(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列を少なくとも有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、グルコース脱水素酵素βサブユニットを構成するチトクロムＣとして機能し得るタンパク質。
【請求項２】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列を少なくとも有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、グルコース脱水素酵素βサブユニットを構成するチトクロムＣとして機能し得るタンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、グルコース脱水素酵素βサブユニットを構成するチトクロムＣとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
さらに配列番号１５の塩基番号１２１〜１８７からなる塩基配列を含む請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡ又は請求項５に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物としてグルコース脱水素酵素βサブユニットを産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素βサブユニットの製造方法。
【請求項８】
さらに、配列番号３のアミノ酸をコードする塩基配列と配列番号２のアミノ酸をコードする塩基配列とを含む、請求項３又は４に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のＤＮＡ又は請求項９に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物としてグルコース脱水素酵素 複合体を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素 複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース脱水素酵素 のβサブユニットを構成するチトクロームＣ、それをコードするＤＮＡ、及びそれらの利用に関する。グルコース脱水素酵素 は、酵素電極を用いたグルコースセンサ等に有用である。
【背景技術】
【０００２】
特定の基質に対して特異的に反応する酵素を用いたバイオセンサの開発は、産業の分野を問わず盛んに行われている。その中でも特にバイオセンサの１つであるグルコースセンサは、主に医療分野で測定方法やその方法を利用した装置の開発が盛んに行われている。例えばグルコースセンサは、１９６２年にＣｌａｒｋとＬｙｏｎｓによってグルコースオキシダーゼと酸素電極を組み合わせたバイオセンサーの報告（Ｌ．ｃ．Ｃｌａｒｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｌｙｏｎａｓ，Ｃ．"Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｓｕｒｇｅｒｙ．"Ａｎｎ，ｎ．ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：２０−４５）が最初にされて以来、約４０年ほどの歴史を有している。
【０００３】
このように、グルコースセンサに、酵素としてグルコースオキシダーゼが採用されてからの歴史は長い。なぜならグルコースオキシダーゼは、グルコースに対する基質特異性が高く、熱安定性に優れており、更に酵素の量産化が可能であり、生産コストが他の酵素と比べて安価である、からである。基質特異性が高いということは、酵素がグルコース以外の糖とは反応しないため、測定値に誤差を生じることなく、正確な測定が行なえるという利点に通じる。また、熱安定性に優れているということは、酵素が熱により変性し酵素活性が失活するという問題を防止することができ、長期間正確な測定が行えるという利点に通じる。
しかし、グルコースオキシダーゼは、上記の様なメリットを有している反面、例えば溶存酸素の影響を受け、測定結果に影響があるという問題も有している。
【０００４】
一方、グルコースオキシダーゼ以外には、グルコース脱水素酵素 （以下、「グルコースデヒドロゲナーゼ」又は「ＧＤＨ」ともいう）を利用したグルコースセンサの開発も行われてきた。そして、酵素も、微生物から発見されている。例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）及びクリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１９）が知られている。
前者のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）は、β−Ｄ−グルコース＋ＮＡＤ（Ｐ）+→Ｄ−δ−グルコノラクトン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ+の反応を触媒する酵素であり、後者のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１９）は、Ｄ−グルコース＋ＮＡＤＰ+→Ｄ−δ−グルコノラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+の反応を触媒する酵素であり、前述した微生物由来のグルコースデヒドロゲナーゼは、既に市販もされている。
これらグルコースデヒドロゲナーゼは、測定サンプルの溶存酸素の影響を受けないという利点を有する。このことは、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酸素量が多く要求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、測定結果に誤差を及ぼさずに正確に測定することができるという利点に通じる。
しかし、従来に見られるグルコースデヒドロゲナーゼは、溶存酸素の影響を受けない一方、熱安定性が悪く、基質特異性がグルコースオキシダーゼよりも劣るという問題点を有しており、センサに採用される酵素として、グルコースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼの両欠点を補う酵素の提供が望まれていた。
【０００５】
尚、本発明者は Ｓｏｄｅ，Ｋ．，Ｔｓｕｇａｗａ，Ｗ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．，Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｎ．，ａｎｄ Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，（１９９６）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９，８２−８５．や、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｔｓｕｇａｗａ，Ｗ．，ａｎｄ Ｓｏｄｅ，Ｋ．，（１９９９）Ａｐｐｌｉ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃ．７７−７９／０３２５や、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｔｓｕｇａｗａ，Ｗ．，ａｎｄ Ｓｏｄｅ，Ｋ．，（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃ Ｌｅｔｔ．２１，１９９−２０２において、温泉近くの土壌より採取した試料を用い、ＧＤＨについての研究結果を報告している。この試料中の微生物が産出するＧＤＨは補酵素結合型であり、すでに至適反応温度、熱安定性、基質特異性などの酵素学的性質が明らかとなっている（前記文献）。本酵素は高い耐熱性を持つ触媒サブユニット（αサブユニット）、電子伝達サブユニット（βサブユニット）、機能不明のγサブユニットから構成されているヘテロオリゴマー酵素であり、活性のピークを４５℃と７５℃に持つ。また、γ、αサブユニット遺伝子はクローニングされており、上記微生物がブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）に属すること、及びβサブユニットのＮ末端アミノ酸配列も明らかにされている（猪瀬 健、東京農工大学修士論文（２００１年））。しかし、βサブユニット遺伝子の構造は未だ報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ブルクホルデリア属微生物のＧＤＨβサブユニットをコードするＤＮＡ、及びその利用法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨに関する研究をさらに進め、ＧＤＨβサブユニットをコードするＤＮＡを単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列を少なくとも有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、グルコース脱水素酵素 βサブユニットとして機能し得るタンパク質。
（２）以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列を少なくとも有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、グルコース脱水素酵素 βサブユニットとして機能し得るタンパク質。
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（２）に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ。
（４）さらに配列番号１５の塩基番号１２１〜１８７からなる塩基配列を含む（３）に記載のＤＮＡ。
（５）（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（６）（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡ又は（５）の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（７）（６）に記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物としてグルコース脱水素酵素 βサブユニットを産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素 βサブユニットの製造方法。
（８）さらにブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素 αサブユニット及びγサブユニットをコードする塩基配列を含む（３）又は（４）に記載のＤＮＡ。
（９）（８）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（１０）（８）に記載のＤＮＡ又は（９）に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（１１）（１０）に記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物としてグルコース脱水素酵素 複合体を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素 複合体の製造方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨβサブユニットをコードするＤＮＡを検索し、単離した。同菌株は、２０００年９月２５日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号第ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。本明細書において、ＧＤＨβサブユニットをコードするＤＮＡを、本発明のＤＮＡ、「βサブユニット構造遺伝子」又は単に「βサブユニット遺伝子」ということがある。
本発明者らは、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株が産生するＧＤＨは、αサブユニット、βサブユニット、及びγサブユニットを含む多量体タンパク質であることを確認している。本発明のタンパク質は、これらのサブユニットのうち、βサブユニットである。ＧＤＨの分光光度解析により、酸化型ＧＤＨの吸収波長はグルコノバクターＳｐ．、アセトバクターｓｐ．のデヒドロゲナーゼチトクローム複合体でできているアルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの吸収波長と類似しており、熱処理によりこの吸収は失われる。このことと、下記に示すβサブユニットの有無によるＧＤＨの至適反応温度の相違から、βサブユニットはチトクロームＣからなっていることが示唆された。
【００１０】
以下に、上記ＧＤＨの理化学的性質を示す。
１．作用：
グルコースの脱水素反応を触媒する。
２．還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａと分子量約４３ｋＤａを示すサブユニットからなる。
３．ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株）製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、分子量約３８０ｋＤａを示す。
４．至適反応温度：
４５℃付近 （Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
また、αサブユニット単独では、以下の理化学的性質を示す。
１．グルコース脱水素酵素 活性を有する。
２．還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａを示す。
３．至適反応温度：
７５℃付近 （Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
【００１１】
βサブユニットは、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の培養物から、ＧＤＨ活性を指標としてＧＤＨ複合体を精製することにより、他のサブユニットとともに取得することができる。ＧＤＨ活性は、公知のＧＤＨの活性測定と同様の方法で測定することができる。具体的には、例えば次のようにして測定することができる。５９４μＭの１−メトキシフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、酵素試料および基質としてグルコースを基質として加え、３７℃でインキュベートする。分光光度計を用いてＤＣＩＰの６００ｎｍにおける吸光度変化を追跡し、当該吸光度の減少速度を酵素反応速度とする。
【００１２】
また、本発明によりβサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１５）が明らかにされたので、この塩基配列を有するＤＮＡ又は同ＤＮＡがコードするアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡを適当な宿主で発現させることによってもβサブユニットを製造することができる。配列番号１５のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号１６に、示す。タンパク質から決定したβサブユニットのＮ末端アミノ酸配列は、配列番号１６のアミノ酸番号２３〜３８と一致していた。したがって、アミノ酸番号１〜２２はシグナルペプチドであると推定される。尚、配列番号１５及び１６において、第１番目のアミノ酸残基はＶａｌと記載されているが、Ｍｅｔである可能性が高く、また、翻訳後に脱落している可能性がある。
【００１３】
上記アミノ酸配列についてＢＬＡＳＴによるホモロジー検索を行ったところ、ラルストニア・ソアナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のオキシドレダクターゼ脱水素酵素のシトクロムｃサブユニットと６５％、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）由来のソルビトール脱水素酵素のシトクロムｃサブユニットと４８％、エルビニア・シプリペディイ（Ｅｒｉｗｉｎｉａ ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｉ）由来のグルコン酸脱水素酵素のシトクロームｃサブユニットと４４％、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）由来２−ケト−グルコン酸脱水素酵素のシトクロームｃサブユニットと塩基配列レベルで５５．７％、アミノ酸レベルで４６．４％と、全体にわたって高い相同性を示していた。またこれらのシトクロームｃのアミノ酸配列中には、ヘム結合モチーフ（配列番号１８）配列が保存されていた。これらのことから、本発明のβサブユニットがチトクロームＣであることが示された。
【００１４】
本発明のβサブユニットは、ＧＤＨのβサブユニットとして機能し得る限り、配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、ＧＤＨのβサブユニットとして機能するとは、ＧＤＨの酵素活性を損なわずにチトクロームＣとして機能することをいう。
本発明のＤＮＡは、上記βサブユニットをコードするＤＮＡであり、例えばブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株から取得することができる。本発明のＤＮＡは、本発明を完成する過程においては、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡから単離された。本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号１３及び１４に示す塩基配列を有するプライマーを用い、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって、取得することができる。また、本発明によりその塩基配列及び同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が明らかとなったので、これらの配列に基づいて化学合成することによっても取得することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡから取得することもできる。また、ブルクホルデリア・セパシアの他の菌株からも、同様にしてバリアントを取得することができる。
【００１５】
本発明のＤＮＡは、配列番号１６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものの他、このアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＧＤＨβサユニットとして機能するタンパク質をコードするものであってもよい。
本発明のＤＮＡとしては、具体的には、配列番号１５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また本発明のＤＮＡは、配列番号１５又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、βサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ストリンジェントな条件としては、７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件、具体的には、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃が挙げられる。
【００１６】
本発明のＤＮＡ又は同ＤＮＡを含む組換えベクターを保持する形質転換体を培養して、同ＤＮＡの発現産物としてＧＤＨβサブユニットを産生させ、これを菌体又は培養液から採取することにより、ＧＤＨβサブユニットを製造することができる。その際、本発明のＧＤＨβサブユニットをコードするＤＮＡは、さらにαサブユニットをコードするＤＮＡ、又はさらにγサブユニットをコードするＤＮＡとともに発現させることによって、ＧＤＨ複合体を製造することができる。γサブユニット及びαサブユニットを連続してコードするＤＮＡ断片は、配列番号１８及び１９に示す塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲによって、取得することができる。
【００１７】
ＧＤＨβサブユニット又はＧＤＨ複合体を産生させる微生物としては、大腸菌をはじめとする腸内細菌群、シュードモナス属やグルコノバクター属などのグラム陰性細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌をはじめとするグラム陽性細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌が挙げられるが、これらに限られず、異種タンパク質生産に適した宿主微生物であれば用いることができる。
本発明のＤＮＡのクローニング又は発現に使用するベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るプラスミド又はファージから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。エシェリヒア・コリ用のベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１９，ｐＵＣ１１９，ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔあるいはコスミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩなどが例示される。一旦本発明のＤＮＡのクローニングに使用したベクターより、発現等に適した他の組換えベクターへの移入は、本発明のＤＮＡを保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法により同ＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる微生物の形質転換は、例えばエシェリヒア属細菌ではカルシウム処理によるコンピテントセル法、バチルス属細菌ではプロトプラスト法、酵母ではＫＵ法やＫＵＲ法、糸状菌ではマイクロマニュピレーション法等の方法によって行うことができる。また、エレクトロポレーション法も広く用いることができる。
【００１８】
宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカー等を指標とすればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００１９】
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
培養温度は菌が生育し、本発明のタンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は１２〜７２時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、本発明のタンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００２０】
培養物中の本発明のタンパク質を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、本発明のタンパク質が培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、本発明のタンパク質を含有する溶液と微生物菌体と分離した後に利用される。本発明のタンパク質が菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加して本発明のタンパク質を可溶化し、水溶液として分離採取する。
上記のようにして得られたタンパク質含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって精製を行うことにより、精製された本発明のタンパク質を得ることができる。
【００２１】
カラムクロマイトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましいが、αサブユニット又はγサブユニットが含まれていてもよい。
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。
本発明のβサブユニット及びαサブユニット、もしくは必要に応じてさらにγサブユニットからなるＧＤＨ複合体、又はそれを保持する形質転換体は、グルコースセンサの酵素電極として用いることができる。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のグルコース脱水素酵素 をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００２２】
グルコースの濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の酵素を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコースの濃度を計算することができる。
また、本発明のβサブユニットを含むＧＤＨ複合体は、グルコース等の糖類アッセイキットの構成要素とすることができる。典型的には、キットは、ＧＤＨ複合体に加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作成のためのグルコースなどの標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う酵素は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
参考例１  ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株ＧＤＨ αサブユニットをコードする遺伝子の単離
【００２４】
＜１＞ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株からの染色体ＤＮＡの調製
ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をＴＬ液体倍地（ポリペプトン １０ｇ、酵母抽出液 １ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、グルコース ５ｇ；１Ｌ、ｐＨ ７．２）を用いて、３４℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離機により回収した。この菌体を１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体ＤＮＡを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥバッファーに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液とした。
【００２５】
＜２＞ＧＤＨαサブユニットのＮ末端アミノ酸配列の決定
実施例２と同様にして精製したＧＤＨを凍結乾燥によって濃縮後、１２．５％ポリアクリルアミドを用いたＳＤＳ−電気泳動法を用いて展開し、αサブユニットを分離した。こうして得られたαサブユニットをポリビニリデンフルオリド膜に転写した後、アミノ酸シークエンサー（島津製作所製、ＰＰＳＱ−１０）によりＮ末端アミノ酸配列の決定を行った。その結果、本酵素には配列番号３のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２〜１２からなる１１残基から構成されるペプチド配列を含むことが明らかとなった。
【００２６】
＜３＞αサブユニットをコードする遺伝子のクローニング
＜１＞で調製したＤＮＡ１μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで限定分解した。これをＣＩＡＰ（仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ）処理した。一方、コスミドであるＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（ストラジーン社から入手）をＢａｍＨＩ処理し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、ＳｕｐｅｒＣｏｓＩにα−１５株由来の染色体ＤＮＡ断片をＳａｕ３ＡＩで限定分解して得られたＤＮＡ断片を組み込んだ。得られた組換えＤＮＡでエシェリヒア・コリＸＬ−１Ｂｌｕｅ ＭＲ（ストラジーン社から入手）を形質転換した。形質転換体はＳｕｐｅｒＣｏｓＩ上の抗生物質耐性であるネオマイシン耐性およびアンピシリン耐性にしたがって１０μｇ／ｍｌのネオマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地から選抜した。得られた形質転換体をＬＢ液体培地で培養した。これらの形質転換菌体を集菌後、ＧＤＨ活性測定試薬に懸濁し、グルコースに対する脱水素酵素活性を指標にクローンを選抜した。その結果、１株のグルコース脱水素酵素 活性を示すクローンが得られた。
【００２７】
＜４＞サブクローニング
＜３＞で得られたαサブユニットをコードする遺伝子を含むコスミドＳｕｐｅｒＣｏｓＩから、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。同コスミドから挿入遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩにより切り出した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理し、それらの断片をＸｂａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８に組み込んだ。各挿入断片を含むプラスミドｐＵＣ１８でエシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転換体を液体のＬＢ培地で培養し、それぞれの細胞のＧＤＨ活性を＜３＞と同様に調べた。その結果、一つの形質転換体にＧＤＨ活性を示す株が得られた。この形質転換体からプラスミドを抽出し、その挿入ＤＮＡ断片を解析したところ、約８．８ｋｂｐの挿入断片が確認された。本プラスミドをｐＫＳ１と命名した。
【００２８】
＜５＞塩基配列の決定
ｐＫＳ１の挿入ＤＮＡ断片について、制限酵素解析及び常法に従い塩基配列を決定した。その結果、本挿入ＤＮＡ断片中に、＜２＞で明かとなったαサブユニットのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が確認され、この配列を含むオープンリーディングフレームが見つかった。決定した塩基配列および同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列は、配列番号１および３に示す通りである。尚、後述するように、配列番号１の塩基配列のうち、塩基番号２３８６以降の塩基配列は、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードしており、β−サブユニットをコードしていると推定された。
参考例２ 組換え大腸菌によるＧＤＨ αサブユニットの生産
αサブユニットの塩基配列が決定されたことにより、前記αサブユニットの構造遺伝子を用いてベクターを作製し、更に前記ベクターにより形質転換体の製造を行った。
【００２９】
先ずベクターに挿入する遺伝子を以下のように調製した。
ＫＳ１株由来のゲノム断片をテンプレートとして、所望の制限酵素部位を含むように、ＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応には次の１組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
（フォワード）
5'-CCCAAGCTTGGGCCGATACCGATACGCA-3'（配列番号５）
（リバース）
5'-GAGAAGCTTTCCGCACGGTCAGACTTCC-3'（配列番号６）
ＰＣＲにより増幅された遺伝子を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ（ＳＩＧＭＡ社）のクローニング部位であるＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／αと命名した。
前記プラスミドｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／αでエッシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。
【００２９】
さらにｐＫＳ１挿入断片について、αサブユニットの上流に関してオープンリーディングフレームを検索したところ、新たに配列番号２に記載される１６８アミノ酸残基から構成されるポリペプチドをコードする５０７塩基から構成される構造遺伝子（配列番号１中塩基番号２５８〜７６１）が見出された。この構造遺伝子は、γサブユニットをコードしていると考えられた。
αサブユニットのコード領域の上流に、γサブユニットをコードする領域の存在が明らかになったことから、γサブユニットとαサブユニットが連続するポリシストロン構造の遺伝子を含む組換えベクターを作製し、同ベクターを導入した形質転換体を構築した。
先ずベクターに挿入する遺伝子を以下のように調製した。
γサブユニットの構造遺伝子およびαサブユニットの構造遺伝子が連続するＫＳ１株由来のゲノム断片をテンプレートとして、所望の制限酵素部位を含むように、ＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応には次の１組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
（フォワード）
5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACACT-3'（配列番号７）
（リバース）
5'-CCCAAGCTTGGGTCAGACTTCCTTCTTCAGC-3'（配列番号８）
【００３０】
このＰＣＲにより増幅された遺伝子の５'末端をＮｃｏＩ、３'末端をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のクローニング部位である、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに挿入した。得られたプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αと命名した。
前記プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αにより、エシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取した。
前記ｐＫＳ１、ｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／α、ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αのそれぞれのプラスミドによって形質転換したエシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を用いてαサブユニットの生産を行った。各形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で１２時間培養を行い、遠心分離機により細胞を集菌した。この細胞をフレンチプレス（１５００ｋｇｆ）で破砕した後、超遠心（４℃、１６０，４００×ｇ、９０分）により膜画分（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０）を分離した。
参考例３ ＧＤＨ活性の確認
【００３１】
先ず前記各膜分画を用いてＧＤＨ活性の確認を行った。具体的には５９４μＭのメチルフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により、目視判定を行った。結果は以下のとおりである。＋の数は、青色から無色への変化の程度を表す。
ｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／αによる形質転換体培養膜分画 ＋
ｐＫＳ１による形質転換体培養膜分画 ＋＋
ｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αによる形質転換体培養膜分画 ＋＋＋
αサブユニットのみを組みこんだｐＦＬＡＧ−ＣＴＳ／αによる形質転換体培養膜分画のＧＤＨ活性が最も低く、効率良くベクターを構築したｐＴｒｃ９９Ａ／γ＋αによる形質転換体培養膜分画が最も高いＧＤＨ活性を示した。
【００３２】
αサブユニットの構造遺伝子のみによるベクターを用いた形質転換体でもαサブユニットは発現されるが、更にγサブユニットの構造遺伝子をαサブユニットの構造遺伝子と合わせたベクターを用いることにより、効率良くαサブユニットを得ることができた。
本発明のグルコース脱水素酵素 を用いてグルコースをアッセイした。本発明のグルコース脱水素酵素 （αサブユニット）を、各種濃度のグルコースで酵素活性を測定した。ＧＤＨ活性の測定は５９４μＭのメチルフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）および５．９４μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の中で行った。酵素試料および基質としてグルコースを基質として加え３７℃でインキュベートした時のＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素反応速度とした。本発明のＧＤＨを用いて、０．０１〜１．０ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた。
【００３３】
実施例１  ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットをコードする遺伝子の単離
＜１＞ブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットの検索
Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅのブルクホルデリア・セパシアＪ２３１５株ゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）を用いて、ＫＳ１株由来ＧＤＨのβサブユニット遺伝子を検索した。すでに明らかにされているＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットのＮ末端配列（配列番号９）を参考に、アセトバクターＳｐ．、グルコノバクターｓｐ．由来のアルコール脱水素酵素（Ｔａｍａｋｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０８８（２）：２９２−３００（１９９１）、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，３０４−３１０（１９９２）、Ｔａｋｅｍｕｒａ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７５，６８５７−６６（１９９３）、Ｋｏｎｄｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６３，１１３１−８（１９９７））、エルビニアｓｐ．、シュードモナスｓｐ．由来のグルコン酸脱水素酵素（Ｙｕｍ ＤＹ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７９，６５６６−７２，（１９９７）、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，８５，１１７３−８１（１９７９））、グルコノバイターｓｐ．由来のソルビトール脱水素酵素（Ｃｈｏｉ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１２５，４５−５０（１９９５））、エルビニアｓｐ．、パントエアｓｐ．由来の２−ケトグルコン酸脱水素酵素（Ｐｕｊｏｌ ＣＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８２，２２３０−７，（２０００））のシトクロームｃサブユニットとホモロジーの高いアミノ酸配列（配列番号１０）をデザインした。
【００３４】
上記アミノ酸配列を指標として、前記ブルクホルデリア・セパシアＪ２３１５株のデーターベースからＢＬＡＳＴを用いてホモロジーの高いアミノ酸配列をコードしている遺伝子配列を検索した。つぎに、得られた５つの配列に対して、ＫＳ１株ＧＤＨαサブユニットのＣ末端配列とのホモロジーを検索した結果、２つの遺伝子断片から翻訳されるアミノ酸配列が高いホモロジー（＞９０％）を示した。各遺伝子断片は２００〜５００ｂｐと短かったので、これらの配列に対して相同性の高い配列を、Ｂｌａｓｔを用いてブルクホルデリア・セパシアＪ２３１５株のゲノムデーターベースから検索し、各断片をつなぎ合わせた。その結果、３１１０ｂｐの断片を得た。得られた塩基配列にはＧＤＨのＣ末端と思われるＯＲＦと１２７５ｂｐからなるシトクロームｃ構造遺伝子と思われるＯＲＦが存在した（配列番号１１）。同ＯＲＦがコードするアミノ酸配列を配列番号１２に示す。得られたＪ２３１５株の塩基配列と既にクローニングされているＫＳ１株αサブユニット塩基配列を比較した結果、αサブユニット下流にはＪ２３１５株シトクロームｃのシグナルペプチドをコードする塩基配列に相同性の高い塩基配列が含まれていた。
【００３５】
以上のことから、参考例１で得られたブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株のクローニング断片中の三番目のＯＲＦ（配列番号１の塩基番号２３８６以降）は、β−サブユニットをコードしていると推定された。また、精製されたβ−サブユニットのＮ末端におけるアミノ酸配列と、配列番号１中の塩基番号２４５２〜２４６６の塩基配列によって翻訳される５アミノ酸残基が一致したことからも、前記ＯＲＦはβサブユニットをコードしていると考えられた。
【００３６】
＜２＞インバースＰＣＲ法を用いたβサブユニット構造遺伝子の増幅
（１）菌体の培養及びゲノムの抽出
ＫＳ１株を５ｍｌの完全培地（０．５％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ、０．３％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ ＮａＣｌ）を用いて３７℃で一晩振とう培養した。得られた菌体からＧｅｎｎｏｍｉｃＰｒｅｐTMＣｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてゲノムを抽出した。方法は付属のマニュアルに従った。得られたゲノムに対してフェノール／クロロホルム処理を行い、エタノール沈殿させた後、精製水に溶解した。
（２）ゲノム断片の環状化
ＫＳ１株より抽出したゲノムを、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、エタノール沈殿によってゲノム断片を回収した。制限酵素消化したゲノム１μｇをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて１６℃で一晩ライゲーション反応を行った。
（３）ＰＣＲ
ＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットのＮ末端シグナル配列領域の塩基配列からデザインしたフォワードプライマー（ＥＦ１配列番号１３）５０ｐｍｏｌ，リバースプライマー（ＥＲ１配列番号１４）５０ｐｍｏｌ（プライマーはいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に依託合成）、ＬＡＴａｑ（宝バイオ（株））０．５ｍｌ、ｄＮＴＰ溶液８μｌ，１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌに精製水を全量５０μｌとなるように加え、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−８０１（ＡＳＴＥＣ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応は、以下の条件で行った。９４℃ ５分、９８℃ ２０秒、６２℃ ３０秒を３０サイクルの後、７２℃ ６分、７２℃ １０分。
ＳｍａＩで制限酵素消化したゲノムをテンプレートとした場合において、約２．１ｋｂｐの大きさの断片がアガロース電気泳動で確認された。
【００３７】
＜３＞ＰＣＲ増幅断片のシークエンシング
（１）ＴＡクローニング
前記のインバースＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、バンドを切り出し、Ｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ ＩＩ ＫＩＴ（Ｂｉｏ１０１ ｉｎｃ．）を用いて精製した。この断片を、ｐＧＥＭＲ−Ｔ ａｎｄ ｐＧＥＭＲ−Ｔ ＥＡＳＹ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒにライゲーションした。ライゲーションを行ったベクターでエシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ ４０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ ０．１μＭを含むＬ寒天培地を用いて一晩培養した。出現したコロニーから白色のコロニーを選択し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ培地で一晩培養して、菌体からプラスドをアルカリ法により抽出した。
（２）シークエンスサンプルの調製
得られたプラスミドをＲＮａｓｅ処理し、これに０．６倍量の２０％ ＰＥＧ６０００／２．５Ｍ ＮａＣｌを加え、氷上に１時間放置した。その後１５０００ｒ．ｐ．ｍ、４℃で１５分間遠心分離し、ペレットを得た。これを７０％エタノールで洗浄し、ペレットを真空乾燥させた。これを精製水に溶解した。
【００３８】
（３）ＤＮＡ塩基配列の解析
（２）で得られたプラスミドの挿入断片の塩基配列を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｚｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ Ａｐｐｌｉｓｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。ベクターのマルチクローニングサイトからＭ１３プライマーを用いて挿入断片の一部の配列を決定した結果、これまでに解析されているβサブユニットＮ末端を含む塩基配列が確認された。この配列を手がかりにプライマーを順次作製して用い、挿入断片の塩基配列を決定した。結果を配列番号１５に示す。また、この塩基配列に含まれるＯＲＦがコードするアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
βサブユニットは、全部で４２５個のアミノ酸残基から構成されており、すでに得られているＮ末端アミノ酸配列と比較して、そのうち２２残基はシグナルペプチドであると考えられる。アミノ酸配列から計算される分子量は４５，２７６Ｄａであり、シグナルペプチドを除いた分子量４２，７３１Ｄａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求められたＫＳ１株ＧＤＨβサブユニットの分子量４３ｋＤａとほぼ同等の値であった。βサブユニットのアミノ酸配列中には、シトクロームｃにおいてヘムとの結合モチーフ（配列番号１８）が３ヶ所に確認された。このＯＲＦはαサブユニット構造遺伝子のＯＲＦのすぐ下流に位置し、開始コドンの上流にＳＤ配列と思われる配列が存在した。
【００３９】
得られたアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴによるホモロジー検索を行ったところ、ラルストニア・ソアナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のオキシドレダクターゼ脱水素酵素のシトクロムｃサブユニットと６５％、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）由来のソルビトール脱水素酵素のシトクロムｃサブユニットと４８％、エルビニア・シプリペディイ（Ｅｒｉｗｉｎｉａ ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｉ）由来のグルコン酸脱水素酵素のシトクロームｃサブユニットと４４％、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）由来２−ケト−グルコン酸脱水素酵素のシトクロームｃサブユニットとアミノ酸レベルで４６．４％と、全体にわたって高い相同性を示していた。またこれらのシトクロームｃのアミノ酸配列中には、ヘム結合モチーフ（配列番号１８）配列が保存されていた。
【００４０】
尚、ＫＳ１株のＧＤＨβサブユニット構造遺伝子は、Ｊ２３１５株のＧＤＨβサブユニット構造遺伝子と、塩基配列レベルで９２．０％、アミノ酸レベルで９２．２％の相同性を有している。
【産業上の利用の可能性】
【００４１】
本発明により、ブルクホルデリア属微生物のＧＤＨβサブユニット及びそれをコードするＤＮＡが提供される。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> SODE, Koji
<120> Glucose dehydrogenase beta-subunit and DNA encoding the same
<130> P-B1124HM2
<140>JP 2004-501977
<141> 2003-04-25
<150> JP 2002-125353
<151> 2002-04-26
<160> 19
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 2467
<212> DNA
<213> Burkhorderia cepacia
<220>
<221> CDS
<222> (258)..(761)
<220>
<221> CDS
<222> (764)..(2380)
<220>
<221> CDS
<222> (2386)..(2466)
<400> 1
aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60
gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120
tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180
tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240
gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc    290
Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg
1               5                  10
cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa   338
His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln
15                  20                  25
ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg   386
Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu
30                  35                  40
cgg gcg ctt gca gac aac ccc ggc act gcg ccg ctc gat acg ttc atg   434
Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met
45                  50                  55
acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc   482
Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile
60                  65                  70                  75
ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc   530
Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala
80                  85                  90
gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg   578
Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr
95                 100                 105
cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc   626
Pro Glu Gln Glu Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu
110                 115                 120
ggc atc gtc gac aac gtc gtg att acg tac gag gaa gca tta atg ttc   674
Gly Ile Val Asp Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe
125                 130                 135
ggc gtc gtg tcc gat acg ctc gtg atc cgt tcg tat tgc ccc aac aaa   722
Gly Val Val Ser Asp Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys
140                 145                 150                 155
ccc ggc ttc tgg gcc gac aaa ccg atc gag agg caa gcc tg atg gcc    769
Pro Gly Phe Trp Ala Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala    Met Ala
160                 165                    170
gat acc gat acg caa aag gcc gac gtc gtc gtc gtt gga tcg ggt gtc   817
Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser Gly Val
175                 180                 185
gcg ggc gcg atc gtc gcg cat cag ctc gcg atg gcg ggc aag gcg gtg   865
Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys Ala Val
190                 195                 200
atc ctg ctc gaa gcg ggc ccg cgc atg ccg cgc tgg gaa atc gtc gag   913
Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile Val Glu
205                 210                 215
cgc ttc cgc aat cag ccc gac aag atg gac ttc atg gcg ccg tac ccg   961
Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro Tyr Pro
220                 225                 230
tcg agc ccc tgg gcg ccg cat ccc gag tac ggc ccg ccg aac gac tac   1009
Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn Asp Tyr
235                 240                 245                 250
ctg atc ctg aag ggc gag cac aag ttc aac tcg cag tac atc cgc gcg   1057
Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile Arg Ala
255                 260                 265
gtg ggc ggc acg acg tgg cac tgg gcc gcg tcg gcg tgg cgc ttc att   1105
Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg Phe Ile
270                 275                 280
ccg aac gac ttc aag atg aag agc gtg tac ggc gtc ggc cgc gac tgg   1153
Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg Asp Trp
285                 290                 295
ccg atc cag tac gac gat ctc gag ccg tac tat cag cgc gcg gag gaa   1201
Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Glu
300                 305                 310
gag ctc ggc gtg tgg ggc ccg ggc ccc gag gaa gat ctg tac tcg ccg   1249
Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr Ser Pro
315                 320                 325                 330
cgc aag cag ccg tat ccg atg ccg ccg ctg ccg ttg tcg ttc aac gag   1297
Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe Asn Glu
335                 340                 345
cag acc atc aag acg gcg ctg aac aac tac gat ccg aag ttc cat gtc   1345
Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe His Val
350                 355                 360
gtg acc gag ccg gtc gcg cgc aac agc cgc ccg tac gac ggc cgc ccg   1393
Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly Arg Pro
365                 370                 375
act tgt tgc ggc aac aac aac tgc atg ccg atc tgc ccg atc ggc gcg   1441
Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile Gly Ala
380                 385                 390
atg tac aac ggc atc gtg cac gtc gag aag gcc gaa cgc gcc ggc gcg   1489
Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala Gly Ala
395                 400                 405                 410
aag ctg atc gag aac gcg gtc gtc tac aag ctc gag acg ggc ccg gac   1537
Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly Pro Asp
415                 420                 425
aag cgc atc gtc gcg gcg ctc tac aag gac aag acg ggc gcc gag cat   1585
Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala Glu His
430                 435                 440
cgc gtc gaa ggc aag tat ttc gtg ctc gcc gcg aac ggc atc gag acg   1633
Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile Glu Thr
445                 450                 455
ccg aag atc ctg ctg atg tcc gcg aac cgc gat ttc ccg aac ggt gtc   1681
Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn Gly Val
460                 465                 470
gcg aac agc tcg gac atg gtc ggc cgc aac ctg atg gac cat ccg ggc   1729
Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly
475                 480                 485                 490
acc ggc gtg tcg ttc tat gcg agc gag aag ctg tgg ccg ggc cgc ggc   1777
Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly Arg Gly
495                 500                 505
ccg cag gag atg acg tcg ctg atc ggt ttc cgc gac ggt ccg ttc cgc   1825
Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro Phe Arg
510                 515                 520
gcg acc gaa gcg gcg aag aag atc cac ctg tcg aac ctg tcg cgc atc   1873
Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ile
525                 530                 535
gac cag gag acg cag aag atc ttc aag gcc ggc aag ctg atg aag ccc   1921
Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met Lys Pro
540                 545                 550
gac gag ctc gac gcg cag atc cgc gac cgt tcc gca cgc tac gtg cag   1969
Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr Val Gln
555                 560                 565                 570
ttc gac tgc ttc cac gaa atc ctg ccg caa ccc gag aac cgc atc gtg   2017
Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg Ile Val
575                 580                 585
ccg agc aag acg gcg acc gat gcg atc ggc att ccg cgc ccc gag atc   2065
Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu Ile
590                 595                 600
acg tat gcg atc gac gac tac gtg aag cgc ggc gcc gcg cat acg cgc   2113
Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His Thr Arg
605                 610                 615
gag gtc tac gcg acc gcc gcg aag gtg ctc ggc ggc acg gac gtc gtg   2161
Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp Val Val
620                 625                 630
ttc aac gac gaa ttc gcg ccg aac aat cac atc acg ggc tcg acg atc   2209
Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile
635                 640                 645                 650
atg ggc gcc gat gcg cgc gac tcc gtc gtc gac aag gac tgc cgc acg   2257
Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr
655                 660                 665
ttc gac cat ccg aac ctg ttc att tcg agc agc gcg acg atg ccg acc   2305
Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met Pro Thr
670                 675                 680
gtc ggt acc gta aac gtg acg ctg acg atc gcc gcg ctc gcg ctg cgg   2353
Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala Leu Arg
685                 690                 695
atg tcg gac acg ctg aag aag gaa gtc tgacc gtg cgg aaa tct act ctc 2403
Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val       Val Arg Lys Ser Thr Leu
700                 705                       710
act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg ccg ggc ttc gcg cgc gcg   2451
Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu Pro Gly Phe Ala Arg Ala
715                 720                 725
gcc gat gcg gcc gat c                                             2467
Ala Asp Ala Ala Asp
730
<210> 2
<211> 168
<212> PRT
<213> Burkhorderia cepacia
<400> 2
Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala Ala
1               5                  10                  15
Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln Gly Ala Leu Ala Leu
20                  25                  30
Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu Arg Ala Leu Ala Asp
35                  40                  45
Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met Thr Leu Ser Glu Ser
50                  55                  60
Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile Gly Glu Arg Leu Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala Asp Ser Leu Pro Gln
85                  90                  95
Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr Pro Glu Gln Glu Ser
100                 105                 110
Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu Gly Ile Val Asp Asn
115                 120                 125
Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe Gly Val Val Ser Asp
130                 135                 140
Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys Pro Gly Phe Trp Ala
145                 150                 155                 160
Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala
165
<210> 3
<211> 539
<212> PRT
<213> Burkhorderia cepacia
<400> 3
Met Ala Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser
1               5                  10                  15
Gly Val Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys
20                  25                  30
Ala Val Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile
35                  40                  45
Val Glu Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro
50                  55                  60
Tyr Pro Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn
65                  70                  75                  80
Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile
85                  90                  95
Arg Ala Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg
100                 105                 110
Phe Ile Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg
115                 120                 125
Asp Trp Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala
130                 135                 140
Glu Glu Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Pro Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe
165                 170                 175
Asn Glu Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe
180                 185                 190
His Val Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly
195                 200                 205
Arg Pro Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile
210                 215                 220
Gly Ala Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala
225                 230                 235                 240
Gly Ala Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly
245                 250                 255
Pro Asp Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala
260                 265                 270
Glu His Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile
275                 280                 285
Glu Thr Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn
290                 295                 300
Gly Val Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His
305                 310                 315                 320
Pro Gly Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly
325                 330                 335
Arg Gly Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro
340                 345                 350
Phe Arg Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser
355                 360                 365
Arg Ile Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met
370                 375                 380
Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr
385                 390                 395                 400
Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg
405                 410                 415
Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro
420                 425                 430
Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His
435                 440                 445
Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp
450                 455                 460
Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser
465                 470                 475                 480
Thr Ile Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys
485                 490                 495
Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met
500                 505                 510
Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala
515                 520                 525
Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val
530                 535
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> Burkhorderia cepacia
<400> 4
Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu
1               5                  10                  15
Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp
20                  25
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 5
cccaagcttg ggccgatacc gatacgca                                    28
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 6
gagaagcttt ccgcacggtc agacttcc                                    29
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 7
catgccatgg cacacaacga caacact                                     27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 8
cccaagcttg ggtcagactt ccttcttcag c                                31
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> Burkhorderia cepacia
<400> 9
Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala
1               5                  10                  15
<210> 10
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:consensus
<220>
<221> UNSURE
<222> (6,17,18,19,22)
<223> Xaa=unknown
<400> 10
Ala Asp Ala Ala Asp Xaa Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala
1               5                  10                  15
Xaa Xaa Xaa Asp Cys Xaa Ala Cys His
20                  25
<210> 11
<211> 2410
<212> DNA
<213> Burkholderia cepacia
<220>
<221> CDS
<222> (673)..(1950)
<400> 11
gatggaccac ccgggcaccg gcgtgtcgtt ctacgcgaac gagaagctgt ggccgggccg 60
cggcccgcag gatatgacgt cgctgatcgg tttccgcgac ggcccgttcc gcgcgaccga 120
agccgcgaag aagatccatc tgtcgaacat gtcccgcatc aaccaggaga cgcagaagat 180
cttcaaggcc ggcaaactga tgaagcacga ggagctcgac gcgcagatcc gcgaccgttc 240
cgcgcgctac gtgcagttcg actgcttcca cgagattctg ccgcagcccg agaaccgcat 300
cgtgccgagc aagacggcca ccgacgcgat cgggatcccg cgccccgaga tcacgtatgc 360
gatcgacgat tacgtgaagc gcggcgccgt gcacacgcgc gaggtctacg cgacggccgc 420
gaaggtgctg ggcggcaccg acgtcgtctt caacgacgag ttcgcgccga acaaccacat 480
cacgggcgcg aggatcatgg gcgcggatgc acgcgactcg gtcgtcgaca aggactgccg 540
cacgttcgac catccgaacc tgttcctctc gagcagctcg acgatgccga ccgtcggtac 600
ggtgaacgtg acgctgacga tcgcggcgct cgcgctgcgg atgtcggaca cgctgaagaa 660
ggaagtctga cc gtg cgg aaa tct act ctc acc ttc ctc ctc gcc ggc tgc 711
Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Leu Ala Gly Cys
1               5                  10
ctc gcg ctg ccc ggc ctc gca cgc gcg gcc gat tcg gcc gat ccg gcg   759
Leu Ala Leu Pro Gly Leu Ala Arg Ala Ala Asp Ser Ala Asp Pro Ala
15                  20                  25
cat gtc aag cgc ggc gaa tac ctc gcc gtc gcg ggc gac tgc atg gca   807
His Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Val Ala Gly Asp Cys Met Ala
30                  35                  40                  45
tgc cac acc gcg aag ggc ggc aag ccg ttc gcg ggc ggc ctc ggc atg   855
Cys His Thr Ala Lys Gly Gly Lys Pro Phe Ala Gly Gly Leu Gly Met
50                  55                  60
ccg gtg ccg atg ctc ggc aag atc tat acg agc aac atc aca ccg gat   903
Pro Val Pro Met Leu Gly Lys Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp
65                  70                  75
ccc gat acc ggc atc ggc aac tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg   951
Pro Asp Thr Gly Ile Gly Asn Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala
80                  85                  90
gtg cgg cac ggc gta tcg aag aac ggc gac aac ctg tac ccg gcg atg   999
Val Arg His Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met
95                 100                 105
ccg tac gtg tcg tac gcg aag atc aac gac gac gac gtg caa gcg ctg   1047
Pro Tyr Val Ser Tyr Ala Lys Ile Asn Asp Asp Asp Val Gln Ala Leu
110                 115                 120                 125
tac gcg tac ttc atg cac ggc gtc gaa ccg gtc aag cag gcg ccg ccg   1095
Tyr Ala Tyr Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro
130                 135                 140
aag aac gag atc ccc gcg ctg ctg agc atg cgc tgg ccg ctg aag atc   1143
Lys Asn Glu Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile
145                 150                 155
tgg aac tgg ctg ttc ctg aag gac ggc gtg tac cag ccg aag ccc gag   1191
Trp Asn Trp Leu Phe Leu Lys Asp Gly Val Tyr Gln Pro Lys Pro Glu
160                 165                 170
cag agc gcc gag tgg aac cgc ggc gcc tat ctc gtg cag ggc ctc gcg   1239
Gln Ser Ala Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala
175                 180                 185
cac tgc agc acg tgc cac acg ccg cgc ggc atc gcg atg cag gag aag   1287
His Cys Ser Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys
190                 195                 200                 205
tcg ctc gac gaa acg ggc ggc agc ttc ctg tcg ggc tcg gtg ctc gcg   1335
Ser Leu Asp Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ser Gly Ser Val Leu Ala
210                 215                 220
ggc tgg gac ggc tac aac atc acg tcc gac ccg aac gcg ggg atc ggc   1383
Gly Trp Asp Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly
225                 230                 235
ggc tgg acg cag cag cag ctc gtc cag tac ctg cgc acc ggc agc gtg   1431
Gly Trp Thr Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val
240                 245                 250
ccg ggc ctc gcg cag gcg gcc ggc ccg atg gcc gag gcg atc gag cac   1479
Pro Gly Leu Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Ile Glu His
255                 260                 265
agc ttc tcg aag atg acc gaa gcc gac atc ggc ggc ccg atg gcc gag   1527
Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Gly Pro Met Ala Glu
270                 275                 280                 285
gcg atc gag cac agc ttc tcg aag atg acc gaa gcc gac atc ggc cgc   1575
Ala Ile Glu His Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Arg
290                 295                 300
tcg tcg tgg ggc aag ccg gcc gag gat ggc ctg aag ctg cgc ggc gtc   1623
Ser Ser Trp Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val
305                 310                 315
gcg ctc gcg tcg tcg ggc atc gat ccg gca ccg ctg tat ctc ggc aac   1671
Ala Leu Ala Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Pro Leu Tyr Leu Gly Asn
320                 325                 330
tgc gcg acc tgc cac cag atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggt tac   1719
Cys Ala Thr Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr
335                 340                 345
tac ccg ccg ttg ttc cac aac tcg acg gtc ggc gcg tcg aat ccg acc   1767
Tyr Pro Pro Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Thr
350                 355                 360                 365
aac ctc gtg cag gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag gcc ggc agc   1815
Asn Leu Val Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ala Gly Ser
370                 375                 380
gag gac gtc ggg atg ccc gcg ttc cgc cac gag ctg tcg gat gcg cag   1863
Glu Asp Val Gly Met Pro Ala Phe Arg His Glu Leu Ser Asp Ala Gln
385                 390                 395
atc gcc gcg ctg acg aac tac ctg acg ggg cag ttc ggc aat ccg gcc   1911
Ile Ala Ala Leu Thr Asn Tyr Leu Thr Gly Gln Phe Gly Asn Pro Ala
400                 405                 410
gcg aag gtg acc gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tga aacgcggcac    1960
Ala Lys Val Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg
415                 420                 425
gcggcgaggc agggcaacaa tagaaaagag gaggagcaca gcacatcggg cgggccccga 2020
tgccggttgt tgcagagcgg gacgggcggc gcaggcggtc gcccgtcctg gttcacaggc 2080
aatccggtgc gcgcacgccg cgcatcgttt tcgttgatcg agaccatgac accgaaccaa 2140
ccgtttctcg cgtcccagcg cgatgtgctg ctgctgctgt cccgaatcct gctcgtgatc 2200
ctgttcgtga tgttcggctg gaagaagatt atcgacttct ccggtacgat cgcgttcatg 2260
ggcagcgagg gcgcgccggc gccgatcatc tcggcggcga tctccgtcgt gatggagctc 2320
atcgtcggga ttgcgatcct cgtcggtttc cagacgcggc cgctcgcgct gttgcttgcg 2380
ctgtacacga tcggtaccgg catcatcggc                                  2410
<210> 12
<211> 425
<212> PRT
<213> Burkholderia cepacia
<400> 12
Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Leu Ala Gly Cys Leu Ala Leu
1               5                  10                  15
Pro Gly Leu Ala Arg Ala Ala Asp Ser Ala Asp Pro Ala His Val Lys
20                  25                  30
Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Val Ala Gly Asp Cys Met Ala Cys His Thr
35                  40                  45
Ala Lys Gly Gly Lys Pro Phe Ala Gly Gly Leu Gly Met Pro Val Pro
50                  55                  60
Met Leu Gly Lys Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr
65                  70                  75                  80
Gly Ile Gly Asn Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His
85                  90                  95
Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val
100                 105                 110
Ser Tyr Ala Lys Ile Asn Asp Asp Asp Val Gln Ala Leu Tyr Ala Tyr
115                 120                 125
Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu
130                 135                 140
Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp
145                 150                 155                 160
Leu Phe Leu Lys Asp Gly Val Tyr Gln Pro Lys Pro Glu Gln Ser Ala
165                 170                 175
Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser
180                 185                 190
Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp
195                 200                 205
Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ser Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp
210                 215                 220
Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Gly Trp Thr
225                 230                 235                 240
Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Leu
245                 250                 255
Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Ile Glu His Ser Phe Ser
260                 265                 270
Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Gly Pro Met Ala Glu Ala Ile Glu
275                 280                 285
His Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Arg Ser Ser Trp
290                 295                 300
Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala
305                 310                 315                 320
Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Pro Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr
325                 330                 335
Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Pro
340                 345                 350
Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Thr Asn Leu Val
355                 360                 365
Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ala Gly Ser Glu Asp Val
370                 375                 380
Gly Met Pro Ala Phe Arg His Glu Leu Ser Asp Ala Gln Ile Ala Ala
385                 390                 395                 400
Leu Thr Asn Tyr Leu Thr Gly Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val
405                 410                 415
Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg
420                 425
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 13
tgcaccgtgc ggaaatctac tctcact                                     27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 14
acttccttct tcagcgtgtc cgacatc                                     27
<210> 15
<211> 1441
<212> DNA
<213> Burkholderia cepacia
<220>
<221> CDS
<222> (121)..(1398)
<400> 15
tccgaacctg ttcatttcga gcagcgcgac gatgccgacc gtcggtaccg taaacgtgac 60
gctgacgatc gccgcgctcg cgctgcggat gtcggacacg ctgaagaagg aagtctgacc 120
gtg cgg aaa tct act ctc act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg   168
Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu
1               5                  10                  15
ccg ggc ttc gcg cgc gcg gcc gat gcg gcc gat ccg gcg ctg gtc aag   216
Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys
20                  25                  30
cgc ggc gaa tac ctc gcg acc gcc atg ccg gta ccg atg ctc ggc aag   264
Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys
35                  40                  45
atc tac acg agc aac atc acg ccc gat ccc gat acg ggc gac tgc atg   312
Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met
50                  55                  60
gcc tgc cac acc gtg aag ggc ggc aag ccg tac gcg ggc ggc ctt ggc   360
Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly
65                  70                  75                  80
ggc atc ggc aaa tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg gtg cgg cac   408
Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His
85                  90                  95
ggc gtg tcg aag aac ggc gac aac ctg tat ccg gcg atg ccg tac gtg   456
Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val
100                 105                 110
tcg tac gcg aag atc aag gac gac gac gta cgc gcg ctg tac gcc tac   504
Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr
115                 120                 125
ttc atg cac ggc gtc gag ccg gtc aag cag gcg ccg ccg aag aac gag   552
Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu
130                 135                 140
atc cca gcg ctg cta agc atg cgc tgg ccg ctg aag atc tgg aac tgg   600
Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp
145                 150                 155                 160
ctg ttc ctg aag gac ggc ccg tac cag ccg aag ccg tcg cag agc gcc   648
Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala
165                 170                 175
gaa tgg aat cgc ggc gcg tat ctg gtg cag ggt ctc gcg cac tgc agc   696
Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser
180                 185                 190
acg tgc cac acg ccg cgc ggc atc gcg atg cag gag aag tcg ctc gac   744
Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp
195                 200                 205
gaa acc ggc ggc agc ttc ctc gcg ggg tcg gtg ctc gcc ggc tgg gac   792
Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp
210                 215                 220
ggc tac aac atc acg tcg gac ccg aat gcg ggg atc ggc agc tgg acg   840
Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr
225                 230                 235                 240
cag cag cag ctc gtg cag tat ttg cgc acc ggc agc gtg ccg ggc gtc   888
Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val
245                 250                 255
gcg cag gcg gcc ggg ccg atg gcc gag gcg gtc gag cac agc ttc tcg   936
Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser
260                 265                 270
aag atg acc gaa gcg gac atc ggt gcg atc gcc acg tac gtc cgc acg   984
Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr
275                 280                 285
gtg ccg gcc gtt gcc gac agc aac gcg aag cag ccg cgg tcg tcg tgg   1032
Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp
290                 295                 300
ggc aag ccg gcc gag gac ggg ctg aag ctg cgc ggt gtc gcg ctc gcg   1080
Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala
305                 310                 315                 320
tcg tcg ggc atc gat ccg gcg cgg ctg tat ctc ggc aac tgc gcg acg   1128
Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr
325                 330                 335
tgc cac cag atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggc tat tac ccg tcg   1176
Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser
340                 345                 350
ctg ttc cac aac tcc acc gtc ggc gcg tcg aat ccg tcg aac ctc gtg   1224
Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val
355                 360                 365
cag gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag atc ggc agc gag gat atc   1272
Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile
370                 375                 380
ggg atg ccc gct ttc cgc tac gat ctg aac gac gcg cag atc gcc gcg   1320
Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala
385                 390                 395                 400
ctg acg aac tac gtg acc gcg cag ttc ggc aat ccg gcg gcg aag gtg   1368
Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val
405                 410                 415
acg gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tga catagtcggg cgcgccgaca     1418
Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg
420                 425
cggcgcaacc gataggacag gag                                         1441
<210> 16
<211> 425
<212> PRT
<213> Burkholderia cepacia
<400> 16
Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu
1               5                  10                  15
Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys
20                  25                  30
Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys
35                  40                  45
Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met
50                  55                  60
Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly
65                  70                  75                  80
Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His
85                  90                  95
Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val
100                 105                 110
Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr
115                 120                 125
Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu
130                 135                 140
Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp
145                 150                 155                 160
Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala
165                 170                 175
Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser
180                 185                 190
Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp
195                 200                 205
Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp
210                 215                 220
Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr
225                 230                 235                 240
Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val
245                 250                 255
Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser
260                 265                 270
Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr
275                 280                 285
Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp
290                 295                 300
Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala
305                 310                 315                 320
Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr
325                 330                 335
Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser
340                 345                 350
Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val
355                 360                 365
Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile
370                 375                 380
Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala
385                 390                 395                 400
Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val
405                 410                 415
Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg
420                 425
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: heme binding motif
<220>
<221> UNSURE
<222> (2,3)
<223> Xaa=unknown
<400> 17
Cys Xaa Xaa Cys His
1               5
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 18
catgccatgg cacacaacga caacact                                     27
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 19
cccaagcttg ggtcagactt ccttcttcag c                                31