(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定すべき物質の抗体に基質との反応により電気化学的に活性な還元型検出物質を生成する酵素を結合させた酵素結合抗体を含む酵素抗体結合層と、
前記酵素結合抗体と結合する物質が、少なくとも試液内の測定すべき物質と競合反応するに充分な量、固定された競合反応層と、
前記酵素との反応により電気化学的に活性な還元型検出物質を生成する基質を含有する電気化学反応層とを
基板上に形成された電極上に積層し、
前記基質を、前記検出物質より電気化学的ポテンシャルが高い物質とし、前記電気化学反応層に、前記基質を少なくとも酵素結合抗体との酵素反応により消費される量より多く含ませ、
電極上に位置する電気化学反応層において、酵素反応により生成された還元型検出物質が電極で酸化された後、再び、基質と反応して還元型検出物質に再還元される反応サイクルを繰り返すように構成した
ことを特徴とする電気化学的バイオセンサー。
【請求項２】
酵素と基質との反応により生成される還元型検出物質が還元型パラアミノフェノールであり、
前記基質が、パラアミノフェニルガラクトピラノシドである
ことを特徴とする請求項１に記載の電気化学式バイオセンサー。
【請求項３】
前記測定すべき物質が尿中に含まれたアルブミンであり、
前記抗体がアルブミン抗体であり、
酵素と基質との反応を介して間接的に尿中のアルブミン量を測定することができるようにした
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の電気化学式バイオセンサー。
【請求項４】
前記測定すべき物質が尿中に含まれたアルブミンであり、
前記抗体がアルブミン抗体であり、
前記電気化学的反応層に、基質としてのパラアミノフェノルガラクトピラノシドが、１〜100mmol/L含有されている
ことを特徴とする請求項２に記載の電気化学式バイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気化学式バイオセンサーに関し、特に、電気化学的に活性な物質を介して間接的に試液中に存在する測定対象物質の量を測定し得る電気化学式バイオセンサーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルブミン等のたんぱく質は通常、腎臓で再吸収され尿にはわずかな量しか排泄されないが、腎不全や腎機能障害になると、腎臓でアルブミンを吸収できなくなるため尿中に排泄されるアルブミンの量が増加する。このため、腎疾患の診断のために尿中のアルブミンを測定することは重要である。特に、糖尿病では腎障害を併発する可能性があるため尿中に排泄されているアルブミンの量の測定は重要である。
上記したアルブミン測定方法としては、アルブミン抗体が固定された膜に、尿を滴下し、尿中に含まれるアルブミンと膜に固定されたアルブミン抗体との相互作用を、光の強度変化として検出できる物質とさらにカップリングさせることで検出する光学的測定方法が一般的に用いられている。
しかし、上記した光学的測定方法は、測定システムが煩雑で費用が多くかかるという問題点があり、より簡便で、より低費用な測定方法の開発が市場では求められている。
簡便で、より低費用な測定方法としては、物質の化学反応を電気信号として取り出す電気化学的測定方法が挙げられるが、アルブミンは、電気的に活性な物質ではないので、アルブミンそのものを、この電気化学的測定方法を用いて測定することはできないという問題がある。
上記した問題は、アルブミンに限らず、電気化学的に活性でない物質に共通する問題である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
出願人は、上記した電気化学的に活性でない物質の測定に関する問題点を解決すべく、鋭意研究した結果、測定すべき物質の抗体に基質との反応により電気化学的に活性な物質を生成する酵素を結合させた酵素結合抗体を含む酵素抗体結合層と、前記酵素結合抗体と結合する物質が、少なくとも試液内の測定すべき物質と競合反応するに充分な量、固定された競合反応層と、前記酵素との反応により電気化学的に活性な物質を生成する基質を含有する電気化学反応層と、電極とを設け、前記酵素抗体結合層から測定すべき物質を含有する試液を導入し、酵素抗体結合層に導入された試液が、競合反応層を通過して電気化学反応層に導入され、電気化学反応層での電気化学的な反応を前記電極を介して測定することができるように構成することにより電気化学的に活性でない物質を、電気的に活性な物質を用いて間接的に電気化学的に測定する方法を発明し、その発明を特許出願した（特願２００２−９３５２６）。
出願人は、上記した方法の研究をさらに進め、測定すべき物質の量が極めて微量な場合でも電極部で取り出すことができる電気信号の値自体を大きくすることができれば、尿中の微量アルブミン測定のように微量な物質の測定に極めて有効であり、より精密な測定結果が得られるという結論に至り、これを達成するための研究を重ね、本発明を発明するに至った。
本発明は、測定すべき物質の量が極めて微量であっても、電極で充分に大きな値の電気信号を取り出すことができ、微量物質についても精密に測定することが可能になる電気化学式バイオセンサーを提供することを目的としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記した目的を達成するために、本発明に係る電気化学式バイオセンサーは、測定すべき物質の抗体に基質との反応により電気化学的に活性な還元型検出物質を生成する酵素を結合させた酵素結合抗体を含む酵素抗体結合層と、前記酵素結合抗体と結合する物質が、少なくとも試液内の測定すべき物質と競合反応するに充分な量、固定された競合反応層と、前記酵素との反応により電気化学的に活性な還元型検出物質を生成する基質を含有する電気化学反応層とを基板上に形成された電極上に積層し、前記基質を、前記検出物質より電気化学的ポテンシャルが高い物質とし、前記電気化学反応層に、前記基質を少なくとも酵素結合抗体との酵素反応により消費される量より多く含ませ、電極上に位置する電気化学反応層において、酵素反応により生成された還元型検出物質が電極で酸化された後、再び、基質と反応して還元型検出物質に再還元される反応サイクルを繰り返すように構成したことを特徴とするものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に添付図面に示した幾つかの実施例を参照しながら本発明に係る電気化学式バイオセンサーの実施の形態について説明していく。
図１は、本発明に係る電気化学式バイオセンサーの概略斜視図を示している。
図中符号１は基板を示しており、この基板１上には、電極２がスクリーン印刷されている。
電極２の上部には、３つの層が積層されている。以下の説明では、これら３つの層を試液が通る順番に従って酵素結合抗体層３、競合反応層４及び電気化学反応層５と称する。
酵素結合抗体層３は、本願発明の第一層を形成する最上部に位置する層であり、この酵素結合抗体層３には、測定すべき物質の抗体に、基質との反応により電気化学的に活性な物質を生成する酵素を結合させた物質が含まれている。本明細書では、この測定すべき物質の抗体に酵素を結合した物質のことを酵素結合抗体と称する。
この酵素結合抗体層３に含まれる酵素結合抗体の量は、測定すべき物質に応じて適宜変更され得るが、競合反応層での試液の展開中に測定すべき物質と競合反応する量より多くしておく必要がある。例えば、β−ガラクトシダーゼ標識アルブミン抗体2.5μgが酵素結合抗体層３に含まれ得る。
競合反応層４は、本発明に係る第二層を形成する層であり、酵素結合層３の下流に位置する。この競合反応層４には、酵素結合抗体層３に含まれた酵素結合抗体と結合し得る物質が固定されている。この物質は、測定対象物質と同じ物質であり得るが、これに限定されることなく、酵素結合抗体層３に含まれている酵素結合抗体と結合し得る物質であれば任意の物質でよい。
この競合反応層４に固定される物質の量は、測定すべき物質の量と、酵素結合抗体層３に含まれる酵素結合抗体の量とに応じて適宜決められ得るが、少なくとも、酵素結合抗体層３において測定すべき物質が結合しなかった余剰な酵素結合抗体と競合反応するのに充分な量に設定される。
電気化学反応層５は、本発明に係る第三層を形成する層であり、最下流に位置し、電極２と直接接触している。この電気化学反応層５には、酵素結合抗体層３に含まれた酵素結合抗体における酵素と反応して電気化学的に活性な物質を生成する基質が含まれている。
前記した酵素及び基質は、反応により電気化学的に活性な検出物質を生成し、かつ、基質の電気化学的ポテンシャルが検出物質より高いものが用いられる。具体的には、酵素としてはβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）が用いられ、基質としては、検出物質であるパラアミノフェノールＰＡＰより電気化学的ポテンシャルが高いパラアミノフェミルガラクシドＰＡＰＧが用いられる。
この電気化学反応層５に含まれている基質の量は、第一層と同様、測定すべき物質の量より多く、即ち、酵素との反応により消費される量より多くしておく必要がある。
【０００６】
上記したように構成された電気化学式バイオセンサーの作用を説明する。
以下の説明では、一例として、測定対象物質をアルブミンＡｌｂ、抗体をアルブミン抗体Ａｂ、酵素をβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、基質をパラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧとして説明していく。
酵素結合抗体層３から試液として尿を導入すると、酵素結合抗体層において、尿中にアルブミン抗体とβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）とを結合させた酵素結合抗体Ａｂ＋Ｇａｌが溶け出す。
尿中に溶け出した酵素結合抗体Ａｂ＋Ｇａｌは、尿中のアルブミンＡｌｂと結合して、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）が結合したアルブミン−抗体複合体（以下、酵素結合型アルブミン−抗体結合体と称する。）となり競合反応層４に入る。
競合反応層４に入った尿には、酵素結合型アルブミン−抗体結合体と、アルブミンＡｌｂと結合できなかった酵素結合抗体Ａｂ＋Ｇａｌが含まれている。競合反応層４には、酵素結合抗体Ａｂ＋Ｇａｌと結合する物質としてアルブミンＡｌｂが予め固定されているので、余剰な酵素結合抗体Ａｂ＋Ｇａｌは、競合反応層４に固定されたアルブミンＡｌｂと結合して競合反応層４に止まる。
従って、競合反応層４で競合反応により測定物質であるアルブミンと結合しない酵素結合抗体Ａｌ＋Ｇａｌは尿中から取り除かれ、電気化学反応層５には、測定すべきアルブミンから生成された酵素結合型アルブミン−抗体結合体だけが入る。
電気化学反応層５には、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）の基質であるパラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧが含まれているので、尿中に含まれている酵素結合型アルブミン−抗体結合体のβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）とパラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧとの酵素反応によりパラアミノフェノールＰＡＰが生成される。
ここで、電気化学反応層５における化学反応を図２を用いて詳細に説明する。図面に示すようにβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）とパラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧとの酵素反応により生成された還元型パラアミノフェノールＰＡＰは、電極２に電子を受け渡して、酸化型パラアミノフェノールＰＡＰとなる。
一方、電気化学反応層５には、パラアミノフェノールＰＡＰより電気化学的ポテンシャルの高いパラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧが含まれているため、酸化型パラアミノフェノールＰＡＰは、パラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧによる還元反応により再び還元型パラアミノフェノールＰＡＰになる。ここで生成される還元型パラアミノフェノールＰＡＰは電極２に電子を受け渡して酸化型パラアミノフェノールＰＡＰとなり、再びパラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧにより還元されるので、一度、酵素反応により還元型パラアミノフェノールＰＡＰが生成されると、その後は、還元型パラアミノフェノールＰＡＰとパラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧとの反応の繰り返しにより電極で得られる電子の数、即ち、電極から取り出される電気信号の値は飛躍的に大きくなる。
その結果、測定対象物が微量であっても、電極から大きな値の電気信号を取り出し、不図示の測定装置に出力することが可能になる。
そして、この電気化学反応層で生成される還元型パラアミノフェノールＰＡＰの量は、尿中に含まれているアルブミンＡｌｂの量と比例関係を持つので、尿中のアルブミンＡｌｂのように、その量が微量なものであっても、測定装置で、精度の高い測定値を算出することが可能になる。
【０００７】
次に、図３〜図７を参照して本発明に係る電気化学的バイオセンサーの第二の実施例について説明していく。
図３は電気化学的バイオセンサーの第二実施例の概略上面図、図４は図３に示した電気化学的バイオセンサーの一部断面概略斜視図、図５は図３のＡ−Ａ断面図、図６は図３のＢ−Ｂ断面図を各々示している。
図中符号１０は絶縁性プラスチックフィルムからなる基板を示しており、この基板１０上には、導電性ペーストインク材料をスクリーン印刷してなる作用極１１及び測定極１２が設けられている。
上記した二つの電極１１及び１２は電極部分及び端子部分を除いて絶縁性レジスト膜１３で被覆されている。
上記したように構成された電極１１及び１２の上には、酵素結合抗体層１４、競合反応層１５及び電気化学反応層１６が図４〜図６に示すように設けられる。以下に、これら各層１４〜１６のレイアウトについて説明する。
電気化学反応層１６は電極１１及び１２の上に設けられ、電極部分と直接接触するように構成されている。
競合反応層１５は、ラテラルフローメンブレンから成り、基板１０の後方（図３における左側）から基板１０の前方（図３における右側）に向かって伸び、電気化学反応層１６の上を微細な隙間１７をあけて通過して、電気化学反応層１６より前方で、基板１０上に形成されているレジスト膜１３に接触するように湾曲され、その先端が前記レジスト膜１３に固定される。前記競合反応層１５は、その露出している上面部分が液密にコーティングされている。また、競合反応層１５とレジスト膜１３の結合部分は、外側（電極の端子側）には液が漏れないが、内側（電極部分側）には液が漏れ出るようにコーティングされている。
酵素結合抗体層１４は、競合反応層１５の上流部分に、競合反応層１５と直接接触するように設けられる。
尚、図中、符号１８はスペーサを示している。
ここで、上記したように構成された電気化学式バイオセンサーにおける試液の流れについて図７を参照しながら簡単に説明しておくと、酵素結合抗体層１４に導入された試液は、競合反応層１５に流入する。競合反応層１５はセンサーの前後方向に試液が流れるように配置されたラテラルフローメンブレンで形成されているので、競合反応層１５に流入した試液は、競合反応層１５の先端に向かって流れる。
競合反応層１５の先端に到達した試液は、競合反応膜１５の先端から内側に漏れ出し、毛細管現象により、電極リード部を形成することで基板１０上に生じさせた段部に沿って電極１１及び１２の電極部分に向かって流れ、さらに、競合反応層１５と電気化学反応層１６との間に形成された微細な間隙１７に引き込まれ、電気化学反応層１６の上面から均一に、電気化学反応層１６に入り込むようになる。
上記したように構成することにより、ラテラルフローメンブレンを使用しているにもかかわらず試液が電気化学反応層１６により均一に流入するようになり、より良好な測定結果を得ることが可能になる。
【０００８】
上記したように構成された電気化学式バイオセンサーを用いて実際に試液中に含まれるアルブミンの量を測定した結果を図８に示す。
この実験では、
酵素結合抗体層１４に、アルブミン抗体とβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）とを結合させた酵素結合抗体Ａｂ＋Ｇａｌを2.5μg含ませ、
競合反応層１５に、アルブミンＡｌｂを20μg/cm2固定し、
電気化学反応層１６に、パラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧを22μg含ませ、
予め１〜１０００ｍｇ／Ｌのアルブミンを含ませた試液を酵素結合抗体層１４から導入して電極での出力電流量を測定した。
図８の実験結果から、上記したように構成された電気化学式バイオセンサーを用いればアルブミン含有量が低い試液でも測定するのに十分な出力電流量が得られることが分かる。
【０００９】
次に、パラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧを用いたことによる出力電流量の増幅効果を表す実験結果を図９に示す。
図９はパラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧの量の変化に応じた出力電流量を示すグラフであり、図１０はパラアミノフェノールＰＡＰの変化に応じた出力電流量を示すグラフである。
この実験では、
電極上に電気化学反応層だけを設け、その電気化学反応層に、パラアミノフェミルガラクトシドＰＡＰＧを０〜１００mmol/L含ませ、
予め０．２５〜１．０mmol/LのパラアミノフェノールＰＡＰを含ませた試液を滴下して電極での出力電流量の測定を行った。
図９及び図１０に示すように、電極から得られる出力値がパラアミノフェミルガラクトシドＰＡＰＧの濃度に応じて増加しており、この値に基づいてパラアミノフェミルガラクトシドＰＡＰＧによる増幅効果のあることが分かる。
【００１０】
尚、上記した実施例では、電気化学式バイオセンサーを、酵素結合抗体層、競合反応層及び電気化学反応層の三つの層から形成しているが、必要に応じて、第一層を構成する酵素結合抗体層の上部に、試液中に含まれる電気化学的に酸化されやすい物質を、予め酸化して除去することができる物質を積層してもよい。これにより、試液中に含まれていて電気的に酸化され易いので測定に影響を及ぼす可能性があるアスコルビン酸、尿酸、アセトアミノフェン等の物質を予め除去しておくことが可能になる。
この電気化学的に酸化されやすい物質を、予め酸化して除去することができる物質としては、例えば、二酸化鉛や二酸化すず等がある。
【００１１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係る電気化学式バイオセンサーは、測定すべき物質の抗体に基質との反応により電気化学的に活性な還元型検出物質を生成する酵素を結合させた酵素結合抗体を含む酵素抗体結合層と、前記酵素結合抗体と結合する物質が、少なくとも試液内の測定すべき物質と競合反応するに充分な量、固定された競合反応層と、前記酵素との反応により電気化学的に活性な還元型検出物質を生成する基質を含有する電気化学反応層とを基板上に形成された電極上に積層し、前記基質を、前記検出物質より電気化学的ポテンシャルが高い物質とし、前記電気化学反応層に、前記基質を少なくとも酵素結合抗体との酵素反応により消費される量より多く含ませ、電極上に位置する電気化学反応層において、酵素反応により生成された還元型検出物質が電極で酸化された後、再び、基質と反応して還元型検出物質に再還元される反応サイクルを繰り返すように構成しているので、測定すべき物質の量が極めて微量であっても、検出物質が基質と電極との間で酸化還元反応を繰り返すことにより電極で得られる電子の数、即ち、電極から取り出される電極信号の値が飛躍的に大きくなり、微量物質についても精密に測定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に係る電気化学式バイオセンサーの概略斜視図である。
【図２】  電気化学反応層５における化学反応を示す図である。
【図３】  電気化学的バイオセンサーの第二実施例の概略上面図である。
【図４】  図３に示した電気化学的バイオセンサーの一部断面概略斜視図である。
【図５】  図３のＡ−Ａ断面図である。
【図６】  図３のＢ−Ｂ断面図である。
【図７】  図４の一部断面斜視図に試液の流れを矢印で示した説明図である。
【図８】  図３〜図７に示した電気化学式バイオセンサーを用いて実際に試液中のアルブミン量を測定した実験結果を示すグラフである。
【図９】  パラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧを用いたことによる出力電流量の増幅効果を表す実験結果である。
【図１０】  パラアミノフェニルガラクトピラノシドＰＡＰＧを用いたことによる出力電流量の増幅効果を表す実験結果である。
【符号の説明】
１  基板
２  電極
３  酵素結合層
４  余剰酵素除去層
５  電気化学反応層
１０  基板
１１  作用極
１２  測定極
１３  レジスト膜
１４  酵素結合層
１５  余剰酵素除去層
１６  電気化学反応層
１７  隙間
１８  スペーサ
【図１】
0004129367.tif 000002
【図２】
0004129367.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004129367.tif 000009
【図９】
0004129367.tif 000010
【図１０】
0004129367.tif 000011