(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカンとコラーゲンを縮合反応により架橋したグリコサミノグリカン−とコラーゲン複合体を製造する方法において、
グリコサミノグリカンとコラーゲンの混合水溶液に水に溶解する塩を存在させることによってグリコサミノグリカンとコラーゲンがポリイオンコンプレックスを形成するのを抑制しつつ、縮合剤として水溶性カルボジイミドを用いた縮合反応により架橋することを特徴とする組織再生マトリックス用グリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造方法。
【請求項２】
縮合剤として水溶性カルボジイミドと２−ヒドロキシスクシンイミドを組み合わせて用いることを特徴とする請求項１記載のグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造方法。
【請求項３】
グリコサミノグリカンがヒアルロン酸であり、コラーゲンがＩＩ型コラーゲンであり、塩がＮａＣｌであり、塩濃度が０．４±０．０５Ｍであることを特徴とする請求項１又は２記載のグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造方法。
【請求項４】
縮合反応前のゾル状の水溶液を鋳型に流し込み、次いで縮合反応を行なうことによって耳、鼻、又は軟骨欠損部の形状を形成することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造方法。
【請求項５】
架橋によって形成したグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体のハイドロゲルからなるマトリックスを水で洗浄し、マトリックス中の塩のイオン、水溶性カルボジイミド、および副生成物を除去することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、軟骨等の組織再生マトリックス用グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）−コラーゲン複合体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
軟骨は非常に再生しにくい臓器であるが、加齢やスポーツ障害による変形性関節症等の関節疾患の対策として軟骨再生材料の開発が切望されている。軟骨組織の主成分は、ＩＩ型コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸鎖が豊富なプロテオグリカンである。これまで、ハイドロキシアパタイト−ＩＩ型コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸自己組織化体が、invivoにおいてある程度軟骨再生を促進する結果が得られている。
【０００３】
また、これまで、ヒアルロン酸を架橋剤（ジアミン、ジエポキシ、エピクロロヒドリン）により架橋したもの、縮合剤（水溶性カルボジイミド）により架橋したもの、ヒアルロン酸のカルボキシル基の部分に疎水基を導入したもの等が報告されている。
【０００４】
また、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）−コラーゲン複合体の調製は、コラーゲン溶液を凍結乾燥したコラーゲンマトリックスへのＧＡＧの固定化（J.S.Pieper et al.,「Biomaterials」, 2000,21:581-593）やＧＡＧ−コラーゲンコンプレックスを化学架橋する手法が取られていた（特表平６−５０５６４２号公報、特開平７−１９６７０４号公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
グリコサミノグリカンとコラーゲンとの複合体に関しては、コラーゲンスポンジに縮合剤を用いてグリコサミノグリカンを固定化する手法と、グリコサミノグリカンとコラーゲンのポリイオンコンプレックスを縮合剤を用いて架橋する手法が報告されているが、これらの手法を用いると成型が困難であるという問題がある。
【０００６】
本発明は、鋳型に入れて成型が可能である系において、軟骨、肝臓、血管、神経等、さまざまな組織再生マトリックスとして使用できる、各組織に極めて類似した物性を示し、生物学的機能も優れている組織再生材料の開発を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
ヒアルロン酸はグリコサミノグリカンと呼ばれる多糖類の一つであり、ＩＩ型コラーゲンはポリカチオンの一つである。ヒアルロン酸水溶液とＩＩ型コラーゲン塩酸溶液は混合するとポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を形成することが知られている。これは、ヒアルロン酸の分子鎖がカルボキシル基の解離により負に帯電（ポリアニオン）しており、一方、ＩＩ型コラーゲンは高分子鎖全体として正に帯電（ポリカチオン）しているため（等電点８以上）である。
【０００８】
また、縮合剤である水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ：１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）は、ｐＨ４から８の条件下で安定にカルボキシル基を活性化し、その活性中間体はアミノ基および水酸基と反応し、アミドおよびエステルを形成することが知られている。
【０００９】
本発明者は、グリコサミノグリカン−ポリカチオン複合体（ハイブリッド）ゲルの調製について検討を行った結果、特定の塩濃度を用いてグリコサミノグリカンとポリカチオンであるコラーゲンとがポリイオンコンプレックスを形成するのを抑制しつつ縮合剤を用いて架橋させることにより、ＷＳＣを用いた縮合反応によりグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体ゲルを得ることができ、軟骨、肝臓、血管、神経等、さまざまな組織の優れた再生材料を得ることができることを見出した。
【００１０】
本発明は、グリコサミノグリカンとコラーゲンを縮合反応により架橋した組織再生マトリックス用グリコサミノグリカン−コラーゲン複合体を提供する。
【００１１】
すなわち、本発明は、グリコサミノグリカンとコラーゲンを縮合反応により架橋したグリコサミノグリカン−とコラーゲン複合体を製造する方法において、
グリコサミノグリカンとコラーゲンの混合水溶液に水に溶解する塩を存在させることによってグリコサミノグリカンとコラーゲンがポリイオンコンプレックスを形成するのを抑制しつつ、縮合剤として水溶性カルボジイミドを用いた縮合反応により架橋することを特徴とする組織再生マトリックス用グリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造方法である。
【００１２】
また、本発明は、縮合剤として水溶性カルボジイミドと２−ヒドロキシスクシンイミドを組み合わせて用いることを特徴とする上記のグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造方法である。
【００１３】
また、本発明は、グリコサミノグリカンがヒアルロン酸であり、コラーゲンがＩＩ型コラーゲンであり、塩がＮａＣｌであり、塩濃度が０．４±０．０５Ｍであることを特徴とする上記のグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造方法である。
【００１４】
また、本発明は、縮合反応前のゾル状の水溶液を鋳型に流し込み、次いで縮合反応を行なうことによって耳、鼻、又は軟骨欠損部の形状を形成することを特徴とする上記のグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造方法である。
【００１５】
また、本発明は、架橋によって形成したグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体のハイドロゲルからなるマトリックスを水で洗浄し、マトリックス中の塩のイオン、水溶性カルボジイミド、および副生成物を除去することを特徴とする上記のグリコサミノグリカン−コラーゲン複合体の製造方法である。
【００１６】
グリコサミノグリカンとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸等の多糖類をいずれも用いることができる。コラーゲンには１０数種のタイプがあるが、種類は特に限定されない。グリコサミノグリカンの代表的なものとしてヒアルロン酸（略号ＨｙａｌＡ）を用い、コラーゲンとしてＩＩ型コラーゲンを用いた場合について、以下に本発明を詳しく説明する。
【００１７】
本発明の方法において、架橋形成の条件は、（１）ＰＩＣを形成しない塩濃度、すなわち、静電的相互作用によりＰＩＣを形成しないような塩濃度で架橋を行うことと、（２）ＷＳＣの安定性の高いｐＨ４以上で架橋を行うことである。
【００１８】
ＮａＣｌ等の塩を含まない水中においてヒアルロン酸はカルボキシル基により分子として負に帯電しており（ポリアニオン）、一方、コラーゲンは分子全体で正に帯電している。塩を含まないヒアルロン酸水溶液と塩を含まないコラーゲン水溶液を混合するとヒアルロン酸の負電荷とコラーゲンの正電荷によってポリイオンコンプレックスとして沈殿が生じる。
【００１９】
ヒアルロン酸とコラーゲンの水溶液を混合する際に適量の塩が存在すると、塩の溶解によって生じたイオンがヒアルロン酸とコラーゲンの電荷を打ち消すためにポリイオンコンプレックスは形成されなくなる。このような原理であるために用いる塩の種類は、水に溶解する塩、例えば、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ2、Ｎａ2ＳＯ2等、であればどのような塩でも使用できる。ただ、塩の種類により最適塩濃度が若干変わることがある。水溶性カルボジイミドで架橋を行うのは、このポリイオンコンプレックスを形成しない塩濃度のときである。
【００２０】
架橋直後では、塩がゲル中に塩のイオンの状態でまだ存在している。この塩を除くには、大過剰の水で洗浄する。ゲル中に含まれるイオンを除かないと、ポリイオンコンプレックスによる架橋形成を行うことができない。すなわち、共有結合＋静電的相互作用による結合が形成されない。
【００２１】
縮合剤で架橋を行う利点は、（１）架橋形成後、縮合剤を洗浄で除くことが可能であるため、架橋剤の毒性を問題にしなくてよいこと、（２）生分解性ハイドロゲルが得られること、（３）縮合剤の濃度をコントロールすることにより架橋度のコントロール（ポアサイズのコントロール）が可能であること、（４）ハイドロゲルに組織の修復を早める作用のあるタンパク質であるＴＧＦ−β(Transforming Growth Factor beta) 、繊維芽細胞の増殖を早める繊維芽細胞増殖因子ＦＧＦ(Fibroblast Growth Factor)、血管内皮細胞の増殖を早める血管内皮細胞増殖因子ＶＥＧＦ(Vascular Endothelial Growth Factor)等のサイトカイン類を内包させ、徐放することも可能であること等である。
【００２２】
本発明のヒアルロン酸−ＩＩ型コラーゲン複合体は、含水率が９０〜９９重量％、ヒアルロン酸（ポリアニオン）／コラーゲン（ポリカチオン）比（重量）が５０／５０〜５／９５、空孔率が９０〜９９容積％である。架橋密度は、含水率に対応している。
【００２３】
図１は、本発明の方法によってグリコサミノグリカン−コラーゲン（ポリカチオン）ゲルを形成直後の複合マトリックスの模式図である。複合マトリックスを形成した直後には、複合マトリックスに塩（図１の場合はＮａＣｌ）が入っているので、ＮａイオンとＣｌイオンがマトリックス中に存在するために共有結合のみでマトリックスが架橋されている。次に、複合マトリックスを大過剰の水に入れ、マトリックス内部のＮａイオン、Ｃｌイオンを除く。
【００２４】
図２は、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンのゲルの水中での膨潤時の構造（共有結合＋静電的相互作用）を示す模式図である。この模式図は、大過剰の水でマトリックスを洗浄し、マトリックス中のＮａイオン、Ｃｌイオン、水溶性カルボジイミドおよびウレア等の副生成物を除去した後の構造を示す。この場合、水溶性カルボジイミドによって形成した共有結合（アミドとエステル結合）の他にも結合が形成されると考えられる。この結合は、ＣＯＯ−とＮＨ3+との静電的な相互作用によるものである。これは、ＮａイオンとＣｌイオンがマトリックス内部から除かれるために未反応のカルボキシル基とアミノ基がコンプレックスを作り、見掛け上の架橋点になるということである。
【００２５】
図３は、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンの混合比を１：１とした場合のヒアルロン酸溶液の種々のｐＨにおけるＰＩＣ形成を５００ｎｍの光の透過率（％）を調べることにより評価したグラフである。この図は、ヒアルロン酸とコラーゲン水溶液（それぞれ１．２５％の濃度）を重量比１：１で混合したときに、どのようなｐＨの時にポリイオンコンプレックスを形成しなくなるかを調べたものである。横軸にヒアルロン酸水溶液のｐＨを取り、縦軸に５００ｎｍの光の透過率（分光光度計[UV/Vis spectrometer] を使用）を取っている。
【００２６】
透過率が０％の時には、光が透過しないということであるから、ポリイオンコンプレックスが形成していることを示す。１００％に近づくほどポリイオンコンプレックスが形成されないことを示している。ヒアルロン酸水溶液のｐＨが６から１．５の間では、透過率がほとんど０％なので、ポリイオンコンプレックスが形成している。ＰＨが１になると透過率が約７０％まで上昇しているので、ポリイオンコンプレックスが形成されなくなることが分かる。
【００２７】
図４は、同じく、種々の塩（図１の場合はＮａＣｌ）濃度におけるＰＩＣ形成を５００ｎｍの光の透過率（％）を調べることにより評価したグラフである。この図は、ヒアルロン酸とコラーゲン水溶液（それぞれ１．２５％の濃度）を重量比１：１で混合したときに、どのような塩濃度の時にポリイオンコンプレックスを形成しなくなるかを調べたものである。横軸にヒアルロン酸とコラーゲンの混合液中に含まれるＮａＣｌ濃度を取り、縦軸に５００ｎｍの光の透過率を取っている。
【００２８】
透過率が０％の時には、光が透過しないということであるから、ポリイオンコンプレックスが形成していることを示す。１００％に近づくほどポリイオンコンプレックスが形成されないことを示す。ＮａＣｌ濃度が０．４Ｍ近くで透過率が急上昇し、０．４Ｍで透過率が最大値を示していることから、０．４Ｍおよびその近傍、数値で表現すれば０．４±０．０５Ｍ程度でポリイオンコンプレックスが形成されなくなることが分かる。
【００２９】
図３、図４から、ｐＨ１または０．４ＭのＮａＣｌ濃度の時に光の透過率（％）が最大となり、ＰＩＣの形成が大幅に抑制されることが明らかとなった。この理由は、低ｐＨになるとヒアルロン酸およびＩＩ型コラーゲンのカルボキシル基の解離が抑制される（ｐＫａ以下）ため、ＩＩ型コラーゲンのプロトン化したアミノ基とコンプレックスを形成できな＜なるためであると考えられる。
【００３０】
一方、ＮａＣｌ濃度が０．４Ｍのときに透過率が最大値を取る理由としては、以下のことが考えられる。すなわち、塩濃度が０．４Ｍまでは塩添加がＰＩＣの形成を抑制する方向に働き、塩濃度が０．４Ｍを超えると塩析効果によりコラーゲンが析出してくるためであると考えられる。
【００３１】
以上の結果から、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンがＰＩＣを形成しない最適の条件は、ｐＨ１または塩濃度０．４Ｍのときであることが明らかとなった。縮合剤のＷＳＣが安定にカルボキシル基を活性化するｐＨは、４〜８であり、ｐＨ１の条件下では極めて不安定である。そこで、塩濃度０．４Ｍの条件下で種々の濃度のＷＳＣ（０〜１０００ｍＭ）を添加し、架橋を行った。
【００３２】
図５は、得られたゲルを大過剰の水で洗浄し、ゲルのマトリックスから縮合剤およびＮａイオン、Ｃｌイオンを除去し、これを凍結乾燥したマトリックスの膨潤度［Swelling Ratio；乾燥したゲルが自重の何倍、水を吸収するかという値＝（湿潤ゲルの重量−乾燥ゲルの重量）／乾燥ゲルの重量］とＷＳＣ濃度（ｍＭ）の関係を示すグラフである。
【００３３】
この図は、ヒアルロン酸とコラーゲンの混合比が１：１の場合に、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）の濃度を変化させたときに得られた複合体の膨潤度がどのように変化するかを調べたものである。この図から言えることは、縮合剤の濃度をコントロールすることによって複合体中に含まれる水の含量をコントロールできるということである。膨潤度が小さくなるということは、複合体中に含まれる水の含量が少なくなることを意味するので、複合体は硬くなる。
【００３４】
図６は、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンの混合比を変えた場合の、マトリックスの転化率とＷＳＣ濃度（ｍＭ）の関係を示すグラフである。この図は、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）の濃度が転化率に及ぼす影響を調べた結果を示すものである。対象の複合体は、ヒアルロン酸とコラーゲンの比率が１：１から１：８までのものである。水溶性カルボジイミドの濃度を増加させていくと、およそ２０〜３０ｍＭで１００％近くに達していることから、ほぼ仕込通りのヒアルロン酸−ＩＩ型コラーゲン複合体が得られることを示している。
【００３５】
逆に言えば、２０〜３０ｍＭ以上の水溶性カルボジイミドを添加しないと定量的に複合体が得られないということを示している。ＷＳＣ濃度が１００ｍＭ以上のときには転化率はさらに大きくなる。ヒアルロン酸の分子量、あるいは、ヒアルロン酸とコラーゲンの濃度を上げると水溶性カルボジイミド濃度は２０ｍＭより低い値でも架橋は可能である。
【００３６】
図７は、同様に、マトリックスの膨潤度とＷＳＣ濃度（ｍＭ）の関係を示すグラフである。この図は、ヒアルロン酸とコラーゲンの比率を１：１から１：８まで変えた場合についても水溶性カルボジイミドの濃度をコントロールすることによって膨潤度の制御が可能であることを示している。
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、水溶性カルボジイミドを用いてグリコサミノグリカンとコラーゲン（ポリカチオン）の架橋を行う際に、ポリイオンコンプレックスを形成しない条件で架橋を行うものであり、ポリイオンコンプレックスを形成させない条件は２つある。一つは、グリコサミノグリカン（例えば、ヒアルロン酸）のカルボキシル基を解離させないｐＨ、もう一つは、ポリイオンコンプレックスを形成しない最適な塩濃度である。ポリイオンコンプレックスを形成しないこの最適の条件は、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンの組み合わせの場合は、ｐＨが１の時と、ＮａＣｌ濃度が０．４±０．０５Ｍ（ｐＨは、ｐＨ調整をしない状態でおよそ５）の時である。この値は、グリコサミノグリカンとコラーゲンの他の組み合わせ（例えば、コンドロイチン硫酸とコラーゲン）では、多少変動するので、それぞれの組み合わせによって最適値を定める。
【００３８】
しかし、水溶性カルボジイミドを用いて架橋を行う場合には、水溶性カルボジイミドの安定性を考える必要がある。水溶性カルボジイミドが安定に反応するｐＨは、４〜８であるから、塩を添加した場合には、水溶性カルボジイミドが安定に存在するｐＨ４〜８の範囲内にあるために架橋が可能となる。
【００３９】
また、用いる水溶性カルボジイミドは、ｐＨが４〜８の範囲のときに安定にカルボキシル基を活性化し、アミノ基または水酸基と反応する試薬である。つまり、水溶性カルボジイミドが安定に存在してポリイオンコンプレックスを形成しない条件というのは、ＮａＣｌ濃度が０．４±０．０５Ｍ（このときのｐＨは、およそ５）の時ということになる。水溶性カルボジイミドの濃度は、グリコサミノグリカンの分子量、あるいはグリコサミノグリカンとコラーゲンの濃度を上げると低い濃度でも架橋が可能である。
【００４０】
水溶性カルボジイミドに２−ヒドロキシスクシンイミドを組み合わせて用いてもよい。２−ヒドロキシスクシンイミドは、水溶性カルボジイミドの反応効率を上げるために使用するもので、その濃度は、水溶性カルボジイミドが１に対して１〜０．１が好ましい。
【００４１】
グリコサミノグリカンとコラーゲンの混合比は任意に変えることができ、混合比を変えることによって、物性や生物学的機能が変わってくる。ヒアルロン酸等グリコサミノグリカンの分子量は、この系では、数万〜数１００万までどのような分子量のものについても適用できる。
【００４２】
縮合剤の濃度をコントロールすることによって複合体中に含まれる水の含量をコントロールできる。複合体中に含まれる水の含量が少なくなる、つまり膨潤度が小さくなると複合体は硬くなる。硬いのがいいのかどうかは、複合体を使ってどのような組織を作るかによる。例えば、複合体を生体内で早く分解させたい時には、水溶性カルボジイミドの濃度を下げて、膨潤度を上げてやることが必要であり、硬いものが必要な場合には、水溶性カルボジイミドの濃度を上げることが必要となる。ただし、水溶性カルボジイミドは、生体に対していいものではないので、濃度が少なく、細胞の増殖能が高いものがより好ましい。
【００４３】
架橋直後には塩が生成したゲル中に塩のイオン（ＮａＣｌの場合はＮａイオンとＣｌイオン）の状態で存在しているので、ゲルを大過剰の水で洗浄して塩のイオンを除去する。洗浄方法としては、例えば、ゲルの体積で１００倍量以上の脱イオン水に生成したゲルを浸漬する。洗浄によって、ゲルの中に含まれるイオンの他に、未反応の水溶性カルボジイミドおよびウレア等の副生成物が除去される。ゲル中に含まれるイオンを除くことによって共有結合＋静電的相互作用による結合が形成される。
【００４４】
本発明の複合体の利用に当たっては、縮合反応前のゾル状の水溶液を適当な鋳型に流し込み、縮合反応を行うことによって、さまざまな形の耳や鼻、軟骨欠損部位等複雑な形状のものまで容易に形成することが可能である。使用法については、スポンジ状、ゲル状のものを使用し、そのマトリックスの中に軟骨を作る場合は、軟骨細胞を、血管を作る場合は、血管内皮細胞を入れて培養する。マトリックス自身として使用可能の他、細胞の増殖、分化を促すための足場としてもマトリックスを使用できる。また、細胞等の実験に用いるには、水中で洗浄した後、生体中の浸透圧とほぼ等しい濃度の塩濃度を持つリン酸緩衝液中に入れ、複合体中の水をリン酸緩衝液に置換した後に使用する。
【００４５】
【実施例】
実施例１〜６
ヒアルロン酸（分子量＝６４０，０００，生化学工業製）１．２５ｗ／ｖ％水溶液およびＩＩ型コラーゲン（新田ゼラチン製）１．２５ｗ／ｖ％０．０１Ｎ−ＨＣｌの混合溶液に０．４ＭのＮａＣｌを添加し、ｐＨがおよそ５の状態で、縮合剤である水溶性カルボジイミド水溶液を滴下し、十分攪拌、脱泡した後、３０℃で２時間放置した。その後、得られたゲルを大過剰の水で２日間洗浄し、ゲルのマトリックスから縮合剤、副生成物、およびＮａイオン、Ｃｌイオンを除去した。これを１日間凍結乾燥した。
【００４６】
実施例１〜６のそれぞれのヒアルロン酸対コラーゲンの比および添加した水溶性カルボジイミドの量（ｍＭ）を下記のとおりとした。実施例１＝１：８−１００、実施例２＝１：１−１００、実施例３＝１：８−２０、実施例４＝１：４−２０、実施例５＝１：２−２０、実施例６＝１：１−２０。例えば、１：８−１００の実施例１では、ヒアルロン酸とコラーゲンの比率が１：８で、水溶性カルボジイミドの濃度が１００ｍＭを示している。なお、コントロールとしてＴＣＰＳ（Tissue Culture PolyStylene；普段用いられている細胞培養用のシャーレ）とコラーゲン（２０ｍＭの水溶性カルボジイミドで架橋）を用いた。
【００４７】
図８に、実施例６、ヒアルロン酸対コラーゲンの比および添加した水溶性カルボジイミドの量が１：１−２００ｍＭのもの、ヒアルロン酸、コラーゲンについて、それぞれＦＴ−ＩＲによりエステル形成の同定を行った結果を示す。実施例６について、化学反応によって共有結合が形成していることが確認できる。
【００４８】
図９は、それぞれの実施例のヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンマトリックスを３７℃で７日軟骨細胞培養し、細胞数をカウントした結果を示し、各実施例のそれぞれのヒアルロン酸対コラーゲン比−（ＷＳＣ濃度）と相対成長率を棒グラフで示している。
【００４９】
各実施例の複合体の調製には、厚さ１ｍｍ、直径１５ｍｍのディスク状の複合体を用いた。その上に、子牛の関節から取り出し増殖させた軟骨細胞を１×１０5 個播種した。このときの培養液の組成は、ＤＭＥＭ培地に１０％ウシ血清（ＦＢＳ）が入ったものを使用した。複合体上に細胞を播種した後、４日後に培養液を交換し、その後３日後（Total の培養日数７日）に細胞数をCell Counting Kit （同仁化学薬品(株) 製）を用いて計数した。
【００５０】
データは、ＴＣＰＳ上の細胞数を１として相対的な細胞数を示してある。この結果から、まず言えることは、本発明による複合体は、どのような比率でも有意（４〜７倍）に軟骨細胞の増殖を促進するということである。これが、コラーゲンのみであると全くといっていいほど細胞数が増えていないが、ヒアルロン酸と複合化することによって優れた細胞増殖能があることが分かる。
【００５１】
また、ヒアルロン酸とコラーゲンとの比率の違いというものは、この場合には、認められない。水溶性カルボジイミドの濃度の違いも有意な差とは言えない。細胞の形態には差があり、ＴＣＰＳとコラーゲン上では、軟骨細胞が繊維状の形態をしており、実施例の複合体上では、軟骨細胞特有の丸い形態をしていることから細胞に対する適合性が高いと言える。
【００５２】
物性と生物学的機能で最も優れている条件は実施例３の条件である。図７では、ヒアルロン酸とコラーゲンとの比が１：４または１：８で水溶性カルボジイミドが２０ｍＭの時に膨潤度が極小値を取っている。これは、複合体中に含まれる水が他のものに比べて少なく、硬いことを示す。すなわち、取り扱いやすいということである。また、図９で、実施例３と実施例４を比較すると細胞数にそれ程差はないとは言え、実施例３の方が、より生物学的に活性が高いと言える。実施例６は最も細胞数が多いが強度が弱く最適とは言えない。
【００５３】
【発明の効果】
本発明のグリコサミノグリカンとコラーゲン複合ゲル、例えばヒアルロン酸−ＩＩ型コラーゲン複合ゲルは、耳、鼻、軟骨欠損部等の複雑な形状を容易に形成することが可能であり、架橋剤の毒性を考慮する必要がなく、生体内の酵素（ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ）により分解することが予想され、組織再生マトリックスとしての有用性が極めて大きいものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンのゲル形成時の構造（共有結合）を示す模式図である。
【図２】図２は、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンのゲルの水中での膨潤時の構造（共有結合＋静電的相互作用）を示す模式図である。
【図３】図３は、ヒアルロン酸溶液の種々のｐＨにおけるＰＩＣの形成を５００ｎｍの光の透過率（％）を調べることにより評価したグラフである。
【図４】図４は、ヒアルロン酸溶液の種々の塩（ＮａＣｌ）濃度におけるＰＩＣの形成を５００ｎｍの光の透過率（％）を調べることにより評価したグラフである。
【図５】図５は、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンマトリックスの膨潤度とＷＳＣ濃度（ｍＭ）の関係を示すグラフである。
【図６】図６は、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンの混合比を変えた場合の、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンマトリックスの転化率とＷＳＣ濃度（ｍＭ）の関係を示すグラフである。
【図７】図７は、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンの混合比を変えた場合の、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンマトリックスの膨潤度とＷＳＣ濃度（ｍＭ）の関係を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明のヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンマトリックスについてのＦＴ−ＩＲによるエステル形成の同定を示すグラフである。
【図９】図９は、各実施例によって得られたヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンマトリックスを用いて軟骨細胞培養したヒアルロン酸対コラーゲン比−（ＷＳＣ濃度）と相対成長率を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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