(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）又は（b）のタンパク質をコードする遺伝子。
（a）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（c）又は（d）のDNAを含む遺伝子。
（c）配列番号１で表される塩基配列からなるDNA
（d）配列番号１で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヘリカーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項３】
請求項１又は２記載の遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする、請求項１又は２記載の遺伝子の少なくとも一部由来の配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
請求項１又は２記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からヘリカーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする前記タンパク質の製造方法。
【請求項７】
以下の（a）又は（b）の組換えタンパク質。
（a）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質
【請求項８】
請求項７記載のタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項７記載のタンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項７記載のタンパク質で免疫された抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることにより得られる、請求項８記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１１】
請求項３記載のオリゴヌクレオチドプローブを含む、ヘリカーゼをコードする遺伝子の検出用試薬。
【請求項１２】
請求項１又は２記載の遺伝子の機能が失われるように処理されたノックアウトマウス。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該タンパク質の製造方法、並びに該タンパク質及び該遺伝子の用途に関する。
背景技術
DNAヘリカーゼは、生体内又は微生物細胞中に於いてDNAが関与する各種の生物反応に作用する重要な酵素であり、その種類も多い。
DNAヘリカーゼが多種類にわたって存在することは、DNAが関与する反応が細胞の複製及び増殖、個体の発生及び成長、さらに生命維持など多岐にわたることから明らかである。これまでに判っている細胞レベルでの生化学反応としては、DNAの複製（replication）、修復（repairing）、転写（transcription）、DNAの分離（segregation）及び解合（recombination）の少なくとも５種類が想定されている。一般的に、DNAヘリカーゼの作用は二本鎖DNAを一本鎖DNAに分別することが知られており、この作用に必要なエネルギーはATPの加水分解により得られていると考えられている。
数あるDNAヘリカーゼの中でも、最近、RecQタイプのDNAヘリカーゼ（大腸菌recQ遺伝子のヘリカーゼドメインとアミノ酸レベルで約40％以上の相同性を示すヘリカーゼドメインを有するヘリカーゼ）が見出され、ヒトの病気及び老化現象と関連するという観点から注目が集まっている。例えば、ブルーム症候群は若年で種々の癌を多発する疾患であり、ウエルナー症候群は早老と異常癌を誘発する遺伝性疾患である。最近これらの疾患の原因が、それぞれ異なるヒトRecQタイプのDNAヘリカーゼをコードする遺伝子の変異によることが明らかにされた（Cell,83,pp655-666（1995）及びScience,272,pp258-262（1996））。
RecQタイプヘリカーゼは、元来、中山等（Mol.Gen.Genet.,195,pp474-480（1984））により大腸菌中に於いて発見されたものであるが、このヘリカーゼに高い相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、酵母とヒト癌細胞中に発見され、それぞれsgs1（Gangloff et al.,Mol.Cell.Biol.14,pp8391-8398（1994））及びRecQ1（Seki et al.,Nuc.Acids Res.22,pp4566-4573（1994））と命名された。
大腸菌や酵母のような単一細胞生命体に於いては、このファミリーに属するヘリカーゼとしては、最初に見出された大腸菌RecQヘリカーゼ及びsgs1の各一種類であるが、多細胞からなるヒトに於いては、前述した疾患に関連するブルームDNAヘリカーゼ（Ellis et al.,Cell,83,pp655-666（1995））及びウエルナーDNAヘリカーゼ（Yu et al.,Science,272,pp258-262（1996））の二種類、並びにいまだ疾患との関連が見出されていないRecQ1ヘリカーゼの合計３種類がこれまでに知られている。
発明の開示
本発明は、ヒトRecQ4型DNAヘリカーゼ遺伝子及び該遺伝子がコードするタンパク質、該タンパク質の製造方法、並びに該タンパク質及び該遺伝子の用途を提供することを目的とする。
本発明者らは、RecQファミリーに属するDNAヘリカーゼが、ヒトに於いては前記３種類のほかにも多数存在するのではないかと考えた。そして、それらの遺伝子が変異を受けた時、ブルーム症候群やウエルナー症候群の例に於いて見られたように、各種疾患を誘発し、いまだ原因不明となっている難病の原因遺伝子となっているのではないかと考察した。そして、本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、いわゆるRACE法により、新たにヒトRecQ4型DNAヘリカーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（a）又は（b）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（a）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質
さらに、本発明は、以下の（c）又は（d）のDNAを含む遺伝子である。
（c）配列番号１で表される塩基配列からなるDNA
（d）配列番号１で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヘリカーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
さらに、本発明は、前記遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブである。
さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクターである。
さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体である。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からヘリカーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする前記タンパク質の製造方法である。
さらに、本発明は、以下の（a）又は（b）の組換えタンパク質である。
（a）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質
さらに、本発明は、前記タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％のホモロジーを有するアミノ酸配列を含む、マウス又はラット由来のヘリカーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするマウス又はラット由来の遺伝子である。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からヘリカーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする前記タンパク質の製造方法である。
さらに、本発明は、前記タンパク質と特異的に反応するモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体である。
さらに、本発明は、前記タンパク質で免疫された抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることにより得られる、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
さらに、本発明は、前記オリゴヌクレオチドプローブを含む、ヘリカーゼをコードする遺伝子の検出用試薬である。
さらに、本発明は、前記タンパク質、並びに前記モノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を含む、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子異常により引き起こされる疾患の診断用キットである。
さらに、本発明は、前記遺伝子の発現レベルを上昇又は下降するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物、及び前記遺伝子の機能が失われるように処理されたノックアウトマウスである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明により明らかになった遺伝子は、新規ヒトRecQ4型DNAヘリカーゼをコードするものであり、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、付加したアミノ酸配列を含み、かつヘリカーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである。
本発明のタンパク質は、図２に示すように、これまで知られているRecQ型DNAヘリカーゼにおいて、アミノ酸レベルでは、大腸菌、酵母及びヒトとの間で良く保存された７つのヘリカーゼ・モチーフを含む。また、図３に示すラジエーションハイブッリドマッピングの結果から明白なように、本発明のヒトRecQ型DNAヘリカーゼ遺伝子は、図４に示すヒト第８染色体の長腕、8q24.3に存在することが確認された。なお、本発明のヒト由来の遺伝子に相当する他種生物由来の遺伝子は、公知技術によりクローニングすることが可能である。
本発明の遺伝子が各種臓器に於てどのように発現しているかを調べる多組織（Multi-Tissue）ノーザンブロットによる解析結果（図５）から、当該遺伝子は、全ての組織において発現し、特に、胸腺及び精巣において著しく強く発現してることが認められた。
以上の結果を総合すると、本発明の遺伝子は、生体の基本的な恒常性の維持に関わる遺伝子の一つであることが強く示唆される。従って、本発明の遺伝子は、発育及び老化との関連を解明するための研究に有用であると共に、この遺伝子の発現制御の解明は、生体の恒常性維持を司るメカニズムを解明するうえでも有用であり、また、生命の基本的な恒常性を維持するための新規医薬品の創製にも有用である。
本発明の遺伝子は、例えば以下のようにして同定し取得することができる。
１．ヒトRecQ型DNAヘリカーゼ遺伝子のクローニング。
本発明の遺伝子（ヒトRecQ4型遺伝子、又はヒトRecQ型DNAヘリカーゼ遺伝子ともいう）は、Long-distance（LD）PCR法及びSuppression PCR法の２つの原理に基づいてRACE［Rapid Amplification of cDNA Ends; Frohman,M.A. et al., Methods Enzymol.Vol.218, pp340-358（1993）］を行うことにより得ることができる。
すなわち、本発明のヒトRecQ型DNAヘリカーゼ遺伝子は、既知の部分配列を有するＤＮＡ断片と、５’及び３’末端を有するが配列が未知のDNA断片とを増幅し、さらに、これらのDNA断片の融合により、完全長のcDNAとして得ることができる。本発明では、完全長のcDNAのクローニングは、例えば市販のキット（MarathonTM cDNA Amplification Kit; CLONETECH社）を用いて行うことができる。
まず、ヒト由来の既知配列を有するDNA断片を増幅する。既知配列は、ヒト組織又は器官由来のpoly（A）+ RNA、例えばヒト精巣又は脾臓由来のpoly（A）+RNAから得ることができる。すなわち、該RNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、RT-PCRにより部分cDNA断片を調製する（図１（1））。次に、得られた部分cDNA断片の配列を決定した後、該部分cDNAの配列を基に４種類の遺伝子特異的プライマー（GSP）を設計する（5’GSP1及び5’GSP2並びに3’GSP1及び3’GSP2という）。GSPは、当該部分cDNA配列より5’側及び3’側の領域に存在するDNA断片であって配列が未知のDNA断片を増幅するために必要とされるプライマーである。GSPの配列は、当該部分cDNA配列から任意に選択することができ、その配列は化学合成により得ることができる。本発明では、当該部分cDNAよりも5’側の未知配列を増幅する際に使用するGSPを5’GSP1及び5’GSP2、また3’側の未知配列を増幅する際に使用するGSPを3’GSP1及び3’GSP2とする（図１（1）の枠囲み部分）。
次に、部分cDNAよりも5’側及び3’側のDNA断片を増幅する（図１（2））。鋳型としては、市販のヒト精巣、脾臓等の由来のcDNA［例えば、CLONETECH社のcDNA ReadyTM］を用いることができる。この鋳型となるDNA断片の配列は未知であるが、各DNA断片の末端にはアダプター配列が付加されている。そこで、アダプター配列にハイブリダイズするプライマー［アダプタープライマー（AP）という］及び前記GSPをプライマーとして用いて、アダプターが連結された、配列が未知のcDNA断片の増幅反応（LD PCR）を２回行う（図１（2））。例えば、5’側の未知配列を増幅するために、まずAP1及び5’GSP1を用いてPCRを行い、得られた断片を鋳型として、次は前記AP1及び5’GSP1の位置よりも内側の領域にハイブリダイズすることができるプライマー（AP2及び5’GSP2）を用いてPCRを行う（nested PCR）。3’側の未知配列も、3’GSP1及び3’GSP2を用いて5’側の未知配列を増幅したと同様に増幅することができる。
本発明では、前記既知の部分配列の断片の位置を基準として、その既知配列よりも上流に位置するDNA断片を5’-RACE産物、下流に位置するDNA断片を3’-RACE産物とする。なお、APはアダプターの突出末端と同じ配列を持つため、アダプターにはアニーリングせず、一回目の増幅では、遺伝子特異的プライマー（GSP）からのみ伸長する（これをSuppression PCRという）。
得られたcDNAの塩基配列の決定は、Hattoriら［Electrophoresis 13,pp560-565（1992）］により記載されたPCRをベースにした方法により行う。すなわち、Perkin Elmer社製の蛍光ダイデオキシターミネーターを含有するPRISMシークエンシングキットを使って反応を行い、Applied Biosystem社製のオートシークエンサー（モデルABI 373）で塩基配列を読み取り、附属のコンピューター（例えばMacintoshコンピューター）によりデータの解析を行う。
上記のようにして得られた既知の部分配列、5’-RACE産物及び3’-RACE産物の塩基配列からアセンブリにより全長cDNAの塩基配列を得ることができる。すなわち、各塩基配列間でオーバーラップしている部分を繋げて5’及び3’部分を含む塩基配列を得ることができる（図１）。
配列番号１に本発明の遺伝子の塩基配列を、配列番号２に該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示すが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質がヘリカーゼ活性を有する限り、当該タンパク質に含まれるアミノ酸配列、又は当該遺伝子の塩基配列に欠失、置換、付加、挿入等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜10個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。従って、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１番目のメチオニン（Met）が欠失しているものなども、このアミノ酸配列の変化によるタンパク質に含まれる。また、本発明のタンパク質に含まれるアミノ酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のタンパク質をコードする縮重異性体も本発明の遺伝子に含まれる。
さらに、本発明は、配列番号１で表される塩基配列からなるDNAを含む遺伝子のほか、該DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヘリカーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む遺伝子も、本発明の遺伝子に含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が15〜60mM、好ましくは15〜30mMであり、温度が55〜70℃、好ましくは60〜70℃での条件をいう。
なお、上記変異の導入は、公知のいずれかの手法により行うことができ、例えば点突然変異導入キット（例えば宝酒造社製のTAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis Kit）等を用いることにより行うことができる。
また、前記タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％のホモロジーを有するアミノ酸配列を含むタンパク質も、本発明のタンパク質に含まれ、そのタンパク質をコードする遺伝子も、本発明の遺伝子に含まれる。このタンパク質及び遺伝子としては、例えばマウス又はラット由来のものが挙げられる。
塩基配列が一旦決定されると、その後は、化学合成によって、又は決定された当該塩基配列から合成したプライマー（例えば配列番号35及び36）を用いたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、所望の遺伝子を得ることができる。
２．組換えベクター及び形質転換体の作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに遺伝子を組み込むことにより作製することができる。また、本発明の形質転換体は、本発明の組み換え体DNAを、該組換えベクターを作製する際に用いたベクターに適合する宿主中に導入することにより得ることができる。
精製された遺伝子を、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して組換えベクターを作製し、当該組換えベクターを用いて、宿主細胞を形質転換する。
DNA断片を挿入するためのベクターDNAは、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。プラスミドDNAとしては、例えばプラスミドpUC118（宝酒造社製）、pUC119（宝酒造社製）、pBluescript SK+（Stratagene社製）、pGEM-T（Promega社製）等が挙げられ、ファージDNAとしては、例えばM13mp18、M13mp19等が挙げられる。
宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、真核細胞及び原核細胞のいずれをも用いることができる。例えば、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞などが挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の組換えベクターが該宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、本発明のDNA、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。例えば、大腸菌としてはXL1-Blue（Stratagene社製）、JM109（宝酒造社製）等が挙げられ、発現ベクターとしては、例えばpBTrp2等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。
本発明では、形質転換は、例えばHanahanの方法［Techniques for Transformation of E. coli In DNA Cloning, vol.1, Glover,D.M.（ed.）,pp109-136, IRL Press（1985）］により行うことができる。
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばYEp13、YCp50等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばgal 1プロモーター、gal 10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法［Methods. Enzymol., 194, pp182-187（1990）］、スフェロプラスト法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp1929-1933（1978）］、酢酸リチウム法［J. Bacteriol.,153, 163-168（1983）］等が挙げられる。
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpcDNAI、pcDNAI/Amp（インビトロジェン社）等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法等が挙げられる。
ベクターDNAとしてプラスミドDNAを用いる場合、例えばEcoRI DNA断片を挿入する際、プラスミドDNAを制限酵素EcoRI（NEB社製）を用いて消化しておく。次いで、DNA断片と切断されたベクターDNAとを混合し、これに、例えばT4 DNAリガーゼ（宝酒造社製）を作用させて組換えベクターを得る。
上記形質転換株のスクリーニングは、目的遺伝子の一部を含むDNA断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーション、あるいは、目的の遺伝子の塩基配列に基づいた5’プライマー（FP; forward primer）を合成し、次いで、相補鎖DNAの塩基配列に基づいた3’プライマー（RP; reverse primer）を合成し、これらのプライマーを用いたPCR法により、目的とする遺伝子を含むコロニーを選択することができる。
３．ヒトRecQ4型遺伝子がコードするタンパク質（ポリペプチド）の生産
前記のようにして得られた組換えベクターを保有する形質転換体を培養すれば、本発明のタンパク質を生産することができる。培養方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好ましい。
形質転換体を培養する培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス等から選ばれる１種以上の窒素源に、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、抗生物質、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。また、必要により培地にIPTG等を添加して、遺伝子の発現を誘導してもよい。培養開始時の培地のpHは7.2〜7.4に調節し、培養は通常36〜38℃、好ましくは37℃前後で14〜20時間、通気撹拌培養、振盪培養等により行う。
培養終了後、培養物より本発明のタンパク質を採取するには、通常のタンパク質精製手段を用いることができる。
すなわち、リゾチーム等の酵素を用いた溶菌処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により菌体を破壊し、本発明の遺伝子がコードするタンパク質を菌体外に排出させる。次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去し、粗タンパク質溶液を得る。
上記粗タンパク質溶液から、該タンパク質をさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を使用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせることにより行う。
４．モノクローナル抗体の作製
本発明のヒトRecQ4型遺伝子がコードするタンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、以下のようにして得ることができる。
（1）抗原の調製
前記３の方法により得られたタンパク質を緩衝液に溶解し、次いでアジュバントを添加する。アジュバントとしては、市販のフロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
（2）免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた免疫原を哺乳動物、例えばラット、マウスなどに投与する。抗原の免疫量は１回に動物１匹当たり、10〜500μg用いる。免疫部位は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入する。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜３週間間隔で、２〜５回、好ましくは３〜４回免疫する。最終の免疫日から２〜７日後、好ましくは４〜５日後に、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
（3）細胞融合
抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地（HAT培地：ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、P3U-1（大日本製薬社製）、P3x63Ag8.653などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞１に対して抗体産生細胞100〜500の割合、例えば108細胞/mlの抗体産生細胞と２×105細胞/mlのミエローマ細胞とを等容量混合し、融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合を促進させるためには、平均分子量1,500ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
（4）ハイブリドーマの選択及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に５〜10細胞/ウェル程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、約14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（EIA; enzyme immuno assay）、RIA（radio immuno assay）等によってスクリーニングを行うことができる。
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
（5）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等が採用できる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば37℃，５％CO2濃度）で10〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約５×106個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水または血清を採集する。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
５．ポリクローナル抗体の作製
（1）抗原の調製
前記３の方法により得られたタンパク質を緩衝液に溶解し、次いでアジュバントを添加する。アジュバントとしては市販のフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバントを用いる。
（2）免疫
動物としては、通常、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジなどを用いる。ウサギを例にとると、ウサギの足蹠に、通常100μgから500μgのタンパク質をフロイント完全アジュバントとともに皮下注射する。二週間後に同量の抗原をフロイント不完全アジュバントと混合して筋肉内注射をする。さらに二週間後に筋肉内注射を繰り返し、最終免疫の一週間後に耳より部分採血してEIA法等により抗体価を測定する。抗体価が目的の値に達していれば全採血し、抗体価が低ければ筋肉内注射を繰り返し、抗体価が目的の値に達するまで免疫を繰り返す。血清から硫安分画による抗体の精製は、モノクローナル抗体の項で述べた方法を採用できる。
６．ヒトRecQ4型遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質の検出用試薬
ヒトRecQ4型遺伝子は、染色体の不安定性を生じ、高頻度発ガンや早老症を引き起こすブルーム症候群やウェルナー症候群の原因遺伝子と高い相同性を有し（図２）、かつ、ヒトのさまざまな組織において高い発現が認められたことから（図５）、生体の基本的な恒常性の維持に関わるDNAヘリカーゼをコードしている遺伝子の一つであるといえる。従って、この遺伝子の発現制御の解明は、生体の恒常性維持を司るメカニズムを解明するうえで有用であり、また、生体の基本的な恒常性を維持するための新規医薬品の創製にも有用であると共に、老化との関連を解明するための研究にも有用である。そして、本発明の試薬は、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の異常により引き起こされる疾患、例えばブルーム症候群やウェルナー症候群（これらに限定されるものではない）の検出、診断に有用である。
本発明の遺伝子を検出用試薬として使用する場合は、クローニングされたヒトRecQ4遺伝子の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイセーションを行い、サザン又はノーザンブロット法により検出が行われる。なお、オリゴヌクレオチドプローブとしては、DNAプローブ、RNAプローブ等が挙げられる。
また、本発明の遺伝子をコードするタンパク質に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を検出用試薬として使用する場合は、EIA、RIA又はウエスタンブロット解析により検出が行われる。
７．遺伝子の発現レベルを上昇又は下降するように修飾された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物
本発明においては、遺伝子の発現を正常に調節しているいくつかの重要な部位（エンハンサー、プロモーター、イントロン等）の一部に欠失、置換、付加、挿入等の変異を起こさせることにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較して人工的に上昇又は下降するように修飾することができる。
上記変異の導入は、公知のいずれかの手法により行うことができ、例えば、点突然変異導入キット（例えば宝酒造社のTAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis kit）等を用いることができる。トランスジェニック動物としては、例えばトランスジェニックマウス、トランスジェニックラット等が挙げられる。前記変異を導入した遺伝子を保有するベクターとしては、各動物種RecQ4型遺伝子を過剰発現させるようなベクター、逆にその発現を抑制するようなアンチセンスのベクターの二つが考えられる。いずれの場合にも、遺伝子の選択のためのポジティブ選別用の薬剤（例えば、ネオマイシンなど）耐性遺伝子を連結させておく。
細胞への遺伝子の導入は、受精卵に直接DNAを注入する方法も使用し得るが、ES細胞は、培養が可能でしかもこの細胞からマウス等を発生させることができるという利点を有しているため、各種ES細胞を用いる方法がより効率的で好ましい。ES細胞としては、例えばTT2細胞が挙げられる（相沢慎一，ジーンターゲッティング，1995年，羊土社）。そして、例えばマウスRecQ4型遺伝子を含む上記ベクターDNAをエレクトロポレーションによりES細胞へ導入し、ネオマイシンでポジティブ選別し、目的の変異ES細胞を得る。上記ES細胞を、胚胎盤胞又は８細胞期胚に毛細管等を用いて注入する。その後、胚胎盤胞又は８細胞期胚を直接仮親の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを仮親の子宮に移植する。仮親から生まれた子のうちキメラ動物を選ぶ。キメラの寄与率が高い動物は、生殖系列の可能性が高いが、キメラ動物を正常動物と交配することにより、生殖系列のキメラ動物であることの確認が可能である。生殖系列のキメラ動物と正常動物との交配により、ヘテロ接合体動物が得られ、ヘテロ接合体同士の交配によりホモ接合体動物を得ることができる。
８．ノックアウトマウス
本発明のノックアウトマウスは、マウスRecQ4遺伝子の機能が失われるように処理されたものである。その処理方法について説明する。
マウスRecQ4遺伝子を含むゲノムDNAを、マウスES細胞から調製したゲノムDNAからPCRにより、又はゲノムライブラリーから得、そのいずれかのエクソンの中にneo耐性遺伝子を挿入したベクターを構築する。この操作により、このエクソンの機能は破壊される。これと同時に、このベクターの中にネガティブ選別用のチミジンキナーゼ（tk）遺伝子又はジフテリア（DT）毒素遺伝子を繋げておく。エレクトロポレーションにより該ベクターDNAをES細胞に導入する。次に、この細胞をポジティブ選別用のネオマイシン及びネガティブ選別用の核酸類似体FIAU（fluoroiodoadenosyluracil）、又はジフテリア毒素の存在下で培養する。この操作により非相同組換えを起こしたジフテリア毒素感受性細胞、及び組換えを全く起こさないG418感受性細胞が除去され、相同組換えを起こした細胞のみが残る。この細胞では、破壊されたエクソンを含む遺伝子がノックアウトされる。得られた細胞をマウスの胚胎盤胞又は８細胞期胚に注入する。その後は、トランスジェニック動物の作製と同様の手法により、ノックアウトマウスを作製することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の遺伝子のクローニング手法を示す図である。
図２は、ヒトRecQ4型遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列について、他の遺伝子由来のものと相同性の比較をした図である。
図３は、ヒトRecQ4型遺伝子のヒト第８番染色体上の位置を示すラジエーションマッピング分析を示す図である。
図４は、ヒト第８番染色体を示す図である。
図５は、ヒトRecQ4型遺伝子のノーザンブロットによる解析結果を示す電気泳動写真である。
図６は、EST-DNA ACC.H16879によりコードされるアミノ酸配列について、大腸菌由来のものと相同性の比較をした図である。
図７は、本発明の遺伝子のアセンブリを示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕全長ヒトRecQ4cDNAのクローニング
（1）大腸菌RecQ4 DNAヘリカーゼに相同性を有するcDNA断片の同定。
まず、本発明のDNAをクローニングするにあたり、大腸菌RecQヘリカーゼに相同性を有するcDNA配列をdbestデーターベースで探索した。この結果、EST-DNA ACC.H16879（図６，H16879のアミノ酸配列をコードするDNA）を含む十数種のEST（Expessed Sequence Tag）DNA配列が得られた。但し、これらのESTと、ヒト以外の例えば大腸菌、酵母、線虫等の生物種由来のEST-DNAとのヌクレオチド配列に於ける相同性、あるいは前記ESTと、ヒト由来のすでに知られているブルーム病ヘリカーゼ、ウエルナー病ヘリカーゼ及びRecQ1ヘリカーゼの各遺伝子とのヌクレオチド配列に於ける相同性を考慮し、これらの遺伝子と相同性の高いEST-DNAについては除外した。
（2）EST-DNA ACC.H16879がヒト組織で発現している遺伝子であることの確認
次に、EST-DNA ACC.H16879の配列が真にヒト組織において発現している遺伝子であることを確認する一連の予備実験を行った。即ち、EST-DNA断片に含まれる塩基配列からPCR（Polymerase Chain Reaction）用のプライマーとしてセンスプライマー（配列番号３）及びアンチセンスプライマー（配列番号４）を用意した。一方ではヒト精巣由来のmRNAから逆転写反応によりcDNAを作製し、先に調製したプライマーを用いてPCRを行い、ヒト精巣cDNA中にEST-DNAが存在するか否かを確認した。
すなわち、（3-i）に後述された方法でRT-PCRを行い、EST-DNA ACC.H16879の配列から予想される約320塩基対のPCR産物を検出することができた。
PCRによる当該EST-DNA配列の有無は、PCRによって増幅されたDNA断片を大腸菌のプラスミドDNA中に組み込みクローン化し、得られたプラスミドクローンDNAの塩基配列を分析することによっても確認された。このようにして、EST-DNA ACC.H16879が新規ヘリカーゼ遺伝子の一部であることを確認した（方法は、後述の（3-ii）及び（3-iii）を参照）。
（3）RT-PCRによるヒトRecQ4型遺伝子の部分cDNA断片のクローニング
（3-i）逆転写によるcDNAの調製及び増幅
ヒト精巣由来のPoly（A）+ RNA（CLONETECH社）約１μg、ジチオスレイトール、dNTP（dATP，dCTP，dGTP及びdTTP）、逆転写酵素用バッファー及び逆転写酵素Super Sucript IIを含む反応液を、42℃で30分反応させ、その後RNase処理をしてcDNAを調製した。このcDNAをテンプレートとしてPCRを行った。
PCRには宝酒造社製のTAKARA Taq及びこれに添付のバッファーを用いた。後述されるTaq DNAポリメラーゼ及びPCRバッファーは、特別の指定がない限りTAKARA Taq及びこれに添付のバッファーをそれぞれ指すものとする、PCRは、１×PCRバッファー、0.2mM dNTP、0.4μM RecQ4プライマー（配列番号３及び４）及び0.625unit Taq DNAポリメラーゼを含む溶液に、適当量の上記ヒト精巣cDNAを加えた25μlの混合反応液中で行った。
まず、上記反応液を94℃で５分反応させ、次に、94℃で30秒、55℃で30秒及び72℃で１分の反応を１サイクルとしてこれを35サイクル行った。得られた反応液をさらに72℃で５分反応させた。
（3-ii）塩基配列決定のためのRT-PCR産物のサブクローニング
上記（3-i）で得られたRT-PCR産物、T4 DNAリガーゼ（宝酒造社製）、バッファー（宝酒造社製）及びpGEM-Tベクター（Promega社製）を含む溶液を15℃で３時間反応させて、RT-PCR産物の断片をpGEM-Tベクターに組み込んだ。このベクターで大腸菌JM109をトランスフォームさせ、この大腸菌を、X-gal、IPTG及びアンピシリン（最終濃度50μg/ml）を含むLBバクトアガープレートに播き、37℃で12時間インキュベートした。出現した白色の大腸菌コロニーについて、アンピシリン（最終濃度50μg/ml）を含むLB培地で、37℃で16時間以上振盪培養し、Kurabo社製のロボット（PI-100Σ）を用いてプラスミドDNAを調製した。
10μg/ml RNaseを含むdH2O 100μlにプラスミドDNAを溶解し、DNAシークエンス用の試料とした。
（3-iii）塩基配列の決定
上記（3-ii）で調製したプラスミドDNAを鋳型DNAとして、非標識プライマー、４種類の蛍光標識ヌクレオチド-5’-トリフォスフェイト及びTaqポリメラーゼを加えた反応系でPCRを行った。反応混合液は以下の通りである。
0004113920.tif 000002
なお、塩基配列決定用プライマーとして、配列番号５〜19に示すものを用いた。
PCRは、96℃で30秒（変性）、55℃で15秒（アニーリング）及び60℃で４分（伸長）の反応を１サイクルとしてこれを25サイクル行った。この反応では、無作為に蛍光色素の入ったDNA断片が合成され、それをシークエンサーで解析することで、最終的には連続した塩基配列を決定することができる。PCR反応物の解析は、Applied Biosystem社製の自動DNAシークエンサー（model ABI373）により行った。得られたヒトRecQ4部分cDNAの塩基配列を配列番号31に示す。
（4）Marathon cDNA Amplification kitを用いたヒトRecQ4遺伝子の５’及び３’領域のクローニング
前記（3）により得られたRecQ4部分cDNA断片の塩基配列を基にして、５’及び３’領域のクローニングを、Marathon cDNA Amplification kit（CLONTECH社）を用いて行った。まず５’RACE産物を増幅するため、Marathon Ready精巣cDNAを鋳型として、アダプター配列特異的なプライマーAP1（配列番号20）と、RecQ4部分cDNA断片に特異的なプライマー5’GSP1（配列番号22）とを用いて１回目のPCRを行った。PCRの反応混合液は以下の通りである。
0004113920.tif 000003
PCRは、94℃で１分で変性し、94℃で30秒（変性）、72℃で４分（アニーリング及び伸長）の反応を１サイクルとしてこれを５サイクル、次に94℃で30秒（変性）、70℃で４分（アニーリング及び伸長）の反応を１サイクルとしてこれを５サイクル、さらに94℃で30秒（変性）、68℃で４分（アニーリング及び伸長）の反応を１サイクルとしてこれを25サイクル行った。
この反応液を希釈したものを鋳型として、更に内側のプライマー、即ち、AP2（配列番号21）と5’GSP2（配列番号23）を用いた２回目のPCRを行った。これにより、約２キロ塩基対の５’RACE産物を得た。同様の方法により、3’GSP1（配列番号24）及び3’GSP2（配列番号25）プライマーを用いて約1.5キロ塩基対の３’RACE産物を得た。これらをpGEM-Tベクターにサブクローニングし、５’及び３’RACE産物の全長の配列を決定した［方法は（3-ii）及び（3-iii）に記載］。
得られたヒトRecQ4遺伝子の５’及び３’RACE産物の塩基配列をそれぞれ配列番号32及び33に示す。
（5）RecQ4遺伝子の転写開始点の決定
5’-RACE産物の塩基配列を解析した結果、RecQ4遺伝子がコードすると予想されるタンパク質の第一メチオニンはこの5’-RACE産物中には見られず、さらに上流に存在すると予想されたので、この遺伝子の転写開始点を調べた。
RecQ4遺伝子の転写開始点を含む５’領域はオリゴキャッピング法により決定した。ヒト精巣由来mRNAを宝酒造製の子牛小腸由来アルカリホスファターゼ（CIAP）で処理し脱リン酸化を行った。反応混合液は以下の通りである。
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反応は37℃で30分行った。次に脱リン酸化したmRNAに含まれる５’CAP構造を除く為、ニッポンジーン製タバコ酸性ピロホスファターゼ（TAP）で処理した。反応混合液は以下の通りである。
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反応は37℃で60分行った。次にCAP構造が除かれたmRNA（TAP-RNA）の５’端にアダプターとして30塩基からなるオリゴRNA（配列番号26）を宝酒造製T4RNAリガーゼを用いて繋げた。反応混合液は以下の通りである。
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反応は18℃で16時間行った。この反応物をフェノール処理にて除タンパクしエタノール沈殿にてオリゴキャッピングRNAを回収した後50μlのdH2Oに溶解した。次にこのオリゴキャッピングRNAを鋳型にして一本鎖cDNAを合成した。反応混合液は以下の通りである。
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70℃で10分間熱した後氷中にて冷却しさらに以下の試薬を加えた。
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37℃で２分間保温し、さらにSuperscript II（Gibco）5μlを加えて37℃で30分間反応させた。反応の後95℃で10分間加熱してdH2Oを加えて全量500μlとしたものをオリゴキャッピングcDNAとした。次にオリゴキャッピングcDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは２回行い、１回目のPCR産物を鋳型として２回目のPCRに用いるnested PCR法を行った。１回目の反応混合液は以下の通りである。
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PCRは95℃で５分（変性）を一回行った後、94℃で30秒（変性）、60℃で30秒（アニーリング）、72℃で１分（伸長）を１サイクルとしてこれを35サイクル行った。そして最後に72℃で５分反応させた。次にこのPCR産物を鋳型にしてさらに２回目のPCRを行った。反応混合液は以下の通りである。
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２回目のPCRのサイクルは１回目と同様に行った。2%アガロースゲル電気泳動にて約400塩基対の大きさのPCR産物が認められたので、この産物をpGEM-Tベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した［方法は（3-ii）及び（3-iii）に記載］。塩基配列決定には配列番号５及び６に記載のプライマーを用いた。
得られたヒトRecQ4遺伝子の５’転写開始点領域の塩基配列を配列番号34に示す。
（6）塩基配列アセンブリによる全長RecQ4 cDNAの構築
前記（3）、（4）及び（5）の結果得られたヒトRecQ4 cDNAの４つの塩基配列を配列番号31〜34に示す。これらの配列は部分的に重複し、その相対的位置関係は図７のように示すことができる。図７において、転写開始領域は配列番号34、5’RACE産物は配列番号32、部分cDNAは配列番号31、3’RACE産物は配列番号33で表されるものである。
この領域をDNASYSソフトを用いてコンピュータで解析し、上記４つの塩基配列を繋げてRecQ4 cDNA全長の配列を得ることができた。このようにして得られたcDNAは、３’端のpolyA配列を除く全長3850ヌクレオチドにより示された（配列番号１）。そのうちオープンリーディングフレーム（ORF）は3624ヌクレオチドであり、これがコードするタンパク質は1208アミノ酸から成り、分子量133070ダルトンであることがわかった。また、この遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
〔実施例２〕ヒトRecQ4型遺伝子のノーザンブロットによる解析
（1）ヒトRecQ4型遺伝子のノーザンブロット解析
（1-i）ヒト多組織ノーザン（Multiple Tissue Northern; MTN-1 and -II）ブロット
本実施例においては、市販のプリメイドフィルター（Clontech社製）を使用してMTNブロットを行った。なお、プリメイドフィルターは、16種類のヒトの組織・臓器より抽出したpoly（A）+ RNA各2μgをアガロース電気泳動にかけ、ナイロン膜にブロットすることにより作製されたものである。
（1-ii）ヒトRecQ4 cDNAプローブ
ヒトRecQ4 cDNAの一部であるオープンリーディングフレーム（配列番号１で表される塩基配列の第2097-2417番目の残基，321bp）を後述の方法に従い放射性ラベルし、これをヒトRECQ4遺伝子の検出プローブとして用いた。
（2）ハイブリダイゼーション
（2-i）プレハイブリダイゼーション
フィルターを弁当箱型ポリ容器の中で、100mlのプレハイブリダイゼーションバッファーに浸し、42℃で４時間インキュベーションした。プレハイブリダイゼーションバッファーには、50％ホルムアミド、５×SSPE、10×Denhardt’s溶液、２％SDS及び100μg/m変性サケ精子DNA断片を含むものを用いた。
（2-ii）ヒトRecQ4 cDNAプローブの放射性ラベリング
テンプレートとして前述のヒトRecQ4 cDNA断片50ng、プライマーとしてランダムヘキサマー50pmolを用い、ランダムプライマーDNAラベリングキットVer.2（宝酒造社製）により［α-32P］-dCTP（NEN社製、第一化学薬品社製）で放射性ラベルした。
（2-iii）ハイブリダイゼーション
プレハイブリダイゼーションバッファーを棄て、新たに50mlのプレハイブリダイゼーションバッファーを加え、気泡がフィルターの下に入りこまないように穏やかに振盪した。これに［32P］-dCTPで放射性ラベルしたプローブを比活性が約１×106cpm/mlとなるように加え、42℃で16時間ハイブリダイズした。
ハイブリダイゼーションの後、フィルターに対し、100mlの２×SSC、0.1％SDS溶液を用いて室温で15分のリンスを２回繰り返し、次に100mlの0.2×SSC、0.1％SDS溶液を用いて室温で15分のリンスを２回行った。
フィルターがやや湿った状態になるまで水分を除き、サランラップ（旭化成社製）にはさんでBAS 1500システム（富士フィルム社製）によるオートラジオグラフィー解析を行った。
（3）Fuji BAS 1500システムによる解析
輝尽性蛍光体を用いた放射線エネルギーメモリ型２次元センサー（イメージングプレート；IP）に、Ｘ線フィルム同様にサンプルを密着露光させ、このIPをHe-Neレーザー光で励起させ、露光量に応じて放出される蛍光をPSL（Photo Stimulated Luminescence）というデジタル量に変換して定量した。定量はBAS 1500システムを用いた。このシステムによる定量値の直線性は良好であり、バックグラウンドの減算、指定領域内の放射線強度の計測、比較が行える。
（4）ヒトRecQ4 mRNAの組織特異的発現結果
ヒト各組織・臓器由来の2μg poly（A）+ RNAを含むMTNブロット（CLONTECH社製）に［32P］標識したヒトRecQ4 cDNAの一部であるORF（配列番号１で表される塩基配列の第2097-2417番目；321bp）をプローブにハイブリダイズさせた。
ヒトRecQ4mRNAの発現は、各種の臓器で幅広く認められ、図５のようなパターンを示した。すなわち、ヒトRecQ4遺伝子は、全ての組織において発現し、特に、胸腺及び精巣において著しく強く発現してることが認められた。図５において、Poly（A）+ RNAの起源は以下の通りである。
a，心臓；b，脳；c，胎盤；d，肺；e，肝臓；f，骨格筋；g，腎臓
h，膵臓；i，脾臓；j，胸腺；k，前立腺；l，精巣；m，卵巣
n，小腸；o，大腸；p，末梢血リンパ球
産業上の利用可能性
本発明により、ヒトRecQ4型遺伝子が提供される。
本発明のヒトRecQ4型遺伝子は、ヒトの恒常性維持及び細胞老化との関連を解明するための研究に有用であると共に、発育及び老化に伴って発症する疾患の病因解明、症状の改善・緩和を目指す治療薬として、また、老化に伴う他の疾病との関連性のある病気の検査・予防のための診断プローブとして、あるいは、ヒト個体の発生に関する医科学的、細胞生物学的、免疫学的、生化学的及び分子生物学的研究のための試薬として有用である。
配列表
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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