(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性腸疾患を有する被験体における確立した結腸炎の炎症応答を処置するための薬学的組成物であって、
インターロイキン１２の結腸炎誘導効果を減少させるに効果的な、インターロイキン１２に対する抗体
を包含する、薬学的組成物。
【請求項２】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、サイトカインであるインターロイキン12（IL-12）の結腸炎誘導効果を阻害することによって、炎症性腸疾患の確立した結腸炎を処置する方法に関する。詳細には、本発明は、特に、IL-12に対する抗体を投与することによって、確立した結腸炎を処置するための方法を提供する。さらに、マウスモデルにおいて、確立した結腸炎の炎症応答の減少および炎症性腸疾患の予防における有効性について物質をスクリーニングするための方法を提供する。
従来技術
炎症性腸疾患（IBD）（クローン病（CD）および潰瘍性結腸炎（UC）を包含する）は、西洋人に頻繁にみられる特発性の慢性疾患である（１、２）。最近、IBDの病因論に新たな洞察を提供するであろう慢性腸炎症の種々の動物モデルが確立されている（３）。これらには、HLA-b27およびβ2-ミクログロブリンのトランスジーンを有するマウス（４）、ならびにインターロイキン２（IL-2）遺伝子（５）、インターロイキン10（IL-10）遺伝子（６）およびＴ細胞レセプターのαまたはβ鎖の遺伝子（７）が相同組換えにより不活化されているマウスが含まれる。さらに、最近、BALB/cマウス由来の正常CD45RBhi Ｔ細胞のC.B -17 scidマウスへの養子免疫細胞移入によって結腸炎モデルが確立された。ここで、移入されたＴ細胞は、肉芽性炎症に関連するTh1サイトカイン応答を発現（顕現）する。この実験的結腸炎は、抗インターフェロンγ（抗IFN-γ）の全身投与（２用量）によって、および組換えインターロイキン４（rIL4）ではなく組換えIL-10（rIL10）の毎日の全身投与（疾患が誘導されると同時に与えられる）によって予防され得る（８）。しかし、これらの方法を使用する確立したIBDの処置は、示唆されていなかった。IL-4（Th2細胞文化の産物）ではなく、IL-10（これもTh2細胞文化の産物）の投与が実験的結腸炎を防止し得るとの観察は、IBDを予防または処置するためのサイトカイン投与の予測不可能性を強調する。
IL-12は、独特の構造および多向性効果を有する最近特徴付けられたサイトカインである（９〜10）。これは、２つのジスルフィド結合サブユニットであるp40およびp35からなる。これらサブユニットは、機能的に活性なp40/p35ヘテロダイマーまたは阻害性p40ホモダイマーを形成する。IL-12は、マクロファージ/単球によって主に産生され、そして細胞内寄生物、細菌、および細菌産生物によって効率的に誘導され得る。機能的な研究により、IL-12はナチュラルキラー（NK）細胞およびマクロファージの細胞溶解活性を増強し、そしてB7/CD28相互作用と協同作用して、活性化したNK細胞およびＴ細胞のサイトカイン産生および増殖を誘導することが示された（13）。さらに、IL-12はTh1 Ｔ細胞分化においてきわめて重要な役割を演じ、そしてナイーブＴ細胞をIFN-γを産生させるよう誘導する。Th1表現型に対してＴ細胞応答を駆動するこの能力の結果、IL-12は、マウスにおける確立した寄生物感染（これはTh2 Ｔ細胞応答を誘発する）の効果的な処置であることが示されている（14、15）。IL-12に対する抗体は実験的な自己免疫脳炎（Th1 Ｔ細胞によって媒介される疾患（16））の予防に有用であることが示されているが、これらの結果は、確立した自己免疫脳炎の処置には拡張されていない。
腫瘍壊死因子α（TNF-α）に対する抗体がCDの処置に用いられたことが示されている（29）。この管理されていない研究において、CDの急性病勢悪化は鈍くなったが、患者はステロイド依存のままであり、そして疾患は決って数ヶ月以内に再発した。
国際特許出願第WO 95/01997号は、ヒトにおけるインターロイキン１が媒介する炎症性障害を処置するためのインターロイキン1βに対する抗体の使用を開示する。国際特許出願第WO 95/23865号は、炎症性障害（例えば、炎症性腸疾患および細菌性肺炎）の処置のためのインターロイキン８に対する抗体の使用を開示する。
本発明は、現存する治療法より意外により効果的なIBDのための有効な処置を提供する。本発明は、さらに、IL-12の結腸炎誘導効果を阻害する能力において効果的な物質についてスクリーニングする方法を提供する。
発明の要旨
本発明は、IBDを有する被験体における確立した結腸炎の炎症応答を処置するための方法を提供する。この方法は、IBD由来の確立した結腸炎と診断された被験体に、インターロイキン12の結腸炎誘導効果を減少させるに効果的な量の、インターロイキン12に対する抗体を投与する工程を包含する。
確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおける有効性について物質をスクリーニングするための方法もまた提供する。この方法は、確立した結腸炎を有する動物を得る工程；物質を動物に投与する工程；およびインターロイキン12に対する効果（結腸炎の炎症応答の減少を生じる）について動物をアッセイする工程、を包含する。ここで、炎症応答の減少量がIFN-γまたはTNF-αに対する抗体の投与によって生じる減少量より大きければ、有効な物質を示す。
さらに、本発明は、炎症性腸疾患の予防における有効性について物質をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、結腸炎に罹り易い動物に物質を投与する工程；この動物を結腸炎を誘導する処置に供する工程；結腸炎の発現についてこの動物をアッセイする工程；および結腸炎発現の防止におけるその物質の有効性を、結腸炎発現の予防におけるインターフェロンγまたは腫瘍壊死因子αに対する抗体の有効性と比較する工程、を包含する。ここで、物質が、結腸炎発現の予防において、インターフェロンγまたは腫瘍壊死因子αに対する抗体より効果的であれば、有効な物質であることを示す。
【図面の簡単な説明】
図１は、エタノールで処置したコントロールBALB/cマウスの結腸切片（白抜きバー）およびTNBSで処置したマウスの結腸切片（黒塗バー）の組織学的格付けの結果である。TNBSまたはエタノールの投与後指定された時点で結腸標本を採取し、HE染色した結腸横断切片にて結腸における炎症変化の大きさを分析した。各群において３つの独立した実験からのデータをプールした。
図２は、TNBSおよびIL-12に対する抗体で処置したBALB/cマウスの結腸切片（白抜きバー）ならびにTNBSおよびラットコントロールIgGで処置したマウスの結腸切片（黒塗バー）の組織学的格付けの結果である。TNBSまたはエタノールの投与後指定された時点で結腸標本を採取し、HE染色した結腸横断切片にて結腸における炎症変化の大きさを分析した。各群において３つの独立した実験からのデータをプールした。
好ましい実施態様の説明
本発明は、本明細書中に含まれる以下の特定の実施態様の詳細な説明および実施例を参照することによってより容易に理解され得る。
本発明は、IBDを有する被験体における確立した結腸炎の炎症応答を処置するための方法を提供する。この方法は、確立した結腸炎と診断された被験体に、IL-12の結腸炎誘導効果を減少させるに効果的な量のIL-12に対する抗体を投与する工程を包含する。ヒトが主たる治療標的であるが、結腸炎に罹患し易いどんな動物でもこの方法によって処置され得る。本明細書中で使用される場合、「確立した結腸炎」とは、１つまたはそれ以上の以下の組織学的特徴が検出され得る炎症状態によって特徴付けられる結腸の状態をいう：白血球浸潤；結腸壁の肥厚；経壁浸潤；杯状細胞の消失；潰瘍形成；肉芽腫；および線維形成。臨床的症状には、下痢、直腸脱、体重減少、腹痛、脱水症、および巨脾症が含まれ得るが、これらに限定されない。
IL-12に対する抗体は任意の供給源由来であり得る。しかし、免疫グロブリン自体の免疫原性を減少させるために、抗体は、好ましくは、ヒト起源であるか、または、実施例VIに記載のように、他の種において生成され、そしてヒトにおける投与のために「ヒト化」された抗体である。IL-12結合活性を維持する抗体フラグメントおよびIL-12結合活性（例えば、ホモダイマー形成）を維持しIL-12の結腸炎誘導効果を減少させるIL-12フラグメントは、用語「抗体」の意に含まれる。このような抗体およびフラグメントは、当該分野において公知の技術により作製され、そして本明細書中の実施例に記載の方法に従って特異性および活性についてスクリーニングされ得る。例えば、抗体産生についての一般的な方法は、HarlowおよびLane（23）に見い出され得る。
本発明において、IL-12に対する抗体は、薬学的に受容可能なキャリア中において、経口または非経口で、ヒト被験体に投与され得る。本発明における使用に適切なキャリアとしては、発熱物質を含まない生理食塩水が挙げられるが、これに限定されない。抗体の非経口投与のためには、添加剤（例えば、エチルオレエートまたはイソプロピルミリステート）を含み得る滅菌溶液または懸濁液が生理食塩水中に調製され、そして例えば、皮下または筋肉組織中に注射され得る。
あるいは、抗体は、天然または合成のいずれかのポリマーを用いて、直径４〜８μmのマイクロ粒子中にマイクロカプセル化され得る。このマイクロ粒子は、腸リンパ系組織を標的し、そして４週間までの抗体の持続性放出を生じる（22、28）。
ヒトの処置のためには、溶液形態のIL-12に対する抗体は、代表的には、体重１kgあたり10mgと20mgとの間の単回投薬量で投与される。あるいは、患者は、体重１kgあたり10mg〜20mgを毎週、結腸炎の症状が治まるまで与えられ得る。経口投与のためには、500mg〜1000mgがP.O.で与えられ得る。非経口投与のためには、体重１kgあたり10mg〜20mgが、単回のまたは週毎の静脈内注射として投与され得る。しかし、最終的な用量の決定には、個体の年齢、体重、および状態を考慮しなければならない。粒子形態のIL-12に対する抗体の投与のためには、500mg〜1000mgが、４〜８週間にわたる徐放について記載されるようにマイクロカプセル化され得る。当業者は、投薬量が臨床医の実践により至適化されること、および投薬量決定の方法が、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences（24）に記載されていることを理解する。
IL-12に対する抗体の経口投与に適切なキャリアには、香味剤、潤滑剤、懸濁剤、または保護剤としても作用し得る１つまたはそれ以上の物質が含まれる。適切な固体キャリアには、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、糖、デンプン、ゼラチン、セルロース、カルボキシポリメチレン、またはシクロデキストランが含まれる。適切な液体キャリアには、水、薬学的に受容可能な油、またはそれらの混合物が含まれ得る。これらの液体はまた、他の適切な薬学的添加物（例えば、緩衝液、保存剤、香味剤、粘性または浸透圧調節剤、安定剤または懸濁剤）を含み得る。適切な液体キャリアの例としては、種々の添加剤（pH調節されたゲルとしてのカルボキシポリメチレンを含む）を含むまたは含まない水が挙げられる。抗体は、胃での分解を避けるために腸に抗体を放出する腸溶皮カプセルに含ませられ得る。
別の実施態様において、本発明は、IL-12の結腸炎誘導効果を減少させることにおける有効性について物質をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、確立した結腸炎を有する動物を得る工程；物質を動物に投与する工程；およびIL-12に対する効果（結腸炎の炎症応答の減少を生じる）について動物をアッセイする工程を包含する。ここで、炎症応答の減少量がIFN-γ、TNF-α、または他のサイトカインに対する抗体の投与あるいはサイトカイン自体の投与から生じる減少量より大きければ、有効な物質であることを示す。確立した結腸炎の炎症応答の減少に有効な物質は、上記のような、炎症の組織学的および臨床的な徴候を減少させるかまたは逆転させるものである。
物質がIL-12の結腸炎誘導効果を減少させる能力は、目的の物質の投与前後に、結腸炎を有する動物の上記のような組織学的および臨床的な徴候を評価すること、および炎症の減少量を定量化することによって決定され得る。物質の投与後の動物において測定されるIL-12によって誘導される炎症応答の減少量が、IFN-γ、TNF-αまたは他のサイトカインに対する抗体の投与後、あるいはサイトカイン自体の投与後の動物において測定されるIL-12によって誘導される炎症応答の減少量より大きい場合、その物質は確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおいて有効であると決定される。
結腸炎を生じさせる動物は任意の哺乳動物であり得、そしてこれには、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、サル、およびチンパンジーが含まれ得るが、これらに限定されない。結腸炎は、当該分野において公知の任意の方法によって、動物中に生じさせ得る。例えば、動物の結腸に、有効量のハプテン試薬を導入することによって、結腸炎を生じさせ得る。ハプテン試薬には、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸、2,4-ジニトロクロロベンゼンおよび他のトリニトロフェニルアミン化合物が含まれ得るが、これらに限定されない。
IBDを有するヒトにおける抗IL-12処置の効力を評価するために、以下の研究を実施し得る。結腸および/または末端回腸の活性な炎症を有する患者であって、IBDの制御のための標準的なプレドニゾン治療（非経口または経口）に失敗した患者が、選択され得る。薬物効力は結腸鏡検査によりモニターされ得る。患者は２つの異なるプロトコルに無作為に分けられ得る。一方のプロトコルにおいて、被験体は最初のステロイド投薬量に維持され得、そして第二のプロトコルにおいて、被験体は抗IL-12治療を受けた後ステロイド投薬量を漸減され得る。
処置は、２時間にわたって注入される、単回投薬量が体重１kgあたり10mg〜20mgのIL-12に対する抗体、または結腸炎の症状が治まるまで各回２時間にわたって注入される、週投薬量が体重１kgあたり10mg〜20mgのIL-12に対する抗体のいずれかからなり得る。被験体の血圧、脈拍および体温を、２時間の注入期間の前、および注入の間30分間隔でモニターし得る。被験体は、１）抗IL-12注入時；２）注入の24時間後；３）注入の72時間後；４）最後の注入の２週間後；５）最後の注入の４週間後；６）最後の注入の６週間後；および７）最後の注入の８週間後の、血小板分画算定を伴う完全血球算定（CBC）、SMA-18化学プロフィール、赤血球沈降速度（ESR）、およびＣ反応性タンパク質アッセイからなる検査室評価を受け得る。
被験体はまた、抗IL-12の注入時、ならびに再び、最後の注入の２、４、６および８週間後に、ビデオ監視を伴うルーチンの結腸鏡検査を受け得る。
さらに、被験体の血清サンプルは、IFN-γレベルについてELISAによってアッセイされて、薬物効力をモニターし得る。また、結腸鏡検査の間に得られた組織剖検サンプルは培養され、そしてIFN-γレベルについてアッセイされ得る。
別の実施態様において、本発明は、炎症性腸疾患の予防における有効性について物質をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、結腸炎に罹り易い動物に物質を投与する工程；この動物を結腸炎を誘導する処置に供する工程；結腸炎の発現について動物をアッセイする工程；および結腸炎発現の予防における物質の有効性を、結腸炎発現の予防におけるインターフェロンγまたは腫瘍壊死因子αに対する抗体の有効性と比較する工程を包含する。ここで、物質が、結腸炎発現の予防において、インターフェロンγまたは腫瘍壊死因子αに対する抗体より効果的であれば、有効な物質であることを示す。
IBDの防止に効果的であることが見い出された物質（例えば、IL-12に対する抗体）は、本明細書中に記載される投与プロトコルに従って、結腸炎の発現を予防するために投与され得る。
本発明は、本発明における多くの改変および変形が当業者に明らかであるので、例示としてのみ意図される以下の実施例においてより詳細に記載される。
実施例
実施例Ｉ．材料、抗体、および細胞
試薬およびモノクロナール抗体。未標識およびビオチン化したモノクローナルラット抗マウスIL-2抗体（クローンJES6-1A12/JES6-5H4）、IL-4抗体（BVD4-1D11/BVD6-24G2）、IL-10抗体（JES5-2A5/SXC-1）、およびIFN-γ抗体（R4-6A2/XMG1.2）、ならびに組換えマウスIL-2（比活性：2.5×106Biological Response Modifiers Program（BRMP）単位/mg）、IL-4（CTLL-2.4アッセイにより１×107単位/mg）、IL-10（５×105単位/mg）、およびIFN-γ（１×107単位/mg）を、それぞれ、PharmingenおよびGenzyme Corp.（Cambridge, MA）から購入した。精製したハムスター抗マウスCD3ε抗体（クローン145-2C11）およびハムスター抗マウスCD28抗体（クローン37.51）を、Pharmingenから入手した。
細胞の単離および固有層CD4＋ Ｔ細胞（LP細胞）の精製。LP細胞を、新たに入手した結腸標本から、van der HeijdenおよびStok（17）により記載された技術の変法を用いて単離した。パイアー斑の除去後、結腸を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡化生理食塩水溶液（HBSS-CMF）中で洗浄し、0.5cm片に切断し、そしてエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）（0.37mg/ml）およびジチオトレイトール（DTT）（0.145mg/ml）を含有するHBSS中で、37℃にて15分間、２回インキュベートした。組織を、振盪インキュベーターにおいてコラゲナーゼＤ（400U/ml）およびDNase Ｉ（0.1mg/ml）（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を含有するRPMI 1640培地（Whittaker, Walkersville, MD）中で、37℃にてさらに消化した。次いで、LP細胞を、40％−100％Percollグラジエント（Pharmacia, Uppsale, Sweden）上に重層し、そしてリンパ球富化集団を、40−100％界面で細胞から単離した。富化したCD4＋ Ｔ細胞集団を、マウスCD4＋ Ｔ細胞単離カラム（ISOCELL▲Ｒ▼；Pierce Co.,Rockford, IL）を用いてネガティブ選択により得た。得られた細胞は、フローサイトメトリー（FACScan; Becton Dickinson, Sunnyvale, CA）により分析した場合、85％を超えるCD4＋細胞からなっていた。
LP細胞の細胞培養。LP細胞の細胞培養を、３mM L-グルタミン、10mM HEPES緩衝液、10μg/mlゲンタマイシン（Whittaker）、それぞれ100U/mlのペニシリンおよびストレプトマイシン（Whittaker）、0.05mM 2-メルカプトエタノール（2ME）（Sigma Chemical, St Louis, MO）ならびに10％ FCSを補充したRPMI-1640培地からなる完全培地中で行なった。
脾臓CD4＋ Ｔ細胞の単離。脾臓を、無菌的に取り出し、続いて、コラゲナーゼ（400U/ml）およびDNase Ｉ（12.5μg/ml）で、37℃にて15分間消化した。濾過（filtration straining）の後、得られた脾細胞懸濁液から、塩化アンモニウム-Tris（ACK）溶解緩衝液（Ｂ＆Ｂ Scott, W.Warwick, RI）での低張性溶解により赤血球（RBC）を枯渇させた。Percollグラジエント遠心分離物の70％/90％層から回収した細胞を、マウスCD4＋ Ｔ細胞単離カラムを用いてさらにネガティブ選択した。蛍光活性化細胞ソーター（FACS）分析により評価したところ、得られた細胞集団は、85％を超えるCD4＋細胞を含んでいた。
脾臓CD4＋ Ｔ細胞の細胞培養。105個の脾臓CD4＋ Ｔ細胞を、１mlの完全培地中で培養した。培養上清を、48時間後に取り出し、そして上記のようにサイトカイン濃度についてアッセイした。
実施例II．抗IL-12抗体でのマウスの処置
抗IL-12抗体での処置。ラット抗マウスIL-12中和抗体を産生するハイブリドーマ細胞株（C17.8）（G.Trinchieri, The Wistar Institute, Philadelphia, PA（20, 21））を用いて、標準的手順に従ってヌードマウス中に腹水液を作製し、そして抗体を、E-Z-SEP精製キット（Middlesex Sciences, Inc, Foxborough, MA）を用いて精製した。ラットコントロールIgGを、Jackson Immuno Research（West Grove, PA）から入手した。それぞれ１mgのラット抗マウスIL-12抗体またはラットコントロールIgGを、種々の時点でTNBSで予め処置したマウスに腹腔内投与した。
実施例III．結腸炎の誘導および評価
結腸炎の誘導。特定病原体未感染の２〜４月齢の雌性BALB/cまたはSJL/Jマウスを、National Cancer Institute（NCI, Bethesda, MD）から入手し、そしてNational Institutes of Healthのビルの10A動物施設で維持した。マウスをメトファン（metofane）（メトキシフルラン；Pitman-Moore, Mundelein IL）で軽く麻酔した。3.5Fカテーテルを、先端が肛門から４cmとなるまで結腸中に挿入した。結腸炎を誘導するために、50％エタノール中の0.5mgのハプテン試薬2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS； Sigma, St.Louis, MO）を、（腸上皮バリアを破壊するために）結腸の管腔中に、１ml注射器に取り付けたカテーテルを通してゆっくりと投与した。コントロール実験では、上記と同じ技術を用いてマウスに50％エタノールを単独で与えた。総注入容量は、両群とも100μlであった。このことは、TNBSまたはエタノールが、盲腸および虫垂を含む結腸全体に到達することを可能にする。動物を、垂直姿勢に30秒間保持し、そしてケージに戻した。
組織学的変化の等級付け。組織を種々の時点で取り出し、そしてパラフィン中に包埋した。パラフィン切片を作製し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。結腸の顕微鏡用横断切片上で炎症の程度を、０から４まで半定量的に等級付けした［０−炎症の徴候なく、結腸は、正常な結腸と区別できない；１−非常に低レベルの白血球浸潤（視野の１〜10％で白血球が浸潤）；２−低レベルの白血球浸潤（視野の11〜25％で白血球が浸潤）、充血；３−高レベルの白血球浸潤（視野の26〜50％で白血球が浸潤）、高い血管密度、結腸壁の肥厚；４−経壁白血球浸潤（視野の＞50％で白血球が浸潤）、杯状細胞の喪失、高い血管密度、結腸壁の肥厚］。等級付けを、同じ病理学者により盲検様式で行なった。
結腸壁の厚さの形態計測評価。各処置群からの３体以上の動物を、種々の時点でランダムに選択し、そして結腸サンプルを取り出し、そしてパラフィン中に包埋した。結腸壁の厚さを、Olympus Vanox S1顕微鏡を用いて目盛り付き接眼レンズを通して、各切片の長さ全体を通して２mm間隔で、奬膜表面から管腔表面までの距離を測定することにより横断切片で決定した。
免疫組織化学。サンプルを、ドライアイス上で最適切断温度（OCT）コンパウンド中に配置し、そして７μmの凍結切片を、標準的手順に従って切断した。次いで、切片を風乾し、そして冷アセトン中で室温で２分間固定した。サンプルを、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中で15分間再水和し、PBS中の５％ウシ胎児血清（FCS）で20分間ブロックし、そしてフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合ラット抗マウスCD4抗体（１：100希釈; Pharmingen, San Diego, CA）とともに、45分間、湿潤暗チャンバー中でインキュベートした。次いで、切片をPBS中で15分間洗浄し、マウントし、そして490nmの励起波長で蛍光顕微鏡を用いて分析した。
CD4＋ Ｔリンパ球の定量を、各時点および各処置群からの少なくとも３標本について凍結切片で、ランダムに選択した10個の強拡大視野（HPF）を検査することにより行なった。これらの実験条件下（×400倍）で、１つのHPFは0.25mm2を示した。
2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸の直腸内投与は、BALB/cマウスおよびSJL/Jマウスに慢性の肉芽腫性結腸炎を誘導する。50％エタノール中のTNBSの直腸内投与に供したBALB/cマウスおよびSJL/Jマウスは、広範な消耗病を併発する重篤な下痢および直腸脱を伴う全結腸炎（pancolitis）を再現性よく発現した。臨床的疾患のピークは３週間で生じ、そして結腸の臨床的徴候は、通常、２カ月後に沈静化する。50％エタノール単独で処置したコントロールマウスは、消耗病を発現せず、そして健康に見えた。
TNBSの投与後７日目に取り出したTNBS処置したBALB/cマウスの結腸は、著しい充血および炎症を現したが、一方、50％エタノール単独で処置したコントロールマウスの結腸は、炎症の肉眼的徴候を全く示さなかった。TNBS処置したマウスは、巨脾腫を示した。
結腸炎の誘導後１日目の間の組織学的分析は、結腸内への好中性顆粒球の浸潤を示した。７日目に、結腸全体（しかし、小腸を除く）を冒した経壁炎症が見出された。結腸炎を、結腸壁の肥厚、潰瘍形成、杯状細胞の喪失、および肉芽腫の存在に関連する、リンパ球浸潤により主に特徴付けた。免疫組織化学的染色は、７日目に、CD4＋ Ｔ細胞が、TNBS処置したマウスの結腸でコントロールマウスと比較して増加したことを示した。炎症活性の相違は、結腸切片の組織学的等級付けによりさらに確認された（図１）。結腸壁の厚さの形態計測分析およびCD4＋ Ｔリンパ球の数（表１）により評価したように、疾患の強度は、通常、TNBSの投与後２週間〜４週間の間にピークがあった。疾患の後期では、顆粒球の数が減少したが、しかし壁内リンパ様擬集体は残存し、そして初期線維症が見出された。炎症のこれらの組織学的徴候は、TNBS処置の２カ月後に依存として検出されたが、しかしエタノール処置したマウスには存在しなかった。
組織学的に、TNBS処置したマウスの脾臓は、コントロールマウスからの脾臓と比較した場合、７日目に赤色脾髄および細動脈周囲リンパ様鞘のサイズの増大を示した。脾臓リンパ球の蛍光活性化細胞ソーター（FACS）分析は、TNBS処置したマウスにおいて、エタノール処置したコントロールマウスおよび正常なBALB/cマウスと比較して、CD4＋およびCD8＋ Ｔ細胞の割合の２倍増加、ならびにB220＋ Ｂ細胞の減少を明らかにした。
IL-12に対する抗体の早期投与は、TNBS処置したマウスにおいて結腸炎を抑制し、そして消耗病をなくす。IL-12に対する抗体が疾患活性に影響を及ぼし得るか否かを決定するために、結腸炎誘導の５日後および９日後に、抗IL-12またはコントロールのラットIgGでマウスを全身的に処置した。マウスを抗IL-12で処置した場合、消耗病の著しい改善が明らかになった。抗IL-12処置したマウスは、非処置のマウスまたはコントロールのラットIgGを与えたマウスと比較して、より活動的になり、そして立毛の外観が消えた。さらに、抗IL-12を投与したマウスは、通常、最初の体重を維持したが、一方、コントロールIgGを処置したマウスは、体重が減少し続けた。最終的に、12日目での結腸の肉眼検査は、抗IL-12を投与した動物での炎症活性の減少を明らかにした。
組織学的研究は、抗IL-12処置したマウスの結腸において、著しく少ない炎症性細胞を示した。ほとんどの場合、抗IL-12処置は、TNBSが誘導した炎症を完全に排除し、そして結腸の正常な組織学的外観を回復した。このことは、結腸切片の組織学的等級付けにより確認された；３つの独立実験によりプールされたデータは、抗IL-12処置後の炎症活性の著しい減少を示した（図２）。
実施例IV．サイトカインアッセイ
ELISA。サイトカイン産生を測定するために、24ウェルプレート（Costar, Cambridge, MA）を、炭酸緩衝液（pH9.6）中の10μg/mlマウス抗CD3ε抗体で、４℃にて一晩、コートした。105 LP Ｔ細胞を、予めコートしたかまたはコートしていないウェルにおいて１mlの完全培地中で培養し、そして１μg/mlの可溶性抗CD28抗体を、抗CD3εコートしたウェルに添加した。培養上清を48時間後に取り出し、そしてサイトカイン濃度についてアッセイした。サイトカイン濃度を、製造者（Pharmingen）の推奨により、Immulon-4 96ウェルマイクロタイタープレート（Dynatech Laboratories Inc.,Chantilly, VA）を用いて、特異的ELISAにより決定した。光学密度を、Dynatech MR 5000 ELISAリーダーで490nmの波長で測定した。
TNBS処置したマウスの刺激LP細胞は、Th1サイトカインを分泌する。TNBS処置したマウスの結腸における浸潤LP細胞によるサイトカイン産生を試験するために、この細胞集団を結腸炎の誘導後７日目に結腸組織標本から精製し、そしてこれらの細胞のサイトカインパターンを、エタノール処置したコントロールマウスの結腸組織標本から得たLP細胞のパターンと比較した。細胞を２日間培養し、そして培養上清を、特異的ELISAによりTh1サイトカイン（IL-2、IFN-γ）およびTh2サイトカイン（IL-4、IL-10）の濃度について分析した。LP細胞による自発的IFN-γ産生の10倍増加が、TNBS処置したマウスにおいて見出された。さらに、TNBS処置したマウスからの、抗CD3および抗CD28で刺激したLP細胞は、コントロールマウスからのLP細胞よりも20〜50倍高レベルのIL-2およびIFN-γを産生した。同様に、自発的（4.5Ｕ対1.8Ｕ）および誘導された（抗CD3および抗CD28での刺激後、46Ｕ対16.8Ｕ）、脾臓CD4＋ Ｔ細胞によるIFN-γ産生の増加は、TNBS処置した動物において、この時点でのエタノールコントロール群と比較して見出された。
上記の知見とは対照的に、TNBS処置したマウスからの刺激していないLP細胞によるIL-4の分泌は、エタノール処置したコントロールマウスからのLP細胞と比較して同じであった。TNBS処置したマウスからの刺激されたLP細胞において、IL-4の平均分泌は、エタノール処置したコントロールマウスと比較して約５倍減少した。最終的に、刺激されたかまたは刺激されていないLP細胞によるIL-10の分泌は、TNBS処置したマウスおよびエタノール処置したマウスで同様であった。
インサイチュ逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）。IFN-γ mRNA発現についてのインサイチュRT-PCRを、以前に記載された（18）ように行なった。凍結切片を、荷電したスライドグラス上に配置して、0.5mlのEppendorfチューブにフィットするように切断した。サンプルを10％ホルムアルデヒド中で４℃にて一晩固定し、PBS中で３回およびオートクレーブしたdH2O中で４回、５分間づつ洗浄した。切片を、0.01N NCl中の２mg／mlトリプシノーゲン（Sigma）で25℃にて15分間透過化し、次いで緩衝液Ａ（0.1M Tris HCl（pH7.5）、0.1M NaCl）で中和した。DNA分解のために、切片を、40mM Tris HCl（pH7.9）、10mM NaCl、６mM MgCl2、および0.1mM CaCl2を含有する緩衝液Ｂ中のRQ1 RNaseフリーDNase（８U/100ml；Promega, Madison, WIから入手）中で、37℃にて12分間および75℃にて10分間、インキュベートした。次に、切片を、Perkin Elmer Thermocycler中で以下の反応混合物100μl中で50℃にて60分間インキュベートした：10mM Tris HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2、25μM dATP、25μM dTTP、25μM dCTP、25μM dGTP（Pharmacia, Piscataway, NJ）、100nMのいずれかのIFN-γプライマー（センス：5’-GACAATCAGGCCATCAGCAACAAC-3’（配列番号１）；アンチセンスプライマー：5’-TCCTGAGGCTGGATTCCGGCAACA-3’（配列番号２）（19））、10mM DTT、75U RNasin、および400U M-MLV逆転写酵素（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）。スライドを、クエン酸ナトリウム緩衝液（３M NaCl、0.3Mクエン酸Na3、pH7.0、２×SSC）、１×SSC、0.5×SSC中でそれぞれ５回づつ、そしてdH2O中で２回洗浄した。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）方法を、センスまたはアンチセンスのいずれかでプライムしたcDNAについて、以下の反応混合液100μl中でインサイチュで行なった：それぞれ25μMのヌクレオチドdATP、dCTP、dGTP、および23.7μM dTTP、1.25μジゴキシゲニン-11-dUTP（dig-11-dUTP；Boehringer Mannheimから入手した）、10mM Tris HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2、５U Taqポリメラーゼ（Boehringer）、および10nMのIFN-γプライマー。95℃にて４分間のサンプル変性後、サーモサイクリングを、５サイクル（94℃にて70秒間、62℃にて１分間、72℃にて１分間）行い；最終伸長を72℃にて10分間行なった。次いで、サンプルを、SSC溶液（２×SSC、１×SSC、0.5×SSC；それぞれ５回）中で洗浄し、そしてDIG核酸検出キット（Boehringer Mannheim）を用いて免疫検出を行なった。切片を、段階的なエタノール中で脱水して、キシレン中に配置し、そしてカバースリップに載せた。
IFN-γについてのElispotアッセイ。105個のLP細胞を、抗CD3εでコートした24ウェルプレート中で１日インキュベートし、そして１μg/mlの可溶性抗CD28抗体を添加した。細胞を、ラット抗マウスIFN-γ（Pharmingen）でコートした24ウェルプレート中でインキュベートした。12時間後、プレートをPBS/TWEEN▲Ｒ▼中で洗浄し、そしてビオチン化ラット抗マウスIFN-γ（Pharmingen）（２μg/ml）を添加した。プレートを、４℃にて一晩インキュベートした。PBS/TWEEN▲Ｒ▼中で洗浄した後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（１：1000希釈；Zymedから入手した）を、37℃にて30分間添加した。プレートをPBS/TWEEN▲Ｒ▼中で再度洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ（AP）基質（Promega, Madison, WI）を、１％アガロースゲルとともに添加した。発色反応を、24時間進行させた後スポットを撮影した。
インサイチュポリメラーゼ連鎖反応研究は、TNBS処置したBALB/cマウスの結腸における上昇したIFN-γ mRNA発現を示す。IFN-γ産生において観察された増大がmRNAレベルでも観察されるか否かを決定するために、TNBS処置したマウスの結腸におけるIFN-γのmRNA発現を、インサイチュPCR研究により評価した。エタノール処置したコントロール動物は、７日目にはIFN-γ mRNAの有意な発現を示さなかった。しかし、TNBS処置した動物において、同じ時点でのIFN-γ mRNA発現の劇的なアップレギュレーションが観察された。高い染色強度は、特に上皮下領域で見られた。
刺激されたLP細胞によるIFN-γ産生は、抗IL-12を与えられたTNBS処置したマウスにおいてなくなる。抗IL-12処置した動物におけるLP細胞によるIFN-γ産生の分析は、ラットIgG処置したマウスと比較して、TNBS処置し、抗IL-12を投与したマウスにおけるIFN-γ産生の排除を明らかにした。このことは、抗IL-12処置が、局所のCD4＋ Ｔ細胞のTh1様応答に影響を与えることにより作用し得ることを示す。さらに、LP細胞によるIFN-γ分泌についてのElispotアッセイは、ラットコントロールIgG処置群と比較して、抗IL-12処置群におけるElispotの平均数の劇的な減少を示した。しかし、Elispotのサイズは両方の群で同様であった。このことは、抗IL-12処置したマウスからのLP細胞によるIFN-γ分泌の減少が、主にIFN-γ分泌細胞数の減少に起因したことを示す。
IL-12に対する抗体の後期投与は、TNBS誘導性結腸炎を有するマウスにおける消耗病をなくす。結腸炎が完全に確立された場合、抗IL-12処置が疾患の後期相の間に有効であるか否かを決定するために、抗IL-12またはコントロールラットIgGの投与を、20日目に開始し、そして24日目および28日目に繰り返した。マウスの平均重量の著しい増大は、抗IL-12処置後に見出されたが、しかしラットコントロールIgG処置の後には見出されなかった。さらに、このようなマウスからのLP細胞を抗CD3および抗CD28で刺激した場合、IFN-γ分泌の排除は、抗IL-12を与えたマウスでは観察されたが、しかしラットコントロールIgGを与えたマウスでは観察されなかった。
実施例Ｖ．抗IL-12抗体でのヒトの処置
確立した結腸炎と診断されたヒト被験体への、IL-12に対する抗体の投与。ヒト被験体におけるIL-12の結腸炎誘導効果を阻害するために、10mg〜20mg/kg体重の、IL-12に対する抗体を、結腸炎の症状（例えば、腹痛、下痢、脱水、またはIBDの他の通常の症状）が沈静化されるまで、２時間にわたって投与される単回用量として、または２時間にわたって投与される週単位注入として非経口投与し得る。経口投与のために、IL-12に対する抗体の500〜1000mgを、上記の結腸炎の症状が沈静化するまで、単回用量または週単位用量としてP.O.投与し得る。
実施例VI．ヒト化抗体
IL-12に対するヒト化マウス抗体の作製。齧歯類のモノクロナール抗体またはポリクローナル抗体を、Junghansら（25）、Brownら（26）、およびKettleboroughら（27）に示すプロトコルに従って改変し得る。詳細には、齧歯類抗体を、当業者に公知の組換えDNAプロトコルにより、齧歯類の可変領域ならびにヒトの重鎖および軽鎖の定常領域から構成されるキメラ齧歯類-ヒト抗体を構築することにより、ヒト投与のために改変し得る。齧歯類抗体をヒト化するための他のアプローチは、齧歯類の可変領域由来の齧歯類の相補性決定領域（CDR）を、ヒトの可変領域にグラフト化することである。これらのアプローチのいずれかを用いることにより、齧歯類抗体は、ヒト被験体への投与のためにヒト化され得る。
実施例VII．動物モデルにおいて物質をスクリーニングするための方法
確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおける有効性についての物質のスクリーニング。IL-12の結腸炎誘導効果を逆転させることにより、確立した結腸炎の炎症応答を減少させることにおいて、ある物質が有効であるか否かを決定するために、確立した結腸炎の動物モデルを、上記の実施例IIIを示すプロトコルに従って調製し得る。次いで、ある量の目的の物質を、１mgの単回用量からなる投薬レジメで、または１mgを１週間に２回の週単位レジメで動物に非経口投与し得る。動物への物質の投与後の指定された時点で、炎症応答の減少量を、上記の実施例IIIに示すプロトコルに従って決定し得る。IFN-γに対する抗体およびTNF-αに対する抗体をまた、動物に投与し得る。この動物では、１mgの単回用量からなる投薬レジメまたは１mgを１週間に２回の週単位レジメで結腸炎が確立される。抗IFN-γまたはTNF-αの投与後の指定された時点で、炎症応答の減少量を、上記の実施例IIIに示すプロトコルに従って決定し得る。抗IFN-γまたは抗TNF-αの投与により誘導される炎症減少量よりも大きな程度で結腸炎の炎症応答を減少させる物質は、確立した結腸炎を処置するために有効な物質であると考えられる。
IBDを予防することにおける有効性についての物質のスクリーニング。ある物質がIBDを予防することにおいて有効であるか否かを決定するために、物質を、結腸炎に罹患し易い動物に投与し得、次いでこの動物に結腸炎を誘導する処置を（例えば、本明細書中の実施例に記載のようにハプテン試薬で処置することにより）受けさせ得る。ある量の目的の物質を、１mgの単回用量からなる投薬レジメ、または１mgを１週間に２回の週単位レジメで動物に非経口投与し得る。動物への物質の投与および結腸炎を誘導するための動物の処置の後の指定された時点で、炎症応答の発現を、上記の実施例IIIに示すプロトコルに従って決定し得る。IFN-γに対する抗体およびTNF-αに対する抗体をまた、動物に投与し得る。この動物は、１mgの単回用量からなる投薬レジメ、または１mgを１週間に２回の週単位レジメで結腸炎に罹患し易い。抗IFN-γまたはTNF-αの投与および結腸炎を誘導するための動物の処置の後の指定された時点で、炎症応答の発現を、上記の実施例IIIに示すプロトコルに従って決定し得る。抗IFN-γまたは抗TNF-αの投与により誘導された炎症予防の程度よりも大きな程度で炎症応答を予防する物質は、IBDを予防するために有効な物質であると考えられる。
本発明のプロセスは、その特定の実施態様の具体的な詳細を参照して記載されているが、このような詳細が、これらが添付の請求の範囲に含まれる場合およびその程度までを除いて、本発明の範囲の限定とみなされるべきであるとは意図していない。
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表１。TNBS処置およびエタノール処置をしたBALB/cマウスの処置後の種々の時点での結腸における結腸壁の厚さおよび１強拡大視野（HPF）あたりのCD4＋ Ｔリンパ球の数の評価。結腸壁の厚さは、μm±SEMで表される。報告されたCD4＋ Ｔリンパ球についての値は、１HPFあたりのポジティブ細胞±SEMとして表される。
参考文献
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配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：ザ  ガバメント  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ，アズ  リプレゼンテッド  バイ  ザ  セクレタリー，デパートメント  オブ  ヘルス  アンド  ヒューマン  サービシーズ
メリーランド  ２０８５２，  ロックビル，スイート  ３２５，エグゼクティブブールバード  ６０１１，  オフィス  オブ  テクノロジー  トランスファー，ナショナル  インスティテューツ  オブ  ヘルス内
（ii）発明の名称：IL-12に対する抗体を使用する、確立した結腸炎を処置する方法
（iii）配列数：２
（iv）連絡住所：
（A）名称：ニードル アンド ローゼンバーグ，ピー．シー．
（B）番地：ピーチツリー ストリート １２７，スイート １２００
（C）市：アトランタ
（D）州：ジョージア
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：３０３０３
（ｖ）コンピュータ読み出し形態：
（A）媒体型：フロッピー ディスク
（B）コンピューター：IBM PC互換用
（C）OS：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン リリース#1.0，バージョン #1.30
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（viii）代理人／事務所情報：
（A）氏名：ペリーマン，デイビッド ジー．
（B）登録番号：３３，４３８
（C）照会／記録番号：１４１４．６７８
（ix）電話回線情報：
（A）電話：４０４／６８８−０７７０
（B）テレファックス：４０４／６８８−９８８０
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号１：
0004148533.tif 000007
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号２：
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【図１】
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【図２】
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