(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
先端基及び前記先端基に共有結合した炭化水素末端基を含むオレアミドヒドロラーゼ阻害剤であって、前記先端基が求電子カルボニルを含みかつ下記構造：
0004184435.tif 000013
で表される基からなる群より選ばれ、前記炭化水素末端基が下記構造：
0004184435.tif 000014
で表される基からなる群より選ばれる、前記オレアミドヒドロラーゼ阻害剤。
【請求項２】
下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。
0004184435.tif 000015
【請求項３】
下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。
0004184435.tif 000016
【請求項４】
下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。
0004184435.tif 000017
【請求項５】
下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。
0004184435.tif 000018
【請求項６】
下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。
0004184435.tif 000019
【請求項７】
下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。
0004184435.tif 000020
【請求項８】
下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。
0004184435.tif 000021
【請求項９】
下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。
0004184435.tif 000022
【請求項１０】
下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。
0004184435.tif 000023
【発明の詳細な説明】
発明の分野：
本発明は、オレアミドヒドロラーゼ阻害剤及びオレアミド誘発睡眠に対するアゴニストに関する。更に詳細には、本発明は、オレアミドヒドロラーゼに対する阻害活性及び/又はオレアミド誘発睡眠に対するアゴニスト活性を示す遷移状態擬態やメカニズムに基づくオレアミド誘導体に関する。
発明の背景：
オレアミド（１、シス-9-オクタデセンアミド）は、睡眠奪取と睡眠回復の状態によって各々蓄積及び消失することがわかった天然に存在する脳成分である（Cravatら，Science 1995, 268, 1506-1509; Lernerら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 1994, 91, 9505-9508; Cravattら，J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 580-590）。構造的に特定の方法で、１は動物においては血管内に投与した場合にナノモル量で生理的睡眠を誘発することがわかった（Cravatら，Science 1995, 268, 1506-1509）。細胞膜内に存在する酵素（オレアミド加水分解酵素）による１の加水分解は、オレアミドをオレイン酸（シス-9-オクタデセン酸）に急速に分解する。１の内在性濃度の制御に関与する調節物質を単離しようと努力して、内在性膜タンパク質、オレアミドヒドロラーゼがオレアミドの加水分解による分解を触媒し、いずれも催眠活性を示さないオレイン酸（シス-9-オクタデセン酸）とアンモニアを生じる（図３）ことがわかった（Cravatら，Science 1995, 268, 1506-1509）。
オレアミドヒドロラーゼは、フェニルメチルスルホニルフルオリド、4,4′-ジチオジピリジンジスルフィド（強力なジスルフィド形成試薬）及びHgCl2（IC50=700nM, Ki,app=37nM）で阻害されるが1mM EDTAで阻害されないことがわかった。これにより、チオールが触媒過程に密接に関係していること及びその酵素が活性部位のシステイン残基を含むシステインアミダーゼか恐らくはセリンアミダーゼであることが示される。
セリン及びシステインプロテアーゼの種々の強固な結合阻害剤又は不可逆阻害剤が記載されている。不可逆的阻害剤、例えば、ハロメチルケトン（Kettnerら，Biochemistry 1978, 17, 4778-4784; Kettnerら，Thromb. Res. 1979, 14, 969-973; C. Giordanoら，Eur. J. Med. Chem. 1992, 27, 865-873; Rauberら，Biochem. J. 1986, 239, 633-640; Anglikerら，Biochem. J. 1987, 241, 871-875）、ミハエルアクセプター（Hanzlikら，J. Med. Chem. 1984, 27, 711-712）、エポキシド（C. Parkesら，Biochem. J. 1985, 230, 509-516）、O-アシルヒドロキシアミン
0004184435.tif 000002
及びジアゾメチルケトン（Greenら，J. Biol. Chem. 1981, 256, 1923-1928）並びに可逆的遷移状態擬似阻害剤、例えば、ケトン（Mehdi, S. Bioorg. Chem. 1993, 21, 249-259）、アルデヒド（Westerikら，J. Biol. Chem. 1972, 247, 8195-8197）、シクロプロペノン（Andoら，J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 1174-1175）及び電子欠損カルボニル化合物、例えば、トリフルオロメチルケトン（Wolfendenら，Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 1976, 5, 271; Gelbら，Biochemistry 1985, 24, 1813-1817; Imperialiら，Biochemistry 1986, 25, 3760-376; Koutekら，J. Biol. Chem. 1994, 269, 22937-22940）、α-ケト酸誘導体（Li, Z.ら，J. Med. Chem. 1993, 36, 3472-3480; Harbesonら，J. Med. Chem. 1994, 37, 2918-2929; Peetら，J. Med. Chem. 1990, 33, 394-407; Angelastroら，J. Med. Chem. 1990, 33, 11-13）及びトリカルボニル化合物（Wassermanら，J. Org. Chem. 1993, 58, 4785-4787）が含まれる。
一方、いままでにオレアミドヒドロラーゼの唯一の恐らくは特異的阻害剤が報告され（IC50=3μM，［S］=0.26Km）（Maurelliら，FEBS Lett. 1995, 377, 82-86）、関連脂肪酸アミダーゼの阻害剤の唯一の研究報告が開示されている（Koutekら，J. Biol. Chem. 1994, 269, 22937-22940）。
オレアミド加水分解を阻害するオレアミドヒドロラーゼの非常に強力な阻害剤やオレアミド誘発睡眠アゴニストが求められている。
発明の要約：
本発明の態様は、オレアミドヒドロラーゼ阻害剤に関する。本阻害剤は、オレアミドヒドロラーゼ内の活性部位のシステイン残基と相互作用するように設計される。本阻害剤は、急速であり，選択的であり、非常に強力である（Ki=13μM〜1nM）。本阻害剤は、オレアミド、睡眠誘発因子の加水分解を阻害するのに有効である。本阻害剤は、また、オレアミドの生物学的役割を確認する有効な手段である。
本阻害剤は、先端基と炭化水素末端基を含む種類を有する。先端基は、炭化水素末端基に共有結合され、求電子カルボニルが含まれる。好ましい先端基は、下記構造で表される基からなる群より選ばれる。
0004184435.tif 000003
好ましい炭化水素末端基は、下記基の構造で表される基からなる群より選ばれる。
0004184435.tif 000004
好ましい阻害剤としては下記の化合物が含まれる。
0004184435.tif 000005
0004184435.tif 000006
本発明の他の態様は、オレアミド加水分解に対するオレアミドヒドロラーゼを阻害する方法に関する。本方法は、オレアミドヒドロラーゼと阻害剤とを接触又は結合するという作用を用いる。本阻害剤は、共有結合した先端基と炭化水素末端基をもっている種類である。先端基としては求電子カルボニル基が含まれる。好ましい先端基は、下記構造で表される基からなる群より選ばれる。
0004184435.tif 000007
好ましい炭化水素末端基は、下記構造で表される基からなる群より選ばれる。
0004184435.tif 000008
上記の方法に用いられる好ましい阻害剤としては、上記の阻害剤と更に下記の阻害剤が含まれる。
0004184435.tif 000009
本発明の態様は、オレアミド感受性動物体内で睡眠を誘発する方法に関する。更に詳細には、本発明のその態様は、オレアミドヒドロラーゼアゴニストの有効量をオレアミド感受性動物に投与する方法に関する。好ましいアゴニストは、下記構造で表される。
0004184435.tif 000010
【図面の簡単な説明】
図１は、22個のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤を各阻害定数（Ki,app（μM））と共に示す表である；オレアミドのKm=5±2μM。
図２は、CD3OD又はアセトン-d6中CD3OD又はD2Oの求電子カルボニルへの付加を決定及び定量する1H NMR及び13C NMRデータを示す表である。データから阻害剤のカルボニルの水和の程度や相対的求電子特性がわかる。予想した傾向は、
0004184435.tif 000011
である。代表的なこれらの傾向、11と12はCD3OD中でヘミアセタールへ完全に変換され、残りの薬剤はヘミアセタール形成の減少を示し、予想した求電子特性：11（100%）、12（100%）、8（75%）、6（48%）、及び4（47%）と一致した。
図３は、オレアミドをオレアミドヒドロラーゼで加水分解により分解してオレイン酸（シス-9-オクタデセン酸）とアンモニアを生じることを示す式である。
図４は、オレアミド１のオレアミドヒドロラーゼ触媒分解に対する化合物6（Molar）の活性のディクソンプロットを示すグラフである（1/速度（分/μM））。
図５は、オレアミドヒドロラーゼに対する化合物11（Molar）の影響を示すグラフである（速度（μM/分/100μL））。
図６は、化合物12によるオレアミドヒドロラーゼ競合阻害（1/ν（分/μM）のラインウィーバー・バークプロットを示す図である。
図７は、pHに対する相対速度の化合物１プロットのオレアミドヒドロラーゼ切断のpH-速度依存性を示すグラフであり、フィットから見掛け上の活性部位pKa 5.4，9.7及び10.3が示される。最高速度はpH10.0で生じる。
図８は、a）パパイン及び他のシステイン又はセリンプロテアーゼに見られる共通の中間体（O’Learyら，Biochemistry 1974, 13, 2077-2081）; b）阻害剤3-15の可能な作用様式を示す図式である。
図９は中間体と阻害剤３、６、７、８、10、24、及び26の化学合成を示す図式である。
図10は、α-ヒドロキシ酸18から化合物27の化学合成と図１に示されるトリフルオロメチルケトン阻害剤12、13、14及び15（R=C16H32-モノ不飽和炭化水素）を示す図式である。
図11は、水和した飽和化合物11の化学合成を示す図式である。
図12は、pH-速度依存性を求めるために用いられる式を示す図である。標準最小自乗法を用いてあてはめた曲線の直線部分から速度を得た。その速度をpHに対してプロットし、加重非直線最小自乗法により図示した式にあてはめた。
発明の詳細な説明
一連の強力な遷移状態擬態やメカニズムによるオレアミドヒドロラーゼ阻害剤2-22（図１〜図２；図９、図10及び図11）が本明細書において開示及び確認される。これらの阻害剤は、新しい種類の生物学的シグナリング剤の原型部分としての１（図１）及びその調節において潜在的に重要な因子であるオレアミドヒドロラーゼの役割を探究及び特定するのに用いうるものである。
本阻害剤の効力は、オレアミドヒドロラーゼの膜結合標品による100μMオレアミド（〜20Km）の加水分解の結果としてアンモニアの発生を測定するイオン選択性電極を用いて求めた。オレアミドのKmは5±2μMであることがわかった。阻害定数は、ディクソン法（図４〜図６）により求めた。溶解度の制限を受けると、試験した阻害剤全てが高濃度で100%阻害を達成することができ、阻害剤はKisの異なる２以上の別個の活性部位に特有の多様な阻害挙動を示さなかった。ほぼ同じ親和性を有する22個の別個の阻害剤を結合する２種類以上の異なる酵素の可能性がないので、これにより標品中の単一の酵素が観察されたオレアミドヒドロラーゼ活性が90%より大きく関与することが強く示される。
最も強力な阻害剤（図１）は、（チオ）ヘミアセタール又は（チオ）ヘミケタールを可逆的に形成することが可能な求電子カルボニル基をもち、セリン又はシステインプロテアーゼ触媒反応の遷移状態を擬態する（図８）。本阻害剤の相対効力は、強固な結合のα-ケトエテルエスチル8（1.4nM）とトリフルオロメチルケトン12（1.2nM）に累積している反応性カルボニルの予想した求電子特性に従うことがわかった。カルボニル求電子性と結合定数間の同様の相関が昆虫幼若ホルモンエステラーゼ（Lindermanら，Rev. Pestic. Toxicol. 1991, 1, 261-9）やアナンダミナーゼ（Koutekら，J. Biol. Chem. 1994, 269, 22937-22940）の阻害剤にも見られた。しかしながら、そのセットの最も求電子性阻害剤であるトリカルボニル阻害剤11は150nMで結合が相対的に不十分であった。この挙動は、かさ高いtert-ブチルエステルと酵素間のステアリン酸相互作用を脱安定化する結果であるか又は一部には天然基質に特有でないC-3のsp2特性によるものである。
本阻害剤のカルボニルの水和と相対求電子特性の程度は、NMR分析で容易にかつ正確に評価され、予想した傾向に従うことがわかった
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トリカルボニル阻害剤11の中心カルボニルは、調製及び確認時に完全に水和された。反応性トリフルオロメチルケトンを含む残りの薬剤は、水和せずにカルボニル構造として単離された。1H NMRと13C NMRを用いてCD3OD及びアセトン-d6中求電子カルボニルへのCD3OD又はD2Oの付加を各々決定及び定量した（図２）。その傾向の代表例、11と12はCD3OD中でそのヘミアセタールに完全に変換され、残りの薬剤はヘミアセタール形成の減少を示し予想した求電子特性：11（100%）、12（100%）、8（75%）、6（48%）及び4（47%）と一致した。
トリフルオロメチルケトン12、13、14及び15は水溶液中でほとんど全部水和物として存在し、それらの化合物は可逆的な酵素-阻害剤ヘミケタール共有結合複合体として酵素に結合すると考えられ、エラスターゼ（Takahasiら，J. Mol. Biol. 1988, 201, 423-428）及びα-キモトリプシン（Liangら，Biochemistry 1987, 26, 7603-7608）の構造的研究及びペチジルトリフルオロメチルケトンに結合した一連のセリンプロテアーゼ（Imperialiら，Biochemistry 1986, 25, 3760-3767）の速度論的研究に示された。また、α-ケトアミド６と７は少なくとも一部には溶液中sp2ケト化合物として存在すると思われるが、α-ケトアミドはプロテアーゼ活性部位では完全にsp3であることが認められた。同様に、システインプロテアーゼパパインの活性部位のアルデヒドはチオヘミアセタールとして結合する（Mackenzieら，Biochemistry 1986, 25, 2293-2298; Schultzら，FEBS Lett. 1975, 50, 47-49）。これらの阻害剤がgem-ジオール（水和したケトン）よりむしろ（チオ）-ヘミケタールとして結合するという仮説は、gem-ジオールに構造的類似性があるにもかかわらず16、17及び18によるオレアミドヒドロラーゼの不十分な阻害により支持される。反応性カルボニルの求電子性はこれらの阻害剤がオレアミドヒドロラーゼに結合する親和性を必要とするのに大きな役割を果たすと思われるが、オレアミドヒドロラーゼに対するこれらの化合物の親和性に影響を及ぼす他の要因もあるらしいことは留意される。アルデヒド４とα-ケトアミド７は等しく求電子性であると思われるが、α-ケトアミドの方が強固に結合し、更に酵素とアミド官能基間で行われる好ましい相互作用、恐らくは水素結合があることが示される。同様に、α-ケトエステル８とトリフルオロメチルケトン12はトリフルオロメチルケトンの求電子性が高いにもかかわらず等しく強固に結合する。
おもしろいことに、オレアミドのC-2に似た位置にカルボニルを取り込むアルデヒド５はオレアミドのC-1に似た位置にアルデヒドカルボニルを組み込む４より５倍強固に結合することがわかった。これはα-ケトエステル系の阻害剤においても認められ、オレアミドのC-1に比べてC-2（９に比べて８）での求電子カルボニルの取り込みにより結合親和性が６倍高められた。この相違は、α-ケトアミド又はトリフルオロメチルケトンには見られなかった。これらの阻害剤の種類においては、オレアミド位置のC-1に比べてC-2で求電子カルボニルを置換すると等しく有効な阻害剤が得られた。これにより、オレアミドのC-2に対するC-1のカルボニル位置類縁体の微妙に異なる結合様式の可能性が示される。
これらの研究により、オレアミドヒドロラーゼが天然基質と同じ９位にシス二重結合の立体化学を含む脂肪酸阻害剤を約10倍選択することがわかる。この傾向はトリフルオロメチルケトン系で最も明らかであり、シス二重結合含有12はトランス二重結合含有14又は飽和誘導体15よりほぼ１桁強固に結合する。
ほとんどの潜在的不可逆的阻害剤（3、19-21）は、その溶解度限度までの濃度においてインキュベーションの最初の15分間は測定可能な時間依存性阻害活性を示さなかった。クロロメチルケトン３は、時間依存性を示したが中程度の阻害（Ki=0.7μM）であり、推定活性部位システインとケトン間の可逆的（チオ）ヘミケタール（Bellら，Advan. Phys. Org. Chem. 1966, 4, 1-29及びその中の参考文献）又は可逆的かつ非共有結合の酵素-阻害剤複合体の形成と一致する。隣接のクロロ置換基の存在はカルボニルの求電子性を増加し、求核攻撃を容易にする。2-クロロオレイン酸（20、Ki=0.3μM）は、オレイン酸（Ki=6μM）に恐らくは似た結合様式で可逆的に結合した。ジアゾメチルケトン21は結合が更に弱かった（Ki=18μM）。
かかる所見から、１が脂肪酸第一アミド生物学的シグナリング分子の種類の原型部分を構成し、機能の多様性又は選択性がアルカン鎖の長さ、及び不飽和の位置、立体化学及び程度から誘導されることが示される。
酵素触媒オレアミド加水分解の速度は、見掛け上の活性部位pKa5.4、9.7及び10.3によりpH依存性であることがわかった（図７）。PMSFの珍しいpH-速度依存性プロファイル、オレアミドKm及び阻害結果はマウレリによる結果と一致し（Maurelliら，FEBS Lett. 1995, 377, 82-86; Mackenziら，Biochemistry 1986, 25, 2293-2298）、ここに示されたオレアミドヒドロラーゼ（ラット肝膜画分由来）とアナンダミドアミドヒドロラーゼ（マウス神経芽腫細胞膜画分由来）が種間変動を条件として同じ酵素であることが示される。しかしながら、配列データ又は精製した酵素がないときには後者は内在性膜タンパク質で達成されることが難しいことがよくあり、それはまだ証明されていない。しかしながら、我々の結果は、生体内脂肪酸アミド加水分解の多酵素モデルを支持することが証明されるようにpH６と８で最大速度を示すアナンダミドアミドヒドロラーゼの他の報告（Desarnaudら，J. Biol. Chem. 1995, 270, 6030-6035）と全く異なる。本阻害剤はpH10.0で分析され、そのpHでのオレアミドヒドロラーゼ活性は我々の分析条件下で最大である。
アゴニスト活性
本発明の他の態様は、オレアミドヒドロラーゼアゴニスト有効量を投与することによりオレアミド感受性動物体内で睡眠を誘発する方法に関する。好ましいアゴニストは化合物６である。化合物６を鉱油に溶解し、腹内注射によりラットの腹膜に有効量を注入した。次の４時間睡眠をモニターした。標準電気生理学的方法により全睡眠時間を求めた。歩行時間の減少と共に深部徐波睡眠（SWS）の増加が認められた。約30%のSWSの増加と同様の%の歩行時間の減少が認められた。
阻害剤の合成
阻害剤の多くを、オレイン酸から既知の手順又は既知の手順の修正によって調製した（図９）。オレイン酸から誘導した酸塩化物（３当量（COCl）2、CH2Cl2、25℃、３時間）とヒドロキシルアミン又はジアゾメタンとを反応させると２と21が得られ、オレイン酸とヒドラジン（1.1当量、2.2当量のEDCI、0.2当量のDMAP、CH2Cl2、25℃、19時間）とを直接縮合すると22が得られた。21をと無水1N HCl−EtOAc（25℃、10分、92%）で処理すると手際よく３が得られた。アルデヒド4（Mancusoら，J. Org. Chem. 1978, 43, 2480-2482）はジメチルアセタール16（Marxら，J. Med. Chem. 1989, 32, 1319-1322）と共に記載されたようにオレイン酸から直接調製される。オレイン酸から誘導したエノレート（LDA、THF）をCCl4又はO2で捕捉すると各々20（Sniderら，J. Org. Chem. 1987, 52, 307-310）と18（Konenら，J. Org. Chem. 1975, 40, 3253-3258）が得られ、酸塩化物の生成（３当量（COCl）2、CH2Cl2、25℃、３時間）と水性NH4OHによる縮合によって対応する第一アミド19と17に変換した。
C-1よりむしろC-2に類似の位置に求電子カルボニルをもつC-18オレイン酸に基づくα-ケトアミド６とα-ケトエスチル８を、α-ヒドロキシアミド17（PDC）とα-ヒドロキシ酸18（デス-マルチン）の酸化に続いてエチルエステルを形成することにより調製した（図９）。オレアミドのC-1に類似の位置に求電子カルボニルをもつ対応するα-ケトエステル９と10を、対応する18Cカルボン酸、オレイン酸とステアリン酸からデーキン・ウェスト反応を変更して直接調製した（Buchananら，Chem. Soc. Rev. 1988, 17, 91-109）（図９）。同様の長さを有するa-ケトアミド７を、21のウォルフ転移によって得られるオレイン酸の1C伸長により調製（触媒AgOBz、CH3OH、25℃、2.5時間、82%）してメチルエステル23を得た。メチルエステルの加水分解に続いてC-19カルボン酸24をα-ケトアミドに変換する方法は、６について詳述した方法に従った（図９）。
9-シスオレフィンを含むC-18脂質のC-2位に求電子カルボニルを取り込む13を含むトリフルオロメチルケトン阻害剤12、13、14及び15を、対応するカルボン酸を各酸塩化物に変換し、引き続きTFAA−ピリジンで処理することにより１操作で調製した（Boivinら，Tetrahedron Lett. 1992, 33, 1285-1288）（６当量/８当量、Et2O、0.75〜２時間、54〜79%）（図10）。a-ヒドロキシ酸18の酸化的分解（Pb（OAc）4、1.1当量、25℃、ベンゼン、50m.）によりアルデヒド５が得られた。これを更に酸化（NaClO2）して酸27を得、これを用いて13を調製した。
トリカルボニル阻害剤11を、ワッセルマンによって詳述された手順に従って調製した（Wassermanら，Tetrahedron Lett. 1992, 33, 6003-6006）。パルミチン酸から誘導された酸塩化物をビス（トリメチルシリル）アセトアミド（BSA）の存在下にtert-ブチル（トリフェニルホスホラニリデン）アセテート（29）で処理し、続いてオキソン酸化することにより11が得られた（図11）。
内在性睡眠誘発脂質（１、シス-9-オクタデセンアミド）の加水分解に関与する酵素オレアミドヒドロラーゼの強力な阻害剤が開発され、該酵素のメカニズム及び睡眠の制御と調節のための薬剤の開発の基本的な根拠が洞察された。
合成プロトコール
概説
旋光をパーキン・エルマー241分光光度計で測定した。UVと可視スペクトルをベックマンDU-70分光計で記録した。1Hと13C NMRスペクトルをブルカーAMX-400とAMX-500分光計により400MHZと500MHZで記録した。高分解能質量スペクトル（HRMS）を高速原子衝撃（FAB）条件下でVG ZAB-ZSE質量分析計により記録した。カラムクロマトグラフィーを70-230メッシュのシリカゲルを用いて行った。分取用TLCをメルクArt. 5744（0.5mm）を用いて行った。
化合物１の合成
化合物１をCravattら，Science 1995, 268, 1506-1509からの手順によって調製した。
化合物４の合成
化合物４をMancuso, A. J.ら，J. Org. Chem. 1978, 43, 2480-2482からの手順によって調製した。
化合物15の合成
化合15をKoutek, B.ら，J. Biol. Chem. 1994, 269, 22937-22940からの手順によって調製した。
化合物16の合成
化合物16をMarx, M. H.ら，J. Med. Chem. 1989, 32, 1319-1322からの手順によって調製した。
化合物18の合成
化合物18をKonenら，J. Org. Chem. 1975, 40, 3253-3258からの手順によって調製した。
化合物20の合成
化合物20をSniderら，J. Org. Chem. 1987, 52, 307-310からの手順によって調製した。
化合物29の合成
化合物29をCookeら，J. Org. Chem. 1982, 47, 4955-4963からの手順によって調製した。
N-ヒドロキシ-9Z-オクタデセンアミド（2）の合成
オレイン酸（250μl、0.79ミリモル、１当量）を無水CH2Cl2（4ml）に溶解し、N2下で0℃まで冷却した。塩化オキサリル（CH2Cl2中2M、1.2ml、2.4ミリモル、３当量）を徐々に加えた。その溶液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、そのフラスコを0℃に冷却した。EtOAc中過剰量のヒドロキシルアミン（その塩酸塩を使用前に50%NaOH溶液からEtOAcへ抽出した）を徐々に加えた。溶媒を減圧下で除去し、クロマトグラフィー（SiO2、1.5×13cm、33−66%EtOAc-ヘキサン勾配溶離）してN-ヒドロキシ-9Z-オクタデセンアミド２を白色固形物として得た（104mg、45%）: mp61-62℃; 1H NMR（CD3OD,400MHZ）δ5.28-5.20（m,2H）,2.00-1.91（m,6H）,1.50（p,2H,J=6.8Hz）,1.22-1.19（m,20H）,0.80（t,3H,J=6.9Hz）; 13C NMR（CD3OD,100MHZ）δ173.0,130.9,130.8,33.8,33.1,30.9（2）,30.6,30.5,30.4,30.33（2）,30.26,30.19,28.2,26.8,23.8,14.5; IR（膜）νmax3276,2999,2917,2849,1665,1621,1463,1428,1117,1067,968cm-1; FABHRMS（NBA-NaI）m/z 320.2577（C18H35NO2+Na+理論値320.2565）。
1-クロロ-10Z-ノナデセン-2-オン（3）の合成
21（347mg、1.13ミリモル、１当量）の試料をEtOAc中1M HCl（4.0ml、4.0ミリモル、3.5当量）で25℃において10分間処理した後、混合液を減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、3×13cm、5%EtOAc-ヘキサン）処理して3（328mg、92%）を透明な油状物として得た: 1H NMR（CD3OD,400MHZ）δ5.29_5.21（m,2H）,4.18（s,2H）,2.48（t,2H,J=7.3Hz）,1.93（m,4H）,1.50（p,2H,J=7.1Hz）,1.31-1.21（m,20H）,0.81（t,3H,J=6.8Hz）; 13C NMR（CD3OD,100MHZ）δ204.5,130.9,130.8,49.3,40.3,33.1,30.9,30.8,30.6,30.5,30.40,30.37,30.19,30.17（2）,28.1,24.6,23.8,14.5; IR（膜）νmax2925,2854,1722,1463,1403,1260,1101,796,723cm-1; FABHRMS（NBA）m/z 315.2468（C19H35OCl+H+理論値315.2455）。
8Z-ヘプタデセナール（5）の合成
N2下25℃において無水ベンゼン（1.6ml）中18（120mg、0.40ミリモル、１当量）をPb（OAc）4（197mg、0.44ミリモル、1.1当量）で処理し、反応混合液を50分間撹拌した。水（2ml）を加え、水層をEtOAc（6×2ml）で抽出した。有機層を乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、2×13cm、1-5%EtOAc-ヘキサン勾配溶離）処理して5（68mg、67%）を透明な油状物として得た。スペクトル特性は文献に記載されたものと一致する（Doleshallら，Tetrahedron Lett. 1977, 381-382; Kempら，J. Am. Oil Chem. Soc. 1975, 52, 300-302）。
2-オキソ-9Z-オクタデセンアミド（6）の合成
Ar下で無水DMF（0.13ml）中17（8mg、0.027ミリモル、１当量）の溶液をPDC（51mg、0.13ミリモル、５当量）で処理し、反応混合液を25℃で１時間撹拌した。粗反応液をH2O（2ml）で処理し、水層をEt2O（4×2ml）で抽出した。有機層を乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、1×3cm、20−66%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）処理して6（6mg、70%）を白色固形物として得、多少の出発物質（2mg、26%）を回収した。6: mp85-86℃; 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ6.79（br,1H）,5.47（br,1H）,5.37-5.28（m,2H）,2.89（t,2H,J=7.4Hz）,2.02-1.93（m,4H）,1.59（p,2H,J=7.2Hz）,1.39-1.24（m,20H）,0.86（t,3H,J=6.8Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ198.6,161.9,130.1,129.6,36.5,31.9,29.7,29.5（2）,29.3（2）,28.9（2）,27.2,27.1,23.1,22.7,14.1; IR（膜）νmax3391,2915,2850,1716,1668,1470,1400,1108cm-1; FABHRMS（NBA-CsI）m/z 428.1547（C18H33NO2+Cs+理論値428.1566）.
2-オキソ-10Z-ノナデセンアミド（7）の合成
25℃において無水CH2Cl2（2.8ml）中26（42mg、0.14ミリモル、１当量）溶液をo-Ph（CO2）I（OAc）3（174mg、0.41ミリモル、３当量）で処理し、反応混合液を1.5時間撹拌した。混合液を10%NaOH水溶液（30ml）で処理し、水層をEtOAc（3×30ml）で抽出した。有機層を乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、1.5×13cm、10−20%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）処理して7（24mg、57%）を白色固形物として得た: mp69-70℃; 1H NMR（CDCl3、400MHZ）δ6.82（br,1H）,5.68（br,1H）,5.36-5.28（m,2H）,2.88（t,2H,J=7.4Hz）,1.98（m,4H）,1.58（p,2H,J=7.0Hz）,1.28-1.24（m,20H）,0.85（t,3H,J=6.9Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ198.7,162.0,130.0,129.7,36.5,31.9,29.74,29.66,29.5,29.3（2）,29.2,29.1,29.0,27.2,27.1,23.1,22.7,14.1; IR（膜）νmax3395,3217,2922,2850,1718,1672,1601,1469,1406,1115cm-1; FABHRMS（NBA-NaI）m/z 332.2570（C19H35NO2+Na+理論値332.2565）.
エチル2-オキソ-9Z-オクタデセノエート（8）の合成
N2下25℃において無水CH2Cl2（1.1ml）中18（102mg、0.34ミリモル、１当量）の溶液をo-Ph（CO2）I（OAc）3（287mg、0.68ミリモル、２当量）で処理し、１時間撹拌した。反応混合液を10%NaOH水溶液（20ml）で処理し、EtOAc（3×20ml）で抽出した。有機層を乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残留物を無水CH2Cl2（1.5ml）に溶解し、N2下で0℃まで冷却した。塩化オキサリル（CH2Cl2中2M、0.5ml、1.0ミリモル、３当量）を徐々に加えた。反応混合液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去し、無水EtOH（5ml）を加えた。クロマトグラフィー（SiO2、2×10cm、1−5%EtOAc−ヘキサン）処理して8（36mg、33%）を透明な油状物として得た: 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ5.37-5.27（m,2H）,4.29（q,2H,J=7.2Hz）,2.81（t,2H,J=7.3Hz）,1.98（m,4H）,1.61（p,2H,J=7.1Hz）,1.36-1.24（m,21H）,0.86（t,3H,J=6.8Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ194.8,161.3,130.1,129.6,62.4,39.3,31.9,29.8,29.5（2）,29.3（2）,28.92,28.86,27.2,27.1,22.9,22.7,14.1,14.0; IR（膜）νmax2925,2854,1729,1462,1260,1056cm-1; FABHRMS（NBA-CsI）m/z 457.1706（C20H36O3+Cs+理論値457.1719）。
エチル2-オキソ-10Z-ノナデセノエート（9）の合成
Ar下25℃において無水THF（0.2ml）中オレイン酸（100μl、0.32ミリモル、１当量）の溶液をDMAP（4mg、0.03ミリモル、0.1当量）、無水ピリジン（77μl、0.95ミリモル、３当量）及び塩化エチルオキサリル（71μl、0.64ミリモル、２当量）で処理した。反応混合液を24時間撹拌した後、更にDMAP（46mg、0.37ミリモル、1.1当量）、ピリジン（80μl、0.95ミリモル、３当量）、塩化エチルオキサリル（80μl、0.64ミリモル、２当量）及びTHF（0.5ml）を加えた。反応混合液を25℃で更に24時間撹拌してから40℃まで48時間温めた後、溶媒を減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、2×13cm、0−10%EtOAc−ヘキサン）処理して9（46mg、43%）を透明な油状物として得た: 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ5.36-5.28（m,2H）,4.29（q,2H,J=7.1Hz）,2.80（t,2H,J=7.3Hz）,1.99（m,4H）,1.60（m,2H）,1.36-1.20（m,23H）,0.85（t,3H,J=6.8Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ194.8,161.2,130.0,129.7,62.4,39.3,31.9,29.7,29.6,29.5,29.3（2）,29.2,29.0,28.9,27.2,27.1,22.9,22.7,14.1,14.0; IR（膜）νmax2925,2854,1730,1465,1260,1059cm-1; FABHRMS（NBA-CsI）m/z 471.1875（C21H38O3+Cs+理論値471.1888）。
エチル2-オキソ-ノナデカノエート（10）の合成
Ar下25℃において無水THF（0.2ml）中ステアリン酸（101mg、0.36ミリモル、１当量）の溶液をDMAP（4mg、0.03ミリモル、0.1当量）、無水ピリジン（85μl、1.1ミリモル、３当量）及び塩化エチルオキサリル（79μl、0.71ミリモル、２当量）で処理した。反応混合液を24時間撹拌した後に溶媒を減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、2×13cm、5−10%EtOAc−ヘキサン）処理して10（35mg、30%）を白色固形物として得た: mp43-44℃; 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ4.29（q,2H,J=7.2Hz）,2.80（t,2H,J=7.4Hz）,1.60（p,2H,J=7.2Hz）,1.35（t,3H,J=7.1Hz）,1.33-1.23（m,28H）,0.86（t,3H,J=6.8Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ194.8,161.2,62.4,39.3,31.9,29.7（7）,29.6,29.40,29.35,29.28,28.9,23.0,22.7,14.1,14.0; IR（膜）νmax2916,2848,1733,1472,1463,723cm-1; FABHRMS（NBA-NaI）m/z 363.2885（C21H40O3+Na+理論値363.2875）。
tert-ブチル3-オキソ-2,2-ジヒドロキシオクタデカノエート（11）の合成
THF−H2O（2:1; 3ml）中28（161g,0.26ミリモル、１当量）の溶液をオキソン（249mg、0.41ミリモル、1.6当量）で処理し、反応混合液を25℃で７時間撹拌した。水（30ml）を加え、水層をEtOAc（3×30ml）で抽出した。有機層を合わせ、乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、2×15cm、10−20%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）して11（65mg、64%）を白色固形物として得た: mp49-51℃; 1H NMR（DMSO-d6,400MHZ）δ6.96（s,2H）,2.17（t,2H,J=7.4Hz）,1.49-1.38（m,11H）,1.22（s,24H）,0.84（t,3H,J=6.8Hz）; 13C NMR（DMSO-d6,100MHZ）δ205.6,174.5,94.2,81.5,35.6,33.6,31.3,29.0（3）,28.9,28.8,28.72,28.70,28.53,28.46,27.4（2）,24.5,22.9,22.1,13.9; IR（膜）νmax3440,2914,2849,1728,1471,1371,1260,1122,831,718cm-11; FABHRMS（NBA-NaI）m/z 409.2925（C22H42O5+Na+理論値409.2930）。
1,1,1-トリフルオロ-10Z-ノナデセン-2-オン（12）の合成
オレイン酸（100μl、0.32ミリモル、１当量）を無水CH2Cl2（1.5ml）に溶解し、N2下で0℃に冷却した。塩化オキサリル（CH2Cl2中2M、0.47ml、0.94ミリモル、３当量）を徐々に加えた。反応混合液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した後に溶媒を減圧下で除去した。無水Et2O（2.2ml）、トリフルオロ酢酸無水物（270μl、1.9ミリモル、６当量）とピリジン（0.2ml、2.5ミリモル、８当量）を25℃で加え、その溶液を45分間撹拌した後に0℃に冷却した。H2O（30ml）を添加して反応液を冷却し、水層をCH2Cl2（3×30ml）で抽出した。有機層を乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、1.5×13cm、5%EtOAc−ヘキサン中1%Et3N）処理して8（75mg、71%）を透明な油状物として得た: 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ5.37-5.28（m,2H）,2.68（t,2H,J=7.3Hz）,1.98（m,4H）,1.65（p,2H,J=7.1Hz）,1.29-1.25（m,20H）,0.86（t,3H,J=6.9Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ191.6（d,J=17Hz）,130.0,129.5,115.6（q,J=145Hz）,36.3,31.9,29.8,29.6,29.5,29.3（2）,29.1,29.0,28.7,27.2,27.1,22.7,22.4,14.1; IR（膜）νmax2926,2855,1766,1467,1404,1261,1208,1153,1039,802,709cm-1; ESIMS m/z（M+）334。
1,1,1-トリフルオロ-9Z-オクタデセン-2-オン（13）の合成
無水CH2Cl2（1.8ml）中27（101mg、0.38ミリモル、１当量）の溶液をN2下で0℃に冷却し、塩化オキサリル（CH2Cl2中2M、0.56ml、1.1ミリモル、３当量）で滴下処理した。反応混合液を25℃に温め、３時間撹拌した後に溶媒を減圧下で除去した。無水Et2O（2.5ml）、トリフルオロ酢酸無水物（0.32ml、2.3ミリモル、６当量）と無水ピリジン（0.12ml、1.5ミリモル、４当量）を25℃で加え、その溶液を２時間撹拌した後に0℃まで冷却した。その反応混合液をH2O（30ml）で処理し、水層をEtOAc（3×30ml）で抽出した。有機層を乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、2×15cm、10%EtOAc−ヘキサン中1%Et3N）処理して13（65.5mg、54%）を透明な油状物として得た: 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ5.39-5.26（m、2H）,2.69（t,2H,J=7.2Hz）,1.99（m,4H）,1.66（m,2H）,1.35-1.24（m,18H）,0.86（t,3H,J=6.9Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ191.4,130.5,129.1,115.6（q,J=146Hz）,36.3,31.9,29.7,29.5,29.3（3）,29.2,28.3,27.2,26.8,22.7,22.3,14.1; IR（膜）νmax2926,2855,1765,1462,1209,1154,1024cm-1; ESIMS m/z（M+Na+）343。
1,1,1-トリフルオロ-10E-ノナデセン-2-オン（14）の合成
無水CH2Cl2（3.5ml）中エライジン酸（204mg、0.72ミリモル、１当量）をN2下で0℃まで冷却し、塩化オキサリル（CH2Cl2中2M、1.1ml、2.2ミリモル、３当量）で処理した。その反応混合液を25℃に温め、３時間撹拌した後に溶媒を減圧下で除去した。無水Et2O（5ml）、トリフルオロ酢酸無水物（0.6ml、4.3ミリモル、６当量）と無水ピリジン（0.23ml、2.8ミリモル、４当量）を25℃で加え、その溶液を１時間撹拌した後に0℃に冷却した。その混合液をH2O（30ml）で処理し、水層をEtOAc（3×30ml）で抽出した。有機層を乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、2×13cm、5−10%EtOAc−ヘキサン中1%Et3N勾配溶離）処理して14（190mg、79%）を透明な油状物として得た: 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ5.41-5.31（m,2H）,2.68（t,2H,J=7.3Hz）,1.94（m,4H）,1.65（p,2H,J=6.9Hz）,1.28-1.24（m,20H）,0.86（t,3H,J=6.6Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ191.5（q,J=35Hz）,130.6,130.1,115.6（q,J=291Hz）,36.3,32.6,32.5,31.9,29.7,29.5（2）,29.3,29.2,29.1,28.8,28.7,22.7,22.4,14.0; IR（膜）νmax2925,2855,1765,1466,1208,1152,967,709cm-1; FABHRMS（NBA-NaI）m/z 334.2475（C19H33OF3-H+理論値334.2484）.
2-ヒドロキシ-9Z-オクタデセンアミド（17）の合成
N2下0℃に冷却した無水CH2Cl2（0.7ml）中18（52mg,0.18ミリモル、１当量）の溶液を塩化オキサリル（CH2Cl2中2M、0.22ml、0.44ミリモル、３当量）で処理した。その溶液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、酸塩化物を0℃に冷却した。その試料を過度に濃縮したNH4OH水溶液で処理した。クロマトグラフィー（SiO2、1.5×10cm、66−100%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）処理して17（31mg、60%）を白色固形物として得た: mp103-104℃; 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ6.37（br、1H）,5.64（br,1H）,5.36-5.28（m,2H）,4.12（t,1H,J=3.8Hz）,2.66（br,1H）,2.02-1.94（m,4H）,1.86-1.77（m,1H）,1.68-1.59（m,1H）,1.43-1.24（m,20H）,0.86（t,3H,J=6.8Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ176.6,130.0,129.7,71.9,34.8,31.9,29.7,29.6,29.5,29.3（2）,29.2,29.1,27.2,27.1,24.9,22.7,14.1; IR（膜）νmax3381,3289,2917,2848,1637,1461,1417,1331,1074cm-1; FABHRMS（NBA）m/z 298.2760（C18H35NO2+H+理論値298.2746）。
2-クロロ-9Z-オクタデセンアミド（19）の合成
N2下0℃に冷却した無水CH2Cl2（0.7ml）中20（48mg、0.15ミリモル、１当量）を塩化オキサリル（CH2Cl2中2M、0.23ml、0.46ミリモル、３当量）で処理した。その溶液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した後に溶媒を減圧下で除去した。粗酸塩化物を0℃に冷却し、過剰量のNH4OH水溶液で処理した。クロマトグラフィー（SiO2、1.5×10cm、20−33%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）処理して19（37mg、78%）を黄色固形物として得た: mp49-50℃; 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ6.49（br,1H）,5.92（br,1H）,5.36-5.27（m,2H）,4.29（m,1H）,2.12-1.86（m,6H）,1.53-1.16（m,20H）,0.85（t,3H,J=6.9Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ171.9,130.1,129.6,60.6,35.5,31.9,29.7,29.6,29.5,29.3（2）,29.0,28.7,27.2,27.1,25.8,22.7,14.1; IR（膜）νmax3383,3183,3001,2921,2850,1657,1465,1412,1240,1100cm-1; FABHRMS（NBA）m/z 316.2415（C18H34NOCl+H+理論値316.2407）。
1-ジアゾ-10Z-ノナデセン-2-オン（21）の合成
N2下でオレイン酸（1.0ml、3.2ミリモル、１当量）を無水CH2Cl2（15ml）に溶解した。その溶液を0℃まで冷却し、塩化オキサリル（CH2Cl2中2M、4.8ml、9.6ミリモル、３当量）を加えた。反応混合液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した後、酸塩化物をすりガラスジョイントのないフラスコに移し、0℃に冷却した。Et2O中過剰量のジアゾメタン（50%KOH水溶液中N-ニトロソメチルウレアから調製、KOHペレットで乾燥）を加えた。反応液を0℃で１時間撹拌した後、25℃で一晩温めた。その溶液をEtOAc（60ml）で希釈し、NaHCO3飽和水溶液（60ml）及びNaCl飽和水溶液（60ml）で洗浄した。有機層を乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、4.0×16cm、5−10%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）処理して21（0.89g、92%）を黄色油状物として得た: 1H NMR（CD3OD,400MHZ）δ5.72（br,1H）,5.29-5.21（m,2H）,2.23（m,2H）,1.94（m,4H）,1.50（p,2H,J=6.9Hz）,1.23-1.20（m,20H）,0.81（t,3H,J=6.9Hz）; 13C NMR（CD3OD,100MHZ）δ198.8,130.9,130.8,41.6,33.1,30.9,30.8（2）,30.6,30.5,30.4（2）,30.3,30.2,28.1（2）,26.5,23.8,14.5; IR（膜）νmax3083,2924,2854,2102,1644,1463,1372,1144cm-1; FABHRMS（NBA）m/z 307.2738（C19H34N2O+H+理論値307.2749）。
N-アミノ-9Z-オクタデセンアミド（22）の合成
N2下0℃において無水CH2Cl2（12ml）中オレイン酸（250μl、0.79ミリモル、１当量）とヒドラジン１水和物（42μl、0.87ミリモル、1.1当量）をEDCI（267mg、0.90ミリモル、1.1当量）及びDMAP（20mg、0.16ミリモル、0.21当量）で処理した後、反応混合液を25℃で７時間撹拌した。別のEDCI（269mg、0.91ミリモル、1.1当量）を加え、反応液を25℃で更に12時間撹拌した後に溶媒を減圧下で除去した。クロマトグラフィー（SiO2、3×18cm、20−100%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）処理して22（123mg、52%）を白色固形物として得た: mp95-96℃; 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ8.94（s,1H）,5.36-5.27（m,2H）,2.23（t,2H,J=7.6Hz）,1.98（m,4H）,1.63（p,2H,J=7.0Hz）,1.27-1.24（m,20H）,0.86（t,3H,J=6.7Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ169.7,130.0,129.7,34.1,31.9,29.8,29.7,29.5,29.3（2）,29.23,29.19,29.12,27.21,27.17,25.4,22.7,14.1; IR（膜）νmax3201,2917,2848,1595,1410,1184,1090,927,717,671cm-1; FABHRMS（NBA-NaI）m/z 297.2916（C18H36N2O+H+理論値297.2906）。
メチル10Z-ノナデセノエート（23）の合成
安息香酸銀（21.8mg、0.095ミリモル、0.1当量）と無水Et3N（0.19ml、1.36ミリモル、1.4当量）を無水CH3OH（1.5ml）中1-ジアゾ-10Z-ノナデセン-2-オン（21、298mg、0.97ミリモル、１当量）の溶液にN2下で滴下し、反応液を25℃で2.5時間撹拌した。反応混合液をEtOAc（30ml）で希釈し、1NHCl水溶液（30ml）及びNaHCO3飽和水溶液（30ml）で洗浄した。有機層を乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、3×15cm、1−5%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）処理して23（246mg、82%）を透明な油状物として得た: 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ5.35-5.27（m,2H）,3.63（s,3H）,2.27（t,2H,J=7.6Hz）,1.97（m,4H）,1.59（p,2H,J=7.3Hz）,1.26-1.24（m,22H）,0.85（t,3H,J=6.8Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ174.3,129.9,129.8,51.4,34.1,31.9,29.74,29.70,29.5,29.3（2）,29.2（2）,29.1（2）,27.2（2）,24.9,22.6,14.1; IR（膜）νmax2925,2854,1744,1465,1436,719cm-1; FABHRMS（NBA-NaI）m/z 311.2969（C20H38O2+H+理論値311.2950）。
10Z-ノナデセン酸（24）の合成
25℃においてTHF−CH3OH−H2O（3:1:1; 7ml）中23（620mg、2.0ミリモル、１当量）をLiOH・H2O（250mg、5.96ミリモル、３当量）で処理し、反応混合液を３時間撹拌した。1N HCl水溶液（60ml）を加えて反応混合液を酸性にし、水層をEtOAc（2×60ml）で抽出した。有機層を乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、4×15cm、10−100%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）処理して24（510mg、86%）を薄黄色油状物として得た: 1H NMR（CDCl3、400MHZ）δ5.37-5.28（m,2H）,2.32（t,2H,J=7.5Hz）,1.98（m,4H）,1.61（p,2H,J=7.3Hz）,1.27-1.25（m,22H）,0.86（t,3H,J=6.9Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ180.4,130.0,129.8,34.1,31.9,29.8,29.7,29.5,29.3（2）,29.2（2）,29.0（2）,27.20,27.17,24.6,22.7,14.1; IR（膜）νmax2925,2854,1711,1466,1412,1260,1093,1019,938,801,722cm-1; FABHRMS（NBA-NaI）m/z 319.2605（C19H36O2+Na+理論値319.2613）。この化合物をDoleshall, G. Tetrahedron Lett. 1980, 21, 4183-4186の方法によっても調製した。
2-ヒドロキシ-10Z-ノナデセン酸（25）の合成
Ar下−55℃において無水THF（2ml）中ジイソプロピルアミン（0.4ml、2.9ミリモル、4.5当量）とn-BuLi（2.3M、1.1ml、2.5ミリモル、４当量）からLDAの新しい溶液を調製した。そのLDA溶液にTHF（0.5ml）中10Z-ノナデセン酸（24、188mg、0.63ミリモル、１当量）と無水HMPA（0.11ml、0.63ミリモル、１当量）の溶液を−55℃において滴下した。反応混合液を25℃まで徐々に温め、50℃で30分間加温した。反応混合液を再び25℃に冷却し、その溶液にO2を20分間吹き込んだ。混合液を1N HCl水溶液（30ml）で処理し、水層をEtOAc（3×30ml）で抽出した。有機層を乾燥（Na2SO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、2×13cm、50−100%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）処理して25（96mg、49%）を白色固形物として得た: mp53-54℃; 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ5.36-5.28（m,2H）,4.24（dd,1H,J=7.5Hz,7.6Hz）,1.98（m,4H）,1.83（m,1H）,1.67（m,1H）,1.47-1.24（m,22H）,0.86（t,3H,J=6.8Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ179.8,130.0,129.7,70.2,34.2,31.9,29.8,29.7,29.5,29.33,29.31（2）,29.22,29.19,27.20,27.16,24.8,22.7,14.1; IR（膜）νmax3512,2917,2849,1704,1467,1293,1274,1251,1212,1143,1079,1041,918,726,648cm-1; FABHRMS（NBA-NaI）m/z 335.2574（C19H35O3+Na+理論値335.2562）。
2-ヒドロキシ-10Z-ノナデセンアミド（26）の合成
N2下で無水CH2Cl2（1.5ml）中25（71mg、0.23ミリモル、１当量）の溶液を0℃に冷却し、塩化オキサリル（CH2Cl2中2M、0.34ml、0.68ミリモル、３当量）で滴下処理した。反応混合液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を0℃に冷却し、過剰量の濃NH4OH水溶液（2ml）を加えた。クロマトグラフィー（SiO2、1.5×13cm、50−66%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）処理して26（53mg、75%）を白色固形物として得た: mp101-102℃; 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ6.36（br,1H）,5.65（br,1H）,5.36-5.28（m,2H）,4.12（dd,1H,J=7.9Hz,8.0Hz）,1.99（m,4H）,1.81（m,1H）,1.63（m,1H）,1.43-1.24（m,22H）,0.86（t,3H,J=6.9Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ176.6,130.0,129.8,71.9,34.8,31.9,29.8,29.7,29.5,29.4,29.3（3）,29.2,27.20,27.16,24.9,22.7,14.1; IR（膜）νmax3383,3290,2917,2849,1644,1467,1426,1331,1075cm-1; FABHRMS（NBA-NaI）m/z 334.2731（C19H37NO2+Na+理論値334.2722）。
8Z-ヘプタデセン酸（27）の合成
N2下25℃においてtBuOH（6.5ml）中5（66mg、0.26ミリモル、１当量）と2-メチル-2-ブテン（1.6ml、15.1ミリモル、58当量）の溶液を脱イオンH2O（2.5ml）中NaClO2（80%、208mg、2.3ミリモル、９当量）とNaH2PO4・H2O（250mg、1.8ミリモル、７当量）の溶液で滴下処理した。反応混合液を更に15分間撹拌した後、減圧下で濃縮した。残留物を水（30ml）で処理し、水層をEtOAc（3×30ml）で抽出した。有機層を乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、2×13cm、10−20%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）処理して27（66mg、95%）を透明な油状物として得た。スペクトル特性は、文献のMirallesら，Lipids 1995, 30, 459-466; Coudercら，Lipids 1995, 30, 691-699に記載されたものと一致する。
3-オキソ-2-（トリフェニルホスホラニリデン）オクタデカノエート（28）の合成
N2下で無水CH2Cl2（2ml）中パルミチン酸（103mg、0.40ミリモル、１当量）を0℃に冷却し、塩化オキサリル（CH2Cl2中2M、0.6ml、1.2ミリモル、３当量）で処理した。その溶液を25℃で３時間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去した。5℃において無水ベンゼン（3ml）中tert-ブチル（トリフェニルホスホラニリデン）アセテート（Cookeら，J. Org. Chem. 1982, 47, 4955-4963）29、167mg、0.44ミリモル、1.1当量）とビス（トリメチルシリル）アセトアミド（195μl、0.79ミリモル、２当量）の溶液をベンゼン（3ml）中粗酸塩化物の溶液で滴下処理した。反応混合液を25℃に温め、1.5時間撹拌した後に溶媒を減圧下で除去した。クロマトグラフィー（SiO2、2×15cm、10−20%EtOAc−ヘキサン勾配溶離）処理して28（193mg、78%）を透明な油状物として得た: 1H NMR（CDCl3,400MHZ）δ7.67-7.61（m,6H）,7.49-7.37（m,9H）,2.82（t,2H,J=7.6Hz）,1.55（p,2H,J=7.0Hz）,1.23-1.21（m,24H）,1.04（s,9H）,0.86（t,3H,J=6.8Hz）; 13C NMR（CDCl3,100MHZ）δ197.9（d,J=6Hz）,167.3（d,J=13Hz）,132.9（d,6C,J=9Hz）,131.3（3）,128.4（d,6C,J=12Hz）,127.4（d,3C,J=96Hz）,78.4,71.2（d,J=114Hz）,40.0,31.9,29.70（8）,29.66,29.3,28.1（3）,25.9,22.7,14.1; IR（膜）νmax3426,2923,2852,1665,1551,1438,1363,1302,1173,1106,1081,746,690cm-1; FABHRMS（NBA-CsI）m/z 615.3959（C40H55O3P+H+理論値615.3967）。
結合定数の測定
オレアミド加水分解に対する化合物の効力を、反応生成物としてのアンモニアを直接測定するイオン選択性アンモニア電極（ATI/Orion）を用いて評価した。オレイン酸以外のKiは全てディクソン法によって求めた。（一定基質濃度での1/速度プロットに対する［I］の加重直線フィットのX切片を式Ki=Xint/［1+［S］/Km］を用いてKiに変換した。）基質と阻害剤の濃度に対する速度の非直線加重最小自乗法からオレイン酸のKiを得た。酵素的に触媒したオレアミド加水分解の速度が最大であるpH10.0に調整した10mlの50mM CAPS緩衝液（Sigma）中で絶えず撹拌しながら分析を行った。ディクソン分析に関係する全ての例において、基質濃度は100μMとした。10〜100μMの基質濃度範囲でオレイン酸のKiを求めた。基質と阻害剤をDMSOに溶解した後に50mM CAPS緩衝液に加え、最終DMSO分析濃度1.67%を生成した。20%までの濃度のDMSOは、速度に対する影響がわずかであった。阻害剤の存在しないときに約0.2μM/分の速度を生じるように酵素濃度を調節し、７〜10分間にわたってアンモニアの生成速度を観測した。
酵素をラット肝由来の膜含有未精製不均一標品として用いた。５分間煮沸した酵素は活性を示さなかった。溶解度限度内で阻害剤は全て100Kiより大きい濃度で活性阻害100%を達成した。付加したオレアミドの存在しないときに検出可能な活性は見られなかった。同様に、このpHで酵素の存在しないときの100μMオレアミドからのアンモニア生成は極めて少量しか検出されなかった。これにより、この未精製酵素標品において観測されたオレアミド加水分解触媒活性は単一タンパク質によることが示される。
オレアミドのKmは、４回の独立した分析から得た平均Kmとして求めた。ラインウィーバー・バークプロットにおけるでデータの加重直線フィットから各々独立したKmを得た。非直線法によるオレイン酸阻害測定の結果として一致している５番目のKmを得た。速度データは、標準ミカエリス・メンテン速度論の式と一致した。（ピンポンBi Bi速度論の速度式は、第２基質、この場合水の濃度が一定である場合には簡単なミカエリス・メンテンのような式になる。）30〜100μMの範囲では、反応速度は実質的に基質濃度に全く依存しない。
我々は酵素試料中に存在するオレアミドヒドロラーゼ量をいまだ求めることができないことから、ここではVmax値を提示していない。我々の阻害データから酵素濃度が2nMより小さいことが示される。高い酵素濃度は溶液中の阻害剤の著しい不足を引き起こし、［E］≫Kiの極限の場合に［E］/2として測定される見掛け上のKiを生じるからである。1nMが測定した最低阻害定数であったことから、［E］<2nMである。
Kiと共に提示された誤差値は、データの誤差処理が伝わることから誘導されたグッドネス・オブ・フィット推定値とみなさなければならない。必ずしも再現性を意味しない。しかしながら、実験を繰り返す場合においてはここに示された見掛け上の誤差によって予想したように結果は統計的に一致した。
pH-速度依存性
5%DMSOを含有する適切なpHの20ml緩衝液中200μMオレアミド（ほぼ溶解限度）の溶液に未精製酵素を加えた。（20%までのDMSO濃度は酵素速度に対する影響は最小であった。）pH4〜9範囲のデータについては50μMクエン酸ナトリウム/ビス-トリス緩衝液を用いた。pH8〜11範囲のデータについては50mMビス-トリス/CAPSを用いた。pH12における溶液は自己緩衝液になるとした。周期的間隔で1mlの分割量を取り出し、9mlのpH14緩衝液で希釈した。アンモニア濃度を720Aメーター（Orion）に接続したイオン選択性アンモニア電極（Orion）を用いて測定し、既知の標準に対して検定した。標準最小自乗法を用いて適合した曲線の直線部分から速度を得た。その速度をpHに対してプロットし、加重非直線最小自乗法（Connors, K. A., Binding Constants; Wiley:ニューヨーク，1987, pp385-395）による図12の式（Fersht, A., Enzyme Structure and Mechanism; W. H. Freeman and Co.:ニューヨーク，1985, pp 157 Connors, K. A., Binding Constants; Wiley:ニューヨーク，1987, pp 385-395）をあてはめた。
２つのpKaが共に近接（１単位未満）する場合には、実質的に様々な種の酵素の混合が溶液中に存在する。そのような条件下では最も活性な種の酵素が高度の存在量に決して達しないので、その種の最大速度理論値が現れることは実際には決して見られない。pKa測定の簡単なグラフ的方法がここに提示されたpH単位の9.7と10.3値と一致しないことはこのためである。
大量の肝原形質膜標品、（12〜14ラット肝）
12〜14のラット肝の切片をつくり、300mlの1mM NaHCO3に入れた。さいの目に刻んだ肝臓の溶液を精製し、更に300mlの1mM NaHCO3で洗浄した。はっきり見える結合組織を切除した。その肝臓を新鮮な800mlの1mM NaHCO3に移し、撹拌してから、400mlの分割量でブレンダーに移した。ブレンドした肝分割量を合わせ、８層のチーズクロスでろ過した。これを1mM NaHCO3で1.0リットルに希釈し、6000rpm、4℃で20分間遠心分離した（BeckmanJA-17ローター）。上清を傾瀉し、沈降物を1mM NaHCO3に懸濁し合わせ、ダウンスホモジェナイズした。遠心分離、傾瀉及び懸濁/均質化を繰り返して最終容量約90mlを得た。ホモジェネートを２容量当量の67%スクロースに加え、十分に混合し、超遠心用コンパチブルチューブに移した。その上部を30%スクロースでおおい、27,000で２時間遠心した（SW-28ローター）。中間の黄色バンドをスクロース勾配から取り出し、合わせ、1mM NaHCO3に懸濁し、ダウンスホモジェナイズした。試料を17,000rpm、4℃で45分間遠心分離した（JA-17ローター）。上清を除去し、沈降物を100mM Na2CO3に懸濁し、ダウンスホモジェナイズし、30分間氷上で放置した。その溶液を27,000rpmで１時間遠心分離（SW-28ローター）し、上清を傾瀉し、沈降物を15mlの50mMトリスHCl、pH7.4と1mM EDTAに懸濁し、ダウンスホモジェナイザーでホモジェナイズした。この物質を多数の分割量に分け、使用まで-78℃に冷凍した。各酵素試料を１回だけ冷凍した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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