(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド抗原に存在する免疫原性Ｔ細胞ペプチド・エピトープを選択する方法において、結合モチーフとＭＨＣクラスＩ分子に結合するサイズを有する抗原の一次配列ペプチドを同定し、該同定ペプチドのＭＨＣクラスＩ分子への結合を測定することから成り、その際、該ペプチドとＭＨＣクラスＩ分子との複合体の安定性を、その表面に該ＭＨＣクラスＩ分子を担持する無傷な細胞上で測定することを特徴とする方法。
【請求項２】
該無傷な細胞がＢ細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該Ｂ細胞がヒトのＢ細胞であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
さらにペプチドを選択する工程を含み、それによって無傷な抗原中のペプチドとそれらの配列を、天然ポリペプチド配列のプロテアゾーム開裂規則に対応してスクリーニングすることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
さらにペプチドを選択する工程を含み、それによって無傷な抗原中のペプチドとそれらの配列を、ペプチドの搬送および／またはＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合規則に対応してスクリーニングすることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＭＨＣクラスＩ分子に、同定されたペプチドを結合するためのさらなる結合アッセイをさらに含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該さらなる結合アッセイは、抗原プロセシング欠損細胞系の表面においてエンプティＭＨＣクラスＩ分子に対する同定されたペプチドの結合を測定することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該プロセシング欠損細胞系がＴ２細胞系であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチド抗原の存在と関連した疾患の治療および／または予防のためのワクチンを製造するための方法において、請求項１〜８のいずれかに記載の方法によって前記ポリペプチド抗原のＴ細胞ペプチドエピトープを選択することと、選択されたペプチドエピトープを調製することと、前記ペプチドエピトープを投与に適したビークルと混合することとを含む方法。
【請求項１０】
アジュバントがワクチンに添加されることを特徴とする請求項９に記載のワクチンを製造するための方法。
【請求項１１】
ペプチドエピトープが合成ペプチドを含むことを特徴とする請求項９または１０に記載のワクチンを製造するための方法。
【請求項１２】
ワクチンが異なる合成ペプチドの混合物を含むことを特徴とする請求項１１に記載のワクチンを製造するための方法。
【請求項１３】
該合成ペプチドが樹枝状細胞上に結合されることを特徴とする請求項１１または１２に記載のワクチンを製造するための方法。
【請求項１４】
ペプチドエピトープが、一連のビーズ状立体配座で存在することを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載のワクチンを製造するための方法。
【請求項１５】
該ビーズ状エピトープがタンパク分解開裂部位を有することを特徴とする請求項１４に記載のワクチンを製造するための方法。
【請求項１６】
ペプチドエピトープが組換えタンパクの一部として与えられることを特徴とする請求項９または１０に記載のワクチンを製造するための方法。
【請求項１７】
組換えタンパクが一連のビーズ状配座を有し、該ビーズがペプチドエピトープであることを特徴とする請求項９に記載のワクチンを製造するための方法。
【請求項１８】
該一連のものがタンパク分解開裂部位を有することを特徴とする請求項１７に記載のワクチンを製造するための方法。
【請求項１９】
組換えタンパクが樹枝状細胞上に結合されることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれかに記載のワクチンを製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
§１．発明の分野
本発明は分子生物学および免疫学の分野に関する。本発明は特にワクチンおよびワクチンを調製する方法に関し、該ワクチンは哺乳動物、特にヒトに投与したときに免疫応答を誘引する。好ましい誘引免疫応答はＴ細胞応答であるが、これはペプチドＴ細胞エピトープにより誘引される。これらのワクチンはガンの治療またはエイズなどの感染症の予防または治療など多くの分野でその適用を見出している。本発明は未処理抗原からペプチド配列を選択する新規な方法を提供するものであり、該抗原は適当な媒介物を用いて投与すると適当な（Ｔ細胞）免疫応答を誘導するものである。該エピトープおよびワクチンは勿論本発明の一部でもある。
§２．発明の背景
事実、現在入手可能なワクチンは全て最少の必須エピトープおよび抗原のプロセシングないし提示の規則に関する詳細な知識に基づいて合理的に設計したものではない。むしろ、入手可能なワクチンは防御の経験的知識に基づいている。本発明の主要目的は、効果が高く、安全で、製造・標準化が容易で、安定であり、廉価で長期間の予防につながる新しい世代のより合理的に設計されたワクチンを開発することにある。本目的はペプチド・エピトープの選択において、一般の抗原プロセシングおよび提示、特に樹枝状細胞における生化学上の我々の知識を用いることにより達成される。次いで、選択したペプチド・エピトープを種々タイプのワクチンに組込み、たとえば、ＨＬＡ−形質転換マウス・モデルで効果を試験する。
本発明により抗原とＨＬＡクラスＩ分子との所与の組み合せに対してペプチド・エピトープの選択は、以下の引き続く工程に分割することができる。
１．抗原の一次配列内でペプチドをコンピューター予測する。該抗原はＭＨＣクラスＩが結合する関連モチーフと比較して、関与するＨＬＡクラスＩ分子に結合する可能性の最も高いものである（１；なお、数字は文献の番号を示す。以下、同様とする）。
２．選択したペプチドが関与するＭＨＣ分子に実際に結合するのを、ＨＬＡ−ペプチド結合およびＨＬＡ−ペプチド複合体の安定性を決定するアッセイ法を用いて測定する（２，３）（本明細書の実施例１および２）。
３．天然タンパク配列のプロテアゾーム開裂規則に対応した（工程１および２によって選択した）ペプチドおよび（未処理抗原の前後関係における）そのフランキング配列をスクリーニングする（４）。
４．有効タンパクの搬送およびＨＬＡクラスＩ分子への負荷規則に対応した（工程１および２によって選択した）ペプチドおよび（未処理抗原の前後関係における）そのフランキング配列をスクリーニングする（５）。
選択したペプチド・エピトープ（工程１〜４参照）を以下のプロトタイプ・ワクチンに組込み、その効果を適当なＨＬＡ形質転換マウス・モデルで比較する。
ｉ．アジュバント中の合成ペプチド混合物。
ii．樹枝状細胞に負荷した合成ペプチド混合物。
iii．大腸菌で合成し、精製した組換えタンパクであり、タンパク分解開裂部位により互いに分離している一連のビーズ状に配列したペプチド・エピトープからなる。アジュバントにて投与される。
iv．樹枝状細胞に負荷した組換えタンパク（iii．参照；マンノシル化）。
ｖ．タンパク分解開裂部位により分離されている一連のビーズ状ペプチド・エピトープをエンコードする組換えＤＮＡ構成物（裸のＤＮＡ）。
vi．タンパク分解開裂部位により分離されている一連のビーズ状ペプチド・エピトープをエンコードする組換えカナリア痘ウイルス。
vii．タンパク分解開裂部位により分離されている一連のビーズ状ペプチド・エピトープをエンコードする組換えヒト・アデノウイルス。
種々の予防接種プロトコールの効果をアッセイするが、その際、先ず免疫した動物の脾臓細胞混合リンパ球培養物において、関連ペプチドで負荷した自家ＬＰＳ−Ｂ細胞の芽球で再刺激し、次いで、合成ペプチドまたは天然加工処理エピトープを提示する標的細胞に対して、得られるＴ細胞の反応性を測定する。
このペプチド・エピトープはまた、ＨＬＡ−形質転換混合リンパ球培養物中でイン・ビトロで抗原特異Ｔ細胞活性を誘導するためにも使用する。その終末までに、選択したペプチドを同系のＬＰＳ−Ｂ細胞芽球または樹枝状細胞のいずれかに負荷する。これらの細胞を照射し、ＨＬＡ−形質転換マウスのナイロンウール通過脾臓細胞を有する刺激細胞として用いる。１週間ないし２週間のイン・ビトロ刺激の後、得られるＴ細胞集団の活性を、合成ペプチドまたは天然加工処理エピトープを提示する標的細胞に対して測定することができる。
ワクチンの合理的な設計は明らかな利点をもつ。安全性がその一つである。たとえば、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７に対するＤＮＡまたはウイルス・ベクター・ワクチンは、そのワクチンが機能的ガン遺伝子を含む場合には本質的に安全ではないが、もし該ＤＮＡまたはウイルスベクターが本発明の好ましい態様である一連のビーズ状エピトープをエンコードしているならば安全である。さらなる利点は効果とその容易性である。効果的に免疫する組成のみが関与する。無関係の配列は削除され、製造と標準化を容易にし、安定性を高め、コストを低減する。
効果的なＴ細胞エピトープ・ワクチンの設計は免疫性ペプチドの正確な選択により定まる。本発明（抗原提示細胞表面でのペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性を分析する方法）により、我々は選択手法を著しく改善した。さらに、我々はまた、ポリ−Ｔ細胞エピトープ含有ワクチンが強力な抗腫瘍および抗ウイルス免疫応答を誘導するための手法を有意に改善した。
このように本発明は、ポリペプチド抗原に存在する免疫原性Ｔ細胞ペプチド・エピトープを選択する方法であって、結合モチーフとＨＬＡクラスＩ分子に結合するサイズを有する抗原の一次配列ペプチドを同定し、該同定ペプチドのＭＨＣクラスＩ分子への結合を測定することから成り、その際、該ペプチドとＭＨＣクラスＩ分子との複合体の安定性を、その表面に該ＭＨＣクラスＩ分子を担持する未処理細胞上で測定することを特徴とする方法を提供する。さらに、本発明は同定したＴ細胞エピトープの新規適用法であって、多数のＴ細胞エピトープを一連のビーズ状構成物に組込むことから成り、そこで該Ｔ細胞エピトープは、好ましくは、効率的な処理工程と関与するＴ細胞エピトープの提示を確実にするスペーサー配列を介して互いに結合していることを特徴とする方法を提供する。
§３．発明の要約
生理的条件下でのＭＨＣに対するペプチド結合は、ＭＨＣ−ペプチド複合体の会合・解離の動的バランスにより支配される。ペプチドがＭＨＣ分子に結合する能力および得られるＭＨＣ−ペプチド複合体の経時的安定性の両方が、標的／刺激細胞の表面で一定のペプチド−ＭＨＣ複合体の量を決めることになり、それによってこの立体配位がＴリンパ球に応答して検出され得る見込みを決めることになる。数種のアッセイ法がヒトおよびマウスの免疫系に関係するこれらのパラメーターを測定することで設定されている。これらのアッセイ法はとりわけ種々のＨＬＡクラスＩ分子に関係するペプチド結合およびペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性を測定するのに適している。
ｉ．プロセシング欠損細胞系１７４ＣＥＭ．Ｔ２（Ｔ２）の表面でエンプティーＭＨＣクラスＩ ＭＨＣ分子にペプチドが結合するのを測定するＴ２−アッセイ法（２）。
ii．適当な細胞系から単離した可溶性クラスＩ ＭＨＣ分子にペプチドが結合するのを測定するアッセイ法（６）。
iii．これらのタンパクを過度に発現する大腸菌培養物から組換えタンパクとして単離した可溶性クラスＩ ＭＨＣ分子にペプチドが結合するのを測定するアッセイ法（７，８）。
iv．未処理ヒトＢ細胞上クラスＩ分子に結合する競合法に基づくＨＬＡクラスＩペプチド−結合アッセイ法（３）（本明細書実施例１）。
ｖ．未処理ヒトＢ細胞上クラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性を測定するＨＬＡクラスＩペプチド−結合アッセイ法（本発明主要目的。本明細書実施例２および３参照）。
本発明の重要な一態様において、後者のアッセイ法、すなわち、未処理ヒトＢ細胞上ＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性を測定する新規アッセイ法を提供する。生理的条件下でＭＨＣ分子に結合するペプチドの親和性は、ペプチド、ＭＨＣクラスＩ重鎖およびβ２−マイクログロブリンから成る３分子複合体の会合・解離の動的平衡である。現在では、一定のクラスＩ分子に対するペプチドの親和性は、細胞結合ＭＨＣクラスＩ分子または精製“無細胞”ＭＨＣクラスＩ分子のいずれかを用いるアッセイ法に基づいている。親和性はプロセシング欠損細胞の表面上でペプチドがＭＨＣクラスＩ分子を上方規制する相対能力により（２）、あるいは高親和性参照ペプチドとの競合能力により（３，９，１０）測定する。しかし、これらのアッセイ法では、短いインキュベーション時間、外来ペプチドの高濃度連続存在、または低温の故に生理的条件下でのペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性を殆ど考慮していない。最近、我々はより生理的条件下で存在するＭＨＣ−ペプチド複合体の経時的運命を測定した。以前のアッセイ系で測定したときの相当する結合親和性を示すペプチドは、ペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性に関して著しい差異を示した。さらに、ペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性は、結合親和性よりもペプチドの免疫原性とよりよく相関した（本特許出願の実施例２および３参照）。
免疫原性Ｔ細胞エピトープを提示する結合親和性の低い自己ペプチドの例は、以下のものから誘導されるペプチドである。ＭＡＲＴ−１（AAGIGILTV／ILTVILGVL）（１１）、Ｐｍｅ１１７／ｇｐ１００（YLEPGPVTA）（１２）、およびｐ５３（LLGRNSFEV）（１３）。これらのペプチドは古典的結合アッセイ法で得られた結果に基づき、この範疇に取り込んだ。しかし、関連のペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性を測定すると、これらの複合体の安定性がウイルス起源の既知エピトープの安定性に匹敵することが明らかとなった（本特許出願の実施例２および３参照）。それ故に、これらのペプチドはＭＨＣ分子に乗り掛かるのが幾分鈍いが、提示しているＭＨＣ分子に対する親和性が低いとみなすべきではない。この概念はペプチド結合親和性に加えて、ペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性が免疫原性ペプチド・エピトープの同定のための重要なパラメーターであることを確証する。ＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性は結合親和性よりもペプチドの免疫原性とよく相関するので、複合体の安定性を測定するアッセイ法は、一次アミノ酸配列から免疫原性ペプチドのエピトープを同定するの使用する手法の連鎖において重要な欠くことのできない新しい工程となる。
本発明の他の重要な態様は、組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）ベクターでの免疫処理により多様な予め選択されたＴ細胞エピトープに対するＴ細胞の反応性を誘導する革新的方法により提供される。該ｒＡｄベクターは一連のビーズ状様式で多様性Ｔ細胞エピトープを含み、該Ｔ細胞エピトープはタンパク分解性開裂部位により互いに結合しているものである。Ｔ細胞エピトープがスペーサー配列により結合していることは、該Ｔ細胞エピトープが効果的にプロセシングを受け、Ｔ細胞に提示されていることを保証している。それ故、リンカー配列により多様性Ｔ細胞エピトープを、好ましくは組換えアデノベクターに組込むことは、多様性Ｔ細胞標的に向けた強い抗ウイルスおよび抗腫瘍Ｔ細胞免疫性を誘導するための重要で強力な新規アプローチである。
§４．発明の詳細な説明
ここに我々はヒトＢ細胞系の表面におけるペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性を測定するアッセイ法について記載する。このアッセイ法は免疫原性ペプチド・エピトープを同定するのに用いるが、その方法は合理的なワクチン設計への道に進む主要工程を構成する。ここに記載するこの新しい方法論は未処理ヒトＢ細胞に結合するペプチドを測定する結合アッセイに基づいている。それ故、このアッセイ法は次項に別に記載する（§４．１）。この結合アッセイは以前に刊行されている。安定性のアッセイは革新的な工程の組み合せを利用するものであって、次々項（§４．２）に記載する。数種の予め選択されたＴ細胞エピトープをエンコードするｒＡｄ含有一連ビーズ状構成物を用いる予防接種戦略について記載した特許出願の部分を§４．５に提示する。
§４．１  未処理ヒトＢ細胞上クラスＩ分子への競合的結合に基づくＨＬＡクラスＩペプチド結合アッセイ
ペプチド結合アッセイには細胞結合ＭＨＣクラスＩ分子（２，３）または精製“無細胞”ＭＨＣクラスＩ分子（６）のいずれかを使用する。細胞結合ＭＨＣクラスＩ分子によるアッセイは、ＭＨＣクラスＩ立体配座特異抗体により検出されるＭＨＣクラスＩ分子（３）の上方規制（２）または再構成に基づいている。無細胞系は定量系であり、標識参照ペプチドが設定した競合系（６）で結合する精製ＭＨＣ分子を使用する。しかし、ＭＨＣクラスＩ分子の精製は煩雑であり、精製または貯蔵の間に立体配座の変化が起こる可能性がある。種々のＨＬＡクラスＩ分子に結合するペプチドを同定するために我々が使用するペプチド結合アッセイでは、ＨＬＡホモ接合Ｂ細胞系上ＨＬＡクラスＩ分子に結合する蛍光標識参照ペプチドを利用する。その際、結合したペプチドは緩和な酸処理により除去してある。ペプチド結合アッセイにおいて手段として未処理ヒトＢ細胞を使用することは、幾つかの明らかな利点を有する。
*  ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞が高級な（＝高価な）組織培養培地または成長因子を使用せずに容易に高個数にまで生育可能である。
*  ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞は高レベルのクラスＩＭＨＣを発現する。このような高発現レベルに到達させるのにＩＦＮγなどのリンホカインでの処理は必要ない。
*  緩和な酸処理Ｂ細胞が容易に調製される。すなわち、培養物からＢ細胞を採取し、平均的アッセイに必要な量のストリップトＢ細胞が使用３０分内に準備できる。
*  クラスＩＭＨＣ分子の種々組合わせを発現するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞系の殆ど無限のレパートリーが世界中の多くの研究所で入手可能である。
*  必要な場合、新しいＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系が一月以内に容易に作製し得る。ヒトＢ細胞のＥＢＶ形質転換は世界中の多くの研究所で日常的に実施される非常に簡単な手技である。
蛍光標識ペプチドがこれらのペプチド−ストリップトＨＬＡクラスＩ分子に結合するのは特異的であり、ペプチドの結合能を準定量的に定量し得る。これらのペプチド−ストリップトＨＬＡクラスＩ分子に結合するペプチドの動力学は、可溶性ＨＬＡクラスＩ分子のものに相応し、新しいＨＬＡクラスＩ分子の生合成からは独立している。このアッセイは最適化されており、ＨＬＡ−Ａ*０１０１、ＨＬＡ−Ａ*０２０１、ＨＬＡ−Ａ*０３０１、ＨＬＡ−Ａ*１１０１またはＨＬＡ−Ａ*２４０１のいずれかに結合することが知られているペプチドで確認している（３，６）（我々の未公開追加データ）。さらに、このアッセイは、とりわけＨＩＶ−１ポリメラーゼから誘導した潜在的ＨＬＡ−Ａ０３０１−制限・保存ＣＴＬエピトープの同定に適用された（３）。
実施例１
未処理ヒトＢ細胞上ＨＬＡ−Ａ０２０１およびＡ０３０１を用いるペプチド結合アッセイの確認（（３）からの改変）
材料と方法
細胞系
競合アッセイに用いるＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系（Ｂ−ＬＣＬ）はＪＹ（ＨＬＡタイプ、Ａ*０２０１、Ｂ７，Ｃｗ７、ＤＲ４、ＤＲｗ６、ＤＰｗ２）およびＥＫＲ（ＨＬＡタイプ、Ａ３、Ｂ７、ＤＲ７、ＤＱｗ２）である。参照ペプチドの特異結合を確認するのに用いるＢ−ＬＣＬはＢ１０９，ＢＲＭ，Ｄ１００，Ｄ１１０，Ｋ９７，ＭＬ，ＮＬ，Ｐ９８，Ｓ５９およびＳ９９である。これら細胞系のＨＬＡタイプは図１に示してある。
ペプチド
蛍光（ＦＬ）標識参照ペプチドはＣｙｓ−誘導体として合成した。標識は４−（ヨードアセトアミド）フルオレセイン（フルカ・ヘミー・アーゲー、ブッシュ、スイス）を用い、ｐＨ７．５（リン酸ナトリウム水溶液／アセトニトリル、１：１）で実施した。標識したペプチドをセファデックスＧ−１０で脱塩し、さらにＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。標識ペプチドをＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ラサーマット、フィンニガン、英国）で特性化した。ＨＬＡ−Ａ*０３０１の結合に用いた参照ペプチドはKVFPC（FL）ALINK（ＭＨ+計算値＝１５２１．８、ＭＨ+測定値＝１５２１．４）であり、ＨＬＡ−Ａ*０２０１に対する参照ペプチドはFLPSDC（FL）FPSV（ＭＨ+計算値＝１５００．６、ＭＨ+測定値＝１５００．１）であった。
ＨＬＡ−Ａ*０３０１またはＨＬＡ−Ａ*０２０１に対する結合に用いる参照ペプチドはセッテ（Sette）らが報文化している（１４）。両ペプチドにおいてこれらの研究者は、チロシンを導入して、放射活性ラベルをペプチドに付加するのに使用した。我々はこのチロシンをシステインに置き換えた。システインは４−（ヨードアセトアミド）フルオレセインの結合を可能にした。
１４種の異なる完全配列ＨＩＶ−１ウイルス株のポリメラーゼアミノ酸配列、すなわち、ＬＡＩ，ＭＮ，ＮＬ４３，ＯＹＩ，ＳＦ２，ＲＦ，ＭＡＬ，Ｄ３１，ＣＡＭ１，ＨＡＮ，ＥＬＩ，ＮＤＫ，ＪＲＣＳＦおよびＪＲＦＬ（１５）につき、スコアシステムを用いて実施可能なＨＬＡ−Ａ*０３０１制限ＣＴＬエピトープに対してスクリーニングした（１）。用いたＨＬＡ−Ａ*０３０１モチーフはクボら（１６）およびインゲルハード（１７）の研究に基づいた。２位のアンカーはＬ、Ｉ，ＶまたはＭが、またＣ−末端アンカーはＫ，ＲまたはＹが好ましいものであった。ペプチドは両方のアンカー位置に所定の残基をもつように合成し、１４種のＨＩＶ−１株全てに完全に保持するようにした。
ペプチドはＦｍｏｃ化学による自動多種ペプチド合成機（アビメッドＡＭＳ４２２、ランゲンフェルド、ドイツ）を用い、固相法により合成した。ペプチドを逆相ＨＰＬＣで分析し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２０μｌに溶解し、０．９％ＮａＣｌ中ペプチド濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、使用時まで−２０℃に保存した。
Ｂ−ＬＣＬの緩和な酸処理
Ｂ−ＬＣＬ上のＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３の緩和な酸処理はストーカスら（１９）の手法のブレマーズ改良法（１８）に従い実施した。簡単に言えば、細胞をＰＢＳで２度洗浄し、氷上に５分間放置した。次いで、細胞を氷冷クエン酸−Na2HPO4バッファー（０．２３Ｍクエン酸と０．１２３Ｍ Na2HPO4の等容量混合物）で９０秒間処理した（２０）。ＨＬＡ−Ａ３に対してバッファーをｐＨ＝２．９に、またＨＬＡ−Ａ２に対してはｐＨ＝３．２に調整した。これらのｐＨの差は結合したペプチドの最適溶出にとって、また外部より添加したペプチドとＭＨＣクラスＩ分子の再構成にとって必須である（１８）。その直後に、溶出した細胞を冷却ＩＳＣＯＶＥの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で緩衝化し、ＩＭＤＭで洗浄し、ＩＭＤＭ＋１．５Ｕｇ／ｍｌ β２ｍ（シグマ、セントルイス、米国）中に７００，０００細胞／ｍｌで再懸濁した。
ペプチド競合アッセイ
競合アッセイのために、ＦＬ−標識参照ペプチド２５μｌ（終末濃度、ＰＢＳ中１５０ｎＭ）を９６穴Ｕ型底プレート（コースター、ケンブリッジ、マサチュウセッツ、米国）中、競合ペプチド２５μｌ（ＰＢＳ中異なる終末濃度）と培養した。緩和な酸処理Ｂ−ＬＣＬ（Ａ２：ＪＹ，Ａ３：ＥＫＲ）１００μｌをこれらのウエルに加えた。
混合物を３時間または２４時間、４℃または２６℃で培養し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＰＢＡ１％）で２度洗浄し、０．５％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＡ１％中に再懸濁し、ＦＡＣスキャン（ベクトン−ディッキンソン、エッテン−ルール、オランダ）で分析した。
競合ペプチド不存在での実験で得られた平均蛍光（ＭＦ）値を最大結合とみなし、０％阻害に等しいとした。参照ペプチド不存在での実験で得られたＭＦ値は１００％阻害に等しいとした。
結合の阻害率％は以下の式を用いて計算した。
（１−（ＭＦ １５０ｎＭ参照および競合ペプチド−ＭＦ参照ペプチド不在）−（ＭＦ １５０ｎＭ参照−ＭＦ参照ペプチド不存在））ｘ １００％
競合ペプチドを加えなかった実験では、蛍光指標（ＦＩ）を計算して、バックグランド（参照ペプチドなし）を超える蛍光がどの程度かを測定した。ＦＩ＝（ＭＦ試料−ＭＦバックグランド）／ＭＦバックグランド。
Ｂ−ＬＣＬでのタンパク合成を阻止するために、以前に示したように（２０）１００μＭエメチン（シグマ、セントルイス、米国）最終濃度を用いた。
結  果
ＦＬ標識参照ペプチドがＨＬＡクラスＩに結合する感度および特異性
ＨＬＡ−Ａ*０２０１およびＨＬＡ−Ａ*０３０１に結合する参照ペプチドが、セッテら（１４）の分子結合アッセイに記載され、使用されている。両方のペプチドにおいて、チロシンを用い、放射活性標識をペプチドに付加した。我々はこのチロシンをシステインに置き換え、４−（ヨードアセトアミド）フルオレセインを結合させた。
競合アッセイに必要な蛍光ペプチド量を設定した。この目的のためにペプチドの滴定を実施した。２６℃で３時間培養した後、平均蛍光（ＭＦ）を測定した。２ｎＭから１００ｎＭの濃度でＨＬＡ−Ａ*０２０１参照ペプチドに対しＭＦの急激な上昇を認め、ＨＬＡ−Ａ*０３０１参照ペプチドに対しては２ｎＭから１５０ｎＭでそれを認めた（データ図示せず）。ＦＬ標識参照ペプチドで培養する前にＢ細胞を緩和に酸処理すると、低ペプチド濃度でより高い蛍光極限値となり、またＭＦのより急激な上昇に至った（図７）。
用いた細胞系の表面で、他のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を含む細胞組成に特異的ペプチド結合が起こるか否かを検討するために、１０種類の異なるＢ−ＬＣＬ細胞系を０または１５０ｎＭのＦＬ標識参照ペプチド（ＨＬＡ−Ａ*０２０１またはＨＬＡ−Ａ*０３０１のいずれか）と培養した。各細胞系に対するＦＩを計算し、参照細胞系ＪＹ（ペプチドがＨＬＡ−Ａ*０２０１に結合）およびＥＫＲ（ペプチドがＨＬＡ−Ａ*０３０１に結合）について得られたＦＩを１００％結合に等しいとした。ＦＬ標識参照ペプチドが１０種の異なる細胞系に結合するのをＦＬ標識参照ペプチドのＪＹまたはＥＫＲへの結合と関係づけるために、相対的ペプチド結合率（パーセント）を決定した。ＦＬ標識参照ペプチドが各細胞系に結合する相対的ペプチド結合率を以下のように計算した。（ＦＩ細胞系／ＦＩ参照細胞系）ｘ１００％。両方のＦＬ標識参照ペプチドに対して、他の細胞組成への非特異的結合は、競合アッセイに用いた細胞系について、２０％を超えることがなかった（図６）。また、ＨＬＡ−Ａ*０３０１のペプチド結合モチーフがＨＬＡ−Ａ１１の結合モチーフによく似ているために（１６）、ＨＬＡ−Ａ*０３０１のＦＬ標識参照ペプチドが、この対立遺伝子を発現するＢ−ＬＣＬ細胞系に結合するのを観察した（図６）。細胞系ＮＬはＨＬＡ−Ａ*０３０１のＦＬ標識参照ペプチドに結合する。それはＨＬＡ−Ａ２８対立遺伝子を発現し、その二つのサブタイプ、ＨＬＡ−Ａｗ６８０１およびＨＬＡ−Ａｗ６８０３はそのペプチド結合モチーフをＨＬＡ−Ａ*０３０１と共有している［エイ・セッテ、個人的情報交換］。
緩和酸処理ＨＬＡクラスＩ分子へのペプチド結合動力学
異なる温度でのペプチド結合の影響を研究するために、ＥＫＲ細胞を溶出し、異なる時間、それぞれ４℃、２６℃または３７℃でＦＬ標識ペプチドと培養した。４℃ではペプチドが当初急速に結合し、次いでやがて着実に増大していく（図７）。２６℃でのペプチド結合はもっと速い（図７）。２６℃で２６時間後に結合したペプチド量は、４℃で結合したペプチド量と違わなかった。ペプチドは３７℃で急速に結合するが、より長時間培養しても結合ペプチドの増加は見られなかった（図７）。３７℃で結合ペプチドの増加が欠如しているのは恐らく二つの現象による。ペプチドの結合しない細胞表面に存在するＨＬＡクラスＩ分子はこの温度で脱統合する。第二に、４℃で培養したときのペプチドの解離に比較して、３７℃でのペプチドの解離が劇的に速いことである（２２）。
緩和酸処理ＨＬＡクラスＩ分子への結合はドウノボ（de novo）タンパク合成に依存しない
細胞関連緩和酸処理ＨＬＡ分子とペプチドの相互作用を特徴づけるために、ペプチド−ストリップトＥＫＲ細胞をＦＬ標識ペプチドと、異なる時間、４℃または２６℃で培養した。図７に示すように、細胞の４℃での蛍光標識化が早晩着実に増大する。溶出に先立ちタンパク合成阻害剤エメチン１００μＭを１時間使用すると２６℃では結合したペプチドの量が減少するが、４℃では減少しない（図７）。
このように、タンパク合成阻害剤の使用はペプチドが４℃で緩和な酸処理ＨＬＡクラスＩ分子に結合するのに影響しなかった。代謝経路は４℃で低下するので、ペプチドが溶出したＨＬＡクラスＩ分子に結合するのは、細胞の外面にすでに存在するＨＬＡクラスＩ分子の利用可能性に依存しているだけである。
競合アッセイ
ＦＬ標識参照ペプチドの濃度に対してＭＦをプロットすると、対数型（log-shaped）曲線となる。我々は全ての競合実験において、標準濃度としてＦＬ標識参照ペプチド１５０ｎＭを選んだ。１５０ｎＭのＦＬ標識参照ペプチドを使用するとＭＦがバックグランドの約４〜５倍となった（図示せず）。非標識参照ペプチドを１５０ｎＭのＦＬ標識参照ペプチドに滴定し、阻害率（パーセント）を計算して非標識ペプチドの濃度に対してプロットした（図５）。４℃での２４時間の競合アッセイにおいて、非標識ＨＬＡ−Ａ*０２０１またはＨＬＡ−Ａ*０３０１参照ペプチドは、ＦＬ標識ペプチドの結合を５０％阻害するのに（ＩＣ50）、ＦＬ標識参照ペプチドの使用濃度の約３〜５倍（それぞれ０．４μＭおよび０．７μＭ）を必要とした（表１）。
最適実験条件を決め、そのアッセイを確認するために、我々はＨＬＡ−Ａ*０２０１またはＨＬＡ−Ａ*０３０１に対し既知の結合性を有するＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７タンパク（６、１０）から誘導したペプチドを異なる濃度で３時間または２４時間、４℃または２６℃で試験した（表１）。細胞を２４時間培養したとき、ペプチドの必要量は少なかった（表１）。細胞を４℃で２４時間培養したとき、競合ペプチドの必要量は最低であった（表１）。４℃では２４時間または４８時間の培養時間の間に差を認めなかった（図示せず）。これは試験が平衡に達したときに、より感度が高いことを意味している。ＦＬ標識参照ペプチドの会合が速いために、短いインキュベーションではＩＣ50に到達するまでにより多くの競合ペプチドを必要とする。ＩＣ50に至るペプチドのランキングを示すと、細胞を４℃で２４時間培養すると、その順序は分子結合アッセイを用いカストら（６）により見出された順序に相応する（表１）。記載されたような結合モチーフをもつペプチド全てが低い結合親和性を示した。これらの結果とエメチン処理細胞上のＨＬＡクラスＩ分子へのペプチド結合の結果を一緒にして、我々は競合アッセイを最良に実施するには、４℃で少なくとも２４時間の培養時間であればよいと結論する。
既知ＣＴＬエピトープでの競合
プール配列決定を経て同定した５種のＨＬＡ−Ａ*０２０１制限ＣＴＬエピトープ、１種のＨＬＡ−Ａ*０３０１制限ＣＴＬエピトープおよび２種のＨＬＡ−Ａ*０３０１ペプチドを高親和性結合ペプチドのＩＣ50値を決めるのに用いた。ＨＬＡ−Ａ*０２０１に対する結合を試験した５種のペプチドは全てＩＣ50≦１．７μＭで非常によく競合した（表２）。ＨＩＶから誘導した既知ＨＬＡ−Ａ*０３０１制限ＣＴＬエピトープを試験した。ＨＩＶ−ｎｅｆから誘導したこのペプチドは０．５μＭのＩＣ50で結合した。プール配列決定により同定した２種のペプチドはＩＣ50≦１５μＭで結合した（表２）。それ故、我々はＩＣ50≦５μＭで競合するペプチドを潜在的ＣＴＬエピトープと考えねばならない。
ＨＬＡ−Ａ*０３０１に対する保存ＨＩＶ−１ｐｏｌ配例の結合
長さ８〜１１アミノ酸から成る２０種のペプチドをＨＬＡ−Ａ*０３０１結合モチーフ、および異なるＨＩＶ−１株のポリメラーゼ遺伝子産物におけるそれらの保存に基づき選択した。このペプチドを４℃で２４時間競合アッセイにより試験した。９種のペプチドがＨＬＡ−Ａ*０３０１に結合することが判った。４種のペプチドが中程度の親和性で結合し、ＩＣ50≦５μＭで競合した（表３）。他の５種のペプチド（星印*でマーク）は高い親和性で結合し、ＩＣ50≦３．０μＭで競合した。既知ＣＴＬエピトープで得られたＩＣ50を考慮して、特にこれら５種のペプチドをＣＴＬエピトープの候補としてもよい。
コメント
これらの結果の広範な検討については（３）を参照されたい。この実施例が示すのは、このアッセイがＨＬＡ−Ａ*０２０１またはＨＬＡ−Ａ*０３０１のいずれかに対する既知結合能力をもつペプチドに関してうまく働くことである。このアッセイにおいて結合するペプチドの動力学は、可溶性ＨＬＡクラスＩ分子を用いるアッセイの動力学に匹敵するものであることを示した。さらに、ＨＩＶ−１ポリメラーゼから誘導される潜在ＨＬＡ−Ａ*０３０１制限ＣＴＬエピトープの探査にこのアッセイを適用した結果、５種の高親和性結合ペプチドが同定された。このアッセイではＨＬＡクラスＩ分子を精製する必要がなく、あるいは細胞をＨＬＡクラスＩ分子を移入する必要がなく、また放射活性標識を用いないので、実施が容易である。さらに、膨大な一連のＨＬＡ分子に対するペプチド結合の手段として、ＨＬＡタイプ・ヒトＢ細胞系の大きなパネルが利用可能である。現在、この系はＨＬＡ−Ａ*０１０１およびＨＬＡ−Ｂ７に結合するペプチドの同定にも成功裏に使用されている。
実施例１の図に関する説明
図１．ＦＬ標識参照ペプチドの特異性
参照細胞系ＥＫＲ（ＨＬＡ−Ａ*０３０１）をｐＨ＝２．９で緩和酸処理した。参照細胞系ＪＹ（ＨＬＡ−Ａ*０２０１）をｐＨ＝３．２で緩和酸処理した。１０種の異なる他のＢ−ＬＣＬ細胞系は、ＨＬＡ−Ａ*０３０１ ＦＬ標識参照ペプチドとのインキュベーションに付す場合にはｐＨ＝２．９で緩和酸処理し、またＨＬＡ−Ａ*０２０１ ＦＬ標識参照ペプチドと培養する場合にはｐＨ＝３．２で緩和酸処理した。ＥＫＲ細胞を１５０ｎＭのＨＬＡ−Ａ*０３０１ ＦＬ標識参照ペプチドと培養し（白抜き棒）、ＪＹ細胞は１５０ｎＭのＨＬＡ−Ａ*０２０１ ＦＬ標識参照ペプチドと培養し（斜線棒）、また他の１０種の異なる他のＢ−ＬＣＬ細胞系は１５０ｎＭのＨＬＡ−Ａ*０３０１（白抜き棒）またはＨＬＡ−Ａ*０２０１ＦＬ標識参照ペプチド（斜線棒）と、それぞれ２６℃で４時間培養した。蛍光指標（ＦＩ）を各細胞系につき計算し、ＥＫＲに結合したＦＬ標識参照ペプチド（ＨＬＡ−Ａ*０３０１に対する結合）のＦＩおよびＪＹに結合したＦＬ標識参照ペプチド（ＨＬＡ−Ａ*０２０１に対する結合）のＦＩを１００％結合に等しいとした。式（ＦＩ細胞系／ＦＩ参照細胞系）ｘ１００％により、１０種の異なるＢ−ＬＣＬ細胞系の相対ペプチド結合率（パーセント）を計算した。上部左側は参照細胞系の完全ＨＬＡタイプを他の細胞系の重複ＨＬＡタイプと共に示す。下部左側は１０種全てのＢ−ＬＣＬ細胞系をその完全ＨＬＡタイプと共に示す。
図２．溶出対非溶出ＨＬＡクラスＩ分子上に結合するペプチド
ＪＹ細胞（黒シンボル）およびそのＨＬＡクラスＩ分子を緩和酸処理したＪＹ細胞（白シンボル）を増量（ｎＭ）したＨＬＡ−Ａ*０２０１ ＦＬ標識ペプチドと培養した。細胞を２６℃で３時間培養し、洗浄、平均蛍光（ｍＦ）をＦＡＣＳｃａｎで測定した。各曲線はＦＬ標識参照ペプチドの濃度に対するｍＦの対数回帰分析の結果を示す。
図３．緩和酸処理ＨＬＡクラスＩ分子に結合するペプチドの動力学
ＥＫＲ細胞を緩和酸処理し、１５０ｎＭのＨＬＡ−Ａ*０３０１ ＦＬ標識参照ペプチドと、異なる時間、４℃（三角）、２６℃（白四角）または３７℃（黒四角）で培養した。１０、２０、４０、９０、１８０および３６０分にＦＬ標識ペプチドの結合を測定した。結合は蛍光指標（ＦＩ）として示してある。４℃および２６℃に対して示した曲線は直線回帰または対数回帰分析の結果である。
図４．タンパク合成阻害剤処理細胞へのＦＬ標識ペプチドの結合
ＥＫＲ細胞を緩和酸処理に先立って１時間１０-4Ｍのエメチン処理（白抜き棒）または未処理（斜線棒）した。１５０ｎＭのＨＬＡ−Ａ*０３０１ＦＬ標識参照ペプチドを加え、インキュベーションの１、３または４．５時間目に結合をモニターした。細胞を２６℃または４℃で培養した。
図５．非標識参照ペプチドとＦＬ標識参照ペプチドとの競合
ＥＫＲ細胞（左）またはＪＹ細胞（右）を１５０ｎＭのＦＬ標識参照ペプチド、すなわち、ｋｖｆｐＣ（ＦＬ）ａｌｉｎｋまたはｆｌｐｓｄＣ（ＦＬ）ｆｐｓｖ、および増量（μＭ）の非標識参照ペプチドとをそれぞれ培養した。結合阻害を計算し、使用した非標識参照ペプチドの量の関係を示した。
§４．２未処理ヒトＢ細胞表面でのペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性を測定するＨＬＡクラスＩペプチド結合アッセイ
平衡にあるＭＨＣ分子に対するペプチドの結合親和性は、ペプチド、ＭＨＣクラスＩ分子およびβ２ｍから成る３分子複合体の連続した会合・解離の結果である。ＭＨＣクラスＩに結合したペプチドの解離速度は競合するペプチドの存在によっても（２３）あるいは競合するペプチドの濃度によって（２４）も影響されない。他方、遊離ＭＨＣペプチド結合部位の量はそれまでに結合したペプチドの解離速度により影響を受け、制限される（２４）。このように、解離速度の低いペプチドはＥＲにおいて安定なＭＨＣ−ペプチド複合体を形成し、細胞表面に移行し、Ｔ細胞の認識を可能にするに十分な時間そこに存在する。
ペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性と免疫原性との間の相関関係を検討するために、我々は一群のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドの解離速度を決めた。このアッセイ法は未処理ＨＬＡ−ホモ接合Ｂ細胞表面でのペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性を測定する。一方で免疫原性とペプチド結合親和性との間の相関を比較し、他方では免疫原性とＭＨＣクラスＩ分子からのペプチドの解離速度との間の相関を比較すると、免疫原性はペプチド結合親和性とよりも解離速度とよりよく相関することを示した。
この複合体−安定性アッセイは未処理ヒトＢ細胞を使用するので、ペプチド結合親和性アッセイについて記載した利点を共有する（§４．１参照）。
実施例２
ＭＨＣクラスＩＭＨＣ分子に結合したペプチドの免疫原性はＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性とよく相関する。
材料と方法
細胞系
ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系、ＪＹ（ＨＬＡタイプ：Ａ*０２０１、Ｂ７，Ｃｗ７，ＤＲ４，ＤＲｗ６，ＤＰｗ２）を、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０ダッチ改変（ギブコＢＲＬ，ペスレイ、スコットランド）、抗生物質（１００ＩＵ／ｍｌペニシリン（ブロカーデス・ファーマ、ライデルドープ、オランダ）および１００ｕｇ／ｍｌカナマイシン（シグマ、セントルイス、ミズーリ、米国））、および２０μＭ ２−ＭＥ（メルク、ダルムシュタット、ドイツ）から成る完全培地中、５％ＣＯ2含有湿潤空気中、３７℃で培養した。
ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ａ*０２０１Ｋb細胞はヒトＴ細胞白血病細胞系、ジャーカットの安定なトランスフェクタントであり、ＨＬＡ−Ａ*０２０１Ｋbキメラ遺伝子の産物を発現する（２５）。それらは２００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８硫酸塩の存在下完全培地中で培養する。
ペプチド
ペプチドはＦｍｏｃ化学による自動多種ペプチド合成機（アビメッドＡＭＳ４２２、ランゲンフェルド、ドイツ）を用い、固相法により合成した。ペプチドを逆相ＨＰＬＣで分析し、ＤＭＳＯ ２０μｌに溶解し、０．９％ＮａＣｌ中ペプチド濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、使用時まで−２０℃に保存した。
競合に基づくＨＬＡクラスＩ結合アッセイに使用する蛍光（ＦＬ）標識ペプチドを合成し、標識化し、前記同様に特徴づけた（３）。ＨＬＡ−Ａ*０２０１に用いる参照ペプチドの配列はFＬＰＳＤＹＦＰＳＶ（１４）であったが、ここで我々は蛍光基を付加してＦＬＰＳＤＣ（ＦＬ）ＦＰＳＶで示されるペプチドとするためにチロシンをシステインに置換えた（３）。
形質転換マウス
ＨＬＡ−Ａ*０２０１Ｋb形質転換マウスはエル・シャーマン博士が親切に世話して下さった（スクリップ・ラボラトリーズ、サンディエゴ、米国）（動物供給業者ハーラン・スプラグ・ドーリー、インク、インディアナポリス、米国、経由）。マウスは清潔な常用条件下に飼育した。形質転換マウスはＨＬＡ−Ａ*０２０１Ｋbキメラ遺伝子の産物を発現し、該遺伝子では重鎖のａ３ドメインを対応するマウスＨ−２Ｋbドメインと置換え、ＨＬＡ−Ａ*０２０１ａｌおよび２ａドメインはそのままに残す（２５）。これはマウスＣＤ８＋Ｔ細胞上のマウスＣＤ８分子が、ハイブリッドＭＨＣクラスＩ分子の同系ａ３ドメインと相互に作用するのを可能とする。
イン・ビボ免疫処理およびマウスＴ細胞培養
数群の３−６ＨＬＡ−Ａ*０２０１Ｋb形質転換マウスの尾部付け根に１４０ｕｇのＨ−２ Ｉ−Ａb−制限ＨＢＶコア抗原誘導Ｔヘルパー・エピトープ（１２８〜１４０、配列TPPAYRPPNAPIL）の存在下、ＩＦＡに懸濁した１００ｕｇのペプチドを皮下注射した（２６）。１１日後、マウスを犠牲とし、Ｔ２５フラスコ（ファルコン、ニュージャーシー、米国）中で、脾臓細胞（１０ｍｌ中３０ｘ１０6細胞）を同系の照射ＬＰＳ刺激Ｂ細胞リンパ芽球（３：１比）および完全培地中１ｕｇ／ｍｌのペプチドでイン・ビトロ再刺激した。培養６日目にこれらバルクの細胞毒性を標準５時間51クロム（51Ｃｒ）遊離アッセイにより試験した。
51Ｃｒ細胞毒性アッセイ
ＣＴＬ活性を以前に記載されているように（２７）、標準クロム遊離アッセイにより測定した。標的細胞を３７℃３０分間１０ｕｇ／ｍｌのペプチドで感作した。標的細胞を９６穴Ｕ型底マイクロタイタープレート中で、最終容量１００μｌの完全培地中多数のエフェクター細胞に加えた。３７℃、５時間のインキュベーションの後、上清を採取した。各３個のウエルの平均特異溶解率（パーセント）を以下のように計算した。特異溶解％＝（（実験遊離−自然遊離）／（最大遊離−自然遊離））ｘ１００。
特異溶解率はＬＵ３０％／１０6細胞で発現され、１ ＬＵ３０％は５時間のアッセイにおいて、２０００ジャーカットＡ*０２０１／Ｋb標的細胞から51Ｃｒの遊離を３０％誘発するのに必要なエフェクター細胞の数に相当する。
緩和酸処理によるペプチド‘ストリッピング’および競合に基づくＨＬＡクラスＩペプチド結合アッセイ
実施例１参照
３７℃におけるＭＨＣ−ペプチド複合体の測定
１，０００，０００〜２，０００，０００細胞／ｍｌ濃度のＪＹ細胞を１０-4Ｍエメチン（シグマ、セントルイス、米国）と３７℃１時間培養し、タンパク合成を止め、その結果、細胞表面のドウノボ合成クラスＩ分子の出現を止めた（２０）。細胞をＰＢＳおよびペプチド−ストリップトで２度洗浄した（上記参照）。１，０００，０００個の細胞を２００ｕｇ／ｍｌのペプチドに加え、室温で１時間培養した。細胞を氷冷ＩＭＤＭで２度洗浄し、１ｍｌのＩＭＤＭに再懸濁した。次いで、細胞を３７℃で０、２、４および６時間培養し、その後、ＢＢ７．２，ＨＬＡ−Ａ２立体配座特異モノクローナル抗体（２８）およびＧａＭ／ＦＩＴＣで染色した。その後、該細胞を０．５％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＡ１％に再懸濁し、固定化した。細胞をＦＡＣｓｃａｎで分析した。蛍光指標（ＦＩ）をＦＩ＝（平均蛍光試料−平均蛍光バックグランド）／平均蛍光バックグランド（ペプチド不存在）として計算した。試料を二重に試験したが、両試料間の変動は常に１０％を下回った。
残余のＨＬＡ−Ａ２分子のパーセンテージを各ペプチドに対し、ｔ＝０ないし１００％のＦＩに等値化することにより算出した。その際、式：残余％＝（ＦＩt=n／ＦＩt=0）ｘ１００％を使用した。ＭＨＣからペプチドが解離するのは直線過程なので、ペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性は、分子の５０％が崩壊するのに必要な時間（ＤＴ５０％）として測定した。我々は出発点として３７℃でｔ＝２時間を用いている。その理由はこの時点からのみＤＴ５０％が安定なペプチド−ＭＨＣ複合体を形成できるペプチドから決められるからである。
統  計
２×２分割表によるフイッシャー検定（フィッシャーの精密２−末尾検定）を用い、３７℃でのペプチドの解離速度（ＤＴ５０％）を該ペプチドの免疫原性と相関した。結合親和性は比較的少数のペプチドであったためカイ２乗検定を用いて免疫原性を相関させることはできなかった。それ故、我々は２ｘ２分割表によるフィッシャー検定を用い、親和性と免疫原性との間に強い相関を確立するために高親和性結合ペプチドと低親和性結合ペプチドとを比較した。
結  果
ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウスにおいて既知結合親和性と免疫原性を有するＨＢＶまたはＨＰＶ１６誘導ペプチドと複合体を形成したＭＨＣクラス−Ｉ分子の安定性
ＭＨＣクラス−Ｉ分子に結合したペプチドの解離とそれらのＣＴＬ応答を誘発する能力との間の相関を研究するために、我々はＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）から誘導した９種のペプチドおよびＨＰＶ１６の８種のペプチドを用いた。なお、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウスにおけるＨＰＶ１６の相対結合親和性および免疫原性はすでに報告されている（６，１０，２９）。１７種のペプチド全てが実際にＨＬＡ−Ａ*０２０１に結合することを示すために、我々はＨＬＡ−クラスＩ結合アッセイ（３）に基づく以前記載の競合法によりその親和性を試験した。ＨＢＶｐｏｌ−６３５，ＨＰＶ１６Ｅ７−１１およびＨＰＶ１６Ｅ７−８６が比較的高い親和性（＜５μＭ）をもって結合した。１４種のペプチドが中程度親和性（５μＭと１５μＭとの間）または低親和性（＞１５μＭ、表Ｉ）で結合した。ペプチドの結合親和性を測定し、そのペプチドの結合親和性を高い、中程度および低いに分類すると、セッテら（１０）およびカストら（６）の親和性と分類に相応する。
立体配座特異的抗ＨＬＡ−Ａ２抗体の使用に続いて、残余のＨＬＡ−Ａ*０２０１ペプチド複合体の量を経時的にモニターした。細胞表面のペプチド安定化ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子の欠損は、ペプチドが結合しているクラス−Ｉ分子からのペプチドの解離を意味する。安定性は分子の５０％が崩壊（ＤＴ５０％）するのに要求される時間で表される。３種の高親和性結合ペプチドおよび中程度親和性結合ペプチド、ＨＢＶｐｏｌ−９９６，ＨＢＶｐｏｌ−１０７６およびＨＰＶ１６Ｅ７−８２の３種全てが３時間を超えるＤＴ５０％を示した（表１）。中程度親和性の他の４種のペプチド、ＨＢＶｐｏｌ−１３４４、ＨＰＶ１６Ｅ６−１８、ＨＰＶ１６Ｅ６−５２およびＨＰＶ１６Ｅ７−７、は１時間および２時間の間にＤＴ５０％を示した（表１）。低親和性結合ペプチドは１時間以下のＤＴ５０％を示した。表２に我々は解離速度、結合親和性およびこれらペプチドの免疫原性間の比較を示す。高親和性結合ペプチドは安定なＭＨＣ−ペプチド複合体を形成し、免疫原性であるが、一方中程度親和性のペプチド群は免疫原性であって、安定なＭＨＣ−ペプチド複合体を形成するか、あるいはその高い解離速度によって示されるように非免疫原性であって、安定なＭＨＣ−ペプチド複合体を形成しないペプチドのいずれかを含む（表２）。
既知ヒトＣＴＬエピトープと複合体を形成するＭＨＣクラス−Ｉ分子の安定性
免疫原性であると初めに報告した１７種のＨＬＡ−Ａ*０２０１結合ペプチド（たとえば、ＣＴＬエピトープとして見出されるか、あるいは一次応答を誘導するこのができるもの）（６，１２，２７，３０〜４０）について、ＨＬＡ−Ａ*０２０１への結合親和性を試験した。８種のペプチドは高親和性で結合し、７種のペプチドは中程度親和性で結合し、２種のペプチドは低親和性で結合した（表３）。解離速度を決めると、ＨＰＶ１１Ｅ７−４およびＨＩＶ−１ｐｏｌ−２６７のペプチドを除く実質的に殆どのペプチドが＞４時間のＤＴ５０％を示した。ＨＰＶ１１Ｅ７−４およびＨＩＶ−１ｐｏｌ−２６７のＣＴＬエピトープは両者とも合成ペプチドまたは極端に高い量の抗原を発現する細胞を用いる一次ＣＴＬ誘導によって見出されたものであるが、より速く解離した（ＤＴ５０％＞２時間、表３）。興味深いのは、ＨＣＶ１コア−１３１ペプチドの配列［ADLMGYIPLV］はＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフに正確に対応するものではない。Ｎ−末端アラニンを欠くＨＣＶコア−１３２ペプチド［DLMGYIPLV］はＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフによく適合する。このことはこのより短いペプチドのより高い親和性（ＩＣ50＝５．０μＭ）にも反映しているが、このペプチドはＨＣＶコア−１３１ペプチドよりも劇的に急速に解離する（図１）。
免疫原性は解離速度と相関する
有意な相関関係がペプチドの免疫原性と解離速度との間に存在する。検討した既知ＨＬＡ−Ａ*０２０１制限免疫原性ペプチドの内、２３種の内の２１種がＤＴ５０％＞３時間を示したが、１１種の非免疫原性ペプチドのいずれもがＤＴ５０％＞３時間を示さなかった（ｐ＝０．００００００３、表４）。この相関関係はペプチド結合親和性と免疫原性との間の相関（ｐ＝０．０００５、表４）よりもより密接しており、表２に見られる傾向を確認させる。免疫原性と解離速度との間の相関関係を中程度または低親和性で結合するペプチドについて研究すると、これは親和性（ｐ＝０．０４）よりも免疫原性に対してなおよく相関した（ｐ＝０．００００７、表５）。このことは、加工処理されて、小胞体に移行し、安定なＭＨＣ−ペプチド複合体を形成することのできるペプチドがＣＴＬエピトープであるらしいことを示唆している。
既知親和性および解離速度を有するＨＩＶ−１誘導ペプチドのＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウスにおける免疫原性
結合親和性と解離速度を測定したペプチドのイン・ビボ免疫原性を評価するために、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb形質転換マウスに２種の対照ペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ７−８６およびＨＢＶコア−１８、FLPSDDFPSV）および４種のＨＩＶ−１誘導ペプチド（表６）を接種した。これら形質転換マウスの誘導化およびそのイン・ビボ免疫原性分析における使用についてはすでに記載がある（１０，２９）。ＨＩＶ−１ｐｏｌ−４６８（ILKEPVHGV）はＣＴＬエピトープであり、中程度の親和性で結合する。ＨＩＶ−１ｐｏｌ−２６７（VLDVGDAYFSV）ペプチドは比較的高用量のペプチドで繰り返し刺激するとヒトの一次誘導において免疫原性であることが分かっていた（２７）。イン・ビトロで測定したＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性予測値を試験するために、我々は他の２種のＨＩＶ−１ｐｏｌペプチド（ＨＩＶ−１ｐｏｌ−３４３、YMDDLYVGSDL、およびＨＩＶ−１ｐｏｌ−５７６、LLWKGEGAV）（表６）の結合親和性と解離速度を決めた。双方のペプチドは、以前に記載されているように、ＨＩＶ−１ｐｏｌの高次保存領域がＨＬＡ−Ａ*０２０１に結合する２つのアンカーを含むアミノ酸配列に対してスクリーニングしたときに検出した（２７）。我々は数群のマウスに全ペプチドを接種した。対照ペプチドを接種したマウスから誘導のバルクＣＴＬが特異的にペプチド感受性ジャーカットＡ*０２０１／Ｋb細胞を溶解した（図２、表６）。予測どおりに、低解離速度のペプチド全てがＣＴＬ応答を備えていたが（図２、表６）、高い相対解離速度をもつ２種のペプチドはＣＴＬ応答を誘発しなかった（図２、表６）。このように、これらペプチドの免疫原性はその解離速度から完全に予測された。
コメント
ＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫性に関するこれらの結果の広範な検討については別途報告する（バン・デル・ブルグら、準備中）。この実施例が示すのはＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性測定が、潜在的Ｔ細胞エピトープを同定するに際して非常に価値が高いということである。新たに明確となった免疫原性ペプチドはその低解離速度で示されるように比較的安定なＭＨＣ−ペプチド複合体を形成したが、一方、非免疫原性ペプチドは高い解離速度を示した。さらに、実際に、全ての以前に記載したＨＬＡ−Ａ*０２０１制限Ｔ細胞エピトープが低い解離速度を示した。さらに我々は、ＨＩＶ−１誘導ペプチドの免疫原性がＭＨＣクラスＩ結合親和性によるよりもその解離速度によりより正確に予測できることを示す。我々はペプチドの解離速度と免疫原性の相関（ｐ＝０．００００００３）が結合親和性と免疫原性との相関（ｐ＝０．０００５）よりもより密接であることを見出す。よりよい相関は中程度または低い親和性で結合するペプチドの群において得られる。結局、親和性とその解離速度に基づくペプチドの選択が、親和性のみに基づく選択よりもより正確にＣＴＬエピトープ候補の同定を可能とする。
このアッセイ法は未負荷分子とペプチド負荷分子との間の識別をすることのできるＨＬＡタイプ特異ＭＡｂｓを必要とすることを留意されたい。そのようなＡｂｓ（抗体）はＨＬＡ−Ａ*０２０１および−Ａ*０３０１については現在入手可能であるが、他のＨＬＡクラスＩ分子に関係するペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性を明確にするためにはさらなるＡｂｓの同定または単離が必要である。そのようなＡｂｓを単離する方法は以下のとおりである。
*  所望の特性を入手可能なＡｂｓ（ＡＴＣＣ，その他の研究所）からスクリーニングする。
*  半合成ファージ抗体展示ライブラリーから関連ＨＬＡ分子を発現するヒトＢ細胞系に対する適当なＡｂｓを選択する（ティー・ロッホテンベルク博士（ユトレヒト大学病院、オランダ）との共同で実施（４１））。
*  精製ペプチド負荷ＭＨＣ分子に対するモノクローナルＡｂｓの産生、またはファージ抗体の選択（６）。
実施例２の図に関する説明
図６．ＨＣＶ１コア−１３１ペプチドおよびＮ−末端アラニン欠失短鎖変異体の結合親和性と解離速度
結合親和性（左）および解離速度（右）を試験した。対象物はＨＬＡ−Ａ*０２０１制限ＣＴＬエピトープＨＣＶ１コア−１３１（黒マル、ADLMGYIPLV）および短鎖変異体（白マル、DLMGYIPLV）であり、後者はより正確にＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフに相応する（材料と方法参照）。独立した２つの実験で得られた競合体ペプチド各濃度での参照ペプチドの平均阻害率を左図に示す。右図は各時間での両ペプチドの残余ペプチド−ＭＨＣ分子の百分比を示す。ｔ＝２時間で存在する百分比を１００％に設定した。曲線は直線回帰分析の結果である。
図７．ＨＬＡ−Ａ*０２０１Ｋb形質転換マウスの予防接種により誘導されるペプチド特異細胞毒性
代表的実験ではＨＬＡ−Ａ*０２０１Ｋb形質転換マウスに低解離速度（Ａ，Ｂ，Ｅ）または高解離速度（Ｃ，Ｄ）を示す表示ペプチドをＩＦＡ中のＨＢＶコア−エンコードＴヘルパー・エピトープと組み合せて接種した（材料と方法参照）。これらマウスの脾臓細胞から誘導されるバルクＣＴＬ培養物はペプチド特異性について、特異ペプチドでパルス処理した（白マル）または処理しない（黒マル）ジャーカットＡ*０２０１Ｋb標的細胞上、細胞毒性アッセイにより試験した。図は表示した標準偏差を有する３〜６匹の動物からのバルクＣＴＬの平均特異溶解を示す。特異溶解は１．５から１００まで変動するＥ／Ｔ比で示してある。
実施例３
ＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性測定アッセイによるメラノーマ関連免疫原性ペプチドの同定
材料と方法
殆どの手法は実施例１および２に記載されている。ヒトＴリンパ球をペプチド負荷樹枝状細胞（ＤＣ）で刺激することによる誘導を以下のように実施した。単球富化ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）分画をＨＬＡ−Ａ*０２０１−サブタイプの健常提供者から総ＰＢＭＣのプラスティック粘着法により単離した。粘着細胞をＲＰＭＩ／Ｌ−グルタミン／抗生物質／１０％ＦＣＳまたは１０％ヒト血清（ＨＳ）、および５００Ｕ／ｍｌ ｒＨｕＩＬ−４，および８００Ｕ／ｍｌ ｒＨｕＧＭ−ＣＳＦで５〜７日間培養した。サイトカイン含有の培地を一日おきに補給した。培養物を５０Ｕ／ｍｌ ｒＨｕＩＬ−１ａおよび２００Ｕ／ｍｌ ｇ−ＩＦＮで２４時間処理し、５０ｕｇ／ｍｌのペプチドとＲＰＭＩ／Ｌ−グルタミン／抗生物質／１％ＦＣＳ中で４時間パルス処理した。ペプチド−パルス処理刺激物を照射（２５００ラド）し、２度洗浄した。２４穴プレートの各ウエルに１ｍｌの１〜２ｘ１０4／ｍｌ刺激細胞含有ＲＰＭＩ／Ｌ−グルタミン／抗生物質／５％ＨＳを分配した。
オートロガス応答動物細胞をプラスティック皿への粘着により（ＣＤ８＋）Ｔ−細胞に富化し、次いで、ダイナビーズ（ダイナル、オスロ、ノルウェイ）を用い、ＣＤ４＋細胞枯渇させた。総ＰＢＭＣ応答物をＣＤ８−富化非粘着性細胞と混合し、最終応答物存在量を約１０％ＣＤ４＋Ｔ細胞とした。応答物を刺激物と１：１０ないし１：２０の比で混合し、１ウエル当たり総量２ｘ１０6応答物とした。ｒＨｕＩＬ−７を５ｎｇ／ｍｌまで添加した。培地＋ｒＨｕＩＬ−７を７日後に補給した。１２日目に、応答物をオートロガス・ペプチド・パルス処理粘着性ＰＢＭＣで再刺激した（以前に記載（４２））。ｒＨｕＩＬ−２を最終濃度１２０ＩＵ／ｍｌとなるように添加した。同様に、ＣＴＬ培養物を毎週再刺激した。ＣＴＬ培養物を、ＲＰＭＩ／Ｌ−グルタミン／抗生物質／５％ＨＳ＋１２０ＩＵ／ｍｌ ｒＨｕＩＬ−２中、ＦＭ３メラノーマ細胞系を発現するＨＬＡ−Ａ*０２０１＋、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１（５０００／ウエル（４３））および６人の提供者からの同種ＰＢＭＣ（１００，０００／ウエル）と３種のＨＬＡ−Ａ*０２０１＋Ｂ−ＬＣＬ（５０００／ウエル）の混合物を用い、Ｕ型底９６穴プレート中で限界希釈によりサブクローン化した。クローンは毎週再刺激した。
結  果
潜在的ＨＬＡ−Ａ*０２０１−結合ＣＴＬエピトープの存在を求めて、３種のペプチド結合アッセイ法、すなわち、Ｔ２−結合アッセイ（２）、未処理ヒトＢ細胞上ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子を使用する結合アッセイ（実施例１参照）およびＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性を測定するアッセイ（実施例２参照）を用い、メラノーマ抗原Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１をスクリーニングした。結合データを比較すると（表９参照）、ＨＬＡ−Ａ*０２０１−陽性メラノーマ細胞（４４）が提示する既述の免疫優性ペプチド・エピトープを表すノナマー・ペプチドAAGIGILTVはＴ２細胞にはわずかに結合するだけであり、また未処理ヒトＢ細胞上のＨＬＡ−Ａ*０２０１に対する結合もあまり強くないことを示している。しかし、このペプチドの１０マー変異体（EAAGIGILTV）は両結合アッセイにおいて、ＨＬＡ−Ａ*０２０１に対しかなりの結合力を示す。逆説的には、これら２つのペプチドをペプチド−ＭＨＣ複合体に関して比較すると、９マーペプチードがＨＬＡ−Ａ*０２０１に結合すると安定なペプチド−ＭＨＣ複合体を形成するが、１０マーとの複合体は不安定である。
ＨＬＡ−Ａ*０２０１−陽性健常提供者の末梢血リンパ球を２種のペプチドのいずれかで負荷したオートロガス樹枝状細胞で刺激することにより、ペプチド特異ＣＴＬの免疫性がイン・ビトロで上昇した。得られるＣＴＬの反応性を関連ペプチドで負荷したＴ２細胞に対して、ならびにＨＬＡ−Ａ*０２０１−およびＭＡＲＴ−１−陽性ヒトメラノーマ細胞に対して試験した。これらの実験が明確に証明しているのは、ペプチド−負荷Ｔ２細胞とメラノーマ細胞に対して反応した腫瘍特異ＣＴＬ活性が、提供者のリンパ球を９マーペプチドAAGIGILTVで刺激した後にのみ得られたということである（これらの実験については別途記載する。バン・デン・エルザスら、報文作成中）。これらのデータが明確に証明しているのは、ペプチド・エピトープの免疫原性が対応するペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性と強く相関するが、ペプチドのＭＨＣ結合をＴ２細胞または未処理Ｂ細胞上で測定したとき、このペプチドが（ｉ）安定なＭＨＣ−ペプチド複合体を形成することおよび（ii）免疫原性であって、３種のアッセイ全てにおいてＨＬＡ−Ａ*０２０１に対して強く安定に結合することを保証するものではないということである（表９参照）。また、ペプチド負荷Ｔ２細胞およびＨＬＡ−Ａ*０２０１−／ＭＡＲＴ−１陽性メラノーマ細胞の双方に対して反応するＣＴＬがこれら２種のペプチドに対しても上昇させることができた（バン・デン・エルザスら、報文作成中）。
これらの結果を合わせて示し得ることは、ＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性に基づき免疫原性ペプチドを選択することが腫瘍関連Ｔ細胞エピトープの同定における有用な手段となるということである。
§４．３  免疫原性ペプチドの同定
本発明は免疫療法のＴ細胞応答標的として作用するＭＨＣ−結合ペプチドを同定するための新技術を提供する。この方法は他の選択工程（§１．参照）と共に、たとえば、腫瘍細胞により加工処理され提示されると思われ、且つ、Ｔ細胞免疫系の免疫原標的を構成するペプチドとして腫瘍により発現されるタンパクの一次配列のスクリーニングに適用される。
以下の抗原から誘導されるペプチド・エピトープが我々の研究に関係する。
＊ ヒトパピローマウイルス・タイプ１６および１８（ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８）のＥ６−タンパク
＊ ヒトパピローマウイルス・タイプ１６および１８（ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８）のＥ７−タンパク
＊ ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＧａｇ，Ｐｏｌおよび
Ｅｎｖ−タンパク
＊ ＭＡＧＥ−２ヒトメラノーマ抗原
＊ チロシナーゼ・ヒトメラノーマ抗原
＊ Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１メラノーマ抗原
＊ ｐ２１Ｒａｓヒト・オンコ−タンパク
＊ ｐ５３ヒト・オンコ−タンパク
＊ ヒト・ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）
＊ ヒト・上皮細胞粘着性分子（ＥｐＣＡＭ）
＊ ＣＤ１９ヒトＢ細胞特異タンパク
＊ ＣＤ２０ヒトＢ細胞特異タンパク
＊ ＣＤ４４細胞表面グリコプロテイン
＊ 免疫グロブリン（Ｉｇ）におけるＢ細胞リンパ腫により発現されるＩｇ重鎖および軽鎖の可変ドメイン
上述のタンパクの配列を以下のＨＬＡクラスＩ分子と関係する免疫原性Ｔ細胞エピトープを提示すると思われるペプチドとしてスクリーニングする。
＊ ＨＬＡ−Ａ*０１０１
＊ ＨＬＡ−Ａ*０２０１
＊ ＨＬＡ−Ａ*０３０１
＊ ＨＬＡ−Ａ*１１０１
＊ ＨＬＡ−Ａ*２４０１
＊ ＨＬＡ−Ｂ７
§４．４  予め選択する手法を経た理由で安定性アッセイによりスクリーニングしたペプチドのリスト
§４．３の実施例２および３で説明したように、免疫原性ペプチドの選択は、ペプチドについて関与するＭＨＣ分子に対する結合のみならず、生成するペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性をスクリーニングする場合、その精度が著しく改善される。以前の報告で我々は種々の抗原（たとえば、腫瘍抗原）から誘導される多様な潜在免疫原性ペプチドにつき記載した。これらのペプチドは、（ｉ）コンピューター予測および（ii）ペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性を考慮していない結合アッセイから成る２段階手法に基づき選択した。当業者は今やこれらのペプチドに関してペプチド−ＭＨＣ複合体を測定する我々の新アッセイ法を適用できるし、それによってさらに確認することもできる。これらのペプチドのリストを表１０〜２０に提供する。
§４．５  数種の限定Ｔ細胞エピトープを一連のビーズ状構成物として含有する組換えアデノウイルスの予防接種
ウイルスまたは腫瘍に対するＴ細胞関連免疫性は２通りの方法で誘導することができる。ウイルス−または腫瘍−特異Ｔ細胞の伝達による受動式、または抗原暴露による能動式である。後者の場合には抗原を弱毒化ウイルスもしくは腫瘍細胞の全体から単離したタンパクに至る多くの異なる形で宿主に投与することができる。事実上これら全ての場合において、ワクチンは最小必須のＴ細胞エピトープが知られているという意味で合理的に設計されていない。それ故、これらの場合の免疫処理が常に所望の効果に導くとは限らない。たとえば、ワクチニアのような弱毒化ウイルスでの免疫化は望ましくない副作用を誘発するか、あるいは野生型ウイルスにより抗原変異を受けるエピトープでＴ細胞免疫に至る可能性がある。同様に、単一のタンパクでの免疫処理は無効であるが、その理由はＴ細胞の応答性を他の準優性Ｔ細胞エピトープに対してＴ細胞の応答を誘導せずに免疫優性Ｔ細胞エピトープのみに誘導する可能性があるから、あるいは標的の全存在率を補うだけの十分量のＣＴＬエピトープを含んでいない可能性があるからである。これらの欠点は他の予防接種法を開拓することで一部は克服することができる。
選択した抗原を発現する組換えウイルスを用いる予防接種法を現在開発中である。抗腫瘍ワクチンを開発する場合には、ＭＡＲＴ１およびｇｐ１００などの数種の腫瘍関連抗原は、組換えウイルス・ベクターに組込むためのよい候補である。しかし、抗腫瘍免疫性を誘発する方法として組換えウイルスベクターにより腫瘍関連抗原をエンコードする全遺伝子を送達するのは、これら腫瘍関連抗原が発ガンに関係している場合、安全ではない。たとえば、ＨＰＶ１６−陽性子宮頚ガン治療または予防用ウイルス・ベクター・ワクチンは、もしそれが機能的ヒトパピローマウイルス・タイプ１６（ＨＰＶ１６）Ｅ６およびＥ７ガン遺伝子を含んでいるならば、本質的に危険である。また、ウイルス・ベクターが発ガンタンパクＨＥＲ２／ｎｅｕ，サイクリン依存性キナーゼ４、変形融合タンパクＢＣＲ−ＡＢＬ，または変異Ｒａｓおよびｐ５３タンパクをエンコードしている場合、これらの遺伝子がガンの成長に密接に関わっている故に、同じことが当てはまる。同様に、腫瘍関連抗原ＭＡＧＥ，ＧＡＧＥまたはＢＡＧＥのファミリーに属する遺伝子をウイルス・ベクターに組込むことは、それらの機能が今まで確定されていない故に、避けるべきである。しかし、そのような腫瘍関連抗原から誘導されるＴ細胞エピトープを組換えウイルス・ベクターにエンコードする配列のみを導入することにより、体細胞性ベクター感染細胞の形質転換などの潜在的危険を導入せずに、免疫応答をこれらの標的に向けることができるようにすべきである。
最近、マウスにおいて数種の一連のビーズ状ＣＴＬエピトープを発現する組換えワクチニア・ワクチンが成功裏に使用されたとの研究が報告されている（４８）（４９）。これらの研究は一連のビーズ状ワクチンが抗ウイルスおよび抗腫瘍免疫の誘発に使用し得る可能性を示している。しかし、ワクチニア・ワクチンに関連する潜在的危険の故に、またポックスウイルスに関係する予防接種プログラムが廃止されたために免疫性が低下したあるいは（若年個体で）欠如したために、組換えワクチニア・ワクチンをヒトに使用することができない。さらにこれらの研究において、ＣＴＬエピトープは互いに直接繋がっており、ＣＴＬエピトープの効果的で正確なプロセシングおよび提示に向けたスペーサー配列を含んでいなかった。そのような理由で、含有されたＣＴＬエピトープの最適プロセシングおよび提示に導くＣＴＬエピトープ間のタンパク分解開裂部位を有し、ｒＡｄを含有する数種の一連のビーズ状ＣＴＬエピトープは、危険な副作用を誘発せずに強いＣＴＬ応答を誘導する。
腫瘍関連抗原全体を含有する組換えアデノウイルスは、予防的抗腫瘍免疫を誘発するのに用いられており（５０〜５２）（５３，５４）、腫瘍特異防御免疫性の誘発のためにｒＡｄを使用する可能性を説明している。
多重Ｔ細胞エピトープとタンパク分解開裂部位をこれらＴ細胞エピトープ間に含むミニ遺伝子をｒＡｄに組込むことによって、我々は今ウイルスおよび腫瘍に対して防御的Ｔ細胞応答を誘発するための新規な革新的方法を開発した。
実施例４
一連のビーズ状形態の種々限定ＣＴＬエピトープを発現するｒＡｄは防御的抗腫瘍免疫性を誘導する。
材料と方法
細胞系
マウス胎児性細胞（ＭＥＣ），Ａｄ５Ｅ１形質転換ＭＥＣ，Ａｄ５Ｅ１＋ｒａｓ形質転換ＭＥＣ，ＨＰＶ１６−形質転換ＭＥＣ，およびＣＯＳ−７細胞を、４％ＦＣＳ（ハイクロン・ラボラトリーズ、ローガン、ユタ）、ペニシリン（１１０ＩＵ／ｍｌ，ブロカーデス・ファーマ、アイデンドルプ、オランダ）および２−メルカプトエタノール（２０μＭ）を補給したイスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ）改変ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）培地（バイオクロム・ＫＧ，セロメド、ベルリン、ドイツ）中に３７℃、５％ＣＯ2空気下に保持した。ＣＴＬクローンを別途記載（５５，５６）（１０５７）どおりに培養した。インフルエンザ・マトリックス特異ＨＬＡ−Ａ*０２０１制限ＣＴＬクローンをＲＰＭＩ中３０Ｇｙで照射したＨＬＡ−Ａ*０２０１−陽性ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系上で生育した。９１１の細胞が（５８）記載のように成長した。
ｒＡｄの産生
ミニ遺伝子１またはミニ遺伝子２（図８参照）をシャトルベクターｐＭａｄ５に挿入した。ｐＭａｄ５（アール・フーベン、未公開）を以下のクローニング工程をへてｐＭＬＰ１０（７３）から誘導した。（ｉ）ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片の除去、（ii）ポリリンカー配列（ＣｌａＩ，ＭｌｕＩ，ＳｎａＢＩ，ＳｐｅＩ，ＡｓｕＩＩ，ＭｕｎＩ）をＡｄ５主要後期プロモーター（ＭＬＰ）およびＡｄ２三部分リーダー配列の直下流ユニークＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入、（iii）ｐＪＭ１７の配列をもつｐＭａｄ５配列の同族組換えを可能とするＡｄ５ゲノムのＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ断片をＭｕｎＩ部位に挿入（下記参照）。ミニ遺伝子１および２の挿入は２工程で実施する。最初のｐＭａｄ５を酵素ＳｐｅＩおよびＭｌｕＩで開裂し、その５’−末端を脱リン酸化した。アニールしたリン酸化二本鎖オリゴヌクレオチド１ａ／ｂおよび２ａ／ｂ（表Ａ参照）をこのベクターに連結した。その結果、メチオニン、NASYATSの配列をもつスペーサーおよびヒトｃ−ｍｙｃ配列SEQKLISEEDLNNから成る小型のオープンリーディングフレームを得た。後者の配列は適当なモノクローナル抗体により認識されるエピトープに相応する。クローニング法の結果として、ｐＭａｄ５の当初ＳｐｅＩおよびＭｌｕＩ部位が分解されるが、一方新しくＳｐｅＩおよびＭｌｕＩ部位がスタートコドンとｃ−ｍｙｃエピトープをエンコードする配列との間に形成された。第二クローニング段階ではＣＴＬエピトープをエンコードする配列がカセットに挿入された。カセット・ベクターを酵素ＳｐｅＩおよびＭｌｕＩで開裂し、アニールした非リン酸化二本鎖オリゴヌクレオチド３ａ／ｂおよび４ａ／ｂをオープン・ベクター（ミニ遺伝子１）に連結した。別法として、アニールした非リン酸化二本鎖オリゴヌクレオチド５ａ／ｂおよび４ａ／ｂをオープン・ベクター（ミニ遺伝子２）に連結した。次いで、非連結オリゴヌクレオチドを連結混合物からセファクリル４００精製カラムにより除去した。溶出したＤＮＡをアニール化したリン酸化二本鎖オリゴヌクレオチド６ａ／ｂおよび７ａ／ｂ（ミニ遺伝子１）またはリン酸化二本鎖オリゴヌクレオチド８ａ／ｂおよび９ａ／ｂ（ミニ遺伝子２）を含む連結反応物に加えた。結果として、図８に示す組換えタンパクをコードする２種のｐＭａｄ５誘導プラスミド（ｐＭａｄ５−１，ｐＭａｄ５−２）を得た。ＲＡｄはＡｄ５Ｅ１−陽性細胞系９１１（５８）を、Ａｄ５変異体ｄ１３０９（５９）の配列を含むプラスミドｐＪＭ１７と一緒にプラスミドｐＭａｄ５−１またはｐＭａｄ５−２のいずれかでトランスフェクションすることにより構築した。９１１の細胞を１０μｇの線状化プラスミドｐＭａｄ５−１またはｐＭａｄ５−２および１０μｇのプラスミドｐＪＭ１７でそれぞれ共トランスフェクションした。ｐＭＡｄ５とｐＪＭ１７との間の相同組換えにより生成したｒＡｄを３度プラーク精製し、次いで９１１の細胞につき増殖し、二重塩化セシウム密度遠心分離により精製し、大規模に透析した。復帰変異体の存在を常法どおりにＨＥＰ−Ｇ２細胞の感染によりチェックした。ウイルス株を１０％グリセロールで分割して−８０℃で保存し、９１１細胞を用いてプラークアッセイにより力価検定した。
ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション
ＣＯＳ−７細胞における一過性のトランスフェクションを別途記載（６０）のごとくに実施した。端的に言えば、Ａｄ５Ｅ１，ＨＰＶ１６Ｅ７，マウスｐ５３、またはインフルエンザ−マトリックスタンパクをエンコードするプラスミド１００ｎｇをＨ−２Ｄb、Ｈ−２ＫｂまたはＨＬＡ−Ａ*０２０１をエンコードするプラスミド１００ｎｇと共にＤＥＡＥ−デクトラン−クロロキン法により１ｘ１０4ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションしたＣＯＳ細胞を８％ＦＣＳ含有イスコブ改変ダルベッコ培地１００μｇ中で３７℃、４８時間培養した。その後、５０シータス単位の組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２，シータス・コープ、エメリービル、カリフォルニア、米国）含有イスコブ改変ダルベッコ培地２５μｌ中の１５００〜５００ＣＴＬを添加した。２４時間後、上清を採取し、以前に記載（６０）したＷＥＨＩ−１６４クローン１３上その細胞毒性効果を測定することにより定量した。
ｒＡｄによるＭＥＣの感染
Ｂ６ＭＥＣを０．５％ウシ血清アルブミン含有イスコブ改変ダルベッコ培地に希釈したｒＡｄで感染させた。室温３０分後、１０％ＦＣＳ含有イスコブ改変ダルベッコ培地を加えた。感染多重度（ＭＯＩ）（Ｂ６ＭＥＣに対し、５０のＭＯＩを用いた）を選択し、少なくとも８０％の感染細胞を得た。これを、大腸菌ＬａｃＺ遺伝子を担持し、ラウス肉腫ウイルスの長鎖末端繰返しからのプロモーターの制御下β−ガラクトシダーゼをエンコードするＡｄ．ＲＳＶβ−Ｇａｌで感染させ、４８時間後にＸ−ｇａｌ染色することにより定量した。
ＣＴＬバルク培養物の生成
２４穴プレートを用い、１ｘ１０8プラーク形成単位（ＰＦＵ）のｒＡｄまたは複製欠損Ａｄ５−変異体ｔｓ１４９で腹腔内免疫処理し、２週間以上後に取り出したＢ６マウスから誘導の脾臓細胞を１ウエル当たり５ｘ１０6細胞あて、１０％照射（２５ＧＹ）ＩＦＮ−γ（１０単位／ｍｌ）処理刺激物細胞と共に６日間共培養した。次いで、エフェクター細胞を採取し、死亡細胞をリンホライトＭ上密度遠心分離により除去した。これらの細胞は細胞介在リンパ球細胞毒性アッセイに用いた。
細胞介在リンパ球細胞毒性
細胞介在細胞毒性を測定するための実験手法を別途記載（５６）のようにユーロピウム（Ｅｕ3+）遊離アッセイ法により実施した。簡潔に説明すると、９６穴Ｕ型底プレートを使用し、０．１５ｍｌの培地中１０3Ｅｕｒ3+標識標的細胞にエフェクター細胞の個数を変化させて添加した。３７℃で４時間インキュベーションの後、上清を集め、エンハンサー溶液（登録商標、ワラック、ツルク、フィンランド）と混合した。試料を１２３４デルフィア（登録商標）蛍光光度計（ワラック）で測定した。特異溶解度を３ヶのウエルの平均百分比として以下のように計算した。
特異溶解％＝［（ｃｐｍ実験遊離−ｃｐｍ自然遊離）
／（ｃｐｍ最大遊離−ｃｐｍ自然遊離）］ｘ１００
ペプチド
以前に記載（６１）のように、多種ペプチド合成機（アビメッドＡＭＳ４２２）を用い、固相法により合成した。
腫瘍細胞のチャレンジ
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ／ＢＳＡ０．２５ｍｌ中１ｘ１０8プラーク形成単位（ＰＦＵ）のｒＡｄまたは複製欠損Ａｄ５−変異体Ａｄ５ｔｓ１４９で腹腔内免疫処理した。２週間後、マウスに０．２５ｍｌＰＢＳ中の０．４ｘ１０6Ａｄ５Ｅ１Ａ＋ｒａｓ細胞を皮下投与した。腫瘍容量をカリパスで測定した。不要の苦痛を避けるために腫瘍が１０００3を超えたときに動物を犠牲に付した。
結  果
数種のＣＴＬエピトープ暗号配列のｐＭａｄ５への挿入
未処理発ガンタンパクをエンコードする組換えウイルスでの予防接種は、組換えウイルス感染細胞の形質転換が起こり得るので本質的に危険である。それ故、我々はベクターｐＭａｄ５の主要後期プロモーターの後にクローン化した数種の異なるＣＴＬエピトープをエンコードする２種のミニ遺伝子を一体とすることにした。我々は一連のビーズ状形態の数種ＣＴＬエピトープを発現するｒＡｄが予防接種の目的に使用できるか否かを検討することから始めたので、ミニ遺伝子の構築に使用したＣＴＬエピトープは、ＣＴＬエピトープおよび／またはＣＴＬエピトープを発現する腫瘍細胞を認識するＣＴＬクローンの利用可能性に基づいて選択した。抗原プロセシングおよび提示についての現在の知識に基づいて、３個のアラニンから成るスペーサーによりＣＴＬエピトープを互いに離した。３個のアラニンから成るタンパク分解開裂部位を組み入れることは、エンコードされたＣＴＬエピトープが適正にプロセシングされることを保証する（６２）。ミニ遺伝子エンコードＣＴＬエピトープを認識するＣＴＬクローンが利用可能であることは、ミニ遺伝子が翻訳されるか否か、また、適当なＭＨＣクラスＩ分子との関係でエンコードされたＣＴＬエピトープが提示されているか否かを決めるために重要である。同様に、利用可能なマウス腫瘍モデルは、構築したｒＡｄが、予防接種したときに、予防的であって、それぞれ治療的ＣＴＬ介在抗ガン免疫性を誘発し得るか否かを決めるための読み出しとして使用することができる。
これらの考えに基づいて、我々は２種の合成ミニ遺伝子をエンコードする２種の組換えアデノウイルスを調製した（図８）。図８に示したＣＴＬエピトープをエンコードする合成ミニ遺伝子を‘材料および方法’の項に記載したようにプラスミドｐＭａｄ５にクローン化した。ｐＭａｄ５−１によりエンコードされたＣＴＬエピトープの全て、およびｐＭａｄ−２によりエンコードされた４つのＣＴＬエピトープの内の２つが、一過性トランスフェクション実験において示されたようにプロセシングされ、腫瘍特異ＣＴＬに提示されることを示した（図９および図１０）。ｐＭａｄ５−２に組込まれたＨＰＶ１６誘導ＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬエピトープのプロセシングおよび提示は、これらペプチドに特異的なＣＴＬが現在入手できないという事情により、試験できなかった。それにもかかわらず、我々のデータは、構成物中の最終（ＡｄｒＥ１Ｂ−誘導）ＣＴＬエピトープが翻訳され、加工処理され、Ａｄ５Ｅ１Ｂ特異ＣＴＬに提示されている以上、これらのペプチドは発現され、そして恐らく加工処理されていることを示している。それ故、我々はｐＭａｄ５−１およびｐＭａｄ５−２によりエンコードされたＣＴＬエピトープの全てが翻訳され、加工処理され、ＣＴＬクローンに提示されていると結論する。
ミニ遺伝子を細胞に導入すると適当なＭＨＣ制限分子との関連で所望のＣＴＬエピトープを提示するので、ミニ遺伝子１または２を含有するプラスミドｐＭａｄ５−１およびｐＭａｄ５−２は複製欠損ｒＡｄを産生するのに使用されている。
構築ｒＡｄによりエンコードされたＣＴＬエピトープが加工処理され、腫瘍特異ＣＴＬに提示される
生成したｒＡｄが感染に際し腫瘍特異ＣＴＬクローンを活性化し得るか否かを分析するために、Ｂ６ＭＥＣをｒＡｄで感染させた。これらのｒＡｄ感染ＭＥＣは、読み出しとしてＴＮＦ産生を用いるＴ細胞活性化アッセイにおける刺激細胞として用いた。簡便という理由で、これらの実験において我々は焦点をＨ−２bエンコード・ウイルス誘導ＣＴＬエピトープに絞った。これらのＣＴＬはこのウイルスで感染したＢ６ＭＥＣと培養したときには活性化されるが、対照のｒＡｄで感染したＢ６ＭＥＣと培養したときには活性化されないので、ｒＡｄエンコードミニ遺伝子（ｒＡｄ−１）での感染により、Ａｄ５Ｅ１Ａ−，ＨＰＶ１６Ｅ７−およびＡｄ５Ｅ１Ｂ−誘導ＣＴＬエピトープは適当なＣＴＬに提示される（図１１）。ｐ５３ノックアウト・マウスから誘導したＭＥＣを感染させることにより、我々はｐ５３誘導ＣＴＬエピトープもまた効果的に加工処理され、ｐ５３特異ＣＴＬに提示されることを示すことができた（データ図示せず）。同様に、Ｂ５ＭＥＣをこのウイルスで感染するとＡｄ５Ｅ１Ｂ特異ＣＴＬを活性化することになるので、ｒＡｄエンコード・ミニ遺伝子２（ｒＡｄ−２）はＡｄ５Ｅ１誘導ＣＴＬエピトープを送達することができる（図１１）。このように、構築したｒＡｄは全ての予め選択されたＣＴＬエピトープを腫瘍特異ＣＴＬに送達することができる。
５．Ｂ６マウスにｒＡｄを予防接種すると腫瘍反応性ＣＴＬ活性を誘導する
ｒＡｄは３種全てのＨ−２−制限ウイルスＣＴＬエピトープを送達できるので、これらウイルスでの予防接種がこれらのＣＴＬエピトープに対してＣＴＬ活性を誘導するか否かを分析した。実際、ｒＡｄ−１で免疫したＢ６マウスから誘導したバルクＣＴＬ培養物は、Ａｄ５Ｅ１Ａ−，ＨＰＶＩ６Ｅ７−，およびＡｄ５Ｅ１Ｂ−エンコードＣＴＬエピトープに対して高いＣＴＬ活性を発揮する（図１２および図１３）。さらに、これらのＣＴＬバルク培養物はまた、関連ＣＴＬエピトープを含有する腫瘍細胞を溶解し、誘導したＣＴＬが強い抗腫瘍活性を発揮することを示す。同様に、Ｂ６マウスをｒＡｄ−２で予防接種すると、Ａｄ５Ｅ１Ｂ発現腫瘍細胞上交差反応するＡｄ５Ｅ１Ｂ−特異ＣＴＬ活性を誘導した（図１２）。これらのデータが共に示すことは、数種のＣＴＬエピトープを一連のビーズ状形態でエンコードする合成ミニ遺伝子を含有するｒＡｄは、予防接種により、選択したＣＴＬエピトープに対し強い腫瘍特異ＣＴＬ応答を誘発することができることである。
ｒＡｄ−１での免疫処理はＡｄ５Ｅ１Ａ＋ｒａｓ形質転換腫瘍細胞の攻撃に対して防御的免疫性を誘導する
上記のデータは、ｒＡｄ−１またはｒＡｄ−２での免疫処理が試験した全てのＣＴＬエピトープに対して強い腫瘍反応性ＣＴＬ活性を誘導することを示す。ｒＡｄを接種したマウスが腫瘍細胞での致死的攻撃に対しても防御するか否か試験するために、我々はこれらのマウスにＡｄ５Ｅ１Ａ領域で形質転換した腫瘍細胞を投与した。これらの腫瘍細胞はＡｄ５Ｅ１Ａ−エンコードＣＴＬエピトープを発現するのみであり、それ故にｒＡｄ−１のみが予防接種によりこの腫瘍に対して防御的免疫を誘発するが、ｒＡｄ−２はそうではない。実際に、ｒＡｄ−１で免疫処理したマウスはＡｄ５Ｅ１Ａ＋ｒａｓ発現腫瘍細胞の発芽後成長に対し防御したが、ｒＡｄ−２またはＰＢＳ／ＢＳＡのみで免疫処理したマウスではそうではなかった（図１４）。さらに、ｒＡｄ−１での予防接種により誘導した防御は照射腫瘍細胞での予防接種により得られた防御よりもよりよいが、このことはｒＡｄでの予防接種が他の予防接種法に比較しても優れていることを示している。このように、数種のＣＴＬエピトープを含有するｒＡｄでの予防接種は、タンパク分解開裂部位と連結して、予め選択した選択Ｔ細胞エピトープに向けられた防御的免疫性を誘導する強力な方法である。
コメント
この実施例は、一連のビーズ状形態にある限定ＣＴＬエピトープをエンコードするｒＡｄは、そのＣＴＬエピトープがＣＴＬエピトープの効果的なプロセシングおよび提示を確実にする配列により互いに連結しており、腫瘍に対して防御的ＣＴＬ応答を誘導するのに非常に効果が高いことを示している。ｒＡｄによりエンコードされたＣＴＬエピトープは全て加工処理されて、腫瘍−およびウイルス−特異ＣＴＬに提示されるが、このことは多様なＣＴＬエピトープが一回の予防接種により宿主に送達され、強力で防御的なＣＴＬ応答を導き出すことを意味している。ｒＡｄは製造が容易であり、予防接種に用いてときにワクチニアのような他の担体に比較して副作用を惹起することがない。それ故に、この予防接種法は非常に効果的で安全であり、現在は本発明に記載した他のＣＴＬエピトープを送達するのに使用している。
実施例５
実施例４に記載したのと同様の方法に従い、ワクチンを調製するが、そのＣＴＬエピトープは表１０〜２０に記載したものが組込まれている。ワクチンは以下の特徴をもつように調製した。
ａ．ワクチンはスペーサーを介して互いに連なった数種のＴ細胞エピトープを含有する。
ｂ．該スペーサーはタンパク分解性開裂部位を有する。
ｃ．Ｔ細胞エピトープ含有構成物は組換えアデノウイルスにより送達するか、あるいは第２および３頁の項目iii〜viiに記載したワクチン型に組込む。
メラノーマ用ワクチンは表１１に言及したペプチドを含有するように調製し、大腸ガン用ワクチンは表１２および２０に言及したペプチドを含有するように調製し、子宮頚ガン用ワクチンは表１３〜１６に言及したペプチドを含有するように調製し、ＨＩＶ用ワクチンは表１９に言及したペプチドを含有するように調製する。適当な場合には、表１０〜２０に掲載した以外のペプチドＴ細胞エピトープをこれらの多重エピトープ・ワクチンに組込む。
これらのワクチンに存在するＴ細胞エピトープを以下のタンパク分解性開裂部位（またはこれらのタンパク分解性開裂部位の一部）を介して互いに連結する。
（６２）に記載のＡＡＡ
（６３）に記載のQGW*FEG,WFE*GLF,FEG*LFN,FTT*LIS,TTL*IST,TLI*STI,FNK*SPW,EGL*FNK,TTL*IST,TLI*STI,FNR*SPW
VSG*LEQ,SII*NFE,INF*EKL,LTE*WTS,IIN*FEK,GLE*QLE,EQL*ESI,NFE*KLT,QLE*SII,EKL*TEW,VVR*FDK,STR*TQI,TQI*NKV,KVV*RFD,VVR*FDK,VRF*DKL,RFD*KLP,DKL*PGE,FGD*SIE,
（６４，６５）に記載のVSG*LEQ,QLE*KVV,FDK*LTE,KLT*EWT,
（６６）に記載のLMY*DMY,SEK*RVV,KRV*WMS,DMY*PHF,TNL*GPS,LMY*DMY,
（６７）に記載のLYE*NKP,
（６８）に記載のVNQ*HLC,SHL*VEA,LVE*ALY,EAL*YLV,LYL*VCG,VNQ*HLC,QHL*CGS,LVE*ALY,EAL*YLV,ALY*LVC,LYL*VCG,YLV*CGE,LVC*GER,RGF*FYT,GFF*YTR,FFY*TPK,FYT*PKA,
（６９）に記載のYTP*KA,TPK*A,
ただし、＊はその後部でプロテアソーム複合体が開裂する部位を表す。
上述の多重エピトープ構成物を有するｒＡｄワクチンは以下の適切な臨床条件で適用される。
投与量：
１０5ｐｆｕと１０11ｐｆｕの間
希釈剤：等張液、１００〜１０００μｌ
投与：
２ないし４週間間隔で１ないし３回
可能部位：
皮下、皮内、腹腔内、筋肉内
臨床評価：
腫瘍成長の抑制、現存腫瘍／転移の退縮
免疫学的評価：
予防接種前後の関連および対照ペプチドＴ細胞エピトープに対するＴ細胞応答の測定
実施例４の図に関する説明
図８．数種のＣＴＬエピトープをエンコードし、３個のアラニンから成るスペーサーを介して連結しているミニ遺伝子。
第一のミニ遺伝子（ｒＡｄ−１）はＡｄ５Ｅ１Ａ234-243−エンコードＨ−２Ｄb−制限ＣＴＬエピトープ（５５）、ＨＰＶ１６Ｅ７49-59−エンコードＨ−２Ｄb−制限ＣＴＬエピトープ（７０）、Ｐ53158-166−エンコードＨ−２Ｋb制限ＣＴＬエピトープ（未発表の結果）、Ａｄ５Ｅ１Ｂ192-200−エンコードＨ−２Ｄb−制限ＣＴＬエピトープ（５６）、およびＭｙｃ−Ｔａｇをエンコードする。
第二のミニ遺伝子（ｒＡｄ−２）はＨＰＶＩ６Ｅ86-93−エンコードＨＬＡ−Ａ*０２０１−制限ＣＴＬエピトープ（７１）、フルマトリックス58-66ＨＬＡＡ*０２０１−制限ＣＴＬエピトープ（７２）、ＨＰＶＩ６Ｅ７１１−２０−エンコードＨＬＡＡ*０２０１−制限ＣＴＬエピトープ（７１）、Ａｄ５Ｅ１Ｂ192-200−エンコードＨ−２Ｄb制限ＣＴＬエピトープ（５６）、およびＭｙｃ−Ｔａｇをエンコードする。
図９．ミニ遺伝子ＩエンコードＣＴＬエピトープは腫瘍特異ＣＴＬクローンに提示される。ｐＭａｄ５−１を適切な制限要素をエンコードするプラスミドと共にＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクション処理する。４８時間後、トランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞について、関連ＣＴＬのＴＮＦ遊離惹起能によるＣＴＬエピトープの発現を試験した。培養上清に存在するＴＮＦをＷＥＨＩ−１６４クローン１３細胞での細胞毒性効果により測定した。
全ての関連ＣＴＬをミニ遺伝子１エンコードプラスミド（無関連の対照プラスミドでは不実施）で適切な制限分子をエンコードするプラスミドと共にトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞で活性化した。このように、ミニ遺伝子１はタンパクに翻訳され、エンコードしたＣＴＬエピトープは加工処理され、適切なＭＨＣ分子との関連で腫瘍特異ＣＴＬに提示される。
図１０．Ｆｌｕ−誘導およびＡｄ５Ｅ１Ｂ−誘導ＣＴＬエピトープをミニ遺伝子によりそれぞれＦｌｕ−およびＡｄ５Ｅ１Ｂ−特異ＣＴＬに提示する。ｐＭａｄ５−２を適切な制限要素をエンコードするプラスミドと共にＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。４８時間後、トランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞について、関連ＣＴＬのＴＮＦ遊離惹起能によるＣＴＬエピトープの発現を試験した。培養上清に存在するＴＮＦをＷＥＨＩ−１６４クローン１３細胞での細胞毒性効果により測定した。関連ＣＴＬをこのプラスミド（無関連の対照プラスミドでは不実施）と適切な制限分子をエンコードするプラスミドとでトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞で活性化した。このように、ミニ遺伝子２はタンパクに翻訳され、エンコードしたＣＴＬエピトープは加工処理され、適切なＭＨＣ分子との関連で特異ＣＴＬに提示される。
図１１．ｒＡｄＶによりエンコードしたＣＴＬエピトープは加工処理され、腫瘍特異ＣＴＬに提示される。Ｂ６ＭＥＣを未感染状態に置くか、あるいはミニ遺伝子１含有ｒＡｄ−１、ミニ遺伝子２含有ｒＡｄ−２またはガラクトシダーゼ遺伝子（ＲＡｄＶ−ＬＡＣ−Ｚ）により感染多重度５０で感染させた。２日後、これらの細胞を上記同様にＴＮＦ−産生アッセイに用いた。Ａｄ５Ｅ１Ａ−，ＨＰＶ１６Ｅ７−およびＡｄ５Ｅ１Ｂ−誘導Ｈ−２Ｄb−制限ＣＴＬエピトープを含有するｒＡｄ−１で感染したＢ６ＭＥＣは、これらＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬクローンを活性化することができる。一方、Ａｄ５Ｅ１Ｂ−誘導ＣＴＬ含有ｒＡｄ−２で感染したＢ６ＭＥＣは、Ａｄ５Ｅ１Ｂ−特異ＣＴＬを活性化するだけである。ＣＴＬは未感染ＭＥＣまたは対照ｒＡｄで感染したＭＥＣとのインキュベーションでは活性化されない。
図１２．ｒＡｄＶで予防接種するとＡｄ５Ｅ１−エンコードＣＴＬエピトープに対して腫瘍反応性ＣＴＬ活性を誘導することになる。Ｂ６マウスは未免疫のままであるか、ミニ遺伝子１含有ｒＡｄ−１で免疫するか、あるいはミニ遺伝子２含有ｒＡｄ−２で免疫した。２週間後、これら動物の脾臓を取り出し、Ａｄ５Ｅ１−およびＡｄ５Ｅ２−特異ＣＴＬを増殖させるためにＡｄ５Ｅ１−形質転換腫瘍細胞で再刺激した。バルクＣＴＬ培養物の溶解活性を、６日後に、センダイウイルス−エンコード対照ＣＴＬエピトープFAPGNYPAL、またはＡｄ５Ｅ１Ａ−エンコードＣＴＬエピトープSGPSNTPPE1、またはＡｄ５Ｅ１Ｂ−エンコードＣＴＬエピトープVNIRNCCYI、またはＨＰＶ１６Ｅ７−エンコードＣＴＬエピトープRAHYNIVTFを負荷したＡｄ５Ｅ１ＭＥＣ，Ｂ６ＭＥＣ上で試験した。ｒＡｄ−１で免疫したマウスはＡｄ５Ｅ１Ａ−およびＡｄ５Ｅ１Ｂ−エンコードＣＴＬエピトープ並びにＡｄ５Ｅ１Ａ−およびＡｄ５Ｅ１Ｂ−エピトープを内在的に提示する腫瘍細胞を認識する。ｒＡｄ−２で免疫したマウスはＡｄ５Ｅ１Ｂ−エピトープ並びにＡｄ５Ｅ１Ｂ−エンコードＣＴＬエピトープを内在的に提示する腫瘍細胞を認識する。一方、未免疫マウスは標的細胞に対して反応性を示さない。特異溶解率％を異なるエフェクターと標的細胞の比で示す。
図１３．ｒＡｄＶで予防接種するとＨＰＶ１６Ｅ７，Ｈ−２Ｄb−制限ＣＴＬエピトープに対し向けられた腫瘍反応性ＣＴＬ活性を誘発する。Ｂ６マウスは未免疫のままであるか、ミニ遺伝子１含有ｒＡｄ−１で免疫するか、あるいはミニ遺伝子２含有ｒＡｄ−２で免疫した。２週間後、これら動物の脾臓を取り出し、Ｈ−２Ｄｂ，ＨＰＶ１６Ｅ７−特異ＣＴＬを増殖させるために、ＨＰＶ１６−形質転換腫瘍細胞で再刺激した。バルクＣＴＬ培養物の溶解活性を、６日後に、センダイウイルス−エンコード対照ＣＴＬエピトープFAPGNYPAL、またはＡｄ５Ｅ１Ａ−エンコードＣＴＬエピトープSGPSNTPPE1、またはＡｄ５Ｅ１Ｂ−エンコードＣＴＬエピトープVNIRNCCYI、またはＨＰＶ１６Ｅ７−エンコードＣＴＬエピトープRAHYNIVTFを負荷したＨＰＶ１６ＭＥＣ，Ｂ６ＭＥＣ上で試験した。ｒＡｄ−１で免疫したマウスはＨＰＶ１６Ｅ７−エンコードＣＴＬエピトープ並びにＨＰＶ１６Ｅ７−エピトープを内在的に提示する腫瘍細胞を認識する。未免疫マウスおよびｒＡｄ−２で免疫したマウスはＨＰＶ１６Ｅ７−ペプチド陽性標的細胞に対して反応性を示さない。特異溶解率％を異なるエフェクターと標的細胞の比で示す。
図１４．ｒＡｄ−１で予防接種するとＡｄ５Ｅ１Ａ−発現腫瘍細胞での致死的攻撃に対して防御的免疫を誘発する。Ｂ６マウスをｒＡｄ−１，ｒＡｄ−２，Ａｄ５−変異体（Ａｄ５Ｅ１Ａ−陽性）Ａｄ５ｔｓ１４９で腹腔内投与免疫、または１０ｘ０１照射Ａｄ５Ｅ１Ａ＋ｒａｓ形質転換腫瘍細胞で皮下投与免疫するか、またはＰＢＳ／ＢＳＡのみを注射した。２週間後、マウスに０．４ｘ１０6Ａｄ５Ｅ１Ａ＋ｒａｓ細胞を皮下投与した。ｒＡｄ−１およびＡｄ５ｔｓ１４９で免疫したマウスは、Ａｄ５Ｅ１Ａ＋ｒａｓ細胞の発芽後成長に対し防御されており、ｒＡｄでの免疫処理が腫瘍に対して防御的免疫を誘導することを示している。
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以下の表は、Ｔ２細胞上でＨＬＡ−Ａ*０２０１分子を上方調整することが可能なヒトメラノーマ関連タンパクチロシナーゼから誘導された予め選択されたペプチドを提示している。
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ＨＰＶ１６／１８タンパクから誘導されたアミノ酸配列を有する予め選択されたペプチド。前記アミノ酸配列は、ヒトＭＨＣクラスＩ対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ２．１に結合する能力を有し、以下のものから成る群から選択される：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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