(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｉｌｅ β３３ Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ α５１ Ｃｙｓ−Ａｓｐ β９９ Ｃｙｓ）、（Ｇｌｎ α５ Ｃｙｓ−Ａｒｇ β８ Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ α３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ β３５ Ｃｙｓ）および（Ｈｉｓ α９０ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ βｙ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間において、サブユニット間非天然ジスルフィド架橋を含むことを特徴とする、αサブユニットとｈＣＧのβサブユニットからなるヒトゴナドトロピン。
【請求項２】
（Ｇｌｎ α５ Ｃｙｓ−Ｔｒｐ β８ Ｃｙｓ）および（Ａｒｇ α３５ Ｃｙｓ−Ａｌａ β３５ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間において、サブユニット間非天然ジスルフィド架橋を含むことを特徴とする、αサブユニットとＬＨのβサブユニットからなるヒトゴナドトロピン。
【請求項３】
（Ｇｌｎ α５ Ｃｙｓ−Ｓｅｒ β２ Ｃｙｓ）および（Ｔｙｒ α３７ Ｃｙｓ−Ｔｒｐ β２７ Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間において、サブユニット間非天然ジスルフィド架橋を含むことを特徴とする、αサブユニットとＦＳＨのβサブユニットからなるヒトゴナドトロピン。
【請求項４】
治療物質として用いられる請求項１〜３のいずれか一項に記載のゴナドトロピン。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の１種類以上のゴナドトロピンおよび医薬上許容されうるキャリヤーを含む卵巣刺激および男性性機能低下のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はゴナドトロピン、該ゴナドトロピンを含有する医薬組成物および該ゴナドトロピンをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゴナドトロピンは構造的に関連する一群の糖タンパク質ホルモンである。代表的なものには絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）がある。ＦＳＨ、ＬＨおよびＴＳＨはほとんどの脊椎動物種に存在し、脳下垂体により合成、分泌される。ＣＧはこれまではヒト等の霊長類とウマのみに発見されており、胎盤組織により合成される。
【０００３】
ゴナドトロピンはαとβと呼ばれる２種類の異なるサブユニットからなるヘテロダイマーであり、これらサブユニットは非共有結合により会合している。一つの種内では、αサブユニットはゴナドトロピンファミリーの各メンバーに関しては基本的には同一であり、種間で高度に保存されてもいる。βサブユニットは各メンバー間、すなわちＣＧ、ＦＳＨ、ＴＳＨおよびＬＨ間で異なっているが、構造的にはかなりの相同性が見られる。さらに、βサブユニットも種間でかなり高度に保存されている。ヒトにおいては、αサブユニットは９２アミノ酸残基からなるが、βサブユニットは各メンバー間で大きさが異なり、ｈＦＳＨで１１１残基、ｈＬＨで１２１残基、ｈＴＳＨで１１８残基、ｈＣＧで１４５残基である（Ｃｏｍｂａｒｎｏｕｓ，  Ｙ．（１９９２），  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １３，  ６７０−６９１，  Ｌｕｓｔｂａｄｅｒ，  Ｊ．Ｗ．ら（１９９３），  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １４，  ２９１−３１１）。ｈＣＧのβサブユニットは、Ｃ末端に約３４個の付加的なアミノ酸（以下、カルボキシ末端タンパク質（ＣＴＰ）と称する）を有している点で他のβサブユニットよりも実質的に大きい。
【０００４】
ヘテロダイマーの二つのサブユニットは多くの保存されたサブユニット内ジスルフィド架橋を示し、αサブユニットには５個のジスルフィド架橋、βサブユニットには６個のジスルフィド架橋がある。対応するシステイン残基は、ゴナドトロピンファミリーのすべてのメンバー間で完全に保存されている。ｈＣＧの最近得られたＸ線構造から、これらのジスルフィド架橋はジスルフィドの結び目（ｋｎｏｔ）と呼ばれる典型的な三次元構造パターンに関与していることが示されている。ゴナドトロピンはＮ−グリコシル化することのできる３又は４個のアスパラギン残基を有している。さらに、ｈＣＧのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）は４つのセリンの位置でＯグリコシル化することができる。
【０００５】
ゴナドトロピンは、代謝、体温調節および生殖プロセス等の多様な体機能に重要な役割を果たしている。例えば、下垂体ゴナドトロピンＦＳＨは卵胞の発達と成熟の促進に中心的な役割を果たしている一方で、ＬＨは排卵を誘導する（Ｓｈａｒｐ，  Ｒ．Ｍ．（１９９０），  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，  ３３，７８７−８０７；  ＤｏｒｒｉｎｇｔｏｎとＡｒｍｓｔｒｏｎｇ  （１９７９），  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．  Ｈｏｒｍ．  Ｒｅｓ．，  ３５，  ３０１−３４２）。最近、ＦＳＨは単独またはＬＨ活性と組み合わせて、卵巣刺激、すなわちインビトロ受精（ＩＶＦ）の卵巣過剰刺激および不妊症無排卵女性のインビボ排卵の誘導（Ｉｎｓｌｅｒ，  Ｖ．（１９８８），  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，  ３３，  ８５−９７，  ＮａｖｏｔとＲｏｓｅｎｗａｋｓ（１９８８），  Ｊ．  Ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔ．  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，  ５，  ３−１３）および男性の性機能低下のために臨床的に応用されている。
【０００６】
現在、治療目的のゴナドトロピンはヒト尿から単離されており、純度が低い（Ｍｏｒｓｅら（１９８８），  Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １７，  １４３）。これらの尿性ゴナドトロピンとは対照的に、組換えゴナドトロピンは均一な品質、すなわち再現性のある生化学的および生物学的性質を有している点で非常に好都合である。ゲノムクローンとｃＤＮＡクローンはすべてのサブユニットについて作られており、それらの一次構造が解明されている。さらに、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をヒトゴナドトロピンのサブユニット遺伝子でトランスフェクションした細胞が完全なダイマーを分泌することができることが示されている（例えば、Ｋｅｅｎｅら（１９８９），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２６４，  ４７６９−４７７５；  Ｖａｎ  Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋら（１９９０），  Ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  （ｅｄｓ  Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ  Ｄ．Ｊ．Ａ．およびＳｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ  Ｈ．編），  ２４５−２５１）。
【０００７】
それ以来、例えば組換えＦＳＨの生化学的および生物学的特性は天然のＦＳＨのものとほとんど同一であることが示されている（Ｍａｎｎａｅｒｔｓら（１９９１），  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １２９，  ２６２３−２６３０）。さらに、組換えＦＳＨを用いる調節された卵巣の過剰排卵後に妊娠が得られた（Ｇｅｒｍｏｎｄら（１９９２），  Ｌａｎｃｅｔ，  ３３９，  １１７０，  Ｄｅｖｒｏｅｙら（１９９２），  Ｌａｎｃｅｔ，  ３３９，  １１７０−１１７１）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
二つのサブユニットをダイマーにうまく組み合わせることがダイマーの生物学的活性にとっての絶対の必須条件である。ヘテロダイマーを対応するサブユニットに解離することはインビボ生物活性の損失の主要な要因であると考えられている。さらに、解離や脱アミド化等のプロセスのために、保存期間を短くしなければならない。したがって、ヘテロダイマーの熱力学的な安定性はインビボとインビトロの両方の条件下でゴナドトロピンの半減期に影響を与える重要な因子であると考えられている。よって、ゴナドトロピンの安定性がさらに改良されることが臨床的に求められている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明はそのようなゴナドトロピンを提供することにある。驚くべきことに、１つ以上の非天然ジスルフィド架橋をゴナドトロピンに導入した結果、該ゴナドトロピンの安定性が向上することが見出された。本明細書に記載の非天然ジスルフィド架橋とは、天然のゴナドトロピンには見られないジスルフィド架橋であり、したがって、この非天然のジスルフィド架橋には天然のゴナドトロピンに存在するαサブユニット中の５つのジスルフィド架橋もβサブユニット中の６つのジスルフィド架橋も含まない。「天然の」ゴナドトロピンはその関連する組織から単離されたゴナドトロピンと同じアミノ酸配列を有するゴナドトロピンである。
【００１０】
したがって、本発明は１つ以上の非天然のジスルフィド架橋を有するαサブユニットとβサブユニットからなるゴナドトロピンを提供する。
【００１１】
この非天然ジスルフィド架橋は部位特異的突然変異誘発（関連部位の天然のアミノ酸残基のシステインへの点突然変異）を用いて導入することができる。この点突然変異はＸ  αｙ  ＣｙｓまたはＸ  βｙ  Ｃｙｓ（ここでＸは、αサブユニットまたはβサブユニットの関連部位ｙでシステインにそれぞれ変異させたアミノ酸残基である）の形で示す（アミノ酸には３文字コードを用いる）。Ｃｙｓαｙ  ＣｙｓまたはＣｙｓ  βｙ  Ｃｙｓとの表記は天然サブユニットのシステインの位置ｙを示す。本発明による点突然変異はゴナドトロピンの高次構造にはわずかな変化をもたらす。
【００１２】
本発明の範囲は１つのみの変異が導入されたゴナドトロピンの態様も包含する。そのような変異をαまたはβサブユニットをコードするＤＮＡに導入して、すでに存在するシステイン残基とジスルフィド架橋を形成することができる新しいシステイン残基を得ることができる。そのような変異は好ましくはαサブユニット、さらに好ましくはアミノ酸位置８８〜９２に導入される。
【００１３】
本発明による非天然のジスルフィド架橋は、異なるサブユニットに配置されている一対のアミノ酸残基間（サブユニット間）に存在することができる。さらに、非天然ジスルフィド架橋は、両アミノ酸残基が同じサブユニットに配置されている一対のアミノ酸残基間（サブユニット内）に存在することもできる。任意に、本発明による１つ以上の非天然ジスルフィド架橋の存在の結果として、１１個の天然のジスルフィド架橋のうち１つ以上を欠落させてもよい。
【００１４】
本発明による非天然ジスルフィド架橋はダイマーの解離を妨げて、天然のゴナドトロピンに比べて高度なインビトロおよびインビボ生物活性と向上した保存期間とをもたらす。さらに、それらはゴナドトロピンのポリペプチド骨格の柔軟性を減じることで、これらのゴナドトロピンは脱アミド化が受けにくくなっている。脱アミド化はその純度とタンパク質の安定性にマイナスの影響を与え、かつ生理学的条件下で起こる自発的なプロセスである。
【００１５】
サブユニット間かサブユニット内に非天然のジスルフィド架橋の組合せが存在するゴナドトロピンも本発明の範囲内にある。
【００１６】
αサブユニットがヒト由来である本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｐｈｅα１８  Ｃｙｓ−Ｉｌｅ  α２５  Ｃｙｓ）、（Ｇｌｎ  α２０  Ｃｙｓ−Ａｌａ  α２３  Ｃｙｓ）、（Ｓｅｒ  α３４  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  α５７  Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ  α３９  Ｃｙｓ−Ｔｈｒ  α５４  Ｃｙｓ）、（Ａｌａ  α６２Ｃｙｓ−Ｈｉｓ  α７９  Ｃｙｓ）、および（Ｌｙｓ  α６３  Ｃｙｓ−Ａｌａ  α８１  Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ  α６５  Ｃｙｓ−Ｈｉｓ  α７９  Ｃｙｓ）、および（Ａｓｎ  α６６  Ｃｙｓ−Ａｓｎ  α７８  Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット内非天然ジスルフィド架橋を含む。
【００１７】
βサブユニットがｈＣＧのβサブユニットである本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｇｌｎ  α５  Ｃｙｓ−Ａｒｇ  β８  Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ  α２４  Ｃｙｓ−Ｇｌｙ  β７１  Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ  α２９  Ｃｙｓ−Ｍｅｔ  β４１  Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ  α３５  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β３５  Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ  α３７  Ｃｙｓ−Ｉｌｅ  β３３  Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ  α５１  Ｃｙｓ−Ａｓｐ  β９９  Ｃｙｓ）および（Ｈｉｓ  α９０  Ｃｙｓ−Ｃｙｓ  βｙ  Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架橋、および／または、（Ｐｒｏ  β４  Ｃｙｓ−Ｐｒｏ  β７  Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ  β１１Ｃｙｓ−Ｔｈｒ  β３２  Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ  β１１  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β８５  Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ  β３２  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β８５  Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ  β６０  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  β８７  Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ  β６０  Ｃｙｓ−Ｇｌｎ  β８９  Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ  β６１  Ｃｙｓ−Ｌｅｕ  β８６  Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ  β６１  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  β８７  Ｃｙｓ）、（Ｓｅｒ  β６６  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  β８１  Ｃｙｓ）および（Ｌｅｕ  β６９  Ｃｙｓ−Ｐｒｏ  β７８  Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット内ジスルフィド架橋を含むことができる。好ましくは、本発明によるｈＣＧは、（Ｍｅｔ  α２９  Ｃｙｓ−Ｍｅｔ  β４１  Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ  α３７  Ｃｙｓ−Ｉｌｅβ３３  Ｃｙｓ）、または（Ｌｙｓ  α５１  Ｃｙｓ−Ａｓｐ  β９９  Ｃｙｓ）または（Ｈｉｓ  α９０  Ｃｙｓ−Ｃｙｓ  βｙ  Ｃｙｓ）のアミノ酸対間にサブユニット間非天然ジスルフィド架橋を含むことができる。
【００１８】
βサブユニットがｈＬＨのβサブユニットである本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｇｌｎ  α５  Ｃｙｓ−Ｔｒｐ  β８  Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ  α２４  Ｃｙｓ−Ｇｌｙ  β７１  Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ  α２９  Ｃｙｓ−Ｍｅｔ  β４１  Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ  α３５  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β３５  Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ  α３７  Ｃｙｓ−Ｉｌｅ  β３３  Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ  α５１  Ｃｙｓ−Ａｓｐ  β９９  Ｃｙｓ）および（Ｈｉｓ  α９０  Ｃｙｓ−Ｃｙｓ  βｙ  Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架橋、および／または、（Ｐｒｏ  β４  Ｃｙｓ−Ｐｒｏ  β７  Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ  β１１Ｃｙｓ−Ｔｈｒ  β３２  Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ  β１１  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β８５  Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ  β３２  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β８５  Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ  β６０  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  β８７  Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ  β６０  Ｃｙｓ−Ａｒｇ  β８９  Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ  β６１  Ｃｙｓ−Ｌｅｕ  β８６  Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ  β６１  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  β８７  Ｃｙｓ）、（Ｓｅｒ  β６６  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  β８１  Ｃｙｓ）および（Ｌｅｕ  β６９  Ｃｙｓ−Ｐｒｏ  β７８  Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架橋を含む。本発明の好ましいゴナドトロピンは、（Ｍｅｔ  α２９  Ｃｙｓ−Ｍｅｔ  β４１  Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ  α３７  Ｃｙｓ−Ｉｌｅ  β３３  Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ  α５１  Ｃｙｓ−Ａｓｐ  β９９  Ｃｙｓ）または（Ｈｉｓα９０  Ｃｙｓ−Ｃｙｓ  βｙ  Ｃｙｓ）のアミノ酸対間にジスルフィド架橋を含むｈＬＨである。
【００１９】
βサブユニットがｈＦＳＨのβサブユニットである本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｇｌｎ  α５  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  β２  Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ  α２４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ  β６５  Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ  α２９  Ｃｙｓ−Ａｒｇ  β３５  Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ  α３５  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β２９  Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ  α３７  Ｃｙｓ−Ｔｒｐ  β２７  Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ  α５１  Ｃｙｓ−Ａｓｐ  β９３  Ｃｙｓ）および（Ｈｉｓ  α９０  Ｃｙｓ−Ｃｙｓ  βｙ  Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架橋、および／または、（Ｌｅｕ  β５  Ｃｙｓ−Ｔｈｒ  β２６  Ｃｙｓ）、（Ｌｅｕ  β５  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β７９  Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ  β２６  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β７９  Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ  β５４  Ｃｙｓ−Ｇｌｎ  β８１  Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ  β５４  Ｃｙｓ−Ｈｉｓ  β８３  Ｃｙｓ）、（Ｇｌｕ  β５５  Ｃｙｓ−Ｔｈｒ  β８０  Ｃｙｓ）、（Ｇｌｕ  β５５  Ｃｙｓ−Ｇｌｎ  β８１  Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ  β６０  Ｃｙｓ−Ｔｈｒ  β７５  Ｃｙｓ）および（Ｖａｌ  β６３  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  β７２  Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット内ジスルフィド架橋を含む。本発明の好ましいゴナドトロピンは、βサブユニットが（Ｔｙｒ  α３７  Ｃｙｓ−Ｔｒｐ  β２７  Ｃｙｓ）または（Ｈｉｓ  α９０  Ｃｙｓ−Ｃｙｓ  βｙ  Ｃｙｓ）のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架橋を含むｈＦＳＨである。
【００２０】
βサブユニットがｈＴＳＨのβサブユニットである本発明の適当なゴナドトロピンは、（Ｇｌｎ  α５  Ｃｙｓ−Ｐｈｅ  β１  Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ  α２４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ  β６６  Ｃｙｓ）、（Ｍｅｔ  α２９  Ｃｙｓ−Ａｒｇ  β３４  Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ  α３５  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β２８  Ｃｙｓ）、（Ｔｙｒ  α３７  Ｃｙｓ−Ｉｌｅ  β２６  Ｃｙｓ）、（Ｌｙｓ  α５１  Ｃｙｓ−Ａｓｐ  β９４  Ｃｙｓ）および（Ｈｉｓ  α９０  Ｃｙｓ−Ｃｙｓ  βｙ  Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット間ジスルフィド架橋、および／または、（Ｐｒｏ  β４  Ｃｙｓ−Ｔｈｒ  β２５  Ｃｙｓ）、（Ｐｒｏ  β４  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β８０  Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ  β２５  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β８０  Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ  β５５  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  β８２  Ｃｙｓ）、（Ａｒｇ  β５５  Ｃｙｓ−Ｌｙｓ  β８４  Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ  β５６  Ｃｙｓ−Ｌｅｕ  β８１  Ｃｙｓ）、（Ａｓｐ  β５６  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  β８２  Ｃｙｓ）、（Ｔｈｒ  β６１  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  β７６  Ｃｙｓ）および（Ｉｌｅ  β６４  Ｃｙｓ−Ｐｒｏ  β７３  Ｃｙｓ）の１つ以上のアミノ酸対間にサブユニット内ジスルフィド架橋を含む。
【００２１】
サブユニット間およびサブユニット内の非天然ジスルフィド架橋の組合せも本発明の範囲に包含されることが明らかであろう。
【００２２】
上記の変異の位置はヒトゴナドトロピンのアミノ酸配列に関連する。他の種からのゴナドトロピンのサブユニット内の類似の非天然ジスルフィド架橋も本発明の範囲内にある。システインに変異させるアミノ酸残基の正確な位置は該ゴナドトロピンのサブユニットの配列とヒトゴナドトロピンサブユニットの配列とを並べ合わせることから導くことができる。
【００２３】
ジスルフィド結合がサブユニットの折たたみと組み立て中に果たす主要な役割のために、本発明による非天然ジスルフィド架橋の導入が適正に折り畳まれたゴナドトロピンの形成を妨害しないということは非常に驚くべきことである。適当なジスルフィド結合の形成は機能的ゴナドトロピンの折たたみと成熟化にとって重要な事象である。特に、βサブユニットでのジスルフィド結合の形成は重要であり、すべてのジスルフィド結合が効率的な組合せと折たたみのために必要とされる。ｈＣＧの折たたみの詳細な研究により、該分子の折たたみが単純な連続的な経路により進むのではなく、分子の異なるドメインで独立して進むことが明らかとなった。したがって、αサブユニットおよび／またはβサブユニットにさらにシステイン残基を導入することは折たたみのプロセスを乱して分子の立体構造を壊し、その結果として分子の機能性と生物活性を損じると考えられた。これは、特に、非常に多くのシステインが既にこれらの分子に存在しているからである。
【００２４】
本発明によりシステインとする点突然変異は全体的なアミノ酸組成とタンパク質特性をわずかに変えるだけなので、本発明のゴナドトロピンはそれらの潜在的な免疫原性が野性型ゴナドトロピンの免疫原性とは実質的に異ならない利点をさらに有している。特に、非天然ジスルフィド架橋がゴナドトロピンのダイマー界面に置かれたときに、その免疫原性に及ぼす影響は無視することができよう。
【００２５】
本発明のゴナドトロピンはその変異部位によってアゴニストまたはアンタゴニストとなることができる。既に示したように、変異部位は分子の高次構造にわずかな変化を導くであろう。変異部位として、レセプター結合および／またはシグナル形質導入に関連したタンパク質部分を選択した場合、本発明の非天然ジスルフィド架橋は、糖タンパク質の向上した安定性とともにシグナル形質導入活性の部分的または完全な損失をもたらすであろう。したがって、本発明は向上した安定性を有するアンタゴニストを提供する。変異部位として糖タンパク質の内部核のダイマー界面を選択する場合、得られる非天然ジスルフィド架橋はレセプター結合および／またはシグナル形質導入活性に影響を与えないが、天然のゴナドトロピンと比較して向上した安定性をもたらすであろう。そのような変異の結果、向上した安定性を有するゴナドトロピンアゴニストが得られる。
【００２６】
本発明のゴナドトロピンは本分野で通常知られている他の改変を有してもよい。
【００２７】
本発明のゴナドトロピンの一つのそうした好ましい改変において、サブユニットの一つのアミノ酸配列のＣ末端は、任意にリンカー部分を介して、他のサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端に結合させる。このリンカー部分は好ましくは部分的または完全なＣＴＰ単位またはその変異体である。
【００２８】
本発明のゴナドトロピンの別の改変は、αサブユニットおよび／またはβサブユニットをそれらの対応するＮまたはＣ末端で部分的もしくは完全なＣＴＰ単位またはその変異体を用いて伸長させてもよい。この伸長は各ＣＴＰ単位を単一または複数の形で有してもよい。あるいは、完全なＣＴＰ単位または部分ＣＴＰ単位またはその複数の形のものを該サブユニットのＮまたはＣ末端に挿入することができる。
【００２９】
さらに、本発明のゴナドトロピンは、グリコシル化、部分グリコシル化または非グリコシル化のいずれかを受けていてもよい。本発明の部分グリコシル化または非グリコシル化ゴナドトロピンは、化学的改変、酵素的改変または部位特異的突然変異誘発のいずれかによって得ることができ、それによってゴナドトロピンの１つ以上のグリコシル化認識部位が除去される。あるいは、本発明のゴナドトロピンのグリコシル化パターンはさらに別のグリコシル化認識部位を導入し、任意に１つ以上のグリコシル化認識部位を除去することにより改変して、該ゴナドトロピンを改変グリコシル化することができる。本明細書で用いられるグリコシル化認識部位はアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここでＸはいずれのアミノ酸でもよい）からなる。
【００３０】
本明細書で用いるＣＧ、ＦＳＨ、ＬＨとＴＳＨのαサブユニットとβサブユニット並びにそれらのヘテロダイマー形は、一般的にそれらの慣用の定義を有し、示されるグリコシル化パターンとは関係なく、それ自体公知のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその対立遺伝子変異体を意味する。
【００３１】
これらタンパク質の「天然」形は、その関連する脊椎動物組織から単離されたアミノ酸配列を有し、これらの公知の配列それ自体またはそれらの対立遺伝子変異体を有しているタンパク質である。
【００３２】
これらの「変異体」は天然のタンパク質と比較してアミノ酸配列に計画的な変更を有するタンパク質である。これらの変更には単一もしくは複数の欠失、挿入、置換およびそれらの組合せが挙げられ、例えば部位特異的突然変異誘発または他の組換え操作により作ることができ、または合成により調製することができる。これらの変更は保存アミノ酸置換からなり、置換される残基は置換が行なわれるものと同じ一般的なアミノ酸のカテゴリーを有する。そのようなアミノ酸の分類は本分野では一般的に知られており、例えばＤａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．らａ（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  １９７２，  ５，  ８９−９９）による記載がある。
【００３３】
本明細書で用いる「ＣＴＰ単位」とは、Ｃ末端の残基のアミノ酸１１２〜１１８から１４５またはその部分まで伸びている、ｈＣＧβサブユニットのカルボキシル末端に見られるアミノ酸配列をいう。「完全」ＣＴＰ単位は、ＣＴＰのＮ末端に応じて２８〜３４アミノ酸を含む。「部分」ＣＴＰ単位は１１２位〜１１８位から１４５位までを含めた位置に存在するアミノ酸配列であるが、該配列は少なくとも一つのアミノ酸を、考えられる最も短い「完全」ＣＴＰ単位（アミノ酸１１８〜１４５）から欠失させてもよい。「複数（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）」ＣＴＰ単位は完全ＣＴＰ単位または部分ＣＴＰ単位のタンデム型配列または両者の組合せを包含するものと理解される。
【００３４】
本発明のいずれかのゴナドトロピンをコードするＤＮＡも本発明の範囲にある。本発明の該ＤＮＡは、置換されるアミノ酸をコードするコドンに代えて置換された１つ以上のシステインをコードするコドンからなる。本発明のＤＮＡは、システインをコードするコドンにより置換されるアミノ酸残基をコードする１つ以上のコドンを該ＤＮＡ中で置換することにより、天然のゴナドトロピンまたはその変異体をコードするＤＮＡから得ることができる。これらの置換は部位特異的突然変異誘発により実施することができる。
【００３５】
本発明のゴナドトロピンを構築する方法は本分野でよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、最新版）。最も実用的なアプローチは所望のタンパク質をコードするＤＮＡの発現によってこれらのゴナドトロピンを生産することである。部位特異的突然変異誘発技術、付加的配列の連結、ＰＣＲおよび適当な発現系の構築は現在ではすべてが本分野でよく知られている。所望のタンパク質をコードするＤＮＡの（好ましくは連結の容易さから制限部位を含む）一部またはすべてが標準的な固相技術を用いる合成で構築することができる。含まれるコード配列の転写と翻訳に適当な調節要素をＤＮＡのコード配列に付与することができる。よく知られているように、細菌等の原核生物宿主、および酵母、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞等の真核生物宿主などの多様な宿主に適合性のある発現系が利用できる。宿主の選択は特に翻訳後の事象に依存し、そのうちでも特にグリコシル化に依存する。グリコシル化の位置はほとんどの場合で分子内のグリコシル化部位の性質により調節されている。しかし、この部位をしめている糖の性質は主に宿主の性質により調節されている。
【００３６】
本発明のゴナドトロピンは天然のゴナドトロピンと同じ臨床的目的のために用いられるが、向上した安定性を示すという利点がある。これらの変異ゴナドトロピンは変異の種類によりアゴニストまたはアンタゴニストとして用いることができる。本発明の適当な医薬組成物は本発明の１種類以上のゴナドトロピンと医薬上許容しうるキャリヤーを含む。
【００３７】
医薬上許容しうるキャリヤーは当業者によく知られており、例えば、滅菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、ゴマ油および水が挙げられる。
【００３８】
さらに、本発明の医薬組成物は１種類以上の安定剤、例えば、ソルビトール、マンニット、デンプン、スクロースデキストリンおよびグルコースなどの炭水化物、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、およびアルカリ性リン酸塩のような緩衝剤などの１種類以上の安定剤を含有してもよい。
【００３９】
適当な投与経路は、筋内注射、皮下注射、静脈内注射または腹腔内注射、経口および鼻腔内投与である。
【００４０】
【発明の実施の形態】
以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきものではない。
【００４１】
【実施例】
実施例  １
インターチェインムテインの製造
ベクターの構築
付加的なインターチェイン（又は鎖間）ジスルフィド結合を有するｈＣＧムテインを発現するために３つの構築物を作った。そららの構造と全体的な構成は、ＣＨＯ細胞中で組換え野性型ｈＣＧ発現のために用いられるベクターｐＫＭＳ．ｈＣＧαg βc と基本的には同一である（図１）。各々のｈＣＧα（Ｆｉｄｄｅｓ，  Ｊ．Ｃ．とＧｏｏｄｍａｎ，  Ｈ．  Ｍ．（１９８１），Ｊ．  Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １，  ３−１８）およびβサブユニット遺伝子（Ｆｉｄｄｅｓ，  Ｊ．  Ｃ．とＧｏｏｄｍｍａｎ，  Ｈ．  Ｍ．（１９８０）  Ｎａｔｕｒｅ  ２８６，  ６８４−６８７）をｐＫＭＳに挿入した。ｃＤＮＡクローンをゲノムクローンと組み合わせることで完全な「ハイブリッド」ｈＣＧα遺伝子を調製し（Ｖａｎ  Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋら１９９０）、これを宿主細胞にトランスフェクションすると野性型αサブユニットを発現することができる。ｈＣＧβのｃＤＮＡは記載されたように単離し、ベクターｐＫＭＳ．ＦＳＨ中のＦＳＨβと交換した。α遺伝子の転写はＳＶ４０初期プロモーターによって指令されるが、β遺伝子はヒト重金属誘発性メタロチオネインＩＩａプロモーターの指令により転写される。３つのｈＣＧインターチェイン構築物が作られた（表１）。
【００４２】
ｈＣＧインターチェイン１中でαサブユニット変異を作るために、チロシンα３７をコードするコドンがシステインをコードするコドンと交換されるように特定の塩基置換を「ハイブリッド」ｈＣＧα遺伝子に導入した。これは標準的なＰＣＲ条件を用いて、部位特異的突然変異誘発および記載の配列（Ｅｒｉｃｈ，Ｈ．  Ａ．（１９８９）  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ，  ｐｐ  ６３−６６）と重なり合うＰＣＲ断片を組み合わせることにより行なった。ＰＣＲ断片は分けて、ｐＧＥＭ３Ｚにサブクローニングし、自動化シーケンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてチェックした。プライマーはサブクローニングされたＰＣＲ断片がｐＫＭＳ．ｈＣＧαg βc の天然のα鎖配列と交換できるように３’と５’の両方で変異のための適当な制限部位を持つように選択した。これは標準的な技術を用いて行なった。ｈＣＧインターチェイン１でβサブユニット変異を作るために、イソロイシンβ３３をコードするコドンがシステインをコードするコドンに変更されるように特定の塩基置換をｈＣＧβに導入した。変異ＰＣＲ反応、サブクローニングおよび配列決定をαサブユニット変異を作るために用いられたものと同等の方法を用いて行なった。ｈＣＧインターチェイン１の最終発現プラスミドの構築のために、ｈＣＧβｃ野性型遺伝子を、すでにαサブユニット変異を有しているｐＫＭＳ．ｈＣＧαg βc 構築物中の変異ｈＣＧβ断片と交換した。
【００４３】
（リジンα５１とアスパラギンβ９９をコードするコドンがシステインをコードするコドンに置き換えられた）ｈＣＧインターチェイン２をコードするベクターと（メチオニンα２９とメチオニンβ４１をコードするコドンがシステインをコードするコドンに置き換えられた）ｈＣＧインターチェイン３をコードするベクターの構築のために相応する方法に従った。
【００４４】
【表１】
0004086922.tif 000002
【００４５】
ＣＨＯ細胞のトランスフェクションと選択
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＣＨＯ  Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）に１０μｇのｐＫＭＳ．ｈＣＧインターチェイン構築物ＤＮＡを安定的にトランスフェクトした。ネオマイシン選択遺伝子を有する選択プラスミドを１０：１（ｐＫＭＳ  ｈＣＧインターチェインを過剰とする）のモル比で同時トランスフェクトすることで、Ｇ４１８（０．８ｍｇ／ｍｌ）を含有する培地で細胞を選択可能とした。
【００４６】
組換えＣＨＯ細胞を免疫反応性タンパク質の分泌について調べた。培養上清液はαとβに特異的なモノクローナル抗体を用いるｈＣＧサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。培養上清液のウェスタンブロッテイングによりｈＣＧインターチェインムテインがｒｅｃ−ｈＣＧ野性型に相当する分子量を有することが示された。
【００４７】
実施例  ２
サブユニット間のジスルフィド形成の分析
新しく導入されたシステインが酸化されてサブユニット間ジスルフィド結合となったかどうかを決定するために、Ｇ４１８耐性トランスフェクションプールからの細胞培養上清液の試料をＳＤＳ含有試料緩衝液中で沸騰させることにより溶解し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ＰＶＤＦメンブレンに移した。ｈＣＧはβサブユニットに対するモノクローナル抗体を用い、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した第二抗体ともにインキュベートし、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）／Ｃｏ++／Ｈ2 Ｏ2 を用いて染色することによる免疫染色を用いて目で確認できるものとした。サブユニット間ジスルフィド結合が形成されている場合、試料をＳＤＳ試料緩衝液中で沸騰しても二つのサブユニットは一緒に保持されるが、ジスルフィド架橋が形成されていない場合ではこれらの可溶化条件ではサブユニットに解離する。対照実験において、試料を室温で還元剤を用いず溶解するか、又はβ−メルカプトエタノール（βＭＥ）を添加することで溶解した（無傷のｈＣＧ）。後者の場合の変性では、インターチェインジスルフィド結合が存在するか否かにかかわらずサブユニットへの変性が起こる。図２のパネルＡに見ることができるように、βＭＥがない状態で室温で可溶化すると、無傷（ｉｎｔａｃｔ）の野性型ｈＣＧ（レーン３、約５０ｋＤの分子量）といくぶんかの遊離βサブユニット（約３２ｋＤの分子量）が検出できる。ＨＣＧインターチェイン１とＨＣＧインターチェイン２からの試料もだいたい同じ大きさの免疫反応性物質を含有し、無傷のｈＣＧムテインの存在を示している。加熱すると、約５０ｋＤバンド（パネルＢのレーン３）の消失から明らかなように野性型ｈＣＧはサブユニットに解離する。対照的に、このことはｈＣＧ変異体（パネルＢのレーン１と２）には起こっているようには見えず、分子間に共有結合があることを示している。還元剤の添加はｈＣＧと変異体をサブユニットに解離するために（パネルＣ）、βＭＥの添加試験の結果から、最終的に２つのサブユニットの分子間結合がジスルフィド結合によりもたらされていることを示している。
【００４８】
実施例  ３
ＬＨ／ＣＧレセプター結合
ＬＨ／ＣＧレセプターへの結合はｈＣＧの作用機構の最初の事象である。ヨウ素化ｈＣＧのラット睾丸膜への移動を用いるｈＣＧインターチェインムテインの相対的レセプター結合力を決定するためにインビトロレセプターアッセイを用いた（Ｒａｏ，  Ｍ．  Ｃ．ら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９７７）  １０１：５１２−５２３）。この目的のために、一定量の［125 Ｉ］ｈＣＧをラット睾丸膜と試料とともに試料の量を増やしながら室温で１８時間インキュベートした。これとは別に、最大結合を調べるために試料を入れずにインキュベーションを行なった。非特異的結合は１０００倍過剰の非標識リガンドを添加することにより決定した（Ｐｒｅｇｎｙｌ，  Ｏｒｇａｎｏｎ，  Ｗｅｓｔ  Ｏｒａｎｇｅ，  ＮＪ）。インキュベーションは試料を、０．１％のＢＳＡを補充した氷冷トリス緩衝液で２倍に希釈し、室温で５分間１５０，０００ｘＮ．ｋｇ-1で遠心することにより停止させた。上清を吸引した後、ペレット中の放射能をガンマカウンターを用いて測定した。
【００４９】
ｈＣＧインターチェイン１はｒｅｃ−ｈＣＧ野性型に相応するヨウ素化ｈＣＧの置換曲線を示している（図３参照）。このことはｈＣＧインターチェイン１のサブユニット間ジスルフィド結合がレセプター結合に何の影響も与えないことを示し、このムテインの高次構造がｒｅｃ−ｈＣＧ野性型と実際に同等のものであることを示している。ヨウ素化ｈＣＧのｈＣＧインターチェイン２による置換はいくぶんか減少した。これは恐らくこのインターチェインジスルフィド架橋がレセプター結合とシグナルトランスアクション（ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ）にとって重要な領域に位置するということによるものであろう。
【００５０】
実施例  ４
ｈＣＧ誘導テストステロンの産生
ｈＣＧはマウスライディッヒ（Ｌｅｙｄｉｇ）細胞でテストステロン産生を誘導する。Ｍａｎｎａｅｒｔｓら（Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ｏｆｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，（１９８７），  Ｒ．  Ｒｏｌｌａｎｄら（編），  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，  ４９−５８）により改良されたインビトロアッセイ（Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅら，  Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９７４）  ７７，  ６５５−６７１）を用いて、インターチェインジスルフィド結合を有するｈＣＧムテインのｈＣＧ生物活性を決定した（図４）。細胞をｈＣＧインターチェイン１で処理した結果、ｒｅｃ−ｈＣＧ野性型と同じ能力を有するテストステロン産生が用量依存的に得られた。したがって、ｈＣＧインターチェイン１は完全なｈＣＧアゴニストとみなすことができる。対照的に、ｈＣＧインターチェイン２のシグナルトランスデューシング能力はゼロまで減少し、ｈＣＧインターチェイン２が野性型ｈＣＧの完全アンタゴニストとして用いることができることを示した。
【００５１】
実施例  ５
雌ビーグル犬での薬物動態学的挙動
ｈＣＧインターチェイン１の薬物動態学的挙動を、雌ビーグル犬に筋内投与後に調べた。二匹の犬にｈＣＧインターチェイン１の一回の筋内注射を２５（ｈＣＧ  ＥＩＡ）ＩＵ／ｋｇの投与レベルで行なった。血液試料を注射前および注射の３０分後と１、１．５、２、３、４、６、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０および２６４時間後に採取した。免疫反応性ｈＣＧインターチェイン１の血漿レベルを、犬血漿で確認したｈＣＧ特異的時間分割蛍光抗体アッセイ（ｈＣＧ−ＤＥＬＦＩＡ）により測定した。ｈＣＧインターチェイン１のクリアランス曲線を図５に示す。比較のために、３匹の犬での筋内投与後のｈＣＧ（組換えｈＣＧ；  ２５  ｈＣＧ  ＥＩＡ  ＩＵ／ｋｇ）のクリアランス曲線を図５に示す。薬物動態学的パラメーターＡＵＣ（血漿レベル−時間曲線下の面積）、Ｃｍａｘ（ピーク濃度）、ｔｍａｘ（ピーク濃度の時間）、ｔ1/2 （血清除去半減期）およびクリアランス曲線から得られたＣＬ（クリアランス速度）を表２に示す。１４４時間ポイントと２４０時間ポイントとの間で測定された時間がｔ1/2 の決定に用いられた。
【００５２】
ｈＣＧインターチェイン１の筋内投与とｒｅｃ−ｈＣＧの筋内投与の比較の結果、ｈＣＧインターチェイン１ＡＵＣとｔ1/2 に関して高い値とＣＬに関して低い値が得られた一方で、Ｃｍａｘとｔｍａｘの値は同等であった。ｈＣＧインターチェイン１とｒｅｃ−ｈＣＧの動力学的比較から、ｈＣＧインターチェイン１は低いクリアランス速度と長い半減期を示すと結論できる。
【００５３】
【表２】
0004086922.tif 000003
【００５４】
実施例  ６
ｈＣＧインターチェイン４（Ｇｌｎ  α５  Ｃｙｓ−Ａｒｇ  β８  Ｃｙｓ）ベクターの構築と発現
さらにもう一つのインターチェインジスルフィド結合を有するｈＣＧムテインを発現するために構築物を作った。その構造と全体的な構成は、新しい変異を導入したことを除けばｐＫＭＳ．ｈＣＧαg βc （図１）と基本的に同じである。特定の塩基置換を、「ハイブリッド」ｈＣＧα遺伝子中でグルタミンα５をコードするコドンをシステインをコードするコドンに変更するように導入し、ｈＣＧβ遺伝子中でアルギニンβ８をコードするコドンをシステインをコードするコドンに変更するように導入した。構築と、その後のＣＨＯ細胞のトランスフェクションおよび選択は他のムテインについて記載したように同様に行なった。実施例２に記載のタンパク質分析で、二つのサブユニット間の分子間結合がジスルフィドによることが示された。
【００５５】
生物活性
レセプター結合活性およびインビトロ生物活性は、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系で発現されたヒトレセプター（Ｊｉａ，  Ｘら（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  ５，  ７５９−７６８）上で決定した。ｈＣＧインターチェイン４のレセプター結合活性は、指数増殖細胞から単離した膜フラクションについて放射性リガンドレセプター置換アッセイにて定量した。０．５ｍｌの総量で、約１００μｇの膜タンパク質を一定量の125 Ｉ−ｈＣＧ（２０，０００ｃｐｍ，約１２ｐＭ）と競合ｈＣＧとともに競合ｈＣＧの量を増やしながら１８時間室温にてインキュベートした。125 Ｉ標識ｈＣＧ（ＮＥＸ−１０６）はＤｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓから入手した。特異的結合は添加した全125 Ｉ−ｈＣＧの１０〜１２％であった。インキュベーション後、結合したホルモンと遊離のホルモンを遠心により分離した。高精製の組換えｈＣＧをスタンダードとして用いた。
【００５６】
ｈＣＧインターチェイン４は、野性型ｈＣＧと比べてわずかに減少したヨウ素化ｈＣＧの置換を示している（図６）。ｈＣＧはヒトＬＨ／ＣＧレセプターを含有するＣＨＯ細胞でのｃＡＭＰ産生を誘導する。インビトロバイオアッセイを用いて、ｈＣＧインターチェイン４のｈＣＧ生物活性を決定した。０．１ｍＭ  ３- イソブチル- １- メチルキサンチンの存在下でｈＣＧインターチェイン４とともにその濃度を増加させながら細胞を４時間インキュベートした結果、用量依存的にｃＡＭＰ産生の増加がもたらされた（細胞外ｃＡＭＰ濃度はＲＩＡ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）により決定し、ｒｅｃ−ｈＣＧ野性型と同等の能力を有していた（図７））。したがって、ｈＣＧインターチェイン４は完全なｈＣＧアゴニストとみなすことができる。
【００５７】
実施例  ７
ｈＣＧインターチェイン５（Ａｒｇ  α３５  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β３５  Ｃｙｓ）
ｈＣＧインターチェイン５を、α鎖の３５位とβ鎖の３５位で、アルギニンとアラニンをそれぞれシステイン残基に置き換える置換により作った。
【００５８】
組換えＣＨＯ細胞を、免疫反応性タンパク質の分泌について他のｈＣＧインターチェインで記載したように選択した。培養上清液は、αとβに特異的なモノクロナール抗体を用いるｈＣＧサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。２サブユニット間の分子間結合がジスルフィドによることが実施例２で記載したようなタンパク質分析により示された。
【００５９】
レセプター結合活性アッセイで、野性型ｈＣＧに比較してわずかに減少したヨウ素化ｈＣＧの置換が見られた（図６）。インビトロバイオアッセイで、ｈＣＧインターチェイン５の能力がｒｅｃ−ｈＣＧ野性型と同等であることが示された（図７）。したがって、ｈＣＧインターチェイン５は完全なｈＣＧアゴニストとみなすことができる。
【００６０】
実施例  ８
ｈＣＧインターチェイン６（Ｈｉｓ  α９０  Ｃｙｓ−Ｃｙｓ  βｙ  Ｃｙｓ）
ｈＣＧインターチェイン６をα鎖の９０位でヒスチジンをシステイン残基に置き換える置換により作った。
【００６１】
組換えＣＨＯ細胞を、免疫反応性タンパク質の分泌のために他のｈＣＧインターチェインについて記載したように選択した。培養上清液は、αとβに特異的なモノクロナール抗体を用いるｈＣＧサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。実施例２で記載したタンパク質分析により２サブユニット間の分子間結合がジスルフィドによることが示された。
【００６２】
レセプター結合活性アッセイで、野性型ｈＣＧに匹敵するヨウ素化ｈＣＧの置換が見られた。インビトロアッセイで、ｈＣＧインターチェイン６の能力が無視できることが示された。したがって、ｈＣＧインターチェイン６はｈＣＧアンタゴニストとみなすことができる。
【００６３】
実施例  ９
ＬＨインターチェイン１（Ｇｌｎ  α５  Ｃｙｓ−Ｔｒｐ  β８  Ｃｙｓ）
付加的な鎖間ジスルフィド結合を有するＬＨムテインを発現するために構築物を作った。ＬＨβのｃＤＮＡは記載されたように単離し（Ｔａｌｍａｄｇｅら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）  ３０７，  ３７−４０）、ベクターｐＫＭＳ．ＦＳＨαg βg 中でＦＳＨβと交換した（Ｖａｎ  Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋら，  １９９０）。
【００６４】
ＬＨインターチェイン１にα鎖変異を作るために、「ハイブリッド」α遺伝子で、グルタミンα５をコードするコドンをシステインをコードするコドンに変更するように特定の塩基置換を導入した。
【００６５】
ＬＨβにおいて、トリプトファンβ８をコードするコドンをシステインをコードするコドンと変更するように特定の塩基置換を導入した。変異ＰＣＲ反応、サブクローニングおよび配列決定はｈＣＧに記載のものと同等の方法を用いて行なった。変異タンパク質はトランスフェクトされたＣＨＯ  Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）細胞中で発現させた。組換えＣＨＯ細胞は免疫反応性タンパク質の分泌について選択した。培養上清液はαとβに特異的なモノクローナル抗体を用いるＬＨサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。実施例２に記載のタンパク質分析で、二つのサブユニット間の分子間結合がジスルフィドによることが示された。
【００６６】
レセプター結合活性とインビトロ生物活性は安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系で発現されるヒトレセプター上で決定した（Ｊｉａら）。ＬＨインターチェイン１は、野性型ＬＨに匹敵するヨウ素化ｈＣＧの置換を示した（図８）。
【００６７】
実施例  １０
ＬＨインターチェイン２（Ａｒｇ  α３５  Ｃｙｓ−Ａｌａ  β３５  Ｃｙｓ）
ＬＨインターチェイン２を、α鎖の３５位とβ鎖の３５位で、アルギニンとアラニンをそれぞれシステイン残基に置き換える置換により作った。。
【００６８】
組換えＣＨＯ細胞を、免疫反応性タンパク質の分泌について他のｈＣＧインターチェインで記載したように選択した。培養上清液は、αとβに特異的なモノクロナール抗体を用いるＬＨサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。
【００６９】
レセプター結合活性アッセイで、ヨウ素化ｈＣＧの置換が野性型ｈＣＧに匹敵することがわかった（図８）。
【００７０】
実施例  １１
ＦＳＨインターチェイン１（Ｇｌｎ  α５  Ｃｙｓ−Ｓｅｒ  β２  Ｃｙｓ）
付加的な鎖間ジスルフィド結合を有するＦＳＨムテインを発現するために構築物を作った。その構造と全体的な構成は、ＣＨＯ細胞中で組換え野性型ＦＳＨの発現のために用いられたベクターｐＭＫＳ．ＦＳＨαg βg のものと基本的には同一である。塩基置換を、ＦＳＨのαサブユニットとβサブユニットの遺伝子のそれぞれ対応するアミノ酸位置５（Ｇｌｎ）と２（Ｓｅｒ）に導入して、システインコドンを得た（β遺伝子の配列に関してはＫｅｅｎｅら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：  ４７６９−４７７５．（１９８９）を参照）。トランスフェクトされた組換えＣＨＯ細胞を免疫反応性タンパク質の分泌について選択した。培養上清液は、αとβに特異的なモノクローナル抗体を用いるＦＳＨサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。
【００７１】
レセプター結合活性とインビトロ生物活性は、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系で発現されるヒトレセプター上で決定した（Ｍｉｎｅｇｉｓｈら，（１９９１）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．１７５，  １１２５−１１３０）。ＦＳＨインターチェイン１のレセプター結合活性は放射性リガンドレセプター置換アッセイを用いて、指数増殖細胞から単離した膜画分において定量した。０．５ｍｌの総量で、約１００μｇの膜タンパク質を一定量の125 Ｉ−ＦＳＨ（２０，０００ｃｐｍ，約１２ｐＭ）と競合ＦＳＨとともに競合ＦＳＨ量を増やしながら１８時間室温にてインキュベートした。125 Ｉ標識ＦＳＨ（ＮＥＸ−１０６）はＤｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓから入手した。特異的結合は添加した全125 Ｉ−ＦＳＨの１０〜１２％であった。インキュベーション後、結合したホルモンと遊離のホルモンを遠心により分離した。高精製の組換えＦＳＨをスタンダードとして用いた。ＦＳＨインターチェイン１は、野性型ＦＳＨに匹敵するヨウ素化ＦＳＨの置換を示した（図９）。
【００７２】
実施例  １２
ＦＳＨインターチェイン２（Ｔｙｒ  α３７  Ｃｙｓ−Ｔｒｐ  β２７  Ｃｙｓ）
ＦＳＨインターチェイン２を、α鎖の３７位とβ鎖の２７位で、チロシンとトリプトファンをそれぞれシステイン残基に置き換える置換により作った。
【００７３】
組換えＣＨＯ細胞を、免疫反応性タンパク質について他のｈＣＧインターチェインで記載したように選択した。培養上清液は、αとβに特異的なモノクロナール抗体を用いるＦＳＨサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで陽性反応を示した。
【００７４】
レセプター結合活性アッセイで、ヨウ素化ＦＳＨの置換が野性型ＦＳＨに匹敵することがわかった（図９）。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｈＣＧαg βc 発現プラスミドｐＭＫＳ．ｈＣＧαc βc の構造。ＳＶ４０＝Ｓｖ４０初期プロモーター。Ｅ＝Ｍ−ＭｕＬＶエンハンサー。ＭＴ−ＩＩA ＝ヒトメタロチオネイン−ＩＩA プロモーター。ｈＣＧαg ＝ｈＣＧαサブユニットをコードするゲノムｈＣＧαミニ遺伝子。ｈＣＧβc ＝ｈＣＧβサブユニットをコードするｃＤＮＡ。βグロビン＝ウサギβグロビンのポリアデニル化配列とスプライスシグナル。Ｓ＝ＳＶ４０転写停止配列。ｐＢＲ３２７＝大腸菌の複製開始点とアンピリシン耐性付与遺伝子を含有するプラスミドｐＢＲ３２７の一部。
【図２Ａ】ｈＣＧ（ムテイン）の発現とサブユニット間ジスルフィド架橋形成のためのｈＣＧインターチェイン１、ｈＣＧインターチェイン２およびｈＣＧ野性型からの細胞培養上清液のウエスタンブロット分析。Ｃ４１８耐性トランスフェクションプール（ｈＣＧインターチェイン１、ｈＣＧインターチェイン２）からの、および約０．２ＩＵ  ｈＣＧを含有するｒｅｃ−ｈＣＧ野性型からの細胞培養上清液を、室温（パネルＡ）または１００℃（パネルＢとＣ）にて、βメルカプトエタノールの非存在下（パネルＡとＢ）または存在下（パネルＣ）で、ＳＤＳ含有試料緩衝液で可溶化した。電気泳動とＰＶＤＦ膜への転写後、βｈＣＧ特異的モノクロナール抗体とのインキュベーション後、第二抗体／ＨＲＰ複合体とのインキュベーションおよびＴＭＢによる染色によりｈＣＧを目で確認できるようにした。室温（パネルＡのレーン１と２）および１００℃（パネルＢのレーン１と２）での可溶化で分かるように、両方の結果はともに完全体（ｉｎｔａｃｔ）のホルモンを検出するが、コントロール（ＷＴ−ｈＣＧ）での沸騰はホルモンをそのサブユニットへと解離する（パネルＢのレーン３）。還元剤を添加した結果、すべての３試料でサブユニットへの解離が見られた（パネルＣ）。よって、データをまとめると、ｈＣＧインターチェイン１と２の両方が分子間ジスルフィド架橋により安定化されているとの結論が導かれる。
【図２Ｂ】ｈＣＧ（ムテイン）の発現とサブユニット間ジスルフィド架橋形成のためのｈＣＧインターチェイン１、ｈＣＧインターチェイン２およびｈＣＧ野性型からの細胞培養上清液のウエスタンブロット分析。（説明は図２Ａ参照）
【図２Ｃ】ｈＣＧ（ムテイン）の発現とサブユニット間ジスルフィド架橋形成のためのｈＣＧインターチェイン１、ｈＣＧインターチェイン２およびｈＣＧ野性型からの細胞培養上清液のウエスタンブロット分析。（説明は図２Ａ参照）
【図３】ｈＣＧサブユニット間ムテインのｈＣＧ置換アッセイ。Ｂ／Ｂ0 ＝全結合．．．の％。−＋−＝ｈＣＧ野性型（ＷＴ）。−Δ−＝ｈＣＧインターチェイン１。−ｏ−＝ｈＣＧインターチェイン２。
【図４】ｈＣＧサブユニット間ムテインのインビトロ生物活性。−＋−＝Ｉ．Ｓ．７５／５３７。−Δ−＝ｈＣＧインターチェイン１。−ｏ−＝ｈＣＧインターチェイン２。
【図５】雌ビーグル犬での組換えｈＣＧ調製物の筋内注射後の血漿ｈＣＧレベル。
【図６】ヒトＬＨ／ＣＧレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞の膜に対する野性型ｈＣＧとｈＣＧインターチェイン変異体の結合活性。膜を125 Ｉ標識ｈＣＧとともに、異なる濃度の未標識の野性型ｈＣＧまたはインターチェインｈＣＧの存在下または不存在下にインキュベートした。置換カーブは未標識ホルモンの各用量で最大結合に対するパーセンテージとして示している。
【図７】野性型ｈＣＧとインターチェインｈＣＧ分子のインビトロ生物活性。細胞外ｃＡＭＰを、ヒトＬＨ／ＣＧレセプターを安定して発現するＣＨＯ細胞の刺激後に特異的ＲＩＡにより測定した。
【図８】ヒトＬＨ／ＣＧレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞の膜に対する野性型ｈＣＧ、野性型ＬＨおよびＬＨインターチェイン変異体の結合活性。膜を125 Ｉ標識ｈＣＧとともに、異なる濃度の未標識の野性型ｈＣＧ、野性型ＬＨまたはインターチェインＬＨの存在下または不存在下にインキュベートした。置換カーブは未標識ホルモンの各用量で最大結合に対するパーセンテージとして示している。
【図９】ヒトＦＳＨレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞の膜に対する野性型ＦＳＨおよびＦＳＨインターチェイン変異体の結合活性。膜を125 Ｉ標識ＦＳＨとともに、異なる濃度の未標識の野性型ＦＳＨまたはインターチェインＦＳＨの存在下または不存在下にインキュベートした。置換カーブは未標識ホルモンの各用量で最大結合に対するパーセンテージとして示している。
【図１】
0004086922.tif 000004
【図２Ａ】
0004086922.tif 000005
【図２Ｂ】
0004086922.tif 000006
【図２Ｃ】
0004086922.tif 000007
【図３】
0004086922.tif 000008
【図４】
0004086922.tif 000009
【図５】
0004086922.tif 000010
【図６】
0004086922.tif 000011
【図７】
0004086922.tif 000012
【図８】
0004086922.tif 000013
【図９】
0004086922.tif 000014