(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＸΔ因子アミノ酸配列のアミノ酸Ａrg１８０からＡrg２３４までが欠失しており、Ｇly１７３とＡrg１７９の間のアミノ酸配列の領域において修飾を有し、該修飾がＸ因子配列のこの位置で天然では開裂しないプロテアーゼのプロセシング部位を示すことを特徴とするＸΔ因子アナログ。
【請求項２】
前記修飾が、＿第１図に示されたアミノ酸の番号付けに基づくＧly１７３とＡrg１７９の間のアミノ酸配列の領域におけるアミノ酸交換であることを特徴とする、請求項１＿記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項３】
Ｇly１７３−Ｒ６−Ｒ５−Ｒ４−Ｒ３−Ｒ２−Ａrg１７９／Ｒ１（２３５）
［ここで、
ａ）Ｒ１は、Ｖal、Ｓer、Ｔhr、ＩleまたはＡlaの群から選択されたアミノ酸であり、
ｂ）Ｒ２は、Ｇlu、Ｔhr、Ｐro、Ｇly、ＬysまたはＡrgの群から選択されたアミノ酸であり、
ｃ）Ｒ３は、Ｌeu、Ｐhe、Ｌys、Ｍet、Ｇln、Ｇlu、Ｓer、Ｖal、ＡrgまたはＰroの群から選択されたアミノ酸であり、
ｄ）Ｒ４は、Ｔhr、Ａsp、Ａsn、Ｉle、Ｓer、Ｍet、Ｐro、ＡrgまたはＬysの群から選択されたアミノ酸であり、
ｅ）Ｒ５は、Ａsn、Ｌys、Ｓer、Ｇlu、Ｇln、Ａla、ＨisまたはＡrgの群から選択されたアミノ酸であり、そして
ｆ）Ｒ６は、Ａsp、Ｐhe、Ｔhr、Ａrg、ＬeuまたはＳerの群から選択されたアミノ酸である］
を有するＸ因子配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項４】
前記修飾が、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、およびＬＰＣ／ＰＣ７からなる群から選択されるエンドプロテアーゼ、またはＩＩａ因子、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子およびカリクレインからなる群から選択されるセリンプロテアーゼ＿から選択されたプロテアーゼのためのプロセシング部位を示すことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項５】
酵素的に不活性な形態の１本鎖の分子として存在することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項６】
前記修飾が、不活性な１本鎖のＸΔ因子アナログポリペプチドの、２本鎖の活性なＸａアナログ形態への活性化を可能にすることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項７】
Ｃ末端のＸ因子アミノ酸配列の領域においてさらなる修飾を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項８】
前記さらなる修飾を、Ｃ末端のβ−ペプチド開裂部位＿において＿有することを特徴とする、請求項７記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項９】
前記さらなる修飾が、アミノ酸Ａrg４６９とＳer４７６の間のＸ因子アミノ酸配列の領域における突然変異、欠失または挿入であることを特徴とする、請求項８記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項１０】
前記さらなる修飾がβ−ペプチドの開裂を阻止することを特徴とする、請求項７〜９のいずれかに記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項１１】
Ｘ因子β−ペプチドが欠失していることを特徴とする、請求項７記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項１２】
Ｘ因子配列のＣ末端領域において翻訳終止シグナルを有することを特徴とする、請求項１１記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項１３】
Ｘ因子配列のアミノ酸Ｌys４７０の位置に翻訳終止シグナルを有することを特徴とする、請求項１２記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項１４】
Ｇly１７３とＡrg１７９の間のアミノ酸配列の領域における前記修飾が、不活性なＸ因子アナログの活性なＸΔ因子アナログへのインビトロでの活性化を可能することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項１５】
前記修飾が、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、およびＬＰＣ／ＰＣ７からなる群から選択されるエンドプロテアーゼ、またはＩＩａ因子、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子およびカリクレインからなる群から選択されるセリンプロテアーゼ＿から選択されたプロテアーゼによる活性化を可能にすることを特徴とする、請求項１４記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項１６】
完全なβ−ペプチドを有し、ＸΔα因子として提供されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項１７】
β−ペプチドが欠失していることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載のＸΔ因子アナログ。
【請求項１８】
コードされるタンパク質の組換え発現のためのベクターに含まれる、請求項１〜１７のいずれかに記載のＸΔ因子アナログをコードする組換えＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１８記載の組換えＤＮＡを含む形質転換細胞。
【請求項２０】
Ｘ因子アミノ酸配列のアミノ酸Ａrg１８０からＡrg２３４までが欠失しており、Ｇly１７３とＡrg１７９の間のアミノ酸配列の領域において修飾を有し、該修飾がＸ因子配列のこの位置で天然では開裂しないプロテアーゼのプロセシング部位を示す精製されたＸΔ因子アナログを含む調製物。
【請求項２１】
少なくとも８０％＿の純度の酵素的に不活性な１本鎖のＸΔ因子アナログを含み、不活性な、Ｘ／Ｘａ因子アナログのタンパク質分解中間体を含まないことを特徴とする、請求項２０記載の調製物。
【請求項２２】
少なくとも９０％の純度の酵素的に不活性な１本鎖のＸΔ因子アナログを含む、請求項２１記載の調製物。
【請求項２３】
少なくとも９５％の純度の酵素的に不活性な１本鎖のＸΔ因子アナログを含む、請求項２１記載の調製物。
【請求項２４】
ＸΔα因子としてＸΔ因子アナログを含むことを特徴とする、請求項２０〜２３のいずれかに記載の調製物。
【請求項２５】
ＦＸΔβとしてＸΔ因子アナログを含むことを特徴とする、請求項２０〜２３のいずれかに記載の調製物。
【請求項２６】
単離された形態の１本鎖の分子としてＸΔ因子アナログを含むことを特徴とする、請求項２０〜２５のいずれかに記載の調製物。
【請求項２７】
分子の高い安定性と構造上の統合性を有するＸΔ因子アナログを含むことを特徴とする、請求項２０〜２６のいずれかに記載の調製物。
【請求項２８】
ＸΔ因子アナログのＸａ因子アナログへのインビトロでの活性化を可能にする修飾を有するＸΔアナログを含むことを特徴とする、請求項２０〜２７のいずれかに記載の調製物。
【請求項２９】
医薬調製物として製剤化されていることを特徴とする、請求項２０〜２８のいずれかに記載の調製物。
【請求項３０】
ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、およびＬＰＣ／ＰＣ７からなる群から選択されるエンドプロテアーゼ、またはＩＩａ因子、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子およびカリクレインからなる群から選択されるセリンプロテアーゼ＿から選択されたプロテアーゼと組み合わせて、ＸΔ因子アナログをＸａ因子アナログに活性化させる装置＿において存在することを特徴とする、請求項２９記載の調製物。
【請求項３１】
前記装置がアプリケーションデバイスである、請求項３０記載の調製物。
【請求項３２】
成分が空間的に分離されて提供されることを特徴とする、請求項３０または３１に記載の調製物。
【請求項３３】
高い安定性と構造上の統合性を有する精製されたＸａ因子アナログを含む調製物であって、＿不活性なＸΔ／Ｘａ因子アナログ中間体および自己タンパク質分解的産物を含まず、請求項１〜１７のいずれかに記載のＸΔ因子アナログを活性化することにより得られる調製物。
【請求項３４】
活性なＸａ因子アナログを単離された形態の２本鎖の分子として含むことを特徴とする、請求項３３記載の調製物。
【請求項３５】
少なくとも８０％＿の純度のＸａ因子アナログを含み、不活性な、Ｘ／Ｘａ因子アナログのタンパク質分解的中間体を含まないことを特徴とする、請求項３３または３４のいずれかに記載の調製物。
【請求項３６】
少なくとも９０％の純度の酵素的に不活性な１本鎖のＸΔ因子アナログを含む、請求項３５記載の調製物。
【請求項３７】
少なくとも９５％の純度の酵素的に不活性な１本鎖のＸΔ因子アナログを含む、請求項３５記載の調製物。
【請求項３８】
生理学的に許容し得る担体を含み、安定に保存可能な形態で提供されることを特徴とする、請求項３３〜３７のいずれかに記載の調製物。
【請求項３９】
＿さらなる成分として血液因子または血液因子の活性された形態を含むことを特徴とする、請求項２０〜３８のいずれかに記載の調製物。
【請求項４０】
さらなる成分としてＶＩＩＩ因子バイパス活性を有する＿成分を含むことを特徴とする、請求項３９記載の調製物。
【請求項４１】
医薬組成物として製剤化されていることを特徴とする、請求項２０〜４０のいずれかに記載の調製物。
【請求項４２】
医薬品を製造するための、請求項２０〜４１のいずれかに記載の調製物の使用。
【請求項４３】
血友病の患者または阻害抗体が生じた血友病患者のような血液凝固疾患の患者の処置のための医薬品を製造するための、請求項２０〜４１のいずれかに記載の調製物の使用。
【請求項４４】
請求項１記載のＸΔ因子アナログを１本鎖の分子として単離し、クロマトグラフィー過程によって精製することを特徴とする、請求項２０記載の精製されたＸΔ因子アナログを含む調製物の製造方法。
【請求項４５】
以下の工程：
請求項１〜１７のいずれかに記載のＸΔ因子アナログをコードする核酸を用意すること、
適当な細胞のトランスフェクション、
ＸΔ因子アナログの発現、
１本鎖のＸΔ因子アナログの単離、および
ポリペプチドの精製
を含むことを特徴とする、請求項４４に記載の製造方法。
【請求項４６】
請求項４４また４５のいずれかにしたがって製造された調製物を、活性化工程に付すことを特徴とする、活性なＸａ因子アナログを含む調製物の製造方法。
【請求項４７】
１本鎖のＸΔ因子アナログを含む調製物を、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、およびＬＰＣ／ＰＣ７からなる群から選択されるエンドプロテアーゼ、またはＩＩａ因子、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子およびカリクレインからなる群から選択されるセリンプロテアーゼ＿から選択されたプロテアーゼと、２本鎖のＸａ因子アナログ形態への開裂を可能にする条件下で接触させることを特徴とする、請求項４６に記載の製造方法。
【請求項４８】
プロテアーゼが固定化されていることを特徴とする、請求項４７記載の製造方法。
【請求項４９】
不活性なＸΔ／Ｘａ因子アナログ中間体を＿含まない、高い安定性と構造上の統合性を有する精製されたＸａ因子アナログが得られることを特徴とする、請求項４５〜４８のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ａrg１８０からＡrg２３４までのアミノ酸が欠失し、Ｇly１７３およびＡrg１７９の間のアミノ酸配列の領域において修飾を有するＸΔ因子アナログ、本発明のＸΔ因子アナログまたはＸａ因子アナログを含む調製物、並びに本発明のＸΔ因子アナログを製造する方法に関する。
血液凝固過程の開始後、血液中の様々なプロ酵素（酵素原）の、その活性形態、例えばセリンプロテアーゼ、への逐次的活性化を経由する凝固カスケードが続く。特に、それらには、ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子、ＸＩ／ＸＩａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、およびプロトロンビン／トロンビンがある。それらの生理学的状態において、これら酵素の大部分は、複合体において膜表面と関連する場合にのみ活性である。Ｃaイオンがこれらの過程の多くに関与している。血液凝固は、すべてのタンパク質成分が血液中に存在する内因系過程か、組織因子が決定的な役割を担う外因系過程のいずれかによる。最後に、トロンビンにより、フィブリノーゲンがフィブリンに分解されて創傷が閉じる。
プロトロンビナーゼ複合体は、プロトロンビンからトロンビンへの活性化を担っている。トロンビンは、プロ凝固因子としても抗凝固因子としても働く重要な酵素である。プロトロンビナーゼ複合体は、特にＶａ因子（コファクターとしての）およびＸａ因子（セリンプロテアーゼとしての）が関与しており、リン脂質の表面でのＣａ依存性の会合において構築される。Ｘａ因子がプロトロンビナーゼ複合体の触媒的要素であるということが議論されている。
Ｘ因子（スチュワート・プロワー因子）は、内因系および外因系血液凝固カスケードによって活性化され得るビタミンＫ依存性凝固糖タンパク質である。Ｘ因子の一次翻訳産物（プレ−プロ−ＦＸ）は、４８８アミノ酸を有し、肝臓またはヒトヘパトーム細胞によって、最初に１本鎖の７５ｋＤ前駆体タンパク質として合成される。血漿において、Ｘ因子は、大部分が２本鎖の分子として存在している（Fairら, 1984, Blood 64: 194-204）。
生合成の間に、シグナルペプチダーゼによるプレ配列の切断（Ｓer２３／Ｌeu２４の間）およびプロペプチドの切断（Ａrg４０／Ａla４１の間）の後、１本鎖のＸ因子分子は、プロセシングとトリペプチドＡrg１８０−Ｌys１８１−Ａrg１８２の除去により、約２２ｋＤの軽鎖と約５０ｋＤの重鎖からなる２本鎖に開裂し、この２本鎖はジスルフィド結合により連結している（第１図）。したがって、Ｘ因子は、血漿中を２本鎖の分子として循環している。
血液凝固過程の間、Ｘ因子は、限定的なタンパク質加水分解により、不活性な酵素原から活性なプロテアーゼＸａ因子に変換されるが、ここで、Ｘ因子は２つの膜関連複合体のいずれかにおいてＸａ因子に活性化される：即ち外因系のＶＩＩａ組織因子複合体においてか、または内因系のＶＩＩＩａ因子−ＩＸａ因子−リン脂質−Ｃａ複合体、即ち“テンナーゼ複合体”において活性化される（Mertensら, 1980, Biochm. J. 185: 647-658）。アミノ酸Ａrg２３４／Ｉle２３５間のタンパク質加水分解による開裂は、重鎖のＮ末端から長さ５２アミノ酸の活性化ペプチドの放出をもたらし、活性な酵素Ｘａ因子が形成する。Ｘａ因子の触媒中心は重鎖に存在する。
ＶＩＩａ因子−ＴＦ（外因系）複合体による活性化は、複合体中のＶＩＩａ因子濃度が低ければ、Ｘａα因子（３５ｋＤ）およびＸａβ因子（３１ｋＤ）の形成をもたらし、同時に４２（ｋＤ）のポリペプチドも形成する。Ｘａα因子は、重鎖のＡrg２３４／Ｉle２３５での開裂によって形成し、Ｘ因子からＸａ因子への活性化を示す。Ｘａβ因子の出現は、恐らく、Ｘａα因子の重鎖のＣ末端におけるＡrg４６９／Ｇly４７０での自己触媒的開裂および４．５ｋＤペプチドの開裂から生じるものである。Ｘａα因子と同様に、Ｘａβ因子は触媒活性を有する。実際、プラスミノーゲンレセプター結合部位がＸａα因子のＸａβ因子への開裂によって形成されること、およびＸａβ因子が場合によりフィブリン分解活性を有するかまたはフィブリン分解にコファクターとして関与することが証明されている。しかし、Ｘａα因子からＸａβ因子への変換はトロンビンの形成よりも遅いので、血餅が形成する前にフィブリン分解の開始が阻止される（Pryzdialら, 1996, J. Biol. Chem. 271: 16614-16620; Pryzdialら, 1996, J. Biol. Chem. 271: 16621-16626）。
４２ｋＤポリペプチドは、その前のＡrg２３４／Ｉle２３５間のプロセシングなしに、Ａrg４６９／Ｇly４７０間の重鎖のＣ末端におけるプロセシングから生じる。Ｌys３７０でのタンパク質加水分解により形成したＸａγ因子フラグメントと同様にこの中間体は触媒活性を持たない（Mertensら, 1980, Biochem. J. 185: 647-658; Pryzdialら, 1996, J. Biol. Chem. 271: 16614-16620）。
内因系Ｘ因子活性化は、ＩＸａ因子−ＶＩＩＩａ因子複合体によって触媒される。同じプロセシング産物が活性化の間に得られるが、Ｘａβ因子産物が他のＸ因子プロセシング産物よりも大量に得られる（Jestyら, 1974, J. Biol. Chem. 249: 5614）。
インビトロでは、例えば、Ｘ因子はラッセルヘビ毒（ＲＶＶ）またはトリプシン（Bajajら, 1973, J. Biol. Chem. 248: 7729-7741）または精製された生理学的活性化因子、例えばＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体またはＩＸａ因子／ＶＩＩＩａ因子複合体など（Mertensら, 1980, Biochem. J. 185: 647-658）によって活性化される。
最も商業的に入手し得る血漿由来Ｘ因子製品はＸａα因子とＸａβ因子の混合物を含んでいる。なぜならば、Ｘ因子のＸａ因子への活性化の後にＸａα因子が主に形成し、次に、それが自己触媒的過程においてＸａβ因子に開裂するからである。
高い分子量統合性を有する均一なＸａ因子製品を製造するために、ＥＰ ０ ６５１ ０５４は、ＲＶＶによりＸ因子を活性化する時間を延長して、得られる最終産物が実質的にＸａβ因子を含むようにすることを示唆している。次に、副生成物、例えばＸａα因子並びにプロテアーゼを、いくつかのクロマトグラフィー工程により除去する。
Ｘ因子のｃＤＮＡは単離されており、特徴付けられている（Leytusら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 82: 3699-3702; Fungら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3591-3595）。ヒトＸ因子はインビトロで様々な種類の細胞、例えばヒト胚性腎細胞またはＣＨＯ細胞において発現している（Rudolphら, 1997, Prot. Expr. Purif. 10: 373-378, Wolf, 1991, J. Biol. Chem. 266: 13726-13730）。しかし、ヒトＸ因子の組換え発現では、インビボの状況とは異なり、Ａrg４０／Ａla４１でのプロセシングの効率が悪く、Ｘ因子の軽鎖は異なるＮ末端の形態であることが分かった（Wolfら, 1991, J. Biol. Chem. 266: 13726-13730）。組換えＸ因子（ｒＦＸ）は、インビトロでＲＶＶによりｒＸａ因子（ｒＦＸａ）に活性化されるか、またはｒＦＸａを直接発現させた。その活性化ペプチドは、２本鎖ｒＦＸａ形態へ直接プロセシングさせるためにアミノ酸１８３からアミノ酸２３４までが欠失しており、トリペプチドによって置換されている。精製したｒＦＸの約７０％が軽鎖と重鎖にプロセシングされたが、残りの３０％は７５ｋＤの１本鎖ｒＦＸを示した。ｒＦＸａの直接発現は、活性なＸａ因子の形成をもたらしたが、不活性な中間体も形成した。さらに、Wolfら（1991, J., Biol. Chem. 266: 13726-13730）は、組換えＸ因子の活性のさらなる減少を検出し、彼等はこれを、ＲＶＶによって活性化されるｒＦＸの能力がより低いということと、不活性なタンパク質および１本鎖の前駆体分子のポリペプチド集団に帰するとした。特に、彼等は、組換え細胞によって発現させたときのｒＦＸａの高い不安定性を見い出し、彼等はそれを、速い速度で起こる自己タンパク質分解に帰するとした。
Ｘａα因子のＣ末端ペプチドの機能を研究するため、Ebyら（1992, Blood 80（suppl. 1）: 1214 A）は、Ｘ因子配列のＧly４３０の位置に終止コドンを導入した。しかし、彼等は、β−ペプチドを有するＸａ因子（ＦＸａα）またはβ−ペプチド（ＦＸａβ）を有さない欠失突然変異体の活性化速度の間に違いは見い出さなかった。
Ｘａ因子は、プロトロンビナーゼ複合体の重要な成分であり、それゆえ急速な止血のための主要なメディエーターとして議論されているところであり、血液凝固疾患、例えば血友病を患っている患者の処置に適当であると思われる。
特に、血漿から製造された因子複合体による、ＶＩＩＩ因子またはＩＸ因子欠乏の血友病患者の処置は、長期間の治療におけるこれらの因子に対する阻害抗体の形成がしばしば厄介になる。それゆえ、バイパス活性を有する因子により血友病患者を処置する数多くの別法が開発されてきた。プロトロンビン複合体、部分的に活性化されたプロトロンビナーゼ複合体（ＡＰＰＣ）、ＶＩＩａ因子またはＦＥＩＢＡの使用が提唱されてきた。ＶＩＩＩ因子バイパス活性（ＦＥＩＢＡ）を有する市販の調製物は、例えばＦＥＩＢＡ▲Ｒ▼、またはＡｕｔｏｐｌｅｘ▲Ｒ▼である。ＦＥＩＢＡは、同等の単位のＩＩ因子、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子およびＦＥＩＢＡと、少量のＶＩＩＩ因子およびＶ因子、および痕跡量のトロンビンやＸａ因子またはＸ因子様活性を有する因子のような、活性化された凝固因子を含んでいる（Elsinger, 1982, Activated Prothrombin Concentrates. Mariani, Russo, Mandelli編, pp. 77-87）。Elsingerは特に、ＦＥＩＢＡにおける“Ｘａ因子様”活性の重要性を示している。動物モデルにおいて、精製されたＸａ因子とリン脂質の組合せに関して、Gilesら（1988, British J. Haematology 9: 491-497）によりＶＩＩＩ因子バイパス活性が示された。
したがって、Ｘ／Ｘａ因子またはＸ／Ｘａ様因子タンパク質は、単独でまたは凝固複合体の構成成分として、高い需要があり、血友病治療における適用の様々な分野で使用され得る。
インビボ並びにインビトロで、Ｘａ因子の半減期は、酵素原の半減期よりもかなり短かい。例えば、Ｘ因子は、グリセリン中で１８ヶ月安定に保存することができるが、Ｘａ因子は、同じ条件下で５ヶ月間しか安定ではなく（Bajajら, 1973, J. Biol. Chem. 248: 7729-7741）、４℃のグリセロール中では８ヶ月後に６０％以上の活性の減少を示した（Tengら, 1981, Thorombosis Res. 22: 213-220）。血清中のＸａ因子の半減期は３０秒に過ぎない。
Ｘ因子は不安定なので、Ｘ因子調製物の投与が示唆された（米国特許第４，５０１，７３１号）。しかし、出血が患者が死亡するかもしれないほど深刻である場合、特に血友病の場合は、Ｘ因子の投与は効果がない。なぜなら、血液凝固の内因系経路において機能する“テンナーゼ複合体”の欠失のために、Ｘ因子はＸａ因子に十分に活性化され得ず、外因系経路を経由する活性化は迅速な効果を示すにはあまりにも遅いことがしばしばであるからである。さらに、血友病患者は、十分な量のＸ因子を有しているはいるが、Ｘ因子のプロトロンビナーゼ活性は、Ｘａ因子の活性よりも１０００倍も低い。そのような場合では、活性化されたＸａ因子を、場合によってはGilesら（1988, British J. Haematology 9: 491-497）に記載されている様にリン脂質と組み合わせて、または他の凝固因子、例えばＶＩＩＩ因子バイパス活性と組み合わせて直接投与することが必要である。
Ｘ因子からのＸａ因子の製造において、活性化は、これまでＲＶＶまたはトリプシンなどの動物起源の非生理学的活性化因子によって行われており、最終産物が完璧にこれらのプロテアーゼを含んでいないことを完全に確認することが必要であった。上述したように、Ｘ因子がＸａ因子に活性化されるとき、そのいくつかは不活性である非常に数多くの中間体が形成する（Bajajら, 1973, J. Bio. Chem. 248: 7729-7741; Mertensら, 1980, Biochem. J. 185: 647-658）。そのような中間体の存在は、生成物の比活性の減少をもたらし、活性なセリンプロテアーゼアンタゴニストとして機能し得る中間体を生成し得る。したがって、慣用の方法に従う、高い比活性を有する均一で純粋な生成物の製造は、活性化の複雑な過程とクロマトグラフィーによる精製を必要とする。
したがって、本発明の目的は、高い安定性を示し、一般のプロテアーゼのいずれか、特にＲＶＶまたはトリプシン等の動物起源のプロテアーゼを使用することなく、Ｘａ因子に活性化することができるＸ／Ｘａ因子活性を有するポリペプドを含む調製物を提供することである。もう１つの目的は、ＶＩＩＩバイパス活性を有する医薬調製物を提供することである。
本発明によれば、Ｘ因子アミノ酸配列のアミノ酸Ａrg１８０からＡrg２３４が欠失し、Ｇly１７３からＡrg１７９の間のアミノ酸配列の領域においてこのＸ因子欠失突然変異体の修飾を有するＸ因子アナログを提供することによってその目的は達成される。Ａrg１８０からＡrg２３４までのアミノ酸配列の欠失によって、トリペプチドＡrg１８０〜Ａrg１８２並びに活性化ペプチドＳer１８３〜Ａrg２３４が欠失し、Ｘ因子の軽鎖および重鎖とアミノ酸Ａrg１７９およびＩle２３５が直接融合する。しかし、この融合配列は、プロテアーゼのための天然の開裂部位は含んでいない。アミノ酸Ｇly１７３からＡrg１７９の間、所望によりＩle２３５までの間のＸ因子配列の領域の修飾によって本発明のＸ因子欠失突然変異体が得られるが、この変異体は、普通この位置でポリペプチドを開裂しないであろうあるプロテアーゼのための、そのポリペプチドのこの位置にはなかったような新規の検出およびプロセシング部位を有する。前記修飾は、少なくとも、Ｘ因子アミノ酸配列のＧly１７３からＡrg１７９までの間、所望によりＩle２３５までの間の少なくとも１つのアミン酸の交換である。アミノ酸の位置は、Ｍet１から始まりＬys４８８で終わる第１図に示した配列の番号付けを意味する。名称を単純にするため、完全なＸ因子配列に付けたアミノ酸番号は、本発明にしたがって飾飾されたＸ因子欠失突然変異体と一致させるが、前記修飾されたＸ因子欠失突然変異体を以下、ＸΔ因子アナログということとする。
この修飾は、少なくとも１つのアミノ酸の置換、またはプロテアーゼ認識または開裂部位を示しているペプチド配列の挿入である。本発明のＸΔ因子アナログにおいては、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７（Barrら, Cell 66: 1-3または米国特許第５，４６０，９５０号に記載されているような）等のエンドプロテアーゼ、ＩＩａ因子、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子またはカリクレイン等のセリンプロテアーゼ、またはこれらのプロテアーゼの誘導体の群に由来するプロテアーゼの認識および開裂配列を示すような修飾が好ましい。
好ましくは、この修飾は、これらプロテ−アーゼの１つによるプロセシングがその生物学的活性において天然のＸａ因子に対応するポリペプチドを導き、Ｘａ因子活性を示す様に選択する。最適なプロセシングのために、個々の場合においてアミノ酸Ｉle２３５を交換することが必要であるかもしれない。
しかし、好ましくは、重鎖のＮＨ2−末端アミノ酸イソロイシンが、活性化後も依然として維持されていることが好ましい。なぜならば、イソロイシンは、基質結合ポケットの形成において本質的な機能を発揮するアミノ酸の１つであるからである（Watzkeら, 1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, Katherine High & Harold Roberts編）。本発明のＸΔ因子アナログは、特にアミノ酸レベルで、天然のＸ因子配列と比較して構造上の違いを示しているけれども、活性化の後で、それらの活性は天然のＸ因子またはＸａ因子の活性とそれぞれ同等である。
本発明は典型的には、欠失している、さらにＧly１７３からＡrg１７９までの間、所望によりＩle２３５までの間の修飾を有する、数多くのＸΔ因子アナログを提供する。第１図にしたがってＭet１からＬys４８８まで番号付けられたＸ因子配列に基づいて、アミノ酸Ｇly１７３からＡrg１７９までの間、および所望によりＩle２３５までの間の領域において、１またはそれ以上の位置での修飾があり得る。アミノ酸置換は、Ｉle２３５（Ｒ１）、Ａrg１７９、Ｇlu１７８（Ｒ２）、Ｌeu１７７（Ｒ３）、Ｔhr１７６（Ｒ４）、Ｇln１７５（Ｒ５）、およびＬys１７４（Ｒ６）があり得るが、Ａrg１７９については、変化させずに残すのが好ましい。
好ましくは、本発明のＸΔ因子アナログは、Ｇly１７３−Ｒ６−Ｒ５−Ｒ４−Ｒ３−Ｒ２−Ａrg１７９−Ｒ１
［ここで、
Ｒ１＝Ｉle、Ｖal、Ａla、ＳerまたはＴhr；
Ｒ２＝Ｇlu、Ｔhr、Ｐro、Ｇly、ＬysまたはＡrg；
Ｒ３＝Ｌeu、Ｐhe、Ｌys、Ｍet、Ｇln、Ｓer、Ｖal、ＡrgまたはＰro；
Ｒ４＝Ｔhr、Ａsn、Ａsp、Ｉle、Ｓer、Ｐro、ＡrgまたはＬys；
Ｒ５＝Ａsn、Ｌys、Ｓer、Ｇlu、Ｇln、Ａla、ＨisまたはＡrg；および
Ｒ６＝Ａrg、Ａsp、Ｐhe、Ｔhr、ＬeuまたはＳer］
を有するＸ因子配列を含んでいる。
本発明のＸ因子アナログの好ましい態様は、以下の修飾を有するＸ因子アナログである。
ａ）Ｒ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ｔhr、Ｒ３＝Ｌeu、Ｒ４＝Ａsn、および所望によりＲ５＝Ａsnおよび／またはＲ６＝Ａspであり、ＶＩＩａ因子またはＩＸａ因子によりプロセシングされる；
ｂ）Ｒ１＝Ｖal、Ｒ２＝Ｔhr、Ｒ３＝Ｐhe、Ｒ４＝Ａsp、および所望によりＲ５＝Ａsnおよび／またはＲ６＝Ｐheおよび／またはＲ１＝ＩleまたはＶal（第２Ａ図）であり、ＸＩａ因子によりプロセシングされる；
ｃ）Ｒ１＝ＩleまたはＶal、Ｒ２＝Ｐhe、Ｒ３＝Ｌys、Ｒ４＝Ｉle、および所望によりＲ５＝Ｌysおよび／またはＲ６＝Ｔhr（第２Ｃ図）、またはＲ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ｔhr、Ｒ３＝Ｓer、Ｒ４＝Ｔhr、および所望によりＲ５＝Ｌysおよび／またはＲ６＝Ｔhr（第２Ｉ図）であり、ＸＩＩａ因子によりプロセシングされる；
ｄ）Ｒ１＝ＩleまたはＶal、Ｒ２＝Ｔhr、Ｒ３＝Ｍet、Ｒ４＝Ｓer、および所望によりＲ５＝Ｓerおよび／またはＲ６＝Ｌeu（第２Ｄ図）であり、カリクレインによりプロセシングされる；
ｅ）Ｒ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ｇly、Ｒ３＝Ｇln、Ｒ４＝Ｐro、および所望によりＲ５＝Ｌysおよび／またはＲ６＝Ｓer（第２Ｈ図）、またはＲ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ｇly、Ｒ３＝Ｇlu、Ｒ４＝Ｉle（第２Ｆ図）、またはＲ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ｔhr、Ｒ３＝Ｌys、Ｒ４＝Ｍet（第２Ｅ図）であり、Ｘａ因子によりプロセシングされる；
ｆ）Ｒ１＝Ｉle、Ｒ２＝Lys、Ｒ３＝Ａrg、Ｒ４＝Ａrg、および所望によりＲ５＝Ｇluおよび／またはＲ６＝Ｌeu、または
Ｒ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ｔhr、Ｒ３＝Ｖal、Ｒ４＝Ａrg、および所望によりＲ５＝Ａlaおよび／またはＲ６＝Ｌeu、または
Ｒ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ａrg、Ｒ３＝Ｖal、Ｒ４＝Ａrg、および所望によりＲ５＝Ｇlnおよび／またはＲ６＝Ｌeu、または
Ｒ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ａrg、Ｒ３＝Ａrg、Ｒ４＝Ａrg、および所望によりＲ５＝Ｈisおよび／またはＲ６＝Ｌeu、または
Ｒ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ｌys、Ｒ３＝Ｐro、Ｒ４＝Ａrg、および所望によりＲ５＝Ａsnおよび／またはＲ６＝Ｌeu、または
Ｒ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ｌys、Ｒ３＝Ａrg、Ｒ４＝Ｉle、および所望によりＲ５＝Ａrgおよび／またはＲ６＝Ｌeu、または
Ｒ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ｌys、Ｒ３＝Ｓer、およびＲ４＝Ａrg、または
Ｒ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ｔhr、Ｒ３＝Ｖal、およびＲ４＝Ａrg、または
Ｒ１＝Ｉle、Ｒ２＝Ｌys、Ｒ３＝Ｌeu、およびＲ４＝Ａrg（すべて２Ｇ図参照）
ｆ）に記載した配列は二塩基性（dibasic）のエンドプロテアーゼ、例えばケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７またはこれらのプロテアーゼの誘導体によってプロセシングされる。
第２図は、変化したプロテアーゼ特異性を導く、修飾およびアミノ酸交換の可能な選択を示している。
修飾は、例えば特異的インビトロ突然変異誘発またはＰＣＲまたは特定のアミノ酸の変化についてＤＮＡ配列を特異的に変化させるために適当である当業者に知られている遺伝子操作の他の方法によって行うことができる。
本発明によれば、本発明のＸΔ因子アナログは、好ましくは、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７等のエンドプロテアーゼ、ＩＩａ因子、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子またはカリクレイン等のセリンプロテアーゼ、またはこれらのプロテアーゼの誘導体の群から選択されたプロテアーゼによってＸａ因子アナログに活性化される。
本発明のＸΔ因子アナログは、酵素的に不活性な形態では、１本鎖ポリペプチドとして存在する。活性なＸａ因子アナログは、プロテアーゼによる２本鎖形態への開裂によってのみ得られる。このように、修飾によって、不活性な１本鎖ＸΔ因子アナログポリペプチドの２本鎖の活性な形態への活性化が可能になる。
活性なＸａ因子の製造における困難性の１つは、その不安定性である。なぜならば、自己触媒作用によってＸａα因子およびＸａβ因子以外の他の不活性な中間体を生じるからである。
それゆえ、本質的に完全な、活性なＸ／Ｘａ因子およびＸ／Ｘａ様分子のそれぞれの製造のために、安定な最終生成物としてそのようなタンパク質のみを得ることが望ましいであろう。
Ｘａα因子（ＦＸａα）からＸａβ因子（ＦＸａβ）へのプロセシングのための好ましい開裂部位はＡrg４６９／Ｇly４７０の間であることはよく知られている。Ebyら（1992, Blood. Vol. 80, suppl. 1, 1214）による研究に基づけば、Ｘ因子のプロミネントなカルボキシ末端ペプチド（アミノ酸残基４７６〜４８７）の隣りに、Ｘａα因子の自己触媒作用により形成される別の、より短かいペプチド（アミノ酸残基４７４〜４７７）が見い出される。不活性なプロセシング中間体を得ることなく、完全なＸ因子の本質的に活性なＸａ因子への特異的プロセシングに焦点を当てるため、本発明のＸΔ因子アナログは所望によりさらなる修飾を有している。
それゆえ、特定の態様によれば、本発明のＸΔ因子アナログは、さらに１つの修飾をＸ因子アミノ酸配列のＣ末端領域に有している。
１つの態様によれば、上記のＸΔ因子アナログは、完全なβ−ペプチドを有する（ＦＸΔａ）。本発明のＸΔ因子アナログは特に、ＸΔ因子からＸａ因子アナログへの活性化の後のＸ因子からのβ−ペプチドの開裂を阻止する、Ｃ末端のβ−ペプチド開裂部位の領域において修飾を有する。このように、完全なＸａα因子分子として１００％まで単離し得るＸａ因子分子が得られる。
この修飾は、アミノ酸番号Ａrg４６９とＳer４７６の間、所望によりＬys３７０までの間のＸ因子アミノ酸配列の領域における、突然変異、欠失または挿入であり得る。しかし、アミノ酸の置換は、そのポリペプリドがアミノ酸変化の結果として折り畳まれるのを阻止するような置換が好ましい。折り畳みは、構造に影響を及ぼし、タンパク質の機能と活性に影響するかもしれない。
１つの態様によれば、本発明のＸΔ因子アナログは、Ａrg４６９および／またはＧly４７０の位置のアミノ酸の１つが交換されており、Ａrg４６９は好ましくはＬys、ＨisまたはＩleに交換され、Ｇly４７０は好ましくはＳer、Ａla、ＶalまたはＴhrに交換される。
Ａrg４６９および／またはＧly４７０における突然変異以外に、本発明のＸΔ因子アナログは、さらにＬｙｓ３７０および／またはＬｙｓ４７５および／またはＳer４７６に突然変異を有し得る。この（これらの）位置でのアミノ酸置換は、カルボキシ末端ペプチドの副次的な（occasional）自己触媒的開裂が不可能になるように天然の配列が修飾されているので、Ｘａα因子アナログのＸａβ因子アナログへのまたはＣ末端が切り取られたＸａ因子アナログへのプロセシングがそれぞれ阻止される。
異なる態様によれば、本発明のＸ因子アナログは、カルボキシ末端のβ−ペプチドが欠失している（ＦＸΔβ）。そのようなＸ因子アナログは、ＸΔ因子アナログをコードしているｃＤＮＡを組換え発現系において発現させ、アミノ酸Ｍet１からＡrg１７９／Ｉle２３５からＡrg４６９をコードする配列のみをクローニングすることによって製造することができる。
さらなる態様によれば、本発明のＸΔ因子アナログは、Ｘ因子配列のＣ末端領域に翻訳終止シグナルを有する。この翻訳終止シグナルは、好ましくは、自然なプロセシングの後で形成するＣ末端アミノ酸の後に続く位置に存在する。したがって、翻訳終止シグナルは、好ましくはＸ因子配列のアミノ酸４７０の位置にあり、その結果、ＸΔβ因子の末端のＡrg４６９が保持される。このため、アミノ酸Ｇly４７０をコードするＧＧＣのコドンを、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡに置換する。
本発明の別の態様は、インビトロで適当なプロテアーゼで処理することによりＸａ因子アナログ、即ち活性化ＸΔ因子アナログに活性化される、ＸΔ因子アナログに関する。使用され活性化されるＸΔ因子アナログに依存して、天然のＸａ因子配列と比べて、軽鎖のＣ末端に、対応したアミノ酸修飾を有するＸaΔ因子アナログが得られる。しかし、本発明によれば、それらの修飾は、生物学的活性に不利な影響を及ぼさないように選択される。
そのようなＸ因子アナログが、さらにβ−ペプチドのＣ末端領域に翻訳終止シグナルを有する場合、修飾されたＸａβ因子分子が得られる。しかし、開裂しないβ−ペプチドを生じるβ−ペプチド配列内の修飾を有するＸ因子アナログを使用するならば、その分子のＣ末端領域においてアミノ酸交換を有するＸａα因子アナログが得られる。
本発明のＸΔ因子アナログは、活性化される能力について特異性を変化させる修飾のみを有し、活性には有意な影響を及ぼさない。したがって、いずれの場合も、生物学的におよび機能的に活性なＸａ因子分子またはＸａ因子アナログがそれぞれ得られる。
インビトロの活性化は、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７等のエンドプロテアーゼ、ＩＩａ因子、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子またはカリクレイン等のセリンプロテアーゼ、またはこれらのプロテアーゼの誘導体の群から選択されるプロテアーゼによって行うことができる。本発明のＸΔ因子アナログをＸａ因子アナログへプロセシングするのに適当である限り、ＲＶＶまたはトリプシンを除くいずれのプロテアーゼを使用することも本発明の範囲内である。
例えば、Wolfら（1991, J. Biol. Chem. 266: 13726-137309）は、Ｋｅｘ２、フリンまたはＰＡＣＥ等のエンドプペプチダーゼが、このグループによって記載されたＸａ因子欠失突然変異体のプロセシングに関与すると推測はしているけれども、Ｘ因子のプロセシングにおけるこれらプロテアーゼのうちの１つの影響に関するヒントは与えていない。同様に、米国特許第５，６６０，９５０号は、ＰＡＣＥの組換え製造およびビタミンＫ依存性タンパク質のプロセシングを改善するためのプロテアーゼの使用を記載している。血液因子の長いリストに、Ｘ因子が言及されているが、この記述を証明するデータは記載されていない。
本発明は、Ｘ因子の成熟過程に必要なプロテアーゼが二塩基性のエンドプロテアーゼ、特に内因系フリンであることをはじめて明白に実証する。インビボでは、エンドプロテアーゼは、おもに１本鎖のＸ因子分子の、重鎖および軽鎖からなる成熟形態への開裂に関与する。インビトロでは、Ｘ因子プロペプチド配列の開裂も媒介する（実施例２）。
特定の態様によれば、１本鎖の分子として精製された形態で好ましく存在するＸΔ因子アナログが提供される。修飾された領域に、組換え細胞には存在しないプロテアーゼのための開裂部位を有するＸΔ因子アナログは、１本鎖分子として発現させた後に得られる。１本鎖のＸΔ因子分子は特に、高い安定性と分子統合性で特徴付られる。これまで、１本鎖の、不活性なＸΔ因子分子は、精製された形態に単離することができなかった。なぜならば、組換え細胞においてＸａ因子と数多くの他のそして不活性な中間体にプロセシングされるからである（Wolfら, 1991, J. Biol. Chem. 266: 13726-13730）。単離された１本鎖のＸΔ因子アナログは、特異的なプロセシングによって２本鎖のＸａ因子アナログ形態に直接活性化し得る。これは、組換え細胞から単離された１本鎖のＸΔ因子分子を、ＸΔ因子アナログに存在する活性化部位を開裂するプロテアーゼと接触させることにより行うことができる。例えば、フリン活性化部位を有するＸΔ因子アナログがフリン欠損細胞において発現したら、それを１本鎖のＸΔ因子アナログとして単離し、フリン／ＰＡＣＥまたはＫｅｘ２等の二塩基性プロテアーゼと接触させることにより活性な２本鎖のＸΔａ因子アナログにプロセシングすることができる。セリンプロテアーゼまたはカリクレインのためのプロセシング部位を有するＸΔ因子アナログもまた、フリン発現細胞において１本鎖の分子として単離した後、セリンプロテアーゼによって活性なＸａ因子アナログにプロセシングすることができる。
選択的および特異的なプロセシング反応のために、得られたＸａ因子アナログは、高い安定性と構造上の統合性を有し、特に、不活性なＸ／Ｘａ因子アナログ中間体および自己タンパク質分解による分解産物を含まない。
本発明によれば、本発明のＸΔ因子アナログは完全なβ−ペプチドを有するＸΔａ因子の形態並びにβ−ペプチドを欠失したＸΔ因子アナログの形態で提供される。
本発明の別の態様は、本発明のＸΔ因子アナログをコードする組換えＤＮＡに関する。この組換えＤＮＡは、発現後に、Ａrg１８０からＡrg２３４までのアミノ酸の欠失、および完全なβ−ペプチドを有する並びにβ−ペプチドが欠失した活性なＸａ因子アナログの両方へのプロセシングを可能にする修飾以外は、ヒトのＸ因子に対応したアミノ酸配列を有するＸΔ因子アナログを生じる。
本発明のさらなる態様は、Ａrg１８０からＡrg２３４までのアミノ酸が欠失し、Ｇly１７３からＡrg１７９の間、所望によりＩle２３５までの間の領域におけるアミノ酸の修飾を有する、精製されたＸΔ因子アナログを含む調製物に関する。この修飾によって、ポリペプチドにおけるこの位置に天然には存在しない、この位置でそのポリペプチドを通常はプロセシングしないあるプロテアーゼのための新規の認識または開裂部位が生じる。この調製物は、１本鎖のＸΔ因子アナログを含む精製された調製物であり得、そのポリペプチドが培養細胞上清または培養細胞抽出液のいずれかから単離した後で培養細胞系から得られる。培養細胞系から精製された組換えＸΔ因子アナログは、当分野で知られた方法によってさらに精製することができる。ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法は、この目的のために特に有用である。
１つの態様によれば、本発明の調製物は、酵素的に不活性な形態の１本鎖としてのＸΔ因子アナログを含み、ＸΔ因子アナログは少なくとも８０％の純度、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％の純度を有し、精製された調製物はＸ／Ｘａ因子アナログの不活性な、タンパク質加水分解による中間体を含まない。
特定の態様によれば、調製物は、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７等の二塩基性エンドプロテアーゼ、ＩＩａ因子、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子またはカリクレイン等のセリンプロテアーゼ、またはこれらプロテアーゼの誘導体からなる群から選択されるプロテアーゼのうちの１つによるＸａ因子アナログへの活性化を可能にする修飾を有する１本鎖のＸΔ因子アナログを含む。活性化は、ＸΔ因子アナログを、修飾配列において開裂しそれによりＸａ因子アナログが得られる適当なプロテアーゼと接触させることにより行うことができる。
本発明による製造では、ＸΔ因子アナログは、完全なβ−ペプチドを有するＸΔα因子（ＦＸΔα）としてか、またはβ−ペプチドが欠失または他のＣ末端が欠失しているＸΔβ因子として存在し得る。
さらなる態様によれば、本発明の調製物はＸΔ因子アナログを、好ましくは単離された形態の１本鎖の分子として含む。このため、ＸΔ因子アナログは、例えば、組換え的製造により、インビトロでＸａ因子アナログへの活性化を可能にする１つの修飾を有する１本鎖の分子として得られる。ＸΔ因子アナログのＸａ因子アナログへの活性化は、Ｘ因子アナログを、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７等の二塩基性エンドプロテアーゼ、ＩＩａ因子、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子またはカリクレイン等のセリンプロテアーゼ、またはこれらプロテアーゼの誘導体からなる群から選択されるプロテアーゼと接触させることによって行うことができる。プロテアーゼは担体に固定化することができる。
本発明の調製物は、Ｘａ因子アナログの製造および回収のための出発物質として供することができる。大規模な製造については、１本鎖のＸΔ因子アナログを含む調製物を、所望によりＸΔ因子アナログのＸａ因子アナログへの最適な活性化を可能にする条件下で固定化したプロテアーゼと接触させて、Ｘａ因子アナログを得ることができる。次に、回収されたＸａ因子アナログを一般に知られた方法により精製し、Ｘａ因子活性を有する医薬組成物に製剤化することができる。
本発明のさらなる態様によれば、高い安定性と構造上の統合性を有するＸａ因子アナログを含む調製物が提供され、これは特に不活性なＸ／Ｘａ因子アナログ中間体と自己タンパク質分解による分解産物を含まない。上で定義したタイプのＸΔ因子アナログを活性化し、対応する調製物を製造することにより得ることが可能である。
特定の態様によれば、精製された、１本鎖のまたは２本鎖のＸΔ因子アナログを含む調製物は、生理学的に許容し得る担体を含み、所望により医薬調製物として製剤化する。従来一般的な方法にしたがって製剤化することができ、ＮaＣl、ＣaＣl2等の塩を含む緩衝剤、およびグリシンおよび／またはリシン等のアミノ酸と、６〜８の範囲のpＨで混合し、医薬調製物として製剤化することができる。Ｘ因子アナログを含む精製された調製物は、保存可能な製品として、既製の溶液として、最終的な使用まで凍結乾燥または急速冷凍された製品として提供し得る。好ましくは、調製物を凍結乾燥された形態で保存し、適当な再構成溶液で視覚的に透明な溶液に溶解する。
しかしながら、本発明の調製物は、液体の調製物または急速冷凍した液体の形態としても提供しうる。
本発明の調製物は、特に安定である。即ち、適用するまで長期間溶解させた形態で置くことができる。本発明の調製物は数時間から数日の間、活性の損失がない。
本発明の調製物は、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７等のエンドプロテアーゼ、ＩＩａ因子、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子またはカリクレイン等のセリンプロテアーゼ、またはこれらプロテアーゼの誘導体からなる群から選択されるプロテアーゼと組み合わせて、適当な装置中で、好ましくはアプリケーションデバイス中で製造することができる。
ＸΔ因子アナログを、ＸΔ因子アナログをＸａ因子アナログに活性化することができるプロテアーゼと組み合わせて含む本発明の調製物は、場合により、固定化されたプロテアーゼを充填した小さいカラムの形態またはシリンジの形態の、担体に固定化されたプロテアーゼを含む容器と、ＸΔ因子アナログを含む医薬調製物を含む容器からなる、組み合わせ調製物として提供し得る。ＸΔ因子アナログの活性化のために、例えば、ＸΔ因子アナログを含む溶液を固体化されたプロテアーゼに通す。調製物を保存する間は、ＸΔ因子アナログを含む溶液を固定化されたプロテアーゼから離しておくのが好ましい。本発明の調製物は、プロテアーゼと同じ容器中に存在していてもよいが、成分については、容易に取り外してその製品を使用することができる不透性の隔壁により空間中で分離する。溶液を個々の容器内で保存し、適用する直前に接触させることもできる。
特定の態様では、活性化に使用するプロテアーゼは、自然界で血液凝固に関与している、ＸＩＩａ因子のようなセリンプロテアーゼであり、これは適用する前に活性化されたＸａ因子アナログから分離する必要はなく一緒に適用することができる。
ＸΔ因子アナログは、使用する直前、即ち患者に適用する直前にＸａ因子アナログに活性化することができる。固定化されたプロテアーゼと接触させることによりまたは一方でプロテアーゼを含む溶液と、他方でＸΔ因子アナログを含む溶液とを混合することにより、活性化を行うことができる。このように、２つの成分を溶液中で別々に保ち、通過しながら成分がお互いに接触し、ＸΔ因子アナログをＸａ因子アナログに活性化させる適当な装置によって混合することが可能である。患者にはＸａ因子と、活性化を引き起こした別のセリンプロテアーゼの混合物が投与される。内因系のＸ因子は、セリンプロテアーゼのさらなる投与によって活性化され、それが凝固時間の短縮を引き起こし得るので、特に、投与量に関しては注意を払わなければならない。
好ましい態様によれば、医薬調製物は、適当な装置中、好ましくはアプリケーションデバイス中で、凍結された液体または凍結乾燥した形態のいずれかで提供される。適当なアプリケーションデバイスは、ＡＴ ３６６ ９１６またはＡＴ ３８２ ７８３に記載されているようなダブルコンパートメントのシリンジであってよい。
本発明のさらなる態様によれば、本発明の調製物は、所望により、酵素原の形態の血液因子または活性なセリンプロテアーゼをさらなる成分として含んでいる。好ましいさらなる成分は、ＦＥＩＢＡ活性を有する成分である。なかでも、特に、ＩＩ因子、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｖ因子および／またはそれらの活性なセリンプロテアーゼである。リン脂質、Ｃaイオンなどもさらなる成分となり得る。本発明の特定の態様によれば、本発明の調製物は、ＦＥＩＢＡ活性を有する少なくとも１つのさらなる成分を含んでいる。
本発明の調製物は、Ｘａ因子活性を単一の成分として、または複数の成分の調製物として他の因子と組み合わせて有する医薬調製物として提供し得る。
医薬調製物に処理する前に、精製したタンパク質を通常の品質管理に付して、治療上投与可能な形態にする。組換え調製物では、精製した調製物を特に、好ましくは、ＥＰ ０ ７１４ ９８７に記載の方法にしたがって、細胞および発現ベクター由来の核酸の不在について試験する。
原則として、いかなる生物学的物質も感染性の微生物で汚染され得るので、安全な調製物を製造するため、調製物に所望によりウイルスの不活化または減少のための処理を施す。
本発明のさらなる態様は、医薬品の製造における上記の調製物の使用である。本発明のＸΔ因子アナログおよび対応して活性化されたＸ因子アナログを含む医薬は、血友病に苦しむ患者または投与された治療剤に対する例えばＶＩＩＩ因子またはＩＸ因子に対する阻害抗体が出現している患者のような、血液凝固疾患を患っている患者の処置に特に有用である。
本発明のさらなる態様は、本発明のＸΔ因子アナログを製造する方法およびＸΔ因子アナログを含む調製物を製造する方法に関する。ＸΔ因子アナログをコードする配列を、適当な発現系に挿入し、適当な細胞を組換えＤＮＡでトランスフェクトする。好ましくは、ＸΔ因子アナログを発現する永久細胞系を樹立する。細胞を遺伝子発現にとって最適な条件下で培養し、Ｘ因子アナログを培養細胞抽出液または培養細胞上清のいずれかから単離する。組換え分子を、アニオンまたはカチオン交換、アフィニティーまたはイムノアフィニティークロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせ等の、誰もが知っているクロマトグラフィー法によってさらに精製する。
本発明のＸΔ因子アナログの製造に関しては、Ｘ因子をコードしている全ｃＤＮＡを発現ベクター中でクローニングする。これは、一般的に知られているクローニング技術によって行う。次に、Ｘ因子をコードするヌクレオチド配列を修飾し、アミノ酸Ａrg１８０からＡrg２３４をコードする配列が欠失し、Ｇly１７３からＡrg１７９の間、所望によりＩle２３５まで間の領域のアミノ酸配列が修飾されて上記のＸΔ因子分子を産生し得るようにする。これは、インビトロ突然変異誘発、配列の欠失等の当技術分野で知られた遺伝子操作技術、例えば、エンドヌクレアーゼによる制限消化および他の配列の挿入、配列の変更、またはＰＣＲにより行う。次に、このように製造されたＸΔ因子突然変異体を組換え発現に適当な発現系へ挿入し、発現させる。
本発明のＸΔ因子アナログは、化学合成によっても製造することができる。
ＸΔ因子アナログは、好ましくは組換え発現によって製造する。それらは、例えば、永久細胞系またはウイルス発現系のような、いずれかの一般的な発現系による遺伝子操作によって製造することができる。永久細胞系は、外来ＤＮＡの、例えば、ｖｅｒｏ、ＭＲＣ５、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、Ｓｋ−Ｈｅｐ１、特に肝臓および腎臓細胞といった宿主細胞染色体への安定な取りこみによって、または、例えばパピローマウイルスに由来するエピソームベクターによって製造することができる。例えば、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスまたはレトロウイルス系のようなウイルス発現系もまた使用することができる。細胞系としては、ｖｅｒｏ、ＭＲＣ５、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、Ｓｋ−Ｈｅｐ１、腺、肝臓および腎臓細胞が一般に使用される。真核発現系、酵母、内因性の腺（endogenous gland）（例えばトランスジェニック動物の腺）および他の種類の細胞も使用できる。勿論、トランスジェニック動物を本発明のポリペプチドまたはその誘導体の発現に使用することもできる。組換えタンパク質の発現には、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ-細胞は、特に有用であることが分かっている（Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77: 4216-4220, 1980）。
本発明のＸΔ因子アナログの組換え製造のために、原核発現系も使用することができる。E. coliまたはB. subtilisにおいて発現可能な系は、特に有用である。
ＸΔ因子アナログを、適当なプロモーターの制御下で、それぞれの発現系において発現させる。真核生物における製造には、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＨＳＶ、ＥＢＶ、β−アクチン、ｈＧＨ等の誰もが知っているプロモーターまたは、例えばｈｓｐまたはメタロチオネインプロモーター等の導入可能なプロモーターが適当である。Ｘ因子アナログは、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ-細胞においてβ−アクチンプロモーターの制御下で好ましく発現する。
本発明の態様によれば、本発明の調製物を製造する方法は、以下の工程を含む：ＸΔ因子アナログをコードするＤＮＡの提供、組換えＤＮＡによる細胞の形質転換、所望によりプロテアーゼの存在下でのＸ因子アナログの発現、Ｘ因子アナログの単離、および所望によるクロマトグラフィー法による精製。
製造方法の態様によれば、Ｘａ因子アナログを２本鎖の分子として直接単離する。フリン等の二塩基性プロテアーゼによるプロセシングを可能にする修飾を有するＸΔ因子アナログを細胞において発現させ、ＸΔ因子アナログを２本鎖のＸａ因子アナログにプロセシングする。細胞は、好ましくは、プロセシング可能なプロテアーゼ、例えばフリン等の二塩基性のプロテアーゼまたはその誘導体を発現する細胞が好ましい。プロセシング効率を改善または増強するために、細胞を所望により、そのプロテアーゼ発現が増強されるよう改変することができる。例えば、これは、フリン／ＰＡＣＥ、Ｋｅｘ２のような対応する二塩基性エンドプロテアーゼまたはその誘導体の同時発現により行うことができる。本発明のＸΔ因子アナログは、２本鎖の活性な形態への不完全なプロセシングをもたらす正常な内因系プロテアーゼ濃度、即ち、プロセシングにとって最適下の濃度、を有する細胞においても発現させることができる。この場合、１本鎖のＸ因子アナログが上記の培養細胞上清へ分泌すれば、次に、プロテアーゼ発現細胞による共生培養によって、または所望により固定化したプロテアーゼと接触させることにより、Ｘａ因子アナログへのプロセシングを行う。担体上に結合したプロテアーゼを有する担体マトリックスへ細胞上清をポンプで送り、２本鎖のＸａ因子アナログを溶出液中で得ることもできる。
次に、このようにして得られたＸａ因子アナログは、上記のように、単離し、精製し、および所望により医薬組成物として製剤化し、さらに使用するまで安定に保存することができる。反応および活性化を行うための反応条件は、実験の構成と与えられた基本的条件にしたがって当業者が容易に至適化できる。接触時間については、本反応物の流速は特に重要である。０．０１ｍL／分および１ｍL／分の間である。さらに、重要なパラメーターは、温度、pＨ値および溶出条件である。通過させた後、Ｘａ因子アナログを所望により、選択的クロマトグラフィーによりさらに精製することができる。担体、好ましくはクロマトグラフィーカラムを使用すれば、その反応の構成によるさらなる精製工程が可能となるので、担体に結合したプロテアーゼによって反応過程を行うのは特に有利である。
ある態様によれば、活性化は、プロテアーゼが担体に固定化されたクロマトグラフィー工程によって行う。精製された１本鎖のＸΔ因子アナログを、そのマトリックスに結合したプロテアーゼを有するマトリックス上で処理し、精製されたＸａ因子アナログを溶出液から単離する。
本発明の態様によれば、活性なＸａ因子アナログを含む調製物は、上記のように製造したＸΔ因子アナログを、プロセシング／活性化工程に付し、活性なポリペプチドを精製された調製物へとさらに処理し、所望により医薬組成物として製剤化することによって得られる。
１本鎖のＸΔ因子アナログを含む調製物の製造のさらなる態様によれば、例えば、二塩基性プロテアーゼのためのプロセシング配列を有するＸΔ因子アナログをエンドプロテアーゼ欠失の細胞において発現させる。細胞は、好ましくは、ケキシン、フリン、ＰＡＣＥ、またはそのホモローガスな誘導体等の二塩基性エンドプロテアーゼを欠失している。そのようなエンドプロテアーゼ欠失突然変異細胞からＸΔ因子アナログを１本鎖の分子として単離することができる。セリンプロテアーゼのためのプロセシング部位を有するＸΔ因子アナログは、フリン陽性細胞を含むいずれかの慣用の細胞において発現させることができ、１本鎖の分子として単離することができる。
次に、このように単離されたおよび所望により精製されたＸ因子アナログを、ケキシン／Ｋｅｘ２、フリン／ＰＡＣＥ、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＬＰＣ／ＰＣ７等のエンドプロテアーゼ、ＩＩａ因子、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩａ因子、Ｘａ因子またはカリクレイン等のセリンプロテアーゼ、またはこれらのプロテアーゼの誘導体の群から選択されたプロテアーゼと、１本鎖のＸ因子アナログが開裂してＸａ因子アナログに活性化される条件下で接触させる。
上に記載した反応過程によってＸａ因子アナログに活性化される本発明のＸΔ因子アナログによって、高い安定性と構造上の統合性を有し特に不活性なＸ／Ｘａ因子中間体を含まない、精製されたＸａ因子アナログが得られる。
以下の実施例および図面によって本発明をより詳細に記載するが、本発明はこれらの特定の例示的な態様に限定されない。
実施例１は、Ｘ因子の構築および発現を記載する；実施例２は、フリンによるrＸ因子の重鎖および軽鎖へのプロセシングを記載する；実施例３は、固定化されたプロテアーゼによるプロＸ因子のプロセシングを記載する；実施例４は、インビトロでプロセシングされたｒＸ因子の活性を記載する；実施例５は、フリン欠失細胞におけるｒＸ因子の発現を記載する；実施例６はｒＸΔ因子アナログの構築および発現を記載する；実施例７は、Ｘ因子プロセシング産物のＮ末端の決定を記載する；実施例８は、Ａrg−Ｖal−Ｔhr−Ａrg／Ｉle部位を有するＦＸ欠失突然変異体（rＦＸΔRVTR/I）の発現およびキャラクタリゼーションを記載する；実施例９は、ｒ−フリン誘導体によるタンパク質rＦＸΔRVTR/Iのインビトロの活性化を記載する。
第１図は、Ｘ因子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
第２図は、修飾されたプロテアーゼ開裂部位を有するＸΔ因子アナログを示す概略図である。
第３図は、発現ベクターｐｈＡｃｔ−ｒＦＸを示す概略図である。
第４図は、ＣＨＯ細胞において発現したｒＸ因子の増幅前および増幅後のウェスタンブロット解析を示す。
第５図は、フリン誘導体によるインビトロ開裂後のｒＸ因子のウェスタンブロット解析を示す。
第６図は、フリン含有およびフリン欠失細胞において発現したｒＸ因子のウェスタンブロット解析を示す。
第７図は、重鎖の修飾されたＣ末端を有するＸΔ因子アナログ構築物の概略図を示す。
第８図は、ＣＨＯ、ＣＨＯ／ｒ−フリンおよびフリン欠失細胞に由来するｒＸ因子プロセシング産物のＮ末端を示す概略図である。
第９図は、ＣＨＯ細胞において発現したｒＸΔRVTR/I因子のウェスタンブロット解析を示す。
第１０図は、フリン誘導体によるインビトロ活性化後のｒＸΔRVTR/I因子のウェスタンブロット解析を示す。
発現ベクターは、標準的なクローニング技術によって調製する（Mmaniatisら,“Molecular Cloning”- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, U.S.A., 1983）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡフラグメントの調製は、一般的な方法に従う（Clacksonら, 1991, PCR A practical approach. McPherson編, Quirke, Taylor, p. 187-214）。
実施例１：
１本鎖のｒＦＸの発現およびｒＦＸ軽鎖／重鎖へのプロセシング
ａ．ｒＦＸ発現ベクターの調製
組換えＦＸ（ｒＦＸ）の調製のために、ＦＸのｃＤＮＡを、Messierら（1991, Gene 99: 291-294）に記載のように、ヒトの肝臓λ−ｃＤＮＡ−ライブラリーから単離した。ＤＮＡフラグメントは、５’−プライマーとしてオリゴヌクレオチド＃２９１１（５’−ＡＴＴ ＡＣＴ ＣＧＡ ＧＡＡ ＧＣＴ ＴＡＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＧＣＧ ＣＣＣ ＡＣＴ Ｇ−３’）（配列番号１）、および３’−プライマーとしてオリゴヌクレオチド＃２９１２（５’−ＡＴＴ ＡＣＡ ＡＴＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＡＣ−３’）（配列番号２）を用い、ＰＣＲによって陽性クローンから増幅した。そのＤＮＡフラグメントは、１，４６７ｋＢのＦＸコード配列と、３９ｂｐの３’−非翻訳領域を含み、５’末端にＸhoＩ開裂部位が結合し、３’末端にＭfeＩ開裂部位が結合している。さらに、プライマー＃２９１１によって、配列ＡＣＣがＦＸのＡＴＧの前に挿入され、最適なコザック翻訳開始配列が生じる。次に、このＰＣＲ産物をＸhoＩ／ＭfeＩフラグメントとして、ＳalＩおよびＥcoＲＩで開裂した発現ベクターｐｈＡｃｔ中でクローニングした。得られた発現プラスミドを、ｐｈＡｃｔ−ｒＦＸと命名した（第３図）。発現ベクターｐｈＡｃｔは、ヒトβアクチンプロモーター、７８ｂｐの５’ＵＴＲおよびイントロン、複数のクローニング開裂部位、およびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含んでいる。
ｂ．ＣＨＯ細胞におけるｒＦＸの発現
安定なｒＦＸ発現細胞系を樹立するために、ｄｈｆｒ欠失ＣＨＯ細胞を、発現プラスミドｐｈＡｃｔ−ｒＦＸおよび選択マーカープラスミドｐＳＶ−ｄｈｆｒで同時トランスフェクションした。以後のすべての発現と機能解析のために、培養細胞を、血清不含選択培地で１０μｇ／ｍLのビタミンＫの存在下、２４時間インキュベートした。得られた細胞クローンにおけるｒＦＸの発現を、抗原の量により検出し（ＥＬＩＳＡ、Asserchrom, Boehringer Mannheim）、次いで、その組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりキャラクタリゼーションした（第４Ａ図および第４Ｂ図）。ウェスタンブロット（第４Ａ図）から分かるように、その最初のクローンとそのサブクローンにおいて、組換えＦＸタンパク質が２２ｋＤの軽鎖（ＬＣ）および約５０ｋＤの重鎖の形態で存在しており、これは血漿Ｘ因子タンパク質と同じである。さらに、タンパク質のバンドが７５ｋＤに見られるが、これは１本鎖（ＳＣ）の分子に対応し、ＦＸでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（Wolfら, J. Biol. Chem. 266: 13726-13730, 1991）およびヒトの血漿（Fairら, Blood 64: 194-204, 1984）におけるその存在は記載されている。高発現クローンの調製のために、最初のクローンを増加する量のメトトレキセートとともに増幅した後、サブクローンニングして安定化させた。発現量を、２４時間あたり、約２００〜５００ｎｇ／１０ Ｅ６細胞または１μｇ／ｍLからそれぞれ、約７８μｇ／１０ Ｅ６細胞または１２０μｇ／ｍLに増加させることができた。これら高発現細胞クローン上清のウェスタンブロット解析（第４Ｂ図および第５Ａ図、レーン２）は、１本鎖のｒＦＸ分子が豊富なこと、およびさらなる軽鎖の形態の存在を示している。血漿での形態（完全にカルボキシル化されプロペプチドを有さない）に対応する２２ｋＤの軽鎖の形態以外に、約２１ｋＤ，２２．５ｋＤ、および２０ｋＤのさらに３つの軽鎖変異体が存在している。組換え物質のＮ末端配列決定によって、これらクローンにおける軽鎖の不均質性は、プロペプチドの不完全な開裂（ここでは、ｒＦＸ物質の約５０％）と低カルボキシル化（hypocarboxylation）（ここではｒＦＸの約５０％）の結果であると決定付けられた。２１ｋＤのタンパク質は、低カルボキシル化されておりプロペプチドを含む形態、２０ｋＤのタンパク質は低カルボキシル化されておりプロペプチド含まない形態の軽鎖であり、一方、２２．５ｋＤのバンドは、完全にカルボキシル化されているがプロペプチドを含む軽鎖の形態である。
実施例２：ｒ−フリン誘導体による１本鎖ｒＦＸのｒＦＸ軽鎖／重鎖へのプロセシング
軽鎖のＸ因子プロペプチド／Ｎ末端間の開裂部位（ＲＶＴＲ↓Ａ）および軽鎖／重鎖の開裂部位（ＲＲＫＲ↓Ｓ）の、フリンコンセンサス検出配列（ＲＸＫ／ＲＲ↓Ｘ）に対する類似性のために、ｒ−フリン誘導体により、プロペプチドを含むｒＦＸ分子のインビトロプロセシングも、１本鎖のインビトロプロセシングも改良することが可能であった。文献では、２つのプロセシング段階に関するプロテアーゼが推測されているけれども、それはフリンではない（Rehemtullaら, 1992, Blood 79: 2349-2355; Wallinら, 1994, Thromb. Res. 1994: 395-403）。
ＣＨＯ−ｒＦＸとＣＨＯ−ｒフリンΔＴＭ６ｘＨis（特許出願ＥＰ ０ ７７５ ７５０）、さらにＣＨＯ−ｒＦＸと非トランスフェクトＣＨＯ（ネガティブコントロールとして）の培養細胞上清を１：１の比で混合し、３７℃でインキュベーションした。反応混合物のアリコートを、インキュベーション前（ｔ＝０）および、種々のインキュベーション時間（ｔ＝２、４、６時間）のプロセシングされたｒＦＸについて、ウェスタンブロット解析により試験した（第５図）。抗ヒトＦＸ抗血清（第５Ａ図）およびＦＸの軽鎖に特異的なモノクローナル抗体（第５Ｂ図）によって細胞上清中でｒＦＸを検出した。
ＣＨＯ−ｒＦＸ／ＣＨＯ混合物とは対照的に、ＣＨＯ−ｒＦＸ／ＣＨＯ−ｒフリンは、３７℃でのインキュベーションの２時間後にすでに、ほぼ完全なプロセシングを示した（第５Ａ図、レーン７；第５Ｂ図、レーン８）。１本鎖ｒＦＸが非常によく反応して軽鎖と重鎖の形態になっている。軽鎖の領域では、２２ｋＤ（カルボキシル化形態）および２０ｋＤ（低カルボキシル化形態）のプロセシングされたプロペプチド不含形態のみが、約５０：５０の比率でみられた。培養細胞の状態を至適化することにより、この比率をカルボキシル化形態寄りに改善することができる。Ａrg−１とＡrg＋１の間のプロ−配列の正しい開裂、および軽鎖のＮ末端の均質性をＮ末端配列の配列決定により測定した。ＣＨＯ−ｒＦＸをＣＨＯ−上清液と混合する対照実験では、６時間後のインキュベーション後でさえ、ｒＦＸバンドのパターンに変化は見られなかった（第５Ａ図、レーン５；第５Ｂ図、レーン６）。このことは、ＣＨＯ細胞の上清中のｒ−フリンが生物学的に活性であり、ｒＦＸの重鎖／軽鎖のプロセシングと同時にプロペプチドもプロセシングすることを示している。
実施例３：
キレート−テンタクルゲルに固定化されたｒ−フリンによるＸ因子のプロセシング
カラムに結合したｒ−フリン誘導体によってある基質が開裂され得るかどうかについて測定するために、カラムマトリックスとしてFractogel ＥＭＤ▲Ｒ▼テンタクルゲル（Merck）を、Ｎi2+ＮＴＡアガロースの代わりに実験の構成において使用することができるかどうかについて調べた。Ｎi2+ＮＴＡアガロースよりも、実際のカラムマトリックスから金属イオンが離れているので、結合したｒ−フリン誘導体への改善された立体的接近が達成され得る。この実験構成では、プロ−Ｘ因子は、ｒ−フリン誘導体が結合したテンタクルゲルによってプロセシングされた。
Fractogel ＥＭＤ▲Ｒ▼テンタクルゲルは、製造元の説明書にしたがってＮi2+イオンを流し、新鮮な血清不含培地で平衡化した。次に、カラムに血清不含ＣＨＯ−ｒフリン誘導体上清を流した。４０ｍＭまで濃度を増加させるイミダゾールを含む血清不含培地により洗浄工程を行った。次に、プロ−Ｘ因子を血清不含ＣＨＯ上清と同様にカラムに通した。プロ−Ｘ因子の２本鎖のＸ因子へのプロセシングが、特異的なＸ因子抗血清を用いるウェスタンブロット解析により、カラムの溶出液において検出された。
実施例４：
インビトロにおいてプロセシングされた組換えＸ因子の活性
組換えＸ因子前駆体を、４℃にて、ｒ−フリン有りおよび無しでインキュベーションした。異なった時間で、試料を取り、−２０℃に冷凍した。インキュベーションが終了した後（約４日後）、すべての試料を、ＦＸ Coatest Kit（Chromogenix）を使用し、ＦＸ活性について試験した。それぞれの上清５０μLをＦＸ欠失ヒト血漿５０μLと混合し、ｒＦＸを、製造元の説明書にしたがって、ＣaＣl2の存在下でヘビ毒（ＲＶＶ）と反応させてｒＦＸａにした；次にｒＦＸａは発色性基質（Ｓ−２３３７）を加水分解して黄色に着色したパラニトロアニリンを遊離する。ｒＦＸａの量と色の強度は互いに比例しているので、ｒＦＸａに達することができるｒＦＸ／ｍL培養細胞上清の量は、血漿希釈系列の値から補間された較正線により決定することができる。これらの結果とｒＦＸ抗原の既知の量（ＥＬＩＳＡデータ）を用いて、Ｘａ因子に活性化されたｒＸ因子の割合を百分率で計算することができる。結果は表１に示す。
ＣＨＯおよびＣＨＯ−ｒ−フリン上清における非特異的なタンパク質加水分解活性を排除するために、これら２つの培養細胞上清の混合物も試験した。
４日後であっても、対照としてＣＨＯ上清とインキュベーションしたＣＨＯ−ｒＦＸ（ｒ−フリンなし）は、ｒＦＸａ活性の実質的な変化を示さず、約８００ｍＵ／ｍLの活性であり、機能するｒＦＸの約５０〜６０％（実験的な変動のため）に相当する。比較のため、ＣＨＯ−ｒＦＸをＣＨＯ−ｒ−フリンとインキュベーションしたとき、ｒＦＸ活性はインキュベーションの間に次第に増加し、約６０％（ｔ＝０）から８６％に上昇した（表１）。このことは、高発現クローン由来のＣＨＯ−ｒＦＸの、ｒ−フリン誘導体を用いたインビトロのプロセシングが、機能するｒＦＸａに活性化され得るｒＦＸの割合を実質的に改善することを示している。
0004108761.tif 000002
実施例５：
フリン欠失細胞における組換えＸ因子の発現
前記実施例に示したように、Ｘ因子前駆体タンパク質の場合、フリンは、インビトロで軽鎖／重鎖への１本鎖の開裂もプロペプチド開裂も媒介する。このことは、これらの段階が、発現したｒＸ因子の量に依存して変化する効率でもって、偏在するフリンにより、細胞において内因的にも引き起こされることを示唆している。このことは、次に、異なる形態のｒＸ因子形態の混合物の産生につながる。
できるだけ均質で且つ安定なｒＸ因子分子の形態を製造する１つの方法は、内因系プロテアーゼ、特にフリンによるｒＸ因子の開裂を阻止し、機能的に不活性なｒＸ因子前駆体（これは、後に、下流のプロセシングにより、理想的には使用前に直接、機能的に活性なその形態に転換され得る）を産生させることである。この製造方法は、もともとの活性化部位の代わりとしてフリン開裂部位を含む、ＦＸ欠失突然変異体の製造において特に有用であろう。これらの構築物では、このような組換えｒＦＸ突然変異体がインビボで内因系フリンによって活性化されて、活性化したより不安定なｒＦＸ形態の分泌につながり得る。ＣＨＯプロテアーゼによるこれらの形態の分解は、例えば培養細胞の高度な細胞溶解条件下で、培養細胞上清の保存または精製過程の間に不安定な分解産物を生じ得る（Wolfら, 1991）。
この目的は、例えば、細胞内のフリン活性を減少または阻止し得る試薬を培地に添加することによって達成することができる。
別の方法は、予めフリン欠失の細胞を使用することである
0004108761.tif 000003
この目的のために、フリン欠失ＣＨＯ細胞クローンＦＤ１１（Gordonら, 1995, Infect. Immun. 63: 82-87）を、２０μｇのｐｈＡｃｔ−ＦＸおよび1μｇのｐＵＣＳＶ−ｎｅｏ（ＳＶ４０プロモーターの制御下でｐＵＣベクター中にネオマイシン耐性遺伝子を含む）で同時トランスフェクトした。安定なクローンを得るために、培地に０．８μｇＧ４１８／ｍLを添加した。フリン含有およびフリン欠失ＣＨＯクローンの血清不含上清中の分泌されたｒＸ因子分子を比較すると、ウェスタンブロットは以下のことを示している：ｒＸ因子前駆体はフリン欠失細胞においてはプロセシングされず、１本鎖のＸ因子前駆体のみが存在していること（第６図）；対照的に、適度に発現した“正常な”細胞によりｒＸ因子は依然として完全にプロセシングされるが、より高度に発現すると、内因系フリンが存在するにもかかわらず非常に限られた程度にしかプロセシングされない。使用した細胞クローンの低いｒＦＸ発現の程度のために、ここではブロットおいてｒＸ因子の軽鎖は見ることができない。
実施例６：
ＸΔ因子アナログの製造（現時点において、出願人はこれを、発明を実施するためのベストモードと考える）
６．１．ＦＸ欠失突然変異体の製造のための発現プラスミドの構築
Ｘ因子欠失突然変異体は、アミノ酸１８０〜２３４の間の約４．５ｋＤａの活性化ペプチドが欠失している点において野生型の配列と異なる。さらに、種々の開裂部位が、軽鎖のＣ末端および／または重鎖のＮ末端に、突然変異誘発により導入されており、この部位が機能して１本鎖のＸ因子分子が活性化され、活性化したポリペプチドがそこから生じる。これらＸ因子欠失突然変異体のための発現プラスミドはすべてｐｈＡｃｔ−ＦＸから得られる（実施例1に記載）。
Ｘ因子欠失突然変異体のクローニングを単純化するために、＋１番から＋１１１６番の領域をコードしているＸ因子を含む、プラスミドｐｈＡｃｔ−ＦＸ由来のＨindIII-ＮaeI ＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵＣ１９のＨindIII／ＳmaI制限開裂部位へ挿入した。得られたプラスミドをｐＵＣ／ＦＸと名付けた。活性化ペプチドを欠失させるためと、新たな開裂部位、例えば、フリン、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ開裂部位を導入するため、ｐＵＣ／ＦＸベクターのＢsp１２０Ｉ／ＢstＸＩ ＦＸ ＤＮＡ断片を合成オリゴヌクレオチドで置換した。トロンビンまたはＦＸＩａ開裂部位を導入するため、ＢstＸＩ−３’−オーバーラップをマングマメヌクレアーゼで平滑化し、その結果、２３５番のアミノ酸Ｉleも交換可能となった。次に、欠失させたＸ因子ＤＮＡ断片は、ＨindIII−ＡgeIによりプラスミドｐＡＣＴ−ＦＸ中でクローニングした。
Ａsp−Ｐhe−Ｔhr−Ａrg／Ｖal ＦＸＩａ開裂部位を調製するため、オリゴヌクレオチドセンス＃０００９（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＧＧ ＧＴＧ−３’）（配列番号３）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００１０（５’−ＣＡＣ ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＴＣ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号４）を使用し、Ｂsp１２０Ｉおよびマングマメヌクレアーゼ処理したＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより、１７６番から１７８番および２３５番のアミノ酸がＡsp−Ｐhe−ＴhrおよびＶalに変異した（第２Ａ図）。
Ａrg／Ｔhr ｆＩＩａ開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００１１（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＣＧＧ ＡＣＣ−３’）（配列番号５）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００１２（５’−ＧＧＴ ＣＣＧ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号６）を使用し、Ｂsp１２０Ｉおよびマングマメヌクレアーゼ処理したＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより、２３５番のアミノ酸ＩleがＴhrに変異した（第２Ｂ図）。
Ｉle−Ｌys−Ｐro−Ａrg／Ｉle ＦＸＩＩａ開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００１３（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号７）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００１４（５’−ＣＴ ＧＧＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号８）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより、１７６番から１７８番のアミノ酸がＩle−Ｌys−Ｐroに変異した（第２Ｃ図）。
Ｓer−Ｍet−Ｔhr−Ａrg／Ｉleカリクレレイン開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００１５（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号９）およびオリゴヌクレオチド＃００１６（５’−ＣＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＣＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号１０）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより１７６番から１７８番のアミノ酸がＳer−Ｍet−Ｔhrに変異した（第２Ｄ図）。
Ｍet−Ｌys−Ｔhr−Ａrg／Ｉle ＦＸａ開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００３３（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＣＧ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号１１）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００３４（５’−ＣＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＣＡＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号１２）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより、１７６番から１７８番のアミノ酸がＴhr−Ｌeu−ＧluからＭet−Ｌys−Ｔhrに変異した（第２Ｅ図）。
Ｉle−Ｇlu−Ｇly−Ａrg／Ｉle ＦＸａ開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００３５（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＡＧ ＧＧＡ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号１３）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００３６（５’−ＣＴ ＴＣＣ ＣＴＣ ＧＡＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号１４）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより１７６番から１７８番のアミノ酸がＴhr−Ｌeu−ＧluからＩle−Ｇlu−Ｇlyに変異した（第２Ｆ図）。
Ａrg−Ａrg−Ｌys−Ａrg／Ｉle フリン開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００１７（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号１５）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００１８（５’−ＣＴ ＣＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号１６）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより１７６番から１７８番のアミノ酸がＡrg−Ａrg−Ｌysに変異した（第２Ｇ図）。
Ａrg−Ｖal−Ａrg−Ａrg／Ｉle フリン開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００１９（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号１７）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００２０（５’−ＣＴ ＣＣＴ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号１８）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより１７６番から１７８番のアミノ酸がＡrg−Ｖal−Ａrgに変異した（第２Ｇ図）。
Ａrg−Ａrg−Ａrg−Ａrg／Ｉle フリン開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００２１（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号１９）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００２２（５’−ＣＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号２０）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより１７６番から１７８番のアミノ酸がＡrg−Ａrg−Ａrgに変異した（第２Ｇ図）。
Ａrg−Ｐro−Ｌys−Ａrg／Ｉle フリン開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００２３（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＧＧ ＣＣＣ ＡＡＧ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号２１）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００２４（５’−ＣＴ ＣＴＴ ＧＧＧ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号２２）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより１７６番から１７８番のアミノ酸がＡrg−Ｐro−Ｌysに変異した（第２Ｇ図）。
Ｉle−Ａrg−Ｌys−Ａrg／Ｉle フリン開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００２５（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＴＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号２３）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００２６（５’−ＣＴ ＣＴＴ ＣＣＴ ＧＡＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号２４）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより１７６番から１７８番のアミノ酸がＩle−Ａrg−Ｌysに変異した（第２Ｇ図）。
Ａrg−Ｓer−Ｌys−Ａrg／Ｉle フリン開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００２７（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号２５）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００２８（５’−ＣＴ ＣＴＴ ＧＣＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号２６）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより１７６番から１７８番のアミノ酸がＡrg−Ｓer−Ｌysに変異した（第２Ｇ図）。
Ａrg−Ｖal−Ｔhr−Ａrg／Ｉle フリン開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００２９（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＧＧ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号２７）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００３０（５’−ＣＴ ＣＧＴ ＧＡＣ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号２８）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより１７６番から１７８番のアミノ酸がＡrg−Ｖal−Ｔhrに変異した（第２Ｇ図）。
Ａrg−Ｌeu−Ｌys−Ａrg／Ｉle フリン開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００３１（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＡＡＡ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号２９）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００３２（５’−ＣＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号３０）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより１７６番および１７８番のアミノ酸がＡrgおよびＬysに変異した（第２Ｇ図）。
Ｐro−Ｇln−Ｇly−Ａrg／Ｉle ＦＸａ開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００３７（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＣＣＣ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号３１）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００３８（５’−ＣＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号３２）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより１７６番から１７８番のアミノ酸がＴhr−Ｌeu−ＧluからＰro−Ｇln−Ｇlyに変異した（第２Ｈ図）。
Ｔhr−Ｓer−Ｔhr−Ａrg／Ｉle ＦＸＩＩａ開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチドセンス＃００３９（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＣＧ ＡＧＣ ＡＣＧ ＡＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号３３）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００４０（５’−ＣＴ ＣＧＴ ＧＣＴ ＣＧＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号３４）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した。これにより１７６番および１７８番のアミノ酸がＳer−Ｔhrに変異した（第２Ｉ図）。
Ａrg／Ｉle トリプシン開裂部位を調製するために、オリゴヌクレオチド＃００４１（５’−ＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＣＧＧ ＡＴＣ−３’）（配列番号３５）およびオリゴヌクレオチドアンチセンス＃００４２（５’−ＣＧ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号３６）を使用し、Ｂsp１２０ＩおよびＢstＸＩ部位へ挿入した（第２Ｊ図）。
得られた発現プラスミド（第３図参照）は、ヒトβ−アクチンプロモーター、７８ｂｐの５’ＵＴＲ、β−アクチンイントロン、修飾されたＸ因子配列、および３９ｂｐの３’ＵＴＲおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含んでいる。
６．２．ＦＸβアナログの調製のための発現プラスミドの構築
これらの構築物は、ＴＧＡ終止コドンを４７０番に導入することにより、上に記載したＸΔ因子アナログ構築物から得られた。４５７番から終止コドンまでのアミノ酸をＳpeIおよび部分的ＢstEII消化によって取り除き、オリゴヌクレオチドペア＃０００３（５’−ＧＴＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＡＡＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＧＡＣ ＡＧＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＣＣ ＡＧＧ ＴＧＡ Ａ−３’）（配列番号３７）および＃０００４（５’−ＣＴＡ ＧＴＴ ＣＡＣ ＣＴＧ ＧＴＴ ＴＴＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＣＴＧ ＴＣＧ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＴＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＧＣＧ−３’）（配列番号３８）で置換した。第７図は、ＸΔβ因子アナログ構築物の概略図である。図を簡略化するために、すべてのＸΔβ因子アナログは、開裂部位の可変アミノ酸が影付きの“Ｘ”になっている一般的な構成で示した。
６．３．ＦＸΔαアナログの製造のための発現プラスミドの構築
重鎖のＮ末端の４．５ｋＤａの活性化ペプチドを切断することによるＸ因子の活性化によって、Ｘａα因子形態は生じる。この形態は、自己タンパク質加水分解活性およびＡrg４６９とＧly４７０の間の重鎖のＣ末端の開裂により、反応してＦＸａβ形態となる。活性化の後はすべて完全なβ−ペプチドを有するＦＸａα形態として存在するであろうＸΔ因子アナログの産生をもたらすＸ因子発現プラスミドの調製のために、Ａrg４６９のアミノ酸をＬysへ変異させて重鎖のＣ末端領域がもはやプロセシングされないようにした。
この目的のために、部分的ＢstＥＩＩ−ＳpeI消化によりＣ末端アミノ酸配列をコードするＸ因子のＤＮＡ配列を１３６３番から終止シグナルまで取り除き、ライゲーションした２つのオリゴヌクレオチドペアで置換した。オリゴヌクレオチド＃０００５（５’−ＧＴＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＡＡＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＧＡＣ ＡＧＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＣＣ ＡＡＧ ＧＧＣ ＴＴＧ ＣＣＣ ＡＡＧ−３’）（配列番号３９）およびオリゴヌクレオチド＃０００６（５’−ＴＴＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＡＡＧ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＴＴ ＴＴＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＣＴＧ ＴＣＧ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＴＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＧＣＧ−３’）（配列番号４０）をオリゴヌクレオチド＃０００７（５’−ＧＣＣ ＡＡＧ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＣＣ ＣＣＧ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＴＡ ＡＣＧ ＴＣＣ ＴＣＴ ＣＣＡ ＴＴＡ ＡＡＧ ＴＧＡ ＧＡＴ ＣＣＣ Ａ−３’）（配列番号４１）およびオリゴヌクレオチド＃０００８（５’−ＣＴＡ ＧＴＧ ＧＧＡ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＴＴ ＡＡＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＴＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＧＧ ＧＣＡ ＴＧＧ ＣＴＣ−３’）（配列番号４２）とライゲーションした。アミノ酸Ａrg４６９の突然変異はオリゴヌクレオチドペア＃０００５−＃０００６によって導入される。第７図はＦＸΔアナログの概略図である。
実施例７：
Ｘ因子およびｒ−フリンを有するおよび有さないプロセシング産物のＮ末端の決定
組換えＸ因子を、実施例１に記載のように内因系フリンを有するＣＨＯ細胞、および実施例５に記載のようにフリン欠失細胞において発現させた。ｒＸ因子は、それぞれ
ａ）前処理しない、
ｂ）３７℃で１２時間インキュベーションした、および
ｃ）ＣＨＯ−ｒ−フリン上清により３７℃にて１２時間前処理した
高発現ＣＨＯ−ｒＦＸクローンの培養細胞上清から、並びに
それぞれ
ｄ）前処理しない、および
ｅ）ＣＨＯ−ｒ−フリン上清により３７℃にて１２時間前処理した
ＣＨＯ−ＦＤ１１−ｒＦＸクローン培養細胞上清から単離した。個々の反応混合物（ａ）〜（ｅ）のＸ因子およびプロセシング産物のＮ末端アミノ酸をEdman分析によって決定した。第８図はその結果を示す図である。
高発現ＣＨＯ細胞に由来するｒＸ因子は、成熟の重鎖および軽鎖の形態でも１本鎖の形態でも存在しており、部分的に依然としてプロペプチドを含んでいる。これらの培養細胞上清を３７℃で１２時間インキュベーションした後（ｂ）、Wolfら（1991, J. Bio. Chem. 266: 13726-13730）によって記載されているように、さらに３つのアミノ酸Ｖal３８−Ｔhr３９−Ａrg４０を有するｒＦＸ軽鎖のさらなる欠陥Ｎ末端が形成する。これらの隠れ（cryptic）末端は、前処理しないＣＨＯ−ＦＤ１１細胞（ｄ）に由来するｒＦＸ物質の配列をしらべたときにも見られる。この観察結果は、これらの欠陥Ｎ末端の形成は、妥当な条件、即ち、ＣＨＯプロテアーゼによるｒＦＸタンパク質分解を最小限にするための、細胞培養の条件、保存および精製方法によって阻止し得ることを示している。
ＣＨＯ細胞（ａおよびｂ）に由来する精製された物質とは対象的に、増殖させなかったフリン欠失細胞（ｄ）に由来するｒＦＸは、プロセシングされていない１本鎖の前駆体の形態でのみ存在する。プロペプチド部分に対応するＮ末端配列はいずれにも見られない。このことは、１本鎖のｒＦＸ前駆体が、フリン欠失ＣＨＯ細胞（ｄ）では、もはや軽鎖／重鎖にプロセシングされないということを示しており、このことは、インビボでのこのプロセシング段階におけるエンドプロテアーゼ、フリンの中心的役割を示唆している。さらに、プロペプチドを含むｒＦＸ分子は、フリン欠失ＣＨＯ細胞でもプロセシングされること、即ち、インビボでのこのプロセシング段階にはフリンは本質的な役割を担っていないということを示している。ＣＨＯ細胞由来の（ｃ）およびＣＨＯ−ＦＤ１１由来の（ｅ）ｒＦＸの、フリンの存在下でのインキュベーション後、正しいＮ末端を有する軽鎖および重鎖のみがみられた。このことは、１本鎖のＦＸ前駆体並びにプロペプチドを含むｒＦＸ分子が、インビトロのプロセシングよって反応して均質な、成熟Ｘ因子になることを示している。このように、フリンの存在下でプロセシングされたＸ因子は、類まれな構造上の統合性を示す。
実施例８：
開裂部位Ａrg−Ｖal−Ｔhr−Ａrg／Ｉle（ＦＸΔRVTR/I）を有する組換えＦＸ欠失突然変異体の発現およびキャラクタリゼーション
開裂部位Ａrg−Ｖal−Ｔhr−Ａrg／Ｉle（ＦＸΔRVTR/I）を有するＦＸ欠失変異体をコードする発現プラスミドを、実施例１に記載のように、選択マーカーｐＳＶ／ｄｈｆｒとともに、ｄｈｆｒ欠失ｙＣＨＯ細胞中に同時トランスフェクトした。永久ＣＨＯクローン由来の組換えタンパク質ＦＸΔRVTR/Iをウェスタンブロット解析によりキャラクタリゼーションした。第９図、レーン４にみられるように、組換えタンパク質は、約５６ｋＤおよび５０ｋＤの２本のバンドの形態で存在する。ＦＸ反応性物質は、トランスフェクトしなかったＣＨＯ細胞の培養細胞上清には検出されなかった（レーン２）。これらの結果によれば、これらのタンパク質のバンドは、野生型ＦＸの解析した上清の、培地中のウシ血清の残留物に由来する不純物から生じたということはあり得ない。したがって、この２本のバンドは、異なる翻訳後修飾、例えば、プロペプチドまたはｒＦＸΔRVTR/I分子の異なったグリコシレーションの存在によって生じたのかもしれない。
この構築物に挿入された開裂部位Ａrg−Ｖal−Ｔhr−Ａrg／Ｉleは、野生型ＦＸ分子のプロペプチド開裂部位と同一であり、ＣＨＯエンドプロテアーゼによってインビボで有効に認識され開裂される（実施例７参照）。ウェスタンブロット解析は、ｒＦＸΔRVTR/I重鎖の活性化されたαおよびβ形態に対応する、さらなる３５ｋＤおよび３１ｋＤの重鎖ＦＸ分子を示していない。これらの結果は、エンドプロテアーゼの量がタンパク質を活性化するに十分でないということ、および／または開裂部位Ａrg−Ｖal−Ｔhr−Ａrg／Ｉleがこの配列環境ではインビボで認識および開裂されないかまたは効果的に認識および開裂されないということを示している。したがって、ｒＦＸΔRVTR/Iは、特に１本鎖の形態でのみ存在する。
実施例９：
インビトロでの組換えフリン誘導体による組換えｒＦＸΔRVTR/Iタンパクの活性化
ｒＦＸプロペプチドにおける開裂部位Ａrg−Ｖal−Ｔhr−Ａrgは、インビボでフリン以外のプロテアーゼによって認識されるが、実施例２は、ｒ−フリン誘導体がインビトロでこの配列を非常に有効にそして正確に開裂することを明らかにした。
インビトロでｒ−フリンにより活性化されるｒＦＸΔRVTR/Iタンパク質の能力を試験するため、混合実験を行った。ＣＨＯＦＸΔRVTR/I細胞から得た培養細胞上清を、２０ｍＭのpＨ７．０のＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮaＣl、４ｍＭＣaＣl2、および０．１％ＢＳＡの存在下で、精製したｒ−フリン誘導体ｒ−フリンΔＣys−スペーサー−１０×Ｈis（特許出願ＥＰ ０ ７７５ ７５０−Ａ２）と１：１の比率で混合した。対照実験では、ＣＨＯｒＦＸΔRVTR/I上清を、緩衝液を含むＢＳＡのみと同じ比率で混合した。ＢＳＡの添加は、ｒ−フリン誘導体の酵素活性と次に形成される活性化されたｒＦＸΔRVTR/I産物を安定化することを目的としている。反応混合物のアリコートを、３７℃にて、ウェスタンブロット解析により、インキュベーションの前と６、２４、４８および７２時間後（ｔ＝０、ｔ＝６、ｔ＝２４、ｔ＝４８、ｔ＝７２）に、ｒＦＸΔRVTR/Iプロセシングについて試験した（第１０図）。ｒ−フリン添加なしの混合実験（第１０Ｂ図）では、インキュベーションの間、バンドのパターンの変化はみられなかった（レーン４〜９）。５６ｋＤの重鎖分子はＢＳＡのバンドでカバーされるので、反応混合物中のＢＳＡの存在によって、分子量が小さい方（５０ｋＤ）のｒＦＸΔRVTR/I分子のみを容易に見ることができる。ｒ−フリン誘導体の存在下（第１０Ａ図）で、３５ｋＤのタンパク質のバンドが、インキュベーションの６時間後に既に現れ（レーン５）、このバンドはＦＸ重鎖のα形態に対応している（レーン９参照）。このタンパク質は、インキュベーションの経過にしたがって蓄積し、α−形態からのタンパク質分解的変換によってβ−形態が形成する血漿ＦＸの場合において既に知られているとおり、次に反応してタンパク質分解されたβ−形態になる（レーン７および８）。２２ｋＤおよび２０ｋＤの軽鎖は、重鎖の活性化された形態の検出と並行して現れ、この軽鎖は、実施例１．ｂの軽鎖の、プロペプチドを含まないカルボキシル化されたＬＣ２形態（実際に機能する形態に対応する）またはプロペプチドを含まない低カルボキシル化されたＬＣ４形態と同定された。低カルボキシル化されたＬＣ４形態の存在は、翻訳後修飾の機構が、分析したＣＨＯクローンにおいて制限されていることを示した。５０ｋＤのバンドは変化していないように見えるが、５６ｋＤ形態は明らかに軽鎖／重鎖に直接分解され、実際は、５６ｋＤの分子が最初に５０ｋＤの形態に変換され、その後でのみ軽鎖および重鎖に開裂される。これは、５６ｋＤの分子にプロペプチドが存在し、それが最初に５０ｋＤの形態の形成によって除去されるからである。
このことは、ｒＦＸΔRVTR/I構築物が、インビトロでｒ−フリン誘導体により、Ａrg−Ｔhr−Ａrg／Ｉle開裂部位の挿入および血漿ＦＸａの大きさに相当するｒＦｘΔRVTR/I構築物のプロセシング産物の生成を経て活性化され得ることを示している。ＦＸΔαの自己タンパク質分解的プロセシングにより形成されるＦＸΔβの生成は、ｒＦＸΔRVTR/I分子の機能性を示すものである。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）特許出願人：
（Ａ）名称：イムノ・アクチエンゲゼルシャフト
（Ｂ）通り：インダストリーシュトラーセ６７番
（Ｃ）市：ヴィーン
（Ｄ）州：オーストリア
（Ｅ）国：オーストリア
（Ｆ）ＺＩＰ：１２２０
（ii）発明の名称：Ｘ因子欠失突然変異体およびそのアナログ
（iii）配列の数：４４
（iv）コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型：フロッピー・ディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパティブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.30（EPO）
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号１：
0004108761.tif 000004
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号２：
0004108761.tif 000005
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号３：
0004108761.tif 000006
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号４：
0004108761.tif 000007
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号５：
0004108761.tif 000008
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号６：
0004108761.tif 000009
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号７：
0004108761.tif 000010
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号８：
0004108761.tif 000011
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号９：
0004108761.tif 000012
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号１０：
0004108761.tif 000013
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号１１：
0004108761.tif 000014
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号１２：
0004108761.tif 000015
（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号１３：
0004108761.tif 000016
（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号１４：
0004108761.tif 000017
（２）配列番号１５の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号１５：
0004108761.tif 000018
（２）配列番号１６の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号１６：
0004108761.tif 000019
（２）配列番号１７の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号１７：
0004108761.tif 000020
（２）配列番号１８の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号１８：
0004108761.tif 000021
（２）配列番号１９の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号１９：
0004108761.tif 000022
（２）配列番号２０の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号２０：
0004108761.tif 000023
（２）配列番号２１の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号２１：
0004108761.tif 000024
（２）配列番号２２の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号２２：
0004108761.tif 000025
（２）配列番号２３の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号２３：
0004108761.tif 000026
（２）配列番号２４の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号２４：
0004108761.tif 000027
（２）配列番号２５の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号２５：
0004108761.tif 000028
（２）配列番号２６の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号２６：
0004108761.tif 000029
（２）配列番号２７の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号２７：
0004108761.tif 000030
（２）配列番号２８の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号２８：
0004108761.tif 000031
（２）配列番号２９の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号２９：
0004108761.tif 000032
（２）配列番号３０の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号３０：
0004108761.tif 000033
（２）配列番号３１の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号３１：
0004108761.tif 000034
（２）配列番号３２の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号３２：
0004108761.tif 000035
（２）配列番号３３の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号３３：
0004108761.tif 000036
（２）配列番号３４の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号３４：
0004108761.tif 000037
（２）配列番号３５の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号３５：
0004108761.tif 000038
（２）配列番号３６の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号３６：
0004108761.tif 000039
（２）配列番号３７の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４９塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号３７：
0004108761.tif 000040
（２）配列番号３８の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４８塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号３８：
0004108761.tif 000041
（２）配列番号３９の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：５７塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号３９：
0004108761.tif 000042
（２）配列番号４０の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：５７塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号４０：
0004108761.tif 000043
（２）配列番号４１の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：５５塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号４１：
0004108761.tif 000044
（２）配列番号４２の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：５４塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：配列番号４２：
0004108761.tif 000045
（２）配列番号４３の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１４６７塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：CDS
（Ｂ）存在位置：1..1467
（xi）配列：配列番号４３：
0004108761.tif 000046
0004108761.tif 000047
（２）配列番号４４の情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４８９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号４４：
0004108761.tif 000048
0004108761.tif 000049
【図１−１】
0004108761.tif 000050
【図１−２】
0004108761.tif 000051
【図２．１】
0004108761.tif 000052
【図２．２】
0004108761.tif 000053
【図３】
0004108761.tif 000054
【図４】
0004108761.tif 000055
【図５】
0004108761.tif 000056
【図６】
0004108761.tif 000057
【図７】
0004108761.tif 000058
【図８】
0004108761.tif 000059
【図９】
0004108761.tif 000060
【図１０】
0004108761.tif 000061