(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する第１のＤＮＡポリメラーゼにより生成されたＰＣＲ産物を精製することなくクローニングする方法であって、ＰＣＲ反応後の該ＰＣＲ反応液に、
（ａ）該第１のＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する抗体、および
（ｂ）ＰＣＲ産物の３’末端にｄＡを付加する活性を有する第２のＤＮＡポリメラーゼを添加することにより、該ＰＣＲ産物の３’末端にｄＡを付加する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
クローニングをする際のプラスミドベクターにいわゆるＴベクターあるいはＵベクターを利用することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する第１のＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する抗体、および、
ＰＣＲ産物の３’末端にｄＡを付加する活性を有する第２のＤＮＡポリメラーゼ
を含む、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより生成されたＰＣＲ産物を精製することなくクローニングするための組成物。
【請求項４】
請求項３記載の組成物を使用する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより生成されたＰＣＲ産物を精製することなくクローニングする方法。
【請求項５】
請求項３記載の組成物を含む、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより生成されたＰＣＲ産物を精製することなくクローニングするためのキット試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分子生物学の分野に属する。本発明は、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて得られたＰＣＲ産物をクローニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の構造及び機能解析を行う上で、正確な塩基配列をもつ目的遺伝子をクローニングすることは非常に重要である。従来から知られている遺伝子のクローニング方法は、例えば遺伝子産物のアミノ酸配列の一部が既知の場合に、そこから可能なＤＮＡ配列を推定しこれを化学合成してＤＮＡプローブとして用いることによりｃＤＮＡライブラリーから目的のクローンを選択するというものであった。近年、ＤＮＡポリメラーゼを用いて目的遺伝子断片を短時間に増幅するＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法が開発され、容易に目的遺伝子断片を取得できるようになった。ＰＣＲ法は、ＤＮＡの変性の工程、プライマーＤＮＡのアニーリングの工程、ＤＮＡの相補鎖を酵素によって合成する工程から成る温度サイクルを任意の回数繰り返すことにより目的遺伝子のみを指数的に増幅することができる。ＤＮＡを増幅及びクローニングするにはこのＰＣＲ法を利用するのが最も簡便で迅速である。
【０００３】
ＰＣＲ法に用いられる酵素は大きく2種類に分けられる。１つがＰＣＲ法開発当初から使用されているTaq ＤＮＡポリメラーゼに代表される3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼであり、もう1つが、ＰＣＲ法によって得られる増幅産物の正確性（鋳型となったＤＮＡとの相同性）を高めるために開発された3'-5'エキソヌクレアーゼ活性（ＤＮＡ校正活性）を有するＤＮＡポリメラーゼである。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼには、KOD ＤＮＡポリメラーゼ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ、Pwo ＤＮＡポリメラーゼ、Ultima ＤＮＡポリメラーゼなどのそれ自身が単独で該活性を有するものや、Taq ＤＮＡポリメラーゼにこれら単独で3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを混合して調製したKOD Dash ＤＮＡポリメラーゼ、EX-Taq ＤＮＡポリメラーゼ、Expand ＤＮＡポリメラーゼなども含まれる。
【０００４】
特に、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲ酵素として用いた場合、ＰＣＲ産物の3'末端はｄＡの突出末端となるため、ＤＮＡ断片の挿入部位において3'末端がｄＴの突出末端となっている、いわゆるＴベクターの利用により非常に簡便にクローニングすることができる。そのため、ＰＣＲによって得られた目的ＤＮＡをクローニングする際には、ＰＣＲ酵素に3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ、クローニングベクターにＴベクターを用いるのが最もよく利用されている。
【０００５】
しかし、通常ＰＣＲに用いられている3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼは該活性を欠くため、ＤＮＡ断片の塩基配列は正確性に乏しい。ゲノムプロジェクトにより各モデル生物の正確なＤＮＡ配列が明らかとなった今、目的遺伝子の構造及び機能解析を行う研究分野が益々盛んになると思われる。そこで、正確な塩基配列をもつＤＮＡ断片を簡単にクローニングする技術の出現が望まれている。
【０００６】
一方、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、正確性の高い塩基配列を有するＤＮＡ断片を得るためのＰＣＲ酵素として用いられている。しかし、該酵素を用いて得られたＰＣＲ産物は該酵素が保有する3'-5'エキソヌクレアーゼ活性のためにその末端は平滑化されており、直接的にＴベクターへ組み込むことができない。該酵素を用いて得られたＰＣＲ産物をクローニングする場合、通常、該産物の平滑末端をリン酸化した上で平滑末端化ベクターへ組み込むか、あるいは該ＰＣＲ産物とベクターＤＮＡを特定の制限酵素により切断後、切断部位を利用して組み込む方法が一般的である。また、Ｔベクターを用いる場合、該ＰＣＲ産物を精製して3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを除去した後、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを用いて該ＰＣＲ産物の3'末端にｄＡを付加した上でＴベクターへ組み込むことが出来るが、いずれの方法もクローニングの簡便性の面で問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて得られた正確性の高い塩基配列を有するＰＣＲ産物を精製することなく、ベクターに組み込んでクローニングする方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記問題を解決するため鋭意検討した結果、正確性の高い方法で増幅されたＰＣＲ産物を簡単にクローニングすることに成功した。具体的にはクローニングの前処理工程において、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する反応と該ＰＣＲ産物の3'末端にｄＡを付加する反応を1つの容器内で行うことにより、該ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片を精製することなくＴベクターにクローニングすることが可能となった。
【０００９】
すなわち、本発明は、本発明は以下のような構成からなる。
項1.ＰＣＲ産物を精製することなく、プラスミドあるいはファージベクターに30％以上の効率でクローニングする方法。
項2.正確性の高い方法で増幅されたＰＣＲ産物を精製することなく、プラスミドあるいはファージベクターに30％以上の効率でクローニングする方法。
項3.該ＰＣＲ産物が3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより生成されることを特徴とする 項1,2記載の方法。
項4.該ＰＣＲ産物がα型ＤＮＡポリメラーゼにより生成されることを特徴とする項1〜3記載の方法。
項5.プラスミドベクターにいわゆるＴベクターあるいはＵベクターを利用することを特徴とする 項1〜4記載の方法。
項6.3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する反応と該ＰＣＲ産物の3'末端にｄＡを付加する工程を含むことを特徴とする 項1〜5記載の方法。
項7.3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する物質と該ＰＣＲ産物の3'末端にｄＡを付加する物質を混合して使用することを特徴とする 項6に記載の方法。
項8.ｄＡを付加する物質が3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする 項7に記載の方法。
項9.1つの容器内で行うことを特徴とする 項6〜8に記載の方法。
項10.3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性抑制と3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼによるｄＡ付加の反応が20〜40℃の常温で行われることを特徴とする 項9に記載の方法。
項11.反応温度が50℃以上である 項10に記載の方法。
項12.反応温度が50〜70℃である 項11に記載の方法。
項13.3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する物質が該ポリメラーゼの抗体であることを特徴とする 項1〜12に記載の方法。項14.3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと該抗体の混合比がモル比で1倍以上であることを特徴とする 項13に記載の方法。
項15. 項1〜14の方法で用いられる少なくとも1種類の抗体。
項16. 項1〜14の方法で用いられる少なくとも1種類のＤＮＡポリメラーゼ。
項17. 項1〜14の方法で用いられる少なくとも1種類の抗体と少なくとも1種類のＤＮＡポリメラーゼを混合した物質。
項18. 項17の物質を個々の活性を損なわず安定な状態で保存することを可能にするための組成物。
項19.30〜60％のグリセロールを主成分とすることを特徴とする 項18記載の組成物。
項20. 項15〜19の物質を含んでなるキット試薬。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＰＣＲ産物を精製することなく、プラスミドあるいはファージベクターに高い効率でクローニングする方法である。具体的には、ＰＣＲ産物を精製することなく、プラスミドあるいはファージベクターに30％以上、好ましくは50％以上、更に好ましくは80％以上の効率でクローニングする方法である。
【００１１】
本発明のクローニングに用いるＰＣＲ産物は、特に限定されるものではないが、例えばｍＲＮＡから逆転写して合成されたｃＤＮＡのように特定のタンパク質遺伝子をコードするＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにて得られたものなどが挙げられる。ここでクローニングされたＰＣＲ産物は、例えば、翻訳されてタンパク質の合成などに用いられる。そのような場合、正しいアミノ酸配列のタンパク質を合成するためには、正しい配列のＤＮＡを用いることが好ましい．即ち、正確性の高い方法で増幅されたＰＣＲ産物を用いる必要がある。正確性として求められるのは、変異挿入率3％以下、好ましくは1％以下、さらに好ましくは0.1％以下である。
このような正しい配列のＰＣＲ産物は、好ましくは、ＤＮＡ合成酵素として、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いることにより得ることができる。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、該活性により誤って取り込まれた塩基を削除できるため、正確性の高い方法に適している。具体的には、α型ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる一群が挙げられ、KODＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）Pwo ＤＮＡポリメラーゼ、Ultima ＤＮＡポリメラーゼなどのそれ自身が単独で該活性を有するものがある。また、Taq ＤＮＡポリメラーゼなどの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たない酵素に、これら単独で3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを混合して調製されたKOD Dash ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）、EX-Taq ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、Expand ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュ社製）なども3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼに含まれる。中でも、KOD ＤＮＡポリメラーゼは強力な3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持ち、『正確性』の高い増幅方法に用いられる酵素として最も好ましい。
【００１２】
本発明において、クローニングの効率は形質転換された宿主細胞に現れる表現型を識別した上で、全ての形質転換体における外来ＤＮＡが挿入されたことを示す表現型を有する形質転換体の割合を算出した値によって表される。好ましくは、外来ＤＮＡ挿入部位がβ-ガラクトシダーゼ遺伝子内に存在するベクターを用いてクローニングを行い、形質転換させた大腸菌をβ-ガラクトシダーゼの基質を含む培地上でコロニー形成させた後、コロニーの青白判定を行った上で全体のコロニーにおける白コロニーの数の割合を算出した値によって表される。例えば3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしてKOD ＤＮＡポリメラーを用いて得られたＰＣＲ産物を未処理のままＴベクターへ挿入した場合のクローニング効率は20％以下であった。それに対して本方法を用いた場合、30％以上の効率が得られるようになった。
【００１３】
また、本発明において、正確性の高い増幅方法の『正確性』とは、ＤＮＡ合成時における塩基の取り込みの正確性を意味する。本発明におけるＰＣＲ増幅の正確性を評価する方法の一例として、ストレプトマイシン耐性に関与するリボゾーマルタンパク質Ｓ１２（rpsL）遺伝子を用いた方法が挙げられる。ストレプトマイシンは原核細胞のタンパク質合成を阻害する抗生物質であり、細菌の３０ＳリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に結合してタンパク質合成の開始複合体形成反応を阻害し、また遺伝子暗号の誤読を引き起こす。ストレプトマイシン耐性変異株ではリボゾームタンパク質Ｓ１２に変異が見られる。この変異はリボゾームの翻訳忠実度を上げるため、サプレッサーｔＲＮＡによる終始コドンの読み取りを抑制するなど多面的効果(pleiotropic effect）を示すことが知られている。したがって、rpsL遺伝子を鋳型としてＰＣＲにより増幅を行うと、ある確率で変異が導入され、それがアミノ酸レベルの変異であった場合、rpsLタンパク質の構造が変化し、ストレプトマイシンが３０ＳリボゾーマルＲＮＡに作用できなくなるようなことが起こる。したがって、増幅したプラスミドＤＮＡによって大腸菌を形質転換した場合、変異が多く導入されるほどストレプトマイシン耐性菌の出現頻度が増すこととなる。
【００１４】
プラスミドpMol 21(Journal of Molecular Biology(1999)289,835-850に記載)は、rpsL遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドである。このプラスミドのアンピシリン耐性遺伝子上にＰＣＲ増幅用プライマーセット（片方をビオチン化、MluI制限酵素サイトを導入）を設計し、プラスミドの全長を耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をストレプトアビジンビーズを用いて精製し、制限酵素MluIを用いて切り出した後、ＤＮＡリガーゼを用いて結合して大腸菌を形質転換した。アンピシリンとアンピシリン及びストレプトマイシンを含有する２種類のプレートに接種して、それぞれのプレートに出現したコロニーの比を算出することによりＰＣＲ産物の『正確性』を求めることができる。
【００１５】
先に示したＰＣＲ産物の『正確性』を求める方法で、Taq ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ産物の正確性を調べたところ、4％以上の変異挿入率であった。一方、単独で3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素では、0.05〜1％の変異挿入率であり、Taq ＤＮＡポリメラーゼなどの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たない酵素に3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を混合して調製された混合型酵素では、2〜4％の変異挿入率であった。ちなみに、KOD ＤＮＡポリメラーゼの変異挿入率は0.1％以下であり、正確性の高いＰＣＲ産物を得るためには最も相応しい酵素である。
【００１６】
本発明で用いるプラスミドベクターには特に制限はないが、DNA断片の挿入部位が平滑末端のものより突出末端となっているものが、簡便なクローニングができる点で、好ましい。中でも、ＤＮＡ断片の挿入部位において3'末端がｄＴの突出末端となっている、いわゆるＴベクターが好ましい。また、3'末端がｄＴの代わりにｄＵとなった、いわゆるＵベクターもＴベクターと同じく利用される。
【００１７】
本発明のクローニング方法においては、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する反応と該ＰＣＲ産物の3'末端にｄＡを付加する工程を含むことができる。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する手段としては、特に限定されるものではないが、例えば、反応時に、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する物質を混合することができる。また、ＰＣＲ産物の3'末端にｄＡを付加する手段としては、特に限定されるものではないが、例えば、反応時に、ＰＣＲ産物の3'末端にｄＡを付加する物質を混合することができる。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する物質と該ＰＣＲ産物の3'末端にｄＡを付加する物質は、混合して使用してもよい。
【００１８】
該ＰＣＲ産物の3'末端にｄＡを付加する物質としては、特に限定されるものではないが、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼが例示される。また、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する物質としては、特に限定されるものではないが、該ポリメラーゼの抗体が例示される。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと該抗体の相対比は、モル比で1倍以上であることが好ましい。
【００１９】
本発明のクローニング方法において、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する反応と該ＰＣＲ産物の3'末端にｄＡを付加する工程は、1つの容器内で行うことが可能である。
【００２０】
本発明において、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性抑制と3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼによるｄＡ付加の反応温度は、特に限定されるものではないが、それぞれのＤＮＡポリメラーゼの至適温度付近で反応を行えば最も効率よくｄＡを付加することができ、最も好ましいと考えられる。
例えば、常温で機能するＤＮＡポリメラーゼを用いれば20〜40℃で反応することができる。
また、我々の検討によれば、例えば、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を抑制する物質として抗体を用いた場合でも、70℃以下の反応温度において抗体が機能できることを確認しているので、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いることも可能である。耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いる場合、50℃以上、好ましくは50〜70℃で反応を行うことができる。
【００２１】
本発明はまた、上記抗体の少なくとも1種類、および／または、上記ＤＮＡポリメラーゼの少なくとも1種類を混合した物質である。これらの物質は、個々の活性を損なわず安定な状態で保存することを可能にするための組成物に含まれることが好ましい。そのような組成物としては、特に限定されるものではないが、30〜60％のグリセロールを含む組成物が例示される。
【００２２】
これらは、キットとしての形態であっても良い。本発明において必要な物質以外の組成については、特に限定されるものではないが、必要に応じ、プライマー、ｄＮＴＰｓ、各種緩衝液類、塩類、界面活性剤、安定化剤、賦形剤、活性化剤などを添加することが可能である。また、キットは、１つ以上のパーツに分割されていても良いし、液体、粉末などの固体、凍結乾燥品などの状態を問わない。
【実施例】
以下実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。
【００２３】
実施例1．
3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて得られたPCR産物の簡便なクローニング
まず、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼとしてKOD-Plus DNAポリメラーゼを用いて、λDNA 2kbのPCRを行った。PCR バッファーはKOD-Plus（東洋紡績製）添付のものを用い、λファージ由来のDNA 1ngを鋳型に、KOD-Plus DNAポリメラーゼ1U、0.2mM dNTPs、配列番号1、2記載のプライマー対0.3μM使用した。94℃,2分の前反応の後、94℃,20秒―60℃,30秒−68℃,1分を30サイクル繰り返すスケジュールでGeneAmp2400（PEアプライドバイオシステムズ社）にてPCRを行った。
次に、pGEM-Tベクターシステム（プロメガ製）を用い、増幅した2kbのDNA断片のTAクローニングを試みた。なお、本キットだけでなく、α型DNAポリメラーゼを用いて得られたDNA断片は精製した後、Taq DNAポリメラーゼを用いて、その3'両末端にアデニン(dA)を付加させる事が一般的な方法として推奨されている。
具体的には、以下の4方法にて行った。
▲１▼PCR産物を全く処理せずそのまま、ライゲーション反応に供与
▲２▼モル比で2.5倍量のKOD抗体と5U Taq DNAポリメラーゼを添加して60℃,20min.反応  後、ライゲーション反応に供与
▲３▼モル比で2.5倍量のKOD抗体と5U Klenow(exo-) DNAポリメラーゼを添加して37℃,2  0min.反応後、ライゲーション反応に供与
▲４▼DNA断片精製後、1xTaqバッファー, 0.2mM ｄATP, 5U Taq DNAポリメラーゼを添加  して70℃,30min.反応したものをライゲーション反応に供与（標準法）
ライゲーション反応はプロメガキット添付の2xライゲーションバッファー、T4 DNAライゲースを用いて、24℃,1時間行った。ライゲーション反応液にて大腸菌JM109を形質転換した後、形質転換体をLB選択培地（200μg/mlアンピシリン,1mM IPTG,0.01％ X-gal含有）に塗布し、37℃、一晩培養した。pGEM-TベクターへのDNA断片の挿入は、X-galの分解能を見ることにより判断した。即ち、外来DNA断片が挿入された場合にはX-galを分解できず、コロニーが白色となることを利用した。
結果を表1に示す。▲１▼の条件では、DNA挿入率が12.3％しか得られなかったが、条件▲２▼では85.2％、条件▲３▼では76.0％と高効率であった。なお、キット推奨の条件▲４▼では、▲２▼▲３▼の簡易法よりも悪く、54.3％であった。
条件▲２▼の結果から反応温度60℃でも、KOD抗体がKOD-Plus DNAポリメラーゼの活性を十分におさえ、更にTaq DNAポリメラーゼが働きDNA断片の3'端にdAを付加できたものと思われる。また、条件▲３▼の結果から、Klenow(exo-) DNAポリメラーゼが反応温度37℃で働き、DNA断片の3'端にdAを付加したものと思われる。なお、キット推奨の方法（条件▲４▼）よりも、DNA挿入率が高くなっているのは、Taq DNAポリメラーゼがdAを付加する反応において、TaqバッファーよりもKOD-Plusバッファーの方が効率良く働いたためと思われる。
このように、PCRに用いた3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの活性を何らかの試薬を添加することによりおさえ、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たない他のDNAポリメラーゼを用いることによりdAを付加することが可能であった。以上の結果から、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼにて得られたPCR産物も精製すること無く、簡単にTAクローニングを行えることが明らかとなった。
【００２４】
【表１】
0004193103.tif 000002
【００２５】
実施例2．
3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼに抗体が添加された酵素を用いた簡便なクローニング
実施例1で示した抗体も用いた簡便なクローニング法が他の3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼでも可能か検討した。KOD以外では3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼに対する抗体の入手が困難なため、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼに予め抗体が添加されている酵素[Pfutubo Hotstart(ストラタジーン製)，KOD-Plus]を用いて行った。即ち、これら酵素液をPCR用酵素として用いたのではなく、それぞれの特異抗体を含有する抗体液と見なして酵素活性の抑制反応を行なった。Pfutubo Hotstart，KOD-Plusを用いて、実施例1と同じ方法にてPCRを行い、PCR後反応液にそれぞれの酵素液1U相当とTaq DNAポリメラーゼ5Uを添加して60℃,20min.反応した後、ライゲーション反応、形質転換、LB選択培地による培養を行った。
結果を表2に示す。KOD-Plusを用いた実験では、処理を施さない場合にはDNA挿入率が17.8％しか得られなかったが、前記のdAを付加する処理を行った場合には91.8％と高効率であった。また、Pfutubo Hotstartを用いた実験では、処理を施さない場合にはDNA挿入率が7.69％しか得られなかったが、前記のdAを付加する処理を行った場合には68.3％とKOD-Plusと同様に高いDNA挿入率を示した。
Pfuturbo Hotstartを用いた結果からほとんど全ての3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼにおいて、PCR後その活性をおさえる何らかの試薬と3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たない他のDNAポリメラーゼを使用することによりdAを付加することができ、簡単にTAクローニングに供与することができるものと思われる。
【００２６】
【表２】
0004193103.tif 000003
【００２７】
実施例3．
3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼが混合された酵素を用いて得られたPCR産物の簡便なクローニング
3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを添加した酵素としてKOD Dash DNAポリメラーゼを用いて、λDNA 2kbのPCRを行った。PCR バッファーはKOD-Plus（東洋紡績製）添付のものを用い、λファージ由来のDNA 1ngを鋳型に、KOD-Plus DNAポリメラーゼ1U、0.2mM dNTPs、配列番号1、2記載のプライマー対0.3μM使用した。94℃,2分の前反応の後、94℃,20秒―60℃,30秒−68℃,1分を30サイクル繰り返すスケジュールでGeneAmp2400（PEアプライドバイオシステムズ社）にてPCRを行った。
次に、pGEM-Tベクターシステム（プロメガ製）を用い、増幅した2kbのDNA断片のTAクローニングを試みた。なお、本キットだけでなく、α型DNAポリメラーゼを用いて得られたDNA断片は精製した後、Taq DNAポリメラーゼを用いて、その3'両末端にアデニン(dA)を付加させる事が一般的な方法として推奨されている。
具体的には、以下の4方法にて行った。
▲１▼PCR産物を全く処理せずそのまま、ライゲーション反応に供与
▲２▼モル比で2.5倍量のKOD抗体と5U Taq DNAポリメラーゼを添加して60℃,20min.反応  後、ライゲーション反応に供与
▲３▼モル比で2.5倍量のKOD抗体と5U Klenow(exo-) DNAポリメラーゼを添加して37℃,2  0min.反応後、ライゲーション反応に供与
▲４▼DNA断片精製後、1xTaqバッファー, 0.2mM ｄATP, 5U Taq DNAポリメラーゼを添加  して70℃,30min.反応したものをライゲーション反応に供与（標準法）
ライゲーション反応はプロメガキット添付の2xライゲーションバッファー、T4 DNAライゲースを用いて、24℃,1時間行った。ライゲーション反応液にて大腸菌JM109を形質転換した後、形質転換体をLB選択培地（200μg/mlアンピシリン,1mM IPTG,0.01％ X-gal含有）に塗布し、37℃、一晩培養した。pGEM-TベクターへのDNA断片の挿入は、X-galの分解能を見ることにより判断した。即ち、外来DNA断片が挿入された場合にはX-galを分解できず、コロニーが白色となることを利用した。
結果を表1に示す。▲１▼の条件では、DNA挿入率が12.3％しか得られなかったが、条件▲２▼では85.2％、条件▲３▼では76.0％と高効率であった。なお、キット推奨の条件▲４▼では、▲２▼▲３▼の簡易法よりも悪く、54.3％であった。
条件▲２▼の結果から反応温度60℃でも、KOD抗体がKOD-Plus DNAポリメラーゼの活性を十分におさえ、更にTaq DNAポリメラーゼが働きDNA断片の3'端にdAを付加できたものと思われる。また、条件▲３▼の結果から、Klenow(exo-) DNAポリメラーゼが反応温度37℃で働き、DNA断片の3'端にdAを付加したものと思われる。なお、キット推奨の方法（条件▲４▼）よりも、DNA挿入率が高くなっているのは、Taq DNAポリメラーゼがdAを付加する反応において、TaqバッファーよりもKOD-Plusバッファーの方が効率良く働いたためと思われる。
このように、PCRに用いた3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの活性を何らかの試薬を添加することによりおさえ、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たない他のDNAポリメラーゼを用いることによりdAを付加することが可能であった。以上の結果から、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼにて得られたPCR産物も精製すること無く、簡単にTAクローニングを行えることが明らかとなった。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片を、精製することなくＴベクターにクローニングすることが可能となった。この方法を用いることにより、正確性の高い方法で増幅されたＰＣＲ産物を簡単にクローニングできるようになった。
【００３０】
【配列表】
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【００３１】
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