(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（１）宿主細胞中で発現可能な担体蛋白質をコードする第一の遺伝子要素に作動可能に結合した調節領域と、
（２）異種蛋白質をコードする第二の遺伝子要素であって、第一及び第二の要素が連続し且つ同じ読み枠にあるように第一要素内に埋め込まれている前記第二要素と
を有するＤＮＡベクターを準備し、
（ｂ）前記ＤＮＡベクターで前記宿主細胞を形質転換し、及び
（ｃ）前記異種蛋白質と前記担体蛋白質との融合蛋白質を発現する工程を含む、原核宿主細胞中で異種蛋白質を発現する方法であって、ここで前記異種蛋白質はそのＮ末端で前記担体蛋白質の第一ドメインに、またそのＣ末端で前記担体蛋白質の第二ドメインに結合され、前記担体蛋白質がＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＣＫＳ）蛋白質であり、担体蛋白質の第一ドメインがＣＫＳのアミノ酸１〜１７１からなり、担体蛋白質の第二ドメインがＣＫＳのアミノ酸１７１〜２６０からなる、前記方法。
【請求項２】
異種蛋白質が細菌蛋白質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異種蛋白質がウイルス蛋白質である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
調節領域が原核生物プロモーター及び原核生物リボソーム結合部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
調節領域がｌａｃオペロンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
異種蛋白質がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の蛋白質である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
異種蛋白質がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８、ｐｐ５２、ｐｐ６５及びｐｐ１５０からなる群から選ばれたウイルス蛋白質の部分を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
異種蛋白質がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８からなる群から選ばれたウイルス蛋白質の免疫原性部分を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
異種蛋白質がＨＣＭＶ蛋白質ｐ６５からなる群から選ばれたウイルス蛋白質の免疫原部分を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
異種蛋白質がＨＣＭＶエピトープＨ１０、Ｆ３及びＡ１Ｃ２からなる群から選ばれたエピトープの免疫原性部分を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
担体蛋白質に埋め込まれた異種蛋白質を含む融合蛋白質であって、前記担体蛋白質がＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＣＫＳ）蛋白質であり、前記融合蛋白質が請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に記載の方法により発現されたものである融合蛋白質。
【請求項１２】
配列ＣＫＳ*−ＣＭＶ*−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＣＫＳ**、ここで、
（ａ）ＣＫＳ*はＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＣＫＳ）のアミノ酸１〜１７１からなり、
（ｂ）ＣＭＶ*はＨＣＭＶ蛋白質の部分であり、
（ｃ）ＣＫＳ**はＣＫＳのアミノ酸１７１〜２６０からなる、
を有する請求項１１に記載の融合蛋白質。
【請求項１３】
ＣＭＶ*がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８、ｐｐ５２、ｐｐ６５及びｐｐ１５０の部分からなる群から選ばれる請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１４】
ＣＭＶ*がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８からなる群から選ばれたウイルス蛋白質の免疫原性部分である請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１５】
ＣＭＶ*がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ６５からなる群から選ばれたウイルス蛋白質の免疫原性部分である請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１６】
ＣＭＶ*がＨＣＭＶエピトープＨ１０、Ｆ３及びＡ１Ｃ２からなる群から選ばれたエピトープの免疫原性部分である請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１７】
ＣＭＶ*が、
（ａ）Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈ１０；
（ｂ）ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）；
（ｃ）ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＳＴＯＰ、ここでＳＴＯＰは終止コドンである；及び
（ｄ）ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）
からなる群から選ばれる請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１８】
（ａ）請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に記載の方法による融合蛋白質として異種蛋白質を発現し；
（ｂ）前記融合蛋白質を単離し；及び
（ｃ）担体蛋白質の第二ドメインの部分の存在を検出する手段に前記融合蛋白質を露呈する、段階を含む、異種蛋白質の完全発現を確認する方法。
【請求項１９】
検出手段が、担体蛋白質の第二ドメインに含まれるエピトープと免疫反応性である免疫グロブリンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
確認方法の段階（ｂ）及び（ｃ）がウエスタンブロッティングを用いて行われる請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）宿主細胞中で発現可能な担体蛋白質をコードする第一の遺伝子要素に作動可能に結合した調節領域、及び
（ｂ）異種蛋白質をコードする第二の遺伝子要素であって、第一及び第二の要素が連続し且つ同じ読み枠内にあるように第一要素内に埋め込まれている前記第二要素
を含む、プラスミドベクターへの挿入のためのＤＮＡ構築物であって、前記担体蛋白質がＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＣＫＳ）蛋白質であり、前記プラスミドでの原核細胞の形質転換において、前記ＤＮＡ構築物が異種蛋白質と担体蛋白質との融合蛋白質を発現し、ここで前記異種蛋白質はそのＮ末端で前記担体蛋白質の第一ドメインに、またそのＣ末端で前記担体蛋白質の第二ドメインに結合され、担体蛋白質の第一ドメインがＣＫＳのアミノ酸１〜１７１からなり、担体蛋白質の第二ドメインがＣＫＳのアミノ酸１７１〜２６０からなる、前記ＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
異種蛋白質が細菌蛋白質である請求項２１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２３】
異種蛋白質がウイルス蛋白質である請求項２１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２４】
調節領域が原核生物プロモーター及び原核生物リボソーム結合部位を含む、請求項２１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２５】
調節領域がｌａｃオペロンを含む請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２６】
異種蛋白質がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）蛋白質である請求項２１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２７】
異種蛋白質がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８、ｐｐ５２、ｐｐ６５及びｐｐ１５０からなる群から選ばれたウイルス蛋白質の部分を含む請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２８】
異種蛋白質がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８からなる群から選ばれたウイルス蛋白質の免疫原性部分を含む請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２９】
異種蛋白質がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ６５からなる群から選ばれたウイルス蛋白質の免疫原性部分を含む請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３０】
異種蛋白質がＨＣＭＶエピトープＨ１０、Ｆ３及びＡ１Ｃ２からなる群から選ばれたエピトープの免疫原性部分を含む請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３１】
請求項２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０に記載のＤＮＡ構築物を含むプラスミドベクター。
【請求項３２】
（ａ）下記図：
【化１】
0004108122.tif 000011
に示されるプラスミドであって、Ｎ−末端からＣ−末端の順に、ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＣＫＳ）蛋白質のアミノ酸１〜１７１からなる担体蛋白質の第一ドメインをコードするＤＮＡ、
ＨＣＭＶのアミノ酸５９５〜６１４からなるｐｐ１５０の部分Ａ１Ｃ２をコードするＤＮＡ、ペプチドＫＬＱＥＦをコードするＤＮＡ、ＨＣＭＶのアミノ酸１００６〜１０４８からなるｐｐ１５０のＦ３部分をコードするＤＮＡ、ＰｓｔＩ部位、ＨＣＭＶのアミノ酸２０２〜４３４からなるｐｐ５２のＨ１０部分をコードするＤＮＡ、ＭｌｕＩ部位、
及びＣＫＳのアミノ酸１７１〜２６０からなる担体蛋白質の第二ドメインを含む前記プラスミド（ｐＣＭＶ-２７）；
（ｂ）下記図：
【化２】
0004108122.tif 000012
に示されるプラスミドであって、Ｎ−末端からＣ−末端の順に、ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＣＫＳ）蛋白質のアミノ酸１〜１７１からなる担体蛋白質の第一ドメインをコードするＤＮＡ、ＨＣＭＶのアミノ酸２９７〜５１０からなるｐｐ６５部分をコードするＤＮＡ、ＭｌｕＩ部位、及びＣＫＳのアミノ酸１７１〜２６０からなる担体蛋白質の第二ドメインを含む前記プラスミド（ｐＣＭＶ-２８）；
（ｃ）下記図：
【化３】
0004108122.tif 000013
に示されるプラスミドであって、Ｎ−末端からＣ−末端の順に、ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＣＫＳ）蛋白質のアミノ酸１〜１７１からなる担体蛋白質の第一ドメインをコードするＤＮＡ、ＨＣＭＶのアミノ酸２９７〜５１０からなるｐｐ６５部分をコードするＤＮＡ、停止コドンをコードするＤＮＡ、ＭｌｕＩ部位、及びＣＫＳ蛋白質のアミノ酸１７１〜２６０からなる担体蛋白質の第二ドメインを含む前記プラスミド（ｐＣＭＶ-２８ＳＴＯＰ）；ならびに
（ｄ）下記図：
【化４】
0004108122.tif 000014
に示されるプラスミドであって、Ｎ−末端からＣ−末端の順に、ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＣＫＳ）蛋白質のアミノ酸１〜１７１からなる担体蛋白質の第一ドメインをコードするＤＮＡ、ＨＣＭＶのアミノ酸１１７〜３７３からなるｐｐ３８部分をコードするＤＮＡ、ＭｌｕＩ部位、及びＣＫＳ蛋白質のアミノ酸１７１〜２６０からなる担体蛋白質の第二ドメインを含む前記プラスミド（ｐＣＭＶ-２９）
からなる群から選ばれた請求項３１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３３】
請求項３１に記載のプラスミドベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３４】
請求項３２に記載のプラスミドベクターで形質転換された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
技術的分野
本発明は微生物宿主細胞による異種蛋白質の生産のための方法に関する。さらに具体的には、本発明は、目的の蛋白質が埋め込まれる、融合蛋白質の形のこのような蛋白質の発現、さらにまた、その蛋白質を産生するために有用なＤＮＡ構築物、プラスミドベクター及び形質転換宿主細胞に関する。
発明の背景
微生物宿主中の原核及び真核生物両方の本来ない（「異種の」）蛋白質を発現することは公知であるが、蛋白質の発現には克服しなければならない多くの技術的困難があり、これらは（ｉ）十分なレベルの発現を得ること、（ｉｉ）容易に分離し、精製される形で蛋白質を得ること、及び（ｉｉｉ）蛋白質が十分に発現され、不完全な翻訳又はその後の分解によって末端を切断されないことを保証することを含む。一つの試みはそれぞれに対する遺伝子を結合して目的の蛋白質を別の「担体」蛋白質と一緒に共発現することであって、生じる融合蛋白質は通常、直接に又は短い結合セグメントによって、互に共有結合した二つの遺伝子産物を含む。
特に好適な発現系は米国特許第５，１２４，２５５号に記載され、この特許は参考文献として本明細書に特に組み入れる。その特許では、融合蛋白質が担体蛋白質として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）酵素ＣＫＳ（ＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ、又はＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸シチジリルトランスフェラーゼ）を利用するとして開示されている。その担体は、目的の蛋白質が担体遺伝子の３’末端に位置するＤＮＡでコードされ、所望の融合蛋白質の高レベルでの発現を可能にする。しかし、融合生成物が密接に関連した発現生成物又は同様な分子量の細胞汚染物質から容易に分離できないことが、この発現系及び他の発現系で起こる。また、典型的に該融合蛋白質のＣ末端にある目的の蛋白質が完全長ではなく、その末端が切り取られることも起こり得る。
これらの困難性は、例えば、目的の蛋白質が、診断免疫アッセイで使用されるべきであるエピトープ又はエピトープの組合せであるときには克服される必要があり、したがって完全に発現され、精製可能でなければならない。従って、広範囲の完全な異種蛋白質の信頼性のある発現を可能にし、さらに、このような蛋白質の精製を容易にする、改良された発現系を開発することが本発明の目的である。
発明の要約
無傷の異種蛋白質は、その異種蛋白質が融合相手として作用する担体に埋め込まれ、該担体に付着されていない融合蛋白質として容易に発現され得ることが分かってきた。この試みは汚染する細胞蛋白質及び汚染する組換え蛋白質末端切断（truncation）型生成物から蛋白質の精製を簡素化する。
従って、本発明の一つの態様では、（ａ）（１）宿主細胞中で発現可能な担体蛋白質をコードする第一の遺伝子要素に作動可能に結合した調節領域、及び（２）異種蛋白質をコードする第二の遺伝子要素であって、第一要素及び第二要素が連続し、同じ読み枠中にあるように第一要素内に埋め込まれている第二要素、を有するＤＮＡベクターを準備し；（ｂ）該ＤＮＡベクターで宿主細胞を転換し；及び（ｃ）該異種蛋白質がそのＮ末端で担体蛋白質の第一ドメインに、またそのＣ末端で担体蛋白質の第二ドメインに結合している、異質蛋白質及び担体蛋白質の融合蛋白質を発現する工程を含む、原核宿主細胞中に異種蛋白質を発現するための方法を開示する。
本発明の第二の態様では、本発明の発現方法によって発現された異種蛋白質を開示する。上記方法によって製造される、異種蛋白質を含む融合蛋白質も同様に開示する。
本発明の別の態様では、（ａ）本発明の発現方法により融合蛋白質として異種蛋白質を発現し；（ｂ）融合蛋白質を単離し；及び（ｃ）担体蛋白質の第二ドメインの一部分の存在を検出する手段に該融合蛋白質を露呈する段階を含む、異種蛋白質の完全発現を確認するための方法が開示される。
本発明の更なる態様では、（ａ）宿主細胞中で発現可能な担体蛋白質をコードする第一の遺伝子要素に作動可能に結合した調節領域、及び（ｂ）異種蛋白質をコードする第二の遺伝子要素であって、第一及び第二要素が連続し同じ読み取り枠にあるように、第一要素内に埋め込まれている第二要素を含む、プラスミドベクター中に挿入するためのＤＮＡ構築物を開示する。
本発明の更に別の側面では、本発明のＤＮＡ構築物を含むプラスミドベクター、及びそれによって形質転換された宿主細胞を開示する。
【図面の簡単な説明】
本発明の次の説明は添付した図面との関連でより容易に理解されるだろう：
図１はプラスミドｐＪＯ２１０及びＪＯ２１５の構築、並びに制限部位ＥｃｏＲＩ並びにＢａｍＨＩの除去の図解説明であり；
図２はプラスミドｐＭＣ２００の構築の図解説明であり；
図３はプラスミドｐＪＯ２００の構築の図解説明であり；
図４はプラスミドｐＭＢ２８：ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２の構築の図解説明であり；
図５はプラスミドｐＭＢ３４：ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３の構築の図解説明であり；
図６はプラスミドｐＭＢ３８：ｌａｃＺ−ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）の構築の図解説明であり；
図７はプラスミドｐＣＭＶ−１Ａ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳの構築の図解説明であり；
図８は（Ａ）Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＨ１０ＤＮＡ配列を含むＰＣＲフラグメントの作製；（Ｂ）ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）及びｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）ＤＮＡ配列を含むＰＣＲフラグメントの作製；並びに（Ｃ）プラスミドｐＣＭＶ−３Ａ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３、プラスミドｐＣＭＶ−３Ｂ：ＣＫＳ−Ｈ１０、プラスミドｐＣＭＶ−４：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０、プラスミドｐＣＭＶ−９：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）及びプラスミドｐＣＭＶ−２６：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）の構築の図解説明であり；
図９は（Ａ）プラスミドｐＪＯ２００−ΔＭｌｕＩ；（Ｂ）プラスミド残基１５１〜１８０（５’−３’）における意図した改変部位を含む、プラスミドｐＪＯ２００のヌクレオチド配列；（Ｃ）プラスミドｐＪＯ２００／ＭｌｕＩ／ＣＩＡＰへの連結反応のために合成された、変異原オリゴヌクレオチド、５’ＣＧＣＧＡＣＧＴ３’の二本鎖構造；及び（Ｄ）改変残基１５１〜１８０（５’−３’）を含む、プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩのヌクレオチド配列の図解説明であり；
図１０はプラスミドｐＥＥｌの構築の図解説明であり；
図１１は（Ａ）Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０，ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）及びｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）ＤＮＡ配列を含むＰＣＲフラグメントの作製；並びに（Ｂ）プラスミドｐＣＭＶ−２７：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳ、プラスミドｐＣＭＶ−２８：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＣＫＳ、プラスミドｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＳＴＯＰ−ＣＫＳ、及びプラスミドｐＣＭＶ−２９：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）−ＣＫＳの構築の図解説明であり；
図１２はヌクレオチド１〜９２０のＤＮＡ配列［配列番号５］、及びプラスミドｐＪＯ２００のアミノ酸１〜２６０の対応するアミノ酸配列である。
発明の詳細な説明
従って、本発明の一つの態様では、（ａ）（１）宿主細胞中で発現可能な担体蛋白質をコードする第一の遺伝子要素に作動可能に結合した調節領域、及び（２）異種蛋白質をコードする第二の遺伝子要素であって、第一及び第二要素が連続して同じ読み枠にあるように第一要素内に埋め込まれている第二要素、を有するＤＮＡベクターを準備する工程；（ｂ）宿主細胞を該ＤＮＡベクターで形質転換する工程；並びに（ｃ）異種蛋白質がそのＮ末端で担体蛋白質の第一ドメインと、またそのＣ末端で担体蛋白質の第二ドメインと結合している、該異種蛋白質と担体蛋白質との融合蛋白質を発現する工程を含む、原核宿主細胞中で異種蛋白質を発現する方法を開示する。
本発明の発現方法では、異種蛋白質は宿主細胞中で発現可能ないずれの蛋白質であってもよく、発現が宿主の成長を有意に害するか又は阻害しないように十分に良性であればよい。適当な異種蛋白質は、細菌及びウイルス蛋白質が好ましいが、細菌、真菌、酵母、ウイルス、原生動物又は他の源（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ又はＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉのような人畜共通伝染病の原因生物を含む）であり得る。
特に好ましくはウイルス蛋白質、及び特にかなり臨床的に重要な病原体であるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、に由来の蛋白質であり、このような蛋白質はＨＣＭＶ特異的免疫グロブリンの存在又は不在の測定においてアッセイ標的としてその使用によるＨＣＭＶ感染の診断において重要である。本発明の方法により発現され得る、及びヒト免疫グロブリンで容易に同定されるエピトープを含む、代表的ＨＣＭＶ蛋白質としては、ｐｐ３８（３８ｋＤアッセンブリィ蛋白質）、ｐｐ６５（６５ｋＤ主要マトリックス蛋白質）、ｐｐ５２（５２ｋＤ非構造的ＤＮＡ結合蛋白質）、ｐｐ１５０（１５０ｋＤ構造的リン酸化蛋白質）が含まれ、これらのうち、ＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８及びｐｐ６５が好ましい。ＨＣＭＶエピトープＨ１０、Ｆ３及びＡ１Ｃ２の中から選ばれたエピトープの免疫原部分を含有する異種蛋白質も好ましく、これらのエピトープはＨＣＭＶに対する免疫グロブリンについてのアッセイにおいて高感度で特異的な手段を提供することが分かった。
上記方法に使用するのに適する代表的調節領域は原核生物プロモーター及び原核生物リボソーム結合部位を含むもの、及び特に制御調節がｌａｃオペロンを含有するものを含む。しかし、使用した宿主細胞に依存して、当該分野で良く知られた他の調節領域も使用することができる。
本発明の埋込発現法（embedded expression method）が、非制限的にβ−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、及びマルトース結合蛋白質を含む他の担体蛋白質との幅広い応用を見いだすことが期待されるが、代表的担体蛋白質（異種遺伝子が融合され、共発現する融合相手）はＣＫＳ蛋白質に由来するものである。ＣＫＳを使用すると、上記方法で使用したＤＮＡベクターの特に好適な実施態様は、異種蛋白質がＣＫＳの１から１７１のアミノ酸の部分を含む担体蛋白質の第一ドメインと、ＣＫＳの１７１から２６０のアミノ酸の部分を含む担体蛋白質の第二ドメインとの間に位置するものである。（下記のように、ＣＫＳ蛋白質と称するものは、ポリリンカーＤＮＡ配列によってコードされたＣＫＳ遺伝子の末端に追加の２０個のアミノ酸が続く本来のｋｄｓＢ遺伝子の第一の２４０個のアミノ酸の両方を含み得る。）
したがって、本発明の好適な融合蛋白質は配列ＣＫＳ*−ＣＭＶ*−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＣＫＳ**を有するものを含み、ここで（ａ）ＣＫＳ*はＣＫＳのアミノ酸１から１７１の部分であり；（ｂ）ＣＭＶ*はＨＣＭＶ蛋白質の部分であり；及び（ｃ）ＣＫＳ**はＣＫＳのアミノ酸１７１から２６０の部分である。これらのうち、ＣＭＶ*がＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８、ｐｐ５２，ｐｐ６５及びｐｐ１５０の部分中から、及び特にＨＣＭＶ蛋白質ｐｐ３８もしくはｐｐ６５の免疫原部分中から又はＨＣＭＶエピトープＨ１０、Ｆ３及びＡ１Ｃ２の免疫原部分から選ばれる融合蛋白質が特に好適である。このような融合蛋白質の特定の例は、ＣＭＶ*が（ａ）Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈ１０；（ｂ）ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）；（ｃ）ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＳＴＯＰ（ここでＳＴＯＰは終止コドンである）；及び（ｄ）ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）中から選ばれるものである。
異種蛋白質の完全発現（intact expression）を確認する本発明の方法では、融合蛋白質の単離が、他の発現生成物（不完全又は末端切断型融合蛋白質）又は細胞成分に関して融合蛋白質の電気泳動ゲル中の示差的移動のような既知の分離法で行ない得る。（なお、「単離」とは、種々の分子種が分離されるか又は分割されることのみを意味し、所望の融合蛋白質が純粋な形で単離されることを意味するものではないことに注意すべきである。）単離後、異種蛋白質にフランキングする担体蛋白質ドメインの部分又は全体の存在を確立するための何らかの適当な検出手段を使用してもよい。好ましい検出手段は、担体蛋白質の第一あるいは第二ドメインに含まれるエピトープと免疫反応を起こす免疫グロブリンを含む。融合蛋白質の単離及びこのような検出手段への該蛋白質の露呈の両方のための特に有用な方法はウエスタンブロット法である。
本発明のＤＮＡ構築物は上記方法及び融合蛋白質に対応するものである。したがって、好適な構築物は、好適な異種蛋白質、エピトープ、調節領域、担体蛋白質、及び上記融合蛋白質要素の並列（juxtaposition）、をコードする配列を含有するものである。本発明のプラスミドベクターに組み込まれると、好適なベクターは、（ａ）ｐＣＭＶ−２７；（ｂ）ｐＣＭＶ−２８；（ｃ）ｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ；及び（ｄ）ｐＣＭＶ−２９の中から選ばれるものを含む。
その種々の態様において本発明は、当該分野で周知の組換え法を用いて行うことができる。例えば、担体としてＣＫＳ蛋白質を用いる異種蛋白質の慣用の発現が上記の米国特許第５，１２４，２５５号に記載されている。関連する方法は米国特許第５，３１２，７３７及び同第５，３２２，７６９号、並びにここに引用された参考文献にも詳細に記載されている。
本発明の発現方法、確認方法、融合蛋白質、ＤＮＡ構築物、プラスミドベクター及び形質転換宿主細胞は、本発明を説明することを意図し本発明の範囲を制限するものでない以下の実施例と関連付けるとより良く理解されるだろう。以下の記載及び本明細書全体にわたって、文献の引用は明らかに参考として含めることを意図している。
実施例１
一般的方法
材料及び供給源
制限酵素，Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）、ポリヌクレオチドキナーゼ、及びＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｙｅｒｌｙ，ＭＡ）又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。ＤＮアーゼＩ及びアプロチニンはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．から購入した。
ＤＮＡ及び蛋白質分子量標準、第一プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル、及び緩衝液付き半乾燥ブロッティングシステムはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）から得た。
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、アクリルアミド、Ｎ−Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、４−クロロ−１−ナフトール、ＣｏｏｍａｓｓｉｅTM  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ２５０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００TM及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）はＢｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から購入した。
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−標識抗体はＫｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。ＥＰＩＣＵＲＩＡＮ  ＣｏｌｉTM  ＸＬ−１  ＢＬＵＥ（−ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ１  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑ  ＺΔＭ１５  Ｔｎ１０（ＴｅｔI）］）ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、ＤＮＡ単離キット、ＲＮＡ単離キット、及びＺＡＰTM−ｃＤＮＡ合成キットはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から得た。
ＧｅｎｅＡｍｐTM試薬キット及びＡｍｐｌｉＴａｑTM  ＤＮＡポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）から購入した。一般的方法で使用されたデオキシヌクレオチド三リン酸はＧｅｎｅＡｍｐTM試薬キットからのものであった。
支持ニトロセルロース膜はＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）から購入した。
ＳｅｑｕｅｎａｓｅTM及び７−デアザ−ｄＧＴＰ及びＳｅｑｕｅｎａｓｅTM  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ配列決定のためのヌクレオチドキットは、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から得た。
ポリＡ+ｍＲＮＡ精製キットはＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。
アンピシリン付きＬｕｒｉａブロスプレート（ＬＢａｍｐプレート）はＭｉｃｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｍｂａｒｄ、ＩＬ）から購入した。
ＯＰＴＩ−ＭＥＭTM培地、牛胎児血清、リン酸緩衝食塩水、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（Ｆ−φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ｄｅｏＲｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｐｈｏＡ  ｈｓｄＲ１７（ｒＫ-、ｍＫ+）ｓｕｐＥ４４λ-ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６ｒｅｌＡ１）、及びｕｌｔｒａＰＵＲＥTMアガロースはＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｉｎｃ．（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。
Ｂａｃｔｏ−トリプトン、Ｂａｃｔｏ−酵母抽出物、及びＢａｃｔｏ−寒天はＤｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）から得た。
ＮＺＹTMブロスはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。
サケ精子ＤＮＡ、リゾチーム、アンピシリン、Ｎ−ラウロイルサルコシン、チメロサール、緩衝液、カゼイン酸加水分解物、ＴＷＥＥＮ  ２０TM（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ピロカルボン酸ジエチル（ＤＥＰＣ）、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、尿素、グリセロール、ＥＤＴＡ、デオキシコール酸ナトリウム及び無機塩類はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
ポリスチレン微粒子はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）から購入した。
過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）はＭａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ（Ｐａｒｉｓ，ＫＹ）から購入した。
メタノールはＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。
培地、緩衝液及び一般試薬
「スーパーブロス  ＩＩ」は１１．２５ｇ／Ｌのトリプトン、２２．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１１．４ｇ／Ｌの二塩基性リン酸カリウム、１．７ｇ／Ｌの一塩基性リン酸カリウム、１０ｍＬ／Ｌのグリセロールを含み、水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整した。
「トリス緩衝食塩水」又は「ＴＢＳ」はｐＨ７．５で２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌからなった。
「トリス緩衝食塩水ＴＷＥＥＮ  ２０TM」又は「ＴＢＳＴ」はＴＢＳプラス０．０５％ＴＷＥＥＮ  ２０TMからなった。
「膜ブロッキング溶液」はＴＢＳ中に１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１％のカゼイン酸加水分解物、及び０．０５％のＴＷＥＥＮ  ２０TMからなった。
「Ｒｕｂａｚｙｍｅ試料希釈緩衝液」又は［ＲｕｂａｚｙｍｅＳＤＢ」は１３５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＴＷＥＥＮ  ２０TM、０．０１％のチメロサール及び４％の牛胎児血清を含むｐＨ７．５の１００ｍＭのトリスからなった。
「Ｒｕｂａｚｙｍｅコンジュゲート希釈剤希釈緩衝液」は１３５ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のチメロサール及び１０％牛胎児血清を含むｐＨ７．５の１００ｍＭトリスからなった。
「ＨＰＲＯ発色溶液」はＴＢＳ中に０．０６％の４−クロロ−１−ナフトール、０．０２％のＨ2Ｏ2及び０．２％メタノールからなった。
「ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液」は２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、５％のβ−メルカプトエタノール及び０．１％のブロモフェノールブル−を含むｐＨ６．８の６２ｍＭトリスからなった。
「ＴＥ緩衝液」はｐＨ８．０で１０ｍＭのトリス及び１ｍＭのＥＤＴＡからなった。
「ＴＥＭ溶解（lysis）緩衝液」はｐＨ８．５で５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び２０ｍＭの塩化マグネシウムからなった。
「ＰＴＥ緩衝液」はｐＨ８．５で５０ｍＭのトリス及び１０ｍＭのＥＤＴＡからなった。
ウイルス増殖及びｃＤＮＡの作製
ＨＣＭＶ  ＡＤ１６９株又はＴｏｗｎｅ株を交換可能に使用し、５％牛胎児血清を補充したＯＰＴＩ−ＭＥＭTM培地中で生育するヒト繊維芽細胞中で増殖させた。ＨＣＭＶ  ＡＤ１６９及びＨＣＭＶゲノムは、Ｃｈｅｅら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．１５４：１２５（１９９０）及びＢａｎｋｉｅｒら，ＤＮＡ  Ｓｅｑ．２：１（１９９１）の刊行物に記載されており、その開示内容を参考として本明細書に含めるものとする。
感染６日後、ＣＭＶ感染繊維芽細胞を遠心分離で収穫し、ＰＢＳで洗浄し、ガラス−ＴｅｆｌｏｎTMホモジナイザーで均質化した。全ウイルスＤＮＡは、Mocarskiら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１２６６（１９８５）に記載のように単離した。全ＲＮＡはＲＮＡ単離キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて均質化した細胞から単離し、ポリＡ+ＲＮＡはｍＲＮＡ単離キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて単離した。ＨＣＭＶ  ｃＤＮＡはＺＡＰ−ｃＤＮＡTM合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて精製ウイルスｍＲＮＡから合成した。
一般的方法
ＤＮＡの全酵素消化は供給者の指示によって行なった。少なくとも５単位の酵素がＤＮＡ１ミクログラム当たりで使用され、十分な培養時間がＤＮＡの完全消化を可能にした。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ＤＮＡ合成、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ及びＲＮＡの操作で使用する種々のキットにおいて供給者のプロトコルに従った。標準方法は、Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡの小規模及び大規模合成、ファージλに感染させたＥ．ｃｏｌｉ細胞からのファージ溶菌液ＤＮＡの合成、抗−Ｅ．ｃｏｌｉ抗体の吸収のためのＥ．ｃｏｌｉ溶菌液の調製、ＤＮＡのフェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱、アガロースゲル上のＤＮＡの制限分析、アガロース及びポリアクリルアミドゲルからのＤＮＡフラグメントの精製、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を用いる制限酵素によるＤＮＡの消化で生じた陥凹３’末端の充填、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡフラグメントの連結反応、及びコンピテントＢ１細胞（Ｆ-ａｒａ  ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｒｐｓＬ  φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ｈｓｄＲ１７）の調製のために使用した（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）。
ＰＣＲ増幅で生成したプラスミドへのクローニングのためのＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲ反応混合物の制限酵素消化に先立って、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた。ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定のためのオリゴヌクレオチドは、製造者のプロトコルによって、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓオリゴヌクレオチド合成器、モデル３８０Ｂ又は３９４で合成した。
ＨＣＭＶ蛋白質Ａ１Ｃ２Ｆ３（ウイルス遺伝子ＵＬ３２由来）、Ｈ１０（ＵＬ４４）及びｐｐ６５（ＵＬ８３）に対するマウスモノクロナール抗体は、それぞれ精製ｒｐＭＢ３４（ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３）、精製ｒｐＲＯＳＨ１０（ｌａｃＺ−Ｈ１０）、及び精製ｒｐＣＭＶ−９（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）によるマウスの免疫化で得られた。ＣＫＳ蛋白質に対するマウスモノクロナール抗体は、Ｄａｉｌｅｙらによる国際公開第ＷＯ９３／０４０８８に記載された、精製ｒｐＨＣＶ−２３（ＣＫＳ−ＢＣＤ）によるマウスの免疫化で得られた。免疫化に使用された蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された様に約９０％の純度であった。マウスの免疫化、細胞融合、モノクロナール抗体の選別及びクローニング、並びにモノクロナール抗体の特性付けのための方法はＭｅｈｔａらによる国際公開第ＷＯ９２／０８７３８に記載のものと同様であった。
実施例２
ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００の構築
図１〜３に示したように、ｐＪＯ２００ベクターは、Ｂｏｌｌｉｎｇ及びＭａｎｄｅｃｋｉ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：４８８（１９９０）に記載された、プラスミドｐＴＢ２０１から出発する三段階で構築された。ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００の構築は、Ｅ．ｃｏｌｉＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ（ＣＫＳ）蛋白質と組換え蛋白質との融合を可能にした。構造蛋白質ＣＫＳ（ｋｄｓＢ遺伝子としても公知）をコードするＤＮＡ遺伝子配列は、Ｇｏｌｄｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１５８３１（１９８６）に公表されている。ＣＫＳのアミノ酸配列は２４８個のアミノ酸（ａａ）残基を含み、同じ文献に記載されている。
プラスミドｐＪＯ２００のための構築計画は、制限酵素部位（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ）の除去及びＣＫＳ遺伝子の３’末端における多クローニング部位の付加を含んだ。これは、ＣＫＳの３’末端における、ＣＭＶ蛋白質抗原をコードするＣＭＶ遺伝子のその後のクローニングを容易にした。最終的に得られたベクターは、全部で２６０個のアミノ酸で、ポリリンカーＤＮＡによりコードされた追加の２０個のアミノ酸が後に続いた、本来のｋｄｓＢ遺伝子由来の最初の２４０個のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡを含んでいた。
段階Ａ：ｐＪＯ２１０の構築
プラスミドｐＪＯ２１０はＣＫＳ発現ベクター、ｐＴＢ２０１の誘導体である（図１）。このプラスミドは、ＣＫＳ遺伝子用のプロモーターから上流に位置するｐＴＢ２０１に存在する単一のＥｃｏＲＩ部位を除去して構築された。大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＴＢ２０１）は一般的方法を用いてＴＢ１細胞から単離された。ＤＮＡはＥｃｏＲＩにより完結するまで消化され、ポリアクリルアミドゲル上で精製された。精製されたｐＴＢ２０１／ＥｃｏＲＩフラグメントはついでデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下でＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片により処理した。この酵素はＥｃｏＲＩ消化後に生じた陥凹３’末端を充填し、平滑末端とした。ＤＮＡはＫｌｅｎｏｗ断片による処理後、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中に再懸濁し、最後に室温で４時間Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応した。この連結反応混合物はコンピテントＴＢ１細胞に形質転換された。ＤＮＡのミニプレプ（miniprep）を形質転換体から調製し、ＤＮＡはＥｃｏＲＩ部位の欠失について選別された。プラスミドｐＪＯ２１０を単離したが、これはプラスミドｐＴＢ２０１のＥｃｏＲＩ部位を欠失していた。
段階Ｂ：ｐＪＯ２１５の構築
プラスミドｐＪＯ２１５はプラスミドｐＪＯ２１０の誘導体である（図１）。このプラスミドは、Ｍａｎｄｅｃｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：７１７７（１９８６）の橋かけ変異誘発法（bridge mutagenesis procedure）を用いて、ＣＫＳ遺伝子用のプロモーターに位置するｐＪＯ２１０の単一ＢａｍＨＩ部位を除去することにより構築された。ＴＢＩ細胞からのプラスミドＤＮＡ（ｐＪＯ２１０）は一般的方法を用いて単離された。ＤＮＡはＢａｍＨＩにより完結するまで消化し、アクリルアミドゲル上で精製した。精製したｐＪＯ２１０／ＢａｍＨＩフラグメントはついで、ＢａｍＨＩ部位に及ぶプラスミドの領域中のｐＪＯ２１０のＤＮＡ鎖の一つに相補的で、配列［配列番号１］を有する変異原オリゴヌクレオチドと混合した。
0004108122.tif 000002
このオリゴヌクレオチドは、プラスミドｐＪＯ２１０に組み込まれると、ＢａｍＨＩ部位を除去する単一のＧ→Ｃ塩基変化（上で下線を付けた、ヌクレオチド＃１５）を含んでいた。
変異原オリゴヌクレオチドをｐＪＯ２１０／ＢａｍＨＩと混合した後、混合物を３分間煮沸し、５分間室温まで冷却し、ついでコンピテントＴＢ１細胞に形質転換した。ミニプレプＤＮＡは形質転換体から調製し、ＢａｍＨＩ部位の欠失について選別した。プラスミドｐＪＯ２１５を単離したが、これはｐＪＯ２１０のＢａｍＨＩ部位を欠失していた。
段階Ｃ：ｐＭＣ２００の構築
プラスミドｐＭＣ２００（図２）は、Ｍａｎｄｅｃｋｉ及びＢｏｌｌｉｎｇ、Ｇｅｎｅ６８：１０１（１９８８）に記載された、プラスミドｐＭＷ５０７の誘導体である。このプラスミドは、Ｍａｎｄｅｃｋｉ及びＢｏｌｌｉｎｇにより記載された遺伝子合成のＦｏｋＩ法を用いるｐＭＷ５０７中に多クローニング部位を含む合成オリゴヌクレオチドのクローニングにより構築された。
大規模プラスミドｐＭＷ５０７ＤＮＡは一般的方法を用いてＴＢ１細胞から単離した。そのＤＮＡをＳｍａＩにより完全に消化し、ついで配列［配意列番号２］を有するオリゴヌクレオチドと混合した。
0004108122.tif 000003
これは末端におけるＦｏｋＩアーム及び数個の制限酵素部位を含んでいた。
多クローニング部位ヌクレオチドは次の制限部位及び配列を含んでいた：５’ＦｏｋＩアーム−ＢｇｌＩＩ  付着末端−ＳａｌＩ／ＡｃｃＩ／ＨｉｎｃＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ−ＫｐｎＩ−ＳｍａＩ／ＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ−ＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ−停止コドン−ＢｇｌＩＩ付着末端−ＦｏｋＩアーム３’。オリゴヌクレオチドをｐＭＷ５０７／ＳｍａＩと混合し、混合物を３分間煮沸し、５分間室温まで冷却し、ついでコンピテントＴＢ１細胞に形質転換した。ミニプレプＤＮＡを形質転換体から調製し、多クローニング部位の存在について選別した。プラスミドｐＭＣ２００は、ＤＮＡ配列決定により確認されたようにｐＭＷ５０７への多クローニング部位の挿入を含んでいた。
段階Ｄ：ｐＪＯ２００の構築
プラスミドｐＪＯ２００はプラスミドｐＪＯ２１５の誘導体である（図３）。プラスミドｐＪＯ２００はｐＭＣ２００からの多クローニング部位の除去及びｐＪＯ２１５中のＣＫＳ遺伝子の３’末端におけるこの部位のクローニングによって構築された。
大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＭＣ２００及びｐＪＯ２１５の両方）は一般的方法を用いてＴＢ１細胞から単離した。プラスミドｐＪＯ２１５ＤＮＡをＢｇｌＩＩにより完全に消化し、ついで連結反応中にプラスミドの再環化を防ぐために仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理した。プラスミドｐＭＣ２００ＤＮＡはＦｏｋＩで消化した。ＦｏｋＩによるプラスミドｐＭＣ２００の消化により、プラスミドから多クローニング部位ＤＮＡを切り出したが、このＤＮＡはＢｇｌＩＩ付着末端を含み、ＢｇｌＩＩで消化した後、それはｐＪＯ２１５ＤＮＡ中に容易に連結できた。プラスミドｐＪＯ２１５／ＢｇｌＩＩ／ＣＩＡＰ及びｐＭＣ２００／ＦｏｋＩ（１０６塩基対）から切り出された多クローニング部位はポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。
プラスミドｐＪＯ２１５／ＢｇｌＩＩ／ＣＩＡＰ及びｐＭＣ２００／ＦｏｋＩから切り出された多クローニング部位は混合され、１６℃でＴ４ＤＮＡリガーゼにより一晩連結された。翌日、連結反応混合物はコンピテントＴＢ１細胞に形質転換した。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ＢｇｌＩＩ部位における正しい配向で多クローニング部位の存在について選別した。プラスミドｐＪＯ２００は正しい配向で多クローニング部位を含んでいた。ＢｇｌＩＩ部位におけるｐＪＯ２００中の多クローニング部位のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定によって確認した。
実施例３
ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３発現ベクターＰＭＢ３４
プラスミドｐＭＢ３４はＨＣＭＶ配列を含み、Ellingerら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２７：９７１（１９８９）に記載されたｌａｃＺ発現ベクターｐＲＯＳの誘導体であった。ｐＲＯＳベクターは、ｌａｃＺ遺伝子の下流に配置されたポリリンカークローニング部位を有するｌａｃＺ遺伝子（１−３７５アミノ酸）の末端切断形を含んでいた。ｐＭＢ３４プラスミドは二段階で構築された。第一段階は、１５０ｋＤ（ｐｐ１５０）の塩基性ＨＣＭＶリン酸化蛋白質をコードするｐｐＵＬ３２の二つの領域の結合、ついでこのＨＣＭＶ融合体とｐＲＯＳのｌａｃＺ遺伝子の３’末端との結合を必要とした。
段階Ａ：ｐＭＢ２８：ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２の構築
プラスミドｐＭＢ２８［プラスミドｐＲＯＳの誘導体（図４）］は、ｐＲＯＳのポリリンカー領域へのＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２を含むＤＮＡフラグメントのクローニングによって構築された。ＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２は、ｐｐ１５０のアミノ酸５９５〜１４（ｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３〜１８４２、ここでヌクレオチド１及び３１４４は、Ｃｈｅｅら（１９９０）及びＢａｎｋｉｅｒら（１９９１）で報告されたように、ＡＤ１６９ＤＮＡの相補鎖の、それぞれヌクレオチド４２９９３及び３９８５０に対応する）をコードするｐｐＵＬ３２遺伝子の領域からのＨＣＭＶゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られた。
大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＲＯＳ）は一般的方法を用いてＤＨ５α細胞から単離した。プラスミドｐＲＯＳはＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ベクター骨格はアガロースゲル上で精製した。ＳａｌＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３で始まるセンスプライマー、及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１８４２で始まるアンチセンスプライマーを合成し、ゲノムＨＣＭＶ  ＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合物を加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ａ１Ｃ２（ｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３〜１８４２）として既知のエピトープを含む６０塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。この精製フラグメントはついで１６℃で一晩インキュベートすることにより精製ｐＲＯＳ／ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結された。翌日、連結反応混合物をコンピテントＤＨ５α細胞に形質転換した。ミニプレプＤＮＡを形質転換体から調製し、その形質転換体はｌａｃＺ遺伝子の末端のｐＲＯＳにおける６０塩基対フラグメントの存在について選別された。プラスミドｐＭＢ２８はＡ１Ｃ２フラグメントを含んでいた。ｐＭＢ２８のＡ１Ｃ２のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定で確認し、Ａ１Ｃ２をコードする領域がｌａｃＺコーディング配列と同じ位相内（inframe）にあることを決定した。
段階Ｂ：ｐＭＢ３４：ｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３の構築
プラスミドｐＭＢ３４［プラスミドｐＭＢ２８の誘導体（図５）］は、Ａ１Ｃ２ＤＮＡ配列のすぐ下流で、ｐＭＢ２８のポリリンカー領域へＨＣＭＶ−Ｆ３エピトープを含むＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって構築した。ＨＣＭＶ−Ｆ３エピトープを含むＤＮＡフラグメントは、ｐｐ１５０のアミノ酸１００６〜１０４８（ヌクレオチド3016〜3144）をコードするｐｐＵＬ３２のλｇｔ１１サブクローンから得られ、Ｍｏｃａｒｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１２６６（１９８５）に記載されたλｇｔ１１ライブラリーからのものであった。
大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＭＢ２８）は一般的方法を用いてＤＨ５α細胞から単離した。ファージ溶解液は一般的方法を用いてファージλｇｔ１１クローンλ−Ｆ３から調製した。プラスミドｐＭＢ２８をＳｔｕＩで消化し、平滑断端をもつベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ファージλ−Ｆ３ＤＮＡはＥｃｏＲＩで消化し、陥凹３’末端をＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で充填し、平滑末端とした。平滑末端化した１２９塩基対λ−Ｆ３フラグメントはアガロースゲル上で精製し、ついでその平滑末端を１６℃で一晩ｐＭＢ２８／ＳｔｕＩに連結した。連結反応混合物は翌日コンピテントＤＨ５α細胞に形質転換された。ミニプレプＤＮＡその形質転換体から作製し、形質転換体を正しい配向のｌａｃＺ遺伝子の末端でｐＭＢ２８中の１２９塩基対フラグメントの存在について選別した。プラスミドｐＭＢ３４は正しい配向でＦ３フラグメント含んでいた。プラスミドｐＭＢ３４のＦ３のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定で確認された。Ｆ３コーディング領域はｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２コーディング配列と同じ位相内にあった。ｐＭＢ３４のｌａｃＺ−Ａ１Ｃ２Ｆ３構築物のコーディング領域は、「ｌａｃＺ（１−３７５ａａ）−Ａ１Ｃ２（５９５−６１４ａａ、ｐｐ１５０）−Ｋ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｆ３（１００６−１０４８ａａ、ｐｐ１５０）」と表示される構築物を結果的に生じさせる、Ａ１Ｃ２とＦ３の間の配列［配列番号３］
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ
（又はＫ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ）を有する、５個のアミの酸の橋かけを含んでいた。ペンタペプチド挿入体を含む完全構築物は、本明細書中で「Ａ１Ｃ２Ｆ３」と称する。
実施例４
ｌａｃＺ−ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）発現ベクターｐＭＢ３８の構築
プラスミドｐＭＢ３８［ｌａｃＺ発現ベクターｐＲＯＳの誘導体（図６）］はポリリンカー領域ｐＲＯＳへＨＣＭＶ−ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）を含むＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって構築された。ＨＣＭＶ−ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）を含むＤＮＡフラグメントはリン酸化蛋白質ｐｐ３８のアミノ酸１０６−３７３（ｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド３１６−１１１９、ここでヌクレオチド１及び１１１９はそれぞれＡＤ１６９ＤＮＡ配列のヌクレオチド１１６２０３と１１７３２１に対応する）をコードするｐｐＵＬ８０ａ遺伝子の領域からのゲノムＨＣＭＶ  ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得られた。
プラスミドｐＲＯＳはＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られたベクター骨格はアガロースゲル上で精製した。ｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド３１６で始まりＳａｌＩ部位を含むセンスプライマー、及びｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド１１１９で始まりＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマーを合成し、両方のプライマーをゲノムＨＣＭＶ  ＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）を含む８０４塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製フラグメントはついで１６℃で一晩精製ｐＲＯＳ／ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結反応混合物は翌日コンピテントＤＨ５α細胞に形質転換された。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、形質転換体をｌａｃＺ遺伝子の末端のｐＲＯＳ中の８０４塩基対ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）フラグメントの存在について選別した。プラスミドｐＭＢ３８はｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）フラグメントを含んでいた。ｐＭＢ３８中のｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定で確認し、ｐｐ３８（１０６−３７３ａａ）コーディング領域はｌａｃＺコーディング配列と同じ位相内にあった。
実施例５
ｐＪＯ２００に基づくＣＫＳ−ＣＭＶ発現ベクターの構築
ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００は一連の６個のＣＫＳ−ＣＭＶ遺伝子融合構築物の出発点として使用した。二種類のＣＫＳ−ＣＭＶ遺伝子融合プラスミドを構築した。本明細書中でエピトープ埋込（epitope-embedding）と称する第一のものは、ＣＭＶ遺伝子ＤＮＡ配列がｐＪＯ２００のヌクレオチド６３８（ＣＫＳのアミノ酸１７１に対応する）においてＣＫＳ遺伝子内に挿入されるように構築された。この構築物は「ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ＣＭＶ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）」と称した。この種の構築物からＥ．ｃｏｌｉ中で発現された融合蛋白質はＣＫＳアミノ酸配列内に完全に埋め込まれた抗原のエピトープを含む。プラスミドｐＣＭＶ−１Ａ（下記）はこの様に構築された。
第二タイプのＣＫＳ−ＣＭＶ遺伝子融合プラスミドは、ＣＫＳアミノ酸２４８に対応する位置でＣＫＳ遺伝子の３’末端に連結したＣＭＶ遺伝子ＤＮＡ配列を用いて構築された。この構築物は「ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−ＣＭＶ」と称した。プラスミドｐＣＭＶ−３Ａ、ｐＣＭＶ−３Ｂ、ｐＣＭＶ−４、ｐＣＭＶ−９、及びｐＣＭＶ−２６（下記）はこのように構築された。大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＪＯ２００）は一般的方法で単離し、下記の構築物のために使用した。
段階Ａ：ｐＣＭＶ−１Ａ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳ
プラスミドｐＣＭＶ−１Ａ［プラスミドｐＪＯ２００の誘導体（図７）］は、プラスミドｐＭＢ３４に含まれたＡ１Ｃ２Ｆ３  ＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られた、ＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３を含むＤＮＡフラグメントを、ｐＪＯ２００のＳｔｕＩ部位にクローニングすることによって構築された。
大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＭＢ３４）は一般的方法で単離した。プラスミドｐＪＯ２００ＤＮＡをＳｔｕＩ及びＭｌｕＨＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ消化はＣＫＳ遺伝子の３’末端の部分を除去し、それは連結反応で後に回復された。２つのＰＣＲ誘導ＤＮＡフラグメントは３経路の連結反応でこのベクター骨格にクローン化された。Ａ１Ｃ２Ｆ３はＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ  ＤＮＡフラグメントとしてクローン化され、ＣＫＳ遺伝子の残りの３’部分はＭｌｕＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメントとしてクローン化され、完全なＣＫＳ遺伝子を回復した。
ＳｔｕＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３で始まるセンスプライマー、及びＭｌｕＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド３１４４で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＭＢ３４を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、Ａ１Ｃ２Ｆ３を含む２０４塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。ｐＪＯ２００のヌクレオチド６４０（ＭｌｕＩ部位を含む）で始まるセンスプライマー、及びｐＪＯ２００のヌクレオチド９０５で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＪＯ２００を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。（上記のヌクレオチド番号付けは図１２に示されたＤＮＡ配列に対応する。）ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＣＫＳ遺伝子の３’部分を含む２６６塩基対フラグメントをゲル精製した。これらの精製ＰＣＲ誘導ＤＮＡフラグメントはついで１６℃で一晩ｐＪＯ２００／ＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩに連結された。翌日、連結反応混合物はコンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。
ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＪＯ２００のＳｔｕＩ部位に挿入されたＡ１Ｃ２Ｆ３の存在について選別した。プラスミドｐＣＭＶ−１ＡはＳｔｕＩ部位に挿入されたＡ１Ｃ２Ｆ３を含んでいた。Ａ１Ｃ２Ｆ３のＤＮＡ配列及びＣＫＳ遺伝子の３’末端はＤＮＡ配列決定により確認した。２個のアミノ酸（スレオニン及びアルギニン）の橋かけを含む蛋白質ｒｐＣＭＶ−１ＡをコードするＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳのコーディング領域はＡ１Ｃ２Ｆ３とＣＫＳの３’末端との間のＭｌｕＩ部位に起因した。さらに、ＣＫＳのアミノ酸１７１は構築物においては二重鎖化され、それは「ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）」と称した。
段階Ｂ：ｐＣＭＶ−３Ａ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３の構築
プラスミドｐＣＭＶ−３Ａ［プラスミドｐＪＯ２００の誘導体（図８Ａ及びＣ）］は、プラスミドｐＭＶ３４に含まれるＡ１Ｃ２Ｆ３  ＤＮＡのＰＣＲ増幅で得られた、ＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３を含むＤＮＡフラグメントをｐＪＯ２００のＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位中にクローニングすることによって構築された。プラスミドｐＪＯ２００をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＳａｃＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３で始まるセンスプライマー、及びＢａｍＨＩ部位が後に続くＡ１Ｃ２Ｆ３コーディング配列の末端に終止コドンを含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド３１４４で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＭＢ３４を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、Ａ１Ｃ２Ｆ３を含む２０４塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製し、ついで１６℃で一晩ｐＪＯ２００／ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩに連結した。
連結反応混合物は翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位におけるｐＪＯ２００中の２０４塩基対フラグメントの存在について選別した。プラスミドｐＣＭＶ−３ＡはＣＫＳ遺伝子と同じ位相内で融合したＡ１Ｃ２Ｆ３フラグメントを含んでいた。Ａ１Ｃ２Ｆ３のＤＮＡ配列及びＣＫＳ遺伝子の３’末端を確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ融合構築物は「ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−Ａ１Ｃ２Ｆ３」と称した。
段階Ｃ：ＣＭＶ−３Ｂ：ＣＫＳ−Ｈ１０の構築
プラスミドｐＣＭＶ−３Ｂ［プラスミドｐＪＯ２００の別の誘導体］は、Ｒｉｐａｌｔｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ４６：３９（１９９４）に記載された、プラスミドｐＲＯＳＨ１０からのＨＣＭＶ−Ｈ１０を含むＤＮＡフラグメントを、ｐＪＯ２００中にクローニングすることによって構築された。Ｈ１０ＤＮＡ配列は、ＨＣＭＶからの５２ｋＤのリン酸化蛋白質をコードするｐｐＵＬ４４から誘導された。ｐＲＯＳＨ１０のｐｐＵＬ４４のＨ１０部分はｐｐＵＬ４４のヌクレオチド６０４−１２９９を含み、ここでヌクレオチド１及び１２９９はそれぞれＡＤ１６９ＤＮＡ配列の相補鎖のヌクレオチド５６５１２及び５５２１４に対応する。Ｈ１０は、アミノ酸２０２−４３４に対応する、リン酸化蛋白質ｐｐ５２のＣ末端側の半分をコードする。プラスミドｐＣＭＶ−３Ｂは、Ｈ１０ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅で得られた、ｐＲＯＳＨ１０からのＨ１０ＤＮＡフラグメントをｐＪＯ２００のＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることで構築された。
プラスミドｐＪＯ２００はＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化され、ベクター骨格はアガロースゲル上で精製した。ＳａｃＩ部位を含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチド６０４で始まるセンスプライマー、及びＢａｍＨＩ部位が後に続くＨ１０コーディング配列の末端に終止コドンを含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチド１２９９で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＲＯＳＨ１０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、Ｈ１０を含む６９６塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製し、ついで１６℃で一晩ｐＪＯ２００／ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩに連結した。連結反応混合物は翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から合成し、ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位におけるｐＪＯ２００中の６９６塩基対フラグメントの存在について選別した。プラスミドｐＣＭＶ−３ＢはＣＫＳ遺伝子と同じ位相内で融合したＨ１０フラグメントを含んでいた。Ｈ１０のＤＮＡ配列及びＣＫＳ遺伝子の３’末端を確認した。ＣＫＳ−ＣＭＶ融合構築物は「ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−Ｈ１０」と称した。
段階Ｄ：ｐＣＭＶ−４：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０の構築
プラスミドｐＣＭＶ−４［ｐＪＯ２００のさらなる誘導体］は、それぞれｐＭＢ３４及びｐＲＯＳＨ１０に由来のＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＨＣＭＶ−Ｈ１０の両方を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントをｐＪＯ２００中にクローニングすることによって構築された。
プラスミドｐＪＯ２００をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。２つのＰＣＲ誘導ＤＮＡフラグメントを３経路連結反応でこのベクター骨格にクローン化した。Ａ１Ｃ２Ｆ３はＳａｃＩ／ＰｓｔＩＤＮＡフラグメントとしてクローン化し、Ｈ１０はＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメントとしてクローン化した。
ＳａｃＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３で始まるセンスプライマー、及びＰｓｔＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド３１４４で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＭＢ３４を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｃＩ及びＰｓｔＩで消化し、Ａ１Ｃ２Ｆ３を含む２０４塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。ＰｓｔＩ部位を含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチド６０４で始まるセンスプライマー、ＢａｍＨＩ部位が後に続くＨ１０コーディング配列の末端に終止コドンを含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチド１２９９で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＲＯＳＨ１０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化し、Ｈ１０を含む６９６塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。
ＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＨＣＭＶ−Ｈ１０精製ＰＣＲ誘導ＤＮＡフラグメントはついで１６℃で一晩ｐＪＯ２００／ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩに連結された。連結反応混合物は翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＪＯ２００のＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入されたＡ１Ｃ２Ｆ３及びＨ１０の存在について選別した。プラスミドｐＣＭＶ−４はｐＪＯ２００のＣＫＳ遺伝子の末端にＡ１Ｃ２Ｆ３及びＨ１０を含んでいた。Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＨ１０のＤＮＡ配列を確認した。組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−４をコードするＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０構築物のコーディング領域はＡ１Ｃ２Ｆ３とＨ１０の間のＰｓｔＩ部位に起因した２個のアミノ酸の橋かけを含んでいた。このＣＫＳ−ＣＭＶ融合構築物は「ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｌ−Ｑ−Ｈ１０」と称した。ジペプチド挿入体を含む完全構築物は本明細書中「Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０」と称する。
段階Ｅ：ＰＣＭＶ−９：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）の構築
プラスミドｐＣＭＶ−９［ｐＪＯ２００のさらに別の誘導体］は、ｐｐ６５のアミノ酸２９７−５１０をコードするｐｐＵＬ８３の領域からのＨＣＭＶｃＤＮＡのＰＣＲ増幅で得られたＨＣＭＶ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含むＤＮＡフラグメントをｐＪＯ２００中にクローニングすることによって構築された。使用したフラグメントはｐｐＵＬ８３のヌクレオチド８８９−１５３０からなり、ここでヌクレオチド１及び１６８３はそれぞれ、ＡＤ１６９ＤＮＡ配列の相補鎖のヌクレオチド１２１０３７及び１１９３５５に対応する。
二段階ネステッド（nested）ＰＣＲ反応を用いて、鋳型としてＨＣＭＶｃＤＮＡを用いてＨＣＭＶ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）ＤＮＡフラグメントを精製した。外側ネストＰＣＲ増幅反応のために、ｐｐＵＬ８３のヌクレオチド８０７で始まるセンスプライマー、及びｐｐＵＬ８３のヌクレオチド１５７２で始まるアンチセンスプライマーを合成し、ＨＣＭＶｃＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、外側ネスト反応混合物を内側ネストＰＣＲ増幅反応のための鋳型ＤＮＡとして使用した。内側ネストＰＣＲ増幅反応のために、ＳａｃＩ部位を含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド８８９で始まるセンスプライマー、及びＢａｍＨＩ部位が後に続くｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）コーディング配列の末端に終止コドンを含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド１５３０で始まるアンチセンスプライマーを合成し、外側ネスト増幅ＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含む６４２塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。
プラスミドｐＪＯ２００をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＨＣＭＶ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）精製ＤＮＡフラグメントはついで１６℃で一晩ｐＪＯ２００／ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩに連結された。連結反応混合物は翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＪＯ２００のＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入されたｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）の存在について選別した。プラスミドｐＣＭＶ−９はｐＪＯ２００のＣＫＳ遺伝子の末端にｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含んでいた。ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）のＤＮＡ配列を確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ融合構築物は「ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）」と称した。
段階Ｆ：ｐＣＭＶ−２６：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）の構築
プラスミドｐＣＭＶ−２６［ｐＪＯ２００のさらに別の誘導体］は、ｐＭＢ３８由来のｐｐ３８（ヌクレオチド３４９−１１１９）のアミノ酸１１７−３７３をコードするｐｐＵＬ８０ａの領域からのｐｐ３８ＤＮＡのＰＣＲ増幅で得られたＨＣＭＶ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含むＤＮＡフラグメントをｐＪＯ２００中にクローニングすることによって構築した。
ＳａｃＩ部位を含むｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド３４９で始まるセンスプライマー、及びＢａｍＨＩ部位が後に続く終止コドンを含むｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド１１１９で始まるアンチセンスプライマーを合成し、ｐＭＢ３８ＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含む７７１塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。
大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＭＢ３４）は一般的方法で単離した。プラスミドｐＪＯ２００をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＨＣＭＶ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）精製ＤＮＡフラグメントはついで１６℃で一晩ｐＪＯ２００／ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩに連結された。連結反応混合物は翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＪＯ２００のＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入されたｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）の存在について選別した。プラスミドｐＣＭＶ−２６はｐＪＯ２００中のＣＫＳ遺伝子の末端にｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含んでいた。ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）のＤＮＡ配列を確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ融合構築物は「ＣＫＳ（１−２４８ａａ）−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）」と称した。
実施例６
ＣＫＳエピトープ埋込発現ベクターｐＥＥ１の構築
ＣＫＳエピトープ埋込発現ベクターは、ＣＫＳ蛋白質内にエピトープ含有組換え蛋白質の埋込を可能にして、作製された。ｐＥＥ１と称するベクターは「ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−組換え蛋白質−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）」と称した。このｐＥＥ１ベクターはＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００から出発し二段階で構築された。第一段階では、変異原オリゴヌクレオチドは、ＭｌｕＩ部位及びＳａｃＩ部位の両方を除くように、ｐＪＯ２００のＣＫＳ遺伝子の５’末端付近に配置された一対の隣接ＭｌｕＩにクローン化された。ｐＪＯ２００へのこの改変は、次の段階でＣＫＳ遺伝子中のさらに下流に導入されるべき唯一のＭｌｕＩクローニング部位の使用を可能にする。第二段階では、プラスミドｐＣＭＶ−１ＡからのＤＮＡのフラグメントはこの改変ｐＪＯ２００ベクターにクローン化され、このようにしてＣＫＳ遺伝子中へのＳｔｕＩ／ＭｌｕＩフラグメントとして遺伝子の埋込を可能にした。
段階Ａ：ｐＪＯ２００−ΔＭｌｕＩの構築
プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ［ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００の誘導体（図９Ａ）］は、変異原オリゴヌクレオチドを用いてｐＪＯ２００ＤＮＡ中のヌクレオチド１６１−１７４（アミノ酸１１−１５）に配置された一対の隣接したＭｌｕＩ部位及びＳａｌＩ部位を除去することによって構築された。本来のｐＪＯ２００ＤＮＡ配列の改変部位はヌクレオチド配列１５１−１８０  ５’−３’に含まれていた（図９Ｂ）。二つの標的化変異原ヌクレオチドｐＪＯ２００ＤＮＡチミン−１６６及びｐＪＯ２００ＤＮＡアデニン−１６９は、二つのＭｌｕＩ部位及びＳａｌＩ部位と同様に、注目される。
プラスミドｐＪＯ２００をＭｌｕＩで消化し、エタノールで沈澱し、アルカリホスファターゼ緩衝液に再懸濁した。プラスミドｐＪＯ２００／ＭｌｕＩはついで仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理され、自己連結を防ぐために５’リン酸基を除去した。ＤＮＡはＣＩＡＰでの処理後、フェノール−クロロホルムで抽出され、エタノールで沈澱され、ＴＥ緩衝液に再懸濁された。ベクター骨格はついでアガロースゲル上で精製した。
図９Ｃの変異原オリゴヌクレオチドはｐＪＯ２００／ＭｌｕＩ／ＣＩＡＰへの連結のために合成された。このオリゴヌクレオチドはその３’末端で自己相補的であり、アニ−リング段階が後に続く熱変性段階の後、二本鎖構造の形成を可能にした。変異原オリゴヌクレオチドはＭｌｕＩで消化したｐＪＯ２００ＤＮＡへの連結を可能にするＭｌｕＩ付着末端を含んでいた。このオリゴヌクレオチドの配列は、本来のｐＪＯ２００ＤＮＡ配列とは異なり、ｐＪＯ２００ＤＮＡ  Ｔ１６６及びｐＪＯ２００ＤＮＡ  Ａ１６９残基が変異原オリゴヌクレオチド（図９Ｃ及びＤ、下線で注意したように）で逆転していた。このように、変異原オリゴヌクレオチドがｐＪＯ２００のＭｌｕＩ部位にクローン化されると、ＭｌｕＩ部位及びＳａｌＩ部位の両方を破壊した。
合成変異原オリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５’末端でリン酸化された。反応混合物は２０分間６５℃まで加熱され、キナーゼを不活性化した。室温まで冷却後、リン酸化オリゴヌクレオチドをｐＪＯ２００／ＭｌｕＩ／ＣＩＡＰと混合し、５分間６５℃まで加熱し、ついで室温まで徐々に冷却して、それ自体へのリン酸化オリゴヌクレオチドのアニ−リングを可能にした。連結反応緩衝液及びＴ４ＤＮＡリガーゼをついで加え、混合物は２０℃から４℃まで温度が低下するように、一晩インキュベートした。連結反応混合物は翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ＭｌｕＩ及びＳａｌＩ部位の欠失について選別した。プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩはこれらの制限酵素部位を失って、単離された。ＣＫＳ遺伝子の５’末端のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列分析で確認された。ＭｌｕＩ及びＳａｌＩ部位の除去に加えて、変異原オリゴヌクレオチドは、Ｓｅｒ−ＴｈｒからＴｈｒ−Ｓｅｒまでのヌクレオチド１６６−１７１でコードされたアミノ酸を変えた。プラスミドｐＪＯ２００ＤＮＡ配列はそれによってプラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ  ＤＮＡに改変され、図９Ｄのヌクレオチド１５１−１８０  ５’−３’の部分配列を有した。
段階Ｂ：ｐＥＥ１の構築
プラスミドｐＥＥ１［プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩの誘導体（図１０）］は、ＣＫＳ遺伝子内に埋め込まれたＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３を含む、プラスミドｐＣＭＶ−１ＡからのＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩを、ｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩのＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ中にクローニングして構築された。ｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩに存在するＣＫＳコーディング領域内のＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＣＭＶ−１ＡからのＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩフラグメントで置換して、生じるプラスミドｐＥＥ１はＣＫＳ遺伝子内に埋め込まれたＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３を含んでいた。プラスミドｐＥＥ１はプラスミドｐＣＭＶ−１Ａとは異なり、ｐＥＥ１はＣＫＳ遺伝子の５’末端に存在する下流ＭｌｕＩ部位を含まなかった。それゆえ、ＳｔｕＩ及びＭｌｕＩによるｐＥＥ１の消化はＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３ＤＮＡフラグメントを放出し、ブラント／ＭｌｕＩ相容性付着末端ＤＮＡフラグメントとしてＣＫＳ遺伝子中に埋め込むための他の遺伝子を受容することができる、アガロースゲル上で精製後のベクター骨格を提供する。
大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ及びｐＣＭＶ−１Ａ）は一般的方法で単離された。プラスミドｐＣＭＶ−１ＡはＳｔｕＩ及びＢａｍＨＩで消化され、Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＣＫＳ遺伝子の３’末端を含む４６１塩基対フラグメントはアガロースゲル上で精製した。プラスミドｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩはＳｔｕＩ及びＢａｍＨＩで消化され、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。Ａ１Ｃ２Ｆ３を含む４６１塩基対フラグメント及びｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩ／ＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩベクター骨格は共に混合され、１６℃で一晩連結された。連結反応混合物を用いて翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＪＯ２００ΔＭｌｕＩの４６１塩基対Ａ１Ｃ２Ｆ３ＤＮＡフラグメントの存在について選別した。プラスミドｐＥＥ１はＡ１Ｃ２Ｆ３ＤＮＡフラグメントを含み、ＣＫＳ遺伝子の５’末端のＭｌｕＩ部位を含まなかった。ＣＫＳ遺伝子の３’末端及びＡ１Ｃ２Ｆ３フラグメントのＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定により確認した。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＢａｍＨＩにより消化した後、アガロースゲル上でベクター骨格を精製して、他のＤＮＡフラグメントとの連結の調製で完全にＡ１Ｃ２Ｆ３ＤＮＡフラグメントを除去した。この精製ベクター骨格は、図式的に「５’Ｘ−目的遺伝子−Ｙ３’」（ここでＸは平滑末端、Ｙは例えばＭｌｕＩ又はＢｓｓＨＩＩのようなＭｌｕＩ相容性付着末端である）として表示される、正しい読み枠のＣＫＳ遺伝子中に埋め込むためのＤＮＡフラグメントを受容可能であった。プラスミドｐＥＥ１は、１９９５年５月１日にブダペスト条約の規定により、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２（米国）に寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６９７９８が与えられた。
実施例７
ｐＥＥ１に基づくＣＫＳエピトープ埋込発現ベクターの構築
ＣＫＳ発現ベクターｐＥＥ１は一連の４種のＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ遺伝子融合構築物の出発点として使用した。各構築物のために、プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクター骨格を精製した。ｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ骨格はその５’末端にＳｔｕＩ部位を、その３’末端にＭｌｕＩ部位を有する、ＰＣＲによって生成したＣＭＶ遺伝子フラグメントを受容できた。ＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化後、ＰＣＲフラグメントはｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ骨格と同じ位相内にクローン化された。これらのベクターから発現したＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合蛋白質は「ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ＣＭＶ−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）」と表示され、ここでＴ及びＲはベクター中に導入された合成ＭｌｕＩ部位でコードされたスレオニン及びアルギニン残基である。
段階Ａ：ｐＣＭＶ−２７：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳの構築
プラスミドｐＣＭＶ−２７［ｐＥＥ１の誘導体（図１１Ａ及びＢ）］は、ｐＣＭＶ−４由来のＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントをｐＥＥ１にクローニングして構築された。プラスミドｐＣＭＶ−２７は１９９５年５月１日にブタペスト条約の規定に基づいてＡＴＣＣに寄託され、受託番号６９７９７を与えられた。
大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１及びｐＣＭＶ−４）は一般的方法で単離された。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクター骨格、ｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩをアガロースゲル上で精製した。ＳｔｕＩ部位を含むｐｐＵＬ３２のヌクレオチド１７８３で始まるセンスプライマー、及びＭｌｕＩ部位を含むｐｐＵＬ４４のヌクレオチド１２９９で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＣＭＶ−４を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０を含む９０６塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製９０６塩基対ＤＮＡフラグメントは１６℃で一晩ｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに連結した。連結反応混合物を用いて翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ部位に挿入されたＡ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０ＤＮＡフラグメントの存在について選別した。プラスミドｐＣＭＶ−２７はｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに埋め込まれたＡ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０を含んでいた。Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０のＤＮＡ配列及びＣＫＳの隣接ＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定で確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合構築物は「ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｌ−Ｑ−Ｈ１０−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０）」と表示され、ここでＬ及びＱ、並びにＴ並びにＲは、それぞれ、ベクターに導入された合成ＰｓｔＩ及びＭｌｕＩ部位でコードされたロイシン、グルタミン、スレオニン及びアルギニン残基である。
段階Ｂ：ｐＣＭＶ−２８：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＣＫＳの構築
プラスミドｐＣＭＶ−２８［ｐＥＥ１の別の誘導体］は、ｐＣＭＶ−９由来のＨＣＭＶ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントをｐＥＥ１にクローニングして構築された。プラスミドｐＣＭＶ−２８は、１９９５年５月１日にブタペスト条約の規定に基づいてＡＴＣＣに寄託され、受託番号６９７９９を与えられた。
大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１及びｐＣＭＶ−９）は一般的方法で単離された。プラスミドｐＥＥ１はＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクター骨格はアガロースゲル上で精製した。ＳｔｕＩ部位を含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド８８９で始まるセンスプライマー、及びＭｌｕＩ部位を含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド１５３０で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＣＭＶ−９を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含む６４２塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製６４２塩基対ＤＮＡフラグメントは１６℃で一晩ｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに連結された。連結反応混合物を用いて翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換された。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ部位に挿入されたｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）ＤＮＡフラグメントの存在について選別した。ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含んだプラスミドｐＣＭＶ−２８はｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ部位に埋め込まれていた。ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）のＤＮＡ配列及びＣＫＳの隣接ＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定で確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合構築物は「ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０）」と表示され、ここでＴ及びＲはベクターに導入された合成ＭｌｕＩ部位によってコードされたスレオニン及びアルギニン残基である。
段階Ｃ：ｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＳＴＯＰ−ＣＫＳの構築
プラスミドｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ［ｐＥＥ１の更なる誘導体］は、ｐＣＭＶ−９由来のＨＣＭＶ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントをｐＥＥ１にクローニングして構築された。翻訳すると、プラスミドは以下のように、組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２８の末端切断形を生じた。
大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１及びｐＣＭＶ−９）は一般的方法で単離された。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＳｔｕＩ部位を含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド８８９で始まるセンスプライマー、及びＭｌｕＩ部位が後に続く終止コドンを含むｐｐＵＬ８３のヌクレオチド１５３０で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＣＭＶ−９を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物はＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含む６４２塩基対フラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製６４２塩基対ＤＮＡフラグメントは１６℃で一晩ｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに連結された。連結反応混合物を用いて翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ部位に挿入されたｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）ＤＮＡフラグメントの存在について選別した。ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）を含んだプラスミドｐＣＭＶ−２８はｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ部位に埋め込まれた。ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）のＤＮＡ配列及びＣＫＳの隣接ＤＮＡ配列を確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合構築物は「ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＳＴＯＰ−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０）」と表示され、ここでＳＴＯＰは終止コドンであり、Ｔ及びＲはベクターに導入された合成ＭｌｕＩ部位によってコードされたスレオニン及びアルギニン残基である。ｐｐ６５コーディング配列の末端の終止コドンの存在のために、ＣＫＳ蛋白質のＣ末端領域に対する残りのコーディング配列は翻訳されず、この構築物からはＥ．ｃｏｌｉ中で発現されなかった。
段階Ｄ：ｐＣＭＶ−２９：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）ＣＫＳの構築
プラスミドｐＣＭＶ−２９［ｐＥＥ１の誘導体］は、ｐＣＭＶ−２６由来のＨＣＭＶ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントをｐＥＥ１にクローニングして構築された。プラスミドｐＣＭＶ−２９は１９９５年５月１日にブタペスト条約の規定に基づいてＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６９７９６が与えられた。
大規模プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１及びｐＣＭＶ−２６）は一般的方法で単離された。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＳｔｕＩ部位を含むｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド３４９で始まるセンスプライマー、及びＭｌｕＩ部位を含むｐｐＵＬ８０ａのヌクレオチド1119で始まるアンチセンスプライマーを合成し、プラスミドｐＣＭＶ−２６を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで消化し、ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含む７７１塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／ＭｌｕＩに連結した。連結反応混合物を用いて翌日コンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。ミニプレプＤＮＡをその形質転換体から調製し、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ部位に挿入されたｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）ＤＮＡフラグメントの存在について選別した。ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）を含んだプラスミドｐＣＭＶ−２９はｐＥＥ１のＳｔｕＩ／ＭｌｕＩ部位に埋め込まれた。ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）のＤＮＡ配列及びＣＫＳの隣接ＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定によって確認した。このＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳ融合構築物は「ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０）」と表示され、ここでＴおよびＲはベクターに導入された合成ＭｌｕＩ部位でコードされたスレオニン及びアルギニン残基である。
実施例８
組換えＣＭＶ抗原の生成と特性化
プラスミドｐＣＭＶ−１Ａ、ｐＣＭＶ−３Ａ、ｐＣＭＶ−４、ｐＣＭＶ−９、ｐＣＭＶ−２６、ｐＣＭＶ−２７、ｐＣＭＶ−２８、ｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ、及びｐＣＭＶ−２９はコンピテントＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株ＸＬ−１Ｂｌｕｅ中に別々に形質転換された。個々のＨＣＭＶ蛋白質を発現する細菌クローンは１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むスーパーブロスＩＩ培地中で３７℃で一晩増殖された。一晩培養物は同じ培地で１：１００に希釈され、６００ｎｍで測定して、培養物が光学密度０．７〜０．９に達するまで、通気して３７℃で増殖された。誘導前試料は培養物から採取され、１３，０００ｘｇで１分間遠心され、粗細菌溶菌液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液に細胞ペレットを再懸濁し、５分間煮沸して調製した。
組換えＨＣＭＶ抗原の合成は、光学密度が０．７〜０．９に達した後、１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧの添加で個々の培養物に誘導された。試料はＩＰＴＧ誘導後４時間培養物から採取され、試料は１３，０００ｘｇで１分間遠心され、粗細菌溶菌液は、細胞ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中に再懸濁し、５分間煮沸して、調製された。細胞は４℃で１２，０００ｘｇで１５分間で集められ、次の処理まで−８０℃で凍結された。
誘導前及び誘導後試料は第一（Ｄａｉｉｃｈｉ）プレキャスト４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードされた。泳動後、ゲルは５０％メタノール及び１０％酢酸中０．１２５％ＣｏｏｍａｓｓｉｅTMブル−色素の溶液中で１時間染色され、ついで透明な背景を得るまで、７％酢酸及び５％メタノールの溶液中で脱色された。蛋白質分子量標準はＥ．ｃｏｌｉ中で発現した組換えＨＣＭＶ蛋白質の分子量決定のためにゲル上で泳動された。
段階Ａ：組換え抗体ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳ（ｒｐＣＭＶ−１Ａ）の特性化
組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−１Ａ（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳ）の発現は、ｐＣＭＶ−１Ａで形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得られた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動することで評価された。ＣｏｏｍａｓｓｉｅTM染色ゲルの分析は、ｒｐＣＭＶ−１Ａ蛋白質が全胞蛋白質の１５％からなることを示した。組換え蛋白質は４４，０００の見かけの分子量を有し、３６，０００の計算分子量より大きかった。
段階Ｂ：組換え抗原ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３（ｒｐＣＭＶ−３Ａ）の特性化
組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−３Ａ（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３）の発現はｐＣＭＶ−３Ａで形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶離液から得られた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して評価された。ゲルを染色したＣｏｏｍａｓｓｉｅTMの分析は、ｒｐＣＭＶ−３Ａ蛋白質が全細胞蛋白質の１５％からなることを示した。組換え蛋白質は４２，０００の見かけの分子量を有し、３４，０００の計算分子量より大きかった。
段階Ｃ：組換え抗原ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０（ｒｐＣＭＶ−４）の特性化
組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−４（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０）の発現はｐＣＭＶ−４で形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得られた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動することで評価された。ゲルを染色したＣｏｏｍａｓｓｉｅTMの分析はｒｐＣＭＶ−４蛋白質が全細胞蛋白質の１５％からなることを示した。組換え蛋白質は７０，０００の見かけの分子量を有し、５８，０００の計算分子量より大きかった。
段階Ｄ：組換え抗原ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）（ｒｐＣＭＶ−９）の特性化
組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−９（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ））の発現はｐＣＭＶ−９で形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得られた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して評価された。ゲルを染色したＣｏｏｍａｓｓｉｅTMの分析は、ｒｐＣＭＶ−９蛋白質がともに計算分子量５１，０００より大きい分子量６０，０００及び５６，０００の２種の蛋白質の間に等しく分布し全細胞蛋白質の１０％からなることを示した。
段階Ｅ：組換え抗原ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）（ｒｐＣＭＶ−２６）の特性化
組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２６（ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ））の発現は、ｐＣＭＶ−２６で形質転換されたＸｌ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得られた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して評価された。ゲルを染色したＣｏｏｍａｓｓｉｅTMの分析はｒｐＣＭＶ蛋白質が全細胞蛋白質の１０％からなることを示した。組換え蛋白質は６５，０００の見かけの分子量を有し、５４，０００の計算分子量より大きかった。
段階Ｆ：組換え抗原ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳ（ｒｐＣＭＶ−２７）の特性化
組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２７（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳ）の発現はｐＣＭＶ−２７で形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得られた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して評価された。ＣｏｏｍａｓｓｉｅTM染色ゲルの分析はｒｐＣＭＶ−２７蛋白質が全細胞蛋白質の１０％からなることを示した。組換え蛋白質は７２，０００の見かけの分子量を有し、６０，０００の計算分子量より大きかった。
段階Ｇ：組換え抗原ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＣＫＳ（ｒｐＣＭＶ−２８）の特性化
組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２８（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＣＫＳ）の発現は、ｐＣＭＶ−２８で形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得られた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して評価された。ＣｏｏｍａｓｓｉｅTM染色ゲルの分析は、ｒｐＣＭＶ−２８蛋白質が全細胞蛋白質の５％からなることを示した。組換え蛋白質は５７，０００の見かけの分子量を有し、５３，０００の計算分子量より大きかった。
段階Ｈ：組換え抗原ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＳＴＯＰ−ＣＫＳ−（ｒｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ）の特性化
組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＳＴＯＰ−ＣＫＳ）の発現は、ｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰで形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得られた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して評価された。ＣｏｏｍａｓｓｉｅTM染色ゲルの分析は、ｒｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ蛋白質が全細胞蛋白質の５％からなることを示した。組換え蛋白質は４７，０００の見かけの分子量を有し、４２，０００の計算分子量より大きかった。
段階Ｉ：組換え抗原ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）−ＣＫＳ（ｒｐＣＭＶ−２９）の特性化
組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２９（ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）−ＣＫＳ）の発現はｐＣＭＶ−２９で形質転換されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞の粗溶菌液から得られた誘導前及び誘導後試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して評価された。ＣｏｏｍａｓｓｉｅTM染色ゲルの分析は、ｒｐＣＭＶ−２９蛋白質が全細胞蛋白質の５％からなることを示した。組換え蛋白質は６７，０００の見かけの分子量を有し、５５，０００の計算分子量より大きかった。
実施例９
埋込及び非埋込ＣＫＳ発現の比較
粗溶菌液及び精製蛋白質はＣＫＳ発現の埋込様式及びＣＫＳ発現の非埋込様式で発現した各組換え抗原に対してＥ．ｃｏｌｉ細胞から調製された。これは組換え抗原のＣＫＳ発現の埋込様式をＣＫＳ発現の非埋込様式と直接比較するために行われた。これらの粗溶菌液及び精製蛋白質は引き続き下記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットで分析された。Ｅ．ｃｏｌｉからの粗溶菌液は実施例８に記載されたように調製された。
Ｅ．ｃｏｌｉからの精製蛋白質は次の一般的方法で調製された。実施例７に記載の細胞ペレットは融解され、追加の１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、２５ｍｇ／ｍＬのＤＮアーゼＩ、２ｍｇ／ｍＬのアプロチニンを含んだＴＥＭ溶菌緩衝液中で均質化された。均質化後、ＰＭＳＦを０．２ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで加え、細胞を室温又は４℃で３０分間溶菌した。溶菌後細胞溶菌液は４℃で３０分間２５，０００ｘｇで遠心された。可溶性Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質及び可溶性組換え抗原は上澄みに見いだされ、不溶性包接体を形成した組換え抗原はペレット中に見いだされた。可溶性Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質は、引き続いて追加のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含んだＰＴＥ緩衝液で一回、追加の１％デオキシコール酸ナトリウムを含んだＰＴＥ緩衝液で一回、及び追加の０．５Ｍ塩化ナトリウムを含んだＰＴＥ緩衝液で一回ペレットを洗浄してペレットから除去された。組換え抗原を含む不溶性ペレットはついで追加の８Ｍ尿素を含むＰＴＥ緩衝液に溶解され、４℃で保存された。
粗溶菌液及び精製蛋白質は実施例８に記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで、下記のようにウエスタンブロットで分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動した後、蛋白質は、Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  ＥｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒTM（Integrated Separation Systems）を用いてニトロセルロース膜に移され、ニトロセルロースは膜ブロッキング溶液を用いて一晩ブロックされた。翌日膜はＲｕｂａｚｙｍｅ試料希釈緩衝液中に希釈された適当なマウスモノクロナール抗体と室温で２時間インキュベートされた。ＴＢＳ及びＴＢＳＴで膜を洗浄後、膜はついでペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと室温で１時間インキュベートされた。ＴＢＳ及びＴＢＳＴで別の洗浄段階後、ブロットは４−クロロ−１−ナフトール／過酸化水素で可視化された。
段階Ａ：ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＣＫＳ（ｐＣＭＶ−２８）とＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）（ｐＣＭＶ−９）の発現の比較
実施例８Ｄ及び８ＧでＣｏｏｍａｓｓｉｅTMで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる粗溶菌液の評価は、プラスミドｐＣＭＶ−２８（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）−ＣＫＳ）の発現はＩＰＴＧによる誘導で分子量５７，０００ダルトンの単一主要蛋白質バンドを生じたが、プラスミドｐＣＭＶ−９（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ））は６０，０００及び５６，０００ダルトンに二重バンドを生じた。これらの構築で誘導後に生じた蛋白質生成物をさらに理解するために、ウエスタンブロット分析がこれらの粗溶菌液について、及びプラスミドｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ（ＣＫＳ−ｐｐ６５（２９７−５１０ａａ）ＳＴＯＰ−ＣＫＳ）から得られた粗溶菌液について行なった（実施例８Ｈ参照）。この構築物における終止コドンの存在により、ＣＫＳの最後の９０アミノ酸を含まない末端切断型蛋白質の形成が生じた。
これら３種の構築物からの溶菌液は、ＣＫＳに対するモノクロナール抗体及びｐｐ６５に対するモノクロナール抗体で試験された。組換え蛋白質ｒｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ、ｒｐＣＭＶ−２８、及びｒｐＣＭＶ−９のウエスタンブロット分析の結果は下の表１に示される。Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ、ｐＣＭＶ−２８、及びｐＣＭＶ−９の発現は期待した完全長の蛋白質の形成を生じた。さらに、蛋白質末端切断生成物の範囲がＣＫＳ及びｐｐ６５のモノクロナール抗体の両方に免疫反応的に観察された。末端切断生成物のサイズと数は各蛋白質で変化した。
0004108122.tif 000004
Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰの発現は期待した完全長の蛋白質（４７ｋＤにおけるｒｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ）プラスｐｐ６５モノクロナール抗体で検出可能な末端切断生成物の範囲の生成を生じた。ＣＫＳモノクロナール抗体で検出される蛋白質生成物はなかった。この結果はＣＫＳモノクロナール抗体で認識されるエピトープが、アミノ酸１７１〜２６０がｐｐ６５遺伝子の下流の終止コドンの存在のためにこの蛋白質に存在しないので、ＣＫＳ蛋白質のＣ末端部分に位置したことを示した。
Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドｐＣＭＶ−２８の埋込発現は、ＣＫＳモノクロナール抗体及びｐｐ６５モノクロナール抗体の両方で検出された、期待した完全な長さの蛋白質（５７ｋＤ）の生成を生じた。しかし、プラスミドｐＣＭＶ−２８（４７から４１ｋＤまで）の末端切断生成物はｐｐ６５モノクロナール抗体でのみ検出された。これは、これらの末端切断生成物がＣＫＳモノクロナール抗体とのエピトープ反応性を失った事実のためであった。
プラスミドｐＣＭＶ−２８からの完全な長さの蛋白質（５７ｋＤで）と、その全てがｐｐ６５モノクロナール抗体と免疫反応性であるｐＣＭＶ−２８（４７から４１ｋＤまで）の末端切断生成物の間に１０ｋＤのギャップが存在することが観察された。ｐｐ６５モノクロナール抗体に免疫反応性である、プラスミドｐＣＭＶ−２８ＳＴＯＰ及びｐＣＭＶ−２８で生じる末端切断生成物が同じ大きさであることに注目することは重要である。それゆえ、Ｅ．ｃｏｌｉ中の埋込ＣＫＳ発現中に、（ｉ）完全な長さの蛋白質生成物が作られるか、又は（ｉｉ）恐らく埋め込まれた遺伝子の翻訳中のリボソーム休止のために、ＣＫＳのＣ末端（アミノ酸１７１〜２６０）を欠いた１０ｋＤ又はそれより小さい末端切断（truncaition）生成物が作られた。
理論に拘束されるつもりはないがＥ．ｃｏｌｉ中の埋込融合遺伝子の翻訳中に二つのことの一つが起こったと思われた。ＣＫＳ遺伝子内に埋め込まれた遺伝子の翻訳中にリボソームが立ち往生して、蛋白質末端切断生成物を生じたか、又はリボソームが埋込遺伝子をうまく翻訳してＣＫＳ遺伝子の残部によって続けたかである。これは、両方のモノクロナール抗体で検出されたように、完全な長さの蛋白質（５９ｋＤ）と最大末端切断生成物（５５ｋＤ）の間に１０ｋＤのギャップが存在しない、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドｐＣＭＶ−９の非埋込発現と対照的である。
これらの結果は、非埋込ＣＫＳ発現を超える埋込ＣＫＳ発現の二つの長所を示す。第一に、埋込ＣＫＳ発現は混入する末端切断生成物のサイズを１０ｋＤだけシフトさせ、したがって標準クロマトグラフ法を使用するときの末端切断生成物からの完全長蛋白質のクロマトグラフィー分離を改善する。第二に、ＣＫＳのＣ末端に対するＣＫＳモノクロナール抗体の使用、及び精製蛋白質のサイズが、埋込エピトープが無傷である埋込ＣＫＳ発現で生じた精製蛋白質のウエスタンブロットデータから証明するために使用できた。この埋込ＣＫＳの末端におけるＣＫＳアミノ酸配列（アミノ酸１７１〜２６０）はＣＫＳモノクロナール抗体を用いるウエスタンブロットで可視化できる免疫学的「タグ」として役立つ蛋白質を発現した。その存在は埋め込みエピトープが精製蛋白質中で無傷であることを保証した。このような蛋白質のＣ末端の何らかの欠陥は免疫学的に無関係なＣＫＳ部分に制限されるだろう。
段階Ｂ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳ（ｐＣＭＶ−２７）とＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０（ｐＣＭＶ−４）の発現の比較
実施例８Ｃ及び８ＦでＣｏｏｍａｓｓｉｅTMで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる粗溶菌液の評価は、プラスミドｐＣＭＶ−２７（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０−ＣＫＳ）及びｐＣＭＶ−４（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０）の発現は、ＩＰＴＧによる誘導で７０，０００〜７２，０００の分子量の単一の主要蛋白質バンドを生じた。
ウエスタンブロット分析は蛋白質生成物をさらに特性化するために、Ｅ．ｃｏｌｉ中のこれらの構築物の発現から得られた粗溶菌液について行われた。これら二つの構築物からの溶菌液はＣＫＳに対するモノクロナール抗体及びＨ１０に対するモノクロナール抗体を用いて試験された。この分析の結果は下の表２に示される。
0004108122.tif 000005
表２に見られるように、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドｐＣＭＶ−２７及びｐＣＭＶ−４蛋白質の発現により、ＣＫＳ及びＨ１０モノクロナール抗体の両方に免疫反応性である、期待した完全長の蛋白質プラスある範囲の蛋白質末端切断生成物の形成を生じた。
Ｅ．ｃｏｌｉ中のＡ１Ｃ２Ｆ３の埋込ＣＫＳ発現は、完全な長さの蛋白質（６８ｋＤ）及びＨ１０モノクロナール抗体と免疫反応性のある範囲の末端切断生成物の生成を生じた。埋込ＣＫＳ発現から生じた混入する末端切断生成物は完全長の蛋白質から大きさで１０ｋＤだけ離れていた。対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＡ１Ｃ２Ｆ３−Ｈ１０の非埋込ＣＫＳ発現により、完全な長さの蛋白質（６８ｋＤ）及びＨ１０モノクロナール抗体と免疫反応性のある範囲の末端切断生成物（６６から５６ｋＤまで）の生成を生じた。非埋込ＣＫＳ発現から生じた混入する蛋白質末端切断生成物は完全長の蛋白質からうまくサイズ分離されなかった。
埋込及び非埋込ＣＫＳ発現から生じた完全長の蛋白質及び非埋込ＣＫＳ発現から生じた蛋白質末端切断生成物はＣＫＳモノクロナール抗体と免疫反応性であった。埋込ＣＫＳ発現から生じた混入する蛋白質生成物は、ＣＫＳモノクロナール抗体がＣＫＳのＣ末端に特異的であるため、ＣＫＳモノクロナール抗体と免疫反応性でなかった。
埋込ＣＫＳ発現は混入する末端切断生成物の大きさを１０ｋＤだけシフトし、したがって標準クロマトグラフィー法を用いるときの末端切断生成物からの完全長蛋白質の分離を改善した。この埋込ＣＫＳ発現蛋白質の末端におけるＣＫＳアミノ酸配列（アミノ酸１７１〜２６０）は、抗ＣＫＳモノクロナール抗体を用いるウエスタンブロットで可視化可能な免疫学的タグとしても役立ち、埋込エピトープが精製蛋白質中で無傷であることを示した。
段階Ｃ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳ（ｐＣＭＶ−１Ａ）とＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３（ｐＣＭＶ−３Ａ）の発現の比較
実施例８Ａ及び８ＢでＣｏｏｍａｓｓｉｅTMで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる粗溶菌液の評価は、プラスミドｐＣＭＶ−１Ａ（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳ）及びｐＣＭＶ３Ａ（ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３）の発現が、ＩＰＴＧによる誘導で４２，０００〜４４，０００ダルトンの分子量の単一主要蛋白質バンドを生じさせたことを示した。ＣｏｏｍａｓｓｉｅTM染色ゲルの分析はｒｐＣＭＶ−１Ａ及びｒｐＣＭＶ−３Ａ蛋白質がそれぞれ全細胞蛋白質の１５％からなることを示した。
プラスミドｐＣＭＶ−３Ａの非埋込ＣＫＳ発現で得られた、ｒｐＣＭＶ−３Ａ蛋白質は、細胞溶菌液の遠心後得られた上澄みに完全に存在した。この蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定されたようにほぼ１５％の純度であった。対照的に、プラスミドｐＣＭＶ−１Ａの埋込ＣＫＳ発現で得られたｒｐＣＭＶ−１Ａ蛋白質は細胞溶菌液の遠心後に得られたペレット内に完全に存在した。プラスミドｐＣＭＶ−１Ａの発現で得られた包接体（inclusion）は上記のように洗浄で精製された。包接体は８Ｍ尿素に可溶化され、ｒｐＣＭＶ−３ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥで８５〜９０％純度であると決定された。ｒｐＣＭＶ−１Ａの埋込ＣＫＳ発現は、非埋込ＣＫＳ発現に優る好ましいＣＫＳ発現様式であった。ｒｐＣＭＶ−１Ａの精製は埋込ＣＫＳ発現で生じた蛋白質の溶解度の変化のために非常に簡素化された。
それ故、Ａ１Ｃ２Ｆ３エピトープクラスター（プラスミドｐＣＭＶ−３Ａ中）の非埋込発現は可溶性組換え抗原を生じさせたが、Ａ１Ｃ２Ｆ３（プラスミドｐＣＭＶ−１Ａ中）の埋込ＣＫＳ発現は不溶性組換え抗原を生じさせた。これらの結果は、非埋込ＣＫＳ発現に優る本発明の埋込ＣＫＳ発現法の別の可能な利点を示し、組換え蛋白質の精製が、埋込ＣＫＳ発現で精製させる場合、蛋白質の溶解性の変化のために非常に簡素化され得る。
段階Ｄ：ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）−ＣＫＳ（ｐＣＭＶ−２９）とＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）（ｐＣＭＶ２６）との発現の比較
実施例７Ｅ及び７ＩでＣｏｏｍａｓｓｉｅTMで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる粗溶菌液の評価は、プラスミドｐＣＭＶ−２９（ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ）−ＣＫＳ）及びｐＣＭＶ−２６（ＣＫＳ−ｐｐ３８（１１７−３７３ａａ））の発現により、ＩＰＴＧによる誘導で６５，０００〜６７，０００ダルトンの分子量の単一の主要蛋白質バンドが生じたことを示した。ＣｏｏｍａｓｓｉｅTM染色ゲルの分析は、ｒｐＣＭＶ２９およびｒｐＣＭＶ−２６の蛋白質がそれぞれ全細胞蛋白質の５％及び１０％からなることを示した。
プラスミドｐＣＭＶ−２６の非埋込ＣＫＳ発現で得られたｒｐＣＭＶ−２６蛋白質は細胞溶菌液の遠心後得られた上澄み内に完全に存在した。この蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定されたように約１０％の純度であった。対照的に、ｐＣＭＶ−２９の埋込ＣＫＳ発現で得られたｒｐＣＭＶ−２９蛋白質は溶菌液の遠心後得られたペレット内に完全に存在した。プラスミドｐＣＭＶ−２９の発現で得られた包接体は上述のように洗浄で精製された。包接体は８Ｍ尿素に溶解され、ｒｐＣＭＶ−２９はＳＤＳ−ＰＡＧＥで８５〜９０％の純度であると決定された。ここで、ｐｐ３８（プラスミドｐＣＭＶ−２６中）のアミノ酸１１７〜３７３の非埋込ＣＫＳ発現は可溶性組換え抗原を生じさせたが、その蛋白質配列（プラスミドｐＣＭＶ−２９中）の埋込ＣＫＳ発現は不溶性組換え抗原を生じさせた。
これらの結果は、組換え蛋白質の精製が、埋込ＣＫＳ発現で生成させる場合、蛋白質の溶解性の変化のために非常に簡素化できることを再び示した。
前述の詳細な説明及び付随の実施例は単に説明であって、添付の請求の範囲及びそれらの均等物によってのみ規定される本発明の範囲を制限するものとして取られるべきではない。開示された実施態様に対する種々の変更及び変形は当業者には明白であろう。例えば、ＣＫＳ担体蛋白質内の部位の任意の数の部位が異種蛋白質の埋込発現を可能にすることが予想される。さらに、ＣＫＳ又は他の担体蛋白質の異なる位置の複数の部位が種々の異種蛋白質の同時埋込発現に使用できると考えられる。エピトープが担体蛋白質の異なる部位に埋め込まれるこのような「セグメント化発現（segmented expression）」は発現レベルを改善することを可能にするだろう。異種蛋白質のセグメント化発現は、融合蛋白質のほぼ同じ領域に結合しようとする免疫グロブリンの間の立体障害を最少にすることが期待されるだろう。発明のさらに別の変形として、ポリリンカー配列が種々の異種蛋白質をコードするＤＮＡの挿入を容易にするために、担体蛋白質遺伝子に挿入されるだろう。さらに、上記実施例のプラスミドの構築がある型の連結（平滑／付着）を示すが、他の型の連結（平滑／平滑又は付着／付着）も使用可能であろう。このような変化及び変形は、制限なしで発現方法、確認方法、融合蛋白質、ＤＮＡ構築物、プラスミドベクター、及び本発明の形質転換宿主細胞、並びにそれらの使用に関するものを含んで、本発明の思想及び範囲から逸脱することなく行ない得る。
配列表
配列番号１
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
配列
0004108122.tif 000006
配列番号２
配列の長さ：１０６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
配列
0004108122.tif 000007
配列番号３
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
配列
0004108122.tif 000008
配列番号４
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
配列
0004108122.tif 000009
配列番号５
配列の長さ：２８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：両形態（直鎖状及び環状）
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
配列
0004108122.tif 000010
【図１】
0004108122.tif 000015
【図２】
0004108122.tif 000016
【図３】
0004108122.tif 000017
【図４】
0004108122.tif 000018
【図５】
0004108122.tif 000019
【図６】
0004108122.tif 000020
【図７】
0004108122.tif 000021
【図８Ａ】
0004108122.tif 000022
【図８Ｂ】
0004108122.tif 000023
【図８Ｃ】
0004108122.tif 000024
【図９Ａ】
0004108122.tif 000025
【図９Ｂ】
0004108122.tif 000026
【図９Ｃ】
0004108122.tif 000027
【図９Ｄ】
0004108122.tif 000028
【図１０】
0004108122.tif 000029
【図１１Ａ】
0004108122.tif 000030
【図１１Ｂ】
0004108122.tif 000031
【図１２Ａ】
0004108122.tif 000032
【図１２Ｂ】
0004108122.tif 000033