(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ＫＳＭ  Ｔ６４５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１８２）を用い、濃度０．３Ｍ以上０．５Ｍ以下でｐＨ７．２５〜７．５のリン酸緩衝液の存在下、パルミチン酸イソプロピルを該菌体に作用させるシス−６−ヘキサデセン酸イソプロピルの製造法。
【請求項２】
ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ＫＳＭ  Ｔ６４５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１８２）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を用いる不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
不飽和脂肪酸又はその誘導体は、香料、薬剤、塗料、界面活性剤、化粧品等として、或いはこれらの合成原料として広く利用されている。
微生物を利用した不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造には、これまでエキノスポラジウム（Echinosporangium）属細菌（特許第２７１０３４４号公報）、モルテイエレラ（Mortierella）属細菌（特開昭６０−２５９１９２号公報）を用いる発酵法等が知られているが、何れも収量が低く、反応時間も長く、また菌体内に不飽和脂肪酸を蓄積するため回収が困難であるという問題があった。
【０００３】
また、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌により、不飽和脂肪酸又はその誘導体が菌体外に生産されることも報告されているが（特公平２−６５１６号公報、特公平４−１２７１８号公報）、その生産性及び純度は十分であるとはいえなかった。
【０００４】
本発明は、微生物により不飽和脂肪酸又はその誘導体を生産する方法であって、菌体外生産ができ、その生産量がより高く、且つ高純度で生産できる方法及びこれに用いる不飽和脂肪酸生産菌を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、不飽和脂肪酸又はその誘導体を効率よく生産する微生物及び生産条件を種々検討したところ、ロドコッカス属に属する不飽和脂肪酸生産菌が特定の濃度及びｐＨをもつリン酸緩衝液の存在下で増殖と連動して不飽和脂肪酸又はその誘導体を高濃度且つ高純度で培地中に生産することを見出した。
【０００６】
すなわち本発明は、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ＫＳＭ  Ｔ６４５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１８２）を用い、濃度０．３Ｍ以上０．５Ｍ以下でｐＨ７．２５〜７．５のリン酸緩衝液の存在下、パルミチン酸又はパルミチン酸イソプロピルを該菌体に作用させるシス−６−ヘキサデセン酸又はシス−６−ヘキサデセン酸イソプロピルの製造法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の製造法において用いられる不飽和脂肪酸生産菌としては、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属し、飽和脂肪酸から不飽和脂肪酸を生産する能力を有するものであればよく、例えばロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ＫＳＭ−Ｂ−３Ｍ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ１５３１）や、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ＫＳＭ−Ｔ６４５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１８２）等が挙げられる。このうち、不飽和脂肪酸の生産量の点からロドコッカス・エスピーＫＳＭ−Ｔ６４５株が特に好ましい。ロドコッカス・エスピーＫＳＭ−Ｔ６４５株は、ロドコッカス・エスピーＫＳＭ−Ｂ−３Ｍ株に紫外線を照射して得られた新規な変異株であり、以下の菌学的性質を有する。
【０００８】
（Ａ）形態
桿菌で、細胞は多形性で、若い培養では短桿状、古い培養では球状となる。大きさは０．５〜０．８μｍ×１．０〜５．０μｍである。
【０００９】
（Ｂ）生理学的性質
▲１▼生育範囲
温度：５〜３７℃（最適２５〜３５℃）
pH：  ５〜９．５（最適６〜８）
▲２▼グラム染色：陽性
▲３▼ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地）：陰性
▲４▼スターチの加水分解（スターチ寒天培地）：陰性
▲５▼脱脂牛乳凝固、ペプトン：共に陰性
▲６▼メラニン様色素の生成（チロシン培地、ペプトン・イースト・鉄培地）：陰性
【００１０】
（Ｃ）炭素源の資化性
▲１▼Ｌ−アラビノース    ＋
▲２▼Ｄ−キシロース      ＋
▲３▼Ｄ−グルコース      ＋
▲４▼Ｄ−フラクトース    ＋
▲５▼シュークロース      ＋
▲６▼イノシトール        ＋
▲７▼Ｌ−ラムノース      ＋
▲８▼Ｄ−マンニトール    ＋
【００１１】
（Ｅ）化学的分類学的性質
▲１▼グルコリルテスト：グリコリル型
▲２▼メナキノン  システム：ＭＫ−８（Ｈ2）
【００１２】
以上の菌学的性質を、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology第９巻（１９９４年）に基づき検索した結果、ロドコッカス属に属する細菌と認められたため、本菌株をロドコッカス・エスピーＫＳＭ−Ｔ６４５と命名した。この菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１８１８２として寄託されている。
【００１３】
本発明の製造法において、原料として用いられる脂肪酸としては、炭素数１〜２２、好ましくは１４〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられ、その誘導体としては当該脂肪酸のアルキル（炭素数１〜１０、好ましくは２〜４）若しくはアリールエステル、第１級若しくは２級アンモニウム塩又はアルカリ金属塩が挙げられる。
このうち、ｎ−ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ｎ−テトラデカン酸（ミリスチン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）これら脂肪酸のメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等の各エステル、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等が好ましい。
【００１４】
斯かる脂肪酸又はその誘導体は、本発明の反応によれば、脂肪酸の炭化水素鎖の特定の位置に不飽和結合が導入された不飽和脂肪酸又はその誘導体に変換される。
例えば、パルミチン酸又はそのエステルを原料として用いれば、シス−６−ヘキサデセン酸を主生成物として得ることができる。
【００１５】
本発明の製造法は、濃度０．２５Ｍ以上でｐＨ７．２〜９のリン酸緩衝液又は濃度０．３Ｍ以上でｐＨ７．０〜９のリン酸緩衝液の存在下、脂肪酸又はその誘導体を微生物菌体に作用させ、不飽和脂肪酸又はその誘導体を反応液中に生成させるものである。
微生物菌体の取得は、通常の微生物の培養方法によればよく、培養に際して用いられる培地、ｐＨ、温度、培養時間等については当該菌株が十分に生育するものであればいずれの条件でもよい。好ましくは、３０℃で１〜２日間、好気的に培養するのがよい。
【００１６】
反応は、得られた培養液をそのまま、或いは培養液から菌体を遠心分離等の方法により回収後、濃度０．２５Ｍ以上でｐＨ７．２〜９のリン酸緩衝液又は濃度０．３Ｍ以上でｐＨ７．０〜９のリン酸緩衝液に懸濁させ、これに脂肪酸又はその誘導体を添加して行われる。
【００１７】
ここで、菌体培養液又は菌体は、反応液に対して０．１〜１０％、特に０．５〜５％用いることが好ましく、脂肪酸又はその誘導体は、１〜３０％、特に１０〜２５％であることが好ましい。
【００１８】
本発明においては、濃度０．２５Ｍ以上でｐＨ７．２〜９のリン酸緩衝液又は濃度０．３Ｍ以上でｐＨ７．０〜７．２のリン酸緩衝液が用いられる。
ｐＨ７．０未満或いは濃度が０．２５未満であると、効率よく不飽和化することができず、ｐＨが９を超えると微生物が増殖できない。斯かる効果の点から、濃度０．２５Ｍ以上でｐＨ７．２〜９であるものが好ましく、特に濃度０．３〜０．５Ｍで、ｐＨ７．２〜８であるものが好ましい。
【００１９】
また、リン酸緩衝液としては、いずれの対イオンを有するものでもよいが、リン酸１ナトリウム−リン酸２カリウム又はリン酸１カリウム−リン酸２カリウムが好ましい。
【００２０】
当該反応液中には、菌体の増殖を妨げない限り、更に硫酸マグネシウム塩、硫酸鉄塩、窒素源、ビタミン類等を添加することができる。尚、この場合、硫酸マグネシウム塩は０．００５〜１％、好ましくは０．０１〜０．５％、硫酸鉄塩は１〜１００ppm、好ましくは５〜５０ppmで添加することが好ましい。
【００２１】
反応は２０〜３７℃、好ましくは２５〜３０℃の温度条件で、好気的条件下に４８〜１２０時間、特に６０〜９６時間行うことが好ましい。
【００２２】
かくして反応液中に生成した不飽和脂肪酸又はその誘導体は、天然有機化合物等で通常行われている抽出・単離方法により、容易に回収・分離できる。例えば反応液を遠心分離により菌体・油相・水相に分けて油相を分取したり、或いは反応液をそのまま有機溶剤で抽出することにより極めて簡便に目的物を回収できる。
また、この反応により高純度の目的物が回収できるが、さらに精製する必要のある場合は通常のカラムクロマトグラフィー、分配抽出、溶媒晶析等により精製単離が可能である。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
ＳＣＤ培地（日本製薬株式会社製）２０mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、３０℃にて１日間培養を行った。この培養液０．４mLを、ＭＳＧ（グルタミン酸ナトリウム）２０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）４．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５mg、ＭｎＳＯ4・６Ｈ2Ｏ  ０．６mg、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２mgを、０．３５Ｍ  リン酸緩衝液（pH７．２５）１Ｌに溶解した培地２０mL及びパルミチン酸イソプロピル３．８mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、２６℃にて４日間、２１０rpmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物（シス−６−ヘキサデセン酸イソプロピル）を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は５１ｇ／Ｌ、反応液中の全油中のシス−６−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は８０．５％であった（表１）。
【００２４】
実施例２
ＳＣＤ培地（日本製薬株式会社製）２０mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、３０℃にて１日間培養を行った。この培養液０．４mLを、ＭＳＧ（グルタミン酸ナトリウム）２０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）３ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５mg、ＭｎＳＯ4・６Ｈ2Ｏ  ０．６mg、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２mgを、０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２５又は７．５）１Ｌに溶解した培地２０mL及びパルミチン酸イソプロピル４．４mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、２６℃にて４日間、２１０rpmにて振盪培養及び反応を行った。反応後、反応液に含まれる主生成物（シス−６−ヘキサデセン酸イソプロピル）を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は４８．５ｇ／Ｌ、反応液中の全油中のシス−６−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は７０．９％であった（表１）。
【００２５】
実施例３
ＳＣＤ培地（日本製薬株式会社製）２０mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、３０℃にて１日間培養を行った。この培養液０．４mLを、ＭＳＧ（グルタミン酸ナトリウム）２０ｇ、酵母エキス（アサヒビール社製）８．０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５mg、ＭｎＳＯ4・６Ｈ2Ｏ  ０．６mg、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２mgを、０．３５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．２５又は７．５）１Ｌに溶解した培地２０mL及びパルミチン酸イソプロピル４．４mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、２６℃にて４日間、２１０rpmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物（シス−６−ヘキサデセン酸イソプロピル）を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は各々のpHで５８．７ｇ／Ｌ、４８．９ｇ／Ｌ、反応液中の全油中のシス−６−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は７３．８％、７９．３％であった（表１）。
【００２６】
実施例４
ＳＣＤ培地（日本製薬株式会社製）２００mLを入れた２L容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、３０℃にて１日間培養を行った後。この培養液すべてを、ＭＳＧ（グルタミン酸ナトリウム）２０ｇ、酵母エキス（アサヒビール社製）７．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５mg、ＭｎＳＯ4・６Ｈ2Ｏ  ０．６mg、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２mgを、０．３５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．２５）に溶解した培地１２．５Ｌ及びパルミチン酸イソプロピル２．７５Ｌを入れた３０Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、２６℃にて４日間、３５０rpm、０．５vvmにて通気攪拌培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物（シス−６−ヘキサデセン酸イソプロピル）を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は４５．０ｇ／Ｌ、反応液中の全油中のシス−６−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は７５．０％であった（表１）。
【００２７】
実施例５
ＳＣＤ培地（日本製薬株式会社製）２０mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-B-3Mを接種し、３０℃にて１日間培養を行った。後、この培養液０．４mLを、ＭＳＧ  ２０ｇ、酵母エキス（Difco社製）３ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５mg、ＭｎＳＯ4・６Ｈ2Ｏ  ０．６mg、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２mgを、０．３Ｍ  リン酸バッファー（pH７．５）１Ｌに溶解した培地２０mL及びパルミチン酸イソプロピル４．４mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、２６℃にて４日間、２１０rpmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物（シス−６−ヘキサデセン酸イソプロピル）を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は４７．０ｇ／Ｌ、反応液中の全油中のシス−６−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は６８．５％であった（表２）。
【００２８】
実施例６
ＳＣＤ培地（日本製薬株式会社製）２mLを入れたφ２２×１９５mm試験管にRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、３０℃にて１日間培養を行った。後、この培養液７０μＬを、ＭＳＧ  ２０ｇ、酵母エキス（Difco社製）３ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５mg、ＭｎＳＯ4・６Ｈ2Ｏ  ０．６mg、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２mgを、０．２５Ｍ  Ｋ，Ｋ２リン酸バッファー（pH７．０）１Ｌに溶解した培地１．５mL及びミリスチン酸イソプロピル０．３５mLを入れたφ２２×１９５mm試験管に接種し、２７℃にて４日間２１０spmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物（シス−６−テトラデセン酸イソプロピル）を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は２６．５ｇ／Ｌ、反応液中の全油中のシス−６−テトラデセン酸イソプロピルの割合は３６．７％であった（表３）。
【００２９】
比較例１
ＳＣＤ培地（日本製薬株式会社製）２０mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、３０℃にて１日間培養を行った後。この培養液０．４mLを、ＭＳＧ（グルタミン酸ナトリウム）２０ｇ、酵母エキス（アサヒビール社製）４．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５mg、ＭｎＳＯ4・６Ｈ2Ｏ  ０．６mg、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２mgを０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに溶解した培地２０mL及びパルミチン酸イソプロピル３．６mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、２６℃にて４日間、２１０rpmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物（シス−６−ヘキサデセン酸イソプロピル）を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は３４．９ｇ／Ｌ、反応液中の全油中のシス−６−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は４１．１％であった（表１）。
【００３０】
比較例２
ＳＣＤ培地（日本製薬株式会社製）２０mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、３０℃にて１日間培養を行った。この培養液０．４mLを、ＭＳＧ（グルタミン酸ナトリウム）２０ｇ、酵母エキス（アサヒビール社製）４．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５mg、ＭｎＳＯ4・６Ｈ2Ｏ  ０．６mg、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２mgを０．１Ｍ又は０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２５）１Ｌに溶解した培地２０mL及びパルミチン酸イソプロピル３．６mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、２６℃にて４日間、２１０rpmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物（シス−６−ヘキサデセン酸イソプロピル）を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は各々２８．１、３２．７ｇ／Ｌ反応液中の全油中のシス−６−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は３７．６％、３７．３％であった（表１）。
【００３１】
比較例３
ＳＣＤ培地（日本製薬株式会社製）２０mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-B-3Mを接種し、３０℃にて１日間培養を行った。後、この培養液０．４mLを、ＭＳＧ  ２０ｇ、酵母エキス（Difco社製）３ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５mg、ＭｎＳＯ4・６Ｈ2Ｏ  ０．６mg、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２mgを、０．３Ｍ  リン酸バッファー（pH７．０）１Ｌに溶解した培地２０mL及びパルミチン酸イソプロピル４．４mLを入れた５００mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、２６℃にて４日間、２１０rpmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物（シス−６−ヘキサデセン酸イソプロピル）を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は３５．５ｇ／Ｌ、反応液中の全油中のシス−６−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は４５．４％であった（表２）。
【００３２】
比較例４
ＳＣＤ培地（日本製薬株式会社製）２mLを入れたφ２２×１９５mm試験管にRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、３０℃にて１日間培養を行った。後、この培養液７０μＬを、ＭＳＧ  ２０ｇ、酵母エキス（Difco社製）３ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５mg、ＭｎＳＯ4・６Ｈ2Ｏ  ０．６mg、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２mgを、０．３５Ｍ  Ｋ，Ｋ２リン酸バッファー（pH７．２５）１Ｌに溶解した培地１．５mL及びミリスチン酸イソプロピル０．３５mLを入れたφ２２×１９５mm試験管に接種し、２７℃にて４日間２１０spmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物（シス−６−テトラデセン酸イソプロピル）を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は１０．５ｇ／Ｌ、反応液中の全油中のシス−６−テトラデセン酸イソプロピルの割合は１１．８％であった（表３）。
【００３３】
【表１】
0004179760.tif 000002
【００３４】
【表２】
0004179760.tif 000003
【００３５】
【表３】
0004179760.tif 000004
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、不飽和脂肪酸又はその誘導体を微生物菌体外に極めて効率よく且つ高純度で製造することができる。