(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリーによる微生物検出方法であって、
(a) 微生物を含む試料に非致死的な静水圧を負荷する工程、及び(b) 微生物を蛍光色素で染色する工程を含み、微生物が酵母であり、蛍光色素がカルボキシジクロロフルオレセイン及びカルボキシジクロロフルオレセインジアセテートからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする方法。
【請求項２】
負荷する静水圧が30〜50MPa である請求項１記載の微生物検出方法。
【請求項３】
微生物を含む試料に非致死的な静水圧を負荷する工程を含む微生物による蛍光色素の取り込み量を増大させる方法であって、微生物が酵母であり、蛍光色素がカルボキシジクロロフルオレセイン及びカルボキシジクロロフルオレセインジアセテートからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする方法。
【請求項４】
負荷する静水圧が30〜50MPa である請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、微生物の検出方法に関し、さらに詳細には、フローサイトメトリーによる高感度の微生物検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
目的試料中に現存する微生物の数を計数することは、広い技術分野において大変重要な課題である。例えば、病原微生物による食材の汚染や伝染病感染者の種々の検査、あるいは赤潮の原因となる有害プランクトンの調査等が挙げられる。一方、基礎研究の観点からは、生態系において分解者としての重要な機能を担う微生物のバイオマスを知ることは、物質やエネルギーの循環を理解する際に重要であるといえる。
フローサイトメトリーは、単離した細胞を浮遊液にし、高速でフローセル中を通過させ、光学的な手法によって細胞の各種の計測を行う方法である。フローサイトメトリーは、生体染色用蛍光色素の新規開発と相まって、ある試料中に含まれる微生物数を、迅速かつ正確に算定するための極めて有力な手段として注目されており、コロニー計数法やATP 定量法に代わる画期的な技術として、ここ数年、国内外を問わず急速に普及しつつある。この手法では、蛍光色素によって微生物が染色されることが絶対条件であり、試料が微細管を通過する過程で発する蛍光を、高感度検出器によって測定している。しかしながら、微生物の種類によっては蛍光色素の取り込み量が極めて少ないものが存在し、特に、フローサイトメトリーによる検出限界を大きく下回る場合には、正確な生菌数の算出が困難になるとの指摘がなされている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、フローサイトメトリーによる高感度の微生物検出方法を提供することである。
本発明の他の目的は、微生物による蛍光色素の取り込み量を増大させる方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記の工程を含む、フローサイトメトリーによる微生物検出方法を提供するものである。
(a) 微生物を含む試料に非致死的な静水圧を負荷する工程、及び
(b) 微生物を蛍光色素で染色する工程。
本発明はまた、微生物を含む試料に非致死的な静水圧を負荷する工程を含む微生物による蛍光色素の取り込み量を増大させる方法を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明において、負荷する静水圧は微生物に対して非致死的なものであればよく、好ましくは10〜100MPa（約100 〜1000気圧）、さらに好ましくは10〜60MPa （約100 〜600 気圧）、最も好ましくは30〜50MPa （約300 〜500 気圧）が適当である。
静水圧の加圧速度及び減圧速度は、微生物の生存率や蛍光色素の取り込みに悪影響を及ぼさない限り特に限定されない。加圧速度としては、0.1 〜1.0 MPa/秒程度が適当であり、減圧速度としては、0.1 〜1.0 MPa/秒程度が適当である。
所定の静水圧に達したら、0.1 〜５時間、好ましくは0.5 〜３時間維持した後、常圧まで減圧する。
【０００６】
本発明は、蛍光色素によって染色され得るあらゆる種類の微生物、細胞を対象とすることができる。本発明が適用される典型的な微生物の例としては酵母が挙げられるが、酵母以外の微生物、例えば、大腸菌、ビブリオ菌等のバクテリア、アオカビやコウジカビなどのカビ類、ギムノジニウム等のプランクトン、動植物由来の培養細胞等にも本発明を適用することができる。
【０００７】
本発明に使用される蛍光色素に特に制限はない。例えば、以下に例示する色素が使用できる。
エチジウムブロマイド（Ethidium bromide）、プロピジウムアイオダイド（Propidium iodide）、ヘキスト（Hoechst)33258/33342 、DAPI、アクリジンオレンジ(Acridine orange) 、クロモマイシン(Chromomycin) 、ミトラマイシン(Mithramycin) 、オリボマイシン(Olivomycin)、パイロニン(Pyronin) Y 、チアゾールオレンジ(Thiazole orange) 、FITC、ローダミン(Rhodamine) 101 イソチオシアネート(isothiocyanate)、BCECF 、BCECF-AM、C.SNARF-1 、C.SNARF-1-AMA 、エクオリン(Aequorin)、Indo-1、Indo-1-AM 、Fluo-3、Fluo-3-AM 、Fura-2、Fura-2-AM 、オキソノール(Oxonol)、ローダミン(Rhodamine) 123 、 10-N-ノニ−アクリジンオレンジ(nony-acridine orange)、フルオレセイン(Fluorescein) 、フルオレセインジアセテート(Fluorescein diacetate) 、カルボキシフルオレセイン(Carboxyfluorescein)(CF)、カルボキシフルオレセインジアセテート(Carboxyfluorescein diacetate)(CFDA)、カルボキシジクロロフルオレセイン(Carboxydichlorofluorescein)(CDCF)、カルボキシジクロロフルオレセインジアセテート(Carboxydichlorofluorescein diacetate)(CDCFDA)。
これら蛍光色素の使用量は、試料液中、1 〜100 μM 程度が適当である。
【０００８】
本発明において、微生物を含む試料に非致死的な静水圧を負荷する工程(a) と微生物を蛍光色素で染色する工程(b) の順序はいずれが先であってもよく、また工程(a) と(b) を同時に行ってもよい。あるいは、工程(a) と(b) を交互に複数回繰り返しても良い。
また、静水圧を負荷する際に、グルコースを存在させておくと、微生物の色素による染色を促進することができる。グルコースの量は、微生物の試料液中10〜100 mM程度が適当である。
微生物を蛍光色素で染色する工程は、微生物の生存率を低下させず、増殖を抑制するような条件下で行う。酵母の場合、静水圧を負荷しながら、あるいは負荷しないで、１５〜３７℃で0.1 〜５時間インキュベートすればよい。
【０００９】
以下実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。
＜細胞培養と加圧処理＞
Saccharomyces cerevisiaeの細胞をYPD (1% 酵母抽出液、2%バクトペプトン、 2% Ｄ−グルコース) 培養液中、24℃で増殖させた。対数増殖期の細胞（2x107-4x107cells/ml)を遠心操作によって集め、50mMクエン酸を含むYPD 培養液(pH3.0または5.0)に再懸濁し、プラスチックチューブ（クライオチューブ、ヌンク社）に2x107-3x107 cells/mlとなるように入れた。パラフィルムでシールした後、チューブをチタン製の圧力容器に入れ静水圧を負荷した。ハンドポンプ（離合社）を用いて目的の圧力までは２分以内に達するようにした。試料を取り出すため、約15秒程度で除圧した。
予備的な実験で、MB緩衝液を60MPa から常圧まで断熱的に減圧したところ、温度の低下は約0.5 ℃だった。このようなわずかな温度変化は無視することができる。事実、細胞の生存率や蛍光物質の蓄積において、加圧や減圧を速く行った場合で結果に大きな違いは認められなかった。
【００１０】
＜蛍光物質による細胞染色＞
対数増殖期の細胞（2x107-4x107 cells/ml) を10μM のCFDA (Sigma cat. no. C- 5041) とともに50mMクエン酸を含むYPD (pH3.0) 中、あるいは10μM のCDCFDA (Molecular Probe  cat. no. C-369)とともに50mMクエン酸を含むYPD (pH5.0) 中で、常圧から60MPa までの圧力下で培養を行った。圧力によって誘起される蛍光色素の蓄積促進のグルコース依存性を調べるため、増殖している細胞を集め、水で２回洗い３０分間氷中で飢餓処理した。細胞をMBA 緩衝液に懸濁しCDCFDAを加え、各濃度のＤ−グルコース存在下で１時間の静水圧処理を行った。
2-デオキシグルコースの影響を調べるために、細胞をCDCFDAとともに100mM Ｄ−グルコースを含むMBA 緩衝液中で培養した。特に断りのない限り、蛍光色素の投与量は10μM とする。静水圧を１時間負荷した後、細胞を10mM MES-Bis-Tris (pH5.0) で２回洗い、MB緩衝液に懸濁した。
染色した細胞の蛍光測定には、サイトフロー2350プレートリーダー（ミリポア社）またはRF5300PC蛍光光度計（島津製作所）を用い、485nm の励起による 535nmの蛍光を測定することにより行った。蛍光強度（任意の単位 [AU] ）は、染色した細胞の蛍光強度から未染色の細胞のそれを差し引き、107 細胞当たりの数値で示した。
【００１１】
＜加圧下における蛍光測定＞
透明なサファイア製の光学窓 (10x8mm) を取り付けた高圧容器内で各圧力下で蛍光測定を行った。試料を透明なキュベットに入れ、RF5300PC蛍光光度計に取り付けた高圧容器にセットし、485nm で励起し535nm における蛍光を測定した。サファイヤの窓を介するため、通常の測定に比べると蛍光強度はやや低下するが、測定には十分であった。静水圧はハンドポンプ（テラメックス社）を用いて負荷した。
【００１２】
＜フローサイトメトリー＞
細胞に10μM のCFDAあるいはCDCFDAを投与し、各圧力下で１時間培養した。除圧後、染色された細胞を水で２回洗い、MB緩衝液に再懸濁した。それらを常圧下で、ブライトHSフローサイトメトリーシステム（バイオラッド社）を用いて解析した。
【００１３】
実施例１
＜加圧下におけるCFおよびCDCFの蓄積＞
CFDAやCDCFDAは細胞内の非特異的エステラーゼによって加水分解され、生成した蛍光物質であるCF(pH 感受性）やCDCF(pH 非感受性）はいずれも液胞などの細胞内酸性コンパートメントに蓄積されることが知られている。CDCFDAはCFDAに比べ、より高いpH（pH5.0 ）でも安定であることや、CDCFがCFに比べ530nm から540nm におけるモル蛍光強度が高いことから、CDCFDAを利用する方が生体染色には有利といえる。
菌株によって蛍光染色の程度に差があることは既に知られているので、２種類の菌株、すなわち清酒酵母(IFO2347)(強く染色される）と(IFO10159)（微弱にしか染色されず、フローサイトメトリーによる検出が困難）を用いた。
【００１４】
IFO2347 株細胞に10μM のCFDAまたはCDCFDAを投与し、各圧力条件下で１時間培養した。染色された細胞はサイトフロー2350を用いて解析した。結果を図１のＡに示す。同様に、IFO10159株細胞に10μM のCFDAまたはCDCFDAを投与し、各圧力条件下で１時間培養した。染色された細胞はサイトフロー2350を用いて解析した。結果を図１のＢに示す。図１のＡおよびＢにおいて、○はCFによって染色された細胞、●はCDCFによって染色された細胞を示す。
IFO2347 株では、CFおよびCDCFの蓄積が加圧処理によって著しく促進され、ピークはそれぞれ40MPa および30MPa にあった (図１のＡ) 。静水圧処理によって促進されたCDCFの蓄積の程度は、CFのそれより大きいことがわかった。そこで、以後の解析には主としてCDCFDAを用いた。
常圧下でCF染色されたIFO10159の蛍光強度は15.5 AU/107 cells であり、その値は染色していない細胞のそれ (9.6 AU/107cells)、すなわちバックグラウンドの自家蛍光のわずか1.6 倍に過ぎず、CDCF染色の細胞 (24.8 AU/107 cells)の場合でも2.5 倍程度であった。50MPa の静水圧は蛍光物質の蓄積量を５〜１０倍に上昇させることがわかった (図１のＢ) 。未染色の細胞の自家蛍光は50MPa の静水圧負荷でもほとんど変化しないことを確認している。
【００１５】
40MPa 以上の静水圧は細胞増殖を著しく阻害する。しかしながら、CFU (colony forming units)で見た場合、１時間程度であれば生存率にはなんら影響は認められない。従って、染色中の静水圧処理によって、その間の細胞の増殖と生存率の低下を回避しつつ、CFやCDCFによる生体染色度を増加させることが可能となり、このことは試料に含まれる生菌数を正確に算定するために大変有利となる。
【００１６】
実施例２
＜フローサイトメトリーによる解析＞
IFO2347 株を10μM CDCFDA存在下、0.1, 30 および60MPa のもとで、24℃、１時間培養した。染色された細胞（約100,000 個）をブライトＨＳフローサイトメトリーシステムにより解析した。図２のＡに、培養後の細胞集団の染色強度分布を示したヒストグラムを示す。
また、IFO10159株を10μM CDCFDA存在下、0.1, 40 および60MPa のもとで、24℃、１時間培養した。染色された細胞（約100,000 個）をブライトＨＳフローサイトメトリーシステムにより解析した。図２のＢに、培養後の細胞集団の染色強度分布を示したヒストグラムを示す。
【００１７】
IFO2347 株を常圧下で染色した場合、ピーク値（その蛍光強度の細胞数が最も多い）と平均値（積分した時の平均）の蛍光強度はそれぞれ23AUおよび26AUであった (図２のＡ、0.1MPa) 。細胞に30MPa の静水圧を１時間負荷した場合、CDCFの蓄積量は常圧に比べ４〜６倍に達することがわかった。ピーク値と平均値はそれぞれ92AUおよび162AU だった (図２のＡ、 30MPa) 。一方、60MPa の処理では、蛍光染色強度は向上しなかった (図２のＡ、60MPa)。
同様の結果がIFO10159株においても得られた（図２のＢ）。ほとんど同じ結果がCFDAを用いた場合にも得られている（結果は示していない）。
これらフローサイトメトリーによる解析結果は、実施例１（図１）に示した一般的な蛍光分析の結果と非常によく一致している。
【００１８】
実施例３
＜静水圧がCDCFDAの加水分解に及ぼす影響＞
IFO2347 株細胞を入れたキュベットを容器にセットし、50μM CDCFDAを投与した後、Ｐ点（図３のＡ）で圧力を負荷し、RF5300PC蛍光光度計を取り付けた高圧容器内で蛍光強度の経時変化を調べた。結果を図３のＡに示す。常圧下(0.1MPa)と60MPa では、蛍光強度はそれぞれ300AU および130AU まで上昇した。一方、30MPa の静水圧では770AU に達した。
次に、IFO2347 株をYPD 培養液中(pH5.0) 、各静水圧下で１時間前処理し、その後、前処理した細胞をキュベットに入れ、常圧下で50μM CDCFDAを投与し、同様に蛍光強度の変化を調べた。結果を図３のＢに示す。30MPa で１時間前処理した細胞は、常圧と60MPa で１時間前処理した細胞に比べおよそ３倍の速度でCDCFDAを分解することがわかった。これらの結果は、細胞を30MPa のもとで前処理することによってCDCFDAの分解活性が誘導され、その活性は除圧後も維持されることを示している。
CFDAを用いた場合にもほとんど同様の結果が得られた。
【００１９】
実施例４
＜グルコース代謝への依存性＞
IFO2347 株において、Ｄ−グルコースと２−デオキシグルコースが静水圧によって誘起されるCDCF蓄積の促進に及ぼす影響を調べた。
IFO2347 株細胞を10μM CDCFDA存在下、各濃度のＤ−グルコースを含むMBA 緩衝液中、所定の静水圧（0.1MPa (○）、 30MPa (●) ）下、24℃で１時間培養した。染色された細胞はサイトフロー2350を用いて解析した。結果を図４のＡに示す。
IFO2347 株細胞を10μM CDCFDA存在下、各濃度の２−デオキシグルコースと100mM のグルコースを含むMBA 緩衝液中、所定の静水圧（0.1MPa (○）、 30MPa (●) ）下、24℃で１時間培養した。染色された細胞はサイトフロー2350を用いて解析した。結果を図４のＢに示す。
図４のＡの結果は、静水圧によるCDCF蓄積の促進にはグルコースが必要であることを示している。CDCF蓄積の最大値の半値を与えるグルコース濃度は約13mMであった（図４のＡ）。２−デオキシグルコースは静水圧による促進効果を顕著に抑制することがわかった（図４のＢ）。阻害の半値を与える２−デオキシグルコース濃度は12mMであり、上記の13mMに非常に近い値だった。いずれの値も、ヘキソーストランスポーターの低感受性部位のKm値(20mM)よりはやや低く、糖リン酸化酵素のKm値(<<1mM) よりは遥かに大きな値であった。このことはグルコース代謝あるいはATP の合成がCDCFの蓄積過程に関与していることを示唆している。
【００２０】
Breeuwerらは酵母菌の染色強度は、(i) 蛍光物質の量（これには前駆体の取り込み、エステラーゼ活性、および蛍光物質の排出が関係している）および(ii)細胞内ｐＨ、の２点に依存すると報告している。単純な化学反応の圧力依存性を調べることで、反応の活性化状態の形成に伴う体積変化を知ることができる。予備的な実験から、CFDAやCDCFDAの分解は、MB緩衝液および細胞抽出物では静水圧負荷によって単純に促進されることがわかった。このことは、これらの蛍光物質の加水分解反応が負の体積変化を伴っていることを示している。
【００２１】
【外１】
0004066215.tif 000002
細胞を30MPa で前処理することによってCDCFの蓄積が誘導されるという結果は、静水圧が、(i) エステラーゼの合成を誘導する、(ii)エステラーゼの加水分解活性を促進する、(iii) 前駆体CDCFDAの細胞内への受動拡散を促進する、あるいは(iV) 30MPaにおいて前駆体の分解に必要とされるグルコースのある種の代謝経路を刺激する、という作用をもつことが示唆される。
【００２２】
【発明の効果】
非致死的な30〜50MPa （約300 〜500 気圧）程度の静水圧を試料に負荷することによって、微生物の生存率を低下させずに蛍光物質の取り込み量を大幅に増大させることができる。これを既存のフローサイトメトリーシステムによって微生物を検出すると、検出感度が５〜１０倍高くなる。50MPa で１時間程度の静水圧処理は、微生物の生存率を低下させずに増殖を抑制する効果がある。従って、蛍光色素染色を行っている際に対象微生物が増殖してしまう、という二次的な影響を排除できる。よって、本発明の方法は、幅広い研究分野で正確な生菌数の算定に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  IFO2347 株（Ａ）およびIFO10159株（Ｂ）におけるCFおよびCDCF蓄積の静水圧による誘起を示す図面である。○：CFによって染色された細胞、●：CDCFによって染色された細胞。
【図２】静水圧下でCDCFDA染色された細胞集団のヒストグラムを示す図面である。
（Ａ）IFO2347 株、（Ｂ）IFO10159株。
【図３】  IFO2347 株のCDCFDA加水分解に対する静水圧の影響を示す図面である。
（Ａ）加圧下におけるCDCFDAの加水分解。
（Ｂ）各圧力条件下で前処理した細胞の常圧下におけるCDCFDAの加水分解。
【図４】  IFO2347 株において、Ｄ−グルコースと２−デオキシグルコースが静水圧によって誘起されるCDCF蓄積の促進に及ぼす影響を示す図面である。
（Ａ）Ｄ−グルコース、（Ｂ）２−デオキシグルコースと100mM のグルコース。
【図１】
0004066215.tif 000003
【図２】
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【図３】
0004066215.tif 000005
【図４】
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