(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の胚細胞および配偶子の培養培地のための組換えヒトアルブミンおよびクエン酸塩を含むサプリメントであって、該サプリメントを含む培養培地で培養した配偶子または胚細胞の生存能力を高め、さらに該サプリメントおよび培養培地が非組換えヒトアルブミンを含まないサプリメント。
【請求項２】
請求項１に記載のサプリメントであって、該サプリメントを含む培養培地中に約０．１ ｍＭ から約１．０ ｍＭの範囲のクエン酸塩が存在する場合に、該培養培地で培養した配偶子または胚細胞の生存能力を高めるサプリメント。
【請求項３】
請求項１または２に記載のサプリメントおよび胚培養培地、胚移植培地、胚低温保存培地、幹細胞培養培地もしくはインビトロ醗酵培地を含み、非組換えヒトアルブミンを含まない哺乳動物の胚細胞および配偶子の培養のための調製物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞の増殖に有用な環境を提供する培養基に関する。より詳細には本発明は、培養基に加えると従来の培養基の問題を回避する、通常ではない源から生成された成分を含む限定培養基サプリメントに関する。
【０００２】
発明の背景
長年、哺乳動物の胚細胞を培養するための培地サプリメントは、動物の体液、特に血清から誘導されている。血清系培地サプリメントは、あるタイプの細胞および組織を培養するためにある程度効果を示してきたが、これらの培地サプリメントは、望ましくないものであることが判明した。これらの血清系培地サプリメントが、細胞を培養するための魅力的ではない候補である主な理由の１つは、生成する培地が、培地を誘導する体液中に見出される不純物、毒素および感染因子によって汚染される可能性があるためである。さらに、血液を収集する動物は異なっており、異なる環境で生きているので、これらの動物が生成する体液は、異なる濃度の異なる成分を有する。認識されてきた血清系培地の１つの重要な面は、培地中に高分子が必要であることである。血清系産物を模倣するために、研究者達はポリビニルアルコールなどの合成高分子を加えて、血清中のアルブミンなどの高分子の代用とすることを試みている。しかしながら、血清の大部分は化学的に不明確なので、培養基から血清を取り除き、相対的に大きい分子のみを取り替えることによって、必須成分を欠いているために理想的とはいえないか、あるいは多くの目的に無効な培養基が生成した。
【０００３】
したがって、血液産物に基づく培養基サプリメントと同等の効果がありながら、同時に可能性のある汚染源を取り除いた培養基サプリメントが必要とされている。さらに、標準化された培養基も必要とされている。
【０００４】
発明の概要
本発明は、哺乳動物の胚細胞および配偶子用の培養基用の、新規な、生理学に基づく完全に限定されたサプリメントを記載する。この培地サプリメントは、インビトロの受精培地、胚移植培地、および哺乳動物の着床前の胚の受精卵を低温保存する培地、および胚幹細胞を成長させるための培地へのサプリメント、または当分野でよく知られている任意の他の同様の培地と共に使用することができる。このサプリメントは、組み換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、発酵生産したヒアルロナン（ＨＹＮ）および／またはクエン酸（塩）、およびこれらの組合せを含む。このサプリメントを培養基に加えることによって、血液から精製した血清アルブミンを補った培地と比べて、同等の成長をもたらす。
【０００５】
発明の詳細な説明
このサプリメントは、それが使用される培地に適切な任意の濃度で組み換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）を含んでよい。本明細書にさらに記載するように、本来存在するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ではなくｒＨＡを使用することには数多くの利点がある。
【０００６】
典型的には、サプリメントがｒＨＡを含むとき、サプリメントは、サプリメントが加えられる培地の合計体積をベースとして、約０．１ｍｇ／ｍｌと約２０．０ｍｇ／ｍｌの間のｒＨＡを含む。一実施形態では、培地の合計体積をベースとして、約０．５ｍｇ／ｍｌから約５．０ｍｇ／ｍｌのｒＨＡを加える。
【０００７】
サプリメントに発酵生産したヒアルロナン（ＨＹＮ）を加えることによって、サプリメントの効率を高めることができる。発酵生産したＨＹＮを培地サプリメントに加えることによって、好ましい結果が示される。
【０００８】
本明細書で使用する「配偶子または胚細胞の生存能力を高める」というフレーズは、本発明のサプリメントを含む培地中で胚を培養すると、サプリメントを含まない同じ培地で培養するのと比べて、培養中に胚の胚盤胞段階への成長が進むこと、透明帯から孵化する能力がインビトロで高まること、および／または胚の培養中に胚の全体的な生存能力が高まること、を含むものとして定義する。
【０００９】
さらに、適切な培地に発酵生産したＨＹＮを加えることは、胚盤胞が凍結に対し生き延びるための能力に著しく影響を及ぼす。発酵生産したＨＹＮを使用することは、オンドリのとさかまたはへその緒などの、天然に存在する定温脊椎動物の源から精製したＨＹＮを使用することに優るいくつかの利点がある。定温脊椎動物の源からのＨＹＮではなく発酵生産したＨＹＮを使用することによって、異なる源およびバッチからのＨＹＮの、安全性および安定性を調節する能力が大幅に高まる。
【００１０】
発酵生産したＨＹＮが存在する場合、発酵生産したＨＹＮの量は一般に、培地の合計体積をベースとして、約０．１ｍｇ／ｍｌと約５．０ｍｇ／ｍｌの間の濃度である。一実施形態では、培地の合計体積をベースとして、約０．１２５ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で、発酵生産したＨＹＮを培地に加える。
【００１１】
クエン酸（塩）を加えることによって、サプリメントをさらに補うことができる。一実施形態では、クエン酸（塩）およびｒＨＡの両方を培地サプリメントに加える。なぜなら、ｒＨＡを含む培地サプリメントにクエン酸（塩）を加えることによって、ｒＨＡにＨＳＡまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の性質をきっちりと再現させることが可能であることが、驚くべきことに、予期せぬことに分かっているからである。クエン酸（塩）を加えることは、培養した細胞物質の成長に対して他の促進的な影響がある。クエン酸コリン、クエン酸カルシウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、およびこれらの組合せだけには限られないが、これらを含めて当分野でよく知られている、培地用に使用する任意のクエン酸（塩）を使用することができる。一実施形態では、クエン酸ナトリウムを使用する。一般には、培地の合計体積をベースとして、約０．１ｍＭと約５．０ｍＭの間の濃度でクエン酸（塩）を加える。一実施形態では、培地の合計体積をベースとして、約０．１ｍＭと約１．０ｍＭの間の濃度でクエン酸（塩）を加える。
【００１２】
本発明の培地サプリメントは、任意の有用な組合せでｒＨＡ、発酵生産したＨＹＮおよび／またはクエン酸（塩）を含む。一実施形態では、培地サプリメント、および培地サプリメントを加える培地には、非組み換え高分子または動物源から精製した高分子が入り込んでいない。他の実施形態では、培地サプリメント、および培地サプリメントを加える培地には、非組み換えＨＳＡおよび／または発酵生産されていないＨＹＮが存在しない。
【００１３】
本発明は、前に記載した培地サプリメント、培地サプリメントを含む培地、培地サプリメントを作成する方法、培地サプリメントを含むキット、および本明細書に記載する培地サプリメントを使用して胚の物質を成長させる方法を対象とする。
【００１４】
本発明は、細胞物質を培養の開始時に培地中に含むことができるか、あるいはこれらを供給バッチ法または連続的な方法で加えることができるように、本明細書に記載する培地サプリメントを使用して、細胞物質、一実施形態では胚を成長させる方法を含む。さらに、培地サプリメントの成分は、培地生成の異なる段階で一緒に、あるいは別々に加えることができる。
【００１５】
このサプリメントは、任意の哺乳動物種からの胚の、胚培養基、胚移植培地、および胚を低温保存した培地（凍結および冷凍保存手順の両方を含ませるための）、および幹細胞培地だけには限られないがこれらを含めた、当分野でよく知られている任意の適切な哺乳動物細胞の物質の培養基に加えることができる。たとえば、重炭酸緩衝培地、Ｈｅｐｅｓ緩衝またはＭＯＰＳ緩衝培地、またはリン酸緩衝食塩水を含めた、胚または細胞の成長を促進することができる任意の培地を使用することができるであろう。培地の例は、Ｇ１．２／Ｇ２．２、ＫＳＯＭ／ＫＳＯＭａａ、Ｍ１６、ＳＯＦ／ＳＯＦａａ、ＭＴＦ、Ｐ１、Ｅａｒｌｅの培地、Ｈａｍｓ  Ｆ−１０、Ｍ２、Ｈｅｐｅｓ−Ｇ１．２、ＰＢＳおよび／またはＷｈｉｔｔｅｎの培地である（Ｇａｒｄｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、１９９９；Ｅｍｂｒｙｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｅｄｉｔｏｒ：Ｔｒｏｕｎｓｏｎ  ＡＯ  ａｎｄ  Ｇａｒｄｎｅｒ  ＤＫ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ｐｐ２０５−２６４）。
【００１６】
ｒＨＡの生成は、当分野でよく知られている。一実施形態では、ヒトアルブミンタンパク質を生成する遺伝的に改変された酵母菌からｒＨＡを得る。酵母菌からｒＨＡを生成するための１つのこのような方法は、米国特許第５，６１２，１９７号中で教示されている。
【００１７】
発酵生産したヒアルロナン（ＨＹＮ）は、当分野でよく知られている任意の方法によって得られる。１つのこのような方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉの連続的な細菌発酵である。ヒアルロナンは、Ｎ−アセチルグルコースアミンとＤ−グルクロン酸の繰り返し二糖単位の、天然に存在するポリマーである。これは身体中に広く分布している。典型的には、発酵生産したＨＹＮの分子量は２．３×１０６ｋＤである。ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓからのＨＹＮの生成は当分野でよく知られており、Ｃｉｆｏｎｅｌｌｉ  ＪＡ、Ｄｏｒｆｍａｎ  Ａ．Ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｙ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ：Ｔｈｅ  ｕｒｉｄｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｏｆ  ｇｒｏｕｐｓ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９５７；２２８：５４７−５５７；Ｋｊｅｍｓ  Ｅ、Ｌｅｂｅｃｈ  Ｋ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｉｎ  ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ．Ａｃｔａ  Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１９７６（Ｓｅｃｔ．Ｂ）；８４：１６２−１６４；およびＭａｒｋｏｖｉｔｚ  Ａ他、Ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｙ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９５９；２３４（９）：２３４３−２３５０で開示されている方法を含めた、任意のよく知られている方法を使用することができる。
【００１８】
他の化合物を、本発明の培地サプリメントに加えることができる。これらは成長因子を含む。なぜなら、哺乳動物の胚および細胞は典型的には成長因子に関する多くの受容体を有しており、このような成長因子を加えることによって、培養物質の成長率を高めることができるからである。このような成長因子には、典型的には０．１から１００ｎｇ／ｍｌの量のインシュリン、典型的には０．１から１００ｎｇ／ｍｌの量のＩＧＦ  ＩＩ、典型的には０．１から１００ｎｇ／ｍｌの量のＥＧＦ、典型的には５から１０００Ｕ／ｍｌの量のＬＩＦ、典型的には０．１から５００μＭの量のＰＡＦ、およびこれらの組合せがあるが、これらだけには限られない。量はすべて、培地サプリメントを加える培地の合計体積をベースとする。
【００１９】
培地サプリメントは２通りの方法で調製することができる。培地調製の後に培地に加えられる別の培地サプリメントとして調製することができるか、あるいは培地サプリメントの成分を、培地調製中に培養基に直接加えることができる。
【００２０】
一例として、以下のように独自に培地サプリメントを調製することができる。培地サプリメントｒＨＡを、水、食塩水または培地を加えることによってストック溶液にして、５０ｍｇ／ｍｌと約５００ｍｇ／ｍｌの間、通常は２５０ｍｇ／ｍｌの濃縮ストック溶液を作成することができる。あるいは、２５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液として、溶液を得ることができる。発酵生産したＨＹＮを水、食塩水または培地中で再構成して、１０ｍｇ／ｍｌと５００ｍｇ／ｍｌの間の、通常は５００ｍｇ／ｍｌの濃縮ストック溶液を作成する。これは水、食塩水または培地をフラスコに加え、所望量のＨＹＮを溶液に加えることにより行う。次いでＨＹＮを、激しい振とう、または攪拌バーを使用する混合によって溶かす。５００ｍｇ／ｍｌの溶液については、溶液１ｍｌに５００ｍｇのＨＹＮを加えることができる。水、食塩水または培地のいずれかを加えて、５ｍＭと５００ｍＭの間の、通常は５００ｍＭの濃縮ストック溶液を作成することによって、ストック溶液としてクエン酸（塩）を調製する。５００ｍＭのストック溶液については、溶液１０ｍｌに０．９６０５ｇのクエン酸を加える。ｒＨＡ、発酵生産したＨＹＮおよびクエン酸（塩）のストックを一緒に加えて、１つのサプリメント溶液を作成し、これを最終培地に１００倍の濃縮ストックとして加える。１０ｍｌの培地については、サプリメント１００μｌを加える。
【００２１】
ｒＨＡは粉末として、あるいはストック溶液として、培養基に直接加えることができる。一例として、以下の実施形態を示す。ストック溶液は、２５０ｍｇ／ｍｌストックの１００μｌとして、９．９ｍｌの培地に加えることができる。発酵生産したＨＹＮは粉末として、あるいはストック溶液として、培養基に直接加えることができる。粉末として、１．２５ｍｇのＨＹＮを１０ｍｌの培地に加えることができる。あるいは１２５μｌの１％ストック溶液を、９．９ｍｌの培地に加えることができる。クエン酸（塩）は粉末として、あるいはストック溶液として、培養基に直接加えることができる。粉末として、９．６ｍｇを１００ｍｌの培地に加えることができ、あるいは５０ｍＭストックの１００μｌを９．９ｍｌの培地に加えることができる。
【００２２】
本明細書で引用する特許および刊行物はすべて、参照によってここに組み込む。
【００２３】
本明細書で引用する範囲はすべて、その範囲限界内に含まれるすべての組合せ、およびより下位組合せを含む。したがって、「約０．１ｍｇ／ｍｌから約２０．０ｍｇ／ｍｌ」という範囲は、約０．１２５ｍｇ／ｍｌから約１１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌから約１５．０ｍｇ／ｍｌなどの範囲を含むであろう。
【００２４】
本発明の培地サプリメントによって、哺乳動物の細胞、組織、胚および他の関連する細胞物質の培養の分野に存在するいくつかの問題が解決される。現在の培地に関する１つの問題は、培養した哺乳動物細胞の物質、特に胚が、ヒトアルブミンなどの高分子血液産物中に見られる、プリオンおよび／または内毒素などの汚染物質によって汚染される可能性があることである。本発明のサプリメントの１つの利点は、胚および他の哺乳動物細胞の物質を培養するために、培地中で血液産物を使用することに関する潜在的な汚染が、それによって取り除かれることである。
【００２５】
現在の培地に関する他の問題は、血清アルブミンなどの血液産物または他の天然に存在する物質を使用すると、このような培地を標準化することが困難であることである。さらに、天然に存在する変化および培地の血液産物中の汚染物質が取り除かれると、本発明によって最終培養物を精製することが容易になる。
【００２６】
本発明によって、他の分子によって汚染されることが多く、異なる調製物間および同じ調製物中のバッチ間で著しく異なる、生物学的タンパク質を使用するときに伴われる固有の変化が除外される。したがって、ｒＨＡなどの組み換え分子を使用することによって、標準化された方式で調製される生理学的培地を調合することができる。これらの調製物には内毒素、プリオンが入り込んでおらず、現在使用されている培地よりも生理学的により適合性がある。現在の培地は、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンなどの他の合成高分子を含み、これらの高分子は成長因子を結合するなどの必須の生理学的機能を果たすことができず、したがって、これらの培地を使用することによって、哺乳動物の細胞物質の成長が低下する結果となる。
【００２７】
本発明は、以下の実施例からより良く理解される。しかしながら当業者は、論じられる具体的な組成物、方法および結果は本発明を単に例示するものであり、本発明に関する制限を意味するものではないことを容易に理解するはずである。
【００２８】
実施例
実施例１
以下の表１に示す濃縮ストック溶液から、培地Ｇ１．２／Ｇ２．２を調製した。２５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液２００μｌとして、培地９．８ｍｌにｒＨＡを加えた。最初の実験では、異系交配させたマウスの胚を培養中に発生させるために、血液から精製したアルブミンをｒＨＡで置き換えることを調べた。ｒＨＡの３つの異なる濃度の１つで、受精卵を４日間培養した。１０胚分の胚インキュベーション体積、２０μｌの培地において６％ＣＯ２：５％Ｏ２：８９％Ｎ２で、３７℃で胚を培養した。胚は培地Ｇ１．２中で４８時間培養し、次に培地Ｇ２．２中で４８時間培養した。陰性対照の処理はタンパク質なし、陽性対照の処理は５ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（血液産物）であった。その結果を以下で表２に示す。
【００２９】
【表１】
0004202121.tif 000002
【００３０】
ストックＡおよびＢ
１．個々の成分の重量を量り、１００ｍｌのフラスコに入れる。
２．５０ｍｌのＨ２Ｏを加える（Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｈ２ＯまたはＢｉｏｗｉｔｔａｋｅｒ）。
３．成分すべてが溶けるまで充分混合する。
４．５０ｍｌのＨ２Ｏをさらに加える。
５．充分混合する。
６．０．２μｍフィルタを介して濾過する。
７．４℃で保存する。
【００３１】
ストックＣからＴ
１．成分の重量を量り、１０ｍｌのチューブに入れる。
２．１０ｍｌのＨ２Ｏを加える（Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｈ２ＯまたはＢｉｏｗｉｔｔａｋｅｒ）。
３．溶けるまで充分混合する。
４．０．２μｍフィルタを介して濾過する。
５．４℃で保存する。
【００３２】
胚の培養基の調製−パート１
ストックＥＤＴＡ
１．ＥＤＴＡ０．０２９ｇを量り、１０ｍｌのチューブに入れる。
２．ＮａＯＨ０．４ｇを量り、別の１０ｍｌのチューブに入れる。
３．１０ｍｌのＨ２Ｏ（Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｈ２ＯまたはＢｉｏｗｉｔｔａｋｅｒ）をＮａＯＨに加え、溶けるまで混合する。
４．２２０μｌのＮａＯＨ溶液をＥＤＴＡに加える。
５．溶けるまで混合する。
６．９．８ｍｌのＨ２ＯをＥＤＴＡに加える。
７．９０ｍｌのＨ２Ｏを１００ｍｌのフラスコに入れる。
８．１０ｍｌのＥＤＴＡ溶液を９０ｍｌのＨ２Ｏに加える。
９．０．２μｍフィルタを介して濾過する。
１０．４℃で保存する。
【００３３】
【表２】
0004202121.tif 000003
【００３４】
少なくとも１．２５から２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、培養中に胚を発生させるために、ＨＳＡをｒＨＡで置き換えることができた。
【００３５】
実施例２
実施例１で教示したように、濃縮ストック溶液から培地Ｇ１．２／Ｇ２．２を調製した。１００倍ストック溶液１００μｌから１０ｍｌの培地に、発酵生産したＨＹＮを加えた。
【００３６】
最初の実験では、異系交配させたマウスの胚を培養中に発生させるために、血液から精製したアルブミンをＨＹＮで置き換えることを調べた。ＨＹＮの４つの異なる濃度の１つで、受精卵を４日間培養した。１０胚分の胚インキュベーション体積、２０μｌの培地において６％ＣＯ２：５％Ｏ２：８９％Ｎ２で、３７℃で胚を培養した。胚は培地Ｇ１．２中で４８時間培養し、次に培地Ｇ２．２中で４８時間培養した。陰性対照処理はタンパク質なしであった。その結果を以下で表３に示す。
【００３７】
【表３】
0004202121.tif 000004
【００３８】
少なくとも０．１２５から０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、発酵生産したＨＹＮがマウス胚の発生を刺激した。
【００３９】
実施例３
実施例１で教示したように、濃縮ストック溶液から培地Ｇ１．２／Ｇ２．２を調製した。２５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液２００μｌとして９．８ｍｌの培地にｒＨＡを加え、１００倍ストック溶液１００μｌから発酵生産したＨＹＮを１０ｍｌの培地に加えた。その後の実験では、異系交配させたマウスの胚を培養中に発生させるために、血液から精製したアルブミンをｒＨＡおよび発酵生産したＨＹＮで置き換えることを調べた。受精卵は４日間培養した。１０胚分の胚インキュベーション体積、２０μｌの培地において６％ＣＯ２：５％Ｏ２：８９％Ｎ２で、３７℃で胚を培養した。胚は培地Ｇ１．２中で４８時間培養し、次に培地Ｇ２．２中で４８時間培養した。その結果を以下で表４に示す。
【００４０】
【表４】
0004202121.tif 000005
【００４１】
ｒＨＡおよび発酵生産したＨＹＮを有する培地は共に、内部細胞の細胞塊（ＩＣＭ）の成長を著しく高める。ＩＣＭの成長は、生命力のある胎児へと発生する能力と直線的に関係するので、ＩＣＭの％の増大は生存能力の向上を意味している可能性がある。
【００４２】
実施例４
実施例１で教示したように、濃縮ストック溶液から培地Ｇ１．２／Ｇ２．２を調製した。２５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液２００μｌとしてｒＨＡを培地９．８ｍｌに加え、１００倍ストック溶液１００μｌから発酵生産したＨＹＮを１０ｍｌの培地に加えた。その後の実験では、異系交配させたマウスの胚をレシピエントマウスに移した後に発生させるために、血液から精製したアルブミンをｒＨＡおよび発酵生産したＨＹＮで置き換えることを調べた。受精卵は４日間培養し、次いで胚盤胞段階でレシピエントの雌マウスに移した。１０胚分の胚インキュベーション体積、２０μｌの培地において６％ＣＯ２：５％Ｏ２：８９％Ｎ２で、３７℃で胚を培養した。胚は培地Ｇ１．２中で４８時間培養し、次に培地Ｇ２．２中で４８時間培養した。その結果を以下で表５に示す。
【００４３】
【表５】
0004202121.tif 000006
【００４４】
ｒＨＡおよび発酵生産したＨＹＮを有する培地によって、ＨＳＡ（血液産物）を補った培地中で培養した胚と同等な胎児の成長が結果としてもたらされた。
【００４５】
実施例５
実施例１で教示したように、濃縮ストック溶液から培地Ｇ１．２／Ｇ２．２を調製した。２５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液２００μｌとしてｒＨＡを９．８ｍｌの培地に加え、１００倍ストック溶液１００μｌから発酵生産したＨＹＮを１０ｍｌの培地に加え、１００倍ストック溶液１００μｌからクエン酸（塩）を１０ｍｌの培地に加えた。ｒＨＡ、発酵生産したＨＹＮおよびクエン酸（塩）をさらに補足することによって、培養中にマウス胚の成長が高まるかどうか決定するために、実験を行った。受精卵からの胚を、クエン酸（塩）の存在下または不在下でｒＨＡおよびＨＹＮと共に４８時間培養した。１０胚分の胚インキュベーション体積、２０μｌの培地において６％ＣＯ２：５％Ｏ２：８９％Ｎ２で、３７℃で胚を培養した。胚は培地Ｇ１．２中で４８時間培養した。その結果を以下で表６に示す。
【００４６】
【表６】
0004202121.tif 000007
【００４７】
ｒＨＡおよび発酵生産したＨＹＮを含む培地にクエン酸（塩）を加えることによって、胚の発生が有意に高まる結果となった。
【００４８】
実施例６
実施例１で教示したように、濃縮ストック溶液から培地Ｇ１．２／Ｇ２．２を調製した。２５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液２００μｌとしてｒＨＡを９．８ｍｌの培地に加え、１００倍ストック溶液１００μｌから発酵生産したＨＹＮを１０ｍｌの培地に加え、１００倍ストック溶液１００μｌからクエン酸（塩）を１０ｍｌの培地に加えた。ｒＨＡ、発酵生産したＨＹＮおよびクエン酸（塩）をさらに補足することによって、培養中にマウス胚の成長が高まるかどうか決定するために、実験を行った。受精卵からの胚を、クエン酸（塩）の存在下または不在下でｒＨＡおよびＨＹＮと共に４８時間培養した。次いで胚を、クエン酸（塩）を含むかあるいは含まない培養基にさらに４８時間移した。１０胚分の胚インキュベーション体積、２０μｌの培地において６％ＣＯ２：５％Ｏ２：８９％Ｎ２で、３７℃で胚を培養した。胚は培地Ｇ１．２中で４８時間培養し、次に培地Ｇ２．２中で４８時間培養した。その結果を以下で表７に示す。
【００４９】
【表７】
0004202121.tif 000008
【００５０】
表７の結果によって見ることができるように、クエン酸（塩）を加えることによって、胚の成長が著しく高まった。
【００５１】
実施例７
実施例１で教示したように、濃縮ストック溶液から培地Ｇ１．２／Ｇ２．２を調製した。２５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液２００μｌとしてｒＨＡを９．８ｍｌの培地に加え、１００倍ストック溶液１００μｌから発酵生産したＨＹＮを１０ｍｌの培地に加え、１００倍ストック溶液１００μｌからクエン酸（塩）を１０ｍｌの培地に加えた。
【００５２】
ウシにおける最初の実験では、受精卵を培養中に発生させるために、血液から精製したアルブミン（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）をｒＨＡまたは発酵生産したＨＹＮのいずれか、あるいはｒＨＡおよび発酵生産したＨＹＮで置き換えることを調べた。受精卵は、６から７日間培養した。５００μｌの培地において６％ＣＯ２：５％Ｏ２：８９％Ｎ２で、３８．５℃で胚を培養した。胚は培地Ｇ１．２中で７２時間培養し、次に培地Ｇ２．２中で７２時間培養した。その結果を以下で表８に示す。
【００５３】
【表８】
0004202121.tif 000009
【００５４】
ｒＨＡと発酵生産したＨＹＮを組み合わせることによって、ＢＳＡの存在下で得られるのと同等な胚の発生が、ウシの胚の培養中に起こった。
【００５５】
実施例８
実施例１で教示したように、濃縮ストック溶液から培地Ｇ１．２／Ｇ２．２を調製した。２５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液２００μｌとしてｒＨＡを９．８ｍｌの培地に加え、１００倍ストック溶液１００μｌから発酵生産したＨＹＮを１０ｍｌの培地に加え、１００倍ストック溶液１００μｌからクエン酸（塩）を１０ｍｌの培地に加えた。
【００５６】
ウシにおけるその後の実験では、受精卵を培養中に発生させるために、血液から精製したアルブミン（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）を、クエン酸（塩）を有するｒＨＡまたはクエン酸（塩）を有さないｒＨＡで置き換えることを調べた。受精卵は、６から７日間培養した。５００μｌの培地において６％ＣＯ２：５％Ｏ２：８９％Ｎ２で、３８．５℃で胚を培養した。胚は培地Ｇ１．２中で７２時間培養し、次に培地Ｇ２．２中で７２時間培養した。その結果を以下で表９に示す。
【００５７】
【表９】
0004202121.tif 000010
【００５８】
ｒＨＡをクエン酸（塩）で補うことによって、ＢＳＡの存在下で培養した胚と比較して、同等なウシの胚の発生が培養中にもたらされた。
【００５９】
実施例９
実施例１で教示したように、濃縮ストック溶液から培地Ｇ１．２／Ｇ２．２を調製した。２５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液２００μｌとしてｒＨＡを９．８ｍｌの培地に加え、１００倍ストック溶液１００μｌから発酵生産したＨＹＮを１０ｍｌの培地に加え、１００倍ストック溶液から１０ｍｌの培地にクエン酸（塩）を加えた。
【００６０】
ウシにおけるその後の実験では、受精卵を培養中に発生させるために、発酵生産したＨＹＮをクエン酸（塩）含有ｒＨＡに加えること、およびその後の受精卵を凍結させる能力を調べた。受精卵は、６から７日間培養した。５００μｌの培地において６％ＣＯ２：５％Ｏ２：８９％Ｎ２で、３８．５℃で胚を培養した。胚は培地Ｇ１．２中で７２時間培養し、次に培地Ｇ２．２中で７２時間培養した。胚盤胞を細胞数に対して染色し、あるいは凍結させ、その後解凍して生存を評価した。その結果を以下で表１０に示す。
【００６１】
【表１０】
0004202121.tif 000011
【００６２】
培地にｒＨＡ、クエン酸（塩）および発酵生産したＨＹＮを補うことによって、胚盤胞が凍結および解凍に対して生き延びる能力が大幅に高まった。
【００６３】
実施例１０
実施例１で教示したように、濃縮ストック溶液から培地Ｇ１．２／Ｇ２．２を調製した。
【００６４】
この実験では、ｒＨＡおよびＨＹＮの存在下で培養中のＣＦ１マウス胚を成長させることの、胚が凍結および解凍に対して生き延びる能力に対する効果を調べた。ＣＦ１マウス胚を胚盤胞段階まで培養して、成長および凍結手順に対して生き延びる能力を評価した。
【００６５】
【表１１】
0004202121.tif 000012
【００６６】
これらの結果から、ｒＨＡ、またはｒＨＡとＨＹＮを有する培地は、ＨＳＡと共に生育した胚盤胞と比較して、解凍後の胚盤胞の孵化率を有意に高めることを明らかに認識することができる（Ｐ＜０．０５）。
【００６７】
低温保存後の培養中に、胚盤胞が増殖する能力も評価した。ＩＣＭおよびＴＥ両方の増殖は、０と３の間のスコアであり、０は増殖しなかったことを表し、３は著しく増殖したことを表す。増殖は、生存能力と関係があることは示されている（ＬａｎｅおよびＧａｒｄｎｅｒ、１９９７）。
【００６８】
【表１２】
0004202121.tif 000013
【００６９】
表１２から見ることができるように、ｒＨＡまたはＨＹＮを含む培地中で胚を培養することによって、ヒト血清アルブミン中で培養した胚と比較して、ＩＣＭの成長が高まった。
【００７０】
実施例１１
この実施例は、ｒＨＡ、ＨＹＮおよびクエン酸（塩）を含む培地によって、低温保存した過剰な胚盤胞を首尾よく広げることができることを例示する。
【００７１】
この実施例では、米国特許出願第０９／２０１，５９４号に教示されるように以下の点を変えて、提供された低温保存型ヒト前核胚を解凍し、培地Ｇ１．３中で４８時間培養し、次に培地Ｇ２．３中で培養した。Ｇ１．２−Ｇ１．３培地は１．０から１．８のＭｇＳＯ４濃度、および１．８から１．０のＣａＣｌ２濃度を有する。Ｇ２．２−Ｇ２．３培地に関する変更は、Ｇ１培地の変更と同じであり、半分の濃度で加えられる必須アミノ酸が追加されるが、ニコチンアミド、イノシトール、および葉酸は存在しない。
【００７２】
両方の培地を２．５ｍｇ／ｍｌのｒＨＡ、および０．１２５ｍｇ／ｍｌのＨＹＮで補った。胚用の凍結溶液は４．５％グリセロールおよび０．１Ｍスクロース（１０分）、次に９％グリセロールおよび０．２Ｍスクロース（７分）であった。胚は−６℃の凍結機中に置き、植付け、１０分間保持し、その後１分間当たり０．５℃で−３２℃まで冷却した。次いで、胚を液体窒素中に押し込んだ。解凍直後に、５００ｎｌの新鮮なＧ２．３中で４時間、胚を個別にインキュベートし、その後、胚を１０マイクロリットルのＧ２．３中に、一晩培養するために個別に置いた。インキュベーションはすべて、５％Ｏ２：６％ＣＯ２：８９％Ｎ２で行った。培地の５００ｎｌサンプルを凍結させ、超ミクロ蛍光発光を使用して分析した。解凍した胚の、グルコースおよびピルビン酸（塩）の取り込みも測定した。
【００７３】
【表１３】
0004202121.tif 000014
【００７４】
実施例１２
この実施例では、Ｇａｒｄｎｅｒ他、１９８８およびＳｃｈｏｏｌｃｒａｆｔ１９９９によって概略が述べられた、ＩＶＦプロトコルを使用した。
【００７５】
この実施例では、ヒトの胚の成長に関する、ｒＨＡ、ＨＹＮおよびクエン酸（塩）を含む培地の利点を示す。
【００７６】
【表１４】
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