(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつコリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列からなるDNA、または配列番号１に示されるDNAと0.7〜1.0 Mの塩化ナトリウム存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、15 mM塩化ナトリウム、および1.5 mMクエン酸ナトリウムを含む溶液によって65℃の条件下で洗浄することにより同定でき、かつコリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項３】
FERM BP-6479に含有される組換え体プラスミドpHLS4に含まれ、かつコリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質をコードする配列番号３で示される塩基配列からなるDNA。
【請求項４】
コリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質が、コリネバクテリウム・グルタミクムに属し、かつ50μg/ml以下のリゾチームに感受性を有する変異株に100μg/mlのリゾチームに非感受性を付与する活性を有する蛋白質である、請求の範囲１〜３のいずれかに記載のDNA。
【請求項５】
DNAがコリネバクテリウム属に属する微生物由来のDNAである請求の範囲１〜４のいずれかに記載のDNA。
【請求項６】
DNAがコリネバクテリウム・グルタミクムに属する微生物由来のDNAである請求の範囲１〜４のいずれかに記載のDNA。
【請求項７】
請求の範囲１〜６のいずれかに記載のDNAを含有してなる組換えベクター。
【請求項８】
請求の範囲７記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項９】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつコリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質。
【請求項１０】
コリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質が、コリネバクテリウム・グルタミクムに属し、かつ50μg/ml以下のリゾチームに感受性を有する変異株に100μg/mlのリゾチームに非感受性を付与する活性を有する蛋白質である、請求の範囲９に記載の蛋白質。
【請求項１１】
請求の範囲８記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求の範囲９または１０に記載の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質の製造方法。
【請求項１２】
染色体上に存在する請求の範囲９または１０に記載の蛋白質をコードする遺伝子に変異を導入する、請求の範囲９または１０に記載の蛋白質が有する活性を不活性化させることを特徴とする、リゾチーム感受性を有するコリネバクテリウム・グルタミクムに属する微生物の作製方法。
【請求項１３】
変異が、配列番号２で示されるアミノ酸配列における１３２番目のトリプトファンをコードするコドンTGGからTAGへの変異である、請求の範囲１２記載の方法。
【請求項１４】
細菌がコリネバクテリウム・グルタミクムに属する微生物である、請求の範囲１２〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求の範囲１２〜１４のいずれかに記載の方法により得られるコリネバクテリウム・グルタミクムに属する微生物。
【請求項１６】
請求の範囲１５記載のコリネバクテリウム・グルタミクムに属する微生物を培地に培養し、培養物中にグルタミン酸またはグルタミンを生成蓄積させ、該培養物からグルタミン酸またはグルタミンを採取することを特徴とするグルタミン酸またはグルタミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に関する。該遺伝子を不活性化して得られるリゾチーム感受性を有する細菌はアミノ酸の製造等に有用である。
背景技術
コリネバクテリウム属に属するリゾチーム感受性変異株は、グルタミン酸の製造（特公平１−２９５５５）およびグルタミンの製造（特公昭６２−４９０３８）に用いられ、また形質転換体を作製するための宿主（特開昭５８−５６６７８）として用いられている。  従来、コリネバクテリウム属に属し、かつリゾチーム感受性を有する微生物は、変異誘起剤を用いて染色体にランダムに変異を導入し、得られた株の中からリゾチーム感受性変異株を選択する方法によって取得されている（特公昭６２−４９０３８、特公平１−２９５５５、特開昭５８−５６６７８）。しかし、この方法では、リゾチーム感受性に係わる変異だけでなく、好ましくない変異も付随して生じる可能性が高いため、計画的かつ効率的にリゾチーム感受性微生物を取得することは困難である。
発明の開示
本発明は、以下の（１）〜（１９）に関する。
（１）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつコリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつコリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（４）ＦＥＲＭ ＢＰ−６４７９に含有されるプラスミドに含まれ、かつコリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（５）コリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質が、コリネバクテリウム・グルタミクムに属し、かつ５０μｇ／ｍｌ以下のリゾチームに感受性を有する変異株に１００μ／ｍｌのリゾチームに非感受性を付与する活性を有する蛋白質である、（１）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（６）ＤＮＡがコリネバクテリウム属に属する微生物由来のＤＮＡである（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（７）ＤＮＡがコリネバクテリウム・グルタミクムに属する微生物由来のＤＮＡである（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡを含有してなる組換えベクター。
（９）（８）の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（１０）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつコリネバクテリウム・グルタミクムのリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質。
（１１）配列番号２で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつコリネバクテリウム・グルタミクムのリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質。
（１２）コリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質が、コリネバクテリウム・グルタミクムに属し、かつ５０μｇ／ｍｌ以下のリゾチームに感受性を有する変異株に１００μｇ／ｍｌのリゾチームに非感受性を付与する活性を有する蛋白質である、（１０）または（１１）に記載の蛋白質。
（１３）（９）記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に（１０）〜（１２）のいずれかに記載の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質の製造方法。
（１４）（１０）〜（１２）のいずれかに記載の蛋白質が有する活性を不活性化させることを特徴とする、リゾチーム感受性を有する細菌の作製方法。
（１５）染色体上に存在する（１０）〜（１２）のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子に変異を導入する、（１４）記載の方法。
（１６）細菌がコリネバクテリウム属に属する微生物である、（１４）または（１５）記載の方法。
（１７）（１４）〜（１６）のいずれかに記載の方法により得られる細菌。
（１８）（１７）記載の細菌を培地に培養し、培養物中にアミノ酸を生成蓄積させ、該培養物からアミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の製造方法。
（１９）アミノ酸がグルタミン酸またはグルタミンである（１８）記載の方法。
本発明のＤＮＡは、コリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであり、例えば以下に記載する本発明の蛋白質をコードするＤＮＡがあげられ、具体的には配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
また、本発明のＤＮＡとしては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがあげられる。
本発明において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ」とは、例えば配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第二版と略す）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：ＣｏｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明の蛋白質としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、該蛋白質をコードするアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつコリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質、配列番号２で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつコリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質をあげることができる。
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつコリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質は、以下、モレキュラー・クローニング第二版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより行うことができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、１個から数十個のアミノ酸であることが好ましく、１個から数個のアミノ酸であることがさらに好ましい。また、配列番号１記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）染色体ＤＮＡおよび組換え体ベクターの調製
本発明のＤＮＡは、コリネバクテリウム属に属するリゾチーム非感受性株より調製することができる。
コリネバクテリウム属に属するリゾチーム非感受性株としては、１００μｇ／ｍｌのリゾチームが培地中に存在していても良好に生育する菌株であれば、例えばコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株、ＫＹ９６１１株等、いずれの菌株を用いてもよい。
コリネバクテリウム属に属するリゾチーム非感受性株を公知の方法、例えばＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９，３１８（１９９３）に記載の方法に従って培養する。
培養後、公知の方法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ａｇｒｉｃ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４９，２９２５（１９８５）に従って、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。
得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、常法、例えばモレキュラー・クローニング第二版等の記載に準じて、該ＤＮＡ断片をコリネバクテリウム用ベクターに挿入することにより、組換え体ベクターを作製することができる。
ベクターとしては、コリネバクテリウム属に属する微生物中で自立複製できるものであればいずれも用いることができ、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２（特開将５８−３５１９７）、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１（いずれも特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＥ５３、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５９９９）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９６，１７５（１９８４）］、ｐＡＪ１８４４（特開昭５８−２１６１９）、ｐＨＫ４（特開平７−２０３９９）、ｐＨＭ１５１９［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１，（１９８５）］、ｐＣＶ３５、ｐＥＣＭ１［いずれもＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，１６６３（１９９０）］、ｐＣ２［Ｐｌａｓｍｉｄ，３６，６２（１９９６）］等を例示することができる。
（２）本発明のＤＮＡの調製
上記で作製した組換え体ベクターを、コリネバクテリウム・グルタミクム属するリゾチーム感受性微生物に導入する。
コリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物としては、コリネバクテリウム・グルタミクムに属し、かつリゾチーム感受性を示すものであれば、野生株、変異株のいずれを用いてもよい。コリネバクテリウム・グルタミクムに属する微生物のうち、野生株は、通常１００μｇ／ｍｌのリゾチームが培地中に存在していてもその生育には何等影響を受けない、即ちリゾチーム非感受性であることが多い。このため、リゾチーム感受性微生物としては、変異株を通常用いる。
リゾチーム感受性微生物は、５０μｇ／ｍｌ以下の低濃度のリゾチームが培地中に存在すると、その生育が阻害される。
リゾチーム感受性微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクムを親株として、公知の方法（特公昭６２−４９０３８、特公平１−２９５５５、特開昭５８−５６６７８）に準じて分離することができる。このような変異株としては、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９６１１株より分離されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３４株（ＦＥＲＭＰ−５９４６）（特開昭５８−５６６７８）、ＫＹ９７１４株、ＫＹ１１９３９株、ＫＹ１１９４０株、ＫＹ１１９４１株、あるいはコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株より分離されたＫＹ９７０４株、ＫＹ９７０６株等を例示することができる。
組換え体ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、プロトプラスト法（特開昭５７−１８６４９２、特開昭５８−５６６７８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９，３０６（１９８４））、エレクトロポレーション法（特開平２−２０７７９１）等をあげることができる。あるいは大腸菌でコリネバクテリウム属に属するリゾチーム非感受性株の染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、これを公知の方法にしたがって、大腸菌より接合伝達によってコリネバクテリウム・グルタミクムのリゾチーム感受性微生物に導入することも可能である［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２，１６６３（１９９０）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，５７６８（１９９６）］。
組換え体ベクターを導入したコリネバクテリウム・グルタミクムのリゾチーム感受性微生物を、１００μｇ／ｍｌのリゾチームを含有する培地、例えば１００μｇ／ｍｌのリゾチームを含有するＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ（ｐＨ７．２）］〕を用い、通常２０〜３９℃で２４〜７２時間培養する。培養後、該培地で生育した菌株を、目的のＤＮＡを有する菌株として選択する。
リゾチーム感受性微生物は、その生育が温度感受性となっている場合がある。その生育が温度感受性となっているリゾチーム感受性微生物は、リゾチームが培地中に存在しない場合でも高温域（例えば３４〜３９℃）では生育できない。このような場合には、リゾチームを含有しない培地を用いて、リゾチーム感受性微生物が生育できない温度、例えば３４〜３９℃、好ましくは３６〜３８℃で生育する菌株を、目的のＤＮＡを有する菌株として選択することができる。
このような変異株としては、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９６１１株より分離されたコリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９７１４株、ＫＹ１１９４１株、あるいはコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株より分離されたＫＹ９７０４株、ＫＹ９７０６株等を例示することができる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
該ＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，６０６９（１９９０）〕、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社製）、ｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）およびｐＮｏＴＡＴ７（５プライム→３プライム社製）などをあげることができる。
上記のようにして取得された新規な塩基配列を有するＤＮＡとして、例えば、配列番号１および配列番号３で示される配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡには、配列番号２記載のアミノ酸配列を有する蛋白質がコードされている。
配列番号１で表される配列を有するＤＮＡを保有するプラスミドを保有する菌株としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９７１４／ｐＨＬＳ２、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９７１４／ｐＨＬＳ４等をあげることができる。
また、上記により決定された塩基配列に基づいたプライマーを調製し、染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により目的とするＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
（３）本発明の蛋白質の製造
本発明の蛋白質は、モレキュラー・クローニング第二版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。  発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］．ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＴｒｓ３０［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＧＫＡ２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ｐＳｕｐｅｘ等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、目的とする蛋白質の生産率を向上させることができる。
本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ & Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄｅの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第二版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明の蛋白質を製造することができる。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の細菌あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｒａｏｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ［Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ，，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第二版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平５−３３６９６３、特開平６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明の蛋白質を宿主細胞外に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
（４）リゾチーム感受性を有する細菌の作製
本発明の蛋白質が有する活性を不活性化させ、リゾチーム感受性を有する細菌を作製する方法について、以下に説明する。
本発明において、「本発明の蛋白質が有する活性を不活性化させる」とは、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の破壊、該遺伝子への転移因子の導入、該遺伝子へのアンチセンス遺伝子の導入等の方法を用いて、本発明の蛋白質が有する活性を低下または消失させることを意味する。
本発明の蛋白質をコードする遺伝子とは、遺伝子のプロモーター部分、オープンリーディングフレーム部分、ターミネーター部分等、本発明の蛋白質の有する活性の発現に関与する情報を有する塩基配列をいう。
本方法において用いられる細菌としては、例えばコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属またはシュードモナス属に属する微生物があげられるが、好ましくはコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはミクロバクテリウム属に属する微生物が、さらに好ましくはコリネバクテリウム属に属する微生物があげられる。
以下、一例としてコリネバクテリウムに属する微生物を用いたリゾチーム感受性を有する細菌の作製方法を記載する。
コリネバクテリウム属に属する微生物の染色体上の本発明の蛋白質をコードする遺伝子に置換、欠失、付加等の変異を導入し、本発明の蛋白質の有する活性を不活性化させることにより、リゾチーム感受性株を作製することができる。
染色体上の該遺伝子に置換、欠失、付加等の変異の導入する方法としては、以下の１）または２）に記載の方法を例示できる。
１）コリネバクテリウム属に属する微生物中で自立複製できないプラスミドに、本発明のＤＮＡの一部または全部を挿入した組換え体プラスミドを作製する。作製した組換え体プラスミドを該微生物中に導入し、染色体上に存在する本発明の蛋白質をコードする遺伝子と該ＤＮＡとの配列の相同性を利用して、組換え体プラスミドを染色体上の相同領域に挿入する。または、該組換え体プラスミドに挿入されたＤＮＡの一部または全部を染色体上の相同領域と置換する。
該微生物中で自立複製ができないプラスミドとしては、ｐＳＵＰ１０２１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，５７６８（１９９６））、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）等があげられる。
２）ある一定条件下において、該微生物中で自立複製できないプラスミドに、本発明のＤＮＡの一部または全部を挿入することにより、組換え体プラスミドを作製する。作製した組換え体プラスミドを該微生物中に導入し、該組換え体プラスミドが自立複製できない条件下で、染色体上に存在する本発明の蛋白質をコードする遺伝子と該ＤＮＡとの配列の相同性を利用して、組換え体プラスミドを染色体上の相同領域に挿入する。または、該組換え体プラスミドに挿入されたＤＮＡの一部または全部を染色体上の相同領域と置換する。  ある一定条件下において、該微生物中で自立複製できないプラスミドとしては、自立複製が温度感受性であるプラスミドｐＨＳＣ４、ｐＨＳＣ２２、ｐＨＳＣ２３（いずれも特開平７−２０３９７７）等があげられる。
上記いずれの方法においても、組換え体プラスミドを作製する前に、該プラスミドに挿入する本発明のＤＮＡの一部または全部に、部位特異的変異誘発法により塩基の置換、欠失、付加等の変異を導入しておいてもよい。該プラスミドに薬剤耐性遺伝子、例えばカナマイシン耐性遺伝子等、選択マーカーとなる遺伝子を挿入しておけば、相同領域の置換した株を選択することが容易になる。
組換え体プラスミドの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、プロトプラスト法（特開昭５７−１８６４９２、特開昭５８−５６６７８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９，３０６（１９８４））、エレクトロポレーション法（特開平２−２０７７９１）等をあげることができる。または、接合伝達によって、該プラスミドを大腸菌からコリネバクテリウム属に属する微生物に導入することもできる（Ｊ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２，１６６３（１９９０）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，５７６８（１９９６））。
組換え体プラスミドに薬剤耐性遺伝子等、選択マーカーとなる遺伝子を挿入した場合は、該プラスミドを宿主細胞へ導入した後、薬剤耐性等を指標にして、相同置換した株を容易に選択することができる。
カナマイシンを選択マーカーとして用いる場合、相同置換した株を選択するための培地としては、１〜８００μｇ／ｍｌ、好適には３〜１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地、例えば該濃度のカナマイシンを含有するＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ（ｐＨ７．２）］等の培地を用いることができる。
カナマイシンを含有する培地で生育する菌株を選択することにより、相同置換した株を容易に選択することができる。
上記方法により選択した菌株を、通常の培地、例えばＬＢ培地〔バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ（ｐＨ７．２）〕、および該培地にリゾチームを含有する培地において、それぞれ２０〜３９℃で２４〜７２時間培養する。
リゾチームを含有する培地としては、リゾチーム感受性微生物が感受性を示す濃度のリゾチームを含有する培地が用いられ、例えば０．５〜５０μｇ／ｍｌ、好適には１〜２５μｇ／ｍｌのリゾチームを含有する培地が用いられる。
以上の方法により、リゾチーム感受性を有する細菌は、通常の培地では生育するが、リゾチームを含む培地では生育しない菌株として取得することができる。
（５）リゾチーム感受性を有する細菌を用いるアミノ酸の製造
リゾチーム感受性を有する細菌を用いるアミノ酸を製造する方法について、以下に説明する。
リゾチーム感受性を有する細菌は、酸性アミノ酸、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸等いずれのアミノ酸の製造に用いてもよいが、グルタミン酸またはグルタミンの製造に好適に用いられる。
本方法は、リゾチーム感受性を有する細菌を用いる以外は、細菌、例えばコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはミクロバクテリウム属に属する微生物を用いる、通常の発酵法によるアミノ酸の製造方法を用いることができる。
すなわち、該細菌を、炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する合成または天然培地において、好気的条件下、温度、ｐＨなどを調節しながら培養し、培養物中にアミノ酸を生成蓄積させ、これを採取することにより、アミノ酸を製造することができる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、グリセロール、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコール類、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの有機酸等が用いられる。微生物の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの無機および有機アンモニウム塩類、尿素、ペプトン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス コーン スチープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミール、またはその消化物などの窒素含有有機物などが用いられる。
無機物としては、リン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどが用いられる。
ビタミン、アミノ酸は、使用する培地の炭素源、窒素源などによって異なるが、必要に応じ、ビオチン、サイアミン、グルタミン酸などが用いられる。
培養は、通常振とう培養または通気攪はん培養などの好気的条件下に行う。
培養は、通常２０〜４０℃、１〜５日間行う。
培養終了後、培養物から菌体を除去した後、得られた培養液を活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法を用いることにより、アミノ酸を採取することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１ コリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９６１１株の染色体ＤＮＡの調製
コリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９６１１株を、１０ｍｌのＬ’培地（ポリペプトン １％、イーストエキストラクト ０．５％、食塩０．５％、グルコース ０．１％、チアミン ２０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）に植菌し、３０℃で一晩培養した。
培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得した。
該菌体をＴＥ緩衝液［５０ｍＭ トリス塩酸、５０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．０］を用いて洗浄後、８００μｌの同緩衝液に懸濁した。懸濁液に、５０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を４０μｌ、１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ溶液を２０μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応液に２０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液を２０μｌ添加し、７０℃で１時間反応させた。２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ溶液を２４μｌ添加し、５０℃で１時間反応させた。更にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ溶液を２４μｌ添加し、５０℃で１時間反応させた。得られた反応液に、等量のフェノールを加えて撹拌後、４℃で１晩放置し、ＤＮＡを水層に抽出し、水層を回収した。該水層に等量のフェノール／クロロフォルムを加えて撹拌後、２時間抽出し、水層を回収した。該水層に等量のクロロフォルム／イソアミルアルコールを加えて撹拌後、３０分間抽出し、水層を回収した。該水層に２倍量のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。得られた沈殿物を３００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭト リス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解し、染色体ＤＮＡとして用いた。
実施例２ リゾチーム感受性を回復する遺伝子の取得
実施例１で取得した染色体ＤＮＡ０．５μｇとプラスミドｐＣ２０．５μｇとをＥｃｏＲＩで切断後、ライゲーションキット（宝酒造社製、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２）を用いて、１６℃で１６時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いて、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９７１４株をモレキュラー・クローニング第二版に記載の方法を用いて形質転換し、ＫＹ９７１４株の生育が温度感受性であるという性質を利用して形質転換体を選択した。即ち、該形質転換体を５μｌ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ’寒天平板培地（Ｌ’培地に１．５％寒天を加えたもの）に塗布し、３７℃で３日間培養した。
得られたコロニーはいずれも、１００μｇ／ｍｌリゾチームを含有するＬ’寒天平板培地で良好な生育が認められ、リゾチーム非感受性であることが示された。生じたコロニーを実施例１に記載の方法に従って培養し、モレキュラー・クローニング第二版に記載の方法に従ってプラスミドを回収した。回収したプラスミドｐＨＬＳ２およびｐＨＬＳ４について、その構造を解析したところ、いずれのプラスミドも、プラスミドｐＣ２のＥｃｏＲＩ部位に、コリネバクテリウム・グルタミクム由来の約４ｋｂの同一のＤＮＡ断片が挿入した構造を有していた。ｐＨＬＳ２およびｐＨＬＳ４における挿入の方向はそれぞれ逆向きであった。
約４ｋｂの挿入ＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列を決定した。決定したＥｃｏＲＩ断片３８２５ｂｐの塩基配列を配列番号５に示した。このようにして決定した塩基配列には、配列番号２に示される６４０アミノ酸残基のアミノ酸配列をコードする、配列番号１に示される塩基配列からなる１９２０ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在していた。なお、配列番号１に示される塩基配列は、配列番号３に示される塩基配列の８１５〜２７３４番目の塩基配列に対応する。
配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドｐＨＬＳ４を含むコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＹ９７１４／ｐＨＬＳ４は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６４７９として、平成１０年９月１日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）に寄託されている。
取得したプラスミドに挿入された約４ｋｂのＤＮＡ断片を用いて、常法に従い種々の欠失プラスミドを作製し、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９７１４株のリゾチーム感受性の相補試験を行ったところ、リゾチーム感受性の相補には、上記で見出された６４０アミノ酸残基からなる１９２０ｂｐのＯＲＦが必須であることが判明した（図１）。
また、約４ｋｂの挿入ＤＮＡ断片のうち、約１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ切断断片を欠くｐＨＬＳ２Ｓおよび約１．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ切断断片を欠くｐＨＬＳ４Ｋを用いた相補試験の結果、染色体ＤＮＡとの相同組換えによると推定される、低頻度のリゾチーム感受性の相補が観察された（図１）。
このことは、１９２０ｂｐのＯＲＦのうち、約１．２ｋｂのＳａｃＩ−ＫｐｎＩ断片、すなわち配列番号１に示される塩基配列のうち２７１〜１５９３番目までの配列の中に、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９７１４株のリゾチーム感受性の原因となる変異が存在することを示している。
実施例３ リゾチーム感受性株の変異点の同定
実施例１と同様の方法により、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９７１４株の染色体ＤＮＡを調製した。実施例２の、約１．２ｋｂのＳａｃＩ−ＫｐｎＩ断片中に、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９７１４株のリゾチーム感受性の原因となる変異が存在するとの知見に基づいて、１９２０ｂｐのＯＲＦのＮ末７０〜７７アミノ酸領域に対応する配列番号６記載のＤＮＡおよび同じくＮ末３３５〜３４２アミノ酸領域に対応する配列番号５記載のＤＮＡをプライマーとして用いて、ＫＹ９７１４株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．２を用いて、９４℃で１分間、９８℃で２０秒間、５０℃で３０秒間、６２℃で３分間からなる反応行程を１サイクルとして、２９サイクル行った後、７０℃で１０分間反応させる条件で行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけた後、ＰＣＲ反応の結果生じた約０．８ｋｂのＤＮＡ断片をモレキュラー・クローニング第二版に記載の方法に従って抽出し、ＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片をＳａｌＩおよびＳｐｈＩで切断後、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩで切断したプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）と混合し、ライゲーションキット（ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２、宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間連結反応を行った。該反応液を用いてエシェリヒア・コリ（Ｅ.ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（ストラタジーン社製）をモレキュラー・クローニング第二版に記載の方法に従って形質転換した。
得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、プラスミド中に挿入された約０．８ｋｂのＳａｌＩ−ＳｐｈＩのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。実施例２でＫＹ９６１１株より取得したＤＮＡの対応する領域との比較を行った結果、ＫＹ９７１４株では、６４０アミノ酸残基からなる蛋白質（配列番号２）をコードする１９２０ｂｐのＯＲＦ（配列番号１）中１３２番目のトリプトファンをコードするコドンが、ＴＧＧからＴＡＧに変異していることが判明した。
実施例４ リゾチーム感受性の相補
実施例２で得られたプラスミドｐＨＬＳ２を、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９６１１より誘導されたリゾチーム感受性株ＡＴＣＣ３１８３４株、ＫＹ１１９３９株、ＫＹ１１９４０株、ＫＹ１１９４１株、およびコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株より誘導されたリゾチーム感受性株ＫＹ９７０４株、ＫＹ９７０６株等、各種のリゾチーム感受性株にそれぞれ導入して、リゾチーム感受性の変化を検討した。  その結果、上記のリゾチーム感受性株は、いずれもリゾチームを１２．５μｇ／ｍｌ含有するＬ’寒天平板培地でその生育が認められなかった。一方、これら菌株にｐＨＬＳ２を導入して得られた形質転換体は、リゾチームを１００μｇ／ｍｌ含有するＬ’寒天平板培地においても良好な生育が認められた。
上記の結果は、いずれの変異株においても上記で見出された６４０アミノ酸残基からなる１９２０ｂｐのＯＲＦによってリゾチーム感受性が相補されること、および該ＯＲＦの変異がリゾチーム感受性の原因であることを示している。
実施例５ リゾチーム感受性株によるグルタミン酸およびグルタミンの生産
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株より誘導されたリゾチーム感受性株ＫＹ９７０４株およびＫＹ９７０６株を用いて、ビオチンを過剰に含有する培地でのグルタミン酸およびグルタミンの生産について検討した。
ＫＹ９７０４株およびＫＹ９７０６株を、それぞれ１０ｍｌのＬ’培地に３０℃で２４時間培養して得られた種培養液０．５ｍｌを、グルコース ５０ｇ／ｌ、（ＮＨ）２ＳＯ４ ３ｇ／ｌ、尿素 ３ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ビオチン １００μｇ／ｌ、チアミン塩酸塩 ５００μｇ／ｌ、フェノールレッド １０ｍｇ／ｌ（ｐＨ７．０）の組成を有する培地１０ｍｌに植菌し、３０℃で４８時間培養した。
培養後、培地中のグルタミン酸およびグルタミンの生成量を測定した。その結果、ＫＹ９７０４株では、４．５ｇ／ｌのグルタミン酸の蓄積が、ＫＹ９７０６株では９．０ｇ／ｌのグルタミンの蓄積が、それぞれ認められた。
同じ条件で親株であるＡＴＣＣ１３０３２株、ならびにＫＹ９７０４株およびＫＹ９７０６株にそれぞれｐＨＬＳ２を導入して得られた形質転換体を用い、上記と同様に培養し、グルタミン酸およびグルタミンの生成量を測定した。しかし、いずれの形質転換体においても、グルタミン酸およびグルタミンの蓄積が認められなかった。
上記の結果は、上記の６４０アミノ酸残基からなる１９２０ｂｐのＯＲＦにおいて変異を起こすことにより、ビオチンを過剰に含有する培地においてグルタミン酸およびグルタミンを生産することが可能であることを示している。
実施例６ コリネバクテリウム・グルタミクムの遺伝子破壊株の作製
実施例２で取得したＤＮＡ断片をＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断し、約１．２ｋｂのＳａｌＩ−ＰｓｔＩ断片をモレキュラー・クローニング第二版に記載の方法に従って取得した。回収したＤＮＡとＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断したプラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）とを混合し、ライゲーションキット（宝酒造社製、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２）を用いて、１６℃で１６時間連結反応を行った。該反応液を用いモレキュラー・クローニング第二版に記載の方法に従ってコリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９６１１株を形質転換した。
該形質転換体を、カナマイシンを１０μｌ／ｍｌ含むＬ’寒天平板培地に塗布し、３０℃で２日間培養した。
培養後、生じたコロニーより、実施例１に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを取得した。取得した染色体ＤＮＡを鋳型として、プラスミドｐＨＳＧ２９８に対応する配列番号６で示される塩基配列を有するＭ１３ＰｒｉｍｅｒＲＶ（宝酒造社製）、および、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のＮ末端から７０〜７７番目のアミノ酸残基に対応する、配列番号４記載のＤＮＡをプライマーとして、実施例３記載の方法に従ってＰＣＲ反応を行った。その結果、いずれの形質転換体からも約１．６５ｋｂの断片が得られた。
上記の結果は、ｐＨＳＧ２９８が、約１．２ｋｂのＳａｌＩ−ＰｓｔＩの領域との相同性により、染色体上の１９２０ｂｐのＯＲＦに組み込まれ、該ＯＲＦが破壊されたことを示している（図２）。
こうして取得した遺伝子破壊株はいずれも、１２．５μｇ／ｍｌのリゾチームを含有するＬ’寒天平板培地でその生育は観察されなかった。
上記の結果は、染色体上の１９２０ｂｐのＯＲＦを破壊することで、効率的にリゾチーム感受性微生物を取得できることを示している。
産業上の利用可能性
本発明によれば、コリネバクテリウム・グルタミクムに属するリゾチーム感受性微生物にリゾチーム非感受性を付与する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、該蛋白質が有する活性を不活性化させたリゾチーム感受性を有する細菌、および該細菌を用いるアミノ酸の製造方法を提供することができる。
「配列リストフリーテキスト」
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD
<120> Novel Gene
<130> 1101
<160> 6
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 1920
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
atgtgcggcc ttcttggcat attgactgca aatgggaacg ctgaagcatt cgttcctgca 60
ctcgagcggg ccttgccatg catgcgccac cgtggtcctg acgatgccgg cacttggcat 120
gacgccgatg cagcgtttgg attcaaccgc ctctccatca ttgatattgc acactcccac 180
caaccactgc gttggggacc tgcggatgaa cccgaccgct acgcaatgac tttcaacggt 240
gagatctaca actacgttga gctgcgtaaa gagctctcgg atttgggata tacctttaat 300
acttctggcg atggcgagcc aattgttgtc ggtttccacc actggggcga gtccgtggtc 360
gagcatctcc gcggaatgtt cggcattgcc atttgggata caaaggaaaa gtcgcttttc 420
cttgcgcgtg atcagttcgg catcaagcca ctgttctacg caaccaccga gcatggcacc 480
gtgttctcct cagagaagaa gaccatcttg gagatggccg aggagatgaa tctagatctg 540
ggccttgata agcgcaccat tgagcactac gtggacctgc agtacgtgcc cgagccagat 600
acccttcacg cgcagatttc ccgcttggag tcaggctgca ccgcaacagt tcgtccgggc 660
ggcaagctgg aacagaagcg ttacttcaag cctcagttcc cagtacagaa ggtcgtaaag 720
ggtaaggagc aggacctctt cgatcgcatt gcccaggtgt tggaggatag cgtcgaaaag 780
catatgcgtg ccgacgtgac cgtaggctcg ttcctttccg gcggcattga ctcaaccgca 840
attgcgccgc ttgcaaagcg ccacaaccct gacctgctca ccttcaccac cggtttcgag 900
cgtgaaggct actcggaggt cgatgtggct gcggagtccg ccgctgcgat tggcgctgag 960
cacatcgtga agattgtctc gcctgaggaa tacgccaacg cgattcctaa gatcatgtgg 1020
tacttggatg atcctgtagc tgacccatca ttggtcccgc tgtacttcgt ggcagcggaa 1080
gcacgtaagc acgtcaaggt tgtgctgtct ggcgagggcg cagatgagct gttcggtgga 1140
tacaccattt acaaagagcc gctatcgctt gctccatttg agaagatccc ttccccacta 1200
cgtaaaggcc tgggaaagct cagcaaggtt ctgccagacg gcatgaaggg caagtccctt 1260
cttgagcgtg gctccatgac catggaagag cgctactacg gcaacgctcg ctccttcaat 1320
ttcgagcaga tgcaacgcgt tattccatgg gcaaagcgcg aatgggacca ccgcgaagtc 1380
actgcaccga tctacgcaca atcccgcaac tttgatccag tagcccgcat gcaacacctg 1440
gatctgttca cctggatgcg cggcgacatc ctggtcaagg ctgacaagat caacatggcg 1500
aactcccttg agctgcgagt tccattcttg gataaggaag ttttcaaggt tgcagagacc 1560
attccttacg atctgaagat tgccaacggt accaccaagt acgcgctgcg cagggcactc 1620
gagcagattg ttccgcctca cgttttgcac cgcaagaagc tgggcttccc tgttcccatg 1680
cgccactggc ttgccggcga tgagctgttc ggttgggcgc aggacaccat taaggaatcc 1740
ggtactgaag atatcttcaa caagcaggct gtgctggata tgctgaacga gcaccgcgat 1800
ggcgtgtcag atcattcccg tcgactgtgg actgttctgt catttatggt gtggcacggc 1860
atttttgtgg aaaaccgcat tgatccacag attgaggacc gctcctaccc ggtcgagctt 1920
<210> 2
<211> 640
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
Met Cys Gly Leu Leu Gly Ile Leu Thr Ala Asn Gly Asn Ala Glu Ala
1               5                  10                  15
Phe Val Pro Ala Leu Glu Arg Ala Leu Pro Cys Met Arg His Arg Gly
20                  25                  30
Pro Asp Asp Ala Gly Thr Trp His Asp Ala Asp Ala Ala Phe Gly Phe
35                  40                  45
Asn Arg Leu Ser Ile Ile Asp Ile Ala His Ser His Gln Pro Leu Arg
50                  55                  60
Trp Gly Pro Ala Asp Glu Pro Asp Arg Tyr Ala Met Thr Phe Asn Gly
65                  70                  75                  80
Glu Ile Tyr Asn Tyr Val Glu Leu Arg Lys Glu Leu Ser Asp Leu Gly
85                  90                  95
Tyr Thr Phe Asn Thr Ser Gly Asp Gly Glu Pro Ile Val Val Gly Phe
100                 105                 110
His His Trp Gly Glu Ser Val Val Glu His Leu Arg Gly Met Phe Gly
115                 120                 125
Ile Ala Ile Trp Asp Thr Lys Glu Lys Ser Leu Phe Leu Ala Arg Asp
130                 135                 140
Gln Phe Gly Ile Lys Pro Leu Phe Tyr Ala Thr Thr Glu His Gly Thr
145                 150                 155                 160
Val Phe Ser Ser Glu Lys Lys Thr Ile Leu Glu Met Ala Glu Glu Met
165                 170                 175
Asn Leu Asp Leu Gly Leu Asp Lys Arg Thr Ile Glu His Tyr Val Asp
180                 185                 190
Leu Gln Tyr Val Pro Glu Pro Asp Thr Leu His Ala Gln Ile Ser Arg
195                 200                 205
Leu Glu Ser Gly Cys Thr Ala Thr Val Arg Pro Gly Gly Lys Leu Glu
210                 215                 220
Gln Lys Arg Tyr Phe Lys Pro Gln Phe Pro Val Gln Lys Val Val Lys
225                 230                 235                 240
Gly Lys Glu Gln Asp Leu Phe Asp Arg Ile Ala Gln Val Leu Glu Asp
245                 250                 255
Ser Val Glu Lys His Met Arg Ala Asp Val Thr Val Gly Ser Phe Leu
260                 265                 270
Ser Gly Gly Ile Asp Ser Thr Ala Ile Ala Pro Leu Ala Lys Arg His
275                 280                 285
Asn Pro Asp Leu Leu Thr Phe Thr Thr Gly Phe Glu Arg Glu Gly Tyr
290                 295                 300
Ser Glu Val Asp Val Ala Ala Glu Ser Ala Ala Ala Ile Gly Ala Glu
305                 310                 315                 320
His Ile Val Lys Ile Val Ser Pro Glu Glu Tyr Ala Asn Ala Ile Pro
325                 330                 335
Lys Ile Met Trp Tyr Leu Asp Asp Pro Val Ala Asp Pro Ser Leu Val
340                 345                 350
Pro Leu Tyr Phe Val Ala Ala Glu Ala Arg Lys His Val Lys Val Val
355                 360                 365
Leu Ser Gly Glu Gly Ala Asp Glu Leu Phe Gly Gly Tyr Thr Ile Tyr
370                 375                 380
Lys Glu Pro Leu Ser Leu Ala Pro Phe Glu Lys Ile Pro Ser Pro Leu
385                 390                 395                 400
Arg Lys Gly Leu Gly Lys Leu Ser Lys Val Leu Pro Asp Gly Met Lys
405                 410                 415
Gly Lys Ser Leu Leu Glu Arg Gly Ser Met Thr Met Glu Glu Arg Tyr
420                 425                 430
Tyr Gly Asn Ala Arg Ser Phe Asn Phe Glu Gln Met Gln Arg Val Ile
435                 440                 445
Pro Trp Ala Lys Arg Glu Trp Asp His Arg Glu Val Thr Ala Pro Ile
450                 455                 460
Tyr Ala Gln Ser Arg Asn Phe Asp Pro Val Ala Arg Met Gln His Leu
465                 470                 475                 480
Asp Leu Phe Thr Trp Met Arg Gly Asp Ile Leu Val Lys Ala Asp Lys
485                 490                 495
Ile Asn Met Ala Asn Ser Leu Glu Leu Arg Val Pro Phe Leu Asp Lys
500                 505                 510v
Glu Val Phe Lys Val Ala Glu Thr Ile Pro Tyr Asp Leu Lys Ile Ala
515                 520                 525
Asn Gly Thr Thr Lys Tyr Ala Leu Arg Arg Ala Leu Glu Gln Ile Val
530                 535                 540
Pro Pro His Val Leu His Arg Lys Lys Leu Gly Phe Pro Val Pro Met
545                 550                 555                 560
Arg His Trp Leu Ala Gly Asp Glu Leu Phe Gly Trp Ala Gln Asp Thr
565                 570                 575
Ile Lys Glu Ser Gly Thr Glu Asp Ile Phe Asn Lys Gln Ala Val Leu
580                 585                 590
Asp Met Leu Asn Glu His Arg Asp Gly Val Ser Asp His Ser Arg Arg
595                 600                 605
Leu Trp Thr Val Leu Ser Phe Met Val Trp His Gly Ile Phe Val Glu
610                 615                 620
Asn Arg Ile Asp Pro Gln Ile Glu Asp Arg Ser Tyr Pro Val Glu Leu
625                 630                 635                 640
<210> 3
<211> 3825
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
gaattcaccc tcgccacgct tttcagccct ctttgcgccc caggcaaaga tggcggtgag 60
gaatagaccc cacatgatga tgccgatgat ccaggcagca acccagaccc atgaccagaa 120
gttacccatg gccactgctt caggggtaat gccatcaggc caacccatac gtaggaaatc 180
tccaagcaca ccgccagagg ggcgacttca cagcctgcga tggcgaggcc acctaagctc 240
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gttctgcctt cctgtccaca caaaaaccag agaccttacg gtcatttcta tcttcgcaga 360
atagcctatt tgccagccga ttccatatct tgtgtttggt ggaaatatct tcgtgggttt 420
cgtttttagg ggcgtcaaat gtctttcaac tgcaacgata tgcccgaatc ctcaggtgga 480
atacctaaag tctaggcaat tggtgtatgc cacgtcacag accatcaacc ttttgattgc 540
ccttgaaatt cccccaccct taccccctac gttcctacaa ggtgcatgta ttaggaaatc 600
aatctggttt tcaggaacct ttgaggatgc tgcaatagtc agctgatgca cgttgtttga 660
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tgacacgaga tttaacaaat gcagcgtctt atttcttcca acaaaatttc tttgcgattt 780
aaggcgcctt ttatttcagg aggatttttc attcatgtgc ggccttcttg gcatattgac 840
tgcaaatggg aacgctgaag cattcgttcc tgcactcgag cgggccttgc catgcatgcg 900
ccaccgtggt cctgacgatg ccggcacttg gcatgacgcc gatgcagcgt ttggattcaa 960
ccgcctctcc atcattgata ttgcacactc ccaccaacca ctgcgttggg gacctgcgga 1020
tgaacccgac cgctacgcaa tgactttcaa cggtgagatc tacaactacg ttgagctgcg 1080
taaagagctc tcggatttgg gatatacctt taatacttct ggcgatggcg agccaattgt 1140
tgtcggtttc caccactggg gcgagtccgt ggtcgagcat ctccgcggaa tgttcggcat 1200
tgccatttgg gatacaaagg aaaagtcgct tttccttgcg cgtgatcagt tcggcatcaa 1260
gccactgttc tacgcaacca ccgagcatgg caccgtgttc tcctcagaga agaagaccat 1320
cttggagatg gccgaggaga tgaatctaga tctgggcctt gataagcgca ccattgagca 1380
ctacgtggac ctgcagtacg tgcccgagcc agataccctt cacgcgcaga tttcccgctt 1440
ggagtcaggc tgcaccgcaa cagttcgtcc gggcggcaag ctggaacaga agcgttactt 1500
caagcctcag ttcccagtac agaaggtcgt aaagggtaag gagcaggacc tcttcgatcg 1560
cattgcccag gtgttggagg atagcgtcga aaagcatatg cgtgccgacg tgaccgtagg 1620
ctcgttcctt tccggcggca ttgactcaac cgcaattgcg ccgcttgcaa agcgccacaa 1680
ccctgacctg ctcaccttca ccaccggttt cgagcgtgaa ggctactcgg aggtcgatgt 1740
ggctgcggag tccgccgctg cgattggcgc tgagcacatc gtgaagattg tctcgcctga 1800
ggaatacgcc aacgcgattc ctaagatcat gtggtacttg gatgatcctg tagctgaccc 1860
atcattggtc ccgctgtact tcgtggcagc ggaagcacgt aagcacgtca aggttgtgct 1920
gtctggcgag ggcgcagatg agctgttcgg tggatacacc atttacaaag agccgctatc 1980
gcttgctcca tttgagaaga tcccttcccc actacgtaaa ggcctgggaa agctcagcaa 2040
ggttctgcca gacggcatga agggcaagtc ccttcttgag cgtggctcca tgaccatgga 2100
agagcgctac tacggcaacg ctcgctcctt caatttcgag cagatgcaac gcgttattcc 2160
atgggcaaag cgcgaatggg accaccgcga agtcactgca ccgatctacg cacaatcccg 2220
caactttgat ccagtagccc gcatgcaaca cctggatctg ttcacctgga tgcgcggcga 2280
catcctggtc aaggctgaca agatcaacat ggcgaactcc cttgagctgc gagttccatt 2340
cttggataag gaagttttca aggttgcaga gaccattcct tacgatctga agattgccaa 2400
cggtaccacc aagtacgcgc tgcgcagggc actcgagcag attgttccgc ctcacgtttt 2460
gcaccgcaag aagctgggct tccctgttcc catgcgccac tggcttgccg gcgatgagct 2520
gttcggttgg gcgcaggaca ccattaagga atccggtact gaagatatct tcaacaagca 2580
ggctgtgctg gatatgctga acgagcaccg cgatggcgtg tcagatcatt cccgtcgact 2640
gtggactgtt ctgtcattta tggtgtggca cggcattttt gtggaaaacc gcattgatcc 2700
acagattgag gaccgctcct acccggtcga gctttaagtc ttaaagccta aaccccctcc 2760
ttctcaagga gggggtttca ctatttcctg aggacaaagc aattacgcca gcaaacacaa 2820
aagctcggcc gtagacaatg cgtccagggc cgagccttta ttcctatata acggaatctc 2880
tttagttgaa ggagtcacca caagcgcaag agctgcctgc gtttgggttg tcgatggtga 2940
agccctgctg ctcgatggtg tcagcgaagt cgatctgagc gccgagcagg tatggggtgc 3000
tcatcttgtc aacgacaagg cgaacgccac cgacgatgtc ttccttatcg ccatcaaggg 3060
tgcggtcgtc gaagtaaagc tggtaacgaa ggccagagca gccgccaggc tgaacggcga 3120
tacgcagaga gaggtcgtcg cggccttcct gatcgatgag tgccttagct ttggacgctg 3180
cggactcggt caagataaca ccggtgttgg ttgatggagc ggtcatcgct ttagtctcct 3240
taactgttgg ccctttgaat tacttttagg ccgggacatc ataggcttgc agtgtactcc 3300
cctttttacg gatctccggc gagcgatgct ggattacgtt catatgggaa gcggatggat 3360
gttccccagc ctactcaccg tccacagatg agtaaacccg gaaaaacccg tatttagtta 3420
ttggttttac ctgcgtgggc tgaaagtctt cacttttaat ccttacagat ggtcgttctg 3480
attcctttca acgatgaagt gtgcacccct attcccgatt tgggaggttt tccttgtagc 3540
ctattgagtg tgaaacttcc ttgggataaa aataagaaca acgaaggggc tgacgctgca 3600
ggccaagacg ccagctccac ccctgagacc gctacgcctg acgctactga gcagaaattg 3660
ccaaaggggc acacggcacc gaagggccgt cccactccga agcgtcgtga agttgagtta 3720
gagcgaggtg tcgttggcgg ccagtctttg gcgcctactg atacttatgc gcagcagcgc 3780
cagaagcgta aagaatttaa agcatctatg accaaggaag aattc                3825
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 4
tgaacccgac cgcatgccaa tgact                                        25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 5
tccaaggtcg acatgatctt aggaa                                        25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 6
caggaaacag ctatgac                                                 17
【図面の簡単な説明】
図１は、約４ｋｂの挿入ＤＮＡ断片について種々の欠失プラスミドを作製し、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９７１４株のリゾチーム感受性の相補試験を行った結果を示した図である。ｐｌａｃは、ベクターｐＣ２上に存在するラクトースプロモーターの位置を示す。＋はリゾチーム感受性を相補することを、−は相補しないことを示す。＊は染色体との相同組換えによる低頻度の相補が起こることを示す。約４ｋｂの挿入ＤＮＡ断片の概略の制限酵素地図およびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の位置と方向を図中に示す。
図２は、遺伝子破壊株の、染色体構造の概略を示した図である。太線でベクター（ｐＨＳＧ２９８）を、点線の矢印でＯＲＦの位置と方向を示す。プライマーの種類と位置、ＰＣＲ産物の大きさと位置を図中に示す。
【図１】
0004184606.tif 000002
【図２】
0004184606.tif 000003