(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者体内に細菌性疾病または原虫性疾病に対して能動免疫活性を産生する方法であって、該被験者がヒトではなく、
（ｉ）生きた病原性細菌と生きた病原性原虫とから選択される生きた病原体と、
（ｉｉ）該生きた病原体に結合した中和因子と
を含むワクチン結合物を被験者に投与するステップを含み、
該中和因子が抗体と抗体フラグメントからなる群から選択され、
該抗体又は抗体フラグメントが該生きた病原体を中和する能力を有し、
該ワクチン結合物が該生きた病原体に対して該被験者が能動免疫応答を産生するための効果的な量で投与される方法。
【請求項２】
上記被験者が鳥である請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記中和因子がIgG免疫グロブリンとIgG免疫グロブリンフラグメントからなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記中和因子がポリクロナール由来のものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
上記中和因子がモノクロナール由来のものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
上記生きた病原体が鳥の原虫であり、被験者が鳥であることを特徴とする１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
上記生きた病原性原虫がEimeria（アイメリア）種であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記生きた病原性原虫がE.tenella又はE.acervulinaであることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
上記生きた病原体が生きたマイコプラズマであることを特徴とする、１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
上記マイコプラズマがMycoplasma gallisepticumであることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
皮下投与と腹腔内投与及び筋肉内投与からなるグループから選ばれる方法により上記ワクチン結合物が被験者に投与されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
上記被験者が鳥であり、上記投与工程が卵内で行われることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
細菌性疾病または原虫性疾病に対して被験者体内に能動免疫活性を産生するのに有用なワクチン製剤であって、該ワクチン製剤がワクチン結合物を含む薬学的に許容される配合物を含み、該ワクチン結合物が
（ｉ）生きた病原性細菌と生きた病原性原虫とから選択される生きた病原体と、
（ｉｉ）該生きた病原体に結合した中和因子と
を含み、
該中和因子は抗体及び抗体フラグメントからなる群から選ばれ、
該抗体又は抗体フラグメントは前記生きた病原体を中和する能力を有し、
該ワクチン結合物は、生きた病原体に対して前記被験者に能動免疫応答を産生するのに効果的な量で該薬学的に許容される配合物に含まれる、ワクチン製剤。
【請求項１４】
上記被験者が鳥である請求項１３に記載のワクチン製剤。
【請求項１５】
上記薬学的に許容される配合物が凍結乾燥されていることを特徴とする、請求項１３または１４に記載のワクチン製剤。
【請求項１６】
上記生きた病原体が鳥の原虫であり、被験者が鳥であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載のワクチン製剤。
【請求項１７】
上記生きた病原性原虫がEimeria（アイメリア）種であることを特徴とする請求項１６に記載のワクチン製剤。
【請求項１８】
上記生きた病原性原虫がE.tenella又はE.acervulinaであることを特徴とする、請求項１７記載のワクチン製剤。
【請求項１９】
上記生きた病原体が生きたマイコプラズマであることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載のワクチン製剤。
【請求項２０】
上記マイコプラズマがMycoplasma gallisepticumであることを特徴とする、請求項１９記載のワクチン製剤。
【請求項２１】
細菌性疾病または原虫性疾病に対して能動免疫活性を産生するワクチンの製造のための製品の使用であって、該製品が、
（ｉ）生きた病原性細菌と生きた病原性原虫とから選択される生きた病原体と、
（ｉｉ）該生きた病原体に結合した中和因子と
を含み、
該中和因子が該生きた病原体を中和する能力を有し、
該中和因子が抗体と抗体フラグメントからなる群から選択され、
前記生きた病原体および前記中和因子が結合物を形成し、該結合物が、前記生きた病原体に対する能動免疫反応を生じさせるのに有効な量で前記製品に含まれる、使用。
【請求項２２】
上記被験者が鳥である請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
上記中和因子がIgG免疫グロブリンとIgG免疫グロブリンフラグメントからなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
上記中和因子がポリクロナール由来のものであることを特徴とする、請求項２１〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
上記中和因子がモノクロナール由来のものであることを特徴とする、請求項２１〜２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
上記生きた病原体が鳥の原虫である請求項２１〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
上記生きた病原性原虫がEimeria（アイメリア）種であることを特徴とする請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
上記生きた病原性原虫がE.tenella又はE.acervulinaであることを特徴とする、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
上記生きた病原体が生きたマイコプラズマであることを特徴とする、２１〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項３０】
上記マイコプラズマがMycoplasma gallisepticumであることを特徴とする、請求項２９記載の使用
【請求項３１】
細菌性疾病または原虫性疾病に対して能動免疫活性を産生するワクチンの製造方法であって、
（ｉ）生きた病原性細菌と生きた病原性原虫とから選択される生きた病原体と、
（ｉｉ）該生きた病原体に結合した中和因子と
を含む結合物をワクチン製剤に処方するステップにより特徴づけられ、
該中和因子が該生きた病原体を中和する能力を有し、
該中和因子が抗体と抗体フラグメントからなる群から選択され、
前記結合物が、前記生きた病原体に対する能動免疫反応を生じさせるのに有効な量で前記ワクチン製剤に含まれる方法。
【請求項３２】
上記被験者が鳥である請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
上記中和因子がIgG免疫グロブリンとIgG免疫グロブリンフラグメントからなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記中和因子がポリクロナール由来のものであることを特徴とする、請求項３１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
上記中和因子がモノクロナール由来のものであることを特徴とする、請求項３１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
上記生きた病原体が鳥の原虫であることを特徴とする請求項３１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
上記生きた病原性原虫がEimeria（アイメリア）種であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
上記生きた病原性原虫がE.tenella又はE.acervulinaであることを特徴とする、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
上記生きた病原体が生きたマイコプラズマであることを特徴とする、３１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
上記マイコプラズマがMycoplasma gallisepticumであることを特徴とする、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
被験者体内における細菌性疾病または原虫性疾病の治療のための医薬の製造のための請求項２１〜３０のいずれかに記載のワクチン製剤の使用。
【請求項４２】
上記被験者が鳥である請求項４１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
本願は1996年9月30日出願の米国仮出願番号60/027,084のに基づく利益を請求する。
発明の背景
本発明は、生きたバクテリア又は原虫動物及び中和抗体又はそのフラグメントからなるワクチン結合物（vaccine conjugate）を被験者に投与することにより細菌性または原虫性の疾病に対して免疫活性を産生する方法に関する。
発明の背景
生きたウィルスとウィルス中和抗体からなるワクチン結合物を投与することによりウィルス性疾病に対して免疫活性を産生する方法は、Whitfill他による米国特許第5,397,568号と第5,397,569号に述べられている。これらの文献はウィルス性疾病にのみ限られたものである。
多様なEimieria株により起こる鳥類及び哺乳類共通の原虫性疾患であるコクシジウム症の治療法は、Baffundoらに与えた米国特許第4,935,007号とMcDonaldら与えた米国特許第5,055,292号に述べられている。コクシジウム症に対する卵内予防接種については、PCT特許出願WO96/40233と96/40234の公報に述べられている。
発明の要旨
本発明は、細菌性又は原虫性疾病に対して免疫活性を被験者内に産生する方法において、生きた細菌または原虫と、該生きた細菌または原虫に結合した中和因子からなるワクチン結合物を被験者に投与することを特徴とする方法を提供する。該中和因子は、抗体及び抗体フラグメントからなる群から選ばれる。該抗体及び抗体フラグメントは、前記生きた細菌または原虫を中和することができるものである。該ワクチン結合物は、生きた細菌または原虫に対して被験者に免疫応答を産生するのに効果的な量を投与する。
本発明の他の態様としては、細菌性又は原虫性疾病に対して被験者内に免疫活性を産生するのに有用なワクチン製剤に関するものである。このワクチン製剤はワクチン結合物からなる薬学的に許容される製剤である。このワクチン結合物は、生きた細菌または原虫と、該生きた細菌または原虫に結合した中和因子からなる。該中和因子は、抗体及び抗体フラグメントからなる群から選択される。該抗体又は抗体フラグメントは、該生きた細菌または原虫を中和することができる。該薬学的に許容される製剤には、生きた細菌または原虫への免疫応答を被験者内に産生するのに効果的な量の該ワクチン結合物が含有されている。
本発明のさらなる態様としては、密閉式の病原体不透過性の容器と該容器に封入された上述の滅菌ワクチン製剤からなる製品である。
【図面の簡単な説明】
図1は、ワクチン接種をしていない対照（cntrl）と抗体なしでオーシストのみを接種した対照と比較して、500個のE.acervulinaのオーシストと2.5、25又は150μLのポリクロナール抗体からなるワクチン結合物を接種した鶏におけるオーシスト（oocyst）排泄量を示したものである。オーシスト排泄量は感染性の尺度として用いられる。
図2は、ワクチン接種をしていない対照（cntrl）と抗体なしでオーシストのみを接種した対照と比較して、500個のE.acervulinaのオーシストと25又は150μLのポリクロナール抗体からなるワクチン結合物を接種した鶏におけるオーシスト排泄量を示したものである。オーシスト排泄量は感染性の尺度として用いられる。
図3は、ワクチン接種及びE.acervulinaを低用量投与後のオーシスト排泄量を示したものである。ワクチン接種には、500個のE.acervulinaのオーシストと2.5、25又は150μLのポリクロナール抗体からなるワクチン結合物を用いた。対照としては、ワクチン接種をしていない対照（cntrl）と抗体なしでオーシストのみを接種した対照を用いた。
図4は、ワクチン接種及びE.acervulinaを高用量投与後の鳥の体重増加（単位：グラム）を示したものである。ワクチン接種には、500個のE.acervulinaのオーシストと25又は150μLのポリクロナール抗体からなるワクチン結合物を用いた。対照としては、ワクチン接種をしていない対照（cntrl）と抗体なしでオーシストのみを接種した対照を用いた。
図5は、ワクチン接種及びE.acervulinaを高用量投与後の鳥の障害評点を示したものである。ワクチン接種には、500個のE.acervulinaのオーシストと25又は150μLのポリクロナール抗体からなるワクチン結合物を用いた。対照としては、ワクチン接種をしていない対照（cntrl）と抗体なしでオーシストのみを接種した対照を用いた。
本発明の詳細な説明
本発明は、生きた有機体（バクテリア又は原虫動物）とその有機体に対して特異的な中和抗体の複合体からなるワクチン製剤を提供するものである。中和抗体の複合体の量は、その有機体が免疫活性応答を誘導可能であると同時に、病原体の悪影響に対してある程度防御できる量である。出願人は一つの理論に囚われるつもりはないが、現在のところ本発明のワクチン複合体が病原有機体を遅れて放出するような形となると考えられる。
本発明のワクチン複合体は、ワクチン有機体の病原作用を遅延させたり、又ワクチン有機体の病原作用からワクチン接種した被験者を初期的に防御すると考えられる。しかしがなら、この遅れ又は初期の防御は一次的なものである（死んだ或いは不活性化したワクチン有機体を用いた場合に期待される遅れや防御と比較した場合）。複合体中のワクチン有機体は免疫活性を誘導して、被験者を最終的に感染させない。遅延の程度は用いる抗体の量、個々のワクチン有機体、ワクチン接種を受ける被験者によって異なる。若い被験者に接種する場合、特に、多数の被験者がワクチンの接種をする場合、感染におけるこのような遅延は重要である。例えば、孵化したばかりの鶏にワクチン接種するのと比べて、卵の状態の鶏にワクチン接種する方がより簡単でコスト効率がよい。
本発明の好ましい態様においては、生きたワクチン有機体による被験者の感染に伴う病理的な変化の発現を遅らせる量の中和因子が提供される。この“遅延”は相対的なものであり、中和因子を配合せずに生きたワクチン有機体を投与した場合に起こるであろう病理変化と比較して、遅いという意味である。
本発明のワクチン結合物の使用は、防御的な免疫活性応答を誘導しうる非結合体有機体を使用するよりも安全である。ここで“安全”とは、ワクチン接種した大多数の被接種体において、どのような害よりもワクチン接種の利点が重要であることを示すものである。
本発明の実施に用いられる抗体は、細菌中和抗体又は原虫中和抗体である。これらの細菌または原虫中和抗体は、細菌または原虫と抗体が十分な時間反応可能である場合、生体内で細菌または原虫の感染性と戦って除去しようとするものである。細菌又は原虫中和抗体の起源はさほど重要ではない。これらは、例えば鳥（例えば、ニワトリ、七面鳥）哺乳類（例えば、ラット、ウサギ、やぎ、馬）等のいずれかの動物に由来するものならなんでもよい。細菌又は原虫中和抗体としては、例えば、D.YeltonとM.ScharffのAmerican Scientist,68,510（1980）に記載されているように、ポリクロナール抗体又はモノクロナール抗体に由来するものであればよい。その抗体は、例えばM.WalkerらのMolecular Immunology,26,403（1989）に記載されているようにキメラであってもよい。
本発明の実施に用いられる細菌又は原虫中和抗体は、いずれのアイソトープの免疫グロブリンでもよく、その例として、IgM,IgG,IgA,IgD及びIgE免疫グロブリンが挙げられる。そのうちIgGとIgMが好ましく、IgG免疫グロブリン（IgG1,IgG2,IgG3,IgG4等）がもっとも好ましい。
本発明の実施に用いられる抗体フラグメントは、可変領域結合部位を保持している細菌又は原虫中和抗体のフラグメントである。例えば、Immunology：Basic Processes,95-97（J.Bellanti編.第2版.1985）に記載されているように、F（ab’）2フラグメントやF（ab’）フラグメントとFabフラグメントが挙げられる。
本発明の実施に用いられる抗体又は抗体フラグメントに、他の成分を結合していてもよい。例えば、その全文を引用することにより本明細書の一部をなすものとするPlattに与えた米国特許第4,493,825号に記載されているように、抗体又は抗体フラグメントに微小球ま又は微粒子が結合していてもよい。
本発明は、中和因子に結合しない場合に、処置中の被験者において病原的（すなわち病気を引き起こしうる）であるような細菌又は原虫に用いると、特に有利である。細菌又は原虫の病原性は、その細菌又は原虫自身に固有のものであるか、又は、処置を受ける被験者（例えば卵内の鳥）の感受性による場合もある。通常、多くの病原性細菌又は原虫は、感染させる被験者の免疫活性を呼び起こすに積極的な影響を与えると共に、細菌又は原虫の多くの弱毒化したワクチン株が被験者に少なくとも幾らか病気を起こす能力を有している。それゆえに本明細書中で細菌又は原虫を説明するのに用いている“病原性”とはこれら細菌又は原虫の投与により被験者に引き起こした弊害がその投与により得られるであろう利益を越えることを意味している。“活性の”又は“生きた”有機体は死滅していないものを指し示している。“ワクチン有機体”とは、ネガティブな副作用が起きたとしても（免疫活性の利益がネガティブな副作用を越えるような場合）防御的な免疫応答を誘導するために用いられるものをさす。細菌又は原虫は、生きた有機体である上、処置している被験体において免疫活性応答を作り出せることが望ましい。
単位あたりのワクチン製剤の中に、処置する被験者に対する細菌又は原虫への免疫活性応答を十分に引き起こすためのワクチン結合物量が含有されている。ここで用いられている“免疫応答”とは、防御が部分的であろうと完全であろうとにかかわらず、細菌又は原虫への暴露から被験者集団にとって何らかの利益をもたらす防御を意味するが、具体的には死亡率の減少、障害評点の減少、食餌変換率の改善或いは病気が引き起こすそれ以外の何らかの有害な作用の減少といった形である。
中和因子によりもたらされる防御の程度に関して述べると、得られた免疫応答の利益が感染により起きる害を越えるレベルまで細菌又は原虫に起因する悪影響を減らせる限り、細菌又は原虫と共に投与されるワクチン中の中和因子の量は、細菌又は原虫から完璧な防御をもたらす程十分な量である必要はない。
ここで“被験者”として意図されているのは、とりわけ、哺乳類及び鳥類である。哺乳類としては、ねずみ、ラット、ブタ、ウサギ、ひつじ、フェレット、犬、猫、牛、馬そして人間を含む霊長類が挙げられる。“鳥”として意図されているのは、オス、メスに関係なくすべての鳥類を指すが、基本的には、卵や肉のために飼育されている鶏をさすものである。したがって、“鳥”としては、特に、ひな鳥、具体的には、ニワトリの雌鳥、雄鳥とあひるの雄、七面鳥、あひる、がちょう、うずら、キジ等を指している。
本発明を実施する際に用いてもよい細菌としては、Actinobacillosis lignieresi、Actinomyces bovis（ウシ放線菌）、Aerobacter aerogenes、Anaplasma marginale、Bacillus anthracis（炭疽菌）、Borrelia anserina（ガチョウスピロヘータ）、Brucella canis（イヌ流産菌）、Clostridium chauvoei（ショウベイ菌）、C.hemolyticium（溶血クロストリジウム）、C.Novyi（ノーヴィ菌）、C perfringens（ウェルチ菌）、C.septicum（悪性水腫菌）、C.tetani（破傷風菌）、Corynebacterium equi、C.pyogenes、C.renale、Cowdria ruminantium、Dermatophilus congolensis、Erysipelothrix insidiosa（豚丹毒菌）、Escherichia coli（大腸菌）、Fusiformis necrophorus、Haemobartonella canis、Hemophilus spp.（ヘモフィルス属）、H.suis（ブタインフルエンザ菌）、Leptospira spp.（レプトスピラ種）、Moraxella bovis、Mycoplasma spp.（マイコプラズマ種）、M.hyopneumoniae、Nanophyetus salminocola（サルミンコラ住血吸虫）、Pasteurella anatipestifer、P.hemolytica、P.multocida、Salmonella abortusovis、Shigella equirulis、Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）、S.hyicus.S.hyos、Streptococcus agalactiae、S.dysgalactiae、S.equi、S.uberisとVibrio fetus（該当する病気については、Veterinary Pharmacology and Therapeutics第5版、746頁、表50.2（N.Booth and L.McDonald編、1982）（Iowa State University Press）を参照されたい）と、Corynebacterium diptheriae（ジフテリア菌）、Mycobacterium bovis（ウシ結核菌）、M.leprae（らい菌）、M.tuberculosis（ヒト結核菌）、Nocardia asteroides、Bacillus anthracis（炭疽菌）、Clostridium botulinum（ボツリヌス菌）、C.difficile、C.perfringens（ウェルチ菌）、C.tetani（破傷風菌）、Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）、Streptococcus pneumoniae（肺炎連鎖球菌）、S.Pyogenes（化膿連鎖球菌）、Bordetella pertusiss（百日咳菌）、Psudomonas aeruginos（緑膿菌）、Campylobacter jejuni,Brucella spp.（ブルセラ種）、Francisella tularenssis（野兎病菌）、Legionella pneumophila（レジオネラニューモフィラ菌）、Chlamydia psittaci（オウム病クラミジア）、C.trachomatis（トラコーマクラミジア）、Escherichia coli（大腸菌）、Klebsiella pneumoniae（肺炎杆菌）、Salmonella typhi（腸チフス菌）、S.typhimurium（ネズミチフス菌）、Yersinia enterocolitica、Y.pestis（ペスト菌）、Vibrio cholerae（コレラ菌）、Haemophilus influenza（インフルエンザ菌）、Mycoplasma pneumoniae（肺炎マイコプラズマ）、Neiseseria gonorrhoeae（リン菌）、N.meningitidis（髄膜炎菌）、Coxiella burneti、Rickettsia mooseria、R.prowazekii（発疹チフスリケッチァ）、R.rickettsii（斑点熱リケッチァ）、R.tsutsugamushi（ツツガムシ病リケッチァ）、Borrelia spp.（ボレリア種）、Leptospira interrogans、Treponema pallidum（梅毒トレポネーマ）とListeria monocytogenes（リステリア菌）（該当する病気については、R.Stanierら著The Microbial World、637-38頁、表32.3（第5版1986）を参照されたい）があるが、そのような細菌に限定されるものではない。
本発明を実施する際に用いてもよい原虫としては、Eimeria種（アイメリア種）（E.tenella、E.necatrix、E.brunetti、E.acervulina、E.mivatiとE.maxima）、Anaplasma marginale、Giardia種（ジアルジア種）（例えば、Giardia lamblia（ランブルべん毛虫））、Babesia種（バベシア種）（例えば、B.canis、B.gibsoni、B.equi、B.caballi、B.bigemina、B.argentina、B.divergensとB.bovis）、Trichomonas foetus、Entamoeba histolytica（赤痢アメーバ）とBalantidum coli（大腸バランチジウム）、そして、Plasmodium種（プラズモジウム種）（P.falciparum（熱帯性マラリア原虫）、P.malariae（四日熱マラリア原虫）、P.vivax（三日熱マラリア原虫）とP.ovale（卵形マラリア原虫））、Leishmania種（リーシュマニア種）（L.donovani（ドノバンリーシュマニア）、L.braziliensis（ブラジルリーシュマニア）、L.tropica（熱帯リーシュマニア）とL.mexicana（メキシコリーシュマニア））、Trypanosoma種（トリパノソーマ種）（T.brucei（ブルーストリパノソーマ）とT.cruzi（クルーズトリパノソーマ））、Entamoeba histolytica（赤痢アメーバ）、Trichomonas vaginalis（膣トリコモナス）、Toxoplasmosa gondii（トキソプラズマ）とPneumocystis carinii（ニューモシスティス）があるが、そのような原虫に限定されるものではない。ここで用いられている“鳥類の原虫”とは、鳥類に感染を起こすこととして知られている原虫である。
有機体は、胞子や包嚢などの適当な形状で投与されることができる。例えば、感染性のコクシジウム有機体は、胞子形成したオーシスト、スポロゾイト、スポロシストなどの状態で投与されることができる。
結合体として投与される有機体の正確な数は、その数が動物による免疫応答をおこすのに効果的でなくてはならない場合を除いては、重要ではない。通常投与される有機体、投与部位及び投与方法、被験者の年齢及び状態等によって異なるが、有機体の数は、1、10、または100個から1000、10,000、100,000または1,000,000個の範囲である。有機体が結合体として卵内の鳥に投与する場合の投与量は、有機体の数が50、100、500個から2,000、10,000、20,000、30,000、50,000、100,000又はそれ以上である。
本発明のワクチンは被験者に適当な方法により投与される。例えば、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、動脈内投与、腹腔内投与、点眼、鼻への噴霧が挙げられる。処置する被験者が鳥である場合、孵化したばかりの鳥（すなわち、孵化して最初の3日）を含む孵化した鳥、成長期の鳥、成鳥が対象である。鳥に対しては、Sharmaに与えた米国特許第4,458,630号（ここではこの特許と他の全ての特許の全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に述べられているように、卵内にワクチンを投与することもできる。
ワクチンの卵内投与には、ワクチンのたまごへの投与を含むものである。本発明のワクチンを投与されるたまごは、抱卵の第４四半期にある受精卵であることが好ましい。鶏の卵では、抱卵期に入ってからの15日から19日目に処置されるが、18日目に処置されるのが最も好ましい（胚の成長の18日目）。七面鳥の卵では、抱卵期に入ってからの約21日から26日目に処置されるのが好ましく、特に約25日目に処置されるのが最も好ましい。
本発明のワクチンを卵に投与するには、この化合物を卵の殻を通して運べる手段であればいずれでもよいが、好ましい投与方法は注射である。注射部位は、例えば、羊水、胚自体等の羊膜により囲まれた領域や卵黄嚢又は肺胞であることが好ましくい。最も好ましくは、羊膜に囲まれた領域に注射を行う。抱卵の第４四半期の初期までに、羊膜は十分に広がっているので、卵の広い端の中心から縦軸に沿って注射する場合、ほとんどどの時期でも、羊膜からの進入が可能である。
卵への注射のメカニズムは重要ではないが、胚の組織や器官または胚を取巻く外の膜を過度に損傷を与えることによって孵化率を低下させることのない方法が好ましい。約18から22ゲージの針がついている皮下注射用シリンジが目的に適っている。肺胞への注射は、針が2ミリ程卵内へ挿入されるだけでよい。1インチの針を卵の広い端の中心から十分に挿入する場合、この針は殻、肺胞を包む外側と内側の外皮膜そして羊膜を貫通する。発達の正確な段階、胚の位置によって異なるが、この長さの針は、ひな鳥の上部の液体内に又はひな鳥自身までにとどまる。針を刺す前に、殻を通すパイロットホールを開けて、針の損傷又は鈍化を防いでもよい。必要ならば、ワックス等の実質的に細菌が侵入できないような密閉材料で卵を密閉し、望ましくない細菌が続いて侵入するのを防ぐことも可能である。
本発明の実施にとっては、鳥の胚に対する高速自動卵注射システムが特に適していると考えられる。例えば、Hebrankに与えた米国特許第4,681,063号、Millerに与えた米国特許第4,040,388号や第4,469,047号と第4,593,646号に開示されている多くこのような装置が使用可能である。本発明の実施に適用されるこのような装置は前述のワクチンをいれた注射器からなり、この注射器は、装置により運ばれてきた卵にワクチンを注射するように配置される。この装置の他の特徴については前述の文献にのべられている。更に、注射した後の卵の穴を密閉するために、注射装置と連動する密閉用装置が適宜提供される。
本発明を実施するための好ましい卵注入装置は、Hebrankに与えた米国特許第4,681,063号と第4,903,635号に開示されており、ここではその全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。この装置は注入器と吸引器からなり、注入器が液状物質を複数の卵に送り込み、吸入器が卵に面した上方位置から複数の卵それぞれを掴むと同時に持ち上げ、この吸引器が卵を掴んでいる間に卵に注入する注入器と共同して働く。この装置の特徴は、本発明を実施するための上述の装置の特徴と一致している。本発明を実施するための好ましい被験者は鳥である。
本発明の方法は好ましくは、卵内の鳥に実施される。
本発明のワクチン結合物は、中和因子と生きた細菌または原虫を薬学的に許容される担体中で、両者の結合体を生成するのに十分な時間混合して得られる（例えば、被験者への投与の前に、結合体を生成するまで、通常の液体担体中で中和因子と細菌または原虫を結合させることにより得られる）。この方法は、中和抗体を含有する超免疫血清を生きた細菌または原虫を含有する水溶液に単に添加することによって、より有効に実施できる。本発明のワクチン製剤は、好ましくは、凍結乾燥状態のワクチン結合物或いはは薬学的に許容される担体にあるワクチン結合物からなる。薬学的に許容される担体としては、好ましくは、液体、特に水溶性の担体が挙げられる。このようなワクチン製剤を製造する目的のためには、中和因子と細菌又は原虫は、りん酸緩衝生理食塩液（pH7.4）、MEMのような通常の媒体、又は、細菌増殖媒体中で混合される。ワクチン製剤は、ゴム栓で密閉した滅菌ガラス容器に保存され、使用時には、このゴム栓を通して液体類が注入され、製剤がシリンジにより吸出される。
本発明のワクチン結合物又はワクチン複合体は、抗体と生きたワクチン有機体との複合体又は結合体である。抗体とワクチン有機体の結合は共有結合ではなく、解除可能な結合である。特定のワクチン有機体及び特定の被験者に用いるのに適した中和抗体の量は既存の技術を用いて容易に決定される。過度に抗体の量が少ないと、ワクチン有機体により早く又は強い病理効果が引き起こされるので好ましくないし、過度に抗体の量が多いと、ワクチン有機体を完全に不活性化してしまったり、防御免疫応答を誘導できなくしてしまう。
本発明のワクチン製剤は、一以上の補助剤を任意に含有することができる。抗原への免疫系の応答を高める化学的及びポリペプチド免疫刺激剤等の適当な補助剤を用いることができる。好ましくは水酸化アルミニウム、りん酸アルミニウムと動物油及びその類等の補助剤はワクチン結合物に対して、被験者の免疫応答を高めるのに十分な量が投与される。ワクチン結合物に添加される補助剤の量は補助剤の性質により異なるが、通常、細菌または原虫の約0.1から約100倍であり、好ましくは細菌または原虫の約1から10倍の重量が添加される。
本発明のワクチン製剤は任意に一以上の安定剤を含有することができる。例えば、ソルビトール（sorbitol）、マニトール（manitol）、澱粉、蔗糖、デキストリン（dextrin）、グルコースなどの炭水化物や、アルブミン、カゼインのようなタンパク質、そしてアルカリ金属りん酸塩等の緩衝液などの適当な安定剤を用いることができる。安定剤の使用はワクチン製剤が凍結乾燥製剤である場合に特に有利である。
本発明は、次の例により更に詳細に説明するが、これにより限定されるものではない。
例  １
細菌の種類
Pasteurella multocida菌は、多くの鳥種に急性かつ高接触感染性の疾病を引き起こす。家禽のコレラは、しばしば罹患率と死亡率の高い敗血症を引き起こす。家禽のコレラには、ニワトリと七面鳥両方に投与可能な生ワクチンがいくつかある。
細菌―抗体複合体を生成するために、P.multocidaの菌株がP.multocida菌に特異的な抗体と試験管内で複合される。この細菌を完全に不活性化せず、かつ免疫活性応答を起こしうる複合体中の細菌と抗体との比を求めるために、種々の細菌と抗体との比はテストされている。これらの複合体はワクチンとして、ニワトリ又は七面鳥に用いられている。ワクチンの応答は追跡調査され、抗体を混ぜていない同量のP.multocidaのワクチンを接種した鳥の応答と比較された。ワクチン接種後の障害、時間経過後の抗体の応答と全体的な鳥の健康状態はテストを通してモニターされている。
他の細菌についても同様にテストされた。例えば、ニワトリ、七面鳥のではMycoplasma gallisepticum菌、七面鳥ではBordetella avium菌、ニワトリ、七面鳥ではSalmonella種の細菌、齧歯動物ではSalmonella種の細菌、Listeria種の細菌等が例として挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
ワクチン結合物は上述のように卵内、或いは孵化後の鳥に投与する。
例  ２
原虫の種類
原虫―抗体複合体を形成するために、原虫Eimeria acervulina（具体的には、この原虫のスポロシスト（sporocysts）及び／又はオーシスト（oocysts））をEimeria acervulinaに特異な抗体と試験管で混ぜた。これらの複合体をニワトリのワクチンとして用いる。得られた原虫―抗体複合体ワクチンの応答を追跡調査し、抗体を無添加の同量のE.acervulinaのワクチンを接種した鳥と比較する。この原虫を完全に不活性化せず、かつ免疫活性応答を起こす複合体中の原虫と抗体との比を求めるために、種々の原虫と抗体との比をテストした。ワクチン接種後、ワクチン接種者の糞便へのオーシスト排泄量、腸吸収能（カロチノイド摂取により評価）及び体重を求めた。ワクチン接種後10-21日目にワクチン接種した各群の鳥にE.acervulinaを与えて毒性を試した。ワクチン接種者とワクチンを接種しない群について、ワクチン接種者の糞便へのオーシスト排泄量、その器官の体重増加と腸吸収能（カロチノイド摂取により評価）を求めた。
他のEimeria（アイメリア）種の原虫についてもニワトリ、七面鳥、噛歯類でテストした。又、ニワトリと七面鳥でCryptosporidium種の原虫（クリプトスポリジウム）と、ニワトリと七面鳥でHistomonas meleagridisのテストも行った。
ワクチン結合物は上述のように卵内、或いは孵化後の鳥に投与する。
例  ３
ワクチン接種後のアイメリアオーシストの排泄量
ニワトリにワクチン接種し、E.acervulinaオーシストワクチンと抗体を混合した効果を調べた。
４種のワクチン接種法について調べた。４つの処置グループに、E.acervulinaに特異的なポリクロナール抗体0、2.5、25、150単位と胞子形成した500個のE.acervulinaオーシストを混合したものをそれぞれワクチン接種した（経口強制投与）。五羽のレグホン種のニワトリからなる３つのグループにそれぞれの処置を施した（各処置グループにつき15羽、計60羽を処置対象とした）。15羽からなる対照群（5羽づつ3回繰返し）には、オーシストも抗体も投与せず、孵化の日に0.1mLのPBSを経口強制投与し、続いて免疫性のテストを行った。
抗体の単位は容量規準で決定し、1μLが1単位である。本例で用いられる抗体製剤の“滴定単位”を求めるためにELISA分析法が用いられているが、この方法の有効性は確認されていない。ELISA分析法により、E.acervulina抗体製剤は90,782単位/mLの滴定量を有した。ここで用いられている投与量は相対的なものである。特定の微生物（organism）と混合する抗体の適切な量はその微生物、抗体製剤、目的被験者により異なる。従来公知の技術を用いている同業者ならば使用する適切な微生物と抗体との比を決定するであろう。
ワクチン接種の最低一時間前に、オーシストと抗体をPBS中で室温で混合した。得られたワクチン複合体は投与までの間4℃で保存した。ニワトリには孵化の日にワクチン接種した。
ワクチン接種後のオーシスト排泄量はワクチン接種後４日目、８日目に糞便を回収し、糞便中のオーシストを数えて求めた。各グループにつきオーシスト排泄量の平均及び標準偏差を求めた。表1に示したように500個のオーシストと１50μLの抗体との複合体を用いることにより、オーシストの排泄量が有効に減少した。
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例  ４
菌投与後のアイメリアオーシスト排泄量
例1で述べた鳥の処置グループについて、孵化後13日目に、PBSに加えたE.acervulinaのオーシスト250個を強制経口投与して菌投与後の免疫性をテストした。テスト後4−8日目に糞便を回収し、平均オーシスト排泄量を対照群のオーシスト排泄量のパーセンテージとして求めた（統計的モデルは対照群を含む）。結果を表2に示す。テスト後のオーシスト排泄量が多いほど、病原菌の投与に対して防御が少ないことを示している。
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例  ５
菌投与後の防御
対照群のデータを統計学的モデルに含まずに、表2に提供したデータを再分析した結果を表3に示す。
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例1−3で得られた結果から、E.acervulinaのオーシスト500個のワクチンを150μLの抗体と共に用いるとワクチン接種により起きる病原作用を減じるか（抗体の量を減らすか、又は全く抗体を用いずに同じワクチン接種をした場合との比較：ワクチン接種後のオーシスト排泄量の減少により明らかとなる）、又はワクチン投与による病原作用を遅延させる可能性があることがわかる。表1から明らかなように、ワクチンオーシストと150μLの抗体の複合体は、抗体なしのワクチン接種又は抗体の量を減らしたワクチン接種
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よりも感染性をレベルに低く抑えた。
表2に示したように、抗体―オーシストワクチンを接種した鳥は、250個のE.acervulinaオーシストを投与した後のオーシスト排泄量が、ワクチン接種していない鳥に比べて、減少している。これらの結果により、抗体―オーシストワクチン製剤は、投与された病原体に対して防御免疫応答を誘発するのに効果的であることがわかる。抗体なしでオーシストを接種した処置グループで最も防御度が高く、有意差レベルが0.05である。表3でも、抗体―オーシストワクチンで処置した鳥のなかで、最も高度な防御が、抗体なしでオーシストで処置したグループにやはり見られる。
上述の結果から、抗体―オーシストワクチン複合体の使用により、防御免疫応答を生じさせながらも、ワクチンオーシストの病原作用が減るか、又はワクチンオーシストの病原作用が遅れることがわかる。ワクチン有機体の病原作用により感受性の高い被験者へのワクチン投与を可能にするか、又はより若い段階にある被験者（例えば卵内の鳥）への投与を可能にすることによって、どちらの作用もワクチンの安全性を高めると期待されている。
上記したのは本発明の例を示すことであるが、それに限定されない。本発明は次のクレームに規定されるが、それらのクレームと同等のものもそれらに含まれる。
例  6
低用量菌投与モデルにおける抗体―オーシスト（Eimeria acervulina）ワクチン結合物の使用
抗体の量を変えて（2.5から150μL）、500個のEimeria acervulinaのオーシストオーシストワクチン複合体を作り、テストした。この処置は、ワクチン接種していない対照と抗体なしでワクチン接種した対照と比較した。すべての処置は、孵化の日に投与することにより行った。ワクチン接種後の４−８日目のオーシスト排泄量を測定した。さらに、13日目に菌を低用量投与した後のオーシスト排泄量を測定した。
材料及び方法：材料抗体の影響をすべて取り除くためにHyvac SPFレグホンを用いた。ポリクロナール抗体をE.acervulinaのオーシストで免疫化したニワトリから生成した。二個の抗体製剤を結合させて最終滴定が90,782であるE.acervulinaの抗体を作った。処置グループと実験の計画を表4に示す。
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上述のワクチン複合体は、適切量のオーシスト（USDA#12ロット28-131-36）と抗体と混ぜて生成した。得られた複合体は、投与前に室温で一時間培養した。孵化の日にそれぞれの処置群に200μLのワクチンを鳥に投与した。４日目と８日目に糞便を回収した。糞便サンプルを加工し、McMaster計算板を用いて鳥一羽当たりのオースト排泄量を求めた。
鳥をひな保育箱に移し、孵化後13日目に低用量の菌（250個のE.acervulinaオーシスト）を投与した。糞便を投与後４−８日に回収し、上述のように数えた。
ワクチン接種した対照群において鳥一羽当たりのオースト排泄量は約12×106であった。抗体の量が2.5μLと25μLでの処置ではどちらも同様の結果を示したが、150μLの抗体で処置した場合、オースト排泄量を抑える効果があったようで、排泄量は対照群に対してただの46％であった。図1を参照されたい。
低量で菌を投与した後は、抗体ワクチンを接種したグループではすべて同じような結果がみられた。図3を参照されたい。抗体で処置した3つのグループの平均は対照群の約40％であった。ワクチンを接種した対照群の排泄量は対照群の23％しかなかった。
例  7
抗体−オーシスト（Eimeria acervulina）ワクチン結合物の高用量菌投与モデルでの使用。
高用量菌投与モデルを用いて、２種類の抗体―オーシストワクチン結合物製剤をテストした。感染力はオースト排泄量により測定し、菌投与に対する応答は体重の増加と障害評点で測定した。このワクチン結合物は500個のE.acervulinaオーストと25μL又は150μLの抗体の複合体からなる（例6で述べたように）。表5を参照されたい。例6と同様の鳥の系統、抗体とオーシストロットを用いた。
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上述のようにワクチンを製造し、200μLを孵化後0日目に投与した。糞便を４日目から８日目まで回収し、カウントした。
本実験で測定した菌投与後のパラメーターは、例6と異なった。13日目に多量の菌を各処置群に投与して、それぞれの鳥の体重を記録した。８日後（即ち、21日目）鳥の体重を量り、障害を評点した。
例6と比較して、ワクチン接種した対照群では、二種類の抗体処置と同様にオーシスト排泄量は少なかった。ワクチン接種した対照は（抗体なし）オーシスト排泄量が20分の１を示した（図2参照のこと）。この減少の理由ははっきりしない。
高用量の菌（500個のオーシスト投与）をすべての処置群に投与して、体重増加及び障害評点を調べた。体重の増加の結果（図4）に関しては、ワクチンを接種した対照群及びワクチンを接種していない対照群を含めて処置群の中で違いはなかった。障害評点のデータによると（図5）ワクチン接種したグループは、ワクチン接種していない対照群より、防御がすぐれていた。
例  8
Pasteurella multocida
P.multocidaの抗血清の生成：孵化後、10羽のSPFニワトリをクリーンルームに入れて、４週令で各鳥に、血清型１，３及び４を含有する市販の不活性化したP.multocidaオイル乳濁液であるSolvayの“Pabac”を0.5mL投与した（首の皮下注射）。８週令で、さらに首に0.5mLの抗原を皮下注射し、もう0.5mLの抗原を右の胸に筋肉注射した。10週令で、約20mLの血液を心臓穿刺により各鳥から採取した。この血液から抗血清を得てプールし、4.5μmのフィルターでろ過した。無菌テストを何度も行った結果がすべて陰性（negative）であった、この抗血清を異なったサイズのバイアルに入れて、使用するまで−20℃の冷凍庫に保存した。
P.multocidaのCuとM9菌株の単離と滴定量測定
P.multocidaのCu菌株とM9菌株をBiomune社の生ワクチン、Choleramune CuとMultimune Mからそれぞれ増殖させた。測定の結果、P.multocidaのこれらの菌株は−70℃の温度で、90％培地と10％グリセロールの混合物中で最もよく凍結した。
例  9
18日目にP.multocidaを接種した卵の孵化可能性
孵卵18日目にSPF卵の卵内にP.multocida菌株CuとM9を接種したが、これら菌株のコロニー形成単位の数の違いが、その後の卵の孵化可能性に影響があるかどうか調べるために本実験を行った。P.multocidaの各菌株をりん酸塩緩衝生理食塩（PBS）で希釈して、3種類の希釈液、即ち0.1mL当たり1000CFU、0.1mL当たり100CFUと0.1mL当たり10CFUの希釈液を得た。孵卵18日目に、各菌株の希釈液0.1mLを14個のSPF卵に接種した。13個の卵はブレインハートインフュージョン培地（BHI：Brain Heart Infusion Broth）、PBS及びグリセロール（賦形剤コントロール）の混合物0.1mLを接種して、13個の卵は接種しなかった。
表6の結果によると、SPF卵の孵化性は２群から７群で、非常に落ち込んでいることがわかった。
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適切な数のCFUを含有する培養菌／PBSの混合物0.1mLを各接種卵に接種した。1×10（2）CFU／mLを含有する希釈液を各菌株に滴定した。滴定量は目的とする数とは幾分異なっていた。４群は実際に10.5CFU／卵、３群は105CFU／卵、２群は1050CFU／卵を含有していた。７群は12.5CFU／卵、６群は125CFU／卵、５群は1250CFU／卵を含有していた。１群では卵はBHI／PBS／グリセロールの混合物を0.1mL接種した。
例  10
ニワトリ抗血清と混合した後のP.multocidaのコロニー増殖
ニワトリP.multocida抗血清（例8参照のこと）1mLを−20℃から取り出し、室温で解凍した。この血清をPBSで順次に２倍づつ希釈した。各血清希釈液1.5mLと、0.5mL当たり100CFU含有するP.multocidaのCu菌株培養液0.5mLとを混合した。得られた混合物を室温で1時間反応させた。1時間後、各血清希釈混合物0.5mLをTSAプレートにのせ、これを二枚作り、200CFU／mLのP.multocidaのCu菌株の保存溶液をプレートにのせ、これを三枚作った。これらのプレートを37℃で48時間培養して、培養後24時間及び48時間後のコロニーを数えた。結果は表7と8に示す。
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混合物をすべて用意してから表8の保存溶液のサンプルをプレートにのせた。溶液は更に1時間静置しなかった。この保存溶液0.5mLと抗血清0.5mLの混合物は、混合物の予想値である152CFU/mLを示した。
これらの結果により、抗血清の希釈率が最低から最高へと向かう程、細菌のCFUの数が減少していることがわかった（表7）。これは反応時間によるかもしれない。最も希釈率の高い抗血清は最も希釈率の低い抗血清よりも生存培養液とより長く反応した（20〜30分長い）。時間がかかればかかるほど、コロニーの死ぬ数が増える。保存溶液（3 c 4CFU/mL）を繰り返し攪拌することも又、コロニー数の減少に影響を与えたのかもしれない。次の例ではさらにこの事を調べる。
例  11
表6に示したように、この実験により、P.multocidaのCu菌株のコロニーと同じ希釈率のP.multocida抗血清との反応を調べた。前の実験のように、P.multocidaのCu菌株の“2×10（2）”保存溶液を連続的に攪拌するかわりに、この溶液をピペットでゆっくり混合した。抗体−細菌複合体を形成するために、1mLの抗血清希釈液を1mLの保存培養希釈液と混合した。得られた混合物を４時間反応させた。保存溶液をTSAプレートにのせて、これを３枚作ったところ、186CFU/mL含有していることがわかった（表9）。この溶液の残りを室温で４時間静置した。
４時間の反応時間の後、各血清−細菌混合物0.5mLを混合し、TSA上に置いて、これを２枚作成した。186CFU／mL保存溶液を混ぜてTSA上に置き、これを３枚作った（一枚当たり0.5mL）。37℃で培養24時間後にコロニーを数え、さらに96時間後に又数えた。結果は表9と表10に示す。
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表10のデータによると、抗血清の希釈率が増えると、前の実験と同じように、コロニー数は減るが、前の実験よりはわずかにこの傾向が顕著である。希釈率が1:16から1:4096までの混合物において、予想よりもCFU/mLは多いようだ。同じ知見が表7にも示されている。表9のコロニー数は、血清が存在しないとCFUはPBS中で死滅してしまうことを提示している。このことが、両方で希釈率1：8192から1：32768で予想よりコロニー数が少ないことを説明している。抗血清は希釈率が高いほど増殖抑制能力を示しているが、一方希釈率が最も少ない混合物では増殖増大効果を示している。次の実験はこれらの観察結果の原因と考えられるものを調べるために行った。
例  12
P.multocidaの抗血清及び陰性血清（negative serum：P.multocida抗体を含有しないニワトリの血清）のP.multocida M9菌株の増殖に対する作用を試験管中で比較した。例11と同様にして血清希釈液とP.multocida培養希釈液を用意した。139CFU/mL含有する1mLの培養液（表6）と1mLの希釈血清を混合した。陰性血清の希釈液を３種類（1：16、1：512と1：32768）を用意し、適切量の細菌培養液と混合した。細菌培養液と血清希釈液の混合物を1時間室温で反応させた。
1時間反応後、得られた血清抗体−細菌混合物をTSAプレートにのせ（0.5mL）、それを２枚作成し、陰性の血清−細菌混合物をプレートにのせてそれを３枚作成した。1.0mLのP.multocida菌株M9保存溶液を抗血清希釈液と陰性血清希釈液すべてに加えて、再度室温で一時間静置した後、プレートにのせて、それを３枚作成した。37℃で24時間培養した後コロニーを数え、培養48時間後のコロニー数の変化を記録した。これらの計数の結果を表11と表12に示す。
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37℃で48時間培養した後もコロニー数には変化がなかった。
例10〜12のデータによると、最初はCFUの数は増加していたが、P.multocidaに対する抗血清の希釈率が高くなるほど、その数は徐々に減少している。データを総合すると、P.multocidaの両方の菌株は実際に血清を増殖媒体として使用しているようだ。血清の濃度が減少すると、P.multocidaの増殖も減少する。幾つかの結果によると、PBSで希釈して室温で１時間から４時間までの時間静置するとP.multocidaが死滅することを示している。このことは、希釈率が1：8192から1：32768の間ではCFU数は予想値よりも少ないことを説明している。血清の濃度が減ると、PBS濃度があがる。一時間おく前と後ではさほど本例の保存コロニー数に大きな違いはなかったが、希釈率が高いほど数が少ないという傾向はなお存在した。
P.multocidaの抗体を含有しない血清混合物のコロニー数を、P.multocida抗体を含有する血清混合物のコロニー数と比較すると、P.multocida抗体を含んだ抗血清の方に幾分増殖抑制能がみられるかもしれない。P.multocida抗血清を含有しないサンプルのCFU数は最初多く、それから減り始めるが、一時間後の保存CFU数と比べて予想していたよりも低くはない。CFU数は、P.multocida抗体を含まない陰性血清サンプルにおいてよりもP.multocida抗体を含有する三つのサンプルのうち２つで低かった。P.multocida抗血清の増殖抑制作用を、存在する他の因子が隠している可能性もある。
例  13
孵卵18日目にP.multocida抗血清-P.multocida CFUを注入した卵の孵化性
ここでは、血清抗体-細菌複合体をSPF卵の卵内に投与したときの作用をテストすることを意図した。P.multocida菌株M9のCFUは同じ数にして（５グループを標的とした）P.multocida抗血清は量を変えてこれらを混合し、次に各混合物を0.1mL、７つのグループの各15個のSPF卵に接種した。P.multocida菌株M9培養液を用いて100CFU/mLの保存溶液を製造した。各卵に同じ数のCFUを投与されるように、各グループ共５分おきに適切量の血清と適切な量の保存溶液を混合した。得られた混合物を室温で30分間静置し、その後、孵卵18日目に15個の卵にこの混合物を0.1mL接種した。最後のグループの混合物を作成し、同じように30分間反応させてから、100CFU/mLの保存溶液をプレート上において、それを３枚作成した（表13）。作成したプレートを37℃で24時間培養し、それからコロニーを数えた。表14は各グループの孵化性を示したものである。
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ここでは、適切量のP.multocida抗血清と5.0CFUの細菌の混合物を投与す予定の各卵に接種することを意図した。表13の滴定に関する情報は、卵は3.2よりも5に近いCFU数を投与され、30分の反応時間の結果コロニーが少し減少したことを示している。表14によると、孵卵後１８日目にP.multocida菌株M9のCFUを少量でも投与するとSPF卵の状態が非常に悪化することがわかる。対照群である７群の孵化率は100％であった。孵化は他の群では著しい影響を受けた。これらの群のうち、５と６群は孵化した鳥のパーセンテージとしては二番目に高い。６群の卵には最も高率（50μL+3.2CFU）のP.multocida抗血清が接種され、全体の孵化率としては60％だが正常な孵化は27％であった。これらの傾向は、生きた細菌を混合した場合、細菌の病原作用を減らすか又は遅らすかしてP.multocida抗血清はニワトリの胚に対して、ある程度の防御を与えていることを示している。
表12と表14のデータによると、P.multocida抗体を加えた血清及び加えていない血清、及び血清抗体の量の違いを比較することで、P.multocidaの血清抗体が有機体の増殖、おそらくは有機体の病原的作用に対して抑制効果を示していることがわかる。表14には、抗体の量が最も多い場合（５群と６群）は、細菌だけの場合（１群）と比べて孵化率がよいことが示されている。
例  14
M.gallisepticumの増殖と超免疫血清の製造
細菌Mycoplasma gallisepticum菌株Ｆの培養液をNorth Carolina州立大学のマイコプラズマ研究所、獣医学カレッジから入手した。M.gallisepticumのF菌株は生ワクチンとして養鶏業者で使われている。15％の豚の血清（FMS）を追加したFrey’s媒体40mLに1.33mLの細菌培養液を接種した。得られた混合物は次に約18時間37℃で培養し、増殖した培養液を80/20の比率で滅菌グリセロールと混合し、−70℃で凍結した。この混合物の無菌性はTrypticase Soy Agar（TSA）でテストし、その結果一切他の有機体が増殖していなかった。−70℃で24時間経たM.gallisepticum菌株F保存培養液を滴定したところ、CFU/mLは5.8×10（8）であった。
M.gallisepticum菌株Rの抗血清をNCSUのマイコプラズマ研究所から購入した。抗血清は、アジュバント内で、不活性化したM.gallisepticum菌株Rでニュージーランド白兎を超免疫化することにより得られた。兎は血液を採取する前に3回筋肉内注射及び皮内注射により免疫化した。この抗血清をMGAとする。
例  15
M.gallisepticum菌株Fに対するMGAの増殖抑制効果
この実験では、異なった量のMGAと有機体を混合した後の一定量のM.gallisepticum菌株Fの経時的な増殖をしらべた。MGAのサンプルを最初1：10の比率でりん酸塩緩衝生理食塩（PBS）で希釈した。次に0.5mLのPBSに0.5mLの前の希釈液を加えて、10回連続して1：2希釈することにより（希釈率1：20から1：10240）、抗血清をさらに希釈した。M.gallisepticumのF菌株保存培養液のバイアルを室温で解凍して1：100に希釈した。この10（-2）保存溶液は5.8×10（6）のCFU/mLを含有していた。11種のMGA希釈液各0.4mLに5.8×10（6）保存溶液0.4mLを加えて細菌―抗体複合体を生成した。これらの複合体を30分間室温で反応させた。12番目の処置液は0.4mLのPBSを0.4mLの同じ細菌の保存溶液に加えたものからなる。
30分の反応後、12個の処置液はFMSで10（-1）から10（-8）まで順に希釈した。これらの試験管を14日間培養して、増殖を41時間、47.5時間及び14日目に測定した（M.gallisepticumの増殖の測定はFMS中で変色により調べた。細菌が増殖すると、媒体のpHが減少し、pH指示薬フェノールレッドの色が変わる。増殖が起きると、色は次第に深い赤からオレンジ色にかわり、最後に黄色になる。増殖の程度は媒体の色によって評価することができる）。結果を表15に示す。
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14日目までには12の処置液すべてに増殖が見られた（表１）。MGAの含有量が最も高いレベルである１群から４群で増殖は遅れた。MGAの含有量が少なめの群では増殖が早く明らかになったが、これらの群の増殖は明らかではなかった。これらの知見はMGAの含有量が多いと細菌に対する増殖抑制効果があるということを示している。
例  16
M.gallisepticumに対するMGAの増殖抑制効果
M.gallisepticum菌株F保存液のバイアルを解凍してFMSで1：100に希釈した。この10（-2）希釈液は約5×10（6）CFU/mLを含有していた。よく混合した後、希釈管８本のそれぞれにこの10（-2）保存溶液を1mLづつ入れた。一定量のMGAを各管に添加して（表16参照）細菌/抗体複合体を混合し、室温で１５分間、次に37℃で培養した。FMS増殖媒体における色変を標識として１３日間にわたって増殖を測定した。結果を表16に示す。
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抗体を含有しない管で培養した場合最初の27時間内にM.gallisepticumの中程度の増殖が起こり、37℃で46時間培養すると増殖はかなりの量になった（表16）。1.5μL以上のMGAを含有する管で培養すると最初の27時間の培養では細菌の増殖はみられなかった。46時間培養すると、MGAを12μL、24μL及び48μL含有する管ではそれぞれ増殖はまだみられなかった。37℃で13日培養すると、どの管でもM.gallisepticumの大量の増殖が見られた。これらの結果は、どの管にも細菌は存在するが、抗血清の量が少ないよりも、抗血清の量が多いほど、より長い間増殖を遅らすということがわかる。増殖が観察される時間は、細菌-抗血清複合体におけるMGAの量に直接比例しているようである。
例  17
M.gallisepticum−MGA複合体の孵化率に対する効果
孵卵後18日目に９つの群の卵に接種を行った。これらの群のうち、７群に７種類のM.gallisepticum菌株F-MGA複合体のうちの一つを接種した。１群には細菌のみを接種し、もう１群にはFMSをPBSで1：4に希釈したものを接種した。
M.gallisepticum菌株F保存液のバイアルを解凍して、10％FMSと90％PBSからなる希釈剤で1：5及び1：10に希釈した。適切量のこれらの希釈液を細菌−MGA複合体生成のために用いた。１群以外のそれぞれの群の各卵に、同量のM.gallisepticum CFUと適切量の抗血清を含有する0.1mLの注射液を投与した。１群の卵には、FMS/PBS希釈剤を0.1mL投与した。複合体は接種前に10分間反応させた。次に卵を孵化するまで孵卵した。
10（-9）までの３連続希釈系を作成し２希釈系のうちの10（-6）希釈液をTSA上に置き37℃で培養して、細菌保存液の1：10希釈液を滴定した。３連続希釈系の管はすべてM.gallisepticumの増殖を示した。滴定量は8×10（8）CFU/mLであった。孵化率の結果は表17に示す。
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MGA−M.gallisepticum複合体は孵化率及びニワトリの健康状態に影響を及ぼした。孵化率が90％以上を示した群は、CFUに対してMGAの比率が最も高い群であった（４群は例外）。抗血清の量が少ないMGA-細菌複合体製剤を投与された群と比較して、２群と３群の健康な状態のニワトリのパーセンテージはかなり高かった。これらの知見は、MGAと細菌の比率が特定の比率である場合は、細菌の病原的効果を遅らす及び/又は減らすことによって、成長しているニワトリの胚を防御する能力を有することを示している。
例  18
M.gallisepticum菌株F/抗体複合体ワクチン
16個の生きている卵からなる６つの群に孵卵１８日目に接種した。陰性対照群（６群）の16個の卵には、0.1mLの希釈剤（PBS９部にFMS１部）を18日目に接種し、他に卵がはいっていない大きい孵卵器で孵化させた。
菌株F保存液のバイアルを室温で解凍し、1：5に希釈した（保存液２）。保存液２の滴定の結果、保存液２は7×10（7）のCFU/mLを含有していることがわかった。保存液２を0.9mLずつに小分けして、MGA0、5、10、20又は40μLとあわせた。混合後、細菌−MGA製剤を室温で15分間培養した。これらの細菌−MGA複合体を0.1mLづつ各群の卵に投与した。１群の卵は細菌のみを含有している接種液を投与された。16個の卵からなる各群を孵化の日までそれぞれ小さな孵卵器においた。MGA−M.gallisepticum製剤テストCFUを表18に示す。
残った保存液２の希釈液を、FMSを用いて、10（-9）まで３連続10倍希釈液に滴定した。各系の10（-4）、10（-5）及び10（-6）希釈管をプレートに置き、それを４枚作成して、FMS寒天上に置き、9日間37℃で培養した。
孵化の日、1群から5群に処置を加えた。正常な健康状態のよいニワトリを選び、後鼻孔裂を滅菌した綿棒でふき1.8mLのFMSを含有する管に接種することによりM.gallisepticumが存在しているかどうか調べた。ニワトリの処置をした後、各群のサンプルのニワトリをP2封じ込め室に入れた。各群を別々の保育ケージにいれて、それぞれのケージは接触させなかった。
賦形剤のみからなる対照群6のニワトリは孵化が遅れたので、1群から5群が孵化した次の日に処置した。10羽の対照の鳥をM.gallisepticumの存在を調べるために綿棒でふき、それぞれP2封じ込め室の保育ケージに入れた。孵化後21日目に、生き残っているニワトリすべてから血液を採取し、血清プレート凝集法（SPA）とELISAによりM.gallisepticum抗体を測定するために血清を集めた。結果を表18に示す。
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抗血清を含まない細菌を投与された卵（1群）及び、少ない量のMGAとM.gallisepticumからなる２つの群（2及び3群）で孵化率が低く、正常な鳥が孵化しなかった。賦形剤からなる対照群（6群）は孵化が遅れ、孵化率も予想より低かった。これは、2000個の卵を孵卵するための大き目の孵卵器で卵を孵卵したせいかもしれない。この孵卵器の問題を除けば、10羽のニワトリは健康でM.gallisepticum単離試験及び２種類の血清抗体試験において陰性の結果を示した。4と5群は1、2、3群と比較して、孵化率と正常孵化率とも、かなりよい結果を示した。これら二つの群の卵はMGAを多量に投与され、5群（3.5×10（6）CFU+40μL MGA）はすべての群のなかで最高の孵化率を示した。血清を採取する段階で生きているすべての鳥は健康であった。SPAテスト及びELISAで測定したM.gallisepticumへの抗体応答は、3、4、5群の鳥に対して、M.gallisepticum菌株F複合体ワクチンが有効であることを示した。
5群の鳥のうちの一羽が孵化の際のM.gallisepticum再単離、SPAテスト及びELISAに陰性を示したことは興味深い。それ以外の3、4、5群の鳥はすべて各場合に陽性であった。つまり、5群の一羽の鳥は決して感染しなかったと考えられる。
例14−18は細菌-抗体ワクチン複合体の有用性をテストするために行われた。生きた細菌に特定の抗血清（ワクチンの細菌に特異である）を適切な比率で添加すると、細菌の病原的効果を減じる又は遅らせることによってニワトリの胚を防御すると共に、体液の免疫活性応答に明らかなように、孵化の際に効果的な免疫応答を発達させることができるいう考えが、これら表のデータにより裏付けられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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