(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID N0: 1に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
SEQ ID N0: 2に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
SEQ ID N0: 1およびSEQ ID N0: 2に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含む、ヒトサイトメガロウィルスに対するワクチン。
【請求項４】
アジュバントをさらに含む、請求項3に記載のワクチン。
【請求項５】
前記アジュバントがDNAアジュバントである、請求項4に記載のワクチン。
【請求項６】
SEQ ID N0: 1に示されるアミノ酸配列およびSEQ ID N0: 2に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドならびにDNAアジュバントを含む、ヒトサイトメガロウィルスに対するワクチン。
【請求項７】
SEQ ID N0: 1に示されるアミノ酸配列およびSEQ ID N0: 2に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを提示する抗原提示細胞を含む、ヒトサイトメガロウィルスに対する細胞ワクチン。
【請求項８】
請求項3に記載のワクチンを含む、ヒトサイトメガロウィルス感染に対する免疫応答をモジュレートするためのワクチン製剤。
【請求項９】
請求項7に記載のワクチンを含む、ヒトサイトメガロウィルス感染に対する免疫応答をモジュレートするためのワクチン製剤。
【請求項１０】
請求項3に記載のワクチンを含む、ヒトサイトメガロウィルスに対してワクチン接種が必要なヒトにワクチン接種するためのワクチン製剤。
【請求項１１】
請求項7に記載のワクチンを含む、ヒトサイトメガロウィルスに対してワクチン接種が必要なヒトにワクチン接種するためのワクチン製剤。
【請求項１２】
SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドをコードする遺伝子を含有する、組換えウィルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、2000年10月20日に出願した先の同時係属中の仮出願シリアルNo. 60/241,944に基づく優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府の支援に基づく研究に関する陳述
本発明は、連邦保健社会福祉省（the United States Department of Health and Human Services）、国立癌研究所（National Cancer Institute）からのグランドNo. CA30206、No. CA77544およびNo. CA33572の形式で政府のサポートを受けた。政府は、本発明において特定の権利を有することができる。
【０００３】
発明の背景
1.  技術分野
[0001]  本発明は、ヒトサイトメガロウィルス（HCMV）に関し、そして特にヒトにおいてHCMVのT-細胞エピトープ類を産生するタンパク質に由来するペプチドフラグメントに関する。ペプチドフラグメントエピトープ類は、ヒト細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を、HCMVにより感染されたヒト細胞を認識しそして溶解する様に方向付けることができる。
【０００４】
2.  背景技術の記載
[0002]  HCMVゲノムは、比較的大型（約235,000塩基対）のものであり、そして200以上のタンパク質をコードすることができる。HCMVは、構造的機能または酵素的機能を有するカプシドタンパク質により囲まれる二本鎖DNAの核複合体、そして外部糖ペプチド-および糖脂質-含有膜エンベロープを含む。
【０００５】
[0003]  HCMV感染は、比較的共通なものであり、そして健康で、免疫適格性の子供または成人においては、通常は自己-制御式である（L. Rasmussen, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154:221-254 (1990)）。しかしながら、ウィルスは、胎児または乳児においては重度な疾患を引き起こす可能性がある。例えば、HCMVは、活動性な感染を保有する母親からin uteroで感染を受ける子供における先天性の精神発育遅滞の共通した原因である。その他の新生児は、疾患の兆候を示すまでのある期間、サイトメガロウィルスを保有する可能性がある。全ての新生児のうちのおよそ10％が、HCMVを保有する。
【０００６】
[0004]  活動性なHCMV感染を有する患者は、しばしば唾液腺、脳、腎臓、肝臓、および肺を含む、患者の生存に関わる器官の少なくともいくつかの機能障害を患う。さらに、HCMVは、単核細胞症および間質性肺炎を含む幅広い範囲の古典的な症候群に関連する。HCMVはまた、腫瘍形成能およびカポジ肉腫を含む特定の型の悪性腫瘍と関連している可能性を有する。
【０００７】
[0005]  HCMV感染がなければ健康な成人における、持続的で一見すると無症候性のHCMV感染もまた、特定の個体において、健康リスクの問題を提起する場合がある。例えば、冠動脈血管形成術を受けた個体は、時々後になって動脈リモデリングの結果として再狭窄を引き起こす。ある研究において、約1/3のそのような再狭窄を起こした患者が、その動脈病変において検出可能なHCMV DNAを有しており（E. Speir et al., Science 265:391-394 (1994)）、別の研究においては、HCMV血清陽性患者がそれらの血清陰性対照よりも5倍も再狭窄を引き起こしやすかった（Y.F. Zhou et al., New England J. Med. 335:624-630 (1996））。これらの研究から、HCMVが感染した宿主細胞の数を減らすことにより、特定の個体に利益をもたらすことができることが示唆される。
【０００８】
[0006]  HCMVはまた、免疫無防備状態の患者において罹患率および死亡率と関連する。HCMVは、後天性免疫不全症（AIDS）を患う患者の治療において、重要な検討事項である。HCMVの特徴的な合併症はウィルス性網膜炎であり、これはもし治療しないままにしておくと、失明に至る可能性がある。HCMVウイルス血症のその他の疾患症状発現には、脳炎、腸炎および肺炎が含まれる。剖検の際に、重度のHCMV網膜症を有するAIDS患者の大半において、HCMV疾患の多-臓器関与が存在する。歴史的には、HCMV疾患は、CD4+ T細胞レベルが100/mm3以下にまで減少するHIV-感染個体を襲う、より破壊的な日和見感染の一つであった。
【０００９】
[0007]  HCMVは、例えば、免疫抑制された臓器移植患者において、日和見感染を引き起こす可能性がある。抗ウィルス化学療法を使用する前には、HCMV感染が実質的な割合の骨髄移植後合併症の原因であった（J. Meyers et al., J. Infect Dis. 153:478-488 (1986)）。実質的な抗-HCMV活性を有するガンシクロビルなどの薬物を使用することにより、骨髄移植後HCMV感染と関連する合併症は減少した（G. Schmidt et al. New England J. Med. 324:1005-1011 (1991); J.M. Goodrich et al., New England J. Med. 325:16C1-1607 (1991)）。しかしながら、ガンシクロビルの予防的投与は、好中球減少症や致死的細菌疾患や致死的真菌疾患の数の増加を含む、いくつかのネガティブな結果を有する。同様に重要なことは、ガンシクロビルもまた、細胞性免疫およびCMVに対する特異的細胞性応答の再構築を遅らせる。この結果、移植の約90日後に発症する“後期CMV疾患”と呼ばれる合併症を引き起こす。後期CMV疾患は、病的状態または致死を引き起こす可能性があり、そして移植後すぐに予防的または治療的ガンシクロビル治療のいずれかを受けた患者において最も一般的なものである。
【００１０】
[0008]  CD8+ CTL応答は、HCMVなどの急性ウィルス感染に対する哺乳動物宿主応答において重要であると考えられている。HCMV感染がはびこりそして持続的であり、そして免疫抑制状態の患者において再び活性化される可能性がありそして臨床的に顕性となる、という知見から、ウィルス-特異的T-細胞が持続的な感染の制御およびHCMV疾患からの回復において重要な役割を果たしていることが示唆される。
【００１１】
[0009]  ヒトにおいて、免疫抑制された骨髄移植レシピエントにおけるHCMV疾患の発症からの防御は、測定可能なCD8+ HCMV-特異的クラスI MHC-拘束性T細胞応答の回復と相関関係にある（Quinnan et al., N. Eng. J. Med. 307:7-13 (1982); Reusser et al., Blood 78:1373-1380 (1991)）。ドナー-由来のHCMV-特異的CD8+ CTLクローンをアレルゲン性の骨髄移植レシピエントに対して移植すると、結果として検出可能なCTL-ベースのHCMV免疫を引き起こし、そして骨髄移植後のHCMV疾患を統計的に顕著に減少させる（Walter et al., N. Eng. J. Med. 333:1038-1044 (1995)）。うまく適用されたとしても、このアプローチは、HCMV-特異的CTLをin vitroで誘導するために、非常に労働集約的かつ非常に費用がかかる洗練された研究室設備が必要とされる、という欠点を有する。
【００１２】
[00010]  ヒトサイトメガロウィルスは比較的一般的であるが、今なおいくつかの極めて重症な健康状態と関連しているため、骨髄移植レシピエント、固形器官移植、心臓病患者、AIDS患者あるいは妊娠期間の女性、における疾患の発生率および重症度を減少させることができるワクチンが非常に望まれていた。減弱生CMV、減弱ポックス-ウィルスに保持させたCMVタンパク質そしてCMV膜タンパク質の可溶性アナログを含む、いくつかのHCMVワクチンが開発中である。残念ながら、それらの開発において多大な努力が行われているにもかかわらず、FDAは、これらのワクチンのいずれも、安全かつ効率的なものとして承認していない。
【００１３】
[00011]  CTLエピトープ類を使用するワクチン開発は、個体を感染性疾患および癌に対して免疫化するために幅広く受け入れられている戦略となっている。CTLエピトープ類の特異性および細胞内タンパク質プロセッシングが必要とされないという事実により、それらが全タンパク質を免疫源として使用することに対する魅力的な代替法となる。このようなワクチンを開発するため、宿主にHCMVを認識させるウィルスタンパク質を同定しなければならない。
【００１４】
[00012]  腫瘍抗原、ウィルス抗原、および自己-タンパク質を含む様々な抗原がペプチドへプロセッシングされ、それが抗原提示細胞の表面上で提示するためにMHCクラスIに対して運ばれる（Reddehase et al., Nature 337:651-653 (1989); Rosenberg et al., Nat. Med.4:321-327 (1998); Visseren et al., J. Immunol. 154:3991-3998 (1995)））。 細胞性タンパク質またはウィルス性タンパク質の8〜12アミノ酸フラグメントがMHCクラスIのペプチド結合溝中に埋め込まれているという発見以来、これらのフラグメントのアミノ酸配列を同定することにかなりの注目が集められてきた（Joyce and Nathenson 1994; Rammensee et al. 1993）。これらのペプチドのいくつかを同定し、ワクチンに製剤化し、そして特定のウィルス性疾患および癌に対する効率について評価した（Vitiello et al. 1995; Wang et al. 1990）。
【００１５】
[00013]  ウィルスのライフサイクルは、ワクチンを標的化してウィルス産生および伝播を最大限防止するための最も効率的な時間枠について、洞察を提供する。HCMVが宿主細胞中に侵入しそして脱殻した後、ウィルスゲノムはその後、極めて初期ウィルスタンパク質（0-2時間）、初期ウィルスタンパク質（2-24時間）および後期ウィルスタンパク質（＞24時間）を介して連続的に発現される。しかしながら、pp65やpp150などの特定のウィルス構造タンパク質は、ウィルス粒子内に大量に存在するため、細胞中にシャペロン化（chaperoned）される。
【００１６】
[00014]  ウィルス構造タンパク質であるpp150は、ほとんどの無症候性HCMV血清陽性個体の末梢血に由来するHCMV-特異的クラスI MHC拘束性CTLに対する標的抗原として同定された。pp150またはpp65に対するCTL（しばしば認識される別のマトリックスタンパク質）は、HCMV-感染細胞を感染1時間以内に、そしてウィルス遺伝子の発現が存在しない場合に、in vitroにて認識しそして溶解することができる（Riddell and Greenberg, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 189:9-34 (1994)）。したがって、HCMV pp150に対するCTLは、HCMV再活性化および疾患の拡大を制限するために重要なエフェクター細胞である。そのような細胞性免疫応答を免疫無防備状態の個体および正常な個体の両方において誘導する能力は、有効なワクチンを生成する際には非常に重要なものであろう（Li et al., Blood 83:1971-1979 (1994)）。ワクチンのために有用なpp65配列に基づくペプチドは、U.S.特許6,074,645に記載され、その開示は参考文献として本明細書中に援用される。
【００１７】
[00015]  個々のMHCクラスI分子は、所定のモチーフのペプチドに優先的に結合する。モチーフの特定の位置のアミノ酸配列は不変であり、所定のペプチドをMHCクラスI分子に対して高い親和性で結合させることができる。これらの不変なアミノ酸を“アンカーポジション”と呼ぶ（Falk et al., Nature 351:290-296 (1991)）。その後の研究により、アンカーポジション以外のアミノ酸位置もまた、MHCクラスI分子に対して結合するペプチドの特異性に寄与することが示唆された。さらに、MHCクラスI分子とは相互作用しないCTLエピトープ内部の位置での残基が、T細胞と相互作用する可能性があり、これはおそらく、T細胞受容体（TCR）が結合することによる。アミノ酸残基のMHC構造またはTCR構造に対する結合は、独立的に制御されており、そのため多くの場合におけるTCR結合性アミノ酸残基の置換が抗原提示細胞の表面上のMHC分子に対する結合を妨害しない可能性がある。
【００１８】
[00016]  エドマン分解の後にN-末端配列解析を使用して、MHCクラスIペプチド結合性溝に対して結合するペプチドの配列を決定した。HPLC-分離ペプチド混合物のマススペクトロメトリーにより、個々のペプチドの一次配列を解明することができる。ほとんどの場合において、これらのペプチドの長さは9〜11アミノ酸の間である。MHCに結合するペプチドフラグメントは、“天然にプロセスされるエピトープ類”と呼ばれる。
【００１９】
[00017]  いくらかの研究者たちは、所定の長さ、すなわち9〜11アミノ酸、のペプチドのいずれが個々のHLAクラスIアリルに最適に結合しうるのかを、そのアリルに対して特異的なモチーフにそれらが従っているかという点のみに基づいて、予測しようとした（Falk et al., Nature 351:290-296 (1991)）。しかしながら、これらの方法は、ウィルスタンパク質の内在性プロセッシングの結果として、T細胞による正しい結合または正しい認識のいずれも、確実には予想しない。
【００２０】
[00018]  もう一つのHCMVタンパク質であるpp65による実験では、利用可能なモチーフプログラムが免疫原性ウィルスタンパク質に対して特異的なヒトT-細胞により認識される配列を正しく予想するためには、十分に適合していないことが示された。天然にプロセスされたエピトープ類の同定には、一般的に、切断解析、重複性ペプチド、およびアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかからの1アミノ酸除去の後に認識および結合をアッセイすることからなるペプチド欠失を含む、力ずくのアプローチ（brute-force approach）が必要とされる。従って、エピトープマッピングは、ほとんど完全に経験に基づくものである（Andersen et al., Tissue Antigens 55:519-531 (2000)）。
【００２１】
[00019]  CTLは、哺乳動物生物がウィルスによる感染およびおそらくは癌に対して自身を防御する、重要な手段である。プロセスされた型の抗原、例えばウィルス性タンパク質最小細胞傷害性エピトープ、は、MHCクラスI分子と組み合わせてT細胞により認識される。ウィルスおよび腫瘍-特異的T細胞の機能的研究の結果、8〜12アミノ酸のペプチドからなる最小細胞傷害性エピトープが、抗原提示細胞が、正しいMHC分子の文脈においてエピトープを提示する限りにおいて、CD8+ CTLにより溶解されるべき抗原提示細胞をプライム化することができることを確認した。
【００２２】
[00020]  細胞中へのタンパク質の侵入の経路から、それがMHCクラスIまたはクラスII分子のいずれかと結合する抗原としてプロセスさせるかどうかを決定する。タンパク質分解の内在性経路またはクラスI経路は、感染性ウィルスが存在する場合、しばしば細胞により使用される。ウィルスの核タンパク質は、細胞内でプロセスされ、そして分解された部分は、MHCクラスI分子を介して表面に輸送される。ウィルスのエンベロープ糖タンパク質は、細胞表面分子であるため、CTL認識を必須には誘導しない。ウィルスの核タンパク質は、主としてプロセスされたエピトープ類の形状で存在するが、しばしばCD8+ CTLにより認識される標的抗原である（Townsend et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond.(Biol). 323:527-533 (1989)）。
【００２３】
[00021]  外来性経路（ピノサイトーシスなど）を介して細胞に侵入する抗原は、典型的にはクラスI MHC分子によっては処理されず、そして提示されない。タンパク質を直接的に細胞質中に導入するための方法は、したがって、ワクチン開発者たちの一つの焦点となっていた。組換えワクシニアウィルスを使用して細胞を感染させ、大量の細胞内抗原を送達することができるが、しかしながらこれらのウィルスそれ自体は、免疫抑制状態のヒト、例えば骨髄移植レシピエントあるいはAIDS患者における疾患を引き起こす潜在力を有する。減弱ワクシニアウィルス、例えば修飾ワクシニアアンカラまたはカナリアポックスウィルスは、免疫抑制状態の個体に対して、抗原およびタンパク質の送達に関して代替法を提供する。最近刊行された報告では、最小型のエピトープワクチンを、それらをウィルスから作製されたタンパク質として送達するか、または最小エピトープをペプチドの形状で使用するかに関わらず、使用することが提唱されたIshioka et al., J. Immunol. 162:3915-3925 (1999); Fu, J. Virol. 72(2):1469-1481 (1998); Rodriguez et al., J. Virol. 72(6):5174-5181 (1998)。ワクチン接種の別のアプローチは、抗原性タンパク質をアジュバントと混合し、そして混合物を皮下注射により皮膚の下に導入することである。
【００２４】
[00022]  細胞傷害性Tリンパ球を誘起する別の可能性のあるアプローチは、特定のMHC拘束性要素の文脈において特異的なウィルス抗原に対して定義される最小細胞傷害性エピトープを使用して、ウィルスに対するT細胞記憶応答をブーストすることである。最小細胞傷害性エピトープが致死用量の感染性ウィルスによるチャレンジに対する防御的免疫を提供する能力は、文献において検討された。内部化もしくはプロセッシングを必要とすることなく細胞表面分子の外部的結合を介して、それがMHCクラスI分子に対して結合できることから、ワクチン開発者たちは、最小細胞傷害性エピトープをワクチンとして使用することに徐々に興味を大きくしていった。
【００２５】
[00023]  最小細胞傷害性エピトープ類は、一般に、ヘルパーCD4エピトープと組み合わせた脂質化ペプチドの形状で投与する場合に最も効果的であった（Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95:341-349 (1995) and Livingston et al., J. Immunol. 159:1383-1392, 1997)）。しかしながら、単独で投与されたペプチドもまた、非常に効果的であり得る。検討されたその他のワクチン修飾には、小胞体貯留（retention）に対するKDELなどのシグナル配列や最大の活性を達成するための標的化が含まれる。文献中には、特定の型の抗原提示細胞（例えば樹状細胞）により提示された最小細胞傷害性エピトープが、ウィルス性感染が存在しない場合にまたはウィルスまたは腫瘍細胞と接触させる前に、一次免疫応答を引き起こす可能性がある、という証拠も存在する。
【００２６】
[00024]  ペプチドおよびその機能性配列変異体を、そのアミノ末端にHTLエピトープが共有結合した、キメラ脂質化ペプチドまたはキメラペプチドとしてのワクチンとして製剤化することができる。HTLエピトープは、ヒトMHCクラスIIに対して幅広い応答性を有し、古典的なヘルパー応答を刺激する、いずれのペプチドであってもよい。そのような分子には、破傷風毒素由来のアミノ酸830-843（P. Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immun. 19:2237-2242 (1989)）、HIVエンベロープタンパク質由来のHTLエピトープ類（J.A. Berzofsky et al., J. Clin. Invest. 88:876-884 (1991)）、または既知アンカー残基から推測される合成物（PADRE）（J. Alexander et al., Immunity 1:751-761 (1994)）が含まれるが、これらのものに限定されない。
【００２７】
[00025]  HTL＋CTLエピトープの脂質化は、好ましくは、HTLエピトープのアミノ末端において起こり、ここでHTLエピトープはCTLエピトープについてのアミノ末端である。適した脂質部分は、既知であり、文献中に記載される（H. Schild et al., Eur. J. Immunol. 21:2649-2654 (1991); A. Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95:341-349 (1995); K. Deres et al., Nature 342:561-564 (1989)）。あるいは、CTLエピトープはそのアミノ末端で、その後HTLエピトープで脂質化されていてもよく、あるいは脂質がカルボキシ末端で、その後CTLまたはHTLエピトープのいずれかで結合していてもよい。非脂質化ワクチン、並びにモノ-脂質化、ジ-脂質化、およびトリ-脂質化ワクチンが、本発明により使用するために企図される。3つのアミノ酸スペーサーが、HTLとCTLエピトープとの間に挿入されていてもよく、またはエピトープ類はインフレームで直接的に融合されていてもよい。あるいは、そのアミノ末端を脂質化されたCTLエピトープを、共有結合を伴わずにHTLエピトープとともに投与してもよい。
【００２８】
[00026]  特定のHCMV抗原およびCTLにより認識されるエピトープ類を同定するための多大な努力にもかかわらず、天然にプロセスされたこれらのエピトープ類は、HCMV感染を予防しそして治療する効果的な方法とともに、商業的に利用可能なものではない。したがって、このような臨床的に重要な疾患に対するペプチド-ベースのワクチンは、大きな価値を有する可能性がある。
【００２９】
発明の概要
[00027]  したがって、本発明は、SEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2に示されるペプチドを含む。さらなる態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2からなる群から選択されるペプチドを含む、ヒトサイトメガロウィルスに対するワクチンを含む。
【００３０】
[00028]  さらにさらなる態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2からなる群から選択されるペプチドを提示する抗原提示細胞を含む、ヒトサイトメガロウィルスに対する細胞性ワクチンを含む。
【００３１】
[00029]  さらにさらなる態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 2に示されるペプチドをコードする遺伝子を発現する組換えウィルスベクターを含む。
【００３２】
[00030]  さらにさらなる態様において、本発明は、上述したワクチンまたは細胞性ワクチンを投与することを含む、ヒトサイトメガロウィルス感染に対する免疫応答をモジュレートする方法を含む。
【００３３】
[00031]  さらにさらなる態様において、本発明は、ヒトサイトメガロウィルスに対するワクチン接種が必要な哺乳動物にワクチン接種する方法であって、前記哺乳動物に対して上述したワクチンまたは細胞性ワクチンを投与することを含む前記方法を提供する。
【００３４】
[00032]  さらにさらなる態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2からなる群から選択されるペプチド、およびアジュバント、好ましくはDNAアジュバントを含むヒトサイトメガロウィルスに対するワクチンを提供する。
【００３５】
[00033]  さらにさらなる態様において、本発明は、SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO: 2からなる群から選択されるペプチドを含む免疫学的試薬を提供する。
好ましい態様の詳細な説明
[00034]  本発明は、HCMVに対して効果的なワクチンを作製するために有用なペプチドに関する。これらのペプチドワクチンは、それらがHCMVに感染したヒトの免疫細胞により認識される正確なエピトープ類であり、そして感染に対して好結果の応答を提供するため、HCMV-感染細胞に対する細胞性免疫応答を誘導することができる。これらのペプチドは、したがって、HCMV感染細胞の効果的な殺傷を刺激することができ、そして感染しているが無症候性のヒトにおいても同様である。本発明のペプチドは、ヒト宿主において抗原提示細胞の表面にルーチンにそして首尾よく提示されるエピトープ類であり、そのことがMHCクラスIに対する生産的な結合とヒトにおけるHCMVに対する細胞性免疫応答の誘導を補償している
[00035]  ワクシニアウィルス中で発現するpp150タンパク質の短縮物を、pp150-特異的T細胞クローンに対してスクリーニングした。これらのCTLクローンは、確立した方法を使用してHCMV-血清陽性ボランティアから樹立した（Walter et al., N. Eng. J. Med. 333(16):1038-1044 (1995); McLaughlin-Taylor et al., J. Med. Virol. 43:103-110 (1994); Yee et al., J. Immunol. 157(9):4074-4086 (1996); Diamond et al., Blood, 90:1751-1767 (1997); LaRosa et' al., Blood 97:1776-1786 (2001)）。pp150遺伝子の全体にわたりおよそ100-200ヌクレオチドの連続的なアミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失を有する組換えワクシニアウィルスを、pp150-特異的T細胞による殺傷のために細胞を感作する能力について試験した。タンパク質の制限された領域がそのクローンの細胞傷害性T細胞応答を媒介するペプチドを含有するものとして同定されるまで、同定した配列の長さをカバーする連続的なより小さな短縮ペプチドを試験した。100アミノ酸程度の長さのペプチドが同定された場合、同定した配列の長さをカバーする一連の重複するペプチドを、さらに解析するために合成した。これらの方法を使用して、3つのアミノ酸により重複する15 merペプチドを使用して100アミノ酸配列をスキャンすると、全部で20種のペプチドが必要とされる。
【００３６】
[00036]  試験のため、自己由来およびHLAミスマッチ（対照）リンパ球細胞株を、50μMの濃度で1〜2時間、スキャニングペプチドにより感作し、そして洗浄した。対応するCTLをその後、ペプチドにより感作したクロム化EBVLCL（Epstein-Barrウィルストランスフォームリンパ球細胞）とともにインキュベートし、そして標準的なクロム放出アッセイを行った。溶解の感受性を決定し、そしていずれかの陽性のペプチドを、そのT細胞クローンのHLAアリルに対応する最小細胞傷害性エピトープが定義されるまで、アミノ末端とカルボキシ末端の両方をさらに短縮した。表Iは、示されたHLAアリルを有するヒトによりpp150から天然にプロセスされるペプチドエピトープ類を提供する。
【００３７】
【表１】
0004099058.tif 000002
[00037]  ワクチンエピトープ類は、一次構造に関わらず、標準的な製剤バッファー（PBS／10％DMSOまたはより高濃度のDMSO／0.01％トリフルオロ酢酸または同一濃度または異なる濃度のその他の酸またはアルコール）中で1回、前腕またはその他の身体の部位において皮下（s.c.）にて注入することができる。ワクチンをPBSまたはいずれかその他の医薬的に適合性のビヒクル中で投与することができる。3〜6週間後に、同一物質のブースター注入を投与することができる。必要であれば、複数回のブースター注入を3〜6週間おきに連続的に投与することができる。
【００３８】
[00038]  ワクチンを、患者またはリスクのある個体に対して、もしくはウィルスに対して陽性であるかまたは陰性であるかのいずれかの骨髄移植のドナーに対して、投与することができる。ワクチンペプチドの説明的な例としては、以下のものが含まれる：
【００３９】
【表２】
0004099058.tif 000003
ここで、Xは、シクロヘキシルアラニンまたはフェニルアラニンであり、そして“Pam”はパルミチン酸である。3つのAまたはそれに代わる構造のスペーサー（下線部）をワクチンペプチド間で置き換えることができる。上記に示されたペプチドのフォーマットは、（アミノ末端から）以下の様に記載することができる：脂質-KSS--HTLエピトープ（斜体）--アミノ酸スペーサー（下線部）--CTLエピトープ。CTLおよびHTLエピトープ類の位置は、置き換えることができる。CTLエピトープ（またはその機能的配列改変体）を、リーダー配列を付加することによりさらに修飾することができ、および／またはアミノ酸KDELをカルボキシ末端に追加して、SEQ ID N0: 8に例示されるような小胞体中の保持および標的化を補助することができる。パルミチン酸またはステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、カプリン酸およびデカン酸を含むがこれらには限定されないいずれかの適した脂質を使用することができる。好ましい脂質部分には、パルミチン酸が含まれる。あるいは、脂質を含まないワクチンの形態を使用して、付随的なアジュバントとともにまたは伴わずに、免疫原性を引き起こす適切なT-ヘルパーエピトープを選択することができる。KSSなどの配列を非脂質化ペプチドのアミノ末端に含んで、可溶性における補助とすることができる。その他のワクチン製剤には、N-末端にアミノ酸の右旋型（dextro form）を有するペプチドが含まれる。非脂質化ワクチンは、KSSリンカー配列を必要としない。
【００４０】
[00039]  アジュバントは、一部のワクチン製剤を形成することができる。完全または不完全フロイントのアジュバント、水酸化アルミニウムなどのアジュバントが企図されるが、しかしながら好ましいアジュバント、特にヒトにおいて使用するためのアジュバントは、DNAアジュバントである。シトシン-ホスフェート-グアノシン（CpG）を含む具体的な配列を含む一本鎖DNAアジュバントは当該技術分野において既知であり、そして本発明により使用することが企図される。これらのCpG配列を欠損するDNAアジュバントもまた、本発明により有用である。例示的なDNAアジュバントには、2つのCpGモチーフを有する20merのヌクレオチド、または一般的には約20〜約25ヌクレオチド長のいずれかのDNAオリゴマーを含むことができる。配列の安定性は、チオエート基を有するヌクレオチドバックボーン中のホスフェート基を置換して、ホスホロ-ジエステルバックボーンではなく、ホスホロ-チオエートバックボーンを生成することにより、増大することができる。
【００４１】
[00040]  本発明のワクチンはまた、DNAワクチンとして製剤化することができる。適切なワクチンには、1またはそれより多いHCMVペプチドまたは本発明の類似体をコードする遺伝子を発現する、組換えウィルスベクター、例えばポックスウィルス、が含まれる。これらのワクチンは、従来技術において既知の方法にしたがって構築することができる。要約すると、これらのペプチドをワクチンとして単独でまたはその他のペプチド配列と組み合わせて、アジュバントの存在下または非存在下において投与することができる。あるいは、ウィルスまたはDNA構築物を利用して送達される免疫原性タンパク質由来の最小CTLエピトープにより、ウィルスの減少または排除のために重要であることが示されたCTL応答を誘導することもできる。
【００４２】
[00041]  本発明のペプチドを免疫学的方法において使用して、患者においてまたは患者由来のサンプルにおいて、pp150-反応性CTLを検出することもできる。以下に記載するクロム放出アッセイなどのアッセイまたはいずれか既知のアッセイが適している。pp150ペプチドを認識する特異的T細胞クローンを、例えば、Altmanら（Science 274:94-96, 1996）または米国特許No. 5,734,023（これらの開示は参考文献として本明細書中に援用される）中に記載された様な四量体試薬またはLa Rosaら（Blood 97(6):1776-1786, 2001）およびGretenら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7568-7573, 1998）（これらの開示は参考文献として本明細書中に援用される）中に開示された様な二量体試薬など、SEQ ID NQ: 1または2に示されるペプチドを含む免疫学的試薬を使用することにより検出することができる。
【００４３】
[00042]  MHC四量体は一般的に当該技術分野において既知であり、そしてβ-2ミクログロブリン、蛍光マーカーと結合したストレプトアビジンと複合体形成しているビオチン化MHCクラスI分子、そして抗原性ペプチド、例えばpp150ペプチドなど、の複合体からなる。MHCクラスIアリルおよびペプチドを組み合わせると、クラスIアリルの文脈におけるそのペプチド抗原を認識するT細胞の特異的認識を可能にする。個々の複合体の親和性は概して低いため、複数の複合体がしばしば互いに連結して結合を増大する。蛍光標識した四量体を使用して、特異的に結合するT細胞を、例えば蛍光活性化細胞ソーティングなどの既知の技術を使用して分離することができる。pp150ペプチド抗原を使用する同一の診断試薬の二量体複合体もまた使用することができる。
【００４４】
[00043]  当業者は、そのような二量体試薬または四量体試薬を使用することになれており、そして当該技術分野において既知の様々な診断方法において使用するためにそのような試薬を構築しそして使用することが十分に可能である。同様に、当業者は、有用な試薬またはこれらの試薬の改変体を容易に合成することができる。
【００４５】
[00044]  以下の実施例は、添付の請求の範囲を限定するのではなく、説明することを意図している。
【００４６】
【実施例】
実施例1.  HCMV-特異的T-細胞クローンの誘導
[00045]  40〜50 mlの全末梢血サンプルをHCMV血清陽性ボランティアから得た（標準的な抗体方法により検出した）。全血は1400 rpmで10分間、卓上遠心分離器で分離し、そして赤血球を取り除いた。白血球細胞（WBCs）をFicoll-HyPaque（DuPont）密度勾配遠心を使用して以下の様にして分離した。バッフィーコートをリン酸緩衝塩類溶液を使用して12 mlまで希釈し、そして6 mlをFicoll-HyPaqueの上部に重層した。2000 rpmで15〜30分間、卓上遠心分離器で遠心分離した後、白血球細胞を含む境界部分を取り出し、PBSで希釈し、1000 rpmで8〜12分間ペレット化した。細胞を再びPBSで再懸濁し、そして上述したようにもう一度洗浄した。白血球細胞を、プールされたAB+（血液型）HCMV血清陰性ドナーから得たヒト血清を含有するT細胞培地（TCM）中にて、4〜5百万細胞/mlで再懸濁した。
【００４７】
実施例2.  LCL抗原-提示細胞の誘導
[00046]  同時に、自己由来抗原提示細胞株をCurrent Protocols in Immunology（Unit 7.22, Wiley-Liss Press (1993)）中に記載される方法にしたがって、末梢血白血球のEpstein Barrウィルス不死化を行うことにより調製した。細胞傷害性Tリンパ球および抗原提示細胞を同一の個体から誘導し、細胞株間でのHLA適合性を確実にした。
【００４８】
実施例3.  HCMVによるT細胞クローンのIn vitro刺激
[00047]  T細胞のin vitro刺激を開始するため、同一のボランティアから得た白血球細胞としての自己由来皮膚線維芽細胞の単層を、12-ウェルプレート中に細胞を105細胞/ml/ウェルで、10％ヒトAB+血清を含有するDMEM中にて24時間プレーティングすることにより樹立した。培養中にて24時間の後、線維芽細胞を、HCMVビリオン（AD169またはTowne系統）により2時間、1〜5の間の感染重複度（MOI）にて感染させた。培地およびウィルスを単層から吸引除去し、そして1 mlの新鮮な培地を添加した。単層をさらに4時間培地中でインキュベートし、その後培地を吸引除去した。8〜10×106の白血球細胞を含有する2 mlの培地を、HCMV感染線維芽細胞を含有するそれぞれのウェルに添加した。白血球細胞および線維芽細胞を、50 U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、4 mM L-グルタミン、25μM 2-メルカプトエタノール、10 mM HEPESおよび10％ヒトAB+血清を含有するRPMI-1640（Irvine Scientific）中で培養した。細胞を7日間共インキュベートした。血清が使い果たされた場合には血清を置換し、あるいは細胞の増殖が活発である場合には培養を拡大した。
【００４９】
[00048]  白血球細胞を、上述したように調製したHCMV-感染自己由来線維芽細胞の新鮮な単層上にプレーティングすることにより、第7日に再刺激した。さらに、γ-照射（2500 rad）自己由来末梢血白血球（WBCよりも5-倍以上）をフィーダー細胞として添加し、そしてこの2回目の刺激の第2日および第4日に、培地に組換えIL-2（10 IU/ml, Chiron-Cetus）を追加した。急速な細胞増殖を示したウェルには、培地が消費されたときに、IL-2を含有する新鮮な培地を供給した。培養中にて12〜16日後、細胞を回収し、そしてクロム放出アッセイにおけるHCMVマトリックスタンパク質の認識についてアッセイした。
【００５０】
実施例4.  クロム放出アッセイ
[00049]  HCMV ppl50に対するDNAを含有する組換えワクシニアウィルスまたは野生型ウィルス、WR系統、を用いた感染による自己由来またはHLA-ミスマッチ（対照）標的抗原提示細胞を調製した。一晩感染させた後、抗原提示細胞をクロム-51とともにインキュベートし、そしてアッセイを既知の方法に従って行った。クロム放出アッセイにおいて、ワクシニア-感染標的細胞をクロム-51でロードし、そしてその後T-細胞（エフェクター細胞）と混合した。好ましくは、細胞を、20：1から1：1まで変化する一連のエフェクター：ターゲット（E：T）細胞比で混合した。4時間のインキュベーション期間の後、細胞をインキュベートした培地を回収した。培地中への放射活性の放出（Re）を、ガンマシンチレーションカウンターで定量した。感染抗原提示細胞が自発的な溶解を示し、そして細胞傷害性Tリンパ球の非存在下での放射活性の放出（RS）の程度を、それぞれのウィルスベクターについて確立した。標的細胞中に取り込まれそして放出可能な放射活性の最大量（Rmax）を、界面活性剤（1％Triton X100; Sigma）溶液中で標的細胞の溶解により確立した。細胞傷害性の割合は、以下の様に表現した：
100×（（Re）-（Rs））／（（Rmax）-（Rs））
自発的放出（Rs）が30％未満ではなかった場合には、アッセイは許容不可能であるとみなされ、そして繰り返された。pp150についての肯定的な結果から、試験されたポリクローナル集団において、ウィルスにより発現されるpp150 HCMVタンパク質を認識するT細胞が存在することが示される。
【００５１】
実施例5.  pp150感染線維芽細胞を利用したCTLクローンの誘導
[00050]  CTLを誘導するさらに別の方法は、pp150を含むHCMVタンパク質の組換え型を発現する自己由来抗原提示細胞を作製することである。実施例1において記載した線維芽細胞の単層を、pp150 Vacにより感染させ、そしてウィルスを数時間のあいだ細胞上で増殖させる。単層を洗浄し、そしてStratalinkerTM装置（Stratagene, LaJolla, CA）を使用して照射する。この手順により、ワクシニアウィルスのさらなる増殖を不活性化するが、しかしながら発現は継続させる。白血球細胞を実施例3に記載したように、単層に添加する。この刺激は、HCMVタンパク質に対して向けられるものであり、そしてpp150に対して特異的な免疫応答に焦点を当てるものである。
【００５２】
実施例6.  CTLエピトープの同定
[00051]  皮膚線維芽細胞上のHCMVによるかまたはppl50 Vac-感染線維芽細胞により2回刺激された白血球細胞を、96ウェルU-底プレート中で限界希釈することによりクローン化した。抗-CD4抗体を結合させた常磁性ビーズを使用して、白血球細胞からCD4+ T細胞を枯渇させた。フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡によりアッセイしたところ、得られた集団は、概して信頼性の高いT細胞サブセットマーカーであるCD8+が90〜95％のあいだであり、そして概してほとんどの末梢血T細胞のマーカーであるCD3+が99％であった。この最終的な集団を、0.3〜3細胞/ウェルのあいだの濃度で、最終容量150μlで、プレート化した。それぞれのウェルはまた、50〜100 IU/mlの組換えIL-2（Chiron-Cetus）および0.5μg/ml PHA（Murex）を添加したヒトAB+血清を含有するT細胞培地中に、γ-照射した1.0〜3.0×105同種異系末梢血単核細胞を含有した。
【００５３】
[00052]  3日間の培養の後、PHAを75μlをrIL-2を添加した新鮮な培養培地に交換することにより2-倍に希釈した。ウェルに3〜4日ごとに新鮮なrIL-2を添加し、そして培地を必要に応じて置換した。細胞を12〜14日に新鮮な同種異系の末梢血単核細胞により上述したように再刺激し、そしてプレートを個々のウェルでの増殖について注意深く観察した。見ることができる細胞増殖は、増殖しているT細胞をより大きなウェルに移す必要性があることを示した。T細胞を2週間ごとに最刺激し、そしてより大きなウェルに段階的に移した。
【００５４】
[00053]  数百万個の細胞の蓄積の段階において、あるものは冷凍保存し、別のものをクロム放出アッセイのために使用した。標的細胞はHCMV感染した線維芽細胞、感染していない線維芽細胞、または野生型ワクシニアまたはpp150または短縮型pp150を発現するワクシニアウィルスのいずれかで感染させた自己由来白血球細胞株であった。HLAミスマッチ型線維芽細胞および白血球を対照として使用した。HCMVおよびppl50-特異的であり、そして自己由来標的に対してのみ反応性であるT細胞クローンを、陽性なものとして選択した。異なるHLA表現型を有するT細胞クローンを、異なるHLA遺伝子型を有するボランティア由来の初めの末梢血サンプルを使用して、同様に単離した。pp150から取り出した合成15〜20アミノ酸ペプチドおよびその欠損物を含む、より小さな部分のpp150を提示する標的細胞を使用したこの方法を繰り返すことにより、その特定のHLAアリルのための最小細胞傷害性エピトープを発見した。
【００５５】
[00054]  すべてのペプチドの純度を、移動相としてアセトニトリル/TFAを使用するVydac C18カラム上でHPLCにより確認した。好ましくは、ペプチドは純度70〜80％以上であるべきであり、そしてクラスI拘束性ペプチドを認識するCTLの特徴であるCD8+状態を確認すべきである。
【００５６】
実施例7.  骨髄移植患者の免疫化
[00055]  本発明による治療的に活性な型の抗原性ペプチドを、一回投与または骨髄移植の前所定日数または所定週数により分割された複数回投与において組織の贈与の前十分な時間に（たとえば6〜8週間）、HCMV-血清陽性骨髄移植ドナーに対して投与し、抗-HCMV細胞性免疫応答の発生を可能にする。抗原性ペプチドを明細書中で記載したパラメータにしたがって、または既知の方法のいずれかに従って作製することができ、アジュバントとともにまたは伴わずに投与することができる。好ましくは、複数投与を与える。操作されていない骨髄移植物をレシピエントに対して与えるべきである場合、そのような移植物には25％またはそれより多い成熟T細胞を含有しうる。免疫化されたドナー骨髄中に存在するT細胞により骨髄移植レシピエントに対する活性免疫を付与しうる。あるいは、T細胞-枯渇骨髄移植物を使用すべき場合、レシピエント患者にHCMV免疫を与えるために移植後（たとえば、約21〜35日後）に、免疫化したドナー由来のT細胞のアリコートを患者に対して投与した。
【００５７】
実施例8.  子どもを持っている期間の健康成人女性の免疫化
[00056]  本発明に従う抗原性ペプチドの治療型を、受胎前または受胎後のいずれかの子供を有する期間のHCMV-陰性またはHCMV-陽性女性に対して投与する。単一または複数-エピトープワクチンを含むワクチンは、女性と接触する可能性がある胎児および子供の第一次のHCMV感染を予防しまたは減少させる。ワクチンを使用して、新規なHCMV感染を予防し、または発生途上の胎児に対して有害でありうる存在する感染を限定的にする。
【００５８】
実施例9.  修飾ワクシニアアンカラ株（MVA）感染EBV-LCLの認識
[00057]  HCMV pp150を発現する組換え修飾ワクシニアアンカラ（MVA）を使用して、HLA A*0301アリルまたはA*68xxアリルを有する個体由来のEBV LCLを感染させた。SEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2のエピトープ類に特異的なT-細胞クローンは、実施例3について記載したように行ったクロム放出アッセイにおいてこれらの標的を認識することができた。非常に実質的な溶解（＞60％特異的細胞傷害性）が見られ、野生型MVAを発現する標的により見られたものよりも5倍以上の特異性を有した。
【００５９】
実施例10.  CMVペプチドと複合体形成したHLA四量体試薬を用いたCMV免疫性についてのスクリーニング
[00058]  末梢血を、同意を得た後に、同種異系造血幹細胞移植（HSCT）のヒトドナーおよびレシピエントから採取する。好都合なことに、研究参加者は、脊髄形成異常を含む血液学的悪性性について同種異系HSCTを受けた、関連するきょうだいのドナーおよびレシピエントであってもよい。ドナーおよび／またはレシピエントは、CMV血清陽性であり、そしてすべてはHIV-陰性である。ドナーサンプルは、顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）の投与の前、そして3〜5日後、移植のための細胞の採取時に取り出される。レシピエント血液サンプルを、移植（幹細胞注入）の40、90、120、150および180日後に取り出す。CMV再活性化についてのモニタリングを、PCRおよび血漿サンプルについての血液培養シェルバイアルアッセイの両方により、通常の患者管理の一部として、1週間に2回行う。CMV再活性化を検出する場合（2回の陽性のPCRアッセイとしてまたは1回の陽性血液培養結果として定義）、患者を予防的ガンシクロビルにより6週間の間治療する。
【００６０】
[00059]  末梢血単核細胞（PBMC）を、標準的密度勾配遠心分離により、ヘパリン化血液から単離し、洗浄し、10％DMSOを含むFCS（Hyclone, Logan, TU）中で再懸濁し、分配し、そして液体N2中で冷凍保存する。解凍したPBMCに対して研究を行い、in vitroで培養することなくまたは刺激することなく、直接的にアッセイした。細胞を以下のようにして調製した四量体試薬であるHLA A*0301（A3）またはHLA A*6801（A68）により標識した。四量体試薬を既知の方法を使用して、再フォールディングしそして精製する。都合よくは、試薬は、多少変更したMAID Tetramer Core Facilityにより使用される手順を使用して調製することができる（www.emory.edu/WHSC/YERKES/VRC/tetramer.html）。簡単に述べれば、ベクターpHN1中でクローン化したA3またはA68重鎖およびβ-2-ミクログロブリン（β2M）を、E. coli XA90中で発現し、そしてそれぞれペプチドSEQ ID NO:1または2により再フォールディングする。再フォールディングしたHLA-A3またはA68/β2M/ペプチド複合体を、酵素BirA（Avidity Inc.）を使用してビオチン化し、そしてその後Sephacryl S300ゲルろ過カラムを使用するFPLCにより精製した後、MonoQイオン交換カラムにより精製する。精製したビオチン化HLA-A3またはA68/β2M/ペプチド複合体を、ストレプトアビジン-PE（Pharmingen）またはストレプトアビジン-APC（Molecular Probes）のいずれかと結合させる。典型的には細胞の標識化は、0.5μgのテトラマーを使用して0.5〜1.0×106細胞を50〜100μl容量のPBS/0.5％BSA中で20分間染色することにより行う。その後細胞を洗浄し、そしてFACScaliburTM（BDIS）フローサイトメーター上で解析した。リンパ球ゲートを前方および側面散乱に基づいて設定し、そして最小で30,000のゲート化現象を捕捉した。四分区画を陰性対照に基づいて設定し、そして四量体-陽性細胞の数を白血球集団のパーセントとして表現する。
【００６１】
実施例11.  ペプチド刺激に対する白血球によるIFN-γ産生の検出
[00060]  PBMCの解凍したアリコートを冷バッファー（PBS/0.5％BSA）で洗浄し、そして実施例10において記載したように調製した四量体試薬により、またはいずれかの従来法により、20分間標識する。その後細胞を洗浄し、10％FCSを添加した1 ml RPMI-1640（Irvine Scientific）中で再懸濁し、そして37℃にて一晩、5％C02インキュベーター中でインキュベートする。Brefeldin A（GolgiPlugTM, Pharmingen）を1時間後に1μMになるまで添加する。あるアリコートに対してはウィルスエピトープペプチド（SEQ ID N0:1または2）を10μg/mlで添加し、そして他のものには関係のないHLA-拘束性ペプチドを陰性対照として添加する。後日に、細胞を洗浄し、そして個別の12×75 mmチューブ中にアリコート当たり1×106細胞となるようにさらにアリコートに分ける。細胞を4℃にて20分間、50μlのバッファー中でインキュベーションすることによりCD8に対するFITC-結合抗体（Pharmingen）により標識する。その後細胞を洗浄し、固定し、そして浸透性にし（Cytofix/Cytoperm, Pharmingen, La Jolia, CA）、その後4℃にて20分間、5μlのIFN-γに対するAPC-結合抗体により標識する。標識した細胞を洗浄し、フローサイトメトリーにより解析する。