(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を含み、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ媒介転写活性化を妨害するポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列を含み、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ媒介転写活性化を妨害する、ＳＭＡＤ相互作用タンパク質をコードする配列番号１の核酸配列を含む単離された核酸。
【請求項３】
適当な調節配列に機能的に連結した請求項１または２に記載の単離された核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換え発現ベクターで形質転換又は形質導入された細胞。
【請求項５】
配列番号２によるアミノ酸配列を含み、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ媒介転写活性化を妨害するポリペプチド。
【請求項６】
Ｓｍａｄとの結合に必要な、一文字コードで表示されたアミノ酸配列ＱＨＬＧＶＧＭＥＡＰＬＬＧＦＰＴＭＮＳＮＬＳＥＶＱＫＶＬＱＩＶＤＮＴＶＳＲＱＫＭＤＣＫＴＥＤＩＳＫＬＫを含むＳＭＡＤ相互作用タンパク質ポリペプチド。
【請求項７】
癌、奇形、免疫もしくは神経の病気、骨代謝に関連した病気、又は、皮膚、肺、腎臓、膵臓、胃、生腺、筋肉又は腸のような臓器に影響を与える病気を診断するための診断キットを製造するための、請求項１又は２に記載の単離された核酸または請求項５もしくは６に記載のポリペプチドの使用。
【請求項８】
請求項１もしくは２に記載の核酸を保持する非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
ＳＭＡＤと配列番号２のＳＭＡＤ相互作用タンパク質の間の相互作用に影響を与える化合物をスクリーニングするための、請求項１又は２に記載の単離された核酸または請求項５もしくは６に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｓｍａｄタンパク質の補因子のようなＳｍａｄ相互作用ポリペプチド（いわゆる、ＳＩＰ）及びそれらの使用に関する。
単一細胞から完全に組織化された生物への発達は、細胞の分裂及び分化が関与した、複雑な過程である。ある種のタンパク質が、この過程において中心的な役割を果たしている。これらのタンパク質は、異なるファミリーに分類され、そのうちのトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリーのリガンド、それらのセリン／スレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）レセプター及びそれらのシグナル伝達成分は、間違いなく重要な調節ポリペプチドである。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、中胚葉形成及び原腸形成のような初期発生イベントのみならず、神経発生、器官形成、アポトーシス及び左右非対称の確立のような後期段階の過程においても重要な役割を果たしていることが証明されている。更に、ＴＧＦ−βリガンド及びそれらのシグナル伝達経路の成分は、成体生物における推定腫瘍抑制因子として同定されている。
最近、Ｓｍａｄタンパク質が、セリン／スレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）レセプターの下流の標的として同定された（Massague, 1996, Cell, 85, 947-950頁）。これらのＳｍａｄタンパク質は、活性化されたＩ型レセプターによりリン酸化されて核に蓄積し、そこで転写活性化に関与し得るシグナル伝達因子である。Ｓｍａｄタンパク質は、高度の種間相同性を示す、少なくとも５つのサブグループからなるファミリーを構成している。それらは、中央のプロリンに富む可変領域により連結された、高度に保存されたＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインを有する、約４５０アミノ酸（５０〜６０kDa）からなるタンパク質である。細胞系又はアフリカツメガエル胚において実施された実験に基づき、サブグループは異なるシグナル伝達経路を決定していることが示唆されている。Ｓｍａｄ１はＢＭＰ２／４経路を媒介し、一方、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３はＴＧＦ−β／アクチビンのシグナル伝達カスケードにおいて機能する。これらのＳｍａｄは、Ｓｍａｄ４（ｄｐｃ−４）との複合体において機能し、いくつかのアクチビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）又はＴＧＦ−βの反応を誘導することが証明されている（Legna et al., 1996, Nature, 383, 832-836頁及びZhang et al., 1996, Nature, 383, 168-172頁）。
Ｓｍａｄタンパク質は３ドメイン構造を有し、それらの高度に保存されたカルボキシルドメイン（Ｃドメイン）が、核におけるＳｍａｄ機能にとって必要十分条件である。Ｓｍａｄタンパク質のこのドメインが、標的遺伝子の転写を制御するために転写因子と相互作用するのかもしれないという考えが、以前に提唱された（Meersseman et al., 1997, Mech. Dev., 61, 127-140頁）。この仮説は、Ｓｍａｄ２とアクチビン依存的な複合体を形成し、Ｍｉｘ−２プロモーター内のアクチビン反応性エレメントに結合する、新たな翼状ヘリックス（winged-helix）転写因子（ＦＡＳＴ１）の最近の同定により裏付けられた（Chen et al.,Nature383,691-696頁,1996）。しかし、ＦＡＳＴ１以外のＳｍａｄタンパク質の補因子は未だ同定されていない。
Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼレセプター及びＳｍａｄの活性化のメカニズム並びにＳｍａｄのヘテロマー化以外に、シグナル伝達機構における他の下流成分についてはほとんど知られていない。このように、細胞がどのようにしてＴＧＦ−β関連リガンドに反応するのかが、この領域における重要な中心的問題である。
Ｓｍａｄタンパク質が、直接的又は間接的に、転写制御における機能を有しているかもしれないことを明確に証明するためには、Ｓｍａｄタンパク質の推定補因子、これらのＳｍａｄタンパク質及び／又は補因子の標的遺伝子内の反応性エレメントを同定し、これらの活性のリガンド依存性を調査する必要がある。
これらの相互作用を理解するためには、（ｉ）リガンド、レセプター及びシグナル伝達成分（特にＳｍａｄファミリーのメンバー）の胚発生及び病気における機能的側面、（ii）リガンド及びレセプターの構造機能分析、（iii）シグナル伝達の解明、（iv）Ｓｍａｄ（関連）タンパク質の補因子の同定並びに（iv）培養細胞、及びショウジョウバエ、両性動物、サカナ及びネズミの胚におけるリガンド反応性遺伝子、に関する分子発生生物学的研究が最も重要である。
バイト（bait）としてＤＮＡ結合ドメインに融合したＳｍａｄ Ｃドメインを用い、プレイ（prey）として脊椎動物ｃＤＮＡライブラリーを用いる、ツー・ハイブリッド・スクリーニング・アッセイ（two hybrid screening assay）（Chien et al., 1991, PNAS, 88, 9578-9582頁）を実施することにより、（一つ又は複数の）ＳＭＡＤ相互作用タンパク質が入手可能であるということが、本発明者らの発明である。当業者には、他の適当なｃＤＮＡライブラリーも同様に使用可能であることが明らかである。例えば、バイトとしてＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインに結合したＳｍａｄ１ Ｃドメインを用い、プレイとしてマウス胚ｃＤＮＡを用いることにより、部分的なＳｍａｄ４及びＳＩＰ１を含むその他のＳｍａｄ相互作用タンパク質（ＳＩＰ）のｃＤＮＡが得られた。
驚くべきことに、このようにして得られた少なくとも４つのＳＭＡＤ相互作用タンパク質には、ＤＮＡ結合ジンクフィンガー・ドメインが含まれることが見出された。これらのタンパク質のうちの一つ、ＳＩＰ１は、δ−クリスタリン・エンハンサー結合タンパク質及びある種のショウジョウバエｚｆｈ−１を含む、ジンクフィンガー／ホメオドメイン・タンパク質ファミリーの新規なメンバーである。δ−クリスタリン・エンハンサー結合タンパク質はＤＮＡ結合リプレッサーとして同定されている。ＳＩＰ１の一つのＤＮＡ結合ドメイン（ＳＩＰ１czfのＣ末端ジンクフィンガー・クラスター）は、Ｅ２ボックス調節配列及びＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質結合部位に結合することが示された。ＳＩＰ１は、細胞内でＥ２ボックス及びＢｒａｃｈｙｕｒｙにより媒介される転写活性化を阻害することが示された。ＳＩＰ１は、酵母において全長Ｓｍａｄと相互作用することができない。Ｓｍａｄタンパク質がＤＮＡ結合リプレッサーと相互作用することができ、それ自体、正常な初期発生の厳密な調節に関与している標的遺伝子の、ＴＧＦ−βリガンドにより制御される抑制に直接関与しているかもしれないことが、初めて示される。
要約すると、ＳＩＰ１のいくつかの特徴は以下のとおりである。
ａ）酵母において全長ＸＳｍａｄ１と相互作用することができない
ｂ）δ−クリスタリン・エンハンサー結合タンパク質及び／又はショウジョウバエｚｆｈ−１を含むジンクフィンガー／ホメオドメイン・タンパク質のファミリーの新規なメンバーである
ｃ）ＳＩＰ１czfがＥ２ボックス部位に結合する
ｄ）ＳＩＰ１czfがＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質結合部位に結合する
ｅ）細胞内でＢｒａｃｈｙｕｒｙにより媒介される転写活性化を阻害する
ｆ）Ｓｍａｄ１、２及び／又は５のＣドメインと相互作用する
Ｅ２ボックス部位とは、Sekido et al., 1996, Gene, 173, 227-232頁に記述されたδ−クリスタリン・エンハンサー結合タンパク質のための結合部位ＣＡＣＣＴを含む−ＣＡＣＣＴＧ−調節保存ヌクレオチド配列を意味する。これらのＥ２ボックス部位は、胚発生及び筋肉形成における転写因子、ＭｙｏＤのような重要な塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（basic helix-loop-helix）（ｂＨＬＨ）因子の既知の標的である。
したがって、本発明に係るＳＩＰ１（ジンクフィンガー／ホメオドメイン・タンパク質）は、免疫反応及び初期胚発生に関連した多数の遺伝子のプロモーター領域内の特異的部位に結合し、それ自体、重要な生物学的過程、例えば細胞の増殖及び分化、胚発生、並びに癌を含む異常な細胞増殖、における重要な分化遺伝子の転写制御に関与しているのかもしれない。
本発明の一部はまた、ＳＭＡＤ相互作用タンパク質をコードする配列番号１に提供されたヌクレオチド配列又はそれらの機能的断片を含む、単離された核酸配列である。
更に、適当な調節配列に機能的に連結した該単離された核酸配列を（センス方向又はアンチセンス方向で）含む組換え発現ベクターが本発明に含まれ、組換え発現ベクターで形質転換又は形質導入された細胞も同様に本発明に含まれる。
本発明は、配列番号１に言及されたヌクレオチド配列を含む正確な単離された核酸配列に限定されず、該配列番号１に提供されたヌクレオチド配列又はそれらの機能的部分にハイブリダイズし、かつＳｍａｄ相互作用タンパク質又はそれらの機能的部分をコードする核酸配列も、本発明に含まれる。
明確のため、「ハイブリダイゼーション」とは、当業者に既知の通常のハイブリダイゼーション条件、好ましくは適当なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を意味する。核酸配列の相補性を決定するためのハイブリダイゼーション技術は、当分野において既知である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、時間の長さ及びハイブリダイゼーション緩衝液の組成を含むハイブリダイゼーション中の多数の因子により決定される。これらの因子は、例えば、マニアティス（Maniatis）ら（1982）分子クローニング；実験マニュアル（Molecular Cloning; A Laboratory manual）（コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州）に概説されている。
本発明のもう一つの局面は、配列番号２に係るアミノ酸配列又はそれらの機能的断片を含むポリペプチドである。アミノ酸が修飾及び／又は当業者にとって明らかな他のアミノ酸により置換されている、ポリペプチドに含まれるアミノ酸の変異体又は類似体も、本発明の範囲に含まれる。例えば、リン酸化のようなポリペプチドの発現後修飾は本発明の範囲から除外されない。ポリペプチド又はそれらの断片は、必ずしも、本発明に係る核酸配列から翻訳されず、例えば化学合成又は組み換え発現系における発現を含むいかなる方法により作製されてもよい。一般的に、「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマーをさし、分子の特定の長さをさすのではない。したがって、直鎖状のペプチド、環状又は分岐状のペプチド、Ｄアミノ酸、オルチニンなどのような非天然又は非標準的なアミノ酸を含むペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、すべて、ポリペプチドの定義に含まれる。本願において使用される「タンパク質」及び「ポリペプチド」なる語は、相互に交換可能である。前述の「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマー（アミノ酸配列）をさし、分子の特定の長さをさすのではない。したがって、ペプチド及びオリゴペプチドはポリペプチドの定義に含まれる。この語はまた、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば糖付加、アセチル化、リン酸化などをさす、又は含む。例えば、アミノ酸の一つ又は複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、置換された結合並びに当業者に既知の天然及び非天然両方のその他の修飾を含むポリペプチドが定義に含まれる。
「調節配列」とは、ライゲートしているコーディング配列の発現を行うために必要な制御ＤＮＡ配列をさす。そのような調節配列の性質は、宿主生物により異なる。原核生物においては、調節配列は一般的にプロモーター、リボソーム結合部位、及び終結因子を含む。真核生物においては、調節配列は一般的に、プロモーター、終結因子、そしていくつかの場合にはエンハンサー、トランス活性化因子、転写因子又は５’及び３’の非翻訳ｃＤＮＡ配列を含む。「調節配列」という語は、少なくとも、発現のために存在することが必要なすべての成分を含むものとし、付加的な有利な成分も含み得る。
「機能的に連結した」とは、そのように記述された成分が、その目的とされた方法で機能することを可能にする関係にある並列をさす。コーディング配列と「機能的に連結した」調節配列は、調節配列に適合した条件下でコーディング配列の発現が達成されるようライゲートされている。調節配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が用いられることは、当業者にとって明白である。
「配列の断片」又は「配列の一部」とは、言及された元の配列の短縮型配列を意味する。短縮型配列（核酸又はタンパク質の配列）の長さは非常に多様であり得る。最少の大きさは、少なくとも言及された元の配列と同等の機能及び／又は活性を有する配列を提供するために十分な大きさであるが、最大の大きさは重要でない。いくつかの適用において、最大の大きさは通常、元の配列の所望の機能及び／又は一つもしくは複数の活性を提供するために必要な大きさより実質的には大きくない。典型的には、短縮型アミノ酸配列の長さは、約５アミノ酸から約６０アミノ酸までの範囲である。しかし、より典型的には、配列の長さは、最大約５０アミノ酸、好ましくは最大約３０アミノ酸である。通常、少なくとも約１０、１２又は１５アミノ酸、最大約２０又は２５アミノ酸の配列を選択することが望ましい。
前記の一つもしくは複数の核酸を含む薬学的組成物又は一つもしくは複数の該ポリペプチドを含む薬学的組成物が、本発明のもう一つの局面である。本発明に係る核酸及び／又はポリペプチドは、所望により、適当な遺伝子治療の目的に用いられ得る。
更に、本発明に係る（一つ又は複数の）核酸を用いることにより、又は（一つ又は複数の）ポリペプチドを用いることにより、病気又は疾患を診断、予後及び／又は追跡するための方法も、本発明の重要な局面を形成する。更に、病気又は疾患を診断、予後及び／又は追跡するための方法において、本発明に係るポリペプチド又はそれらの断片に対する抗体も、便利に用いられ得る。本明細書において用いられるように、「抗体」という語は、好ましくは精製されたポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、変化した抗体、一価抗体、Ｆａｂタンパク質、単一ドメイン抗体又はキメラ抗体をさすが、これらに限定されない。多くの場合において、抗体の抗原への結合現象は、他のリガンド／抗リガンド結合と等価である。「抗原」という語は、少なくとも一つのエピトープを含むポリペプチド又はペプチドの群をさす。「エピトープ」とは、エピトープに特有の空間的配置で３アミノ酸を含むポリペプチドにより通常決定される抗体結合部位をさし、一般的にエピトープは少なくとも５個のそのようなアミノ酸、より一般的には少なくとも８〜１０個のそのようなアミノ酸からなる。
病気又は疾患を診断するための前記の方法を実施するための、本発明に係る（一つ又は複数の）核酸及び／又は（一つ又は複数の）ポリペプチド又はポリペプチドもしくはそれらの断片に対する抗体を含む診断キットも同様に、明らかに本発明に含まれる。これに関する病気又は疾患は、例えば、癌、奇形、免疫もしくは神経の病気、又は骨代謝に関連した病気もしくは疾患に関する。更に、皮膚、肺、腎臓、膵臓、胃、生腺、筋肉又は腸のような臓器に影響を与える病気も同様に、本発明に係る診断キットを用いて診断され得る。本発明の核酸配列を基礎として用いて、例えばＳＩＰコードする配列又はそれらの機能的部分とハイブリダイズする、約８ヌクレオチド又はそれ以上のオリゴマーを、切断又は合成により調製することができる。いわゆるプローブは、既に定義されたハイブリダイゼーションにより検出又は決定するため化合物の特有の配列を検出することを可能にする長さを有する。６〜８ヌクレオチドが実行可能な長さであるが、約１０〜１２ヌクレオチドが好ましく、約２０ヌクレオチドが最適であると考えられる。ヌクレオチド配列は、例えば放射性化合物、ビオチン、酵素、色素材料又は金属ゾル、蛍光又は化学発光化合物で標識され得る。プローブは診断キット中にパッケージングされ得る。診断キットは、標識されていてもよいプローブ・ヌクレオチド配列を含む。又は、該プローブが非標識であって、該プローブが所望により標識されるよう、標識のための成分が別の容器でキットに含まれていてもよい。キットは、特定のハイブリダイゼーション・プロトコルに必要な、その他の適当にパッケージングされた試薬及び材料、例えば標準、洗浄用緩衝液、並びに試験を行うための説明書を含んでいてもよい。診断キットは、イムノアッセイを行うために、本発明に係るポリペプチド又はそれらの断片に対する既に定義された抗体を含んでいてもよい。イムノアッセイの設計は、極めて多様であってもよく、これらの多様性は当分野において既知である。イムノアッセイは、例えば、競合、又は直接反応、又はサンドイッチ型アッセイに基づくことができる。
本発明の重要な側面は、ＳＭＡＤとＳＭＡＤ相互作用タンパク質のうち現在既知であるＳＩＰ（いわゆる、本明細書に特別に開示されたＳＩＰ１及びＳＩＰ２のようなＳＩＰ）との相互作用に影響を与える化合物（化学的に合成されるか、又は天然起源から入手可能である）をスクリーニングする方法の開発である。
ゲノム内に本発明に係る（一つ又は複数の）核酸を保持するトランスジェニック動物も、本発明の範囲に含まれる。該トランスジェニック動物も同様に、薬剤及び治療モデルを試験するために使用され得る。トランスジェニック動物とは、外来遺伝子（トランスジーンと呼ばれる）がゲノム内に組み込まれた非ヒト動物を意味する。この遺伝子は、生殖系組織に存在するため、最初のファウンダー動物（founder animal）からトランスジェニック動物系を確立するとき、親から子孫へと受け継がれる。（一つ又は複数の）新規遺伝子のゲノム内への導入及び組み込みの後、トランスジェニック動物自体は、特別な種変異体又は系統として認識される。「トランスジェニック」という語は、（一つ又は複数の）遺伝子又は遺伝子の一部が選択的に破壊された、又は宿主ゲノムから除去されたキメラ又は「ノックアウト」動物にまで拡大されている。遺伝子導入実験の目的により、トランスジーンは、ゲイン・オブ・ファンクション（gain-of-function）、レポーター・ファンクション（reportor function）及びロス・オブ・ファンクション（loss-of-function）という３つの主要な型に分類される。ゲイン・オブ・ファンクション・トランスジーンは、トランスジェニック個体に新規な機能を追加するため、又は遺伝子がトランスジェニック個体において適切に（例えば、いくつかの細胞型においてのみ）発現される場合トランスジェニック個体の同定を容易にするために、設計される。レポーター遺伝子は、遺伝子導入作業の成功を同定するために一般的に使用される。機能的プロモーターと融合した細菌クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼの遺伝子が、レポーター・ファンクション・トランスジーンの一つの型である。ロス・オブ・ファンクション・トランスジーンは、宿主遺伝子の発現を妨害するために構築される。これらの遺伝子は、転写後プロセス又は内因性ｍＲＮＡの翻訳を妨害するためのアンチセンスＲＮＡをコードし得る。又は、これらの遺伝子は、特定のｍＲＮＡを切断し、それにより正常な遺伝子産物の作製を中止させる触媒性ＲＮＡ（リボザイム）をコードしていてもよい。所望により、ロス・オブ・ファンクション・トランスジーンは、内因性タンパク質の活性を妨害するドミナント・ネガティブ変異体の過剰発現によって、又は通常ＤＮＡ（少なくともＤＮＡの一部）が欠失し相同性組み換えにより外来ＤＮＡと交換されている遺伝子もしくは遺伝子の一部を標的とした不活化によっても得られうる。この外来ＤＮＡは、通常、選択マーカー及び／又はレポーターのための発現カセットを含む。動物をトランスジェニックにするため核酸構築物が動物に導入されるとき、核酸は必ずしも導入された形態のままでなくてもよいことが理解されよう。「子孫」とは、子孫がトランスジーンを保有しているのであれば、トランスジェニック動物と他のトランスジェニック動物との交配の任意の産物を意味する。
以下の特徴を有するＳＭＡＤ相互作用タンパク質も、本発明の範囲に含まれる。
ａ）酵母において全長ＸＳｍａｄ１と相互作用する
ｂ）ショウジョウバエ「Clipper」及びゼブラフィッシュ（Zebrafish）「Noarches」を含む５ＣＣＣＨ型ジンクフィンガーのクラスターを含むタンパク質のファミリーのメンバーである
ｃ）一本鎖又は二本鎖ＤＮＡに結合する
ｄ）ＲＮａｓｅ活性を有する
ｅ）Ｓｍａｄ１、２及び／又は５のＣドメインと相互作用する
Ｓｍａｄの機能及び／又は活性とｍＲＮＡ安定性との間の相互作用の操作又は調整による、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーによる遺伝子発現の転写後制御のための方法も、本発明の一部である。
明確のため以下に本発明を更に詳細に記述する。
Ｓｍａｄ相互作用タンパク質の酵母ツー・ハイブリッド・クローニング
Ｓｍａｄ１の補因子を同定するため、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４DBD）と融合したＸＳｍａｄ１のＣドメインをバイトとして用い、マウス胚（１２．５ｄｐｃ）由来のｃＤＮＡライブラリーを候補プレイ源として用いた、酵母におけるツー・ハイブリッド・スクリーニングを実施した。ＧＡＬ４DBD−Ｓｍａｄ１バイト・タンパク質は、単独で、又は空のプレイ・プラスミドと共に、ＧＡＬ−４依存性のＨＩＳ３及びＬａｃＺ転写をレポーター酵母株において誘導することができなかった。４百万個の酵母形質転換体のスクリーニングにより、ＨＩＳ３及びＬａｃＺを発現する約５００個のコロニーが同定された。次に、プレイｃＤＮＡ及びバイトｃＤＮＡの両方の発現に依存する表現型を示すコロニーを特徴決定した。プラスミドをレスキューし、プレイｃＤＮＡを配列決定した（添付の配列表の配列番号１〜２０；表には各核酸配列について一本の鎖のみが表示されている）。これらのうちの４個（本願明細書においてそれぞれＳＩＰ１、ＳＩＰ２、ＳＩＰ５及びＳＩＰ７とも呼ばれるｔｈ１、ｔｈ１２、ｔｈ７６及びｔｈ７４）を詳細に開示する（それぞれ、配列番号１、２、３、４、１０、８に埋め込まれている）。一つ（ｔｈ７２＝配列番号６及び７を組み合わせたもの）は、ＧＡＬ４トランス活性化ドメイン（ＧＡＬ４TAD）が、プロリンに富むドメイン内のアミノ酸（ａａ）２５２から開始する部分的Ｓｍａｄ４ ｃＤＮＡとインフレームで融合しているタンパク質をコードする。Ｓｍａｄ４は、他のＳｍａｄタンパク質と相互作用することが示されているが、現在までに、他のＳｍａｄのＣドメインをバイトとして用いた酵母におけるツー・ハイブリッド・スクリーニングにおいて選出されているＳｍａｄは存在しなかった。これらのデータは、両方の相互作用Ｓｍａｄタンパク質のＮドメイン、そしてプロリンに富むドメインの一部（Ｓｍａｄ４）又は全部（Ｓｍａｄ１）が、少なくとも酵母におけるツー・ハイブリッド・アッセイを用いた場合には、Ｓｍａｄタンパク質間のヘテロダイマー性相互作用にとって不可欠ではないことを示唆している。
第二の陽性プレイ・プラスミドのｃＤＮＡ挿入配列、ｔｈ１（配列番号１に埋め込まれている）は、ＧＡＬ４TADをコードする配列が、６２６ａａのポリペプチドＳＩＰ１（Ｔｈ１）をコードする約１．９kb長のｔｈ１ ｃＤＮＡとインフレームで融合しているタンパク質をコードする。データベース検索により、ＳＩＰ１（Ｔｈ１）が、ホメオドメイン様セグメントを含み、脊椎動物δ−クリスタリン・エンハンサー結合タンパク質（δ−ＥＦ１）及びショウジョウバエｚｆｈ−１を含むＤＮＡ結合タンパク質のファミリーの新規メンバーであることが明らかになった。これらのジンクフィンガー／ホメオドメイン含有転写因子は、中胚葉組織における器官形成及び／又は神経系の発達に関与している。ｔｈ１ ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質は、Ｓｍａｄ相互作用タンパク質（ＳＩＰ）であり、ＳＩＰ１（ＴＨ１）と命名された。
ＳＩＰ１
酵母及びインビトロにおけるＳＩＰ１−Ｓｍａｄ相互作用の特徴決定
全長ＸＳｍａｄ１及び修飾型Ｃドメインに対するＳＩＰ１（ＴＨ１）の結合を試験した。修飾型Ｃドメインは、アミノ酸置換（Ｇ４１８Ｓ）又は最後の４３ａａの欠失（Δ４２４−４６６）のいずれかを有している。第一は、ショウジョウバエにおけるＳｍａｄ類似体Ｍａｄを不活化し、哺乳動物細胞におけるＳｍａｄ１のＢＭＰ−依存性リン酸化を消失させる。変異体Δ４２４−４６６と類似した短縮型Ｍａｄは、ショウジョウバエにおいて変異表現型を引き起こし、ヘテロ接合性欠損背景（loss-of-heterozygosity background）におけるＳｍａｄ４（ｄｐｃ−４）における類似の短縮は、膵臓癌に関係している。ＳＩＰ１（ＴＨ１）は、全長ＸＳｍａｄ１とも変異体Δ４２４−４６６とも相互作用しなかった。他のＳｍａｄ相互作用プレイ（ｔｈ１２）は全長Ｓｍａｄバイトと効率よく相互作用したため、全長ＸＳｍａｄ１の会合が検出不能であるのは、酵母における全長ＸＳｍａｄ１の発現が不十分なためではない。酵母においてＳＩＰ１（ＴＨ１）と全長ＸＳｍａｄ１とが会合しないのは、Ｓｍａｄ Ｃドメインの活性がＮドメインにより抑制されること、及びこの抑制が哺乳動物細胞において流入ＢＭＰシグナルにより排除されることを示す以前の示唆と矛盾していない。Ｓｍａｄ１のＣドメインにおけるＧ４１８Ｓ変異は、ＳＩＰ１との相互作用を消失させず、このことは、この変異がＳｍａｄ１機能の他の側面に影響を与えることを示している。したがって、活性化されたレセプターＳＴＫ活性により全長Ｇ４１８Ｓ Ｓｍａｄタンパク質が機能を有するようになる能力は影響を受けるが、Ｇ４１８Ｓ Ｃドメインが下流の標的と相互作用する能力は影響を受けないのかもしれない。このことは、Ｓｍａｄの活性化がＳＩＰ１のような標的との相互作用にとって不可欠であり、それよりも先行して起こることを示している。変異体Δ４２４−４６６における欠失は、活性化されたＩ型ＳＴＫレセプターによるリン酸化の直接の標的であるＳｍａｄのＣ末端の３個の保存された機能的に重要なセリンを含む。
Ｓｍａｄ１及び２のＣドメインは、極めて高度な配列保存にもかかわらず、アフリカツメガエル胚において個別に過剰発現された場合、それぞれ、腹側又は背側の中胚葉を誘導する。極めて最近、Ｓｍａｄ５がアフリカツメガエル胚において腹側の運命を誘導することが示された。Ｓｍａｄ１、５及びＳｍａｄ２の生物学的活性の著しい違いが、補因子との相互作用の違いによるのか否かを調べるため、酵母ツー・ハイブリッド・アッセイにおいてＳＩＰ１（ＴＨ１）タンパク質がＳｍａｄ１、５及びＳｍａｄ２のＣドメインと相互作用する能力を試験した。ＳＩＰ１（ＴＨ１）は、３個のＳｍａｄメンバーすべてのＣドメインと酵母において相互作用することが見出された。次に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウン・アッセイを用いて、インビトロにおけるＳＩＰ１と異なるＳｍａｄ Ｃドメインとの相互作用を調査した。ＧＳＴ−Ｓｍａｄ融合タンパク質を大腸菌で作製し、グルタチオン・セファロース・ビーズにカップリングさせた。無関係のＧＳＴ融合タンパク質及び非融合ＧＳＴを陰性対照として使用した。ワクシニアウイルス（Ｔ７ＶＶ）に基づく系を用いて、哺乳動物細胞において、放射性標識されエピトープタグを付加されたＳＩＰ１タンパク質を作製することに成功した。ＧＳＴ−Ｓｍａｄビーズを用いて、ＳＩＰ１タンパク質を細胞溶解物からプルダウンし、その同定をウェスタンブロッティングにより確認した。再び、酵母の場合と同様に、ＳＩＰ１が異なるＳｍａｄ Ｃドメインに対する共通の結合タンパク質であることが見出され、このことは、ＳＩＰ１が、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの異なるメンバーに対する共通の細胞反応を媒介しているのかもしれないことを示唆している。又は、Ｓｍａｄタンパク質は、インビボにおいてＳＩＰ１に対して異なる親和性を有しているのかもしれないし、又はＳｍａｄ−ＳＩＰ１相互作用の特異性がもし存在するとすれば、その特異性を他のメカニズムが決定しているのかもしれない。
ＳＩＰ１はδＥＦ−１ファミリーのジンクフィンガー／ホメオドメイン・タンパク質の新規メンバーである
ｃＤＮＡライブラリー・スクリーニングを５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲと組み合わせることにより、更なるＳＩＰ１オープン・リーディング・フレーム配列が得られた。スクリーニングにより、ｔｈ１ ｃＤＮＡと部分的に重複する３．２kb長のＳＩＰ１ ｃＤＮＡ（ｔｗ６）が得られた。ＳＩＰ１タンパク質のオープン・リーディング・フレームは、９４４ａａ（配列番号２）をコードし、δ−ＥＦ１タンパク質、ＺＥＢタンパク質、ＡＲＥＢ６タンパク質、ＢＺＰタンパク質及びｚｆｈ−１タンパク質のある領域との相同性、並びに極めて類似した推定機能性ドメインの構造を示す。これらのタンパク質と同様に、ＳＩＰ１はホメオドメイン及びグルタミン酸に富むドメインにより分離された２個のジンクフィンガー・クラスターを含む。詳細な比較は、ＳＩＰ１が２つの手部を有する（two-handed）ジンクフィンガー／ホメオドメイン・タンパク質の新規の異なるメンバーであることを明らかにする。δ−ＥＦ１の場合と同様、標準的なホメオドメインすべてのヘリックス３及び４に保存されている５個の残基のうちの３個が、ＳＩＰ１には存在しない。ホメオドメインを含むがＣ末端ジンクフィンガー・クラスター及びグルタミン酸に富む配列は含まないＳＩＰ１（Ｔｈ１）は、Ｓｍａｄと相互作用する。この相互作用は、ホメオドメイン様ドメインを除去しても維持され、このことはＳＩＰ１のａａ４４〜２３６（配列番号２による番号付け）をコードするセグメントがＳｍａｄとの相互作用にとって十分であることを示している。このドメインを更に狭くするため、この１９３ａａ領域のＮ末端及びＣ末端から開始する段階的な欠失変異体を作成した。ＰＣＲにより段階的な２２ａａ欠失構築物を作製した。酵母ツー・ハイブリッド・バイト・ベクターｐＡＣＴ２（クロンテック（Clontech））における増幅された配列のクローニングを可能にするため、２つの制限部位（５’末端ＳｍａＩ部位、３’末端ＸｈｏＩ部位）を構築した。これらのいわゆるＳＢＤ変異構築物をプレイとし、ＸＳｍａｄ１ Ｃドメインをバイトとして、拡張的なツー・ハイブリッド実験を行った。（配列番号２の）ａａ１６６〜２３６又はａａ４４〜２１６をコードする変異ＳＢＤ構築物は、まだバイト・プラスミドと相互作用することができたが、ａａ１８６〜２３６又はａａ４４〜１９６をコードする変異構築物はバイトと相互作用することができなかった。このようにして、ＸＳｍａｄ１ Ｃドメインとまだ相互作用する最小ドメインは、配列番号２のａａ１６６〜２１６にわたる５１ａａのドメインであることが決定された。したがって、Ｓｍａｄとの相互作用に必要な該ＳＢＤのアミノ酸配列は、以下のとおりである（一文字コードで表示されている）。
0004108768.tif 000002
この領域のＮ末端又はＣ末端における更なる２０ａａの欠失は、Ｓｍａｄ結合活性を破壊した。続いて、再びＰＣＲに基づく方法を用いて、この５１ａａ領域をＳＩＰ１タンパク質に関して欠失させ、欠失の位置にＮｃｏＩ制限部位を作製した。このＳＩＰ１ΔＳＢＤ５１は、「哺乳動物プルダウン・アッセイ」によりアッセイしたとき、もはやＳｍａｄ Ｃドメインと相互作用することができなかった。これらの実験においては、Ｎ末端にｍｙｃタグを付加されたＳＩＰ１を、ＧＳＴ−ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン融合タンパク質と共に、ＣＯＳ−１細胞において発現させた。グルタチオン−セファロース・ビーズを用いて、ｍｙｃ−ＳＩＰ１タンパク質をＧＳＴ−ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン融合タンパク質と共に細胞抽出物から共精製し、抗ｍｙｃ抗体を用いたウェスタン・ブロッティングにより証明した。ＳＩＰ１における５１ａａの欠失がＸＳｍａｄ１ Ｃドメインとの相互作用を消失させたことが、このアッセイにより検出された（図１を参照）。ＳＩＰ１のＣ末端ジンクフィンガー・クラスターのＤＮＡ結合活性の分析
δ−ＥＦ１はある種の遺伝子のエンハンサー活性を制御する抑制因子である。この抑制因子は、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）活性化因子のサブグループのための結合部位でもある、Ｅ２ボックス配列（５’−ＣＡＣＣＴＧ）に結合する（Sekido, R et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14, 5692-5700頁）。興味深いことに、δ−ＥＦ１に結合することが示されたＣＡＣＣＴ配列は、Ｂｒａタンパク質のためのコンセンサス結合部位の一部でもある。細胞型に特異的な遺伝子発現は、抑制因子と活性化因子との間のＣＡＣＣＴ配列に対する競合的結合により達成されるということが提唱されている。δ−ＥＦ１により媒介される抑制は、非Ｂ細胞におけるＩｇＨエンハンサーを休止させる（silencing）ための主要なメカニズムであるかもしれない。δ−ＥＦ１はＢ細胞にも存在するが、Ｂ細胞に特異的なｂＨＬＨ因子、Ｅ２Ａにより対抗される。同様に、δ−ＥＦ１は、ｂＨＬＨ因子Ｅ４７との結合において競合して、Ｉｇκエンハンサーを抑制する。δ−ＥＦ１のＣ末端ジンクフィンガー・クラスターは、Ｅ２ボックス配列との結合及び活性化因子との競合を担っている。ＳＩＰ１とδ−ＥＦ１の間のこの領域の高度の配列類似性を考慮し、両方のタンパク質が類似のＤＮＡ結合特異性を有しているか否かを、ゲル阻止（gel retardation）アッセイを用いて、まず試験することに決定した。したがって、ＳＩＰ１のＣ末端ジンクフィンガー・クラスター（ＳＩＰ１CZFと命名された）のＤＮＡ結合特性を分析した。ＳＩＰ１CZFは、短いＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌で効率よく産生され、精製された。より大きいＧＳＴ−ＳＩＰ１融合タンパク質は大腸菌においてプロテアーゼ分解を受けた。
精製されたＧＳＴ−ＳＩＰ１CZFは、ＩｇＨ κＥ２エンハンサーのＥ２ボックスに結合することが示された。ｂＨＬＨ因子Ｅ４７の結合には影響を与えるが、δ−ＥＦ１の結合には影響を与えないことが以前に示されている、この部位の変異（Ｍｕｔ１）は、ＳＩＰ１CZFの結合に影響を与えなかった。このκＥ２部位における他の２つの変異（それぞれＭｕｔ２及びＭｕｔ４）は、δ−ＥＦ１の結合を消失させることが示されており（Sekido et al.,1994）、ＳＩＰ１CZFの場合にも同様であった。更に、インターロイキン−２プロモーターのＮｉｌ−２Ａ結合部位、Ｂｒａタンパク質結合部位及びＡＲＥＢ６結合部位へのＳＩＰ１CZFの結合が証明された。Ｂｒａ結合部位へのＳＩＰ１CZFの結合の特異性は、競合実験において更に証明された。この部位へのＳＩＰ１CZFの結合は、過剰の非標識Ｂｒａ結合部位プローブにより競合され、κＥ２野生型プローブは、極めて強力な競合因子であるその変異体Ｍｕｔ１よりは効率が低かったが、競合した。ＧＡＴＡ−２プローブと同様、κＥ２−Ｍｕｔ２及びκＥ２−Ｍｕｔ４は競合できなかったが、ＡＲＥＢ６部位は極めて効率よく競合した。これらの実験から、ＧＳＴ−ＳＩＰ１CZF融合タンパク質は、δ−ＥＦ１及び関連タンパク質のＣＺＦ領域を用いて作成された他のＧＳＴ融合タンパク質と同一のＤＮＡ結合特異性を示すと結論付けることができた（Sekido et al., 1994）。更に、Ｂｒａにとっての標的部位でもある制御配列にＳＩＰ１が特異的に結合することが、初めて証明された。このことは、他のδ−ＥＦ１関連タンパク質にも同様に当てはまるかもしれず、これらはＢｒａ依存性遺伝子活性化をインビボで妨害するかもしれない。
ｂＨＬＨ因子ＭｙｏＤにより認識される部位を分析した。ＭｙｏＤは、Ｅ２ボックス配列に結合することにより、筋肉クレアチン・キナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターからの転写を活性化することが示されている（Weintraub et al., 1994, Genes Dev., 8, 2203-2211頁；Katagiri et al., 1997, Exp. Cell Res. 230, 342-351頁）。興味深いことに、δ−ＥＦ１は、筋肉クレアチン・キナーゼ・エンハンサーのＭｙｏＤ依存性の活性化、そして１０Ｔ１／２細胞における筋発生を抑制することが証明されており、これにはＥ２ボックスが関与していると考えられている（Sekido et al.,1994）。更に、ＴＧＦ−β及びＢＭＰ−２は、筋肉特異的プロモーターの活性をダウンレギュレートすることが報告されており、この阻害効果はＥ２ボックスにより媒介される（Katagiri et al., 1997）。Ｅ２ボックスは、多くの筋肉特異的遺伝子の制御領域に存在し、筋肉特異的発現にとって必要であり、（ＭｙｏＤファミリーの）の筋原性ｂＨＬＨタンパク質と、Ｅ４７のような広範に発現している因子とのヘテロダイマーにより最適に認識される。ＳＩＰ１CZFは、ＭＣＫエンハンサーＥ２ボックスを包含するプローブに結合することができ、この複合体はＥ２ボックス・オリゴヌクレオチド及びその他のＳＩＰ１結合部位により競合された。更に、以前に使用されたκＥ２−Ｍｕｔ４部位に類似したＥ２ボックス内の点突然変異も、ＳＩＰ１CZFの結合を消失させた。これらの結果から、ＳＩＰ１CZFがＭＣＫプロモーターのＥ２ボックスに結合することが確認された。したがって、ＳＩＰ１は、Ｓｍａｄと相互作用しＭＣＫ Ｅ２ボックスに結合するタンパク質として、ＭｙｏＤにより制御されるＭＣＫプロモーターのＴＧＦ−β及びＢＭＰによる抑制を媒介する因子であるかもしれない（Katagiri et al., 1997）。
ＳＩＰ１はＢｒａ活性化因子のＢＭＰ依存性抑制因子である
ＳＩＰ１CZFは、Ｂｒａタンパク質結合部位、ＩＬ−２プロモーターに結合し、筋肉特異的遺伝子のＢＭＰ又はＴＧＦ−βによる抑制に関与しているＥ２ボックスに結合することが、実験により証明された。したがって、これらの観察から、ＳＩＰ１（ＳＩＰ１TW6として）がＢＭＰにより制御される抑制因子であるか否かを試験することにした。ルシフェラーゼ遺伝子と融合したＳＩＰ１結合部位（Ｂｒａタンパク質結合部位）を含むレポーター・プラスミドを構築した。ＢＭＰレセプターを発現し、シグナル伝達を補助することが証明されているため（Hoodless et al., 1996, Cell, 85, 489-500頁）、形質転換の間、低血清（０．２％）培地で維持されたＣＯＳ細胞を、その後の一過性形質転換実験で使用した。ＳＩＰ１TW6は、Ｂｒａ結合部位を介してＢｒａタンパク質のトランス活性化活性を変化させることができないことが見出された。更に、１０％又は０．２％の血清の存在下、及びＢｒａ発現ベクターの非存在下で、ＳＩＰ１TW6によるこのレポーター・プラスミドのトランス活性化は、検出できなかった。したがって、細胞をＢＭＰ−４に曝す同一の実験を実施した。ＳＩＰ１TW6はＢｒａにより媒介されるレポーターの活性化を抑制した。これは用量依存的に起こった（ＳＩＰ１TW6プラスミドの量、ＢＭＰ−４の濃度）。形質転換されたＣＯＳ細胞は２４時間後にのみＢＭＰ−４に曝されたため、この型の実験で完全な抑制は得られなかった。その後、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ活性の結果として実験の最初の２４時間の間に、ルシフェラーゼｍＲＮＡ及びタンパク質が蓄積する。これらの実験からの結論は、ＳＩＰ１がＢｒａ活性化因子の抑制因子であり、その抑制因子としての活性がＢＭＰの存在下でのみ検出されることを明確に示している。ＳＩＰ１が、Ｂｒａ標的部位を介した転写の活性化因子であることが見出されたことは、重要である。ポリグルタミン酸に富む区域（本明細書で使用されているＳＩＰ１TW6にも存在する）がδ−ＥＦ１様タンパク質に存在することから、これらの抑制因子が転写活性化因子としても同様に機能するかもしれないことが以前に推測されていたため、このことは興味深い。特に、ＡＲＥＢ６は、ハウスキーピング遺伝子Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅα−１のプロモーターに結合すること、及び細胞型及び結合部位の状況に依存して遺伝子発現を抑制することが示されている（Watanabeet al., 1993, J. Biochem., 114, 849-855頁）。
マウスにおけるＳＩＰ１ｍＲＮＡ発現
ノーザン分析により、成体マウスの胚及びいくつかの組織に、主要なＳＩＰ１の６kbのｍＲＮＡが存在しており、肝臓及び精巣には極めて弱く発現していることが証明された。しかし、７ｄｐｃ胚に存在する、少量の９ｋｂ長の転写物も検出された。インサイチュー・ハイブリダイゼーションにより、７．５ｄｐｃ胚における、胚外及び胚の中胚葉におけるＳＩＰ１転写が証明された。遺伝子は、胚の外胚葉に弱く発現している。８．５ｄｐｃ胚において、胚外中胚葉（血島）、神経上皮及び神経管、第一及び第二鰓弓、眼隆起、並びに主に背側の前原体節期中胚葉に極めて強い発現が見られる。体節及び脊索には弱いが有意な発現が検出される。８．５日目と９．５日目の間、このパターンは明確に三叉神経及び顔面−聴覚神経堤組織に拡張した。妊娠中期（midgestation）付近では、ＳＩＰ１遺伝子は、背側根神経節、脊索、三叉神経節、前頭皮質の脳室域、腎臓間葉、十二指腸及び中腸の非上皮細胞、膵臓原基、尿生殖隆線及び性線、下顎及び鼻領域、上腕骨領域の軟骨原基、鎖骨の原基並びに椎軸に沿った分節性前軟骨硬節由来の縮合（condensation）に発現している。ＳＩＰ１ ｍＲＮＡは、口蓋棚、肺間質、胃及び迷走神経の下方神経節にも検出され得る。更に、プライマー伸長分析により、胚性幹細胞におけるＳＩＰ１ ｍＲＮＡの存在が証明された。驚くべきことに、８．５ｄｐｃ胚における、血島及び前体節中胚葉におけるＳＩＰ１の発現は、６．５ｄｐｃと９．５ｄｐｃの間に可変性の表現型をもって死亡することが示されている、ＢＭＰ−４ノックアウト・マウスにおいて影響を受けた組織と一致する。発生の後期まで生存し続けたこれらは、破壊された背部構造及び血島を含む胚外中胚葉の変形を示した（Winnier et al., 1995, Genes Dev., 9, 2105-2116）。
δ−ＥＦ１タンパク質のｍＲＮＡ発現も同様に証明されている。マウスにおいて、δ−ＥＦ１ ｍＲＮＡは脊索、体節及び腎口のような中胚葉組織、並びに胚の神経系及び胚の水晶体のようなその他の部位に検出されている（Funahashi et al., 1993, Development, 119, 433-446頁）。成体ハムスターにおいては、δ−ＥＦ１ ｍＲＮＡは内分泌膵臓の細胞、下垂体前葉及び中枢神経系に検出されている（Franklin et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14, 6773-6788頁）。これらのδ−ＥＦ１及びＳＩＰ１の発現部位の大部分は、ある種のＩ型ＳＴＫレセプター（ＡＬＫ−４／ＡｃｔＲ−ＩＡ及びＡＬＫ−６／ＢＭＰＲ−ＩＢなど）の限定された発現パターンが証明されている部位と重複する（Verschueren et al., 1995, Mech. Dev., 52, 109-123頁）。
ＳＩＰ２
ＳＩＰ２の特徴決定
ＳＩＰ２は、最初、酵母においてＳｍａｄ１、２及び５のＣ末端ドメイン並びに全長Ｓｍａｄ１との相互作用を示す１０５２ｂｐのツー・ハイブリッド・クローン（ｔｈ１２）として選出された。ＧＳＴ−プルダウン実験（ＳＩＰ１について記述した）の使用によって、インビトロにおけるＳｍａｄ１、２及び５のＣ末端ドメインとの相互作用も証明された。
ａ）ＳＩＰ２全長配列
ｔｈ１２は、ヒト骨髄芽球細胞系ＫＧ１から単離された部分的ｃＤＮＡ（ＫＩＡＡ０１５０）と高い相同性を示した。しかし、このヒトｃＤＮＡの方が、ｔｈ１２の３’末端で＋／−２ｋｂ長かった。このヒトｃＤＮＡを用いて、ＥＳＴライブラリーをスクリーニングし、ＫＩＡＡ０１５０ ｃＤＮＡの３’末端に相同なマウスＥＳＴを検出した。ｔｈ１２配列及び見出されたマウスＥＳＴに基づきプライマーを設計し、３’末端に終止コドンを含むｃＤＮＡを増幅した。５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲを用いて、開始コドンを包含する５’配列を得た。
ＳＩＰ２オープン・リーディング・フレームを完成するために用いられた上記ＥＳＴクローンの遺伝子銀行受託番号：
ヒトＫＩＡＡ０１５０；Ｄ６３４８４
マウスＥＳＴ配列；ソアレス（Soares）マウスｐ３ＮＭＦ１９．５；Ｗ８２１８８
ＳＩＰ２オープン・リーディング・フレームを再構築するために用いられたプライマー：
0004108768.tif 000003
５’−ｒａｃｅに用いられたプライマー：
すべてｔｈ１２配列に由来する逆方向プライマーである。
0004108768.tif 000004
これらの配列の集合体から導出された全長ＳＩＰ２は、配列番号４に表示された９５０アミノ酸を含み、ヌクレオチド配列は配列番号３に表示されている。
ｂ）ＳＩＰ２配列相同性
ＳＩＰ２は、５ＣＣＣＨ型ジンクフィンガーを包含するドメインを含む。このドメインは、ショウジョウバエにおけるＣｌｉｐｐｅｒ、ゼブラフィッシュにおけるNo Arches及び哺乳動物におけるＣＰＳＦのような他のタンパク質に見出された。No Archesは、ゼブラフィッシュにおける鰓弓の発生にとって必須であり、ＣＰＳＦは転写終結及びポリアデニル化に関与している。Ｃｌｉｐｐｅｒ内の５ＣＣＣＨを包むドメインは、エンドＲＮａｓｅ活性を有していることが示された（下記参照）。
ｃ）ＳＩＰ２ ＣＣＣＨドメインはＲＮＡｓｅ活性を有している
ＳＩＰ２の５ＣＣＣＨ型ジンクフィンガーを包むドメインをＧＳＴと融合させ、融合タンパク質を大腸菌から精製した。この融合タンパク質は、インビトロで作製された標識ＲＮＡと共にインキュベートしたとき、ＲＮＡｓｅ活性を示す。更に、この融合タンパク質は一本鎖ＤＮＡに結合できることが示された。更に詳細には：ＳＩＰ２ ５×ＣＣＣＨのＧＳＴ融合タンパク質；ＰＬＡＧ１（非関連ジンクフィンガー・タンパク質）、ＳＩＰ１CZF（ＳＩＰ１のＣ末端ジンクフィンガー・クラスター）及びｔｈ１（ツー・ハイブリッド・スクリーニングで単離されたＳＩＰ１部分的ポリペプチド）、及びＣＤ４０の細胞質テイルを大腸菌で作製し、グルタチオン・セファロース・ビーズを用いて精製した。ClipperのＲＮＡｓｅ活性を証明するために以前に用いられた３つの35Ｓ標識基質、ショウジョウバエ由来の関連タンパク質（Bai,C及びTolias P.P.1996,発生的に制御されたＣＣＣＨジンクフィンガー・タンパク質により媒介されるＲＮＡヘアピンの分解（cleavage of RNA Hairpins Mediated by a Developmentally Regulated CCCH Zinc Finger Protein.）Mol Cell. Biol. 16: 6661-6667）をインビトロ転写により作製した。精製されたＧＳＴ融合タンパク質を用いたＲＮＡ分解反応をＲＮＡｓｉｎ（ＲＮＡｓｅＡ活性を遮断する）の存在下で行った。等量の各反応液を１’、７’、１５’、３０’、６０’の時点で採取した。分解産物を変性ポリアクリルアミド・ゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。これらの実験により、ＧＳＴ−ＳＩＰ２ ５×ＣＣＣＨは、ＲＮＡｓｅ活性を有しており、すべての被検基質を分解するが、ＧＳＴ−ＰＬＡＧ１、ＧＳＴ−ＣＤ４０、ＧＳＴ−ＳＩＰ１CZF及びＧＳＴ−ｔｈ１はこの活性を有しないことが証明された。
ｄ）ＧＳＴプルダウン実験におけるｔｈ１２（部分的ＳＩＰ２ポリペプチド）とＳｍａｄ Ｃドメインとの相互作用
アフリカツメガエル（Ｘ）Ｓｍａｄ１並びにマウスＳｍａｄ２及び５のＣドメインを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として大腸菌で作製し、グルタチオン・ビーズにカップリングさせた。無関係のＧＳＴ−融合タンパク質（ＧＳＴ−ＣＤ４０細胞質部分）及びＧＳＴそのものを、陰性対照として用いた。Ｎ末端にＨＡタグが付加されたｔｈ１２タンパク質を、Ｔ７ワクシニア・ウイルス発現系を用いてＨｅｌａ細胞で作製し、代謝的に標識した。Ｔｈ１２の発現を、ＨＡ抗体を用いて免疫沈降させた後、ＳＤＳ−ｐａｇｅ及びオートラジオグラフィーにより確認した。Ｔｈ１２タンパク質は±５０kdのタンパク質として作製される。このタンパク質を発現するＨｅｌａ細胞から調製された細胞抽出物を、ＧＳＴプルダウン緩衝液中でＧＳＴ−Ｓｍａｄ Ｃドメイン・ビーズと混合し、４℃で一晩インキュベートした。次に、ビーズを同緩衝液中で４回洗浄し、結合したタンパク質をレムリ（Laemmli）試料緩衝液で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。「プルダウンされた」ｔｈ１２タンパク質を、ＨＡ抗体を用いたウェスタン・ブロッティングにより可視化した。これらの実験により、ｔｈ１２が、ＧＳＴ−Ｓｍａｄ Ｃドメイン・ビーズにより効率よくプルダウンされ、ＧＳＴ−ＣＤ４０又はＧＳＴ単独によってはプルダウンされないことが証明された。
ＳＩＰ２に関する結論
ＳＩＰ２はＲＮＡｓｅ活性を含むＳｍａｄ相互作用タンパク質である。Ｓｍａｄが潜在的ＲＮＡｓｅと相互作用するという発見は、ＴＧＦ−βシグナル伝達とｍＲＮＡ安定化の間の予想外の関連を提供する。
ＳＩＰ５
ＳＩＰ５の特徴決定
一つの隣接するオープン・リーディング・フレームを、ツー・ハイブリッド・ベクターｐＡＣＴ−２（クロンテック）のＧＡＬ４トランス活性化ドメインとインフレームで融合させる。インフレームの翻訳終止コドンが存在しないため、これは部分的ｃＤＮＡである。配列はデータベース内のいずれの配列とも有意な相同性を有しないが、以下のＥＳＴクローンと相同性が高い領域を示す。
マウス：受託番号：ＡＡ２１２２６９（ストラタジーン（Stratagene）マウス黒色腫）；ＡＡ２１５０２０（ストラタジーン・マウス黒色腫）、ＡＡ７９４８３２（ノールズ・ソルター（Knowles Solter）マウス２ｃ）及びヒト：受託番号ＡＡ８３００３３、ＡＡ８２７０５４、ＡＡ６８７２７５、ＡＡ５０５１４５、ＡＡ３７１０６３。酵母ツー・ハイブリッド・アッセイにおける、ＳＩＰ５プレイ・タンパク質と、異なるバイト・タンパク質（ＳＩＰ１で得られたデータ・セクションに記述されている）との相互作用の分析は以下のように要約できる。
空のバイト・ベクターｐＧＢＴ９                            −
全長ＸＳｍａｄ１                                          ＋
ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン                                   ＋
Ｇ４１８Ｓ置換を有するＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン             ＋
マウスＳｍａｄ２ Ｃドメイン                               ＋
マウスＳｍａｄ５ Ｃドメイン                               ＋
ラミン（Lamin）（ｐＬＡＭ；クロンテック（Clontech））     −
上記のｃＤＮＡによりコードされるＳＩＰ５部分的タンパク質は、ＧＳＴプルダウン・アッセイ（ＳＩＰ１及びＳＩＰ２について前述）により分析したときも、インビトロでＸＳｍａｄ１、マウスＳｍａｄ２及び５のＣドメインと相互作用する。簡単に述べると、部分的ＳＩＰ５タンパク質のＣ末端にｍｙｃタグを付加し、ＣＯＳ−１細胞で発現させた。ＧＳＴ−Ｓｍａｄ Ｃドメイン融合タンパク質、ＧＳＴ−ＣＤ４０細胞質テイル及びＧＳＴ単独を大腸菌で発現させ、グルタチオン・セファロース・ビーズにカップリングさせた。その後、これらのビーズを用いて、ＣＯＳ細胞溶解物から部分的ＳＩＰ５タンパク質をプルダウンし、プルダウンされたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後の抗ｍｙｃ抗体を用いたウェスタン・ブロッティングにより証明した。このアッセイにおいて、ＳＩＰ５は、ＧＳＴ−Ｘｓｍａｄ１、２及び５のＣドメインによりプルダウンされたが、ＧＳＴ単独又はＧＳＴ−ＣＤ４０によってはプルダウンされなかった。部分ではあるが、ＳＩＰ５をコードする核酸配列を配列番号１０に表示する。
ＳＩＰ７
ＳＩＰ７の特徴決定
一つの隣接するオープン・リーディング・フレームを、ツー・ハイブリッド・ベクターｐＡＣＴ−２のＧＡＬ４トランス活性化ドメインとインフレームで融合させる。インフレームの翻訳終止コドンが存在しないため、これは部分的クローンである。このクローンの一部は、Ｗｎｔ−７ｂ、受託番号Ｍ８９８０２と相同性を示すが、クローンは新規ｃＤＮＡ又はクローニング・アーティファクトであると考えられた。ＳＩＰ７ ｃＤＮＡの既知のＷｎｔ−７ｂ ｃＤＮＡとの相同性は、ヌクレオチド３９０で開始し、ヌクレオチド８４６まで続いていた。これは、Ｗｎｔ７−ｂコーディング配列のヌクレオチド７４〜５３０に相当する（翻訳開始コドンのＡをヌクレオチド番号１と考える）。ＳＩＰ７ ｃＤＮＡにおいて、この相同領域の前にはデータベース内のいずれの配列とも相同性を示さない配列が存在する。ＳＩＰ７ ｃＤＮＡが例えば新規Ｗｎｔ７−ｂ転写物であるか否か、又はｃＤＮＡライブラリーの作製中に２つのｃＤＮＡが融合した結果の混合クローンであるか否かは明らかでない。
酵母ツー・ハイブリッド・アッセイにおける、ＳＩＰ７プレイ・タンパク質と、異なるバイト・タンパク質との相互作用の分析は以下のように要約できる。
ＰＧＢＴ９                                                −
全長ＸＳｍａｄ１                                          −
ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン                                   ＋
Ｇ４１８Ｓを有するＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン，               ＋
ａａ４２４−４６６欠失を有するＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン     −
ＸＳｍａｄ１ Ｎ末端ドメイン                               −
マウスＳｍａｄ２ Ｃドメイン                               ＋
マウスＳｍａｄ５ Ｃドメイン                               ＋
ラミン（ｐＬＡＭ）                                        −
上記のｃＤＮＡによりコードされるＳＩＰ７は、ＳＩＰ５について前述されたようなＧＳＴプルダウン・アッセイにより分析したときも、インビトロでＸＳｍａｄ１、マウスＳｍａｄ２及び５のＣドメインと相互作用する。このアッセイにおいて、Ｎ末端でｍｙｃ標識を付されたＳＩＰ７タンパク質は、ＧＳＴ−ＸＳｍａｄ１、２及び５のＣドメインにより特異的にプルダウンされたが、ＧＳＴ単独又はＧＳＴ−ＣＤ４０によってはプルダウンされなかった。部分的ではあるがＳＩＰ７をコードする核酸配列を配列番号８に表示する。
用いられた方法の一般的な説明
プラスミド及びＤＮＡ操作
この実験において用いられたマウスＳｍａｄ１及びＳｍａｄ２のｃＤＮＡは、Ｓｍａｄ５（Meerssenman et al., 1997, Mech. Dev., 61, 127〜140頁に記述されたＭＬＰ１．２クローン）をプローブとして用い、１２ｄｐｃマウス胚から作成されたオリゴｄＴでプライムされたλＥｘｌｏｘ ｃＤＮＡライブラリー（ノバゲン（Novagen））を低ストリンジェンシー条件下でスクリーニングすることにより同定された。同ライブラリーを用いて、全長ＳＩＰ１をスクリーニングし、λＥｘＴＷ６を得た。ｔｗ６ ｃＤＮＡは３．６kb長であり、ｔｈ１ ｃＤＮＡと重複していたが、インフレームの終止コドンを含む付加的な３’コーディング配列は含んでいた。付加的な５’配列は、ギブコ−ＢＲＬ５’ＲＡＣＥキットを用いた５’ＲＡＣＥにより得られた。
ＸＳｍａｄ１の全長及びＣドメインのバイト・プラスミドは、以前に記述されたＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ挿入配列（Meerssenman et al., 1997, Mech. Dev., 61, 127-140頁）を用いて構築し、ＧＡＬ４DBDとのインフレームの融合体が得られるよう、バイト・ベクターｐＧＢＴ−９（クロンテック）のＥｃｏＲＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングした。マウスＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ５を有する同様のバイト・プラスミドは、Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）並びにＥｃｏＲＩ部位及びＸｈｏＩ部位を有するプライマーを用いて、Ｃドメインをコードする各ｃＤＮＡ断片を増幅することにより作製した。Ｇ４１８Ｓ ＸＳｍａｄ１ Ｃドメインは、オリゴヌクレオチド指向突然変異（バイオラド（Biorad））により作製した。
Ｓｍａｄ ＣドメインとＧＳＴとのインフレームの融合体を作製するため、同じＳｍａｄ断片をｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア（Pharmacia））中にクローニングした。ＳＩＰ１（ＴＨ１）がインフレームの翻訳開始コドン、インフルエンザ・ウイルスのＨＡエピトープ・タグ、及び終止コドンと共にプレイ・ベクターから取り出されるよう、ｔｈ１プレイｃＤＮＡをＢｇｌＩＩで部分制限分解した後、ＳａｌＩで制限分解することにより、Ｔ７ＶＶ系において使用するためのファージＴ７プロモーターに基づくＳＩＰ１（ＴＨ１）構築物を作製した。この断片をＴ７ＶＶ系において用いるためｐＧＥＭ−３Ｚ（プロメガ（Promega））中にクローニングした。類似の方法を用いて、ＳＩＰ２（ｔｈ１２）をｐＧＥＭ−３Ｚ中にクローニングした。
オリゴテックス−ｄＴ（キアゲン（Qiagen））を用いて、１２．５ｄｐｃマウス胚からポリＡ+ＲＮＡを得た。スーパースクリプト・チョイス・システム（Superscript Choice system）（ギブコ（Gibco）−ＢＲＬ）を用いて、ランダム・プライムドｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを、ＳｔｕＩ部位及びＢａｍＨＩ部位を含む過剰のＳｆｉ二本鎖アダプターにライゲートさせた。ｃＤＮＡのクローニングを容易にするため、プレイ・プラスミドｐＡｃｔ（クロンテック）を修飾し、ｐＡｃｔ／Ｓｆｉ−Ｓｆｉを作製した。このプラスミドをＳｆｉで制限分解することにより、相補的でない付着末端が生じ、ｃＤＮＡクローニングの際のベクターの自己ライゲーションが防止される。平均で１，１００bpの挿入配列サイズを有する、３．６×１０6個の独立した組換えクローンを含むライブラリーが得られた。
ＳＩＰ１の合成及びＧＳＴプルダウン実験
Ｔ７ＶＶ系を用いた哺乳動物細胞におけるＳＩＰ１（ＴＨ１）及びＳＩＰ２（ＴＨ１２）の発現及び細胞溶解物の調製は以前に記述されたようにして行った（Verschueren, K et al., 1995, Mech. Dev., 52, 109-123頁）。
ＧＳＴ融合タンパク質を大腸菌（ＢＬ２１株）において発現させ、グルタチオン−セファロース・ビーズ（ファルマシア）で精製した。ビーズをまずプロテアーゼ阻害剤を追加したＰＢＳで４回洗浄し、次に５０μlの溶解物（Ｔ７ＶＶ感染ＳＩＰ１発現哺乳動物細胞から調製）を含む１mlのＧＳＴ緩衝液（５０mMトリス塩酸pH７．５、１２０mM ＮａＣｌ、２mM ＥＤＴＡ、０．１％（v/v）ＮＰ−４０、及びプロテアーゼ阻害剤）と混合した。それらを４℃で１６時間混合した。ＧＳＴ緩衝液で４回ビーズを洗浄することにより未結合のタンパク質を除去した。試料緩衝液中で加熱することにより結合したタンパク質を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。抗ＨＡモノクローナル抗体（１２ＣＡ５）及びアルカリホスファターゼ結合抗マウス二次抗体（アマシャム（Amersham））を用いて、ウェスタン・ブロッティングの後、オートラジオグラフィー又は免疫学的検出を用いて、分離されたタンパク質を可視化した。
ＥＭＳＡ（＝電気泳動移動度シフト・アッセイ）
セキド（Sekido）ら（1994, Mol. Cell. Biol., 14, 5692-5700頁）に開示されているように、κＥ２ ＷＴオリゴヌクレオチドと変異κＥ２オリゴヌクレオチドの配列は同一である。ＡＲＥＢ６オリゴヌクレオチドの配列は、イケダ（Ikeda）ら（1995, Eur. J. Biochem., 233, 73-82頁）から得られた。ＩＬ２オリゴヌクレオチドはウィリアムズ（Williams）ら（1991, Science, 254, 1791-1794頁）に表示されている。
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ結合部位の配列は、５’−ＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＧＴＧＴＧＡＡＴＴ−３’である。陰性対照ＧＡＴＡ２オリゴヌクレオチド配列は、エンドセリン・プロモーター由来であった（Dorfman et al; 1992, J. Biol. Chem., 267, 1279-1285頁）。二本鎖オリゴヌクレオチドをポリヌクレオチド・キナーゼ及び32Ｐγ−ＡＴＰで標識し、１５％ポリアクリルアミド・ゲルから精製した。ゲル阻止アッセイは、セキド（Sekido）ら（1994, Mol. Cell. Biol., 14, 5692-5700頁）に従い行った。
ツー・ハイブリッド・スクリーニングの結果（Ｘｓｍａｄ１ Ｃドメインバイト対１２．５ｄｐｃマウス胚ライブラリー；４×１０6個の酵母においてスクリーニングされた６００．０００組換えクローン）
ＳＩＰ１−単離された３個の独立したクローン（ｔｈ１、ｔｈ８８及びｔｈ９４）
−ジンクフィンガー・ホメオドメイン・タンパク質
−δＥＦ−１との相同性（上記参照）
−酵母における相互作用
ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン・バイト                           ＋
空のバイト                                                −
ラミン                                                    −
ＸＳｍａｄ１全長                                          −
ＸＳｍａｄ１ Ｎドメイン                                   −
ｍＳｍａｄ１ Ｃドメイン                                   ＋
ｍＳｍａｄ２ Ｃドメイン                                   ＋
ｍＳｍａｄ５ Ｃドメイン                                   ＋
４２４−４６６欠失を有するＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン         −
Ｇ４１８Ｓを有するＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン                 ＋
*ＧＳＴプルダウン及び共免疫沈降を用いてインビトロで確認されたＸＳｍａｄ１及びｍＳｍａｄのＣドメインとの相互作用
*ｔｈ１配列をプローブとして用いたライブラリー・スクリーニングにより単離された拡張クローン（ＴＷ６）
*Ｃ末端ＴＷ６ジンクフィンガー・クラスターはＥ２ボックス（ｃｆｒδＥＦ−１）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔ結合部位、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙプロモーター配列に結合する
クローンＴＨ１２とも呼ばれるＳＩＰ２−単離された３個の独立したクローン（ｔｈ１２、ｔｈ７３、ｔｈ９３）
骨髄芽球細胞系ＫＧ１から単離されたＫＩＡＡ０１５０遺伝子産物と高度に相同（Nagase et al. 1995; DNA Res 2（4）167-174を参照）
−酵母における相互作用
ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン・バイト                           ＋
空のバイト                                                −
ラミン                                                    −
ＸＳｍａｄ１全長                                          ＋
ＸＳｍａｄ１ Ｎドメイン                                   ＮＤ
ｍＳｍａｄ１ Ｃドメイン                                   ＋
ｍＳｍａｄ２ Ｃドメイン                                   ＋
ｍＳｍａｄ５ Ｃドメイン                                   ＋
４２４−４６６欠失を有するＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン         −
Ｇ４１８Ｓを有するＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン                 ＋
ＴＨ６０−単離された２個の独立したクローン（ｔｈ６０及びｔｈ７７）
−ジンクフィンガー・タンパク質
ｓｎａｉｌ（転写抑制因子）及びＡＴＢＦ１（複合体ホメオドメイン・ジンクフィンガー・タンパク質）に相同
−酵母における相互作用：
ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン・バイト                           ＋
空のバイト                                                −
ラミン                                                    −
ＴＨ７２−単離された１個のクローン
−部分的ＤＰＣ−４（Ｓｍａｄ４）ｃＤＮＡをコードする（上記参照）
−酵母における相互作用：
ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン・バイト                           ＋＋＋
空のバイト                                                −
ラミン                                                    −
ＸＳｍａｄ１全長                                          ＮＤ
ＸＳｍａｄ１ Ｎドメイン                                   −
ｍＳｍａｄ１ Ｃドメイン                                   ＋＋＋
ｍＳｍａｄ２ Ｃドメイン                                   ＮＤ
ｍＳｍａｄ５ Ｃドメイン                                   ＋＋＋
４２４−４６６欠失を有するＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン         −
Ｇ４１８Ｓを有するＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン                 ＋
ＳＩＰ５（クローンｔｈ７６とも呼ばれる）
酵母ツー・ハイブリッド・アッセイにおける、異なるバイト・タンパク質（ＳＩＰ１で得られたデータ・セクションに記述されている）とのＳＩＰ５プレイ・タンパク質の相互作用の分析は、以下のように要約できる。
空のバイト・ベクターｐＧＢＴ９                            −
全長ＸＳｍａｄ１                                          ＋
ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン                                   ＋
Ｇ４１８Ｓ置換を有するＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン             ＋
マウスＳｍａｄ２ Ｃドメイン                               ＋
マウスＳｍａｄ５ Ｃドメイン                               ＋
ラミン（ｐＬＡＭ；クロンテック）                          −
ＳＩＰ７（クローンｔｈ７４とも呼ばれる）
酵母ツー・ハイブリッド・アッセイにおける、異なるバイト・タンパク質とのＳＩＰ７プレイ・タンパク質の相互作用の分析は、以下のように要約できる。
ＰＧＢＴ９                                                −
全長ＸＳｍａｄ１                                          −
ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン                                   ＋
Ｇ４１８Ｓを有するＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン                 ＋
ａａ４２４−４６６欠失を有するＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン     −
ＸＳｍａｄ１ Ｎ末端ドメイン                               −
マウスＳｍａｄ２ Ｃドメイン                               ＋
マウスＳｍａｄ５ Ｃドメイン                               ＋
ラミン（ｐＬＡＭ）                                        −
以下のクローンは、充分に調査されていない。それらは、ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン・バイトとは相互作用するが、空のバイト（即ち、ＧＡＬ−４ＤＢＤ単独）とは相互作用しないため、「真の陽性」であると考えられる。
ＴＨ７５：−単離された３個の独立したクローン（ｔｈ７５、ｔｈ８３及びｔｈ８９）
−部分的ａａ配列は公共のデータベース内のタンパク質と有意な相同性を示さない
−酵母における相互作用
ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン・バイト                           ＋＋＋
空のバイト                                                −
ＴＨ９２：−ジンクフィンガー・タンパク質
−ＫＵＰと相同
ＴＨ７９、ＴＨ８６、ＴＨ９０：部分的配列は公共のデータベース内のいずれのタンパク質配列とも有意な相同性を示さない
クローン表記から配列表表記への変換表としての配列表において利用可能なクローン
ＳＩＰ１ヌクレオチド配列                      ＝配列番号１
ＳＩＰ１アミノ酸配列                          ＝配列番号２
ＳＩＰ２ヌクレオチド配列                      ＝配列番号３
ＳＩＰ２アミノ酸配列                          ＝配列番号４
ＴＨ６０（ＴＨ７７）                          ＝配列番号５
ＴＨ７２（ＤＰＣ４又はＳｍａｄ４）            ＝配列番号６
ＴＨ７２Ｒ                                    ＝配列番号７
ＳＩＰ７（ｔｈ７４）                          ＝配列番号８
ＴＨ７５Ｆ（ＴＨ８３Ｆ、ＴＨ８９Ｆ）          ＝配列番号９
ＳＩＰ５（ｔｈ７６）                          ＝配列番号１０
ＴＨ７９Ｆ                                    ＝配列番号１１
ＴＨ７９Ｒ                                    ＝配列番号１２
ＴＨ８３Ｒ                                    ＝配列番号１３
ＴＨ８６Ｆ                                    ＝配列番号１４
ＴＨ８６Ｒ                                    ＝配列番号１５
ＴＨ８９＝ＴＨ７５Ｒ                          ＝配列番号１６
ＴＨ９０Ｆ                                    ＝配列番号１７
ＴＨ９０Ｒ                                    ＝配列番号１８
ＴＨ９２Ｆ                                    ＝配列番号１９
ＴＨ９２Ｒ                                    ＝配列番号２０
図１の説明
ＸＳｍａｄ１ Ｃドメインは哺乳動物細胞においてＳＩＰ１と相互作用し、ＳＩＰ１内の５１ａａ長のＳＢＤ（Ｓｍａｄ結合ドメイン）の欠失は相互作用を消失させる。Ｎ末端にｍｙｃタグを付加されたＳＩＰ１及びＧＳＴ−ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン融合タンパク質をコードする発現構築物で、ＣＯＳ−１細胞を一過性形質転換した。ＧＳＴ−ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン融合タンパク質を、グルタチオン−セファロース・ビーズを用いて細胞抽出物から精製した。精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＧＳＴ抗体（ファルマシア）を用いたウェスタン・ブロッティングの後可視化した（パネルＡ、細い矢印）。ｍｙｃタグを付加されたＳＩＰ１タンパク質がＧＳＴ−ＸＳｍａｄ１ Ｃドメイン融合タンパク質と共に共精製されたことが、抗ｍｙｃモノクローナル抗体（サンタクルーズ（Santa Cruz））を用いた同材料のウェスタン・ブロッティングにより示された（パネルＣ、レーン１、太い矢印）。ＳＩＰ１内の５１ａａ長のＳＢＤの欠失は、この相互作用を消失させた（パネルＣ、レーン２）。全細胞抽出物中の精製されたＧＳＴ−ＸＳｍａｄ１ Ｃドメインタンパク質の量及び両方のＳＩＰ１（野生型及びＳＢＤ欠失ＳＩＰ１）タンパク質の発現のレベルがほぼ同程度であることに注意されたい（パネルＡ及びＢのレーン１及び２を比較せよ）。
配列表
0004108768.tif 000005
0004108768.tif 000006
0004108768.tif 000007
0004108768.tif 000008
0004108768.tif 000009
0004108768.tif 000010
0004108768.tif 000011
0004108768.tif 000012
0004108768.tif 000013
0004108768.tif 000014
0004108768.tif 000015
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