(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０〜２５℃、イオン強度が０．１の水溶液中での亜鉛に対するキレート安定度定数（ｌｏｇＫ）が８〜１４である有機酸又はその塩である添加剤と、緩衝剤と、アルカリ性フォスファターゼ測定用基質であるリン酸エステルとを含む改良された酵素基質組成物。
【請求項２】
前記有機酸又はその塩である添加剤が、クエン酸及び／又はコハク酸、或いはそれらの塩である請求項１の酵素基質組成物。
【請求項３】
有機酸又はその塩である添加剤の含有量が０．１〜１０００ｍＭである請求項１又は２の酵素基質。
【請求項４】
アルカリ性フォスファターゼ測定用基質であるリン酸エステルが４メチルウンベリフェロンリン酸又はその塩である請求項１の酵素基質組成物。
【請求項５】
水溶液である請求項１〜４いずれかの項に記載の酵素基質組成物。
【請求項６】
請求項１〜５いずれかの項に記載の酵素基質組成物を含んでなる酵素活性測定用試薬セット。
【請求項７】
請求項１〜６いずれかの項に記載の酵素基質組成物を含んでなる、酵素を標識物質として用いる免疫測定用試薬セット。
【請求項８】
２０〜２５℃、イオン強度が０．１の水溶液中での亜鉛に対するキレート安定度定数（ｌｏｇＫ）が８〜１４である有機酸又はその塩である添加剤と、緩衝剤とを添加する、安定化されたリン酸エステルを含む組成物の製造方法。
【請求項９】
前記有機酸又はその塩である添加剤がクエン酸及び／又はコハク酸、或いはそれらの塩である請求項８の安定化されたリン酸エステルを含む組成物の製造方法。
【請求項１０】
０．１〜１０００ｍＭの有機酸又はその塩である添加剤を添加する請求項８又は９の製造方法。
【請求項１１】
アルカリ性フォスファターゼ測定用基質であるリン酸エステルが４メチルウンベリフェロンリン酸又はその塩である請求項１０の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、改良された酵素基質、改良された酵素基質の製造方法、更には改良された酵素基質を含んでなる酵素活性測定用の試薬キット等に関するものであり、例えば酵素免疫測定方法等に使用可能な、安定性の向上した、優れた酵素基質等を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、血清、尿等の生体試料中の微量蛋白質等の含有量等は、抗体や抗原を利用した、いわゆるサンドイッチ法、競合法等の酵素免疫測定を実施することで知ることが可能である。例えばサンドイッチ法と呼ばれる方法においては、測定されるべき蛋白質等に対する固相化モノクローナル抗体（固相化抗体）と、測定されるべき蛋白質等に対する、前記モノクローナル抗体とは異なるモノクローナル抗体であって酵素と結合させた抗体（標識抗体）を使用し、測定されるべき蛋白質等の量に相関した（固相化抗体−蛋白質等−標識抗体）とのサンドイッチ複合体を形成させ、このようなサンドイツチ複合体を形成していない標識抗体を分離した後、サンドイッチ複合体中の酵素量をその活性を基に測定し、最終的に測定されるべき蛋白質等の量を推定する。
【０００３】
酵素反応に使用する酵素基質は、溶液として又は凍結乾燥等した粉末状態で提供されることが多い。実際に酵素反応を行うに際しては、該溶液を希釈又は希釈することなしに、或いは該凍結乾燥粉末に水等を加えて溶液としてから使用するが、提供された溶液や粉末状態の酵素基質が劣化していた場合、再現性が悪化する等、酵素活性の測定結果に与える影響は大きい。従って、酵素基質を製造し提供する側から言えば、より長時間に渡って安定で酵素との反応性等が変化しない酵素基質を提供することが必要である。
【０００４】
以上に説明した酵素免疫測定では、酵素は目的とする抗原等を測定するための標識として使用されるが、このような場合以外にも、例えば体液中の酵素含有量を、その酵素活性を測定することで知る方法も頻繁に実施されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
例えば特開平２−１８８５７８号公報には、酵素基質をアルカリ条件下におくことで安定化させることが記載されている。しかし、各種酵素には活性発現に際して最適ｐＨが存在するため、このようにアルカリ条件下で安定化された酵素基質をそのまま酵素活性の測定に使用すると、当該ｐＨが測定しようとする酵素の最適ｐＨと一致しない場合には酵素活性自体が小さくなってしまい、測定精度が低下するという課題を生じる。むろん、このようにアルカリ条件下で安定化された酵素溶液のｐＨを酵素の最適ｐＨに調整することも可能ではあるが、酵素活性測定に先立ってｐＨ調整という工程が必要となる。
【０００６】
また例えば米国特第５１４３８２５号公報には、酵素基質溶液へＥＤＴＡやＥＧＴＡ等の金属キレート剤を添加する、酵素溶液の安定化させる方法が記載されている。この方法は、４メチルウンベリフェロンリン酸又はその塩を非酵素的に分解してしまう金属イ才ンを捕捉することでこれらを安定化するものである。この方法においては、しかし、例えば免疫測定に頻繁に使用されるアルカリ性フォオスファターゼ等、その活性の発現にマグネシウムイオンや亜鉛イ才ンが必要とされる酵素基質として４メチルウンベリフェロンリン酸又はその塩を使用する場合、上記キレート剤によって前記イオンも捕捉され、酵素活性が阻害される恐れがあるため、使用に先立ってキレート剤を除去する等の操作が必要となる。
【０００７】
なお、酵素基質を凍結乾燥等することにより、溶液として保存等する場合に比べて安定性を向上させることが可能である。しかし、このような凍結乾燥処理を行う場合であっても、更に長期間、更に安定的に酵素基質の品質を保持し得る酵素基質を提供できれば、使用者にとって便利である。即ち、凍結乾燥された酵素基質は使用に先立って適当な溶液に溶解されるため、凍結乾燥された基質であっても溶解後の保存安定性を良好にできれば、大量の貯蔵液を調製し保存しておくことが可能となるからである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、より安定な酵素基質を提供すべく鋭意研究を行った結果、クエン酸及び／又はコハク酸を共存させることにより、免疫測定等の分野において標識物質として頻繁に使用されているアルカリ性フォスファターゼ等の加水分解酵素の基質であるリン酸エステルを安定化し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、２０〜２５℃、イオン強度が０．１の水溶液中での亜鉛に対するキレート安定度定数（ｌｏｇＫ）が８〜１４である有機酸又はその塩である添加剤と、緩衝剤と、アルカリ性フォスファターゼ測定用基質であるリン酸エステルとを含む改良された酵素基質であり、かかる酵素基質を含んでなる酵素活性測定用試薬セットや、かかる酵素基質を含んでなる、酵素を標識物質として用いる免疫測定用試薬セットである。
【０００９】
また本発明は、２０〜２５℃、イオン強度が０．１の水溶液中での亜鉛に対するキレート安定度定数（ｌｏｇＫ）が８〜１４である有機酸又はその塩である添加剤と、緩衝剤とを添加する、安定化されたリン酸エステルの製造方法である。以下本発明を詳細に説明する。
【００１０】
２０〜２５℃、イオン強度が０．１の水溶液中での亜鉛に対するキレート安定度定数（ｌｏｇＫ）が８〜１４である有機酸又はその塩は、４メチルウンベリフェロンリン酸又はその塩（以下単に４ＭＵＰという）等のリン酸エステルを非酵素的に分解する金属イオン等を捕捉することにより、保存中にその品質等が劣化するのを抑制する。かかる条件下でのＥＤＴＡの安定度定数（ｌｏｇＫ）は１６．５程度であり、ＥＤＴＡよりも弱い金属イオン捕捉力の有機酸又はその塩を用いることにより、４ＭＵＰ等のリン酸エステルを、活性発現のために金属イオンを必要とする酵素用の基質として使用する場合であっても、これら活性発現に必要な金属イオンが捕捉されてしまうという不都合がない。
【００１１】
本発明において使用される好適な有機酸又はその塩として、例えば、該定数が１１程度のクエン酸やシュウ酸、１３程度のコハク酸、或いはこれらのナトリウムやカリウムの塩（水和物を含む）を示すことができる。クエン酸、シュウ酸、コハク酸等の有機酸、或いはこれらの塩は、単独で、或いは２種以上を同時に使用できる。
【００１２】
前記有機酸又はその塩は、例えば４ＭＵＰ等の長期保存に先だって添加することが好ましいが、他にも種々時期に添加できる。例えば４ＭＵＰの原液の調製直後やこれを凍結乾燥する場合における凍結乾燥処理直前が特に好ましいが、酵素活性の測定に先だつ添加であれば前記本発明の効果が期待できる。
【００１３】
４ＭＵＰ等のリン酸エステルに添加し、共存させる有機酸又はその塩の量については特に制限されないが、総量で０．１〜１０００ｍＭが良く、特に総量で１〜１００ｍＭが好ましい。
【００１４】
後の実施例からも明らかではあるが、本発明者の知見によれば、クエン酸やコハク酸が共存しても酵素活性の測定に影響はなく、酵素と４ＭＵＰ等の反応性は変化しない。従って、有機酸又はその塩を添加して製造した４ＭＵＰ等のリン酸エステルを、例えば酵素免疫測定法等の酵素活性測定用試薬キットの一構成試薬として使用することで、安定化され、再現性の向上が期待できるという高品質の試薬キットを提供することが可能である。
【００１５】
【発明の効果】
本発明により、従来と比較して、より長期間に渡って酵素基質を安定化することが可能である。この結果、従来安定性を向上させるために凍結乾燥品として提供されていた４ＭＵＰ等のリン酸エステルを、同等の安定性を保証しつつ溶液状態で提供することも可能である。従って本発明によれば、凍結乾燥のような煩雑で各工程での制御が厳しい操作を省くことが可能となり、溶液状態の４ＭＵＰであっても長期間安定的に保存することか可能とある。これにより、酵素基質溶液を必要時に必要量調製して使用しなくとも再現性に支障をきたすことが無くなり、逐次基質を調製するという不便さを解消することも可能である。むろん、本発明によって製造された４ＭＵＰ等のリン酸エステル溶液を凍結乾燥等することを排除するものではなく、本発明により提供される酵素基質を凍結乾燥等した場合には、特に該乾燥物を溶解した後の安定性を向上することができる。
【００１６】
本発明は、酵素免疫測定法で頻繁に使用されるアルカリ性フォスファターゼの酵素活性測定に多用される４ＭＵＰ等のリン酸エステルについて顕著に安定性を向上できるため、酵素免疫測定の分野における酵素基質の長期安定性向上のために有用である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を更に詳細に説明するために４ＭＰＵに関する実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１  ４ＭＵＰの加水分解速度に与えるクエン酸及び／又はコハク酸（クエン酸及び／又はコハク酸イオン）の効果
（酵素基質の製造）
２−アミノ−２一メチル−１−プロパノール（ナカライ化学（株）製）４４．４６ｇ及びアジ化ナトリウム（ナカライ化学（株）製）１ｇを容器に秤りとり、これに精製水を加えて約９００ｍ１とした。この溶液をｐＨメーターでモニターしながら濃塩酸を加え、ｐＨ１０に調整した後、更に精製水を加え液量を１リットルにした。
【００１９】
以上のようにして調製した溶液に４−メチルウンベリフェロンリン酸（米国ＪＢＬ社製、以下４ＭＵＰという）２５６．２ｍｇ加え、１ｍＭの４ＭＵＰ溶液とした（以下この溶液をベース基質という）。
【００２０】
ベース基質へマンガン溶液（ナカライ化学（株）製）、亜鉛溶液（ナカライ化学（株）製）、カドミウム溶液（ナカライ化学（株）製）、アルミニウム溶液  （ナカライ化学（株）製）、鉄溶液（ナカライ化学（株）製）、コバルト溶液  （ナカライ化学（株）製）、ニッケル溶液（ナカライ化学（株）製）、マグネシウム溶液（ナカライ化学（株）製）又は鉛溶液（ナカライ化学（株）製）を最終濃度が１００ｐｐｍとなるように添加し、対照溶液とした。
【００２１】
（基質の安定性の測定）
前記のようにして調製した溶液を４、２５、３５、４５℃の保温器へ入れ、一定時間毎に取り出し、希釈液（０．１４Ｍリン酸緩衝液、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ  （ナカライ化学（株）製）、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．１）にて１０倍に希釈した後、蛍光分光光度計（日立Ｆ２０００型、１ｃｍガラス角セル使用）にて測定した。蛍光分光光度計による測定は、励起波長３６３ｎｍ（バンドパス５ｎｍ）、蛍光波長４４７ｎｍ（バンドパス５ｎｍ）で室温にて実施し、４ＭＵＰが加水分解されて生じる４ＭＵ濃度測定のため既知濃度の４ＭＵ（希釈液（０．１４Ｍリン酸緩衝液、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ナカライ化学（株）製、２ナトリウム・２水和物）、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．１）により希釈系列を作製した）を測定したものとの相対蛍光強度の比較にて計算した。
【００２２】
４５℃で保温した場合の結果を図１〜３に示す。この結果から、ベース基質と比較して対照溶液、特に鉄溶液を添加した対照溶液では４ＭＵの生成が早いこと、即ち、即ちこれら金属イオンの共存により４ＭＵＰの安定性が失われる（加水分解される）されることが分かる。また４、２５及び３５℃で保温した結果（不図示）では、保温温度が低下するに従って生成４ＭＵ量は低下し、前記金属イオン共存下での４ＭＵＰの非酵素的分解は温度依存性であることも示された。
【００２３】
実施例２  ４ＭＵＰの加水分解における鉄イオン濃度の影響
実施例１と同様にして調製したベース基質及びベース基質に鉄溶液（ナカライ化学（株）製）を最終濃度１、１０又は１００ｐｐｍとなるように添加した対照溶液を実施例１と同様に一定温度で一定時間保温した後、蛍光分光光度計を用いて４ＭＵ濃度を測定した。
【００２４】
結果を図４〜７に示す。これら図によれば、鉄イオンの濃度に依存して４ＭＵの生成、即ち４ＭＵＰの非酵素的加水分解の度合いが増加することが分かる。
【００２５】
実施例３  ４ＭＵＰの加水分解におけるコハク酸又はクエン酸の効果
実施例１と同様にして調製したベース基質、ベース基質に鉄溶液（ナカライ化学（株）製）を最終濃度１又は１０ｐｐｍとなるように添加した対照溶液、対照溶液に対してコハク酸又はクエン酸を最終濃度が１０ｍＭとなるように添加した基質溶液（以下、コハク酸添加基質又はクエン酸添加基質という）を実施例１と同様に一定温度で一定時間保温した後、蛍光分光光度計を用いて４ＭＵ濃度を測定した。
【００２６】
４５℃で保温した場合の結果を図８に示す。この結果から、ベース基質と比較して対照溶液では４ＭＵの生成が増加するものの、クエン酸添加基質又はコハク酸添加基質ではその増加が抑制されていることが分かる。
【００２７】
実施例４  アルカリ性フォスファターゼの酵素活性測定
実施例１と同様にして調製したベース基質をもとに、ベース基質に鉄溶液（ナカライ化学（株）製）を最終濃度１ｐｐｍとなるように添加した対照溶液、対照溶液に対してコハク酸、クエン酸又はＥＤＴＡを最終濃度が１０ｍＭとなるように添加した基質溶液（以下、コハク酸添加基質、クエン酸添加基質、ＥＤＴＡ添加基質という）を調製した。
【００２８】
各基質溶液１．５ｍｌに対し、市販のアルカリ性フォスファターゼ（シグマ社製）の最終濃度が１４ｇ／ｍｌとなるように調製した０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を２０μｌ添加した後、実施例１と同様にして４ＭＵ濃度を測定した。なお、本例の操作は３７℃の温度条件下で実施した。
【００２９】
結果を図９に示す。図９からは、ベース基質、対照溶液、コハク酸添加基質及びクエン酸添加基質については同様に４ＭＵ濃度が増加すること、即ち４ＭＵを産生する酵素活性が阻害されていないことが分かる。一方、ＥＤＴＡ添加基質では、酵素活性が阻害された結果４ＭＵの増加が抑制されていることが分かる。
【００３０】
本例の結果と前記実施例１〜３の結果からは、コハク酸等を添加することにより、酵素活性を阻害することなく、４ＭＵＰ等を安定的に保存可能なことが理解できる。
【００３１】
実施例５  ＴＳＨの酵素免疫測定（抗体固定化固相ビーズの調製）
ウォーターストランド法により得た平均直径１．４ｍｍ、平均長さ１．５ｍｍのエチレン−酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ）ペレット（東ソー（株）製）を特開平６２−１９７４２５号公報に記載された方法に従って真球化し、フェライト  （東ソー（株）製）を熱融着させ、更にグリシジルメタアクリレート（ＧＭＡ）でポリマーコーティングした。得られたポリマーコーティングビーズを苛性ソーダ・メタノール溶液で処理して表面層のエポキシ基を開環させジオールにした。以上のようにして得られたビーズに、以下に示すようにマウス抗ヒトＴＳＨ  （甲状腺刺激ホルモン）モノクローナル抗体（抗体１）を固定化した。まずビーズ１０００００個に対し、特開平６３−１５１６７号公報に記載された方法に従って５００ｍｇのＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：東京化成工業（株）製）を含む乾燥アセトン２５ｍｌを窒素雰囲気下、室温下で３０分間激しく撹拌して活性化処理を行った。この活性化されたビーズを洗浄後、２．５ｍｇ／２０ｍｌのマウス抗ヒトＴＳＨモノクローナル抗体を加え、室温にて４時間振とうして抗体を粒子に結合させた。
【００３２】
ビーズを洗浄後、１．０％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）を加えブロッキング処理を行った。
【００３３】
標識に用いる酵素としてウシ小腸由来のアルカリ性フォスファターゼを使用しこれを常法に従って抗ヒトＴＳＨモノクローナル抗体（抗体２）と結合した。
【００３４】
調製した抗体固定化ビーズを用いて、ヒトＴＳＨの酵素免疫測定を行なった。まず抗体固定化ビーズ１２個をプラスチック製カップに入れ、これに５０μｌの標識抗体（抗体２）を加えたものを用意した。これを下部に磁石を有する測定装置（ＡＩＡ一１２００、東ソー（株）製）にセットし、抗原溶液として、０又は４８μＩＵ／ｍｌ濃度のＴＳＨ溶液１００μｌを添加して酵素免疫反応を開始した。ＴＳＨの抗原抗体反応を進行させるために３７℃にて４０分間、下部の磁石を約８３ストローク／分にて振とうさせながらインキュベートし、その後、反応容器を洗浄液にて洗浄した（Ｂ／Ｆ分離）。
【００３５】
洗浄終了後、実施例４で調製した各種の基質溶液１００μｌを分注して酵素反応を実施した。反応は、３７℃にて３、６、１０分間、下部の磁石を約８３ストローク／分にて振とうさせながらインキュベートさせて実施した。酵素反応停止液である希釈液（０．１４Ｍリン酸緩衝液、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．１）５００μｌを添加して酵素反応を停止させた後、反応が停止された反応用液を実施例１に示した希釈液にて希釈し、実施例１同様に蛍光量を測定した。
【００３６】
結果を図１０、１１に示す。これらの結果からは、ベース基質、クエン酸添加基質及びコハク酸添加基質ではほぼ同じ蛍光量（４ＭＵ量）が得られること、即ち（１）クエン酸及び／又はコハク酸の共存が酵素活性を阻害しないこと、及び（２）及びクエン酸及び／又はコハク酸の共存が免疫反応を阻害しないこと、が分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例１の結果中、ベース基質とマンカン、亜鉛、カドミウム溶液を含む対照溶液の結果について示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は保存時間（時間）を示し、白丸はベース基質の、黒丸はマンガンを含む対照溶液の、黒三角は亜鉛を含む対照溶液の、黒四角はカドミウムを含む対照溶液の結果をそれぞれ示す。
【図２】図２は実施例１の結果中、ベース基質とアルミニウム、鉄、コバルト溶液を含む対照溶液の結果について示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は保存時間（時間）を示し、白丸はベース基質の、黒丸はアルミニウムを含む対照溶液の、黒三角は鉄を含む対照溶液の、黒四角はコバルトを含む対照溶液の結果をそれぞれ示す。
【図３】図３は実施例１の結果中、ベース基質とニッケル、マグネシウム、鉛溶液を含む対照溶液の結果について示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は保存時間（時間）を示し、白丸はベース基質の、黒丸はニッケルを含む対照溶液の、黒三角はマグネシウムを含む対照溶液の、黒四角は鉛を含む対照溶液の結果をそれぞれ示す。
【図４】図４は実施例２の結果中、ベース基質又は鉄を含む対照溶液を４℃で保存した結果について示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は保存時間  （時間）を示し、自丸はベース基質の、黒丸は１ｐｐｍの鉄を含む対照溶液の、黒三角は１０ｐｐｍの鉄を含む対照溶液の、黒四角は１００ｐｐｍの鉄を含む対照溶液の結果をそれぞれ示す。
【図５】図５は実施例２の結果中、ベース基質又は鉄を含む対照溶液を２５℃で保存した結果について示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は保存時間（時間）を示し、白丸はベース基質の、黒丸は１ｐｐｍの鉄を含む対照溶液の、黒三角は１０ｐｐｍの鉄を含む対照溶液の、黒四角は１００ｐｐｍの鉄を含む対照溶液の結果をそれぞれ示す。
【図６】図６は実施例２の結果中、ベース基質又は鉄を含む対照溶液を３５℃で保存した結果について示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は保存時間（時間）を示し、白丸はベース基質の、黒丸は１ｐｐｍの鉄を含む対照溶液の、４黒三角は１０ｐｐｍの鉄を含む対照溶液の、黒四角は１００ｐｐｍの鉄を含む対照溶液の結果をそれぞれ示す。
【図７】図７は実施例２の結果中、ベース基質又は鉄を含む対照溶液を４５℃で保存した結果について示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は保存時間（時間）を示し、白丸はベース基質の、黒丸は１ｐｐｍの鉄を含む対照溶液の、黒三角は１０ｐｐｍの鉄を含む対照溶液の、黒四角は１００ｐｐｍの鉄を含む対照溶液の結果をそれぞれ示す。
【図８】図８は実施例３の結果中、４５℃で保存した結果について示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は保存時間（時間）を示し、白丸はベース基質の、自三角は鉄を含む対照溶液の、黒丸はコハク酸添加基質の、黒三角はクエン酸添加基質の、黒四角はＥＤＴＡ添加基質の結果をそれぞれ示す。
【図９】図９は実施例４の結果を示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は酵素反応時間（秒）を示し、白丸はベース基質の、黒四角は鉄を含む対照溶液の、黒三角はコハク酸添加基質の、白三角はクエン酸添加基質の、黒丸はＥＤＴＡ添加基質の結果をそれぞれ示す。
【図１０】図１０は実施例５の結果中、０μＩＵ／ｍｌ濃度のＴＳＨを測定した場合の結果について示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は酵素反応時間（分）を示し、白丸はベース基質の、白三角は鉄を含む対照溶液の、黒丸はコハク酸添加基質の、黒三角はクエン酸添加基質の、黒四角はＥＤＴＡ添加基質の結果をそれぞれ示す。
【図１１】図１１は実施例５の結果中、５０μＩＵ／ｍｌ濃度のＴＳＨを測定した場合の結果について示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は酵素反応時間（分）を示し、白丸はベース基質の、白三角は鉄を含む対照溶液の、黒丸はコハク酸添加基質の、黒三角はクエン酸添加基質の、黒四角はＥＤＴＡ添加基質の結果をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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