(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素、蛍光マーカー及び必要に応じて補助的造粒剤を含んでなる粒体を造粒装置において製造する方法において、この製造法は下記の工程：
前記蛍光マーカーに対して蛍光分析を行い、当該蛍光分析は、造粒工程又はコーティング工程でオンライン又はアットラインで光を粒体組成物に照射することにより行い、ここで当該粒体組成物の粒体は酵素を含んでなりそして100−1000μmの間の最長径での平均大きさを有し、前記光は、粒体組成物の中に含有される蛍光マーカーを蛍光励起でき；
前記蛍光マーカーから放射された光を検出し；そして
蛍光励起にアクセス可能な粒体組成物中の蛍光マーカーの量を予測する；
を含んでなる粒体の製造方法。
【請求項２】
波長10〜380 nmの紫外線を放射する光源で粒体組成物を照明する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
紫外線が1〜10の離散単色波長から成る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
紫外線が1つの離散単色波長、特に260〜280 nmから成る、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
蛍光マーカーから放射された光の検出が1〜10の離散単色波長、特に185〜2600 nmの放射光を検出することから成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
蛍光マーカーが酵素であり、そして蛍光マーカーから放射された光の検出が1つの離散単色波長、特に300〜400 nmの放射光を検出することから成る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
放射光を電子信号の変換できる少なくとも1つの検出器を使用して、検出を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
放射光をディジタル二次元像に変換できるCCDカメラまたはICCDカメラを使用して、検出を実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
放射光をディジタル二次元像に変換できる少なくとも2つCCDカメラまたはICCDカメラを使用して、検出を実施する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
粒体組成物から放射された光を既知量の蛍光マーカーを含有する粒体組成物から放射された光と比較することによって、予測を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
予測が実時間で行なわれる、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素が、ヒドロラーゼ及びオキシドレダクターゼから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
粒体組成物が補助的造粒剤をさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
補助的造粒剤が繊維材料、結合剤、充填剤、液状剤、酵素安定剤、懸濁剤、架橋剤、メディエイターおよび／または溶媒から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
蛍光マーカーが補助的造粒剤であり、そして蛍光マーカーから放射された光の検出が1つの離散単色波長、特に350〜500 nmの放射光を検出することから成る、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素が補助的造粒剤と均質に混合されており、前記粒体がコアを含んでなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記粒体が、酵素及び好ましくは補助的造粒剤を含んでなる層でコーティングされた粒子を含んでなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
粒体が、200〜800 μmの平均大きさを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
粒体がコーティング剤でコーティングされている、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
蛍光分析を造粒プロセス間にオンラインおよび実時間で実施し、造粒プロセス間に2回以上反復する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
蛍光分析の結果として少なくとも1つのプロセスパラメーターを変化させる工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
プロセスパラメーターを酵素の供給、補助的造粒剤の供給、コーティング剤の供給、ガスの供給、温度、圧力、pHおよび造粒材料に与えられる機械的力から選択する、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
酵素および必要に応じて補助的造粒剤を含んでなる粒体をコーティング剤でコーティングし、そしてパラメーターが造粒装置へのコーティング剤の供給であるコーティングプロセスによりさらに特徴づけられる、請求項21又は22に記載の方法。
【請求項２４】
蛍光分析を造粒プロセス後にアットラインで実時間に実施し、2回以上反復する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、粒体組成物を蛍光分析に付すことによって、生物活性化合物を含んでなる粒体組成物の性質を分析する方法に関する。本発明は、また、生成物を蛍光分析に付すことによって特定の生成物を製造する方法に関する。さらに、本発明は、蛍光分析の手段を含んでなる生物活性化合物を含んでなる粒体組成物を調製するために適当な造粒および／またはコーティング装置に関する。
【０００２】
発明の背景
光で励起するとき蛍光を示す化合物 (蛍光体) を利用する、試料中の化学化合物の分析 (蛍光分析) はこの分野においてよく知られている。蛍光分析は十分に限定された試料において高感度、正確であるという利点を有するが、また、重大な欠点を有する。例えば、複雑な試料において、蛍光体の蛍光は蛍光体を取り囲む環境の中に存在する他の化合物によってしばしば変更され (クエンチングとして知られている)、複雑なおよび／または低度に規定された試料について蛍光分析定量的に使用することが困難となる。これは特に異質的または固相試料において適用され、ここで光の散乱をまた処理しなくてはならない。
【０００３】
最近数年のエレクトロニクスの発展の間、カメラ検出器を使用するいっそう複雑化した蛍光結像法が出現し、蛍光性試料において放射光を写真撮影することが可能となったので、二次元像は試料中の蛍光体の空間的分布を示す。
紫外線励起を使用する粉末精製のためにアリューロン組織を蛍光結像する1つの例は、下記の文献から知られている：Dexter他、Cereal Chemistry、Vol. 70(1)、90−95、1993。
Kaufman他、Powder Technology、Vol. 78(3)、239−246、1994は、蛍光顕微鏡検査を使用して液体流動床中の石炭粒子分布のin situ可視化を実施した。
【０００４】
分析における結像のいっそう一般的な例は、Buydens他、Analytical Chimica Acta、Vol. 361(1−2)、161−176、1998の中に見出され、ここには赤外範囲付近の光を使用する結像に基づく廃棄物中のプラスチックについてのオンライン分類および多変量像解析が報告されている。
【０００５】
Watano他、Pharmaceutical Bulletin、Vol. 48(8)、1154−1159、2000は、結像プロセシングシステムにより高翦断造粒において粒体成長のオンラインモニターを報告した。
Watano他は米国特許第5,497,232号において、写真撮影カメラ、例えば、ビデオカメラにおいて使用する型のCCDカメラを使用して、流動床またはパン型造粒装置における粒体成長の結像を報告した。
【０００６】
発明の要約
本発明は、蛍光分析に粒体組成物に付すことによって、精製された生物活性化合物を含んでなる粒体組成物の性質を分析する方法に関する。製品の性質を改良し、こうして商業的にいっそう魅力的するために、通常、化合物を仕上げられた製品に配合すること、特に造粒を必要とする。しかしながら、生物活性化合物について、意図する使用において適用されるまで、生物活性化合物を取り囲む環境から分離して製品の取扱いを安全にしなくてはならないので、製造業者にとって造粒はしばしば強制的である。
【０００７】
造粒製品から、例えば、ダストの形態で、逃散することがある生物活性化合物の量を最小に維持して、製品を取扱う人が生物活性化合物との接触から悪影響を受けないようにしなくてはならない。逆に、活性化合物を粒体の外側の環境から保護して、使用するとき、安定にかつ活性に維持しなくてはならない。いったん活性化合物が造粒されると、生物活性化合物を含んでなる粒体をさらにコーティングして、粒体からの活性化合物からの解放をさらに抑制し、粒体中の活性化合物の安定性をさらに改良することが知られている。通常コーティング層の厚さを増加させることによって、粒体の性質をさらに改良することが好ましい。
【０００８】
本発明の1つの目的は、精製された生物活性化合物を含んでなる粒体組成物の品質パラメーターを測定する、特に結像システムの形態の、方法を提供することである。このようなパラメーターは、例えば、粒体組成物を製造するプロセス間または後の、活性ダストの形態で粒体から解放される活性化合物の量を包含する。他のパラメーターは、ダスト形成を抑制しかつ活性化合物の安定性を増加するために粒体に適用されるコーティング層の厚さおよび／または完全性である。このような厚さおよび／または完全性は、本発明によれば、生物活性化合物を含んでなる粒体組成物のコーティングプロセス間または後に測定することができる。本発明の他の目的は造粒装置を設計し、この方法をこのような医薬組成物の製造においてオンラインまたはインラインで使用し、この方法を実時間に粒体組成物のプロセシング間に生物活性化合物を含んでなるダストのレベルについての情報を提供することができるように、この方法の構成を選択することである。
【０００９】
精製された生物活性化合物を含んでなる粒体組成物について、蛍光マーカー、例えば、生物活性化合物それ自体を蛍光励起できる光で組成物を照明し、蛍光マーカーから放射された光を検出することによって、粒体の表面領域に制限された活性化合物および、例えば、粒体からの活性化合物の解放または不十分な造粒から生ずる、ダスト粒子中の組成物の中に存在する活性化合物の両方を評価できることを我々は発見した。第1の面において、本発明は、粒体組成物の中に含有される蛍光マーカーを蛍光励起できる光で、精製された生物活性化合物を含んでなる粒体組成物を照明し、蛍光マーカーから放射された光を検出し、そして蛍光励起にアクセス可能な粒体組成物中の蛍光マーカーの量を予測することを含んでなる蛍光分析法を提供する。アクセス可能な蛍光マーカーの量は、粒体組成物の性質、例えば、ダストのレベルおよび／またはコーティングの厚さまたは完全性に関係づけることができる。
【００１０】
さらに、第2の面において、本発明は、本発明の第1の面 (上を参照) に従い蛍光分析を実施する工程を含んでなる、造粒装置において精製された生物活性化合物、蛍光マーカーおよび必要に応じて補助的造粒剤を含んでなる粒体を製造する方法を提供する。
【００１１】
なおさらに、第3の面において、本発明は、 (a) 材料を造粒するまたは造粒された材料をコーティングする少なくとも1つのチャンバーを含んでなる造粒またはコーティング装置、 (b) 放射された光を検出することができる少なくとも1つの検出器、 (c) プロセシングされる粒体の一部分上に照明光源を投射する手段、 (d) 照明された粒体から放射された光を検出器に発射する手段、および (e) 照明光または放射光の波長を選択する少なくとも1つの装置、を含んでなる造粒またはコーティング装置を提供する。
最後に、第4の面において、本発明は、精製された生物活性化合物を含んでなる粒体についての蛍光分析の使用を提供する。
【００１２】
発明の詳細な説明
蛍光分析
本発明は、前述したように、活性化合物を含んでなる粒体組成物について蛍光分析を実施する方法に関する。
【００１３】
この方法の第1工程は、粒体組成物の中に含有される蛍光マーカーを蛍光励起できる光ビームで粒体組成物を照明することを含んでなる。このプロセスにおいて、照明光からのフォトンは蛍光マーカーにより吸収され、その結果、蛍光化合物中の電子はエネルギーを獲得し、特定の増加したエネルギーレベルにされる。励起された蛍光マーカーは、電子がもとの基底状態のエネルギーレベルに戻り、引き続いて増加したエネルギーレベルともとのエネルギーレベルとの間のエネルギー差の特徴を示す波長の光のフォトンを放射することによって、獲得したエネルギーの少なくともあるものを遊離する。
【００１４】
この方法の第2工程は、放射光を電子信号に変換できる検出器で、粒体組成物から放射された光を検出することを含んでなる。
この方法の第3工程は、電子信号を処理して、蛍光励起にアクセス可能な粒体組成物中の蛍光マーカーの量を予測することによって、放射光の量を粒体組成物の1または2以上の性質に関係づける。
蛍光分析の基本原理に関する、すべて用語の解釈および意味は当業者に知られている。
【００１５】
粒体組成物の照明
粒体組成物の照明は、粒体組成物中の蛍光マーカーを励起することができる潤滑化粒体を放射する、任意の適当な光源を使用して実施することができる。光源は、例えば、通常のグローランプ、いっそう特殊化されたキセノンランプまたはストロボ電球であることができる。
【００１６】
蛍光マーカー化合物の光学的性質は既知であり、既知の蛍光マーカーの励起を最適化することができ、蛍光マーカーの励起に適当な波長の光の実質的な部分を選択することが好ましい。分析を妨害することがある、蛍光マーカー以外の他の化合物の励起およびそれらからの放射を回避することが望ましい (既知の蛍光マーカーを使用するとき、起こることがある) 場合、選択した波長の光のみが粒体組成物を照明するように、光ビームを濾過することが望ましいことがある。
【００１７】
これは1または2以上のビームスプリッタおよび1または2以上の帯域通過フィルタ、例えば、高いおよび／または低い帯域通過フィルタ、または特定の波長の光のみを通過させる格子モノクロメータを使用して実施することができる。これらの特徴は通常商業的に入手可能な、例えば、パーキン・エルマー (Perkin Elmer、米国) から入手可能な蛍光分析装置において統合される。帯域通過フィルタおよびモノクロメータは狭い範囲、通常数nm以内、例えば、0.5〜10 nmの波長を有する光を通過させることはこの分野において知られている。こうして、単色光は帯域通過フィルタまたは格子モノクロメータにより決定された狭い範囲内の波長の光として理解すべきである。
【００１８】
特定の態様において、粒体組成物を照明する光は1〜10の離散単色波長、特に1〜4離散単色波長から成る。特に、粒体組成物を照明する光は1つの離散単色波長から成る。粒体組成物を照明する工程において、例えば、鏡、ビームスプリッタ (例えば、二色鏡) および／またはファイバーオプティクスを含んでなる光学的集成装置を適当に使用して、粒体組成物上に照明光を発射することができる。
【００１９】
放射光の方向
放射光は蛍光マーカー、または蛍光マーカーの中に含有される化学的基または構成成分の特徴を示すことができる。蛍光マーカーは通常1または2以上の狭い範囲の波長のみを放射するので、これらの範囲内の放射光のみを検出器に到達させるように、放射光を濾過することが好ましい。これは前述したように1または2以上の帯域通過フィルタまたはモノクロメータで放射光を濾過することによって達成することができる。したがって、特定の態様において、1〜10の離散単色波長、特に1〜4の離散単色波長の放射光のみを検出する。特に、検出に到達する放射光は1つの離散単色波長から成る。
【００２０】
さらに、照明に関して、放射光を検出する工程において、例えば、鏡、ビームスプリッタ (例えば、二色鏡)、ファイバーオプティクスおよび／または放射光を収束する手段を含んでなる光学的集成装置を適当に使用して、検出器の中に照明光を投射することができる。
【００２１】
種々の検出器を使用して放射光を検出することができる。検出器は光電子増倍型検出器、フォトダイオードまたはフォトダイオードアレイ、線走査カメラ、CCDカメラ、ICCDカメラまたは放射光の検出に適当な任意の他の型であることができる。特定の カメラは、カメラ型検出器、例えば、グレースケールカメラ、線走査カメラ、フォトダイオードアレイ、CCD (電荷結合デバイス) カメラおよびICCD (積分CCD) カメラから成る群から選択される検出器であることができる。CCDカメラおよびICCDカメラは、いっそう高感度でありかつ光放射粒体またはダスト粒子の空間的分布を示す、二次元像を形成することができるので、選択する カメラであることができる。
【００２２】
これは訓練した分析者により蛍光像成形と呼ばれる。特定の態様において、2種またはそれ以上の検出器を使用して、2またはそれ以上の選択した波長または2またはそれ以上の範囲の波長を同時に記録する。2以上の蛍光マーカーを測定すべき場合、または特定の蛍光マーカーが異なる波長の光を放射する場合、これは望ましい。特に、これは、1または2以上のビームスプリッタおよび2またはそれ以上の帯域通過フィルタまたはモノクロメータを含む光学的集成装置を使用して達成される。最も特定の態様において、第1図に概略的に示すように、2つのCCDカメラ、二色鏡、帯域通過フィルタおよびレンズを含む光学的集成装置を使用する。
【００２３】
検出された信号の処理
検出器において放射光を電子信号に変換し、この信号を測定値、例えば、数に変換し、これから放射光の量および励起にアクセス可能な蛍光マーカーの量を予測することは、蛍光分析を実施する分析装置が豊富に利用可能であるので、当業者に知られている。既知の性質を有する粒体組成物から放射された光についてのデータと未知の粒体組成物から放射された光の量を比較し、こうして未知の粒体組成物において励起にアクセス可能な蛍光マーカーの量を予測することによって、この予測を適当に実施することができる。
【００２４】
ほとんどの検出器、例えば、光電子増倍に基づく型またはいくつかのフォトダイオードに基づく型の出力はアナログ信号である。多数の単一フォトダイオードの検出器を含んでなる、ほとんどの検出器、例えば、多数のカメラは、アナログ信号をディジタル信号に変換できる組込みのアナログ−ディジタル変換機を有することができる。アナログ−ディジタル変換機はコンピューター化データ処理にいっそう適する。放射光の量に関係づけようとする粒体組成物の蛍光マーカーおよび性質に依存して、放射光から生ずるディジタルデータを処理することができる。
【００２５】
この処理は、コンピューターシステムにおいて、このような処理のために設計されるソフトウェアを使用して適当に実施される。このようなソフトウェアは本明細書における実施例おいて使用するようなLabViewソフトウェアであるか、あるいは放射光の量を粒体組成物の性質に関係づける所望のデータ処理を実施する必要の能力を提供する、任意の他のソフトウェアであることができる。データ処理は、商業的に入手可能なソフトウェアの中に含まれているデータ処理機能である操作、例えば、粒子の計数、ゲージング、パターンの合致 (グレースケールおよび色)、統計、限界、多変量の像解析、AMT、小斑点分析、面積計算、へり検出、形態分析、回旋、フォルディングおよびアンフォルディング、FFT、種々の濾過技術、例えば、メジアン濾過 − すべて技術は訓練した分析者に知られている − を包含することができる。
【００２６】
データを計算単位装置に転送するプロセスにおいて、計算単位装置は計算単位装置の中に記憶させるデータを通常検出器から獲得するハードウェアを装備しなくてはならない。蛍光粒体の二次元像を生成するCCDカメラまたは他の型のカメラを使用するとき、また、離散ディジタル静止像の形態で二次元像を記録できるソフトウェアを計算単位装置において使用することは好都合である。このようなソフトウェアはフレームグラッバープログラムとして知られている。このようなソフトウェアが像を記録できる速度は通常計算単位装置の速度に依存し、そして大部分の蛍光分析の目的には、約15フレーム／秒の速度は十分である。これは15／秒の二次元像を記録することを意味する。
【００２７】
粒体組成物
物理的性質
本発明の粒体組成物は、粒子または粒体にプロセシングされる、生物活性化合物、生物活性化合物それ自体であることができる蛍光マーカー、および必要に応じて補助的造粒剤およびコーティング剤を含んでなる組成物である。したがって、仕上げられた粒体は本発明のプロセスおよび方法の結果である。用語「粒体」は、高分子の大きさ、特に最長の直径で測定して20〜2000 μm、より特に100〜1000 μm、最も特に200〜800 μmの平均大きさを有する、主として球形または球形に近い構造物として理解すべきである。好ましくは、球形構造物は粒体の最小寸法の直径 (a) および最大寸法の直径 (b) 間の1：1〜1：5、特に1：1〜1：3の比 (a)：(b) を有する。
【００２８】
粒体の「大きさ分布」(PSD) を個々の粒子の質量平均直径により表すことができる。D50の平均質量直径は、粒体の50質量％がより小さい直径を有するが、50質量％がより大きい直径を有する直径である。値D10およびD90は、粒体のそれぞれ10質量％および90質量％が問題の値よりも小さい直径を有する直径である。「SPAN」はPSDの幅を示し、次のように表される：
(D90−D10) ／D50
【００２９】
本発明の目的に対して、造粒後の粒体のPSDは通常できるだけ狭い。本発明によれば、造粒プロセスをコントロールするために蛍光分析を使用すると、PSDの低下は促進され、したがって、造粒後の粒体組成物のSPANは特に約2.5より小さく、特に約2.0より小さく、より特に約1.5より小さく、最も特に約1.0より小さい。
【００３０】
粒体は特にコーティング剤でコーティングされる。コーティング剤は粒体の回りに特に均質な、凝着性の連続層を形成する。コーティング剤という用語は、本明細書において使用するとき、単一コーティング化合物またはコーティング化合物の混合物として理解すべきである。こうして、コーティングされた粒体は粒体のコアおよび粒体のコーティングから成る。特に、コーティング層は比較的厚く、さらに生物活性化合物のダスチングを減少させ、安定性を改良する。コーティングの厚さはコーティングされた粒体コアの平均直径とコーティングされない粒体コアとの間の比 (以後においてDG/DCと略す)、すなわち、コーティングされた粒体の平均直径を粒体コアのみの平均直径で割った値で記載することができる。
【００３１】
例えば、直径100 μmの粒体コアを厚さ200 μmのコーティング層でコーティングする場合、粒体は直径 (200＋100+200) ＝500 μmを有し、そしてDG/DCは500 μm／100 μm＝5である。本発明のコーティングされた粒体は特に少なくとも1.1のDG/DCを有し、これはコーティングの厚さが平均粒体コア直径の少なくとも5％であることを意味する。より特にDG/DCは少なくとも1.5、より特に少なくとも2、より特に少なくとも2.5、より特に少なくとも3、最も特に少なくとも4である。しかしながら、DG/DCは特に約100以下、特に約50以下、より特に25以下、最も特に10以下である。DG/DCの最も特定の範囲は約4〜約6である。
【００３２】
さらに、本発明において、コーティングは酵素を実質的に含まない。用語「酵素を実質的に含まない」は、本明細書において使用するとき、コーティングについてコーティング剤1 g当たり5 mg以下の酵素が存在することを意味する。
本発明の粒体を構成する材料 (下文参照) を考慮すると、これらの材料は、ガラスのような透明な材料と反対に、一般に可視光線を通過させず、例えば、通常粒体は透明ではない。しかしながら、生物活性化合物を含んでなる粒体を励起光に暴露するとき、このような励起光は粒体表面を透過し、粒体表面および／またはその付近に存在する適当な蛍光化合物を励起し、そしてこのような蛍光化合物から放射された光は粒体から逃散するので、検出器により受け取られることを我々は発見した。
【００３３】
さらに、粒体中の湿分は典型的には20 w/w％より少なく、特に15 w/w％より少なく、より特に10 w/w％より少なく、4〜8 w/w％の範囲である。
【００３４】
構築
粒体は任意のこの分野において知られている造粒法により構築することができる。
本発明の粒体の構築は、下記の非網羅的カテゴリーに分割することができる：
a) 噴霧乾燥した粒体、ここで生物活性化合物を含有する液体溶液を噴霧乾燥器中で噴霧化して小さい液体粒子を形成し、これらの液体粒子は乾燥器を落下する間に生物活性化合物を含んでなる粒体材料を形成する。このようにして、非常に小さい粒体を製造することができる (Michael S. Showell (編者)；Powdered detergents；Surfactant Science Series；1998；Vol. 71；pp. 140−142；Marcel Dekker)。これらの粒体について、生物活性化合物は液体溶液の中に存在する任意の他の補助的造粒剤と均質に混合される。
【００３５】
b) 層状粒体、ここで生物活性化合物を前もって形成したコア粒子の回りに層としてコーティングし、ここで生物活性化合物、および特に補助的造粒剤を含有する溶液を、典型的には前もって形成したコア粒子が流動化されている流動床装置中で、噴霧化し、そして生物活性化合物の溶液はコア粒子に付着し、乾燥してコア粒子表面上に乾燥した生物活性化合物の層として残る。必要な大きさの有用なコア粒子を見出すことができる場合、この方法で必要な大きさの粒体を得ることができる。この型の粒体は、例えば、WO 97/23606に記載されている。
【００３６】
c) 吸収されたコア粒体、ここでコアの回りの層として生物活性化合物をコーティングするよりむしろ、生物活性化合物をコア表面の上におよび／またはその中に生物活性化合物を吸収させる。このような方法はWO 97/39116に記載されている。
【００３７】
d) 押出またはペレット化された粒体、ここで生物活性化合物を含有するペーストを型中でプレスするか、あるいは圧力下に小さい開口を通して押出し、切断して粒体し、引き続いて粒体を乾燥する。押出開口(通常穴あけ口を有するプレート) を構成する材料は押出開口に加える許容可能な圧力を制限するので、このような粒体はかなりの大きさを有する。また、小さい開口を使用するとき、非常に高い押出圧力はペースト中の発熱を増加させ、これは生物活性化合物に対して有害であることがある。(Michael S. Showell (編者) ；Powdered detergents；Surfactant Science Series；1998；Vol. 71；pp. 140−142；Marcel Dekker)。
【００３８】
e) 噴霧冷却した粒体、ここで生物活性化合物の粉末を溶融した蝋の中に懸濁させ、この懸濁液を、例えば、回転するディスク型アトマイザーを通して、冷却チャンバーの中に噴霧し、ここで液体粒子は急速に固化する (Michael S. Showell (編者)；Powdered detergents；Surfactant Science Series；1998；Vol. 71；pp. 140−142；Marcel Dekker)。これらの粒体について、生物活性化合物は粒体表面上に濃縮する代わりに蝋と均質に混合される。また、この技術に関係する文献は米国特許第4,016,040号および米国特許第4,713,245号である。
【００３９】
f) 高翦断ミキサーの粒体、ここで生物活性化合物を含有する液体を補助的造粒剤の乾燥粉末組成物に添加する。適当な比率の液体および粉末を混合し、液体の湿分が乾燥粉末の中に吸収されるとき、乾燥粉末は付着し、凝集し、粒体が増成され、生物活性化合物を含んでなる粒体が形成する。これらの粒体について、活性化合物は補助的造粒剤と均質に混合される。このような方法は米国特許第4,106,991号 (NOVO NORDISK) および関係する文献EP 170360 B1  (NOVO NORDISK)、EP 304332 B1  (NOVO NORDISK)、EP 304331 (NOVO NORDISK)、WO 90/09440 (NOVO NORDISK) およびWO 90/09428 (NOVO NORDISK) に記載されている。
【００４０】
粒体組成物中のダスト粒子
粒体組成物の中に存在することがあるダスト粒子は、全粒体のフラグメントであり、通常粒体よりもかなり小さく、粒体の特徴を示す球形をもたないことを特徴とする。典型的には、ダスト粒子は不規則的非球形、截形の構造、例えば、ロッドまたはフレークの形状を有する。ダスト粒子は典型的には粒体の平均大きさよりも非常に小さく、大部分のダスト粒子は粒体組成物に依存して20 μmより小さい直径を有する。
全粒体のフラグメントであるダスト粒子は同一の不透明性を有し、通常前述の完全な粒体と同一の湿分を有する。
粒体組成物中の化合物
【００４１】
生物活性化合物
本発明の粒体組成物は、生物活性化合物、特に精製された生物活性化合物を含んでなる。生物活性化合物という用語は、本明細書において使用するとき、生物学的系において活性である任意の化合物、例えば、生物学的経路または生物学的反応を妨害し、および／または修飾する化合物として理解すべきである。用語「精製された」は、造粒前に、例えば、過剰量の材料を除去し、および／または活性化合物を濃縮する1または2以上の精製工程に付された生物活性化合物として理解すべきである。活性化合物が微生物学的発酵プロセスにより製造される場合、精製工程は、生物活性化合物の中に濃縮される混合物を生ずる、バイオマスおよび水を含む他の望ましくない物質を除去するために、特に濾過、限外濾過、凝集、沈降、蒸発、抽出およびその他から選択される工程を包含する。
【００４２】
生物活性化合物は、なかでも、有機化合物、例えば、生物触媒、治療剤、除草剤、農薬および殺菌剤を包含する。特に、生物活性化合物は、活性化合物を産生する微生物を発酵することによって生産可能である。
【００４３】
特に、化合物はタンパク質およびペプチド、より特に触媒タンパク質、すなわち、酵素である。なぜなら、酵素のようなタンパク質は非常に大きい体積で工業的に使用され、このようなタンパク質に対して暴露されるとき、ヒトおよび動物において悪いアレルギー反応を引き起こすことが知られているからである。さらに、酵素は家庭用製品、例えば、生物由来の汚れを除去する洗浄剤において広く使用されており、そして多数の工業的プロセスはヒトによる酵素の取扱いを包含する。酵素は、酵素の造粒を通して取り囲む環境から酵素を分離することが望ましい、任意の酵素であることができる。
【００４４】
本明細書において使用する酵素の分類は下記に従う：Recommendations (1992) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Academic Press, Inc., 1992。
したがって、本発明の粒体の中に適当に混入できる酵素の型は下記のものを包含する：オキシドレダクターゼ (EC 1.−.−.−)、トランスフェラーゼ (EC 2.−.−.−)、ヒドロラーゼ (EC 3.−.−.−)、リアーゼ (EC 4.−.−.−)、イソメラーゼ (EC 5.−.−.−) およびリガーゼ (EC 6.−.−.−)。
【００４５】
特に、本発明の関係におけるオキシドレダクターゼは、ペルオキシダーゼ (EC 1.11.1)、ラッカーゼ (EC 1.10.3.2) およびグルコースオキシダーゼ (EC 1.1.3.4) であるが、特定のトランスフェラーゼは下記のサブクラスの任意におけるトランスフェラーゼである：
【００４６】
a)     1つの炭素基を転移させるトランスフェラーゼ (EC 2.1)；
b)     アルデヒドまたはケトン残基を転移させるトランスフェラーゼ (EC 2.2)；アシルトランスフェラーゼ (EC 2.3)；
c)     グリコシルトランスフェラーゼ (EC 2.4)；
d)     メチル以外のアルキルまたはアリール基を転移させるトランスフェラーゼ (EC 2.5)；および
e)     ニトロ発生基を転移させるトランスフェラーゼ (EC 2.6)。
本発明の関係におけるトランスフェラーゼ特定の型は、トランスグルタミナーゼ (タンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ；EC 2.3.2.13) である。
【００４７】
適当なトランスグルタミナーゼのそれ以上の例は、WO 96／06931 (Novo Nordisk A／S) に記載されている。
本発明の関係における特定のヒドロラーゼは次の通りである：カルボン酸エステルヒドロラーゼ (EC 3.1.1.−)、例えば、リパーゼ (EC 3.1.1.3)；フィターゼ (EC 3.1.3.−)、例えば、3−フィターゼ (EC 3.1.3.8) および6−フィターゼ (EC 3.1.3.26)；グルコシダーゼ(EC 3.2、これは本明細書において 「カルボヒドラーゼ」 と呼ぶグループ内に入る)、例えば、α−アミラーゼ (EC 3.2.1.1)；ペプチダーゼ (EC 3.4、これはまたプロテアーゼとして知られている)；および他のカルボニルヒドロラーゼ。
【００４８】
本発明の関係において、用語 「カルボヒドラーゼ」 は、特に5および6員環構造の炭水化物鎖 (例えば、澱粉またはセルロース) を破壊することができる酵素 (すなわち、グルコシダーゼ、EC 3.2) を意味するばかりでなく、かつまた炭水化物、例えば、6員環構造、例えば、D−グルコースを5員環構造、例えば、D−フルクトースに異性化することができる酵素を意味するために使用される。
【００４９】
関係するカルボヒドラーゼは下記のものを包含する (括弧の中はEC番号である) ：α−アミラーゼ (EC 3.2.1.1)、β−アミラーゼ (EC 3.2.1.2)、グルカン1,4−α−グルコシダーゼ (EC 3.2.1.3)、セルラーゼ (EC 3.2.1.4) 、エンド−1,3 (4)−β−グルカナーゼ (EC 3.2.1.6)、エンド−1,4 −β−キシラナーゼ (EC 3.2.1.8)、デキシトラナーゼ (EC 3.2.1.11)、キチナーゼ (EC 3.2.1.14)、ポリガラクツロナーゼ (EC 3.2.1.15)、リゾチーム (EC 3.2.1.17)、β−グルコシダーゼ (EC 3.2.1.21)、α−ガラクトシダーゼ (EC 3.2.1.22)、β−ガラクトシダーゼ (EC 3.2.1.23)、アミロ−1,6−グルコシダーゼ (EC 3.2.1.33)、キシラン1,４−β−キシロシダーゼ (EC 3.2.1.37)、グルカンエンド−1,3 −β−D−グルコシダーゼ (EC 3.2.1.39)、α−デキストリンエンド−1,6−α−グルコシダーゼ (EC 3.2.1.41)、スクロースα−グルコシダーゼ (EC 3.2.1.48)、グルカンエンド−1,3 −α−グルコシダーゼ (EC 3.2.1.59)、グルカン1,4−β−グルコシダーゼ (EC 3.2.1.74)、グルカンエンド−1,6−β−グリコシダーゼ (EC 3.2.1.75)、アラビナンエンド−1,5−α−L−アラビノシダーゼ (EC 3.2.1.99)、ラクターゼ (EC 3.2.1.108)、キトサナーゼ (EC 3.2.1.132) およびキシロースイソメラーゼ (EC 5.3.1.5)。
【００５０】
商業的に入手可能なオキシドレダクターゼ (EC 1.−.−.) の例は、GLUZYMETM (Novo Nordisk A／Sから入手可能な酵素) を包含する。商業的に入手可能なプロテアーゼ (ペプチダーゼ) の例は次の通りである：KANNASETM、EVERLASETM、ESPERASETM、ALCALASETM、NEUTRASETM、DURAZYMTM、SAVINASETM、PYRASETM、PANCREATIC TRYPSIN NOVO (PTN)、BIO−FEEDTM、 PROおよびCLEAR−LENSTM PRO (すべてはNovo Nordisk A／S、Bagsvaerd、Denmark、から入手可能である)。
【００５１】
他の商業的に入手可能なプロテアーゼは下記のものを包含する：MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、OPTICLAEANTMおよびPURAFECTTM (Genencor International Inc.またはGist−Brocadesから入手可能である)。
商業的に入手可能なリパーゼの例は次の通りである：LIPOPRIMETM、LIPOLASETM、LIPOLASETM ULTRA、LIPOZYMETM、PALATASETM、NOVOZYMETM 435およびLECITASETM (すべてはNovo Nordisk A／Sから入手可能である)。
【００５２】
他の商業的に入手可能なリパーゼの例は次の通りである：LUMAFASTTM (Genencor International Inc.からのPseudomonas mendocinaのリパーゼ)；LIPOMAXTM (Gist−Brocades／Genencor International Inc.からのPs. pseudoalcaligenesのリパーゼ；およびSolvay酵素からのBacillus種のリパーゼ)。
【００５３】
商業的に入手可能なカルボヒドラーゼの例は次の通りである：ALPHA−GALTM、BIO−FEEDTM ALPHA、BIO−FEEDTM BETA、BIO−FEEDTM PLUS、BIO−FEEDTM PLUS、NOVOZYMETM 188、CELLUCLASTTM、CELLUSOFTTM、CEREMYLTM、CITROZYMETM、DENIMAXTM、DEZYMETM、DEXTROZYMETM、FINIZYMTM、FUNGAMYLTM、GAMANASETM、GLUCANEXTM、LACTOZYMTM、MALTOGENASETM、PENTOPANTM、PECTINEXTM、PROMOZYMETM、PULPZYMETM、NOVAMYLTM、TERMAMYLTM、AMGTM (アミログルコシダーゼ Novo)、MALTOGENASETM、SWEETZYMETMおよびAQUAZYMTM (すべてはNovo Nordisk A／Sから入手可能である)。それ以上のカルボヒドラーゼは他の供給会社から入手可能である。
【００５４】
本発明の粒体の中に混入すべき酵素の量は、粒体の意図する使用に依存するであろう。多数の用途について、酵素含有率はできるだけまたは実施可能だけ高いであろう。
本発明の粒体中の酵素含有率 (純粋な酵素タンパク質として計算した) は典型的には酵素含有粒体の約0.5〜50重量％の範囲であろう。
【００５５】
補助的造粒剤
特に、本発明の粒体は、粒体形成の促進、粒体の密度および体積のコントロール、粒体中の活性化合物の量のコントロール、活性化合物の安定化およびその他のような目的で補助的造粒剤を含有する。
【００５６】
補助的造粒剤は下記のものを包含するが、これらに限定されない：
a) 充填剤、例えば、造粒の分野において慣用されている充填剤、水溶性および／または不溶性無機塩、例えば、微粉砕アルカリ硫酸塩、アルカリ炭酸塩および／またはアルカリ塩化物) 、粘土、例えば、カオリン (例えば、SpeswhitteTM、English China Clay)、ベントナイト、タルク、ゼオライト、および／またはケイ酸塩である。
【００５７】
b) 結合剤、例えば、造粒の分野において慣用されている結合剤、例えば、非蝋の特質のすべてまたは一部分において高い融点をもつか、あるいはもたない結合剤、例えば、ポリビニルピロリドン、デキストリン、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースまたはCMCである。適当な結合剤は炭水化物の結合剤、例えば、Glucidex 21D (Roquette Freres、フランス国、から入手可能である)。
【００５８】
c) 繊維材料、例えば、造粒の分野において慣用されている繊維。繊維の形態の純粋なまたは不純のセルロースは、おがくず、純粋な繊維状セルロース、ワタであるか、あるいは純粋なまたは不純の繊維質セルロースであることができる。また、繊維質セルロースをベースとする濾過助剤を使用することができる。繊維の形態のセルロースのいくつかのブランド、例えば、CEPOおよびARBOCELLが販売されている。Svenska Traejolsfavrikerna ABからの刊行物、”Cepo Cellulose Powder” の中に、Cepo S/20セルロースについて、概算最大繊維長さは500 μmであり、概算平均繊維長さは160 μmであり、概算最大繊維幅は50 μmであり、そして概算平均繊維幅は30 μmであることが記載されている。
【００５９】
また、Cepo SS/200セルロースは、150 μmの概算最大繊維長さ、50 μmの概算平均繊維長さ、45  μmの最大繊維幅、および25 μmの概算平均繊維幅を有することが記載されている。これらの寸法を有するセルロース繊維は、本発明の目的に対して非常に十分に適している。言語 “Cepo” および “Arbocel” は商標である。好ましい繊維状セルロースはArbocelTM BFC200である。また、EP 304331 B1に記載されているように、合成繊維を使用することができ、そして典型的な繊維はポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、特にナイロン、ポリビニルフォーマット、ポリ (メト) アクリル化合物から作ることができる。
【００６０】
d) 液状剤、例えば、造粒の分野において慣用されている液状剤。液状剤は、慣用ミキサー粒状化プロセスにおいて、慣用粒状化成分粒子の蓄積または凝集を粒体にするために使用される。液状剤は水および／または蝋状物質である。液状剤は粒体プロセスにおいて液相中で常に使用されるが、後に固化することができる；したがって、蝋状物質が存在する場合、それを水の中に溶解または分散させるか、あるいは溶融する。
【００６１】
用語 「蝋状物質」 は、本明細書において使用するとき、下記の特性のすべてを有する物質を意味する：1) 融点が30〜100 ℃、好ましくは40〜60 ℃である、2) 物質は強靭であり、脆くない特質を有する、そして3) 物質は温室において多少可塑性を有する。水および蝋状物質の両方は液状剤である、すなわち、それらの両方は粒体の形成の間に活性である；蝋状物質は仕上げられた粒体中の1成分として止まるが、水の大部分は乾燥工程の間に除去される。蝋状物質の例は、ポリグリコール、脂肪族アルコール、エトキシル化脂肪族アルコール、高級脂肪酸のモノ−、ジ−およびトリグリセロールエステル、例えば、グリセロールモノステアレート、アルキルアリールエトキシレート、およびココナツエタノールアミドである。
【００６２】
多量の蝋状物質を使用する場合、比較的少量の水を添加し、逆もまた同じである。こうして、液状剤は水単独、蝋状物質単独または水と蝋状物質との混合物であることができる。水と蝋状物質との混合物を使用するとき、水および蝋状物質を任意の順序で添加することができる、例えば、最初に水、次いで蝋状物質を添加するか、あるいは最初に蝋状物質、次いで水または水中の蝋状物質の溶液または懸濁液を添加することができる。また、水と蝋状物質との混合物を使用するとき、蝋状物質は水の中に可溶性または不溶性 (しかし分散性) であることができる。液状剤として水を使用する場合、通常、水の大部分はミキサー粒体の引き続く乾燥の間に乾燥除去されるので、水は仕上げられたミキサー粒体の一部分であることができない。
【００６３】
e) 酵素の安定剤または活性成分の保護剤、例えば、造粒の分野において慣用されている酵素の安定剤または活性成分の保護剤。安定剤または保護剤はいくつかのカテゴリーの中に入る：アルカリ性または中性の物質、還元剤、酸化防止剤および／または最初の遷移系列の金属イオン塩。これらの各々は同一であるか、あるいは異なるカテゴリーの他の保護剤と組み合わせて使用することができる。アルカリ性保護剤の例は、アルカリ金属のケイ酸塩、炭酸塩または重炭酸塩であり、これらは、例えば、酸化体を活発に中和することによって化学的掃去作用を提供する。
【００６４】
還元的保護剤の例は亜硫酸塩、チオ亜硫酸塩またはチオ硫酸塩であるが、酸化防止剤の例はメチオニン、ブチル化ヒドロキシトルエン (BHT) またはブチル化ヒドロキシアニソール (BHA) である。最も好ましい安定剤または保護剤はチオ硫酸塩、例えば、チオ硫酸ナトリウムである。また、酵素の安定剤はホウ酸塩、ホウ砂、ギ酸塩、ジカルボン酸、トリカルボン酸および可逆的酵素インヒビター、例えば、スルフヒドリル基をもつ有機化合物またはアルキル化またはアリール化ホウ酸であることができる。
【００６５】
f) 架橋剤、例えば、造粒の分野において慣用されている架橋剤。架橋剤は酵素適合性界面活性剤、例えば、エトキシル化アルコール、特に10〜80個のエトキシ基を有するアルコールである。
さらに、懸濁剤、メディエイター (例えば、洗浄において粒体を溶解するとき漂白作用を促進するメディエイターまたは酵素のメディエイター) および/または溶媒を補助的造粒剤として混入することができる。
【００６６】
コーティング剤
コーティングは、下記の特許出願に記載されている1種または2種以上のコーティング剤を含んでなる：WO 89/08694、 WO 89/08695、EP 270 608 B1および／またはWO 00/01793。コーティング剤の他の例は下記の特許出願の中に見出すことができる：米国特許第4,106,991号、EP 170360、EP 304332、EP 304331、EP 458849、EP 458845、WO 97/39116、WO 92/12645A、WO 89/08695、WO 89/08694、WO 87/07292、WO 91/06638、WO 92/13030、WO 93/07260、WO 93/07263、WO 96/38527、WO 96/16151、WO 97/23606、米国特許第5,324,649号、米国特許第4,689,297号、EP 206417、EP 193829、DE 4344215、DE 4322229 A、DD 263790、JP 61162185 Aおよび／またはJP 58179492。WO 00/01793に記載されている塩コーティングは本発明におけるコーティングに有用である。
【００６７】
コーティング剤は前述の補助的造粒剤のリストから選択することができる。さらに、コーティング剤は、ポリマー、塩素掃去剤、可塑剤、顔料、潤滑剤 (例えば、界面活性剤または静電防止剤) および芳香剤の下記のリストから選択することができる。
コーティング層において有用であるポリマーは、ビニルポリマーまたはビニルコポリマー、例えば、ポリビニルアルコール (PVA) および／またはポリビニルピロリドンまたはそれらの誘導体を包含する。また、イソフタル酸ポリマーが包含される。
【００６８】
本発明の関係におけるコーティング層において有効な可塑剤は、例えば、下記のものを包含する：ポリオール、例えば、糖類、糖アルコール、または1000より小さい分子量を有するポリエチレングリコール (PEG)；尿素、フタレートエステル、例えば、ジブチルまたはジメチルフタレート；および水。
適当な顔料は下記のものを包含するが、これらに限定されない：微粉砕白色体質顔料、例えば、二酸化チタンまたはカオリン、有色顔料、水溶性着色剤、ならびに1または2以上の顔料と水溶性着色剤との組み合わせ。
【００６９】
本発明の関係において使用するとき、用語「潤滑剤」は、表面摩擦を減少させ、粒体表面を潤滑し、静電気の蓄積傾向を減少させ、および／または粒体の脆砕性を減少させる、任意の物質である。また、コーティング中の結合剤の粘着性を減少させることによって、コーティングプロセスの改良において関係する役割を演ずることができる。こうして、潤滑剤は凝集防止剤および湿潤剤として働くことができる。適当な潤滑剤の例は、低級ポリエチレングリコール (PEG) およびエトキシル化脂肪族アルコールである。
【００７０】
洗浄剤配合物の粒体を主として目的とする態様において、異なる「機能的」成分、例えば、TAED、CMC、漂白剤、OBE、界面活性剤、香料ならびに当業者に知られている洗浄剤配合物において使用する他の機能的成分をコーティングに添加することができる。また、コーティングは必要に応じて薬剤産業、農学、食品産業、パン焼き産業、添加剤産業、飼料産業、洗浄剤産業または生物活性化合物を含んでなる粒体を使用できる他の産業における特定の用途について選択される機能的成分を含んでなることができる。
【００７１】
本発明の特定の態様において、本発明の粒体は、WO 89/08694 (これは引用することによって本明細書の一部とされる) に開示されているように、少なくとも81％の高い一定の湿度を有する保護コーティングでコーティングされる。したがって、ある態様において、コーティングは湿分および／または漂白剤バリヤーとして作用してコア中の生物活性化合物を安定化すべきである。さらに、他の態様において、コーティング単位は機械的プロセス、例えば、投与またはタブレット化間に機械的バリヤーとして作用する。ある態様において、コーティング単位は、構造的意味においてかつ活性化合物の生物活性に関して、コアがタブレット化プロセスに耐えるために十分に圧縮可能でありかつ柔軟性である。これは洗浄剤配合物について最も適用可能である。
【００７２】
特定の態様において、コーティング剤は励起源からの光および粒体中の蛍光マーカーから放射された光を吸収するので、粒体表面のある区域がコーティング剤でコーティングされるとき、この区域から放射された光の検出が減少する。
【００７３】
蛍光マーカー
本発明の粒体組成物の中に含有される蛍光マーカーは、照明するとき、蛍光を示す化合物であることができる。蛍光マーカーは有機であり、電磁スペクトルのX線、紫外線および／または可視領域の光、例えば、波長10〜700 nmの光、より特に紫外線領域、すなわち、10〜380 nmの光で照明するとき、蛍光を示す。
さらに、本発明の粒体組成物の中に含有される蛍光マーカーは、励起すると、電磁スペクトルの紫外線、可視および／または近赤外領域の光、すなわち、適当には185〜2600 nmの光を放射する。
【００７４】
蛍光マーカーは生物活性化合物、補助的造粒剤およびコーティング剤のグループに属することができるか、あるいは本発明の蛍光分析を実施するという唯一の目的で粒体組成物に添加する化合物であることができる。しかしながら、コストを節約する観点から、蛍光マーカーは生物活性化合物それ自体であるか、あるいは補助的造粒剤であることが好ましい。
【００７５】
蛍光分析により評価すべき粒体組成物の性質、例えば、ダストの性質またはコーティングの厚さに依存して、異なる蛍光マーカーを選択することができる。ダストの性質を評価するために、粒体組成物の中に存在するダスト粒子中の潜在的に損傷性の活性化合物の量を評価することが必要であるので、例えば、蛍光マーカーとして生物活性化合物を選択することがいっそう適当であるが、コーティングの厚さを評価するために、蛍光マーカーとして適当な補助的造粒剤を選択することができる。
【００７６】
生物活性化合物が、蛍光放射の原因となる芳香族アミノ酸残基、例えば、チロシンまたはトリプトファンを有する蛍光マーカー、特にタンパク質および／またはペプチドの特定のグループに属するものである場合、蛍光分析において、紫外線、特に波長10〜380 nm、より特に200〜400 nmまたは200〜300 nm、最も特に260〜280 nmの紫外線の実質的な部分を放射する光源で粒体組成物を照明することが好ましい。この場合において、波長200〜700 nm、例えば、400〜700 nmまたは300〜400 nm、特に280〜360 nmまたは325〜375 nmの放射光のみを検出することがさらに好ましい。また、この場合において、これらの波長の放射光を検出することができる検出器、例えば、CCDカメラを選択することが必要である。
【００７７】
蛍光マーカーが補助的造粒剤の1つである場合、蛍光分析において、波長350〜550 nm、より特に375〜425 nmの光を放射する光源で粒体組成物を照明することが好ましい。また、この場合において、これらの波長の放射光を検出することができる検出器、例えば、CCDカメラを選択することが必要である。粒体を製造するプロセスにおいて、蛍光分析のための蛍光マーカーであるという目的としてのみ働く蛍光マーカーをこのプロセスに添加することもできる。広い範囲の適当な蛍光マーカーは、例えば、モレキュラー・プローブ (Molecular Probes、米国) から入手可能である。
【００７８】
造粒およびコーティングプロセスにおける蛍光分析
また、本発明は、粒体組成物の性質を予測し、製造方法をコントロールしかつ改良する前述の蛍光分析法を使用して、造粒装置において生物活性化合物および必要に応じて補助的造粒剤を含んでなる粒体組成物を製造する方法に関する。
したがって、本発明は、造粒装置において形成される粒体について蛍光マーカーの蛍光分析を実施する工程を含んでなる、精製された生物活性化合物、蛍光マーカーおよび必要に応じて補助的造粒剤を含んでなる粒体を造粒装置において製造する方法を提供する。
【００７９】
特定の態様において、造粒プロセスにおいて粒体が形成される間に蛍光分析を、特にオンラインで、実施する。これは蛍光分析を適当な反復率で2回以上造粒プロセス間にオンラインおよび実時間で実施することを意味する。反復率は、なかでも、1または2以上の検出器からのデータ処理に依存する。CCDカメラまたはICCDカメラを使用する特定の態様において、約15回／秒の放射光の測定値を造粒プロセスにおいて二次元像の形態で記録する。また、用語「粒体の形成」は、コーティング層で粒体をコーティングすることを包含する。
【００８０】
この態様において、また、このプロセスは蛍光分析の結果として少なくとも1つのプロセスパラメーターを変化させることをさらに含む。変化させるプロセスパラメーターは、造粒プロセスおよび／または形成した粒体の性質に影響を及ぼすパラメーターであることができる。これらのパラメーターは、造粒装置への造粒材料、すなわち、生物活性化合物および／または補助的造粒剤および／またはコーティング剤の供給、造粒装置へのガスの供給、造粒装置における温度、造粒装置における圧力、造粒装置におけるpHおよび造粒材料に与えられる機械的力であることができる。プロセスパラメーターは、マニュアルで、造粒装置の自動化システムを通して変化させることができる。
【００８１】
それ以上の態様において、本発明による蛍光分析は、また、造粒後に仕上げられた粒体組成物のダスチング性質をコントロールするために適当に使用することができる。したがって、本発明は、さらに、生物活性化合物を含んでなる粒体組成物中の活性ダストを蛍光分析する方法を提供する。この方法を使用して、ダストに関して必要な品質を満足しない粒体組成物を廃棄または再プロセシングすることができる。
【００８２】
それ以上の追加の態様において、本発明による蛍光分析は、また、造粒後に仕上げられた粒体組成物のコーティング厚さおよび／または均質性をコントロールするために適当である。したがって、本発明は、さらに、生物活性化合物を含んでなるコーティングされた粒体の組成物におけるコーティング厚さを蛍光分析する方法を提供する。この方法を使用して、コーティング厚さに関して必要な品質を満足しない粒体組成物を廃棄または再プロセシングすることができる。
【００８３】
結像システムを使用して、品質パラメーター、例えば、活性ダスト値またはコーティング厚さを評価することができる。1つの態様において、例えば、コーティングプロセス間に、評価をオンラインで実施する。評価は、特にカメラにより、励起光源に暴露した粒体から放射された光の像を記録し、記録された像と既知の品質パラメーター値を有する試料 (参照試料) の記録された像とを比較することによって、実施される。参照試料の蛍光像および対応する品質パラメーターを使用して、目盛定めモデル、例えば、部分的最小二乗モデルまたは像データの目盛定めモデルの製造に適当な他のモデル化システムを提供する。次いで、このモデルを使用して、未知試料の蛍光像から品質パラメーターの推定値を予測する。
【００８４】
こうして、本発明は、また、下記の工程を含んでなる、精製された生物活性化合物を含んでなる粒体組成物の品質パラメーターを推定する方法を提供する：
(a)  既知の品質パラメーターを有する精製された生物活性化合物を含んでなる粒体組成物を、粒体組成物の中に含有される蛍光マーカーを蛍光励起できる光で照明し、既知品質の粒体組成物から放射された光の1または2以上の像を記録し、記録された像を、特に部分的最小二乗データ処理の形態の、データ処理に付して目盛定めモデルを準備し、
【００８５】
(b)  精製された生物活性化合物を含んでなる未知の粒体組成物を、粒体組成物の中に含有される蛍光マーカーを蛍光励起できる光で照明し、未知の粒体組成物から放射された光の少なくとも1つの像を記録し、
(c)  未知の粒体組成物の少なくとも1つの像を目盛定めモデルと比較し、そして
(d)  未知の粒体組成物の品質パラメーターを推定する。
【００８６】
造粒装置
また、本発明による粒体組成物について蛍光分析を実施する手段を含んでなる造粒および／またはコーティング装置が本発明の範囲内に含まれる。したがって、本発明は、下記の構成成分：
(a)  材料を粒体またはコーティングされた粒体にプロセシングする少なくとも1つのチャンバーを含んでなる造粒またはコーティング装置、および
(b)  プロセシングされる粒体を照明する光源、プロセシングされる材料から放射された光を検出することができる少なくとも1つの検出器、プロセシングされる材料の一部分上に照明光を発射する手段、照明された材料から放射された光を検出器に発射する手段、および光を濾過する少なくとも1つの濾過装置を含んでなる光学的集成装置、
を含んでなる造粒またはコーティング装置を提供する。
【００８７】
造粒またはコーティング装置は任意の慣用造粒装置であることができ、特にそれは流動床造粒装置またはコーター、高翦断ミキサー造粒装置、噴霧乾燥器、噴霧冷却器、押出機から選択することができる。
光学的集成装置において、光源は、特に波長10〜700 nmの光、より特に紫外線領域、すなわち、10〜380 nmを放射することができる、通常のグローランプ、いっそう特殊化されたキセノンランプまたはストロボ電球である。
光学的集成装置において、検出器は特にカメラ型検出器、より特に線走査カメラ、CCDカメラまたはICCDカメラである。
【００８８】
必要に応じて、光学的集成装置は放射光を収束する手段、例えば、レンズを含んでなる。
プロセシングされる材料上に照明光を発射し、前記材料から放射された光を検出器に発射する手段は、ファイバーオプティクス、鏡、レンズ、ビームスプリッタおよびその他の1または2以上を包含する。
【００８９】
光学的集成装置は、照明光および／または放射光を濾過する少なくとも1つの濾過装置を含む。特定の態様において、この装置は帯域通過フィルタまたは格子モノクロメータである。1つの態様において、放射光のみを濾過しかつ放射光が1または2以上のフィルタを通過した後、1または2以上の検出器に到達するように、1または2以上の濾過装置は位置決定されている。他の態様において、照明光および放射光の両方を濾過するように、少なくとも2つの濾過装置が位置決定されている。最も好ましいフィルタは、特定の蛍光マーカーについて前述した、波長を選択するフィルタである。2つの検出器を使用する場合、光学的集成装置は少なくとも1つのビームスプリッタ、例えば、二色鏡をまた含む。
【００９０】
最も特定の態様において、光学的集成装置は、第1図に描写するように、ストロボスコープ光源、2つのCCDカメラ検出器、照明光を濾過する1つの帯域通過フィルタ、放射光を濾過する2つの帯域通過フィルタ、レンズおよび2つの二色鏡ビームスプリッタを含む。
1つ特定の態様において、発射手段はチャンバー中の開口を通してチャンバー中でプロセシングされている材料の部分上に照明光を発射し、チャンバー中のこの材料から放射された光を検出器に投射する手段を含む。
【００９１】
いっそう特定の態様において、造粒装置はチャンバーから粒体のパージ流を提供する手段をさらに含んでなる。この場合において、光学的集成装置はチャンバーの中に存在する材料よりむしろパージ流中の材料の蛍光分析を可能とするように位置決定されている。この態様が好ましい1つ理由は、造粒プロセスが通常造粒装置のかなりの摩耗および引裂きを含むことである。生物活性化合物、例えば、酵素を造粒するとき、いくつかの補助的造粒剤は粘土または他の無機物質であることができる。
【００９２】
これらの物質は造粒装置に対して有意な研磨作用を有することができる。したがって、造粒装置の内部表面が1年当たり数ミリメートルの鋼が研磨されることを観測することは通常のことである。この大きさの摩耗および引裂きは、光学的集成装置の感受性装置に対して非常に有害であることがある。パージ流中の粒体は適当に再循環させることができ、この方法において、蛍光分析は造粒プロセスを妨害しない。パージ流は粒体が適当にパージ流の一部分を通過するようにさせて光に対して透明とし、ここで光を投射することができる。1例として、パージ流は造粒チャンバーから、輸送システムを通して、光学的集成装置に輸送することができる。
【００９３】
輸送システムは、例えば、シュート、パイプ、コンベヤベルト、サイクロンおよびその他から選択される1または2以上の要素であることができる。蛍光分析は輸送システムのある点において実施することができ、ここで造粒生成物は照明光によりアクセスすることができ、この点から放射光は1または2以上の検出器に到達することができる。例えば、このような点は、例えば、パイプ材料の一部分を輸送材料、例えば、ガラス、石英またはポリマー材料で置換された点であることができる。
【００９４】
特に、蛍光分析を実施する点において、パージ流を提供する手段は粒体の単一層を形成する手段を含み、こうして粒体からの検出において、検出の瞬間に互いに重なる、オーバーラップがほとんどあるいはまったく起こらないようにする。これは造粒生成物を傾斜した (非水平) 振動する表面 (例えば、振動するシュート) 上に載せることによって達成することができ、ここで表面積、粒体の負荷速度、および振動表面上の輸送速度 (傾斜角度) を調節して、震蘯表面積が表面上に存在する粒体の面積よりも常に大きいようにする。
【００９５】
このようにして、粒体は表面上を輸送される粒体の実質的に単一 (モノ) 層を形成するであろう。蛍光分析はこの単一粒体層の任意の場所で実施することができる。特に、また、振動表面の1または2以上のへり上に落下する (滝に匹敵する) とき、粒体が単一層として振動表面を去ることができ、そして振動表面からの反射を回避するために、特に振動表面を粒体が去った後であるが、単一粒体層が維持されている、ある点において蛍光分析を実施する。
【００９６】
単一粒体層を形成する粒体について測定することによって、オーバーラップを回避し、粒体は主として二次元においてのみ分布するので、粒体から放射された光はいっそう正確に収束させることができる。このようにして、二次元検出器、例えば、CCDカメラにより、蛍光分析点を通過するほとんどすべての個々の粒体の鋭く収束された像を得ることができる。
【００９７】
上に示したように、粒体組成物のオンラインまたはアットラインの蛍光分析を可能とするように、光学的集成装置を造粒またはコーティング装置に適当に接続する。オンライン分析は、粒体が実際に造粒されているとき、例えば、造粒装置または再循環パージ流中の粒体を分析することによって、粒体について実施される分析として理解すべきである。アットライン分析は、造粒プロセス後に下流 (例えば、出口) でまたは造粒間に造粒装置から採取した非再循環試料について実施される分析として理解すべきである。
【００９８】
造粒装置は他の要素、検出器からのデータを処理する計算単位装置を含んでなることができ、必要に応じて特殊化データ取扱いハードウェアおよびソフトウェアを装備する。また、造粒装置は、蛍光分析の結果に基づいて造粒プロセスをコントロールし、調節する計算単位装置に結合したコントロール単位装置を含んでなることができる。コントロール単位装置は、計算単位装置からデータを受け取り、造粒プロセス、例えば、供給の流れ、速度、温度、空気流およびその他に影響を及ぼす1または2以上のハードウェア装置をコントロールする出力に、これらのデータを変換する、PLCまたは他の装置であることができる。
本発明を実施する手法を下記の実施例において証明する。実験は本発明の1態様の単なる実施例であり、本発明を限定するものと解釈すべきでない。
【００９９】
実施例
実施例1．酵素粒体を製造する原料についての蛍光分析
酵素粒体および酵素濃厚物の8つの異なる原料の蛍光をLS50B (Perkin Elmer) で測定した。原料を230〜500 nmの異なる波長の内部光源で10 nmのステップで励起させ、材料からの放射を270〜700 nmにおいて1 nmのステップで記録した。励起および放射の両方についてパーキン・エルマー (Perkin Elmer) 計器のスリットギャップは4 nmであった。材料を石英容器 (クベット) の中に入れ、計器設計により要求されるように照明光の方向から22.5度変位した角度で原料からの蛍光放射を測定することによって、蛍光を測定した。
いくつかの原料は有意に蛍光を放射したが、酵素濃厚物は約350 nmにおいて非常に強い放射を独特に有した。
【０１００】
実施例2．酵素粒体の蛍光分析
コーティングしない酵素粒体およびコーティングした粒体の蛍光をLS50B (Perkin Elmer) で測定した。粒体を230〜500 nmの異なる波長の内部光源で10 nmのステップで励起させ、材料からの放射を270〜700 nmにおいて1 nmのステップで記録した。励起および放射の両方についてパーキン・エルマー (Perkin Elmer) 計器のスリットギャップは4 nmであった。材料を石英容器 (クベット) の中に入れ、計器設計により要求されるように照明光の方向から22.5度変位した角度で原料からの蛍光放射を測定することによって、蛍光を測定した。
結果は酵素濃厚物に対応する約350 nmのピークを示した。造粒補助剤の中の蛍光性化合物のために、他の強いピークが450〜500 nmにおいて発生した。結果は粒体中の酵素の検出の可能性を示す。
【０１０１】
実施例3．粒体のオンライン蛍光分析
第1図に示す光学的集成装置を使用して、コーティングしない酵素粒体およびコーティングした粒体の蛍光を測定した。試料導入点にCCIR追加の35 mmレンズを装備した、ドンピシャ (Donpisha) 型「プログレッシブ・カメラ・モジュール」XC−8500CE 1/2" ITCCD 782 (H) × 582 (V) の2台のカメラ検出器を使用した。光源はオリエル(Oriel) キセノン・フラッシュ・ランプ60000/w オリエル・アタッチメント60008およびオリエル・パワー・サプライ68826であった。帯域通過フィルタを使用して照明光を濾過して、波長450 nmの光ビームを生成した。カメラに到達前に、放射光を二色鏡ビームスプリッタにより二本のビームに分割し、各ビームを帯域通過フィルタにより濾過した。一方のフィルタ (緑色フィルタ) は波長530 nmの光を通過させ、他方のフィルタ (赤色フィルタ) は波長620 nmの光を通過させた。
【０１０２】
粒体を通過させる比率の出口を有する漏斗の中に酵素粒体を充填し、漏斗出口直後に漏斗を去る粒体について分析を実施することによって、照明および放射光の検出を実施した。
データ獲得ハードウェアDAQおよびSCR−68ブレッドボードおよび像処理ソフトウェア、Labview 4.1.1 IMAQビジョンおよび万能Labview (すべてNational Instrumentsから) を装備した計算単位装置 (通常のパーソナル・コンピュータ) に、検出器からの信号を転送して、照明光ビームを通過させる蛍光粒体の瞬間的ディジタル像を生成した。
【０１０３】
これらの測定により、１系列の像が得られ、これらを記録し、動画として再生することができた。コーティングしない粒体は輝いて蛍光を放射し、ここで粒体の形態および形状は明瞭に描写され、こうして酵素粒体の製造において蛍光分析を使用する可能性が証明された。コーティングされた粒体について、蛍光は有意に減少し、コーティング層が蛍光マーカーへのアクセスを減少することが示された。こうして、記録のより暗い区域はより厚いコーティングを有する粒体を示し、こうしてコーティングされた粒体の製造において蛍光分析を使用する可能性が証明された。
【０１０４】
実施例4．酵素濃度が変化する酵素粒体の蛍光分析
生物活性化合物がまた蛍光マーカーであることができるかどうかを評価するために、実験を実施した。精製されたプロテアーゼ濃厚物の含量が変化する4つのバッチをレジゲ (Loedige) ミキサーにより作った。プロテアーゼの含量は、それぞれ、0 (参照)、1、4および12 KPNUであった。ここでKPNUはキロNOVOプロテアーゼ単位であり、これはプロテアーゼ標準に対して相対的に決定され、この決定は標準的条件、すなわち、50 ℃、pH 8.3、9分の反応時間、3分の測定時間において、ジメチルカゼイン (DMC) 溶液のタンパク質分解酵素による消化に基づく。
【０１０５】
試料をオリエル(Oriel) キセノン・フラッシュ・ランプ60000/w オリエル・アタッチメント60008およびオリエル・パワー・サプライ68826で励起させた。帯域通過フィルタを使用して照明光を濾過して、波長300〜400 nmの光ビームを生成した。放射光を3−CCDカメラ (JAI) (M−90) で検出した。カメラにコンピュータ55 Telecentricレンズを取り付けた。IFC51フレーム・グラッバーおよびImage−Pro Plusバージョン4.5を装備した計算単位装置 (通常のパーソナル・コンピュータ) に、検出器からの信号を転送した。
【０１０６】
粒体の記録した蛍光像は、精製されたプロテアーゼの増加する濃度の関数として、放射光の平均強度が有意に増加することを示した。
引き続いてカオリンおよび二酸化チタンを含有する標準的PEG−コーティング (PEG 4000) で、粒体の4つのバッチをコーティングした。コーティングされた粒体の記録された蛍光像は、事実、精製されたプロテアーゼの増加する濃度の関数として、放射光の平均強度が有意に増加することを示した。
これにより示されるように、この実験においてプロテアーゼである生物活性化合物は、また、蛍光マーカーであることができる。
【０１０７】
実施例5．コーティングの厚さが変化する酵素粒体の蛍光分析
コーティングの厚さと放射光の強度との間に相関が存在かどうかを研究するために、実験を実施した。カオリンおよび二酸化チタンを含有する標準的PEG−コーティング (PEG 4000) で、酵素を含有する粒体の標準的バッチをコーティングした。コーティングを粒体 (Huettlin) 上に噴霧し、それぞれ10％、25％および50％のコーティングが投与されたとき、粒体の試料をプロセスから抜き取った。
【０１０８】
試料をオリエル(Oriel) キセノン・フラッシュ・ランプ60000/w オリエル・アタッチメント60008およびオリエル・パワー・サプライ68826で励起させた。帯域通過フィルタを使用して照明光を濾過して、波長300〜400 nmの光ビームを生成した。放射光を3−CCDカメラ (JAI) (M−90) で検出した。カメラにコンピュータ55 Telecentricレンズを取り付けた。IFC51フレーム・グラッバーおよびImage−Pro Plusバージョン4.5を装備した計算単位装置 (通常のパーソナル・コンピュータ) に、検出器からの信号を転送した。
【０１０９】
コーティングされた粒体の記録された蛍光像は、事実、コーティングの濃度が増加する (すなわち、コーティングの投与量が10％、25％および50％となる) とき、放射光の平均強度が減少することを示した。
これにより示されるように、蛍光放射光の強度を使用してコーティングの厚さを予測することができる。
【０１１０】
実施例6．酵素活性ダストの量が変化する酵素粒体の蛍光分析
蛍光分析を使用してダスト量を予測できるかどうかを評価するために、実験を実施した。推測的に、コーティングの中に傷を有するコーティングされた酵素粒体は酵素活性ダストの問題に導くことが知られている。
29 ng／g〜2420 ng／gのプロテアーゼ／gのダストのプロテアーゼ活性ダスト値を有する8つの試料をオンライン蛍光分析に付した。
【０１１１】
試料をオリエル(Oriel) キセノン・フラッシュ・ランプ60000/w オリエル・アタッチメント60008およびオリエル・パワー・サプライ68826で励起させた。帯域通過フィルタを使用して照明光を濾過して、波長300〜400 nmの光ビームを生成した。放射光を3−CCDカメラ (JAI) (M−90) で検出した。カメラにコンピュータ55 Telecentricレンズを取り付けた。IFC51フレーム・グラッバーおよびImage−Pro Plusバージョン4.5を装備した計算単位装置 (通常のパーソナル・コンピュータ) に、検出器からの信号を転送した。
【０１１２】
試料を結像システムにほぼ10 cmの距離で運搬した。
粒体組成物の記録された蛍光像は、事実、プロテアーゼ活性ダスト値の量が増加する組成物について、放射光の平均強度が増加することを示した。
これにより示されるように、蛍光放射光の強度を使用して粒体組成物中の生物活性ダストの量を推定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  第1図：光学的集成装置の1例、ここで1＝検出器 (CCDカメラ)、2＝光源、3＝帯域通過フィルタ、4＝二色鏡ビームスプリッタ、5＝レンズ、6＝漏斗、7＝照明光ビームを通過する蛍光粒体。
【図２】  第2図：オンライン光学的集成装置の1例、1＝CCDカメラにより記録される粒体から放射された光を示す描写、2＝CCDカメラ、3＝光源、4＝コンベヤベルト上の粒体。
【図１】
0004198996.tif 000002
【図２】
0004198996.tif 000003