(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素の定量法であって、酵素の酵素活性により光学的に測定可能な物質に変換される基質の溶液に酵素を添加して反応液を生成した後、該酵素の酵素活性を抑制する阻害剤を反応液に添加して、該酵素の酵素活性を一定の割合で抑制した状態で１回以上光学的な測定を行う方法。
【請求項２】
酵素の定量法であって、（１）酵素の酵素活性により光学的に測定可能な物質に変換される基質の溶液に酵素を添加して反応液を生成し、（２）予備的な光学的測定を行い、測定値に基づいて該酵素の酵素活性を抑制する阻害剤を添加するか否かを判定し、該判定に従って該阻害剤を反応液に添加し又は添加せずに、（３）阻害剤を添加して該酵素活性を一定の割合で抑制した状態又は阻害剤を添加することなく、１回以上、光学的な測定を行う方法。
【請求項３】
前記（３）における光学的な測定が、反応液の生成から所定時間後に１回だけ行われるか又は反応液の生成後一定時間内に２回以上行われることを特徴とする、請求項２の方法。
【請求項４】
前記（２）が、反応液を生成した後前記予備的な光学的測定を行うまでの時間とその測定値に基づき、当該測定において最後に行う測定における測定値を推定し、推定された測定値と光学的測定に用いる測定装置が測定可能な上限値を比較して、推定された測定値が前記上限値より大きい場合には、前記最後に行う測定における測定値を前記上限値以下に抑制し得る量の前記阻害剤を添加することからなる、請求項２の方法。
【請求項５】
前記（２）が、反応液を生成した後前記予備的な光学的測定を行うまでの時間とその測定値に基づき、当該測定において最後に行う測定における測定値を推定し、推定された測定値と反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定される測定値を比較して、推定された測定値が反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定される測定値より大きい場合には、前記最後に行う測定における測定値を前記反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定される測定値以下に抑制し得る量の前記阻害剤を添加することからなる、請求項２の方法。
【請求項６】
酵素を定量するための装置であって、（１）酵素の酵素活性により光学的に測定可能な物質に変換される基質の溶液に酵素を添加する分注手段、（２）反応液について光学的な測定を行うための光学測定手段、（３）光学測定手段を用いる予備的な光学的測定によって得られた測定値に基づいて該酵素の酵素活性を一定の割合で抑制する阻害剤を添加するか否かを判定する手段、及び、（４）判定に従って阻害剤を反応液に添加するための阻害剤分注手段とを有する装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、高感度かつ広濃度範囲の酵素の測定を可能にする酵素の定量法及びそのための装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生化学検査の分野では、例えば血液や尿等の生体試料に含まれる酵素量の定量が行われている。またその他にも、例えばエンザイムイムノアッセイ法（ＥＩＡ）等では、対象物質の定量を行うために酵素を標識（マーカー）とし、その定量を通して生体試料に含まれる抗原、抗体、又は特異的な配列を有する核酸に代表される対象物質を定量することが行われている。このような定量方法は、酵素によって吸光、発光又は蛍光等により光学的に測定可能な物質に変換される基質を使用し、変換された基質量を測定することによって当該酵素を定量するものである。
【０００３】
前記ＥＩＡ等の酵素を標識として対象物質を定量する方法では、測定感度の高感度化の要望が強いが、測定感度を高感度化するには標識である酵素の定量を高感度で実施可能とする必要がある。ちなみに近年では、アトモルオーダーの酵素の定量が要求されるようになっている。
【０００４】
こうした要望に答える形で、高感度化に対応可能な化学発光や生物発光を利用した検出方法が用いられるようになってきている。化学発光を利用した検出方法では、例えばアダマンチル・ジオキセタン化合物であるスピロアダマンタン−４−メトキシ−４−ホスホリルオキシフェノール−１，２−ジオキセタンを基質として用いる検出方法では、酵素（アルカリ性ホスファターゼ）を１０-20モルレベルまで検出可能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記したように、化学発光等を利用することによって検出感度の高感度化が図られてはいるが、これにより、いわゆるレンジオーバー（検出器の受光許容量オーバー）の問題が生じ、検出上限が制限されてしまうという新たな課題が生じている。かかる課題を回避するための物理的な手法（例えば特許第２６２６７３８号に開示されたような、感度の異なる２台の検出器を用いる手法や、後述した減光フィルターを用いる手法）が提案されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記した、いわゆるレンジオーバーを回避するための物理的な方法は、検出器の受光許容量オーバーによって酵素量の測定が不能になる現象の回避を目的としているが、感度の異なる２台の検出器を用いる等しなければならず、ハードウェア的な無駄が生じてしまう。またこのような従来の方法では、前記レンジオーバーを回避できたとしても、定量されるべき酵素の量が極端に多い場合には、該酵素によって検出可能な物質に変換される基質が不足し、結果的に検出不能になってしまうという課題もある。
【０００７】
そこで本発明の目的は、２台の検出器を用いる等しなくとも前記レンジオーバーの課題を解決することが可能で、しかも、定量されるべき酵素の量が極端に多いために該酵素によって検出可能な物質に変換される基質が不足してしまうような場合であっても酵素検出を可能とする方法及び装置を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するためになされた本発明は、定量されるべき酵素の活性（基質を測定可能な物質に変換する活性）を人為的にコントロールすることにより、前記レンジオーバーの場合に生じる課題や酵素の量が極端に多い場合に生じる課題を解決するものである。かかる目的を達成するための請求項１の発明は酵素の定量法であって、酵素の酵素活性により光学的に測定可能な物質に変換される基質の溶液に酵素を添加して反応液を生成した後、該酵素の酵素活性を抑制する阻害剤を反応液に添加して該酵素の酵素活性を抑制した状態で１回以上光学的な測定を行う方法である。
【０００９】
請求項２の発明は酵素の定量法であって、（１）酵素の酵素活性により光学的に測定可能な物質に変換される基質の溶液に酵素を添加して反応液を生成し、（２）予備的な光学的測定を行い、測定値に基づいて該酵素の酵素活性を抑制する阻害剤を添加するか否かを判定し、該判定に従って該阻害剤を反応液に添加し又は添加せずに、（３）阻害剤を添加して該酵素活性を抑制した状態又は阻害剤を添加することなく、１回以上、光学的な測定を行う方法である。請求項３の発明は前記請求項２の発明に係り、前記（３）における光学的な測定が、反応液の生成から所定時間後に１回だけ行われるか又は反応液の生成後一定時間内に２回以上行われることを特徴とする。請求項４の発明は前記請求項２の発明に係り、前記（２）が、反応液を生成した後前記予備的な光学的測定を行うまでの時間とその測定値に基づき、当該測定において最後に行う測定における測定値を推定し、推定された測定値と光学的測定に用いる測定装置が測定可能な上限値を比較して、推定された測定値が前記上限値より大きい場合には、前記最後に行う測定における測定値を前記上限値以下に抑制し得る量の前記阻害剤を添加することからなる。請求項５の発明は前記請求項２の発明に係り、前記（２）が、反応液を生成した後前記予備的な光学的測定を行うまでの時間とその測定値に基づき、当該測定において最後に行う測定における測定値を推定し、推定された測定値と反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定される測定値を比較して、推定された測定値が反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定される測定値より大きい場合には、前記最後に行う測定における測定値を前記反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定される測定値以下に抑制し得る量の前記阻害剤を添加することからなる。
【００１０】
請求項６の発明は酵素を定量するための装置であって、（１）酵素の酵素活性により光学的に測定可能な物質に変換される基質の溶液に酵素を添加する分注手段、（２）反応液について光学的な測定を行うための光学測定手段、（３）光学測定手段を用いる予備的な光学的測定によって得られた測定値に基づいて該酵素の酵素活性を抑制する阻害剤を添加するか否かを判定する手段、及び、（４）判定に従って阻害剤を反応液に添加するための阻害剤分注手段とを有する装置である。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明において、検出されるべき酵素としては例えばアルカリ性フォスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はグルコース−６−ホスファターゼ等を例示できるが、これら例示以外の酵素であっても制限はない。これら酵素に対する基質としては、従来知られた蛍光又は色素系の種々の基質を例示することができるが、本発明の実施に際しては、検出感度の高めることができる化学発光基質を用いることが特に好ましい。本発明は、レンジオーバー等によって生じる検出上限の制限という課題を解決するものであるが、検出下限を向上し得る（より低濃度の酵素を定量可能とする）化学発光基質等との併用により、低濃度から高濃度までの酵素定量が可能となるからである。
【００１３】
本発明でいう酵素の酵素活性を抑制する阻害剤（以下「阻害剤」ということがある）とは、該酵素による、基質の光学的に測定可能な物質への変換を妨害するものを意味する。阻害剤としては、酵素の定量性に影響を与えないもの、即ち一定の割合で阻害効果が得られるものを用いるが、例えばアルカリ性ホスファターゼに対する阻害剤としてはりん酸塩や金属キレート剤を例示することができ、ペルオキシダーゼ類に対する阻害剤としてはアジ化塩を例示することができ、グルコース−６−ホスファターゼに対する阻害剤としては金属キレート剤を例示することができる。なお阻害剤を添加した後に得られる測定値からの酵素量の定量は、定量しようとする酵素に対する特定阻害剤の効果、即ち任意量の阻害剤を添加した場合の酵素活性の阻害度合を予め測定し、補正式を作成しておく等すれば可能である。
【００１４】
酵素の定量に際しては、まず、基質溶液に定量されるべき酵素を添加して反応液を生成する（酵素溶液に基質溶液を添加して反応液を生成する場合も同様である）。この段階では、反応液中の酵素量は不明であるため、レンジオーバー等が引き起こされるか否かや、反応液を生成してから一定時間の内に基質が不足してしまうか否かは不明である。そこで本発明では、反応液を生成した後に予備的な光学的測定を行い、その測定値に基づいて測定されるべき酵素の酵素活性を抑制する阻害剤を反応液に添加等するのである。
【００１５】
酵素の定量を行う場合、反応液を生成した後、一定時間経過後の酵素活性を測定する、いわゆるエンドポイント法と呼ばれる方法や、反応液を生成した後、数回に渡って酵素活性を測定する、いわゆるレート法と呼ばれる方法が知られているが、本発明はどちらの方法を採用しても良い。いずれの方法を採用する場合であっても、前記予備的な光学的測定を反応液生成後速やかに実施し、反応液を生成してから該予備的な光学的測定を実施するまでの時間とその測定値とから実際に行う最後の測定において測定されるであろう測定値を推定し、該推定値が光学的測定に用いる測定装置における測定可能な上限値より大きい（この場合にいわゆるレンジオーバーの問題が生じる）か否かを判定するのである。そして推定値が前記上限値より大きい場合には、所定量の阻害剤を添加して酵素活性を抑制するのである。ここで添加する阻害剤の量は、最後に行う測定において測定されると予想される測定値を前記上限値以下に抑制し得る量であれば良い。
【００１６】
本発明は、前記したレンジオーバーの問題の他に、定量されるべき酵素の量が極端に多い場合には、該酵素によって検出可能な物質に変換される基質が不足し、結果的に検出不能になってしまうという課題をも解決するものである。この目的のためには、前記のようにして推定された測定値を、反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定されるであろう測定値より大きい（この場合には検出可能な物質に変換される基質が不足し、結果的に検出不能になってしまうことになる）か否かを判定するのである。そして推定値が前記上限値より大きい場合には、所定量の阻害剤を添加して酵素活性を抑制するのである。ここで添加する阻害剤の量は、最後に行う測定において測定されると予想される測定値を反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定されるであろう測定値以下に抑制し得る量であれば良い。
【００１７】
前記した「反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定されるであろう測定値」とは、必ずしも反応液中に存在する基質量から計算によって得られる測定値ではなく、例えば酵素の定量に際して使用する基質溶液に対して既知量の酵素を添加して光学的な測定を行った場合に観察される、見かけ上の値を意味する。例えば反応液中に未変換の基質が存在したとしても、見かけ上の測定値が平衡に達する測定系においては、当該測定値が「反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定されるであろう測定値」に該当する。
【００１８】
上記した光学的測定に用いる測定装置における測定可能な上限値及び／又は反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定されるであろう測定値の決定に当たっては、それぞれ、酵素の定量を正確に行う上で十分な程度の余裕を持った値を設定することが好ましい。
【００１９】
本発明が提供する酵素を定量するための装置は、（１）酵素の酵素活性により光学的に測定可能な物質に変換される基質の溶液に酵素を添加する分注手段（該手段は、酵素溶液に基質を分注する分注手段であっても良い）、（２）反応液について光学的な測定を行うための光学測定手段、（３）光学測定手段を用いる予備的な光学的測定によって得られた測定値に基づいて該酵素の酵素活性を抑制する阻害剤を添加するか否かを判定する手段、及び、（３）判定に従って阻害剤を反応液に添加するための阻害剤分注手段とを有する。ここで判定手段は、事前に外部から入力される、光学的測定に用いる測定装置における測定可能な上限値及び／又は反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定されるであろう測定値や、最後の測定を行う時間を記憶する記憶手段に加え、経時のための手段を備え、前記した推定値を発生した後に該推定値を前記上限値等と比較するようにプログラムされたコンピュータ等で構成することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下に、図面等に基づき本発明を更に詳細に説明する。
【００２１】
化学発光基質を用いた酵素の定量では、実際に測定される発光量と時間の関係は酵素の種類及び量と、基質の種類及び量等に依存して変化するが、発光量が時間に対し単調に増加する、持続発光性の化学発光性基質を用いた場合の発光量と時間の関係を一般化すると図１のようになる（図１では、単純化のために発光量の増加を直線的に示してある）。
【００２２】
図１において（ｂ）は、反応液を生成した後、時間の経過とともに酵素反応が進行するが、酵素量が多量であるため、ある時点で光学的測定に用いる測定装置における測定可能な上限値（図では発光検出飽和点と記載）を越え、レンジオーバーとなる。しかし（ｂ）の場合は、その後も反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定されるであろう測定値には達しない。（ｃ）においてもある時点でレンジオーバーとなるが、（ｃ）の場合はレンジオーバーに加え、その後、反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定されるであろう測定値を越えてしまう。
【００２３】
図２は、図１における（ｃ）の場合を例に、本発明を適用した結果を示すものである。即ち、レンジオーバーかつ反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定されるであろう測定値を越えてしまうという場合（図中Ａ）であっても酵素活性を抑制する阻害剤を添加して測定を継続することにより、レンジオーバーが起きず、かつ、反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定されるであろう測定値を越えない場合（図中Ｃ）と同様に測定を実施することが可能となる（図中Ｂ）。このように本発明を適用することにより、図１における（ｂ）のような場合、即ちレンジオーバーのみが問題となる場合にも対応することが可能である。
【００２４】
図３及び図４は、本発明に従う阻害剤の添加を説明する図である。本例では、酵素が添加された反応容器に化学発光基質を分注して反応液を生成後、瞬時に予備的な光学的測定（測光（１））を実施する。そして反応液を生成してから該予備的な光学的測定を実施するまでの時間とその測定値とから実際に行う最後の測定において測定されるであろう測定値を推定し、推定値があらかじめ設定しておいた阻害剤添加基準値、即ち測定装置における測定可能な上限値又は反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定されるであろう測定値のいずれか小さい値、と比較し、該値を越える場合（Ａ）には直ちに阻害剤を分注する。一方、推定値が前記阻害剤添加基準値に達しない場合（Ｂ）には阻害剤を添加することなく測定を実施する。なお前記比較は、例えば予備的な光学的測定を実施した時間に基づいて、測定されるであろう測定値が前記阻害剤添加基準値を越える時間を計算し、該計算された時間と最後の測定を実施する予定の時間を比較しても良い。
【００２５】
以上に説明した本発明の装置の構成を図５に示す。図中▲１▼は分注手段であり、▲２▼は阻害剤分注手段であり、▲３▼は反応液を保持する反応容器であり、▲４▼は光学測定手段であり、▲５▼は判定のための手段である。
【００２６】
以下、本願発明を更に詳細に説明するため実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
アルカリ性ホスファターゼの特異性化学発光基質であるＣＳＰＤ（Ｄｉｓｏｓｉｕｍ  ３−（４−（ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ［１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５’−ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１3,7］−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐａｈｅｔｅ；商品名、Ｔｒｏｐｉｘ  Ｉｎｃ．社製）を用いてウシ小腸由来アルカリ性ホスファターゼ（オリエンタル酵母（株）製）の検出を行う測定系において、アルカリ性ホスファターゼの阻害剤であるりん酸塩の酵素反応に対する影響の確認を行った。酵素反応／発光検出は市販の測定装置（ベルトールド社製、ＬＢ９６Ｖ）にて行った。
【００２８】
ＣＳＰＤと各種濃度のりん酸水素２カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）を１対１に混合したものを用意し、あらかじめ各濃度のアルカリ性ホスファターゼ１０μｌを分注しておいた９６穴黒色マイクロタイタープレート中へそれぞれ５０μｌずつ分注・混和し、酵素反応させて発光を検出した。結果を図６及び表１に示す。
【００２９】
【表１】
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図６及び表１から明らかなように、りん酸水素2カリウム濃度依存的に発光阻害効果が得られた。また測定装置の発光検出器は受光量にして約１００万カウント／ｓｅｃ程度が測定可能な上限値（発光検出飽和点）であった。この上限値は、通常の測定ではアルカリ性ホスファターゼ濃度にして１０-15モル／アッセイが測定上限であることを示すものであるが、０．１Ｍのりん酸水素2カリウムを添加することにより、で用いると１０-13モル／アッセイまで測定可能となることが分かった。
【００３０】
比較例１  減光フィルターを用いた検討
減光フィルターを用い、測定装置の発光検出器への入光量を低減して１０-13モル／アッセイのアルカリ性ホスファターゼを測定した。測定装置としては市販の装置（ＡＩＡ−２１、商品名、東ソー（株）製）の検出器部分を利用し、減光フィルターとして透過率１％減光フィルター（シグマ光機（株）製）を用いた。この測定装置の模式図を図７に示す。図中、▲１▼は反応液を保持する反応容器であり、▲２▼は反応液からの発光であり、▲３▼は減光フィルターであり、▲４▼はフィルター透過光であり、▲５▼は光学測定手段であり、▲６▼は判定のための手段（コンピューター）である。
【００３１】
このような測定装置を用いて、阻害剤添加した場合と阻害剤を添加しない場合で測定を実施し、結果を比較した。阻害剤を添加した場合では、実施例１と同様、ＣＳＰＤとりん酸水素２カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）を１対１に混合し、その５０μｌを１０μｌのアルカリ性ホスファターゼ溶液を分注した反応容器に分注し、反応させた。阻害剤を添加しない場合の経過時間と発光の関係を図８に、阻害剤を添加した場合の経過時間と発光の関係を図９にそれぞれ示す。
【００３２】
阻害剤を添加しない場合では、反応液生成直後からフィルターが無いと仮定すると単に検出器レンジオーバーとなるのみならず、その後、基質が不足して発光量が低下することがわかる。一方阻害剤添加した場合は、最後の測定（反応液生成後５分経過時の測定）まで発光量は低下しないことがわかる。
【００３３】
以上の結果から、物理的手法により検出器への入光量を調節するのみでは正確な酵素量の測定は行えず、本発明により、酵素活性を抑制する阻害剤を用いることで精度良く定量を行えることが示された。
【００３４】
実施例３
阻害剤の添加を自動化すべく図１０に示すような装置を組み立てた。図中、▲１▼は基質溶液であり、▲２▼は阻害剤の溶液であり、▲３▼は基質溶液及び阻害剤溶液の分注手段（分注シリンジ）であり、▲４▼は電磁弁であり、▲５▼は基質溶液及び阻害剤溶液の温調用ヒーターであり、▲６▼は反応容器であり、▲７▼は光学測定手段であり、▲８▼は判定手段（コンピューター）である。
【００３５】
この装置では、酵素が添加された反応容器に基質溶液が自動的に分注されて反応液が生成されると判定手段における計時手段が経過時間のカウントを開始する。あらかじめ判定手段に入力しておいた時間が経過した段階で光学的測定手段による予備的な光学的測定（発光量の測定）が行われ、この結果に基づいて酵素活性を抑制する阻害剤が反応液に添加されるように構成されている。
【００３６】
上記構成の測定装置を使用して、まず阻害剤を添加せずにアルカリ性フォスファターゼサンプル（１０-20モル〜１０-13モル／アッセイ）の測定を行った。各種濃度のアルカリ性フォスファターゼ溶液を１０μＬ添加した反応容器に、５０μｌの基質（ＣＳＰＤ）溶液を分注し、繰り返し測定数ｎ＝５で１秒間にカウントされた発光量を測定した。なお最後の測定は、反応液生成後５分経過してから１秒間に渡って実施した。結果を表２に示す。１０-14モル／アッセイ以上のアルカリ性フォスファターゼでは検出器の測定レンジオーバー（表中ＤＯ）となった。したがって、本測定結果における測定範囲は１０-18モル〜１０-15モル／アッセイであった。
【００３７】
【表２】
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次に、最後の測定を反応液の生成から５分後に行う点は同一とした上で、反応液の生成から１秒経過した段階での予備的な光学的測定を行い、１秒間に測定される発光量が５０００カウント／ｓｅｃを越えた場合には阻害剤を添加し、５０００カウント／ｓｅｃ以下の場合には阻害剤を添加しないで実施した（繰り返し測定数ｎ＝５で１秒間にカウントされた発光量を測定）。酵素反応阻害剤（分注量５０μｌ）としては０．１Ｍりん酸水素2カリウムを使用した。なお上記５０００カウント／ｓｅｃとの値は、測定装置の物理的な測定上限値を考慮し、正確な定量を実施するために余裕を持たせて設定した値である。測定結果を表３に示す。
【００３８】
【表３】
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本実施例の結果、阻害剤はアルカリ性フォスファターゼ濃度が１０-15モル／アッセイ以上で添加され、阻害剤を添加しない場合には測定装置の検出上限を越えて測定不能であった１０-13モル／アッセイにおいても測定が可能であった。またこの時の変動係数ＣＶ（％）も良好であったことから、阻害剤を添加しない場合と比較すると良好な精度を保ちつつ測定範囲を約１００倍拡大することが可能であることが示された。
【００３９】
実施例４  定量性確認の検討
実施例３の結果から、アルカリ性ホスファターゼが１０-18モル／アッセイから１０-15モル／アッセイ程度の範囲であれば阻害剤を添加することなく、アルカリ性フォスファターゼがそれ以上の場合は阻害剤を添加することにより上限１０-13モル／アッセイ程度まで測定可能であることが分かった。そこで、濃度既知のアルカリ性ホスファターゼサンプルを重量希釈してこの範囲の濃度としたサンプル（合計５サンプル）を調製し、阻害剤を添加しない場合の標準曲線又は阻害剤を添加した場合の標準曲線から濃度を求めた。
【００４０】
上記阻害剤を添加しない場合の標準曲線は、濃度範囲が１０-18モル／アッセイから１０-15モル／アッセイ、濃度設定点が６点の標準曲線（図１１）であり、阻害剤を添加した場合の標準曲線は、濃度範囲が１０-15モル／アッセイから１０-13モル／アッセイ、濃度設定点が６点の標準曲線（図１２）である。
【００４１】
測定は繰り返し測定数ｎ＝５で測定し、阻害剤の添加は実施例３の条件に従って決定した。測定結果を表４に示す。表４では、重量希釈濃度値と測定結果との比を濃度回収率として示した。いずれの標準曲線を用いた場合も１００プラスマイナス２０％以内であり、良好な結果であった。
【００４２】
【表４】
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【発明の効果】
以上に説明したように、本発明によれば、測定装置における検出器の受光許容量オーバーによって酵素量の測定が不能になる現象を回避することが可能となり、また同時に、定量されるべき酵素の量が極端に多い場合に、該酵素によって検出可能な物質に変換される基質が不足し、結果的に検出不能になってしまうという課題を解決することが可能である。しかも本発明では、２台の検出器を用いる等する必要がないため、既存の装置を改良したり、或いは既存の装置にコンピューター等で構成される判定手段を追加することにより実施可能である。
【００４３】
そして本発明によれば、測定装置における検出器の測定可能範囲（ダイナミックレンジ）を実質的に拡張し、低濃度から極めて高濃度の酵素の定量にも対応することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、発光量が時間に対し単調に増加する、持続発光性の化学発光性基質を用いた場合の発光量と時間の関係を一般化して示した図である。
【図２】図２は、レンジオーバーかつ反応液中の基質が実質的に全て光学的に測定可能な物質に変換された場合に測定されるであろう測定値を越えてしまうという場合に本発明を適用した例を説明するための図である。
【図３】図３は、本発明に従う阻害剤の添加を説明する図である。
【図４】図４は、本発明に従う阻害剤の添加を説明する図である。
【図５】図５は、本発明の装置の構成を示す図である。
【図６】図６は、実施例１の結果を示すものである。
【図７】図７は、比較例１で用いた測定装置を模式的に示す図である。
【図８】図８は、阻害剤を添加しない場合の経過時間と発光の関係を示す図である。
【図９】図９は、阻害剤を添加した場合の経過時間と発光の関係を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例３で使用した、阻害剤の添加を自動化した装置を示す図である。
【図１１】図１１は、阻害剤を添加しない場合の標準曲線である。
【図１２】図１２は、阻害剤を添加した場合の標準曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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