(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記反応式（１）、（２）及び（３）で示される酵素反応を利用してクレアチンホスホキナーゼの活性を測定する方法であって、Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’−）ペンタホスフェートと、グルコース−６−リン酸を除く糖リン酸エステルとを使用して溶血干渉を回避することを特徴とするクレアチンホスホキナーゼ活性の測定方法。
【化１】
0004067147.tif 000007
【請求項２】
糖リン酸エステルとして、グルコース−１，６−ジリン酸、フルクトース−１，６−ジリン酸、フルクトース−２，６−ジリン酸、アラビノース−５−リン酸、エリスロース−４−リン酸、グリセリン酸−２−リン酸、グリセリン酸−３−リン酸、グリセリン酸−２，３−ジリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、グリセロール−３−リン酸及びマルトース−６−リン酸から選ばれた１種又は２種以上を使用する請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のクレアチンホスホキナーゼ活性の測定方法に用いられるクレアチンホスホキナーゼ活性測定用試薬であって、第１試薬と第２試薬よりなり、第１試薬はβ−ＮＡＤ（Ｐ）を少なくとも含有し、第２試薬はＡＤＰ及びクレアチンリン酸を少なくとも含有し、Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’−）ペンタホスフェート及び糖リン酸エステルがそれぞれ第１試薬及び第２試薬の少なくとも一方に添加されていることを特徴とするクレアチンホスホキナーゼ活性測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はクレアチンホスホキナーゼ（以下、ＣＰＫという）活性の測定方法及び試薬に関する。より詳細には、酵素法によるＣＰＫ活性の測定法において、溶血による干渉を回避することができる方法及びその試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＣＰＫは分子量約８万のＳＨ酵素であり、後記反応式−１で示される酵素反応を可逆的に触媒し、筋収縮に伴うエネルギー代謝に重要な働きをしている。ＣＰＫは、急性心筋梗塞、多発性筋炎、進行性筋ジストロフィーにおいて異常増加が認められることから、臨床検査においてＣＰＫ活性の測定（定量）が行われている。また、筋萎縮症の判別にもＣＰＫ活性の測定が利用される。
ＣＰＫ活性測定は、下記反応式−１，２，３で示されるように、クレアチンリン酸、ＡＤＰを基質としてヘキソキナーゼ（ＨＫ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を共役させ、β−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度上昇として測定する酵素反応法により行われている。
【０００３】
0004067147.tif 000002
【０００４】
しかしながら、上記の方法において、溶血した検体中のＣＰＫ活性を測定しようとすると血球中の成分により正の干渉を受ける。この原因は、ＭＫ（ミオキナーゼ）がＡＤＰを基質としてＡＴＰとＡＭＰを生成するため（反応式−４参照）、その分ＣＰＫ活性により生成したＡＴＰに上乗せされて測り込まれてしまうことによる。
この溶血の影響（一般に溶血干渉といわれる）を回避するためには、大きく分けて２つの方法がある。１つはＭＫの活性を阻害するものであり、ＡＭＰ、Ｐ1，Ｐ5−ジ（アデノシン−５’−）ペンタホスフェート（以下、Ａｐ５Ａという）の添加が行われている（臨床化学・補冊231-255; 1987)。他にＮａＦ(Clin. Chem., 23, 1569-1575; 1977)、抗ミオキナーゼ抗体（特開平５−２６０９９７号公報）などを添加する報告がある。もう１つは、検体盲検（クレアチンリン酸を除く試料を用いた測定値）をとって、その値を差し引くことにより溶血干渉を回避する方法であり、現在、自動分析措置においてはダブルレートが行えるようになってきているので、広く用いられている。この方法の原理は、試薬を２つに分け、第１試薬にはクレアチンリン酸を除くすべてを加えておき、第２試薬をクレアチンリン酸にする。検体と第１試薬だけを反応させ吸光度変化料を測定する（ＭＫ活性の測定）。次に第２試薬を加えて反応させ吸光度変化量を測定する（ＭＫ＋ＣＰＫ活性の測定）。前後の吸光度変化量を差し引くことにより真のＣＰＫ活性を求める方法である。
【０００５】
しかし、上述の方法は、ダブルレートすることのできない自動分析装置に対しては応用できないし、２回測定して差し引くために再現性の低下が起こるだけでなく、第２試薬添加前後のｐＨ変動、希釈による反応条件の変化が起こるため、正確には盲検をとれないという問題がある。また、第１試薬中にクレアチンリン酸を除くすべてを添加するため試薬の安定性が低下する問題が起こる。例えば、グルコース、ＮＡＤ（Ｐ）とＧ６ＰＤＨを共存させると、Ｇ６ＰＤＨはグルコースデヒドロゲナーゼ活性を持っているために経時的にＮＡＤ（Ｐ）がＮＡＤ（Ｐ）Ｈとなり試薬ブランクの上昇が起こってしまう。また、ＡＤＰのｐＨ安定性はアルカリ側（ｐＨ８以上）で安定であり、酸性側では経時的に加水分解されてリン酸基が遊離してＡＭＰになる。特に最近では液状安定化試薬が要望されており、こうした不安定要因は極力排除する必要性がある。従って、グルコース、ＡＤＰをアルカリ性の第２試薬（クレアチンリン酸もＡＤＰと同様のｐＨ安定性を示す）に添加する方が安定な液状試薬になる。ところが、逆にこうした安定化液状試薬にするとダブルレートができなくなってしまう欠点を有していた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような問題から、本発明者等は、溶血干渉を回避できると共に液状安定性に優れた試薬を目的として鋭意検討を行った。まず、従来からＭＫ活性の阻害剤として使用されているＡｐ５Ａを大量に添加する実験を行った（後記参考例２及び図３参照）。その結果、Ａｐ５Ａは約１００μＭ以上加えても溶血干渉を完全に回避することはできず、一定の溶血干渉を受けることが分かった。この事実は、溶血干渉がＭＫ以外の血球成分による干渉と考えられた（図３の結果より９５％はＭＫ活性による干渉であると推察される）。そこで、本発明者等は、血球成分が解糖系の酵素、基質成分（糖のリン酸エステル）を多く含むことから、各種糖リン酸エステルを加えることにより解糖系酵素を阻害できるのではと考え、Ａｐ５Ａと糖リン酸エステルを併用したところ、溶血干渉を著しく低減できることが判明した。また、測定用試薬各成分の配合組合せの最適化を図ることにより、安定性の高い液状製剤を得られることが判明した。本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明の目的は、溶血干渉を回避できるＣＰＫ活性測定法及び液状安定性の良好なＣＰＫ活性測定試薬を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明の要旨は、
(a)下記反応式（１）、（２）及び（３）で示される酵素反応を利用してクレアチンホスホキナーゼの活性を測定する方法であって、Ａｐ５Ａと、グルコース−６−リン酸を除く糖リン酸エステルとを使用して溶血干渉を回避することを特徴とするクレアチンホスホキナーゼ活性の測定方法；
【化２】
0004067147.tif 000003
(b)糖リン酸エステルとして、グルコース−１，６−ジリン酸、フルクトース−１，６−ジリン酸、フルクトース−２，６−ジリン酸、アラビノース−５−リン酸、エリスロース−４−リン酸、グリセリン酸−２−リン酸、グリセリン酸−３−リン酸、グリセリン酸−２，３−ジリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、グリセロール−３−リン酸及びマルトース−６−リン酸から選ばれた１種又は２種以上を使用する上記(a)記載の方法；
(c)上記(a)又は(b)に記載のクレアチンホスホキナーゼ活性の測定方法に用いられるクレアチンホスホキナーゼ活性測定用試薬であって、第１試薬と第２試薬よりなり、第１試薬はβ−ＮＡＤ（Ｐ）を少なくとも含有し、第２試薬はＡＤＰ及びクレアチンリン酸を少なくとも含有し、Ａｐ５Ａ及び糖リン酸エステルがそれぞれ第１試薬及び第２試薬の少なくとも一方に添加されていることを特徴とするクレアチンホスホキナーゼ活性測定用試薬；
である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は上記の構成よりなり、本発明の測定方法は、上記反応式（１）、（２）及び（３）で示される酵素反応を利用したＣＰＫ活性の測定法において、Ａｐ５Ａと、グルコース−６−リン酸を除く糖リン酸エステルとを使用して溶血干渉を回避することからなる。即ち、前述のように、Ａｐ５Ａのみでは溶血干渉を完全に回避するには困難であり、本発明ではＡｐ５Ａと、グルコース−６−リン酸を除く糖リン酸エステルとを併用して溶血干渉を低減するものである。
本発明において、糖リン酸エステルとしては、Ａｐ５Ａと併用することにより溶血干渉を低減できるものであれば各種の糖リン酸エステル類を使用することができるが、好ましい例としては、例えば、グルコース−１，６−ジリン酸、フルクトース−１，６−ジリン酸、フルクトース−２，６−ジリン酸、アラビノース−５−リン酸、エリスロース−４−リン酸、グリセリン酸−２−リン酸、グリセリン酸−３−リン酸、グリセリン酸−２，３−ジリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、グリセロール−３−リン酸、マルトース−６−リン酸などが挙げられる。なお、糖リン酸エステルは２種以上を併用してもよい。
Ａｐ５Ａと糖リン酸エステルの使用量は、Ａｐ５Ａと糖リン酸エステルの相互の使用量、検体中の溶血成分含量などに依存するが、前述のようにＡｐ５ＡはＣＰＫ活性測定反応液中、約１００μＭの濃度で使用するのが好ましく、この場合、糖リン酸エステルはＣＰＫ活性測定反応液中で０．２〜５ｍＭ程度、好ましくは０．３〜３ｍＭ程度に調整される。０．２ｍＭ未満では効果が不十分であり、また５ｍＭを超えるとＣＰＫ活性を阻害するおそれがある。
【０００９】
本発明の方法はＣＰＫ活性測定反応液中にＡｐ５Ａと糖リン酸エステルを共存させることにより行うことができ、本発明の方法によれば、溶血干渉を回避できるので、シングルレートで測定を行うことができる。更に、従来のダブルレートする場合においても、検体盲検の吸光度変化量は小さい方が正確に測定されるため、ダブルレートに本発明の方法を適用しても効果を奏する。
また、本発明の方法は、前述の反応式−１，２，３に基づくＣＰＫ活性の測定法に限らず、酵素反応を利用したＣＰＫ活性の測定法であって、溶血干渉を受ける方法であれば、何れの方法にも効果的に利用することができる。
【００１０】
次に、本発明のＣＰＫ活性測定試薬は、前記反応式−１，２，３に基づくＣＰＫ活性測定用試薬であり、
(a)第１試薬と第２試薬よりなり、
(b)第１試薬はβ−ＮＡＤ（Ｐ）を少なくとも含有し、第２試薬はＡＤＰ及びクレアチンリン酸を少なくとも含有し、
(c)Ａｐ５Ａ及び糖リン酸エステルのそれぞれが第１試薬及び第２試薬の少なくとも一方に添加されていること、
からなる。
前述のように、現在、ＣＰＫ活性測定用試薬においては液状製剤が好まれているが、前記反応式−１，２，３に基づくＣＰＫ活性測定試薬の構成成分において、グルコース、β−ＮＡＤ（Ｐ）及びＧ６ＰＤＨを共存させると、経時的にβ−ＮＡＤ（Ｐ）が還元されてβ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成して試薬ブランクの上昇が起こり、またクレアチンリン酸やＡＤＰはアルカリ性側で安定であることが判明した。
【００１１】
このような事実から、本発明者等は、液状で且つ安定性の高いＣＰＫ活性測定用試薬を得るため、試薬各成分の組合せを種々検討した結果、測定用試薬を第１試薬と第２試薬に分け、第１試薬にはβ−ＮＡＤ（Ｐ）を少なくとも含有させ、第２試薬はＡＤＰ及びクレアチンリン酸を少なくとも含有させることにより、測定用試薬の安定性を著しく高められることが判明した。更に、Ａｐ５Ａ及び糖リン酸エステルをそれぞれ第１試薬及び第２試薬の少なくとも一方に添加（好ましくは第１試薬にＡｐ５Ａを、第２試薬に糖リン酸エステルを添加）することにより、溶血干渉の回避を図った。なお、他の試薬成分であるＧ６ＰＤＨ、ＨＫ、グルコースなどは、保存安定性や酵素反応性を考慮して、第１試薬及び／又は第２試薬に添加される。
即ち、本発明のＣＰＫ活性測定用試薬は、安定性の高い液状製剤であり、且つ溶血干渉を回避できる試薬を提供するものである。
【００１２】
上記の第１試薬は適当な緩衝液（例えば、イミダゾール緩衝液、トリス緩衝液等）溶液とされ、液性は弱酸性（ｐＨ６．０〜６．８程度）とするのが好ましく、また第２試薬は適当な緩衝液（例えば、ジエタノールアミン緩衝液、モノエタノールアミン緩衝液等）溶液とされ、液性はアルカリ性（ｐＨ８．５〜９．５程度）とするのが好ましい。
また、ＣＰＫは、チオール化合物、Ｍｇ2+などにより活性化されるので、第１試薬及び／又は第２試薬には、これらの活性化成分を添加するのが好ましい。
なお、Ａｐ５Ａ及び糖リン酸エステルの使用量は前述の条件を引用することができる。
より具体的に一例を示すと、第１試薬としては、２〜３ｍＭのβ−ＮＡＤ（Ｐ）、２〜３Ｕ／ｌのＧ６ＰＤＨ、４〜６Ｕ／ｌのＨＫ、１０ｍＭ程度の酢酸マグネシウム、２ｍＭ程度のＥＤＴＡ、４０〜５０ｍＭのチオグリセロールを含有するイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．５程度）；第２試薬としては、６．５〜７．５ｍＭのＡＤＰ、６５〜８０ｍＭのグルコース、９０〜１２０ｍＭのクレアチンリン酸、１０ｍＭ程度の酢酸マグネシウム、２ｍＭ程度のＥＤＴＡ、５〜２０ｍＭ程度のＡＭＰを含有するジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．０程度）が例示される。
【００１３】
本発明の試薬の使用法としては、例えば、検体と第１試薬とを混合し、３７℃程度で５分間程度インキュベートした後、第２試薬を添加して２分間程度インキュベートし、次いで波長３４０ｎｍの吸光度変化量を測定することによりＣＰＫ活性を測定することができる。
本発明の方法及び試薬は、臨床検査における血清検体中のＣＰＫ活性測定などに利用される。
【００１４】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、溶血干渉を回避することができるので、検体の性状にかかわらずＣＰＫ活性を正確に測定することができるという効果を奏する。
また、本発明の試薬によれば、溶血干渉を回避できると共に、長期間安定な液状製剤を得ることができるという効果を奏する。
【００１５】
【実施例】
以下、参考例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
参考例１
１００ｍＭ イミダゾール緩衝液（ｐＨ５．８，ｐＨ６．６，ｐＨ７．３）、１００ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．１）、１００ｍＭ ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．１）、１００ｍＭ モノエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１０．１）に１０ｍＭのクレアチンリン酸及びＡＤＰを別々に溶解し、３０℃で１４日間放置後、クレアチンリン酸濃度とリン酸濃度及びＡＤＰ濃度とリン酸濃度の測定を行った。
その結果を図１（クレアチンリン酸の安定性）及び図２（ＡＤＰの安定性）に示す。ＡＤＰ、クレアチンリン酸ともｐＨ９以上では安定性は良好であるが、酸性側ではリン酸の生成に比例して残存量が低下している。従ってＡＤＰ、クレアチンリン酸はアルカリ側の試薬に添加した方が試薬の安定化が図れる。
【００１６】
参考例２
以下の組成のＣＰＫ試薬を調製し、第２試薬にＡｐ５Ａの濃度を変えて添加した。溶血液は、ヒト血球を生理食塩水で洗浄したものに精製水を加え、−２０℃で凍結融解させて調製した。検体は、ヒト血清９容に溶血液１容を加えて、ヘモグロビン濃度が５００ｍｇ／ｄｌになるよう調製した。溶血液の代わりに精製水１容添加したものをコントロールとした。検体８μｌに第１試薬２５０μｌを加え３７℃で５分間インキュベートした。これに第２試薬１００μｌを加え２分間インキュベート後、波長３４０ｎｍの吸光度変化量からＣＰＫ活性を測定した。結果を図３に示した。
図３から分かるように、Ａｐ５Ａは１００μＭまではＭＫ活性に相当すると思われる溶血干渉の低下が見られるが、１００μＭ以上では濃度を上げても溶血干渉は低くならない。従って、この溶血干渉分はＭＫ以外の成分による干渉と考えられた。
【００１７】
（第１試薬）
１４３ｍＭ イミダゾール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、４３ｍＭ チオグリセロール、２．８６ｍＭ β−ＮＡＤ（Ｐ）、２．５Ｕ／ｌ Ｇ６ＰＤＨ、５Ｕ／ｌ ＨＫ（ｐＨ８．６）
（第２試薬）
２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、７．１６ｍＭ ＡＤＰ、１７．９ｍＭ ＡＭＰ、７２ｍＭ グルコース、１０４ｍＭ クレアチンリン酸（ｐＨ９．０）
【００１８】
実施例１
参考例２の試薬組成の第２試薬に０．３６ｍＭ Ａｐ５Ａを添加し（ＣＰＫ活性測定反応液中、１００μＭ）、第１試薬に１ｍＭ（ＣＰＫ活性測定反応液中、０．７ｍＭ）の各種リン酸エステルを添加した。検体及び操作方法は、参考例２に準じて調製、操作した。結果を表１に示した。
表１に示されるように、糖リン酸エステルを添加することにより、溶血干渉を回避できるとことが判明した。
【００１９】
【表１】
0004067147.tif 000004
【００２０】
実施例２
実施例１で特に効果の高かった糖リン酸エステルの濃度を変えて実施例１と同様に操作し、糖リン酸エステル濃度の影響を調べた。その結果を表２に示す。表２に示される結果より、ＣＰＫ活性測定反応液中に０．２ｍＭ以上の濃度で効果が現われる。添加量が多い程影響を回避できるが、ＣＰＫ活性も低下することから０．２〜３ｍＭ以下の添加が好ましい。
【００２１】
【表２】
0004067147.tif 000005
【００２２】
実施例３
溶血液の添加量を変えてヘモグロビン量として０，１００，２００，３００，４００，５００ｍｇ／ｄｌになるよう検体を調製した。実施例１の第２試薬に３ｍＭ（ＣＰＫ活性測定反応液中、０．８４ｍＭ）のグリセリン酸−２，３−ジリン酸を添加し、各検体のＣＰＫ活性を測定した。その結果を表３に示す。
またダブルレートのできる試薬として以下の試薬を調製し、第２試薬反応分から第１試薬反応分（検体盲検）を差し引く方法と比較した。その結果も表３に示した。
表３に示されるように、ダブルレートの主反応では最大２２Ｕ／ｌの溶血干渉を受けているが、盲検を差し引くと最大５Ｕ／ｌの溶血干渉になる。それに対して、グリセリン酸−２，３−ジリン酸を添加した本発明は、シングルレートでも最大５Ｕ／ｌの溶血干渉であることが明らかになった。
【００２３】
（第１試薬）
１４３ｍＭ イミダゾール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、２ｍＭ ＡＤＰ、５ｍＭ ＡＭＰ、２０ｍＭ グルコース、４３ｍＭ チオグリセロール、２．８６ｍＭ β−ＮＡＤ（Ｐ）、２．５Ｕ／ｌ Ｇ６ＰＤＨ、５Ｕ／ｌ ＨＫ（ｐＨ８．６）
（第２試薬）
２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．３６ｍＭ Ａｐ５Ａ、３ｍＭ グリセリン酸−２，３−ジリン酸、２ｍＭ ＡＤＰ、５ｍＭ ＡＭＰ、２０ｍＭ グルコース、１０４ｍＭ クレアチンリン酸（ｐＨ９．０）
【００２４】
【表３】
0004067147.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】クレアチンリン酸のｐＨ安定性を示す図である。
【図２】ＡＤＰのｐＨ安定性を示す図である。
【図３】溶血干渉に与えるＡｐ５Ａの効果を示す図である。
【図１】
0004067147.tif 000008
【図２】
0004067147.tif 000009
【図３】
0004067147.tif 000010