(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのクロストリジウムの種または抗原型に由来する免疫原および、ワクチン組成物中単一のアジュバントとしてサポニンを含む、多成分系クロストリジウム・ワクチン組成物。
【請求項２】
６種またはそれ以上のクロストリジウムの種または抗原型に由来する免疫原を含む、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項３】
クロストリジウム免疫原が２種またはそれ以上のクロストリジウム・バクテリンまたはトキソイドからなる請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項４】
２種またはそれ以上のクロストリジウム・バクテリンまたはトキソイドが、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・セプチカム、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・ショウベイ、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・ソルデリイ、クロストリジウム・ヘモリチカム、クロストリジウム・ボツリナムからなるクロストリジウム種およびその抗原型の群に由来する請求項３記載のワクチン組成物。
【請求項５】
組成物がクロストリジウム・ショウベイ、クロストリジウム・セプチカム、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・ソルデリイ、Ｃ型クロストリジウム・パーフリンジェンスおよびＤ型クロストリジウム・パーフリンジェンスの各々に由来するクロストリジウム・バクテリンまたはトキソイドからなる請求項３記載のワクチン組成物。
【請求項６】
組成物がクロストリジウム・ヘモリチカム、クロストリジウム・ショウベイ、クロストリジウム・セプチカム、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・ソルデリイ、Ｃ型クロストリジウム・パーフリンジェンスおよびＤ型クロストリジウム・パーフリンジェンスの各々に由来するクロストリジウムバクテリンまたはトキソイドからなる請求項３記載のワクチン組成物。
【請求項７】
（ａ）クロストリジウム・ショウベイ、クロストリジウム・セプチカム、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・ソルデリイ、Ｃ型クロストリジウム・パーフリンジェンスおよびＤ型クロストリジウム・パーフリンジェンスの各々に由来するクロストリジウム・バクテリンまたはトキソイドと
（ｂ）ワクチン組成物中単一のアジュバントとしてサポニンと、
からなる多成分系クロストリジウム・ワクチン組成物。
【請求項８】
（ａ）クロストリジウム・ヘモリチカム、クロストリジウム・ショウベイ、クロストリジウム・セプチカム、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・ソルデリイ、Ｃ型クロストリジウム・パーフリンジェンスおよびＤ型クロストリジウム・パーフリンジェンスの各々に由来するクロストリジウムバクテリンまたはトキソイドと、
（ｂ）ワクチン組成物中単一のアジュバントとしてサポニンと
からなる多成分系クロストリジウム・ワクチン組成物。
【請求項９】
有効量の請求項１に記載のワクチン組成物をウシ科動物に投与することからなるウシ科動物におけるクロストリジウム感染症の予防または治療方法。
【請求項１０】
有効量の請求項７に記載のワクチン組成物をウシ科動物に投与することからなるウシ科動物におけるクロストリジウム感染症の予防または治療方法。
【請求項１１】
有効量の請求項８に記載のワクチン組成物をウシ科動物に投与することからなるウシ科動物におけるクロストリジウム感染症の予防または治療方法。
【請求項１２】
筋肉内注射を介して投与する請求項９記載の方法。
【請求項１３】
筋肉内注射を介して投与する請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
筋肉内注射を介して投与する請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
皮下注射を介して投与する請求項９記載の方法。
【請求項１６】
皮下注射を介して投与する請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
皮下注射を介して投与する請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、一般に、ワクチン組成物および該組成物の使用方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、安定化担体または貯蔵アジュバントでなく、易分散性の水溶性アジュバントであるサポニン配合の多成分系クロストリジウム・ワクチン（clostridial vaccine）に関する。
発明の背景
クロストリジウム属は嫌気性芽胞形成杆状形菌で構成されており、該微生物は、土壌ならびにヒトを包含する動物の腸管に天然に存する。病原菌株は創傷汚染または経口摂取のいずれかで獲得され、前記クロストリジウム属の構成菌は、予防接種をしないと、飼育業にて著しい経済的損失をもたらす種々の疾患の原因となる。かかる疾患は、炭疽疾患、巨大頭、気腫疽、腸性毒血症、伝染性壊死性肝炎、悪性水腫、ボツリヌス中毒症、破傷風などを包含する。
クロストリジウム感染症の抗生物質治療は、予測できることが稀であり、効果的でないことがしばしばである。したがって、かかる感染症は、一般に、１種またはそれ以上のクロストリジウム・バクテリンまたはトキソイド配合のワクチン組成物を用いて予防的に制御される。例えば、米国特許第４，２９２，３０７号；第４，２６４，５８８号；第３，５７９，６３３号；ウェブスター・エイ・シーおよびフランク・シー・エル（Webster,A.C.およびFrank,C.L.）のオーストラル・ベト・ジェイ（Austral.Vet.J.）６２：１１２−１１４（１９８５）；ケリー・ジェイ・ビーおよびクレイ・ジー・アール（Craig,G.R.）のザ・ベタラナリ・レコード（The Veterinary Record）１０５：５５１−５５４（１９７９）；スターン（Sterne）らのザ・ベタラナリ・レコード ７４：９０９−９１３（１９６２）参照。クロストリジウム・トキソイドは相対的に低抗原性の可溶性蛋白質であり、伝統的に安定性に乏しい。かくして、クロストリジウム・ワクチンは、抗原強度を増加させ、安定性を向上させるのに、アジュバントを必要とする。典型的には、クロストリジウム・トキソイドの吸着能および／または沈降能を有し、ならびに注射部位で該トキソイドの保持能を有するアルミニウム化合物が用いられる。例えば、トムソン・アール・オーおよびナイト・ピー・エイ（Thomson,R.O.およびKnight,P.A.）の（１９７６）デベロップメンタル・バイオロジー・スタンダード（Develop.Biol.Standard）３２：２６５−２６９（１９７６）；トムソンら（１９６９年７月２６日）、ザ・ベタラナリ・レコード，８１〜８５頁参照のこと。油中水型エマルジョンおよびカーボポールのような他の強力な貯蔵アジュバントもまたクロストリジウム・ワクチンに用いられている。該アジュバントは、抗原性を増加させるが、通常、皮下または筋肉内注射した場合、肉芽腫、膿瘍および瘢痕のような重度の持続的局所反応を引き起こす。これらの局所反応は胴体きずの原因となり、トリミングを必要とし、不経済的であって、ワクチンを筋肉組織に注射した場合、肉の価値を下げることとなると考えられる。
サポニンは、いくつかの共通する特性に基づいて類別されるグリコシド性天然植物生成物である。サポニンは、振盪した場合、泡沫を形成することを特徴とする界面活性剤である。サポニンは赤血球を溶解させることができ、コレステロールと複合体を形成し、魚に対して毒性である。サポニンは、原生動物感染症に対するワクチン（米国特許第４，７６７，６２２号）、イヌのジステンパーワクチン（米国特許第５，１７８，８６２号）、とりわけ、脚および口腔疾患に対するワクチンを含む、多くのワクチン組成物におけるアジュバントとして用いられている。アワド（Awad）らのアシウト・ベット・メド・ジェイ（Assiut Vet.Med. J.）１７：２０１−２１４（１９８６）は、アラム（alum）、すなわちアルミニウムゲルと、サポニンまたは油状アジュバントを含む単一成分の気腫疽ワクチンを比較して記載している。しかしながら、これまで、サポニンのような注射部位から容易に分散し、貯蔵作用のない可溶性アジュバントの多成分系クロストリジウム・ワクチンにおける使用は記載されたことがない。
発明の開示
本発明は、水溶性アジュバントであるサポニンが、ウシについての多成分系クロストリジウム・ワクチンにて、貯蔵アジュバントの代わりに用いることができるという驚くべき知見に基づくものである。
したがって、一の具体例において、本発明は、２種またはそれ以上のクロストリジウム免疫原と、分散性の可溶性アジュバントとからなる多成分系クロストリジウム・ワクチン組成物に関する。
もう一つ別の具体例において、本発明は：
（ａ）クロストリジウム・ショウベイ（Clostridium chauvoei）、クロストリジウム・セプチカム（Clostridium septicum）、クロストリジウム・ノビイ（Clostridium novyi）、クロストリジウム・ソルデリイ（Clostridium sordellii）、Ｃ型クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）およびＤ型クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の各々に由来するクロストリジウム・バクテリンまたはトキソイド；および
（ｂ）サポニンアジュバント
からなる多成分系クロストリジウム・ワクチン組成物に関する。
さらにもう一つ別の具体例において、本発明は：
（ａ）クロストリジウム・ヘモリチカム（Clostridium haemolyticum）、クロストリジウム・ショウベイ、クロストリジウム・セプチカム、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・ソルデリイ、Ｃ型クロストリジウム・パーフリンジェンスおよびＤ型クロストリジウム・パーフリンジェンスの各々に由来するクロストリジウムバクテリンまたはトキソイド；および
（ｂ）サポニンアジュバント
からなる多成分系クロストリジウム・ワクチン組成物に関する。
本発明のさらに他の具体例は、ウシ科動物におけるクロストリジウム感染症の予防または治療方法であって、有効量の本発明のワクチン組成物をウシ科動物に投与することからなる方法に関する。
特に好ましい具体例において、筋肉内または皮下内にて投与を行う。
本発明のこれらの具体例および他の具体例は、当該分野における当業者にとって、本発明の開示を考慮すれば容易なことであろう。
詳細な記載
本発明の実施は、特記しない限り、クロストリジウムの微生物学および免疫学の分野における公知の常套手段を用いる。かかる技法は、例えば、スターンおよびバティー（SterneおよびBatty）の、パソゲニック・クロストリジア（Pathogenic Clostridia）（ボストン、バターワース）（１９７５）；デベロップメント・イン・バイオロジカル・スタンダージゼーション（Developments in Biological Standardization），３２巻，エス・カルガー（S.Karger），バーゼル（Basel）（１９７６）におけるジョイント・ＯＩＥ−１ＡＢＳ「シンポジウム・オン・クロストリジアル・プロダクツ・イン・ベタラナリ・メジシン（Symposium on Clostridial Products in Veterinary Medicine）」にて説明されている。
前記または後記した特許、特許出願およびその中の公開物はすべて、出典明示により本明細書の一部とする。
本明細書および添付した請求の範囲にて用いる場合、単数形は、その内容が別に明らかである以外、複数形をも包含する。
Ａ．定義
本発明を記載するにおいて、次の用語を用い、それは以下に示すように定義されるものである。
「サポニン」は、広範な種々の植物に見られるいずれのサポゲニングリコシド、ならびにその誘導体を意味し、一緒に投与された抗原の強度を増加させる能力を有する。サポゲニン部は、一般に、ステロイド、トリテルペノイドまたはステロイドアルカロイドである。糖部は大いに変形していてもよく、例えば、数ある中で、グルコース、ガラクトース、ペントース、メチルペントースとすることができる。
「多成分系」クロストリジウム・ワクチン組成物とは、同一クロストリジウム種の２またはそれ以上の抗原型の培養体および／または異なるクロストリジウム種から誘導される培養体に由来するワクチンをいう。多成分系ワクチンは、一般に、問題の疾患および治療される対象に依存して、２ないし１５種の異なる抗原型または種から、さらに一般的には、２ないし１０種の異なる抗原型または種から誘導される。
「免疫原」とは、動物に導入された場合、後記のように免疫応答を刺激する物質をいう。本発明の目的のため、免疫原は全微生物（生菌、死菌または弱毒菌）、調製物が関連付けられる天然の全微生物に由来する調製分離物および単離物（例、微生物より放出されるトキシンまたは全微生物に由来する細胞不含抽出物に含まれる蛋白質を不活化することにより製造されるトキソイド調製物）または免疫応答を刺激するであろう１種またはそれ以上のエピトープを含有する分子をいう。
組成物またはワクチンに対する「免疫応答」は、クロストリジウム疾患の徴候が予防されるかまたは軽減されるような、宿主における組成物またはワクチンに対する細胞性および／または抗体免疫応答の発生をいう。
「ウシ科対象」とは、雄または雌の種々の雌牛または雄牛のいずれをもいう。該用語は特定の年齢を指すものではない。したがって、成牛および新生牛のいずれも包含するものである。
Ｂ．一般的方法
本発明の核心は、安定した強力な多成分系クロストリジウム・ワクチンが、貯蔵アジュバントを用いることなく、製造できるという驚くべき知見にある。特に、本発明は、速やかに分散する可溶性アジュバント、すなわち、注射部位に有意な期間保持されないアジュバントからなり、そのために組織反応性が低いワクチンを提供するものである。本発明のワクチンは、筋肉内および皮下経路を介して投与した場合、他のクロストリジウム・ワクチン組成物で見られる、有害な副作用ならびに肉芽腫および膿瘍を誘起させる慢性炎症応答を示すことなく、筋肉内および皮下投与できる。
該ワクチンは多価ワクチンであり、すなわち、２種またはそれ以上のクロストリジウム抗原型の培養物から、および／または種々のクロストリジウム種から誘導される。したがって、免疫原は、標的とされる疾患に依存して、シー・パーフリンジェンス（C.perfringens）；シー・セプチカム（C.septicum）；シー・テタニ（C.tetani）；シー・ショウベイ（C.chauvoei）；シー・ノビイ（C.novyi）；シー・ソルデリイ（C.sordellii）；シー・ヘモリチカム（C.haemolyticum）；シー・ボツリナム（C.botulinum）；およびこれらの種の抗原型のような、クロストリジウム種およびその抗原型から誘導できるが、これらに限定されるものではない。
シー・ショウベイのバクテリンおよびシー・ヘモリチカム、シー・ショウベイ、シー・セプチカム、シー・ノビイ、シー・ソルデリイおよびＣ型とＤ型シー・パーフリンジェンスのトキソイドに由来する多成分系ワクチン組成物が特に興味がある。かかる多成分系ワクチン組成物は示唆されている特定の微生物に対してだけでなく、Ｂ型シー・パーフリンジェンスに対しても免疫性を付与するため、本明細書中、該ワクチン組成物を「８−ウエイ」（”８−ｗａｙ”）ワクチンと称する。もう一つ別の好ましいワクチンは、シー・ヘモリチカムを除き、前記と同じフラクションを有し、そこで該ワクチンを「７−ウエイ」（”７−ｗａｙ”）ワクチンと称する。
非クロストリジウム抗原をまた該ワクチンに加え、広範囲にわたる疾患に対する保護を得ることができる。例えば、ウシ科対象に用いるため、モラクセラ・ボビス（Moraxella bovis）、ヘモルフィルス・ソンヌス（Haemolphilus somnus）、パスツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella hemolytica）、種々の呼吸器ウイルス、ならびに他のウイルスに由来する抗原を、本発明の多成分系クロストリジウム・ワクチン組成物に加えることができる。
クロストリジウム免疫原は、一般に、トキソイド（不活性化トキシン）および／またはバクテリン（死菌不活性化全培養物）として提供され、当該分野において周知の常套手段に従って調製できる。例えば、関連する微生物は、嫌気性条件および当業者により容易に決定される温度、pＨなどの制御条件下、適当な培地にて増殖する。適当な培地は、一般に、通常、１〜４％（ｗ／ｖ）のペプトン水溶液であり、酵母または筋肉、肝臓および膵臓などの器官の抽出物、またはビタミンおよび他の増殖因子等の栄養素が添加されていてもよい。グルコースのような糖を、炭素およびエネルギー源として加える。システイン塩酸塩のような還元剤をまた、低濃度、例えば、０．０１〜０．０５％（ｗ／ｖ）にて加えてもよい。個々の培養体の増殖速度またはトキシン産生速度に依存して、微生物を、一般に、４〜７２時間、またはより長くインキュベートする。ついで、該培養体を以下のように処理する。
まず、個々の培養体に依存して、ホルマリン（ホルムアルデヒド溶液、ＵＳＰ）を用い、適当な濃度、温度およびｐＨで、培養体を１〜５日間不活性化させる。ホルムアルデヒドへの暴露は最小であることが好ましい。不活性化は細菌を殺し、トキシンを無毒であるが、効果的に抗原性トキソイドに変える。細菌培養物の不活性化操作は当業者に周知であるか、または当業者であれば容易に決定できる。
バクテリンが望ましい場合、その場合、不活性化培養物をそのまま残すか、または死菌を、遠心分離および／または濾過により培地より分離してもよい。さらに、細胞を常套手段、例えば、付加的な遠心分離および／または透析操作を用いて精製してもよい。
トキソイドをワクチン組成物にて用いようとする場合、不活性化培養物を濃縮し、トキソイドを、濾液より塩析させることにより、すなわち、硫酸アンモニウムを用いることにより、または透析濾過と共にまたはなしで、分子濾過により部分的に精製してもよい。該トキソイドはさらに透析または遠心分離により精製し、塩を排除できる。残りの不活性化剤はいずれも中和剤、例えば、亜硫酸水素ナトリウムを約０．１〜０．２５％ｖ／ｖまで添加して部分的にまたは完全に中和できる。クロストリジウム・トキソイドを産生する操作について、例えば、出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第３，５７９，６３３号；第４，２６４，５８８号；および第４，２９２，３０７号；ならびにロザノ・イー・エイ（Lozano,E.A.）のアメリカン・ジャーナル・オブ・ベタラナリー・リサーチ（Am.J.Vet.Res.）４２：１６４１−１６４４（１９８１）参照のこと。
前記バクテリンおよびトキソイドを易分散性（すなわち、非貯蔵性）の可溶性アジュバントを配合したワクチン組成物にて投与し、これにより注射部位での慢性的炎症を回避する。例えば、このようなアジュバントは、例えば、アンフィゲン（Amphigen）（米国特許第５，０８４，２６９号）およびサイトカイン（例、種々のインターロイキンまたはインターフェロン）のような、鉱油を用いて製造した温和な水中油型エマルジョンを包含する。
本発明のワクチン組成物に用いるのに特に好ましい分散性の非貯蔵性アジュバントはサポニンである。サポニンは、商業的には、例えば、ベルハウゼン・コーポレーション（Berghausen Corporation）（オハイオ州、シンシナチ）；シグマ・ケミカル・コーポレーション（Sigma Chemical Co.）（ミズリー州、セントルイス）；アルドリッチ（Aldrich）（ウイスコンシン州、ミルウォーキー）；アルファ（マサチューセッツ州、ワードヒル）より入手可能である。また、サポニンは多くの植物種、その中でも特に、例えばジプソフィリア種（Gypsophilia sp.）、サポナリア種（Saponaria sp.）、クイラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）、クイラヤ・モリナ（Quillaja molina）、本草薬、例えば、アケビア・クイナタ（Akebia quinata）、ファトジア・ジャポニカ（Fatsia japonica）、カウロフィラム・ロブスタム（Caulophyllum robustum）、ヘデラ・ロムベア（Hedera rhombea）、クレマティス・キネンシス（Clematis chinensis）、プルサティラ・セルヌア（Pulsatilla cernua）、サピンダス・ムクロッシ（Sapindus mukurossi）、パナックス・ジャポニカム（Panax japonicum）、グリシリザ・グラブラ（Glysyrrhiza glabra）、グリシリザ・ウラレンシス（Glysyrrhiza uralensis）、ポリガラ・セネガ（Polygala senega）、プラチコドン・グランジフロラム（Platycodon grandiflorum）、ポリガラ・テヌイホリア（Polygala tenuifolia）、アキランテス・ファウリエイ（Achyranthes fauriei）、パナックス・ジンセン（Panax ginseng）、パナックス・ノトジンセン（Panax notoginseng）、パナックス・クインクエホリウム（Panax quinquefolium）より抽出できる。これらの供給源からのサポニンの抽出方法は当該分野において公知である。例えば、そのすべてを出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第５，０５７，５４０号および第４，５０１，７３４号、ならびに国際公開Ｎｏ．ＷＯ８８／０９３３６参照のこと。
ワクチン組成物は、一般に、医薬上許容されるビヒクルまたは賦形剤と一緒に処方される。適当なビヒクルは、例えば、水、セイライン、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組み合わせである。加えて、所望により、ビヒクルは少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤およびpＨ緩衝剤を含有してもよい。トキソイドを産生するのに用いられる不活性化剤はまた保存剤として供するが、さらなる保存剤をまたワクチン処方に添加することができる。かかる保存剤は当該分野において公知であり、チメロサール、フェノールおよびフェノール性化合物、ならびに抗生物質を包含する。適当なワクチン用ビヒクルおよび添加剤は公知であるか、または当該分野における当業者にとって明らかであろう。例えばレミントンの製薬科学（Remington’s Pharmaceutical Sciences)、マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Company）、ペンシルベニア州、イーストン、第１８版（１９９０）参照のこと。特に好ましい組成物は、好ましくはpＨを約７に緩衝化した、クロストリジウム成分含有の水性懸濁液または溶液からなる。
例えば、注射可能なワクチン処方は、前記にて製造した有効量の２種またはそれ以上のバクテリンおよび／またはトキソイドを、抗原含量検定により測定される割合にて合することにより調製し、その正確な量は当業者であれば容易に決定できる。本発明の目的のために、クロストリジウム成分の「有効量」は、クロストリジウム疾患の徴候を予防するかまたは軽減させるのに十分な量の循環抗体を産生するのに要する量である。このような量は数種の単位を用いて表すことができる。例えば、クロストリジウム・バクテリンの有効量は、通常、不透明または吸収度の単位（各々、Ｏ．Ｕ．またはＡ．Ｕ．）で表される。これらの単位は、適当な波長、例えば、６２５ｎｍで測定した場合の、培養体の光学濃度（Ｏ．Ｄ．）に基づいている。ついで、該Ｏ．Ｄ．値にワクチン１用量の培養体の体積を掛ける。例えば、３Ｏ．Ｄ．の抗原用量は、６のＯ．Ｄ．を有する培養体０．５ｍｌで得られる。トキソイドの有効量は、Ｌ＋の用語で表してもよい。トキソイドのＬ＋単位は、マウスにおけるトキシン−抗トキシン力価により測定した場合の、標準抗トキシンの１単位に相当する。（ビー・シー・ジャンセン（B.C.Jansen）、デベロップメント・イン・バイオロジカル・スタンダージゼイション（Developments in Biological Standardization）、第３２巻、９１頁、エス・カルガー（S.Karger）、バーゼル（Basel）（１９７６））。有効量はまた、最小致死用量（ＭＬＤ）（試験したマウスの少なくとも８０％が致死する量）に基づいてマウスにて測定してもよい。有効量はまた、培養体におけるトキソイドが、標準抗血清の抗トキシン分子上の結合部位を覆い、中和する能力を測定する免疫吸着検定を用いて決定した、全結合力（ＴＣＰ）単位について表すことができる。
典型的なクロストリジウム成分の有効量は以下のとおりである：
シー・ショウベイ‥約１．５−４Ｏ．Ｕ．、好ましくは約２−２．５Ｏ．Ｕ．、最適には約２．２８Ｏ．Ｕ．；
シー・セプチカム‥不活性化前、約５００−２０００ＭＬＤ、好ましくは約８００−１２００ＭＬＤ、最適には約９００ＭＬＤ；
シー・ノビイ‥不活性化前、約５０００−３００００ＭＬＤ、好ましくは約１００００−２００００ＭＬＤ、最適には約１５，０００ＭＬＤ；
シー・ソルデリイ‥不活性化前、約２５−１００Ｌ＋、好ましくは約４０−６０Ｌ＋、最適には約５０Ｌ＋；
Ｃ型シー・パーフリンジェンス‥不活性化前、約２００−５００Ｌ＋、好ましくは約３００−４００Ｌ＋、最適には約３７５Ｌ＋；
Ｄ型シー・パーフリンジェンス‥不活性化前、約５０−２００Ｌ＋、好ましくは約８０−１２０Ｌ＋、最適には約１００Ｌ＋；および所望により、
シー・ヘモリチカム‥不活性化前、約１５０−５００Ｌ＋、好ましくは約２５０−３００Ｌ＋、最適には約２７０Ｌ＋。シー・ヘモリチカム全細胞をまた約２−８Ｏ．Ｕ．、さらに好ましくは約４−５Ｏ．Ｕ．、最適には約４．５Ｏ．Ｕ．の量にて加えることができる。これらおよび他のクロストリジウム抗原の付加的な有効量は、当業者であれば標準用量応答曲線を用いて容易に決定するであろう。
分散可能な非貯蔵性アジュバントは、一般に、約０．０１％ｗ／ｖないし約０．１％ｗ／ｖ、さらに好ましくは約０．０３％ｗ／ｖないし約０．０８％ｗ／ｖ、最適には約０．０５％ｗ／ｖの最終濃度まで加える。組み立てた後、滅菌水または他の適当なビヒクルを必要な容量まで加えることができる。ついでpＨを６．５〜７．５の間の値に調節する。残量ホルムアルデヒドはホルマリンによって検定でき、要すれば、長期保存の間の非吸着クロストリジウム・トキソイドに対するホルムアルデヒドの不安定作用を回避するために０．３％（ｖ／ｖ）を越えないように、好ましくは０．２％（ｖ／ｖ）を越えないように調整する。最も好ましくは、ワクチン組成物の貯蔵の間、ホルマリン含量を０．２％またはそれ以下に保持する。
ウシ科対象を免疫化するのに、一般に、本発明のワクチン組成物を非経口的に、好ましくは、筋肉内または皮下注射により投与する。しかし、腹腔内および静脈内注射のような他の投与方法もまた許容される。投与されるべき量は治療されるべき動物、動物の免疫系の抗体を合成する能力、所望する保護の程度および標的とされる特定のクロストリジウム感染症に依存する。例えば、前記のクロストリジウム・ワクチン組成物でウシを免疫化するのに、一般に、０．５ｍｌ〜１０ｍlを、より好ましくは１〜５ｍｌが投与される。当業者であれば、他の有効量を一般的実験を介して容易に確立できる。
ワクチン処方を、少なくとも１回、好ましくは２回またはそれ以上の回数投与することにより該対象を免疫化する。しかし、クロストリジウム感染症に対する免疫性を維持するのに必要な回数にて動物に投与してもよい。免疫性を有効レベルで持続するために、例えば、一定間隔、すなわち、６カ月または１年毎にブースターを投与することが望ましい。
最適結果を得るために、前記のワクチン組成物を、離乳前に、離乳時に投与する用量の二分の一を動物に投与してもよい。一度の予防接種したことがない妊娠動物には、２回投与することができ、妊娠期間の終わり近くに１回投与する。以前に予防接種した動物においては、単一のブースターを分娩前に投与できる。
Ｃ．実験
以下の記載は、本発明を実施するための特定の具体例の例示である。実施例は単に例示的目的で示されるにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
用いる数（例、量、温度など）に関して、正確な値を得るための努力がなされてきたが、ある種の実験的誤差または逸脱は、もちろん、許されるべきものである。
実施例１
サポニンアジュバント配合の８ウエイ多成分系クロストリジウム・ワクチンの調製
シー・ショウベイ、シー・セプチカム、シー・ノビイ、シー・ソルデリイ、Ｃ型シー・パーフリンジェンスおよびＤ型シー・パーフリンジェンスを用い、８−ウエイクロストリジウムワクチンを以下のとおり処方した。（該ワクチンは、列挙した微生物に対してだけでなく、Ｂ型シー・パーフリンジェンスに対しても保護を付与するため、８−ウエイワクチンと称する）。
前記したクロストリジウム種を当該分野における周知技法を用いて培養した。６２５ｎｍで光学濃度を測定することにより培養物をモニター観察した。培養物の光学濃度が最大に達した時に、ホルマリンを０．７％（ｖ／ｖ）ないし０．８％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで加えた。ついで、培養物をおよそ１ないし３日間不活性化した。
不活性化後、シー・パーフリンジェンス培養物を遠心分離で無菌的に清澄化させ、４℃で貯蔵した。必要ならば、該不活性化かつ清澄化した培養物を限外濾過により濃縮し、系列構成に要する培養物体積を減少させ、生成物の標準化を助成した。
水酸化アルミニウムゲル不在下、高濃度のホルマリンにより誘起される不安定化作用を回避するために、処理が終了したら（すなわち、濃縮および清澄化後）、重亜硫酸ナトリウム溶液（３７％（ｗ／ｖ））をすべての培養物に加え、残りの遊離ホルマリンを０．２％過剰量にて中和した。
一回のワクチン用量が標準量の以下の各培養物フラクションを含有するように培養物を合した：シー・ショウベイ‥２．２８Ｏ．Ｄ．、シー・セプチカム‥９００ＭＬＤ、シー・ノビイ‥１５，０００ＭＬＤ、シー・ソルデリイ‥５０Ｌ＋、Ｃ型シー・パーフリンジェンス‥３７５Ｌ＋、Ｄ型シー・パーフリンジェンス‥１５０Ｌ＋、シー・ヘモリチカム‥２７０Ｌ＋および４．５Ｏ．Ｄ．菌細胞。
必要な各培養物の体積を、一投与当たりに必要な抗原量を用いる培養物中の抗原含量で割り、ついで必要な投与回数を掛けることにより決定した。
例えば、シー・ノビイ培養物の前不活性化トキシン検定は８０，０００ＭＬＤ／ｍｌを含有することを示し、培養物を１５，０００ＭＬＤ／投与に標準化した。３００，０００回投与の１５００リットル系列について要求される培養物の量は、（１５，０００／８０，０００）ｘ３００，０００＝５６．２５リットルであった。
典型的な系列構成を次のように行った：
完成した培養成分が利用できたと仮定すれば、それは以下の算定された抗原値を有した：
i.    シー・ショウベイ              ＯＤ１２．０
ii.   シー・セプチカム              ３，０００ＭＬＤ／ｍｌ
iii.  シー・ノビイ                  ８０，０００ＭＬＤ／ｍｌ
iv.   シー・ソルデリイ              ７０Ｌ＋／ｍｌ
v.    Ｃ型シー・パーフリンジェンス  ４００Ｌ＋／ｍｌ
vi.   Ｄ型シー・パーフリンジェンス  １２０Ｌ＋／ｍｌ
vii.  シー・ヘモリチカム            ３６０Ｌ＋／ｍｌおよびＯＤ６．０
表１に示す成分より、１５００リットルの系列を構成した。
0004129544.tif 000002
アジュバント、サポニンの最終濃度は０．０５％（ｗ／ｖ）であった。該製品のホルマリン濃度を再び試験し、０．１５−０．２％に調整した。該ホルマリンは単なる保存剤にすぎない。該構成体のpＨを６．８−７．０に調整した。
実施例２
多成分系クロストリジウム・ワクチンの効能
前記の実施例１の記載に従って調製した８−ウエイワクチンをウサギおよびモルモットの効能試験に付した。シー・セプチカム以外の各微生物に対して、ＵＳＤＡ標準試験（９ＣＦＲ１１３．１０６−１１２）を用いた。シー・セプチカムについてはＵＳＤＡ試験は行わない。標準モルモット試験に加えて、シー・ヘモリチカム抗トキシン応答を力価測定した。
単一群の予防接種したウサギ由来の血清についてすべての抗トキシン力価測定を行った。体重が４ないし８ポンドの少なくとも８匹のウサギに、２０〜２３日間隔で２回、ウシ用量の半分の量を皮下注射した。再予防接種の１４〜１７日後にウサギを採血した。少なくとも７匹のウサギからの血清をプールし、種々の抗トキシンについて検定した。
表２に示すように、該生成物はすべての効能用標体と合致するかまたは卓越するものであった。シー・ヘモリチカム成分は、公式モルモット効能試験およびウサギにおける非公式の抗トキシン応答試験の両方にて非常に優れた挙動を示した。
0004129544.tif 000003
実施例３
サポニンアジュバント配合の７−ウエイ多成分系クロストリジウムワクチンの調製
シー・ヘモリチカムが処方中に配合されないことを除いて、実施例１の記載に従って、７−ウェイ多成分系クロストリジウム・ワクチンを調製した。このワクチンを、アジュバント不含の同等のワクチンならびに商業上入手可能な多成分系クロストリジウム・ワクチンであるウルトラバック７（Ultrabac ７）（スミスクライン・ビーチャム（SmithKline Beecham）（アジュバントとして２５％のＡl（ＯＨ）3ゲル配合）と、ウシの局所反応、ウシの抗体応答、およびモルモットの抗体応答および伝染性攻撃について実験し、比較した。
Ａ．安全性
実験１．  １０頭のウシに３種のワクチン（各５ｍｌ）を別々の部位にて２回（４週間の間隔）、皮下注射にて予防接種した。ウシの注射部位反応を、再予防接種の４および６週間後に観察した。結果を以下の表に示す。
0004129544.tif 000004
0004129544.tif 000005
表３および４に示されるように、ウルトラバック７（２５％ｖ／ｖの水酸化アルミニウムゲル含有）をウシに皮下注射した場合、該アジュバントは局所反応を誘発した。第１投与が動物を感作したのは明らかであるが、ウシは第２投与に対してワースト反応を示した。上記表は、４および６週間で測定した場合の、第２投与に由来した膨潤体積を提供するものである。反応は１０頭のうち６頭のウシに慢性的であり、６週間でなおも測定可能であった。サポニン単独で、またはアジュバント不含の他の２種のワクチンは２ないし３日間一過性膨潤を誘発した。４または６週間後にはワクチンを注射した部位にて何も検出されなかった。いずれのウシも局所的または全身的な他の臨床的徴候を全く示さなかった。
実験２．  ４０頭のウシ（２０頭の肉牛と２０頭の乳牛）を、実施例２のように製造した、アジュバントとしてサポニン含有の８−ウエイワクチンで予防接種した。該ウシを２回（２週間間隔）、腿部（尻）に５ｍｌを予防接種した。１０頭の動物（各種類から５頭づつ）を第２投与の３０日後に殺し、残りの５頭を第２投与の６１日後に殺した。注射部位を切開し、組織病理学用に試料を摘出した。
狭い帯状の繊維傷跡組織が、あらゆる場合にて注射した筋肉内で垂直方向に走っているのが見られた。該帯の長さは５ないし１０ｃｍであった。該帯は４ないし６週間経過後で厚みが平均約１ｃｍであった。９ないし１１週間までに、大部分の傷跡組織は消滅し、正常な筋肉と置き換わった。この段階で、該傷跡組織は平坦なリボン状の形態であり、検出すること、および筋肉間の筋膜面における正常な繊維組織と区別することは困難であった。組織病理学は反応体の純繊維特性を確認し、膿または膿物形成についての証拠を何ら示さなかった。かかるわずかな傷跡が屠殺場で検出されるか、またはトリム損失に至ることもないであろう。
実験３．  皮下注射に対する反応性の違いを証明するために、ウシを肩の後ろから肋骨にかけて２回（２１日間隔）にて予防接種した。第２投与を第１投与の後ろ１５ないし２０ｃｍに注射した。５頭をウルトラバック８（５ｍｌ）で予防接種し、５頭を実験２にて用いたサポニン含有の８−ウエイワクチン（５ｍｌ）で予防接種した。第１週の間、サポニンを有する生成物は、ウルトラバック８によって誘発される膨潤部よりも小さい拡散した平坦な膨潤部を誘発した。２ないし３週間までに、サポニン含有の生成物により誘発される膨潤部はほとんど完全に消滅した。ウルトラバック８により誘発される膨潤部はコンパクトになり、限界が画され、皮膚の下に鶏卵が移植されたようであった。これらの膨潤部は５-１／２週間でほとんど消散しなかった。この時点でサポニン生成物の注射部位は完全に検出できなかった。
この実験に用いたウシは、シャロレー（Charolais）品種であると考えられる１頭の子ウシは別として、純粋または交配種のアバディーン・アンガスまたはヘレフォード（Aberdeen AmgusまたはHerefords）種であった。この子ウシをウルトラバック８で予防接種し、ウルトラバック８群のうち該子ウシだけが記載されているような反応を生じなかった。
Ｂ．抗体応答
一群８頭のウシを、サポニンまたはウルトラバック７含有の７−ウエイワクチンで皮下的に予防接種し、陰性対照は予防接種しないままであった。予防接種対象に、５ｍｌを２回（４週間間隔）注射し、２週間および再度３カ月後に採血した。その抗体応答を表５および表６に示す。モルモットを同様に予防接種し、その結果を表７に示す。表から明らかなように、モルモットの抗体応答はウシの結果を支持している。この実験はまた、シー・ショウベイについてのＵＳＤＡ標準効能試験にて、ビルラント攻撃からのモルモットの保護について、サポニンがＡl（ＯＨ）3ゲル（ウルトラバック７）よりも優れていることを示した。
0004129544.tif 000006
0004129544.tif 000007
0004129544.tif 000008
このように、本発明はサポニンアジュバントを用いる新規多成分系クロストリジウム・ワクチン組成物およびその投与方法を開示する。本発明の好ましい具体例が詳細な説明にて記載されているが、添付した請求の範囲により定義される精神および範囲を逸脱することなく明らかな変形を行うことができることが認識されるであろう。