(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バレンセンをムコール属に属する微生物の菌体又はその処理物で処理してヌートカトンに変換することによりヌートカトンを製造することを特徴とするヌートカトンの製造法。
【請求項２】
ムコール属に属する微生物が、ムコール・ヒエマリス（Mucor hiemalis）、ムコール・ムセド（Mucor mucedo）、ムコール・ジャバニクス（Mucor javanicus）、ムコール・フラギリス（Mucor fragilis）、ムコール・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）及びムコール・ジェネベンシス（Mucor genevensis）からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
ムコール・ヒエマリスがムコール・ヒエマリス・エフ・ヒエマリス（Mucor hiemalis f. hiemalis）IFO8567、ムコール・ヒエマリス・エフ・ヒエマリス IFO8565、ムコール・ヒエマリス・エフ・ヒエマリス IFO8449、ムコール・ヒエマリス・エフ・ヒエマリス IFO5834、ムコール・ヒエマリス・エフ・コルチコラス（Mucor hiemalis f. corticolus）IFO9400、ムコール・ヒエマリス・エフ・コルチコラス IFO9401 又はムコール・ヒエマリス・エフ・ルテウス（Mucor hiemalis f. luteus）IFO9410、ムコール・ムセドがムコール・ムセド IFO6750、ムコール・ジャバニクスがムコール・ジャバニクス IFO5382 、ムコール・フラギリスがムコール・フラギリス IFO9402、ムコール・シルシネロイデスがムコール・シルシネロイデス・エフ・シルシネロイデス（Mucor circinelloides f. circinelloides）IFO30470 及びムコール・ジェネベンシスがムコール・ジェネベンシス IFO6415である、請求項２に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バレンセンをムコール属に属する微生物の菌体又はその処理物で処理してヌートカトンに変換することによりヌートカトンを製造することを特徴とするヌートカトンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種食品材料、食品添加物、飲食品、香粧品類、保健衛生材料等の多様化に伴い、これらに用いる香料として従来にない新しい要望が高まり、嗜好性の高いユニークな香気を有した香料物質の開発が要求されてきている。特に香料の中でも最も需要の高いシトラスフルーツ系香料や食品系香料に関して、安全性の面からも天然化合物若しくは天然化合物由来の物質を原料とし、酵素や培養細胞等による生化学的変換反応によって得られる香料材料の開発が強く望まれていた。
【０００３】
次式
【化１】
0004082917.tif 000002
で表されるヌートカトンは重要な香料材料の一つであるが、天然においては、代表的にはグレープフルーツ油中に約１％以下しか含有されておらず、天然物から得られる精製品は非常に高価である。そこで、製品の安全性や化学合成による反応剤の使用及び大量の溶媒等の廃棄などの製造上の環境保全等を考慮し、天然物を原料とした酵素反応や生物による変換反応を利用して得られるヌートカトンの開発が待ち望まれ、従来から種々の製造法が検討されている。
【０００４】
また、ヌートカトンは鏡像異性体間でその香気強度が大きく異なっており、天然と同じ絶対構造を有するヌートカトンの価値は非常に高いものである。
このような状況において、従来から天然物であるバレンセンを原料とし、生化学的反応を利用することにより天然物と同じ絶対構造を有するヌートカトンを製造する方法が報告されている。
【０００５】
例えば、バレンセンを原料とし、ロドコッカス属の微生物を用いてヌートカトンを製造する方法（特開平6-303,967号公報）、或いはバレンセンを原料とし、シトラス細胞懸濁培地を用いて生物変換反応によりヌートカトンを製造する方法（Plant Cell Report, ３巻, 37頁,1984年）等が報告されている。しかしながら、例えば、特開平6-303967号において、ロドコッカス属微生物の菌体懸濁液50mlを含む500mlフラスコに500mgのバレンセンを添加して30℃で４日間培養した場合に得られるヌートカトンが2.5mgとわずかであるように、これらの方法によればヌートカトンへの変換効率が低く、工業的に望ましいものとは言い難い。
【０００６】
また、最近、ラッカラーゼ触媒酸化や酵素酸化反応によってバレンセンをバレンセンヒドロパーオキサイドへ変換した後、このヒドロパーオキサイドを分解してヌートカトンを得る方法が報告されている（特表平11-501052号、特開2001-103989号）が、コストや収率の問題などの点から未だ望ましいものではない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述した種々の問題点を解決することを目的とし、収率が高く、かつ、光学活性選択性の点からも工業的実用化に適し、さらに安全性や製造上の環境保全をも考慮した、天然物であるバレンセンからヌートカトンを安価に製造する方法を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ムコール属に属する微生物の菌体又はその処理物を用いて変換を行うことによって、バレンセンからヌートカトンを製造することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（３）を提供する。
（１）  バレンセンをムコール属に属する微生物の菌体又はその処理物で処理してヌートカトンに変換することによりヌートカトンを製造することを特徴とするヌートカトンの製造法。
【００１０】
（２）  ムコール属に属する微生物が、ムコール・ヒエマリス（Mucor hiemalis）、ムコール・ムセド（Mucor mucedo）、ムコール・ジャバニクス（Mucor javanicus）、ムコール・フラギリス（Mucor fragilis）、ムコール・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）及びムコール・ジェネベンシス（Mucor genevensis）からなる群から選択されるものである、（１）に記載の製造法。
【００１１】
（３）ムコール・ヒエマリスがムコール・ヒエマリス・エフ・ヒエマリス（Mucor hiemalis f. hiemalis）IFO8567、ムコール・ヒエマリス・エフ・ヒエマリス IFO8565、ムコール・ヒエマリス・エフ・ヒエマリス IFO8449、ムコール・ヒエマリス・エフ・ヒエマリス IFO5834、ムコール・ヒエマリス・エフ・コルチコラス（Mucor hiemalis f. corticolus）IFO9400、ムコール・ヒエマリス・エフ・コルチコラス IFO9401 又はムコール・ヒエマリス・エフ・ルテウス（Mucor hiemalis f. luteus）IFO9410、ムコール・ムセドがムコール・ムセド IFO6750、ムコール・ジャバニクスがムコール・ジャバニクス IFO5382 、ムコール・フラギリスがムコール・フラギリス IFO9402、ムコール・シルシネロイデスがムコール・シルシネロイデス・エフ・シルシネロイデス（Mucor circinelloides f. circinelloides）IFO30470 及びムコール・ジェネベンシスがムコール・ジェネベンシス IFO6415 である、（２）に記載の製造法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の製造法において、基質として用いられるバレンセンは、グレープフルーツ、オレンジ、バレンシアオレンジ等の柑橘類の精油から単離・精製したものを用いることができるが、特にこれらに限定されるものではない。
バレンセンの純度は、３０％以上が好ましく、５０％以上が特に好適である。
【００１３】
本発明の方法においては、ムコール属に属する微生物を使用する。該微生物としては多くの種が確認されており、本発明の製造法では、バレンセンをヌートカトンに変換する能力を有する微生物であればいずれの微生物も使用可能である。そのようなムコール属の微生物としては、ムコール・ヒエマリス（Mucor hiemalis）、ムコール・ムセド（Mucor mucedo）、ムコール・ジャバニクス（Mucor javanicus）、ムコール・フラギリス（Mucor fragilis）、ムコール・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）及びムコール・ジェネベンシス（Mucor genevensis）等が挙げられる。これらの微生物は自然界にも広く分布しており、自然界より分離取得することが可能であるが、例えば、日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目17番85号  財団法人発酵研究所から容易に入手可能なムコール・ヒエマリス・エフ・ヒエマリス（Mucor hiemalis f. hiemalis） IFO8567、IFO8565、IFO8449、IFO5834、ムコール・ヒエマリス・エフ・コルチコラス（Mucor hiemalis f. corticolus） IFO9400、IFO9401、ムコール・ヒエマリス・エフ・ルテウス（Mucor hiemalis f. luteus） IFO9410、ムコール・ムセド IFO6750、ムコール・ジャバニクス IFO5382、ムコール・フラギリス IFO9402、ムコール・シルシネロイデス・エフ・シルシネロイデス（Mucor circinelloides f. circinelloides）IFO30470 及びムコール・ジェネベンシス IFO6415 等を利用することができる。また、ヌートカトンに変換する能力を有する限り、上記ムコール属微生物の菌体に人為的な処理、例えば、変異処理等を行うことによって得られる変異株であってもよく、さらには、細胞融合法、組換えDNA法等などの遺伝子工学手法を施して得られる融合株、形質転換株であってもよい。
【００１４】
本発明の方法における変換は、これらのムコール属の微生物を用いて行う。該変換は、基本的には、微生物の菌体又はその処理物を水性媒体中で原料のバレンセンに作用させてヌートカトンに変換する方法であれば、特に限定されない。ここで、菌体の処理物とは、該菌体の培養物、凍結乾燥物、摩砕物、粗酵素又は精製酵素などの抽出物、固定化菌体等の該菌体に種々の処理を施したものを意味する。菌体の処理物は必要に応じて水性媒体中で作用させる。水性媒体としては、水、緩衝液、培養液等が挙げられるがこれに限定されるものではない。本発明の変換を行う具体的な方法としては、(1)該微生物菌体の培養物にバレンセンを添加する方法、(2)バレンセン含有培地で該微生物菌体を培養する方法、(3)該微生物の固定化菌体にバレンセンを接触させる方法、(4)該微生物菌体の摩砕物にバレンセンを接触させる方法、(5)該微生物菌体の抽出酵素液にバレンセンを接触させる方法、等がある。
例えば、該微生物菌体の培養物にバレンセンを添加する方法は、以下のようにして実施することができる。
【００１５】
培養培地としては、ムコール属の微生物を培養可能なものであるならば何ら限定されるものではないが、例えば、実施例１に記載のCzapek-peptone培地等が用いられる。培養は、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養等を行うことができ、培養温度は２０〜３０℃、ｐＨは４〜８が好ましい。このうち、特に好ましくは、２７℃、ｐＨ４〜８である。培養日数は変換に必要な細胞数に至るまでの期間が必要とされ、通常は５〜２０日前後であるが、特にこれに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の変換の反応は、上記のように増殖させたムコール属の微生物の培養物に変換の基質となるバレンセンを添加し、さらなる培養を行うことによって達成することができる。添加するバレンセンは、その純度や増殖させたムコール属の微生物の種類及びその細胞数によって変化するが、添加濃度として0.5mg/l〜50g/lが好ましく、例えば、ムコール属菌1,000mg/100mlを含む培養物100mlに対し、バレンセンを500mg以上添加することができる。さらに、界面活性剤等の使用によりその添加量を増やすことも可能である。バレンセンは、固体又は液体の形状で添加することができ、その添加全量は、一段階又は二段階以上の多段階、もしくは連続的に加えてもよい。
【００１７】
変換の反応を行う培養は、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養等のいずれの条件下においても実施可能であるが、反応速度の点から振盪培養が好ましく、具体的には0〜150rpmで実施するのが適当である。また、反応温度は２０〜３０℃、ｐＨは４〜８が好ましい。変換の反応は基質バレンセンの添加とともに開始されるが、その反応時間は５〜１８日が好ましい。
【００１８】
上記のような方法において、ムコール属に属する微生物の菌体又はその処理物の変換によって得られた反応生成物のヌートカトンは、一般の有機化合物の分離・精製において公知の方法、例えば、濾過、抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー等の手段、或いはこれらの組み合わせによって培養液から回収、精製することができる。
本発明により得られたヌートカトンは、各種食品、食品添加物、飲食品、香粧品類、保険衛生材料等の香料材料として有用である。
【００１９】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
なお、実施例中において物性の測定に用いた装置は次の通りである。
１）化学純度
ガスクロマトグラフ；HP-5890（Hewlett Packard社製）
カラム；DB-17（0.25ｍｍ×30ｍ）（J&W社製）
注入口温度２５０℃、昇温プログラムは初期温度５０℃から２５０℃まで５℃/min.、キャリヤーガスはヘリウム（１ml/min.）で行った。
２）核磁気共鳴スペクトル
1Ｈ−ＮＭＲ；Mercury-300型（300ＭＨｚ）（Varian社製）
13Ｃ−ＮＭＲ；Mercury-300型（75ＭＨｚ）（Varian社製）
３）赤外吸収スペクトル（ＩＲ）
FTIR-410型（日本分光株式会社製）
４）質量スペクトル（ＭＳ）：
質量選択検出器付ガスクロマトグラフ；HP-5890/HP5973（Hewlett Packard社製）
カラム；DB-17（0.25ｍｍ×30ｍ）（J&W社製）
５）旋光度
DIP-1000（日本分光株式会社製）
【００２０】
［実施例１］バレンセンのムコール・ヒエマリスによるヌートカトンへの変換反応
財団法人発酵研究所より入手したムコール・ヒエマリス・エフ・ヒエマリスIFO8567を以下の組成のＭＹ培地100mlを含む各500mlフラスコに接種し、６日間振盪培養した。
（ＭＹ培地組成；１Ｌ当たり）
イーストエキス          0.3ｇ
モルトエキス            0.3ｇ
ポリペプトン            0.5ｇ
グルコース              1.5ｇ
【００２１】
その培養液の５mlを以下に示すCzapek-peptone培地100mlを入れた500mlのひだつき坂口フラスコに接種した。
（Czapek-peptone 培地組成）
スクロース              15 g
グルコース              15 g
ポリペプトン             5 g
K2HPO4                    1 g
MgSO4・7H2O              0.5 mg
KCl                     0.5 mg
FeSO4・7H2O              0.01 g
H2O                     1.0 L
（培地のpHはHClでpH=7.0に調整する）
【００２２】
２７℃で４日間、150回転で振盪培養して菌体を増殖させ、これに基質であるバレンセン（([α]D20 +96.5゜(c=0.99, CHCl3)は純度95％以上 (GC-MSより)）50mgを添加し、さらに２７℃で５日間、150回転で振盪培養した。
反応の経時的変化は、２４時間ごとに一定量（１ml）の培養液を吸着剤であるエクストレルートに採取し、エーテルにて溶出した後、エーテル抽出物についてGC-MS分析(Hewlett-Packard, capillary GC-quadrupole MS system, Model HP-5890 (GC/MSD HP-5890/HP-5973); DB-17 column)を行うことにより確認した。
【００２３】
培養液にエーテル５０mlを加え、一時間150rpmにて振盪した後、吸引ろ過を行い、ろ液として水層とエーテル層に分けた。そのエーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過し、３０℃の低温でロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮することによって残渣46.7mgを得た。この残渣を内票法によるＧＣ分析で定量した結果、ヌートカトンの含量は26.5mg（バレンセンからの収率は56.8％）であった。さらに、本実施例で得られた残渣をＧＣ分取してNMR測定したところ、標準品と一致した。
【００２４】
［実施例２］バレンセンのムコール・ムセド、ムコール・ジャバニクス、ムコール・フラギリス、ムコール・ヒエマリスによるヌートカトンへの変換反応
実施例１のムコール・ヒエマリス・エフ・ヒエマリスIFO8567を、ムコール・ムセドIFO6750、ムコール・ジャバニクスIFO5382、ムコール・フラギリスIFO9402、ムコール・ヒエマリス・エフ・ヒエマリスIFO5834にかえて、実施例１と同様の試験を行った。その結果、ＧＣ分析によって以下のヌートカトンの生成が確認された。
【００２５】
0004082917.tif 000003
【００２６】
なお、実施例１及び２の結果を特開平6-303967と比較すると、特開平6-303967では、ロドコッカス属微生物の菌体懸濁液50mlを含む500mlフラスコに500mgのバレンセンを添加して３０℃で４日間培養した場合にヌートカトンが2.5mgしか得られていないのに対し、本発明のヌートカトンの生成量は著しく高いことが確認された。
【００２７】
［実施例３］
Czapek-peptone培地200mlを500ml三角フラスコに入れ、滅菌後、苔類クモノスゴケから採取したムコール・エスピー（Mucor sp.）を植菌し、３０℃で３日間回転培養(100rpm)した。その培養液に基質であるバレンセン（([α]D20 +96.5゜(c=0.99, CHCl3)は純度95％以上 (GC-MSより))を約300mg添加した。反応の経時的変化は、２４時間ごとに一定量（１ml）の培養液を吸着剤であるエクストレルートに採取し、エーテルにて溶出した後、エーテル抽出物についてGC-MS分析(Hewlett-Packard, capillary GC-quadrupole MS system, Model HP-5890 (GC/MSD HP-5890/HP-5973); DB-17 column)を行うことにより確認した。培養反応９日目に反応を止め、培養液にエーテル５０mlを加え、一時間150rpmにて振盪した後、吸引ろ過を行い、ろ液として水層とエーテル層に分けた。そのエーテル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、１０℃の低温でロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮することによって残渣（243.2mg）を得た。さらに、その残渣をシリカゲル(20g; Merck社製70〜230mesh)を用いたカラムクロマトグラフィーにへキサン−エーテル系溶媒でエーテルの含量を増加させながらかけ、純度95％以上のヌートカトン（151.6 mg；バレンセンからの収率は47.2％）を得た。
【００２８】
ヌートカトンの比旋光度 （[α]D20 +193.5゜(c=1.10, CHCl3)）は、標品のヌートカトンの比旋光度（[α]D20 +195.5゜(c=1.5, CHCl3)）と一致した。また、MSスペクトル、IRスペクトル、1H NMRスペクトル、13C NMR スペクトルについても標品のスペクトルデータと完全に一致した。
【００２９】
［実施例４］
添加するバレンセンの量を100mgとし、バレンセン添加後の反応を１１日目に停止する以外は実施例１と同じ条件で、苔類クモノスゴケから採取したムコール・エスピーによる変換反応を行い、減圧濃縮による残渣99.5mgを得た。その残渣をシリカゲル(10g; Merck社製70〜230mesh)を用いたカラムクロマトグラフィーにへキサン−エーテル系溶媒でエーテルの含量を増加させながらかけ、純度95％以上のヌートカトン（65.2mg；バレンセンからの収率は61.0％）を得た。
【００３０】
【発明の効果】
本発明の方法は、ヌートカトンが公知の従来技術に比べて高収率、高選択的に得られ、工業的に適している。また、本発明の方法は、副生成物の生成も極めて少なく、非常に効率の良い製法である。さらに、本発明の方法によって得られるヌートカトンは、従来の方法によって得られるヌートカトンに比べて純度も高く、香気においても大変優れているので、各種食品、食品添加物、飲食品、香粧品類、保険衛生材料等の香料材料として、幅広い範囲で利用に供することができる。