(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
擬似移動床式クロマト分離装置の分離剤としてアニオン交換樹脂を用い、溶離剤として塩濃度が0.01〜1.5MでpHが1〜10の溶液を用い、結合様式の異なるシアリルラクトースを含む原料溶液を擬似移動床式クロマト分離装置に供給して、シアル酸（SA）と乳糖（Galβ1→4Glc）とがα2→3結合したSAα2→3Galβ1→4Glcと、シアル酸（SA）と乳糖（Galβ1→4Glc）とがα2→6結合したSAα2→6Galβ1→4Glcとを分離することを特徴とするシアリルラクトースの分離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、シアリルラクトース中に混在しているシアル酸（ＳＡ）と乳糖（Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）とがα２→３結合したＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ及びシアル酸（ＳＡ）と乳糖（Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）とがα２→６結合したＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃを結合様式の違いにより分離、回収する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シアリルラクトースは、乳中に多く含まれていることが知られており、感染防御活性などの生理活性を有していることが知られている。近年、このシアリルラクトースについては、結合様式の違いによりその生理的効果が異なることが解明されつつある。例えば、シアル酸（ＳＡ）と乳糖（Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）とがα２→３結合したＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃについては、胃炎の原因菌といわれているカンピロバクター・ピロリ(Campylobacter pylori) の付着を阻害すること[Infect Immun., vol.56, pp.2896-2906, 1988] や新生児の脳膜炎や敗血症の原因菌であるＳ型大腸菌の付着を阻害すること[Acta Pediatr, vol.82, pp.6-11, 1993] が報告されている。また、シアル酸（ＳＡ）と乳糖（Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）とがα２→６結合したＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃについては、Ａ型インフルエンザ・ウイルスのレセプターであることが報告されている[Nature, vol.333, pp.426-431, 1988] 。
【０００３】
このシアリルラクトースについては、通常、牛乳などの乳から分離、回収されることが多い。しかし、このシアリルラクトース中には、結合様式の異なるＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとが混在しており、また、このＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとの乳中での存在比率は生物種や泌乳期により大きく異なることが知られている。例えば、ヒト初乳中に含まれるＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとの存在比は約５：１であるが、牛常乳中に含まれるＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとの存在比は約１：６である。
【０００４】
本発明者らは、先に擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）を用いて牛乳などの乳からシアリルラクトースを工業的規模で分離、回収する方法について提案している [特願平5-252462号] 。
【０００５】
牛乳などの乳から分離、回収したシアリルラクトースについて、さらに、その結合様式の違いにより分離する方法としては、樹脂にシアリルラクトースを吸着させた後、樹脂を水洗し、塩濃度勾配溶出法により分離する方法[Biochem.Biophys Acta, vol.130, pp.1-11, 1966]やシリカゲル樹脂を用い有機溶媒で分離する方法などが知られているが、これらの方法は操作が非常に煩雑であり、しかも、工業的規模で連続的に大量処理するのに適した方法とはいえない。したがって、工業的規模で大量かつ簡便にシアリルラクトースを結合様式の違いにより分離する方法が求められていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、シアリルラクトースを結合様式の違いにより分離する方法について、鋭意研究を進めたところ、擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）を用いて処理することにより、従来なし得なかった工業的規模で大量かつ簡便にシアリルラクトースを結合様式の違いにより分離することが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）を用いてシアリルラクトースを結合様式の違いにより分離する方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、先に擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）を用い酸性オリゴ糖であるグルクロン酸含有オリゴ糖を連続的に分離する方法について提案した [特開平6-253879号公報] 。また、擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）を用いシアリルラクトースを連続的に分離する方法についても提案している [特願平5-252462号] 。そして、これらの擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）を用い糖質を連続的に分離する方法を研究することにより蓄積した知見を基に、シアリルラクトースを結合様式の違いにより分離する方法について鋭意研究を重ねたところ、擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）を用い、アニオン交換樹脂を充填剤として処理条件を最適化することにより、ＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとを連続的に分離、回収することができるということを見出した。
【０００８】
本発明では、シアリルラクトースを結合様式の違いにより分離する際に擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）を用いる。そして、ＳＭＢの充填剤としてアニオン交換樹脂を用いる。アニオン交換樹脂については、特に限定はないが、強塩基性アニオン交換樹脂Ｉ型であり、好ましくは、架橋度２〜８％で対イオンが酢酸型のものを用いると良い。なお、この強塩基性アニオン交換樹脂Ｉ型の樹脂としては、アンバーライト XT-5021（オルガノ社製）、Dowex 1x4 （ダウ・ケミカル社製）、ダイヤイオン SAIIA (三菱化学社製）などが市販されている。
【０００９】
ＳＭＢの溶離液については、pHが１〜10の範囲のものであれば特に限定はないが、好ましくは、pHが４〜５の酢酸緩衝液を用いると良い。なお、酢酸緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液や酢酸アンモニウム緩衝液などを例示できる。また、塩濃度が0.01〜1.5Mの範囲のものであれば特に限定はないが、好ましくは、塩濃度が0.05〜0.1Mのものを用いると良い。
【００１０】
擬似移動床式クロマト分離装置（ＳＭＢ）を用い、このような条件で処理することで、工業的規模で大量かつ簡便にシアリルラクトースを結合様式の違いにより分離することができる。
【００１１】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
なお、シアリルラクトースについては、薄層クロマトグラフィー（Art13927、メルク社製）により、ｎ−プロパノール：アンモニア：水＝120:2.5:57.5の展開液で展開し、レゾルシノールで発色させてクロマトスキャナー（CS-930、島津製作所製）で定量した。
【００１２】
【参考例１】
限外濾過装置で脱脂乳から蛋白質を除去し、シーディングにより生成した乳糖結晶を除去した乳糖結晶母液をエバポレーターで固形率30％となるまで濃縮したものをＳＭＢ処理液とした。また、脱イオン水をＳＭＢ溶離液とした。なお、ＳＭＢは、カラム直径25mm長さ460mm の８塔型で、各々、カチオン交換樹脂 UBK510L（三菱化学社製）の対イオンをＮａ型として充填したものを用いた。ＳＭＢの運転条件は、ＳＭＢ処理液供給量3.4ml/分、ＳＭＢ溶離液供給量5.8ml/分、エキストラクト抜き出し量5.0ml/分、ラフィネート抜き出し量4.2ml/分、カラム温度10℃、ステップ時間7.40分とした。
【００１３】
以上のＳＭＢ処理条件で乳糖結晶母液濃縮液46.5リットルを処理したところ、ラフィネートにシアリルラクトースを含む画分69.0リットルを得た。次に、このラフィネートをロータリーエバポレーターで固形率30％となるまで濃縮した後、再びＳＭＢ処理液とし、同様の条件で処理した。このようにして得られたシアリルラクトース画分を濃縮し、凍結乾燥して純度99％のシアリルラクトース900gを得た。
【００１４】
【実施例１】
参考例１のようにして得られた牛乳由来のシアリルラクトース中に混在するＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとの分離を試みた。なお、ＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとの存在比は13：２であった。
【００１５】
牛乳由来のシアリルラクトースを含む溶液を 0.07M酢酸緩衝液(pH 4.5)で固形率が10％となるよう希釈し、ＳＭＢ処理液とした。また、 0.07M酢酸緩衝液(pH 4.5)をＳＭＢ溶離液とした。なお、ＳＭＢは、カラム直径30mm長さ500mm の８塔型で、各々、アニオン交換樹脂 Dowex 1x4（ダウ・ケミカル社製）を充填したものを用いた。ＳＭＢの運転条件は、ＳＭＢ処理液供給量 1.64ml/分、ＳＭＢ溶離液供給量 3.99ml/分、エキストラクト抜き出し量 2.82ml/分、ラフィネート抜き出し量 2.82ml/分、カラム温度15℃、ステップ時間159.56分とした。
【００１６】
以上のＳＭＢ処理条件でシアリルラクトース含有溶液 7.1リットルを処理したところ、ラフィネートにＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃを含む画分12.2リットル及びエキストラクトにＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとを含む画分12.2リットルをそれぞれ得た。次に、このラフィネート及びエキストラクトそれぞれをロータリーエバポレーター（柴田科学機械工業社製）で３リットルとなるまで濃縮した後、電気透析装置（TS-2型、トクヤマ社製）で脱塩した。そして、凍結乾燥し、純度99％のＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ粉末246g及びＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとの存在比が３：７の白色粉末320gを得た。
【００１７】
【実施例２】
実施例１のようにして得られたＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとの存在比が３：７の白色粉末を0.5M酢酸ナトリウムで固形率が５％となるよう溶解し、ＳＭＢ処理液とした。また、0.5M酢酸ナトリウム溶液をＳＭＢ溶離液とした。なお、ＳＭＢは、カラム直径30mm長さ500mm の８塔型で、各々、アニオン交換樹脂 XT5021(三菱化学社製）を充填したものを用いた。ＳＭＢの運転条件は、ＳＭＢ処理液供給量 0.72ml/分、ＳＭＢ溶離液供給量 3.07ml/分、エキストラクト抜き出し量 1.90ml/分、ラフィネート抜き出し量 1.90ml/分、カラム温度15℃、ステップ時間 26.04分とした。
【００１８】
以上のＳＭＢ処理条件でＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとを３：７の割合で含有する溶液 4.0リットルを処理したところ、ラフィネートにＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃを含む画分 10.56リットル及びエキストラクトにＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃを含む画分 10.56リットルをそれぞれ得た。次に、このラフィネート及びエキストラクトそれぞれをロータリーエバポレーターで３リットルとなるまで濃縮した後、電気透析装置で脱塩した。そして、凍結乾燥し、純度99％のＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ粉末7.8g及びＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとの存在比が１：４の白色粉末 55gを得た。
【００１９】
【実施例３】
実施例２のようにして得られたＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとの存在比が１：４の白色粉末を 0.07M酢酸緩衝液(pH 4.5)で固形率が10％となるよう溶解し、ＳＭＢ処理液とした。また、 0.07M酢酸緩衝液(pH 4.5)をＳＭＢ溶離液とした。なお、ＳＭＢは、カラム直径30mm長さ500mm の８塔型で、各々、アニオン交換樹脂 Dowex 1x4（ダウ・ケミカル社製）を充填したものを用いた。ＳＭＢの運転条件は、ＳＭＢ処理液供給量 1.64ml/分、ＳＭＢ溶離液供給量 3.99ml/分、エキストラクト抜き出し量 2.82ml/分、ラフィネート抜き出し量 2.82ml/分、カラム温度15℃、ステップ時間159.56分とした。
【００２０】
以上のＳＭＢ処理条件でＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとを１：４の割合で含有する溶液 3.0リットルを処理したところ、ラフィネートにＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃを含む画分5.15リットル及びエキストラクトにＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃを含む画分5.15リットルをそれぞれ得た。次に、このラフィネート及びエキストラクトそれぞれをロータリーエバポレーターで２リットルとなるまで濃縮した後、電気透析装置で脱塩した。そして、凍結乾燥し、純度99％のＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ粉末 22g及びＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとの存在比が１：２の白色粉末 25gを得た。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の方法によると、シアリルラクトース中に混在するＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃとＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃとを工業的規模で大量かつ簡便に分離することができる。したがって、高純度のＳＡα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ及びＳＡα２→６Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃを大量かつ安価に提供できるので、これらの素材を飲食品、医薬品、化粧品、飼料などに利用することが容易となる。