(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡであって、アガロースゲル電気泳動による測定で６００ｂｐの長さを有し、かつ、ＡＴＣＣ第９８３６６号寄託物中のプラスミドｐＳｐｅＩＲ７をＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより取得可能である前記単離ＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載の単離ＤＮＡを挿入されたベクターを含む組み換えＤＮＡベクター。
【請求項３】
ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼをコードする単離ＤＮＡであって、
ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動による測定で６００ｂｐの長さを有し、かつ、ＡＴＣＣ第９８３６６号寄託物中のプラスミドｐＳｐｅＩＲ７をＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより取得可能であり；および
ＳｐｅＩメチラーゼをコードする単離ＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動による測定で１ｋｂｐの長さを有し、かつ、ＡＴＣＣ第９８３６６号寄託物中のプラスミドｐＳＹＸ２０ＳｐｅＩＭ９をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断することにより取得可能である、前記単離ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載の単離ＤＮＡを含むクローニングベクター。
【請求項５】
請求項２または４に記載のクローニングベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼを作製する方法であって、請求項２または４に記載のベクターで形質転換した宿主細胞を前記エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下に培養することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組み換えＤＮＡ、並びに該ＤＮＡからのＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼの作製に係わる。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、細菌において天然に生じる一群の酵素である。この制限エンドヌクレアーゼは、他の細菌成分から精製すれば実験室において、ＤＮＡ分子を切断して分子クローニング及び遺伝子特性解明のための正確な断片を得るのに用いることができる。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子中の特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、これに結合することによって機能する。結合した制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子を、認識配列の途中または一端において切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列への親和性を有する。今日までに調べられた幾百もの細菌種の中から、独自の特異性を具えた制限エンドヌクレアーゼが１８０余り同定されている。
【０００４】
細菌には、各種毎に精々少数の制限エンドヌクレアーゼしか有しない傾向が有る。エンドヌクレアーゼは典型的には、当該エンドヌクレアーゼが由来する細菌に従って命名される。即ち、例えばＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ種は、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩ及びＤｒａＩＩＩと命名された三つの異なるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素は配列ＴＴＴＡＡＡ、ＰｕＧＧＮＣＣＰｙ及びＣＡＣＮＮＮＧＴＧをそれぞれ認識及び切断する。他方、大腸菌ＲＹ１３は、配列ＧＡＡＴＴＣを認識するＩＩ型制限酵素ＥｃｏＲＩただ一つしか合成しない。
【０００５】
自然界では、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の繁殖において保護的役割を果たすと考えられる。制限エンドヌクレアーゼによって細菌は、前記酵素が存在しなかったら細菌を破壊し、または細菌に寄生するであろうウイルス及びプラスミドなどの外来ＤＮＡ分子への感染に耐性となり得る。このような耐性は制限エンドヌクレアーゼが、侵襲する外来ＤＮＡ分子を認識配列が出現する度に切断することによって実現される。前記のように行なわれる切断によって、感染遺伝子の多くは機能不能となり、ＤＮＡは非特異的ヌクレアーゼによって更に分解されるようになる。
【０００６】
細菌保護系の第二の要素に修飾メチラーゼが有る。この酵素は制限エンドヌクレアーゼを補足し、細菌が細菌自体のＤＮＡを外来の感染ＤＮＡから区別して保護することを可能にする手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識してこれに結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに前記配列内のいずれかのヌクレオチドをメチル基の付加によって化学的に修飾する。メチル化後、認識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって切断されない。細菌細胞のＤＮＡは、前記細胞が有する修飾メチラーゼの活性に基づき常に修飾されている。従って、内在制限エンドヌクレアーゼの存在には非感受性である。制限エンドヌクレアーゼによる認識及び切断に対して感受性であるのは修飾されていない、従って確実に外来のＤＮＡのみである。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現によって今や、遺伝子をクローン化し、それによって該遺伝子がコードするタンパク質及び酵素を通常の精製技術で得られるよりも大量に生産することができる。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する上での重要点は、前記クローンが１０-3から１０-4といった低い頻度でしか出現しない場合に「ショットガン」操作によって派生させた複雑な「ライブラリー」即ちクローン集団内で前記クローンを同定する簡単でかつ確実な方法を開発することである。その方法は好ましくは、不要な大部分のクローンを破壊する一方で望ましい稀少クローンを生存させるような選択性を有するべきである。
【０００８】
ＩＩ型制限−修飾系はいよいよ頻繁にクローン化されている。最初にクローン化された系では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する手段としてバクテリオファージ感染が用いられた［その開示が本明細書に参考として含まれるＫｏｓｙｋｈ等，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ  １７８，  ｐｐ．７１７−７１９，  １９８０（ＥｃｏＲＩＩの場合）；  Ｍａｎｎ等，  Ｇｅｎｅ  ３，  ｐｐ．９７−１１２，  １９７８（ＨｈａＩＩの場合）；  Ｗａｌｄｅｒ等，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７８，  ｐｐ．１５０３−１５０７，  １９８１（ＰｓｔＩの場合）参照］。細菌は、該細菌に制限−修飾系が存在することによりバクテリオファージへの感染に対して耐性となり得るので、クローン化制限−修飾遺伝子を移入した細胞は原則として、ファージに曝露したライブラリーから生存細胞として選択的に単離できる。しかし、この方法には限られた価値しか無いことが判明した。特に、クローン化された制限−修飾遺伝子は選択的生存の実現に十分なファージ耐性を必ずしももたらさないことが明らかになった。
【０００９】
別のクローニング法では、プラスミド保持性（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）であることを最初に解明した系を大腸菌クローニングプラスミドに移入する［その開示が本明細書に参考として含まれるＢｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ等，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  １２，  ｐｐ．３６５９−３６７６，  １９８４（ＥｃｏＲＶの場合）；  Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０，  ｐｐ．４０２−４０６，  １９８３（ＰａｅＲ７の場合）；  Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ及びＲｏｙ，  Ｇｅｎｅ  １９，  ｐｐ．３５５−３５９，  １９８２；  Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ等，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６４，  ｐｐ．５０１−５０９，  １９８５（ＰｖｕＩＩの場合）参照］。
【００１０】
より多くの系のクローニングに用いられている第三の方法では、活性なメチラーゼ遺伝子を選択する［その開示が本明細書に参考として含まれる米国特許第５，２００，３３３号；  及びＫｉｓｓ等，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  １３，  ｐｐ．６４０３−６４２１，  １９８５（ＢｓｕＲＩの場合）を参照されたい］。制限遺伝子と修飾遺伝子とはしばしば近接して連結されているので、これら両遺伝子を同時にクローン化することはしばしば可能である。しかし、上記選択によって常に完全な制限系が得られるとは限らず、メチラーゼ遺伝子しか得られないこともある［その開示が本明細書に参考として含まれるＳｚｏｍｏｌａｎｙｉ等，  Ｇｅｎｅ  １０，  ｐｐ．２１９−２２５，  １９８０（ＢｓｐＲＩの場合）；  Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ等，  Ｇｅｎｅ  ２０，  ｐｐ．１９７−２０４，  １９８２（ＢｃｎＩの場合）；  Ｋｉｓｓ及びＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ  ２１，  ｐｐ．１１１−１１９，  １９８３（ＢｓｕＲＩの場合）；  及びＷａｌｄｅｒ等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８，  ｐｐ．１２３５−１２４１，  １９８３（ＭｓｐＩの場合）参照］。
【００１１】
メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローン化する更に別の方法は、ＤＮＡ損傷についての比色アッセイに基づく（米国特許第５，４９２，８２３号を参照されたい）。メチラーゼに関してスクリーニングを行なう場合、プラスミドライブラリーでＡＰ１−２００などの宿主大腸菌株を形質転換する。メチラーゼの発現により、ＭｃｒＡ+、ＭｃｒＢＣ+またはＭｒｒ+である大腸菌株においてＳＯＳ応答が誘発される。ＡＰ１−２００株はＭｃｒ系及びＭｒｒ系に関して温度感受性であり、大腸菌の損傷誘導性ｄｉｎＤ座に融合したｌａｃＺ遺伝子を有する。メチラーゼまたはエンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする組み換えプラスミドの検出は、ｌａｃＺ遺伝子の制限（ｒｅｓｔｉｃｔｉｖｅ）温度における誘導に基づく。メチラーゼ遺伝子をコードする形質転換体は、Ｘｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上で青色のコロニーとして検出される［その開示が本明細書に参考として含まれるＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚ等，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９，  ｐｐ．１８３１−１８３５，  １９９１；  及びＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚ等，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７３，  ｐｐ．１５０−１５５，  １９９１参照］。同様に、大腸菌株ＥＲ１９９２もｄｉｎＤ１−ｌａｃＺ融合体を有するが、この菌株はメチル化依存性制限系ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣ及びＭｒｒを欠いている。上述のシステム（「エンド−ブルー（ｅｎｄｏ−ｂｌｕｅ）」法と呼称）においてエンドヌクレアーゼ遺伝子は、その同種（ｃｏｇｎａｔｅ）メチラーゼの不在下に検出でき、前記不在下ではエンドヌクレアーゼは宿主細胞ＤＮＡを損傷し、ＳＯＳ応答を誘発する。ＳＯＳ応答を誘発された細胞は、Ｘｇａｌを補充されたＬＢ寒天プレート上で紺色のコロニーを形成する（その開示が本明細書に参考として含まれるＸｕ等，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  ｐｐ．２３９９−２４０３，  １９９４参照）。
【００１２】
単純なメチラーゼ選択法は時に、様々な障害に起因してメチラーゼ（及び／またはエンドヌクレアーゼ）クローンをもたらさないことがある。例えば、その開示が本明細書に参考として含まれるＬｕｎｎｅｎ等，  Ｇｅｎｅ  ７４（１），ｐｐ．２５−３２，  １９８８を参照されたい。制限−修飾遺伝子のクローニングにとっての潜在的障害の一つは、まだ修飾によって保護されていない宿主にエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入する試みの中に存在する。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを単一クローンとして一緒に導入する場合、メチラーゼは宿主ＤＮＡを、エンドヌクレアーゼが前記ＤＮＡを切断する機会を得る前に修飾して保護しなければならない。従って、場合によっては、上記両遺伝子をまずメチラーゼ遺伝子、次いでエンドヌクレアーゼ遺伝子と逐次クローン化することしかできないこともある（米国特許第５，３２０，９５７号参照）。
【００１３】
制限−修飾系のクローニングにとっての障害は、或る種の大腸菌株がシトシンまたはアデニン修飾に対して好ましくない反応を示すという発見中にも認められる。上記大腸菌株は、メチル化されたシトシン（その開示が本明細書に参考として含まれるＲａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３，  ｐｐ．９０７０−９０７４，  １９８６参照）またはメチル化されたアデニン（その開示が本明細書に参考として含まれるＨｅｉｔｍａｎ及びＭｏｄｅｌ，  Ｊ．  Ｂａｃｔ．  １９６，  ｐｐ．３２４３−３２５０，  １９８７；  Ｒａｌｅｉｇｈ，  Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ及びＲｅｖｅｌ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２，  ｐｐ．２７９−２９６，  １９８９；Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ等，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７３，  ｐｐ．５２０７−５２１９，  １９９１参照）を含むＤＮＡを破壊する系を有する。このような菌株中へシトシン特異的またはアデニン特異的メチラーゼ遺伝子をクローン化することは当該遺伝子単独でも、また対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒にでも不可能である。この問題を回避するには、上記のような系を欠く突然変異大腸菌株（ＭｃｒＡ-及びＭｃｒＢ-またはＭｒｒ-）を用いなければならない。
【００１４】
第三の潜在的障害は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及びメチラーゼ遺伝子の中には由来生物と大腸菌との、プロモーター及びリボソーム結合部位の相違などといった転写機序の相違に起因して大腸菌では発現しないものが有ることである。メチラーゼ選択法では、大腸菌においてメチラーゼが、遺伝子を保持するプラスミドの少なくとも幾分かを完全に保護するのに十分な量で発現されなければならない。
【００１５】
精製された制限エンドヌクレアーゼと、この酵素ほどではないにせよ修飾メチラーゼとは実験室における遺伝子の特性解明に有用な手段であるので、これらの酵素を大量に合成する菌株を組み換えＤＮＡ技術によって得ることが商業的に求められている。上記のような菌株は、精製作業を簡略化し、また商業的有用量での生産の手段を提供するので有用である。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組み換えＤＮＡ、並びにこのような組み換えＤＮＡから作製した酵素を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種から取得可能な、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼの遺伝子をコードする組み換えＤＮＡと、この組み換えＤＮＡから前記酵素を作製する関連方法とを提供する。本発明はまた、ＤＮＡ配列５′ＡＣＴＡＧＴ  ３′を認識し、前記認識配列のＣの５′側のホスホジエステル結合を切断して５′側に４塩基延長部分を創出する酵素である制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩを発現させる形質転換宿主も提供する。本発明により作製したＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、通常の技術で作製した制限エンドヌクレアーゼ調製物中に通常見出される汚染物質を含まない。
【００１８】
ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子ではなくＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子が、メチラーゼ選択と呼称される技術に概ね従って取得された（その開示が本明細書に参考として含まれる米国特許第５，２００，３３３号参照）。しかし、メチラーゼ選択によって得られたクローンのうちで検出可能なＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を発現したものは無かった。メチラーゼクローンを配列決定し、ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子を他のＮ６−アデニンメチラーゼとの相同性に基づき同定することが行なわれた。クローンはＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子の５′側に約３ｋｂのＤＮＡを有した。しかし、クローン化ＤＮＡの３′側はメチラーゼ遺伝子の３′末端のごく近傍で終わっていた。メチラーゼクローンが検出可能なＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ活性を示さなかったので、エンドヌクレアーゼ遺伝子はおそらくメチラーゼ遺伝子の３′側に位置すると推測された。従って、ＳｐｅＩメチラーゼクローンの３′末端に続くＤＮＡを逆向き（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ技術によってＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種から増幅し、配列決定した。
【００１９】
ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、その位置を確定して正に（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ）同定するべく、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種から得て高度に精製したＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。このアミノ酸配列を、メチラーゼ選択技術によって得られたメチラーゼクローンのＤＮＡ配列のアミノ酸翻訳と比較したところ、整合は認められなかった。推定アミノ酸配列がＳｐｅＩエンドヌクレアーゼのＮ末端アミノ酸配列と整合する読み取り枠は、逆向きＰＣＲ技術によって得られた、メチラーゼ遺伝子の３′側に位置するＤＮＡ配列中に観察された。エンドヌクレアーゼ読み取り枠はメチラーゼ遺伝子に対して収斂する（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）向きを有しており、該読み取り枠の直前の位置には制御タンパク質即ちＣタンパク質読み取り枠が観察された。次に、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅し、発現ベクターに連結し、これを、別の相容性ベクターに載せたＳｐｅＩメチラーゼで予め修飾した宿主に導入した。その後、エンドヌクレアーゼ遺伝子及びメチラーゼ遺伝子を移入した宿主を増殖させ、誘導し、これを回収してＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ生産に用いた。
【００２０】
ＳｐｅＩ制限−修飾系をクローン化する好ましい方法は、メチラーゼ選択法に従ってメチラーゼ陽性クローンを得ること、ＳｐｅＩメチラーゼ陽性クローンのＤＮＡ配列を決定すること、メチラーゼ遺伝子の３′側に隣接するＤＮＡを逆向きＰＣＲ技術で増幅すること、及び前記ＤＮＡを配列決定することから成る。Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種由来のＳｐｅＩエンドヌクレアーゼタンパク質をほぼ均質に精製し、Ｎ末端アミノ酸配列を決定する。ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列データに基づきＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定する。次に、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種ゲノムＤＮＡから完全な遺伝子を増幅し、これをｐＲＲＳ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）などの発現ベクター中に連結することによってＳｐｅＩエンドヌクレアーゼを発現させる。構築物を、ｐＳＹＸ２０（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）などといった別の相容性プラスミド上で発現するＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子の移入によりＳｐｅＩ部位において予め修飾した宿主に導入する。ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子を移入した宿主を増殖させ、適当な発現条件で誘導し、細胞を回収し、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼを精製することによってＳｐｅＩエンドヌクレアーゼを得る。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼをコードする組み換えＤＮＡ、並びにこのような組み換えＤＮＡから作製した酵素を提供する。
【００２２】
Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種由来のＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングは好ましいことが判明した。メチラーゼ選択操作によってメチラーゼクローンを得たが、このクローンはエンドヌクレアーゼ遺伝子をもたらさなかった。メチラーゼ選択を行なうべく、ＳｐｅＩ部位を有する１２ｂｐオリゴマーをｐＵＣ１９のＳｓｐＩ及びＨｉｎｃＩＩ部位に挿入してベクターｐＳｓｐＩＨｉｎｃＩＩ／ＳｐｅＩを形成することにより、２個のＳｐｅＩ部位を有するベクターを創出した。ｐＳｓｐＩＨｉｎｃＩＩ／ＳｐｅＩベクター中に、ＰｓｔＩによって部分的に切断したＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種ＤＮＡの「ショットガン」ライブラリーを構築した。精製したショットガンプラスミドライブラリーのＤＮＡをＳｐｅＩエンドヌクレアーゼで消化し、これを大腸菌に戻して該菌を形質転換した。機能性ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子を含むクローンは、メチラーゼ修飾によってＳｐｅＩ消化から保護される。このように、メチラーゼ遺伝子を含むクローンはエンドヌクレアーゼに攻撃されても無傷で生存するので、前記クローンの選択が可能となる。続いて、生存クローンから得たＤＮＡを精製し、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼによる消化からの保護によって活性メチラーゼ遺伝子の存在を確認した。同等の４ｋｂ挿入部分を有する二つのクローンがＳｐｅＩ消化から保護されたことが判明した。メチラーゼ遺伝子の位置及び向きを確認するべく、上記二つのクローンのうちでｐＳｐｅＩＭ１と命名した方に対してＤＮＡ配列決定を行なった。ＤＮＡ配列の推定アミノ酸翻訳から、ｍ6Ａβ型アデニンメチラーゼと一致する二つのアミノ酸配列モチーフを含む読み取り枠が明らかとなった（その開示が本明細書に参考として含まれるＷｉｌｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１６，  ｐｐ．２５９−２７９，  １９９２参照）。
【００２３】
メチラーゼ選択によって得られたメチラーゼクローンをＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ活性について試験したが、検出可能なエンドヌクレアーゼ活性は観察されなかった。ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子がメチラーゼクローン上に存在はしても大腸菌において検出可能なレベルで発現しなかったか、またはメチラーゼクローンがＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を含まなかったためである。
【００２４】
ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、その位置を確定して正に同定するべく、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定し、またメチラーゼ遺伝子の３′側に隣接するＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種ＤＮＡに関するＤＮＡ配列情報を求めた。ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を得るために、ＳｐｅＩタンパク質をほぼ均質に精製するタンパク質精製法を開発した。自動配列決定装置における精製タンパク質の逐次分解によって、最初の２８アミノ酸残基を明らかにした。メチラーゼ遺伝子の３′側に位置するＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種ＤＮＡに関するＤＮＡ配列情報は、前記ＤＮＡを逆向きＰＣＲ技術（その開示が本明細書に参考として含まれるＯｃｈｍａｎ等，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２０，  ｐ．６２１，  １９８８；  Ｔｒｉｇｌｉａ等，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６，  ｐ．８１８６，  １９８８；  並びにＳｉｌｖｅｒ及びＫｅｅｒｉｋａｔｔｅ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｓｕｐｐｌ．）  １３Ｅ，  ｐ．３０６，  ＡｂｓｔｒａｃｔＮｏ．  ＷＨ２３９，  １９８９参照）で増幅し、増幅産物を配列決定することにより得た。その後、上記ＤＮＡ配列の６フレームアミノ酸翻訳とＳｐｅＩエンドヌクレアーゼタンパク質のＮ末端アミノ酸配列とを比較することによって、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を正に同定した。
【００２５】
ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の５′末端に隣接する２４６ｂｐの読み取り枠（ＯＲＦ）が、今日までに発見された他の幾つかの制限−修飾系の制御（Ｃ）遺伝子との広範な相同性を示すことも判明した。即ち、前記ＯＲＦはＳｐｅＩ制御遺伝子であると考えられる。図２に、ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子及び推定ＳｐｅＩ制御遺伝子の位置及び向きを示す。
【００２６】
ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼをクローン化して発現させるべく、二段階クローニング法を試みた。ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を移入した細菌宿主の安定化のため、最初に宿主のＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む発現ベクターと相容性である別のベクターに載せたＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子の導入によりＳｐｅＩ部位においてメチル化した。そのために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計及び合成してＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子を増幅し、この遺伝子の発現をｐＳＹＸ２０ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）中で促進した。メチラーゼ遺伝子はＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種ＤＮＡから増幅し、増幅産物を適当な制限酵素で切断したものを、同じ制限酵素で予め切断したベクターｐＳＹＸ２０中に連結し、得られた構築物で大腸菌ＥＲ２４２７（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）宿主細胞を形質転換した。個々の形質転換体を採取し、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ切断からの保護について分析した。
【００２７】
制御遺伝子を伴わないエンドヌクレアーゼをクローン化するべく、合成ＤＮＡプライマーを設計してＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を正確に増幅した。順配向プライマーは次の諸要素、即ちＮｓｉＩクローニング部位、ｌａｃＺタンパク質の翻訳を終了させる、ｌａｃＺ遺伝子と同枠内に有る終結コドン、強力に認識されるリボソーム結合部位、前記ｒｂｓとＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンとの間に位置する７ヌクレオチドスペーサー、及びＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種ＤＮＡと相補的なハイブリダイゼーションのための配列を有した。３′（逆配向）プライマーは、エンドヌクレアーゼ遺伝子のまさに３′末端にハイブリダイズしてメチラーゼクローンとの重複を最小限に留めるように設計した。このプライマーにはＢａｍＨＩによって切断される制限部位を導入し、それによってクローニングを容易にした。Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種ゲノムＤＮＡからエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅した。増幅したＤＮＡをＮｓｉＩ及びＢａｍＨＩで切断したものを、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで予め切断し、かつゲル精製した発現ベクターｐＲＲＳ中に連結した。連結反応混合物で、ｐＳＹＸ２０に挿入したＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子を移入した大腸菌ＥＲ２４２７コンピテント細胞を形質転換した。所望の大きさの挿入部分を有するベクターはミニプレップ操作で同定した。得られたクローンを対数期半ば（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）まで増殖させ、ＩＰＴＧで誘導した。その後、細胞を遠心によって回収し、音波処理用緩衝液中に再懸濁させ、音波処理によって溶解させた。抽出物をＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ活性についてアッセイした。一つのＳｐｅＩ発現宿主即ちｐＳｐｅＩＲ７を増殖させてＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ生産に用いた。ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼは、後述するタンパク質精製法で精製することができる。
【００２８】
本明細書に開示した、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子を好ましくクローン化し、かつ発現させる方法を図１に示す。この方法は次の諸ステップを含む。
【００２９】
１．  ＣＧＹＡ培地（ＡＴＣＣ  ＃１１０３）を入れたフラスコ内でＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種（ＡＴＣＣ  ＃１３９２３）を増殖させ、細胞を溶解させ、ゲノムＤＮＡを精製する。
【００３０】
２．  Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種ＤＮＡのランダムライブラリーを構築する。ＳｐｅＩ部位を有するＤＮＡオリゴマーをｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩ及びＳｓｐＩ部位に導入することにより、２個のＳｐｅＩ部位を有するベクターｐＳｓｐＩＨｉｎｃＩＩ／ＳｐｅＩを構築する。Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種ＤＮＡをＰｓｔＩで部分的に消化し、ベクターｐＳｓｐＩＨｉｎｃＩＩ／ＳｐｅＩ中に連結する。連結したＤＮＡで大腸菌を形質転換し、形質転換体をプールし、プラスミド集団を精製してライブラリーを得る。
【００３１】
３．  メチル化選択法を用いてＳｐｅＩメチラーゼクローンを選択する。ＰｓｔＩライブラリーをＳｐｅＩエンドヌクレアーゼで消化する。ＳｐｅＩ制限プラスミドを大腸菌に戻して該菌を形質転換し、それによって切断されなかったクローンを回収する。ＳｐｅＩ消化後も生存するプラスミドがもたらす形質転換体を幾つか個別に増殖させ、前記プラスミドのミニ調製物（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を作製する。プラスミドを、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ消化に対する耐性に関して分析する。二つの同等クローンがＳｐｅＩ切断から保護されたことが判明する。これらのクローンはいずれも４ｋｂ挿入部分を有する。メチラーゼ陽性クローンをＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性についてアッセイするが、活性を検出することはできない。
【００３２】
４．  ＳｐｅＩメチラーゼクローンの配列決定：  クローンｐＳｐｅＩＭ１の４ｋｂ挿入部分のＤＮＡの一部を配列決定する。ｍ6Ａβ型メチラーゼの保存領域（モチーフＩ及びＩＶ）と相同のアミノ酸配列を有する、メチオニンから始まる読み取り枠が観察され、これをＳｐｅＩメチラーゼとして同定する。メチラーゼ読み取り枠は３′末端において開き、ベクター中へと続いていた（回収したメチラーゼクローンはＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子の最後の４個のアミノ酸コドンを欠くことが後に判明した）。
【００３３】
５．  メチラーゼ遺伝子の３′側に隣接するＤＮＡを、ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子内でハイブリダイズするプライマーを用いる逆向きＰＣＲ技術で増幅する。逆向きＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列を決定する。
【００３４】
６．  Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種からＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼタンパク質を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓで開発されたタンパク質精製技術の組み合わせによってほぼ均質に精製する（実施例のステップ６参照）。上記のように精製したエンドヌクレアーゼはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の際にほぼ均質であり、約２０ｋＤａの見掛けの分子量を有する。
【００３５】
７．  上記エンドヌクレアーゼのアミノ末端アミノ酸配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）４７０Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて調べる（その開示が本明細書に参考として含まれるＰ．  Ａ．  Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ，  Ｃ．  Ｊ．  Ｋｅａｔｉｎｇ，  Ｌ．  Ｓ．  Ｍｏｒａｎ，  Ｂ．  Ｅ．  Ｓｌａｔｋｏ，  Ｌ．  Ｊ．  Ｈｏｒｎｓｔｒａ及びＪ．  Ｓ．  Ｂｅｎｎｅｒ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７３，  ｐｐ．５２０７−５２１９，  １９９１参照）。
【００３６】
８．  ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡ配列のアミノ酸翻訳をＳｐｅＩエンドヌクレアーゼのＮ末端アミノ酸配列から得られたアミノ酸配列データと比較することによってＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定する。ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とは互いに対して収斂する向きを有し、その３′末端同士が１４アミノ酸残基だけ重複する。エンドヌクレアーゼ遺伝子の５′側に該遺伝子と同じ向きを有する、８２アミノ酸から成るペプチドをコードする読み取り枠が位置する。このＯＲＦのＤＮＡ配列は他の幾つかの制限−修飾系中に見出される制御遺伝子と高度に相同であり、即ち前記ＯＲＦはＳｐｅＩ制御遺伝子と同定される。
【００３７】
９．  ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現：
Ａ．全般的考察
制限遺伝子を過剰発現させ得る方法は幾つか存在する。ＤＮＡ配列及び詳細な切断地図に関する情報を利用することにより、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を過剰発現させる最良の方法を決定できる。
【００３８】
或る過剰発現方法は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の制限エンドヌクレアーゼＮ末端に対応する末端に直接ハイブリダイズするプライマーと、前記遺伝子から幾分下流（３′側）にハイブリダイズするプライマーとを設計し、それによってポリメラーゼ連鎖反応を用いて完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅することを含む。得られたＤＮＡ断片は、ｐＡＩＩ１７やｐＲＲＳといった発現ベクターの誘導性プロモーター（Ｔ７またはＰｌａｃＵＶ５）の直ぐ下流に挿入し得る。
【００３９】
あるいはまた、過剰発現はｐＡＧＲ３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）のＰｔａｃなどの、大腸菌によって強力に認識されるプロモーターを制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点の直前に挿入することによっても実現可能である。前記挿入は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点及び終了点の近傍に適当な制限部位を見出すと共にｐＡＧＲ３のプロモーターの近傍にも対応する制限部位を見出し、ｐＡＧＲ３に制限遺伝子を、Ｐｔａｃプロモーターと前後に並び合うように導入することによって行ない得る。用い得る他の調節プロモーターに、ｐＵＣ１９及びｐＢＲ３２２誘導体のＰｌａｃＵＶ５（その開示が本明細書に参考として含まれるＦｕｌｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  １９，  ｐｐ．４３−５４，  １９８２参照）及びＩＰＬ（その開示が本明細書に参考として含まれるＳｈｉｍａｔａｋｅ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５４，  ｐ．１２８，  １９８１参照）が有る。加えて、強力なリボソーム結合部位（その開示が本明細書に参考として含まれるＳｈｉｎｅ及びＤａｌｇａｒｎｏ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７１，  ｐｐ．３４２−３４６，  １９７４参照）を遺伝子の前に配置して発現を促進することも可能である。
【００４０】
制限エンドヌクレアーゼを過剰発現する安定なクローンを得るために、通常宿主を制限エンドヌクレアーゼ消化から予め保護する。本発明ではこの保護を、別のプラスミドにおいてＳｐｅＩメチラーゼをクローン化することによって行なう。用いるプラスミドは発現ベクターと相容性でなければならない。また、メチラーゼは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子が発現する制限エンドヌクレアーゼによる消化から宿主のゲノムを保護するレベルで産生されなければならない。
【００４１】
遺伝子のＤＮＡ配列を部位特異的突然変異誘発によって、または遺伝子自体の再合成によって変更し、それによって大腸菌においてより効率的に利用されるコドンを用いることが可能である（その開示が本明細書に参考として含まれるＩｋｅｍｕｒａ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５１，  ｐｐ．３８９−４０９，  １９８１参照）。
【００４２】
Ｂ．相容性ベクターにおけるＳｐｅＩメチラーゼのクローニング
ＤＮＡプライマーを設計及び合成してＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子を増幅する。順配向プライマーは次の諸要素、即ちクローニングを容易にするＢａｍＨＩ部位、テトラサイクリン遺伝子の翻訳を終了させる終結コドン、共通大腸菌リボソーム結合部位、前記ｒｂｓとＳｐｅＩメチラーゼのＡＴＧ開始コドンとの間に位置する７ヌクレオチドスペーサー、及びＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子ＤＮＡ配列と整合するハイブリダイゼーションのための１９ヌクレオチドを有する。逆配向プライマーは、クローニングを容易にするＳａｌＩ部位、及びＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子の３′末端部分のＤＮＡ配列と整合する１９ヌクレオチドを有する。これらのプライマーを用いてメチラーゼ遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅し、ベクターｐＳＹＸ２０（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）中へクローン化する。個々のクローンをミニプレップ処理し、所望の大きさの挿入部分を有するプラスミドをメチラーゼ発現に関して検査する。この検査は、ｐＳＹＸ２０メチラーゼ構築物を移入した大腸菌細胞に１個のＳｐｅＩ部位を有するベクターＬｉｔｍｕｓ３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）を導入し、ミニプレップ処理し、ＳｐｅＩで消化することによって行なう。検査したクローンはいずれも、プラスミドＬｉｔｍｕｓ３８をＳｐｅＩによる消化から完全に保護するのに十分なメチラーゼ活性を発現する。ｐＳＹＸ２０ＳｐｅＩＭ９と命名した単クローンからコンピテント細胞を調製し、これを次のＳｐｅＩエンドヌクレアーゼの発現に用いる。
【００４３】
Ｃ．ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼの発現
ＤＮＡプライマーを設計及び合成してＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅する。順配向プライマーは次の諸要素、即ちＮｓｉＩクローニング部位、ｌａｃＺ遺伝子と同枠内に有る終結コドン、強力な共通大腸菌リボソーム結合部位、前記リボソーム結合部位とＳｐｅＩエンドヌクレアーゼのＡＴＧ開始コドンとの間に位置する７ヌクレオチドスペーサー配列、及びＳｐｅＩエンドヌクレアーゼＤＮＡ配列と整合するハイブリダイゼーションのための２１ヌクレオチドを有する。逆配向（３′）プライマーは、クローニングを容易にするＢａｍＨＩ部位、及びＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種ＤＮＡ由来のエンドヌクレアーゼ遺伝子の３′末端部分と整合するハイブリダイゼーションのための２０ヌクレオチドを有する。これらのプライマーを用いてエンドヌクレアーゼ遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅する。増幅したＤＮＡをＮｓｉＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで予め切断し、かつゲル精製した発現ベクターｐＲＲＳ中に連結する。連結反応混合物で、ｐＳＹＸ２０ＳｐｅＩＭ９を移入した大腸菌ＥＲ２４２７コンピテント細胞を形質転換する。所望の大きさの挿入部分を有するベクターをミニプレップ操作で同定する。同定したクローンを幾つか対数期半ばまで増殖させ、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで１６時間誘導する。その後、細胞を遠心によって回収し、音波処理用緩衝液中に再懸濁させ、音波処理によって溶解させ、抽出物をＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ活性についてアッセイする。このようにして見出し、ｐＳｐｅＩＲ７と命名したＳｐｅＩ発現宿主を増殖させ、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ生産に用いる。
【００４４】
１０．  生産：  過剰発現するＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子と、ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子とを移入した宿主細胞を発酵装置において富裕培地中で増殖させ、適当な抗生物質選択及び誘導を行なうことにより、前記細胞からＳｐｅＩエンドヌクレアーゼを得ることができる。上記操作後、細胞を遠心によって回収し、かつ音波処理によって破壊して、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を有する粗な細胞抽出物を作製する。
【００４５】
１１．  精製：  ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼを含有する粗な細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーといったタンパク質精製技術の組み合わせによって精製する。
【００４６】
上述の諸ステップは本発明実施の好ましい形態ではあるが、これらのステップとして説明した操作を当業者に公知の技術に従って改変し得ることは、当業者には明らかであろう。
【００４７】
【実施例】
本発明の、現在好ましく実施できる具体例を以下の実施例に詳述する。この実施例は説明のためのものであり、該実施例に本発明が、特許請求の範囲各項に記された点以外で限定されるとは看做すべきでないことは理解されよう。
【００４８】
ＳｐｅＩ修飾メチラーゼ遺伝子及びＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
１．ＤＮＡ精製：  Sphaerotilus species（ＡＴＣＣ  ＃１３９２３）のゲノムＤＮＡを調製するために、２５％スクロース、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  ５ｍＬ中で乳鉢と乳棒を用いて細胞壁をすりつぶして、細胞ペースト２８ｇを再懸濁させた。２５％スクロース、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  ４５ｍＬをすりつぶした細胞に加え、次に０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０  ２５ｍＬを加えた。リゾチーム溶液（０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム）２４ｍＬを加え、溶液を３７℃で２時間インキュベートした。次に、溶菌混合液（１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、６２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）４８ｍＬを加え、溶液を再度３７℃で３０分間インキュベートした。平衡化フェノール：クロロホルム（５０：５０，ｖ／ｖ）１容量で該溶液を抽出し、水相を回収し、クロロホルム１容量で２度抽出した。次に、該水溶液を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０  ２Ｌを４回交換して透析した。透析液を３７℃で１時間ＲＮａｓｅ（１００μｇ／ｍＬ）で消化した。５Ｍ  ＮａＣｌ  １／１０容量及び２−プロパノール０．５５容量を添加してＤＮＡを沈殿させ、ガラス棒上に巻きつけた。ＤＮＡを空気乾燥し、濃度約１６０μｇ／ｍＬになるようにＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１５ｍＬに溶解し、４℃で保存した。
【００４９】
２．選択可能ベクターでのSphaerotilus species ＤＮＡのランダムライブラリーの構築
Ａ．選択可能ベクターｐＳｓｐＩＨｉｎｃＩＩ／ＳｐｅＩの構築：
ＳｐｅＩ部位を含む１２個のヌクレオチドＤＮＡオリゴマーを以下の様に合成した。連結を容易にするために５′Ｃ残基をリン酸化した。
【００５０】
ＳｐｅＩリンカー：５′−pCCAACTAGTTGG−３′（配列番号１）
ベクターｐＵＣ１９内の２個の部位、ＳｓｐＩ（２５０１）とＨｉｎｃＩＩ（４２９）に、該リンカーを挿入した。
【００５１】
（１）１個のＳｐｅＩ部位を有するベクターの構築：  最終容量５０μＬの１×ＮＥＢ＃２緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）中で、ｐＵＣ１９  ＤＮＡ  ６μｇを３７℃で２時間ＳｓｐＩ  ２５ユニットで消化した。ウシ腸アルカリホスファターゼ、即ちＣｌＰ（ＮＥＢ＃２９０）１０ユニットを加え、反応液を１時間インキュベートした。酵素を７８℃で２０分間熱不活化させた。最終容量３０μＬの１×リガーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）１２００ユニットを用い、ＳｓｐＩ消化、脱リン酸化ベクター２４０ｎｇ（２μＬ）を、自己アニールしたＳｐｅＩリンカー４．５μｇに連結させた。反応液を１６℃で一晩インキュベートし、次にＥ．ｃｏｌｉ  ＲＲＩ株（ＡＴＣＣ３１３４３）を形質転換させた。形質転換細胞を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（Ｌ−Ｂｒｏｔｈ）寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。ｍｉｎｉｐｒｅｐを行い、精製ＤＮＡをＳｐｅＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、所望の構築物のクローンを同定した。所望構築物を含む一つのクローンをｐＳｓｐＩ／ＳｐｅＩと命名し、以下の工程で使用した。
【００５２】
プラスミドクローンの分析：  １００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬ−ｂｒｏｔｈの１．８ｍＬの培養液に、個々の形質転換菌を植菌し、下記のように、ＢｉｒｎｂｏｉｎとＤｏｌｙの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ７：１５１３（１９７３）（引用により本明細書に含まれるものとする））から適合させた以下のｍｉｎｉｐｒｅｐプラスミド精製方法によって、該形質転換菌が有するプラスミドを調製した。ＳｐｅＩ消化によってリンカーの存在についてプラスミドをアッセイした。
【００５３】
ｍｉｎｉｐｒｅｐ方法：  各培養液１．５ｍＬを８００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース、ｐＨ８．０  ２００μＬに再懸濁した。新たに調製した０．２Ｍ  ＮａＯＨ  ４００μＬ、１％ＳＤＳの溶液４００μＬを各チューブに加え、チューブを振蕩し細胞を溶解した。溶液が清澄化した後、３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．８  ３００μＬを各チューブに加え、振蕩して穏やかに混合した。形成した沈殿を１４，０００ｒｐｍ、４℃、３分間の遠心にかけた。各上清をイソプロパノール７００μＬ含有遠心分離チューブに注ぎ、混合した。チューブを１４，０００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心にかけ、沈殿した核酸をペレットにした。上清を捨て、ペレットを室温で１５分間空気乾燥した。乾燥後、５０μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ含有１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ２５０μＬ中にペレットを溶解し、３７℃で１時間インキュベートし、ＲＮＡを消化した。５Ｍ  ＮａＣｌ  ２５μＬ、次に２−プロパノール１７５μＬを添加して、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを、４℃で５分間の遠心分離で集め、上清を捨て、ペレットを乾燥し、次に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（１×ＴＥ）５０μＬに再溶解した。次に、種々の制限酵素による消化で、プラスミドｍｉｎｉｐｒｅｐを分析した。
【００５４】
（２）２個のＳｐｅＩ部位を有するベクターの構築：  最終容量５０μＬの１×ＮＥＢ＃４緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）中で、ｐＳｓｐ／ＳｐｅＩ  ０．５μｇを３７℃で２時間ＨｉｃＩＩ  ２０ユニットで消化し、次に、上記のようにＣｌＰ  ５ユニットで脱リン酸化した。酵素を７８℃で２０分間熱不活化させた。最終容量３０μＬの１×リガーゼ緩衝液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１２００ユニットを用い、ＨｉｎｃＩＩ消化、脱リン酸化ＤＮＡ４０ｎｇを、ＳｐｅＩリンカー４．５μｇに連結させた。反応液を１６℃で一晩インキュベートし、次にＥ．ｃｏｌｉ  ＲＲＩ株を形質転換させた。形質転換細胞を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。ｍｉｎｉｐｒｅｐを行い、精製ＤＮＡをＳｐｅＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって消化産物を分析して、所望の構築物のクローンを同定した。２個のＳｐｅＩ制限部位を有する所望構築物を含む一つのクローンをｐＳｓｐＩＨｉｃＩＩ／ＳｐｅＩと命名し、ＳｐｅＩゲノムライブラリー構築物用選択可能ベクターとして使用した。
【００５５】
Ｂ．ＳｐｅＩゲノムライブラリーの構築：  最終容量１００μＬの、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ補充ＮＥＢ＃３緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）中で、Sphaerotilus species ゲノムＤＮＡ約１５μｇを、ＰｓｔＩで部分消化し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼの２．７ユニット／μｇＤＮＡ〜０．０１６ユニット／μｇの連続希釈で部分消化を行った。次に、７８℃で２０分間加熱して反応を停止させた。最終容量５０μＬの１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０００ユニットを用いて、ＰｓｔＩ部分消化反応液の各々からの消化ＳｐｅＩゲノムＤＮＡ５μｇを、ベクターｐＳｓｐＩＨｉｎｃＩＩ／ＳｐｅＩ（前もってＰｓｔＩ開裂、ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化、ゲル精製）１μｇに連結させた。反応液を室温で１６時間放置した。次に、各連結反応混合液１０μＬで、Ｅ．ｃｏｌｉＲＲＩ細胞を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＬ−Ｂｒｏｔｈ寒天プレート上に播いた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。合計１４，５００個の別々の形質転換菌を得、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５  １４ｍＬ中にかきとって一緒にプールし、十分に混合した。このプール２ｍＬを用い、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＬ−ｂｒｏｔｈ５００ｍＬに植菌し培養液を３７℃で一晩振蕩しながら増殖させた。４０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で細胞を得た。２５％スクロース、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０  １０ｍＬ中に細胞ペレットを再懸濁させ、次に２５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０  ５ｍＬ及び２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム３ｍＬを添加した。この懸濁液を氷上に１時間放置し、次に溶菌混合液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．０）１２ｍＬを加え、この混合液を氷上に１０分間放置した。溶菌した混合液を１７，０００ｒｐｍ、４℃、４５分間の遠心分離にかけた。上清２２ｇを，ＣｓＣｌ  ２０ｇと１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中の臭化エチジウム５ｍｇ／ｍＬ  １ｍＬと混合した。溶液を２個の５／８インチ×３インチ遠心分離チューブに移し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｔｉ７０ローターで５０，０００ｒｐｍ、１７℃、３０時間の遠心を行った。バンドを紫外線光で照射し、注射器と注射針を用いてプラスミドを集めて、プラスミドを単離した。２個のチューブからのサンプルをプールし、緩衝液飽和、冷Ｎ−ブタノールで５度抽出して、臭化エチジウムを除去した。水溶液を１０ｍｍ  透析チューブに入れ、２ＬのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に対し４度透析を行った。次に、透析した溶液を、冷２−プロパノール２容量と５Ｍ  ＮａＣｌ  １／１０容量で沈殿させ、１５，０００ｒｐｍで１５分間の遠心を行った。最終濃度１．４ｍｇ／ｍＬで１ｍＬ  ＴＥ中にペレットを再懸濁させた。
【００５６】
３．ＳｐｅＩメチラーゼ選別：  最終濃度５０μＬ中の、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを補充した１×ＮＥＢ＃１緩衝液（１０ｍＭ  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ  プロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．０）中で、プラスミドライブラリー２．４μｇをＳｐｅＩ  １２ユニットで消化した。フェノール：クロロホルム（５０：５０，ｖ／ｖ）でサンプルを抽出し、ＤＮＡを５Ｍ  ＮａＣｌ  １／１０容量と２−プロパノール２容量で沈殿させた。ＣｌＰ（ウシ腸アルカリホスファターゼ、ＮＥＢ）１０ユニットを加え、反応液を３７℃で３０分間インキュベートし、次にＣｌＰを更に１０ユニット加え、反応を更に３０分間進行させた。この反応液を平衡化フェノール：クロロホルム（５０：５０，ｖ／ｖ）１容量で抽出し、５Ｍ  ＮａＣｌ  １／１０容量と２−プロパノール２容量でＤＮＡを沈殿させた。次に、ＤＮＡペレットをＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）１０μＬ中に再懸濁し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＲＩコンピテント細胞を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有Ｌ−ｂｒｏｔｈプレートにまいた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。総計１８個の形質転換菌を以下のように分析した。各コロニーからのプラスミドをｍｉｎｉｐｒｅｐ方法で単離し、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼで消化した。２個のクローンが、ＳｐｅＩ消化から十分に保護されていることが知見された。更なる制限分析により、これらのクローンは同一であり、４ｋｂの挿入配列を含んでいた。このようなメチラーゼ含有の一つのクローンをｐＳｐｅＩＭ１と命名した。
【００５７】
４．  ＤＮＡ配列決定：  Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用い、製造業者の指示に基づき、ｐＳｐｅＩＭ１の４ｋｂ挿入配列のＤＮＡ配列決定を行った。配列決定を容易にするために、ＰｖｕＩＩ／Ｘｂａｌサブクローンを、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ活性に抵抗性でもあるベクターｐＵＣ１９中に作出した。このサブクローン構築物をｐＳｐｅＩＭ２と命名した。プラスミドｐＳｐｅＩＭ１とｐＳｐｅＩＭ２上でＥｘｏ−Ｓｉｚｅ凵@ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用い、製造業者の指示に基づき、一連のエクソヌクレアーゼ欠失を行った。クローンｐＳｐｅＩＭ１とｐＳｐｅＩＭ２、及び種々のエキソヌクレアーゼ欠失サブクローンのｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ調製物を鋳型として用い、Ｍ１３／ｐＵＣプライマー＃１２３３と＃１２２４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を配列決定のプライマーとして用いた。ＤＮＡ配列情報を得た後、ＤＮＡ配列から翻訳される６個のフレームのアミノ酸配列を、公知のメチラーゼの保存アミノ酸モチーフと比較し、メチラーゼのｍ6Ａβ−タイプクラスのモチーフＩとＩＶを同定した。モチーフＩのＤＮＡ配列は、５′−ＣＡＣＴＧＣＡＣＣＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣＧＴＴＧＡＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＣＧＴＡＣＴＴＧＡＣＣＣＧＴＴＴＧＣＴＧＧＴＴＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＧＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＴＣＧＧＴＣＴＣＡＣＴＴＡＴＣＴＴＧＧＴＡＴＣＧＡＧ−３′（配列番号２）であることが知見された。それは以下のアミノ酸配列に翻訳される：ＨＣＴＶＫＰＬＰＬＭＬＫＬＶＧＭＭＶＰＰＦＡＮＮＩＶＬＤＰＦＡＧＳＧＴＴＬＶＡＡＫＱＬＧＬＴＹＬＧＩＥ（配列番号３）（下線のアミノ酸は保存又はほぼ保存の残基である）。モチーフＩＶのＤＮＡ配列は５′−ＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＡＡＣＴＡＣＴＧＧＣＧＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＡＴＣＧＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴＴＡＣＡＧＡＣＣＣＡＣＣＣＴＡＣ−３′（配列番号４）であることが知見された。これは以下のアミノ酸配列に翻訳される：ＧＤＣＲＥＬＬＡＫＩＰＡＡＳＩＡＡＣＩＴＤＰＰＹ（配列番号５）。メチラーゼ読取り枠は、クローンｐＳｐｅＩＭ１中のベクターでオープンで連続的であった。次に、下記のように逆ＰＣＲ法を用いてメチラーゼへの３′側のSphaerotilus species ＤＮＡを増幅させたときに、ＳｐｅＩメチラーゼの終止コドンはｐＳｐｅＩＭ１クローンの最後を超えた４個のアミノ酸残基に存在していることが知見された。
【００５８】
５．  ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子への３′側のＤＮＡのクローニング：  逆ＰＣＲ増幅用鋳型調製物：５０μＬ反応容量の１×ＮＥ緩衝液＃２中のＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ１０ユニットを用い３７℃で１時間Sphaerotilus species ＤＮＡ．１μｇを消化した。７５℃、２０分間インキュベートしてＨｉｎｄＩＩＩ酵素を熱不活化した。１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液５０μＬとｄＨ2Ｏ  ４００μＬ、次にＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ＃２０２）５μＬ（２０００ＮＥＢユニット）を加え、１６℃で１６時間インキュベートすることによって、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡを環状化させた。次に、この環状化連結反応液の一部を、次の逆ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。環状化ＥａｅＩ消化Sphaerotilus species ＤＮＡを同様に調製した。
【００５９】
下記の配列のプライマーＳｐｅＩ−ＩＰ１とＳｐｅＩ−ＩＰ２を合成した。これらのプライマーはＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子内でハイブリダイズし、互いに反対向きである。
【００６０】
プライマーＳｐｅＩ−ＩＰ１
５′−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＡＧＴＣＴＣＡＣＣＧ−３′（配列番号６）
プライマーＳｐｅＩ−ＩＰ２
５′−ＧＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＧＴＣＡＡＴＧＣＣＧＡＧ−３′（配列番号７）
産物を増幅させるのに成功した反応において、反応混合液は、以下のものを混合して作出された：
１０μＬ  １０×Ｖｅｎｔ剩ス応緩衝液
６μＬ  ４ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液
５μＬ  濃度１０μＭのプライマーＳｐｅＩ−ＩＰ１
５μＬ  濃度１０μＭのプライマーＳｐｅＩ−ＩＰ２
４μＬ  １００ｍＭ  ＭｇＳＯ4（最終濃度６ｍＭ  Ｍｇ++）
１２．５μＬ  環状化ＤＮＡ鋳型（約２５ｎｇ）
５８μＬ  ｄＨ2Ｏ
２μＬ（４ユニット）  Ｖｅｎｔ凾dｘｏ−ポリメラーゼＮＥＢ＃２５７
ＰＣＲ増幅条件は以下の通りであった：９５℃３分の１サイクル、続いて９５℃で２０秒、５２℃で３０秒、７２℃で１．５分の４サイクル、続いて９５℃で２０秒、６２℃で３０秒、７２℃で１．５分の２０サイクル。ＰＣＲ反応液１０μＬを、０．８％アガロースゲルでの電気泳動で分析した。
【００６１】
４００ｂｐの産物がＨｉｎｄＩＩＩ環状鋳型ＰＣＲ反応で観察され、１．２ｋｂ産物がＥａｅＩ環状鋳型ＰＣＲ反応で観察された。これらの２個の産物をゲル精製し、１×ＴＥ  ２５μＬに再懸濁した。次に、製造業者の指示に従いＡＢＩ３７３自動配列決定システムを使用し、配列決定プライマーとして上記ＰＣＲプライマーを用い、これらのＰＣＲ産物の配列決定を行った。次に、新しい読取り配列に相補的な２個の新規配列決定プライマーを下記のように合成し、それらを用い、ＥａｅＩ  １．２ｋｂ  ＰＣＲ産物の配列決定を行った。
【００６２】
プライマーＳｐｅＩ−Ｓ１
５′−ＧＡＡＣＴＡＴＣＡＡＧＡＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣ−３′（配列番号８）
プライマーＳｐｅＩ−Ｓ２
５′−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＧＡＧＧＧＧＴＧ−３′
（配列番号９）
６．Sphaerotilus speciesからのＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼのほぼ均一の精製：  Sphaerotilus specie（ＡＴＣＣ＃１３９２３）細胞を３０℃でＣＧＹＡ培地（ＡＴＣＣ＃１１０３）で増殖させた。２０時間の増殖後、遠心分離で細胞を得、使用するまで−７０℃に保存した。以下の方法の全てを氷上又は４℃で行った。細胞ペレット（湿重量）３５ｇを、緩衝液Ａ．１（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）１２０ｍＬに再懸濁し、音波破砕を行った。抽出液を、１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間の遠心分離にかけた。緩衝液Ａ．１で平衡化したヘパリン−セファロースカラム２５ｍＬに、上清を負荷した。カラムを緩衝液Ａ．１．  ６０ｍＬで洗浄し、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）２５０ｍＬを用い、０．１Ｍ  ＮａＣｌから１Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジエント溶出を行った。５ｍＬ分画を集めた。Ｔ７  ＤＮＡに対するＳｐｅＩ制限活性を各分画でアッセイし、制限酵素活性のピークは０．３８Ｍから０．４６Ｍ  ＮａＣｌでカラムから溶出することが知見され、それをプールした。ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ量は２５０，０００ユニットであると推定した。このヘパリン−セファロースプールを緩衝液Ａ  ２容量で希釈し、緩衝液Ａ．１で平衡化したヘパリン−ＴＳＫ  ＦＰＬＣカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ；Ｐｈｉａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）３ｍＬにかけ、続いて緩衝液Ａ  ４０ｍＬを用い、０．１Ｍ  ＮａＣｌから０．６Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジエント溶出を行った。１ｍＬ分画を集めた。Ｔ７  ＤＮＡに対するＳｐｅＩ活性を各分画でアッセイした。制限酵素活性のピークは０．２６〜０．３２Ｍ  ＮａＣｌで溶出し、７分画をプールした。このヘパリン−ＴＳＫプールはＳｐｅＩ活性を約２１０，０００ユニット含んでいた。プールを緩衝液Ａ  ３．５容量で希釈し、６０ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液Ａ（Ａ．０６）で平衡化したＭｏｎｏ  Ｑ  ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ：Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）１ｍＬにかけ、緩衝液Ａ．０６  ６ｍＬで洗浄し、続いて緩衝液Ａ中の０．１Ｍ  ＮａＣｌから０．６Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジエント４０ｍＬを行った。１ｍＬ分画を集めた。Ｔ７  ＤＮＡに対するＳｐｅＩ活性を各分画でアッセイした。ＳｐｅＩ活性は洗浄液で溶出し、それをプールした。次に、このＭｏｎｏ  Ｑ  プールを緩衝液Ａ．０６で平衡化したＭｏｎｏ  Ｓ  ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ：Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）１ｍＬに負荷し、緩衝液Ａ．０６  ６ｍＬで洗浄し、緩衝液Ａ  ４０ｍＬを用い、０．１Ｍ  ＮａＣｌから０．６Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジエント溶出を行った。１ｍＬ分画を集めた。Ｔ７  ＤＮＡに対するＳｐｅＩ活性を各分画でアッセイした。酵素活性の全てが洗浄液で溶出し、プールした。このＭｏｎｏ  Ｓプールを最終濃度０．１Ｍ  ＮａＣｌに調整し、緩衝液Ａ．１で平衡化したヘパリン−ＴＳＫ  ＦＰＬＣカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）３ｍＬに負荷し、次に緩衝液Ａ  ４０ｍＬを用い、０．１Ｍ  ＮａＣｌから０．６Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジエント溶出を行った。１ｍＬ分画を集めた。Ｔ７  ＤＮＡに対するＳｐｅＩ活性を各分画でアッセイした。酵素活性のピークは０．３５Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。ＳｐｅＩ活性約２０，０００ユニットがほぼ均一まで精製された。ピーク分画の１６μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルに負荷し、電気泳動を行った。ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性に対応する約２０ｋＤの顕著なバンドを観察した。
【００６３】
７．  アミノ末端ＳｐｅＩタンパク質配列：  上記セクション６に記載したように調製したＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼを電気泳動にかけ、以前に記載されたように改変した（Ｌｏｏｎｅｙ，Ｍ．Ｃ．，Ｍｏｒａｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｊａｃｋ，Ｗ．Ｅ．，Ｆｅｅｈｅｒｙ，Ｇ．Ｒ．，Ｂｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｓｌａｔｋｏ，Ｂ．Ｅ．，＆  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ｇ．，Ｇｅｎｅ  ８０：１９３−２０８，１９８９）Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ法（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１００３５−１００３８，１９８７）に基づき、電気ブロットした。膜をクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、約２０ｋｄのタンパク質バンドを切出し、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）モデル４０７Ａ気相タンパク質配列決定機（Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ，Ｐ．Ａ．，Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｃ．Ｊ．，Ｍｏｒａｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｓｌａｔｋｏ，Ｂ．Ｅ．，Ｈｏｒｎｓｔｒａ，Ｌ．Ｊ．．ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：５２０７−５２１９，１９９１）で逐次分解を行った。２０ｋｄタンパク質の最初の２８残基は、（Ｍｅｔ）−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｘｘｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号１０）に対応する。このデータを用い、メチラーゼ遺伝子への３′側のＤＮＡ配列から導かれるアミノ酸配列と比較し、エンドヌクレアーゼ遺伝子を同定した。
【００６４】
８．ＳｐｅＩ制限−修飾系の同定：  ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子に隣接したＤＮＡ配列のアミノ酸翻訳を、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼのＮ末端アミノ酸配列決定から得られたアミノ酸配列データと比較することによって、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定する。ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子に収束し、それらの３′末端で１４個のアミノ酸残基だけメチラーゼ遺伝子と重なる読取り枠が見出され、その読取り枠では、ＤＮＡ配列にコードされた最初の２８個のアミノ酸は、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼタンパク質から決定されたアミノ酸配列と一致した。アミノ酸配列決定結果の位置２０の不明の残基ＸはＤＮＡ配列からアルギニンであると知見された。更に、８２個のアミノ酸のペプチドをコードする読取り枠はエンドヌクレアーゼ遺伝子の５′直前に位置し、エンドヌクレアーゼ遺伝子と同一方向に向いている。この読取り枠のアミノ酸配列は、他の幾つかの制限−修飾系で見出された制御遺伝子に高度な相同性を有し（Ｔａｏら、Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８３：１３６７−１３７５（１９９１）（引用により本明細書に含まれるものとする））、ＳｐｅＩ制御遺伝子と同定される。
【００６５】
９．ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼの過剰発現：
Ａ．適合性ベクターへのＳｐｅＩメチラーゼのクローニング：  ｔｅｔ遺伝子転写系を利用するために、ｐＳＹＸ２０のテトラサイクリン遺伝子に遺伝子を挿入することによって、ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子を発現させた。これを行うために、ＤＮＡ配列データを利用して、２個のオリゴヌクレオチドプライマーを作出した。第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、クローニングを容易にするためのＢａｍＨＩ部位、ｔｅｔタンパク質の翻訳を終止させるためのテトラサイクリン遺伝子とフレームのあった終止コドン、Ｅ．ｃｏｌｉコンセンサスリボソーム結合部位、リボソーム結合部位とＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの間の７個のヌクレオチドスペーサー、及びハイブリダイゼーションのためのSphareotilus species ＤＮＡに相補的な１９個のヌクレオチドを含んでいた。
【００６６】
プライマーＳｐｅＭｅｘｐ１：
５′−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＴＡＣＴＡＴＧＡＧＴＧＧＣＡＴＧＣＧ−３′（配列番号１１）
メチラーゼ遺伝子の３′末端にハイブリダイズするように逆プライマーを設計し、それはクローニングを容易にするためにＳａｌＩ部位を有した。
【００６７】
プライマーＳｐｅＭｅｘｐ２：
５′−ＣＣＴＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＡＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＣＣＴＧ−３′（配列番号１２）
これらの２個のプライマーを用い、
１０μＬ  １０×Ｖｅｎｔ剩ス応緩衝液
６μＬ  ４ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μＬ（４００ｎｇ）Sphaerotilus species  ゲノムＤＮＡ
５μＬ（１０μＭ保存）プライマーＳｐｅＭｅｘｐ１
５μＬ（１０μＭ保存）プライマーＳｐｅＭｅｘｐ２
４μＬ  １００ｍＭ  ＭｇＳＯ4（最終濃度８ｍＭ  Ｍｇ++）
６８μＬ  ｄＨ2Ｏ
０．８μＬ（１．６ユニット）Ｖｅｎｔ刄|リメラーゼ（２ユニット／μＬ保存）；
を混合し、９５℃３分を１サイクル、続いて９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃１分を４サイクル、続いて９５℃３０秒、６５℃３０秒、７２℃１分を２０サイクル行い増幅させることによって、Sphaerotilus species  ゲノムＤＮＡからＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ反応液１５μＬを、０．８％アガロースゲルでの電気泳動で分析した。約１．０ｋｂのバンドが、ＤＮＡ配列データから予期されたように観察された。このバンドをゲル精製し、最終容量５０μＬのＮＥＢ緩衝液ＳａｌＩ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭジチオトレイトール、ｐＨ７．９、約２５℃）中で、ＢａｍＨＩ（２０ユニット）とＳａｌＩ（２０ユニット）を用いて、ゲル精製ＤＮＡ約１μｇを消化した。この反応液を、３７℃で１時間インキュベートし、７８℃で２０分間加熱して反応を停止させた。１６℃で２時間、容量２０μＬ中のＴ４ＤＮＡリガーゼ４００ユニットを用いて、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで前もって開裂させたベクターｐＳＹＸ２０  １００ｎｇに、消化ＤＮＡ  ５μＬ（１００ｎｇ）を連結させ、アガロースゲル精製した。連結混合液１０μＬでＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２４２７株を形質転換し、別々のコロニーを得るために、５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有Ｌ−ｂｒｏｔｈプレートに播いた。１２個の別々のコロニーを、５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有Ｌ−ｂｒｏｔｈ１０ｍＬ中で、一晩攪拌しながら３７℃で増殖させ、ｍｉｎｉｐｒｅｐを行いプラスミドを単離した。試験した１２個の別々のプラスミドのうち５個が、ＢａｍＨＩとＳａｌＩによる切断で切出すことができる１ｋｂ挿入配列を含んでいた。これらの５個の構築物がＳｐｅＩメチラーゼ活性を発現するかどうかを試験するために、単一ＳｐｅＩ部位を含むベクターＬｉｔｍｕｓ３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を５個の予測されるｐＳＹＸ２０ＳｐｅＩメチラーゼクローンと共に用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２４２７株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンと５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有Ｌ−ｂｒｏｔｈプレートに播いた。ｍｉｎｉｐｒｅｐを行い、個々の形質転換体を単離し、ＳｐｅＩとＳｃａＩで消化した。８０１  ｂｐのｓｃａＩ／ＳｐｅＩフラグメントが無いことで示されるように、５個のメチラーゼクローンの全てからのプラスミドはＳｐｅＩ消化から十分に保護されていた。このようなクローンの一つをｐＳＹＸ２０ＳｐｅＩＭ９と命名し、エンドヌクレアーゼ発現のために使用した。
【００６８】
Ｂ．エンドヌクレアーゼクローニング：  制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を、強い誘導性プロモーター（ＰｌａｃＵＶ５）と強く認識されるリボソーム結合部位の直下で、発現ベクターｐＲＲＳに挿入することによって制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現させた。このことを行うために、ＤＮＡ配列データを用い、２個のオリゴヌクレオチドプライマーを作出した。正方向オリゴヌクレオチドプライマーは、クローニングを容易にするためのＮｓｉＩ部位、ｌａｃＺタンパク質の翻訳を停止させるためのｌａｃＺ遺伝子とフレームのあった終止コドン、強く認識されるリボソーム結合部位、リボソーム結合部位とＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの間の７個のヌクレオチドスペーサー、及びハイブリダイゼーションのためのSphaerotilus species ＤＮＡに相補的な２１個のヌクレオチドを含んでいた。
【００６９】
プライマーＳｐｅＩＲｅｘｐ１：
５′−ＧＧＴＴＡＴＧＣＡＴＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＣＡＴＡＴＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＣＣＡＡＣＡＡＧ−３′（配列番号１３）
ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の３′末端でSphaerotilus species ＤＮＡにハイブリダイズするように、逆プライマーを設計した。それは、クローニングを容易にするためのＢａｍＨＩ制限部位とＴＧＡからＴＡＡの終止コドンの変更を含んでいた。
【００７０】
プライマーＳｐｅＩＲｅｘｐ２：
５′−ＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＣＧＧＡＣＡＡＣＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣ−３′（配列番号１４）
これらの２個のプライマーを用い、
１０μＬ  １０×Ｖｅｎｔ剩ス応緩衝液
６μＬ  ４ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μＬ（４００ｎｇ）Sphaerotilus species  ゲノムＤＮＡ
５μＬ（１０μＭ保存）プライマーＳｐｅＲｅｘｐ１
５μＬ（１０μＭ保存）プライマーＳｐｅＲｅｘｐ２
４μＬ  １００ｍＭ  ＭｇＳＯ4
６８μＬ  ｄＨ2Ｏ
０．６μＬ（１．２ユニット）Ｖｅｎｔ刄|リメラーゼ（２ユニット／μＬ保存）；
を混合し、９５℃３分を１サイクル、続いて９５℃３０秒、６０℃２０秒、７２℃４５秒を４サイクル、続いて９５℃３０秒、６５℃２０秒、７２℃４５秒を２０サイクル行い増幅させることによって、Sphaerotilus species  ゲノムＤＮＡからＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅させた。約６００ｂｐの増幅産物をゲル精製し、ＮｓｉＩとＢａｍＨＩで開裂し、フェノール−クロロホルム抽出を行い、沈殿させ、ＴＥに再懸濁させ、前もってＰｓｔＩとＢａｍＨＩで開裂させたｐＲＲＳベクターに連結し、ゲル精製を行った。連結反応液で、ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子構築物ｐＳＹＸ２０ＳｐｅＩＭ９で予め改変したＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２４２７株を形質転換した。分析した６個の別々の形質転換菌のうち、全てがＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ活性を発現した。これらのクローンの一つであるｐＳｐｅＩＲ７をＳｐｅＩエンドヌクレアーゼを産生させるために選別し、株名ＮＥＢ＃１０３８をつけた。株ＮＥＢ＃１０３８の粗抽出液から産生されたＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の滴定を図４に示す。酵素力価は約２×１０7ユニット／ｇ（細胞）であった。
【００７１】
１０．  アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）とカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）含有Ｌ−ｂｒｏｔｈ培地を含む発酵槽中で対数中期まで増殖させることによって、ＮＥＢ＃１０３８からＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼを産生させることができる。最終濃度０．３ｍＭまでＩＰＴＧを添加して培養液の誘導を行い、１６時間生育を続けさせる。細胞を遠心分離で得て、その細胞は−７０℃で保存できるし、又は直ちに使用できる。
【００７２】
１１．  ＮＥＢ＃１０３８からのＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼの精製は、上記ステップ６で記載したように、アフィニティークロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーなどの標準的タンパク質精製技術の組合せによって達成できる。この精製で得られるＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、非特異的なエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの夾雑は無い。
【００７３】
ｐＳＹＸ２０ＳｐｅＩＭ９とｐＳｐｅＩＲ７（ＮＥＢ＃１０３８）の両方を含むＥ．ｃｏｌｉのサンプルは、ブダペスト条約の条件下、American  Type Culture  Collectionに１９９７年３月２０日寄託し、ＡＴＣＣ受託番号９８３６６を受けた。
【００７４】
【配列表】
0004108173.tif 000002
【００７５】
【化１】
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【００７６】
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【００７７】
【化２】
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【００７８】
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【００７９】
【化３】
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【００８０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼをクローン化及び作製する好ましい方法のフローチャートである。
【図２】メチラーゼクローンｐＳｐｅＩＭ１が含むＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ属種ＤＮＡの制限地図である。クローンｐＳｐｅＩＭ１はメチラーゼ選択によって得られ、機能性ＳｐｅＩメチラーゼを含む。ＳｐｅＩメチラーゼの位置及び向きを示す。
【図３】ＳｐｅＩメチラーゼ遺伝子、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子及びＳｐｅＩ制御遺伝子の相対位置及び向きを示す説明図である。
【図４】ｐＲＲＳ由来プラスミドｐＳｐｅＩＲ７上のＳｐｅＩエンドヌクレアーゼと、ｐＳＹＸ２０由来プラスミドｐＳＹＸ２０ＳｐｅＩＭ９上のＳｐｅＩメチラーゼとを移入した大腸菌ＥＲ２４２７の細胞抽出物のＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲルの写真である。１．８ｇの細胞ペーストを２５ｍｌの音波処理用緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭジチオトレイトール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に懸濁させ、音波処理によって細胞を破壊し、遠心によって懸濁液を清澄化した。抽出物の稀釈物を用いて、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２中に反応体積５０μｌ当たり１μｇの量で加えたＴ７  ＤＮＡを消化した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、消化産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した。レーン１及び８はＨｉｎｄＩＩＩ−λ＋ＨａｅＩＩＩ−φＸ１７４寸法標準であり、レーン２は２×１０-3μｌ粗抽出物であり、レーン３は１×１０-3μｌ粗抽出物であり、レーン４は５×１０-4μｌ粗抽出物であり、レーン５は２．５×１０-4μｌ粗抽出物であり、レーン６は１．２５×１０-4μｌ粗抽出物であり、レーン７は６．２５×１０-5μｌ粗抽出物である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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