(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における急性期タンパク質の産生の低下を誘導する方法であって、前記細胞を、前記急性期タンパク質の産生を低下させるのに十分な量のIL-TIF調節物質と接触させることを含み、その調節物質がIL-10Rβ分子に特異的に結合する抗体であり、該急性期タンパク質がヒト血清アミロイドA 、α1-アンチキモトリプシン、またはハプトグロビンである方法。
【請求項２】
前記細胞が肝細胞である請求項１の方法。
【請求項３】
前記IL-TIFが哺乳類IL-TIFである請求項１の方法。
【請求項４】
前記哺乳類IL-TIFがヒトIL-TIFである請求項３の方法。
【請求項５】
前記ヒトIL-TIFが配列番号25または配列番号26によってコードされる請求項４の方法。
【請求項６】
IL-TIF分子の活性を調節する方法であって、IL-TIF活性に対して感受性を持つ細胞を、IL-TIF活性を調節するのに十分な量のIL-TIF調節物質と接触させることを含み、その調節物質がIL-10Rβ分子に特異的に結合する抗体である方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本願は、出願番号第09/419,568号（1999年10月18日出願）の一部継続出願であり、前記第09/419,568号は出願番号第09/354,243号（1999年7 月16日出願）の一部継続出願であり、さらに前記第09/354,243号は出願番号第09/178,973号（1998年10月26日出願）の一部継続出願である。これらの出願は全て参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は新たに単離された核酸分子およびそれらの用途に関する。これらの核酸分子はサイトカイン・インターロイキン9 （「IL-9」）によってアップレギュレートされることを明らかにする。また、これらの核酸分子によってコードされるタンパク質も開示する。これらの分子は「T 細胞由来誘導性因子」または「TIF 」と記載されていたが、現在では「インターロイキン-21 」または「IL-21 」、ならびに「IL-TIF」として知られている。そのため、本明細書ではこれらの用語を可換的に使用することにする。これらの核酸分子は、細胞においてSTAT活性化を誘導するタンパク質をコードする。これらは、例えば標的組織の再生の刺激などに使用することができる。さらに、その阻害剤またはアンタゴニストは、他の組織の分化を遅延、防止または阻害するために使用することができる。
【０００３】
（背景および従来技術）
免疫系とその調節に関する知識はこの十年間に著しく増加した。特に重要な一領域は、免疫系を調節するタンパク質および糖タンパク質に関する研究領域であった。最もよく知られているこれらの分子のファミリーの一つはサイトカインである。サイトカインは細胞相互間の「コミュニケーション」に関与する分子である。サイトカインファミリーの個々の構成要員は、広範囲にわたる種々の病理学的状態、例えば癌およびアレルギーなどに関与することがわかっている。サイトカインは、それらの状態の病理に関与する場合もあるが、治療上有用であることも知られている。
【０００４】
インターロイキンはサイトカインの一種である。インターロイキンについては膨大な文献がある。この分野の代表的な特許としては、Mertelsmann らの米国特許第4,778,879 号、Stern の米国特許第4,490,289 号、Markらの米国特許第4,518,584 号、およびMiyajiらの米国特許第4,851,512 号（これらは全てインターロイキン2 （「IL-2」）に関する）が挙げられるが、これらに限るわけではない。その他、インターロイキン1 （「IL-1」）に関する特許、例えばCosmanの米国特許第4,808,611 号なども発行されている。これらの特許の開示はいずれも参照により本明細書に組み込まれる。他のインターロイキンに関する最近の特許には、例えば米国特許第5,694,234 号（IL-13 ）、第5,650,492 号（IL-12 ）、第5,700,664 号、第5,371,193 号および第5,215,895 号（IL-11 ）、第5,728,377 号、第5,710,251 号、第5,328,989 号（IL-10 ）、第5,580,753 号、第5,587,302 号、第5,157,112 号、第5,208,218 号（IL-9）、第5,194,375 号、第4,965,195 号（IL-7）、第5,723,120 号、第5,178,856 号（IL-6）、ならびに第5,017,691 号（IL-4）などがある。これらの特許文献を概観しただけでも、インターロイキンファミリーの構成要員の性質の多様性がわかる。さらに大きいサイトカインファミリーになれば、多様性はさらに増加すると推定できる。例えばAggarwalら編「Human Cytokines: Handbook For Basic And Clinical Research 」1992年，Blackwell Scientific Publications 、Paul編「Fundamental Immunology」1993年，Raven Press ，p.763-836 ，「T-Cell Derived Cytokines And Their Receptors」および「Proinflammatory Cytokines and Immunity」を参照されたい。引用した文献は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０００５】
様々なサイトカイン間の関係は複雑である。ここに引用した文献からわかるように、個々のサイトカインのレベルは増減するので、これは対象によって産生される他の分子のレベルに直接的または間接的な影響を及ぼしうる。影響を受ける分子には他のサイトカインも含まれる。
【０００６】
以前「P40 」と呼ばれていたリンホカインIL-9は、最初はT4細胞株の抗原非依存的永久増殖を維持する因子として同定されたT 細胞由来分子である。例えば、Uyttenhoveら,Proc.Natl.Acad.Sci.85:6934 （1988）およびVan Snick ら,J.Exp.Med.169:363（1989）を参照されたい。これらの文献は、Simpson ら,Eur.J.Biochem.183:715（1989）と共に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００７】
IL-9の活性は、最初は限られたT4細胞株に観察され、CTL または新鮮単離T 細胞には活性を認めることができなかった。例えばUyttenhoveら（前掲）およびSchmitt ら,Eur.J.Immunol.19:2167（1989）を参照されたい。この活性の範囲は、Hultner らがEur.J.Immunol.および米国特許第5,164,317 号に記載しているように（これらは参照によって本明細書に組み込まれる）、IL-9およびT 細胞成長因子III （「TCGF III」）と呼ばれる分子は、IL-3に対する骨髄由来マスト細胞の増殖応答を強化する因子MEA （マスト細胞成長促進活性）と同一であることが、実験的に明らかになったことによって拡大した。ヒト型のIL-9が巨核芽球性白血病細胞の増殖を刺激することもわかった。Yangら,Blood 74:1880（1989）を参照されたい。IL-9に関する研究によって、IL-9が赤芽球コロニー形成を支援すること（Donahue ら,Blood 75(12):2271-2275 （6-15-90 ））、骨髄赤芽球バースト形成細胞の増殖を促進すること（Williamsら,Blood 76:306-311 （9-1-90）、そして成人および胎児由来のBFU-E のクローン成熟を支援すること（Holbrookら,Blood 77(10):2129-2134 (5-15-91) ）も明らかになっている。IL-9の発現は、ホジキン病および大細胞型退形成リンパ腫にも関連づけられている（Merzら,Blood 78(8):1311-1317（9-1-90））。気管支反応亢進を発症しやすいまたは発症しにくいマウスの遺伝子解析によって、IL-9遺伝子との連鎖ならびにこのモデルにおけるIL-9産生と感受性との相関関係が解明された（Nicolaidesら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,13175-13180,1997 ）。ヒト遺伝子研究でもIL-9およびIL-9R 遺伝子が喘息の候補として示されている（Doull ら,Am.J.Respir.Crit.Care Med.,153,1280-1284,1996、Holroyd ら,Genomics 52,233-235,1998 ）。また、IL-9トランスジェニックマウスにより、IL-9発現が肺肥満細胞症、過好酸球増加症、気管支反応亢進および高レベルのIgE をもたらすことの証明も可能になった（Temannら,J.Exp.Med.188,1307-1320,1998 、Godfraind ら,J.Immunol.160,3989-3996,1998 、McLaneら,Am.J.Resp.Cell.Mol.19:713-720（1999））。これらの知見を総合すると、IL-9はこの疾患に主要な役割を果たすことが強く示唆される。他の研究でも、IL-9およびこのサイトカインの突然変異タンパク質が喘息およびアレルギーに関連づけられている。例えば、PCT 出願US96/12757（Levittら）およびPCT/US97/21992（Levittら）を参照されたい（これらの出願はどちらも参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００８】
IL-9は対象における他の分子のレベルにも影響を及ぼすことが知られている。Louahed ら,J.Immunol.154:5061-5070（1995）、Demoulinら,Mol.Cell.Biol.16:4710-4716 （1996）を参照されたい（これらの文献はどちらも参照により本明細書に組み込まれる）。影響を受ける分子が生体系でそれら自身の機能を持つことは理解されるだろう。例えばDemoulinらは、IL-9の既知の活性の多くが、STAT転写因子の活性化によって媒介されることを明らかにしている。したがって、その存在および/ またはレベルが他の分子、例えばサイトカインなどによる影響を受ける分子を同定する努力には、絶えず関心が払われている。
【０００９】
本明細書では、そのような分子を、以下に記載する。本発明のタンパク質をコードする核酸分子はIL-9の存在下では発現されるが、IL-9の不在下では発現されないことがわかった。したがって、これらの分子は、とりわけ、対象におけるIL-9の発現または効果の「マーカー」となる。かつてT 細胞由来誘導性因子または「TIF 」と呼ばれていたこれらの分子は、現在インターロイキン21または「IL-21 」と呼ばれている。本発明のこれらの特徴および他の特徴は以下の説明から理解されるだろう。
【００１０】
（好ましい態様の詳細な説明）
実施例1
ネズミリンパ腫細胞株BW5147は、培養培地にサイトカイン類を添加しなくてもインビトロで成長することができる細胞としてよく知られている。IL-9によって誘導される遺伝子を同定するために、IL-9（200U/ml ）を添加して、またはIL-9を添加せずに、BW5147の試料を24時間培養した。次に、グアニジンイソチオシアネート溶解およびCsCl勾配遠心分離によって全RNA を単離した。これらの技術は当技術分野ではよく知られている。続いて、オリゴ(dT)セルロースカラムを使って、ポリアデニル化RNA を全RNA から精製した。次に、単離されたポリA RNA を使って、二本鎖cDNAを作製した。市販のオリゴ(dT)プライマーを使用した。3 〜5 μg のポリA RNA を1 μg のオリゴ(dT)と共に70℃に10分間加熱した後、5 ×第一鎖バッファー（250mM HCl(pH8.3)、375mM KCl 、15mM MgCl2）、10mMジチオスレイトール、500 μM のデオキシヌクレオチド三リン酸、および800Uの逆転写酵素と共にインキュベートした。反応混合物の総液量は20μl とし、37℃で1 時間にわたって反応を進行させた。これにより、cDNAの第一鎖が合成された。第二鎖合成は、30μl の5 ×第二鎖バッファー（100mM トリス-HCl(pH6.9) ）、450mM KCl 、23mM MgCl2、0.75mMβ-NAD+ 、50mM (NH4)2SO4を、60U の大腸菌由来DNA ポリメラーゼI 、2Uの大腸菌RNアーゼH 、10U の大腸菌DNA リガーゼ、および250 μM のデオキシヌクレオチド三リン酸と共に添加することによって行い、最終液量は150 μl にした。その混合物を16℃で2 時間インキュベートした。
【００１１】
フェノール- クロロホルムを使って産物を抽出し、エタノールで沈殿させた。次に、最終cDNA産物を200 μl のTEに再懸濁した。
【００１２】
これらのステップを、刺激BW5147細胞（以下「テスター（tester）」）と、非刺激BW5147（以下「ドライバー（driver）」）との両方について、並行して行なった。
【００１３】
実施例2
次に、実施例1 で作製したcDNAを周知の方法によるサブトラクションクローニングにかけた。これを行なうために、以下の6 つのオリゴヌクレオチドを作製した：
5'-AGCACTCTCC AGCCTCTCAC CGCA-3'（配列番号1 ）、
5'-GATCTGCGGT GA-3' （配列番号2 ）、
5'-ACCGACGTCG ACTATCCATG AACA-3'（配列番号3 ）、
5'-GATCTGTTCA TG-3' （配列番号4 ）、
5'-AGGCAACTGT GCTATCCGAG GGAA-3'（配列番号5 ）、および
5'-GATCTTCCCT CG-3' （配列番号6 ）。
【００１４】
これらの使用方法は以下に説明するとおりである。二本鎖cDNA（2 μg ）を制限エンドヌクレアーゼDpnII で消化し、フェノール- クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、20μl のTE（10mMトリス-HCl(pH7.5) 、1mM EDTA）に再懸濁した。脱塩した配列番号1 （2mg/ml）4 μl 、脱塩した配列番号2 （1mg/ml）4 μl 、5 ×アダプターバッファー（330mM トリス-HCl、pH7.6 、50mM MgCl2、5mM ATP ）10μl 、DTT （100mM ）7 μl 、および H2O 28 μl を含む混合液中で、12μl （1.2 μg ）の切断済みcDNAを、二本鎖状の配列番号1 および2 に連結した。この混合物を50℃に加熱した後、それを1 時間かけて10℃に冷却することによって、オリゴヌクレオチドを互いに、そして試料DNA にアニールさせ、次に5 μl のT4 DNAリガーゼを添加し、12〜16℃で12〜14時間インキュベートした。140 μl のTEを添加することによって、混合物を希釈した。次に、試料200 μl に対して以下に述べるようにPCR を行なった。
【００１５】
実施例3
PCR を行なうために、66mMトリス-HCl(pH8.8) バッファー中の連結産物2 μl 、4mM MgCl2 、16mM (NH4)2SO4、33μg/ml BSA、0.3mM の各dNTP（濃度500 μM ）および2 μg の配列番号1 を含む試料200 μl を、まず72℃で3 分間加熱することにより、実施例2 の産物にハイブリダイズしている配列番号2 を全て除去した。次に、5UのTaq ポリメラーゼを使って3'端を埋めた（72℃、5 分間）。20サイクルの増幅（1 サイクルは95℃で1 分、72℃で3 分）を行なった後、産物を合わせ、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、TEバッファーに0.5 μg/μl の濃度で再懸濁した。以下、これをレプレゼンテーション（representation）という。
【００１６】
実施例4
次に、サブトラクティブハイブリダイゼーションに備えて、DpnII での消化によって配列番号1 をレプレゼンテーションから除去した。得られた消化物をフェノール抽出し、エタノール沈殿した。非刺激試料の場合はこれによってドライバーが得られ、刺激試料ではテスターを得た。テスターの一部（20μg ）を1.2 ％アガロースゲルでゲル精製し、単離した。配列番号1 および2 を連結した時と同じ上述の方法で、試料（2 μg ）を配列番号3 および4 に連結した。
【００１７】
サブトラクティブハイブリダイゼーションの第1 サイクルでは、配列番号3 および4 を連結したテスターの試料0.4 μg を、40μg のドライバーcDNAと混合した。その混合物をフェノール抽出し、エタノール沈殿し、2 μl の3 ×EEバッファー（30mM EPPS pH8.0 ）、3mM EDTA pH8.0、3mM EDTAに溶解した。これに30μl の鉱油を重層し、98℃で5 分間変性した。5M NaCl 溶液（0.5 μl ）を加え、DNA を67℃で20時間ハイブリダイズさせた。反応混合物をTEおよびtRNAキャリヤで200 μl に希釈した。この試料を72℃で3 分間インキュベートして配列番号4 を融解除去した後、4 つのPCR 反応（200 μl ）を用意した。これらはプライマーを含まない希釈ハイブリダイゼーションミックス20μl を含み、再アニールしたテスターの末端を埋めた後、配列番号3 の試料を添加して10サイクルの増幅を行ない（1 サイクルは95℃で1 分、70℃で3 分）、次に産物を合わせ、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、40μl の0.2 ×TEバッファーに再懸濁した。この物質20μl を20U のマングビーンヌクレアーゼと共に40μl の総液量で30分間処理することによって、一本鎖DNA を分解した。試料をpH8.9 の50mMトリス-HClに希釈（1 ：5 ）した後、98℃で5 分間加熱して、酵素を失活させた。上述の産物20μl 、配列番号3 （1mg/ml）2 μl 、およびTaq DNA ポリメラーゼ1 μl （5U）を使って、第2 のPCR を行なった。合計18サイクルした（1 サイクルは95℃で1 分、70℃で3 分）。産物を合わせ、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、0.5 〜1 μg/μl の濃度で再懸濁した。以下、この産物を「DP1 」または第1 差分産物（first difference product）という。
【００１８】
実施例5
次にDP1 をエンドヌクレアーゼDpnII で上述のように消化し、配列番号1 、2 、3 および4 に関する説明と同じ手順で、配列番号5 および6 に連結した。実施例4 に記載のサブトラクティブハイブリダイゼーションおよび選択的増幅を繰り返して、第2 差分産物（「DP2 」）を得た。これらの実験では、50ngのDP1 をテスターとした。ドライバー（40μg ）は上述のとおりとした。アダプターとして配列番号3 および4 を使用してこのプロセスを繰り返すことにより、第3 差分産物を得た。第3 産物を得るために、100pg のテスターを40μg のドライバーと混合した。95℃で1 分および70℃で3 分を1 サイクルとして最終増幅を22サイクル行った点以外は、上述したプロトコールの全ステップを繰り返した。これにより、最終差分産物を得た。
【００１９】
実施例6
最終差分産物をDpnII で消化した後、市販のベクター、すなわちpTZ19RのBamHI 部位にクローニングした。標準的方法で二本鎖DNA プラスミドを調製し、配列決定した。その配列を、GenBank およびEMBLデータベースの既知配列と、BLAST 検索プログラムを使って比較した。
【００２０】
このサブトラクション操作を経て、短いcDNAフラグメント、すなわち約200 塩基対長のフラグメントが同定された。このフラグメントを使って、BW5147細胞由来のcDNAライブラリーをスクリーニングした。最も大きいクローンを配列決定した。これについて以下に述べる。これはどの既知配列とも一致しない。
【００２１】
このヌクレオチド配列（配列番号7 ）は1119塩基長であり、179 アミノ酸長のタンパク質をコードする537 塩基対のオープンリーディングフレームを含んでいる。このタンパク質の予想分子量は20,093である。ATG コドンはさらに2 つあり、これらが開始コドンとして作用したとすると、それぞれ19,335ダルトンおよび18,770ダルトンの分子量を持つ172 アミノ酸長および167 アミノ酸長のタンパク質が生成する。各形態のタンパク質は、小胞体によって分子から切り離されて成熟タンパク質を与える疎水性アミノ酸の配列を特徴とする。
【００２２】
配列を解析すると、3 つのATリッチなモチーフ（TTATTTAT）が見つかる。これらのモチーフはサイトカインおよび癌遺伝子の5'非翻訳領域にしばしば見いだされる。Kruys ら,Science 245:852（1989）には、これらの反復配列がmRNAの安定性を調節することが示されている。
【００２３】
実施例7
次に、TIF αのゲノムDNA を同定するために、上記実施例6 で単離し解析したcDNAをプローブとして使用した。
【００２４】
129 系統マウスから作製したゲノムライブラリーを、標準的方法に従って配列番号7 でスクリーニングした。陽性クローンから得られるEcoRI フラグメントをプラスミドpZERO にサブクローニングし、部分的に配列決定した。その部分配列を配列番号8 に記載する。
【００２５】
実施例8
上記実施例7 に記載の陽性クローンから得られる別のEcoRI フラグメントもサブクローニングした。ホモロジーは高かったが、同一配列ではなかった。具体的に述べると、この配列のイントロン1 は配列番号8 と98％同一、イントロン2 は100 ％同一、イントロン3 は92％同一だった。
【００２６】
これらの配列で目を引くのはプロモーターが全く相同ではないことである。これは独立した調節を受けることを示唆している。5'非翻訳領域は92％同一である。TIF αの第1 エキソンはエキソン1 αとエキソン1 βとに分割される。第1 コーディングエキソン（TIF αの場合はエキソン1b、TIF βの場合はエキソン1 ）は99.5％同一であり、第2 エキソンは100 ％同一、第3 エキソンは97％同一、第4 エキソンは98.5％同一、第5 エキソンは96％同一である。3'非翻訳領域におけるホモロジーは96％である。
【００２７】
実施例9
上記実施例8 に記載した情報を使って、TIF βと名付けた第2 クローンのcDNA配列を推定した。これを配列番号9 に記載する。ゲノムDNA 配列も上記と同じ方法で確認した。これを配列番号42に記載する。アミノ酸配列は配列番号41である。
【００２８】
TIF αのコード領域と比較して、TIF βのコード領域は6 つのサイレント変異を持つ。重要でないアミノ酸変異をもたらす変化は2 つ存在する（36位でも103 位でもTIF αのVal がTIF βではIle になる）。112 位には、Gln がArg になるという、重要度の高い変異もある。
【００２９】
実施例10
TIF 類の発現を調べるための実験を計画した。BW5147細胞を様々な時間（0.2 、0.5 、1 、2 および24時間）にわたって組換えネズミIL-9（200U/ml ）で刺激した。次に、標準的な方法と試薬を使って、全RNA を単離した。次に、5 μg の全RNA とオリゴ(dT)プライマーとを使って、逆転写を行なった。次に、20ngの全RNA に相当するcDNAの試料を、異なるプライマーを使って25サイクル増幅した（1 サイクルは94℃で4 分、57℃で1 分、および72℃で2 分である）。使用したTIF プライマーは、
5'-CTGCCTGCTT CTCATTGCCC T-3' （配列番号10）
および
5'-CAAGTCTACC TCTGGTCTCA T-3' （配列番号11）
（それぞれセンスおよびアンチセンス）である。
【００３０】
これらは、それぞれ配列番号7 のヌクレオチド107-127 およびヌクレオチド766-786 に相当する。対照として、β- アクチンも18サイクル増幅した（第1 サイクルは94℃で4 分、60℃で1 分、72℃で2 分とし、続くサイクルは94℃で1 分、60℃で1 分、72℃で2 分とした）。
【００３１】
増幅に続いて、PCR 後の産物を1 ％アガロースゲルで解析し、特異的増幅を確認した後、放射性内部プローブを使ってブロッティングを行なった。使用したTIF 用プローブは、
5'-GACGCAAGCA TTTCTCAGAG-3' （配列番号12）
である。ここに記載する条件およびプローブはどちらのTIF にも特異的ではないが、TIF αの増幅産物はKpnI制限部位を含み、TIF βの場合はこの制限部位を含まない。増幅産物をKpnIで消化したところ、IL-9によって誘導されるTIF mRNAの全てではないにしても大半がTIF αであることがわかった。これは、TIF α発現がIL-9によって迅速に誘導されることを示唆している。TIF αのmRNAは30分の刺激後には検出することができ、1 時間から24時間までの期間をかけてプラトーに達した。
【００３２】
実施例11
次に、上述したIL-9によるTIF mRNAの誘導がタンパク質合成を必要としないことを示す実験を行なった。これらの実験では、実施例10で述べたように24時間刺激した細胞（ただし、10μg/mlのタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドを4.5 時間加えたもの、またはシクロヘキシミドを加えなかったもの）から、全RNA を抽出した。並行して行なったもう一組の実験では、細胞を刺激しなかった。全RNA を抽出し、実施例10で述べたようにRT-PCR増幅を行なった。PCR 後の産物を臭化エチジウム染色した1 ％アガロースゲルで解析した。タンパク質合成を遮断してもIL-9による誘導は起こることがわかった。したがってIL-9の効果は媒介タンパク質の合成を必要としない直接的効果である。
【００３３】
実施例12
これらの実験では、TIF mRNAの誘導におけるSTATタンパク質の役割を、細胞株BW5147の誘導株で調べた。第1 の細胞株BWh9R は野生型ヒトIL-9受容体を発現させる。BW-Phe116 株は、IL-9受容体のSTAT転写因子活性化能力を失わせる単突然変異を（116 位に）持つトランスフェクタントである。さらにもう一つの株BW-mut6 は、IL-9受容体のSTAT5 活性化能力を失わせるが、STAT1 およびSTAT3 活性化能力は変化させない突然変異を持つ。最後に、細胞株BW-mut7 は、IL-9受容体のSTAT1 およびSTAT3 活性化能力を失わせるが、STAT5 活性化能は変化させない単突然変異を持つ。
【００３４】
細胞刺激、全RNA の単離、cDNAの逆転写および増幅は全て、実施例10に記載した通りに行なった（細胞は24時間刺激した。ヒト組換えIL-9およびネズミ組換えIL-9の両方を使用した）。PCR 産物を上述のように臭化エチジウム染色した1 ％アガロースゲルで解析した。
【００３５】
この解析により、ヒトIL-9はBW-Phe116 での発現を誘導しないことがわかった。これはSTAT転写因子の関与を示唆している。IL-9はBW-mut6 突然変異株ではTIF 発現を誘導するが、mut7変異株ではTIF 発現を誘導しないことがわかった。これは、STAT1 またはSTAT3 が関与し、STAT5 は関与しないことを示唆している。
【００３６】
実施例13
次に、正常マウス脾細胞におけるTIF mRNAの発現を調べた。
【００３７】
10〜12週齢のBalb/cマウスから得た脾細胞を、対照培地または20μg/mlのLPS （これはB リンパ球およびマクロファージを活性化する）もしくはConA（これはT 細胞を活性化する）もしくはConA＋ネズミIL-9に対する1 ％遮断抗血清を補足した対照培地で24時間培養した。対照としてβ- アクチンを使用した。RNA の精製、RT-PCR解析は上述のように行なった。
【００３８】
得られたデータから、TIF は休止脾細胞ではせいぜい極めて弱く発現されるに過ぎず、LPS では誘導されないが、ConAでは強く誘導されることがわかった。抗IL-9抗血清はConAによる誘導に影響を及ぼさなかった。これは、この効果がIL-9によって媒介されるのではないこと、すなわち他のサイトカインによって媒介されることを示唆している。
【００３９】
ConAによって活性化された脾細胞をRT-PCR産物の配列を使って解析したところ、これらの細胞は主として、またはもっぱら、TIF αを発現していることがわかった。
【００４０】
実施例14
さらなる実験により、TIF mRNAはIL-9誘導が無くても発現されることがわかった。
【００４１】
5 週齢のFVB マウスから得た脾細胞中のT 細胞を、ナイロンウールカラムを使って濃縮した。次に、IL-9の存在下または不在下に、ConA（T 細胞活性化因子）またはPMA （これはほとんどの細胞でPKC を活性化する）を補足した培地で細胞を24時間刺激した。
【００４２】
全RNA を標準的技術を使って単離した後、2.2Mホルムアミドを含む1.3 ％アガロースゲルでの電気泳動によって、10μg の試料を分画した。次に、それらの画分をニトロセルロース膜に転写し、標識し、参照により本明細書に組み込まれるVan Snick ら,J.Exp.Med.169:363（1989）に準拠したハイブリダイゼーションアッセイでアッセイした。
【００４３】
その結果、ConAによるTIF の誘導は変化しないことと、PMA によって活性化された脾細胞ではTIF RNA はIL-9によって誘導されないことがわかった。
【００４４】
実施例15
様々な細胞株におけるTIF mRNAの発現を調べた。これらの実験では、ネズミ細胞株を特定のサイトカインで少なくとも1 日間刺激した。具体的に述べると、9T7 はIL-2、IL-4またはIL-9に応答するT 細胞リンパ腫である。細胞株TS3 およびTS6 はT ヘルパー細胞クローンに由来し、IL-2またはIL-9の存在下で増殖する。MC9 およびLI38は、IL-3またはIL-9の存在下で増殖するマスト細胞株である。
【００４５】
刺激に続いて、標準的なグアニジウムイソチオシアネート溶解およびCsCl勾配遠心分離によって、全RNA を調製した。
【００４６】
次に、9T7 株はノーザンブロット法により、実施例14で述べたように解析し、他の株は上述のRT-PCR解析法でアッセイした。
【００４７】
IL-9はT ヘルパー細胞およびマスト細胞におけるTIF 発現をアップレギュレートするが、IL-2およびIL-3はT ヘルパー細胞およびマスト細胞におけるTIF 発現をアップレギュレートしないことが明らかになった。しかし9T7 細胞株はサイトカインとは無関係にほぼ同じレベル発現を示した。これは、IL-9がTIF 発現にとって必須ではないことを示している。
【００４８】
実施例16
次に、B 細胞株におけるTIF mRNAの発現を調べた。細胞株A20 、70Z/3 、およびBCL-1 は、サイトカイン類が存在しなくてもインビトロで成長するB 細胞白血病細胞株である。これらの細胞をIL-4およびIL-9で24時間刺激し、標準的方法で全RNA を単離した。発現は、RT-PCRを35サイクル行なった後、上述のようにブロッティングおよびハイブリダイゼーションを行なうことによって解析した。
【００４９】
その結果、B 細胞にTIF 発現を検出することはできるが、IL-9およびIL-4の存在下でもせいぜい弱くアップレギュレートされるにすぎないことがわかった。
【００５０】
実施例17
次に、T ヘルパー細胞株における本発明分子の発現を調べるために実験を行なった。TS2 およびTS1 は、T ヘルパー細胞クローンに由来する既知のT ヘルパー細胞株であり、IL-9またはIL-2（TS2 ）およびIL-9またはIL-4（TS1 ）の存在下で増殖する。具体的に述べると、TS1 またはTS2 細胞を、上記サイトカインの存在下で少なくとも10日間成長させた後、既知の方法でRNA を抽出した。分子の発現は、上述のプロトコールを使って、RT-PCR（35サイクル）によって調べた。TS1 細胞ではIL-4もIL-9もTIF 発現を誘導するが、IL-2はTS2 細胞でのTIF 発現を誘導しない。
【００５１】
実施例18
様々なマウス器官におけるTIF mRNAの発現を調べた。標準的グアニジンイソチオシアネート法およびCsCl勾配遠心法を使って、肝臓、腎臓、心臓、脳、腸、脾臓、胸腺、肺、筋肉および骨髄から全RNA を調製した。上述のプロトコールを用いて、40サイクルのRT-PCRを行なった。最も強い発現は胸腺組織に見いだされ、脳組織にはそれより弱いシグナルは見いだされ、残りの組織ではさらに弱い発現が見いだされた。
【００５２】
実施例19
以下の実施例では、293-EBNA細胞におけるTIF αの産生について説明する。
【００５３】
TIF αの相補DNA については上述した。これを市販の発現ベクターpCEP-4に、CMV プロモーターが作動できるような形でサブクローニングした。得られたプラスミドを293-EBNA細胞に標準的なリポフェクトアミン法を使ってトランスフェクトした。トランスフェクションに続いて、35S 標識メチオニンを補足したメチオニン不含培地で、細胞を24時間インキュベートした。上清を収集し、アクリルアミドゲルにのせた後、電気泳動にかけた。次にゲルを乾燥し、1 日間、オートラジオグラフィーにさらした。次に、cDNAがアンチセンス方向にクローニングされた同じプラスミドを細胞にトランスフェクトすることによって、対照実験を行なった。
【００５４】
センス方向のTIF をトランスフェクトした細胞からは、約25〜30キロダルトンの外来バンドが見つかった。予想分子量と系内での実際の分子量との不一致および不均一性は、糖鎖付加に起因すると考えることができる。一連の並行実験では、ネズミcDNAを発現させた方法と同じ方法で、ヒトTIF をコードするcDNAを発現させた。cDNAを変えた点以外は、全て同じ実験パラメータを使用した。
【００５５】
実施例20
COS 細胞におけるTIF αの産生を調べるために、さらに実験を行なった。具体的に述べると、TIF α cDNA を、Demoulinらの文献（前掲）に記載のプラスミドｐEF-BOS.puro に、EF-1αプロモーターが作動できるような形でサブクローニングした。そのプラスミドcDNAを、上記と同じリポフェクトアミン法を使って、COS 細胞にトランスフェクトした。35S メチオニンを補足したメチオニン不含培地でCOS 細胞を24時間インキュベートした後、上清を上記実施例19で述べたように処理した。ここでも25〜30キロダルトンの外来バンド、ならびにおそらく非糖鎖付加型の分子に相当すると思われる18キロダルトンバンドが観察された。
【００５６】
実施例21
これらの実験では、メサンギウム細胞、神経メラノーマ（neuronal melanoma ）細胞、および肝癌細胞においてTIF がSTAT活性化を誘導することを見いだした。サイトカインがSTAT因子を活性化すると、これらの因子は二量化し、細胞質から核に移動し、プロモーター中の標的配列に結合することが知られている。実験の詳細を以下に述べる。
【００５７】
上述のトランスフェクト293-EBNA細胞を、通常の培地で48時間インキュベートした後に使用した。また、やはり上述した対照から得られる上清も同様に使用した。マウス腎臓メサンギウム細胞株（以下「MES13 」）、ラット褐色細胞腫細胞株（以下「PC12」）、4 種類のヒトメラノーマ（SK23、AUMA、NA-8mel およびMULL）、ヒト肝癌（HepG3 ）およびラット肝癌（H-4-II-K）の試料を使用した。細胞試料（0.5 ×106 ）を、1 ％の上清の存在下で5 〜10分間刺激した。次に、参照により本明細書に組み込まれるDemoulinら,Mol.Cell.Biol.16:4710（1996）に従って、核抽出物を調製した。簡単に述べると、細胞をPBS で洗浄した後、1ml の氷冷低張バッファーに15分間再懸濁した（使用したバッファーは10mMヘペスバッファー、pH7.5 、10mM KCl、1mM MgCl2 、5 ％グリセロール、0.5mM EDTA、0.1mM EGTA、0.5mM ジチオスレイトール、1mM Pefabloc（登録商標）、1mM Na3V4 、および5mM NaF である）。次に、65μl のNP-40 を加えてボルテックスすることにより、細胞を溶解した。14,000rpm で30秒間ボルテックスすることによって核をペレット化した後、HEPES (20mM ）、グリセロール（20％）およびNaCl（420mM ）を補足したバッファーで抽出を行なった。核破片を2 分間の遠心分離によって除去した。DNA 結合活性は、FcγRI遺伝子プロモーターのSTAT結合部位、すなわち
5'-ATGTATTTCC CAGAAA-3' （配列番号13）
および
5'-CCTTTTCTGG GAAATAC-3'（配列番号14）
（GRR プローブ中の結合部位の上の鎖および下の鎖に相当）を含む「GRR 」と呼ばれる32P 標識二本鎖オリゴヌクレオチドを使用し、Demoulinら（前掲）に従って決定した。簡単に述べると、5 μl の核抽出物を結合バッファー（12mM HEPES、pH7.6 、10mM KCl、0.5mM EDTA、2.5 ％グリセロール、1ml あたり0.1mg のポリ(dI-dC) ）中で5 分間インキュベートした。放射標識GRR プローブ（105cpm、約0.5ng ）を加え、インキュベーションを25分間続けた後、非変性ポリアクリルアミドゲルにのせた。
【００５８】
また、MES13 細胞で観察された複合体（上述）は、抗STAT5 抗体でも抗STAT3 抗体でも、部分的にオーバーシフトすることがわかった。これは、（i ）試験した細胞がTIF の標的であること、および（ii）STAT3 およびSTAT5 は、TIF によって活性化される複合体の主要成分であることを示している。上記実施例12のプロフィールと比較したSTATプロフィールの相違は、細胞源の相違（ヒト対マウス）に起因すると考えられる。また、ヒトTIF はネズミ細胞でも機能し、その逆も起こることが観察された。
【００５９】
実施例22
この実施例ではヒトTIF をコードする核酸分子の単離およびクローニングについて詳述する。まず、ヒト末梢血単核細胞を標準的な密度勾配遠心分離によって調製した。この調製に続いて、試料を、抗CD3 モノクローナル抗体の存在下または不在下に、3 ×106 細胞/ml の密度で24時間培養した（使用した抗体は市販のOKT3 mAbで、希釈率1/500 の腹水の形で使用した）。一般にT 細胞由来のサイトカインは例えばCD3 特異抗体などによって活性化された場合にのみ発現されるので、この抗体を使用した。
【００６０】
標準的なグアニジンイソチオシアネート/CsCl 超遠心分離技術を使って、これらの細胞から全RNA を単離した。単離に続いて、そのRNA の試料10μg をオリゴ(dT)15プライマーを使って逆転写した。
【００６１】
上に概説したcDNAの作製に続いて、100ng の全RNA に相当する試料を、ネズミcDNA配列（すなわち配列番号7 ）に基づく以下のプライマーを使って、PCR で増幅した：
5'-AGGTGCTGAA CTTCACCCTG GA-3'（配列番号15）
5'-CCACTCTCTC CAAGCTTTTT CA-3'（配列番号16）。
【００６２】
PCR 条件は増幅サイクル数を30とし、1 サイクルを94℃で1 分の後、42℃で1 分、次に72℃で2 分とした。増幅産物を標準的方法によってアガロースゲルで分離した後、配列決定した。その結果、cDNAのフラグメントが増幅されていることがわかった。そこで、配列番号16の代わりに配列番号17、すなわち
5'-CAAGTCTACC TCTGGTCTCA T-3'
を用いた点以外は同じ材料を使って、第2 の反応を行なった。この第2 のPCR 反応は25サイクル行い、1 サイクルは94℃で1 分の後、45℃で1 分、次に72℃で2 分とした。増幅産物を第1PCRと同じ工程に供した。418 ヌクレオチドのフラグメントが増幅された。このフラグメントは抗CD3 刺激細胞には見いだされたが、休止PBMCには見いだされなかった。このフラグメントのヌクレオチド配列を配列番号18に示す。
【００６３】
実施例23
増幅産物を調製した後、標準的な5'-RACE 法を使ってcDNAの5'端を単離した。簡単に述べると、プライマーとして配列番号19、すなわち
5'-TGGCCAGGAA GGGCACCACC T-3'
を使用して、第一鎖cDNAを作製した。このプライマーは実施例22に従って得た配列情報に基づいたものである。簡単に述べると、上述のように調製した1 μg の全RNA 、2.5 ピコモルの配列番号19、逆転写酵素、逆転写酵素バッファー、2.5 μl のdNTPミックス（10mM）、2.5 μl のMgCl2 （25mM）、および2.5 μl のジチオスレイトール（0.1M）を混合することによって、5'-RACE 法を行なった。反応を行い、反応完了後に、RNアーゼH およびRNアーゼTIを加えることによって元のRNA を除去した。組み込まれなかったdNTPならびにプライマーおよびタンパク質を全て除去した。ターミナルトランスフェラーゼ（TdT ）を使ってcDNAにテールを付加した。この酵素により、後述する短縮型アンカープライマーの3'結合部位が生成する。テール付加は、精製した第一鎖cDNA、TdT 、バッファー（10mMトリス-HCl、25mM KCl、1.5mM MgCl2 ）、および200 μM のdCTPを混合することによって行なった。
【００６４】
テール付加反応に続いて、
5'-CCTATCAGAT TGAGGGAACA G-3' （配列番号20）
および
5'-RACE 短縮型アンカープライマー：5'-GGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGIIGGGIIGGGIIG-3'（配列番号21）
を使って PCRを行なった。増幅は35サイクル（1 サイクルは94℃で1 分、56℃で1 分、および72℃で2 分とした）行なった。これに続いて、増幅産物の1/100 希釈液5 μl に対して、配列番号20および短縮型汎用増幅プライマー：
5'-GGCCACGCGT CGACTAGTAC-3' （配列番号22）
を使って、ネスト型の増幅を行なった。増幅は30サイクル（1 サイクルは94℃で1 分、56℃で1 分、および72℃で2 分とした）行なった。その結果得られたPCR 産物を標準的方法に従ってクローニングし、配列決定した。
【００６５】
これらの3 つのプロトコール、すなわちフラグメントを得た上述の2 実験と、やはり上述した5'-RACE PCR とにより、配列決定した増幅産物を整列して、完全配列を得ることが可能になった。
【００６６】
整列に続いて、推定オープンリーディングフレームに隣接するオリゴヌクレオチド、すなわち
5'-CCTTCCCCAG TCACCAGTTG-3' （配列番号23）
および
5'-TAATTGTTAT TCTTAGCAGG-3' （配列番号24）
を作製した。これらのプライマーを使用し、上述のようにCD3 特異mAb で刺激した細胞のmRNAを使って、オープンリーディングフレーム全体を増幅した。増幅は25サイクル行なった（1 サイクルは94℃で1 分、56℃で1 分、および72℃で2 分とした）。
【００６７】
ヒトcDNAの完全配列を配列番号25に示す。これは、179 アミノ酸のタンパク質をコードする537 塩基対のORF を含んでいる。これはネズミタンパク質と同じ長さである。ヒトタンパク質はネズミタンパク質と79％のアミノ酸ホモロジーを有し、IL-10 とは25％のホモロジーを有する。ヒトタンパク質およびマウスタンパク質をそれぞれ配列番号43および配列番号40に記載する。
【００６８】
実施例24
これらの実験では、上述のcDNAに対応するヒトゲノムDNA を単離する作業について詳述する。
【００６９】
cDNA配列に基づいて、配列番号25のヌクレオチド51-70 に相当するプライマーおよびヌクレオチド631-650 の相補鎖に対応するプライマーを開発した。標準的方法でPCR を行なった。具体的に述べると、CESS細胞（EBV 形質転換リンパ芽球様細胞株）から得た100ng のゲノムDNA をテンプレートとして使用し、33サイクルの増幅を行なった（増幅1 サイクルは、94℃で30秒、50℃で30秒、および72℃で5 分とした）。配列が単離されたら、それを配列決定した。これを配列番号26に記載する。この配列は約4.8 キロ塩基長であり、TIF 分子をコードする全ゲノム配列を含み、欠けているのは5'隣接領域、プロモーター、および3'端だけであると考えられる。解析したところ、これはネズミのゲノム配列と同様に、6 つのエキソンと5 つのイントロンを含むことがわかった。
【００７０】
標準的な方法を使ってサザンブロットハイブリダイゼーションを行なった。これにより、ゲノムはTIF 遺伝子を1 コピーだけ含んでいることがわかった。
【００７１】
実施例25
上述したゲノムDNA がヒトゲノムのどこに位置するか確認することは、興味深い。この目的を達成するために、2 つの異なるアプローチをとった。第1 のアプローチでは、上述の配列、すなわち配列番号26を蛍光ラベルで標識し、それを使って、標準的方法による蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（「FISH」）で、ヒトゲノムをプローブした。
【００７２】
もう一つのアプローチでは、放射性ハブリッドクローンのパネルを、配列番号25のヌクレオチド51-71 および5'-ATCAGATGGA TTACTGAATG-3' （配列番号27）からなるプローブを使ってスクリーニングした。テンプレートとして25ngのゲノムDNA を使って、PCR を35サイクル（1 サイクルは94℃で1 分、55℃で1 分、および72℃で2 分とする）行なった。
【００７３】
どちらの方法論でも、上記遺伝子は染色体12q15 に位置することが示された。いくつかの研究により、喘息に関係する疾患がこの部位に関連づけられている。例えば、Nat.Genet.15:389-392（1997）、Oberら,Hum.Mol Genet.7(9):1393-1398 （1998）、Nickelら,Genomic 46(1):159-162（1997）、Takahashi ら,Genomics 44(1):150-2 （1997）、Barnesら,Genomics 37(1):41-50 （1996）を参照されたい。これらの文献は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
公開データベースにあたって、それらのデータベースにこれらの配列の一部が登録されていないかどうかを決定した。TIF の最後のエキソンが、染色体12q15 由来のBAC クローン（アクセッション番号AC007458；191,111 塩基対、BAC RDCI11-444B24 ）に見つかった。このクローン上に最後のエキソンが同定されたことから、TIF 遺伝子はIFN 遺伝子から約90キロ塩基の位置にあり、IL-10 関連サイトカインであってAK155 と呼ばれる遺伝子からは30キロ塩基未満に位置することが示唆される（Knappeら,J.Virol 74:3881-3887 （2000）) 。
【００７５】
実施例26
これらの実験ではTIF タンパク質に結合する抗体の製造について説明する。これらの抗体を作製するために、配列番号7 がコードするアミノ酸40-61 からなるペプチドを、KLH キャリアタンパク質に、標準的方法により、ペプチド1mg 対キャリアタンパク質1mg の比率でカップリングした。この複合体150 μg を使って、対象動物（ウサギ）を、2 週間間隔で3 回免疫処置した。1 回目の注射では完全フロイントアジュバントに免疫原を乳化し、次の2 回は不完全フロイントアジュバントに免疫原を乳化した。
【００７６】
最初の採血は最後の注射の1 ヶ月後に行ない、既知の方法に従って血清を調製した。
【００７７】
次にその血清を標準的ウェスタンブロットで試験した。簡単に述べると、配列番号7 または配列番号25をトランスフェクトした細胞から得られる上清10μl をSDS-PAGE電気泳動によって分離した後、PVDF膜にブロットした。抗血清を1:500 に希釈し、それを、二次抗体としての抗ウサギ抗体および市販の検出キットと共に、標準的ウェスタンブロットプロトコールで使用した。
【００７８】
血清は実際にTIF タンパク質を認識することがわかった。
【００７９】
実施例27
この実施例では、ヒトTIF に応答する細胞株を同定するために行なった実験について述べる。上述のHEK293-EBNA ヒト胎児腎臓細胞を6 穴プレートに3 ×105 細胞/ ウェルの密度でトランスフェクションの前日に接種した。それらの細胞に、CMV プロモーターの制御下にヒトTIF のcDNAを含んでいるpCEP-4プラスミド2 μg をトランスフェクトした。組換えヒトTIF の産生量を最大にするために、トランスフェクション後に細胞を1.5ml の通常培地で3 日間インキュベートした。
【００８０】
ヒトTIF はネズミ因子と同じ方法でSTAT転写因子の活性化を誘導するという仮説を設けた。上記実施例21のプロトコールに従った。核抽出物と標識DNA プローブとの混合物に、抗STAT抗体（0.75μg の抗STAT1 、1 μg の抗STAT3 、または1 μg の抗STAT5b）を加え、インキュベートすることによって、スーパーシフトアッセイを行なった。
【００８１】
肝癌細胞株HepG2 を使用すると、TIF によって誘発されるバンドシフトが観察された。上述の抗体を使って、その応答をさらに特徴付けた。抗STAT3 抗体は遅延複合体（retardation complex ）の大半をシフトさせたが、残りのわずかな複合体は抗STAT1 抗体によってスーパーシフトした。抗STAT-5抗体には効果がなかった。これは、STAT-3がTIF によって活性化される主要転写因子であり、STAT-3ほどではないがSTAT-1もTIF によって活性化される主要転写因子であることを示している。これらの結果は、ヒト肝癌細胞株HepG3 を使った場合にも、また肝癌細胞株H4IIE を使った場合にも得られた。
【００８２】
実施例28
この実施例では、レポーター遺伝子を利用してSTAT活性化を測定するために計画した実験について説明する。使用したレポーターは「pGRR5 」である。これは、TKプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子の上流に、実施例21に記載の配列を5 コピー含んでいる。使用した対照は、TKプロモーターの制御下にあるウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターpRL-TKである。
【００８３】
アッセイは、106 個のHepG2 細胞を15μg のpGRR5 および1 μg のPrl-TKと混合することによって行なった（250V、74Ω、1,200 μF ）。トランスフェクタントのプールを24穴プレートに分注した（42,000細胞/ ウェル）。
【００８４】
1 時間後に、ヒトTIF （1 ％HEK293細胞上清）と300U/ml のヒトIL-6、モックトランスフェクトHEK293細胞から得た1 ％上清、または培地のみで、細胞を刺激した。
【００８５】
2 時間後に、細胞をペレット化し、溶解した。ルシフェラーゼ活性を標準的方法でモニターした。その結果、本発明の分子による刺激は、STAT結合部位を含むプロモーターの転写活性を増大させることがわかった。
【００８６】
実施例29
IL-6のようなサイトカインによるSTAT-3の活性化は、肝癌細胞における急性期タンパク質誘導をもたらすことが知られている。TIF が同じ活性を発揮するかどうかを決定するために、5 ×106 個のHepG2 細胞を、一過性に感染したHEK293-EBNA 細胞から得た1 ％上清で2 、13、または24時間刺激した。一部の実験では、タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドを10μg/mlの濃度で使用し、これを細胞および上清と混合した。刺激に続いて、標準的方法で全RNA を単離し、全RNA の試料10μg に対してオリゴ(dT)プライマーを使った逆転写を行なった。次に、
ヒト血清アミロイドA （「SAA 」）に特異的なプライマー：
agctcagcta cagcacagat （センス、配列番号28）
cctgccccat ttattggcag （アンチセンス、配列番号29）、
ヒトα1-アンチキモトリプシンに特異的なプライマー：
tgtcctctgc caccctaaca （センス、配列番号30）
taattcacca ggaccatcat （アンチセンス、配列番号31）、
ヒトハプトグロビンに特異的なプライマー：
gtggactcag gcaatgatgt （センス、配列番号32）
acatagagtgt taaagtggg （アンチセンス、配列番号33）、
ヒトβ- アクチンに特異的なプライマー：
gctggaaggt ggacagcgag （センス、配列番号34）
tggcatcgtg atggactccg （アンチセンス、配列番号35）
を使って、20ngのRNA に相当するcDNAを18サイクル増幅した。SAA の場合、Tmは54℃だったが、ヒトα1-アンチキモトリプシンとハプトグロビンの場合は52℃、β- アクチンの場合は56℃だった。臭化エチジウム染色したアガロースゲルで、標準的方法によって、PCR 産物を解析した。
【００８７】
その結果、TIF はSAA およびα1-アンチキモトリプシンを強く誘導し、これらよりは弱いがハプトグロビンも誘導することがわかった。TIF がSAA を直接アップレギュレートするかどうか、またはタンパク質合成が必要かどうかを決定するために、HEPG2 細胞をシクロヘキシミドの存在下で上述のように刺激した。SAA 発現は影響を受けず、TIF 活性にはタンパク質合成が必要でないことが示された。
【００８８】
実施例30
上記の結果は、TIF とIL-6とが、急性期反応物質に対して類似した活性を持つらしいことを示している。IL-6活性はgp130 によって媒介されるので、TIF 活性もgp130 によって媒介されるかどうかを決定するための実験を行なった。
【００８９】
そうであるかどうかを決定するために、HepG2 細胞に上述のようにルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトした後、gp130 相互作用サイトカインの活性を遮断することを前もって確認しておいたポリクローナル抗gp130 抗体の存在下に、TIF またはIL-6で刺激した。
【００９０】
その結果、このポリクローナル抗体はIL-6活性だけを遮断することがわかった。
【００９１】
IL-10Rβ鎖が関与するかどうかを決定するための実験も並行して行なった。抗IL-10Rβ抗体の存在下では、TIF 活性は完全に遮断されたが、IL-6活性には影響がなかった。SAA 発現に関するアッセイでも、同じ傾向が観察された。
【００９２】
実施例31
インビボで急性期タンパク質を調節するTIF の能力を決定するために、これらの実験を計画した。
【００９３】
様々な量のネズミ組換えTIF （50、12.5、3.2 、0.8 または0.2 μg ）をエンドトキシン耐性C3H/HeJ 雌マウス（10〜12週齢）に腹腔内注射した。注射の6 時間後にマウスを屠殺した。ただし、例外として、50μg のTIF を与えたマウスは、1 、3 、6 、12または24時間後に屠殺した。肝臓を摘出し、液体窒素で直ちに凍結した。次に、標準的方法によって全RNA を抽出した後、全RNA の試料10μg を、2.2ml/リットルのホルムアルデヒドを含む1.3 ％アガロースゲルで分画した。次に試料をニトロセルロース膜に移した。
【００９４】
市販のラベリングキットを使ってネズミSAA プローブを作製した。ハイブリダイゼーションアッセイは、参照により本明細書に組み込まれるVan Snick ら,J.Exp.Med.169:363-368（1989）に従って行なった。プローブ自体は、上述のように単離したネズミ肝由来のcDNAを使って、上述のようにPCR によって得た。プローブの作製に使用したプライマーは、
tctgctccct gctcctggga （センス、配列番号36）
および
tccaggaggt ctgtagtaat （アンチセンス、配列番号37）
である。その結果、最高用量のネズミTIF （50μg ）は、i.p.注射後わずか1 時間でSAA 発現を誘導することがわかった。6 時間後には最大効果に到達した。SAA の発現レベルは注射の24時間後に低下した。
【００９５】
様々な用量のTIF を使った実験から得たデータにより、3.2 μg の投与量を用いても、最大のSAA 誘導が起こることがわかった。0.8 μg しか使わなかった場合でも、SAA メッセージは検出可能だった。
【００９６】
実施例32
当初、TIF は、T 細胞由来サイトカインとして同定された。肝急性期を調節するサイトカインは、そのほとんどが、主として炎症中に産生される。インビボでTIF が炎症刺激によって産生されうるかどうかを決定するために、12週齢の雌BALB/cマウスに2 μg の大腸菌リポ多糖抗原を腹腔内注射した。2 時間後にマウスを屠殺し、器官を液体窒素で凍結した。標準的プロトコールに従って全RNA を単離し、オリゴ(dT)プライマーを使って10μg の全RNA に対して逆転写を行なった。逆転写に続いて、20ngの全RNA に相当するcDNAを、55℃のTmを持つTIF に特異的なプライマー、すなわち
ctgcctgctt ctcattgccc t （センス、配列番号38）
および
caagtctacc tctggtctca t （アンチセンス、配列番号39）
を使って、25サイクル増幅した。PCR 産物をアガロースゲル電気泳動によって解析した。
【００９７】
その結果、LPS は調べた器官の全てでTIF の発現を誘導することがわかった。これは、TIF が炎症過程に関与することを示している。
【００９８】
上記の実施例では、TIF タンパク質（例えば、配列番号7 、25または26のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を持つもの）をコードする単離された核酸分子を一側面とする本発明について説明した。遺伝コードの縮重により、配列番号7 、25または26のヌクレオチド配列と同一ではないが同じタンパク質をコードする核酸分子の作製が容易であることは、当業者には理解されるだろう。もちろん配列番号7 、25および26は本発明の好ましい態様であるが、他の態様も本発明の一部である。ゲノムDNA 、相補DNA 、およびメッセンジャーRNA などのRNA はすべて本発明に包含されるものとする。他の哺乳動物を含む他の動物種に由来する単離された核酸分子も本発明の一部である。本発明の好ましい一側面は、その相補鎖が配列番号7 、配列番号8 、配列番号9 、または配列番号25もしくは配列番号26にストリンジェントな条件でハイブリダイズする単離された核酸分子である。本明細書にいう「ストリンジェントな条件」とは、例えば、緩衝液（3.5 ×SSC ）、0.02％フィコール、0.02％ポリビニルピロリドン、0.02％ウシ血清アルブミン、25mM NaH2PO4（pH7 ）、0.1 ％SDS 、2mM EDTA中、65℃でハイブリダイゼーションを行なった後、最終洗浄を室温の2 ×SSC で行い、次に例えば約65℃程度の高温の0.1 ×SSC/0.2 ×SDS で行なうような条件を指す。よりストリンジェントな条件、例えば0.1 ×SSC なども使用することができる。これらの核酸分子は、STAT1 、STAT3 および/ またはSTAT5 などのSTATタンパク質を活性化する約17〜22kD（SDS-PAGEで測定）のタンパク質をコードする。糖鎖付加型の場合、これらのタンパク質は、SDS-PAGEによる測定で、約17〜約30キロダルトンである。また、配列番号7 、25または26によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも45％、より好ましくは少なくとも60％、最も好ましくは90％のアミノ酸一致度を持つタンパク質をコードする単離された核酸分子、例えば配列番号42も、本発明の一部である。
【００９９】
また、DNA の発現が促進されるようにプロモーターに作動可能な形で連結された本発明の核酸分子を含む発現ベクターも、本発明の一部である。このようなベクターを製造することは、当業者の技術で十分に可能である。
【０１００】
ベクターならびに核酸分子そのものは、発現ベクターまたは核酸分子そのものが組み込まれた真核または原核組換え細胞の作製に使用することができる。大腸菌細胞、COS 細胞、CHO 細胞などは全て、本発明のこの側面に従って使用することができる細胞タイプの例である。
【０１０１】
上述の核酸分子（好ましくは単離されているもの）によってコードされるタンパク質は、本発明のもう一つの特徴である。「タンパク質」は、核酸分子の発現の直接産物、その糖鎖付加型、ならびに二量体、三量体などの多量体型を意味する。少なくとも1 つの本発明のタンパク質分子と、少なくとも1 つの異なるタンパク質分子とを含む、二量体などの多量体も本発明の一部である。この異なるタンパク質分子はIL-10 などのサイトカインであることが好ましい。また、上述のタンパク質の全部または一部が何らかの形で（例えば融合タンパク質として）少なくとも1 つの別のタンパク質もしくはペプチドまたはアミノ酸配列に連結されているコンストラクト（例えば融合タンパク質）も、本発明の一特徴として包含される。「融合パートナー」としては、例えば、認識可能なシグナルを直接的または間接的に与える分子（FLAGペプチド、β- ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）を挙げることができる。これらの融合パートナーは、好ましくは、タンパク質のN 端および/ またはC 端で上述の分子に接合されるが、分子をアミノ酸に接合する技術は数多く知られており、それらの方法論のどれを使っても、本発明の一部であるコンストラクトを製造することができると理解すべきである。
【０１０２】
個々の本発明タンパク質は、上述のように、SDS-PAGEによる測定で、約17〜約30キロダルトンの分子量を持つ。多量体型では、複合体の分子量はもちろん変化するだろうが、そこに含まれているTIF 分子はそれぞれに、SDS-PAGEによる測定で、約17〜30キロダルトンの分子量を持つだろう。
【０１０３】
本タンパク質は、好ましくは、少なくとも約120 残基であってかつ約200 残基を越えないアミノ酸からなる。アミノ酸配列は、好ましくは、配列番号7 、8 、9 、25または26によってコードされるアミノ酸配列の全部または一部からなるか、または配列番号7 、8 、9 、25または26によってコードされるアミノ酸配列の全部または一部を含む。より好ましくは、アミノ酸配列は前記配列番号によってコードされる最初の約40アミノ酸を除く全てのアミノ酸を含む。さらに好ましくは、これらの配列によってコードされる最初の約20アミノ酸を除く全てのアミノ酸を含む。最も好ましくは、本タンパク質は配列番号40または41に記載のアミノ酸を含み、また上述のアミノ酸一致度によって定義されるタンパク質も含む。
【０１０４】
上に挙げた核酸分子によってコードされるタンパク質が本発明の一特徴であり、標準的プロトコールに従って、抗体の産生に利用することができることは、当業者には理解されるだろう。モノクローナル型およびポリクローナル型のそのような抗体は、それら抗体の断片、キメラ型、ヒト化型、組換え型などと共に、本発明のもう一つの特徴を構成する。また、本発明タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を含み、好ましくはアジュバント（完全または不完全フロイントアジュバントなど）と混合されている免疫原も、本発明の一特徴である。タンパク質配列の一部をキーホールリンペットヘモシアニンなどの他の分子に連結して免疫原性を向上させてもよい。これらの抗体は、例えば、本発明のタンパク質が存在するかどうかを決定するために使用することができる。これは、以下に説明するように、本発明のさらなる一特徴である。本発明の核酸分子がIL-9の存在下で発現されることは実施例に示した。したがって、本発明のさらにもう一つの特徴は、IL-9が存在するかどうか、または存在していたかどうかを決定する方法であり、この方法では、本発明のタンパク質を例えば抗体を使って検出するか、または本発明の核酸分子をプローブとして利用してmRNAを検出する。mRNAは直接決定するか、またはcDNAの形で決定することができる。このようなプローブを標識するか標識しないかは、使用者の選択次第であり、どちらでもよい。したがって例えば、IL-9の投与後に、本発明の核酸分子が存在するかどうかを決定することによって、このサイトカインがまだ有効であるかどうかを決定することができる。このタイプのアッセイは、例えば細胞がIL-9に対して感受性を示すかどうか、また感受性を示すなら、それはどの程度の感受性であるかを決定する定量的試験に適合させることができる。また、STAT1 、STAT3 および/ またはSTAT5 などのSTATタンパク質をリン酸化するために、本発明のタンパク質を利用することもできる。これは結果としてSTATタンパク質の二量化をもたらし、続いて核への移動が起こって、これらのSTATタンパク質が細胞に対して持っている効果が誘発される。
【０１０５】
また、これらの分子を使って、対象、例えばリンパ腫を患っている対象、アレルギー、後天性免疫不全症候群、自己免疫性糖尿病、甲状腺炎などの免疫系障害を患っている対象、または例えば米国特許第5,830,454 号、同第5,824,551 号、係属中の特許出願第08/925,348号（1997年9 月8 日出願、特許査定済）（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている他の状態を患っている対象に投与した場合のIL-9アゴニストまたはアンタゴニストの効力を試験することもできるだろう。また、これらの分子は、これらの状態および他の状態においてIL-9の役割を媒介するためにも使用することができる。詳しく述べると、IL-9はTIF を誘導するので、TIF はIL-9活性媒介因子として有用である。したがって、本発明のさらにもう一つの側面は、例えば過剰なIL-9活性が関係する喘息、アレルギー、およびリンパ腫などの状況において、内因性IL-9の活性を決定する方法である。また、例えばアンチセンス分子、TIF に結合する抗体、またはこれらの分子の他のアンタゴニストなどを使ってTIF またはTIF 活性を遮断または阻害することにより、IL-9活性を遮断または阻害することもできる。例えば、TIF 受容体に結合するがその受容体を活性化せず、よってIL-9が誘導する活性を阻害するTIF の突然変異タンパク質は、本発明の一特徴である。このようなTIF 突然変異タンパク質を使って処置することができる状態の例は、アレルギー、喘息などである。本発明の突然変異タンパク質は、例えばWeigelら,Eur.J.Biochem 180(2):295-300 （1989）およびEppsら,Cytokine 9(3):149-156（1997）（これらの文献はどちらも参照により本明細書に組み込まれる）などに従って作製することができる。このような突然変異タンパク質は、喘息、アレルギーまたはその両方の処置に使用することができる。さらに、上述のモデルを使って適当な突然変異タンパク質を選別できることも当業者には明らかだろう。IL-9活性を調節する能力は、上に挙げたような状態、ならびにアポトーシス（コルチゾール誘発性アポトーシスを含む）などの状態、BCL-3 の核発現を伴う状態において重要である。というのも、例えばIL-9はこのような発現を誘導することが知られているからである。本明細書にいう「抗体」とは、TIF に結合する抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体を含む）の任意の部分を指す。
【０１０６】
本発明のもう一つの特徴は、本発明のTIF 型分子が活性を示す組織タイプの再生を促進するまたはその分化を阻害するという本発明TIF 型分子の能力に関係する。上に示したように、TIF 分子は様々な癌および正常細胞株（すなわちメサンギウム細胞およびニューロン細胞ならびにメラノーマおよび肝癌細胞）を標的とする。したがって、例えばTIF 分子が作用する組織の再生を必要とする試料にある量のTIF 型分子を加えることによって、組織の再生を刺激することができる。このアプローチはインビトロでもインビボでも使用することができる。同様に、メラノーマまたは肝癌などの特定組織タイプの分化を阻害することが目的であるような状況では、TIF のアンタゴニストを加えることができる。
【０１０７】
上記実施例25で述べたように、TIF をコードする遺伝子は、染色体12上に位置する。この染色体が喘息に関係することは、当技術分野で知られているとおりである。また、領域12q15 は他の炎症性疾患に関係があることも知られている。したがって、本発明のさらにもう一つの態様は、TIF 遺伝子の位置に多型、欠失、付加などの異常が存在するかどうかを決定することによって、喘息などの状態または喘息に関係する状態への陥りやすさを決定する方法である。このような異常は、喘息、アレルギー状態または1 もしくは複数の関連状態への陥りやすさ、または喘息、アレルギー状態、または1 もしくは複数の関連状態の存在の指標になりうる。あるDNA 配列中の異常を検出できることは当技術分野ではよく知られており、そのような方法は本明細書で説明するまでもない。好ましくは、上述の方法論およびプライマーを使ったPCR などの標準的な技術によって、1 または複数の異常を検出する。
【０１０８】
上記のデータ、特にLPS による本発明分子の発現の誘導と、この分子による急性期応答の調節は、本発明の分子が炎症応答に積極的に関与することを示している。したがって、本発明のさらにもう一つの特徴は、IL-TIF/IL-21を使った炎症誘発物質および抗炎症物質の同定に関する。IL-TIF/IL-21が炎症応答を調節できることは、当業者には明らかだろう。本発明の好ましい一側面は、IL-TIF/IL-21またはそのアンタゴニストを投与することによって、肝臓などの器官による急性期応答を調節することである。例えば、参照により本明細書に組み込まれるJaneway ら著「Immunobiology 」第4 版を参照されたい。Janeway は、IL-1、IL-6およびTNF-αなどの様々なサイトカインが肝細胞を活性化して、C 反応性タンパク質およびマンナン結合レクチンなどの急性期タンパク質ならびに上記実施例に記載したタンパク質などを合成させると説明している。
【０１０９】
急性期タンパク質を活性化するIL-TIF/IL-21の役割は、推定上のアゴニストまたはアンタゴニストおよびIL-TIF/IL-21の存在下で急性期タンパク質産生が変化するかどうか決定することによって、IL-TIF/IL-21のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法にもつながる。産生量の増加は試験化合物がアゴニストであることを示し、その逆も同様であると解釈すべきである。
【０１１０】
インターロイキン10受容体との関係でIL-TIF/IL-21の活性を調節する方法も本発明の一部である。上に示したように、抗体などのIL-10Rβアンタゴニストを使用すると、IL-TIF/IL-21活性が阻害される。したがって本発明のもう一つの特徴は、IL-TIF/IL-21産生を調節を目的とする、IL-10RβアゴニストおよびアンタゴニストなどのIL-10 受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの使用である。
【０１１１】
本発明の他の特徴は当業者には明らかであり、これ以上述べる必要はないだろう。
【０１１２】
本明細書で使用した用語および表現は限定のためではなく説明のために使用したものであって、かかる用語および表現の使用に、本明細書に示し説明した特徴またはその一部の均等物を排除する意図はなく、本発明の範囲内で様々な変更態様が可能であると理解される。
【配列表】
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