(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（I）又は（II）
【化１】
0004113923.tif 000010
【化２】
0004113923.tif 000011
で表わされる化合物。
【請求項２】
アルテロモナスsp.D-12株（FERM P-15733）を培地に培養し、培養物中に請求項１記載の化合物を生成蓄積させ、該培養物から請求項１記載の化合物を採取することを特徴とする請求項１記載の化合物の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、紫外線吸収物質として有用な新規化合物、および微生物を用いたその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、化粧品などには紫外線吸収剤としてベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、パラメトキシ桂皮酸誘導体、サリチル酸誘導体などの化学合成品が主に使用されてきた。しかし、化学合成品に対する拒否反応も伴って、天然物の中から安全性が高い新規紫外線吸収物質を探索し、それを応用、利用しようとする研究が行われている。天然の紫外線吸収物質としては海藻、海底動物、微細藻、カビ類などが生産するマイコスポリン様アミノ酸類が知られている（ボータニカマリーナ（Bot. Mar.）16, 23 (1974)、マリーンバイオロジー（Mar. Biol.）108, 157 (1991)、ジャーナルオブプランクトンリサーチ（J. Plankton Res.）12, 909 (1990)、プラントディジーズレポーター（Plant Dis. Reptr.）57, 760 (1973)）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの物質は水溶性であるためその応用範囲が限られている。このため、天然物に由来し、脂溶性の紫外線吸収物質が求められていた。
本発明は、かかる技術的背景の下になされたものであり、その目的は、新規な紫外線吸収物質およびその製造方法を提供することにある。
【０００４】
【発明を解決するための手段】
本発明者は、アルテロモナス属に属する菌株の培養液から得られた化合物が、従来まったく知られていない新規な化合物であることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、下記の式（I）又は（II）
【０００５】
【化３】
0004113923.tif 000002
【０００６】
【化４】
0004113923.tif 000003
【０００７】
で表わされる化合物である。
【０００８】
また、本発明は、アルテロモナス属に属し、上記記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に上記記載の化合物を生成蓄積させ、該培養物から上記記載の化合物を採取することを特徴とする上記記載の化合物の製造法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
（１）本発明の化合物の性質
本発明の一群の新規な化合物は、下記の式（I）又は（II）で表わされる。
【００１０】
【化５】
0004113923.tif 000004
【００１１】
【化６】
0004113923.tif 000005
【００１２】
本発明者は、これらの新規化合物のうち、式（I）で表わされる化合物を「ウルバクチン D（Ulbactin D）」、式（II）で表わされる化合物を「ウルバクチン E（Ulbactin E）」と命名した。以下に各化合物の理化学的性質を示す。
【００１３】
＜ウルバクチン D＞
(1) 物質の色：無色
(2) 物質の形状：油状
(3) 分子量：３７９
(4) 分子式：Ｃ16Ｈ17Ｎ3 Ｏ2 Ｓ3 
(5) 質量分析：高分解ＦＡＢＭＳ  実測値  380.0566  〔Ｍ＋Ｈ〕+ 
計算値  380.0561 (Ｃ16Ｈ18Ｎ3 Ｏ2 Ｓ3 ）
(6) 比旋光度：〔α〕D25+257° (c  0.0033 、クロロホルム中)
(7) 紫外線吸収スペクトル
(メタノール中)：λmax 316nm  (log ε3.68)、253(4.09)、212(4.44)
(8) 赤外線吸収スペクトル  (KBr)
νmax 3442、2934、1659、1622、1597、1491、1230 cm -1
【００１４】
(9)1Ｈ−ＮＭＲ（重クロロホルム中で測定、400MHz）
δppm  2.91（dd, J=9.6, 4.8Hz 1Ｈ), 3.03（dd, J=11.2, 9.6Hz, 1Ｈ),
3.13（dd, J=10.7, 6.4Hz, 1Ｈ), 3.28（dd, J=11.2, 8.0Hz, 1Ｈ),
3.36（dd, J=11.2, 8.0Hz, 1Ｈ), 3.50（d, J=10.7Hz, 1Ｈ),
3.97（dd, J=11.2, 4.8Hz, 1Ｈ), 4.50（d, J=6.4Hz, 1Ｈ),
4.90（qd, J=8.0Hz, 1Ｈ), 5.14 (s, 1Ｈ), 5.62（d, J=8.0Hz, 1Ｈ),
6.86（ddd, J=7.8, 7.6, 1.2Hz, 1Ｈ), 6.99 (dd, J=8.4, 1.2Hz, 1H)
7.34（ddd, J=8.4, 7.6, 1.6Hz, 1Ｈ), 7.39 (dd, J=7.8, 1.6Hz, 1H)
【００１５】
(10)13C−ＮＭＲ（重クロロホルム中で測定、125MHz）
δppm  34.1 (t), 34.3 (t), 40.4 (t), 61.3 (d), 65.1 (d), 65.3 (d),
69.2 (d),81.0 (d), 116.2 (s), 117.2 (d), 118.9 (d), 130.7 (d), 133.4 (d),159.2 (s), 167.9 (s), 174.2 (s)
(11)溶解性  ：メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルおよびクロロホルムに可溶、水には難溶
(12)呈色反応：塩化第二鉄発色陽性
【００１６】
(13)薄層クロマトグラフィー：シリカゲル薄層 (Kieselgel 60 F 254 Art.5554. Merck社製) クロロホルム：メタノール (10：1)展開溶媒でのRf値は0.48
(14)高速液体クロマトグラフィー：Develosil 充填カラムODS-HG-5  4.6mmφ、25cm、野村化学社製、アセトニトリル：水（０〜５分：２０％アセトニトリル、５〜６分：２０〜３６％アセトニトリル、6〜３５分：３６％アセトニトリル、３５〜３６分：３６〜６０％アセトニトリル、３6〜５０分：６０％アセトニトリル）、流速1.0ml/minでの保持時間は44.8分。
【００１７】
＜ウルバクチン E＞
(1) 物質の色：黄色
(2) 物質の形状：油状
(3) 分子量：２６４
(4) 分子式：Ｃ12Ｈ12Ｎ2 ＯＳ2 
(5) 質量分析：高分解ＦＡＢＭＳ  実測値  265.0489  〔Ｍ＋Ｈ〕+ 
計算値  265.0469 (Ｃ12Ｈ13Ｎ2 ＯＳ2 ）
(6) 比旋光度：〔α〕D24 -19 °  (c  0.015、クロロホルム中)
(7) 紫外線吸収スペクトル
(メタノール中)：λmax 315nm  (log ε3.72)、252(4.10)、213(4.41)
(8) 赤外線吸収スペクトル  (KBr)
νmax 3446、1622、1595、1491、1255、1222 cm -1
【００１８】
(9)1Ｈ−ＮＭＲ（重クロロホルム中で測定、500MHz）
δppm  3.27（dd, J=10.8, 9.0Hz, 1Ｈ), 3.30（dd, J=10.8, 9.0Hz, 1Ｈ),
3.98（dd, J=4.3, 1.3Hz, 2Ｈ), 5.38（td, J=9.0, 4.0Hz, 1Ｈ),
6.37（tdd, J=4.3, 4.0, 2.4Hz, 1Ｈ),
6.87（td, J=7.6, 1.2Hz, 1Ｈ), 6.99（dd, J=8.2, 1.2Hz, 1Ｈ),
7.35（ddd, J=8.2, 7.6, 1.6Hz, 1Ｈ), 7.39 (dd, J=7.6, 1.6Hz, 1H)
7.58（dt, J=2.4, 1.3Hz, 1Ｈ)
【００１９】
(10)13Ｃ−ＮＭＲ（重クロロホルム中で測定、125MHz）
δppm  32.0 (t), 44.6 (t), 80.3 (d), 87.3 (d), 116.1 (s), 117.1 (d),
118.8 (d), 130.7 (d), 133.2 (d), 159.2 (s),162.5 (d), 173.2 (s)
(11)溶解性  ：メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルおよびクロロホルムに可溶、水には難溶
(12)呈色反応：塩化第二鉄発色陽性
【００２０】
(13)薄層クロマトグラフィー：シリカゲル薄層 (Kieselgel 60 F 254 Art.5554. Merck社製) クロロホルム：メタノール (10：1)展開溶媒でのRf値は0.63
(14)高速液体クロマトグラフィー：Develosil 充填カラムODS-HG-5  4.6mmφ、25cm、野村化学社製、アセトニトリル：水（０〜５分：２０％アセトニトリル、５〜６分：２０〜３６％アセトニトリル、6〜３５分：３６％アセトニトリル、３５〜３６分：３６〜６０％アセトニトリル、３6〜５０分：６０％アセトニトリル）、流速1.0ml/minでの保持時間は43.5分。
【００２１】
（２）本発明の化合物の製造
本発明の化合物は、微生物を培地に培養し、培養物中に本発明の化合物を生成蓄積させ、該培養物から本発明の化合物を採取することにより製造することができる。ここで用いる微生物としては、アルテロモナス属に属し、本発明の化合物を生産する能力を有するものであれば特に限定されず、例えば、アルテロモナス sp. D-12株を挙げることが出来る。また、前記菌株の変異株であって、本発明の化合物を生産する能力を有する菌株も使用することができる。
【００２２】
アルテロモナス sp. D-12株は、自然界から新たに単離した株であり、その細菌学的性質については下記の通りである。なお、形態観察は、培地にアルテロモナス sp.Ｄ-12株を植菌し、30℃で3〜5日間培養したのちに光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用いて行った。培地は、マリンアガー（Bacto Marine Agar 2216, Difco社製）あるいはマリンブロス（Bacto Marine Broth 2216, Difco社製）を用いた。なお、本菌株は培地中の塩化ナトリウム濃度が１％以下では菌の生育が認められないことから、生化学的性状の試験は75％人工海水を用いて培地を作製するか、あるいは培地中に3％塩化ナトリウムを添加することによって行った。
【００２３】
ａ. 形態
1）  細胞の形および大きさ：桿菌、1.6-2.5×0.8-1.1μｍ
2）  細胞の多形性の有無：無し
3）  運動性の有無、鞭毛の着生状態：有り、極毛。
4）  胞子の有無：無し
5）  グラム染色性：陰性
6）  抗酸性の有無：無し
【００２４】
0004113923.tif 000006
【００２５】
0004113923.tif 000007
【００２６】
0004113923.tif 000008
【００２７】
0004113923.tif 000009
【００２８】
上記の菌学的性質をバージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第８版の分類基準に従って公知の菌種と比較した。本菌株は好気性グラム陰性桿菌で極鞭毛を有し、ブドウ糖を酸化的に分解、オキシダーゼ、カタラーゼが陽性であった。さらに、ゼラチンを液化し、DNAを加水分解し、GC含量が５０％以下であることからアルテロモナス属に所属すると考えられ、アルテロモナス  スピーシーズ（Alteromonas sp.）と同定した。アルテロモナスsp. D-12株は、平成8年7月12日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM  P-15733として寄託されている。
【００２９】
本発明に用いる微生物の培養は、通常の微生物の培養方法が用いられる。培地としては、資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。炭素源としてはグルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フラクトース、シュクロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などを単独または組み合わせて用いられる。さらに、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、必要に応じて食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、燐酸二水素カリウム、燐酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛などの無機塩類を加える。さらに使用菌の生育やウルバクチン Dおよびウルバクチン Eの生産を促進する微量成分を適当に添加することができる。培養法としては、液体培養法が最も適している。培養温度３０〜３５℃が適当であり、培養中の培地のＰＨは７〜８に維持することが望ましい。液体培養で通常３〜５日間培養を行うと、目的物質が培養液中に生成蓄積される。培養物中の生成量が最大に達した時に培養を停止する。
【００３０】
培養物からウルバクチン Dおよびウルバクチン Eの単離精製は、微生物代謝生産物をその培養物から単離精製するために常用される方法に従って行われる。例えば培養物を濾過や遠心分離により培養瀘液と菌体に分け、菌体を含水メタノール、含水エタノールなどで抽出する。ついで、抽出液と培養瀘液とを合わせて濃縮し、シリカゲルによるカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィーなどにより、ウルバクチン Dおよびウルバクチン Eを得る。
なお、培養、精製操作中のウルバクチン Dおよびウルバクチン Eの動向は、高速液体クロマトグラフィーによる紫外線吸収を指標として追跡することができる。
【００３１】
（３）本発明の化合物の用途
本発明の化合物は、紫外線吸収能が強いので、化粧品などの紫外線吸収成分として利用することができる。
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３２】
【実施例】
種菌としてアルテロモナスsp. D-12株を用いた。該菌株を、５０ｍｌの昆布茶液体培地（昆布茶：１０g、グルコース：３．０g、ブイヨン：１．０g、炭酸カルシウム：２．０g、ろ過海水：５００ｍｌ、蒸留水：５００ml、pＨ＝７．４）を入れた３００ml三角フラスコ中で、３０℃、２４時間振盪（１００rpm.）培養し、前々培養液を得た。培養中、培地のｐＨは特に制御しなかった。この前々培養液１２mlを、３００mlの昆布茶液体培地を入れた１L三角フラスコに植菌し、３０℃、８時間振盪（１００rpm.）培養し、前培養液を得た。この前培養液全量を３Lの昆布茶液体培地を入れた５Lジャーファーメンターに植菌し、３０℃、２００rpm、通気量０．２L/minで５日間本培養を行った。
【００３３】
このようにして得られた培養液３．３Ｌを遠心分離し、得られた上澄み液を、酢酸エチル（６．６Ｌ）で抽出する。酢酸エチル抽出部を４０℃以下で減圧濃縮し、得られた濃縮液を逆相高速液体クロマトグラフィー（Develosil 充填カラムODS-HG-5  20mmφ、25cm、野村化学社製、水：アセトニトリル＝８０：２０〜４０：６０へ段階的に変化させた）により分画し、２つの画分を得た。１つ目の画分はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Sep-Pak(登録商標)Vac 12cc 、Waters製、ヘキサン-アセトン＝10：1）により精製し、ウルバクチン Dを0.6mg を得た．２つ目の画分は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Sep-Pak(登録商標)Vac 12cc 、Waters製、ヘキサン-酢酸エチル＝10：1）により精製し、ウルバクチン Eを0.8mg を得た。
ここで得たウルバクチン Dおよびウルバクチン Eは、前記した理化学的性質を示した。
【００３４】
【発明の効果】
本発明は、新規な化合物および該物質の微生物を用いた製造法を提供する。本発明の化合物は、脂溶性で、紫外線吸収能が強いので、化粧品の成分等として利用できる。