(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１：
0004173551.tif 000033
〔式中、Ｒ1は、そのいずれかが１個又はそれより多くのヒドロキシル基により置換されていてもよいα−分枝Ｃ3〜Ｃ8アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシアルキル又はアルキルチオアルキル基；Ｃ5〜Ｃ8シクロアルキルアルキル基（ここで、アルキル基はα−分枝Ｃ2〜Ｃ5アルキル基である）；Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル又はＣ5〜Ｃ8シクロアルケニル基（そのいずれかがメチル、あるいは１個又はそれより多くのヒドロキシル、あるいは１個又はそれより多くのＣ1〜Ｃ4アルキル基、あるいはハロゲン原子により置換されていてもよい）；あるいは飽和、あるいは完全又は一部不飽和で、任意に１個又はそれより多くのＣ1〜Ｃ4アルキル基、あるいはハロ原子により任意に置換される、３〜６員の酸素又は硫黄含有複素環式環であるか；あるいはＲ1はＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ及びＣ1〜Ｃ4アルキルチオ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル及びシアノから選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよいフェニルであるか；あるいは
Ｒ１は下記の式（ａ）：
0004173551.tif 000034
（式中、ＸはＯ、Ｓ又は−CH2−であり、ａ、ｂ、ｃ及びｄは各々別々に０〜２であって、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≦５である）を有する基であり；
Ｒ2は、Ｈ又はOHであり；
Ｒ3〜Ｒ5は各々別々にＨ、CH3又はCH2CH3であり；
Ｒ6はＨ又はOHであり；そして
Ｒ7はＨ、CH3又はCH2CH3であり；
Ｒ8はＨ又はデソサミンであり；
Ｒ9はＨ、CH3又はCH2CH3であり；
Ｒ10はOH、ミカロース（R13はＨである）又はクラジノース（Ｒ13はCH3である）であり；又は
Ｒ11はＨであるか；Ｒ10＝Ｒ11＝Ｏであり；そして
Ｒ12はＨ、CH3又はCH2CH3である〕
で表わされる化合物、但し、（14S,15S）14−（１−ヒドロキシエチル）エリスロマイシンＡ、14−（１−プロピル）エリスロマイシンＡ及び14［１（１−ヒドロキシプロピル）］エリスロマイシンＡを除く、並びにそれらの製薬上許容可能なその塩。
【請求項２】
式２：
0004173551.tif 000035
〔式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、Ｃ2〜Ｃ8アルケニル、Ｃ2〜Ｃ8アルキニル、アルコキシアルキル又はアルキルチオアルキル（各々のアルキル又はアルコキシ基中に１〜６個の炭素原子を含有する）（ここで、前記のアルキル、アルコキシ、アルケニル又はアルキニル基はいずれかが１個又はそれより多くのヒドロキシル基により、あるいは１個又はそれより多くのハロ原子により置換されていてもよい）；あるいはメチルにより、あるいは１個又はそれより多くのＣ1〜Ｃ4アルキル基又はハロゲン原子により置換されていてもよいＣ3〜Ｃ8シクロアルキル又はＣ5〜Ｃ8シクロアルケニル；あるいは飽和、あるいは完全又は一部不飽和で、１個又はそれより多くのＣ1〜Ｃ4アルキル基により、あるいはハロ原子により置換されていてもよい３〜６員の酸素又は硫黄含有複素環式環であるか；あるいは式SR14（ここで、R14はＣ1〜Ｃ8アルキル、Ｃ2〜Ｃ8アルケニル、Ｃ2〜Ｃ8アルキニル、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、Ｃ5〜Ｃ8シクロアルケニル、フェニル、又は置換フェニル（ここで、置換基はＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ又はハロである）、あるいは飽和、あるいは完全又は一部不飽和で、任意に１個又はそれより多くのＣ1〜Ｃ4アルキル基、あるいはハロ原子により任意に置換される３〜６員化酸素又は硫黄含有複素環式環である）（但し、Ｒ1はCH3ではない）の基であり；
Ｒ2は、Ｈ又はOHであり；
Ｒ3〜Ｒ5は各々別々にＨ、CH3又はCH2CH3であり；
Ｒ6はＨ又はOHであり；そして
Ｒ7はＨ、CH3又はCH2CH3であり；
Ｒ8はＨ又はデソサミンであり；
Ｒ9はＨ、CH3又はCH2CH3であり；
Ｒ10はOH、ミカロース（Ｒ13はＨである）又はクラジノース（Ｒ13はCH3である）であり；
Ｒ11はＨであるか；あるいはＲ10＝Ｒ11＝Ｏであり；そして
Ｒ12はＨ、CH3又はCH2CH3であり、但し、Ｒ3〜Ｒ5がCH3であり、Ｒ7がCH3であり、Ｒ9がCH3であり、そしてＲ12がCH3である場合には、Ｒ1はＨ又はＣ1アルキルではない〕
により表わされる化合物、並びに製薬上許容可能なその塩。
【請求項３】
Ｒ1が、１個又はそれより多くのヒドロキシル基によりあるいは１個又はそれより多くのＣ1〜Ｃ4アルキル基により置換されていてもよいＣ3〜Ｃ6シクロアルキル又はシクロアルケニル基である請求項１記載の式１の化合物。
【請求項４】
Ｒ1がシクロプロピルである請求項３の化合物。
【請求項５】
Ｒ1がシクロブチルである請求項３の化合物。
【請求項６】
Ｒ1がシクロペンチルである請求項３の化合物。
【請求項７】
Ｒ1がシクロヘキシルである請求項３の化合物。
【請求項８】
Ｒ1がα−分枝Ｃ3〜Ｃ8アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシアルキル又はアルキルチオアルキル基である請求項１の化合物。
【請求項９】
Ｒ1がイソプロピルである請求項８の化合物。
【請求項１０】
Ｒ1がsec−ブチルである請求項８の化合物。
【請求項１１】
Ｒ1が２−ブテン−２−イル、２−ペンテン−２−イル又は４−メチル−２−ペンテン−２−イルである請求項８の化合物。
【請求項１２】
Ｒ1が１−メチルチオエチルである請求項８の化合物。
【請求項１３】
Ｒ1が、１個又はそれより多くのヒドロキシル基により、あるいはＣ1〜Ｃ4アルキル基又はハロゲン原子により置換されていてもよい５又は６員の酸素又は硫黄含有複素環式環である請求項１の化合物。
【請求項１４】
Ｒ1が３−チエニルである請求項13の化合物。
【請求項１５】
Ｒ1が３−フラニルである請求項13の化合物。
【請求項１６】
Ｒ1がフェニルである請求項１の化合物。
【請求項１７】
Ｒ1が式（ａ）（式中、ａ及びｂは０であり、ｃ及びｄは１であり、Ｘは−CH2−である）の基である請求項１の化合物。
【請求項１８】
Ｒ1が式（ａ）（式中、ａ及びｂは０であり、ｃは１であり、ｄは２であり、Ｘは−CH2−である）の基である請求項１の化合物。
【請求項１９】
Ｒ1が式（ａ）（式中、ａ及びｂは０であり、ｃ及びｄは１であり、ＸはＯである）の基である請求項１の化合物。
【請求項２０】
Ｒ1がSR14であり、Ｒ14がメチル又はエチルである請求項２の化合物。
【請求項２１】
Ｒ1がエチル、プロピル、ブチル、イソプロピル又はsec−ブチルである請求項２の化合物。
【請求項２２】
Ｒ1が１−（トリフルオロメチル）エチルである請求項２の化合物。
【請求項２３】
式Ｒ１がCO2H（式中、Ｒ1は請求項１又は２に記載の通りである）のカルボン酸、あるいはその塩、エステル又はアミド、あるいはその酸化性前駆体の存在下でエリスロマイシンを産生し得る生物を発酵させて、式１又は２の化合物を単離する工程から成る請求項１記載の式１又は請求項２記載の式２の化合物の製造方法。
【請求項２４】
生物がSaccharopolyspora erythraeaである請求項23の方法。
【請求項２５】
前記生物が式１の化合物の生合成を指令し得る有効に組込まれたプラスミドを含む、請求項24の方法。
【請求項２６】
前記プラスミドがII型PKSプロモーター／アクチベーター遺伝子を含む、請求項25の方法。
【請求項２７】
前記生物Saccharopolyspora erythraeaがNRRL 2338、18643又は21484株から選択される、請求項24〜26のいずれか１項の方法。
【請求項２８】
前記生物が式１の化合物の生合成を指令することができる有効に組込まれたプラスミドを含有し、前記プラスミドがactIプロモーター及びそのコグネイトアクチベーター遺伝子actII−orf4を含有し得る、請求項27の方法。
【請求項２９】
前記生物が、pAVLD、pIG1、pND30、pCJR26、pCJR49、pC−AT12及びpC−ATXから選択される有効に組込まれたプラスミドを含有する、請求項27の方法。
【請求項３０】
生物がS.erythraea ERMD１、S.erythraea NRRL 2338/pIG1、S.erythraea NRRL 2338/pND30、又はその他の同様の形質転換体である請求項27の方法。
【請求項３１】
治療的有効量の請求項１又は請求項２の化合物を製薬上許容可能な担体と組合せて包含する製剤組成物。
【請求項３２】
ヒト以外の哺乳類、魚類又は鳥類における細菌感染又は細菌感染に関連した疾患、あるいは原生動物感染又は原生動物感染に関連した疾患の治療方法であって、治療的有効量の請求項１又は請求項２の化合物を前記哺乳類、魚類又は鳥類に投与する工程を包含する方法。
【請求項３３】
哺乳類、魚類又は鳥類における細菌感染を治療するための薬剤の製造における請求項１又は請求項２の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、新規のポリケチド（polyketide）及びその調製のための方法及び手段に、特にヒトを含めた哺乳類、並びに魚類及び鳥類における抗細菌薬及び抗原生動物薬として、並びにその他の用途（例えば、抗癌、アテローム硬化症、胃運動性低減等）に有用な新規のエリスロマイシンに関する。本発明はさらに、新規の化合物を含有する製剤組成物に、そしてこのような治療を必要とする哺乳類、魚類及び鳥類に新規の化合物を投与することによる哺乳類、魚類及び鳥類における細菌及び原生動物感染の治療方法に関する。
発明の背景
異なるポリケチド生合成遺伝子集団から得られるポリケチド生合成遺伝子又はその一部分を操作して、新規のエリスロマイシンを産生し得る。
ポリケチドは大きなそして構造的に多様な種類の天然物質であって、その例としては、抗生物質的又はその他の薬理学的特性を有する多数の化合物、例えば、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ラパマイシン、アベルメクチン、ポリエーテルイオノフォア及びＦＫ５０６が挙げられる。特に、ポリケチドはストレプトミセス属及び関連する放線菌類（actinomycete）により豊富に産生される。それらは、脂肪酸生合成と同様の方法で、アシルチオエステルの反復的段階的縮合により合成される。天然ポリケチド間に認められるより大きな構造的多様性は、「スターター」又は「エキステンダー」単位として（通常は）酢酸塩又はプロピオン酸塩を選択することにより、そして各々の縮合後に観察されるβ−ケト基の異なる程度のプロセシングにより生じる。プロセシング工程の例としては、β−ヒドロキシアシルへの還元、脱水後の２−エノイル−への還元、及び飽和アシルチオエステルへの完全還元が挙げられる。これらのプロセシング工程の立体化学的結果は、鎖延長の各周期に関しても明記される。ポリケチドの生合成は、ポリケチドシンターゼとして公知の鎖生成酵素の一群により開始される。２種類のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）が、放線菌類（actinomycete）で記載されている。しかしながら、本発明の目的である新規のポリケチドそして製造方法は、マクロライド系エリスロマイシン、アベルメクチン及びラパマイシン（図１）に関するＰＫＳに代表されるＩ型ＰＫＳにより合成され、そしてポリケチド鎖延長の各周期に関する異なる組の又は「モジュール」の酵素で構成される（図２Ａ）（Cortes,J.et al.,Nature（1990）348:176-178;Donadio,S.et al.,Science（1991）252:675-679;MacNeil,D.J.et al.,Gene（1992）115:119-125;Schwecke,T.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1995）92:7839-7843）。注：「天然モジュール」という用語は、本明細書で用いる場合、一周期のポリケチド鎖延長を成し遂げるβ−ケトアシルシンターゼ（「ＫＳ」）遺伝子から次のアシル担体タンパク質（「ＡＣＰ」）遺伝子までの隣接ドメインの組を示す。「組合せモジュール」という用語は、最初の天然モジュールの第一の点から第二天然モジュールの第二の等価点まで延びる隣接ドメイン（及びドメイン部分）のあらゆる群を示すために用いられる。第一及び第二の点は一般に、すべてのモジュールに存在するコアドメインに、即ち、それぞれのＫＳ、ＡＴ（アシルトランスフェラーゼ）、ＡＣＰドメインの等価点で、又はドメイン間のリンカー領域にある。
図２は、エリスロマイシン産生ＰＫＳ（６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ  ＤＥＢＳとしても公知である）遺伝子の機構を示す。３つのオープンリーディングフレームは、ＤＥＢＳポリペプチドをコードする。遺伝子は、６つのモジュールと呼ばれる反復単位を編成する。最初のオープンリーディングフレームは、３つのモジュール：即ち負荷モジュール（ｅｒｙ−負荷）と２つの延長モジュール（モジュール１及び２）から成る第一多重酵素又はカセット（ＤＥＢＳ１）をコードする。負荷モジュールは、アシルトランスフェラーゼ及びアシル担体タンパク質で構成される。これは、ＷＯ９３／１３６６３の図１と対比される（以下に示す）。これはＯＲＦ１が２つのモジュールのみから成ることを示し、その最初のものは実際、負荷モジュールと第一延長モジュールである。
ＤＥＢＳにおけるモジュール５のケトレダクターゼドメインの一部をコードするＤＮＡのフレーム内欠失は、エリスロマイシン類似体  ５，６−ジデオキシ−３−ミカロシル−５−オキソエリスロノリドＢ、５，６−ジデオキシ−５−オキソエリスロノリドＢ及び５，６−ジデオキシ−６．６−エポキシ−５−オキソエリスロノリドＢの形成を引き起こす（Donadio,S.et al.,（1991）252:675-679）。同様に、ＤＥＢＳにおけるモジュール４のエノイルレダクターゼドメインの活性部位残基の変化は、対応するＰＫＳ−コードＤＮＡの遺伝子工学処理及びSaccharopolyspora erythraea中へのその導入により、６，７−アンヒドロエリスロマイシンＣの産生を生じた（Donadio,S.et al.,Pro.Natl.Acad.Sci.USA（1993）90:7119-7123）。
国際特許出願第ＷＯ９３／１３６６３号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）は、ポリケチドの変化を生じ得るＤＥＢＳ遺伝子の別の種類の遺伝子操作を記載する。しかしながら、多数のこのような試みは不毛であったことが報告されている（Hutchinson C.R.and Fujii,I.,Annu.Rev.Microbiol.（1995）49:201-238,p.231）。大環式免疫抑制ポリケチド  ラパマイシンの生合成を支配するモジュラーＩ型ＰＫＳをコードするStreptomyces hygroscopicusからの遺伝子の完全ＤＮＡ配列が開示されている（Schwecke,T.et al.（1995）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7839-7843）（図３）。ＤＮＡ配列は、寄託番号Ｘ８６７８０で、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｄｅｔａｂａｓｅに寄託されている。
多数の治療的に重要なポリケチドが確認されているけれども、増強された特性を示すか又は完全に新規の生物活性を有する新規のポリケチドを得る必要が依然としてある。モジュラーＩ型ＰＫＳにより産生される複雑なポリケチドは、それらが、駆虫薬、殺昆虫薬、免疫抑制薬、抗真菌薬および／または抗細菌薬のような公知の用途を有する化合物を含む場合、特に有益である。それらが構造的に複雑なために、全体的化学合成により、又は公知のポリケチドの化学的修飾によっては、このような新規のポリケチドは容易に得られない。本発明の一局面は、Ｉ型ＰＫＳ遺伝子アッセンブリーが延長モジュールを後に従えた負荷モジュール（loading module）をコードする、という我々の認識から生じる。負荷モジュールが延長モジュールに対して異種であり、スターターユニットの変化を示すポリケチドを生じるようなものであるハイブリッドＰＫＳ遺伝子アッセンブリーを提供することが特に有用である。これは、負荷モジュールの存在を認識しないため、従来技術に対して全く未知の概念である。ＷＯ９３／１３６６３は、単一機能（即ち、単一酵素）を不活性化することによりＰＫＳ遺伝子を変化させるか、あるいはその欠失、挿入又は置換により「完全モジュール」に影響を及ぼすことに言及する。負荷アッセンブリーは、それらの表現では、モジュールではない。
負荷モジュールが多数の異なるカルボン酸単位を受容するものである場合には、ハイブリッド遺伝子アッセンブリーを用いて多数の異なるポリケチドを生成し得る。例えば、ハイブリッド遺伝子アッセンブリーは、ｅｒｙ延長モジュールを伴うａｖｒ負荷モジュールをコードする核酸を用い得る。負荷モジュールは非天然酸単位及びその誘導体を受容し得る；ａｖｒ負荷モジュールは、これに関しては特に有用である（Dutton et al.,（1991）J.Antibiot.44:357-365）。さらに、非天然スターター単位に対する天然負荷モジュールの特異性を確定し、そして新規のポリケチドを生成するための負荷モジュールの特異性緩和を利用することができる。したがって、本発明の別の局面は、非天然カルボン酸及びその誘導体を組み込んで、ＤＥＢＳ遺伝子のみを含有するエリスロマイシン産生株中で新規のエリスロマイシンを生成するｅｒｙ負荷モジュールの予期せぬ能力である。もちろん、異なる酸化状態でのおよび／または異なる立体化学を有するケチド単位を与えるもので延長モジュールを置換することにより特に、生成物ポリケチド内で変更を成し得る。ポリケチド鎖中のメチル基の立体化学はアシルトランスフェラーゼにより確定されるが、しかしそれは、実際、ＰＫＳのその他のドメインの特徴であり、したがってそのドメインの置換によって、個々に、あるいはモジュール置換によってのみ変化を開始する、と一般的に考えられる。メチル及びその他の置換基は、アシルトランスフェラーゼドメイン置換又は全体的モジュール置換によって、付加又は除去される。したがって、広範囲の新規のエリスロマイシンを生成する一メカニズムとして、エリスロマイシン負荷モジュールの緩和基質特異性の使用を延長モジュール置換と、そして延長モジュール置き換えによるハイブリッド負荷モジュール置換と組合せることもできる、ということも当業者には明らかになる。したがって、本発明は、非形質転換化生物による新規のエリスロマイシンの生成、並びにこのような遺伝子アッセンブリー、このような遺伝子アッセンブリーを含有するベクター、そして形質転換生物内で新規のエリスロマイシンを生成するためにそれらを発現し得る形質転換体生物を記載する。形質転換体生物は組換え体プラスミドを保有するか、又はプラスミドが一体化し得る。ｉｎｔ配列を有するプラスミドは、宿主染色体の特異的付着部位（ａｔｔ）中に組み込まれる。形質転換体生物は、例えばエリスロマイシンの製造においてすべての又はいくつかの生合成修飾を実施することにより、初期生成物を修飾し得る（図２Ｂ）。しかしながら、正常経路のいくつかが遮断されて、例えば、ＷＯ９１／１６３３４に又はWeber et al.,（1985）J.Bacteriol.164:425-433（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されているように、例えば１つ又はそれ以上の「天然」ヒドロキシ基又は糖基を有さない生成物を生成するように、突然変異体生物が使用される。あるいは、例えばＷＯ９７／０６２６６（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されているように、所望の生成物の製造において考え得る速度制限工程を克服するよう、正常経路のいくつかが過剰発現される生物体が用いられる。
本方法のこの局面は、酵素系を構築し、したがって所望の型の新規のエリスロマイシン生成物を構築するために用いられる建築用ブロックとしてＰＫＳ遺伝子モジュールを処理することに大いに関係がある。これは一般的に、モジュールの切断及びアッセンブリー、並びに多重モジュール組分けを包含する。モジュール間連結を作成及び破壊するための理論的場所は、モジュール間の連接領域にある。しかしながら、実際には、その縁に近接したドメイン（即ち、酵素コード部分）内で切断及び連結させるのが好ましい。ＤＮＡは、ここでは、全モジュールＰＫＳ間に高度に保存され、これは転写され得るハイブリッドの構築に役立つ。それは、コードか酵素の活性部位の間隔を保持する場合にも手助けし、このことは重要である。例えば、ｅｒｙ負荷モジュールをａｖｒ負荷モジュールで置き換えることによりハイブリッド遺伝子を生成する場合、ｅｒｙモジュールは少量のその後のケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインとともに除去される。ＫＳドメイン（活性部位と十分間隔を置いた）の開始は高度に保存され、したがって負荷ドメインとＫＳドメインの開始との間のリンカー領域に対する代替物として適切なスプライシング部位を提供する。切り取られたｅｒｙモジュールは次に、ａｖｒ負荷モジュールに置き換えられる。
実際、負荷モジュールを置換する場合は、負荷モジュールドメイン（一般にアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）及びアシル担体タンパク質（ＡＣＰ））きっかりでなく、その後ろの延長モジュールの開始のＫＳも置き換えるのが望ましい。典型的には、切り取られた負荷モジュールはプロピオン酸塩スターターを提供し、置き換えは１つ又はそれ以上の異なるスターターを提供するよう意図される。しかしながら、プロピオン酸塩は、宿主細胞中でプロピオン酸塩プールから延長モジュールのＫＳ中に送り込まれて、所望生成物の希釈液を生じる。これは、すべての又はほとんどのＫＳドメインを含めた延長化負荷モジュールを置換することにより大いに阻止される（スプライシング部位はＫＳ遺伝子の末端領域にあるか、又は初期にはその後のＡＴ遺伝子にあり、あるいはそれらの間のリンカー領域にある）。
「モジュール」を置き換える場合、あるものは「天然」モジュールに制限されない。例えば、切り取られるか、および／または置換されるか、および／または挿入される「組合せモジュール」は、２つの天然型モジュールの対応するドメインから、例えばあるモジュールのＡＴから、次のＡＴまで、あるいはＫＳからＫＳまで延長する。スプライシング部位は、対応する保存縁領域に、又はリンカー領域にある。組合せモジュールはさらに、２つ又はそれ以上のモジュールを同時に付加するために、「二重」又はそれ以上の「多重」であり得る。
さらに別の局面では、本発明は前記の局面によって得られる新規のエリスロマイシンを提供する。これらは、以下のものを包含する：
（ｉ）Ｃ−１３がエチル以外の側鎖、一般的には直鎖Ｃ3〜Ｃ6アルキル基、分枝鎖Ｃ3〜Ｃ8アルキル基、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル又はシクロアルケニル基（任意に、例えば１つ又はそれ以上のヒドロキシ、Ｃ1〜4アルキル又はアルコキシ基あるいはハロゲン原子で置換される）、あるいはＯ又はＳを含有する、飽和、あるいは全部又は一部不飽和、任意に置換される（シクロアルキルに関してと同様に）３〜６員複素環を保有するか、あるいはＲ1がフェニル（Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ及びＣ1〜Ｃ4アルキルチオ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル及びシアノから選択される少なくとも１つの置換基で任意に置換される）であるか；又はＲ1が下式（ａ）：
0004173551.tif 000002
（式中、ＸはＯ、Ｓ又は−ＣＨ2−であり、ａ、ｂ、ｃ及びｄは各々別々に０〜２であって、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≦５である）を有する基であるエリスロマイシン類似体（１４員環を有するマクロライド系化合物である）。Ｃ−１３置換基Ｒの好ましい候補は，ａｖｒスターターモジュール又はラパマイシンスターター変異体による基質として有用なカルボキシレート単位ＲＣＯＯＲ′の基である。好ましい基質は、カルボン酸ＲＣＯＯＨである。有効に使用され得る代替基質は、カルボン酸塩、カルボン酸エステル又はアミドである。好ましいエステルは、欧州特許第０３５０１８７号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）でDutton等が説明したようにａｖｒスターターモジュールにより基質として容易に利用され得るＮ−アセチル−システアミンチオエステルである。好ましいアミドは、Ｎ−アシルイミダゾールである。使用され得るその他の代替的基質は、カルボン酸に対する酸化的前駆体である誘導体である；したがって、例えば適切な基質は、式ＲＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨのアミノ酸、式ＲＣＯＣＯＯＨのグリオキシル酸、式ＲＣＨ2ＮＨ2のメチルアミン誘導体、式ＲＣＨ2ＯＨのメタノール誘導体、式ＲＣＨＯのアルデヒド、又は式Ｒ（ＣＨ2）nＣＯＯＨ（ここで、ｎは２、４又は６である）の置換アルカン酸である。したがって、好ましい基質の例としては、イソブチラート（Ｒ＝ｉ−Ｐｒ）及び２−メチルブチラート（Ｒ＝１−メチルプロピル）が挙げられる。その他の可能性としては、ｎ−ブチラート、シクロプロピルカルボキシレート、シクロブチルカルボキシレート、シクロペンチルカルボキシレート、シクロヘキシルカルボキシレート、シクロヘプタニルカルボキシレート、シクロヘキセニルカルボキシレート、シクロヘプテニルカルボキシレート、及び環状カルボキシレートの環メチル化変異体、並びにその前記の誘導体が挙げられる。
エリスロマイシン類似体は、ＰＫＳの初期物質（６−でオキシエリスロノリド）又は１つ又はそれ以上の正常生合成工程後の生成物に対応する。図２ｂに示したように、これらは：６−ヒドロキシル化；３−０−グリコシル化；５−０−グリコシル化；１２−ヒドロキシル化；及び特異的糖メチル化を包含する。
したがって、類似体は、図２ｂに示したように、６−デオキシエリスロノリドＢ、エリスロマイシンＡ、並びに種々の中間体及び代替物（これらに限定されない）を含む。
（ｉｉ）１つ又はそれ以上のケチド単位酸化状態の対応する「天然」化合物とは異なるエリスロマイシン類似体（即ち、基：−ＣＯ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、＝ＣＨ−及び−ＣＨ2−からの代替物の選択）。
任意の−ＣＨ（ＯＨ）−の立体化学もそれぞれ選択可能である。
（ｉｉｉ）「天然」メチル側鎖の非存在下での対応する「天然」化合物とは異なるエリスロマイシン類似体（これは変異体ＡＴの使用により達成される）。正常延長モジュールはＣ2又はＣ3単位を用いて非メチル化及びメチル化ケチド単位を提供する。メチル化単位が天然である場合には非メチル化単位が提供され（そして、天然非メチル化単位が存在する場合にはその逆）、さらに、より大きい単位、例えばＣ4を提供して、エチル置換基を提供し得る。
（ｉＶ）「天然」メチル；および／またはメチル以外の環置換基の立体化学における対応する「天然」化合物とは異なるエリスロマイシン類似体。
（ｖ）項（ｉ）〜（ｉｖ）の２つ又はそれ以上の特徴を有するエリスロマイシン類似体。
（ｖｉ）非ＰＫＳ酵素による加工処理、例えばヒドロキシル化、エポキシド化、グリコシル化及びメチル化のうちの１つ又はそれ以上の処理を受けた上記の任意の誘導体。
本発明の新規のエリスロマイシンの製造のための方法を記載する。最も簡単な方法では、非天然スターター単位（好ましくは非天然スターター単位のカルボン酸類似体、しかしこれらに限定されない）が、エリスロマイシンを生成し得る非形質転換化生物体に導入される。好ましいアプローチとしては、エリスロマイシン生成生物の発酵ブロス中へのスターター単位の導入が含まれるが、このアプローチはエリスロマイシンを生成し得る形質転換化生物に関してより有効である。しかしながら、スターター単位類似体は、エリスロマイシン生成生物の代替調製物、例えば分別又は非分別破壊細胞調製物にも導入される。さらに、このアプローチは、エリスロマイシンを生成し得る形質転換化生物に関して、等しく有効である。別の方法では、異種Ｉ型ＰＫＳ（「ドナー」ＰＫＳ）内の個々のモジュール又はドメインをコードするＤＮＡの１つ又はそれ以上のセグメントを用いて、エリスロマイシン産生生物のＤＥＢＳ遺伝子内のそれぞれ個々のモジュール又はドメインをコードするＤＮＡを置き換え得る。あらゆる天然又は非天然Ｉ型ＰＫＳから得られた負荷モジュール及び延長モジュールは、この「ドナー」ＰＫＳに適しているが、この目的に特に適しているのは、エリスロマイシン、ラパマイシン、アベルメクチン、テトロナシン、オレアンドマイシン、モネンシン、アンホテリシン及びリファマイシンの生合成のためのＩ型ＰＫＳの成分であって、このための遺伝子及びモジュール機構は、少なくとも一部は、遺伝子配列分析により公知である。ドナーＰＫＳの負荷モジュールの特に好ましい例は、特異性緩和を示す負荷モジュール、例えばストレプトマイセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）のアベルメクチン（ａｖｒ）生成ＰＫＳの負荷モジュール；又は例外的特異性を有する負荷モジュール、例えばラパマイシン、ＦＫ５０６−及びアスコマイシン生成ＰＫＳ（これらはすべて、シキミ酸由来スターター単位を天然に受容する）の負荷モジュールである。予期に反して、非形質転換化及び遺伝子工学処理エリスロマイシン産生生物は、適切な条件下で培養されると、非天然性エリスロマイシンを産生することが判明し、適切な場合には、生成物は天然エリスロマイシンと同じ加工処理を受けることが判明した。
本発明のさらに別の局面では、「ドナー」ＰＫＳ  ＤＮＡを含有するプラスミドは、相同的組換えによりエリスロマイシン産生株の染色体上のＤＥＢＳ遺伝子中に組み込まれる条件下で、宿主細胞中に導入されて、ハイブリッドＰＫＳを生じる。好ましい実施態様は、ドナーＰＫＳ  ＤＮＡが、この負荷モジュールが染色体上でＤＥＢＳ遺伝子に連結されるような方法で、負荷モジュールをコードするセグメントを包含する。このようなハイブリッドＰＫＳは、本明細書中に記載したような適切な条件下で培養されると、有益且つ新規のエリスロマイシン生成物を産生する。特に、ＤＥＢＳ遺伝子の負荷モジュールがアベルメクチン産生（ａｖｒ）ＰＫＳの負荷モジュールに置き換えられた場合、新規のエリスロマイシン生成物はａｖｒＰＫＳに用いられるものに典型的なスターター単位を含有する。したがって、ｅｒｙＰＫＳの負荷モジュールがａｖｒ負荷モジュールに置き換えられると、このようなハイブリッドＰＫＳを含有するサッカロポリスポラ・エリスレア（Saccharopolyspora erythraea）株は，ａｖｒＰＫＳにより典型的に用いられるスターター単位を含有する１４員マクロライドを産生することが分かっている。
Ｓ．エリスレア（S.erythraea）のこのような組換え体細胞により産生される１４員マクロライド系ポリケチドがエリスロマイシンＡの誘導体を含むことが判明したことは予想外で、このことは、ハイブリッドＰＫＳの生成物の新規の且つ治療的に有益なエリスロマイシンＡ誘導体への形質転換に必要ないくつかの処理工程が正しく実行されたことを示す。本発明のさらに別の局面は、ハイブリッド遺伝子がそのプロモーターに対する特異的アクチベーター遺伝子に連結されたＩＩ型ＰＫＳ遺伝子に関してプロモーターの制御下に置かれると、あらゆるハイブリッドエリスロマイシン遺伝子の転写が特異的に増大され得る、という予想外の且つ驚くべき知見である。このような制御下のハイブリッドエリスロマイシン遺伝子を含有する遺伝子工学処理細胞がエリスロマイシン産生に適した条件下で培養されると、有意増強レベルの新規のエリスロマイシンが産生される、ということは特に注目すべきである。有益なエリスロマイシン生成物の産生におけるこのような特異的増大は、ＩＩ型ＰＫＳプロモーター及びアクチベーター遺伝子の制御下に置かれた天然エリスロマイシンＰＫＳに関しても観察される。好ましい実施態様では、ＳＣＰ２*由来プラスミド上に存在する所望の遺伝子がStreptomyces coelicolorのアクチノロジン生合成遺伝子集団由来の二方向性ａｃｔＩプロモーターの制御下に置かれ、この場合、ベクターはさらに、特異的アクチベータータンパク質Ａｃｔ  ＩＩ−ｏｒｆ４をコードする構造遺伝子を含有する。組換え体プラスミドは、導入ＰＫＳ遺伝子又は宿主株中にすでに存在するＰＫＳ遺伝子がａｃｔＩプロモーターの制御下で発現される条件下で、サッカロポリスポラ・エリスレア（Saccharopolyspora erythraea）中に導入される。
このような株は所望のエリスロマイシン生成物を産生し、アクチベーター遺伝子は、プロモーターからの転写効率を増強するためには、特異的プロモーターの存在のみを要する。Ａｃｔ  ＩＩ−ｏｒｆ４族の活性物質がＤＮＡ結合タンパク質の認識された種類に属さない場合には、これは特に意外である。したがって、さらに別のタンパク質又はその他の制御素子が、アクチノロジン又は関連のイソクロマンキノン色素を産生することが公知でない異種宿主で生じるための活性化に必要である、と予測される。組換え体株が、同一ＰＫＳ遺伝子が天然プロモーターの制御下にある場合より１０倍、エリスロマイシン生成物を産生し得る、そして特異的エリスロマイシン生成物は成長相から定常相への移行中にのみというよりむしろ、成長培養中で早成的に産生される、ということも意外であり、且つ有用である。このようなエリスロマイシンは、ヒト及び獣医学における抗生物質として、そして多数のその他の目的のために、有用である。したがって、遺伝子工学処理細胞がサッカロポリスポラ・エリスレア（Saccharopolyspora erythraea）である場合、アクチベーター及びプロモーターは、アクチノロジンＰＫＳ遺伝子集団に由来し、そして低コピー数プラスミドベクターの部位特異的組込み後に、ａｃｔＩ／ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４調節ｅｒｙＰＫＳ遺伝子集団は染色体中に収容され、適切な条件下でのこれらの細胞の培養は、このような異種制御下にない匹敵する株におけるよりも１０倍以上の総１４員マクロライド系生成物を産生し得る。Ｓ．エリスレア（S.erythraea）のこのような遺伝子工学処理細胞では、この異種制御下のＰＫＳ遺伝子は、その構築が本明細書中に記載されているハイブリッドＩ型ＰＫＳ遺伝子である場合、このような制御下にない同一のハイブリッドＩ型ＰＫＳ遺伝子と比較して、１０倍以上のハイブリッドポリケチド生成物が得られる。特に、ハイブリッドＩ型ＰＫＳ遺伝子が、付加モジュールがａｖｒモジュールに置き換えられるｅｒｙＰＫＳ遺伝子である場合には、本明細書に記載したような適切な条件下で培養すると、遺伝子工学処理細胞により産生される新規の１４員マクロライドの総量が１０倍増大することが判明した。
非形質転換処理及び遺伝子工学処理エリスロマイシン産生細胞を増殖させる適切な且つ好ましい手段、並びに新規のエリスロマイシンの単離、同定及び実際的効用のための適切且つ好ましい手段は、実施例でさらに詳細に記載する。
発明の要約
本発明は、式１：
0004173551.tif 000003
（式中、Ｒ1はα−分枝鎖Ｃ3〜Ｃ8アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシアルキル又はアルキルチオアルキル基（そのいずれかが１つ又はそれ以上のヒドロキシル基に任意に置換される）；Ｃ5〜Ｃ8シクロアルキルアルキル基（ここで、アルキル基はα−分枝鎖Ｃ2〜Ｃ5アルキル基である）；Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル又はＣ5〜Ｃ8シクロアルケニル基（そのいずれかがメチル、あるいは１つ又はそれ以上のヒドロキシル、あるいは１つ又はそれ以上のＣ1〜Ｃ4アルキル基、あるいはハロ原子により任意に置換される）；あるいは飽和された、あるいは完全又は一部不飽和で、任意に１つ又はそれ以上のＣ1〜Ｃ4アルキル基、あるいはハロ原子により任意に置換される、３〜６員化酸素又は硫黄含有複素環式環であるか；あるいはＲ1はＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ及びＣ1〜Ｃ4アルキルチオ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル及びシアノから選択される少なくとも１つの置換基で任意に置換されるフェニルであるか；あるいはＲ1は下記の式（ａ）：
0004173551.tif 000004
（式中、ＸはＯ、Ｓ又は−ＣＨ2−であり、ａ、ｂ、ｃ及びｄは各々別々に０〜２であって、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≦５である）
を有する基であり；
Ｒ2は、Ｈ又はＯＨであり；Ｒ3〜Ｒ5は各々別々にＨ、ＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ3であり；Ｒ6はＨ又はＯＨであり；そしてＲ7はＨ、ＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ3であり；Ｒ8はＨ又はデソサミンであり；Ｒ9はＨ、ＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ3であり；Ｒ10はＯＨ、ミカロース（Ｒ13はＨである）又はクラジノース（Ｒ13はＣＨ3である）であり；Ｒ11はＨであるか；Ｒ10＝Ｒ11＝Ｏであり；そしてＲ12はＨ、ＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ3である）
の化合物、及び製薬上許容可能なその塩に関する。
上記の定義において、３個又はそれ以上の炭素原子を含有するアルキル基は、直鎖又は分枝鎖である。ハロとは、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを意味する。α−分枝とは、Ｃ−１３一に結合した炭素がさらに別の２つの炭素原子に連結する第二炭素原子であることを意味し、残りのアルキル鎖は直鎖又は分枝鎖である。式１の好ましい化合物は、Ｒ3〜Ｒ5、Ｒ7、Ｒ9及びＲ12がＣＨ3であり、Ｒ1が、１つ又はそれ以上のヒドロキシル基により任意に置換されるイソプロピル又はｓｅｃ−ブチル、２−ブテン−２−イル、２−ペンテン−２−イル又は４−メチル−２−ペンテン−２−イルであるものである。さらに好ましいのは、Ｒ3〜Ｒ5、Ｒ7、Ｒ9及びＲ12がＣＨ3であり、Ｒ1が、１つ又はそれ以上のヒドロキシル基あるいは１つ又はそれ以上のＣ1〜Ｃ4アルキル基により任意に置換されるＣ3〜Ｃ6シクロアルキル又はシクロアルケニルである式１の化合物である。さらに別の群の好ましい化合物では、Ｒ1は、１つ又はそれ以上のヒドロキシル基、あるいは１つ又はそれ以上のＣ1〜Ｃ4アルキル基、あるいはハロゲン原子により任意に置換される５又は６員化酸素又は硫黄含有複素環式環、特に３−チエニル又は３−フリル環である。別の群の好ましい化合物では、Ｒ1はＣ3〜Ｃ8アルキルチオアルキル基、特に１−メチルチオエチル基である。
本発明のその他の特定の実施態様は、式２：
0004173551.tif 000005
（式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、Ｃ2〜Ｃ8アルケニル、Ｃ2〜Ｃ8アルキニル、各々のアルキル又はアルコキシ基中に１〜６個の炭素原子を含有するアルコキシアルキル又はアルキルチオアルキル（ここで、前記のアルキル、アルコキシ、アルケニル又はアルキニル基はいずれかが１つ又はそれ以上のヒドロキシル基により、あるいは１つ又はそれ以上のハロ原子により置換される）；あるいはメチル、あるいは１つ又はそれ以上のＣ1〜Ｃ4アルキル基又はハロ原子により任意に置換されるＣ3〜Ｃ8シクロアルキル又はＣ5〜Ｃ8シクロアルケニル；あるいは飽和された、あるいは完全又は一部不飽和で、任意に１つ又はそれ以上のＣ1〜Ｃ4アルキル基、あるいはハロ原子により任意に置換される３〜６員化酸素又は硫黄含有複素環式環であるか；あるいは式ＳＲ14（ここで、Ｒ14はＣ1〜Ｃ8アルキル、Ｃ2〜Ｃ8アルケニル、Ｃ2〜Ｃ8アルキニル、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル、Ｃ5〜Ｃ8シクロアルケニル、フェニル、又は置換フェニル（ここで、置換基はＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ又はハロである）、あるいは飽和された、あるいは完全又は一部不飽和で、任意に１つ又はそれ以上のＣ1〜Ｃ4アルキル基、あるいはハロ原子により任意に置換される３〜６員化酸素又は硫黄含有複素環式環である）の基であり；
Ｒ2は、Ｈ又はＯＨであり；Ｒ3〜Ｒ5は各々別々にＨ、ＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ3であり；Ｒ6はＨ又はＯＨであり；そしてＲ7はＨ、ＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ3であり；Ｒ8はＨ又はデソサミンであり；Ｒ9はＨ、ＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ3であり；Ｒ10はＯＨ、ミカロース（Ｒ13はＨである）又はクラジノース（Ｒ13はＣＨ3である）であり；Ｒ11はＨであるか；Ｒ10＝Ｒ11＝Ｏであり；そしてＲ12はＨ、ＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ3であるが、但し、Ｒ3〜Ｒ5がＣＨ3であり、Ｒ7がＣＨ3であり、Ｒ9がＣＨ3であり、そしてＲ12がＣＨ3である場合には、Ｒ1はＨ又はＣ1アルキルではない）
の化合物、及び製薬上許容可能なその塩を包含する。
上記の定義において、３個又はそれ以上の炭素原子を含有するアルキル基は、直鎖又は分枝鎖である。ハロとは、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを意味する。
式２の好ましい化合物は、Ｒ2〜Ｒ6がＣＨ3であり、Ｒ7がＣＨ3であり、Ｒ9がＣＨ3であり、そしてＲ12がＣＨ2であり、Ｒ1がＳＲ14（ここで、Ｒ14はメチル又はエチルである）であるものである。別の群の好ましい化合物では、Ｒ1は、１つ又はそれ以上のヒドロキシル基により置換されるメチル、イソプロピル又はｓｅｃ−ブチルである。さらに別の群の好ましい化合物では、Ｒ1は、１つ又はそれ以上のヒドロキシル基、あるいは１つ又はそれ以上のハロ原子、特に（トリフルオロメチル）エチルにより置換される分枝Ｃ3〜Ｃ8アルキル基である。
本発明はさらに、治療的有効量の式１又は式２の化合物、あるいは製薬上許容可能なその塩、そして製薬上許容可能な担体を包含する、哺乳類、魚類又は鳥類における細菌感染又は原生動物感染の治療のための製剤組成物に関する。
本発明はさらに、治療的有効量の式１又は式２の化合物、あるいは製薬上許容可能なその塩を、前記の哺乳類、魚類又は鳥類に投与することから成る、哺乳類、魚類又は鳥類における細菌感染又は原生動物感染の治療方法に関する。
「治療」という用語は、本明細書中で用いる場合は、別記しない限り、本発明の方法に提示されるような細菌感染又は原生動物感染の治療又は防止を含む。
本明細書中で用いる場合、別記しない限り、「細菌感染（単数又は複数）」及び「原生動物感染」という用語は、本発明の化合物のような抗生物質を投与することにより治療又は防止され得る哺乳類、魚類及び鳥類に起きる細菌感染及び原生動物感染、並びに細菌感染及び原生動物感染に関連した障害を含む。このような細菌感染及び原生動物感染、並びにこのような感染に関連した障害としては、以下のものが挙げられる：ストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumoniae）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、モラキセラ・カタラリス（Moraxella catarrhalis）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）又はペプトストレプトコッカス・spp.（Peptostreptococcus spp.）による感染に関連した肺炎、中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、扁桃炎及び乳様突起炎；ストレプトコッカス・ピオゲニス（Streptococcus pyogenes）、Ｃ及びＧ群連鎖球菌、クロストリジウム・ジフテリア（Clostridium diphtheriae）又はアクチノバシルス・ヘモリティクム（Actinobacillus haemolyticum）による感染に関連した喉頭炎、リウマチ熱及び糸球体腎炎；マイコプラズマ・ニューモニア（Mycoplasma pneumoniae）、レギオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumoniae）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）又はクラミジア・ニューモニア（Chlamydia pneumoniae）による感染に関連した気道感染；スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌（即ち、Ｓ．エピデルミディス（S.epidermidis）、Ｓ．ヘモリティクス（S.hemolyticus）等）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、連鎖球菌Ｃ〜Ｆ群（微小コロニー連鎖球菌）、ビリダンス（viridans）連鎖球菌、コリネバクテリウム・ミヌチシウム（Corynebacterium minutissimum）、クロストリジウム  spp.（Clostridium spp.）又はバルトネラ・ヘンセラ（Bartonella henselae）による感染に関連した非併発性皮膚及び柔組織感染、膿瘍及び骨髄炎、並びに産褥熱；スタフィロコッカス・サプロフィチクス（Staphylococcus saprophyticus）又はエンテロコッカス・spp.（Enterococcus spp.）による感染に関連した非併発性急性尿道感染；クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、ヘモフィリス・ドゥクレイル（Haemophilus ducreyl）、トレポネマ・パリドゥム（Treponema pallidum）、ウレアプラズマ・ウレアリティクム（Ureaplasma urealyticum）又はナイゼリア・ゴノルヘア（Neiserria gonorrheae）による感染に関連した尿道炎及び子宮頸管炎、並びに性感染症；Ｓ．アウレウス（S.aureus）（食中毒及びトキシックショック症候群）、又はＡ、Ｂ及びＣ群連鎖球菌による感染に関連した毒素病；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）による感染に関連した潰瘍；ボレリア・レクレンチス（Borrelia recurrentis）による感染に関連した全身性熱性症候群；ボレリア・ブルグドルフエリ（Borrelia burgdorferi）による感染に関連したライム病；クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、ナイゼリア・ゴノルホエア（Neisseria gonorrhoeae）、Ｓ．アウレウス（S.aureus）、Ｓ．ニュモニア（S.pneumoniae）、Ｓ．ピオゲネス（S.pyogenes）、Ｈ．インフルエンザ（H.influenzae）又はリステリア・spp.（Listeria spp.）による感染に関連した結膜炎、角膜炎及び涙膿炎；ミコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）又はミコバクテリウム・イントラセルラー（Mycobacterium intracellulare）による感染に関連した播種性鳥型結核菌複合（ＭＡＣ）症；カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）による感染に関連した胃腸炎；クリプトスポジウム・ssp.（Cryptosporidium spp.）による感染に関連した腸管原生動物；ビリダンス（viridans）連鎖球菌による感染に関連した歯牙形成性感染；ボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertussis）による感染に関連した持続性咳；クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Clostridium perfringens）又はバクテロイデス・spp.（Bacteroides spp.）による感染に関連したガス壊疸；並びにヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）又はクラジミア・ニューモニア（Chlamydia pneumoniae）による感染に関連したアテローム硬化症。
動物において治療又は防止され得る細菌感染及び原生動物感染、並びにこのような感染に関連した障害としては、以下のものが挙げられる：Ｐ．ハエム（P.haem）、Ｐ．マルトシダ（P.multocida）、マイコプラズマ・ポビス（Mycoplasma bovis）又はボルデテラ・spp.（Bordetella spp.）による感染に関連したウシ呼吸器疾患；大腸菌  E.coli又は原生動物（即ち、球虫類、クリプトスポリジウム属等）による感染に関連した雌牛腸疾患；スタフィロコッカス・アウレウス（Staph.aureus）、スタフィロコッカス・ウベリス（Strep.uberis）、スタフィロコッカス・アガラクチア（Strep.agalactiae）、スタフィロコッカス・ディスガラクチア（Strep.Dysgalactiae）、クレブシラ・spp.（Klebsiella spp.）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）又はエンテロコッカス・spp.（Enterococcus spp.）による感染に関連した乳牛乳腺炎；Ａ．プレウロ（A.pleuro）、Ｐ．マルトシダ（P.multocida）又はマイコプラズマ・spp.（Mycoplasma spp.）による感染に関連したブタ呼吸器疾患；大腸菌（E.coli）、ラウソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis）、サルモネラ（Salmonella）又はセルプリナ・ヒオジシンティア（Serpulina hyodyisinteriae）による感染に関連したブタ腸疾患；大腸菌による感染に関連した雌牛子宮炎；フソバクテリウム・ネクロフォルム（Fusobacterium necrophorum）又はバクテロイデス・ノドサス（Bacteroides nodosus）による感染に関連した雌牛毛様疣；モラキセラ・ボビス（Moraxella bovis）による感染に関連した雌牛感染性角結膜炎；原生動物（即ち、ネオスポリウム（neosporium））による感染に関連した雌牛早発性流産；大腸菌による感染に関連したイヌ及びネコにおける尿道感染；スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staph.epidermidis）、スタフィロコッカス・インテゥメディウス（Staph.Intermedius）、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス（Staph.）又はＰ．マルトシダ（P.multocida）による感染に関連したイヌ及びネコにおける皮膚及び柔組織感染；アルカリゲネス・spp.（Alcaligenes spp.）、バクテロイデス・spp.（Bacteroides spp.）又はプレボテラ（Prevotella）による感染に関連したイヌ及びネコにおける歯又は口腔感染。帆なの方法により治療又は防止し得るその他の細菌感染及び原生動物感染、並びにこのような感染に関連した疾患は、J.P.Sanford et al.,“The Sanford Guide To Antimicrobial Therapy”,26th Edition,（Antimicrobial Therapy,Inc.,1996）に示されている。本発明の化合物が細菌又は原生動物感染に通常は関連しない疾病状態（例えば、癌、エイズ及びアテローム硬化症）の治療にかなりの効用を有する、ということも漸次明らかになりつつある。
哺乳類、例えばヒト、又は魚類又は鳥類における細菌感染又は細菌感染に関連した疾患あるいは癌を治療するために用いられる場合、式１又は式２の化合物は、単独で、又は化合物及び製薬上許容可能な希釈剤又は担体を包含する製剤組成物の形態で投与し得る。このような組成物は、例えば錠剤又はカプセルとして経口的に、あるいは皮下又は筋肉内注射を含めて非経口的に投与される。式１又は式２の化合物は、例えば座薬の適用により直腸投与され得る。製薬上許容可能な担体は、意図される投与方式に依っている。例えば、ラクトース、クエン酸ナトリウム及びリン酸の塩は、崩壊剤（例えばデンプン）及び滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク）と一緒に、製薬上許容可能な担体として錠剤中に用い得る。さらに、カプセル中での使用に関しては、有用な製薬上許容可能な担体は、ラクトース及び高分子ポリエチレングリコール（例えば、２，０００〜４，０００の分子量を有する）である。非経口的使用に関しては、滅菌溶液又は懸濁液が調製されるが、この場合、製薬上許容可能な担体は水性（例えば、水、等張食塩水又は等張デキストロース）又は非水性（例えば、綿実油又は落花生油のような植物起源の、そしてグリセロール又はプロピレングリコールのようなポリオールの脂肪油）である。
哺乳類被験者における細菌感染又は細菌感染に関連した疾患を治療するために、あるいはヒト（特に、非小型細胞肺癌）及びその他の哺乳類、例えばイヌにおける種々の癌の治療のために、in vivoで用いる場合、有用１日用量は、０．１〜１００ｍｇ／体重１ｋｇ、特に０．５〜２５ｍｇ／体重１ｋｇの範囲で、１回に又は数回に分けて投与する。
「製薬上許容可能な塩（１又は複数）」という語句は、本明細書中で用いる場合には、別記しない限り、本発明の化合物中に存在し得る酸性又は塩基性基を含む。天然で塩基性である本発明の化合物は、種々の無機及び有機酸による広範囲の塩を生成し得る。このような塩基性化合物の製薬上許容可能な酸付加塩を調製するために用い得る酸は、非毒性酸付加塩、即ち製薬上許容可能な陰イオンを含有する塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカノン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩及びパモエート［即ち、１，１‘−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート）］を形成するものである。
天然で酸性である本発明の化合物は、種々の製薬上許容可能な陽イオンと塩基性塩を形成し得る。このような塩の例としては、アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩、特に、本発明の化合物のカルシウム、マグネシウム、ナトリウム及びカリウム塩である。
本発明のある種の化合物は不斉中心を有し、したがって異なるエナンチオマー及びジアステレオマー形態で存在する。本発明は、本発明の化合物のすべての光学異性体及び立体異性体、並びにその混合物の使用に関し、そして本発明は、それらを用いるか又は含有するすべての製剤組成物及び治療方法に関する。
本発明は本発明の化合物、及びその製薬上許容可能な塩を包含するが、この場合、１つ又はそれ以上の水素、炭素又はその他の原子はその同位体に置換される。このような化合物は、代謝薬物動態試験における、そして結合検定における探索及び診断用具として有用である。
本発明の化合物は、エリスロマイシンを産生し得る非形質転換化又は形質転換化生物の発酵により生成される。それらの例としては、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）の種、ストレプトコッカス・クリセオプラヌス（Streptomyces griseoplanus）、ノカルディア（Nocardia）の種、ミクロモノスポラ（Micromonospora）の種、アースムバクター（Arthobacter）の種及びストレプトマイセス（Streptomyces）抗生物質が挙げられるが、これらに限定されず、又、Ｓ．コエリコラ（S.coelicolor）は含まれない。この点で特に適しているのは、サッカロポリスポラ・エリスレア（Saccharopolyspora erythraea）の非形質転換及び形質転換株、例えばＮＲＲＬ  ２３３８、１８６４３，２１４８４である。特に好ましい形質転換株は、エリスロマイシン負荷モジュールがアベルメクチン産生体であるストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、又はラパマイシン産生体であるストレプトマイセス・ヒグロスコポクス（Streptomyces hygroscopocus）からの負荷モジュールで置き換えられたものである。本発明の化合物の化合物の好ましい製造方法は、式Ｒ1ＣＯＯＨ（ここで、Ｒ1は式１又は２の前述の定義と同様である）の適切なカルボン酸又はその塩、エステル（特に好ましいのはＮ−アセチルシステアミンチオエステルである）又はアミド、あるいはその酸化前駆体の存在下での適切な生物の発酵による。酸又はその誘導体は、接種時に、又は発酵中に時々、発酵に付加される。本発明の化合物の生成は、発酵から試料を取り出し、クロマトグラフィーにより、例えば高圧液体クロマトグラフィーを用いて本発明の化合物の出現後に、有機溶媒で抽出することにより、モニタリングする。式１又は２の化合物の収量が最大になるまで、一般的には４〜１０日間、インキュベーションを継続する。カルボン酸又はその誘導体の各々の好ましい付加レベルは、０．０５〜４．０ｇ／Ｌである。酸又はその誘導体を発酵に、一般的に漸次付加することにより、例えば数日間毎日付加することにより、式１又は２からの化合物の最高収量が得られる。発酵に用いられる培地は、炭素、窒素及び微量元素の同化可能供給源を含有する従来の複合培地である。
非形質転換化及び遺伝子工学処理化エリスロマイシン産生細胞を増殖させる適切且つ好ましい手段、並びに式１及び２の化合物の単離、同定及び実際的効用のための適切且つ好ましい手段は、実施例に詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
本発明のいくつの実施態様を、添付の図面を参照しながら説明する。
図１は、３つの公知のポリケチドの化学式を示す。
図２ａは、エリスロマイシンＡの前駆体である、６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ＤＥＢ）を産生するＰＫＳである６−デオキシエリスロノリドシンターゼＢ（ＤＥＢＳ）の機能を示す図である。
図２ｂは、６−ＤＥＢのエリスロマイシンＡへの転換を含めたエリスロマイシンの後ＰＫＳ生合成を示す。
図３ａ及び３ｂは、プラスミドｐ１Ｇ１の構築を示す図である。
図４ａ、４ｂ及び４ｃは、プラスミドｐＮＤ３０の構築を示す図である。
図５は、プラスミドｐＡＶＬＤの構築を示す図である。
図６は、Ｓ．エリスレア（S.erythraes）ＮＲＲＬ２３３８のゲノム中へのｐＡＶＬＤの組込みを示す。
図７は、ラパマイシンの生合成を示す図である。
図８は、プラスミドｐＭＯ６の構築を示す図である。
図９は、プラスミドｐＣＪＲ２６の構築を示す図である。
図１０は、プラスミドｐＣ−ＡＴＸの構築を示す図である。
図１１は、プラスミドｐＣ−ＡＴ１２の構築を示す図である。
図１２は、プラスミドｐＣＪＲ４９の構築を示す図である。
発明の詳細な説明
ａｖｒ負荷モジュールに受容される広範囲のスターター単位が、従来の試験で包括的に確定されている（例えば欧州特許出願第0 214 731号、第0 350 187号、第0 317 148号）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。したがって、本発明はこれらの実施例の特定の詳細に限定されず、それらは単にａｖｒ負荷モジュールの有効性を確証するのに役立つと理解されるべきである。さらに、ｐＩＧ１又はｐＮＤ３０構築物を用いる実施例は、ａｖｒ負荷モジュールに連結した場合に、本発明の新規の化合物の発現を増強するａｃｔＩプロモーター及びそのコグネイトアクチベーター遺伝子ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４の能力を明確に立証する。サッカロポリスポラ・エリスレア（Saccharopolyspora erythraea）の非形質転換株も外因的に供給される基質を容易に取り込んで、新規のエリスロマイシンポリケチドを生成し得る、ということも実施例から明らかである。その結果として、適切なエリスロマイシン産生株を選択し（任意に、所望の株中にｐＩＧ１又はｐＮＤ３０プラスミドを組み入れる）、そして発酵に適切なスターター単位を補足することにより、本発明の特定の新規の化合物が容易に生成され得る、ということも当業者には明らかである。したがって、本発明の６−デオキシエリスロマイシン及び６，１２−ジデオキシエリスロマイシン誘導体は、米国特許第５，１４１，９２６号及びＷＯ９７／０６２６６に記載されているようなサッカロポリスポラ・エリスレア（Saccharopolyspora erythraea）ＮＲＲＬ  １８６４３又はＮＲＲＬ  ２１４８４を用いて容易に産生される。同様に、Weber等（J.Bacteriol.,164:425-433,1991）が記載したサッカロポリスポラ・エリスレア（Saccharopolyspora erythraea）株を用いて、本発明の所望の新規の類似体を得ることができる。例えば、ＵＷ２４株を用いて（任意にｐＩＧ１又はｐＮＤ３０で形質転換して）、エリスロノリドＢの新規の類似体が得られる。
Hewlett-Packard１０９０Ｍダイオードアレイ分光光度計を用いて、ＵＶスペクトルを記録した。ＮＭＲスペクトルはすべて、別記しない限りは、Varian Unity５００ＭＨｚ分光計によりＣＤＣｌ3で測定した。ピーク位置は、テトラメチルシランからのダウンフィールド（ｐｐｍ）で表される。ピーク形状は、以下のように示される：ｓ  一重線；ｄ  二重線；ｔ  三重線；ｑ  四重線；ｍ  多重線；ｂｒ  広。ＮＭＲ構造に示される原子数は、標準名称を代表するものではないが、ＮＭＲデータを特定実施例に相関させる。ＡＰＣＩ供給源を装備したＶＧ  ＰｌａｔｆｏｒｍＩＩ質量分光計とインターフェースするHewlett-Packard１０９０Ｍ液体クロマトグラフを用いて（方法Ａ）、又はＡＰＣＩ供給源を装備したＶＧ  ＰｌａｔｆｏｒｍＩＩ質量分光計とインターフェースするHewlett-Packard１０５０Ｍ液体クロマトグラフを用いて（方法Ｂ及び方法Ｃ）、ＨＰＬＣ−ＭＳデータを得た。
ＨＰＬＣ方法Ａ：
カラム    Beckman Ultrasphere 5μm ODS 4mmx25cm
流速      0.85mL/分
移動相    勾配：アセトニトリル：0.05M酢酸アンモニウム（28:72）を22分間でアセトニトリル：0.05M酢酸アンモニウム（50:50）に。アセトニトリル：0.05M酢酸アンモニウム（50:50）に22〜25分の間保持。25〜30分で初期状態に戻る。
ＨＰＬＣ方法Ｂ：
カラム    MetaChem Inertsil 5μm C8 3mmx150mm
流速      0.5mL/分
移動相    アイソクラチック：メタノール：0.05M酢酸アンモニウム＋0.1%トリクロロ酢酸（６０：４０）
ＨＰＬＣ方法Ｃ：
カラム    Waters Symmetry 5μm C18 2.1mmx150mm
流速      0.22mL/分
移動相    勾配：アセトニトリル：0.05M酢酸アンモニウム（30:70）を30分間でアセトニトリル：0.05M酢酸アンモニウム（50:50）に。
以下の培地及び溶液を用いた：
スクロース−コハク酸塩限定培地
スクロース                ６９ｇ
ＫＮＯ3                   １０ｇ
コハク酸                    ２．３６ｇ
ＫＨ2ＰＯ4                  ２．７ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ          １．２ｇ
ＺｎＣｌ2                 １０ｍｇ
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ          ６．２ｇ
ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ          ０．５３ｍｇ
ＣｏＣｌ2                   ０．５５ｍｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ          ２．５ｍｇ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ        ３８ｍｇ
milli-Q水                 全量を１．０Ｌにする量
ＫＯＨ                    ｐＨ６〜６．４にする量
水道水培地
グルコース                  ５ｇ
トリプトン                  ５ｇ
酵母菌抽出物                ２．５ｇ
ＥＤＴＡ                  ３６ｍｇ
水道水                    全量を１．０Ｌにする量
ＫＯＨ                    ｐＨ７．１にする量
ＥＲＹ−Ｐ培地
デキストロース            ５０ｇ／Ｌ
NutrisoyTM粉              ３０ｇ／Ｌ
（ＮＨ4）2ＳＯ4             ３ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                    ５ｇ／Ｌ
ＣａＣＯ3                   ６ｇ／Ｌ
ｐＨを７．０に調整
NutrisoyTM粉は、British Arkady Group,Skerton Road,Manchester,UKから購入。
以下の実施例により本発明を説明する。
実施例１ａ：プラスミドｐＩＧ１の構築
プラスミドｐＩＧ１は，ｅｒｙ負荷モジュール，ｅｒｙＰＫＳの最初の２つの延長モジュール及びｅｒｙＰＫＳのチオエステラーゼの代わりにａｖｒ負荷モジュールを包含するハイブリッドＩ型ＰＫＳ遺伝子を含有するＳＣＰ２*由来プラスミドから成る。これは、以下に示すように、いくつかの中間プラスミドを介して構築される（図３）。
（ｉ）プラスミドｐＶＥ３．４の構築
アベルメクチン（ａｖｒ）ＰＫＳ遺伝子の一部を含有するプラスミドｐＶＥ１４４６を大腸菌ＡＴＣＣ６８２５０株から得た（MacNeil,D.J.et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.（1994）721:123-132）。プラスミドｐＶＥ１４４６をＢａｍＨＩで消化し、座標３２．１５及び３．４０間の７．６ｋｂｐ断片（MacNeil,D.J.et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.（1994）721:123-132）をゲル電気泳動により精製し、再循環させた。混合物は、所望のプラスミドｐＶＥ３．４を含有した。これを大腸菌ＴＧ１ｒｅｃＯ株（Dr.P.Oliver（Dept.of Genetics,U.Cambridge）により構築された;Kolodner,R.et al.,J.Bacteriol.（1985）163:1060-1066;T.Gibson,Ph.D.Thesis,U.Cambridge,1985）の形質転換後に単離した。
（ｉｉ）プラスミドｐＮＣＯ１２の構築
プラスミドｐＢＫ２５（Bevitt,D.J.et al.,Eur.J.Biochem.（1992）204:39-49）をＮｃｏＩで消化し、１２ｋｂｐ断片を末端修復して、ＳｍａＩで線状化しておいたプラスミドｐＵＣ１８に連結した。連結混合物を大腸菌ＴＧ１ｒｅｃＯ中で形質転換させ、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＮＣＯ１２を制限パターンにより同定した。
（ｉｉｉ）プラスミドｐＣＲａｂｃの構築
プラスミドｐＣＲａｂｃ（図３）を、以下のように構築した。３つの別々のＰＣＲ反応を実施した：先ず、２０ｐｍｏｌの各々の合成オリゴヌクレオチドＡ１（5’-CTCGTCGGTGGCTTTGCG-3’）及びＡ２（5’-CCCGGGAAAAACGAAGACTAGTGGCGCGGACGGCCG-3’）を用いて１００ｎｇのｐＮＣＯ１２鋳型から１．０ｋｂｐ生成物を増幅した。ＰＣＲ生成物を末端修復して、リン酸化し、そしてＳｍａＩ切断ｐＵＣ１８中でクローニングして、プラスミドｐＣＲａを得た。第二に、２０ｐｍｏｌの各々の合成オリゴヌクレオチドＣ１（5’-CACGCGCAGCGCGGCGGA-3’）及びＣ２（5’-CGAACCGCTAGCGGTCGTCGCGATGGCCT-3’）を用いて１００ｎｇのｐＮＣＯ１２鋳型から１．５ｋｂｐ生成物を増幅した。生成物を末端修復して、リン酸化し、そしてＳｍａＩ切断ｐＵＣ１８中でクローニングして、プラスミドｐＣＲｃを得た。第三に、２０ｐｍｏｌの各々の合成オリゴヌクレオチドＢ１（5’-GTGGCCCGGCCGTCCGCGCCACTAGTCTTCGTTTTT-3’）及びＢ２（5’-AACAGCTAGCGGTTCGTCCGCCGCTGCCGTGCC-3’）を用いて１００ｎｇのｐＶＥ３．４鋳型から１．４ｋｂｐ生成物を増幅した。生成物を末端修復して、リン酸化し、そしてＳｍａＩ切断ｐＵＣ１８中でクローニングして、プラスミドｐＣＲｂを得た。
プラスミドｐＣＲａをＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｅＩで消化して、プラスミドｐＣＲａｂを得た。プラスミドｐＣＲｃをＮｈｅＩ及びＥｃｏＲ１で消化して、１．５ｋｂｐ挿入物を予めＮｈｅＩ及びＥｃｏＲ１で消化しておいたプラスミドｐＣＲａｂと結紮して、プラスミドｐＣＲａｂｃを得た。
（ｉｖ）プラスミドｐＮＥＷＡＶＥＴＥの構築
プラスミドｐＣＲａｂｃをＭｆｅＩ及びＳｆｉＩで消化し，ａｖｒＰＫＳの負荷ドメインを含有するＤＮＡ断片をゲル電気泳動により精製し、ＭｆｅＩ及びＳｆｉＩで消化しておいたプラスミドｐＮＴＥＰ２と連結して、大断片をゲル電気泳動で精製した。連結混合物を大腸菌ＴＧ１ｒｅｃＯ中で形質転換させて、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＮＥＷＡＶＥＴＥ（１３．７ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｖ）プラスミドｐＲＭ５２の構築
プラスミドｐＲＭ５２はプラスミドｐＲＭ５の誘導体である（McDaniel,R.et al.,Science,（1993）262:1546-1550）。ｐＲＭ５を先ずＮｄｅＩで消化して線状にし、末端修復して、次に再連結して、ｐＲＭ５１を生成した。ｐＲＭ５１をＰａｃＩ及びＮｓｉＩで切断し、大型ＰａｃＩ−ＮｓｉＩ断片を単離し、ＮｄｅＩ部位を含有する短二本鎖オリゴヌクレオチドリンカーに連結して、一緒にアニーリングした合成オリゴヌクレオチド5’-TAAGGAGGACACATATGCA-3’及び5’-TAATTCCTCCTGTGTAT-3’から構築した。連結混合物を大腸菌ＴＧ１ｒｅｃＯ中で形質転換させて、単離コロニーをそれらのプラスミド含量に関してスクリーニングした。所望のプラスミド（１９．６ｋｂｐ）をその制限マップにより同定し、ｐＲＭ５２と命名した。
（ｖｉ）プラスミドｐＩＧ１の構築
プラスミドｐＮＥＷＡＶＥＴＥをＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し、挿入物をスクロース勾配上での沈降により精製した。精製挿入物をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化しておいたプラスミドｐＲＭ５２（１９．６ｋｂｐ）と連結して、スクロース勾配上での沈降により、ベクターを精製した。連結混合物を用いて大腸菌を形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＩＧ１をその制限パターンにより同定した。
実施例１ｂ：プラスミドｐＮＤ３０の構築
プラスミドｐＮＤ３０は，ｅｒｙ負荷モジュール，ｅｒｙＰＫＳの最初の２つの延長モジュール及びｅｒｙＰＫＳのチオエステラーゼの代わりにａｖｒ負荷モジュールを包含するハイブリッドＩ型ＰＫＳ遺伝子を含有するＳＣＰ２*由来プラスミドから成る。これは、以下に示すように、いくつかの中間プラスミドを介して構築される（図４）。
（ｉ）プラスミドｐＣＪＲ１０１の構築
ｐＣＪＲ１０１（図４）は、放線菌類におけるＰＫＳ遺伝子の発現のために用いられるよう構築されたシャトルプラスミドである。それは、大腸菌中で複製させるためのＣｏＩＥ１レプリコン、ＳＣＰ２*低コピー数ストレプトミセス属（Streptomyces）レプリコン（Bibb,M.J.and Hopwood,D.A.,J.Gen.Microbiol.（1981）126:427）及び、植物性菌糸体における成長相から定常相への移行中にａｃｔプロモーターからの転写を活性化するａｃｔ集団からのａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４アクチベーター遺伝子を包含する。それは、以下のように構築される：ｐＭＦ１０１５からの約９７０ｂｐのＤＮＡ断片（ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４アクチベーター遺伝子を含有する）（Fernandez-Moreno,M.A.et al.,Cell（1991）66:769-780）を、プライマーとして合成オリゴヌクレオチド：5’-ACTAGTCCACTGCCTCTCGGTAAAATCCAGC-3’及び5’-CTTAAGAGGGGCTCCACCGCGTTCACGGAC-3’を用いて、ＰＣＲにより増幅する。これは、さらにフランキングＳｐｅＩ及びＡｆＩＩＩ制限部位を導入する。この断片をプラスミドｐＵＣ１９の末端修復ＡａｔＩＩ部位中でクローニングして、プラスミドｐＣＪＲ１８を産生する。約２１５ｂｐのＤＮＡ断片（Parro,V.et al.,Nucl.Acids Res.（1991）19:2623-2627）を、プライマーとして合成オリゴヌクレオチド：5’-ACATTCTCTACGCCTAAGTGTTCCCCTCCCTGCCTC-3’及び5’-GTGATGTATGCTCATATGTGTCCTCCTTAATTAATCGATGCGTTCGTCCGGTG-3’を用いて、二方向性プロモーター対ＰａｃｔＩＩＩ／ＰａｃｔＩを含有するｐＭＶ４００から増幅する。これもフランキングＮｄｅＩ及びＡｆＩＩＩ部位を導入する。ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩ及びＡｆＩＩＩで消化し、予めＮｄｅＩ及びＡｆＩＩＩで切断しておいたプラスミドｐＣＪＲ１８と連結して、プラスミドｐＣＪＲ１９を生成した。チオストレプトンに対する耐性を賦与する、ｔｓｒ遺伝子を含有する１．１ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ  ＳｐｈＩ断片を、鋳型としてのプラスミドｐＩＪ９２２からＰＣＲにより、プライマーとしてオリゴヌクレオチド：5’-TGAACACCAAGCTTGCCAGAGAGCGACGACTTCCCC-3’及び5’-GACAGATTGCATGCCCTTCGAGGAGTGCCCGCCCGG-3’を用いて、得た。これもフランキングＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩ部位を導入する。ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで消化し、予めＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで切断しておいたプラスミドｐＣＪＲ１９に連結して、プラスミドｐＣＪＲ２４を得た。プラスミドｐＩＪ９２２をＢａｍＨＩ及びＳｓｔＩで消化し、繁殖可能性遺伝子座及び複製のオリジンを含有する断片（Lydiate,D.J.et al.,Gene（1985）35:223-235）をＢａｍＨＩ及びＳｓｔＩで消化したｐＵＣ１９に連結して、二機能性プラスミドｐＣＪＲ１６（１４．７ｋｂｐ）を生成した。プラスミドｐＣＪＲ２４をＳａＩＩ及びＳｐｈＩで消化し、消化物からの２つの大型断片をゲル電気泳動により精製し、予めＸｈｏＩ及びＳｐｈＩで消化しておいたプラスミドｐＣＪＲ１６との４成分連結で併合した。連結混合物を用いて、Streptomyces lividansを形質転換し、チオストレプトンの存在下でコロニーを選択した。このようなコロニーのあるものは、所望のプラスミドｐＣＪＲ１０１（約１２．４ｋｂｐ）を含有することが示され、これはその制限パターンにより同定された。
（ｉｉ）プラスミドｐＣＪＲ２９の構築
プラスミドｐＣＪＲ２９の構築は、図４に説明されている。チオストレプトンに対する耐性を賦与する、ｔｓｒ遺伝子を含有する１．１ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片を、鋳型としてのプラスミドｐＩＪ９２２からＰＣＲにより、プライマーとしてオリゴヌクレオチド：5’-TGAACACCAAGCTTGCCAGAGAGCGACGACTTCCCC-3’及び5’-GACAGATTCTCGAGCCTTCGAGGAGTGCCCGCCCGG-3’を用いて、得た。これもフランキングＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位を導入する。ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで消化し、予めＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで切断しておいたプラスミドｐＣＪＲ１６に連結して、プラスミドｐＣＪＲ２５を得た。プラスミドｐＣＪＲ２５をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで消化し、予めＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで消化しておいたプラスミドｐＣＪＲ１９と連結して、所望のプラスミドｐＣＪＲ２９（約１２．４ｋｂｐ）を生成し、これをその制限パターンにより同定した。プラスミドｐＣＪＲ２９は、プラスミドｐＣＪＲ１０１とは、複製のＳＣＰ２*由来オリジンに関して、ｔｓｒ遺伝子、ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４遺伝子及びａｃｔＩＩ／ａｃｔＩＩＩプロモーターの配向が異なっていた。
（ｉｉｉ）プラスミドｐＮＤ３０の構築
プラスミドｐＮＥＷＡＶＥＴＥをＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し、挿入物をスクロース勾配上での沈降により精製した。精製挿入物をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化しておいたプラスミドｐＣＪＲ２９（約１２．４ｋｂｐ）と連結して、スクロース勾配上での沈降により、ベクターを精製した。連結混合物を用いて大腸菌を形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＮＤ３０をその制限パターンにより同定した。
実施例１ｃ：プラスミドｐＣＪＲ２６の構築
数工程で、プラスミドｐＭＯ６（図８）を先ず構築した：
（ｉ）プラスミドｐＭＯ１の構築
ｅｒｙＡＩ（Donadio,S.et al.,Science（1991）252,675-679）のヌクレオチド１９４８からヌクレオチド３２７３に延びるS.erythraeaのｅｒｙＡＩ遺伝子の約１．３ｋｂｐＤＮＡセグメントを、ＰＣＲにより、プライマーとして合成オリゴヌクレオチド：5’-CATGCTCGAGCTCTCCTGGGAAGT-3’及び5’-CAACCCTGGCCAGGGAAGACGAAGACGG-3’を、そして鋳型としてプラスミドｐＮＴＥＰ２を用いて、増幅した。ＰＣＲ生成物を末端修復し、予めＳｍａＩで消化して線状にしておいたプラスミドｐＵＣ１８に連結し、次にアルカリ性ホスファターゼで処理した。連結混合物を用いて大腸菌ＴＧ１ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。挿入物の境界を成すＳｔｕＩ部位がポリリンカー中のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する所望のプラスミドｐＭＯ１（３．９ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｉｉ）プラスミドｐＭＯ２の構築
ｒａｐＡのヌクレオチド１６４３からヌクレオチド２４８６に延びるストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）のｒａｐＡ遺伝子の約０．８５ｋｂｐＤＮＡセグメントを、ＰＣＲにより、プライマーとして次の合成オリゴヌクレオチド：5’-TTCCCTGGCCAGGGGTCGCAGCGTG-3’及び5’-CACCTAGGACCGCGGACCACTCGAC-3’を、そして鋳型として組換え体バクテリオファージλ−１Ｅ（Schwecke,T.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1995）92:7839-7843）からのＤＮＡを用いて、増幅した。ＰＣＲ生成物を末端修復し、予めＳｍａＩで消化して線状にしておいたプラスミドｐＵＣ１８に連結し、次にアルカリ性ホスファターゼで処理した。連結混合物を用いて大腸菌ＴＧ１ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＭＯ２（３．５ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｉｉｉ）プラスミドｐＭＯ３の構築
ｅｒｙＡＩのヌクレオチド４１２８からヌクレオチド５９２８に延びるＳ．エリスレア（S.erythraea）のｅｒｙＡＩ遺伝子の約１．７ｋｂｐＤＮＡセグメントを、ＰＣＲにより、プライマーとして合成オリゴヌクレオチド：5’-TGGCCAGGGAGTCGGTGCACCTAGGCA-3’及び5’-GCCGACAGCGAGTCGACGCCGAGTT-3’を、そして鋳型としてプラスミドｐＮＴＥＰ２を用いて、増幅した。ＰＣＲ生成物を末端修復し、予めＳｍａＩで消化して線状にしておいたプラスミドｐＵＣ１８に連結し、次にアルカリ性ホスファターゼで処理した。連結混合物を用いて大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。ＢａＩＩ及びＡｖｒＩＩ部位がポリリンカー中のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する所望のプラスミドｐＭＯ３（４．４ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｉｖ）プラスミドｐＭＯ４の構築
プラスミドｐＭＯ１をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａＩＩで消化し、１．３ｋｂｐ挿入物を、予めＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａＩＩで消化しておいたプラスミドｐＭＯ３に連結した。連結混合物を用いて、大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＭＯ４（５．６ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｖ）プラスミドｐＭＯ５の構築
プラスミドｐＭＯ４をＳｔｕＩで消化し、３．０ｋｂｐ挿入物を、予めＳｔｕＩで消化しておいたプラスミドｐＮＴＥＰ２に連結し、ゲル電気泳動により精製して、３．８ｋｂｐ挿入物を除去した。連結混合物を用いて、大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。プラスミドｐＭＯ５（１２．８ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｖｉ）プラスミドｐＭＯ６の構築
プラスミドｐＭＯ２をＢａＩＩ及びＡｖｒＩＩで消化し、挿入物を、予めＢａＩＩ及びＡｖｒＩＩで消化しておいたプラスミドｐＭＯ５に連結した。連結混合物を用いて、大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＭＯ６（１３．５ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｖｉｉ）プラスミドｐＣＪＲ２６の構築
プラスミドｐＣＪＲ２６は、ｅｒｙ負荷モジュール，ｅｒｙＰＫＳの一次及び二次延長モジュール、並びにｅｒｙ鎖終止チオエステラーゼを包含するＰＫＳ遺伝子を含有するＳＣＰ２*ベースのプラスミドであるが、但し、一次延長モジュール内のメチルマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡセグメントは、ｒａｐＰＫＳのモジュール２のマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡにより特異的に置換されていた。それを、以下のように構築した（図９）：プラスミドｐＭＯ６をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し，挿入物を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化しておいたプラスミドｐＣＪＲ２４と連結して、ゲル電気泳動で精製した。連結混合物を用いて大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＣＪＲ２６をその制限パターンにより同定した。
実施例１ｄ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＪＣ２／ｐＣＪＲ２６の構築及びＴＫＬ誘導体の生成
プラスミドｐＣＪＲ２６を用いて、Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＪＣ２プロトプラストを形質転換した。チオストレプトン耐性コロニーを、１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するＲ２Ｔ２０培地上で選択した。いくつかのコロニーを、そのゲノムＤＮＡとＤＩＧ標識ＤＥＢＳ１−ＴＥ遺伝子とのサザーンブロットハイブリダイゼーションにより染色体中に組み込まれたｐＣＪＲ２６の存在に関して試験した。
ｐＣＪＲ２６の組込みコピーを有するクローンを、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するＳＳＭ培地中で増殖させて、２８〜３０℃で７日間増殖させた。この後、ブロスを濾過して菌糸体を除去し、ｐＨ３に調整した。ブロスを２容量の酢酸エチルで２回抽出し、併合酢酸エチル抽出物を等容量の飽和塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥して、減圧下で酢酸エチルを除去し、約５００ｍｇの粗製物質を得た。生成物は（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−２−メチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン及び（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ）−２−メチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン：
0004173551.tif 000006
であることが示された。
実施例１ｅ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ  ２３３８／ｐＣＪＲ２６の構築及び１４員マクロライドの生成におけるその使用
約５ｍｇのｐＣＪＲ４９を用いて、Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８プロトプラストを形質転換して、プラスミドが染色体中に組み込まれる株を得た。数個のコロニーから、全ＤＮＡを得て、サザーンハイブリダイゼーションにより分析して、プラスミドがＥｒｙＡＩのモジュール２に組み込まれて新規のマクロライド生合成経路を生じることを確証した。さらなる組込みが起きて、反復プラスミド配列を生じた。Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＣＪＲ４９を５ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するトリプシンダイズブロス中に接種して、３０℃で３日間インキュベートした。１００ｍＬのこの種子培養を用いて、分散及び３００ｒｐｍでの振盪を補助するために２個のスプリングを有する、各々５００ｍＬの培地を含有する５ｘ２Ｌフラスコ中の５ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有する２Ｌのスクロースコハク酸塩限定培地に接種した。さらに５日間増殖させた後、培養を遠心分離して、上清のｐＨをｐＨ９に調整した。次に、上清を等容量の酢酸エチルで３回抽出し、蒸発させて溶媒を除去した。生成物をＨＰＬＣ／ＭＳにより分析し、２つのマクロライドをエリスロマイシン類似体：
0004173551.tif 000007
と同定した。
実施例１ｆ：プラスミドｐＣ−ＡＴＸの構築
プラスミドｐＣ−ＡＴＸは、ｅｒｙ負荷モジュール、ｅｒｙＰＫＳの一次及び二次延長モジュール、並びにｅｒｙ鎖終止チオエステラーゼを包含するＰＫＳ遺伝子を含有するＳＣＰ２*ベースのプラスミドであるが、但し、一次延長モジュール内のメチルマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡセグメントは、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）ＡＴＣＣ  １４５１３（ポリエーテルポリケチドモネンシンのプロデューサー）からクローン化された推定上のＩ型ＰＫＳ遺伝子からのマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡにより特異的に置換されていた。それを、いくつかの中間プラスミドを介して、以下のように構築した（図１０）。
（ｉ）コスミドｐＳＣＩＮ０２の単離
ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）ＡＴＣＣ  １４５１３（モネンシンプロデューサー）のゲノムライブラリーを、ＢａｍＨＩ−線状化及びアルカリ性ホスファターゼ処理コスミドベクターｐＷＥ１５に連結した染色体ＤＮＡのサイズ分別化３５〜４５ｋｂｐＳａｕ３Ａ断片から構築した。連結混合物を、Gigapackパッケージング抽出物を用いてλ粒子中にパッケージングし、大腸菌ＮＭ１ブルー中にトランスフェクトした。ライブラリーの約６００個のコロニーをナイロン膜の表面で増殖させて、溶解し、それらのＤＮＡを、ＵＶ照射により膜に架橋させた。膜は、その後、スクリーニング操作に用いた。ＤＥＢＳのモジュール２からのケトシンターゼドメインを包含するｐＭＯ８の挿入物を、35ＰαＡＴＰの存在下でのランダムプライミングにより標識して、ＤＮＡハイブリダイゼーション用のプローブとして用いた。プローブを４．０ｘＳＳＣ緩衝液中で６８℃で１６時間ハイブリダイズした後、０．８ｘＳＳＣ緩衝液中で６８℃で１時間、洗い落とした。３つの陽性コロニーが単離された。３つのクローンすべての挿入物のＤＮＡを、ベクターｐＷＥ１５中に存在するＴ３及びＴ７プライミング部位から末端シーケンシングした。Ｉ型ケトシンターゼ及びマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼドメインと相同の領域が、鋳型としてクローン２（ｐＳＣＩＮ０２と命名）を用いて、Ｔ７プライミング部位からのＤＮＡ配列中に見出された。マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼドメイン（ＡＴＸと命名）の部分ＤＮＡシーケンシングは、前記のマロネート−又はメチルマロネート−特異的ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（Haydock,S.F.et al.,FIBS（1995）374:246-248）とは実質的に異なるドメインの推定上の基質認識部分における独特の配列モチーフを明示した。
（ｉｉ）プラスミドｐＭＯ３８の構築
ＡＴＸドメインの約０．９ｋｂｐＤＮＡセグメントを、ＰＣＲにより、プライマーとして次の合成オリゴヌクレオチド：5’-CTGGCCAGGGCGCGCAATGGCCGAGCAT-3’及び5’-CCCTAGGAGTCGCCGGCAGTCCAGCGCGGCGCCC-3’を、そして鋳型としてコスミドｐＳＣＩＮ０２からのＤＮＡを用いて、増幅した。ＰＣＲ生成物を末端修復し、予めＳｍａＩで消化して線状にしておいたプラスミドｐＵＣ１８に連結し、次にアルカリ性ホスファターゼで処理した。連結混合物を用いて大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＭＯ３８（３．５ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｉｉｉ）プラスミドｐＭＯ３４の構築
プラスミドｐＭＯ３４は、挿入されたＤ１−ＡＴ２遺伝子の停止コドン後に挿入されたポリクローニング部位を有するｐＭＯ６の誘導体である。プラスミドｐＭＯ６をＥｃｅＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ポリクローニング部位の二本鎖領域を形成する２つのオリゴヌクレオチド；5’-AATTCATAACTAGTAGGAGGTCTGGCCATCTAGA-3’及び5’-TCGAAGATCTACCGGTCTGGAGGATGATCAATAC-3’を用いてアニーリングした。混合物を連結し、大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯ中で形質転換した。個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＭＯ３４（１３．５ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｉｖ）プラスミドｐＭＯ３５の構築
プラスミドｐＭＯ３５は、ストレプトマイセス・コリヌス（Streptomyces collinus）からのＴＫＬＳ−ＡＴ２遺伝子及び翻訳的共役化クロトニル−ＣｏＡ−レダクターゼ遺伝子を含有するｐＭＯ３４の誘導体である（Wallace et al.,E.J.Biochem.（1995）233:954-962）。クロトニル−ＣｏＡ−レダクターゼ遺伝子を、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片としてプラスミドｐＺＹＢ３（K.Reynolds教授より贈呈された）から切り取って、これを緑豆ヌクレアーゼで処理して、盲端を生成し、予めＳｐｅＩで切断しておいたｐＭＯ３４に連結し、緑豆ヌクレアーゼを用いて同様に盲端化した。連結混合物を用いて大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。クロトニル−ＣｏＡ−レダクターゼ遺伝子の正しい配向を有する所望のプラスミドｐＭＯ３５（１４．２ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｖ）プラスミドｐＭＯ３６の構築
プラスミドｐＭＯ３８をＢａＩＩ及びＡｖｒＩＩで消化し、挿入物を、予めＢａＩＩ及びＡｖｒＩＩで消化しておいたプラスミドｐＭＯ３５に連結した。連結混合物を用いて、大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＭＯ３６（１３．５ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｖｉ）プラスミドｐＣ−ＡＴＸの構築
プラスミドｐＭＯ３６をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し，ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化しておいたプラスミドｐＣＪＲ２９と連結して、ゲル電気泳動で精製した。連結混合物を用いて大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＣ−ＡＴＸをその制限パターンにより同定した。
実施例１ｇ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＪＣ２／ｐＣ−ＡＴＸの構築及びＴＫＬ誘導体の生成
プラスミドｐＣ−ＡＴＸを用いて、Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＪＣ２プロトプラストを形質転換した。チオストレプトン耐性コロニーを、１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するＲ２Ｔ２０培地上で選択した。いくつかのコロニーを、そのゲノムＤＮＡとＤＥＢＳ１−ＴＥ遺伝子をコードするＤＩＧ標識ＤＮＡとのサザーンブロットハイブリダイゼーションにより染色体中に組み込まれたｐＣ−ＡＴＸの存在に関して試験した。
ｐＣ−ＡＴＸの組込みコピーを有するクローンを、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するＳＳＭ培地中で増殖させて、２８〜３０℃で７日間増殖させた。この後、ブロスを濾過して菌糸体を除去し、ｐＨ３に調整した。ブロスを２容量の酢酸エチルで２回抽出し、併合酢酸エチル抽出物を等容量の飽和塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥して、減圧下で酢酸エチルを除去し、約５００ｍｇの粗製物質を得た。生成物をガスクロマトグラフィー、質量分析法及びＮＭＲにより特性化して、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−メチル−４−エチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン及び（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−メチル−４−エチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン：
0004173551.tif 000008
であることが示された。
実施例１ｈ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ  ２３３８／ｐＣ−ＡＴＸの構築及び１４員マクロライドの生成におけるその使用
約５ｍｇのｐＣ−ＡＴＸ  ＤＮＡを用いて、Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８プロトプラストを形質転換して、プラスミドが染色体中に組み込まれる株を得た。数個のコロニーから、全ＤＮＡを得て、サザーンハイブリダイゼーションにより分析して、プラスミドがＥｒｙＡＩのモジュール２に組み込まれて新規のマクロライド生合成経路を生じることを確証した。さらなる組込みが起きて、反復プラスミド配列を生じた。Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＣ−ＡＴＸを５ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するトリプシンダイズブロス中に接種して、３０℃で３日間インキュベートした。１００ｍＬのこの種子培養を用いて、分散及び３００ｒｐｍでの振盪を補助するために２個のスプリングを有する、各々５００ｍＬの培地を含有する５ｘ２Ｌフラスコ中の５ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有する２Ｌのスクロースコハク酸塩限定培地に接種した。さらに５日間増殖させた後、培養を遠心分離して、上清のｐＨをｐＨ９に調整した。次に、上清を等容量の酢酸エチルで３回抽出し、蒸発させて溶媒を除去した。生成物をＨＰＬＣ−ＭＳにより分析し、２つのマクロライド生成物：
0004173551.tif 000009
と同定した。
実施例１ｉ：プラスミドｐＣ−ＡＴ１２の構築
プラスミドｐＣ−ＡＴ１２は、ｅｒｙ負荷モジュール、ｅｒｙＰＫＳの一次及び二次延長モジュール、並びにｅｒｙ鎖終止チオエステラーゼを包含するＰＫＳ遺伝子を含有するＳＣＰ２*ベースのプラスミドであるが、但し、二次延長モジュール内のメチルマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡセグメントは、ｒａｐＰＫＳのモジュール２のマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡにより特異的に置換されていた。それを、いくつかの中間プラスミドを介して、以下のように構築した（図１１）。
（ｉ）プラスミドｐＭＯ２５の構築
ｅｒｙＡＩ（Donadio,S.et al.,Science（1991）252,675-679）のヌクレオチド６６９６からヌクレオチド７７０７に延びるＳ．エリスレア（S.erythraea）のｅｒｙＡＩ遺伝子の約１．０ｋｂｐＤＮＡセグメントを、ＰＣＲにより、プライマーとして合成オリゴヌクレオチド：5’-GGCGGGTCCGGAGGTGTTCACCGAGTT-3’及び5’-ACCTTGGCCAGGGAAGACGAACACTGA-3’を、そして鋳型としてプラスミドｐＮＴＥＰ２を用いて、増幅した。ＰＣＲ生成物を末端修復し、予めＳｍａＩで消化して線状にしておいたプラスミドｐＵＣ１８に連結し、次にアルカリ性ホスファターゼで処理した。連結混合物を用いて大腸菌ＴＧ１ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。挿入物の境界を成すＳｔｕＩ部位がポリリンカー中のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する所望のプラスミドｐＭＯ２５（３．６ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｉｉ）プラスミドｐＭＯ２６の構築
ｅｒｙＡＩのヌクレオチド８６６０からヌクレオチド９２５８に延びるＳ．エリスレア（S.erythraea）のｅｒｙＡＩ遺伝子の約０．６ｋｂｐＤＮＡセグメントを、ＰＣＲにより、プライマーとして合成オリゴヌクレオチド：5’-TCCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3’及び5’-AAACACCGCGACCTGGTCCTCCGAGC-3’を、そして鋳型としてプラスミドｐＮＴＥＰ２を用いて、増幅した。ＰＣＲ生成物を末端修復し、予めＳｍａＩで消化して線状にしておいたプラスミドｐＵＣ１８に連結し、次にアルカリ性ホスファターゼで処理した。連結混合物を用いて大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。ＡｖｒＩＩ部位がポリリンカー中のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する所望のプラスミドｐＭＯ２６（３．２ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｉｉｉ）プラスミドｐＭＯ２７の構築
プラスミドｐＭＯ１をＥｃｏＲＩ及びＢａＩＩで消化し、１．０ｋｂｐ挿入物を、予めＥｃｏＲＩ及びＢａＩＩで消化しておいたプラスミドｐＭＯ２に連結した。連結混合物を用いて、大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＭＯ２７（４．４ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｉｖ）プラスミドｐＭＯ３２の構築
プラスミドｐＭＯ２６をＡｖｒＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．６ｋｂｐ挿入物を、予めＡｖｒＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたプラスミドｐＭＯ２７に連結した。連結混合物を用いて、大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＭＯ３２（５．１ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｖ）プラスミドｐＭＯ３３の構築
プラスミドｐＭＯ３２をＢｓｐＥＩ及びＳｅｘＡＩで消化し、２．７ｋｂｐ挿入物を、予め同一の２つの酵素で消化しておいたプラスミドｐＮＴＥＰ２に連結し、ゲル電気泳動により精製して、２．８ｋｂｐ挿入物を除去した。連結混合物を用いて、大腸菌ＴＧ１ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。プラスミドｐＭＯ３３（１２．８ｋｂｐ）をその制限パターンにより同定した。
（ｖｉ）プラスミドｐＣ−ＡＴ１２の構築
プラスミドｐＭＯ３３をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し，ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化しておいたプラスミドｐＣＪＲ２９と連結して、ゲル電気泳動で精製した。連結混合物を用いて大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯを形質転換し、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＣ−ＡＴ１２をその制限パターンにより同定した。
実施例１ｊ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＪＣ２／ｐＣ−ＡＴ１２の構築及びＴＫＬ誘導体の生成
プラスミドｐＣ−ＡＴ１２を用いて、Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＪＣ２プロトプラストを形質転換した。チオストレプトン耐性コロニーを、１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するＲ２Ｔ２０培地上で選択した。いくつかのコロニーを、そのゲノムＤＮＡとＤＥＢＳ１−ＴＥ遺伝子をコードするＤＩＧ標識ＤＮＡとのサザーンブロットハイブリダイゼーションにより染色体中に組み込まれたｐＣ−ＡＴ１２の存在に関して試験した。
ｐＣ−ＡＴ１２の組込みコピーを有するクローンを、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するＳＳＭ培地中で増殖させて、２８〜３０℃で７日間増殖させた。この後、ブロスを濾過して菌糸体を除去し、ｐＨ３に調整した。ブロスを２容量の酢酸エチルで２回抽出し、併合酢酸エチル抽出物を等容量の飽和塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥して、減圧下で酢酸エチルを除去し、約５００ｍｇの粗製物質を得た。生成物は、（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−メチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン及び（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−メチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン：
0004173551.tif 000010
であることが示された。
実施例１ｋ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ  ２３３８／ｐＣ−ＡＴ１２の構築及び１４員マクロライドの生成におけるその使用
約５μｇのｐＣ−ＡＴ１２  ＤＮＡを用いて、Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８プロトプラストを形質転換して、プラスミドが染色体中に組み込まれる株を得た。数個のコロニーから、全ＤＮＡを得て、サザーンハイブリダイゼーションにより分析して、プラスミドがＥｒｙＡＩのモジュール２に組み込まれて新規のマクロライド生合成経路を生じることを確証した。さらなる組込みが起きて、反復プラスミド配列を生じた。Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＣ−ＡＴ１２を５ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するトリプシンダイズブロス中に接種して、３０℃で３日間インキュベートした。１００ｍＬのこの種子培養を用いて、分散及び３００ｒｐｍでの振盪を補助するために２個のスプリングを有する、各々５００ｍＬの培地を含有する５ｘ２Ｌフラスコ中の５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有する２Ｌのスクロースコハク酸塩限定培地に接種した。さらに５日間増殖させた後、培養を遠心分離して、上清のｐＨをｐＨ９に調整した。次に、上清を等容量の酢酸エチルで３回抽出し、蒸発させて溶媒を除去した。生成物をＨＰＬＣ−ＭＳにより分析し、２つのマクロライド生成物を同定した：
0004173551.tif 000011
実施例１１：プラスミドｐＣＪＲ４９の構築
プラスミドｐＣＪＲ４９は、モジュール２中にケトレダクターゼを有さない突然変異体ＤＥＢＳ１−ＴＥ遺伝子を含有するｐＣＪＲ２４ベースのプラスミドであり、二次モジュール内のメチルマロニルエキステンダーの代わりにマロニルエキステンダーを組み入れるために、モジュール２のＡＴドメインがＲＡＰＳ  ＡＴ２に置き換えられていた（図１２）。
ｐＭＯ３２をＢｓｐＥＩ及びＳｅｘＡＩで消化し、ＲＡＰモジュール２からのＡＴを含有する断片を、予めＢｓｐＥＩ及びＳｅｘＡＩで消化しておいたｐＵＣ１−０中でクローン化して、プラスミドｐＣＪＲ４３を産生した。
ｐＣＪＲ４３をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し，突然変異体ＤＥＢＳ１−ＴＥ遺伝子を含有する断片を、予めＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化しておいたｐＣＪＲ２４中でクローン化して、プラスミドｐＣＪＲ４９を産生した。ｐＣＪＲ４９をその酵素マッピングにより確証した。
実施例１ｍ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＪＣ２／ｐＣＪＲ４９の構築及びＴＫＬ誘導体の生成
約５μｇのｐＣＪＲ４９  ＤＮＡを用いて、Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＪＣ２プロトプラストを形質転換して、プラスミドが染色体中に組み込まれる株を得た。数個のコロニーから、全ＤＮＡを得て、サザーンハイブリダイゼーションにより分析して、プラスミドがｅｒｙＴＥに組み込まれていたことを確証した。Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＪＣ２／ｐＣＪＲ４９を５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するトリプシンダイズブロス中に接種して、３０℃で３日間インキュベートした。１００ｍＬのこの種子培養を用いて、分散及び３００ｒｐｍでの振盪を補助するために２個のスプリングを有する、各々５００ｍＬの培地を含有する５ｘ２Ｌフラスコ中の５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有する２Ｌのスクロースコハク酸塩限定培地に接種した。さらに５日間増殖させた後、培養を遠心分離して、上清のｐＨをｐＨ９に調整した。次に、上清を等容量の酢酸エチルで３回抽出し、蒸発させて溶媒を除去した。生成物をメタノール中に溶解し、Finnegan-ＭＡＴ  ＧＣＱ  Ｓｙｓｔｅｍ上でＧＣＭＳにより分析した。この分析は、合成標準と比較することにより、２つの新規のラクトンが存在することを示した。これらの生成物は、（４Ｓ，５Ｒ）−４−メチル−３−ケト−５−ヒドロキシヘキサン酸δラクトン及び（４Ｓ，５Ｒ）−４−メチル−３−ケト−５−ヒドロキシヘプタン酸δラクトンであった：
0004173551.tif 000012
実施例１ｎ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ  ２３３８／ｐＣＪＲ４９の構築及び１４員マクロライドの生成のためのその使用
５μｇのｐＣＪＲ４９  ＤＮＡを用いて、Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８プロトプラストを形質転換して、プラスミドが染色体中に組み込まれる株を得た。数個のコロニーから、全ＤＮＡを得て、サザーンハイブリダイゼーションにより分析して、プラスミドがＥｒｙＡＩのモジュール２に組み込まれて新規のマクロライド生合成経路を生じることを確証した。さらなる組込みが起きて、反復プラスミド配列を生じた。Ｓ．エリスレア（S.erythraea）／ｐＣＪＲ４９を５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するトリプシンダイズブロス中に接種して、３０℃で３日間インキュベートした。１００ｍＬのこの種子培養を用いて、分散及び３００ｒｐｍでの振盪を補助するために２個のスプリングを有する、各々５００ｍＬの培地を含有する５ｘ２Ｌフラスコ中の５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有する２Ｌのスクロースコハク酸塩限定培地に接種した。さらに５日間増殖させた後、培養を遠心分離して、上清のｐＨをｐＨ９に調整した。次に、上清を等容量の酢酸エチルで３回抽出し、蒸発させて溶媒を除去した。生成物をＨＰＬＣ−ＭＳにより分析し、２つのマクロライド生成物を同定した：
0004173551.tif 000013
実施例２：ａｖｒ負荷ドメインがS.erythraeaＮＲＲＬ２３３８のｅｒｙ負荷ドメインの代わりに置き換えられるハイブリッドＰＫＳ遺伝子を保有するS.erythraeaＥＲＭＤ１の構築
（ｉ）プラスミドｐＡＶＬＤの構築
プラスミドｐＣＲａｂｃ（実施例１）をＢａｍＨＩで線状化して、予めＢｇＩＩＩで消化したｐＩＪ７０２に連結した。混合物は、所望のプラスミドｐＡＶＬＤ（図５）を含有した。連結混合物を大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯ中で形質転換させて、個々のコロニーをそれらのプラスミド含量に関して調べた。所望のプラスミドｐＡＶＬＤをその制限パターンにより同定した（図５）。
（ｉｉ）Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＥＲＭＤ１の構築
大腸菌ＴＧ１  ｒｅｃＯ（ｐＡＶＬＤ）から単離したｐＡＶＬＤ  約５〜１０μｇをＳ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８中で形質転換させて、安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した。３つのコロニーのうちの１つを選択して、全ＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、プローブとして、ケトシンターゼドメインＫＳ１をコードするｅｒｙＡＩ遺伝子の断片を含有するプラスミドｐＣＲｃからの挿入物を用いて、サザーンハイブリダイゼーションにより分析した。分析は８．５ｋｂｐ、４．８ｋｂｐ及び３３ｋｂｐの陽性ハイブリダイジングＰｓｔＩ断片を示したが、これは、ｐＡＶＬＤの２つのタンデム方式で組み込まれたコピーの存在を示す（図６）。
実施例３：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＥＲＭＤ１を用いたイソプロピル及びｓｅｃ−ブチルエリスロマイシンの調製
Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＥＲＭＤ１の５０ｍＬ発酵を水道水培地上で実施し、３０℃で４日後に、菌糸体を収穫して、トリストレプトン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する１．５Ｌのスクロース−コハク酸塩培地に接種した。３０℃で４日間増殖させた後、全ブロスを等容量の酢酸エチルで２回、抽出した。併合抽出物を減圧下で濃縮し、クロロホルム／メタノール／．８８アンモニア  ８：２：０．０１分（容量で）で溶離したシリカゲルプレート（２０ｘ２０ｃｍ）上での分取薄層クロマトグラフィー処理を２回施した。１ｍＬ／分でメタノール／０．５％酢酸アンモニウム（７０：３０（vol／vol））で溶離したＰｈａｓｅＳｅｐＣ１８ベースの脱活性化逆相カラムＳ５ＯＤＳ（オクタデシルシラン）６（４．６ｍｍｘ２５ｃｍ）上でのＨＰＣＬにより、生成物をさらに分離した。分画を、３つの別々の注入から７〜１１分の間に収集し、プールした分画を１０回の別々の注入で再注入した。４−炭素（Ｃ−４：イソブチリル）スターター単位の組入れに由来するイソプロピル側鎖（式１のＲ1でのイソプロピル）を含有する類似体は初期に溶離し、５−炭素（Ｃ−５：２−メチブチリル）スターター単位の組入れに由来するｓｅｃ−ブチル側鎖（式１のＲ1でのｓｅｃ−ブチル）を含有する類似体は数分後に出現した。高分離度ＭＳは、Ｃ−４ｅｒｙＡ，ｅｒｙＢ及びｅｒｙＤ類似体に関する、並びにＣ−５ｅｒｙＡ及びｅｒｙＢ類似体に関する結果を示し、これらは下記のように密接に対応する：
0004173551.tif 000014
これらの実験では、天然エリスロマイシンは低量又は検出不可能な量でのみ存在し、検出可能量のｅｒｙＣ類似体は認められなかった。発酵ブロス中のＣ−４／Ｃ−５化合物の全体的濃度比は、ブロスの酢酸エチル抽出物のＥＳＭＳにより査定した場合、４：１〜６：１でＣ−４化合物が優勢であった。Ａ：Ｂ：Ｄ類似体の比は変動性で、約１５：６０：２５であったが、発酵が進行するとＡ類似体の割合が増大した。エリスロマイシンの全収率は、約４００μｇ／Ｌであった。イソ酪酸又は２−メチル酪酸の補足は成されなかった。したがって、イソブチリル及び２−メチルブチリルスターター単位は、天然アベルメクチンの合成と同様に、内因性供給前駆体に由来すると思われた（例えば、Hafner et al.,（1991）,J.Antibiot.,44:349-356）。
実施例４ａ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ  ２３３８／ｐＩＧ１の構築
約５μｇのプラスミドｐＩＧ１をＳ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ  ２３３８のプロトプラスト中で形質転換させて、安定チオストレプトン耐性コロニーを単離した。いくつかのこのようなコロニーから、全ＤＮＡを得て、サザーンハイブリダイゼーションにより分析して、プラスミドがｅｒｙＡＩ中に特異的に組み入れられていたことを確証した。サザーン分析はさらに、組入れ部位が，ａｖｅ負荷モジュールを介して変化したマクロライドを産生するのに適切であったことを示した。
実施例４ｂ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ  ２３３８／ｐＮＤ３０の構築
約５μｇのプラスミドｐＮＤ３０をＳ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ  ２３３８のプロトプラスト中で形質転換させて、安定チオストレプトン耐性コロニーを単離した。いくつかのこのようなコロニーから、全ＤＮＡを得て、サザーンハイブリダイゼーションにより分析して、プラスミドがｅｒｙＡＩ中に特異的に組み入れられていたことを確証した。サザーン分析はさらに、組入れ部位が、ａｖｅ負荷モジュールを介して変化したマクロライドを産生するのに適切であったことを示した。
実施例５ａ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を用いた１３イソプロピル及び１３−ｓｅｃ−ブチルエリスロマイシンの調製
Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を、５０μｇ／ｍＬチオストレプトンを含有する水道水培地中に接種し、３０℃で４日間増殖させた。この後に、２０ｍＬの菌糸体を用いて、２８０ｒｐｍで振盪し、強打を低減するために単一スプリングを有する２Ｌフラスコ中で、トリストレプトン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する５００ｍＬのスクロース−コハク酸塩培地に接種した。３．５〜６日後、ブロスを濾過して菌糸体を除去し、次に等容量の酢酸エチルで３回、抽出した。併合酢酸エチル抽出物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発により溶媒を除去した。ＧＣ及び電気噴霧ＭＳを用いて生成混合物を分析した結果、全体で５〜６ｍｇ／Ｌの１４員マクロライド生成物が生じ、大きい方の成分はｓｅｃ−ブチル−エリスロマイシンＤ（約１．５ｍｇ／Ｌ）であり、他の成分はｓｅｃ−ブチル−エリスロマイシンＢ及びｓｅｃ−ブチル−エリスロマイシンＡ；イソプロピル−エリスロマイシンＡ、Ｂ及びＤ；そして少量の天然エリスロマイシンＡ、Ｂ及びＤであった。Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１は、等価のＳ．エリスレア（S.erythraea）ＥＲＭＤ１構築物（実施例２参照）と比較して、約１０〜１５倍多い新規のイソプロピル−及びｓｅｃ−ブチル−エリスロマイシンを産生した。これは、Ｉ型ＰＫＳの発現を増強するａｃｔＩプロモーター及びそのコグネイトアクチベーター遺伝子ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４の能力を明白に実証する。さらに、イソ酪酸又は２−メチル酪酸の補足は行われなかった。したがって、イソブチル及び２−メチルブチリルスターター単位は内因的に供給された前駆体に由来する、と考えられた。
実施例５ｂ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた１３−イソプロピル及び１３−ｓｅｃ−ブチルエリスロマイシンの調製
Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を、５０μｇ／ｍＬチオストレプトンを含有する水道水培地中に接種し、３０℃で４日間増殖させた。この後に、２０ｍＬの菌糸体を用いて、２８０ｒｐｍで振盪し、強打を低減するために単一スプリングを有する２Ｌフラスコ中で、トリストレプトン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する５００ｍＬのスクロース−コハク酸塩培地に接種した。３．５〜６日後、ブロスを濾過して菌糸体を除去し、次に等容量の酢酸エチルで３回抽出した。併合酢酸エチル抽出物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発により溶媒を除去した。ＧＣ及び電気噴霧ＭＳを用いて生成混合物を分析した結果、全体で５〜６ｍｇ／Ｌの１４員マクロライド生成物が生じ、大きい方の成分はｓｅｃ−ブチル−エリスロマイシンＤ（約１．５ｍｇ／Ｌ）であり、他の成分はｓｅｃ−ブチル−エリスロマイシンＢ及びｓｅｃ−ブチル−エリスロマイシンＡ；イソプロピル−エリスロマイシンＡ、Ｂ及びＤ；そして少量の天然エリスロマイシンＡ、Ｂ及びＤであった。Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０は、等価のＳ．エリスレア（S.erythraea）ＥＲＭＤ１構築物（実施例２参照）と比較して、約１０〜１５倍多い新規のイソプロピル−及びｓｅｃ−ブチル−エリスロマイシンを産生した。これは、Ｉ型ＰＫＳの発現を増強するａｃｔＩプロモーター及びそのコグネイトアクチベーター遺伝子ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４の能力を明白に実証する。したがって、イソブチル及び２−メチルブチリルスターター単位は内因的に供給された前駆体に由来する、と考えられた。
実施例６ａ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を用いた１３−シクロペンチル−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を、３００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬ水道水培地中に接種した。２８℃で３６時間インキュベーション後、このフラスコを用いて、５Ｌミニジャー中の３．５ＬのＥＲＹ−Ｐ培地に接種した。ブロスを、１．７５Ｌ／分の通気速度で、２８℃でインキュベートした。シクロペンタンカルボン酸（１．４ｍＬ）を２４時間後に付加して、発酵を１６８時間継続した。この後、全ブロスを、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８．５に調整し、酢酸エチル（１０Ｌ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を濃縮、乾燥して、粗製生成物をゴム（４．２ｇ）として得た。この抽出物  １ｇを酢酸エチル（５ｍＬ）に溶解し、酢酸エチル（１０ｍＬ）で予め状態調節した予充填シリカゲルカートリッジ（１０ｇ；International Sorbent Technology）に付加した。カラムを継続的に酢酸エチル（４ｘ１０ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール（１：１）（２ｘ１０ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール：アンモニア（９０：９：１）（１ｘ１０ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール：アンモニア（８０：１９：１）（１ｘ１０ｍＬ）；メタノール（２ｘ１０ｍＬ）で溶離した。分画７〜１０を併合し、蒸発、乾燥させた。この分別を残りの３．２ｇのゴムに関して反復した。この濃縮工程により、所望の物質を含有するゴム状固体  約９２０ｍｇを得た。これを、８ｍＬ／分でのアセトニトリル：０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（７：３）の移動相をもちいるＺｏｒｂａｘ  ７μｍＯＤＳカラム（２１．２ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いて分取逆相ＨＰＬＣにより、さらに精製した。４つの別々の注入からの、当該物質を含有する分画を併合し、蒸発、乾燥させた後に、アセトニトリル：０．０５酢酸アンモニウム（２８：７２）からアセトニトリル：０．０５酢酸アンモニウム（５０：５０）までの移動相勾配を用いて、１８分間掛けて（流速４ｍＬ／分）、Beckman ５μｍ  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳカラム（１０ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いる反復分取逆相ＨＰＬＣ処理した。５つの別々の注入からの、当該物質を含有する分画を併合し、蒸発、乾燥して、精製白色固体（７ｍｇ）を得た。生成物の構造を、質量分析（ＭＳ）及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により、以下のように確証した：
ＨＰＬＣ保持時間−方法Ａ−２６．０分
ＡＰＣＩ−ＭＳ−（Ｍ＋Ｈ）+（ｍ／ｅとして観察７５８。Ｃ40Ｈ72ＮＯ12について７５８であるべきである）
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実施例６ｂ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた１３−シクロペンチル−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた実施例６ａと同様の実験は、実施例６ａで例示した化合物を生成した。
実施例７ａ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を用いた１３−シクロブチル−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を、３ｘ３００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬ水道水培地中に接種した。２８℃で７２時間インキュベーション後、このフラスコを用いて、３ｘ５Ｌミニジャー中の３．５ＬのＥＲＹ−Ｐ培地に接種した。ブロスを、２．０Ｌ／分の通気速度で、２８℃でインキュベートし、５００ｒｐｍで攪拌した。シクロブタンカルボン酸（１．４ｍＬ）を２４時間及び４８時間後に付加して２回供給し、発酵を１６８時間継続した。この後、全ブロスのｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８．５に調整し、酢酸エチル（２０Ｌ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を濃縮、乾燥して、粗製生成物をゴム（９．２ｇ）として得た。この抽出物の一部（２．３ｇ）を酢酸エチル（１２．５ｍＬ）に溶解し、酢酸エチル（１０ｍＬ）で予め状態調節した予充填シリカゲルカートリッジ（１０ｇ；International Sorbent Technology）に付加した。カラムを継続的に酢酸エチル（４ｘ２４ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール（９：１）（１ｘ２４ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール（８：２）（２ｘ２４ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール：アンモニア（８０：１９：１）（１ｘ２４ｍＬ）で溶離した。分画６〜８を併合し、蒸発、乾燥させた。この分別を残りのゴム（４．７ｇ）に関して反復した。この濃縮工程により、所望の物質を含有する固体  約４１５ｍｇを得た。これを、８ｍＬ／分でのアセトニトリル：０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（３：１）の移動相をもちいるＺｏｒｂａｘ  ７μｍＯＤＳカラム（２１．２ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いて分取逆相ＨＰＬＣにより、さらに精製した。５つの別々の注入からの、当該物質を含有する分画を併合し、蒸発、乾燥させた後に、アセトニトリル：０．０５酢酸アンモニウム（２８：７２）からアセトニトリル：０．０５酢酸アンモニウム（５０：５０）までの移動相勾配を用いて、１８分間掛けて（流速４ｍＬ／分）、Beckman ５μｍ  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳカラム（１０ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いる反復分取逆相ＨＰＬＣ処理をした。当該物質を含有する分画を併合し、蒸発、乾燥して、精製白色固体（２７ｍｇ）を得た。生成物の構造を、ＭＳ及びＮＭＲにより、以下のように確証した：
ＨＰＬＣ保持時間−方法Ａ−２２．３分
ＡＰＣＩ−ＭＳ−（Ｍ＋Ｈ）+（ｍ／ｅとして観察７４４。Ｃ39Ｈ70ＮＯ12について７４４であるべきである）
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実施例７ｂ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた１３−シクロブチル−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた実施例７ａと同様の実験は、実施例７ａで例示した化合物を生成した。
実施例８ａ：Ｓ，エリスレア（S.erythraeaＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を用いた１３−（３−フラニル）−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を、３００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬ水道水培地中に接種した。２８℃で７２時間インキュベーション後、このフラスコを用いて、５Ｌミニジャー中の３．５ＬのＥＲＹ−Ｐ培地に接種した。ブロスを、１．７５Ｌ／分の通気速度で、２８℃でインキュベートした。３−フロ酸（メタノール  ６ｍＬ中に１．４ｇ）を２４時間後に付加して、発酵を１３８時間継続した。この後、全ブロスのｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８．５に調整し、酢酸エチル（１０Ｌ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を濃縮、乾燥して、粗製生成物をゴム（３．８ｇ）として得た。この抽出物の一部（１．９ｇ）を酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解し、酢酸エチル（１０ｍＬ）で予め状態調節した予充填シリカゲルカートリッジ（１０ｇ；International Sorbent Technology）に付加した。カラムを継続的に酢酸エチル（４ｘ２４ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール（９：１）（１ｘ２４ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール（８：２）（２ｘ２４ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール：アンモニア（８０：１９：１）（１ｘ３６ｍＬ）；メタノール（１ｘ２４ｍＬ）で溶離した。分画８及び９を併合し、蒸発、乾燥させた。この分別を残りの１．９ｇのゴムに関して反復した。この濃縮工程により、所望の物質を含有する固体を得た。これを、８ｍＬ／分でのアセトニトリル：０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（３：１）の移動相をもちいるＺｏｒｂａｘ  ７μｍＯＤＳカラム（２１．２ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いて分取逆相ＨＰＬＣにより、さらに精製した。３つの別々の注入からの、当該物質を含有する分画を併合し、蒸発、乾燥させた後に、アセトニトリル：０．０５酢酸アンモニウム（２８：７２）からアセトニトリル：０．０５酢酸アンモニウム（５０：５０）までの移動相勾配を用いて、１８分間掛けて（流速４ｍＬ／分）、Beckman ５μｍ  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳカラム（１０ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いる反復分取逆相ＨＰＬＣ処理した。３つの別々の注入からの、当該物質を含有する分画を併合し、蒸発、乾燥して、精製１３−（３−フラニル）−エリスロマイシンＢを白色固体（９ｍｇ）として得た。生成物の構造を、質量分析により、以下のように確証した：
ＨＰＬＣ保持時間−方法Ａ−１７．０分
ＡＰＣＩ−ＭＳ−（Ｍ＋Ｈ）+（ｍ／ｅとして観察７５６。Ｃ39Ｈ66ＮＯ13について７５６であるべし）
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実施例８ｂ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた１３−（３−フラニル）−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた実施例８ａと同様の実験は、実施例８ａで例示した化合物を生成した。
実施例９ａ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を用いた１３−シクロプロピル−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を、３００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬ水道水培地中に接種した。２８℃で７２時間インキュベーション後、このフラスコを用いて、３．５ＬのＥＲＹ−Ｐ培地に接種した。滅菌直後に、チオストレプトン（１０５ｍｇ）を付加した。ブロスを、２Ｌ／分の通気速度で、２８℃でインキュベートし、５００ｒｐｍで攪拌した。シクロプロパンカルボン酸（１．２ｍＬ）を２４時間後に付加して、発酵を１４４時間継続した。この後、全ブロスのｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８．５に調整し、酢酸エチル（３Ｌ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を濃縮、乾燥して、粗製生成物をゴム（１．７ｇ）として得た。この抽出物（０．８５ｇ）を酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解し、酢酸エチル（２０ｍＬ）で予め状態調節した予充填シリカゲルカートリッジ（１０ｇ；International Sorbent Technology）に付加した。カラムを継続的に酢酸エチル（４ｘ２４ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール（９：１）（１ｘ２４ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール（８：２）（ｌｘ２４ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール：アンモニア（８０：１９：１）（３ｘ２４ｍＬ）；メタノール（１ｘ２４ｍＬ）で溶離した。分画６〜９を併合し、蒸発、乾燥させた。この分別を残りの０．８５ｇのゴムに関して反復した。この濃縮工程により、所望の物質を含有する固体を得た。これを、８ｍＬ／分でのアセトニトリル：０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（３：１）の移動相をもちいるＺｏｒｂａｘ  ７μｍＯＤＳカラム（２１．２ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いて分取逆相ＨＰＬＣにより、さらに精製した。４つの別々の注入からの、当該物質を含有する分画を併合し、蒸発、乾燥させた後に、アセトニトリル：０．０５酢酸アンモニウム（２８：７２）からアセトニトリル：０．０５酢酸アンモニウム（５０：５０）までの移動相勾配を用いて、１８分間掛けて（流速４ｍＬ／分）、Beckman ５μｍ  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳカラム（１０ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いる反復分取逆相ＨＰＬＣ処理した。３つの別々の注入からの、当該物質を含有する分画を併合し、蒸発、乾燥して、精製１３−シクロプロピル−エリスロマイシンＢを白色固体（９ｍｇ）として得た。生成物の構造を、質量分析により、以下のように確証した：
ＨＰＬＣ保持時間−方法Ａ−１７．９分
ＡＰＣＩ−ＭＳ−（Ｍ＋Ｈ）+（ｍ／ｅとして観察７３０。Ｃ38Ｈ68ＮＯ12について７３０であるべし）
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実施例９ｂ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた１３−シクロプロピル−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた実施例９ａと同様の実験は、実施例９ａで例示した化合物を生成した。
実施例１０ａ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を用いた１３−（１−メチルチオ−エチル）−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を、２．８Ｌフェルンバッハフラスコ中の１Ｌ水道水培地中に接種した。２９℃で８４時間インキュベーション後、このフラスコを用いて、１４Ｌ発酵器ジャー中の８Ｌの補足ＥＲＹ−Ｐ培地（５０ｇ／Ｌ  デキストロース、３０ｇ／Ｌ  Nutrisoy粉、３ｇ／Ｌ  硫酸アンモニウム、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ3、１０ｇ／Ｌ  スクロース、５ｇ／Ｌ  コーン浸漬固体  corn steep solids、０．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4及び１ｍＬ／ＬのＰ２０００）に接種した。ブロスを、８Ｌ／分の通気速度で、２８℃でインキュベートし、８００ｒｐｍで攪拌し、ＮａＯＨ又はＨ2ＳＯ4（１５％）を用いてｐＨを６．９〜７．３に保持した。メチルチオ乳酸（３．２ｍＬ）を２４及び４８時間後に付加した。さらに１２０時間後に、メチルチオ乳酸（１．６ｍＬ）を付加した。発酵を１４２時間継続した。この後、全ブロスを、遠心分離して、遠心分離物（３４Ｌ）を生成し、これをＸＡＤ−１６樹脂カラム（６００ｍＬ；Rohm and Haas）に投入した。次に、樹脂カラムを水（１．８Ｌ）で洗浄し、酢酸エチル（２．５Ｌ）で溶離した。酢酸エチルを一部濃縮して（２５０ｍＬに）、次に当該生成物を１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ３．５（１．３Ｌ）中に抽出し、生成物を、水を水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整して酢酸エチルに戻し、次に酢酸エチル（４５０ｍＬ）と混合した。エリスロマイシンリッチな酢酸エチル層を分離し、蒸発させて、ゴム（５．０ｇ）を得て、次に、２０％メタノール（１２０ｍＬ）中に再懸濁して、これをＣＧ−１６１樹脂カラム（１００ｍＬ；Toso Haas）に投入した。樹脂カラムを、連続的に２０％メタノール（３ｘ１００ｍＬ）、４０％メタノール（３ｘ１００ｍＬ）、６０％メタノール（３ｘ１００ｍＬ）、８０％メタノール（３ｘ１００ｍＬ）及び純メタノール（４ｘ１００ｍＬ）で溶離した。当該生成物を含有する純メタノール分画２及び３を蒸発させて固体（２２０ｍｇ）とし、２１５ｍＬ／分の流速で６０分間、アセトニトリル：０．０５Ｍ酢酸アンモニウム＋０．１％トリフルオロ酢酸の移動相を用いて、逆相１０μｍＯKromasilＣ１８ＨＰＬＣカラム（７５ｍｍｘ２５ｃｍ）上で、さらに精製した。当該物質を含有する分画を併合し（１．７Ｌ）、水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整し、塩化メチレン（３００ｍＬ）中に抽出した。塩化メチレン層を分離し、蒸発、乾燥させて、部分的精製物質を得た。分取ＨＰＬＣ工程及び抽出工程を反復して、精製１３−（１−メチルチオ−エチル）−エリスロマイシンＢ（３１ｍｇ）を得た。生成物の構造を、ＭＳ及びＮＭＲ分光測光法（Bruker DMX500MHz分光光度計）により、以下のように確証した：
ＨＰＬＣ保持時間−方法Ｂ−１４．９分
ＡＰＣＩ−ＭＳ−（Ｍ＋Ｈ）+（ｍ／ｅとしての観察７６４。Ｃ38Ｈ70ＮＯ12について７６４であるべし）
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実施例１０ｂ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた１３−（１−メチルチオ−エチル）−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた実施例１０ａと同様の実験は、実施例１０ａで例示した化合物を生成した。
実施例１１：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８を用いた１３−シクロブチル−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８を、３００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬ水道水培地中に接種した。２８℃で４８時間インキュベーション後、このフラスコを用いて、３００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬのＥＲＹ−Ｐ培地に接種した。ブロスを２８℃でインキュベートした。シクロブタンカルボン酸（２０ｍＬ）を２４時間後に付加して、発酵を１６８時間継続した。この後、全ブロスのｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８．５に調整し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を濃縮、乾燥した。試料をＨＰＬＣ−ＭＳ分析のためにメタノール（１ｍＬ）に再溶解した。これにより、ａｖｒ負荷モジュールを含有する遺伝子工学処理株（ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１構築物）に関して実施例７に記載したような非形質転換化、非組換え体ＮＲＲＬ２３３８による１３−シクロブチル−エリスロマイシンＢの産生が確証された。
ＨＰＬＣ保持時間−方法Ａ−２２．３分
ＡＰＣＩ−ＭＳ−（Ｍ＋Ｈ）+（ｍ／ｅとして観察７４４。Ｃ39Ｈ70ＮＯ12について７４４であるべし）
実施例１２：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８を用いた１３−シクロプロピル−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８を、３００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬ水道水培地中に接種した。２８℃で４８時間インキュベーション後、このフラスコを用いて、３００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬのＥＲＹ−Ｐ培地に接種した。ブロスを２８℃でインキュベートした。シクロブタンカルボン酸（２０ｍＬ）を２４時間後に付加して、発酵を１６８時間継続した。この後、全ブロスのｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８．５に調整し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を濃縮、乾燥した。試料をＨＰＬＣ−ＭＳ分析のためにメタノール（１ｍＬ）に再溶解した。これにより、ａｖｒ負荷モジュールを含有する遺伝子工学処理株（ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１構築物）に関して実施例９に記載したような非形質転換化、非組換え体ＮＲＲＬ２３３８による１３−シクロプロピル−エリスロマイシンＢの産生が確証された。
ＨＰＬＣ保持時間−方法Ａ−１７．９分
ＡＰＣＩ−ＭＳ−（Ｍ＋Ｈ）+（ｍ／ｅとして観察７３０。Ｃ38Ｈ68ＮＯ12について７３０であるべし）
実施例１３ａ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を用いた１３−シクロブチル−エリスロマイシンＡの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を、３ｘ３００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬ水道水培地中に接種した。２８℃で７２時間インキュベーション後、このフラスコを用いて、３ｘ５Ｌミニジャー中の３．５ＬのＥＲＹ−Ｐ培地に接種した。ブロスを、２．０Ｌ／分の通気速度で、２８℃でインキュベートし、５００ｒｐｍで攪拌した。シクロブタンカルボン酸（１．４ｍＬ）を２４時間及び４８時間後に付加して２回供給し、発酵を１６８時間継続した。この後、全ブロスのｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８．５に調整し、酢酸エチル（２０Ｌ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を濃縮、乾燥して、粗製生成物をゴム（９．２ｇ）として得た。この抽出物の一部（２．３ｇ）を酢酸エチル（１２．５ｍＬ）に溶解し、酢酸エチル（１０ｍＬ）で予め状態調節した予充填シリカゲルカートリッジ（１０ｇ；International Sorbent Technology）に付加した。カラムを継続的に酢酸エチル（４ｘ２４ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール（９：１）（１ｘ２４ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール（８：２）（２ｘ２４ｍＬ）；ジクロロメタン：メタノール：アンモニア（８０：１９：１）（１ｘ２４ｍＬ）で溶離した。分画６〜８を併合し、蒸発、乾燥させた。この分別を残りのゴム（４．７ｇ）に関して反復した。この濃縮工程により、所望の物質を含有する固体  約４１５ｍｇを得た。これを、８ｍＬ／分でのアセトニトリル：０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（３：１）の移動相を用いるＺｏｒｂａｘ  ７μｍＯＤＳカラム（２１．２ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いて分取逆相ＨＰＬＣにより、さらに精製した。５つの別々の注入からの、当該物質を含有する分画を併合し、蒸発、乾燥させた後に、アセトニトリル：０．０５酢酸アンモニウム（２８：７２）からアセトニトリル：０．０５酢酸アンモニウム（５０：５０）までの移動相勾配を用いて、１８分間掛けて（流速４ｍＬ／分）、Beckman ５μｍ  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳカラム（１０ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いて反復分取逆相ＨＰＬＣ処理をした。当該物質を含有する分画を併合し、蒸発、乾燥して、精製白色固体（４ｍｇ）を得た。生成物の構造を、ＭＳ及びＮＭＲにより、以下のように確証した：
ＨＰＬＣ保持時間−方法Ａ−１７．５分
ＡＰＣＩ−ＭＳ−（Ｍ＋Ｈ）+（ｍ／ｅとして観察７６０。Ｃ39Ｈ70ＮＯ13について７６０であるべし）
0004173551.tif 000029
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実施例１３ｂ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた１３−シクロブチル−エリスロマイシンＡの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた実施例１３ａと同様の実験は、実施例１３ａで例示した化合物を生成した。
実施例１４ａ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を用いた１３−シクロプロピル−エリスロマイシンＡの調製
６つの２８００ｍＬフェルンバッハフラスコに、Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を接種した。各フラスコは、各フラスコに付加された５０ｍｇのチオストレプトンを含む水道水培地  １Ｌを含入した。２８℃で２４時間インキュベーション後、各フラスコに、２００ｐｐｍのシクロプロパンカルボン酸を付加した。フラスコを９０時間インキュベートし、滅菌８Ｌ吸引瓶中に混合した。吸引瓶を用いて、５００ガロンバイロット容器中のＥＲＹ−Ｐばいち３１４ガロンに接種した。ブロスをインキュベートし、２７℃〜２９℃で、ｐＨ範囲６．７〜７．４で、通気速度２０標準立方フィート／分で作用させ、１７５ｒｐｍで攪拌した。シクロプロパンカルボン酸（２００ｍｇ／Ｌ）を３３時間、８１時間及び１１７時間後に付加した。発酵を１９８時間継続した。この後、全ブロスを０．２μｍセラミックフィルター（３０ｆｔ2、U.S.Filter）上で濾過した。濾液をＸＡＤ−１６樹脂カラム（１２Ｌ；Rohm and Haas）上に投入した。次に、樹脂カラムを酢酸エチル（６０Ｌ）で溶離した。酢酸エチル抽出物を濃縮して、ゴム（３０２ｇ）として、これに塩化メチレン  ２Ｌを付加した。その結果生じた塩化メチレン溶液を８Ｌの２５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９で洗浄した。
エリスロマイシンリッチな塩化メチレン層を分離し、蒸発させて、ゴム（２００ｇ）を得て、次に、４０％メタノール（１０Ｌ）中に再懸濁して、これをＣＧ−１６１樹脂カラム（９Ｌ；Toso Haas）に投入した。樹脂カラムを４０％メタノール（３０Ｌ）で洗浄し、、連続的に７５％メタノール（８ｘ１００ｍＬ）及び純メタノール（３ｘ１０Ｌ）で溶離した。当該生成物を含有する７５％メタノール分画５〜８を蒸発させて３．２Ｌとした。濃縮物をｐＨ９に調整し、０．９５Ｌの塩化メチレンに付加した。塩化メチレン層を分離し、蒸発させて、１２．４ｇのゴムを得た。ゴムの一部（６ｇ）を、２１５ｍＬ／分の流速で、メタノール：０．０５Ｍ酢酸アンモニウム＋０．１％トリフルオロ酢酸アイソクラチック（５０：５０）の移動相を用いて、Kromasil１０μｍ  Ｃ１８ＨＰＬＣカラム（７５ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いる分取逆相ＨＰＬＣにより、さらに精製した。当該物質を含有する分画を併合し（２３０ｍＬ）、蒸発させて濃縮し（１１０ｍＬ）、水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整し、塩化メチレン（５０ｍＬ）中に抽出した。塩化メチレン層を分離し、蒸発、乾燥させて、６３０ｍｇの部分的精製物質を得た。ゴムの別の部分（１ｇ）を、１２５ｍＬ／分の流速で５０分間、アセトニトリル：０．０５Ｍ酢酸アンモニウム＋０．１％トリフルオロ酢酸勾配（２０：８０）〜（２５：７５）の移動相を用いて、ＭｅｔａＣｈｅｍ  Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  １０μｍＣ８カラム（５０ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いる分取逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。当該化合物を含有する分画（２８〜４６分）を併合し、重炭酸ナトリウムで飽和し、塩化メチレンで抽出した。塩化メチレンを分離し、蒸発、乾燥させて、部分的精製物質  ３６１ｍｇを得た。これらの部分的精製物質の一部を、１００ｍＬ／分の流速でメタノール：０．０５Ｍ酢酸アンモニウム＋０．１％トリフルオロ酢酸アイソクラチック（５０：５０）の移動相を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｐｒｏｄｉｇｙ  １０μｍ  Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）により例証されているように逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。当該化合物を含有する分画（２７〜３１分）を併合し、重炭酸ナトリウムで飽和し、塩化メチレンで抽出した。塩化メチレンを分離し、蒸発、乾燥させて、部分的精製物質を得た。物質を、１００ｍＬ／分の流速でメタノール：０．０５Ｍ酢酸アンモニウム＋０．１％トリフルオロ酢酸アイソクラチック（４８：５２）の移動相を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｐｒｏｄｉｇｙ  １０μｍ  Ｃ１８カラム（５０ｘ２５ｃｍ）を用いて、分取逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。当該化合物を含有する分画（４１〜４５分）を併合し、重炭酸ナトリウムで飽和し、塩化メチレンで抽出した。塩化メチレンを分離し、蒸発、乾燥させて、１３−シクロプロピル−エリスロマイシンＡを固体（２０ｍｇ）として得た。生成物の構造を、ＭＳ及びＮＭＲ分光法（Bruker DMX500MHz分光光度計）により、以下のように確証した：
ＨＰＬＣ保持時間−方法Ｂ−５．６分
ＡＰＣＩ−ＭＳ−（Ｍ＋Ｈ）+（ｍ／ｅとして観察７４６。Ｃ38Ｈ68ＮＯ13について７４６であるべし）
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実施例１４ｂ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた１３−シクロプロピル−エリスロマイシンＡの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた実施例１４ａと同様の実験は、実施例１４ａで例示した化合物を生成した。
実施例１５ａ：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を用いた１３−（３−チエニル）−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＩＧ１を、３００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬ水道水培地中に接種した。２８℃で４８時間インキュベーション後、このフラスコを用いて、３００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬのＥＲＹ−Ｐ培地に接種した。ブロスを２８℃でインキュベートした。３−チオフェンカルボン酸（メタノール０．５ｍＬ中に２０ｍｇ）のＮ−アセチルシステアミンチオエステルを２４時間後に滅菌フィルターを付加して、発酵を１６８時間継続した。この後、全ブロスのｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８．５に調整し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を分離し、濃縮、乾燥した。試料をＨＰＬＣ−ＭＳ分析のためにメタノール（１ｍＬ）に再溶解した。これにより、１３−（３−チエニル）−エリスロマイシンＢの産生が確証された。
ＨＰＬＣ保持時間−方法Ａ−２０，０分
ＡＰＣＩ−ＭＳ−（Ｍ＋Ｈ）+（ｍ／ｅとして観察７７２。Ｃ39Ｈ86ＮＯ12について７７２であるべし）
実施例１５ｂ；Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた１３−（３−チエニル）−エリスロマイシンＢの調製
培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ２３３８／ｐＮＤ３０を用いた実施例１５ａと同様の実験は、実施例１５ａで例示した化合物を生成した。
実施例１６：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ１８６４３を用いた６−デオキシ−１３−シクロプロピル−エリスロマイシンＢの調製
Ｓ．エリスレア（S.erythraea）のｅｒｙＦ突然変異体である培養Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ１８６４３（Science,252;114-5,April 1991）を、２．８Ｌフェルンバッハフラスコ中の１Ｌ水道水培地中に接種した。２００ｒｐｍで攪拌しながら、２９℃で２４時間インキュベーション後、シクロプロパンカルボン酸（２００ｍＬ）を付加した。計３日間のインキュベーション後、一フラスコを用いて、１４Ｌ発酵器ジャー中の８Ｌの補足ＥＲＹ−Ｐ培地（６０ｇ／Ｌ  セレロース、３０ｇ／Ｌ  Nutrisoy粉、３ｇ／Ｌ  硫酸アンモニウム、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ  コーン浸漬固体  corn steep solids、０．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4及び１ｍＬ／ＬのＰ２０００）に接種した。ブロスを、８Ｌ／分の通気速度で、８００ｒｐｍで攪拌しながら、２８℃でインキュベートし、ＮａＯＨ又はＨ2ＳＯ4（１５％）を用いてｐＨを６．９〜７．３に保持した。シクロプロパンカルボン酸（１．６ｍＬ）を２４及び４８時間後に付加した。発酵を、二重に実施して、１６３時間インキュベーション後に、収穫した。全ブロスのｐＨを、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９に調整し、酢酸エチル（１６Ｌ）で抽出した。２０Ｌ  Buchi回転蒸発ユニット中で、酢酸エチルを濃縮して、油とした。油を塩化メチレン  ５００ｍＬで再溶解させた。水  ５００ｍＬをこの液体に付加し、水性相のｐＨを、１０％水酸化アンモニウムでｐＨ９に調整した。激しく攪拌後、塩化メチレン層を収集し、１Ｌ回転蒸発フラスコ中で蒸発させて、１１．０ｇの油状残渣を得た。この物質を４：６  メタノール：水の溶液  ２５０ｍＬにようかいさせて、８０ｍＬ  ＣＧ−１６１樹脂カラム（Toso Haas）に投入した。カラムを、４：６  メタノール：水の溶液  ３５０ｍＬで洗浄した。次に、カラムを７：３  メタノール：水溶液を用いて、８ｍＬ／分で、着色不純物がカラムから溶離し始めるまで、カラムを手短に洗浄した（約２床容量洗浄）。この時点で、１時間勾配処理を開始し、８ｍＬ／分で、１時間に７０％から１００％にメタノールが濃縮された。当該物質を含有する分画を蒸発、乾燥させて、１２０ｍＬ／分の流速で５０分間、アセトニトリル：０．０１Ｍ酢酸アンモニウム＋０．０２％トリフルオロ酢酸＋２６％アセトニトリルを含有する緩衝液（５：９５）の移動相を用いて、逆相１０μｍＯKromasilＣ１８ＨＰＬＣカラム（５０ｍｍｘ２５ｃｍ）上で、さらに精製した。これを、次の４０分間に、（５：９５）から（３３：６７）の線状勾配処理した。当該物質を含有する分画を併合し（５３０ｍＬ）、１０％水酸化アンモニウムでｐＨ９に調整し、塩化メチレン（４００ｍＬ）中に抽出した。塩化メチレン層を分離し、蒸発、乾燥させて、精製６−デオキシ−１３−シクロプロピル−エリスロマイシンＢ（１２ｍｇ）を得た。生成物の構造を、ＭＳにより、以下のように確証した：
ＨＰＬＣ保持時間−方法Ｂ−２１．４分
ＡＰＣＩ−ＭＳ−（Ｍ＋Ｈ）+（ｍ／ｅとして観察７１４。Ｃ38Ｈ88ＮＯ12について７１４であるべし）
実施例１７：Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ１８６４３を用いた６−デオキシ−１３−プロピル−エリスロマイシンＢの調製
Ｓ．エリスレア（S.erythraea）ＮＲＲＬ１８６４３を、＿ＹＰＤ寒天培地（０．５％Difco酵母菌抽出物、０．５％ Difco Bactoペプトン、０．２５％デキストロース、０．５％ＭＯＰＳ、１．７％ Difco Bacto寒天。ｐＨを７．０に調整）上の３日間パッチから、２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中の２５ｍＬの＿ＹＰＤブロス（０．５％Difco酵母菌抽出物、０．５％ Difco Bactoペプトン、０．２５％デキストロース、０．５％ＭＯＰＳ。ｐＨを７．０に調整）に接種した。フラスコを、２９℃で４８時間、２２５ｒｐｍでインキュベートした。２．５ｍＬを２５ｍＬのＥＲＹ−Ｐ培地（５％  デキストロース、３％  Nutrisoy粉、０．３％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５％ＮａＣｌ、０．６％ＣａＣＯ3。ｐＨを７．０に調整）に接種し、２２５ｒｐｍで、２９℃で、計６日間インキュベートした。酪酸を、２４，７２及び１２０時間目（それぞれ、４００ｐｐｍ、４００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ）にフラスコに付加した。次に、全ブロスのｐＨを、１Ｎ  ＮａＯＨを用いて９．１に調整した。試料を等容量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル相を窒素中で濃縮、乾燥して、次にＨＰＬＣ−ＭＳ分析のために、１．０ｍＬメタノール中に再懸濁した。これは、６−デオキシ−１３−プロピル−エリスロマイシンＢの産生を確証した。
ＨＰＬＣ保持時間−方法Ｃ−２３．５分
ＡＰＣＩ−ＭＳ−（Ｍ＋Ｈ）+（ｍ／ｅとして観察７１６。Ｃ38Ｈ70ＮＯ11について７１６であるべし）
実施例１８：抗細菌活性の評価
in vitro抗細菌検定を微小力価で実行し、Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests-Sixth Edition；Approved Standard（出版：The National Committee for Clinical Laboratory Standards（NCCLS）guidelines）にしたがって解釈した。最小抑制濃度（ＭＩＣ）は、種々の細菌に対して得られた。例えば、Staphylococcus aureus ８０ＣＲ５（マクロライド感受性株）は、一般的に≦０．１〜１．５６μｇ／ｍＬの範囲の値を提示した。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
0004173551.tif 000040
【図４ａ】
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【図４ｂ】
0004173551.tif 000042
【図４ｃ】
0004173551.tif 000043
【図５】
0004173551.tif 000044
【図６】
0004173551.tif 000045
【図７】
0004173551.tif 000046
【図８】
0004173551.tif 000047
【図９】
0004173551.tif 000048
【図１０】
0004173551.tif 000049
【図１１】
0004173551.tif 000050
【図１２】
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