(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の酵素学的性質を有するアルカリエキソポリガラクツロナーゼ
（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）及びペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、ジガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応pH：pH８〜９（トリス−塩酸緩衝液）
（３）最適反応温度：約５５℃（０．４mM塩化カルシウムを含むトリス−塩酸緩衝液、pH９．０）
（４）pH安定性：pH３〜１１（４０℃、６０分間処理）
（５）耐熱性：約５０℃（１mM塩化カルシウムを含むトリス−塩酸緩衝液、pH７．０、１５分間処理）
（６）分子量：約１０５０００（ＳＤＳ電気泳動法）
（７）等電点：pH４．３付近（等電点電気泳動法）
【請求項２】
請求項１記載のアルカリエキソポリガラクツロナーゼを生産するバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ６６０（以下ＦＥＲＭ Ｐ−１７５６４）。
【請求項３】
請求項１記載のアルカリエキソポリガラクツロナーゼを生産するバチルス属に属する細菌を培養し、培養物から当該酵素を採取するアルカリエキソポリガラクツロナーゼの製造法。
【請求項４】
細菌がバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ６６０（ＦＥＲＭＰ−１７５６４）である請求項３記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗浄剤等に有用なアルカリエキソポリガラクツロナーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペクチン質を分解する酵素にはポリガラクツロナーゼ（ペクチナーゼ）、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼ等が知られている。食品工業分野ではこれらの酵素を有効に利用し、果汁、ワイン等の清澄化、柑橘類ジュースの搾汁率の向上、果物残渣から可溶性成分の回収、みかん果皮の剥皮等に応用している。特に食品工業分野においては一般的に作用pHの低い領域で効率良く働くポリガラクツロナーゼが使用されるが、事実、従来公知のポリガラクツロナーゼの最適反応pHは殆どが酸性側に存在している。
【０００３】
一方、ジャム、ケチャップ、ジュースなどのペクチン質含量の高い食物の衣服についた食べこぼしや染み汚れの除去にポリガラクツロナーゼを衣料洗剤用酵素として利用しようとする試みもあり、例えば、特開昭６０−２２６５９９号公報、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９８／０６８０９号等が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
衣料用洗剤や他の洗浄剤等にポリガラクツロナーゼを用いる場合には、酵素が中性からアルカリ性領域で作用すること、洗浄剤の成分である界面活性剤等に対し安定であることが必要である。
現在までに唯一知られているアルカリポリガラクツロナーゼ（特公昭４８−６５５７号公報）は好アルカリ性バチルスＰ−４−Ｎ株が生産し、アルカリ性領域で作用するエンド型の酵素である。最適反応pHは１０付近にあるが、pH５から７では最大活性の２０％以下の相対活性を示すにすぎず広範囲で作用させるためには、他の中酸性酵素との併用が必要である。フザリウム  オキシスポラム(Fusarium oxysporum) 株由来の酵素はポリガラクツロン酸を基質にした場合の最適反応pHは５付近に存在する。反応生成物はモノガラクツロン酸であるが、ＳＤＳにより著しく阻害されること、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛等の金属イオンによって阻害されることなど(Maceira et al., FEMS Microbiol. Lett., 154, 37-43, 1997)洗浄剤用酵素としては適さない。また、セレノモナス  ルミナンティウム(Selenomonas ruminantium）由来の酵素は、最適反応pHを７付近に示すが、作用pHならびに安定pH範囲が非常に狭いことが特徴であり、最適反応温度は４０℃付近で、反応産物はジガラクツロン酸である（Heinrichova et al., J. Appl. Bacteriol., 66, 169-174, 1989 ）。
【０００５】
従って本発明の目的は、アルカリ性領域に最適反応pHを有し、且つ広いpH範囲で作用する界面活性剤に耐性のアルカリエキソポリガラツクロナーゼを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、土壌中の微生物が産生する酵素の中から、pH８〜９に最適反応pHを有し、且つ広いpH範囲においても作用する界面活性剤耐性のアルカリエキソポリガラクツロナーゼを見出し本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、下記の酵素学的性質を有するアルカリエキソポリガラクツロナーゼ、それを生産する微生物及びその製造法を提供するものである。
（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）及びペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、ジガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応pH：pH８〜９（トリス−塩酸緩衝液）
（３）最適反応温度：約５５℃（０．４mM塩化カルシウムを含むトリス−塩酸緩衝液、pH９．０）
（４）pH安定性：pH３〜１１（４０℃、６０分間処理）
（５）耐熱性：約５０℃（１mM塩化カルシウムを含むトリス−塩酸緩衝液、pH７．０、１５分間処理）
（６）分子量：約１０５０００（ＳＤＳ電気泳動法）
（７）等電点：pH４．３付近（等電点電気泳動法）
【０００８】
本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼは、例えばアルカリエキソポリガラクツロナーゼ生産菌を培養し、その培養液から採取することにより製造できる。かかる生産菌としては、バチルス属に属する細菌、例えば下記の菌学的性質を有するバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ６６０株が挙げられる。
【０００９】
Ａ  形態学的性質
（ａ）細胞の形、大きさ：桿菌（０．６〜０．８×４．０〜５．０μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の有無）：楕円形、０．６〜０．８×１．０〜２．０μｍ、準端、膨潤有り
（ｅ）グラム染色：不定（ＣＶＴ寒天培地には生育せず、水酸化カリウム法で粘性を示さず）
（ｆ）抗酸性：陰性
（ｇ）肉汁寒天培地上での生育：乳白色、葉状のコロニーを形成
【００１０】
Ｂ  生理学的性質
（ａ）硝酸塩の還元：＋
（ｂ）脱窒反応：−
（ｃ）ＭＲテスト：−
（ｄ）ＶＰテスト：−
（ｅ）インドール生成：−
（ｆ）硫化水素の生成：−
（ｇ）デンプン加水分解：＋
（ｈ）ゼラチン加水分解：＋
（ｉ）カゼイン加水分解：＋
（ｊ）クエン酸の利用：−
（ｋ）無機窒素の利用：−
（ｌ）ウレアーゼ：−
（ｍ）オキシダーゼ：＋
（ｎ）カタラーゼ：＋
（ｏ）リトマスミルク：酸性化する
（ｐ）生育温度範囲：１８〜５０℃
（ｑ）生育pH範囲：pH６〜１０
（ｒ）嫌気条件下での生育：生育せず
（ｓ）ＯＦテスト：−
（ｔ）グルコースからのガス産生：−
（ｕ）塩化ナトリウムに対する耐性：７％で生育
（ｖ）糖からの酸生成：以下の糖類から酸生成を認めた。ガラクトース、キシロース、アラビノース、シュークロース、グルコース、マンニトール、マンノース、イノシトール、ソルビトール、トレハロース、ラクトース、グリセリン、マルトース、フラクトース、ラフィノース、サリシン、メリビオース、可溶性デンプン、ラムノース
【００１１】
以上バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ６６０株の形態学、生理学的性質について「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」（Williams & Wilkins社、１９８４年）の記載に準じ比較検討した結果、本菌株はバチルス  サーキュランスに近縁な菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のバチルス  サーキュランスとは一致せず、他のバチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新規なバチルス属細菌として本菌株を工業技術院生命工学研究所へバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ６６０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５６４）として寄託した。
【００１２】
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ６６０株等のアルカリエキソポリガラクツロナーゼ生産菌を用いて本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い振盪培養あるいは通気攪拌培養すれば良い。
【００１３】
得られた培養物中からのアルカリエキソポリガラクツロナーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段、濃縮等により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００１４】
本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼの一例であるバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ６６０株由来のアルカリエキソポリガラクツロナーゼは、以下のような酵素学的性質を有する。
【００１５】
尚、酵素活性の測定は以下のように行った。
〔標準酵素活性測定法〕
試験管に０．２mLの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH９．０）、０．１mLの４mM塩化カルシウム、０．２mLの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸（ＩＣＮバイオメディカル；ｌｏｔ１４４８２、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整）、０．４mLの脱イオン水を添加し、３０℃で５分間恒温した。これに０．１mLの適当に希釈した酵素液〔希釈は５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で行った〕を加え２０分間反応させた後、１mLのジニトロサリチル酸試薬を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４mLの脱イオン水を加え５３５nmにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmolのＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とした。
【００１６】
（１）基質特異性
ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペクチンを基質とし、標準活性測定法により反応速度を調べた。エステル化度２８％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ７４Ｈ１０９２）では約３５％、エステル化度６７％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ７４Ｈ１０９３）に対して約１１％、エステル化度９３％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ２５Ｈ０１２３）に対しては、この条件下では分解活性を示さなかった。
【００１７】
（２）基質の分解様式
５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．５）、０．２％ポリガラクツロン酸、０．２mM塩化カルシウムからなる反応液に０．０５Ｕの本酵素を添加し、全量を０．２５mLとした。３０℃、３０分間反応させた液を薄層クロマトプレート（kiesel gel  ６０：メルク）に約１０μＬスポットし、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝５：２：３（ｖ／ｖ）の溶媒系にて展開を行った。反応物の検出にはアニスアルデヒド−硫酸溶液を用い、プレートに噴霧後、１００℃、１０分間乾燥器中で発色させた。その結果、反応生成物としてジガラクツロン酸のみが検出され、本酵素はエキソ型のポリガラクツロナーゼと判断された。
【００１８】
（３）最適反応pH
４０mMブリットンロビンソン緩衝液（pH４〜１２）、１００mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９．５）、１００mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８〜１１）を用いて最適反応pHを調べた結果、本酵素はpH８〜９のトリス−塩酸緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、pH５から１１の広範囲でも最大活性の４０％以上の活性を有してた（図１）。
【００１９】
（４）最適反応温度
０．４mM塩化カルシウムを含む１００mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．５）中、２０℃〜７０℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた。その結果、本酵素は５５℃付近に最適反応温度を示した。また、塩化カルシウムを反応系に添加しない場合において最適反応温度は５０℃付近へシフトするとともに、カルシウム添加系の最大活性値に比べて約５０％の活性を示した（図２）。
【００２０】
（５）安定pH範囲
塩化カリウム−塩酸緩衝液（pH１．６〜２．７）、酢酸緩衝液（pH４〜６）、ＭＯＰＳ緩衝液（pH６〜８）、トリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）、ホウ酸緩衝液（pH９〜１１）及び塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１２．４〜１３．５）の各緩衝液（５０mM）に１mM塩化カルシウムを添加した系に酵素を加え、４０℃、６０分間恒温した後、残存活性を測定した。その結果、本酵素はホウ酸緩衝液（pH１１）中での残存活性を１００％とした場合、pH３〜１１の範囲で８０％以上の残存活性を示した（図３）。
【００２１】
（６）耐熱性
１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）中に酵素を添加し、３０℃〜８０℃の各温度で１５分間恒温した後の残存活性を測定した。本酵素は、この条件下において５０℃まで安定であった。また、塩化カルシウムを添加しない場合、４５℃付近まで安定であった（図４）。
【００２２】
（７）分子量（ＳＤＳ電気泳動法）
７．５％アクリルアミドゲルを用いて粗酵素液の電気泳動を行った。泳動後のゲルをポリガラクツロン酸プレート〔１％ポリガラクツロン酸、０．１％リン酸１水素カリウム、１％塩化ナトリウム、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）、１．５％寒天〕上に置き、３７℃、３時間恒温した。その後、１％（ｗ／ｖ）セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を注ぎ、約１０分後、ポリガラクツロナーゼ活性由来の溶解斑を示したタンパク質バンドを切り出し裁断した。少量のＳＤＳ処理液を加え１００℃、２分間の熱処理を行った後、１２．５％アクリルアミドゲルを用いＳＤＳ電気泳動を行った。標準タンパク質としてミオシン（２０００００）、β−ガラクトシダーゼ（１１６２５０）、ホスホリラーゼｂ（９７４００）、牛血清アルブミン（６６２００）、卵白アルブミン（４５０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（３１０００）を用い、それぞれの移動度と分子量から検量線を作製し、本酵素の分子量を求めたところ約１０５０００と推定された。
【００２３】
（８）等電点
ＰＡＧ−Ｐｌａｔｅ（ファルマシア；pH３．５〜９．５）を用いて酵素の等電点電気泳動を行った。泳動したゲルを１０mMリン酸緩衝液（pH７．０）中に浸した後、前述のポリガラクツロン酸プレート上に置いた。３７℃、３時間恒温した後、ゲルを取り去り、１％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を注いだ。約１０分後に活性に伴う溶解斑が生じた位置のタンパク質移動度と標準タンパク質の等電点と移動度から得た検量線より本酵素の等電点は、pH４．３付近であると決定された。
【００２４】
（９）界面活性剤の影響
各界面活性剤を０．１％（ｗ／ｖ）になるように添加した反応系において、酵素活性を測定した。その結果、０．１％という高濃度の各界面活性剤の存在下においても本酵素は対照に比べ６５％以上の活性を発現しうることが判った（表１）。
【００２５】
【表１】
0004139538.tif 000002
【００２６】
（１０）キレート剤の影響
本酵素を１０mMＥＤＴＡを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）中で３０℃、３０分間恒温した後、１０倍に希釈し残存活性を測定した。標準活性測定法において塩化カルシウムを添加した場合と無添加の場合においての残存活性を比較すると塩化カルシウム添加系では、活性が１００％残存するのに対し、無添加系では、５％程度の活性発現が認められたにすぎなかった。従って、本酵素は反応にカルシウムイオンを要求することが判った。
【００２７】
このように本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼは、最適反応pHが８〜９付近にあり、界面活性剤耐性を有する、ジガラクツロン酸生成型の新規な酵素である。
【００２８】
【実施例】
実施例１  アルカリエキソポリガラクツロナーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、２０分間熱処理し、下記の組成を有する寒天平板培地に塗布した。３０℃の培養器で３〜７日間静置培養し、菌の生育後、０．２％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸、０．１％リン酸１水素カリウム、１％塩化ナトリウム、０．２Ｍクエン酸３ナトリウム、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）、０．８％寒天から成る軟寒天を重層し、３７℃で１時間恒温した。コロニー周辺にポリガラクツロン酸の分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返し、ポリガラクツロン酸分解酵素の生産能を検定した。このようにして得られた多くの菌株は、主にペクチン酸リアーゼを生産したが、その中でポリガラクツロナーゼ生産菌としてバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ６６０株を得た。
【００２９】
【表２】
0004139538.tif 000003
【００３０】
実施例２  バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ６６０株によるアルカリエキソポリガラクツロナーゼの生産
上述のスクリーニングにより得られたバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ６６０株の培養は、５００mL容坂口フラスコに５０mLの培地を加え、３０℃、２日間好気的に行った。培地組成は、０．５％（ｗ／ｖ）ペクチン、２％ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸１水素カリウム、０．００５％硫酸マンガン、０．５％炭酸ナトリウム（別滅菌）であった。本条件下においてアルカリエキソポリガラクツロナーゼの生産性は約３１０Ｕ／Ｌであった。
【００３１】
実施例３  アルカリエキソポリガラクツロナーゼの精製
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ６６０株の培養液を遠心分離（９０００×ｇ、２０分間、４℃）により上清液（３．５Ｌ）を得た。これを限外濾過用モジュール（ＡＣＰ１３０００：旭化成）により濃縮、脱塩を行った（４５０mL）。得られた濃縮液は２mMβ−メルカプトエタノール、１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化しておいたSuper Ｑトヨパール６５０Ｍカラム（２．５×１８cm：東ソー）に添着した。約２．１Ｌの平衡化緩衝液を用いて非吸着タンパク質を洗浄溶出させた後、０から０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液（４５０mLずつ）を用い、濃度勾配溶出法により吸着タンパク質の溶出を行った。その結果、０．１４Ｍ付近の塩化ナトリウム濃度でアルカリポリガラクツロナーゼが溶出された。この画分を集め（７６mL）、限外濾過（ＹＭ３メンブレン：アミコン）により濃縮、脱塩を行った（１．３mL、６６Ｕ、２７０mgタンパク質）。
上記精製操作により得られたアルカリエキソポリガラクツロナーゼ画分は、前述の酵素学的性質を示した。
【００３２】
【発明の効果】
本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼは、pH８〜９に最適反応pHを有し、界面活性剤耐性を有する新規酵素であり衣料用洗剤等の洗浄剤酵素として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼ活性に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図２】本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼ活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図３】本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図４】本発明のアルカリエキソポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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