(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４４ポリペプチド骨格を有し、かつシアリル化フコシル化グリカンを含み、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチンまたはその両方に結合することを特徴とする、実質的に精製されたグリコシル化ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＣＤ４４ポリペプチド骨格が配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のグリコシル化ポリペプチドを発現する細胞を特定する方法であって、
（ａ）被験細胞集団を、抗ＣＤ４４抗体、およびＨＥＣＡ−４５２抗体または請求項１または２記載のグリコシル化ポリペプチドに特異的な抗体に、該被験細胞集団中に前記細胞が存在する場合に前記抗体と該細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において接触させ；さらに、
（ｂ）前記コンプレックスを検出し、それによって前記細胞を特定する；各工程を含む方法。
【請求項４】
前記被験細胞が血液細胞または骨髄細胞であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞集団から請求項１または２記載のグリコシル化ポリペプチドを発現する細胞を単離する方法であって、
（ａ）被験細胞集団を、抗ＣＤ４４抗体、およびＨＥＣＡ−４５２抗体または請求項１または２記載のグリコシル化ポリペプチドに特異的な抗体に、該被験細胞集団中に前記細胞が存在する場合に前記抗体と該細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において接触させ；
（ｂ）前記コンプレックスを検出し；
（ｃ）前記細胞集団から前記コンプレックスを回収し、それによって細胞集団から前記細胞を単離する；各工程を含む方法。
【請求項６】
請求項１記載のグリコシル化ポリペプチド、あるいはそのフラグメントであってＥ−セレクチン、Ｌ−セレクチンまたはその両方に結合するフラグメントを含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
資金援助を受けた研究であることの宣言
本発明は、国立衛生研究所の研究補助金NHLBI  RO1  HL60528およびCA84156を受けてアメリカ合衆国政府の援助の下に行ったものである。政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、幹細胞を確認し、ならびに、造血性疾患（例えば、白血病など）、癌、炎症性疾患および幹細胞を用いた処置が可能な疾患（例えば、心筋梗塞、パーキンソン病、糖尿病または卒中など）を治療するための組成物およびその使用法を提供する。
発明の概要
造血微小環境における分化した細胞構造は、接着分子が直線特異的に発現することによって厳密に制御されている個々の細胞−細胞、細胞−マトリックスの相互作用によって形成されている。初期のヒト造血前駆細胞（HPCｓ）は、直線性に関する特異的マーカーの欠如および細胞表面分子であるCD34の発現によって特徴づけられる。HPC上に発現する接着分子は多様であり、CD44（「ヒアルロン酸レセプター」、H-CAMとしても知られている）、インテグリン類（例えば、LFA-1、VLA-4など）および免疫グロブリン（例えば、ICAM1など）スーパーファミリー、ならびにセレクチンファミリーのひとつであるL-セレクチンなどが挙げられる。L-セレクチン（CD62L）は、接着分子のひとつであり、カルシウム依存性、炭化水素結合性タンパク質である。接着分子としてはその他に、活性化された血管内皮細胞上に発現するＥ−セレクチン（CD62E）、および活性化された血小板および内皮細胞上に発現するＰ−セレクチン（CD62P）が存在する。セレクチンを介した相互作用は、負傷部位における迅速かつ効率的な白血球の循環のみならず、次のような場合における定常的、組織特異的ホーミングにおいて重要である：（１）末梢リンパ節へのリンパ球のホーミング、（２）ヒトの皮膚ホーミングＴ細胞の皮膚局所性、および（３）造血前駆細胞（ＨＰＣ）の骨髄への侵入。
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトの正常な造血前駆細胞上および白血球芽細胞上に発現し、造血細胞Ｅ−セレクチン／Ｌ−セレクチンリガンド（HCELL）と称される新規なグリコシル化ポリペプチドに関する。本明細書においては、HCELLポリペプチドは「KGla  CD44」とも記載している。HCELLは、HECA-452反応性のシアル化フコシル化Ｎ−グリカンを含むCD44の新規なグリコフォームである。HCELLポリペプチドはＬ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのリガンドである。
【０００３】
また本発明は、HCELLに特異的に結合する物質と幹細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において、１種類またはそれ以上の物質に被験細胞を接触させることにより幹細胞を確認する方法に関する。コンプレックスを検出し、存在が確認された場合にはその細胞は幹細胞である。適切な結合物質としては、抗CD44抗体またはモノクローナル抗体HECA-452の結合特異性を有する抗体が挙げられる。
【０００４】
幹細胞は、固相上にセレクチンポリペプチド（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンなど）を固定化し、該固相に被験細胞懸濁液を含む液体サンプルを接触させることによっても確認することができる。固相表面においてずれ応力が発生するように、液体サンプルに固相を接触させる。固相に接着している細胞を観察することによって幹細胞を確認する。被験細胞としては例えば、血液または骨髄などを用いることができる。
【０００５】
さらに本発明は、細胞集団から幹細胞（例えば、多機能分化性幹細胞など）を単離するための多様な方法を提供する。HCELLポリペプチドに特異的に結合する物質と幹細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において、１種類またはそれ以上の結合物質に細胞集団を接触させることにより幹細胞を確認する。コンプレックスの形成を検出し、細胞集団から除去することにより、細胞集団から幹細胞を単離する。さらに、幹細胞／物質のコンプレックスを解離する。
【０００６】
別の方法としては、固相上にセレクチンポリペプチド（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンなど）を固定化し、該固相に被験細胞懸濁液を含む液体サンプルを接触させることによって幹細胞を単離する。固相表面においてずれ応力が発生するように、液体サンプルに固相を接触させる。固相に接着している細胞を回収することによって幹細胞を単離する。
【０００７】
さらに本発明は、上記の方法に従って単離した細胞を含む組成物を哺乳類に投与することにより、哺乳類における造血性疾患、癌、および幹細胞を用いた処置が可能な疾患を治療する方法（すなわち、幹細胞療法）に関する。
【０００８】
またさらに本発明は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに対する細胞の親和性を高める方法を提供するが、このとき、HCELLポリペプチドの細胞表面における発現または活性を増強させる１種またはそれ以上の物質を細胞に接触させることにより、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに対する細胞の親和性を高める。適切な物質としては例えば、CD44、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸などが挙げられる。
【０００９】
本発明は、幹細胞の移植能を高める方法に関し、これは、HCELLポリペプチドの細胞表面における発現または活性を高める１種またはそれ以上の物質を幹細胞に接触させることにより、幹細胞の移植能を高めるものである。
【００１０】
別の方法としては、固相上にセレクチンポリペプチド（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンなど）を固定化し、被験細胞集団を含む液体サンプルに固相を接触させることによって細胞集団の移植能を高める。固相表面においてずれ応力が発生するように、液体サンプルに固相を接触させる。固相に接着している細胞を回収する。
【００１１】
対象（例えば、ヒトなど）内における移植幹細胞のレベルの上昇は、対象内の細胞表面のHCELLポリペプチドまたはHCELLポリペプチドの発現を増やす物質を投与することによって達成することができる。適切な物質としては例えば、CD44、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸などが挙げられる。別の方法としては、上記の方法に従って単離した細胞を含む組成物を対象に投与することにより、対象内における移植幹細胞のレベルを上昇させる。
【００１２】
さらに本発明は、対象における造血性疾患（例えば、白血病など）を治療する方法に関する。造血性疾患は、対象内の細胞表面のHCELLポリペプチドまたはHCELLポリペプチドの発現を減少させる物質を投与することによって治療する。別の方法としては、造血性疾患は、対象から採血し、HCELLポリペプチドに特異的に結合する物質と血液細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において、１種類またはそれ以上の結合物質に血液を接触させることによって治療する。コンプレックスを検出し、存在が確認された場合には血液から分離する。血液は対象に戻す。
【００１３】
さらに、造血性疾患は、対象から採血し、固相上にセレクチンポリペプチド（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンなど）を固定化し、該固相に血液を接触させることによって治療する。固相が血液サンプルと接触することにより、固相表面においてずれ応力が発生する。次に、血液を対象に戻す。
【００１４】
さらに、造血性疾患は、HCELL糖タンパク質に特異的に結合する物質を対象に投与することによって治療する。
【００１５】
さらに本発明は、対象にHCELL糖タンパク質またはそれらのフラグメントを投与することにより、炎症性疾患を治療する方法に関する。
【００１６】
さらにまた本発明は、HCELL糖タンパク質に特異的に結合する物質と対象から採取した細胞集団とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において、１種類またはそれ以上の結合物質に細胞集団を接触させ、形成したコンプレックスを検出することにより、造血器疾患に関する感受性を診断または判定する方法に関する。コンプレックスが存在することは、対象が造血性疾患に罹患している、または感受性を有していることを示唆している。
【００１７】
さらに、本発明は、HCELL糖タンパク質に特異的に結合する物質と対象から採取した細胞集団とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において、１種類またはそれ以上の結合物質に細胞集団を接触させ、コンプレックスが形成した場合にはそれを検出することにより、造血性疾患に関する予後または治療効果を判断する方法に関する。
【００１８】
特に記載していない限り、本明細書において使用している技術用語および科学用語は、本発明の属する分野に関して通常の知識を有する当業者によって通常理解されている意味と同義である。本明細書に記載されている方法および材料と類似または同等の方法および材料を用いて本発明を実施または試験することができるが、適切な方法および材料について以下に記載する。本明細書において引用しているすべての印刷物、特許出願、特許およびその他の参考文献については、参照として全体的に取り入れておく。紛争時には、定義を含む本明細書を照査する。さらに、材料、方法および実施例は、本発明を具体的に説明するためのみのものであり、制限することを意図するものではない。
【００１９】
本発明のその他の特徴および利点については以下の詳細な説明および請求項から明らかである。
【００２０】
図面の簡単な説明
図１Ａは、多様なヒト造血細胞系においてHECA-452反応性エピトープが発現していることを示すウェスタンブロットの写真である。
【００２１】
図１Ｂは、グルタルアルデヒドで固定した単層上における造血細胞系細胞の繋留（tethering）およびローリング（rolling）を示す棒グラフである（ずれ応力は2.8dyne/cm2）。データは、視野あたりのCHO-E細胞のローリングを５視野において計数した時の平均±標準偏差で表しており、少なくとも３回の実験を行った。
【００２２】
図２は、単離した新鮮なヒト骨髄内皮細胞上におけるヒト造血細胞のローリングを示す棒グラフである。
【００２３】
図３Ａは、Ｅ−セレクチンリガンド活性についてブロットローリングアッセイを行った結果を示す棒グラフである。
【００２４】
図３Ｂは、HECA-452染色についてＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った結果を示すウェスタンブロットの写真である。
【００２５】
図３Ｃは、KG1a細胞上でPSGL-1が発現していることを示すウェスタンブロットの写真である。
【００２６】
図３Ｄは、Ｅ−セレクチンリガンド活性に対するＮ−グリコシダーゼ−Ｆの影響を示すブロットローリングアッセイ膜の写真である。
【００２７】
図４Ａは、抗CD44抗体（Hermes-1）を用いて徹底的に免疫沈降させたHCELLのＥ−セレクチン結合活性を示すブロットローリングアッセイ膜の写真である。（免疫沈降前）：KG1aの全溶解物10μｇ；（レーン１）：Hermes-1免疫沈降第１回目；（レーン２）：Hermes-1免疫沈降第２回目；（レーン３）：Hermes-1免疫沈降第３回目；（レーン４）：Hermes-1免疫沈降を３回実施した後の溶解物残渣。
【００２８】
図４Ｂは、Hermes-1抗体を用いて徹底的に免疫沈降させたHCELLのＥ−セレクチン結合活性を示すブロットローリングアッセイ膜の写真であり、ブロットはHECA-452抗体で染色した。（免疫沈降前）：KG1aの全溶解物10μｇ；（レーン１）：Hermes-1免疫沈降第１回目；（レーン２）：Hermes-1免疫沈降第２回目；（レーン３）：Hermes-1免疫沈降第３回目；（レーン４）：Hermes-1免疫沈降を３回実施した後の溶解物残渣。
【００２９】
図５Ａは、Ｅ−セレクチンを介したCHO-E細胞のローリングを示す棒グラフである。ローリングは、KG1a  CD44上において2.8dyne/cm2で観察されたが、2.8dyne/cm2ではＫＧ１a  PSGL-1上と比較すると顕著に少なかった（ｐ＜0.001）。N-グリコシダーゼ−Ｆ処理およびＬ−フコシダーゼ処理を行ったKG1a  CD44、ならびKG1aに膜タンパク質をビブリオ・コレラ（コレラ菌）（Vibrio cholerae）ノイラミニダーゼ処理した場合には、CHO-E細胞のローリングが阻害された（ｐ＜0.001）。
【００３０】
図５Ｂは、ＣＨＯ−Ｐ細胞のローリングを示す棒グラフである。ローリングは、KG1a  PSGL-1においては観察されたが、KG1a  CD44では観察されなかった（2.8dyne/cm2）。負の対照（CHO-Mock細胞および抗P−セレクチンモノクローナル抗体AK-4（10μg／ml）を用いて作用を阻害する処理を行ったCHO-P細胞）においては、ローリングは観察されなかった。
【００３１】
図６Ａは、多様な造血細胞におけるHCELL活性を示したブロットローリングアッセイ膜の写真である。（１）ヒトBM単核細胞（108個）、（２）CD34-／直系＋細胞（107個）、（３）CD34＋／直系−細胞（107個）、（４）CD34-／直系＋細胞（108個）。
【００３２】
図６Ｂは、成人骨髄性白血病（AML）由来の循環性芽細胞におけるHECA-452活性に対してN-グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った場合の影響を示すウェスタンブロットの写真である。
【００３３】
図６Ｃは、アイソタイプ対照またはHermes-1モノクローナル抗体を用いて免疫沈降させたAML（Ｍ５）膜タンパク質（50μg）、ならびにＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理したHermes-1の免疫沈降物のブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。
【００３４】
図６Ｄは、AML（M0）、AML（M1）および異型CML（brc/abl）の膜調製物（50μg）から沈降されたCD44、ならびにBM内皮細胞系（BMEC-1、総タンパク質量100μｇ）のHECA-452染色を示す写真であり、E-セレクチンリガンド活性に関して評価を行った。E-セレクチンリガンド活性は、100kDaのバンドのHECA-452染色強度と相関していた。
【００３５】
図６Ｅは、BMEC-1におけるCD44の発現を示すウェスタンブロットの写真である。
【００３６】
図７Ａは、ヒト白血病細胞系K562（レーン１）、RPMI-8402（レーン２）、HL-60（レーン３）、ＫＧ１a（レーン４）、ノイラミニダーゼ処理ＫＧ１a（レーン５）およびOSGE処理ＫＧ１a（レーン６）由来のHECA-452反応性膜タンパク質（30μg／レーン）に関するウェスタンブロットの写真である。
【００３７】
図７Ｂは、KG1a細胞全体についてノイラミニダーゼ処理を行い、さらにツニカマイシン処理を行った後、該細胞上にHECA-452反応性タンパク質が再発現していることを示すすウェスタンブロットの写真である。レーン１：未処理、レーン２：ノイラミニダーゼ処理、レーン３：ノイラミニダーゼ処理後、DMSOで24時間かけて回復、レーン４：ノイラミニダーゼ処理後、ツニカマイシンで24時間かけて回復。
【００３８】
図７Ｃは、２−［3H］−マンノースを用いて代謝的放射ラベルを行い、６％の還元SDS-PAGE上で解析を行ったKG1a膜タンパク質のオートラジオグラフの写真である。
【００３９】
図７Ｄは、ブロット膜上におけるL-セレクチン依存性のリンパ球の繋留およびローリングを示す棒グラフであり、HECA-452活性を有する98、120および130KDaのKG1aタンパク質上、流体力学的流量条件下（2.3dyne/cm2）で行った。
【００４０】
図８は、３段階のSDS-PAGE（６〜９％のビス／アクリルアミド）精製過程のうちの第３段階から得られた98kDaのゲルフラグメントに関するHECA-452（0.4μg／ml）または抗CD44 モノクローナル抗体（A3D8もしくはHermes-1（１μg／ml））との反応性を示すウェスタンブロットの写真である。
【００４１】
図９は、L-セレクチンを介したブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真であり、免疫沈降はKG1a  CD44を用いて行い、Hermes-1（左）またはHECA-452（右）で免疫染色した。
【００４２】
図１０Ａは、KG1a細胞から免疫沈降させたCD44のL-セレクチンリガンド活性について、N-グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った場合のブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。
図１０Ｂは、AML（M5）芽細胞から免疫沈降させたCD44 のL-セレクチンリガンド活性についてN-グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った場合のブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。
【００４３】
図１１Ａは、［35S］SO4を用いて放射ラベルし、胆汁酸処理を行わなかったKG1a細胞および胆汁酸処理を行ったKG1a細胞から免疫沈降されたCD44のオートラジオグラムの写真である。
【００４４】
図１１Ｂは、胆汁酸処理を行った（＋）KG1a細胞および胆汁酸処理を行わなかった（−）KG1a細胞から免疫沈降されたKG1a  CD44のHECA-452イムノブロットの写真である。L-セレクチンリガンド活性（倍率200倍における１視野あたりのリンパ球の平均数／５視野）は、スルフェート化KG1a  CD44および非スルフェート化（胆汁酸処理）ＫＧ１a  CD44において同等であった。
【００４５】
図１２Ａは、図に示すずれ応力の範囲において、グルタルアルデヒド固定した造血細胞系KG1a、HL60、K562およびRPMI-8402上におけるリンパ球のローリングの結果を示す棒グラフである。
【００４６】
図１２Ｂは、図に示すずれ応力の範囲において、グルタルアルデヒド固定した造血細胞系ＫＧ１a、HL60、K562およびRPMI-8402上における好中球のローリングの結果を示す棒グラフである。
【００４７】
図１２Ｃは、図に示す回転数において、KG1a、HL60、K562およびRPMI-8402細胞系がL-セレクチンを介したリンパ球の結合を支持する能力を評価するために行った、ずれ応力に基づくスタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイの結果を示すグラフである。KG1a細胞に接着したリンパ球数の平均はHL60細胞に接着したそれの10倍以上であった（スチューデント（Student）のt検定においてｐ＜0.001）。L-セレクチンを介したリンパ球の接着は、抗L-セレクチンモノクローナル抗体（10μg／ml）でリンパ球を前処理することにより、PMA処理したリンパ球を用いることにより、および／または、５mMのEDTAを含むアッセイ培地を用いることにより、すべて阻害された。
【００４８】
図１３Ａは、グルタルアルデヒドで固定した造血細胞の単層上におけるCHO-P細胞またはmock形質転換体細胞のローリングを示す棒グラフであり、平行プレートフローチャンバー内で測定した。0.4dyne/cm2 においては、P-セレクチンを介したCHO-P細胞のローリングに対するKG1a細胞およびHL60細胞の支持能力は同程度であった。
【００４９】
図１３Ｂは、ＫＧ１a細胞およびHL60細胞上におけるCHO-P細胞ローリング相互作用を示すグラフである。相互作用の測定は同様なずれ応力範囲で行い、EDTAの存在下においては排除され、また、モカーギン（mocarhagin）（10μg／ml）を用いてKG1a細胞およびHL60細胞を前処理することによって阻害された。
【００５０】
図１４Ａは、Hermes-1（CD44）およびPL-2（PSGL-1）の免疫沈降物、ならびにHCELLおよびPSGL-1のＬ−セレクチンリガンド活性のオートラジオグラフの写真である。
【００５１】
図１４Ｂは、免疫沈降したKG1a  CD44（1.5μｇ）およびPSGL-1（３μｇ）についてのスタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイの結果を示すグラフである。
【００５２】
図１5Ａ〜Ｆは、スタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイにおいてヒトHC  CD44またはPSGL-1に結合したリンパ球の顕微鏡写真である。イムノアフィニティー精製したKG1aもしくはAML（M1）のCD44（1.5μｇ）ならびにKG1a  PSGL-1（２または６μｇ）は、方法の項の記載に従って調製し、スタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイにおいてL-セレクチンを介したリンパ球の接着に関する分析を行った。KG1aもしくはAML（M1）のCD44（それぞれ、パネルAおよびD）は、N-グリコシダーゼ−Ｆ処理したこれらのＣＤ４４（パネルＢおよびＥ）、ならびにアイソタイプ対照免疫沈降物であるモノクローナル抗体（Hermes-1）単独もしくはＬ−セレクチン免疫沈降物（KG1aもしくはAML（M1）についてそれぞれパネルＣおよびＦ）よりも明らかに多数のリンパ球を支持していた。抗Ｌ−セレクチン抗体（10μg／ml）、５mMのEDTAを含むアッセイ培地またはPMA処理（50ng／ml）リンパ球は、リンパ球の吸着を完全に阻害し（ＫＧ１aもしくはAML（M1）についてそれぞれパネルＣおよびＦに示している）、このアッセイ系におけるリンパ球L-セレクチンの特異性を証明するものである。
【００５３】
図１６は、KG1a CD44およびPSGL-1上のHECA-452エピトープを示すウェスタンブロットの写真である。
【００５４】
図１７Ａ、Ｂは、ヒト造血細胞系上におけるグルコシルトランスフェラーゼ類（FucTIV、FucTVIIおよびST3GalIV）の発現を示す写真である。パネルAは、FucTIVおよびFucTVIIのRT-PCR発現分析である。レーン１：FucTIV、レーン２：FucTVII、レーン３：β−アクチン、およびレーン４：ddH2O。パネルBは、ST3GalIVのRT-PCR発現分析である。レーン１：ST3GalIV、レーン２：β−アクチン、およびレーン３：ddH2O。
【００５５】
発明の詳細な説明
本発明は、正常なヒト造血前駆細胞および白血球芽細胞上において発現される新規なグリコシル化ポリペプチドであって、造血細胞E-セレクチン／L-セレクチンリガンド（HCELL）と称されるものの発見に部分的に基づく。本明細書においては、HCELLポリペプチドは、「KG1a  CD44」とも称する。ブロットローリングアッセイを行うことにより、HCELLは、HECA-452反応性のシアリル化フコシル化N-グリカンを含むCD44の新規なグリコフォームであることが示された。HCELLポリペプチドは、Ｌ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのリガンドである。HCELLがＬ−セレクチンおよびＥ−セレクチンリガンド活性を発揮するためには、ラットのモノクローナル抗体であるHECA-452によって認識されるシアロフコシル化N-結合グリカンを必要とし、この活性は硫酸化非依存性である。
【００５６】
CD44は、細胞外部分の主要構成成分であるグルコサミノグリカンヒアルロン酸（HA）に対する細胞表面糖タンパク質レセプターとして広く分布している。CD44は、大部分の造血細胞、角化細胞、軟骨細胞、多数の上皮細胞系ならびに数種の内皮細胞および神経細胞を含む多様な細胞において発現される。CD44は、細胞−細胞凝集、細胞周囲マトリックスの保持、マトリックス−細胞および細胞−マトリックス間のシグナル伝達、レセプターを介したヒアルロン酸の取込み／分解、ならびに細胞移動をふくむ細胞の広範な機能に関与していることが知られている。これらの機能はすべて、CD44−ヒアルロン酸の相互作用に基づいており、硫酸化依存性である。
【００５７】
CD44遺伝子をコードしている遺伝子は20個のエクソンを有しており、初期の文献には19個のエクソンが記載されているが、このうち、６aおよび６ｂがエクソン６および７と再分類されたことから、計20個のエクソンが存在する。ヒト11番染色体の短腕上に存在している１個の遺伝子がCD44をコードしているが、20個のエクソンの内の12個が交互にスプライシングされることによって生じる複数のmRNA転写体が確認されている。標準的かつ最も一般的な型のCD44（CD44類と称する）は、エクソン１〜５、16〜18および20によってコードされているタンパク質から構成されている。この型は、造血細胞上において最も多く存在する型であり、CD44Hとしても知られている。CD44類は、細胞外ドメイン（エクソン１〜５および16）、高度に保存された膜貫通ドメイン（エクソン18）および細胞質ドメイン（エクソン20）を有する。ヒトCD44類に対応する1482bpから構成されるオープンリーディングフレームから、約37kDaのポリペプチド鎖の翻訳が行われる。N-結合およびO-結合オリゴ糖が翻訳後付加されることにより、最終的なCD44タンパク質の分子量は約85kDaになる（SDS-PAGEにより測定）。
【００５８】
CD44（CD44H）の標準型または造血性イソ型（アイソフォーム）は、約270個のアミノ酸から構成される細胞外ドメインを有するI型膜貫通分子であり、ここで、該細胞外ドメインは、20個のアミノ酸から構成されるリーダー配列、21個のアミノ酸から構成される膜貫通ドメインおよび72個のアミノ酸から構成される細胞質ドメインを含む。約180個のアミノ酸から構成されるアミノ末端は、哺乳類種間で保存されている（相同性は約85％）。この領域は、６個の保存性システイン、およびN-グリコシル化のための６個の保存性コンセンサス部位を含む。N-グリコシル化のための５個の保存性コンセンサス部位は、120個のアミノ酸から構成されるCD44のアミノ末端に位置している。マウスおよびヒトの細胞系においては、５個の部位すべてが利用されていると考えられている。いくつかの研究においては、細胞特異的N-グリコシル化によって、CD44のHA結合作用が調節されることが示されている。N-グリコシル化の状態が異なる細胞系および正常B細胞においては、HA結合の状態が異なっている。特に、HA結合細胞由来のCD44は、HA非結合細胞由来のそれに比べてグリコシル化の割合が低い。さらに、細胞表面およびCD44-Ig融合タンパク質からシアル酸を除去することにより、HA結合が増強される。従って、本発明のHCELL CD44グリコフォームは、これまでに記載されているいずれのCD44とも異なったものである。
【００５９】
対照的に、非保存性領域（アミノ酸番号183番〜256番）においては、哺乳類種間の類似性はわずかに約35％である。この領域は、CD44に対して多様な炭化水素修飾を行うことができる部位、およびCD44遺伝子の多様なエクソンからさらにアミノ酸配列を挿入するための交互スプライシング部位を含む。
【００６０】
HCELLポリペプチドは、CD44のアミノ酸配列を有し、モノクローナル抗体HECA-452（ATCC番号：HB-11485）の結合特異性を有する抗体に結合する。HECA-452は、皮膚リンパ球関連抗原を認識する。HCELLへのHECA-452の結合は、N-グリコシダーゼ−Ｆ、シアリダーゼまたはフコシダーゼで処理することによって低下する。さらに、HCELL活性（例えば、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチン結合性など）も、N-グリコシダーゼ−Ｆ、シアリダーゼまたはフコシダーゼ処理によって低下することから、HCELLの機能においては、シアロフコシル化Ｎ−結合グリカンの存在が重要であることを示している。対照的に、CD44をシアリル化することにより、CD44のヒアルロン酸への結合が阻害される。さらに、CD44のヒアルロン酸への結合は硫酸化によって促進されるが、硫酸化はHCELLのＥ−およびＬ−セレクチン活性に対しては必要ではない。
【００６１】
好ましくは、CD44ポリペプチドはCD44の標準型または造血性イソ型（CD44H）である。別の好ましいCD44ポリペプチドとしては、Ｒ１（CD44R1）またはＲ２（CD44R2）イソ型がある。例えば、HCELLポリペプチドは、配列番号１（ジェンバンク（GenBank）アクセッション番号CAA40133；表１）のアミノ酸配列を含む。HCELLポリペプチドと配列番号１のポリペプチド配列との相同性は、少なくとも約30％、50％、70％、80％または95％である。
【００６２】
【表１】
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HCELLポリペプチド
ひとつの側面から見ると、本発明は、単離されたHCELL糖タンパク質、ならびに生物学的に活性なそれらの一部、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。また本発明は、抗HCELL抗体を誘起するための免疫原として使用することに適したポリペプチドフラグメントを提供する。ひとつの実施態様においては、天然型HCELL糖タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用い、適切な精製手順に従うことにより、細胞または組織から単離することができる。
【００６３】
別の実施態様においては、組換えＤＮＡ技術によってHCELL糖タンパク質を産生する。組換え発現以外の方法としては、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的にHCELL糖タンパク質またはポリペプチドを合成することができる。
【００６４】
「単離された」もしくは「精製された」タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分とは、HCELL糖タンパク質が含まれていた細胞または組織由来の細胞性材料またはその他の混入タンパク質を実質的に含まない、あるいは、化学的に合成されたものの場合には、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないことを意味する。「細胞性材料を実質的に含まない」という語は、HCELL糖タンパク質の調製物をも包含し、該タンパク質が含まれていた細胞、または組換え産生された細胞の細胞性構成成分から分離されたものである。ひとつの実施態様においては、「細胞性材料を実質的に含まない」という語は、HCELL糖タンパク質調製物中の非HCELL糖タンパク質の量が乾燥重量で約30％以下、より好ましくは、非HCELL糖タンパク質の量が乾燥重量で約20％以下、さらにより好ましくは、非HCELL糖タンパク質の量が乾燥重量で約10％以下、最も好ましくは、非HCELL糖タンパク質の量が乾燥重量で約５％以下である該調製物を包含する。HCELL糖タンパク質または生物学的に活性なそれらの一部が組換えによって産生されたものである場合には、タンパク質調製物中に培養培地を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、培養培地の混入が容量で約20％以下、より好ましくは、約10％以下、最も好ましくは約５％以下である。
【００６５】
「化学的前駆物質またはその他の化学物質を実質的に含まない」という語は、タンパク質合成に使用した化学的前駆体またはその他の化学物質から分離されたタンパク質であるHCELL糖タンパク質の調製物を包含する。ひとつの実施態様においては、「化学的前駆物質またはその他の化学物質を実質的に含まない」という語は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質調製物中の化学的前駆体またはその他の化学物質の量が乾燥重量で約30％以下、より好ましくは、化学的前駆体またはその他の化学物質の量が乾燥重量で約20％以下、さらに好ましくは、化学的前駆体またはその他の化学物質の量が乾燥重量で約10％以下、最も好ましくは、化学的前駆体またはその他の化学物質の量が乾燥重量で約５％以下である該調製物を包含する。
【００６６】
HCELL糖タンパク質中の生物学的に活性な部分とは、HCELL糖タンパク質のアミノ酸配列に対して十分な相同性を有するアミノ酸配列から構成されるペプチド、または、HCELL糖タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列など）に由来するペプチドを含み、それらは、HCELL糖タンパク質の全長よりもアミノ酸数が少なく、かつ、HCELL糖タンパク質の活性の内の少なくともひとつ（例えば、HECA-452抗体反応性、抗CD44抗体反応性、E-セレクチン結合性またはL-セレクチン結合性など）を示す。一般的には、生物学的に活性な部分には、HCELL糖タンパク質の活性の内の少なくともひとつを有するドメインまたはモチーフ（例えば、N-結合グリコシル化部位など）を含む。HCELL糖タンパク質中の生物学的に活性な部分とは、例えば、アミノ酸数が10個、25個、50個、100個またはそれ以上であるポリペプチドである。好ましくは、HCELL糖タンパク質中の生物学的に活性な部分は、CD44ポリペプチドのN-末端ドメインのアミノ酸配列を含む。
【００６７】
本発明は、上述の構造ドメインの内の少なくとも１個を含む。さらに、生物学的に活性なその他の部分（タンパク質中のその他の領域が欠失した部分）は、組換え技術によって調製することができ、天然型HCELL糖タンパク質の機能的活性（例えば、E-セレクチン結合活性、L-セレクチン結合活性など）のうちの１種またはそれ以上に関して評価を行うことができる。ひとつの実施態様においては、HCELL糖タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。別の実施態様においては、HCELL糖タンパク質は、以下に詳細に記載しているような天然の対立遺伝子変化または突然変異によってアミノ酸配列が異なってはいても、配列番号１に実質的に相同であり、配列番号１のタンパク質の機能的活性を保有している。従って、別の実施態様においては、HCELL糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも約45％であるアミノ酸配列を含み、配列番号１のHCELL糖タンパク質の機能的活性を保持しているタンパク質である。
【００６８】
別の表現をすれば、HCELLポリペプチドは、Ｎ−結合グリコシル化を行うことができるCD44アミノ酸配列を有する。
【００６９】
キメラタンパク質または融合タンパク質
本発明は、HCELLキメラタンパク質または融合タンパク質をも提供する。本明細書において使用しているHCELL「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、非HCELLポリペプチドに機能発揮できるように結合しているHCELLポリペプチドをさす。「HCELLポリペプチド」とは、HCELLに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをさし、一方、「非HCELLポリペプチド」とは、HCELL糖タンパク質と実質的に相同ではないタンパク質（例えば、HCELL糖タンパク質とは異なるタンパク質、および同一または異なる器官を起源とするタンパク質など）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをさす。HCELL融合タンパク質に関しては、HCELLポリペプチドは、HCELL糖タンパク質のすべてまたは一部に対応している。ひとつの実施態様においては、HCELL融合タンパク質は、HCELL糖タンパク質中の生物学的に活性な部分を少なくとも１個有する。別の実施態様においては、HCELL融合タンパク質は、HCELL糖タンパク質中の生物学的に活性な部分を少なくとも２個有する。さらに別の実施態様においては、HCELL融合タンパク質は、HCELL糖タンパク質中の少なくとも３個の生物学的に活性な部分を有する。融合タンパク質に関しては、「機能発揮できるように連結されている」とは、HCELLポリペプチドと非HCELLポリペプチドが互いにインフレーム（in-frame）融合していることを示すものである。非HCELLポリペプチドは、HCELLポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合することができる。例えば、ひとつの実施態様においては、HCELL融合タンパク質は、HCELL抗CD44結合ドメインを有しており、該ドメインは、第二のタンパク質の細胞外ドメインに機能発揮できるように連結している。そのような融合タンパク質はさらに、HCELL活性を調節する化合物のスクリーニングアッセイに用いることができる。
【００７０】
ひとつの実施態様においては、融合タンパク質は、GST-HCELL融合タンパク質であり、これは、GST（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端にHCELL配列が融合したものである。そのような融合タンパク質は、組換えHCELLの精製に役立つ。別の実施態様においては、融合タンパク質は、Ｎ−末端に異種シグナル配列を含むHCELL糖タンパク質である。例えば、天然のHCELLシグナル配列を除去し、他のタンパク質由来のシグナル配列と置換することができる。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞など）においては、異種シグナル配列を利用することにより、HCELLの発現および／または分泌を増加させることができる。
【００７１】
ひとつの実施態様においては、融合タンパク質はHCELL−免疫グロブリン融合タンパク質であり、これは、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのうちのひとつに由来する配列にHCELL配列またはそれらのフラグメントを融合させたものである。本発明のHCELL−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬剤学的組成物に取り入れて対象に投与することにより、細胞表面でのHCELLリガンドとHCELL糖タンパク質との相互作用を阻害し、それにより、イン・ビボ（in vivo）におけるHCELLを介したシグナル伝達を抑制することができる。HCELL−免疫グロブリン融合タンパク質を用いることにより、HCELL固有リガンドのバイオアベイラビリティー（生体利用性）に影響を及ぼすことができる。HCELLリガンド／HCELL相互作用を阻害することは、増殖性および分化性疾患の治療、ならびに細胞生存の調節（例えば、促進または阻害など）に有用である。
【００７２】
さらに、本発明のHCELL−免疫グロブリン融合タンパク質を免疫原として使用することにより、対象内での抗HCELL抗体産生、HCELLリガンドの精製、およびHCELLとHCELLリガンドとの相互作用を阻害する分子を確認するためのスクリーニングアッセイを行うことができる。
【００７３】
本発明のHCELLキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術によって産生することができる。例えば、従来技術に従い、別異のポリペプチド配列をコードしているDNAフラグメントを互いにインフレーム連結するが、そのような従来技術としては、連結用の平滑末端もしくは付着末端、制限酵素切断を使用した適切な末端の作出、付着末端の適切な充填、アルカリホスファターゼ処理をおこなうことによる所望しない結合の排除、ならびに酵素を使用した連結などが挙げられる。別の実施態様においては、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含む従来技術によって合成することができる。さらに、別の実施態様としては、２個の連続した遺伝子フラグメント間において相補的な突出部を創出するようなアンカープライマーを用いて、遺伝子フラグメントのPCR増幅を行うことができ、このとき、該連続遺伝子フラグメントをアニールし、再増幅させ、キメラ遺伝子配列を作出することができる（例えば、アウスベル（Ausubel）ら、編、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」ジョン・ウィレー＆サンズ（ John Wiley & Sons ）社、1992年などを参照）。さらに、融合部位（例えば、GSTポリペプチドなど）を既にコードしている多くの発現ベクターが市販されている。HCELLをコードしている核酸は、そのような発現ベクター内にクローニングすることができ、このとき、融合部位をHCELL糖タンパク質にインフレーム連結させる。
【００７４】
HCELLのアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明は、HCELLアゴニスト（ミメチック）またはHCELLアンタゴニストとして作用するHCELL糖タンパク質の変異体にも関する。HCELL糖タンパク質の変異体は、突然変異誘発（例えば、HCELL糖タンパク質の不連続点突然変異または切断など）によって作出することができる。HCELL糖タンパク質のアゴニストは、天然に存在する型のHCELL糖タンパク質が有する生物学的活性と実質的に同じまたはその一部を有している。HCELL糖タンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する型のHCELL糖タンパク質の生物学的活性のうちのひとつまたはそれ以上を阻害することができ、例えば、HCELL糖タンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流部分または上流部分に競合結合する。従って、特異的な生物学的効果は、機能を限定した変異体を用いて処理することによって誘起することができる。ひとつの実施態様においては、天然に存在する型のタンパク質が有する生物学的活性の一部のみを有する変異体を用いて対象を治療することにより、天然に存在する型のHCELL糖タンパク質を用いて治療する場合よりも副作用が少なくなる。
【００７５】
HCELLアゴニスト（ミメチック）またはHCELLアンタゴニストとして機能するHCELL糖タンパク質の変異体は、HCELL糖タンパク質アゴニスト活性またはHCELL糖タンパク質アンタゴニスト活性に関して、HCELL糖タンパク質の突然変異体（例えば、切断突然変異体など）を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって確認することができる。ひとつの実施態様においては、核酸レベルにおいてコンビナトリアル突然変異誘発を行うことにより、HCELL変異体から構成される変化に富んだライブラリーを作成し、このとき、該変異体は変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされている。変化に富んだHCELL変異体のライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素の作用によって遺伝子配列内に連結させることによって産生することができ、このとき、HCELL配列候補を構成する縮重セットが、別異のポリペプチドとして発現し得るように、または、HCELL配列の組を含む一組の大きな融合タンパク質（例えば、ファージディスプレー用など）として発現し得るようにする。縮重オリゴヌクレオチド配列からHCELL変異体候補を含むライブラリーを作成するために用いることができる方法には多様なものがある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動DNA合成機で行うことができ、合成された遺伝子を適切な発現ベクターに連結する。遺伝子の縮重セットを用いることにより、ひとつの混合物中において、HCELL配列候補を含むする所望するセットをコードしているすべての配列が用意される。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該分野において既知である（例えば、ナラン（Narang）、Tetrahedron, 39: 3(1983)；イタクラ（Itakura）ら、Annu. Rev. Biochem., 53: 323(1984)；イタクラ（Itakura）ら、Science 198: 1056(1984)；イケ（Ike）ら、Nucl. Acids Res., 11: 477(1983)などを参照のこと）。
【００７６】
抗HCELL抗体
本発明は、本発明に従う任意のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Fabまたは（Fab）2など）を包含する。単離されたHCELL糖タンパク質またはそれらの一部もしくはフラグメントを免疫原として使用し、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の調製に関する標準的な技術を用い、HCELLに結合する抗体を作出することができる。HCELL糖タンパク質の全長を用いることができ、または、本発明においては、免疫原として使用するためのHCELLの抗原性ペプチドフラグメントを提供する。HCELLの抗原性ペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の内の少なくとも４個のアミノ酸残基を有し、さらに、HCELLのエピトープを含むことにより、ペプチドに対して誘起された抗体がHCELLと特異的免疫コンプレックスを形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも６個、８個、10個、15個、20個または30個のアミノ酸残基を有する。当業者において既知である使用および方法に応じて、短い抗原性ペプチドよりも長い抗原性ペプチドの方が好ましい場合がある。より好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１個のN結合グリコシル化部位を有する。
【００７７】
本発明のひとつの実施態様においては、抗原性ペプチドに含まれている少なくとも１個のエピトープは、タンパク質表面に存在しているHCELL領域（例えば、親水性領域など）である。抗体産生を目的とした手段としては、当該分野において既知である任意の方法（例えば、フーリエ変換を行う、もしくは行わない、カイト−ドゥーリトル（Kyte-Doolittle）法またはホップ−ウッズ（Hopp-Woods）法など）を用い、親水性および疎水性領域を表すヒドロパシープロットを作成することができる。例えば、ホップ（Hopp）およびウッズ（Woods））、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824-3828(1981)；カイト（Kyte）およびドゥーリトル（Doolittle）、J. Mol. Biol., 157: 105-142(1982)などを参照のこと。これらを参考として全て本明細書中に取り入れておく。
【００７８】
本明細書に記載しているように、HCELL糖タンパク質配列、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログは、そのようなタンパク質構成物に免疫特異的に結合する抗体の産生において、抗原として使用することができる。本明細書において使用している「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の中の免疫学的に活性な部分、すなわち、HCELLなどの抗原に特異的に結合する（免疫反応を起こす）抗原結合部位を含む分子をさす。そのような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、FabおよびF（ab'）2フラグメント、ならびにFab発現ライブラリーなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。特別な実施態様においては、ヒトHCELL糖タンパク質に対する抗体を開示している。当該分野において既知である多様な方法を用いて、配列番号１に示すHCELL糖タンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生することができる。そのようなタンパク質のうちのいくつかに関しては以下に記載している。
【００７９】
ポリクローナル抗体の産生に関しては、天然型のタンパク質、もしくは合成によって調製したそれらの変異体、またはそれらの誘導体などを多様な適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳類など）に注射することによって免疫することができる。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換えによって発現させたHCELL糖タンパク質または化学的に合成したHCELLポリペプチドなどを含む。調製物にはさらにアジュバントを含むことができる。免疫学的応答を増強させるために使用するアジュバントとしては以下のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。フロイント（完全および不完全）アジュバント、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウムなど）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、複数の多価アルコール類、多価陰イオン類、ペプチド類、油状エマルション類、ジニトロフェノールなど）、カルメット−ゲラン菌（Bacille Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルヴァン（Corynebacterium parvum）などのようなヒト用アジュバント、または免疫刺激性の同様な物質など。所望する場合には、HCELLに対する抗体分子を哺乳類（例えば、血液など）から単離し、タンパク質Aクロマトグラフィーなどの既知の技術を用いてさらに精製してIgG画分を得ることができる。
【００８０】
本明細書において使用している「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、HCELLの特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を１個のみ有する抗体分子の集団を指す。従って、一般的には、モノクローナル抗体組成物は、該組成物が免疫反応する特定のHCELL糖タンパク質に対して一種類の結合親和性を示す。特定のHCELL糖タンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するモノクローナル抗体を産生するためには、細胞系の培養を連続して行うことによって抗体分子を産生することができるような任意の技術を用いることができる。そのような技術としては、ハイブリドーマ法（コーラー（Kohler）およびミルステイン（Milstein）、Nature, 256: 495-497(1975)を参照）、トリオーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法（コツバー（Kozber）ら、Immunol Today, 4: 72(1983)を参照）、ならびにヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ法（コール（Cole）ら、「モノクローナル抗体および癌療法（Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy）」、アラン  R.リス（Alan R. Liss）社、pp. 77-96(1985)を参照）などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ヒトモノクローナル抗体は本発明の実施において使用することができ、ヒトハイブリドーマを用いて（コート（Cote）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026-2030(1983)を参照）、またはイン・ビトロ（in vitro）においてエプスタイン−バー（Epstein-Barr）ウイルスを用いてヒトB細胞を形質転換する（コール（Cole）ら、「モノクローナル抗体および癌療法（Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy）」、アラン  R.リス（Alan R. Liss）社、pp. 77-96(1985)を参照）ことによって産生することができる。上記の各引用文献を参考としてすべて本明細書中に取り入れておく。
【００８１】
本発明に従い、HCELL糖タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に適するように方法を変更することができる（例えば、米国特許第4,946,778号などを参照）。さらに、Fab発現ライブラリーの構築に適するように方法を変更する（例えば、ヒューズ（Huse）ら、Science, 246: 1275-1281(1989)などを参照）ことにより、HCELL糖タンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対して所望する特異性を有するFabフラグメントを迅速かつ効率的に確認することができる。非ヒト抗体は、当該分野において既知の技術を用いることにより、「ヒト化」することができる。例えば、米国特許第5,225,539号などを参照。HCELL糖タンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該分野において既知である技術を用いて産生することができるが、これらに限定されるわけではない。（i）抗体分子をペプシン消化することによって産生されるF（ab'）2フラグメント、（ii）F（ab'）2フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって産生されるFabフラグメント、（iii）パパインおよび還元剤を用いて抗体分子を処理することによって産生するFabフラグメント、ならびに（iv）Fvフラグメント。
【００８２】
さらに、標準的な組換えDNA技術を用いて作成することができ、ヒトおよび非ヒト部分を有する組換え抗HCELL抗体（キメラモノクローナル抗体およびヒト型モノクローナル抗体など）も本発明の範ちゅうに含まれる。そのようなキメラモノクローナル抗体およびヒト型モノクローナル抗体は、当該分野において既知である組換えDNA技術によって産生することができ、例えば、以下の文書に記載されている方法などを用いる。国際特許出願PCT/US86/02269号；ヨーロッパ特許出願第184,187号；ヨーロッパ特許出願第171,496号；ヨーロッパ特許出願第173,494号；PCT国際公開WO86/01533号；米国特許第4,816,567号；米国特許第5,225,539号；ヨーロッパ特許出願第125,023号、ベター（Better）ら、Science, 240: 1041-1043(1987)；リウ（Liu）ら、PNAS 84: 3439-3443(1987)；リウ（Liu）ら、J. Immunol., 139: 3531-3526(1987)；サン（Sun）ら、PNAS 84: 214-218(1987)：ニシムラ（Nishimura）ら、Cancer Res., 47: 999-1005(1987)；ウッド（Wood）ら、Nature, 314: 446-449(1985)；シャウ（Shaw）ら、J. Natl. Cancer Inst., 80: 1553-1559(1988)；モリソン（Morrison）、Science, 229: 1202-1207(1988)；オイ（Oi）ら、BioTechniques, 4: 214(1986)；ジョーンズ（Jones）ら、Nature, 321: 552-525(1986)；ヴァーホーヤン（Verhoeyan）ら、Science, 239: 1534(1988)；およびベイルダー（Beilder）ら、J. Immunol., 141: 4053-4060(1988)。上記の各引用文献を参考としてすべて本明細書中に取り入れておく。
【００８３】
ひとつの実施態様においては、所望する特異性を有する抗体をスクリーニングする方法としては、固相酵素免疫検定法（ELISA）、および当該分野において既知であるその他の免疫学的方法などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。特別な実施態様においては、HCELL糖タンパク質の特定のドメインに特異的な抗体は、そのようなドメインを有するHCELL糖タンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマを作出することによって選択することができる。N結合グリコシル化部位に特異的な抗体、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログも本発明によって提供される。
【００８４】
HCELL糖タンパク質の局在および／または定量に関する分野における既知の方法（例えば、適切な生体サンプル中のHCELL糖タンパク質の量の測定、診断法、タンパク質の画像化など）に抗HCELL抗体を使用することができる。ある実施態様においては、HCELL糖タンパク質またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する抗体は、抗体由来の結合ドメインを含んでおり、薬剤学的に活性な化合物（本明細書においては、以後、「治療剤」と表記する）として使用される。
【００８５】
抗HCELL抗体（例えば、モノクローナル抗体など）を用い、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術に従うことにより、HCELLを単離することができる。抗HCELLを用いることにより、細胞からの天然型HCELLの精製、または宿主細胞において発現された組換え産生HCELLの精製を行うことができる。さらに、HCELL糖タンパク質の発現量およびパターンを評価することを目的として、抗HCELL抗体を用いて、細胞溶解物中または細胞上清中などに含まれるHCELL糖タンパク質を検出することができる。抗HCELL抗体を用い、臨床試験の一部として、例えば、治療法の効果を判断することなどを目的として、組織内のタンパク質レベルを診断的にモニターすることができる。別の用途としては、抗HCELL抗体を用いて白血病の治療または診断を行うことができる。検出は、検出可能な物質に抗体をカップリングさせる（すなわち、物理的に結合させる）ことによって行うことができる。検出可能な物質の例としては、多様な酵素、配合族、蛍光材料、発光材料、生体発光材料、および放射活性材料などが挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼなどが挙げられ；適切な配合族コンプレックスの例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどが挙げられ；適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン、フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンなどが挙げられ；発光材料の例としてはルミノールが挙げられ；生体発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびアクオリンが挙げられ；さらに、適切な放射活性材料の例としては、125I、131I、35Sまたは3Hなどが挙げられる。
【００８６】
HCELL組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明を別の側面から見ると、ベクター、好ましくは、HCELLポリペプチド、融合ポリペプチドまたはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードしている核酸を含む発現ベクターに関する。本明細書において使用している「ベクター」とは、核酸分子であって、該核酸分子が結合していた場所に別の核酸を輸送することができるものをさす。ベクターのひとつの型が「プラスミド」であり、これは、環状二本鎖ＤＮＡループであり、その中に追加のＤＮＡセグメントを連結することができる。別の型のベクターとしてはウイルスベクターがあり、該ウイルスゲノム内に追加のＤＮＡセグメントを連結することができる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞内において自律的複製をすることができる（例えば、バクテリアベクターは、バクテリア由来の複製起点およびエピソーム性哺乳類ベクターを有する）。その他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクターなど）は、宿主細胞内に導入されることによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、該ベクターが機能発揮できるように連結された遺伝子の発現を指図することができる。本明細書においては、そのようなベクターを「発現ベクター」と称する。一般的には、組換えＤＮＡ技術において使用する発現ベクターは、プラスミドの形であることが多い。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの型であるため、本明細書においては、「プラスミド」と「ベクター」とを相互に入れ換えて使用することができるものとする。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス類、アデノウイルス類およびアデノ関連ウイルス類など）などの他の型の発現ベクターをも包含する。
【００８７】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内における核酸の発現に適した型の本発明の核酸を含んでおり、すなわち、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された１個またはそれ以上の制御配列を有しており、該制御配列は、発現されるべき核酸配列に機能発揮できるように連結している。組換え発現ベクター内においては、「機能発揮できるように連結している」とは、目的のヌクレオチド配列が発現することができるように（例えば、イン・ビトロ（in vitro）転写／翻訳系において、または、ベクターが宿主細胞内に導入された場合には宿主細胞内において）、該ヌクレオチド配列が制御配列に連結していることをさす。
【００８８】
「制御配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御因子（例えば、ポリアデニル化シグナルなど）をさす。そのような制御配列については、例えば、ゴッデル（Goeddel）著、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Gene Expression Technology: Methods in Enzymology）第185巻」（アカデミック・プレス（Academic Press）社、カリフォルニア州サンディエゴ、1990年）などに記載されている。制御配列には、多くの型の宿主細胞内において核酸配列の構成的発現を指図するもの、および、ある種の宿主細胞においてのみ核酸配列の発現を指図するもの（例えば、組織特異的制御配列など）がある。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの因子に応じて行わねばならないことは、当業者において周知の事実である。本発明に従う発現ベクターは、宿主細胞内に導入することにより、本明細書に記載されている核酸配列によってコードされているタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）を産生することができる。
【００８９】
本発明に従う組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞内においてHCELLポリペプチドまたは融合ポリペプチドを発現するように設計することができる。例えば、HCELLポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、大腸菌（E . coli）などのバクテリア細胞、昆虫細胞（バキュウロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳類細胞内において発現することができる。適切な宿主細胞については、ゴッデル（Goeddel）著、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Gene Expression Technology: Methods in Enzymology）第185巻」（アカデミック・プレス（Academic Press）社、カリフォルニア州サンディエゴ、1990年）において言及されている。別の方法としては、T7プロモーター制御配列およびT7ポリメラーゼなどを用い、組換え発現ベクターをイン・ビトロ（in vitro）において転写／翻訳させることができる。
【００９０】
原核細胞におけるタンパク質の発現は、融合もしくは非融合タンパク質の発現を指図する構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを有するベクターを用い、大腸菌（E . coli）内で行うことが多い。融合ベクターは、その中にコードされているタンパク質（通常は、組換えタンパク質のアミノ末端）に多数のアミノ酸を付加する。一般的に、そのような融合ベクターは、次の３つの目的に対して使用する：（i）組換えタンパク質の発現を増加させる；（ii）組換えタンパク質の溶解性を向上させる；（iii）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を促進する。融合発現ベクターにおいては、融合部位の連結部分にタンパク質加水分解性解裂部位が導入されている場合が多く、融合タンパク質の精製に続いて、融合部位から組換えタンパク質を分離することができる。そのような酵素およびそれらに対応する認識配列としては、Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼなどが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐGEX（ファルマシア・バイオテク（ Pharmacia Biotech ）社；スミス（Smith）およびジョンソン（Johnson）、Gene, 67: 31-40(1988)）、ｐMAL（ニューイングランド・バイオラブス（New England Biolabs）社、マサチューセッツ州ビヴァリー）、およびｐRIT5（ファルマシア（ Pharmacia ）社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）などが挙げられ、これらは、目的とする組換えタンパク質にグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAをそれぞれ融合させる。
【００９１】
適切な誘導性非融合大腸菌（E . coli）発現ベクターの例としては、ｐTrc（アムラン（Amrann）ら、Gene, 69: 301-315(1988））およびｐET11ｄ（ステュデアー（Studier）ら、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Gene Expression Technology: Methods in Enzymology）第185巻」pp. 60-89（アカデミック・プレス（Academic Press）社、カリフォルニア州サンディエゴ、1990年）が挙げられる。
【００９２】
大腸菌（E . coli）における組換えタンパク質の発現を最大にするためのひとつの方法は、組換えタンパク質をタンパク質分解する能力が損なわれている宿主バクテリア内でタンパク質を発現させることである。例えば、ゴッテスマン（Gottesman）、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Gene Expression Technology: Methods in Enzymology）第185巻」pp. 119-128（アカデミック・プレス（Academic Press）社、カリフォルニア州サンディエゴ、1990年）などを参照のこと。別の方法としては、各アミノ酸に対するそれぞれのコドンが大腸菌（E . coli）において好んで利用されるものになるように、発現ベクターに組み込まれる核酸の核酸配列を変化させる（例えば、ワダ（Wada）ら、Nucl. Acids Res., 20: 2111-2118(1992)などを参照のこと）。本発明における核酸配列のそのような変更は、標準的なDNA合成技術によって実施可能である。
【００９３】
別の実施態様においては、HCELLポリペプチドまたは融合ポリペプチド発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母であるビール酵母菌（Saccharomyces cerivisae）における発現用ベクターの例としては、pYepSec1（バルダリ（Baldari）ら、EMBO J., 6: 229-234(1987) ）、pMFa（クラン（Kurjan）およびヘルスコヴィッツ（Herskowitz）、Cell, 30: 933-943(1982)）、pJRY88（シュルツ（Schultz）ら、Gene, 54: 113-123(1987）、pYES2（インヴィトロジェン（Invitrogen）社、カリフォルニア州サンディエゴ）およびpicZ（インヴィトロジェン（Invitrogen）社、カリフォルニア州サンディエゴ）などが挙げられる。
【００９４】
別の実施態様としては、バキュウロウイルス発現ベクターを用い、昆虫細胞内でHCELLポリペプチドまたは融合ポリペプチドを発現させることができる。培養昆虫細胞（例えば、SF9細胞など）内でタンパク質を発現することができるバキュウロウイルスベクターとしては、pAcシリーズ（スミス（Smith）ら、Mol. Cell Biol., 3: 2156-2165(1983)）およびpVLシリーズ（ラックロウ（Lucklow）およびサマーズ（Summers）、Virology, 170: 31-39(1989)）などが挙げられる。
【００９５】
さらに別の実施態様においては、哺乳類発現ベクターを用い、哺乳類細胞内で本発明に従う核酸を発現させる。哺乳類ベクターの例としては、pCDM8（シード（Seed）、Nature, 329: 840(1987)）およびpMT2PC（カウフマン（Kaufman）ら、EMBO J., 6: 187-195(1987)）などが挙げられる。哺乳類細胞内において使用する場合には、発現ベクターの制御機能は、ウイルス性の制御因子から供給される場合が多い。例えば、汎用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス40由来である。原核細胞および真核細胞の両方に適したその他の発現系については、例えば、サンブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第２版、（コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989年）などを参照のこと。
【００９６】
別の実施態様においては、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞系内において優先的に核酸を発現させるようにすることができる（例えば、組織特異的制御因子を用いて核酸を発現させるなど）。組織特異的制御因子は当該分野において既知である。適切な組織特異的プロモーターの例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；ピンカート（Pinkert）ら、Genes Dev., 1: 268-277(1987)）、リンパ腺特異的プロモーター類（カラメ（Calame）およびイートン（Eaton）、Adv. Immunol., 43: 235-275(1988)）、特にT細胞レセプターのプロモーター類（ウィノト（Winoto）およびボルティモア（Baltimore）、EMBO J., 8: 729-733(1989)）および免疫グロブリン類（バナージ（Banerji）ら、Cell, 33: 729-740(1983)；クイーン（Queen）およびボルティモア（Baltimore）、Cell, 33: 741-748(1983））、神経特異的プロモーター類（例えば、神経繊維プロモーターなど；バーン（Byrne）およびラドル（Ruddle）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5473-5477(1989)）、膵臓特異的プロモーター類（エドランド（Edlund）ら、Science, 230: 912-916(1985）、ならびに乳腺特異的プロモーター類（例えば、乳清プロモーターなど；米国特許第4,873,316号おいおびヨーロッパ特許出願公開第264,166号）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。マウスhoxプロモーター類（ケセル（Kessel）およびグラス（Gruss）、Science, 249: 374-379(1990）およびα−フェトプロテインプロモーター（キャンペス（Campes）およびティルーマン（Tilghman）、Genes Dev., 3: 537-546(1989)）などのような、発生過程に従って制御されるプロモーター類も包含される。
【００９７】
さらに本発明は、本発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供し、このとき、該DNA分子は、発現ベクター内にアンチセンス方向にクローニングされている。すなわち、DNA分子は、該DNA分子の転写により、HCELLポリペプチドに対してアンチセンスであるRNA分子または融合ポリペプチドmRNAが発現することができるような様式で、機能発揮できるように制御配列に連結している。アンチセンス方向にクローニングされた核酸に対して、機能発揮できるように連結している制御配列は、多様な細胞系において連続的にアンチセンスRNA分子を発現させるものを選択することができ（例えば、ウイルス性プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）、あるいは、制御配列は、アンチセンスRNAを構成性、組織特異的もしくは細胞型特異的に発現させるものを選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒ウイルスの様式で用いることができ、このとき、高効率制御領域の制御下においてアンチセンス核酸が産生され、該制御領域の活性は、ベクターが導入された細胞型によって決まる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の制御については、例えば、ウェイントラウブ（Weintraub）ら、「遺伝子分析のための分子ツールとしてのアンチセンスRNA（Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis）」（総説−遺伝学における動向（Reviews-Trends in Genetics）第１巻（１） 、1986年）などを参照のこと。
【００９８】
本発明を別の側面から見ると、本発明に従う組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。本明細書においては、「宿主細胞」と「組換え宿主細胞」とは相互に入れ換えて使用することができる。そのような語句は、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫もしくは子孫となり得るものをもさすことは明らかである。突然変異または環境の影響により、継代を続ける間に細胞にある種の変形が生じる可能性があるため、実際のところ、そのような子孫は親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用している語句の範ちゅうに含まれる。
【００９９】
宿主細胞としては、任意の原核細胞または真核細胞を使用することができる。例えば、HCELLポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、大腸菌（E . coli）などのバクテリア細胞、昆虫細胞、酵母、または哺乳類細胞（ヒト、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、もしくはCOS細胞など）において発現させることができる。その他の適切な宿主細胞も当該分野において既知である。
【０１００】
従来型の形質転換またはトランスフェクション技術を用いてベクターDNAを原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書において使用している「形質転換（トランスフォーメーション）」および「トランスフェクション」とは、宿主細胞内に外来性の核酸（例えば、DNAなど）を導入するための既知の多様な技術をさし、それらには例えば、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈法、DEAE-デキストランを利用したトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションなどが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために適した方法に関しては、サンブルック（Sambrook）らの「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第２版、（コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989年）またはその他の実験室マニュアルに記載されている。
【０１０１】
哺乳類細胞を安定的にトランスフェクトするためには、使用する発現ベクターおよびトランスフェクト法に応じて、わずかな細胞のみが外来性DNAをゲノム内に取り込むことがわかっている。そのような組み込まれたものを確認、選択するためには、一般的には、目的の遺伝子と共に、選択的マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性など）をコードしている遺伝子を宿主細胞に導入する。多様な選択的マーカーが存在するが、薬物（例えば、G418、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートなど）に対する耐性を付与するものなどが挙げられる。選択的マーカーをコードしている核酸は、HCELLポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードしているベクターと同じベクターを利用して宿主細胞内に導入することができ、または、別のベクターを利用して導入することができる。導入された核酸が安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択（例えば、選択的マーカー遺伝子が組み込まれている細胞は生存するが、その他の細胞は死ぬ、など）によって確認することができる。
【０１０２】
本発明の宿主細胞、例えば、培養原核細胞または培養真核細胞などを用い、HCELLポリペプチドまたは融合ポリペプチドを産生（すなわち、発現）させることができる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用してHCELLポリペプチドまたは融合ポリペプチドを産生する方法を提供する。ひとつの実施態様においては、そのような方法は、HCELLポリペプチドまたは融合ポリペプチドの産生に適した培地中で、本発明に従う宿主細胞（HCELLポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードしている組換え発現ベクターが導入された宿主細胞）を培養することを含む。別の実施態様においては、本発明はさらに、培地または宿主細胞からHCELLポリペプチドまたは融合ポリペプチドを単離することを含む。
【０１０３】
幹細胞の確認法
本発明は、幹細胞を確認および／または単離するための多様な方法を提供する。幹細胞とは、中胚葉、外胚葉または内胚葉を起源とする多分化能細胞である。好ましくは、幹細胞は中胚葉由来である。より好ましくは、幹細胞は、造血前駆細胞である。
【０１０４】
幹細胞は、被験細胞集団を１種類またはそれ以上の物質（例えば、タンパク質、ポリペプチドまたは低分子であって、ＨＣＥＬＬポリペプチドに特異的に結合するもの）と接触させることによって確認する。好ましくは、そのような物質は、抗体またはそれらのフラグメントである。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれも用いることができる。例えば、そのような物質はHCELL抗体である。あるいは、使用する物質は、抗CD44抗体またはHECA-452抗体である。
【０１０５】
特異的結合とは、細胞と物質との間の相互作用の強度がコンプレックスを形成するのに十分であるという意味である。細胞／物質コンプレックスを検出する。コンプレックスが存在するということは、被験細胞が幹細胞であることを示唆している。別の方法においては、被験細胞集団からコンプレックスを除去することにより、被験細胞集団から幹細胞を単離する。フローサイトメトリーなどの当該分野において既知の方法によって被験細胞集団からコンプレックスを分離することができる。さらに、コンプレックスを解離することにより、物質から幹細胞を分離することによって幹細胞を単離することができる。コンプレックスの解離は、希釈したEDTAなどを用いたイオンキレート化などによって行うことができる。
【０１０６】
別の方法としては、固相（例えば、ガラス、プラスチックまたは膜など）にセレクチンポリペプチド（例えば、E-セレクチンまたはL-セレクチンなど）を固定し、固相に被験細胞の懸濁物を含む液体サンプルを接触させることによって幹細胞を確認することができる。ある観点においては、液体サンプルを移動させる。液体サンプルを移動させることにより、サンプルが膜の表面を一定方向に流れていくことを意味する。流れの中の液体サンプルと固定されたリガンドとの間の相互作用は、広範な定流量条件下において（静止インキュベーションから生理的なずれ流量レベルまで、静止状態および静止状態とずれ状態を連続して付加する、さらに生理的以上のずれ流量レベルまで）実験することができる。例えば、ずれ流量条件としては、流力は0.6dynes／cm2以上である。別の見方をすると、ずれ流量条件としては、流力は少なくとも2.8dynes／cm2である。さらに、ずれ流量条件としては、流力は少なくとも9.0dynes／cm2である。ある観点から見ると、液体は、膜の表面において生理的ずれ応力が生じるように膜を通過する。次に、固相と細胞との間の相互作用を測定する。液体サンプル中の細胞と固相との間に相互作用が生じることは、該細胞が幹細胞であることを示唆している。
【０１０７】
本発明は、幹細胞の単離法をも包含する。単離法には、固相上にセレクチンポリペプチドを固定し、固相に細胞懸濁物を含む液体サンプルを接触させることを含む。次に、固相に接着した細胞を回収する。結合した細胞は、当該分野において既知の任意の方法（例えば、希釈したEDTAを用いたイオンキレート化、および／または大きなずれ応力をかけるなど）によって除去することができる。ブロット表面から回収された結合細胞を集め、溶出後、表現型または生物学的機能について分析を行う。マトリックスに固定化されていたリガンドを再使用することによって多様な細胞群における相互作用を比較することができ、または、イン・サイチュー（ in situ ）で操作することによって調査中の細胞集団の特性付けを行うことができる。
【０１０８】
細胞と固相との間の相互作用は、例えば、回転（ローリング）、強固な接着、または特異的相互作用などである。ある側面から見ると、特異的相互作用は、アフィニティー係数で定義される。例えば、特異的相互作用とは、Kdが0.1mM〜７mMである相互作用である。好ましくは、Kdは１mM以上である。
【０１０９】
細胞／物質相互作用または細胞／固相相互作用は、例えば、顕微鏡下、比色測定、蛍光測定などの視覚的検査により、または、フローサイトメトリーもしくは平行プレートフローチャンバーアッセイ（parallel plate flow chamber assay）を用いることにより測定することができる。別の方法としては、蛍光ラベル、ビオチン、酵素（アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼなど）、放射活性同位体または当該分野において既知であるその他のラベル類を用いて細胞、HCELLポリペプチドまたは物質をラベルすることによって相互作用を分析する。ラベルは、細胞、HCELLポリペプチド、または物質を被験細胞集団と接触させる前、または後に添加することができる。次に、膜または固相についてスペクトロフォトメーター分析または放射線写真分析を行い、固相のセレクチンポリペプチドと相互作用している細胞数を計数する。
【０１１０】
本発明は、上述した方法に従って単離された細胞を投与することにより、造血性疾患などの細胞疾患、がん、または幹細胞を用いて治療すること（すなわち、幹細胞治療）ができるような疾患（例えば、心筋梗塞、パーキンソン病、糖尿病、先天性筋ジストロフィー、卒中、遺伝性／先天性疾患 （例えば、骨形成不全症など）ならびにヒトなどの哺乳類における肝障害など）を治療する方法をも提供する。
【０１１１】
E-セレクチン／L-セレクチンリガンド親和性を高める方法
本発明は、細胞を調製し、該細胞の細胞表面におけるHCELLポリペプチドの発現または活性を高めるような１個またはそれ以上の物質と細胞を接触させることにより、E-セレクチンおよび／またはL-セレクチンに対する該細胞のアフィニティー（親和性）を高める方法を提供する。
【０１１２】
細胞は、HCELLポリペプチドを発現することができる任意の細胞を用いることができる。そのような細胞の例としては、幹細胞（すなわち、多分化能細胞）が挙げられる。細胞は、中胚葉、外胚葉または内胚葉を起源とするものを用いることができる。好ましくは、細胞は中胚葉由来である。より好ましくは、細胞は、造血前駆細胞である。物質に暴露する（すなわち、接触させる）細胞集団は、任意数の細胞、すなわち、１個またはそれ以上であり、イン・ビトロ（in vitro）、イン・ビボ（in vivo）またはイクス・ビボ（ex vivo）において調製することができる。
【０１１３】
適切な物質としては、例えば、ポリペプチド、核酸などを用いることができる。そのような物質の例としては、CD44、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼポリペプチド、または、CD44、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸、あるいは、CD44、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼポリペプチド、およびそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードしている核酸の発現を増加させる核酸などが挙げられる。CD44、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸の発現を増加させる核酸としては、例えば、プロモーター、エンハンサーなどが挙げられる。該核酸は、内在性のものも外来性のものも使用することができる。
【０１１４】
CD44ポリペプチドをコードしている核酸の起源として適したものとしては、例えば、ヒトCD44核酸（およびコードされているタンパク質配列）などがあるが、それらはジェンバンク（GenBank）から入手可能であり、アクセッション番号はそれぞれ、LO5407およびCAA40133である。その他の起源としては、ジェンバンク（GenBank）アクセッション番号U35632およびP16079で表されるヒトCD44核酸およびタンパク質配列が挙げられ、それらを参考として本明細書中にすべて取り入れておく。グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードしている核酸の起源として適したものとしては、例えば、ヒトグリコシルトランスフェラーゼ核酸（およびコードされているタンパク質配列）などがあるが、それらはジェンバンク（GenBank）から入手可能であり、アクセッション番号はそれぞれ、AJ276689およびCAB81779である。グリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸の起源として適したものとしては、例えば、ヒトグリコシダーゼ核酸（およびコードされているタンパク質配列）などがあるが、それらはジェンバンク（GenBank）から入手可能であり、アクセッション番号はそれぞれ、AJ279864およびCAC08178である。その他のCD44、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼのポリペプチドおよび核酸を使用することについても当該分野において既知であり、本発明の範ちゅうに包含される。
【０１１５】
細胞に物質を直接接触（すなわち、核酸または核酸を含むベクターに細胞を直接接触させる）または間接接触させることができる。
【０１１６】
HCELLの発現は、核酸またはタンパク質レベルで測定することができる。核酸の発現は、当該分野において既知の任意の方法を用い、RNAレベルで測定することができる。例えば、目的の配列のうちの１個またはそれ以上を特異的に認識するプローブを使用したノーザンハイブリダイゼーションによって遺伝子発現を測定することができる。別の方法としては、逆転写に基づくPCRアッセイによって発現を測定することもできる。発現はタンパク質レベルで測定することもでき、すなわち、遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルを測定することによって行う。そのような方法は当該分野において既知であり、例えば、遺伝子によってコードされているタンパク質に対する抗体に基づくイムノアッセイなどが挙げられる。
【０１１７】
HCELL活性は、例えば、L-セレクチンまたはE-セレクチン結合活性によって測定することができる。
【０１１８】
細胞の移植能を高める方法
本発明は、細胞の移植能を高める方法を提供する。
【０１１９】
移植能を高めるとは、細胞を移植した後の生存率が、未処理細胞よりも高いことを意味する。
【０１２０】
細胞は、中胚葉、外胚葉または内胚葉を起源とするものを用いることができる。好ましくは、細胞は中胚葉由来である。より好ましくは、細胞は、造血前駆細胞である。
【０１２１】
本発明は、細胞を調製し、細胞表面のHCELLポリペプチド発現またはHCELLポリペプチド活性を高める１種類もしくはそれ以上の物質に該細胞を接触させることにより、細胞の移植能を高める方法に関する。さらに本発明は、ヒトなどの被験対象内の１種またはそれ以上の幹細胞における細胞表面のHCELLまたはHCELL発現を高める物質を該対象に投与することにより、移植幹細胞のレベルを上昇させる方法をも提供する。そのような物質は、イン・ビボ（in vivo）、イクス・ビボ（ex vivo）またはイン・ビトロ（in vitro）で投与することができる。
【０１２２】
また本発明は、固相（例えば、ガラス、プラスチックまたは膜など）にセレクチンポリペプチド（例えば、E-セレクチンまたはL-セレクチンなど）を固定し、該固相に被験細胞の懸濁物を含む液体サンプルを接触させることにより、細胞集団の移植能を高める方法をも含む。ある側面から見ると、液体サンプルは移動している。液体サンプルを移動させるとは、液体サンプルを移動させることにより、サンプルが膜の表面を一定方向に流れていくことを意味する。流れの中の液体サンプルとリガンドとの間の相互作用は、広範な定流量条件下において（静止インキュベーションから生理的なずれ流量レベルまで、静止状態ならびに、静止状態とずれ状態を連続して付加する、さらに生理的以上のずれ流量レベルまで）実験することができる。例えば、ずれ流量条件では、流力は0.6dynes／cm2以上である。別の見方をすると、ずれ流量条件では、流力は少なくとも2.8dynes／cm2である。さらに、ずれ流量条件では、流力は少なくとも9.0dynes／cm2である。ある観点から見ると、液体は、膜の表面において生理理的ずれ応力が生じるように膜を通過する。次に、固相に接着した細胞を回収する。結合細胞は、当該分野において既知の任意の方法（例えば、希釈したEDTAを用いたイオンキレート化および／または強いずれ応力をかけるなど）によって除去することができる。ブロット表面から回収された結合細胞を集め、溶出後、表現型または生物学的機能について分析を行う。マトリックスに固定化されていたリガンドを再使用することによって多様な細胞群における相互作用を比較することができ、または、イン・サイチュー（ in situ ）で操作する（以下に概説している）ことによって調査中の細胞集団の特性付けを行うことができる。さらに本発明は、上述の方法に従って単離された細胞を含む組成物を対象に投与することにより、対象内における移植幹細胞のレベルを高める方法を提供する。
【０１２３】
適切な物質としては、例えば、ポリペプチド、核酸などが挙げられる。例えば、そのような物質としては、CD44、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼのポリペプチド、または、CD44、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼのポリペプチドをコードしている核酸、あるいは、CD44、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼのポリペプチド、およびそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログをコードしている核酸の発現を高めるような核酸などが挙げられる。CD44、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼのポリペプチドをコードしている核酸の発現を高めるような核酸としては、例えば、プロモーター、エンハンサーなどが挙げられる。核酸は、内在性のものも外来性のものも使用することができる。
【０１２４】
CD44ポリペプチドをコードしている核酸の起源として適したものとしては、例えば、ヒトCD44核酸（およびコードされているタンパク質配列）などがあるが、それらはジェンバンク（GenBank）から入手可能であり、アクセッション番号はそれぞれ、LO5407およびCAA40133である。その他の起源としては、ジェンバンク（GenBank）アクセッション番号U35632およびP16079で表されるヒトCD44核酸およびタンパク質配列が挙げられ、それらを参考として本明細書中にすべて取り入れておく。グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードしている核酸の起源として適したものとしては、例えば、ヒトグリコシルトランスフェラーゼ核酸（およびコードされているタンパク質配列）などがあるが、それらはジェンバンク（GenBank）から入手可能であり、アクセッション番号はそれぞれ、AJ276689およびCAB81779である。グリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸の起源として適したものとしては、例えば、ヒトグリコシダーゼ核酸（およびコードされているタンパク質配列）などがあるが、それらはジェンバンク（GenBank）から入手可能であり、アクセッション番号はそれぞれ、AJ279864およびCAC08178である。その他のCD44、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼのポリペプチドおよび核酸を使用することについても当該分野において既知であり、本発明の範ちゅうに包含される。
【０１２５】
被験対象は、好ましくは哺乳類である。哺乳類としては、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシなどが挙げられる。さらに、そのような対象は、造血性疾患（例えば、白血病など）、癌、または炎症性疾患（慢性関節リューマチなどのような慢性炎症性疾患など）に苦しんでいる、または発症する危険性がある。
【０１２６】
造血性疾患（例えば、白血病など）、癌、または炎症性疾患（慢性関節リューマチなどのような慢性炎症性疾患など）に罹患している、または発症する危険性を有する哺乳類は、特定の疾患に関与している既知の危険因子（例えば、性別、年齢、喫煙歴、遺伝的もしくは家族的素因など）を検出することによって確認することができる。別の方法としては、造血性疾患（例えば、白血病など）、癌、または炎症性疾患（慢性関節リューマチなどのような慢性炎症性疾患など）に苦しんでいる、または発症する危険性を有する哺乳類は、特定の疾患を診断するための当該分野において既知の方法によって確認することができる。
【０１２７】
造血性疾患の治療法
本発明は、被験対象内の細胞表面のHCELLポリペプチドまたはHCELLポリペプチドの発現を低下させる物質を対象に投与することにより、造血性疾患（例えば、白血病、再生不良性貧血、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、多骨髄腫慢性リンパ性白血病および多様な骨髄異形成症候群など）を治療する方法に関する。
【０１２８】
さらに本発明は、被験対象の造血性疾患を治療する方法を提供するが、これは、被験対象から血液を採取し、HCELLポリペプチドと特異的に結合する物質と血液中の血液細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において、１種類またはそれ以上の該物質に血液を接触させることによって行う。好ましくは、血液細胞は癌性である。より好ましくは、血液細胞は白血病性血液細胞である。コンプレックス形成を検出し、血液からコンプレックスを除去することにより、細胞が除去される。次に、血液を被験対象内に戻す。
【０１２９】
適切な物質としては、HCELLポリペプチドに特異的に結合するタンパク質、ポリペプチドまたは低分子などが挙げられる。好ましくは、そのような物質は、抗体またはそれらのフラグメントである。抗体は、ポリクローナル抗体もモノクローナル抗体も用いることができる。例えば、そのような物質は、HCELL抗体である。別の物質としては、抗CD44抗体、またはHECA-452抗体が挙げられる。特異的に結合するとは、細胞と物質との間の相互作用がコンプレックスを形成するのに十分であることを意味する。フローサイトメトリーなどの当該分野において既知の方法を用いることにより、血液からコンプレックスを分離することができる。
【０１３０】
また本発明は、被験対象の血液、および固相（例えば、ガラス、プラスチックまたは膜など）に固定したセレクチンポリペプチド（例えば、E-セレクチンまたはL-セレクチンなど）を用意し、血液に固相を接触させることにより、造血性疾患を治療する方法を提供する。ある側面から見ると、血液サンプルは移動している。血液サンプルを移動させるとは、サンプルを移動させることにより、サンプルが膜の表面を一定方向に流れていくことを意味する。流れの中の血液サンプルとリガンドとの間の相互作用は、広範な流量条件において（静止インキュベーションから生理的なずれ流量レベルまで、静止状態ならびに静止状態とずれ状態を連続して付加する、さらに生理的以上のずれ流量レベルまで）実験することができる。例えば、ずれ流量条件では、流力は0.6dynes／cm2以上である。別の見方をすると、ずれ流量条件では、流力は少なくとも2.8dynes／cm2である。さらに、ずれ流量条件では、流力は少なくとも9.0dynes／cm2である。ある観点から見ると、血液は、膜の表面において生理的ずれ応力が生じるように膜を通過する。次に、血液を被験対象内に戻す。血液の採取および再注入は、当該分野において既知のプラズマフェレーシス法によって行う。
【０１３１】
さらに本発明は、HCELL糖タンパク質に特異的に結合する物質を被験対象に投与することにより、造血性疾患を治療する方法を提供する。そのような物質としては、例えば、ポリペプチドまたは低分子などが挙げられる。好ましくは、そのような物質はHCELL抗体である。特異的に結合するとは、細胞と物質との間の相互作用がコンプレックスを形成するのに十分であることを意味する。コンプレックスの形成においては、そのような物質は、補体を活性化し、または、細胞毒性（例えば、抗体依存性細胞毒性（ADCC）など）もしくはその他の直接的な免疫学的影響を媒介する。
【０１３２】
別の方法としては、第一および第二ドメインを含む物質を被験対象に投与することにより、造血性疾患を治療することができる。第一ドメインは、HCELL糖タンパク質に特異的に結合する化合物を含む。好ましくは、第一ドメインはHCELL抗体またはそれらのフラグメントである。第二ドメインは、共有結合（例えば、ペプチド結合など）によって第一ドメインに連結している毒素を含む。毒素とは、接触時に細胞を破壊する、または選択的に殺すことができる任意の化合物である。「選択的に殺す」とは、第一ドメインが結合する細胞を殺すという意味である。毒素の例としては、ジフテリア毒素（DT）、プソイドモナス属外毒素（PE）、リシンA（RTA）、ゲロニン、ポークウィード抗ウイルス性タンパク質、およびドデカンドロンなどが挙げられる。
【０１３３】
第一および第二ドメインは、任意の順序で配置されており、物質中には各ドメインが１個またはそれ以上含まれている。
【０１３４】
被験対象は、好ましくは哺乳類である。哺乳類としては、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシなどが挙げられる。
【０１３５】
造血性疾患にに対する感受性を診断または測定する方法
本発明は、HCELL糖タンパク質に特異的に結合する１種類またはそれ以上の物質に被験対象由来の細胞集団を接触させることにより、被験対象の造血性疾患に対する感受性を診断または測定する方法を提供する。特異的に結合するとは、細胞と物質との間の相互作用がコンプレックスを形成するのに十分であることを意味する。細胞／物質コンプレックスを検出する。コンプレックスが存在しているということは、対象が造血性疾患に罹患している、または、感受性を有することを示している。
【０１３６】
本方法によって検出可能な造血性疾患としては、例えば、貧血、好中球減少症、血小板増加症、骨髄増殖性疾患または造血性腫瘍などが挙げられる。
【０１３７】
被験対象は、好ましくは哺乳類である。哺乳類としては、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシなどが挙げられる。
【０１３８】
造血性疾患治療の予後または効果を判断する方法
本発明は、HCELL糖タンパク質に特異的に結合する１種類またはそれ以上の物質に被験対象由来の細胞集団を接触させることにより、造血性疾患治療の予後または効果を判断する方法を提供する。特異的に結合するとは、細胞と物質との間の相互作用がコンプレックスを形成するのに十分であることを意味する。細胞／物質コンプレックスを検出する。コンプレックスが存在しないということは、造血性疾患の予後が良好である、または治療が有効であることを示している。コンプレックスが存在しているということは、造血性疾患の予後がよくない、または治療の効果がなかったことを示している。
【０１３９】
「有効である」とは、治療によって被験対象内の造血性疾患が減退することを意味する。治療を予防的に行う場合には、「有効である」とは、治療によって造血性疾患の発症を遅延させる、または防御することを意味する。
【０１４０】
本方法によって検出可能な造血性疾患としては、例えば、貧血、好中球減少症、血小板増加症、骨髄増殖性疾患または造血性腫瘍などが挙げられる。
【０１４１】
被験対象は、好ましくは哺乳類である。哺乳類としては、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシなどが挙げられる。
【０１４２】
炎症性疾患の治療法
本発明は、被験対象にHCELL糖タンパク質またはそれらのフラグメントを投与することにより、炎症性疾患を治療する方法を提供する。
【０１４３】
炎症性疾患としては、例えば、慢性関節リューマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＡ）および喘息などが挙げられる。
【０１４４】
HCELLポリペプチド融合ポリペプチドまたはそれらをコードしている核酸を含む薬剤学的組成物
投与に適した薬剤学的組成物には、ＨＣＥＬＬポリペプチドもしくはこれらの融合タンパク質をコードしている核酸分子、および本発明の方法に従って単離された細胞（本明細書においては、「治療剤」または「活性化合物」とも称する）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログを用いることができる。一般的には、そのような組成物には、核酸分子、タンパク質、細胞もしくは抗体、ならびに薬剤学的に許容されるキャリヤーを含む。本明細書において使用している「薬剤学的に許容されるキャリヤー」とは、薬剤学的投与に適した任意ならびにすべての溶媒、分散剤、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。適切なキャリヤーについては、当該分野における標準的な教科書である「レミントン  薬剤学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」の最新版に記載されており、参考として本明細書中に取り入れておく。そのようなキャリヤーまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。リポソームおよび非水性ビヒクル（不揮発油など）も用いることができる。薬剤学的に活性な物質に対してそのような媒剤および物質を使用することは、当該分野において既知である。従来から使用されている媒剤または物質が活性化合物と非相溶性である場合を除けば、それらを組成物に使用することは企図の範囲内である。補助的な活性化合物を組成物に取り入れることもできる。
【０１４５】
本明細書に開示している活性物質はリポソームとして製剤化することができる。リポソームは既知の方法に基づいて調製することができ、例えば、エプスタイン（Epstein）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688(1985)；ホワン（Hwang）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030(1980)；ならびに米国特許第4,485,045号および第4,544,545号などに記載されている。循環時間を延長させることができるリポソームについては米国特許第5,013,556号に記載されている。
【０１４６】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG-誘導化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いた逆相エバポレーション法によって調製することができる。一定の孔径のフィルターを通してリポソームを押し出すことにより、所望する直径のリポソームを得ることができる。
【０１４７】
本発明に従う薬剤学的組成物は、予定している投与経路に適合するように製剤化する。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下など）、経口（例えば、インハレーションなど）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜および直腸投与などが挙げられる。非経口、皮内または皮下投与に使用する溶液または懸濁液には次のような組成物を用いて製剤化することができる：注射用に用いる水などの滅菌希釈剤、生理食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコールもしくはその他の合成溶媒、抗菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類）、抗酸化剤（アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（EDTA）など）、緩衝液（酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液など）ならびに張度の調整剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口投与用製剤は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、または、複数回投与用のガラスもしくはプラスチック製のバイアルに充填することができる。
【０１４８】
注射に適した薬剤学的組成物としては、滅菌水性溶液（水溶性の場合）もしくは分散剤、ならびに滅菌注射溶液もしくは分散剤を用時調製するための滅菌粉末などが挙げられる。静脈注射用には、生理食塩水、制菌性水、クレモフォアEL（Cremophore EL(登録商標））（BASF社、ニュージャージー州パルシパニー）またはリン酸緩衝生理食塩水などの適切なキャリヤーを用いる。すべての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易に注射器で押し出すことができる程度に液状でなければならない。製造および保存の条件下において安定でなければならず、バクテリアおよび真菌などの微生物の混入を阻止しなければならない。キャリヤーとしては、溶媒または分散剤、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物などを用いることができる。レシチンなどのコーティング剤を使用する、分散製剤の場合には所望する粒子径を維持する、および界面活性剤を使用するなどの手段により、適切な流動性を維持することができる。微生物活性の阻止は、多様な抗生剤および抗菌剤を用いることによって可能であり、そのようなものとしては例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどが挙げられる。多くの場合には、糖類、ポリアルコール類（例えば、マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウムなどのような等張剤を組成物中に含有することが好ましい。注射可能な組成物の吸収時間を延長するためには、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどのような吸収を遅延させる物質を組成物に組み込む。
【０１４９】
滅菌注射溶液は、上述の材料を１種類または組み合わせたものと共に、必要量の適切な溶媒中に活性化合物を添加し、必要に応じて滅菌ろ過することによって調製することができる。一般的には、分散製剤は、基本的な分散剤および上述したその他の必要な材料を含む滅菌ビヒクルに活性化合物を添加することによって調製することができる。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、調製法は減圧乾燥および凍結乾燥であるが、この操作により、活性材料と、事前に滅菌ろ過した溶液から得た所望するその他の追加材料とを含む粉末が得られる。一般的には、経口組成物は、不活性希釈剤または可食性キャリヤーを含む。そのような組成物は、ゼラチンカプセルへ封入する、または錠剤に圧縮することができる。経口投与による治療を行うためには、活性化合物を賦形剤と組み合わせることが可能であり、錠剤、トローチまたはカプセルの形で使用することができる。経口組成物は、液体キャリヤーを用いて調製し、マウスウオッシュとして使用することができるが、このとき、液体キャリヤー中の該化合物を口腔内に入れ、漱ぎ、はき出すかまたは飲み込む。薬剤学的に許容される結合剤および／またはアジュバント剤を組成物の一部として添加することができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどには、以下に記載する材料または同様の性質を有する化合物のうちの任意のものを用いることができる：結合剤（微晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなど）；賦形剤（でんぷんまたは乳糖など）；崩壊剤（アルギニン酸、プリモゲル（Primogel）またはコーンスターチなど）；光沢剤（ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Sterotes）など）；グリダント（glidant）（コロイド性二酸化ケイ素など）；甘味料（ショ糖またはサッカリンなど）；または香料（ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料など）。
【０１５０】
インハレーションによる投与の場合には、気体（例えば、二酸化炭素など）などの適切な推進剤を充填した加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形で化合物を放出することができる。
【０１５１】
経粘膜または経皮投与によって全身投与を行うこともできる。経粘膜または経皮投与を行うためには、被浸透バリアに適した浸透剤を製剤中に混入する。一般的には、そのような浸透剤は当該分野において既知であり、例えば、経粘膜投与用には、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体などが挙げられる。経粘膜投与は、点鼻用スプレーまたは坐薬を使用することによって実施することができる。経皮投与用には、当該分野において既知である、軟膏、蝋膏、ゲルまたはクリームなどの状態に活性化合物を製剤化することができる。
【０１５２】
直腸投与を行うために、化合物を坐薬（例えば、カカオ脂またはその他のグリセリドなどのような従来から使用されている坐薬基剤を用いるなど）または滞留浣腸（retention enema）の様式に製剤化することもできる。
【０１５３】
ひとつの実施態様においては、キャリヤーを用い、活性化合物を放出制御製剤（例えば、インプラント（埋込製剤）およびマクロカプセル封入デリバリーシステムなど）などに製剤化するが、そのようなキャリヤーは、化合物が身体から迅速に排出されることを防ぐ。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物類（polyanhydrides）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類およびポリ乳酸などのような生体分解性、生体許容性のポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製法については、当該分野において既知である。材料は、アルザ社（Alza Corporation）およびノヴァ・ファーマシューティカルズ（Nova Pharmaceuticals）社から購入することもできる。薬剤学的に許容されるキャリヤーとしては、リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含み、感染細胞を標的とするリポソームを含む）を用いることもできる。それらは、例えば、米国特許第4,522,811号などに記載されいているような当該分野において既知の方法に従って調製することができる。
【０１５４】
いくつかの実施態様においては、経口または非経口組成物は、投与の容易性および均一性を目的として、投与ユニット型に製剤化する。本明細書において使用している投与ユニット型とは、被験対象への均一な投与（unitary dosages）に適した物理的に独立したユニットをさし、各ユニットには、必要とされる薬剤学的キャリヤーと協調して所望する治療効果を発揮するために、予め計算された量の活性化合物が含まれている。本発明に従う投与ユニット型に関する定義は、活性化合物に特有の性質および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個別の対象の治療用にそのような活性化合物を製剤化することにおける本質的な制限によって指定され、直接的に関連している。
【０１５５】
本発明に従う核酸分子はベクターに挿入することができ、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静注、局所投与（例えば、米国特許第5,328,470号などを参照）、または定位注射（例えば、チェン（Chen）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3054-3057(1994)を参照）などによって対象に投与することができる。遺伝子治療ベクターの薬剤学的調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含有する、または、遺伝子送達ビヒクルが包埋された遅放性マトリックスを構成することができる。別の方法としては、組換え細胞において、完全な遺伝子送達ベクターがそのままの形で産生される（例えば、レトロウイルス性ベクターなど）場合には、薬剤学的調製物は、遺伝子送達系を発現することができる１個またはそれ以上の細胞を含有することができる。
【０１５６】
所望する場合には、徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーから構成される半透過性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成型物の様式である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル類、水性ゲル類（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）など）、ポリラクチド類（米国特許第3,773,919号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー類、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性酪酸−グリコール酸コポリマー類（リュープロン・デポ(登録商標）（酪酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドから構成される注射可能なマイクロスフェアー）など）、およびポリ−D-（−）−３−ヒドロキシブチル酸などが挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび酪酸−グリコール酸などのポリマー類は100日以上にわたって分子を放出することができるが、ある種の水性ゲルは、タンパク質を放出する期間がそれらよりも短い。
【０１５７】
薬剤学的組成物は、使用説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサーに充填することができる。
【０１５８】
本発明は、以下の実施例においてより詳細に説明されるが、これらは、請求項に記載された発明の範ちゅうを制限するものではない。
【０１５９】
【実施例】
実施例１：ヒト造血細胞におけるHECA-452反応性の膜糖タンパク質の確認
HECA-452反応性のエピトープに関するSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析は、複数のヒト造血細胞系由来の膜タンパク質について行った。
【０１６０】
細胞の調製
ヒト造血細胞系（KG1a、HL60、RPMI-8402およびK562）およびBM内皮細胞系BMEC-1（カンダル（Candal）ら、1996年）は、RPMI1640／10％のFBS／１％のペニシリン−ストレプトマイシン（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）社、ニューヨーク州グランドアイランド）中で増殖させた。 新鮮な循環白血球芽細胞は、患者の末梢血をフィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）（1.077〜1.0800g/ml ）（ICNバイオメディカルズ（ICN Biomedicals）社、オハイオ州オーロラ）密度勾配遠心分離にかけることによって単離したが、このとき、末梢血中における白血球芽細胞の割合は、全循環白血球の80％以上であった。正常なヒトBM細胞は、家族の同意が得られた死体臓器供与者から、およびニューイングランド臓器バンク（New England Organ Bank）（マサチューセッツ州ニュートン）の協力の下で、椎体から抽出した。BM単核細胞は、フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）（1.077〜1.0800g/ml ）密度遠心分離によって単離した。陰性細胞選択ステムセプヒト幹細胞濃縮カラム（StemSep(登録商標） human progenitor enrichment column）（ステムセル・テクノロジーズ（StemCell Technologies）社、カナダ・ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）を使用することにより、また別の方法としては、イムノマグネティックビーズ分離法（ミルテニィ・バイオテク（Miltenyi Biotec）社、カリフォルニア州オーバーン）を用いてCD34+細胞または骨髄細胞のその他の亜集団（単球（CD14+）、顆粒球（CD15+）、B細胞（CD19+）またはT細胞（CD3+））に対する陽性選択を行うことにより、CD34+ならびに直系＋／CD34-亜集団に分離することができる。CD34+／CD44+、CD34+／CD44-およびCD34-／CD44+細胞集団は、フルオロクロムコンジュゲート抗CD34モノクローナル抗体（HPCA-2）（ベクトン−ディッキンソン（Becton-Dickinson）社）および抗CD44モノクローナル抗体（Hermes-1）（フレッド・ハッチンソン癌研究所（Fred Hutchinson Cencer Research Center）のブレンダ・サンドマイアー（Brenda Sandmaier）博士から供与）を用い、モーフロー装置（MoFlo apparatus）（サイトメーション（Cytomation）社）上で細胞選択を行うことにより単離した。
【０１６１】
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット
HPCの膜調製物は、既報（サクステイン（Sackstein）およびディミトロフ（Dimitroff）、2000年）に従って単離した。SDS-PAGEおよびウェスタンブロット用には、還元緩衝液中で膜調製物を希釈し、６〜９％のSDS-PAGEゲル上で分離した。特に示している場合においては、既報（サクステイン（Sackstein）およびディミトロフ（Dimitroff）、2000年）に従い、N-グリコシダーゼF（ロシュ・モレキュラー・バイオメディカルズ（Roche Molecular Biomedicals）社）（８U/mlで24時間 ）またはコレラ菌（Vibrio Cholerae）（ロシュ・モレキュラー・バイオメディカルズ（Roche Molecular Biomedicals）社）ノイラミニダーゼ（0.1U/ml 、H/H/Ca2+中、37℃で１時間）を用いて膜タンパク質をさらに処理した。解析された膜タンパク質をセクィ−ブロット（Squi-blot（登録商標））PVDF膜（バイオラド（ Biorad ）社、カリフォルニア州ハーキュレス）に移し、PBS／ツイーン20（Tween 20）／20％のFBSを用い、４℃で１時間ブロックした。ラットモノクローナル抗体HECA-452（ファーミジェン（Pharmigen）社、カリフォルニア州サンディエゴ）（1.2μg／ml、PBS中）または抗PSGL-1モノクローナル抗体４H10（ジェネティクス・インスティテュート（Genetics Institute）社）を添加して室温で１時間ブロットをインキュベートした。ラットIgMまたはマウスIgGを用いたアイソタイプ対照イムノブロットを平行して行い、非特異的反応タンパク質を評価した。PBS／0.1％のツイーン20（Tween 20）で３回洗浄した後、最初に添加した抗体に応じて、AP-コンジュゲートウサギ抗ラットIgMモノクローナル抗体（１：400）またはAP-コンジュゲートヤギ抗マウスIgG（１：8000）を加えてブロットをインキュベートした。AP基質であるウェスタンブルー（Western Blue（登録商標））（プロメガ（Promega）社、ウィスコンシン州マディソン）を添加してブロットを染色した。
【０１６２】
図１Aに示すように、KG1a細胞から単離された膜タンパク質のSDS-PAGE上においては、多数のはっきりとしたHECA-452反応性のバンドが検出された。これらのブロットの分析においては、使用したKG1a膜タンパク質の量は、HL-60、RPMI-8402またはK562細胞の膜タンパク質の10分の１以下であったにもかかわらず、KG1a細胞は、よりはっきりとしたHECA-452染色を示すいくつかの構成タンパク質を含んでいた。HL-60細胞においては、約140kDaの１本の幅広いバンドのみが検出されたが、これは、イムノブロットにより、PSGL-1のモノマー（単体）に相当するものであることがわかった（図１A）。RPMI-8402またはK562細胞については、抗PSGL-1抗体４H10（ディミトロフ（Dimitroff）、2000年）を用いて行ったウェスタンブロットにおいてPSGL-1は検出されたが、HECA-452反応性膜タンパク質は存在していなかった。この知見から、これらの細胞は適切なHECA-452結合エピトープ、および、少なくともPSGL-1のE-セレクチン結合種を欠いていることが示唆された。
【０１６３】
実施例２：一定のずれ流量条件下におけるE-セレクチンへのヒト造血細胞の結合の評価
ヒト造血細胞系によるHECA-452の発現がE-セレクチンリガンド活性と相関しているか否かを調べるため、平行プレートフローチャンバー（prallel-plate flow chamber）実験を行い、一定のずれ流量条件下におけるＥ−セレクチンへの結合を評価した。
【０１６４】
単層細胞の使用
造血細胞単層とCHO-E（ヒトＥ−セレクチンをコードしているcDNAの全長が安定的にトランスフェクトされているチャイニーズハムスター卵巣細胞）の懸濁物との間において、一定のずれ応力下におけるＥ−セレクチンを介した接着相互作用を流れの中で調べた。CHO-Eおよび空のベクター構築体（CHO-Mock）は、MEM  10％のFBS／１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ライフ・テクノロジー（Life Technologies）社）およびHAM's  Ｆ−12（セルグロー（Cellgro）社）／５％のFCS／１％のペニシリン／ストレプトマイシン中でそれぞれ維持した。平行プレートフローチャンバーを用い、ビデオ顕微鏡によって造血細胞単層上におけるCHO-E細胞の繋留（tethering）およびローリング（rolling）を即時可視化した。実験を行う前に、５mMのEDTAを用いてCHO-E細胞を回収し、HBSS中で２回洗浄し、HBSS／10mMのHEPES／２mMのCaCl2（H/H/CC）中、１×107／mlになるように懸濁した。負の対照群は、Ｈ／Ｈアッセイ緩衝液に５mMのEDTAを添加する（結合に必要なCa2+をキレートさせるため）、CHO-E細胞を抗Ｅ−セレクチン抗体（クローン68-5H11；ファーミジェン（Pharmigen）社）で処理する、またはCHO−空のベクター形質転換体（CHO-Mock細胞）を使用することによって調製した。90％以上のコンフルエントを示す造血細胞単層を調製するため、重炭酸ナトリウム／２％のFBS不含RPMI1640中に２×106個／mlの細胞（KG1a、HL60、K562またはRPMI8402）を懸濁させたものを遠心分離し、６ウェルプレートに５×106個／ウェルとなるように加え、３％のグルタルアルデヒドを加えて固定した。0.2Mのリシンを加えて反応性アルデヒド基をブロックし、プレート内の細胞をH/H/Ca2+に懸濁させた。同時に、コレラ菌（Vibrio Cholerae）ノイラミニダーゼ（0.1U/ml H/H/Ca2+中、37℃で１時間）またはO-シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼ（OSGE）（60μ/ml H/H/Ca2+中、37℃で１時間；アキュレート・ケミカルズ（Accurate Chemicals）社、ニューヨーク州ウェストバリー）を用いて細胞をそれぞれ前処理した。細胞単層を平行プレートフローチャンバー内に置き、CHO-E/Mock細胞をチャンバー内に灌流させた。CHO-EまたはCHO-Mock細胞が細胞単層に接触するように放置した後、流速を調整してずれ応力が2.8dynes/cm2になるようにした。各単層上におけるCHO-E/Mock細胞細胞のローリングは、複数回の実験において、倍率を10倍にし、独立した５個の視野から構成されている１個のフレーム内で測定した。少なくとも３回の実験を行い、結果は平均±標準偏差として表した。
【０１６５】
別の方法としては、既報（ラフィー（Rafii）ら、1994年）に従って培養されたヒト一次BMECを用時単離したものを使用し、二次培養での継代数が５回以内であるBMECを６ウェルプレートに５×106個／ウェルとなるように播種し、コンフルエントが90〜100％に達したときに、IL-1α（40U／ml）を添加して４時間刺激し、細胞表面におけるE-セレクチンの発現を亢進させた（発現はフローサイトメトリー分析によって測定した）。次に、生きている培養細胞を平行プレートフローチャンバーに入れ、チャンバー内のBMECに造血細胞（H/H/Ca2+中、107個／ml）を灌流させた。2.8dynes/cm2において、繋留およびローリングしている造血細胞を可視化した。E-セレクチンを介した接着の特異性を評価するため、対照として、IL-1αで活性化しなかったBMECおよび10μg／mlの抗E-セレクチンモノクローナル抗体（クローン68-5H11）を用いて処理したIL-1α活性化BMECを使用した。細胞のローリングは、上述に従って定量および表現した。
【０１６６】
固定化免疫沈降物の利用
CD44は、未処理の細胞溶解物から、または、N-グリコシダーゼF（0.8U/ml）、コレラ菌（Vibrio Cholerae）ノイラミニダーゼ（0.1U/ml）もしくはL-フコシダーゼ（80mU／ml）で処理した細胞溶解物から免疫沈降され、PSGL-1は、既に記載（サクステイン（Sackstein）およびディミトロフ（Dimitroff）、2000年；ディミトロフ（Dimitroff）ら、2000年）されている未処理の細胞溶解物から免疫沈降された。
【０１６７】
CD44またはPSGL-1の免疫沈降物をプラスチックのペトリ皿に滴下し、３％のグルタルアルデヒドで固定し、0.2Mのリシン中でインキュベートすることによって未反応のアルデヒド基をブロックし、次に、100％のFBS中、室温で１時間インキュベートすることによって非特異的結合を阻止した。スポットを覆うようにコレラ菌（Vibrio Cholerae）ノイラミニダーゼを添加し（アッセイ培地中0.1U/ml）、37℃で１時間インキュベートすることによって固定されたスポットを処理した。試料の入ったペトリ皿を平行プレートフローチャンバーに入れ、CHO-E、CHO-P（P-セレクチンの全長をコードしているヒトｃDNAが安定的にトランスフェクトされているCHO）、機能をブロックする抗P-セレクチンモノクローナル抗体（クローンAK-4；ファーミジェン（Pharmigen）社））（10μg／ml）で処理したCHO-P細胞、機能をブロックする抗E-セレクチンモノクローナル抗体（クローン68-5H11）（10μg／ml）処理したCHO-E細胞またはMockトランスフェクト体が基質に接触するまで、流速0.2ml／分でそれらの細胞をチャンバー内に灌流させた(H/H/Ca2+中、２×106個／ml)。流速を上げてずれ応力を2.8dynes/cm2にした。倍率を100倍にして視野あたりの細胞のローリング頻度を測定し、少なくとも３回の実験から得られた８視野についての平均±標準偏差として表した。
【０１６８】
グルタルアルデヒドで固定したKG1aおよびHL60細胞の単層上でE-セレクチンを高レベルで発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO-E）の繋留およびローリングを2.8dynes/cm2において観察した（図１B）。MockをトランスフェクトしたCHO細胞（CHO-Mock）はローリングを示さなかった。CHO-E細胞のローリングは、HL60細胞上よりもKG1a細胞上の方が２倍以上であり、また、アッセイ培地に５mMのEDTAを添加することにより、CHO-E細胞を抗E-セレクチン抗体と共に事前にインキュベートしておくことにより、または、KG1a細胞もしくはHL60細胞をコレラ菌（Vibrio Cholerae）ノイラミニダーゼ（末端のシアル酸を解裂する）で前処理することにより、完全に阻害された。RPMI-8402またはK562細胞系にはE-セレクチンリガンド活性はなかったが、それらの細胞の膜タンパク質は、HECA-452エピロープを有していなかった。驚くべきことに、KG1aおよびHL60細胞のE-セレクチンリガンド活性は、細胞に50μg／mlのHECA-452を加えてインキュベートしても阻害されず、また、フローサイトメトリーにより、KG1a  CD34上のOSGE感受性エピトープであるQBEND-10が消失していることによってOSGEの生物活性を確認していたにもかかわらず、OSGEによる前処理では該活性は阻害されなかった。
【０１６９】
ヒトHPCと生理的に重要な細胞上において、天然に発現されたE-セレクチンとの間の相互作用を分析することを目的として、新しく単離したヒトBM微小脈管内皮細胞（BMEC）を用いた。生理学的ずれ流量条件下、IL-1αで活性化した生きたBMECの単層上におけるKG1aおよびHL60細胞のローリングを観察した。HPC  E-セレクチンリガンド活性を評価するために行ったCHO-E細胞を用いた実験の結果と同じく、IL-1で活性化したBMEC上のE-セレクチン上において、KG1a細胞はHL60細胞の４倍以上のローリング能を有しており、RPMI-8402およびK562細胞は最小限のE-セレクチンリガンド活性しか有していなかった（図２）。KG1aおよびHL60細胞のE-セレクチンリガンド活性は、IL-1αによる活性化を行わなかったBMEC、または抗E-セレクチンモノクローナル抗体を用いて機能をブロックしたIL-1α活性化BMECにおいては観察されなかった。
【０１７０】
実施例３：ヒト造血細胞由来のE-セレクチン糖タンパク質リガンドに関するブロットローリングアッセイを用いた評価
HECA-452反応性のKG1a膜タンパク質すべてについてE-セレクチンリガンド活性を調査することを目的として、ずれ流量下、セレクチンを発現する細胞全体とウェスタンブロット上に固定されたタンパク質との間の接着相互作用を評価した（ディミトロフ（Dimitroff）ら、2000年）。
【０１７１】
ブロットローリングアッセイは、既報（ディミトロフ（Dimitroff）ら、2000年）に従って行った。概説すると、上述したように、CHO-E、CHO-PまたはCHO-Mock形質転換体を単離し、HBSS中で２回洗浄し、HBSS／10mMのHEPES／２mMのCaCl2（H/H/Ca2+）／10％のグリセロール中、１×107個／mlになるように懸濁した。HECA-452を用いて染色したHPC膜調製物のウェスタンブロットは、Ｈ／Ｈ／Ｃa2+／10％のグリセロール中でインキュベートすることによって透過させた。次に、ブロットを平行プレートフローチャンバー内に入れ、CHO形質転換体（２×106個／ml）をチャンバー内に灌流させた。ブロット膜に細胞を接触させた後、流速を調整してすれ応力を3.8dynes/cm2にした。10％のグリセロール接着アッセイ培地の粘度はずれ応力値に相当すると考えられた。ビデオモニター上の各視野を100倍に拡大し、ローリングしている細胞数および各免疫染色バンド領域間の細胞数を計数したが、このとき、目的のタンパク質のみかけの分子量を整列させ、可視化するための補助として、分子量マーカー（カレイドスコープ分子量マーカー（Kaleidoscope Molecular Weight Markers）、バイオラド（ Biorad ）社；ノヴェックス（Novex）社から販売されているシー・ブルー（See Blue(登録商標））を用いた。実験は少なくとも３回行い、結果は、倍率100倍における１視野あたりの細胞ローリングを平均±標準偏差として表した。負の対照は、CHO-E  H/Hアッセイ緩衝液に５mMのEDTAを添加し、結合に必要なCa2+をキレートさせることにより、抗E-セレクチン抗体（クローン68-5H11；10μg／ml）を用いてCHO-E細胞を前処理することにより、またはCHO-Mock細胞が固定化したタンパク質と相互作用する能力について評価を行うことにより、調製した。
【０１７２】
Ｅ−セレクチンリガンド活性は、HECA-452で染色されたバンドのうち、100、120、140、190および220kDaにおいては観察されたが、74kDaにおいては観察されなかった（図３A）。CHO-Mock形質転換体はいずれのバンドとも相互作用を示さなかった。Ｅ−セレクチンに対する特異性は、５mMのEDTAまたは抗Ｅ−セレクチン機能ブロック抗体の存在下において、CHO-E細胞のローリングが停止することによって示された。HL60細胞においては、幅広い140kDaのHECA-452免疫染色バンド（すなわち、PSGL-1/CLA）上においてのみCHO-E細胞のローリングが観察された。E-セレクチン結合決定因子がN-グリカン上に存在するか否かを確認することを目的として、KG1a膜タンパク質をN-グリコシダーゼFで処理した。脱N-グリコシル化したタンパク質をSDS-PAGEで解析し、HECA-452反応性およびE-セレクチンリガンド活性について分析した。N-グリコシダーゼFで処理することにより、HECA-452染色は明らかに弱まり（図３B）、ブロット上のすべてのタンパク質上におけるCHO-E細胞のローリングも完全に停止したことから、KG1a細胞上のすべての糖タンパク質E-セレクチン結合決定因子は、N-グリカン上にのみ存在していることが示唆された。
【０１７３】
実施例４：HCELLの確認および特性付け
アクリルアミドの濃度を変化させて調製したSDS-PAGEゲルから連続的に切り出した98kDaのKG1a膜タンパク質上におけるHECA-452エピトープの発現は以下のようにして行った。各回のSDS-PAGE精製後、98kDaのタンパク質は、ブロットに基づく流体力学的フローアッセイにおいて、リンパ球のローリングを支持する能力を保持していた。SDS-PAGE精製を３回行った後、98kDaのバンドに加えて、約190kDaの位置にHECA-452染色バンドがかすかに検出されたことから、単離過程において、98kDaタンパク質が何らかの形に凝集したことが示唆された。次に、98kDaのクーマジーブルー（Coomasie blue）染色ゲルフラグメントについて、トリプシン消化ペプチドフラグメントに関するマススペクトロメトリー分析を行った。一次ペプチドマップは、KG1a細胞上で発現することが既に明らかにされているCD44の標準型のそれと一致した。CD44に対するモノクローナル抗体（マウスIgG A3D8またはラットIgG Hermes-1）をHECA-452と共に使用し、HECA-452、A3D8またはHermes-1を用いた３回目のゲル精製後、精製した98kDaのバンドのイムノブロットを行った（図８）。各抗体は、98kDaのバンド、および凝集タンパク質を示していると考えられる約190kDaの薄いバンドを検出した。HECA-452と抗CD44モノクローナル抗体との間に相関が確認されたことから、CD44のKG1aグリコフォームはHECA-452炭化水素決定因子を含んでいることが示唆された。
【０１７４】
HECA-452反応性バンドからKG1a細胞性PSGL-1/CLAを区別することを目的として、イムノアフィニティー精製したPSGL-1のブロットおよびKG1aの全膜タンパク質のブロットについて、HECA-452または抗PSGL-1を用いて免疫染色を行った（図３C）。KG1a細胞は、PSGL-1の単体（モノマー）および二量体（ダイマー）イソ型を発現し、それらは、140kDaおよび220kDaのHECA-452反応性タンパク質を表していた（図３C）。従って、CHO-E細胞のローリングを支持する100kDa、120kDaおよび190kDaのHECA-452反応性バンド（図３A）は、非PSGL-1タンパク質に該当した。
【０１７５】
CD44に対するN-グリカン特異的変形がE-セレクチンリガンド活性に影響を与えているか否かを判断することを目的として、KG1a膜タンパク質からイムノアフィニティー精製したCD44が、ブロットローリングアッセイにおいてE-セレクチンリガンドとして作用する能力について調べた。図３Dに示すように、KG1a CD44はHECA-452に対して反応を示し、E-セレクチンリガンド活性を有していた。CD44をN-グリコシダーゼFで処理すると、HECA-452反応性は顕著に低下し、CHO-E細胞のローリングは完全に停止した（図３D）。CD44を徹底的に免疫沈降する（３回）ことにより、100kDaにおける染色可能なCD44分子が消失し（Hermes-1イムノブロットおよびHECA-452イムノブロット）、また、100kDaおよび190kDaのバンドにおけるすべてのE-セレクチンリガンド活性が消失した（図４Aおよび４B）。さらに、免疫沈降を３回行った後は、120kDaのバンドにおけるE-セレクチンリガンド活性が55％も低下していた（図４B）。特筆すべきことは、CD44の除去後においても、PSGL-1の140kDaのモノマーに対するHECA-452染色またはE-セレクチンリガンド活性には差異がなかったことである。
【０１７６】
CD44のE-セレクチンリガンド活性をさらに精査することを目的として、ヒト造血細胞系からCD44を直接免疫沈降させ、平行プレートフローチャンバー内においてCHO-E細胞の結合を分析した。ヒト造血細胞系HL60、K562およびRPMI-8402から単離したCD44はCHO-E細胞のローリングを全く支持しなかったが、KG1a  CD44は、ずれ応力の範囲を超えてもE-セレクチンリガンド活性を示した。N-グリコシダーゼF処理したKG1a  CD44上、L-フコシダーゼ処理したKG1a  CD44上、コレラ菌（Vibrio Cholerae）ノイラミニダーゼ処理したKG1a膜タンパク質上、またはアイソタイプ抗体免疫沈降物（対照）上によりも、未処理のKG1a  CD44上において非常に激しいCHO-E細胞のローリングが観察された（図５A）。さらに、2.8dynes/cm2においては、等モル量の免疫沈降KG1a PSGL-1と比較すると、CD44は非常に高いE-セレクチンリガンド活性を示した（ｐ＜0.001）（図５A）。しかしながら、ずれ応力が小さい（0.6dynes/cm2）場合には、PSGL-1上におけるCHO-E細胞のローリングは、CD44上におけるそれと同等であった。これらのデータから、ずれ応力が小さい場合には、PSGL-1およびCD44は、E-セレクチン結合に対して重複して寄与するが、生理的ずれ応力が大きくなると、CD44とE-セレクチンとの関係が優先されることを示唆している。注意すべきことは、P-セレクチンをトランスフェクトしたCHO細胞はKG1a PSGL-1上ではローリングしたが、KG1a  CD44上においてはローリングしなかった（図５Ｂ）ことから、CD44はP-セレクチンリガンドではないことが示唆される（図５B）。すべての実験において、負の対照であるCHO細胞（CHO-Mock形質転換体、ならびに機能をブロックするＢ−セレクチンモノクローナル抗体もしくはＰ−セレクチンモノクローナル抗体でそれぞれ処理したCHO-E細胞もしくはCHO-P細胞）では、いずれのタンパク質も繋留およびローリングしなかった。
【０１７７】
正常ヒトHPC上で天然に発現されたCD44がE-セレクチンリガンドとして機能するか否かを判断することを目的として、初期のCD34+細胞上、およびより成熟した（CD34-／直系＋）ヒトBM細胞（単球（CD14+）、顆粒球（CD15+）、およびリンパ球（B細胞（CD19+）、T細胞（CD3+））に富んだ細胞集団を含む）上で発現されたCD44におけるHECA-452活性およびE-セレクチンリガンド活性の分布を調査した。驚くべくことに、KG1a細胞のHermes-1免疫沈降物について行ったSDS-PAGEでは３本のバンド（100kDa、120kDaおよび190kDa）が明らかになったが、CD34+細胞および直系＋／CD34-細胞から免疫沈降したのは100kDa  CD44のみであり、CD34+細胞由来のCD44のみがHECA-452で染色され、E-セレクチンリガンドとして機能した（図６A）。負の選択または正の選択を行ってCD34+細胞の割合を高めることによって同様の結果が得られた。CD44を免疫沈降させるにあたり、10倍過量の直系＋細胞膜タンパク質を使用しても、CD44のHECA-452染色およびCD44のE-セレクチンリガンド活性は観察されなかった（図６A）。さらに、プラスチック上に固定した場合には、CD34+／CD44+細胞から免疫沈降したCD44のみがCHO-E細胞のローリングを支持し、一方、CD34-から免疫沈降したCD44はE-セレクチンリガンド活性を全く有していなかった。
【０１７８】
ヒト造血細胞上のHECA-452反応性CD44の発現および構造についてさらに分析を行うことを目的として、天然の白血球芽細胞におけるHCELLの発現を測定した。急性骨髄性白血病（AML）（亜型M5）の白血球芽細胞からは、４本の主要なHECA-452染色バンドが検出された（74kDa、100kDa、140kDaおよび190kDa）（図６B）。N-グリコシダーゼF処理後は、100kDaの位置におけるHECA-452染色は完全に消失し、74kDaおよび140kDaのバンドは染色を維持しており、100kDaのバンドは明らかに分子量が減少した位置に染色されていた（図６B）。AML（M5）膜タンパク質から免疫沈降したCD44をN-グリコシダーゼFで処理した場合には、HECA-452反応性およびE-セレクチンリガンド活性は完全に消失した（図６C）。免疫沈降したKG1a  CD44と同様に、AML（M5）  CD44においては、HECA-452によって検出された120kDaの微量のイソ型の存在が明らかになったが、主要なバンドおよび生物学的に活性なタンパク質は、100kDaのCD44イソ型であった。CD44は、未分化AML（M０）の芽細胞、成熟していないAML（M１）、および非典型慢性骨髄性白血病（CML）（bcr/abl-）からも免疫沈降された。注意すべきことは、免疫沈降されたCD44上におけるHECA-452反応性エピトープの発現は、CHO-E細胞のローリングを支持する能力と直接的に相関しているということである（図６D）。これらの白血病細胞上におけるCD44（Hermes-1モノクローナル抗体）の発現は同等であり（フローサイトメトリーにより、90％以上の細胞が陽性染色される）、さらに、E-セレクチンとの相互作用能は、HECA-452反応性グリコシル化作用に応じて決まることが示唆された。またさらに、CD44は造血細胞以外の細胞上でも発現されることから、ヒトBM内皮細胞系BMEC-1上におけるCD44の発現について分析を行った。BMEC-1は高レベルでCD44を発現したが（図６E）、これらの細胞由来のCD44はHECA-452反応性ではなく、E-セレクチンリガンド活性を全く有していなかった（図６D）。
【０１７９】
実施例５：ヒト造血細胞由来のL-セレクチン糖タンパク質リガンドに関するブロットローリングアッセイを用いた評価
HECA-452反応性のすべてのKG1a膜糖タンパク質について、L-セレクチンリガンド活性を調査することを目的として、ずれ流量下、セレクチンを発現する全細胞とウェスタンブロット上に固定されたタンパク質との間の接着相互作用を評価した。
【０１８０】
L-セレクチンを発現するリンパ球は、既報（オックスレー（Oxley）, S. M.およびサクステイン（Sackstein）, R.、Blood, 84: 3299-3306(1994)；サクステイン（Sackstein）, R.、フー（Fu）, L.およびアレン（Allen）, K.L.、 Blood, 89: 2773-2781(1997)）に従って単離し、HBSS中で２回洗浄し、ＨＢＳＳ／10mMのＨＥＰＥＳ／２mMのＣａＣｌ2（Ｈ／Ｈ／Ｃa2+）／10％のグリセロール中、２×107／mlになるように懸濁した。SDS-PAGEによって細胞溶解物を分離し、標準的なブロット条件下においてPVDFに移したKG1a膜調製物のウェスタンブロットはHECA-452、A3D8またはHermes-1で染色し、Ｈ／Ｈ／Ｃa2+／10％のグリセロール中でそれらをインキュベートすることによって透過させた。L-セレクチンを介した接着相互作用について調べることを目的として、ブロットを平行プレートフローチャンバーに入れ、2.8dynes/cm2のずれ応力でチャンバー内にリンパ球を灌流させ、さらに、ビデオ顕微鏡によって細胞接着相互作用を観察し、即時解析した。
【０１８１】
200倍に拡大したビデオモニターの５ヶ所の別異の視野において、免疫染色されたバンド領域上および領域間でローリングしているリンパ球の数を計測したが、このとき、目的のタンパク質を整列させ、可視化するためのガイドとして分子量マーカーを用いた。実験は少なくとも３回行い、結果は、ローリングしている細胞数の平均／視野として表した。負の対照は、リンパ球H/Hアッセイ緩衝液に５mMのEDTAを添加し、結合に必要なＣa2+をキレートさせることにより、PMA（50ng/ml、L-セレクチンの解裂を誘導する（オックスレー（Oxley）, S. M.およびサクステイン（Sackstein）, R.、Blood, 84: 3299-3306(1994)））で処理したリンパ球を使用する、または、機能をブロックする抗L-セレクチンモノクローナル抗体（10μg／ml）を用いてリンパ球を処理することによって調製し、L-セレクチンの特異的関与を証明した。
【０１８２】
HECA-452で免疫染色したKG1a膜タンパク質のウェスタンブロット（オックスレー（Oxley）, S. M.およびサクステイン（Sackstein）, R.、Blood, 84: 3299-3306(1994)；サクステイン（Sackstein）, R.、フー（Fu）, L.およびアレン（Allen）, K.L.、 Blood, 89: 2773-2781(1997)）をブロット上に灌流させ、解析された免疫染色バンドにおけるL-セレクチンリガンド活性を評価した。L-セレクチン依存性であり、HECA-452によって染色された98kDa、120kDaおよび130kDaのバンド上において、ずれ応力依存性のリンパ球の繋留およびローリング（ずれ応力は2.3dynes/cm2）が観察された。ずれ応力依存性のリンパ球の繋留およびローリングがL-セレクチンによって決定されることを確認することを目的として、５mMのEDTAの存在下において、ならびに、機能をブロックする抗L-セレクチンモノクローナル抗体もしくはPMAを用いてリンパ球を前処理することにより、アッセイを行った（図７D）。ブロットのうちのHECA-452非反応性領域においては、L-セレクチンリガンド活性は全く示されなかった（図７D）。HECA-452で染色された98kDaのバンドは、最も高いL-セレクチンリガンド活性を示し（他のバンドと比較して６倍以上）、このバンドは、KG1a細胞上で発現されるN-グリカンを有するタンパク質の主要部分でもある（図７C）。HECA-452反応性のKG1aバンドのうちのいくつかはL-セレクチンリガンド活性を有していなかったことから、これらのHECA-452反応性タンパク質に関する構造的変形がL-セレクチンリガンド活性の発揮に対しては不十分であったことが示唆された。HL60、K562およびRPMI-8402の膜タンパク質にはHECA-452反応性のバンドが存在していたにもかかわらず、それらの膜タンパク質のウェスタンブロットにおいてはL-セレクチンリガンド活性は観察されなかった。ウェスタンブロットの流体力学的フローアッセイにおいては、HECA-452染色は、対応する固定化KG1aタンパク質にL-セレクチンを介してリンパ球が接着することを干渉しなかった。
【０１８３】
実施例６：免疫沈降KG1a CD44（HCELL）のL-セレクチンリガンド活性
KG1a細胞の全溶解物中のKG1a CD44についてHermes-1モノクローナル抗体を用いて行ったイムノブロットでは、98kDaのバンド、ならびにイソ型をに対応すると考えられる120kDaおよび130kDaのバンドが検出されたが、これらのイソ型は既にCD44R2およびDE44R1と名付けられている（図９）（ドウガーティー（Dougherty）, G. J.、ランスドロップ（Lansdrop）, P. M.、クーパー（Cooper）, D. L.およびハンフリーズ（Humphries）, R. K.、J. Exp. Med., 174: 1-5(1991)）。Hermes-1およびA3D8で検出された190kDaの弱いシグナルは、CD44のコンドロイチン硫酸修飾型を反映したものである。（図９）（ヤルカネン（Jalkanen）, S. T.、ヤルカネン（Jalkanen）, M、バーガッツェ（Bargatze）, R.、タミー（Tammi）, M.およびブッチャー（Butcher）, E. C.、J. Immunol., 141: 1615-1623(1988)）。このCD44グリコフォームがL-セレクチンリガンド活性を示すか否かを直接分析することを目的として、Hermes-1モノクローナル抗体をもちいてKG1a細胞由来のKG1a CD44を免疫沈降させ、次に、Hermes-1またはHECA-452のいずれかで染色されたCD44のイムノブロット上でブロットローリングアッセイを行った。驚くべきことに、Hermes-1で免疫沈降させ、次にHermes-1を用いてイムノブロットを行ったCD44は、98kDaおよび190kDaのバンドのみを示し、120kDaおよび130kDaのバンドは示さなかった。一方、Hermes-1で免疫沈降させ、次にHECA-452を用いてイムノブロットを行ったCD44は、98kDaのバンドのみならず、120kDa、130kDaおよび190kDaのバンドをも示した（図９）。すべての場合において、HECA-452反応性、Hermes-1反応性の98kDaのタンパク質のみがL-セレクチンリガンド相互作用を支持した（図９）。
【０１８４】
実施例７：L-セレクチンリガンド活性およびHECA-452による免疫検出に関するN-グリコシル化との関連性
N-グリコシル化に対するL-セレクチンリガンド活性の関連性を調査することを目的として、N-グリコシダーゼFで前処理したKG1a膜タンパク質上において、Hermes-1を用いたKG1a CD44の免疫沈降を行った。図１０Aに示すように、N-グリコシダーゼFで処理することにより、HECA-452による98kDaのバンドの染色は完全に消失し、さらに、ブロット上におけるL-セレクチンを介したリンパ球の繋留およびローリングはすべて停止した。N-グリコシダーゼF処理したサンプルの全分子量範囲にわたってリガンド活性を評価したところ、糖タンパク質の脱N-グリコシル化に伴う若干の分子量の変化が観察された。脱N-グリコシル化後は、L-セレクチンリガンド活性を示すバンドは存在しなかった。
【０１８５】
CD44のL-セレクチンリガンド活性をさらに分析することを目的として、免疫沈降したCD44およびKG1a細胞のアイソタイプ対照（ラットIgG）免疫沈降物を用い、既報（サクステイン（Sackstein）およびディミトロフ（Dimitroff）、Blood, 96: 2765-2774(2000)）に従ってスライドガラス上に滴下して、スタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイを行った。コレラ菌（Vibrio Cholerae）ノイラミニダーゼ処理したCD44、抗L-セレクチンモノクローナル抗体（ラットリンパ球に対してはHRL-1；ヒトリンパ球に対してはLAM-1-3）処理したリンパ球、または５mMのEDTAを添加した共インキュベーションを用いたアッセイを負の対照とした。免疫沈降KG1a  CD44はL-セレクチンを介したリンパ球の接着を支持した（結合細胞は362±15個／視野、５視野を計数、１回の実験に３枚のスライドガラスを使用、実験は２回実施）が、アイソタイプ対照免疫沈降物、またはノイラミニダーゼ処理した免疫沈降KG1a  CD44もしくはEDTA／抗L-セレクチン抗体処理したものにおいては、結合は全く観察されなかった（結合細胞は＜10個／視野）。単離されたKG1a  CD44、KG1aの全細胞またはKG1a膜タンパク質に対するリンパ球の接着は、HECA-452の添加濃度を100μg／mlまで上げても阻害されなかった。これらの結果は、上述の平行フローチャンバー実験から得られたデータと一致しており、追認するものである。
【０１８６】
実施例８：用時単離したヒト造血細胞内において、KG1a  CD44（HCELL）はL-セレクチンリガンドとして機能する
CD34+／CD44+細胞、CD34+／CD44-細胞、CD34-／CD44+細胞およびCD34-／CD44-細胞を選別した細胞集団についてスタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイを行うことにより、正常な骨髄単核球内におけるHCELL活性を調査した。HCELL活性は、CD44-のすべての集団においては欠如していたが、CD34+／CD44+細胞では80％以上に存在しており、CD34-／CD44+細胞では約１％にしか存在していなかった。そのような分析用に十分な量の細胞を入手することが困難であるため、正常なヒトCD34+骨髄細胞上のCD44に関する生化学的実験には限界があることから、HCELL活性を発現することが知られている芽細胞から単離したCD44のHCELL活性を調べた（サクステイン（Sackstein）およびディミトロフ（Dimitroff）、Blood, 96: 2765-2774(2000)）。次の11例の白血病由来の芽細胞を分析した：９例の骨髄性白血病（未分化型（M0）２例、成熟していない型（M1）２例、成熟型（M2）１例、骨髄単球性（M4）２例および単球性（M5）２例）、１例の急性リンパ急性白血病（pre-B）、および１例の二重表現型白血病。１例のM0を除くすべての白血球芽細胞がHCELL活性を示した。上述の白血病のうちの５例（HCELL活性を欠く１例のM0、ならびにHCELL活性を有する二重表現型白血病、もう１例のM0、M4およびM5 ）の芽細胞から単離したCD44のL-セレクチンリガンド活性を分析した。全膜タンパク質のブロットローリングアッセイにおいては、HCELLを発現しているすべての白血病細胞について、98kDaのバンド上で白血球の繋留およびローリングが観察されたが、HCELL活性を欠くM0由来の膜タンパク質上ではローリングは観察されなかった。これらの細胞からCD44をそれぞれ免疫沈降させたところ、KG1a細胞由来のCD44と同様に、主要なイソ型は98kDaのものであった。これらのデータの代表例として、M4白血病から得られたデータを図１０Bに示す。HECA-452反応性およびL-セレクチンリガンド活性を発現するためには、CD44上のN-グリコシル化構造が必要であることは、白血病膜タンパク質をN-グリコシダーゼFで前処理することによって確認された（図１０B）。逆に、HCELL（−）のM0芽細胞は、HCELL（＋）の白血病種と同量のCD44を保有していた（フローサイトメトリーおよびHermes-1抗体を用いたウェスタンブロットによって確認した）が、これらの細胞由来のCD44は、HECA-452反応性ではなく、L-セレクチンリガンド活性を示さなかった。これらの知見を考え合わせると、HCELL活性を示すCD44グリコフォームはKG1a細胞系に特異的な特徴ではなく、ある種のヒト白血病亜群に含まれる芽細胞に存在するCD44の生理的変形を表しているものであることが示唆された。これらの知見から、N-グリカンの構成成分がCD44上に発現しているというさらなる事実が得られた。
【０１８７】
実施例９：KG1a  CD44のL-セレクチンリガンド活性は硫酸化と無関係である
KG1a細胞上のCD44が硫酸化されているか否かを確認することを目的として、［35S］−SO4を用いてKG1a細胞の培養物を代謝的にラベルした。これらの細胞から免疫沈降されたCD44は確かに硫酸化されていた（図１１A）。CD44のL-セレクチンリガンドに硫酸化が必須であるか否かを調べることを目的として、KG1aのHCELL活性をすべて消失させるプロテアーゼであるブロメライン（サクステイン（Sackstein）およびディミトロフ（Dimitroff）、Blood, 96: 2765-2774(2000)）を0.1％の濃度で用いてKG1a細胞を前処理し、ならびに、細胞表面からCD44を除去した（ハーレ（Hale）, L. P.およびハインズ（Haynes）, B. F.、J. Immunol., 149: 3809-3816(1992)）。KG1aをブロメラインで分解した後、HCELLの再発現にはデ・ノボ（de novo）タンパク質合成が必要であり、塩素酸塩（タンパク質および炭化水素の硫酸化に対する代謝的阻害剤）の存在下において合成されたタンパク質は硫酸化されていない（サクステイン（Sackstein）, R.、フー（Fu）, L.およびアレン（Allen）, K. L.、Blood, 89: 2773-2781(1997)）。故に、KG1aをブロメラインで処理し、フローサイトメトリーによってCD44が除去されたことを確認した。10mMの塩素酸ナトリウム不含または含有培地中でKG1a細胞を24時間培養し、さらに、細胞を代謝的にラベルするため、硫酸不含CRCM-30培地に［35S］−SO4を添加して少なくとも８時間インキュベートした。図１１Aに示すように、免疫沈降CD44（Hermes-1）への［35S］−SO4の取り込みは、塩素酸塩処理細胞では完全に阻害された。塩素酸塩のこのような効果は硫酸の取り込みに特異的であったが、CD44の［35S］−メチオニン／システイン代謝放射ラベルについては、塩素酸塩処理細胞集団と塩素酸塩未処理集団との間で差異が認められなかったことから、CD44タンパク質合成を一般的に阻害するものではなかった。
【０１８８】
次に、対照細胞および塩素酸塩処理細胞から免疫沈降したCD44上においてブロットローリングアッセイを行った。硫酸化および非硫酸化CD44のL-セレクチンリガンド活性を図１１Bに示す。これらの実験データは、HCELL活性が硫酸化の影響を受けないことを示した発明者らが以前に行った研究の結果を確認するものであった（サクステイン（Sackstein）, R.、フー（Fu）, L.およびアレン（Allen）, K. L.、Blood, 89: 2773-2781(1997)）。驚くべくことに、硫酸化されていないCD44に対してのHECA-452による認識は阻害されなかった（図１１B）。これらのデータは、硫酸化は、HECA-452モノクローナル抗体によって認識されるKG1a  CD44のエピトープに重要な特徴ではないことを示している。
【０１８９】
実施例１０：ヒト造血細胞L-セレクチンリガンドであるHCELLおよびPSGL-1におけるL-セレクチンリガンド活性の特異性
A．一般的方法
細胞、抗体および酵素  ヒト造血細胞系KG1a（骨髄球性白血病、HCELL+／PSGL-1+）、HL60（前骨髄球性白血病、HCELL-／PSGL-1+）、RPMI-8402（リンパ球性白血病、HCELL-／PSGL-1+）およびK562（赤血球性白血病（erythrocytic leukemia）、HCELL-／PSGL-1-）、ならびに成熟していないデ・ノボ（de novo）急性骨髄性白血病（AML）（M1）由来の循環芽細胞（HCELL+／PSGL-1+）は、RPML-1640／10％のFBS／１％のペニシリン−ストレプトマイシン（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）社）中で維持した。P-セレクチンをコードしているｃDNAの全長をトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（CHO-P；クローンE4I）およびCHO-空ベクター（CHO-Mock）はロバート  C. フールブリッジ（Robert C. Fuhlbrigge）（ハーバード大学医学部（Harverd Medical School））から入手し、MEM／10％のFBS／１％のペニシリン−ストレプトマイシン（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）社）およびHAM's F-12／５mMのグルタミン／５％のFCS／１％のペニシリン−ストレプトマイシン中で維持した。ヒトリンパ球（PBMC）は、既報（オックスレー（Oxley）, S. M.およびサクステイン（Sackstein）、Blood, 84(10): 3299-3306(1994））に従って全血から調製した。ヒトリンパ球L-セレクチンと同様な機能を発揮するL-セレクチンを高レベルで発現するラット気管支リンパ球（TDL）は、既報（オックスレー（Oxley）, S. M.およびサクステイン（Sackstein）、Blood, 84(10): 3299-3306(1994））に従い、ラットの気管支にカニューレを挿入することによって採取した。ヒト好中球は末梢全血から調製したが、これは、クエン酸緩衝液／0.6％のデキストラン中に全血を加え、室温で30分間、比重に従って赤血球を分離させて得た。Ca2+／Mg2+不含PBSを用い、白血球に富んだプラズマを１：１の割合で希釈し、フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）（1.077〜1.0800g ／ml）密度勾配遠心分離によって顆粒球を沈殿させた。細胞ペレット中に残存している赤血球を溶解させるため、細胞を低張液に30秒間接触させた後、高張ＮａＣｌ溶液を用いて中和した。この過程を経ることにより、顆粒球が98％以上になった。成熟していない（Ｍ１）急性骨髄性白血病患者由来の循環白血球芽細胞は、末梢血をフィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）（1.077〜1.0800g ／ml）密度勾配遠心分離にかけることによって単離した。
【０１９０】
抗PSGL-1モノクローナル抗体PL-1およびPL-2、FITC抗CD45ならびに抗CD34 QBEND抗体は、クールター−イムノテック（Coulter-Immunotech）社、（フランス、マルセーユ）から購入した。抗PSGL-1モノクローナル抗体PSL-275はレイ・キャンプハウゼン（Ray Camphausen）博士（ジェネティクス・インスティテュート（Genetics Institute）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）から供与された。抗シアリル酸ルイスXモノクローナル抗体（anti-sialyl Lewis X monoclonal Ab）（CSLEX-1）、抗CD44（クローンL178）および抗CD43抗体は、ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）社（カリフォルニア州サンノゼ）から購入した。抗CD44モノクローナル抗体Hermes-1（ラットIgG2a）は、ヤルカネン（Jalkanen）らによって最初に特性付けが行われた（ヤルカネン（Jalkanen）, S. T.、バーガッツ（Barbatze）, R.F.、ヘロン（Herron）, L. R.およびブッチャー（Butcher）, E. C.、Eur. J. Immunol., 16: 1195-1202(1986)）。ラットモノクローナル抗体抗ヒトCLA（HECA-452）、抗ラットL-セレクチン（HRL-1；リガンドブロック抗体）、抗ヒトP-セレクチン（クローンAK-4）および抗ヒトL-セレクチン（LAM1-3）は、ファーミンジェン（Pharmingen）社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。すべての蛍光色素コンジュゲート二次抗体およびアイソタイプ対照は、ザイムド（Zymed）社（カリフォルニア州サンフランシスコ）から購入した。
【０１９１】
OSGEはアキュレート・ケミカルズ（Accurate Chemicals）社（ニューヨーク州ウェストバリー）から購入し、コレラ菌（Vibrio Cholerae）ノイラミニダーゼおよびN-グリコシダーゼFはロシェ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Roche Molecular Biochemicals）社（インディアナ州インディアナポリス）から購入した。コブラ毒素メタロプロテアーゼであるモカーギン（mocarhgin）（スパーティニ（Spertini）, O.、コーデイ（Cordey）, A. S.、モナイ（Monai）, N.、ギフレ（Giuffre）, L.およびシャピラ（Schapira）, M.、J. Cell Biol., 135(2): 523-531(1996) ；デ・ルカ（De Luca）, M.、ダンロップ（Dunlop）, L. C.、アンドリュース（Andrews）, R. K.、フラネリー（Flannery）, J. V.、エトリング（Ettling）, R.、カミング（Cumming）, D. A.、ヴェルドマン（Veldman）, G. M.およびバーンド（Berndt）, M. C.、J. Biol. Chem., 270(45): 26734-26737(1995)）は、レイ・キャンプハウゼン（Ray Camphausen）博士（ジェネティクス・インスティテュート（Genetics Institute）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）から供与された。代謝阻害剤であるツニカマイシンおよびその他すべての化学物質はシグマ（ Sigma ）社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【０１９２】
フローサイトメトリー分析  フローサイトメトリー分析は、直接および間接免疫蛍光染色法を用い、ヒトHC上で行った。これらの実験に使用したすべての細胞は、冷PBS／２％のFBSで２回洗浄し、107個／mlとなるようにPBS／１％のFBSに懸濁した。一次抗体である抗CLA、抗CD15、抗CD34、抗CD43、抗CD44、抗CD62L、抗PSGL-1（PSGL-275およびPL-1）は、適切なアイソタイプ適合対照抗体と共に、細胞を添加して氷上で30分間インキュベートした。次に、PBS／２％のFBSで細胞を２回洗浄し、PBS／１％のFBS中に再懸濁し、それぞれに適した蛍光色素コンジュゲート二次抗体（２μｌ）を加えて氷上で30分間インキュベートした。PBS／２％のFBSで細胞を２回洗浄してPBS中に再懸濁し、488nmに調整したアルゴンレーザーを取り付けたFACScan装置（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）社（カリフォルニア州サンノゼ））上でフローサイトメトリーを行った。
【０１９３】
ヒトHC膜タンパク質の放射ラベル、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析  膜タンパク質調製を行う前に、メチオニン不含RPMI-1640培地中、［35S］−イージータグ−L-メチオニン（［35S］−EasyTag(登録商標）−L-Methionine）（150μCi／ml）（ネン（NEN）社、マサチューセッツ州ボストン）を添加し、細胞（１〜２×106個／ml）を８時間インキュベートした。膜タンパク質は、既報に従って調製した。SDS-PAGEおよびウェスタンブロット用には、還元サンプル緩衝液を用いて膜タンパク質または免疫沈降物を希釈し、７％のSDS-PAGEゲル上で分離した。オートラジオグラフィー用には、［35S］でラベルした免疫沈降物を解析したゲルを乾燥させ、コダック・バイオマックスMRフィルム（Kodak Biomax MR film）（フィッシャー・サイエンティフィク（Fisher Scientific）社）に３時間接触させた。ウェスタンブロット用には、解析した膜タンパク質を「セクゥイ−ブロット」  PVDF膜（Sequi-blot PVDF membrene）（バイオラド（ Biorad ）社、カリフォルニア州ハーキュレス）に移し、PBS／１％のツイーン20（Tween 20）／60％のFBSを用いて４℃で２時間かけてブロックした。ラットIgM抗ヒトCLA HECA-452（1.2μg／ml）、ラットIgG抗ヒトCD44  Hermes-1（１μg／ml）または抗ヒトPSGL-1抗体PL-2（１μg／ml）を加えて、ブロットを室温で１時間インキュベートした。ラットIgM、ラットIgGまたはマウスIgGを用いたアイソタイプ対照イムノブロットを平行して行い、非特異反応タンパク質を確認した。PBS／0.1％のツイーン20（Tween 20）でブロットを３回洗浄した後、対応する二次抗体であるAP-コンジュゲートウサギ抗ラットIgM抗体（１：400）、ヤギ抗ラットIgGまたはヤギ抗マウスIgG（１：8000）（ザイムド・ラブズ（Zymed Labs）社、カリフォルニア州サンフランシスコ）を加えてブロットをインキュベートした。次に、AP基質である「ウェスタンブルー」（Western Blue）（プロメガ（Promega）社、ウィスコンシン州マディソン）を添加してブロットを発色させた。
【０１９４】
流体力学的平行プレートフローチャンバー分析
L-セレクチンを介した接着相互作用
一定のずれ応力条件下において平行プレートフローチャンバーを使用し、ヒトHCと白血球上で天然に発現されたL-セレクチン（オーレンス（Awrence）, M. B.、マクインタイア（McIntire）, L. V.およびエスキン（Eskin）, S. G.、Blood 70(5): 1284-1290(1987)）との間に生じるL-セレクチンを介した接着相互作用について調査した。ヒトHC単層上における白血球の繋留およびローリングは、以下のように調製した平行プレートフローチャンバーを用い、ビデオ顕微鏡によって即時可視化した。実験前にHBSSで白血球を２回洗浄し、次に、HBSS／10 mMのHEPES／２mMのCaCl2（H／H／Ca2+）中に107個／mlとなるように懸濁した。負の対照群は、細胞をPMA（H／H／Ca2+中50ng/ml、37℃で１時間）で処理し、細胞表面からのL-セレクチンの解離を誘導することにより、モノクローナル抗体HRL-1（10μg/ml）で前処理してL-セレクチンの結合をブロックすることにより、または、５mMのEDTAを加えてインキュベートし、L-セレクチンの結合に必要なCa2+をキレートさせることにより、調製した。ヒトHC単層（100％コンフルエント）を調製することを目的として、重炭酸ナトリウム／２％のFBS不含RPMI-1640中で２×106個／mlとなるように懸濁したHC（KG1a、HL60、RPMI8402、K562）を５×106個／ウェルとなるように６ウェルプレートに播種し、遠心分離して細胞を層にし、３％のグルタルアルデヒドで固定した。0.2Mのリジン中で反応性のアルデヒド基をブロックし、播種した細胞をH／H／Ca2+中に懸濁させた。L-セレクチンリガンド上のシアル酸残基による結合の依存性を評価することを目的として、コレラ菌（Vibrio Cholerae）ノイラミニダーゼを用いて細胞を前処理した（H/H/Ca2+中、0.1U／ml、37℃で１時間）。シアロムシン（cialomucins）（PSGL-1を含む）およびPSGL-1単独の関与を調べることを目的として、OSGE（H／H／Ca2+中、60μg／ml、37℃１時間）またはモカーギン（10μg／ml、37℃で20分間）による処理を行った。さらに、HCELLはKG1a細胞上に発現され、HCELLのシアリル化N-グリコシル化がL-セレクチンリガンド活性に重要である（サクステイン（Sackstein）およびディミトロフ（Dimitroff）、Blood, 96: 2765-2774(2000)）ことから、最初にコレラ菌（Vibrio Cholerae）ノイラミニダーゼを用いて細胞表面由来のすべてのシアル酸残基を解裂させ（0.1U／ml、37℃で１時間）、次に、N-グリコシル化の代謝阻害剤であるツニカマイシンを添加して細胞をインキュベートし（５％のCO2条件下、15μg／ml、37℃で24時間）、N-グリカン（すなわち、CD44／HCELL上のHECA-452エピトープ）のデ・ノボ（de novo）合成を阻止することにより、KG1a細胞上のHCELLの関与を識別した。ノイラミニダーゼを用いた前処理により、残留していたHCELL活性が細胞表面からすべて除去され、故に、このような処理を行ったことによって、細胞表面上に新規に合成されたHCELLの評価が可能になった。HCサイトスピン（cytospin）調製物は、上述に従って多ウェルプレート内で調製した。細胞単層の上部に平行プレートフローチャンバーを設置し、チャンバー内に白血球を灌流させた。ずれ応力0.5dyne/cm2（この値では接着を起こさない）で白血球を細胞単層に接触させた後、ずれ応力が１〜＞30dyne/cm2となるように流速を調整した。0.2、0.4、0.8、2.2、4.4、8.8、17.6および26.4dyne/cm2 のずれ応力において、倍率を200倍にし、５ヶ所の別異の視野から構成される１個のフレーム内でローリングする白血球の数を計数した。ずれ応力の全範囲について最低３回の実験を行い、結果を平均±標準偏差で表した。
【０１９５】
P-セレクチンを介した接着相互作用  これらの実験においては、上述に従ってグルタルアルデヒド固定HC単層を６ウェルプレートに調製し、指示したように、モカーギン（10μg／ml）を用いて30分間細胞を前処理し、固定前に、重炭酸ナトリウム／２％のFBS不含RPMI1640を用いて徹底的に洗浄した。P-セレクチンを介した接着相互作用を調査することを目的として、５mMのEDTAを添加したフラスコから、P-セレクチンの全長を安定的に発現するコンフルエントCHO細胞（CHO-P）または空のベクター（CHO-Mock）を取り出し、H/H/Ca2+中で十分に洗浄し、平行プレートフローチャンバー内で使用するために、２×106個／mlとなるように再懸濁した。CHO-P細胞上におけるP-セレクチンの発現は、フローサイトメトリー分析によって確認した。５mMのEDTAまたは抗P-セレクチンモノクローナル抗体（10μg／ml、氷上で30分間）を含有する細胞懸濁物を負の対照として用い、カルシウム依存性結合であることを確認した。0.2、0.4、0.8および2.2dyne/cm2 のずれ応力におけるP-セレクチン接着相互作用の評価を開始する前に、細胞をチャンバー内に灌流させ、細胞単層上に落下させた。細胞の繋留およびローリングは、倍率100倍で可視化し、上述に従って計数および分析した。
【０１９６】
スタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイ
L-セレクチンを介して生じるHCELLおよびPSGL-1へのリンパ球の接着  イムノアフィニティー精製した等モルのHCELLまたはPSGL-1（還元HCELL（100kDa）として75μg、ならびに完全に還元されたPSGL-1（140kDa）として１μg）をスライドガラス上に滴下し、乾燥させた。次に、３％のグルタルアルデヒドを用いてこれらのタンパク質スポットを固定し、0.2Mのリジン中で未反応のアルデヒド基をブロックし、試験の準備が整うまで、重炭酸ナトリウム／２％のFBS不含RPMI1640中でスライドガラスを保存した。これらの固定免疫沈殿物上をリンパ球（重炭酸ナトリウム／２％のFBS不含RPMI1640中、107個／ml）で被覆し、軌道振とう器上、４℃、80rpmで30分間インキュベートした。倍率を100倍にし、接眼格子を用いた光学顕微鏡下で接着したリンパ球数を計測した（スライドガラス１枚あたり最低５視野、１回の実験で２枚のスライドガラスを使用し、独立して３回の実験を行った）。データは、結合リンパ球数の平均±標準偏差として表した。同様の方法でKG1a CD34およびL-セレクチン対照免疫沈降物も試験した。シアル酸に対する依存性を確認することを目的として、コレラ菌（Vibrio Cholerae）ノイラミニダーゼ（重炭酸ナトリウム／２％のFBS不含RPMI1640中、0.1U/ml、37度で１時間）を用いてグルタルアルデヒド固定スポットを処理した。さらに、細胞接着がL-セレクチン依存性であることを確認することを目的として、すべてのアッセイに負の対照を設定したが、ここで、そのような負の対照は、PMA（50ng/ml、37℃で30分間）、もしくは機能をブロックする抗体（抗ラットL-セレクチンモノクローナル抗体HRL-1または抗ヒトL-セレクチンモノクローナル抗体LAM1-3；10μg／ml）を用いて処理したリンパ球、または５mMのEDTAを含むリンパ球懸濁物であった。
【０１９７】
ヒトHCへのL-セレクチンを介したリンパ球の接着  ヒトHCの細胞性L-セレクチンリガンド活性を分析するため、KG1a、HL60、RPMI-8402およびK562細胞、ならびにデ・ノボ（de novo）白血球芽細胞のサイトスピン調製物を３％のグルタルアルデヒドで固定し、0.2Mのリジンでブロックし、その上をリンパ球（重炭酸ナトリウム／２％のFBS不含RPMI1640中、107個／ml）で被覆し、軌道振とう器上、４℃、80rpmで30分間インキュベートした。次に、PBSを用いてスライドガラスを注意深く洗浄し、結合しているリンパ球を３％のグルタルアルデヒドで固定した。すべてのアッセイには、上述した負の対照を設定した。データは、独立して行った３回の実験の二枚のサンプルスライド上、倍率を100倍にし、スライドガラス１枚あたり最低５視野から計数した結合リンパ球数の平均値（±標準偏差）として表した。
【０１９８】
B.幅広いずれ応力範囲にわたって、HCELLはL-セレクチンと結合することができる
本研究の最終目的は、幅広いずれ応力範囲において、ヒトHC上のHCELLおよびPSGL-1がずれ応力に依存してL-セレクチン結合活性を支持する能力を評価することであった。これらの各分子のL-セレクチン結合特性については、HCELLおよび／またはPSGL-1を発現するヒトHC（KG1a（HCELL+／PSGL-1＋）、HL60（HCELL-／PSGL-1＋）、RPMI-8402（HCELL-／PSGL-1＋）、K562（HCELL-／PSGL-1-）およびデ・ノボ（de novo）未成熟急性骨髄性白血病（AML  Ｍ１）（HCELL+／PSGL-1＋））を用い、ずれ応力に基づく接着アッセイ法を行うことによって分析した（表２）（オックスレー（Oxley）, S. M.およびサクステイン（Sackstein）, R.、Blood, 84(10): 3299-3306(1994)；サクステイン（Sackstein）, R.、フー（Fu）, L.およびアレン（Allen）, K. L.、Blood, 89: 2773-2781(1997)；サクステイン（Sackstein）およびディミトロフ（Dimitroff）、Blood, 96: 2765-2774(2000)）。
【０１９９】
【表２】
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一定の流体力学的ずれ応力下において平行プレートフローチャンバーを用い、グルタルアルデヒド固定したヒトHC単層上におけるL-セレクチンを介した白血球の繋留およびローリングを観察した。すべての実験に負の対照を設定し、細胞−細胞接着に対する介在について、L-セレクチン単独の関与を確認した。既にに示されているように（ローレンス（Lawrence）, M. B.、カンサス（Kansas）, G. S.、クンケル（Kunkel）, E. J.およびレイ（Ley）, K.、Cell Biol., 136(3): 717-727(1997)；フィンガー（Finger）, E. B.、プーリ（Puri）, K. D.、アロン（Alon）, R.、ローレンス（Lawrence）, M. B.、フォン・アンドリアン（von Andrian）, U. H.およびスプリンガー（Springer）, T. A.、Nature 379(6562): 266-269(1996)）、L-セレクチンを介した接着相互作用には、約0.5dyne/cm2 のずれ応力閾値が必要であった（図１２A）。このレベルのずれ応力に達した後、広範なずれ応力範囲にわたって白血球の繋留およびローリングを計数した。HL60細胞上では、0.4dyne/cm2 から最高10dyne/cm2 のずれ応力範囲においてL-セレクチン依存性のヒトリンパ球およびラットTDLのローリングが観察された（図１２A）。しかしながら、K562細胞上ではリンパ球のローリングは起こらず、また、PSGL-1を高発現するにもかかわらず、RPMI-8402細胞もL-セレクチンリガンド活性を示さなかった（図１２Aおよび表２）。対照的に、KG1a細胞単層上では、26dyne/cm2 以上のずれ応力において、L-セレクチンを介したヒトリンパ球およびラットTDLのローリングが観察されたが、HL60細胞上では、ヒトリンパ球／TDLのローリングは17dyne/cm2 以上になると消失した（図１２A）。さらに、KG1a細胞上でのリンパ球のローリング頻度は、HL60細胞上でL-セレクチンを介したローリングを支持していたずれ応力の全範囲にわたって、HL60細胞上でのそれの５倍以上であった（図１２A）。KG1a細胞上の高L-セレクチンリガンド活性とHL60細胞上の低活性との間の相違についても、同レベルのL-セレクチンを発現するヒト好中球を用い、フローサイトメトリー分析によって観察した。KG1a細胞は、HL60細胞上におけるL-セレクチンを介した好中球のローリングの４倍以上のローリングを支持した（図１２B）。これらのデータから、KG1a細胞は、広範なずれ応力範囲にわたってL-セレクチンを介した白血球の接着を支持する大きな能力を有しており、かつ、リンパ球または好中球上で天然に発現されるL-セレクチンは、ヒトHC上で発現されるHCELLまたはPSGL-1と同等の結合活性を示すことが明らかになった。
【０２００】
KG1a細胞上において、HCELL活性からPSGL-1活性の関与を区別することを目的として、OSGEもしくはモカーギンを用いて細胞を酵素処理する、または、機能ブロック抗体であるPL-1を加えて細胞をインキュベートする操作を行ったが、これらにより、PSGL-1がL-セレクチンに結合できなくなる（スペルティーニ（Spertini）, O.、コーデイ（Cordey）, A.S.、モナイ（Monai）, N.、ギフレ（Guiffre）, L.およびシャピラ（Schapira）, M.、J. Cell Biol., 135(2): 523-531(1996)；ガイヤー（Guyer）, D.A.、ムーア（Moore）, K. L.、ライマン（Lyman）, E. B.、シャメル（Schammel）, C. M. G.、ロゲリ（Rogelj）, S.、マクエヴァー（McEver）, R. P.およびスクラー（Sklar）, L. A.、Blood, 88: 2415-2421(1996)；テュ（Tu）, L.、チェン（Chen）, A.、デラハンティ（Delahunty）, M. D.、ムーア（Moore）, K. L.、ワトソン（Watson）, S. R.、マクエヴァー（McEver）, R. P.およびテダー（Tedder）, T. F.、J. Immunol., 157: 3995-4004(1996)；デ・ルカ（De Luka）, M.、ダンロップ（Dunlop）, L. C.、アンドリュース（Andrews）, R. K.、フラネリー（Flannery）, J. V.、エトリング（Ettling）, R.、カミング（Cumming）, D.A.、ヴェルドマン（Veldman）, G. M.およびバーンド（Berndt）, M. C.、J. Biol. Chem. 270(45): 26734-26737(1995)）。別の方法としては、KG1a細胞上のHCELL活性（該活性は、シアリル化N-グルカン類上で特に発揮される）の関与を識別することを目的として、KG1a細胞およびデ・ノボ（de novo）白血病由来の芽細胞をノイラミニダーゼで前処理し、次に、ツニカマイシン中でインキュベートした。従って、KG1a細胞のL-セレクチンリガンド活性は、OSGEもしくはモカーギンによる酵素処理、ならびにPL-1抗体処理に対して抵抗性であった（表３）。しかしながら、KG1aのL-セレクチンリガンド活性はノイラミニダーゼ処理によって消失し、ツニカマイシン処理後のリガンド活性の再発現は顕著に減少し、一方、DMSO単独で処理した細胞（対照）のリガンド活性はベースラインレベルまで回復した（ｐ＜0.001）（表３）。これらのデータから、N-グリカン依存性のHCELLは、KG1a細胞上におけるL-セレクチン結合の一次媒介物質であることが示された。対照的に、HL60細胞のL-セレクチンリガンド活性は、OSGEで処理することによって完全に消失し（ｐ＜0.001）（表３）、モカーギン処理により（ｐ＜0.001）、および機能をブロックする抗PSGL-1  PL-1モノクローナル抗体で処理することにより（ｐ＜0.002）、著しく阻害された（表３）。OSGE処理およびモカーギン処理の有効性は、CD34およびPSGL-1上の感受性エピトープについてモノクローナル抗体QBEND-10およびモノクローナル抗体PSL-275をそれぞれ用いてフローサイトメトリー分析を行うことによって確認した。興味深いことに、HL60細胞上のL-セレクチンリガンド活性はOSGE処理後に完全に消失したが、PL-1またはモカーギン処理によっては完全に消失しなかったことから、HL60細胞は、その他の非PSGL-1、O-シアロ糖タンパク質L-セレクチンリガンド活性を発現していることが示唆された。これらのデータは、HL60細胞においてOSGE感受性の非PSGL-1  L-セレクチンリガンドの発現を明らかにしたこれまでの研究結果と一致している（ラモス（Ramos）, C.、スミス（Smith）, M. J.、スナップ（Snapp）, K. R.、カンサス（Kansas）, G. S.、スティックニー（Stickney）, G. W.、レイ（Ley）, K.およびローレンス（Lawrence）, M. B.、Blood, 91(3): 1067-1075(1998)）。
【０２０１】
【表３】
0004198990.tif 000004
ヒトHC上に発現されるHCELLおよびPSGL-1のL-セレクチンリガンド活性についてさらに精査を行うことを目的として、ある範囲のrpm下において、グルタルアルデヒドで固定したHC単層に対するL-セレクチンを介したリンパ球の接着に関して、スタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイを行った。KG1a細胞は、＞40〜120rpmの範囲でHCELLリガンド活性を有しており、80rpmで最大活性を示したが、HL60細胞は、80rpmで主にL-セレクチンリガンド活性を示した（図１２C）。さらに、80rpmにおけるKG1a細胞に対するL-セレクチンを介したリンパ球の接着は、HL60細胞に対するそれの10倍であり、K562細胞およびRPMI-8402細胞に対してリンパ球が結合したという事実は認められなかった（図１２C）。HL60細胞上の一次L-セレクチンリガンドはPSGL-1であり、その発現量はKG1a細胞およびHL60細胞で同等であることから、これらのデータからさらに、細胞１個あたりにおけるKG1a  HCELL活性は、広範なずれ応力範囲にわたり、リガンドとして機能する能力が高いことが示唆された。
【０２０２】
PSGL-1の発現レベルはHL60細胞とKG1a細胞とで同等であるが、KG1a細胞上のPSGL-1の機能がHL60細胞上のPSGL-1のそれと同等であるか否かについて試験を行った。P-セレクチンに対するPSGL-1の必須N-末端結合決定因子は、L-セレクチンに対する構造的結合決定因子と重複していることから（スナップ（Snapp）, K. R.、ディン（Ding）, H.、アトキンス（Atkins）, K.、ワーンケ（Warnke）, R.、ルシンスカス（Luscinskas）, F. W.およびカンサス（Kansas）, G. S.、Blood, 91: 154-164(1998)；デ・ルカ（De Luka）, M.、ダンロップ（Dunlop）, L. C.、アンドリュース（Andrews）, R. K.、フラネリー（Flannery）, J. V.、エトリング（Ettling）, R.、カミング（Cumming）, D.A.、ヴェルドマン（Veldman）, G. M.およびバーンド（Berndt）, M. C.、J. Biol. Chem. 270(45): 26734-26737(1995)）、KG1a細胞およびHL60細胞上のP-セレクチン結合能は、PSGL-1のL-セレクチンへの結合効率と相関していると推測された。故に、ヒトP-セレクチンの全長をコードしているｃDNAをトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO-P）を用い、P-セレクチンリガンド活性に関するフローチャンバーアッセイを行った。HL60細胞およびKG1a細胞は、PSGL-1を介したCHO-P細胞のローリングについて同等の支持を示したが、K562細胞およびRPMI-8402細胞は全く活性を有していなかった（図１３A）。KG1a細胞およびHL60細胞上のP-セレクチンリガンド活性は、モカーギン処理後に阻害された（図１３B）。KG1a細胞とHL60細胞との間ではL-セレクチンリガンド活性の支持能に差があることとは異なり、これらのデータからは、細胞膜内に発現される天然のPSGL-1は、これらの細胞系内においては構造的および機能的に類似していることが示唆された。特筆すべきことは、RPMI-8402のPSGL-1は、L-セレクチンリガンドまたはP-セレクチンリガンドとしての機能を有しておらず、このことは、ある種のリンパ球細胞上のPSGL-1は、生物活性リガンドの形成に必要なα１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびコア２β１，６−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの活性を欠いていることにより非機能性であることと一致している（ヴァキーノ（Vachino）, G.、チャン（Chang）, X. -J.、ヴェルドマン（Veldman）, G. M.、クマー（Kumar）, R.、サコ（Sako）, D.、フォウサー（Fouser）, L. A.、バーンド（Burndt）, M. C.およびチャミング（Chumming）, D.A.、J. Biol. Chem., 270(37): 21966-21974(1995)）。
【０２０３】
C．ヒトHC細胞上における好ましいL-セレクチンリガンドはHCELLである
全細胞上のHCELLとPSGL-1との間のL-セレクチンリガンド活性に関する差異は、これらの分子の発現の表面密度および／または膜局在の差異を反映していると考えられる。HCELLおよびPSGL-1の結合能を直接比較することを目的として、KG1a細胞およびHL60細胞ならびにデ・ノボ（de novo）AML（M1）からイムノアフィニティー精製したHCELLまたはPSGL-1を等モル用い、L-セレクチンを介したリンパ球の接着について、従来から行われているずれ応力に基づくスタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイを行った。
【０２０４】
細胞結合実験用のHCELLおよびPSGL-1を単離することを目的として、細胞膜タンパク質調製物からKG1a CD44（Hermes-1ラットIgG）およびPSGL-1（PL-2マウスIgG）をイムノアフィニティー精製した。［35S］で代謝的に放射ラベルしたKG1a細胞の全細胞溶解物から得られたHermes-1およびPL-2免疫沈降物のオートラジオグラフィーにより、Hermes-1およびPL-2がそれぞれの抗原に対して特異性を有することが示され（図１４A）たことから、CD44の100kDa型が主に単離され、さらに、PSGL-1のダイマー（約220kDa）およびモノマー（約140kDa）のイソ型が単離されたことが明らかになった（図１４A）。Hermes-1によって免疫沈降された30kDaの微量混入タンパク質が存在していたが、免疫沈降物を50kDaの分子量カットオフフィルターに通すことによって除去した。スタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイに使用する精製タンパク質のモル等価性を一致させることを目的として、スライドガラス上に滴下したイムノアフィニティー精製材料のオートラジオグラム上において、［35S］−メチオニンでラベルしたCD44およびPSGL-1（それぞれ、50kDaの分子量カットオフフィルターに通した）の吸光度（OD）を比較した。１μgのPSGL-1のODは、0.75μgのCD44のODの２倍であることがわかった。モノマーのPSGL-1（約140kDa）の分子量は、CD44（100kDa）の約1.4倍であり、PSGL-1はCD44の約２倍（13対６）のメチオニン残基を有することから、PSGL-1のシグナルが２倍であることは、0.75μgのCD44と１μgのPSGL-1がそれぞれのタンパク質について等モル量であることを示唆していた。このような等モル量を用いたところ、80rpmにおいては、PSGL-1と比較して、CD44はリンパ球結合を10倍支持し、40〜100rpmにおいては、PSGL-1と比較して、CD44はリンパ球結合を５〜10倍支持した（図１４B）。KG1a細胞から免疫沈降させたCD34およびL-セレクチン（負の分子対照）は、L-セレクチンを介したリンパ球の接着を全く支持しなかった（図１４B）。精製CD44およびPSGL-1の相対的L-セレクチン結合効率を直接比較したこれらのデータは、全細胞分析から得られた結果と同様であった。
【０２０５】
天然のヒト造血細胞においても、HCELLおよびPSGL-1の本質的に異なるL-セレクチンリガンド活性が存在するか否かを調査することを目的として、成熟していないAML（M1）の患者から採取した循環芽細胞上のHCELLおよびPSGL-1のL-セレクチンリガンド活性を調べた。AML（M1）細胞全体の活性について予備的に行ったスタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイにおいては、AML（M1）細胞は、KG1a細胞のL-セレクチンリガンド活性と同程度の活性を示し、CD44およびPSGL-1の発現（フローサイトメトリーで測定）もKG1a細胞のそれと類似していた。これらの細胞から得たCD44およびPSGL-1を免疫沈降させ、スタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイ（80rpm）によってそれらの結合能を調べた。平行して、KG1a細胞およびHL60細胞由来のHCELLおよびPSGL-1のL-セレクチンリガンド活性についても測定し、比較分析用に、N-グリコシダーゼFおよびOSGEを用いた処理を行った。KG1a細胞およびAML（M1）由来のCD44は、KG1a細胞、HL60細胞またはAML（M1）由来のPSGL-1よりもL-セレクチンを介したリンパ球の接着を非常に強く支持した（CD44に結合したリンパ球数の平均は、PSGL-1に結合したそれの３倍以上であった；ｐ＜0.001）（表４）。さらに、HL60細胞由来のCD44、アイソタイプ対照免疫沈降物、CD34およびL-セレクチン免疫沈降物、またはノイラミニダーゼ処理CD44ならびにKG1a細胞由来のPSGL-1免疫沈降物（表４）は、L-セレクチンリガンド活性を全く有していなかった。KG1a細胞由来のCD44をN-グリコシダーゼF処理した場合と同様に、AML（M1）由来のCD44をN-グリコシダーゼF処理した場合のL-セレクチンリガンド活性は著しく（バックグラウンドレベルまで）低下した（表４）。興味深いことに、天然のPSGL-1に対するP-セレクチンを介した結合は、KG1a細胞とHL60細胞との間で同等であったにもかかわらず（図１３Aおよび１３B）、KG1a細胞およびAML（M1）芽細胞から単離したPSGL-1は、HL60細胞由来のPSGL-1よりもL-セレクチンとの結合能が高かった（表４）。スタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイにおけるCD44またはPSGL-1に結合したリンパ球の顕微鏡写真から、KG1a  PSGL-1（図１５G）と比較して、KG1a  CD44およびAML（M1）  CD44（図１５Aおよび１５D）のL-セレクチンリガンド活性の範囲が明らかに異なることが示された；KG1a  PSGL-1を３倍モル過量にしても（図１５H）、CD44（図１４A）のL-セレクチンリガンド活性はPSGL-1のそれよりも大きかった。N-グリコシダーゼF処理（図１５Bおよび１５E）およびOSGE処理（図１５I）により、リンパ球の結合がアイソタイプ対照レベル（図１５C）まで著しく低下したことにより、HCELL上およびPSGL-1上のN-グリカン類およびO-グリカン類の有意味な関与が確認された。
【０２０６】
【表４】
0004198990.tif 000005
PSGL-1のL-セレクチンへの結合能と比較して、HCELLのそれが高いことについての見識を得ることを目的として、CD44上およびPSGL-1上のシアリル−フコシル化構造物（ラットモノクローナル抗体HECA-452で認識される）の発現を調べたところ、発現量はL-セレクチン結合能と相関していた。KG1a膜タンパク質由来のCD44およびPSGL-1の免疫沈降物を等モル量用いて行ったSDS-PAGEおよびHECA-452イムノブロット分析から、CD44はPSGL-1よりもHECA-452反応性が明らかに高いことが示され（図１６）、このことから、HCELLはPSGL-1よりも多数のHECA-452エピトープを有することが示唆され、L-セレクチンに対する高い結合性を説明することができた。
【０２０７】
実施例１１：HCELLおよびPSGL-1のイムノアフィニティー精製
ヒトHCからHCELLおよびPSGL-1を免疫沈降させた。免疫沈降法は既報（ディミトロフ（Dimitroff）, C. J.、リー（Lee）, J. Y.、フールブリッジ（Fuhlbrigge）, R. C.およびサクステイン（Sackstein）, R.、Proc. Natl. Acad. Sci., 97(25): 13841-13846(2000)）に従って行った。概説すると、最初に、ヒトHCの膜タンパク質（ディミトロフ（Dimitroff）, C. J.、リー（Lee）, J. Y.、フールブリッジ（Fuhlbrigge）, R. C.およびサクステイン（Sackstein）, R.、Proc. Natl. Acad. Sci., 97(25): 13841-13846(2000)）を２％のNP-40に溶解し、プロテインG-アガロース（Protein G-Agarose）（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）社）内で予備精製した。次に、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Bradford protein assay）（シグマ（ Sigma ）社）を用いて膜タンパク質を定量した。可溶化し、予備精製した膜タンパク質調製物（［35S］−メチオニンで放射ラベルした膜タンパク質および全細胞溶解物を含む）（ディミトロフ（Dimitroff）, C. J.、リー（Lee）, J. Y.、フールブリッジ（Fuhlbrigge）, R. C.およびサクステイン（Sackstein）, R.、Proc. Natl. Acad. Sci., 97(25): 13841-13846(2000)）に抗PSGL-1抗体であるPL-2もしくは抗CD44モノクローナル抗体であるHermes-1（比率は、タンパク質100μgに対して抗体３μg）を加え、回転振とう機上、４℃で18時間インキュベートした。抗CD34抗体であるQBEND-10、抗L-セレクチン抗体（LAM1-3）またはマウスIgG／ラットIgGアイソタイプ対照を用いて免疫沈降を行い、負の対照とした。抗体−細胞溶解物の混合物をプロテインG-アガロース（Protein G-Agarose）に加え、一定の回転振動をさせながら４℃で１時間インキュベートした。SDS-PAGE／ウェスタンブロット用には、溶解緩衝液／２％のNP-40／１％のSDS／１％のBSAを用いて５回、さらにBSA不含溶解緩衝液を用いて３回免疫沈降物を洗浄し、分析を行うために還元サンプル緩衝液中で煮沸した。接着アッセイにおいてCD44またはPSGL-1の機能を評価するためには、溶解緩衝液／２％のNP-40／１％のSDS／１％のBSAを用いて５回、さらに、NP-40、SDSもしくはBSA不含の溶解緩衝液を用いて３回免疫沈降物を洗浄し、次に、PBS中に懸濁し、５分間煮沸して免疫コンプレックスからCD44またはPSGL-1を解離させた。次に、溶出物を50kDaの分子量カットオフミクロコンR（MicroconR）フィルター（フィッシャー・サイエンティフィク（Fisher Scientific）社）に通した。 ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Bradford protein assay）によってレテンテート（retentate）のタンパク質濃度を測定した。
【０２０８】
平行実験を行ったが、このとき、それぞれの抗体にプロテインG-アガロース（Protein G-Agarose）を加えてインキュベートし、上述したように、PBS中で免疫沈降物を煮沸した。溶出物をSDS-PAGEで分析し、クーマジーブルー（Coomasie blue）で染色することにより、PBS中で煮沸した後も99％以上の抗体がプロテインG-アガロース（Protein G-Agarose）に結合したままであることが明らかになったことから、定量したタンパク質レベルにはほとんど影響していない。さらに、Hermes-1の免疫沈降物中の30kDaの微量混入バンドを除いては、Hermes-1およびPL-2を用いた免疫沈降により、その他の非CD44タンパク質および非PSGL-1タンパク質は単離されなかった（［35S］で代謝的に放射ラベルしたKG1a細胞の細胞全溶解物（７）から得られた免疫沈降物のオートラジオグラムを参照、図１４A）。Hermes-1によって免疫沈降された30kDaの混入タンパク質は、50kDaの分子量カットオフフィルターで除去し、純粋なKG1a  CD44を得た。
【０２０９】
HCELL上のN-グリカン類またはPSGL-1上のO-シアログリカン類の関与を確認することを目的として、既報（ディミトロフ（Dimitroff）, C. J.、リー（Lee）, J. Y.、フールブリッジ（Fuhlbrigge）, R. C.およびサクステイン（Sackstein）, R.、Proc. Natl. Acad. Sci., 97(25): 13841-13846(2000)）に従い、免疫沈降を行う前に、N-グリコシダーゼF（0.8U／ml）またはOSGEを用いて膜調製物を処理した。 スタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイによる分析に使用するため、イムノアフィニティー精製した材料をスライドガラス上に滴下した（0.75〜３μg／スポット）（アッセイの詳細については以下を参照）。免疫沈降させた［35S］−メチオニン放射ラベルCD44およびPSGL-1のオートラジオグラフ分析に使用するため、免疫沈降物をスライドガラス上に滴下して乾燥させ、−80℃においてコダック・バイオマックス−MRフィルム（Kodak BioMax-MR film）を12時間感光させた。ヒューレット・パッカード・スキャンジェット5200C（Hewlett-Packard Scanjet 5200C）スキャナーならびにNIHイメージ（NIH Image）プロセシングおよび分析プログラムを用いて、オートラジオグラムの光学密度分析（吸光度）を行った。
【０２１０】
実施例１２：α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（FucTIVおよびFucTVII）ならびにα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ST3GalIV）のRT-PCR分析
HECA-452の発現は、コアのポリ−N-アセチルラクトサミニル鎖上において重要なシアロフコシル化に応じて定められることから、HECA-452エピトープの発現とL-セレクチン結合活性との間の相対的差異は、促進制御されたα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ST3GalIV）および白血球α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（FucTIVおよびFucTVII）の影響によるものであるか否かを調べたが、ここで、それらの酵素はHECA-452エピトープの生合成に必要である（ササキ（Sasaki）, K.、ワタナベ（Watanabe）, E.、カワシマ（Kawashima）, K.、セキネ（Sekine）, S.、ドヒ（Dohi）, T.、オシマ（Oshima）, M.、ハナイ（Hanai）, N.、ニシ（Nishi）, T.およびハセガワ（Hasegawa）, M.、J. Biol. Chem., 268(30): 22782-22787(1993)；フールブリッジ（Fuhlbrigge）, R. C.、キーファー（Kieffer）, D.、アマーディング（Amerding）, D.およびクッパー（Kupper）, T. S.、Nature, 389: 978-981(1997)；ゾルナー（Zollner）, O.、ヴェストウェーバー（Vestweber）, D. M.、J. Biol. Chem., 271: 33002-33008(1996)；ゲルツ（Goelz）, S.、クマー（Kummer）, R.、ポットヴィン（Potvin）, B.、サンダラム（Sundaram）, S.、ブリッケルメイヤー（Brickelmaier）, M.およびスタンレー（Stanley）, P.、J. Biol. Chem., 269: 1033-1040(1994)）。
【０２１１】
細胞性全RNAは、トリゾールLS反応試薬（Trizol(登録商標） LS reagent）（ギブコ、ライフサイエンシーズ（Gibco, Life Sciences））をメーカーのプロトコールに従って用いることにより抽出し、チタンワンチューブRT-PCRシステム（Titan(登録商標） One Tube RT-PCR System）（ロシェ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Roche Molecular Biochemicals）社）内で使用した。ST3GalIVのセンス５’−ctctccgatatctgttttattttcccatcccagagagagaagaaggag−３’プライマー（配列番号２）およびアンチセンス５’−gattaaggtaccaggtcagaaggacgtgaggttctt−３’プライマー（配列番号３）、ならびに加熱サイクル条件（52℃で45分間逆転写、94℃で２分間を１サイクル、94℃で１分間、57℃で１分間および72℃で２分間を30サイクル、さらに、68℃で７分間を１サイクル）を用いてST3GalLIVの0.96kbのｃDNAフラグメントを増幅した。FucTVIIの0.55kbのｃDNAフラグメント（ジェンバンク（GenBank）、アクセッション番号U08112）を増幅させることを目的として、特異的プライマーであるセンス５’−cccaccgtggcccagtaccgcttct−３’（配列番号４）およびアンチセンス５’−ctgacctctgtgcccagcctcccgt−３’（配列番号５）、ならびに加熱サイクル条件（52℃で45分間逆転写、94℃で２分間を１サイクル、94℃で30秒間、60℃で45秒間および72℃で１分間を30サイクル、さらに、68℃で７分間を１サイクル）を使用した。同一の逆転写および加熱サイクル条件を使用し、センス５’−cgggtgtgccaggctgtacagagg−３’プライマー（配列番号６）およびアンチセンス５’−tcgggaacagttgtgtatgagatt−３’プライマー（配列番号７）から、FucTIVの0.50kbのｃDNAフラグメントを作出した（ジェンバンク（GenBank）、アクセッション番号M58597）。
【０２１２】
KG1a細胞、HL60細胞、K562細胞およびRPMI-8402細胞におけるFucTIVおよびFucTVIIならびにST3GalIVの遺伝子発現に関するRT-PCR分析により、FucTIVの発現はすべての細胞系においてほぼ同程度であったが（図１７Aおよび図１７B）、FucTVIIの発現は、HL60細胞およびKG1a細胞において最も高い（図１７Aにおいて、レーン１がFucIV、レーン２がFucTVII）ことが示された。興味深いことに、ST3GalIV（図１７Bのレーン１）はKG1a細胞において高レベルで発現され、他のすべての細胞系においては非常に低レベルでしか発現されなかったことから、ST3GalIVの固有のレベルが、KG1a  CD44および／またはPSGL-1上の関連するHECA-452反応性構造および重要なL-セレクチン結合決定因子の発現調節を補助していることが示唆された。
【０２１３】
HECA-452の発現は、コアのポリ−N-アセチルラクトサミニル鎖上において重要なシアロフコシル化に応じて定められる。HECA-452エピトープの発現とL-セレクチン結合活性との間の相対的差異は、促進制御されたα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ST3GalIV）および白血球α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（FucTIVおよびFucTVII）の影響によるものであり、ここで、それらの酵素はHECA-452エピトープの生合成に必要であることを調べた。KG1a細胞、HL60細胞、K562細胞およびRPMI-8402細胞におけるFucTIVおよびFucTVIIならびにST3GalIVの遺伝子発現に関するRT-PCR分析により、FucTIVの発現はすべての細胞系においてほぼ同程度であったが（図１７Aおよび図１７B）、FucTVIIの発現は、HL60細胞およびKG1a細胞において最も高い（図１７Aにおいて、レーン１がFucIV、レーン２がFucTVII）ことが示された。興味深いことに、ST3GalIV（図１７Bのレーン１）はKG1a細胞において高レベルで発現され、他のすべての細胞系においては非常に低レベルでしか発現されなかったことから、ST3GalIVの固有のレベルが、KG1a  CD44および／またはPSGL-1上の関連するHECA-452反応性構造および重要なL-セレクチン結合決定因子の発現調節を補助していることが示唆された。
【０２１４】
発明の等価性
本発明の特定の実施態様に関する以上の詳細な記載から、新規な組成物および用途が記載されていることは明らかである。本明細書においては、特定の実施態様について詳細に開示したが、それらは、具体的な説明のために例として行ったものであり、請求項の範ちゅうを制限するためのものではない。発明者らは、特に、請求項に定義されている本発明の方針および範囲を逸脱することなく、本発明について多様な置換、変更または変形を行うことができると考えている。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】多様なヒト造血細胞系においてHECA-452反応性エピトープが発現していることを示すウェスタンブロットの写真である。
【図１Ｂ】グルタルアルデヒドで固定した単層上における造血細胞系細胞の繋留およびローリングを示す棒グラフである。
【図２】単離した新鮮なヒト骨髄内皮細胞上におけるヒト造血細胞のローリングを示す棒グラフである。
【図３Ａ】Ｅ−セレクチンリガンド活性についてブロットローリングアッセイを行った結果を示す棒グラフである。
【図３Ｂ】HECA-452染色についてＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った結果を示すウェスタンブロットの写真である。
【図３Ｃ】KG1a細胞上でPSGL-1が発現していることを示すウェスタンブロットの写真である。
【図３Ｄ】Ｅ−セレクチンリガンド活性に対するＮ−グリコシダーゼ−Ｆの影響を示すブロットローリングアッセイ膜の写真である。
【図４Ａ】抗CD44抗体（Hermes-1）を用いて徹底的に免疫沈降させたHCELLのＥ−セレクチン結合活性を示すブロットローリングアッセイ膜の写真である。
【図４Ｂ】Hermes-1抗体を用いて徹底的に免疫沈降させたHCELLのＥ−セレクチン結合活性を示すブロットローリングアッセイ膜の写真である。
【図５Ａ】Ｅ−セレクチンを介したCHO-E細胞のローリングを示す棒グラフである。
【図５Ｂ】ＣＨＯ−Ｐ細胞のローリングを示す棒グラフである。
【図６Ａ】多様な造血細胞におけるHCELL活性を示したブロットローリングアッセイ膜の写真である。
【図６Ｂ】成人骨髄性白血病（AML）由来の循環性芽細胞におけるHECA-452活性に対してN-グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った場合の影響を示すウェスタンブロットの写真である。
【図６Ｃ】アイソタイプ対照またはHermes-1モノクローナル抗体を用いて免疫沈降させたAML（Ｍ５）膜タンパク質（50μg）、ならびにＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理したHermes-1の免疫沈降物のブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。
【図６Ｄ】AML（M0）、AML（M1）および異型CML（brc/abl）の膜調製物（50μg）から沈降されたCD44、ならびにBM内皮細胞系（BMEC-1、総タンパク質量100μｇ）のHECA-452染色を示す写真である。
【図６Ｅ】BMEC-1におけるCD44の発現を示すウェスタンブロットの写真である。
【図７Ａ】ヒト白血病細胞系K562（レーン１）、RPMI-8402（レーン２）、HL-60（レーン３）、ＫＧ１a（レーン４）、ノイラミニダーゼ処理ＫＧ１a（レーン５）およびOSGE処理ＫＧ１a（レーン６）由来のHECA-452反応性膜タンパク質（30μg／レーン）に関するウェスタンブロットの写真である。
【図７Ｂ】KG1a細胞全体についてノイラミニダーゼ処理を行い、さらにツニカマイシン処理を行った後、該細胞上にHECA-452反応性タンパク質が再発現していることを示すすウェスタンブロットの写真である。
【図７Ｃ】２−［3H］−マンノースを用いて代謝的放射ラベルを行い、６％の還元SDS-PAGE上で解析を行ったKG1a膜タンパク質のオートラジオグラフの写真である。
【図７Ｄ】ブロット膜上におけるL-セレクチン依存性のリンパ球の繋留およびローリングを示す棒グラフである。
【図８】３段階のSDS-PAGE（６〜９％のビス／アクリルアミド）精製過程のうちの第３段階から得られた98kDaのゲルフラグメントに関するHECA-452（0.4μg／ml）または抗CD44 モノクローナル抗体（A3D8もしくはHermes-1（１μg／ml））との反応性を示すウェスタンブロットの写真である。
【図９】L-セレクチンを介したブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。
【図１０】Ａは、KG1a細胞から免疫沈降させたCD44のL-セレクチンリガンド活性について、N-グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った場合のブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。Ｂは、AML（M5）芽細胞から免疫沈降させたCD44 のL-セレクチンリガンド活性についてN-グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った場合のブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。
【図１１Ａ】［35S］SO4を用いて放射ラベルし、胆汁酸処理を行わなかったKG1a細胞および胆汁酸処理を行ったKG1a細胞から免疫沈降されたCD44のオートラジオグラムの写真である。
【図１１Ｂ】胆汁酸処理を行った（＋）KG1a細胞および胆汁酸処理を行わなかった（−）KG1a細胞から免疫沈降されたKG1a  CD44のHECA-452イムノブロットの写真である。
【図１２Ａ】図に示すずれ応力の範囲において、グルタルアルデヒド固定した造血細胞系KG1a、HL60、K562およびRPMI-8402上におけるリンパ球のローリングの結果を示す棒グラフである。
【図１２Ｂ】図に示すずれ応力の範囲において、グルタルアルデヒド固定した造血細胞系ＫＧ１a、HL60、K562およびRPMI-8402上における好中球のローリングの結果を示す棒グラフである。
【図１２Ｃ】図に示す回転数において、KG1a、HL60、K562およびRPMI-8402細胞系がL-セレクチンを介したリンパ球の結合を支持する能力を評価するために行った、ずれ応力に基づくスタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイの結果を示すグラフである。
【図１３Ａ】グルタルアルデヒドで固定した造血細胞の単層上におけるCHO-P細胞またはmock形質転換体細胞のローリングを示す棒グラフである。
【図１３Ｂ】ＫＧ１a細胞およびHL60細胞上におけるCHO-P細胞ローリング相互作用を示すグラフである。
【図１４Ａ】Hermes-1（CD44）およびPL-2（PSGL-1）の免疫沈降物、ならびにHCELLおよびPSGL-1のＬ−セレクチンリガンド活性のオートラジオグラフの写真である。
【図１４Ｂ】免疫沈降したKG1a  CD44（1.5μｇ）およびPSGL-1（３μｇ）についてのスタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイの結果を示すグラフである。
【図１５】スタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイにおいてヒトHC  CD44またはPSGL-1に結合したリンパ球の顕微鏡写真である。
【図１６】KG1a CD44およびPSGL-1上のHECA-452エピトープを示すウェスタンブロットの写真である。
【図１７Ａ】ヒト造血細胞系上におけるグルコシルトランスフェラーゼ類（FucTIV、FucTVIIおよびST3GalIV）の発現を示す写真である。
【図１７Ｂ】ヒト造血細胞系上におけるグルコシルトランスフェラーゼ類（FucTIV、FucTVIIおよびST3GalIV）の発現を示す写真である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【配列表】
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