(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
古細菌の培養菌から得られた細菌塊を、ハロゲン化溶媒を用いる第１段階と、Ｃ1 −Ｃ4 のアルカノールを用いる第２段階との２段階連続抽出によりその脂質成分から遊離した後、フェノール抽出することなく、水で抽出して得られる古細菌由来の糖タンパク質画分を含有する、化粧品に使用する（治療のための薬剤への使用を除く）ための細菌生産物。
【請求項２】
前記細菌生産物が、前記古細菌由来の糖タンパク質を重量で２５ないし４０％含むことを特徴とする請求項１に記載の細菌生産物。
【請求項３】
前記古細菌が好塩菌（Halobacterium ）であることを特徴とする請求項１または２に記載の細菌生産物。
【請求項４】
前記古細菌が高度好塩菌（Halobacterium Halobium）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細菌生産物。
【請求項５】
前記化粧品が、排気ガスにより生ずる汚染および／または紫外線から皮膚を保護するためのものである請求項１〜４のいずれかに記載の細菌生産物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の細菌生産物をジェル、ミルク、ローション、セラム、パックまたはクリームの形態の化粧品として使用しうる媒体中に少なくとも含むことを特徴とする化粧品組成物。
【請求項７】
古細菌の培養菌から得られた細菌塊を、ハロゲン化溶媒を用いる第１段階と、Ｃ1 −Ｃ4 のアルカノールを用いる第２段階との２段階連続抽出によりその脂質成分から遊離した後、フェノール抽出することなく、水で抽出することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細菌生産物に含有される糖タンパク質画分の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、古細菌：Halobacterium Halobium（ハロバクテリウムハロビウム，高度好塩菌）から抽出される糖タンパク質画分の抽出方法および使用に関する。本発明の細菌生産物は、化粧品調製物中にその一部として含ませれば、汚染物質および／または紫外線照射の有害な作用から皮膚細胞を保護するという特性を確実に発揮する。
【０００２】
【従来の技術】
好塩菌（Halobacteria）は、系統樹の３つの主分岐の１つである古細菌界に分類される。他の２つは、真正細菌（原核生物とも称される）および真核生物である。
【０００３】
古細菌は、１００℃を超える温度、ｐＨ＝０の酸度あるいは３０％を超える塩濃度という生命限界的にすべて過酷なところで確認されてきた。
【０００４】
古細菌は、その細胞壁由来のペプチドグリカンの一成分分子として、通常の細菌（bacteria) には存在するムラミン酸が存在しないという例外的な細胞壁をもっている。さらには、他の生物は、２つの脂肪酸鎖と１分子のグリセロールとのエステル結合を介する会合により、その膜構成脂質を形成するのに対し、古細菌の脂質は、エーテル結合を介してグリセロールに結合したイソプロペニルアルコールからなる長い鎖から構成される。
【０００５】
好塩菌は、その生存必須条件が予想を越える細菌である。該菌は、実に、その生育のために、極めて高い塩濃度（１０ないし３０％）のＫＣｌ、ＭｇＣｌ2 、特にＮａＣｌを要求する。これら生物は、天然培地（米国のグレートソールトレークあるいはイスラエルの死海）あるいは人工培地（塩田）から単離されている。好塩菌は、その内部浸透圧が、培地中のＮａＣｌ濃度との平衡状態を保持するように、細胞質中に３ないし４Ｍの塩をＫＣｌの形態で蓄積する。好塩菌をＮａＣｌ濃度２Ｍを含む培地中に懸濁すると、細菌エンベロープの固さを全く失い、次いで細菌は丸形状を帯びる。塩濃度を１Ｍ以下に減ずると、細菌リーシス（溶解）に至る。
【０００６】
好塩菌コロニーは赤色であり、実際、それらのエンベロープは、着色顔料（バクテリオルベリン）を含み、それらが曝される強い紫外線から自身を保護している。
【０００７】
好塩菌のうちでも、Halobacterium Halobiumは、外側にさらにもう１枚のエンベロープである紫色の膜をもっており、該膜は独特の光合成メカニズムをサポートとする働きをする。
【０００８】
濃厚塩培地中の好塩菌の通常の形状は、長さ４〜１０μｍで、直径０．７μｍの、細長いバチルス（桿菌）のそれである。この細菌は、５ないし８の房毛状鞭毛をもつ。Halobacterium Halobiumは、炭素およびエネルギー源として炭水化物を利用する能力がない。
【０００９】
これら細菌のもつ耐性能力および独特の特徴は、この細菌をまさに工業的に有望なツールとする。これら細菌は、すでに農業用−栄養素、紙、洗剤あるいは薬剤工業などの様々な部門で利用されている。
【００１０】
米国特許明細書ＵＳ５０９１３６４は、糖タンパク質を酵素分解した後に身体の感染に対する免疫的防御を高めるために使用することを意図して、古細菌の培養菌から抽出されるエンベロープ糖タンパク質の調製について言及している。
【００１１】
フランス特許公報ＦＲ２５９０２７３でも、古細菌由来の画分を使用しているが、皮膚科学における美粧料製品のコンテクスト中への合成海水と組合わせでの使用である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
出願人は、Halobacterium Halobiumの細菌ペレットから得られる糖タンパク質画分が優れた化粧効果、特に排気ガスにより生ずる汚染および／または紫外線照射の有害な作用から皮膚細胞を保護するための化粧効果に優れることを見出した。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
したがって本発明の主題は、古細菌から抽出された糖タンパク質画分である。
【００１４】
他の主題は、この画分を含む化粧品組成物である。
【００１５】
さらに他のいくつかの主題は、以下に続く説明および実施例の記載により明らかになる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の主題である細菌生産物は、古細菌から抽出された糖タンパク質画分を含むことを特徴としている。
【００１７】
本発明に係る細菌生産物は、古細菌の糖タンパク質を２０ないし４０％含む。
【００１８】
古細菌は、好ましくは好塩菌（ハロバクテリア）である。
【００１９】
上記細菌生産物は、以下の方法により得ることができる。
まず古細菌の培養菌から得られた細菌塊を、最初にハロゲン化溶媒による、次いでＣ1 −Ｃ4 のアルカノールによる連続した２つの抽出により、その脂質成分から遊離した後、蒸留水で抽出する。次いで得られた抽出物は、限外濾過して無機塩残渣を除去する。濾液を真空下で濃縮・乾燥すれば、ニンヒドリンに対して強い陽性反応を呈する黄白色粉末が得られる。
【００２０】
本発明に係る細菌生産物の抽出方法は、古細菌、好ましくは好塩菌、より好ましくはHalobacterium Halobiumに適用される。
【００２１】
本発明の抽出方法により得られる糖タンパク質画分は、画分グラム当たり、２０ないし４０％の古細菌の糖タンパク質抽出分を含むことを特徴とする。この画分はSURVIUM と称される。
【００２２】
本発明の他の主題は、排気ガスにより生ずる汚染および／または紫外線照射から皮膚を保護するために処方される化粧用調製物のための本発明のタンパク質画分の使用である。
【００２３】
本発明の化粧品組成物は、化粧料として使用可能な媒体中に、古細菌、好ましくはHalobacterium Halobiumから抽出された本発明に係る糖タンパク質画分を含むことを特徴としている。
【００２４】
本発明の化粧品組成物は、上記糖タンパク質画分に加えて、水および化粧品中に慣習的に使用される添加剤を含むことができる。これら添加剤は、たとえば、糊料、香料、保存剤、乳化剤、植物油または鉱油、防腐剤、酸またはアルカリ試薬、ビタミン類、紫外線防止剤、界面活性剤、溶媒、ｐＨ安定化剤、シリコーン類などである。
【００２５】
本発明に係る組成物は、ミルク、クリーム、ローション、セラム（serum ）、パックまたはジェルの形態で提供される。
【００２６】
【実施例】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の本質を何ら限定するものではない。
実施例１：Halobacterium Halobiumから得られる糖タンパク質画分の抽出
エステルヘルト（D. Oesterhelt ）およびステッケニウス（W. Stoeckenius）らにより開示されたプロトコルに従い培養され、凍結された細菌塊は、ＣＮＲＳ（フランス国立科学研究センター）より赤色を有する圧縮された粒状物質の形態で調達される。
【００２７】
所定量の細菌槐を、ウルトラスラックス（ultra-thurax）装置を用い、予め、少量のジクロロメタン（非極性溶媒）中に溶媒１００ｍｌ当り細菌槐４０ｇの量で分散する。この分散液を、セルロース製抽出カートリッジ中に移し、全てをソックスレー抽出器（Macherey-Nagel）の筒容器内に置く。フラスコに溶媒５００ｍｌを充填した後、密閉した容器を８５℃に温度設定した水浴中に置く。６時間抽出後、溶媒から抜き出して真空中で乾燥したカートリッジを、９９．９％エタノールを用いて９０℃の温度での第２の抽出を行う。最後に、蒸留水を用いて６時間抽出する。得られた溶液を、次いで真空下のロータリーエバポレーター（Rotavapor ）で濃縮する。
【００２８】
得られた濃縮物は、無機塩を高濃度で含むため、精製する必要がある。最少量の蒸留水に再溶解し、マクロセップ（Macrosep）セル（Pall-Filtron）を用いて塩画分を限外濾過で除去すれば、１ｋＤより小さい分子量をもつ成分を除去することができる。その後、精製画分は、デシケータ中、真空下で乾燥する。抽出率の計算値は、最初の細菌槐の８％である。
【００２９】
実施例２：試験のための上記タンパク質画分の細胞毒性の評価
細胞ローン（lawns ）の生存能力をＭＴＴ試験により評価した。ミトコンドリア脱水素酵素の代謝能力を、ＭＴＴの加水分解を測定することによって定量化した。具体的には、無色テトラゾリウム塩から青色ホルマザン結晶への変化はミトコンドリア酵素：スクシネートデヒドロゲナーゼの活性に比例する。すなわち、ホルマザン濃度は、ウエル中の生細胞量に比例する。
【００３０】
抽出された糖タンパク質から得られる試験のための細菌生産物を、溶液中に溶解する。
【００３１】
次いで、細菌生産物の２０％（重量／容積）を培地中に溶解して貯蔵液を調製する。
【００３２】
試験はヒトケラチン細胞の培地において行われる。細胞を９６ウエルのプレート中で上記試験細菌生産物の存在下、２４時間培養する。これらを２４時間接触後、細胞をリンスし、培地をＭＴＴを含む培地に置換える。次いで、細胞を溶解し、ホルマザン結晶を酸性イソプロパノールに溶解する。得られたホルマザンの量は、波長５４０ｎｍで分光分析し定量する。
【００３３】
細胞生存能力（３試験の平均）は下記式に基づいて算出される。
【数１】
0004163439.tif 000002
【００３４】
【表１】
0004163439.tif 000003
【００３５】
以下の試験のために選択された細菌生産物濃度は、培養中の細胞に対し毒性を示さない最終濃度である。このようにして選択された濃度は０．００３２の貯蔵液であり、６．４μｇ／ｍｌの細菌生産物に該当する。
【００３６】
実施例３：使用した汚染物質の細胞毒性の決定
汚染物質は排気ガス残渣である。汚染粒子はフィルターで回収した。まず汚染物質の水溶性成分を培地に溶解する。次いで、繊維分をエタノールでリンスした後培地中に浸漬し、すべてを渦流撹拌する。室温で３時間後、調製物を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。浮遊物の容積を２０ｍｌに調節する。これにより得られた培地は均質で、かつ灰色である。
細胞ローンの生存能力は上記したＭＴＴ試験により評価される。
【００３７】
【表２】
0004163439.tif 000004
【００３８】
以下の実施例では、汚染物質はそのままであるいは半分に希釈して使用される。
実施例４：培養中のヒトケラチン細胞のエネルギー代謝における細菌生産物の効果のin vitroでの定量化
間接的方法によるＡＴＰ分析は、酸素、マグネシウムおよび下記反応を触媒するルシフェラーゼ存在下でのＡＴＰとＤ−ルシフェリンとの反応の間、生物発光により発光される光子の測定に基づいている。
【００３９】
【数２】
0004163439.tif 000005
この反応の収率は、反応したＡＴＰのモル数に対する発光された光子数の比に対応して集計される。
【００４０】
２４ウエルのプレート中、細胞は、上記細菌生産物、汚染物質あるいは細菌生産物＋汚染物質の存在下または非存在下に培養される。測定は３回行われる。細胞ローンをＰＢＳ中で洗浄し、細胞を氷上、０．２％トリトン（Triton）Ｘ１００（Sigma ）を含む水１００μｌに溶解する。ＡＴＰ分析は“ＡＴＰ生物発光キットＨＳII”分析キット（Roche Diagnostics Gmbh）を用いて行われる。一連の計算により結果が得られる。
【００４１】
【表３】
0004163439.tif 000006
試験のための細菌生産物がＡＴＰ合成量に及ぼす効果は顕著ではない。細菌生産物による阻害は無視しうる程度である。
【００４２】
【表４】
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汚染物質は、そのままでも半分に希釈されてもＡＴＰ合成を阻害する。
【００４３】
細菌生産物および汚染培地の存在下で合成されるＡＴＰ分析
保護指数は以下の方法により算出される：
P.I.＝ 100−｛100 ×（｛処理された非汚染培地−処理された汚染培地｝÷｛非汚染コントロール培地−汚染コントロール培地｝）｝
【００４４】
【表５】
0004163439.tif 000008
【００４５】
これら結果から、試験された細菌生産物は、非汚染培地中の貯蔵ＡＴＰを低減せず、かつ汚染物質の作用から培養中の細胞を保護する（保護指数はそれぞれ８８および９２％）。
【００４６】
実施例５：ヒトケラチン細胞懸濁液における試験のための細菌生産物による抗フリーラジカル効果のin vitroでの分析
ヒトケラチン細胞を、成長因子および抗生物質を補強したＫＧＭ培地（ケラチン細胞成育培地）中で培養した。この培地は、具体的にｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝液、必須および非必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルとともに有機化合物および無機塩を含む。成長因子は、ＨＧＫ（ヒトケラチン細胞成育剤）、ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出物）、ウシインスリン、ヒドロコルチゾン、ウシトランスフェリンおよびヒトＥＧＦ（上皮成長因子）である。
【００４７】
細胞をトリプシンで消化し、培地１リットル当り１０6 細胞で懸濁した。これらケラチン細胞に、フリーラジカル合成を活性化するための紫外線Ａ光およびＢ光を発光するヘリウム（Helarium）ランプを用いて３０分間照射する。この照射終了時に、試験のための細菌生産物を含むかまたは含まないケラチン細胞懸濁液を酸性化し（ｐＨ３．３の懸濁液とするため、細胞懸濁液２６０μｌ当り２モル／ｌのクエン酸を５０μｌ）、カタラーゼ溶液を添加する。実際には、上記細胞懸濁液に、メタノール／tert- ブタノール１００μｌおよび蒸留水４００μｌを添加した後、０．２ｍｇ／ｍｌカタラーゼをこの細胞懸濁液１００μｌ当り１５μｌ添加し、擬似反応シグナルを発生する過酸化水素を排除する。
【００４８】
次いで発光試薬を添加する。その後、細胞におけるフリーラジカルの作用により形成された過酸化物を、化学発光により分析する。光量計（luminometer ）の読み取りを１分間行い、発光された相対的光量（ＲＬＵ）数を集計する。
【００４９】
試験のための細菌生産物を、６．４μｇ／ｍｌの濃度で培地中に希釈する。ケラチン細胞の懸濁液には、この希釈液を添加するか、あるいは添加しない。
【００５０】
フリーラジカル合成に対する細菌生産物の保護能力は、％で表記される有効性Ｅで示され、下記式で算出される。
Ｅ％＝（ＣＩ−ＣＴＩ）÷（ＣＩ−ＣＮＩ）×１００
ここで、ＣＩは細菌生産物で処理されてない被照射細胞、ＣＴＩは細菌生産物で処理された被照射細胞を示し、ＣＮＩは非照射かつ非処理細胞を示す。
【００５１】
【表６】
0004163439.tif 000009
【００５２】
本研究の条件下では、細菌生産物は、紫外線に曝露された細胞に対し、フリーラジカル形成から細胞を保護する作用をする。この細菌生産物は、６４％の対フリーラジカル保護効果を示す。
【００５３】
実施例６：細菌生産物を含有するクリームの汚染防止効果のin vitroでの定量化ここでは、各個別の設定によるランダムな比較研究（細菌生産物対プラセボ）を行った。２種のクリームを各ボランティアに塗る。
化粧クリームは以下の処方に従い調製される。
【００５４】
【表７】
0004163439.tif 000010
【００５５】
化粧品または皮膚製剤の汚染防止能力は、非処理領域に対する（および／またはプラセボに対する）、カーボン微粒子からの皮膚保護パーセンテージを算出することにより評価される。環境汚染物質の標識として使用される汚染物質粒子は、水中に懸濁したカーボン微粒子である。
【００５６】
この研究における被験者（ボランティア）のプロトコルは、以下に定められる条件を満たすものとする。
・女性
・１８歳以上
・白色人種（コーカソイド）系
・フォトタイプII-III-IV
【００５７】
妊婦、授乳中の女性、被検領域に皮膚疾患または皮膚剥離および／または紅斑をもつ女性、ならびに重篤な疾患または進行性の疾患を患う被験者は、このプロトコルから除外される。抗炎症剤、コルチコステロイドまたはレチノイドの薬物治療中の女性もこのプロトコルから除外される。
【００５８】
このプロトコルは、試験日当日、被検部分に皮膚製薬用製品または化粧品を使用してない被験者１０人に実施される。
【００５９】
【表８】
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【００６０】
２種のクリームを試験する。
・クリーム５０９０はプラセボである。
・クリーム５０９１はクリーム５０９０と同一組成に、最終濃度１ｍｇ／ｍｌで細菌生産物が添加された組成をもつ。
【００６１】
各人の前腕に１６ｃｍ2 の領域を決める（プラセボ領域と処理領域）。
ｔ＝０時、上記所定の２つの領域に、プラセボと、試験のための細菌生産物とを基準量（２μｌ／ｃｍ2 ）で塗る、すなわち各領域あたり３２μｌずつのクリーム５０９０および５０９１を領域全面に塗り、その後、指サックを用いて当該箇所を円形を描きながら１５秒間軽くマッサージする。
ｔ＝２０分時、基準量（２μｌ／ｃｍ2 ）の汚染物質をそれぞれ所定領域に塗る。
ｔ＝６０分時、被検領域を所定方法でリンスおよび乾燥した後、各領域をイメージ取込みする（領域毎に３イメージ取りこみ）。皮膚表面上の汚染粒子の視覚化は、イメージ取込みのためのコンピュータシステムに接続された×１００長さの可動式光ファイバを備えたビデオ顕微鏡を用いて行われる。
【００６２】
細菌生産物またはプラセボで処理された各領域の皮膚について観察される“汚染物質”の減少を表すために、結果は下記式で求められるパーセント比率（Ｐ％）として示される。
Ｐ％＝｛（ＺＡＶ−ＺＡＰ）÷ＺＡＶ｝×１００
ここで、ＺＡＶはリンス前の領域で（画素数で）測定されるカーボン粒子量、ＺＡＰはリンス後に（画素数で）測定されるカーボン粒子量である。
ＳＥＭは被験者１０人の結果の平均の標準誤差を示す。
Ｐ％＝１００％ならば、つまり汚染物質に対し完全に保護されており、皮膚表面にはもはやカーボン粒子の痕跡すら存在しない。
【００６３】
【表９】
0004163439.tif 000012
【００６４】
この研究の条件下では、プラセボを用いた時の結果と、試験のための細菌生産物を含むクリームを用いた時の結果とでは、差異が認められる。プラセボは５６％で皮膚を保護するのに対し、細菌抽出生産物を含むクリームは７７％で皮膚を保護する。
【００６５】
実施例７：化粧品処方の形態
【表１０】
0004163439.tif 000013
【表１１】
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【００６６】
【表１２】
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【表１３】
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【００６７】
【発明の効果】
本発明の細菌生産物は、化粧品調製物中に含ませれば、具体的に、汚染物質および／または紫外線の有害な作用から皮膚細胞を保護するという効果を示す。