(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチド中の１以上のヌクレオチドの配列を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
標的特異的プライマーを、該プライマーが１以上の該標的ポリヌクレオチド中のプライマー相補領域に特異的にアニーリングするに有効な条件下でポリヌクレオチドサンプルと接触させて、１以上の標的−プライマーハイブリッドを形成させる工程であって、ここで各該標的特異的プライマーが、（ｉ）標的結合セグメントおよび（ｉｉ）該標的に結合しない移動度低減部分を含み、該移動度低減部分は、ポリヌクレオチドセグメントを含む、工程、
該１以上の標的−プライマーハイブリッドを、選択されたヌクレオチド塩基型に相補的な少なくとも１つの標識３’ヌクレオチドターミネーターの存在下で、検出可能なシグナルを生成する少なくとも１つの標識３’ヌクレオチドターミネーターで終結する１以上のプライマー伸長産物を形成するに有効な条件下でプライマー伸長試薬と反応させる工程、
該プライマー伸長産物を、より小さな伸長産物が、より大きな伸長産物よりも迅速に移動し、該標識３’ヌクレオチドターミネーターからの少なくとも１つの検出可能な分解産物が、伸長されていないプライマーよりも前に溶出して該プライマー伸長産物と溶出が重複しないように、分子篩マトリックス中で変性条件下で電気泳動によって分離する工程、および
該分離した伸長産物からの少なくとも１つの検出可能なシグナルを検出して、該分離した伸長産物の移動度および検出可能なシグナルに基づいて標的配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
プライマー伸長が、標的相補ポリヌクレオチドモノマーおよびターミネーターの添加によって、少なくとも１つの伸長可能ヌクレオシドモノマーの存在下で、特異的にハイブリダイズしたプライマーを伸長するに有効な条件下で行われて、前記１以上の伸長産物が形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマー伸長が、伸長可能ヌクレオシドモノマーの非存在下で、前記少なくとも１つの標識３’ヌクレオチドターミネーターを、該ターミネーターが、少なくとも１つの特異的にアニーリングしたプライマーの伸長可能末端に隣接した前記標的ポリヌクレオチド中の塩基に相補的である場合にのみ、該アニーリングしたプライマーに対して付属させるに有効な条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの３’ヌクレオチドターミネーターが、蛍光標識を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記反応させる工程が、４つの異なる３’ヌクレオチドターミネーターの存在下で行われ、該ターミネーターが、（ｉ）各々、異なるヌクレオチド塩基型に相補的であり、そして（ｉｉ）各々、該ターミネーターの塩基型を同定する区別可能な蛍光標識を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分離する工程が、スラブゲル電気泳動によって行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記分離する工程が、キャピラリー電気泳動によって行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記分離する工程が、マイクロチャネル中で行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの３’ヌクレオチドターミネーターが、放射性標識を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記移動度低減部分が、該移動度低減部分を欠く対応するプライマー伸長産物の移動度と比較して、少なくとも１０個のヌクレオチド塩基の付加に等しい量で各プライマー伸長産物の移動速度を減少させるに有効である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
移動度における前記減少の量が、少なくとも１５個のヌクレオチド塩基の付加に等しい、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
移動度における前記減少の量が、少なくとも２０個のヌクレオチド塩基の付加に等しい、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法における使用のためのキットであって、該キットは、
標的特異的プライマーであって、（ｉ）標的結合セグメントおよび（ｉｉ）該標的に有意には結合しない移動度低減部分を含み、該移動度低減部分は、ポリヌクレオチドセグメントを含む、標的特異的プライマー、
少なくとも１つの標識ヌクレオチドターミネーター、
プライマー伸長試薬、ならびに
該キットを利用するための使用説明書、
を備える、キット。
【請求項１４】
請求項１３に記載のキットであって、該キットは、少なくとも１つの伸長可能３’ヌクレオシドをさらに備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、ポリヌクレオチドを配列決定するための方法に関する。詳細には、本発明は、配列決定プライマーに隣接する塩基の配列決定可能な範囲を拡張する、改良されたターミネーター配列決定法に関する。
【０００２】
【表１】
0004113675.tif 000002
0004113675.tif 000003
（発明の背景）
ポリヌクレオチドの配列決定は、生化学の研究および産業において益々重要な役割を果たしている。例えば、最近、真核生物、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＳ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０１２（１９９８）を参照のこと）について、全てのゲノム配列が報告され、そして現在、ヒトゲノムを配列決定をするために多大な努力がなされている。生物学的ポリヌクレオチド配列の知見は、異なる生物体由来の遺伝子配列および関連する遺伝子産物を特徴付け、そして比較するためのみならず、診断試験の開発のため（例えば、遺伝的変異の検出、遺伝子型の決定、疾患の診断、法医学、および治療上の標的の同定のため）にもまた有用である。
【０００３】
過去２０年間にわたって、ヌクレオチド配列決定には２つの主要なアプローチが存在した：ＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎ（１９７７）のチェーンターミネーション法、ならびにＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）の化学分解法。両方法は、１つ以上のセットの標識したＤＮＡフラグメント（各々は共通の起源を有し、そして各々は公知の塩基で終止する）の作製を必要とする。次いで、フラグメントのセット（単数または複数）は、標的配列を明らかにするために、サイズで分けられなければならない。
【０００４】
より最近では、チェーンターミネーション法は、現在利用可能な全ての自動ＤＮＡ配列決定装置にとって標準的な方法となっている。この方法は、一般に、４つの標準的なデオキシリボヌクレオチド塩基および１つ以上のジデオキシヌクレオチドターミネーターの存在下での、５’プライマーの、標的鋳型鎖に沿った酵素的伸長を含む。プライマー伸長の間のターミネーターの取り込みは、種々の長さの産物の混合物を生じ、各々の産物は、ターミネーターを有するその３’末端で終止する。最初に提案したように、４つの別々の配列決定反応を所定の標的配列について（各ジデオキシヌクレオチド塩基型について１つ）行った。次いで、各混合物由来の産物を、サイズに基づいた４つの別々のレーンに溶解し、そして標的配列を、フラグメントの移動の相対的な順番から決定した。
【０００５】
５’−伸長プライマー（Ｓｍｉｔｈ、１９８６）または３’−ジデオキシターミネーター塩基（Ｐｒｏｂｅｒ、１９８７；Ｐｒｏｂｅｒ  １９９５；Ｂｅｒｇｏｔ、１９９１）のいずれかに結合した、スペクトル的に識別可能な蛍光標識を使用するＳａｎｇｅｒ法に対する改変が、その後、開発された。前者の場合、伸長反応は、適切に標識されたプライマーの存在下で、各々異なるターミネーター塩基について別々に（各々異なるターミネーターについて１つの異なる標識）行われなければならず、その後、標識された伸長産物は、一つの分離経路において組合わされ、そして分離され得る。後者の場合、プライマー伸長は、１つの反応混合物中で行われ得る。なぜなら、塩基特異的標識の取り込みが、ポリメラーゼ酵素によって、次いで１つの分離レーンにおける分離によって高い忠実度で行われるからである。
【０００６】
標識ターミネーター法は、有意により少ない反応器しか含まず、そして使用により便利であるから、選り抜きの配列決定法となっている。しかし、この方法は、伸長プライマーに近接した配列決定フラグメントヌクレオチドを慣用的に同定することの困難さに起因して、制限されてきた。伸長反応は、配列決定フラグメントの十分な産生を保証するために、高濃度の標識されたターミネーターを必要とする。残念ながら、残留ターミネーター塩基またはその分解産物は、短い配列決定フラグメントと共に移動する。なぜなら、それらは同様の移動特性を有するからである。結果として、短い配列決定フラグメントについての配列決定データは、信頼できないか、または全く使用に適さないかのいずれかであった。理論的には、配列決定分析の前に、例えば、事前のサイズベースの分離工程によって、残留ターミネーター塩基を除去することは可能である。しかし、これは、配列決定プロセスに、大規模な配列分析を妨げる余計な工程を導入する。さらに、このような予備精製は、十分な残留ターミネーター物質が除去されるまで、繰り返さなければならないかもしれない。
【０００７】
従って、伸長プライマーに近接した配列決定を可能にする標識ターミネーター配列法を提供することが本発明の目的である。
【０００８】
さらなる本発明の目的は、以前の標識ターミネーター配列決定法に付随してきた混入の問題を克服することである。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、１つの局面において、標的ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドの配列を決定するための方法を提供する。この方法において、標的特異的プライマーは、このプライマーを１つ以上の標的ポリヌクレオチド中のプライマーに相補的な領域に特異的にアニールさせるために有効な条件下で、ポリヌクレオチドサンプルと接触させられ、１つ以上の標的プライマーハイブリッドを形成する。標的特異的プライマーは、（ｉ）標的結合セグメントおよび（ｉｉ）標的に有意には結合しない移動度低減部分を含む。このハイブリッドは、プライマー伸長試薬と、少なくとも１つの標識化３’ヌクレオチドターミネーターで終結する１つ以上のプライマー伸長産物を形成するために有効な条件下で、選択された標的ヌクレオチド塩基型に相補的な少なくとも１つの標識化３’ヌクレオチドターミネーターの存在下で、反応させる。次いで、このプライマー伸長産物は、より小さい伸長産物がより大きい伸長産物より速く移動するような変性条件下で、分子篩マトリックスにおいて電気泳動で分離され、そして所望の配列情報は、分離された伸長産物の移動度および終結標識に基づいて決定される。
【００１０】
１つの実施形態において、標的に相補的なポリヌクレオチドモノマーおよびターミネーターの付加により特異的にハイブリダイズされたプライマーの３’末端を伸長するために有効な条件下で、標識化３’ヌクレオチドターミネーターに加えて少なくとも１つの伸長可能ヌクレオシドモノマーの存在下で、プライマー伸長が、実施され、１つ以上のプライマー伸長産物を形成する。
【００１１】
別の実施形態において、ターミネーターが、アニールされたプライマーの伸長可能末端のすぐ隣にある、標的ポリヌクレオチド中の塩基に相補的である場合にのみ、ハイブリッド中のアニールされたプライマーにターミネーターを付加させるために有効な条件下で、プライマー伸長は、伸長可能オリゴヌクレオチドの非存在下で実施される。
【００１２】
本発明において使用されるターミネーターは、好ましくは１つ以上の伸長産物の電気泳動移動の間に検出され得る標識を含む。１つの実施形態では、少なくとも１つの３’−ヌクレオチドターミネーターは、蛍光標識を含む。好ましい実施形態では、４つの異なる３’−ヌクレオチドターミネーターの存在下で伸長が行なわれ、この３’−ターミネーターは、（ｉ）異なるヌクレオチド塩基型にそれぞれ相補的であり、そして（ｉｉ）ターミネーターの塩基型を同定する識別可能な蛍光標識をそれぞれ含む。
【００１３】
配列決定のために、配列決定伸長産物は、より小さなフラグメントが、より大きなフラグメントの前に溶出する任意の方法により、サイズに基づいて分離される。例えば、これらの産物は、スラブゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、またはマイクロチャネル電気泳動により、好ましくは分子篩マトリックスを用いて分離され得る。
【００１４】
１つの実施形態では、移動度低減部分は、実質的に標的ポリヌクレオチドに結合しないポリマーセグメントを含む。１つの好ましい実施形態では、ポリマーセグメントは、実質的に標的ポリヌクレオチドに結合しないポリヌクレオチドセグメントを含む。他の実施形態では、ポリマーセグメントは、サブユニットの非ポリヌクレオチドポリマーのような非ポリヌクレオチド部分を含む。
【００１５】
移動度低減部分は、各プライマー伸長産物の移動速度を特定の量だけ低減させるように選択され得る。１つの実施形態では、移動度低減部分は、各プライマー伸長産物の移動速度を、移動度低減部分を欠く対応するプライマー伸長産物の移動度に比べて、少なくとも４つのさらなるヌクレオチド塩基に等しい量に、低減させる。他の実施形態では、移動度における低減量は、使用者の必要および設計選択に従って、少なくとも１０のさらなるヌクレオチド塩基、少なくとも１５のさらなるヌクレオチド塩基、または少なくとも２０のさらなるヌクレオチド塩基の付加に等しい。
【００１６】
本発明はまた、上記のような方法を実施する際に有用なキットを含む。このキットは、（ｉ）標的結合セグメント、および（ｉｉ）有意には標的に結合しない移動度低減部分を含む標的特異的プライマーを含む。このキットは、以下のうちの１つ以上をさらに含み得る：少なくとも１つの標識化ヌクレオチドターミネーター、少なくとも１つの伸長可能３’−ヌクレオシド、およびプライマー伸長試薬（例えば、ポリメラーゼ酵素）。このキットはまた、本発明にしたがってこのキットを利用するための使用説明書を含む。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の考察に照らしてより明らかとなる。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、配列決定プライマーの３’末端に隣接して配置される標的配列領域に、改善された配列読み取り能力を提供することに関する。多くのターミネターベースの配列決定プロトコルについて、配列決定プライマーの３’末端の近傍の標的領域を配列決定する能力は、標識化３’−ターミネーターまたはそれらの分解産物の同時移動による妨害のために、妨げられる。この問題は、プライマー伸長が完了した後に、残りのターミネーターを除去することにより低減され得るが、１つより多くの精製工程が、満足な結果を得るためにしばしば必要とされる。従って、プライマーの近傍の標的（例えば、プライマーの３’末端のすぐ隣）が、残りのターミネーターを除去するための１つより多くの前精製工程なしで、容易に配列決定される場合には、都合が良い。
【００１９】
この目的は、移動度低減部分を含む配列決定プライマーを使用することにより本発明において達成され、この移動度低減部分は、プライマー伸長産物の移動速度を、移動度低減部分を含まずに形成された比較の伸長産物の移動速度に対して低減させる。伸長産物の移動度を低減することにより、ターミネーターは、プライマー伸長産物の前に溶出するため、標識化ターミネーターおよびそれらの分解産物との重複による妨害は、減少されるかまたは排除され得る。従って、本発明は、プライマー伸長産物の配列決定可能な領域を広げる。
【００２０】
（Ｉ．定義）
本明細書中で使用される場合、以下の用語は、他に示されないかぎり以下の意味を有する：
「ヌクレオシド」は、プリン、デアザプリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基のような塩基対合部分（「塩基」ともいわれる）（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン、またはそれらの任意の機能的等価体）を含む化合物をいい、これは、糖環またはそれらの任意の機能的等価体のような骨格部分に連結される。ヌクレオシドは、天然に存在するヌクレオシドを含み、この天然に存在するヌクレオシドは、ペントース環（それらの２’−デオキシ形態および２’−ヒドロキシル形態を含む（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、１９９２））の１’−炭素、ならびにペントースアナログおよびそれらの開環等価体（Ｓｃｈｅｉｔ，１９８０；Ｕｈｌｍａｎ，１９９０）に連結される塩基対合部分（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）を含む。例えば、イノシン（ｄＩＴＰ）は、配列決定の際に、グアノシン（ｄＧＴＰ）の代わりとして、ポリ−Ｇ配列領域におけるバンド圧縮を低減させるためにしばしば使用される。
【００２１】
用語「ヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、トリリン酸エステル）をいい、ここで最も一般的なエステル化部位は、ペントース５’−ヒドロキシ基である。特定の場合には、用語「ヌクレオシド」は、簡便さのために、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方をいう。本明細書中で使用される場合、用語ヌクレオチドおよびヌクレオシドは、例えば、他で記載されるように（Ｓｃｈｅｉｔ  １９８０；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１）、改変ヌクレオシド塩基部分、改変糖部分、および／または改変リン酸エステル部分を有する合成アナログを含むことが意図される。
【００２２】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシドモノマーのポリマーをいい、一本鎖、二本鎖および三本鎖デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、これらのα−アノマー形態などを含む。通常、ヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル結合、すなわち、リン酸ジエステルまたはそのアナログ（ここでリン原子は、＋５酸化状態であり、１つ以上の酸素原子が、非酸素部分で置換される）により連結される。例示的なホスフェートアナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニリノチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート、ボロノホスフェートなどが挙げられ、対イオンが存在する場合、付随する対イオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4+、Ｎａ+など）を含む。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」はまた、リン酸エステルまたは他の結合により連結される、非ヌクレオチドモノマーのポリマーを含み、これらは、標的核酸（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ；例えば、Ｋｎｕｄｓｅｎ，１９９６を参照のこと）と配列特異的ハイブリッドを形成し得る。ポリヌクレオチドは、代表的に少ないモノマー単位（例えば、８〜４０）から数百または数千のモノマー単位のサイズの範囲である。他に示されないかぎり、ポリヌクレオチドが文字の配列（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）で表される場合は必ず、ヌクレオチドは、５’から３’の順に、左から右であり、そして「Ａ」はデオキシリボアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すということが、理解される。
【００２３】
「プライマー」は、特異的標的配列に選択的にアニールし得、そしてその後５’→３’または３’→５’方向のプライマー伸長反応の開始点として作用し得るポリヌクレオチドを意味する。
【００２４】
「プライマー伸長反応」は、テンプレート−プライマーハイブリッドと１つ以上のヌクレオチドとの間の反応を意味し、この反応により、１つ以上のヌクレオチドの、プライマーの選択された末端への付加を生じ、その結果、付加されたヌクレオチドは、標的テンプレート核酸中の対応するヌクレオチドに相補的である。
【００２５】
「伸長可能プライマー」とは、プライマーの伸長可能な末端、代表的にはプライマーの３’末端に付加される（共有結合で連結される）ヌクレオチドを有し得るプライマーをいう。
【００２６】
「標的特異的プライマー」とは、完全にまたは実質的には標的配列に相補的な標的結合セグメントを有するプライマーをいい、その結果、プライマーは、十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非標的配列に有意に結合することなく、意図された標的に特異的に結合する。
【００２７】
「ヌクレオチドターミネーター」とは、（１）プライマーが相補テンプレートにアニールされる場合、伸長可能（ｅｘｔｅｎｄｉｂｌｅ）プライマーの末端に共有結合で結合可能であるが、（２）ヌクレオチドターミネーターをプライマーに共有結合で結合するために使用される条件下で、さらに伸長し得ない、ヌクレオチドまたはヌクレオシドをいう。
【００２８】
「特異的結合対」は、互いに特異的に結合して結合複合体を形成する１対の分子をいう。特異的結合対の例としては、抗体−抗原（またはハプテン）対、リガンド−レセプター対、酵素−基質対、ビオチン−アビジン対、相補塩基対を有するポリヌクレオチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
「プライマー伸長試薬」は、プライマーが相補標的核酸にアニールされる場合に、ヌクレオチドターミネーターのプライマー末端ヘの共有結合連結を生じる反応を触媒し得る酵素または他の触媒を意味する。
【００３０】
「標識」は、本発明のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに連結される場合、このようなヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを、公知の検出手段を使用して検出可能であるようにする、任意の部分を意味する。
【００３１】
「分子篩マトリックス」または「分子篩媒質」は、マトリックスを通る荷電された種の電気泳動移動を遅らせるために有効な架橋ポリマーまたは非架橋ポリマーを含み、その結果より小さい伸長産物が、より大きい伸長産物よりも速く移動する、電気泳動媒質を意味する。
【００３２】
（Ａ．サンプル核酸）
本発明と共に使用するための標的核酸は、任意の供給源由来であり得、合成または天然のどちらでも、原核生物、真核生物、植物、動物、およびウイルスのような生物体、ならびに合成核酸を含むがこれらに限定されない。標的核酸は、細胞核（例えば、ゲノムＤＮＡ）および核外核酸（例えば、プラスミド、ミトコンドリア核酸など）のような任意の広範な種々のサンプル型のいずれかの起源であり得る。標的ポリヌクレオチドは、公知の技術に従って一本鎖または二本鎖の形態で得られ得る。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、そして通常ＤＮＡである。
【００３３】
多くの方法が、本発明において使用するための標的核酸の単離および精製に利用可能である。好ましくは、標的核酸は、十分に、タンパク質および任意の他の妨害物質を含まない状態であり、標的特異的プライマーのアニーリングおよび伸長を可能にする。好ましい精製方法としては以下が挙げられる：（ｉ）例えばフェノール／クロロホルム有機試薬を使用して（Ａｕｓｕｂｅｌ）、好ましくは自動化ＤＮＡ抽出機（例えば、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からのＭｏｄｅｌ  ３４１  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）を使用する、有機抽出、続くエタノール沈殿；（ｉｉ）固相吸着法（Ｗａｌｓｈ，１９９１；Ｂｏｏｍ）；および（ｉｉｉ）塩誘導ＤＮＡ沈殿法（Ｍｉｌｌｅｒ）（このような方法は代表的に「塩析」法といわれる）。最適には、上記の精製方法の各々は、タンパク質をサンプルから除去するための酵素消化工程（例えば、プロテイナーゼＫ、または他の同様なプロテアーゼを用いる消化）の後に行なわれる。
【００３４】
検出を容易にするために、標的核酸は、フラグメント分析の前に、適切な増幅手順を使用して増幅され得る。このような増幅は、線形または指数関数的であり得る。好ましい実施形態において、標的核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ）を使用して達成される。一般に、ＰＣＲは、任意の二本鎖核酸サンプルの鎖を分離する最初の変性工程、続いて以下の工程の繰り返しからなる：（ｉ）アニーリング工程（この工程は、増幅プライマーが、標的配列に隣接する位置に特異的にアニール化するのを可能にする）；（ｉｉ）伸長工程（この工程は、５’から３’の方向にプライマーを伸長し、それによって標的配列に相補的なアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）核酸を形成する）；および（ｉｉｉ）変性工程（この工程は、標的配列からアプリコンを分離させる）。上記の各工程は、異なる温度で、好ましくは自動化熱循環機（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行なわれ得る。
【００３５】
好ましい実施形態では、標的増幅工程が使用される場合、ＰＣＲ増幅は、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰの存在下で行なわれ、そして増幅は好ましくは、（Ｌｏｎｇｏら（１９９０）およびＨａｒｔｌｅｙ（１９９１）により教示されるように、前の増幅からのテンプレートの持ち越しを減らすために、Ｅ．ｃｏｌｉウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）での処理の後に行なわれる。簡便には、このＰＣＲ技術を実施するためのキットが、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＧＥＮＥＡＭＰ  Ｃａｒｒｙ−Ｏｖｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．Ｎ８０８−００６８）から入手可能である。簡単には、標的ポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅の初期反応混合物は、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含むように改変される。ＭｇＣｌ2およびＤＮＡテンプレートの添加の後、ＵＮＧ酵素（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．Ｎ８０８−００６８）を添加し、そしてこの混合物を５０℃までの温度で、以前の増幅からのＵ含有ＰＣＲ増幅ＤＮＡ混入物を切断するために十分な時間（例えば、１〜１０分間）インキュベートする。ＵＮＧ酵素はｄＵＴＰモノマーを切断しない。次いでこの混合物を、９５℃で１０分間インキュベートし、（１）ＵＮＧにより生成された無塩基（ａｂａｓｉｃ）のｄＵを含有する任意のポリヌクレオチドを切断し、（２）ＵＮＧを不可逆的に不活化し、そして（３）テンプレートＤＮＡおよびプライマーを変性する。これらの条件は、「ＡＭＰＬＩＴＡＱ」または「ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ」（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）のような熱安定ポリメラーゼを有意に不活化しない。次いでこの混合物を所望の量の増幅が得られるまで、選択された回数のＰＣＲサイクルを循環させる。適切な熱循環機（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）は、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの「ＧＥＮＥＡＭＰ  ＰＣＲ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ  ＳＹＳＴＥＭ」である。好ましくは、プライマーアニーリング温度は、任意の残留ＵＮＧ酵素の活性を抑制するために、５５℃より高い。最後のサイクルの後、サンプルを、好ましくは熱循環機から取り出すまで７２℃に保持する。取り出す際、混合物を好ましくは直ちに−２０℃で貯蔵するか、または任意の残留ＵＮＧ活性を変性させるために等容量のクロロホルムで処理する。
【００３６】
（Ｂ．配列決定試薬）
本発明は、配列決定のための３’−標識化プライマー伸長産物を生成するための、伸長可能で標的特異的なプライマー、１つ以上の標識化ヌクレオチドターミネーター、および他の試薬を利用する。選択された試薬は、以下で考察される。
【００３７】
（１．ヌクレオチドターミネーター）  各ヌクレオチドターミネーターは、選択されたポリヌクレオチド塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）に相補的であり、そしてまたプライマーまたは伸長産物が、標的ポリヌクレオチドテンプレートに特異的にアニールされる場合に、配列決定プライマーまたは増殖プライマー伸長産物の３’末端に共有結合で連結され得る、任意のヌクレオチドである。従って、配列決定プライマーまたはその伸長産物の３’末端に共有結合で連結するために、ヌクレオチドターミネーターは、（１）プライマー３’−ヒドロキシル基と反応するための適切な５’反応性基（例えば、５’−トリホスフェート部分）を含むが、ターミネーターは、（２）例えば、３’−ヒドロキシル基の代わりにリボース環またはデオキシリボース環に３’−デオキシ置換基または３’−ヒドロキシ−ブロック基を有することにより、３’方向にさらに伸長し得ない。３’−デオキシ置換基の例としては、例えば以下が挙げられる：水素、３’−フルオロ、３’−アミノ、および３’−アジド（Ｍｉｋｈａｉｌ−ｏｐｕｌｏら、１９８９；Ｋｒａｙｅｖｓｋｉら、１９８４；Ｃｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅ、１９８６）。３’−ヒドロキシブロック基の例としては、例えばホスフェート、ホスホネート、ｔ−ＢＯＣ、およびＯ−アセチルが挙げられる。例示的なヌクレオチド糖部分としては、２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−デオキシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、および２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル（例えば、Ｃｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅ，１９８５）。
【００３８】
各ヌクレオチドターミネーターは、ターミネーターを含む配列決定プライマー伸長産物を検出するために、検出可能な標識部分を含む。標識は、それ自身が検出可能な直接的標識、または２次的な化学剤の使用と組合せて検出可能な間接的標識であり得る。例示的な直接的標識としては、蛍光団、発色団、放射性同位体（例えば、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、3Ｈ）、スピンラベル、化学発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な間接的標識としては、シグナル生成事象を触媒する酵素、および特異的結合対のメンバーであるリガンドが挙げられ、特異的結合対は、例えば、検出可能な抗リガンドに高い親和性で特異的に結合し得る抗原またはビオチン、例えば、標識化抗体またはアビジンである。好ましくは、標識は、非放射性同位体標識である。より好ましい実施形態では、標識は蛍光標識または化学発光標識であり、最も好ましくは、蛍光標識である。
【００３９】
同位体標識は、公知の方法によりターミネーターに導入され得る。例えば、32Ｐは、αホスフェート位置に、適切な５’−活性化ヌクレオシド前駆体の５’−リン酸化により取り込まれ得る。35Ｓは、公知の硫化プロセスにより、５’−α−リン原子に付加され得る。トリチウムまたは14Ｃを、ヌクレオシド構造に取り込むための方法もまた、周知である。
【００４０】
非同位体標識がまた、公知の方法によってヌクレオシドアナログに取り込まれ得る。代表的に、標識は、ヌクレオシド塩基中に位置される適切な置換位置（例えば、ピリミジンの５位および７−デアザプリンの７位）に付着される（例えば、Ｐｒｏｂｅｒ、１９８７、１９９５；Ｍｅｎｃｈｅｎら、１９９１、１９９４；Ｌｅｅら、１９９２ａ、ｂ）。
【００４１】
本発明に従って使用される蛍光標識は、以下の性質を有するべきである：（１）この標識の検出を容易にし、そして存在し得る他の塩基特異的標識から識別可能にする、識別可能な発光波長、（２）他の標識とのスペクトルのオーバーラップを減少するための、狭い発光帯域幅、（３）安価な光源（例えば、４８８ｎｍおよび５１４ｎｍの発光ピークのアルゴンレーザー）による励起を受けやすい吸収スペクトル、（４）励起後の蛍光発光が、緩和の主要な経路であることを意味する、高量子収量、（５）プライマー伸長フラグメントの付属物のために、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによるプロセシングに適合性の立体特性および化学特性、ならびに（６）伸長工程、分離工程および検出工程に対する安定性。
【００４２】
多くの有用な蛍光標識されたヌクレオチドターミネーターが記載されている。Ｐｒｏｂｅｒら（１９８７、１９９５）は、特定のキサンテン（スクシニルフルオレセイン）を開示し、このキサンテンは、単一伸長反応において使用され、続いて単一レーンで電気泳動分離され得る。さらに、優れた蛍光標識が、以下に記載される：Ｂｅｒｇｏｔら（１９９１；１９９４）およびＲｏｓｅｎｂｌｕｍら（１９９７）（４，７−ジクロロ置換を有するかまたは有さない、９’−フェニルローダミン骨格）；Ｍｅｎｃｈｅｎら（１９９１；１９９４）（４，７−ジクロロフルオレセイン）；Ｌｅｅら（１９９２ａ；１９９２ｂ）（フルオレセイン骨格）；およびＬｅｅら（１９９７ａ、ｂ）およびＲｏｓｅｎｂｌｕｍら（１９９７）（４，７−ジクロロローダミン（「ｄローダミン」）およびフルオレセイン−ローダミン  ドナー−アクセプター結合体）。後のクラスの蛍光標識が、好ましい。なぜなら、これらは、高スペクトル分解能（ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）および超高量子効率（ｖｅｒｙ  ｈｉｇｈ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（〜１００％）を有する４色色素セットを提供し得るからである。
【００４３】
標識は、ヌクレオチド塩基、詳細にはピリミジンの５位およびデアザプリンの７位に容易に結合し得る。これらの位置における置換は、一般的に、関連する塩基の正常な塩基対形成を妨げず、そして同時にこれらは、種々のポリメラーゼによるプロセシングを受容可能である（Ｐｒｏｂｅｒ、１９９５、１７頁）。
【００４４】
一般的に、リンカーは、異なる形態の数を取り得、その結果、ターミネーター塩基および標識の間の連結の長さおよび剛性は、大きく変化し得る。例えば、使用され得るいくつかの適切な塩基標識手順が、報告されている：例えば、Ｇｉｂｓｏｎら（１９８７）、Ｇｅｂｅｙｅｈｕら（１９８７）、Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら（１９８７）、Ｈａｕｇｌａｎｄ（１９８９）、Ｍｅｎｃｈｅｎ（１９９４）、Ｌｅｅら（１９９２ｂ）など。特に、フルオレセインおよびローダミン標識は、適切な官能基（例えば、カルボキシル、スルホニル、イソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、ホスホルアミダイト、アミノおよびメチルアミノ）を含むように改変され得る（例えば、Ｍｅｎｃｈｅｎ、１９９４）。１つの実施形態において、標識および塩基の間の連結基は、Ｐｒｏｂｅｒら（１９９５）およびＨｏｂｂｓら（１９９１、１９９２）によって教示（これらは、本明細書中に参考として援用される）されるように、蛍光標識のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルをターミネーター（３−アミノ−１−プロピニルリンカーを含む）のアルキニルアミノ誘導体化された塩基と反応させることによって形成される。Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら（１９９７）に記載のプロピニルエトキシアミノリンカーのようなより長いリンカー（これは、ローダミン化合物の５または６−カルボキシ基をｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄＧの塩基部分と連結するために使用される）がまた、使用され得る。ドナー−アクセプター蛍光標識（ときどき、エネルギー移動色素とも呼ばれる）に関して、ドナーおよびアクセプターはまた、Ｌｅｅら（１９９７ａ）およびＲｏｓｅｎｂｌｕｍら（１９９７）に記載されるような種々のリンカー（４’−アミノメチルベンゾエート−含有リンカーが好まれる）によって、連結され得る。種々の連結技術に関するさらなる詳細は、例えば、Ｌｅｅら（１９９２ｂ）、Ｐｒｏｂｅｒら（同書）、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら（１９９７）、およびＬｅｅら（１９９７ａ、ｂ）に見出され得る。
【００４５】
（２．プライマー）本発明の方法は、好ましくは、標的特異的プライマーを利用し、これは、（ｉ）標的結合セグメント、および（ｉｉ）標的に結合しない移動度低減部分を含む。プライマーは、標準的な化学（例えば、ホスホルアミダイト化学）を用いて、好ましくは自動ＤＮＡ合成機（例えば、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のモデル３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成器）を用いた任意の適切な方法によって調製され得る（Ｂｅａｕｃａｇｅ；Ｇａｉｔ，１９８４、１９９０）。
【００４６】
プライマーの標的結合セグメントの配列は、選択された相補標的配列にハイブリダイズするように選択される。代表的には、選択された標識配列は、サンプルがクローニングされるプラスミド（例えば、ｍ１３ファージ）のようなクローニングベクター由来のユニバーサルプライマー配列である。あるいは、その標的結合セグメントは、配列決定される標的座の上流の保存された領域または目的の領域の上流の特有の標的配列にアニールするように選択され得る。
【００４７】
標的結合セグメントの長さは、サンプル中の非標的核酸への有意な交差ハイブリダイゼーションを伴わずに、そのプライマーのその所望の標的への特異的ハイブリダイゼーションを保証するように選択される。好ましくは、標的結合セグメントの融解温度は、摂氏３５℃と７５℃の間、より好ましくは５０℃と７０℃の間、そしてなおより好ましくは５５℃と６５℃の間である。選択された融解温度は、プライマー融解温度の推定のための公知の方法（例えば、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ、１９８６；Ｒｙｃｈｌｉｋ，１９８９および１９９０；Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１；Ｏｓｂｏｒｎｅ，１９９１；Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔ，１９９２）に基づく、塩基組成物および結合セグメント長の適切な選択によって達成され得る。代表的に、標的配列セグメントは、１５塩基と３０塩基の間の長さである。約１８塩基および２４塩基の間の長さの標的結合セグメント長が、通常好ましい。なぜなら、そのようなオリゴヌクレオチドは、アニーリング温度がプライマー融解温度の数度内に設定される場合、非常に配列特異的になりやすいからである（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、１９９５）。
【００４８】
標的結合セグメントは、好ましくは伸長可能であるように設計され、これは、標的配列セグメントが相補標的配列にハイブリダイズする場合、ヌクレオチドモノマーまたはターミネーターが、標的結合セグメントの末端の１つに付加され得ることを意味する。代表的に、プライマーの伸長可能な末端は、標的結合セグメントの３’末端に配置され、その結果、３’−末端塩基は、３’−ヒドロキシル、３’−アミノまたはプライマー伸長試薬によってヌクレオチドターミネーターに共有結合し得る他の反応基を含む。最も代表的には、プライマーの３’−末端は、３’−末端ヒドロキシル基を含む。
【００４９】
上記のように、配列決定のプライマーは、さらに、標的ポリヌクレオチドに有意に結合またはハイブリダイズしない移動度低減部分を含む。移動度低減部分の主な目的は、配列決定伸長産物の移動速度を減少するためであり、その結果、標識されたターミネーター分解産物は、電気泳動分離の間に、伸長されていないプライマーの前に溶出する。特に、移動度低減部分は、各プライマー伸長産物の移動速度を特定の量で（例えば、プライマー中の少なくとも１０個のさらなるヌクレオチド塩基の存在に等しい量で）減少するように、移動度低減部分を欠く対応するプライマー伸長産物の移動度に対応して、選択され得る。
【００５０】
第１の実施形態において、移動度低減部分は、ポリヌクレオチドセグメントを含む。ポリヌクレオチドの配列は、サンプルポリヌクレオチドに対して非相補的であるように選択され、その結果、特異的または非特異的ハイブリダイゼーションの何れも、サンプルポリヌクレオチドと共に生じ得ない。例えば、このセグメントは、ホモ重合体（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ）（例えば、ポリ−Ｃ、Ｇ、ＡまたはＴ）であり得るか、または二量体反復（例えば、ポリ（ＴＣ）（実施例１）、ポリ（ＣＡ）など）を含み得る。移動度低減部分の正確な配列は、通常、サンプルがセグメントに対して完全な相補配列を含まない限り、ならびに標的特異的アニーリングおよびプライマー伸長が、配列決定に対して信頼して実施され得る限り、重要ではない。
【００５１】
第２の一般的な実施形態において、移動度低減部分は、非ポリヌクレオチドポリマーである。このポリマーは、ホモポリマーまたはブロックポリマーであり得、そして例えば、線形、コーム、分岐、樹枝状または他の構築物を有し得る。好ましいポリマーは、親水性であるポリマーか、または標的結合セグメントに結合した場合にそのプライマーが水性媒体中で容易に可溶性であることを保証するのに少なくとも十分に親水性であるポリマーである。ポリマーはまた、標的ポリヌクレオチドへの標的結合セグメントのハイブリダイゼーションに影響を与るべきではない。模範的なポリマーは、エチレンオキシド、グリコール酸、乳酸、アミノ酸残基およびポリペプチド、糖類および多糖類、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシドならびにそれらのブロックコポリマー（荷電結合基または非荷電結合基によって結合された多重サブユニットのユニットからなるポリマーを含む）から調製され得る。好ましい実施形態において、移動度低減部分は、エチレンオキシドポリマーのポリマーであり、形態が［−（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-）−］m（ここで、ｎは、５または６、そしてｍは、２〜２０または好ましくは５〜１０である）である。そのようなエチレンオキシド含有ポリマーは、ペンタエチレンオキシドまたはヘキサエチレンオキシドポリマーブロックから調製され得、次いでこれは、活性化されたホスホルアミダイト誘導体に転換されて、続いて標準的なホスホルアミダイト合成法によって選択された数のポリマーブロックホスホルアミダイトが標的結合セグメントの５’−末端に連続して添加される（例えば、実施例１〜４のＧｒｏｓｓｍａｎら、１９９６を参照のこと）。
【００５２】
本発明を支持する研究は、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）5ＯＰＯ2−の各ユニットが、約２個のさらなるヌクレオチドの等価体によって、結合されたポリヌクレオチドの移動度を減少し、そして−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＰＯ2−の各ユニットが、約２．５個のさらなるヌクレオチドの等価体によって、結合されたポリヌクレオチドの移動度を減少することを示した。
【００５３】
移動度低減部分は、標的結合セグメントが意図される標的テンプレートに沿ったプライマー伸長を許容する場合、標的結合部分の任意の部分に結合され得る。より好都合なことには、移動度低減部分は、プライマーの標的結合セグメントの５’末端に連結される。移動度低減部分がポリヌクレオチドである場合、その部分は、標準的な合成方法によってプライマー中に容易に組み込まれ得る。同様に、非ポリヌクレオチドの移動度低減部分は、標準的な結合体化方法によって添加され得るか、または標準的な固相合成方法用いてポリマー鎖サブユニットを結合セグメントに添加することによって、標的結合セグメント上に構築され得る。さらに、本発明は、関連する標的結合セグメントに単一の部位で付着する単一ポリマー鎖に関して本明細書中に記載され得るが、本発明はまた、１つより多くのポリマー鎖エレメントによって誘導体化される標的結合セグメントもまた意図し、ここでこのエレメントは、ポリマー鎖を集合的に形成する。選択された長さのポリマーを合成する方法は、例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら（１９９６）に記載される。
【００５４】
（３．プライマー伸長試薬）プライマー伸長試薬は、標的テンプレート鎖に相補的な伸長可能なプライマー末端にヌクレオチドモノマーを付加するのに有効な、任意の化学試薬または酵素試薬であり得る。１つの実施形態において、プライマー伸長試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素である。模範的なポリメラーゼ酵素としては、限定されないが、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ＣｏｌｉポリメラーゼＩ、Ｔ−７ポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ  ＦＳ、クレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ）。ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素がまた、使用され得る（例えば、ＲＮＡプライマーのために）。
【００５５】
（ＩＩ．方法）
本発明の方法の実施において、選択されたポリヌクレオチドサンプルは、プライマーが１つ以上の標的ポリヌクレオチドのプライマー相補領域に特異的にアニールするに効果的な条件下で、その標的特異的プライマーと接触され、１つ以上の標的プライマーハイブリッドを形成する。
【００５６】
上記に議論したように、この標的は、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡであり得、そして公知の方法に従って、例えば、「ＭＩＣＲＯＣＯＮ−１００」膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））もしくは「ＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰ」スピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）を用いた超遠心分離によってか、またはそのサンプルをエビアルカリホスファターゼおよびエキソヌクレアーゼ１と処理すること（例えば、「ＰＣＲ  ＰＲＥ−ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＫＩＴ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いる）によって、調製され得る。細菌人工染色体（ＢＡＣ）のようなより長いＤＮＡ標的のために、塩化セシウムバンドまたはアルカリ溶解に供され（Ｍａｒｒａら、１９９６）、必要な場合、さらなるフェノール抽出およびイソプノパノール沈澱工程を伴う、ＤＮＡテンプレートが好ましい。ＢＡＣ  ＤＮＡ調製のための市販のキットがまた、入手可能である（ＬｉｇｏＣｈｅｍ．，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｇｏｃｈｅｍ．ｃｏｍ）。
【００５７】
アニーリング工程は、配列特異性を保証し、さらに受容可能な速度で安定なハイブリッドの形成を十分に可能にするに十分なストリンジェントである条件下で実施される。プライマーアニーリングに必要な温度および時間の長さは、塩基組成、プライマーの長さおよび濃度、ならびに使用される溶媒の性質（例えば、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ホルムアミドまたはグリセロールなどの共溶媒の濃度、およびマグネシウムまたはマンガンなどの対イオン）を含むいくつかの因子に依存する。代表的に、ハイブリダイゼーション（アニーリング）は、アニーリング溶液における標的プライマーハイブリッドの融解温度より約５〜１０℃下である温度で実施される。代表的に、このアニーリング温度は、５５〜７５℃の範囲であり、そしてこのプライマーの濃度は、約０．２μＭである。そのような条件下において、アニーリング反応は、通常、数秒内に完了する。
【００５８】
標的へのプライマーのアニーリングに続いて、このハイブリッドは、少なくとも１つの標識された３’−オリゴヌクレオチドターミネーターで終止する１つ以上のプライマー伸長を形成するに効果的な条件下で、選択された標的ヌクレオチド塩基型に相補的な少なくとも１つの標識された３’−ヌクレオチドターミネーターの存在下で、プライマー伸長試薬と反応する。
【００５９】
１つの実施形態において、プライマー伸長は、ターミネーターがアニーリングされるプライマーの伸長可能な末端のすぐ側の標的ポリヌクレオチド中の塩基に相補的な場合のみ、ハイブリッド中でそのターミネーターがアニーリングされたプライマーに付加されるに効果的な条件下で、伸長可能なヌクレオチドの非存在において実施される。そのプライマーの標的結合セグメントの配列は、選択された相補標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするように選択され、この選択された相補標的ポリヌクレオチドは、そのプライマーの伸長可能な末端の末端塩基のすぐ側に位置する（直に隣接する）潜在的多型部位を含む。この検出される標的配列は、標的ポリヌクレオチドにおける多型または変異の存在を同定するか、特定の対立遺伝子を同定するか、または潜在的な標的配列の存在を除外するのに十分な任意の塩基であり得る。例えば、ゲノムＤＮＡ標的において、標的塩基は、単一ヌクレオチド多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＮＰ）であり得、これは、ＨＬＡ型または任意の他の遺伝子型形質もしくは表現型形質を有する特定の疾患の頻度と関連する。さらなる例示として、この標的塩基は、例えば、（１）配列挿入の末端；（２）１つ以上の標的塩基の欠失の結果として、標的中のプライマー相補領域にスプライスされた遠隔領域の末端；または（３）誤ってスプライスされたｍＲＮＡセグメントの末端を定義し得る。いくつかの場合において、標的多型または変異は、２つの可能な選択的塩基のうちの１つを含む。従って、アニールされたプライマーを、伸長試薬の存在下で対応する２つの相補ターミネーター塩基と反応させることは、２つの可能な代替配列のうちの少なくとも１つの同定に十分であるべきである。同様に、標的多型が３または４つの可能な代替物の１つである場合、アニールされたプライマーは、適切な数の可能な塩基型代替物と反応すべきであり、どの可能な配列が実際に存在するかを確認する。
【００６０】
別の実施形態において、プライマー伸長は、標的相補ポリヌクレオチドモノマーおよびターミネーターの添加によって特異的にハイブリダイズされたプライマーの３’末端を伸長するのに効果的な条件下で、標識された３’−ヌクレオチドターミネーターに加えて少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチドモノマーの存在中で実施され、１つ以上のプラーマー伸長生成物を形成する。代表的に、伸長は、４つの標準的なデオキシリボヌクレオチド三リン酸（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（例えば、適切である場合、ｄＧのｄＩ置換およびｄＴのｄＵ置換を含む））および１、２、３または好ましくは４つの異なるヌクレオチドターミネーター、ターミネーターを用いて実施され、数１０または数百の長さを有する配列に関する配列情報を提供するために、１つ以上のプライマー伸長生成物を形成する。
【００６１】
伸長可能なヌクレオチド（存在する場合）および標識されたターミネーターの濃度は、ポリメラーゼおよび公知の手順に従う他のパラメーター（上記に引用）の選択に依存する。特に、ターミネーター濃度は、標識のシグナル強度（１より多くの標識が使用される場合）およびポリメラーゼによる取り込み率における任意の変動を考慮して最適化され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら（１９９７）の表Ｉに開示されるターミネーター濃度を参照のこと）。
【００６２】
プライマー伸長に使用される反応条件は、使用者によって選択される任意の適切な条件であり得、そしてサンプルの量、ターミネーターの特徴、そしてプライマー伸長試薬の特性に一般に依存する。好ましくは、プライマー伸長試薬は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼであり、そして標識されたヌクレオチドターミネーターは、５’−三リン酸基を含み、プライマーの３’−ヒドロキシル基への共有連結を容易にする。核酸ポリメラーゼを用いるアニールされたプライマーを伸長する条件は、周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ）。例えば、反応条件は、伸長試薬の補助因子の使用条件、ｐＨ依存性および緩衝液の選択に従って最適化され得る。特に、ターミネーター型の選択は、しばしば、ポリメラーゼの選択に影響を与える。例えば、Ｐｒｏｂｅｒ（１９９５）に記載のキサンテン標識されたターミネーターは、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素およびバクテリオファージＴ７ポリメラーゼに適合性であるが、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントには適合性でない。Ｂｅｒｇｏｔら（１９９１、１９９４）に記載のローダミン標識ターミネーターに関して、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９８９、１９９０）の改変されたＴ７  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｍｅｎｃｈｅｎら（１９９１；１９９４）およびＬｅｅら（１９９２ａ、ｂ）によって記載される蛍光ターミネーターに対して好ましい。４，７−ジクロロローダミンターミネーターおよびローダミンフルオレセイン（「ＢＩＧＤＹＥ」）エネルギー移動ターミネーター（Ｌｅｅら（１９９７ａ、ｂ）およびＲｏｓｅｎｂｌｕｍら（１９９７）によって記載）に関して、「ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＦＳ」が、通常好ましい（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。上記のターミネーターを用いるプライマー伸長に関する反応条件は、上記の参考文献およびいずれかに記載されるか、または標準的な技術によって容易に最適化され得る。
【００６３】
プライマーの選択、および特に移動度低減部分の選択は、使用される標識されたターミネーターの型およびターミネーター分解産物の移動度に依存する。例えば、ローダミン標識されたターミネーターは、対応する非標識ターミネーターに対するターミネーターの移動度を遅らせる３−窒素原子および６−窒素原子によって共有される共鳴安定化陽電荷を含む。従って、ローダミンターミネーターおよびその分解産物は、短いプライマー伸長産物とともに同時移動し得、そして配列決定を妨害し得る。同様に、Ｌｅｅら（１９９７）およびＲｏｓｅｎｂｌｕｍら（１９９７）によって記載される「ＢＩＧＤＹＥ」ローダミン／フルオレセインターミネーターは、正に荷電したローダミン部分の存在に起因して、短いプライマー伸長産物を妨害し得る分解産物を生じる。最終的に、フルオロセインターミネーターは、通常、配列決定プライマーの前方に移動するが（３−酸素原子および６−酸素原子によって共有される、共鳴安定化された負電荷の存在に起因して）、脱リン酸化および塩基部分の切断は、伸長産物と重複する分解産物を生じ得る。従って、プライマー中の移動度低減部分の長さは、特定の長さの範囲のプライマー伸長産物、および好ましくは、すべてのプライマー伸長産物が、標識されたターミネーターまたはターミネーター分解産物からの妨害なしに目的の領域において配列決定され得ることを保証するように選択される。特定の好ましい実施形態において、移動度低減部分を欠く、対応するプライマー伸長産物の移動度と比較して、少なくとも４または少なくとも１０のさらなるヌクレオチド塩基に等価な量で、または少なくとも１５のさらなるヌクレオチド塩基の付加と等価な量で、または少なくとも２０のさらなるヌクレオチド塩基の付加と等価な量で、移動度低減部分は、各プライマー伸長産物の移動度速度を減少するように選択される。
【００６４】
１つの実施形態（ここでは、１つ以上の伸長可能なヌクレオチドが使用される）において、プライマー伸長は、ハイブリダイゼーション混合液を２つ以上のアリコートに分割することによって達成され、そして各アリコートは、異なる、単一のヌクレオチドターミネーター塩基型を用いて反応される。例えば、ハイブリダイゼーション混合液は、４つのアリコートに分割され、そして各アリコートは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ／Ｕに等価な選択されたターミネーターを用いて反応される。このアプローチを用いると、各異なるターミネーター型についての伸長反応が、プライマー伸長および電気泳動による分離の間、互いに分離したままであるならば、すべてのターミネーターは、同じ標識を含み得る。好ましくは、ハイブリダイゼーション混合液は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵ／Ｔを含む４つのターミネーター型のセットを用いて同じ混合液中で同時に反応され、そして別個の標識を有して、各ターミネーター型を同定する。
【００６５】
本発明の種々の実施形態に従って、プライマー伸長の複数のサイクルは、公知の方法（サイクルシークエンシング）を使用して反応混合液中で実行され、分析のための伸長産物のレベルを増大し得る。従って、第１の伸長反応後、プライマー（伸長したものおよび伸長していないもの）は、適切な手段によって（例えば、伸長産物の融解温度より十分上に伸長反応を加熱することによって）標的ポリヌクレオチドから変性され得、新規な伸長していないプライマーの標的ポリヌクレオチドへのアニーリング、およびプライマー伸長へと続く。伸長していないプライマーは、通常、標的ポリヌクレオチドに対して過剰に存在するので、標的ポリヌクレオチドに再アニーリングする伸長したプライマーの量は、通常有意ではない。例えば、伸長混合液は、複数のサイクル（例えば、１０〜５０）を通してサイクルされ得、このサイクルは、（１）９５℃、１０秒間の加熱（変性）、４５℃、５秒間（プライマーアニーリング）の加熱、および６０℃、１〜５分間（伸長）の加熱を含む。
【００６６】
プライマー伸長産物が形成された後、産物混合物は、電気泳動の前に、残りのターミネーターおよびターミネーター副産物ならびに他の反応成分を除去するために必要に応じて精製される。このような精製工程は、サンプルから標識されたターミネーター産物のバルクを減少させるために有用であり得る。しかし、精製の利点は、精製工程の数とともに一般的に減少する。また、精製工程は、配列決定のコストおよび時間を増大し、そして伸長産物の損失に起因して、シグナルを減少し得る。
【００６７】
公知の技術（例えば、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（１９９８）、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから利用可能である「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」という表題のプロトコルを参照のこと）に従って、任意の適切な精製方法（例えば、ゲル濾過、エタノール沈殿、またはイソプロパノール沈殿）が使用され得る。例えば、ゲル濾過は、好ましくは、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ｐ／Ｎ  ＣＳ−９０１）からの「ＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰ」スピンカラムを使用して達成される。このカラムを、カラムの内側に滴下することなく、カラムベッドの中心上に注意深くロードされるべきである。ロード後、このカラムは、好ましくは２分間未満、３２５〜７３０×ｇで遠心する。濾液は、後の分離のために微量遠心管中で乾燥され得る所望の伸長産物を含む。エタノール沈殿は、酢酸ナトリウムを用いて好ましく実行される。例えば、５０μＬの非変性９５％エタノールおよび２μＬの３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．６）を、シール可能なチューブ中で約２０μＬの伸長反応混合物に添加し、約６５％エタノールを含有する７２μＬの最終容量を生じ得る。より高いエタノール濃度およびより低いエタノール濃度もまた、使用され得る。次いで、そのチューブをシールし（例えば、３Ｍ「スコッチテープ」４２５−３接着性背面アルミニウムホイルテープの小片を用いて）、そして数回ひっくり返して混合する（またはピペッティングによって混合する）。そのチューブを、１５分間室温に放置して、伸長産物を優先的に沈殿させる。次いで、そのチューブを、３０〜４５分間、１４００〜３０００×ｇで遠心分離して、沈殿物をペレット化する。遠心分離後、ペレットをかき乱すことなくすぐに粘着性テープを除去し、そして上清を、ペーパータオル上でそのチューブを逆さまにすることによって除去する。逆さまにしたチューブを、ペーパータオルとともに遠心管に入れ、１分間、７００×ｇで遠心分離する。ペレットを、５０〜１００μＬの７０％エタノールでリンスし得、続いて、手短なボルテックス、遠心分離、上清の除去、およびペレットの乾燥を行い得る。
【００６８】
本発明の別の利点に従って、移動度低減部分（例えば、ポリヌクレオチドセグメント）の存在は、短いプライマー伸長産物のエタノール沈殿からの回収を改善し得る。代表的には、伸長産物の回収は、エタノール濃度に依存する。より低いエタノール濃度は、より少ない量のターミネーターおよびターミネーター分解産物を沈殿させる傾向がある。しかし、短いプライマー伸長産物の回収もまた、減少され得る。一方、より高いエタノール濃度は、沈殿した短い伸長産物の量を増大し得るが、未反応のターミネーターおよびターミネーター分解産物もまた、増大し得、得られる電気泳動像においてノイズの増大をもたらす。本発明を支持して行われた研究は、移動度低減部分を含むプライマーを用いて産生された短い伸長産物が、移動度低減部分を欠く、対応する伸長産物よりもエタノール沈殿によってより容易に沈殿し得ることを示す。従って、より低いエタノール濃度は、伸長産物を選択的に沈殿させるために使用され得るが、一方未反応のターミネーターは、上清に残っている。従って、標識したターミネーターおよびターミネーター分解産物によって生成されたシグナルはさらに減少され得、その結果、短い伸長産物の配列決定は、さらに単純化される。
【００６９】
伸長産物は、より小さい伸長産物が、より大きな伸長産物よりもより迅速に移動するような分子篩マトリックス中で変性条件下で電気泳動的に分離され得る。使用され得る分子篩マトリックスには、共有結合的に架橋したマトリックス（例えば、ビス−アクリルアミドと共有結合によって架橋されたアクリルアミド（Ｃｏｈｅｎら、１９９０）；直鎖状ポリマーで形成されたゲルマトリックス（Ｍａｔｔｈｉｅｓら、１９９２）；およびゲルを含まない分子篩媒体（Ｚｈｕら、１９９２）が含まれる。好ましくは、電気泳動用マトリックスの型は、約２〜２０重量％の間の濃度（重量／体積）を有する、架橋ポリアクリルアミドまたは非架橋ポリアクリルアミドである。より好ましくは、ポリアクリルアミド濃度は、約４〜８％の間である。分離マトリックスは、さらに、変性剤（例えば、７Ｍ  尿素、ホルムアミドなど）を含み得る。このようなマトリックスを構築するための詳細な手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９７５、１９８０）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８２、１９８９）によって与えられている。特定の分離において使用される最適なポリマー濃度、ｐＨ、温度、変性剤の濃度などは、分離される伸長産物のサイズ範囲のような因子、異なる長さのフラグメントの数、およびそれらの塩基組成に依存する。従って、本発明の適用は、特定の分離についての条件を最適化するための予備的な試験を必要とし得る。
【００７０】
分離媒体の配置は、使用者によって選択される任意の適切な配置であり得る。代表的な配置には、垂直スラブゲルまたは平面スラブゲル、キャピラリー電気泳動チューブ、およびガラス基材またはシリコン基材のような基材において形成されたチャネルが挙げられる。例えば、キャピラリーチューブまたはマイクロチャネルは、代表的には、２００μｍ以下の内径、およびより好ましくは、１００μｍ以下の内径を有する電気泳動経路を規定する。
【００７１】
伸長産物の分離の間またはその分離の後で、標的配列は、分離された伸長産物の移動の順番から決定され得る。使用される標識の型に適切な任意の検出方法が使用され得る。典型的な検出方法には、放射活性検出（例えば、ＣＣＤまたはホスホルイメージャーを使用すること）、光学吸光度検出（例えば、ＵＶ−可視吸光度検出）、および光学発光検出（例えば、蛍光および化学発光）が挙げられる。
【００７２】
１つの好ましい実施形態において、異なる伸長産物が、検出を可能にするさらなる化学的要素とフラグメントとの反応を必要とすることなく、直接検出される。例えば、蛍光標識された伸長産物は、上述のように、スラブゲルまたはキャピラリーチューブ中でなお、直接的に読みとられ得る。
【００７３】
詳細には、蛍光標識された伸長産物は、色素標識されたポリヌクレオチドからの蛍光発光を測定することによって検出され得る。このような検出を実行するために、標識されたポリヌクレオチドは、標準的な手段（例えば、高強度水銀蒸気ランプ、レーザーなど）によって照射される。好ましくは、これらの照射手段は４８８ｎｍと５５０ｎｍとの間の波長の照射ビームを有するレーザーである。より好ましくは、色素ポリヌクレオチドは、アルゴンイオンレーザーによって生成されるレーザー光、特に、アルゴンイオンレーザーの４８８ｎｍおよび５１４ｎｍの発光線、または５３２ｎｍのネオジミウム半導体ＹＡＧレーザーの発光線によって照射される。これらの線と同時にレーザーを発するいくつかのアルゴンイオンレーザー（例えば、Ｃｙｏｎｉｃｓ，Ｌｔｄ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）Ｍｏｄｅｌ  ２００１など）が市販されている。次いで、蛍光は、光感受性検出器（例えば、光電子増倍管、荷電結合デバイス（ｃｈａｒｇｅｄ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）など）によって検出される。配列決定のための典型的な市販のシステムには、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０（キャピラリー電気泳動）および３７７（スラブゲル電気泳動）ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が挙げられる。配列決定のための検出の種々のモードに関するさらなる手引きは、Ｐｒｏｂｅｒら（１９９５）、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら（１９９７）、およびＬｅｅら（１９９７ａ、ｂ）において見出され得る。塩基呼び出しソフトウェアは、多数の商業的な供給源より入手可能であり、さらに配列決定を単純化する。このようなソフトウェアは、好ましくは、標識したターミネーターによって引き起こされる移動度シフトを修正するためのアルゴリズムを含む。
【００７４】
配列決定が、伸長可能な４つのヌクレオチドモノマーおよび４つの異なって標識されたターミネーター（または、同じ標識を含む４つの異なるターミネーター、これらは、調製され、そして別々のレーンで電気泳動的に分離される）を使用して行われる場合、連続する塩基の配列は、４つの異なるターミネーターを含むフラグメントの移動の順番を照合することによって容易に決定され得る。しかし、４つより少ない異なるターミネーターを使用することもまた、予想される配列の存在または非存在を同定し得る電気泳動的なサインまたは指紋の形態（すなわち、Ｔで終了するフラグメント）で、有用な情報を提供し得る。
【００７５】
ヘテロ接合性サンプルについては、配列情報は、寄与する対立遺伝子配列が公知である場合、重複配列の解析によって入手され得、そして互いに十分に区別可能である。さもなくば、伸長産物の分析を単純化するために、対立遺伝子配列のサブセットに選択的にハイブリダイズする、１つ以上の対立遺伝子特異的なプライマーを別々に利用することが必要であり得る。伸長可能なヌクレオチドモノマーの非存在下で標識されたターミネーターを利用する実施形態について、ヘテロ接合性サンプルは、代表的には、等量の２つの可能な塩基型の存在に基づいて特徴付けされ得る。
【００７６】
（ＩＩＩ．配列決定キット）
別の局面において、本発明は、上記の方法のいずれかにおいて使用され得るキットおよび試薬を含む。１つの実施形態において、本発明は、（ｉ）標的結合セグメントおよび（ｉｉ）標的に有意には結合しない移動度低減部分、を含む標的特異的プライマーを含むキットを含む。そのキットはさらに、以下の１つ以上を含み得る：（ｂ）少なくとも１つの標識したヌクレオチドターミネーター、（ｃ）少なくとも１つの伸長可能な３’−ヌクレオシド、（ｄ）プライマー伸長試薬（例えば、ポリメラーゼ酵素）。このキットはまた、本発明に従ってキットを利用するための取扱説明書を含み得る。好ましくは、少なくとも１つの標識したヌクレオチドターミネーターは、２’，３’−ジデオキシモノヌクレオチドである。好ましい実施形態において、このキットは、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンまたはウラシルの塩基に相補的な、４つの異なって標識されたヌクレオチドターミネーターを含む。このキットはまた、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵ／Ｔに相補的な４つの伸長可能な３’−ヌクレオチドを含み得る。
【００７７】
前述より、本発明の目的および特徴がいかに合致しているかが理解され得る。本発明は、改善された色素ターミネーターポリヌクレオチド配列決定方法を提供し、この方法は、色素ターミネーターおよび短いプライマー伸長産物を伴うターミネーター分解産物の同時移動から生じる問題を回避する。本発明は、伸長プライマーの近傍のポリヌクレオチド領域の配列決定を可能にし、これは、多型改変体を区別するために重要であり得る。さらに、本発明は、色素ターミネーターに基づく配列決定方法によって、配列決定可能なポリヌクレオチド長範囲を効果的に拡大する。従って、本発明は、直接標識法によって単一のポリヌクレオチド標的またはヘテロ接合性ポリヌクレオチド標的を配列決定するために特に有用である。その直接標識法では、検出のための第２の試薬を用いる伸長産物の反応を必要とすることなく、配列情報は誘導されるが、伸長産物は分離媒体中にあるか、またはその媒体から出つつある（例えば、電気泳動の間のリアルタイムモニタリング、またはゲル中の選択される長さの範囲を横切る１つ以上のレーン中の移動パターンをスキャンすることによって）。
【００７８】
本発明はさらに、本発明の範囲を限定することを意図することなく、以下の実施例を考慮することによってさらに理解され得る。
【００７９】
（実施例１）
ヒトＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子座を含むサンプルを、ＨＬＡ−ＤＲＢエキソン２（逆方向）についての２つのコドン−８６  ＧＧＴ−特異的プライマーを使用して、「ＨＬＡ−ＤＲＢ  ＢＩＧＤＹＥ  ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ−ＢＡＳＥＤ  ＴＹＰＩＮＧ  ＫＩＴ」（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，１９９８）についてのプロトコルブックレット中に記載されるプロトコルに従って配列決定した。２つのプライマーは、以下の配列を有した。ここで第２のプライマーは、２４塩基長のポリｄ（ＴＣ）移動度低減部分を含む：
（配列番号１（プライマー１））
ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＣＡＣ  Ｃ
（配列番号２（プライマー２））
ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  Ｃ
プライマー伸長反応は、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（１９９８）から利用可能である「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」という表題のプロトコルにおいて記載される手順に従って、これらのプライマーのどちらか一方を単独で、および（１）ｄｄＴ−ＥＯ−６ＣＦＢ−ｄＴＭＲ、ｄｄＧ−ＥＰ−５ＣＦＢ−ｄＲ１１０、ｄｄＣ−ＥＯ−６ＣＦＢ−ｄＲＯＸ、およびｄｄＡ−ＰＡ−６ＣＦＢ−ｄＲ６Ｇと呼ばれる、４つのＢＩＧＤＹＥターミネーター（ＰＥ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＢＩＧＤＹＥ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｅｍｉｘ）を含む混合物または（２）ｄｄＴ−ＥＯ−６ＲＯＸ、ｄｄＧ−ＥＯ−５ｄＲ１０、ｄｄＣ−ＥＯ−５ｄＴＭＲ、およびｄｄＡ−ＰＡ−５ｄＲ６Ｇ（ＰＥ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｅｍｉｘ）を含む混合物のいずれかを使用して実行した。伸長反応後、しかし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｍｏｄｅｌ  ３７７  ＤＮＡシークエンサー上の電気泳動前に、プライマー伸長産物混合物（１０μＬ）を、１００％エタノール：酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ  ４．６）の１００：４（ｖ：ｖ）混合物３０μＬと混合した。結果は以下の通りであった。
【００８０】
ＢＩＧＤＹＥターミネーターおよびプライマー１を使用する伸長反応について、いくつかの大きな残りの（取り込まれていない）ターミネーターピークは、２７の最も速く移動する伸長産物とともに同時に移動し、その結果、プライマーを過ぎて最初の約３０の標的塩基の配列を決定することは不可能であった。対照的に、ＢＩＧＤＹＥターミネーターおよびプライマー２を使用して形成された伸長産物については、同じ残りのターミネーターピークが、最も迅速に移動する伸長産物（プライマーおよび１塩基の伸長）の先に約３〜２７塩基のウィンドウ中に移動した。たとえあったとしても、非常に少ないターミネーターピークがプライマー伸長産物とともに同時に移動し、その結果、最初の２０の標的ヌクレオチド塩基を含む、すべてのプライマー伸長産物が読みとり可能であった。
【００８１】
ｄローダミン伸長産物については、プライマー２の使用が、最も速く移動するプライマー伸長産物の先に約５〜８塩基を移動させるいくつかの２つの主要なターミネーターピークを生ずるのに有効であった。さらに、いくつかの他の小さなターミネーターピークもまた、最も速く移動するプライマー伸長産物の先に移動した。その結果、最初の２０の標的塩基を含む全体の標的配列が容易に決定され得た。対照的に、プライマー１の使用は、最初の２０のプライマー伸長産物中のいくつかの大きなターミネーターピークの同時移動をもたらし、その結果、いくつかの最初の２０の標的塩基は決定され得なかった。
【００８２】
この研究は反復され、そこでは、３０μＬの代わりに２５μＬのエタノール：酢酸ナトリウム混合液が使用された。この改変は、すべての場合において、残りのターミネーターピークの増幅を減少させるのに有効であった。しかし、プライマー１を用いて形成されたプライマー伸長産物について、約２０の最も速く移動する伸長産物のレベルは、実質的に減少し、その結果、最初の２０の標的塩基は、決定するのが困難かまたは不可能であった。対照的に、２０の最も速く移動する伸長産物についてでさえ、これらの種の効率よいエタノール沈殿に起因して、プライマー２を含む伸長産物についてのシグナルは強力であった。
【００８３】
全般的に、これらの結果は、本発明の方法が、短いプライマー伸長産物、特に最初の２０の標的塩基の読みとり可能性を改善するために有利であることを実証する。
【００８４】
本発明は、特定の実施形態に関して記載されてきたが、種々の改変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることが理解される。上記で引用されたすべての参考文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【配列表】
0004113675.tif 000004