(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列
【化１】
0004173539.tif 000012
からなる、ＩＬ−６活性を阻害することができるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡを含むプラスミドベクター。
【請求項３】
ＩＬ−６の活性を阻害するための治療に使用される、請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１記載のＤＮＡと１またはそれ以上の薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを組み合わせて含む、ＩＬ−６が病原的な役割をしている疾患を治療するための薬剤組成物。
【請求項５】
請求項２記載のプラスミドベクターと１またはそれ以上の薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを組み合わせて含む、ＩＬ−６が病原的な役割をしている疾患を治療するための薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ＩＬ−６の活性を阻害することができるヌクレオチド配列、そのヌクレオチド配列の治療への使用、およびそのヌクレオチド配列を含む薬剤組成物に関する。
発明の背景
ＩＬ−６は、生物の免疫応答および造血作用を刺激する際に重要な働きをすることが証明されている、サイトカインの一群に属するタンパク質である。
実際、造血系およびリンパ系において、肝臓、およびその他の標的器官や細胞中において、ＩＬ−６についての多くの生物学的機能が見いだされた。これらの機能には有用なものがあるが、病理学的状態と関連しているものもある。後者の機能の中で、ＩＬ−６は複数のミエローマ細胞にとっての成長因子であることがわかっている；抗ＩＬ−６抗体により、白血病の患者の体内で一時的にミエローマ細胞の増殖が阻止されることが示された（たとえば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７８，（５），ｐｐ．１１９８−１２０４，１９９１およびＬｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２ｐｐ．２８１９−２８２４，１９９２を参照）。
ＩＬ−６濃度の増加は慢性関節リューマチ、糸球体腎炎、落屑、およびキャッスルマン病などの自己免疫疾患および炎症性疾患と相関性を有している（たとえば、Ｇｒａｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．，７１，ｐｐ．６６４−６７１，１９９３を参照）。ＩＬ−６は骨喪失および高カルシウム血症においても直接的な働きを示した（たとえば、Ｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ．，１３，（５）ｐｐ．１１８９−１１９６およびＹｏｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，ｐｐ．７３７−７４０，Ｆｅｂ．１９９３参照）。
ＩＬ−６活性の阻害剤の作成はこのようなわけで活発な研究対象となっている。このような目的に対して、ＩＬ−６に対する抗体（Ｋｌｅｉｎらにより上記に報告されている）、ｇｐ１３０あるいはｇｐ８０に対する抗体を使用すること；可溶性ｇｐ１３０を使用すること；またはＩＬ−６またはＩＬ−６受容体についての変異タンパク質を使用することを含む、様々なアプローチが行われた。
これらのアプローチは、臨床的応用（Ｌｕら、上記により報告）において特異的な望ましくない効果が関連しうるため、ＩＬ−６活性を阻害するための別の戦略を立てることが必要でありうる。
そのため出願人は、ＩＬ−６活性を阻害する別のアプローチ、すなわちＩＬ−６シグナルを媒介する細胞内タンパク質を阻害することによりＩＬ−６活性を阻害することを研究した。
反応性の細胞におけるＩＬ−６のシグナル伝達は、詳細に研究されている。Ｆｏｗｌｋｅｓら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８１，ｐｐ．２３１３−２３１６，１９８４）は、ラットのフィブロネクチン遺伝子に隣接させたＩＬ−６に対して特異的なＤＮＡ反応性要素に最初に着目した。
後にＫｕｒｚら（Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．，１７，（３），１１２１−１１３７，１９８９）は、ラットα2−マクログロブリン遺伝子中に、ＩＬ−６に対して反応するための、ラットフィブロネクチン遺伝子中に存在するものと同一のコア配列（ＣＴＧＧＧＡ）を含む応答要素を含むことを示した。
上述した配列と関連する配列を含むＤＮＡ応答要素は、ヒトＣ反応タンパク質（ＣＲＰ）をコードする遺伝子（Ｔｏｎｉａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７，ｐｐ．１９９−２１２，１９９０を参照）、ヒトハプトグロビンをコードする遺伝子（Ｏｌｉｖｉｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ．，６，（７），ｐｐ．１９０５−１９１２，１９８７を参照）、そしてＩＬ−６により誘導される別の急性相タンパク質をコードするその他の遺伝子（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６５，ｐｐ．６２１−６３６，１９９０を参照）中においても見いだされ、ＣＴＧＧＧＡＷまたはＣＴＧＧＲＡＡ（ここでＷはＡまたはＴを意味し、ＲはＡまたはＧを意味する）のコアコンセンサス配列の定義を導いた。
Ｈｏｃｈｅら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２，（５），ｐｐ．２２８２−２２９４，１９９２）は、関連する複数のコア配列が上述したコア配列と同様にＩＬ−６に応答する野生型の遺伝子の調節領域に存在しうること、およびリポーター遺伝子アッセイにより機能について解析されたように、この複数性が応答の増幅を導くことを示した。
Ｗｅｇｅｎｋａら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３，（１），ｐｐ．２７６−２８８，１９９３）は最近、式ＫＴＭＹＫＧＫＡＡ（ＭはＣまたはＡを意味し、ＫはＴまたはＧを意味し、ＹはＣまたはＴを意味する）により示すことができる、ヘパトーマ細胞（肝細胞癌）において活性である、急性相応答要素（ＡＰＲＥ）としてのコアコンセンサス配列の拡張版を示した。
このようなＡＰＲＥ様の配列が、最近クローニングされたＡＰＲＦと呼ばれる分子量９０ＫＤのタンパク質転写因子（Ａｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７７，ｐｐ．６３−７１，１９９４を参照）と結合することを、Ｙｕａｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４，（３），ｐｐ．１６５７−１６６８，１９９４）は示した。その結果実際上は、活性化されたＡＰＲＦがＡＰＲＥ配列に結合することにより、ＩＬ−６応答細胞において（このようなＡＰＲＥ配列を含む）ＩＬ−６誘導性遺伝子を活性化させることができる。
この結果、ＡＰＲＥ要素を以下のようにＩＬ−６応答細胞において標的遺伝子のエンハンサーとして使用することができる：ＩＬ−６応答細胞において、ＩＬ−６により処理することがＡＰＲＦタンパク質の合成を誘導し、ＡＰＲＦタンパク質がＡＰＲＥ要素に結合し、このような結合により標的遺伝子が活性化する。
Ｓｅｒｌｕｐｉ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉら（１９９４年６月１４−１７日にバルセロナで開催された、第１２回欧州免疫学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｅｔｉｎｇ）でのポスター発表）は、ＡＰＲＥのＤＮＡ配列を８回繰り返したもの（Ｍ８）がＨｅｐＧ２ヒトヘパトーマ細胞において、ＩＬ−６によるリポーター遺伝子の誘導を５０−１００倍にすることができることを示した。二本鎖オリゴヌクレオチドは実際、一つの転写因子に対することを示した。
発明の概要
本発明の主要な対象物は、
ｉ）一般式ＺＸＭＹＫＧＫＡＡ（この中でＺはＴまたはＧまたは塩基が存在しなくてもよいことを意味し、ＸはＴまたは塩基が存在しなくてもよいことを意味し、ＭはＣまたはＡを意味し、ＹはＣまたはＴを意味し、ＫはＴまたはＧを意味する）で表されるＡＰＲＥ要素であるヌクレオチド配列を少なくとも一つ、
ｉｉ）ＡＰＲＥ要素以外の、プロモーター領域に存在するような転写因子結合部位を構成するヌクレオチド配列を少なくとも一つ、
これらを組み合わせて含む、ＩＬ−６活性を阻害することができるヌクレオチド配列である。
後者のタイプのヌクレオチド配列の例としては、ＴＡＴＡボックス、そしてＡＰ−１（Ｒｉａｂｏｗｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８９，ｐｐ．１５７−１６１，１９９２を参照）、ＡＰ−２、ＨＮＦ−１（Ｃｌｕｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．，２１（１５），ｐｐ．３４０５−３４１１を参照）、ＳＰ−１（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９，ｐｐ．２０３−２０９，１９９０を参照）、ＮＦ−κＢ（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，ｐｐ．９９７−１０００，１９９０を参照）、Ｏｃｔ−１、Ｅ−２、およびＳＲＦ転写因子などの転写因子結合部位が含まれる。
本発明のより好ましい態様において、ＡＰＲＥ要素（ｉ）および／または上記一般式で表されるヌクレオチド配列（ｉｉ）の両方が、それぞれ少なくとも２回、より好ましくは３回から１０回、さらにより好ましくは８回繰り返す。
本発明のさらにより好ましい態様において、要素（ｉ）は少なくとも２種類の異なるＡＰＲＥ要素を含み、および／またはヌクレオチド配列（ｉｉ）はＡＰＲＥ要素以外の転写因子結合部位を構成する少なくとも２種類の異なるオリゴヌクレオチド配列を含む。
ヌクレオチド配列（ｉｉ）は好ましくはＳＶ４０初期プロモーターである。
ＡＰＲＥ要素（ｉ）はたとえば以下のヌクレオチド配列、すなわちＴＴＣＴＧＧＧＡＡを含む。
図２は、より好ましい態様に従う、本発明の範囲に属するヌクレオチド配列について報告する。このようなヌクレオチドは配列番号１としても報告し、それは本発明の対象物の一つを構成する。
本発明のさらなる対象物は、本発明のヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターである。
本発明の別の観点は、ＩＬ−６が病原的な役割をしている疾患において、ＩＬ−６の活性を阻害するための治療における道具として本発明のヌクレオチド配列を使用することである。
本発明は、本発明によるヌクレオチド配列またはプラスミドベクターを含む薬剤組成物を提供する。このような組成物は、経口的な使用、直腸からの使用、静脈からの使用あるいは局所的な使用として処方することができる。本発明の処方は、ウィルス媒介性遺伝子導入、リポソーム処方、受容体媒介性ＤＮＡ送達および／または本発明による活性を有するヌクレオチド阻害配列のダンベル構造の任意の組み合わせを使用することを含みうる。
本発明のヌクレオチド配列の阻害活性は、リポーター遺伝子アッセイにより特定した。
本発明のリポーター遺伝子アッセイは、（上述した）ＩＬ−６応答細胞において、任意の遺伝子のエンハンサーとして機能するためのＡＰＲＥ要素の能力に基づいている。この場合ＡＰＲＥ要素は、（たとえばＨｅｐＧ２のような肝細胞である）ＩＬ−６応答細胞において、（たとえばルシフェラーゼ遺伝子である）標的となるリポーター遺伝子のエンハンサーとして使用する。細胞はその後ＩＬ−６で処理する：もし多量の生成されたＡＰＲＥタンパク質が過剰量の本発明によるヌクレオチド配列によりとらえられれば、標的遺伝子は活性化されていないだろう。
このアッセイにより、本発明のヌクレオチド配列を含む阻害プラスミドを構築する。このようなプラスミドの例は、その構築戦略とともに図１に示している。
本発明のヌクレオチド配列を含むこのプラスミドおよびその他のプラスミドも、本発明のさらなる態様を構成することを意図している。
本発明は、以下の実施例により記載されるだろうが、しかしいかなる場合でも本発明を限定するものとして構成すべきではない。実施例は、本明細書で以下に特定する図に言及する予定である。
【図面の簡単な説明】
図１：プラスミドｐＭ８ＳＶの構築戦略。
ｐＭ８ＳＶＬをＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、接着末端はクレノー反応によりブラント末端に転換する。結果として得られた３．２ＫｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、その後自己ライゲーションさせた。このようにＭ８配列（およそ１７０ｂｐ）およびＳＶ４０ウィルス初期プロモーター由来の配列（およそ１９０ｂｐ）を含み、ルシフェラーゼ遺伝子を含まないプラスミドｐＭ８ＳＶを作成する。
図２：プラスミドｐＭ８ＳＶのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ阻害ＤＮＡ断片の配列。
示したヌクレオチド配列の上半分の上部に引かれた実線は、Ｍ８配列を示している。ヌクレオチド配列の下半分の上部に引かれた太い実線は、ＳＶ４０プロモーター配列を示している。ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素部位も示してある。
図３：Ｔ４７Ｄ細胞中およびＭ１細胞中でのＩＬ−６リポーター遺伝子アッセイ。種々のＭ８含有プラスミドの試験。
報告した光放射の値は、トランスフェクションした細胞から３０秒間にわたって積算したｃｐｓ（ＡＵＣ＝曲線下領域（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  Ｃｕｒｖｅ）を２種に分けて測定したもののそれぞれの平均値である。それぞれの棒グラフは、３回のトランスフェクションの平均±ＳＥＭを示している。
図４：ＩＬ−６による処置後の、トランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞の経時的ルシフェラーゼ誘導性。
プラスミドｐＭ８ＳＶＬを、陽性リポーター遺伝子プラスミドとして使用した。それぞれの棒グラフは、２回のトランスフェクションの平均±ＳＥＭを示している。２回の実験を図中に示す。
図５：ＩＬ−６に対するＨｅｐＧ２リポーター遺伝子アッセイ。リポーター遺伝子プラスミドとしてのｐＭ８ＳＶＬに対する阻害プラスミドとしてのｐＭ８の試験。
それぞれの棒グラフは、３回のトランスフェクションの平均±ＳＥＭを示す。４回の実験を図中に示す。
図６：ＩＬ−６に対するＨｅｐＧ２リポーター遺伝子アッセイ。リポーター遺伝子プラスミドとしてのｐＭ８ＳＶＬに対する阻害プラスミドとしてのｐＭ８ＳＶの試験。
それぞれの棒グラフは、３回のトランスフェクションの平均±ＳＥＭを示す。結果を阻害プラスミドを含まない担体プラスミドｐＣをトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞に対する阻害の割合（％）で表す。
図７：ＩＬ−６に対するＨｅｐＧ２リポーター遺伝子アッセイ。リポーター遺伝子プラスミドであるｐＭ８ＳＶＬに対する阻害プラスミドとしてのｐＳＶおよびｐＭ８ＳＶの試験。
それぞれの棒グラフは、３回のトランスフェクションの平均±ＳＥＭを示す。結果を阻害プラスミドを含まない担体プラスミドｐＣをトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞に対する阻害の割合（％）で表す。
図８：ヒトハプトグロビン遺伝子プロモーター由来のＩＬ−６誘導性調節配列の調節下における、ルシフェラーゼ遺伝子に基づくＨｅｐＧ２リポーター遺伝子アッセイにおける阻害プラスミドｐＭ８およびｐＭ８ＳＶによる、ＩＬ−６活性の阻害試験。
それぞれの棒グラフは、３回のトランスフェクションの平均±ＳＥＭを示す。結果を阻害プラスミドを含まない担体プラスミドｐＣをトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞に対する阻害の割合（％）で表す。トランスフェクションは、０．１μｇのリポータープラスミドＤＮＡと示されたモル数の過剰量の阻害プラスミドとを用いて行った。トランスフェクションされたＤＮＡの総量は、担体プラスミドにより一定に保たれた。トランスフェクションされた細胞は、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６で１８時間処理された。
発明の詳細な説明
実施例１：プラスミドの構築
まず最初に未切断のＢａｍＨＩ部位を５’ブラント末端に、そして３’末端にＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位を両立する４ヌクレオチドの一本鎖突出部分を有する３８ｂｐの二本鎖オリゴヌクレオチドを化学合成することで調製することにより、ＩＬ−６応答性ルシフェラーゼ遺伝子プラスミドを構築した。この合成ヌクレオチドはＭ２と命名し、そしてこの合成ヌクレオチドはラットα2−マクログロブリン遺伝子プロモーター領域由来の２個の同一なＡＰＲＥ配列を含んでいた。オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである（上流側の鎖、５’末端から３’末端）：
ＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴ ＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧ ＡＴＣＣＴＴＣＴＧＧ ＧＡＡＴＴＣＴＧ（配列番号２）。このオリゴヌクレオチドは、プラスミドｐＧＬ２−ｐｖ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）のＳｍａＩ−ＢｇｌＩＩ部位にクローニングされ、その中でルシフェラーゼリポーター遺伝子はＳＶ４０ウィルスの初期プロモーターにより駆動され、その結果自己ライゲーションをした後プラスミドｐＭ２ＳＶＬが作成される。
５’末端がブラント末端である合成オリゴヌクレオチドは、上記と同一のプラスミドｐＧＬ２−ｐｖのＳｍａＩ制限酵素部位にもライゲーションされ、その結果得られた直鎖状のライゲーション生成物はその後ＨｉｎｄＩＩＩで切断された。結果として得られた直鎖状のベクターは、以下のＤＮＡ断片、すなわち１）プラスミドｐＭ２ＳＶＬ由来の２３８ｂｐであるＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片であり、自己ライゲーションの後プラスミドｐＭ４ＳＶＬを形成するもの；２）プラスミドｐＭ４ＳＶＬ由来の２８０ｂｐであるＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片であり、自己ライゲーションの後プラスミドｐＭ６ＳＶＬを形成するものおよび３）プラスミドｐＭ６ＳＶＬ由来の３２２ｂｐであるＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片であり、自己ライゲーションの後プラスミドｐＭ８ＳＶＬを形成するものをクローニングするために、レシピエントとして使用した。
プラスミドｐＭ８ＳＶＬをＳｆａｎＩにより酵素消化することにより、そして接着末端をクレノー酵素を用いた埋め込み反応によりブラント末端に転換することにより、プラスミドｐＭ８Ｌを構築した。ＢａｍＨＩ消化の後、得られた１６３ｂｐのＭ８ＤＮＡ断片には１６ｂｐのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ合成アダプター配列をライゲーションし、その後ｐＧＬ２−ｂベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）をＳｍａＩおよびＫｐｎＩで消化して得られた５．６ＫｂのＤＮＡ断片中にクローニングした。プラスミドｐＧＬ−２ｂは、ｐＧＬ−２ｂ中にＳＶ４０プロモーター配列が存在しないこと以外は上述したｐＧＬ−２ｐｖプラスミドと同一である。１６ｂｐのアダプター配列はマルチクローニング部位を含み、以下の配列を含むように化学合成により調製した：
0004173539.tif 000002
上記構築物から得られたプラスミドはｐＭ８Ｌであり、そしてそのプラスミドはルシフェラーゼ遺伝子の上流部にあるマルチクローニング部位に埋め込まれた、プロモーターを伴わないＭ８ＤＮＡ配列であった。
ルシフェラーゼリポーター遺伝子プラスミドｐＭ８ＴＫＬは、プラスミドｐＧＥＭ−ＴＫ−ＣＡＴ（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，７（５），ｐｐ．１４１１−１４１９，１９８８中に記載）をＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩで切断することにより調製した。ウィルス性ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子のＴＫプロモーター配列を含む得られた１８１ｂｐの断片は、Ｍ８とルシフェラーゼＤＮＡ配列の間にあるｐＭ８Ｌベクターの５．８ＫｂのＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片にライゲーションした。
ヒトゲノムＤＮＡ由来のハプトグロビン遺伝子プロモーター領域から得た８４１ｂｐのＰＣＲ増幅物により、ルシフェラーゼリポーター遺伝子プラスミドｐＨＰＳＶＬを最初に構築した。増幅されたＰＣＲ断片の３’末端は、ヒトハプトグロビン遺伝子の転写開始部位の−３６の位置に対応していた（Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０（１１），ｐｐ．６６９８−６７０９，Ｊｕｎｅ  １０，１９８５に報告されている）。このＰＣＲ産物は、それぞれＭｌｕＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素部位を含む上流側プライマーと下流側プライマーにより調製した。ハプトグロビンのプロモーター領域をゲノム増幅することで合成したＤＮＡプライマーには以下の配列が含まれる：
0004173539.tif 000003
このように得られたＰＣＲ産物は、上述したルシフェラーゼリポーター遺伝子プラスミドｐＧＬ２−ｐｖのＳＶ４０初期プロモーターの上流にあるＭｌｕＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素部位に挿入した。得られたプラスミドはｐＨＰＳＶＬであった。
阻害プラスミドｐＭ８を構築するために、上記プラスミドｐＭ８ＬをＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、その結果できた接着末端をクレノー反応によりブラント末端に修復した。ルシフェラーゼ遺伝子配列を含まない得られた３．１Ｋｂの断片は、アガロースゲル電気泳動により精製し、その後自己ライゲーションさせることにより阻害プラスミドｐＭ８を生成した。
阻害プラスミドｐＭ８ＳＶは、図１に示したように調製した。ｐＭ８ＳＶＬをＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、できた接着末端をクレノー反応によりブラント末端に転換した。得られた３．２ＫｂのＤＮＡ断片は、、アガロースゲル電気泳動により精製し、その後自己ライゲーションさせた。このようにしてＭ８配列（およそ１７０ｂｐ）およびＳＶ４０ウィルス由来初期プロモーター（およそ１９０ｂｐ）を含むがルシフェラーゼ遺伝子を含まないプラスミドｐＭ８ＳＶを生成した。
阻害プラスミドｐＳＶは、上述したプラスミドｐＧＬ２−ｐｖから得られたルシフェラーゼ遺伝子を含むＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を切り出すことにより構築した。得られた３．１Ｋｂの断片は、クレノー酵素による埋め込み反応を行い、アガロースゲル電気泳動により精製し、その後自己ライゲーションさせ、その結果ＳＶ４０プロモーターを含むがルシフェラーゼ遺伝子は含まないプラスミドｐＳＶを得た。
担体プラスミドｐＣを上述したプラスミドｐＧＬ２−ｂをＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断することにより調製した。得られた２．９Ｋｂの断片は、クレノー酵素による埋め込み反応を行い、アガロースゲル電気泳動により精製し、その後自己ライゲーションさせ、その結果プラスミドｐＣを得た。
上述したすべてのプラスミド構築物は、標準的手法（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従い、Ｅ．ｃｏｌｉの系統であるＸＬ１−Ｂｌｕｅをトランスフォームするために使用した。プラスミドＤＮＡは、少量調製アルカリ融解法（Ａｕｓｕｂｅｌ、上述による）によりトランスフォームしたクローンから抽出した。プラスミドＤＮＡは、制限酵素解析およびアガロースゲル電気泳動により調節した。予想したパターンを示したクローンを選択した。ホ乳類細胞をトランスフェクションするときに使用する精製したプラスミド調製物を得るために、選別したトランスフォームＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅの３００ｍｌの培養液を調製した。その後プラスミドは、ＱＩＡＧＥＮチップ５００イオン交換ミニカラムにより、製造者による解説書に従って、精製した。
実施例２：細胞株および培養条件
ＨｅｐＧ２ヒトヘパトーマ細胞細胞（ＡＴＣＣより入手）は、１０％ＦＣＳ、５ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン添加ＭＥＭ培地で培養した。Ｔ４７Ｄヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣより入手）は、１０％ＦＣＳ、５ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ培地で培養した。Ｍ１マウス骨髄性白血病細胞（ＡＴＣＣより入手）は、１０％ＦＣＳ、５ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ培地で培養した。上記細胞株の培養は、適切な濃度のＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手したＣＨＯ細胞由来ヒトＩＬ−６）の存在下および非存在下において、以下に詳述したように行った。
実施例３：一過性トランスフェクションとルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイ
ＨｅｐＧ２ヒトヘパトーマ細胞およびＴ４７Ｄヒト乳癌細胞の一過性トランスフェクションは、標準的手法（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従い、ＨＥＰＥＳ緩衝液中でのリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿法を利用して行った。マウスＭ１骨髄性白血病細胞の一過性トランスフェクションは、標準的手法（Ａｕｓｕｂｅｌ、上記による）に従い、ＤＥＡＥ−デキストランを使用して行った。
ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの活性を検出するために、細胞を１０6細胞あたり１ｍｌの抽出緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−リン酸  ｐＨ７．８、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で、室温で１５分間インキュベーションすることによりｉｎ  ｓｉｔｕで抽出した。ルシフェラーゼ活性を測定するために、２０μｌの細胞抽出液を、１００μｌのルシフェラーゼアッセイ緩衝液（２０ｍＭトリシン、１．０７ｍＭ  （ＭｇＣＯ3）4Ｍｇ（ＯＨ）2−５Ｈ2Ｏ、２．６７ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ  ＤＴＴ、０．２７ｍＭコエンザイムＡ、０．４７ｍＭルシフェリン、０．５３ｍＭ  ＡＴＰ）で、直接アッセイした。β−ガラクトシダーゼ活性を測定するために、１０μｌの細胞抽出液を、１００μｌのルミガル（Ｌｕｍｉｇａｌ）基質（Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）と３７℃で１時間インキュベーションした。ルミガルおよびルシフェラーゼの読みとりは、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ａｕｔｏｌｕｍａｔ  ＬＢ９５３光測定器を用いて行い、カウント／秒（ｃｐｓ）で表される出力は、ルシフェラーゼに関しては３０秒間、β−ガラクトシダーゼに関しては１５秒間の測定値を積算して求めた。
リポータープラスミドｐＭ８ＳＶＬは、ＨｅｐＧ２細胞の一過性トランスフェクションの後、ルシフェラーゼ活性の発現が５０−１００倍に上昇するほどＩＬ−６反応性を付与することが示された（Ｓｅｒｌｕｐｉ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉら、１９９４年６月１４−１７日にバルセロナで開催された、第１２回欧州免疫学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｅｔｉｎｇ）でのポスター発表）。
このプラスミドはＴ４７Ｄヒト乳癌細胞においておよびマウスＭ１骨髄性白血病細胞においても試験された。Ｍ１細胞は１０6細胞あたり０．５μｇのＤＮＡで、ＤＥＡＥ−デキストランを使用してトランスフェクションし、Ｔ４７細胞は１０5細胞あたり２．５μｇのＤＮＡで、リン酸カルシウムを使用してトランスフェクションした。
これら２種の細胞株間では、ヒトＩＬ−６に対する共通の反応以外では非常に限定された特徴しか共通していない。結果（図３）は、ｐＭ８ＳＶＬプラスミド中のＭ８ＤＮＡ分子がＩＬ−６での処置後にどちらの細胞株においても顕著に活性化していることが示された。図３に示したように、ＩＬ−６に対する顕著な応答は、ｐＭ８ＳＶＬ中に存在しているＳＶ４０プロモーターとは異なるチミジンキナーゼプロモーターとＭ８分子が隣接しているリポーター遺伝子プラスミドｐＭ８ＴＫＬでトランスフェクションしたＭ１細胞中でも、ＩＬ−６に対する顕著な応答が観察された。
ＩＬ−６（１ｎｇ／ｍｌ）で処理した後、トランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞の経時的ルシフェラーゼ誘導性を試験した。プラスミドｐＭ８ＳＶＬを陽性リポーター遺伝子プラスミド（１０5細胞あたり０．２μｇ）として使用した。細胞は一晩トランスフェクションし、それらを分割し、そしてその後ＩＬ−６処理で感作した。結果は図４に示し、それによりＩＬ−６に対するほとんど完全な応答性を、わずか２時間のＩＬ−６の処理の後に得ることができた。
実施例４：阻害プラスミドｐＭ８の試験
Ｍ８ＤＮＡ分子によるＩＬ−６活性の阻害は、ＨｅｐＧ２細胞中にｉ）ＩＬ−６応答性のｐＭ８ＳＶＬリポーター遺伝子プラスミドおよびｉｉ）ｐＭ８阻害プラスミド中に挿入されたＭ８分子をコトランスフェクションした後に測定した。この後者のプラスミドにはＭ８配列が存在するが、それによりＩＬ−６に対する応答性を付与することはできなかった。ＨｅｐＧ２細胞は、ＩＬ−６応答性リポーター遺伝子プラスミドｐＭ８ＳＶＬ（Ｍ８およびルシフェラーゼ遺伝子を含む）を１０5細胞あたり最大で２．５μｇで、そして１０または５０倍過剰量のｐＭ８を、様々な濃度のＩＬ−６の存在下でトランスフェクションした。一回トランスフェクションあたりの総ＤＮＡ量は、ｐＭ８プラスミド中には存在する１６５ｂｐの長さのＭ８ＤＮＡ断片が存在しない以外はｐＭ８と同一である担体プラスミドｐＣを使用することで一定に保った。
図５に報告したように、阻害プラスミドは４回の実験で、５０倍過剰量のｐＭ８阻害プラスミドでさえも、ＩＬ−６活性に対する顕著で再現性のある特異的な阻害効果を示さなかった。これらの実験で、ＩＬ−６応答性リポーター遺伝子プラスミドｐＭ８ＳＶＬをの１０5細胞あたり０．１μｇの濃度で使用したが、トランスフェクションに使用した一定にした総ＤＮＡ量は１０5細胞あたり５μｇであった。これらの実験に使用した近最適量（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ  ｄｏｓｅ）は、１ｎｇ／ｍｌであった。図５に示したように、これらの実験条件においては可変性が許容され、その可変性は別個のトランスフェクション自体が可変性の不可避な要素であるという事実から引き起こされる。
実施例５：阻害プラスミドｐＭ８ＳＶの試験
阻害プラスミドｐＭ８の活性型Ｍ８阻害ＤＮＡ配列がｐＭ８ＳＶＬリポーター遺伝子プラスミドの活性型配列と同一であるため、図５に報告された結果はやや驚くべきものであった。コトランスフェクションの後、これら別々のプラスミド中に存在する二つの同一なＭ８配列の競争があることが予想され、その結果リポーター遺伝子アッセイにおいてＩＬ−６の活性を阻害すると予想できた。
さらに上述した結果は、データが制限した量のＩＬ−６の存在下で得られたものであるため、Ｍ８阻害ＤＮＡ配列により十分に中和されていない活性化したＩＬ−６特異的転写因子（群）が過剰に存在することによっては説明することはできない。さらに既知の転写因子群（２６−３０）のＤＮＡ結合部位での同様な実験について報告されたデータが図５で報告した結果と一致していない。
図５で示した結果に対する別の説明としては、リポーター遺伝子プラスミド中に存在するＭ８以外の配列がＩＬ−６特異的シグナル伝達に寄与しうるというものがあり得る。これらの配列はｐＭ８阻害プラスミドからは取り除くべきであるが、陽性リポーター遺伝子プラスミドｐＭ８ＳＶＬ中では（たとえば一般的転写因子と結合しうるＳＶ４０初期遺伝子プロモーターの配列）存在するべきである。阻害プラスミドｐＭ８はこのように、リポーター遺伝子プラスミドｐＭ８ＳＶＬと競争するときには効力がないようである。
この仮説を検証するために、ＩＬ−６阻害ＤＮＡ配列としてＭ８配列およびＳＶ４０プロモーター配列の両方を含む阻害プラスミド（ｐＭ８ＳＶ）を構築した（図１参照）。この阻害プラスミドは、ＨｅｐＧ２細胞によるＩＬ−６リポーター遺伝子アッセイにおいて検証した。４回の別個の実験を行い、それぞれに実験で２つの同一のトランスフェクションを行った。トランスフェクションは図６に示したように、０．１μｇのリポータープラスミドＤＮＡおよび過剰量の阻害プラスミドとで行った。トランスフェクションした総ＤＮＡ量は、担体プラスミドにより一定に保った。トランスフェクションした細胞は１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６で１８時間処理した。
図６に示した結果は、ｐＭ８ＳＶ阻害プラスミドによる明らかなＩＬ−６の濃度依存的阻害を示した。図６の生データは、表１に示した。それぞれの実験において、阻害プラスミドの濃度あたり３回のトランスフェクションを反復して行った。それぞれの実験に対して、一つの列に示された誘導された値および誘導されたものではない値は、同一のトランスフェクションから得られた値である。光放射の報告された値は、３０秒間にわたって積算されたｃｐｓである。このような表１において示し得るように、いくらかの可変性がこれらの実験において観察され、特に阻害プラスミドの濃度が低い場合に観察されたが、トランスフェクションを反復して行った場合のＣＶは通常、おそらく２０％以下である。
ｐＭ８ＳＶ阻害プラスミドにより提供されるＩＬ−６活性の阻害が、もっぱらＳＶ４０プロモーターのＤＮＡ配列によるものなのかそしてＭ８とＳＶ４０配列の組み合わせによるものではないのかということを除外するために、別の阻害プラスミドを構築しリポーター遺伝子アッセイで試験した。このプラスミドはＩＬ−６活性の阻害のためにはＳＶ４０ＤＮＡ配列のみを含み、Ｍ８阻害配列だけでなくルシフェラーゼ遺伝子も持たないものである。
トランスフェクションは、０．１μｇのリポータープラスミドＤＮＡおよび過剰量の阻害プラスミドを図７に示したように行った。トランスフェクションしたＤＮＡの総量は担体プラスミドにより一定に保った。トランスフェクションした細胞は１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６で１８時間処理した。図７に報告した結果は、この阻害プラスミド（ｐＳＶ）が阻害効果として４０％以上になるということは決してなく、そして濃度依存的でない、部分的なＩＬ−６活性の阻害効果しか示さないことを示す。これにより、ＳＶ４０ＤＮＡ配列単独ではＩＬ−６の活性を効果的に阻害するには不十分であることが結論づけられる。これとは対照的に、ルシフェラーゼ含有リポータープラスミドｐＧＬ２−ｐｖはＳＶ４０プロモーター配列は含むもののＭ８配列を含まないが、結果として基礎レベルのルシフェラーゼの発現はＩＬ−６によりさらに誘導的になるということはなかった。このプラスミドにおいては、基礎的レベルのルシフェラーゼの発現はｐＭ８ＳＶ阻害プラスミドによっては阻害されず、その結果ｐＧＬ２−ｐｖのＳＶ４０プロモーター領域にのみ特異的に結合する転写因子はｐＭ８ＳＶ阻害プラスミドにより効率よく取り除かれないことを示している。実際、後者の阻害プラスミドの存在下におけるリポータープラスミドｐＧＬ２−ｐｖから得られるルシフェラーゼ活性は、阻害プラスミドの非存在下においてよりもずっと高かった（結果は示していない）。
実施例６：リポーター遺伝子プラスミドｐＨＰＳＶＬにより付与された、ＩＬ−６活性のｐＭ８ＳＶによる阻害
我々は、ＩＬ−６に対する別のリポーター遺伝子アッセイにおいて、リポーター遺伝子プラスミド中にあるＩＬ−６シグナルを媒介する標的ＤＮＡ配列は、Ｍ８阻害配列とは完全には適合しない阻害プラスミドｐＭ８ＳＶを試験しようとした。ＨｅｐＧ２細胞はその結果、８４１ｂｐのヒトハプトグロビン遺伝子由来のプロモーター配列がＳＶ４０プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子と隣接したものを含むプラスミドｐＨＰＳＶＬでトランスフェクションした。ハプトグロビンプロモーター配列由来の一つのＡＰＲＥ部位（Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０（１１），ｐｐ．６６９８−６７０９，Ｊｕｎｅ  １０，１９８５による）が、このプラスミド中に存在する。我々は以前に、このプラスミドが実際にＩＬ−６に応答しルシフェラーゼの発現が６−８倍に増加することを示した（Ｓｅｒｌｕｐｉ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉら、１９９４年６月１４−１７日にバルセロナで開催された、第１２回欧州免疫学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｅｔｉｎｇ）でのポスター発表）。
３回繰り返したトランスフェクションの一つの実験の結果を図８に示した。リポーター遺伝子プラスミドｐＨＰＳＶＬと５０倍過剰量の担体プラスミドをコトランスフェクションした後、ＩＬ−６による誘導性は、結果として基礎レベルに対しておよそ４倍のルシフェラーゼの高発現となった。これとは対照的に、リポーター遺伝子プラスミドｐＨＰＳＶＬと５０倍過剰量の阻害プラスミドｐＭ８ＳＶをコトランスフェクションした場合には、ＩＬ−６による誘導性は完全に消失した。ｐＭ８ＳＶ阻害プラスミドはこのように、ｐＭ８ＳＶＬ以外のＩＬ−６応答性リポーター遺伝子プラスミド（たとえばリポータープラスミドｐＨＰＳＶＬ）を試験したときにも、ＩＬ−６活性を阻害することができた。
実施例７：Ｔ４７Ｄ細胞中での阻害プラスミドｐＭ８ＳＶの試験
ｐＭ８ＳＶ阻害プラスミドは、ＩＬ−６シグナル伝達系がヘパトーマ細胞と異なる可能性があるＴ４７Ｄヒト乳癌細胞を使用して、ｐＭ８ＳＶＬリポーター遺伝子アッセイにおいても試験した。以前に述べたように、ｐＭ８ＳＶＬリポーター遺伝子プラスミドを用いたＩＬ−６リポーター遺伝子アッセイは、最適化はされていないが、この細胞株で行っている。アッセイの感度はＴ４７Ｄ細胞を用いた場合にはやや低いので、トランスフェクションは１０5細胞あたりに、比較的高レベルのプラスミドＤＮＡである、１μｇの陽性リポーター遺伝子プラスミドを使用して行った。その結果本実験においては、過剰量の担体プラスミドまたは過剰量の阻害プラスミドの存在下では非特異的阻害がみられ、結果としてＩＬ−６特異的阻害には高い可変性が認められた。
結果は表２に示す。２回の実験から得られた、３回繰り返したトランスフェクションについての平均（ＡＶＧ）および標準偏差（ＳＤ）を示す。
誘導倍率の平均値はそれぞれのトランスフェクションの生の値から計算する。１０5のトランスフェクションした細胞あたり、１および５μｇのリポーター遺伝子プラスミドを、実験１および２のそれぞれで使用した。
これらの実験において担体プラスミドおよび阻害プラスミドは別々にトランスフェクションを行い、プラスミドはどちらもリポータープラスミドに対して示された過剰量で使用した。
トランスフェクションの後、細胞を１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６で１８時間誘導した。光放射の報告された値は、３０秒間にわたって積算したｃｐｓである。これらの実験におけるＩＬ−６特異的阻害は、過剰量の阻害プラスミドの存在下において得られる誘導と対応する濃度の担体プラスミドの存在下において得られる誘導とを比較することにより評価した。
さらに、非特異的阻害のため、ルシフェラーゼの発現の基礎レベルはアッセイの定量限界に近かった。表２に報告した結果は（実験１を参照）、３回のトランスフェクションの後のＩＬ−６の活性と関連するそして特異的な阻害は２０倍過剰量の阻害プラスミドｐＭ８ＳＶをトランスフェクションした時には得られたが、１０倍過剰量の時には得られなかった。非特異的阻害が非常に高くなったため、５０倍過剰量の阻害プラスミドをこの実験で試験することはできなかった。
これらの結果は、１０5細胞あたり０．５μｇのＤＮＡを使用したときには（表２、実験２参照）、別の実験においても再現することができなかった。再現性がなかったことの理由としては、Ｔ４７Ｄリポーター遺伝子アッセイが比較的高い可変性を有すること、および感度が低いことを挙げることができる。別の言葉で言えば、独特の標的細胞の選択性によりこれらの結果を説明しうる。
実施例８：最小ＤＮＡ阻害配列の決定
ＩＬ−６による誘導性に対して関与する転写因子の結合を阻害する能力を保持している最小ＤＮＡ配列を特定するために、電気泳動移動性シフトアッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ、ＥＭＳＡ）を用いた実験のアプローチを使用することができる（Ａｕｓｕｂｅｌによる）。この最小配列により与えられた機能的阻害のための試験は、実施例３および以下の実施例において述べるリポーター遺伝子アッセイを使用することにより、行うことができる。リポーター遺伝子アッセイにおいてＩＬ−６活性を機能的に阻害することを我々が示した最小ＤＮＡ配列は、阻害プラスミドｐＭ８ＳＶ由来の３５０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片であり、これにはＡＰＲＥＤＮＡ配列の８回繰り返し配列およびＳＶ４０初期プロモーター配列が含まれる。この後者の配列は、ＡＰ−１様部位（Ｚｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，５（２），ｐｐ．３８７−３９７，１９８６に記載されている）およびＳｐ−１部位の６回繰り返し配列（Ｄｙｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３５，ｐｐ．７９−８７，１９８３に記載されている）などの一般的転写因子に対する結合部位を含むことが知られている。ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのＤＮＡ断片は、たとえば２つのＡＰＲＥ配列およびＳＶ４０初期プロモーター由来の特異的転写因子に対する一つだけあるいはいくつかの結合部位を含むため、ＰＣＲまたは核酸分解酵素処理（Ａｕｓｕｂｅｌによる）などの従来からの方法により、その５’末端および／または３’末端を切断することができる。結果として得られたＤＮＡ配列は、ＨｅｐＧ２細胞におけるｐＳＶＭ８Ｌを基礎としたリポーター遺伝子アッセイの阻害試験のために使用することができる。
さらにＩＬ−６シグナルを機能的に阻害する完全な能力を有する最小ＤＮＡ断片は、このＤＮＡを末端標識法あるいはクレノー反応などの従来の方法で32Ｐヌクレオチドで標識することにより、ＥＭＳＡおいて使用することができる。結果として得られた標識ＤＮＡ断片は、ＩＬ−６処理の後ＨｅｐＧ２細胞から得られた核抽出物とインキュベートすることができる。
競争ＤＮＡ配列が増加することにより、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ阻害ＤＮＡ断片を上述した様に欠損させることにより得られた非標識ＤＮＡ断片のいずれかなどと共にインキュベートすることができる。インキュベーションの後、混合物は非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることができる。試験した標識ＤＮＡ断片に対する関連する転写因子の結合は、結合していない標識ＤＮＡについて予想されるゲル移動度のシフト（遅延）により示しうる。競争物である非標識ＤＮＡ配列の存在下におけるこの結合の阻害は、ゲル中のシフトしたバンドが特異的に消失することにより示しうる。
0004173539.tif 000004
0004173539.tif 000005
配列表
（１）全般的情報
（ｉ）出願人
（Ａ）名称：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＲＳ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｎ．Ｖ．
（Ｂ）街区（Ｓｔｒｅｅｔ）：６  Ｊｏｈｎ  Ｇｏｒｓｉｒａｗｅｇ
（Ｃ）市：Ｃｕｒａｃａｏ
（Ｅ）国：Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ａｎｔｉｌｌｅｓ
（Ｆ）郵便番号：なし
（ｉｉ）発明の名称：ＩＬ−６活性阻害剤
（ｉｉｉ）配列の数：６
（ｉｖ）コンピューター可読形式
（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ＃１．０，バージョン＃１．３０（ＥＰＯ）
（２）配列番号１
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の形態：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖型
（ｉｉ）分子のタイプ：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）条件：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１
0004173539.tif 000006
（２）配列番号２
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の形態：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖型
（ｉｉ）分子のタイプ：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）条件：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２
0004173539.tif 000007
（２）配列番号３
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の形態：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖型
（ｉｉ）分子のタイプ：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）条件：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｘｉ）配列の記載：配列番号３
0004173539.tif 000008
（２）配列番号４
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の形態：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖型
（ｉｉ）分子のタイプ：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）条件：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｘｉ）配列の記載：配列番号４
0004173539.tif 000009
（２）配列番号５
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の形態：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖型
（ｉｉ）分子のタイプ：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）条件：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｘｉ）配列の記載：配列番号５
0004173539.tif 000010
（２）配列番号６
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の形態：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖型
（ｉｉ）分子のタイプ：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）条件：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｘｉ）配列の記載：配列番号６
0004173539.tif 000011
【図１】
0004173539.tif 000013
【図２】
0004173539.tif 000014
【図３】
0004173539.tif 000015
【図４】
0004173539.tif 000016
【図５】
0004173539.tif 000017
【図６】
0004173539.tif 000018
【図７】
0004173539.tif 000019
【図８】
0004173539.tif 000020