(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コード配列がデルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有するA.thaliana蛋白質をコードし、下記のSEQ ID NO:１のヌクレオチド配列を含む核酸：
【化１】
0004082469.tif 000012
並びに、上記配列の対立遺伝子又は上記配列が１以上数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加により修飾された配列を含み、デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸である核酸。
【請求項２】
下記のSEQ ID NO:３のアミノ酸配列からなるコンセンサス配列をコードするプライマーオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ技術により増幅して得られる請求項１に記載の核酸：
【化２】
0004082469.tif 000013
（式中、７位のＸａａはＴｒｐ又はＴｙｒであり、１２位のＸａａはＨｉｓ又はＬｙｓである）。
【請求項３】
デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有し、且つ下記のSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含むA.thaliana蛋白質：
【化３】
0004082469.tif 000014
並びに、上記配列の対立遺伝子又は上記配列が１以上数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加により修飾された配列を含み、デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸を有する蛋白質。
【請求項４】
デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有し、且つSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を有し、且つデルタ−７Ｒｅｄと呼ばれるA.thaliana蛋白質。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のＤＮＡ配列を含む宿主細胞における発現により得られるデルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質。
【請求項６】
A.thaliana蛋白質である請求項５の蛋白質。
【請求項７】
宿主細胞が酵母又は糸状菌である、請求項５又は６に記載の蛋白質。
【請求項８】
請求項３〜７の何れか１つに記載のデルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質に対する抗体。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターによりトランスフォームされた宿主細胞。
【請求項１１】
デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸の微生物におけるクローニング方法であって、ナイスタチン耐性に基づく代謝干渉により行なわれるクローニング方法。
【請求項１２】
請求項１１に規定した方法によって得られる請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を含むベクターによりトランスフォームされた宿主細胞。
【請求項１４】
宿主が酵母又は糸状菌である、請求項１０又は１３に記載のトランスフォームされた宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１０、１３又は１４の何れか１つに記載のトランスフォームされた宿主細胞を培養して、発現された蛋白質を単離する、デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質の製造方法。
【請求項１６】
宿主細胞がトランスフォームされた酵母であり、該酵母において、コードＤＮＡ配列が酵母プロモーターの制御下に置かれている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｃ−７位が不飽和のステロールのイン・ビトロでの還元方法であって、還元すべきステロールを請求項１５又は１６の方法で製造された蛋白質とインキュベートし、得られる還元されたステロールを単離する還元方法。
【請求項１８】
Ｃ−７位が不飽和の外因性ステロールのイン・ビボでの還元方法であって、ステロールを、請求項１０、１３又は１４の何れか１つに記載のトランスフォームされた宿主細胞とインキュベートし、得られる還元されたステロールを単離する還元方法。
【請求項１９】
Ｃ−７位が不飽和の内因性ステロールのイン・ビボでの還元方法であって、請求項１４に記載のトランスフォームされた宿主株を培養し、蓄積する還元されたステロールを単離する還元方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９の何れか１つに記載のイン・ビトロ又はイン・ビボでの還元方法であって、得られる還元されたステロールがコレステロールの側鎖の制限酵素（Ｐ450ＳＣＣ）の基質である還元方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載のイン・ビボでの還元方法であって、還元すべき内因性ステロールがエルゴスタ５，７ジエン３−オール、エルゴスタ５，７，２４（２８）トリエン３−オール若しくはエルゴスタ５，７，２２トリエン３−オール又はこれらの混合物である還元方法。
【請求項２２】
プレグネノロンの製造方法であって、請求項１４に記載のトランスフォームされた宿主細胞を培養し、蓄積した内因性ステロール又はＣ−７位が還元されたステロールを単離し、これらの還元されたステロールをＰ450ＳＣＣの存在下であるが、アドレノドキシンレダクターゼ（ＡＤＲ）及び／又はアドレノドキシン（ＡＤＸ）が存在してもしなくてもよい条件下で、インキュベートして得られるプレグネノロンを単離する製造方法。
【請求項２３】
宿主細胞が酵母である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
プレグネノロンの製造方法であって、デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質及びＰ450ＳＣＣ活性を有する蛋白質、並びにＡＤＲ活性及びＡＤＸ活性の少なくとも１の活性を有する又は有さない蛋白質の同時発現を与える１つ以上の請求項９に記載のベクターによりトランスフォームされた酵母を培養し、遊離の若しくはエステル化したプレグネノロンを単離する製造方法。
【請求項２５】
デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ、Ｐ450ＳＣＣ、ＡＤＲ及びＡＤＸ活性を有する蛋白質を同時発現するトランスフォームされた酵母を培養する、請求項２４に記載のプレグネノロンの製造方法。
【請求項２６】
デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質がA.thalianaデルタ−７Ｒｅｄ蛋白質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
酵母株が番号Ｉ−１５３８として寄託されたＥＣ０１／ｐＣＤ６３株である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ、Ｐ450ＳＣＣ、ＡＤＲ及びＡＤＸ活性を有する蛋白質を同時発現して、遊離の又はエステル化したプレグネノロンを蓄積するトランスフォームされた請求項１３に記載の酵母株。
【請求項２９】
デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質がA.thalianaデルタ−７Ｒｅｄ蛋白質である、請求項２８に記載の酵母株。
【請求項３０】
番号Ｉ−１５３８として寄託されたＥＣ０１／ｐＣＤ６３と呼ばれる、請求項２９に記載の酵母株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有するA. Thaliana の蛋白質をコードするＤＮＡ配列、デルタ７−Ｒｅｄ蛋白質、製造方法、トランスフォームした酵母株、及び利用。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有するA. Thaliana の蛋白質をコードするＤＮＡ配列、デルタ７−Ｒｅｄ蛋白質、それらの製造方法、トランスフォームした酵母株、及びそれらの利用に関するものである。
【０００３】
デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ（Ｅ．Ｃ．１．３．１．２１）は、ラット肝ホモジェネート中（M. E. Dempsey 等、 Methods Enzymol., 15, 501-514, 1969 ）並びにトウモロコシ植物調製物中（M. Taton等、 Biochem.Biophys.Res.Commun., 181, 465-473, 1991 ）の活性により存在が示されているミクロソーム酵素である。このレダクターゼはＮＡＤＰＨに依存して、イン・ビトロで、７−デヒドロコレステロールをコレステロールに還元する。
【０００４】
ステロールは、真核生物メンバーの主要な構成成分であるが、種によって構造的差異を示す。酵母等の真核生物の細胞においては、主要なステロールは、Ｃ−５位及びＣ−７位の二重不飽和、Ｃ−２４位の分枝側鎖及びＣ−２２位の不飽和を含むエルゴステロールであるが、他方、哺乳動物においては、コレステロールはＣ−５位の不飽和及び飽和側鎖により特徴付けられる。シトステロール、スチグマステロール及びカンペステロール（これらは、植物における最も一般的なステロールを代表するものである）は、分枝しているが飽和の側鎖を有し、脊椎動物のステロールと同様に、Ｃ−７位には不飽和を有しない。このステロール核の構造における差異の原因である酵素は、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼである。
【０００５】
デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼは、均質に精製されたことはなく、単に部分精製が記載されただけである（M. E. Dempsey 等; M. Taton等、 既出）。この蛋白質は、その物理化学的性質により特性決定されていない。この蛋白質の配列の情報及びそれに対する抗体は記載されていない。更に、ＲＳＨ／スミス−レムリ−オピッツ（ＳＬＯ）症候群に関連するヒトにおいて、７−デヒドロコレステロールレダクターゼの明白な不足が記載されている（J. M. Opitz 等、 Am. J. Med. Genet., 50, 326-338, 1944 ）。
【０００６】
従って、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼをコードするｃＤＮＡのクローニング（それは、対応する蛋白質の配列を同定すること並びにそのヒト遺伝子又はその先天的欠失の特性表示を可能にする）は、例えばハイブリダイゼーション及び／又は免疫学的検出技術を利用する公知の方法を用いては達成できない。従って、実施すべきクローニングを、特に蛋白質の情報のない場合に、可能にする創意に富むスクリーニング方法を得ることが必要とされる。
【０００７】
カビの膜の主要なステロールであるエルゴステロールは、Ｃ−５、７位に一対の共役二重結合を含む（それは、ナイスタチン等のポリエンのファミリーの化合物に抗真菌活性を与える）（R. Bittman等、 J. Biol. Chem., 260, 2884-2889, 1985）。ナイスタチンの作用の、Ｃ−５、７位の不飽和ステロールの膜濃度に対する強い依存性は、S.cerevisiaeにおいて蓄積されるステロールについての変異株の選択を可能にした（S. W. Molzahn 等、 J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972 ）。従って、変異体ｅｒｇ２及びｅｒｇ３は、それぞれ、ステロールデルタ−８，７イソメラーゼ（W. Ashman 等、 Lipids, 26, 628, 1991 ）及びステロールデルタ−５デヒドロゲナーゼ（B. Arthinton等、 Gene, 102, 39, 1991 ）の不足の故に、Ｃ−５，７位に共役二重結合を有しないステロールを蓄積する。かかる変異体は、エルゴステロール（酵母の主要な天然ステロール）がある条件下でコレステロールを含む種々の代用ステロールによって置き換え可能である故に生存可能である。
【０００８】
本願発明者は、S.cerevisiaeにおける代謝干渉を利用するスクリーニング方法を用いて、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する異種蛋白質をコードするｃＤＮＡをクローン化することにつき、Ｃ−５，７位に二重不飽和を有しないステロールに富む酵母株のナイスタチン耐性を増すことの有利さに気付いた。しかしながら、ＤＮＡ配列又は蛋白質を知ること並びに酵素活性にのみ基づく検出に依存しない有利さを提供するこのアプローチの成功は、克服されるべき多くの技術的困難の故に予知できるものではない。
【０００９】
第１の制限は、ナイスタチンが働く仕方が完全には解明されていないという事実に由来するものである（L. W. Parks 等、 CRC Critical Reviews in Microbiology, 301-304, 1978 ）。例えば、ナイスタチンによる選択の低い特異性は、その間接的性質により予知でき、それは、酵母において、ｅｒｇ変異体等の自然のゲノム変異（S. W. Molzahn 等、 既出）又はステロール経路に依らない耐性を含むゲノム変異の選択へと導く。同様に、遺伝子ライブラリーによりトランスフォームされた細胞は、ステロール経路と無関係のナイスタチン耐性を与える異種遺伝子を発現することができる。
【００１０】
予想される制限の他の例は、例えば、下記の理由の１つのために、異種蛋白質が細胞内で弱く作用して、ナイスタチンに対する耐性の欠如又は低い耐性へ導くという事実に関係する：１）デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼをコードする遺伝子が弱く発現される；２）この蛋白質が、不十分な折りたたまりのため又は不正確な細胞下配向の結果、活性が弱いか又は活性がない；３）この植物蛋白質が酵母自身のステロールを基質として認識しない；４）基質たり得るステロールがエステル型であるか小胞中に貯蔵されていてこの酵素と接触しない。従って、この仕方で蓄積されるステロールがデルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ（これは、真核生物では、ミクロソームに局在化されると考えられている）の作用を免れることは予想され得る。
【００１１】
本発明は、デルタ−７Ｒｅｄと呼ばれるデルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする A.thaliana のｃＤＮＡの、ナイスタチン耐性に基づく代謝干渉により酵母において行なうクローニング方法によるクローニングに関するものである。このデルタ−７Ｒｅｄ蛋白質は、Ｃ−７位に不飽和を有するステロールを生物学的還元プロセスによって還元させ、それは、更に、Ｃ−５、７に二重不飽和を有するステロール又はステロイドのＣ−７位における選択的還元の問題に有利な解決を与える（化学的経路を用いる還元方法は、それを与えない）。
【００１２】
この発明は又、Ｃ−７位及び適宜Ｃ−２２位が飽和された生成物を驚くべき仕方で蓄積するデルタ−７Ｒｅｄを発現するトランスフォームされた酵母細胞にも関係し、該生成物は、エルゴステロールと対照的に、コレステロールの側鎖の制限酵素（即ち、チトクロームＰ450 ＳＣＣ）の基質である。
【００１３】
これらの予期しない性質は、工業的及び／又は薬理学的用途を有するステロール若しくはステロイドの製造方法、特に、Ｃ−７位が還元された酵母の内因性ステロールのチトクロームＰ450 ＳＣＣ（Ｐ450 ＳＣＣ）による、アドレノドキシンレダクターゼ（ＡＤＲ）及びアドレノドキシン（ＡＤＸ）の存在下での生物学的酸化によるプレグネノロンの製造において、この発明のトランスフォームされた酵母の利用を可能にする。この発明のトランスフォームされた酵母は、哺乳動物及び他の脊椎動物におけるコレステロールのヒドロコーチゾンへの代謝経路の中間体ステロイドの製造方法においても利用することができる。この利用は、ヒドロコーチゾン又はその中間体の生物学的酸化プロセスにおける製造を可能にする利点を有し、該プロセスは、コレステロール等の外因性ステロールの初期基質としての利用を必要とせず、従って、ステロールの酵母中への透過の問題を回避する（好気性条件下での酵母の外因性ステロールに対する不透過性は、R. T. Lorentz 等、 J. Bacteriology, 981-985, 1986に記載されている）。
【００１４】
この発明は又、この発明のクローニング方法を用いて得られた核酸配列の利用にも関係する。デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼをコードするＲＮＡ又はＤＮＡ配列を、このデルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼの遺伝子の生成物が関係する疾患の診断又は治療に用いることが出来る。例えば、７−デヒドロコレステロールをコレステロールに変換するデルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼの不足は、ＲＳＨ／ＳＬＯ症候群に関係すると推定されている。従って、ヒトＤＮＡ配列を、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼの不足を診断するためのプローブとして利用することができ、かかる不足を矯正するための遺伝子治療において利用することもできる。
【００１５】
従って、本発明の主題は、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする配列を含む核酸配列であり、該核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、特にｃＤＮＡである。
【００１６】
デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性は、例えば、イン・ビトロで酵素的試験を用いて示すことができる（実験部分にて更に説明する）。
【００１７】
本発明の更に特別の主題は、コード配列が、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有し且つ下記のSEQ ID NO:１のヌクレオチド配列を有する A.thaliana の蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列：
【化４】
0004082469.tif 000002
並びに、この配列の対立遺伝子変異体である。
【００１８】
図３に示した配列（SEQ ID NO:２）に対応する４３０アミノ酸を有する蛋白質をコードする上記のｃＤＮＡ配列は、例えば、酵母におけるクローニング（A.thaliana発現ライブラリーから開始し、後述の詳細な説明の操作条件に従って、酵母のナイスタチン耐性の出現に基づくスクリーニング方法を用いることによる）によって得ることのできるｃＤＮＡ配列である。
【００１９】
上記のヌクレオチド配列SEQ ID NO:１の知識は、当業者に公知の方法によって（例えば、化学合成、又はハイブリダイゼーション技術若しくはＰＣＲ増幅により合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて遺伝子ライブラリー若しくはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより）、本発明を再現することを可能にする。
【００２０】
この発明の主題は又、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードし且つ、平均的若しくは高緊縮条件下でヌクレオチド配列SEQ ID NO:１とハイブリダイズし又はこの配列と約６０％以上の配列同一を有するＤＮＡ配列でもある。
【００２１】
この配列SEQ ID NO:１と検出可能な様式でハイブリダイズする配列は、平均的緊縮の標準的条件下でハイブリダイズする。例えば、４２℃で、ホルムアミドの５０％溶液、ＳＳＣ×６中で１２時間のハイブリダイゼーションの後に洗浄するか又は一層緊縮でない条件下でのハイブリダイゼーション、例えば、ホルムアミドの２０％溶液、ＳＳＣ×６中での４２℃、２４時間のハイブリダイゼーションの後に公知の標準的条件下で洗浄する（T. Maniatis 等、 Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。
【００２２】
ヌクレオチド配列同一のパーセンテージは、例えば、NCBIサーバーにて、BLAST プログラム「基礎的局所的整列（alignment ）サーチ用ツール」（S. F. Altschul等、 J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990 ）を用いることにより決定することができる。
【００２３】
この発明は又、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードし、下記のアミノ酸配列SEQ ID NO:３を有するコンセンサス配列をコードするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ技術により増幅可能であるＤＮＡ配列にも関係する：
【化５】
0004082469.tif 000003
（式中、７位のＸａａは、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、１２位のＸａａは、Ｈｉｓ又はＬｙｓである）。
【００２４】
上記の配列SEQ ID NO:３は、新規なコンセンサス配列に対応し、該配列は、新規な配列SEQ ID NO:２（ヌクレオチド配列SEQ ID NO:１から演繹される）と公知の配列（Ｃ−７位以外の位置での作用特異性を有する他のステロールレダクターゼ又はラミンＢレセプターの配列）との間のアミノ酸配列の同一の整列により規定された（実験部分にて更に詳細に説明する）。アミノ酸配列SEQ ID NO:３により与えられる情報から、最大で４５ヌクレオチドから構成されるプライマーを規定して合成することができ、該プライマーは、再結合配列としての第２プライマーオリゴｄＴ（１７ヌクレオチド）と組み合わせて、市販のＰＣＲアッセイキット（例えば、Stratagene）を用いて、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの増幅を可能にする。
【００２５】
この発明は又、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有し且つ下記のアミノ酸配列SEQ ID NO:２を有する A.thaliana の蛋白質：
【化６】
0004082469.tif 000004
並びに、この配列の対立遺伝子変異体及びアナログにも関係する。
【００２６】
対立遺伝子及びアナログには、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により修飾された配列が、これらの生成物が同じ機能を維持する限りにおいて、含まれる。これらの修飾配列は、例えば、当業者に公知の位置指定突然変異導入技術を用いることにより作ることができる。
【００２７】
この発明の特別の主題は、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有し且つ上記のアミノ酸配列SEQ ID NO:２を有してデルタ−７Ｒｅｄと呼ばれる A.thaliana の蛋白質である。
【００２８】
この発明は又、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有し、配列SEQ ID NO:２と約６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質にも関係する。
【００２９】
同一性のパーセンテージは、例えば、上記のBLAST プログラムを用いて決定することができる。
【００３０】
この発明は又、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有し且つ上で規定した A.thaliana デルタ−７Ｒｅｄ蛋白質と交差免疫反応性を有する蛋白質にも関係する。
【００３１】
この蛋白質は、例えば、公知の方法により調製したデルタ−７Ｒｅｄ蛋白質に対する抗血清を用いる免疫沈降によって検出することができる。
【００３２】
この発明の一つの面は、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質、例えば、前に規定したＤＮＡ配列を含む宿主細胞における発現により得られるもの等に関係し、特に A.thaliana の蛋白質例えば上記のアミノ酸配列SEQ ID NO:２をコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞における発現により得られるものに関係する。
【００３３】
この発明の蛋白質を宿主細胞における発現により得る場合は、これを、当業者に公知の遺伝子工学及び細胞培養法によって行なう。
【００３４】
発現は、この発明のデルタ−７Ｒｅｄをコードする配列（適当なプロモーターを先行させる）を含む原核生物宿主細胞例えば大腸菌、又は真核生物宿主細胞例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞若しくは酵母にて行なうことができる。
【００３５】
得られる組換え蛋白質は、グリコシル化されていてもされていなくてもよい。
【００３６】
特に、この発明は、この発明による蛋白質、例えば、酵母中での発現により得られたもの等に関係する。
【００３７】
この発明は又、前に規定したデルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質に対する抗体にも関係する。この抗体は、当業者に公知の方法により調製されたポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００３８】
この発明は又、前に規定したＤＮＡ配列を含む発現ベクター並びにこのベクターによりトランスフォームされた宿主細胞にも関係する。
【００３９】
これらの発現ベクターは、適当なプロモーターの制御下で蛋白質の発現を与える公知のベクターである。原核生物細胞用には、このプロモーターは、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、β−ラクタマーゼプロモーター又はＰＬプロモーターであってよい。哺乳動物細胞用には、このプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター又はアデノウイルスのプロモーターであってよい。バキュロウイルス型のベクターも又、昆虫細胞における発現用に用いることができる。酵母細胞用には、このプロモーターは、例えば、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＣＹＣ１プロモーター又はＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーターであってよい。
【００４０】
宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。原核細胞は、例えば、大腸菌、バチルス、ストレプトミセスである。真核宿主細胞は、酵母及び糸状菌並びに更に高等な生物の細胞例えば哺乳動物細胞又は昆虫細胞を含む。哺乳動物細胞は、ハムスターのＣＨＯ細胞又はサルのＣｏｓ細胞であってよい。昆虫細胞は、例えば、ＳＦ９細胞である。酵母細胞は、例えば、Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe 又はKluyveromyces lactisであってよい。
【００４１】
この発明の主題は又、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸の、微生物における、下記より選択するスクリーニング方法を含むクローニング方法でもある：
−  微生物のナイスタチン又は類似化合物（その毒性がＣ−７位に不飽和を有するステロールの存在に依るもの）に対する耐性、
−  核酸の、上記の配列SEQ ID NO:１のヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション、
−  ランダムに単離されたＤＮＡ配列からの、データ処理技術を用いることによる核酸の同定、
−  蛋白質の直接発現とそれに続く上記のアミノ酸配列SEQ ID NO:２を有する蛋白質に対する抗体を用いる免疫学的検出。
【００４２】
微生物とは、例えば、S.cerevisiae、S.pombe 又は K.lactis を意味する。
【００４３】
ナイスタチンに類似する化合物は、例えば、アンフォテリシンＢ又はフィリピンを含む。
【００４４】
ハイブリダイゼーションとは、公知の標準的条件による平均的又は高緊縮条件下でのハイブリダイゼーションを意味する（T. Maniatis 等、 既出）。
【００４５】
データ処理技術を利用する同定は、例えば、上記のBLAST プログラムによって行なうことができる。
【００４６】
スクリーニング方法が酵母のナイスタチン耐性を利用する上記のクローニング方法の一例を、実験部分において更に説明する。
【００４７】
この発明の主題は又、上記のクローニング方法によって得られたＤＮＡ又はＲＮＡ核酸配列でもある。その核酸配列は、クローニングを行なう材料によって、原核生物起源でも、真核生物起源でもよい（例えば、ヒト起源でもよい）。
【００４８】
この発明の主題は又、上記のクローニング方法により得られたＤＮＡ配列を含むベクターによりトランスフォームされた宿主細胞でもある。この宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。宿主細胞及びベクターの例は、前に示されている。
【００４９】
この発明の特別の主題は、前に規定した発明によるＤＮＡ配列又は上記のクローニング方法により得られたＤＮＡ配列等を含むベクターによりトランスフォームされた酵母又は糸状菌から選択する宿主細胞である。
【００５０】
この発明の主題の一つは又、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質の製造方法にも関係し（該製造方法においては、本発明によりトランスフォームされた宿主細胞を培養して発現された蛋白質を単離する）、特に、宿主細胞がトランスフォームされた酵母（該酵母において、コードＤＮＡ配列は、酵母プロモーターの制御下に置かれる）である方法に関係する。
【００５１】
この発明の主題の一つは又、Ｃ−７位が不飽和のステロールのイン・ビトロでの還元方法にも関係する（該方法においては、還元すべきステロールを、上記の方法により得られた蛋白質と共にインキュベートし、得られる還元されたステロールを適宜単離する）。
【００５２】
この発明の主題の一つは又、Ｃ−７位が不飽和の外因性ステロールのイン・ビボでの還元方法にも関係する（該方法においては、ステロールを、この発明によりトランスフォームした宿主細胞と共にインキュベートし、得られる還元されたステロールを適宜単離する）。宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい（特に、酵母又は糸状菌であってよい）。
【００５３】
この発明の主題の一つは又、Ｃ−７位が不飽和の内因性ステロールのイン・ビボでの還元方法にも関係する（該方法においては、酵母又は糸状菌から選択し、この発明によってトランスフォームした宿主を培養して、蓄積された還元されたステロールを適宜単離する）。
【００５４】
特に、この発明は、上に規定したイン・ビトロ又はイン・ビボでの還元方法に関係し（該方法においては、得られる還元されたステロールは、コレステロールの側鎖の制限酵素（Ｐ450 ＳＣＣ）の基質である）、特に、イン・ビボでの還元方法に関係する（該方法においては、還元すべき外因性ステロールは、エルゴスタ５，７ジエン３−オール、エルゴスタ５，７，２４（２８）トリエン３−オール又はエルゴスタ５，７，２２トリエン３−オール又はこれらの混合物である）。
【００５５】
この発明の主題は又、プレグネノロンの製造方法でもある（該方法においては、酵母又は糸状菌から選択してこの発明によりトランスフォームした宿主細胞を培養し、蓄積された内因性のステロール又はＣ−７位が還元されたステロールを適宜単離し、これらの還元されたステロールをＰ450 ＳＣＣの存在下で（適宜、アドレノドキシンレダクターゼ（ＡＤＲ）及びアドレノドキシン（ＡＤＸ）の存在下で）インキュベートして得られるプレグネノロンを適宜単離する）。
【００５６】
この発明の特別の主題は、上に規定したプレグネノロンの生成方法（宿主細胞は酵母）である。
【００５７】
この発明は又、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ及びＰ450 ＳＣＣの活性を有する蛋白質並びに適宜ＡＤＲ及びＡＤＸの活性を有する蛋白質の同時発現を可能にする１つ以上のベクターでトランスフォームした酵母を培養し、遊離の若しくはエステル化したプレグネノロンを適宜単離するプレグネノロンの生成方法にも関係する。
【００５８】
この発明は、特に、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ、Ｐ450 ＳＣＣ、ＡＤＲ及びＡＤＸの活性を有する蛋白質を同時発現するトランスフォームされた酵母を培養する上記の方法に関係し、特に、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質が A.thaliana の蛋白質デルタ−７Ｒｅｄである上記の方法に関係し、特に、酵母株がＥＣ０１／ｐＣＤ６３株である上記の方法に関係する。
【００５９】
この発明によるプレグネノロンの生成の例を、更に、実験部分で与える。
【００６０】
上記のプレグネノロンの生成方法を実施するために用いられるトランスフォームされた酵母は、例えば、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むこの発明の発現ベクター並びにチトクロームＰ450 ＳＣＣの及び適宜ＡＤＸ及びＡＤＲの発現ベクターにより同時トランスフォームされた酵母であってよい。これらのチトクロームＰ450 ＳＣＣ及び／又はＡＤＸの発現ベクターは公知であり、調製は、例えば、欧州特許出願ＥＰ０３４０８７８並びに実験部分に記載されている。
【００６１】
用いるトランスフォームされた酵母は又、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列がゲノムの特定の遺伝子座（例えば、ＡＤＥ２遺伝子座）にインテグレートされ及びエルゴステロールがもはやデルタ−７レダクターゼの発現条件下において主要ステロールでない酵母であってもよい。得られた「インテグレートされた」酵母を、次いで、チトクロームＰ450 ＳＣＣ並びに適宜ＡＤＸ及びＡＤＲをコードするＤＮＡ配列を含むインテグレート発現カセット又は発現ベクターによりトランスフォームすることが出来る。
【００６２】
プレグネノロン又はその酢酸エステルをイン・ビボで産生する酵母株の構築の例を、更に、実験部分に与える。
【００６３】
従って、この発明の主題は又、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ、Ｐ450 ＳＣＣ、ＡＤＲ及びＡＤＸの活性を有する蛋白質を同時発現し且つ遊離若しくはエステル化したプレグネノロンを蓄積するトランスフォームされた酵母株でもあり、特に、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼの活性を有する蛋白質が  A.thalianaの蛋白質デルタ−７Ｒｅｄである上記の酵母株、特にＥＣ０１／ｐＣＤ６３と呼ばれる酵母株（その正確な構築を更に実験部分で与える）でもある。
【００６４】
この発明は又、上に規定したクローニング方法により得られ、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼの先天的欠乏を診断するためのプローブとして利用されるヒトＤＮＡ配列にも及ぶ。デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼの欠乏は、例えば、異常に低いレベルの血漿コレステロールの原因である７−デヒドロコレステロールレダクターゼの欠乏を含む。
【００６５】
この発明は又、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料を上に規定したプローブと共に標準的ハイブリダイゼーション条件下でインキュベーションし、そのプローブのゲノムＤＮＡへの固定又は固定の不在を示すこと（固定の不在又は後者の減少は、デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼの先天的欠乏を示す）を含むデルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼの欠乏の検出方法にも関係する。
【００６６】
この発明の方法は、例えば、出生前デルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼの先天的欠乏又は新生児並びに種々の病気特にＲＳＨ／ＳＬＯ症候群の臨床的明示を有する患者における先天的欠乏の検出を可能にすることができる。
【００６７】
下記の実施例は、この発明を制限することなく説明する。
【００６８】
【実施例】
実施例１：A.thalianaの５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ（デルタ−７Ｒｅｄ）をコードするｃＤＮＡのクローニング
Ａ  −  酵母中のA.thalianaの発現ライブラリーのスクリーニング
出発ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、M.Minet 等（Plant J., 2, 417-422,     1992）により記載されたライブラリーであり、該ライブラリーは、二葉の発芽段階のA.thalianaのｍＲＮＡから調製され、そのＮｏｔＩ部位と接するｃＤＮＡがシャトルベクターE.coli/S.cerevisiae ｐＦＬ６１の発現カセットのＢｓｔＸＩ部位に挿入された。このカセットは、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）のプロモーター及びターミネーター配列を含む。２ｕ配列から誘導された酵母の複製オリジン及び選択の指標ＵＲＡ３は、このベクターの酵母中での増殖を確実にする。このベクターの大腸菌中での増殖は、プラスミッドｐＵＣ１９に由来する。
【００６９】
酵母ＦＹ１６７９株（Mata）（これは、Thierry 等（Yeastk, 6, 521-534, 1990）により記載されたＳ２８８Ｃの同系株である）を、D.Gietz 等（Nucleic Acids Res., 20, 1425, 1992）により記載された酢酸リチウム法を用いて、ｃＤＮＡライブラリーによりトランスフォームした。
【００７０】
これらの細胞を、７ｇ／ｌの「yeast nitrogen base 」（Difco ）、１ｇ／ｌのバクトカザミノ酸（Difco ）、２０ｇ／ｌのグルコース、２０ｍｇ／ｌのトリプトファンを含み、ウラシルを含まない合成培地ＳＧＩ上にプレートした。１０5 のウラシルについての原栄養体トランスフォーマントが得られ、次いで、分類して同じウラシルを含まず２若しくは５μｇ／ｍｌのナイスタチンを含む合成培地上に５×１０4 細胞／皿の割合で再プレートした。各ナイスタチン濃度について１０6 細胞を、この方法でスクリーニングした。３日間２８℃でインキュベーションした後に、２μｇ／ｍｌのナイスタチン濃度で成育させた約１００クローンを、５つのクローンの群を構成することにより集めた（ステロール組成を逆相構成の液体クロマトグラフィー（以後、ＲＰ−ＨＰＬＣと呼ぶ）により分析した）が、単一の耐性クローン（Ｆ２２と呼ぶ）が、５μｇ／ｍｌのナイスタチン濃度で得られた。
【００７１】
Ｂ  −  クローンＦ２２に蓄積されたステロールの分析
酵母の全ステロールを、L. Parks等（Methods in Enzymol., 111, 333-346, 1985 ）により記載されたアルカリ鹸化法によって調製し、次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣ及び／又はガスクロマトグラフィー（ＧＣと呼ぶ）により分析した。
【００７２】
得られたステロールの残渣をエタノール−テトラヒドロフラン−水の混合物（６５：１０：２５ｖ／ｖ）に溶解させ、次いで、Applied Biosystems C18結合シリカカラム（１００×２．１ｍｍ）上での、水中のメタノールの直線的勾配（１８分間にわたって、５０〜１００％）及び２０５ｎｍ及び２８５ｎｍでの測光検出（エルゴステロール、カンペステロール及びコレステロール標準と比較）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより分析する（１ｍｌ／分の流量及び５５℃で行なう）。
【００７３】
ステロールの組成は又、ヘリウムをキャリアーガスとして使用するAlltech SE-30 キャピラリーカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ）上でのＧＣ（インジェクター及び検出器での温度は、それぞれ、２８０℃及び３１０℃）によっても分析する（初期に４５℃／分の速度で温度を１１０℃から２４５℃まで増大させ、次いで、３℃／分にて２８０℃に達する）。
【００７４】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析（図１Ａ）及びＧＣによる分析（図１Ｂ）は、上で得られたクローンＦ２２に蓄積したステロールのプロフィルを示し、それは、トランスフォームしてないＦＹ１６７９株の主要ステロールであるエルゴステロールの事実上完全な消失、及び２つの主要ステロール（類似の量）での置き換えにより特徴付けられ、該ステロールは、２８５ｎｍにて吸収せず、従って、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析により、もはや共役二重不飽和を有しない。
【００７５】
図１Ａにおいて、カンペステロール（Sigma ）（２４−Ｒ−エルゴスタ５−エン３−オール）は、約３５％のジヒドロブラシカステロール（２４−Ｓ−エルゴスタ５−エン３−オール）を含む。
【００７６】
Ｃ  −  デルタ−７ＲｅｄｃＤＮＡのクローニング
クローンＦ２２起源のプラスミッドを J. N. Strathern等（Methods in Enzymol., 194, 319-329, 1991 ）により記載された方法によって大腸菌中で増幅し、次いで、ＮｏｔＩにより消化した。約６００塩基対（ｂｐ）の断片及び１．６ｋｂｐの断片を得た。ＦＹ１６７９株を上記の各断片でそれぞれトランスフォームした。トランスフォームした酵母の各クローンのステロールの組成を上記のように分析し、ステロールの変化したプロフィルの原因である遺伝子を有するプラスミッドを弁別した。この方法で同定したプラスミッドをｐＦ２２と命名した。
【００７７】
Ｄ  −  デルタ−７ＲｅｄのｃＤＮＡ配列の決定
ｐＦ２２のｃＤＮＡインサートを、ｐＵＣ９（Pharmacia ）から誘導したベクターｐＵＣ９ＮのＮｏｔＩ部位にサブクローン化した（該ベクターにおいては、多数クローニング部位のＥｃｏＲＩ部位をＮｏｔＩ制限部位の挿入により置き換えてあるが、他方、ＬａｃＺ遺伝子のリーディングフレームは保持している）。次いで、制限地図を決定した（図２）。
【００７８】
外部ＮｏｔＩ部位及び内部ＥｃｏＲＩ、ＰｖｕＩＩ又はＨｉｎｄＩＩＩ部位をそれぞれ有する制限断片を、pBluescript プラスミッド（Stratagene）中にサブクローン化した。そのヌクレオチド配列を、これらの二鎖について、ＤＮＡポリメラーゼ Sequenase（Stratageneキット）を用いて、pBluescript ｐＵＣ９、Ｔ３及びＴ７の直接及び逆行プライマー又はｃＤＮＡヌクレオチド配列の推定の特異的プライマーを利用することにより、サンガー法によって決定した。
【００７９】
得られた配列をすべて編集すると、図３に示した A.thaliana のデルタ−７ＲｅｄｃＤＮＡヌクレオチド配列（SEQ ID NO:１）を与える。それは、ポリアデニル化配列で終了する１４９６ヌクレオチドを含む。それは、ヌクレオチド７６のメチオニンイニシエーターで開始し、ヌクレオチド１３６６の終止コドンで終了するオープンリーディングフレームを有する。これは、４３０アミノ酸の蛋白質をコードする１２９０ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを生じる。デルタ−７ＲｅｄｃＤＮＡのコード領域は、蛋白質デルタ−７Ｒｅｄをコードし、その演繹したアミノ酸配列（SEQ ID NO:２）を図３に示す。この蛋白質の配列は、４３０アミノ酸を含み、アミンは、４９．２８６ｋＤａの計算分子質量を有する。
【００８０】
ベクターｐＵＣ９Ｎ中のデルタ−７ＲｅｄｃＤＮＡ（デルタ７Ｒｅｄ／ｐＵＣ９ＮｃＤＮＡと呼ぶ）を含む大腸菌ＤＨ５−１株の試料を、ＣＮＣＭに、１９９５年２月１０日に、番号Ｉ−１５３５にて寄託した。
【００８１】
Ｅ  −  コンセンサス配列SEQ ID NO:３の決定
配列データベース（Genbank 及びEMBL）のコンピューター検索を利用して、A.thalianaのデルタ−７Ｒｅｄ蛋白質の配列が、他のステロールレダクターゼ、特に、R. T. Lorentz 等（DNA Cell Biol., 11, 685-692, 1992 ）及び  W. Chen 等（Yeast, 7, 305-308, 1991 ）によりそれぞれ記載された S.cerevisiae のステロールＣ−１４レダクターゼ及びステロールＣ−２４（２８）レダクターゼ並びに  M. Shimanuki等（Mol. Biol. Cell, 3, 263-273, 1992 ）により記載されたS.pombe の sts１＋遺伝子の生成物及び Neurospora crassaのステロールＣ−１４レダクターゼ（EMBLデータベースでの番号 X77955 ）と幾らかの配列類似性を有することが示された。更に、デルタ−７Ｒｅｄ蛋白質は、H. J. Worman等（J. Cell Biol., 111, 1535-1542, 1990 ）及び E. Schuler 等（J. Biol. Chem., 269, 11312-11317, 1994）により記載されたニワトリラミンＢレセプターのＣ末端の４００アミノ酸及び対応するヒトレセプターのそれとの類似性を示す。
【００８２】
上で得られたデルタ−７ＲｅｄｃＤＮＡから演繹したアミノ酸配列SEQ ID NO:２と３つの酵母ステロールレダクターゼ及び２つのラミンＢレセプターのそれとの間の配列同定整列（alignment ）を確立し、次いで、下記のアミノ酸配列（SEQ ID NO:３）を有する新たなコンセンサス配列：
【化７】
0004082469.tif 000005
（式中、７位のＸａａはＴｒｐ又はＴｙｒであり、１２位のＸａａはＨｉｓ又はＬｙｓである）を、デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする新たなゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅するためのプライマーとして利用し得るオリゴヌクレオチドを調製するために規定した。
【００８３】
Ｆ  −  酵母におけるデルタ−７Ｒｅｄ蛋白質の発現
ａ）酵母において誘導可能な発現ベクターデルタ−７／Ｖ８の構築
ｐＦ２２のｃＤＮＡの非コード領域の欠失を、下記の特異的オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅により行なった：
【化８】
5' CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 3' （SEQ ID NO:４）及び
【化９】
5' CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3'  （SEQ ID NO:５）
（これらは、ＢａｍＨＩ制限部位を開始コドンのすぐ上流に導入し、ＫｐｎＩ部位を停止コドンのすぐ下流に導入するために規定した）。
【００８４】
このｃＤＮＡを、１ｎｇの「デルタ７ｒｅｄ／ｐＵＣ９ＮｃＤＮＡ」から出発して、２単位のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ及び０．２ｕＭの上記の各プライマーの存在下で、次の増幅条件を用いることにより増幅した（３３サイクル）：
９４℃、１０秒；５２℃、５０秒；７４℃、９０秒（Stratagene PCRキット使用）。
【００８５】
約１３００ｂｐの断片を得、次いで、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化して、C. Cullin 等（Gene, 65, 203-217, 1988 ）により記載された E.coli/S.cerevisiaeｐＹｅＤＰ１／８−２シャトルベクター（Ｖ８と呼ばれる）のＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ部位に挿入した。Ｖ８は、選択指標ＵＲＡ３を有し、酵母における発現カセットを含む（ＰＧＫ遺伝子のプロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１及びターミネーター配列を含む）。従って、この得られたベクター（デルタ−７／Ｖ８と呼ぶ）は、ガラクトースによるデルタ−７Ｒｅｄ蛋白質の誘導可能発現を与える。
【００８６】
ｂ）デルタ−７Ｒｅｄ蛋白質の生成
酵母ＦＹ１６７９株（Mata）を、上で得たデルタ−７／Ｖ８プラスミッドで、D. Gietz等（既出）により記載された酢酸リチウム法を用いることによりトランスフォームした。
【００８７】
トランスフォームした酵母を、上記のＳＧＩ選択培地（但し、グルコース濃度は５ｇ／ｌ）にて、細胞密度の飽和（ＯＤ600nm ＝１２）が得られるまで、２７℃で培養した。この培養物を、次いで、一容の完全培地ＹＰ（１０ｇ／ｌのイーストエキス（Difco ）及び１０ｇ／ｌのバクトペプトン（Difco ））を加え、次いで、エタノール（１．５％ｖ／ｖ）を炭素源として加えることにより希釈する。少なくとも７×１０7 細胞／ｍｌの細胞濃度に達するまで成育させたときに、デルタ−７Ｒｅｄの発現を２０ｇ／ｌの濃度のガラクトースを加えることにより誘導した。
【００８８】
この誘導を、ＳＬＩ選択用最小培地（グルコースをガラクトース（２０ｇ／ｌ）で置き換えたＳＧＩ培地に相当）においても、２×１０7 細胞／ｍｌの細胞濃度が得られるまで行なった。
【００８９】
ｃ）デルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性のイン・ビトロ酵素試験
デルタ−７Ｒｅｄ蛋白質の発現を、M. Taton等（Biochem. Bioph. Res. Commun., 181, 465-473, 1991）により記載された酵素試験（但し、ＮＡＤＰＨ再生系を除き、上記の誘導した酵母のミクロソーム又は細胞質ゾルの細胞調製物を使用）を用いることにより示した。
【００９０】
誘導した細胞の機械的破壊及び P. Urban 等（Eur. J. Biochem., 222, 843-850, 1994）により記載された方法による超遠心分離による単離によって細胞画分を得た。これらの細胞を集め、次いで、ＴＥ−ＫＣｌ緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＫＣｌ）で２回洗い、０．６Ｍ  ＴＥ−ソルビトール溶解緩衝液中に再懸濁する。直径０．４５〜０．５ｍｍのガラスビーズ（Braun ）を細胞懸濁液の表面を通して見えるまで加え、次いで、４℃で５分間激しく揺り動かす。その表面上の細胞溶解物を集め、ガラスビーズを溶解緩衝液で３回洗う。この溶解物及び洗液を合わせ、次いで、ミトコンドリア画分を除去するために、４℃で１３分間、２０，０００ｇで遠心分離する。集めた上清を、４℃で１時間、１００，０００ｇで遠心分離する。ミクロソーム画分を含むペレットと細胞質ゾル画分に相当する上清をそれぞれ集める。
【００９１】
得られたミクロソーム画分又は細胞質ゾル画分を、それぞれ、基質としてツイーン８０（１．５ｇ／ｌ）で乳化した１５０ｕｍの７−デヒドロコレステロールを含む１００ｍＭ  トリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３）中で、２ｍＭ  ＮＡＤＰＨの存在下で、３７℃で９０分間インキュベートする。これらのステロールを、３容のメタノール−ジクロロメタン混合物（５０：５０、ｖ／ｖ）の添加により抽出し、次いで、ＧＣにより、標準生成物との比較により分析する。
【００９２】
上記のように酵母ＦＹ１６７９から得たミクロソーム画分（３．５ｍｇ／ｍｌの蛋白質）を用いる、７−デヒドロコレステロール（ＲＴ＝１６．５２８分）からのコレステロール（ＲＴ＝１５．８８７分）の生成を図４に示す。該酵母は、デルタ−７／Ｖ８ベクターでトランスフォームし、３時間誘導したものであり、その内因性ステロールは、一層高い保持時間を有する（エルゴスタ５−２２ジエン３−オールのＲＴ＝１６．６８２分；エルゴステロールのＲＴ＝１７．２４９分及びエルゴスタ５−エン３−オールのＲＴ＝１７．６６４分）。
【００９３】
これらの結果は、一方で、デルタ−７Ｒｅｄ蛋白質がトランスフォームされた酵母において発現されることを示し、他方で、該蛋白質がデルタ−５，７ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性を有することを示す。
【００９４】
実施例２：Ｃ−７位が不飽和の酵母の内因性ステロールのイン・ビボでの還元
主要ステロールがＣ−５，７位に二重結合を有する酵母株を、実施例１で得たデルタ−７／Ｖ８ベクターでトランスフォームし、次いで、培養して実施例１に示したように誘導した。これらの内因性ステロール（そのプロフィルをＧＣにより分析する）を抽出し、調製用Ｃ１８カラム（１００×４．６ｍｍ）を用いて実施例１で示したようにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、次いで、ＩＲ、ＵＶ、ＭＳ及びＮＭＲにより同定した。下記の３つの株を、それぞれ、用いた：
−  実施例１に記載したＦＹ１６７９株；
−  ｅｒｇ５変異株（ＰＬＣ１０５１と呼ぶ）。該株は、ステロールＣ−２２デサチュラーゼの欠乏により特徴付けられ、ＦＹ１６７９株と S. W. Molzahn等（J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972 ）により記載された元のｐｏｌ５株との間の交配により構築されたものであり、エルゴスタ５，７−ジエン３−オールを蓄積する。
【００９５】
−  ｅｒｇ４，５二重変異株（ＰＬＣ１４５１と呼ぶ）。該株は、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ（ｅｒｇ５）及びステロールＣ−２４（２８）レダクターゼ（ｅｒｇ４）の欠乏により特徴付けられ、ＦＹ１６７９株と S. W. Molzahn等（既出）により記載されたｐｏｌ５株との間の交配により得られたものであり、ステロールの変異体を探すための酵母の系統的スクリーニングの間に自然のナイスタチン耐性を獲得しており、エルゴスタ５，７，２４（２８）トリエン３−オールを蓄積する。その結果生じた二重変異ｅｒｇ４、ｅｒｇ５を有する一倍体株は、ガラクトース及び非発酵性基質の存在下で成育し、ウラシル、トリプトファン及びヒスチジンについて独立栄養性である。これらのＰＬＣ１０５１株及びＰＬＣ１４５１株を、ＣＮＣＭに、１９９５年２月１０日に、それぞれ、番号Ｉ−１５３６及びＩ−１５３７にて寄託した。
【００９６】
上記のトランスフォームされた３つの株からそれぞれ同定された主要な還元されたステロールを次の表に示す：
【表１】
0004082469.tif 000006
【００９７】
実施例３：  Ｃ−７位が還元された酵母の内因性ステロールの制限によるイン・ビトロでのプレグネノロンの生成
Wada等（Arch. Biochem. Biophys., 290, 376-380, 1991 ）により記載されたイン・ビトロでのコレステロール側鎖の酵素的制限試験を用いることにより、プレグネノロンの生成を行なう。該試験において、実施例２で得たＣ−７位が還元されたステロール２６０ｕＭを、１５０ｕｌの１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３％  ツイーン２０中で、１４０ｎＭのアドレノドキシンレダクターゼ、１．１６ｕＭのアドレノドキシン及び０．６８ｕＭのウシ起源のチトクロームＰ450 ＳＣＣ（副腎から、例えば、D. W. Seybert 等、 J. Biol. Chem., 254, 12088-12098, 1979に従って得たもの）の存在下でインキュベートする。
【００９８】
１５０ｕＭのＮＡＤＰＨの添加により反応を引き起こす。８０分間３７℃でインキュベートした後に、一容のメタノール−ジクロロメタン混合物（５０：５０ｖ／ｖ）を加えることにより反応を停止させる。これらのステロールを、実施例１に示したように、抽出してＧＣにより分析する。
【００９９】
図５は、それぞれ、エルゴスタ５−エン３−オール（図５Ａ）、エルゴスタ５，２４（２８）ジエン３−オール（図５Ｂ）又はエルゴスタ５，２２ジエン３−オール（図５Ｃ）が、チトクロームＰ450 ＳＣＣの基質であり、コレステロールの制限により同じ条件下で得られるプレグネノロンのＲＴと同じＲＴを有する生成物へと導く。
【０１００】
得られた結果は、デルタ−７Ｒｅｄを発現するトランスフォームされた酵母が、イン・ビトロでの生物学的酸化によってプレグネノロンを生成するのに直接に利用できるステロールを蓄積することを示している。
【０１０１】
実施例４：  イン・ビボでプレグネノロン又はその酢酸エステルを生成する酵母株の構築
Ａ  −  一倍体株ＦＹ１６７９交配型ａ（ＦＹ１６７９Ｍａｔａ）の遺伝子座ＡＤＥ２にインテグレートされた A.thaliana のデルタ−７Ｒｅｄの発現カセットを含むＥＬＲ０１株の構築
ａ）インテグレートプラスミッドｐＡＤデルタ−７（ｐＡＤΔ７）の構築：
プラスミッドｐＡＤ７の構築を、図６に記載したように行なった。S.cerevisiaeのＡＤＥ２遺伝子を含むＢｇｌＩＩ断片（２２４４ｂｐ）を、プラスミッドｐＡＳＺ１１（A. Stotz等、 Gene, 95, 91, 1990）から単離し、pBluescriptII KS+ ベクター（Stratagene）の多数クローニング部位のＢａｍＨＩ部位に挿入した。
【０１０２】
得られたプラスミッド（ｐＢＳ−ＡＤＥ２と呼ぶ）を、次いで、その単一ＳｔｕＩ部位にて線状化して、脱リン酸化した。プロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１、デルタ−７Ｒｅｄ（ステロール７レダクターゼ）のコードフェーズ及びターミネーターＰＧＫ（ｔＰＧＫ）を含む約２．４４ｋｂの断片を、プラスミッドデルタ−７／Ｖ８から得た。該プラスミッドは、実施例１Ｆにおいて、下記のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ技術により得たものである：
【化１０】
5' GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 3' （SEQ ID NO:６）及び
【化１１】
5' AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 3' （SEQ ID NO:７）
（これらは、それぞれ、ｔＰＧＫの３’末端及びＵＲＡ３遺伝子の３’末端と対合するように規定したものである）。テンプレートとしてのプラスミッドデルタ−７／Ｖ８（８０ｎｇ）、天然のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratageneが勧める緩衝液中に１単位）及び次の増幅条件を用いた（３５サイクル）：
９５℃で１分；９５℃で５秒；５６℃で３０秒；７０℃で４分３０秒。得られた増幅断片を、次いで、上で線状化したプラスミッドｐＢＳ−ＡＤＥ２の鈍端にクローン化してプラスミッドｐＡＤΔ７を与えた。該プラスミッドにおいて、約４７２０ｂｐのＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ断片が、デルタ−７Ｒｅｄの発現カセットにより中断されたＡＤＥ２遺伝子を運ぶ。
【０１０３】
ｂ）酵母ＦＹ１６７９Ｍａｔａ株における染色体インテグレーション：
制限酵素ＮｏｔＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミッドｐＡＤΔ７から単離したＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ断片（４７２０ｂｐ）を、D. Gietz等（既出）により記載された酢酸リチウム法を用いるトランスフォーメーションによって酵母ＦＹ１６７９Ｍａｔａに導入した。
【０１０４】
相同組換えによりこの断片をインテグレートしたトランスフォーマントをそれらのナイスタチン耐性によって選択した（この表現型は、酵母のデルタ−５，７ステロールをデルタ−５ステロールに変換するデルタ−７Ｒｅｄの発現によるものである）。
【０１０５】
これらのトランスフォームした細胞を、グルコース（２０ｇ／ｌ）を含み且つアデニン（２０ｍｇ／ｌ）を補った実施例１に記載した完全培地ＹＰ中で２８℃で４時間インキュベートした。次いで、それらを濃縮し、それから、ＳＬＩ−寒天最小培地（１ｇ／ｌのバクトカザミノ酸；７ｇ／ｌの「yeast nitrogen base 」；２０ｇ／ｌのガラクトース；２０ｍｇ／ｌのアデニン；２０ｇ／ｌの寒天）上にプレートし、２８℃で一晩インキュベートしてデルタ−７Ｒｅｄ遺伝子の発現を誘導した。ウラシルの補足のない場合は、細胞の成育が制限される。これらのクローンを集めてグループ分けしてからガラクトース（２０ｇ／ｌ）を含み、アデニン（２０ｍｇ／ｌ）を補った完全培地ＹＰ皿上にプレートした（各皿は、それぞれ、０、１、２、５、２０μｇ／ｍｌの濃度のナイスタチンを含む）。４日目に、５μｇ／ｍｌのナイスタチン濃度にて成育した約２０クローンが得られた。これらのクローンの内の１２を、ウラシル、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジン及びアデニンを豊富（それぞれ、２０ｍｇ／ｌ）にした最小培地ＷＯ（７ｇ／ｌのアミノ酸を含まない「yeast nitrogen base 」、２０ｇ／ｌのグルコース）にて、皿上でサブクローン化した。
【０１０６】
次いで、ＡＤＥ２遺伝子の崩壊によるアデニンの栄養要求性を、ウラシル、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンを豊富に有するがアデニンを含まない上記の最小培地ＷＯ上で成育しないことを観ることにより確認した。
【０１０７】
酵母のゲノム中の発現カセットの存在を、得られたクローンのゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅（上記の配列SEQ ID NO:６及び７を有するプライマーを使用）により制御した。
【０１０８】
インテグレートされたデルタ−７Ｒｅｄ遺伝子の機能性を、酵母中に蓄積したステロールを、実施例１Ｂに記載した操作方法によってアルカリ鹸化により抽出して、その組成のＧＣ分析により確認した（５メートルのＳＥ３０キャピラリーカラム（Alltech ）使用）。分析は、クローンをガラクトースの存在下で培養した場合には、Ｃ−７位が飽和したステロールを含む改変されたプロフィルを示す。得られた株（ＥＬＲ０１と呼ぶ）は、エルゴスタ５，７，２２トリエン３−オール（エルゴステロール）（図７に示すように、初期の株ＦＹ１６７９の主要ステロール）の代わりにエルゴスタ５エン３−オール及びエルゴスタ５，２２ジエン３−オールを蓄積する。
【０１０９】
この方法で構築した株ＥＬＲ０１は、プロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１による転写制御の事実のために、ガラクトースの存在下で培養した場合に、デルタ−７Ｒｅｄ遺伝子を発現する。デルタ−７Ｒｅｄの発現ユニットは、ＡＤＥ２遺伝子と同じ転写方向を有するにもかかわらず、グルコースの存在下で培養を行なった場合には、プロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１のリプレッションの結果、ＧＣによるステロールの組成の分析によってデルタ−７Ｒｅｄの発現は検出されない。
【０１１０】
Ｂ  −  一倍体株ＦＹ１６７９交配型アルファ（ｍａｔ．ａｌｐｈａ）の遺伝子座ＬＥＵ２とＳＰＬ１の間にインテグレートされた成熟型ウシアドレノドキシンレダクターゼ（ＡＤＲｍ）用の発現カセットを含むＣＤＲ０１株の構築。
ａ）シャトルベクター E.coli - S.cerevisiaeＶ１３の構築
Ｖ１３ベクターは、ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーター（ｐＧ／Ｃ）を含む酵母における選択指標ＵＲＡ３及び発現カセットを有するＶ８ベクター（C. Cullin 等、 既出）に対応し、該ベクターにおいては、図８に与えたダイヤグラムに従って、更なるＳａｌＩ部位（Ｓａ）が多数クローニング部位に導入されている。
【０１１１】
Ｖ８ベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＵＲＡ３遺伝子及びＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーターを含む得られたＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（１７２２ｂｐ）（今後、「ｕｒａ−ｇａｌ」と呼ぶ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１８ベクター（Pharmacia ）の対応部位の間にサブクローン化した。
【０１１２】
この「ｕｒａ−ｇａｌ」断片を、次いで、得られたｐＵＣ１８／「ｕｒａ−ｇａｌ」プラスミッド（９５℃で３０秒間変性したもの）から次の条件を用いるＰＣＲによって増幅した（３０サイクル）：８６℃で５秒；９５℃で１０秒；３８℃で４０秒；５５℃で５秒及び７４℃で２分、２単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer）（製造者の緩衝液中）及び下記のヌクレオチド配列を有するプライマー各１μＭを使用：
【化１２】
0004082469.tif 000007
【化１３】
5' GTAAAACGAC GGCCAGT 3'                  （SEQ ID NO:９）
プライマーSEQ ID NO:８は、「ｕｒａ−ｇａｌ」断片と同じＢａｍＨＩ部位GGATCC、テンプレートとハイブリダイズしないＢａｍＨＩ部位における３つの連続したヌクレオチド、ＳａｌＩ部位GTCGAC及びＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーターと相同な配列を含む。プライマーSEQ ID NO:９は、ｐＵＣ１８の多数クローニング部位のＨｉｎｄＩＩＩ部位に先行する配列とマッチする。増幅後に得られた１７２２ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで消化して、ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーター（ｐＧ／Ｃ）を含む２５４ｂｐの断片を遊離させ、次いで、それを、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化したＶ８ベクター中にサブクローン化した。
【０１１３】
生成したＶ１３ベクターは、成熟ウシアドレノドキシンレダクターゼ（ＡＤＲｍ）、成熟ウシアドレノドキシン（ＡＤＸｍ）及びウシチトクロームＰ450 ＳＣＣをコードするｃＤＮＡの容易なサブクローン化を可能にする制限部位を含む。
【０１１４】
このＶ１３ベクターから出発して、Ｖ１３−ＡＤＲベクター、Ｖ１３−ＡＤＸベクター及びＶ１３−ＳＣＣ１０ベクターを、それぞれ、下記の方法にて調製した：
【０１１５】
ａ）Ｖ１３−ＡＤＲベクターの構築
ＡＤＲｍをコードするｃＤＮＡを有する１４７８ｂｐのＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片を、欧州特許出願ＥＰ３４０８７８の実施例２５に記載されたプラスミッドｐＧＢＡＤＲ−２から単離し、Ｖ１３ベクターの対応部位にサブクローン化してＶ１３−ＡＤＲベクターを与えた。
【０１１６】
ｂ）Ｖ１３−ＡＤＸベクターの構築
ＡＤＸｍをコードするｃＤＮＡを有する３９０ｂｐのＳａｌＩ  ＢａｍＨＩ断片を、欧州特許出願ＥＰ３４０８７８の実施例２３に記載されたプラスミッドｐＧＢＡＤＸ−１から単離し、Ｖ１３ベクターの対応部位にサブクローン化してＶ１３−ＡＤＸベクターを与えた。
【０１１７】
ｃ）Ｖ１３−ＳＣＣ１０ベクターの構築
Ｐ450 ＳＣＣをコードするｃＤＮＡを有する１５５４ｂｐのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、欧州特許出願ＥＰ３４０８７８の実施例６に記載されたプラスミッドｐＧＢＳＣＣ−１０から単離し、Ｖ１３ベクターの対応部位にサブクローン化してＶ１３−ＳＣＣ１０ベクターを与えた。
【０１１８】
ｂ）インテグレートプラスミッドｐＣＤ６２−１及びｐＣＤ６２−２の構築：
プラスミッドｐＣＤ６２−１及びｐＣＤ６２−２の構築を図９に記載したようにして行なった。
【０１１９】
ａ）プラスミッドｐＦＬ２６ＣＤの構築
ＮｏｔＩ部位を、下記の操作方法に従って、プラスミッドｐＦＬ２６（N. Bonneaud 等、 Yeast, 7, 609-615, 1991 ）中に、ｌｅｕ２遺伝子をｓｐｌ１遺伝子（ｓｐｌ１と呼ぶ）（C. Kolman 等、 J. Bacteriol., 175, 1433, 1933）の５’から分離する遺伝子間領域に導入した：
【０１２０】
ｌｅｕ２の５’末端及びＳｐｌ１の３’末端をそれぞれ運ぶ７０４ｂｐ及び３４７ｂｐの２つのＤＮＡ断片を、下記のヌクレオチド配列を有するプライマーを用いてＰＣＲにより合成した：
【化１４】
5' TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 3'           （SEQ ID NO:１０）及び
【化１５】
0004082469.tif 000008
及び
【化１６】
5' CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 3' （SEQ ID NO:１２）及び
【化１７】
5' TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 3'           （SEQ ID NO:１３）
（３４７ｂｐ断片の増幅用）。
【０１２１】
プライマーSEQ ID NO:１１及びSEQ ID NO:１２は、ＮｏｔＩ部位に対応する配列GGCGGCCGを有し、その中の３塩基はテンプレートとマッチしない。プライマーSEQ ID NO:１０は、ｌｅｕ２の停止コドンの５３６ｂｐ上流に位置する配列とマッチし、プライマーSEQ ID NO:１３は、ｓｐｌ１Δの停止コドンの１９４ｂｐ上流に位置する配列とマッチする。
【０１２２】
７０４ｂｐ及び３４７ｂｐ断片を、先ず、プラスミッドｐＦＬ２６をテンプレートとし、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを酵素として用いて、供給者（Stratagene）により記載された標準条件下で、ＰＣＲによって増幅する。
【０１２３】
得られた２つの増幅された断片は、プライマーSEQ ID NO:１１（７０４ｂｐ断片）及びプライマーSEQ ID NO:１２（３４７ｂｐ断片）により生成された末端のレベルで２０ｂｐにわたってマッチした（５’末端から開始）（これらの２０ｂｐは、それぞれ、これらのプライマーの各々の最初の２０ヌクレオチドに対応する）。
【０１２４】
７０４ｂｐ（１ｎｇ）及び３４７ｂｐ（２ｎｇ）のＤＮＡ断片の対合から生じた生成物を、プライマーSEQ ID NO:１０及びSEQ ID NO:１３並びに次の条件を用いて増幅した：９５℃で１０秒、６０℃で５秒、４５℃で１分、６５℃で５秒及び７２℃で２分を３０サイクル行ない、その後、７２℃で７分を１サイクル行なう（５０μｌの反応緩衝液（Stratagene）中で、５０ｐモルの各プライマー及び１単位のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用）。ＮｏｔＩ制限部位を含む１０３１ｂｐの増幅された断片が得られた。この断片を、次いで、ＢｓｔＸＩ及びＮｓｉＩ酵素で消化し、得られたＮｏｔＩ部位を含む９２０ｂｐの断片をｐＦＬ２６の初期ＢｓｔＸＩ−ＮｓｉＩ断片の代わりに挿入してプラスミッドｐＦＬ２６ＣＤを与えた（その地図を図９Ａに示す）。
【０１２５】
ｂ）プラスミッドｐＣＤ６０の構築
−  プラスミッドｐＤＰ１００３６の調製：
成熟ウシアドレノドキシン（ＡＤＸｍ）をコードするｃＤＮＡを有する３９０ｂｐのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片を、プラスミッドＶ１３−ＡＤＸから単離し、次いで、プラスミッドｐＴＧ１００３３の多数クローニング部位のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位にサブクローン化した（それは、誘導可能なプロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１及びターミネーターｔｅｒＰＧＫと隣接する）。プラスミッドｐＴＧ１００３３（その地図を図１８に示す）は、後述する操作方法に従って調製した。該プラスミッドは、プロモーターＣＹＣ１及びｔｅｒＰＧＫを含む発現ベクターｐＴＧ１００３１（図１７）に対応し、その中のプロモーターＣＹＣ１がプロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１で置き換えられている。
【０１２６】
こうして得られたプラスミッド（ｐＤＰ１００３４と呼ぶ）は、ＡＤＸ発現カセット即ちＧＡＬ１０／ＣＹＣ１及びｔｅｒＰＧＫの転写制御下でＡＤＸｍをコードする遺伝子を有する。従って、用語「発現カセット」は、ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１及びｔｅｒＰＧＫに転写的に依存する任意の遺伝子について使用される。
【０１２７】
選択指標ＵＲＡ３及びＡＤＲ発現カセットを有する３５９３ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミッドＶ１３−ＡＤＲから単離し、次いで、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミッドｐＤＰ１００３４の対応部位に挿入した。得られたプラスミッド（ｐＤＰ１００３６と呼ぶ）は、マーカーＵＲＡ３により互いに分離されたＡＤＸ及びＡＤＲ発現カセットを含む（図９Ｂ）。
【０１２８】
−  プラスミッドｐＣＤ６０の調製：
ＡＤＲカセットを有する２７７０ｂｐのＡｆｌＩＩＩ−ＡｃｃＩ断片を、プラスミッドｐＤＰ１００３６を制限酵素ＡｆｌＩＩＩ及びＡｃｃＩで部分消化することにより単離し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で処理して鈍端を生成し、その鈍端でのライゲーションの後にプラスミッドpBlue-Script KS+（Stratagene）のＳｍａＩ部位にサブクローン化した。得られたプラスミッド（ｐＣＤ６０と呼ぶ）において、ＡＤＲ発現カセットは、両側をＮｏｔＩ部位にはさまれ、該部位の一つはＡｆｌＩＩＩ／ＳｍａＩライゲーション部位の２０９ｂｐ上流に位置してサブクローン化された断片に由来し、他方は、pBlue-Script KS+の多数クローニング部位（ＭＣＳ１）に由来する（図９Ｂ）。
【０１２９】
ｃ）プラスミッドｐＣＤ６２−１及びｐＣＤ６２−２の構築：
制限酵素ＮｏｔＩで消化したプラスミッドｐＣＤ６０から単離した２５５８ｂｐのＮｏｔＩ断片を、次いで、プラスミッドｐＦＬ２６ＣＤの単一ＮｏｔＩ部位にサブクローン化した。断片の挿入の方向によって、２種類のプラスミッド（ｐＣＤ６２−１及びｐＣＤ６２−２と呼ぶ）が得られた（図９Ｃ）。
【０１３０】
プラスミッドｐＣＤ６２−１において、ＡＤＲ発現カセットは、ｌｅｕ２遺伝子の転写の方向に向けられ、この向きはプラスミッドｐＣＤ６２−２における向きと逆である。
【０１３１】
プラスミッドｐＣＤ６２−１を、続く構築のために保持した。
【０１３２】
ｃ）酵母ＦＹ１６７９株（Ｍａｔａｌｐｈａ）における染色体インテグレーション：
プラスミッドｐＣＤ６２−１は、ＦＹ１６７９株の染色体遺伝子座に相同な領域を含む。これらの領域は、それぞれ、図１０に示した１０６０ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ断片（Ａ）、７０７ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片（Ｂ）及び６０２ｂｐのＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片（Ｃ）に対応する。
【０１３３】
このプラスミッドｐＣＤ６２−１の４８６ｂｐのＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩ断片に対応する領域は、ＦＹ１６７９株においては欠失し、それは、この株のロイシンに関する栄養要求性（ＬＥＵ２- 株）を意味する（R. S. Sikorski等、 Genetics, 122, 19, 1989 ）。
【０１３４】
プラスミッドｐＣＤ６２−１を、制限酵素ＸｂａＩ（その制限部位は相同領域の外に位置する）での消化により線状化し、次いで、ＦＹ１６７９株（Ｍａｔａｌｐｈａ）に酢酸リチウム法（D. Gietz等、 既出）を用いるトランスフォーメーションにより導入した。
【０１３５】
酵母による細胞のＤＮＡ修復能力（「ｇａｐ修復」）及び表現型ＬＥＵ２+ を有する組換え体の選択は、第１に、２つの型の組換え体を選択することを可能にした：第１の型は、断片Ａ及びＢのレベルにおける相同組換えの後に得られ、第２の型は、断片Ａ及びＣのレベルにおける相同組換えの後に得られる。後者の型の組換えだけが、表現型ＬＥＵ２+ の回復に加えてＡＤＲ発現カセットのインテグレーションを与えた。
【０１３６】
この第２の型のクローンを選択するために、ＰＣＲによるスクリーニングを、上記のプライマーSEQ ID NO:１０及び下記のヌクレオチド配列を有するプライマーを用いて、ＦＹ１６７９株（Ｍａｔａｌｐｈａ）のゲノム中のＡＤＲ発現カセットの存在及び正確な位置を確認するように行なった：
【化１８】
5' TACATTAGGT CCTTTGTAGC 3'             （SEQ ID NO:１４）。
【０１３７】
このスクリーニングにおいて、プライマーSEQ ID NO:１４は、専ら、ＡＤＲｍをコードする配列とマッチし、プライマーSEQ ID NO:１０は、染色体配列（図１０）とマッチする。
【０１３８】
増幅反応を、ＦＹ１６７９株（Ｍａｔａｌｐｈａ）（C. Hoffman等、 Gene, 57, 267, 1987 ）から単離したゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）をテンプレートとし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ、Boehringer）、５０ｐモルの各プライマー及び３０ＰＣＲサイクル（９５℃で１０秒、５５℃で１分、７２℃で３分）を用いて供給者により記載された標準条件下で行なった。
【０１３９】
増幅は、発現カセットがインテグレートされた場合には、２．９ｋｂの対応する断片の単離へと導いた。逆の場合には、増幅生成物は、検出されなかった。
【０１４０】
ＡＤＲインテグレートされた発現カセットを含むこの方法で選択されたＦＹ１６７９株（Ｍａｔａｌｐｈａ）は、ＣＤＲ０１と呼ばれた。
【０１４１】
この株によるＡＤＲの発現は、実施例１Ｆに記載したプロトコールに従って調製した細胞質ゾルの細胞画分から、抗−ＡＤＲ抗体により認識される蛋白質の免疫検出によって示された。
【０１４２】
ＣＤＲ０１株によって発現されたＡＤＲの機能性を、実施例３に記載したイン・ビトロでのコレステロールの側鎖の酵素的制限試験（精製ＡＤＲ（０．２８ｐモル）を、１００ｕｇの全蛋白質を含むＣＤＲ０１株の細胞質ゾルの細胞画分で置き換えた）にて確認した。約２５％のコレステロールからプレグネノロンへの生物学的変換率が認められ、これは、精製ＡＤＲで得られたものに匹敵した。
【０１４３】
Ｃ  −  A. Thaliana のデルタ−７ＲｅｄとＡＤＲｍとを同時発現するＥＣ０１二倍体株の構築。
ＥＣ０１二倍体株を、上で得たＣＤＲ０１及びＥＬＲ０１一倍体株を G. Sprague 等（Methods in Enzymology, 194, 77, 1991）により記載されたプロトコールに従って交配させることによって得た：
【０１４４】
ウラシル、トリプトファン及びヒスチジンを豊富に（各２０ｍｇ／ｌ）含むがロイシンを含まない前述した最小培地ＷＯ上での第１の選択は、二倍体クローンＬＥＵ２+ （ＡＤＲ発現カセットの存在を示す原栄養体特性）の単離を可能にする。これらのクローンを、次いで、それらの５μｇ／ｍｌナイスタチンに対する耐性（デルタ−７Ｒｅｄの発現カセットの存在を示す耐性特性）について、前記の固体合成ＳＬＩ−寒天培地上で試験した。
【０１４５】
ＥＣ０１と呼ばれる株が、この方法において、ナイスタチン耐性のクローンから任意に単離された。
【０１４６】
Ｄ  −  プレグネノロン及びプレグネノロン３−アセテートを生成するＥＣ０１／ｐＣＤ６３株の構築。
ａ）発現プラスミッドｐＣＤ６３の構築
プラスミッドｐＣＤ６３の構築を、図１１に記載したように行なった。
【０１４７】
ＡＤＸ発現カセット、選択指標ＵＲＡ３及びＡＤＲ発現カセットを含む４９６１ｂｐのＮｏｔＩ断片を、上で調製したプラスミッドｐＤＰ１００３６から単離して、制限酵素ＮｏｔＩで消化し、次いで、プラスミッドｐＦＬ４５Ｌ（N. Bonneaud 等、 Yeast, 7, 609, 1991 ）の多数クローニング部位のＮｏｔＩ部位にクローン化した。こうして得られたベクター（ｐＤＰ１００３７と呼ぶ）を図１１に示す。
【０１４８】
一方において、プラスミッドｐＤＰ１００３７を、ＡＤＲｍをコードする遺伝子内に制限部位がある酵素Ｔｔｈ１１１Ｉで消化して線状化した。
【０１４９】
他方において、Ｐ450 ＳＣＣの発現カセット及びＵＲＡ３マーカーの５’末端を含む３４７６ｂｐのＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、前に得たプラスミッドＶ１３−ＳＣＣ１０から精製して制限酵素ＰｖｕＩＩ及びＥｃｏＲＶで消化した。
【０１５０】
これらの別々に得た２種類の線状ＤＮＡは、図１１Ａに示すように、一方で遺伝子ＵＲＡ３の５’末端及びＧＡＬ１０／ＣＹＣ１に対応し、他方で、ｔｅｒＰＧＫに対応する相同領域を有する。
【０１５１】
これらの２種類の断片を、次いで、酢酸リチウム法（D. Gietz等、 既出）を用いる同時トランスフォーメーションによって酵母ＦＹ１６７９株（Ｍａｔａ）に導入した。
【０１５２】
続く原栄養性組換え体のウラシル及びトリプトファン（ＵＲＡ３+ 、ＲＴＰ１+ ）についての選択は、制限酵素Ｔｔｈ１１１Ｉでの消化により生じた二本鎖破壊が、相同組換えによる発現カセットＰ450 ＳＣＣのインテグレーションの結果修復されたクローンの単離を与えた。
【０１５３】
組換え体（ＵＲＡ３+ 、ＲＴＰ１+ ）の選択を、ロイシン、ヒスチジン及びロイシンに富む（各２０ｍｇ／ｌ）がウラシル及びトリプトファンを含まない最小培地ＷＯ上で行なった。５０の集めたクローンから出発して、全ＤＮＡを C. Hoffman 等（Gene, 57, 267, 1987 ）により記載された方法によって抽出し、次いで、エレクトロポレーションにより大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（Stratagene）に導入した。「ｇａｐ修復」により生成したプラスミッドによりトランスフォームしたクローンを、５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む豊富な培地ＬＢ（トリプトファン１％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ  １％）にて選択した。選択したクローンの１つから出発して、ｐＣＤ６３と呼ばれるプラスミッドを、J. Sambrook 等、 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載された方法に従って抽出した。得られたプラスミッドｐＣＤ６３は、図１１Ｂに示したように、選択指標ＵＲＡ３により分離された発現カセットＡＤＸ及びＰ450 ＳＣＣを含む。
【０１５４】
ｂ）ＥＣ０１株のプラスミッドｐＣＤ６３によるトランスフォーメーション
プラスミッドｐＣＤ６３を、酢酸リチウム法（D. Gietz等、 既出）によるトランスフォーメーションにより上で得たＥＣ０１株に導入した。トランスフォームした酵母を、次いで、ウラシル、トリプトファン、アデニン及びロイシンを含まないがヒスチジン（２０ｍｇ／ｌ）を補った前述の最小培地ＷＯ上で培養した。
【０１５５】
ＥＣ０１／ｐＣＤ６３と呼ばれる株をこの方法で単離した。この株の試料（ＥＣ０１／ｐＣＤ６３として言及する）を、ＣＮＣＭに、１９９５年２月１０日に、番号Ｉ−１５３８で寄託した。
【０１５６】
ｃ）プレグネノロン及びプレグネノロン３−アセテートのイン・ビボでの産生。
ＥＣ０１／ｐＣＤ６３株を、３リットルのエルレンマイヤーフラスコにて、グルコース濃度が５ｇ／ｌの実施例１Ａに記載したＳＧＩ選択培地中で、定常成育期（ＤＯ６００＝１２〜１３）に達するまで、好気条件（１３０ｒ／分）下で、２８℃で培養した。次いで、培養物を、上記の完全培地ＹＰ一容の添加と、続く炭素源としてのエタノール（０．５％ｖ／ｖ）の添加によって希釈する。新たな定常成育期に到達したとき（ＤＯ６００＝１２〜１３）に、ガラクトースを、それぞれプロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１の制御下にあるＡＤＸｍ、ＡＤＲｍ、Ｐ450 ＳＣＣ及びデルタ−７Ｒｅｄをコードする遺伝子の発現を同時に誘導するために、濃溶液（５００ｇ／ｌ）の形態で培養に添加する。
【０１５７】
これらの４つの遺伝子の同時発現は、それぞれ細胞及び培養上清に蓄積したステロールの下記の操作方法による分析により示される：
【０１５８】
この培養の５０ｍｌの試料を、誘導の９時間及び２４時間後に採取する。各試料を、細胞を培養培地から分離するために遠心分離する（４０００ｇ、１０分、４℃）。
【０１５９】
一方において、これらの細胞を、実施例１Ｆに記載した方法により、ガラスビーズの存在下で機械的破壊によって溶解させる。こうして得られた溶解物から出発し、次いで、細胞内ステロールを一容のヘキサンの添加によって抽出する。
【０１６０】
他方において、培養培地中に存在するステロールを、一容のヘキサンの添加によって直接抽出する。
【０１６１】
抽出したステロールの組成を、実施例１に記載したように、ＧＣによって、標準生成物と比較して分析する。
【０１６２】
９時間又は２４時間の誘導の後に得られた結果を、それぞれ、図１２Ａ及び図１２Ｂに示す。
【０１６３】
９時間の誘導の後、図１２Ａは、下記を示す：
−  細胞溶解物において、存在する主要化合物は、標準プレグネノロンアセテート（ＲＴ＝１１．８分）と同じ保持時間を有し、１つの非常に弱いピークがプレグネノロンの保持時間（ＲＴ＝９．９分）に存在するだけである。Ｃ−７位が還元されたこの酵母の内因性ステロール（エルゴスタ５−エン３−オール及びエルゴスタ５，２２ジエン３−オール）が少量、それぞれ、ＲＴ＝１８分及びＲＴ＝１７分にて同定される。分析前の細胞溶解物のアルカリ鹸化は、プレグネノロンと同時移動する主要化合物の存在へと導く。これは、１１．８分のＲＴを有する蓄積した化合物がプレグネノロンアセテートに相当することの確認を与える。
【０１６４】
−  培養培地において、プレグネノロン又はそのアセテートは、有意に、存在しない。
【０１６５】
２４時間の誘導の後、図１２Ｂは、下記を示す：
−  細胞溶解物において、少量のプレグネノロン（ＲＴ＝１０．２分）及びプレグネノロンアセテート（ＲＴ＝１２分）並びにこの酵母の還元された内因性ステロール（ＲＴ＝１７分及びＲＴ＝１８分）が存在する。コレステロール（ＲＴ＝１６．２分）は、抽出前に加えた内部標準である。
【０１６６】
−  培養培地において、主に存在するのはプレグネノロンアセテートであり、プレグネノロンは、少量である。
【０１６７】
対照用プラスミッド例えば前述のｐＦＬ４５ＬでトランスフォームしたＥＣ０１株を用いて並行して行なった実験は、遊離のプレグネノロン又はアセテート形態のプレグネノロンに対応するピークを示さなかった。
【０１６８】
この方法で行なったステロールの同定は、酵母ＥＣ０１／ｐＣＤ６３株が、外因性ステロール源の不在において、ガラクトースの存在下での誘導の後、９時間の誘導の後の主要な産生を伴って、プレグネノロン及びプレグネノロンアセテートを蓄積したことを示す。
【０１６９】
これらの結果は、一方において、ＥＣ０１株のＣ−７位が還元された内因性ステロールの効果的な流動化を、他方において、内因性ステロールの側鎖の制限反応のカップリングの極度の効果を示す。
【表２】
0004082469.tif 000009
【０１７０】
実施例４の準備：プラスミッドｐＴＧ１００３３の構築
１．新しい多数クローニング部位を有するｐＵＣ１９の誘導体：
クローニングベクターＭ１３ｍｐ１９（C. Yanish-Peron 等、 Gene, 33, 103, 1985 ）を、下記のオリゴヌクレオチドを用いて突然変異誘発し：
【化１９】
5' GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 3'             SEQ ID NO:１５
ＮｏｔＩ部位を切り詰めたｌａｃＩ遺伝子の配列中に導入して、プラスミッドＭ１３ＴＧ７２４を与えた。
【０１７１】
次いで、ＥｃｏＲＩ、ＳｎａＢＩ及びＮｏｔＩ部位を含む「ポリリンカー」を、下記のオリゴヌクレオチドを用いてプラスミッドＭ１３ＴＧ７２４のＥｃｏＲＩ部位に導入し：
【化２０】
5' AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 3'                 SEQ ID NO:１６
及び
【化２１】
5' AATTCATACG TACGCGGCCG C 3'                 SEQ ID NO:１７
プラスミッドＭ１３ＴＧ７２４４を与えた（増幅段階において、インサートの改変が認められた）。プラスミッドＭ１３ＴＧ７２４４のインサートは、下記のヌクレオチド配列を有する：
【化２２】
GAATTCATACGTACGCGGCCGCAATTGCGGCCGGTACGTATAATTCACTGGCCGT
（式中、ＥｃｏＲＩ、ＳｎａＢＩ及びＳｓｔＩ部位に下線を引き、又、右端の９ヌクレオチドは、ｐＵＣ１９のｌａｃＺ配列である）。
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｓｔＩによるプラスミッドＭ１３ＴＧ７２４４の消化の後に、ＭｌｕＩ及びＡｖｒＩＩ部位を含む「ポリリンカー」を、下記のオリゴヌクレオチドを用いて導入した：
【化２３】
5' CAACGCGTCC TAGG 3'                         SEQ ID NO:１８
【化２４】
5' AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 3'                SEQ ID NO:１９。
【０１７２】
酵素ＰｖｕＩＩでの消化の後に、得られたＰｖｕＩＩ断片を、ｐＵＣ１９（C. Yanish-Porch 等、 既出）にてサブクローン化してプラスミッドｐＴＧ７４５７（図１３）を与えた。
【０１７３】
２．ＰＧＫターミネーターのサブクローン化
ｐＵＣ１９を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、下記のオリゴヌクレオチドを用いて、新たな「ポリリンカー」ＢａｍＨＩ  ＳｓｔＩを導入した：
【化２５】
5' GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 3'    SEQ ID NO:２０、
【化２６】
0004082469.tif 000010
【化２７】
5' CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 3'   SEQ ID NO:２２  及び
【化２８】
5' AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 3'          SEQ ID NO:２３。
【０１７４】
この方法で得たプラスミッドｐＴＧ７４５３（図１４）を、次いで、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳｓｔＩで消化した。ＢａｍＨＩとＳｓｔＩの間の「ポリリンカー」の部位を、上で得たプラスミッドｐＴＧ７４５７の誘導体に導入して、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳｓｔＩで消化した。得られた新たなプラスミッドは、ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳｓｔＩ（＝ＳａｃＩ）、ＭｌｕＩ、ＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｎａＢＩ、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＰｖｕＩ部位を含む。
【０１７５】
この新しいプラスミッドを、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＰＧＫプロモーター（R. A. Hitzeman等、 Nucleic Acids Res., 10, 7791, 1982）を含むＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を前者に挿入してプラスミッドｐＴＧ１００１４（図１５）を与えた。
【０１７６】
３．プロモーターのサブクローニング：
ａ）ＣＹＣ１プロモーター
プラスミッドｐＴＧ７４５３のＢａｍＨＩとＳｓｔＩの間の「ポリリンカー」の部位を、上で同定したプラスミッドｐＴＧ７４５７の誘導体に導入した。得られた新しいプラスミッドを制限酵素ＳｎａＢＩで消化し、次いで、ファージｆ１の複製オリジンを含むプラスミッドｐＥＭＢＬ８（L. Dente等、 Nucleic Acids Res., 11, 1645, 1983）の４５６ｂｐのＲｓａＩ−ＤｒａＩ断片を導入してプラスミッドｐＴＧ７５０３を与えた。
【０１７７】
欧州特許出願ＥＰ０３４０３７８の実施例６において調製したプラスミッドｐＧＢＳＣＣ−９の０．７８ｋｂのＢａｍＨＩ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片（S.cerevisiaeのＣＹＣ１プロモーター、「ポリリンカー」及び K.lactis のラクターゼターミネーターを含む）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミッドｐＴＧ７５０３中にサブクローン化してプラスミッドｐＴＧ１０００４（図１６）を与えた。
【０１７８】
次いで、ＣＹＣ１プロモーターのＸｈｏＩ及びＭｌｕＩ部位を、下記のオリゴヌクレオチドを用いる、プラスミッドｐＴＧ１０００４の二本鎖ＤＮＡの位置指定突然変異導入法によって除去した：
【化２９】
0004082469.tif 000011
こうして得られたプラスミッドｐＴＧ１０００５を、次いで、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化し、それから、ＭｌｕＩ部位を、下記のオリゴヌクレオチドを用いて導入して：
【化３０】
5' TCGACGGACG CGTGG 3'                        SEQ ID NO:２５
及び
【化３１】
5' TCGACCACGC GTCC 3'                         SEQ ID NO:２６
プラスミッドｐＴＧ１０００６を与えた。
【０１７９】
ｂ）ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーター
プラスミッドｐＹｅＤＰ１／８−２（C. Cullin 等、 Gene, 203, 1988 ）を、制限酵素ＸｈｏＩで開いた。生成した粘着末端を、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を用いて埋め、次いで、そのプラスミッドを再結合（religated ）した。こうして得られたプラスミッドｐＴＧ１００１０（ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーターは、もはやＸｈｏＩ部位を含まない）を、ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用いる。
【０１８０】
４．発現ベクターｐＴＧ１００３１の構築
ｌａｃＺをコードする配列の残りの部分を、下記のオリゴヌクレオチドを用いる位置指定突然変異導入法により、プラスミッドｐＴＧ７５０３において除去して：
【化３２】
5' TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 3'  SEQ ID NO:２７
プラスミッドｐＴＧ７５４９を与えた。
【０１８１】
プラスミッドｐＴＧ７５４９中に存在するＬａｃＺプロモーターを、次いで、下記のオリゴヌクレオチドを用いて削除して：
【化３３】
5' GGCCGCAAAA CCAAA 3'                        SEQ ID NO:２８
及び
【化３４】
5' AGCTTTTGGT TTTGC 3'                        SEQ ID NO:２９
（これらは、予め制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミッド中に挿入されており、２つの部位を回復する）プラスミッドｐＴＧ７５５３を与えた。
【０１８２】
ＣＹＣ１プロモーターを含むＢａｍＨＩ  ＭｌｕＩ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＭｌｕＩで消化したプラスミッドｐＴＧ１０００６から得て、ＰＧＫプロモーターを含むＭｌｕＩ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、制限酵素ＭｌｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミッドｐＴＧ１００１５から単離した。これらの２種の断片をライゲートし、得られたライゲーション生成物を、制限酵素ＭｌｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで予め消化したプラスミッドｐＴＧ７５５３に挿入した。
【０１８３】
下記のオリゴヌクレオチド：
【化３５】
5' GATCTATCGA TGCGGCCGCG 3'                   SEQ ID NO:３０
を下記のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせたもの
【化３６】
5' CGCGCGCGGC CGCATCGATA 3'                   SEQ ID NO:３１
（該ハイブリッド分子は、ＣｌａＩ及びＮｏｔＩ部位を含むＢａｍＨＩ  ＭｌｕＩ「リンカー」を構成する）を加えて、ライゲートして発現ベクターｐＴＧ１００３１（図１７）を与えた。
【０１８４】
プラスミッドｐＹｅＤＰ１／８−２から上で得たＰＣＲにより増幅した断片を制限酵素ＣｌａＩ及びＳａｌＩで消化し、次いで、予め同じ制限酵素で消化したプラスミッドｐＴＧ１００３１に導入してプラスミッドｐＴＧ１００３３（図１８）を与えた。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】酵母ＦＹ１６７９中のA.thalianaライブラリーのスクリーニングにより得られたナイスタチン耐性のクローンＦ２２から抽出した全ステロールのプロフィルを示す図である。２０５ｎｍ若しくは２８５ｎｍでのＲＰ−ＨＰＬＣにより、トランスフォームしてない酵母ＦＹ１６７９と比較して、分析を行なう。
【図１Ｂ】酵母ＦＹ１６７９中のA.thalianaライブラリーのスクリーニングにより得られたナイスタチン耐性のクローンＦ２２から抽出した全ステロールのプロフィルを示す図である。２０５ｎｍ若しくは２８５ｎｍでのＧＣにより、トランスフォームしてない酵母ＦＹ１６７９と比較して、分析を行なう。
【図２】プラスミッドｐＦ２２のＮｏｔＩ断片の制限地図及び配列決定のストラテジーを示す図である。
【図３Ａ】ｃＤＮＡデルタ−７Ｒｅｄのヌクレオチド配列（SEQ ID NO:１）及び対応するアミノ酸配列（SEQ ID NO:２）を示す図である。
【図３Ｂ】ｃＤＮＡデルタ−７Ｒｅｄのヌクレオチド配列（SEQ ID NO:１）及び対応するアミノ酸配列（SEQ ID NO:２）を示す図（続き）である。
【図３Ｃ】ｃＤＮＡデルタ−７Ｒｅｄのヌクレオチド配列（SEQ ID NO:１）及び対応するアミノ酸配列（SEQ ID NO:２）を示す図（続き）である。
【図３Ｄ】ｃＤＮＡデルタ−７Ｒｅｄのヌクレオチド配列（SEQ ID NO:１）及び対応するアミノ酸配列（SEQ ID NO:２）を示す図（続き）である。
【図３Ｅ】ｃＤＮＡデルタ−７Ｒｅｄのヌクレオチド配列（SEQ ID NO:１）及び対応するアミノ酸配列（SEQ ID NO:２）を示す図（続き）である。
【図４】誘導可能発現ベクター「デルタ−７／Ｖ８」でトランスフォームしたＦＹ１６７９のミクロソーム画分のデルタ−５，７−ステロール，デルタ−７レダクターゼ活性のイン・ビトロでの測定を示す図である。ＧＣを用いて分析を行ない、内因性ステロール５，２２ジエン３−オール（ＲＴ＝１６．６８２）；エルゴステロール（ＲＴ＝１７．２４９）；エルゴスタ５−エン３−オール（ＲＴ＝１７．６６４）の存在下での基質７−デヒドロコレステロール（ＲＴ＝１６．５２８）のコレステロール（ＲＴ＝１５．８８７）へのトランスフォームを示す。
【図５Ａ】エルゴスタ５−エン３−オールの制限によるイン・ビトロでのプレグネノロンの生成（デルタ−７Ｒｅｄを発現するトランスフォームした酵母から精製し、次いで、Ｐ450 ＳＣＣ、ＡＤＸ及びＡＤＲとインキュベートする）を示す図である。コレステロールの対照制限と比較したＧＣにより分析を実施する。
【図５Ｂ】エルゴスタ５，２４（２８）ジエン３−オールの制限によるイン・ビトロでのプレグネノロンの生成（デルタ−７Ｒｅｄを発現するトランスフォームした酵母から精製し、次いで、Ｐ450 ＳＣＣ、ＡＤＸ及びＡＤＲとインキュベートする）を示す図である。コレステロールの対照制限と比較したＧＣにより分析を実施する。
【図５Ｃ】エルゴスタ５，２２ジエン３−オールの制限によるイン・ビトロでのプレグネノロンの生成（デルタ−７Ｒｅｄを発現するトランスフォームした酵母から精製し、次いで、Ｐ450 ＳＣＣ、ＡＤＸ及びＡＤＲとインキュベートする）を示す図である。コレステロールの対照制限と比較したＧＣにより分析を実施する。
【図６Ａ】デルタ−７Ｒｅｄ（ステロールデルタ−７レダクターゼ）をコードするｃＤＮＡのインテグレーションを可能にするインテグレートプラスミッドｐＡＤデルタ−７の構築を示す図である。
【図６Ｂ】デルタ−７Ｒｅｄ（ステロールデルタ−７レダクターゼ）をコードするｃＤＮＡのインテグレーションを可能にするインテグレートプラスミッドｐＡＤデルタ−７の構築を示す図（続き）である。
【図７】ＦＹ１６７９株及びインテグレートされたＥＬＲ０１株（ガラクトースの存在下で培養）のアルカリ鹸化により抽出した全ステロールのＧＣによる分析を示す図である。
【図８】多数クローニング部位に単一ＳａｌＩ（Ｓａ）を含むシャトルベクターE.coli-S.cerevisiae Ｖ１３の構築を示す図式表示である。
【図９Ａ】ＡＤＲ発現カセットのｌｅｕ２とｓｐｌ１デルタとの遺伝子間領域への挿入を可能にするインテグレートプラスミッドｐＣＤ６２−１及びｐＣＤ６２−２の構築の段階を示す図である。ＭＣＳ１及びＭＣＳ２：  多数クローニング部位
【図９Ｂ】ＡＤＲ発現カセットのｌｅｕ２とｓｐｌ１デルタとの遺伝子間領域への挿入を可能にするインテグレートプラスミッドｐＣＤ６２−１及びｐＣＤ６２−２の構築の段階を示す図（続き）である。ＭＣＳ１及びＭＣＳ２：  多数クローニング部位
【図９Ｃ】ＡＤＲ発現カセットのｌｅｕ２とｓｐｌ１デルタとの遺伝子間領域への挿入を可能にするインテグレートプラスミッドｐＣＤ６２−１及びｐＣＤ６２−２の構築の段階を示す図（続き）である。ＭＣＳ１及びＭＣＳ２：  多数クローニング部位
【図１０】ＣＤＲ０１株の構築ストラテジーを示す図である。
【図１１Ａ】２つの発現カセットＡＤＸ及びＰ450 ＳＣＣを含む発現プラスミッドｐＣＤ６３の構築の段階を示す図である。
【図１１Ｂ】２つの発現カセットＡＤＸ及びＰ450 ＳＣＣを含む発現プラスミッドｐＣＤ６３の構築の段階を示す図（続き）である。
【図１２Ａ】ガラクトースにより９時間にわたって誘導した後に、細胞（細胞溶解物）又は培養培地（ＥＣ０１／ｐＣＤ６３から単離）から抽出したステロールのＧＣによる分析を示す図である。
【図１２Ｂ】ガラクトースにより２４時間にわたって誘導した後に、細胞（細胞溶解物）又は培養培地（ＥＣ０１／ｐＣＤ６３から単離）から抽出したステロールのＧＣによる分析を示す図である。
【図１３】プラスミッドｐＴＧ７４５７の構造を示す図である。
【図１４】プラスミッドｐＴＧ７４５３の構造を示す図である。
【図１５】プラスミッドｐＴＧ１００１４の構造を示す図である。
【図１６】プラスミッドｐＴＧ１０００４の構造を示す図である。
【図１７】プラスミッドｐＴＧ１００３１の構造を示す図である。
【図１８】プラスミッドｐＴＧ１００３３の構造を示す図である。
【図１Ａ】
0004082469.tif 000015
【図１Ｂ】
0004082469.tif 000016
【図２】
0004082469.tif 000017
【図３Ａ】
0004082469.tif 000018
【図３Ｂ】
0004082469.tif 000019
【図３Ｃ】
0004082469.tif 000020
【図３Ｄ】
0004082469.tif 000021
【図３Ｅ】
0004082469.tif 000022
【図４】
0004082469.tif 000023
【図５Ａ】
0004082469.tif 000024
【図５Ｂ】
0004082469.tif 000025
【図５Ｃ】
0004082469.tif 000026
【図６Ａ】
0004082469.tif 000027
【図６Ｂ】
0004082469.tif 000028
【図７】
0004082469.tif 000029
【図８】
0004082469.tif 000030
【図９Ａ】
0004082469.tif 000031
【図９Ｂ】
0004082469.tif 000032
【図９Ｃ】
0004082469.tif 000033
【図１０】
0004082469.tif 000034
【図１１Ａ】
0004082469.tif 000035
【図１１Ｂ】
0004082469.tif 000036
【図１２Ａ】
0004082469.tif 000037
【図１２Ｂ】
0004082469.tif 000038
【図１３】
0004082469.tif 000039
【図１４】
0004082469.tif 000040
【図１５】
0004082469.tif 000041
【図１６】
0004082469.tif 000042
【図１７】
0004082469.tif 000043
【図１８】
0004082469.tif 000044