(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光反応性多糖の溶液を凍結する工程（Ａ）と、凍結した溶液に光を照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖スポンジを得る工程（Ｂ）とを含む製造方法によって得られる多糖スポンジ。
【請求項２】
光反応性多糖の溶液を凍結乾燥する工程（Ｃ）と、凍結乾燥物に光を照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖スポンジを得る工程（Ｄ）とを含む製造方法によって得られる多糖スポンジ。
【請求項３】
光反応性多糖の多糖部分が、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、キチン、キトサン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースから選択される１種以上である請求項１又は２に記載の多糖スポンジ。
【請求項４】
光反応性多糖が、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸、フリルアクリル酸、又はチオフェンアクリル酸を光反応性残基として有する光架橋基が結合した多糖であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の多糖スポンジ。
【請求項５】
下記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含むことを特徴とする多糖スポンジの製造方法。
（Ａ）：光反応性多糖の溶液を凍結する工程；
（Ｂ）：凍結した溶液に光を照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖スポンジを得る工程
【請求項６】
下記工程（Ｃ）及び（Ｄ）を含むことを特徴とする多糖スポンジの製造方法。
（Ｃ）：光反応性多糖の溶液を凍結乾燥する工程；
（Ｄ）：凍結乾燥物に光を照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖スポンジを得る工程
【請求項７】
光反応性多糖の多糖部分が、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、キチン、キトサン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースから選択される１種以上である請求項５又は６記載の多糖スポンジの製造方法。
【請求項８】
光反応性多糖が、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸、フリルアクリル酸、又はチオフェンアクリル酸を光反応性残基として有する光架橋基が結合した多糖であることを特徴とする請求項５〜７の何れか１項に記載の多糖スポンジの製造方法。
【請求項９】
光反応性多糖の溶液を凍結乾燥することによって得られる光反応性多糖スポンジ。
【請求項１０】
光反応性多糖の多糖部分が、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、キチン、キトサン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースから成る群から選択された１種以上である請求項９記載の光反応性多糖スポンジ。
【請求項１１】
光反応性多糖が、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸、フリルアクリル酸、又はチオフェンアクリル酸が光反応性残基として含まれる光架橋基が結合した多糖であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の光反応性多糖スポンジ。
【請求項１２】
カルボキシメチルセルロースにケイ皮酸又は置換ケイ皮酸を光反応性基として含む光架橋基が結合してなる光反応性多糖。
【請求項１３】
ヒアルロン酸にフリルアクリル酸又はチオフェンアクリル酸を光反応性残基として含む光架橋基が結合してなる光反応性多糖。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は多糖スポンジとその製造方法に関する。ここで、スポンジとは、独立気泡または連通気泡を有する多孔質物質を指す。
【０００２】
【従来の技術】
高分子を使用したスポンジはその吸水性から生体へ適用すべく様々な試みがなされている。中でも生分解性の多糖を使用したスポンジは生体に対する親和性が高く有用である。しかし、生体適合性を有する多糖の多くは、親水性で分解し易い。従って、スポンジの崩壊を遅延または防止させるべくスポンジに使用される多糖はしばしば不溶化または高分子化されて生体適合性のスポンジに利用される。
【０００３】
例えば、特開平１０−２２６７３２号公報には、多糖溶液を凍結させた後、架橋剤が含有された水混和性有機溶剤中に浸漬して多糖を架橋し、その後、乾燥してスポンジとする、多糖スポンジの製造方法が提案されている。
【０００４】
しかしながら、上記の方法による場合は、未反応の架橋剤がスポンジ中に含まれるため、スポンジを洗浄する作業が必要となる。ところが、スポンジの様な多孔質の洗浄は極めて困難である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記実情に鑑みなされたものである。本発明の目的は、不純物の除去が容易な多糖スポンジを提供することにある。
【０００６】
すなわち、主な本発明の要旨は、光反応性多糖を架橋させて得られる架橋多糖によって形成されることを特徴とする多糖スポンジ及びその製造方法に存する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
１．本発明多糖スポンジ：
本発明多糖スポンジは、光反応性多糖を架橋させて得られる架橋多糖によって形成されることを特徴とする多糖スポンジである。
【０００９】
本発明多糖スポンジは、多孔質である。本発明多糖スポンジの有する孔は、その吸水・排水効率の観点から、後述の実施例中の電子顕微鏡写真の撮影範囲である１６０×２４６＝３９３６０μｍ２当たり３０個以上であり、好ましくは４０個以上である。これらの孔は、スポンジの構造の均一性の観点から、一定の範囲の孔径を有することが好ましく、上記面積に存在する孔数の５０％以上が１０〜５０μｍの孔径を有していることが好ましく、６０％以上の孔が１０〜５０μｍの孔径を有していることがより好ましく、７０％以上の孔が１０〜５０μｍの孔径を有していることが極めて好ましい。この様なスポンジの単位面積当たりの孔数や孔径は、得られた多糖スポンジの電子顕微鏡写真などを用いて計測することが可能である。
【００１０】
また、本発明多糖スポンジは、吸水状態でもその形状が一定に保たれることが好ましい。例えば本発明多糖スポンジは、２４℃条件下で大過剰量の水に多糖スポンジを浸漬した際に、少なくとも１時間、より好ましくは３時間、さらに好ましくは２４時間、最も好ましくは４８時間経過した時点で、スポンジの形態を保っていることが好ましい。
【００１１】
更に、本発明多糖スポンジは、５秒間注射用水に浸漬した際の重量（Ｗｗ）と、更に、これを濾紙により水分を完全に除去した際の重量（Ｗｄ）とを用いて算出した含水率：｛（Ｗｗ−Ｗｄ）／Ｗｗ｝×１００が７０％以上、好ましくは７５％以上、更に好ましくは８０％以上であることが最も好ましい。
【００１２】
本発明多糖スポンジを形成する多糖とは、生体に親和性を有する多糖であればその種類は特に制限されないが、親水性が高く、生体親和性を有する多糖が好ましい。尚、ここで「生体親和性を有する」とは、生体の拒絶反応や抗原性を惹起しない状態を指称する。好ましい多糖としては、具体的には、グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸など）、ポリウロン酸（アルギン酸、ペクチン酸など）、マンナン、デンプン、寒天、アラビアゴム、トラガカントゴム、セルロース又はその親水性誘導体（カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等）、ポリアミノ多糖（キチン、キトサン等）が挙げられる。これらの中では、形成された多糖スポンジの形態安定性が高い面からも、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、キチン、キトサン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースが特に好ましい。
【００１３】
上記多糖の分子量（重量平均分子量）は次の通りである。ヒアルロン酸以外の多糖の場合は、通常２，０００〜３，０００，０００、好ましくは３，０００〜２，７００，０００、更に好ましくは４，０００〜２，５００，０００である。ただし、ヒアルロン酸の場合は、通常２０万〜３００万、好ましくは３０万〜２００万、更に好ましくは４０万〜１２０万である。
【００１４】
本発明多糖スポンジにおける架橋多糖とは、光反応性多糖を光照射によって架橋させた多糖である。この光反応性多糖とは、上記の多糖に光架橋基が化学結合した誘導体を指す。上記光架橋基は、光反応性残基を有する架橋基である。光反応性残基としては、光の照射により光二量化反応または光重合反応を生じる化合物の残基であれば特に制限されない。本発明においては、光架橋基の導入により多糖のグリコシド結合が切断されない様な光反応性残基が好ましい。
【００１５】
上記の様な光反応性残基としては、例えば、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸（例えばアミノケイ皮酸（ベンゼン環のいずれかの水素がアミノ基に置換したケイ皮酸：好ましくはp−アミノケイ皮酸））、アクリル酸、マレイン酸、フマル酸、フリルアクリル酸、チオフェンアクリル酸、シンナミリデン酢酸、ソルビン酸、チミン、クマリン等が挙げられる。これらの中では、光によりシクロブタン環を形成可能なビニレン基を有したものであることが好ましい。その中でも特に光反応性及び生体に対する安全性の面からケイ皮酸又は置換ケイ皮酸（特にアミノケイ皮酸）が好ましい。また、光反応性残基の多糖に対する影響を極力低下させるために、スペーサーを介して多糖に光反応性残基が結合していることが好ましい。従って、ケイ皮酸又は置換ケイ皮酸にスペーサーが結合した誘導体が光架橋基としては最も好ましい。
【００１６】
最も好ましい光架橋基としては、例えば、ケイ皮酸のカルボキシル基にアミノアルコール（H2N-(CH2)n-OH等：n=1〜18、H2N-(CH2-O)m-CH2-OH：m=1〜9）がエステル結合したケイ皮酸アミノアルキルエステル誘導体（Ph-CH=CH-CO-O-(CH2)n-NH2、Ph-CH=CH-CO-O-CH2-(CH2-O)m-NH2等：n、mは上記と同じ、Phはフェニル基を表す）、ジアミン（H2N-(CH2)l-NH2：l=1〜10）、ジオール（HO-(CH2)k-OH等：k=1〜10）が導入された誘導体（Ph-CH=CH-CO-NH-(CH2)l-NH2、Ph-CH=CH-CO-O-(CH2)k-OH等：l、k、Phは上記と同じ）、アミノ酸（HOOC-(CHR)j-NH2：j=1〜10、Rはそれぞれ独立にアミノ酸の側鎖を示す）、ペプチド等を置換ケイ皮酸（アミノケイ皮酸）に導入した誘導体（OC-CH=CH-Ph-NH-CO-(CHR)j-NH、OC-CH=CH-Ph-NH-(ペプチド)：R、j、Phは上記と同じ）等が挙げられるが、好ましくはケイ皮酸のカルボキシル基にアミノアルコールがエステル結合で導入された誘導体（ケイ皮酸アミノアルキルエステル）である。アミノアルコールは上記一般式においてｎが１〜１８が好ましく、特に３〜６が好ましく、３〜４が極めて好ましい。特にケイ皮酸アミノアルキルエステルを光架橋基として使用する場合には、多糖としてはカルボキシル基を有する多糖（好ましくはウロン酸を含む多糖、最も好ましくはヒアルロン酸）を使用することが好ましい。この場合、アミノアルキル基のアミノ基と多糖のカルボキシル基とがアミド結合することにより光架橋基が多糖に結合される。この様な光反応性多糖は、例えば、特開平６−７３１０２号公報、特開平８−１４３６０４号公報、ＷＯ９７／１８２４４号公報、特開平９−８７２３６号公報などの公知の方法に従って調製することが出来る。
【００１７】
本発明多糖スポンジは、下記の製造方法１又は製造方法２によって得ることが出来る。
【００１８】
製造方法１：光反応性多糖の溶液を凍結する工程（Ａ）と、（Ａ）工程で得られた凍結した溶液に光を照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖スポンジを得る工程（Ｂ）とを含む製造方法
【００１９】
製造方法２：光反応性多糖の溶液を凍結乾燥する工程（Ｃ）と、（Ｃ）工程で得られた凍結乾燥物に光を照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖スポンジを得る工程（Ｄ）とを含む製造方法
【００２０】
以下、製造方法１及び製造方法２を各々説明する。
【００２１】
２．製造方法１：
（１）工程（Ａ）：
工程（Ａ）は光反応性多糖の溶液を凍結する工程である。調製する溶液中の光反応性多糖の濃度は、光反応性多糖における多糖の分子量と光架橋基の導入率との関係によって適宜選択されるが、通常０．１〜１０重量％の範囲である。例えば、重量平均分子量４０〜１２０万のヒアルロン酸に対して導入率１．０〜８．０％で光架橋基が導入されている場合は０．５〜６．０重量％が例示される。
【００２２】
なお、導入率とは、多糖中に存在する「光架橋基を導入可能な多糖の官能基のモル数」に対する「導入された光架橋基のモル数」を百分率で表示した値である。また、ここで、光架橋基を導入可能な多糖の官能基とは、光架橋基および使用するスペーサーの種類によって異なる。光架橋基またはスペーサーのカルボキシル基を多糖への結合に使用する場合は、多糖中のアミノ基またはヒドロキシル基が例示される。また光架橋基またはスペーサーのアミノ基を多糖への結合に使用する場合は、多糖中のカルボキシル基が例示される。
【００２３】
上記の溶液の調製に使用される溶媒としては、光反応性多糖を溶解または懸濁した状態で凍結することが可能である溶媒である限りその種類は特に限定されない。この様な溶媒としては、水、水と有機溶媒（ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、ピリジン、ジオキサンなど）との混合液、又は有機溶媒が挙げられる。特に調製された多糖スポンジの孔径を好ましい範囲の１０〜５０μｍに保つためには水又は水と有機溶媒との混合液の様な水を含む溶媒が好ましい。従って、この様な溶媒を含む、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水、蒸留水、注射用水などが工程（Ａ）の光反応性多糖の溶液の調製に使用される。
【００２４】
本発明においては、上記の溶液から予め光反応性多糖と溶媒、緩衝液中の有機酸塩類等以外の、多糖スポンジに残留することが好ましくない物質（例えば、未反応の光架橋基を有する反応試薬、不純物、異物）を除去しておくことにより、得られる多糖スポンジにおける架橋多糖の純度を医療用具などの医療目的に使用し得る程度に高めることが出来る。溶液中の不純物や異物などの除去は、例えば、透析、濾過、遠心分離などの公知の手法に従って行なうことが出来る。光反応性多糖は、通常、水と水溶性有機溶媒の混合液に可溶性であり、これらの溶液に溶解した溶液の状態で得られるため、この溶液に対して不純物や異物の除去操作を行うことにより多糖と反応しなかった光架橋基を有する反応試薬の除去がきわめて容易に行われる。殊に洗浄が困難な多孔質であるスポンジの調製においては、その原料である光反応性多糖が純粋に得られることは有利である。
【００２５】
光反応性多糖の溶液は、多糖スポンジの使用目的に応じた形状になる様に凍結させられる。これにより、光の照射によって架橋反応をさせた際のスポンジの形状が規制される。一方、光反応性残基として例えばケイ皮酸などの紫外線を吸収して架橋反応を起こす基を使用する場合は、凍結物の紫外線透過性を考慮し、紫外線の透過距離が１ｃｍ以下となる様に凍結を行なうことが好ましい。
【００２６】
凍結条件は、特に制限されず、通常の条件を採用し得る。例えば、多糖スポンジの形状を規制する容器などに光反応性多糖の溶液を収容して液体窒素の様な超低温雰囲気下で急激に凍結してもよく、また、溶液を凍結可能な冷凍機を使用して比較的緩やかに凍結してもよい。なお、溶液の形状規制に使用する容器の外壁を介して外部から光を照射して光架橋反応を行う場合、当該容器の材質は、光架橋基の架橋反応に必要な波長の光を吸収しない材質であって、その様な光を透過する材質でなければならない。斯かる材質としては、例えば、光架橋反応に紫外線が使用される場合は、紫外線吸収率が低いポリプロピレン等の高分子化合物、ガラス、特に石英ガラス、硬質ガラス等が挙げられる。
【００２７】
（２）工程（Ｂ）：
工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られた「凍結した光反応性多糖の溶液」に光を照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖スポンジを得る工程である。使用する光反応性物質に応じて照射する光線の種類を選択する。例えば、光架橋基としてケイ皮酸を使用した場合は、照射する光として紫外線を使用する。この場合、紫外線の波長は１００〜４００ｎｍの範囲から選択するのが好ましい。
【００２８】
また、光の照射時間は、光源の出力および製造する光架橋多糖の使用目的に応じて適宜変化させる。例えば、ケイ皮酸を光架橋基として使用する場合であって、４００Ｗの高圧水銀ランプ１灯を使用して１０ｍＬの光反応性多糖溶液から架橋した多糖スポンジを製造する場合において、比較的高い機械的強度（通常、実施例に記載の測定法で４重量％の光反応性多糖溶液を用いた場合に３５０ｇ以上、２重量の溶液を用いた場合に１００ｇ以上）を有する多糖スポンジを得るためには、光源からの距離４ｃｍ（１０．９〜１１．３ｍＷ／ｃｍ２：波長２８０ｎｍの紫外線に換算）で３０秒以上７分以下の照射時間を選択する。更に長時間の光照射を行うことにより、一層高硬度の多糖スポンジを得ることが可能である。また、同じ照射時間であっても、より低出力の光源を使用したり、光源からの距離をさらに長くしたりすることにより生分解性の優れた架橋度の低い多糖スポンジを得ることが可能となる。
【００２９】
例えば、上述の４００Ｗ高圧水銀ランプ１灯を使用して光源から４ｃｍの照射条件でケイ皮酸を導入したヒアルロン酸の４％溶液に光を照射する際の光反応性架橋基の導入率、照射時間および架橋率との関係は、図１に示す通りである。なお、一般に上述の様々な架橋率の光架橋ヒアルロン酸は以下の表１に示す様な性状を示す。
【００３０】
【表１】
0004135502.tif 000002
【００３１】
上記の比較的高い機械的強度を有する多糖スポンジとは、多糖の分子量によって幅はあるものの、少なくとも７％以上の架橋率を有する多糖スポンジであり、８％以上であることが好ましく、特に１０〜４０％の架橋率が好ましい。１〜５％程度の架橋率を有する多糖スポンジは生分解性の優れており、特に１〜３％の架橋率が好ましい。上記架橋率とは多糖１分子に結合した光架橋基の分子数を基準として、光架橋した光架橋基の分子数を百分率により表示した数値である。
【００３２】
３．製造方法２：
工程（Ｃ）は、光反応性多糖の溶液を凍結し、常法によって凍結乾燥する工程である。光反応性多糖溶液の凍結までは、上記製造方法１における工程（Ａ）と共通である。
【００３３】
（１）工程（Ｃ）：
工程（Ｃ）の凍結乾燥とは、「凍結した光反応性多糖の溶液」から凍結した状態で溶媒を除去する処理であれば特に限定はされず、冷却を行いながら凍結した光反応性多糖の溶液を減圧して溶媒を昇華させても良く、また常温で急激に減圧して溶媒を昇華させても良い。この様な処理をすることで、凍結時に溶媒が存在した部分に空隙が生じ、本発明多糖スポンジが有する孔が、好ましい孔径で形成されることとなる。この工程（Ｃ）を経ることで、光反応性多糖によって形成される光反応性多糖スポンジが得られることとなる。この様な光反応性多糖スポンジは、１６０×２４６μｍの単位面積当たり孔数が３０個以上、好ましくは４０個以上であり、その孔数のうちの５０％以上、好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上の孔径が１０〜５０μｍであるという特徴を有している。光反応性多糖スポンジは後述の実施例で記載した様な強度を有しているが、易溶性なので、その様な性質を利用するスポンジとして使用することが可能である。
【００３４】
（２）工程（Ｄ）：
工程（Ｄ）は、工程（Ｃ）で得られる「光反応性多糖の溶液の凍結乾燥物」に光を照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖スポンジを得る工程である。
【００３５】
照射する光の種類は製造方法１における工程（Ｂ）と共通である。光の照射時間は、光源の出力及び製造する光架橋多糖スポンジの使用目的に応じて変化させる。例えば、ケイ皮酸を光架橋基として使用する場合であって、４００Ｗの高圧水銀ランプ１灯を使用して１０ｍＬの光反応性多糖溶液の凍結物から多糖スポンジを製造する場合において、比較的高い機械的強度を有する多糖スポンジを得るためには、光源から４ｃｍ（１０．９〜１１．３ｍＷ／ｃｍ２：波長２８０ｎｍの紫外線に換算）で２５秒以上７分以下の照射時間を選択する。さらに長時間の光照射を行うことにより一層高硬度の多糖スポンジを得ることが可能である。
【００３６】
また、同じ照射時間であっても、より低出力の光源を使用したり、光源からの距離をさらに長くしたりすることにより生分解性の優れた架橋度の低い多糖スポンジを得ることが可能である。得られた多糖スポンジは、実施例４に記載された様に製造方法１によって調製された多糖スポンジと比較すると、形態保持能や吸水性、孔径やその分布、架橋率および異性化率が同等の多糖スポンジである。
【００３７】
上記の製造方法１又は製造方法２に従って光を照射して多糖に結合した光架橋基の架橋反応を行うと、光反応性多糖の溶液の凍結物（工程（Ａ）によって調製された凍結した溶液）又は凍結乾燥物（工程（Ｃ）によって調製された凍結乾燥物）はその形状を保った状態で光架橋した多糖からなるスポンジとなる。すなわち、本発明多糖スポンジは、精製が容易である溶液状態の光反応性多糖をもとに調製されるため、不純物を含まないスポンジを容易に形成させることが可能である。
【００３８】
また、凍結状態又は凍結乾燥した状態での光架橋反応は、溶液状態での光架橋反応と比して格段に少ない光のエネルギーで引き起こすことが出来る。従って、同じ光の照射条件で溶液に照射して得られる架橋多糖よりもさらに高架橋の架橋多糖からなるスポンジを容易に得ることが出来る。また、光架橋基の導入率が同じ場合、架橋率が従来の光架橋物と比して格段と高く、例えば、医薬品、医療用具としての滅菌性を保証するための条件より厳しい条件、すなわち１２２℃で２０分間のオートクレーブ滅菌を行った後においても、オートクレーブ滅菌を行う前のスポンジの形状を保ち続ける程度の形状保持能を有する。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
【００４０】
実施例１：
ヒアルロン酸（生化学工業株式会社製：重量平均分子量９０万）の全カルボキシル基の３％にケイ皮酸アミノプロピルを導入した光反応性ヒアルロン酸（導入率３％）１ｇを注射用水２５ｍＬに溶解して４重量％光反応性ヒアルロン酸水溶液を調製した。この水溶液を層厚が１ｍｍとなる様に硬質（パイレックス）ガラス板（旭テクノグラス社製）に挟み、−８０℃の雰囲気下で急激に凍結した後、凍結状態を維持したまま、高圧水銀ランプ（シゲミスタンダード製の４００Wのランプ、以下同じ）にて５分間光を照射した。照射後の物質を室温で融解し、白色の光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
【００４１】
上記の光架橋ヒアルロン酸スポンジは、多孔質であることが肉眼で確認可能であり、指で水分を搾り出すことが出来、また、水分を失ったスポンジは、容易に水分を吸収できる優れた吸水・排水性を示した。調製したスポンジは、注射用水に５秒間浸漬したところ、６．１ｇとなり、これを濾紙により水分を完全に除去すると０．８ｇとなった。更に、再度、注射用水に５秒間浸漬すると５．９ｇとなり、８６．９％の含水率を示した。また、この光架橋ヒアルロン酸スポンジをプラスチックシャーレに入れ、２０℃の雰囲気下、１０ｍｍＨｇで５時間凍結真空乾燥することにより、乾燥状態の光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
【００４２】
この光架橋ヒアルロン酸スポンジの断面を電子顕微鏡（ＪＳＭ−５２００  走査型電子顕微鏡：日本電子株式会社製）を用いて観察したところ撮影範囲（１６０×２４６μｍ＝３９３６０μｍ２）当たり１０８個の孔が観察され、そのうちの７０個（６５％）が１０〜５０μｍの孔径を有していた（図２）。
【００４３】
実施例２：
実施例１と同様に、調製した光反応性ヒアルロン酸水溶液の凍結物に７分間光を照射して、光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。得られた光架橋ヒアルロン酸スポンジは、実施例１で得られた光架橋ヒアルロン酸スポンジと同様、多孔質で優れた吸水・排水性を示した。
【００４４】
この光架橋ヒアルロン酸スポンジの断面を電子顕微鏡（ＪＳＭ−５２００  走査型電子顕微鏡）を用いて観察したところ撮影範囲（１６０×２４６μｍ＝３９３６０μｍ２）当たり９２個の孔が観察され、そのうちの５６個（６１％）が１０〜５０μｍの孔径を有していた（図３）。
【００４５】
実施例３：
ヒアルロン酸（生化学工業株式会社製：重量平均分子量９０万）の全カルボキシル基の３％にケイ皮酸アミノプロピルを導入した光反応性ヒアルロン酸（導入率３％）１ｇを注射用水２５ｍＬに溶解して４重量％光反応性ヒアルロン酸水溶液を調製した。この水溶液を層厚が１ｍｍとなる様に硬質（パイレックス）ガラス板（旭テクノグラス社製）に挟み、−８０℃の雰囲気下で急激に凍結した後、２０℃の雰囲気下、１０ｍｍＨｇで２４時間凍結真空乾燥を行って、光反応性ヒアルロン酸スポンジ（凍結乾燥物）を得た。この凍結乾燥物に常温で高圧水銀ランプ（シゲミスタンダード製の４００Wのランプ、以下同じ）にて５分間光を照射し、光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
【００４６】
上記の光架橋ヒアルロン酸スポンジは、多孔質であることが肉眼で確認可能であり、蒸留水に浸漬すると優れた吸水性を示した。このスポンジは、注射用水に５秒間浸漬すると４．９ｇとなり、これを濾紙により水分を完全に除去すると０．７ｇとなった。更に、再度、注射用水に５秒間浸漬すると４．６ｇとなり、含水率は８５．７％を示した。吸水した光架橋ヒアルロン酸スポンジは、指で水分を搾り出すことが出来、優れた吸水・排水性を示した。
【００４７】
上記の光架橋ヒアルロン酸スポンジの断面を電子顕微鏡（ＪＳＭ−５２００  走査型電子顕微鏡）を用いて観察したところ撮影範囲（１６０×２４６μｍ＝３９３６０μｍ２）当たり９１個の孔が観察され、そのうちの６７個（７３％）が１０〜５０μｍの孔径を有していた（図４）。
【００４８】
実施例４：
実施例１（製造方法１）及び実施例３（製造方法２）で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジの同一性（同等性）を架橋率と異性化率の観点から対比した。架橋率は１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬで各々のスポンジ１ｇを１時間鹸化した後、得られた溶液を酸性にして酢酸エチルで光架橋基由来物（単量体、二量体）を抽出し、常法に従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により解析した。検量線法を用いて、二量体の量を測定した。そして、ヒアルロン酸に導入された光架橋基に対する二量体となった光架橋基のモル数を百分率で算出した（図５）。
【００４９】
異性化率は、単量体のピークから算出した単量体のケイ皮酸の量に対する、シス体の単量体の量（トランス体とは別のピークとして現れる）を百分率で算出したものである（図６）。これらの結果から、実施例１の光架橋ヒアルロン酸スポンジと、実施例３の光架橋ヒアルロン酸スポンジとは、架橋率及び異性化率の面から、同等の多糖スポンジであることが示された。
【００５０】
実施例５：
実施例１と同様の４％光反応性ヒアルロン酸水溶液１ｍＬを高密度ポリプロピレンパックに封入し、−８０℃の雰囲気下で急激に凍結した後、凍結状態を維持したまま、高圧水銀ランプにて５分間光照射を行った。その後、オートクレーブ滅菌（１２２℃、２０分）処理を行なって滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
【００５１】
上記の光架橋ヒアルロン酸スポンジは、オートクレーブ滅菌前の形状を維持しており、多孔質であることが肉眼で確認可能であり、そのまま指で水分を搾り出すことが出来、また、水分を失ったスポンジは、容易に水分を吸収できる優れた吸水・排水性を示した。また、この光架橋ヒアルロン酸スポンジを実施例１と同様に凍結真空乾燥することにより、乾燥状態の光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
【００５２】
実施例６：
実施例１と同様の４％光反応性ヒアルロン酸水溶液１ｍＬを高密度ポリプロピレンパックに封入し、一般冷凍庫（−７℃）で緩やかに凍結した後、凍結状態を維持したまま、高圧水銀ランプにて５分間光照射を行った。その後、オートクレーブ滅菌（１２２℃、２０分）処理を行なって滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
【００５３】
上記の滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジは、多孔質であることが肉眼で確認可能であり、そのまま指で水分を搾り出すことが出来、また、水分を失ったスポンジは、容易に水分を吸収できる優れた吸水・排水性を示した。また、この滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジをプラスチックシャーレに入れ、一般冷凍庫（−７℃）で緩やかに凍結し、１０ｍｍHｇで５時間凍結真空乾燥することにより、乾燥状態の光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
【００５４】
上記の乾燥状態の光架橋ヒアルロン酸スポンジは、再度水に浸してもそのまま指で水分を搾り出すことが出来、容易に水分を吸収できる優れた吸水・排水性を示した。凍結真空乾燥の前後において、機械的物性の低下は認められなかった。
【００５５】
実施例７：
ヒアルロン酸の全カルボキシル基の４％にフリルアクリル酸アミノプロピルを導入したヒアルロン酸誘導体１ｇを注射用水２５ｍＬに溶解して４重量％光反応性ヒアルロン酸水溶液を調製した。この水溶液１ｍＬを層厚が１ｍｍとなる様に高密度ポリプロピレンパックに封入し、−８０℃の雰囲気下で急激に凍結した後、凍結状態を維持したまま、高圧水銀ランプにて５分間光照射を行った。その後、オートクレーブ滅菌（１２２℃、２０分）処理を行なって滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
【００５６】
上記の滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジは、多孔質であることが肉眼で確認可能であり、そのまま指で水分を搾り出すことが出来、また、水分を失ったスポンジは、容易に水分を吸収できる優れた吸水・排水性を示した。また、この滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジをプラスチックシャーレに入れ、２０℃の雰囲気下、１０ｍｍHｇで５時間凍結真空乾燥することにより、乾燥状態の光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
【００５７】
なお、上記のフリルアクリル酸アミノプロピル導入ヒアルロン酸は次の様にして調製した。すなわち、ヒアルロン酸１ｇを注射用水１００ｍＬ、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解し、室温で３０分攪拌した後、０．３当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボシイミド塩酸塩、１−ヒドロキシスクシンイミド、フリルアクリル酸アミノプロピルを順次加え、２時間攪拌の後、ＮａＣｌ１ｇを加えて、エタノール００ｍＬに注ぎ沈殿を析出させた。その後、エタノールで３回洗浄を行った後、遠沈して沈殿を回収、４０℃減圧下で一晩乾燥してフリルアクリル酸アミノプロピル導入ヒアルロン酸約１ｇを得た。
【００５８】
実施例８：
ヒアルロン酸の全カルボキシル基の４％にチオフェンアクリル酸アミノプロピルを導入したヒアルロン酸誘導体１ｇを注射用水２５ｍＬに溶解して４重量％ヒアルロン酸誘導体水溶液を調製した。この水溶液１ｍＬを層厚が１ｍｍとなる様に高密度ポリプロピレンパックに封入し、−８０℃の雰囲気下で急激に凍結した後、凍結状態を維持したまま、高圧水銀ランプにて５分間光照射を行った。その後、オートクレーブ滅菌（１２２℃、２０分）処理を行なって滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
【００５９】
上記の滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジは、多孔質であることが肉眼で確認可能であり、そのまま指で水分を搾り出すことが出来、また、水分を失ったスポンジは、容易に水分を吸収できる優れた吸水・排水性を示した。また、この滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジをプラスチックシャーレに入れ、２０℃の雰囲気下、１０ｍｍHｇで５時間凍結真空乾燥することにより、乾燥状態の光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
【００６０】
なお、上記のチオフェンアクリル酸アミノプロピル導入ヒアルロン酸は次の様にして調製した。すなわち、ヒアルロン酸１ｇを注射用水１００ｍＬ、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解し、室温で３０分攪拌した後、０．３当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボシイミド塩酸塩、１−ヒドロキシスクシンイミド、チオフェンアクリル酸アミノプロピルを順次加え、２時間攪拌の後、ＮａＣｌ１ｇを加えて、エタノール５００ｍＬに注ぎ沈殿を析出させた。その後、エタノールで３回洗浄を行った後、遠沈して沈殿を回収、４０℃減圧下で一晩乾燥してチオフェンアクリル酸アミノプロピル導入ヒアルロン酸約１ｇを得た。
【００６１】
実施例９：
アルギン酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製：重量平均分子量４万）の全カルボキシル基の３％にケイ皮酸アミノプロピルを導入した光反応性アルギン酸１ｇを注射用水２５ｍＬに溶解して４重量％光反応性アルギン酸水溶液を調製した。この水溶液１ｍＬを層厚が１ｍｍとなる様に高密度ポリプロピレンパックに封入し、−８０℃の雰囲気下で急激に凍結した後、凍結状態を維持したまま、高圧水銀ランプにて２分間光照射を行い、光架橋アルギン酸スポンジを得た。
【００６２】
上記の光架橋アルギン酸スポンジは、多孔質であることが肉眼で確認可能であり、そのまま指で水分を搾り出すことが出来、また、水分を失ったスポンジは、容易に水分を吸収できる優れた吸水・排水性を示した。また、この光架橋アルギン酸スポンジをプラスチックシャーレに入れ、２０℃の雰囲気下、１０ｍｍＨｇで５時間凍結真空乾燥することにより、乾燥状態の光架橋アルギン酸スポンジを得た。
【００６３】
なお、上記のケイ皮酸アミノプロピル導入アルギン酸は次の様にして調製した。すなわち、アルギン酸（粘度：５０〜１００ｃｐ）１ｇを注射用水１００ｍＬ、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解し、室温で３０分攪拌した後、０．３当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボシイミド塩酸塩、１−ヒドロキシスクシンイミド、ケイ皮酸アミノプロピルを順次加え、２時間攪拌の後、ＮａＣｌ１ｇを加えて、エタノール５００ｍＬに注ぎ沈殿を析出させた。その後、エタノールで３回洗浄を行った後、遠沈して沈殿を回収、４０℃減圧下で一晩乾燥してケイ皮酸アミノプロピル導入アルギン酸約１ｇを得た。
【００６４】
実施例１０：
カルボキシメチルセルロース（ナカライテスク製：重量平均分子量１８万）の残存カルボキシル基の３％にケイ皮酸アミノプロピルを導入した光反応性カルボキシメチルセルロース１ｇを注射用水２５ｍＬに溶解して４重量％光反応性カルボキシメチルセルロース水溶液を調製した。この水溶液１ｍＬを層厚が１ｍｍとなる様に高密度ポリプロピレンパックに封入し、−８０℃の雰囲気下で急激に凍結した後、凍結状態を維持したまま、高圧水銀ランプにて５分間光照射を行った。その後、オートクレーブ滅菌（１２２℃、２０分）処理を行なって滅菌光架橋カルボキシメチルセルローススポンジを得た。
【００６５】
上記の滅菌光架橋カルボキシメチルセルローススポンジは、多孔質であることが肉眼で確認可能であり、そのまま指で水分を搾り出すことが出来、また、水分を失ったスポンジは、容易に水分を吸収できる優れた吸水・排水性を示した。また、この光架橋カルボキシメチルセルローススポンジをプラスチックシャーレに入れ、２０℃の雰囲気下、１０ｍｍＨｇで５時間凍結真空乾燥することにより、乾燥状態の光架橋カルボキシメチルセルローススポンジを得た。
【００６６】
なお、上記のケイ皮酸アミノプロピル導入カルボキシメチルセルロースは次の様にして調製した。すなわち、カルボキシメチルセルロース（平均分子量：１８万)１ｇを注射用水１００ｍＬ、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解し、室温で３０分攪拌した後、置換率３０％と見做して残存カルボキシル基量に対し、０．３当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボシイミド塩酸塩、１−ヒドロキシスクシンイミド、ケイ皮酸アミノプロピルを順次加え、２時間攪拌の後、ＮａＣｌ１ｇを加えて、エタノール５００ｍＬに注ぎ沈殿を析出させた。その後、エタノールで３回洗浄を行った後、遠沈して沈殿を回収、４０℃減圧下で一晩乾燥してケイ皮酸アミノプロピル導入カルボキシメチルセルロース約１ｇを得た。
【００６７】
実施例１１：
コンドロイチン硫酸Ｃ（生化学工業株式会社製：重量平均分子量６万）の全カルボキシル基の２％にケイ皮酸アミノプロピルを導入した光反応性コンドロイチン硫酸１ｇを注射用水１２．５ｍＬに溶解して８重量％コンドロイチン硫酸誘導体水溶液を調製した。この水溶液１ｍＬを層厚が１ｍｍとなる様に高密度ポリプロピレンパックに封入し、−８０℃の雰囲気で急激に凍結した後、凍結状態を維持したまま、高圧水銀ランプにて１５分間光照射を行って光架橋コンドロイチン硫酸スポンジを得た。
【００６８】
上記の光架橋コンドロイチン硫酸スポンジは、多孔質であることが肉眼で確認可能であり、そのまま指で水分を搾り出すことが出来、また、水分を失ったスポンジは、容易に水分を吸収できる優れた吸水・排水性を示した。また、この光架橋コンドロイチン硫酸スポンジをプラスチックシャーレに入れ、２０℃の雰囲気下、１０ｍｍＨｇで５時間凍結真空乾燥することにより、乾燥状態の光架橋コンドロイチン硫酸スポンジを得た。
【００６９】
なお、上記のケイ皮酸アミノプロピル導入コンドロイチン硫酸は次の様にして調製した。すなわち、コンドロイチン硫酸(平均分子量６万）１ｇを注射用水１００ｍＬ、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解し、室温で３０分攪拌した後、０．３当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボシイミド塩酸塩、１−ヒドロキシスクシンイミド、ケイ皮酸アミノプロピルを順次加え、２時間攪拌の後、ＮａＣｌ１ｇを加えて、エタノール５００ｍＬに注ぎ沈殿を析出させた。その後、エタノールで３回洗浄を行った後、遠沈して沈殿を回収、４０℃減圧下で一晩乾燥してケイ皮酸アミノプロピル導入コンドロイチン硫酸約１ｇ得た。
【００７０】
実施例１２：
実施例１及び実施例２の光架橋ヒアルロン酸スポンジの蒸留水への浸漬時の形状保持能を、ヒアルロン酸水溶液の凍結乾燥物及び実施例３中で調製された光反応性ヒアルロン酸スポンジと比較した。
【００７１】
すなわち、４重量％ヒアルロン酸水溶液の厚さ１ｍｍの凍結乾燥物（１０ｍｍＨｇで２４時間凍結乾燥を行った：ヒアルロン酸スポンジ）、実施例１及び２の光架橋ヒアルロン酸スポンジ、及び実施例３中で調製された光反応性ヒアルロン酸スポンジを各々厚さが１ｍｍとなる様に調製した。各々のサンプルを１×２ｃｍとなる様に短冊状に切断し、それを２４℃条件下で５ｍＬの蒸留水に浸漬した。浸漬時、浸漬から１時間経過後、３時間経過後、及び４８時間経過後の様子を観察した。その結果、ヒアルロン酸スポンジと光反応性ヒアルロン酸スポンジは、浸漬時にすぐに蒸留水に溶解してしまい、１時間経過後には既に形状が崩れて形態がゲル状の塊になっていた。３時間経過後もゲル状の塊であったが、４８時間後には、溶液に均一に溶解していた。一方、実施例１及び２の光架橋ヒアルロン酸スポンジは浸漬した際には、吸水による厚みの増加以外は変化はせず、形態は一定に保たれ、１時間経過後、３時間経過後及び４８時間経過後においても、その形態は一定に保たれたままであった。
【００７２】
また、２重量％のヒアルロン酸溶液を使用して調製したヒアルロン酸スポンジ、２重量％の光反応性ヒアルロン酸水溶液を使用して実施例１、２、３と同様に調製した厚さ１ｍｍの光架橋ヒアルロン酸スポンジ、光反応性ヒアルロン酸スポンジで同様の蒸留水への浸漬実験を行ったところ、浸漬時に吸水による厚みの増加以外は変化はせず形態形状は一定に保たれ、１時間経過後、３時間経過後、及び４８時間経過後においても、その形態は一定に保たれたままであった。従って、架橋構造を有していれば、使用した光反応性ヒアルロン酸の濃度にか拘わらず、水中での形態安定性を獲得することが示された。
【００７３】
また、各スポンジの破断強度の比較を、テクスチャーアナライザー（ＴＡ−ＸＴ２：Stable Micro Systeｍs社製）を用いて行った。測定は、固定したサンプルに、直径１２．５ｍｍの球状プローブを１ｍｍ／秒の速度で押しつけた際の最大応力を破断強度とした（表２）。その結果、ヒアルロン酸スポンジと比して、光反応性ヒアルロン酸スポンジ、及び光架橋ヒアルロン酸スポンジは強度の向上が見られたが、光反応性ヒアルロン酸スポンジと光の照射時間が異なる実施例１及び２の光架橋ヒアルロン酸スポンジの破断強度の相違は見られなかった。このことは、破断強度は架橋構造の有無、及び架橋構造の多少にさほど影響はされず、光架橋基を導入したヒアルロン酸によって調製したスポンジであれば単なるヒアルロン酸から調製されたスポンジよりも高強度を獲得することを示している。
【００７４】
【表２】
0004135502.tif 000003
【００７５】
【発明の効果】
以上説明した本発明によれば、不純物の除去が容易であると共に、溶媒の除去工程を必要としない簡素化された工程により成る、医療用具などに利用可能な程度に不純物を除去した多糖スポンジが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、光反応性架橋基の導入率、照射時間および架橋率との関係を示すグラフである。
【図２】  図２は、実施例１で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジの走査型電子顕微鏡により観察した図面代用の写真である。
【図３】  図３は、実施例２で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジを走査型電子顕微鏡により観察した図面代用の写真である。
【図４】  図４は、実施例３で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジを走査型電子顕微鏡により観察した図面代用の写真である。
【図５】  図５は、製造方法１で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジと製造方法２で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジとを異性化率の観点から対比したグラフである。
【図６】  図６は、製造方法１で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジと製造方法２で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジとを架橋率の観点から対比したグラフである。
【図１】
0004135502.tif 000004
【図２】
0004135502.tif 000005
【図３】
0004135502.tif 000006
【図４】
0004135502.tif 000007
【図５】
0004135502.tif 000008
【図６】
0004135502.tif 000009