(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然の原料から遺伝子工学及び／又はバイオテクノロジーによって得られ治療に使用される核酸を含む調製物から、クロマトグラフィー材料で処理することによりエンドトキシンを減量又は除去する方法であって、
−前記天然原料を溶解してフラクションを得て；
−前記フラクションを水性塩溶液及び洗剤とプレインキュベートし、陰イオン交換材料で処理し、その後さらに塩溶液で洗浄し、核酸を陰イオン交換体から溶出した後、それ自体知られた方法でさらに精製する方法。
【請求項２】
前記天然原料の溶解により得られたフラクションを、遠心するか、濾過するか又はアフィニティークロマトグラフィー法により処理して透明化溶解物を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記天然原料をアルカリ溶解、加圧（フレンチプレス）、煮沸溶解、リゾチーム、洗剤又はそれらの組み合わせによって溶解して前記透明化溶解物を得る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸がプラスミドＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記天然原料が細胞、細胞器官、組織又は微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記陰イオン交換体が、ポリマー性の担体材料を基材とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマー性の担体材料が、アガロース、アクリルアミド、デキストラン、シリカゲル又はそれらの組み合わせである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
透明化溶解物のプレインキュベーションが０．１から２．０M NaCl溶液に相当する濃度を持つ塩溶液を用いて行われ、非イオン性洗剤の濃度が０．１から３０％の範囲内にある、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化グアニジウム、又は過塩素酸ナトリウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プレインキュベートした「透明化溶解物」の前記陰イオン交換材料による前記処理の後に、アルカリハロゲン化物を含有し０．５から２．０M NaClのイオン強度に相当する塩溶液による洗浄処理が行われる、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルカリハロゲン化物が、NaCl、KCl、又は塩化リチウムである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載された処理の後に、無機材料又は有機材料によって核酸をさらに精製する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記無機材料が、シリカゲル、珪藻土、ガラス、アルミナ、チタニア、もしくはハイドロキシアパタイトであり、ならびに／又は、前記有機材料が、アガロース、デキストラン、アクリルアミド、ポリスチレン樹脂、もしくは上述のポリマーのモノマー構成ブロックから成るコポリマーである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は天然の原料から遺伝子工学及び／又はバイオテクノロジーによって得られ治療に使用される活性成分を含む調製物から、クロマトグラフィー材料で処理することによりエンドトキシンを減量又は除去する方法、並びにその使用、当該方法を行うための水溶液、及び当該方法を行うための構成要素を含むキットに関する。
分子生物学的方法は医薬品の製造における重要性が高まりつつある。それらには一方で医薬品を製造するための古典的な遺伝子工学的手法が含まれ、同時に次第に範囲が広がりつつあるものとして、治療を受けるべき種のゲノム中に核酸を誘導するいわゆる遺伝子治療が含まれる。そのような局面でエンドトキシンの除去は非常に重要となりつつある。
例えば、予備スケールでプラスミドDNAを調製するにはいわゆる宿主細胞によるプラスミドの増殖が必要である。これらは一般に、大腸菌（E．coli）K-12の変異株のようなグラム陰性のエンテロバクテリアである。グラム陰性細菌は外膜に包まれた細胞壁を持つ。この膜上に位置するのが、エンドトキシンの名称でも知られるいわゆるリポポリサッカライド（LPS）である。エンドトキシンは、例えば、エンドトキシンショックのみならず炎症反応及び発熱のような細菌中毒に伴う典型的な現象の原因となる。
独国特許P 44 03 692及びP 44 22 291に記されているように、生体内（in vivo）及び生体外（ex vivo）の遺伝子治療には、嚢胞性繊維症のような遺伝的な原因による疾患の治療用だけでなく、癌或いは血友病の治療、又は感染症に対する予防注射に用いるためのプラスミドDNAの使用が含まれる（TIBTECH，臨時増刊：Gene Therapy Therapeutic Strategy and Commercial Prospects，May 1993，Vol．11，No．5（112））。この場合、投与されたDNAが炎症性又は壊死性の反応のような副作用を起こさないことが重要である。従って、その種の治療に用いられるDNAはエンドトキシンの混入がないことが保証されなければならない。
遺伝子工学及び／又はバイオテクノロジーによって作られる製剤にもエンドトキシンが混入することがある。そこで、エンドトキシンを生理的に安全な量以下に除去又は減量することが重要である。
例えばグラム陰性菌からのプラスミドDNAの精製方法で現在知られているものはプラスミドDNAからエンドトキシンを完全に除去することはできない。これらの方法としては、例えばセシウムクロライド濃度勾配遠心又は陰イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。
セシウムクロライド濃度勾配遠心は異なるサイズのDNA分子は塩濃度勾配中で異なる移動速度を示すという事実に基づいている。しかしながら、リポポリサッカライドは濃度勾配中でDNAと同様の移動性を示し、そのため効果的にDNAから分離することができない。
陰イオン交換クロマトグラフィーに比べると、セシウムクロライド濃度勾配遠心は時間がかかり、エチジウムブロミドのような毒性のある物質を幾つか使用する。また、セシウムクロライドは別に透析して除去しなければならない。
アイダ及びパブスト（Aida and Pabst）は「Triton X 114を用いた相分離による蛋白溶液からのエンドトキシンの除去」（J．Immunol．Methods 132，191-195（1990））でTriton▲Ｒ▼ X 114抽出法により蛋白溶液からエンドトキシンを除去する方法を示唆している。処理される溶液に洗剤Triton▲Ｒ▼ X 114を加える。インキュベーション及び遠心の後、蛋白が含まれる水相を除去すると、エンドトキシンが除去された蛋白又はエンドトキシンが減量された蛋白が沈殿する。WO 95/21177に既に示されているように、この方法はDNA溶液からのエンドトキシンの抽出に使用することもできる。しかしながら、この方法には作業経費がかなりかかるという特徴があり、DNAを単離した後にのみ用いられる。この方法は、分取スケールとりわけ工業用スケールでのDNA量の精製にはあまりふさわしくない。
本発明の目的は、遺伝子工学及び／又はバイオテクノロジーによる原料から得られ治療に使用される、活性成分を含むエンドトキシン−フリー又はエンドトキシンの減量された製剤をうまく製造することができる方法を提供することにある。本発明の方法は、上に述べたような欠点を避けることができる。DNAの精製及びエンドトキシンの分離又は減量が同じ処理又は処理段階において行うことができる。
この目的は請求項１で規定される特徴を持つ方法によって達成される。請求項２から７は本発明の方法の好ましい態様に関する。請求項８は核酸を含有する調製物からエンドトキシンを減量又は除去するための陰イオン交換体の使用に関する。
本発明の方法では、治療に用いられる活性成分を含む製剤が遺伝子工学及び／又はバイオテクノロジーによってそれから得られる天然原料を、最初に溶解（lyse）する。この溶解は好ましくはアルカリ溶解のようなそれ自体知られた方法によって行われるが、高圧の適用（フレンチプレス）、煮沸溶解、又は洗剤或いはリゾチームの使用のような他の溶解法によって行うこともある。アルカリ溶解によって得られた材料から場合により、遠心又は濾過処理によって粗い細胞破片を除く。
本発明では、例えば通常の陰イオン交換クロマトグラフィーによる実際の精製の前に、例えばアルカリ溶解によって得られている「透明化溶解物」（cL）を続いてPCT/EP 95/00392に示されている操作によって濾過し、その後ある種の塩／洗剤の組み合わせと共にプレインキュベーションする。
ドイツ特許出願PCT/EP 95/00392は天然の原料から核酸のような細胞内容物を単離する方法及び装置を示唆している。そこに述べられている核酸調製のための濾過方法は核酸を含有する原料の溶解から始まり、溶解物を一定時間静置し、得られた溶解物をガラス、シリカゲル、アルミナ或いは圧縮珪藻土のフィルター層、又はグラスファイバー及びシリカゲルを織り交ぜた或いは張り合わせた不織布、並びにセルロース、紙、圧縮紙、紙製不織布及び粒子又はシート、メンブレン、或いはポリプロピレンを基材とする不織布のようなプラスチック製品に通し、その後フィルター層を通過するフラクションを回収した後に、回収したフラクションから核酸をさらに処理する。フィルター層は核酸に対するアフィニティーが存在しなくなるように、特に水酸基を持つ無機質又はコーティングされた無機質、とりわけジオールシリカゲル、ジオール珪藻土、及び／又はジオールパーライトによって修飾されていてもよい。これはシリカゲルが核酸に対してアフィニティーを持たないような条件下で行うことができる。PCT/EP 95/00392に示されている方法を行うための好ましい装置は、内部に濾過手段が配された円筒状の中空体である。特にこのフィルター層は5μmないし500μmの範囲の粒子サイズを持つ珪藻土の圧縮層から成り、フィルター層の全体の厚みは0.1ないし200mmである。さらに、中空体内、すなわち珪藻土フィルターの上及び／又は下に、濾過する溶液がフィルター内に本来浸透しない時期に浸透してしまうことやこの装置から溶液が流出してしまうことを防ぐために別の層を配すると有利なこともある。
PCT/EP 95/00392に示された装置は、核酸の調整に有用な41 39 664 Alに開示されているような他の器械とうまく組み合わせることができる。
41 27 276 Alメンブレン（3M Empore▲Ｒ▼メンブレン）に埋め込まれた陰イオン交換体を開示している。このようなシステムはQIAWELL▲Ｒ▼の名称の元入手可能である。
インキュベーション溶液としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化グアニジニウム、過塩素酸ナトリウム、及び他のカオトロピック塩を用いることができる。
洗剤としては、特に、NP 40、Tween▲Ｒ▼ 80、Tween▲Ｒ▼ 20、Triton▲Ｒ▼ X 100、Triton▲Ｒ▼ X 114、Syperonic▲Ｒ▼ F-68、又は他の非イオン性洗剤などを使用することができる。洗剤は好ましくは0.1%ないし30%の濃度で存在する。塩溶液は通常0.1-2.0 M NaCl溶液のそれに相当するイオン強度を持つ。
濾過した溶解物をアフィニティークロマトグラフィー材料と共にインキュベートすることもできる。これは特に、シリカゲルに結合したキレート剤でもよい。NTA（ニトリロ三酢酸）又はIDA（イミノ二酢酸）で修飾したシリカ表面のようなアフィニティー材料が有用であることが証明されている。このアフィニティー担体上では、別の配位結合部位により蛋白中の側鎖窒素含有アミノ酸残基と相互作用できる例えばニッケルイオンがキレートを作る。濾過した溶解物を、特に、シリカゲルを基材とするNi/NTAクロマトグラフィー材料とインキュベートしてもよい。クロマトグラフィー材料は、バッチ形式を用いる場合はインキュベート完了後に例えば遠心して除去してもよく、上清は陰イオン交換体又は他の材料を通して更に精製してもよい。バッチ形式の他に、カラム式の操作もサンプル条件が許せば行うことができる。
上記陰イオン交換体は好ましくは、アクリル樹脂、デキストラン、アガロース又はそれらの組み合わせのようなポリマー性の無機担体材料を基材とする材料であって、陰イオン交換体に結合している基が担体表面領域に0.5ないし500μM/mlに相当する1ないし4μM/m2の表面電荷を持つものである。P 44 03 692に示されているクロマトグラフィー担体材料は、修飾された多孔質又は非多孔質の無機及び／又は有機材料として使用することもできる。さらに、QIAGEN▲Ｒ▼、DEAEセファロース▲Ｒ▼、Qセファロース、DEAEセファデックス▲Ｒ▼、Poros 20 M/P及び／又はPoros 50 M/Pのような陰イオン交換体をエンドトキシン除去処理の後に使用することもできる。
エンドトキシンを除去又は減量するために本発明の方法を行った後に、シリカゲル、珪藻土、ガラス、アルミナ、チタニア、ハイドロキシアパタイトのような無機材料、又はアガロース、デキストラン、アクリルアミド、ポリスチレン樹脂、及び上述のポリマーのモノマー構成ブロックから成るコポリマーのような無機材料によってDNAをさらに精製することもできる。
特に、核酸、例えばプラスミドDNAのような活性成分が本発明の方法によりエンドトキシンフリーで得ることができる。さらに、6 bpないし1000 kbpのサイズを持つRNA、YAC又はゲノムDNAのような核酸もエンドトキシンフリーで得ることができる。例えば核酸又は治療に用いるための成分が得られる天然の原料としては、例えば、細胞、細胞器官、組織又は微生物を挙げることができる。
また、蛋白溶液又は、アデノウィルス、AAV或いはレトロウィルスのようなウィルス粒子も、本発明の方法によってエンドトキシンフリーにするか、又はエンドトキシン含量を低下させることができる。
「透明化溶解物」のプレインキュベーションは好ましくは、アルカリハロゲン塩、非イオン性界面活性剤、及びバッファー物質を含む塩溶液を用いて行う。アルカリハロゲン化物濃度はNaClの0.1ないし2.0 M濃度のようなイオン強度に相当する。
上記のように処理したフラクションをクロマトグラフィー材料に接触させて活性成分を担体表面に吸着させる。塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム等のようなアルカリハロゲン化物を含む塩溶液を好ましくは使用する。洗浄用溶液のイオン強度はおよそ0.5ないし2.0 MのNaCl溶液のそれに相当する。
本発明の方法により、遺伝子工学及び／又はバイオテクノロジーによって天然の原料から得られ治療に使用される活性成分を含む調製物からのエンドトキシンの減量又は除去が驚くほど単純な方法で確実に行われる。驚くべきことに、塩／洗剤と共にプレインキュベーションすることにより、その後のクロマトグラフィー精製におけるプラスミドDNAの収率及び純度に悪影響を及ぼすことなくエンドトキシンの分離がなされる。
以下の実施例により本発明をより詳しく説明する。
P1、P2、P3、QBT、QC及びQNの略号で示すバッファーは以下の組成物を有する：
P1    10μg/ml RNase A，50 mM Tris/HCl，100 mM EDTA
P2    200 mM NaOH，1% SDS
P3    3 M KAc，pH 5.5
QBT   750 mM NaCl，50 mM MOPS，15%アルコール*，pH 7.0，0.15%Triton▲Ｒ▼ X 100
QC    1.0 M NaCl，50 mM MOPS，15% アルコール，pH 7.0
QN    l.6 M NaCl，50 mM MOPS，15% アルコール，pH 7.0
エンドトキシン除去バッファー（750ｍM NaCl/10% Triton▲Ｒ▼ X 100/50 mM MOPS，pH7.0）*アルコールは、好ましくはイソプロパノール又はエタノールを使用する。
実施例１
陰イオン交換クロマトグラフィー法によるエンドトキシン−フリーのpUC18 DNA 100 mgの精製
プラスミドpUC18の発酵培養液10 ｌを遠心し、得られた細菌ペレットを500 mlのバッファーP1に再懸濁し、バッファーP2及びP3をそれぞれ500 mlずつ加えてアルカリ溶解を行う。細胞破片、ゲノムDNA及びSDS沈殿物（SDS=ドデシル硫酸ナトリウム）は、例えばWO 95/21177に提示されているような濾過ユニットを用いて分離除去する。
次に、「透明化溶解物(cL)」にその1/10容量（150 ml）のエンドトキシン除去バッファーを加え、cLと混合する。この混合液を4℃で１時間インキュベートし、次いで蠕動ポンプを用いて4 ml/minの流速で直径4.4 cm、長さ50 cmの陰イオン交換カラム上に供給する。カラムは予め350 mlのQBTバッファー（10 ml/min）で平衡化してあった。このカラムを2.5 ｌのQC（15 ml/min）で洗浄する。プラスミドDNAを400 mlのQNバッファー（3 ml/min）で溶出し、その後0.7容量のイソプロパノールで沈殿させて、70%エタノールで洗浄する。
エンドトキシン含量の測定はBioWhittaker LALテストにより行う。精製DNAは遺伝子ワクチンとして筋肉又は他の組織中に直接注射することができる。
エンドトキシンの減量を行った後、上記DNAには僅か＜ 50 I.U./mg DNAしかエンドトキシンの混入がない。
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実施例２
陰イオン交換クロマトグラフィー法によるエンドトキシン−フリーのpBR322 DNA 10 mgの精製
プラスミドpBR322の振蘯培養液5ｌを遠心し、得られた細菌ペレットを125 mlのバッファーP1に再懸濁し、バッファーP2及びP3をそれぞれ125 mlずつ加えてアルカリ溶解を行う。細胞破片、ゲノムDNA及びSDS沈殿物は遠心によって分離除去する。その後、溶解物をひだ織り濾紙を通して透明にする。
上記で得られたcLにその1/10容量（35 ml）の、20% NP 40，750 mM NaCl，50 mM MOPS，pH 7.0から成るバッファーを加え、このcL混合液を4℃で１時間インキュベートする。続いてDNAを以下のように単離する：前処理したcLをQIAGEN▲Ｒ▼ tip 10,000陰イオン交換カラム上に供給する。cLを通した後、カラムをバッファーQCで洗浄し、続いてDNAをバッファーQF（1.25 M NaCl，50 mM Tris/HCl，15% エタノール，pH 8.5）で溶出する。このようにして調製されたDNAは組み換えアデノウィルス粒子に結合させることができる。得られたアデノウィルス/DNA複合体はその後、生体内（in vivo）及び生体外（ex vivo）の遺伝子治療に使用することができる。
プラスミドpUC19の発酵培養液20 ｌのバイオマスにバッファーP1、P2、P3をそれぞれ1ｌずつ加えて溶解し、続いてカラム中に配した珪藻土パッキングで濾過する。濾過した溶解物に20 gのNi-NTA修飾シリカゲルを加えた後、室温で振蘯しながら30分間インキュベートする。その後、Ni-NTA修飾シリカゲルを遠心分離し、上清をさらに陰イオン交換クロマトグラフィーカラムで精製する。