(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
含硫複素環式化合物に、無機硫黄化合物または含硫アミノ酸による発現抑制を受けないプロモーターおよび含硫複素環式化合物の脱硫遺伝子を含む発現用組換えベクターを有するロドコッカス属に属する微生物またはその培養物を接触させて含硫複素環式化合物の脱硫を行う方法であって、脱硫する含硫複素環式化合物がジベンゾチオフェン又は4,6-ジメチルジベンゾチオフェンであり、無機硫黄化合物または含硫アミノ酸による発現抑制を受けないプロモーターがロドコッカス属に属する微生物の16SrRNAプロモーターであり、脱硫遺伝子がｄｓｃＡ，ｄｓｃＢ、ｄｓｃＣ及びｄｓｃＤであることを特徴とする、含硫複素環式化合物の脱硫方法。
【請求項２】
含硫複素環式化合物の脱硫を無機硫黄化合物または含硫アミノ酸の存在下で行うことを特徴とする、請求項１に記載の脱硫方法。
【請求項３】
ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス属T09株（FERMP-17268）である、請求項２に記載の脱硫方法。
【請求項４】
前記プロモーターをコードするDNAを含む塩基配列が、配列番号１に示される塩基配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の脱硫方法。
【請求項５】
前記発現用組換えベクターを有するロドコッカス属に属する微生物が、培養菌体または休止菌体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の脱硫方法。
【請求項６】
無機硫黄化合物または含硫アミノ酸による発現抑制を受けないプロモーターおよび含硫複素環式化合物の脱硫遺伝子を含む発現用組換えベクターを有するロドコッカス属に属する微生物であって、無機硫黄化合物または含硫アミノ酸による発現抑制を受けないプロモーターがロドコッカス属に属する微生物の16SrRNAプロモーターであり、脱硫遺伝子がｄｓｃＡ，ｄｓｃＢ、ｄｓｃＣ及びｄｓｃＤであることを特徴とする、上記微生物。
【請求項７】
前記ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス属T09株（FERMP-17268）である、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
前記プロモーターをコードするDNAを含む塩基配列が、配列番号１に示される塩基配列である、請求項７に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を利用する複素環式有機硫黄化合物(以下、含硫複素環式化合物)の脱硫方法に関する。特に石油等の化石燃料中に含まれるアルキルジベンゾチオフェン類の脱硫方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
石油のような炭化水素燃料中には多種類にわたる硫黄化合物が存在しており、環境規制に対応して石油中の硫黄含量を低減させるための脱硫操作が必要となる。脱硫方法としてはアルカリ洗浄や溶剤脱硫などの方法も知られているが、現在では水素化脱硫が主流となっている。水素化脱硫は、石油留分中の硫黄化合物を触媒の存在下で水素と反応させ、硫化水素として除去して製品の低硫黄化をはかる方法である。触媒としては、アルミナを担体としたコバルト、モリブデン、ニッケル、タングステン、などの金属触媒が使用される。金属触媒は一般にその基質特異性が低く、多様な種類の硫黄化合物を脱硫し、化石燃料全体の硫黄含量を低下させる目的には適しているが、特定のグループの硫黄化合物に対してはその脱硫効果が不十分となることがあると考えられる。例えば、脱硫後の軽油中にはなおもアルキルベンゾチオフェン、アルキルジベンゾチオフェンなどの含硫複素環式化合物が残存している。
【０００３】
このような背景から、微生物を用いて含硫複素環式化合物を脱硫する方法についても検討されている。それらはジベンゾチオフェンあるいはアルキルジベンゾチオフェンの脱硫に関するものであり、例えば、シュウドモナス(Pseudomonas) CB1（Isbister, J.D. and Kobylinski,E.A.(Microbial desulfurization of coal, in Coal Science andTechnology,Ser.9, p.627 (1985))、ロドコッカス ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)IGTS8 (ATCC53968) (Kilbane,J.J. Resources, Conservation and Recycling, 3, 69-70 (1990))、コリネバクテリウム(Corynebacterium)sp. SY-1 (Ohmori, T., Monna,L.,Saiki, Y. andKodama,T. Appl.Environ. Microbiol.,58,911-915, 1992)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium) sp. DO (van Afferden, M.,Schacht, S., Klein, J.andTruper,H.G.,Arch. Microbiol.,153, 324-328,1990)、およびアルスロバクター(Arthrobacter) K3b(Dahlberg, M.D.(1992) Third International Symposium on the Biological Processing of Coal, May4-7, ClearwaterBeach, FL,pp.1-10.Electric Power Research Institute, PaloAlto, CA.)などがある。
【０００４】
石油の脱硫を目的とする場合、これらの有機硫黄化合物のC-S結合を特異的に切断し、炭化水素骨格の分解による燃焼効率の損失を行うことなく、無機硫黄を遊離する反応が好ましく、このような脱硫反応を触媒する4S経路と呼ばれる酵素反応系およびその酵素遺伝子に関するクローニングが行われている。さらに、その報告例のほとんどはロドコッカス属、ゴルドニア属、ミコバクテリウム属というノカルディオフォーム型細菌に分類される微生物であり、実用性の高い脱硫用微生物の構築を目的とした育種を行う場合には、ノカルディオフォーム型細菌を宿主とすることが望ましい。
【０００５】
一方、脱硫細菌のアルキルジベンゾチオフェン脱硫活性はジベンゾチオフェン、ジメチルスルホキシド等の特殊な硫黄化合物を唯一の硫黄源として生育させた場合のみ脱硫活性を発現することが知られており、特に一般に細菌の培養において用いられる無機硫黄化合物や、含硫アミノ酸を低濃度添加した場合において活性が抑制されることが報告されている（Mamie, Z.L., Squires, C.H., Monticello, D.J., and Childs, J.D., J. Bacteriol., 178, 6409-6418, 1996）。このような発現抑制を解消するため、変異処理等によるプロモーター部分の改良も試みられたが、抑制解除は不可能であった（Mamie, Z.L., Squires, C.H., Monticello, D.J., and Childs, J.D., J. Bacteriol., 178, 6409-6418, 1996）。また、この問題を解決するために、無機硫黄化合物または含硫アミノ酸等による発現抑制を受けない入手の容易な大腸菌由来のプロモーターを用いた検討も行われているが、大腸菌(Reichmuth, D.S., Hittle, J.L., Blanch, H.W., and Keasling, J.D., Biotechnol. Bioeng., 67, 72-78, 2000)やシュウドモナス（Pseudomonas）属細菌(Gallardo, M.E., Ferrandex, A., Lorenzo V.D., Garcia, J., Diaz E., J. Bacteriol., 179, 7156-7160, 1997)のようなグラム陰性型細菌を宿主とした検討にとどまっている。ノカルディオフォーム型細菌内での脱硫活性を発現させるためには、機能面のみならず、組換え菌使用時の生物的封じ込めに関する安全面からノカルディオフォーム型細菌由来のプロモーターを使用することが有用であると考えられるが、無機硫黄化合物や、含硫アミノ酸による抑制のかからないノカルディオフォーム型細菌由来のプロモーターを用いた脱硫細菌の育種に関する報告はなされていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、組換え微生物を用いて含硫複素環式化合物を脱硫する方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、無機硫黄化合物または含硫アミノ酸による発現抑制を受けないプロモーターおよび含硫複素環式化合物の脱硫遺伝子を含む発現用組換えベクターを有する微生物が、無機硫黄化合物または含硫アミノ酸の存在下に培養した場合においても高い含硫複素環式化合物の脱硫能力を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、含硫複素環式化合物に、無機硫黄化合物または含硫アミノ酸による発現抑制を受けないプロモーターおよび含硫複素環式化合物の脱硫遺伝子を含む発現用組換えベクターを有する微生物またはその培養物を接触させて含硫複素環式化合物の脱硫を行うことを特徴とする、含硫複素環式化合物の脱硫方法を提供する。特に、本発明は、上記の含硫複素環式化合物の脱硫を無機硫黄化合物または含硫アミノ酸の存在下でも行うことができる、含硫複素環式化合物の脱硫方法を提供する。
【０００９】
本発明に係る脱硫方法において、前記微生物は、好ましくはノカルディオフォーム型細菌に属する微生物、より好ましくはロドコッカス属に属する微生物、さらに好ましくはロドコッカス属T09株である。
【００１０】
本発明に係る脱硫方法において、前記プロモーターは、好ましくはロドコッカス属に属する微生物の16SrRNAプロモーターであり、より好ましくは、前記プロモーターをコードするDNA配列が、配列番号１に示される塩基配列であるのが好ましい。
また、本発明は、前記微生物が、培養菌体または休止菌体であることを特徴とする、上記方法を提供する。
【００１１】
上記方法において、前記含硫複素環式化合物は、好ましくはアルキルジベンゾチオフェン類であり、より好ましくは3-メチルジベンゾチオフェン、3-エチルジベンゾチオフェン、3-プロピルジベンゾチオフェン、3-イソプロピルジベンゾチオフェン、1-メチルジベンゾチオフェン、2-メチルジベンゾチオフェン、4,6-ジメチルジベンゾチオフェン、3,6-ジメチルジベンゾチオフェン、2,8-ジメチルジベンゾチオフェン、2,8-ジメチルジベンゾチオフェン、および3,4,6-トリメチルジベンゾチオフェンからなる群より選択される少なくとも１種以上を含むものである。
【００１２】
また、本発明は、無機硫黄化合物または含硫アミノ酸による発現抑制を受けないプロモーターおよび含硫複素環式化合物の脱硫遺伝子を含む発現用組換えベクターを有する微生物を提供する。前記微生物は、好ましくはノカルディオフォーム型細菌に属する微生物であり、より好ましくはロドコッカス属に属する微生物であり、さらに好ましくはロドコッカス属T09株である。
【００１３】
本発明に係る微生物において、前記プロモーターは、好ましくはロドコッカス属に属する微生物の16SrRNAプロモーターであり、より好ましくは、前記プロモーターをコードするDNAを含む塩基配列は、配列番号１に示される塩基配列である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る脱硫方法を詳細に説明する。
本発明に係る脱硫方法において使用する宿主微生物は、ノカルディオフォーム型細菌に属する微生物であるのが好ましい。ノカルディオフォーム型細菌は、グラム陽性型細菌であり、例えば、ロドコッカス(Rhodococcus)属T09株（FERMP-17268）が好適に用いられ、それと実質的に同一の菌学的性質を有する菌株であればいずれの菌株も使用することができる。この菌株は、アルキルベンゾチオフェンを脱硫する能力を有する微生物として公知である(特開平2000-245446号公報)。
【００１５】
他に宿主微生物として使用できるノカルディオフォーム型細菌の微生物としては、ゴルドニア(Gordonia)属、ミコバクテリウム(Mycobacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ノカルジア（Nocardia）属およびそれと実質的に同一の菌学的性質を有する菌株を挙げることができる。
【００１６】
本発明に係る脱硫方法において宿主微生物に導入される発現用組換えベクターは、宿主内において機能する複製配列、含硫複素環式化合物の脱硫遺伝子およびその脱硫遺伝子を発現させるためのプロモーター、形質転換体の選択に必要なマーカー遺伝子を含むものである。本発明に係る脱硫方法において使用される発現用ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージミドベクター、コスミドベクターおよび酵母ベクターが挙げられる。
【００１７】
本発明に係る脱硫方法において用いることができる含硫複素環式化合物の脱硫に関与する遺伝子としては、例えば、アルキルジベンゾチオフェンから相当するアルキルヒドロキシビフェニル体を生成する一連の酵素遺伝子の１つであるアルキルジベンゾチオフェン脱硫遺伝子を挙げることができる。
【００１８】
本発明の好適な実施形態においては、該脱硫遺伝子として、ロドコッカス(Rhodococcus)属IGTS8株由来の脱硫遺伝子(C.S.Piddinton, B.R.Kovacevich and J.Rambosek, Appl.Environ.Microbiol. 61,468-475(1995))、スフィンゴモナス(Sphingomonas)属AD109株由来の脱硫遺伝子(WO 98/45446)、ペニバチルス(Paenibacillus)属A11-1またはA11-2株由来の脱硫遺伝子（特開平11‐341987号公報）を用いることができる。
【００１９】
脱硫遺伝子を発現させるためのプロモーターは、無機硫黄化合物または含硫アミノ酸の存在による発現抑制を受けないプロモーターであればいずれであってもよい。本発明の好適な実施形態においては、ロドコッカス属T09株より取得したrRNAオペロンのプロモーター(rrnプロモーター)を使用することができる。例えば、ロドコッカス(Rhodococcus)属T09株を宿主微生物として用いる場合には、複製必須領域としてロドコッカス ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)IFO3338由来の内在性プラスミドpRC4（Y.Hashimoto, M.Nishiyama, F.Yu, I.Watanabe, S.Horinouchi and T.Beppu, J.Gen.Microbiol.138,1003-1010(1992)）を利用し、選択マーカーおよび大腸菌複製領域としてpHSG298（S.Takeshita, M.Sato, M.Toba, W.Masahashi and T.Hashimoto-Gotoh,Gene  61,63-74(1987)）を利用して作製した融合プラスミドシャトルベクターpRHK1に、rrnプロモーターの下流にロドコッカス エリスロポリス KA2-5-1株(PERM P-16277)のアルキルジベンゾチオフェン脱硫遺伝子を配置した遺伝子を挿入したpNTを用いることができる。
【００２０】
本発明に係る脱硫方法において用いられる発現用組換えベクターを有する微生物は、電気パルス法、コンピテントセル法、接合伝達法、プロトプラスト法など当技術分野において公知の技術を用いて宿主微生物を形質転換または形質導入することにより取得することができる。これらの方法は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(1989)に記載されている。例えば、pRKPPまたはpRKPPRを用いて、ロドコッカス(Rhodococcus)属T09株を宿主微生物として形質転換する場合には電気パルス法が用いられる。
【００２１】
形質転換体は、導入する発現用組換えベクター内に含まれるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、pRKPPまたはpRKPPRにより形質転換したロドコッカス(Rhodococcus)属T09株はカナマイシン硫酸を約100mg/L含む寒天LB培地を用いて選択することが可能である。
【００２２】
本発明に係る脱硫方法において用いる組換え微生物の培養は、微生物の通常の培養法にしたがって行われる。培養の形態は固体培養でも液体培養でもよいが、液体培養が好ましい。培地の栄養源としては通常用いられているものが広く用いられる。炭素源としては、本発明の組換え微生物が利用可能な炭素化合物であればいずれも使用することができ、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、コハク酸、クエン酸、酢酸などを使用することができる。窒素源としては、本発明に係る脱硫方法において用いられる組換え微生物が利用可能な窒素化合物であればいずれも使用することができ、例えば、酵母エキス、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物などの有機栄養物質を使用することができる。硫黄源としては、本発明の組換え微生物が利用可能な硫黄化合物であればいずれも使用することができ、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、亜硫酸マグネシウム、亜硫酸ナトリウム等の無機硫酸化合物、メチオニン、システイン、シスチン、タウリン等の含硫アミノ酸、メルカプトエタノール等のチオール化合物などを使用することができる。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン類などを必要に応じて用いることができる。培養は、微生物が生育可能である温度、pHで行われ、使用する微生物の最適培養条件で行うのが好ましい。一般的には、培養は、培地のpHを適当なpH、例えばpH６〜８に調節し、また、適当な温度、例えば約30℃にて、振盪又は通気条件下で好気的に行われる。
【００２３】
本発明に係る脱硫方法により脱硫可能な含硫複素環式化合物としては、アルキルジベンゾチオフェン類が挙げられ、具体的には、含硫複素環式化合物として、ジベンゾチオフェン、3-メチルジベンゾチオフェン、3-エチルジベンゾチオフェン、3-プロピルジベンゾチオフェン、3-イソプロピルジベンゾチオフェン、1-メチルジベンゾチオフェン、2-メチルジベンゾチオフェン、4,6-ジメチルジベンゾチオフェン、3,6-ジメチルジベンゾチオフェン、2,8-ジメチルジベンゾチオフェン、2,8-ジメチルジベンゾチオフェン、3,4,6-トリメチルジベンゾチオフェン等のアルキルジベンゾチオフェン類を用いることができる。
【００２４】
本発明の好適な実施形態においては、本発明によるアルキルジベンゾチオフェンの脱硫は、上記のような培地にアルキルジベンゾチオフェンを添加し、上記微生物を上記のような条件で培養することにより行うことができる。その場合、基質である含硫複素環式化合物の培地中の濃度は、好ましくは5〜1,000ppmである。
【００２５】
また、上記微生物を上記培地中で培養した後、得られた培養物から遠心分離などの集菌操作によって得られた休止菌体を含硫複素環式化合物と共にインキュベーションして脱硫を行うこともできる。好適な実施形態においては、このような休止菌体による脱硫は、以下のようにして行われる。
【００２６】
まず、休止菌体を調製する。新鮮な培地に種菌を適当量、例えば１〜２容量％接種する。培地としては、上記の培地を用いることができる。種菌としては、対数増殖期初期から定常期までのいずれかの状態の菌を用いることができ、好ましくは対数増殖期後期のものを用いる。種菌の量は必要に応じて増減することができる。その後、pH６〜９、約30℃にて１〜２日間往復又は回転振盪培養する。培地としてはA培地（Izumi Y.,Ohshiro T.,Ogino H.,Hine Y.,Shimao M., Applied and Environmental Microbiology, 223-226 (1994)）に適宜硫黄源を添加した培地を用いるのが好適である。次いで、菌体を分離集菌し、洗浄することにより休止菌体が得られる。集菌は、培養菌体が対数増殖期初期から定常期までのいずれの状態にある時に行ってもよいが、対数増殖期中期から後期の状態にある時に行うのが好ましい。また、集菌は、遠心分離の他、濾過、沈降分離等のいかなる方法で行ってもよい。菌体の洗浄には、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等のいかなる緩衝液を使用してもよく、また、水を用いて菌体を洗浄することもできる。
【００２７】
休止菌体を用いる脱硫法は、休止菌体を適当な緩衝液に懸濁して調製した菌懸濁液に基質である含硫複素環式化合物を添加して反応させることにより行う。緩衝液としては種々の緩衝液を使用できる。緩衝液のpHは、休止菌体が含硫複素環式化合物を脱硫できる範囲内において特に限定されないが、pH６〜７が好適である。また、緩衝液の代わりに、水や培地等を使用することもできる。菌体懸濁液の濃度は、ＯＤ660 が１〜100の間が好適であり、必要に応じて増減できる。基質の濃度は、5〜1,000ppm が好適であるが、必要に応じて増減できる。反応は30℃で行うのが好適であるが、そのほかの適当な温度でもよく、また反応時間は１〜２時間が好適であるが、必要に応じて増減できる。また、基質を添加する前に反応温度と同じ温度に反応液を予備加熱してもよい。
【００２８】
また、休止菌体による反応は、n-テトラデカン等の有機溶媒を添加した油水２相系で行うこともできる。この場合、使用可能な有機溶媒としては、n-テトラデカンの他、Ｃ8〜Ｃ20のn-パラフィンやケロシン、軽油、重油などが挙げられる。また、必要に応じて反応液上方の気相を酸素で置換封入してもよい。
脱硫率の測定は、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー／質量スペクトル分析などを使用して行うことができる。また、必要に応じて他の分析方法を併せて利用してもよい。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
〔実施例１〕ロドコッカス属T09株からのプロモーターDNAの取得
ロドコッカス属T09株（FERMP-17268）の16SrRNAの部分領域を得るために、ロドコッカス属細菌の16SrRNA遺伝子間で保存されており、大腸菌の16SrRNAでの保存性の低い遺伝子領域から、オリゴヌクレオチドプライマー(5'-CGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT-3'：配列番号２および5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGA-3'：配列番号３)を設計した。
【００３０】
このプライマーを用いて、ロドコッカス属T09株（FERMP-17268）の全DNAをテンプレートとして、PCR反応を行った。反応液の一部を0.8％アガロースゲル電気泳動により分析し、約1kbの遺伝子増幅断片が得られたことを確認した。また、得られた1kbDNA断片が、ロドコッカス属の16SrRNAのDNA配列を有することを310型genetic analyzer（パーキンズエルマー社）を用いて確認した。さらにこの1kbDNA断片をDIGラベリングキット（ロシュダイアグノスティックス社製）を用いてジゴキシゲニン標識化したDNAプローブを作成した。ロドコッカス属T09株の全DNAに制限酵素Bam HIを加え、37℃、12時間反応させた。
【００３１】
一方、大腸菌由来のベクターpBluescript II KS(+) （ストラタジーン社）を制限酵素BamHIで37℃、1時間反応させ、プラスミドDNAを切断した。この反応液１容に1/10容の1M Tris-HCl (pH8.0)を加え、アルカリホスファターゼ(1unit)と65℃、1時間反応させた。この溶液に1容のフェノールクロロホルム（１容：１容）を加えよく混ぜた後、４℃で10分間17000gの遠心分離を行い、分離した上層を採取した。採取した上層1容に対し、0.1容の3M酢酸ナトリウム水溶液と2.5容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、TE緩衝液[0.025M トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、0.025Ｍ EDTA :pH8.0]に溶解した。
【００３２】
上記のロドコッカス属T09株の全DNA 反応物とpBluescript II KS(+)DNA断片を含む液を各１容ずつ混合し、Takara ligation キットversion 2（宝酒造社製）のI液を２容加え、よく攪拌した後、16℃、30分間インキュベートした。
【００３３】
大腸菌JM109株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、0℃、1時間静置後、42℃、1分間の熱処理を行い、SOC培地[トリプトン2％、酵母エキス0.5％、0.025M 塩化ナトリウム, 0.0025M 塩化カリウム、0.01M 硫酸マグネシウム、0.01M 塩化マグネシウム、0.0.M グルコース：pH7.4]を加えて、37℃、1時間、振とうした。得られた大腸菌および、上記DNAプローブを用いて、Sambrookら(前掲)の方法に従い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。コロニーハイブリダイゼーション法により上記DNAプローブとハイブリダイゼーションしたプラスミドを有する大腸菌を採取し、採取した大腸菌から、プラスミド、pR16Aを調製した。得られたプラスミドはT09株DNA由来の約８kbのDNA断片を含んでいた。Rhodococcus sp. T09 16s rRNA gene PCR産物の塩基配列の情報をもとにEcoRVおよびPmaCIにてpR16Aを消化し、約1.5 kbのDNA断片を得た。このうち、BamHI切断部位からPmaCIに至るT09株のDNAに由来する断片、pR16APの塩基配列を310型genetic analyzer（パーキンズエルマー社）を用いて決定したところ、配列番号１に示す塩基配列であることが明らかとなった。
【００３４】
pR16APのDNA溶液にpUC18 SmaI/BAP Ready-To-Goキット(ファルマシア社)を添加し、製品プロトコルに従い、pR16AP断片をpUC18にクローニングし、pUC-16APを得た。
【００３５】
pUC-16APのDNA溶液にEcoRIおよびXbaIを添加し、37℃、１時間インキュベートした。この溶液に1容のフェノールクロロホルム（１容：１容）を加えよく混ぜた後、４℃で10分間17000gの遠心分離を行い、分離した上層を採取した。採取した上層1容に対し、0.1容の3M酢酸ナトリウム水溶液と2.5容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、TE緩衝液[0.025M トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、0.025Ｍ EDTA :pH8.0]に溶解し、pR16APの上流末端にEcoRI切断部位、下流末端にXbaI切断部位を有する断片、E-pR16AP-Xを得た。
【００３６】
〔実施例2〕アルキルジベンゾチオフェン脱硫遺伝子を含む組換えプラスミドの作成
pBluescript II SK(+)（ストラタジーン社）のXbaIおよびHind III間にdsz A, B, C、D遺伝子(dszA、B、C遺伝子についてはGenBank、受託番号L37363、dszD遺伝子についてはGenBank、受託番号AB051429)を含む組換えプラスミドpSKABC溶液にXba I およびHind III溶液を添加し、37℃、１時間インキュベートした。得られた反応液を0.8％アガロースゲル電気泳動を用いてDNAを分離し、約3.8kbのDNA断片をGel extraction kit (キアゲン社)を用いて回収し、TE緩衝液[0.025M トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、0.025Ｍ EDTA :pH8.0]に溶解し、dsz ABCDを含むDNA断片を得た。
【００３７】
一方、Rhocodoccus-E.coli用シャトルベクターpRHK1を含むDNA溶液にEcoRIおよび、Hind III溶液を添加し、37℃、１時間インキュベートした。この溶液に1容のフェノールクロロホルム（１容：１容）を加えよく混ぜた後、４℃で10分間17000gの遠心分離を行い、分離した上層を採取した。採取した上層1容に対し、0.1容の3M酢酸ナトリウム水溶液と2.5容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、TE緩衝液[0.025M トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、0.025Ｍ EDTA :pH8.0]に溶解し、pRHK1/EcoRI/Hind III断片を得た。
【００３８】
上記のようにして得られたdsz ABCDを含むDNA断片溶液、pRHK1/EcoRI/Hind IIIのDNA断片溶液、および実施例１で得られたE-pR16AP-X断片溶液を各１容ずつ混合し、Ligation High （東洋紡社）を３容加え、よく攪拌した後、16℃、30分間インキュベートした。
【００３９】
大腸菌JM109株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、0℃、1時間静置後、42℃、1分間の熱処理を行い、SOC培地[トリプトン2％、酵母エキス0.5％、0.025M 塩化ナトリウム, 0.0025M 塩化カリウム、0.01M 硫酸マグネシウム、0.01M 塩化マグネシウム、0.0.M グルコース：pH7.4]を加えて、37℃、1時間、振とう培養した。得られた培養液0.1mlをカナマイシン25mg/l、寒天15g/1を含むLB培地に塗布し、37℃、1昼夜培養した。得られた培養コロニーをカナマイシン25mg/lを含むLB培地1.5mlに植菌し、Qiaprep spin miniprep キット（キアゲン社）を用いて調製したプラスミドDNAを、50μl TE緩衝液に溶解し、pNT遺伝子溶液を得た。
【００４０】
〔実施例3〕pNTによるロドコッカス属T09株の形質転換
500ml容三角フラスコに入った滅菌済みのLB培地100mlにロドコッカス属T09株を植菌し、30℃で24時間培養した。得られた培養液を4℃、10,000rpm、10分遠心分離し、沈殿を滅菌水にて2回洗浄し、測定波長660nmでの濁度が40になるように10％グリセロール水溶液に懸濁した。
【００４１】
該懸濁液80μlにpNT遺伝子溶液1μlを添加し、ジーンパルサーII（バイオラッド社）を用いて25μF、400Ω、1.5kV/cmの条件で処理した。処理液にSOC培地0.42mlを添加し、30℃、3時間培養を行った。得られた培養液をカナマイシン硫酸塩100mg/lおよび寒天末15 g/lを含むLB培地（LBAK培地）に塗末し、30℃、48時間培養した。LBAK培地においてコロニーを形成した菌を再度新鮮なLBAK培地に画線することによって菌体を純化し、T09/pNT株を得た。
【００４２】
〔実施例4〕菌体によるジベンゾチオフェンの分解方法（休止菌体反応）
硫酸マグネシウム7水和物500mg/lおよびカナマイシン100mg/lを含むA培地2mlに、1白菌耳量のT09/pNT 株を植菌し、30℃で24時間培養した培養液1mlを上記と同じ組成の培地50mlに移植し、さらに30℃で48時間培養した。
得られた培養液を4℃、10,000rpm、5minの条件で遠心分離し、沈殿をpH7.4の1/15M リン酸緩衝液にて2回洗浄し、同緩衝液に懸濁して反応用菌体を得た。この反応用菌体の測定波長660nmでの濁度は20であった。
【００４３】
分解反応は、反応用菌体1mlの入った20ml容のガラス試験管にグルコース水溶液およびジベンゾチオフェン（N,N-ジメチルホルムアミド溶液）を終濃度それぞれ、10g/l、80mg/lになるように加え、30℃にて１２時間往復振とうすることにより行った。残存ジベンゾチオフェン量および脱硫生成物である2ヒドロキシビフェニル（2HBP）の測定は、一定時間反応後の反応液に6N塩酸水溶液0.1mlおよび等量の酢酸エチルを添加、撹拌抽出後、酢酸エチル層を、ガスクロマトグラフィーにより定量した。反応2時間後のジベンゾチオフェン分解率は、93.2％であった。また、2HBPの生成量は53mg/lであった。一方、脱硫遺伝子の上流に本来のプロモーターであるdszプロモーターを配した組換えプラスミドpRKPPを保持するT09の形質転換株を上記と同様の操作で培養、反応した場合、ジベンゾチオフェンの分解、2HBPの生成はともに認められなかった。
【００４４】
上記と同様の操作で、培養時の生育硫黄源として硫酸マグネシウム7水和物を添加する代わりに、システイン、またはメチオニン 1mMをそれぞれ使用した場合のジベンゾチオフェン分解による2HBP生成量を表１に示す。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
〔実施例5〕菌体によるジベンゾチオフェンの分解方法（培養法）
硫酸マグネシウム7水和物500mg/lおよびカナマイシン100mg/l、ジベンゾチオフェン90mg/lを含むA培地2mlに、1白菌耳量のT09/pNT 株を植菌し、30℃、110rpmで4日間培養した。得られた培養液に6N塩酸水溶液0.1mlおよび等量の酢酸エチルを添加、撹拌抽出後、酢酸エチル層の残存ジベンゾチオフェン濃度を、ガスクロマトグラフィーにより分析した。その結果、ジベンゾチオフェン分解率は90.5％、2HBPの生成量は13mg/lであった。dszプロモーターを配した組換えプラスミドpRKPPを保持するT09の形質転換株を上記と同様の操作で培養した場合、ジベンゾチオフェン分解、2HBP生成はともに認められなかった。
上記と同様の操作で、培養時の硫黄源として硫酸マグネシウム7水和物を添加する代わりに、表２に示す 硫黄化合物1mMをそれぞれ使用した場合の結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
〔実施例6〕菌体によるジベンゾチオフェン類の分解方法（油水二相系培養法）
実施例5と同様の操作でジベンゾチオフェンをn-テトラデカンに100mg/lになるように溶解したものを培地2mlあたり1ml添加した後、1白菌耳量のT09/pNT 株を植菌し、30℃、110rpmで4日間培養した。得られた培養液に6N塩酸水溶液0.1mlおよび等量の酢酸エチルを添加、撹拌抽出後、酢酸エチル層の残存ジベンゾチオフェンを、ガスクロマトグラフィーにより分析した。その結果、ジベンゾチオフェン分解率は95.3％、2HBPの生成量は30.3mg/lであった。
dszプロモーターを配した組換えプラスミドpRKPPを保持するT09の形質転換株を上記と同様の操作で培養した場合、ジベンゾチオフェン、2HBPの生成はともに認められなかった。
【００４９】
〔実施例7〕菌体によるアルキルジベンゾチオフェン類の分解方法(油水二相系培養法)
実施例6と同様の操作でジベンゾチオフェンの代わりに4,6-ジメチルジベンゾチオフェンをn-テトラデカンに100mg/lになるように溶解したものを培地2mlあたり1ml添加した後、1白菌耳量のT09/pNT 株を植菌し、30℃、110rpmで4日間培養した。得られた培養液に6N塩酸水溶液0.1mlおよび等量の酢酸エチルを添加、撹拌抽出後、酢酸エチル層を、ガスクロマトグラフィーにより分析した。その結果、4,6-ジメチルジベンゾチオフェン分解率は95.0％、4、6-ジメチル-ヒドロキシビフェニルの生成量は43.5mg/lであった。
【００５０】
dszプロモーターを配した組換えプラスミドpRKPPを保持するT09の形質転換株を上記と同様の操作で培養した場合、4,6-ジメチルジベンゾチオフェン分解、4、6-ジメチル-ヒドロキシビフェニル生成はともに認められなかった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明に係る脱硫方法によれば、無機硫黄化合物または含硫アミノ酸による発現抑制を受けないプロモーターおよび脱硫遺伝子を含む発現用組換えベクターを有する微生物を用いて、含硫複素環式化合物を効率的に脱硫することができた。
【００５２】
【配列表】
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【００５３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−ロドコッカスT09株由来rrnプロモーターを含む塩基配列pR16AP。
配列番号２−人工配列の説明：PCRに使用したプライマー。
配列番号３−人工配列の説明：PCRに使用したプライマー。
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えプラスミドpNTの模式図である(dsz A-D; アルキルジベンゾチオフェン脱硫遺伝子、pRC4; ロドコッカスロドクラウス由来クリプティックプラスミド領域、T09-16SP; ロドコッカス属T09株由来16Sプロモーター(rrn)を含む領域、Km;カナマイシン耐性遺伝子、Ori; 大腸菌複製開始点、Cla I, EcoRI, Hind III, Xba I; 制限酵素切断部位)。
【図１】
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