(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイズ排除ＨＰＬＣによって計算した見かけの大きさが少なくとも５００ｋＤであり、一つ以上のポリアルキレンエーテルに共有的に結合した一つ以上の抗体フラグメントから構成された複合体であって、
前記抗体フラグメントが、無傷の抗体の抗原結合部位又は可変領域を含むが、無傷の抗体のＦｃ領域における重鎖の定常領域を含まず、抗体フラグメントが親抗体から誘導された重鎖および軽鎖を含み、親抗体において、重鎖および軽鎖が、軽鎖のシステイン残基と重鎖のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって共有的に結合しており、抗体フラグメントにおいて、軽鎖または重鎖のシステイン残基が別のアミノ酸で置換され、かつその反対側の鎖のシステイン残基がポリアルキレンエーテルに共有的に結合した、複合体。
【請求項２】
サイズ排除ＨＰＬＣによって計算した見かけの大きさが少なくとも８００ｋＤである、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
サイズ排除ＨＰＬＣによって計算した見かけの大きさが少なくとも１４００ｋＤである、請求項１記載の複合体。
【請求項４】
サイズ排除ＨＰＬＣによって計算した見かけの大きさが少なくとも１８００ｋＤである、請求項１記載の複合体。
【請求項５】
サイズ排除ＨＰＬＣによって計算した見かけの大きさが、抗体フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣによって計算した見かけの大きさよりも少なくとも８倍大きい、請求項１記載の複合体。
【請求項６】
サイズ排除ＨＰＬＣによって計算した見かけの大きさが、抗体フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣによって計算した見かけの大きさよりも少なくとも１５倍大きい、請求項５記載の複合体。
【請求項７】
サイズ排除ＨＰＬＣによって計算した見かけの大きさが、抗体フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣによって計算した見かけの大きさよりも少なくとも２５倍大きい、請求項６記載の複合体。
【請求項８】
抗体フラグメントを一つだけ含み、かつ、抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびＦ（ａｂ’）２からなる群から選択された、請求項１記載の複合体。
【請求項９】
抗体フラグメントがＦ（ａｂ’）２である、請求項８記載の複合体。
【請求項１０】
抗体フラグメントが、１０以下のポリアルキレンエーテルに共有的に結合した、請求項１記載の複合体。
【請求項１１】
抗体フラグメントが、５以下のポリアルキレンエーテルに共有的に結合した、請求項１０記載の複合体。
【請求項１２】
抗体フラグメントが、２以下のポリアルキレンエーテルに共有的に結合した、請求項１１記載の複合体。
【請求項１３】
抗体フラグメントが、１以下のポリアルキレンエーテルに結合した、請求項１２記載の複合体。
【請求項１４】
抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦａｂ’−ＳＨからなる群から選択された、請求項８記載の複合体。
【請求項１５】
抗体フラグメントが、１以下のポリアルキレンエーテルに共有的に結合した、請求項１４記載の複合体。
【請求項１６】
複合体のポリアルキレンエーテルが、抗体フラグメントのヒンジ領域に共有的に結合した、請求項１５記載の複合体。
【請求項１７】
ポリアルキレンエーテルが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１記載の複合体。
【請求項１８】
ＰＥＧが少なくとも２０ｋＤの平均分子量を有する、請求項１７記載の複合体。
【請求項１９】
ＰＥＧが少なくとも４０ｋＤの平均分子量を有する、請求項１８記載の複合体。
【請求項２０】
ＰＥＧが一本鎖分子である、請求項１９記載の複合体。
【請求項２１】
ＰＥＧが分枝鎖分子である、請求項１９記載の複合体。
【請求項２２】
抗体フラグメントを一つだけ含み、かつ、抗体フラグメントがＦ（ａｂ’）２であって、２以下のＰＥＧ分子に共有的に結合した、請求項１８記載の複合体。
【請求項２３】
抗体フラグメントを一つだけ含み、かつ、抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦａｂ’−ＳＨからなる群から選択され、１以下のＰＥＧ分子に共有的に結合した、請求項１８記載の複合体。
【請求項２４】
ＰＥＧ分子が抗体フラグメントのヒンジ領域に共有結合した、請求項２３記載の複合体。
【請求項２５】
抗体フラグメントが、ヒトＩＬ−８に結合する抗原結合部位を有する、請求項１記載の複合体。
【請求項２６】
複合体が一つだけの抗体フラグメントを含み、抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦａｂ’−ＳＨからなる群から選択され、抗体フラグメントが１以下のポリアルキレンエーテルに共有的に結合し、かつポリアルキレンエーテルが少なくとも３０ｋＤの実分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項２５記載の複合体。
【請求項２７】
抗体フラグメントがヒト化されている、請求項１記載の複合体。
【請求項２８】
抗体フラグメントを一つだけ含む、請求項１記載の複合体。
【請求項２９】
請求項１記載の複合体とキャリアとを含む炎症性疾患の治療のための組成物。
【請求項３０】
無菌である請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
サイズ排除ＨＰＬＣによって計算した見かけの大きさが少なくとも５００ｋＤであり、分子構造が別の物質を含まない、一つ以上のポリアルキレンエーテルに共有的に結合した一つ以上の抗体フラグメントによって形成された複合体であって、
前記抗体フラグメントが、無傷の抗体の抗原結合部位又は可変領域を含むが、無傷の抗体のＦｃ領域における重鎖の定常領域を含まず、抗体フラグメントが親抗体から誘導された重鎖および軽鎖を含み、親抗体において、重鎖および軽鎖が、軽鎖のシステイン残基と重鎖のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって共有的に結合しており、抗体フラグメントにおいて、軽鎖または重鎖のシステイン残基が別のアミノ酸で置換され、かつその反対側の鎖のシステイン残基がポリアルキレンエーテルに共有的に結合した、複合体。
【請求項３２】
サイズ排除ＨＰＬＣによって計算した見かけの大きさが少なくとも５００ｋＤであり、抗体フラグメントがポリマーを含まない非タンパク様ラベルを結合し、かつ、分子構造が別の物質を含まない、一つ以上のポリアルキレンエーテルに共有的に結合した一つ以上の抗体フラグメントによって形成された複合体であって、
前記抗体フラグメントが、無傷の抗体の抗原結合部位又は可変領域を含むが、無傷の抗体のＦｃ領域における重鎖の定常領域を含まず、抗体フラグメントが親抗体から誘導された重鎖および軽鎖を含み、親抗体において、重鎖および軽鎖が、軽鎖のシステイン残基と重鎖のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって共有的に結合しており、抗体フラグメントにおいて、軽鎖または重鎖のシステイン残基が別のアミノ酸で置換され、かつその反対側の鎖のシステイン残基がポリアルキレンエーテルに共有的に結合した、複合体。
【請求項３３】
非タンパク様ラベルが放射性同位元素である、請求項３２記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本願は、ポリマーを用いて誘導された抗体フラグメントの分野、特に抗体フラグメント−ポリマー複合体の循環半減期を増加するような誘導の使用に関する。本願は、ヒト化抗インターロイキン８（ＩＬ−８）抗体および当該抗体の高親和性変異体にも関する。
背景
ポリエチレングリコールを用いたタンパク修飾（“ＰＥＧ化（PEGylation）”）は、滞留時間を増加し、かつインビボにおける免疫原性を低減する可能性を備える。例えば、Knaufら，J.Biol.Chem.,263:15064-15070（1988）は、インターロイキン２の種々のポリオキシル化グリセロールおよびポリエチレングリコール修飾種について、ラットにおける薬力学的挙動の研究を報告した。ＰＥＧ化の既知の利点にも関わらず、ＰＥＧ化タンパクは、臨床的適用について広くは利用されなかった。抗体フラグメントの場合、ＰＥＧ化は、有益なレベルまで血清半減期を延長することが示されていなかった。Delgadoら，Br.J.Cancer,73:175-182（1996）、Kitamuraら，Cancer Res.,51:4310-4315（1991）、Kitamuraら，Biochem.Biophys.Res.Comm.,171:1387-1394（1990）およびPedleyら，Br.J.Cancer,70：1126-1130（1994）は、ある抗腫瘍抗原抗体または低分子量（５ｋＤ）ＰＥＧを用いて誘導された抗体フラグメントの血液クリアランスおよび組織取り込みを特徴決定する研究を報告した。Zapataら，FASEB J.,9:A1479（1995）は、Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域のスルフヒドリル基に付着した低分子量（５または１０ｋＤ）ＰＥＧが、親のＦａｂ’分子と比較してクリアランスを低減することを報告した。
インターロイキン８（ＩＬ−８）は、炎症性媒介物質に反応して種々の細胞によって分泌される好中球走化性ペプチドである（論評については、Hebertら．Cancer Investigation 11（6）:743（1993）を参照）。ＩＬ−８は、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症性ショックおよび多発性器官不全のような炎症性疾患の病因において重要な役割を演じ得る。このような炎症性疾患の免疫治療は、抗ＩＬ−８抗体を用いて患者を治療することを含むことができる。
Sticherlingら（J.Immunol.143:1628（1989））は、ＩＬ−８に対する４つのモノクローナル抗体の産生および特徴決定を開示している。１９９２年３月１９日に発表されたＷＯ９２／０４３７２号は、ＩＬ−８のレセプター相互作用部位およびＩＬ−８のペプチドアナログと反応するポリクローナル抗体と、患者において炎症反応を妨げるために当該抗体を使用することを開示する。St.Johnら（Chest 103:932（1993））は、抗ＩＬ−８抗体の可能な治療的使用を含む、ＡＲＤＳ、敗血症性ショックおよび多発性器官不全の免疫治療を論評する。Sekidoら（Nature 365:654（1993））は、ＩＬ−８に対するモノクローナル抗体によるウサギにおける肺の再灌流障害の予防について開示している。Mulliganら（J.Immunol.150:5585（1993））は、ラットにおいて、炎症性の肺の損傷におけるヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体の保護効果を開示している。
ＷＯ９５／２３８６５号（１９９５年９月８日に公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２５８９）は、抗ＩＬ−８モノクローナル抗体が、細菌性肺炎および炎症性腸疾患のような他の炎症性疾患の処置において治療的に用いられ得ることを証明する。
抗ＩＬ−８抗体は、ＩＬ−８をアッセイするための試薬としてさらに有用である。例えば、Sticherlingら（Arch.Dermatol.Res.284:82（1992））は、免疫組織化学的研究における試薬として抗ＩＬ−８モノクローナル抗体の使用を開示する。Koら（J.Immunol.Methods 149:227（1992））は、ＩＬ−８について酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）において試薬として抗ＩＬ−８モノクローナル抗体の使用を開示する。
発明の要旨
本発明の一つの態様は、本質的に、一つ以上のポリマー分子に共有結合した一つ以上の抗体フラグメントからなり、見かけの大きさが少なくとも約５００ｋＤの複合体である。
本発明の別の態様は、図４５（配列番号：）の６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｅ軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列の相補性決定領域を含む、抗ＩＬ−８モノクローナル抗体または抗体フラグメントである。
本発明のさらなる態様は、上記抗ＩＬ−８モノクローナル抗体または抗体フラグメントをコードする核酸配列を含む核酸分子；ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞によって認識された対照配列に実施可能に連結された核酸分子を含む発現ベクター；ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞；および抗体フラグメントをコードする核酸が発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む抗体フラグメントを産生する方法であって、それによって抗体フラグメントを産生し、かつ宿主細胞から抗体フラグメントを回収する方法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、抗ＩＬ−８モノクローナル抗体５．１２．１４による、好中球からのＩＬ−８媒介エラスターゼ放出のブロッキングを図示するグラフである。
図２は、未標識ＩＬ−８による、好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合の阻害を図示するグラフである。
図３は、アイソタイプ対応ネガティブコントロールＦａｂ（“４Ｄ５ Ｆａｂ”と表す）が、ヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合を阻害しないことを示す。
図４は、平均ＩＣ50が１．６ｎＭである、キメラ５．１２．１４Ｆａｂによる、ヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合の阻害を示すグラフである。
図５は、平均ＩＣ50が７．５ｎＭである、キメラ６Ｇ．４．２５Ｆａｂによる、ヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合の阻害を示すグラフである。
図６は、キメラ６Ｇ４．２．５Ｆａｂとキメラ５．１２．１４Ｆａｂによる、ヒトＩＬ−８媒介好中球走化性の阻害を示す。
図７は、ウサギＩＬ−８媒介好中球走化性を阻害するキメラ６Ｇ４．２．５Ｆａｂとキメラ５．１２．１４Ｆａｂの相対能力を示す。
図８は、種々の濃度のヒトおよびウサギＩＬ−８による、ヒト好中球からのエラスターゼ放出の刺激を図示する。エラスターゼ放出の相対的な程度は、４０５ｎｍにおける吸収を測定することにより定量された。このデータは、３つのサンプルの平均±ＳＥＭを示す。
図９は、ヒトＩＬ−８により刺激されたヒト好中球からのエラスターゼ放出を阻害するキメラ６Ｇ４．２．５Ｆａｂとキメラ５．１２．１４Ｆａｂの能力を図示するグラフである。この結果は、１００ｎＭのＩＬ−８のみによって誘導されたエラスターゼ放出のパーセントを反映するように標準化された。このデータは、異なる血液ドナーを用いて異なる日に行われた３つの別個の実験の平均±ＳＥＭを示す。ＩＣ50値は、４つのパラメーターフィットによって計算された。
図１０は、ウサギＩＬ−８により刺激されたヒト好中球からのエラスターゼ放出を阻害するキメラ６Ｇ４．２．５Ｆａｂとキメラ５．１２．１４Ｆａｂの相対的能力を図示するグラフである。この結果は、１００ｎＭのＩＬ−８のみによって誘導されたエラスターゼ放出のパーセントを反映するように標準化された。このデータは、異なる血液ドナーを用いて異なる日に行われた３つの別個の実験の平均±ＳＥＭを示す。ＩＣ50値は、４つのパラメーターフィットによって計算された。
図１１Ａ−１１Ｊは、ウサギ潰瘍性大腸炎モデルにおける以下のパラメーターを図示する一組のグラフである：図１１Ａは組織中のミエロペルオキシダーゼレベルを図示する；図１１Ｂは組織中のＩＬ−８レベルを図示する；図１１は結腸重量を図示する；図１１Ｄは肉眼でわかる炎症を図示する；図１１Ｅは水腫を示す；図１１Ｆは壊死の程度を示す；図１１Ｇは壊死の深刻さを示す；図１１Ｈは好中球の辺縁趨向を示す；図１１Ｉは好中球浸潤を示す；そして、図１１Ｊは単核浸潤を示す。
図１２は、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、大腸菌（Escherichiacoli）または緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）に感染した動物における、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の好中球の数に対する抗ＩＬ−８モノクローナル抗体治療の効果を示す図である。６Ｇ４．２．５を用いた処置は、アイソタイプコントロールマウスＩｇＧを用いて処置された動物と比較して、ＢＡＬ液中に存在する好中球の数を顕著に低減させた（図１２）。
図１３は、軽鎖および重鎖のそれぞれについて設計された３つのプライマーのＤＮＡ配列（配列番号：１−６）を図示する。ブライマーハイブリダイゼーションの機会と、モノクローナル抗体５．１２．１４の種々の軽および重領域をクローニングするための第一鎖ｃＤＮＡ合成の効率を増大させるために、多重プライマーが設計された。
図１４は、５．１２．１４軽鎖可変領域増幅のための、一つの正プライマーと一つの逆プライマーのＤＮＡ配列（配列番号：７−１０）を図示する。
図１５は、５．１２．１４重鎖可変領域増幅のための、一つの正プライマーと一つの逆プライマーのＤＮＡ配列（配列番号：１１−１８）を図示する。
図１６は、５．１２．１４軽鎖可変領域および部分的なマウス定常軽領域のＤＮＡ配列（配列番号：１９）およびアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線が付されたアミノ酸）またはKabat配列比較（星印が付されたアミノ酸）で示されている。重要な制限部位は、イタリック体で示されている。ＳＴＩＩのシグナルペプチドはアミノ酸−２３から−１である。マウス可変軽領域はアミノ酸１から１０９である。部分的なマウス定常軽領域はアミノ酸１１０から１２３である（イタリック体）。
図１７は、５．１２．１４重鎖可変領域および部分的なマウス定常重領域のＤＮＡ配列（配列番号：２１）およびアミノ酸配列（配列番号：２２）を示す。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線が付されたアミノ酸）またはKabat配列比較（星印が付されたアミノ酸）によって示されている。重要な制限部位は、イタリック体で示されている。ＳＴＩＩのシグナルペプチドはアミノ酸−２３から−１である。マウス可変重領域はアミノ酸１から１２０である。部分的なマウス定常重領域はアミノ酸１２１から１３０である。
図１８は、マウス軽および重鎖定常領域残基を、それらのヒト等価物に変換するために用いられた増幅プライマーのＤＮＡ配列（配列番号：２３−２６）を示す。
図１９は、５．１２．１４軽鎖可変領域とヒトＩｇＧ１軽鎖定常領域に関するＤＮＡ配列（配列番号：２７）およびアミノ酸配列（配列番号：２８）を示す。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線が付されたアミノ酸）またはKabat配列比較（星印が付されたアミノ酸）によって示されている。ヒト定常領域は、イタリック体で示されている。ＳＴＩＩのシグナルペプチドはアミノ酸−２３から−１である。マウス可変軽領域はアミノ酸１から１０９である。ヒト定常軽領域はアミノ酸１１０から２１５である。
図２０Ａ−２０Ｂは、５．１２．１４重鎖可変領域とヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域に関するＤＮＡ配列（配列番号：２９）およびアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線が付されたアミノ酸）またはKabat配列比較（星印が付されたアミノ酸）によって示されている。ヒト定常領域は、イタリック体で示されている。ＳＴＩＩのシグナルペプチドはアミノ酸−２３から−１である。マウス可変重領域はアミノ酸１から１２０である。ヒト定常重領域はアミノ酸１２１から２２９である。
図２１は、軽鎖および重鎖のそれぞれについて設計された３つのプライマーのＤＮＡ配列（配列番号：３１−３６）を示す。プライマーハイブリダイゼーションの機会と、モノクローナル抗体６Ｇ４．２．５の種々の軽および重領域をクローニングするための第一鎖ｃＤＮＡ合成の効率を増大させるために、多重プライマーが設計された。
図２２は、６Ｇ４．２．５軽鎖可変領域増幅のための、一つの正プライマーと一つの逆プライマーのＤＮＡ配列（配列番号：３７−４０）を図示する。
図２３は、６Ｇ４．２．５重鎖可変領域増幅のための、一つの正プライマーと一つの逆プライマーのＤＮＡ配列（配列番号：４１−４６）を図示する。
図２４は、６Ｇ４．２．５軽鎖可変領域および部分的なマウス定常軽領域のＤＮＡ配列（配列番号：４７）およびアミノ酸配列（配列番号：４８）を示す。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線が付されたアミノ酸）またはKabat配列比較（星印が付されたアミノ酸）によって示されている。有益なクローニング部位は、イタリック体で示されている。ＳＴＩＩのシグナルペプチドはアミノ酸−２３から−１である。マウス可変軽領域はアミノ酸１から１１４である。部分的なマウス定常軽領域はアミノ酸１１５から１３１である。
図２５は、６Ｇ４．２．５重鎖可変領域および部分的なマウス定常重領域のＤＮＡ配列（配列番号：４９）およびアミノ酸配列（配列番号：５０）を示す。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線が付されたアミノ酸）またはKabat配列比較（星印が付されたアミノ酸）によって示されている。有益なクローニング部位は、イタリック体で示されている。ＳＴＩＩのシグナルペプチドはアミノ酸−２３から−１である。マウス可変重領域はアミノ酸１から１２２である。部分的なマウス定常重領域はアミノ酸１２３から１３５である。
図２６は、マウス軽鎖および重鎖定常領域をそれらのヒト等価物に変換するためのプライマーのＤＮＡ配列（配列番号：５１−５４）を示す。
図２７Ａ−２７Ｂは、キメラ６Ｇ４．２．５軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号：５５）とアミノ酸配列（配列番号：５６）を示す。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線が付されたアミノ酸）またはKabat配列比較（星印が付されたアミノ酸）によって示されている。ヒト定常領域は、イタリック体で示されている。ＳＴＩＩのシグナルペプチドはアミノ酸−２３から−１である。マウス可変重領域はアミノ酸１から１１４である。ヒト定常重領域はアミノ酸１１５から２２０である。
図２８Ａ−２８Ｂは、キメラ６Ｇ４．２．５重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：５７）とアミノ酸配列（配列番号：５８）を示す。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線が付されたアミノ酸）またはKabat配列比較（星印が付されたアミノ酸）によって示されている。ヒト定常領域は、イタリック体で示されている。ＳＴＩＩのシグナルペプチドはアミノ酸−２３から−１である。マウス可変重領域はアミノ酸１から１２２である。ヒト定常重領域はアミノ酸１２３から２３１である。
図２９は、６Ｇ４２５のヒト化において用いられる、マウス６Ｇ４２５軽鎖可変ドメイン（配列番号：５９）、ヒト化６Ｇ４２５Ｆ（ａｂ）−１軽鎖可変ドメイン（配列番号：６０）およびヒト軽鎖κＩコンセンサスフレームワーク（配列番号：６１）アミノ酸配列のアミノ酸配列の整列、並びにマウス６Ｇ４２５重鎖可変ドメイン（配列番号：６２）、ヒト化６Ｇ４２５Ｆ（ａｂ）−１重鎖可変ドメイン（配列番号：６３）およびヒトＩｇＧ１サブグルーブIII重鎖可変ドメイン（配列番号：６４）アミノ酸配列のアミノ酸配列の整列を示す。軽鎖ＣＤＲは、ラベルされたＬ１、Ｌ２、Ｌ３である；重鎖ＣＤＲはラベルされたＨ１、Ｈ２およびＨ３である。＝および＋は、それぞれ、Ｘ線結晶学的接触および配列超可変性によって定義されたＣＤＲ配列を示す。＃は、整列された配列間の差異を示す。残基の番号付けはKabatらに従ったものである。小文字は、humIIIコンセンサス配列番号付けに関してアミノ酸残基の挿入を示す。
図３０は、それぞれ、ヒト野生型ＩＬ−８、ヒト単遺伝子性ＩＬ−８、およびアカゲザルＩＬ−８が媒介する好中球走化性を阻害するＦ（ａｂ）−９（ヒト化６Ｇ４Ｖ１１  Ｆａｂ）の能力を示す３つのパネル（Ａ、ＢおよびＣ）を備えたグラフである。パネルＡは、２ｎＭのヒト野生型ＩＬ−８の存在下で、０．０６ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度におけるＦ（ａｂ）−９サンプルについて、１００ｎＭの濃度のアイソタイプ対照抗体（“４Ｄ５”と表す）サンプルについて、並びに、抗体を含まない対照サンプルについて阻害データを示す。パネルＢは、４ｎＭのヒト単遺伝子性ＩＬ−８（“ＢＤ５９”および“単遺伝子性ＩＬ−８”と表す）の存在下で、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭおよび５０ｎＭの濃度におけるＦ（ａｂ）−９サンプルについて、１００ｎＭの濃度のアイソタイプ対照抗体（“４Ｄ５”と表す）サンプルについて、並びに、抗体を含まない対照サンプルについて阻害データを示す。パネルＣは、２ｎＭのアカゲザルＩＬ−８の存在下で、１ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭおよび５０ｎＭの濃度におけるＦ（ａｂ）−９サンプルについて、１００ｎＭの濃度のアイソタイプ対照抗体（“４Ｄ５”と表す）サンプルについて、並びに、抗体を含まない対照サンプルについて阻害データを示す。さらに、全てのパネルＡ、ＢおよびＣそれぞれが、各阻害アッセイにおけるＩＬ−８を含まないバッファー対照サンプル（“バッファー”と表す）についてデータを示す。
図３１Ａは、ＳＴＩＩリーダーペプチドとＮ末端で融合したヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５Ｖ１１軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：６５）、ＳＴＩＩリーダーペプチドとＮ末端で融合したヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５Ｖ１１重鎖のアミノ酸配列（配列番号：６６）、およびＭ１３ファージ遺伝子IIIコートタンパクとＣ末端で融合したペプチドリンカーのアミノ酸配列（配列番号：６７）を示す。
図３１Ｂは、ＳＴＩＩリーダーペプチドとＮ末端で融合したヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５Ｖ１１軽鎖の核酸配列（配列番号：６８）および翻訳されたアミノ酸配列（配列番号：６５）を示す。
図３１Ｃは、ＳＴＩＩリーダーペプチドとＮ末端で融合したヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５Ｖ１９軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：６９）、ＳＴＩＩリーダーペプチドとＮ末端で融合したヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５Ｖ１９重鎖のアミノ酸配列（配列番号：７０）を示す。
図３２は、ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５Ｖ１１抗体の三次元コンピューターモデルである。重鎖ＣＤＲループおよび可変ドメイン領域は紫色に見え、ＣＤＲ−Ｈ３側鎖残基は黄色に見える。重鎖定常ドメイン領域は赤色に見える。軽鎖ＣＤＲループおよび可変ドメイン領域はオフホワイト色であり、ＣＤＲ  Ｌ１のアミノ酸３５位のＡｓｎ残基（Ｎ３５）は緑色に見える。軽鎖定常ドメイン領域は琥珀色に見える。
図３３は、完全なマウス６Ｇ４．２．５抗体（６Ｇ４マウスｍＡｂと表す）、６Ｇ４．２．５マウス−ヒトキメラＦａｂ（６Ｇ４キメラと表す）、ヒト化６Ｇ４．２．５Ｆａｂバージョン１および１１（Ｖ１およびＶ１１と表す）、並びに変異体６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５ＡＦａｂ（Ｖ１１Ｎ３５Ａと表す）によって表された、ヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合の阻害を示すスキャッチャードプロットである。
図３４は、それぞれ、ヒト野生型ＩＬ−８、ヒト単遺伝子性ＩＬ−８、ウサギＩＬ−８、およびアカゲザルＩＬ−８が媒介する好中球走化性を阻害する６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂの能力を図示する４つのパネル（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）を含むグラフである。パネルＡは、２ｎＭのヒト野生型ＩＬ−８の存在下で、０．５、１、２、４、８、１６および３３ｎＭの濃度における６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂサンプルについて、３３ｎＭの濃度のアイソタイプ対照抗体（“４Ｄ５”と表す）サンプルについて、並びに、抗体を含まない対照（“ＨｕＩＬ−８”と表す）サンプルについて阻害データを示す。パネルＢは、２ｎＭのヒト単遺伝子性ＩＬ−８の存在下で、０．５、１、２、４、８、１６および３３ｎＭの濃度における６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂサンプルについて、３３ｎＭの濃度の完全な６Ｇ４．２．５ｍＡｂサンプルについて、３３ｎＭの濃度のアイソタイプ対照抗体（“４Ｄ５”と表す）サンプルについて、並びに、抗体を含まない対照（“ＢＤ５９”と表す）サンプルについて阻害データを示す。パネルＣは、２ｎＭのウサギＩＬ−８の存在下で、０．５、１、２、４、８、１６および３３ｎＭの濃度における６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂサンプルについて、３３ｎＭの濃度の完全な６Ｇ４．２．５ｍＡｂサンプルについて、３３ｎＭの濃度のアイソタイプ対照抗体（“４Ｄ５”と表す）サンプルについて、並びに、抗体を含まない対照（“Ｒａｂ  ＩＬ−８”と表す）サンプルについて阻害データを示す。パネルＤは、２ｎＭのアカゲザルＩＬ−８の存在下で、０．５、１、２、４、８、１６および３３ｎＭの濃度における６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂサンプルについて、３３ｎＭの濃度の完全な６Ｇ４．２．５ｍＡｂサンプルについて、３３ｎＭの濃度のアイソタイプ対照抗体（“４Ｄ５”と表す）サンプルについて、並びに、抗体を含まない対照（“Ｒｈｅ  ＩＬ−８”と表す）サンプルについて阻害データを示す。さらに、パネルＢ、ＣおよびＤは、それぞれ、各アッセイにおいて２ｎＭ濃度のヒト野生型ＩＬ−８対照（“ＨｕＩＬ−８”と表す）サンプルについてデータを示し、かつパネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、それぞれ、各アッセイにおいてＩＬ−８を含まないバッファー対照（“バッファー”と表す）サンプルについてデータを示す。
図３５は、ＳＴＩＩリーダーペプチドとＮ末端で融合したヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：７１）、ＳＴＩＩリーダーペプチドとＮ末端で融合したヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ重鎖のアミノ酸配列（配列番号：６６）、およびＧＣＮ４ロイシンジッパーペプチドのアミノ酸配列（配列番号：７２）を示す。６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ軽鎖のアミノ酸３５位におけるＡｌａ残基（野生型Ａｓｎ残基の代わりに置換された）は、太字で表されている。ＧＣＮ４ロイシンジッパー配列における推定上のペプシン切断部位に下線が付されている。
図３６は、ＳＴＩＩリーダーペプチドとＮ末端で融合したヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号：７３）およびアミノ酸配列（配列番号：７１）を示す。相補性決定領域Ｌ１、Ｌ２およびＬ３には下線が付されている。
図３７Ａ−３７Ｂは、ＳＴＩＩリーダーペプチドとＮ末端で融合し、かつＧＣＮ４ロイシンジッパー配列とＣ末端で融合したヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：７４）およびアミノ酸配列（配列番号：７５）を示す。相補性決定領域Ｈ１、Ｈ２およびＨ３には下線が付されている。
図３８は、６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ（Ｆａｂと表す）、６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2（Ｆ（ａｂ’）2と表す）、およびヒト野生型ＩＬ−８対照（ＩＬ−８と表す）によって表された、ヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８結合の阻害を示すスキャッチャードプロットである。
図３９は、６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2および６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂの野生型ヒトＩＬ−８媒介好中球走化性阻害活性の比較を表すグラフである。阻害データは、２ｎＭのヒト野生型ＩＬ−８の存在下で、０．３、１、３、１０、３０および１００ｎＭの濃度における６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂサンプル（“Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ”と表す）および６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2サンプル（Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2と表す）について、１００ｎＭの濃度のアイソタイプ対照抗体（“４Ｄ５”と表す）サンプルについて、並びに、抗体を含まない対照サンプルについて阻害データを示す。さらに、ＩＬ−８を含まないバッファー対照サンプル（“バッファー”と表す）について阻害データを示す。
図４０は、ヒト単遺伝子性ＩＬ−８、アカゲザルＩＬ−８、およびウサギＩＬ−８が媒介した好中球走化性を阻害する６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2の能力を示すグラフである。０．５ｎＭのヒト単遺伝子性ＩＬ−８（“ＢＤ５９”と表す）の存在下で、０．３、１、３および１０ｎＭの濃度における６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2サンプルについて、１００ｎＭの濃度のアイソタイプ対照抗体（“４Ｄ５”と表す）サンプルについて、並びに、抗体を含まない対照サンプル（“ＢＤ５９”と表す）について、ヒト単遺伝子性ＩＬ−８媒介好中球走化性データを示す。２ｎＭのアカゲザルＩＬ−８の存在下で、０．３、１、３および１０ｎＭの濃度における６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2サンプルについて、並びに、抗体を含まない対照サンプルについて、アカゲザルＩＬ−８媒介好中球走化性データを示す。２ｎＭのウサギＩＬ−８の存在下で、０．３、１、３および１０ｎＭの濃度における６Ｇ４．２．５Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2サンプルについて、並びに、抗体を含まない対照サンプルについて、ウサギＩＬ−８媒介好中球走化性データを示す。さらに、ＩＬ−８を含まないバッファー対照サンプル（“バッファー”と表す）について、並びに、２ｎＭのヒト野生型ＩＬ−８（“ＨｕＩＬ−８”と表す）について阻害データを示す。
図４１Ａ−４１Ｑは、ｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．Ｆ（ａｂ’）2ベクターの核酸配列（配列番号：７６）を図示する。
図４２は、ヒト化抗体６Ｇ４Ｖ１１の可変軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１におけるアミノ酸３５位の任意変異誘発に使用した、停止鋳型プライマーの核酸配列（配列番号：）およびＮＮＳ無作為化プライマーの核酸配列（配列番号：）を示す。
図４３Ａは、ヒト化抗体６Ｇ４Ｖ１１の可変軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸３５位の無作為化によって得られた種々のファージ展示クローンの頻度を記載するデータの表である。
図４３Ｂは、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｄ、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅおよび６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｇ  Ｆａｂ’によって示された、好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合の阻害を図示する置換曲線のグラフを含む。
図４４は、ＩＬ−８に結合する抗ＩＬ−８抗体フラグメント（６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）２）の典型的な動力学を図示したグラフを含む。図４４は、ＩＬ−８に結合する６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂの平衡定数（速度定数については調べていない“ＮＤ”）、およびＩＬ−８に結合する６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）２および６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ  Ｆａｂの平衡および速度定数を提供するデータの表をも含む。
図４５は、ＳＴＩＩリーダーペプチドとＮ末端で融合した６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号：）およびアミノ酸配列（配列番号：）を図示する。相補性決定領域Ｌ１、Ｌ２およびＬ３に下線が付されている。
図４６は、ヒトＩＬ−８（暗いカラム）およびウサギＩＬ−８（明るいカラム）が媒介した好中球走化性を阻害する６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ  Ｆａｂの能力を図示するグラフである。２ｎＭのヒトＩＬ−８または２ｎＭのウサギＩＬ−８の存在下で、０．４、１．２、３．７、１１および３３ｎＭの濃度における６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ  Ｆａｂサンプルについて、１００ｎＭの濃度のアイソタイプ対照抗体（４Ｄ５）サンプルについてデータを示す。さらに、ＩＬ−８を含まないバッファー対照サンプル（“バッファー”と表す）について、並びに、ヒトおよびウサギＩＬ−８対照サンプル（“ＩＬ−８”と表す）について阻害データを示す。
図４７は、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ重鎖のアミノ酸Ｌｅｕ４からＰｈｅ２９をコードするＰｖｕII−ＸｈｏI合成ヌクレオチドのセンス（配列番号：）およびアンチセンス（配列番号：）鎖のＤＮＡ配列を図示する。
図４８Ａ−４８Ｔは、プラスミドｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．ｃｈｏＳＤ９のＤＮＡ配列（配列番号：）を図示する。
図４９は、変異体６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａおよび６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅの全長ＩｇＧ１形態によって示された好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合阻害を図示する置換曲線のグラフを含む。
図５０Ａ−５０Ｂは、ヒトＩＬ−８（図５０Ａ）およびウサギＩＬ−８（図５０Ｂ）媒介好中球走化性を阻害する、全長６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  ＩｇＧ１および６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ  ＩｇＧ１の能力を図示するグラフである。
図５１は、ＩＬ−８に結合する全長抗ＩＬ−８抗体（６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  ＩｇＧ１）の典型的な動力学を図示するグラフを含む。図５１は、ＩＬ−８に結合する全長のマウス６Ｇ４．２．５  ＩｇＧ２ａ、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  ＩｇＧ１および６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ  ＩｇＧ１の平衡および速度定数を提供するデータの表を含む。
図５２は、全長の６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  ＩｇＧ１および６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ  ＩｇＧ１用いて行われた未標識ＩＬ−８／125Ｉ−ＩＬ−８競合ラジオイムノアッセイの結果を図示する置換曲線のグラフを含む。
図５３は、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’重鎖（ヒンジ領域においてシステイン残基を含むように修飾された６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ重鎖）のＤＮＡ配列（配列番号：）およびアミノ酸配列（配列番号：）を図示する。
図５４Ａ−５４Ｃは、ＰＥＧ−マレイミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’分子に対するＩＬ−８結合およびＩＣ50を図示する置換曲線のグラフを含む。
図５５Ａ−５５Ｃは、ヒトＩＬ−８およびウサギＩＬ−８媒介好中球走化性を阻害するＰＥＧ−マレイミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’分子の能力を図示するグラフである。
図５６Ａ−５６Ｃは、好中球からのβ−グルクロニダーゼのＩＬ−８媒介放出を阻害するＰＥＧ−マレイミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’分子の能力を図示するグラフである。
図５７Ａ−５７Ｂは、ＰＥＧ−スクシニミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’2分子により示された好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合の阻害を図示する置換曲線のグラフを含む。
図５８Ａ−５８Ｂは、ヒトＩＬ−８媒介好中球走化性を阻害するＰＥＧ−スクシニミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2分子の能力を図示するグラフである。
図５９Ａ−５９Ｂは、好中球からのβ−グルクロニダーゼのヒトＩＬ−８媒介放出を阻害するＰＥＧ−スクシニミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2分子の能力を図示するグラフである。
図６０は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって調べられたＰＥＧ−マレイミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’分子の理論分子量（点が付された棒）および有効サイズ（塗りつぶされた棒）を図示するグラフである。
図６１は、種々のＰＥＧ−マレイミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’分子の電気泳動移動度を図示するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
図６２は、種々のＰＥＧ−スクシニミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2分子の保持時間および有効（流体力学的）サイズを図示するサイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を含む。
図６３は、種々のＰＥＧ−スクシニミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2分子について、理論的分子量（白抜きのカラム）、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで調べられた有効サイズ（塗りつぶされたカラム）、およびＳＥＣ−光散乱で調べられた実際の分子量（影が付されたカラム）を図示するグラフである。
図６４は、種々のＰＥＧ−スクシニミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2分子の電気泳動移動度を図示するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。左から右に、レーン１は未修飾のＦ（ａｂ’）2を含み、レーン２は二つの４０ｋＤの分枝状ＰＥＧ−スクシニミド分子に結合したＦ（ａｂ’）2（“Ｂｒ（２）−４０ｋＤ（Ｎ）−Ｆ（ａｂ’）２”と表す）を含み、レーン３は一つの４０ｋＤの分枝状ＰＥＧ−スクシニミド分子に結合したＦ（ａｂ’）2（“Ｂｒ（１）−４０ｋＤ（Ｎ）−Ｆａｂ’２”と表す）を含み、レーン４は４つの２０ｋＤの直鎖状ＰＥＧ−スクシニミド分子に結合したＦ（ａｂ’）2と５つの２０ｋＤの直鎖状ＰＥＧ−スクシニミド分子に結合したＦ（ａｂ’）2の混合物（“Ｌ（４＋５）−２０ｋＤ−（Ｎ）−Ｆａｂ’２”と表す）を含み、レーン５は１つの２０ｋＤの直鎖状ＰＥＧ−スクシニミド分子に結合したＦ（ａｂ’）2（“Ｌ（１）−２０ｋＤ−（Ｎ）−Ｆａｂ’２”と表す）を含み、かつ、レーン６は分子量基準を含む。
図６５は、ウサギにおける、種々のＰＥＧ−マレイミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’分子（上のグラフ）および種々のＰＥＧ−スクシニミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2分子（下のグラフ）の、血清濃度に対する時間のプロフィールを比較したグラフを含む。上のグラフにおいて、“分枝．（１）４０Ｋ（ｓ）Ｆａｂ’”は、一つの４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ−マレイミド分子に結合した６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’を示し、“直鎖．（１）４０Ｋ（ｓ）Ｆａｂ’”は、一つの４０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ−マレイミド分子に結合した６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’を示し、“直鎖．（１）３０Ｋ（ｓ）Ｆａｂ’”は、一つの３０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ−マレイミド分子に結合した６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’を示し、“直鎖．（１）２０Ｋ（ｓ）Ｆａｂ’”は、一つの２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ−マレイミド分子に結合した６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’を示す。下方のグラフでは、“分枝．（２）４０Ｋ（Ｎ）Ｆａｂ’２”は、二つの４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ−スクシニミド分子に結合した６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2を示し、“分枝．（１）４０Ｋ（Ｎ）Ｆａｂ’２”は、一つの４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ−スクシニミド分子に結合した６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2を示し、かつ、“Ｆａｂ’２”は、未修飾の６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2を示す。両方のグラフにおいて、“ＩｇＧ”は、以下の例Ｆに記載されたヒト−マウスキメラ抗ウサギＩＬ−８  Ｆａｂの全長のＩｇＧ１等価物を示す。
図６６は、一つの４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ−マレイミド分子に結合した６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’（“分枝．（１）４０Ｋ（ｓ）Ｆａｂ’”と表す）、一つの４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ−スクシニミド分子に結合した６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2（“分枝．（１）４０Ｋ（Ｎ）Ｆａｂ’２”と表す）、未修飾の６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2（“Ｆａｂ’２”と表す）、未修飾の６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’（“Ｆａｂ”と表す）、かつ、以下の例Ｆに記載されたヒト−マウスキメラ抗ウサギＩＬ−８  Ｆａｂの全長のＩｇＧ１（“ＩｇＧ”と表す）等価物の、血清濃度に対する時間プロフィールを比較するグラフを含む。
図６７は、一つの４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ−マレイミド分子に結合した６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’（“ＰＥＧ４０Ｋｄ”と表す）およびマウス抗ウサギＩＬ−８モノクローナル抗体６Ｇ４．２．５（全長ＩｇＧ２ａ）（“６Ｇ４．２．５”と表す）の、ＡＲＤＳウサギモデルにおける完全な肺の総重量に与える効果を図示したグラフである。
図６８は、一つの分枝状４０ｋＤ  ＰＥＧ−マレイミド分子に結合した６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’（“ＰＥＧ４０Ｋｄ”と表す）およびマウス抗ウサギＩＬ−８モノクローナル抗体６Ｇ４．２．５（全長ＩｇＧ２ａ）（“６Ｇ４．２．５”と表す）の、ＡＲＤＳウサギモデルにおけるＢＡＬ全白血球数（明るい方のカラム）および多形核細胞数（暗い方のカラム）に与える効果を図示したグラフである。未処理（未治療）対照動物のデータは、“対照”として示されている。
図６９は、一つの分枝状４０ｋＤ  ＰＥＧ−マレイミド分子に結合した６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆａｂ’（“ＰＥＧ４０Ｋｄ”と表す）およびマウス抗ウサギＩＬ−８モノクローナル抗体６Ｇ４．２．５（全長ＩｇＧ２ａ）（“６Ｇ４．２．５”と表す）の、ＡＲＤＳウサギモデルにおける処置後２４時間（明るい方のカラム）および処置後４８時間（暗い方のカラム）におけるＰａＯ２／ＦｉＯ２比に与える効果を図示したグラフである。未処理（未治療）対照動物のデータは、“対照”として示されている。
好ましい態様の記載
Ｉ．定義
一般に、以下の単語又はフレーズは、記載、実施例、及び請求の範囲において使用される場合には、示した意味を有する。
”ポリメラーゼ連鎖反応”又は”ＰＣＲ”とは、微量の核酸、ＲＮＡ、及び／又はＤＮＡの特定の断片を、１９８７年７月２８日発行の米国特許第４，６８３，１９５号に記載されるようにして増幅する方法又は技術を示す。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることができるように、興味ある領域の末端、又はそれを越えた部分の配列情報が入手可能である必要がある；これらのプライマーは、増幅する鋳型の反対側の鎖と、配列において同一又は類似である。二つのプライマーの５’末端のヌクレオチドは、増幅する物質の末端と符合することができる。ＰＣＲを利用して、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡ由来の特定のＤＮＡ配列、及び全細胞質ＲＮＡより転写されるｃＤＮＡ、バクテリオファージ、またはプラスミド配列等を増幅することが可能である。一般的なものとして、Mullis et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263（1987）;Erlich,ed.,PCR Technology（Stockton Press,NY,1989）を参照されたい。本願では、ＰＣＲとは核酸試料を増幅するための、核酸ポリメラーゼ反応法であって、既知の核酸としてのプライマー、及び核酸の特定の部分を増幅又は産生するための核酸ポリメラーゼを具備するものの一例であるが、これのみには限定されない。
”抗体”（Ａｂｓ）及び”免疫グロブリン”（Ｉｇｓ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパクである。抗体が特定の抗原に対しての結合特性を呈するのに対して、免疫グロブリンは抗体、及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子を含んでいる。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系では低レベルで、また骨髄腫では増大したレベルで産生される。
”ネイティブな抗体及び免疫グロブリン”とは通常、約１５０，０００ダルトンの、ヘテロ四量体糖タンパクであって、二つの同一の軽（Ｌ）鎖と二つの同一の重（Ｈ）鎖とからなっている。それぞれの軽鎖は一つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されていて、一方、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖間で異なっている。重鎖及び軽鎖のそれぞれはまた、規則正しく間隔の開いた鎖内ジスルフィドブリッジを有している。それぞれの重鎖は一端において可変領域（ＶH）とその後に続く数多くの定常領域を有している。それぞれの軽鎖は一端における可変領域（ＶL）と他端の定常領域とを有している；軽鎖の定常領域は、重鎖の第一定常領域と整列していて、また軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と整列している。軽鎖と重鎖の可変領域の間には、特定のアミノ酸残基が界面を形成していると考えられている（Clothia et al.,J.Mol.Biol.186:651（1985）;Novotny and Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:4592（1985））。
”可変”という用語は、可変領域中のある部分は、抗体間において配列が著しく異なっていて、それぞれの特定の抗体について、その特定の抗原に対する結合性及び特異性に利用されているという事実を意味している。しかしながら、可変性は抗体の可変領域にわたって均一に分布してはいない。相補性決定領域（ＣＤＲｓ）又は超可変領域と呼ばれる、ともに軽鎖及び重鎖の可変領域にある３つのセグメントに集中している。可変領域においてより保存比率の高い部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれている。ネイティブな重鎖及び軽鎖のそれぞれは、β−シート構造を大きく取り入れ、３つのＣＤＲｓで連結され、ループ連結を形成し、またある場合にはβ−シート構造の一部を形成する４つのＦＲ領域を含んでいる。それぞれの鎖のＣＤＲｓはＦＲ領域により近傍に保持されていて、他の鎖からのＣＤＲｓとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat et al.,Sequence of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,MD（1991）を参照）。定常領域は、抗体の抗原に対する結合には直接的には関与していないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与等の、種々のエフェクター機能を呈する。
抗体をパパインで消化すると、それぞれが単一の抗原結合部位を有している”Ｆａｂ”断片と呼ばれる同一の抗原結合性断片を二つと、結晶化が容易であることが名称に反映されている残りの”Ｆｃ”断片が一つ産生される。ペプシン処理すると、抗原結合部位を二つ有し、かつ抗原と架橋することがいまだ可能なＦ（ａｂ’）2断片を生じる。
”Ｆｖ”は完全な抗原認識性且つ結合性部位を含む最小抗体断片である。二鎖のＦｖ種においては、この領域は、一の重鎖及び一の軽鎖の可変領域の緊密な非共有結合による二量体から成っている。単一鎖Ｆｖ種（ｓｃＦｖ）においては、一の重鎖及び一の軽鎖の可変領域が、フレキシブルなペプチドリンカーにより軽鎖と重鎖とが二鎖Ｆｖ種のもののような二量体構造で関連することができるようにして共有結合されている。それぞれの可変領域の３つのＣＤＲｓが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を決定しているのは、この構造においてである。集団的に６つのＣＤＲｓが抗体に抗原結合特異性を付与している。しかしながら、単一の可変領域（又は抗原特異的な３つのＣＤＲｓを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも低親和性においてではあるものの、抗原を認識して結合することが可能である。ｓｃＦｖについてのレビューはPluckthum,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315（1994）を参照されたい。
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常領域及び重鎖の第一定常領域（ＣＨ１）を含んでいる。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片と比較すると、抗体のヒンジ領域由来の一以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端の二三の残基が付加されている点で異なっている。本願においてＦａｂ’−ＳＨは、定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’を示している。Ｆ（ａｂ’）2抗体断片はもともと、間にヒンジのシステインを有する、Ｆａｂ’断片の対として産生されたものである。抗体断片の他の化学的連結もまた知られている。
いかなる脊髄動物種の抗体（免疫グロブリン）の”軽鎖”も、その定常領域のアミノ酸配列に基づき、カッパ（ｋ）とラムダ（ｌ）と呼ばれるの二つの明確に区別されるタイプの一方に分類される。
それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラスがあり（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）、これらのいくつかは更にサブクラス（アイソタイプ）、すなわちＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、及びＩｇＡ2に分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応した重鎖の定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
”抗体”という用語は、もっとも広い意味において用いられ、特に単一のモノクローナル抗体（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）及びポリエピトープ特異性を有する抗体組成物を含むものである。
本願において、”抗体断片”及びその文法的変形例は、抗原結合部位又は無傷の抗体の可変領域を有する無傷の抗体の一部として定義されるが、ここで一部とは、無傷の抗体のＦｃ領域における重鎖の定常領域（すなわち、抗体のアイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を一切含んでいない。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｖ断片；ダイアボディーズ（Diabodie）；近接するアミノ酸残基の分断されていない一の配列からなる一次構造を有するポリペプチド（本願では”単一鎖抗体断片”又は”単一鎖ポリペプチド”と呼ばれる）であるいかなる抗体断片：
これには（１）単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子
（２）単一鎖ポリペプチドであって一の軽鎖可変領域、又はその断片であって軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み重鎖部分とは結合していないもの、及び
（３）一の重鎖可変領域のみを含む単一鎖ポリペプチド、又はその断片であって重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、軽鎖部分とは結合していないもの；そして抗体断片より形成される多特異的、多価的構造物が含まれるが、これらには限定されない。
一以上の重鎖を含む抗体断片においては、重鎖は、無傷の抗体の非Ｆｃ領域に見られるいかなる定常領域配列（例えばＩｇＧアイソタイプにおけるＣＨ１）を含むことが可能であり、及び／又は無傷の抗体に見られるいかなるヒンジ領域配列をも含むことが可能であり、及び／又は当該ヒンジ領域の配列又は重鎖の定常領域の配列に融合されるか又は位置しているロイシンジッパー配列を含むことが可能である。適当なロイシンジッパー配列には、Kostelney et al.,J.Immunol.,148:1547-1553（1992）により教示されるjun及びfosロイシンジッパー、並びに以下の実施例に記載されるＧＣＮ４ロイシンジッパーが含まれる。
特に反する記載がないかぎり、本願に記載され請求される”複合体”という用語は、一以上の抗体断片を一以上のポリマー分子へ共有結合的に付加することにより形成される異種分子を意味するが、ここで異種分子とは水溶性、すなわち血液等の生理的な液体に可溶であり、また異種分子とは構造を有する凝集体のいかなるものをも含まない。前述の定義との関係において、”構造を有する凝集体”という用語は、（１）水溶液中において回転楕円体又は回転楕円体のシェル構造を有する分子のいかなる凝集体であって、異種分子がミセルや他のエマルジョン構造をとっておらず、また脂質二重層、小胞、又はリポソームにアンカリングしていないものを意味し、又、（２）固形化又は不溶化した形態の分子の凝集物のいかなるものであって、クロマトグラフィーのビーズマトリックスのような、水相と接触したときに溶液中に異種分子を放出しないものを意味する。従って、本願で定義される”複合体”という用語には、沈降物中にある前出の異種分子、沈殿物、生侵食性マトリックス、又は他の固形物であって当該固形物の水和により水溶液中に異種分子を放出することが可能なものが含まれる。
特に反する記載がないかぎり、”ポリマー”、”ポリマー分子”、”非タンパク様ポリマー”、及び”非タンパク様ポリマー分子”という用語は、交互に使用され、また二以上の単一物の共有結合により形成される分子であると定義されるが、ここで単一物のいずれも、アラニン基（Ａｌａ）、システイン基（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸基（Ａｓｐ）、グルタミン酸基（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン基（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン基（Ｈｉｓ）、イソロイシン基（Ｉｌｅ）、リジン基（Ｌｙｓ）、ロイシン基（Ｌｅｕ）、メチオニン基（Ｍｅｔ）、アスパラギン基（Ａｓｎ）、プロリン基（Ｐｒｏ）、グルタミン基（Ｇｌｎ）、アルギニン基（Ａｒｇ）、セリン基（Ｓｅｒ）、スレオニン基（Ｔｈｒ）、バリン基（Ｖａｌ）、トリプトファン基（Ｔｒｐ）、及びチロシン基（Ｔｙｒ）からなる群には含まれない。
本願における”モノクローナル抗体”（ｍＡｂ）とは、実質的に均一な抗体の集団、すなわち集団を構成する個々の抗体が、少量で存在するかも知れない天然の変異を除いて同一であるものより得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり単一の抗原性部位に対して向けられている。更に、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体群を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、それぞれのｍＡｂは抗原上の単一決定基に向けられている。特異性のみならず、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により、他の免疫グロブリンの汚染を受けずに合成され得るという点で有利である。修飾語である”モノクローナル”は、抗体が実質的に均一な抗体集団より得られているという抗体の特徴を示し、特定の方法によって抗体を産生することを要求しているものととらえるべきものではない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerらにより最初に記載されたハイブリドーマ法（Nature,256:495（1975））や、組換えＤＮＡ法（例えばCabillyらの米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって調製してもよい。”モノクローナル抗体”にはまた、抗原認識及び結合部位を含有する抗体断片のクローン（Ｆｖクローン）であって、例えばClacksonら（Nature,352：624-628（1991））やMarksら（J.Mol.Biol.,222:581-597（1991））の記載の技術を利用したファージ抗体ライブラリー由来のものが含まれる。
本願ではモノクローナル抗体には、所望の生物学的活性を呈するかぎり、抗−ＩＬ−８抗体の可変（超可変を含む）領域を定常領域とスプライスして産生されるハイブリッド及び組換えの抗体（”ヒト化”抗体）、軽鎖と重鎖とによるもの、又は一の種由来の鎖と別の種由来の鎖とによるもの、あるいは種の起源、又は免疫グロブリンのクラス名若しくはサブクラス名が異なっているとに関らず異種タンパクとの融合物、更には抗体断片（例：Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦｖ）が含まれる。（例えばCabilyらの米国特許第４，８１６，５６７号；Mage及びLamoyiのMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp79-97（Marcel Dekker,Inc.,New York,1987）を参照されたい）。
本願ではモノクローナル抗体には特に、所望の生物学的活性を呈する限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同的であって、一方、鎖の残部は別の種由来又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同的である”キメラ”抗体（免疫グロブリン）を含み、また同様にその断片も含む（Cabily et al.,上記；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851（1984））。
非ヒト（例えばマウス）抗体の”ヒト化”型は、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はそれらの断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、又は他の抗体の抗原結合性配列）であって、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むものである。たいていの場合ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、例えばマウス、ラット又はウサギ等の所望の特異性、親和性、性能を有する非ヒト種（提供者抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基で置換されている。更に、ヒト化抗体は受容者抗体中にも、インポートされたＣＤＲ又はフレームワーク配列中にも見られない残基を含むことが可能である。これらの修飾は更に改良して抗体の性能を最大限にする。一般的にヒト化抗体は、少なくとも一の、典型的には二の可変領域であって、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、且つ全て又は実質的に全てのＦＲ領域がヒトの免疫グロブリンのコンセンサス領域のものであるものについての実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた適宜、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含むであろう。更なる詳細については、Jonesら（Nature,321:522（1986））、Reichmannら（Nature,332:323（1988））、及びPrestaら（Curr.Op.Struct.Biol.2:593（1992））を参照されたい。
”処置”とは治療的処置、及び予防的又は防止的な処置の両方を意味する。処理が必要な者には、既に疾患にかかっている者のみならず、当該疾患にかかりやすい者又は当該疾患が防止される者が含まれる。
処置する”ほ乳類”とは、ほ乳類に分類されるいかなる動物をも意味し、これにはヒトや、家畜、動物園、狩猟用、又は愛玩動物であるイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等が含まれる。本願ではほ乳類は好ましくはヒトである。
本願では、タンパク、ペプチド、及びポリペプチドは交互に使用してアミノ酸のポリマー、又は二以上の互いに影響するか若しくは結合するアミノ酸ポリマーのセットを意味する。
本願では、”炎症性疾患”という用語は、典型的には好中球化学走性により引き起こされる炎症を結果として引き起こす病理学的状態を意味する。このような疾患の例には乾癬などの炎症性皮膚病、；炎症性腸疾患（例えばクローン病や潰瘍性大腸炎）；虚血性再灌流；成人呼吸困難症；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；リウマチ様関節炎、ヨールゲン（Sjorgen’s）症候群、脈管炎等の自己免疫疾患；白血球漏出が関与する疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性疾患、敗血症又は外傷に次ぐ多機能障害性疾患；アルコール性肝炎、細菌性肺炎、抗原−抗体複合体媒介性疾患；肺の炎症（肋膜炎、肺胞炎、脈管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、及び嚢胞性繊維症が含まれる）等が含まれる。好ましい適応症は細菌性肺炎、及び潰瘍性大腸炎等のような炎症性腸疾患である。
分子についての”流体力学的サイズ”、”見かけのサイズ”、”見かけの分子量”、”有効サイズ”、及び”有効分子量”は本願では同義的に使用され、ゲル濾過クロマトグラフィーシステムで球形の分子量標準タンパクで作成した標準曲線との比較により決定される分子サイズを意味するが、ここで標準曲線はそれぞれの標準の実際の分子量を、ゲル濾過クロマトグラフィーシステムで観測された溶出時間に対してマッピングして作成される。よって、検体分子の見かけサイズは、分子の溶出時間を利用して、標準カーブの推定の分子量を外挿することにより得られる。標準曲線を作成するのに使用される分子量標準は、検体分子の見かけサイズが標準曲線の線形部分内に入るようにして選択することが好ましい。
II．発明の実施の形態
本発明は一つには、有効サイズ又は見かけサイズが、当該技術分野において記載されている抗体断片−ポリマー複合体のものよりも顕著に大きい抗体断片−ポリマーの複合体により、血清中の半減期が増大し、血行中の平均滞留時間（ＭＲＴ）が増大し、及び／又は当該技術分野で知られる抗体断片−ポリマー複合体で得られる生物学的性質における控えめな変化は、非誘導体化抗体に比べてかなり越えた血清排除率を与えるといった驚くべき、また予期しなかった発見に起因している。本発明者らは、抗体断片の有効サイズを少なくとも約５００，０００Ｄにまで増大、又は抗体断片の有効サイズを少なくとも、元の抗体断片の有効サイズの約８倍にまで増大させるか、あるいは抗体断片を分子量において少なくとも２０，０００Ｄのポリマーと誘導体化させると、商業的に有益な薬物動態的特徴を有する分子が生じるということを初めて決定した。本発明の複合体は、その血清半減期が大きく延び、ＭＲＴが延び、及び／又は血清排除率が低減したので、多くの疾患の兆候を治療するために使用される無傷の抗体にとって代わり、このような複合体は実行可能となる。抗体断片は、無傷の抗体よりも顕著に有益であるが、とりわけ組換え体抗体断片は細菌性細胞発現系で作成可能であるとう事実においてそうである。細菌性細胞発現システムは、ほ乳類性細胞発現系に比べて有利な点をいくつか提供するが、これには研究開発、及び商品の製造段階の双方において時間とコストが低減されることが含まれる。
本発明はもう一つには、ＷＯ９５／２３８６５（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２５８９、１９９５年９月８日発行）に記載される、マウス抗−ウサギＩＬ−８モノクローナル抗体（”６Ｇ４．２．５”）のヒト化より起因しているが、特にこれに開示されている全てを参照することにより本願に組み込む。抗体６Ｇ４．２．５を産生するハイブリドーマは、１９９４年９月２８日にAmerican Type Culture Collectionに寄託され、下記の実施例に記載されているようにＡＴＣＣアクセス番号ＨＢ１１７２２が与えられている。本発明は一つには、ヒト化した６Ｇ４．２．５抗体の誘導体である、変異体１１（本願では”６Ｇ４．２．５ｖ１１”と呼ぶ）を提供するものであるが、これにおいては６Ｇ４．２．５のマウスＣＤＲが、ヒト軽鎖κＩ及びヒト重鎖サブグルーブＩＩＩのコンセンサスクレームワークにグラフトされていて、これに続いてマウス６Ｇ４．２．５の元の重鎖の可変領域の配列由来の３つのクレームワーク残基が、以下の実施例に記載されるように、ヒト鋳型配列における重鎖の可変領域の同等の部位に導入されている。本発明は別の点において、あるアミノ酸が置換され、ヒトＩＬ−８に対する親和性が増大し、及び／又は組換えによる製造プロセスの効率が大きくなった、６Ｇ４．２．５ｖ１１抗体の変異体を提供するものである。
このセクション（ＩＩ）及びその全てのサブセクションの内容においては、複合体に含まれる”抗体断片”又は”当該抗体断片”とは、複合体中の抗体断片の数がはっきりと示されていること以外において、複合体中の一以上の抗体断片を指すものと理解される（上のセクション（Ｉ）において明らかにされた”複合体”の定義と首尾一貫する）。このセクション（ＩＩ）及びその全てのサブセクションにおいて、複合体中の”ポリマー”、”ポリマー分子”、”当該ポリマー”、又は”当該ポリマー分子”とは、複合体ポリマー分子の数がはっきりと示されていること以外において、複合体中の一以上のポリマー性分子を指すものと理解される（上のセクション（Ｉ）に明らかにされている”複合体”の定義と首尾一貫する）。
１．有効サイズの大きい抗体断片−ポリマー複合体
本発明は一つにおいて、ポリマーに共有結合して少なくとも約５００，０００ダルトン（Ｄ）の有効サイズ又は見かけサイズを有する複合体を形成する抗体断片を提供するものである。本発明は別の点においては、ポリマーに共有結合して元の抗体断片の見かけサイズよりも少なくとも約８倍の見かけサイズを有する複合体を形成する抗体断片を提供するものである。本発明は更に別の点においては、分子量（Ｍ．Ｗ．）が少なくとも約２０，０００Ｄのポリマーに共有結合している抗体断片を提供するものである。予期せぬほどのまた驚くほどの、抗体断片の血清半減期の増大、ＭＲＴの増大、及び／又は血清排除率の低減は、有効サイズを少なくとも約５００，０００Ｄの複合体を提供するいかなるタイプのポリマー又はポリマー分子のいかなる個数を用いることにより、又は元の抗体断片の少なくとも約８倍の有効サイズを有する複合体を提供するいかなるタイプのポリマー又はポリマー分子のいかなる個数を用いることにより、又はそれぞれのポリマー分子がＭ．Ｗ．において少なくとも約２０，０００Ｄであるいかなるタイプのポリマー又はポリマー分子のいかなる個数により成し遂げられることが評価されるであろう。よって本発明は、いかなる特定のポリマーの使用や、複合体中の抗体断片に対するポリマーのモル比に依存するものではない。
付け加えると、本発明の利点は、抗原特異性のない抗体断片にまで拡張する。抗体間の変異は予期されるものであるが、ある抗体の抗原特異性は、本願で教示される抗体断片の誘導体化により得られるその抗体断片の血清半減期、ＭＲＴ、及び／又は血清排除率の異常な改善を実質的には害さないであろう。
一つの態様において、複合体は少なくとも約５００，０００Ｄ、少なくとも約８００，０００Ｄ、少なくとも約９００，０００Ｄ、少なくとも約１，０００，０００Ｄ、少なくとも約１，２００，０００Ｄ、少なくとも約１，４００，０００Ｄ、少なくとも１，５００，０００Ｄ、少なくとも約１，８００，０００Ｄ、少なくとも約２，０００，０００Ｄ、又は少なくとも約２，５００，０００Ｄの有効サイズを有する。
別の態様においては、複合体は５００，０００Ｄ若しくは約５００，０００Ｄ乃至１０，０００，０００Ｄ若しくは約１０，０００，０００Ｄの有効サイズ、５００，０００Ｄ若しくは約５００，０００Ｄ乃至８，０００，０００Ｄ若しくは約８，０００，０００Ｄの有効サイズ、５００，０００Ｄ若しくは約５００，０００Ｄ乃至５，０００，０００Ｄ若しくは約５，０００，０００Ｄの有効サイズ、５００，０００Ｄ若しくは約５００，０００Ｄ乃至４，０００，０００Ｄ若しくは約４，０００，０００Ｄの有効サイズ、５００，０００Ｄ若しくは約５００，０００Ｄ乃至３，０００，０００Ｄ若しくは約３，０００，０００Ｄの有効サイズ、５００，０００Ｄ若しくは約５００，０００Ｄ乃至２，５００，０００Ｄ若しくは約２，５００，０００Ｄの有効サイズ、５００，０００Ｄ若しくは約５００，０００Ｄ乃至２，０００，０００Ｄ若しくは約２，０００，０００Ｄの有効サイズ、５００，０００Ｄ若しくは約５００，０００Ｄ乃至１，８００，０００Ｄ若しくは約１，８００，０００Ｄの有効サイズ、５００，０００Ｄ若しくは約５００，０００Ｄ乃至１，６００，０００Ｄ若しくは約１，６００，０００Ｄの有効サイズ、５００，０００Ｄ若しくは約５００，０００Ｄ乃至１，５００，０００Ｄ若しくは約１，５００，０００Ｄの有効サイズ、あるいは５００，０００Ｄ若しくは約５００，０００Ｄ乃至１，０００，０００Ｄ若しくは約１，０００，０００Ｄの有効サイズを有する。
別の態様において、複合体は８００，０００Ｄ若しくは約８００，０００Ｄ乃至１０，０００，０００Ｄ若しくは約１０，０００，０００Ｄの有効サイズ、８００，０００Ｄ若しくは約８００，０００Ｄ乃至８，０００，０００Ｄ若しくは約８，０００，０００Ｄの有効サイズ、８００，０００Ｄ若しくは約８００，０００Ｄ乃至５，０００，０００Ｄ若しくは約５，０００，０００Ｄの有効サイズ、８００，０００Ｄ若しくは約８００，０００Ｄ乃至４，０００，０００Ｄ若しくは約４，０００，０００Ｄの有効サイズ、８００，０００Ｄ若しくは約８００，０００Ｄ乃至３，０００，０００Ｄ若しくは約３，０００，０００Ｄの有効サイズ、８００，０００Ｄ若しくは約８００，０００Ｄ乃至２，５００，０００Ｄ若しくは約２，５００，０００Ｄの有効サイズ、８００，０００Ｄ若しくは約８００，０００Ｄ乃至２，０００，０００Ｄ若しくは約２，０００，０００Ｄの有効サイズ、８００，０００Ｄ若しくは約８００，０００Ｄ乃至１，８００，０００Ｄ若しくは約１，８００，０００Ｄの有効サイズ、８００，０００Ｄ若しくは約８００，０００Ｄ乃至１，６００，０００Ｄ若しくは約１，６００，０００Ｄの有効サイズ、８００，０００Ｄ若しくは約８００，０００Ｄ乃至１，５００，０００Ｄ若しくは約１，５００，０００Ｄの有効サイズ、あるいは８００，０００Ｄ若しくは約８００，０００Ｄ乃至１，０００，０００Ｄ若しくは約１，０００，０００Ｄの有効サイズを有する。
別の態様において、複合体は９００，０００Ｄ若しくは約９００，０００Ｄ乃至１０，０００，０００Ｄ若しくは約１０，０００，０００Ｄの有効サイズ、９００，０００Ｄ若しくは約９００，０００Ｄ乃至８，０００，０００Ｄ若しくは約８，０００，０００Ｄの有効サイズ、９００，０００Ｄ若しくは約９００，０００Ｄ乃至５，０００，０００Ｄ若しくは約５，０００，０００Ｄの有効サイズ、９００，０００Ｄ若しくは約９００，０００Ｄ乃至４，０００，０００Ｄ若しくは約４，０００，０００Ｄの有効サイズ、９００，０００Ｄ若しくは約９００，０００Ｄ乃至３，０００，０００Ｄ若しくは約３，０００，０００Ｄの有効サイズ、９００，０００Ｄ若しくは約９００，０００Ｄ乃至２，５００，０００Ｄ若しくは約２，５００，０００Ｄの有効サイズ、９００，０００Ｄ若しくは約９００，０００Ｄ乃至２，０００，０００Ｄ若しくは約２，０００，０００Ｄの有効サイズ、９００，０００Ｄ若しくは約９００，０００Ｄ乃至１，８００，０００Ｄ若しくは約１，８００，０００Ｄの有効サイズ、９００，０００Ｄ若しくは約９００，０００Ｄ乃至１，６００，０００Ｄ若しくは約１，６００，０００Ｄの有効サイズ、あるいは９００，０００Ｄ若しくは約９００，０００Ｄ乃至１，５００，０００Ｄ若しくは約１，５００，０００Ｄの有効サイズを有する。
別の態様において、複合体は１，０００，０００Ｄ若しくは約１，０００，０００Ｄ乃至１０，０００，０００Ｄ若しくは約１０，０００，０００Ｄの有効サイズ、１，０００，０００Ｄ若しくは約１，０００，０００Ｄ乃至８，０００，０００Ｄ若しくは約８，０００，０００Ｄの有効サイズ、１，０００，０００Ｄ若しくは約１，０００，０００Ｄ乃至５，０００，０００Ｄ若しくは約５，０００，０００Ｄの有効サイズ、１，０００，０００Ｄ若しくは約１，０００，０００Ｄ乃至４，０００，０００Ｄ若しくは約４，０００，０００Ｄの有効サイズ、１，０００，０００Ｄ若しくは約１，０００，０００Ｄ乃至３，０００，０００Ｄ若しくは約３，０００，０００Ｄの有効サイズ、１，０００，０００Ｄ若しくは約１，０００，０００Ｄ乃至２，５００，０００Ｄ若しくは約２，５００，０００Ｄの有効サイズ、１，０００，０００Ｄ若しくは約１，０００，０００Ｄ乃至２，０００，０００Ｄ若しくは約２，０００，０００Ｄの有効サイズ、１，０００，０００Ｄ若しくは約１，０００，０００Ｄ乃至１，８００，０００Ｄ若しくは約１，８００，０００Ｄの有効サイズ、１，０００，０００Ｄ若しくは約１，０００，０００Ｄ乃至１，６００，０００Ｄ若しくは約１，６００，０００Ｄの有効サイズ、あるいは１，０００，０００Ｄ若しくは約１，０００，０００Ｄ乃至１，５００，０００Ｄ若しくは約１，５００，０００Ｄの有効サイズを有する。
更なる態様において、複合体は元の抗体断片の有効サイズと比較して、少なくとも約８倍大きい有効サイズ、少なくとも約１０倍大きい有効サイズ、少なくとも約１２倍大きい有効サイズ、少なくとも約１５倍大きい有効サイズ、少なくとも約１８倍大きい有効サイズ、少なくとも約２０倍大きい有効サイズ、少なくとも約２５倍大きい有効サイズ、少なくとも約２８倍大きい有効サイズ、少なくとも約３０倍大きい有効サイズ、あるいは少なくとも約４０倍大きい有効サイズを有する。
別の態様において、複合体は元の抗体断片の有効サイズと比較して、約８倍乃至約１００倍大きい有効サイズ、約８倍乃至約８０倍大きい有効サイズ、約８倍乃至約５０倍大きい有効サイズ、約８倍乃至約４０倍大きい有効サイズ、約８倍乃至約３０倍大きい有効サイズ、約８倍乃至約２８倍大きい有効サイズ、約８倍乃至約２５倍大きい有効サイズ、約８倍乃至約２０倍大きい有効サイズ、約８倍乃至約１８倍大きい有効サイズ、あるいは約８倍乃至約１５倍大きい有効サイズを有している。
別の態様において、複合体は元の抗体断片に比較して、約１２倍乃至約１００倍大きい有効サイズ、約１２倍乃至約８０倍大きい有効サイズ、約１２倍乃至約５０倍大きい有効サイズ、約１２倍乃至約４０倍大きい有効サイズ、約１２倍乃至約３０倍大きい有効サイズ、約１２倍乃至約２８倍大きい有効サイズ、約１２倍乃至約２５倍大きい有効サイズ、約１２倍乃至約２０倍大きい有効サイズ、あるいは約１２倍乃至約１８倍大きい有効サイズ、約１２倍乃至約１５倍大きい有効サイズを有している。
別の態様において、複合体は元の抗体断片と比較して、約１５倍乃至約１００倍大きい有効サイズ、約１５倍乃至約８０倍大きい有効サイズ、約１５倍乃至約５０倍大きい有効サイズ、約１５倍乃至約４０倍大きい有効サイズ、約１５倍乃至約３０倍大きい有効サイズ、約１５倍乃至約２８倍大きい有効サイズ、約１５倍乃至約２５倍大きい有効サイズ、約１５倍乃至約２０倍大きい有効サイズ、あるいは約１５倍乃至約１８倍大きい有効サイズを有している。
別の態様において、複合体は元の抗体断片に比較して、約１８倍乃至約１００倍大きい有効サイズ、約１８倍乃至約８０倍大きい有効サイズ、約１８倍乃至約５０倍大きい有効サイズ、約１８倍乃至約４０倍大きい有効サイズ、約１８倍乃至約３０倍大きい有効サイズ、約１８倍乃至約２８倍大きい有効サイズ、あるいは約１８倍乃至約２０倍大きい有効サイズを有している。
別の態様において、複合体は元の抗体断片に比較して、約２０倍乃至約１００倍大きい有効サイズ、約２０倍乃至約８０倍大きい有効サイズ、約２０倍乃至約５０倍大きい有効サイズ、約２０倍乃至約４０倍大きい有効サイズ、約２０倍乃至約３０倍大きい有効サイズ、約２０倍乃至約２８倍大きい有効サイズ、あるいは約２０倍乃至約２５倍大きい有効サイズを有している。
別の態様において、複合体は元の抗体断片に比較して、約２５倍乃至約１００倍大きい有効サイズ、約２５倍乃至約８０倍大きい有効サイズ、約２５倍乃至約５０倍大きい有効サイズ、約２５倍乃至約４０倍大きい有効サイズ、約２５倍乃至約３０倍大きい有効サイズ、あるいは約２５倍乃至約２８倍大きい有効サイズを有している。
別の態様において、複合体は元の抗体断片に比較して、約２８倍乃至約１００倍大きい有効サイズ、約２８倍乃至約８０倍大きい有効サイズ、約２８倍乃至約５０倍大きい有効サイズ、約２８倍乃至約４０倍大きい有効サイズ、あるいは約２８倍乃至約３０倍大きい有効サイズを有している。
別の態様において、複合体は元の抗体断片に比較して、約３０倍乃至約１００倍大きい有効サイズ、約３０倍乃至約８０倍大きい有効サイズ、約３０倍乃至約５０倍大きい有効サイズ、あるいは約３０倍乃至約４０倍大きい有効サイズを有している。
別の態様において、複合体は元の抗体断片に比較して、約４０倍乃至約１００倍大きい有効サイズ、約４０倍乃至約８０倍大きい有効サイズ、あるいは約４０倍乃至約５０倍大きい有効サイズを有している。
更に別の態様において複合体は、実際のＭＷが少なくとも約２０，０００Ｄである少なくとも一のポリマーに共有結合した抗体断片である。
更なる態様において複合体は、実際のＭＷが少なくとも約３０，０００Ｄである少なくとも一のポリマーに共有結合した抗体断片である。
更に別の態様において複合体は、実際のＭＷが少なくとも約４０，０００Ｄである少なくとも一のポリマーに共有結合した抗体断片である。
別の態様において複合体は、実際のＭＷが２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、あるいは４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄである少なくとも一のポリマーに共有結合した抗体断片である。
別の態様において複合体は、実際のＭＷが２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、あるいは４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄである少なくとも一のポリマーに共有結合した抗体断片である。
別の態様において複合体は、実際のＭＷが２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、あるいは４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄである少なくとも一のポリマーに共有結合した抗体断片である。
別の態様において複合体は、実際のＭＷが２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、あるいは４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄである少なくとも一のポリマーに共有結合した抗体断片である。
別の態様において複合体は、実際のＭＷが２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ、あるいは３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄである少なくとも一のポリマーに共有結合した抗体断片である。
本発明の複合体は、現在知られている、又は今後開発される、抗体断片をポリマーで誘導体化するいずれかの適切な技術を使用すれば作成することが可能である。本発明は抗体断片とポリマーとの間の何れかの特定タイプの連結を使用している複合体に限定されないことは理解されるであろう。
本発明の複合体には、ポリマーが元の抗体断片上の単一又は複数の非特異的部位に共有結合した種類を含むが、即ちポリマーの結合は元の抗体断片の特定の領域又は特定のアミノ酸残基に向けられているものではない。このような態様において、カップリングの化学は例えば、元の抗体中のリジン残基にあるフリーなエプシロンアミノ基をポリマーの結合部位として利用するが、そのようなリジン残基アミノ基はポリマーとランダムに誘導体化している。
更に本発明の複合体には、ポリマーが元の抗体断片上の単一又は複数の特定部位に共有結合した種類を含み、従ってポリマーの結合は元の抗体断片上の特定領域又は単一若しくは複数の特定アミノ酸残基に向けられている。このような態様においては、カップリングの化学は例えば、元の抗体断片のジスルフィド架橋には存在しないシステイン残基のフリーなスルフヒドリル基を利用する。一つの態様においては、ポリマー用の単一又は複数の特定結合部位を提供する目的で、一以上のシステイン残基を選択した単一又は複数の部位に導入する。ポリマーは、元の抗体断片上にあるフリーなスルフヒドリル基又はチオール基と特異的に反応することが可能な何れかの官能基、例えばマレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート（triflate）、テシレート（tesylate）、アジリジン、エキシラン（exirane）及び５−ピリジル等の官能基で活性化することが可能である。ポリマーは、選択するカップリング系の化学に適する何れかのプロトコール、例えば以下の実施例のセクション（ＩＩ）（１）（ｂ）又はセクション（Ｔ）に記載されるプロトコール及び系を使用して、元の抗体断片にカップリングさせることが可能である。
別の態様において、ポリマーの結合は元の抗体断片のヒンジ領域に向けられている。ヒンジ領域の位置は、元の抗体のアイソタイプに応じて変動する。典型的には、ＩｇＧ、ＩｇＤ、及びＩｇＡアイソタイプの重鎖のヒンジ領域は、ＣH１及びＣH２領域の間に伸びるプロリン豊富なペプチド配列中に含まれている。好ましい態様においては、ポリマーをヒンジ領域の選択位置に特異的にカップリングするように、単一又は複数のシステイン残基が元の抗体断片のヒンジ領域に組み込まれている。
一の側面において本発明は、複合体に対して本願で教示するような所望の範囲内で見かけのサイズを賦与する、いずれかのポリマー対抗体断片モル比率を有する複合体を含んでいる。複合体の見かけのサイズは、一部には使用するポリマーのサイズと形、使用する抗体断片のサイズと形、抗体断片に結合したポリマー分子の数、及び抗体断片内での結合部位の位置に依存するであろう。これらのパラメーターは、簡単に同定していかなるタイプの抗体断片、ポリマー及び結合システムに対しても所望の見かけサイズを有する複合体を得るのに最大化することが可能である。
別の側面において本発明は、約１０：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、又は約１：１のポリマー対抗体断片モル比率を越えない複合体を含んでいる。
更に別の側面において本発明は、抗体断片が約１０又はそれ未満のポリマー分子に結合していて、それぞれのポリマー分子が少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有している複合体を含んでいる。別の態様において、複合体は、約５又はそれ未満のポリマー分子に結合した抗体断片を含んでいて、それぞれのポリマー分子は、少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有している。更に別の態様において、複合体は約４又はそれ未満のポリマー分子に結合した抗体断片を含んでいて、それぞれのポリマー分子は、少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有している。更なる態様において、複合体は約３又はそれ未満のポリマー分子に結合した抗体断片を含んでいて、それぞれのポリマー分子は、少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有している。更なる態様においては、複合体は約２又はそれ未満のポリマー分子に結合した抗体断片を含んでいて、それぞれのポリマー分子は、少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有している。本願においては更に、単一のポリマー分子で少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有するものに結合した抗体断片を含む複合体を提供するものである。
更に別の側面において本発明は、複合体であってその中の全てのポリマー分子が、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量を有し、また当該複合体にはわずかに約１０のポリマー分子、わずかに約５のポリマー分子、わずかに約４のポリマー分子、わずかに約３のポリマー分子、わずかに約２のポリマー分子、又はわずかに約１のポリマー分子しか含まないものを含む。
更に別の側面において本発明は、複合体であってその内部のポリマー分子の全てが２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量を有し、また当該複合体にはわずかに約１０のポリマー分子、わずかに約５のポリマー分子、わずかに約４のポリマー分子、わずかに約３のポリマー分子、わずかに約２のポリマー分子、又はわずかに約１のポリマー分子しか含まないものを含む。
更に別の側面において本発明は、複合体であってその内部のポリマー分子の全てが２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量を有し、また当該複合体にはわずかに約１０のポリマー分子、わずかに約５のポリマー分子、わずかに約４のポリマー分子、わずかに約３のポリマー分子、わずかに約２のポリマー分子、又はわずかに約１のポリマー分子しか含まないものを含む。
更に別の側面において本発明は、複合体であってその内部のポリマー分子の全てが２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量を有し、また当該複合体にはわずかに約１０のポリマー分子、わずかに約５のポリマー分子、わずかに約４のポリマー分子、わずかに約３のポリマー分子、わずかに約２のポリマー分子、又はわずかに約１のポリマー分子しか含まないものを含む。
更に別の側面において本発明は、複合体であってその内部のポリマー分子の全てが２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ、又は３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量を有し、また当該複合体にはわずかに約１０のポリマー分子、わずかに約５のポリマー分子、わずかに約４のポリマー分子、わずかに約３のポリマー分子、わずかに約２のポリマー分子、又はわずかに約１のポリマー分子しか含まないものを含む。
何れの抗体断片の血清半減期、ＭＲＴ及び／又は血清排除率は、本願で教示されるポリマーで抗体断片を誘導体化することにより大きく改善することが可能であると考えられている。一の態様において、複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦ（ａｂ’）2からなる群より選択される抗体断片を含む。
好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含んでいて、この複合体中のポリマー分子の全てが抗体断片をヒンジ領域に結合している。
別の好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含んでいて、この複合体中のポリマー分子の全てが抗体断片のヒンジ領域に結合していて、この複合体にはわずかに約１０のポリマー分子、わずかに約５のポリマー分子、わずかに約４のポリマー分子、わずかに約３のポリマー分子、わずかに約２のポリマー分子、又はわずかに約１のポリマー分子しか含んでいない。
更に別の好ましい態様において複合体は、わずかに約２のポリマー分子に結合したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、ポリマー分子の全てが、通常は軽鎖と重鎖との間を連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、このジスルフィドブリッジはセリン等の他のアミノ酸で、反対側の鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
更なる態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含んでいて、この抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマーは通常は軽鎖と重鎖との間を連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジはセリン等の他のアミノ酸で、反対側の鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
更なる態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、当該複合体内のポリマー分子の全ては分子量が少なくとも約２０，０００Ｄ、分子量が少なくとも約３０，０００Ｄ、又は分子量が少なくとも約４０，０００Ｄであり、複合体内のポリマー分子の全てが抗体断片のヒンジ領域に結合していて、複合体にはわずかに約１０のポリマー分子、わずかに約５のポリマー分子、わずかに約４のポリマー分子、わずかに約３のポリマー分子、わずかに約２のポリマー分子、又はわずかに約１のポリマー分子しか含んでいない。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、当該複合体内のポリマー分子の全ては分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄであり、複合体内のポリマー分子の全てが抗体断片のヒンジ領域に結合していて、複合体にはわずかに約１０のポリマー分子、わずかに約５のポリマー分子、わずかに約４のポリマー分子、わずかに約３のポリマー分子、わずかに約２のポリマー分子、又はわずかに約１のポリマー分子しか含んでいない。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、当該複合体内のポリマー分子の全ては分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄであり、複合体内のポリマー分子の全てが抗体断片のヒンジ領域に結合していて、複合体にはわずかに約１０のポリマー分子、わずかに約５のポリマー分子、わずかに約４のポリマー分子、わずかに約３のポリマー分子、わずかに約２のポリマー分子、又はわずかに約１のポリマー分子しか含んでいない。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、当該複合体内のポリマー分子の全ては分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄであり、複合体内のポリマー分子の全てが抗体断片のヒンジ領域に結合していて、複合体にはわずかに約１０のポリマー分子、わずかに約５のポリマー分子、わずかに約４のポリマー分子、わずかに約３のポリマー分子、わずかに約２のポリマー分子、又はわずかに約１のポリマー分子しか含んでいない。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、当該複合体内のポリマー分子の全ては分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄであり、複合体内のポリマー分子の全てが抗体断片のヒンジ領域に結合していて、複合体にはわずかに約１０のポリマー分子、わずかに約５のポリマー分子、わずかに約４のポリマー分子、わずかに約３のポリマー分子、わずかに約２のポリマー分子、又はわずかに約１のポリマー分子しか含んでいない。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、当該複合体内のポリマー分子の全ては分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ、又は分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄであり、複合体内のポリマー分子の全てが抗体断片のヒンジ領域に結合していて、複合体にはわずかに約１０のポリマー分子、わずかに約５のポリマー分子、わずかに約４のポリマー分子、わずかに約３のポリマー分子、わずかに約２のポリマー分子、又はわずかに約１のポリマー分子しか含んでいない。
更なる態様において複合体は、わずかに約２のポリマー分子に結合したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、当該複合体内のポリマー分子の全ては、分子量が少なくとも約２０，０００Ｄ、分子量が少なくとも約３０，０００Ｄ、又は分子量が少なくとも約４０，０００Ｄであり、当該複合体内のポリマー分子の全ては、通常は軽鎖と重鎖とを連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で、反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
別の態様において複合体は、わずかに約２のポリマー分子に結合したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、当該複合体内のポリマー分子の全ては、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄであり、当該複合体内のポリマー分子の全ては、通常は軽鎖と重鎖とを連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で、反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
別の態様において複合体は、わずかに約２のポリマー分子に結合したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、当該複合体内のポリマー分子の全ては、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄであり、当該複合体内のポリマー分子の全ては、通常は軽鎖と重鎖とを連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で、反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
別の態様において複合体は、わずかに約２のポリマー分子に結合したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、当該複合体内のポリマー分子の全ては、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄであり、当該複合体内のポリマー分子の全ては、通常は軽鎖と重鎖とを連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で、反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
別の態様において複合体は、わずかに約２のポリマー分子に結合したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、当該複合体内のポリマー分子の全ては、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄであり、当該複合体内のポリマー分子の全ては、通常は軽鎖と重鎖とを連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で、反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
別の態様において複合体は、わずかに約２のポリマー分子に結合したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、当該複合体内のポリマー分子の全ては、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ、又は分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄであり、当該複合体内のポリマー分子の全ては、通常は軽鎖と重鎖とを連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で、反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
更に別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマー分子は、分子量が少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄであり、当該ポリマー分子は、通常は軽鎖と重鎖とを連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で、反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマー分子は分子量が、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄであり、当該ポリマー分子は、通常は軽鎖と重鎖とを連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で、反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマー分子は、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄであり、当該ポリマー分子は、通常は軽鎖と重鎖とを連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で、反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマー分子は、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄであり、当該ポリマー分子は、通常は軽鎖と重鎖とを連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で、反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマー分子は、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄであり、当該ポリマー分子は、通常は軽鎖と重鎖とを連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で、反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマー分子は、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ、又は分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄであり、当該ポリマー分子は、通常は軽鎖と重鎖とを連結するジスルフィドブリッジを形成する、抗体断片の軽鎖又は重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で、反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
更に別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマー分子は、分子量が少なくとも約２０，０００Ｄ、分子量が少なくとも約３０，０００Ｄ、又は分子量が少なくとも約４０，０００Ｄであり、当該ポリマー分子は抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマー分子は、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄであり、当該ポリマー分子が抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマー分子は、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄであり、当該ポリマー分子が抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマー分子は、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄであり、当該ポリマー分子が抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマー分子は、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、又は分子量が４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄであり、当該ポリマー分子が抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はわずかに１のポリマー分子に結合していて、当該ポリマー分子は、分子量が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ、又は分子量が３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄであり、当該ポリマー分子が抗体断片のヒンジ領域に結合している。
何れのタイプのポリマーも本発明の複合体の構築用に考慮され、これには以下のセクション（ＩＩ）（１）（ｂ）に記載されるポリマー及び化学結合システムが含まれるが、本願での使用においてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーが好ましい。
一の態様において複合体は、少なくとも約２０，０００Ｄの実際のＭＷを有する少なくとも一のＰＥＧに共有結合した抗体断片である。
別の態様において複合体は、少なくとも約３０，０００Ｄの実際のＭＷを有する少なくとも一のＰＥＧに共有結合した抗体断片である。
更に別の態様において複合体は、少なくとも約４０，０００Ｄの実際のＭＷを有する少なくとも一のＰＥＧに共有結合した抗体断片である。
別の態様において複合体は、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄ、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの実際のＭＷを有する少なくとも一のＰＥＧに共有結合した抗体断片である。
別の態様において複合体は、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄ、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの実際のＭＷを有する少なくとも一のＰＥＧに共有結合した抗体断片である。
別の態様において複合体は、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄ、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの実際のＭＷを有する少なくとも一のＰＥＧに共有結合した抗体断片である。
別の態様において複合体は、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄ、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの実際のＭＷを有する少なくとも一のＰＥＧに共有結合した抗体断片である。
別の態様において複合体は、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ、又は３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの実際のＭＷを有する少なくとも一のＰＥＧに共有結合した抗体断片である。
別の側面において本発明は、ＰＥＧ：抗体断片のモル比率がわずかに約１０：１、わずかに約５：１、わずかに約４：１、わずかに約３：１、わずかに約２：１、又はわずかに約１：１である複合体を含んでいる。
更に別の側面において本発明は、約１０以下のＰＥＧ分子に抗体断片が結合していて、それぞれのＰＥＧ分子が少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有する複合体を含んでいる。別の態様において複合体は、約５以下のＰＥＧ分子に結合していて、それぞれのＰＥＧ分子が少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有する抗体断片を含んでいる。更に別の態様において複合体は、約４以下のＰＥＧ分子に結合していて、それぞれのＰＥＧ分子が少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有する抗体断片を含んでいる。更なる態様において複合体は、約３以下のＰＥＧ分子に結合していて、それぞれのＰＥＧ分子が少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有する抗体断片を含んでいる。付加的な態様において複合体は、約２以下のＰＥＧ分子に結合していて、それぞれのＰＥＧ分子が少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有する抗体断片を含んでいる。本願では更に、少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有する、単一のＰＥＧ分子に結合している抗体断片を提供する。
別の側面において本発明は、抗体断片がＰＥＧで誘導体化されていて、複合体中の全てのＰＥＧ分子が、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量を有し、またわずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含む複合体を含んでいる。
別の側面において本発明は、抗体断片がＰＥＧで誘導体化されていて、複合体中の全てのＰＥＧ分子が、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量を有し、またわずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含む複合体を含んでいる。
別の側面において本発明は、抗体断片がＰＥＧで誘導体化されていて、複合体中の全てのＰＥＧ分子が、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量を有し、またわずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含む複合体を含んでいる。
別の側面において本発明は、抗体断片がＰＥＧで誘導体化されていて、複合体中の全てのＰＥＧ分子が、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量を有し、またわずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含む複合体を含んでいる。
別の側面において本発明は、抗体断片がＰＥＧで誘導体化されていて、複合体中の全てのＰＥＧ分子が、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量、又は３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量を有し、またわずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含む複合体を含んでいる。
更に別の側面において本発明は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ及びＦ（ａｂ’）2からなる群より選択される抗体断片を含む複合体であって、抗体断片が約１０以下のＰＥＧ分子に結合していて、それぞれのＰＥＧが少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有するものを含んでいる。別の態様において前記の複合体は、約５以下のＰＥＧ分子に結合している抗体断片を含んでいて、複合体中のそれぞれのＰＥＧ分子は少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有している。更に別の態様において前記の複合体は、約４以下のＰＥＧ分子に結合している抗体断片を含んでいて、それぞれのＰＥＧ分子は少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有している。更なる態様において前記の複合体は、約３以下のＰＥＧ分子に結合している抗体断片を含んでいて、それぞれのＰＥＧ分子は少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有している。付加的な態様において前記の複合体は、約２以下のＰＥＧ分子に結合している抗体断片を含んでいて、それぞれのＰＥＧ分子は少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有している。本願では更に、単一のＰＥＧ分子に結合している抗体断片を含み、それぞれのＰＥＧ分子が少なくとも約２０，０００Ｄ、少なくとも約３０，０００Ｄ、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有しているものを提供する。
別の側面において本発明は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ及びＦ（ａｂ’）2からなる群より選択される抗体断片を含む複合体であって、抗体断片がＰＥＧで誘導体化されていて、複合体中のそれぞれのＰＥＧ分子が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量であり、わずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含む複合体が含まれている。
別の側面において本発明は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ及びＦ（ａｂ’）2からなる群より選択される抗体断片を含む複合体であって、抗体断片がＰＥＧで誘導体化されていて、複合体中のそれぞれのＰＥＧ分子が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量であり、わずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含む複合体が含まれている。
別の側面において本発明は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ及びＦ（ａｂ’）2からなる群より選択される抗体断片を含む複合体であって、抗体断片がＰＥＧで誘導体化されていて、複合体中のそれぞれのＰＥＧ分子が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量であり、わずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含む複合体が含まれている。
別の側面において本発明は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ及びＦ（ａｂ’）2からなる群より選択される抗体断片を含む複合体であって、抗体断片がＰＥＧで誘導体化されていて、複合体中のそれぞれのＰＥＧ分子が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量であり、わずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含む複合体が含まれている。
別の側面において本発明は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ及びＦ（ａｂ’）2からなる群より選択される抗体断片を含む複合体であって、抗体断片がＰＥＧで誘導体化されていて、複合体中のそれぞれのＰＥＧ分子が２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量、又は３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量であり、わずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含む複合体が含まれている。
好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片は少なくとも約２０，０００Ｄの分子量、少なくとも約３０，０００Ｄの分子量、又は少なくとも約４０．０００Ｄの分子量を有するＰＥＧで誘導体化されていて、複合体中のＰＥＧ分子の全ては、抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片は２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量を有するＰＥＧで誘導体化され、複合体中のＰＥＧ分子の全ては、抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片は２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量を有するＰＥＧで誘導体化され、複合体中のＰＥＧ分子の全ては、抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片は２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量を有するＰＥＧで誘導体化され、複合体中のＰＥＧ分子の全ては、抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片は２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量を有するＰＥＧで誘導体化され、複合体中のＰＥＧ分子の全ては、抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片は２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量、又は３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量を有するＰＥＧで誘導体化され、複合体中のＰＥＧ分子の全ては、抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はＰＥＧで誘導体化され、複合体中のＰＥＧ分子の全ては少なくとも約２０，０００Ｄの分子量、少なくとも約３０，０００Ｄの分子量、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量であり、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては抗体断片のヒンジ領域に結合していて、また複合体はわずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含んでいる。
別の好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はＰＥＧで誘導体化され、複合体中のＰＥＧ分子の全ては２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量であり、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては抗体断片のヒンジ領域に結合していて、また複合体はわずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含んでいる。
別の好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はＰＥＧで誘導体化され、複合体中のＰＥＧ分子の全ては２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量であり、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては抗体断片のヒンジ領域に結合していて、また複合体はわずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含んでいる。
別の好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はＰＥＧで誘導体化され、複合体中のＰＥＧ分子の全ては２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００の分子量であり、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては抗体断片のヒンジ領域に結合していて、また複合体はわずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含んでいる。
別の好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はＰＥＧで誘導体化され、複合体中のＰＥＧ分子の全ては２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量であり、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては抗体断片のヒンジ領域に結合していて、また複合体はわずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含んでいる。
別の好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、抗体断片はＰＥＧで誘導体化され、複合体中のＰＥＧ分子の全ては２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量、又は３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量であり、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては抗体断片のヒンジ領域に結合していて、また複合体はわずかに約１０のＰＥＧ分子、わずかに約５のＰＥＧ分子、わずかに約４のＰＥＧ分子、わずかに約３のＰＥＧ分子、わずかに約２のＰＥＧ分子、又はわずかに１のＰＥＧ分子を含んでいる。
更なる好ましい別の態様において複合体はＰＥＧで誘導体化したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては少なくとも約２０，０００Ｄの分子量、少なくとも約３０，０００Ｄの分子量、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有し、抗体断片はわずかに約２のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子の全ては、通常は軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドブリッジを形成している、抗体断片の軽鎖及び重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
好ましい別の態様において複合体は、ＰＥＧで誘導体化したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量を有し、抗体断片はわずかに約２のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子の全ては、通常は軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドブリッジを形成している、抗体断片の軽鎖及び重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
好ましい別の態様において複合体は、ＰＥＧで誘導体化したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量を有し、抗体断片はわずかに約２のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子の全ては、通常は軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドブリッジを形成している、抗体断片の軽鎖及び重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
好ましい別の態様において複合体は、ＰＥＧで誘導体化したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量を有し、抗体断片はわずかに約２のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子の全ては、通常は軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドブリッジを形成している、抗体断片の軽鎖及び重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
好ましい別の態様において複合体は、ＰＥＧで誘導体化したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量を有し、抗体断片はわずかに約２のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子の全ては、通常は軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドブリッジを形成している、抗体断片の軽鎖及び重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
好ましい別の態様において複合体は、ＰＥＧで誘導体化したＦ（ａｂ’）2抗体断片を含み、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量、又は３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量を有し、抗体断片はわずかに約２のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子の全ては、通常は軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドブリッジを形成している、抗体断片の軽鎖及び重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
更に好ましい別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、当該抗体断片はＰＥＧで誘導体化され、当該複合体中のＰＥＧ分子の全ては、少なくとも約２０，０００Ｄの分子量、少なくとも約３０，０００Ｄの分子量、又は少なくとも約４０，０００Ｄの分子量を有し、抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子は、通常は軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドブリッジを形成している、抗体断片の軽鎖及び重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
好ましい別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、当該抗体断片はＰＥＧで誘導体化され、複合体中の全てのＰＥＧ分子が、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量を有し、抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子は、通常は軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドブリッジを形成している、抗体断片の軽鎖及び重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
好ましい別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、当該抗体断片はＰＥＧで誘導体化され、複合体中の全てのＰＥＧ分子が、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量を有し、抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子は、通常は軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドブリッジを形成している、抗体断片の軽鎖及び重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
好ましい別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、当該抗体断片はＰＥＧで誘導体化され、複合体中の全てのＰＥＧ分子が、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量を有し、抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子は、通常は軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドブリッジを形成している、抗体断片の軽鎖及び重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
好ましい別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、当該抗体断片はＰＥＧで誘導体化され、複合体中の全てのＰＥＧ分子が、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量、３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量、又は４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量を有し、抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子は、通常は軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドブリッジを形成している、抗体断片の軽鎖及び重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
好ましい別の態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含み、当該抗体断片はＰＥＧで誘導体化され、複合体中の全てのＰＥＧ分子が、２０，０００Ｄ若しくは約２０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量、又は３０，０００Ｄ若しくは約３０，０００Ｄ乃至４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄの分子量を有し、抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子は、通常は軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドブリッジを形成している、抗体断片の軽鎖及び重鎖内のシステイン残基に結合していて、当該ジスルフィドブリッジは、セリン等の別のアミノ酸で反対鎖の対応するシステイン残基を置換することにより避けられている。
ＰＥＧポリマーを利用した本発明の上記した全ての態様には、ＰＥＧポリマーが直鎖又は枝分かれしたものである複合体が含まれることが評価されるであろう。好ましい態様において複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含んでいて、抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子は枝分かれしていて少なくとも約４０，０００Ｄの分子量である。特に驚くべき、また予期しなかったこととしては、本発明者らは上述の複合体は、以下の実施例Ｘに示されるように、完全長のものに近い血清半減期、ＭＲＴ及び血清除去率を示すことを発見したことである。
別の好ましい態様において、複合体はＦａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含んでいて、抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子は枝分かれしていて、且つ４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量を有している。
別の好ましい態様において、複合体はＦａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含んでいて、抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子は枝分かれしていて、且つ４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量を有している。
別の好ましい態様において、複合体はＦａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含んでいて、抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子は枝分かれしていて、且つ４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量を有している。
別の好ましい態様において、複合体はＦａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含んでいて、抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合していて、ＰＥＧ分子は枝分かれしていて、且つ４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量を有している。
別の好ましい態様において本発明は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含む複合体を提供するが、ここで抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合し、ＰＥＧ分子は枝分かれしていて且つ少なくとも４０，０００Ｄの分子量であり、ＰＥＧ分子は抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の好ましい態様において本発明は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含む複合体を提供するが、ここで抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合し、ＰＥＧ分子は枝分かれしていて且つ４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至３００，０００Ｄ若しくは約３００，０００Ｄの分子量を有し、ＰＥＧ分子は抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の好ましい態様において本発明は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含む複合体を提供するが、ここで抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合し、ＰＥＧ分子は枝分かれしていて且つ４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至１００，０００Ｄ若しくは約１００，０００Ｄの分子量を有し、ＰＥＧ分子は抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の好ましい態様において本発明は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含む複合体を提供するが、ここで抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合し、ＰＥＧ分子は枝分かれしていて且つ４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至７０，０００Ｄ若しくは約７０，０００Ｄの分子量を有し、ＰＥＧ分子は抗体断片のヒンジ領域に結合している。
別の好ましい態様において本発明は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ’−ＳＨからなる群より選択される抗体断片を含む複合体を提供するが、ここで抗体断片はわずかに１のＰＥＧ分子に結合し、ＰＥＧ分子は枝分かれしていて且つ４０，０００Ｄ若しくは約４０，０００Ｄ乃至５０，０００Ｄ若しくは約５０，０００Ｄの分子量を有し、ＰＥＧ分子は抗体断片のヒンジ領域に結合している。
一の側面において本発明は、わずかに１の抗体断片を含む、上記の何れの抗体断片をも提供する。更に本願では、例えばポリマー分子でともに共有結合している二以上の抗体断片を含む複合体等の、一以上のポリマー分子に共有結合した一以上の抗体断片を含む、上記の何れの複合体も提供される。一の態様において、ポリマー分子は二つの抗体断片をともに結合して亜鈴型構造を形成するのに使用される。本願に含まれるものとしては更に、ポリマー分子で連結してロゼット型又は他の型を形成する二以上の抗体断片により形成される複合体がある。このような構造の抗体断片は、同じ又は異なった断片タイプのものでもよく、同じ抗原特異性を有することも、異なる抗原特異性を有することも可能である。このような構造は、直接的な結合を許容するマルチな官能基で誘導体化したポリマー分子により、又は二、又は多官能性のリンカーによる二以上の抗体断片のポリマー骨格への結合により作成することができる。
別の側面において本発明は、ウサギＩＬ−８及び／又はヒトＩＬ−８に結合する抗原認識部位を具備した抗体断片を利用した、上記の何れの複合体をも含んでいる。更に別の側面において本発明は、以下に定義する６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａ又は６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを具備した抗体断片を利用した、上記の何れの複合体をも含んでいる。更に別の側面において本発明は、以下に定義する６Ｇ４．５．２．５ＨＶ１１を具備した抗体断片を利用した、上記の何れの複合体をも含んでいる。更なる側面において本発明は、以下に定義するｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａ又はｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを具備した抗体断片を利用した、上記の何れの複合体をも含んでいる。付加的な側面として本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶを具備する抗体断片を利用した、上記の何れの複合体をも含んでいる。更に本願は、６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａ又は６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを具備し、更に以下に定義する６Ｇ４．２．５ＨＶのＣＤＲを具備した抗体断片を利用した、上記の何れの複合体をも含んでいる。更に本願は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａ又はｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを具備し、更に以下に定義するｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶを具備する抗体断片を利用した、上記の何れの複合体をも含んでいる。更には本願は、以下に定義する６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ又は６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｅを具備する抗体断片を利用した、上記の何れの複合体をも含んでいる。更に本願は、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ又は６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｅ、及び以下に定義する６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を更に具備する抗体断片を利用した、上記の何れの複合体をも含んでいる。
ａ．抗体フラグメントの産生
抗体フラグメントは、当該技術分野において知られたいずれかの方法によって産生されうる。一般的に、抗体フラグメントは親の完全な抗体から誘導される。親抗体は、多数の部位に、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）／トレハロースジクリノミコラート（ＴＤＭ）（Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT）のようなアジュバントと抗原の多数の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注入によって所望の抗原に対するポリクローナル血清を生じさせることによって産生されうる。二週間後にその動物がブーストされる。７から１４日後、この動物から採血し、血清が抗抗原力価についてアッセイされる。力価がプラトーになるまでブーストされる。血清は動物から採取され、ポリクローナル抗体は、プロテインＡ−セファロースクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過、透析、または抗原親和性クロマトグラフィーのような従来のイムノグロブリン精製工程によって、血清から単離される。所望の抗体フラグメントは、従来の酵素学的方法によって精製されたポリクローナル抗体調製物から産生されうる。例えば、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは完全な抗体のペプシン切断によって産生され、かつＦａｂフラグメントはパパインで完全抗体を簡単に切断することによって産生される。
あるいは、抗体フラグメントは所望の抗原に対して産生されたモノクローナル抗体から誘導される。モノクローナル抗体は、Kohlerら，Nature,256:495（1975）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて調製されてもよく、また、組み換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）によって調製されてもよい。
ハイブリドーマ法では、免疫に用いられたタンパクに特異的に結合する抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を誘導するために、マウス、あるいはハムスターまたはマカクザルのような別の適切な宿主動物が上述したように免疫される。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫されてもよい。次いで、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いて、リンパ球がミエローマ細胞と融合される（Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103（Academic Press,1986））。
かくして調製されたハイブリドーマ細胞は、未融合の、親ミエローマ細胞の成長または生存を阻害する一つ以上の物質を好ましくは含む適切な培養培地中に蒔かれ、かつ生育させられる。例えば、もし親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いているなら、通常はハイブリドーマの培養培地は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の生育を阻害するヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むだろう（ＨＡＴ培地）。
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定で高レベルの産生を支持し、かつＨＡＴ培地のような培地に敏感なものである。これらの中では、好ましいミエローマ細胞ラインは、the Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USAから入手できるＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍から誘導されたもの、およびthe American Type Culture Collection,Rockville,Maryland USAから入手できるＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞のような、マウスミエローマ系である。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Kozbor,J.Immunol.,133:3001（1984）;Brodeurら，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63（Marcel Dekker,Inc.,New York,1987））。
ハイブリドーマ細胞が生育する培養培地は、抗原に向けられたモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性が、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイまたは免疫沈降法によって調べられる。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonら，Anal.Biochem.,107:220（1989）のスキャッチャード分析によって調べられる。
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後で、クローンは制限的な希釈方法でサブクローンされ、標準的な方法で生育されてもよい（Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103（Academic Press,1986））。この目的に適した培養培地は、例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで生育されてもよい。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーのような慣例的なイムノグロブリン精製方法によって、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣例的な方法を用いて容易に単離および配列決定される（例えば、モノクローナル抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合しうるオリゴヌクレオチドプローブを使用）。ハイブリドーマ細胞は、ＤＮＡの好ましい起源として役立つ。単離後、ＤＮＡは発現ベクターに写されてもよく、次いで、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得るために、イムノグロブリンタンパクを他に産生しないE.coli細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現に関する論評は、Skerraら，Curr.Opinion in Immunol.,5:256（1993）およびPluckthun,Immunol.Revs.,130:151（1992）を含む。
好ましい実施態様では、抗体断片はヒト化抗体から誘導される。非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、ヒト以外の起源から導入された一つ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒト以外のアミノ酸残基は、しばしば“インポート”残基と呼ばれ、通常は“インポート”可変ドメインから得られる。ここに記載されているように提供された、あらゆる非ヒト動物ファージディスプレイライブラリー誘導Ｆｖクローンまたはあらゆる非ヒト動物ハイブリドーマ誘導抗体クローンから得られた種々のドメイン配列が、本発明のヒト化抗体の構成物において用いられた“インポート”可変ドメインとして役立つことが認められるだろう。ヒト化は、齧歯動物等の非ヒト動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列に置き換えることによって、Winterと共同研究者の方法（Jonesら，Nature,321:522（1986）;Riechmannら，Nature,332:323（1988）;Verhoeyenら，Science,239:1534（1988））に従って本質的に実施されうる。従って、このような“ヒト化”抗体は、実質的により少ない完全なヒト可変ドメインがヒト以外の種の対応する配列によって置換された、キメラ抗体（Cabinyら，上掲）である。実際に、ヒト化抗体は、一般的には、あるＣＤＲ残基およびおそらくあるＦＲ残基が、例えば齧歯類のようなヒト以外の動物の抗体の類似部位の残基によって置換されたヒト抗体である。
ヒト化抗体の調製に用いられる、軽重両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するのに非常に重要である。いわゆる“最適”方法によれば、例えば齧歯類等のヒト以外の動物の抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリーに対してスクリーンされる。ヒト以外の動物の配列に最も近いヒトの配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められる（Simsら，J.Immunol.,151:2296（1993）;Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901（1987））。別の方法は、特定のサブグループ軽鎖または重鎖の全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導された特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークはいくつかの種々のヒト化抗体に使用されうる（Carterら，Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:4285（1992）;Prestaら，J.Immunol.,151:2623（1993））。
抗体が抗原に対して高い親和性および別の好適な生物学的特性を保持するようにヒト化されることも重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体が、親およびヒト化された配列の三次元モデルを用いて、種々の概念上のヒト化産物および親配列の分析の工程によって調製される。三次元イムノグロブリンモデルは、一般に利用され、当業者に周知である。選択された候補イムノグロブリン配列の可能性のある三次元コンホメーショナル構造を例示および表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示の閲覧は、候補イムノグロブリン配列の機能化における残基の有望な役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補イムノグロブリンの能力に影響する残基の分析を可能にする。このように、ＦＲ残基は、標的抗原に対する親和性の増加のような所望の抗体特性が達成されるように、コンセンサスおよび重要な配列から選択または組み合わせられる。一般に、ＣＤＲ残基は、増大する抗原結合に直接的かつ殆ど実質的に含まれる。
さらに、ここで使用する抗体フラグメントは、ヒトモノクローナル抗体から誘導することができる。関心の向けられた抗原に対するヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって調製されうる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞ラインは、例えばKozbor J.Immunol.,133:3001（1984）;Brodeurら，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp51-63（Marcel Dekker,Inc.,New York,1987）;およびBoernerら，J.Immunol.,147:86（1991）に記載されている。
免疫化により、内因性イムノグロブリン産生の不在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を産生することが可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異体マウスの抗体重鎖接続領域（ＪＨ）のホモ接合欠失が内因性抗体産生の完全な阻害を引き起こすことが記載されている。生殖細胞系変異体マウスにおけるヒト生殖細胞系イムノグロブリン遺伝子アレイの転移が、抗原チャレンジによりヒト抗体の産生を生じる。例えば、Jakobovitsら，Proc.Natl.Acad.Sci USA,90:2551（1993）;Jakobovitsら，Nature,362:255（1993）;Bruggermannら，Year in Immunol.7:3（1993）を参照。
あるいは、ファージディスプレイ技術（McCaffertyら，Nature 348:552（1990））は、免疫されていないドナーのイムノグロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロにおいてヒト抗体および抗体フラグメントを産生するために用いることができる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄのような糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームにクローン化され、ファージ粒子の表面に機能的抗体フラグメントとして提示される。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的特徴に基づく選別は、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選別も生じる。かくして、ファージは、Ｂ細胞のある特徴をまねる。ファージディスプレイは、種々のフォーマットで行うことができ、その論評については例えばJohnsonら，Current Opinion in Structural Biology 3:564（1993）を参照。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの起源がファージディスプレイに使用することができる。Clacksonら，Nature 352:624（1991）は、免疫されたマウスの脾臓から誘導されたＶ遺伝子の小ランダム組み合わせライブラリーから種々のアレイの抗オキサゾロン抗体を単離した。免疫されていないヒトのドナーのＶ遺伝子のレパートリーを構成し、種々のアレイの抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、Marksら，J.Mol.Biol.222:581（1991）またはGriffithら，EMBO J.12:725（1993）によって記載された技術に本質的に従って単離することができる。
天然の免疫応答において、抗体遺伝子は高い比率で変異を蓄積する（身体のハイパーミューテーション）。誘導されたいくつかの変化は高い親和性を付与し、高親和性表面イムノグロブリンを提示するＢ細胞は、その後の抗原チャレンジの際に選択的に複製および分化される。この天然方法は、“チェーンシャフリング”として知られる技術を用いてまねることができる（Marksら，Bio/Technol.10:779（1992））。この方法において、ファージディスプレイによって得られた“主要な”ヒト抗体の親和性は、免疫されていないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に生じる変異体（レパートリー）のレパートリーを用いて、重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を逐次置換することによって改良することができる。この技術は、ｎＭのレンジで親和性を備えた抗体および抗体フラグメントの産生を可能にする。非常に大きなファージ抗体レパートリーを作製する方法が、Waterhouseら，Nucl.Acids Res.21:2265（1993）によって記載されている。
遺伝子シャフリングは、例えば齧歯類のようなヒト以外の抗体からヒト抗体を誘導するためにも使用することができ、ヒト抗体は、最初のヒト以外の抗体に似た親和性および特異性を有する。“エピトープインプリンティング”とも呼ばれるこの方法に従えば、上述したファージディスプレイ技術によって得られた非ヒト抗体フラグメントの重鎖または軽鎖可変領域がヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換され、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖまたはＦａｂキメラの集団を形成する。抗原を用いた選別により、ヒト鎖が主なファージディスプレイクローンにおける対応する非ヒト鎖の除去の際に破壊された抗原結合部位を修復する、すなわちエピトープがヒト鎖パートナーの選択を決定（刻印づけ）する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖまたはＦａｂが単離される。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの方法が繰り返されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ  ＷＯ９３／０６２１３を参照）。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の慣例的なヒト化とは違って、この技術は、非ヒト由来のＦＲまたはＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体を提供する。
本発明は、少なくとも二つの異なる抗原に対する特異性を備えた二重特異的（bispecific）およびヘテロ共役的（heteroconjugate）抗体フラグメントの使用も含む。二重特異的およびヘテロ共役的抗体は、全長の抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2二重特異的抗体フラグメント）として調製することができる。二価以上を有する抗体フラグメント（例えば、３価以上の抗体フラグメント）もここでの使用が考えられる。二重特異的抗体、ヘテロ共役抗体、および多価抗体は、以下のセクション（II）（３）（Ｃ）に記載されているように調製することができる。
上述したように、関心の向けられたモノクローナル抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡは、起源のハイブリドーマまたはファージディスプレイクローンから単離され、次いで、ヒト化および／または親和性が発達した構成物を形成するために操作される。さらに、例えば、重鎖のヒンジ領域のシステイン残基のような、抗体フラグメントのポリペプチドバックボーンの所望の位置にアミノ酸残基を導入するために、既知の技術を用いることができ、それによってポリマー分子の特異的付着のための部位を提供する。ある実施態様では、軽鎖および重鎖を連結するジスルフィド結合を通常形成する抗体フラグメントの軽鎖または重鎖の天然システイン残基が、ポリマー分子の特異的付着のために遊離したスルフヒドリルを備えた反対の鎖におけるパートナーシステイン残基を残すために、セリンのような別のアミノ酸で置換される。
クローンをコードする所望の抗体または抗体フラグメントの構築により、クローンは、以下のセクション（II）（４）に記載したような抗体フラグメントの組み換え産生のために使用することができる。最後に、抗体または抗体フラグメント産物は、宿主細胞培養物から回収され、以下のセクション（II）（４）（Ｆ）に記載したように精製することができる。上述したような軽鎖と重鎖との間のジスルフィド架橋を通常形成するシステイン残基を欠如するように操作された抗体フラグメントを利用する実施態様の場合、好ましい組み換え産生システムは、細菌発現および、以下の実施例Ｔの“選択的Ｆａｂ’−ＳＨ精製”のセクションに記載された低ｐＨ浸透圧衝撃法を利用した産物回収方法を含む。もし全長の抗体が産生されれば、所望の抗体フラグメントは、それから、例えば以下のセクション（II）（４）（Ｇ）に記載されたような既知の方法に従って、完全な抗体を酵素分解に曝すことにより得られる。
ｂ．抗体フラグメント−ポリマー複合体の作製
本発明の抗体フラグメント−ポリマー複合体は、不活性ポリマーを備えた所望の抗体フラグメントを誘導することによって形成することができる。所望の見かけの大きさを備えた複合体を提供するか、あるいはここで教示したような選択された実際のＭＷを備えたあらゆる不活性ポリマーが、本発明の抗体フラグメント−ポリマー複合体を構成する際の使用に適していることが認められるだろう。
多くの不活性ポリマーが、薬剤における使用に適している。例えば、Davisら，Biomedical Polymers:Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use,pp.441-451（1980）を参照。本発明の全ての実施態様において、非タンパク様ポリマーが用いられる。通常、非タンパク様ポリマーは、親水性合成ポリマー、すなわち天然には見出されないポリマーである。しかしながら、天然源から単離されたポリマーのように、天然に存在し、組み換えまたはインビトロの方法によって産生されるポリマーも使用できる。例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンのような、親水性ポリビニルポリマーは本発明の範囲内に含まれる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリアルキレンエーテル；ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックコポリマー（プルロニクス（Pluronics））のようなポリオキシアルキレン；ポリメタクリラート；カーボマー；サッカリドモノマーＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアリン酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸、またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースおよびノイラミン酸を含む分枝状または分枝状でないポリサッカリドであって、ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルスターチ、アミロース、デキストランスルファート、デキストラン、デキストリン、グリコーゲンまたは例えば、ヒアルロン酸のような酸性粘液多糖類のポリサッカリドサブユニットのようなホモポリサッカリドおよびヘテロポリサッカリドを含むもの；ポリソルビトールおよびポリマンニトールのような糖アルコールのポリマー；ヘパリンまたはヘパロンが特に有益である。架橋結合前のポリマーは、水溶性であることが好ましいが、必ずしもその必要はないが、最終的な複合体は水溶性でなければならない。好ましくは、複合体は、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌの水溶性を示し、さらに好ましくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは少なくとも約１ｇｍ／ｍｌの水溶性を示す。さらに、ポリマーは、複合体形態で高度に免疫原性であるべきではなく、また、もしその複合体が静脈への輸液または注入といった経路で投与されることが意図されるならば、そのような経路に合わないような粘度を備えるべきではない。
ある実施態様においては、このポリマーは、唯一の反応基を含む。これは、タンパク分子の架橋結合の回避を助ける。しかしながら、架橋結合を還元する反応条件を最大化すること、あるいは実質的に均質な誘導体を回収するために、ゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィーを介して反応産物を精製することは、ここの範囲内に含まれる。別の実施態様では、ポリマーが、多価抗体フラグメントをポリマーバックボーンに結合する目的で二つ以上の反応基を含む。さらに、ゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィーは、実質的に均質な形態の所望の誘導体を回収するために使用することができる。
ポリマーの分子量は、約５０００００Ｄまでの範囲とすることができ、好ましくは少なくとも約２００００Ｄ、少なくとも約３００００Ｄ、少なくとも約４００００Ｄである。選択された分子量は、達成される複合体の有効サイズ、ポリマーの性質（例えば、直鎖状または分枝状のような構造）、および誘導の程度、すなわち抗体フラグメント当たりのポリマー分子の数、並びに抗体フラグメントにおけるポリマー付着部位に依存しうる。
このポリマーは、このポリマーと、結合される抗体フラグメントの一つ以上のアミノ酸残基とを反応させる多機能架橋結合剤を介して抗体フラグメントに共有結合されうる。しかしながら、誘導されたポリマーを抗体フラグメントと反応させることによりポリマーを直接架橋すること、またはその逆も本発明の範囲内である。
抗体フラグメントの共有架橋結合部位は、Ｎ末端アミノ基およびリジン残基に見出されるエプシロンアミノ基、別のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたは別の親水性の基を含む。ポリマーは、多機能（通常は二官能性）架橋結合剤の使用をすることなく抗体フラグメントに直接共有結合されてもよい。アミノ基に対する共有結合は、シアヌル酸塩化物、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応基（ＰＥＧアルコキシドとブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧとＤＭＳＯおよび無水酢酸、またはＰＥＧ塩化物と４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、活性化スクシニミジルエステル、活性化ジチオカルボナートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホルマートまたはＰ−ニトロフェニルクロロホルマート活性化ＰＥＧ）に基づく既知の化学によって達成される。カルボキシル基はカルボジイミドを用いてＰＥＧ−アミンをカップリングすることによって誘導される。スルフヒドリル基は、１９９７年３月２７日に公開されたＷＯ９７／１０８４７に記載されているようなマレイミド置換ＰＥＧ（例えば、アルコキシ−ＰＥＧアミンとスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート）、または、Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,ALから商業的に入手可能なＰＥＧ−マレイミドにカップリングすることによって誘導される。あるいは、抗体フラグメントの遊離のアミノ基（例えば、リジン残基のエプシロンアミノ基）は２−イミノ−チオラン（Traut’s試薬）を用いてチオール化され（thiolated）、次いで、Pedleyら，Br.J.Cancer,70:1126-1130（1994）に記載されているようにＰＥＧの誘導体を含むマレイミドに結合される。
ポリマーは、アミノ酸側鎖、結合したポリペプチドのアミノ酸側鎖、Ｎ末端またはＣ末端と直接反応するか、多機能架橋結合剤と反応する基を備える。一般的に、このような反応基を有するポリマーは、固定化されたタンパクの調製について知られている。このような化学を用いるためには、今までタンパクの固定化に用いられてきた不溶性ポリマーと同じ形式で誘導された水溶性ポリマーを用いるべきである。臭化シアン活性化は、架橋結合ポリサッカリドにおいて用いるのに特に有益な方法である。
最初のポリマーに関して“水溶性”であるとは、複合体に用いられたポリマーまたはその反応性中間物が、誘導反応に関係するのに十分水溶性であることを意味する。
上記ポリマーとの置換の程度は、抗体フラグメントの反応部位の数、分子量、親水性およびポリマーの別の特徴、並びに、選択された特定の抗体フラグメント誘導部位に依存して変化するだろう。一般的に、１から約１０のポリマー分子を含むが、本発明の抗体フラグメントに付着したより大きな数のポリマー分子も考慮される。所望量の誘導は、置換の程度を変えるために、時間、温度および他の反応条件が変更された実験的マトリックスを用いることによって容易に達成され、その後、複合体のポリマー置換レベルがゲルろ過クロマトグラフィーまたは当該技術分野で知られた他の手段によって決定される。
例えばＰＥＧ等のポリマーは、ＰＥＧのような非タンパク様ポリマーを用いたタンパクの共有結合修飾についてそれ自身知られた種々の方法で、抗体フラグメントに架橋結合される。しかしながら、これらの方法のあるものは、この目的には好ましくない。シアヌロニック塩化物（cyanuronic chloride）化学は、タンパクの架橋結合を含む多くの副反応を導く。さらに、特に、スルフヒドリル基を含むタンパクの不活性化を導くかもしれない。カルボニルジイミダゾール化学（Beauchampら，Anal Biochem.131,25-33［1983］）は、タンパクを不活性化しうる高いｐＨ（＞８．５）を必要とする。さらに、“活性化されたＰＥＧ”の中間物は水と反応しうるので、タンパク以上に大過剰モル量の“活性化されたＰＥＧ”が必要である。カルボニルジイミダゾール化学に必要な高濃度のＰＥＧも、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび親水性相互作用クロマトグラフィーの両方が逆に影響されるので、精製の際に問題を引き起こす。さらに、高濃度の“活性化されたＰＥＧ”がタンパクを沈降し、それ自身以前に記載されていた問題である（Davis，米国特許第４１７９３３７号）。一方、わずかに４０倍モル過剰のＰＥＧと１−２時間のインキュベーションのみを必要とするので、アルデヒド化学（Royer，米国特許第４００２５３１号）はより効率的である。しかしながら、“金属をベースとする酸化剤を用いて複合体を形成するＰＥＧの明白な傾向のために”、ＰＥＧアルデヒドの調製のためにRoyerによって示唆された二酸化マンガンは問題がある（Harrisら，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22,341-52［1984］）。ＤＭＳＯおよび無水酢酸を利用したMoffatt酸化の使用が、この問題をうまく回避する。さらに、Royerによって示唆されたホウ化水素ナトリウムは、高いｐＨで用いられなければならず、また、ジスルフィド結合を還元する有意味な傾向を備える。対照的に、中性ｐＨで有効でありかつジスルフィド結合を還元する傾向が殆どないシアノホウ化水素ナトリウムが好ましい。別の好ましい実施態様では、マレイミド活性化ＰＥＧがその抗体フラグメントに遊離のチオールをカップリングするために用いられる。
本発明の抗体フラグメントを修飾するために機能化されたＰＥＧポリマーは、Shearwater Polymers,Inc.（Huntsville,AL）から入手できる。このように商業的に入手可能なＰＥＧ誘導体は、アミノ−ＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル、ＰＥＧ−ヒドラジン、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−スクシナート、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ−プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧスクシニミジルスクシナート、ＰＥＧスクシニミジルプロピオナート、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシニミジルエステル、ＰＥＧのスクシニミジルカーボナート、アミノ酸ＰＥＧのスクシニミジルエステル、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ−ニトロフェニルカーボナート、ＰＥＧトレシラート（tresylate）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル、ＰＥＧ−アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィド、ヘテロ機能性（heterofunctional）ＰＥＧ、ＰＥＧビニル誘導体、ＰＥＧシラン、およびＰＥＧホスホリドを含むが、これらに限定されない。これらのＰＥＧ誘導体をカップリングするための反応条件は、タンパク、所望の程度のＰＥＧ化、および利用されるＰＥＧ誘導体に依存して変化する。ＰＥＧ誘導体の選択に係るいくつかのファクターは、付着の所望のポイント（リジンまたはシステインＲ基のような）、誘導体の加水分解安定性および反応性、結合の安定性、毒性および抗原性、分析の適性等を含む。あらゆる特定の誘導体の使用に特異的な指示が製造者から入手可能である。
本発明の複合体は、ゲルろ過またはイオン交換ＨＰＬＣによって未反応の出発材料から分離される。異種の複合体は、同様にお互いから精製される。
複合体は、イオン交換クロマトグラフィーによって精製されてもよい。多くの求電子的に活性化されたＰＥＧの化学は、ＰＥＧ化産物のアミノ基チャージの還元を生じる。かくして、高分解能イオン交換クロマトグラフィーは、遊離および結合したタンパクを分離し、かつ、種々のレベルのＰＥＧ化を有する種を分離するために用いられる。実際に、異なる種（例えば、一つまたは二つのＰＥＧ残基を含む）の分離は、未反応のアミノ酸のイオン特性における差によっても可能である。ある実施態様では、異なるレベルのＰＥＧ化を備えた種は、ＷＯ９６／３４０１５に記載された方法に従って分離される（１９９６年１０月３１日に公表された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５５５０）。
好ましい実施態様において、複合体は、以下の実施例のセクション（Ｔ）に記載された誘導および精製方法を利用することによって調製される。
ある実施態様では、本発明は、その構成部によって形成されたあらゆる上記複合体、すなわち、複合体の共有分子構造に本題と関係のない物を含まない、一つ以上のポリマー分子に共有的に付着した一つ以上の抗体フラグメントを提供する。
ｃ．巨大な有効サイズ複合体の別の誘導体
別の態様において、上記複合体が、複合体を形成する抗体フラグメント成分およびポリマー成分に加えて、一つ以上の成分を含むように修飾されてもよく、その修飾は、複合体が誘導された親の抗体フラグメントと比較して、複合体の本質的な機能的特性、すなわち、実質的に改良された血清半減期、ＭＲＴおよび／または血清クリアランス速度を変更しないものである。ある実施態様において、本発明は、一つ以上の非タンパク様官能基を取り込むように修飾されたあらゆる上記複合体を提供する。例えば、この複合体は、99Ｔｃ、90Ｙ、111Ｉｎ、32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、131Ｉ、11Ｃ、15Ｏ、13Ｎ、18Ｆ、35Ｓ、51Ｃｒ、57Ｔｏ、22Ｒａ、60Ｃｏ、59Ｆｅ、75Ｓｅ、152Ｅｕ、67Ｃｕ、217Ｃｉ、211Ａｔ、212Ｐｂ、47Ｓｃ、109Ｐｄ、234Ｔｈ、40Ｋ等のような放射性同位元素標識、157Ｇｄ、55Ｍｎ、52Ｔｒ、56Ｆｅ等のような非放射性同位元素標識、希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアナート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレサミン、152Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナールラベル、イソルミナールラベルのような蛍光体を含む蛍光または化学発光ラベル、芳香族アクリジニウムエステルラベル、イミダゾールラベル、アクリジミウム塩ラベル、シュウ酸エステルラベル、エクオリンラベル、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピンラベル、安定な遊離基等のような、医学的治療またはイメージングにおいて使用、または動物モデルにおけるエフェクター機能またはトレーサーとして使用されるあらゆる放射活性物質を含む、放射性同位元素のような非タンパク様ラベルまたはレポーター分子を取り込むように修飾されてもよい。
複合体のポリペプチド抗体フラグメントまたはポリマー成分に共有的に上記ラベルを結合するために、慣例的な方法が利用される。ある実施態様では、本発明の複合体が、上記非タンパク様ラベルのいずれかを用いて抗体フラグメント成分を誘導することによって修飾され、その際には、ラベルが直接または間接的（カップリング剤を介して）に抗体フラグメントに付着され、かつ、このような抗体フラグメントの誘導が、複合体の分子構造にポリマー分子を与えも導入もしない。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス−イミダート、ビス−ジアゾ化ベンジジン等のようなカップリング剤が、上記蛍光または化学発光ラベルで抗体フラグメントをタグ付けするために用いられる。例えば、米国特許第３９４０４７５号（蛍光比色法）、Morrison,Meth.Enzymol.,32b,103（1974）,Svyanenら，J.Biol.Chem.,284,3762（1973）,およびBoltonとHunter,Biochem.J.,133,529（1973）を参照。
放射性同位元素標識を用いた実施態様の場合、直接的および間接的ラベル化の両方が、複合体に選択された放射性核種を導入するために用いられる。放射性同位元素標識との関係においてここで用いられるように、用語“間接的ラベル化”と“間接的ラベル化アプローチ”の両方は、キレート剤が、複合体の抗体フラグメント分子あたはポリマー分子に共有結合され、かつ、少なくとも一つの放射性核種がキレート剤に挿入されることを意味する。好ましいキレート剤と放射性核種は、Srivagtava,S.C.とMease,R.C.,”Progress in Research on Ligands,Nuclides and Techniques for Labeling Monoclonal Antibodies,”Nucl.Med.Bio.,18（6）:589-603（1991）に記載されている。特に好ましいキレート剤は、１−イソチオシクマトベンジル−３−メチルジオテレントリアミネペント酢酸（1-isothiocycmatobenzyl-3-methyldiothelene triaminepent acetic acid）（“ＭＸ−ＤＴＰＡ”）である。放射性同位元素標識との関係においてここで用いられるように、用語“直接的ラベル化”と“直接的ラベル化アプローチ”の両方は、放射性核種が、複合体の抗体フラグメント分子（通常は、アミノ酸残基を介して）またはポリマー分子に直接的に共有結合していることを意味する。複合体の直接的ラベル化に用いられる好ましい放射性核種は、上掲のSrivagtavaとMeaseに記載されている。ある実施態様では、複合体はチロシン残基に共有結合した131Ｉで直接的にラベルされる。別の実施態様では、複合体の抗体フラグメント成分は、上記放射性同位元素標識を用いて直接または間接的にラベルされ、このような抗体フラグメントのラベル化は、複合体の分子構造にポリマー分子を与えも導入もしない。
ｄ．巨大な有効サイズの複合体の治療用組成物および投与
本発明の複合体は、親の完全な抗体を用いて処置される疾患の指標を処置するのに有益である。例えば、抗ＩＬ−８抗体またはフラグメントから誘導された複合体は、以下のセクション（II）（５）（Ｂ）に記載されているように炎症性疾患の処置に有益である。本発明の複合体の治療的製剤は、以下のセクション（II）（５）（Ｂ）において本発明の抗ＩＬ−８抗体およびフラグメントの製剤について記載された同一の方法を用いて調製することができる。本発明の複合体は、複合体の種々の薬力学的特徴によって要求され、かつ、一般的な医学的知識および実践によって命ぜられる通りに、製剤、投与量、投与プロトコルおよび治療的養生法の別の態様を変更することによって、所定の疾患の指標に対する親抗体の代わりに投与される。
ｅ．巨大な有効サイズの複合体のための試薬使用
本発明の複合体は、複合体によって認識された抗原の生物学的機能のインビボでの研究のための動物モデルシステムにおける試薬としても適用できる。複合体は、このシステムからＦｃ相互作用（完全な抗体の使用に伴う）を除去する間、当該技術分野において知られた構成物よりも長い時間、従業者が、循環系または組織において、同起源の抗原を不活性化または検出することを可能にする。さらに、本発明の複合体の増大した半減期は、アレルゲン寛容化のためのWieら，Int.Archs.Anergy Appl.Immunol.,64:84-99（1981）の方法を用いることによって、試験動物における未誘導の抗体フラグメントに対する寛容の誘発に有利に適用することができ、これは、親フラグメントに対する免疫反応を生じることなく、未誘導の親抗体フラグメントを用いて寛容化された動物を従業者が繰り返しチャレンジすることを可能にする。
２．ヒト化６Ｇ４．２．５モノクローナル抗体及び抗体フラグメント
１つの実施態様で、本発明は、図３７Ａ−３７Ｂ（配列番号：７５）のヒト化抗−ＩＬ−８ ６Ｇ４．２．５ｖ１１重鎖ポリペプチドアミノ酸配列のアミノ酸１−２３０のアミノ酸配列を含む重鎖（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＨＶ１１”という）を含む抗体フラグメントまたは全長の抗体を提供する。
本発明は、付加的なアミノ酸配列を有する６Ｇ４．２．５ＨＶ１１またはこれを有していない６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む、一本鎖抗体フラグメントを包含する。１つの実施態様で、本発明は、連結する軽鎖アミノ酸配列、すなわちＦａｂフラグメントの１／２を構成する一本鎖種を有していない６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む、一本鎖抗体フラグメントを包含する。
さらにここでは６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含み、さらに図３１Ｂ（配列番号：６５）のヒト化抗−ＩＬ−８ ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ１１”という）を含む抗体あるいは抗体フラグメントが提供される。
１つの実施態様で、本発明は、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１と６Ｇ４．２．５ＬＶ１１が一本鎖ポリペプチドに含有される一本鎖抗体フラグメントを提供する。好適な実施態様で、一本鎖抗体フラグメントは、フレキシブルペプチドリンカー配列によって６Ｇ４．２．５ＬＶ１１に結合した６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含み、ここで重鎖と軽鎖ドメインは、二本鎖Fab種で形成したものに類似した”dimeric（二量体）”構造で結合することができる。他の実施態様で、一本鎖抗体フラグメントは、相補ドメイン、すなわち他方のモノマーと二量体化により、ダイアボディ（diabody）を形成する一本鎖ポリペプチドモノマーの分子内ペアリングを許容するには短いリンカーによって６Ｇ４．２．５ＬＶ１１に結合されたＧ４．２．５ＨＶ１１を含む種である。
また別の実施態様で、本発明は、１つのポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含み、第２のポリペプチドが６Ｇ４．２．５ＬＶ１１を含み、２つのポリペプチド鎖が１つ以上の鎖内ジスルフィド結合で共有結合されている複数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。好適な実施態様で、前記2本鎖抗体フラグメントは、Ｆａｂ，Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、およびＦ（ａｂ’）2からなる群より選択される。
本発明は、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む重鎖を含み、任意にさらに６Ｇ４．２．５ＬＶ１１を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントも提供する。ここで重鎖、任意に軽鎖は付加的な部分、例えばイムノグロブリン定常ドメイン配列と融合している。定常ドメイン配列は、重鎖および／または軽鎖配列に付加されて全部または一部の長さのHおよびまたは軽鎖を有する種を形成することができる。この目的でいかなるアイソトープの定常領域、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの定常領域も用いることができ、そのような定常領域はいかなるヒトあるいは動物種からも得られることができるということは好都合である。好ましくは、定常ドメイン配列はヒト由来である。好ましいヒト定常ドメイン配列はKabatら（前述）から得ることができる。
好ましい実施態様で、抗体あるいは抗体フラグメントはロイシンジッパー配列に融合あるいはこれを含む重鎖中に、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む。ロイシンジッパーは所望の抗体あるいは抗体フラグメントの親和性および／または生産効率を増加させることができる。好ましいロイシンジッパー配列は、Kostelneyら、J.Immunol.,148:1547-1553（1992）に教示されたjunとfosロイシンジッパーと、以下の実施例に記載されたGCN4ロイシンジッパーを含む。好ましい実施態様で、抗体あるいは抗体フラグメントは、そのC末端でGCN4ロイシンジッパーに融合され、図３７A-37B（配列番号：７５）の重鎖ポリペプチドアミノ酸配列のアミノ酸１−２７５のアミノ酸配列となった６Ｇ４．２．５ＨＶ１１（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＨＶ１１ＧＣＮ４”という）を含む。
３．ヒト化６Ｇ４．２．５モノクローナル抗体および抗体フラグメントの変異体
本発明はさらに、6G4.2.5相補性決定領域（CDRs）の変異体またはヒトIL-8により高い親和性を示すおよび／または組換え体生産プロセスでより高い収率の特性を有する６Ｇ４．２．５ｖ１１可変ドメインの変異体を含むヒト化抗−ＩＬ−８モノクローナル抗体および抗体フラグメントを包含する。
A.  ６Ｇ４．２．５ＬＶ変異体
１つの態様で、本発明は、図２４の６Ｇ４．２．５軽鎖可変ドメインアミノ酸配列の相補性決定領域（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶのＣＤＲｓ”という）Ｌ１，Ｌ２，およびＬ３を含むヒト化抗−ＩＬ−８モノクローナル抗体および抗体フラグメントを提供する。ここでL1は図２４のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９、L２は図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１、L３は図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応する。
さらに本発明は、図２４（配列番号：４８）の６Ｇ４．２．５可変軽鎖ドメインアミノ酸配列の相補性決定領域Ｌ１，Ｌ２，およびＬ３の変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ ＣＤＲｓ変異体”という）を含むヒト化軽鎖可変ドメインを含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体および抗体フラグメントを提供する。１つの実施態様で、本発明は、L1がAsn以外のアミノ酸（”X35”と表す）でアミノ酸位置３５のAsnが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様で、本発明は、L1がAlaでアミノ酸位置３５のAsnが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａ”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。別の好ましい実施態様で、本発明は、L1がGluでアミノ酸位置３５のAsnが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅという）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。
第2の態様で、本発明は、L1がSer以外のアミノ酸（”X26”と表す）でアミノ酸位置２６のSerが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｓ２６Ｘ26”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様で、本発明は、L1がAlaでアミノ酸位置２６のSerが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｓ２６Ａ”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。
第3の態様で、本発明は、L1が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３がHis以外のアミノ酸（”X98”と表す）でアミノ酸位置９８のHisが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ３Ｈ９８Ｘ98”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様で、本発明は、L1が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２は図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３はAlaでアミノ酸位置９８のHisが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ３Ｈ９８Ａ”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。
第４の態様で、本発明は、L1がSer以外のアミノ酸（”X26”と表す）でアミノ酸位置２６のSerが置換され、Asn以外のアミノ酸（”X35”と表す）でアミノ酸位置３５のAsnが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｓ２６Ｘ26，Ｎ３５Ｘ35”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様で、本発明は、L1がAlaでアミノ酸位置２６のSerが置換され、Alaでアミノ酸位置３５のAsnが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３は図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｓ２６Ａ，Ｎ３５Ａ”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。
第５の態様で、本発明は、L1がAsn以外のアミノ酸（”X35”と表す）でアミノ酸位置３５のAsnが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３がHis以外のアミノ酸（”X98”と表す）でアミノ酸位置９８のHisが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35／Ｌ３Ｈ９８Ｘ98”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様で、本発明は、L1がAlaでアミノ酸位置３５のAsnが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３がAlaでアミノ酸位置９８のHisが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａ／Ｌ３Ｈ９８Ａ”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。
第６の態様で、本発明は、L1がSer以外のアミノ酸（”X26”と表す）でアミノ酸位置２６のSerが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３はHis以外のアミノ酸（”X98”と表す）でアミノ酸位置９８のHisが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｓ２６Ｘ26／Ｌ３Ｈ９８Ｘ98”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様で、本発明は、L1がAlaでアミノ酸位置２６のSerが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３がAlaでアミノ酸位置９８のHisが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｓ２６Ａ／Ｌ３Ｈ９８Ａという）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。
第７の態様で、本発明は、L1が、Ser以外のアミノ酸（”X26”と表す）でアミノ酸位置２６のSerが置換され、Asn以外のいかなるアミノ酸（”X35”と表す）でアミノ酸位置３５のAsnが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３がHis以外のアミノ酸（”X98”と表す）でアミノ酸位置９８のHisが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｓ２６Ｘ26，Ｎ３５Ｘ35／Ｌ３Ｈ９８Ｘ98”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様で、本発明は、L1が、Alaでアミノ酸位置２６のSerが置換され、Alaでアミノ酸位置３５のAsnが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸２４−３９に対応し、L２が図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸５５−６１に対応し、L３がAlaでアミノ酸位置９８のHisが置換された図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸９４−１０２に対応するような、６Ｇ４．２．５ＬＶＣＤＲｓ変異体（ここでは”６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｓ２６Ａ，Ｎ３５Ａ／Ｌ３Ｈ９８Ａ”という）を含む変異体６Ｇ４．２．５ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。
本発明のヒト化軽鎖可変ドメインは、当該分野で周知の抗体ヒト化のいかなる技術を用いても、構築することができる。ヒト化は、Winterおよび共同研究者の方法（Jonesら、Nature 321:522（1986）;Riechmannら、Nature 332:323（1988）;Verhoeyenら、Science 239:1534（1988））に従って、6G4.2.5LVのCDRsまたは6G4.2.5LV CDRs変異体のCDRsで、ヒト抗体軽鎖可変ドメインの対応配列を置換することにより実質的に実施することができる。したがって、そのような６Ｇ４．２．５ＬＶのＣＤＲｓまたは６Ｇ４．２．５ＬＶ ＣＤＲｓ変異体のＣＤＲｓを含む”ヒト化”誘導体は、キメラである（Ｃａｂｉｌｌｙら、前述）。６Ｇ４．２．５ＬＶのＣＤＲｓまたは６Ｇ４．２．５ＬＶ ＣＤＲ変異体のＣＤＲｓを含むヒト化軽鎖可変ドメインは、ネズミの６Ｇ４．２．５抗体軽鎖可変ドメイン（”６Ｇ４．２．５ＬＶ”）中の類似する位置からの残基で置換されたいくつかのＦＲ残基も含むことができる。６Ｇ４．２．５ＬＶの完全なアミノ酸配列は、図２４（配列番号：４８）のアミノ酸配列のアミノ酸配列１−１１４として示される。
本発明はまた、前述の６Ｇ４．２．５ＬＶのＣＤＲｓまたは６Ｇ４．２．５ＬＶ ＣＤＲ変異体のＣＤＲｓを含むヒト化軽鎖可変ドメインを含み、さらに図２５（配列番号：５０）の６Ｇ４．２．５（ネズミモノクローナル抗体）可変重鎖ドメインアミノ酸配列の相補性決定領域（CDRs）H1,H2,およびH3を含むヒト化重鎖可変ドメインを含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。ここでH1は、図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、L３はHis以外のいかなるアミノ酸（X98と表す）でアミノ酸位置９８のHisが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。上記６Ｇ４．２．５重鎖可変ドメイン（”６Ｇ４．２．５ＨＶ”）のＨ１，Ｈ２，およびＨ３ＣＤＲｓはまとめて”６Ｇ４．２．５ＨＶのＣＤＲｓ”と称する。
別の実施態様で、前述の６Ｇ４．２．５ＬＶのＣＤＲｓまたは６Ｇ４．２．５ＬＶ ＣＤＲｓ変異体のＣＤＲｓを含むヒト化軽鎖可変ドメインを含み、さらに図２５（配列番号：５０）の６Ｇ４．２．５（ネズミモノクローナル抗体）可変重鎖ドメインアミノ酸配列のH1,H2,およびH3 CDRsの変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＨＶ ＣＤＲｓ変異体”という）を含むヒト化重鎖可変ドメインを含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。１つの６Ｇ４．２．５ＨＶ ＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ１Ｓ３１Ｚ31”という）で、Ｈ１は、Ｓｅｒ以外のアミノ酸（”Ｚ31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第２の６Ｇ４．２．５ＨＶ ＣＤＲｓ変異体（ここでは”６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ２Ｓ５４Ｚ54”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい６Ｇ４．２．５ＨＶ ＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ２Ｓ５４Ａ”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第３の６Ｇ４．２．５ＨＶ ＣＤＲｓ変異体（ここでは、”６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ３Ｄ１００Ｅ”’という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第４の６Ｇ４．２．５ＨＶ ＣＤＲｓ変異体（６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ３Ｒ１０２Ｋという）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第５の６Ｇ４．２．５ＨＶ ＣＤＲｓ変異体（６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ３Ｄ１０６Ｅという）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３はGluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第７の６Ｇ４．２．５ＨＶ ＣＤＲｓ変異体（６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ３Ｄ１００Ｅ，Ｒ１０２Ｋという）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第８の６Ｇ４．２．５ＨＶ ＣＤＲｓ変異体（６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ３Ｒ１０２Ｋ，Ｄ１０６Ｅという）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第９の６Ｇ４．２．５ＨＶ ＣＤＲｓ変異体（６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ３Ｄ１００Ｅ，Ｄ１０６Ｅという）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第１０の6G4.2.5HV CDRs変異体（6G4.2.5HV/H3D100E,R102K,D106Eという）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第１１の6G4.2.5HV CDRs変異体（6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54という）で、H1はSer以外のいかなるアミノ酸（Z31と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２はSer以外のいかなるアミノ酸（Z54と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54Aという）で、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第１２の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは”6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E”という）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E”という）で、H1は、Alaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第１３の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは”6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3R102K”という）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31A/H3R102K”という）で、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第１４の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D106E”という）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31A/H3D106E”という）で、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第１５の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K”という）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E,R102K”という）で、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第１６の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3R102K,D106E”という）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31A/H3R102K,D106E”という）で、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第１７の6G4.2.5HV CDRs変異体（6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E、D106Eという）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E、D106Eという）で、H1は、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第１８の6G4.2.5HV CDRs変異体（6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E、R102K、D106Eという）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E、R102K、D106Eという）で、H1は、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第１９の6G4.2.5HV CDRs変異体（6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100Eという）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第２０の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3R102K”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H2S54A/H3R102K”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第２１の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは”6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D106E”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H2S54A/H3D106E”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第２２の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E,R102K”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E,R102K”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第２３の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3R102K,D106E”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H2S54A/H3R102K,D106E”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第２４の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E,D106E”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E,D106E”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第２５の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106E”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E,R102K,D106E”という）で、H1は図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第２６の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E”という）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E”という）で、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第２７の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K”という）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K”という）で、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第２８の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D106E”という）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のいかなるアミノ酸（Z54と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D106E”という）で、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第２９の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102Kという）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K”という）で、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第３０の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K,D106E”という）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K,D106Eという）で、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はLysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第３１の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,D106E”という）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,D106E”という）で、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
第３２の6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106E”という）で、H1はSer以外のアミノ酸（”Z31”と表す）でアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はSer以外のアミノ酸（”Z54”と表す）でアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。好ましい6G4.2.5HV CDRs変異体（ここでは、”6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K,D106Eという）で、H1はAlaでアミノ酸位置３１のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸２６−３５に対応し、H２はAlaでアミノ酸位置５４のSerが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸５０−６６に対応し、H３はGluでアミノ酸位置１００のAspが置換され、Lysでアミノ酸位置１０２のArgが置換され、Gluでアミノ酸位置１０６のAspが置換された図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸９９−１１１に対応する。
上記の軽鎖の可変ドメインヒト化におけるように、ヒト化重鎖可変ドメインは6G4.2.5HVのCDRsまたは6G4.2.5HV CDR変異体のCDRsで、ヒト重鎖可変ドメイン中の対応する配列を置換することにより構築される。6G4.2.5HVのCDRsまたは6G4.2.5HV CDR変異体のCDRsを含むヒト化重鎖可変ドメインは、ネズミの6G4.2.5抗体重鎖可変ドメイン中の類似位置からの残基で置換されたいくつかのFR残基も含むことができる。6G4.2.5HVの完全なアミノ酸配列は、図２５（配列番号：５０）のアミノ酸配列のアミノ酸配列１−１２２として示される。
ヒト化抗体および抗体フラグメントを作製するために用いられるヒト可変ドメインの選択は、LでもHでも、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる”ベストフィット”の方法に従って、げっ歯類の抗体の可変ドメインの配列が、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。げっ歯類の配列に最も近いヒト配列は、ついでヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（FR）として許容される（Simsら，J.Immunol.151:2296（1993）;ChothiaおよびLesk,J.Mol.Biol.196:901（1987））。別の方法は、Lまたは重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークはいくつかの異なるヒト化抗体に用いられることができる（Carterら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285（1992）;Prestaら，J.Immunol.151:2623（1993）。
本発明の抗体及び抗体フラグメントが、ヒトIL-8に対する高親和性及び他の好ましい生理的特性を保持してヒト化されることも重要である。この目的を達成するため、好ましい方法に従って、本発明のヒト化抗体および抗体フラグメントは、親およびヒト化配列の3次元モデルを用いた親配列および種々の概念ヒト化産物の分析方法によって調製される。3次元イムノグロブリンモデルは、一般的に用いることができ、当業者によく知られている。選択された候補のイムノグロブリン配列の可能性のある3次元コンフォメーション構造を描いて示すコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の検査は、候補のイムノグロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち候補のイムノグロブリンの抗原への結合能力に影響を与える残基の分析を可能にする。こうして、所望の抗体の特性、例えばターゲットの抗原への高親和性が達成されるように、FR残基が、コンセンサスおよび親配列から選択されることができ、結合されることができる。6G4.2.5.LVのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV”という。
6G4.2.5.LV/L1N35X35のCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1N35X35”という。
6G4.2.5.LV/L1N35AのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1N35A”という。
6G4.2.5.LV/L1N35EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1N35E”という。
6G4.2.5.LV/L1S26X26のCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1S26X26”という。
6G4.2.5.LV/L1S26AのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1S26A”という。
6G4.2.5.LV/L3H98X98のCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L3H98X98”という。
6G4.2.5.LV/L3H98AのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L3H98A”という。
6G4.2.5.LV/L1S26X26,Ｎ35X35のCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1S26X26,N35X35”という。
6G4.2.5.LV/L1S26A,N35AのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1S26A,N35A”という。
6G4.2.5.LV/L1N35X35/L3H98X98のCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1N35X35/L3H98X98”という。
6G4.2.5.LV/L1N35A/L3H98AのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1N35A/L3H98A”という。
6G4.2.5.LV/L1S26X26/L3H98X98のCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1S26X26/L3H98X98”という。
6G4.2.5.LV/L1S26A/L3H98AのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1S26A/L3H98A”という。
6G4.2.5.LV/L1S26X26,N35X35/L3H98X98のCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1S26X26,N35X35/L3H98X98”という。
6G4.2.5.LV/L1S26A,N35A/L3H98AのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/L1S26A,N35A/L3H98A”という。
hu6G4.2.5.LV/L1N35X35、hu6G4.2.5.LV/L1S26X26、hu6G4.2.5.LV/L1S26X26/L3H98X98、hu6G4.2.5.LV/L1S26X26,N35X35、hu6G4.2.5.LV/L1N35X35/L3H98X98、hu6G4.2.5.LV/L1S26X26/L3H98X98、およびhu6G4.2.5.LV/L1S26X26,N35X35/L3H98X98のヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/ｖL1-3X”という。
hu6G4.2.5.LV/L1N35A、hu6G4.2.5.LV/L1S26A、hu6G4.2.5.LV/L1S26A/L3H98A、hu6G4.2.5.LV/L1S26A,N35A、hu6G4.2.5.LV/L1N35A/L3H98A、hu6G4.2.5.LV/L1S26A/L3H98A、hu6G4.2.5.LV/L1S26A,N35A/L3H98Aのヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.LV/ｖL1-3A”という。
6G4.2.5.HVのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31のCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31”という。
6G4.2.5.HV/H1S31AのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A”という。
6G4.2.5.HV/H2S54Z54のCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54”という。
6G4.2.5.HV/H2S54AのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54A”という。
6G4.2.5.HV/H3D100EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H3D100E”という。
6G4.2.5.HV/H3R102KのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H3R102K”という。
6G4.2.5.HV/H3D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H3D106E”という。
6G4.2.5.HV/H3D100E,R102KのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H3D100E,R102K”という。
6G4.2.5.HV/H3R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H3R102K,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H3D100E,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H3D100E,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H3D100E,R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H3D100E,R102K,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54のCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D100EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D100E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3R102KのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3R102K”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D100E,R102KのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3R102K,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D100E,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D100E,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3D100EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3D100E”という。
6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3R102KのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3R102K”という。
6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3D106E”という。
6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3R102K,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3D100E,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3D100E,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3D100E、R102K、D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102KのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102KのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54AのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D100EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D100E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H3R102KのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3R102K”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D100E,R102KのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D100E,R102K”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H3R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3R102K,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D100E,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D100E,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D100E,R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D100E,R102K,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H2S54A/H3D100EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54A/H3D100E”という。
6G4.2.5.HV/H2S54A/H3R102KのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54A/H3R102K”という。
6G4.2.5.HV/H2S54A/H3D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54A/H3D106E”という。
6G4.2.5.HV/H2S54A/H3R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54A/H3R102K,D106Eという。
6G4.2.5.HV/H2S54A/H3D100E,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54A/H3D100E,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H2S54A/H3D100E,R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H2S54A/H3D100E,R102K,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D100EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3R102KのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102KのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,D106E”という。
6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K,D106EのCDRsを含むあらゆるすべてのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K,106E”という。
hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31、hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54、hu6G4.2.5.HV/H3D100E、hu6G4.2.5.HV/H3R102K、hu6G4.2.5.HV/H3D106E、hu6G4.2.5.HV/H3D100E,R102K、hu6G4.2.5.HV/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H3D100E,D106E、hu6G4.2.5.HV/H3D100E,R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D100E、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3R102K、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D100E,D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3D100E、hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3R102K、hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3D106E、hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3D100E,D106E、hu6G4.2.5.HV/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,D106E、およびhu6G4.2.5.HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106Eのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/ｖH1-3Z”という。
hu6G4.2.5.HV/H1S31A、hu6G4.2.5.HV/H2S54A、hu6G4.2.5.HV/H3D100E、hu6G4.2.5.HV/H3R102K、hu6G4.2.5.HV/H3D106E、hu6G4.2.5.HV/H3D100E,R102K、hu6G4.2.5.HV/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H3D100E,D106E、hu6G4.2.5.HV/H3D100E,R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D100E、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3R102K、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D100E,R102K、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D100E,D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H3D100E,R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H2S54A/H3D100E、hu6G4.2.5.HV/H2S54A/H3R102K、hu6G4.2.5.HV/H2S54A/H3D106E、hu6G4.2.5.HV/H2S54A/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H2S54A/H3D100E,D106E、hu6G4.2.5.HV/H2S54A/H3D100E,R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,D106E、およびhu6G4.2.5.HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K,D106Eのヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、ここではまとめて”hu6G4.2.5.HV/ｖH1-3A”という。
本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含む軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。別の実施態様では、本発明はｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａを含む軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。さらに別の実施態様では、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含む軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。さらに別の実施態様では、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含む軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。さらに別の実施態様では、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを含む軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。
本発明はさらに、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらにｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む重鎖可変ドメインをさらに含む、ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。別の実施態様では、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらにｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む重鎖可変ドメインをさらに含む、ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。さらに別の実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらにｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａを含む重鎖可変ドメインをさらに含む、ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。
さらなる実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含む軽鎖可変ドメインを含み、さらにｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む重鎖可変ドメインをさらに含む、ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。別の実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｎ３５Ｘ35を含む軽鎖可変ドメインを含み、さらにｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａを含む重鎖可変ドメインをさらに含む、ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、抗体または抗体フラグメントは、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含む軽鎖可変ドメインを含み、さらに６Ｇ４．２．５ＨＶ１１のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖をさらに含む。
さらなる実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらにｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む重鎖可変ドメインをさらに含む、ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。別の実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｎ３５Ａを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらにｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａを含む重鎖可変ドメインをさらに含む、ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。さらに別の実施態様において、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらにｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶを含む重鎖可変ドメインをさらに含む。さらに別の実施態様において、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらにｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶを含む重鎖可変ドメインをさらに含む。好ましい実施態様において、抗体または抗体フラグメントは、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらに６Ｇ４．２．５ＨＶ１１のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖をさらに含む。別の好ましい実施態様では、抗体または抗体フラグメントは、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらに６Ｇ４．２．５ＨＶ１１のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖をさらに含む。
本発明は、付加的なアミノ酸配列を備えた、または備えない、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含む一本鎖抗体フラグメントを含む。別の実施態様では、本発明は、結合した重鎖可変ドメインアミノ酸配列を持たないｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含む一本鎖抗体フラグメント、すなわちＦｖフラグメントの半分を形成する一本鎖種を提供する。別の実施態様では、本発明は、結合した重鎖可変ドメインアミノ酸配列を持たないｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａを含む一本鎖抗体フラグメントを提供する。さらに別の実施態様では、本発明は、結合した重鎖可変ドメインアミノ酸配列を持たないｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含む一本鎖抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、本発明は、結合した重鎖可変ドメインアミノ酸配列を持たないｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含む一本鎖抗体フラグメントを提供する。さらに別の好ましい実施態様において、本発明は、結合した重鎖可変ドメインアミノ酸配列を持たないｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを含む一本鎖抗体フラグメントを提供する。
好ましい実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘと、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚとが一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含むｓｃＦｖ種であり、重鎖および軽鎖可変ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、二つの可変ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディ（diabody）を形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
別の実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａと、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚとが一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａを含むｓｃＦｖ種であり、重鎖および軽鎖可変ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、二つの可変ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａを含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
別の実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａと、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａとが一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａを含むｓｃＦｖ種であり、重鎖および軽鎖可変ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、二つの可変ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａを含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
別の実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35と、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚとが一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含むｓｃＦｖ種であり、重鎖および軽鎖可変ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、二つの可変ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
さらに別の実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35と、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａとが一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含むｓｃＦｖ種であり、重鎖および軽鎖可変ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、二つの可変ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
別の実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａと、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚとが一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含むｓｃＦｖ種であり、重鎖および軽鎖可変ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、二つの可変ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅと、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶとが一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体フラグメントもここに提供される。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを含むｓｃＦｖ種であり、重鎖および軽鎖可変ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、二つの可変ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
さらに別の実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａと、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａとが一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含むｓｃＦｖ種であり、重鎖および軽鎖可変ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、二つの可変ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによってｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
さらに別の実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含み、第二のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。
さらに別の実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含み、第二のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａを含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含み、第二のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＨＶ１１のアミノ酸配列を含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。
さらに別の実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａを含み、第二のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。
さらに別の実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａを含み、第二のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａを含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ａを含み、第二のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＨＶ１１のアミノ酸配列を含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。
また、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含み、第二のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを含む。
さらに別の実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含み、第二のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａを含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含み、第二のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＨＶ１１のアミノ酸配列を含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。
本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含み、第二のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントをさらに含む。
また本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを含み、第二のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶを含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを含む。
さらに別の実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含み、第二のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａを含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含み、第二のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＨＶ１１のアミノ酸配列を含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。さらに好ましい実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを含み、第二のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＨＶ１１のアミノ酸配列を含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。
好ましい実施態様において、先のいずれの二本鎖抗体フラグメントも、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）2からなる群から選択される。別の好ましい実施態様においては、抗体フラグメントは、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含む第一ポリペプチド鎖とｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶを含む第二ポリペプチド鎖とを含み、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）2からなる群から選択される。さらに別の好ましい実施態様においては、抗体フラグメントは、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含む第一ポリペプチド鎖とｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶを含む第二ポリペプチド鎖とを含み、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）2からなる群から選択される。さらに好ましい実施態様においては、抗体フラグメントは、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを含む第一ポリペプチド鎖とｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶを含む第二ポリペプチド鎖とを含み、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）2からなる群から選択される。さらに別の好ましい実施態様においては、抗体フラグメントは、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含む第一ポリペプチド鎖と６Ｇ４．２．５ＨＶ１１のアミノ酸配列を含む第二ポリペプチド鎖とを含むＦ（ａｂ’）2である。さらに好ましい実施態様においては、抗体フラグメントは、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを含む第一ポリペプチド鎖と６Ｇ４．２．５ＨＶ１１のアミノ酸配列を含む第二ポリペプチド鎖とを含むＦ（ａｂ’）2である。
また本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらに任意にｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む重鎖可変ドメインを含む、抗体または抗体フラグメントを提供するものであり、軽鎖可変ドメインと任意的な重鎖可変ドメインは、イムノグロブリン定常ドメインのような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
本発明はさらに、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらに任意にｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａを含む重鎖可変ドメインを含む、抗体または抗体フラグメントを提供するものであり、軽鎖可変ドメインと任意的な重鎖可変ドメインは、イムノグロブリン定常ドメインのような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
本発明はさらに、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含む軽鎖可変ドメインを含み、さらに任意にｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む重鎖可変ドメインを含む、抗体または抗体フラグメントを提供するものであり、軽鎖可変ドメインと任意的な重鎖可変ドメインは、イムノグロブリン定常ドメインのような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
本発明はさらに、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｘ35を含む軽鎖可変ドメインを含み、さらに任意にｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａを含む重鎖可変ドメインを含む、抗体または抗体フラグメントを提供するものであり、軽鎖可変ドメインと任意的な重鎖可変ドメインは、イムノグロブリン定常ドメインのような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
また本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらに任意にｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む重鎖可変ドメインを含む、抗体または抗体フラグメントを含むものであり、軽鎖可変ドメインと任意的な重鎖可変ドメインは、イムノグロブリン定常ドメインのような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
本発明はさらに、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらに任意にｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ａを含む重鎖可変ドメインを含む、抗体または抗体フラグメントを提供するものであり、軽鎖可変ドメインと任意的な重鎖可変ドメインは、イムノグロブリン定常ドメインのような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
本発明はさらに、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ａを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらに任意に６Ｇ４．２．５ＨＶ１１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗体または抗体フラグメントを含むものであり、軽鎖可変ドメインと任意的な重鎖は、イムノグロブリン定常ドメイン配列のような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
本発明はさらに、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／Ｌ１Ｎ３５Ｅを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらに任意に６Ｇ４．２．５ＨＶ１１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗体または抗体フラグメントを含むものであり、軽鎖可変ドメインと任意的な重鎖は、イムノグロブリン定常ドメイン配列のような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
好ましい実施態様では、抗体または抗体フラグメントが、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含む軽鎖可変ドメインを含み、さらにロイシンジッパー配列に融合されているか、該配列を包含する重鎖にｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む。ロイシンジッパーは、関心の向けられた抗体または抗体フラグメントの親和性または生産効率を増大することができる。安定なロイシンジッパー配列は、Kostelneyら，J.Immunol.,148:1547-1553（1992）に教示されたｊｕｎおよびｆｏｓロイシンジッパー、および以下の実施例に記載されたＧＣＮ４ロイシンジッパーを含む。
特に本発明は、Ａｓｎ以外のあらゆるアミノ酸（“Ｘ35”と表す）が、アミノ酸３５位におけるＡｓｎと置換されていることを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35”と表す）。
別の実施態様において、本発明は、Ｓｅｒ以外のあらゆるアミノ酸（“Ｘ26”と表す）が、アミノ酸２６位におけるＳｅｒと置換されていることを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ｘ26”と表す）。
さらに別の実施態様において、本発明は、Ｈｉｓ以外のあらゆるアミノ酸（“Ｘ98”と表す）が、アミノ酸９８位におけるＨｉｓと置換されていることを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｈ９８Ｘ98”と表す）。
さらに別の実施態様において、本発明は、Ｓｅｒ以外のあらゆるアミノ酸（“Ｘ26”と表す）が、アミノ酸２６位におけるＳｅｒと置換され、かつ、Ａｓｎ以外のあらゆるアミノ酸（“Ｘ35”と表す）が、アミノ酸３５位におけるＡｓｎと置換されていることを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ｘ26／Ｎ３５Ｘ35”と表す）。
さらに別の実施態様において、本発明は、Ａｓｎ以外のあらゆるアミノ酸（“Ｘ35”と表す）が、アミノ酸３５位におけるＡｓｎと置換され、かつ、Ｈｉｓ以外のあらゆるアミノ酸（“Ｘ98”と表す）が、アミノ酸９８位におけるＨｉｓと置換されていることを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35／Ｈ９８Ｘ98”と表す）。
さらに別の実施態様において、本発明は、Ｓｅｒ以外のあらゆるアミノ酸（“Ｘ26”と表す）が、アミノ酸２６位におけるＳｅｒと置換され、かつ、Ｈｉｓ以外のあらゆるアミノ酸（“Ｘ98”と表す）が、アミノ酸９８位におけるＨｉｓと置換されていることを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ｘ26／Ｈ９８Ｘ98”と表す）。
また本発明は、Ｓｅｒ以外のあらゆるアミノ酸（“Ｘ26”と表す）が、アミノ酸２６位におけるＳｅｒと置換され、Ａｓｎ以外のあらゆるアミノ酸（“Ｘ35”と表す）が、アミノ酸３５位におけるＡｓｎと置換され、かつ、Ｈｉｓ以外のあらゆるアミノ酸（“Ｘ98”と表す）が、アミノ酸９８位におけるＨｉｓと置換されていることを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ｘ26／Ｎ３５Ｘ35／Ｈ９８Ｘ98”と表す）。
さらに本発明は、図３６の変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：７１）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ”と表す）。
さらに、図４５の変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：７１）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｅ”と表す）。
別の実施態様において、本発明は、Ａｌａがアミノ酸２６位のＳｅｒと置換されたことを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ａ”と表す）。
さらに別の実施態様において、本発明は、Ａｌａがアミノ酸９８位のＨｉｓと置換されたことを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｈ９８Ａ”と表す）。
さらに別の実施態様において、本発明は、Ａｌａがアミノ酸２６位のＳｅｒと置換され、かつＡｌａがアミノ酸３５位のＡｓｎと置換されたことを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ａ／Ｎ３５Ａ”と表す）。
さらに別の実施態様において、本発明は、Ａｌａがアミノ酸２６位のＳｅｒと置換され、かつＡｌａがアミノ酸９８位のＨｉｓと置換されたことを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ａ／Ｈ９８Ａ”と表す）。
また本発明は、Ａｌａがアミノ酸３５位のＡｓｎと置換され、Ａｌａがアミノ酸９８位のＨｉｓと置換されたことを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを含む（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ／Ｈ９８Ａ”と表す）。
本発明はさらに、Ａｌａがアミノ酸２６位のＳｅｒと置換され、Ａｌａがアミノ酸３５位のＡｓｎと置換され、Ａｌａがアミノ酸９８位のＨｉｓと置換されたことを条件として、図３１Ｂの変異形ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５ｖ１１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：６５）のアミノ酸１−２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを含む（ここでは“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ａ／Ｎ３５Ａ／Ｈ９８Ａ”と表す）。
本発明は、何らかのさらなるアミノ酸配列を含む、または含まない、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ｘ26、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｈ９８Ｘ98、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ｘ26／Ｎ３５Ｘ35、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35／Ｈ９８Ｘ98、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ｘ26／Ｈ９８Ｘ98、および６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ｘ26／Ｎ３５Ｘ35／Ｈ９８Ｘ98からなる群から選択された変異形軽鎖を含む一本鎖抗体フラグメントを提供する。６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ｘ26、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｈ９８Ｘ98、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ｘ26／Ｎ３５Ｘ35、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35／Ｈ９８Ｘ98、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ｘ26／Ｈ９８Ｘ98、および６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ｘ26／Ｎ３５Ｘ35／Ｈ９８Ｘ98からなる群は、集合的に“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体群”と表され、この群の個々のメンバーは、一般的に“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体”と表されると解する。ある実施態様において、本発明は、結合した重鎖アミノ酸配列を全く含まない６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘを含む一本鎖抗体フラグメント、すなわちＦａｂフラグメントの半分を形成する一本鎖種を提供する。好ましい実施態様において、本発明は、結合した重鎖アミノ酸配列を全く含まない６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35を提供する。
本発明は、何らかのさらなるアミノ酸配列を含む、または含まない、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ａ、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｈ９８Ａ、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ａ／Ｎ３５Ａ、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ／Ｈ９８Ａ、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ａ／Ｈ９８Ａ、および６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ａ／Ｎ３５Ａ／Ｈ９８Ａからなる群から選択された変異形軽鎖を含む一本鎖抗体フラグメントを含む。６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ａ、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｈ９８Ａ、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ａ／Ｎ３５Ａ、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ／Ｈ９８Ａ、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ａ／Ｈ９８Ａ、および６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｓ２６Ａ／Ｎ３５Ａ／Ｈ９８Ａからなる群は、集合的に“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ａ変異体群”と表され、この群の個々のメンバーは、一般的に“６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ａ変異体”と表されると解する。ある実施態様において、本発明は、結合した重鎖アミノ酸配列を全く含まない６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ａを含む一本鎖抗体フラグメント、すなわちＦａｂフラグメントの半分を形成する一本鎖種を提供する。好ましい実施態様において、本発明は、結合した重鎖アミノ酸配列を全く含まない６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａを提供する。
さらに、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体を含む軽鎖を含み、さらに６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む重鎖を含む抗体または抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、本発明は６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35変異体を含み、さらに６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む抗体または抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、本発明は６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａを含み、さらに６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む抗体または抗体フラグメントを提供する。別の好ましい実施態様においては、本発明は６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｅを含み、さらに６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む抗体または抗体フラグメントを提供する。
好ましい実施態様において、本発明は、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体と、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１とが一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によって６Ｇ４．２．５ＨＶ１１に結合した６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体を含み、重鎖および軽鎖ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、相補的ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによって６Ｇ４．２．５ＨＶ１１に結合した６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体を含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
さらに別の実施態様において、本発明は、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35変異体と、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１とが一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によって６Ｇ４．２．５ＨＶ１１に結合した６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35変異体を含み、重鎖および軽鎖ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、相補的ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによって６Ｇ４．２．５ＨＶ１１に結合した６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35変異体を含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
さらなる実施態様において、本発明は、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａと、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１とが一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によって６Ｇ４．２．５ＨＶ１１に結合した６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａを含み、重鎖および軽鎖ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、相補的ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによって６Ｇ４．２．５ＨＶ１１に結合した６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａを含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
さらなる実施態様において、本発明は、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｅと、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１とが一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によって６Ｇ４．２．５ＨＶ１１に結合した６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｅを含み、重鎖および軽鎖ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、相補的ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによって６Ｇ４．２．５ＨＶ１１に結合した６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｅを含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
さらに別の実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体を含み、第二のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。さらに別の実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35変異体を含み、第二のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含む抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、先のいずれの二本鎖抗体フラグメントも、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、およびＦ（ａｂ’）2からなる群から選択される。別の好ましい実施態様においては、二本鎖抗体フラグメントは、第一ポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａを含み、第二ポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含むＦ（ａｂ’）2である。さらに好ましい実施態様においては、抗体フラグメントは、第一ポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｅを含み、第二ポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含むＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、またはＦ（ａｂ’）2である。特に好ましい実施態様では、抗体フラグメントは、以下の実施例に記載された６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ  Ｆ（ａｂ’）2ＧＣＮ４ロイシンジッパー種である。別の特に好ましい実施態様では、抗体フラグメントは、以下の実施例に記載された６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ  Ｆ（ａｂ’）2ＧＣＮ４ロイシンジッパー種である。さらに別の特に好ましい実施態様では、抗体フラグメントは、以下の実施例に記載された６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ  Ｆａｂである。
また本発明は、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体を含む軽鎖を含み、さらに任意に６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む重鎖を含む、抗体または抗体フラグメントを提供するものであり、軽鎖と任意的な重鎖は、付加的なイムノグロブリン定常ドメイン配列のような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
本発明はさらに、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35変異体を含む軽鎖を含み、さらに任意に６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む重鎖を含む、抗体または抗体フラグメントを提供するものであり、軽鎖と任意的な重鎖は、付加的なイムノグロブリン定常ドメイン配列のような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
さらに本発明は、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａを含む軽鎖を含み、さらに任意に６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む重鎖を含む、抗体または抗体フラグメントを提供するものであり、軽鎖と任意的な重鎖は、付加的なイムノグロブリン定常ドメイン配列のような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
さらに本発明は、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｅを含む軽鎖を含み、さらに任意に６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む重鎖を含む、抗体または抗体フラグメントを提供するものであり、軽鎖と任意的な重鎖は、付加的なイムノグロブリン定常ドメイン配列のような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
好ましい実施態様では、抗体または抗体フラグメントが、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体を含む軽鎖を含み、さらにロイシンジッパー配列に融合されているか、該配列を包含する重鎖に６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む。ロイシンジッパーは、関心の向けられた抗体または抗体フラグメントの親和性または生産効率を増大することができる。安定なロイシンジッパー配列は、Kostelneyら，J.Immunol.,148:1547-1553（1992）に教示されたｊｕｎおよびｆｏｓロイシンジッパー、および以下の実施例に記載されたＧＣＮ４ロイシンジッパーを含む。別の好ましい実施態様では、抗体または抗体フラグメントが、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａを含む軽鎖を含み、さらにＧＣＮ４ロイシンジッパーに融合した６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む重鎖を含む。
Ｂ．６Ｇ４．２．５ＨＶ変異体
本発明は、６Ｇ４．２．５ＨＶ  ＣＤＲ変異体のＣＤＲを含むヒト化抗体および抗体フラグメントを提供する。本発明のヒト化抗体および抗体フラグメントの６Ｇ４．２．５ＨＶ  ＣＤＲ変異体の使用は、ヒトＩＬ−８に対する高い親和性および／または改善された組み換えによる製造の節約の利点を付与する。
６Ｇ４．２．５ＨＶ  ＣＤＲ変異体のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインは、本質的に上記セクション（II）（２）（Ａ）に記載されているように、６Ｇ４．２．５ＬＶのＣＤＲまたは６Ｇ４．２．５ＬＶ  ＣＤＲ変異体のＣＤＲを含む軽鎖と共同してヒト化される。ある実施態様において、６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ１Ｓ３１Ｚ31、６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ２Ｓ５４Ｚ54、および６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ１Ｓ３１Ｚ31／Ｈ２Ｓ５４Ｚ54からなる群から選択された６Ｇ４．２．５ＨＶ  ＣＤＲ変異体を含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。さらに、本発明は、６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ１Ｓ３１Ａ、６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ２Ｓ５４Ａ、および６Ｇ４．２．５ＨＶ／Ｈ１Ｓ３１Ａ／Ｈ２Ｓ５４Ａからなる群から選択された６Ｇ４．２．５ＨＶ  ＣＤＲ変異体を含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。特に、６Ｇ４．２．５ＨＶ  ＣＤＲ変異体は、上記セクション（II）（２）（Ａ）に記載されているようなｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含むヒト化抗体または抗体を構成するために用いることができる。
さらに本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む重鎖可変ドメインを含み、そしてさらに、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含む軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。
本発明はさらに、何らかの付加的なアミノ酸配列を備えた、または備えないｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む一本鎖ヒト化抗体フラグメントをも包含する。ある実施態様において、本発明は、結合した重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含まないｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む一本鎖抗体フラグメント、すなわち半分のＦｖフラグメントを作製する一本鎖種を提供する。
ある実施態様において、本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚと、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘとが、一本鎖ポリペプチド種に含まれている、一本鎖ヒト化抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、一本鎖抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によってｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含むｓｃＦｖ種であり、重鎖および軽鎖可変ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖抗体フラグメントは、二つの可変ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによってｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘに結合したｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
さらに別の実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含み、第二のポリペプチド鎖がｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含むヒト化抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、先の二本鎖抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）2からなる群から選択される。
また本発明は、ｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む重鎖可変ドメインを含み、さらに任意にｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶまたはｈｕ６Ｇ４．２．５ＬＶ／ｖＬ１−３Ｘを含む軽鎖可変ドメインを含む、ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供するものであり、重鎖可変ドメインと任意的な軽鎖可変ドメインは、イムノグロブリン定常ドメインのような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatらから得ることができる。
好ましい実施態様では、ヒト化抗体または抗体フラグメントが、ロイシンジッパー配列に融合されているか、該配列を包含する重鎖にｈｕ６Ｇ４．２．５ＨＶ／ｖＨ１−３Ｚを含む。ロイシンジッパーは、関心の向けられた抗体または抗体フラグメントの親和性または生産効率を増大することができる。安定なロイシンジッパー配列は、Kostelneyら，J.Immunol.,148:1547-1533（1992）に教示されたｊｕｎおよびｆｏｓロイシンジッパー、および以下の実施例に記載されたＧＣＮ４ロイシンジッパーを含む。
さらに本発明は、Ａｌａがアミノ酸３１位におけるＳｅｒと置換されていることを条件として、図３７Ａ−３７Ｂの６Ｇ４．２．５ＨＶ１１ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：７５）のアミノ酸１−２３０のアミノ酸配列を含む重鎖を含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ｓ３１Ａ”と表す）。
別の実施態様において、本発明は、Ａｌａがアミノ酸５４位におけるＳｅｒと置換されていることを条件として、図３７Ａ−３７Ｂの６Ｇ４．２．５ＨＶ１１ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：７５）のアミノ酸１−２３０のアミノ酸配列を含む重鎖を含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ｓ５４Ａ”と表す）。
さらに別の実施態様において、本発明は、Ａｌａがアミノ酸３１位におけるＳｅｒと置換され、かつ、Ａｌａがアミノ酸５４位におけるＳｅｒと置換されていることを条件として、図３７Ａ−３７Ｂの６Ｇ４．２．５ＨＶ１１ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号：７５）のアミノ酸１−２３０のアミノ酸配列を含む重鎖を含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する（ここでは“６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ｓ３１Ａ／Ｓ５４Ａ”と表す）。
以下の表１および２に挙げられているいずれの軽鎖と重鎖との組み合わせを含むヒト化抗体または抗体フラグメントが、さらにここに提供されている。
0004108760.tif 000002
0004108760.tif 000003
本発明は、何らかのさらなるアミノ酸配列を含む、または含まない、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ｓ３１Ａ、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ｓ５４Ａ、および６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ｓ３１Ａ／Ｓ５４Ａからなる群から選択された変異形重鎖を含む一本鎖ヒト化抗体フラグメントを含む。６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ｓ３１Ａ、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ｓ５４Ａ、および６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ｓ３１Ａ／Ｓ５４Ａからなる群は、集合的に“６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体群”と表され、この群の個々のメンバーは、一般的に“６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体”と表されると解する。ある実施態様において、本発明は、結合した軽鎖アミノ酸配列を全く含まない６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａを含む一本鎖ヒト化抗体フラグメント、すなわちＦａｂフラグメントの半分を形成する一本鎖種を提供する。
６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体を含む重鎖を含み、さらに６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ａ変異体または６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体を含む軽鎖を含む、ヒト化抗体または抗体フラグメントをさらに提供する。別の実施態様では、ヒト化抗体または抗体フラグメントが、上記表１および表２に挙げられた軽鎖および重鎖のあらゆる組み合わせを含む。別の実施態様では、本発明は、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体を含み、さらに６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35を含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、本発明は、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体を含み、さらに６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａを含むヒト化抗体または抗体フラグメントを提供する。
さらに別の実施態様では、本発明は、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体と、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１とが、一本鎖ポリペプチド種に含まれている、一本鎖ヒト化抗体フラグメントを提供する。別の実施態様において、本発明は、上記表１および表２に挙げられた軽鎖および重鎖のあらゆる組み合わせが一本鎖ポリペプチド種に含まれる一本鎖ヒト化抗体フラグメントを提供する。さらに別の実施態様では、本発明は６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体と、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体とが、一本鎖ポリペプチド種に含まれる一本鎖ヒト化抗体フラグメントを提供する。さらに別の実施態様において、本発明は６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体と、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35変異体とが、一本鎖ポリペプチド種に含まれる一本鎖ヒト化抗体フラグメントを提供する。さらなる実施態様において、本発明は６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体と、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ変異体とが、一本鎖ポリペプチド種に含まれる一本鎖ヒト化抗体フラグメントを提供する。
好ましい実施態様において、一本鎖ヒト化抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によって６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35変異体、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ変異体、または６Ｇ４．２．５ＬＶ１１に結合した６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体を含み、重鎖および軽鎖ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖ヒト化抗体フラグメントは、相補的ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによって６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35変異体、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ変異体、または６Ｇ４．２．５ＬＶ１１に結合した６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体を含む種、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
さらに別の実施態様では、一本鎖ヒト化抗体フラグメントは、柔軟なペプチドリンカー配列の手段によって上記表１および２に挙げられた軽鎖および重鎖のあらゆる対を含み、重鎖および軽鎖ドメインが、二本鎖Ｆｖ種に形成された構造と類似した“二量体”構造となるように結合することができる。別の実施態様では、一本鎖ヒト化抗体フラグメントは、相補的ドメインの分子内対合をするには短すぎるリンカーによって結合した上記表１および２に挙げられた軽鎖および重鎖のあらゆる対、すなわち別のモノマーと二量化してディアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーを含む。
さらに別の実施態様では、本発明は、一方のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体を含み、第二のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35変異体、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ変異体、または６Ｇ４．２．５ＬＶ１１を含み、かつ二つのポリペプチド鎖が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって共有的に結合された、多数のポリペプチド鎖を含むヒト化抗体フラグメントを提供する。好ましい実施態様において、先の二本鎖抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、およびＦ（ａｂ’）2からなる群から選択される。
さらなる実施態様において、本発明は、上記表１および２に挙げられた重鎖と軽鎖のあらゆる対を含む二本鎖ヒト化抗体フラグメントを提供するものであり、ここで各鎖は別々の分子に含まれる。別の実施態様において、上記表１および２に挙げられた重鎖および軽鎖のあらゆる対を含む二本鎖抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、およびＦ（ａｂ’）2からなる群から選択される。好ましい実施態様において、二本鎖ヒト化抗体フラグメントは、上記表１および２に挙げられた重鎖および軽鎖のあらゆる対を含むＦ（ａｂ’）2である。別の好ましい実施態様において、二本鎖ヒト化抗体フラグメントは、一方のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体を含み、第二のポリペプチド鎖が６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａを含むＦ（ａｂ’）2である。
また本発明は、６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体を含む重鎖を含み、さらに任意に６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｘ変異体、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ｘ35変異体、６Ｇ４．２．５ＬＶ１１Ｎ３５Ａ、または６Ｇ４．２．５ＨＶ１１を含む軽鎖を含む、ヒト化抗体または抗体フラグメントを提供するものであり、重鎖と任意的な軽鎖は、付加的なイムノグロブリン定常ドメイン配列のような付加的な分子に融合されている。定常ドメイン配列は、全体的または部分的な長さの重鎖および／または軽鎖を有する種を形成するために、重鎖および／または軽鎖配列に付加することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、あらゆるアイソタイプの定常領域がこの目的のために用いられること、並びに、このような定常領域があらゆるヒトまたは動物種から得られることが認められる。好ましくは、定常ドメイン配列はヒトに由来するものである。適切なヒト定常ドメイン配列は、Kabatら（上掲）から得ることができる。
好ましい実施態様では、ヒト化抗体または抗体フラグメントが、ロイシンジッパー配列に融合されているか、該配列を包含する重鎖に６Ｇ４．２．５ＨＶ１１Ａ変異体を含む。ロイシンジッパーは、関心の向けられた抗体または抗体フラグメントの親和性または生産効率を増大することができる。安定なロイシンジッパー配列は、Kostelneyら，J.Immunol.,148:1547-1553（1992）に教示されたｊｕｎおよびｆｏｓロイシンジッパー、および以下の実施例に記載されたＧＣＮ４ロイシンジッパーを含む。
Ｃ．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、モノクローナルの、好ましくはヒトの、またはヒト化された、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を備えた抗体である。本願の場合、結合特異性の一方は、ＩＬ−８に対し、他方は別の抗原に対する。例えば、ＩＬ−８と神経栄養性因子、あるいは二つの異なるタイプのＩＬ−８ポリペプチドに特異的に結合する二重特異性抗体が本発明の範囲内である。
二重特異性抗体を作製する方法は、当該技術分野において知られている。慣例的には、二重特異性抗体の組み換え産生が、二つのイムノグロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を備えている（MilsteinとCuello,Nature 305-537（1983））。イムノグロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな分類により、これらのハイブリドーマ（quadromas）は１０の異なる抗体分子の可能性のある混合物を産生し、そのうちの一つだけが適当な二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる適当な分子の精製は、むしろ扱いにくく、産物の収量も低い。類似した方法は、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、およびTrauneckerら，EMBO J.10:3655（1991）に記載されている。
別個の、かつより好ましいアプローチによれば、所望の結合特異性を備えた抗体可変ドメイン（抗体−抗原連結部位）が、イムノグロブリン定常ドメイン配列に融合している。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、イムノグロブリン重鎖定常ドメインを用いて行われる。少なくとも一つの融合物に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第一重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。イムノグロブリン重鎖融合物、所望であればイムノグロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に共トランスフェクトされる。これは、構成物において用いられた三つのポリペプチド鎖の一様でない比率が最大の収量を与える実施態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互の比率を調整することに大きな柔軟性を付与する。しかしながら、同じ比率で少なくとも二つのポリペプチド鎖を産生することが高い収量をもたらす場合、あるいはその比率が特に重要ではない場合に、一つの発現ベクターに二つまたは三つ全てのポリペプチド鎖をコードする配列を挿入することが可能である。このアプローチの好ましい実施態様において、二重特異性抗体は、一方の腕における第一の結合特異性を備えたハイブリッドイムノグロブリン重鎖と、他方の腕におけるハイブリッドイムノグロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を付与する）から構成される。この不均斉の構造は、半分の二重特異性分子のみにおけるイムノグロブリン軽鎖の存在が分離の容易な方法を提供するので、所望でないイムノグロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物の分離を容易にする。二重特異性抗体を生成するさらなる詳細については、例えば、Sureshら，Methods in Enzymology 121:210（1986）を参照。
別のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面が、組み換え細胞培養から回収されたヘテロダイマーのパーセントを最大にするように設計することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインの少なくとも一部のＣH３ドメインを含む。この方法では、第一の抗体分子の界面の一つ以上の小さいアミノ酸側鎖が、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換される。大きい側鎖に同一または類似のサイズの代償的“空洞”が、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはトレオニン）と置換することによって第二抗体分子の界面に形成される。これは、ホモダイマーのような他の所望でない最終産物を越えてヘテロダイマーの収量を増大するためのメカニズムを提供する。
二重特異性抗体は、架橋結合した、または“ヘテロ複合体”抗体を含む。例えば、ヘテロ複合体の一方の抗体をアビジンに結合させ、他方をビオチンに結合させることができる。このような抗体は、例えば、所望でない細胞に免疫機構細胞を標的化するため（米国特許第４６７６９８０号）、並びにＨＩＶ感染の処置（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３およびＥＰ０３０８９）のために提案されている。ヘテロ複合体抗体は、あらゆる簡便な架橋結合方法を用いて作製されてもよい。適切な架橋結合剤は当該技術分野において周知であり、多数の架橋結合技術と共に、米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を産生するための技術も、文献に開示されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製されうる。Brennanら，Science,229:81（1985）は、完全な抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（ａｂ’）2フラグメントを産生する方法を記載する。これらのフラグメントは、ビシナルジチオールを安定化し、かつ分子間ジスルフィド形成を避けるジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。産生されたＦａｂ’フラグメントは、次いでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方が、メルカプトエチルアミンを用いた還元によってＦａｂ’−チオールに再返還され、二重特異性抗体を形成するために等モル量の別のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合される。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の試薬として用いられる。
最近の進歩は、二重特異性抗体を形成するために化学的に結合され得る、大腸菌（E.coli）のＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接的回収を容易にした。Shalabyら，J.Exp.Med.,175:217-225（1992）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）2分子の産生を記述している。各Ｆａｂ’フラグメントは、別個に大腸菌から分泌され、二重特異性抗体を形成するためにインビトロにおいて意図された化学結合にさらされる。かくして形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性の引き金を引くことができる。
組み換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体フラグメントを作製および単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelnyら，J.Immunol.,148（5）:1547-1553（1992）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパクからのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって二つの異なる抗体のＦａｂ’部位に連結された。抗体ホモダイマーは、モノマーを形成するためにヒンジ領域で還元され、次いで抗体ヘテロダイマーを形成するために再度酸化された。この方法は、抗体ホモダイマーの産生にも利用されうる。Hollingerら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448（1993）によって記載された“ディアボディ”技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための選択的なメカニズムを提供した。このフラグメントは、同一の鎖上の二つのドメイン間の対合をするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、一つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインが、別のフラグメントの相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対合するように強いられ、それによって二つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製する別の方法も報告されている。Gruberら，J.Immunol.,152:5368（1994）を参照。
二価以上の抗体を考慮することができる。例えば、三重特異性抗体が調製されうる。Tuttら，J.Immunol.147:60（1991）。
４．ヒト化抗ＩＬ−８  ６Ｇ４．２．５モノクローナル抗体、抗体フラグメントおよび変異体の産生
本発明の抗体および抗体フラグメントは、当該技術分野で知られたあらゆる適切な抗体製造方法を利用して産生することができる。通常、抗体または抗体フラグメントは、組み換え発現システムを用いて作製される。多重ポリペプチド鎖抗体または抗体フラグメント種は、宿主細胞は抗体または抗体フラグメントの各鎖を産生し、インビボで抗体または抗体フラグメントを形成するために多重結合構造となるようにポリペプチド鎖を組み立てる単一宿主細胞発現システムにおいて作製され、その後、宿主細胞から抗体または抗体フラグメントを回収する。例えば、完全な抗体または抗体フラグメントの産生に適切な組み換え発現システムは、Lucasら，Nucleic Acids Res.,24:1774-1779（1996）に記載されている。あるいは、所望の抗体または抗体フラグメントの別個のポリペプチド鎖は、別個の発現宿主細胞において調製され、各宿主細胞から別個に回収され、かつ関心の向けられた多重サブユニット抗体または抗体フラグメントの形成を可能にする条件下でインビトロにおいて混合され得る。例えば、Cabillyらの米国特許第４８１６５６７号とCarterら，Bio/Technology,10:163-167（1992）は、別個の発現宿主において抗体重鎖および軽鎖の組み換え産生、次いでインビトロにおける別個の重鎖および軽鎖からの抗体の組立の方法を提供する。
組み換え発現方法に関する以下の議論は、一本鎖抗体ポリペプチド種と多重サブユニット抗体および抗体フラグメント種の産生に同等に適用する。以下に与えられた抗体または抗体フラグメントの産生のための全ての組み換え方法は、（１）所望の最終産物として一本鎖抗体種の製造；（２）単一宿主細胞における全てのサブユニットの産生による多重サブユニット抗体または抗体フラグメント種の製造、宿主細胞におけるサブユニットの組み立て、次いで任意に、培養培地中への多重サブユニット最終産物の宿主細胞分泌、並びに、宿主細胞および／または培養培地から多重サブユニット最終産物の回収；並びに（３）別個の宿主細胞におけるサブユニットの産生による多重サブユニット抗体または抗体フラグメントの製造（次いで任意に、培養培地へのサブユニットの宿主細胞分泌）、各宿主細胞および／または培養培地からのサブユニットの回収、次いで、多重サブユニット最終産物を形成するためのインビトロにおけるサブユニット組み立てを記載するために理解される。単一の宿主細胞において産生された多重サブユニット抗体または抗体フラグメントの場合、種々のサブユニットの産生は、単一ベクターに保有された多重ポリペプチドをコードする核酸配列の発現によって、あるいは、宿主細胞に含まれた多重ベクターに保有されたポリペプチドをコードする核酸配列の発現によってもたらされると認識される。
Ａ．ヒト化６Ｇ４．２．５モノクローナル抗体、抗体フラグメントおよび変異体をコードするＤＮＡの作製
上記方法に従って本発明のヒト化抗体または抗体フラグメントの選別をした後、当業者は所望の抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡを設計するために遺伝コードを用いることができる。ある実施態様では、発現宿主細胞によって好まれるコドンが、興味の向けられた抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡの設計において用いられる。所望の抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡが、当該技術分野において知られた種々の方法によって調製されうる。これらの方法は、トリエステル、亜リン酸塩、ホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホナート法のような、Engelsら，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,28:716-734（1989）に記載された方法による化学合成を含むが、これらに限定されるものでなく、その開示の全体を参照としてここに含める。
上記方法の変形は、遺伝子融合物の使用を考慮し、そこでは抗体または抗体フラグメントをコードする遺伝子が、ベクターにおいて、別のタンパクまたは別タンパクのフラグメントをコードする遺伝子と結合されている。これは、別のタンパクとの融合物として宿主細胞によって産生される抗体または抗体フラグメントを生じる。“別の”タンパクとは、多くの場合、細胞によって分泌されるタンパクまたはペプチドであり、培養培地から所望のタンパクを単離および生成することを可能にし、所望のタンパクが細胞の内部に残存している場合に生じる宿主細胞を破壊する必要性を除去する。あるいは、融合タンパクは、細胞間に発現されうる。高度に発現された融合タンパクを用いることが有利である。
遺伝子融合物の使用は、必須ではないが、大腸菌における異種タンパクの発現、次いでこれらの遺伝子産物の精製を容易にすることができる（Harris,T.J.R.in Genetic Engineering,Williamson,R.,Ed.,Academic,London,Vol.4,p.127（1983）;Uhlen,M.& Moks,T.,Methods Enzymol.185:129-143（1990））。プロテインＡ、特にプロテインＡのＺドメイン、のＩｇＧに対する結合が融合タンパクの精製のための“親和性の手”を与えることから、プロテインＡ融合物がよく用いられる（Nilsson,B.& Abrahmsen,L.Methods Enzymol.185:144-161（1990））。大腸菌で直接発現された場合には多くの異種タンパクが分解されるが、融合タンパクとして発現された場合には安定であることが示された（Marston,F.A.O.,Biochem J.240:1（1986））。
融合タンパクは、メチオニンで切断する臭化シアン、またはＡｓｎとＧｌｙとの間を切断するヒドロキシルアミンのような薬品を用いて切断されうる。標準的な組み換えＤＮＡ手法を用いて、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対が、抗体または抗体フラグメント遺伝子の５’末端の直前に挿入されてもよい。
あるいは、最近になって論評された融合タンパクのタンパク切断を用いることができる（Carter,P.（1990）in Protein Purification:From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes,Ladisch,M.R.,Willson,R.C.,Painton,C.C.,およびBuilder,S.E.,eds.,American Chemical Society Symposium Series No.427,Ch 13,181-193）。
Ｘａ因子、トロンビン、サブチリシンおよびこれらの変異体のようなプロテアーゼが、融合タンパクを切断するために幸運にも用いられてきた。通常は、用いられたプロテアーゼによる切断を受けるペプチドリンカーが、“別の”タンパク（例えばプロテインＡのＺドメイン）と、ヒト化抗ＩＬ−８抗体または抗体フラグメントのような関心の向けられたタンパクとの間に挿入される。組み換えＤＮＡ法を用いて、リンカーをコードするヌクレオチド塩基対が、別のタンパクをコードする遺伝子または遺伝子フラグメントの間に挿入される。適当なリンカーを含む部分的に精製された融合タンパクのタンパク切断は、天然の融合タンパク、または還元または変性された融合タンパクのいずれかにおいて行われ得る。
親のヒト化抗体または抗体フラグメントに関して結果として生じるタンパクのアミノ酸配列における付加、欠失または変更をコードする変異形ヒト化抗体または抗体フラグメントを産生するために用いられ得る種々の技術も利用できる。
例示として、手持ちのヒト化抗体または抗体フラグメントをコードする発現ベクターを用いて、部位特異的変異誘発（Kunkelら，Methods Enzymol.204:125-139（1991）;Carter,P.ら，Nucl.Acids.Res.13:4331（1986）;Zoller,M.J.ら，Nucl.Acids Res.10:6487（1982））、カセット式変異誘発（Wells,J.A.ら，Gene 34:315（1985））、制限選択変異誘発（Wells,J.A.ら，Philos.Trans,R.Soc.London SerA 317,415（1986））または別の既知の技術が、抗体または抗体フラグメントＤＮＡに対して行われてもよい。次いで変異形ＤＮＡは、上記発現ベクターに挿入することによって親ＤＮＡの代わりに用いることができる。変異ＤＮＡを備えた発現ベクターを含む宿主細菌の生育は、ここに記載されたように単離されうる、変異形ヒト化抗体または抗体フラグメントを産生させる。
Ｂ．クローニング媒体へのＤＮＡの挿入
さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクター中に、抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡが挿入される。多くのベクターを利用することができるが、適切なベクターの選別は、（１）それがＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現のために用いられるべきものかどうか、（２）ベクターに挿入されるべきＤＮＡのサイズ、並びに（３）ベクターを用いてトランスフォームされるべき宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）並びにそれが適合する宿主細胞に依存して、種々の成分を含む。ベクター成分は、一般的に、シグナル配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー、プロモーター、および転写終結配列の一つ以上を含むが、これらに限定されない。
（i）シグナル配列成分
一般的に、シグナル配列は、ベクターの成分であっても、またベクターに挿入された抗体または抗体フラグメントＤＮＡの一部であってもよい。好ましくは、異種シグナル配列が、対応する融合タンパクにおけるシグナル配列が、宿主細胞のタンパク分泌システム中で認識され、輸送され、かつプロセシング（すなわち、シグナルペプチダーゼによる切断）されるように、抗体または抗体フラグメントＤＮＡに選択または融合される。原核生物の宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーからなる群から選択される。好ましい実施態様において、STIIシグナル配列は、以下の実施例に記載されているように用いられる。酵母分泌のために、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス属およびクルイベロミセス属（kluyveromyces）α因子リーダーを含む）、あるいは酸性ホスファターゼリーダー、C.albicansグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載されたシグナルで置換されてもよい。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物のシグナル配列とウイルスの分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナル、を利用することができる。
（ii）複製起点成分
発現ベクターとクローニングベクターの両方が、一つ以上の選別された宿主細胞においてベクターが複製できるようにする核酸配列を含む。一般的に、クローニングベクターにおいては、この配列は、宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製できるようにする配列であって、複製起点または自立複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに使用できる。一般的に、複製起点成分は、哺乳動物の発現ベクターには必要とされない（初期プロモーターを含むことのみを理由として、一般的にＳＶ４０起点が用いられてもよい）。
殆どの発現ベクターは、“シャトル”ベクターであり、すなわち少なくとも一つのクラスの生物体で複製することができるが、発現用の別の生物体にトランスフェクトされることができる。例えば、ベクターが大腸菌でクローン化され、次いで、たとえ宿主細胞の染色体から独立に複製することはできないとしても、同じベクターが発現のために酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。
ＤＮＡは、宿主ゲノムへの挿入によって増幅されてもよい。これは、例えば、バチルス属のゲノムＤＮＡに見出される配列に相同なＤＮＡ配列をベクターに含めることにより、宿主としてバチルス属を用いて容易に行われる。このベクターを用いたバチルス属のトランスフェクションにより、ゲノムとの相同的組換え、および抗体または抗体フラグメントＤＮＡの挿入がもたらされる。
（iii）選択遺伝子成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むべきである。この遺伝子は、選択的培養培地において生育されたトランスフォームされた宿主細胞の生存または生育に必須のタンパクをコードする。選択遺伝子を含むベクターでトランスフォームされていない宿主細胞は、培養培地中で生存できない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン等の抗生物質またはその他の毒素に対する耐性を付与するタンパク、（ｂ）栄養素要求性欠損を補うタンパク、または（ｃ）例えばバチルス属のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のように、複合媒体から入手できない重大な栄養素を与えるタンパクをコードする。
選択機構の一例は、宿主細胞の生育を阻止する試薬を利用する。異種の遺伝子で首尾よくトランスフォームされた細胞は、薬剤耐性を付与するタンパクを発現し、かくして選択的条件を生き抜く。かかる優勢選択の例は、ネオマイシン（Southernら，J.Molec.Appl.Genet.,1:327（1982））、ミコフェノール酸（Mulliganら，Science,209:1422（1980））またはハイグロマイシン（Sugdenら，Mol.Cell.Biol.,5:410-413（1985））を用いる。上記３つの例は、適切な試薬に対する耐性を伝達するために、真核細胞の調節下に細菌の遺伝子を用いる（それぞれ、Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネティシン、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、およびハイグロマイシン）。
哺乳動物細胞に適した選択マーカーの別の例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼのような、抗体または抗体フラグメントの核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にするものである。哺乳動物細胞トランスフォーマントは、トランスフォーマントのみがマーカーを取り込んだことにより生存に唯一適するような選択圧力下に移される。選択圧力は、培地中の選択試薬の濃度が連続的に変化する条件下でトランスフォーマントを培養することによって付与され、それによって選択遺伝子と、抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡの両方の増幅を導く。増幅は、生育に重要なタンパクの産生に大いに必要性のある遺伝子が、組み換え細胞の連続する世代の染色体内に縦に一列に並んで繰り返されるような方法である。増大した量の抗体または抗体フラグメントは、増幅されたＤＮＡから合成される。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子を用いてトランスフォームされた細胞は、ＤＨＦＲの競争的なアンタゴニストである、メトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中で全てのトランスフォーマントを培養することによって最初に同定される。野生型のＤＨＦＲが用いられた場合の適切な宿主細胞は、UrlaubとChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216（1980）に記載されているように調製および繁殖された、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ラインである。トランスフォームされた細胞は、次いで、増大したレベルのメトトレキサートに曝される。これは、ＤＨＦＲ遺伝子の多重コピー、並びに、これに付随して、抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡのような発現ベクターを含む別のＤＮＡの多重コピーの合成を引き起こす。この増幅技術は、もし例えば、Ｍｔｘに高度に耐性のある変異ＤＨＦＲ遺伝子が用いられるのであれば、内因性ＤＨＦＲが存在するにもかかわらず、例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１  ＣＨＯ−Ｋ１等の他の点で適切な宿主と共に用いられる（欧州特許第１１７０６０号）。あるいは、抗体または抗体フラグメント、野生型ＤＨＦＲタンパク、およびアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような別の選択マーカーをコードするＤＮＡ配列を用いてトランスフォームまたはコトランスフォームされた宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８等のアミノグリコシド系抗生物質のような選択マーカーのための選択剤を含む培地における細胞生育によって選択されうる。米国特許第４９６５１９９号参照。
酵母において使用するための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Stinchcombら，Nature,282:39（1979）;Kingsmanら，Gene,7:141（1979）;またはTschemperら，Gene,10:157（1980）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１のような、トリプトファン中で生育する能力を欠いた酵母の変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones,Genetics,85:12（1977）。酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの不在下で生育することによりトランスフォーメーションの検出に有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０６２２または３８６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補足される。
（iv）プロモーター成分
通常、発現ベクターは、宿主生物体によって認識され、抗体または抗体フラグメント核酸に実施可能に結合されたプロモーターを含む。プロモーターは、それらが実施可能に結合した、抗体または抗体フラグメントをコードする配列のような特定の核酸配列の転写および翻訳を調節する、構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）（一般的に約１００から１０００ｂｐ以内）に配置された翻訳されない配列である。このようなプロモーターは、通常、二つのクラス、すなわち誘導性のものと構成的なものとに分けられる。誘導性プロモーターは、例えば栄養素の存在または不在、もしくは温度変化等の培養条件の変化に応じて、その調節下にあるＤＮＡからの増大したレベルの転写を開始するプロモーターである。現在、種々の潜在的な宿主細胞によって認識された大量のプロモーターが周知である。
真核性の宿主を用いた使用に適したプロモーターは、β−ラクタマーゼとラクトースプロモーターシステム（Changら，Nature,275:615（1978）;およびGoeddelら，Nature,281:544（1979））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Goeddel,Nucleic Acids Res.,8:4057（1980）および欧州特許第３６７７６号）およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター（deBoerら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25（1983））を含む。しかしながら、その他の既知の細菌性プロモーターが適している。それらのヌクレオチド配列が公表されており、それによって、当業者が、必要なあらゆる制限部位を供給するためにリンカーまたはアダプターを用いて、抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡにそれらを実施可能に連結することが可能である（Siebenlistら，Cell,20:269（1980））。また、細菌のシステム中で用いられるプロモーターは、一般的に、抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡに実施可能に結合したシャイン-ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
酵母宿主を用いた使用に適したプロモーター配列は、３−ホスホグリセラートキナーゼ（Hitzemanら，J.Biol.Chem.,255:2073（1980））または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスファートジヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような、他の解糖酵素（Hessら，J.Adv.Enzyme Reg.,7:149（1968）;およびHolland,Biochemistry,17:4900（1978））のプロモーターを含む。
生育条件によって調節された転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである、別の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に係る分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースとガラクトース利用の原因となる酵素のプロモーター領域である。酵母発現における使用に適したベクターおよびプロモーターは、Hitzemanら，欧州特許公開第７３６５７号公報にさらに記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターと共に有利に用いられる。
プロモーター配列は、真核生物について知られている。実質的に全ての真核性遺伝子は、転写が開始される部位から約２５から３０塩基上流に位置したＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始点から７０から８０塩基上流に見出される別の配列は、ＸがどんなヌクレオチドでもよいＣＸＣＡＡＴ領域である。殆どの真核性遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端に対するポリＡテールの付加のためのシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列が存在する。これらの全ての配列が、哺乳動物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞における抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡのベクターが誘導した転写は、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開された英国特許第２２１１５０４号）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、そして最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られたプロモーター、例えばアクチンプロモーターまたはイムノグロブリンプロモーターのような異種の哺乳動物プロモーター、並びに、宿主細胞システムに適合するという条件で熱ショックプロモーターによって調節されうる。
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をも含むＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られる。Fierら，Nature,273:113（1978）;MulliganとBerg,Science,209:1422-1427（1980）;Pavlakisら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:7398-7402（1981）。ヒトのサイトメガロウイルスの即時型初期プロモーターは、HindIII E制限フラグメントとして都合よく得られる。Greenawayら，Gene,18:355-360（1982）。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いて哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるシステムは米国特許第４４１９４４６号に開示されている。このシステムの変更については米国特許第４６０１９７８号に記載されている。また、サルの細胞における免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡの発現については、Grayら，Nature,295:503-508、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターの調節下における、マウス細胞におけるヒト−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Reyesら，Nature,297:598-601（1982）、培養されたマウスおよびウサギ細胞におけるヒトインターフェロン１遺伝子の発現については、CanaaniとBerg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:5166-5170（1982）、プロモーターとしてラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列を用いた、ＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞における細菌性ＣＡＴ配列の発現については、Gormanら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:6777-6781（1982）を参照。
（v）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物宿主細胞による抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増大させられる。エンハンサーは、通常は約１０−３００ｂｐのシス作動性エレメントであり、その転写を増大するプロモーターに作用する。エンハンサーは、イントロンの内部（Banerjiら，Cell,33:729（1983））並びにコード配列そのものの内部（Osborneら，Mol.Cell Bio.,4:1293（1984））において、転写単位の５’（Laiminsら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:993（1981））および３’（Luskyら，Mol.Cell Bio.,3:1108（1983））に見出され、比較的向きと位置に無関係である。多くのエンハンサー配列は、現在、哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、−フェトプロテインおよびインスリン）から分かっている。しかしながら、通常は、真核細胞ウイルスのエンハンサーを用いるだろう。例として、複製起点の後部のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後部のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化の増強エレメントについては、Yaniv,Nature,297:17-18（1982）を参照。エンハンサーは、抗体または抗体フラグメントＤＮＡの５’または３’位においてベクターにスプライスされてもよいが、プロモーターの５’部位に位置することが好ましい。
（vi）転写終結成分
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または別の多細胞生物の有核細胞）に用いられた発現ベクターは、転写終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含むことができる。一般に、このような配列は、真核またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、また時に３’未翻訳領域から入手できる。これらの領域は、抗体または抗体フラグメントをコードするｍＲＮＡの未翻訳部におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。３’未翻訳領域は、転写終結部位も含む。
一つ以上の上記成分と所望のコードおよび調節配列とを含む適切なベクターは、標準的なリゲーション技術によって作製される。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、所望のプラスミドを産生するために、所望の形態に切断、調節、再連結される。
作製されたプラスミドに適切な配列を確認するための分析として、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）をトランスフォームするためにリゲーション混合物が用いられ、成功したトランスフォーマントが、適切であればアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択される。トランスフォーマントのプラスミドが、調製され、制限エンドヌクレアーゼ分解によって分析され、かつ／またはMessingら，Nucleic Acids Res.,9:309（1981）の方法、またはMaxamら，Methods in Enzymology,65:499（1980）の方法によって配列決定される。
本発明の実施において特に有益なものは、抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現を提供する発現ベクターである。一般的に、一過性発現は、宿主細胞が多くのコピーの発現ベクターを蓄積し、この発現ベクターにコードされた所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞において効率的に複製することができる発現ベクターの使用を含む。
組み換え脊椎動物細胞培養における抗体または抗体フラグメントの合成への適合に適した別の方法、ベクター、および宿主細胞は、Gethingら，Nature,293:620-625（1981）;Manteiら，Nature,281:40-46（1979）;Levinsonら，欧州特許第１１７０６０号；および欧州特許第１１７０５８号に記載されている。ＩｇＥペプチドアンタゴニストの哺乳動物細胞培養物発現のために特に有益なプラスミドは、ｐＲＫ５（欧州特許公開第３０７２４７号）またはｐＳＶ１６Ｂ（１９９１年６月１３日に公表された国際出願ＷＯ９１／０８２９１）である。
Ｃ．宿主細胞の選択とトランスフォーメーション
ここでベクターをクローニングまたは発現するのに適切な宿主細胞は、上記の原核細胞、酵母、または高等真核生物細胞である。適切な原核細胞は、例えば大腸菌、枯草菌（B.subtilis）のようなバチルス属、緑膿菌（P.aeruginosa）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）またはレイ菌（Serratia marcescens）のようなシュードモナス属のようなグラム陰性またはグラム陽性生物のような真正細菌を含む。一つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のような別の株も適している。これらの例は例証であって、限定するものではない。好ましくは宿主細胞は、最小量のタンパク分解酵素を分泌すべきである。好ましい実施態様では、大腸菌株４９Ｄ６は、以下の実施例に記載されているように発現宿主として用いられる。細菌宿主細胞における抗体の組み換え産生について記載した文献は、Skerraら，Curr.Opinion in Immunol.,5:256（1993）とPluckthun,Immunol.Revs.,130:151（1992）を含む。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核生物の微生物が、抗体または抗体フラグメントＤＮＡを含むベクターに適した宿主である。しかしながら、S.pombe（BeachとNurse,Nature,290:140（1981））、Kluyveromyces lactis（Louvencourtら，J.Bacteriol.,737（1983））、yarrowia（欧州特許出願第４０２２２６号）、Pichia pastoris（欧州特許出願第１８３０７０号）、Trichoderma reesia（欧州特許出願第２４４２３４号）、Neurospora crassa（Caseら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5259-5263（1979））、およびA.nidulansのようなアスペルギルス属宿主（Ballanceら，Biochem.Biophys.Res.Commun.,112:284-289（1983）;Tulburnら.,Gene,26:205-221（1983）;Yeltonら.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:1470-1474（1984））およびA.niger（KellyとHynes,EMBO J.,4:475-479（1985））のような、多数の別の属、種および株が、一般に入手でき、かつ有益である。
また、多細胞生物から誘導された宿主細胞が、抗体または抗体フラグメントの組み合わせ産生において用いられてもよい。このような宿主細胞は、複合プロセシングおよびグリコシル化活性を行うことができる。原則として、脊椎動物または無脊椎動物培養物から、あらゆる高等真核細胞培養物が利用できる。無脊椎動物の例は植物および昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株および変異体、並びにSpodoptera frugiperda（チョウ・ガ類幼生）、Aedes aegypti（蚊）、Aedes albopictus（蚊）、Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）およびカイコ宿主細胞のような宿主からの対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。例えば、Luckowら，Bio/Technology,6:47-55（1988）;Millerら，Genetic Engineering,Setlow,J.K.ら，8:277-279（Plenum Publishing,1986）,およびMaedaら，Nature,315:592-594（1985）を参照。例えば、Autographa californica NPVのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株のような、種々のウイルス株が公的に入手でき、そのようなウイルスは、特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、本発明に従ってここでウイルスとして用いることができる。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物を宿主として利用することができる。通常、植物は、抗体または抗体フラグメントＤＮＡを含むように予め操作された、バクテリウム属Agrobacterium tumefaciensのある株とインキュベーションすることによってトランスフェクトされる。A.tumefaciensを用いた植物細胞培養物のインキュベーション中に、抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡは、トランスフェクトされて、適切な条件下で抗体または抗体フラグメントＤＮＡを発現するように、植物細胞宿主に移される。さらに、ノパリン合成酵素プロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような、植物細胞に適合した調節およびシグナル配列を入手することができる。Depickerら，J.Mol.Appl.Gen.,1:561（1982）。さらに、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から単離されたＤＮＡセグメントは、組み換えＤＮＡ含有植物組織における植物が発現できる遺伝子の転写レベルを活性化または増加することができる。１９８９年６月２１に公開された欧州特許出願第３２１１９６号を参照。
脊椎動物細胞培養物は、全長の抗体の組み換え産生に好ましい。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、近年になって定まった方法になった（Tissue Culture,Academic Press,KruseとPatterson,editors（1973））。使用できる哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０でトランスフォームされたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓系（２９３または懸濁培養における生育のためにサブクローン化された２９３細胞，Grahamら，J.Gen Virol.,36:59（1977））;新生児ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、UrlaubとChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216（1980））;マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251（1980））;サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌの腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Matherら，Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68（1982））;ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーム細胞系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。好ましい宿主細胞は、ヒト胚腎細胞２９３とチャイニーズハムスター卵巣細胞である。他にイムノグロブリンタンパクを産生しないミエローマ細胞も、全長の抗体の組み換え産生に有益な宿主細胞である。
宿主細胞は、本発明の上記発現またはクローニングベクターを用いてトランスフェクト、および好ましくはトランスフォームされ、プロモーターを誘導し、トランスフォーマントを選択し、あるいは所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように変更された慣例的な栄養培地中で培養される。
トランスフェクションとは、コード配列が実際に発現されているか否かによらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを指す。例えば、ＣａＰＯ4沈殿析出および電気穿孔法のようなトランスフェクションの多数の方法が当業者に知られている。このベクターの操作の何らかの示唆が宿主細胞内に生じた場合に、成功したトランスフェクションが一般的に認識される。
トランスフォーメーションは、染色体外エレメントとして、または染色体構成要素によって、ＤＮＡが複製可能であるように、ＤＮＡを生物体に導入することを意味する。用いられた宿主細胞に依存して、トランスフォーメーションは、上記細胞に適した標準的な技術を用いて行われる。上掲したSambrookらのセクション１．８２に記載されているように、一般に、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理が、堅固な細胞壁バリアを含む原核生物またはその他の細胞に対して用いられる。Agrobacterium tumefaciensを用いた感染は、Shawら，Gene,23:315（1983）と１９８９年６月２９日に公開された国際出願第８９／０５８５９号に記載されているように、ある植物細胞のトランスフォーメーションのために用いられる。このような細胞壁を持たない哺乳動物細胞について、Sambrookら、上掲のセクション１６．３０−１６．３７に記載されたリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞宿主システムトランスフォーメーションの一般的な態様は、１９８３年８月１６日に公表された米国特許出願第４３９９２１６号においてAxelによって記載されている。酵母へのトランスフォーメーションは、通常、Van Solingenら，J.Bact.,130:946（1977）とHsiaoら，Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,76:3829（1979）の方法に従って行われる。しかしながら、核注入、電気穿孔法またはプロトプラスト融合のような細胞にＤＮＡを導入する別の方法も用いることができる。
Ｄ．宿主細胞の培養
抗体または抗体フラグメントを産生するために用いられる原核細胞は、上掲のSambrookらに一般的に記載されている適切な培地中で培養される。
抗体または抗体フラグメントを産生するために用いられた哺乳動物宿主細胞は、種々の培地中で培養されうる。Ham’s F10（Sigma）、Minimal Essential Medium（（MEM）,Sigma）、RPMI-1640（Sigma）およびDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（（DMEM）,Sigma）のような商業的に入手可能な培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、HamとWallace,Meth.Enz.,58:44（1979）、BarnesとSato,Anal.Biochem.,102:255（1980）、米国特許出願第４７６７７０４号；第４６５７８６６号；第４９２７７６２号；または第４５６０６５５号；国際特許出願第９０／０３４３０号；国際特許出願第８７／００１９５号；米国特許第３０９８５号；または米国特許出願第５１２２４６９号に記載されているあらゆる培地、これら全ての開示内容が参照としてここに含められ、宿主細胞の培養培地として用いられてもよい。これらの培地のいずれも、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシンとチミジン）、抗生物質（例えばGentamycinTM剤）、微量元素（ミクロモル範囲の終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは等価のエネルギー源が必須成分として補足されてもよい。別のあらゆる必須補足成分も、当業者に知られた適切な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞を用いて以前に用いられていたものであり、当業者には自明である。
この開示内容に言及された宿主細胞は、インビトロ培養における細胞と宿主動物内に存在する細胞とを含む。
Ｅ．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅および／または発現は、ここで提供された配列に基づいて、適切にラベルされたプローブを用いて、例えば、慣例的なサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノザンブロッティング（Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205（1980））、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュ・ハイブリダイゼーションによって、直接的にサンプル中で測定されてもよい。種々のラベル、すなわち最も一般的な放射性同位元素、例えば32Ｐが用いられてもよい。しかしながら、ポリヌクレオチドに導入するためにビオチン修飾ヌクレオチドを用いるように、別の技術が用いられてもよい。次いで、ビオチンは、アビジンまたは抗体に結合するための部位として作用し、これらは放射性核種、蛍光体、酵素等のような広範囲のラベルで標識されてもよい。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いてもよい。反対に抗体がラベルされてもよく、表面に二本鎖を形成した際に、二本鎖に結合した抗体が検出されるように、表面に二本鎖が結合しているアッセイが行われてもよい。
あるいは、遺伝子産物の発現を直接定量するために、遺伝子発現が、組織断片の免疫組織化学的染色および細胞培養物または体液のアッセイのような免疫学的方法によって測定されてもよい。免疫組織化学的染色技術を用いて、細胞サンプルは、通常は、脱水および固定化、次いで遺伝子産物に特異的なラベルされた抗体との反応によって調製される。通常、ラベルは、酵素的ラベル、蛍光ラベル、発光ラベル等の視覚的に検出可能なラベルである。本発明における使用に適した特に敏感な染色技術は、Hsuら，Am.J.Clin.Path.,75:734-738（1980）に記載されている。
Ｆ．抗体または抗体フラグメントの精製
宿主細胞分泌システムの場合、抗体または抗体フラグメントは培養培地から回収される。あるいは、抗体は細胞内、または、細菌宿主細胞のペリプラズムに産生されうる。もし抗体が細胞内に産生されるのであれば、第一段階として、宿主細胞が溶解され、例えば遠心または限外濾過によって得られた微粒子状の破片が除去される。Carterら，Bio/Technology 10:163-167（1992）は、大腸菌のペリプラズム分泌された抗体を単離する方法を記述している。要約すると、細胞ペーストを、約３０分間、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）の存在下で溶解する。細胞の破片は遠心によって除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、このような発現システムからの上清が、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットのような、商業的に入手可能なタンパク濃縮フィルターを用いて、一般的に最初に濃縮される。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害因子が、タンパク分解を阻害するために上記段階のいずれかにおいて含まれてもよく、また抗生物質が偶発的な混入物の生育を妨げるために含まれてもよい。
細胞から調製された抗体組成物は、例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析および親和クロマトグラフィーを用いて精製することができ、ここで親和クロマトグラフィーは好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在するあらゆるイムノグロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づいて、抗体を精製するために用いることができる（Lindmarkら，J.Immunol.Meth.62:1-13（1983））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に推奨される（Gussら，EMBO J.5:15671575（1986））。親和性リガンドが付着したマトリックスは、多くの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用できる。調節された多孔質ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いた場合よりも早い流速および短いプロセシング時間とすることができる。抗体がＣH３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXTM樹脂（J.T.Baker,Phillipsburg,NJ）を精製に使用することができる。イオン交換カラムにおける分離、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースTMにおけるクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）におけるクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿のようなタンパク精製のためのその他の技術も、回収されるべき抗体に依存して利用できる。
いずれかの予備精製段階の後で、関心の向けられた抗体と混入物とを含む混合物は、好ましくは低塩濃度（例えば約０−０．２５Ｍの塩）で行われる、約２．５−４．５の間のｐＨの溶出バッファーを用いた低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに処されてもよい。
Ｇ．抗体フラグメントの産生
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨまたはＦ（ａｂ’）2フラグメントを含む本発明のヒト化抗体フラグメントの産生のために、種々の技術が開発されてきた。伝統的に、これらのフラグメントは完全な抗体のタンパク分解を介して誘導された（例えば、Morimotoら，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117（1992）およびBrennanら，Science,229:81（1985）を参照）。しかしながら、これらのフラグメントは、組み換え宿主細胞によって直接的に産生することができる。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接的に回収することができ、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを形成するために化学的に結合されうる（Carterら，Bio/Technology,10:163-167（1992））。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、組み換え宿主細胞培養物から直接的に単離されうる。抗体フラグメントの産生のための別の技術は、当業者に自明であろう。
５．抗ＩＬ−８抗体の使用
Ａ．診断的使用
ＩＬ−８の検出または定量を必要とする診断的適用のために、本発明の抗体または抗体フラグメントは、通常、検出可能な分子でラベルされる。検出可能な分子は、直接または間接的に、検出可能なシグナルを産生することができるあらゆるものとすることができる。例えば、検出可能な分子は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓまたは125Ｉのような放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリンのような蛍光または化学発光化合物；例えば125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、または3Ｈのような放射活性同位体ラベル；あるいはアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素とすることができる。
検出可能な分子に抗体または抗体フラグメントを別個に結合するための当該技術分野において知られたあらゆる方法を用いることができ、Hunterら，Nature 144:945（1962）;Davidら，Biochemistry 13:1014（1974）;Painら，J.Immunol.Meth.40:219（1981）;およびNygren,J.Histochem.and Cytochem.30:407（1982）に記載されている方法を含む。
本発明の抗体および抗体フラグメントは、競争的結合アッセイ、直接および間接サンドウィッチアッセイ、および免疫沈降アッセイのような、既知のアッセイ方法において用いることができる。例えば、Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,pp147-158（CRC Press,Inc.,1987）参照。
競争的結合アッセイは、ラベルが付された標準（ＩＬ−８またはその免疫学的反応性部位とすることができる）が、限定された量の抗体または抗体フラグメントと結合することについて、試験サンプルアナライト（ＩＬ−８）と競合し得る能力によるものである。試験サンプルにおけるＩＬ−８の量は、抗体に結合する標準の量に反比例する。結合した標準の量を調べやすくするために、抗体に結合した標準およびアナライトを、未結合の標準およびアナライトから容易に分離できるように、一般に、競合の前後において抗体または抗体フラグメントが不溶性である。
サンドウィッチアッセイは二つの抗体の使用を含み、各抗体は、検出されるべきタンパク（ＩＬ−８）の異なる抗原部位、すなわちエピトープに結合することができる。サンドウィッチアッセイにおいて、テストサンプルアナライトは、固相に固定されている第一抗体に結合され、その後第二抗体がアナライトに結合し、かくして不溶性の３部複合体を形成している（米国特許出願第４３７６１１０号）。第二抗体は、それ自身が検出可能な分子でラベルされてもよく（直接サンドウィッチアッセイ）、検出可能な分子でラベルされた抗イムノグロブリン抗体を用いて測定されてもよい（間接サンドウィッチアッセイ）。例えば、サンドウィッチアッセイの一種はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な分子は酵素である（例えば、ホースラディシュペルオキシダーゼ）。
ＩＬ−８抗体および抗体フラグメントは、組み換え細胞培養物または天然源からのＩＬ−８の親和精製のために使用することもできる。例えば、これらの抗体は、培養上清または組織のような源からＩＬ−８を精製するために当該技術分野において周知の技術によって固体支持体に固定することができる。
Ｂ．治療用組成物および抗ＩＬ−８抗体の投与
本発明のヒト化抗ＩＬ−８抗体および抗体フラグメントは、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、循環血液量減少性ショック、潰瘍性大腸炎および慢性関節リウマチのような炎症疾患の処置に使用することができる。
ヒト化抗ＩＬ−８抗体および抗体フラグメントの治療的製剤は、凍結乾燥されたケークまたは水溶液の形態に、任意に生理学的に許容されるキャリアー、賦形剤または安定剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences，上掲）と、所望の程度の純度を備えた抗体または抗体フラグメントとを混合することによって、貯蔵用に調製される。許容できるキャリアー、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および濃度において受容者に対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリンのようなタンパク；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類および、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／またはTween、Pluronicsまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
インビボ投与に用いられるヒト化抗ＩＬ−８ｍＡｂまたは抗体フラグメントは、無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後において、無菌濾過膜を介して濾過することによって容易に達成される。ヒト化抗ＩＬ−８ｍＡｂまたは抗体フラグメントは、通常、凍結乾燥された形態または溶液の形態で貯蔵される。
治療用のヒト化抗ＩＬ−８ｍＡｂまたは抗体フラグメント組成物は、一般的に、例えば、静脈注射溶液バッグまたは皮下用注射針によって刺し通すことができるストッパーを備えたバイアルのような、無菌連絡口を備えた容器に収容される。
ヒト化抗ＩＬ−８ｍＡｂまたは抗体フラグメントの投与経路は、既知の方法、例えば、静脈、腹腔内、大脳内、筋内、眼内、動脈内または病変内経路、浣腸または坐剤、あるいは、以下に示すような持続作用性システムによる吸入、注入または輸液のような既知の方法を用いて行われる。好ましくは、抗体は全身的または炎症部位に投与される。
持続作用性調製物の適切な例は、例えばフィルムまたはマイクロカプセルのような形状が付された物品の形態の半透過性ポリマーマトリックスを含む。持続作用性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許出願第３７７３９１９号、欧州特許出願第５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタマートとのコポリマー（Sidmanら，Biopolymers 22:547（1983））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）（Langerら，J.Biomed.Mater.Res.15:167（1981）とLanger,Chem.Tech.12:98（1982））、エチレンビニルアセタート（Langerら，上掲）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願第１３３９８８号）を含む。また、持続作用性ヒト化抗ＩＬ−８抗体または抗体フラグメント組成物は、リポソームに収容された抗体または抗体フラグメントを含む。抗体または抗体フラグメントを含むリポソームは、それ自身知られた方法によって調製される：独国特許出願第３２１８１２１号；Epsteinら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3688（1985）;Hwangら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:4030（1980）;欧州特許出願第５２３２２号；欧州特許出願第３６６７６号；欧州特許出願第８８０４６号；欧州特許出願第１４３９４９号；欧州特許出願第１４２６４１号；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許出願第４４８５０４５号および第４５４４５４５号；および欧州特許出願第１０２３２４号。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０モルパーセントより大きいコレステロールを含む小さい（約２００−８００オングストローム）単層型であり、この選択された割合は、最も効果の高い抗体または抗体フラグメント治療用に調節されている。
治療に用いられるヒト化抗ＩＬ−８抗体または抗体フラグメントの“有効量”は、例えば、治療対象、治療経路、および患者の状態に依存する。従って、最適な治療効果を得るために必要であれば、治療専門家は、投与量を評価し、投与経路を変更することが必要とされる。通常、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に至るまで、ヒト化抗ＩＬ−８抗体または抗体フラグメントを投与する。この治療の経過は、慣例的なアッセイによって容易に監視される。
本発明のヒト化抗ＩＬ−８抗体または抗体フラグメントを用いた炎症疾患の処置および予防において、抗体組成物は、優れた診療に一致した形式で、製剤化、投薬および投与される。このような関係において考慮すべきファクターは、治療される個々の疾患、治療される個々の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、疾患の原因、抗体の輸送部位、抗体の個々のタイプ、投与の方法、投与のスケジュール、並びに医師に知られている別のファクターを含む。投与されるべき抗体の“治療に有効な量”は、上記の考慮によって決定され、急性または慢性の呼吸性疾患を処置すること、並びに、炎症反応を低減することを含む、炎症疾患を予防、改善、または治療するために必要な最小量である。このような量は、宿主に毒性であるか、あるいは宿主を感染に対して顕著に敏感にする量以下であることが好ましい。
一般的な提案として、投与量当たり非経口的に投与される抗体または抗体フラグメントの最初の薬学的に有効な量は、一日当たり患者の体重に対して約０．１から５０ｍｇ／ｋｇの範囲とされ、使用される抗体の典型的な最初の範囲は０．３から２０ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは０．３から１５ｍｇ／ｋｇ／日である。
しかしながら、上述したように、これらの示唆された抗体または抗体フラグメントの量は、治療上の判断に大きく左右される。適切な投与量およびスケジュールを選択する際のキーファクターは、上述したような得られた結果である。
抗体または抗体フラグメントは、必ずしも必要ではないが、任意に、問題の炎症疾患を予防または治療するために現在用いられている一つ以上の薬剤と共に製剤される。例えば、慢性関節リウマチでは、抗体は、グルココルチコステロイドと合わせることができる。このような別の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体または抗体フラグメントの量、疾患または処置のタイプ、並びに上記別のファクターに依存する。これらは、一般的に、上記と同じ投与量および投与経路、あるいはこれまでに用いられた投与量の約１から９９％で用いられる。
以下の実施例は、例示的なものであって、限定的に示されたものではない。明細書中に引用された全ての参考文献の開示、並びにこのような参考文献中の全ての引用文献の開示を、明らかに参照としてここに含める。
実施例
Ａ．ヒトＩＬ−８に対するモノクローナル抗体の生成と特徴付け
Balb/cマウスを、MPL/TDM（Ribi Immunochem.Research Inc.,Hamilton,MT）に再懸濁された１０μｇの組み換えヒトＩＬ−８（ユビキチン（HebertらJ.Immunology 145:3033-3040（1990））を有する（ｓｅｒ−ＩＬ−８）72の融合物として産生され；ＩＬ−８はPeproTech,Inc.,Rocky Hill,NJから商業的に入手可能）を用いて、後ろ足または腹腔内に免疫し、同量のＩＬ−８を用いて二度ブーストした。これらの実験において、“ＩＬ−８”は、他に明記しなければ、（ｓｅｒ−ＩＬ−８）72を意味する。１０μｇのＩＬ−８の最終ブーストは、融合前３日間与えられた。脾臓細胞または膝窩リンパ節細胞を、上記したように３５％のポリエチレングリコールを用いて、ミエローマP3X63Ag8の非分泌性クローンであるマウスミエローマP3X63Ag8U.1（ATCC CRL1597）と融合した。融合後１０日間、培養上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−８に対するモノクローナル抗体の存在についてスクリーンした。
ＥＬＩＳＡは以下のように行った。Nunc96ウェルイムノプレート（Flow Lab,McLean,VA）を、４℃で一夜、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２μｇ／ｍｌのＩＬ−８の５０μｌ／ウェルを用いて被覆した。以後の工程は、室温で行われた。非特異的結合部位は、１時間（ｈｒ）、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロックされた。次いで、プレートは、６７２の生育親融合ウェルからの５０μｌ／ウェルのハイブリドーマ培養上清を用いて１ｈｒインキュベートされた後、１ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶液のアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇ（Tago Co.,Foster City,CA）の１：１０００希釈物の５０μｌ／ウェルと１ｈｒインキュベートした。プレートに結合した酵素結合抗体のレベルは、炭酸水素ナトリウムバッファー中の０．５ｍｇ／ｍｌのｒ−ニトロフェニルホスファート、ｐＨ９．６の１００μｌ／ウェルを添加することによって調べられた。呈色反応が、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Titertrek Multiscan,Flow Lab,McLean,VA）を用いて４０５ｎｍにおいて測定された。各工程の間に、０．０５％Tween20を含むＰＢＳ中で３回洗浄した。
対照培地よりも４倍以上のＩＬ−８の結合を引き起こした培養上清が、陽性であるとして選択された。この基準に従って、６７２生育親融合ウェルの１６（２％）が陽性であった。これらの陽性ハイブリドーマ細胞系は、限界希釈法を用いて少なくとも２度クローン化された。
７つの陽性ハイブリドーマを、以下のようにしてさらに特徴付けした。モノクローナル抗体のアイソタイプは、Nunc96ウェルイムノプレート（Flow Lab,McLean,VA）をＩＬ−８を用いて一晩被覆し、ＢＳＡでブロックし、培養上清とインキュベートし、所定量のアイソタイプ特異的アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇ（Fisher Biotech,Pittsburgh,PA）を添加することによって調べられた。プレートに結合した結合抗体のレベルは、上述したようにｒ−ニトロフェニルホスファートを添加することによって調べられた。
試験された全てのモノクローナル抗体は、ＩｇＧ1またはＩｇＧ2イムノグロブリンアイソタイプに属していた。これらのモノクローナル抗体を含む腹水液は、ＥＬＩＳＡにおいて結合する最大の５０％を与えた希釈ファクターの逆数によって調べると、１００００から１０００００の範囲で抗体力価を有する。
これらのモノクローナル抗体が同じエピトープに結合したかどうかを評価するために、競争結合ＥＬＩＳＡを行った。ビオチニル化ｍＡｂと未標識のｍＡｂの割合が１：１００のときに、ビオチニル化ｍＡｂ５．１２．１４の結合は、ｍＡｂ４．１．３によってではなく、その相同的ｍＡｂによって顕著に阻害され、一方、ビオチニル化ｍＡｂ４．１．３の結合は、ｍＡｂ５．１２．１４によってではなく、ｍＡｂ４．１．３によって阻害された。モノクローナル抗体５．２．３はｍＡｂ４．１．３と同じように挙動し、一方、モノクローナル抗体４．８および１２．３．９はｍＡｂ５．１２．１４に類似している。かくして、ｍＡｂ４．１．３およびｍＡｂ５．２．３は、モノクローナル抗体１２．３．９、４．８および５．１２．１４に認識されたエピトープとは異なるエピトープに結合する。
イムノドットブロット解析を、ニトロセルロースペーパー上に固定されたＩＬ−８に対する抗体反応性を評価するために行った。対照マウスＩｇＧ抗体は認識しなかったが、全部で７つの抗体がペーパーに固定されたＩＬ−８を認識した。
これらのモノクローナル抗体が可溶性125Ｉ−ＩＬ−８を捕獲する能力が、放射性免疫沈降試験（ＲＩＰ）によって評価された。要約すると、トレーサー125Ｉ−ＩＬ−８（４ｘ１０4ｃｐｍ）が、０．５％のＢＳＡと０．０５％のTween20を含む０．２ｍｌのＰＢＳ（アッセイバッファー）において、モノクローナル抗ＩＬ−８抗体の種々の希釈物と室温で１ｈｒインキュベートされた。１００マイクロリットルの所定の濃度のヤギ抗マウスＩｇ抗血清（Pel-Freez,Rogers,AR）を添加し、この混合物を室温で１ｈｒインキュベートした。免疫複合体を、４℃に保たれた０．５ｍｌの６％ポリエチレングリコール（分子量８０００）を添加して沈降させた。４℃で２０００ｘｇで２０分間遠心した後に、上清を吸引して除去し、沈殿に残る放射活性をガンマカウンターでカウントした。特異的結合のパーセントを、（沈殿のｃｐｍ−バックグラウンドのｃｐｍ）／（全ｃｐｍ−バックグラウンドのｃｐｍ）に従って計算した。モノクローナル抗体４．１．３、５．２．３、４．８、５．１２．１４および１２．３．９は、非常に効率的に125Ｉ−ＩＬ−８を捕獲し、一方、抗体９．２．４および８．９．１は、ＥＬＩＳＡプレートに被覆されたＩＬ−８に結合できたにもかかわらず、ＲＩＰ中の可溶性125Ｉ−ＩＬ−８を捕獲できなかった（表Ｉ）。
これらのモノクローナル抗体の分離定数は、競争結合ＲＩＰアッセイを用いて調べられた簡単に言うと、種々の量の未標識ＩＬ−８による、125Ｉ−ＩＬ−８（アッセイ当たり２００００−４００００ｃｐｍ）に対する各抗体の結合の競争阻害が、上記ＲＩＰによって調べられた。各ｍＡｂの分離定数（親和性）は、VersaTerm-PROコンピュータープログラム（Synergy Software,Reading,PA）に与えられているようなスキャッチャードプロット解析（Munson，ら，Anal.Biochem.107:220（1980））を用いて調べられた。これらのモノクローナル抗体（９．２．４と８．９．１を除く）のＫｄは、２ｘ１０-8から３ｘ１０-10Ｍの範囲であった。Ｋｄが３ｘ１０-10Ｍであるモノクローナル抗体５．１２．１４は、試験された全てのモノクローナル抗体の中で最も高い親和性を示した（表３）。
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上記モノクローナル抗体のＩＬ−８活性を中和する能力を評価するために、種々の量の培養上清の存在下でヒトの好中球および精製されたモノクローナル抗体に結合した125Ｉ−ＩＬ−８の量が測定された。好中球は、Mono-Poly Resolving Medium（M-PRM）（Flow Lab.Inc.,McLean,VA）を用いて調製された。簡単に言うと、新鮮で、ヘパリンが添加されたヒトの血液が、血液対培地が３．５：３．０の比率でＭ−ＰＲＭに添加され、室温で３０分間３００ｘｇで遠心された。中間層に濃縮された好中球は、回収されＰＢＳで一度洗浄された。このような調製物は、Wright’s Giemsa染色に従って９５％以上の好中球を決まって含む。レセプター結合アッセイは以下のようにして行われた。５０μｌの125Ｉ−ＩＬ−８（５ｎｇ／ｍｌ）は、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中の、５０μｌの未標識のＩＬ−８（１００μｇ／ｍｌ）またはモノクローナル抗体を用いて、室温で３０分間インキュベートされた。この混合物は、３７℃で１５分間、１００μｌの好中球（１０7細胞／ｍｌ）とインキュベートされた。結合した125Ｉ−ＩＬ−８は、２０％のショ糖と０．１％のＢＳＡとを含むＰＢＳの０．４ｍｌに混合物を添加し、３００ｘｇで１５分間遠心することにより未結合物質から分離された。上清を吸引により除去し、沈殿物の放射活性をガンマカウンターでカウントした。
モノクローナル抗体４．１．３、５．２．３、４．８、５．１２．１４および１２．３．９は、ＩＬ−８とｍＡｂとが１：２５のモル比であるときに、ヒト好中球に対するＩＬ−８の結合の８５％以上を阻害した。一方、モノクローナル抗体９．２．４および８．９．１は、ヒト好中球上のレセプターに対するＩＬ−８の結合を増強するらしい。対照マウスＩｇＧも、好中球に対するＩＬ−８の結合を増幅したので、ｍＡｂ９．２．４と８．９．１によるレセプターに対するＩＬ−８の結合の増幅は非特異的らしい。しかして、モノクローナル抗体４．１．３、５．１．３、４．８、５．１２．１４および１２．３．９は、可能性のある中和モノクローナル抗体であり、一方、モノクローナル抗体８．９．１および９．２．４は、非中和モノクローナル抗体である。
抗ＩＬ−８抗体がＩＬ−８によって誘導された好中球走化性をブロックする能力は、以下のようにして試験された。ＩＬ−８によって誘導された好中球走化性は、Boydenチャンバー法（Larsen，らScience 243:1464（1989））を用いて調べられた。０．１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ中に再懸濁された１００μｌのヒト好中球（１０6細胞／ｍｌ）を上方のチャンバーに準備し、モノクローナル抗体を含むまたは含まない２９μｌのＩＬ−８（２０ｎＭ）を下方のチャンバーに準備した。細胞を３７℃で１ｈｒインキュベートした。下方のチャンバーに移動した好中球は、Wright’s Giemsa染色を用いて染色され、顕微鏡（１００ｘの倍率）でカウントした。実験グループ当たり約１０の異なる領域が調べられた。中和モノクローナル抗体５．１２．１４および４．１．３は、ＩＬ−８とｍＡｂとが１：１０の比率において、ＩＬ−８の好中球走化活性の約７０％をブロックした。
各ｍＡｂの等電点電気泳動（ＩＥＦ）パターンは、Fastゲルシステム（Pharmacia,Piscataway,NJ）を用いてＩＥＦポリアクリルアミドゲル（ｐＨ３−９、Pharmacia）に精製された抗体を添加することによって調べられた。このＩＥＦゲルは、サンプルを添加する前１０分間、１％Triton X100（Sigma,St.Louis,MO）を含むファーマライト（pharmalyte）を用いて予備処理された。このＩＥＦパターンは、製造者の指示に従って銀染色によって視覚化された。全てのモノクローナル抗体は異なるＩＥＦパターンを有し、異なるクローンに由来することが確かめられる。抗体のｐＩ値は表３に掲載されている。
これら全てのモノクローナル抗体は、（ａｌａ−ＩＬ−８）７７および（ｓｅｒ−ＩＬ−８）７２形態のＩＬ−８の両方と等価に結合した。ＩＬ−８は、β−ＴＧ（Van Dammeら，Eur.J.Biochem.181:337（1989）;Tanakaら，FEB236（2）:467（1988））およびＰＦ４（Deuelら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:2256（1977））のような炎症性サイトカインの血小板第４因子（ＰＦ４）のあるメンバーと３０％以上の配列相同性を備えているので、それらはβ−ＴＧとＰＦ４、並びにその他の好中球活性化因子、Ｃ５ａに対する可能性のある交差感受性について試験された。β−ＴＧに対してわずかな交差感受性を有するｍＡｂ４．１．３を除いて、これらのタンパクのいずれかに対する検出可能な結合は、何も観察されなかった。
抗体の一つ、ｍＡｂ５．１２．１４は、好中球によるエラスターゼのＩＬ−８媒介放出をブロックできるかどうかを調べるために、さらに研究された。簡単に言うと、ヒト好中球が、１．０％のＢＳＡ、Fraction V（Sigma,St.Louis,MO）、２ｍｇ／ｍｌのα−Ｄ−グルコース（Sigma）、４．２ｍＭの炭酸水素ナトリウム（Sigma）および０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１（JRH Bioscience,Lenexa,KS）を含むHanks平衡塩類溶液（Gibco,Grand Island,NY）に再懸濁された。サイトカラシンＢ（Sigma）の貯蔵物を調製し（ジメチルスルホキシド（Sigma）に５ｍｇ／ｍｌ）、２−８℃において貯蔵した。サイトカラシンＢは、終濃度５μｇ／ｍｌとするために好中球調製物に添加され、３７℃で１５分間インキュベートされた。ヒトＩＬ−８は、１ｍｌのポリプロピレンチューブ（DBM Scientific,San Fernando,CA）中で、ｍＡｂ５．１２．１４（２０μｌ）または陰性対照抗体と、３７℃で３０分間インキュベートされた。ＩＬ−８の最終的なアッセイ濃度は、５０および５００ｎＭであった。モノクローナル抗体を、以下の比率（ＩＬ−８：Ｍａｂ）：１：５０、１：１０、１：２、１：１および１：０．２５とするために希釈した。サイトカラシンＢ処理好中球が添加され（１００μｌ／チューブ）、２５℃で２時間インキュベートされた。このチューブを１０分間遠心し（２１０Ｘｇ、２−８℃）、上清を９６ウェル組織培養プレートに移した（３０μｌ／ウェル）。エラスターゼ基質貯蔵物、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭメトキシスクシニル−アラニル−アラニル−プロピル−バリル−ｐ−ニトロアニリド（Calbiochem,La Jolla,CA）を調製し、２−８℃に貯蔵した。エラスターゼ基質溶液（１．２ｍＭ基質、１．２Ｍ  ＮａＣｌ（Mallinckrodt,Paris,Kentucky）、上流水中の０．１２Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２）を上清に添加し（１７０μｌ／ウェル）、３７℃で０．５から２時間インキュベートした（対照Ｏ．Ｄ．が１．０に達するまで）。吸収を４０５ｎｍで測定した（ＳＬＴ３４０ＡＴＴＣプレートリーダー、SLT Lab Instruments、オーストラリア）。
この結果は、図１に示されている。ＩＬ−８とｍＡｂ5.12.14との比が１：１のときに、抗体は好中球からのエラスターゼの放出を効果的にブロックすることができた。
ハイブリドーマ産生抗体5.12.14は、the American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,U.S.A.（ATCC）に１９９３年２月１５日に寄託され、ATCC Accession No.HB11553に指定された。
Ｂ．ウサギＩＬ−８に対するモノクローナル抗体の産生および特徴付け
ウサギＩＬ−８に対する抗体は、免疫原としてウサギＩＬ−８を用いて（C.Broaddus氏が好意的に提供；YoshimraらJ.Immunol.146:3483（1991）も参照）、抗ヒトＩＬ−８抗体と本質的に同じ方法で産生された。この抗体は、ＥＬＩＳＡプレートに被覆された別のサイトカインに対する結合について上述したように特徴が調べられ、ＭＧＳＡ、ｆＭＬＰ、Ｃ５ａ、ｂ−ＴＧ、ＴＮＦ、ＰＦ４またはＩＬ−１に対して測定可能な結合は観察されなかった。
抗体6G4.2.5を産生するハイブリドーマは、the American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,U.S.A.（ATCC）に１９９４年９月２８日に寄託され、ATCC Accession No.HB11722に指定された。
5.12.14および6G4.2.5に対する組み換えヒト−マウスキメラＦａｂを以下に記載するようにして作製した。キメラ6G.4.25Ｆａｂは、以下に詳細に、キメラ5.12.14Ｆａｂと比較されている。
１．5.12.14−ＦＡＢおよび6G4.2.5−ＦＡＢによる、ヒト好中球に対するＩＬ−８の結合の阻害
二つのキメラＦａｂ、5.12.14−Ｆａｂおよび6G4.2.5−ＦａｂがＩＬ−８に効果的に結合し、かつヒト好中球上のＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８の結合を妨げる能力を、ＩＣ50、すなわちＩＬ−８結合の５０％阻害を達成するのに必要な濃度を計算するための競争結合アッセイを行うことによって調べた。
ヒト好中球（５Ｘ１０5）を、種々の濃度（０から３００ｎＭ）の5.12.14−Ｆａｂ、6G4.2.5−Ｆａｂ、アイソタイプ対照（４Ｄ５−Ｆａｂ）または未標識ＩＬ−８の存在下で、０．５ｎＭの125Ｉ−ＩＬ−８を用いて４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、リン酸緩衝生理食塩水中に２０％のショ糖と０．１％ウシ血清アルブミンの溶液を介して、未結合の125Ｉ−ＩＬ−８を遠心分離し、細胞に結合した125Ｉ−ＩＬ−８の量をガンマカウンターで細胞ペレットを計測することによって調べた。図２は、未標識ＩＬ−８による好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合の阻害を示す。図３は、陰性アイソタイプ対応Ｆａｂが、ヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合を阻害しないことを示す。抗ＩＬ−８Ｆａｂ、5.12.14Ｆａｂ（図４）および6G.4.25（図５）の両方が、それぞれ１．６ｎＭおよび７．５ｎＭの平均ＩＣ50でヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合を阻害することができた。
２．5.12.14−ＦＡＢおよび6G.4.25−ＦＡＢによるＩＬ−８媒介好中球走化性の阻害
ヒト好中球が単離され、計測され、０．１％ウシ血清アルブミンを含むHank’s平衡塩類溶液（HBSSと略記；カルシウムとマグネシウムを含まない）に５ｘ１０6細胞／ｍｌとなるように再懸濁された。好中球は、終濃度が２．０μＭとなるように、カルセインＡＭ（Molecular Probe,Eugene,OR）を添加することによりラベルされた。３７℃で３０分間インキュベーションした後に、細胞をHBSS-BSAで２回洗浄し、５ｘ１０6細胞／ｍｌに再懸濁した。
走化性の実験は、Neuro Probe（Cabin John,MD）９６−ウェルチャンバー、モデルMBB96で行われた。実験サンプル（バッファーのみの対照、ＩＬ−８のみ、またはＩＬ−８＋Ｆａｂ）を、下方のチャンバーに配置されたPolyfiltronics 96ウェルViewプレート（Neuro Probe Inc.）に添加した。１００μｌのカルセインＡＭラベルされた好中球を上方のチャンバーに添加し、下方チャンバーサンプルの方に、５ミクロメーター孔質ＰＶＰフリーポリカーボネートフレームフィルター（Neuro Probe Inc.）を介して移動させた。次いで、この走化性の装置を、５％ＣＯ２を用いて３７℃で４０から６０分間インキュベートした。インキュベーション後、上方のチャンバーに残存する好中球を吸引し、上方のチャンバーをＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ポリカーボネートフィルターを外して、移動していない細胞を、ＰＢＳで湿らせたスキージを用いて拭き取り、このフィルターを１５分間空気乾燥した。
フィルターを介して移動する好中球の相対数（好中球移動インデックス）は、フィルターの蛍光強度と、下方のチャンバーの内容物の蛍光強度を測定し、これら二つの値を足し合わせることにより調べられた。蛍光強度は、感度３において、４８５−２０ｎｍ励起フィルターと５３０−２５発光フィルターを用いてCorning96ウェルプレートを読みとるように設定されたCytoFluor 2300蛍光プレートリーダー（Millipore Corp.Bedford,MA）を用いて測定された。
この結果は、図６および７に示されている。図６は、キメラ6G4.2.5および5.12.14ＦａｂによるヒトＩＬ−８媒介好中球走化性の阻害を示す。図７は、キメラ6G4.2.5および5.12.14Ｆａｂが、ウサギＩＬ−８媒介好中球走化性を阻害する相対的能力を示す。
３．種々の濃度の6G4.2.5および5.12.14ＦＡＢによるＩＬ−８媒介好中球エラスターゼ放出の阻害
ヘパリン化注射器に健全な男性ドナーから採血した。好中球を、デキストラン沈降法、リンパ球分離媒体（Organon Teknika,Durham,NC）上における遠心、Bermanらによって記載されているような混入赤血球細胞の低張溶解（J.Cell Biochem.52:183（1993））によって単離した。最終的な好中球ペレットを、１％ＢＳＡ（フラクションＶ,Sigma,St.Louis,MO）、２ｍｇ／ｍｌグルコース、４．２ｍＭの炭酸水素ナトリウム、および０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２を含むHanks平衡塩類溶液（Gibco,Grand Island,NY）からなるアッセイバッファー中に１ｘ１０7細胞／ｍｌの濃度となるように懸濁した。この好中球を、１ｈｒ未満の間、４℃で貯蔵した。
ＩＬ−８（１０μｌ）を、１ｍｌのポリプロピレンチューブ中で、抗ＩＬ−８Ｆａｂ、アイソタイプ対照Ｆａｂ、またはバッファー（２０μｌ）と混合し、３０分間、３７℃のウォーターバス中でインキュベートした。投与量応答研究において０．０１から１０００ｍＭの範囲の終濃度で（図８）、また、エラスターゼ放出に対するＦａｂの効果を示す実験において１００ｎＭの終濃度で（図９および１０）、ＩＬ−８を用いた。Ｆａｂの濃度は、約２０ｎＭから３００ｎＭの範囲であり、Ｆａｂ：ＩＬ−８分子比は０．２：１から３：１となった。サイトカラシンＢ（Sigma）を５μｇ／ｍｌの濃度で好中球懸濁液に添加し（ＤＭＳＯ中に作製された５ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶液を使用）、細胞を３７℃のウォーターバス中で１５分間インキュベートした。サイトカラシンＢ処理好中球（１００μｌ）をＩＬ−８／Ｆａｂ混合物に添加した。室温で３ｈｒインキュベーションした後に、好中球を遠心（２００ｘｇで５分間）によりペレット状とし、細胞を含まない上清の一定量を９６ウェルプレートに移した（３０μｌ／ウェル）。エラスターゼ基質、メトキシスクシニル−アラニル−アラニル−プロリル−バリル−ｐ−ニトロアニリド（Calbiochem,La Jolla,CA）をＤＭＳＯ中に１０ｍＭ貯蔵溶液として調製し、４℃に貯蔵した。エラスターゼ基質作用溶液を、使用の直前に調製し（１．２ｍＭエラスターゼ基質、１．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．１２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）、１７０μｌを各サンプル含有ウェルに添加した。３０分間、または陽性対照を読みとった光学密度が少なくとも１．０に達するまで、プレートを３７℃組織培養インキュベーターに移した。吸収を、ＳＬＴ３４０プレートリーダーを用いて４０５ｎｍにおいて測定した（SLT Lab Instruments，オーストラリア）。
図９は、ヒトＩＬ−８によって刺激されたヒト好中球からのエラスターゼ放出を阻害する、キメラ抗ＩＬ−８Ｆａｂの能力を示す；図１０は、ウサギＩＬ−８によって刺激されたヒト好中球からのエラスターゼ放出を阻害する、キメラ抗ＩＬ−８Ｆａｂの相対能力を示す。
Ｃ．マウス5.12.14（抗ＩＬ−８）モノクローナル抗体の可変軽および重領域も分子クローニング
全てのＲＮＡを、ChomczynskiとSacchi（Anal.Biochem.162:156（1987））によって記載された方法を用いて、１Ｘ１０8細胞（ハイブリドーマ細胞系ATCC HB-11722）から単離した。カッパ軽鎖またはＩｇＧ２ａ重鎖の定常領域（これらの領域のＤＮＡ配列は、Sequence of Proteins of Immunological Interest,Kabat,E.Aら（1991）NIH Publication 91-3242,V1-3）をコードするマウスＲＮＡの領域とハイブリダイズするように設計された合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いてｍＲＮＡを特異的にプライミングすることによって第一鎖ｃＤＮＡを合成した。３つのプライマー（配列番号：１−６）を、プライマーハイブリダイゼーションの機会、および第一鎖ｃＤＮＡ合成の効率を増大するように、軽鎖および重鎖のそれぞれに対して設計した（図１３）。第一鎖ｃＤＮＡの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡへの増幅は、二セットの合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー：軽鎖可変領域増幅に対して一つの正プライマー（配列番号：７−９）と一つの逆プライマー（配列番号：１０）、そして、重鎖可変領域増幅に対して一つの正プライマー（配列番号：１１−１４）および一つの逆プライマー（配列番号：１５−１８）を用いて行われた。5.12.14の軽鎖または重鎖のいずれかの最初の８アミノ酸のＮ末端配列が、この領域に対応する推定上のマウスＤＮＡ配列を作製するために用いられた。（全部で２９のアミノ酸がエドマン分解タンパク配列決定法を用いて軽鎖および重鎖可変領域の両方のＮ末端から配列決定された）。この情報は、天然マウスＤＮＡコドンに対するプライマーハイブリダイゼーションの機会を増大するために、あるコドンの第三位に縮重が形成され、クローニングベクターのSTIIエレメントの３’末端に対するリゲーションを容易にするために、軽鎖可変領域正プライマーと重鎖可変領域正プライマーの両方に特有の制限部位ＭｌｕＩを含む、正の増幅プライマーを設計するために用いられた。逆増幅プライマーは、可変／定常接合部近くの軽鎖または重鎖の定常領域の部位に対応するマウスＤＮＡ配列とアニールするように設計された。軽鎖可変領域逆プライマーは、独特のBstBI制限部位を含み、重鎖可変領域逆プライマーは、ベクターのヒトＩｇＧ１定常軽領域またはＩｇＧ１定常重領域、ｐＢ１３．１（軽鎖）およびｐＢ１４（重鎖）のいずれかの５’末端へのリゲーションに独特のApaI制限部位を含む。これらのプライマーセットを用いたポリメラーゼ鎖反応は、約４００ｂｐのＤＮＡフラグメントを生じた。5.12.14軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡは、ベクターｐＢ１３．１にクローン化されて、pA51214VLを形成し、5.12.14重鎖可変領域はベクターｐＢ１４にクローン化されて、pA51214VHを形成した。ｃＤＮＡ挿入物はＤＮＡ配列決定によって調べられ、図１６（マウス軽鎖可変領域）のＤＮＡ配列（配列番号：１９）およびアミノ酸配列（配列番号：２０）、並びに図１７（マウス重鎖可変領域）のＤＮＡ配列（配列番号：２１）およびアミノ酸（配列番号：２２）に示されている。
Ｄ．5.12.14ＦＡＢベクターの作製
最初の作製物、pA51214VLにおいて、5.12.14マウス軽鎖可変配列の末端とヒトＩｇＧ１定常軽鎖配列の独特のクローニング部位BstBIとの間のアミノ酸は、マウスＩｇＧ１定常領域の最初の１３アミノ酸に対応するマウス由来のものである（図１６）。それゆえ、このプラスミドは、5.12.14マウス軽鎖可変領域とヒト軽鎖ＩｇＧ１定常領域とを分離するマウス定常領域の余分な箇所を含む。この介在配列は、キメラのアミノ酸配列を変え、おそらく不正確に折り畳まれたＦａｂを産生するだろう。この問題は、Ａ１０９後のｃＤＮＡクローンを直接切りつめ、ポリメラーゼ鎖反応によって可変／定常接合点にBstBI部位を再配置によって扱われる。図１８は、これらの修飾を成すために用いられた増幅プライマーを示す。正のプライマー、VL.front（配列番号：２３）は、MluIクローニング部位を含むSTIIシグナル配列の最後の５つのアミノ酸、および5.12.14マウス軽鎖可変配列の最初の４つのアミノ酸に適合するように設計された。この配列は、後の作製に用いられる独特のEcoRVクローニング部位を作製するために最初の二つのコドンＤ１（ＴからＣ）およびＩ２（ＣからＴ）の第三位においてもとのｃＤＮＡから変更された。逆プライマー、VL.rear（配列番号：２４）は、独特のBstBIクローニング部位を含む5.12.14軽鎖可変配列の最後の７つのアミノ酸と、ヒトＩｇＧ１定常軽鎖配列の最初の３つのアミノ酸とに適合するように設計された。BstBI部位を添加する方法において、いくつかのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が変更される：Ｌ１０６（ＴＴＧからＣＴＴ）、アルギニンへの保存的アミノ酸置換を生じるＫ１０７（ＡＡＡからＣＧＡ）、並びにＲ１０８（ＣＧＧからＡＧＡ）。修飾された5.12.14軽鎖可変配列をコードするＰＣＲ産物は、二部リゲーションにおいてｐＢ１３．１にサブクローンされた。軽鎖可変領域をコードするMluI-BstBI切断5.12.14ＰＣＲ産物を、プラスミド、pA51214VL’を形成するためにMluI-BstBI切断ベクターにリゲートした。修飾されたｃＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定によって特徴が調べられた。5.12.14軽鎖のコード配列は、図１９に示されている。
同様に、重鎖可変領域の末端と、pA51214VHのヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインの独特のクローニング部位、APaIとの間のＤＮＡ配列は、マウスからヒトにこのエリアのアミノ酸を変化させるように再構成された。これはポリメラーゼ鎖反応によって成された。マウス5.12.14重鎖可変配列の増幅は、図１８に示されたプライマーを用いて行われた。正のＰＣＲプライマー（配列番号：２５）は、STIIシグナル配列の上流pA51214VHのヌクレオチド８６７−８８７および重鎖可変領域をコードする推定上のｃＤＮＡ配列に適合するように設計され、独特のクローニング部位SpeIを含む。逆ＰＣＲプライマー（配列番号：２６）は、5.12.14重鎖可変配列の最後の４つのアミノ酸、並びに独特のクローニング部位ApaIも含んだヒトＩｇＧ１重鎖定常配列に対応する最初の６つのアミノ酸に適合するように設計された。修飾された5.12.14重鎖可変配列をコードするＰＣＲ産物は、二部リゲーションで発現プラスミドpMHM24.2.28にサブクローン化された。ベクターはSpeI-ApaIで切断され、重鎖可変領域をコードするSpeI-ApaI分解5.12.14ＰＣＲ産物それにリゲートされて、プラスミドpA51214VH’を形成する。修飾されたｃＤＮＡはＤＮＡ配列決定によって特徴付けされた。5.12.14重鎖をコードする配列は、図２０Ａ−２０ＢのＤＮＡ配列（配列番号：２９）およびアミノ酸配列（配列番号：３０）に示されている。
5.12.14のキメラＦａｂをコードする第一の発現プラスミド、pantiＩＬ−８．１は、EcoRVとBpu1102IでpA51214VH’を切断し、EcoRV-Bpu1102Iフラグメントを、pA51214VL’のマウス5.12.14軽鎖可変領域をコードするEcoRV-Bpu1102Iフラグメントで置換することによって形成された。かくして得られたプラスミドは、5.12.14の軽鎖および重鎖の両方のマウス−ヒト可変／定常領域を含む。
pantiＩＬ−８．１を用いたＦａｂ発現の予備的分析は、軽鎖および重鎖が細胞内に産生されるが、大腸菌のペリプラズムには殆ど分泌されないことを示した。この問題を解決するべく、第二の発現プラスミドが作製された。
第二の発現プラスミドpantiＩＬ−８．２を、ベクターとしてプラスミドｐｍｙ１８７を用いて作製した。プラスミドpantiＩＬ−８．２は、MluIとSphIを用いてｐｍｙ１８７を切断することによって作製され、pantiＩＬ−８．１のマウス5.12.14マウス−ヒトキメラＦａｂをコードするMluI（部分）−SphIフラグメントがそれにリゲートされた。かくして得られたプラスミドは、5.12.14の軽鎖および重鎖の両方のマウス−ヒト可変／定常領域を含む。
プラスミドpantiＩＬ−８．２は、the American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,U.S.A.（ATCC）に１９９５年２月１０日に寄託され、ATCC Accession No.ATCC97056に指定された。
Ｅ．マウス6G4.2.5モノクローナル抗体の可変軽および重領域の分子クローニング全てのＲＮＡを、ChomczynskiとSacchi（Anal.Biochem.162:156（1987））によって記載された方法を用いて、１ｘ１０8細胞（ハイブリドーマ細胞系6G4.2.5）から単離した。カッパ軽鎖またはＩｇＧ２ａ重鎖の定常領域（これらの領域のＤＮＡ配列は、Sequence of Proteins of Immunological Interest,Kabatら（1991）NIH Publication 91-3242,V1-3）をコードするマウスＲＮＡの領域とハイブリダイズするように設計された合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いてｍＲＮＡを特異的にプライミングすることによって第一鎖ｃＤＮＡを合成した。３つのプライマー（配列番号：３１−３６）を、プライマーハイブリダイゼーションの機会、および第一鎖ｃＤＮＡ合成の効率を増大するように、軽鎖および重鎖のそれぞれに対して設計した（図２１）。第一鎖ｃＤＮＡの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡへの増幅は、二セットの合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー：軽鎖可変領域増幅に対して一つの正プライマー（配列番号：３７−３９）と一つの逆プライマー（配列番号：４０）（図２２）、そして、重鎖可変領域増幅に対して一つの正プライマー（配列番号：４１−４２）および一つの逆プライマー（配列番号：４３−４６）（図２３）を用いて行われた。6G4.2.5の軽鎖または重鎖のいずれかの最初の８アミノ酸のＮ末端配列が、この領域に対応する推定上のマウスＤＮＡ配列を作製するために用いられた。（全部で２９のアミノ酸がエドマン分解タンパク配列決定法を用いて軽鎖および重鎖可変領域の両方のＮ末端から配列決定された）。この情報は、天然マウスＤＮＡコドンに対するプライマーハイブリダイゼーションの機会を増大するために、あるコドンの第三位に縮重が形成され、ベクターpchimＦａｂのSTIIエレメントの３’末端に対するリゲーションを容易にするために、軽鎖可変領域正プライマーに独特な制限部位NsiIを含み、重鎖可変領域正プライマーに独特な制限部位MluIを含む、正の増幅プライマーを設計するために用いられた。逆増幅プライマーは、可変／定常接合部近くの軽鎖または重鎖の定常領域の部位に対応するマウスＤＮＡ配列とアニールするように設計された。軽鎖可変領域逆プライマーは、独特のMunI制限部位を含み、重鎖可変領域逆プライマーは、ベクターpchimＦａｂのヒトＩｇＧ１定常軽領域またはＩｇＧ１定常重領域のいずれかの５’末端へのリゲーションに独特のApaI制限部位を含む。これらのプライマーセットを用いたポリメラーゼ鎖反応は、約４００ｂｐのＤＮＡフラグメントを生じ、それぞれベクターpchimＦａｂにクローン化されて、p6G425VLおよびp6G425VHを形成した。ｃＤＮＡ挿入物はＤＮＡ配列決定によって調べられ、図２４（マウス軽鎖可変領域）のＤＮＡ配列（配列番号：４７）およびアミノ酸配列（配列番号：４８）、並びに図２５（マウス重鎖可変領域）のＤＮＡ配列（配列番号：４９）およびアミノ酸（配列番号：５０）に示されている。
Ｆ．6G4.2.5キメラＦＡＢベクターの作製
最初の作製物、p6G425VLにおいて、6G4.2.5マウス軽鎖可変配列の末端とヒトＩｇＧ１定常軽鎖配列の独特のクローニング部位MunIとの間のアミノ酸は、マウス由来のものである。これらのアミノ酸は、キメラＦａｂを適切に折り畳むために、ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列に適合しなければならない。二つのマウスアミノ酸Ｄ１１５とＳ１２１は、ヒトＩｇＧ１定常ドメインのβ鎖のループに見出されたアミノ酸とは劇的に異なり、図２６に示されたプライマー（配列番号：５１−５４）を用いた部位特異的突然変異によって適切なヒトアミノ酸残基Ｖ１１５およびＦ１２１に変換された。これらの特異的突然変異はＤＮＡ配列決定によって確認され、この修飾されたプラスミドは、p6G425VL’と命名された。コード配列は、図２７Ａ−２７ＢのＤＮＡ配列（配列番号：５５）およびアミノ酸配列（配列番号：５６）に示されている。
同様に、重鎖可変領域の末端と、p6G425VHのヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインの独特のクローニング部位、ApaIとの間のＤＮＡ配列は、マウスからヒトにこのエリアのアミノ酸を変化させるように再構成された。この方法は、重鎖可変領域の末端近くのBstEII部位の発見によって容易化された。この部位とApaI部位は、対応するＩｇＧヒトアミノ酸配列をコードするＤＮＡの合成ピースの付加のために用いられた。図２６に示された合成オリゴヌクレオチドは、２７ｂｐピースのｄｓＤＮＡを形成するために互いの相補として設計された。プラスミドp6G425VHがベクター配列内にさらにBstEII部位を含むことから、作製は３部リゲーションとして行われた。MluI−ApaIを用いて切断されたp6G425VHの５３０９ｂｐフラグメントが、6G4.2.5重鎖可変領域を有する３８８ｂｐフラグメント、並びにプラスミドp6G425VH’を形成するヒトＩｇＧ１定常領域の最初の６つのアミノ酸をコードする２７ｂｐの合成ＤＮＡフラグメントにリゲートされた。ＤＮＡの合成ピースの挿入は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。コード配列は、図２８Ａ−２８ＢのＤＮＡ配列（配列番号：５７）およびアミノ酸配列（配列番号：５８）に示されている。
6G4.2.5のキメラＦａｂをコードする発現プラスミド、p6G425chim2は、STIIマウスＨＰＣ４重鎖可変領域を除去するためにMluIとApaIでp6G425chimVL’を切断し、それをp6G425chimVH’のSTIIマウス6G4.2.5重鎖可変領域をコードするMluI−ApaIフラグメントで置換することによって形成された。かくして得られたプラスミドは、6G4.2.5の軽鎖および重鎖の両方のマウス−ヒト可変／定常領域を含む。
プラスミドp6G425chim2は、the American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,U.S.A.（ATCC）に１９９５年２月１０日に寄託され、ATCC Accession No.97055に指定された。
Ｇ．抗ＩＬ−８抗体6G4.2.5のヒト化された形態の作製
ハイブリドーマ細胞系6G4.2.5から得られたマウスｃＤＮＡ配列情報を、マウス抗ＩＬ−８抗体の組み換えヒト化変異体を作製するために用いた。第一のヒト化変異体Ｆ（ａｂ）−１は、ヒト６サブグループＩ軽鎖とヒトＩｇＧ１サブグループIII重鎖とを含む、ファージミドベクターｐＥＭＸ１（Wertherら，J.Immunol,157:4986-4995（1996））に、重鎖および軽鎖のマウスＣＤＲをコードする合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーをグラフトすることによって作製された（図２９）。相補性決定領域（ＣＤＲ）によるＩＬ−８への高親和結合に必要なコンホメーションを維持するのに潜在的に重要な抗体のフレームワークを含むアミノ酸は、Carterら，PNAS 89:4285（1992）およびEigenbrotら，J.Mol.Biol.229:969（1993）によって記載された方法を用いてマウスおよびヒト化6G4.2.5（Ｆ（ａｂ）−１）可変ドメインの分子モデルを比較することによって同定された。さらなるヒト化フレームワーク変異体（Ｆ（ａｂ）２−９）は、これらのモデルから得られた情報から作成され、以下の表４に示されている。これらの変異形において、Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci USA,82:488（1985）の部位特異的変異誘発法が、特異的なヒトフレームワーク残基をそれらが対応する6G4.2.5マウス対応部と交換するために利用された。続いて、各変異体の完全なコード配列が、ＤＮＡ配列決定によって確認された。各Ｆ（ａｂ）変異体の発現および精製は、ニワトリ卵白リゾチームが精製プロトコルから省略されたことを除いて、Wertherら（上掲）によって既に記述されているように行った。変異形抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、エレクトロスプレー質量分析、およびアミノ酸解析により分析した。
0004108760.tif 000005
ａ  使用された鋳型に対して作製されたアミノ酸の変化。マウス残基は太字のイタリックであり、残基番号はKabatらによる。
ｂ  ヒト化およびマウス可変ドメインの分子モデルに観察された相互作用に基づく変化導入の目的。
ｃ  競争結合アッセイにおけるヒト好中球に対するヨウ化ＩＬ−８の結合を阻害するために必要な変異体のｎＭ濃度
ｄ  キメラＦ（ａｂ）は、ヒト軽鎖ｋＩ定常ドメインおよびヒト重鎖サブグループIII定常ドメインＩにそれぞれ融合したマウス重鎖および軽鎖可変ドメインを有するＦ（ａｂ）である。
ｅ  ｒｈｕ４Ｄ５Ｆ（ａｂ）はヒト化６Ｇ４２５Ｆ（ａｂ）と同じアイソタイプであり、ヒト化抗ＨＥＲ２ Ｆ（ａｂ）であり、それゆえＩＬ８に結合しない。
第一のヒト化変異形、Ｆ（ａｂ）−１は、Ｘ線結晶学および配列超可変性の両方によって調べられた全てのマウスＣＤＲアミノ酸がヒトフレームワークに移された、未変更のＣＤＲスワップである。上記セクション（Ｂ）（１）に記載された方法に基づいて、ヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合を阻害する精製されたＦ（ａｂ）の能力について調べられたとき、上記表４に示されたように、結合親和性において５．５倍低減することが明らかである。Ｆ（ａｂ）−１の次の形態は、ＩＬ−８に結合するのにより有利なコンホメーションとなるようにＣＤＲループの三次元構造を形成するように設計された。上記セクション（Ｂ）（１）に記載されているようなヒト好中球を用いた競争結合実験から決定されたＦ（ａｂ）変異形の相対親和性は、上記表４に示されている。ＩＬ−８結合におけるわずかな低減（＜２倍）がＦ（ａｂ）−２−３について観察され、一方、ＩＬ−８結合におけるほんのわずかな増加がＦ（ａｂ）３−５について示された。変異形Ｆ（ａｂ）−６は、ＩＬ−８に対する親和性において最も高い増加を示し（約２倍）、Ｆ（ａｂ）−１  ＩＬ−８結合親和性が６３ｎＭであるのと比較して３４．６ｎＭのＩＬ−８結合親和性を示した。Ｈ６９のＩｌｅをマウスＬｅｕ、かつＨ７８のＬｅｕをマウスＡｌａで置換することは、ＣＤＲ  Ｈ１とＨ２のパッキングに影響すると予想される。鋳型としてＦ（ａｂ）−６変異形を用いたさらに別のフレームワーク置換は、キメラＦ（ａｂ）により近い結合親和性を有するように作製された。インビトロ結合実験は、Ｆ（ａｂ）−７の親和性（３８．４ｎＭ）に変化を示さなかったが、Ｆ（ａｂ）−８／９の親和性、それぞれ１４ｎＭおよび１９ｎＭにおいて顕著な改善を示した。抗ＩＬ−８抗体の３Ｄコンピューター作製モデルの分析によれば、Ｆ（ａｂ）−８におけるＨ３８のＡｒｇとマウスＬｙｓを置換することがＣＤＲ−Ｈ２に影響するが、一方、Ｆ（ａｂ）−９におけるＧｌｕとマウスＧｌｎのＨ６における変化がＣＤＲ−Ｈ３に影響を与えるとの仮説が立てられた。アミノ酸変異性に関するヒト抗体配列の調査が、残基Ｈ３８におけるＡｒｇの頻度が＞９９％であり、残基Ｈ６がそれぞれＧｌｎ〜２０％もしくはＧｌｕ〜８０％であることを示した（Kabatら，Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th Ed.（1991））。それゆえ、抗体に対する免疫応答を引き起こす見込みを減らすために、Ｆ（ａｂ）−９は、さらなる親和性飽和研究のために、Ｆ（ａｂ）−８を越えて選択された。変異形Ｆ（ａｂ）−９は、ＩＬ−８媒介走化性を阻害する能力についても試験された（図３０）。この抗体は、上記セクション（Ｂ）（２）に記載されているように行われたＩＬ−８媒介好中球走化性阻害アッセイにおいて、各ＩＣ50が約１２ｎＭ、１５ｎＭ、および２２ｎＭで、野生型ヒトＩＬ−８、ヒト単一物ＩＬ−８およびアカゲザルＩＬ−８によって誘導された好中球移動をブロックすることができた。変異形Ｆ（ａｂ）−８のアミノ酸配列は、図３１ｃに与えられている。Ｆ（ａｂ）−８は、上記セクション（Ｂ）（２）に記載されているように行われたＩＬ−８媒介好中球走化性阻害アッセイにおいて、各ＩＣ50が１２ｎＭおよび１０ｎＭで、ヒトおよびアカゲザルＩＬ−８媒介走化性をブロックすることが見出された。
Ｈ．ファージディスプレイのための抗ＩＬ−８−遺伝子III融合タンパクの作製およびアラニンスキャニング変異誘発
融合タンパク（ヒト化6G4.2.5バージョン１１抗体の重鎖とＭ１３ファージ遺伝子IIIコートタンパク）とヒト化6G4.2.5バージョン１１抗体の軽鎖とをコードする発現プラスミドpPh6G4.V11は、ファージ粒子に抗ＩＬ−８抗体の一価提示を産生するように組み立てられた。この作製は、現存する不適切な抗体コード配列を除去するために、プラスミドｐＦＰＨＸをEcoRVおよびApaIを用いて切断し、かつ、それをヒト化6G4.2.5バージョン１１抗ＩＬ−８抗体をコードするプラスミドp6G4.V11の１３０５ｂｐのEcoRV−ApaIフラグメントで置換することによって成された。ヒト化6G4.2.5バージョン１１重鎖の翻訳された配列（配列番号：６６）、ペプチドリンカーおよび遺伝子IIIコートタンパク（配列番号：６７）が図３１Ａに示されている。ｐＦＰＨＸプラスミドは、ヒト成長ホルモンと遺伝子III ＤＮＡコード配列との間にインフレームアンバーコドン（ＴＡＧ）を含むphGHam-3の誘導体である。大腸菌のアンバーサプレッサー株にトランスフォームした際に、このコドン（ＴＡＧ）は、グルタミン酸として読みとられ、成長ホルモン（ｈＧＨ）−遺伝子III融合タンパクを産生する。同様に、大腸菌の正常株において、ｋのコドン（ＴＡＧ）は、停止として読みとられ、遺伝子III配列への翻訳読み過ごしを妨げ、可溶性ｈＧＨを産生させる。pGHam-3プラスミドは、Methods:A Companion to Methods in Enzymology,3:205（1991）に記載されている。最終産物pPh6G4.V11は、ＣＤＲのアラニンスキャニング変異誘発の鋳型として用いられ、かつ、ヒト化6G4.V11抗体の無作為化ＣＤＲライブラリーの作製のために用いられる。
Ｉ．ヒト化抗体6G4.2.5バージョン１１のアラニンスキャニング変異誘発
ヒト化抗ＩＬ−８ 6G4.2.5バージョン１１抗体（h6G4V11）のＣＤＲの溶媒露出アミノ酸残基は、抗ＩＬ−８抗体の３Ｄコンピューター作製モデルの分析によって同定された。ＣＤＲのどの溶媒露出アミノ酸がインターロイキン−８への結合に影響を与えるのかを調べるために、各溶媒露出アミノ酸が別個にアラニンに変更され、各変異体が一つの溶媒露出残基においてアラニン置換を含む変異形抗体のパネルを作製した。このアラニンスキャニング変異誘発は、Leongら，J.Biol.Chem.,269:19343（1994）によって記載されているようにして行われた。
h6G4V11 wtおよび変異抗体のＩＣ50（相対的親和性）は、Cunninghamら，（EMBO J.13:2508（1994））およびLeeら（Science 270:1657（1995））によって記載された、競争ファージＥＬＩＳＡアッセイを用いて確立された。このアッセイは、溶液に種々の濃度のフリーのＩＬ−８（０．２から１μＭ）の存在下で９６ウェルプレート上に被覆されたＩＬ−８に結合する各抗体の能力を測定する。このアッセイの最初の段階は、野生型および変異型抗体を有するファージの濃度が標準化されることを必要とする。各抗体の相対的親和性を比較する。この標準化は、ＩＬ−８被覆プレートでファージを滴定し、ＥＣ50を確立することによって成された。スルフヒドリル被覆９６ウェル結合プレート（Corning-Costar;Wilmington,MA）は、２５ＥＣで１時間、１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ６．５のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に０．１ｍｇ／ｍｌ溶液とされたＫ６４Ｃ ＩＬ−８（Ｋ６４Ｃ ＩＬ−８のフリーのチオール基とスルフヒドリル被覆プレートとの間にジスルヒド結合を形成させるようにリジン６４がシステインと置換され、ＩＬ−８のレセプター結合ドメインを溶液界面に位置づける）とインキュベートされ、次いでＰＢＳで３回洗浄され、最後に、プレート上の全てのフリーの反応性スルフヒドリル基をブロックするために１．７５ｍｇ／ｍｌのＬ−システイン−ＨＣｌおよび０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３を含むＰＢＳ溶液とインキュベートされた。プレートをもう一度洗浄し、２００μｌのＰＢＳ／ウェルで４ＥＣで被覆され貯蔵された。参照抗体h6G4V11または変異形h6G4V11抗体のいずれかを示すファージは、ＰＥＧ沈降によって生育および回収された。このファージは、５００μｌの１０ｍＭTris−HCl ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁され、４ＥＣで３時間以下保持された。各ファージの分注量は、０．０５％ Tween-20（BioRad,Richmond,Ca）および０．５％ＢＳＡ ＲＩＡグレード（Sigma,St.Louis,Mo）（ＰＢＢ）を含むＰＢＳ中に４倍に希釈され、２５ｍＭの炭酸バッファーｐＨ９．６に５０ｍｇ／ｍｌのスキムミルクパウダーを用いて２５ＥＣにおいて少なくとも２時間ブロックされたＩＬ−８被覆プレートに添加された。次いで、このファージは、ウェルＡからＨまで、プレートに沿って３倍に連続的に希釈された。このプレートを２５ＥＣで１時間インキュベートし、０．０５％のTween20を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を用いて９回素早く洗浄した。次いで、プレートを、１：３２００希釈のウサギ抗ファージ抗体および１：１６００希釈の二次ヤギ抗ウサギＦｃ ＨＲＰ複合抗体を用いて２５ＥＣで１５分間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで９回素早く洗浄した。このプレートを、２５ＥＣで４分間、０．０１５％のＨ2Ｏ2を含むクエン酸リン酸バッファーｐＨ５．０中の１ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤ（Sigma,St.Louis,Mo）の８０μｌ／ウェルを用いて発色させ、４０μｌの４．５Ｍ Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止させた。このプレートは、ＳＬＴモデル３４０ＡＴＴＣプレートリーダー（SLT Lab Instruments）で波長８492において分析された。各ＥＣ50＝は、プログラムKaleidagraph（Synergy Software,Reading,Pa）および４−パラメーター適合等式を用いてデータを分析することによって調べられた。４ＥＣに保持されたファージは、各ＥＣ50または実験の競争セグメ��トのターゲットＯＤ492に対応する最終濃度を達成するために、ＰＢＢに直ちに希釈され、ウェルＡの１μＭから始まりウェルＨにおける０．２μＭで終わる範囲の可溶性ＩＬ−８の４倍連続希釈を含む９６ウェルプレートに分注された。１２チャンネルピペットを用いて、１００μｌのファージ／ＩＬ−８混合物をＩＬ−８被覆９６ウェルプレートに移し、上述したように実施した。各サンプルについて３回、３カラム／サンプル行った。
0004108760.tif 000006
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各サンプルは、３回／実験で行われた。
ＮＤＢ＝検出できる結合なし  ／ｎｄ＝値が測定されていない
残基番号はKabatらによる。
アラニンスキャンの結果は上記表５にまとめられている。多くの変異形抗体のアラニン置換は、ＩＬ−８に対する結合親和性に対して逆の効果を全くまたは殆ど持たない（＜３倍）。ＩＬ−８の検出できる結合なし（ＮＤＢ）を示すことが見出された変異体は、おそらく、ＣＤＲの決定的な構造または覆い隠されたアミノ酸により与えられた抗体のコンホメーション構造に崩壊を含む。スキャンの結果に基づいて、ＣＤＲ−Ｈ３（重鎖、第三ＣＤＲ）が、ＩＬ−８を結合する優性結合エピトープとして同定された。このＣＤＲにおけるアラニン置換が、結合親和性において３から＞２６倍の低減を生じた。これらの残基が溶媒露出されていること、並びに、これらの残基が、ＩＬ−８、もしくは、ＩＬ−８に対する結合またはＣＤＲ−Ｈ３ループ構造のコンホメーションのいずれかに影響を与える抗体の別のアミノ酸との水素結合またはチャージ相互作用に関係することが、抗ＩＬ−８抗体のコンピューター作製モデルから調べられたことから、アミノ酸Ｙ５９７、Ｙ５９９およびＤ６０２は、特に興味深い。（図３２に記載されているモデルを参照）。結合親和性の予想外の増加（１．８＞２．７倍）が、ＣＤＲ−Ｈ１のＳ５２８とＳ５３１、並びにＣＤＲ−Ｈ２のＳ５５３について示された。
驚くべきことに、結合親和性における顕著な増加が、ＣＤＲ−Ｌ１（軽鎖、第一ＣＤＲ）に存在するアラニン変異形Ｎ３５Ａに観察された。親和性における３−６倍の増加が、野生型h6G4V11抗体と比較して観察された。ＩＬ−８結合に関するこの増加は、ＣＤＲ−Ｈ３に対するＮ３５Ａに極めて近い結果である。アラニン置換は、ＣＤＲ−Ｈ３の隣接するアミノ酸残基のパッキング相互作用を変えるＣＤＲ−Ｌ１のコンホメーションにおいてわずかな変化を付与し、それによって、ＩＬ−８とのより適切な接触を容易にするコンホメーションにＣＤＲ−Ｈ３のループをねじるかもしれない。同様に、Ｎ３５Ａも、ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸の方向またはＩＬ−８との直接的な相互作用に影響を与えるかもしれない。また、親和性における予想外の増加（〜２倍）が、ＣＤＲ−Ｌ１のＳ２６およびＣＤＲ−Ｌ３のＨ９８について観察された。
Ｊ．ヒト化抗ＩＬ−８抗体6G4V11N35Aの特徴付け
可溶性6G4V11N35A Ｆａｂ抗体は、pPh6G4.V11を用いて、大腸菌のアンバー非サプレッサー株、３４Ｂ８をトランスフォームすることによって作製され、２４時間、低濃度リン酸媒体中で培養物を生育させた。ペリプラズム画分を回収し、Hi-Trap Protein-Gカラム（Pharmacia,Piscataway,NJ.）を通過させ、脱塩および濃縮工程を行った。このタンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析およびアミノ酸解析で分析した。このタンパクは適切なサイズとアミノ酸組成を有する（図３５）。6G4V11N35A Ｆａｂは、上記セクション（Ｂ）（１）および（Ｂ）（２）に記載されているように、ヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合を阻害し、かつＩＬ−８媒介好中球走化性を阻害する能力について調べられた。図３３に示されているように、ハイブリドーマ誘導完全マウス抗体（６Ｇ４マウスｍＡＢ）、組み換え６Ｇ４マウス−ヒトキメラＦａｂ、組み換えヒト化Ｆａｂバージョン１および１１、並びに6G4V11N35A Ｆａｂは、それぞれ、平均ＩＣ50が５ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、１０ｎＭおよび３ｎＭで、ヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合を阻害することが見出された。6G4V11N35A Ｆａｂは、6G4.2.5キメラＦａｂより少なくとも２倍高い親和性を示し、6G4V11よりも３倍高い親和性を示した。図３４に示されているように、6G4V11N35A Ｆａｂは、野生型および単一ヒトＩＬ−８の両方、並びに二つの異なる動物種、すなわちウサギとアカゲザルのＩＬ−８により誘導されたＩＬ−８媒介好中球走化性を阻害することが見出された。不適切なアイソタイプ対照Ｆａｂ（４Ｄ５）は、好中球移動を阻害しなかった。平均ＩＣ50値は、３ｎＭ（ｗｔ ＩＬ−８）、１ｎＭ（単一ＩＬ−８）、５ｎＭ（ウサギＩＬ−８）および１０ｎＭ（アカゲザルＩＬ−８）であった。
Ｋ．6G4V11N35A Ｆ（ａｂ’）2ロイシンジッパーの作製
ヒト化抗ＩＬ−８ 6G4V11N35A ＦａｂのＦ（ａｂ’）2バージョンの産生は、酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパーを用いて融合タンパクを作製することによって行われた。発現プラスミドｐ6G4V11N35A．Ｆ（ａｂ’）2は、6G4.2.5マウス−ヒトキメラＦａｂをコードするＤＮＡ配列を除去するために制限酵素bsaIとapaIを用いてプラスミドp6G425chim2.fab2を切断し、それをpPh6G4.V11N35Aの２６２０ｂｐのbsaI-apaIフラグメントで置換することによって作製された。プラスミドp6G425chim2.fab2は、融合タンパク（抗ＣＤ１８の重鎖に融合したＧＣＮ４ロイシンジッパー）と抗ＣＤ１８抗体の軽鎖をコードするｐＳ１１３０の誘導体である。この発現プラスミドｐ6G4V11N35A．Ｆ（ａｂ’）2は、the American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,U.S.A.（ATCC）に１９９６年２月２０日に寄託され、ATCC Accession No.97890に指定された。抗体のヒンジ領域におけるペプシン切断部位は、鎖間ジスルヒド結合を生じるシステインによって二つのイムノグロブリンモノマーを結合させたまま、ロイシンジッパーの除去を容易にする。h6G4V11N35A.Ｆ（ａｂ’）2のＤＮＡとタンパクの配列は、図３５−３７に図示されている。
発現宿主細胞は、本質的に上記セクション（II）（３）（Ｃ）に記載されているようにして、ｐ6G4V11N35A．Ｆ（ａｂ’）2を用いて大腸菌株４９Ｄ６をトランスフォームすることによって得られた。トランスフォームされた宿主大腸菌４９Ｄ６（ｐ6G4V11N35A．Ｆ（ａｂ’）2）は、ATCCに１９９７年２月２０日に寄託され、ATCC Accession No.98332に指定された。トランスフォームされた宿主細胞は培養で生育され、6G4V11N35A Ｆ（ａｂ’）2産物が、本質的に上記セクション（II）（３）（Ｆ）に記載されているようにして、宿主細胞ペリプラズムから回収された。
Ｌ．ヒト化6G4V11N35A Ｆ（ａｂ’）2ロイシンジッパーの特徴付け
6G4V11N35A ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2が、上記セクション（Ｂ）（１）に記載された方法に従って好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合を阻害する能力について試験された。二回行われた代表的な結合実験からの置換曲線が図３８に図示されている。このデータのスキャッチャード解析は、6G4V11N35A Ｆ（ａｂ’）2が、０．７ｎＭ（＋／−０．２）の平均ＩＣ50で、ヒト好中球への125Ｉ−ＩＬ−８の結合を阻害したことを示す。これは、ハイブリドーマ誘導完全マウス抗体（平均ＩＣ50は５ｎＭ）と比較して親和性において少なくとも７倍の増加、並びにＦａｂバージョン（平均ＩＣ50は２ｎＭ）を越えて親和性において少なくとも２．８倍の増加である。
6G4V11N35A Ｆ（ａｂ’）2は、上記セクション（Ｂ）（２）に記載された方法に従って、ＩＬ−８媒介好中球走化性を阻害する能力についても試験された。４回行って代表的な走化性実験の結果が、図３９に図示されている。図３９に示されているように、6G4V11N35A Ｆ（ａｂ’）2は、ヒトＩＬ−８媒介好中球走化性を阻害した。6G4V11N35A Ｆ（ａｂ’）2は、6G4V11N35A Ｆａｂの平均ＩＣ50値が２．７ｎＭであるのに対して、１．５ｎＭの平均ＩＣ50値を示し、これは、ＩＬ−８の効果を中和する抗体の能力において約２倍の改善があったことを示す。不適当なアイソタイプ対照Ｆａｂ（４Ｄ５）は、好中球の移動を阻害しなかった。さらに、6G4V11N35A Ｆ（ａｂ’）2抗体は、上記のように行われた好中球走化性実験において、単一ＩＬ−８、並びに二つの異なる動物種、すなわちウサギとアカゲザルのＩＬ−８によるＩＬ−８媒介好中球走化性を阻害する能力を維持した。個々の実験は図４０に示されている。平均ＩＣ50値は、１ｎＭ（単一ＩＬ−８）、４ｎＭ（ウサギＩＬ−８）および２．０ｎＭ（アカゲザルＩＬ−８）であった。
Ｍ．ヒト化抗体６Ｇ４Ｖ１１のＣＤＲ−Ｌ１中の軽鎖アミノ酸（Ｎ３５Ａ）のランダム変異誘発
上記セクション（Ｉ）に記載されたようにヒト化６Ｇ４Ｖ１１ ｍＡｂのＣＤＲ−Ｌ１（軽鎖）における３５位のアスパラギンに対してアラニンで置換した場合、ヒト好中球に結合する125Ｉ−ＩＬ−８を阻害するためのＩＣ５０における３倍の改良が観察された。この結果は、抗原結合についてより受け入れやすくなるように、ＣＤＲ−Ｌ１または近隣のＣＤＲ−Ｈ３（重鎖）の構造を改変するより小さい非極性側鎖（Ｒ基）の置換の結果として、抗原−抗体結合界面の間の接触における改良に寄与した。ＣＤＲ−Ｌ１の３５位でのアラニンの許容性は、この位置が改良された親和性に寄与し、この位置での他のアミノ酸によるＣＤＲループ／抗原結合領域（類）の再モデル化の評価が正当な理由となることを示唆した。ヒト化６Ｇ４．Ｖ１１ ｍＡｂの親和性成熟バージョンの選択（Kunkel,T.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488（1995））は、ＣＤＲ−Ｌ１１の３５位のランダム変異誘発と、抗体−ファージライブラリーの構築によって達成された。ＣＤＲ−Ｌ１の３５位でのアスパラギン（Ｎ）についてのコドンを、２０の周知のアミノ酸の何れかに対するランダム化のターゲットとした。
初めに、停止テンプレートであるｐＰｈ６Ｇ４．Ｖ１１−ｓｔｏｐを、該ライブラリー由来の混在している野生型Ｎ３５配列を除去するために作製した。これは、プライマーＳＬ．９７．２（配列番号）（図４２）を使用して停止コドン（ＴＡＡ）を用いてＮ３５についてのコドン（ＡＡＣ）を置換するための、ｐＰＨ６Ｇ４Ｖ１１（上記セクション（Ｈ）に記載）の部位特異的突然変異誘発（Muta-Gene Kit,Biorad,Ricmond,CA）を実施することによって達成された。停止コドンの取り込みは、ＤＮＡシークエンシングによって確認された。引き続き、停止テンプレートを使用してトランスフォームされた大腸菌ＣＪ２３６由来のウラシル含有一本鎖ＤＮＡを、Lowmanに記載された方法（Methods in Molecular Biology,87第25章；1-15（1997））に引き続き、抗体−ファージライブラリーを生産するために使用した。このライブラリーから生産された変異体は、ＣＤＲ−Ｌ１中の３５位での２０の周知のアミノ酸の一つを含む抗体のコレクションを生産すると予想された。アミノ酸置換は、配列ＮＮＳ（Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｔ／Ｃ；Ｓ＝Ｇ／Ｃ；）（配列番号）（図４２）を用いて変性したオリゴヌクレオチドプライマー（ＳＬ．９７．３）を使用した部位特異的突然変異誘発によって達成された。コドンの使用は、アンバー停止コドン（ＴＡＧ）を含む２０アミノ酸の何れかの発現を許容するはずである。抗体−ファージ変異体のコレクションを、エレクトロポレーションによって大腸菌ＸＬ−１ｂｌｕｅ株（Stratagene,San Diego,CA）内にトランスフェクトし、該ライブラリーの増幅のため３７℃で一晩成育させた。固く結合するヒト化６Ｇ４Ｖ１１ Ｆａｂの選択は、上記セクション（Ｉ）に記載されているようにＩＬ−８コート化９６穴プレート上で該ライブラリーを選別することによって達成された。選別の前に、ファージ／ライブラリーの数を、１．１×１０13ファージ／ｍｌに標準化し（それは最大ＯＤ２７０読み取り＝１ＯＤユニットを生産する）、ＩＬ−８コート化プレートを、ファージの添加の前２時間でブロッキング溶液（５０ｍｇ／ｍｌスキムミルクを含む２５ｍＮカルボン酸塩バッファー）を使用してインキュベートした（各選択は８のＩＬ−８コート化ウェル／ライブラリーを使用した）。ブロッキングおよび洗浄工程の後、８のＩＬ−８コート化ウェルのそれぞれに抗体−ファージ（１．１×１０１３ファージ／ｍｌで滴定）の１００μｌの添加と共に始め、引き続き２５℃で１時間インキュベートした。非特異的結合抗体−ファージを、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を使用して１０回急速に洗浄することによって除去した。ソート＃１について、低緊縮洗浄（２５℃で１０分１００μｌＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／ウェル）を、固定化ＩＬ−８に結合した固い結合抗体−ファージの小割合を捕らえるために使用した。ＩＬ−８に特異的に結合した抗体−ファージ変異体を、２５℃で５分２００ｍＭグリシン、ｐＨ２．０の１００μｌ／ウェルを使用して溶出した。それから、８のウェルから溶出された抗体−ファージ変異体をプールし、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（１／３溶出容量）を使用して中和した。ファージを滴定し、上記セクション（Ｉ）に記載されたように増殖させた。洗浄の緊縮性を、選択の最後でのファージの回収パーセントに依存して選別の各周で連続的に増大した。洗浄条件は以下のものであった：ソート＃２（４×１５分間隔；全時間＝６０分）およびソート＃３（それぞれ＃３ａ：８×１５分間隔；＃３ｂ：１２×１０分間隔；全時間＝１２０分）。回収されたファージの全数は、各選択の後に段階的に減少し、、非バインダーまたは弱いバインダーが再び選択されていることを示唆した。陰性対象（抗体−ファージストップ変異体）の回収は、選別を通じて一定量であった（およそ０．０００１から０．００００１パーセント）。
ソート＃３由来の１８のランダム変異体を、ＣＤＲ−Ｌ１の３５位でのアミノ酸コンセンサスを探すためにＤＮＡシークエンシングにより分析した。図４３Ａに存在するデータは、グリシンがシークエンスされた変異体の３３％で３５位を占めることを示した。しかしながら、ＮＮＳコドン組み合わせ／アミノ酸の数を校正した後、グリシンの頻度は、１６．６％に減少した。グルタミン酸が最高頻度（２２％）で現れ、引き続きアスパラギン酸およびグリシン（１６．６％）が現れた。野生型アスパラギンおよび置換アラニンの回収の頻度は、わずか５．６％であった。興味深いことに、高頻度のグリシンは、ずっと広範囲の構造が、側鎖として単一の水素原子の結果として結合角度（φ−ψ）ペアリングの立体化学的妨害の減少に寄与するＣＤＲ−Ｌ１のループを許容することを示唆した。逆に、３５位でのグルタミン酸は、より固定化した大きな電荷極性側鎖によって強いられる回転のより小さい自由度を強制されることによってループの可変性を制限した。
親和性成熟変異体の可溶性Ｆａｂ（Ｎ３５Ｇ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５ＥおよびＮ３５Ａ）は、ＩＬ−８結合をブロックする能力を評価するための上記セクション（Ｊ）に記載されたように作製された。図４３Ｂに示されるように、変異体Ｎ３５Ａ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５ＥおよびＮ３５Ｇは、それぞれおよそ０．２ｎＭ、０．９ｎＭ、０．１ｎＭおよび３．０ｎＭのＩＣ50でヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８結合を阻害することが見出された。親和性成熟変異体の全てが、ヒト化６Ｇ４Ｖ１１ ｍＡｂと比較して３から１００倍の範囲でＩＬ−８を結合する点での改良を示した。親和性成熟変異体、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅは、アラニンスキャン変異体、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａよりもヒト好中球に対するＩＬ−８結合のブロックにおいて２倍以上の能力を有した。
変異体６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａおよび６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅの平衡化および速度論の測定値を、Blake等，J.Biol.Chem.271:27677（1996）に記載されたように。ＫｉｎＥＸＡTM自動イムノアッセイ系（Sapidyne Instruments Inc.,Idaho City,ID）を使用して測定した。抗原コート粒子を調製する方法を、以下のように修飾した：１ｍｌの活性化アガロースビーズ（Reacti-Gel 6X;Pierce,Rockford,IL）を、２０μｇ／ｍｌのヒトＩＬ−８を含む５０ｍＭカルボン酸バッファー、ｐＨ９．６中の抗原を使用してコートし、２５℃で一晩ロッカー上で穏やかに攪拌しながらインキュベートした。それからＩＬ−８コートビーズを、ビーズ上の非反応性基を不活性化するために１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を使用して二度洗浄し、非特異的結合を減少するために２５℃で１時間、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Pierce,Rockford,IL）を使用してブロックした。該ビーズを、３０ｍｌの最終濃度でアッセイバッファー（ＰＢＳ中に０．１％ウシ血清アルブミン）中に再懸濁した。５５０μｌの等量のＩＬ−８コート化ビーズ懸濁液を、ＫｉｎＥＸＡ観察細胞において新鮮な４ｍｍ高カラムをパックするために各時間で使用した。平衡化および速度論の実験の両者で、ＩＬ−８コート化ビーズによって捕らえられた抗体−抗原混合物由来の非結合抗体の量を、蛍光的にラベルされた二次抗体を使用して測量した。ネズミ６Ｇ４．２．５を、Ｒ−ＰＥ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）2ヤギ抗マウスＩｇＧ、２°抗体特異的Ｆｃ断片（Jackson Immuno Research Laboratories,West Grove,PA）およびヒト化親和性成熟Ｎ３５Ａ（ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2）を使用して検出し、Ｎ３５Ｅ Ｆａｂを、Ｐ−ＲＥ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）２°抗体（jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,PA）を使用して検出した；両者は１：１０００希釈物であった。
平衡化測定値を、様々な濃度のヒトＩＬ−８（０，０．００９，０．０１９，０．０３９，０．０７８，０．１５６，０．３１２，０．６２５，１．２５，２．５ｎＭ）を使用して抗ＩＬ−８抗体（０．００５μｇ／ｍｌ）の一定量をインキュベートすることによって測定した。抗体−抗原混合物を、該分子を平衡に到達するようにさせるため、２５℃で２時間インキュベートした。その後、各サンプルを、０．５ｍｌ／分の流速でトータル９分／サンプル、ＫｉｎＥＸＡ観察細胞中の天然ＩＬ−８コート化ビーズパックを通過させた。平衡定数（Ｋｄ）を、Sapidyne Instruments Inc.によって提供されたソフトウェアーを使用して計算した。
会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）の速度を、一定量の抗体と抗原を共にインキュベートし、経時的にＩＬ−８コート化ビーズに結合した非複合体化抗ＩＬ−８の量を測定することによって測定した。速度論実験で使用された抗体の濃度は、上記記載の平衡化実験で使用されたものと同一であった。一般的に、使用されたヒトＩＬ−８の量は、ＩＬ−８コート化ビーズに結合する抗ＩＬ−８の７０％阻害を引き起こす平衡実験の結合曲線から由来する濃度であった。およそ９のデータ点を校正するために１５分ごとに測定をなした。ｋａは、Sapidyne Instruments,Incによって提供されたソフトウェアーを使用して計算した。回路速度は、式：ｋｄ＝Ｋｄ／ｋａを使用して測定した。
図４４は、親和性成熟変異体、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅおよび６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂに対する平衡定数（Ｋｄ）はそれぞれおよそ５４ｐＭおよび１１４ｐＭであったことを示す。ＩＬ−８に対する６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ Ｆａｂの親和性の改良は、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ Ｆａｂに対する４．７×１０6対６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆ（ａｂ’）2に対する２．０×１０6の２倍速い会合の速度（Ｋon）に寄与することができる。（６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆ（ａｂ’）2および６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ ＦａｂのＫｄは同じである。）解離速度（Ｋoff）は有意に異ならなかった。分子モデル化は、グルタミン酸を用いたアスパラギンの置換が、ＩＬ−８との接触を容易にするＣＤＲ中のＲ９８（ＣＤＲ−Ｈ３）またはＫ５０）ＣＤＲ−Ｌ２）の近隣残基の電荷を中和することによってそれぞれ直接または間接にＩＬ−８との抗体の相互作用に影響することを示唆する。もう一つの効果は、ＩＬ−８との他のＣＤＲ−Ｌ１ループ残基のより適切な接触を容易にするＣＤＲ−Ｌ１に対するより安定なループ構造の形成である。軽鎖においてアスパラギンをグルタミン酸に置換することを示すｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ．ＦａｂのＤＮＡ（配列番号）およびアミノ酸（配列番号）は、図４５に示されている。
Ｎ．ヒト化抗ＩＬ−８変異体６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ Ｆａｂの特徴付け
親和性成熟Ｆａｂ変異体、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅを、上記セクション（Ｂ）（２）に記載されたように、ＩＬ−８介在性好中球走化性を阻害する能力について試験した。セクション（Ｂ）（２）に記載された再使用可能９６穴走化性チェンバーを、５ミクロンＰＶＰフリーポリカルボン酸塩フィルター（ChemoTx101-5,Neuro Probe,Inc.Cabin John,MD）を含む内毒素フリー使い捨て走化性チェンバーと置換した。図４６に示されているように、変異対Ｎ３５Ｅは、ウサギまたはヒトＩＬ−８のそれぞれの２ｎＭ刺激によって誘導されるＩＬ−８介在性好中球走化性を効率的にブロックする。実際、３．７ｎＭ−３３ｎＭの間の抗体濃度での阻害レベルは、バッファー対照とは有意に異ならず、変異体Ｎ３５Ｅがこの反応を完全に阻害することを示した。ウサギおよびヒトＩＬ−８の両者に対するＩＣ50は、それぞれおよそ２．８ｎＭおよび１．２ｎＭであった。無関係なアイソタイプコントロールＦａｂ（４Ｄ５）は好中球移動を阻害せず、親和性変異体Ｎ３５Ｅで観察された結果はＩＬ−８特異的である。
Ｏ．ヒト化６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ Ｆ（ａｂ’）2ロイシンジッパーの構築
６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅに対するＦ（ａｂ’）2発現プラスミドを、上記セクション（Ｋ）に記載されたものと同様な方法を使用して構築した。発現プラスミドｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ．Ｆ（ａｂ’）2を、プラスミドｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．Ｆ（ａｂ’）2（上記セクション（Ｋ）に記載されている）を、重鎖定常ドメイン−ＧＣＮ４ロイシンジッパーをコードする２８０５ｂｐ断片を単離するために、制限酵素ＡｐａＩおよびＮｄｅＩを使用して切断し、上記セクション（Ｍ）に記載されたように得られたｐＰＨ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅファージディスプレークローン（６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ Ｆａｂをコードする）のＡｐａＩ−ＮｄｅＩ断片にそれを連結することによって作製した。完全なコード配列の完全性を、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。
Ｐ．全長ヒト化６Ｇ２Ｖ１１Ｎ３５Ａ ＩｇＧ発現プラスミドの構築
ヒト化抗ＩＬ−８変異体６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａの全長ＩｇＧ1バージョンを、６Ｇ４．２．５抗ＩＬ−８ ｍＡｂの全長組換えネズミ−ヒトキメラを含むジシストロニックＤＨＦＲ−イントロン発現ベクター（Lucas等，Nucleic Acids Res.,24:1774-1779（1996））を使用して作製した。ヒト化変異体６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａをコードする発現プラスミドを、以下のように評価した。第一に、中間体プラスミド（ｐＳＬ−３）を、ヒト化抗ＩＬ−８変異体６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａの可変重鎖をコードする配列を、キメラ６Ｇ４．５抗ＩＬ−８抗体の可変重鎖領域を含むｐＲＫ５６Ｇ４ｃｈｉｍ．２Ｖｈに運ぶために作製した。ベクターｐＲＫ５６Ｇ４ｃｈｉｍ．Ｖｈを、キメラ抗体の重鎖可変領域を取り出すためにＰｖｕＩＩおよびＡｐａＩを使用して切断し、ｐＳＬ−３を作製するために、８０ｂｐ ＰｖｕＩＩ−ＸｈｏＩ合成オリゴヌクレオチド（６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５ＡのＬｅｕ４からＰｈｅ２９をコードする）（図４７）、および６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａの可変重鎖配列の残余の部分を運ぶｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．７由来の２９１ｂｐ ＸｈｏＩ−ＡｐａＩ断片と再連結した。哺乳動物発現プラスミド、ｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５ＡｃｈｏＳＤ．９（ＡＴＣＣに１９９７年１２月１６日に寄託がなされたｐ６Ｇ４２５Ｖ１１Ｎ３５Ａ．ｃｈｏＳＤと同一であり、ＡＴＣＣ登録番号２０９５５２を与えら得た）を作製するために、この中間体プラスミドを２つの他のプラスミドｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．Ｆ（ａｂ’）２およびｐ６Ｇ４２５ｃｈｉｍ２．ｃｈｏＳＤと接合するべく使用した。この発現構築物を、以下のＤＮＡ断片を使用して４部分の連結で集合させた：哺乳動物発現プラスミドの調節エレメントをコードする５２０３ｂｐ ＣｌａＩ−ＢｌｐＩ断片（ｐ６Ｇ４２５ｃｈｉｍ２．ｃｈｏＳＤ）、ヒト化６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ抗体の重鎖可変領域を含む４５１ｂｐ ＣｌａＩ−ＡｐａＩ断片（ｐＳＬ−３）、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ抗体の重鎖定常領域を運ぶ１９２１ｂｐ ＡｐａＩ−ＥｃｏＲＶ断片（ｐ６Ｇ４２５ｃｈｉｍ２．ｃｈｏＳＤ）および６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａの軽鎖可変および定常領域をコードする５５４ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＢｌｐＩ断片（ｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．Ｆ（ａｂ’）2）。クローンｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．ｃｈｏＳＤ．９のＤＮＡ配列（配列番号）をＤＮＡシークエンシングにより確認し、図４８に記載されている。
Ｑ．全長ヒト化６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ ＩｇＧ発現プラスミドの構築
ヒト化６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅに対する哺乳動物発現ベクターを、以下のように６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅを使用して６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａの軽鎖可変領域を交換することによって作製した：７５６６ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＢｌｐＩ断片（６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａの軽鎖可変領域をコードする５５４ｂｐ断片の空のもの）を、ｐＰＨ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ．７由来の５５４ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＢｌｐＩ断片（６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅの軽鎖可変領域をコードする）に連結した。ｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ．ｃｈｏＳＤ．１０の軽鎖のＮ３５位でのミューテーションを、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
Ｒ．変異体Ｎ３５ＡおよびＮ３５Ｅに対する安定なＣＨＯ細胞系
最終ヒト化ＩｇＧ１変異体（６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａおよび６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ）の安定な発現のため、重鎖及び軽鎖の両者を共発現するようにデザインされた上記記載のジシストロニックベクター（それぞれｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．ｃｈｏＳＤ．９およびｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ．ｃｈｏＳＤ．１０）を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＰ−１２細胞をトランスフェクトした（Lucas等，Nucleic Acid Res.24:1774-79（1996））。プラスミドをリポフェクチンを介してＣＨＯ ＤＰ１２細胞内へ導入し、ＧＨＴフリー培地中での増殖について選択した（Chisholm,V.High efficiency gene tranfer in mammalian cells.In:Glover,DM,Hames,BD.DNA Cloning 4.Mammalian systems.Oxford Univ.Press,Oxford pp 1-41（1996））。およそ２０の非増幅クローンをランダムに選択し、９６穴プレート内に再接種した。各コロニーの相対的特異的生産性を、３日後に各ウェルに蓄積した全長ヒトＩｇＧを定量するためにＥＬＩＳＡを使用して、およびウェル当たりの生存細胞数の代用マーカーとして蛍光色素、Ｃａｌｓｉｅｎ ＡＭを使用してモニターした。これらのデータに基づいて、いくつかの非増幅クローンを、増大する濃度のメトトレキサートの存在下でさらなる増幅のため選択した。１０，５０および１００ｎＭのメトトレキサートで生存する個々のクローンを選択し、生産性スクリーニングのため９６穴プレートに移した。再生産的に高特異的生産性を示す各抗体の一つのクローン（６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａに対してクローン＃１９３３ ａＩＬ８．９２ ＮＢ２８６０５／１２；６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａに対してクローン＃１９３４ ａＩＬ８．４２ ＮＢ２８６０５／１４）をＴフラスコ中で増殖させ、スピナー培養物をイノキュレートするために使用した。いくつかの工程の後、懸濁液適応細胞を、様々なホルモン及びタンパク質加水分解物を補ったＧＨＴ含有血清フリー培地中で生産培養物をイノキュレートするために使用した。組換えヒト化抗ＩＬ８を含む回収された細胞培養物液体を、プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂを使用して精製した。この工程の後の純度は、およそ９９％であった。均質化のための引き続く精製を、イオン交換クロマトグラフィー工程を使用して実施した。増幅の第一周の後のヒト化６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ ＩｇＧ１抗体の生産力価、および増幅の第二周の後のヒト化６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ ＩｇＧ１抗体の生産力価は、それぞれ２５０ｍｇ／Ｌおよび１５０ｍｇ／Ｌであった。
Ｓ．ヒト化６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ／Ｅ ＩｇＧ変異体の特徴付け
ヒト化全長ＩｇＧ変異体６Ｇ４．２．５を、125Ｉ−ＩＬ−８の結合を阻害し、ヒト好中球の活性化を中和する能力について試験した：その方法は上記セクション（Ｂ）（１）および（Ｂ）（２）に記載されている。図４９に示されるように、変異体６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａおよび６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅの全長ＩｇＧ１形態は、それぞれおよそ０．３ｎＭおよび０．５ｎＭのＩＣ５０でヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８結合を等しく阻害した。これは、全長ネズミｍＡｂ（ＩＣ50＝７．５ｎＭ）と比較してＩＬ−８の結合のブロックの１５−２５倍の改良を表す。同様に、二つの抗ＩＬ−８変異体は、ＩＬ−８介在性ヒト好中球走化性の阻害の観点で、等しい中和能力を示した（図５０Ａ−５０Ｂ）。ヒトＩＬ−８に対する６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ ＩｇＧ１および６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ ＩｇＧ１のＩＣ50は、それぞれ４．０ｎＭおよび６．０ｎＭであり、ウサギに対するものは、それぞれ４．０ｎＭおよび２．０ｎＭであった。関連するアイソタイプ対照Ｆａｂ（４Ｄ５）は、好中球移動を阻害しなかった。
ネズミ６Ｇ４．２．５ｍＡｂと比較したこれらの変異体のＩＬ−８に対する能力を、セクション（Ｍ）に記載されたようなＫｉｎＥｘＡを使用して測定した。図５１は、全長親和性成熟変異体６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ ＩｇＧ１および６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ ＩｇＧ１に対する平衡定数（Ｋｄ）が、それぞれおよそ４９ｐＭおよび８８ｐＭであったことを示す。６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ ＩｇＧ１に対するＫｄを、速度論実験から直接測定した。それぞれのＦａｂで報告されたように、親和性の改良は、６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ ＩｇＧ１（ｋａ＝８．７×１０5）のものと比較して６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ ＩｇＧ１（ｋａ＝３．０×１０6）のオンレートでおよそ２倍の増大に寄与した。さらに、これらの結果は、ヨウ素化ヒトＩＬ−８を使用した競合的ラジオイムノアッセイによって確認された。６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａまたは６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ ＩｇＧ１の５０ｐＭを、125Ｉ−ＩＬ−８の３０−５０ｐＭおよび非ラベルＩＬ−８の様々な濃度（０から１００ｎＭ）を用いて２時間インキュベートした。それから抗体−抗原混合物を、プロテインＡビーズの７０％溶液の１０μｌ（０．１％ＢＳＡでプレブロックした）を使用して４℃で１時間インキュベートした。そのビーズをマイクロ遠心器で短く回転し、非結合125Ｉ−ＩＬ−８を除去するため上清を捨てた。抗ＩＬ−８抗体に特異的に結合した125Ｉ−ＩＬ−８の量を、ガンマカウンターでプロテインＡペレットをカウントすることによって測定した。およそのＫｄ値は、ＫｉｎＥＸＡによって測定されたものと同様であった。６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ ＩｇＧ１および６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ ＩｇＧ１に対する平均Ｋｄは、それぞれ５４ｐＭ（１８−９０ｐＭ）および１９ｐＭ（５−３４ｐＭ）であった（図５２）。
Ｔ．ポリエチレングリコールによる修飾のためのヒト化６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ／Ｅ Ｆａｂの構築
６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａに対するＦａｂ発現ベクターを、酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパーと融合したヒトＩｇＧ１定常ドメインをコードする２８０５bp断片を除去するために、制限酵素ＡｐａＩおよびＮｄｅＩを使用してｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．Ｆ（ａｂ’）2を切断し、Eigenbrot等，Proteins:Struct.Funct.Genet.,18:49-62（1994）に記載されたプラスミドｐＣＤＮＡ．１８から２６８３ｂｐ ＡｐａＩ−ＮｄｅＩ断片とそれを置換することによって構築した。ｐＣＤＮＡ．１８ ＡｐａＩ−ＮｄｅＩ断片は、ＰＥＧ分子を付着するために使用されるヒンジ領域中の遊離システイン酸基を含むヒト定常ＩｇＧ１重鎖のコード配列を有する。ｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．Ｆ（ａｂ’）2から単離された３７５８ｂｐ ＡｐａＩ−ＮｄｅＩ断片（６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａの軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする）を、ｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．ＰＥＧ−１を作製するためにｐＣＤＮＡ．１８の２６８３ｂｐ ＡｐａＩ−ＮｄｅＩ断片に連結した。完全なコード配列の完全性を、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。ヒンジ内にシステインを有する重鎖定常ドメインのヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列が、図５３に示されている。
６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅに対するＦａｂ’発現プラスミドを、６Ｇ＄Ｖ１１Ｎ３５Ｅの完全な軽鎖および重鎖可変ドメインを有する３７５８ｂｐ ＡｐａＩ−ＮｄｅＩ ＤＮＡ断片を単離するために制限酵素ＡｐａＩおよびＮｄｅＩを使用してｐＰＨ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ（上記セクション（Ｏ）由来）を切断し、ｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ｅ．ＰＥＧ−３を作製するためにｐ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．ＰＥＧ−１由来の２６８３ｂｐ ＡｐａＩ−ＮｄｅＩ ＤＮＡ断片にそれを連結することによって同様に作製した。完全なコード配列の完全性を、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
抗ＩＬ−８ ６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂ’変異体を、２０ｋＤ直鎖状メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド、３０ｋＤ直鎖状メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド、４０ｋＤ直鎖状メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド、または４０ｋＤ分枝状メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドを用いて、以下に記載のように修飾した。全てのＰＥＧは、Shearwater Polymers,Inc.から商業的に得た。
ａ．物質と方法
Ｆａｂ’−ＳＨ精製
親和性成熟抗体６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５ＡのＦａｂ’−ＳＨ抗体断片を、Carter等，Bio/Technology 10,163-167（1992）に記載されたように、発酵器で抗細胞密度に成育した大腸菌内で発現した。Ｆａｂ’−ＳＨ断片の精製は、４’，４’−ジチオジピリジン（ＰＤＳ）を使用したＦａｂ’−ＳＨ断片の保護、保護されたＦａｂ’−ＳＨ断片の部分的精製、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用したＦａｂ’−ＰＤＳの脱保護、最後にゲル浸透クロマトグラフィーを使用することによる遊離Ｆａｂ’−ＳＨの単離によって成し遂げられた。
ＰＤＳを使用したＦａｂ’−ＳＨの保護
発酵ペーストサンプルを、発酵ペーストのグラム当たり１．７mgの４’，４’−ジチオジピリジンを含む３容量の２０ｍＭ ＭＥＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０に溶解し、６．０に近いｐＨを有する懸濁液を生じた。該懸濁液をホモゲナイザーを通し、０．２５％の最終濃度にホモゲナイズされた物に対して５％ ＰＥＩ（ｗ／ｖ）、ｐＨ６を引き続き加えた。それから該混合物を固体を除去するために遠心分離し、透明な上清を冷水の添加によって３ｍｌより小さい伝導率に調節した。
イオン交換クロマトグラフィーを使用したＦａｂ’−ＳＨ分子の部分的精製
調節された上清を、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０に平衡化されたＡＢＸ（Baker）カラムに乗せた。該カラムを平衡バッファーで洗浄し、引き続き２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０から２０ｍＭ ＭＥＳ、３５０ｍＭ塩化ナトリウムまでの１５カラム容量の直線勾配を使用して、Ｆａｂ’−ＳＨを溶出した。該カラムを２８０ｎｍの吸光度でモニターし、溶出物を分画に回収した。
ＤＴＴを使用したＦａｂ’−ＳＨ抗体断片の脱保護
ＡＢＸプールのｐＨを、希釈ＨＣｌを加えて４．０に調節した。それからｐＨ調節溶液を、０．２ｍＭの最終濃度にＤＴＴを加えることによって脱保護した。該溶液を約３０分インキュベートし、それから１５ｍＭリン酸アトリウム、２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ４．０を使用して平衡化したゲル濾過セファデックスＧ２５カラムにアプライした。溶出後、該プールのｐＨをｐＨ５．５に上昇させ、貯蔵ののために−７０℃で凍結するかまたは以下に記載のＰＥＧ−ＭＡＬを使用して誘導化
代わりのＦａｂ’−ＳＨ精製
代わりに、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を、以下の方法を使用して精製することができる。１００ｇの発酵ペーストを、５０っＭ酢酸、ｐＨ２．８、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦの２００ｍｌの存在下で溶解する。室温で３０分強烈に混合した後、該抽出物を１００ｍｇのタカ卵白リゾチームと共にインキュベートする。ＤＥＡＥ高流速樹脂（およそ１００ｍｌ）を、焼結ガラス漏斗上で１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５，１ｍＭ ＥＤＴＡを使用して平衡化する。それからＦａｂ’−ＳＨ断片を含む浸透圧ショック抽出物を、樹脂を通じて濾過する。
プロテインＧセファロースカラムを、１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５、１ｍＭ ＥＤＴＡを使用して平衡化し、それからＤＥＡＥフロースルーサンプルを置く。該カラムを洗浄し、引き続き１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５，１ｍＭ ＥＤＴＡを使用して３回の４カラム容量の洗浄を実施する。遊離チオールを含むＦａｂ’−ＳＨ抗体断片を、１００ｍＭ酢酸、ｐＨ２．８、１ｍＭ ＥＤＴＡを使用して該カラムから溶出する。溶出後、該プールのｐＨをｐＨ５．５に上昇させ、貯蔵のため−７０℃ですぐに凍結するかまたは以下に記載のようにＰＥＧ−ＭＡＬを使用して誘導化する。
Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧの調製
上記記載のように得られたＦａｂ’−ＳＨ調製物の遊離チオール含有量を、Protein Structure:A Practical Approach,Creighton,T.E.,編，IRL Press（Oxford,UK:1990）,pp.155-167中のCreightonの方法にしたがって、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）分析によって測定した。遊離チオールの濃度を、チオニトロ安息香酸アニオンに対してｅ412＝１４，１５０ｃｍ-1Ｍ-1を使用し、Ｆａｂ’−ＳＨ抗体に対してＭｒ＝４８，６９０およびｅ280＝１．５を使用して、４１２ｎｍの吸光度の増大から計算した。Ｆａｂ’−ＳＨプロテインＧセファロースプール、または脱保護Ｆａｂ’−ＳＨゲル浸透プールに対して、５モル等量のＰＥＧ−ＭＡＬを加え、ｐＨを１０％ＮａＯＨを使用してｐＨ６．５にすぐに調節した。
Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧを、２．５×２０ｃｍカチオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ５０−ＨＳ）を使用して精製した。該カラムを、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５を含むバッファーを使用して平衡化した。ＰＥＧ化抗体断片を含むカップリング反応物を、およそ２．０ｍＳの伝導率に脱イオン水を使用して希釈した。それから調節カップリング反応物を、平衡化Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳカラムに乗せた。非反応ＰＥＧ−ＭＡＬを、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５の２カラム容量を使用して該カラムから溶出した。Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧを、１５カラム容量かけて２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５中の０から４００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配を使用して該カラムから溶出した。
代わりに、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸカラムを、Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ分子を精製するために使用することができる。該カラムを、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０（バッファーＡ）を使用して平衡化する。カップリング反応物を、伝導率がバッファーＡのものと等しくなるまで（およそ２．０ｍＳ）脱イオン水で希釈し、該カラムに乗せる。非反応ＰＥＧ−ＭＡＬを、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０の２カラム容量を使用して該カラムから洗浄させる。Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧを、１５カラム容量かけて、２０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０中の０から１００ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4の直線勾配を使用して該カラムから溶出する。
サイズ排除クロマトグラフィー
各分子の流体力学サイズまたは有効サイズを、Pharmacia Superose 6 HR 10/30カラム（１０×３００ｍｍ）を使用して測定した。流動相は、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．０であった。流速は０．５ｍｌ／分であり、該カラムを環境温度で維持した。ＰＥＧがほとんどシグナルに影響しない場合、２８０ｎｍの吸光度をモニターした。シオアノコバラミン、ミオグロビン、オボアルブミン、ＩｇＧ、チログロブリンモノマーおよびダイマーを含むＢｉｏｒａｄ ＮＷスタンダードを、ＰＥＧ化種の有効サイズを見積もるための標準曲線を作製するために使用した。
ｂ．結果
サイズ排除クロマログラフィー
各修飾種の有効サイズを、サイズ排除クロマログラフィーを使用して特徴付けした。その結果が図６０の下部に示されている。ＰＥＧ ５ｋＤ、１０ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤ（直鎖状）、４０ｋＤ（分枝状）または１００，０００ｋＤを使用して修飾された抗ＩＬ−８ Ｆａｂ断片の理論的分子量が、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによって得られたＰＥＧ化断片の見かけの分子量と共に示されている。Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ断片の理論的分子量と比較して、見かけの分子量（サイズ排除ＨＰＬＣによって計算される）は、該断片に付着したＰＥＧのサイズの増大によって劇的に増大する。例えばＰＥＧ １０，０００Ｄといった小分子量ＰＥＧの付着は、１８０，０００Ｄの見かけの分子量に３倍までＰＥＧ化抗体断片（５９，７００Ｄ）の理論的分子量を増大するのみである。対照的に、抗体断片に対する例えば１００，０００Ｄ ＰＥＧといったより大きい分子量のＰＥＧの付着は、２，０００，０００Ｄの見かけの分子量に１２倍までＰＥＧ化抗体断片（１５８，７００Ｄ）の理論的分子量を増大する。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
図６１において、上部のパネルは、還元条件下で５ｋＤ（直鎖状）、１０ｋＤ（直鎖状）、２０ｋＤ（直鎖状）、３０ｋＤ（直鎖状）、４０ｋＤ（直鎖状）、４０ｋＤ（分枝状）の分子量のＰＥＧを使用して修飾された抗ＩＬ−８断片のサイズが示されている。非修飾Ｆａｂは、右から左にレーン２に示されている。Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の両者は、ＰＡＧＥによって測定されたようにおよそ３０ｋＤの分子量を有した。各ＰＥＧ化断片サンプルは、（１）３０ｋＤの分子量を示す第一のバンド（軽鎖に寄与する）；および（２）４０，４５，７０，１１０，１２５，１５０および３００ｋＤの増大する分子量を示す第二のバンド（ＰＥＧがヒンジＳＨで特異的に結合した重鎖に寄与する）の二つのバンドを生じた。この結果は、ＰＥＧ化が軽鎖は非修飾したままで、Ｆａｂの重鎖に特異的に制限されることを示唆した。
下部のパネルは、５ｋＤ（直鎖状）、１０ｋＤ（直鎖状）、２０ｋＤ（直鎖状）、３０ｋＤ（直鎖状）、４０ｋＤ（直鎖状）、４０ｋＤ（分枝状）または１００ｋＤ（直鎖状）の分子量のＰＥＧを使用して修飾された抗ＩＬ−８断片のサイズを示す悲観源ＰＡＧＥである。ＰＥＧ化断片は、およそ７０ｋＤ、１１５ｋＤ、１２０ｋＤ、１４０ｋＤ、２００ｋＤおよび３００ｋＤの分子量を示す。
ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルは、Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ分子が均質に精製されており、該分子がそれらに付着したＰＥＧ分子のサイズの観点でのみ異なることを確認する。
Ｕ．抗ＩＬ−８−Ｆ（ａｂ’）2断片のアミン特異的ＰＥＧ化
ＰＥＧ化Ｆ（ａｂ’）2種を、活性に影響する最小のタンパク質修飾を有する大きな有効サイズを達成するために、大分子量または分枝状ＰＥＧを使用することによって生産した。修飾は、一次アミンと反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミド化学に関与した（リシンおよびＮ末端）。ＣＤＲ領域に非常に近接したＮ末端を修飾する可能性を減少するために、一般的に使用される７のｐＨよりもむしろ８のｐＨでの反応を使用した。ｐＨ８．０では、反応性の種（電荷ＮＨ3+）の量は、アミノ末端のα−ＮＨ２基（およそ７のｐＫa）よりも、リシン基のε−ＮＨ２基（ｐＫa＝１０．３）に対してかなり存在するであろう。直鎖状ＰＥＧについて、ＮＨＳ−ＰＥＧのメトキシ−スクシンイミド誘導体を、ＰＥＧのＮＨＳエステル（ｐＨ８．０で２５℃で５−７分の半減期）と比較して溶液中での有意に長い半減期（上記条件下で１７分）のため使用した。より加水分解しない傾向にあるＰＥＧを使用することによって、より大きい程度の修飾が、より少ないＰＥＧで達成される。分枝状ＰＥＧを、抗体断片の有効サイズの大きな増大を誘導するために使用した。
ａ．物質
全てのＰＥＧ試薬は、Shearwater Polymersから購入し、デシケーターで−７０℃で貯蔵した：分枝状Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ＰＥＧ（ＰＥＧ２−ＮＨＳ−４０ＫＤａ）は、二つの分枝のそれぞれで２０ｋＤａ ＰＥＧを有し、メトキシ−スクシンイミジル−プロピオン酸−ＰＥＧ（Ｍ−ＳＰＡ−２００００）は、２０ｋＤａのＰＥＧを有する直鎖状ＰＥＧ分子である。タンパク質を、上記セクション（Ｋ）および（Ｏ）に記載されたように大腸菌において組換え的に生産し、（Ｆａｂ’）2として精製した。
ｂ．方法
ＩＥＸ法：J.T.Baker Wide-Pore Carboxy-sulfone（CSX）、５ミクロン、７．７５×１００ｍｍ ＨＰＬＣカラムを、異なるＰＥＧ化産物の分画のため使用し、リシンが修飾されるための電荷の差異を利用した。該カラムを４０℃に熱した。以下の表７に示されたような勾配を使用し、バッファーＡは２５ｍＭホウ酸ナトリウム／２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０であり、バッファーＢは１Ｍ硫酸アンモニウムであり、バッファーＣは５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０であった。
0004108760.tif 000008
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：各分子の流体力学的または有効サイズを、Pharmacia Superrose-6 HR 10/30 カラム（１０×３００ｍｍ）を使用して測定した。移動相は、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０であった。流速は０．５ｍｌ／分であり、該カラムを環境温度で維持した。ＰＥＧがシグナルにほとんど寄与しない場合に、２８０ｎｍでの吸光度をモニターした。シアノコバラミン、ミオグロブリン、オボアルブミン、ＩｇＧ、チログロブリンモノマーおよびダイマーを含むＢｉｏｒａｄ ＭＷスタンダードを、ＰＥＧ化種の有効サイズを見積もるための標準曲線を生産するために使用した。
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ−光散乱：正確な分子量の測定のために、このカラムを、５０°、９０°および１３５°の３つの検出角度を装備したオンライン光散乱検出器（Wyatt Minidawn）に接続した。屈折率検出器（Wyatt）もまた、濃度を測定するためにオンライン上に置いた。全てのバッファーを、Millipore 0.1μフィルターを使用して濾過した；さらに、０．０２μ Whatman Anodisc 47を、該カラムの前にオンライン上に置いた。
散乱された光の強度は、以下の式にしたがって形状とは独立に散乱種の分子量（Ｍ）を直接的に比例する：
Ｍ＝Ｒ0／Ｋ．ｃ
式中Ｒ０はＲａｙｌｅｉｇｈ比であり、Ｋは溶液の屈折率、入射角の波長、およびｄｎ／ｄｃに関する光学定数であり、ｄｎ／ｄｃは溶液濃度、ｃの変化の観点から溶媒と溶液の間の変化屈折率である。該系は、トルエン（６３２．８ｎｍで１．４０６×１０-5のＲ0）を使用して修正された；０．１８のｄｎ／ｄｃ、および１．２の吸光係数を使用した。該系は〜５％の最大の精度を有した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：４−１２％Ｔｒｉｓ−グリシンＮｏｖｅｘミニゲルを、Ｎｏｖｅｘ供給Ｔｒｉｓ−グリシンランニングバッファーと共に使用した。１０−２０μｇのタンパク質を各ウェルにアプライし、該ゲルを４５分１５０ｍＶ／ゲルで冷蔵ボックス内で操作した。それから該ゲルを、コロイド状クマシーブルー（Novex）を使用して染色し、それから数時間水を使用して洗浄し、保存して染色バッファー（Novex）に乾燥させた。
直鎖状（１）２０ｋＤａ−（Ｎ）−（Ｆａｂ’）2の調製：ｐＨ５．５バッファーに最初に処方された抗ＩＬ８の４ｍｇ／ｍｌ溶液を、ｐＨ８．０のリン酸ナトリウムバッファーに対して一晩透析した。５ｍＬタンパク質３：１のモル比で混合した。該反応を、１５ｍＬポリプロピレンファルコンチューブ内で実施し、ＰＥＧを５秒の低速度で該サンプルを揮発させながら加えた。それからそれを３０分振動器上に置いた。修飾の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。全部の５ｍｌ反応混合物を、非反応ＰＥＧの除去および単一または二重ＰＥＧ化種の精製のため、ＩＥＸ上に注入した。上記の反応は、５０％単一ラベル抗ＩＬ８の混合物を生産した。他の５０％非反応抗ＩＬ８を、ＰＥＧ化／精製工程の通じて再利用した。プールされたＰＥＧ化産物を、インビトロアッセイおよび動物ＰＫ研究のためｐＨ５．５のバッファーに対して透析した。内毒素レベルを、動物への投与の前、または細胞ベースアッセイのため測定した。レベルは、０．５ｅｕ／ｍｌより小さかった。分画はまた、均質性を確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に流した。最終産物の濃度は、１．３４の吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸光度、同様にアミノ酸分析によって評価した。
分枝状（１）４０ＫＤａ−（Ｎ）−（Ｆａｂ’）２の調製：ｐＨ５．５バッファー内に処方された抗ＩＬ−８（Ｆａｂ’）2の４ｍｇ／ｍＬ溶液を、ｐＨ８．０リン酸塩バッファーに対して一晩透析した。固体のＰＥＧパウダーを、６：１の最終ＰＥＧ：タンパク質モル比を与えるために二つの等量物で５ｍＬのタンパク質に加えた。各固体ＰＥＧ等量物を、５秒間低速度で揮発しながら１５ｍＬポリプロピレンファルコンチューブ中で該タンパク質に加え、１５分間浸透器上に該サンプルを置いた。修飾の程度を４−１２％Ｔｒｉｓ−グリシン（Novex）ゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、コロイド状クマシーブルー（Novex）を使用して染色した。５ｍＬのＰＥＧ−タンパク質混合物を、非反応ＰＥＧの除去のためイオン交換カラムに注入した。上記反応は、非反応（３７％）、単一ラベル（４５％）、二重ラベルおよび三重ラベル（１８％）種の混合物を生産した。これらは、高分子量内転物よりもむしろ、抗体当たり１ＰＥＧのみを有するタンパク質の最大の回収を得るために最適な条件であった。非修飾抗ＩＬ８は再利用した。ＰＥＧ化産物を、ファルコンチューブ内で分離して分画し、それからアッセイおよび動物ＰＫ研究のためｐＨ５．５のバッファーに対して透析した。内因性レベルは０．５ｅｕ／ｍｌより低かった。該分画をまた、均質性を確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動させた。最終産物の濃度を、１．３４の吸光係数を使用して２８０ｎｍの吸光度、同様にアミノ酸分析によって評価した。
分枝状（２）−４０ＫＤａ−（Ｎ）（Ｆａｂ’）２の調製：この分子は、既に修飾された分枝状（１）−４０ＫＤａ−（Ｎ）−（Ｆａｂ’）２に対して３：１のモル比のＰＥＧを１５分間隔で三回加えることによって効率的に作製された。該分子を、５０％分枝状（２）−４０ＫＤａ−（Ｎ）−（Ｆａｂ’）２としてＩＥＸで精製した。非修飾分子を、〜２０ｍｇのタンパク質が動物ＰＫ研究で単離されるまで再利用した。該産物を、ＳＥＣ−光散乱およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けした。
ｃ．結果
ＰＥＧはゲル濾過（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって測定されたように産物の流体力学的または有効サイズを有意に増大した。図６２は、２８０ｎｍでのＵＶ検出を使用したＰＥＧ化Ｆ（ａｂ’）種のＳＥＣプロフィールを示す。各分子の流体力学的サイズは、スタンダードＭＷ修正器を参考にして見積もった。図６２に要約されているように、（Ｆａｂ’）2の有効サイズの増大は、直鎖状２０ＫＤａ ＰＥＧ分子を加えることによって約７倍、一つの分枝状（”Ｂｒ（１）”）４０ｋＤａ ＰＥＧ分子を加えることによって約１１倍となり、二つの分枝状（”Ｂｒ（２）”）ＰＥＧ分子を加えることによっていくらかそれ以上となった。
光散乱検出は、該産物の正確な分子量を与え、修飾の程度を確認した（図６３）。精製物質の均質性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示された（図６４）。非誘導化Ｆ（ａｂ’）2は、１２０ｋＤａ種として移動し、直鎖状（１）２０ＫＤ−（Ｎ）−Ｆ（ａｂ’）2は、２２０ｋＤａバンドとして移動し、Ｂｒ（１）−４０ＫＤ（Ｎ）−Ｆ（ａｂ’）2は、４０ｋＤａの一つの主要バンドとして移動し、Ｂｒ（２）−４０ＫＤ−（Ｎ）−Ｆ（ａｂ’）2は、約５５０ｋＤａの主要バンドとして移動した。タンパク質は、ＰＥＧの立体効果のためその絶対的なＭＷよりも幾分大きく見えた。
Ｖ．６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５ＡのＰＥＧ修飾Ｆａｂ’断片のインビトロ活性特徴付け
５−４０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ分子および４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ分子を使用して修飾された抗ＩＬ−８６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂ’変異体を、ＩＬ−８結合及びヒト好中球の活性化の両者を阻害する能力について試験した；該方法は、上記セクション（Ｂ）（１）、（Ｂ）（２）および（Ｂ）（３）に記載された。ＰＥＧ−マレイミド修飾６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂ’分子に対する結合曲線およびＩＣ50は、図５４Ａ−５４Ｃに提示されている。５ｋＤＰＥＧ化Ｆａｂ’（３５０ｐＭ）のＩＣ50およびＦａｂ対照の平均ＩＣ50（３６６ｐＭ）は有意には異ならず、５ｋＤ ＮＷ ＰＥＧの添加が、修飾Ｆａｂ’に対するＩＬ−８の結合に影響しないことを示唆した（図５４Ａ）。しかしながら、１０ｋＤおよび２０ｋＤＰＥＧ化Ｆａｂ’分子に対するＩＬ−８の結合の減少が、天然Ｆａｂの平均ＩＣ50と比較して、次第に高くなるＩＣ５０（それぞれ５３７ｐＭおよび７３２ｐＭ）によって表されるように観察された。これらの値は、結合活性の最小の損失のみを表す（１．５から２．０倍の間）。ＩＬ−８結合におけるより明白な差異は、３０ｋＤおよび４０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ抗体について観察された（図５４Ｂ）。ＩＣ50は、Ｆａｂ対照の８０２ｐＭの値と比較して、それぞれ６２４ｐＭおよび１．１ｎＭであった。４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ Ｆａｂ’は、天然Ｆａｂに対してＩＬ−８結合の最大の減少（２．５倍）を示した（図５４Ｃ）。それにも関わらず、これらのＰＥＧ化ＦａｂによるＩＬ−８の結合の減少は、最小である。
ヒト好中球のＩＬ−８介在性活性化をブロックするＰＥＧ化抗体の能力を、ＰＭＮ走化性（上記セクションＢ（２）に記載された方法に従う）およびβ−グルクロニダーゼ放出（Lowman等，J.Biol.Chem.,271:14344（1996）に記載された方法に従う）アッセイを使用して示した。ＩＬ−８介在性走化性をブロックするＩＣ50が、図５５Ａ−５５Ｃに示されている。５−２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ化Ｆａｂ’抗体は、非ＰＥＧ化Ｆａｂ対照の２−３倍の範囲内でＩＬ−８介在性走化性をブロックすることができる（図５５Ａ）。この差異は、固有の変異体がこのタイプのアッセイを２倍に上昇することができるため、有意なものではない。しかしながら、Ｆａｂ対照（０．８ｎＭ）と比較して、３０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ−Ｆａｂ’（２．５ｎＭ）および４０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ−Ｆａｂ’（３．７ｎＭ）のより高いＩＣ50によって示されるように、３０ｋＤおよび４０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ化Ｆａｂ’抗体について、有意な差異が検出された（図５５Ｂ）。ＩＬ−８介在性走化性をブロックする４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ Ｆａｂ’分子の能力は、４０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ Ｆａｂ’のものと同様であった（図５５Ｃ）。ほとんどの場合、ＩＬ−８介在性走化性をブロックするＰＥＧ化Ｆａｂ’抗体の能力は、２−３倍のみ減少した。さらに、好中球の粒子からのβ−グルクロニダーゼの放出を、ヒトＰＭＮのＩＬ−８介在性活性化を評価するためのもう一つの指標として使用した。図５６Ａ（５ｋＤ、１０ｋＤおよび２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧを使用して得られる結果を表す）、図５６Ｂ（３０ｋＤおよび４０ｋＤ直鎖状ＰＥＧを使用して得られる結果を表す）、および図５６Ｃ（４０ｋＤ分枝状ＰＥＧを使用して得られる結果を表す）は、全てのＰＥＧ化Ｆａｂ’抗体が非ＰＥＧ化Ｆａｂ’対照と同様にまたはそれ以上にβ−グルクロニダーゼのＩＬ−８介在性放出を阻害することができることを示す。該データは、ＰＥＧ化Ｆａｂ’変異体が生物学的に活性であり、ヒト好中球を使用したインビトロアッセイにおいて外因性ＩＬ−８の高い量を阻害することができることを示す。
Ｗ．６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５ＡのＰＥＧ修飾Ｆ（ａｂ’）2断片のインビトロ活性の特徴付け（スクシンイミジル化学的カップリング法）。
（ａ）Ｆ（ａｂ’）2当たり単一２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ分子、（ｂ）Ｆ（ａｂ’）2当たり単一４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ分子、（ｃ）Ｆ（ａｂ’）2当たり３，４または５個の２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ分子（（１）Ｆ（ａｂ’）2当たり３つの２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ分子を有する種、（２）Ｆ（ａｂ’）2当たり４つの２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ分子を有する種、（３）Ｆ（ａｂ’）2当たり５つの２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ分子を有す種の混合物；「２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ（３，４，５）Ｆ（ａｂ’）2」と表す）、または（ｄ）Ｆ（ａｂ’）2当たり２つの４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ分子（「４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ（２）Ｆ（ａｂ’）2」と表す）を、125Ｉ−ＩＬ−８結合を阻害する能力、及びヒト好中球の活性化を中和する能力について試験した。使用される方法は、上記セクション（Ｂ）（１）、（Ｂ）（２）および（Ｂ）（３）に記載されている。ＰＥＧ化Ｆ（ａｂ’）2変異体についての結合曲線は、図５７Ａ−５７Ｂに示されている。Ｆ（ａｂ’）2対照、単一２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ修飾Ｆ（ａｂ’）2、および単一分枝状ＰＥＧ修飾Ｆ（ａｂ’）2の間で有意な差異は観察されなかった（図５７Ａ）。しかしながら、複数のＰＥＧ分子を含むＦ（ａｂ’）2変異体は、ＩＬ−８を結合する能力においてわずかな減少（２倍より小さい）を示した。２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ（３，４，５）Ｆ（ａｂ’）2および４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ（２）Ｆ（ａｂ’）2変異体のＩＣ50は、Ｆ（ａｂ’）2対照の３４９ｐＭと比較して、それぞれ４３７ｐＭおよび５１０ｐＭであった（図５７Ｂ）。
ＩＬ−８介在性好中球走化性をブロックするこれらのＰＥＧ化Ｆ（ａｂ’）2変異体の能力は、図５８Ａ−５８Ｂに示されている。ＰＭＮ結合データと一致して、単一直鎖状および分枝状ＰＥＧ Ｆ（ａｂ’）2変異体は、非ＰＥＧ化Ｆ（ａｂ’）2対照と同様のＩＬ−８介在性走化性をブロックすることができた（図５８Ａ）。ＰＭＮ走化性を阻害する４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ（２）Ｆ（ａｂ’）2変異体の能力は対照Ｆ（ａｂ’）2と同一である一方、２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ（３，４，５）Ｆ（ａｂ’）2混合物は、対照抗体の３倍以内で阻害することができた（図５８Ｂ）。
図５９Ａおよび５９Ｂには、ＩＬ−８刺激化ヒト好中球による脱粒子化の測定であるβ−グルクロニダーゼ放出アッセイの結果が示されている。単一２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ修飾Ｆ（ａｂ’）2および単一４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ修飾Ｆ（ａｂ’）2変異体は、Ｆ（ａｂ’）2対照と同様にβ−グルクロニダーゼの放出を阻害することができた（図５９Ａ）。４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ（２）Ｆ（ａｂ’）2は、Ｆ（ａｂ’）2対照の２倍以内でこの反応を阻害した（図５９Ｂ）。２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ（３，４，５）分子は試験しなかった。全体として、Ｆ（ａｂ’）2ＰＥＧ化抗ＩＬ−８抗体は生物学的に活性であり、ヒト好中球に対するＩＬ−８結合、および細胞活性化を導くシグナリング現象を有効に妨げた。
Ｘ．静脈投与に引き続く正常ウサギにおけるＰＥＧ化抗ＩＬ−８（ヒト化）Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ’断片の８個の構成物の薬力学的および安全性研究
本研究の目的は、正常ウサギにおける非ＰＥＧ化断片に対する６個のＰＥＧ化ヒト化抗ＩＬ−８構成物（上記セクション（Ｔ）および（Ｕ）に記載されてように得られたＰＥＧ化６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．Ｆａｂ’およびＰＥＧ化６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．Ｆ（ａｂ’）2）の薬力学および安全性に関するＰＥＧ化の影響を評価することであった。２／３匹のオスのウサギの８個の群が、一つの抗ＩＬ−８構成物の単一の静脈（ＩＶ）丸薬投与を介して、ＰＥＧ化６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ．Ｆａｂ’またはＰＥＧ化６Ｇ４Ｎ１１Ｖ３５Ａ．Ｆ（ａｂ’）２構成物（２ｍｇ／ｋｇ）の等量のタンパク質量を受け取った。以下の表８に示されたようなスケジュールにしたがって、血清サンプルを集め、抗ＩＬ−８タンパク質濃度およびＥＬＩＳＡによる抗ＩＬ−８構成物に対する抗体処方について分析した。
0004108760.tif 000009
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ａ．方法
群当たり３匹のニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷ）（第７群、ｎ＝２を除く）は、耳の縁の静脈中のＩＶ丸薬投与を介して等量の６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａタンパク質（Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）2）構成物を２ｍｇ／ｋｇで受け取った。アミノ酸組成分析、並びに６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂ’構成物に対して１．２６および６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆ（ａｂ’）２構成物に対して１．３４の吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸光度を、タンパク質濃度を測定するために実施した。全血液サンプルを、約５個の点で耳動脈カニューレ挿入を介して集めた。サンプルを血清について回収し、ＩＬ−８結合ＥＬＩＳＡを使用して遊離６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）2構成物についてアッセイした。アッセイは、サンプルが利用可能になるため、研究を通じて実施した。全ての動物を、最後の血液採取に引き続き殺し、第１，４−８群において全ての動物で死体解剖を実施した。６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ構成物に対する抗体の形成のため、非区画化薬力学分析を、１６８時間までのみ濃度対時間データで実施した。
ｂ．結果
４匹の動物（動物Ｂ、Ｐ、Ｑ、Ｖ）において、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるウサギ血清に対する干渉を検出した（すなわち、投与前の抗ＩＬ−８抗体の測定可能な濃度）。しかしながら、これらの値は非有意なレベルであり、薬力学的分析に影響しないため、該データはこの干渉に対して修正しなかった。
１匹の動物（動物Ｇ；第３群）を、該研究の終結の前に取り除き、薬力学的分析から除外した。４時間で、ウサギ動脈カニューレ挿入を介した血液採取に引き続いてウサギで生じるため、該動物は薬剤が関連するとは思われない発作の兆候を示した。
正常なウサギにおける８つの抗ＩＬ−８構成物の平均濃度−時間プロフィールが、以下の表９に要約されている。抗ＩＬ−８構成物に対して有意な抗体は、第１群（Ｆａｂ’対照）を除いて全ての投与群において第１３−１４日で存在した。
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分配の最初の容量は、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2の両者に対する血漿容量に近かった。ＰＥＧ化により、ｋｏｕＩＬ−８断片の血清ＣＬが減少し、以下の表１０に示されるように最終半減期とＭＲＴの両者が伸長した。
0004108760.tif 000012
ＰＥＧ化抗ＩＬ８ Ｆａｂ’断片について、ＣＬは４６から１８０倍に減少した。最終半減期およびＭＲＴは、それぞれ１４から３５倍および５３から２４０倍に増大した。ＰＥＧ化抗ＩＬ８ Ｆ（ａｂ’）2分子について、ＣＬはＰＥＧ化と共に１５から１７倍に減少し、最終半減期およびＭＲＴはそれぞれ５倍および１３倍より大きく増大した。これらのパラメーターの変化は、ＰＥＧ分子量の増大と共にＰＥＧ化Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2分子の両者について増大し、全長抗ＩＬ８の値（７４時間の最終半減期、９９時間のＭＲＴ、および０．４７ｍＬ／時／ｋｇのＣＬ）に近づいた。分枝状（１）４０Ｋ Ｆａｂ’（第６群）および分枝状（１）４０Ｋ Ｆ（ａｂ’）2（第４群）を比較した場合、予期しない薬力学が観察された。ＰＥＧ化Ｆａｂ’分子は、ＰＥＧ化Ｆ（ａｂ’）2よりも長く血清中で維持されるようであった（図６６参照）。分枝状（１）４０Ｋ Ｆａｂ’の平均ＣＬは０．６３ｍＬ／時／ｋｇであったが、より高いＣＬが分枝状（１）４０ｋＤ Ｆ（ａｂ’）2で観察された（ＣＬ ０．９２ｍＬ／時／ｋｇ）。同様に最終半減期は、Ｆ（ａｂ’）2ＰＥＧ化分子よりＦａｂ’について高かった（１１０対４５時間）。
薬力学的データは、ＰＥＧ化が全長抗ＩＬ８のものに近づけるように、抗ＩＬ８断片のＣＬを減少させ、最終ｔ１／２およびＭＲＴを増大することを示した。クリアランスはＦａｂ’について４６から１８０倍、Ｆ（ａｂ’）2についておよそ１６倍、ＰＥＧ化と共に減少した。Ｆａｂ’抗ＩＬ８断片の最終半減期は、１４から３５倍増大し、Ｆ（ａｂ’）2抗ＩＬ８についてはおよそ１４倍増大した。同様にＭＲＴは、Ｆａｂ’について５３から２４０倍伸長し、Ｆ（ａｂ’）2についておよそ１４倍伸長した。分枝状（１）４０ｋＤ Ｆａｂ’は、分枝状（１）４０ｋＤ Ｆ（ａｂ’）2と比較して、より長い最終半減期およびより低いクリアランスを有した。
Ｙ．虚血／再灌流および酸吸引誘導性急性呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）のウサギモデルにおける抗ＩＬ−８抗体試薬のインビボ効力試験
全長ネズミ抗ウサギＩＬ−８モノクローナル抗体６Ｇ４．２．５、４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ−６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂ’、および対照抗体（抗ＨＩＶ ｇｐ１２０モノクローナル抗体９Ｅ３．１Ｆ１０）を、ウサギＡＲＤＳモデルにおいて試験した。該動物を検量し、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ体重）、キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ体重）およびアセプロマジン（０．７５ｍｇ／ｋｇ体重）の筋肉内注射によって麻酔をかけた。第二の投与（第一の投与量の２０％）を血管クリップの除去の前１５分でＩＭに与え、第三の投与（第一の投与量の６０％）を気管切開で与えた。動脈内カテーテル（２２Ｇ、１ ｉｎ、Angiocath）および静脈内カテーテル（２４Ｇ、１ ｉｎ、angiocath）を、血液サンプリング（動脈血液ガスおよびＣＢＣ）並びに抗ＩＬ−８および液体投与のそれぞれのために、耳中枢動脈および後脳梁耳静脈に置いた。麻酔をかけた動物を、手術トレー上に仰向けの位置で移した；腹の領域の毛を剃り、手術の準備をした。腹部縦切開を介して、上腸間膜動脈（ＳＭＡ）を単離し、微小血管動脈クリップを大動脈起源で適用した。９ｍ傷クリップ（Autoclip,Baxter）を使用した腹の一次的縫合の前に、１５ｍｌの一般的塩水を、液体補給として腹膜内に与えた。腸の虚血の１１０分後、腹部切開を再開し、動脈クリップを再灌流のためはずした。縫合の前に、５ｍｌの一般的塩水を液体補給のため腹膜内に与えた。腹部切開を２つの層で閉じ、動物を眠らせたままにした。
手術後、動物をヒートパッド（３８℃）の上に置き、再灌流後６時間まで継続的にモニターし、授乳リンガーを８−１２ｍｌ／ｋｇ／時ＩＶを液体補給のため与えた。
再灌流の２２−２４時間で、気管切開を無感覚の下で実施した。一般的な生理学的塩水を水で１：３に希釈し、ｐＨ１．５に調節した（１Ｎ ＨＣＬを使用して調節した）；それから３ｍｌ／ｋｇ体重を気管内に注いだ。直腸温度を、恒温動物熱治療パッド（Ｋ−Ｍｏｄ ＩＩ、Baxter）を使用して３７＋／−１度に維持した。５ｍｌ／ｋｇ／時のＩＶの流速で液体補給（ＬＲＳ）を与えた。血液ガスを毎時モニターした。６時間の継続的なモニターの後、ウサギをかごに戻した。
吸引の直前、塩水、対照モノクローナル抗体（抗ＨＩＶ ｇｐ−１２０ ＩｇＧ ９Ｅ３．１Ｆ１０）、全長ネズミ抗ウサギＩＬ８（６Ｇ４．２．５ネズミIgG2a抗ウサギＩＬ８）またはＰＥＧ化６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂ’（上記セクションＴに記載されたような４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ−マレイミドを使用して修飾された６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂ’、「４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ−６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂ’」として表される）を使用して動物を処理した。塩水または他衣装抗体処理動物由良のデータを組み合わせ、「コントロール」として表した。動脈血液ガスおよびＡ−ａ ＰＯ２勾配測定を毎日実施し、ｉＶ液体補給を毎日実施した。Ａ−ａ ＰＯ２勾配を、再灌流の９６時間で測定した。Ａ−ａ ＰＯ２勾配は以下のように計算された：
Ａ−ａ ＰＯ２
＝［ＦＩＯ２（ＰＢ−ＰＨ２Ｏ）−（ＰａＣＯ２／ＲＱ）］−ＰａＯ２
ＰａＯ２／ＦｉＯ２比を、室内空気および１００％酸素の下で２４時間および４８時間で測定した。
最終Ａ−ａ ＰＯ２勾配測定の後、動物をＮｅｍｂｕｔａｌ １００ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．を使用して麻酔をかけ、気管支肺胞洗浄液体（ＢＡＬ）の赤血球細胞混在を減少するために、腹部大動脈を横断することによって動物を安楽死させた。肺をひとまとめにして取り出した。全肺を測量し、それからＨＢＳＳおよびリドカインの３０ｍｌを使用して気管内チューブ（Hi-Lo気管チューブ、３ｍｍ）を使用して洗浄した。ＢＡＬにおける全および分化した白血球の数を測定した。病変／変化を、各動物の右の肺の各葉の組織組織学的実験によって立証した。
全部の肺の重量、ＢＡＬ中の全白血球および多型核細胞数、および得られたＰａＯ２／ＦｉＯ２データが、それぞれ図６７，６８および６９に表されている。４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ−６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂ’を使用した処理は、「コントロール」群と比較して該モデルにおいて測定された生物学的パラメーターに対して何の影響も示さなかった。しかしながら、該データは上記セクション（Ｖ）および（Ｘ）に存在する４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ−６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂ’に対する薬理苦学的分析またはインビトロ活性分析と矛盾しなかった。さらにこれらのデータは、循環器または他の組織における疾患エフェクターターゲットに到達及び機能する、４０ｋＤ分枝状ＰＥＧ−６Ｇ４Ｖ１１Ｎ３５Ａ Ｆａｂ’の能力に矛盾しなかった。
以下の生物学的物質は、American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,USA（ATCC）に寄託されている：
0004108760.tif 000013
特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に基づいてこれらの寄託がなされた。これは寄託の日から30年間生存能力のあるカルチャーの管理を保証する。これらの細胞系は、ブタペスト条約の定める期間ATCCから入手可能であり、Genentech,Inc.とATCCの間の合意により、関係のある米国特許の発行か、米国または外国の特許出願の公開かの、いずれか早い時点で公衆に対して細胞系の永久に制限のない入手可能性が保証され、かつ米国特許法第122条ならびにそれに従う長官規則（特に886OG638に関係する37CFR1.14を含む）に従って米国特許商標長官によって権利を与えられることが決定された公衆に対する細胞系の入手可能性が保障される。
本出願の譲受人は、もし寄託した細胞系が、適したコンディションの下で培養されながら失われたまたは破壊された場合、同じ細胞系の標本を告示して直ちにそれらを置き換えることを合意した。寄託された細胞系の利用可能性は、特許法にしたがっていかなる政府の権威に基づいて許可された権利に違反して、自由に本発明を実施できるというように解釈されない。
配列表
（1）一般情報:
（i）出願人:Hsei,Vanessa
Koumenis,Iphigenia
Leong,Steven R.
Presta,Leonard G.
Shahrokh,Zahra
Zapata,Gerardo A.
（ii）発明の名称:抗体フラグメント−ポリマー複合体およびヒト化抗ＩＬ−８モノクローナル抗体
（iii）配列の数:76
（iv）連絡の住所:
（A）住所:Genentech,Inc.
（B）通り:1 DNA Way
（C）都市名:South San Francisco
（D）州名:California
（E）国名:USA
（F）郵便番号:94080
（v）コンピューターが読み込むことのできる形態:
（A）媒体種:3.5インチ，1.44Mb フロッピーディスク
（B）コンピューター:IBM PC 互換機
（C）オペレーティングシステム:PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア:WinPatin（Genentech）
（vi）本出願の情報:
（A）出願番号:
（B）出願日:９８／２／２０
（C）分類:
（viii）弁理士/代理人の情報:
（A）名称:Love,Richard B.
（B）登録番号:34,659
（C）参照/事件整理番号:P1085R3PCT
（ix）通信情報:
（A）電話:650/225-5530
（B）ファックス:650/952-9881
（2）配列番号（SEQ ID NO）:1の情報:
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（A）長さ:39塩基対
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（A）長さ:39塩基対
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（A）長さ:780塩基対
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（A）長さ:298アミノ酸
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（i）配列の特徴:
（A）長さ:6563塩基対
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0004108760.tif 000113
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004108760.tif 000120
【図８】
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【図９】
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【図１０】
0004108760.tif 000123
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４１Ｅ】
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【図４１Ｆ】
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【図４１Ｇ】
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【図４１Ｈ】
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【図４１Ｉ】
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【図４１Ｊ】
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【図４１Ｋ】
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【図４１Ｌ】
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【図４１Ｍ】
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【図４１Ｎ】
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【図４１Ｏ】
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【図４１Ｐ】
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【図４１Ｑ】
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【図４１Ｒ】
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【図４１Ｓ】
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【図４１Ｔ】
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【図４１Ｕ】
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【図４１Ｖ】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ−１】
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【図４３Ｂ−２】
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【図４３Ｂ−３】
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【図４３Ｂ−４】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４８Ｄ】
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【図４８Ｅ】
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【図４８Ｆ】
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【図４８Ｇ】
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【図４８Ｈ】
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【図４８Ｉ】
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【図４８Ｊ】
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【図４８Ｋ】
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【図４８Ｌ】
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【図４８Ｍ】
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【図４８Ｎ】
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【図４８Ｏ】
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【図４８Ｐ】
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【図４８Ｑ】
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【図４８Ｒ】
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【図４８Ｓ】
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【図４８Ｔ】
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【図４８Ｕ】
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【図４８Ｖ】
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【図４８Ｗ】
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【図４８Ｘ】
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【図４８Ｙ】
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【図４８Ｚ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５６Ｃ】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図６０】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５Ａ】
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【図６５Ｂ】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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