(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用成分としてＰＴＸ３タンパク質および薬理学上許容される賦形剤を含む、経口、非経口、経皮または皮下投与可能な、感染性疾患または腫瘍の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
バクテリア、菌類、プロトゾア、またはウイルスが原因である感染性疾患の治療のための請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＰＴＸ３のアミノ酸配列が、天然に現存しているＰＴＸ３のアミノ酸配列である請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
ＰＴＸ３のアミノ酸配列が、配列番号１の配列を有するヒトのＰＴＸ３のアミノ酸配列である請求項３記載の組成物。
【請求項５】
ＰＴＸ３をコードしている完全なｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含む、感染性疾患または腫瘍の治療のための医薬組成物。
【請求項６】
バクテリア、菌類、プロトゾア、またはウイルスが原因である感染性疾患の治療のための請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
発現ベクターがプラスミドである請求項５または６記載の医薬組成物。
【請求項８】
プラスミドがプラスミドｐＳＧ５である請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項５-８のいずれかに記載の発現ベクターを用いて形質移入された組換え宿主細胞を含む、感染性疾患または腫瘍の治療のための医薬組成物。
【請求項１０】
宿主細胞がＣＨＯ細胞である請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
腫瘍性疾患の患者から採取された細胞に、ＰＴＸ３をコードしている完全なｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターを形質移入することを含む、該腫瘍性疾患の患者に接種するための細胞の調製方法。
【請求項１２】
ＰＴＸ３をコードしている完全なｃＤＮＡ配列を含むウイルス起源の発現ベクターを含む、腫瘍性疾患の患者に注入するための医薬組成物。
【請求項１３】
ウイルス起源の発現ベクターがアデノウイルスまたはレトロウイルスである請求項１２記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、長いペントラキシンＰＴＸ３(ＰＴＸ３)、またはその機能性誘導体の一つを含む医薬組成物に関する。特に、本発明は、感染性および炎症性疾患または腫瘍の治療のための前記の組成物に関する。
【０００２】
本発明はまた、ＰＴＸ３またはその機能性誘導体の一つをコードしている完全なｃＤＮＡを含む発現ベクター、そのような発現ベクターを用いて形質移入された組換え宿主細胞および、ＰＴＸ３またはその機能性誘導体の一つを製造する方法に関する。さらに、本発明は腫瘍の治療のための前記発現ベクターの使用に基づく遺伝子治療法に関する。
【０００３】
炎症性のサイトカインであるインターロイキン１ベータ(ＩＬ-１ベータ)および腫瘍壊死因子アルファ(ＴＮＦ-アルファ)に暴露された後に、様々なタイプの細胞で、最も顕著には単核の食細胞および内皮細胞で発現されるタンパク質であるＰＴＸ３の生物学的機能は、今日まで、未だ完全には理解されていない。
【０００４】
今日まで、ＰＴＸ３またはその機能性誘導体の治療的使用については、全く報告されていなかった。
【０００５】
ＰＴＸ３は２つの構造領域からなり、Ｎ末端は既知のいずれの分子とも関連せず、およびＣ末端はＣ-反応性タンパク質(ＣＲＰ)のような短いペントラキシンと類似している。かなりの程度の類似性がヒトのＰＴＸ３(ｈＰＴＸ３)と動物のＰＴＸ３の間に見出されている。
【０００６】
ＰＴＸ３遺伝子は、マウス第三染色体上の、ヒトの３ｑ領域(ｑ２４-２８)に類似した領域に、３ｑ２５領域中にあると報告されているｈＰＴＸ３の位置と一致して存在している。さらに、マウスＰＴＸ３(ｍＰＴＸ３)(Introna M., Vidal Alles V., Castellano M., Picardi G., De Gioia L., Bottazzi B., Peri G., Breviario F., Salmona M., De Gregorio L., Dragani T.A., Srinivasan N., Blundell T.L., Hamilton T.A. and Mantovani A.: マウスＰＴＸ３のクローニング、肝外部位で発現される新メンバーのペントラキシン遺伝子ファミリー。Blood 87 (1996) 1862-1872)は、構成、位置および配列に関してｈＰＴＸ３と非常に類似している(Breviario F., d'Aniello E.M., Golay J., Peri G., Bottazzi B., Bairoch A., Saccone S., Marzella R., Predazzi V., Rocchi M., Della Valle G., Dejana E., Mantovani A., Introna M.: 内皮細胞中のインターロイキン-１-誘導性遺伝子。Ｃ-反応性タンパク質および血清アミロイドＰ成分に関連する新規な遺伝子のクローニング。J. Biol. Chem. 267:22190, 1992)。
【０００７】
特に、配列間の同一性の程度はヒトとマウスの遺伝子間では８２％であり、保存的置換を考慮する場合、９０％に達する。
【０００８】
ｈＰＴＸ３とｍＰＴＸ３の配列間の同一性の程度が高いのは、進化の間のペントラキシンの保存の程度が高い印である(Pepys M.B., Baltz M.L.: Ｃ-反応性タンパク質および関連タンパク質(ペントラキシン)および血清アミロイドＡタンパク質に特に関連する急性期応答タンパク質。Adv. Immunol. 34:141, 1983)。
【０００９】
ＣＲＰは、免疫性-炎症性および感染性疾患のマーカーである。外傷後、組織の損傷または感染により、損傷が拡大するのを防ぐこと、感染している生物体を破壊することおよび、正常な機能を回復させるために修復機構を活性化させることを目的とした複雑なシリーズの反応が侵された患者において誘発される。このプロセスはいわゆる急性相応答を構成するが、急性相応答に現在用いられている主なマーカーはＣＲＰである。正常なヒトの血清においては通常、ＣＲＰは１０μｇ／ｍｌ未満の濃度で存在するが、外傷または炎症に反応すると１，０００倍以上増加する可能性がある(Koj A.: "Acute phase reactants" in "Structure and Function of Plasma Proteins". Allison A., ed. Plenum Press, New York, 1974, pp. 73-131)。
【００１０】
これまでのＣＲＰの治療的使用については、すでに知られている。例えば、１９８９年８月１５日付けのＵＳ特許４，８５７，３１４は、腫瘍の治療のためのＴＮＦと組み合わせたＣＲＰの使用を開示する。
【００１１】
１９９４年２月２４日付けの国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２１８１は、生物体液中の免疫複合体の測定のための診断キットの調製および、ウイルス性および微生物性疾患、腫瘍および内毒素ショックの治療のために有用なＣＲＰの変異体を開示する。
【００１２】
１９９４年８月２６日付けの国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９７２９もまた、診断キットの調製および、ウイルス性および微生物性疾患および腫瘍の治療に有用なＣＲＰの変異体を開示する。
【００１３】
短いペントラキシンにより認識されるリガンドに対してＰＴＸ３が認識をし、かつ特異的に結合する能力がインビトロにおいて、精製された組換えＰＴＸ３を用いて評価されている。ＣＲＰおよびＳＡＰ(血清アミロイドＰ成分)のような短いペントラキシンは、ホスホコリン、ホスホエタノールアミン、多くの糖質を含む広い範囲のリガンドに対してカルシウム依存性の様式で認識および結合することができることにより特徴付けられるが、その中で最も特徴づけられるものとしては、ピルベートに富むアガロース誘導体、［メチル  ４-６-Ｏ-(１-カルボキシエチリデン)-ベータ-Ｄ-ガラクト-ピラノシド］若しくはＭＯβＤＧ、補体断片および細胞外マトリックスのタンパク質、特にフィブロネクチンおよびタイプＩＶコラーゲンである。短いペントラキシンと異なり、ＰＴＸ３は(誘導結合型プラズマ／原子発光分析により測定される)カルシウムまたはホスホコリン、ホスホエタノールアミンまたはＭＯβＤＧのいずれとも結合することができない。さらにＰＴＸ３は、フィブロネクチンまたはタイプＩＶコラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質と結合することができない。他方、ＰＴＸ３は短いペントラキシンにも認識されるＣ１ｑ補体断片に結合することができる(表１)。しかしながら、Ｃ１ｑに結合するためには、ＣＲＰとＳＡＰは架橋されなければならないのに対し、ＰＴＸ３は天然に現存している形でこの補体断片を認識し、結合することができるということが強調されるべきである。
【００１４】
驚くべきことに、長いペントラキシンＰＴＸ３またはその機能性誘導体が、特に、感染性および炎症性疾患または腫瘍の治療に有用な治療薬であることが今回見出された。
【００１５】
「長いペントラキシンＰＴＸ３」が意味するものは、長いペントラキシンＰＴＸ３のいずれであってもよく、すなわち、天然(ヒトまたは動物)起源であるか合成起源であるかには関わらない。ヒトの長いペントラキシンＰＴＸ３(配列１および図５を参照されたい)が好ましい形である。
【００１６】
実質量の、長いペントラキシンＰＴＸ３またはその機能性誘導体の一つを製造する便利な方法は、ＰＴＸ３またはその機能性誘導体の一つをコードしている完全なｃＤＮＡ配列を含む発現ベクター(例えばプラスミド)を調製すること、およびこれらを用いて培養真核細胞(例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＨＯ)に形質移入することから成る。こうして形質移入された組換え宿主細胞をクローニングした後、最も高いレベルのＰＴＸ３を製造することができる細胞クローンを選抜する。
【００１７】
本発明に従い、長いペントラキシンＰＴＸ３をコードしているｃＤＮＡ配列を含む前記の発現ベクターは、腫瘍性疾患の治療のための遺伝子治療法にも利用される。
【００１８】
第一の遺伝子治療法は
ａ)腫瘍に侵されている患者から細胞のサンプルを採取すること、；
ｂ)長いペントラキシンＰＴＸ３またはその機能性誘導体の一つをコードしている完全なｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターをこれらの細胞に形質移入すること、；および、
ｃ)これらの形質移入細胞を腫瘍患者に接種すること：
から成る。
【００１９】
腫瘍の治療のための第二の遺伝子治療法は、
ａ)長いペントラキシンＰＴＸ３またはその機能性誘導体の一つをコードしている完全なｃＤＮＡ配列を含む、(アデノウイルスまたはレトロウイルスのような)ウイルス起源の発現ベクターを調製すること、；および
ｂ)こうして得られた発現ベクターを腫瘍に侵された患者に接種すること：
から成る。
【００２０】
ＰＴＸ３またはその機能性誘導体の作用のメカニズムはまだ明確には明らかにされていないが、少なくともその抗癌作用は、腫瘍細胞への直接的な細胞溶解または細胞増殖抑制効果によるものではあり得ず、むしろ宿主が介在するメカニズム、および、次に記載するような、これらの化合物が発揮する白血球増加能に関係するメカニズムによるものである。
【００２１】
以下に実施例を記載し、この中に記載されている発明による、化合物の予期しない作用を説明している結果を報告する。
【００２２】
組換えＰＴＸ３の製造：ヒトＰＴＸ３の完全なｃＤＮＡ配列を含む断片(配列２および図６)を発現ベクターｐＳＧ５(図１)のＢａｍ  Ｈ１部位にサブクローニングし(Stratagene, La Jolla, CA, USA)、沈殿カルシウム法を用いてＣＨＯ細胞に形質移入した。Ｇ４１８中で選抜し、大量のＰＴＸ３を製造することができるクローンをソースとして用いて、そこからタンパク質をイオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。
【００２３】
ＰＴＸ３のＣ１ｑへの結合：ＰＴＸ３のＣ１ｑへの結合をＥＬＩＳＡシステムによって測定した。９６穴のプレートを１ウェルあたり２５０-５００ｎｇのＣ１ｑで覆い(一晩、４℃)、および次いで０．０５％のトゥイーン２０を含むＣａ++およびＭｇ++を含有するＰＢＳ(ＰＢＳ)を用いて洗浄した。ウェルを次いでＰＢＳ中の５％ミルクを用いてブロックし(２時間室温)、その後様々な濃度のＰＴＸ３と共にインキュベートした(３０分間３７℃)。更に数回洗浄した後、ＰＴＸ３に対するラットのモノクローナル抗体と共に(１時間室温にて)、次いで第二抗体、ペルオキシダーゼ-結合ラット抗-ＩｇＧ抗体と共に(１時間室温にて)、プレートをインキュベートした。洗浄後、クロモゲンを添加し、吸光度をオートマチックプレートリーダーを用いて４０５ｎｍにて読んだ。幾つかの実験においては、ウェルをＰＴＸ３で覆い、Ｃ１ｑの結合を抗Ｃ１ｑ抗体を用いて評価した。
【００２４】
ビオチン化たんぱく質をＣ１ｑの結合親和力を測定するための使用した。「スペーサーアーム」を添加することにより修飾された活性化ビオチンを用いて常套法に従いＰＴＸ３をビオチン化した(SPA-Societa Prodotti Antibiotici)。
【００２５】
図２(Ａ)および２(Ｂ)はＣ１ｑの結合および結合親和力の結果を示す。これらの結果は、非常に高い、ＰＴＸ３のＣ１ｑ結合および結合親和力を示す。
【００２６】
白血球の増加：  ＰＴＸ３により誘導される白血球の増加を、皮下ポケットシステムにおいてインビボで調査した。皮下ポケットを、５ｍＬの空気を動物の背中に３日の処置間隔を空けて２回皮下注射することにより実験動物に誘導した。６日目に、０．５％のカルボキシメチルセルロール中１μｇのＰＴＸ３をポケットに投与した。４時間後、動物を麻酔し、ポケットを１ｍＬの塩水溶液で洗浄した。洗浄液を回収し、存在している細胞の総数および分画を計測した。
【００２７】
得られた結果を図３に報告するが、これは、正常動物におけるＰＴＸ３の実質的な白血球増加能を示す。他方、図４はＣ１ｑを持たない、遺伝子操作された動物において得られた結果を示すが、白血球の増加は明らかに低い。
【００２８】
抗癌作用：  マウスの肥満細胞腫Ｐ８１５系統に、ヒトＰＴＸ３のｃＤＮＡまたはそのアンチセンスを含む発現ベクターｐＳＧ５および、形質移入細胞にネオマイシン耐性を与えるベクターｐＳＶ２をエレクトロポーレイションにより同時形質移入した。ネオマイシン０．５ｍｇ／ｍＬを用いた選抜の後、細胞を限界希釈によりクローニングした。
【００２９】
ＰＴＸ３の産生を測定するために、２．５×１０5細胞を２００μｌのＲＰＭＩ＋３％ＦＣＳ中で２４時間培養し、上清をＥＬＩＳＡによりテストした。得られたクローンは、１から３５ｎｇ／ｍＬの範囲にわたるレベルのタンパク質を産生したが、アンチセンスを含むクローンは測定可能なレベルのＰＴＸ３を産生しなかった。検討したクローンはインビボで同じ成長速度を示した。
【００３０】
８-１０週の週齢のオスのＤＢＡ／２Ｎ  ＣｒｌＢＲマウスに１×１０5細胞のＰ８１５  ＰＴＸ３-産生クローンまたはアンチセンス遺伝子を含むクローンを皮下接種した。腫瘍の発生に関しては１日に３回、および生存に関しては１日に１回マウスをモニターした。
【００３１】
得られた結果を表２に報告するが、その結果は、遺伝子治療のこの実験モデルにおいて、接種された腫瘍細胞の生着後にＰＴＸ３が動物の治癒および完全な腫瘍の拒絶をもたらす効力を示すというものであった。
【００３２】
これらの結果は、コントロールと比較してもアンチセンスを用いて処理した群と比較してもｐ＜０．０１で統計的に有意である(フィッシャーテスト)。
【００３３】
これらの結果に照らして、前に報告した抗癌作用がＰＴＸ３がＣ１ｑを認識した結果としてマウスに起こる白血球の増加と密接に関連していることは明らかである。遺伝子操作されたマウスにおいては、そのような白血球の増加は全く起こらない。白血球増加能は、本発明による化合物の抗癌作用を基礎として、これらの化合物をバクテリア、菌類、プロトゾアまたはウイルスのような病原体が原因である疾患の治療において有効に適用できる可能性があることを示唆している。
【００３４】
【表１】
表１  様々なリガンドへのペントラキシンの結合能力
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ＮＤ：テストせず
【００３５】
【表２】
表２  ＰＴＸ３のインビボ抗癌作用
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１：１×１０5細胞の表示クローンを皮下注射した。
２：腫瘍が生着した動物の総数に対する、完全に腫瘍を拒絶した動物の数
*：親細胞を用いて処理されたマウスおよびアンチセンスクローンの細胞を用いて処理されたマウスの両方と比較してｐ＜０．０１ (フィッシャーテスト)。
【００３６】
【図面の簡単な説明】
【図２】  Ｃ１ｑへのＰＴＸ３の結合。パネルＡは、プレート上に固定されたＣ１ｑおよびＣ１ｓへの、ＰＴＸ３（センス）を含む培養物の上清および精製タンパク質の結合を示す。結合を４０５ｎｍにおける光学濃度(Ｏ．Ｄ．)として評価した。パネルＢはビオチン化タンパク質を用いて得られた飽和曲線を示す。反応速度パラメータを、非線形適合統計法を用いて算出した。
【図３】  ＰＴＸ３により誘導された白血球の増加：５ｍｌの空気を接種することによりＣＤ１マウスの背中に誘導した皮下ポケットに１μｇのＰＴＸ３を注射する。
【図４】  正常な動物および、Ｃ１ｑを持たない遺伝子操作された動物における、ＰＴＸ３により誘導された白血球の増加。ＰＴＸ３を動物の背中に誘導された皮下に注射する。
【図５】  配列１：  ヒトのＰＴＸ３のアミノ酸配列。下線を引いたアミノ酸がペプチドシグナルを構成する。成熟ｈＰＴＸ３は３６４アミノ酸から成る。ここで、配列１は配列表の配列番号１である。
【図６】  配列２：  ヒトＰＴＸ３のｃＤＮＡの断片のヌクレオチド配列。大文字はタンパク質をコードしているヌクレオチドを示すのに対し、小文字は翻訳されないが構築物中に存在する３’および５’領域を示す。ここで、配列２は配列表の配列番号２である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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