(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−３−ヒドロキシ酪酸を含有する微生物菌体の懸濁液をｐＨ２未満の酸性側で５０℃以上に加熱し、次いで該懸濁液のｐＨを７を超えるアルカリ性側に調整した後、該懸濁液よりポリ−３−ヒドロキシ酪酸を分離することを特徴とする微生物菌体からのポリ−３−ヒドロキシ酪酸の回収方法。
【請求項２】
酸性側での加熱時のｐＨが１以下である請求項１の回収方法。
【請求項３】
酸性側での加熱温度が８０〜１２０℃であり、その後８０℃以下の温度においてｐＨ７を超えるアルカリ性側に調整する請求項１記載の回収方法。
【請求項４】
アルカリ性側に調整する場合のｐＨが８〜１２である請求項１記載の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸を含有する微生物菌体から、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸を回収する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下ＰＨＢと記す）は、多くの微生物のエネルギー貯蔵物質として菌体内部に生成・蓄積される、完全生分解性および生体適合性を有する熱可塑性ポリエステルである。近年、合成プラスチックが環境汚染、廃棄物処理および資源循環の観点から深刻な社会問題となっており、それ故ＰＨＢは「クリーンプラスチック」として注目され、その実用化が切望されている。
ＰＨＢの製造は、特公平03-65154号公報、特公平02-20238号公報、特公平05-997号公報等  に提案されているように、細菌、例えばシュードモナス（Pseudomonas ）属、アルカリゲネス（Alcaligenes ）属、プロトモナス（Protomonas）属、アゾトバクター（Azotobacter ）属、ノカルジア（Nocardia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属等の細菌を培養し、菌体内にＰＨＢを顆粒状に蓄積せしめた後、その菌体からＰＨＢを回収することによって行われる。
【０００３】
菌体からのＰＨＢの回収方法は、ＰＨＢが可溶である溶剤により菌体からＰＨＢを抽出する方法と、ＰＨＢ以外の菌体構成成分を可溶化させて除くことによりＰＨＢ顆粒体を得る方法が知られている。溶剤抽出によってＰＨＢを分離精製する方法においては、ＰＨＢが可溶である溶媒として、例えば１, ２−ジクロロエタンやクロロホルムといったハロゲン化炭化水素が用いられる。この場合菌体を予め乾燥する等、溶媒が菌体中のＰＨＢ顆粒体と接触できるようにするための工程が必要となる（特開昭57-65193号公報等）。また、これらの方法においてはＰＨＢを実用に値する濃度（例えば５％）に溶解したハロゲン化炭化水素が極めて粘稠となり、抽出工程後溶媒に溶解しなかった菌体残渣とＰＨＢを含む溶媒層との分離が困難となる。さらに、溶媒層からＰＨＢを回収率良く再沈殿させるためには多量の貧溶媒（例えばメタノール等）の添加が必要であり、工程には大容積の容器が必要となるとともに溶媒の使用量は膨大なものとなり、従って溶媒の回収コストと損失溶媒のコストがかさみ、経済的な方法とはいいがたい。ＰＨＢが可溶であり、かつ水と混ざり合う溶媒、例えばジオキサン（特開昭63-198991 号公報）またはプロパンジオール（特開平02-69187号公報）のような親水性の溶媒を用いた抽出方法も提案されている。これらの方法は乾燥菌体のみならず湿潤菌体からもＰＨＢを抽出することが可能である点と、菌体残渣と分離した溶媒層を冷却するだけでＰＨＢの再沈殿が行われる点で好ましい方法と言える。しかしながら、これらの方法においてもＰＨＢを溶解した溶媒の粘稠性の問題は未解決であり、また抽出率が（従って回収率も）劣ること等の欠点も有している。
【０００４】
一方、ＰＨＢ以外の菌体構成成分を可溶化して除くことによってＰＨＢ顆粒体を得る方法として、J.Gen.Microbiology  vol19  198〜209 頁（1958）には菌体懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムで処理することによりＰＨＢ以外の菌体構成成分を可溶化してＰＨＢ顆粒体を得る方法が記載されている。この方法は簡単ではあるが、多量の次亜塩素酸ナトリウムを使用する必要があるためにそのコストが高いこと、加えてＰＨＢが多くの用途に対して不適当になるまでの著しい分子量低下が引き起こされることなどから、実用には適さない。特公平04-61638号公報には、ＰＨＢを含有する菌体懸濁液を１００℃以上で加熱処理し、次いで蛋白質分解酵素処理と、リン脂質分解酵素処理あるいは過酸化水素処理との組み合わせによりＰＨＢ以外の菌体構成成分を可溶化して除いてＰＨＢ顆粒体を得る方法が提案されている。また、不純物の除去方法として界面活性剤で処理する方法も記載されている。このように多段階の工程を経ることによって、純度的には良好なＰＨＢを得ることができるが、処理工程が非常に多く、複雑であり、そのために経費がかかる等の欠点を有している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来技術における上記のような課題を解決し、少ない工程数で安価にＰＨＢ含有菌体からＰＨＢ以外の菌体構成成分を効率よく除き、かつ純度の高いＰＨＢを高収率で得るためのＰＨＢの回収方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、少ない工程数で安価にＰＨＢ含有菌体からＰＨＢ以外の菌体構成成分を効率よく除き、かつ純度の高いＰＨＢを高収率で得るためのＰＨＢの回収方法に関して鋭意検討を行った結果、ＰＨＢ含有菌体の懸濁液をｐＨ２未満の酸性側で５０℃以上に加熱することにより、微生物菌体が良好に破壊されることを見いだし、更にその後ｐＨが７を越えるアルカリ性側に調整し、ＰＨＢを菌体懸濁液より分離することによりＰＨＢ以外の菌体構成成分が良好に除去され、高純度のＰＨＢ顆粒体を回収できることを見いだし本発明に到達した。即ち、本発明によれば、ＰＨＢを含有する微生物菌体の懸濁液をｐＨ２未満の酸性側で５０℃以上に加熱し、次いで該懸濁液のｐＨを７を越えるアルカリ性側に調整した後、該懸濁液よりＰＨＢを分離する微生物菌体からのＰＨＢの回収方法が提供される。
【０００７】
菌体を破壊する既知の方法としては、超音波処理、ワーリングブレンダー等のブレンダー、リゾチームのような酵素による処理、菌体の凍結融解を繰り返す処理等があるが、いずれも工業的規模においては実用的ではない。特公平04-61638号公報には、ＰＨＢを含有する菌体懸濁液を１００℃以上で加熱処理し、次いでタンパク質分解酵素処理と、リン脂質分解酵素処理あるいは過酸化水素処理との組み合わせによりＰＨＢ以外の菌体構成成分を可溶化して除いてＰＨＢ顆粒体を得る方法が記載されているが、ここでは核酸類の変性および可溶化を目的として加熱処理を行っている。ＰＨＢを含有する菌体懸濁液を１００℃以上で加熱処理することによっても、一部の菌体は破壊されていたものと推察されるが、加熱時のｐＨ条件が中性付近であったため十分な菌体破壊が行われず、従って高純度のＰＨＢを得るために加熱処理後に多段階にわたる複雑な工程を行う必要が生じたものと思われる。
【０００８】
本発明者らは、ＰＨＢを含有する菌体懸濁液をｐＨ２未満の酸性側で５０℃以上に加熱することによって、菌体の破壊が非常に良好に行われ、その後ｐＨを７を越えるアルカリ性側に調整し、該懸濁液よりＰＨＢを分離することによりＰＨＢ以外の菌体構成成分が非常に良好に除去され、そのためそれ以上の多段階にわたる複雑な工程を経ることなく、高純度のＰＨＢを取得できることを見いだした。ＰＨＢは脂肪族ポリエステルであるため、水性懸濁液中で加熱すると加水分解を受け、特に水性懸濁液が酸性またはアルカリ性の場合に著しく加水分解を受けて分子量が低下してしまうと考えられていたが、本発明の方法によると、ＰＨＢを含有する菌体懸濁液をｐＨ２未満の酸性側で５０℃以上に加熱しても、ＰＨＢ分子量は１００万程度の大きさを保持し、著しい分子量低下を避けることができた。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の詳細について説明する。本発明に用いられるＰＨＢを含有する菌体は、ＰＨＢを菌体内に蓄積した細菌細胞であればどのようなものでもよく、このような細菌として例えば、アゾトバクター  ビネランディー（Azotobacter vinelandii）、アルカリゲネス  ユウトロフス（Alcaligenes eutrophus ）、メチロバクテリウム  エクストルクエンス（Methylobacuterium extorquens）等の種に属する菌株が挙げられる。その菌体は、上記の細菌等をグルコース、フラクトース、メタノール、酢酸、酪酸などの炭素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ペプトンなどの窒素源、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムなどのリン酸源およびその他細菌の増殖に必要なミネラル、微量栄養源を含む培地で、炭素源以外の菌体増殖に必須な栄養素などが増殖の制限因子となるようにして好気的に培養することによって得られる。
【００１０】
ＰＨＢ含有菌体の細胞を破壊するのに必要とされる加熱処理時のｐＨは、加熱温度および加熱時間により異なるが、ｐＨ２未満の酸性側であれば良く、ｐＨ１以下とすることが好ましい。ｐＨを酸性側に調整する際に用いる酸の種類は特に限定されず、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸などの無機酸類、蟻酸、酢酸、クロロ酢酸などの有機酸類を用いることができ、これらの中で好ましいのは無機酸類であり、中でも硫酸が好適に使用される。加熱処理時の温度は、加熱時のｐＨおよび加熱時間により異なるが、５０℃以上であれば良く、８０〜１２０℃とすることが好ましい。加熱処理の時間は、加熱時のｐＨおよび加熱温度により異なるが、少なくとも１０分間以上、好ましくは２０分〜５時間加熱する。このようにＰＨＢ含有菌体の細胞を破壊するのに必要とされる加熱処理条件は、加熱温度、加熱時のｐＨおよび加熱時間を適宜組み合わせることによって任意に設定することができる。このような加熱処理条件として、例えば加熱温度８０℃でｐＨ０．１、加熱時間１時間、あるいは加熱温度１００℃でｐＨ０．３、加熱時間１時間、あるいは加熱温度１２０℃でｐＨ１．０、加熱温度１時間などが挙げられる。また、加熱処理時の微生物の菌体濃度は１〜３００ｇ／ｋｇ、好ましくは５０〜２５０ｇ／ｋｇにすることができる。
【００１１】
本発明においては酸性側で加熱後にｐＨを、ｐＨ７を越えるアルカリ性側にする必要がある。その場合ｐＨ８〜１２とすることが好ましい。酸性側での加熱温度が８０℃を越える場合には、菌体懸濁液の温度を８０℃以下に冷却した後に菌体懸濁液のｐＨをアルカリ性側に調整することが好ましい。ｐＨをアルカリ性側に調整する際に用いるアルカリの種類は特に限定されず、例えば水酸化ナトリウム、アンモニアなどを使用することができる。所定のアルカリ性側のｐＨに調整した後、そのｐＨの値を１分〜３時間、好ましくは１０分〜２時間保持することが好ましい。アルカリ性側にｐＨを調整した後の菌体懸濁液からのＰＨＢの分離は、例えば濾過、遠心分離などにより行うことができる。菌体懸濁液からのＰＨＢの分離操作に引き続き、アルカリ水溶液やメタノール、アセトン等の有機溶剤を用いてＰＨＢの洗浄を行うことにより、さらに高純度のＰＨＢを得ることもできる。
【００１２】
特に高純度のＰＨＢを得る必要があるときには、ＰＨＢの分離および洗浄操作の後に、例えば酵素、酸化剤、界面活性剤またはこれらを組み合わせた化学的処理等を行うこともできる。
【００１３】
【実施例】
次に本発明を実施例によって更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
プロトモナス  エクストルクエンス（Protomonas extorquens ）[ メチロバクテリウム  エクストルクエンス（Methylobacterium extorquens ）と改名] Ｋ（微工研菌寄第８３９５号）をメタノールを唯一の炭素源とする完全合成培地を用いて、窒素供給を菌体増殖の制限因子になるようにして連続培養を行い、ＰＨＢを含有する菌体の培養液を得た。培養液の菌体濃度は１０％、菌体中のＰＨＢ含有量は乾燥菌体重量に対して６０％、乾燥菌体中の蛋白質含有量は１３．３％、ＰＨＢ分子量は２４７万であった。
この培養液を硫酸でｐＨ０．５にした後、１００℃で１時間加熱した。酸性加熱後の培養液を５０℃に冷却し、水酸化ナトリウムでｐＨを８．５、９．５及び１０.5に調整して、５０℃で１時間攪拌した後、２０００Ｇで１０分間遠心分離した。得られた沈殿をアルカリ調整時と同じｐＨのアルカリ水溶液に懸濁し５０℃で１時間攪拌した後、２０００Ｇで１０分間遠心分離することにより洗浄した。遠心分離により得られた沈殿を乾燥した。ＰＨＢの回収率、ＰＨＢ純度、蛋白質含量およびＰＨＢ分子量は表−１の通りであった。酸性加熱後、ｐＨ調整を行わずに上記と同様の操作を行った場合を比較例として表−１に示した。
【００１４】
【表１】
0004126511.tif 000002
【００１５】
実施例２
実施例１と同様にして得た培養液を用い、加熱温度およびｐＨを変えて１時間酸性加熱処理を行った。ｐＨの調整は硫酸を用いて行った。酸性加熱後の培養液を５０℃に冷却し、水酸化ナトリウムでｐＨを１０に調整し、５０℃で１時間攪拌した後、２０００Ｇで１０分間遠心分離した。得られた沈殿をアルカリ調整時と同じｐＨのアルカリ水溶液に懸濁し５０℃で１時間攪拌した後、２０００Ｇで１０分間遠心分離することにより洗浄した。遠心分離により得られた沈殿を乾燥した。ＰＨＢの回収率、ＰＨＢ純度、蛋白質含量およびＰＨＢ分子量は表−２の通りであった。ｐＨ調整を行わずに加熱し、その後上記と同様の操作を行った場合を比較例として表−２に示した。
【００１６】
【表２】
0004126511.tif 000003
【００１７】
実施例３
実施例１と同様にして得た培養液を用い、加熱温度およびｐＨを変えて１時間酸性加熱処理を行った。ｐＨの調整は硫酸を用いて行った。酸性加熱後の培養液を５０℃に冷却し、水酸化ナトリウムでｐＨを１０に調整し、５０℃で１時間攪拌した後、２０００Ｇで１０分間遠心分離した。得られた沈殿をアルカリ調整時と同じｐＨのアルカリ水溶液に懸濁し５０℃で１時間攪拌した後、２０００Ｇで１０分間遠心分離することにより洗浄した。その後更にメタノールで２回、さらにアセトンで２回洗浄した。乾燥後に得られたＰＨＢの回収率、ＰＨＢ純度、蛋白質含量およびＰＨＢ分子量は表−３の通りであった。
【００１８】
【表３】
0004126511.tif 000004
【００１９】
【発明の効果】
ポリ−３−ドロキシ酪酸を含有する微生物菌体から、少ない工程数で安価に、かつ高純度のポリ−３−ヒドロキシ酪酸を高収率で回収することができる。