(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コチニール抽出液を蛋白分解処理した後、吸着処理及びメンブランフィルターろ過膜処理を順に行い、次いでナノフィルトレーションろ過膜処理を行うことにより分子量６０００以上の分画を除去する工程を含むコチニール色素の製造方法。
【請求項２】
さらに、イオン交換処理及び酸処理よりなる群から選択される少なくとも一種の処理工程を含む、請求項１に記載のコチニール色素の製造方法。
【請求項３】
コチニール抽出液が、含水アルコールを用いてカイガラムシを抽出処理して得られるものである請求項１または２に記載のコチニール色素の製造方法。
【請求項４】
コチニール抽出液を酸性条件下で蛋白分解処理する請求項１〜３のいずれかに記載のコチニール色素の製造方法。
【請求項５】
吸着処理を酸性条件下で行う、請求項１〜４のいずれかに記載のコチニール色素の製造方法。
【請求項６】
吸着処理が、コチニール色素を担体に酸性条件下で吸着させ、含水アルコールを用いてｐＨ７〜９条件下で溶出させることからなる請求項１〜５のいずれかに記載のコチニール色素の製造方法。
【請求項７】
酸処理が食品添加物として使用される酸を用いた処理である請求項２〜６のいずれかに記載のコチニール色素の製造方法。
【請求項８】
コチニール抽出液を蛋白分解処理した後、吸着処理及びメンブランフィルターろ過膜処理を順に行い、次いでナノフィルトレーションろ過膜処理を行うことにより分子量６０００以上の分画を除去する工程を含むコチニール色素の脱臭方法。
【請求項９】
さらに、イオン交換処理及び酸処理よりなる群から選択される少なくとも一種の処理工程を含む、請求項８に記載のコチニール色素の脱臭方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は高度に精製されて実質的にアレルゲンを含まないことを特徴とするコチニール色素、及び該色素を含有する色素製剤に関する。また本発明は、精製度が高く実質的にアレルゲンを含まないことを特徴とする上記コチニール色素の製造方法に関する。
背景技術
従来から医薬品や食品等の着色料として広く用いられているコチニール色素は、メキシコ、中央アメリカ及び南アメリカの砂漠地帯に産するサボテン科のベニコイチジク（Ｎｏｐａｌｅａ  ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｆｅｒａ）等に寄生するカイガラムシ科エンジムシ（Ｃｏｃｃｕｓ  ｃａｃｔｉ  Ｌ．）の雌の体内に含まれる赤色色素に由来する。このためコチニール色素は、上記エンジムシを原料としてその乾燥体を水またはアルコールで抽出して調製されている。
最近になって、上記の如く昆虫を原料として調製されるコチニール色素には、アレルゲンとなる夾雑蛋白が含まれておりアレルギーを引き起こす要因になる可能性があるという報告がなされている（Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ，Ｖｏｌ．８４（５），５４９−５５２，２０００．）。
また、従来の方法で得られるコチニール色素は上記原料に由来すると思われる臭いを有しており、それを適用する製品の種類や用途並びに使用濃度が制限されるという問題がある。さらに、従来のコチニール色素は、上記原料に由来する蛋白などの夾雑物を含むため、経時的に沈殿を生じやすいという問題も指摘されている。
発明の開示
本発明者らは、上記コチニール色素に関するアレルゲンの問題を解決すべく日夜鋭意検討した結果、下記のコチニール色素を開発するに至った。
すなわち、本発明は下記（１）〜（２）に掲げる精製コチニール色素である。
（１）実質的にエンジムシに由来するアレルゲンを含まないことを特徴とする精製コチニール色素である。
（２）実質的に分子量６０００以上の蛋白質を含まないことを特徴とする（１）記載の精製コチニール色素。
また、本発明は下記（３）〜（５）に掲げる色素組成物及び該色素組成物からなる色素製剤である。
（３）請求項１記載の精製コチニール色素及び食品衛生上若しくは薬学上許容される担体又は添加物を含有する色素組成物。
（４）コチニール色素としてカルミン酸、カルミン酸のアルミニウムレーキ、カルミン酸のカルシウムレーキ及びこれらアルミニウムレーキまたはカルシウムレーキの重合体よりなる群から選択される少なくとも１種を含有する（３）記載の色素組成物。
（５）（３）記載の色素組成物からなる食品、医薬品、医薬部外品若しくは化粧品用の色素製剤。
さらに、本発明は下記（６）〜（１６）に掲げるコチニール色素の製造方法である。
（６）コチニール抽出液を蛋白分解処理した後、分子量６０００以上の分画を除去する工程を含むコチニール色素の製造方法。
（７）コチニール抽出液を蛋白分解処理した後、吸着処理、イオン交換処理、酸処理及び膜処理よりなる群から選択される少なくとも一種の処理工程を行うコチニール色素の製造方法。
（８）コチニール抽出液を蛋白分解処理及び吸着処理した後、吸着処理、イオン交換処理、酸処理び膜処理よりなる群から選択される少なくとも一種の処理工程を行うコチニール色素の製造方法。
（９）コチニール抽出液が、含水アルコールを用いてカイガラムシを抽出処理して得られるものである（６）記載のコチニール色素の製造方法。
（１０）コチニール抽出液を酸性条件下で蛋白分解処理する（６）記載のコチニール色素の製造方法。
（１１）吸着処理を酸性条件下で行う、（７）または（８）に記載のコチニール色素の製造方法。
（１２）吸着処理が、コチニール色素を担体に酸性条件下で吸着させ、含水アルコールを用いてｐＨ７〜９条件下で溶出させることからなる（７）または（８）に記載のコチニール色素の製造方法。
（１３）酸処理が食品添加物として使用される酸を用いた処理である（７）または（８）に記載のコチニール色素の製造方法。
（１４）膜処理が、逆浸透膜処理、ナノフィルトレーション膜処理、限外濾過膜処理及び精密ろ過膜処理よりなる群から選択されるいずれか少なくとも１種である（７）または（８）に記載のコチニール色素の製造方法。
（１５）膜処理が、逆浸透（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｏｓｍｏｓｉｓ（ＲＯ））ろ過膜処理、メンブランフィルター（ＭＦ）ろ過膜処理、ウルトラフィルター（ＵＦ）ろ過膜処理、及びナノフィルトレーション（ＮＦ）ろ過膜処理よりなる群から選択されるいずれか少なくとも１種である（７）または（８）に記載のコチニール色素の製造方法。
（１６）膜処理が２０００〜８０００の分画分子量を有する膜を利用した処理である（７）または（８）に記載のコチニール色素の製造方法。
（１７）膜処理によって分子量６０００以上の分画を除去する（７）または（８）に記載のコチニール色素の製造方法。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、原料として用いるエンジムシに由来するアレルゲンを実質的に含まないことを特徴とするコチニール色素である。
コチニール色素は、一般にアントラキノン系色素のカルミン酸を主成分とする赤色素であって、前述するようにカイガラムシ科エンジムシ（Ｃｏｃｃｕｓ  ｃａｃｔｉ  Ｌ．）を原料として調製される。
本発明のコチニール色素は、上記目的において実質的に分子量６０００以上の蛋白質を含まないように精製されてなるものである。
かかる本発明のコチニール色素は、エンジムシを適当な溶媒で抽出処理して得られるコチニール抽出液を蛋白分解処理し、さらにイオン交換処理や膜処理等の各種任意の精製処理を行うことによって、該コチニール抽出液から分子量６０００以上の分画を排除することによって調製することができる。
より具体的には、本発明の高度に精製されてなるコチニール色素は、コチニール抽出液を蛋白分解処理した後の処理液に対して、吸着処理、イオン交換処理、酸処理、または膜処理のいずれか一種の処理を行うか、またはこれらの処理を任意に２種以上組み合わせて行うことによって製造取得することができる。
本発明において用いられるコチニール抽出液は、エンジムシの乾燥品を好ましくは粉砕した後、水、アルコールまたは含水アルコールで抽出することによって得ることができる。なお、アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール又はブタノール等の炭素数１〜４の低級アルコールを例示することができる。好ましくはエタノールである。
抽出方法としては、抽出に一般に用いられる方法を採用することができる。制限はされないが、例えば上記溶媒中にエンジムシの乾燥粉砕物を冷浸、温浸等によって浸漬する方法、加温し攪拌しながら抽出を行い、濾過して抽出液を得る方法、またはパーコレーション法等を挙げることができる。好ましくは加温した溶媒にエンジムシの乾燥粉砕物を数分から数時間、好ましくは数十分かけて浸漬する方法を挙げることができる。抽出に用いる溶媒のｐＨは特に制限されないが、好ましくは中性〜アルカリ性であり、具体的にはｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ７〜８、より好ましくは約ｐＨ７．５を例示することができる。この場合、抽出溶媒をアルカリ性に調整するために使用される塩基性化合物としては、食品に配合することができるものを広く挙げることができ、この限りにおいて特に制限されない。例えば水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム等を挙げることができる。
かくして得られるコチニール抽出液は、必要に応じてろ過、共沈または遠心分離によって固形物を除去した後、そのまま若しくは濃縮して、蛋白分解処理に供せられる。蛋白分解処理は、通常、酵素を用いて行うことができる。
蛋白分解処理に用いられる酵素としては、蛋白質またはペプチドを分解する作用を有する酵素であれば特に制限されない。簡便には例えばプロテアーゼ、ペプチダーゼなどとして市販されているものを使用することができる。酵素による蛋白分解処理は、使用する各酵素に適した所定の条件で実施することができる。例えば酸性条件下で酵素処理する場合は、上記のコチニール抽出液を例えば塩酸、硫酸若しくはリン酸等の無機酸又はクエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、酢酸若しくはフマル酸等の有機酸を用いてｐＨ３〜５、好ましくはｐＨ３．５〜４．５の範囲に調整することが好ましい。また蛋白分解処理を行う温度条件は、特に制限されないが、通常３０〜６０℃の範囲を用いることができる。
かくして得られる蛋白分解処理液は、必要に応じてろ過、共沈または遠心分離によって生じた沈殿物を除去した後、そのまま若しくは濃縮して、吸着処理、イオン交換処理、酸処理、または膜処理に供せられる。好ましくは吸着処理である。
なお、上記沈殿物をはじめとして本発明で採用する処理工程で生じる沈殿を濾過する場合には、例えば珪藻土やセライトなどの濾過助剤を用いて行うことができ、これらの濾過助剤を用いることによって微細で濾過困難なものまで除去することができる。
吸着処理は、常法に従って行うことができ、例えば活性炭、シリカゲルまたは多孔質セラミックなどの担体を用いた吸着処理；スチレン系のデュオライトＳ−８６１（商標Ｄｕｏｌｉｔｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ．ダイヤモンド・シャムロック社製、以下同じ）、デュオライトＳ−８６２、デュオライトＳ−８６３又はデュオライトＳ−８６６；芳香族系のセパビーズＳＳＰ７００（商標、三菱化学（株）製、以下同じ）、セパビーズＳＰ８２５；ダイヤイオンＨＰ１０（商標、三菱化学（株）製、以下同じ）、ダイヤイオンＨＰ２０、ダイヤイオンＨＰ２１、ダイヤイオンＨＰ４０、及びダイヤイオンＨＰ５０；あるいはアンバーライトＸＡＤ−４（商標、オルガノ製、以下同じ）、アンバーライトＸＡＤ−７、アンバーライトＸＡＤ−２０００などの吸着樹脂担体を用いた吸着処理を挙げることができる。
吸着処理は、制限はされないが、酸性条件下で行うことが好ましい。具体的には、吸着処理に供する試料を前述する無機酸または有機酸を使用してｐＨを２〜４、好ましくはｐＨ３程度に調整することが好ましい。
吸着処理によって各種吸着用担体に吸着担持されたコチニール色素は、例えば含水アルコールなどの適当な溶媒で該担体より溶出することによって、コチニール色素を回収することができる。尚、かかる溶出処理前に、吸着用担体をコチニール色素が脱離しない例えば水などの適当な溶媒で洗浄することが好ましい。ここで含水アルコールとしては通常１０〜６０容量％、好ましくは２０〜８０容量％のアルコールを含有するものを好適に例示することができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール又はブタノール等の炭素数１〜４の低級アルコールを挙げることができる。好ましくはエタノールである。
この場合、溶出処理用の溶媒は中性〜アルカリ性、具体的にはｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ８〜９の液性を有するものが好ましく、かかるｐＨには例えばクエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等で調整することができる。
かくして得られるコチニール抽出液の吸着処理液は、再度吸着処理に付しても、またイオン交換処理、膜処理、又は酸処理等の各種の処理に供することができる。
吸着処理としては、前述する処理を挙げることができる。
イオン交換処理は、特に制限されず慣用のイオン交換樹脂を用いて常法に従って陽イオン交換処理または陰イオン交換処理を行うことができる。例えば陽イオン交換樹脂としては、制限されないが、ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（商標、三菱化学（株）製、以下同じ）、ダイヤイオンＳＫ１０２、ダイヤイオンＳＫ１１６、ダイヤイオンＰＫ２０８、ダイヤイオンＷＫ１０、ダイヤイオンＷＫ２０、等の強陽イオン交換樹脂や弱陽イオン交換樹脂などが、また陰イオン交換樹脂としては、制限されないが、ダイヤイオンＳＡ１０Ａ（商標、三菱化学（株）製、以下同じ）、ダイヤイオンＳＡ１２Ａ、ダイヤイオンＳＡ２０Ａ、ダイヤイオンＰＡ３０６、ダイヤイオンＷＡ１０、ダイヤイオンＷＡ２０などが例示される。
また本発明でいう膜処理とは、膜によるろ過処理を広く意味するものであり、例えばメンブランフィルター（ＭＦ）ろ過膜、ウルトラフィルター（ＵＦ）ろ過膜、ナノフィルター（ＮＦ）ろ過膜、逆浸透（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｏｓｍｏｓｉｓ（ＲＯ））ろ過膜および電気透析膜などの機能性高分子膜を用いたろ過処理を挙げることができる。
また膜処理法としてはこれらの膜を利用したＵＦろ過膜法やＲＯろ過膜法などのほか、イオン選別膜による濃度勾配を利用した透析法、隔膜としてイオン交換膜を使用し電圧を印加する電気透析法などが知られている。工業的にはＮＦろ過膜による膜処理法が好ましい。かかる膜処理法に用いられる膜材料としては、天然、合成、半合成の別を問わず、例えばセルロース、セルロース・ジアセテート若しくはトリアセテート、ポリアミド、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリイミド、ポリアクリロニトリルなどを挙げることができる。
本発明の膜処理には、分画分子量が例えば１００００〜１００００００の範囲にある膜を用いて高分子化合物を分離除去する処理方法と、分画分子量が約２０００〜８０００程度、好ましくは６０００程度、より好ましくは３０００程度の膜を用いて低分子化合物を分離除去する処理方法が含まれる。
前者の方法として具体的にはＮＴＵ−３１５０膜，ＮＴＵ−３２５０膜，ＮＴＵ−３５５０膜，ＮＴＵ−３８００ＵＦ膜（以上、日東電工製）；Ｃｅｆｉｌｔ−ＵＦ（日本ガイシ製）；ＡＨＰ−２０１３膜，ＡＨＰ−３０１３膜，ＡＨＰ−１０１０膜（以上、旭化成製）；等を利用したＵＦろ過膜処理を挙げることができ、また後者の方法として具体的にはＮＴＲ−７２５０膜，ＮＴＲ−７４１０膜，ＮＴＲ−７４３０膜，ＮＴＲ−７４５０膜（以上、日東電工製）、ＡＩＰ−３０１３膜，ＡＣＰ−３０１３膜，ＡＣＰ−２０１３膜，ＡＩＰ−２０１３膜，ＡＩＯ−１０１０膜（以上、旭化成製）などの膜を利用した逆浸透膜（ＮＦろ過膜、分画分子量３０００程度）処理を挙げることができる。これらは１種単独で行ってもまた２種を組み合わせて実施してもよい。
また酸処理は、コチニール抽出液の蛋白分解処理液若しくは上記の各種処理が施された処理液をｐＨ１〜６、好ましくはｐＨ１．５〜４に調整し、酸性条件下に曝されることによって実施できる。酸処理は、具体的には上記処理液に酸を添加配合することによって簡便に行うことができる。かかる酸としては、食品添加物として通常使用される酸であれば特に制限されず、かかる中から任意に選択使用することができる。例えばクエン酸、酢酸、リンゴ酸、乳酸等の有機酸または硫酸、塩酸、リン酸、硝酸等の無機酸等を例示することができる。好ましくは食品添加物として通常使用される無機酸を用いた酸処理である。
かかる酸処理を行う温度条件は特に制限されず、通常５〜１００℃の範囲から適宜選択使用することができる。例えば２０〜１００℃や４０〜１００℃の範囲を例示することができる。酸処理時間も特に制限されず、通常１〜３００分の範囲から適宜選択することができる。一般に高温下での処理であればより短い処理時間で十分であり、よって例えば４０〜１００℃での処理の場合は５〜６０分の範囲から処理時間を採択することができる。なおこの時、処理液は撹拌してもよいし、またしなくてもよく、特に制限されない。
また、任意処理として、炭酸ガス、エチレン、プロパン等をコチニール抽出液の蛋白分解処理液または吸着処理液に臨界点以上の温度、圧力下の密閉系装置内で接触させる処理を行うこともできる。
上記の各種処理は、コチニール抽出液の蛋白分解処理液または吸着処理液に対して１種単独で行っても、また任意の２種以上の処理を任意の順番で組み合わせて行ってもよく、また同一処理を、同一もしくは異なる条件で、繰り返し実施してもよい。
好ましい処理方法は、特に制限されないが、コチニール抽出液を蛋白分解処理した蛋白分解処理液に対し、吸着処理を行い、吸着用担体から脱離処理した脱吸着処理液に、膜処理を行う方法である。また、必要に応じて上記吸着処理後に更にイオン交換処理を行うこともできる。なお、ここで膜処理は、好ましくはＭＦろ過膜処理、ＵＦろ過膜処理またはＮＦろ過膜処理であり、より好ましくはＭＦろ過膜処理またはＮＦろ過膜処理である。また、当該膜処理は、分画分子量が２０００〜８０００、好ましくは６０００付近、より好ましくは３０００付近である膜を用いて高分子量の化合物、好ましくは分子量６０００以上、より好ましくは分子量３０００以上の化合物を含む画分を排除することが好ましい。
かくして得られる本発明のコチニール色素は、アレルゲンとなるエンジムシ由来の蛋白質をはじめとする各種夾雑物が効果的に除去されてなるものであって、これによって経口摂取されるか若しくはその可能性のある食品、医薬品、医薬部外品または化粧品等に配合してもそのアレルギー症状を誘発しないコチニール色素を提供することができる。また、上記方法によって得られる本発明のコチニール色素は、沈澱物を経時的にほとんど生じず、保存安定性にすぐれたものである。
なお、コチニール色素とは主にカルミン酸を意味するものであるが、本発明のコチニール色素の範疇には、当該カルミン酸に加えて、カルミン酸にアルミニウムイオン又はカルシウムイオン等の金属イオンが結合してなるカルミン（錯体及びそのポリマーを含む）が含まれる。カルミンには、具体的にはカルミン酸とアルミニウムイオンとの錯体及びその重合体（アルミニウムレーキ）またはカルミン酸とカルシウムイオンとの錯体及びその重合体（またはカルシウムレーキ）を例示することができる。
かくして得られる本発明のコチニール色素は、さらに食品衛生上または薬学的に許容される担体や添加剤を配合して色素組成物として調製することができる。かかる色素組成物は、飲料を含む食品、医薬品、医薬部外品又は化粧品などの着色、特に経口的に摂取されるか若しくはその可能性のある製品の着色に用いられる色素製剤として好適に使用できる。
色素製剤の形態は特に制限されず、例えば水、エタノールなどのアルコール又はその他の溶媒（例えばプロピレングリコール、グリセリン等）を担体として用いて、それにコチニール色素を溶解若しくは分散させてなる溶液状態、又は例えばデキストリン、乳糖、粉末水飴等を担体（賦形剤）として用いて、それをコチニール色素に配合して粉状、顆粒状、錠剤状もしくは丸剤状などに成形してなる乾燥（固形）状態の色素製剤として調製することができる。
当該色素製剤に配合される添加剤としては、特に制限されないが、色素や色素製剤に通常用いられる保存剤（酢酸ナトリウム、プロタミンなど）、安定剤（アラビアガム、ジェランガム、カラギーナン、トレハロース、水溶性ヘミセルロース、燐酸ナトリウム、メタ燐酸ナトリウムなど）、乳化剤（レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステルなど）または酸化防止剤（チャ抽出物、生コーヒー抽出物、ヒマワリ種子抽出物、ヤマモモ抽出物、ルチン抽出物、ローズマリー抽出物、酵素処理ルチン、ルチン分解物（ケルセチン）、酵素処理イソクエルシトリン、トコフェロール類、アスコルビン酸類など）などの食品添加物を挙げることができる。
なお、後述の実施例３において示すように本発明の製造方法によれば、有意に脱臭されたコチニール色素を調製することができる。従って、本発明のコチニール色素の製造方法は、コチニール色素の脱臭方法と言い換えることもできる。かかる観点から本発明には下記の態様が含まれる：
（ａ）．コチニール抽出液を蛋白分解処理した後、分子量６０００以上の分画を除去する工程を含むコチニール色素の脱臭方法。
（ｂ）．コチニール抽出液を蛋白分解処理した後、吸着処理、イオン交換処理、酸処理、及び膜処理よりなる群から選択される少なくとも一種の処理工程を行うコチニール色素の脱臭方法。
（ｃ）．コチニール抽出液を蛋白分解処理及び吸着処理した後、吸着処理、イオン交換処理、酸処理、及び膜処理よりなる群から選択される少なくとも一種の処理工程を行うコチニール色素の脱臭方法。
（ｄ）．コチニール抽出液が、含水アルコールを用いてカイガラムシを抽出処理して得られるものである（ａ）記載のコチニール色素の脱臭方法。
（ｅ）．コチニール抽出液を酸性条件下で蛋白分解処理する（ａ）記載のコチニール色素の脱臭方法。
（ｆ）．吸着処理を酸性条件下で行う、（ｂ）または（ｃ）に記載のコチニール色素の脱臭方法。
（ｇ）．吸着処理が、コチニール色素を担体に酸性条件下で吸着させ、含水アルコールを用いてｐＨ７〜９条件下で溶出させることからなる（ｂ）または（ｃ）に記載のコチニール色素の脱臭方法。
（ｈ）．酸処理が食品添加物として使用される酸を用いた処理である（ｂ）または（ｃ）に記載のコチニール色素の脱臭方法。
（ｉ）．膜処理が、逆浸透ろ過膜処理、メンブランフィルターろ過膜処理、ウルトラフィルターろ過膜処理、及びナノフィルトレーションろ過膜処理よりなる群から選択されるいずれか少なくとも１種である（ｂ）または（ｃ）に記載のコチニール色素の脱臭方法。
（ｊ）．膜処理が２０００〜８０００分画分子量を有する膜を利用した処理である（ｂ）または（ｃ）に記載のコチニール色素の脱臭方法。
（ｋ）．膜処理によって分子量６０００以上の分画を除去する（ｂ）または（ｃ）に記載のコチニール色素の脱臭方法。
実施例
以下、実施例を掲げて、本発明を詳しく説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
（１）コチニール色素及び色素製剤の調製
エンジムシ乾燥粉末３５ｋｇに苛性ソーダでｐＨ７．５に調整した水８００Ｌを加えて９０〜１００℃で２０〜３０分間撹拌しながらコチニール色素を抽出した。抽出後、６０メッシュ金網にて固液分離した液（コチニール抽出液）にクエン酸を加え、コチニール抽出液をｐＨ４に調整し、約５０℃まで冷却したところで、蛋白分解酵素０．１％を添加して上記温度にて３時間攪拌した。次いで、得られた蛋白分解処理液をクエン酸でｐＨ３に調整した後、濾過助剤及び珪藻土を配合してろ紙濾過し、蛋白分解処理液約２５０Ｌを得た。このコチニール蛋白分解処理液を樹脂塔に充填した吸着樹脂アンバーライトＸＡＤ−７（１５０Ｌ）に通液してコチニール色素を吸着させ、次いで該樹脂をその８倍量の水でよく洗浄した後、５０％エタノール水溶液１３０Ｌ（ｐＨ７．５）を用いてコチニール色素を溶出し、溶出液８２Ｌを得た。次いで得られた吸着処理液をＭＦろ過膜（セラミックフィルター、日本碍子製、０．２μｍ）を用いて２ｋｇ／ｃｍ２，２０℃で処理しＭＦろ過処理液８２Ｌを得た。
更に、ＮＦろ過膜（ＣＦ３０−Ｓ、日東電工社製、分画分子量６０００）を用いて３ｋｇ／ｃｍ２，２０℃で処理しＮＦろ過膜処理液８０Ｌを得た。次いでこのＮＦろ過膜処理液を、減
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色素液２０ｋｇに水３２．４ｋｇとエチルアルコール１３ｋｇ、クエン酸（結晶）６００ｋｇを加
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（０．１Ｎ塩酸水）の可視部での極大吸収波長（４１０ｎｍ付近）における吸光度を測定し、該吸光度を１０ｗ／ｖ％溶液の吸光度に換算した数値である。
（２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析
各製造工程で得られた処理液（コチニール抽出液、蛋白分解処理液、吸着処理液、ＭＦろ過膜処理液、及ＮＦろ過膜通過液）をそのまま電気泳動に供するとコチニール色素中に存在する色素、塩類等の影響により蛋白質を分析することが困難である。そこで、液体クロマトグラフィー装置を用い、各処理液中より蛋白質
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液５μｌをＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８；ＯＤＳカラム（φ０．４６ｍｍ×２５０ｍｍ）用い、展開溶媒：７０％ＭｅＯＨ、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２８０ｎｍの条件で色素、塩類と蛋白を分離し、蛋白画分を分取した。この操作を１０回繰り返し集めた蛋白画分液を濃縮乾固し、１００μｌの水で溶解したものをサンプルとして電気泳動を行った。電気泳動条件はＬａｅｍｍｌｉ法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））に準拠して行い、次いで得られた電気泳動ゲルを常法に従って銀染色した。尚、電気泳動には、上記サンプル１０５μｌに２−メルカプトエタノール１０μｌ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２５μｌ、１０重量％ＳＤＳ４０μｌ及び７０重量％グリセリン２０μｌを混合して、３分間煮沸加熱して調製した試料を用いた。
また、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）条件は下記の通りである。
・分析試料    ：１０μｌ／レーン
・Ｂｕｆｆｅｒ：Ｔｒｉｓ−ｇｌｙｃｉｎ（ｐＨ６．８）、０．１％ＳＤＳ
結果を電気泳動像として図１に示す。図中、レーン左から、▲１▼分子量マーカー（１６９５０Ｄａ，１４４１０Ｄａ，１０７０４Ｄａ，８１６７Ｄａ，６２１７Ｄａ，２５１２Ｄａ）、▲２▼コチニール抽出液、▲３▼蛋白分解処理液、▲４▼吸着処理液、▲５▼ＭＦろ過膜処理液、▲６▼ＮＦろ過膜処理液の泳動結果を示す。
最近、ＭＴＬｉｚａｓｏらによってコチニール色素中に含まれるアレルゲンは分子量が１７０００、２８０００及び５００００の蛋白質であることが報告されている（Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ，Ｖｏｌ．８４（５），５４９−５５２  ２０００．）。一般にアレルギーを引き起こす蛋白質は分子量が１００００以上の比較的大きな蛋白質であると言われるが、蛋白質と別の成分が結合してアレルゲンとなるという報告もある。
図１の結果からわかるように、本発明の方法によれば、コチニール抽出液から、上記分子量１７０００、２８０００及び５００００といった蛋白質はもとより、可能性としてアレルゲンとなると思われる分子量６０００以上の蛋白質までもが、銀染色で確認できない程度（約１００ｐｐｂ以下）まで排除されている。さらに、本発明の方法によればＮＦろ過膜処理後の試料中に蛋白質がほとんど検出できないほど高度に精製され、極めて安全性の高いコチニール色素が得られることがわかる。
実施例２
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加え、この色素液に酒石酸８ｋｇ、焼ミョウバン９．３ｋｇ、消石灰（水酸化カルシウム）０．６ｋｇを添加し溶解（色素溶解液）する。次に、攪拌しながら温度を８０℃に上げ５時間保持することによって、水不溶性のコチニールアルミニウムレーキ（カルミン）を調製した。次に、水に懸濁状態となっているカルミンをろ過機（フィルタープレス；藪田（株）製）を用いてケーキ状のカルミンケークを回収し、その後、５０℃のもと真空乾燥し、粉砕して粉末カルミンを調製した。
このようにして得られたカルミンを実施例１と同様に電気泳動法で蛋白分析したところ、蛋白質は検出されなかった。このことより、実施例１の方法を用いることでアレルゲンとなる可能性のある蛋白質がほとんど存在しないカルミンが調製されることが分かった。
なお、本発明者の知見によると、カルミン酸のアルミニウムレーキ物やカルシウムレーキ物（カルミン）が重合してポリマーを形成する場合には、低分子の蛋白質を共存させるほうがより綺麗にレーキ化し色調が赤くなる傾向がある。従って、アレルゲンを除去した上記色素溶解液にアレルゲンとならない比較的低分子の蛋白質を添加することによって、より赤い色調の商品価値の高いコチニール色素（カルミン）が調製できると考えられる。
実施例３
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有無を確認した。具体的には、上記コチニール色素製剤５ｇを水で希釈して色価
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訓練された１０名の臭気判定の専門パネラーによる判定に基づいて評価した。このときの比較対照標品としては、実施例１に記載の方法に従ってエンジムシ乾燥粉末から調製したコチニール色素の水抽出液（ｐＨ７．５）（比較色素１）、また該水抽出液を更に吸着樹脂処理して調製したコチニール色素（比較色素２）を用いた。
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で加温した状態で臭いの評価判定に使用した。結果を表１に示す。
【表１】
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＜評価基準＞
エンジムシ由来の臭いがかなり強い      ：＋＋＋
エンジムシ由来の臭いがする            ：＋＋
エンジムシ由来の臭いがかすかにする    ：＋
エンジムシ由来の臭いが殆ど気にならない：±
エンジムシ由来の臭いが全くしない      ：−
この結果から、本発明のコチニール色素は、無臭かまたはやや臭いがあっても殆ど気にならない程度であり、本発明の製造方法によれば、有意に脱臭された状態でコチニール色素を調製できることがわかった。
実施例４
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沈殿の有無を確認した。具体的には、上記コチニール色素製剤を溶解状態で５℃で６ヶ月間保存し、沈殿の発生状況を目視によって観察した。その結果、本発明の色素製剤は沈殿を生じることなく、経時的に安定であった。
この結果から、本発明の製造方法によれば、長期保存においても沈殿の発生が有意に抑制されてなるコチニール色素が調製できることがわかった。
産業上の利用可能性
本発明のコチニール色素は、原料として用いるエンジムシに由来する蛋白質やその他の夾雑物が有意に排除されて高度に精製されることによって、実質的にアレルゲンを含まない安全性の高い色素である。このため、本発明の色素または当該色素を含有する色素製剤は、飲料その他の食品類、医薬品、医薬部外品又は化粧品など、特に経口的に摂取されるかもしくはその可能性のある製品の着色料として、アレルギーの問題なく安心して使用することができる。
また、本発明のコチニール色素は、有意に脱臭されており殆ど臭いがないため、臭いが商品価値に影響するような食品や化粧品などの製品の着色に有用に使用することができる。
さらに、本発明のコチニール色素は、経時的に沈殿物が発生することが極めて少ないため、使用時に濾過処理することなく、飲料、菓子等の食品を始めとする各種の製品を均一に着色することができる。
【図面の簡単な説明】
図１．実施例１において、各製造工程で得られる処理液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて得られた電気泳動像を示す図である。レーン左から、▲１▼分子量マーカー（１６９５０Ｄａ，１４４１０Ｄａ，１０７０４Ｄａ，８１６７Ｄａ，６２１７Ｄａ，２５１２Ｄａ）、▲２▼コチニール抽出液、▲３▼蛋白分解処理液、▲４▼吸着処理液、▲５▼ＭＦろ過膜処理液、▲６▼ＮＦろ過膜処理液の泳動結果を示す。
【図１】
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