(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光体標識した核酸断片を塩基長に応じて分離する手段と、
前記蛍光体標識した核酸断片から生じる蛍光を蛍光強度波形データとして検出する検出手段と、
複数の既知塩基配列の複数の蛍光強度波形データセットの各々について、最大の蛍光強度を有する塩基種の信号強度により全てのピーク位置での正規化処理を行い、前記全てのピーク位置での信号値の平均値及び標準偏差を対応する塩基毎に算出し統計処理情報として格納するデータ格納手段と、
前記検出する手段が検出した前記蛍光強度波形データと前記データ格納手段に格納された前記統計処理情報とを比較する蛍光強度波形データ比較手段と、
前記蛍光強度波形データ比較手段の比較結果に応じて前記蛍光体標識した核酸断片の塩基配列を判定する塩基配列判定手段とを有することを特徴とする核酸塩基配列決定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸試料から得られる蛍光強度波形データを解釈して塩基配列を決定する核酸塩基配列決定装置および検査システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトの遺伝情報（ヒトゲノム）を解読するための研究が世界中で盛んに行われており、これに伴いヒトの様々な疾患が核酸（ＤＮＡ）塩基配列の変異に起因することが解明されつつある。個人間においては、その身体的特徴が異なるのと同様に核酸塩基配列も多くの部位で異なっており、この違いは多型と呼ばれている。多型は、ある塩基の変化が人口中１％以上の頻度で存在しているものと定義されており、一つの塩基が他の塩基に置き換わっているもの（Single  Nucleotide  Polymorphisms：ＳＮＰｓ）や、１〜数十塩基が欠失していたり挿入されているもの、２塩基から数十塩基の遺伝配列が繰り返している部位の繰り返し回数が個人間で異なっているもの等がある。
【０００３】
ヒトゲノム３０億塩基中では、５００塩基〜１０００塩基に一カ所位の割合で変異が存在していると推測されており、３００万個以上の一塩基変異対（ＳＮＰｓ）があると考えられている。このようなＳＮＰｓ等を指標とする遺伝子診断（ＤＮＡマーカー）法は、疾患遺伝子の探索や疾患感受性の判断、および医薬品の開発（テーラーメイド医療）等で、その利用が期待されている。
【０００４】
現在、このような多型を低コストかつ容易に検出する方法が多数開発されているが、何れの方法も核酸断片の大きさを比較して間接的に変異を知る方法であるため、最終的な確認として信頼度が高く変異部位を直接検出できる塩基配列決定を行う場合が多い。従来、この塩基配列を決定するため、核酸断片への蛍光標識技術および高感度の蛍光検出技術、そして高解像度のゲル電気泳動技術を組み合わせたＤＮＡシーケンシング法が広く用いられてきた。
【０００５】
上記ＤＮＡシーケンシング法では、まず初めに塩基配列を知りたいＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ）を用意する。通常、未知の配列を持ったＤＮＡをプラスミド（細菌等の細胞内にある核以外の細胞質中のＤＮＡで、主に複製開始情報のみを有する）に組み込んだものか、ポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）法で塩基配列を直接増幅した核酸断片を用いる。つぎに、テンプレートＤＮＡとプライマー（テンプレートＤＮＡの特定部分の配列と相補的な塩基配列を有するもので、ＰＣＲ法を用いた場合は反応で利用した片側のものに相当する）を試験管内の溶液中で混合し、温度をコントロールすることでプライマーとテンプレートが相補的な二本鎖を形成するようにする（アニーリング）。
【０００６】
さらにこのプライマーを起点としてＤＮＡを複製する過程に進む。この複製はＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる酵素を触媒として行われる。この反応液中にはＤＮＡの合成に必要なｄＮＴＰ（deoxy  nucleotide  triphosphate）すなわち各種塩基であるアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）（もしくはウラシル（Ｕ））のモノマーと、４種類のｄｄＮＴＰ（dideoxy  nucleotide  triphosphate）すなわちＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔ（もしくはＵ）のターミネーターを所定の割合で混合し、所定の濃度で入れておく。このようにするとＤＮＡが合成されていくとき、ｄｄＮＴＰが取り込まれることでＤＮＡの合成がそれ以上進まなくなる。
【０００７】
ここで、ｄｄＮＴＰにそれぞれの塩基に応じて色の異なる蛍光色素を標識しておくと、末端にｄｄＮＴＰを持つ様々な長さ（塩基長）で合成が停止した核酸断片が生成され、各断片はその末端塩基に応じた蛍光色で標識されることになる。このようにしてできた核酸断片を含む溶液を濃縮精製した後、一本鎖に変性し、ゲル電気泳動装置を用いて塩基長毎に核酸断片を分離する。
【０００８】
以下では、前記ゲル電気泳動装置の一例としてキャピラリ泳動装置を用いた場合について説明する。まず、粘性のある高分子ポリマーをキャピラリ（ガラス細管）に充填しておき、その両端に電圧を印加することにより、負の電荷を有する核酸断片をキャピラリの片側から導入・泳動させる。
【０００９】
核酸断片は鎖状の重合体高分子であるため、ポリマー中を分子量に反比例した速度で移動する。すなわち短い（分子量が小さい）核酸断片ほど速く、長い（分子量が大きい）核酸断片ほどゆっくり移動するため、塩基長毎に核酸断片を分離することができる。そしてキャピラリの終端付近（各核酸断片を１塩基の長さの差異で分離可能となった位置）で核酸断片にレーザを照射し、各断片末端塩基から発生する蛍光を検出器により測定する。前記のとおり、短い核酸断片から順番に蛍光を発生していくので、４塩基種毎の蛍光強度曲線が得られ、各ピーク位置での４種類の蛍光強度等を比較することにより塩基種（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ（Ｕ））の配列決定を可能としていた。
【００１０】
図２は、蛍光強度波形データの例２ａと、それを解釈して決定される塩基配列の例２ｂである。図の縦軸は蛍光強度を表し、横軸は泳動時間を表している。また、実際には１度の計測で数百塩基分のデータが得られるが、ここでは説明のためにその一部を示している。
【００１１】
蛍光強度波形データ２ａに現れるピークの高さは、ある長さの核酸断片の量を反映したものである。通常、長い核酸断片ほど泳動時間が遅いところにピークが現れ、ピーク間隔は核酸断片が長くなるにつれて大きくなる傾向がある。そこで、表示の時間軸が塩基長に比例するように、泳動電圧等の泳動条件で決まるパラメータを用いて補正する場合もある。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
前述した従来技術による核酸塩基配列決定方法では、しばしば塩基配列の決定が困難な蛍光強度波形が得られる場合があった。その原因としては、（ａ）核酸断片の量が少なく信号強度が弱い、（ｂ）核酸断片が自分自身で２次構造をとり、余分な信号成分が発生する、（ｃ）塩基配列を決定すべき核酸試料の精製度が低いため余分な信号成分となる核酸断片が生成される、あるいは（ｄ）シーケンス反応時や電気泳動時の条件によって信号に歪みが生じる、などが考えられる。
【００１３】
一般にこれらの問題に対しては、塩基配列を決定すべき核酸試料に対して相補な塩基配列を持つ核酸の塩基配列を決定し、互いに相補な２つの塩基配列を照らし合わせることにより解決できる場合が多い。しかし、この方法は２つの試料を用意して塩基配列を２回決定しなければならず、２倍の労力を必要とする。しかも、試料によっては互いに相補な二つの塩基配列データが得られない場合もある。
【００１４】
以上の問題点は、全くの未知塩基配列を解読しようとする場合にしばしば問題となる。しかし、実際の核酸試料の塩基配列決定では、ある特定部位における塩基の変異を調べる場合のように、塩基配列を決定すべき核酸試料の塩基配列の少なくとも一部が既知である場合も少なくない。このような参照できる既知の塩基配列が存在する場合、既知の塩基配列を何らかの方法により参照して、核酸断片検出データの解釈がなされている。すなわち、既知の蛍光強度波形とその塩基配列（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔという塩基種の文字の並び）を用意し、新規に取得した核酸断片の蛍光強度波形と比較検討することにより、塩基配列を決定することができる。
【００１５】
しかし上記の比較参照は核酸断片の蛍光強度波形と既知の蛍光強度波形および塩基配列を目視で比較参照する必要があり、労力がかかるばかりでなく、比較基準が明確でない場合には判定者によって異なる決定が下されるという問題が生じていた。
【００１６】
さらに、計測毎にシーケンス反応や電気泳動時の条件が変化し、信号に異なる歪みが生じている場合、参照比較する蛍光強度波形が一例だけでは判定すること自体が困難となる問題があった。また、複数の蛍光強度波形例を同時に比較検討する場合には、限られたスペースに多くの波形を表示するため比較が困難となる問題、あるいは比較基準の冗長性が増すといった問題が生じていた。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明では上記課題を解決するため、核酸試料をもとに核酸断片を調製する手段と、調製した核酸断片を塩基長毎に分離し、蛍光体で標識する手段と、蛍光体標識した核酸断片を電気泳動して蛍光強度波形データを検出する手段と、検出した蛍光強度波形データを解釈して前記核酸断片の塩基配列を決定する手段を有する核酸塩基配列決定装置において、前記塩基配列を決定する手段は、塩基配列が既知である複数の蛍光強度波形データを統計処理して得られた情報を格納する機能と、上記統計処理して得られた情報と前記検出した蛍光強度波形データとを比較することにより塩基配列を決定する機能とを持たせた。
【００１８】
【発明の実施の形態】
図３に、本発明が適用される核酸塩基配列決定装置の構成例を示す。この装置は、蛍光標識した核酸断片群を電気泳動し、塩基長の違いにより分離する核酸断片分離部３ａ、分離した核酸断片にレーザを照射する光学機器や発生する蛍光を検出する検出器等からなる蛍光信号計測部３ｂ、計測した蛍光強度波形データを信号処理し塩基配列の決定等を行う蛍光信号処理部３ｃ、蛍光強度波形データおよび決定した塩基配列等の表示を行うデータ表示部３ｄ、蛍光強度波形データおよび決定した塩基配列等の記録を行うデータ格納部３ｅ、上記の各部を制御する装置制御部３ｆからなる。
【００１９】
ここで、上記制御部３ｆは核酸断片分離部３ａの電源の制御や、蛍光信号計測部３ｂの光源制御と検出器のサンプリング条件の制御、蛍光信号処理部３ｃとデータ表示部３ｄおよびデータ格納部３ｅ間のデータ転送の制御、および蛍光信号処理部３ｃにおけるデータ処理内容の制御等を行う。
【００２０】
上記図３の装置を用いて塩基配列を決定するためには、まず従来の技術で述べた方法と同様に、上記核酸断片分離部３ａにおいてサンガー法等を用いて塩基配列を決定すべき核酸試料をもとに様々な長さの核酸断片群を調製する。反応には、蛍光色素により標識したプライマー、または蛍光色素により標識したｄｄＮＴＰを用い、核酸断片群に蛍光色素を標識する。
【００２１】
つぎに標識された核酸断片群に対し、上記蛍光信号処理部３ｃにおいて以下のような処理を行い、塩基配列の決定を行う。通常、図４に示すように、上記蛍光信号処理部３ｃにおいて、核酸断片の蛍光強度波形データ４ａに対するスムージング処理４ｂや、バックグラウンド補正４ｃ、ピークの検出４ｄおよびピーク間隔の決定４ｅを行う。また、電気泳動時の泳動むら（スマイリング）によりピーク間隔は常に一定になるとは限らないため、得られたピーク間隔の大きさから必要に応じてピーク位置の補正（スマイリング補正４ｆ）を行う。つぎに、各ピーク位置での各塩基種の信号強度（あるいは各ピークの面積等）を比較して、所定の同定基準に従い塩基種を順次決定する（塩基配列の（仮）決定４ｇ）。
【００２２】
この同定基準の例としては、あるピーク位置においてある塩基種（例えばＡ）の信号強度が一番大きく、残る３つの塩基種の中で最も大きな塩基種（例えばＣ）の信号強度が最大塩基種（ここではＡ）の信号値のＴ％未満であった場合（Ｔは閾値、例えば５０％）、最大塩基種（ここではＡ）として同定する。また、二番目の塩基種（ここではＣ）がＴ％（例えば５０％）以上であり、かつ三番目の塩基種（例えばＧ）の強度が最大塩基種（ここではＡ）の信号値のＴ％（例えば５０％）未満であった場合、最大塩基種（ここではＡ）と二番目の塩基種（ここではＣ）のヘテロ（ここではＭ：ＩＵＢ規格の混合塩基表示法）として決定される。同様にして全ての組み合わせに応じて混合塩基の表示方法（ＩＵＢ規格の混合塩基表示法）が決められているが、その判定基準には明確な基準は示されていない。
【００２３】
上記の核酸塩基配列決定方法では、前述したとおり様々な原因によって塩基配列の決定が困難な蛍光強度波形が得られる場合があり、特に全く未知の塩基配列を解読しようとする場合にしばしば問題となる。しかし、実際の核酸試料の塩基配列決定では、ある特定部位における塩基の変異を調べる場合のように、塩基配列を決定すべき核酸試料の塩基配列の少なくとも一部が既知である場合も多い。このような参照できる既知の塩基配列が複数存在する場合、塩基配列が既知である複数の蛍光強度波形データを統計処理して得られた情報を参照して核酸断片検出データの解釈を行う機能を、上記蛍光信号処理部３ｃに行わせることができる。
【００２４】
以下、上記統計処理の具体的な処理内容、および得られた統計情報を用いて新規データの塩基配列を決定する処理内容について、図５および図１を用いて説明する。
【００２５】
まず、特定範囲の塩基配列が既知である複数の蛍光強度波形データセット（４塩基種分の蛍光強度波形データを１セットとする）と、同定された各データセットの塩基配列を用意する（５ａ）。なお、塩基配列が既知である複数の蛍光強度波形データを得る際には、前述した互いに相補な核酸試料に対して両者の塩基配列を決定する方法等を用いる。
【００２６】
つぎに、各々の蛍光強度波形データセットに対して、全ピーク位置において、最大の蛍光強度を有する塩基種の信号強度により正規化処理５ｂを行う。例えば、あるピーク位置（例えば、ピーク番号ｎ）における４塩基種の蛍光強度を、Ａ0(ｎ)，Ｃ0(ｎ)，Ｇ0(ｎ)，Ｔ0(ｎ)(もしくはＵ0(ｎ))とした場合、正規化後の値Ａ(ｎ)，Ｃ(ｎ)，Ｇ(ｎ)，Ｔ(ｎ)(もしくはＵ(ｎ))は、それぞれ数１〜数４で算出される。
【００２７】
【数１】
0004103315.tif 000002
【００２８】
【数２】
0004103315.tif 000003
【００２９】
【数３】
0004103315.tif 000004
【００３０】
【数４】
0004103315.tif 000005
【００３１】
ここで、ｍａｘ｛Ａ0(ｎ)，Ｃ0(ｎ)，Ｇ0(ｎ)，Ｔ0(ｎ)(ｏｒＵ0(ｎ))｝は、Ａ0(ｎ)，Ｃ0(ｎ)，Ｇ0(ｎ)，Ｔ0(ｎ)(もしくはＵ0(ｎ))のうちの最大値をとる関数である。なお、ピーク位置の信号値だけではなく、ピークを形成するピーク位置前後の全ての信号値を、上記ｍａｘ｛Ａ0(ｎ)，Ｃ0(ｎ)，Ｇ0(ｎ)，Ｔ0(ｎ)(ｏｒＵ0(ｎ))｝で正規化することにより、ピーク全体の正規化を行っておくこともできる。また、正規化を行う際の分母として上記最大ピーク強度の代わりに最大ピーク面積を用いても構わない。また、異なる試料のデータセット毎にピーク位置が少しずつ異なっている場合には、上記正規化処理を行う前に、各蛍光強度波形のピーク位置がデータセット間で揃うように、全ピーク間隔を等間隔にする補間データ処理や間引きデータ処理等を行っておいてもよい。
【００３２】
つぎに、正規化処理後の複数の蛍光強度波形データセットに対して、各ピーク点（あるいは各サンプリング位置）における信号値の平均値Ｍおよび標準偏差Ｓを、同定された塩基毎に算出する。例えば、あるピーク位置（例えばピーク番号ｎ）において、そのピーク位置の塩基種が少なくともＡを含むこと（Ａのみ、Ａのホモ、Ａと他の塩基種とのヘテロのいずれかの場合）が既に分かっているＡの蛍光強度波形データがｍ試料分(Ａ１(ｎ)，Ａ２(ｎ)，…，Ａｍ(ｎ))ある場合（５ｃ〜５ｅ）、ピーク番号ｎにおける塩基種Ａの蛍光強度の平均値ＭＡ（ｎ）および標準偏差ＳＡ（ｎ）は、それぞれ下記数５または数６で算出される（５ｆ）。
【００３３】
【数５】
0004103315.tif 000006
【００３４】
【数６】
0004103315.tif 000007
【００３５】
同様にして残るＣ，Ｇ，Ｔ（もしくはＵ）に対しても、あるピーク位置（ピーク番号ｎ）の塩基種が、少なくともそれぞれの塩基種を含むことが既に分かっている各々の蛍光強度波形データについて、平均値ＭＣ（ｎ），ＭＧ（ｎ），ＭＴ（ｎ）（もしくはＭＵ（ｎ））、および標準偏差ＳＣ（ｎ），ＳＧ（ｎ），ＳＴ（ｎ）（もしくはＳＵ（ｎ））を算出する（５ｈ〜５ｉ，５ｋ〜５ｌ，５ｎ〜５ｏ）。
【００３６】
ただし、あるピーク位置（ピーク番号ｎ）における既知の塩基種が１種類しかない場合（既知の多型がない場合）や２種類の多型がある場合、および３種類の多型が知られている場合には、それぞれ既知の塩基種に関してのみ上記平均および標準偏差の算出を行えばよい。なお、既知の塩基種の波形データがない場合には、既知でないことを示すために、その平均値および標準偏差にゼロ等を代入しておいてもよいし（５ｇ，５ｊ，５ｍ，５ｐ）、他の塩基種に同定されている全てのデータセットにおいて、その塩基種の蛍光強度の平均値および標準偏差を算出して代入しておいてもよい。
【００３７】
上記一連の手順と同様にして、全てのピーク位置における平均値および標準偏差を順次算出し、算出結果をデータ格納部３ｅに記録しておく（５ｑ〜５ｓ）。
【００３８】
つぎに、このようにして得られた平均値および標準偏差を用いて、新規に取得した蛍光強度波形の塩基配列決定を行う方法について説明する。
【００３９】
図１は、塩基配列の決定が困難な部位（１ｄ）を含む正規化処理（図４の４ｈ）後の蛍光強度波形データ１ａ（ピーク全体の正規化を行ったもの）と、上述した従来の同定基準（例えば、閾値Ｔ＝５０％）により仮決定（４ｇ）した塩基配列１ｂと、既知の塩基配列に対し塩基配列１ｂとのホモロジー検索（４ｉ）を行い、ホモロジー（相同性）が高い塩基配列の部分１ｃと、塩基配列１ｃに同定された複数の蛍光強度波形データから算出した平均値および標準偏差を箱ひげ図１ｅ，１ｆ（図６参照）により示したものである。なお、上記ホモロジー検索の操作は、表示画面上において塩基配列１ｂに対し既知の塩基配列データを１塩基ずつマニュアル操作でシフトして行ってもよいし、既に一般に知られているホモロジー解析アルゴリズムを利用して自動的に行ってもよい。
【００４０】
図１の箱ひげ図では、平均値と標準偏差の３倍値の和（例えば、ＭＡ（ｎ）＋３×ＳＡ（（ｎ））を上限値、平均値と標準偏差の３倍値の差（例えば、ＭＡ（ｎ）−３×ＳＡ（（ｎ））を下限値としている。図１の１ｄの部位では、塩基Ａと塩基Ｃの波形上に箱ひげ図が表示されており、これは１ｄの部位において塩基種Ａと同定された既知のデータと、塩基種Ｃと同定された既知のデータが存在することを示している。ここで、塩基Ｇおよび塩基Ｔ（もしくはＵ）は、既知データがない、すなわち平均値と標準偏差がゼロであるため、箱ひげ図を表示していない。
【００４１】
そして図１では、新規に取得した蛍光強度波形１ａにおいて、部位１ｄにおける塩基種Ａを示す蛍光の信号量が上記箱ひげ図１ｅの示す上限値と下限値の間にあり、かつ塩基種Ｃを示す蛍光の信号量が上記箱ひげ図１ｆの示す上限値と下限値の間にあるため、この未知の塩基種をＡとＣのヘテロ（ＩＵＢ規格の混合塩基表示法ではＭ）と同定でき（４ｊ）、決定配列１ｇを得ることができる（４ｋ）。
【００４２】
なお、塩基種を同定する際には「蛍光信号量が上限値と下限値の間にある」という上記判定条件にしたがって上記蛍光信号処理部３ｃが自動的に決定する機能を実行しても構わないし、上記蛍光信号処理部３ｃに操作者がマニュアル操作で塩基種をＶからＭに書き換える操作を行える機能を持たせてもよい。
【００４３】
同様にして、順次、未知の塩基種を同定したのち、決定した塩基配列をデータ格納部３ｅに記録する。このようにして、上記一連の機能を有する核酸塩基配列決定装置を用いて核酸塩基配列の決定を行うことにより、決定精度の高い塩基配列を取得することが可能となる。
【００４４】
なお上記の例では、ある塩基種の蛍光信号量が箱ひげ図の上限値と下限値の間にあるときに自動的に前記塩基種と同定する場合について説明したが、蛍光信号量が箱ひげ図の上限値以上の場合にも前記塩基種と同定しても構わない。
【００４５】
また上記の例では、従来の同定基準により仮決定した塩基配列において、従来の同定基準では決定が困難な部位に対してのみ、上記統計処理結果を参照して配列決定を行う場合について説明したが、塩基配列が既知であるプライマー以降の全ての部位において、上記統計処理結果を参照して配列決定を行うことも可能である。
【００４６】
また上記の例では、箱ひげ図を用いて各ピーク位置の上限値と下限値を表示していたが、図７に示すように、全塩基種の全サンプリング点において上限値と下限値を示してもよい。ここで、図の７ａ〜７ｄは上限値を示す曲線、７ｅ〜７ｈは下限値を示す曲線である。この場合、同定された既知データがない塩基種に関しては、他の塩基種に同定されている全てのデータセットにおいて該当塩基種の蛍光強度に対して統計処理を行った結果を用いてもよい。
【００４７】
この図７の例では、ピーク位置７ｉにおいて、塩基種Ａを示す蛍光の信号量が７ａの示す上限値と７ｅの示す下限値の間にあり、かつ塩基種Ｃを示す蛍光の信号量が７ｂの示す上限値と７ｆの示す下限値の間にないため、この未知の塩基種をＡと同定できる。なおここで、ピーク位置７ｉの既知配列がＭ（ＡとＣのヘテロ）を示していることにより、このピーク位置において塩基種Ｇおよび塩基種Ｔの既知データがないことが分かる。
【００４８】
また上記の例では、４塩基の蛍光強度波形データを４つのグラフに個別に表示する場合について説明したが、塩基種毎に異なる色あるいは線種等を用いて、１つのグラフに重畳して表示してもよい。
【００４９】
また上記の例では、有効範囲の上限値と下限値を上記データ表示部３ｄに表示した後、配列決定を確認する場合について説明したが、このような上限値と下限値の表示や配列決定の確認を行わずに、上記データ処理部３ｃが自動的に有効範囲内にある塩基種を同定（自動決定）した後、決定した配列を上記データ格納部に格納してもよい。
【００５０】
また上記の例では、上記データ格納部３ｅに予め記録されていた蛍光強度波形データの統計処理結果（既存のデータベース）を用いる場合について説明したが、新規に計測した蛍光波形データに対して得られた処理結果を、自動的あるいはマニュアル操作によって前記データベースに追加・更新していく機能を上記データ処理部３ｃおよび上記データ格納部３ｅに行わせてもよい。
【００５１】
また上記の例では、有効範囲の上限値と下限値を既知データの平均値と標準偏差を用いて設定する例について説明したが、既知データの最大値を上限値、最小値を下限値として設定した場合にも同様の効果を得ることができる。また、既知データの上側α（例えばα＝１０）％点（データを大きさの順に並べたときに、上から数えてちょうどその割合（α％）にデータが分かれる点）を上限値、下側α％点（下から数えてその割合（α％）にデータが分かれる点）を下限値として用いた場合も、同等の効果を得ることができる。なお、上記平均値、標準偏差、最大値、最小値、上側α％点、および下側α％点を算出する際、外れ値（データの大部分が含まれるデータ値の区間からかけ離れた所に位置するデータ）を除外した後、計算を行ってもよい。
【００５２】
また上記の例では、上記蛍光信号計測部３ｂで得られたデータに、スムージング補正、バックグラウンド補正、スマイリング補正、ピーク間隔の補正、正規化補正等が加えられた補正結果に対して統計演算を行う場合について述べたが、上記の補正処理のいくつかを省いた処理結果に対して統計演算を行った場合、あるいは上記蛍光信号計測部３ｂで得られたデータそのものに対して上記統計演算を行ってもよい。
【００５３】
また上記の例では、一種類の核酸試料に対して、一つの核酸塩基配列測定装置上で同等のシーケンス処理および同等の泳動条件を用いて計測した蛍光強度波形データ群を用意して、それに対する統計処理結果を格納しておく場合について説明したが、異なる種類の核酸試料毎、異なる装置特性を有する核酸塩基配列測定装置毎、異なるシーケンス処理毎、異なる泳動条件毎に、塩基配列が既知である複数の蛍光強度波形データ群を用意し、それぞれに対する統計処理結果を格納しておくことにより、装置依存、処理依存、条件依存により発生する蛍光強度波形のばらつきを考慮したデータ解釈が可能となる。
【００５４】
また上記の例では、既知データの統計処理および処理結果の記録を行う機能、核酸断片を計測して蛍光強度波形データを取得する機能、前記統計処理結果と前記計測した蛍光強度波形データを比較して核酸塩基配列を決定する機能等を、一つの核酸塩基配列決定装置が備える例について述べたが、図８に示すように、核酸断片を計測して蛍光強度波形データを取得する機能と通信機能等を備えた検査クライアント８ａ（８ｂ）と、既知データの統計処理および処理結果の記録（８ｄ）を行う機能と、通信機能と、通信回線８ｅ経由で得られた前記検査クライアントの蛍光強度波形データと前記統計処理結果とを比較して核酸塩基配列を決定する機能等を備えた検査サーバ８ｃからなる核酸塩基配列検査システムを構成し、図９の詳細機能ブロック図にしたがって機能の分散を行ってもよい。
【００５５】
すなわち、検査クライアント８ａ（８ｂ）は、核酸塩基波形を測定する機能９ａ、判定依頼を行う塩基波形データの情報（核酸試料の種類、反応条件、泳動条件、プライマー名、データ名等）や判定依頼先等を入力する機能９ｂ、通信回線９ｄ（ネットワーク）を通じて検査サーバ８ｃと通信を行う機能９ｃにより、検査サーバ８ｃに測定した核酸塩基波形の配列判定を依頼することができる。
【００５６】
検査サーバ８ｃは、塩基配列が既知である複数の蛍光強度波形データを統計処理して得られた情報を記憶する機能９ｆ、塩基配列を同定する際の判定条件を記憶する機能９ｇ、通信機能９ｅを通じて受信した核酸塩基波形と前記統計処理結果とを比較し、かつ前記判定条件にしたがって塩基配列を判定する機能９ｈ、判定依頼元（検査クライアント名等）を送信先として設定したり、判定した塩基配列を出力として設定する機能９ｉにより、検査クライアント８ａ（８ｂ）に判定した塩基配列を返信したりすることができる。
【００５７】
なお検査クライアント８ａ（８ｂ）は、返信されてきた塩基配列を表示する機能９ｊ、返信されてきた塩基配列を記憶する機能９ｋ、測定した塩基波形を表示する機能９ｌ、測定した塩基波形を記憶する機能９ｍを有していてもよい。また、検査サーバ８ｃは、塩基配列が既知である複数の蛍光強度波形データを入力する機能９ｎ、既知の蛍光強度波形データを記憶する機能９ｏ、塩基配列が既知である複数の蛍光強度波形データに対して統計処理を行う機能９ｐを有していてもよい。
【００５８】
なお、図８に示した構成は一つの構成例であり、本発明の適用はこの構成に限定されるものではない。例えば、検査サーバは複数存在してもよいし、検査クライアントは３台以上、核酸塩基波形測定装置は４台以上存在してもよい。
【００５９】
また上記の例では、通信回線を用いて情報を伝達する場合について述べたが、フロッピーディスクや光ディスク等の記録媒体を用いて、情報の伝達を行ってもよい。
【００６０】
【発明の効果】
本発明によれば、核酸断片を測定して得られた蛍光強度波形データを解釈して、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（Ｕ）等の塩基配列を決定する際に、塩基配列が既知である複数の蛍光強度波形データを統計処理して得られた情報を参照してデータ解釈を行うことにより、塩基配列の決定精度を向上させることができる。
【００６１】
本発明の装置を用いて一塩基変異対（ＳＮＰｓ）等を指標とする遺伝子診断（ＤＮＡマーカー）を行うことにより、疾患遺伝子の探索や疾患感受性の判断あるいは医薬品の開発（テーラーメイド医療）等において、その判定精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による箱ひげ図を使用した塩基配列決定の説明図。
【図２】従来法における蛍光強度波形データと塩基配列の例を示す説明図。
【図３】塩基配列決定装置の構成例を示すブロック図。
【図４】本発明における塩基配列決定の手順図。
【図５】本発明による蛍光強度波形データに対する統計処理の手順図。
【図６】箱ひげ図の説明図。
【図７】本発明による上下限曲線を使用した塩基配列決定の説明図。
【図８】本発明による核酸塩基配列検査システムの構成例を示す概略図。
【図９】本発明による核酸塩基配列検査システムの詳細機能ブロック図。
【符号の説明】
１ｄ…配列決定の困難な部位、１ｅ…Ａ塩基の箱ひげ図、１ｆ…Ｃ塩基の箱ひげ図、７ａ…Ａ塩基の上限値を示す曲線、７ｂ…Ｃ塩基の上限値を示す曲線、７ｃ…Ｇ塩基の上限値を示す曲線、７ｄ…Ｔ塩基の上限値を示す曲線、７ｅ…Ａ塩基の下限値を示す曲線、７ｆ…Ｃ塩基の下限値を示す曲線、７ｇ…Ｇ塩基の下限値を示す曲線、７ｈ…Ｔ塩基の下限値を示す曲線。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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