(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するヘム含有酵素の鋳型遺伝子を、プロテイン・ジスルフィド・イソメラーゼ（ＰＤＩ）、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｅｐＥ又はチオレドキシン（Ｔｘ）から選ばれる１種又は２種以上のシャペロン機能を有するタンパク質と共に大腸菌に由来する無細胞抽出液に添加するプロセスと、
この無細胞抽出液を用いて、前記分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するヘム含有酵素を生産するプロセスと、
を含むタンパク質の生産方法。
【請求項２】
前記無細胞抽出液からは還元剤が排除されている、請求項１に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項３】
前記無細胞抽出液に対して、前記鋳型遺伝子及びシャペロン機能を有するタンパク質と共にヘミンを添加する、請求項１に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項４】
前記ヘム含有酵素の少なくとも一部を、前記ヘミンが関与する特定の機能を示す活性型として得る、請求項３に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項５】
前記ヘム含有酵素がペルオキシダーゼである、請求項１に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項６】
前記ヘム含有酵素を、無細胞抽出液のままで活性測定を行い得る濃度で、活性型として無細胞抽出液中に得る、請求項１に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項７】
分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するヘム含有酵素をコードする核酸の塩基配列に対して特定の又はランダムな塩基配列の変更を加えてなる鋳型遺伝子を、プロテイン・ジスルフィド・イソメラーゼ（ＰＤＩ）、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｅｐＥ又はチオレドキシン（Ｔｘ）から選ばれる１種又は２種以上のシャペロン機能を有するタンパク質と共に大腸菌に由来する無細胞抽出液に添加するプロセスと、
この無細胞抽出液を用いて鋳型遺伝子によりコードされたヘム含有酵素を生産するプロセスと、
生産されたヘム含有酵素を活性の測定によりスクリーニングするプロセスと、
を含むタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項８】
機能の発現に特定のパターンの分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合の形成を必要とし、該機能の少なくとも一部が未知であるヘム含有酵素をコードする鋳型遺伝子を、プロテイン・ジスルフィド・イソメラーゼ（ＰＤＩ）、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｅｐＥ又はチオレドキシン（Ｔｘ）から選ばれる１種又は２種以上のシャペロン機能を有するタンパク質と共に大腸菌に由来する無細胞抽出液に添加するプロセスと、
この無細胞抽出液を用いて鋳型遺伝子によりコードされたヘム含有酵素を生産するプロセスと、
生産されたヘム含有酵素の機能の試験により該ヘム含有酵素の未知の機能を検索するプロセスと、
を含むタンパク質の機能検索方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無細胞タンパク質合成系（ in vitro 転写・翻訳系）によって、特定の分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質を効率的に生産するタンパク質の生産方法に関する。又、本発明は、前記タンパク質の生産方法を応用したタンパク質のスクリーニング方法に関する。更に、本発明は、前記のタンパク質の生産方法を応用したタンパク質の機能検索方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
〔関連技術の記載〕
近年、例えばイネゲノムやヒトゲノム等の塩基配列の解明のように、大規模なＤＮＡ解析が活発に行われている。これらを可能にした大きな要因が、鋳型ＤＮＡを迅速かつ大量にクローニングできるＰＣＲ（ Polymerase Chain Reaction）法の開発であった。
【０００３】
現在は「ポスト・ゲノムの時代」と呼ばれ、ゲノム中に含まれる遺伝子が転写・翻訳されて発現する各種の酵素、抗体等の機能性タンパク質の解析に大きな関心が持たれている。機能性タンパク質の解析には、そのタンパク質を解析に供し得る程度に大量生産することが望まれる。しかしタンパク質に関しては、ＤＮＡにおける上記ＰＣＲ法のような、自己複製による大量生産技術は存在しない。
【０００４】
そこで、いわゆる無細胞タンパク質合成系（in vitro転写・翻訳系）によるタンパク質の効率的生産方法が注目される。この方法では、無細胞抽出液を利用することによって、細胞内において鋳型遺伝子が転写・翻訳されてタンパク質を発現するプロセスに必要な要素を維持できる。しかも、細胞内部でタンパク質を生産することに伴う多様な制約を解除できる。無細胞抽出液としては、一定の理由から、例えば大腸菌や小麦胚芽細胞等に由来する無細胞抽出液が好んで用いられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、細胞内におけるタンパク質生産プロセスの内容や、生物種毎のタンパク質生産プロセスの相違等については、必ずしも詳細に解明されてはいない。更に、無細胞系によるタンパク質の生産方法と、元の細胞内における同じタンパク質の生産プロセスとの相違点の有無や、相違点の内容について、解明されていない点が多い。
【０００６】
例えば、無細胞系により、活性型である特定の機能性タンパク質の効率的生産に成功した事例が報告された場合を仮定する。この場合、同一の無細胞系によって、その機能性タンパク質と同じファミリーを構成する類似の機能性タンパク質を生産し得るであろう、との予測は可能である。しかし、前記の特定の機能性タンパク質とは異種のタンパク質については、このような予測は成立し難い。
【０００７】
分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質には、各種の抗体や、金属を含有する一定の機能性タンパク質（例えば、金属を含有する酵素）等の非常に有用なタンパク質が含まれている。抗体は、Ｌ鎖とＨ鎖との間で形成される分子間ジスルフィド結合により、特有の空間的コンフォメーションを構成する機能性タンパク質である。分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有し、かつ金属を含有する機能性タンパク質のファミリーには、鉄（Fe）を含有する酵素であるペルオキシダーゼ、同じくFeを含有する酸素運搬タンパク質であるヘモグロビン、銅（Cu）を含有する酸素運搬タンパク質であるヘモシアニン、カルシウムと結合したシグナル伝達関連タンパク質であるカルモジュリン等が包含される。
【０００８】
しかし、これらの分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質は一般的に無細胞系によっては活性型の生産が困難であるとされている。
【０００９】
例えば、抗体等の分子間ジスルフィド結合を有するタンパク質の無細胞系による生産についての報告例は全くない。因みに、本来はＨ鎖とＬ鎖を分子間ジスルフィド結合により架橋したものである Fab抗体を、ペプチドリンカーにより連結された１本鎖としたもとで、人工的な活性型の抗体を合成した例は報告されている（Nat. Biotechnol. vol.15, p79, 1997）。しかし、これは分子間ジスルフィド結合を有するタンパク質ではない。
【００１０】
組換え型ヘム含有タンパク質であるペルオキシダーゼについては、大腸菌による封入体での生産例が報告されている。この場合、封入体を尿素等の変性剤に溶解した後、ヘムを添加してリフォールディングさせる必要がある（Tienら，Biochem.Biophys.Research Comm.;216,1013-1017;1995 ）。 Amoldらにより、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を大腸菌のペリプラズムにおいて活性型酵素として分泌させた例（Biotechnol.Prog.;15,467-471;1999）や、ＨＲＰを酵母において発現及び分泌させた例（Protein Eng.;13,377-84;2000 ）が報告されている。これらの場合、ヘムを作らせるためにヘム前駆体（δ−アミノレブリン酸）を培地中に添加する必要がある。酵母においてＣｉＰ（Coprinus cinereus ペルオキシダーゼ）を発現及び分泌させた例（ Novo Nordisk 社；Nature biotechnol.;17,379-384;1999）も報告されている。
【００１１】
しかし、以上の金属含有タンパク質の生産例は、いずれも無細胞系を利用したものではない。一般的に、ヘム含有タンパク質等の金属含有タンパク質を大腸菌封入体として生産する場合、不活性型のタンパク質が得られる。そして、これを活性型にフォールディングするためには、少なくとも数日程度の処理時間を要する、と言う不具合がある。酵母細胞を用いた発現系は、酵母の増殖が遅いことから操作性が悪い、と言う不具合がある。又、本来的に金属含有タンパク質を生産可能な高等動植物の細胞内において金属含有タンパク質の生産を図る場合でも、添加する大量の金属含有物質の毒性等の理由から、一般的に金属含有タンパク質の大量発現は困難であると考えられる。
【００１２】
従って、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有する活性型のタンパク質、特に(a) 活性型の抗体や、(b) 活性型の金属含有タンパク質、を迅速にかつ大量に生産できるタンパク質生産方法が求められている。又、ポストゲノム時代の重要技術である、進化分子工学においてスクリーニングにより新規な改変酵素等を得る目的からも、このようなタンパク質生産方法が求められている。更に、いわゆるバイオインフォーマティクスへの応用等を考えても、このようなタンパク質生産方法が強く求められている。
【００１３】
このような要求に対する有力な解決手段の一つとして、無細胞タンパク質合成系（in vitro転写・翻訳系）による上記タンパク質の効率的生産方法を提供することが期待されている。しかし、上記(a) ，(b) のようなタンパク質生産方法の成功例は未だ報告されていない。
【００１４】
今までのところ、無細胞系によって(a) ，(b) のタンパク質を生産できるか、は不明である。無細胞系によって(a) ，(b) の活性型タンパク質を生産できるかも不明である。大腸菌等に由来する汎用性の高い無細胞系によって(a) ，(b) の活性型タンパク質を生産できるか、も不明である。更に無細胞系によって(a) ，(b) の活性型タンパク質を効率的に大量生産できるか、も不明である。
【００１５】
〔本発明の概要〕
本発明は、無細胞系によって、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質を効率的に生産できるタンパク質生産方法を提供することを目的とする。これらのタンパク質は、好ましくは抗体又は金属含有タンパク質である。又、本発明は、無細胞系によって活性型の上記タンパク質を効率的に生産できるタンパク質生産方法を提供することを目的とする。又、本発明は、このタンパク質生産方法を利用したこれらのタンパク質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、前記タンパク質生産方法を利用したタンパク質の機能検索方法を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
（第１発明）
本願の第１発明（第１アスペクト）は、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質の鋳型遺伝子を無細胞抽出液に添加するプロセスと、この無細胞抽出液を用いて前記分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質を生産するプロセスと、を含むタンパク質の生産方法である。
【００１７】
本願発明者は、第１発明のように、無細胞抽出液に対して所定の鋳型遺伝子を添加することにより、無細胞タンパク質合成系（in vitro転写・翻訳系）による分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質の生産に初めて成功した。
【００１８】
又、第１発明は無細胞抽出液を利用するので、細胞内において鋳型遺伝子が転写・翻訳されるプロセスに必要な要素を維持しつつ、細胞内部でタンパク質を生産することに伴う多様な制約から開放される。そのため、目的とするタンパク質をより迅速かつ大量に生産することができる。
【００１９】
（第２発明）
本願の第２発明（第２アスペクト）においては、上記の第１発明における前記無細胞抽出液に対して、前記鋳型遺伝子と共に１種又は２種以上のシャペロン機能を有するタンパク質を添加する。
【００２０】
本願発明において特に注目すべき点の一つは、第２発明のように、無細胞抽出液に対して鋳型遺伝子と共にシャペロン機能を有するタンパク質を添加することである。このことにより、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有する活性型のタンパク質の生産量が著しく向上する。
【００２１】
即ち、従来は、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有する活性型タンパク質の無細胞系による合成の成功例はなかったが、これが可能であることが、第２発明によって初めて示された。無細胞抽出液に対して鋳型遺伝子と共にシャペロン機能を有するタンパク質を添加することにより、鋳型遺伝子に基づくペプチド鎖合成と同時にその折りたたみが正確に行われ、活性型タンパク質への変換が効率的に進行するのである。
【００２２】
（第３発明）
本願の第３発明（第３アスペクト）においては、上記の第２発明における前記シャペロン機能を有するタンパク質がプロテイン・ジスルフィド・イソメラーゼ（ＰＤＩ）である。
【００２３】
本願発明で用いるシャペロン機能を有するタンパク質としては、第３発明に係るＰＤＩがとりわけ好ましい。
【００２４】
（第４発明）
本願の第４発明（第４アスペクト）においては、上記の第２発明における前記シャペロン機能を有するタンパク質が、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｅｐＥ又はチオレドキシン（Ｔｘ）である。
【００２５】
本願発明で用いるシャペロン機能を有するタンパク質として、第４発明に係る各種のタンパク質も好ましく用いることができる。
【００２６】
（第５発明）
本願の第５発明（第５アスペクト）においては、上記の第１発明〜第４発明における前記無細胞抽出液からは還元剤が排除されている。
【００２７】
本願発明において特に注目すべき点の一つは、無細胞抽出液に常套的に添加されているＤＴＴ（ジチオスレイトール）等の還元剤に着目したことである。分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質においては、その機能の発現のために特定パターンの分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合の形成を必要とする。ところが、本願発明者は、無細胞抽出液を還元状態とすることにより、このような特定パターンのジスルフィド結合が確定的に形成され難くなることを見出した。従って、機能の発現のために分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合の形成を必要とする各種のタンパク質を活性型として生産するに当たり、無細胞抽出液から還元剤を排除しておくことは非常に有効である。
【００２８】
なお、無細胞抽出液に前記のシャペロン機能を有するタンパク質を添加し、かつ無細胞抽出液から還元剤を排除することにより、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有する活性型のタンパク質の生産量が一層著しく向上する。
【００２９】
（第６発明）
本願の第６発明（第６アスペクト）においては、上記の第１発明〜第５発明における前記分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質が抗体である。
【００３０】
「分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質」の内、分子間ジスルフィド結合を有するタンパク質としては、抗体が特に好ましく例示される。本願発明者は、無細胞抽出液に対して一定の鋳型遺伝子を添加することによって、無細胞タンパク質合成系（in vitro転写・翻訳系）による抗体の生産に初めて成功した。
【００３１】
（第７発明）
本願の第７発明（第７アスペクト）においては、上記の第６発明における前記抗体を、無細胞抽出液のままで活性測定を行い得る濃度で、活性型として無細胞抽出液中に得る。活性型の抗体について、「無細胞抽出液のままで活性測定を行い得る濃度」とは、無細胞抽出液中に合成された活性型抗体の量が１０μｇ／ｍＬ以上であることを言う。
【００３２】
上記第６発明に係るタンパク質の生産方法においては、第７発明のように活性型の抗体が無細胞抽出液のままで活性測定を行い得る濃度で無細胞抽出液中に得られることが分かった。従って目的タンパク質である抗体の濃縮又は精製操作等を一切行うことなく抗体の活性測定を行うことができる。この効果は、一般的に転写・翻訳反応液が１μｌあればタンパク質活性等の機能の評価が可能であることから、研究開発の現場において自動化された機器等を用いた迅速な大量スクリーニングを可能とする等の点で大きなメリットをもたらす。
【００３３】
（第８発明）
本願の第８発明（第８アスペクト）においては、上記の第１発明〜第５発明における前記分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質が金属含有タンパク質である。
【００３４】
「分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質」の内、分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質としては、金属含有タンパク質が特に好ましく例示される。本願発明者は、鋳型遺伝子を利用する無細胞タンパク質合成系（in vitro転写・翻訳系）によって金属含有タンパク質の生産に初めて成功した。
【００３５】
この金属含有タンパク質の生産方法は、鉄（Fe）を含有する酵素ペルオキシダーゼ、同じくFeを含有する酸素運搬タンパク質ヘモグロビン、銅（Cu）を含有する酸素運搬タンパク質ヘモシアニン、カルシウムと結合したシグナル伝達関連タンパク質カルモジュリン等の金属含有タンパク質のファミリーに対して一般的に適用できると考えられる。
【００３６】
（第９発明）
本願の第９発明（第９アスペクト）においては、上記の第８発明における前記無細胞抽出液に対して、前記鋳型遺伝子と共に金属を含む機能単位を添加する。上記の第８発明においては、無細胞抽出液に対して鋳型遺伝子と共に金属を含む機能単位とを添加することが、より好ましい。
【００３７】
（第１０発明）
本願の第１０発明（第１０アスペクト）においては、上記の第９発明における前記金属含有タンパク質の少なくとも一部を、前記金属を含む機能単位が関与する特定の機能を示す活性型として得る。
【００３８】
第９発明に係るタンパク質の生産方法において、金属含有タンパク質の少なくとも一部が、金属を含む機能単位が関与する特定の機能を示す活性型として得られることが確認された。従って金属含有タンパク質を取得した後、その活性化のために長時間を要してフォールディング等を行うと言う操作性の悪さを回避することが可能となる。
【００３９】
（第１１発明）
本願の第１１発明（第１１アスペクト）においては、上記の第９発明における前記金属を含む機能単位が金属錯体である。
【００４０】
第９発明において、鋳型遺伝子と共に無細胞抽出液に添加する金属を含む機能単位として、特に金属錯体が好ましく例示される。
【００４１】
（第１２発明）
本願の第１２発明（第１２アスペクト）においては、上記の第１１発明における前記金属錯体がヘミンである。
【００４２】
第１１発明に係る金属錯体としては特にヘミンが好ましく例示される。従来、封入体として金属含有タンパク質を生産させるため、例えば前記従来技術のように、金属（Fe）イオンとヘム前駆体（δ−アミノレブリン酸）を培地中に添加した例はある。しかし、鋳型遺伝子と共に金属錯体等の金属を含む機能単位を添加することで、無細胞系において金属含有タンパク質を生産できることが、初めて見出された。
【００４３】
（第１３発明）
本願の第１３発明（第１３アスペクト）においては、上記の第８発明〜第１２発明における前記金属含有タンパク質がヘム含有酵素である。
【００４４】
第８発明〜第１２発明において生産される金属含有タンパク質として、各種のペルオキシダーゼ等のヘム含有酵素が、とりわけ有用性が高い。これらについては、例えば洗剤への添加、ポリマー重合、無塩素系によるパルプ漂白、芳香族系の難分解環境汚染物質の分解、排水処理等の用途を挙げることができる。
【００４５】
（第１４発明）
本願の第１４発明（第１４アスペクト）においては、上記の第１３発明における前記ヘム含有酵素がペルオキシダーゼである。
【００４６】
第１３発明に係るヘム含有酵素としては、各種のペルオキシダーゼが好ましく例示される。
【００４７】
（第１５発明）
本願の第１５発明（第１５アスペクト）においては、上記の第８発明〜第１４発明における前記金属含有タンパク質を、無細胞抽出液のままで活性測定を行い得る濃度で、活性型として無細胞抽出液中に得る。活性型の金属含有タンパク質について「無細胞抽出液のままで活性測定を行い得る濃度」とは、無細胞抽出液中に合成された活性型金属含有タンパク質の量が１０μｇ／ｍＬ以上であることを言う。
【００４８】
上記第８発明〜第１４発明に係るタンパク質の生産方法においては、第１５発明のように活性型の金属含有タンパク質が無細胞抽出液のままで活性測定を行い得る濃度で無細胞抽出液中に得られることが分かった。
【００４９】
従って、目的タンパク質である金属含有タンパク質の濃縮又は精製操作等を一切行うことなく金属含有タンパク質の活性測定を行うことができる。この効果は、一般的に転写・翻訳反応液が１μｌあればタンパク質活性等の機能の評価が可能であることから、研究開発の現場において自動化された機器等を用いた迅速な大量スクリーニングを可能とする等の点で、大きなメリットをもたらす。
【００５０】
（第１６発明）
本願の第１６発明（第１６アスペクト）においては、上記の第１発明〜第１５発明における前記無細胞抽出液が大腸菌に由来するものである。
【００５１】
大腸菌に由来する無細胞抽出液は、汎用性が高く入手も容易である。大腸菌に由来する無細胞抽出液を利用して、抗体や金属含有タンパク質等の分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質を生産できることは、発明の実施上非常に有利である。
【００５２】
（第１７発明）
本願の第１７発明（第１７アスペクト）は、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有する任意の種類のタンパク質をコードする核酸の塩基配列に対して特定の又はランダムな塩基配列の変更を加えてなる鋳型遺伝子を無細胞抽出液に添加するプロセスと、この無細胞抽出液を用いて鋳型遺伝子によりコードされたタンパク質を生産するプロセスと、生産されたタンパク質を活性の測定によりスクリーニングするプロセスと、を含むタンパク質のスクリーニング方法である。
【００５３】
任意のタンパク質をコードする核酸の塩基配列に対して特定の又はランダムな変更を加え、これを鋳型遺伝子として発現させることにより、新たな機能を持つタンパク質をスクリーニングすると言う手法が注目されている。
【００５４】
第１７発明は、この手法を、無細胞系において、しかも分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質に関して導入することを可能にしたものである。この方法は、無細胞抽出液に対してシャペロン機能を有するタンパク質を添加した場合、及び／又は、無細胞抽出液から還元剤を排除した場合に、一層有効である。その結果、これらのタンパク質につき、迅速に活性型のタンパク質を生産させ、新機能を有するタンパク質を大量スクリーニングすることが可能となる。例えば、大腸菌等の生細胞を用いた系では１ケ月近くを要するスクリーニングを、１日で行うことが可能となる。
【００５５】
（第１８発明）
本願の第１８発明（第１８アスペクト）は、機能の発現に特定のパターンの分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合の形成を必要とし、該機能の少なくとも一部が未知である任意のタンパク質をコードする鋳型遺伝子を無細胞抽出液に添加するプロセスと、この無細胞抽出液を用いて鋳型遺伝子によりコードされたタンパク質を生産するプロセスと、生産されたタンパク質の機能の試験により該タンパク質の未知の機能を検索するプロセスと、を含むタンパク質の機能検索方法である。
【００５６】
機能の発現に特定のパターンの分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合の形成を必要とし、該機能の少なくとも一部が未知である任意のタンパク質群の機能検索は、ポストゲノムの時代において極めて重要である。そのためには、これらのタンパク質を、活性型で、迅速に、かつ少なくとも解析可能な程度には大量に、発現させる必要がある。
【００５７】
しかし、そのために従来利用されて来たin vitro転写・翻訳系によるタンパク質生産では、活性型でのタンパク質生産が難しかった。第１８発明によって上記の問題が解決され、効率的なタンパク質の機能検索方法が提供される。この方法は、無細胞抽出液に対してシャペロン機能を有するタンパク質を添加した場合、及び／又は、無細胞抽出液から還元剤を排除した場合に、一層有効である。
【００５８】
（第１９発明）
本願の第１９発明（第１９アスペクト）においては、上記の第１８発明における前記タンパク質が、任意の機能を有するタンパク質複合体のサブユニットを構成するタンパク質である。
【００５９】
上記第１８発明に係るタンパク質として、任意の機能を有するタンパク質複合体のサブユニットを構成するタンパク質を好ましく例示することができる。タンパク質複合体のサブユニットを構成するタンパク質においては、上記特定パターン分子間のジスルフィド結合は、他のサブユニットを構成するタンパク質分子との間で形成される。
【００６０】
（第２０発明）
本願の第２０発明（第２０アスペクト）においては、上記の第１９発明における前記タンパク質複合体が抗体である。
【００６１】
上記第１９発明に係るタンパク質複合体として、抗体を好ましく例示することができる。抗体においては、上記特定パターン分子間のジスルフィド結合は、Ｌ鎖とＨ鎖との間で形成される。
【００６２】
【発明の実施の形態】
〔発明の詳細な記載〕
（タンパク質の生産方法）
本発明に係るタンパク質の生産方法は、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質を生産するための in vitro 転写・翻訳系による生産方法であって、無細胞抽出液に対して少なくとも鋳型遺伝子を添加することにより行われる。後述する金属含有タンパク質を生産する場合においては、無細胞抽出液に対して、前記鋳型遺伝子と共に金属含有タンパク質における金属を含む機能単位を添加することが好ましい。
【００６３】
本発明に係るタンパク質の生産方法は、下記の (c)〜(e) の実施形態において特に好ましく行われる。
【００６４】
(c) 無細胞抽出液に対して、前記鋳型遺伝子と共に１種又は２種以上のシャペロン機能を有するタンパク質を添加する。
【００６５】
(d) 無細胞抽出液から、常用されているＤＴＴ等の還元剤を排除する。「還元剤を排除する」とは、in vitro転写・翻訳系において常套的に添加されているＤＴＴ等の還元剤の添加を行わないか、あるいは既に還元剤が添加されている市販のin vitro転写・翻訳系から透析等によってこれを排除したり、又はヨードアセトアミド等のＳＨ基修飾剤や酸化剤等を添加して結果的に還元剤を無効化したりすることを言う。
【００６６】
(e) 上記(c) のシャペロン機能を有するタンパク質の添加と、上記(d) の還元剤の排除とを一緒に行う。
【００６７】
これら(c) 〜(e) の実施形態によれば、無細胞抽出液中の活性型タンパク質を、無細胞抽出液そのままで濃縮・精製することなく活性測定を行い得る濃度で、無細胞抽出液中に得ることができる。
【００６８】
（無細胞抽出液）
無細胞抽出液としては、良く利用される大腸菌，小麦胚芽，昆虫細胞等に由来するものは勿論利用できるが、これらに限定されず、細菌等の原核細胞生物一般，酵母等の真核単細胞生物一般，植物細胞一般，動物細胞一般に由来するものを利用できる。金属含有タンパク質の生産方法においては、元々その生産能力を有する細胞に由来する無細胞抽出液も利用できるし、元々その生産能力を有しない細胞に由来する無細胞抽出液も利用できる。あるいは、金属錯体をその金属イオンと前駆体とから合成する経路を備えない細胞に由来する無細胞抽出液も利用できる。
【００６９】
上記各種の細胞からの無細胞抽出液の調製方法は、必要に応じて各種の周知又は公知の方法を任意に採用すれば良く、別段に限定されない。例えば、ホモジナイザーで細胞を磨り潰したり、急激な圧力変化を与えて細胞を破砕したり、超音波処理によって破砕したりすることができる。これらの操作に加えて、細胞骨格成分等を例えば遠心分離等で排除しても良い。あるいは、市販されている無細胞抽出液を利用することもできるが、市販品にＤＴＴ等の還元剤が添加されている場合には、前記のようにこれを排除又は無効化することが好ましい。
【００７０】
無細胞抽出液には、タンパク質の生産能力を向上させるために一般的に添加される各種の成分を添加することも好ましい。これらの成分として、緩衝液，鋳型遺伝子の転写に使用される４種類のヌクレオチド３リン酸やＲＮＡポリメラーゼ，翻訳に使用される各種のアミノ酸，トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ），ポリエチレングリコール，リン酸化酵素等を例示することができる。
【００７１】
（鋳型遺伝子）
鋳型遺伝子は、目的とする分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質をコードする核酸を含む限りにおいて、その構成を限定されない。前記核酸の塩基配列に適当な制御配列を連結することが好ましい。例えば、上流にプロモーターを付加したり、下流にターミネーターを付加することができる。プロモーターからターミネーターまでの遺伝子を適当なベクターに挿入したものも使用できるし、プロモーターからターミネーターまでの遺伝子をＰＣＲで増幅した断片も使用できる。
【００７２】
（分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質）
本発明において、「分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質」とは、分子間及び／又は分子内で形成される特定のジスルフィド結合によって一定の空間的コンフォメーションが構成され、そのことがタンパク質の機能発現に不可欠であるタンパク質を言う。
【００７３】
この種のタンパク質の種類は限定されない。例えば、分子間ジスルフィド結合を有するタンパク質としては、Ｌ鎖とＨ鎖との間で分子間ジスルフィド結合が形成される抗体や、インシュリン、α−キモトリプシン等が代表的である。例えば、分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質としては、後述する各種の金属含有タンパク質や、ＮＯｘリダクターゼ等の還元酵素、トリプシン、リボヌクレアーゼＡ等が代表的である。
【００７４】
（抗体）
本発明において、抗体とは、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質であって、Ｈ鎖とＬ鎖からなる一定の機能単位を構成要素とするタンパク質を言う。抗体として IgG免疫グロブリン抗体、 Fab抗体、 Fab' 抗体、 F(ab')２抗体等の抗原結合部位を１つ又は２つ含むタンパク質を例示できる。
【００７５】
（金属含有タンパク質）
本発明において、金属含有タンパク質とは、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質であって、金属を含む一定の機能単位を構成要素とし、活性型においては当該機能単位が関与する特定の機能を示すようなタンパク質を言う。この条件に合致する限りにおいて金属含有タンパク質の種類、金属を含む機能単位の種類、金属の種類は限定されない。
【００７６】
金属含有タンパク質としては、例えば、鉄（Fe）を含むヘム含有タンパク質である酵素ペルオキシダーゼや酸素運搬タンパク質ヘモグロビン、銅（Cu）を含有する酸素運搬タンパク質ヘモシアニン、カルシウム（Ca）と結合したシグナル伝達関連タンパク質カルモジュリン、等を挙げることができる。
【００７７】
ペルオキシダーゼとしては、マンガンペルオキシダーゼ，ホースラディッシュ（西洋ワサビ）ペルオキシダーゼ，チトクロームｃペルオキシダーゼ，リグニンペルオキシダーゼ等を例示することができる。
【００７８】
金属を含む機能単位の種類は限定されないが、金属錯体が代表的であり、上記ペルオキシダーゼやヘモグロビンにおけるFe−ポルフィリン錯体であるヘミン等を挙げることができる。
【００７９】
（シャペロン機能を有するタンパク質）
シャペロン機能を有するタンパク質とは、対象とする一定のタンパク質を正しい立体構造に修復させ、更にはそのことにより対象とするタンパク質本来の特定の機能を発現可能にする働きを持つタンパク質を言う。シャペロン機能を有するタンパク質としては、例えば、対象とするタンパク質におけるジスルフィド結合を正しく形成させる（ジスルフィド結合の掛け直しをさせる）ことによりシャペロン機能を奏するものが例示される。その他にも、アグリゲーションの溶解、前駆体タンパク質の安定化、アグリゲーションの抑制等によりシャペロン機能を奏するもの等が例示され、更にシャペロン機能に類似したシャペロン様機能を奏するものも例示される。
【００８０】
本発明において、シャペロン機能（又はシャペロン様機能）を有するタンパク質として最も好ましいものはＰＤＩ（プロテイン・ジスルフィド・イソメラーゼ）、とりわけカビＰＤＩである。他種のシャペロン機能を有するタンパク質、例えば実施例で使用しているＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳの他、ＧｒｅｐＥ、Ｔｘ等も限定なく使用できる。
【００８１】
（タンパク質のスクリーニング方法）
本発明に係るタンパク質のスクリーニング方法は、上記した分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質の生産方法をタンパク質の分子進化工学に応用するものである。
【００８２】
より具体的には、鋳型遺伝子として、任意の分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質をコードする核酸の塩基配列に特定の又はランダムな多様な変更を加える。こうして準備された多数種の鋳型遺伝子を上記のタンパク質の生産方法によって転写・翻訳させる。そして、生産される多様なタンパク質が、活性を検出可能な程度ないしは非常に大量に活性型を含む点を利用して、活性型タンパク質を大規模にしかも迅速にスクリーニングするのである。
【００８３】
本発明に係るタンパク質のスクリーニング方法も、前記した (c)〜(e) の実施形態において特に好ましく行われる。又、金属含有タンパク質を対象とする場合には、所定の鋳型遺伝子と共に金属含有タンパク質における金属を含む機能単位を添加することが好ましい。
【００８４】
本発明に係るタンパク質のスクリーニング方法によれば、転写・翻訳反応液を数μｌ調製すればスクリーニングができるので、短時間でスクリーニングが可能となる。そして例えばタンパク質立体構造のコンピュータモデルとの組合わせで、目的のタンパク質の効率的デザインが可能となる。
【００８５】
（タンパク質の機能検索方法）
本発明に係るタンパク質の機能検索方法は、上記したタンパク質の生産方法を、機能の発現に特定パターンの分子間ジスルフィド結合の形成を必要とするタンパク質であって機能（の少なくとも一部）が未知のタンパク質の機能検索に応用するものである。より具体的には、無細胞抽出液に機能未知である任意のタンパク質をコードする鋳型遺伝子を添加し、生産された活性型タンパク質の機能を検索するのである。機能の発現に特定パターンの分子間ジスルフィド結合の形成を必要とするタンパク質としては、その種類は限定されないが、任意の機能を有するタンパク質複合体のサブユニットを構成するタンパク質を例示できる。このようなタンパク質複合体の種類も限定されないが、Ｌ鎖とＨ鎖からなる抗体を例示できる。機能検索方法の対象となるタンパク質としては、前記の金属含有タンパク質も例示できる。
【００８６】
本発明に係るタンパク質の機能検索方法も、前記した (c)〜(e) の実施形態において特に好ましく行われる。又、金属含有タンパク質を対象とする場合には、所定の鋳型遺伝子と共に金属含有タンパク質における金属を含む機能単位を添加することが好ましい。
【００８７】
本発明に係るタンパク質の機能検索方法により、近年のバイオインフォーマティクス（プロテオミクス）で問題であった機能未知のタンパク質の機能推定が容易となり、産業上のメリットが大きい。
【００８８】
【実施例】
（実施例１−１：マンガンペルオキシダーゼの生産）
ヘムタンパク質であって分子内ジスルフィド結合を有するマンガンペルオキシダーゼの合成反応を行った。即ち、ホモジナイザー処理や遠心分離を含む通常の調製法に従い、大腸菌Ａ１９株由来のＳ３０菌体の抽出液を調製した。この菌体抽出液に対して、鋳型遺伝子とヘミンを含む以下の１）〜１５）の成分を添加し、２５°Ｃで２時間、in vitroでの転写・翻訳反応を行った。なお、菌体抽出液に対してＤＴＴ（ジチオスレイトール）等の還元剤は添加しなかった。
【００８９】
１）鋳型遺伝子：配列番号１に塩基配列を示す白色腐朽菌由来のマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）遺伝子の上流にT7プロモーターとリボソーム結合部位、下流にT7ターミネーターを付加したＰＣＲ反応産物を５０μｇ／ｍｌ
２）１０μＭ  ヘミン
３）５６．４ｍＭ   Tris-酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）
４）１．２ｍＭ  ＡＴＰ、各１ｍＭのＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰ
５）４０ｍＭ  クレアチンフォスフェート
６）０．７ｍＭ  アミノ酸ミックス（生体タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸混合物）
７）４．１％（Ｗ／Ｗ）  ポリエチレングリコール６０００
８）３５μｇ／ｍｌ  フォリン酸
９）０．２ｍｇ／ｍｌ  大腸菌ｔＲＮＡ
１０）３６ｍＭ  酢酸アンモニウム
１１）０．１５ｍｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ
１２）１０ｍＭ  酢酸マグネシウム
１３）１００ｍＭ  酢酸カリウム
１４）１０μｇ／ｍｌ  リファンピシン
１５）７．７μｇ／ｍｌ  T7ＲＮＡポリメラーゼ      。
【００９０】
上記の転写・翻訳反応の後、通常の方法にて反応産物のウェスタンブロッティング及びオートラジオグラフィを行い（１４Ｃ−ロイシンで標識）、ＭｎＰと同じ分子量にメインバンドがあることを確認した。バンドの濃度から推定される菌体抽出液中のＭｎＰの生産量は１０μｇ／ｍｌ程度であった。
【００９１】
又、上記の転写・翻訳反応を２時間行った時点での菌体抽出液２００μｌを分取し、生産されたＭｎＰに付加してあるHis-tag を利用して、ＭｎＰをHis-tagビーズに吸着させて精製・濃縮し、そのＭｎＰ活性を測定した。
【００９２】
このＭｎＰ活性測定は次のように行った。即ち、２００μｌの２５ｍＭ  コハク酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して０．５ｍＭ  硫酸マンガン、２ｍＭ  シュウ酸及び５ｍＭ  ＡＢＴＳ（2,2'-azinobis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate）を含ませた溶液に、０．１ｍＭの過酸化水素を加えたもの（酵素活性測定液）を調製した。次いでこの酵素活性測定液に上記のＭｎＰを吸着したビーズを加え、２５°Ｃで５分間の反応を行わせた後、４１５ｎｍでの吸光度を測定した。その結果を図１の「 MnP(-DTT)」の欄に示す。この結果から、生産されたＭｎＰの内、活性型は約１％であると推定された。
【００９３】
（比較例）
上記実施例１−１のin vitro転写・翻訳系でタンパク質合成を行うに際して、更に還元剤ＤＴＴを１．７６ｍＭ加えた点以外は上記と同様に行った比較例と、上記実施例１のin vitro転写・翻訳系でタンパク質合成を行うに際して、鋳型遺伝子を添加しなかった点以外は上記と同様に行った比較例とを行った。これらについても同上の要領でＭｎＰ活性測定を行った。その吸光度測定の結果を図１の「 MnP(+DTT)」の欄と「鋳型なし」の欄に示すが、いずれの比較例も発色の程度が極めて低く、活性型ＭｎＰは含まれないと考えられる。
【００９４】
（実施例１−２：シャペロン機能を有するタンパク質の添加効果）
上記実施例１−１のin vitro転写・翻訳系でタンパク質合成を行うに際して、無細胞抽出液中にそれぞれ以下の１６）〜２０）に示すシャペロニン又はＰＤＩを添加した。なお１９）の牛ＰＤＩと２０）のカビＰＤＩについては、１ｍＭ
ＧＳＨ及び０．１ｍＭ  ＧＳＳＧを併せて添加した。
【００９５】
１６）１μＭ  ＤｎａＫ及び０．４μＭ  ＤｎａＪ
１７）１．２５μＭ  ＧｒｏＥＬ及び１．２５μＭ  ＧｒｏＥＳ
１８）上記１６）と１７）のシャペロニンを併せ加えたもの
１９）３２μｇ／ｍｌ  牛ＰＤＩ（市販品）。
【００９６】
２０）３２μｇ／ｍｌ  カビＰＤＩ（特開平６−３８７５２に開示のもの）
これらの例を上記実施例１−１と同様に行い、反応後にＭｎＰをHis-tag ビーズに吸着させて精製・濃縮したものについて、実施例１−１と同様の要領で、ＭｎＰ活性測定（吸光度測定）を行った。その結果を図２に示す。図２において、「 MnP」の欄は前記実施例１−１の結果を、「MnP+DnaK/J」は上記１６）の結果を、「MnP+GroEL/ES」は上記１７）の結果を、「 DnaK/J,GroEL/ES」は上記１８）の結果を、「MnP+牛PDI 」は上記１９）の結果を、「MnP+カビPDI 」は上記２０）の結果を、「鋳型なし」は前記実施例１−１における鋳型遺伝子を添加しなかった比較例の結果を、それぞれ示す。
【００９７】
図２の結果から明らかなように、シャペロン機能を有するタンパク質を添加することにより、活性型として正しくフォールディングされたＭｎＰの割合が増大する効果が明らかに観察され、特にＰＤＩを添加した場合の効果が著しかった。とりわけカビＰＤＩを添加した場合の効果が著しく、この場合の活性型は約２５％であると推定された。
【００９８】
一方、上記の各例の内、上記２０）の例について、所定の時間反応させた後の菌体抽出液をそのまま（His-tag ビーズにより精製・濃縮せずに）分取し、実施例１−１と同じ酵素活性測定液にその１μｌを加えてＭｎＰ活性測定（吸光度測定）を行った。その結果を図３に「 MnP+PDI」のグラフとして示す。なお、前記実施例１−１における鋳型遺伝子を添加しなかった比較例についても、同様の測定を行った。その結果を図３に「鋳型なし」のグラフとして示す。「 MnP+PDI」のグラフから分かるように、この場合にはＭｎＰ活性を十分に検出できる。
【００９９】
（実施例２：リグニンペルオキシダーゼの生産）
ヘムタンパク質であって分子内ジスルフィド結合を有するリグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）について、上記ＭｎＰ合成の最適条件と同じ条件でタンパク質合成反応を行わせた。
【０１００】
即ち、実施例１−１と同じ菌体抽出液に対して、前記ＭｎＰ鋳型遺伝子と同量のＬｉＰ鋳型遺伝子と、実施例１−１に前記した２）〜１５）の成分と、実施例１−２に前記した２０）の成分とを添加した。このＬｉＰ鋳型遺伝子の塩基配列は公知であり、GENEBANK/ ×76689, Nucleic Acids Res(1988) vol16, 1219pageに開示されている。又、ＬｉＰ鋳型遺伝子も、前記ＭｎＰ鋳型遺伝子と同様に上流にT7プロモーターとリボソーム結合部位、下流にT7ターミネーターを付加したものである。そして、この菌体抽出液によって、２５°Ｃで２時間、in vitroでの転写・翻訳反応を行った。なお、菌体抽出液に対してＤＴＴ等の還元剤は添加しなかった。
【０１０１】
又、上記の転写・翻訳反応を１時間行った時点での菌体抽出液２００μｌを分取し、生産されたＬｉＰに付加してあるHis-tag を利用して、ＬｉＰをHis-tagビーズに吸着させて精製・濃縮し、そのＬｉＰ活性を測定した。
【０１０２】
このＬｉＰ活性測定は次のように行った。即ち、２００μｌの５０ｍＭ  コハク酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して０．５ｍＭ  ベラトリルアルコール及び５ｍＭ  ＡＢＴＳを含ませた溶液に、０．４ｍＭの過酸化水素を加えたもの（酵素活性測定液）を調製した。次いでこの酵素活性測定液に上記のＬｉＰを吸着したビーズを加え、２５°Ｃで５分間の反応を行わせた後、４１５ｎｍでの吸光度を測定した。その結果を図９における「 LiP+PDI」のグラフとして示す。
【０１０３】
図９には、ＬｉＰの鋳型遺伝子を添加しなかった点以外は上記と同じ組成の菌体抽出液を用いてタンパク質合成反応を行わせた場合の同上の測定結果を「鋳型なし」のグラフとして示す。又、前記２０）の成分を添加しなかった点以外は上記と同じ組成の菌体抽出液を用いてタンパク質合成反応を行わせた場合の同上の測定結果を「 LiP」のグラフとして示す。図９から分かるように、「 LiP」のグラフや「鋳型なし」のグラフは実質的にＬｉＰ活性が認められず、これらに対して「 LiP+PDI」は有効なＬｉＰ活性が認められた。
【０１０４】
（実施例３：in vitro転写・翻訳系における還元剤排除の効果）
コルチゾールに対する Fab抗体（分子間Ｓ−Ｓ結合を有する）について、上記ＭｎＰ合成の最適条件と同じ条件でタンパク質合成反応を行わせた。
【０１０５】
即ち、実施例１−１と同じ菌体抽出液に対して、前記ＭｎＰ鋳型遺伝子と同量の Fab抗体鋳型遺伝子と、実施例１−１に前記した２）〜１５）の成分と、実施例１−２に前記した２０）の成分とを添加した。この Fab抗体鋳型遺伝子の塩基配列は公知であり、特許出願公開２０００−１３９４６０号公報に開示されている。又、 Fab抗体鋳型遺伝子も前記ＭｎＰ鋳型遺伝子と同様に上流にT7プロモーターとリボソーム結合部位、下流にT7ターミネーターを付加したものである。
【０１０６】
なお、この Fab抗体のin vitroでの転写・翻訳として、還元剤を添加しない系と、還元剤としてＤＴＴを１．７６ｍＭ添加した系とを設定した。そしてこれらの菌体抽出液について、２５°Ｃで２時間、in vitroでの転写・翻訳反応を行って、それぞれ Fab抗体の生産を試みた。次いで、通常の方法でウェスタンブロッティングを行った。その結果を図４に示す。図４から分かるように、分子量マーカーとの対比により、「-DTT」で示す還元剤を添加しない系では Fab抗体の生産及び活性を確認した。「+DTT」で示すＤＴＴを添加した系では、Ｌ鎖とＨ鎖との生産が認められるものの、この両者間で分子間ジスルフィド結合を形成できないために、活性な Fab抗体を生産できていない。
【０１０７】
（実施例４：熱安定化変異ＭｎＰのスクリーニング）
ＭｎＰ遺伝子を、error-prone PCR(10 mM Tris-HCl pH9.0, 50 mM KCl, 0.1％ TritonX-100, 7 mM MgCl２, 0.7 mM MnCl２, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 100 ng/ μl MnP,  0.3 μM primer, 25 mU/μl Promega Taq
DNA polymerase) により増幅し、１００塩基当たり平均１．５個の変異（エラー率１．５％）をランダムに導入したライブラリーを作製した。
【０１０８】
そして平均１分子／ウェルまで希釈した後に宝酒造社製 LA Taq polymeraseを用いて、94°C-2 min.
96°C-10 sec., (Tm-5) °C-5 sec., 72°C-1.6 min. : 65 cycles
72°C-7 min.
でＰＣＲを行った。
【０１０９】
次に、前記大腸菌Ａ１９株由来のＳ３０菌体抽出液に対して実施例１−１に示した２）〜１５）の成分と、実施例１−２に示した２０）の成分とを添加した。そして、この菌体抽出液の３７μｌに対して上記のＰＣＲ産物各３μｌを鋳型として加え、２５°Ｃで３時間、in vitroでの転写・翻訳反応を行った。
【０１１０】
その後、合成産物各１．５μｌを実施例１−１と同じ酵素活性測定液１００μｌに添加し、６０°Ｃで２５分間のインキュベートの後、これに終濃度０．１ｍＭとなるように過酸化水素を添加し、４１５ｎｍでの吸光度測定によってＭｎＰ活性を測定した。
【０１１１】
本実施例に係る上記合成産物について、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が可能な３８４穴プレート（１〜２４列×Ａ〜Ｐ列）でのスクリーニングの結果を図５に示すが、図示のようにポジティブクローンが確実に検出できている。
【０１１２】
更に、３８４穴プレート１６枚（６１４４ウェル分）についてスクリーニングした結果、上記した６０°Ｃで２５分間のインキュベート後にＭｎＰ活性を示す１次ポジティブクローン４個を取得した。これらのＮｏ．１〜Ｎｏ．４のクローンのＭｎＰ活性を図６に示す。同時に図示するように、変異導入前のＭｎＰ（野生型ＭｎＰ）では、このような温度処理後は活性を示さない。
【０１１３】
（実施例５：過酸化水素安定化変異ＭｎＰのスクリーニング）
ＭｎＰにおける過酸化水素結合ポケットの入り口に位置する３個のアミノ酸（７９番目のアラニン、８１番目のアスパラギン、８３番目のイソロイシン）を、それぞれ２０種類のアミノ酸へ変換した変異ライブラリー（ＮＮＳ変異；Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ or Ｔ、Ｓ＝Ｃ or Ｇ）を作製した。変異ライブラリーを平均１分子／ウェルまで希釈した後に、前記 LA Taq polymeraseを用いて実施例４の場合と同じ条件でＰＣＲを行った。
【０１１４】
次に、実施例４で用いたものと同じ無細胞タンパク質合成反応液３７μｌに対して上記のＰＣＲ産物各３μｌを鋳型として加え、転写・翻訳共役反応を行った。そして合成産物各１．５μｌを実施例１−１と同じ酵素活性測定液１００μｌに添加し、これに終濃度１ｍＭとなるように過酸化水素を添加し、４１５ｎｍでの吸光度測定によってＭｎＰ活性を測定した。
【０１１５】
本実施例に係る上記合成産物について、実施例４と同様のＨＴＳを３８４穴プレート１０枚（３８４０ウェル分）を用いて行った。そのスクリーニングの結果を図７に示すが、図示のように終濃度１ｍＭの過酸化水素存在下でＭｎＰ活性を示す１次ポジティブクローン１２個（図の No.１〜 No.１２のクローン）を取得した。同時に図示するように、野生型ＭｎＰでは、このような過酸化水素処理後は活性を示さない。
【０１１６】
次に過酸化水素安定性を詳細に評価した。即ち、上記の１次ポジティブクローン１２個を用いた転写・翻訳共役反応の合成産物を、それぞれ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ及び１．０ｍＭの過酸化水素の存在下で、３７°Ｃで５分間インキュベートした。その後、過酸化水素濃度が０．５ｍＭ及び１．０ｍＭであるものについては、過酸化水素濃度が０．１ｍＭになるまで、５０ｍＭ  コハク酸緩衝液で希釈した。
【０１１７】
次に、これらの過酸化水素濃度が０．１ｍＭである合成産物に対して、実施例１−１で前記した酵素活性測定液であって過酸化水素を含まないものを１００μｌ添加し、４１５ｎｍでの吸光度測定によってＭｎＰ活性を測定した。その結果、 No.１〜 No.１２のクローンの内、 No.１，２，４，６，８の５個のクローンにおいて、野生型ＭｎＰよりも過酸化水素に対する安定性が向上していた。これら５個の２次ポジティブクローンについて、０．１ｍＭ過酸化水素の存在下で４°Ｃで５分間インキュベートした後のＭｎＰ活性を１００％とした場合における残存活性を、図８に示す。
【０１１８】
上記の５個の２次ポジティブクローンのアミノ酸配列を決定して、野生型ＭｎＰのアミノ酸配列と比較した。その結果を表１に示す。
【０１１９】
【表１】
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表１では野生型ＭｎＰを「変異なし」と表記し、そのアミノ酸配列の一部を１文字表記式により「アミノ酸配列」の欄に記載している。このアミノ酸部分配列中、左から２番目の「Ａ」は７９番目のアラニン、左から４番目の「Ｎ」は８１番目のアスパラギン、左から６番目の「Ｉ」は８３番目のイソロイシンである。そして表から分かるように、いずれの２次ポジティブクローンにおいても、（ａ）７９番目のアラニンがグルタミン酸又はセリンに変換され、（ｂ）８１番目のアスパラギンがセリン又はロイシンに変換され、（ｃ）８３番目のイソロイシンがロイシンに変換されていることが分かった。
【０１２０】
（実施例の評価）
上記の各実施例から明らかなように、本発明によれば、無細胞抽出液を用いて、活性型の金属含有タンパク質あるいは分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質を効果的に生産することができ、更に本発明のバイオインフォマティクスへの応用が可能である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１−１におけるＭｎＰ活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】実施例１−２におけるＭｎＰ活性の測定結果を示すグラフである。
【図３】実施例１−２において、ＭｎＰを精製・濃縮せずに行ったＭｎＰ活性の測定結果を示すグラフである。
【図４】実施例３におけるウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図５】実施例４におけるＨＴＳによるポジティブクローンの検出結果を示す３次元グラフである。
【図６】実施例４における１次ポジティブクローンのＭｎＰ活性の測定結果を示すグラフである。
【図７】実施例５における変異ＭｎＰのスクリーニングの結果を示すグラフである。
【図８】実施例５における変異ＭｎＰの活性の測定結果を示すグラフである。
【図９】実施例２におけるＬｉＰ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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