(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択膜、トランスデューサー部、液流の注入口および排出口を備えた溶液中の被検物質を選択的に検出するための化学センサーにおいて、上記液流中に認識要素を注入するための手段、トランスデューサー部と選択膜の間に設けられた空間部、トランスデューサー部と選択膜が貫流チャンバーを形成していること、上記膜の片面が上記被検物質を含有する上記溶液と接触していること、被検物質が選択膜を通過して認識要素と相互作用をすること、この相互作用を上記トランスデューサー部が上記溶液中の被検物質濃度に比例するシグナルに変換すること及び選択膜が、透析膜、イオン交換膜、ガス透過性膜、被検物質選択膜および被検物質群または単一被検物質の選択的遮蔽膜からなる群より選ばれることを特徴とする動的初期変化測定過程に基づく化学センサー。
【請求項２】
トランスデューサー部が電気化学的、光学的、磁気的、音響的／ピエゾ電気的もしくは熱的トランスデューサーまたはそれらの組合せである請求項１記載の化学センサー。
【請求項３】
トランスデューサー部が電流測定型トランスデューサーである請求項１または２記載の化学センサー。
【請求項４】
トランスデューサー要素がｐＨトランスデューサーである請求項１から２のいずれか一項に記載の化学センサー。
【請求項５】
化学センサーが貫流チャンバーに液流をポンプで送るための手段をさらに備えていることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の化学センサー。
【請求項６】
化学センサーが、生物学的起源の触媒性または非触媒性認識要素を使用して被検物質を検出するために、すなわち、バイオセンサーとして配置されていることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の化学センサー。
【請求項７】
認識要素を被検物質含有溶液と選択膜を介して接触させ、この接触によりトランスデューサー部で検出可能な応答を生じさせる溶液中の被検物質の選択的検出するための動的初期変化測定過程に基づく方法において、認識要素を液流中に注入し、当該液流をトランスデューサー部および選択膜を備えた貫流チャンバー内を通過させ、ここで選択膜の外側の溶液から透過する被検物質と接触させ、認識要素と被検物質との相互作用によりシグナルを発生させ、これをトランスデューサー部で検出すること及び選択膜として透析膜、イオン交換膜、ガス透過性膜、被検物質選択膜または被検物質群もしくは単一被検物質の選択的遮蔽膜を用いることにより認識要素の被検物質含有溶液への漏出を防止または低下させることを特徴とする方法。
【請求項８】
認識要素を含有する液流をして検出時に貫流チャンバーを連続的に通過せしめる請求項７記載の方法。
【請求項９】
認識要素を含有する液流をして検出時に貫流チャンバー内に滞留せしめる請求項７記載の方法。
【請求項１０】
貫流チャンバー内を一連の異なる認識要素をして通過せしめる請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
貫流チャンバー内を酵素の混合物をして通過せしめる請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
トランスデューサー部および／または選択膜を再生するため、貫流チャンバーに緩衝溶液または洗浄溶液を通す請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
トランスデューサー部を電気的クリーニングによって再生する請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
試薬、メディエーター、指示薬および安定剤からなる群より選ばれる他の物質を貫流チャンバー内にさらに導入する請求項７から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
トランスデューサー部による検出が電気化学的、光学的、磁気的、音響的／ピエゾ電気的もしくは温度測定的特性またはそれらの組合せである請求項７から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
認識要素が生物学的起源の要素である請求項７から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
認識要素が触媒性要素または非触媒性要素から選ばれる請求項７から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
反応システム、フローシステムまたはインビボシステム内の被検物質を検出する目的での請求項１から６のいずれか一項に定義された化学センサーの使用。
【請求項１９】
オンラインおよび／またはインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）測定を目的とする請求項１から６のいずれか一項に定義された化学センサーの使用。
【請求項２０】
高温での測定を目的とする請求項１から６のいずれか一項に定義された化学センサーの使用。
【請求項２１】
過酷な化学環境における測定を目的とする請求項１から６のいずれか一項に定義された化学センサーの使用。
【請求項２２】
高ｐＨ値もしくは低ｐＨ値、高塩濃度および／または変性物質の存在下での測定を目的とする請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
認識要素の使用および不使用による示差測定を目的とする請求項１から６のいずれか一項に定義された化学センサーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の被検物質を選択的に検出する化学センサー、溶液中の被検物質を選択的に検出する方法および上記化学センサーの使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
化学センサーとは、複合メジウム（サンプル溶液）中の標的分子（被検物質）を選択的に検出し、検討対象である被検物質の濃度に比例するシグナルを出力する装置である。化学センサーは、いわゆる認識要素とトランスデューサー部品という２つの隣接する構成部品からできている。認識要素の機能は、サンプル溶液中に存在する被検物質に選択的に結合することである。結合に際して、結合またはそれに続く化学現象を、トランスデューサー部品の定量可能な電気的出力シグナルに変換しなければならない。様々な認識要素とトランスデューサー部品の多数の組合せがこれまでに報告されている1,2,3）。認識要素は、生物的起源か非生物的起源か、それが触媒的特性を有するか非触媒的特性を有するかによって分類することができる（表１参照）。トランスデューサー部品は、様々な操作原理に基づいて作動し、このような原理としては、電気化学的、光学的、磁気的、音響的／ピエゾ電気的または温度測定的特性が挙げられる。
化学センサーの性能は選択性、感度、安定性、応答時間および再利用性のようなパラメーターによって表示することができる。これまでに多数の様々な概念のセンサーが提出されてきた中で、いわゆるバイオセンサーは、選択性と感度の点で、多数の被検物質に対して極めて有望な性質を示してきた。しかし残念なことに、バイオセンサーの機能が生物学的起源の認識要素を基盤とするために、その安定性は十分ではない。
Enfors，S-0とNilsson，H，1979（４）には、手動で交換可能な認識要素を有するバイオセンサーが記載されている。このバイオセンサーは酵素の溶液をバイオセンサーに注入することによって作動する。応答はｐＨシグナルとして測定される。大過剰の酵素溶液を使用しなければならない。上記の著者らは信頼できるｐＨ応答値を得るためには溶液をバイオセンサー内で静置しておかなければならない、と述べている。新たな測定を開始できるようになる前に被検物質と形成した酵素産物をバイオセンサーから外部に拡散させなければならないことから、再生には時間を要するものと思われる。しかも、このシステムには、第二のトランスデューサー部品すなわち周囲のサンプル溶液のｐＨを測定するｐＨ電極を導入する必要もある。
GBF，Scientific Annual Report 1990,62-63および126-127頁,”Biosensors for Pesticides in Water”には液流を基盤とし、これに様々な物質を注入したバイオセンサーが記載されている。液流は抗体が固定化された選択膜反応器を通過している。すなわち、このバイオセンサーは、固定した認識要素によって液流中の被検物質を検出することを基本とするものである。
フローインジェクション分析（Flow Injection Analysis，ＦＩＡ）における様々なアプローチでは、サンプルの前処理を必要とし、貫流系／検出器の汚染の可能性があり、過酷な化学環境下における操作は不可能であり、オンラインまたはインサイチュ（in situ)でのモニタリングは不能で、サンプルを採取しなければならない（Ruzicka，J．& Hansen,E.T.”Flow Injection Analysis”，John Wiley &Sons，NY，1981）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明の一面においては、新型の化学センサーが提供される。
本発明の他の面においては、溶液中の被検物質を選択的に検出する方法が提供される。
本発明のさらに他の面においては、本発明によるセンサーの異なる応用への利用が提供される。
本発明を、添付の図面を参照しながら以下にさらに詳細に説明する。
本発明の第一の面では、貫流チャンバー２、選択膜３、トランスデューサー部４、認識要素を含有する液流の注入口５および排出口６を備えた、溶液中の被検物質を選択的に検出する化学センサー１が提供される。
その第二の面によれば、本発明は、認識要素を被検物質含有溶液と選択膜を介して接触させ、この接触によってトランスデューサー部で検出可能な応答を生じさせ、それによって該認識要素を液流中に注入し、該液流をトランスデューサー部と選択膜とを備えた貫流チャンバーを通過させ、ここで選択膜の外側の溶液から透過する被検物質と接触させて、認識要素と被検物質の相互作用によりシグナルを発生させ、これをトランスデューサー部で検出する、溶液中の被検出物質の選択的検出方法を提供する。
本発明の第三の面では、反応システム、フローシステムまたはインビボ(in vivo）システムにおいて被検物質を検出するための化学センサーの利用が提供される。
本発明において、認識要素が生物学的起源のものである場合には、従来技術のバイオセンサーが示す有望な特性、すなわち極めて多様な被検物質に対する選択性および感度と同時に、これまで達成されなかった極めて重要な安定性を示す、全く新しいタイプのバイオセンサーが創成される。
本発明においては、バイオセンサーへ認識要素を注入するため、上述の性質に加え既知の化学センサーと比較して以下の有利な新たな特徴および利点を提供する。すなわち、分析がより迅速となり、応答時間が短縮され、さらに認識要素の汚染および不活性化の危険を防止することが可能になる。この理由は、測定過程が動的であり初期変化をサンプル溶液中の被検物質濃度に関係づけることが可能とするからと認識要素を再生させる必要がないためである。本発明によれば、複数種の被検物質の同一のトランスデューサー部による一連の検出も可能である。また、本発明によれば、干渉化合物の影響を低減させるために認識要素を用いておよび用いずして示差測定を行うことも可能である。
これらの新たな特徴および利点はすべて、経済的に極めて重要であり、工業、医療および研究分野における新たな応用に機会を提供するものである。
本発明は、反応システム、フローシステムまたはインビボシステムにおいて、単一または複数の被検物質を検出するために使用することができる。本発明はまた、オンラインおよび／またはインサイチュ（in situ)測定にも、また高温および過酷な化学環境下、たとえば高ｐＨ値もしくは低ｐＨ値、高塩濃度および／または変性物質の存在下での測定にも使用できる。本発明の使用にはさらに、認識要素の使用および不使用による示差測定における使用がある。
トランスデューサー部としては、電気化学的、光学的、磁気的、音響的／ピエゾ電気的もしくは熱的トランスデューサー、またはそれらの組合せが使用できる。
とくに好ましい態様においては、トランスデューサー部は電流測定型トランスデューサーである。他の好ましい態様においてはトランスデューサー部はｐＨトランスデューサーである。
本発明に使用するのに好ましい選択膜は、透析膜、イオン交換膜、ガス透過性膜、被検物質選択膜および被検物質群または単一被検物質の選択的遮蔽膜である。
本発明の化学センサーはまた、貫流チャンバーに液流をポンプで送るための手段や液流中に認識要素を注入するための手段を備えていてもよい。
他の好ましい態様においては、化学センサーは、認識要素として生物学的起源の触媒性または非触媒性物質を用いて、生物学的被検物質の検出用に配置されている。他の種類の認識要素は以下の表に掲げる。
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認識要素として使用される酵素の具体例にはオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼおよびヒドロラーゼがある。
測定は、検出時に認識要素を貫流チャンバーを連続的に通過させることによっても、認識要素を貫流チャンバーに滞留させることによっても実施できる。
本発明の特筆すべき利点は緩衝溶液または洗浄溶液を数分間のような短時間、貫流チャンバーを通過させることによりトランスデューサー部および／または選択膜の簡単で迅速な再生が可能なことである。電気化学的トランスデューサーはまた電気クリーニング操作として、すなわち極値間（たとえば±２Ｖ）での作用電極電位の掃引を用いて再生できる。これは、認識要素が固定化されるのではなく、液流中に注入されることによるものである。このほかの大きな利点は極めて微量の認識要素しか必要としないことである。すなわち、認識要素としてたとえば酵素溶液を用いる場合、必要な容量はわずかに1〜100μlのオーダーである。
本発明は新型の化学センサーに関し、その作動原理は注入可能である認識要素に基づく（図１）。緩衝溶液Ａは、注入口（５）側または排出口（６）側に配置され吸引様式で作動するポンプ部７により、インジェクター８を通して送り込まれる。認識要素Ｂは緩衝溶液中に注入され、トランスデューサー部４と選択膜３の間の空間に流入される。選択膜の逆側はサンプル溶液Ｅと接触している。被検物質はこの膜を通過して認識要素と相互作用することが可能で、この化学過程がトランスデューサー部により、サンプル溶液中の被検物質の濃度に比例する電気的出力シグナルＦに変換される。液流は最終的に廃液容器Ｓに収集される。
この構成はまた、一連の注入可能な異なる認識要素Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３・・・によりサンプル溶液中の様々な被検物質を一連に検出する多重センサー機能を可能にする。また、複数の酵素の混合物を注入することも可能であり、各酵素は特異的応答（ｐＨ，Ｈ2Ｏ2，発色産物・・・）を与え、その応答は使用される複数のトランスデューサーの一つにより検出される。さらに、他の物質、たとえば試薬、メディエーター、指示薬および安定剤を認識要素とともにトランスデューサー部と選択膜の間に存在させることもできる。洗浄溶液を定期的にトランスデューサー部と選択膜の間に通して、その迅速な再生を行うことも可能である。
本発明は、反応システム、密閉もしくは開放容器（たとえば発酵器）中またはフローシステム中（インビボ適用を含む）における１種またはそれ以上の被検物質の検出に使用することができる。
本発明の好ましい一態様においては、被検物質の検出に電流測定型トランスデューサーが使用される。本発明のバイオセンサーに使用される定電位三電極システムでの測定用に設計されたこの種のトランスデューサーの一例を図２に示す。このトランスデューサーは、作用電極として働く白金線、ステンレス鋼補助電極、および外部Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を備えている。センサーは直径１mmの銀線をＡｇ／ＡｇＣｌで被覆した内部参照電極も有している。
以下の例は本発明の態様をわかりやすい例としてのみ示すものであって、請求の範囲に定義された本発明を限定するものと解すべきではない。
【実施例】
【０００４】
例１
本発明を例示するため、上述の原理に従い、トランスデューサー部としてｐＨ電極を用いた尿素（バイオ）センサーを構築して予備的試験を行った。図３から明らかなように、センサーのｐＨ応答はサンプル溶液中の尿素含量と相関関係がある。濃度範囲は臨床治療に関連の深い０〜５ｍＭである。
さらに、干渉する可能性がある物質、たとえばグルコース、アセトン、クエン酸および酢酸ナトリウムの作用を検討した（表２参照）。
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これらの物質はｐＨ応答に影響しなかった。銅イオンが使用済みの認識要素、つまり酵素尿素の触媒能を阻害することは周知であり、したがってサンプル溶液中にこの種のイオンが存在するとすればｐＨ応答が低下したことは驚くべきことではない。しかしながら、この作用は銅イオンと反応する安定剤（たとえば、銅イオンと強力な錯体を形成するＥＤＴＡ）を共存させると、すなわち酵素とともに注入すると完全に消失させることができるはずである。
最後に、尿素（バイオ）センサーのｐＨ応答を高温において測定して解析した（図４参照）。これらの測定において、本発明によるセンサーは、たとえば50℃の高温では速やかに不活性化される慣用のバイオセンサーに比べて、その優位性を示している。この場合、ｐＨ応答は25％の低下を生じたのみであった。
例２
この試験では注入可能な認識要素（グルコースオキシダーゼ）を有するバイオセンサーを用い、ヤナギ水解物の発酵から得られる粗サンプル中のグルコース濃度を測定した。
材料および方法
酵母：パン酵母，Saccharomyces cerevisiae
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を発酵に使用した。
リグノセルロース水解物の調製：ヤナギ，Salix capreaを205℃で６分間蒸気前処理に付した［２］。前処理材料を水洗し、Larox圧搾ろ過装置によって圧力14バールでろ過した。セルロース繊維は、攪拌タンク中Celluclast（20％w/w)およびNovozyme（5％w/w)(Novo Nordisk，Denmark）を用い、30℃、ｐＨ4.8において90時間加水分解した。
発酵：2.5g・ｌ-1の酵母エキス，0.25g・ｌ-1の（ＮＨ4）2ＰＯ4,0.0025g・ｌ-1ＭｇＳＯ4・7Ｈ2Ｏおよび0.1ＭのＮａＰＯ4を上記リグノセルロース水解物に供給し、最終細胞濃度6g/ｌに接種した。発酵は16ｌのメジウムを含有する22ｌの発酵器（Bioengineering，Switzerland)中30℃，ｐＨ5.5，攪拌速度300rpmにおいて実施した。
バイオセンサーによるグルコースの測定：発酵器から採取したサンプル中のグルコース濃度を、本発明のバイオセンサーを用いて測定した。使用した移動相緩衝液は0.15Ｍの食塩を含有する0.1Ｍのリン酸ナトリウム（pH6.0)であった。流速は0.2ml／分に設定した。認識要素、つまりグルコースオキシダーゼ溶液（移動相緩衝液中１mg/ml）を移動相に注入し、それがバイオセンサーチャンバーに到達した時点で、液流を停止させた。電流の読み（ＥＲ）を48秒後に記録した。さらに、移動相緩衝液を代わりに注入する以外は同様の手順でバックグランド電流の読み（Ｂｒ）を記録した。バイオセンサーの応答はこれら２つの電流の読みの差（ＥＲ−Ｂｒ）として計算した。バイオセンサーは標準グルコース溶液（移動相緩衝液中０〜50g/l）により検量した。酵母細胞を除去してグルコースの消費を停止させるため、発酵器からのサンプルは遠心分離した（1000rpmで５分間）。その後非希釈サンプルについてバイオセンサーによる測定を実施した。
ＨＰＬＣによるグルコースの分析：発酵培地からのサンプルを0.2μm膜フィルター（Sartorius，Germany）を通してろ過し、ＨＰＬＣ（Shimadzu，Japan）により分析した。グルコースとエタノールをAminex HPX-87Hカラム（Bio-rad，USA）を用いて45℃で分離し、屈折率検出計（Waters Millipore，USA）によって検出した。移動相としては５ｍＭのＨ2ＳＯ4を流速0.6ml/分で用いた。
図５は、発酵器中のグルコース濃度を発酵時間の関数として示したグラフである。
図６は、本発明のバイオセンサーによって（非希釈サンプルについて）得られた結果とＨＰＬＣ分析によって（希釈サンプルについて）得られた結果の比較を示す。
結果および考察
ＨＰＬＣによる測定と異なり、本発明のバイオセンサーによって実施した測定は、リグノセルロース水解物の複合マトリックス中に存在する干渉化合物によって影響されず、したがってグルコース濃度を非希釈サンプルでモニタリングすることができた（図４）。認識要素は、この場合はグルコースオキシダーゼであったが、高度に特異的で、標的被検物質にのみ応答する。サンプル成分の直接酸化によって生じることのあるバックグランド電流の補償を可能にするよう示差測定法を使用する。サンプルの前処理は不必要で、測定は希釈もろ過もしないサンプルについて行った。本発明による測定の前に酵母細胞が充分早期に除去されなかったので本発明の方法を用いて得た各サンプルに対するグルコース濃度は、発酵が継続しているため、サンプルを直ちにろ過し酵母細胞を除去してＨＰＬＣ分析によって得られた値よりもわずかに低くなったのである（図５）。測定を本発明によるセンサーによって実施したのち、ＨＰＬＣ分析を再度行ったところ、結果は観察されたグルコース濃度の低下を確認するものであった（データは示していない）。エタノール発酵の１回のＨＰＬＣ分析には発酵培地中に存在する全化合物の溶出に少なくとも30分を要するのに対し、本発明によるセンサーを用いた場合の分析時間は５分を越えず、センサーの再生には全く時間がかからないので、これは分析回数を著しく多くできることを意味する。このセンサーは極めて広い濃度範囲をカバーし、２μＭグルコースまでの低濃度の検出が可能である。本発明によるセンサーは発酵過程のインサイチュでのモニタリングに適している。このセンサーによれば、インサイチュでの滅菌が可能であり、したがって汚染の危険を最小限にすることができる。発酵の間に再生が必要な場合には、清浄化剤の注入もしくは電極への高電位（±２Ｖ）の適用によって再生を行うことができる。各アッセイ毎に新鮮な酵素溶液（10μl）が注入されるので、生物学的成分の失活が起こることはないであろう。分析の自動化は自動注入機を電極に連結することによって容易に達成される。現在までに、５種の異なる酵素が、尿素、グルコース、ガラクトース、ラクテートおよびＬ-アミノ酸の検出のための認識要素として評価されている。数種の培地成分の測定が、一連の異なる酵素の注入によって可能になるであろう。
過酷な化学環境下での測定に対する本発明の有用性を証明するために、オレンジジュース、コカコーラ（登録商標）、コカコーラ（登録商標）ライトおよびペプシコーラ（登録商標）中のグルコース含量を測定し、良好な結果が得られている。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】本発明の化学センサーの一態様の模式図である。
【図２】本発明のバイオセンサーに使用するのに適した電流測定型トランスデューサーの断面図である。
【図３】本発明の尿素バイオセンサーのｐＨ応答をサンプル溶液中の尿素濃度の関数として示したグラフである。
【図４】本発明の尿素バイオセンサーのｐＨ応答を温度の関数として示したグラフである。
【図５】本発明のバイオセンサーを使用して非希釈サンプルについて測定した発酵槽中のグルコース濃度を発酵時間の関数として示したグラフである。
【図６】本発明のバイオセンサーによって（非希釈サンプルについて）得られた結果をＨＰＬＣ分析によって（希釈サンプルについて）得られた結果と比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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