(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)構成二糖１モル当たり平均０．３〜１．５モルの硫酸基を含むケラタン硫酸にケラタン硫酸のグリコシド結合を切断する作用を有する酵素を作用させて硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得、(b)次いで得られた該硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を完全脱硫酸化する工程からなる、目的の分子サイズを有するＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
前記酵素が下記酵素群から選ばれる１種または２種以上である請求の範囲第１項に記載の製造方法。
酵素群(1)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用：
ケラタン硫酸のβ−ガラクトシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基の６位に硫酸基を有する当該β−ガラクトシド結合には作用しない。
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基（６位に硫酸基を有さない）の非還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位の硫酸基の有無にかかわらず当該β−ガラクトシド結合に作用する。
酵素群(2)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用：
ケラタン硫酸のβ−ガラクトシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基の６位に硫酸基を有する当該β−ガラクトシド結合には作用しない。
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基（６位に硫酸基を有さない）の非還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を有する当該β−ガラクトシド結合には作用する。
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基（６位に硫酸基を有さない）の非還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を有さない当該β−ガラクトシド結合には作用しない。
酵素群(3)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用：
ケラタン硫酸のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を切断する。
(b)基質特異性：
・β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に関与するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位およびそのＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガラクトース残基の６位にそれぞれ硫酸基を有する当該β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に作用する。
・β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に関与するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を有し、そのＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガラクトース残基の６位には硫酸基を有さない当該β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に作用する。
・β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に関与するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位およびそのＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガラクトース残基の６位のどちらにも硫酸基を有さない当該β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合には作用しない。
【請求項３】
前記工程(a)が硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を分画する工程をさらに含み、前記工程(b)がＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を分画する工程をさらに含むことを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の製造方法。
【請求項４】
前記酵素群(1)に属する酵素が、エシエリキア・フロインディ（Escherichia freundii）由来のエンド−β−ガラクトシダーゼである請求の範囲第２項または第３項記載の製造方法。
【請求項５】
前記酵素群(2)に属する酵素が、シュードモナスｓｐ．（Pseudomonas sp.）由来のエンド−β−ガラクトシダーゼである請求の範囲第２項または第３項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記酵素群(3)に属する酵素が、バチルスｓｐ．Ｋｓ３６（Bacillus sp.Ks36）由来、またはバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２（Bacillus circulans KsT202）由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである請求の範囲第２項または第３項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の糖鎖骨格が、下記一般式(1)〜(6)のいずれか１つで表される請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の製造方法。
(GlcNAc-Gal)n           (1)
SA-Gal-(GlcNAc-Gal)m    (2)
(Gal-GlcNAc)n           (3)
SA-(Gal-GlcNAc)m        (4)
Gal-(GlcNAc-Gal)n       (5)
GlcNAc-(Gal-GlcNAc)n    (6)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SAはシアル酸残基を、-はグリコシド結合を、nは3〜6の整数を、mは3〜10の整数をそれぞれ表す）
【請求項８】
前記Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖が、下記一般式(1)〜(6)のいずれか１つで表される請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の製造方法。
(GlcNAc-Gal)n           (1)
SA-Gal-(GlcNAc-Gal)m    (2)
(Gal-GlcNAc)n           (3)
SA-(Gal-GlcNAc)m        (4)
Gal-(GlcNAc-Gal)n       (5)
GlcNAc-(Gal-GlcNAc)n    (6)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SAはシアル酸残基を、-はグリコシド結合を、nは3〜6の整数を、mは3〜10の整数をそれぞれ表す）
【請求項９】
少なくとも下記の工程を含むことを特徴とする、目的の分子サイズを有する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法。
工程：構成二糖１モル当たり平均０．３〜１５モルの硫酸基を含むケラタン硫酸を下記酵素群(1)〜(3)のいずれかに属する１種または２種以上の酵素を作用させて硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得る工程。
酵素群(1)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用：
ケラタン硫酸のβ−ガラクトシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基の６位に硫酸基を有する当該β−ガラクトシド結合には作用しない。
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基（６位に硫酸基を有さない）の非還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位の硫酸基の有無にかかわらず当該β−ガラクトシド結合に作用する。
酵素群(2)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用：
ケラタン硫酸のβ−ガラクトシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基の６位に硫酸基を有する当該β−ガラクトシド結合には作用しない。
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基（６位に硫酸基を有さない）の非還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を有する当該β−ガラクトシド結合には作用する。
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基（６位に硫酸基を有さない）の非還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を有さない当該β−ガラクトシド結合には作用しない。
酵素群(3)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用：
ケラタン硫酸のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を切断する。
(b)基質特異性：
・β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に関与するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位およびそのＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガラクトース残基の６位にそれぞれ硫酸基を有する当該β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に作用する。
・β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に関与するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を有し、そのＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガラクトース残基の６位には硫酸基を有さない当該β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に作用する。
・β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に関与するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位およびそのＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガラクトース残基の６位のどちらにも硫酸基を有さない当該β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合には作用しない。
【請求項１０】
下記一般式(1),(2),(4),(5)及び(6)のいずれか１つで表されるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖。
(GlcNAc-Gal)n           (1)
SA-Gal-(GlcNAc-Gal)m (2)
SA-(Gal-GlcNAc)m        (4)
Gal-(GlcNAc-Gal)n       (5)
GlcNAc-(Gal-GlcNAc)n    (6)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SAはシアル酸残基を、-はグリコシド結合を、nは3〜6の整数を、mは3〜10の整数をそれぞれ表す。）
【請求項１１】
前記Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖が６〜１２糖のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖であり、前記ケラタン硫酸が構成二糖１モル当たり平均０．３〜１．３モルの硫酸基を含む請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記酵素が前記酵素群(3)から選択され、前記Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖が下記一般式(3)及び(4)のいずれかで表わされる請求の範囲第８項に記載の製造方法。
(Gal-GlcNAc)n           (3)
SA-(Gal-GlcNAc)m        (4)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SAはシアル酸残基を、-はグリコシド結合を、nは3〜6の整数をmは3〜6の整数をそれぞれ表す）
【請求項１３】
下記一般式(4)で表わされる請求の範囲第１０項に記載のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖。
SA-(Gal-GlcNAc)m        (4)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SAはシアル酸残基を、-はグリコシド結合を、mは3〜6の整数をそれぞれ表す）
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の新規な製造方法に関し、詳しくは、硫酸基含量を調整したケラタン硫酸から酵素反応と化学反応とによりＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を製造する方法に関する。また本発明は硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の新規な製造方法に関する。さらに本発明は新規なＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖にも関する。
背景技術
Ｎ−アセチルラクトサミン(LacNAc)構造を骨格とするオリゴ糖およびその誘導体は、セレクチンファミリーへの結合能をもつ糖鎖として、生体内では重要な生理的機能を果たしている。細胞表面におけるこれらの糖鎖の発現は、異種細胞間の特異的な接着に関与していることが明かとなり、これら糖鎖を利用した機能賦活剤や抑制剤は、有用な薬物になると期待されている。すなわち、その中心的な化合物であるシアリルルイスＸ(SLex)およびその類縁化合物は、セレクチン分子をブロックし、リンパ球と内皮細胞との接着を阻害することによって、炎症を伴う種々の疾患の軽減に役立つと考えられている。また、これらの糖鎖はがん細胞が血行性転移をする場合の内皮細胞への接着や、微生物がターゲット細胞へ感染する際の接着に関与するとも考えられており、これらの疾病を抑制する薬剤開発の素材として重視されている。
Ｎ−アセチルラクトサミン構造を骨格として有するオリゴ糖およびその誘導体は、新規な薬剤の開発や、生体内の生理活性に関する研究において重要な役割を果たすことが期待されている。その基本骨格であるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖、特にセレクチンファミリーの天然のリガンド糖鎖に類似した、長鎖のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖が得られれば、該Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖にシアル酸残基、フコース残基、硫酸基、セラミド等を適宜付加することによって、天然に微量しか存在しないセレクチンファミリーのリガンド糖鎖を合成することができると考えられる。
さらに、Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖、特に長鎖のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の安定した供給も望まれる。しかし、Ｎ−アセチルラクトサミン構造を骨格とするオリゴ糖は天然に微量しか存在せず、また長鎖のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の合成的製造は極めて困難であり、工業的規模かつ安価なＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の生産方法が望まれている。
また、硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖、特に長鎖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖は、Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖、特に長鎖のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の合成中間体として有用であり、この製造方法が提供されれば、Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の安定的な供給につながることが期待される。
発明の開示
本発明は上記観点からなされたものであり、セレクチンファミリーのリガンド糖鎖を合成するための素材となる新規なＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖、Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の新規な製造方法、および硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の新規な製造方法を提供することを課題とする。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｎ−アセチルラクトサミン構造を基本骨格としてもつケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸を酵素によって硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖に分解し、次いで完全脱硫酸化することによってＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（特に長鎖のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖）が得られることを見出し、本発明に至った。
また、ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸を酵素消化することによって硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（特に長鎖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖）が得られることを見出し、本発明に至った。
また、新規なＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得ることに成功し、本発明に至った。
すなわち本発明は、ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸に、ケラタン硫酸のグリコシド結合を切断する作用を有する酵素（本明細書では単に「ケラタン硫酸分解酵素」ということもある）を作用させて硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得、次いで得られた該硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を完全脱硫酸化する工程からなるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法（本明細書中では単に「本発明方法１」ということもある）、および新規なＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（本明細書中では単に「本発明オリゴ糖」ということもある）を提供する。
また本発明は、ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸に、硫酸基の存在の有無によって基質特異性が異なる３種類のケラタン硫酸分解酵素の酵素群のいずれかに属する１種または２種以上の酵素を作用させる工程を少なくとも含む、硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法（本明細書中では単に「本発明方法２」ということもある）を提供する。なお、本発明方法１と本発明方法２を合わせて単に「本発明方法」ということもある。
本明細書中で「Ｎ−アセチルラクトサミン」という用語は、ガラクトース残基（Gal）とＮ−アセチルグルコサミン残基（GlcNAc）とがグリコシド結合した構造（Gal-GlcNAc）を意味する。また本明細書中では、「Ｎ−アセチルラクトサミン」という用語には、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（GlcNAc）とガラクトース残基（Gal）とがグリコシド結合した構造（GlcNAc-Gal）の意味をも包含する。
本明細書中で「Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖」とは、Ｎ−アセチルラクトサミン構造を少なくとも１つ有するオリゴ糖をいい、例えば、Ｎ−アセチルラクトサミン自体や、グリコシド結合を介したＮ−アセチルラクトサミンの繰り返しからなるオリゴ糖が包含される。また非還元末端にシアル酸残基が付加されていてもよい。また非還元末端および還元末端は、ガラクトース残基とＮ−アセチルグルコサミン残基のいずれであってもよい。これらはいずれも本明細書中の「Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖」という用語に包含される。すなわち下記一般式(1)〜(6)で表されるオリゴ糖は、いずれも本明細書中の「Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖」に包含される。
(GlcNAc-Gal)n           (1)
SA-Gal-(GlcNAc-Gal)m    (2)
(Gal-GlcNAc)n           (3)
SA-(Gal-GlcNAc)m        (4)
Gal-(GlcNAc-Gal)n       (5)
GlcNAc-(Gal-GlcNAc)n    (6)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SAはシアル酸残基を、-はグリコシド結合を、nは1〜6の整数を、mは1〜10の整数をそれぞれ表す）
本明細書中で「硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖」とは、硫酸基を有するＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を意味する。
本明細書中で「硫酸化オリゴ糖」とは、硫酸基を有するオリゴ糖を意味する。
本明細書中で「硫酸基含量を調整する」とは、所望の硫酸基含量となるように硫酸基含量を増加させること（すなわち硫酸化すること）、減少させること（すなわち部分的脱硫酸化すること）および硫酸基含量を増加または減少させなくとも所望の硫酸基含量であるならば、硫酸基含量を変化させないことをも意味する。
本明細書中で「部分的脱硫酸化」とは、硫酸基を部分的に除去することを意味し、硫酸基を一部残す点において「完全脱硫酸化」とは異なる。
本明細書中で「完全脱硫酸化」とは、硫酸基を実質的に全て除去することを意味し、硫酸基を部分的に除去することとは異なる。
【図面の簡単な説明】
図１は、メタノール塩酸法によるケラタン硫酸の部分的脱硫酸化の時間と、６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の生成率との関係を示すグラフである。
図２は、ＤＭＳＯ法によるケラタン硫酸の部分的脱硫酸化の温度と、６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の生成率との関係を示すグラフである。
図３は、種々の温度でＤＭＳＯ法により部分的脱硫酸化したケラタン硫酸に、Escherichia freundii由来のエンド−β−ガラクトシダーゼまたはケラタナーゼIIを作用させて得られた生成物をゲル濾過に付して得られた溶出曲線を示す。
発明を実施するための最良の形態
１．本発明方法
本発明方法１は、ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸にケラタン硫酸分解酵素を作用させて硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得、次いで得られた該硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を完全脱硫酸化する工程からなるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法である。
本発明方法２は、ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸に、硫酸基の存在の有無によって基質特異性が異なる３種類のケラタン硫酸分解酵素の酵素群のいずれかに属する１種または２種以上の酵素を作用させる工程を少なくとも含む、硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法である。
以下に本発明方法の各工程における技術について詳述する。なお以下に示す(1)〜(5)については本発明方法１および２に共通の技術であり、(6)および(7)は本発明方法１に関連する技術である。
(1)本発明方法で用いるケラタン硫酸
ケラタン硫酸は、ガラクトース残基(Gal)とＮ−アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)がグリコシド結合した二糖（Ｎ−アセチルラクトサミン；LacNAc）を繰り返し構造単位として有し、その二糖１モル当たりに１〜２モルの硫酸基を有するグリコサミノグリカンである。動物種および器官などによってケラタン硫酸の硫酸基含有量は異なっているが、通常はサメなどの軟骨魚類、クジラ、ウシなどの哺乳動物の軟骨、骨や角膜等の生原料から製造される。本発明方法において使用されるケラタン硫酸は、通常入手できるものであればよく、特に限定されないが、構成糖であるガラクトース残基が硫酸化された高硫酸化ケラタン硫酸（構成二糖１モル当たり１．５〜２モルの硫酸基を含む高硫酸化ケラタン硫酸をケラタンポリ硫酸ということもある）を用いることが好ましい。また、ガラクトース残基の硫酸基の位置としては、６位が好ましい。このような高硫酸化ケラタン硫酸は、例えば、サメ等の軟骨魚類の軟骨のプロテオグリカンから取得できる。また市販されているものを使用することもできる。なお、本明細書中において「ケラタン硫酸」という用語には、特にことわらない限り、高硫酸化ケラタン硫酸やケラタンポリ硫酸も包含される。
(2)ケラタン硫酸の硫酸基含量の調整
ケラタン硫酸の硫酸基含量の調整方法としては、所望の硫酸基含量となるように硫酸化すること、部分的脱硫酸化すること、および硫酸基含量を増加または減少させなくとも所望の硫酸基含量であるならば、硫酸基含量を変化させないことをも包含する。いずれの硫酸基含量の調整方法を選択するかは、本発明方法で用いるケラタン硫酸の硫酸基含量、本発明方法で用いるケラタン硫酸分解酵素の種類、および目的とするオリゴ糖のサイズに応じて、当業者が適宜選択できるものである。
なお、硫酸基含量は、ケラタン硫酸分解酵素の作用により目的とする分子サイズのオリゴ糖が得られる程度に調整するものであり、より具体的には、構成二糖１モル当たり平均０．３〜１．５モルの硫酸基が存在する程度に調整する。
なお、ケラタン硫酸分解酵素として、後述する酵素群(1)または(2)に属する酵素を用いる場合には、構成二糖１モル当たり１．１〜１．５モルの硫酸基が存在する程度に硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸を用いることが好ましい。また、ケラタン硫酸分解酵素として、後述する酵素群(2)または(3)に属する酵素を用いる場合には、構成二糖１モル当たり０．３〜０．８モルの硫酸基が存在する程度に硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸を用いることが好ましい。
以下に、ケラタン硫酸の硫酸基含量の調整方法を説明する。
(2-1)部分的脱硫酸化
部分的脱硫酸化は、グリコサミノグリカンの公知の脱硫酸化方法により行うことができるが、硫酸基が実質的に全て除去されないように脱硫酸化反応時の温度、脱硫酸化反応の時間、脱硫酸化剤の濃度等の反応条件を設定する必要がある。すなわち、硫酸基が実質的に全て除去される反応条件よりも脱硫酸化反応時の温度、脱硫酸化反応の時間、脱硫酸化剤の濃度等を低く設定する。具体的な反応条件は、用いるケラタン硫酸、硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸のグリコシド結合の切断に用いるケラタン硫酸分解酵素のタイプ、目的とするＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の分子サイズ（分子量、糖鎖数）等に応じて当業者が適宜設定することができる。
グリコサミノグリカンの公知の脱硫酸化方法としては、例えば酸加水分解、アルカリ分解、および有機溶媒中で加熱する方法等が挙げられる（Method in Carbo-hydrate Chemistry、vol.VIII、p281-289、1980年）。すなわち脱硫酸化剤として酸、アルカリ、有機溶媒等を用いることができる。
例えば酸加水分解する場合、酸としては無機酸、有機酸、強酸性陽イオン交換樹脂、特にスルホン酸系樹脂等を用いることができ、反応溶媒としては水、メタノール等を用いることができる。本発明方法においては塩化アセチルを含む無水メタノール溶液を用いることが好ましい。
例えば有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、ピリジン等の非プロトン性溶媒を用いることができる。ＤＭＳＯを用いる場合、水またはメタノール５〜10％を含むＤＭＳＯ溶液中、ケラタン硫酸ピリジニウム塩を20〜100℃の範囲で加熱する方法が広く用いられており（新生化学実験講座３、糖質II、東京化学同人、p325-326、1989年）、本発明方法においてもこの方法を用いることが好ましい。
また、シリル化剤を用いる脱硫酸化方法を用いることもできる。
特開平５−２３００９０号公報には、硫酸化糖の有機塩基塩を、該有機塩基の存在下に、N,O-ビス（トリメチルシリル）アセトアミド類と反応させることにより、硫酸化糖の第１級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸することを特徴とする脱硫酸化糖の製造方法が開示されており、この方法を用いることもできる。
まず、有機塩基を溶媒としてケラタン硫酸を溶解し、ケラタン硫酸の有機塩基塩を形成させる。ケラタン硫酸の有機塩基塩としては、ピリジン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリン等の芳香族アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、トリオクチルアミン、N,N,N’,N’-テトラメチル-1,8-ナフタレンジアミン等の３級アミン；Ｎ−メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン等のＮ−アルキル複素環アミン等の有機塩基との塩が挙げられる。
続いて無水の有機塩基の存在下、トリメチルシリル化試薬であるN,O-ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（BTSA）、N,O-ビス（トリメチルシリル）トリフロロアセトアミド（BTSFA）、N,O-ビス（トリメチルシリル）ジフロロアセトアミド、N,O-ビス（トリメチルシリル）モノフロロアセトアミド等を加え、反応温度を室温〜１００℃で反応させることにより脱硫酸化を行うことができる。
特開平７−６２００１号公報には、下記一般式(A)
CH3-C[-OSi(R)3]=CH-COCH3  ・・・・(A)
（式中、Ｒは同一または異なり、アルキル基またはアリール基を示す）
で表されるシリル化剤の存在下に脱硫酸化反応に付すことを特徴とする脱硫酸化糖の製造方法が開示されており、この方法を用いることもできる。この方法でも硫酸化糖の有機塩基塩に、上記一般式(A)で表されるシリル化剤を反応させることが好ましく、有機塩基塩としては上記特開平５−２３００９０号公報に記載のものと同様の有機塩基塩を用いることができる。上記一般式(A)における(R)3SiOとしては、トリメチルシリルオキシ、トリエチルシリルオキシ、ジメチルイソプロピルシリルオキシ、イソプロピルジメチルシリルオキシ、メチルジ−ｔ−ブチルシリルオキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ、ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ、トリイソプロピルシリルオキシ等が例示される。上記一般式(A)で表されるシリル化剤として最も好ましいものは、２−トリメチルシロキシペント−２−エン−４−オンである。反応温度を室温〜１００℃で反応させることにより脱硫酸化を行うことができる。
国際公開公報（WO96/01278）には、下記一般式(B)
(R1)3C-C(=O)N(-R2)-Si(R3)3  ・・・・(B)
（式中、R1は同一または異なり水素原子またはハロゲン原子を示し、R2は低級アルキル基を示し、R3は同一または異なり低級アルキル基、アリール基またはハロゲン原子を示す）で表されるシリル化剤を反応させることにより、第１級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸化することを特徴とする脱硫酸化多糖の方法が開示されており、この方法も用いることができる。この方法でも硫酸化糖の有機塩基塩に、上記式で表されるシリル化剤を反応させることが好ましく、有機塩基塩としては上記特開平５−２３００９０号公報に記載のものと同様の有機塩基塩を用いることができる。シリル化剤としては、上記一般式(B)においてR1は同一または異なり水素原子またはフッ素等のハロゲン原子を示し、R2はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル等の炭素数１〜６の低級アルキル基を示し、R3は同一または異なり、前記と同様の低級アルキル基、フェニル等のアリール基または塩素、フッ素等のハロゲン原子を示す。上記一般式(B)における(R3)3Siとしては、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ジメチルイソプロピルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジ−ｔ−ブチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリイソプロピルシリル基等が例示される。上記一般式(B)で表されるシリル化剤で最も好ましいものとしては、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルアセトアミド（MTMSA）またはＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（MTSTFA）が挙げられる。室温〜１００℃で反応させることにより脱硫酸化を行うことができる。
さらに、ケラタン硫酸の脱硫酸化をする作用を有する酵素を用いてもよい。
これらグリコサミノグリカンの公知の脱硫酸化方法における反応条件を適宜設定することにより、硫酸基を適度に減らしたケラタン硫酸を得ることができる。
(2-2)硫酸化
硫酸化は、グリコサミノグリカンの公知の硫酸化方法により行うことができ、特に限定されるものではないが、例えば特開昭６１−４７７０１号公報に記載されている方法等が挙げられる。前述した通り、一般的にケラタン硫酸は硫酸基含量が多いことから、ケラタン硫酸の硫酸基含量の調整は、部分的脱硫酸化による場合が圧倒的に多い。しかし、硫酸基含量が極端に低いケラタン硫酸等が入手でき、利用できる場合には、硫酸化により硫酸基含量を調整することもできる。なお硫酸化により硫酸基含量を調整する場合、ガラクトース残基および／またはＮ−アセチルグルコサミン残基の６位のみを硫酸化することが好ましいことから、６位特異的な硫酸化方法を選択することが好ましい。
また、ケラタン硫酸のガラクトース残基および／またはＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に特異的に硫酸基を転移する酵素（スルホトランスフェラーゼ）を用いてもよい。
ケラタン硫酸や、硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸の硫酸基含量は、公知の方法で定量することができ、例えばケラタン硫酸分解酵素を作用させて得られた結果に基づいて評価することができる。あるいは、構成二糖１モル当たりの硫酸基のモル数で評価してもよい。構成二糖１モル当たりの硫酸基のモル数は、アンスロン法やアミノ糖分析によりガラクトースやＮ−アセチルグルコサミンを定量することにより糖残基数を求めるとともに、糖の塩酸分解物のイオンクロマトグラフィー分析により硫酸基含量を求め、これらの値から算出することによって決定できる。もし原料となるケラタン硫酸の硫酸基含量が所望の硫酸基含量であるならば、積極的に硫酸基含量の調整（すなわち硫酸化や部分的脱硫酸化）を行う必要もなく、そのまま本発明に用いることができる。
なお本発明方法においては、ケラタン硫酸は一般的に硫酸基含量が多いこと、さらに高硫酸化ケラタン硫酸やケラタンポリ硫酸を原料として用いることが好ましいこと等から、本発明方法におけるケラタン硫酸の「硫酸基含量の調整」は、部分的脱硫酸化によって行う場合が多く、かつ好ましい。またそれに伴って用いるケラタン硫酸分解酵素（後述する）を選択することが好ましい。
(3)本発明方法で用いるケラタン硫酸分解酵素
本発明方法で用いることができるケラタン硫酸分解酵素は、ケラタン硫酸のグリコシド結合を切断する作用を有する酵素である限りにおいて特に限定されないが、下記酵素群(1)〜(3)のいずれかに属する１種または２種以上の酵素を用いることが好ましい。
酵素群(1)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用：
ケラタン硫酸のβ−ガラクトシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基の６位に硫酸基を有する当該β−ガラクトシド結合には作用しない。
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基（６位に硫酸基を有さない）の非還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位の硫酸基の有無にかかわらず当該β−ガラクトシド結合に作用する。
酵素群(1)は、エンド−β−ガラクトシダーゼであることが好ましい。
酵素群(1)に含まれる酵素としては、例えばエシエリキア・フロインディ（Escherichia freundii）由来のエンド−β−ガラクトシダーゼ（H.Nakagawa, T.Yamada, J-L.Chien, A.Gardas, M.Kitamikado, S-C.Li, Y-T.Li, J.Biol. Chem., 255, 5955(1980)；本明細書中において、単に「E-Galase」ということもある）が挙げられ、かつ好ましい。
酵素群(2)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用：
ケラタン硫酸のβ−ガラクトシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基の６位に硫酸基を有する当該β−ガラクトシド結合には作用しない。
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基（６位に硫酸基を有さない）の非還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を有する当該β−ガラクトシド結合には作用する。
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基（６位に硫酸基を有さない）の非還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を有さない当該β−ガラクトシド結合には作用しない。
酵素群(2)は、エンド−β−ガラクトシダーゼであることが好ましい。
酵素群(2)に含まれる酵素としては、例えばシュードモナス（Pseudomonas）ｓｐ．IFO-13309株由来のエンド−β−ガラクトシダーゼ（K.Nakazawa, N.Suzuki, S.Suzuki, J. Biol. Chem., 250, 905(1975)、K.Nakazawa, S.Suzuki, J.Biol. Chem., 250, 912(1975)）や、特公昭５７−４１２３６号公報に開示されているシュードモナス・レプティリボーラ（Pseudomonas reptilivora）が産生するエンド−β−ガラクトシダーゼ（これらは本明細書中において、単に「ケラタナーゼ」または「KSase」ということもある）が挙げられ、かつ好ましい。
酵素群(3)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用：
ケラタン硫酸のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を切断する。
(b)基質特異性：
・β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に関与するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位およびそのＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガラクトース残基の６位にそれぞれ硫酸基を有する当該β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に作用する。
・β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に関与するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を有し、そのＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガラクトース残基の６位には硫酸基を有さない当該β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に作用する。
・β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に関与するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位およびそのＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガラクトース残基の６位のどちらにも硫酸基を有さない当該β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合には作用しない。
酵素群(3)は、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが好ましい。
酵素群(3)に含まれる酵素としては、例えばバチルスｓｐ．Ｋｓ３６（Bacillus sp. Ks36）由来（橋本信一、森川清志、菊池博、吉田圭一、徳安清親、生化学、60, 935（1988）；本明細書中において、単に「ケラタナーゼII」または「KSaseII」ということがある）、またはバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２（Bacillus circulans KsT202）由来（ＷＯ９６／１６１６６号公報に記載）のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ等が挙げられ、かつ好ましい。
酵素群(1)および(2)はいずれもエンド−β−ガラクトシダーゼ型の酵素であるが、糖鎖に存在する硫酸基によって基質特異性が異なる。また酵素群(3)は、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型の酵素である。よって、酵素消化によって得られるオリゴ糖の還元末端は、エンド−β−ガラクトシダーゼ型の酵素を用いた場合にはガラクトース残基(Gal)であり、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型の酵素を用いた場合にはＮ−アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)である。
なお、酵素群(1)〜(3)の基質特異性を以下にまとめた。下記一般式(a)〜(k)中の「〜」で示されるグリコシド結合（酵素群(1)および(2)においてはβ−ガラクトシド結合、酵素群(3)においてはβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合である）を切断するか否かを示した。
0004179567.tif 000002
(4)酵素作用条件
軟骨由来のケラタン硫酸は、二硫酸化されたＮ−アセチルラクトサミン（LacNAc-diS）残基の含量が高く、特にサメ由来のケラタン硫酸ではその含量が高い。従って、このようなケラタン硫酸に対しては酵素群(1)および(2)の酵素（例えばE-GalaseやKSase）は殆ど作用しないが、逆に酵素群(3)の酵素（例えば、KSase II）によってほとんど分解され、容易に二糖および四糖となる。しかし、この糖鎖を部分的に脱硫酸したケラタン硫酸は、脱硫酸化の度合いが高まるに従って、酵素群(1)および(2)の酵素の作用が上昇し、これと全く対照的に酵素群(3)の酵素の作用が低下する。以上の酵素の基質特異性とケラタン硫酸の部分的脱硫酸化の程度との組み合わせによって、本発明方法により最終的に得られるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の分子サイズの調節が可能である。すなわち、使用する酵素の特異性により、酵素の作用が上昇するように部分的硫酸化の程度を調節すれば分子サイズが小さくなる。逆に、酵素の作用が低下するように部分的硫酸化の程度を調節すれば分子サイズが大きくなる。
なお、少量であれば、硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸と上記酵素群(1)〜(3)のいずれかに属する１種または２種以上の酵素とを共存させて、該酵素を作用させればよいが、大量に酵素処理する場合は、適当な固相（ビーズ等）に当該酵素を結合させた固定化酵素や、限外濾過膜、透析膜等を用いる膜型のリアクター等を用いて連続的に酵素を作用させることが好ましい。
このように、ケラタン硫酸の部分的脱硫酸化の程度と、ケラタン硫酸分解酵素の基質特異性とを適宜組み合わせることによって、所望の分子サイズの硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得ることができる。
(5)硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の分画
上記のように酵素を作用させることによって生じた硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の分画は、通常の糖鎖の分離、精製の手法を用いることができる。例えば吸着クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフィー、有機溶媒による分画、あるいはこれらの組合わせ等の操作により行うことができるが、これらに限定されるものではない。
なお酵素処理によって生じた硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖は、オリゴ糖の分子サイズに応じて分画することが好ましい。分子サイズに応じた分画の方法は、特に限定されるものではないが、例えば種々のゲル濾過担体を用いたゲル濾過クロマトグラフィーや有機溶媒を用いた分画法を挙げることができる。ゲル濾過担体は、分子篩を目的として作られた担体であれば特に限定されるものではなく、アクリルアミド架橋体、デキストラン、アガロース、セルロースのような多糖体の架橋粒子などを挙げることができる。また、目的とするオリゴ糖の分子サイズに応じて、それぞれにふさわしい架橋度の担体を適宜選択することができる。ゲル濾過クロマトグラフィーを用いることにより、八糖程度のオリゴ糖まではそれぞれのオリゴ糖の分子サイズに応じて分離できるが、それ以上の長さのオリゴ糖の分離能は、オリゴ糖の分子サイズが大きくなるに従って低下する。この場合は、何種類かの分子サイズのオリゴ糖の混合物として分画される。
また、オリゴ糖混合物を予め陰イオン交換樹脂によって硫酸基密度別に分画を行なってもよく、これによりゲル濾過クロマトグラフィーによる分離能を向上させることができる。多硫酸化されたオリゴ糖は、一般に硫酸基の密度が等しい場合には、分子サイズの大きい方が陰イオン交換樹脂上で強く吸着されるので、この原理で塩濃度を調節することによって相互分離が可能である。
また有機溶媒による分画の場合は、例えばアルコールやアセトン等を用いることが好ましい。
このようにして得られる硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の糖鎖骨格は、下記一般式(1)〜(6)で表される。具体的には、下記一般式(1)および(2)は、本発明方法において硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸に前記酵素群(1)および／または前記酵素群(2)に属する酵素を作用させた時に得ることができる硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の骨格である。下記一般式(3)および(4)は、本発明方法において硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸に前記酵素群(3)に属する酵素を作用させた時に得ることができる硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の骨格である。また下記一般式(5)および(6)は、本発明方法において硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸に前記酵素群(1)および／または(2)に属する酵素と、前記酵素群(3)に属する酵素との両方を作用させた時に得ることができる硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の骨格である。
(GlcNAc-Gal)n           (1)
SA-Gal-(GlcNAc-Gal)m    (2)
(Gal-GlcNAc)n           (3)
SA-(Gal-GlcNAc)m        (4)
Gal-(GlcNAc-Gal)n       (5)
GlcNAc-(Gal-GlcNAc)n    (6)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SAはシアル酸残基を、-はグリコシド結合を、nは1〜6の整数を、mは1〜10の整数をそれぞれ表す）
例えば本発明方法において、前記酵素群(3)に属する酵素であるケラタナーゼIIを硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸に作用させた場合、例えば下記の式で表される骨格を有する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖が得られる。
Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc                                     (7)
Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc                          (8)
Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc               (9)
Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc   (10)
SA-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc                                 (11)
SA-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc                      (12)
SA-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc           (13)
SA-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc(14)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SAはシアル酸残基を、-はグリコシド結合をそれぞれ表す）
なお、上記(7)〜(14)の式で表される骨格を有する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖は、あくまで前記一般式(3)および(4)で表される骨格を有する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の具体的例示にすぎす、これらに限定されるものではない。
前記(1)〜(6)の一般式で表される骨格を有する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を、後述する方法で完全脱硫酸化することによって、下記一般式で表されるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得ることができる。
(GlcNAc-Gal)n           (1)
SA-Gal-(GlcNAc-Gal)m    (2)
(Gal-GlcNAc)n           (3)
SA-(Gal-GlcNAc)m        (4)
Gal-(GlcNAc-Gal)n       (5)
GlcNAc-(Gal-GlcNAc)n    (6)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SAはシアル酸残基を、-はグリコシド結合を、nは1〜6の整数を、mは1〜10の整数をそれぞれ表す）
例えば、上記(7)〜(14)の式で表される骨格を有する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖は、後述する方法で完全脱硫酸化することによって下記式で表されるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得ることができる。
Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc                                    (15)
Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc                         (16)
Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc              (17)
Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc   (18)
SA-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc                                 (19)
SA-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc                      (20)
SA-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc           (21)
SA-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc(22)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SAはシアル酸残基を、-はグリコシド結合をそれぞれ表す）
なお、上記(15)〜(22)の式で表されるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖は、あくまで前記一般式(3)および(4)で表される骨格を有する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖から得られるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の具体的例示にすぎす、これらに限定されるものではない。
また上記式(1)〜(6)においてｎは１〜６の整数であるが、長鎖のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖、例えばｎが３〜６の整数であるものが好ましく、ｎが５〜６の整数であるものが特に好ましい。
また上記式(1)〜(6)においてｍは１〜１０の整数であるが、長鎖のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖、例えばｍが３〜１０の整数であるものが好ましく、ｍが５〜１０の整数であるものが特に好ましい。
上記式(1)〜(22)において、好ましいシアル酸残基(SA)はＮ−アセチルノイラミン酸残基(NeuAc)である。またシアル酸残基(SA)と、該シアル酸残基(SA)の還元末端側に隣接するガラクトース残基(Gal)との間のグリコシド結合は、α−２，３グリコシド結合またはα−２，６グリコシド結合であることが好ましい。また、ガラクトース残基(Gal)と、該ガラクトース残基(Gal)の還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)との間のグリコシド結合は、β−１，４グリコシド結合であることが好ましい。また、Ｎ−アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)と、該Ｎ−アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)の還元末端側に隣接するガラクトース残基(Gal)との間のグリコシド結合は、β−１，３グリコシド結合であることが好ましい。また後述する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の完全脱硫酸化において述べるように、特にシアル酸残基を有する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の脱硫酸化条件については従来報告されておらず、本発明者らによって初めて見出された条件である。このことから本発明方法におけるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖および硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の中でも、シアル酸残基を有するＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖および硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（例えば上記式(1)〜(22)中の、(2)、(4)、(11)、(12)、(13)、(14)、(19)、(20)、(21)、(22)）が特に好ましい。
(6)硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の完全脱硫酸化
酵素消化によって得られた硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の完全脱硫酸化は、前記したケラタン硫酸の部分的脱硫酸化の方法に従い、実質的に全て脱硫酸化されるように適宜脱硫酸化条件を設定することによって行うことができるが、硫酸基の位置、糖の種類および結合様式によって、その脱硫酸化の条件は著しく異なる。即ち、温度および溶媒条件によっては、糖鎖に分解が生じたり、硫酸基が残ってしまったりする。特にシアル酸残基を有する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を完全脱硫酸化する場合、脱硫酸化の条件を強く設定しすぎると、硫酸基は実質的に全て除去されるが、シアル酸残基も除去されてしまう。これを防ぐためには、シアル酸残基を保持したまま完全脱硫酸化する条件を設定する必要があり、この条件については従来報告されていなかった。従って、シアル酸残基を有する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖については、以下に述べる脱硫酸化条件（すなわちシアル酸残基を保持したまま完全脱硫酸化する条件）は本発明者らの検討により始めて得られたものであり、本願は、シアル酸残基を有する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を、シアル酸残基を保持したまま完全脱硫酸化する方法に関する発明をも包含している。
硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の完全脱硫酸化の方法としては、前記したケラタン硫酸の部分的脱硫酸化方法と同様に、例えば酸加水分解、アルカリ分解、および有機溶媒中で加熱する方法、シリル化剤を用いる方法、酵素を用いる方法等が挙げられるが、その反応条件が部分的脱硫酸化の時とは異なる。
以下に有機溶媒を用いる脱硫酸化方法として「ジメチルスルホキシド法」、酸加水分解することによる脱硫酸化方法として「メタノール塩酸法」、シリル化剤を用いる脱硫酸化方法として「トリメチルシリル化剤法」をそれぞれ挙げて、完全脱硫酸化する方法についてより具体的に説明する。
(a)ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）法
硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を水に溶解し、強カチオン交換樹脂（Ｈ型）を通過させてフリーの硫酸基を除去した後、これをピリジンで中和して、硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖のピリジニウム塩とする。硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖のピリジニウム塩を、５〜２０容量％、好ましくは10容量％の水を含むＤＭＳＯ溶液に溶解し、７０〜１００℃で２〜１０時間、好ましくは100℃で５時間加熱することにより、糖鎖の分解を起こさずに完全脱硫酸化することができる。
(b)メタノール塩酸法
水分を十分除去した乾燥メタノールに塩化水素ガスを通して、メタノール塩酸溶液を作る。この液を乾燥メタノールで希釈して０．０１〜１規定、好ましくは0.1規定に調節する。よく乾燥した硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖をメタノール塩酸液に分散させ、４〜３０℃で０．５〜５０時間、好ましくは室温で１５時間攪拌することにより、完全脱硫酸化することができる。
(c)トリメチルシリル化剤（ＴＭＳ）法
硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖をN-,O-ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＴＳＡ）類と加熱することにより脱硫酸化させる方法である。例えば、Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖をピリジン溶液に溶解し、ＢＴＳＡを硫酸基に対して５〜１６倍モル、好ましくは10倍モル濃度加えて、４０〜９０℃で０．５〜３時間、好ましくは80℃で1時間反応させることにより完全脱硫酸化することができる。本方法による脱硫酸化率は、発明者らの検討により、温度と処理時間の変化によって任意に調節できることが確認された。
この他に完全脱硫酸化する方法としては、硫酸等の酸や、水酸化ナトリウム等のアルカリを作用させる方法等を挙げることができる。
なお、完全脱硫酸化の方法はこれらに限定されるものではない。
硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を完全脱硫酸化することによって、Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖が得られる。
(7)Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の分画
Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の分画は、前記した硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の分画方法と同様、通常の糖鎖の分離、精製の手法を用いることができる。例えば吸着クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフィー、有機溶媒による分画、あるいはこれらの組合わせ等の操作により行うことができるが、これらに限定されるものではない。
シアル酸残基を有するＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（シアリルＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖）とＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖との分離方法も、特に限定されるものではないが、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより行うことができる。また、分子サイズの異なるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の相互分離の方法も特に限定されるものではないが、例えば逆相系のカラムを用いたクロマトグラフィーにより、メタノール濃度を０から20％まで上昇させることによって分離することができる。
以上の方法により、本発明オリゴ糖であるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を製造することができる。本発明オリゴ糖については後述する。
本発明方法は、好ましくは、ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸を上記酵素群(1)〜(3)のいずれかに属する１種または２種以上の酵素で処理して硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得る工程（工程１）、および、硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を完全脱硫酸化する工程（工程２）を含む。なお、工程１には硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を分画する工程を含むことが好ましく、また工程２にはＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を分画する工程を含むことが好ましい。これらの分画する工程は、工程１または工程２の片方のみに含んでいても良いが、分画は硫酸基があった方が容易であることから、工程１に硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を分画する工程を含むことがより好ましい。また、工程１には硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を分画する工程を含み、かつ工程２にはＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を分画する工程を含むことが特に好ましい。
また、硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得るにあたり、ケラタン硫酸の部分的脱硫酸化または硫酸化の条件が、ケラタン硫酸のグリコシド結合を切断する作用を有する酵素が活性を失わない条件である場合には、ケラタン硫酸の部分的脱硫酸化または硫酸化と硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸の分解とを同時に（例えば、同一反応器内において）行ってもよい。
本発明方法によれば、ケラタン硫酸分解酵素の基質特異性に基づき、通常に得ることのできるケラタン硫酸をあらかじめ部分的に脱硫酸化することによって、そのままのケラタン硫酸に上記酵素を作用させるよりも、目的の分子サイズのオリゴ糖を一層効率よく得ることができる。
なお、本発明方法により製造される上記(1)〜(6)の一般式で表されるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖に、該Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の非還元末端糖を切り出すエキソ型グリコシダーゼを作用させることによって、糖残基数が１つ減少したＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得ることができる。具体例を次に示す。
エキソ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを下記一般式(1)および(6)にそれぞれ作用させると、それぞれ下記一般式(23)〜(24)のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得ることができる。
(GlcNAc-Gal)n         (1)  →Gal-(GlcNAc-Gal)n-1   (23)
GlcNAc-(Glc-GlcNAc)n  (6)  →(Gal-GlcNAc)n         (24)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、-はグリコシド結合を、nは2〜6の整数をそれぞれ表す）
エキソ−β−ガラクトシダーゼを下記一般式(3)および(5)にそれぞれ作用させると、それぞれ下記一般式(25)〜(26)のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得ることができる。
(Gal-GlcNAc)n         (3)  →GlcNAc-(Gal-GlcNAc)n-1(25)
Gal-(GlcNAc-Gal)n     (5)  →(GlcNAc-Gal)n         (26)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、-はグリコシド結合を、nは2〜6の整数をそれぞれ表す）
また、例えばＮ−アセチルノイラミニダーゼのようなシアリダーゼを適宜用いることによって、シアル酸が除去されたＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得ることもできる。
２．本発明オリゴ糖
本発明オリゴ糖は、下記の方法によって得られ、かつ下記の理化学的性質を有するオリゴ糖である。
（1）方法：
ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸にケラタン硫酸のグリコシド結合を切断する作用を有する酵素を作用させて生成物を得、次いで当該生成物を完全脱硫酸化することを特徴とする方法。
（2）理化学的性質：
・アンスロン法により測定されるガラクトース残基含量が３５〜５０重量％である。
・元素分析により測定される窒素含量が３〜４重量％である。
・マススペクトロメトリーにより測定される分子量が１０００〜２２００である。
なお硫酸基含量の調整は、部分的脱硫酸化により行うことが好ましい。
なお上記方法は、少なくとも下記の工程１および２を含むことが好ましい。
工程１：ケラタン硫酸の硫酸基含量を調整し、硫酸基含量が調整されたケラタン硫酸を下記酵素群(1)〜(3)のいずれかに属する１種または２種以上の酵素を作用させて硫酸化オリゴ糖を得る工程。
酵素群(1)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用：
ケラタン硫酸のβ−ガラクトシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基の６位に硫酸基を有する当該β−ガラクトシド結合には作用しない。
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基（６位に硫酸基を有さない）の非還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位の硫酸基の有無にかかわらず当該β−ガラクトシド結合に作用する。
酵素群(2)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用：
ケラタン硫酸のβ−ガラクトシド結合を切断する。
(b)基質特異性：
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基の６位に硫酸基を有する当該β−ガラクトシド結合には作用しない。
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基（６位に硫酸基を有さない）の非還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を有する当該β−ガラクトシド結合には作用する。
・β−ガラクトシド結合に関与するガラクトース残基（６位に硫酸基を有さない）の非還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を有さない当該β−ガラクトシド結合には作用しない。
酵素群(3)：下記の作用および基質特異性を有する酵素群
(a)作用：
ケラタン硫酸のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を切断する。
(b)基質特異性：
・β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に関与するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位およびそのＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガラクトース残基の６位にそれぞれ硫酸基を有する当該β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に作用する。
・β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に関与するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位に硫酸基を有し、そのＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガラクトース残基の６位には硫酸基を有さない当該β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に作用する。
・β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合に関与するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位およびそのＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端側に隣接するガラクトース残基の６位のどちらにも硫酸基を有さない当該β−Ｎ−アセチルグルコサミニド結合には作用しない。
工程２：硫酸化オリゴ糖を完全脱硫酸化する工程。
なお、上記酵素群(1)に含まれる酵素としては、エンド−β−ガラクトシダーゼが好ましく、例えばエシエリキア・フロインディ（Escherichia freundii）由来のエンド−β−ガラクトシダーゼ（H.Nakagawa, T.Yamada, J-L.Chien, A.Gardas, M. Kitamikado, S-C.Li, Y-T.Li, J.Biol.Chem., 255, 5955(1980)；本明細書中において、単に「E-Galase」ということもある）が挙げられ、かつ好ましい。
上記酵素群(2)に含まれる酵素としては、エンド−β−ガラクトシダーゼが好ましく、例えばシュードモナス（Pseudomonas）ｓｐ．IFO-13309株由来のエンド−β−ガラクトシダーゼ（K.Nakazawa, N.Suzuki, S.Suzuki, J.Biol.Chem., 250, 905(1975)、K.Nakazawa, S.Suzuki, J.Biol.Chem., 250, 912(1975)）や、特公昭５７−４１２３６号公報に開示されているシュードモナス・レプティリボーラ（Pseudmonas reptilivora）が産生するエンド−β−ガラクトシダーゼ（これらは、本明細書中において、単に「ケラタナーゼ」または「KSase」ということもある）が挙げられ、かつ好ましい。
上記酵素群(3)に含まれる酵素としては、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが好ましく、例えばバチルスｓｐ．Ｋｓ３６（Bacillus sp. Ks36）由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（橋本信一、森川清志、菊池博、吉田圭一、徳安清親、生化学、60, 935（1988）；本明細書中において、単に「ケラタナーゼII」または「KSaseII」ということがある）や、バチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２（Bacillus circulans KsT202）由来（ＷＯ９６／１６１６６号公報に記載）のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ等が挙げられ、かつ好ましい。
また本発明オリゴ糖は、前記理化学的性質に加えて、チオバルビツール酸法により測定されるシアル酸含量が１０〜２０重量％であるものがより好ましい。
さらに本発明は、下記一般式(1)〜(6)のいずれか１つで表される新規なＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を提供する。
(GlcNAc-Gal)n           (1)
SA-Gal-(GlcNAc-Gal)m    (2)
(Gal-GlcNAc)n           (3)
SA-(Gal-GlcNAc)m        (4)
Gal-(GlcNAc-Gal)n       (5)
GlcNAc-(Gal-GlcNAc)n    (6)
（式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SAはシアル酸残基を、-はグリコシド結合を、nは1〜6の整数を、mは1〜10の整数をそれぞれ表す。ただし、式(1)および(3)においてnは1ではない）
本発明オリゴ糖の製造方法は、本発明オリゴ糖が得られる限りにおいて特に限定されるものではないが、本発明方法により得ることが好ましい。本発明方法については前述した。
例えば本発明方法によって本発明オリゴ糖を製造する場合、例えば上記式(1)または(2)のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得たい場合には、本発明方法においてエンド−β−ガラクトシダーゼ型の酵素（例えば、酵素群(1)または(2)に属する酵素）を用いればよい。
例えば上記式(3)または(4)のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得たい場合には、本発明方法においてエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型の酵素（例えば、酵素群(3)に属する酵素）を用いればよい。
また例えば上記式(5)または(6)のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得たい場合には、本発明方法においてエンド−β−ガラクトシダーゼ型の酵素（例えば、酵素群(1)または(2)に属する酵素）とエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型の酵素（例えば、酵素群(3)に属する酵素）の両方を用いればよい。
シアル酸残基を含有する本発明オリゴ糖（例えば上記式(2)および(4)）において、シアル酸残基としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基やＮ−グリコリルノイラミン酸残基等が挙げられるが、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基(NeuAc)であることが好ましい。
また上記式(1)〜(6)においてｎは１〜６の整数である（ただし、上記式(1)および(3)においてｎは１ではない）が、長鎖のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖、例えばｎが３〜６の整数であるものが好ましく、ｎが５〜６の整数であるものが特に好ましい。
また上記式(1)〜(6)においてｍは１〜１０の整数であるが、長鎖のＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖、例えばｍが３〜１０の整数であるものが好ましく、ｍが５〜１０の整数であるものが特に好ましい。
またシアル酸残基(SA)と、該シアル酸残基(SA)の還元末端側に隣接するガラクトース残基(Gal)との間のグリコシド結合は、α−２，３グリコシド結合またはα−２，６グリコシド結合であることが好ましい。また、ガラクトース残基(Gal)と、該ガラクトース残基(Gal)の還元末端側に隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)との間のグリコシド結合は、β−１，４グリコシド結合であることが好ましい。また、Ｎ−アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)と、該Ｎ−アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)の還元末端側に隣接するガラクトース残基(Gal)との間のグリコシド結合は、β−１，３グリコシド結合であることが好ましい。また前述した硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の完全脱硫酸化において述べたように、特にシアル酸残基を有する硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の完全脱硫酸化の条件については従来報告されておらず、本発明者らによって初めて見出された条件であり、このことから本発明方法および本発明オリゴ糖におけるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の中でも、シアル酸残基を有するＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（例えば上記式(1)〜(6)中の(2)、(4)）が特に好ましい。
本発明オリゴ糖の糖組成の分析は、糖鎖工学分野で通常用いられる方法、例えばアンスロン法（ガラクトース残基の定量）、アミノ糖分析（Ｎ−アセチルグルコサミン残基の定量）、チオバルビツール酸法（TBA法；シアル酸残基の定量）によって行うことができるが、これらに限定されるものではない。また、硫酸基含量は、本発明オリゴ糖を塩酸で分解し、イオンクロマトグラフィーにより分析することによって分析することもできるが、この方法に限定されるものではない。また、本発明オリゴ糖の分子サイズの分析方法も特に限定されるものではないが、例えばゲル濾過クロマトグラフィーおよびE-Galase処理後のオリゴ糖を分析することにより調べることができる。また本発明オリゴ糖の糖鎖配列については、例えばグリコシダーゼによる逐次分解法によって調べることができる。
これらの分析方法を用いることによって本発明オリゴ糖の同定が可能であり、例えば本発明方法により得られる本発明オリゴ糖の確認にも用いることができる。
なお本発明オリゴ糖に、例えばシアル酸残基、フコース残基、硫酸基、セラミド等を適宜付加することもできる。これらの物質の付加は化学的方法によって行うこともできるが、酵素を用いて行うことが好ましい。
例えば本発明オリゴ糖にフコース残基を付加する場合は、フコシルトランスフェラーゼを用いて本発明オリゴ糖にフコース残基を転移させればよい。この際、フコース残基はＮ−アセチルグルコサミン残基に結合させることが好ましく、さらに好ましくはα−１，３グリコシド結合によりＮ−アセチルグルコサミン残基に結合させることが好ましい。よってこのような作用を有するフコシルトランスフェラーゼを用いることが好ましい。
また上記式(1)、(3)、(5)または(6)の本発明オリゴ糖にシアル酸残基を付加する場合は、シアリルトランスフェラーゼを用いて本発明オリゴ糖にシアル酸残基を転移させればよい。この際、シアル酸残基はガラクトース残基に結合させることが好ましく、より好ましくはα−２，３グリコシド結合またはα−２，６グリコシド結合により非還元末端のガラクトース残基に結合させることが好ましい。よってこのような作用を有するシアリルトランスフェラーゼを用いることが好ましい。
また、本発明オリゴ糖に硫酸基を付加する場合は、スルホトランスフェラーゼを用いて本発明オリゴ糖に硫酸基を転移させればよい。スルホトランスフェラーゼとしては、コンドロイチン ６−スルホトランスフェラーゼ（J. Biol. Chem., 268(29), 21968-21974, 1993）等を挙げることができる。
また、セラミドを付加する場合は、本発明オリゴ糖の還元末端に結合させることが好ましい。
これらの酵素は、目的とするオリゴ糖に応じて適宜選択して用いることができ、単独で用いてもよく、また複数の酵素を同時に作用させてもよく、また複数の酵素を順次作用させてもよい。
実施例
以下、本発明を実施例により説明する。
実施例１
＜１＞硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の調製
１−１．メタノール塩酸法によるケラタン硫酸の部分的脱硫酸化と、硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の調製
ケラタン硫酸（以下ＫＳともいう）は、サメ軟骨から文献（生化学，33, 746-752, 1961）に従って調製したものを用いた。構成二糖１モル当たりの硫酸基のモル数は１．７であった。
よく乾燥したＫＳ ５ｇを、塩化アセチル5mlを含む無水メタノール溶液（0.06N HClに相当）１L中に懸濁し、4℃で振盪しながら反応させ、0、2.5、5、10、20および40時間反応時点で各200mlを採取した。それぞれの採取液について、遠心分離により不溶物を回収し、これを蒸留水に溶解して、0.01規定の水酸化ナトリウムで中和し、透析、脱塩した後に50mlまで濃縮し、エタノールを5倍容加えて沈殿を回収した。沈殿をエタノール、エーテルで順次洗浄して、乾燥粉末を回収した。0、2.5、5、10、20および40時間の反応生成物の構成二糖１モル当たりの硫酸基のモル数は、それぞれ、1.7、1.3、1.2、1.0、0.9および0.8であった。
得られた乾燥粉末各100mgに対して、10mlの20mM酢酸緩衝液（pH6.5）を加えて溶解し、これに１ユニットのケラタナーゼII（KSase II、生化学工業株式会社製；１ユニット(U)は、pH6.5、37℃で１時間にケラタン硫酸（ウシ角膜由来；生化学工業株式会社製）から１μモルの還元基（Ｎ−アセチルグルコサミン）を遊離する酵素量である）を加えて、37℃で12時間酵素消化した。酵素消化後の溶液に終濃度0.2ＭとなるようにNaClを添加し、セルロファインGCL-90sf（Cellulofine GCL-90sf；生化学工業株式会社製）カラム（2×90cm）にアプライして、0.2M NaClを用いてゲル濾過を行い、溶出した硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖をアンスロン法（別冊  蛋白質 核酸 酵素、生物化学実験法XI、−糖質実験法−、P15、（1968）、共立出版）により検出した。メタノール塩酸法によるＫＳの部分的脱硫酸化の時間と、６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の生成率との関係を図１に示す。なお、６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の生成率は、ゲル濾過により得られる硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の溶出曲線と時間軸により囲まれる図形の全面積に対する、６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖に相当する画分が占める面積の割合として算出した。
図１に示した通り、ＫＳの部分的脱硫酸化を行わなかった場合（すなわちメタノール塩酸法による反応時間が０時間の場合）の６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の生成率は約１０％であった。これに対し、メタノール塩酸法によるＫＳの部分的脱硫酸化を４℃において４０時間以内で行った場合には、６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の生成率は約２〜４倍増加した。
特に、部分的脱硫酸化の時間が2.5〜20時間の場合には、生成率は約３０％以上であり、部分的脱硫酸化の時間が５〜10時間の場合には、生成率は約４０％にも達した。このことから、1UのKSase IIを用いて37℃で12時間ＫＳを酵素消化することによって６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得る場合、ＫＳをメタノール塩酸法により４℃で部分的脱硫酸化する時間は、４０時間以下（０時間を除く）が好ましく、2.5〜20時間がより好ましく、５〜10時間が特に好ましいことは、当業者であれば容易に理解される。
１−２．ＤＭＳＯ法によるＫＳの部分的脱硫酸化と、硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の調製
ＫＳ １ｇを40mlの水に溶解し、Dowex 50WX（H+, 100-200mesh；ダウケミカル社製）カラムを通過させた後、ピリジンで中和してピリジニウム塩とし、凍結乾燥した。この凍結乾燥物の収量は980mgであった。
ＫＳのピリジニウム塩の凍結乾燥物800mgを80mlの90％ DMSO（10％ H2O）に溶解し、20mlづつ4画分に分け、それぞれを40、50、60、70または80℃で３時間反応させ、当容量の水を加えて反応を停止させた。それぞれの反応溶液を一晩流水中で透析した後、4mlまで濃縮し、これを2mlづつ２等分し、一方に10mM酢酸カルシウムを含む250mM酢酸緩衝液(pH6)を、他方に100mM酢酸緩衝液(pH6.5)をそれぞれ0.5ml加え、前者にEscherichia freundii由来のエンド−β−ガラクトシダーゼ（E-Galase、生化学工業株式会社製；１ユニット(U)は、pH5.8、37℃で１分間にケラタン硫酸から１μモルのガラクトースに相当する還元基を遊離する酵素量である）、後者にKSase IIをそれぞれ１ユニット加えて、37℃で5時間酵素消化した。酵素消化後の溶液は、前記１−１と同様にゲル濾過を行い、生成した硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を分画した（図３）。ＤＭＳＯ法によるＫＳの部分的脱硫酸化時の温度と、６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の生成率との関係を図２に示す。６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の生成率は、前記１−１と同様に算出した。
図２に示した通り、酵素消化においてEscherichia freundii由来のエンド−β−ガラクトシダーゼを用いる場合には、ＤＭＳＯ法によるＫＳの部分的脱硫酸化の温度が約50〜70℃のときには、６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の生成率は約２０％以上となり、部分的脱硫酸化の温度が60℃のときには生成率が約４０％にも達した。
また、酵素消化においてKSase IIを用いる場合には、ＤＭＳＯ法によるＫＳの部分的脱硫酸化の温度が約65℃以上のときには、６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の生成率は約２０％以上となり、部分的脱硫酸化の温度が70℃のときには生成率が30％、80℃のときには生成率が約４０％にも達した。これらの結果から、1UのEscherichia freundii由来のエンド−β−ガラクトシダーゼを用いて37℃で５時間ＫＳを酵素消化することによって６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得る場合、ＫＳをＤＭＳＯ法により３時間部分的脱硫酸化するときの温度は、約50〜70℃が好ましく、60℃がより好ましいことは、当業者であれば容易に理解される。また、1UのKSase IIを用いて37℃で５時間ＫＳを酵素消化することによって６〜１２糖の硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得る場合、ＫＳをＤＭＳＯ法により３時間部分的脱硫酸化するときの温度は、約65℃以上が好ましく、70℃以上がより好ましく、80℃が極めて好ましいことは、当業者であれば容易に理解される。
なお、ＫＳをＤＭＳＯ法により３時間部分的脱硫酸化する時の温度が40、50、60、70および80℃のときの反応生成物（硫酸基含量が調整されたＫＳ）の構成二糖１モル当たりの硫酸基のモル数は、それぞれ、1.6、1.4、1.0、0.8および0.3であった。
＜２＞硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の完全脱硫酸化と、Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の分画
２−１．硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の完全脱硫酸化
乾燥ＫＳ 10gを、前記１−１と同様に、メタノール塩酸で10時間反応し、KSase II消化およびゲルろ過分画で処理し、得られた硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の６〜１２糖相当の画分を分取、脱塩、凍結乾燥して回収した。収量は3.8ｇであった。
この乾燥粉末3gを0.01規定の塩酸・メタノール溶液100mlに懸濁し、室温で20時間ゆっくり攪拌した。反応後の溶液は、0.01規定の水酸化ナトリウムで中和し、溶媒を乾燥除去後、これに水を加えてセルロファインGCL-25（Cellulofine GCL-25；生化学工業株式会社製）のカラムを用いて脱塩し、これを凍結乾燥してＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を得た。収量は2.5g（ガラクトース；32.4％、シアル酸；1.8％であった）
２−２．Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の分画
上記２−１で得られたＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の凍結乾燥粉末２ｇを水50mlに加温しながら溶解し、予め５mM NaCl溶液で平衡化したDowex 1x8Cl-, 200-400meshカラム（3×50cm；ダウケミカル社製）に通し、同溶液１Ｌで洗浄した。その後、5mM〜200mMのNaCl溶液２Ｌによる直線濃度勾配により溶出し、アンスロン法およびチオバルビツール酸法によりガラクトースおよびシアル酸をそれぞれ検出し、陽性画分を回収した。素通り溶液のアンスロン陽性画分を濃縮し、セルロファインGCL-90sf（Cellulofine GCL-90sf；生化学工業株式会社製）カラム（4×100cm）を用いて、水を溶媒としてゲルろ過を行った。溶出物をアンスロン法で検出し、６、８、10、12糖に相当するピーク部分を集め、濃縮、脱塩し、凍結乾燥した（収量は６糖が253mg，８糖が324mg，10糖が185mg，12糖が54mgであった）。このうち、10糖のもの100mgを水10mに溶解して、ODSカラム、ダイソーパックSP-120-25-ODS-B（ダイソー株式会社製；2×50cm）へ2mlづつ５回アプライし、水から20％メタノール溶液までの濃度勾配系を用いて溶出させ、10糖画分を濃縮し、凍結乾燥して回収した。収量は78mgであった。同様にして、８糖、６糖画分それぞれ100mgから精製粉末をそれぞれ85mg,82mg回収した。
他方、Dowexカラム吸着に吸着し、5mM〜200mMのNaCl溶液２Ｌによる直線濃度勾配によって溶出されたチオバルビツール酸陽性画分濃縮液も同様に、セルロファインGCL-90sf（Cellulofine GCL-90sf）カラムに負荷し、0.2M NaCl溶液でゲル濾過を行い、９糖、11糖、13糖相当画分を集め、それぞれを同カラムでゲル濾過を繰り返して精製し、脱塩、凍結乾燥した。その結果、９糖、11糖、13糖のシアリルＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖（Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の非還元末端にシアル酸残基が付加されている）をそれぞれ12mg、15mg、７mg得た。
このうち、６糖、８糖、10糖、９糖、11糖、13糖の画分についてそれぞれシアル酸含量、ガラクトース含量および窒素含量を測定した。なおシアル酸含量はチオバルビツール酸法、ガラクトース含量はアンスロン法、窒素含量は元素分析により測定した。結果を表２に示す。
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さらに、上記の６糖、８糖、10糖、11糖の画分について、質量分析を行った。質量分析は、高速原子衝撃マススペクトロメトリー（FABマススペクトロメトリー）により行った。ポジティブFABマススペクトルおよびネガティブFABマススペクトルから読みとれるメインピークのm/z値を表３に示した。また質量分析から得られる分子量（表中の「測定値」）、および構造式から求められる分子量（表中の「理論値」）も表３に併せて示した。
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表３の結果から、本発明により得られたＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の分子サイズ（分子量）が理論値にほぼ一致していることが確認された。また、微妙に分子サイズ（分子量）が異なるＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を、分子サイズに応じて分取できることが確認された。
またこの結果から、表２中の９糖がNeuAc-(Gal-GlcNAc)4であること、13糖がNeuAc-(Gal-GlcNAc)6であることが示唆された。
産業上の利用可能性
本発明により、新規なＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖および新規なＮ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法が提供される。本発明オリゴ糖は、天然に微量しか存在しないセレクチンファミリーのリガンド糖鎖の合成の素材として利用することができる。セレクチンファミリーのリガンド糖鎖は、新規な医薬品、特に抗炎症剤として利用することができる。
また本発明方法１により、工業的規模かつ安価に本発明オリゴ糖を生産することができる。
また本発明方法２により、本発明オリゴ糖の製造中間体として有用な硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖を、工業的規模かつ安価に生産することができる。また、この硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖は、新規な生理活性を有する可能性もあり、医薬品としての利用も期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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