(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のアミノ酸およびケト酸を、第二のアミノ酸およびピルビン酸を生成するのに適した条件下で、トランスアミナーゼ酵素と反応させること、および、このピルビン酸を、トランスアミナーゼ酵素と反応しない化合物を生成するのに適した条件下で、アセト乳酸シンターゼ酵素と反応させることを含む、アミノ酸を生産するための方法であって、該第一のアミノ酸がアラニンであることを特徴とするアミノ酸を生産するための方法。
【請求項２】
第一のアミノ酸およびケト酸を、第二のアミノ酸およびピルビン酸を生成するのに適した条件下で、トランスアミナーゼ酵素と反応させること、および、このピルビン酸を、トランスアミナーゼ酵素と反応しない化合物を生成するのに適した条件下で、アセト乳酸シンターゼ酵素と反応させることを含む、アミノ酸を生産するための方法であって、該第一のアミノ酸がＬ−アスパラギン酸であることを特徴とするアミノ酸を生産するための方法。
【請求項３】
ａ）ケト酸を生成するのに適した条件下で、第一のアミノ酸と酵素を反応させること、
ｂ）第三のアミノ酸およびピルビン酸を生成するのに適した条件下で、（ａ）でできたケト酸を、第二のアミノ酸およびトランスアミナーゼ酵素と反応させること、および、
ｃ）トランスアミナーゼ酵素と反応しない化合物を生成するのに適した条件下で、ピルビン酸をアセト乳酸シンターゼ酵素と反応させること
を含む、アミノ酸を生産するための方法であって、該第二のアミノ酸がアラニンであることを特徴とするアミノ酸を生産するための方法。
【請求項４】
ａ）ケト酸を生成するのに適した条件下で、第一のアミノ酸と酵素を反応させること、
ｂ）第三のアミノ酸およびピルビン酸を生成するのに適した条件下で、（ａ）でできたケト酸を、第二のアミノ酸およびトランスアミナーゼ酵素と反応させること、および、
ｃ）トランスアミナーゼ酵素と反応しない化合物を生成するのに適した条件下で、ピルビン酸をアセト乳酸シンターゼ酵素と反応させること
を含む、アミノ酸を生産するための方法であって、該第二のアミノ酸がＬ−アスパラギン酸であることを特徴とするアミノ酸を生産するための方法。
【請求項５】
ａ）２−ケト酪酸を生成するのに適した条件下で、Ｌ−スレオニンをスレオニンデアミナーゼと反応させること、
ｂ）オキサロ酢酸およびＬ−２−アミノ酪酸を生成するのに適した条件下で、２−ケト酪酸、Ｌ−アスパラギン酸、およびトランスアミナーゼ酵素と反応させること、
ｃ）オキサロ酢酸からピルビン酸を生産させること、
ｄ）アセト乳酸を生産するのに適した条件下で、ピルビン酸をアセト乳酸シンターゼ酵素と反応させること、
ｅ）アセト乳酸からアセトインを生産すること、および、
ｆ）アセトインとＬ−２−アミノ酪酸を別々に回収すること
を含む、Ｌ−２−アミノ酪酸を生成するための方法。
【請求項６】
ケト酸、アラニン又はＬ−アスパラギン酸から選択されるアミノ酸、トランスアミナーゼ酵素、およびアセト乳酸シンターゼ酵素を必須に含む天然には存在しない反応混合物。
【請求項７】
ケト酸が２−ケト酪酸である、請求項６の反応混合物。
【請求項８】
トランスアミナーゼ酵素が、トランスアミナーゼ酵素を産生する全細胞として水溶液中に存在する、請求項６の反応混合物。
【請求項９】
全細胞が、５０ｍｇ／ｍｌから２００ｍｇ／ｍｌの細胞濃度で水溶液中に存在する、請求項８の反応混合物。
【請求項１０】
全細胞が、１００ｍｇ／ｍｌの細胞濃度で水溶液中に存在する、請求項９の反応混合物。
【請求項１１】
トランスアミナーゼ酵素が、トランスアミナーゼ酵素を産生する全細胞の細胞抽出物として水溶液中に存在する、請求項６の反応混合物。
【請求項１２】
トランスアミナーゼ酵素が、固定化された酵素として存在する、請求項６の反応混合物。
【請求項１３】
アセト乳酸シンターゼ酵素が、アセト乳酸シンターゼ酵素を産生する全細胞として水溶液中に存在する、請求項６の反応混合物。
【請求項１４】
全細胞が、５０ｍｇ／ｍｌから２００ｍｇ／ｍｌの細胞濃度で水溶液中に存在する、請求項１３の反応混合物。
【請求項１５】
全細胞が、１００ｍｇ／ｍｌの細胞濃度で水溶液中に存在する、請求項１４の反応混合物。
【請求項１６】
アセト乳酸シンターゼ酵素が、アセト乳酸シンターゼ酵素を産生する全細胞の細胞抽出物として水溶液中に存在する、請求項６の反応混合物。
【請求項１７】
アセト乳酸シンターゼ酵素が、固定化された酵素として存在する、請求項６の反応混合物。
【請求項１８】
アセト乳酸シンターゼ酵素をコードするＤＮＡコード配列を含む、天然には存在しない微生物によって、アセト乳酸シンターゼ酵素が産生される、請求項６の反応混合物。
【請求項１９】
微生物が、アセト乳酸シンターゼ酵素をコードするＤＮＡコード配列を含むプラスミドを含む、請求項１８の反応混合物。
【請求項２０】
プラスミドが下記の制限酵素地図で表されるｐＰＯＴ３００である、請求項１９の反応混合物。
0004108766.tif 000050
【請求項２１】
さらにデアミナーゼを含む、請求項６の反応混合物。
【請求項２２】
さらにＬ−スレオニンを含む、請求項２１の反応混合物。
【請求項２３】
下記の制限酵素地図で表されるプラスミドｐＰＯＴ３００。
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【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の技術分野
本発明は、アミノトランスフェラーゼを用いて、アミノ酸を製造するための方法に関する。より特定すると、本発明は、アミノトランスフェラーゼを用いて、Ｌ−２−アミノ酪酸およびＬ−ｔ−ロイシンなどの非天然型アミノ酸を生産するための方法に関する。
関連する背景技術
本発明の方法は、トランスアミナーゼ酵素を用いた、天然型および非天然型のアミノ酸を生産するための先行技術に改良を加えたものである。トランスアミナーゼは、何年も前から文献上知られている。Ｐｈｉｌｉｐｐ  ＣｈｉｒｉｓｔｅｎとＤａｖｉｄ  Ｅ．  Ｍｅｔｚｌｅｒ編、トランスアミナーゼ（Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）（１９８５）（ニューヨークのジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ））を参照のこと。要約すると、トランスアミナーゼ反応には、アミノ酸とケト酸という２つの基質が必要である。トランスアミナーゼは、ケト酸のケト基（Ｃ＝Ｏ）とアミノ酸のアミノ基（−ＮＨ2）との交換を触媒する。この交換によって、ケト酸からは新規のアミノ酸が、また、アミノ酸からは新規のケト酸が生成する。典型的には、どちらか一つの生成物のみが所望され、一般的には、新規のアミノ酸が所望され、もう一方のものは望まれていない副産物である。この酵素は、分けて使用すると、２つの基質は２つの生成物に変換される。理論的には、この反応は可逆的であるため、基質から生成物への変換がおよそ５０％という平衡に達するまで進行するはずである。
米国特許第４，５１８，６９２号（”Ｒｏｚｚｅｌｌ  Ｉ”）は、Ｌ−アスパラギン酸とさまざまな２−ケト酸をトランスアミナーゼによって反応させて、Ｌ−アミノ酸を生産するための方法を開示している。Ｒｏｚｚｅｌｌ  Ｉ法は、オキサロ酢酸を製造するためにアミノ酸としてＬ−アスパラギン酸を用い、ピルビン酸を形成するためにオキサロ酢酸を脱炭酸するさまざまな方法を説明している。しかし、本明細書に示すように、Ｒｏｚｚｅｌｌ  Ｉ法で生産されるピルビン酸は、アラニンを生成する可逆反応過程で、依然ケト供与体として作用することができる。Ｔｏｋａｒｓｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｓ，Ｖｏｌ．  １０（１）（１９８８），ｐｐ．  ７−１０は、アラニンが、トランスアミナーゼ反応における基質として作用することを示している。トランスアミナーゼ（Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）（１９８５）；および、Ｋｌａｕｓ  Ｍ．  ＨｅｒｍａｎｎとＲｏｎａｌｄ  Ｌ．  Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ編、アミノ酸：生合成と遺伝子制御（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ：  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、（１９８３）（マサチューセッツ州レディング（Ｒｅａｄｉｎｇ）のアディソン−ウェズリーパブリシング（Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ））も参照のこと。Ｔｏｋａｒｓｋｉらは、トランスアミナーゼを用いて、２−ケト酪酸とアラニンからＬ−２−アミノ酪酸を生産することを研究した。しかし、この文献は、生産物への変換率が２５〜３０％にすぎないことを開示しており、この可逆反応によって、５０％という理論的な限界に到達できないことを示している。これは、固有の性質であり、トランスアミナーゼ反応の問題であると長い間考えられていて、これが主な理由となって、このような酵素触媒反応が、これらの非常に望ましいアミノ酸生成物を生成するための工業的製造法にさらに活用されることはなかった。本発明は、可逆反応の基質となる可能性のあるものを混合物から除去するための効果的な酵素法を提供する点で、Ｒｏｚｚｅｌｌ  ＩおよびＴｏｋａｒｓｋｉらとは異なる。
米国特許第４，８２６，７６６号（”Ｒｏｚｚｅｌｌ  ＩＩ”）は、２種類のトランスアミナーゼ酵素と、さらに別のケト酸を用いた、改良されたトランスアミナーゼ触媒反応を開示している。この方法では、第一のトランスアミナーゼ酵素が、第一のアミノ酸と第一のケト酸の間の反応を触媒して、第二のアミノ酸と第二のケト酸を生成させる。そして、第二のトランスアミナーゼ酵素は、第二のアミノ酸と第三のアミノ酸の反応をさらに触媒して、所望のアミノ酸を形成させる。この２種類のトランスアミナーゼ酵素は、第一の酵素が第二の反応を触媒せず、第二の酵素が第一の反応を触媒しないように選択する。しかし、Ｒｏｚｚｅｌｌ  ＩＩ法では、さらに別のケト酸が必要となり、また、アセト乳酸シンターゼの使用については開示いしていない。
これらの特許および文献の開示は、それらの全体が、参照して本明細書に組み込まれる。このように、トランスアミナーゼ酵素を用いて、アミノ酸の収率を上げる方法が望ましい。
本発明は、トランスアミナーゼ酵素を、トランスアミナーゼ反応によって生成されるケト酸を除去する第二の酵素と組み合せて、平衡状態が形成されるのを阻害し、アミノ酸生成反応を完全に行なわせる、改良されたトランスアミナーゼ法を提供する。第二の酵素は、ケト酸をトランスアミナーゼとそれ以上反応することができない基質に変換する反応を触媒する。第二のケト酸を除去することによって、第二の酵素は、所望のアミノ酸生成物が、生成されるアミノ酸のほぼ１００％となる程度までアミノ酸生成反応が進行することを可能にする。
この方法によって生産されるアミノ酸は、例えば、食品添加剤、フレーバー増強剤、甘味料、および栄養補給剤として、それだけでも有用であるが、合成中間化合物として用いて、有用産物、特に、薬剤を生産するために、さらに反応させることもできる。この生産方法によるアミノ酸生成物は、キラル薬剤を生産するための単一の鏡像異性体の出発物質として特に有用である。
発明の概要
本発明は、第一のアミノ酸、第一のケト酸、およびトランスアミナーゼ酵素を、第二のアミノ酸およびピルビン酸を生産するのに適した条件下で反応させ、および、このトランスアミナーゼ酵素と反応しない化合物を生産するのに適した条件下で、このピルビン酸をアセチル乳酸シンターゼと反応させることを含む、アミノ酸を生産するための方法を提供する。
本発明は、また、
ａ）ケト酸を生産するのに適した条件下で、第一のアミノ酸を酵素と反応させること、
ｂ）第三のアミノ酸およびピルビン酸を生産するのに適した条件下で、このケト酸を第二のアミノ酸およびトランスアミナーゼ酵素と反応させること、および、
ｃ）ピルビン酸をアセト乳酸シンターゼと反応させることを含む、アミノ酸生産のための方法を提供する。
本発明は、さらに、
ａ）２−ケト酪酸を生産するのに適した条件下で、Ｌ−スレオニンをスレオニンデアミナーゼと反応させること、
ｂ）オキソ乳酸およびＬ−２−アミノ酪酸を生産するのに適した条件下で、２−ケト酪酸、Ｌ−アスパラギン酸、およびトランスアミナーゼ酵素と反応させること、
ｃ）オキソ乳酸からピルビン酸を生産すること、
ｄ）アセト乳酸を生産するのに適した条件下で、ピルビン酸をアセト乳酸シンターゼ酵素と反応させること、
ｅ）アセト乳酸からアセトインを生産すること、および、
ｆ）アセトインとＬ−２−アミノ酪酸を別々に回収することを含む、Ｌ−アミノ酪酸を生産するための方法を提供する。
本発明は、また、
ａ）２−ケト酪酸を生産するのに適した条件下で、Ｌ−スレオニンをスレオニンデアミナーゼ酵素と反応させること、
ｂ）２−アミノ酪酸およびピルビン酸を生産するのに適した条件下で、２−ケト酪酸を、アミノ酸およびトランスアミナーゼ酵素と反応させること、および、
ｃ）トランスアミナーゼ酵素と反応しない化合物を生産するのに適した条件下で、ピルビン酸をアセト乳酸シンターゼ酵素と反応させること
を含む、２−アミノ酪酸を生産するための方法も提供する。
本発明は、また、ケト酪酸、アミノ酸、トランスアミナーゼ酵素、およびアセト乳酸シンターゼ酵素を含む反応媒質も提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、後述の実施例６で説明する、プラスミドｐＬＧ３３８からのプラスミドｐＩＦ３４９の作製を示している。
図２は、後述の実施例１で説明する、プラスミドｐＢＲ３２２からのプラスミドｐＩＦ３０６の作製を示している。
図３は、後述の実施例１で説明する、プラスミドｐＩＦ３０６からのプラスミドｐＩＦ３０７の作製を示している。
図４は、後述の実施例１で説明する、プラスミドｐＩＦ３０７からのプラスミドｐＩＦ３１２の作製を示している。
図５は、後述の実施例５で説明する、プラスミドｐＩＦ３１２からのプラスミドｐＩＦ３２２の作製を示している。
図６は、後述の実施例２で説明する、プラスミドｐＩＦ３１２からのプラスミドｐＩＦ３４７の作製を示している。
図７は、後述の実施例１で説明する、プラスミドｐＩＦ３１２からのプラスミドｐＩＦ３５３の作製を示している。
図８は、後述の実施例７で説明する、プラスミドｐＩＦ３２８を示している。
図９は、後述の実施例３で説明する、プラスミドｐＭＥ６４を示している。
図１０は、後述の実施例１で説明する、プラスミドｐＰＯＴ１を示している。
図１１は、後述の実施例１で説明する、プラスミドｐＰＯＴ１からのプラスミドｐＰＯＴ２の作製を示している。
図１２は、後述の実施例１で説明する、プラスミドｐＰＯＴ２からのプラスミドｐＰＯＴ３の作製を示している。
図１３は、後述の実施例４で説明する、プラスミドｐＰＯＴ３からのプラスミドｐＰＯＴ３００の作製を示している。
図１４は、後述の実施例８で説明する、プラスミドｐＰＯＴ３からのプラスミドｐＰＰＴ３６８の作製を示している。
発明の詳細な説明
本発明は、第一のアミノ酸、ケト酸、およびトランスアミナーゼ酵素を、第二のアミノ酸およびピルビン酸を生産するのに適した条件下で反応させ、また、トランスアミナーゼ酵素と反応しない化合物を生産するのに適した条件下で、このピルビン酸をアセチル乳酸シンターゼと反応させることを含む、アミノ酸を生産するための方法を提供する。
本発明の方法の概要を説明すると、次のようになる：
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本発明を実施するときに、本明細書において、時に、”アミノ供与体”と呼ばれている第一のアミノ酸は、トランスアミナーゼ、および、本明細書において、時に”ケト供与体”と呼ばれているケト酸と反応して、所望のアミノ酸生成物（反応図式１の”アミノ酸２”）とピルビン酸（反応図式１の”ケト酸２”）を生成する、あらゆるアミノ酸を含む。一つの実施形態において、第一のアミノ酸は、このような条件下で直接、ピルビン酸になるアラニンである。Ｔｏｋａｒｓｋｉらを参照のこと。好ましい態様において、第一のアミノ酸はＬ−アスパラギン酸である。ケト酸とＬ−アスパラギン酸とのトランスアミナーゼ反応は、第二のケト酸としてオキサロ酢酸を生成する。Ｒｏｚｚｅｎｌｌ  Ｉの開示とは逆に、通常の条件下では、オキサロ酢酸はＣＯ2を自然に失ってピルビン酸になることを当業者は認識している。
本発明の方法は、第二の酵素である、ピルビン酸２分子を縮合してアセト乳酸を生成させるアセト乳酸シンターゼの反応によってピルビン酸を除去する。縮合過程で、カルボキシル基が二酸化炭素分子となって脱離するため、この反応は、本質的に不可逆的なものとなる。次に、アセト乳酸は、さらに、自然に脱炭酸を起こしてアセトインを生成するが、これは、揮発性であるため、望ましければ、精製したアミノ酸生成物を提供するための公知の技術を用いて、アミノ酸反応生成物から分離するのは容易である。
さまざまな選択性をもつトランスアミナーゼが知られている。トランスアミナーゼ（Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）（１９８５）；アミノ酸：生合成と遺伝子制御（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（１９８３）；および米国特許第４，８２６，７６６号（”Ｒｏｚｚｅｌｌ  ＩＩ”）を参照のこと。本発明の方法は、トランスアミナーゼ酵素を産生するバクテリアまたはウイルスなど、天然に存在する、または天然には存在しない微生物の使用を含むことを想定している。本明細書で用いられる”天然には存在しない微生物”という用語は、遺伝子を改変した微生物で、トランスアミナーゼ酵素を産生するものすべてを含むことを想定している。例えば、Ｒｏｚｚｅｌｌ  ＩＩは、芳香族アミノ酸、分枝アミノ酸、および酸性側鎖をもつアミノ酸に対する選択性をもつトランスアミナーゼの微生物源をいくつか開示している。
本方法の一つの態様において、トランスアミナーゼ酵素は、トランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子をもつ、天然には存在しない微生物の細胞によって産生される。例えば、細胞がトランスアミナーゼ酵素を産生するよう、トランスアミナーゼをコードする遺伝子を、細胞の中に挿入されるプラスミドの中に組み込むことができる。本発明の別の態様において、例えば、２種類、３種類、４種類など、複数のトランスアミナーゼ酵素を、本方法において、同時に利用することができる。したがって、本明細書で用いられる場合、”トランスアミナーゼ酵素”は、同時に用いるのに、１種類または１種類よりも多いトランスアミナーゼ酵素を含むことができる。好ましい態様においては、単一のトランスアミナーゼ酵素の場合も、複数のトランスアミナーゼ酵素の一つの場合も、用いられるトランスアミナーゼ酵素は、本明細書で説明されているプラスミドｐＭＥ６４によって産生される酵素である。
アセト乳酸シンターゼの供給源についての一般的な説明は、Ｒｅｎｎａ，  Ｍ．Ｃ．ら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９９３）Ｖｏｌ．  １７５，  ｐｐ．  ３８６３−３８７５；およびＷｅｋ，  Ｒ．Ｃ．  ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（１９８５）Ｖｏｌ．  １３，  ｐｐ．  ３９９５−４０１０の中に見られる。これらの文献は、その全体が、参照して本明細書に組み込まれる。トランスアミナーゼ酵素について上記したように、本発明の方法は、アセト乳酸シンターゼ酵素を産生するバクテリアまたはウイルスなど、天然に存在するか、または天然には存在しない微生物の使用を含むことを想定している。本方法の一つの態様において、アセト乳酸シンターゼ酵素は、トランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子をもつ、天然には存在しない微生物の細胞によって生産される。例えば、細胞にアセト乳酸シンターゼ酵素を生産させるために、細胞の中に挿入されるプラスミドの中に、アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を組み込むことができる。本発明の別の態様において、本方法では、例えば、２種類、３種類、４種類など、複数のアセト乳酸シンターゼを同時に利用することができる。したがって、本明細書で用いられる場合、”アセト乳酸シンターゼ酵素”は、同時に用いるのに、１種類または１種類よりも多いアセト乳酸シンターゼ酵素を含むことができる。好ましい態様においては、単一のアセト乳酸シンターゼ酵素の場合も、複数のアセト乳酸シンターゼ酵素の一つの場合も、用いられるアセト乳酸シンターゼ酵素は、本明細書で説明されているプラスミドｐＰＯＴ３００によって産生される酵素である。
本発明の方法を応用して、適当なケト酸を選択することによって、さまざまな天然型および非天然型のアミノ酸を生産することができる。米国特許第４，５１８，６９２号、およびトランスアミナーゼ（Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）（１９８５）をみると、本発明において有用な広範なケト酸を開示している。好ましい態様において、ケト酸は２−ケト酪酸である。別の好ましい態様において、ケト酸はトリメチルピルビン酸である。
これらの供給源に加えて、ケト供与体は、別のアミノ酸を含む、容易に利用することのできる出発物質から調製することもできる。例えば、スレオニンデアミナーゼという酵素は、Ｌ−スレオニンと反応して２−ケト酪酸を生成する。下記の反応図式２を参照のこと。そして、このようにして生成したケト酸を、上述した方法にしたがって、Ｌ−アスパラギン酸のアミノ酸基質と反応させて、Ｌ−２−アミノ乳酸を生産する。Ｌ−スレオニンは、アーチャー・ダニエルズ・ミッドランド社（Ａｒｃｈｅｒ  Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｍｉｄｌａｎｄ）（イリノイ州ディケーター（Ｄｅｃａｔｕｒ））から購入することのできる安価な出発物質であり、この反応は、本質的に１００％の収率で２−ケト酪酸を生成する。上記アミノ酸：生合成と遺伝子制御（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ：  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（１９８３）を参照のこと。
0004108766.tif 000003
本方法において有用なさまざまなケト酸を生産するためのさまざまなアミノ酸出発物質を用いる、さらに別の反応が当技術分野で知られている。Ｇｅｎｅ，（１９８９）Ｖｏｌ．  ７６，ｐｐ．  ２５５−２６９およびＧｅｎｅ，（１９８８）Ｖｏｌ．  ６３，  ｐｐ．  ２４５−２５２に説明がある。また、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）のアミノ酸デアミナーゼ酵素の活性に関する一般的な説明については、Ｍａｓｓａｄ  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９９２）Ｖｏｌ．  １７７，  ｐｐ．  ５８７８−５８８３を参照のこと。これらの文献は、その全体が、参照して本明細書に組み込まれる。
このように、本発明は、また、
ａ）ケト酸を生産するのに適した条件下で、第一のアミノ酸を酵素と反応させること、
ｂ）第三のアミノ酸およびピルビン酸を生産するのに適した条件下で、このケト酸を第二のアミノ酸およびトランスアミナーゼ酵素と反応させること、および、
ｃ）ピルビン酸をアセト乳酸シンターゼと反応させることを含む、アミノ酸生産のための方法も提供する。
工程（ｃ）におけるピルビン酸の反応は、上記の説明にしたがって進行して、アミノ酸生産物を単離するために、第三のアミノ酸から容易に単離することができるアセトインを生成する。好ましい態様において、工程（ａ）の酵素は、デアミナーゼ酵素である。特に好ましい態様においては、第一のアミノ酸はスレオニン、また酵素はスレオニンデアミナーゼである。
好ましい態様において、本発明は、
ａ）２−ケト酪酸を生産するのに適した条件下で、Ｌ−スレオニンをスレオニンデアミナーゼ酵素と反応させること、
ｂ）２−アミノ酪酸およびピルビン酸を生産するのに適した条件下で、２−ケト酪酸を、アミノ酸およびトランスアミナーゼ酵素と反応させること、
ｃ）ピルビン酸をアセト乳酸シンターゼ酵素と反応させること、を含む、２−アミノ酪酸生産のための方法を提供する。
これらの方法を実施するときに、デアミナーゼなど、工程（ａ）で用いられる酵素は、上述の供給源のいずれに由来していてもよく、また、上述したような複数の酵素でもよい。本発明の一つの態様において、本方法では、例えば、２種類、３種類、４種類など、複数の酵素を、同時に利用することができる。したがって、本明細書で用いられる場合、”デアミナーゼ酵素”は、同時に用いるのに、１種類または１種類よりも多いデアミナーゼ酵素を含むことができる。本方法の好ましい態様において、デアミナーゼ酵素は、本明細書で説明されているプラスミドｐＩＦ３４７によって産生されるスレオニンデアミナーゼ酵素である。本方法を実施するときに、デアミナーゼなど、工程（ｂ）で用いられるアミノ酸およびトランスアミナーゼ酵素は、ピルビン酸を生成するアミノ酸およびトランスアミナーゼ酵素でもよい。好ましい態様において、工程（ｂ）のアミノ酸はＬ−アスパラギン酸である。別の好ましい態様において、トランスアミナーゼ酵素は、プラスミドｐＭＥ６４によって産生される酵素である。工程（ｃ）で使用されるアセト乳酸シンターゼは、上述の供給源のいずれからのものでもよい。本発明の好ましい態様において、アセト乳酸シンターゼ酵素は、プラスミドｐＰＯＴ３００によって産生される酵素である。
酵素を利用するための技術
本発明を実施するときに、上述の酵素を、上述の基質と反応させるのに”適した条件”は、当業者にとって既知のものである。
例えば、トランスアミナーゼおよびアセト乳酸シンターゼ酵素を産生する細胞を、ケト酸およびアミノ酸の出発物質を含む溶液に接触させることができ、混合液中のケト酸出発物質の少なくとも一部を、所望のアミノ酸生成物に変換するという結果をもたらすことができる。基質および生成物が、細胞の内外に容易に拡散するよう、細胞を透過性にすることも可能である。この透過性化は、登録商標トィーン８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、登録商標トリトン  Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、登録商標ノニデットＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０）、塩化セチルピリジニウム、デオキシコール酸、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、または塩化ベンズアルコニウムなどを含むが、これらに限定はされない界面活性剤を低濃度で用いて細胞を処理することによって行なうことができる。さらに、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノールまたはアセトンなどであるが、これらに限定はされない有機溶媒を低濃度で用いて、透過性を高めることもできる。トランスアミナーゼ、スレオニンデアミナーゼ、およびアセト乳酸シンターゼなどの酵素も、粗製酵素、部分精製酵素、または精製した酵素を含む細胞抽出物の形で、出発反応混合物に加えることもできる。細胞破砕および酵素の回収のために用いられる、当業者に既知の方法によって、細胞抽出物を調製する。細胞破砕は、物理的手段または非物理的手段によって行なうことができる。バクテリア懸濁液には、当業者に公知の特定の方法とともに、フレンチプレス、超音波、ビーズ式破砕、またはマントン−ゴーリン（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ）式ホモジナイザーが最もよく用いられる。Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．”タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）”（１９８２）（ニューヨークのスプリンガーフェアラーク社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ））を参照のこと。次に、上述した全細胞法と同じ方法で、細胞抽出物を用いた反応を行なう。
酵素を含む細胞、またはその抽出物もしくは精製酵素もしくは酵素画分は、望ましければ、固定化することもできる。本発明を実施するときに用いることのできる固定方法には、ポリマーゲルへの捕捉、共有結合、クロスリンキング、吸着、およびカプセル化などの公知の方法が含まれる。これらの方法のいくつかの実例が、参照してここに組み込まれる、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９：７２２−７２７（１９８３）とその中の文献において、Ａ．Ｍ．  Ｋｌｉｂａｎｏｖによって、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第４４巻（Ｋ．  Ｍｏｓｂａｃｈ編）（１９７９）において説明されている。米国特許第５，０１９，５０９号において開示されている一つの方法では、少なくとも２０重量％のシリカまたはアルミナを含む支持物質を、アミノアルキルシラン、ポリエチレンイミン、またはポリアルキルアミンなどのアミノアルキル化合物と接触させてから、グルタルアルデヒドによって活性化させる。そして、酵素を含む溶液を、活性化させた支持体と接触させ、トランスアミナーゼおよび／またはアセト乳酸シンターゼの活性をもつ固定化酵素組成物を作製する。本発明を実施する上で有用なその他の固定化支持体には、多孔性ガラスおよび多孔性セラミック、ベントナイト、珪藻土、登録商標チャコールセファロース（ｃｈａｒｃｏａｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）および登録商標セファロース誘導体、セルロースおよびセルロース誘導体、ポリアクリルアミドおよびポリアクリルアミド誘導体、ポリアゼチジン、アルギナート、カラゲナン、および登録商標クロモソーブ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ）などがあるが、これらに限定はされない。登録商標セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（スウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）のファルマシアファインケミカルズ社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））は、アガロースから調製されるビーズ状のゲルである。製造業者の製品説明書によると、自然な状態では、アガロースは、寒天（アガー）と呼ばれる、荷電した多糖類と中性の多糖類との複合的混合物の一部として存在する。登録商標セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を作製するために用いられるアガロースは、荷電性多糖を取り除いて、非常に少数の残留荷電基だけをもつゲルを作製するという精製処理によって得られる。当業者には、細胞、またはそれに由来する抽出物を固定するのに適したその他多くの物質も、本発明で用いる酵素の固定に有用であることが理解できよう。これらの支持体は、望ましい場合には、当技術分野において公知の技術によって活性化することができる
トランスアミナーゼおよびアセト乳酸シンターゼを含む細胞、またはこの細胞から採った抽出物を含む組成物を利用して、所望のアミノ酸生成物を生成する反応は、第一のケト酸の少なくとも一部を所望のアミノ酸に変換させることのできる条件下で、第一のケト酸と第一のアミノ酸を含む溶液を酵素と接触させることによって行なう。本発明の方法を実施するとき、細胞は酵素水溶液と、約５０ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌの範囲の細胞濃度にて接触させる。好ましい態様において、細胞濃度は約１００ｍｇ／ｍｌである。細胞の抽出物を用いて本発明を実施するときには、これらの細胞濃度を生じさせるような細胞量から抽出物を調製する。
本発明の酵素反応は、約３０℃から約５０℃の温度範囲で、好ましくは、約３７℃から約４５℃の温度範囲で実施する。反応にとって至適なｐＨは、約６から約９の範囲におよび、より好ましくは、約７から約８であるが、ｐＨ  ８がもっとも好ましい。
これから、以下の実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は、後述する請求項において明らかにされる本発明の範囲を制限するためのものではなく、そのように解釈してはならない。
実験の詳細
実施例１−４は、請求の範囲に記載されている発明の方法、すなわちＬ−２−アミノ酪酸の生産の、好ましい態様において用いられる好ましい酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製法、を示している。実施例では、これらのプラスミド、ｐＩＦ３４７、ｐＭＥ６４、およびｐＰＯＴ３００は、それぞれ、宿主菌株Ｗ３１１０を利用して、別々に、個々のバクテリア宿主菌株中で用いた。Ｗ３１１０は、ＡＴＣＣ（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ））から入手する（ＡＴＣＣ受託番号２７３２５）。しかし、当業者は、本発明を実施するには、それぞれ別の宿主菌株も適していると考えよう。さらに、当業者は、２種類以上のプラスミド、またはすべてのプラスミドを、単一の宿主菌株の中に組み込んで、上述のように利用することができると考えよう。
当業者にとって公知の一般的な分子生物学的技術を全面的に用いることができる。例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（第２版、１９８９）、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）（ニューヨーク州コールドスプリングハーバーパブリケーションズ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ））。ＰＣＲ法は、ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）（ニュージャージー州ブランチバーグ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ））によって販売されているパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡｍｐキットを用いて、配布された説明書にしたがって実施した。ＤＮＡ連結は、タカラバイオケミカル社（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）のパンベラ社（ＰａｎＶｅｒａ  Ｃｏｒｐ．））によって販売されているキットを用い、配布された使用説明書にしたがって実施した。ＤＮＡ切断は、ニューイングランドバイオラブズ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州バヴァリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）によって販売されている制限酵素を用い、配布された使用説明書にしたがって実施した。染色体ＤＮＡは、ＱｉａｇｅｎゲノミックＤＮＡキッツ（カリフォルニア州サンタクラリタ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，  ＣＡ）のキアゲン社（Ｑｕｉａｇｅｎ））のものを用い、配布された使用説明書にしたがって実施した。さらに、キアゲン社から、ＰＣＲ精製キットの供給を受けたが、これを配布された使用説明書にしたがって用いた。
遺伝子発現は、本発明の好ましい態様を代表する一連の発現ベクターで、本明細書で、ｐＰＯＴと呼ばれているベクター上で行われた。これらのプラスミドは、醗酵槽の温度を調節することによって、細胞増殖の特定の段階で、遺伝子に酵素産生を開始させることができる。これらのプラスミドは、ラムダファージ由来のｃＩと名づけられたリプレッサーの変異配列をもっている。Ｒ．Ｗ．  Ｈｅｎｄｒｉｘら編（１９８３）、（ニューヨーク州コールドスプリングハーバーパブリケーションズ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；およびストラタジーンクローニングシステムズ社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））の製品カタログ（カリフォルニア州ラホヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を参照のこと。この変異は、リプレッサーを温度が約３０℃を超える温度に上昇すると、不安定にする。このリプレッサーは、通常は、ＰRプロモーターの制御下にある遺伝子を発現させない。温度が上昇すると、リプレッサーが不活性化されて、プロモーターが働きだす。いずれの場合にも、目的の遺伝子は、ＰRプロモーターの調節下に置かれている。
実施例１
発現ベクターｐＰＯＴ１、ｐＰＯＴ２、およびｐＰＯＴ３の構築
プラスミドｐＰＯＴ１。プラスミドｐＢＲ３２２を、ニューイングランドバイオラブズ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州バヴァリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）から購入した。ｐＢＲ３２２上の唯一のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩ部位の間に、改変したｐｈｅＡプロモーターを挿入して、ｐＩＦ３０６を構築した。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ挿入配列中には、唯一のＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩ部位が存在する。改変したｐｈｅＡプロモーターは、参照してここに組み込まれる、Ｆｏｔｈｅｒｉｎｇｈａｍｒらへの同じ所有の米国特許第５，１２０，８３７号で特徴付けられているプロモーターに由来しており、次のよう配列であった。
0004108766.tif 000004
ｐＩＦ３０６をＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで切断した。３．９ｋＢの断片を単離して、同じように切断した、大腸菌Ｋ１２のｉｌｖＥ遺伝子を含むフラグメントと連結させた、このフラグメントは、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって、Ｗ３１１０の染色体から作製した。
0004108766.tif 000005
こうしてできたベクターにｐＩＦ３０７という名前をつけた。プラスミドｐＩＦ３０７をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断して、４．１ｋＢの断片を単離した。この断片を、同じように切断して精製した９８２塩基対のＤＮＡ断片で、プラスミドｐＬＧ３３８からのカナマイシン耐性遺伝子を含むものと連結させた（ｐＬＧ３３８については、米国特許第５，１２０，８３７号、およびＳｔｏｋｅｒら、Ｇｅｎｅ  １８：  ３３５−３４１で説明されている）。この断片は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲを用いて作製された。
0004108766.tif 000006
こうしてできたプラスミドをｐＩＦ３１２と名付けた。プラスミドｐＩＦ３１２をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、その結果できた４．９７ｋＢの断片を、ラムダファージｃＩ８５７遺伝子に連結させた。この遺伝子は、ラムダ（Ｌａｍｂｄａ）ＺａｐＩＩベクター（カリフォルニア州ラホヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）にあるストラタジーン社（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を鋳型として用い、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって単離した後、同じように切断して得た。
0004108766.tif 000007
こうしてできたプラスミドをｐＰＴ３５３と名付けた。このプラスミドをＰｓｔＩおよびＥａｇＩで切断して、３．１７ｋＢの断片を単離した。次に、この断片を、ｐＢＲ３２２の１．９５ｋＢのＰｓｔＩ−ＢｓｐＥ１断片と、次のオリゴヌクレオチドを用いて、ｐＬＧ３３８から作製したＰＣＲ断片に連結させてプラスミドｐＰＯＴ１を構築できる。
0004108766.tif 000008
このＰＣＲによって、０．５９ｋＢのＤＮＡ断片が増幅される。このＤＮＡ断片を、ＢｓｐＥＩとＥａｇＩで切断して、３種類の分子を連結してｐＰＯＴ１を作製するのに必要な粘着末端を作製する。
プラスミドｐＰＯＴ２を作製するために、ｐＰＯＴ１をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断して、４．６８ｋＢの断片を単離した。この断片を、以下の２種類のオリゴヌクレオチドのアニーリングにより調製したオリゴヌクレオチドリンカーに連結させた。
0004108766.tif 000009
こうしてできたプラスミドをｐＰＯＴ２と名付けた。このプラスミドをＸｈｏＩおよびＰｓｔＩで切断して、３．９ｋｂの断片を単離した。この断片を、同じようにＸｈｏＩおよびＰｓｔＩで切断した断片で、米国特許第５，３４５，６７２号（Ｆｏｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ）（この特許の開示は、参照して本明細書に組み込まれる）に記載されているＨＳＧ４１５のｃａｔ遺伝子を含む断片に連結させた。ｃａｔ遺伝子は、宿主細胞にクロラムフェニコールに対する耐性を付与し、ＨＳＧ４１５から、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて単離することができる。
0004108766.tif 000010
こうしてできたプラスミドをｐＰＯＴ３と名付けた。
実施例２
スレオニンデアミナーゼをコードする大腸菌ｉｌｖＡ遺伝子を含むプラスミドｐＩＦ３４７
ｐＩＦ３４７を構築するために、スレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を、大腸菌Ｋ１２の染色体ＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。大腸菌Ｋ１２の染色体ＤＮＡは、常法にしたがって調製した。ｉｌｖＡ遺伝子は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって特異的に増幅した。
0004108766.tif 000011
このＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断し、こうして作製した１．５７ｋＢの断片を、同じようにＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断したｐＩＦ３１２の４．１ｋＢの断片に連結させた。こうしてできたプラスミドをｐＩＦ３４７と名付けた。
実施例３
チロシンアミノトランスフェラーゼをコードする大腸菌ｔｙｒＢ遺伝子を含むプラスミドｐＭＥ６４
ｔｙｒＢ遺伝子をコードする大腸菌Ｋ１２染色体の断片を含むプラスミドｐＭＥ６４は、Ｆｏｔｈｅｒｉｎｇｈａｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，（１９８６）Ｖｏｌ．  ２３４，  ｐｐ．  ５９３−６０４に記載されており、この内容は、参照して本明細書に組み込まれる。ｔｙｒＢ遺伝子は、文献に開示されている配列に基づいたオリゴヌクレオチドプライマーを用い、常法を用いて、大腸菌Ｋ１２の染色体から直接単離することもできる。
実施例４
アセト乳酸シンターゼをコードする枯草菌ａｌｓＳ遺伝子を含むプラスミドｐＰＯＴ３００
ＰＣＲを用いて、枯草菌の染色体からａｌｓＳ遺伝子を増幅した。枯草菌の染色体ＤＮＡは、大腸菌Ｋ１２に用いた方法と同じ方法を用いて調製した。ａｌｓＳ遺伝子は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによって特異的に増幅された：
0004108766.tif 000012
そして、このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩ酵素で切断してできた１．９ｋＢの断片を、同じようにＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断した後アガロースゲル電気泳動によって単離したｐＰＯＴ３の４．７６ｋＢの断片に連結させた。こうしてできたプラスミドをｐＰＯＴ３００と名付けた。
実施例５
プラスミドｐＩＦ３２２の構築
ａｓｐＣ遺伝子も、刊行物Ｆｏｔｈｅｒｉｎｇｈａｍら、（１９８６）で説明されている。この刊行物で開示されている配列に基づいて、この遺伝子のコード配列を、大腸菌Ｋ１２の染色体から、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって、１．２ｋＢの断片として単離することができる。
0004108766.tif 000013
ｐＩＦ３２２を構築するために、プラスミドｐＩＦ３１２をＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断して、以前と同じように４．１ｋＢの断片を単離した。これを、ａｓｐＣを含むＰＣＲ断片に連結させてｐＩＦ３２２を作出した。
実施例６
プラスミドｐＩＦ３４９の構築
Ｆｏｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ（１９８６）に開示されている配列に基づいて、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、野生型のプロモーター領域とともにａｓｐＣ遺伝子を１．６ｋｂの断片として単離することができる。
0004108766.tif 000014
ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットを用いてＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで制限酵素消化して得た断片を、プラスミドｐＬＧ３３８の７．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片に連結させることができる。プラスミドｐＬＧ３３８については、米国特許第５，１２０，８３７号、およびＳｔｏｋｅｒら、Ｇｅｎｅ  ｖｏｌ．  １８：ｐｐ．  ３３５−３４１で説明されて、その内容は、参照して、本明細書に組み込まれる。こうしてできたプラスミドがｐＩＦ３４９である。
実施例７
プラスミドｐＩＦ３２８の構築
プラスミドｐＩＦ３２８は、ｐＩＦ３１２に由来している。まず、ｐＩＦ３１２のｐｈｅＡに由来するプロモーター領域を、大腸菌Ｋ１２のｐｃｋＡプロモーターに由来する領域と置換した。この領域は、ＧＥＮＢＡＮＫエントリーＥＣＯＰＣＫＡに記載されている。ｐｃｋＡプロモーターを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、２７０  ｂｐ断片上で増幅した。
0004108766.tif 000015
５’  ＧＡＴＡＡＴ３’という野生型の−１０配列が５’  ＴＡＴＡＡＴ３’になるよう、標準的なＰＣＲによる突然変異誘発法を用いて、ｐｃｋＡプロモーターの−１０領域に突然変異を導入した。この結果、このプロモーターによる正常な代謝的抑制が失われる。
この断片を単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＩの切断断片により生じたｐＩＦ３１２の４．９７ｋｂ断片に連結した。こうしてできたプラスミミドがｐＩＦ３１２である。
そして、プラスミドｐＩＦ３１３をＥｓｐＥＩとＳｐｈＩ酵素で切断し、４．１４ｋｂの断片を単離して、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。次に、ｐＬＧ３３８の部分的遺伝子座であるＰａｒを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した：
0004108766.tif 000016
この結果できた９７０  ｂｐ断片をＢｓｐＥＩとＳｐｈＩで切断し、ｐＩＦ３１３断片に連結させた。この結果できたプラスミドがｐＩＦ３２８であった。
実施例８
プラスミドｐＰＴ３６８の構築
ｐＰＴ３６８を構築するために、プラスミドｐＰＯＴ３を、ＢａｍＨＩとＳｐｈＩ酵素によって切断し、４．８ｋｂ断片を単離した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって、大腸菌染色体から大腸菌Ｋ１２のｉｌｖＥ遺伝子を増幅した：
0004108766.tif 000017
この０．９４ｋｂの断片をＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＢａｍＨＩとＳｐｈＩで同じように切断して、ｐＰＯＴ３の断片に連結させた。この結果、プラスミドｐＰＴ３６８ができた。
次の実施例９および１０では、２−ケト酪酸またはＬ−スレオニンを基質として用いて、２−アミノ酪酸生合成に対するアセト乳酸シンターゼの効果を調べた。ＬＢ寒天培地からの単一コロニーを５０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、５００ｍｌフラスコに入れて、３７℃で一晩振とう培養器中で培養して、ｐＭＥ６４、ｐＰＯＴ３００、またはｐＩＦ３４７をもつＷ３１１０細胞の細胞培養液を調製した。適当なものに、抗生物質を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、４０μｇ／ｍｌカナマイシン、および１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールという濃度で添加した。上記の実施例でのプラスミドの説明によって、どの抗生物質が各プラスミドに必要かが分かる。そして、一晩培養した培養液を用いて、１リットルのＬＢに適当な抗生物質を加えたもののＯＤ６００が、まず０．０５になるように植菌した。これらを４リットルフラスコ中で、ＯＤ６００が１．０になるまで３００ｒｐｍで回転しながら３７℃で増殖させた。次に、１０，０００Ｇで５分間遠心分離して、この細胞を回収し、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で洗浄して、また同じように沈殿させた。沈殿させた生細胞を必要な重量、生物学的変換用混合液に加えた。
アミノ酸のＨＰＬＣ解析を、以下のようにして行なった。
１．Ｌ−２−アミノ酪酸：
方法：ＯＰＡ／ＢＯＣ−Ｃｙｓ誘導体化。
移動相：勾配法、ポンプＡ＝６０％ＭｅＯＨ、４０％０．０５ＭＴＥＡＰ、緩衝液のｐＨ＝７．０；ポンプＢ＝Ｈ2Ｏ；ポンプＢ０分および６分後、３２％、８分後までに５％。１４．１分後に、開示した時の条件に復帰させる。４０℃のオーブン。
カラム：スペルコシル（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ）ＬＣ−１８ＤＢ、３μ、１５０×４．６ｍｍ
流速：１．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ  ＠  ３３８ｎｍ
注入容量：１０μｌ
２．Ｌ−ｔ−ロイシン：
方法：ＯＰＡ／ＢＯＣ−Ｃｙｓ誘導体化。
移動相：保存溶液３００ｍＭＮａＨＰＯ4、ｐＨ７．０；１リットルの水に溶解した１１．６３５ｇのＮａＨ2ＰＯ4、および３０．７２３ｇのＮａ2ＨＰＯ4；勾配法、ポンプＡ＝１５ｍＭＮａＨＰＯ4；水で１Ｌに希釈した５０ｍｌの保存溶液；ポンプＢ＝９００ｍｌのポンプＡ溶液、および１１００ｍｌのＡＣＮ。
カラム：スペルコシル（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ）ＬＣ−１８ＤＢ、３μ、１５０×４．６ｍｍ
流速：１．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ  ＠  ３３８ｎｍ
注入容量：１０μｌ
実施例９
２−ケト酪酸を基質として用いた、２−アミノ酪酸の生合成反応は、以下の基質濃度を用いて行なった：
反応Ａ
反応容量２ｍｌ
２−ケト酪酸５００ｍＭ（ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整）
Ｌ−アスパラギン酸５００ｍＭ（ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整）
１００ｍＭトリスｐＨ７．５
反応時間２４時間
ｐＭＥ６４をもつＷ３１１０の細胞、１００ｍｇ／ｍｌ
反応Ｂ
反応容量２ｍｌ
２−ケト酪酸５００ｍＭ（ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整）
Ｌ−アスパラギン酸５００ｍＭ（ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整）
１００ｍＭトリスｐＨ７．５
反応時間２４時間
ｐＭＥ６４をもつＷ３１１０の細胞、１００ｍｇ／ｍｌ、およびｐＰＯＴ３００をもつＷ３１１０の細胞、５０ｍｇ／ｍｌ
２４時間インキュベートした後、各反応液から２００μｌのサンプルを採って、遠心分離によって細胞を取り除いた。そして、このサンプルを１００倍に希釈して、上述の方法によるＨＰＬＣによるアミノ酸解析（以下で詳述）を行なった。
次の表において、”Ｌ−２−ａｂａ”は、Ｌ−２−アミノ酸酪酸を意味し、”Ｌ−ａｌａ”はＬ−アラニン含有量を表し、”Ｌ−ａｓｐ”はＬ−アスパラギン酸を表し、”Ｌ−ｔｈｒ”はＬ−スレオニンを表し、”Ｌ−ｔ−ｌｅｕ”はＬ−ｔ−ロイシン含有量を表し、”Ｌ−ｇｌｕ”はＬ−グルタミン酸含有量を表している。表中のすべての含有量の値は、ｍｇ／ｍｌで表されている。
0004108766.tif 000018
実施例１０
Ｌ−スレオニンを基質として用いた、２−アミノ酪酸の生合成
反応は、以下の基質濃度を用いて行なった：
反応Ａ
反応容量２ｍｌ
Ｌ−スレオニン５００ｍＭ（ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整）
Ｌ−アスパラギン酸５００ｍＭ（ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整）
反応時間２０時間
ｐＭＥ６４をもつＷ３１１０の細胞、１００ｍｇ／ｍｌ
ｐＩＦ３４７をもつＷ３１１０の細胞、５０ｍｇ／ｍ
反応Ｂ
反応容量２ｍｌ
Ｌ−スレオニン５００ｍＭ（ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整）
Ｌ−アスパラギン酸５００ｍＭ（ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整）
反応時間２０時間
ｐＭＥ６４をもつＷ３１１０の細胞、１００ｍｇ／ｍｌ
ｐＩＦ３４７をもつＷ３１１０の細胞、５０ｍｇ／ｍｌ、およびｐＰＯＴ３００をもつＷ３１１０の細胞、５０ｍｇ／ｍｌ
２４時間インキュベートした後、各反応液から２００μｌのサンプルを採って、遠心分離によって細胞を取り除いた。そして、このサンプルを１００倍に希釈して、ＨＰＬＣによるアミノ酸解析を行なった。
0004108766.tif 000019
これらの結果は、アセト乳酸シンターゼを使用すると、生物学的変換において、Ｌ−アラニンの蓄積が極めて有意に低く抑えられることを示している。これは、ケト酸の供給源として２−ケト酪酸またはＬ−スレオニンのいずれかを用いた生物学的変換にも当てはまる。
２−ケト酪酸の場合、収量と相対的精製度は以下のとおりである。
0004108766.tif 000020
Ｌ−スレオニンの場合、収量と相対的精製度は以下のとおりである。
0004108766.tif 000021
どちらの場合も、産物の収率が少し向上し、２−ａｂａ：アラニンの比率が、劇的に、およそ７倍および１０倍向上している。
これらの実施例では、遺伝子がそれぞれ別々の菌株のそれぞれ別のプラスミド上に存在しているが、一つ以上のプラスミド上の遺伝子を一つの菌株の中で組み合わせるのも論理的なステップであろう。こうすることによって、本方法を用いてＬ−２−ａｂａまたはその他のアミノ酸を大規模に製造するための生物を培養する時間、煩雑さ、および費用が低減されよう。さらに、当業者は、トランスアミナーゼ、デアミナーゼ、および／またはアセト乳酸シンターゼ酵素の一つ以上をコードする別々の遺伝子を単一のプラスミドに組み込むことができることを認識するであろう。
実施例１０
比較例
ａｌｓＳと組合わされたまたは組合されていないトランスアミナーゼを使用したＬ−ｔ−ロイシンの生合成
以下の反応によって、この発明の方法と、上述したＲｏｚｚｅｌｌ  Ｉ特許で開示されている方法との比較が提供される。
反応Ａ
反応容量１リットル
トリメチルピルビン酸５００ｍＭ
Ｌ−アスパラギン酸５５０ｍＭ
Ｌ−グルタミン酸５０ｍＭ
ｐＨ８．０
反応時間４８時間
ｐＩＦ３４９およびｐＰＴ３６８をもつＷ３１１０の細胞、１００ｍｇ／ｍｌ
反応Ｂ
反応容量１リットル
トリメチルピルビン酸５００ｍＭ
Ｌ−アスパラギン酸５５０ｍＭ
Ｌ−グルタミン酸５０ｍＭ
ｐＨ８．０
反応時間４８時間
ｐＩＦ３２８をもつＷ３１１０の細胞、１００ｍｇ／ｍｌ
ｐＩＦ３２２をもつＷ３１１０の細胞、５０ｍｇ／ｍｌ
ｐＰＯＴ３００をもつＷ３１１０の細胞、５０ｍｇ／ｍｌ
４８時間インキュベートした後、各反応液から１ｍｌのサンプルを採って、遠心分離によって細胞を取り除いた。そして、このサンプルを１００倍に希釈して、ＨＰＬＣによるアミノ酸解析を行なった。
0004108766.tif 000022
これらの結果は、Ｒｏｚｚｅｌｌ  Ｉ特許で説明されている反応が、アミノ供与体から生成物への完全な変換を示してはいるが、混入アミノ酸としてのアラニンの蓄積をもたらすことを示している。また、反応液にアセト乳酸シンターゼ酵素を加えると、アラニン生合成の低下をもたらす。結果を、Ｌ−アラニンに対するＬ−ｔ−ロイシンの比率として表すことができる。反応Ａ（−ａｌａＳ）において、この比率は３．７８である。反応Ｂ（＋ａｌａＳ）において、この比率は８．０２である。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：９５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000023
配列番号：２
配列の長さ：４２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000024
配列番号：３
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000025
配列番号：４
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000026
配列番号：５
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000027
配列番号：６
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000028
配列番号：７
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000029
配列番号：８
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000030
配列番号：９
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000031
配列番号：１０
配列の長さ：７４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000032
配列番号：１１
配列の長さ：７４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000033
配列番号：１２
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000034
配列番号：１３
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000035
配列番号：１４
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000036
配列番号：１５
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000037
配列番号：１６
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000038
配列番号：１７
配列の長さ：３９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000039
配列番号：１８
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000040
配列番号：１９
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000041
配列番号：２０
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000042
配列番号：２１
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000043
配列番号：２２
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000044
配列番号：２３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000045
配列番号：２４
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000046
配列番号：２５
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000047
配列番号：２６
配列の長さ：４２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000048
配列番号：２７
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
合成オリゴヌクレオチド
0004108766.tif 000049
【図１】
0004108766.tif 000052
【図２】
0004108766.tif 000053
【図３】
0004108766.tif 000054
【図４】
0004108766.tif 000055
【図５】
0004108766.tif 000056
【図６】
0004108766.tif 000057
【図７】
0004108766.tif 000058
【図８】
0004108766.tif 000059
【図９】
0004108766.tif 000060
【図１０】
0004108766.tif 000061
【図１１】
0004108766.tif 000062
【図１２】
0004108766.tif 000063
【図１３】
0004108766.tif 000064
【図１４】
0004108766.tif 000065