(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１〜３で表される配列から成るペプチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のペプチド、その生理的に許容される塩、請求項２記載のペプチド及びその生理的に許容される塩から選ばれる１種又は２種以上を含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項４】
請求項３記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤と製剤上許容される他の材料とを含有する医薬用組成物。
【請求項５】
請求項３記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤と食用に用いられる他の材料とを含有するアンジオテンシンＩ変換酵素を阻害するための食品用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規のペプチド、これを含有するアンジオテンシンＩ変換酵素（以下、「ＡＣＥ」ともいう）阻害剤、かかるＡＣＥ阻害剤を含有する医薬用組成物及び食品用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高血圧症は、循環器系の種々の疾病の重要な危険因子であり、血圧を正常な範囲に保つことは、健康の維持に重要であるが、平成１０年の国民栄養調査によれば、１５歳以上の男性１９．８％、女性１４．５％が高血圧である。
【０００３】
高血圧症の多くは、明確にその原因が特定できない本態性高血圧症であるが、近年、遺伝子レベルで高血圧症とレニン・アンジオテンシン系との関連を示唆する報告がでる等、高血圧症の要因の一つとしてＡＣＥの作用異常が挙げられるようになった。
【０００４】
ＡＣＥは、主に２つの血圧調節系に関与して昇圧作用を示す酵素であるが、この酵素が異常に作用すると高血圧症を誘発するとされる。そこで、このようなＡＣＥの昇圧作用を阻害する物質を投与することにより高血圧症を改善しようとする試みがなされ、目立った副作用もないことから全高血圧治療薬に占める割合も増加している。
【０００５】
一方、食品の三次機能としての生体調節機能の解明が様々な食品についてなされ、その過程において多くのＡＣＥ阻害物質を単離した報告も数多くなされている。また、このような食品等から得られたＡＣＥ阻害物質の中には、高血圧症のモデル動物への投与で効果が確認されているものもあり、このような特徴を利用した機能性食品の開発もなされてきている。
【０００６】
ところで、光合成を行う緑色植物の葉緑素には、ルビスコ（ RuBisCO : ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase）と呼ばれる酵素が含まれている。本酵素は光合成の暗反応において、リブロース−１，５−二リン酸と二酸化炭素から二分子のグリセリン酸−３−リン酸を生成することにより、二酸化炭素をカルビン回路に取り込む働きを持っており、地球上においてもっとも量が多い酵素であるとも言われる。現在までに、ルビスコからＡＣＥ阻害剤を分離し又はルビスコからＡＣＥ阻害ペプチドを単離し、その構造を決定したという報告は知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記観点からなされたものであり、新規のペプチド、これを含有するＡＣＥ阻害剤、かかるＡＣＥ阻害剤を含有する医薬用組成物及び食品用組成物を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ルビスコのペプシン又はペプシンとパンクレアチンによる加水分解物、及び該加水分解物から得た画分にＡＣＥ阻害作用があることを見出した。さらに、該画分を単離、構造決定したところ、かかるＡＣＥ阻害作用を有するものは新規のペプチドであることを同定し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下に示すものに係る。
（１）配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１〜３で表される配列から成るペプチド。
（２）配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチド。
（３）（１）に記載のペプチド、その生理的に許容される塩、（２）に記載のペプチド及びその生理的に許容される塩から選ばれる１種又は２種以上を含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
（４）（３）に記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤と製剤上許容される他の材料とを含有する医薬用組成物。
（５）（３）に記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤と食用に用いられる他の材料とを含有するアンジオテンシンＩ変換酵素を阻害するための食品用組成物。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の新規ペプチド及びアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤
本発明のペプチドは、新規の化合物であり、ＡＣＥ阻害作用を有する。
【００１１】
本発明のペプチドは、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｒｐで表される配列番号１のアミノ酸配列から成るものである。
【００１２】
また本発明のペプチドは、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐで表される配列番号２のアミノ酸配列から成るものである。
【００１３】
これら本発明のペプチドは、アミノ酸配列が明らかなため、化学的に合成することにより得ることもできるし、例えば下記に示す方法等により、ホウレンソウ由来のルビスコをペプシン又はペプシンとパンクレアチンで加水分解して得られる加水分解物から、単離することにより得ることもできる。
【００１４】
本発明のペプチドの高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」ともいう）を用いた抽出例を以下に例示する。
（１）ルビスコの加水分解物の調製
詳しくは後述するように、ホウレンソウ由来のルビスコの溶解液にペプシンを加えて酵素反応させる。酵素反応を終了させた後、遠心分離により不溶物を除き、得られた上清を凍結乾燥してペプシンの加水分解物を得る。
【００１５】
また前記操作において、ペプシンの反応後にパンクレアチンを加えて更に酵素反応させ、その酵素反応を終了させた後、遠心分離で不溶物を除き、得られた上清を凍結乾燥すれば、ペプシン−パンクレアチンの加水分解物が得られる。
【００１６】
（２）ＨＰＬＣによる分画
前記の加水分解物に対し、溶出液の組成を適宜変更させた条件で、ＨＰＬＣを用いてクロマトグラフ分画を行う。分画により単離したペプチドの構造決定は、詳しくは後述する実施例で示すように、ペプチドシーケンサーによる定法に従って行うことができ、またこれらのペプチドの活性は、これも詳しくは後述する実施例の方法で測定できる。
【００１７】
以上により、配列番号１においてアミノ酸番号１〜３で表されるアミノ酸配列から成るペプチド又は配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチドの分画物を単離することができる。
【００１８】
以上のようにしてホウレンソウ由来のルビスコの加水分解物から単離された本発明のペプチドは、詳しくは後述する実施例で示すように、ＡＣＥ阻害作用を有するため、ＡＣＥ阻害剤として有用である。尚、配列番号２のアミノ酸配列から成る本発明のペプチドは、実施例で述べているようにプロドラッグタイプである可能性があるが、いずれにしても、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１〜３で表される配列から成る本発明のペプチド及び配列番号２のアミノ酸配列から成る本発明のペプチドは両者ともにＡＣＥ阻害剤として有用である。
【００１９】
また本発明のペプチドを単離する前のルビスコの加水分解物又はその粗精製物も、これらに含まれる本発明のペプチドの示すＡＣＥ阻害作用を利用することができ、後述する実施例で示すようにＡＣＥ阻害作用を示す。したがって、前記のようなルビスコの加水分解物やその粗精製物も本発明のＡＣＥ阻害剤として有用である。
【００２０】
このように、本発明のペプチド、これを含有するルビスコの加水分解物、又はこれらの生理的に許容される塩は、１種又は２種以上を組み合わせて、本発明のＡＣＥ阻害剤として利用することができる。
【００２１】
ここで、前記の生理的に許容される塩とは、生理的に許容されるものであれば特段の限定はされないが、例えばナトリウム塩やカリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩やマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩やトリエタノールアミン塩等の有機アミン塩、又はリジン塩やアルギニン塩等の塩基性アミノ酸塩が好適に例示できる。
【００２２】
さらに前記のＡＣＥ阻害剤と、医薬用又は食品用として通常用いられている他の任意成分とを組み合わせれば、ＡＣＥ阻害作用を有する医薬用組成物や食品用組成物を提供することができる。
【００２３】
尚、本発明において、ＡＣＥ阻害作用を示すか否かを判断する方法としては、後述する実施例に示す通り、公知の測定方法を利用した評価方法を用いることができる。
【００２４】
＜２＞本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤を含有する医薬用組成物
本発明の医薬用組成物は、前記した本発明のＡＣＥ阻害剤を定法に従って配合したものである。
【００２５】
本発明の医薬用組成物の剤型は、特に限定されないが、一般に製剤上許容される１又は２種類以上の担体、賦型剤、統合剤、防腐剤、安定剤、香味剤等の材料と共に混合して、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、水薬、ドリンク剤等の内服剤型とすることが好ましい。このような製剤化は、通常、医薬品の製造に用いられる方法に従って製剤化することができる。
【００２６】
本発明の医薬用組成物の投与量としては、症状、患者の年齢、体重等により異なるが、成人１日当たり、前記した本発明のペプチドが０．１〜５０mgとなるように、１回ないし数回に分けて経口投与するのが好ましい。
【００２７】
＜３＞本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤を含有する食品用組成物
本発明の食品用組成物は、前記した本発明のＡＣＥ阻害剤を常法にしたがって配合したものである。
【００２８】
本発明の食品用組成物は、食品として通常用いられている任意の成分や原料等の材料に前記した本発明のＡＣＥ阻害剤を所要量配合することで製造できる。本発明のＡＣＥ阻害剤を配合する際に特に留意することはなく、通常の製造方法により加工製造することにより、健康食品、機能性食品を製造することができる。食品用組成物中における本発明のＡＣＥ阻害剤の配合量は、食品の種類により異なるが、食品の味を損なわず、且つ十分なＡＣＥ阻害効果を得るためには、食品用組成物中において前記した本発明のペプチドが０．００１〜１質量％となるよう配合するのが望ましい。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３０】
【実施例１】
＜ルビスコ加水分解物の調製及び本発明のペプチドの単離＞
＜１＞ルビスコ加水分解物の調製
（１）ペプシンによる加水分解物の調製
ホウレンソウ由来のルビスコ（Ｓｉｇｍａ社製）１００mgを１０mLの純水に懸濁し、塩酸を加えてｐＨ２．０で溶解した後、ペプシン（Ｓｉｇｍａ社製）１mgを添加し、３７℃にて５時間酵素反応させた。
【００３１】
続いて、１ＭのＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ７．５に調整し、酵素反応を終了させ、さらに遠心分離（１００００ｒｐｍで１０分）により不溶物を除き、得られた上清を凍結乾燥してペプシン加水分解物を得た。
【００３２】
（２）ペプシン−パンクレアチンによる加水分解物の調製
ホウレンソウ由来のルビスコ（Ｓｉｇｍａ社製）１００mgを１０mLの純水に懸濁し、塩酸を加えてｐＨ２．０で溶解した後、ペプシン（Ｓｉｇｍａ社製）１mgを添加し、３７℃にて５時間酵素反応させた。続いて、１ＭのＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ７．５に調整した後、パンクレアチン（Ｓｉｇｍａ社製）を５mg添加し、さらに３７℃にて５時間酵素反応させた。
【００３３】
続いて、塩酸を加えてｐＨ２．０に調整し、酵素反応を終了させ、さらに遠心分離（１００００ｒｐｍで１０分）により不溶物を除き、得られた上清を凍結乾燥して、ペプシン−パンクレアチン加水分解物を得た。
【００３４】
＜２＞ＨＰＬＣによるペプチドの単離及び構造決定
前記の実施例１の＜１＞（２）で得られたペプシン−パンクレアチン加水分解物を純水に再溶解し、下記の表１に示す条件で逆相カラムを順番に用い、ＨＰＬＣによりＡＣＥ阻害ペプチドを単離した。
【００３５】
【表１】
0004179586.tif 000002
【００３６】
表１において、
ＨＰＬＣに用いた溶媒：アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）／純水（０．１％トリフルオロ酢酸）
溶媒の濃度勾配：アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸)：４０分間に０→４０％
カラム：ＯＤＳ・・Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ、Φ２０mm×２５０mm（ナカライテスク社製）
ＰｈＡ・・Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５ＰＥ−ＭＳ、Φ４．６mm×２５０mm（ナカライテスク社製）
ＣＮ・・Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５ＣＮ−Ｒ、Φ４．６mm×２５０mm（ナカライテスク社製）
Ｎ−ＰｈＡ・・Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５ＮＰＥ、Φ４．６mm×１５０mm（ナカライテスク社製）
【００３７】
（１）前記のＯＤＳカラムを用いてＨＰＬＣによる分画を行ったときの状態を図１に示した。図１中、Ｉ〜IIIの３箇所にＡＣＥ阻害活性が認められた。図１中、ＯＤＳカラムによるＡＣＥ阻害物質の分画において、画分Ｉのリテンションタイムは２２分、画分IIのリテンションタイムは２７分、画分IIIのリテンションタイムは３１分であった。
【００３８】
（２）前記の実施例１＜２＞（１）で得られた３つの画分を、更にＰｈＡカラム、ＣＮカラム及びＮ−ＰｈＡカラムで順次分画し、活性画分の単離を行った。画分IIの分離過程を図２（ａ）〜（ｃ）に示した。
【００３９】
図２（ａ）中、ＰｈＡカラムによる分画において矢印で示す画分を次のＣＮカラムに供試した。また図２（ｂ）中、ＣＮカラムによる分画において矢印で示す画分を次のＮ−ＰｈＡカラムに供試した。図２（ａ）中、矢印の画分のリテンションタイムは１．２分、また図２（ｂ）中、矢印の画分のリテンションタイムは４．９分、さらに図２（ｃ）中、矢印の画分のリテンションタイムは３８分であった。
【００４０】
（３）前記の実施例１＜２＞（１）で示したようにＯＤＳカラムで分画した画分IIを、前記の実施例１＜２＞（２）で示したようにＰｈＡカラム、ＣＮカラム及びＮ−ＰｈＡカラムで順次分画し、最終的に得られた活性画分を、プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステム社製、４９２型）にて分析し、ペプチドのアミノ酸配列を決定した。その結果、「Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ（以下、ＭＲＷＲＤともいう）」（配列番号２）で示されるアミノ酸配列から成るペプチドであることが確認された。
【００４１】
また、前記の実施例１＜２＞（１）で示したようにＯＤＳカラムで分画した画分IIIを、前記の実施例１＜２＞（２）と同様、ＰｈＡカラム、ＣＮカラム及びＮ−ＰｈＡカラムで順次分画し、最終的に得られた活性画分を、前記の実施例＜２＞（３）と同様、プロテインシーケンサーにて分析した。その結果、「Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ（以下、ＭＲＷともいう）」（配列番号１においてアミノ酸番号１〜３で表される配列）で示されるアミノ酸配列から成るペプチドであることが確認された。
【００４２】
【実施例２】
＜ＡＣＥ阻害作用の評価＞
＜１＞本発明のペプチド等のＡＣＥ阻害作用は、山本らの方法（日本胸部疾患誌、ｖｏｌ．１８，ｐ２９７−３０３（１９８０））に準じて以下の方法により評価した。
【００４３】
ここで、酵素基質としては、Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕの８６mgをリン酸緩衝液１６mLに溶解した溶液を使用し、また酵素溶液としては、アンジオテンシンＩ変換酵素（ウサギ肺由来、Ａ６７７８（シグマ社製））を１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）に０．１ｕｎｉｔｓ／mLとなるよう溶解したものを使用した。
【００４４】
前記の酵素基質を１００μＬ、酵素溶液を１２μＬ及び所定濃度の試料（本発明のペプチド等）を混合し、水で全体を２５０μＬとした後、３７℃で３０分間反応を行った。反応は１ＮのＨＣＬ水溶液２５０μＬを用いて終了させた。反応終了液に酢酸エチル１．５mLを入れ、１５秒攪拌し、それを遠心分離した。酢酸エチル層から１．０mLをとり出して、酢酸エチルを留去し、それに１．０mLの蒸留水を入れて残渣を溶解し、抽出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの吸光度（ＯＤ２２８）を測定した。阻害率は試料（本発明のペプチド等）を混合せず、したがってＡＣＥ阻害剤なしで反応したときの吸光度を１００％とし、また反応時間０分のときの吸光度を０％として求め、阻害率５０％の時の試料の濃度ＩＣ５０を決定した。
【００４５】
＜２＞結果
（１）前記の実施例１＜１＞で得た本発明のペプチドを含有するルビスコの加水分解物のＡＣＥ阻害作用を評価した。すなわち、前記の実施例２＜１＞において、試料として実施例１＜１＞で得たルビスコの加水分解物を用いた。その結果、表２で示すように、何れの酵素を使用したルビスコの加水分解物も、ＡＣＥ阻害作用を有することが認められた。
【００４６】
【表２】
0004179586.tif 000003
【００４７】
（２）前記の実施例１＜２＞で得た本発明のペプチドのＡＣＥ阻害作用を評価した。すなわち前記の実施例２＜１＞において、試料として実施例１＜２＞で得た本発明のペプチドを用いた。その結果、表３で示すＩＣ５０値を示した。
【００４８】
【表３】
0004179586.tif 000004
【００４９】
【実施例３】
＜自然発症性高血圧ラット（ＳＨＲ）への単回投与試験＞
＜１＞１９及び２０週齢のＳＨＲに対して、本発明のペプチドＭＲＷの場合は２０mg／kg（ＳＨＲの体重）、本発明のペプチドＭＲＷＲＤの場合は３０mg／kg（ＳＨＲの体重）となるように生理食塩水に溶解させて経口投与し、その後の血圧の変化を室町機械製ＭＫ−２０００を用いて２時間ごとに非観血的に測定した。
【００５０】
＜２＞結果
ＭＲＷの２０mg／kgの経口投与により、投与２時間後の測定において、投与前よりも約１５mmHgの降圧作用が認められた（図３）。これに対して、生理食塩水を投与した対照においては、収縮期血圧に変化はなかった。また、４時間後の測定時には、ＭＲＷ投与による降圧作用は保持されていなかった。
【００５１】
一方、ＭＲＷＲＤ３０mg／kgの投与では、投与後２時間後及び４時間後において、投与前よりも約１０mmHgの降圧作用が認められた（図４）。６時間後においては、収縮期血圧は投与前のレベルに戻っていたが、ＭＲＷＲＤは、ＭＲＷと比較して、降圧の程度は弱いものの、作用の継続時間が長いことが示された。これは、体内のペプチダーゼによってＭＲＷＲＤが代謝されて遊離するＭＲＷがＡＣＥの真の阻害剤であり、ＭＲＷＲＤがプロドラッグタイプの阻害剤である可能性があることを推察させた。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、新規のペプチド、これを含有するＡＣＥ阻害剤、かかるＡＣＥ阻害剤を含有する医薬用組成物及び食品用組成物を提供することができた。
【００５３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Kagome Co., Ltd.
<120> 新規のペプチド、これを含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤、かかるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤を含有する医薬用組成物及び食品用組成物
<130> P-9780
<160> 2
<210> 1
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (4,5)
<400> 1
Met Arg Trp
1       3
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Arg Trp Arg Asp
1               5
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１において、ＯＤＳカラムによるＡＣＥ阻害物質の分画を説明する図。
【図２】  （ａ）実施例１において、画分IIのＰｈＡカラムによる分画を説明する図。
（ｂ）実施例１において、画分IIのＣＮカラムによる分画を説明する図。
（ｃ）実施例１において、画分IIのＮ−ＰｈＡカラムによる分画を説明する図。
【図３】  実施例３において、ＭＲＷの経口投与がＳＨＲの血圧に及ぼす影響を説明する図。
【図４】  実施例３において、ＭＲＷＲＤの経口投与がＳＨＲの血圧に及ぼす影響を説明する図。
【図１】
0004179586.tif 000005
【図２】
0004179586.tif 000006
【図３】
0004179586.tif 000007
【図４】
0004179586.tif 000008