(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
先駆体ズブチリシンに由来する、天然では見い出せないアミノ酸配列を有するズブチリシン変異体であって、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンのＮ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ、Ｎ７６Ｄ／Ｖ１０４Ｉ、Ｎ７６Ｄ／Ｉ１０７Ｖ、又はＮ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ／Ｓ１０１Ｒに相当するアミノ酸残基の置換を含んで成る変異体であって、前記ズブチリシン変異体が前記先駆体カルボニルヒドロラーゼにおけるバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンと比較した場合、改善された洗浄性能を有することを特徴とする、カルボニルヒドロラーゼ変異体。
【請求項２】
前記バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの
Ｎ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ／Ｓ１０３Ａ、Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０１Ｒ／Ｓ１０３Ａ、Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０１Ｒ／Ｖ１０４Ｉ、Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ、Ｎ７６Ｄ／Ｖ１０４Ｉ／Ｉ１０７Ｖ、Ｎ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ／Ｓ１０１Ｒ／Ｓ１０３Ａ、Ｎ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ／Ｓ１０１Ｒ／Ｖ１０４Ｉ、Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０１Ｒ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ、Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｓ１２８Ｇ、Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｄ１９７Ｅ、Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｓ１０５Ａ、Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｌ１３５Ｉ、Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｌ１２６Ｆ、Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｐ２１０Ｉ、に相当するアミノ酸残基の置換を含む、請求項１のズブチリシン変異体。
【請求項３】
バチルス・ズブチリシンに由来する、請求項１又は２に記載のズブチリシン変異体。
【請求項４】
バチルス・レンタス・ズブチリシンに由来する、請求項３に記載のズブチリシン変異体。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のズブチリシン変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡをコードする発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
関連出願のクロスリファレンス
本願は1993年10月14日に提出され（係属中）、そして引用することで全体を本明細書に組入れる米国出願08／137,240号の一部継属出願である。
発明の分野
本発明に新規のカルボニルヒドロラーゼ変異体であって、先駆体カルボニルヒドロラーゼの複数のアミノ酸残基、詳しくはバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ズブチリシンにおける残基＋76、それとの組合せにおける＋99，＋101,＋103,＋104,＋107,＋123,＋27，＋105,＋109,＋126,＋128,＋135,＋156,＋166,＋195,＋197,＋204,＋206,＋210,＋216,＋217,＋218,＋222,＋260,＋265及び／又は＋274より成る群から選ばれる１又は複数の残基に対応又は相当する位置にある複数のアミノ酸残基が別のアミノ酸により置換されているアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変異体に関する。一般に、かかる突然変異体／変異体カルボニルヒドロラーゼは、天然又は組換カルボニルヒドロラーゼをコードする先駆体DNA配列を、先駆体アミノ酸配列の複数の上記のアミノ酸残基置換をコードするように、in vitro修飾することによって得られるものであり、ここでこの置換は単独でも、先駆体アミノ酸配列のその他の置換、挿入もしくは欠失と組合せてもよい。
発明の背景
セリンプロテアーゼはカルボニルヒドロラーゼのサブグループである。これらは幅広い特異性及び生物学的機能を有する多種多様なクラスの酵素を含んで成る。Stroud,R.Sci.Amer.,131：74-88。その機能の多様性にもかかわらず、セリンプロテアーゼの触媒機構は少なくとも２種類の遺伝子的に異なる酵素のファミリーによりアプローチされている：即ち、ズブチリシン及び哺乳動物キモトリプシンに近縁且つ相同性の細菌セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン及びＳ．グレシウス（S.gresius）トリプシン）。これら２ファミリーのセリンプロテアーゼは著しく類似し触媒機構を示す。Kraut,J.（1977）,Ann.Rev.Biochem.46：331-358。更に、一次構造は近縁でないが、これら２種の酵素ファミリーの三次構造は共にセリ、ヒスチジン及びアスパラギン酸より成るアミノ酸の保存性触媒トリアドを寄せ集めている。
ズブチリシンは多種多様なバチルス種及びその他の微生物から大量に分泌されるセリンエンドプロテアーゼ（MW 27,500）である。ズブチリシンのタンパク質配列は少なくとも４種類のバチルス種から決定されている。Markland,F.S.ら（1983）,Honne-Seyler's Z.Physiol.Chem.,364：1537-1540。バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの2.5Å解像度での三次元結晶グラフィー培養も報告されている。Wright,C.S.ら（1969）,Nature,221：235-242；Drenth,J.,ら（1972）Eur.J.Biochem.,26：177-181。これらの研究は、ズブチリシンが哺乳動物セリンプロテアーゼとは遺伝子的に近縁しているが、それは似たような活性部位構造を有することを示唆している。共有結合ペプチドインヒビターを含むズブチリシン（Robertus,J.D.ら（1972）,Biochemistry,11：2439-2449）又は生成複合物（Robertus,J.D.ら（1976）,J.Biol.Chem.,251：1097-1103）のＸ線結晶構造も、ズブチリシンの活性部位及び推定の基質結合性クレフト（裂目）についての情報を提供する。更に、ズブチリシンについての数多くの動力学的及び化学的修飾研究が報告されており（Philipp,M.ら（1983）,Mol.Cell.Biochem.,51：5-32；Svendsen,B.（1976）,Carlsberg Res.Comm.,41：237-291；Markland,F.S.Id）、また少なくとも一人は、ズブチリシンの残基222にあるメチオニンの側鎖を過酸化水素によりメチオニン−スルホキシドに変換すること（Stauffer,D.C.,ら（1965）,J.Biol.Chem.,244：5333-5338）及び残基221にあるセリンの側鎖を化学修飾によりシステインに変換すること（Polgarら（1981）,Biochimica et Biophysica Acta,667：351-354）を報告している。
米国特許第4,760,025号（RE 34,606）は、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンのチロシン−１、アスパラギン酸＋32、アスパラギン＋155、チロシン＋104、メチオニン＋222、グリシン＋166、ヒスチジン＋64、グリシン＋169、フェニルアラニン＋189、セリン＋33、セリン＋221、チロシン＋217、グルタミン酸＋156及びアラニン＋152の位置に対応するズブチリシンアミノ酸残基の修飾を開示している。米国特許第5,182,204号は、有用なズブチリシンの突然変異体又は変異体を形成するための、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンのアミノ酸＋224残基及びその他のズブチリシンの相当位置の修飾を開示しており、これは置換、挿入又は欠失により修飾され、そして米国特許第4,760,025号（RE 34,606）に示されている残基への修飾と組合せることができる。米国特許第5,155,033号はＢ．アミロリケファシエンス・ズブチリシンの＋225に相当する位置に修飾を有する類似の突然変異ズブチリシンを開示する。米国特許第5,185,258号及び5,204,015号は位置＋123及び／又は＋274に修飾を有する突然変異ズブチリシンを開示する。これらの特許の開示内容、同様にズブチリシン内の数多くのアミノ酸残基、例えば特に＋99，＋101,＋103,＋107,＋126,＋128,＋135,＋197及び＋204の残基の修飾を開示する米国出願SN07／898,382号の開示内容を引用することで本明細書に組入れる。これらの特許／出願は全て共有のものである。米国特許第4,914,031号は位置＋76において修飾されたズブチリシンを含む一定のズブチリシン類似体を開示する。この特許の開示内容も引用することで本明細書に組入れる。しかしながら、本明細書に記載の特定の残基及び／又は本願の請求の範囲に係る特定の組合せはこれらの文献の中で特定されていない。
従って、本発明の目的は、カルボニルヒドロラーゼ（好ましくはズブチリシン）変異体であって、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの位置＋76、それとの組合せにおける＋99，＋101,＋103,＋104,＋107,＋123,＋27，＋105,＋109,＋126,＋128,＋135,＋156,＋166,＋195,＋197,＋204,＋206,＋210,＋216,＋217,＋218,＋222,＋260,＋265及び／又は＋274の群から選ばれる１又は数の位置に対応する、先駆体カルボニルヒドロラーゼをコードするDNAにおける複数のアミノ酸残基の置換を含む変異体の提供にある。かかる変異体は一般に、この変異体のアミノ酸配列が由来しているカルボニルヒドロラーゼ先駆体の同種の特性とは異なる少なくとも一種の特性を有する。
更なる目的はかかるカルボニルヒドロラーゼ変異体をコードするDNA配列、及びかかる変異DNA配列を含む発現ベクターの提供にある。
更に、本発明の別の目的は、かかるベクターで形質転換された宿主細胞、並びに細胞内的又は細胞外的にカルボニルヒドロラーゼ変異体を産生するようにかかるDNAを発現できる宿主細胞の提供にある。
上記の文献は単に本件の出願日前のその開示内容を紹介するために提供したものであり、そして本願のいづれの事項も、本発明者が先願に基づく先の発明又は優先権によるかかる開示内容の遡及効の資格を有する許可と考えるべきではない。
本発明の概要
本発明は、非天然カルボニルヒドロラーゼ変異体であって、その変異体のアミノ酸配列が由来している先駆体カルボニルヒドロラーゼのそれとは異なるタンパク質分解活性、安定性、基質特異性、pHプロフィール及び／又は性能特性を有する変異体を含む。この先駆体カルボニルヒドロラーゼは天然カルボニルヒドロラーゼ又は組換ヒドロラーゼであってよい。特に、かかるカルボニルヒドロラーゼ変異体は天然では見い出されないアミノ酸配列を有しており、それは先駆体カルボニルヒドロラーゼの複数のアミノ酸残基の別のアミノ酸による交換に由来する。先駆体酵素の複数のアミノ酸残基は位置＋76、それとの組合せにおける１又は複数の下記の残基＋99，＋101,＋103,＋104,＋107,＋123,＋27，＋105,＋109,＋126,＋128,＋135,＋156,＋166,＋195,＋197,＋204,＋206,＋210,＋216,＋217,＋218,＋222,＋260,＋265及び／又は＋274に対応し、ここで番号位置は、バチルス・アミロリケファシエンス由来の天然ズブチリシン又はバチルス・レンタス（Bacillus lentus）ズブチリシンの如くのその他のカルボニルヒドロラーゼ又はズブチリシンの相当アミノ酸残基に対応する。本発明のカルボニルヒドロラーゼ変異体はアミノ酸残基＋76の交換、それとの組合せにおける１又は複数の異なる修飾を含んで成る。好ましくは、本発明の変異酵素は下記の組合せにおけるアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含んで成る：
76／99；76／101；76／103；76／104；76／107；76／123；76／99／101；76／99／103；76／99／104；76／101／103；76／101／104；76／103／104；76／104／107；76／104／123；76／107／123；76／99／101／103；76／99／101／104；76／99／103／104；76／101／103／104；76／103／104／123；76／104／107／123；76／99／101／103／104；76／99／103／104／123；76／99／101／103／104／123；76／103／104／128；76／103／104／260；76／103／104／265；76／103／104／197；76／103／104／105；76／103／104／135；76／103／104／126；76／103／104／107；76／103／104／210；76／103／104／126／265及び／又は76／103／104／222。最も好ましくは、本発明の変異酵素はＢ．アミロリケファシエンス・ズブチリシンの下記の残基組合せにおけるアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含んで成る：76／99；76／104；76／99／104；76／103／104；76／104／107；76／101／103／104；76／99／101／103／104及び76／101／104。
本発明はまたかかるカルボニルヒドロラーゼ又はズブチリシン変異体をコードする変異DNA配列を含む。これらの変異DNA配列は天然又は組換先駆体酵素をコードする先駆体DNA配列に由来する。この変異DNA配列は、先駆体DNA配列を、バチルス・アミロリケファシエンスの位置76，99，101，103，104，107，123，27，105，109，126，128，135，156，166，195，197，204，206，210，216，217，218，222，260，265及び／もしくは274又は任意のそれらの組合せに対応する、先駆体DNA配列によりコードされる１又は複数の特定のアミノ酸残基の置換をコードするように修飾することにより誘導体される。本明細書で特定するアミノ酸残基はＢ．アミロリケファシエンスに適用できる番号付けに従って特定しているが（これは全てのズブチリシンにおける残基位置を特定するための慣用法となっている）、本発明において有用な好適なる先駆体DNA配列は図６に示すバチルス・レンタスのDNA配列である（Seq ID No.11）。
本発明の変異DNA配列はアミノ酸残基76での挿入又は置換、それとの組合せにおける１又は複数の追加の修飾をコードする。好ましくは、この変異DNA配列は下記の組合せにおけるアミノ酸残基の置換又は挿入をコードする：76／99；76／101；76／103；76／104；76／107；76／123；76／99／101；76／99／103；76／99／104；76／101／103；76／101／104；76／103／104；76／104／107；76／104／123；76／107／123；76／99／101／103；76／99／101／104；76／99／103／104；76／101／103／104；76／103／104／123；76／104／107／123；76／99／101／103／104；76／99／103／104／123；76／99／101／103／104／123；76／103／104／128；76／103／104／260；76／103／104／265；76／103／104／197；76／103／104／105；76／103／104／135；76／103／104／126；76／103／104／107；76／103／104／210；76／103／104／126／265及び／又は76／103／104／222。最も好ましくは、この変異DNA配列は下記の残基の組合せの修飾をコードする：76／99；76／104；76／99／104；76／103／104；76／104／107；76／101／103／104；76／99／101／103／104及び76／101／104。これらの組換DNA配列は、新規のアミノ酸配列を有し、且つ先駆体カルボニルヒドロラーゼDNA配列によりコードされる酵素の同種の特性とは実質的に異なる少なくとも一種の特性を一般に有するカルボニルヒドロラーゼ変異体をコードする。かかる特性にはタンパク質分解活性、基質特異性、安定性、改変pHプロフィール及び／又は向上した性能特性が含まれる。
本発明は表示のアミノ酸残基の位置にある19個の天然Ｌ−アミノ酸のいづれかの置換を包括する。かかる置換は先駆体ズブチリシン（原核系、真核系、哺乳動物、等）において施してよい。好ましくは、特定する各アミノ酸残基の位置で施す置換には、限定することなく、以下が含まれる：
位置76でのＤ，Ｈ，Ｅ，Ｇ，Ｆ，Ｋ，Ｐ及びＮを含む置換；
位置99でのＤ，Ｔ，Ｎ，Ｑ，Ｇ及びＳを含む置換；
位置101でのＧ，Ｄ，Ｋ，Ｌ，Ａ，Ｅ，Ｓ及びＲを含む置換；
位置103でのＱ，Ｔ，Ｄ，Ｅ，Ｙ，Ｋ，Ｇ，Ｒ，Ｓ及びＡを含む置換；
位置104での19個全ての天然アミノ酸を含む置換；
位置107でのＶ，Ｌ，Ｍ，Ｙ，Ｇ，Ｅ，Ｆ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｎ及びＩを含む置換；
位置123でのＮ，Ｔ，Ｉ，Ｇ，Ａ，Ｃ及びＳを含む置換；
位置27でのＫ，Ｎ，Ｃ，Ｖ及びＴを含む置換；
位置105でのＡ，Ｄ，Ｇ，Ｒ及びＮを含む置換；
位置107でのＡ，Ｌ，Ｖ，Ｙ，Ｇ，Ｆ，Ｔ，Ｓ及びＡを含む置換；
位置109でのＳ，Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｎ及びＤを含む置換；
位置126でのＡ，Ｆ，Ｉ，Ｖ及びＧを含む置換；
位置128でのＧ，Ｌ及びＡを含む置換；
位置135でのＡ，Ｆ，Ｉ，Ｓ及びＶを含む置換；
位置156でのＤ，Ｅ，Ａ，Ｇ，Ｑ及びＫを含む置換；
位置166での19個全ての天然アミノ酸を含む置換；
位置195でのＥを含む置換；
位置197でのＥを含む置換；
位置204でのＡ，Ｇ，Ｃ，Ｓ，及びＤを含む置換；
位置206でのＬ，Ｙ，Ｎ，Ｄ及びＥを含む置換；
位置210でのＬ，Ｉ，Ｓ，Ｃ及びＦを含む置換；
位置216でのＶ，Ｅ，Ｔ及びＫを含む置換；
位置217での19個全ての天然アミノ酸を含む置換；
位置218でのＳ，Ａ，Ｇ，Ｔ及びＶを含む置換；
位置222での19個全ての天然アミノ酸を含む置換；
位置260でのＰ，Ｎ，Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｃ，Ｋ及びＤを含む置換；
位置265でのＮ，Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｃ，Ｋ，Ｙ及びＨを含む置換；並びに
位置274でのＡ及びＳを含む置換。
かかる各位置において置換すべき特に好適なアミノ酸を以下の表Ｉに示す。特定のアミノ酸は表Ｉに示しているが、特定した残基において任意のアミノ酸が置換されうることが理解されるであろう。
0004086207.tif 000002
更に、本発明はかかる変異カルボニルヒドロラーゼDNA配列を含む発現ベクター、及びかかる変異体を産生できるかかるベクターで形質転換された宿主細胞を含む。本発明はまた本発明のカルボニルヒドロラーゼ変異体を含んで成る洗剤に関する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ〜Ｃはバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンについてのDNA及びアミノ酸配列、並びにこの遺伝子の部分的制限地図を示す（Seq ID No.６）。
図２はバチルス・アミロリケファシエンス（BPN）′及びバチルス・レンタス（野生）由来のズブチリシンの中の保存アミノ酸配列を示す。
図３Ａ及び３Ｂは４種のズブチリシンのアミノ酸配列を示す。第１列はバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシン由来のズブチリシン（時折りズブチリシンBPN′とも呼ぶ）のアミノ酸配列を示す（Seq ID No.７）。第２列はバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来のズブチリシンのアミノ酸配列を示す（Seq ID No.８）。第３列はＢ．リシェニホルミス（B.licheniformis）由来のズブチリシンのアミノ酸配列を示す（Seq ID No.９）。第４列はバチルス・レンタス由来のズブチリシン（PCT WO 89／06276においてズブチリシン309とも呼ばれている）のアミノ酸配列を示す（Seq ID No.10）。記号★はズブチリシンBPN′と対比させた特定のアミノ酸残基の欠落を示す。
図４はプラスミドGGA274の構築を示す。
図５はGGT274の構築を示し、これは本用途において用いる一定の発現プラスミドの中間体である。
図６Ａ及び６Ｂはバチルス・レンタス由来のズブチリシンのDNA及びアミノ酸配列を示す（Seq ID No.11）。成熟ズブチリシンタンパク質はAlaに相当するコドンCGC（334−336）で始まるコドンによりコードされる。
図７Ａ及び７Ｂは本発明の好適な態様のDNA及びアミノ酸配列を示す（N76D／S103A／V104I）（Seq ID No.12）。この図の中のDNAは位置76においてアスパラギン酸、位置103においてアラニン及び位置104においてイソロイシンをコードするように記載の方法により修飾されている。この成熟ズブチリシン変異タンパク質はAlaに相当するコドンGCG（334−336）で始まるコドンによりコードされる。
図８はベクターpBCDAICATの構築を示す。
図９はベクターpUCCATFNAの構築を示す。
図10は液体洗剤の中での、野生型と比較した好適な突然変異酵素の安定性を示す。
発明の詳細な説明
バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの＋76に相当するＢ．レンタス・ズブチリシンにおけるアミノ酸残基のin vitro突然変異は、先駆体ズブチリシンに勝る改変された安定性（例えば改良された自己タンパク質分解安定性）を示すズブチリシン変異体をもたらすことが発見された（表IV及びVI参照のこと）。
また、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンにおける＋99，＋101,＋103,＋104,＋107,＋123,＋27，＋105,＋109,＋126,＋128,＋135,＋156,＋166,＋195,＋197,＋204,＋206,＋210,＋216,＋217,＋218,＋222,＋260,＋265及び／又は＋274に相当する残基でのin vitro突然変異は、単独で、又は互いとの組合せで、且つ＋76突然変異との組合せにおいて、改変されたタンパク質分解活性、改変された熱安定性、改変されたpHプロフィール、改変された基質特異性及び／又は改変された性能特性を示すズブチリシン変異体をもたらすことが発見された。
カルボニルヒドロラーゼは
0004086207.tif 000003
結合を含む化合物を加水分解する（ここでＸは酸素又は窒素である）。これらには天然のカルボニルヒドロラーゼ及び組換カルボニルヒドロラーゼが含まれる。天然カルボニルヒドロラーゼは主としてヒドロラーゼ、例えばペプチドヒドロラーゼ、例えばズブチリシン又はメタロプロテアーゼを含む。ペプチドヒドロラーゼにはα−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシルプロテイナーゼ及びメタロプロテイナーゼが含まれる。セリン、メタロ、チオール及び酸性プロテアーゼ、並びにエンド及びエキソ−プロテアーゼも含まれる。
「組換カルボニルヒドロラーゼ」とは、天然カルボニルヒドロラーゼをコードするDNA配列が、カルボニルヒドロラーゼアミノ酸配列の中の１又は複数のアミノ酸の置換、挿入又は欠失をコードする突然DNA配列となるように修飾されている場合におけるカルボニルヒドロラーゼを意味する。適当な修飾法は、本明細書、並びに引用することで本明細書に組入れる米国特許第4,760,025号（RE 34,606）、米国特許第5,204,015号及び米国特許第5,185,258号に開示されている。
ズブチリシンはタンパク質又はペプチドのペプチド結合を解裂するように一般的に働く細菌又は菌類カルボニルヒドロラーゼである。天然ズブチリシンのシリーズが産生されることで知られ、そして往々にして様々な微生物種により分泌される。このシリーズの構成員のアミノ酸配列は全体が相同性であるわけではない。しかしながら、このシリーズのズブチリシンは同一又は類似のタンパク質分解活性を示す。このクラスのセリンプロテアーゼは触媒トリアドを規定する共通のアミノ酸配列を共有しており、このトリアドはそれらをキモトリプシン近縁のセリンプロテアーゼクラスと差別化する。ズブチリシン及びキモトリプシン近縁セリンプロテアーゼは共にアスパラギン酸、ヒスチジン及びセリンを含んで成る触媒トリアドを有する。ズブチリシン近縁プロテアーゼにおいては、これらのアミノ酸の相対順序は、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、アスパラギン酸−ヒスチジン−セリンである。ところが、キモトリプシン近縁プロテアーゼにおいては、相対順序は、ヒスチジン−アスパラギン酸−セリンである。即ち、本明細書におけるズブチリシンはズブチリシン近縁プロテアーゼの触媒トリアドを有するセリンプロテアーゼを意味する。その例には、限定することなく、本願の図３の中に特定しているズブチリシンが含まれる。
「組換ズブチリシン」とは、ズブチリシンをコードするDNA配列が、天然ズブチリシンアミノ酸配列の中の１又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入をコードする変異（又は突然変異）DNA配列となるように修飾されている場合におけるズブチリシンを意味する。かかる修飾を施す適当な方法及び本明細書に開示の方法と組合せることのできる方法には、米国特許第4,760,025号（RE 34,606）、米国特許第5,204,015号及び米国特許第5,185,258号に開示されているものが含まれる。
「非ヒトカルボニルヒドロラーゼ」及びそれをコードするDNAは数多くの原核及び真核生物から獲得できうる。原核生物の適当な例には、グラム陰性生物、例えばＥ．コリ（E.coli）又はシュードモナス（Pseudomonas）及びグラム陽性菌、例えばマイクロコッカス（Micrococcus）又はバチルスが含まれる。カルボニルヒドロラーゼ及びその遺伝子が獲得できうる真核生物の例には、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、菌類、例えばアスペルギルス種、及び非ヒト哺乳動物起源、例えばウシが含まれ、それからはカルボニルヒドロラーゼキモシンをコードする遺伝子が獲得できる。ズブチリシンと同様に、カルボニルヒドロラーゼのシリーズが様々な近縁種から獲得でき、これはそのシリーズの構成員間では全体が相同性でないが、にもかかわらず、同一又は類似のタイプの生物活性を示すアミノ酸配列を有する。即ち、ここで利用する非ヒトカルボニルヒドロラーゼとは、原核及び真核起源と直接又は間接的に結びつけられたカルボニルヒドロラーゼを意味する機能的な定義を有している。
「カルボニルヒドロラーゼ変異体」は先駆体カルボニルヒドロラーゼ」のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する。先駆体カルボニルヒドロラーゼ（例えばズブチリシン）には天然カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）及び組換カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）が含まれる。カルボニルヒドロラーゼ変異体のアミノ酸配列は、先駆体ヒドロラーゼアミノ酸配列から、この先駆体アミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入によって、「誘導」されている。かかる修飾は、先駆体カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）酵素を操作するよりも、先駆体カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）のアミノ酸配列をコードする「先駆体DNA配列」に施す。先駆体DNA配列のかかる操作のために適当な方法には、本明細書開示の方法、並びに当業者に公知の方法が含まれる（例えばEP 0,328,299号、WO 89／06279号、並びに既に引用している米国特許及び出願を参照のこと）。
バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの位置＋76、それとの組合せにおける１又は複数の下記の位置＋99，＋101,＋103,＋104,＋107,＋123,＋27，＋105,＋109,＋126,＋128,＋135,＋156,＋166,＋195,＋197,＋204,＋206,＋210,＋216,＋217,＋218,＋222,＋260,＋265及び／又は＋274に対応する特定の残基を突然変異のためにここで特定する。好ましくはこの修飾残基は下記の組合せにより選ばれる：
76／99；76／101；76／103；76／104；76／107；76／123；76／99／101；76／99／103；76／99／104；76／101／103；76／101／104；76／103／104；76／104／107；76／104／123；76／107／123；76／99／101／103；76／99／101／104；76／99／103／104；76／101／103／104；76／103／104／123；76／104／107／123；76／99／101／103／104；76／99／103／104／123；76／99／101／103／104／123；76／103／104／128；76／103／104／260；76／103／104／265；76／103／104／197；76／103／104／105；76／103／104／135；76／103／104／126；76／103／104／107；76／103／104／210；76／103／104／126／265及び／又は76／103／104／222；そして最も好ましくは76／99；76／104；76／99／104；76／103／104；76／104／107；76／101／103／104；76／99／101／103／104及び76／101／104である。これらのアミノ酸の位置番号は図１に紹介する成熟バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシン配列について認定されたものに関する。しかしながら、本発明のこの特定のズブチリシンの突然変異に限定されず、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの中の特別の特定残基に「相当する」位置にアミノ酸残基を含む先駆体カルボニルヒドロラーゼにまで及ぶ。本発明の好適な態様において、この先駆体ズブチリシンはバチルス・ズブチリシンであり、置換、欠失又は挿入はＢ．レンタスにおける上記に挙げた残基に対応する相当アミノ酸残基において施されている。
先駆体カルボニルヒドロラーゼの残基（アミノ酸）は、以下の場合、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの残基に相当する。バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの特定の残基又はその残基の一部と相同性（即ち、一次又は三次構造のいづれかにおける位置で対応する）又は類似である場合（即ち、結合、反応又は化学相互作用するのに同一又は類似の機能を有する）。
一次構造に対する相同性を樹立するため、先駆体カルボニルヒドロラーゼのアミノ酸配列を、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの一次配列、そして特に配列のわかっているズブチリシンにおいて不変であることで知られる残基のセットと直接対比させる。本明細書の図２はＢ．アミロリケファシエンス・ズブチリシン及びＢ．レンタス・ズブチリシンの間での保存残基を示す。整合性を維持するのに（即ち、任意の欠失及び挿入を介する保存残基の削除を避けるのに）必須の挿入及び欠失を可能にする保存残基の整合の後、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの一次配列の中の特定のアミノ酸に相当する残基を特定する。保存残基の整合はかかる残基を100％保存すべきである。しかしながら、75％より高い、又は50％ほどに低い保存残基の整合性も相当残基を規定するのに適する。触媒トリアドAsp32／His64／Ser221の保存は維持されているべきである。
例えば、図３において、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・スブチリス、バチルス・リシェニホルミス（カールスバーゲンシス）（carlsbergensis）及びバチルス・レンタス由来のズブチリシンのアミノ酸配列を整合させ、アミノ酸配列間の相同性の最大値を得た。これらの配列の対比は、各配列の中に多数の保存残基が含まれていることを示す。これらの保存残基（BPN′及びＢ．レンタス間として）を図２に示す。
従って、これらの保存残基を、本明細書における好適なズブチリシン先駆体酵素であるバチルス・レンタス由来のズブチリシン（1988年７月13日公開のPCT公開No.WO 89／06279号）又は好適なバチルス・レンタス・ズブチリシンに対して高度に相同性であるPB92と称されるズブチリシン（EP 0,328,299号）の如くのその他のカルボニルヒドロラーゼにおけるバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの対応の相当アミノ酸残基を規定するのに用いることができる。これらのズブチリシンの一定のアミノ酸配列を図３Ａ及び３Ｂの中で、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの配列と整合させ、保存残基の最大相同性を得ている。ここでわかる通り、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンと対比して、バチルス・レンタスの配列の中には多くの欠失がある。従って、例えば、その他のズブチリシンにおけるバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの中のVal165に関する相当アミノ酸は、Ｂ．レンタス及びＢ．リシェニホルミスについてのイソロイシンである。
従って、例えば、位置＋76におけるアミノ酸は、Ｂ．アミロリケファシエンス及びＢ．レンタス・ズブチリシンの両方においてアスパラギン酸（Ｎ）である。しかしながら、本発明の好適なズブチリシン変異体において、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの中の＋76に相当するアミノ酸はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている。置換のためのここで特定する一定のアミノ酸残基と、かかる位置それぞれのための最も好適な置換との対比を例示の目的で表IIに示す。
0004086207.tif 000004
相当残基は、三次構造がＸ−線結晶グラフィーにより決定されている先駆体カルボニルヒドロラーゼについての三次構造のレベルにおいて相同性を決定することによっても特定されうる。相当残基とは、先駆体カルボニルヒドロラーゼ及びバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの特定のアミノ酸残基の２個以上の主鎖原子（Ｎ上のＮ、CA上のCA、Ｃ上のＣ及びＯ上のＯ）の原子配位（atomic coordinate）が、整合の後、0.13nm以内、そして好ましくは0.1nm以内であるものとして定義する。整合は、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンについての注目のカルボニルヒドロラーゼの水素以外のタンパク質原子の原子配位の最大重複が得られるように最良のモデルが配向及び配置された後に達成される。最良のモデルは得られる最大の解像度での実験回析データーに関して最低のＲ係数を供する結晶グラフィーモデルである。
0004086207.tif 000005
バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの特定の残基と機能的に類似の相当残基は、先駆体カルボニルヒドロラーゼのアミノ酸であって、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの特定の残基により規定される及びそれに帰する状況でタンパク質の構造、基質結合能又は触媒能を改変、改良又は貢献するようなコンホメーションを帯びることのできうる先駆体カルボニルヒドロラーゼのアミノ酸と規定される。更に、これらは下記に示す程度にまで類似の位置を占めている先駆体カルボニルヒドロラーゼの残基である（それについて、三次構造はＸ線結晶グラフィーにより得られる）：即ち、たとえ一定の残基の主鎖原子が相同な位置の占拠に基づく等価性の基準に合っていなかったとしても、この残基の少なくとも２個の側鎖原子の原子配位はバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの対応の0.13nmの側鎖原子に収まっている。バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの三次構造の配位はEPO公開No.0,251,446号に記載され（米国特許出願SN 08／212,291号に相当；その開示内容は引用することで本明細書に組入れる）、そして三次構造のレベルに基づき相当残基を決定するために上記で概略した通りに利用できる。
置換、挿入又は欠失のために同定された一部の残基は保存残基であり、一方その他はそうではない。保存型でない残基の場合、１又は複数個のアミノ酸の交換は、天然では見い出せるものに相当しないアミノ酸配列を有する変異体を生み出す。保存型残基の場合、かかる交換は天然配列をもたらさないであろう。本発明のカルボニルヒドロラーゼ変異体は成熟形態のカルボニルヒドロラーゼ変異体、並びにかかるヒドロラーゼ変異性のプロ−及びプレプロ−形態を含む。プレプロ−形態が好適な構築体であり、なぜならこれはカルボニルヒドロラーゼ変異体の発現、分泌及び成熟を助長するからである。
「プロ配列」とは、成熟形態のカルボニルヒドロラーゼのＮ−末端部分に結合したアミノ酸配列であって、外れたとき、このカルボニルヒドロラーゼの「成熟」形態の出現をもたらす配列を意味する。多くのタンパク質分解酵素は翻訳プロ酵素生成物のままで見い出され、そして後翻訳プロセシングされないと、この形態で発現される。カルボニルヒドロラーゼ変異体、特にズブチリシン変異体を生成するための好適なプロ配列はバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの推定プロ配列であるが、その他のズブチリシンが利用できうる。実施例１及び２において、バチルス・レンタス（ATCC 21536）由来のズブチリシンからの推定プロ配列を利用した。
「シグナル配列」又は「プレ配列」とは、カルボニルヒドロラーゼのＮ−末端部分又はプロヒドロラーゼのＮ−末端部分に結合したアミノ酸の任意の配列であって、ヒドロラーゼの成熟形態又はプロ形態の分泌に関与しうる配列を意味する。このシグナル配列の定義は機能的な事項であり、天然の条件下でのズブチリシン又はその他のカルボニルヒドロラーゼの分泌の成就に関与する。ズブチリシン遺伝子のＮ−末端部分によりコードされる全てのアミノ酸配列又はその他の分泌性カルボニルヒドロラーゼを含むことを意味している。本発明はここに定義した通りカルボニルヒドロラーゼ変異体の分泌を及ぼすかかる配列を利用する。本実施例において用いた好適なシグナル配列は、バチルス・スブチリス・ズブチリシン由来のシグナル配列の最初の７個のアミノ酸を含んで成り、これはバチルス・レンタス（ATCC 21536）由来のズブチリシンのシグナル配列の残り部と融合している。
カルボニル・ヒドロラーゼ変異体の「プレプロ」形態は、ヒドロラーゼのアミノ末端に作動連結したプロ配列と、プロ配列のアミノ末端に作動連結した「プレ」又は「シグナル」配列とを有する成熟形態のヒドロラーゼより成る。
「発現ベクター」は、適当な宿主の中での前記DNAの発現を及ぼすことのできる適当なコントロール配列に作動連結したDNA配列を含むDNA構築体を意味する。かかるコントロール配列は転写を及ぼすプロモーター、かかる転写をコントロールする任意的なオペレーター配列、適当なmRNAリボソーム結合性部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了をコントロールする配列を含む。適当な宿主に一旦形質転換できたら、このベクターは宿主ゲノムとは独立して複製及び機能することができ、又はある状況においては、ゲノム自体に組込んでよい。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は時折り同義語として用い、なぜならプラスミドが現状最も一般的に用いられているベクター形態であるからである。しかしながら、本発明は、同等の機能を担い、且つ当業界に公知である、又は公知となるその他の形態の発現ベクターを含むことを意図している。
本発明において用いられる「宿主細胞」は一般に原核又は真核系宿主であって、好ましくは米国特許第4,760,025号（RE 34,606）に開示の方法により酵素的に活性なエンドプロテアーゼを分泌できないように操作されている宿主である。ズブチリシンを発現するのに好適な宿主細胞は酵素的に活性な中性プロテアーゼ及びアルカリ性プロテアーゼ（ズブチリシン）を欠くバチルス株BG2036である。株BG2036の構築は米国特許第5,264,366号に詳細されている。ズブチリシンを発現するためのその他の宿主細胞には、バチルス・スブチリス1168（米国特許第4,760,025号（RE 34,606）及び米国特許第5,264,366号にも記載；その開示内容は引用することで本明細書に組入れる）、及び任意の適当なバチルス株、例えばＢ．リシェニホルミス、Ｂ．レンタス等が含まれる。
宿主細胞は組換DNA技術を利用して構築したベクターにより形質転換又はトランスフェクションせしめる。かかる形質転換宿主細胞はカルボニルヒドロラーゼ変異体をコードするベクターを複製できるか、又は所望のカルボニルヒドロラーゼ変異体を発現できる。カルボニルヒドロラーゼ変異体のプレ−又はプレプロ形態をコードするベクターの場合、かかる変異体は、発現されたとき、一般に宿主細胞から宿主細胞用培地へと分泌される。
「作動連結」とは、２つのDNA領域間の関係を述べているとき、単にそれらが互いと機能的に関係し合っていることを意味する。例えば、プレ配列は、それがシグナル配列として機能し、最も可能としてはシグナル配列の切断に関与するタンパク質の成熟形態に関与するとき、ペプチドと作動連結している。プロモーターは、それが配列の転写をコントロールするなら、コード配列に作動連結している。リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能とするように配置されているなら、コード配列に作動連結している。
天然先駆体カルボニルヒドロラーゼをコードする遺伝子は当業者に公知の一般方法に従って得られうる。この方法は一般に、注目のヒドロラーゼの領域をコードする推定配列を有するラベル化プローブを合成し、このヒドロラーゼを発現する生物からゲノムライブラリーを調製し、そしてプローブに対するハイブリダイゼーションによって注目の遺伝子についてライブラリーをスクリーニングにかけることを含んで成る。陽性ハイブリダイズクローンを次にマッピングし、そして配列決定する。実施例において用いたＢ．レンタス遺伝子は米国特許第5,185,258号のExample １に記載され、その開示内容は引用することで本明細書に組入れる。実施例５において用いたBPN′遺伝子はRE 34,606のExample １に記載の通りにしてクローニングした。その開示内容は引用することで本明細書に組入れる。
次にクローニングしたカルボニルヒドロラーゼを宿主細胞を形質転換するのに用いてヒドロラーゼを発現させる。次いでヒドロラーゼ遺伝子を高コピー数プラスミドの中にライゲーションする。このプラスミドはプラスミド複製にとって必須の以下の周知の要素を含むので、宿主の中で複製する：注目の遺伝子に作動連結したプロモーター（これは、宿主により認識、即ち、転写されるなら、遺伝子自体の同族プロモーターとして供給されうる）；外生であるか、又はヒドロラーゼ遺伝子の内生ターミネーター領域により供給される転写終止及びポリアデニル化領域（これは一定の真核宿主細胞中でヒドロラーゼ遺伝子から宿主により転写されたmRNAの安定のために必須である）；及び所望するには、抗生物質含有培地の中での増殖によりプラスミド感染化宿主細胞の連続培養維持を可能とする選択遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子。高コピー数プラスミドは宿主にとっての複製起点も含み、従って染色体の制約を受けることなく細胞質の中に大量のプラスミドを作ることができる。しかしながら、ヒドロラーゼ遺伝子の多数のコピーを宿主ゲノムの中に組み込むことは本発明に属する。これは相同組換に極めて敏感な原核及び真核生物により助長される。
本例において用いる遺伝子は天然のＢ．レンタス遺伝子及び天然のＢ．アミロリケファシエンス遺伝子である。他方、天然又は突然変異先駆体カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）をコードする合成遺伝子を生成してよい。かかる手法において、先駆体ヒドロラーゼ（ズブチリシン）のDNA及び／又はアミノ酸配列を決定する。その後、多数の重複合成一本鎖DNAフラグメントが合成され、それはハイブリダイゼーション及びライゲーションにより、先駆体ヒドロラーゼをコードする合成DNAをもたらす。合成遺伝子の構築の例は米国特許第5,204,015号のExample ３に記載され、その開示内容を引用することで本明細書に組入れる。
天然又は合成先駆体カルボニルヒドロラーゼ遺伝子をクローニングできたら、天然先駆体カルボニルヒドロラーゼの合成ではあり得ないほどに遺伝子の利用性を高めるためにいくつかの修飾を施す。かかる修飾には米国特許第4,760,025号（RE 34,606）及びEPO公開No.0,251,446に開示の組換カルボニルヒドロラーゼの製造、並びに本明細書記載のカルボニルヒドロラーゼ変異体の製造が含まれる。
以下のカセット突然変異誘発法を、本発明のカルボニルヒドロラーゼ変異体の構築及び同定を助長するために用いてよいが、しかしながら部位特異的突然変異誘発を含むその他の方法も利用できうる。第一に、ヒドロラーゼをコードする天然遺伝子を獲得し、そして全体的又は部分的に配列決定する。次いでこの配列を、コード化酵素の中の１又は複数個のアミノ酸の突然変異（欠失、挿入又は置換）を施すことを所望する位置において、スキャンにかける。この位置に隣接する配列を、発現されたならば様々な突然変異をコードするであろうようなオリゴヌクレオチドプールにより、短い遺伝子セグメントの交換用制限部位の存在について評価する。かかる制限部位は好ましくは、遺伝子セグメントの交換を助長するため、ヒドロラーゼ遺伝子内の固有部位である。しかしながら、制限消化により作れる遺伝子フラグメントが適当な順序で再集成できるなら、ヒドロラーゼ遺伝子が過度に豊富でない任意の慣用の制限部位を使用してよい。選定した位置から好都合な距離内（10〜15ヌクレオチド）の位置に制限部位がないなら、かかる部位は、リーディングフレームもコード化アミノ酸も最終構造において変化させてしまわないような状況で遺伝子のヌクレオチドを置換することによって作り上げる。所望の配列に適合するように配列を変えるための遺伝子の突然変異は一般に公知の方法に従うＭ13プライマー伸長によって成し遂げる。適当な隣接領域の位置決め及び必要な変更が２つの好都合な制限部位配列にあることの評価の作業は、遺伝子コードの冗長度、遺伝子の制限酵素地図及び多種多様な制限酵素によりルーチンに行われる。好都合な隣接制限部位が得られたなら、上記の方法は部位を含まない隣接領域との関係においてのみ利用する必要があることに注意すべきである。
天然DNA又は合成DNAをクローニングできたら、突然変異すべき位置に隣接する制限部位を同系制限酵素で消化し、そして複数の末端終結相補性オリゴヌクレオチドカセットを遺伝子にライゲーションさせる。突然変異誘発はこの方法により簡単となり、なぜなら全てのオリゴヌクレオチドが同じ制限部位を有するように合成でき、そして制限酵素を作り上げるのに合成リンカーを必要としないからである。
本明細書で用いるタンパク質分解活性とは、活性酵素mg当りのペプチド結合の加水分解率として定義する。タンパク質分解活性を測定するための数多くの公知の手順がある（K.M.Kalisz,「Microbial Proteinases」Advances in Biochemical Engineering／Biotechnology,A.Fiechter編、1988）。改良タンパク質分解活性に加えて、又はそれに変えて、本発明の変異酵素はその他の改良特性、例えばＫm，Ｋcat，Ｋcat／Ｋm比及び／又は改良基質特異性及び／又は改良pH活性プロフィールを有しうる。これらの酵素は存在するものと期待される特定の基質、例えばペプチドの調製における基質又は加水分解工程、例えば洗濯用途のための基質のために仕立てることができる。
本発明の一の観点おいて、その目的は先駆体カルボニルヒドロラーゼと比べて改変されたタンパク質分解活性を有する変異体カルボニルヒドロラーゼを確保することにあり、なぜならかかる活性を強める（数学的に高くなる）ことは、酵素の利用が標的基質に対して一層有効に作用することを可能にするからである。更に関心がもたれるのは先駆体と比べて改変された安定性及び／又は改変された基質特異性を有する変異酵素である。好ましくは、突然変異すべきカルボニルヒドロラーゼはズブチリシンである。ズブチリシン型カルボニルヒドロラーゼの中で、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンにおける＋76，＋99，＋101,＋103,＋104,＋107,＋123,＋27，＋105,＋109,＋126,＋128,＋135,＋156,＋166,＋195,＋197,＋204,＋206,＋210,＋216,＋217,＋218,＋222,＋260,＋265及び／もしくは＋274又は任意のその組合せに相当する残基においてかかる結果を獲得するのに有用な特定のアミノ酸を実施例の中で紹介する。ある状況においては、低めのタンパク質分解活性が所望されることがあり、例えばカルボニルヒドロラーゼの合成活性（ペプチドの合成のため）を所望する場合、タンパク質分解活性の低下が有用でありうる。ある場合には、かかる合成生成物を破壊してしまうタンパク質分解活性の低下を所望しうる。逆に、ある状況においては、先駆体に比して変異酵素のタンパク質分解活性を強めることが所望されうる。更に、変異体のアルカリ又は熱安定性のいづれかの安定性の増強又は減少（改変）が所望されうる。Ｋcat，Ｋm又はＫcat／Ｋmの増強又は減少は、このような反応速度論パラメーターを決定するのに用いた基質に対して特異的である。
本発明の別の観点において、ズブチリシンにおける＋76に相当する残基、それとの組合せにおけるその他のいくつかの修飾は酵素の総合的な安定性及び／又はタンパク質分解活性を調節するのに重要である。即ち、実施例の中に記載してある通り、バチルス・レンタス・ズブチリシンにおける相当位置＋76にあるアスパラギン（Ｎ）は、好適な態様において、以下のアミノ酸残基
＋99，＋101,＋103,＋104,＋107,＋123,＋27，＋105,＋109,＋126,＋128,＋135,＋156,＋166,＋195,＋197,＋204,＋206,＋210,＋216,＋217,＋218,＋222,＋260,＋265及び／又は＋274の１又は複数個の修飾との組合せにおいて、アスパラギン酸（Ｄ）により置換され、結果としての突然変異酵素の高められた安定性及び／又は高められた活性を生み出すことができる。
本発明の最も好適な態様を実施例に記載した。それらには下記の特定の置換残基の組合せが含まれる：
N76D／S99D；N76D／V104I；N76D／S99D／V104I；N76D／S103A／V104I；N76D／V104I／I107V；N76D／V104Y／I107V及びN76D／S101R／S103A／V104I。更に、実施例に記載してあるのは全て本発明の請求の範囲記載の突然変異の組合せである。これらの置換は好ましくはバチルス・レンタス（組換又は天然型）ズブチリシンの中で施しているが、しかし任意のバチルス・ズブチリシンの中でこの置換を施してよい。
この変異体ズブチリシン及びその他の変異体ズブチリシンにより得られる結果を基礎に、バチルス・アミロリケファシエンスの中の位置＋76，＋99，＋101,＋103,＋104,＋107,＋123,＋27，＋105,＋109,＋126,＋128,＋135,＋156,＋166,＋195,＋197,＋204,＋206,＋210,＋216,＋217,＋218,＋222,＋260,＋265及び／又は＋274に相当するカルボニルヒドロラーゼ（好ましくはズブチリシン）の中の残基は、これらの酵素のタンパク質分解活性、性能及び／又は安定性、並びにかかる変異体酵素の清浄又は洗浄性能に重要であることが明らかである。
本発明の数多くのカルボニルヒドロラーゼ変異体、特にズブチリシンは様々な洗剤に配合せしめるのに有用である。数多くの公知の化合物が、本発明のカルボニルヒドロラーゼ突然変異体を含んで成る組成物において有用な適当な界面活性剤である。これらには非イオン、アニオン、カチオン、アニオン又は双イオン性洗剤が含まれ、Barry J.AndersonのUS 4,404,128号及びJiri FloraらUS 4,261,868号に開示されている。適当な洗剤は米国特許第5,204,015号（先に引用）Example ７に記載のものである。当業者は洗浄組成物として利用できうる様々な製剤に練れ親しんでいる。典型的な洗浄組成物に加えて、本発明のズブチリシン変異体は天然又は野生型ズブチリシンを利用する任意の目的のために利用されうる。即ち、これらの変異体は、例えばバー又は液体石けん用途、食器洗剤、コンタクトレンズ洗浄溶液又は製品、ペプチド加水分解、廃棄処理、繊維用途、タンパク質製造における融合−分解酵素として、等に利用できる。本発明の変異体は洗剤の高められた性能（先駆体と比べ）を含んで成りうる。本明細書で用いる洗剤の高められた性能とは、標準の洗浄サイクルを経た通常の評価による決定に従う、草又は血液の如くの一定の酵素感受性汚染の強められた洗浄力と定義する。
本発明のズブチリシンは約0.01〜約５重量％（好ましくは0.1〜0.5重量％）のレベルで、6.5〜12.0のpHを有する公知の粉末又は液体洗剤の中に配合してよい。このような洗浄用組成物はその他の酵素、例えば公知のプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ又はエンドグリコシダーゼ、並びにビルダー及び安定剤をも含みうる。
慣用の洗浄組成物への本発明のズブチリシンの添加は任意の特別な用途制限をもたらさない。換言すれば、洗剤にとって適当な任意の温度及びpHは、そのpHが上記の範囲内であり、且つそのpHが記載のズブチリシンの変性温度より低いなら、本組成物にとっても適当である。更に、本発明のズブチリシンは洗剤抜きの洗浄組成物に、単独で、又はビルダー及び安定剤と組合せて使用できる。
以下は例示の目的で提供し、本請求の範囲を限定するものと考えるべきではない。
実施例１
Ｂ．スブチリスにおけるGG36遺伝子の発現のための構築
Ｂ．レンタス由来のズブチリシン遺伝子の発現のためのクローニング及び構築は米国特許第5,185,258号に記載と本質的に同じようにして実施した。プラスミドGGA274（本明細書の図４に記載）を図５に示す以下の方法で更に修飾した。GGA274プラスミドの構築中に導入したPstＩ部位を下記に示す配列を有するオリゴヌクレオチドにより、以下に記載のオリゴヌクレオチド依存性突然変異誘発により除去した：
５′−GAAGCTGCAACTCGTTAAA−３′（Seq ID No.１）。下線の「Ａ」残基は制限酵素PstＩの認識配列を排除し、そして位置274の対応のアミノ酸残基アラニンをスレオニンへと変えてしまった。位置274のスレオニンはクローニングされたＢ．レンタス・ズブチリシン遺伝子配列の中にもとからある野生型の残基である。ズブチリシンをコードするDNAセグメントをプラスミドGGA274又はその誘導体（図５に示すGGT274）からEcoRＩ及びBamHＩ消化により切り出した。このDNAフラグメントをバクテリオファージＭ13−ベースベクター、例えばMP19に、突然変異誘発のためにサブクローニング返還した。突然変異誘発の後、EcoRＩ及びHindIII消化、それに続くクローニングを行って、突然変異ズブチリシンタンパク質の発現及び回収のために発現プラスミド、例えばGGA274の中に突然変異ズブチリシン遺伝子を戻した。
実施例２
オリゴヌクレオチド依存性突然変異誘発
オリゴヌクレオチド依存性突然変異誘発はZoller,M.ら（1983）Methods Enzymol.,100；468−500に記載の通りにして実施した。例えば、配列５′GCTGCTCTAGACAATTCG３′（Seq ID No.２）の合成オリゴヌクレオチドを、位置76にあるアミノ酸残基のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）（又はN76D）へと変えるために用いた。下線の「Ｇ」及び「Ｃ」残基は野生型遺伝子配列からの変更を示す。CAは位置＋75のロイシンを保持させ、そしてXbaＩ制限部位酵素のXbaＩ認識部位（TCTAGA）の導入のためにアミノ酸配列を変化させ、一方、GACでの変更は＋76のアスパラギンをアスパラギン酸に変える。
位置99，101，103及び104での突然変異誘発のため、様々なオリゴヌクレオチドを所望の突然変異組合せに依存して利用してよい。例えば、５′GTATTAGGGGCGGACGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT ３′（Seq. ID No.３）のオリゴヌクレオチドは単一のズブチリシン分子の中で同時に以下の変化を施すために用いた：S99D；S101R；S103A及びV104I。同様に配列５′TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGATTG ３′（Seq.ID No.４）及び５′CACGTTGCTAGCTTGAGTTTAG３′（Seq.ID.No ５）のオリゴヌクレオチドをI107V及びN123Sをそれぞれに作るために用いた。ここでも、下線の残基は、アミノ酸配列又は制限酵素認識配列のいづれかの所望の変化を生み出す野生型配列からの変更を示す。
実施例３
ズブチリシン変異体のタンパク質分解活性
実施例２の方法に従い、表IIIに挙げる変異体を作った。これらのズブチリシン変異体それぞれのタンパク質分解活性を表IIIに示す。
P.Bonneauら（1991）J.Am.Chem.Soc.,Vol.113,No.3,p1030記載の方法を利用して合成ペプチド基質スクシニル−L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p−ニトロアニリドの加水分解についての反応速度論パラメーターＫcat，ＫM及びＫcat／ＫMを測定した。簡単には、ズブチリシン変異体ストック溶液の少量のアリコートを、0.1Ｍのトリス−HClバッファーpH8.6の中に溶かした基質を含む１cmのキュベットに加えた。そして25℃に恒温とした。反応進行を410nmでの反応生成物ｐ−ニトロアニリンの吸収をモニターすることにより光学的に追った。反応速度論パラメーターは、各反応の反応速度及び生成物濃度をミカエリス−メンテン式にフィットさせるよう、非線形回帰アルゴリズムを利用して得た。
0004086207.tif 000006
表IIIに挙げる結果は、試験したズブチリシン変異体全てがタンパク質分解活性を保持することを示した。更に、データーの詳細な分析は、バチルス・レンタス・ズブチリシンについてのタンパク質分解活性が、バチルス・アミロリケファシエンスの位置76，99，101，103，104，107及び123に相当するアミノ酸残基での様々な置換の組合せによって有意に変わることを示した。
実施例４
ズブチリシン変異体の熱安定性
実施例２により行った。バチルス・レンタス・ズブチリシン及び本発明の変異体について観察される熱安定性の対比を表IVに示す。50mMのCaCl2を有する又は有さない0.1Ｍのグリシン、0.01％のTween 80 pH10.0中の15μｇ／mlの精製酵素を小さなチューブの中に小分けし、そして10°Ｃで５分、１分かけて10℃から60℃、そして60℃で20分インキュベートした。次いでチューブを氷の上に10分置いた。チューブ由来のアリコートを、25℃に恒温とした0.1Ｍのトリス−HClバッファー、pH 8.6の中に溶解した合成ペプチド基質スクシニル−L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p−ニトロアニリド1.2mMを含む１cmのキュベットに加えることにより酵素活性についてアッセイした。初期の線形反応速度を、経時的に410nmで反応生成物ｐ−ニトロアニリンの吸収をモニターすることにより光学的に追った。データーは加熱前の％活性として表わす。表IVに挙げる結果は、変異体の大多数が、50mMのCaCl2を添加した試験条件においてバチルス・レンタス・ズブチリシンに匹敵する熱安定性を示すことを示した（26のうち24）。50mMのCaCl2を添加していない条件では、大多数の変異体（26のうちの19）はバチルス・レンタス・ズブチリシンよりも有意に安定であった。更に変異体N76D／S99D，N76D／V104I，N76D／S99D／V104I，N76D／S103A／V104I，N76D／V104I／I107V，N76D／V104Y／I107V及びN76D／S101R／S103A／V104Iは、50mMのCaCl2を加えていない試験条件において単一置換変異体N76Dよりも有意に安定であった。
0004086207.tif 000007
実施例５
ファージミドから作った一本鎖DNA鋳型によるオリゴヌクレオチド依存性突然変異誘発
Ａ．Ｂ．レンタス変異体の構築
突然変異プロトコールは実施例２に記載と本質的に同じである。一本鎖DNA鋳型とファージミド法により作った。一本鎖DNA鋳型を作るためのファージミドベクターを構築するため、我々はまずベクターpBCDAICATを構築した。ベクター構築のフローチャートを図８に概略した。まず、pC194プラスミド由来のCAT遺伝子をコードするClaＩ〜ClaＩフラグメント（Horinouchi,S.及びWeisblum,B.,J.Bacteriol.,150:8-15,1982）をpUC19（New England BioLabs,Beverly,MA）のポリリンカー領域のAccＩ部位の中にクローニングしてプラスミドpUCCHLを作り、次いでGG36DAIコードDNAの５′末端由来のEcoRＩ−DraＩ 0.6KBフラグメントをpBSKSプラスミド（Stratagene,Inc.,San Diego,CA）のEcoRＩ及びEcoRＶ部位の中にクローニングしてpBC2SK5を作った。プラスミドpBC2SK5の一つのEcoRＩ部位をEcoRＩ消化により排除し、次いでT4 DNAポリメラーゼにより触媒してフィル・インし、そして再ライゲーションしてEcoRＩ部位をもたないプラスミドpBC2SK-5Rを作った。pBCSK-5Rの中にクローニングしたEcoRＩ−DraＩフラグメントをPstＩ−HindIIIフラグメントとして単離し、そしてpUCCHL（pUC19のポリリンカーの一部）のPstＩ−HindIII部位の中にクローニングしてプラスミドpUCCHL5Rを作った。GG36DAI遺伝子のコード配列をEcoRＩ−BamHＩフラグメントとして切り出し、そしてpUCCHL5RのEcoRＩ−BamHＩ部位にクローニングしてpUCCATを作った。pUCCATの大型EcoRＩ−HindIIIフラグメントをBS2KS+のEcoRＩ及びHindIII部位にクローニングしてプラスミドpBCDAICATを作った。
一本鎖DNAを作るため、pBCDAICATを含むＥ．コリをファージR408（Stratagene,San Diego,CAより入手）で感染せしめ、Russel,M.Kidd,S.及びKelley,M.R.,GENE 45：333-338,1986に記載のプロトコールを行った。一本鎖DNA鋳型が入手できたら、実施例２に記載の通りにして上記の標準突然変異誘発法を実施した。一定の突然変異体の構築を以下に例示の目的で詳細する。
Ｂ．レンタス（GG36）N76D／S103A／V104I／L217Hの構築のため、GG36 N76D／S103A／V104IをコードするEcoRＩ−BamHＩ DNAフラグメントをpUCCATの構築に用い（図８参照）、プラスミドpBCDAICATを作った。上記のプロトコールに従って一本鎖DNA鋳型が出来た後、下記の配列
0004086207.tif 000008
を有する突然変異誘発プライマーをL217Hを作るために用いた。上記のように、下線残基は施したヌクレオチド変更を示し、そしてx ClaＩは現存のClaＩ部位が突然変異誘発の後に排除されたことを示す。突然変異誘発プロトコールを実施例２に記載する。突然変異誘発の後、プラスミドDNAをClaＩ部位の排除についてスクリーニングし、そしてClaＩ部位を失ったクローングをDNA配列分析にかけて、217番目のアミノ酸残基でのＬからＨへの変化の施されたDNA配列を確認した。
Ｂ．BPN′変異体の構築及びＢ．スブチリスにおけるその発現
Ｂ．アミロリケファシエンス（BPN′）N76D／Q103A／Y104I／Y217Lの構築を、２段連続工程であることを除き、同じようにして行った。N76DをまずBPN′Y217Lに導入してBPN′N76D／Y217Lを作り、次いで第二突然変異誘発を行ってBPN′N76D／Y217LをBPN′N76D／Q103A／Y104I／Y217Lへと変換させた。第一突然変異誘発のための一本鎖DNA鋳型を作るため、BPN′Y217LズブチリシンをコードするEcoRＩ−BamHＩフラグメント（Wells,J.ら、PNAS,84,5167,1087に記載のY217Lプラスミド由来）をプラスミドpUCCATFNAを構築するのに用いた（図９参照）。BPN′Y217Lを含むpUCCATFNAプラスミドをpBCFNACATプラスミドを構築するのに用いた（図９）。一本鎖DNAを上記の通りに作った。BPN′N76D／Y217Lを作るため、配列
0004086207.tif 000009
を有するオリゴヌクレオチドプライマーを変化N76Dを作るために利用した。次いで一本鎖DNAをBPN′N76D／Y217Lを含むpBCFNACATプラスミド（N76D突然変異誘発後のpBCFNACATプラスミド）から調製し、そして配列
0004086207.tif 000010
を有する別のオリゴヌクレオチドで突然変異させてBPN′N76D／Q103A／Y104I／Y217Lを得た。クローニング、一本鎖DNAの調製、突然変異誘発及び突然変異体のスクリーニングに関する工程は全て上記の通りに実施した。BPN′遺伝子及びその変異体の発現はプラスミドDNA（種々の変異体BPN遺伝子を含むpBCFNACAT）をRE 34,606に記載のとおりにしてバチルス・スブチリスのプロテアーゼ欠損株の中に直接組込むことによって達成できた。
数多くの変異体を実施例２及び５の教示に従って作った。反応速度論データー及び安定性データーをかかる変異体のために作った。反応速度論データーは実施例３に記載の方法を利用して作製し、そして表Ｖに提供する。安定性データーを本明細書に詳細する。結果を表VIに示す。
熱安定性アッセイ手順
精製酵素を0.1ＭのグリシンpH10.0、0.01％のTween 80に、その酵素をこのバッファーで平衡にした。Sephadex G-25より成るカラムに載せ、そしてその酵素を同じバッファーを用いてカラムから溶出させることによってバッファー交換した。
60℃に恒温となった0.1Ｍのグリシン、0.01％のTween 80、pH10.0を含むチューブに、バッファー交換済み酵素を15μｇ／mlの最終酵素となるように加えた。
様々な時間において60℃のインキュベーション物からアリコートを取り出し、そして酵素活性について、25℃に恒温とした0.1Ｍのトリス−HClバッファー、pH 8.6に溶かした合成ペプチド基質スクシニル−L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p−ニトロアニリド1.2mMを含む１cmキュベットに加えることにより、直ちにアッセイした。初期線形反応速度を経時的に410nmでの反応生成物ｐ−ニトロアニリンの吸収をモニターすることにより光学的に追った。
50％の酵素の失活のために必要な時間の長さである半減期を、60℃でのインキュベーション時間の関数としての反応速度の一次プロットから決定した。
データーは表VIの中に、同一の条件下でバチルス・レンタス・ズブチリシン（GG36）について決定された半減期の％として表わす。
0004086207.tif 000011
0004086207.tif 000012
0004086207.tif 000013
実施例６
洗浄性能試験
先の実施例に記載の変異体の洗浄性能を、EMPA 116（血液／ミルク／カーボンブラック付き綿）布地見本（Test fabrics,Inc.,Middlesex,NJ 07030）からの汚れの除去を測定することにより評価した。
波形縁を有する３×４ 1/2インチに切った６枚のEMPA 116見本を、1000mlの水、15gpgの硬度（Ca++:Mg++::3：1::ｗ：ｗ）、７ｇの洗剤、及び適宜酵素を含むModel 7243 S Terg-O-Tometer（United States Testing Co.,Inc.,Hoboken,NJ）の各ポットに入れた、洗剤ベースはwfk-Testgewebe GmbH,Adlerstrasse 42,Post fach 13 07 62,D-47759 Krefeld,Germany由来のWFKI洗剤とした：
0004086207.tif 000014
このベース洗剤に、以下の添加物を加えた。
0004086207.tif 000015
過ホウ酸ナトリウム−水和物はDegussa Corporation,Ridgefield-Park,NJ 07660より入手した。Sokalan CP5はBASF Corporation,Parsippany,NJ 07054より入手した。Mykon ATC Green（TAED，テトラアセチルエチレンジアミン）はWarwick International,Limited,Mostyn,Holywell,Clwyd CH8 9HE,Englandより入手した。Tinopal AMS GXはCiba-Geigy Corporation,Greensboro,NC 27419より入手した。
６枚のEMPA 116見本を酵素含有洗剤で60℃で30分洗い、そして1000mlの水で５分づつ、２回すすいだ。標準曲線のために酵素を0.05〜１ppmの濃度で加えて、そしてルーチン分析のためには0.25ppmとした。見本を乾かし、そして加圧し、そして見本からの反射率はMinolta Chroma Meter,Model CR-200（Minolta Corporation,Ramsey,NJ 67446）のL★a★b★スケールに基づくＬ値を利用して測定した。性能を、Ｂ．レンタス（GG36）プロテアーゼの性能の％として報告し、そして同程度の汚れ除去性能×100を供するのに必要な量の変異体プロテアーゼによりＢ．レンタス（GG36）の量を除することによって計算した。
0004086207.tif 000016
実施例７
液体洗剤中でのプロテアーゼの安定性
液体洗剤の中で失活に至るプロテアーゼ安定性の比較をバチルス・レンタス・ズブチリシン及びその変異酵素N76D／S103A／V104Iについて、ここに概略の手順に従って行った。この研究のために用いた洗剤はProcter & Gamle Companyより米国で作られたTide Ultra液体洗濯洗剤の市販のボトルのものとした。洗剤の熱処理が、プロテアーゼをin-situで失活させるのに必要とされた。これは96℃で4.5時間の洗剤のインキュベーションにより成し遂げられた。Ｂ．レンタス・ズブチリシン及びN76D／S103A／V104I変異体の20ｇ／ｌの酵素の範囲での濃縮調製品を熱処理したTide Ultraに、室温で、洗剤中で0.3ｇ／ｌの酵素の最終濃度となるように加えた。プロテアーゼの添加した熱処理洗剤を50℃に恒温とした湯浴の中でインキュベートした。インキュベーションチューブから０，24，46，76及び112時間のインターバルでアリコートを取り出し、そし25℃に恒温とした0.1ＭのトリスバッファーpH 8.6に溶かした合成ペプチド基質suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p−ニトロアニリド1.2mMを含む１cmのキュベットに加えることにより、酵素活性についてアッセイした。初期線形反応速度を経時的に410nmでの反応生成物ｐ−ニトロアニリンの吸収をモニターすることにより光学的に追った。図10に示す通り、N76D／S103A／V104I変異体は天然Ｂ．レンタス・酵素よりも失活に対して有意に安定であることが観察された。この２つの酵素の、特定の試験条件下でのTide Ultra洗剤の中での失活についての推定半減期は、Ｂ．レンタ変異体に関しては45時間、そしてN76D／S103A／V104I変異体については125時間であった。
本明細書全体にわたり、様々なアミノ酸についての言及は一般の１文字及び３文字コードによる。かかるコードはDale,J.W.（1989）のMolecular Genetics of Bacteria,John Wiley & Sons,Ltd.,付録Ｂに記載されている。
本発明の好適な態様を上述したきたが、本発明は、本発明の範囲を逸脱することなく、全体的に、様々な変更及び均等物改良を施すことができることを当業者は理解するであろう。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：Graycar,Thomas P
Bott,Richard R
Wilson,Lori J
（ii）発明の名称：ズブチリシン変異体
（iii）配列の数：15
（iv）連絡先：
（Ａ）宛先：Genencor International,Inc
（Ｂ）通り：180 Kimball Way
（Ｃ）市：So.San Francisco
（Ｄ）州：CA
（Ｅ）国：USA
（Ｆ）郵便番号：94080
（ｖ）コンピューター読取フォーム：
（Ａ）媒体タイプ：Floppy disk
（Ｂ）コンピューター：IBM PC compatible
（Ｃ）作動システム：PC-DOS／MS-DOS
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0,Version #1.25
（vi）現出願データー：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：13-OCT-1994
（Ｃ）分類：
（viii）代理人／代理店情報：
（Ａ）名称：Horn,Margaret A.
（Ｂ）登録番号：33,401
（Ｃ）参照番号／事件番号：GC235-2
（ix）通信情報：
（Ａ）電話：（415）742-7536
（Ｂ）ファックス：（415）742-7217
（２）SEQ ID NO：１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：19塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：１
0004086207.tif 000017
（２）SEQ ID NO：２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：18塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：２
0004086207.tif 000018
（２）SEQ ID NO：３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：39塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：３
0004086207.tif 000019
（２）SEQ ID NO：４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：33塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：４
0004086207.tif 000020
（２）SEQ ID NO：５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：22塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：５
0004086207.tif 000021
（２）SEQ ID NO：６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1497塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：６
0004086207.tif 000022
（２）SEQ ID NO：７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：275アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：７
0004086207.tif 000023
（２）SEQ ID NO：８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：275アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：８
0004086207.tif 000024
（２）SEQ ID NO：９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：274アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：９
0004086207.tif 000025
（２）SEQ ID NO：10についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：269アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：10
0004086207.tif 000026
（２）SEQ ID NO：11についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1140塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：11
0004086207.tif 000027
（２）SEQ ID NO：12についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1140塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：12
0004086207.tif 000028
（２）SEQ ID NO：13についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：30塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：13
0004086207.tif 000029
（２）SEQ ID NO：14についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：31塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：14
0004086207.tif 000030
（２）SEQ ID NO：15についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：33塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：15
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｂ−３】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３】
0004086207.tif 000039
【図３Ｂ】
0004086207.tif 000040
【図４】
0004086207.tif 000041
【図５】
0004086207.tif 000042
【図６Ａ】
0004086207.tif 000043
【図６Ｂ】
0004086207.tif 000044
【図６】
0004086207.tif 000045
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７】
0004086207.tif 000049
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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