(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フザリウム属菌の生菌体と、セピオライトおよびアタパルジャイトから選ばれる層−リボン構造を有する粘土鉱物とを含むフザリウム属菌生菌製剤。
【請求項２】
生菌体が芽胞を含むものである請求項１記載のフザリウム属菌生菌製剤。
【請求項３】
増量剤、結合剤または界面活性剤をさらに含む請求項１または２記載のフザリウム属菌生菌製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の病害を抑制するための非病原性フザリウム属菌生菌製剤に関し、特に農園芸において抵抗性誘導あるいは交叉防御法に用いられるフザリウム属菌の生菌体を含む固体製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
土壌あるいは養液栽培液中には多くの伝染性病原菌が生息しており、植物の生育に多大な影響を与えている。これら病原菌防除の方法として、病原菌を熱や薬剤などで直接殺菌するのではなく、病原菌の活性を低下させたり、感染を阻止することによる生態的防除方法が注目されている。このうち病原菌の活性低下による防除方法としては、輪作、土壌理化学性の改善や有機物施用、拮抗微生物の導入等があげられるが、いずれも活性抵下や菌数減少といった消極的な効果しか得られない。
【０００３】
感染を阻止する方法としては、特定の病原菌に抵抗性を示す抵抗品種の育成、誘導物質による抵抗性誘導あるいは異なった病原菌に同時に抵抗性を示す交叉防御法が知られている。例えば、トマト萎凋病菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）によるトマト萎凋病に対して、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ククメリナム（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）の前接種による発病抑制効果が大きいことが報告されている〔山口健一、飯田  格  他：日植病夏期関東部会講演要旨  １９９３年〕。
【０００４】
またカーネーションではフザリウム・ローゼアム“アベナセアム”（Fusarium roseum “Avenaceum"）による立枯病に対して、非病原性のフザリウム・ローゼアム（Fusarium roseum）が発病抑制効果を有するとの報告がある〔ベイカー、ハンキー、ドッテラー：ファイトバソロジー（BAKER, HANCHEY, DOTTARAR: Phytopathology）１９７８年〕。
【０００５】
さらに、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・バテイタス（Fusarium oxysporum f. sp. batatas）によって起こるサツマイモつる割れ病に対して、サツマイモ導管部から分離した非病原性フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）のさし芽切り口浸漬などの前接種が発病抑制効果が高いと報告されている〔小川  奎、駒田  旦：日植病報、５０，１９８４年〕。
【０００６】
しかしこれらのフザリウム菌を用いた微生物防除法は、１）液体培養した生菌をそのまま使用するため雑菌が混入して繁殖しやすい、２）フザリウム菌は振とう培養によって多くの芽胞が形成されるが、静置保管すると、芽胞は防除活性のない菌糸体に変化する、３）液状のため搬送が不便で、温度等の影響を受けやすく、一定の菌数を維持できない等の理由により大量生産が困難で、流通性に乏しい。
【０００７】
そこでこれらの点を改善するために、非病原性フザリウム属菌をはじめとする農業有用微生物の安定化およびその製剤化の検討が行われている。例えばフザリウム菌に関しては、生菌体をゼオライト系基材に吸着させ、自然乾燥した製剤（特開昭６３−２２７５０７号）、Ｄ−ソルビトールを主体とし、これに少量のグルタミン酸塩を添加した分散媒にフザリウム菌の生菌体を分散し、真空凍結乾燥させたフザリウム生菌製剤（特開昭６３−２２７５０７号）、バーク炭に吸着させた資材（特開平３−１１２９０９号）およびキチン質含有物と菌を混合した資材（特開平６−２４９２４号）および白土または炭酸カルシウムに菌を保持させた資材（特開平８−２９４３８５号）が知られている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、フザリウム菌の生菌体をゼオライト系基材に吸着させた製剤は、クレー、タルク等に吸着させたものより菌の生存率が高いとされているが、室温で保存すると生存菌数が急速に減少する。またＤ−ソルビトールを主体とし、これに少量のグルタミン酸塩を添加した分散媒にフザリウムの生菌体を分散し、真空凍結乾燥させた製剤は、所定の菌数を維持するために冷蔵庫中に製剤を保管しなければならない。またバーク炭に吸着させた資材およびキチン質含有物と菌を混合した資材もフザリウム属菌の増殖により高活性を得ることを目的としており、室温での長期間の保存性には問題がある。また白土または炭酸カルシウムにフザリウム菌を保持させる製剤は、室温での長期保存性はあるものの、製剤を乾燥する際に２〜１５℃という低温で乾燥するため、１〜７日間かかり製剤の完成までに時間がかかり過ぎるという欠点を有している。
【０００９】
本発明の課題は、生菌体の生存率が高く、かつ室温で長期にわたって保存可能であるとともに耐熱性も高く、流通性に優れるフザリウム属菌生菌製剤を提供することである。
本発明の他の課題は、生菌体の生存率が高く、かつ室温で長期にわたって保存可能であって、耐熱性も高く流通性に優れるとともに、水に希釈して用いる際も、持続可能な高い懸垂性を有し、取り扱いに優れるフザリウム菌生菌製剤を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は次のフザリウム属菌生菌製剤である。
（１）フザリウム属菌の生菌体と、セピオライトおよびアタパルジャイトから選ばれる層−リボン構造を有する粘土鉱物とを含むフザリウム属菌生菌製剤。
（２）生菌体が芽胞を含むものである上記（１）記載のフザリウム属菌生菌製剤。
（３）増量剤、結合剤または界面活性剤をさらに含む上記（１）または（２）記載のフザリウム属菌生菌製剤。
【００１１】
本発明のフザリウム属菌生菌製剤に用いるフザリウム属菌は、フザリウム（Fusarium）属に属する真菌であって、特に抵抗性誘導、あるいは交叉防御法に適した病原菌に対する防除性能を有するものが好ましい。
【００１２】
このようなフザリウム属菌としては、例えばフザリウム  オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム  モニリフォルメ（Fusarium moniliforme）、フザリウム  ローゼアム（Fusarium roseum）、フザリウム  ソラニ（Fusarium solani）、その他のフザリウム属に属する菌があげられる。
【００１３】
製剤に用いる菌は生菌体であって、芽胞を主体とするものが好ましいが、厚膜胞子あるいは菌糸体が含まれていてもよい。フザリウム菌は液体培地を用いて振とう培養すると、芽胞を主体とする生菌体が得られる。本発明ではこのような芽胞を含む培養物全体をそのまま用いてもよく、また濾過、遠心分離等により培養液画分を除いた菌体部分を用いてもよい。
【００１４】
フザリウム属菌の培養に用いる培地としては特に制限されず、フザリウム属菌を培養できるものであれば任意に選択できるが、液体培地が好ましく、例えばポテト−デキストロール培地、ポテト−スクロース培地、駒田培地、ツァペック−ドックス培地などが使用できる。これらの培地は所定濃度のものが好ましく、滅菌後フザリウム菌を接種し、２５〜３０℃の温度で１〜３０日間振とう培養することにより芽胞濃度の高い培養物を得ることができる。
【００１５】
本発明で用いる層−リボン構造の粘土鉱物は輝石に似た単鎖が複数本（例えば２〜３本）結合して四面体リボンを形成している粘土鉱物であり、セピオライトおよびアタパルジャイトから選ばれるものであるが、これらの変種も含まれる。これらの粘土鉱物は塊状、繊維状、紙状などの形状で産出し、そのままの形状で用いてもよいが、一般的には粉砕して粉粒径０．０１〜１００μｍ、好ましくは１〜５０μｍの粉末として用いるのが好ましい。
【００１６】
本発明の生菌製剤はフザリウム属菌の生菌体と前記層−リボン構造の粘土鉱物との組成物からなるものであり、両成分は単に混合した組成物でもよいが、生菌体を含む液を粘土鉱物に吸着させて乾燥することにより、生菌体を粘土鉱物に固定したものが好ましい。生菌体を含む液としては、振とう培養による培養物、この培養物から分離した芽胞を含む生菌体を別の液に分散した、分散物などがあげられる。
【００１７】
組成物中の生菌体の割合は乾重基準で１〜９０重量％、好ましくは２〜８０重量％、さらに好ましくは３〜７０重量％、粘土鉱物の割合は乾重基準で１０〜９９重量％、好ましくは２０〜９８重量％、さらに好ましくは３０〜９７重量％である。組成物中の菌体濃度は、組成物中に芽胞１０〜１×１０10個−芽胞／ｇ−組成物、好ましくは１×１０3〜１×１０9個−芽胞／ｇ−組成物、さらに好ましくは１×１０5〜１×１０8個−芽胞／ｇ−組成物とするのが好適である。
【００１８】
本発明の生菌製剤は上記フザリウム属菌の生菌体および層−リボン構造の粘土鉱物のみからなるものでもよいが、適用する剤型に応じてこれらの成分のほかに、増量剤、結合剤、界面活性剤等の他の成分を含んでいてもよい。これらの添加剤はフザリウム菌に対して無害であるか、あるいはほとんど影響を及ぼさないものが好ましい。
例えば本発明の生菌製剤を粉剤、粒剤などとして用いる場合、生菌製剤を希釈して生菌濃度を低くする方が施用が容易になるので、増量剤を添加することができる。
【００１９】
増量剤としては水溶性増量剤あるいは非水溶性増量剤を用いることができ、これらを組合せて用いることもできる。水溶性増量剤としては、例えば硫酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の有機または無機酸塩類；クエン酸、コハク酸等の有機酸塩類；ショ糖、ラクトース等の糖類；尿素などをあげることができる。また非水溶性増量剤は一般的に鉱物質微粉末が用いられ、例えばクレー類、炭酸カルシウム、タルク、天然珪藻土、合成珪藻土、ベントナイト、ホワイトカーボンなどをあげることができる。これらの増量剤の組成物中の割合は乾重基準で０〜８０重量％、好ましくは５〜６０重量％とすることができる。
【００２０】
また本発明の生菌製剤を粒剤または粒状の水和剤などとするときには結合剤を配合するのが好ましい。
結合剤は農薬粒状組成物に一般的に用いられるもので、水溶性のものが好ましい。例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム塩、デキストリン、水溶性デンプン、キサンタンガム、グアシードガム、ショ糖、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどをあげることができる。これらの結合剤の組成物中の割合は乾重基準で０〜１０重量％、好ましくは０．０１〜５重量％、さらに好ましくは０．１〜５重量％とすることができる。
【００２１】
本発明の生菌製剤を水和剤あるいは粒状水和剤の形態とする場合には、水への分散を良好にするために、界面活性剤を用いることができる。界面活性剤としては、例えばポリエチレングリコール高級脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンアリルフェニルエーテル、ソルビタンモノアルキレート等のノニオン性界面活性剤；アルキルアリールスルホン酸塩、ジアルキルスルホン酸塩、リグニンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩およびその縮合物、アルキル硫酸エステル塩、アルキル燐酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルアリール燐酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアリルフェニルエーテル燐酸塩、ポリカルボン酸型高分子活性剤等のアニオン性界面活性剤などをあげることができる。これらの界面活性剤は単独で、あるいは２種類以上を混合して用いることができる。これらの界面活性剤の組成物中の割合は乾重基準で０〜３０重量％、好ましくは０．１〜２０重量％、さらに好ましくは１〜１０重量％とすることができる。
【００２２】
本発明のフザリウム属菌生菌製剤は耐熱性を有するため、室温以上の温度で乾燥することができる。従って、従来のフザリウム属菌生菌製剤に比べ、短時間で製剤を乾燥することができ、工業的にも有利である。乾燥温度は通常２〜７０℃、好ましくは１５〜６０℃、さらに好ましくは２５〜５０℃である。乾燥時間は０．１時間〜２４時間、好ましくは０．２時間〜１２時間、さらに好ましくは０．５時間〜６時間であり、このときの製剤の最終水分含量は１〜３０重量％、好ましくは２〜２０重量％、さらに好ましくは５〜１５重量％である。
【００２３】
本発明のフザリウム属菌生菌製剤は、フザリウム属菌の生菌体を層−リボン構造を有する粘土鉱物と配合することにより製造される。この場合フザリウム属菌培養物、あるいはそれを遠心分離や濾過することにより得た芽胞成分の液を、粘土鉱物と均一に混合後、乾燥して製造するのが好ましい。乾燥の際、粉末が凝集して固まる場合は粉砕することができる。
増量剤その他の添加剤は上記の組成物が得られたのち配合してもよいが、予め粘土鉱物と混合した状態で培養物または分離した菌体を含む液と混合して乾燥させるのが好ましい。
【００２４】
本発明の生菌製剤を水和剤とする場合は、上記の方法で得たフザリウム属菌を含有する粉末と界面活性剤を混合して得るか、あるいは予めフザリウム属菌培養物、あるいはそれを遠心分離や濾過することにより得た芽胞成分と界面活性剤を混合した液を、粘土鉱物および必要に応じて増量剤を配合した粉末と均一に混合後、乾燥して製造することができる。乾燥の際、粉末が凝集して固まる場合は粉砕することができる。
【００２５】
本発明の生菌剤を粒剤とする場合は、上記で得た生菌体および粘土鉱物の組成物とを配合し、また粒状水和剤とする場合は、上記の組成物と界面活性剤、および必要に応じて結合剤を配合し、攪拌造粒、転動造粒、流動層造粒、練り押し造粒後乾燥するか、あるいは予めフザリウム属菌培養物、あるいはそれを遠心分離や濾過することにより得た芽胞成分と界面活性剤を混合した液と粘土鉱物および必要に応じて増量剤、結合剤等を配合し、同様の方法で造粒後乾燥し製造することができる。
【００２６】
こうして得られた本発明のフザリウム属菌生菌製剤は、粉剤または粒剤の場合、水に希釈しないでそのまま、発芽前の種子や塊茎またはさし芽切り口等を直接処理し、あるいは土壌等に直接施用する。これにより接種されたフザリウム属菌が増殖し、病原菌の増殖を抑制し、発病を防止することができる。水和剤または粒状水和剤の場合は、上記により得た生菌製剤を水に希釈して散布するか、あるいは種子等を直接処理して使用することにより、同様の防除効果を得ることができる。
【００２７】
上記のように調製されたフザリウム属菌生菌製剤は固体状態であって、室温で製造、乾燥ができ、また長期間保存し、流通させることが可能であり、保存流通後においても初期の効能を維持する。また水和剤または粒状水和剤は使用場面においては、直接または水に希釈して施用できるなど、取扱が簡便であり、懸垂分散性に優れているため、一般農薬と同様の簡単な用法で十分な防除効果が得られる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。
実施例では、東京大学応用微生物研究所保存菌株で標準菌株であるフザリウムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）ＩＡＭ−５００９、農林水産省生物資源研究所保存菌株フザリウム  モニリフォルメ（Fusarium moniliforme）ＭＡＦ−２３５４６３および非病原性フザリウム  スピシーズ（Fusarium sp.）ＫＦ−０２７０を試験菌として用いた。
【００２９】
実施例１
ポテト−デキストロース培地（ディフコ社製）３００ｍｌを１００ｍｌずつ３本に分注し、滅菌後それぞれにＩＡＭ−５００９株、ＭＡＦ−２３５４６３株およびＫＦ−０２７０株を接種して、２７℃で３日間振盪培養し、芽胞が主体である菌体を得た。これらをそれぞれ濾過による集菌後、菌体を１０ｍｌの水に懸濁し、それぞれにアタパルジャイト（水分含量約３重量％）を１０ｇずつ加えてよく混合し、４０℃で５０分間乾燥し破砕した。このときの各製剤の水分含量は６重量％±０．５重量％であった。これらの操作によりフザリウムＩＡＭ−５００９株製剤１０．９ｇ、ＭＡＦ−２３５４６３株製剤１０．９ｇおよびＫＦ−０２７０株製剤１０．８ｇを得た。
【００３０】
実施例２
実施例１と同様にポテト−デキストロース培地で培養し、芽胞が主体である菌体を得た。集菌後、菌体を１０ｍｌの水に懸濁し、それぞれにセピオライト（水分含量約３重量％）を１０ｇずつ加えてよく混合し、４０℃で５０分間乾燥し破砕した。このときの各製剤の水分含量は６重量％±０．４重量％であった。これらの操作によりフザリウムＩＡＭ−５００９株製剤１０．９ｇ、ＭＡＦ−２３５４６３株製剤１０．８ｇおよびＫＦ−０２７０株製剤１０．９ｇを得た。
【００３１】
実施例３
実施例１と同様にポテト−デキストロース培地で培養し、芽胞が主体である菌体を得た。集菌後、菌体を１０ｍｌの水に懸濁し、トキサノンＧＲ−３１Ａ（ポリカルボン酸高分子界面活性剤：三洋化成工業社製）を１ｇずつ加えて混合し、それぞれにアタパルジャイト（水分含量約３重量％）を８．８ｇ、結合剤としてシペリナート０．１ｇ、ポリビニルピロリドン０．１ｇずつ加えてよく混合し、４０℃で５０分間乾燥し破砕した。このときの各製剤の水分含量は６重量％±０．６重量％であった。これらの操作により、水懸垂性のあるフザリウムＩＡＭ−５００９株製剤１１．０ｇ、ＭＡＦ−２３５４６３株製剤１０．９ｇおよびＫＦ−０２７０株製剤１１．１ｇを得た。
【００３２】
実施例４
実施例１と同様にポテト−デキストロース培地で培養し、芽胞が主体である菌体を得た。集菌後、菌体を１０ｍｌの水に懸濁し、トキサノンＧＲ−３１Ａ（ポリカルボン酸高分子界面活性剤：三洋化成工業社製）を１ｇずつ加えて混合し、それぞれにセピオライト（水分含量約３重量％）を８．８ｇ、結合剤としてシペリナート０．１ｇ、ポリビニルピロリドン０．１ｇずつ加えてよく混合し、４０℃で５０分間乾燥し破砕した。このときの各製剤の水分含量は６重量％±０．３重量％であった。これらの操作により、水懸垂性のあるフザリウムＩＡＭ−５００９株製剤１０．８ｇ、ＭＡＦ−２３５４６３株製剤１０．９ｇおよびＫＦ−０２７０株製剤１１．０ｇを得た。
【００３３】
比較例１
実施例１と同様にポテト−デキストロース培地で培養し、芽胞が主体である菌体を得た。集菌後、菌体を１０ｍｌの水に懸濁し、それぞれにゼオライト（水分含量約３重量％）を１０ｇずつ加えてよく混合し、２７℃で１晩乾燥して破砕した。このときの各製剤の水分含量は８重量％±０．３重量％前後であった。これらの操作によりフザリウムＩＡＭ−５００９株製剤１０．９ｇ、ＭＡＦ−２３５４６３株製剤１０．８ｇおよびＫＦ−０２７０株製剤１０．９ｇを得た。
【００３４】
比較例２
実施例１と同様にポテト−デキストロース培地で培養し、芽胞が主体である菌体を得た。集菌後、菌体を１０ｍｌの水に懸濁し、トキサノンＧＲ−３１Ａ（ポリカルボン酸高分子界面活性剤：三洋化成工業社製）を１ｇずつ加えて混合し、それぞれにゼオライト（水分含量約３重量％）を８．８ｇ、シペリナート０．１ｇ、ポリビニルピロリドン０．１ｇずつ加えてよく混合し、２７℃で１晩乾燥して破砕した。このときの各製剤の水分含量は８重量％±０．４重量％前後であった。これらの操作により水懸垂性のあるフザリウムＩＡＭ−５００９株製剤１１．０ｇ、ＭＡＦ−２３５４６３株製剤１０．９ｇおよびＫＦ−０２７０株製剤１１．１ｇを得た。
【００３５】
試験例１  フザリウム生菌粉剤の保存性（１）
実施例１〜４、比較例１〜２で調製した製剤を室温（温度２０〜３５℃）に放置し、製剤調製直後から６ヶ月間、１ヶ月毎に製剤１ｇ当たりに生存している菌数を希釈平板法にて調査した。結果を図１ないし図３に示す。その結果、実施例１〜４のものは比較例１〜２のものに比べて室温保存にもかかわらず、いずれの製剤も菌の生存率が高く、また殆ど菌の減少は観察されず、長期保存性が高いことがわかる。
【００３６】
試験例２  フザリウム生菌粉剤の保存性（２）
実施例１〜４、比較例１〜２で調製した製剤を室温（温度２０〜３５℃）、５０℃および７０℃に２４時間放置した後、製剤１ｇ当たりに生存している菌数を希釈平板法にて調査した。その結果、表１に示した通り、実施例１〜４の製剤は比較例１〜２のものに比べていずれも高い耐熱性を有し、保存性が高いことがわかる。
【００３７】
【表１】
0004161395.tif 000002
【００３８】
試験例３  フザリウム生菌水和性製剤の懸垂性
１００ｍｌ計量用のメスシリンダーに水を１００ｍｌ入れ、そこに実施例３〜４、比較例２で調製した製剤を０．１ｇ懸濁させた。懸濁直後と２４時間後にメスシリンダーの中央部から懸濁水を採取し、１ｍｌ中に生存しているフザリウム菌について希釈平板法にて調査した。その結果、表２に示した通り、実施例３〜４の製剤は比較例のものに比べていずれも、高い懸垂性が持続することがわかる。
【００３９】
【表２】
0004161395.tif 000003
【００４０】
【発明の効果】
本発明のフザリウム属菌生菌製剤は、フザリウム属菌の生菌体と、セピオライトおよびアタパルジャイトから選ばれる層−リボン構造を有する粘土鉱物を含むため、生菌体の生存率が高く、室温での長期保存性および耐熱性も高く、流通性に優れたフザリウム菌生菌製剤が得られる。本発明のフザリウム菌生菌製剤は、界面活性剤等を含むことにより、懸垂性に優れ、簡単な操作で水で希釈し施用して、優れた防除効果を得ることができるフザリウム菌生菌製剤が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例におけるＩＡＭ−５００９株の保存性の試験結果を示すグラフである。
【図２】実施例におけるＭＡＦ２３５４６３株の保存性の試験結果を示すグラフである。
【図３】実施例におけるＫＦ−０２７０株の保存性の試験結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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