(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織因子凝固系インヒビターを有効成分として含有することを特徴とする血管内皮細胞の増殖抑制剤。
【請求項２】
組織因子凝固系インヒビターを有効成分として含有することを特徴とする血管内皮細胞の増殖により惹起される血管新生の阻害剤。
【請求項３】
血管内皮細胞の増殖により惹起される血管新生病を予防または治療するための請求項２に記載の阻害剤。
【請求項４】
当該血管新生病が、悪性腫瘍、糖尿病性網膜症、水晶体後の繊維増殖、血管新生性緑内障、乾癬、線維性血管腫、リウマチ様関節炎、アテローム性動脈硬化症プラーク内での毛細血管の増殖、血管腫、又はカポジ肉腫である請求項２又は３に記載の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、組織因子凝固系インヒビター（Tissue Factor Pathway Inhibitor；ＴＦＰＩ）を有効成分として含有する血管内皮細胞の増殖抑制剤及び血管内皮細胞の増殖により惹起される血管新生の阻害剤に関する。特に、本発明は、血管内皮細胞の増殖により惹起される血管新生を効果的に阻害することにより血管新生病を予防又は治療しうるＴＦＰＩ含有製剤に関する。
背景技術
血管新生とは、新しい血管、特に毛細血管の成長である。この血管新生は、発育中の胎児および成長過程の生体にとっては重要な生理的現象であるが、健康な成人での血管新生は逆に生体にとって病的な作用であることが多く、傷の治癒及び月経サイクルに関してのみ有意義に生じるものであることが広く知られている。例えば、悪性腫瘍の場合、血管内皮細胞の増殖及び新しい毛細血管の新生は腫瘍組織の成長に必須のものである。これは腫瘍細胞が血管新生に必要な増殖因子を産生、分泌し、その結果、周囲の血管内皮細胞が刺激され腫瘍に向かって分裂、成長するためであると考えられている。そのため血管新生を阻害することは、悪性腫瘍の成長を抑制するひとつの手段となりうる。
また、悪性腫瘍の治療法として外科的摘出が行われるが、摘出後に腫瘍細胞が患部に残存した場合には再発を引き起こす。さらに、血管新生の進行した腫瘍組織の外科的摘出術中・術後では、血中に流出する腫瘍細胞が増加することが報告されており［マックロック（McCulloch,P.）ら、The Lancet,３４６,ｐ１３３４（１９９５）］、これは他の臓器への転移の危険性を示している。このような腫瘍組織の外科的摘出の際に血管新生阻害剤を処置することにより血管新生を抑制することができれば原発巣での再発及び転移した腫瘍細胞の増殖を防止することが可能となり、悪性腫瘍に対する治療法の一手段となりうることが考えられる。
血管新生が原因となる疾患としては悪性腫瘍の成長の他にも様々なものが知られており、例えば、糖尿病性網膜症、水晶体後の繊維増殖、血管新生性緑内障、乾癬、線維性血管腫、免疫及び非免疫性炎症（リュウマチ様関節炎を含む）、アテローム性動脈硬化症プラーク内での毛細血管の増殖、血管腫、カポジ肉腫などの一般に血管新生病（angiogenic diseases）と総称されているものが挙げられる［フォークマン（Folkman,J.）ら、Science,２３５,ｐ４４２（１９８７）］。これら疾患に対しても、同様に血管新生を阻害することによって病態の改善が十分に期待される。
血管新生の機序においては血管内皮細胞の増殖が非常に重要であることが明らかとなってきている。すなわち、血管新生の作用機序として、まずタンパク質分解酵素による既存血管の基底膜の融解が生じ、局所的に破壊された部分から血管内皮細胞が血管外に遊走し、この血管外に遊走した血管内皮細胞が分裂・増殖を繰り返し、次第に血管内皮細胞が分化して管腔を形成した後、管腔間での接合が起こって血管新生に至ると考えられているからである［フォークマンら、J.Biol.Chem.,２６７,ｐ１０９３１（１９９２）。このような血管新生の促進因子としては、ペプチド性物質である酸性線維芽細胞増殖因子（acidic Fibroblast Growth Factor；ａＦＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（basic Fibroblast Growth Factor；ｂＦＧＦ）が知られており、これらの因子は血管内皮細胞の遊走及び増殖を促進することにより血管新生を惹起する。また近年、血管内皮細胞に対して特異的な増殖因子である血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子（Vascular Endothelial Growth Factor／Vascular Permeability Factor；ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）が新たな血管新生促進因子として発見されている［フェララ（Ferrara,N.）ら、J.Clin.Invest.,８４,ｐ１４７０（１９８９）］。
血管内皮細胞の増殖抑制を示す化合物としては、これまでにも幾つかのものが知られている。そのうちの一つにプロタミンがあり、これは精子中にのみ存在する分子量４，３００のタンパク質で、塩基性アミノ酸であるアルギニンを豊富に含んでいる。これまでの実験でプロタミンが腫瘍の血管新生を阻害することにより腫瘍の成長を抑制することが見出されており、その機序はヘパリン結合能力に基づくものであることが示されている［テイラー（Taylor,S.）ら、Nature,２９７,ｐ３０７（１９８２）］。しかしながら、プロタミンはヒトに対して抗原性を示すため２回目以降の投与時にアナフィラキシー反応を引き起こすことが知られており、この毒性のため頻繁にヒトに用いることは困難である。そのため、血管内皮細胞増殖及び血管新生の阻害剤として有効かつヒトに対して無毒な物質の研究・探索がこれまで行われてきているが、有効な血管新生阻害作用と安全性とを兼ね備えた化合物は未だ見出されていないのが現状である。
【図面の簡単な説明】
図１はＴＦＰＩの添加による血管内皮細胞増殖抑制効果を示す。
図２は全長型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ＋Ｃ）及びＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ−Ｃ）の血管内皮細胞増殖抑制効果を示す。
図３は増殖を停止させた血管内皮細胞に対するＴＦＰＩの効果を示す。
発明の開示
本発明者らは、血管内皮細胞の増殖及び血管新生を抑制することにより悪性腫瘍をはじめとした種々の血管新生病を予防又は治療しうる薬剤を見出すべく、培養したヒトの血管内皮細胞を用いてその増殖を抑制する作用をもつ物質の検索を行った結果、組織因子凝固系インヒビター（以下、「ＴＦＰＩ」という）に血管内皮細胞の増殖を極めて効果的に抑制する全く新規な作用があることを見いだし、この発見に基づいて本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、ＴＦＰＩを有効成分として含有することを特徴とする血管内皮細胞の増殖抑制剤及び血管内皮細胞の増殖により惹起される血管新生の阻害剤に関するものであり、該薬剤を有効量投与することにより、悪性腫瘍あるいはその他の血管新生病を効果的に予防あるいは治療することができる。ヒトＴＦＰＩは、ヒト生体内に本来的に存在するものであるので、これを外部より投与したとしても抗原性を示すことなく、安全に使用することができる。ヒトＴＦＰＩと実質的なホモロジーを有する他の哺乳動物由来のＴＦＰＩもまた、ヒトＴＦＰＩと同様に抗原性を示すことなく、安全に使用することができる。ＴＦＰＩはまた、病的な新生血管の進行防止のみならず、すでに形成された新生血管に対しても作用してその退縮を促すことができる。
ＴＦＰＩは、外因系血液凝固反応を阻害する働きを持つことで知られている生体内の糖蛋白質である［ブローズ（Broze,G.J.）、Proc.Natl.Acad.Sci.（ＵＳＡ）、８４、ｐ１８８６（１９８７）］。ＴＦＰＩは幾つかのドメインから構成され、アミノ末端側から順に、酸性アミノ酸に富む領域（以下、「Ｎ末端領域」という）、一般的にクニッツ領域と呼ばれる３つの構造領域（アミノ末端側から順に「クニッツ１」、「クニッツ２」及び「クニッツ３」という）、及びＣ末端側の塩基性アミノ酸に富む２７アミノ酸からなる領域（以下、「Ｃ末端領域」という）からなる。クニッツ１は血液凝固因子の一つである活性化第ＶＩＩ因子と結合してそのプロテアーゼ活性を中和し、クニッツ２はやはり血液凝固因子の一つである活性化第Ｘ因子と結合してそのプロテアーゼ活性を中和し、これらの作用により血液凝固反応を初期の段階で効果的に阻害しているものと考えられている。Ｎ末端領域に何らかの生理的な作用があるかどうかは知られていないが、Ｃ末端領域は陰性荷電を持つグリコサミノグリカン、中でもヘパリンに強く結合することが知られている。ヒトＴＦＰＩは２７６個のアミノ酸からなり、分子量は約４２，０００である。
ＴＦＰＩのアミノ酸配列については、ヒト［ウン（Wun,T.−C.）ら、J.Biol.Chem.,２６３,ｐ６００１（１９８８）］、サル［亀井（Kamei,S.）ら、J.Biochem.,１１５,ｐ７０８（１９９４）］（ヒトとのホモロジーは９４％）、ウサギ［ベッセルシュミット（Wesselschmidt,R.L.）ら、Nuc.Acids Res.,１８,ｐ６４４０（１９９０）：ウォーン−クラマー（Warn−Cramer,B.J.）ら、Nuc.Acids Res.,２０,ｐ３６４２（１９９２）］（ヒトとのホモロジーは７２％）、ラット［円城寺（Enjyoji,K.）ら、J.Biochem.,１１１,ｐ６８１（１９９２）］（ヒトとのホモロジーは５６％）等が報告されている。
本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤及び血管新生阻害剤の有効成分として使用するＴＦＰＩは、ヒトその他の哺乳動物の血液あるいは培養細胞から得られる天然のＴＦＰＩ及び遺伝子組換え技術によって製造されるヒトその他の哺乳動物由来の組換えＴＦＰＩのいずれであってもよい。また、血管内皮細胞の増殖抑制及び血管新生の阻害作用を有する限り、血液あるいは培養細胞由来の天然ＴＦＰＩまたは遺伝子組換え技術によって製造される組換えＴＦＰＩと同等の生理学的活性を有し、ＴＦＰＩのアミノ酸配列中の１又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加された誘導体も本発明に含まれる。特に、以下の実施例にも記載するように、ＴＦＰＩの構造中のＣ末端領域の２７アミノ酸が完全に欠失したＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ−Ｃ）もまた全長型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ＋Ｃ）と同様に有意の血管内皮細胞の増殖抑制作用及び血管新生阻害作用を示すことがわかっており、かかる欠損型ＴＦＰＩもまた本発明においてＴＦＰＩとして用いることができる。本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤及び血管新生阻害剤はヒトに投与するものであるので、有効成分であるＴＦＰＩもヒト由来のものであるのが、免疫応答を回避し、安全性を確保するうえで好ましい。
本発明におけるＴＦＰＩの製造方法は特に限定されないが、ヒトその他の哺乳動物の血液あるいは培養細胞からの分離精製、及び遺伝子組換え技術による製造が含まれる。しかしながら、血液からＴＦＰＩを分離精製する場合は血液中のＴＦＰＩ含量が非常に少なく（約１００ｎｇ／ｍＬ）、大量に製造することが困難であるため、遺伝子組換え技術によって製造するのが好ましい。
本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤及び血管新生阻害剤は、有効成分としてＴＦＰＩを含有し、さらに治療目的や実際の適用に応じて薬理学的に許容しうる適当な担体（ゼラチンスポンジなど）や賦形剤（ヒト血清アルブミン、糖類など）を含有する。具体的な剤型としては、ＴＦＰＩに公知の適当な賦形剤（ヒト血清アルブミン、糖類など）、安定剤（アミノ酸など）及び緩衝剤（クエン酸など）を混合した乾燥製剤を注射用水を用いて溶解したものが好ましいが、これに限られるものではない。ＴＦＰＩを保存するに際しては、凍結乾燥法などの方法を用いて乾燥した状態で密封保存しておくのが薬効を最大限に維持するために好ましい。その際、公知の適当な賦形剤または安定化剤と混合してもよい。
本発明のＴＦＰＩ含有製剤の投与方法は特に限られないが、例えば、ＴＦＰＩを適当な滅菌水性媒体中に溶解した液剤を手術中に患部組織内部へ直接投与するか、患部の表面あるいはその周辺へ塗布するか、ボーラスもしく連続的に静動脈内、皮下、皮中、筋肉内へ注入する投与方法などが挙げられ、点眼法も採用できる。また、溶解せずにＴＦＰＩの粉末を患部に直接投与する方法も選択できる。さらに、ＴＦＰＩを発現するべく作られた遺伝子を、適当な遺伝子発現ベクターに組み込んで直接患部の組織に導入し、ＴＦＰＩを患部で過剰発現させる方法も選択可能である。また、安全性が確認される限り、抗癌剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、糖尿病用剤、抗生物質等の他の薬剤と併用してもよい。
本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤及び血管新生阻害剤の有効成分であるＴＦＰＩの有効投与量は、投与経路あるいは投与方法等により変わりうるが、新生血管の内部に存在する血液のＴＦＰＩ濃度が５μｇ／ｍｌから８０μｇ／ｍｌの範囲となるようなものが望ましい。
以下、本発明の理解を深めるために実施例に沿って説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
製造例
ＴＦＰＩの調製
以下の実施例で使用するＴＦＰＩは、亀井ら（特開平７−７９７７４号）や円城寺の報告［Biochem.,３４,ｐ５７２５（１９９５）］に記載した方法に従い、ヒトＴＦＰＩのｃＤＮＡを導入したチャイニーズハムスター卵巣由来細胞株の培養上清から、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体（ＨＴＦＰＩ−Ｋ９（微工研菌寄１４４６７号））を結合させたゲルとヘパリンゲル（ファルマシア（Pharmacia−ＬＫＢ）によるアフィニティークロマトグラフィーを行って精製した。培養上清中には全長型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ＋Ｃ）とＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ−Ｃ）が存在するが、ヘパリンゲルによるアフィニティークロマトグラフィーの溶出を塩化ナトリウムの濃度勾配溶出で行うことによって、この両者を分離精製することができる。この方法で得られた全長型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ＋Ｃ）及び全長型ＴＦＰＩのＣ末端側２７アミノ酸を欠損させたＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ−Ｃ）を用いて以下の検討を行った。
実施例１
全長型ＴＦＰＩによるヒト血管内皮細胞の増殖抑制効果
内皮細胞はクラボウ社より購入したヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、継代歴３代で使用した。増殖用培地はクラボウ社製Ｅ−ＧＭ培地（２％ウシ胎児血清、１０ｎｇ／ｍｌヒト上皮成長因子、１μｇ／ｍｌハイドロコーチゾン、０．４％ウシ脳抽出物、１０μｇ／ｍｌヘパリン、及び抗菌剤を含む改変ＭＣＤＢ１３１培地）を用いた。
Ｅ−ＧＭ培地に懸濁した内皮細胞を、２，５００個／ウェルの細胞密度で４８ウェル培養プレート（岩城硝子株式会社製）に播種し、３７℃のＣＯ2インキュベーターにて培養した。播種の２日後、各種濃度（０、１０、２０、及び４０μｇ／ｍｌ）の全長型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ＋Ｃ）を含むＥ−ＧＭ培地に交換し、以後２日毎に新鮮な同培地にて培地交換しながら培養を継続した。培地量はウェルあたり０．３ｍｌとした。播種して６日後、プレート上に増殖した細胞を常法に従いトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で剥離した後、コールターカウンター（コールター社製）を用いて１ウェルあたりの細胞数を計測した。
図１は各群３ウェルの細胞数の平均値と標準偏差をグラフにして示したものである。ＴＦＰＩの添加によって濃度依存的に内皮細胞の増殖が有意（スチューデントｔ検定、有効水準１％）に抑制された。
実施例２
全長型ＴＦＰＩ及びＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩによるヒト血管内皮細胞の増殖抑制効果
全長型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ＋Ｃ）のヘパリン結合領域であるＣ末端塩基性アミノ酸配列（２７アミノ酸）が欠如したＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ−Ｃ）の内皮細胞増殖抑制効果を検討した。
増殖培地であるＥ−ＧＭ培地に懸濁した内皮細胞を、２，５００個／ウェルの細胞密度で４８ウェル培養プレートに播種し、３７℃のＣＯ2インキュベーターにて培養した。播種の２日後、各種濃度（０、5、１０、２０、４０、及び８０μｇ／ｍｌ）の全長型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ＋Ｃ）、または同濃度のＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ−Ｃ）を含むＥ−ＧＭ培地に交換し、以後２日毎に新鮮な同培地にて培地交換しながら培養を継続した。培地量はウェルあたり０．３ｍｌとした。播種して６日後、プレート上に増殖した細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で剥離した後、コールターカウンターを用いて１ウェルあたりの細胞数を計測した。
図２は全長型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ＋Ｃ）添加群及びＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ−Ｃ）添加群の細胞数の平均値と標準偏差をグラフにして示したものである（１群４ウェルにて実施）。その結果、どちらのタイプのＴＦＰＩも濃度依存的に内皮細胞の増殖を有意（スチューデントｔ検定、有効水準１％）に抑制することが判明し、ＴＦＰＩは全長型でなくとも内皮細胞の増殖を抑制しうることが示された。
実施例３
増殖を停止させた血管内皮細胞に対するＴＦＰＩの効果
血管内皮細胞を、増殖因子を含まない培地（クラボウ社製基礎培地HuMedia−ＥＢに２％ウシ胎児血清および抗菌剤を添加したもの）で培養し、細胞増殖が生じない条件下でのＴＦＰＩの効果を検討した。
増殖因子を含まない培地に懸濁した内皮細胞を、１０，０００個／ウェルの細胞密度で４８ウェル培養プレートに播種し、３７℃のＣＯ2インキュベーターにて培養した。播種の２日後、各種濃度（０、５、１０、２０、４０、及び８０μｇ／ｍｌ）の全長型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ＋Ｃ）、又は同濃度のＣ末端領域欠損型ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ−Ｃ）を含む同培地に交換し、さらに２日培養した後、プレート上に接着している細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で剥離した後、コールターカウンターを用いて１ウェルあたりの細胞数を計測した。
図３にＴＦＰＩの濃度とプレート上の細胞数との関係を示した。各群４ウェルにて実施しており、細胞数はその平均値と標準偏差を表している。その結果、どちらのタイプのＴＦＰＩも濃度依存的に細胞数を有意（スチューデントｔ検定、有効水準１％）に減少させた。
この結果から、ＴＦＰＩは内皮細胞の増殖抑制作用に加えて、増殖が停止した内皮細胞に対してもその機能を阻害することが判明した。すなわち、ＴＦＰＩは病的な新生血管の進行防止のみならず、既に形成された新生血管に対しても作用してその退縮を促す可能性が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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