラーゼにより引き続いて脱飽和されることが示された。
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実施例８
Cpal2トランスジェニックLinolaタンパク質の脂肪酸分析
Cpal2 cDNAクローンからなる前述のバナリープラスミド構築物（第９図）を、エレクトロポレーションにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）AGL1株の中に形質転換した。Lawrence et al.（1989）が記載するように、形質転換されたA.tumefaciensを使用してLinum usitarissimum var.Eyre外植体を感染させたが、ただし再生したシュート材料上の根の誘導のための基礎培地としてMS培地を使用した。
２つの一次Linola形質転換体（TOの植物）（AP20およびAP21と表示する）は、Cpal2遺伝子に対して向けられたプロモーターを使用するPCRにより、およびこれらの植物がカナマイシン耐性であることを示すことによって、トランスジェニックであるとして確証された。標準的技術により、各植物からの10個のT1種子を脂肪酸組成について個々に分析した。
表７に示すように、AP20からの種子は３つのクラスに分離し、これらのクラスはベルノール酸を含まない３個の種子、0.7%より多いベルノール酸を有する２個の種子、および中間レベル（0.13〜0.47%）のベルノール酸を有する５個の種子から構成されていた。
同様に、AP21からの種子は３つのクラスに分離し、これらのクラスはベルノール酸を含まない５個の種子、0.25%より多いベルノール酸を有する２個の種子、および中間レベル（0.09〜0.14%）のベルノール酸を有する３個の種子から構成されていた（表８）。
こうして、ベルノール酸を含有する、合計12個の種子が得られた。ベルノール酸を含有する、12個のAP20およびAP21種子は、また、１２，１３−エポキシ−９，１５−オクタデカジエン酸を含有した。
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AP20からのカナマイシン耐性実生から、４つのT1植物が確立された。すべての４つの植物は引き続いてそれらのT2種子においてベルノール酸を産生することが示された（表９）。これらのT2種子において、18:2エポキシ脂肪酸のレベルを分析しなかった。
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実施例９
トランスジェニック生物におけるエポキシ脂肪酸の産生
本明細書において記載するエポキシゲナーゼ遺伝子、特に配列識別NO:1を、前の実施例に記載したように、Arabidopsis thalianaの中に形質転換することによって、ベルノール酸に富んだ油の産生を達成した。表５に示すように、配列識別NO:1を発現するトランスジェニックA.thaliana系統は、それらの種子において、他の脂肪酸に関して高いレベルのベルノール酸を産生する。特に、１つのトランスジェニック系統（Cpal-17）において、産生されたベルノール酸は総脂肪酸含量の15.2%（w/w）程度に多い。
常態で非常に高いレベルのリノール酸を有しかつ基質としてリノール酸を利用することができる最少の他の競合酵素活性を有する、任意の油蓄積生物の中に、本明細書において記載するエポキシゲナーゼ遺伝子、配列識別NO:1、３、５、19または20の任意の１つ、好ましくは配列識別NO:1または３または５の任意の１つを形質転換することによって、また、ベルノール酸に富んだ油の産生を達成した。本発明の遺伝子配列は、脂肪種子において高いレベルの発現を産生するプロモーター、例えば、ナピン種子特異的プロモーターの制御下に、作用可能に配置される。
A.thalianaの形質転換に対する１つの別のアプローチにおいて、アマ、ヒマワリ、トウモロコシまたはベニバナの高いリノール酸遺伝子型を本発明のエポキシゲナーゼで形質転換する。エポキシゲナーゼ遺伝子が高いレベルで発現されるとき、種子油の合成の間にトランスジェニック植物により、高いレベルのベルノール酸が産生される。
また、LinolaR（＝低いリノレン酸）アマを本発明のエポキシゲナーゼ遺伝子で形質転換する。エポキシゲナーゼ遺伝子が高いレベルで発現されるとき、種子油の合成の間にトランスジェニックLinolaRアマにより、高いレベルのベルノール酸が産生される。
さらに、発育するアマ種子に供給された標識化ベルノール酸は分解されず、トリグリセリド分子のすべての３つの位置において貯蔵脂質の中に組込まれることを、本発明者らは示した（実施例10参照）。これらのデータと一致して、導入されたエポキシゲナーゼにより合成された高いレベルのベルノール酸は、この種の種子油のトリグリセリドの中に容易に沈着される。
実施例１０
発育する亜麻仁の子葉の脂質の中へのオレイン酸およびベルノール酸の組込み
種子の発育の中期段階（顕花後20日）における分離した発育する亜麻仁の子葉（各インキュベーションにおいて６対、二重反復試験のインキュベーション）を、0.2mlのリン酸塩緩衝液pH7.2中の10nmolの[1-14C]ベルノール酸（比活性3000d.p.m./nmol）または[1-14C]オレイン酸（比活性5000d.p.m./nmol）のアンモニウム塩と30℃において30分間インキュベートした。次いで子葉を1mlの蒸留水で３回すすぎ、BlighおよびDyer（1959）に従いUltra Turrax中で直ちに抽出するか、あるいは抽出前に0.5mlの0.1Mのリン酸塩緩衝液pH7.2中で90または270分間さらにインキュベートした。クロロホルム中の脂質のアリコートを、メチル化し、シリカゲルのTLCプレート上でｎ−ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（85:15:1）中で分離した。各試料中のクロロホルム相中の脂質の残部を２つの別々のシリカゲルのTLCプレート上に適用し、プレートを極性脂質の分離のためにクロロホルム／メタノール／酢酸／水（85:15:10:3.5体積）中で展開し、そして中性脂質の分離のためにｎ−ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（60:40:1.5）中で展開した。真性標準に対応する移動を有する脂質区域を取出し、そして各脂質における放射能を液体シンチレーション計数により定量した。
クロロホルム相中の14C標識の回収を第12図に描写する。[14C]オレイン酸および[14C]ベルノール酸の双方からの添加した放射能の半分よりも多少多くが子葉により吸収され、そして30分のパルス標識化後、親油性物質として回収された。双方の基質とのさらに270分のインキュベーションの間において、この量は非変化に止まった。脂質の放射性メチルエステルの分離は、[14C]ベルノール酸供給実験からの放射能の大部分（92%）がメチル−ベルノールエートと同一の移動を有する化合物の中に存在することを示し、これによりエポキシ基は270分のインキュベーションを通じて亜麻仁の子葉の中に無傷で残留することが証明された。
クロロホルム相の中に存在する[14C]ベルノール酸供給からの活性の約28%は30分後においてホスファチジルコリンの中に存在し、そして放射能は300分のインキュベーションにおいてわずかに５%に減少した（第13図）。
クロロホルム相の中に存在する[14C]オレイン酸供給からの活性の約22%は30分後においてホスファチジルコリンの中に存在し、そして放射能は300分のインキュベーションにおいて約11%に減少した（第13図）。
クロロホルム相の中に存在する[14C]ベルノール酸供給からの活性の約32%は30分後においてトリアシルグリセロールの中に存在し、そして放射能は300分のインキュベーションにおいて60%以上に増加した（第14図）。ジアシルグリセロールは[14C]ベルノール酸供給実験においてほぼ24%の活性を含有し、そしてこの量はインキュベーション期間にわたってむしろ一定に止まった。
クロロホルム相の中に存在する[14C]オレイン酸供給からの活性の約５%は30分後においてトリアシルグリセロールの中に存在し、そして放射能は300分のインキュベーションにおいて18%に増加した（第14図）。ジアシルグリセロールは[14C]ベルノール酸供給実験においてほぼ19%の活性を含有し、そしてこの量はインキュベーション期間にわたってむしろ一定に止まった。
上記実験が示すように、亜麻仁の子葉はベルノール酸のエポキシ基を大きい程度に代謝しない。さらに、実験が示すように、亜麻仁の子葉はベルノール酸を膜脂質から効率よく除去し、それらをトリアシルグリセロールの中に組込むメカニズムを有する。
実施例１１
他のエポキシ含有種からの△12−エポキシゲナーゼ遺伝子のクローニング
発育する種子において高度に発現される△12混合機能のモノオキシゲナーゼの遺伝子ファミリーのメンバーをクローニングし、そしてそれらのアミノ酸配列を既知の△12−デサツラーゼ配列および△12−エポキシゲナーゼ配列のアミノ酸配列と比較することによって、エポキシ脂肪酸に富んだ他の種から、Cpal2△12−エポキシゲナーゼ遺伝子の相同体を得た。本明細書において記載するように、発育する種子のcDNAライブラリーをCpal2遺伝子（配列識別NO:1）またはD12Vフラグメント（配列識別NO:7）をベースとする遺伝的プローブでスクリーニングするか、あるいは植物△12混合機能のモノオキシゲナーゼの保存された配列に対して設計されたプライマーを使用してPCRフラグメントを増幅することによって、このような遺伝子をクローニングする。推定上の△12−エポキシゲナーゼ配列は、既知の△12−デサツラーゼ配列に対するよりも、本明細書において開示する△12−エポキシゲナーゼ配列に対して、より大きい全体の配列の同一性を示す。
このアプローチの１つの例において、高いレベルのベルノール酸をその種子油の中に含有し、クレピス・パレスチナ（Crepis palaestina）であることが知られていない、未同定のCrepis sp.から、全長の△12−エポキシゲナーゼ様配列を得た。QuickPrep Micro mRNA精製キット（Pharmacia Biotechnology）を使用して、このCrepis sp.の発育する種子からポリ（A）+RNA単離し、オリゴ糖d（T）−プライムド二本鎖cDNAの合成に使用した。次いで、こうして得られた二本鎖cDNAをEcoRI/NotIアダプター（Phamacia Biotechnology）に結合し、そしてZAP-cDNA Gigapackクローニングキット（Stratagene）を使用して、cDNAライブラリーを構築した。製造業者が規定するようにクレピス・アルピナ（Crepis alpina）から誘導されたランダム標識化D12Vフラグメント（配列識別NO:7）で、標準的ハイブリダイゼーション条件下に、Hybond N+膜フィルター上のcDNAライブラリーをスクリーニングした。これにより、組換えバクテリオファージ（CrpXと表示する）が精製された。
CrpX cDNAのヌクレオチド配列を決定し、配列識別NO:3に記載する。CrpXの推定されたアミノ酸配列（配列識別NO:4）は374アミノ酸のタンパク質からなり、このタンパク質はCpal2△12−エポキシゲナーゼ配列に対して97%の同一性を有するが、Arabidopsis thaliana L26296△12−デサツラーゼ配列に対してわずかに57%の同一性を有する。これは高いベルノール酸含量を有する他のCrepis sp.中の遺伝子の存在を明らに証明し、この遺伝子はCpal2△12−エポキシゲナーゼ遺伝子に対して高度に相同性であり、そして明らにデサツラーゼ遺伝子ではない。
このアプローチの第２の例において、ベルノール酸を含有する種ベルノニア・ガラメンシス（Vernonia galamensis）から、部分的△12−エポキシゲナーゼ様配列を得た。標準的手順により、V.galamensisの発育する種子から単離された全体のRNAから、第１鎖cDNA鋳型を調製した。
植物の混合機能のモノオキシゲナーゼの推定されたアミノ酸配列から誘導されたプライマーを使用して、一本鎖cDNAを増幅することによって、PCRフラグメント（550ヌクレオチド長さ）（Vgl1と表示する）を得た。増幅されたDNAのヌクレオチド配列を標準的手順により決定し、配列識別NO:5に記載する。
Vgl1のPCRフラグメント（配列識別NO:6）の推定されたアミノ酸配列をCpal2△12−エポキシゲナーゼおよびArabidopsis thaliana L26296△12−デサツラーゼ（第２図）の全長の配列と整列させると、増幅されたVgl1配列はCpal2ペプチドのアミノ酸残基103-285をスパンする領域に対応するアミノ酸配列をコードすることが証明される。この領域内において、Vgl1配列はA.thaliana△12−デサツラーゼ配列（60%）よりもCpal2△12−エポキシゲナーゼ配列（67%）に対して、より大きいアミノ酸の同一性を示し、これにより増幅されたDNAはデサツラーゼ配列よりもむしろエポキシゲナーゼに対応することが示唆される。
当業者は知るように、本発明は本明細書において詳述するもの以外の変化および変更が可能である。本発明はすべてのこのような変化および変更を包含することを理解すべきである。また、本発明は、この明細書において、個々にまたは集合的に、言及しまたは示した、すべてのこのような工程、特徴、組成物および化合物、および前記工程または特徴の２またはそれ以上の組合わせを包含する。
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0004108765.tif 000019
配列表
（１）一般情報
（i）出願人：Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation AND Sten Stymne
（ii）発明の名称：PLANT FATTY ACID EPOXYGENASE GENES AND USES THEREFOR
（iii）配列の数：20
（vii）先行出願のデータ：
（A）出願番号：AU PO6223
（B）出願日：1997年4月15日
（vii）先行出願のデータ：
（A）出願番号：AU PO6226
（B）出願日：1997年４月15日
（vii）先行出願のデータ：
（A）出願番号：US 60/043706
（B）出願日：1997年４月16日
（vii）先行出願のデータ：
（A）出願番号：US 60/050403
（B）出願日：1997年６月20日
（２）配列番号：１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1358塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY：CDS
（B）位置：30..1151
（xi）配列の記載：配列番号：１：
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（２）配列番号：２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：374アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：蛋白質
（xi）配列の記載：配列番号：２：
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（２）配列番号：３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1312塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：cDNA
（vi）由来：
（A）生物：Crepis sp.
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY：CDS
（B）位置：26..1147
（xi）配列の記載：配列番号：３：
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（２）配列番号：４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：374アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：蛋白質
（xi）配列の記載：配列番号：４：
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（２）配列番号：５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：550塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：cDNA
（vi）由来：
（A）生物：Vernonia galamensis
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY：CDS
（B）位置：1..549
（xi）配列の記載：配列番号：５：
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（２）配列番号：６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：183アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：蛋白質
（xi）配列の記載：配列番号：６：
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（２）配列番号：７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：177塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：cDNA
（vi）由来：
（A）生物：Crepis alpina
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY：CDS
（B）位置：1..177
（xi）配列の記載：配列番号：７：
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（２）配列番号：８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：59アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：蛋白質
（xi）配列の記載：配列番号：８：
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（２）配列番号：９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：383アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：蛋白質
（vi）由来：
（A）生物：Arabidopsis thaliana
（xi）配列の記載：配列番号：９：
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（２）配列番号：10の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：384アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：蛋白質
（vi）由来：
（A）生物：Brassica juncea
（xi）配列の記載：配列番号：10：
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（２）配列番号：11の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：383アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：蛋白質
（vi）由来：
（A）生物：Glycine max
（xi）配列の記載：配列番号：11：
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（２）配列番号：12の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：383アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：蛋白質
（vi）由来：
（A）生物：Solanum commersonii
（xi）配列の記載：配列番号：12：
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（２）配列番号：13の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：387アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：蛋白質
（vi）由来：
（A）生物：GLycine max
（xi）配列の記載：配列番号：13：
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（２）配列番号：14の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：387アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：蛋白質
（vi）由来：
（A）生物：Ricinus communis
（xi）配列の記載：配列番号：14：
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（２）配列番号：15の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：蛋白質
（v）フラグメント型：内部
（xi）配列の記載：配列番号：15：
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（２）配列番号：16の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（v）フラグメント型：中間
（xi）配列の記載：配列番号：16：
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（２）配列番号：17の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（v）フラグメント型：中間
（xi）配列の記載：配列番号：17：
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（２）配列番号：18の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：29塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：オリゴヌクレオチド
（xi）配列の記載：配列番号：18：
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（２）配列番号：19の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1610塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：cDNA
（vi）由来：
（A）生物：Euphordia lagascae
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY：CDS
（B）位置：8..1546
（xi）配列の記載：配列番号：19：
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（２）配列番号：20の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：1698塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY：CDS
（B）位置：8..1504
（xi）配列の記載：配列番号：20：
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
0004108765.tif 000069
【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４】
0004108765.tif 000074
【図５】
0004108765.tif 000075
【図６】
0004108765.tif 000076
【図７】
0004108765.tif 000077
【図８】
0004108765.tif 000078
【図９】
0004108765.tif 000079
【図１０Ａ】
0004108765.tif 000080
【図１０Ｂ】
0004108765.tif 000081
【図１０Ｃ】
0004108765.tif 000082
【図１１】
0004108765.tif 000083
【図１２】
0004108765.tif 000084
【図１３】
0004108765.tif 000085
【図１４】
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