(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板のスロンビンリセプタの開裂を抑制することによってスロンビン誘発の血小板凝集を抑制するための薬剤を製造するためのペプチドの使用であって、前記ペプチドは式：
0004067117.tif 000031
［式中、
Ｘ1は、０〜３０個の天然もしくは合成アミノ酸であり；
Ｘ2は、０〜３０個の天然もしくは合成アミノ酸である］
のアミノ酸配列からなり、ただし前記ペプチドは天然ブラジキニンであってはならないことを特徴とする前記ペプチドの使用。
【請求項２】
血小板のスロンビンリセプタの開裂を抑制することによってスロンビン誘発の血小板凝集を抑制するための薬剤を製造するためのペプチドの使用であって、前記ペプチドはアミノ酸配列
0004067117.tif 000032
からなる２個もしくはそれ以上のセグメントからなり、前記ペプチドは式：
0004067117.tif 000033
［式中、
Ｌは共有結合もしくは化学基を含むリンカーであり；
Ｘ1は各セグメントにて同一でも異なってもよく、０〜３０個の天然もしくは合成アミノ酸であり；
Ｘ2は各セグメントにて同一でも異なってもよく、０〜３０個の天然もしくは合成アミノ酸であり；
ｎは２〜２０の整数である］
で表されることを特徴とする前記ペプチドの使用。
【請求項３】
Ｘ2は、１〜３０個の天然もしくは合成アミノ酸であることを特徴とする請求項１又は２のペプチドの使用。
【請求項４】
式：
0004067117.tif 000034
で表される化合物。
【請求項５】
式：
0004067117.tif 000035
で表される化合物。
【請求項６】
医薬キャリアと、請求項４又は５の化合物と、を含むことを特徴とする、血栓症又は動脈閉塞を予防又は処置するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
政府認可の説明
ここに記載する発明は部分的に認可番号ＨＬ−３５５５３としてナショナル・ハート・ラング・アンド・ブラッド・インスチチュートにより支援された研究の過程でなされたものである。
関連出願の説明
本出願は１９９５年６月９日付け出願の米国特許出願第６０／０００，０９６号を優先権とする。
発明の技術分野
本発明は、α−スロンビン−誘発およびＡＤＰ−誘発の細胞活性化の抑制に関するものである。
発明の背景
ブラジキニンは、カリクレインおよび他の酵素により先駆体血漿キニノゲンから遊離される血管活性ペプチドである［サリバ等、アメリカン・ジャーナル・フィジオロジー、第１５６巻、第２６１〜２７４頁（１９４９）］。ブラジキニンは、プロスタサイクリン産生の刺激［Ｓ．Ｌ．ホンダ、スロンビン・リサーチ、第１８巻、第７８７頁（１９８０）：クラッチレイ等、バイオヘミカ・バイオフィジカ・アクタ、第７５１巻、第９９頁（１９８３）］およびプラスミノーゲン活性化剤の放出の刺激［スミス等、ブラッド、第６６巻、第８３５頁（１９８３）］を含め複数の生理学的機能を有すると記載されている。ブラジキニンは超酸化物形成および内皮依存性の平滑筋過分極を誘発する［Ｊ．Ａ．ホーランド等、ジャーナル・セル・フイジオロジー、第１４３巻、第２１頁（１９９０；Ｍ．ナカシマ等、ジャーナル・クリニカル・インベスチゲーション、第９２巻、第２８６７頁（１９９３）］。アセチルコリンと並び、ブラジキニンは窒素酸化物生成の主たる誘発剤である［Ｒ．Ｍ．Ｊ．パルマー等、ネイチャー、第３２７巻、第５２４頁（１９８７）］。ブラジキニンは大抵の血管床にて血管拡張をもたらすと特性化されており、これは冠動脈循環にて血流増加をもたらす［ライン等、ジャーナル・モレキュラ・セル・カルジオロジー、第２４巻、第９０９頁（１９９２）］。これらの特徴はブラジキニンを心臓保護剤として特性化している［ライン等、上記；ゴールケ等、ハイパーテンション、第２３巻、第４１１頁（１９９４）；パラット等、カルジオバスキュラ・リサーチ、第２８巻、第１８３頁（１９９４）；ツァンジンガー等、カルジオバスキュラ・リサーチ、第２８巻、第２０９頁（１９９４）］。アンギオテンシン変換酵素抑制剤によるブラジキニンの上昇は、これら薬物が心臓疾患に対する有利な作用を促進するメカニズムであると思われる。
ブラジキニンの放出に加え、その親蛋白質、すなわち高（ＨＫ）および低（ＬＫ）分子量キニノゲンもα−スロンビンの選択性抑制剤となる能力を有し、細胞を活性化させるα−スロンビンの能力を抑制するが、その酵素能力を阻害しない［メロニー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストー、第２６６巻、第６７８６頁（１９９１）；プリ等、ブラッド、第７７巻、第５００頁（１９９１）］。この活性はキニノゲンの独特な機能、すなわち他の蛋白質には寄与していない機能であると思われた。α−スロンビンの殆どの天然産ヒト蛋白質抑制剤はそのプロテアーゼ活性に向けられる。ＨＫおよびＬＫは、血小板膜への結合からα−スロンビンを封鎖することにより血小板を活性化させるスロンビンの能力の選択的抑制剤である［メロニー等、上記；プリ等、上記］。このキニノゲンの活性は、分離されたドメン３がその活性を保持するので、重鎖におけるドメイン３に局在すると思われた［ジアング等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６７巻、第３７１２頁（１９９２）］。
ドメイン３による血小板活性化の抑制は、顆粒内容物を凝集および分泌させる血小板の能力の顕著な低下により観察される。顆粒内容物は止血作用、血栓症および炎症反応に関与する蛋白質を含む。内皮細胞活性化の抑制も同様に、たとえば組織プラスミノーゲン活性化剤およびフォン・ウィレブランド因子のような内皮細胞内容物の分泌低下により観察することができる。
ドメイン３ポリペプチドはその親蛋白質ＨＫおよびＬＫと同様に、その標的細胞に結合するスロンビンを封鎖することにより、細胞活性化を抑制するよう機能する。このポリペプチドはスロンビン誘発の血小板活性化の選択的抑制剤である。したがってドメイン３の投与は、スロンビン以外のたとえばコラーゲン、アデノシン二燐酸、エピネフィリンおよび血小板活性化因子のような生理学的物質による血小板活性化の誘発に対し作用しない。
たとえば冠動脈血栓崩壊または経皮的経腰冠状血管形成術のような冠動脈病の介入手法は、急性冠動脈血栓崩壊からの死亡率を減少させるのに良好な結果を治めている。しかしながら溶解剤による冠動脈内血栓崩壊の後、再閉塞が高い。再閉塞の主たる原因は血小板血栓である。人工的ダクロン移植体をヒト動脈に埋設すれば、全患者の３０％までが手術の数時間内に血小板血栓症を発生する。この予想される高い合併症割合は、しばしば付随合併症を伴う追加手術を必要とする。したがって、血小板血栓に基づく前記再閉塞現象を防止するには追加療法が必要とされる。
冠動脈血栓症を予防するための２種の競合種類の抗血小板剤が考えられている。モノクローナル抗体７Ｅ３を含め１種類の作用剤は、グリコ蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、すなわちインテグリンαIIbβ3を抑制することにより血小板活性化の最終的な一般的経路を封鎖することを目的とする。７Ｅ３は有効な作用剤であるが、これはネズミ抗体であってヒトにおいては抗原性である。第２の種類の抗血小板剤は血小板活性化の予想される主たる開始剤、すなわちα−スロンビンを抑制する。Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロルメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、すなわちα−スロンビン蛋白分解活性の有力な抑制剤の注入は出血時間（すなわち血小板機能の大凡の尺度）を引き延ばす［Ｓ．Ｒ．ハンソン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・第８５巻、第３１８４〜３１８８頁（１９８８）］。有力なα−スロンビン蛋白分解抑制剤が臨床試験に入った最初のものは、医薬リーチから誘導された組換産生物、すなわちヒルジンである。小分子量であると共に抗原性でないと考えられるこの化合物は有力な抗スロンビン剤である。ヒルジンの合成同族体（すなわちヒルログ）はヒルジンの陰イオンエキソサイトＩ結合特性をＰＰＡＣＫの蛋白分解抑制活性と共に有する。第ＩＩＩ期の臨床試験において、これら両薬物は血小板活性化の有効な抑制剤であったが、有効な抗凝固のトレードオフが出血を増大させて３種の臨床試験の停止をもたらした。したがってα−スロンビンの非選択的蛋白分解抑制剤は臨床的に許容されず、決して産業上の重要性を持たない。
動脈血栓症を予防する理想的な抗血栓剤は、α−スロンビンがヒブリノーゲンを凝固させると共に蛋白Ｃ、因子ＸＩＩＩ並びに因子ＶおよびＶＩＩＩを活性化させる蛋白分解活性を妨げることなく、血小板および内皮細胞の活性化を防止するものである。２種のみの公知蛋白質、すなわち高分子量（ＨＫ）および低分子量（ＬＫ）キニノゲンは天然産の選択性抗スロンビン剤である［Ｆ．Ｊ．メロニー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６６巻、第６７８６〜６７９４頁（１９９１）；Ｒ．Ｎ．プリ等、ブラッド、第７７巻、第５００〜５０７頁（１９９１）］。低分子量および高分子量の両キニノゲンは、そのアミノ末端から１２個のアミノ酸を介しブラジキニンのカルボキシ末端を越える同一のアミノ酸配列を有する。ＬＫおよびＨＫは共通の重鎖（６２ｋＤａ）とブラジキニン（ＢＫ）部分（０．９ｋＤａ）と「軽鎖」のそれぞれのアミノ末端部分における最初の１２アミノ酸とを共有する［Ｙ．タカガキ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第８６０１〜８６０９頁（１９８５）；Ｎ．キタムラ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第８６１０〜８６１７頁（１９８５）］。この同一性は残基１〜約残基３８３に対応する［サルベソン等、バイオケミカル・ジャーナル、第２３４巻、第４２９頁（１９８６）；ケラーマン等、ヨーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第１５４巻、第４７１頁（１９８６）参照］。これらはその軽鎖の寸法において異なり、ＬＫの軽鎖は４ｋＤａであるのに対しＨＫの軽鎖は５６ｋＤａである［タカギ等、上記；キタムラ等、上記］。
以下、「ヒトキニノゲン」という用語は特記しない限りヒト血漿、血小板、内皮細胞、顆粒球または皮膚もしくは他の組織または器官から得られる、体液または組織相のいずれに存在するかに拘らず全ての各種形態における任意のキニノゲン分子の高分子量および低分子量形態の両者を意味する。
「軽鎖」とは、ヒトキニノゲンを言及し或いは関連する場合、全キニノゲン欠失血漿における凝固欠陥を修正する能力を持ったＨＫの５６ｋＤａ中間血漿カリクレイン−開裂フラグラントを意味する。
「重鎖」とは、ヒトキニノゲンを言及し或いは関連する場合、ブラジキニンおよび「軽鎖」を含まないＨＫもしくはＬＫの６４ｋＤａカリクレン−開裂フラグメントを意味する。
キニノゲン重鎖に関する「ドメイン３」とは、約２１ｋＤａであるヒトキニノゲン重鎖のトリプシン−開裂フラグメントを意味する。
「天然アミノ酸」とは、典型的にはペプチドおよびポリペプチドを形成する２０種の主たる天然アミノ酸を意味する。「合成アミノ酸」とは、これが合成的に製造されるか或いは天然源から誘導されるかには無関係に、他の任意のアミノ酸を意味する。
「ＢＫ同族体」とは、α−スロンビンを血小板および他の細胞におけるリセプタの開裂から抑制してペプチドがスロンビンリセプタにおけるＳＰＡＮ１２エピトープの変化もしくは損失を防止すると共にペプチドＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の開裂を封鎖しうるようなノナペプチドであるブラジキニンの配列に類似したアミノ酸配列を有するペプチドを意味し、スロンビンリセプタにおけるα−スロンビン開裂部位をスパンする。ＢＫ同族体は、したがってスロンビン誘発の血小板活性化を抑制することができる。
本発明の主題における命名法の幾つかは長い用語を含む。当業者はこれら用語を当業界で周知されたように略記するのが一般的である。これらの一般的かつ通常の略記号を以下に示し、本明細書中で使用することができる。
略記号
ＡＴＡＰ１３８：スロンビンリセプタにおけるエピトープに対し特異性のモノクローナル抗体（このエピトープはリセプタのα−スロンビン開裂の後にも保持される）
ＢＫ：ブラジキニン
Ｄ３：キニノゲンのドメイン３
ＤＦＰ：フルオロ燐酸ジイソプロピル
Ｄ−Ｔｉｃ：Ｄ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−イル−カルボニル
ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸
ＦＩＴＣ：フルオレスセインイソチオシアネート
ＨＢＴＵ：２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキソフルオロホスフェート
ＨＯＢt：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＫ：ヒト高分子量キニノゲン
４Ｈｙｐ：（４Ｒ）−４−ヒドロキシプロピル
ＬＫ：ヒト低分子量キニノゲン
ＮＡＴ１２：スロンビンリセプタにおけるα−スロンビン開裂部位をスパンするペプチド配列Asn-Ala-Thr-Leu-Asp-Pro-Arg-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg
Ｏｉｃ：（３ａ５，７ａ５）−オクタヒドロインドール−２−イルカルボニル
ＰＡＤＧＥＭ：血小板活性化依存性の顆粒外膜蛋白質（Ｐ−セレクチンＧＭＰ  １４０もしくはＣＤ  ６２としても知られる）
ＰＧＥ１：プロスタグランジンＥ１
ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオライド
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＰＡＮ１２：スロンビンリセプタにおけるα−スロンビン開裂部位をスパンする配列Asn-Ala-Thr-Leu-Asp-Pro-Arg-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg（SEQ ID NO:2）に特異性のモノクローナル抗体
Ｔｈｉ：３−（２−チエニル）アラニル
ＴＲＡＰ：アミノ酸配列Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn（SEQ ID NO:19）を有するスロンビンリセプタ活性化ペプチド
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
発明の要点
本発明は、スロンビン誘発の血小板もしくは他の細胞の活性化を抑制するに際し、処置を必要とする個人に血小板もしくは細胞のスロンビン活性化を抑制する有効量のペプチドを投与することからなり、前記ペプチドが式Ｘ1−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ2    （Ｉ）
［式中、Ｘ1は０〜３０個の天然もしくは合成アミノ酸であり；
Ｘ2は、０〜３０個の天然もしくは合成アミノ酸である］のアミノ酸配列を有し、ただしペプチドが天然ブラジキニンであってはならないことを特徴とする抑制方法である。
本発明の１具体例において、Ｘ1は０〜７個のアミノ酸であり、Ｘ2は０〜９個のアミノ酸である。本発明の好適具体例において、式Ｉによるペプチドは配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を有する。
さらに本発明はＡＤＰ−誘発の血小板活性化の抑制方法をも含み、この方法は処置を必要とする個人に有効量の式Ｉによるペプチドを投与することからなっている。
本発明の他の具体例は血小板凝集の防止方法を含み、この方法は処置を必要とする個人に有効量の式Ｉによるペプチドを投与することからなっている。
さらに本発明の他の具体例によれば、ＡＤＰ−誘発の血小板活性化の抑制方法は処置を必要とする個人に血小板もしくは他の細胞のスロンビン活性化を抑制する有効量のペプチドを投与することからなり、前記ペプチドはアミノ酸配列Ｘ1−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ2を有する１個もしくはそれ以上のセグメントで構成され、このペプチドは式：
Ｌ−（Ｘ1−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ2）n      （ＩＩ）
［式中、Ｌは共有結合もしくは化学基からなるリンカーであり；
Ｘ1は各セグメントにて同一でも異なってもよく０〜３０個の天然もしくは合成アミノ酸であり；
Ｘ2は各セグメントにて同一でも異なってもよく０〜３０個の天然もしくは合成アミノ酸であり；
ｎは２〜２０の整数である］
を有する。
本発明の１具体例において、式ＩＩによるペプチドのセグメントは配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を有する。
さらに本発明はＡＤＰ−誘発の血小板活性化の抑制方法をも含み、この方法は処置を必要とする個人に有効量の式ＩＩ［式中、Ｌ、Ｘ1、Ｘ2およびｎは上記の意味を有する］によるペプチドを投与することからなっている。
本発明の他の具体例は血小板凝集の防止方法を含み、この方法は処置を必要とする個人に有効量の式ＩＩ［式中、Ｌ、Ｘ1、Ｘ2およびｎは上記の意味を有する］によるペプチドを投与することからなっている。
ここで説明する本発明は式：
0004067117.tif 000002
を有する化合物をも含む。
さらに本発明の具体例は式：
0004067117.tif 000003
を有する化合物を含む。
図面の説明
第１Ａ〜１Ｄ図は、ヒトα−スロンビンを添加して反応を開始させる前における増加濃度のペプチドの存在下または不存在下で培養したＢＫ（１Ａ）およびＢＫ同族体（１Ｂ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、１Ｃ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：１Ｄ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）によるα−スロンビン誘発の血小板凝集および分泌の抑制のプロット図である。％残留凝集活性（◇）、％残留［14Ｃ］５−ヒドロキシトリプタミン分泌（□）。各図面は、少なくとも３回の実験から得られたデータの平均±ＳＥＭである。
第２Ａ〜２Ｄ図は、α−スロンビン単独（２Ａ）、ＨＫ（２Ｂ）；ＢＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（２Ｃ）；またはＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４（２Ｄ）の存在下におけるヒト血小板でのα−スロンビン誘発カルシウム可動化のプロット図である。各図面は、少なくとも３回の実験からの代表的実験である。
第３図は、ＢＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４によるα−スロンビン媒介のカルシウム可動化の抑制のプロット図である。増加する濃度（０．０１ｍＭ〜２ｍＭ）のＢＫ（□）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４（◇）をα−スロンビンの添加前にゲル濾過血小板と共に培養した。データをペプチド処理試料および未処理試料にて移動したＣａ-2の抑制％としプロットした。図面は、各濃度にて３回の同一実験から得られたデータの平均±ＳＥＭである。
第４Ａ〜４Ｄ図は、血小板におけるα−スロンビン誘発のカルシウム可動化に対するＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の作用のプロット図である。血小板を１．０ｎＭ（４Ｂ）、０．５ｍＭ（４Ｃ）および０．１２５ｍＭ（４Ｄ）の濃度におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の存在下または（４Ａ）の不存在下（４Ａ）で１ｎＭα−スロンビンと共に培養した。各図面は数回の実験の代表的実験である。
第５図は、２００ｎＭのＨＫ（◇）、１ｍＭのＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４（〇）もしくは１ｍＭのＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８（△）の存在下または不存在下（□）における血小板への125Ｉα−スロンビン結合の抑制のプロット図である。図面は、３回の実験から得られたデータの平均±ＳＥＭである。
第６Ａ〜６Ｆ図は、スロンビンリセプタの抗原性の発現に対する各種ＢＫ同族体の作用を示す流れサイトグラムである。洗浄した血小板をモノクローナル抗体ＳＰＡＮ１２単独（第６Ａ図）と共に或いは１ｍＭのＢＫ（第６図）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４（第６Ｃ図）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８（第６Ｄ図）もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（第６Ｅ図）の存在下に培養した。ゴースト曲線は未刺激の血小板を示し、実線曲線はα−スロンビン活性化血小板を示す。マウスＩｇＧ（第６Ｆ図）を比較として使用した。各図面は、３回の実験の代表的実験である。
第７Ａ〜７Ｄ図は、血小板のα−スロンビン活性化後におけるスロンビンリセプタへのモノクローナル抗体ＡＴＡＰ１３８の結合に対するＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の作用を示す流れサイトグラムである（第７Ｂ図）。マウスＩｇＧ（第７Ｃ図）およびＣＤ６２に対する抗体（第７Ｄ図）を用いて比較実験をも行った。ゴースト曲線は未刺激血小板によるスロンビンリセプタ発現を示し、実線曲線はα−スロンビン活性化血小板による発現を示す。第７Ａ〜７Ｄ図の流れサイトグラムは、第６Ａ〜６Ｄ図における流れサイトグラムと同じ血小板にて同じ日に行った。各図面は、３回の実験の代表的実験である。
第８Ａ〜８Ｆ図は、スロンビンリセプタペプチドＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のα−スロンビン誘発開裂に対するＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０および非ＢＫ同族体ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）の作用を示すクロマトグラフである。ＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をα−スロンビンの不存在下（第８Ａ図）または存在下（第８Ｃ図）にて培養した。ＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の不存在下（第８Ｃ図）または存在下（第８Ｄ図）にてα−スロンビンと共に培養した。第８Ｅ図は、α−スロンビンの存在下にＨＫと共に培養したＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のクロマトグラフである。これに対し、第８Ｆ図は非−ＢＫ同族体ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）の対応クロマトグラフである。
第９図は、ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の注入後における３匹のウサギでのＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の血漿濃度のプロット図である。
第１０図は、ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の１回の注入後における経時的なスロンビン−もしくはＡＤＰ−誘発のウサギ血小板凝集の抑制のプロット図である。（〇）、２０μＭのＡＤＰ；（●）、２０ｎＭのγ−スロンビン；（△）、４０ｎＭのγ−スロンビン。
第１１図は、１ｍＭの非−ＢＫ同族体ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、０．５ｍＭのＢＫ同族体ヘテロダイマー（「ヘテロダイマー」）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、０．５ｍＭの４−ＭＡＰおよび１ｍＭのＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、並びにγ−スロンビン単独（比較）の存在下で処理されたヒト血小板のγ−スロンビン誘発（２０ｎＭ）凝集の凝集計追跡図である。
発明の詳細な説明
本発明は、選択性抗スロンビン剤として作用するブラジキニン配列関連の同族ペプチドの使用による血栓症の予防方法に向けられる。ＢＫ同族体は、各種の基質（たとえばフィブリノーゲンおよび因子Ｖ）を蛋白分解するα−スロンビンの能力を阻害することなく血小板の活性化からヒトα−スロンビンおよびγ−スロンビンを抑制しうるので、選択的抗−血栓剤である。殆どの公知スロンビン抑制剤（ヒルジン、ヒルログおよびＰＰＡＣＫ）は、その蛋白分解活性の全部を封鎖することによりα−スロンビン作用を阻害する。血小板のα−スロンビン活性化を抑制するためのこれら蛋白分解抑制剤の使用は過度の抗凝集および出血をもたらしうる。本発明の方法で用いるＢＫ同族体は、α−スロンビンの酵素活性を阻害することなく細胞誘発の血栓形成を抑制しうる。ＢＫ同族体を使用して、冠動脈血栓症および発作から生ずる動脈閉塞を防止することができる。
本発明者等は、ＢＫ同族体が血小板で発現されるスロンビンリセプタの開裂からスロンビンを抑制することを突き止めた。したがって本発明者等は、ＢＫ同族体がスロンビンリセプタの開裂を封鎖してスロンビン誘発の血小板活性化を抑制し、次いで開裂リセプタの新たなアミノ末端の露呈による血小板の活性化を抑制する能力を有することをも突き止めた。ここに説明するＢＫ同族体の投与は血小板、内皮細胞、脳細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞またはスロンビンのリセプタを含有する他の細胞のスロンビン誘発活性化を抑制するための治療方法を構成する。この機能は、血小板血栓形成およびスロンビンリセプタにより媒介される他の活性を抑制する。
ＢＫ同族体は、無傷キニノゲンおよびその分離ドメイン３と同じメカニズムにより血小板活性化を抑制しない。１種のｍＭ  ＢＫ同族体は、モル過剰の精製ＨＫ、ＬＫもしくは分離ドメイン３と同様に血小板に対する125Ｉα−スロンビン結合を抑制しない。本発明者等は、ＢＫ同族体が：
（１）血小板におけるα−スロンビン−誘発のカルシウム可動化を封鎖し；
（２）０．７ｍＭのクロモゲン基質Ｓ２２３８を加水分解する１ｎＭのα−スロンビンの能力を抑制せず；
（３）１００ｍｇ／ｄＬのヒィフリノゲンの存在下に血小板の活性化から１ｎＭのγ−スロンビンを封鎖し；
（４）モノクローナル抗体ＳＰＡＮ１２およびＡＴＡＰ１３８により検出されるようにスロンビンリセプタの発現変化からα−スロンビンを封鎖し；
（５）スロンビンリセプタの開裂からα−スロンビンを防止し；
（６）インビボおよびインビトロにおける血小板機能を抑制する
ことを突き止めた。特定の理論に拘束されるものでないが、ＢＫ同族体はα−スロンビンを血小板および他の細胞におけるリセプタの開裂から抑制することにより、血小板および他の細胞の活性化を抑制するよう作用するものと思われる。
本発明の１具体例によれば、ＢＫ同族体は成熟ヒトキニノゲン重鎖からの親セグメントの連鎖切断同族体を示し、前記親セグメントはキニノゲン重鎖アミノ酸３３３〜３９６をスパンし、同族体はコア配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを含み、このコア配列はキニノゲン重鎖残基３６３〜３６６に対応する。
他の具体例において、ＢＫ同族体はキニノゲン重鎖親セグメントの連鎖切断同族体を示し、このペプチドはコア配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを含有すると共にコア配列のキニノゲン重鎖親セグメントから上流（アミノ末端方向）の７アミノ酸までおよびコア配列のキニノゲン重鎖親セグメントから下流（カルボキシ末端方向）の９アミノ酸までを含む。より好ましくは、コア配列のアミノ末端およびカルボキシ末端に付加されるアミノ酸はそれぞれキニノゲン重鎖残基３５７〜３６３および３６７〜３８３から選択される。ヒトキニノゲン重鎖親セグメントのアミノ酸配列をここではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３として示す。ヒトキニノゲン重鎖の完全配列はケラーマン等、ヨーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第１５４巻、第４７１〜４７８頁（１９８６）（その開示全体を参考のためここに引用する）に見ることができる。
本発明の１具体例において、天然もしくは合成の一般式
0004067117.tif 000004
［式中、Ｒは水素原子または任意の有機基である］
を有するアミノ酸は天然ＢＫ配列セグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のコア配列（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）からなるペプチドのカルボキシル末端もしくはアミノ末端に付加されて連鎖延長同族体を形成する。好ましくは、アミノ酸は５アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）のカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれかに付加される。３０個までのアミノ酸をコア配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１もしくはＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれかに付加することができる。好ましくは０〜７個のアミノ酸がアミノ末端に付加されると共に、０〜９個のアミノ酸がコア配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）のカルボキシ末端に付加される。より好ましくは、ペプチドはアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を含む。本発明に包含されるＢＫ同族体の例はＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４であって、２個のアミノ酸がアミノ末端に付加されると共に１０個のアミノ酸がコア配列のＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のカルボキシル末端に付加されている。
本発明の他の具体例において、ペプチドは（D-Arg）-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-（D-Tic）-Oic-Arg（SEQ ID NO:17）
のアミノ酸配列を有するＨＯＥ  １４０である。ＨＯＥ１４０はヘキスト社、フランクフォード、ドイツ国から購入することもでき或いはホック等、ブリティッシュ・ジャーナル・ファマコロジー、第１０２巻、第７５８〜７７３頁（１９９１）およびラムベック等、ブリティッシュ・ジャーナル・ファマコロジー、第１０２巻、第２９７〜３０４頁（１９９１）（その開示全体を参考のためここに引用する）の方法にしたがって作成することができる。
本発明の他の具体例によれば、２種もしくはそれ以上の一本鎖ＢＫ同族体を１個もしくはそれ以上のリンカーＬにより結合させてホモダイマーおよびヘテロダイマーを生成させる。ここに規定するホモダイマーおよびヘテロダイマーはダイマー、トライマーおよび他のマルチマーを包含する。ホモダイマーは２個もしくはそれ以上の同一の一本鎖ＢＫ同族体で構成され、ヘテロダイマーは２個もしくはそれ以上の異なる一本鎖ＢＫ同族体で構成される。リンカーは共有結合または化学基のいずれかとすることができる。本発明において、結合させうる一本鎖ＢＫ同族体の個数は２〜３２個である。好ましくは、結合させるＢＫ同族体の個数は２〜２０個、より好ましくは２〜８個、特に好ましくは２〜４個である。結合させるべきＢＫ同族体は同一とすることができ、或いは異なってもよい。
２個の一本鎖ＢＫ同族体を結合する共有結合の例は、システインアミノ酸を含有する２個の一本鎖ＢＫ同族体の酸化により形成されるジスルフィド結合である。これはペプチドがＣｙｓ残基を適する位置に含むよう最初に親ペプチドを改変させることを必要とする。一本鎖ＢＫ同族体におけるシステイン残基は、１ｍｇの一本鎖ペプチドを１．５ｍＬの０．１％（ｖ／ｖ）１７．５ｍＭ酢酸（ｐＨ８．４）に溶解させた後に窒素でフラッシュさせ、次いで０．０１ＭのＫ2Ｆｅ（ＣＮ）6でフラッシュさせることにより、ＢＫ同族体ダイマーを生成させるよう酸化することができる。室温にて１時間にわたり培養した後、ダイマーペプチドをＨＰＬＣにより精製する。
２個の一本鎖ＢＫ同族体を結合するのに適する共有結合の他の例は、一方の連鎖におけるリジンアミノ酸残基のアミノ基を他の連鎖におけるグルタミン酸もしくはアスパラギン酸アミノ酸残基のカルボン酸基と反応させて形成されるアミド結合である。
代案として、結合基は架橋剤を用いて２個の一本鎖ＢＫ同族体の間で共有結合により形成させるこもできる。たとえばホモダイマーおよびヘテロダイマーは、先ず最初にチェロニス等、ジャーナル・メジカル・ケミストリー、第３７巻、第３４８頁（１９９４）の方法にしたがいＳ−（Ｎ−ヘキシルスクシンイミド）−改変ペプチドモノマーを作成して製造することができる。Ｎ−ヘキシルマレイミド（すなわち改変ペプチドモノマーの先駆体）は、２種の化合物を飽和ＮａＨＣＯ3中で０℃にてボダンスキーおよびボダンスキーの方法、ザ・プラクティス・オブ・ペプチド・シンセシス、スプリンガー・フェアラーク、ニョーユーク、第２９〜３１頁（１９８４）の方法にしたがい混合してＮ−（メチキシカルボニル）マレイミドとＮ−ヘキシルアミンとから作成される。得られる反応混合物の生成物は、酢酸エチル中に抽出し、次いで水洗すると共にＮａ2ＳＯ4で脱水し、次いで減圧濃縮してＮ−ヘキシルマレイミドを淡黄色油状物として生成させることにより単離される。次いでＳ−（Ｎ−ヘキシルシスクシンイミド）−改変ペプチドモノマーは、１部のペプチドを１．５部のＮ−ヘキシルマレイミドとジメチルホルムアミド中で混合（３．３ｍＬ／ｍＭペプチド）中で混合し、次いで３０倍容量の０．１Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．５）を添加することによりシステイン含有ペプチド（モノマー）とＮ−ヘキシルマレイミドとから作成される。このように行われるＳ−アルキル化反応は３０分間で完結する。得られるＳ−（Ｎ−ヘキシルスクシンイミド）−改変ペプチドモノマーは調製用逆相ＨＰＬＣに続く羽毛状白色粉末としての凍結乾燥により精製される。
ホモダイマーもしくはヘテロダイマーのいずれかとしてのビススクシンイミドヘキサンペプチドダイマーは、チェロニス等（上記）の方法にしたがい、それぞれ同一もしくは異なる位置にてシステイン置換ペプチドから作成することができる。１部のビスマレイミドヘキサンを２部のペプチドモノマーとジメチルホルムアミド中で混合し（３．３ｍＬ／ｍＭペプチド）、次いで０．１Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．５）に添加する。この反応混合物を室温にて撹拌し、一般に３０分間以内に完結させる。得られるビススクシンイミドヘキサンペプチドダイマーは調製用逆相ＨＰＬＣにより精製される。凍結乾燥の後、物質は羽毛状の白色粉末となる。
本発明の共有架橋したＢＫ同族体ダイマーは、ホモ二官能性架橋試薬、たとえば酒石酸ジスクシニミジル、スベリン酸ジスクシニミジル、エチレングリコールビス（スクシニミジルスクシネート）、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（「ＤＦＮＢ」）、４，４′−ジイソチオシアノ−２，２′−ジスルホン酸スチルベン（「ＤＩＤＳ」）およびビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）を用いて作成することができる。架橋反応は、各一本鎖ＢＫ同族体の間でランダムに生ずる。
代案として、ヘテロ二官能性架橋試薬を用いることもできる。この種の試薬はたとえばＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（「ＳＰＤＰ」）、スルホスクシニミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３′−ジチオプロピオネート（「ＳＡＳＤ」、ピアス・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、ＩＬ）、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミジルエステル（「ＭＢＳ」）、ｍ−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（「スルホ−ＭＢＳ」）、Ｎ−スクシニミジル（４−イオドアセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」、スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、スクシニミジル−４−（Ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ」）、スルホスクシニミジル（４−イオドアセチル）アミノベンゾエート（「スルホ−ＳＩＡＢ」）、スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「スルホ−ＳＭＣＣ」）、スルホスクシニミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（「スルホ−ＳＭＰＢ」）、ブロモアセチル−ｐ−アミノベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミジルエステル、イオドアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステルなどを包含する。
ヘテロ二官能性架橋については、第１の一本鎖ＢＫ同族体をたとえば二官能性試薬のＮ−ヒドロキシスクシニミジル部分で誘導化させ、この誘導化したＢＫ同族体をゲル濾過によって精製する。次いで、第２の一本鎖ＢＫ同族体（これは第１のＢＫ同族体と同じでも異なってもよい）を二官能性試薬の第２の官能基と反応させて、ＢＫダイマーの各成分間における結合の指向配列を確保する。
蛋白質−蛋白質結合体を形成せさせるための典型的なヘテロ二官能性架橋剤は一方の官能基としてアミノ反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ−エステル）を有すると共に、他方の官能基としてスルフヒドリル反応性基を有する。先ず最初に、第１の一本鎖ＢＫ同族体の表面リジン残基のε−アミノ基を架橋剤のＮＨＳ−エステル基でアシル化する。遊離スルフヒドリル基を有する第２の一本鎖ＢＫ同族体を架橋剤のスルフヒドリル反応基と反応させて共有架橋ダイマーを生成させる。一般的なチオール反応性基はマレイミド、ピリジルジスルフィドおよび活性ハロゲンを包含する。たとえばＭＢＳはアミノ反応性基としてＮＨＳ−エステルを含有すると共に、スルフヒドリル反応性基としてマレイミド成分を含有する。
光活性ヘテロ二官能性架橋剤（たとえば光反応性フェニルアジド）も使用することができる。この種の１種の試薬ＳＡＳＤは、そのＮＨＳ−エステル基を介し一本鎖ＢＫ同族体に結合することができる。結合反応はｐＨ７にて室温で約１０分間にわたり行われる。約１〜約２０の架橋剤とＢＫ同族体のモル比を使用することができる。
精製されかつ誘導化されたＢＫ同族体は、ＢＫ同族体に対する親和性を有するマトリックス（たとえばＢＫ同族体に対し発生したポリクローナル抗体）を用いて親和性クロマトグラフィーにより回収される。この目的の抗体は、ＢＫ同族体を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド−ＨＣＬを用いてキーホールリンペットヘモシアニンにカップリングさせて作成することができる［グッドフレンド等、サイエンス、第１４４巻、第１３４４頁（１９６４）］。得られた結合体を用いて、ミュラー・エスタール等、メソッズ・エンチモロジー、第１６３巻、第２４０頁（１９８８）の方法によりウサギを免疫化することにより抗−ＢＫ同族抗体を産生させる。精製された抗体をアフィゲル１０［ビオラド社、リッチモンド、ＣＡ］にカップリングさせて親和性カラムを形成させる。次いで、誘導化ＢＫ同族体が結合された固定化抗−ＢＫ同族抗体を０．２Ｍグリシン溶出によりカラムから除去し、次いで第２の一本鎖ＢＫ同族体の溶液に懸濁させる。紫外線光源［たとえばミネラライトＵＶＳＬ−２５、ウルトラ・バイオレット・プロダクツ・インコーポレーション、サン・ガブリエル、ＣＡ］を緩和に撹拌された懸濁物から１ｃｍの位置に設置すると共に、長波長範囲にて約１０分間にわたり照射する。懸濁物を抗−ＢＫ同族抗体親和性カラムに戻し、０．１５ＭのＮａＣｌと０．１％のウシ血清アルブミンと０．０１％のポリソルベート８０と２５  ＫＩＵ／ｍＬのアプロチニンとを含有する緩衝液で洗浄して反応副生物を除去する。共有架橋したダイマーを、０．２Ｍのグリシンまたは５Ｍのグアニジンを含有する同じ緩衝液系で溶出させる。溶出したダイマーを緩衝液に対し透析してカオトロピック剤を除去する。
紫外線照射の下でのＢＫ同族体との反応および上記反応混合物のクロマトグラフィーの後、共有架橋したダイマーを０．２Ｍのグリシンもしくは５Ｍのグアニジンのいずれかで溶出させる。
上記手順はＳＡＳＤ（すなわち開裂性架橋剤）を用いるが、たとえばβ−エチル−１，３−ジチオプロピオネート成分でなくα−ヘキサノエートを含有する非開裂性架橋用試薬も使用することができる。ＭＳＢは非開裂性架橋剤の１例である。
一本鎖ＢＫ同族体は、自動化合成を用いる慣用の固相ペプチド合成技術により作成することができる。代案として、ＢＫ同族体を組換ＤＮＡ技術により作成することもできる。ブラジキニンの既知アミノ酸配列に基づき、合成遺伝子をその配列に対応して構成し、適するクローン化ベクターにより適する宿主中へ導入することができる。したがって本発明は、単にペプチド合成法により作成されるＢＫ同族体の使用のみに限定されず、組換技術により作成される対応のポリペプチドをも包含することを了解すべきである。
さらに、この種の組換技術の使用により当業者はたとえば適切なＤＮＡの部位指向突然変異により天然ブラジキニンの同族体を作成することもでき、天然アミノ酸配列を得られる単一もしくは複数のアミノ酸付加もしくは欠失により改変させる。ＢＫ同族体をもたらすこの種の改変も全て本発明の範囲内に包含され、ただし分子はスロンビン誘発の細胞活性化を抑制する能力を実質的に保持するものとする。
本発明のＢＫ同族体はα−スロンビン誘発およびＡＤＰ−誘発の血小板凝集を抑制し；α−スロンビン誘発のカルシウム可動化を封鎖し；血小板への125Ｉ−α−スロンビン結合を封鎖せず；さらにα−スロンビンをスロンビンリセプタの開裂から防止する。これら活性を測定するための方法論は、それぞれセクションＩＩＡ〜ＩＩＥおよびセクションＩＩＩに示される。
精製されたＢＫ同族体は、スロンビン誘発もしくはＡＤＰ誘発の血小板活性化もしくは血小板凝集の抑制が求められる任意の状況にて投与することができる。これらは任意の原因による血小板血栓症を有する患者に投与され、或いは血小板血栓に基づく再閉塞現象を人工ダクロン移植体の挿入により防止する手術を受けた人間につき予防的に使用することができる。さらに、これらは発作および脳浮腫を予防すべく個人に注入することもできる。
ペプチドは、血流中へ相当量で供給する任意便利な手段により投与することができる。静脈内投与が好適な投与ルートとして現在考えられるが、鼻腔内投与も用いることができる。ＢＫ同族体は水溶性であるため、これらは溶液にて効果的に投与することができる。投与する実際の投与量は、処置の性質が予防的または治療的のいずれであっても患者の体格および体重、患者の年令、健康状態および性別、投与のルートなどの因子を考慮に入れることができる。インビボクリアランス試験に基づきＨＫ、ＬＫ、Ｄ3およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を含め活性成分の１日の有効投与量は体重７０ｋｇ当たり毎日約３ｇである。好適投与量は、２．４ｇの１回のボルス注入に続く０．０２５ｇ／１時間の連続注入とすれば体重７０ｋｇ当たり毎日約３ｇである。当業者は、特定の状況および患者の必要性に適するよう適する投与量および投与方式を得ることができる。
ＢＫ同族体の投与量は所望の血小板凝集抑制の程度に依存する。３ｇ／１日の投与量を得るのに充分なＢＫ同族体の注入を有利に用いうるが、それより多量もしくは少量のペプチドも必要に応じ投与することができる。治療終点は、凝集および分泌、出血、並びに血管能力により血小板機能を監視して判定することができる。所望の静脈内濃度を得るための実際のＢＫ同族体の投与量および治療長さは、慣用方法で当業者により容易に決定しうる。
ＢＫ同族体は医薬上許容しうるキャリヤとの混合物として医薬組成物で投与することができる。医薬組成物は慣用の医薬処方技術にしたがい配合することができる。キャリヤは、投与につき所望される製剤の形態に応じ広範な種類の形態とすることができる。非経口投与すべき組成物につきキャリヤは一般に無菌水を含むが、溶解度を高め或いは保持目的につき他の成分を含ませることもできる。注射用懸濁物も作成することができ、この場合は適する液体キャリヤ、懸濁剤などを用いることができる。好適な非経口投与ルートは静脈内投与である。
静脈内投与につき、ＢＫ同族体は生理学上適合しうる物質（たとえば生理学的条件に合致する緩衝ｐＨを持った無菌塩化ナトリウム）を含有する任意適する静脈内供給ベヒクルに溶解させることができる。この種の静脈内供給ベヒクルは当業者に公知である。
以下の実験セクションにより本発明の実施を例示する。
Ｉ．高分子量キニノゲンおよびＢＫ同族体の作成
Ａ．高分子量キニノゲンの作成
ＨＫをジョンソン等、スロンビン・リサーチ、第４８巻、第１８７頁（１９８７）およびミラー・エスタール等、メゾッズ・エンチモロジー、第１６３巻、第２４０頁（１９８７）の方法の改変により血漿から精製した。１００ｍＬの１ｍＭ  ＤＦＰ処理された新鮮凍結血漿を３７℃にて解凍させ、これに１０ｍＭのベンズアミジン−ＨＣｌと４０μｇ／ｍＬのポリブレンと２ｍＭのＥＤＴＡと０．２ｍＭのＰＭＳＦと０．２ｍｇ／ｍＬの大豆トリプシン抑制剤と１００Ｕ／ｍＬのアプロチニンと２ＭのＮａＣｌとをシュマイエル等、メソッズ・イン・エンチモロジー、第１６９巻、第２７６頁（１９８９）の方法にしたがって添加した。次いで、処理された血漿を、２ＭのＮａＣｌと１ｍＭのベンズアミジン−ＨＣｌと４０μｇ／ｍＬのポリブレンと０．２ｍＭのＰＭＳＦと０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ3とを含有する５０ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化されたＣＭ−パパイン−セファロース４Ｂの２．５×２０ｃｍカラムに施した。ＣＭ−パパイン−セファロース４Ｂカラムはジョンソン等、スロンビン・リサーチ、第４８巻、第１８７頁（１９８７）の方法により作成した。ＨＫおよびＬＫを、２ｍＭのＥＤＴＡと０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ3とを含有する５０ｍＭの燐酸塩緩衝溶液（ｐＨ１１．５）を添加した後に単一ピークで溶出させた。５ｍＬづつのフラクションを、１Ｍの酢酸ナトリウムにおける４ｍＭのＰＭＳＦで構成された０．２５ｍＬの溶液（ｐＨ４．２）を含有する試験管に集めて最終ｐＨを６．０にした。ＨＫおよびＬＫを含有するフラクションを次いでハサン等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６９巻、第３１８２２頁（１９９４）により報告された方法にしたがい０．０１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で平衡化された反応性ブルー・セファロースカラム（シグマ・ケミカル・コーポレーション、セントルイス、ＭＯ）に施した。結合したＬＫおよびＨＫを、それぞれ０．３Ｍおよび２ＭのＮａＣｌを含有する同じ緩衝液により溶出させた。ＨＫ（１２０  ｋＤａ）およびＬＫ（６６  ｋＤａ）は還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて単一バンドとして移動した。ＨＫはＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッツチングによりその重鎖および軽鎖に対するモノクローナル抗体と反応したのに対し、ＬＫはその重鎖に指向する抗体によってのみ認識された。精製されたＨＫはその前凝集活性を保持すると共に、シュマイエル等（上記）により報告されたような１１〜２２Ｕ／ｍｇの比活性を有した。
Ｂ．ＢＫ同族体の作成
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、並びにペプチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を包含する天然ＢＫ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の全部または１部を包含する多数のＢＫ同族体を合成した。各ペプチドはアプライド・バイオシステムス・モデル４３１型ペプチド合成装置で合成すると共に、カルボキシ末端アミノ酸を固相支持体に共有付着させ、次いで順次にアミノ酸をアミノ末端にカップリングさせた。付着させるべきアミノ酸におけるカルボキシル基を２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキソフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）で活性化させた。次いでフルオレニル−メチルオキシカルボニル部分を、封鎖基としてアミノ末端部に付着させた。全ペプチドを調製用逆相ＨＰＬＣにより精製した。これらペプチドはそれぞれ無色無臭であり、ただし水溶性であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を例外とする。各ペプチドは逆相ＨＰＬＣ、質量分光光度法およびアミノ酸配列決定により均質であると特性化された。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５は疎水性であって、これを溶解させるには０．０１％のＤＭＳＯを必要とした。
Ｃ．ヘテロダイマーおよび４種のブランチＭＡＰ  ＢＫ同族体の作成
ここに記載したＢＫ同族体の一本鎖および多重鎖ペプチドを次の手順にしたがい作成した。
１．ヘテロダイマーの作成
ヘテロダイマーを作成すべく使用した個々のＢＫ同族体を上記セクションＩ．Ｂ．に記載したように合成した。ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のヘテロダイマーは、上記セクションＩ．Ｂ．に記載した手順にしたがいＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を合成することにより作成した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ末端に、Ｎα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎε−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−リジンをＨＢＴＵおよびＨＯＢｔを用いて付着させた。Ｌ−リジンの付着に続き同じ手順によりＮ−フルオレニル−メチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ブチルオキシカルボニルエステルを付着させた。次いでグルタミン酸の遊離カルボキシル基をＬ−リジンのアミン側鎖に付着させて、線状アミノ酸でなくヘテロダイマーを生成させた。次いでＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０をＬ−グルタミン酸のＮ−フルオレニル−メチルオキシカルボニルの遊離アミンに構築させた。式：
0004067117.tif 000005
を有するヘテロダイマーを逆相ＨＰＬＣにより精製し、単一の物質を質量分光光度法により特性化した。
２．４ブランチＭＡＰの作成
以下、「４−ＭＡＰ」と称するＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の４−ブランチＭＡＰを作成した。「ＭＡＰ」とは、「多重抗原性ペプチド」の頭文字である。４−ＭＡＰの構造は次の通りである：
0004067117.tif 000006
４−ＭＡＰを作成するため、カルボキシル基を介して付着したβ−アラニンを有する樹脂コアを、β−アラニン（βＡｌａ）の遊離アミンを介してリジンの遊離カルボキシルに結合させてリジン−β−アラニン複合体を生成させた。２個の追加リジン残基を次いでその遊離アミン基により第１リジンの遊離カルボキシルに付着させた。次いでＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の４個の分子をそのフェニルアラニン残基を介し２個のリジン残基の遊離アミノ基に付着させ、次いで上記Ｉ．Ｄ．に記載されたようこにＨＢＴＵおよびＨＯＢｔで活性化した。４−ＭＡＰを逆相ＨＰＣＬにより精製し、次いで質量分光光度法により特性化した。
ＩＩ．ＢＫ同族体によるスロンビン誘発の血小板活性化の抑制
以下の試験は、ＨＫの重鎖における残基約３５７から残基３８３まで延びる領域に対応するＢＫ同族体がスロンビン誘発の血小板活性化の抑制剤として有用であることを示す。
Ａ．血小板凝集および分泌のＢＫ同族体抑制
以下の試験は、ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４が１ｍＭの濃度にてα−スロンビン誘発の血小板凝集および分泌を完全に抑制するのに対しＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４と同じアミノ酸数を有する混雑ペプチド）が１ｍＭにて僅か２６％の凝集抑制および８％の分泌の抑制をα−スロンビン活性化の後に与えたことを示す。同様に、配列にてＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４と重なるペプチド（すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８（１ｎＭ））は僅か２２％の凝集抑制および４％の分泌抑制を示した。一連の血小板凝集および分泌の試験をも行って、α−スロンビン誘発の血小板活性化を抑制する能力を保持する最小の天然ＢＫ配列を規定した。
新鮮な全血液を集め、０．０１３Ｍのクエン酸ナトリウムと混合し、血小板リッチな血漿をメロニー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６６巻、第６７８６頁（１９９１）の方法にしたがい作成した。洗浄された血小板をＨｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（０．１３７ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、０．４ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１２ｍＭのＮａＨＣＯ3、１ｍＭのＭｇＣｌ2、２０ｍＭのグルコースを含有する１４．７ｍＭのＨｅｐｅｓおよび０．２％のウシ血清アルブミン）（ｐＨ７．３５）にてセファローズ２Ｂカラムでのゲル濾過により作成した。凝集および分泌試験のための血小板をシュマイエル等、ブラッド、第５６巻、第１０１３頁（１９８０）の方法にしたがい５−［14Ｃ］ヒドロキシトリプタミンと共に３７℃で３０分間にわたり培養した。５−［14Ｃ］ヒドロキシトリプタミンで放射能標識された洗浄血小板（２×１０8／ｍＬの最終濃度）を凝集計［クロノログ・コーポレーション、ヘイベルタウン、ＰＡ］のキュベットに添加し、メロニー等（上記）の方法により基準化した。ＺｎＣｌ2を添加した後、最終濃度５０μＭの精製されたＨＫ（１μＭ）もしくは各種の濃度のペプチド（０．１〜３ｍＭ）または緩衝液単独をキュベットに添加した。基線を安定化させた後、α−スロンビン［０．１２５Ｕ／ｍＬ（１ｎＭ）の最終濃度］を次いで添加して血小板活性化を開始させた。撹拌された血小板をα−スロンビンおよび添加物と共に１分間培養した。他の実験において、血小板をＴＲＡＰ（０．６２５〜２．５μＭ）、ＡＤＰ（１〜５μＭ）（シグマ社）、コラーゲン（１．２５μｇ／ｍＬ）（ホルム、ミュンヘン、ドイツ国）またはＵ−４６６１９（１μＭ）（カルビオケム・ベーリング社、サンジエゴ、ＣＡ）で刺激した。ヒトフィブリノーゲン（１００ｍｇ／ｄＬ）の存在下にγ−スロンビン（１ｎＭ）で刺激された洗浄血小板を用いて追加実験を行った。γ−スロンビンおよびヒトフィブリノーゲンの両者はエンザイム・リサーチ・ラボラトリース、サウス・ベント、ＩＮから購入した。培養の終了後、全血小板試料を１０，９００×ｇ（モデルＥ、ベックマン・インストルメント社、パロ・アルト、ＣＡ）にて０．１３５ｍＭのホルムアルデヒド、５ｍＭのＥＤＴＡ溶液（血小板懸濁物４部に対しホルムアルデヒド−ＥＤＴＡ１部）に対し遠心分離し、上澄液の１部を５−［14Ｃ］ヒドロキシトリプタミン分泌につき分析するまで氷上に貯蔵した。分泌％を、作用剤処理された試料の上澄液における５−［14Ｃ］ヒドロキシトリプタミンの損失と、比較上澄液の数値（すなわち未刺激試料における５−［14Ｃ］ヒドロキシトリプタミンのレベル）を両者から引算した後の血小板溶解物の上澄液における５−［14Ｃ］ヒドロキシトリプタミンの損失との比により決定した。
第１Ａ〜１Ｃ図に示したように、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を含有した各ペプチドはα−スロンビン誘発の血小板凝集および分泌の濃度依存性抑制を示した。全ての場合、血小板凝集の抑制程度は、ペプチドの所定濃度にて血小板分泌の抑制程度より大であった。試験したもののうち、最も有力なスロンビン抑制剤はＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４であって、それぞれ０．２３および０．５ｍＭのＩＣ50にて血小板凝集および分泌を示した（第１表）。ＢＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）もα−スロンビン誘発の血小板活性化につき有力な抑制剤であって、それぞれ凝集および分泌の抑制につき０．２５ｍＭのＩＣ50および１．０ｍＭを有した。天然ＢＫ配列セグメントの４個のカルボキシ末端アミノ酸と１２個の追加アミノ酸とからなるＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８は極く僅かなα−スロンビン誘発の血小板活性化の抑制を示し、ＩＣ50≧３ｍＭであった。天然ＢＫ配列セグメントＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）の５個のアミノ末端アミノ酸を含むＢＫ同族体は０．５ｍＭのＩＣ50にてα−スロンビン誘発の血小板凝集を抑制した。１ｍＭにてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０は血小板凝集の９５％および分泌の２５％を抑制したのに対し、アミノ酸ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を有する２種の混雑ペプチドは１ｍＭにてα−スロンビン誘発の血小板凝集および分泌を抑制しなかった。ＢＫ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の中間もしくはカルボキシ末端領域のＢＫ同族体はＩＣ50≧２ｍＭにてα−スロンビン誘発の血小板活性化の貧弱な抑制剤であった。さらに、天然ＢＫアミノ酸配列のアミノおよびカルボキシル末端アルギニン残基はα−スロンビン誘発の血小板活性化の抑制に関与することも明かである。血小板活性化を封鎖するＢＫ同族体の能力は、ＢＫ同族体がコラーゲン−またはＵ４６６１９−誘発の血小板凝集および分泌を抑制しなかった点でスロンビン誘発血小板活性化につき特異的であった。さらに、ＢＫ同族体は１００ｍｇ／ｄＬのヒトフィブリノーゲンの存在下および血小板リッチな血漿にてγ−スロンビン誘発（１ｍＭ）の血小板活性化を抑制した。
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Ｂ．カルシウム可動化のＢＫ同族体抑制
さらに試験を行って、ＢＫ同族体が血小板におけるα−スロンビン誘発のＣａ2+可動化を抑制するかどうかを確認した。血小板刺激反応カップリングのα−スロンビン活性化は血小板凝集に先立つので［シャロ等、ジャーナル・クリニカル・インベスチゲーション、第６０巻、第８６６頁（１９７７）］、ＢＫ同族体がα−スロンビン誘発のカルシウム可動化を抑制するという知見は、ＢＫ同族体が刺激反応カップリングメカニズムのレベルにて血小板のα−スロンビン活性化を阻害することを示す。
細胞質の遊離Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）を蛍光Ｃａ2+指示薬フラ−２［モレキュラ・プローブス・インコーポレーション、ユーゲン、ＯＲ］を用いて測定した。Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液におけるゲル濾過血小板に、ラスムッセン等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６８巻、第１４３２２頁（１９９３）の方法にしたがい３７℃にて１μＭのフラ−２／アセトキシメチルエステルと共に４５分間にわたり培養することにより、フラ−２を充填した。次いで、標識された血小板を再ゲル濾過して過剰のプローブを除去した。標識された血小板懸濁物の１部を磁気撹拌機を備えた石英キュベットに移し、次いでこれを蛍光分光光度計［ジュアル・ウェイブ・レンス・シマズ  ＳＰ５０００型スペクトロフルオロメータ、シマズＵＳＡ、ピッツバラ、ＰＡ）にて３７℃の恒温制御チャンバに入れた。各試薬をキュベットに直接添加した。励起波長を３４０〜３８０ｎｍの範囲で変化させた。フィッシャー等、モレキュラ・ファーマコロジー、第３５巻、第１９５頁（１９８９）により報告されたように、５１０ｎｍにおける発光を記録して蛍光を測定した。最小発光を２０ｍＭのジギトニン、１０ｍＭのＥＧＴＡ溶解血小板試料にて測定し、最大発光を１０ｍＭのＣａ2+を添加した同じ試料につき測定した。血小板内の遊離Ｃａ2+濃度をグリキエウィッツ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６０巻、第３４４０頁（１９８５）の方法により計算した。蛍光測定値の比をＲ＝３４０／３８０ｎｍとして計算し、式［Ｃａ2+］i−ＫD（（Ｒ−Ｒmin）／Ｒmax−Ｒ））（Ｓf2／Ｓb2）にしたがい処理して血小板内の遊離Ｃａ2+濃度を測定した。フラ−２のＫDは２２４ｎＭであると推定された。ＲmaxおよびＲminは、それぞれ実験の終了時に測定した最大および最小の蛍光比である。Ｓf2およびＳb2は、それぞれ飽和［Ｃａ2+］の存在下および不存在下における３８０ｎｍでの蛍光値である。
第２Ａ図に示したように、スロンビン単独はＨＫにより抑制されたＣａ2+可動化の相当な変化を誘発する（第２Ｂ図）。ＢＫおよびＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４は、その親蛋白質ＨＫと同様にα−スロンビン誘発カルシウム可動化を封鎖する（第２Ｃ図および第２Ｄ図）。ＢＫおよびＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の増加濃度は、それぞれ０．２３および０．３ｍＭのＩＣ50にて減少Ｃａ2+可動化をもたらした。濃度依存性試験の結果を第３図に示す。
さらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０は濃度依存的にα−スロンビン誘発のカルシウム可動化を抑制しうることも見出された。１ｍＭのＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０はα−スロンビン誘発カルシウム可動化の８０％抑制を示した（第４Ｂ図）。ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の濃度を０．５ｍＭおよび０．１２５ｍＭまで減少させると、α−スロンビン誘発のカルシウム可動化のレベルはα−スロンビン抑制剤の不存在下で示されたレベルまで戻った（第４Ａ図）。これらの結果を第４Ｃ図および第４Ｄ図にそれぞれ示す。これらデータは、ＢＫ同族体が刺激反応カップリングメカニズムのレベルにて血小板のα−スロンビン活性化を疎外したことを示す。
Ｃ．ＢＫ同族体は血小板に対する125Ｉ−α−スロンビン結合を抑制しない
125Ｉ−α−スロンビン結合試験を行って、ここに記載したＢＫ同族体が血小板に対する沃素化α−スロンビン結合を抑制したかどうかを決定した。
ゲル濾過された血小板をポリプロピレン管に入れ、２ｍＭのＣａＣｌ2と５０μＭのＺｎＣｌ2と添加物とを含有するＨｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液により２×１０8血小板／ｍＬの最終濃度まで希釈した。反応を１ｎＭの125Ｉ−α−スロンビンの添加により開始させ、これはメロニー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６６巻、第６７８６頁（１９９１）により報告されたイオドゲン技術を用いて作成した。培養を３７℃にて特定時間にわたり種々の添加物を用いて行った。培養の後、５０μＬ部分を各実験につき３反復で取出し、ポリプロピレン微小遠沈管に、１部のアピエゾンＡ油と９部のｎ−ブチルフタレートとよりなる２００μＬの油混合物を含有した延長先端と共に入れ［グスタフソン等、ジャーナル・クリニカル・インベスチゲーション、第７８巻、第８１０頁（１９８６）］、次いで微小遠沈管［モデルＥ、ベックマン・インスツルメンツ社、パロ・アルト、ＣＡ］にて１０，９００×ｇで２分間にわたり室温にて遠心分離した。上澄液を取出し、先端部をγカンウタに挿入すべく切断した。細胞ペレット中に存在する放射能をＬＫＢラック・ガンマー・カウンタ［ＬＫＢインスツルメンツ・インコーポレーション、ガイセルスブルグ、ＭＤ］により測定した。非特異性結合を１００倍モル過剰のα−スロンビンの存在下に測定した。
第５図にプロットしたデータは３回の実験の平均値であって、２００ｎＭのＨＫが蛋白分解活性のα−スロンビンを血小板への結合から抑制しえたことを示す。これに対し、ＢＫ同族体はα−スロンビン誘発の血小板凝集、分泌およびカルシウム可動化の１ｍＭ濃度における良好な抑制剤であったが、ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は洗浄された血小板に対する125Ｉ−α−スロンビン結合を封鎖しなかった。これらデータは、ＢＫ同族体がα−スロンビン抑制の血小板活性化を抑制するメカニズムがＨＫ、ＬＫもしくはＤ3により示されるメカニズムとは異なることを示し、すなわちこれらは血小板に対する125Ｉ−α−スロンビン結合を封鎖しない。
Ｄ．流れサイトメトリーにより測定される血小板のα−スロンビン活性化のＢＫ同族体抑制メカニズム
流れサイトメトリー試験を行って、ＢＫ同族体がリセプタのα−スロンビン開裂の後に喪失されるスロンビンリセプタにおけるエピトープを除去することからα−スロンビンを防止するかどうかを決定した。ＳＰＡＮ１２は血小板におけるスロンビンリセプタに対する抗体であって、この種のエピトープにつき特異性である。モノクローナル抗体ＡＴＡＰ１３８により認識されるエピトープに対するＢＫ同族体の作用を決定するための試験をも行った。抗体は、α−スロンビンがリセプタを開裂させた後に保持されるスロンビンリセプタにおけるエピトープに向けられる（第７Ａ〜７Ｄ図）。
モノクローナル抗体ＳＰＡＮ１２を１２アミノ酸Asn-Ala-Thr-Leu-Asp-Pro-Arg-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg（SEQ ID NO:2）まで成育させ、これはα−スロンビン開裂部位をスロンビンリセプタ上にモリノット等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２７０巻（出版中）（１９９５）の方法により架橋させる。モノクローナル抗体ＡＴＡＰ１３８はプラス等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６７巻、第１３７９５頁（１９９２）に報告されたようにα−スロンビンによる開裂の後に保持されるスロンビンリセプタにおけるエピトープAsn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe（SEQ ID NO:3）を認識する。スロンビンリセプタに対するモノクローナル抗体ＳＰＡＮ１２およびＡＴＡＰ１３８はＦ．ローレンス博士、プラス・オプ・ユニバーシティー・オブ・ペンシルバニアから入手し、ブラス等（上記）の方法により作成された。
流れサイトメトリー試験のための血小板は、８．７ｍＬのクエン酸デキストロース（１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、６６ｍＭのクエン酸、１１１ｍＭのグルコース、ｐＨ４．６）で凝固防止された新鮮な５３．３ｍＬの血液から作成した。血小板リッチな血漿からの洗浄血小板を室温にて１８０×ｇで１５分間にわたり遠心分離することにより作成した。血小板リッチな血漿をＰＧＥ１（シグマ社）および１：２５（ｖｏｌ：ｖｏｌ）にて１Ｍのクエン酸ナトリウムにより２．８μＭの最終濃度にした。５分間の室温における培養の後、血小板リッチな血漿を室温にて１２００×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。次いで血小板ペレットを１０ｍＬの血小板洗浄緩衝液（１２８ｍＭのＮａＣｌ、４．２６ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、７．４６ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、４．７７ｍＭのクエン酸ナトリウム、２．３５ｍＭのクエン酸、５．５ｍＭのグルコース、３．５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、ｐＨ６．５）に再懸濁させ、次いで室温にて１２００×ｇで５分間にわたり遠心分離した。５ｍＬの血小板懸濁緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．６ｍＭのＫＣｌ、１３．８ｍＭのＮａＨＣＯ3、５．５ｍＭのグルコース、１ｍＭのＭｇＣｌ2、０．３６ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３．５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、ｐＨ７．３５）に再懸濁させた後、血小板カウント数を４００，０００／μＬに調整した。１００μＬの洗浄された血小板を次いで５ｍＬの丸底ポリスチレン管に入れ、ＢＫ同族体への露出またはその不存在および／または血小板作用物質α−スロンビン（０．１２５Ｕ／ｍＬもしくは１ｎＭ）と共にまたはそれなしの５分間にわたる培養を含め各種の処理にかけた。一次抗体を２μｇ／ｍＬの最終濃度で添加し、抗体を血小板と共に４℃にて３０分間にわたり培養した。培養の後、血小板を５００μＬの血小板懸濁緩衝液で希釈し、１２００×ｇにて室温で５分間にわたり再び遠心分離した。次いで血小板ペレットを１００μＬの血小板懸濁緩衝液に再懸濁させ、ＦＩＴＣと結合した抗マウスＩｇＧの１：４０希釈物と共に培養した。さらに３０分間にわたり４０℃で培養した後、血小板を再び１２００×ｇにて５分間にわたり遠心分離し、次いで５００μＬの血小板懸濁緩衝液に再懸濁させた。
マウスＩｇＧおよびエピトープＣＤ６２に対する抗体を比較として用いた。マウスＩｇＧ（コードＮｏ．４３５０）はビオソース社、カマリロ、ＣＡから購入した。血小板に対する結合ＦＩＴＣ−抗ＩｇＧの蛍光をエピックス−Ｃ流れ血球計［クールター・エレクトロニックス社、ヒアリー、ＦＬ］で監視した。散乱光および蛍光チャンネルを対数増加に設定した。レーザー励起を４８８ｎｍにした。緑色蛍光を５２５ｎｍバンドパスフィルタで観察した。少なくとも１５，０００血小板の相対蛍光強度を各試料にて分析した。ＣＤ６２（Ｐ−セレクチン）に対する抗体はベクトン・ジキンソン（カタログＮｏ．５５００１４）、サン・ジョーズ、ＣＡから購入した。
流れサイトグラムの前方スキャッターにより見られるように（第６Ａ図、ゴースト曲線）、ＳＰＡＮ１２は未刺激血小板におけるスロンビンリセプタの抗原を検出する。スロンビンリセプタはルー等、セル、第６４巻、第１０５７頁（１９９１）により記載された。洗浄された血小板を１ｎＭのα−スロンビンで処理すると（第６Ａ図、実線曲線）、モノクローナル抗体ＳＰＡＮ１２のエピトープの抗原発現の減少が生じた。未刺激血小板にて見られたＳＰＡＮ１２エピトープの前方スキャッター（第６Ａ図のゴースト曲線）は、α−スロンビン活性化血小板における源泉の方向に移動し（実線曲線、第６Ｂ図）、比較として使用したマウスＩｇＧ（第６Ｆ図）と同様な不存在の抗原検出パターンを与えた。１ｍＭのＢＫおよびＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の存在はα−スロンビン活性化血小板（１ｎＭ）におけるスロンビンリセプタのエピトープの損失を防止した（第６Ｂ図および第６Ｃ図）。しかしながら、１ｎＭのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列に部分的に重なるＢＫ同族体、またはＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に類似するアミノ酸含有量を有する１ｎＭの未関連ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）は、α−スロンビンをエピトープをＳＰＡＮ１２まで変換させることから防止しなかった（第６Ｄ図および第６Ｆ図）。特定の理論に拘束するものでないが、これら試験はＢＫ同族体が実際にα−スロンビンをそのクローン化リセプタの開裂から防止することにより機能することを示唆する。
活性化（実線曲線）と未活性化（ゴースト曲線）との間のＡＴＡＰ１３８のエピトープ発現の程度で見られる減少（第７Ａ図）はホクシー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６８巻、第１３７５６頁（１９９３）およびブラス等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６９巻、第２９４３頁（１９９４）により示唆された活性化の後の血小板スロンビンリセプタのインタナリゼーションを示す。ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４は、α−スロンビンをモノクローナル抗体ＡＴＡＰ１３８のエピトープの除去から封鎖した（第７Ｂ図）。比較実験をもマウスＩｇＧ（第７Ｃ図）およびＣＤ６２に対するエピトープ（第７Ｄ図）を用いて行い、これらはα−スロンビン活性化の前後に流れサイトグラムにおける移動を示さない。
Ｅ．ＢＫ同族体はα−スロンビンをスロンビンリセプタの開裂から防止する
他の試験を行ってＢＫ同族体がα−スロンビンをブー等、セル、第６４巻、第１０５７頁（１９９１）により報告されたスロンビンリセプタの開裂から防止するかどうか決定した。スロンビンリセプタにおけるα−スロンビン開裂部位のアミノ酸５５〜４６をスパンするペプチドＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を用いて、ここに記載したＢＫ同族体がクローン化リセプタのα−スロンビン開裂を封止したかどうか決定した。
開裂試験をモリノ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２７０巻、第１１１６８頁（１９９５）の方法にしたがって行い、ここではＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を０．０１ＭのＮａＨ2ＰＯ4および０．１５ＭのＮａＣｌの溶液（ｐＨ７．４）に溶解させた。次いで、この混合物を８ｎＭのα−スロンビンと共に３７℃にて１時間にわたり１ｍＭのＢＫ同族体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）の存在下もしくは不存在下（比較）または１ｍＭの非−ＢＫ同族体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）の存在下または３００ｎＭのＨＫの存在下に培養した。培養の後、各混合物をバイアデックＣ−１８ＨＰＬＣカラムに０．１％トリフルオロ酢酸にて施すと共に混合物を０〜１００％の８０％ＭｅＣＮおよび０．１％のトリフルオロ酢酸の濃度勾配で溶出させると共に混合物を０〜１００％の８０％ＭｅＣｌおよび０．１％トリフルオロ酢酸の濃度勾配で溶出させることにより分離した。分離された生成物の寸法を質量分光光度法により確認した。
第８図に示したように、ＨＰＬＣにより測定されたＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は単一のピークを示した。第８Ａ図のピーク１は１００％を示す。ＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をα−スロンビンで処理した場合（第８Ｃ図、ピーク１）、そのピーク領域は８１％だけ減少し、２つの新たなピークがその左側に出現して初期ピーク領域のそれぞれ４４％（ピーク３）および３７％（ピーク２）を示した（第８Ａ図）。第８Ｃ図に示した追加ピーク（すなわちピーク３および２）はＮＡＴ１２の開裂生成物を示す。ＢＫ同族体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）の存在下（第８Ｄ図）において、ＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のピーク１はα−スロンビンでの処理後に５７％だけ減少した。ＮＡＴ１２の開裂生成物（第８Ｄ図、ピーク３および２）は、それぞれ未処理ピーク領域（第８Ａ図）の３１％および２６％を構成する。
第８Ｂ図は分離されたＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のクロマトグラフを示す。ＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の存在下にα−スロンビンで処理した場合、ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のピークがα−スロンビン開裂生成物（第８Ｄ図、ピーク３および２）のピーク間に出現した。１００ｎＭのＨＫの存在において、α−スロンビンはＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）（第８Ａ図）の初期ピークの寸法を僅か３２％だけ減少させた（第８Ｅ図）。さらに、２種のα−スロンビン開裂フラグメント（すなわち第８Ｅ図におけるピーク３および２）はそれぞれ第８Ａ図におけるピーク１の領域の僅か１８％および１４％を構成した。第８Ｅ図に見られる第４ピークはＨＫ調製物からのピークを示し、追加α−スロンビン開裂断片でない。
非−ＢＫ同族体（キニノゲンのドメイン３から得られる）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）をＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と反応させた場合、α−スロンビン開裂からの保護は観察されなかった（第８Ｆ図）。非−ＢＫ同族体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）の存在下に、α−スロンビンは無傷ＮＡＴ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と対比してピーク面積（第８Ｆ図）における８６％減少を示すと共に、それぞれピーク３および２にて５４％および３２％のピーク面積がピーク１（第８Ａ図）と比較して減少した。
これらの結果は、ここに記載したＢＫ同族体がα−スロンビンをクローン化スロンビンリセプタの開裂から防止したことを確認する。これは血小板のα−スロンビン活性化の抑制に関する新規なメカニズムを示すと思われる。
ＩＩＩ．ＢＫ同族体はインビボおよびインビトロにて血小板機能を抑制する
追加試験を行って、ここに記載したＢＫ同族体がウサギにてインビボおよびヒト血小板にてインビトロでスロンビン誘発の血小板活性化を抑制することを示した。
Ａ．ウサギクリアランスおよび機能抑制の試験
クリアランス試験を、ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を有するニュージーランド白ウサギで行った。体重２．０〜２．５ｋｇの白ウサギを予めミッシェルソン等、ジャーナル・モレキュラ・セル・カルジオロジー、第２０巻、第５４７頁（１９８８）の方法にしたがい１０ｍｇ／ｋｇの１Ｍキシラジンおよび１０ｍｇ／ｋｇの１Ｍケタミンにより予備処理した。器官切開、挿管および室内空気での陽圧換気（ハーバード・インスツルメント社）の後、第ＩＩＩ段階の手術麻酔を２０ｍｇ／ｍＬの静脈内ペントバルビタールで維持した。頸動脈および頸静脈を次いで露出させた。カテーテルを露出頸動脈に血液試料を抜き取るため挿入すると共に、動物の血圧を監視した［ゴウルド・インコーポレーション、カルジオバスキュラ・プロダクツ、オックスナルド、ＣＡ］。同様にして、カテーテルを露出された頸静脈に挿入て、麻酔剤およびＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を投与した。
クリアランス試験のため、単一ボルスのＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を注射した。注射したＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の量を、血液容量がペプチドで１ｍＭとなるよう動物の体重から計算した。たとえば２．５ｋｇのウサギにつき、体重の７％は１７５ｍＬの推定血液容量を与える。したがって、８９ｍｇのＢＫ同族体を注射して、１７５ｍＬの血漿試料を１ｍＭにした。動物の体格に応じ、７５〜９０ｍｇのペプチドを注射した。血液試料を、０．０１３Ｍのクエン酸ナトリウム抗凝集剤溶液中に注入した後に２分間、４分間、６分間、８分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、６０分間、９０分間および１２０分間の間隔にて集めた。血漿を経時的に回収した各血液試料から１０，００×ｇにて２分間にわたる血液試料の遠心分離により作成した。血漿の１部を、ＥＬＩＳＡ技術により大日本製薬株式会社、大阪、日本国からのマルキット−Ｍ［１−５］ＢＫ分析を用いＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０抗原の存在につき分析した。
機能抑制試験につき、体重２．０〜２．５ｋｇの他のニュージーランド産白ウサギを上記と同様に手術作成した。上記したように計算されたＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の単一ボルス注入の後、５ｍＬの血液試料を０．０１３Ｍのクエン酸ナトリウム抗凝固剤溶液中に注入した後に２分間、６分間、１０分間、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、１５０分間、１８０分間、２１０分間および２４０分間の間隔にて回収した。回収された血液試料を１８０×ｇ（１０００ｒｐｍ）にて１５分間にわたり室温で遠心分離した。血液の血小板リッチな血漿（ＰＲＰ）部分は上澄液に含有された。Ｈ−１０セルカウンタ［テキサス・インターナショナル・ラボラトリース・インコーポレーション、ヒューストン、ＴＸ］で得られたＰＲＰの血小板カウント数をウサギ血小板プアの血漿で２００，０００〜２５０，０００血小板／μＬに調整した。
ＰＲＰにおける血小板凝集試験を４−チャンネルの凝集計［ビオデータ−ＰＡＰ−４、ビオ・データ・コーポレーション・ハットボロー、ＰＡ］にて行った。血小板凝集の程度を、３７℃に維持されたＰＲＰの撹拌懸濁物に対する光透過の増加を測定して決定した。血小板凝集を、２０μＭのＡＤＰおよびγ−スロンビンの添加によりハーフェニスト等、スロンビン・ヘモスト、第５３巻、第１８３頁（１９８５）の方法にしたがいＰＲＰ試料にて誘発させた。γ−スロンビン［エンザイム・リサーチ・ラボラトリース社、サウス・ベンド、ＩＮ］をα−スロンビンの代わりにこの試験に用いた。何故なら、これはフィブリノーゲンを蛋白分解せずに血小板リッチな血漿を凝固させるからである。ヒト血小板と同様に、ウサギ血小板はγ−スロンビンに対し種々の反応を示す。各ウサギ血小板をＢＫ同族体注入の前にそのγ−スロンビンに対する域値反応につき評価した。この実験に用いたウサギ血小板は１０〜４０ｎＭのγ−スロンビンに対し反応した。同時にγ−スロンビン−誘発の血小板凝集試験を１０ｎＭ、２０ｎＭおよび４０ｎＭのγ−スロンビン並びに２０μＭのＡＤＰにより行った。
第９図に示したように、注入後のＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のピーク血漿濃度はＥＬＩＳＡにより測定して３種のウサギのうち２匹につき６０ｍｇ／ｍＬ（０．１２０ｍＭ）であった。ＢＫ同族体のボルス注射の後、動物には好ましくない作用が検出されなかった。ウサギの血圧、脈搏および血小板カウント数は安定に留まり、切断部および挿管部の手術部位に異常な出血は存在しなかった。血漿におけるＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０抗原クリアランスの半減期は注入の６．６分間後であると計算された。ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のクリアランスは初期には腎臓排泄に基づかなかった。何故なら、動物の腎臓動脈の結窄は薬剤の半減期を長期化させなかったからである（第９図、ウサギ２）。したがって、ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０抗原の即座のクリアランスの主たる決定子は結合および／またはメタボリズムに帰因した。
しかしながら第１０図に示したように、ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０は長期の生物学的クリアランスを有した。ＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の１回のボルス注入の後、１０ｎＭのγ−スロンビン誘発血小板凝集は４時間以上にわたり１００％抑制され（データ示さず）、２０ｎＭのγ−スロンビン誘発の血小板凝集は２．７５時間にわたり≧５０％抑制され、また４０ｎＭのγ−スロンビン誘発の血小板凝集は１時間にわたり≧５０％抑制された。このデータはさらに、大凡４５分間にわたりＡＤＰ−誘発の血小板凝集の≧５０％抑制が存在したことを示した。この知見は、スロンビンがインビボでもＡＤＰ−誘発の血小板活性化を媒介することを示唆した。要約して、データは注入の２分間後に僅か０．１２０ｍＭのピークペプチド濃度を有するＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の１回のボルス注入後に、ここに記載したＢＫ同族体がインビボにてスロンビン誘発の血小板活性化に対し長期の選択的抑制作用を示しうることを示す。
Ｂ．ＢＫ同族体はインビトロにてヒト血小板におけるスロンビン誘発の血小板活性化を抑制する
ニュージーランド白ウサギで行ったインビトロの血小板凝集試験と同様に、ヒト血小板を用いて試験を行い、ＢＫ同族体がインビトロにてスロンビン誘発の血小板活性化を抑制するかどうか決定した。
ヒト血小板試験の方法はセクションＩＩＩ．Ａにて上記した白ウサギに関する機能試験と同一にしたが、以下の相違点を伴う。
血液試料を正常なヒト志願者から入手した。血小板カウント数をクールター・カウンタ・モデル２Ｆ［クールター、ヒアリー、ＦＬ］で測定すると共に２００，０００血小板／μＬの血小板カウント数に調整した。基線における各個人の血小板をγ−スロンビンに対する域値反応につき測定した。典型的な域値レベルは１０〜４０ｎＭの範囲であった。
第１１図は、γ−スロンビン誘発の血小板活性化につきヘテロダイマーＢＫ同族体（標識「ヘテロダイマー」）および４−ＭＡＰを用いた結果を示す。ＰＲＰにおけるヒト血小板を２０ｎＭのγ−スロンビンで処理した。第１１図は、凝集計からの追跡を示す。１ｍＭのＢＫ同族体ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０もしくは０．０５ｍＭの４−ＭＡＰまたは０．５ｍＭのヘテロダイマーを２０ｎＭのγ−スロンビンと反応させた場合は、凝集追跡を省略した。この反応の特異性は、その結果を１ｍＭの非−ＢＫ同族体ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）で行った反応の結果と比較して示した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、は血小板活性化を誘発するγ−スロンビンの能力を変化させることができなかった。
要約して、ウサギおよびヒトの血小板機能抑制試験、並びにウサギクリアランス試験からのデータは、ここに記載したＢＫ同族体がスロンビン誘発およびＡＤＰ誘発の血小板活性化を抑制しえたことを示す。
合成、製造および分析の各方法に関する引例を全て参考のためここに引用する。
以上、本発明を実施例につき説明したが、本発明は他の形態においても本発明の思想および範囲を逸脱することなく実現しうることが当業者には了解されよう。
配列リスト
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：ザ  リージェンツ  オブ  ザ  ユニバーシティ  オブ  ミシガン；
シュメイヤー，アルビン  エイチ；  及び
ハサーン，アーメド  エイ  ケイ
（ｉｉ）発明の名称：選択性スロンビン抑制剤としてのブラジキニン同族体
（ｉｉｉ）配列の数：１
（ｉｖ）通信宛先：
（Ａ）宛名：サイデル、ゴンダ、ラボンニャ  アンド  モナコ  ＰＣ
（Ｂ）町名：ツー  ペン  センター  プラザ  １８００
（Ｃ）市名：フィラデルフィア
（Ｄ）州名：ベンシルバニア州
（Ｅ）国名：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：１９１０２
（ｖ）コンピュータ解読フォーム：
（Ａ）メディア種類：ディスケット、３．５０インチ、７２０Ｋｂ
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＳ／２
（Ｃ）作動システム：ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト  ５．１
（ｖｉ）現出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）先行出願データ：
（Ａ）出願番号：６０／０００，０９６
（Ｂ）出願日：１９９５年６月９日
（ｖｉｉｉ）代理人の情報：
（Ａ）氏名：モナコ，ダニエル  エイ
（Ｂ）登録番号：３０，４８０
（Ｃ）参照番号：８８２０−２  ＰＣ
（ｉｘ）電信情報：
（Ａ）電話：（２１５）５６８−８３８３
（Ｂ）テレファックス：（２１５）５６８−５５４９
（Ｃ）テレックス：
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
0004067117.tif 000008
（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：
0004067117.tif 000009
（４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
0004067117.tif 000010
（５）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：
0004067117.tif 000011
（６）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：
0004067117.tif 000012
（７）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：
0004067117.tif 000013
（８）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：
0004067117.tif 000014
（９）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：
0004067117.tif 000015
（１０）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９：
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（１１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：
0004067117.tif 000017
（１２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：２７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：
0004067117.tif 000018
（１３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２：
0004067117.tif 000019
（１４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：
0004067117.tif 000020
（１５）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４：
0004067117.tif 000021
（１６）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：２６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５：
0004067117.tif 000022
（１７）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６：
0004067117.tif 000023
（１８）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７：
0004067117.tif 000024
（１９）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８：
0004067117.tif 000025
（２０）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９：
0004067117.tif 000026
（２１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０：
0004067117.tif 000027
（２２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１：
0004067117.tif 000028
（２６）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２：
0004067117.tif 000029
（２７）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３の情報：
（ｘ）配列特性
（Ａ）長さ：６４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：線状
（ｘｉ）配列説明ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３：
0004067117.tif 000030
【図１Ａ】
0004067117.tif 000036
【図１Ｂ】
0004067117.tif 000037
【図１Ｃ】
0004067117.tif 000038
【図１Ｄ】
0004067117.tif 000039
【図２Ａ】
0004067117.tif 000040
【図２Ｂ】
0004067117.tif 000041
【図２Ｃ】
0004067117.tif 000042
【図２Ｄ】
0004067117.tif 000043
【図３】
0004067117.tif 000044
【図４Ａ】
0004067117.tif 000045
【図４Ｂ】
0004067117.tif 000046
【図４Ｃ】
0004067117.tif 000047
【図４Ｄ】
0004067117.tif 000048
【図５】
0004067117.tif 000049
【図６Ａ】
0004067117.tif 000050
【図６Ｂ】
0004067117.tif 000051
【図６Ｃ】
0004067117.tif 000052
【図６Ｄ】
0004067117.tif 000053
【図６Ｅ】
0004067117.tif 000054
【図６Ｆ】
0004067117.tif 000055
【図７Ａ】
0004067117.tif 000056
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
0004067117.tif 000059
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
0004067117.tif 000061
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
0004067117.tif 000063
【図８Ｅ】
0004067117.tif 000064
【図８Ｆ】
0004067117.tif 000065
【図９】
0004067117.tif 000066
【図１０】
0004067117.tif 000067
【図１１】
0004067117.tif 000068