(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを除く哺乳類の有郭乳頭付近の舌上皮細胞より、インテグリンβ１を発現する細胞を磁気カラムを用いて選抜すること、および、前記で選抜した細胞を、塩基性繊維芽細胞成長因子を含みカルシウム濃度が３．０〜７．０ｍｇ／ｍｌである培地で培養することを特徴とする舌上皮前駆細胞の単離増殖方法。
【請求項２】
哺乳類がマウスである請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、舌上皮前駆細胞の単離方法およびその分化誘導方法に関し、詳しくは舌上皮細胞より舌上皮前駆細胞を単離と培養する方法並びに該前駆細胞を上皮様細胞または神経様細胞に分化誘導する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
上皮細胞は、体の表面あるいは内腔の内面を覆っている組織であり、様々な種類の細胞の存在が知られており、例えば皮膚の表皮、腸の粘膜上皮や腹膜の上皮等がある。このうち、皮膚や小腸等の上皮については、該上皮前駆細胞や長期生存細胞を単離し、さらに培養したことが報告されている（Kunimura C. ら、Oncogene (1998) 17, 187-197)。
一方、表皮や上皮組織では、低親和性神経成長因子受容体やインテグリンβ４が特異的に発現している長期生存細胞が発見され、これらを指標として長期生存細胞を単離する方法が提案されている（特開２０００−４９００号公報）。
【０００３】
しかし、舌上皮細胞に関しては、舌の味細胞の培養方法についての報告があるが、僅か３日程度しか味細胞様の形態を維持できないことが知られている（Ann NY Acad. Sci. 1998, Nov. 30; 855: 1-13）。また、胎児舌の器官培養においても、７日間程度しか舌の形状を保つことができず、培養は非常に困難であることが知られている。舌上皮前駆細胞については、単離して培養したという報告は全くなく、長期生存細胞も同定されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
舌上皮細胞においては、長期生存細胞やインテグリンβ１を発現する上皮前駆細胞を培養することは困難であった。その理由は、舌上皮の上皮前駆細胞の細胞数が少なく、同定が困難であったこと、舌上皮を筋肉層から効率よく剥離し、その後舌上皮から舌上皮前駆細胞を効率よく単離することが難しいこと、さらに該前駆細胞を舌の上皮細胞および味細胞へ分化させる方法とそのことを確認する方法が確立されていないからであった。
本発明の目的は、第１に舌上皮細胞から該前駆細胞を単離・培養する方法を確立することであり、第２に該前駆細胞を上皮様細胞または神経様細胞に分化誘導する方法を確立することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、インテグリンβ１を発現する舌上皮前駆細胞を効率良く単離する方法を確立することに成功した。さらに、該舌上皮前駆細胞を培養するにあたり、舌上皮前駆細胞の培養上清を存在させると、味細胞の前駆細胞が多く含まれる部位からの舌上皮前駆細胞を増殖させることができ、この培養物から該味細胞前駆細胞を取得できることを見出した。このようにして得られた味細胞前駆細胞を含む舌上皮前駆細胞を、分化誘導因子を加えた培地で培養すると、舌上皮に存在する上皮様細胞もしくは味細胞を含む神経様細胞に分化誘導させることができることも判明した。
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００６】
請求項１記載の本発明は、ヒトを除く哺乳類の有郭乳頭付近の舌上皮細胞より、インテグリンβ１を発現する細胞を磁気カラムを用いて選抜すること、および、前記で選抜した細胞を、塩基性繊維芽細胞成長因子を含みカルシウム濃度が３．０〜７．０ｍｇ／ｍｌである培地で培養することを特徴とする舌上皮前駆細胞の単離増殖方法である。
請求項２記載の本発明は、哺乳類がマウスである請求項１記載の方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
請求項１記載の本発明は、上記したように、ヒトを除く哺乳類の有郭乳頭付近の舌上皮細胞より、インテグリンβ１を発現する細胞を磁気カラムを用いて選抜すること、および、前記で選抜した細胞を、塩基性繊維芽細胞成長因子を含みカルシウム濃度が３．０〜７．０ｍｇ／ｍｌである培地で培養することによって、舌上皮前駆細胞を単離増殖する方法である。
本発明の方法を適用することができる舌上皮細胞には特に制限がなく、例えばマウス、ラット、ブタ、ヒトをはじめとするあらゆる哺乳動物由来の細胞が挙げられる。
本発明に用いる舌上皮細胞としては、幹細胞およびtransit amplifying細胞を含むものが好ましい。これらの細胞を維持するための条件を採用することによって、舌上皮前駆細胞の培養系樹立が可能となる。
【０００８】
舌上皮前駆細胞の単離方法について、マウス舌上皮前駆細胞の場合を例として詳しく説明する。まず、マウスから舌を採取し、該舌から舌上皮細胞シートを調製する。本発明の方法においては、舌上皮細胞シート全体または有郭乳頭付近等の特定の部分を用いることもできる。
調製した舌上皮細胞シートから、上皮前駆細胞集団を分離するために、プロテアーゼを上皮直下に注射器で注入し、３０〜４０℃、好ましくは３７℃で１５〜４５分間、好ましくは３０分間程反応させることによって、筋肉に富んだ層から上皮層を分離させる。
【０００９】
このとき用いるプロテアーゼとしては、通常の組織培養に用いられるものであれば特に制限はないが、コラゲナーゼ、トリプシン、エラスターゼ等が好ましいものであり、これらの中から１種もしくは２種以上を適宜選択して用いることができる。中でも、基底膜に存在するコラーゲンタイプIVを分解するコラゲナーゼであるコラゲナーゼIV（フナコシ社製）およびエラスチンを分解するエラスターゼ（フナコシ社製）を組み合わせることが好ましい。
プロテアーゼの使用量は、５〜３０ｕｎｉｔｓ（２〜４ｍｇ）、好ましくは８〜１０ｕｎｉｔｓ（２〜３ｍｇ）である。なお、プロテアーゼとして、コラゲナーゼIVおよびエラスターゼを用いた場合の使用量の１例を示すと、コラゲナーゼIVは１０ｕｎｉｔｓ（２．５ｍｇ）、エラスターゼは８ｕｎｉｔｓ（２ｍｇ）である。
【００１０】
プロテアーゼ処理によって筋層から分離した舌上皮層よりピンセット等の器具を用いて上皮をシート状に剥がし、メス刃で細かく裁断する。上皮を裁断後、細胞を分散させるために、再度プロテアーゼ処理をする。このプロテーゼ処理は、プロテアーゼの溶解した酵素液に裁断した上皮細胞を浸漬し、３５〜４０℃、好ましくは３７℃で１０〜２０分間、好ましくは１５分間反応させることによって、細胞塊を１個ずつの細胞に分散させる。
このとき用いるプロテアーゼとしては、通常の組織培養に用いられるものであれば特に制限はないが、好適にはディスパーゼ等を用いることができる。ディスパーゼの使用量は、９００〜１０５０ｕｎｉｔｓ（３．０〜３．５ｍｇ）、好ましくは１０００ｕｎｉｔｓ（３．３ｍｇ）である。
【００１１】
続いて、剥がれて分散した１個ずつの上皮細胞を回収する。回収の方法は、常法によればよく、例えばピペッティングをして７０μｍ幅のセルストレイナーによって回収する。このようにして回収した舌上皮細胞は、氷冷したＰＢＳ（−）で数回、通常は３回リンスし、０．５〜２．０×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、好ましくは１．０×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＰＢＳ（−）に懸濁する。この懸濁液に、１〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは４μｇ／ｍｌの濃度となるように一次抗体であるビオチン標識抗インテグリンβ１抗体を加え、一定の振盪を与えながら舌上皮細胞と抗体とを２〜１０℃、好ましくは４℃で２０〜４０分間、好ましくは３０分間反応させる。
【００１２】
次に、一次抗体と反応させた舌上皮細胞をＰＢＳ（−）で数回、通常は３回洗浄し、これを再度ＰＢＳ（−）に懸濁し、舌上皮前駆細胞を含む舌上皮細胞懸濁液を得ることができる。
該懸濁液に、磁気ビーズ１０〜２０μｌ、好ましくは２０μｌを加え、６〜１２℃、好ましくは１０℃で１０〜２０分間、好ましくは１５分間反応させる。このとき用いる磁気ビーズは、抗体等を考慮して適宜選択することができるが、選択に要する時間の短縮のため、ストレプトアビジン−マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）が好ましいものである。
反応終了後、磁気ビーズの結合した舌上皮前駆細胞をＰＢＳ（−）で数回、通常は３回洗浄した後、磁気細胞分離システム、すなわちバリオＭａｃｓ磁気装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）にＲＳ＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を装着したものに、該細胞をロードする。
該細胞をロードしたカラムをＰＢＳ（−）で数回、通常は３回洗浄した後、カラムを磁気装置から離し、抗体でトラップされた舌上皮前駆細胞をＰＢＳ（−）で溶出する。このとき用いるＰＢＳ（−）の量は１〜１．５ｍｌ、好ましくは１ｍｌが適当である。
この溶出液には、インテグリンβ１陽性細胞集団である舌上皮前駆細胞のみが含まれていることになる。
【００１３】
次に、上記手法によって単離した上皮前駆細胞を培養する方法について説明する。
まず、単離した舌上皮前駆細胞を２〜１０×１０4 個、好ましくは５×１０4 個となるように調製し、これを下記の組成を有する培地（ＭＣＤＢ基本培地）２０〜１００μｌ、好ましくは５０μｌに懸濁する。このとき用いる培地のカルシウム濃度は３．０〜７．０ｍｇ／ｍｌが適当で、５．０ｍｇ／ｍｌが好ましい。
その懸濁液をドロップレットとして、直径３ｃｍ程度の培養皿の上に設置し、炭酸ガスインキュベーター内で１５〜１８０分間、好ましくは３０分間の培養を行う。次いで、舌上皮前駆細胞の前培養液に、さらに下記の組成を有する培地（ＭＣＤＢ基本培地）１〜３ｍｌ、好ましくは２ｍｌを加え、３５〜３８℃、好ましくは３７℃で１〜３週間、好ましくは２週間の培養を行う。
【００１４】
培地：ＭＣＤＢ１５３基本培地（Ｃａ濃度は、５．０ｍｇ／ｍｌ）
上皮細胞成長因子          最終濃度      １０ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子  最終濃度      １０ｎｇ／ｍｌ
インシュリン              最終濃度      ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン          最終濃度      １０μｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン                        ０．５μｇ／ｍｌ
エタノールアミン                        ０．５μＭ
ホスホエタノールアミン                  ０．５μＭ
透析された牛胎児血清      最終濃度      ０．５％
【００１５】
上記の培養によって取得した味細胞前駆細胞を含む舌上皮前駆細胞を、適当な分化誘導因子を添加した培地にて培養することによって、上皮様細胞あるいは神経様細胞に分化誘導することができる。
上記の舌上皮前駆細胞を上皮様細胞に分化させる場合には、分化誘導因子としてカルシウムを培地に添加する。すなわち、上記の培地に、分化誘導因子としてカルシウムを０．１〜２．０ｍＭ、好ましくは１ｍＭを添加し、さらに２〜５日間、好ましくは３日間培養を続けることにより、上皮様細胞に分化誘導させることができる。なお、カルシウムの添加濃度が上限を超えた場合は、細胞死を誘導するため好ましくない。また、下限に満たない場合は、上皮様細胞に分化できないため好ましくない。上皮様細胞に分化させる場合に用いることができる培地の組成を、以下に示す。
【００１６】
（分化誘導因子としてカルシウムを添加する場合の培地）
培地：ＭＣＤＢ１５３高カルシウム培地（Ｃａ濃度は、１１．８ｍｇ／ｍｌ（０．１４５ｍＭ））
上皮細胞成長因子          最終濃度      １０ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子  最終濃度      １ｎｇ／ｍｌ
インシュリン              最終濃度      ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン          最終濃度      １０μｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン                        ０．５μｇ／ｍｌ
エタノールアミン                        ０．５μＭ
ホスホエタノールアミン                  ０．５μＭ
透析された牛胎児血清      最終濃度      ０．５％
なお、カルシウムはＣａＣｌ2 の溶液として用いた。
【００１７】
舌上皮前駆細胞が上皮様細胞へ分化したことの確認については、常法によって行うことができるが、下記にその１例を示す。すわちち、０．１％トライトンＸ−１００等の界面活性剤と４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で分化させた細胞を固定後、抗β−カテニン抗体と抗Ｅ−カドヘリン抗体等の抗体を用いて免疫染色することによって確認することができる。
β−カテニンは、細胞間の接着分子であるカドヘリンの細胞内領域に結合するタンパク質である。Ｅ−カドヘリンは、上皮細胞等に存在するカドヘリン・スーパーファミリーに属する細胞接着因子であり、カルシウム依存的にＥ−カドヘリン同士が結合することが知られている。これらは、共に上皮細胞のマーカーとして用いられているタンパク質である。
【００１８】
また、単離した舌上皮前駆細胞を神経様細胞に分化させる場合には、培地に分化誘導因子としてレチノイン酸を添加する。すなわち、前記した培地に、分化誘導因子としてレチノイン酸を１〜５μＭ、好ましくは２μＭを添加して３日間培養し、さらにレチノイン酸のみを抜いて３〜１４日間、好ましくは５〜１０日間培養を続けることにより、神経様細胞に分化させることができる。レチノイン酸の添加濃度が上限を超えた場合は、細胞死を誘導するため好ましくない。また、下限に満たない場合は、分化が十分に行われないため好ましくない。
さらに、舌上皮前駆細胞を単離する際に、舌上皮細胞シートのうち味細胞前駆細胞が多く含まれている有郭乳頭付近等の特定の部分を用いた場合には、味細胞等に分化させることができる。神経様細胞に分化させる場合に用いることができる培地の組成を、以下に示す。
【００１９】
（分化誘導因子としてレチノイン酸を添加する場合の培地）
培地：ＭＣＤＢ１５３神経分化培地（Ｃａ濃度は、５．０ｍｇ／ｍｌ）
上皮細胞成長因子          最終濃度      １０ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子  最終濃度      １ｎｇ／ｍｌ
アクチビン                最終濃度      ５ｎｇ／ｍｌ
インシュリン              最終濃度      ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン          最終濃度      １０μｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン                        ０．５μｇ／ｍｌ
エタノールアミン                        ０．５μＭ
ホスホエタノールアミン                  ０．５μＭ
レチノイン酸                            ０．６μｇ／ｍｌ（２μＭ）
透析された牛胎児血清      最終濃度      ０．１％
【００２０】
神経様細胞への分化の確認についても、上皮様細胞の場合と同様に、常法によって行うことができる。以下に、その１例を示す。すなわち、培養後に０．１％トライトンＸ−１００等の界面活性剤及び４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で細胞を固定後、抗神経中間系フィラメント抗体と抗脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネル抗体等の抗体を用いて免疫染色することによって確認することができる。なお、神経中間系フィラメントおよび脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネルは、共に神経細胞のマーカーとして用いられているタンパク質である。
【００２１】
図１は、本発明に係る舌上皮前駆細胞の単離方法および単離した上皮前駆細胞の培養方法の１例のフローチャートを示したものである。すなわち、コラゲナーゼIV（フナコシ社製）とエラスターゼ（フナコシ社製）による処理を行って舌より剥がした舌上皮シートを、さらに細かく裁断してから、ディスパーゼ処理により細胞を１個ずつに分散させる。
ここに、ビオチン標識した抗インテグリンβ１抗体とストレプトアビジン磁気ビーズを添加して、インテグリンβ１を発現する細胞を磁場により選択して、培養を行う。この培養細胞は、培養液中にカルシウムを加えると、上皮様に分化し、レチノイン酸を加えると、神経様に分化した。
【００２２】
【実施例】
以下において、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（抗インテグリンβ１抗体による舌上皮前駆細胞の検出）
舌上皮前駆細胞の検出は、マウスから採取した舌から摘出した有郭乳頭付近の組織を、抗インテグリンβ１抗体（ベクトンディッキンソン社製）を用いて免疫染色することによって行った。
誕生４日後のマウスから舌を摘出し、この舌から有郭乳頭付近をメス刃で切除した後、直ちに凍結切片作製用の試薬であるＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラ精器製）０．５ｍｌ中で急速凍結した。この後、クライオセクションＣＭ１８５０（ライカ社製）を用いて１０μｍの凍結切片を作製した。
【００２３】
切片（１０μｍ）を乗せたスライドグラスを、０．１％トライトンＸ−１００（半井社製）と４％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で２０分間室温にて固定した。
固定後、５％ヤギ血清（ケミコン社製）を含むＰＢＳ（−）を用い室温で２時間ブロッキング処理し、一次抗体である抗インテグリンβ１抗体（ベクトンディッキンソン社製）０．４μｇ／ｍｌと４℃で一晩反応させた。
固定化した切片と抗体との反応終了後、余分な抗インテグリンβ１抗体を０．０５％ツウィーン２０（半井社製）を含むＰＢＳ（−）で数回洗い流した。
次に、一次抗体の結合した固定された切片と蛍光色素であるＣｙ３で標識された抗ハムスター二次抗体（ジャクソンラボ社製）１．２５μｇ／ｍｌとを、室温にて１時間反応させた。反応終了後、余分な二次抗体を上記と同様の０．０５％ツウィーン２０を含むＰＢＳ（−）で洗い流し、蛍光顕微鏡ＤＭＲＩＢ（ライカ社製）で観察した。図２は、抗インテグリンβ１抗体を用いて有郭乳頭付近の組織を免疫染色した場合の蛍光顕微鏡像の写真である。
【００２４】
図２の蛍光顕微鏡像から明らかように、生後４日目の有郭乳頭付近では、抗インテグリンβ１抗体は基底膜および膜より上層部のtransit amplifying細胞が存在すると考えられる部位を認識していた。このことから、インテグリンβ１発現細胞が該部位に存在することが強く示唆された。
【００２５】
実施例２（抗インテグリンβ１抗体による舌上皮前駆細胞の単離と培養）
マウス舌上皮前駆細胞の単離と、単離した該細胞の培養は、以下の方法によって実施した。
（１）舌上皮前駆細胞の単離
実施例１と同様に、生後８−１２週齢のマウスから舌を摘出し、これからシート状の上皮組織を作製し、舌上皮前駆細胞集団を抗インテグリンβ１抗体を用いて選抜した。すなわち、１０ｕｎｉｔｓ（２．５ｍｇ）のコラゲナーゼIV（フナコシ社製）と８ｕｎｉｔｓ（２ｍｇ）のエラスターゼ（フナコシ社製）を上皮直下に注射器で注入し、３７℃で３０分間反応させた。
【００２６】
続いて、上記の処理をした舌上皮をピンセットでシート状に剥がし、メス刃で細かく裁断した後、さらに１０００ｕｎｉｔｓ（３．３ｍｇ）のディスパーゼ（三光純薬社製）を加えて、３７℃で１５分間反応させた。
反応終了後、数回ピペッティングを行い、剥がれた１個ずつの細胞を７０μｍ幅のセルストレーナー（ベクトンディキンソン社製）により回収した。こうして回収した舌上皮細胞は、氷冷したＰＢＳ（−）で３回リンスし、１．０×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＰＢＳ（−）に懸濁した。
【００２７】
この懸濁液に、４μｇ／ｍｌの濃度となるようにビオチン標識抗インテグリンβ１抗体（ベクトンディッキンソン社製）を加え、舌上皮細胞と抗体とを一定の振盪条件下に４℃で３０分間反応させた。
次に、抗体と反応させた舌上皮前駆細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、これをＰＢＳ（−）８０μｌに懸濁し、舌上皮前駆細胞懸濁液を得た。該懸濁液に、磁気ビーズであるストレプトアビジン−マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）２０μｌを加え、１０℃で１５分間反応させた。
【００２８】
反応終了後、バリオＭａｃｓ磁気装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）にＲＳ＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を装着し、該細胞をロードした。
該細胞をロードしたカラムは、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、カラムを磁気装置から離し、抗体でトラップされた舌上皮前駆細胞をＰＢＳ（−）５００μｌにて溶出した。この溶出液に、インテグリンβ１陽性細胞集団である舌上皮前駆細胞のみが含まれていることを間接免疫抗体法による免疫染色にて確認した。
【００２９】
（２）単離された舌上皮前駆細胞の培養
上記（１）で単離された舌上皮前駆細胞の培養を以下の方法で行った。すなわち、上記（１）で単離された舌上皮前駆細胞を５×１０4 個となるように調整し、これを下記の組成を有する培地５０μｌに懸濁した。その懸濁液をドロップレットとして、直径３５ｍｍの培養皿の上に設置し、炭酸ガスインキュベーター内で３０分間の培養を行った。次いで、舌上皮前駆細胞の前培養液に、さらに下記の組成を有する培地２ｍｌを加えて、３７℃にて２週間の培養を行った。
【００３０】
培地：ＭＣＤＢ１５３基本培地（Ｃａ濃度は、５．０ｍｇ／ｍｌ）
上皮細胞成長因子          最終濃度      １０ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子  最終濃度      １０ｎｇ／ｍｌ
インシュリン              最終濃度      ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン          最終濃度      １０μｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン                        ０．５μｇ／ｍｌ
エタノールアミン                        ０．５μＭ
ホスホエタノールアミン                  ０．５μＭ
透析された牛胎児血清      最終濃度      ０．５％
【００３１】
２週間の培養後、培養した舌上皮前駆細胞をメタノールで固定した。固定後、５％ヤギ血清を含むＰＢＳ（−）で室温にて２時間処理し、０．４μｇ／ｍｌの濃度となるように調製した一次抗体である抗インテグリンβ１抗体（ベクトンディッキンソン社製）と４℃で一晩反応させた。
反応終了後、舌上皮前駆細胞を０．０５％ツウィーン２０を含むＰＢＳ（−）で３回洗浄した。洗浄後、蛍光色素であるＣｙ３で標識された抗ハムスター二次抗体（ジャクソンラボ社製）１．２５μｇ／ｍｌと室温で１時間反応させた。その後、余分な二次抗体を０．０５％ツウィーン２０を含むＰＢＳ（−）で洗い流してから、蛍光顕微鏡ＤＭＲＩＢ（ライカ社製）で観察した。図３Ａは、舌上皮前駆細胞を透過光で撮影した顕微鏡像の写真である。また、蛍光を撮影した顕微鏡像の写真を図３Ｂに示す。
【００３２】
図３Ａは、透過光で撮影した顕微鏡像の写真であり、細胞の形態を明確に識別することができる。また、図３Ｂは、同一視野のＣｙ３で染色した蛍光顕微鏡像の写真であり、培養細胞はインテグリンβ１を発現していることが分かる。
【００３３】
実施例３（上皮前駆細胞のカルシウム添加による上皮様細胞への分化）
実施例２（２）に示したＭＣＤＢ１５３基本培地に、分化誘導因子として１ｍＭのカルシウムを添加し、この培地に実施例２（２）で得た培養細胞を接種し、さらに３日間培養を続けた。なお、対照として、分化誘導因子であるカルシウムを添加しなかったこと以外は同じ条件で培養した。
培養終了後、０．１％トライトンＸ−１００（半井社製）と４％パラホルムアルデヒド（シグマ社製）を含むＰＢＳ（−）で細胞を固定したのち、抗β−カテニン抗体（ベクトンディッキンソン社製）と抗Ｅ−カドヘリン抗体（タカラ社製）を用いて免疫染色した。図４は、カルシウム添加の有無による抗β−カテニン抗体と抗Ｅ−カドヘリン抗体による免疫染色の結果を示した写真である。
【００３４】
図４から明らかなように、分化誘導因子であるカルシウムを培養液に添加しないで培養を行った場合、β−カテニンおよびＥ−カドヘリンの細胞膜で発現量は共に低かった。
これに対して、分化誘導因子として１ｍＭのカルシウムを添加して培養した場合は、β−カテニンとＥ−カドヘリンの細胞膜、特に細胞と細胞とが接している部位への両タンパク質の局在が認められ、形態的にも上皮様細胞に分化していることが明らかとなった。
【００３５】
実施例４（舌上皮前駆細胞のレチノイン酸添加による神経様細胞への分化）
実施例２（２）に示したＭＣＤＢ１５３分化培地に、分化誘導因子として２μＭのレチノイン酸（和光純薬社製）を添加し、この培地に実施例２（２）で得た培養細胞を接種して３日間培養を続けた。
さらに、以下の培地を用いて７日間培養を続けた。なお、対照として、分化誘導処理しないものについても同様に実施した。
【００３６】
培地：ＭＣＤＢ１５３神経分化培地（Ｃａ濃度は、５．０ｍｇ／ｍｌ）
上皮細胞成長因子          最終濃度        １０ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子  最終濃度        １ｎｇ／ｍｌ
アクチビン                最終濃度        ５ｎｇ／ｍｌ
インシュリン              最終濃度        ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン          最終濃度        １０μｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン                          ０．５μｇ／ｍｌ
エタノールアミン                          ０．５μＭ
ホスホエタノールアミン                    ０．５μＭ
透析された牛胎児血清      最終濃度        ０．１％
【００３７】
７日間および１４日間の培養を続けた後に、０．１％トライトンＸ−１００（半井社製）と４％パラホルムアルデヒド（シグマ社製）を含むＰＢＳ（−）で細胞を固定後、抗神経中間系フィラメント抗体（ケミコン社製）と抗脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネル抗体（ケミコン社製）を用いて免疫染色した。図５は、レチノイン酸添加の有無による抗神経中間系フィラメント抗体と抗脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネル抗体による免疫染色の結果を示した顕微鏡写真である。
【００３８】
図５から明らかなように、通常の培養条件の場合には、神経細胞のマーカーである神経中間系フィラメントと脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネルの発現レベルは低かった。
これに対して、分化誘導因子であるレチノイン酸を添加した分化培地で培養した場合には、神経中間系フィラメントと脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネルがいずれも、より顕著に発現が上昇していた。このことから、培地に分化誘導因子としてレチノイン酸を添加した神経分化培地で舌上皮前駆細胞を培養することによって、神経様細胞に分化することが明らかとなった。
【００３９】
実施例５（培養上清存在下での特定部位由来の舌上皮前駆細胞の培養と分化）
生後４週齢のマウスより得た舌上皮細胞シートから、有郭乳頭付近の部位を鋏で切り出した。次に、該部位をマトリゲル（ベクトンディッキンソン社製）でコートした３５ｍｍディッシュを用いて、炭酸ガスインキュベーター内で３７℃で２週間培養した。このとき用いた培地は、実施例２（２）で使用した培地に、実施例２において舌上皮前駆細胞の培養で得た培養上清を該培地の１／３〜１／１０量を加えたものである。
【００４０】
続いて、実施例４と同様に、分化誘導因子としてレチノイン酸を添加した培地を用いて上記の舌上皮前駆細胞を培養し、分化誘導を行った。培養終了後、０．１％トライトンＸ−１００と４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で、分化した細胞を固定した。固定化した細胞について、味細胞で特異的に発現することが知られているガストデューシンの発現の有無を、抗ガストデューシン抗体（サンタクルス社製）を用いた免疫染色を以下のように行った。すなわち、培養した細胞を、内在性のペルオキシダーゼの活性を抑えるために０．３％ヒドロキシルペルオキシドを含むメタノールで２５℃で３０分間処理し、その後０．２％トゥイン２０を含むＰＢＳで５分間洗浄した。洗浄後、５％正常ウサギ血清を含むブロッキング試薬で２５℃にて２時間処理し、抗ガストデューシン抗体と４℃で一晩反応させた。続いて、ビオチン標識化された二次抗体と２５℃で３０分間反応させた後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンと２５℃で１０分間反応させた。反応終了後、３,３’−ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）、１ｎＭ  ヒドロキシルペルオキシドを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で染色した。
【００４１】
また、分化誘導前の細胞およびレチノイン酸を添加して分化誘導した細胞を試料として用い、これらから常法によってＲＮＡを抽出し、これを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことによって、ｍＲＮＡレベルでのガストデューシンの発現の有無を確認した。まず、１μｇのトータルＲＮＡから、以下のようにして、Preamplification kit (Gibco 社、18089-011)を用いてｃＤＮＡを合成した。１μｇの oligo(dT)とトータルＲＮＡを混合し、７０℃で１０分間インキュベートした後、１分間氷冷を行った。これにＰＣＲバッファー  ２μｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ2 ２μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰmix １μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  １μｌを加え、４２℃で１５分間加熱した。ここに、１μｌのSuperscript II Reverse Transcriptaseを加え、４２℃で５０分間反応させた。次いで、７０℃で１５分間加熱して酵素を失活させた後、室温に戻して１μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｈを加えて、３７℃で２０分間反応させた。得られた反応液２μｌに、２μｌ  １０×ＰＣＲバッファー、２μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰmix 、１μｌ  ガストデューシン  プライマー  セット、１μｌ  Taq ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）１μｌを加え、９４℃  １分間（変性）、５５℃  １分間（アニーリング）、７２℃  １分間（伸長）を３５サイクル行ってＤＮＡを増幅させて、その５μｌを電気泳動に供した。
【００４２】
結果を図６に示す。この図は、特定部位由来の舌上皮前駆細胞における抗ガストデューシン抗体で免疫染色の結果を示した顕微鏡写真である。また、図７は、ＲＴ−ＰＣＲを行った試料についての電気泳動写真である。図中、レーン１は有郭乳頭付近の細胞、２は分化誘導前の細胞、３は分化誘導後の細胞を示す。
【００４３】
図６から明らかなように、培養細胞の一部の細胞質が染色されていることから、特定部位由来の舌上皮前駆細胞を用いても、分化誘導因子であるレチノイン酸を培地に添加することにより、味細胞に特異的なガストデューシンを発現する神経様細胞に分化誘導できることが明らかとなった。
また、図７から明らかなように、味細胞で特異的に発現するガストデューシンｍＲＮＡは、レチノイン酸を培地に添加した場合に発現しており、このことからもレチノイン酸添加により味細胞に分化している細胞が誘導されたことは明らかである。
【００４４】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、従来は困難であった舌上皮細胞および味細胞の前駆細胞を培養することが可能となる。また、本発明の方法により、味細胞の分化過程を経時的に詳細に解析することが可能となると同時に、分化途上の味細胞および分化した味細胞を長期間に渡って維持することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  舌上皮細胞から、免疫磁気ビーズにより上皮前駆細胞を単離、培養する本発明の流れを示したフローチャートである。
【図２】  実施例１において、抗インテグリンβ１抗体を用いて免疫染色を行った場合の蛍光顕微鏡像の写真である。
【図３】  実施例２において、培養した舌上皮前駆細胞を撮影した顕微鏡像の写真である。図中のＡは、磁気ビーズにより選択された培養細胞の顕微鏡の透過像、Ｂは選択に用いた抗インテグリンβ１抗体によりＡの培養細胞を免疫染色した顕微鏡像である。
【図４】  実施例３のカルシウム添加の有無において、抗β−カテニン抗体と抗Ｅ−カドヘリン抗体で免疫染色した顕微鏡像の写真であり、各タンパク質が発現していることを示している。図中、Ａは抗β−カテニン抗体を用い通常の低カルシウムで培養したもの、Ｂは抗Ｅ−カドヘリン抗体を用い通常の低カルシウムで培養したもの、Ｃは抗β−カテニン抗体を用いカルシウムを添加して培養したもの（本発明）、Ｄは抗Ｅ−カドヘリン抗体を用いカルシウムを添加して培養したもの（本発明）をそれぞれ示す。
【図５】  実施例４のレチノイン酸添加の有無において、抗神経中間系フィラメント抗体と抗脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネル抗体で免疫染色した顕微鏡像の写真であり、各タンパク質が発現していることを示している。図中、Ａは基本培地で培養したものを抗神経中間系フィラメント抗体で染色したもの（本発明）、Ｂは基本培地で培養したものを抗脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネル抗体で染色したもの、Ｃは基本培地にレチノイン酸を添加して培養したものを抗神経中間系フィラメント抗体で染色したもの（本発明）、Ｄは基本培地にレチノイン酸を添加して培養したものを抗脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネル抗体で染色したもの（本発明）をそれぞれ示す。
【図６】  実施例５において、特定部位由来の舌上皮前駆細胞における抗ガストデューシン抗体で免疫染色の結果を示した顕微鏡写真である。
【図７】  実施例５において、ＲＴ−ＰＣＲを行った各試料についての電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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