(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞に影響を与える高増殖性皮膚疾患の治療用哺乳動物用薬剤の生産のためのｄ（ｐＴ）2の使用。
【請求項２】
哺乳動物がヒトである請求項１記載の使用。
【請求項３】
ｄ（ｐＴ）2が送達ビークル中に存在する請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
送達ビークルがリポソームを含有する請求項３記載の使用。
【請求項５】
送達ビークルがプロピレングリコールを含有する請求項３記載の使用。
【請求項６】
送達ビークルがさらにジアシルグリセロールを含有する請求項３記載の使用。
【請求項７】
上皮細胞がガン細胞である請求項１記載の使用。
【請求項８】
上皮細胞が皮膚細胞である請求項１記載の使用。
【請求項９】
ｄ（ｐＴ）2を含んでなる、哺乳動物において上皮細胞に影響を与える高増殖性皮膚疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１０】
ｄ（ｐＴ）2が送達ビークルで投与される請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
送達ビークルがリポソームを含有してなる請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
送達ビークルがプロピレングリコールを含有してなる請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
送達ビークルがさらにジアシルグリセロールを含有してなる請求項１０記載の組成物。
【請求項１４】
ｄ（ｐＴ）2が経口的に投与される請求項９記載の組成物。
【請求項１５】
ｄ（ｐＴ）2がエアゾールによって投与される請求項９記載の組成物。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトである請求項９記載の組成物。
【請求項１７】
目的の上皮細胞がガン細胞である請求項９記載の組成物。
【請求項１８】
目的の上皮細胞が皮膚細胞である請求項９記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本出願は、Barbara A. Gilchrest、Mark S. EllerおよびMina Yaarによる、名称が「局所適用ＤＮＡ断片の使用」である、１９９５年６月６日出願の同時係属中の米国特許出願第０８／４６７，０１２号明細書の一部継続出願であり、その教示の全体は、参照により本明細書に取り込まれる。
発明の背景
人の皮膚は二つの層、真皮および表皮からなる。二つの皮膚層の上部である表皮は、メラノサイトおよびケラチノサイト等の多くの異なる細胞形を含む。メラノサイトは表皮の基底層にある特殊化された細胞であり、メラニンを合成する；メラニンは、次にメラノソームに包み込まれ、次にケラチノサイトに輸送される。
皮膚を太陽に曝すと、ビタミンＤ合成、日焼け（紅斑）およびタンニング（tanning）を生じ、紫外線（ＵＶ）照射から続く皮膚障害に対する、皮膚の内因性防御の主要な型である。様々な形態的および酵素的変化は、ＵＶ照射に応答して、表皮のメラノサイトの細胞レベルで起きる。「タンニングされた」皮膚中で増加されたメラニンは、ＵＶ領域内に吸光度を有するフィルターとして働き、個体に対する光予防を提供する。
紅斑に対するピーク活性スペクトルは、ＵＶ−Ｂ領域、２９０〜３０５ｎｍにある。ＵＶ−Ｂ線は、表皮の蛋白質および核酸により吸収され、チミン二量体を発生させ、このチミン二量体は、核ＤＮＡのＵＶ照射によって形成され、エンドヌクレアーゼ等の高度に特異的な酵素の働きによってＤＮＡ鎖から切り出されることが知られている。除去されないならば、これらの二量体は、一本鎖ＤＮＡの領域を生じさせるＤＮＡ複製フォークを停止させ得る。ゲノム中のチミン二量体および他のＤＮＡ変異を除去しないことは、癌を生じさせる体の変異へ導くかも知れない。
細菌において、停止された複製フォークから放出されたＤＮＡ断片は、次にＵＶ傷害に対する生物のＳＯＳ応答の一部としてのＤＮＡ中の特定の遺伝子の発現を制御する核蛋白質と相互作用できることが知られている。皮膚のタンニング応答は、哺乳動物の皮膚におけるＳＯＳ応答の類似の一部であると考えることが合理的かも知れない。しかしながら、ＵＶ誘導タンニングに対する正確な刺激は、知られていないままである。
ＵＶ照射は、特定の皮膚の状況に対する光線療法および光化学療法において、成功して用いられる。例えば、乾癬は、人口の１〜２％に影響する共通の皮膚病の疾患である。乾癬は、ＵＶ−Ｂ照射単独で、またはコールタールもしくはアンセラリン等の剤と合同で、又はＵＶ−Ａ照射とソラレンとを組み合わせて（ＰＵＶＡ療法）治療することができる。ＵＶ照射治療に応答する他の疾患としては、アトピー性皮膚炎および白斑が挙げられる。光線療法および光化学療法の恩恵にもかかわらず、これらの治療は、しわになること、「光老化」、および皮膚癌等の太陽への慢性曝露と同じ危険を伴う。
発明の概要
本発明は、哺乳類における、乾癬または高増殖性、前癌性もしくはＵＶ誘導皮膚病等の他の皮膚病等の、上皮細胞に影響する高増殖性疾患あるいは前癌性症状の治療または予防方法に関する。さらに、本発明は、哺乳類における、皮膚癌に対する予防方法または皮膚癌の進行の見込みを減少させる方法、ならびに太陽の曝露から生じる光老化の激しさを減少させる方法を含む。本方法は、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはジヌクレオチド二量体が細胞に利用できるように、一本鎖もしくは二本鎖のいずれかのＤＮＡ断片、または一本鎖および二本鎖ＤＮＡ断片両方の混合物、あるいはデオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはジヌクレオチド二量体を、哺乳類の上皮細胞に適用することからなる。別法として、ｐ５３蛋白質の活性を増加させる剤を、上皮細胞に適用する。断片、デオキシヌクレオチドもしくはジヌクレオチド、またはｐ５３活性を増加させる剤は、局所的に、経口的に、エアゾールにより、または点滴注入等のいかなる他の適当な方法により送達される。一本鎖もしくは二本鎖のいずれかＤＮＡ断片、または一本鎖および二本鎖ＤＮＡ断片両方の混合物、あるいはデオキシヌクレオチドまたはジヌクレオチドを、紫外線照射に付すことができる。
また、本発明は、前記方法に用いる、リポソーム等の適当な送達ビークル中にＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤を含む組成物を含む。
【図面の簡単な説明】
図１は、水（希釈液）、１００μＭのｐＴｐＴ（Ｔ2）又は１００μＭのｐｄＡｐｄＡ（Ａ2）を投与した場合の、ヒト扁平上皮ガン細胞の細胞成長速度を示すグラフである。０日目は投与前であり、１、３、４及び５日目は投与後である。
図２は、水（希釈液）又は１００μＭのｐＴｐＴ（Ｔ2）を投与した場合の、正常ヒト繊維芽細胞の細胞成長速度を示すグラフである。０日目は投与前であり、１、３、４及び５は投与後の日である。値は、２回の培養での平均±標準偏差で示されている。
図３は、水（希釈液）又は１００μＭのｐＴｐＴ（Ｔ2）いずれかを投与した場合の、ヒト子宮ガン細胞の細胞成長速度を示すグラフである。０日目は投与前であり、１、４及び６日目は投与後である。
図４は、希釈液又は１００μＭのｐＴｐＴ（Ｔ2）いずれかを投与した場合の、ヒトメラノーマ細胞株の細胞の収量を示すグラフである。
図５は、水（希釈液）又は１００μＭのｐＴｐＴ（Ｔ2）を投与した場合の、正常ヒトケラチノサイトの細胞成長速度を示すグラフである。０日目は投与前であり、８、２４、４８及び７２は投与後の時間である。値は、２回の培養での平均±標準偏差で示されている。
図６は、水、Ｔ2又はＡ2を投与した場合の、ヒト新生児繊維芽細胞の平均細胞数を示すグラフである。
図７は、水、Ｔ2又はＡ2いずれかを投与した場合の、ヒト新生児繊維芽細胞の平均細胞数を示すグラフである。
図８は、水（希釈液）又は１００μＭのｐＴｐＴ（Ｔ2）を投与した場合の、正常ヒト繊維芽細胞の細胞成長速度を示すグラフである。０日目は投与前であり、８、２４、４８及び７２は投与後の時間である。値は、２回の培養での平均±標準偏差で示されている。
図９は、水（希釈液）又は１００μＭのｐＴｐＴ（Ｔ2）を投与した場合の、ｐ５３−ｎｕｌｌ  Ｈ１２９９肺ガン細胞の細胞成長速度を示すグラフである。０日目は投与前であり、１、２、３及び４は投与後の日である。値は、２回の培養での平均±標準偏差で示されている。
図１０は、ｐＴｐＴで処理した場合の、ヒトケラチノサイトのレポータープラスミドのＤＮＡ修復の向上性を示すグラフである。塗りつぶしていない帯は擬似照射コントロールプラスミドであり、塗りつぶした帯は紫外線照射プラスミドである。
図１１は、ｐＴｐＴで処理した場合の、ヒト繊維芽細胞のレポータープラスミドのＤＮＡ修復の向上性を示すグラフである。塗りつぶしていない帯は擬似照射コントロールプラスミドであり、塗りつぶした帯は紫外線照射プラスミドである。
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳類および特にヒトにおける、乾癬および高増殖性、前癌性またはＵＶ誘導皮膚病等の皮膚病を含めた、上皮細胞に影響する特定の高増殖性疾患または前癌性症状の予防または治療のための、以下の説明に定義したＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３蛋白質の活性を増加させる剤の使用に関する。さらに、本発明は、哺乳類における、光老化の低下または皮膚癌の進行の見込みの予防もしくは低減のための、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３蛋白質の活性を増加させる剤の使用に関する。
さらに、本発明は、該ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３蛋白質の活性を増加させる剤を含む組成物を提供する。
本発明の一つの態様において、長さが約３〜２００塩基のＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド（１塩基）、ジヌクレオチドまたはジヌクレオチド二量体は、適当なベクシル中で動物に投与される。本明細書に用いられる場合、「ＤＮＡ断片」は、一本鎖ＤＮＡ断片、二本鎖ＤＮＡ断片、または一本鎖および二本鎖ＤＮＡ断片両方の混合物をいう。「デオキシヌクレオチド」は、一つの型のデオキシヌクレオチドまたは異なるデオキシヌクレオチドの混合物のいずれかをいう。「ジヌクレオチド」は、一つの型のヌクレオチドまたは異なる型のヌクレオチドを含んでいてもよく、異なる型のジヌクレオチドの混合物を含んでいてもよい。好ましい態様において、ジヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドである。代表的なジヌクレオチドとしては、ｄ（ｐＴ）2、ｄ（ｐＣ）2、ｄ（ｐＡ）2、ｄ（ｐＣｐＴ）、ｄ（ｐＴｐＣ）、ｄ（ＣｐＴ）、ｄ（ＴｐＣ）およびｄ（ＴｐＴ）が挙げられ、ここで、Ｔはチミン、Ｃはシトシン、ｄはデオキシ、ｐはリン酸塩である（Niggli, Photochem. Photobiol. 38（3）: 353-356（1988）参照）。また、少なくとも二つ以上のＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドおよび／またはジヌクレオチド二量体の組み合わせを用いることもできる。ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチドまたはジヌクレオチドは、紫外線照射されてもよい。かかる紫外線照射は、ＤＮＡ断片またはジヌクレオチドに存在する二つの隣接したピリミジン残基（即ち、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ））間の光二量化を生じる。
ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはジヌクレオチド二量体は、いかなる適当な源から得てもよく、合成ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはジヌクレオチド二量体であってもよい。例えば、サケ精子ＤＮＡを水に溶解させ、次に混合物をオートクレーブに付して、ＤＮＡを断片化させてもよい。
本明細書で用いる「ｐ５３蛋白質の活性を増加させる剤」とは、直接ｐ５３ＤＮＡもしくはＲＮＡの転写または翻訳を刺激すること；ｐ５３蛋白質の発現もしくは生産を増加させること；ｐ５３蛋白質の安定性を増加させること；ｐ５３のｍＲＮＡもしくは蛋白質の分解に対する耐性を増加させること；細胞の核へのｐ５３の蓄積を起こさせること；存在するｐ５３の量を増加させること；または別な方法でｐ５３の活性を促進すること等により、ｐ５３蛋白質の活性を増加させる剤（例えば、薬剤、分子、核酸断片またはヌクレオチド）である。また、ｐ５３蛋白質自身も、ｐ５３蛋白質の活性を増加させる剤である。ｐ５３の活性を増加させる１以上の剤を組み合わせをて用いることができる。別法として、またはさらに加えて、ｐ５３の活性を増加させる剤を、前記ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチドまたはジヌクレオチドと組み合わせて用いてもよい。
ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３蛋白質の活性を増加させる剤は、単独で適用してもよく、香水または着色料等の他の化合物と組み合わせて適用してもよい。それらは、水、塩水またはその他の適当な送達ビークルに適用することができる。送達ビークルは、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３蛋白質の活性を増加させる剤を送達するいかなる適したビークルであってもよい。一つの態様において、プロピレングリコールを送達ビークルとして用いる。好ましい態様において、３％ベンジルスルホン酸および５％オレイルアルコールを含むプロピレングリコール：エタノール：イソプロピルミリステート（１：２．７：１）の混合物を用いる。他の態様において、リポソーム調製物を用いる。リポソーム調製物は、角質層を貫通し、細胞膜と融合するいかなるリポソームからなっていてもよく、それにより細胞中へリポソームの含有物を送達する。例えば、Yaroshの米国特許第５，０７７，２１１号明細書、Redziniakらの米国特許第４，６２１，０２３号明細書、またはRedziniakらの米国特許第４，５０８，７０３号明細書に記載のもの等のリポソームを用いることができる。
送達ビークルは、香水、着色料、安定化剤、日焼け止め剤または他の成分を含んでいてもよい。
ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤を、目的の上皮細胞に適当な方法で適用（投与）する。本明細書に用いられる「目的の細胞」とは、高増殖性疾患または前癌症状により影響されるようになるか又は影響される細胞である。一つの態様において、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤は、皮膚表面に局所的に適用される。他の態様において、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤は、経口的に口上皮もしくは腸上皮に；エアゾールにより呼吸器上皮に；点滴注入により膀胱上皮に；または他の方法により体の他の細胞もしくは組織に送達される。ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤は、適当な時期に、効果的な量で適用される。「適当な時期」は、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、または用いた剤の型および分子量；治療または予防される症状；得ようとする結果；ならびに個々の患者に依存して、変化する。本明細書で用いる「効果的な量」は、所望の結果を達成するのに十分な量または濃度である。効果的な量は、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、または用いた剤の型および分子量；治療または予防される症状；得ようとする結果；ならびに個々の患者に依存する。例えば、乾癬の治療もしくは予防にとっての、または高増殖性、前癌性もしくはＵＶ誘導皮膚病にとって、効果的な量とは、疾患の症状を和らげる、疾患に影響された皮膚の領域を減少させる、または影響された領域の形成を予防するために必要な量である。濃度は、通常約２〜３００μｍで、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、または用いた剤の型および分子量；治療または予防される症状；得ようとする結果；ならびに個々の患者に依存する。好ましい態様において、濃度は５０〜２００μｍ；より好ましい態様において、濃度は７５〜１５０μｍである。
本発明の第１の態様において、一本鎖ＤＮＡ断片、二本鎖ＤＮＡ断片等のＤＮＡ断片、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ断片の混合物、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤は、上皮細胞に影響する高増殖性疾患を治療または予防するために、ビークル無しまたは適当な送達ビークル中で、哺乳類の目的の上皮細胞に適用される。ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤を、単独で影響を受けた領域に適用することができ、高増殖性疾患により影響された共通の領域に予防的に適用してもよい。
本発明の好ましい態様において、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤は、ビークル無しまたは適当な送達ビークル中で、乾癬の治療または予防のために表皮に適用される。ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤を、単独で影響された領域に適用してもよく、影響された共通の表皮の領域に予防的に適用してもよい。
本発明の他の好ましい態様において、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤は、ビークル無しまたは適当な送達ビークル中で、アトピー性皮膚炎の治療または予防のために表皮に適用される。ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤を、単独で影響された領域に適用してもよく、影響された共通の表皮の領域に予防的に適用してもよい。本発明のその他の好ましい態様において、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤を、単独または適当な送達ビークル中いずれかで、白斑の治療または予防のために表皮に適用される。ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤を、単独で影響された領域に適用してもよく、影響された共通の表皮の領域に予防的に適用してもよい。
その他の好ましい態様において、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤は、単独または適当な送達ビークル中いずれかで、他の高増殖性、前癌またはＵＶ誘導皮膚病の治療または予防のために表皮に適用される。
第２の態様において、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤を、単独または適当な送達ビークル中いずれかで、光老化の低下または皮膚癌の進行の見込みの予防もしくは低減のために、表皮に適用する。ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤は、適当な時期（即ち、皮膚をＵＶ照射へ曝露する時期に十分近い）に適用される：ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはジヌクレオチド二量体は、ＵＶ照射への曝露前、中または後に適用される。それらは、毎日または規則的もしくは断続的間隔で適用される。好ましい態様において、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドもしくはジヌクレオチド二量体、またはｐ５３活性を増加させる剤は、その日のうちに太陽光に曝露されたかもしれない皮膚に、日常ベースで適用してもよい。
本発明を下記の実施例によりさらに説明する。
実施例１ ヒト扁平上皮ガン細胞への適用
ヒト扁平上皮ガン細胞株ＳＣＣ１２Ｆ細胞を、初代ケラチノサイト培地（３００ｍｌ  ＤＭＥ、１００ｍｌ  Ｆ−１２栄養補給物、５０ｍｌ  １０×アデニン、５０ｍｌ  ウシ胎児血清、５ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン  ストック、ならびに０．５ｍｌの１０μｇ／ｍｌの表皮成長因子およびヒドロコーチゾンを１．４μｇ／ｍｌの終濃度にしたもの）で維持し、水（希釈液）、１００μＭのｐＴｐＴ（Ｔ2、ミッドランド  サーティファイド  リージェント  カンパニー社、ミッドランド、テキサス州）または１００μＭ  ｐｄＡｐｄＡ（Ａ2）のいずれかを投与した。細胞を投与前（日数０）、ならびに投与後１、３、４、および５日間で集め、コールターカウンターでカウントした。集めたあと、該細胞を全ＲＮＡ単離し、ノーザンブロットにより解析した。図１に示すように、ｐＴｐＴ（Ｔ2）のヒト扁平上皮ガン細胞への添加は、細胞成長速度の著しい減少を生じた。対照のデオキシアデニンジヌクレオチド（ｐｄＡｐｄＡまたはＡ2）、ｐＴｐＴと大変類似しているがＵＶ照射によって直ちに二量体化せず、それゆえにＵＶ誘導ＤＮＡ修復のコースの間に切断されない化合物の添加は、効果（Ａ）を持たなかった。
２番目の実験において、ＳＣＣ１２Ｆ細胞を前記のように培養した。播種後２または３日間で、前コンフルエントな培地に１００μＭ  Ｔ2または対照として希釈液のいずれかを補給した新鮮な培地に与えた。細胞を毎日トリプシン処理により集め、コールターカウンターによってカウントした。Ｔ2で処理した培地中の該細胞の収量は、５日後の組にした対照培地の細胞の収量に比べて、７５％減少した（図２）。これは、Ｔ2処理細胞の１度の倍加と比べて、対照細胞のこの時間における２．３集団倍加の一致する。これらの結果は、さらに、ＤＮＡ断片の適用が細胞増殖を阻害することを示す。
３番目の実験において、２４〜７２時間のヒト扁平上皮ガン細胞へのチミジンジヌクレオチドの添加は、少なくとも３つの遺伝子のアップレギュレーションを生じたことが立証された：  成長停止およびＤＮＡダメージ（ＧＡＤＤ４５）、老化誘導された阻害剤（Ｓｄｉ−Ｉ）、および除去修復クロス相補（ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｒｅｐａｉｒ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）（ＥＲＣＣ−３）（データは示されない）。ＳＣＣ１２Ｆ細胞の対の培養物を、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）−ベースの、１０％胎児ウシ血清（ハイクローン  ラボ，ローガン，ＵＴ）および（ホーランダー（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ），エム．シー．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３２８〜３３６（１９９２））に記載の表皮成長因子を補給したケラチノサイト成長培地中で維持した。前コンフルエントな培地に、１００μＭのｐＴｐＴ、または等量の希釈液のいずれかを補給した新鮮な培地を与えた。細胞は、毎日添加後集められ、製造者のプロトコールに従ったトリ−リージェント  エクストラクション  メソッド（Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（モレキュラーリサーチセンター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）、シンシンアティ、オハイオ州）を用いた全ＲＮＡ単離に供した。１０μｇの各試料由来のＲＮＡをゲル電気泳動しナイロン膜に転写し、既報（ナダ（Ｎａｄａ），エー．等、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１１：９０〜９８（１９９４））のようにしてプローブした。ＧＡＤＤ４５のｃＤＮＡをヒトＧＡＤＤ４５遺伝子配列（ミツドミ（Ｍｉｔｓｕｄｏｍｉ），ティー．等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ７：１７１〜１８０（１９９２））に基づいたプライマーを用いたＰＣＲによって生成した。ＥＲＣＣ３のｃＤＮＡをアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，ロックビル，ＭＤ）から購入した。ＳＤＩ  １のｃＤＮＡは、ジェイ．スミス博士の贈与であり、既報であった（ウォルワース（Ｗａｌｗｏｒｔｈ），エヌ．シー．およびバーナード（Ｂｅｒｎａｒｄｓ），Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：３５３〜３５６（１９９６））。
希釈液対照に比べて、ＧＡＤＤ４５、ＥＲＣＣ３およびＳＤＩ  １のｍＲＮＡは、ｐＴｐＴ処理された細胞において２４時間ぐらい速くアップレギュレートされ、数日間上昇したままであった。対照デオキシアデニンジヌクレオチド（Ａ2）の添加は、これらの遺伝子を誘導する際には、ほとんど効果的でないかまたは効果がなかった（データは示されない）。Ｓ９１メラノーマ細胞および正常なヒト繊維芽細胞の予備的実験で比較データを得た。
誘導のタイムコースは本発明において研究した二つの遺伝子（ＧＡＤＤ４５およびＳｄｉ  Ｉ）へのＵＶ照射後に観察されるもの（フォーナース（Ｆｏｒｎａｃｅ），エー．ジェイ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：８８００〜８８０４（１９８８）；ホーランダー，エム．シー．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４３８５〜２４３９３（１９９３）；ザーン（Ｚｈａｎ），キュー．等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：２３６１−２３７１（１９９４）；エル−デイリー（Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ），ダブリュー．エス．等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１１６９〜１１７４（１９９４）；およびエルデイリー，ダブリュー．エス．等，Ｃｅｌｌ  ７５：８１７〜８２５（１９９３））と類似しており、メラノサイトおよびメラノーマ細胞におけるＴ2によるチロシナーゼ遺伝子誘導のタイムコース（マルツマン（Ｍａｌｔｚｍａｎ），ダブリュー．およびエル．ツァイジック（Ｃｚｙｚｙｋ），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，４：１６８９〜１６９４（１９８４）；ならびにルー（Ｌｕ），エックス．およびディー．ピー．ラン（Ｌａｎ），Ｃｅｌｌ  ７５：７６５〜７７８（１９９３））にも類似している。Ｓｄｉ  Ｉは、細胞周期制御および特に細胞分化を妨げることに関与することが公知である。ヒトＤＮＡ修復酵素である、ＧＡＤＤ４５およびＥＲＣＣ−３は、ＵＶ誘導されたＤＮＡ障害の修復に関与することが公知である。ｐＴｐＴに対する応答は、これらの細胞株のＵＶ照射後に観察されるものと同じであり、高増殖性皮膚障害（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｋｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）の治療において臨床的に効果的であるメトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などの様々な抗代謝物に対する応答にも類似する。
実施例２ ヒト頸部ガン細胞への適用
ヒト頸部ガン細胞（ヒーラー（ＨｅＬａ）細胞）をＤＭＥ＋１０％ウシ血清中で保持し、水（希釈液）または１００μＭ  ｐＴｐＴ（Ｔ２）のいずれかを投与した。細胞を投与後１、４および６日で集め、コールターカウンターによってカウントした。
図３に示すように、ｐＴｐＴ（Ｔ2）のヒト頸部ガン細胞への添加は、細胞成長速度の著しい減少を生じた。
実施例３ ヒトメラノーマ細胞への適用
ヒトメラノーマ細胞株ＣＲＬ１４２４、マルマ（Ｍａｌｍａ）、ＳＫ  Ｍｅｌ  ２、およびＳＫ  Ｍｅｌ  ２８をアメリカンタイプカルチャーコレクション〕（ＡＴＣＣ）から得た。該細胞株をＤＭＥ＋２％ウシ血清中で保持し、ＤＭＥを含む水（希釈液）またはＤＭＥ中１００μＭ  ｐＴｐＴのいずれかを投与した。投与１週間後、細胞を集め、コールターカウンターによってカウントした。
図４に示すように、ｐＴｐＴ（Ｔ2）の４つの異なるメラノーマ細胞株いずれかへの添加は、細胞収量の著しい減少を生じた。
実施例４ ヒトケラチノサイトへの適用
正常なヒト新生児のケラチノサイトを、前記実施例１のＳＣＣ１２Ｆ細胞のようにして培養し、１００μＭ  Ｔ2または対照として希釈液のいずれかで処理した。細胞を細胞のカウントのために集めた。Ｔ2処理した細胞の収量は、組にした３日後の対照培地の収量に比べて６３％まで減少した（図５）。これは、Ｔ2処理した細胞の数が同じだけ残ると同時に、この時間における対照細胞の１集団倍加に一致する。これらの結果は、さらに、ＤＮＡ断片の適用が細胞増殖を阻害することを示す。
ｐＴｐＴで２４〜７２時間処理した正常なヒトケラチノサイトのノーザンブロット解析は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ遺伝子の誘導を示す（データは示さない）。ＵＶ照射で誘導されることが公知な、この免疫変調サイトカインはこのようにｐＴｐＴによって誘導されてもよい。したがって、局所投与されたＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはジヌクレオチド二量体の使用は、皮膚の応答の免疫変調（ｉｍｍｕｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ）および免疫変調に関与する疾患もしくは症状の治療または予防に有効である。
実施例５ ＤＮＡ断片による正常な新生児の繊維芽細胞の細胞成長阻害
正常なヒト新生児繊維芽細胞を、Ｆａｌｃｏｎ  Ｐ３５培養ディッシュへ、９×１０4細胞／ディッシュの密度でプレートした。培養培地は、ＤＭＥ＋１０％ウシ血清、プレートあたり２ｍｌであった。プレート後１日で、培養物にＤＭＥ中の１００μｌの２ｍＭ  Ｔ2もしくはＤＭＥ中の１００μｌのＡ2または水（コントロール）を補給した。二つのプレートを集め、添加前にカウントし、開始、または「日数０」解釈（ｒｅａｄｉｎｇ）を与えた。各条件の２連のプレートを補給物の添加後５日間にわたって集め、細胞数を決定した。全細胞数の計数をコールターカウンターで行った。結果を図６および７に示す。該結果は、ＤＮＡ断片の適用が細胞増殖を阻害することを示す。
二番目の実験において、前記実施例１のＳＣＣ１２Ｆ細胞と同様に、正常なヒト新生児繊維芽細胞をプレートし培養した。培養物に、１００μｌの２μＭ  Ｔ2または水（対照）のいずれかを補い、細胞数をカウントするために細胞を集めた。Ｔ2処理した繊維芽細胞培養物の細胞収量は、３日後の対の対照培養物の収量と比較して、４０％まで減少した（図８）。これは、Ｔ2処理細胞の３．６倍加と比べて、対照細胞のこの時間における４集団倍加に一致する。これらの結果は、さらに、ＤＮＡ断片の適用が細胞増殖を阻害することを示す。
実施例６ 表皮の標識指数（Ｉｎｄｅｘ）におけるｐＴｐＴ適用の効果
モルモットに、一つまたは二つの、１００μＭ  ｐＴｐＴ、または対照としてビークル単独の毎日の局所適用を３日間受けさせた。４日目に、穿刺生検を得、１０μＣｉ／ｍｌ  3Ｈ−チミジン（比活性９．０Ｃｉ／ｍ  ｍｏｌｅ，ＮＥＮ）を補給した初代ケラチノサイト培地中で７または８時間維持した。ついで組織を非放射性培地でリンスし、１０％リン酸緩衝化ホルマリン中で固定した。一連の脱水工程後、組織をパラフィンで覆った。６μｍの切片を切り、ガラススライドにマウントし、ＮＴＢ−２  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｃｋ感光乳剤でちょっと浸して染め、暗中４℃で７日間で保存した。切片をＫｏｄａｋ  Ｄ−１９現像機で現像し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。１００基底ケラチノサイトの標識された核の百分率を計算することによって標識指数を測定した。
0004159107.tif 000002
結果±ＳＤを示す。
両方の実験においては、標識指数（表皮ターンオーバー速度の測定）は、ビークル処理した皮膚においてよりｐＴｐＴ処理した皮膚において、より少ない（＞０．０３  対のＴ試験）。これらの結果は、ＤＮＡ断片が表皮ターンオーバー速度を減らすことを示す。
実施例７ ＤＮＡ修復におけるｐ５３の役割
ＧＡＤＤ４５およびＳＤｉ  １遺伝子の両方は、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３によって転写的に制御されることが公知である（カスタン（Ｋａｓｔａｎ），エム．ビー．等，Ｃｅｌｌ  ７１：５８７〜５９７（１９９２）；エルデイリー，ダブリュー．エス．等，Ｃｅｌｌ  ７５：８１７〜８２５（１９９３））。ＵＶ−およびγ−照射、ならびにＤＮＡ障害を与える化学剤での細胞の処理後、ｐ５３の速い安定化および核蓄積があり（フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈｅ），エム．等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：３０７〜３１８（１９９３）；ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ），ダブリュー．ジー．およびカスタン，エム．ビー．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：１８１５〜１８２３（１９９４）；ルー（Ｌｕ），エックス．およびラーン（Ｌａｎｅ），ディー．ピー．Ｃｅｌｌ  ７５：７６５〜７７８（１９９３））、その後、このタンパク質は、特異的なプロモーターのコンセンサス配列に結合し制御された遺伝子を調節する（ルー，エックス．およびラーン，ディー．ピー．，Ｃｅｌｌ  ７５：７６５〜７７８（１９９３））。最近のデータは、ｐ５３が小さい一本鎖ＤＮＡ、ならびにあるペプチドおよび抗体のこのタンパク質のカルボキシル末端ドメインへの結合によって活性化されることもできることが示されている（ヤイアラマン（Ｊａｙａｒａｍａｎ），エルおよびプライブス（Ｐｒｉｖｅｓ），シー．，Ｃｅｌｌ  ８１：１０２１〜１０２９（１９９５）；フップ（Ｈｕｐｐ），ティー．アール．等，Ｃｅｌｌ  ８３：２３７〜２４５（１９９５））。ジヌクレオチドｐＴｐＴの細胞増殖への阻害効果がｐ５３を介しているかどうかを決定するために、ｐ５３ヌル細胞株、Ｈ１２９９肺ガン細胞の成長応答を試験した。該ｐ５３ヌル  Ｈ１２９９細胞（サンチェズ（Ｓａｎｃｈｅｚ），ワイ．等Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：３５７〜３６０（１９９６））を、１０％のウシ血清を含むＤＭＥＭ中で保持した。前コンフルエントな培養物に、１００μＭ  ｐＴｐＴまたは希釈液いずれかを補給した新鮮な培地を与えた。トリプシン処理による連続した日数で細胞を集め、コールターカウンターでカウントした。図９に示すように、希釈液処理した対照に比べてｐＴｐＴ処理したＨ１２９９細胞の増殖の阻害はなかった。
正常新生児の繊維芽細胞のｐ５３のレベルおよび細胞内の分布に対するｐＴｐＴの効果を、ｐ５３特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ  ４２１，オンコジーン，ケンブリッジ，マサチューセッツ州）を用いる免疫ペルオキシダーゼ染色によって調べた。前コンフルエントな培養物を、１００μＭ  ｐＴｐＴまたは希釈液のいずれかで、細胞染色の２４時間前に処理した。細胞は、最初にヒストチョイス  フィクサクティブ（Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ  ｆｉｘａｃｔｉｖｅ）（アムレスコ（Ａｍｒｅｓｃｏ），ソロン，オハイオ州）で１分間固定し、次いでＰＢＳ中５分間リンスをした。ベクタテイン  エリット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ）ＡＢＣキット（ベクター  ラボラトリーズ，ブリンゲイム，カリフォルニア州）およびｐ５３特異的モノクローナル抗体ｍＡｂ４２１を用いて、ｐ５３を検出した。ＵＶ照射後報告された（フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈｅ），エム．等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：３０７〜３１８（１９９３）；ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ），ダブリュー．ジー．およびカスタン，エム．ビー．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：１８１５〜１８２３（１９９４）；ルー，エックス．およびラーン，ディー．ピー．Ｃｅｌｌ  ７５：７６５〜７７８（１９９３））ように、２４時間以内に、希釈液処理した細胞と比べてｐＴｐＴ処理した細胞において核内ｐ５３における増加を検出した（データは示さない）。これらの結果は、ＳＣＣ１２Ｆ細胞においてと同様に繊維芽細胞において、ｐＴｐＴによる、ｐ５３抑制された遺伝子ＧＡＤＤ  ３４およびＳＤＩ  １の誘導と一致する（データを示さない）。
別の実験において、ｐＴｐＴは、ｐ５３依存的な方法でＳＤＩ  １のｍＲＮＡの発現を誘導することが分かった。Ｈ１２９９細胞の前コンフルエントな培養物を、ヒトサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー（ベート（Ｂｅｒｔ）  ホゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）博士，ジョン  ホプキンズ  オンコロジーセンター）の制御下で野生型のヒトｐ５３ｃＤＮＡを含む発現ベクターで形質導入した。対照形質導入をｐ５３のｃＤＮＡを除いたベクターを用いて行った。形質導入を、リポフェクチン  リージェントキット（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて行った。形質転換後１日で、（ヤー（Ｙａａｒ），エム．等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１５５０〜１５６２（１９９４））に記載のように２０μｇの全タンパク質を用いたウエスタンブロット分析のために、細胞を集めた。ｍＡｂ  ４２１、西洋ワサビ  ペルオキシダーゼに結合した抗マウスＩｇ（アマシャム，アーリントン  ハイト，イリノイ州）およびＥＣＬ−キット（アマシャム）を用いて、製造者の指示にしたがってｐ５３を検出した。タンパク質を集めるとき、ｐ５３発現ベクター（「ｐ５３」で示す）または対照ベクター（「ｃｔｒｌ」）で形質導入したＨ１２９９細胞のの２連の培養物に、希釈液（ＤＭＥＭ）または１００μＭ  ｐＴｐＴのいずれかを与えた。２４時間後、細胞を集め、ＲＮＡ単離およびＳＤＩ  １のｃＤＮＡプローブのノーザンブロット解析を行った。オートラジオグラフは、マッキントッシュＩＩｓｉコンピューターおよびマッキントッシュ  ワン  スキャナーを用いてスキャンし、明るさおよびコントラストをオートラジオグラフのシグナルが最大限に違いを見せる用に調節した。その結果は、ｐ５３ヌルＨ１２９９細胞が、非常に低いレベルのＳＤＩ  １転写物を発現し、このレベルが、ｐＴｐＴの添加によって影響されないことを示した（データは示さない）。野生型ｐ５３発現ベクターによるこれらの細胞の形質導入は、ＳＤＩ  １のレベルを増加し、ｐＴｐＴの添加により誘導されうるこの転写物を与えた（データは示さない）。ウエスタン解析は、Ｈ１２９９細胞が通常ｐ５３を発現せず、形質導入したＨ１２９９細胞が高いレベルのｐ５３を発現したことを確実にした（データは示さない）。これらのデータは、ｐＴｐＴが、ｐ５３の転写活性を増加することを強く示唆する。
実施例８ ＤＮＡ修復の増強
ＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサー配列の制御下で、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含有するＵＶ障害をうけたレポータープラスミドの発現は、老化および初期段階の皮膚ガンに関連するヒトリンパ球の減少したＤＮＡ修復能を検出することをあらかじめ示し（ウェイ，キュー．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：１６１４〜１６１８（１９９３））、正常な新生児ヒト皮膚由来繊維芽細胞およびケラチノサイトのＤＮＡ修復能を測定するために使われた。
新生ケラチノサイトを、（スタヌリス−プレーガー（Ｓｔａｎｕｌｉｓ−Ｐｒａｅｇｅｒ，ビー．エム．およびギルシュレスト（Ｇｉｌｃｈｒｅｓｔ），ビー．エー．等，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３９：１１６〜１２４（１９８９））に既報のように、レインウォルド（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ）およびグリーン（Ｇｒｅｅｎ）の方法の改良法（ギルシュレスト（Ｇｉｌｃｈｒｅｓｔ），ビー．エー．等，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０１：６６６〜６７２（１９９３））を用いて構築した。最初の継代接種（Ｆｉｒｓｔ−ｐａｓｓａｇｅ）のケラチノサイトを、非分化低Ｃａ2+培地（ケイ−スティム，コラボレイティブ  バイオメディカル  プロダクト，ベッドフォード，マサチューセッツ州）中で維持した。繊維芽細胞を（レインウォルド，ジェイ．ジー．およびグリーン，ジェイ．Ｃｅｌｌ  ６：３３１〜３４３（１９７５））に既報のように皮膚の生きた組織片から構築し、１０％ウシ血清を補給したＤＭＥＭ中で維持した。細胞を１００μＭ  ｐＴｐＴまたは等量の希釈液（ＤＭＥＭ）のいずれかで形質導入に先立って５日間処理した。各々の条件の２連の培養物を、リポフェクチンリージェントキット（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）および５μｇのレポーターＤＮＡ、ｐＣＡＴ対照ベクター（プロメガ，マディソン，ウィスコンシン州）を用いて形質導入をした。（ヤー，エム．等，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８５：７０〜７４（１９８５））に述べられたように、形質導入前、該ベクターＤＮＡを疑似（ｓｈａｍ）照射またはリサーチ  ラジオメーター（ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ）（モデル  ＩＬ  １７００Ａ，インターナショナル  ライト，ニューバリーポート，マサチューセッツ州）を用いて、２８５±５ｎｍで測定された１ＫＷ  キセノン  アーク  ソーラー  シミュレーター（Ｘｅｎｏｎ  ａｒｃ  ｓｏｌａｒ  ｓｉｍｕｌａｔｏｒ）（ＸＭＮ１０００−２１，オプティカル  ラジエーション（Ｏｐｔｉｃａｌ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ），アズザ，カリフォルニア州）由来の１００ｍＪ／ｃｍ2  ＵＶＢ放射に曝露した。形質導入後２４時間でＣＡＴエンザイムアッセイシステム（プロメガ，マディソン，ウィスコンシン州）で提供される溶解緩衝液中で製造者によって提供されたプロトコールを用いて、細胞を集めた。ＣＡＴ酵素活性を、液体シンチレーション計数プロトコールおよび該アッセイシステムキットの成分を用いて決定した。標識したクロラムフェニコール〔５０〜６０ｍＣｌ  （１．８５〜２．２２ＭＢｑ）ｍｍｏｌ〕をニューイングランドニュークリアー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）（ボストン，マサチューセッツ州）から購入した。細胞抽出物中のタンパク質濃度をブラッドフォードの方法によって決定した（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８（１９８６））。ＣＡＴ活性は、ｃ．ｐ．ｍ．／１００μｇタンパク質として発現され、疑似（ｓｈａｍ）−照射したプラスミドで形質導入した細胞の百分率活性として示した。
予備的な実験において、形質導入に先立って、ソーラーシミュレートした（ｓｏｌａｒ−ｓｉｍｕｌａｔｅｄ）照射（１００ｍＪ／ｃｍ2，２８５ｎｍで測定した）への該プラスミドの曝露は、疑似（ｓｈａｍ）−照射したプラスミドを形質導入した培養物の活性に比べて、形質導入後１６〜２４時間の細胞溶解物中でアッセイされたＣＡＴ活性の約７５％の低下を生じることを同定された。しかしながら、形質導入前に１００μＭ  ｐＴｐＴで５日間前処理されたケラチノサイト（図１０）および繊維芽細胞（図１１）は、疑似照射した形質導入された対照の活性の５０％を超えるＣＡＴ活性を現わした。レポータープラスミドが複製していないため、ＣＡＴ活性のレベルは、生物学的活性を回復するＵＶ障害を受けたＣＡＴ遺伝子のＤＮＡ修復の程度を直接的に反映する。これらのデータは、このように、正常なヒト繊維芽細胞およびケラチノサイトのｐＴｐＴ処理は、２４時間の期間に渡るＵＶ誘導されたＤＮＡ障害を修復する細胞の能力を２倍以上にすることを示す。培養されたヒト細胞は、照射後２４時間以内に、ＵＶ誘導された光生成物の７０％を超えて修復すること示した（（ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ），ディー．エル．等，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ＵＶ  Ｐｈｏｔｏｌｏｇｙ（ヤング（Ｙｏｕｎｇ），エー．アール．等編），３４５〜３７７（プレナム  プレス，ニューヨーク  アンド  ロンドン，１９９３））。疑似−照射したプラスミドの発現が、非−ｐＴｐＴ処理した細胞より高くないため、ｐＴｐＴ処理した細胞中のＵｖ照射されたプラスミドの増強された発現は、これらの細胞中でのプラスミド転写の一般的な増加に起因しなかった。
均等物
当業者であれば、単なる日常的な実験手法によって、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することが出来るであろう。そのような均等物は、下記クレームに記載されるような本発明の範疇に含まれるものである。
【図１】
0004159107.tif 000003
【図２】
0004159107.tif 000004
【図３】
0004159107.tif 000005
【図４】
0004159107.tif 000006
【図５】
0004159107.tif 000007
【図６】
0004159107.tif 000008
【図７】
0004159107.tif 000009
【図８】
0004159107.tif 000010
【図９】
0004159107.tif 000011
【図１０】
0004159107.tif 000012
【図１１】
0004159107.tif 000013