(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレアーゼをコードするＤＮＡを分離する方法であって、
（ａ）ヌクレアーゼをコードする供給源からＤＮＡライブラリーを形成するステップ；
（ｂ）適切なクローニングベクターにステップ（ａ）のＤＮＡを連結するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）のクローニングベクターにより、（ｉ）インジケーター／レポーター遺伝子に融合したＤＮＡ損傷誘発プロモーターを含み、（ii）ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣまたはｍｒｒに欠陥がある大腸菌宿主細胞を形質転換するステップ；
（ｄ）インジケーター／レポーター遺伝子の発現産物と反応する基質及び適切な抗生物質を含むインジケータープレート上で、ステップ（ｃ）の形質転換宿主細胞を平板培養／インキュベートするステップ；及び
（ｅ）ステップ（ｄ）の平板培養された形質転換宿主細胞から適切なコロニーを選択し、発現されたヌクレアーゼの存在についてスクリーニングするステップを含む前記方法。
【請求項２】
インジケーター／レポーター遺伝子に融合したＤＮＡ損傷誘発プロモーターがｄｉｎＤ１::ｌａｃＺである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インジケーター／レポーター遺伝子の発現産物と反応する基質がＸｇａｌである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ダークブルーコロニーに対する培地を選抜することによりステップ（ｃ）の選択を実施する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ヌクレアーゼが制限エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞がｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣまたはｍｒｒに欠陥がある、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞が大腸菌ＥＲ１９９２である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
インジケーター／レポーター遺伝子に融合したＤＮＡ損傷誘発プロモーターを含み、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣまたはｍｒｒに欠陥がある、ヌクレアーゼをクローン化するための大腸菌宿主細胞。
【請求項９】
大腸菌ＥＲ１９９２である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
配列番号４のヌクレオチド配列を有する、ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ。
【請求項１１】
配列番号６のアミノ酸配列を有するＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメントが挿入されたベクターを含む組換えＤＮＡベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の単離ＤＮＡを含むクローニングベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のクローニングベクターにより形質転換された大腸菌宿主細胞。
【請求項１４】
ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼを産生させる方法であって、該エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下に請求項１２に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
ヌクレアーゼは一本鎖または二本鎖ＤＮＡを分解もしくは切断する酵素である。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子中の特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、これに結合する一群の重要なヌクレアーゼである。上記のように結合した制限エンドヌクレアーゼは、認識配列の内部またはその一端においてＤＮＡ分子の両鎖を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列を認識する。今までに試験された何百もの細菌種の中から１８０を越える種類の、独自の特異性を有する制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
自然界では制限エンドヌクレアーゼは、細菌細胞を無事であるように保護する役割を果たすと考えられる。制限エンドヌクレアーゼによって細菌は、前記酵素が存在しなければ細菌を破壊するかまたは細菌に寄生するであろうウイルス及びプラスミドのような外来ＤＮＡ分子への感染に耐性であり得る。この耐性は、適当な認識配列が存在する場合に制限エンドヌクレアーゼが侵入した外来ＤＮＡ分子を切断することによってもたらされる。前記切断によって感染遺伝子の多くは無力化され、ＤＮＡは非特異的エンドヌクレアーゼによって更に分解される。
上記のような細菌保護系の第二の構成要素に修飾メチラーゼが有る。この酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、細菌が細菌自体のＤＮＡを切断から保護し、かつ外来の感染ＤＮＡと区別することを可能にする手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識ヌクレオチド配列を認識してこれに結合するが、ＤＮＡを切断する替わりに配列内のいずれかのヌクレオチドをメチル基の付加によって化学的に修飾する。メチル化された認識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって結合も切断もされない。細菌細胞のＤＮＡは修飾メチラーゼの活性により、常に完全に修飾されている。従って、細菌細胞のＤＮＡは内在制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に非感受性である。制限エンドヌクレアーゼによる認識及び切断に感受性であるのは、修飾されない、従って確実に外来性であるＤＮＡのみである。
遺伝子操作技術の出現に伴い、遺伝子をクローン化し、当該遺伝子がコードするタンパク質及び酵素を通常の精製技術によって得られるよりも大量に生産することが可能となった。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する鍵は、このクローンが１０-3〜１０-4といった低い頻度で発生する場合に複雑な「ライブラリー」、即ち「ショットガン」操作によって得られるクローン集団内で該クローンを同定する簡単でかつ確実な方法を開発することである。
タイプII制限−修飾系はますます頻繁にクローン化されるようになっている。最初にクローン化された系には、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する手段としてバクテリオファージ感染が用いられた（ＥｃｏＲII：  Ｋｏｓｙｋｈ等，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  １７８，  ｐｐ．７１７−７１９，  １９８０；  ＨｈａII：  Ｍａｎｎ等，  Ｇｅｎｅ  ３，  ｐｐ．９７−１１２，  １９７８；  ＰｓｔＩ：  Ｗａｌｄｅｒ等，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８，  ｐｐ．１５０３−１５０７，  １９８１）。細菌は制限−修飾系を有することによってバクテリオファージによる感染に耐性となり得るので、クローン化された制限−修飾遺伝子を持つ細胞は原則として、ファージに曝露したライブラリーから生存細胞として選択的に単離し得る。しかし、この方法の価値は限られていることが判明した。特に、クローン化された制限−修飾遺伝子は選択的生存を実現するのに十分なファージ耐性を常に示すわけではないことが明らかとなった。
別のクローニング法では、最初にプラスミド保持型（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）であると特徴付けられた系を大腸菌クローニングプラスミドに挿入する（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ等，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  １２，  ｐｐ．３６５９−３６７６，  １９８４；  ＰａｅＲ７：  Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０，  ｐｐ．４０２−４０６，  １９８３；  Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ及びＲｏｙ，  Ｇｅｎｅ  １９，  ｐｐ．３５５−３５９，  １９８２；  ＰｖｕII：  Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ等，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６４，  ｐｐ．５０１−５０９，  １９８５）。
次第に多数の系のクローニングに用いられてきている第三の方法では、活性なメチラーゼ遺伝子を選択することによってクローニングを行なう。例えば米国特許第５，２００，３３３号、及びＢｓｕＲＩに関してはＫｉｓｓ等，Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  １３，  ｐｐ．６４０３−６４２１，  １９８５を参照されたい。制限遺伝子と修飾遺伝子とはしばしば近接して連結されているので、両遺伝子を同時にクローン化することがしばしば可能である。しかし、このような選択は常に完全な制限系をもたらすとは限らず、メチラーゼ遺伝子のみをもたらす場合も有る（ＢｓｐＲＩ：  Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ等，  Ｇｅｎｅ１０，  ｐｐ．２１９−２２５，  １９８０；  ＢｃｎＩ：  Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ等，  Ｇｅｎｅ  ２０，  ｐｐ．１９７−２０４，  １９８２，  ＢｓｕＲＩ：  Ｋｉｓｓ及びＢａｌｄａｕｆ，  Ｇｅｎｅ  ２１，  ｐｐ．１１１−１１９，  １９８３；  並びにＭｓｐＩ：  Ｗａｌｄｅｒ等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８，ｐｐ．１２３５−１２４１，  １９８３）。
第四のクローニング法（「メチラーゼインジケーター」法）では、メチル化依存制限系ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣ及びＭｒｒ（Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３，  ｐｐ．９０７０−９０７４，  １９８６；  Ｈｅｉｔｍａｎ及びＭｏｄｅｌ，  Ｇｅｎｅ  １０３，  ｐｐ．１−９，１９９１；  Ｋｅｌｌｅｈｒ及びＲａｌｅｉｇｈ，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７３，  ｐｐ．５２２０−５２２３，  １９９１）並びにｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺオペロン融合体を用いて、メチラーゼ遺伝子を含むクローンをスクリーニングする。ｄｉｎＤ１遺伝子座は、大腸菌において紫外線処理、マイトマイシン処理、またはメチル化ＤＮＡへのＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣもしくはＭｒｒ制限エンドヌクレアーゼの作用などにより「ＳＯＳ応答」が誘起されると発現するＤＮＡ損傷誘導性遺伝子である（その開示が本明細書に参考として含まれるＫｅｎｙｏｎ及びＷａｌｋｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７，  ｐｐ．２８１９−２８２３，  １９８０；  Ｈｅｉｔｍａｎ及びＭｏｄｅｌ，上掲誌，１９９１；  Ｈｅｉｔｍａｎ及びＭｏｄｅｌ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６９，  ｐｐ．３２３４−３２５０，  １９８９；  並びにＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚ等，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７３，  ｐｐ．１５０−１５５，  １９９１）。ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ及びｍｒｒの温度感受性突然変異体、並びにｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺ融合体を有する株を構築し、これを大腸菌以外の細菌供給源から得たメチラーゼ遺伝子の大腸菌中への直接クローニングに用いることが行なわれた（その開示が本明細書に参考として含まれるＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚ等，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  １９，  ｐｐ．１８３１−１８３５，  １９９１）。連結したゲノム−ベクターＤＮＡで上記のような株を形質転換すると、上記メチル化依存制限系のうちのいずれかに対する感受性をもたらすメチラーゼを発現する遺伝子を有する形質転換体が、ＳＯＳ  ＤＮＡ修復誘導及びβ−ガラクトシダーゼ発現を惹起するメチル化依存制限の結果としてＸｇａｌインジケータープレート上に４２℃において白色のコロニー、３０℃において青色のコロニーを形成する。ほとんどの制限酵素遺伝子と同種（ｃｏｇｎａｔｅ）メチラーゼ遺伝子とが近接して連結されているので、適当な大きさのＤＮＡ断片中のメチラーゼ遺伝子をクローン化すれば同種エンドヌクレアーゼ遺伝子を共にクローン化することになり得る。
標準的な方法が実用的でないか、または好ましい成果をもたらさない場合には代替方法として、制限エンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを直接クローン化する方法を設計することが望ましい。
発明の概要
本発明は、大腸菌において制限エンドヌクレアーゼ遺伝子などのヌクレアーゼ遺伝子を直接クローン化する新規な方法を提供する。本発明はまた、上記方法の適用を容易にする新規な株も提供する。本発明の方法は、ＢｓｏＢＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＴａｑＩ及びＥｃｏ０１９１などの制限エンドヌクレアーゼを含めたヌクレアーゼをコードする幾つかの遺伝子のクローニングに首尾よく適用できた。従って本発明は、上記のようなヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ、並びにそれらのヌクレアーゼの発現に用いるベクター及び形質転換宿主細胞も提供する。
本発明は特に、（ｉ）制限系を総て欠く（ＥｃｏＫＲ-、ＭｃｒＡ-、ＭｃｒＢＣ-、Ｍｒｒ-）、ｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺ融合体を有する新規な大腸菌株、（ｉｉ）ｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺ融合体などの、ＤＮＡ損傷誘導プロモーターとインジケーター／レポーター遺伝子との融合体を含む株を用いる、大腸菌においてヌクレアーゼ遺伝子を直接クローン化する方法、並びに（ｉｉｉ）本発明の方法でクローン化した、或る種のヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡに係わる。大腸菌においてＴ７．３エンドヌクレアーゼ、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ制限酵素によって導入されたＤＮＡの切れ目（ｂｒｅａｋｓ）もしくはニックがＳＯＳ応答を誘起することが判明しているので（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ及びＦｏｎｔａｉｎｅ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６０，  ｐｐ．３１７３−３１７７，  １９８５；  Ｈｅｉｔｍａｎ及びＭｏｄｅｌ，上掲誌，１９９１；  Ｘｕ及びＳｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６，  ｐｐ．４４２５−４４２９，  １９９１）、本発明者は、先に述べた制限系を総て欠くｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺなどのインジケーター株に連結ゲノムＤＮＡ断片及びベクターを導入し、形質転換体をＸｇａｌプレート上で平板培養すれば、ヌクレアーゼ保有クローンを青色コロニーの選出（ｐｉｃｋｉｎｇ）によって直接発見できるのではないかと推論した。制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子のクローニングに本発明を用いる場合、メチラーゼ選択法の時とは異なり、メチラーゼ遺伝子が宿主染色体を完全に保護する必要は無い。実際のところ、メチラーゼ遺伝子が全く存在しなくともよいことも有る。このことは特に、形質転換体を本発明により比較的低温、即ち約３０〜３７℃で増殖させる場合の熱安定酵素の場合に該当する。上記のような低温では熱安定性の制限エンドヌクレアーゼはさほど活性でなく、形質転換宿主細胞は保護的メチル化を一部にしか、更には全く受けていなくとも生存し得る。
即ち、本発明の方法によれば、好ましい大腸菌細胞（ｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺ、ＥｃｏＫＲ-、ＭｃｒＡ-、ＭｃｒＢＣ-、Ｍｒｒ-）などの宿主細胞を連結ゲノム−ベクターＤＮＡで形質転換し、形質転換体をＸｇａｌプレート上で平板培養すると、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有する細胞は青色のコロニーを形成し、なぜなら制限酵素はｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡを損傷し、ＳＯＳ  ＤＮＡ修復応答を誘起するからである。この方法（「エンドヌクレアーゼインジケーター法」）はＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚ等，上掲誌，１９９１に記載された「メチラーゼインジケーター法」と、後者の従来方法がエンドヌクレアーゼではなくメチラーゼの発現を検出する点において相違する。上記従来方法は、特異的なメチル化配列に作用する内在制限酵素（ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣまたはＭｒｒ）のＤＮＡ損傷作用に依拠していた。適当な外来メチラーゼの発現によって、上記メチル化特異的エンドヌクレアーゼのうちの一つ以上に感受性である配列が創出され得、その結果ＳＯＳ応答の誘起と青色の発色とが生起する。メチラーゼ遺伝子は同種エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を伴っても伴わなくてもよい。本発明のエンドヌクレアーゼインジケーター法はエンドヌクレアーゼのみを検出してメチラーゼは検出せず、なぜなら関連するメチル化依存制限系が宿主細胞に存在しないからである。本発明の方法によって熱安定制限酵素ＴａｑＩ（５′ＴＣＧＡ３′；  配列番号１）及びＴｔｈ１１１Ｉ（５′ＧＡＣＮＮＮＧＴＣ３′；  配列番号２）をコードする遺伝子を、大腸菌において首尾よくクローン化した。メチラーゼ選択法（Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ等，上掲誌，１９８０）と「エンドヌクレアーゼインジケーター法」とを組み合わせて制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローン化することも可能である。これら２方法の組み合わせによって、制限エンドヌクレアーゼコーディング遺伝子ｅｃｏＯ１０９ＩＲをクローン化した。
【図面の簡単な説明】
図１はＴｔｈ１１１Ｉをコードする遺伝子であるｔｔｈ１１１ＩＲ遺伝子の大腸菌におけるクローニングの説明図である。
図２は大腸菌によって産生されたクローン化ＴａｑＩ及びＴｔｈ１１１Ｉ制限酵素のＤＮＡ切断パターンを示す。細胞抽出物のＴａｑＩ及びＴｔｈ１１１Ｉエンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。レーン１は切断していないｐＢＲ３２２  ＤＮＡ、レーン２はＴａｑＩエンドヌクレアーゼを含有する細胞抽出物で切断したｐＢＲ３２２、レーン３は精製ＴａｑＩで切断したｐＢＲ３２２、レーン４はＢｓｔＥII切断λＤＮＡ寸法標準、レーン５は切断していないλＤＮＡ、レーン６はＴｔｈ１１１Ｉエンドヌクレアーゼを含有する細胞抽出物で切断したλＤＮＡ、レーン７は精製Ｔｔｈ１１１Ｉエンドヌクレアーゼで切断したλＤＮＡである。ＴａｑＩ及びＴｔｈ１１１Ｉ制限消化は６５℃で１時間行なった。
図３はＢｓｏＢＩ活性アッセイの結果を示す。５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び１ｍＭ  ＤＴＴを含有する緩衝液中で１μｇのλＤＮＡ基質を１０μｌの細胞抽出物と共に６５℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡ消化産物を０．８％アガロースゲル中で分離させ（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）、エチジウムブロミド染色によって検出した。単離物＃１６から得られた細胞抽出物はＢｓｏＢＩヌクレアーゼ活性を有することが判明した。最初のレーンはＢｓｏＢＩ陽性対照である。各レーン上の数字は単離物番号を示す。
図４ＡはＢｓｏＢＩメチラーゼ遺伝子である（配列番号３）。図４ＢはＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子である（配列番号４）。図４ＣはＢｓｏＢＩメチラーゼ遺伝子に対応するアミノ酸配列である（配列番号５）。図４ＤはＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子に対応するアミノ酸配列である（配列番号６）。
図５はＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ挿入部分の制限マップである。挿入部分の大きさは約８．０ｋｂである。挿入部分はＳａｕ３ＡＩで部分消化したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムＤＮＡから得、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位へクローン化した。
発明の詳細な説明
本発明はその一形態によって、ヌクレアーゼ遺伝子を直接クローン化する新規な方法を提供する。本発明の方法は通常次のステップを含むが、当業者には理解されるように、これらのステップの変形も結果に悪影響を及ぼさずに可能である。
１）  ヌクレアーゼ産生株からゲノムＤＮＡを調製し、これを完全に、または部分的に切断して約５００〜２０，０００ｂｐのクローン化可能なＤＮＡ断片を生じさせる。このような断片は、例えば制限酵素を用いたり、音波処理で切り取ったりして取得し得る。得られた断片はその後、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１８７、ｐＳＣ１０１、またはこれらの誘導体中の相容性の付着端または平滑末端を持つクローニングベクターに連結する。
２）  連結ＤＮＡ混合物を、好ましくはｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ融合体などの、インジケーター／レポーターと融合したＤＮＡ損傷性プロモーターを有し、かつメチル化依存制限系を欠く細菌株（ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）に移入する。好ましい株の一つに大腸菌ＥＲ１９９２（ＮＥＢ  ＃９０７）が有り、この株の標本はブダペスト条約の約定に基づき１９９４年５月２４日付でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｒｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、ＡＴＣＣ受託番号第５５５８２号の下に寄託してある。用い得る他のＤＮＡ損傷誘導プロモーターにはｄｉｎＡ（Ｍ．  Ｉｗａｓａｋｉ等，Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７２，  ｐｐ．６２６８−６２７３，  １９９０）及びｄｉｎＧ（Ｌ．  Ｋ．  Ｌｅｗｉｓ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７４，  ｐｐ．５１１０−５１１６，  １９９２）が含まれ、前記文献の開示は本明細書に参考として含まれる。上記プロモーターのうちのいずれかと融合し得る他のインジケーター／レポーター遺伝子には、アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，  ｐｐ．５１０７−５１１１，  １９８５）、ルシフェラーゼ（ｌｕｘ；  Ｊ．  Ｅｎｇｅｌｒｅｃｈｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７，  ｐｐ．１３４５−１３４７，  １９８５）、β−グルクロニダーゼ（Ｗ．  Ｗ．  Ｍｅｔｃａｌｆｅ，  Ｇｅｎｅ  １２９，  ｐｐ．１７−２５，  １９９３）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｊ．  Ｍ．  Ｗａｒｄ等，  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０３，  ｐｐ．４６８−４７８，  １９８６）及びエンドグルカナーゼ（Ｗ．  Ｗ．  Ｂｉｎｇｌｅ等，  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９，  ｐｐ．７０−８０，  １９９３）が含まれ、前記文献の開示は本明細書に参考として含まれる。
大腸菌ＥＲ１９９２の形質転換後、細胞を、Ｘｇａｌ及び適当な抗生物質を含有するインジケータープレート上で平板培養し、約３０〜４２℃で一晩インキュベートする。クローン化するべき特定の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子またはヌクレアーゼ遺伝子次第では、宿主のメチル化依存制限系の全部または一部を不活性化しなくともよい場合が有る。上記制限系が常に欠けている必要は無いが、修飾塩基（異常なＣ5シトシン、Ｎ4シトシンまたはＮ6アデニン）が未知である場合の制限−修飾系のクローニングには総てのメチル化依存系を欠くｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ株を用いることが好ましい。
３）  個々の中青色（ｍｅｄｉｕｍ  ｂｌｕｅ）／暗青色コロニーを選出し、適当な抗生物質を加えたＬＢ培地（１０〜１０００ｍｌ）に接種して約３０〜４２℃で一晩振盪する。
４）  細胞を遠心によって回収し、溶菌酵素を加えた音波処理緩衝液中に再懸濁させ、細胞溶解を音波処理によって完了させる。細胞破片及び不溶性構成要素を遠心によって除去する。
５）  クローン化するべきヌクレアーゼ遺伝子が熱安定性の細菌に由来する場合は溶解物を約６５℃で、大腸菌天然タンパク質の変性に十分な時間（例えば３０分間）加熱する。このステップによって、天然の大腸菌ヌクレアーゼを効率的に不活性化する。
６）  上清（細胞抽出物）を適当な緩衝液中で３７〜６８℃において、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、Ｍ１３ｍｐ１８／１９複製形態もしくは一本鎖ＤＮＡまたはλＤＮＡといった適当なＤＮＡ基質に対するヌクレアーゼ活性に関してアッセイする。
７）  ＤＮＡ消化パターンもしくは断片をアガロースゲル電気泳動またはＰＡＧＥによって分離させ、エチジウムブロミド染色によって検出する。
上述の方法は、ｔａｑＩＲ遺伝子、ｔｔｈ１１１ＩＲ遺伝子、及びＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ由来のＤＮＡヌクレアーゼをコードする遺伝子を含めた幾つかのヌクレアーゼ遺伝子のクローニングに首尾よく用いることができた。先に指摘したように、本発明の方法は特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＥＢ  ＃８８２）由来のＢｓｏＢＩなどの熱安定ヌクレアーゼを含めた上記以外のヌクレアーゼのクローニングに有用である。ＢｓｏＢＩは、ＣＰｙＣＧＰｕＧ（配列番号７）を認識するＡｖａＩのアイソシゾマーである。
本発明は別の形態によって、上述のエンドヌクレアーゼインジケーター法で用い得る新規な株を提供する。この株、即ち大腸菌ＥＲ１９９２はｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ融合体を有し、かつ総ての制限系を欠いている（ＥｃｏＫＲ-、ＭｃｒＡ-、ＭｃｒＢＣ-及びＭｒｒ-）。
大腸菌ＥＲ１９９２［Ｆ-  λ-  Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）Ｕ１６９  ｓｕｐＥ４４  ｅ１４-  ｄｉｎＤ１：：Ｍｕ  ｄｌ１７３４（ＫａｎR，ＬａｃＺ+）  ｒｆｂＤ１？  ｒｅｌＡ１？  ｅｎｄＡ１  ｓｐｏＴ１？  ｔｈｉ−１  Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０］は、（ｉ）ＮＫ６９９３由来のΔ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）Ｕ１６９に連結したｐｒｏＣ：：Ｔｎ５での形質導入、ＫａｎRの選択、及びＬａｃ-Ｐｒｏ-のスクリーニングによりＥＲ１９８４を得ることによってＥＲ１８２１のＬａｃ-誘導体を取得し、（ｉｉ）前記誘導体をＥＲ１５７８からの形質導入によりＰｒｏ+ＫａｎSとしてＥＲ１９９１を得、（ｉｉｉ）ＪＨ１４０［ｄｉｎＤ１：：μｄｌ１７３４（ＫａｎR，ＬａｃＺ+）である大腸菌株；  Ｊ．  Ｈｅｉｔｍａｎ等，上掲誌，１９９１）からの形質導入、ＫａｎＲの選択、及びｄｉｎＤ融合体によって媒介されるβ−ガラクトシダーゼのナリジキシン酸誘導性発現のスクリーニングによってｄｉｎＤ１：：μｄｌ１７３４（ＫａｎR，ＬａｃＺ+）を導入する３ステップで構築した。この大腸菌株を、上記ＤＮＡ損傷物質を収容したウェルを中央に設けたＸｇａｌプレート上で試験した。精製した形質導入体を、ウェルから放射状に画線培養した。暗青色にグラデーションの有る培養を大腸菌ＥＲ１９９２と名付けた。この株は一切のＤＮＡ損傷を受けず、Ｘｇａｌ上で淡青色を示した。
以下の実施例を、現段階で好ましく実施される本発明の具体例を説明するために示す。これらの実施例は説明用であり、本発明は添付の請求の範囲に記されている事以外では前記実施例に限定されないと考えるべきであることは理解されよう。
実施例１
ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするｂｓｏＢＩ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ中でのクローニング
細菌ＤＮＡの精製：５ｇのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＥＢ＃８８２）細胞を、２５％スクロース、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を含む緩衝液２５ｍｌに再懸濁した。該細胞懸濁液に、５ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び６ｍｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。室温で１０分間インキュベートした後、３６ｍｌの溶菌緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６２ｍＭ ＥＤＴＡ）及び５ｍｌの１０％ ＳＤＳを加えて、細胞を完全に溶解した。フェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で２回抽出してタンパク質を取り出した。１／１０容量の３．５Ｍ 酢酸ナトリウム及び等量のイソプロパノールを添加し、１５，０００ｒｐｍ／分で遠心して、ゲノムＤＮＡを沈降させた。ＤＮＡペレットを５０ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、真空下に乾燥した。ＤＮＡペレットを１０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、２リットルのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中４℃で一晩透析した。
ゲノムＤＮＡの部分消化：５０μｇのゲノムＤＮＡを、それぞれ、２単位、１単位、０．５単位、０．２５単位、０．１２５単位のＳａｕ３ＡＩで３０分間３７℃で消化した。消化ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で２回抽出し、エタノールで沈降させて精製した。ベクターｐＵＣ１９ ＤＮＡをＢａｍＨＩ制限酵素により直鎖状にし、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で脱リン酸化した。ＣＩＰ処理した後、ベクターＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で２回抽出し、エタノールで沈降させて精製した。
連結及び形質転換：Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した１０μｇのゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ切断及びＣＩＰ処理したｐＵＣ１９ ＤＮＡ１μｇと一晩１６℃で連結させた。等量のＴＥ緩衝液を加えて連結ＤＮＡを希釈し、ＥＲ１９９２（ｄｉｎＤ１::ｌａｃＺ+、ｈｓｄＲ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）コンピテント細胞の形質転換に用いた。形質転換細胞をアンピシリン（Ａｐ）＋Ｘｇａｌプレート（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｘｇａｌ、０．０１６％ｗ／ｖ）上で平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした。１０，０００個の形質転換細胞中に２４のブルーコロニーが見出された。各ブルーコロニーを１０ｍｌのＬＢ＋Ａｐに接種し、振盪機中３７℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心して収穫し、１ｍｌの音波処理緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）に再懸濁した。３０秒間の音波処理を２回行って細胞の溶菌を完了した。不溶成分を遠心して除去し、上清を捕集して、以下のようなエンドヌクレアーゼ活性アッセイに用いた：１μｇのλＤＮＡ基質を、１０μｌの細胞抽出物と共に、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭＤＴＴを含む緩衝液中６５℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡフラグメントを０．８％アガロースゲル中で分離し、臭化エチジウム染色により検出した。１つの分離物からの細胞抽出物は、ＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼ活性を含むことが判明した（図３、分離物＃１６参照）。この株からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＢｓｏＢＩ制限インドヌクレアーゼで消化して耐性を調べた。該プラスミドＤＮＡはＢｓｏＢＩで切断されたが、これは、ＢｓｏＢＩメチラーゼ遺伝子が挿入物中に存在しないか、又は該メチラーゼ遺伝子が全く発現されないことを示している。ＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ＢｓｏＢＩＲ）を有するプラスミドをｐＢｓｏＲ１と命名した。ＢｓｏＢＩクローンの安定性を測定するために、ＥＲ１９９２［ｐＢｓｏＲ１］細胞を３７℃で増殖させ、プラスミドＤＮＡを細胞から分離し、ＥＲ１９９２コンピテント細胞への再形質転換に用いた。再形質転換実験では、さらなる突然変異を最小限にするべく、形質転換細胞を３０℃で平板培養した。形質転換細胞の６７％がブルーコロニーを形成する（５２８個の形質転換細胞中３５６のブルーコロニー）のに対し、他の３３％はホワイトコロニーを形成する（５２８個の形質転換細胞中１７２のホワイトコロニー）ことが知見された。プラスミドＤＮＡをホワイトコロニーから分離し、制限消化により分析すると、該ＤＮＡが広範囲の欠失を示すことが見出された。ＥＲ１９９２［ｐＢｓｏＲ１］細胞は３７℃ではあまり安定ではないという結論を得た。ｐＢｓｏＲ１を有するブルーコロニーを３７℃の代わりに３０℃で一晩インキュベートすると、ＥＲ１９９２［ｐＢｓｏＲ１］細胞はより安定になる。３０℃培養物から分離したプラスミドＤＮＡを用いて再形質転換すると、形質転換細胞の９９．６％が３０℃でブルーコロニーを形成する（４８０のブルーコロニー、２つのホワイトコロニー）。ｐＢｓｏＲ１（ＮＥＢ＃９５１）の試料は、ブダペスト���約の条項に基づき、１９９４年１２月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号７５９６６の元に受託された。
ＡｖａＩ制限−修飾系をコードする遺伝子は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓでクローン化された。ＡｖａＩ及びＢｓｏＢＩは同一の認識配列５′ＣＰｙＣＧＰｕＧ３′（配列番号７）を共有している。ＡｖａＩメチラーゼ遺伝子（ａｖａＩＭ）を有する１．８ｋｂのＰｓｔＩフラグメントをｐＡｖａＩＲＭ１２から消化し、ｐＲ９７６ベクター（ｐＡＣＹＣ１８４誘導体、ＴｃR）にクローン化した。プラスミドｐＲ９７６−ＡｖａＩＭ+をＥＲ１９９２（ｄｉｎＤ::ｌａｃＺ）細胞に形質転換して、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体を予備修飾した。次いで、ＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を有する第２のプラスミド、ｐＢｓｏＲ１をｐＲ９７６−ＡｖａＩＭ+を含む細胞に導入し、Ｘｇａｌインジケータープレート上で平板培養した。該形質転換細胞はまだブルーコロニーを形成することが知見されたが、これは、ＡｖａＩメチラーゼがＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼ損傷に対してＥ．ｃｏｌｉ染色体を保護しないことを示唆している。
プラスミドミニ調製手順：１．５ｍｌの一晩培養物を１４，０００ｒｐｍ／分で３分間ペレット化した。上清を流し出し、細胞ペレットを２００ｍｌのＳＴＥＴ緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、８％スクロース）に再懸濁した。該細胞懸濁液に５０μｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。溶解した細胞を沸騰水中で１分間沸騰させ、沈降物を１４，０００ｒｐｍ／分で１０分間スピンした。２００μｌの上清を捕集し、１００μｌの７．５Ｍ ＮＨ3Ａｃ及び６００ｍｌの９５％エタノールと混合した。室温で１０分間１４，０００ｒｐｍ／分で遠心してＤＮＡを沈降させた。ＤＮＡペレットを１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、真空下に１５分間乾燥した。乾燥したペレットを１００μｌのＴＥ緩衝液＋５μｌのＲＮアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁した。
挿入物の制限マッピング：プラスミドＤＮＡ ｐＢｓｏＲ１を種々の制限酵素で消化し、消化ＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。制限マップを図５に示した。
ｂｓｏＢＩＲ遺伝子を、欠失マッピングにより８ｋｂのゲノムＤＮＡ挿入物中の１．４ｋｂのＥｃｏＮＩ／ＸｂａＩフラグメント内にマッピングした。全ｂｓｏＢＩＲ遺伝子を、サブクローン及び欠失クローン（ＳｓｐＩフラグメントサブクローン、ＡｖｒII／ＸｂａＩサブクローン、ＮｌａIIIフラグメントサブクローン、Ｓａｕ３ＡＩフラグメントサブクローン、ＥｃｏＮＩ／ＡｖｒIIサブクローン、ＡｖｒII／ＸｈｏＩ）並びに「プライマーウォーキング」から配列決定した。精製ＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼのＮ末端タンパク質配列は開始コドンの後の予測タンパク質配列〔（Ｍ）ＮＴＱＫＰＦＥＮＨＬＫＳＶＤＤＬ（配列番号６の１−１７アミノ酸に対応する）〕とマッチするので、ｂｓｏＢＩＲ遺伝子の開始コドンをＴＴＧコドンと定めた。ｂｓｏＢＩＲ遺伝子の両側のＤＮＡも配列決定して、８．０ｋｂのＤＮＡフラグメントにクローン化されているシトシンメチラーゼ遺伝子の一部が存在するかどうかを測定した。ｂｓｏＢＩＭ遺伝子又は該遺伝子の一部は、保存されたメチラーゼモチーフに基づいて同定し得る。ｂｓｏＢＩＲ遺伝子の後のＤＮＡ領域を配列決定し、６つのフレーム全てについて翻訳すると、保存されたＮ４シトシンメチラーゼモチーフが１個見つかった。この配列は、ＤＰＦＬＧＳＧＴＴ（配列番号５の１０６−１１４アミノ酸に対応する）である。ｂｓｏＢＩＭ遺伝子の７２７ｐｂのみが元の８．０ｋｂ挿入物上に存在していた。従って、逆ＰＣＲを用いてメチラーゼ遺伝子の残りの部分をクローン化した。ＨａｅII及びＮｌａIII切断／自己連結したゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ産物のクローニング及び配列決定により、別の保存メチラーゼモチーフＴＳＰＰＹ（配列番号５の３１９−３２３アミノ酸に対応する）が見出された、メチラーゼ遺伝子の別の９０２ｂｐを得た。全メチラーゼ遺伝子（１６２９ｂｐ）をゲノムＤＮＡからｌａｃRにより増幅し、ｐＳＸ３３ｌａｃＩqにクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１コンピテント細胞に形質転換して、宿主を予備修飾した。ｂｓｏＢＩＲ遺伝子を含むＢｂｓＩ／ＸｂａＩフラグメントを発現ベクターｐＲＲＳにクローン化して過産生構築物Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１（ｐＳＸ３３ｌａｃＩq−ＢｓｏＢＩＭ+、ｐＲＲＳ−ＢｓｏＢＩＲ+）を得た。ｂｓｏＢＩＭ及びｂｓｏＢＩＲ遺伝子の配列をそれぞれ図４−１〜図４−４に示す。
実施例２
Ｔａｑ／Ｒ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ中でのクローニング
細菌ＤＮＡの精製を以下のように行った：５ｇのＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＹＴ−１（ＡＴＣＣ ２５１０４）細胞を、２５％スクロース、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む２５ｍｌの緩衝液中に懸濁した。該細胞懸濁液に、５ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び６ｍｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。室温で１０分間インキュベートした後、３６ｍｌの溶菌緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６２ｍＭ ＥＤＴＡ）及び５ｍｌの１０％ＳＤＳを加えて細胞を完全に溶解した。フェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で２回抽出してタンパク質を取り出し、１／１０容量の３．５Ｍ 酢酸ナトリウム及び等量のイソプロパノールを加え、１５，０００ｒｐｍ／分で遠心してゲノムＤＮＡを沈降させた。ＤＮＡペレットを５０ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、真空下に乾燥した。ＤＮＡを１０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、２リットルのＴＥ緩衝液中４℃で一晩透析した。５０μｇのゲノムＤＮＡを、１単位、０．５単位、０．２５単位、０．１２５単位のＳａｕ３ＡＩで３０分間３７℃で消化した。消化ＤＮＡをフェノールＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で２回抽出し、エタノールで沈降させて精製した。ベクターｐＢＲ３２２ ＤＮＡをＢａｍＨＩ制限酵素で直鎖状とし、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で脱リン酸化した。ベクターＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で２回抽出し、エタノールで沈降させて再度精製した。
Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩで切断し、ＣＩＰ処理したｐＢＲ３２２ ＤＮＡと連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２（ｄｉｎＤ１::ｌａｃＺ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）コンピテント細胞及び連結ＤＮＡを混合して、１回の形質転換実験から合計して約４，０００のコロニーを得、形質転換細胞をＡｐ＋Ｘｇａｌプレート上で平板培養する。１０のブルーコロニーが見出された。各コロニーを１０ｍｌのＬＢ＋Ａｐに接種し、振盪機中３７℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心して収穫し、１ｍｌの音波処理緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）＋リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁した。音波処理により細胞の溶菌を完了した。６５℃で３０分間溶解物をインキュベートして、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質を熱変性させた。不溶成分を遠心して除去し、上清をエンドヌクレアーゼ活性アッセイに用いた。λ又はｐＢＲ３２２ ＤＮＡ基質を５μｌの細胞抽出物と共に６５℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡフラグメントを０．８％アガロースゲル中で分離し、臭化エチジウム染色により検出した。細胞抽出物をｐＢＲ３２２基質上でエンドヌクレアーゼ活性について調べたが、２つの株はＴａｑＩエンドヌクレアーゼを産生することがわかった（図２）。これら２つの株からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＴａｑＩエンドヌクレアーゼ消化にかけた。１方のプラスミドはＴａｑＩ消化に対して部分的に耐性であり、他方は完全に消化された。上記結果から、一方のクローンはＴａｑＩメチラーゼ遺伝子を含み、他方のクローンは該遺伝子を含んでいないものと推論された。
ＴａｑＩエンドヌクレアーゼ収率を予測するために、１リットルの細胞培養物を３７℃にし、細胞抽出物をその活性についてアッセイした。両株とも、湿潤細胞１ｇ当たり５×１０4単位のＴａｑＩを産生した。細胞抽出物は以下のように調製した：１リットルのＬＢ＋Ａｐに５ｍｌの一晩細胞を接種し、３７℃で一晩振盪した。細胞を遠心し、細胞ペレットを２０ｍｌの音波処理緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）中に再懸濁し、３０秒バーストで１０回音波処理し、１５，０００ｒｐｍ／分で３０分間遠心して、細胞破片を除去した。上清を、ＴａｑＩ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2）中６５℃で１時間エンドヌクレアーゼ活性についてアッセイした。
実施例３
Ｔｔｈ１１１ＩＲ遺伝子のクローニング
Ｔｔｈ１１１Ｉ制限酵素を産生するＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ １１１（ＮＥＢ＃２４９）株からゲノムＤＮＡを形成した。５ｇの細胞を、２５％スクロース、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を含む２５ｍｌの緩衝液に再懸濁した。該細胞懸濁液に５ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び６ｍｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。室温で１０分間インキュベートした後、３６ｍｌの溶菌緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６２ｍＭ ＥＤＴＡ）及び５ｍｌの１０％ＳＤＳを加えて、細胞を完全に溶解させた。フェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で２回抽出してタンパク質を取り出し、１／１０容量の３．５Ｍ 酢酸ナトリウム及び等量のイソプロパノールを加え、１５，０００ｒｐｍ／分で遠心してゲノムＤＮＡを沈降させた。ＤＮＡペレットを５０ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、真空下に乾燥した。ＤＮＡを１０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、２リットルのＴＥ緩衝液中４℃で一晩透析した。５０μｇのゲノムＤＮＡを、１単位、０．５単位、０．２５単位、０．１２５単位のＳａｕ３ＡＩで３０分間３７℃で消化した。消化ＤＮＡをフェノールＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で２回抽出し、エタノールで沈降させて精製した。ベクターｐＢＲ３２２ ＤＮＡをＢａｍＨＩ制限酵素で直鎖状とし、ＣＩＰで脱リン酸化した。ベクターＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で２回抽出し、エタノールで沈降させて再精製した。Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理したｐＢＲ３２２ ＤＮＡと連結した。該ＤＮＡ連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２（ｄｉｎＤ１::ｌａｃＺ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）コンピテント細胞に形質転換した。８，０００個の形質転換細胞中に４０のブルーコロニーが見出された。これら４０の株をエンドヌクレアーゼ活性について調べた。１４の株はＴｔｈ１１１Ｉエンドヌクレアーゼを産生した（図２）。Ｔｔｈ１１１Ｉ産生株からプラスミドＤＮＡを作成し、Ｔｔｈ１１１Ｉ制限消化にかけた。１２のプラスミドはＴｔｈ１１１Ｉエンドヌクレアーゼにより直鎖状となった。これは、メチラーゼ遺伝子が同一フラグメント中には含まれていないか、又は３７℃では発現されないことを示唆している。３つのプラスミドはＴｔｈ１１１Ｉに対して部分的に耐性であり、これは、クローン化フラグメント上に同種メチラーゼ遺伝子が存在することを示している。
実施例４
メチラーゼ選択法とブルーコロニースクリーニング法の組合わせによるＥｃｏＯ１０９ＩＲ遺伝子のクローニング
この実施例においては、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするためにメチラーゼ選択法とエンドヌクレアーゼインジケーター法を組合わせる可能性をテストした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ７０９ｃ（ＮＥＢ＃３６１）のゲノムＤＮＡを実施例２に記載のように作成した。ＤＮＡを実施例２に記載のようにＳａｕ３ＡＩで部分的に切断し、１６℃で一晩ｐＢＲ３２２（ＢａｍＨＩで直鎖状にし、ＣＩＰ処理した）に連結した。該連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＲＲ１コンピテント細胞を形質転換した。合計１０5個の形質転換細胞をプールし、５００ｍｌのＬＢ培地に接種した。細胞培養物を一晩３７℃で振盪した。細菌細胞を遠心して収穫し、２０ｍｌの緩衝液Ｐ１（１００μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＡ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。２０ｍｌの緩衝液Ｐ２（１００ｍＭ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を添加した後、室温で５分間インキュベートし、２０ｍｌの緩衝液Ｐ３（２．５５Ｍ ＫＡｃ、ｐＨ４．８）を加えた。４℃で３０分間遠心（１５，０００ｒｐｍ／分）して沈降物を除去した。上清を、緩衝液ＱＢＴ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５％エタノール、ｐＨ７．０、０．１５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で予備平衡化した２つのＱｉａｇｅｎ中型カラムに装入した。プラスミドＤＮＡを２０ｍｌの緩衝液ＱＣ（１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５％エタノール，ｐＨ７．０）で洗浄し、５ｍｌの緩衝液ＱＦ（１．２５ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５％エタノール、ｐＨ８．２）で溶離した。プラスミドＤＮＡを等量のイソプロパノールで沈降させ、４℃で３０分間遠心した。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、真空下に乾燥、１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解した。プラスミドライブラリーからの１０μｇのプラスミドＤＮＡを１００単位のＥｃｏＯ１０９Ｉ制限酵素で３時間３７℃で消化した。消化プラスミドＤＮＡを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２（ｄｉｎＤ１::ｌａｃＺ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）を形質転換し、細胞をＸｇａｌ＋Ａｐプレート上で平板培養した。１２０個の形質転換細胞中に１４のブルーコロニーが見出された。１４の株それぞれから１０ｍｌの細胞培養物を調製し、細胞抽出物を作成してλＤＮＡ基質上でＥｃｏＯ１０９Ｉエンドヌクレアーゼ活性についてアッセイした。８つの株がＥｃｏＯ１０９Ｉ制限エンドヌクレアーゼを産生することが判明した。メチラーゼ選択法とエンドヌクレアーゼインジケーター法を組み合わせることにより、メチラーゼ遺伝子のみを含むか又はチャレンジ後に切断部位を欠失したクローンは排除するが、エンドヌクレアーゼ遺伝子を単独で有するか又はエンドヌクレアーゼ遺伝子とメチラーゼ遺伝子とを共に有するクローンを同定し得る。
実施例５
熱安定性ＤＮＡヌクレアーゼ（ＴＦヌクレアーゼ）をコードする遺伝子のクローニング
実施例２に記載のようにして、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ株からゲノムＤＮＡを作成した。該ＤＮＡを実施例２に記載のようにＳａｕ３ＡＩで部分的に切断し、１６℃で一晩ｐＢＲ３２２（ＢａｍＨＩで直鎖状にし、ＣＩＰ処理した）に連結した。連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２コンピテント細胞を形質転換し、Ｘｇａｌ、Ａｐプレート上で平板培養した。１回の形質転換実験から合計８，０００個の形質転換細胞を得た。これらの形質転換細胞中に２３のブルーコロニーが見出された。２３のブルー分離物それぞれから、１０ｍｌの細胞培養物を作製し、細胞抽出物を（実施例２に記載のように）調製して、ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ基質上でＤＮＡヌクレアーゼ活性についてアッセイした。１つの分離物（＃１７）からの細胞抽出物は、ｐＢＲ３２２二本鎖ＤＮＡ上６８℃のインキュベーション温度でＤＮＡニック活性を示した。ヌクレアーゼ活性をさらにテストするために、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ形態（二本鎖ＤＮＡ）及び一本鎖形態を基質として用いた。この場合も、該ヌクレアーゼは二本鎖基質上でＤＮＡニック活性を示す。該ヌクレアーゼを加えて一本鎖ＤＮＡを分解した。二本鎖ＤＮＡ（λＤＮＡ又はＭ１３ＲＦ形態）をヌクレアーゼと共に長時間（１２時間）インキュベートすると、ＤＮＡも分解した。従って、Ｔｆヌクレアーゼに好ましい基質は一本鎖ＤＮＡであるとの結論を得た。さらに、テストにより、該ヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼIIIで消化した後のような一方向欠失の適用に用い得、残りの一本鎖ＤＮＡはＴｆヌクレアーゼにより除去し得ることも判明した。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004036892.tif 000002
配列番号：２
配列の長さ：９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004036892.tif 000003
配列番号：３
配列の長さ：１６２９
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004036892.tif 000004
0004036892.tif 000005
配列番号：４
配列の長さ：９６６
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
0004036892.tif 000006
配列番号：５
配列の長さ：５４２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004036892.tif 000007
0004036892.tif 000008
配列番号：６
配列の長さ：３２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0004036892.tif 000009
0004036892.tif 000010
配列番号：７
配列の長さ：６
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
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【図１】
0004036892.tif 000012
【図２】
0004036892.tif 000013
【図３】
0004036892.tif 000014
0004036892.tif 000015
【図４Ａ】
0004036892.tif 000016
【図４Ｃ】
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【図５】
0004036892.tif 000018