(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病の措置のための薬品を選別するための方法であって、該方法が、
培養液内のアミロイドβペプチドのポリマー化を、該培養液を有効な量のメリッチン又はリノール酸及びオレイン酸からなる群から選択される非エステル化脂肪酸からなる化合物と接触させることによって増大させるステップと、
前記の薬品が、前記非エステル化脂肪酸によって誘発されるアミロイドβペプチドのポリマー化を抑制するかどうかを判定するために前記の薬品をテストするステップ、
とで構成されるアルツハイマー病の措置のための薬品を選別するための方法。
【請求項２】
非エステル化脂肪酸が１マイクロモルから100マイクロモルの量で見出される請求項１の方法。
【請求項３】
化合物がメリッチンである請求項１の方法。
【請求項４】
メリッチンが0.1マイクロモルから1.0マイクロモルの量で見出される請求項１の方法。
【請求項５】
アルツハイマー病の措置のための薬品を選別するための方法であって、該方法が、
培養液内のタウペプチドのポリマー化を、該培養液を有効な量のメリッチン又はアラキドン酸、パルミトレイン酸、リノール酸、オレイン酸、およびステアリン酸によって構成されるグループから選択される非エステル化脂肪酸からなる化合物と接触させることにより増大させるステップと、
前記の薬品が上記非エステル化脂肪酸によって誘発されたタウペプチドのポリマー化を抑制するかどうかを判定するために前記の薬品をテストするステップ、
とで構成されるアルツハイマー病の措置のための薬品を選別するための方法。
【請求項６】
化合物がアラキドン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸およびステアリン酸から選択される請求項５の方法。
【請求項７】
非エステル化脂肪酸が１マイクロモルから100マイクロモルの量で見出される請求項５の方法。
【請求項８】
化合物がメリッチンである請求項５の方法。
【請求項９】
メリッチンが0.1マイクロモルから1.0マイクロモルの量で見出される請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
連邦政府資金援助に関するコメント
本発明は一部ＮＩＨ援助金ＡＧ09031及びＡＧ06569による資金援助を受けている。従って、連邦政府は本発明に対して一定の権利を有している。
発明の分野
本発明は一般的には神経学および蛋白質化学に関係している。より具体的には、本発明はアルツハイマー病に関連した蛋白質の調節とその利用に関係している。
関連技術の説明
アルツハイマー病は蛋白質代謝の変性によって特徴づけられる脳の不全である。いくつかの研究所で行われた研究から、アルツハイマー病内で細胞内神経原繊維変化において変性蛋白質の沈着の関連が示唆されている。アルツハイマー病の細胞内繊維形成病理は真っ直ぐな、あるいは対になったらせん形状を有するフィラメントの存在で特徴づけられる（Kidd, 1963；Yagishitaら、1981）。これらのフィラメントは体神経原繊維変化（神経原繊維変化）およびジストロフィー性neuropil threadsの両方で蓄積される（Braakら、1986；Kowall及びKoshik, 1987）。神経原繊維変化の形成とジストロフィー性神経炎は空間的に相互関係をもっており（Probstら、1989；Yamaguchiら、1990）、そして両方の病変は重度の痴呆と高度の関連性を有している（McKeeら、1991）。このタイプのフィラメントの取り込みはダウン症候群（Wisniewskiら、1985）、グアマニアン・パーキンソン氏病性痴呆（Hiranoら、1968）、およびその他の疾病状態（Wisniewskiら、1979）においても見られる。進行性の上核麻痺において、神経原繊維変化は主に真っ直ぐで対になっていない形状を有するフィラメントで構成されている（Tellez-Nagel及びWisniewski, 1973；Bugianiら、1979）。ポリマーが付着したニューロンの死は細胞外空間における不溶性不規則形成物の存在によって証明されるが、ポリマー集団が退化を引き起こす程ニューロンの機能を破壊するのか、あるいはそれらが単にすでに神経症プロセスに関与しているニューロン内で優先的に形成されるのかはいまのところ不明である。
真っ直ぐなフィラメント（ＳＦ）および対になったらせん状フィラメント（対になったらせん状フィラメント）は、個々の神経原繊維変化内にそれらが共存していることからも示されるように、同じような条件下で形成される（Perryら、1987）。真っ直ぐなフィラメントは対になったらせん状フィラメントとエピトープを共有していると同時に、ＳＤＳあるいはプロテアーゼ処理に対するそれらの抵抗性を開発する手順で共純度を共有している（Perryら、1987；Crowther, 1991）。加えて、単一のフィラメント内で続いている真っ直ぐで、それから対になったらせん状形状のつながりを有する原繊維の過程的な形態についてのいくつかの報告がある（Wischikら、1985；Perryら、1987；Papasozomenos, 1989, Crowther, 1991）。これら及びその他の知見は真っ直ぐなフィラメントと対になったらせん状フィラメントが集合体の同様のメカニズムによって形成されるのではないかという推測をもたらす（Perryら、1987；Crowther, 1991；Willeら、1992）。
対になったらせん状フィラメントで知られている唯一の構造構成物は（タウの正常の生物学的特性を検査するための；Lee, 1990参照）微小管結合蛋白質タウである。タウ蛋白質の存在は免疫化学手段（Grundke-Iqbalら、1986；Kosikら、1986）、及び対になったらせん状フィラメントから抽出されたペプチド類の配列決定（Wischikら、1988；Kondoら、1988）の両方で実証されている。対になったらせん状フィラメントから抽出されたタウは正常な脳から単離されたタウより多量のホスホリル化残基を含んでおり（Hasegawaら、1992；Ksiezak-Redingら、1992）、これらホスホリル化はポリマー化プロセスにおけると同様しばしば起こされる。
脳から、あるいは脳微小管（ＭＴ）から直接精製されるタウは真っ直ぐなフィラメントあるいは対になったらせん状フィラメントに類似した種々のポリマーを形成することが報告されている。豚の微小管タウを６−８Ｍ尿素で数日間分解すると幅が５〜35nmのポリマーをつくりだし、これらのポリマーは類似の対になったらせん状フィラメントのサブセットを含んでいる（Montejo de Garciniら、1986；Montejo deGarcini及びAvila, 1987）。尿素の効果はグルタミン残基の脱アミノ化あるいはリシン残基のカルバミル化にその原因が求められているが、酵素あるいは化学的手段によってこれら修正物をつくりだしても尿素処理だけの効果は十分には再現されなかった。尿素で処理したタウは0.0〜１Ｍの範囲でＮａＣｌ濃度とは無関係に集合することが報告されている。仔ウシの脳全体から直接精製されたタウを用いて、10nmフィラメントは酵素活性のために最適化された条件の下で架橋酵素、トランスグルタミナーゼの存在下によって形成された（Dudek及びJohnson, 1993）。しかしながら、単量体タウは単離された神経原繊維変化から可溶化されるので（Greenberg及びDavies, 1990；Leeら、1991）、イン・ビボでのタウ・ポリマー化のためにこの酵素が必要であるとは思われない。ポリマー形成もバクテリアで表現されたヒト遺伝子組換えタウを用いて実証されている。タウの微小管結合領域にほぼ相当する消去構成物と類似の酸性条件を用いるふたつのグループは対になったらせん状フィラメントのねじれた形状を有するサブセットを含んだいくつかのポリマー種をつくりだした（willeら、1992；Crowtherら、1992）。全長タウ構成物はこれらの条件下では集合しなかった。しかしながら、より最近、中性pH及び高いイオン強度（1.25Ｍ  ＣＨ3ＣＯ2−Ｋ・）を用いて、全長タウ構成物はフィラメントを形成することが観察され、その一部は対になったらせん状フィラメントに類似していた（Crowtherら、1994）。
タウの真っ直ぐなフィラメントおよび対になったらせん状フィラメントへの集合とホスホリル化あるいはその他の酵素的あるいは化学的措置などの可能な調節ファクターとの間の通常の関係の確立はこれらのポリマーが生理学的に適切な条件の下で形成することを実証できるイン・ビトロ集合システムから利益を受けるであろう。運動的にはゆっくりしたプロセスであるが、イン・ビトロでの形成は基本的に生理学的な条件の下で観察される。
先行技術はラットあるは豚微小管から精製されたタウが真っ直ぐなフィラメントに類似しておりタウの増殖を規制するフィラメントの均一な集団に集合する条件を判定する有効な手段が欠如している点で不十分である。本発明はこの技術分野で長い間存在していたニーズおよび願望を達成する。
発明の要約
本発明のひとつの実施の形態で、そうした措置を必要とする哺乳動物の脳の蛋白質タウの集合を調節するための、該哺乳動物に薬学的に有効な量の脂肪酸開放あるいは放出抑制剤を投与するステップを含む方法が提供される。
本発明の別の実施の形態で、そうした措置を必要とする哺乳動物におけるアルツハイマー・タイプ類澱粉症の発生を抑制する、薬学的に有効な量の脂肪酸開放あるいは放出の少なくともひとつのモジュレータを投与するステップを含む方法を提供し、そのモジュレータは細胞内神経原繊維変化及び細胞外類澱粉質斑点において見られる蛋白質の集合の割合を調節することができることを特徴としている。
本発明によるさらに別の実施の形態において、該蛋白質を滅菌されていない脂肪酸と接触させるステップを含むタウ蛋白質のポリマー化を促進する方法が提供される。
本発明の別の実施の形態においては、類澱粉質ペプチドのポリマー化を促進する、該ペプチドを脂肪酸と接触させるステップを含む方法が提供される。
本発明の他の、そしてさらなる側面、特徴、利点は開示の目的で示される本発明の現時点での好ましい実施例についての以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
上に述べたような本発明の特徴、利点、及び目的、及びこれから明らかになるその他の特徴、利点、及び目的が達成され、さらに詳細に理解できるように、上に要約的に述べた発明のより具体的な説明を添付図面に示すそのいくつかの実施の形態を参照して以下におこなう。これらの図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施の形態を示すものであって、従って、その範囲を限定することは想定されていない。
図１はラットおよびブタのタウ蛋白質のポリマー化を示している。Ｐ14ラット（図１Ａ、図１Ｆ、図１Ｇ）、Ｐ10ラット（図１Ｂ）、成長したラット（図１Ｃ、図１Ｄ）、あるいは成長したブタ（図１Ｅ、図１Ｈ−Ｋ）からの微小管タウを以下に述べる方法でポリマー化し、酢酸アラニルで染色した。分散された製剤に加えて、非フィラメント状（図１Ｂ）及びフィラメント状（図１Ｃ）集団が示されている。タキゾールで安定化した微小管（矢印）をサイズを見るためのいくつかのグリッド上に共沈殿させた。バーは500nm（図１Ａ−１Ｅ）あるいは100nm（図１Ｆ−Ｋ）である。
図２はイン・ビボ及びイン・ビトロで集合したタウ・ポリマーの比較を示している。生成された神経原繊維変化部（図２Ａ及び２Ｂ）とタウ・フィラメント（図２Ｃ）を２％酢酸アラニルで染色した。対になったらせん状フィラメント（図２Ａ）と真っ直ぐなフィラメント（図２Ｂ）の両方の実例を示してある。バーは0.2μmである。
図３はタウを見かけ上均一に生成した状態を示している。Ｐ14ラット（５mg−−Ａ，Ｃ）あるいは成長したラット（10mg−−Ｂ，Ｄ）からの微小管タウを４〜20％ゲル上で分離し、コマッシー・ブルーで染色するか（Ａ，Ｂ）、あるいは68kD神経フィラメント蛋白質に結合するモノクローナル抗体でブロットした（Ｃ，Ｄ）。神経フィラメント蛋白質もコマッシー・ブルーでブロット（40nf−−Ｅ）あるいは染色させた（15mg−−Ｆ）。分子量のマーク（降順で、208，101，71，44，29及び18kDa）を左側に示し、神経フィラメント三重蛋白質を右側に示す。ランクＣ−Ｅは同じブロットから抽出されたものである。
図４はタウ・ポリマーの抗体ラベリングを示している。ブタのタウは一昼夜かけて集合化され、フィラメントはグリッド上に直接沈殿されるか（図４Ａ−Ｄ）、あるいはグリッド上に沈殿される前に37℃の温度で30分間、500mM ＫＣｌ内で培養された（図４Ｅ，４Ｆ）。その後グリッドをタウ・モノクローナル抗体，Ｔau−２で（図４Ａ，４Ｂ，４Ｅ，４Ｆ）か、あるいはコントロール・バッファ（図４Ｃ，４Ｄ）で培養し、その後10nmコロイド状金に接種した二次抗体によって培養した。その後グリッドを酢酸アラニルで染色した。各条件で金ラベリングした２つの例を示す。バーは0.2ミクロンである。
図５はフィラメント長が時間と温度に依存していることを示している。Ｐ14ラット微小管から精製されたタウは22℃の温度で（図５Ａ−Ｅ）10mM ＤＴＴ内で、あるいは37℃の温度で（図５Ｆ−Ｊ）15分間（図５Ａ，５Ｆ）、30分間（図５Ｂ，５Ｇ）、６０分間（図５Ｃ，５Ｈ）、120分間（図５Ｄ，５Ｉ）、あるいは240分間（図５Ｅ，５Ｊ）培養した。試料をＥＭで処理し、代表的な領域を記録した。バーは1.5ミクロン。
図６はフィラメント長が指数関数的な分布を示すことを示している。Ｐ14ラット・タウは22℃（図６Ａ−６Ｅ）、あるいは37℃（図６Ｆ−６Ｊ）の温度で10mM ＤＴＴ内で培養され、時間数（ｔ）は時間で示してある。以下に述べるような方法で得られたフィラメント測定値を用いてヒストグラムを作成した。平均フィラメント長（ｘ）と試料・サイズ（ｎ）も各データの組み合わせに示してある。ビン幅は200nm。
図７はタウ・フィラメントのポリマー化がイオン強度に依存していることを示している。ブタのタウを緩衝液Ａ内で１：１に種々の量のＫＣｌで補強した中性50mM トリス/20mM ＤＴＴ内で希釈した。試料は37℃の温度で24時間培養し、その後さらに500mM ＫＣｌを加えた。ひとつのアリコットをＥＭ処理のためにすぐ取り出し（白丸）、そして37℃の温度で24時間培養した後別のエリコットを取り出した（黒丸）。ランダム・フィールドを数値化して、その後フィラメントを測定して、その長さを合計した。平均合計ポリマー長／フィールド＋/−Ｓ．Ｅ．Ｍを最初のカチオン濃度，ｎ＞10の関数としてプロットした。
図８はタウのポリマー化が還元能力に依存していることを示している。Ｐ14ラット・タウをpH7.2で1.0Ｍ（図８Ａ）、0.1Ｍ（図８Ｂ）、10mM（図８Ｃ）、1.0mM（図８Ｄ）、0.1Ｍ（図８Ｅ）、あるいは0.0mM（図８Ｆ）にbＭＥを加えて一昼夜培養した。試料をＥＭのために処理し、代表的なフィールドを示した。バーは１ミクロン。
図９はフィラメント長が還元能力の関数であることを示している。図９Ａ−Ｅ。ブタ微小管タウは、示されている濃度のＤＴＴを用いて24時間培養された。試料はグリッド上に沈殿させ、10個のランダムに選んだフィールドからのフィラメントをデジタル化し、測定した。ビン幅は300nm。図９は各フィラメント・ポピュレーションの平均長がＤＴＴ濃度の関数としてプロットされることを示している。
図10はタウ集合のアラキドン酸への依存性を示している。図10Ａ：100μg/ml（−2.5μM）で用いられた子供のラットＭＴtの試料が示されたアラキドン酸濃度で補強され、24時間（黒い四角）、66時間（白い四角）、108時間（黒丸）、あるいは214時間（白丸）で集合した。図10Ｂは図10Ａからのデータを示しており、ポリマーのまとまりを時間の関数として再プロットしてある。試料は20μM（黒丸）、40μM（白丸）、あるいは80μM（黒い四角）のアラキドン酸の存在下で培養された。図10Ｃはタウ・ポリマーが成長したラットＭＴt（100mg/ml）（黒丸）、ブタの脳全体から精製されたタウ（200μg/ml）（白丸）、あるいは大腸菌内部で表現された精製ヒト遺伝子組換えタウ（200μg/ml）（黒丸）から集合されることを示している。試料は66時間培養された。種々の方法により精製されたタウの集合の相対的な有効性に関しては、最初の種が異なっているので一般的な結論を下すことはできない。すべての試料（図10Ａ及び図10Ｂ）は2％酢酸ウラニルでネガティブに染色され、ランダム・フィールドの電子顕微鏡写真をデジタル化し、トレースした。示されている値は平均合計ポリマー長／フィールド±Ｓ．Ｅ．Ｍ．，ｎ≧12である。
図11はアラキドン酸が存在している場合、及び不在の場合に形成されるタウ・フィラメントの形状を示している。タウ・ポリマーは成長したラットＭＴt（図11Ａ，11Ｂ）、ブタの脳タウ（図11Ｃ）、あるいはヒト遺伝子組換えタウ（図11Ｄ）を用いて集合された。試料は50μMアラキドン酸が不在の場合（図11Ａ）及び存在している場合（図11Ｂ−Ｄ）の両方の条件で72時間培養された。バー＝100nm。
図12はタウ・ポリマー化に対する種々の脂肪酸の影響を示している。Ｐ11ラット脳微小管から精製されたタウを用いてタウ・ポリマーを上に述べたように集合させ、定量した。試料を50μM脂肪酸の存在下で72時間培養した。一般的に、任意の鎖長さに対して不飽和脂肪酸は飽和脂肪酸よりもっとタウの集合を促した。アラキドン酸、パルミトレイック酸、あるいはリノール酸を用いた場合ポリマー形成が20〜30倍増大することが観察された。集合条件下での代表的な脂肪酸の臨界ミセラー濃度（ＣＭＣ）の測定はミセル化はそれらの刺激性活性を増大も減少のさせないことを示している。ＣＭＣ値は蛍光インジケータフェニルナフチルアミンのフェーズ分割に基づいている（Kovatchevら、（1981），J. Biol. Chem, 256 (20)：10369−10374）。
図13はアラキドン酸存在下でのタウ・ポリマー化の調節を示している。すべての試料は100μg/mlラットＭＴτ及び50μＭアラキドン酸を含んでおり、72時間培養された。ネガティブに染色された試料の電子顕微鏡写真をデジタル化、トレースして、ポリマー含有量を全量（図13Ａ及び図13Ｂ）か、あるいは平均フィラメント長及びフィラメント／フィールドの数として（図13Ｃ）示した。すべての場合に示されている数字は平均＋/−Ｓ．Ｅ．Ｍ．，ｎ＝12である。図13Ａは子供の（白丸）、あるいは成長した（黒丸）の試料を４℃，22℃または37℃で培養した結果を示している（図13Ｂ）。成長したタウは示された濃度のＮａＣｌ（緩衝条件については以下参照）の存在下で集合した。図13Ｃ：成長したタウは示された濃度のＤＴＴの存在下で集合された。ＤＴＴの濃度の増大に伴って見られる平均フィラメント長の増大（白丸）はフィラメント・フィールド数（黒丸）の減少に反映された。
図14は類澱粉質の脂肪酸依存集合を示している。図14Ａ及びＢは遊離脂肪酸の不在化で24時間培養する前（図14Ａ）あるいはその後（図14Ｂ）の類澱粉質ペプチドの溶液内に存在しているフィラメント状団塊を示している。図14Ｃ及び図14Ｄは40mMオレイック酸（図14Ｃ）あるいは50mMリノレイッグ酸（図14Ｄ）によって24時間培養した後の長いフィラメントを示している。すべての試料は４％酢酸ウラニルで染色した後、30ｋの定格強度で撮影した。バー＝275nm。
図15は類澱粉質集合の蛍光分光計分析の結果を示している。類澱粉質ペプチドが示された濃度のオレイック酸（白丸）あるいはリノレイック酸（黒い四角）で24時間培養された。チオフラビンＴとの混合後に得られた蛍光値（単位は任意）を平均±Ｓ．Ｄ．，ｎ＝３として示す。
図16はＡＤ病原の遊離脂肪酸モデルを示している。apoＥがリスク形成因子である場合のＮＰおよびＮＦＴ形成に関与すると考えられる種々の要素間の関係について示してある。共通影響因子モジュールは脂肪酸で、これはＮＰにおいてＣＳＦを調節することによって最初の個所から解剖学的にＮＦＴ形成の離れた個所に移動される場合がある。
図17はSharon Greenberg博士によって提供された対になったらせん状フィラメントがGreenberg及びDaviesの方法で精製され（ＳＤＳ抽出は行われない）、緩衝液Ａ内に再懸濁されたことを示している。Ｐ11ラット微小管タウ（400μg/ml）、ＰＨＦ（250μg/ml），及び緩衝液Ｂ（硼酸食塩水、20mMＤＴＴ）を１：１：２の比率で混合し、50μMアラキドン酸の存在下で37℃の温度で２〜３日培養した。その結果得られるハイブリッド形態はＰＨＦの同じ末端から出ている２つの真っ直ぐなフィラメント（図17Ａ−Ｃ）、あるいはＰＨＦの両方の末端から出ているひとつの真っ直ぐなフィラメント（図17Ｄ）と解釈された。バー＝100nm。
発明の詳細な説明
本発明はそうした措置を必要とする哺乳動物の脳における蛋白質タウの集合を調節する方法において、該哺乳動物に対して薬学的に有効な量の脂肪酸開放あるいは放出の抑制因子を投与するステップを含む方法に関連している。こうした脂肪酸の代表的な例としては図12に示すような脂肪酸がある。これらの薬剤は両方ともレシチン・コレステロール・アシル・トランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の抑制因子である。脳脊髄（ＣＳＦ）内に存在していることに加えて、この酵素は血清にも存在しており、この酵素の抑制に関して現在入手できるデータのほとんどは血清活性のアッセイに基づくものである。しかしながら、ＬＣＡＴ、脂質及びコレステロールの血清濃度はＣＳＦ（100−ＩＯＯＯＸ）で観察されるものよりずっと高いので、血清効果に必要な薬剤濃度はＣＳＦ効果のために必要なものよりずっと高くてもよい。第１の薬剤はプロプラノロールである。その用量は2.5〜250mg/日の範囲であろう。この薬剤はＬＣＡＦを抑制することに加えて類澱粉質フィラメントのリソゾーム内での核化に関与している可能性のあるリソゾーマル・ホスホリパーゼも抑制する。ｄ−プロプラノロール及びＩ−プロプラノロールは多少異なった薬学的特性を持っているが、それらを個別に使いたい場合もあるであろう。第２のタイプの薬品は一般的なクラスのテルペン類に所属しており、メンソール、メンソーン、及び樟脳などを含んでいる。治療的な目的のための用量は0.2〜20mg/kgの範囲であろう。
本発明はそうした措置を必要とする哺乳動物に対して有効な量の少なくともひとつの脂肪酸開放あるいは放出のモジュレータを投与するステップを含んでおり、そのモジュレータが細胞該類澱粉質斑点において見られる蛋白質の集合速度を制御することができることを特徴とするアルツハイマー・タイプの類澱粉症の発生を抑制するための方法にも関連している。こうした脂肪酸開放あるいは放出抑制因子の代表的な例は上に示した通りである。
本発明はまたそうした措置を必要とする患者に対して有効な量の脂肪酸開放あるいは放出の少なくともひとつの、細胞内神経原繊維変化部および細胞該類澱粉質斑点において見られる蛋白質の集合の速度を制御することができるモジュレータを投与するステップを含む哺乳動物のアルツハイマー病に関連した類澱粉症を措置する方法にも関連している。
本発明はまた、蛋白質をエステル化されていない脂肪酸に接触させるステップを含むタウ蛋白質のポリマー化を促進する方法も提供する。代表的な脂肪酸には図12に示されるものなどがあり、アラカドニック酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸およびステアリン酸を含んでいる。この方法はＡＤを有する患者の脳におけるタウ・ポリマー形成およびその他の、部分的にイン・ビボでのタウ・ポリマー形成によって特徴づけられる他の関連した神経劣化性疾患を阻止する化合物の選別にも用いることができる。
本発明はまた、該ペプチドを脂肪酸と接触させるステップを含む類澱粉質ペプチドのポリマー化を促進する方法も提供する。こうした脂肪酸の代表的な例としてはアラカドン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、及びステアリン酸を含んでいる。
本発明はまたタウ・ポリマーを還元剤と接触させるステップを含むタウ・ポリマーのポリマー化を促進する方法を提供する。代表的な還元剤はジチオストレイトル、ジチオエチルスレイトル、２−メルカプトタノール、及び還元されたグルタチオンである。この方法はＡＤ患者又は少なくとも部分的にイン・ビボでのタウ蛋白質形成の増大によって特徴づけられる神経劣化性疾患を有する患者の脳におけるタウ蛋白質形成を防ぐ薬剤を発見するためのスクリーリング・アッセイにおいても用いることができる。
本発明の別の実施の形態においては、そうした措置を必要とする動物の脳における類澱粉質及び／又はタウ蛋白質のポリマー化を減少させるの、その動物の脳脊髄液内にその脳脊髄液内のエステル化されていない脂肪酸を吸収するのに有効な量の化合物を導入するステップを含む方法を提供する。
本発明による方法でこの新しい脂肪酸開放あるいは放出抑制剤を用いて医薬品組成物をつくることが具体的に考えられる。そうした場合、その医薬品組成物はこの新しい脂肪酸開放あるいは放出抑制剤と薬学的に許容される基剤を含むことになる。この分野の当業者であれば、それほどの実験を行わなくても、本発明による新しい脂肪酸開放あるいは放出抑制剤の適切な用量および投与ルートを決めることができるであろう。
該培養体を有効な量の少なくともひとつのエステル化されていない脂肪酸あるいは脂肪酸開放あるいは放出を誘発する化合物と接触させて培養液内のＡβペプチドのポリマー化を増大させるステップと、その薬品がエステル化されていない脂肪酸によって誘発されるＡβペプチドのポリマー化を抑制するかどうかを判定するために薬品をテストするステップとで構成されたアルツハイマー病の措置に役立つための薬品を選別するための方法。有益な脂肪酸の代表的な例としてはアラカドン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、そしてステアリン酸である。好ましくはエステル化されていない脂肪酸は１マイクロモルから100マイクロモル程度の量で見いだされる。脂肪酸開放あるいは放出を誘発する化合物のひとつの代表的な例はメリッチン。好ましくはメリッチンは0.1マイクロモルから1.0マイクロモル程度の量で見いだされる。好ましくは、上記培地は細胞培養あるいは試験管で構成されるグループから選択される。
該培養体を有効な量の少なくともひとつのエステル化されていない脂肪酸あるいは脂肪酸開放あるいは放出を誘発する化合物と接触させて培養液内のＡβペプチドのポリマー化を増大させるステップと、その薬品がエステル化されていない脂肪酸によって誘発されるタウ・ペプチドのポリマー化を抑制するかどうかを判定するために薬品をテストするステップとで構成されたアルツハイマー病の措置に役立つための薬品を選別するための方法。有用な脂肪酸の代表的な例としてはアラカドン酸、パルミトイル酸、オレイン酸、リノール酸そしてステアリン酸である。好ましくは上記エステル化されていない脂肪酸は１マイクロモルから100マイクロモル程度の範囲で見いだされる。脂肪酸開放あるいは放出を誘発する化合物の代表的な例はメリッチンである。好ましくはメリッチンは0.1マイクロモルから1.0マイクロモル程度の量で見いだされる。好ましくは、上記培地は細胞培養あるいは試験管で構成されるグループから選択される。
以下の例は本発明の種々の実施の形態を説明するために示されるものであって、いかなる意味でも本発明を限定することは意図していない。
実施例１
脳の組織
新鮮なウシの脳をJohn Morrel Meat Packing, Montogomery, ALより入手した。新鮮なブタの脳はBryan Meat Packing, Westpoint, MSから得た。ヒトの脳はバーミンガム、アラバマ大学のBrain ResourceCenterのRichard Power博士によって提供された。Sprague-DawleyラツトをCharles River, Wilmington, MAから入手して、それを殺してその頭部をとった。精製した神経繊維不規則形成物（Iqbalら、1984）は、発達不全基礎研究所、Staten Island, NYのKhalid Iqbal博士によって提供された。神経フィラメント抗体（Amersham）および蛋白質は、ノースウエスタン大学医学部、シカゴＩＬのRobert Goldman博士によって提供された。
実施例２
蛋白質の精製
微小管はこれまでに述べたような（Shelanskiら、1973）２つのサイクルの温度依存集合体から、最初の加温培養の場合だけグリセロルを加えて25％にして精製した。さらにツブリンは（Slobodaら、1976）に述べているプレサイクルした燐酸セルロースを用いて、燐酸セルロース・クロマトグラフィー（Weingartenら，1975）によって精製された。タキソールで安定化させた微小管（Vallee, 1982）を10μMのタキソールを５mg/mlで精製したブタのツブリンを30分間、37℃の温度で培養することによって得、その後、電子顕微鏡観察のために１/20に希釈した。
他の人々（SandovalとWeber, 1980；Johnsonら、1989）によって発表されているのと同様の手順を用いてタウを分離し、熱処理（Clevelandら、1977ａ）に対するその蛋白質の安定性と過塩素酸における可溶性（Lindwall及びCole, 1984）を付与した。微小管から分離するために、ペレットを0.8Ｍ  ＮａＣｌおよび２mM ＤＴＴで補強したサイクリング緩衝液（100mM ＰＩＰＥＳ，１mM ＥＧＴＡ，１mM ＭｇＣｌ2，pH6.9）に再懸濁して、氷上で30分間撹拌し、10分間煮沸し、さらに氷上で30分間撹拌し、そして100,000×ｇで45分間遠心分離にかけた。上澄液をAmicon YM10の限外濾過膜で濃縮し、Bio-GelＡ−1.5シーブ・カラム（32×430mm, 5ml/hour）に入れ、0.8ＭのＮａＣｌと２mMのＤＴＴ（緩衝液Ａ＋）を追加した緩衝液Ａ（20mMのＭＥＳ，80mMのＮａＣｌ，２mMのＥＧＴＡ，１mMのＭｇＣｌ2，0.1mMのＥＤＴＡ，pH6.8）で平衡させた。タウを含む画分を、2.5％の過塩素酸に入れ、氷上で30分間撹拌し、そして100,000×ｇで30分間遠心分離にかけた。上澄液を緩衝液Ａに透析し、限外濾過膜によって濃縮した。残留ＤＤＴは0.2μM以下であると推定された。煮沸処理を除く全ての処理を４℃で行なった。
脳全体から直接タウを分離するために、冷凍した組織を解凍して、0.8Ｍ  ＮａＣｌとなるように十分な量の乾燥ＮａＣｌを追加して緩衝液Ａ＋内でWaringブレンダーを用いて均一化させた（１：１wt/vol）。次に150,000×ｇで45分間遠心分離にかけた後に、その上澄液を上記のように10分間煮沸し、30分間氷上で撹拌し、回転させた。その後その上澄液（ＮＨ4）2ＳＯ4で60％飽和溶液として、氷上で45分間撹拌し、回転させた。ペレットを全体で50mlの緩衝液Ａ＋に再懸濁して、同じ溶液に対して透析し、限外濾過膜で濃縮し、シーブ・カラム上に入れた。その後、タウの微小管からの分離は上に述べた手順に従って行った。
実施例３
タウ・ポリマー化の条件
一般的に、緩衝液Ａ内で−80℃の温度で保管していたタウを４℃で解凍して、ＤＴＴあるいはｂ−メルカプトエタノール（bＭＥ）を含むpH7.2，100mMトリスで希釈し、37℃の温度で培養した。pH７以下の緩衝条件を必要とする実験のためには100mM ＭＥＳを用いた。最終的なタウ濃度を１〜10μMの範囲に設定した。時間、温度、pH、イオン強度、および還元剤の濃度にかなりの変化が見られた。
実施例４
電子顕微鏡による観察
試料を10mlアリコットで0.4％フォームバーでコーティングされた400メッシュ・ニッケル・グリッド上に沈着させ、Ｈ2Ｏ  ５滴でリンスして、２％酢酸ウラニル５滴で染色し、再度の滴下後１分間経過してからブロッティングを開始した。グリッドは80kVで作動されるＪＥＯＬ  ＪＥＭ−100ＣＸ伝送電子顕微鏡を用いて検査された。フィラメント長の測定のために、15Ｋ（図６）あるいは10Ｋ（図７と９）の定格倍率で得た電子顕微鏡写真をＳＩＴ68カメラを用いてデジタル化し（ＭＴＩ）、Universal Imaging Corporationからのソフトウエアを用いて長さを判定した。視野内に完全に含まれており少なくとも50nmの長さのフィラメントだけがデータ・セットに含まれた。ランダムに選択された視野を低い照度で、そして10Ｘ接眼鏡の助けを借りずに選んだので、フォームバーは存在しているフィラメントを見ることなしに評価できた。フィラメント幅の測定は図１Ｆ−Ｋに示してあるのと同様の顕微鏡写真を用いて手作業で行われた。微小管（24nm想定直径、６〜７本の判別可能なプロトフィラメント）をサイズ基準として用いた。
コロイド状金のラベリングを行うために、グリッド状に置いてＨ2Ｏでリンスした後、グリッドを硼酸食塩水（0.1Ｍ Ｈ3ＢＯ3，25mM Ｎａ2Ｂ4Ｏ7，75mM ＮａＣｌ）で希釈した一次抗体（Ｔau−２；Papasozomenos及びBinder, 1987）の10ml滴下で極性反転させた。グリッドを硼酸食塩水でリンスして、二次抗体（Ted Pella，１/25に希釈）の滴下で極性反転させ、1.5Ｍ ＮａＣｌで補強した硼酸食塩水でリンスして、２％酢酸ウラニルで染色した。
実施例５
電気泳動
蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemmli, 1970）で分離してコマッシー・ブルーで染色するか、あるいはニトロセルロース上に移した（Towbinら、1979）。ウェスターン・ブロットを行うために、抗体およびブロキング（２％脱脂ドライ・ミルク）培養を硼酸食塩水内で行った。蛋白質濃度は、試料をLaemmli試料緩衝液内で10体積の10％過塩素酸、１％ホスホタングステン酸で沈殿させた後、ローリーの方法を用いて決定された。
実施例６
微小管のポリマー化
精製された蛋白質を還元剤の存在でスルフィドリル管活性が制限されている中性トリスあるいはＭＥＳ緩衝液内に希釈することによってタウのポリマー化を行った。種々の条件下で形成されたポリマーを図１に示す。ポリマー化は若い（生後（Ｐ）日数で示す）、成長したラット、及び成長したブタで、蛋白質濃度が1.6〜6.5μMを用いて示された。培養は５〜25mM bＭＥあるいは２〜20mM ＤＴＴを用いて37℃の温度で５〜26時間行われた。これらのフィラメントは、それらが非ラセン状で対を形成しないという意味で、神経原繊維変化内にあることが知られている真っ直ぐなフィラメントとよく似ている。しかしながら、幾つかのフィラメント（図１Ｄ）は明らかに弾力性を持っており、そのことが厳密には非ユークリッド的な意味では真直ぐになっているが、より固いように見える対になったらせん状フィラメント（Wisniewskiら、1984）と真っ直ぐなフィラメント（Crowther, 1991）とは違っている。これらのタウ・ポリマーは最も幅の広い箇所で6.5〜13nmの範囲で、平均的な幅は10.5nmである。フィラメントは不規則な間隔で、しかもいろいろの長さで、最も広い幅に対して50％程度まで狭くなっている（図１Ｈ，Ｊ）。こうした狭まりはわずかに捻れたフィラメントの重なり点を表している可能性がある。神経原繊維変化から分離された真っ直ぐフィラメントも長軸のねじれから発生していると思われる（Crowther, 1991）幅の変動を示す。観察された半径寸法の比較的大きな範囲はグリッド上に置く時に発生する種々のねじれから発生しており、フィラメントの形状が種々あることから発生しているのではないと考えられる。１つの領域内（図１Ａ）の多重フィラメント集団と見られるものを創くりだす染色強度の違いも一般的に観察される。これらは、グリッド表面全体で正および負の染色が不規則に関与していることが原因であり、多数のフィラメント形状の存在を示唆するものではない。
また、図１にも示されているように、ポリマー化タウの調製物には２つのタイプの集団が通常観察される。第１のものは最初に若いラットのタウ試料に最も普通に見られるものであり、非フィラメント上タウのタウ・フィラメントへの沈着が関与しているように見える（図１Ｂ）。これらの集合体が電子顕微鏡に不透明であることから、高度に圧縮された短いフィラメントによって構成されている可能性を否定することはできない。しかしながら、これらは、通常１つの判別可能なタウ・フィラメントと関連している。こうした集合体との出現は、通常、電子顕微鏡で観察できるフィラメント密度の明らかな減少と関連しており、可溶性でフィラメント状タウを遠心分離によってポリマー化を定量する試みが行われている。タウ・フィラメントの束化もたまに観察される（図１Ｃ）。両方の形態の集合体は、トリス集合体緩衝液を硼酸食塩水と置換すると減少するように思われるが（データは示さず）、ポリマーの収率は減少する。
15のサンプルのタウについてフィラメント形成能力を観察した。２サイクル化微小管から精製されたタウ調製物のすべてが集合能力を示しているが、脳抽出物全体から直接精製した調製タウはこの性質を示さない。集合能力のないタウにはウシ、ブタおよびヒトの脳から単離されてたものも含まれていた。両方の方法で精製されたタウは同様の構造を持つと推定されるが、微小管サイクリング中に存在するホスホターゼ及びキナーゼの活性によって、ホスホリル化の違った状態にある可能性がある（Tsuyamaら、1986；Burns, 1991）。特定の翻訳後修正のレベルの違いもポリマー化を促進したり抑制したりすることに関係している可能性がある。
実施例７
イン・ビトロで集合されたタウ・ポリマーの形状
イン・ビトロで集合されたタウ・ポリマーの形状をアルツハイマーの真っ直ぐなフィラメントおよび対になったらせん状フィラメントの形状と比較した（図２）。神経原繊維変化をＳＤＳ抽出手順（Iqbalら、1984）に基づいて分離し、タウ・フィラメントと同様のやり方で電子顕微鏡検査のために処理した。神経原繊維変化調製物に見られるフィラメントのほとんどは典型的な対になったらせん状フィラメント形状を示した（図２Ａ）。たまに、真っ直ぐなフィラメントが観察され、そして稀にではあるが真っ直ぐなフィラメントだけで構成されている神経原繊維変化フィラメントが観察された（図２Ｂ）。真っ直ぐなフィラメントとタウ・フィラメントの比較（図２Ｃ）は幅がほぼ同様で、表面が滑らかで、この染色法では内部構造がほとんど観察されない２つのフィラメント群が明らかになった。対になったらせん状フィラメントはその幅が最も広い箇所でイン・ビトロで集合されたタウ・フィラメントの真っ直ぐなフィラメントよりずっと幅が広かった。神経原繊維変化において見られる真っ直ぐなフィラメントは見かけ上タウ・フィラメントよりずっと固そうで（図１Ｄ）、そしてしばしばかなり曲げようとするとフィラメント内の接触によって壊れるようであった。これはホスホリル化タウから形成されたパラクリスタルの固さが増大するのと同様に、より多数のホスホリル化残基を真っ直ぐなフィラメントが含んでいることが理由なのかもしれない（Hagestedtら、1989）。
ポリマーがサイズにおいても神経フィラメントと類似しており、そして神経フィラメントはそれから集合成分タウ（Berkowitzら、1977）が精製されたサイクル化微小管の汚染物質として知られているところから、タウ分離物を神経フィラメント蛋白質で汚染されていないかどうか検査した。ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された２つの典型的なタウ調製物のコマッシー染色はタウ・バンドだけに色素が結合することを示した（図３Ａ，３Ｂ）。神経フィラメント軽鎖に向けられたモノクローナル抗体を用いた同じゲルのウェスターン・ブロットは40ngの部分的に精製された神経フィラメント調製物への結合を示した（図３Ｅ、結合は10ngでも検出された）が、５〜10μg/レーンで置かれたタウ蛋白質への結合は見られなかった（図３Ｃ，３Ｄ）。最大神経フィラメント汚染可能性は＜0.1％と計算された。
イン・ビトロで集合したフィラメントがタウで構成されていることをさらに確かめるために、タウモノクローナル抗体を金接合二次抗体と組み合わせてＥＭによる位置決定を行った。金粒子はフィラメントをタウ−２モノクローナル抗体で予備培養した場合にフィラメントと結合した（図４Ａ，４Ｂ）が、一次抗体を用いない場合は結合しなかった（図４Ｃ，４Ｄ）。非特定的に結合した蛋白質をフィラメントの表面に移動させるために0.5Ｍ ＫＣｌでフィラメントを処理してもラベリングに影響はなかった（図４Ｅ，４Ｆ）。
フィラメント集合の分析は、ポリマー化の程度が培養時間と温度に依存していることを明らかにした（図５）。培養時間を増大させると、グリッド表面に長めのフィラメンとが存在した。タウを３７℃の温度で培養すると（図５Ｆ−５Ｊ）、形成されるフィラメントはその長さと数が22℃で形成される場合より大きくなるように思われる（図５Ａ−５Ｅ）。このＰ14ラット・タウの調製物では、４℃の温度で４時間培養してもポリマー化は認められなかった。しかし成長したラットを用いた以下の実験では、４℃で一定のポリマー化が認められた（データは示さず）。
図５に見られるのと同様の電子顕微鏡写真を、フィラメント長が測定できるようにデジタル化した（図６）。つくられたヒストグラムから、平均フィラメント長は時間と共に増大し、任意の時間で37℃で培養した試料のフィラメントの方が長かった。このデータもフィラメントが、微小管群において通常見られるようなガウス分布（Symmons及びBurns, 1991）ではなく指数関数的な分布を示すことを示している。このタイプの分布は一定の割合で核化部位を増やしており、一定の下部構造崩壊を示しているフィラメント群との一貫性をもっている。
フィラメント集合のイオン強度に対する依存度についても調べた。中性溶液（25mM トリス、４０mM ＮａＣｌ）に0.75mM ＫＣｌを加えると、その後にグリッド表面に見られるフィラメントは著しく減少した（図７）。すべての試料に対してはグリッド上に置く前に500mM ＫＣｌを加えたので、この減少はそうした処理が行われなければそれら試料の種々の塩成分から発生したであろうグリッド面への接着度の違いによるものではない。フィラメントはＫＣｌが100mMで加えられた場合（トリス＋Ｎａ＋Ｋ＝165mM）は低濃度で観察されたが、より高い塩濃度では完全な抑止が通常観察された（データは示さず）。
フィラメントの脱ポリマー化に関しては、ＫＣｌの濃度を集合抑止濃度よりかなり高くすると一定のフィラメント分解が起きただけであった。24時間予備集合させた試料をさらに500mM ＫＣｌ上で24時間培養しても、未だフィラメントが観察された（図７）。このことは集合したフィラメントが一定の下部構造分解を示すだけであることを示しており、フィラメント長分布に関して得られたデータと一致している（図６）。
タウ群に対するpHの影響を表Ｉに示す。Ｐ14および成長したラットからのタウを種々のpHで緩衝させた20mM bＭＥ内で一昼夜培養し、その後電子顕微鏡によってフィラメント形成についての評価を行った。集合は６から11までの広いpH範囲で起きたが、pH5.6ではかなり抑制され、pHがより低くなると完全に抑止された。抑制的なpHで一昼夜培養し、その後中性領域にpHを上げた場合の試料は通常の集合を示した（データは示さず）。
0004135810.tif 000002
Ｐ14ラット・タウのイン・ビトロでのポリマー化の最も早い時期の試みで、識別されるのに十分な長さのフィラメントを形成するためには培養緩衝液内に還元剤を含ませねばならないことが明らかになった。ｂＭＥ濃度とＰ14タウから集合されたフィラメントの長さとの関係を図８に量的に示す。ｂＭＥ濃度を0.1Ｍ（図８Ｂ）から0.1mM（図８Ｅ）に下げると、最大フィラメント長が観察された。低いｂＭＥ濃度では、フィラメントとして認められるものより小さな粒子の増大がしばしば認められた（図８Ｄ及び図８Ｅ）。これらは最小長ポリマーを示しているのかもしれない。ブタのタウおよびＤＴＴを還元剤として用いた場合も同様のデータが得られた（図９）。平均フィラメント長はＤＴＴの濃度が減少すると明らかに減少したが（図９Ｆ）、最低の還元剤濃度レベルで観察されるフィラメントの長さは他の実験において見られるよりも変わりやすく（図８）、2.4ミクロンもの長さのフィラメントも記録された。この変動は種々の微小管調製物タウがポリマー化するのが観察される程度を反映しており、最も高いレベルのポリマーをつくり出した調製物は還元剤の濃度が低い場合より均一的に短いフィラメント群を示した。長いフィラメントの集合を最大限化するために多くの実験で高い濃度の還元剤が用いられるが、図９に示される還元能力の範囲は明らかに細胞質内で起きると予想される値を上回ることを強調しなければならない。グラチオンの生理学的濃度（１〜10mM、Hwangら、1992）−−細胞質のレドックス緩衝能力のほとんどを構成するトリペプチド−−もＰ11ラット、成長したラット、及び成長したブタの脳から精製された微小管タウの集合を促進した。
実施例８
蛋白質の分離
Charles River, Wilmington, MAからSprague-Dawleyラットを得て、生後11日目（若い）あるいは６週間以上（成長した）で殺して頭部を切り離した。新鮮なブタの脳をBryan Meat Packing, Westpoint MSから入手した。脳全体、あるいは二度サイクルされた脳微小管からのタウの分離についての詳細手順は上に述べた通りである。非ホスホリル化された遺伝子組換えヒト・タウ（htau40：Goedertら、1989）はノースウェスタン大学医学部Jeff Kuret博士から贈られたものであった。遺伝子組換えタウは大腸菌内でポリヒスチジン・タグとの融合蛋白質としてつくりだされ、ニッケル−キレート及びゲルろ過クロマトグラフィーによってほぼ均一な状態に精製された（Carmelら、1994）。精製後、タウ単離物を緩衝液Ａ（20mM モルフォリノエタンスルホン酸、pH6.8，80mM ＮａＣｌ、２mM ＥＧＴＡ，１mM ＭｇＣｌ2，0.1mM ＥＤＴＡ）で透析し、−80℃で保存した。Laemmli試料緩衝液（Laemmli、1970）内で試料を10体積分の10％過塩素酸、１％ホスホタングステン酸で沈殿させた後、蛋白質濃度をLowryの方法（Lowryら、1951）を用いて判定した。比較対象としてブタ血清アルブミンを用いた。
実施例９
脂肪酸の調製
すべての脂肪酸はSignma Chemical Companyからcis配座で可能な最高の純度で購入された。遊離脂肪酸をすべての試料および比較対象での最終エタノールが0.5％となるように200Ｘエタノール原料からのタウ及び類澱粉質内に希釈させた。遊離脂肪酸を集合緩衝液内に希釈させた場合の10mMフェニルナフチルアミン（Kovatchevら、1981）の相分割に基づいて臨界モル濃度値を得た。
実施例10
タウ蛋白質集合
ほとんどの実験で、タウ蛋白質を緩衝液Ａ内での望ましい濃度である２Ｘに希釈し、次に20mMジチオスレイトル（ＤＴＴ）で補強した硼酸食塩水（0.1Ｍ Ｈ3ＢＯ3、25mM Ｎａ2Ｂ4Ｏ7、75mM ＮａＣｌ）内で１/２に希釈し、その後遊離脂肪酸（最終pH8.4）の必要な濃度である２Ｘに希釈した。集合のイオン強度に対する依存性を評価するために、示されたＮａＣｌ最終濃度を得るように，タウを補強された111mM トリス pH7.2，11mM ＤＴＴ内に１/10に希釈された。200mM ＮａＣｌで、トリス緩衝系内のアラキドン酸の測定されたＣＭＣは＞２mMであった。
実施例11
類澱粉ペプチド集合
Ａβ1-40（類澱粉質β−蛋白質、残基１−40、Sigma）を0.5mg/mlの濃度でＡβ集合緩衝液（100mM トリス、pH7.4，150mM ＮａＣｌ）内に再懸濁させ、−80℃でいくつかのアリコットで冷凍した。解凍したアリコットを集合緩衝液内で50mg/mlで希釈し、２時間の予備培養後、Eppendorf 5415Ｃデスクトップ遠心分離装置内で14,O00rpmで10分間遠心分離した。清浄化した溶液に再度遊離脂肪酸を加えて再懸濁させ（最終Ａβ濃度−10mM）、24時間培養した。すべての手順を４℃で行うように注意を払った。
蛍光分光測定を（Castanoら、1995）が述べているように行った。アリコットを67mMグリシン、pH９，４mMチオフラビンＴ内に１/６に希釈させ、回転させた後、クオーツ・キュベット内に配置した。試料をPerkin Elmer ＬＳ−50Ｂ蛍光分光計で読み取ったところ、励起＝43.5nm、放射＝48.5nm、そしてスリット幅＝５nmであった。最初の10回分の10秒間サンプリング間隔からのデータを平均して積分強度を求めた。信号は少なくとも数時間は安定していた。Ａβを有していない５つの試料の蛍光を平均してすべての読取値から背景値として差し引いた。遊離脂肪酸は用いられた濃度範囲では蛍光信号に影響を及ぼさなかった。
実施例12
電子顕微鏡検査
試料を10mlアリコットにして0.4％フォームバーでコーティングした400メッシュ・ニッケル・グリッド上に１分間置いた。タウ試料をＨ2Ｏ  ４滴でリンスして、２％酢酸ウラニル４滴で染色し、最後の液滴を１分間放置してからブロッティングを行った。類澱粉質フィラメントを染色するために、４％酢酸ウラニルを用い、Ｈ2Ｏでのリンスは省略した。60〜80kVで作動されるＪＥＯＬ  ＪＥＭ−100ＣＸ放射電子顕微鏡を用いてグリッドを検査した。フィラメント長を測定するため、15Ｋの定格解像度で得られたランダムな顕微鏡写真をデジタル化し、Universal Imaging Corporationからのソフトウエアか公共領域ＮＩＨ画像プログラム（マッキントッシュ用；ＮＩＨのW. Rasband作成、zippy.nimh.nig.govでインターネット経由で、あるいはＮＴＩＳ，5285 Port Royal Rd., Springfield, VA 22161，パーツ番号PB93-504868からフロッピー・ディスクで入手可能）を用いてトレースした。少なくとも50nmの測定値を有するタウ・フィラメントだけがデータに取り入れられた。短いフィラメントはデジタル画像では背景のごみと区別が困難である場合が多いので、より長いフィラメントを最大限につくりだすため、高濃度のＤＴＴを用いるようにした。ランダムで選択された領域が低照度で選ばれ、フォームバーの強度を存在しているフィラメントを見ないで評価できるように、10Ｘ接眼鏡の助けは借りなかった。
実施例13
タウ集合の脂肪酸依存性
集合系を用いて、アラキドン酸（５，８，11，14−エイコサテトラエン酸）は検査されたすべてのタウ調製物のポリマー化を促進することが観察された。成長した脳内でつくり出された６つのタウ・アイソフォームのうちの最小のもので均一に構成されている若いＭＴτは（Lee,1990）、容量に依存する形態で集合した（図10Ａ）。刺激の見かけ上の臨界は時間の関数であり、テストされた最長の時点で10μM以下であった。図10Ａのデータをポリマー質量が時間の関数として表現されるように再プロットすると（図10Ｂ）、作成された曲線はほぼ線形で平衡状態を示す証拠はなく、このことは集合の速度が66時間（80μM）、108時間（40μM）、あるいは214時間（20μM）まで比較的一定であることを示唆している。アラキドン酸も成長したラットのＭＴτのポリマー化を促進した（図１Ｃ）。この調製物は若いＭＴτより自発的に集合する傾向が高いことを示したが、アラキドン酸のレベルが10〜40μMの場合ポリマー形成の絶対増加がより大きかった。しかしながら、若いＭＴτは40〜80μMアラキドン酸で刺激すると、より高い増加率を示した。同じ条件で、ヒトの遺伝子組換えタウ及びブタの脳全体から精製されたタウでは自発的な集合は示されなかった。しかしながら、これらの調製物を20〜80μMアラキドン酸で培養すると、フィラメントが観察された（図10Ｃ）。異なったタウ調製物で自発的、及び誘発可能な集合のレベルは変化したが、こうした違いの源泉は用いられた蛋白質の濃度（100〜200μg/ml）、翻訳後修正のレベル、そしてアミノ酸配列の種固有変差などの違いから判定することはできなかった。
どの脂肪酸が最も効果的にタウ集合の誘発因子として用いることができるかを判定するために、その炭素鎖の長さと飽和度が異なっている遊離脂肪酸の刺激効果について調べた。一般的に、テストされたすべての鎖長さに対して、不飽和脂肪酸は飽和脂肪酸より強力であった（表II）。50μMアラキドン酸、パルミトール酸、あるいはリノレン酸を用いた場合にポリマー形成の20〜30倍の増加が観察された。いくつかの代表的遊離脂肪酸のＣＭＣの測定値は、それらがこの値以下の濃度で有効であったことを示しているから、遊離脂肪酸の刺激効果は遊離脂肪酸によってつくりだされる表面電荷の局所濃度のせいではなかった（表II）。グリッドの定量的な検査に基づいて、タウ集合は50μM（その測定ＣＭＣ値以下）でも用いられたアラキドン酸のメチル、あるいはエチル・エステルによって刺激を受けるようには思われなかった。
0004135810.tif 000003
実施例14
脂肪酸で誘発されるタウ・ポリマーの特性
タウ・サンプルへの遊離脂肪酸を加えると集合の速度は調節されるが形成されるポリマーの性質は調節されない。遊離脂肪酸が存在しない場合にＭＴτから集まるフィラメント（図11Ａ）は50μMアラキドン酸の存在下で集まったもの（図11Ｂ）と区別はつかない。精製タウの供給源がブタの脳全体（図11Ｃ）、あるいはヒト遺伝子組換えタウ（図11Ｄ）の場合でも、フィラメントの形状は変化するようには見えなかった。
50μMアラキドン酸の存在下でのタウ・フィラメントのポリマー化は、前に遊離脂肪酸の不在下でのポリマー化に関して示されたのと同様、温度、イオン強度、及び還元性に依存しており、これはフィラメント構造が遊離脂肪酸によっては変性されないという結論を裏づけている。若いＭＴτは、温度を４℃から37℃に上昇させると集合が500％程度増大した（図13Ａ）。成長したＭＴτの集合は温度に依存していないが（図13Ａ）、この場合も成長した個体に固有のアミノ酸配列及び／又は翻訳後修正の状態が集合プロセスの変性熱力学的パラメータであることを示している。150mM程度のＮａＣｌ濃度が成長したＭＴτのポリマー化には最適であるように見えるが、濃度がより高くなると抑制的効果を示した（図13Ｂ）。これは塩（ＮａＣｌ＋ＫＣｌ）濃度が65mM程度の場合に抑制効果を示したこれまでの知見とは多少異なっており、遊離脂肪酸がイオン強度への依存性を生理学的最適条件により近い方向に変えることを示唆している。成長したＭＴτの集合は還元性の関数でもある（図13Ｃ）。ＤＴＴの濃度を増大することによってつくりだされる平均フィラメント長の増大はフィラメント総数の減少を伴っていた。最後に、成長した、及び若いＭＴτの集合は50mMアラキドン酸の存在下でpH６以下で完全に抑制され、分析されたすべてのフィラメント・ポピュレーションはフィラメント長の指数関数的分布を示したが、これは遊離脂肪酸が不在の場合に得られたデータと一致している。
実施例15
類澱粉質集合の脂肪酸依存性
ＡＤ脳内でタウおよび類澱粉質病理が同時に出現することから、Ａβ集合も遊離脂肪酸によって促進されるのかどうかについて調べられた。不飽和遊離脂肪酸はより効果的にタウ集合を誘発するようであるから、ＣＳＦの不飽和脂肪酸成分の45％を構成するオレイン酸とリノール酸をこれらの実験に選んだ。遊離脂肪酸に依存したポリマー化を検出する能力を最適化するために、Ａβの自発的な集合が最小になるような条件を選んだ。同様の理由から、より長い、より急速に集合化するＡｂ変種ではなくＡβ１−40をこれらの研究で用いるために選んだ。２時間の予備培養と清浄化のための簡単な回転の後、電子顕微鏡で調べたペプチド溶液について、グリッド表面で個別に、あるいは小さな集団内に分布している比較的短い（＜0.5mm）フィラメントの存在で特徴付けを行った（図14Ａ）。遊離脂肪酸の不在下で試料を２４時間培養すると、フィラメントはより集団化され、長さがわずかに増大した（図14Ｂ）。
対照的に、試料をオレイン酸あるいはリノール酸で培養すると、フィラメント長の劇的な増大が観察された（図14Ｃ及び14Ｄ）。フィラメント長は５〜10nm程度で、他のイン・ビトロで集合された類澱粉質小片について報告されている（Burdickら、1992；Castanoら、1995）値と同様であった。Ａβ濃度を10μMから25μMに増大すると、類澱粉質フィラメントの自発的な形成にかなりの増大が認められ、遊離脂肪酸の相対的な関与度の評価が難しくなった。フィラメントの集団化とグリッド面上でのこうした集団の非均一的な分散とから、図14に観察されるフィラメント密度は溶液内でのフィラメント密度を必ずしも示していない。電子顕微鏡検査のために類澱粉質試料を調製する場合、より長い培養で形成されるより大型の集団がフォームバーを崩壊させたり染色手順中にグリッドを洗い流してしまう可能性があるので、集合培養を24時間以下に制限することが必要である。
遊離脂肪酸はフィラメントの長さの増大に対する影響を持っているように見えるが、顕微鏡的な方法だけではこの現象の原因を下部構造取り込みの誘発に限定できない。というのはフィラメントの長さの増大は遊離脂肪酸の不在下で観察される短いフィラメントの横方向あるいは長さ方向のアニーリングによるものかも知れないからである。従って、ペプチド溶液内に存在している総ポリマー重量の測定手段として蛍光アッセイを用いた。このアッセイは独自の励起と、チオフラビンの蛋白質のβ−シート構造への結合からもたらされる放出最大値に基づいて行われる（Naikiら、1989、LeVine, 1993）。この方法で得られた定量的な結果は電子顕微鏡で行われた観察の結果と一致していた。蛍光信号は遊離脂肪酸の不在下で形成される低レベルのポリマーを示していたが、10〜20μM遊離脂肪酸の存在で基本ライン以上の増大は認められなかった（図15）。40μMの濃度のオレイン酸およびリノール酸の存在下でポリマー含有率のかなりの増大が観察された。遊離脂肪酸の濃度がさらに高くなると、リノレン酸の方が類澱粉質集合のより強力な誘発因子であることが分かった。遊離脂肪酸によって誘発される総ポリマー重量の増大はフィラメント長の増大が予め存在しているフィラメントのアニーリングだけには帰せしめられないこと、そしてペプチド下部単位の一層の取り込みが関係している可能性のあることを示している。類澱粉質およびタウ・フィラメントのポリマー化はＮＰ及びＮＦＴ形成のプロセスが共通のエフェクタ・モジュールを共有している場合に予想されるように、同様の遊離脂肪酸の濃度によって促進されたことは注目に値する。
実施例16
本発明はひとつの実施の形態でアルツハイマー病において見られる真っ直ぐなフィラメントに形状的に関連しているように思われるタウ・フィラメントの均一な群の集団がうまく行われることを示している。これまで、タウが細胞内環境で通常見られる条件の下でこうした性質のポリマーを形成することは示されていない。真っ直ぐ、あるいは対になったらせん状の形状（幅は10〜25nm）を有するタウ・フィラメントの集合について述べている従来のの研究は非生理学的条件の使用に基づいていた。ウシあるいはブタのタウの集合はこれまで化学的（Montejo de garciniら、1986）あるいは酵素的（Dudek及びJohnson, 1993）による蛋白質の修正後のみに行われた。遺伝子組換えタウ構造物の集合は塩濃度が高い（1.25Ｍ  ＣＨ3ＣＯ2−Ｋ+；Crowtherら、1994）か、酸性pH（willeら、1992、Crowtherら、1992）に基づいて、タウ配列を部分的、あるいは完全に含んで構成される。これら従来の研究はいずれもその集合反応において還元剤を用いていなかった。還元性の環境においては、10nmタウ・フィラメントの集合は温度、pH、およびイオン強度の変数を生理学的な値に調節することによって起きた。これらの変数のうちで、イオン強度だけを生理学的値に制限すると、低い塩濃度で最適の集合が発生した。生理学的なイオン強度で観察されるフィラメントの密度は低かったけれども、かなりのポリマー重量が長い時間の間に蓄積され、これが病変の原因と関連しているようである。
イン・ビボで形成される真っ直ぐなフィラメントと同様、イン・ビトロで形成されるタウ・フィラメントはその断面がその厚みのほぼ２倍であり、その測定された断面はそれらがフラットに堆積されているか、あるいは端に堆積されているかの程度に依存しているという意味でリボン状である。タウ・フィラメントに関して測定された範囲内で２倍の差が認められることもこうした解釈と一致している。一部端に広がっている可能性のあるフィラメントの一例が図１Ｊに認められ、中央の部分は非常に狭いが、その端部はより典型的な寸法になることが認められる。フィラメントの形状に関するこの解釈はこれらタウ・ポリマーの実際の最大幅が平均測定幅（10.5nm）より最大範囲（13nm）により近いことを示唆している。薄く分離された組織内の真っ直ぐなフィラメントの幅に関して報告されている15nmという値はある程度大きいが（Metuzalsら、1981；Yagishitaら、1981）、この手法ではポジティブ染色による過大評価があるかもしれない（Rubenら、1993）。
その寸法の類似性から、タウ調製物から集合されたポリマーは実際の神経原繊維である可能性について調べた。コマッシーで染色した代表的なタウ試料のゲルは神経原繊維あるいはその他の蛋白質汚染物質を示さなかったが、同じ試料をウェスターン・ブロットすると抗神経原繊維蛋白質抗体とクロス反応する蛋白質は示されなかった。形成されたポリマーは周辺に結合した蛋白質を除去するために高い塩分内でフィラメントを培養した後でも抗タウ抗体により重度にラベルされた。ここに述べられている集合条件と神経原繊維の集合に関して前に報告された条件との間にも差異があった。タウ・フィラメントの集合は低イオン強度で促進され、イオン強度が高くなると抑止されたが、神経原繊維は高いイオン強度でも集合され（Geisler及びWeber、1981）、そして低いイオン強度で分解された（Hisanaga及びHirokawa, 1998）。加えて、温度を下げるか、あるいはフィラメント集合のために用いられた緩衝液のpHを上げてもタウ・フィラメントの形状に変化は見られなかったが（データは示さず）、異常な形状を示す神経原繊維の形成がもたらされた（Aebiら、1988）。
異なった温度でポリマー化の時間的経過をたどると、３つの興味ある点が示された。第１の点はすべてのフィラメント群がフィラメント長の指数関数的な分布を示すことで、この事実は一定の範囲のＤＴＴ濃度でつくりだされる長さ分布によって確認される。このタイプの分布は平衡化された微小管群で観察されるガウス分布（Symmons及びBurns、1991）と対照的であり、限定的な下部構造分解を示し、一定の割合で核化箇所を増大するフィラメント群と一致している。この解釈は集合を抑制するのに十分な塩濃度で培養されたタウ・フィラメントが限定的な分解だけを示したという観察結果によって裏づけられ、このことも下部構造分解の速度が比較的ゆっくりしていることを示している。第２の興味深い点は形成されるポリマーの重量が温度の上昇と共に増大したことである。これはタウの２次構造含有率も温度の関数として増大したことを示す環状２色性に関する研究結果（Rubenら、1991）と一致している。従って、ポリマー化の前にタウ分子がより高度の形態をとるということも考えられる。第３の点はタウ・フィラメントが時間の経過と共に長くなるらしいのに、半径寸法は一定であることである。このことはフィラメントが下部構造を、予め形成された原フィラメントの横方向ではなく、縦方向に加えることで長くなっていることを示している。これはひとつの時点だけでポリマーを調べていたこれまでの研究では示されなかったことである。
対になったらせん状フィラメント状ポリマーの集合体内のタウ二量体の役割についての示唆がこれまでにも行われてきている（willeら、1992）。シスチン残基の非還元性架橋を誘発するためにタウ構造物をフェニレンジマレイミドで処理するとＳＤＳ−ＰＡＧＥで示されるようなタウ二量体の形成がもたらされ、これらの二量体は集合して未処理タウで形成されるのと同じフィラメントが形成された（willeら、1992）。bＭＥあるいはＤＴＴ濃度が減少するとフィラメント長が減少するという観察結果はより弱い還元性環境内で形成される二量体はポリマー化プロセスを抑止する可能性があることを示唆している。しかしながら、微小管群内で、集合を促進するファクター（微小管に関連した蛋白質）が平均微小管長を減少する（Slobodaら、1976）という結果がこれまでに示されている。このことは集合速度とフィラメント長との間に存在し得る逆の関係を示している。細胞質還元に対して抵抗性を示すジスルフィド結合が小球蛋白質内で見出されているが、それらは延長された形態で存在しており限定的な２次的構造を有していると考えられる（Clevelandら、1997ｂ，Hirokawaら、1988）タウなどの蛋白質内に存在していることは予想されていなかった。シスチン残基を含んでいるタウの領域はその分子の比較的親水性の強い部分に存在していることが知られているが（Rubenら、1991）、形状変化は二量体に関連しているか、あるいはポリマー化が還元剤ではアクセスしずらい中央親水領域内に関連シスチンを取り込んでしまうのかもしれない。
ジスルフィド結合の関与は集合のpH依存性によっても示唆されている（表Ｉ）。pH6.0以下で見られる集合の抑止はスルフィドリルの反応性が減少することにその原因を求められるかもしれないが、このpH範囲ではヒスチジンの陽イオン化による効果の可能性を排除することはできない。タウ消去突然変異体の集合もpHに依存することが観察されている。非還元性条件の下では、微小管結合領域の大部分を含む構造物は中性pH領域では集合することは観察されなかったが、pH5.0〜5.5(Willeら、1992)、あるいはpH4.5〜5.0（Crowtherら、1992）の範囲ではフィラメントを形成した。非還元性条件の下では中性pHでかなりの長さのフィラメントを形成しないタウ調製物（図８Ｆ）がpH5.5で長いフィラメントを形成する（データは示さず）。これらのデータをまとめると、十分に低いpHではポリマー化が完全に阻止されるが、集合をより導きやすい条件の下では、pHおよび還元剤のジスルフィド安定性に対する効果は付加的で、［bＭＥ］か［Ｈ＋］のいずれかを増大させると平均フィラメント長も増大する。
微小管から精製されるタウは集合条件下でフィラメントを形成することが観察されたが、脳全体から精製されたタウは集合能力を欠いているように思われた。しかしながら、別の研究では、グルタミン酸とリシン残基間の分子間架橋を触媒する酵素であるトランスグルミターゼで培養された脳全体からのタウの試料内に10nmのフィラメントが存在していることを示すことができた(DudekとJohnson、1993)。形状的にここに示したものと類似しているフィラメントの形成は、脳全体から得たタウが微小管タウのポリマー化に先行するのと似たやり方で結合させることができることを示唆している。しかしながら、架橋酵素が存在しない場合は、脳全体のタウの場合、この結合が可逆的であるらしい。このことはこれら２つの方法で精製されたタウの翻訳後修正の違いが凝集性タウ相互作用の安定性に直接影響を及ぼし得ること、そしてトランスグルタミナーゼがこれらの修正に依存する集合を誘発できることを示唆している。
ホスホリル化はタウの構造的及び機能的特性の多くに影響を及ぼす。通常のタウが対になったらせん状フィラメント及び真っ直ぐなフィラメントに組み込まれたタウのそれと同じホスホリル化状態で分離できないことを考えれば、これらの形状が複製されないことは驚くべきことではない。イン・ビトロで集合されたタウ・フィラメントは対になったらせん状フィラメントとは似ておらず、真っ直ぐなフィラメントよりずっと大きな柔軟性を示した。対になったらせん状フィラメントの集合中に下部構造の横方向での結合を可能にするホスフェートは不在でもよく、あるいはサイクル化微小管から精製されたタウ内に存在している他のホスフェートに取り込まれていてもよい。同様に、真っ直ぐなフィラメント及び対になったらせん状フィラメント内に取り込まれたタウのホスホリル化が増大すると、ホスホリル化によって誘発されるタウ・パラクリスタルの剛性の増大と同様、構造的な固さの増大に寄与するかもしれない（Hagestedtら、1989）。真っ直ぐなフィラメント及び対になったらせん状フィラメントのホスホリル化状態が複製できれば、これら集合条件下で同じ構造が形成されるであろう。
本発明によって定義されるタウ・ポリマー化のための条件を用いることはこれまでに報告されている手順よりいくつかの利点がある。第１に、比較的低いタウ濃度（１〜10mM）で妥当なフィラメント収量が得られたことである。これまでの研究では50mM（＜10フィラメント／フィールド、Montejo deGarcini及びAvila, 1987）から250mM（Crowtherら、1994）の濃度が用いられていた。ひとつの研究は2.5mMのタウ濃度で集合することが報告されているが、それはトランスグルタミナーゼが存在しない場合だけである（Dubek及びJohnson, 1993）。この酵素は生理学的に適切な翻訳後修正に無関係な形態でポリマー蓄積を誘発するが、この手順はフィラメント形状あるいは集合の速度の変化をもたらす蛋白質修正を定義するのには適していないかもしれない。第２に、タウ・フィラメントの集合に関して報告されている条件とは異なって（Willeら、1992；Crowtherら、1992）、ここで定義されている条件は全長タウ蛋白質の集合をもたらす。集合プロセスに対するタウ配列のすべての領域の関与について評価する場合はこのことは重要である。第３に、これらのフィラメント集合条件を用いると形状的に均一のフィラメント群がもたらされる。従って、蛋白質修正からもたらされる形状変化を分析することは雑多なフィラメント群をもたらすことが知られている条件を用いるより有効かもしれない（Montejo de garciniら，1986；Willeら、1992；Crowtherら、1992；Crowtherら、1994）。最後に、イン・ビボでのタウ・ポリマー化を調整する能力についてタウの化学的あるいは酵素的措置について選択しなければならない場合は、それらはできるだけ生理学的条件に近い条件で調べられるべきであろう。
遊離脂肪酸とＡＤ脳内に観察されるものに関連したポリマーのイン・ビトロ集合との間には一定の関係が確立されている。アラキドン酸は調べられたすべてのタウ調製物のポリマー化を促進され、2.5〜５μMのタウ濃度で10〜20μM程度の遊離脂肪酸でも集合が誘発された。加えて、種々のタウ単離物の自発的および誘発的集合において測定される違いは配列及び／又はホスホリル化がタウ・ポリマー化の調節に一定の役割を果している可能性を示唆している。繊維処理及び微小管サイクリング中に存在するキナーゼおよびリン酸塩の活性は微小管に関連した蛋白質２に関して示されたのと同様に、脳全体から精製されたタウのそれとは異なった微小管タウのホスホリル化状態をつくりだすことが予想される。若い、及び成長した脳は異なった組み合わせの発達的に調節されたキナーゼおよびホスフェートを含んでおり、これら２つの供給源から精製されたＭＴτがそのリン酸塩含有率においても異なっている。遺伝子組換えタウ蛋白質はホスホリル化残基を含んでいることは考えられない。これらホスホリル化状態のいずれもイン・ビボで起きるとは限らないことを強調しなければならない。遊離脂肪酸の存在及び不存在下で集合されるタウの比較はいくつかの物理的なパラメータと形状的に区別のつかないフィラメントの形成に同様に依存していることを明らかにする。遊離脂肪酸は形成されるフィラメントのタイプを変えずに集合を促進するように思われるので、それらはホスホリル化およびさらにタウのポリマー化を調節する可能性のあるその他のファクターの研究で一般的に利用する可能性について証明する必要がある。
タウ集合のメカニズムについてのその示唆の故にさらに詳しい調査が必要なひとつの研究は還元性に変化があった時に観察されるフィラメント長とフィラメント数との間の相互関係である。核化および延長というできごとが一定の下部構造のプールに対して競合するのであれば、その場合還元性を増大し、それによってジスルフィドに依存する二量体化の減少は２つの方法で解釈できるであろう。第１に、二量体化の減少が核化を犠牲にして延長を促進することである。このことは過剰なＤＴＴの存在下で形成されるタウ二量体がフィラメント末端へのタウ・モノマーの付加を抑制するする可能性を示唆しており、この現象はこうした条件では存在すると思われる過剰の単量体を考えれば可能性はなさそうに考えられる。第２に、二量体化が減少すると核化が抑制され、一層の延長が可能になることである。後者の解釈と一致しているのは10mM ＤＴＴを0.01〜1.0mM ＤＴＴと比較した場合に観察される総ポリマー重量（フィラメント数×平均長、図13Ｃ）における50％以上の減少で、これは還元性がより大きいと集合が全体的に抑止されることを示唆している。このデータについての解釈はタウ消去構造物のポリマー化に先行して分子内でのジスルフィドに基づく二量体化が起きるという従来の報告を裏付けている（Willeら、1992；Schweersら、1995）。ポリマー化に先行する折り込み現象によってつくられる親水性領域は２つの並列するタウ単量体が共有するジスルフィド結合を保護して、還元条件下でかなりの数の二量体の形成を可能にする。タウ・ポリマー化に対する遊離脂肪酸の促進的効果はこの親水性領域の安定化、およびそれに関連した折り込まれたタウの形状によって緩和されるのかもしれない。
類澱粉質集合を促進する遊離脂肪酸の能力はＡβ形状ペプチドの集合促進形状の安定化によってもたらされている可能性もある。チオフラビン結合アッセイは遊離脂肪酸がポリマー重量の増大を促進するが、それはフィラメントの核化や延長にはそれほど関与していないことを示している。しかしながら、遊離脂肪酸で処理した短い試料におけるフィラメントの少なさは核化が制限されることを示唆している。遊離脂肪酸を含まない10μM溶液内で、25μMでは自発的な集合が観察されるが、10μMでは観察されず、可溶性の集合を促進するペプチドの濃度は集合に必要な臨界濃度以下である可能性がある。遊離脂肪酸によるペプチドの集合促進性形状の安定化は上記臨界濃度以上に濃度を上げてしまい、ペプチド溶液内に最初に存在している短いフィラメントの群の延長をもたらす可能性がある。形状変化の可能性は脂肪酸のＡβペプチドの親水性残基との相互作用によって媒介される可能性がある。報告されているapoＥのＡβとの相互作用はペプチドの親水性にも依存しており、apoＥの脂質結合領域によって媒介される。従って、apoＥ及び遊離脂肪酸の集合促進活性は種々の基質によって共有される特性である可能性がある。β−類澱粉質のポリマー化が可逆的なプロセスであることを考えれば、フィラメント延長の速度を増大するいずれのファクターも類澱粉質ポリマーの分解と正常の除去を減少させ、それによって類澱粉質分解に貢献している。
ＡＤの病理に対する遊離脂肪酸の関与の可能性を認識すれば、イン・ビトロでのポリマー集合を促進することが示されている遊離脂肪酸の濃度がイン・ビボで生理学的に関連しているかどうかを調べることは興味がある。遊離脂肪酸の細胞内濃度は直接には測定されていないが、しかしながら遊離脂肪酸の融合を促進し遊離脂肪酸の細胞内緩衝液としてふるまうことと考えられる蛋白質であると考えられる脂肪酸結合蛋白質への結合に関して報告されている分解定数（0.2〜0.3μM）から推定されるように、低いマイクロモル範囲にある可能性がある。従って、遊離脂肪酸に依存する病理効果の誘発は低いマイクロモル範囲の遊離脂肪酸濃度で起きると予想され（つまり、通常の生理的な状態よりわずかに高い）、これはタウ集合の促進に関して示された５〜10μMの見かけ上の臨界と一致している。ＣＳＦでは、非エステル化脂肪酸濃度は低いマイクロモル範囲（10-6〜10-5）でも測定されたが、物理的な外傷に対応して30〜50μMまで上昇することが報告されている。６〜８の高親水性遊離脂肪酸結合箇所でもＣＳＦ内のアルブミンの濃度は２〜３μM程度に過ぎないので、アルブミンの緩衝能力は一定の外傷関連条件下でそれを上回り、細胞外、及び膜通過拡散による細胞内遊離脂肪酸レベルの両方の上昇をもたらす可能性がある。この後者の観点に関連して、類澱粉質沈着の増大と頭部外傷に犠牲者の間でのＡＤの多発がある。
不飽和遊離脂肪酸がタウ及びＡβ１−40集合を促進する能力をもっていることはホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）活性がＡＤ病態の発生に関連しているかもしれないことを示唆している。多くのＰＬＡ2酵素はＣａ++で活性化され、信号変換異型Ｇ蛋白質に直接、あるいは間接的に結合して、この蛋白質は次に受容体結合神経伝達因子、ホルモン、サイトカイン、バクテリア毒素、及びフッ化アルミニウムなど多くの因子によって活性化されるようになる。ＰＬＡ2活性によってつくりだされるアラキドン酸のレベルは記憶形成のプロセスに関連した現象である長期相乗作用（ＬＰＴ）中に上昇される。いくつかの条件下で、レクチン：コレステロール・アシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）もＰＬＡ2活性を示す。血清ＬＣＡＴは通常りん酸脂質類から脂肪酸を解放してその遊離コレステロールによるエステル化に対する触媒作用を果たし、十分な遊離コレステロールが存在しなければ遊離脂肪酸がつくりだされる。脳内で合成されＣＳＦのリポプロテインの成分でもあるこの酵素は、それが最近確認されたＡＤの一般的な因子であるapoＥによって活性化されることを考えると、特殊な役割を果たしている可能性がある。apoＥ内のリスク形成対立形質性変差がそのＬＣＡＴの活性化を調節できるかどうかはまだ分かっていない。
同時に発生するが脳全体で相互に相関関係をもたない形態で分布する２つの異なった病変の出現によって特徴づけられる多因子性疾患において、分散可能な遊離脂肪酸は病原に影響を及ぼしている可能性の高い候補である。以下のモデル（図16に図式的に示す）が遊離脂肪酸不均衡からＡＤが空間的、暫定的にどのように進行していくかを示す例として提案される。ＮＰ形成の最も初期的な段階から始まって、フィラメント状類澱粉質の最初の沈着によってつくりだされる毒素的効果が神経系の劣化と周辺ニューロピル内にグリアシン細胞をつくりだす。この最初の類澱粉質のポリマー化はＡｂの局所濃度が集合を引き起こす臨界濃度を越えると発生し、これは上記臨界濃度におけるペプチド濃度の上昇あるいは低下から起きている可能性がある、これらのいずれも多数の遺伝的、あるいは環境的由来の多数の因子にその原因を求めることができるであろう。初期病変斑点に関連したアストロサイトとして、それらはＡＤ脳で観察されるのと同様、apoＥ生産において増加傾向を示す。脂質の伝達及び代謝の調節におけるその役割から、apoＥの異なったアイソフォームは遊離脂肪酸放出におけるアイソフォームに依存した上昇を起こすことができる。これはいろいろなやり方で起きていると考えられ、これまでに明らかにされた自由な代謝経路の要素だけが関与している。遊離脂肪酸放出のapoＥに依存したシミュレーションによって類澱粉質集合をさらに誘発させることができるようになり、その斑点のさらなる発展を促進する能動的なフィードバック・ループが確立されている。加えて、遊離脂肪酸の局所的な増大はその斑点に関連した劣化しつつある神経炎内のタウ・ポリマーの集合を誘発させるであろう。ＮＦＴ及びニューロピル糸内でのタウのポリマー化に関しては、先ず、タウ蛋白質が細胞内リパーゼの通常の作用の結果として遊離脂肪酸の一定の基本濃度に構成的に露出されていることに留意する必要がある。ニューロンがつくられて、この露出基本レベルを増大させるいくつかの条件によってタウ・フィラメントの集合をもたらす可能性がある。遊離脂肪酸の細胞内レベルがＣＳＦ内を循環しているＮＰを奪われた遊離脂肪酸によって十分な程度まで上昇されると、タウ・ポリマー化のプロセスがこのつくられたニューロンの群内で開始されるのであろう。
脳内の脂質の代謝は現在の段階ではまだ良く分かっていないので、上昇されたapoＥのレベルが遊離脂肪酸放出をどのような手段で調節することができるのかは血清脂質代謝におけるこの蛋白質の知られている役割に照らして検討される必要がある。上に述べたように、apoＥはＬＣＡＴを活性化させる因子である。ＣＳＦ内の非エステル化コレステロールの存在によってＬＣＡＴによるコレステロール・エステル化の割合が制限されるのであれば、その場合ＬＣＡＴの活性が増大すればその酵素の脱アキレート化活性はその酵素のエステル化活性を上回ってしまい、apoＥ関連脂質からの遊離脂肪酸の細胞外への放出をもたらすであろう。また、apoＥは脂質を細胞に提供することによって遊離脂肪酸の細胞内放出を調節する可能性もある。この点で、apoＥのリポプロトシン及びＬＤＬに対するapoＥのアイソフォーム固有結合が実証されている。別のapoＥ受容体である非常に密度が低いリポプロテイン受容体はＡＤ脳内ではそのレベルが上昇しており、日本人の間ではＡＤの危険因子として確認されている。この受容体の固有の対立形質を有している固体間ではＡＤの発生率が２倍高いことが観察されている。
病原の遊離脂肪酸モデルにおいて、関連する最初の事態は類澱粉質フィラメントの集合で、これは類澱粉質カスケード仮定と一致している。しかしながらこの仮定とは対照的に、ＡＤの危険因子は類澱粉質ポリマー化の速度を増大させるものだけに限定されず、ＮＰ生成を遊離脂肪酸放出と結びつけるファクターも含むであろう。遊離脂肪酸モデルはＮＦＴ形成のためのニューロンを標的とすることはそのニューロンのその後の死とは切り離すことができること、そしてタウ・ポリマー化がニューロンの機能喪失およびその結果としてのその疾患の臨床的発現に直接関与していることを示唆している。これはＮＦＴがこの壊死プロセスの『墓石』にすぎないという見解とは対照的である。ＮＰ以外の供給源から奪われた遊離脂肪酸はタウ・ポリマー化を能動的に誘発させる場合もあるから、ＮＦＴは細胞内遊離脂肪酸放出およびＮＰの不在で特徴づけられる他の病態状態において発生することが予想される。同様に、類澱粉質の沈着を遊離脂肪酸放出に結びつける危険因子が存在しない場合に、類澱粉質の集合はタウ病態を同時に誘発させることなく起きる可能性がある。上にも述べたように、類澱粉質の最初の沈着とＮＦＴ形成のためのニューロンの生成に関与するファクターは恐らく多数あり、さらにいろいろな起源に由来しており、ＡＤ症例の比較においてＮＦＴとＮＰの相対的な数がかなり違っている理由もそこにあるのであろう。
遊離脂肪酸によって促進されるタウおよび類澱粉質集合についての実証はＡＤにおけるこれら構造的に独自の特徴を有する病変の形成が通常のエフェクタ分子によって媒介されているということについての新しい証拠を提供する。生物学的なシステムに対する遊離脂肪酸の関連性は確認されている危険因子および観察されている病態の多くを取り入れた単純明解なモデルを提供してくれる。この遊離脂肪酸に基づく発病モデルはＡＤにおいて遊離脂肪酸のＣＳＦレベルが上昇すること、そしてそのレベルが脳における総斑点負荷に比例することを予想している。このモデルはまた、ＡＤ脳において独自に観察される細胞外類澱粉質と細胞内タウ・ポリマーの同時平行的出現についての説明も示唆している。ＡＤ発病におけるリパーゼ活性を有する種々の酵素の関与もアルツハイマー病の治療のための治療標的を示している。
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本明細書に述べられているすべての特許あるいは出版物は本発明が関連する技術分野の当業者のレベルに対応するものである。これらの特許及び出版物は、個々の出版物が参照によって具体的、個別的に取り込まれるのと同じ程度にここに組み込まれるものである。
当業者であれば本発明が、本質的に付随する上に述べられた課題を実行し、目的と利点を達成するのによく適合していることは容易に理解できるであろう。ここに示されている実施例はその方法、手順、処理、分子、および具体的な化合物と共に本発明の現時点での代表的実例であり、具体例であって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。請求項の範囲に定義されている本発明の精神の範囲内で変更や他の使用法が可能なことは当業者には自明であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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