(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々の赤血球の形状を決定する方法において、
ａ）電解質流体内の個々の赤血球の流れを形成し、
ｂ）前記個々の赤血球の流れを測定開口を介して流動させ、
ｃ）前記開口を介して流れる電流を提供すると共に前記電流に対する前記開口の抵抗を測定し、
ｄ）前記開口を介して流れる前記赤血球の流れ内の赤血球により生じせしめられる電気抵抗の変化を測定し、それにより開口における赤血球の体積を測定し、
ｅ）前記開口を介して流れる前記赤血球により生じせしめられる電気抵抗の変化を表す振幅を有する対応する第１の信号を獲得し、
ｆ）前記赤血球が前記開口を介して流動するときに赤血球に光線を照射して赤血球により該光が散乱されるようにし、
ｇ）少なくとも二つの相異なる方位角範囲において前記赤血球により散乱された光の強度を測定し、前記二つの相異なる方位角範囲が流体流れ方向に対し平行な軸線に沿って位置する角度範囲と、流体流れ方向に対し垂直な軸線に沿って位置する角度範囲とを具備しており、該方位角範囲において散乱された光が前記赤血球の屈折指数から独立するように該方位角範囲が選択されており、
ｈ）各方位角範囲に対応する信号であって、前記方位角範囲に散乱された光の強度を表す振幅を有する信号を獲得し、
ｉ）前記対応する第１の信号と前記角範囲に対応する信号とから前記赤血球の形状を決定する、
各ステップを具備し、
前記方位角範囲が、流体流れ方向に対し平行な軸線の１．１度から７度の散乱角と−４５°から＋４５°の方位角とを有する第１の角度範囲と、流体流れ方向に対し垂直な軸線の１．１度から７度の散乱角と−４５°から＋４５°の方位角とを有する第２の角度範囲とである、
方法。
【請求項２】
前記電気抵抗の変化が直流電気抵抗の変化であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記赤血球により散乱される光の強度を測定するステップが四つの相異なる角度範囲で行われ、四つの相異なる角度範囲が流体流れ方向に対し平行な軸線に沿って位置する二つの角度範囲と、流体流れ方向に対し垂直な軸線に沿って位置する二つの角度範囲とであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記個々の赤血球のけい光を測定するステップを更に特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記赤血球のけい光を測定する前に前記赤血球に対する網状赤血球の副集団を特定するために使用される核酸ステインを付加するステップを更に特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記赤血球のけい光を測定する前に前記赤血球に対する赤血球の副集団を特定するために使用されるけい光標識されたモノクローナル抗体を付加するステップを更に特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記個々の赤血球の変形可能性指数を決定するステップを更に特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は赤血球が流動血球計算測定開口を通過するときに個々の赤血球の形状を決定する装置及び方法に関する。特に本発明は形状を決定し、かつ複数の赤血球を含む血液サンプルの統計上の特徴を決定し、かつこのサンプルにおける赤血球の副集団を特定する装置及び方法に関する。
発明の背景
人の赤血球に関する情報の決定は個人の健康を監視するために、またある種の血液の病気の診断時に定期的に行われる。定期的に決定される赤血球についての情報は全血単位量当たりの赤血球の数（「赤血球カウント」又は「ＲＢＣ」と称される）、血液単位量当たりのヘモグロビンの量（ヘモグロビン含量又は［Ｈｂ］）、各赤血球の体積、各赤血球のヘモグロビン含量、及び各赤血球のヘモグロビン濃度を含む。
個々の赤血球に関する情報のために、複数の赤血球を一度だけ測定してその集団の平均値を決定してもよいし、或いは多数の赤血球を複数回測定してこれらの測定から平均値を算出してもよい。個々の赤血球を複数回測定することは、その集団における測定分布を決定して大きな集団内の異例の副集団を特定することができる点で、この平均値に付加的情報を提供する。例えば、個々の赤血球測定により赤血球容量を決定するようにすると、赤血球分布幅（ＲＤＷ）及び平均赤血球体積（ＭＣＶ）を決定することができる。同様に、ヘモグロビン含量及びヘモグロビン濃度について個々の赤血球を測定することにより、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、及びそれらの分布を決定することができる。
自動血液細胞分析装置は細胞の測定を行うために種々の電気インピーダンスと光学技術を使用する。一般にこれらの測定は測定がなされている間の細胞の形状と指向方向とに依存する。電気的手段により細胞の数及び体積を量化するためのウォレス・コルター（Ｗａｌｌａｃｅ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）の先駆的発明（米国特許第２６５６５０８号明細書、１５５３）以来、細胞の体積の測定に対する細胞の形状の影響が研究されてきている。電気的な体積測定に基く細胞の形状の補正がグローバら（グローバ（Ｇｒｏｖｅｒ），ＮＢ，ナーマン（Ｎａａｍａｎ），Ｊ，ベンサッソン（Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎ），Ｓ，ドルジャンスキー（Ｄｏｌｊａｎｓｋｉ），Ｆ），「懸濁液中の粒子の電気的分粒（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｓｉｚｉｎｇ  ｏｆ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）：１．理論」，生物物理学ジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，９：１３９８−１４１４，１９６９）により説明されたのが最初である。この補正は血球計算の当業者には、球状細胞に対する１．５から細長状細胞に対する１．０まで変化する「形状係数」として知られている。
静止時には、赤血球は通常円盤の形状であって非常に変形し易い。流動中においては、赤血球はこれに作用する流体のメカニカル要素に応答して細長形状に変形する。一般的には、流れ場で変形した赤血球はその長軸が流動方向に対し平行となる傾向がある。これらの力に応じた赤血球の変形量は細胞の内部粘度、細胞膜の固有の剛さ及び粘度、並びに細胞の体積に対する膜の表面積の比を含む個々の細胞の多数の物質的及び幾何学的特性により決定される。
血球計算装置を流れる赤血球は赤血球を大きくかつ可変的に変形させる流体の力を受ける。血球計算測定中の赤血球の形状のこのような変化を説明するために、装置製造業者は幾つかの企画を採用してきた。多くの装置は特定の形状を仮定して校正され、この仮定に基いてすべての測定を解釈している。この企画は変形した細胞の形状が正常な集団の形状と異なっている異常細胞集団に関して特に不正確な結果を導き出すことがある。別の装置は測定を行う前に赤血球を化学的に球状にして安定させる。このプロセスは細胞形状の異種性による誤りを避けることはできるが、細胞の形態学とレオロジィに関する情報が失われる。これら二つの企画はいずれも細胞体積の正確な決定及びその細胞の本来の変形可能性の決定を可能とするものではない。
血球計算測定における赤血球の形状の効果に加えて、赤血球自体の変形可能性の臨床上の重要性に関する証拠が出てきている。赤血球が流体の機械的力に応じた変形可能性が赤血球が循環系統を流動して人体内で酸素運搬機能を果たすことができるという重要な結果をもたらすと考えられている。
更に、赤血球の変形可能性の代替物が多くの病気の進行に関係付けられてきた。赤血球の変形可能性及び形状を測定するための多くの特殊装置が開発されてきた。これらの装置の評論はボアソーにより提供される（ボアゾー（Ｂｏｉｓｓｅａｕ），Ｍ，「人間の血液に関する現代レオロジィ技術の実施のニュートレンド（Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ）」，臨床ヘモレオロジィ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｍｏｒｈｅｏｌｏｇｙ），１６：２７−３０，１９９６）。これらの測定は粘度測定装置、濾過装置、又は顕微鏡を基礎とするシステムで行われるのが最も一般的である。通常、これら装置は標準的な赤血球特性を測定しない専門化された装置であり、従って典型的には臨床実験室の装置としては使用されない。現在のところ個々の赤血球の形状又は変形可能性を、別の血球計算測定を使用して同時に決定する装置及び方法は存在しない。
光散乱により赤血球の形状及び変形を測定する原理はベシス（Ｂｅｓｓｉｓ）及びモハンダス（Ｍｏｈａｎｄａｓ）（米国特許第３９５５８９０号明細書、１９７３）により教示されたのが最初である。彼らが確認したのは円形状粒子の散乱パターンは円形であるが、細長状粒子の散乱パターンは楕円形状であるということである。これらのパターンは回折パターンの長軸が細長状粒子の長軸に対し垂直になるよう指向する。彼らが教示したのは、光散乱パターンの非対称性を測定することにより赤血球のような粒子の変形を定性的に観察できるということである。彼らはレーザ光線源及び光散乱検出器を備えたクエット型粘度計をもって構成される装置を作成して「エクタサイトメータ」と名付けた。赤血球の懸濁液は粘度計内に配置されてこの粘度計を回転して発生されるせん断応力により変形せしめられる。レーザからの光線はこの赤血球懸濁液を貫通しつつ投射されて照射された各細胞の散乱から複合散乱パターンを発生させる。典型的には、数百の個々の赤血球がこの装置内で光を瞬時に散乱させる。二つの直交主軸に沿った特定の位置で散乱光を監視することにより、パターンの非対称性の測定結果が決定される。パターンの変形可能性指数（Ｄ．Ｉ．）と称されるこの測定結果は細胞集団の変形に定性的に関係する。この測定は一度に照射された集団全体の平均であるから、この光散乱パターンの形状とこの集団の赤血球の実際の形状とを正確に相関させることは不可能であった。
次いで、ストリースクトラ（Ｓｔｒｅｅｓｋｔｒａ）他（ストリースクトラ（Ｓｔｒｅｅｓｋｔｒａ）ＧＪ，ホエスクトラ（Ｈｏｅｓｋｔｒａ）ＡＦ，ニジョフ（Ｎｉｊｈｏｆ）Ｅ−Ｊ，及びヘートハー（Ｈｅｅｔｈａａｒ）ＲＭ，「エクタサイトメトリでの赤血球による光散乱（Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｅｋｔａｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）：フラウンホッファと変則回折（Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ  ｖｅｒｓｕｓ  Ａｎｏｍａｌｏｕｓ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）」、応用光学（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ）、３２：２２６６−２２７２，１９９３）は変形した赤血球集団の実際の幾何模様の見地から光散乱パターンを分析する方法を報告している。この改善された方法は単純な光散乱検出器の代わりにビデオカメラを使用している。しかしながら、この方法も一定時間に照射された細胞の集団全体の平均である測定法であることに変わりはない。
次いで、ベシス（Ｂｅｓｓｉｓ）の特許（米国特許第４４２８６６９号明細書、１９８４）はレーザに基く形状測定のために赤血球を変形させる毛管流動システムの使用を説明している。このシステムも測定を行うために単一の細胞とは対象的に細胞の集団からの散乱に依存している。
血球計算測定開口内で個々の細胞の形状を測定する方法についての最初の説明はグラベス（Ｇｒｏｖｅｓ）他によりなされた（米国特許第４２９８８３６号明細書、１９８１年）。彼らは他の血球計算測定による決定の正確さを改善するために細胞形状測定方法の有用性を確認した。このグラベス他の発明は血球計算の当業者には「スリット走査」として知られている技術を採用した。この技術は細胞が狭い光のスリットを横断するのに必要な時間の長さを測定し、この時間の測定結果から細胞の長さと細胞の速度とを決定する。この方法は細胞の速度を既知値に極めて正確に制御しなければならないという問題に遭遇する。しかしながら、瞬時の速度を正確に制御することは困難であるので、細胞の長さ及び形状を決定するためにこのスリット走査技術を使用することは公知の商品装置において実施されることはなかった。
別の文献において、スミス（Ｓｍｉｔｈ）他の米国特許第４７３７６４８号明細書は繊維状粒子、特にアスベスト繊維の長さ及び直径を、流体力学的に焦点合わせされたガス流れ内に整列された繊維による近接前方散乱光に基づいて決定する装置を教示している。
光散乱の非対称性を使用して、或いは光散乱の非対称性と電気抵抗とを使用して個々の赤血球の形状を決定することを開示する先行技術はこれまでなかった。その結果、個々の赤血球の形状を決定する装置及び方法の必要性が存在する。好ましくは、この装置及び方法はこの形状決定方法を他の血球計算測定と同時に行うことができる。
発明の概要
前記記載に鑑みて、本発明の目的は流体サンプルとしての個々の赤血球の形状を細胞の屈折指数及び細胞の体積と無関係の光散乱を使用して決定する改善された装置及び方法を提供することにある。更に、本発明の目的は流体サンプルとしての個々の赤血球の形状を細胞の屈折指数及び電気抵抗と無関係の光散乱を使用して改善された装置及び方法を提供することにある。
従って、本発明は、流体サンプル内の個々の赤血球の形状を決定する装置及び方法を提供し、この装置は流体内の個々の赤血球の流れを形成する手段と、前記個々の赤血球の流れを開口を介して流動させる手段と、前記赤血球が前記開口を介して流動する間に赤血球に光線を照射して赤血球により該光が散乱されるようにする手段と、少なくとも二つの相異なる方位角範囲において前記赤血球により散乱された光の強度であって、該方位角範囲において前記赤血球の屈折指数及び前記赤血球の体積から独立している光の強度を測定する手段と、各方位角範囲に対応する信号であって、前記方位角範囲に散乱された光の強度を表す振幅を有する信号を獲得する手段と、各方位角範囲について前記対応する信号から前記赤血球の形状を決定する手段と、を具備している。
装置及び方法の好ましい実施例によれば、本発明は更に、前記開口を介して流れる電流を提供する手段、及び前記電流に対する前記開口の抵抗を測定する手段と、前記開口を介して流れる前記赤血球の流れ内の赤血球により生じせしめられる電気抵抗の変化を測定する手段と、少なくとも二つの相異なる方位角範囲において前記赤血球により散乱された光の強度であって、該方位角範囲において前記赤血球の屈折指数から独立している光の強度を測定する手段と、前記対応する第１の信号と前記角範囲に対応する信号とから前記赤血球の形状を決定する手段とを提供する。
本発明及びその種々の利点は添付図面を参照してなされる以下の好ましい実施例の詳細な説明で更に理解されるであろう。なお、図面において同じ参照記号は同じ部分を示す。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の装置の略図、
図２（ａ）及び２（ｂ）は本発明の好ましい実施例で記載されるような光散乱検出器の略図、
図３（ａ）及び３（ｂ）は本発明に適した二つの追加の光散乱検出器の形態の略図、
図４（ａ）及び４（ｂ）は光検出器の要素の２次元検出列の略図、
図５は二つの相異なる収集角範囲を包含する光散乱検出器に対し形状及び屈折指数の範囲に亙って三つの相異なる細胞体積の赤血球からの光散乱を示す計算結果を示す図、
図６は二つの相異なる収集角範囲を包含する光散乱検出器に対し相異なる細胞体積に対する光散乱比の算出された感度を示す図、
図７は本発明により決定される赤血球の形状を確認するために使用される光学画像表示手段により形成される赤血球の画像を示す図、
図８は形状比１から６の複数の赤血球に関して本発明により決定された赤血球の形状と光学画像表示手段により決定された赤血球の形状との相関を示す図、
図９は本発明から得られる赤血球サンプルの平均変形可能性指数とエクタサイトメトリにより得られる変形可能性指数との相関を示す図である。
好ましい実施例の詳細な説明
本発明は今日まで不可能であった血球計算測定システム内で隣接細胞原理により細胞の形状を迅速、正確且つ経済的に決定することができる装置及び方法を提供する。
流体サンプル内の個々の赤血球の形状を決定する本発明の装置は電解質流体内の個々の赤血球の流れを形成すると共に、前記個々の赤血球の流れを測定開口を介して流動させる流体手段と、前記開口を介して流れる電流を提供する手段、及び前記電流に対する前記開口の抵抗を測定する手段と、前記開口を介して流れる前記赤血球の流れ内の赤血球により生じせしめられる電気抵抗の変化を測定する手段と、前記開口を介して流れる前記赤血球により生じせしめられる電気抵抗の変化を表す振幅を有する対応する第１の信号を獲得する手段と、前記赤血球が前記開口を介して流動する間に赤血球に光線を照射して赤血球により該光が散乱されるようにする手段と、少なくとも二つの相異なる方位角範囲において前記赤血球により散乱された光の強度を測定する手段と、各方位角範囲に対応する信号であって、前記方位角範囲に散乱された光の強度を表す振幅を有する信号を獲得する手段と、前記対応する第１の信号と前記角範囲に対応する信号とから前記赤血球の形状を決定する手段と、を具備する。
流体システムは電解質流体内の個々の赤血球の流れを形成すると共に、前記個々の赤血球の流れを開口を介して流動させる手段を具備しているが、これは当業者には周知であるので添付図面には示されていない。この流体システムは典型的には、加圧貯蔵器から同心管内を進行する個々に懸濁された血液細胞の液体流れを具備する。層状の液体被膜が別の加圧貯蔵器から前記管を進行して個々の血液細胞の流れを包囲するようにする。この血液細胞の液体流れはこの管から出てゆくので、細胞の流れが液体被膜の速度を得るにつれて流体力学上の圧力により流れの直径を減少せしめられる。この液体被膜はまた、細胞の流れを中心に集めるよう作用して細長状細胞軸線が中心軸に整列されつつ粒子が中心軸に沿いオリフィスを通過するようにする。
測定開口について更に詳しく説明する。この開口は開口を介して流れる前記赤血球の流れ内の赤血球により生じせしめられる電気抵抗の変化を測定するとき使用される。好ましくは、電源として一定電流電源を使用してこの開口を横断しつつ印加される低周波数又は直流電界を設けることができる。従って、電極間の電気抵抗の変動を電極間の電圧の変動として検出することができる。
好ましくは、前記赤血球が前記開口を介して流動するときに赤血球を照射する手段として、単色光源、例えばレーザ光線源が使用される。赤血球は光を散乱せしめる。
赤血球により散乱される光の強度を測定する手段として、光ダイオード、光トランジスタ、光倍率器などを使用することができる。ここでは好ましい実施例が提供されている。
電気抵抗及び光散乱信号から赤血球の形状を決定する手段として、データプロセッサ又はマイクロコンピュータを具備した演算手段を使用することができる。好ましくは、適当な表示装置、例えば陰極線管（ＣＲＴ）、プリンタ又はその他の装置が演算手段の演算結果を表示する。更にこの演算手段は細胞集団の平均形状及び形状集団の分布を決定することができる。この演算手段はまた、各細胞の変形可能性指数、集団に関する平均変形可能性指数、及び集団における変形可能性指数の分布を決定することができる。更にこの演算手段は個々の細胞の体積、細胞集団の平均体積、体積集団の分布、及び集団内部の各細胞の体積と細胞形状について得られる測定結果との相互関係を決定することができる。
本発明を添付図面に示される実施例に関連して詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
図１に示すように、本発明の装置は流体システム４に接続された流動室２から構成されており、流体システム４は流動室２に希釈された赤血球サンプルを提供する。流動室２は測定開口６を含み、この測定開口を介し赤血球が一度に概ね一つ流れるようになっている。電極８がこの開口の両側に設けられている。この電極は電気回路１０に接続されて開口を横断する電界を形成することができる。電流源は直流電源であることが好ましい。この開口はこの開口内を流れる細胞により発生する光散乱を測定できるように構成されている。光源１２が血液細胞が流れる開口の部分を照射するように配置されている。検出手段１４は電気抵抗検出器１６と光散乱検出器１８とを含み、光散乱検出器は光源と対向する側に配置されて特定の角度範囲で散乱される光を収集できるようになっている。電気抵抗検出器及び光散乱検出器はデジタル化手段２２によりデジタルコンピュータ２０に接続される。アナログ信号をデジタルコンピュータに適した信号に変換するこのデジタル化手段は当業者には公知である。デジタルコンピュータ２０は記録手段２４と演算手段２６とを含む。この演算手段は測定された電気信号及び光散乱信号から各細胞の形状を決定するために使用される。更に、この演算手段は同じ電気抵抗信号及び光散乱信号から各細胞の変形可能性指数と体積とを決定する。この演算手段はまた、赤血球の形状及び体積の変動の平均、標準偏差及び係数を含む赤血球集団の統計値を編集する。
図２（ａ）に示すように、本発明の好ましい実施例として、光散乱検出器は４要素配列体２８から構成されている。この又は同様の形態の検出器は市場で入手可能である。この検出器は垂直要素３０及び３２が流動室の垂直軸に対して方位角−４５°から＋４５°に亙り散乱する光を受光し、水平要素３４及び３６が流体流れ方向に対し垂直な流動室の水平軸に対して−４５°から＋４５°に亙り散乱する光を受光するように流動室と整列される。図２（ｂ）に示すように、レーザから直接進行する散乱されない光が検出器の中心部に当たらないようにしかつ散乱光の収集が特定の散乱角度に限定されるようにするために、光学的に不透明のマスク３８がこの検出器に使用される。この装置の実施例においては、この検出器は入射光の軸から、約１度から１０度までの散乱角度で受光する。更に好ましくは、この検出器は入射光の軸から約１．１度から７度までの散乱角度で受光する。
別の形態の光散乱検出器も本発明において使用するのに適している。一例として、単一の垂直要素及び単一の水平要素が使用される。単一の垂直要素及び単一の水平要素を含む検出器は本発明で記載される測定を行うには十分ではあるが、好ましい実施例で示されるような四つの要素を使用するとこの検出器を照射光及び流動室に対して正確に整列することができ、また測定の精度を改善するために付加情報を収集できる。第２の例として、図３（ａ）に示すように、水平方向及び垂直方向に配置された検出器要素４０の線状配列体を使用することもできる。同様に、図３（ｂ）に示すように、半径方向距離が増大するにつれて幅が増大する検出器要素４２の水平方向及び垂直方向配列体を構成することができる。この構成は「マルタ十字」と称される。
図４（ａ）に示すような別の実施例として、光検出器の２次元配列体を用いることができる。図４（ｂ）はこの検出要素により測定された変形赤血球からの光散乱パターンを示している。
これらの形態の各々に関して、配列体の適当な要素を電子的に分析することにより光散乱の非対称性を解釈する上で必要な特定の角度範囲が構成される。更に、本発明の精神及び本質を維持しつつ検出器要素及び光マスクを配置及び数を他の構成にすることができる。
また、本発明は個々の赤血球の形状を決定する方法において、電解質流体内の個々の赤血球の流れを形成し、前記個々の赤血球の流れを測定開口を介して流動させ、前記開口を介して流れる前記赤血球の流れ内の赤血球により生じせしめられる電気抵抗の変化を測定し、前記開口を介して流れる前記赤血球により生じせしめられる電気抵抗の変化を表す振幅を有する対応する第１の信号を獲得し、前記赤血球が前記開口を介して流動する間に赤血球に光線を照射して赤血球により該光が散乱されるようにし、少なくとも二つの相異なる方位角範囲において前記赤血球により散乱された光の強度を測定し、各方位角範囲に対応する信号であって、前記方位角範囲に散乱された光の強度を表す振幅を有する信号を獲得し、前記対応する第１の信号と前記角範囲に対応する信号とから前記赤血球の形状を決定する、各ステップを具備した方法を提供する。
各赤血球の形状は下記の演算手段による光散乱信号及び直流抵抗の測定から決定される。この細胞形状は細胞の幅に対する長さの比として説明される。この比は「ｍ」で表される。従って、長さと幅とが等しい球の「ｍ」値は１に等しい。赤血球は通常約６に等しい「ｍ」の最大値まで変形することができる。
先に説明したように、光散乱信号は流体流れに平行な軸線と流体の流れに垂直な軸線とに沿って収集される。流体流れ方向に対し平行な信号は垂直光散乱又は「ＶＬＳ」と称される。流体流れ方向に対し垂直な信号は水平光散乱又は「ＨＬＳ」と称される。垂直光散乱に対する水平光散乱の比は光散乱比又は「ＬＳＲ」で表される。光散乱測定に関して、形状比ｍはその細胞の体積（Ｖ）及び屈折指数（ηr）はもとより光散乱比の関数である。この一般的関係は次式で与えられる。
0004173552.tif 000002
従って、形状比を決定するためには光散乱比に加えて細胞の体積及び屈折指数を決定せなばならない。この一連の測定から細胞の形状を決定することは、細胞の体積を測定する公知の方法、例えば上述した電気抵抗法、及び屈折指数を測定する方法も細胞の形状の関数であるという事実により複雑になる。従って、細胞の形状を決定するということは同時に少なくとも三つの方程式を解くことを含む。これら方程式を解くことはこれら方程式が非線形であり且つ相互に結合しているために困難である。従って、形状の決定が細胞の屈折指数から大きく独立し、また別の実施例において形状の決定も体積から独立するように特定の光収集角度範囲を決定することは本発明の重要な利点であり、意味のあるユニークな特徴である。このため、測定の回数、数学的分析の複雑さ、より複雑な測定及び分析に関連する誤差を減少することができ、最終的にはこの装置及び方法を商品としての診断装置に組み込む形とすることができる。
電気的絶縁性の楕円体粒子に関して電気抵抗と細胞の形状と体積との間の特定の関係はグローバ（Ｇｒｏｖｅｒ）他（ｏｐ．ｃｉｔ．）によって次のように定められている。
0004173552.tif 000003
ここで、Ｋはこの測定システムに特定の定数であり、開口の寸法、流体の導電性、電気増幅器の利得及びその他の因子により決定される。
赤血球に相当する寸法及び屈折指数の非球体粒子による光散乱の適切な説明は光散乱理論の分野の当業者には「変則回折理論」として知られている。この理論は次のように定義されかつ１より大きい粒子寸法パラメータ「α」と、１に近い相対屈折指数ηrelとの両方を必要とする。
0004173552.tif 000004
（ここでλは入射光の波長であり、Ｌは粒子の寸法である）。粒子寸法パラメータαは正常及び異常集団において見られる赤血球の範囲に関して、また波長６７０ｎｍの光源に関して約１５から１７０まで変動する。
相対屈折指数ηrelは環境媒体（典型的にはηｒ＝１．３４の電解液）の屈折指数に対する粒子（この場合赤血球）の屈折指数の比として定義される。１９から４９ｇ／ｄＬのヘモグロビンの濃度についてηrelの値の範囲は１．０２７から１．０６９である。従って、両方の条件は変則回折理論の適用に合致する。
この理論により説明されるように光散乱について、光散乱強度分布Ｉｔｏｔａｌはフラウンホッファ回折及び屈折伝導光（ファンデフルスト（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｈｕｌｓｔ），ＨＣ，小粒子による光散乱（Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ），ドーバー出版社，ニューヨーク，１９８１）からの寄与をまとめて次式で説明することができる。
0004173552.tif 000005
ここでα及びｍは先に定義した粒子寸法パラメータ及び形状であり、θは散乱角度であり、φは方位角でありηrelは先に定義した相対屈折指数である。この全強度を別個の回折成分と屈折成分とに分解すると、回折項の拡張を楕円体粒子に使用することができるが、以前の理論、例えばミー（Ｍｉｅ）理論では不可能である。屈折成分はホドキンソン（Ｈｏｄｋｉｎｓｏｎ）及びグリーンリーブス（Ｇｒｅｅｎｌｅａｖｅｓ）により次式のように記載されている（Ｈｏｄｋｉｎｓｏｎ，ＴＲ及びＧｒｅｅｎｌｅａｖｅｓ，Ｉ．，「回折及び幾何光学による光散乱及び消滅の演算、並びにミー理論との比較」，アメリカ光学学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ），５３（５），５７７−５８８，１９６３）。
0004173552.tif 000006
カスーリア（Ｋａｔｈｕｒｉａ）の推論のように（カスーリア（Ｋａｔｈｕｒｉａ），ＹＰ，「楕円状開口とその環形の遠界放射線パターン（Ｆａｒ−Ｆｉｅｌｄ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ  Ａｐｅｒｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｎｎｕｌｌｉ）」，ＩＥＥＥ会報，アンテナ伝播（Ａｎｔｅｎｎａｓ  Ｐｒｏｐａｇ．），ＡＰ−３１，３６０−３６３）、楕円体粒子に関する回折成分は次式のようになる。
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ここでＪ1は第一種の一次ベッセル（Ｂｅｓｓｅｌ）関数であり、ｘ及びｙは入射光に対し垂直な面内のカーテシアン（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）座標であり、Ｆは粒子から回折パターンが投影される面までの距離であり、αは先にも述べた通り、楕円体の主軸長さによる寸法パラメータであり、ｍは楕円体の幅に対するの長さの比である。次の関係により、上記の等式を散乱角θ及び方位角φによる座標系に変換することができる。
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上述したように、光散乱強度の角度依存性の理論上の関係から、特定の検出器要素への全入射光は強度を適当な散乱角及び方位角に亙って積分することにより決定される。また、先に説明したように、特定の角度範囲で積分された光散乱の結果は細胞の形状はもとより細胞の体積及び屈折指数の関数である。
屈折指数及び体積に一般的に依存することのない詳細な特定角度範囲についての本発明の実施例を説明する。図５（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）には、各軸の散乱角度１．１から７．０度と方位角−４５°から＋４５°とからなる収集角度からの光散乱比が６０、９０、及び１２０フェムトリットル（ｆＬ）の細胞体積に対してそれぞれ示されている。これらの範囲は図５（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に示されるように、ＬＳＲが細胞の屈折指数から本質的に独立するように選択される。図５（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）では、散乱各は１５．０から２５．０度であった。ここで、光散乱比は細胞の屈折指数に依存し、従って屈折指数を知らずして光散乱から細胞の形状を決定することは不可能である。屈折指数から独立した結果は散乱角１．１°から５０．０°で得られる（データは示さない）。
図６（ａ）に見られるように、光散乱比「ＬＳＲ」と形状比「ｍ」との関係の依存性は各軸の散乱角１．１から７．０度と方位角−４５°から＋４５°とを含む実施例において細胞の体積の関数である。しかしながら図６（ｂ）に示されるように、各軸の散乱角１．１から５．０度と方位角−４５°から＋４５°とからなる実施例においては光散乱比は細胞の体積から独立している。
従って、本発明の第１の実施例（散乱角１．１から５．０度及び方位角−４５°から＋４５°）において、光散乱比は屈折指数と細胞の体積との両方から独立している。従って、細胞の形状を光散乱比の測定結果のみから決定することが可能である。本発明の第２の好ましい実施例では、光散乱測定（各軸の散乱角１から１０度及び方位角−４５°から＋４５°、好ましくは各軸の散乱角１．１から７．０度及び方位角−４５°から＋４５°）を行うときに細胞の体積を示す付加的測定がなされる。第１の実施例は細胞の体積を測定する必要がない点で簡単のように思われるが、この実施例の性質は比較的困難でありかつその実施には経費がかかり、従って本発明の好ましい実施例ではない。特に、より広範囲の光散乱角で収集するための追加の光学要素が必要となる。レンズ及び装着ハードウエアからなるこれらの要素は実施例のコスト及び複雑差を増大する。赤血球の体積は通常所望されるけれども、狭い散乱角の測定及び細胞の体積の測定からなる実施例は最も実用的、経済的、且つ有益な本発明の実施例であり、好ましい実施例である。
このような実施例に対して、細胞の体積を電気抵抗法により測定することは好ましい方法である。細胞の体積を決定するその他の技術は血球計算法の当業者には公知であり、本発明のために実施できる。このような技術の例には、測定開口内での細胞の軸線方向の光損を測定する光学手段、或いは測定開口内での細胞の低角度光散乱を測定する光学方法がある。しかしながら、これらの方法は両者とも細胞、特に本発明が目的とする非球形状細胞の体積を決定する電気抵抗分粒法に比較して精度に乏しいことが知られているので、本発明の実施例として好ましくない。
本明細書で説明されるように、光散乱比及び電気抵抗からの細胞の形状の決定方法は血球計算測定と同時に赤血球のビデオ画像に直接記録されることにより確認されている。図７はこの確認作用に用いられたそのような画像の例を示している。図８は本発明の方法により決定された約５００個の赤血球の形状を、直接画像化により決定されたものと比較した結果を示している。細胞は化学的手段で処理されて長さ／幅比が１から６の範囲になるようにされている。
本発明の別の実施例では、前記実施例で詳細に説明した配置とは別の光散乱検出器の配置であって、赤血球の形状を正確に決定する配置を採用することができる。一実施例において、図４に示すような２次元検出器配列体を用いることができる。これら配列体で発生する信号は輪郭法で分析されて細胞の形状を決定する。この方法では同じ信号マグニチュードを有する検出器要素の位置が特定されてこれら要素が提供する輪郭形状が決定される。光散乱理論の分野の当業者には知られているように、この輪郭の形状は光が散乱される元来の物体の形状と均等である。この２次元配列体法について、そのような配列体及び関連する電子部品のコストが好ましい実施例よりも実質的に大きい。従って、本発明のこの実施例は好ましい実施例ではない。
更に、細胞の形状比「ｍ」の決定から細胞の変形を説明する細胞の変形可能性指数（ＤＩ）を定義することができる。この変形指数は形状比「ｍ」を用いて次のように定義される。
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図９は先に説明した細胞の形状から算出した赤血球のサンプルの平均変形可能性指数を、エクタサイトメトリにより得られた変形可能性指数と比較してを示している。これらの値の相互関係がわかる。
本発明の別の実施例において、本発明で説明したように赤血球の形状、変形可能性指数及び体積の測定と同時に他の流動血球計算測定がなされる。一実施例において、付加的な流動血球計算測定は赤血球集団中の網状赤血球の副集団の確認である。これは赤血球をけい光核酸ステインで着色してそのけい光発光を適当な波長、好ましくは４００ナノメートルよりも大きな波長で測定することにより行われる。適当なけい光ステインはコリフォスフェンＯ及びチアゾールオレンジである。形状及び変形可能性指数の決定と同時に行われる網状赤血球の確認によって、変形可能性が小さい網状赤血球を確認することができる。また、形状及び変形と、網状赤血球として確認された赤血球の熟成状態との相互関係によって、網状赤血球の熟成中の変形可能性の変化を測定することができる。別の実施例において、けい光標識された抗体を使用することにより、赤血球の副集団が赤血球の大きな集団の中で特定される。このような標識の実例はトランスフェリン受容体（ＣＤ７１）に対するモノクローナル抗体である。
本発明は上述の特定の実施例を参照して説明されたが、添付の請求の範囲に定義されたような本発明の範囲から逸脱することなく、上述の実施例に種々の改造及び変更を施しうることは当業者には明らかである。例えば、流動室２或いは抵抗パルス分別開口６を適当に修正して、抵抗信号測定を光散乱測定の上流で行うことも可能であり、又はこれら二つの測定を概ね平行して行うことも可能である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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