(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）蛋白産生物を含む、網膜神経節細胞の損傷または変性を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
網膜神経節細胞の損傷または変性が緑内障に関連するものである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物がさらに、緑内障治療用の治療薬を含有する請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
膠細胞系由来神経栄養因子蛋白産生物を含む、視神経を形成する網膜神経節細胞軸索の損傷または変性を治療するための医薬組成物。
【請求項５】
前記視神経の損傷または変性が、緑内障、乳頭浮腫、乳頭炎および虚血からなる群から選択される視神経頭部に影響を与える状態に関連するものである請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物が、配列番号１に示したＧＤＮＦアミノ酸配列、または配列番号１の配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換しているアミノ酸配列からなり、ＧＤＮＦの活性を有する変異体を含有する請求項１ないし５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物が［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦを含む請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物が、持続性放出医薬組成物である請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）蛋白産生物を投与することで、網膜神経節細胞の損傷または変性を治療する方法に関する。本発明は具体的には、網膜神経節細胞変性が関与する緑内症その他の疾患／状態を治療する方法に関するものである。
神経栄養因子は天然蛋白であり、神経系によって刺激される神経組織または非神経組織に認められ、ある種の細胞群および／または膠細胞群の生存を促進し、表現型分化を維持する機能を有する（Varon et al., Ann.Rev.Neuroscience, 1:327, 1979;Thoenen et al., Science, 229:238,1985）。この生理的役割があることから、神経栄養因子は、神経損傷によって生じるそのような神経細胞の変性および分化機能の喪失を治療する上で有用である。神経損傷は、（１）軸索突起の変性（次に神経細胞死を起こす）および／または損傷部位付近の神経細胞体の変性を起こす物理的損傷；（２）卒中などの神経系の一部への血流の一時的または永久的停止（虚血）、（３）それぞれ癌およびＡＩＤＳの化学療法薬であるシスプラチナムおよびジデオキシシチジンなどの神経毒への意図的または偶発的曝露、（４）糖尿病または腎臓機能障害などの慢性代謝疾患、あるいは（５）特定のニューロン群の変性によって生じるパーキンソン病、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症などの神経変性性疾患などの１以上の種類の神経細胞の生存および／または適切な機能を障害する状態によって起こる。特定の神経栄養因子が神経損傷の治療に有用となるには、損傷を受けた種類の神経細胞がその因子に対して反応性でなければならない。全てのニューロン群が全ての神経栄養因子に対して反応性であるとは限らず、それら因子によって等しく影響を受けるとは限らないことが明らかになっている。
確認された最初の神経栄養因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）であった。ＮＧＦは、ニューロトロフィン（neurotrophin）と呼ばれる明確な栄養因子類の最初のものであり、それには現在、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ＮＴ−４／５およびＮＴ−６などがある（Thoenen, Trends. Neurosci., 14:165-170, 1991; Snider, Cell, 77:627-638, 1994; Bothwell, Ann.Rev.Neurosci., 18:223-253, 1995）。これらのニューロトロフィン類は、ｔｒｋチロシンキナーゼ受容体類、すなわちｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣおよび低親和性ｐ７５受容体を介して作用することが知られている（Snider,Cell,77:627-638,1994; Bothwell, Ann.Rev.Neurosci.,18:223-253, 1995; Chao et al., TINS 18:321-326, 1995）。
膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は最近発見された蛋白であって、in vitroでの中脳ドーパミン作働性ニューロンの生存を促進し、該ニューロンの伝達物質表現型を刺激する上でのそれの効力に基づいたアッセイを用いて、確認・精製されている（Lin et al., Science, 260:1130-1132, 1993）。ＧＤＮＦは糖付加ジスルフィド結合ホモダイマーであり、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの蛋白と一部構造的に相同している（Lin et al., Science, 260:1130-1132, 1993; Krieglstein et al., EMBO J., 14:736-742, 1995; Poulsen et al., Neuron, 13:1245-1252, 1994）。ＧＤＮＦｍＲＮＡが、筋肉および末梢神経系のシュワン細胞（Henderson et al., Science, 266:1062-1064, 1994; Trupp et al., J.Cell Biol., 130:137-148, 1995）ならびに中枢神経系のＩ型星状細胞（Schaar et al., Exp.Neurol., 124:368-371, 1993）で検出されている。in vivoでの外因性ＧＤＮＦ治療により、パーキンソン病の動物モデルにおいて、黒質ニューロンのドーパミン作働性表現型が刺激され、軸索切断術またはドーパミン作働性神経毒誘発の機能障害が回復される（Hudson et al., Brain Res.Bull., 36:425-432, 1995; Beck et al., Nature, 373:339-341, 1995; Tomac et al., Nature, 373:335-339, 1995; Hoffer et al., Neurosci.Lett., 182:107-111, 1994）。最初はドーパミン作働性ニューロンに対して比較的特異的であると考えられていたが、少なくともin vitroで、ＧＤＮＦが中脳ドーパミン作働性ニューロンおよび体細胞性運動ニューロン以外の広い範囲の神経栄養標的を有する可能性があることを示す証拠が出始めている（Yan and Matheson, Nature 373:341-344, 1995; Oppenheim et al., Nature, 373:344-346, 1995; Matheson et al., Soc.Neurosci.Abstr, 21, 544, 1995; Trupp et al., J.Cell Biol., 130:137-148, 1995）。特に、ＧＤＮＦはin vivoおよびin vitroのいずれにおいても、脳幹および脊髄のコリン作働性運動ニューロンに対して神経栄養的効力を有することが認められている（Oppenheim et al., Nature, 373:344-346, 1995; Zurn et al., Neuroreport, 6:113-118, 1994; Yan et al., Nature, 373:341-344, 1995; Henderson et al., Science, 266:1062-1064, 1994）。
本発明と関係があるものとしては、１９９３年４月１日公開のＷＯ９３／０６１１６（Lin et al., Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture）がある。該出願においては、ＧＤＮＦがパーキンソン病に関連する損傷などの神経損傷の治療に有用であることが報告されている。さらに興味深いものとしては、ＧＤＮＦｍＲＮＡが検出可能となり、ピロカルピン誘発発作後に上昇したという報告（Schmidt-Kastner et al., Mol.Brain Res., 26:325-330, 1994）；前脳基底部星状細胞が培養条件下に中等度のレベルのＧＤＮＦｍＲＮＡを発現したが、ＧＤＮＦは前脳基底部ＣｈＡＴ活性を変えなかったという報告（Schaar et al., Exp.Neurol., 124:368-371, 1993およびSchaar et al., Exp.Neurol., 130:387-393, 1994）；ならびにＧＤＮＦが前脳基底部コリン作働性ニューロンの損傷または変性の治療に有用であるという１９９５年９月２８日出願で現在係属中の米国特許出願０８／５３５６８２号の報告がある。ＧＤＮＦが損傷を受けた網膜神経節細胞の生存または再生を促進することはこれまで明らかにされていない。
網膜神経節細胞は、いくつかの段階で起こる視覚認知において主要な役割を果たす。第１に、網膜の外側の層にある光受容器と呼ばれる特殊なニューロンによって、光が電気信号に変換される。その信号は次に一つにまとめられ、介在ニューロンによって網膜の内側の層にある網膜神経節細胞に伝達され、その細胞が次にその情報を脳の視覚野領域に中継する。網膜神経節細胞軸索は集束して視神経を形成し、それが側面の膝状核および脳の上丘、ならびに脳幹核に投影する。
網膜神経節細胞への損傷は、緑内障において認められる主要な損傷であり、緑内障は失明の原因としては３番目に多いものである。緑内障は、網膜神経節細胞が徐々に失われる眼球神経疾患を特徴とする障害群に使用される用語である。この網膜神経節細胞への損傷は、視神経頭部内での軸索輸送機能障害および軸索の組織病理的異常を特徴とするものであり、代表的には視神経頭部の陥凹形状に関連している。視神経変性はさらに、視神経円板の他の状態、例えば脳圧上昇による乳頭浮腫、乳頭炎（一種の視神経炎）または虚血によっても生じる場合がある。
ほとんどの緑内障で、視神経損傷は眼内圧上昇によって生じる。眼内圧上昇に関連する主要な種類の緑内障としては、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障および二次緑内障がある。一部の緑内障では、眼内圧は正常範囲であっても、神経頭部の同様の陥凹が起こる。いずれの場合も、眼内圧の上昇は神経損傷の増加に関連している。緑内障は通常、内科的または外科的に眼内圧を下げるよう試みることで治療される。
慢性開放隅角緑内障が最も一般的なものであり、欧米成人の約０．５％で認められる。この種の緑内障では、眼球内房水の再吸収遮断があるために、眼内圧が２１ｍｍＨｇという正常最大圧より高くなって、視神経円板における軸索および支持組織が徐々に破壊される。この種の緑内障は、かなり進行するまで無症候性であるのが普通である。最初の視力低下は、周辺視野において認められる。眼内圧測定、視神経円板検査および患者の視野検査によって診断が行われる。治療は主として内科的であり、眼内圧を低下させる作用のある副交感神経興奮薬（ピロカルピンおよびカルバコール）、β−アドレナリン遮断薬（チモロール）および交感神経興奮剤（エピネフリン）の局所投与によって行われる。これらの薬剤を個々にあるいは併用で投与して進行性損傷が停止しない場合、間接的副交感神経興奮薬（エコチオフェート）および炭酸脱水素酵素阻害薬（アセタゾラミドおよびメタゾラミド）が処方される。内科療法が不首尾である場合、外科的治療を行って、流出路を開くことができる。開放隅角緑内障のある種の群は先天性であり、眼球におけるある種の解剖学的構造の発達不良が原因である。
閉塞隅角緑内障では、前眼房が浅いために房水の流出が物理的に妨害される。瞳孔ブロックが隅角における再吸収表面を妨害するまで（瞳孔を通る房水の流れに対する抵抗を生じる）、眼内圧は正常である。そうして圧力が急激に上昇して、５０ｍｍＨｇを超える場合が多い。この緑内障は片眼で起こるのが普通であり、赤眼および眼球の疼痛、固定瞳孔および瞳孔散大、視力低下、発汗ならびに吐き気を特徴とする。急性発作に対しては救急治療が施され、アセタゾールアミドの非経口投与、グリセリンの経口投与またはマニトールの静脈投与、ならびにピロカルピンおよび場合によってはチモロールの局所投与による治療が行われる。急性発作を管理した後に、手術によって解剖学的問題を除去することができる。
二次緑内障は、別の眼球疾患の結果として生じる。例えば、水晶体の腫脹、隅角構造における血管新生（新たな血管の形成）、慢性炎症あるいは隅角構造に対する重度の鈍的外傷がある。二次水晶体誘発緑内障の治療は、水晶体の外科的除去である。他のほとんどの二次緑内障は、一次開放隅角緑内障と同様に内科的に管理される。血管新生性緑内障は治療が困難であるが、レーザ光凝固術によって改善することができる。
緑内障などの状態に関連する網膜神経節細胞損傷の治療に有用な方法および治療用組成物が常に望まれている。そのような方法および治療用組成物は理想的には、進行性損傷から網膜神経節細胞および視神経を保護し、損傷を受けたニューロンの生存または再生を促進し、しかも重度の有害な副作用を起こさないものであると考えられる。
発明の概要
本発明は、治療上有効な量の膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）蛋白産生物を投与することで、網膜神経節細胞の損傷または変性を治療する方法を提供するものである。本発明の一つの具体的な態様によれば、治療上有効量のＧＤＮＦ蛋白産生物を投与することで緑内障を治療する方法が提供される。別の態様では、緑内障、乳頭浮腫、乳頭炎および虚血などの視神経頭部に影響を与える状態による視神経の損傷または変性を治療する方法が提供される。治療上有効な量のＧＤＮＦ蛋白産生物を投与することで、視神経を形成している網膜神経節細胞軸索の生存または再生を促進する。そのようなＧＤＮＦ蛋白産生物には、配列番号１で示したアミノ酸配列によって描かれるものなどのＧＤＮＦ蛋白、ならびにそれの変異体および誘導体などがあることが想到される。本発明は、網膜神経節細胞が選択的にＧＤＮＦ蛋白産生物を取り込み、その蛋白を逆行輸送し、しかもＧＤＮＦがin vitroで網膜神経節細胞の生存を促進するという発見、ならびにＧＤＮＦがin vivoで損傷を受けた網膜神経節細胞、すなわち緑内障で損傷を受けたニューロンの主要部分の生存を促進するという発見に基づいたものである。
本発明によると、ＧＤＮＦ蛋白産生物は、用量範囲約１μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、代表的には約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２５ｍｇ／ｋｇ／日、通常は約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日で非経口的に投与することができる。さらに、個々の患者のニーズ及び投与経路に応じて、ＧＤＮＦ蛋白産生物を、毎日ではなく週１回または週数回という比較的低頻度で投与できることも想到される。さらに、ＧＤＮＦ蛋白産生物を直接眼内に投与できることも想到される。当業者であれば、そのような眼内投与を行うことで、比較的少量のＧＤＮＦ蛋白産生物を、例えば単回注射または連続注射で約１μｇ／眼球〜約１ｍｇ／眼球の範囲の眼内用量で用いることができることは明らかであろう。さらに、ＧＤＮＦ蛋白産生物を、有効量の第２の緑内障治療薬と併用であるいは同時に投与することも想到される。
本発明はさらに、緑内障治療を含めた網膜神経節細胞の損傷または変性の治療用の薬剤または医薬用組成物の製造におけるＧＤＮＦ蛋白産生物の使用を提供するものでもある。そのような医薬組成物には、局所、経口または非経口投与用のＧＤＮＦ蛋白産生物製剤などがある。当業者には、投与プロセスは、以下に後述するように、細胞療法および遺伝子療法を介して行うことができることも明らかであろう。本発明の現在好ましい実施態様について記載した以下の発明の詳細な説明を検討することで、当業者には、本発明の多くの別の態様および利点が明らかになる。
発明の詳細な説明
本発明は、治療上有効な量の膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）蛋白産生物を投与することで、網膜神経節細胞の損傷または変性を治療する方法を提供するものである。本発明の１態様によれば、医薬組成物、ＧＤＮＦ発現細胞の植え込み（implant）またはＧＤＮＦ遺伝子療法を用いた治療上有効量のＧＤＮＦ蛋白産生物の投与によって、緑内障が原因の網膜神経節細胞変性を治療する方法が提供される。本発明は、配列番号１で示したアミノ酸配列によって示されるＧＤＮＦ蛋白ならびにそれの変異体および誘導体を含めた生理活性ＧＤＮＦ蛋白産生物を用いて実施することができる。ＧＤＮＦ蛋白産生物の経口投与、非経口投与または局所投与に加えて、細胞療法および遺伝子療法を介しての投与が想到される。
本発明は、ＧＤＮＦが培養において網膜神経節細胞の生存を促進するという発見、ならびに網膜神経節細胞が選択的にＧＤＮＦを取り込み、それを受容体特異的な形で逆行輸送するという発見に基づいたものである。そして、ＧＤＮＦがこれらニューロンの発達、生存および機能維持において何らかの役割を果たすことが明らかになった。さらに本発明は、ＧＤＮＦ蛋白産生物が、損傷を受けた網膜神経節細胞、すなわち緑内障で損傷を受けたニューロンの主要部分を占める細胞のin vivoでの生存を増加させるという発見に基づいたものである。外因性ＧＤＮＦ蛋白産生物を投与することで、外傷性損傷あるいは軸索から細胞体への神経栄養因子の輸送中断によって生じる神経栄養因子欠乏が原因で生じる損傷から網膜神経節細胞が保護されることが予想される。そのような治療によって網膜神経節細胞は、その処置を行わなければ緑内障その他の視神経疾患を起こす可能性のある眼圧、血管栄養不足その他の環境による間歇的傷害に対して耐容することができ、しかも視神経の機能的完全性を保守することができると予想される。
本発明によると、ＧＤＮＦ蛋白産生物は、用量範囲約１μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、代表的には約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２５ｍｇ／ｋｇ／日、通常は約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日で非経口的に投与することができる。ＧＤＮＦ蛋白産生物を、直接眼内に投与することができる。そのような場合、比較的少量のＧＤＮＦ蛋白産生物を、例えば単回注射または連続注射で約１μｇ／眼球〜約１ｍｇ／眼球の範囲で投与できる。ＧＤＮＦはさらに、光受容器層と網膜色素（pigmentosa）上皮層との間の網膜下空間に投与することもできる。さらに、ＧＤＮＦ蛋白産生物を、有効量の緑内障治療用の第２の治療薬とともに投与できることも想到される。そのような第２の薬剤としては例えば、副交感神経興奮薬（ピロカルピンおよびカルバコール）、β−アドレナリン遮断薬（チモロール）、交感神経興奮剤（エピネフリン）、間接的副交感神経興奮薬（エコチオフェート）および炭酸脱水素酵素阻害薬（アセタゾラミドおよびメタゾラミド）などが考えられる。本発明はさらに、緑内障治療を含めた網膜神経節細胞の損傷または変性の治療用の薬剤の製造におけるＧＤＮＦ蛋白産生物の使用を提供するものでもある。以下に、各種医薬製剤および各種投与方法についてさらに詳細に説明する。
本明細書で使用する場合、「ＧＤＮＦ蛋白産生物」という用語は、精製した天然、合成もしくは組換え膠細胞系由来神経栄養因子、生理活性なＧＤＮＦ変異体（挿入変異体、置換変異体および欠質変異体など）、ならびにそれらの化学修飾誘導体などがある。さらに、配列番号１に示したアミノ酸配列を有するヒトＧＤＮＦと実質的に相同であるＧＤＮＦも含まれる。ＧＤＮＦ蛋白産生物は、その生理活性型では、ホモダイマーやヘテロダイマーとして存在する場合もある。
本明細書で使用される場合の「生理活性」という用語は、ＧＤＮＦ蛋白産生物が、配列番号１に示したアミノ酸配列を有するＧＤＮＦと類似の神経栄養的性質を示すが、同一の性質を必ずしも全て示すとは限らず、程度も必ずしも同じではないことを意味している。対象とする特定の神経栄養的性質の選択は、ＧＤＮＦ蛋白産生物の投与を行う用途によって決まる。
本明細書で使用される「実質的に相同」という用語は、配列番号１で示したアミノ酸配列を有するＧＤＮＦと、好ましくは７０％超、最も好ましくは８０％超、さらに好ましくは９０％または９５％超という相同性を有することを意味している。例えば、ラット蛋白とヒト蛋白の間の相同性は約９３％であり、好ましい哺乳動物ＧＤＮＦは同様に高い相同性を有することが想到される。本明細書に記載の相同パーセントは、アミノ酸１００個の長さに４個のギャップを導入して整列しやすくした場合に、比較対象の配列において同一のアミノ酸残基が並ぶ２個の配列中の短い方の配列で認められるアミノ酸残基のパーセントとして計算される（Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol.5, p.124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C.（1972）に記載のもの。該文献は参照によって本明細書に含まれるものとする）。配列番号１のＧＤＮＦに対する抗体との交差反応性によって単離することができるか、あるいは配列番号１のＧＤＮＦをコードする遺伝子またはその遺伝子の断片とのハイブリッド形成によって遺伝子が単離できるＧＤＮＦ蛋白産生物も実質的に相同のものに含まれる。
本発明によるＧＤＮＦ蛋白産生物は、当業者には公知の手段によって単離または生成することができる。本発明で有用なＧＤＮＦ蛋白産生物を生成する方法の例としては、１９９４年５月２３日出願の米国特許出願０８／１８２１８３号およびそれの親出願；ＷＯ９３／０６１１６号として公開された１９９２年９月１７日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０７８８８号（Lin et al., Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture）；ＥＰ６１０２５４号として公開された欧州特許出願９２９２１０２２．７号；１９９５年９月２８日出願の共有で同時係属中の米国特許出願０８／５３５６８１号（「Truncated Glial Cell-Line Derived Neurotrophic Factor」）に記載のものなどがあり、これらは参照によって本明細書に含まれるものとする。
天然ＧＤＮＦ蛋白産生物は、哺乳動物ニューロン細胞調製物
あるいはＧＤＮＦを分泌もしくは発現する哺乳動物細胞系から単離することができる。例えばＷＯ９３／０６１１６号には、Ｂ４９神経膠芽細胞腫細胞の血清を含まない成長調整培地からのＧＤＮＦの単離が記載されている。ＧＤＮＦ蛋白産生物は、当業者には公知の手段によって化学的に合成することもできる。組換え法によると、比較的高純度で比較的多量の蛋白を得ることができることから、ＧＤＮＦ蛋白産生物は好ましくは組換え法によって製造する。組換え型のＧＤＮＦ蛋白産生物には、糖付加および非糖付加型の蛋白、ならびに細菌、哺乳動物または昆虫の細胞系で発現される蛋白などがある。
一般に組換え法には、ＧＤＮＦをコードする遺伝子の単離；好適なベクターおよび細胞種へのその遺伝子のクローニング；必要に応じた遺伝子の修飾による所望の変異体のコード；遺伝子発現によるＧＤＮＦ蛋白産生物の生成が関与する。別法として、所望のＧＤＮＦ蛋白産生物をコードするヌクレオチド配列を化学的に合成することができる。ＧＤＮＦ蛋白産生物は、遺伝暗号の縮退または対立遺伝子変種のためにコドン使用において異なるヌクレオチド配列を使用することで発現させ得ることが想到される。ＷＯ９３／０６１１６号には、ラットＧＤＮＦ遺伝子のｃＤＮＡクローンの単離および配列決定、ならびにヒトＧＤＮＦ遺伝子のゲノムＤＮＡクローンの単離、配列決定および発現が記載されている。ＷＯ９３／０６１１６号にはさらに、ＧＤＮＦ蛋白産生物の発現のためのベクター、宿主細胞および培養成長条件につても記載されている。大腸菌におけるＧＤＮＦ蛋白産生物の発現に好適な別のベクターが、１９９１年４月２４日公開の欧州特許出願ＥＰ０４２３９８０号（「Stem Cell Factor」）（引用によって本明細書に含まれるものとする）に開示されている。成熟ヒトＧＤＮＦをコードする遺伝子のＤＮＡ配列およびそのＧＤＮＦのアミノ酸配列が、ＷＯ９３／０６１１６号の図１９（配列番号５）に示してある。図１９には、ＧＤＮＦのプレ−プロ部分の全コード配列は示されていないが、ヒトプレ−プロＧＤＮＦの最初の５０個のアミノ酸がＷＯ９３／０６１１６号の図２２（配列番号８）に示してある。
天然ＧＤＮＦは、その生理活性型ではジスルフィド結合ダイマーである。細菌系での発現後に単離されたものは実質的に生理活性を持たず、モノマーとして存在する。生理活性ジスルフィド結合ダイマーを得るには、リフォールディングが必要である。細菌系で発現されたＧＤＮＦのリフォールディングおよび天然化（naturation）の方法がＷＯ９３／０６１１６号に記載されている。ＧＤＮＦ活性を測定するための標準的なin vitroアッセイが、ＷＯ９３／０６１１６号ならびに１９９５年９月２８日出願の共有かつ同時係属出願の米国特許出願０８／５３５６８１号に記載されている（これらは引用によって本明細書に含まれるものとする）。
Ａ．ＧＤＮＦ変異体
本明細書で使用される「ＧＤＮＦ変異体」という用語は、天然ＧＤＮＦのアミノ酸配列中の残基からアミノ酸が欠失したポリペプチド（「欠失変異体」）、該残基にアミノ酸が挿入されたポリペプチド（「付加変異体」）または該残基でアミノ酸が置換しているポリペプチド（「置換変異体」）を含むものである。そのような変異体は、そのポリペプチドをコードするＤＮＡへ適切なヌクレオチド修飾を組み込むことで、あるいは所望のポリペプチドのin vitroでの化学合成によって得られる。当業者であれば、最終的な分子がＧＤＮＦ生理活性を持つのであれば、欠失、挿入および置換の多くの組み合わせが可能であることは明らかであろう。
１以上の特定のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失に対する突然変異誘発法が、当業者には公知である（例：米国特許４５１８５８４号；引用によって本明細書に含まれるものとする）。変異体の構築には、突然変異部位の位置と突然変異の性質という２つの主要な変数がある。ＧＤＮＦ変異体を形成する場合、突然変異部位と突然変異の性質の選択は、修飾すべきＧＤＮＦ特性によって決まる。突然変異の部位は、個別にあるいは連続的に、例えば（１）最初に保存的なアミノ酸選択によって置換を行い、次に得られた結果に応じて、よりラジカルな選択によって置換を行うか、（２）標的アミノ酸残基の欠失を行うか、あるいは（３）指定部位に隣接してアミノ酸残基を挿入することで修飾することができる。１〜２０個のアミノ酸での保存的修飾が好ましい。所望のＧＤＮＦ蛋白産生物のアミノ酸配列が決定されたら、蛋白の発現に使用する核酸配列は容易に決定される。Ｎ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体を蛋白分解酵素によって得ることもできる。
ＧＤＮＦ欠失変異体の場合、欠失は一般に、約１〜３０個の残基、より普通には約１〜１０個の残基、代表的には約１〜５個の隣接する残基である。Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失および内部の配列内欠失が想到される。他のＴＧＦ−βスーパーファミリーのものとの相同性が低い領域に欠失を導入して、ＧＤＮＦの活性を修飾することができる。他のＴＧＦ−βスーパーファミリー配列と実質的に相同である領域での欠失は、より大幅にＧＤＮＦ生理活性を変える可能性が高い。連続欠失の数を選択することで、システイン架橋などの影響を受けるドメインにおけるＧＤＮＦ蛋白産生物の三次構造が維持される。欠失変異体の例としては、１９９５年９月２８日出願の共有で同時係属中の米国特許出願０８／５３５６８１号（引用によって本明細書に含まれるものとする）に記載のようなＧＤＮＦの１〜４０個のＮ末端アミノ酸を持たない切断（truncated）ＧＤＮＦ蛋白産生物；ＧＤＮＦのＣ末端残基を持たない変異体；あるいはそれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。
ＧＤＮＦ付加変異体の場合、アミノ酸配列の付加には代表的には、１個の残基から１００個以上の残基を有するポリペプチドまでの範囲の長さのＮおよび／またはＣ末端融合、ならびに１個または複数のアミノ酸残基の内部配列内付加などがある。内部付加は、約１〜１０個の残基、より代表的には約１〜５個の残基、通常は約１〜３個のアミノ酸残基があり得る。Ｎ末端付加変異体の例としては、［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦと称されるＮ末端メチオニン残基を有するＧＤＮＦ（細菌組換え細胞培養でのＧＤＮＦの直接発現のアーチファクト）ならびに組換え宿主細胞からの成熟ＧＤＮＦの分泌を促進するための、ＧＤＮＦのＮ末端への異種Ｎ末端シグナル配列の融合などがある。そのようなシグナル配列は、所定の宿主細胞種から得られることから、それと相同性である。他の神経栄養因子の配列由来のアミノ酸配列の付加などもあり得る。本発明による使用において好ましいＧＤＮＦ蛋白産生物は組換えヒト［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦである。ＧＤＮＦ置換変異体では、ＧＤＮＦアミノ酸配列の１以上のアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されている。そのような置換変異体には、１個のアミノ酸変化を生じる場合と生じない場合のある生物群における自然のヌクレオチド配列変化を特徴とする対立遺伝子変異体などがある。置換変異体の例としては、１９９５年９月２８日出願の共有で同時係属中の米国特許出願０８／５３５６８１号（引用によって本明細書に含まれるものとする）に開示のものがある（例：配列番号５０）。
ＧＤＮＦアミノ酸配列の特異的突然変異には、糖付加部位への修飾が関与する場合がある（例：セリン、トレオニンまたはアスパラギン）。糖付加の不在またはごく一部の糖付加は、アスパラギン連結糖付加認識部位あるいはＯ−連結炭水化物付加によって修飾された分子のいずれかの部位でのアミノ酸の置換または欠失によって生じる。アスパラギン連結糖付加認識部位は、適切な細胞糖付加酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列を有する。そのトリペプチド配列は、Ａｓｎ−Ｘａａ−ＴｈｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒのいずれかであり、その場合ＸａａはＰｒｏ以外のアミノ酸である。糖付加認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方での各種のアミノ酸置換または欠失（および／または第２位置でのアミノ酸欠失）により、修飾トリペプチド配列での非糖付加が生じる。そうして、適切に変化させたヌクレオチド配列の発現によって、その部位で糖付加していない変種が得られる。別法として、ＧＤＮＦアミノ酸配列を変えることで、糖付加部位を加えることができる。
突然変異誘発のためのＧＤＮＦアミノ酸残基または領域を確認するための一つの方法は、カニンガムらの報告に記載の「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれるものである（Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085, 1989）。この方法では、中性または負電荷を持つアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）によって、アミノ酸残基または標的残基群（例：Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの電荷を持つ残基）が確認・置換されて、細胞内外の周囲の水性環境とそれらアミノ酸との相互作用に影響を与える。次に、置換部位に追加の残基または別の残基を導入することで、置換基に対する官能基的感受性を示すそれらのドメインを強化する。そうして、アミノ酸配列変化を導入するための標的部位を決定し、ＤＮＡ配列の相当する標的コドンまたは領域についてアラニン走査または無作為突然変異誘発を行い、発現されたＧＤＮＦ変異体を、所望の活性および活性度の最適な組み合わせについてスクリーニングする。
置換突然変異誘発に関して最も興味深い部位には、各種生物からのＧＤＮＦ蛋白で認められるアミノ酸が、側鎖の大きさ、電荷および／または疎水性に関してかなり異なる部位などがある。他の興味深い部位としては、各種動物から得られたＧＤＮＦ様蛋白の特定の残基が同一である部位である。そのような位置は一般に、蛋白の生理活性にとって重要である。最初に、これらの部位を比較的保存的な方法で置換する。そのような保存的置換を、好ましい置換という見出しの下に表１に示してある。そのような置換によって生理活性の変化が生じる場合、より大幅な変化（置換例）を導入するか、又は他の付加若しくは欠失を行うことができ、得られる生成物について活性のスクリーニングを行う。
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アミノ酸配列に対する保存的修飾（およびコード核酸配列に対応する修飾）は、天然のＧＤＮＦのものと類似の機能的・化学的特性を有するＧＤＮＦ蛋白産生物を生成すると予想される。それとは対照的に、ＧＤＮＦ蛋白産生物の機能的および／または化学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えばシート状またはらせん状コンホメーションとしての置換領域におけるポリペプチド骨格鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の大きさの維持に対する効果において大きく異なる置換を選択することで行うことができる。天然の残基は、一般的な側鎖性質に基づいて以下のように群分けされる。
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
非保存的置換では、これら分類のある群のものを別のものに交換する場合がある。そのような被置換残基は、他のＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白と相同性であるＧＤＮＦ蛋白の領域あるいはその分子の非相同性領域に導入することができる。
Ｂ．ＧＤＮＦ誘導体
ＧＤＮＦまたはＧＤＮＦ変異体の化学修飾誘導体は、本明細書の開示を考慮して、当業者であれば製造することができる。誘導体化に最も好適な化学部分には、水溶性ポリマーなどがある。水溶性ポリマーは、それが付着している蛋白が生理的環境などの水系環境で沈殿しないことから望ましい。好ましくはそのポリマーは、治療薬または治療用組成物の製造において医薬的に許容されるものである。当業者であれば、ポリマー／蛋白接合体が治療に使用可能か否か、そして使用可能であれば望ましい用量、循環時間、蛋白分解に対する耐性および他の検討事項などの検討事項に基づいて望ましいポリマーを選択することができる。誘導体化の有効性は、望ましい剤型で（すなわち、浸透ポンプにより、あるいはより好ましくは注射もしくは注入により、さらには経口投与、肺投与その他の投与経路用に製剤されたものにより）誘導体を投与し、その有効性を測定することで確認することができる。
好適な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミン酸類（ホモポリマーまたはランダム共重合体）、ならびにデキストランもしくはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイド共重合体、ポリオキシエチル化多価アルコール類（例：グリセリン）、ポリビニルアルコールならびにそれらの混合物があるが、これらに限定されるものではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であることから、製造において有利であると考えられる。
ポリマーの分子量に制限はなく、分岐であっても直鎖であっても良い。ポリエチレングリコールの場合、好ましい分子量は、取り扱いやすさおよび製造しやすさから、約２kDa〜約１００ｋＤａの範囲である（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製において、一部の分子の分子量が指定の分子量より大きく、一部の分子ではそれより小さかったりすることを示している）。所望の治療プロファイルに応じて（例：所望の徐放期間、生理活性がある場合はその生理活性に対する効果、取り扱いやすさ、抗原性の程度もしくはその欠如、ならびに治療効果のある蛋白もしくは変異体に対するポリエチレングリコールの他の既知の効果）、それ以外の大きさのものを用いることができる。
そうして付着するポリマー分子の数は多様であることができ、当業者であれば、機能上の効果を確認することができる。モノ誘導体化を行うことができたり、あるいは同一もしくは異なる化学部分によって、ジ、トリ、テトラまたは数個の組み合わせの誘導体化を行うことが可能である（例：分子量の異なるポリエチレングリコール類などのポリマー）。蛋白（もしくはペプチド）分子に対するポリマー分子の割合は、それらの反応混合物中での濃度同様に変動するものである。一般に、所望の誘導体化程度（例：モノ、ジ、トリなど）、選択されるポリマーの分子量、そのポリマーが分岐であるか直鎖であるか、反応条件などの因子によって、至適比率（過剰の未反応の蛋白やポリマーがない反応の効率に関して）を決定する。
ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）は、蛋白の機能性または抗原性ドメインに対する効果を考慮して蛋白に付着させなければならない。当業者が使用可能な付着方法が多くある。例えば、ＥＰ０４０１３８４号（引用によって本明細書に含まれるものとする）（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへの結合）、マリクらの報告（Malik et al., Exp.Hematol., 20:1028-1035, 1992；塩化トレシル（tresyl chloride）を用いるＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化について報告）などがある。例えばポリエチレングリコールは、遊離のアミノ基またはカルボキシル基などの反応性基を介してアミノ酸残基によって共有結合的に結合することができる。反応性基とは、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得る基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基などがあり得る。遊離カルボキシル基を有するものには、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基などがあり得る。ポリエチレングリコール分子を付着させるための反応性基として、メルカプト基を使用することもできる。治療のためには、Ｎ末端またはリジン基での付着などのアミノ基での付着が好ましい。受容体結合が望ましい場合、受容体結合にとって重要な残基での付着は避けるべきである。
特にＮ末端で化学修飾された蛋白が望ましい場合がある。本発明の組成物を説明する上でポリエチレングリコールを用いる場合、各種のポリエチレン分子（分子量、分岐などによって）、反応混合物中の蛋白（もしくはペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の割合、実施するＰＥＧ化反応の種類、選択されるＮ末端ＰＥＧ化蛋白を得る方法から選択することができる。Ｎ末端ＰＥＧ化品を得る方法は（すなわち、必要に応じてこの部分を他のモノＰＥＧ化部分と分離する方法）、ＰＥＧ化蛋白分子群からのＮ末端ＰＥＧ化品の精製によるものである。選択的Ｎ末端化学修飾は、特定蛋白における誘導体化に使用可能な各種１級アミノ基（リジンとＮ末端）の反応性差を利用する還元的アルキル化によって行うことができる。適切な反応条件下で、含カルボニル基ポリマーによるＮ末端での蛋白の実質的に選択的な誘導体化を行う。例えば、リジン残基のｅ−アミノ基と蛋白のＮ末端残基のａ−アミノ基との間のｐＫａ差を利用できるｐＨで反応を行うことで、蛋白をＮ末端で選択的にＰＥＧ化することができる。そのような選択的誘導体化によって、蛋白への水溶性ポリマーの付着が調節され、ポリマーとの接合が蛋白のＮ末端で支配的に起こり、リジン側鎖アミノ基などの他の反応性基にはほとんど変化が起こらない。還元的アルキル化を用いると、水溶性ポリマーは上記の種類のものになると考えられ、蛋白への結合のための１個の反応性アルデヒドを有するはずである。１個の反応性アルデヒドを有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用することができる。
本発明は、１以上のポリエチレングリコール分子に連結した原核生物発現ＧＤＮＦである誘導体またはそれの変異体の使用、ならびアシル結合またはアルキル結合を介して１以上のポリエチレングリコール分子に付着したＧＤＮＦまたはそれの変異体の使用を想到するものである。
ＰＥＧ化は、当業界で公知のいずれかのＰＥＧ化反応によって行うことができる。それには各種文献がある（例：Focus on Growth Factors, 3（2）:4-10, 1992；EP 0154316号（引用によって本明細書に含まれるものとする）；EP 0401384号；ならびにＰＥＧ化に関連する本明細書で引用の他の刊行物）。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類縁の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行うことができる。
アシル化によるＰＥＧ化には通常、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体とＧＤＮＦ蛋白もしくは変異体との反応が関与する。公知の反応性ＰＥＧ分子または今後発見される反応性ＰＥＧ分子を用いて、ＧＤＮＦ蛋白または変異体のＰＥＧ化を行うことができる。好ましい活性化ＰＥＧエステルは、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドにエステル化したＰＥＧである。本明細書で使用する場合の「アシル化」とは、治療効果のある蛋白とＰＥＧなどの水溶性ポリマーとの間のアミド、カーバメート、ウレタンなどの形の連結（これらに限定されるものではないが）を含むものと理解される（Bioconjugate Chem., 5:133-140, 1994参照）。反応条件は、ＰＥＧ化分野で公知のものあるいは今後開発されるものから選択することができるが、修飾対象のＧＤＮＦまたは変異体を失活させると考えられる温度、溶媒およびｐＨの条件は回避しなければならない。
アシル化によるＰＥＧ化は、ポリＰＥＧ化ＧＤＮＦ蛋白または変異体を生じるのが一般的である。好ましくは、連結結合はアミドとする。さらに好ましくは、得られる生成物は、実質的にモノ、ジまたはトリＰＥＧ化したもののみとする（例：＞９５％）。しかしながら、使用される具体的反応条件に応じて、ＰＥＧ化度がそれより高い一部化学種数種が、いくらか形成される可能性がある。所望に応じて、特に透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび電気泳動などの標準的精製方法によって、混合物、特には未反応化学種から、より精製されたＰＥＧ化物を分離することができる。
アルキル化によるＰＥＧ化には、還元剤存在下でのＰＥＧの末端アルデヒド誘導体とＧＤＮＦ蛋白もしくは変異体との反応が関与する。アルキル化によるＰＥＧ化によっても、ポリＰＥＧ化ＧＤＮＦ蛋白もしくは変異体が得られる。さらに、反応条件を操作して、実質的にＧＤＮＦ蛋白もしくは変異体のＮ末端のａ−アミノ基のみでのＰＥＧ化を指向するようにすることができる（すなわち、モノＰＥＧ化蛋白）。モノＰＥＧ化またはポリＰＥＧ化のいずれの場合も、ＰＥＧ基は好ましくは、−ＣＨ2−ＮＨ−基を介して付着させる。−ＣＨ2−基について特に言及すれば、この種の連結を本明細書で「アルキル」連結と称する。
還元的アルキル化を介しての誘導体化によるモノＰＥＧ化生成物取得では、誘導体化に利用可能な各種１級アミノ基（リジンとＮ末端）の反応性の差を利用する。その反応は、リジン残基のｅ−アミノ基と蛋白のＮ末端残基のａ−アミノ基との間のｐＫａ差を利用できるｐＨで反応を行う。そのような選択的誘導体化によって、アルデヒドなどの反応性基を有する水溶性ポリマーの蛋白への付着が調節され、ポリマーとの接合が蛋白のＮ末端で支配的に起こり、リジン側鎖アミノ基などの他の反応性基にはほとんど変化が起こらない。重要な１態様では本発明は、モノポリマー／ＧＤＮＦ蛋白（または変異体）接合体分子の実質的に均質な製造物（すなわち、ポリマー分子が実質的に１ヶ所のみ（すなわち＞９５％）で付着しているＧＤＮＦ蛋白または変異体）の使用を想到するものである。より具体的には、ポリエチレングリコールを使用する場合、本発明は、抗原性となり得る連結基を持たず、ＧＤＮＦ蛋白もしくは変異体に直接結合したポリエチレングリコール分子を有するＰＥＧ化ＧＤＮＦ蛋白もしくは変異体の使用を含むものでもある。
そこで、本発明に従って使用されるＧＤＮＦ蛋白産生物には、ＰＥＧ基がアシル基もしくはアルキル基を介して付着したＰＥＧ化ＧＤＮＦ蛋白もしくは変異体などがあり得ることが想到される。前述のように、そのような生成物はモノＰＥＧ化またはポリＰＥＧ化されたものであることができる（例えば２，６−ＰＥＧ基および好ましくは２，５−ＰＥＧ基を含む）。ＰＥＧ基は、アミノ酸のａ−アミノ基またはｅ−アミノ基で蛋白に付着するが、好適な反応条件下にＰＥＧ基に付着するだけの反応性を有する蛋白に付着のアミノ基にＰＥＧ基を付着させ得ることも想到される。
アシル化法およびアルキル化法の両方で使用されるポリマー分子は、上記の水溶性ポリマーから選択することができる。選択されるポリマーは修飾して、アシル化用の活性エステルまたはアルキル化用のアルデヒドなどの１個の反応性基を有するようにして、好ましくは本発明の方法に対して提供されるように重合度を制御できるようにしなければならない。反応性ＰＥＧアルデヒドの例としては、水安定性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、あるいはそれのモノＣ1〜Ｃ10アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体がある（米国特許５２５２７１４号）。そのポリマーは分岐でも直鎖であっても良い。アシル化反応の場合、選択されるポリマーは、１個の反応性エステル基を持つものでなければならない。本発明での還元的アルキル化では、選択されるポリマーは、１個の反応性アルデヒド基を持つものでなければならない。天然のグリコシル残基は哺乳動物組換え発現系によって比較的容易に得られることから、水溶性ポリマーは天然グリコシル残基からは選択されない。そのポリマーの分子量については制限はなく、分岐または直鎖であることができる。
本発明での使用に特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。本明細書で使用する場合、ポリエチレングリコールとは、モノ−（Ｃ1〜Ｃ10）アルコキシまたはアリールオキシポリエチレングリコールなどの他の蛋白を誘導体化するのに使用されているいずれの形態のＰＥＧも含むものとする。
一般に、化学的誘導体化は、活性化ポリマー分子と生理活性物質とを反応させるのに使用される好適な条件下に実施することができる。ＰＥＧ化ＧＤＮＦ蛋白または変異体を製造する方法は、（ａ）ＧＤＮＦ蛋白もしくは変異体を、その蛋白が１以上のＰＥＧ基に付着する条件下にポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体など）と反応させる段階、ならびに（ｂ）反応生成物を得る段階とを有するものである。一般に、アシル化反応の最適反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて個別に決定される。例えば、ＰＥＧ：蛋白の比が大きいほど、ポリＰＥＧ化生成物のパーセントが高くなる。
還元的アルキル化によって実質的に均質なモノポリマー／ＧＤＮＦ蛋白（または変異体）接合体分子群を得る工程では、（ａ）ＧＤＮＦ蛋白または変異体のアミノ末端でのα−アミノ基の選択的修飾を可能とするのに好適なｐＨで、還元的アルキル下条件下に、ＧＤＮＦ蛋白または変異体を反応性ＰＥＧ分子と反応させる段階、ならびに（ｂ）反応生成物を得る段階がある。
モノポリマー／ＧＤＮＦ蛋白（または変異体）接合体分子の実質的に均質な群の場合、還元的アルキル化反応条件は、水溶性ポリマー部分のＧＤＮＦ蛋白もしくは変異体のＮ末端への選択的付着を可能とする条件である。そのような反応条件は通常、リジンアミノ基とＮ末端のα−アミノ基の間でｐＫａ差を与える（ｐＫａとは、アミノ酸の５０％がプロトン化され、５０％がプロトン化されないｐＨである）。ｐＨはさらに、使用されるポリマー／蛋白比にも影響を与える。一般に、ｐＨが低いと、蛋白に対してより過剰のポリマーを使用することが望ましい（すなわち、Ｎ末端α−アミノ基の反応性が低いと、至適条件を得るのに必要なポリマーの量が増える）。ｐＨが高いと、ポリマー：蛋白比は大きくする必要はない（すなわち、より多くの反応性基が使用可能となることから、必要なポリマー分子が少なくなる）。本発明においては、ｐＨは通常３〜９の範囲、好ましくは３〜６の範囲となる。
別の重要な検討事項はポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が大きくなるほど、蛋白に付着し得るポリマー分子は減少する。同様に、それらのパラメータを至適化する場合には、ポリマーの分岐を考慮しなければならない。一般に、分子量が大きいほど（あるいは分岐が多いほど）、ポリマー：蛋白比は大きくなる。一般に、本発明で想到されるＰＥＧ化反応の場合、好ましい平均分子量は約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである。好ましい平均分子量は約５ｋＤａから約５０ｋＤａであり、特に好ましくは約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａである。水溶性ポリマー／ＧＤＮＦ蛋白もしくは変異体の比は１：１〜１００：１の範囲であり、好ましくは（ポリＰＥＧ化の場合）１：１〜２０：１および（モノＰＥＧ化の場合）１：１〜５：１である。
上記で示した条件を用いると、還元的アルキル化によって、アミノ末端にα−アミノ基を有するＧＤＮＦ蛋白もしくは変異体に対するポリマーの選択的付着、ならびにモノポリマー／ＧＤＮＦ蛋白（もしくは変異体）接合体の実質的に均質なものが得られる。「モノポリマー／ＧＤＮＦ蛋白（もしくは変異体）接合体」という用語は本明細書では、ＧＤＮＦ蛋白またはＧＤＮＦ変異体蛋白の分子に付着した１個のポリマー分子を含む組成物を意味するものとして用いられる。モノポリマー／ＧＤＮＦ蛋白（もしくは変異体）接合体は好ましくは、リジンアミノ側鎖基にではなく、Ｎ末端に位置するポリマー分子を有する。その製造物は好ましくは、モノポリマー／ＧＤＮＦ蛋白（もしくは変異体）接合体が９０％超、より好ましくはモノポリマー／ＧＤＮＦ蛋白（もしくは変異体）接合体が９５％超であり、残りの観察される分子は未反応物である（すなわち、ポリマー部分のない蛋白）。
本発明における還元的アルキル化では、還元剤は水溶液中で安定であり、好ましくは還元的アルキル化の初期の工程で生成するシッフ塩基のみを還元できるものでなければならない。好ましい還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボランおよびピリジンボランから選択することができる。特に好ましい還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウムである。溶媒、反応時間、温度などの他の反応パラメータならびに生成物の精製手段は、水溶性ポリマーによる蛋白の誘導体化に関係する発表データに基づいて個別に決定することができる（本明細書に引用の刊行物参照）。
Ｃ．ＧＤＮＦ蛋白産生物医薬組成物
ＧＤＮＦ蛋白産生物医薬組成物は代表的には、治療上有用量のＧＤＮＦ蛋白産生物を１以上の医薬的および生理的に許容される製剤材料との混合で含有する。好適な製剤材料には、酸化防止剤、保存剤、着色剤、芳香剤および希釈剤、乳化剤、懸濁剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝剤、放出ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬補助剤などがあるが、これらに限定されるものではない。例えば、好適なビヒクルには、注射用水、生理食塩水または人工ＣＳＦなどが挙げられるが、これらには非経口投与用の組成物に一般的な他の材料を補充することもできる。さらに別の例としては、中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水がある。
ビヒクル中の主要な溶媒は、性質上水系または非水系であることができる。さらにビヒクルは、製剤のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄度、色、無菌性、安定性、溶解速度または臭気を調整または維持するための医薬的に許容される他の賦形剤を含有していても良い。同様にビヒクルは、ＧＤＮＦ蛋白産生物の放出速度を調整または維持したり、あるいは眼球の膜を通ってのＧＤＮＦ蛋白産生物の吸収もしくは浸透を促進するためのさらに他の医薬的に許容される賦形剤を含有することができる。そのような賦形剤は、単位用量または複数用量製剤での非経口投与剤を製剤するのに一般的かつ慣例的に使用される物質である。
治療用組成物を製剤したら、それを液剤、懸濁液、ゲル、乳剤、固体剤または脱水もしくは凍結乾燥粉剤として無菌瓶に保管することができる。そのような製剤は、そのまま使用できる形で、あるいは例えば凍結乾燥品などの投与に先だって再生する必要のある形態で保存することができる。
最適な医薬製剤は、投与経路および所望の用量などの検討事項に応じて当業者が決定する（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, pp.1435-1712参照；これは引用によって本明細書に含まれるものとする）。そのような製剤は、本発明のＧＤＮＦ蛋白、変異体および誘導体の物理的状態、安定性、in vivoでの放出速度およびin vivoでのクリアランス速度に影響を与える場合がある。
非経口徐放製剤、吸入薬ミストまたは経口活性製剤などの他の有効な投与製剤も含まれる。例えば、持続性放出製剤では、ＧＤＮＦ蛋白産生物をポリマー化合物（ポリ酢酸、ポリグリコール酸など）またはリポソームの粒子状製剤に結合させるか組み込むことができる。ヒアルロン酸も使用することができ、循環系における持続期間を促進する効果を有する場合がある。ＧＤＮＦ蛋白産生物医薬組成物はさらに、例えば眼内注入または注射によって非経口投与用に製剤することができ、徐放性または持続性の循環製剤などもあり得る。そのような非経口投与治療組成物は代表的には、医薬的に許容されるビヒクルに入ったＧＤＮＦ蛋白産生物を含む発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形である。一つの好ましいビヒクルは、無菌蒸留水である。
ＧＤＮＦ蛋白産生物を含むある種の製剤は経口投与するものであることも想到される。その形で投与されるＧＤＮＦ蛋白産生物はカプセル剤とすることができ、固体製剤の配合で一般に使用される担体を含んでまたは含まずに製剤できる。そのカプセルは、生物学的利用能が最大となり、前全身分解がわずかである時点で消化管の所定の箇所で製剤の活性部分を放出するよう設計することができる。別の賦形剤を含有させて、ＧＤＮＦ蛋白産生物の吸収を促進することができる。希釈剤、芳香剤、低融点ロウ、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤を用いることもできる。
点眼液、懸濁液および軟膏などの局所眼科製剤が当業者には公知である（Remington's Phamaceutical Sciences, 18th Edition, Chapter 86, pp.1581-1592, Mack Publishing Company, 1990）。他の投与形態が利用でき、それには眼内注射（前眼房に直接または硝子室に直接注射することができる）、結膜下注射および眼球後注射などがあり、そのような形態の投与に好適な眼科製剤を製造するための方法および手段も公知である。
本願で使用する場合、「眼球外」という用語は、眼球表面および眼球と眼瞼の間の（外部）空間を指す。眼球外領域の例としては、眼瞼円蓋または盲嚢（cul-de-sac）、結膜表面および角膜表面などがある。その箇所はいずれの眼球組織にとっても外部であり、その領域の処置には侵襲的方法は必要ない。眼球外系の例としては、その領域に治療用物質を放出するために用いることができる挿入物ならびに「局所」投与点眼液、ゲルまたは軟膏などがある。眼球外医療機器は通常、患者によってさえ容易に取り外すことができる。
ヒグチら（Higuchi et al．）の米国特許３９８１３０３号、３９８６５１０号および３９９５６３５号（薬剤を含有する生物分解性眼球挿入物）には、眼球外領域に薬剤を投与するのに使用される眼球外系が開示されている。その挿入物は、眼球の盲嚢、すなわち眼球と眼瞼の間の眼球外空間で保持されるよう各種形状のものとすることができる。いくつかの一般的な生物適合性ポリマーが、その機器を製造する上で使用するのに好適なものとして開示されている。そのポリマーには、アルギン酸亜鉛、ポリ（乳酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（無水物）およびポリ（グリコール酸）などがある。上記の特許ではさらに、薬剤への浸透が少ない膜コーティング機器および製剤を保持する中空室についても記載されている。
米国特許４２１７８９８号（Theeuwes）には、薬剤の徐放投与に使用される微孔性貯液物が開示されている。この機器は、眼球盲嚢に眼球外で取り付けられる。興味深いポリマー系には、ポリ（塩化ビニル）−コポリ（酢酸ビニル）共重合体がある。カウフマン（Kaufman）は、米国特許４８６５８４６号および４８８２１５０号において、結膜嚢用の少くとも１つ以上の生物侵食性材料または軟膏担体を含む眼球薬放出系を開示している。その特許には、好適な放出系として、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ビニルアルコール）および架橋コラーゲンなどのポリマー系が開示されている。
網膜の疾患または損傷の治療におけるＧＤＮＦ蛋白産生物の本明細書に記載の使用においては、局所投与用眼科製剤に、眼球への治療薬の浸透または輸送を促進する薬剤を含有させることも有利である。そのような薬剤は当業界では公知である。例えば米国特許５２２１６９６号（Ke et al.）は、角膜を通っての眼科製剤の浸透を促進する材料の使用を開示している。
眼内系とは、眼球自体の組織層内、その間あるいはその周囲におけるいずれの組織区画での使用にも好適な系である。そのような箇所には、結膜下（眼球に隣接する眼球粘膜の下）、眼窩（眼球の背後）および眼房内（眼球自体の房内）などがある。眼球外系とは対照的に、この領域に処置を行うには、注射または植え込み（implant）からなる侵襲的方法が必要である。
以下の特許が、眼内機器を開示している。米国特許４８５３２２４号（Wong）には、眼房に投与するための微小カプセル封入薬剤が開示されている。この系で使用されるポリマーには、ポリエステルおよびポリエーテルがある。米国特許４８６３４５７号（Lee）には、治療薬の徐放のために手術によって眼内に植え込む生物分解性機器が開示されている。その機器は、結膜（眼球の粘膜）下へ手術によって植え込むものである。米国特許４１８８３７３号（Krezancaki）には、ヒトの体温でゲル化する医薬ビヒクルが開示されている。このビヒクルは薬剤およびガムまたはセルロース由来合成誘導体の水系懸濁液である。米国特許４４７４７５１号および４４７４７５２号（Haslam et al.）には、室温で液体で体温でゲル化するポリマー−薬剤系が開示されている。この系で使用される好適なポリマーには、ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンなどがある。米国特許５３８４３３３号（Davis et al．）には、長期薬剤放出を行う生物分解性注射薬放出ポリマーが開示されている。その薬剤組成物は、生物分解性ポリマー基体に医薬的に活性な薬剤を含ませたものであり、その場合ポリマー基体は２０℃〜３７℃の範囲の温度で固体であり、３８℃〜５２℃の範囲の温度で流動性である。その薬剤運搬ポリマーは、可溶性または液体の薬剤製剤の放出のみに限定されるものではない。例えば、そのポリマーを、薬剤を含むミクロスフェア、リポソームその他の粒子結合薬剤を注射部位で安定化および保持するための基材として使用することができる。
眼内注射に特に好適なビヒクルとしては無菌蒸留水があり、それでＧＤＮＦ蛋白産生物を適切に保存処理された無菌の等張液として製剤する。さらに別の眼科製剤では、蛋白の徐放または持続性放出を行う注射可能なミクロスフェアまたはリポソームなどの薬剤を用いてのＧＤＮＦ蛋白産生物の製剤を行うことができ、それを蓄積注射として投与する。ＧＤＮＦ蛋白産生物の眼内投与に好適な他の手段としては、ＧＤＮＦ蛋白産生物を含む植え込み可能な薬剤投与機器などがある。
本発明の眼科製剤、特に局所投与製剤には、例えば眼科的に許容される保存剤、等張化剤、共溶媒、湿展剤、錯化剤、緩衝剤、抗菌剤、酸化防止剤および界面活性剤などの当業界では公知の他の成分を含有させることができる。例えば好適な等張性促進剤には、アルカリ金属ハライド（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マニトール、ソルビトールなどがある。十分な等張性促進剤を加えることで、点眼する製剤が低張または実質的に等張となるようにすることが有利である。好適な保存剤には、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸などがあるが、これらに限定されるものではない。過酸化水素も、保存剤として使用することができる。好適な共溶媒には、グリセリン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなどがあるが、これらに限定されるものではない。好適な錯化剤には、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどがある。好適な界面活性剤または湿展剤には、ソルビタンエステル類、ポリソルベート８０などのポリソルベート類、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポールなどがあるが、これらに限定されるものではない。緩衝剤としては、ホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、重炭酸塩またはトリス−ＨＣｌなどの従来の緩衝剤を用いることができる。
これら製剤成分は、眼球外または眼内の投与部位に許容される濃度で存在させる。例えば、緩衝剤を用いて、組成物を生理的ｐＨまたはそれよりわずかに低いｐＨ、代表的には約５〜約８の範囲のｐＨに維持する。
別の製剤成分には、眼球外投与治療薬の長期眼球滞留を行うことで、局所接触を高め、吸収を促進する材料などがあり得る。好適な材料には、眼科製剤の粘度を上昇させるポリマーまたはゲル形成材料などがある。キトサンは、持続性液体眼科薬製剤における眼球放出速度調節剤として特に好適な材料である（米国５４２２１１６号；Yen et al．）。眼球での眼科治療薬の放出調節（例：持続性投与および長期投与）における本発明の製剤の好適性は、当業界で公知の各種方法によって決定することができる（例：Journal of Controlled Release, 6:367-373, 1987に記載の方法ならびにそれの変法）。
さらに別の眼科製剤では、有効量のＧＤＮＦ蛋白産生物を、錠剤の製造に好適な無毒性の眼科的に許容される賦形剤との混合物で用いることができる。無菌水その他の適切な媒体に錠剤を溶かすことで、眼科液剤を単位製剤にて得ることができる。好適な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、乳糖またはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；あるいはデンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの潤滑剤などがあるが、これらに限定されるものではない。
Ｄ．ＧＤＮＦ蛋白産生物の投与／放出
ＧＤＮＦ蛋白産生物は、皮下投与、筋肉投与、静脈投与、経肺投与、経皮投与、くも膜下投与または脳内投与によって非経口的に投与することができる。眼科的状態の治療の場合、ＧＤＮＦ蛋白産生物を、局所投与、挿入物、注射、インプラント、細胞療法または遺伝子療法によって、前述のように眼球外または眼球内に投与することができる。例えば、生物分解性ポリマー基体に包埋された神経栄養因子を含む徐放性インプラントは、ＧＤＮＦ蛋白産生物を放出することができる。ＧＤＮＦ蛋白産生物は、化学修飾または組み合わせた形で脳外で投与して、それが血液−脳関門を通過するようにできるか、あるいはＧＤＮＦ蛋白産生物による関門通過を促進する能力を有する１以上の薬剤とともにそれを投与することができる。同様に、ＧＤＮＦ蛋白産生物を眼内投与できるか、あるいはＧＤＮＦ蛋白産生物の眼球膜を通っての通過または輸送を促進する能力を有する１以上の薬剤と組み合わせて眼球外に投与することができる。投与の頻度は、製剤されたＧＤＮＦ蛋白産生物の薬物動態パラメータならびに投与経路によって決まる。
具体的な用量は、体重、体表面積または臓器の大きさを考慮して計算することができる。上記各製剤が関与する投与に適した用量を決定するのに必要な計算をさらに詳細に行うことは、当業者が通常行うことであり、特に本明細書に開示の用量データおよびアッセイを考慮すれば、通常行う業務の範囲内である。適切な用量−応答データとともに、使用用量を決定するための既存のアッセイを用いて、適切な用量を確認することができる。眼内投与製剤で使用される用量は、全身投与または経口投与で使用される用量と比較して非常に小さいことは、当業者には明らかであろう。
上記の状態の治療方法に関与する最終的な投与計画は、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、感染の重度、投与時間ならびに他の臨床的要素などの薬剤作用に影響を与える各種要素を考慮して、担当医が決定する。試験を行うことで、各種疾患および状態の治療に適した用量レベルに関してさらにデータが得られる。
ある種の治療には、ＧＤＮＦの連続投与または徐放が有利であることが考えられる。連続投与は注入ポンプなどの機械的手段を介して行うことができるが、連続投与またはほぼ連続投与の他の形態も想到される。例えば、化学的誘導体化またはカプセル封入によって、所定の投与法に基づいて、予想可能な量にて、連続的存在の効果を有する蛋白の持続製剤を得ることができる。そのように、ＧＤＮＦ蛋白産生物には、そのような連続投与を行うために、誘導体化その他の形で製剤された蛋白も含まれる。
ＧＤＮＦ蛋白産生物を産生する細胞の眼内植え込みなどのＧＤＮＦ蛋白産生物細胞療法も想到される。この実施態様では、生理活性型のＧＤＮＦ蛋白産生物を合成・分泌する能力を有する細胞を患者に植え込むものことになると考えられる。そのようなＧＤＮＦ蛋白産生物産生細胞には、ＧＤＮＦ蛋白産生物の天然産生体である細胞（Ｂ４９神経膠芽細胞腫細胞に類似のもの）や、あるいは発現および分泌を促進するのに好適なベクターで所望のＧＤＮＦ蛋白産生物をコードする遺伝子を形質転換することでＧＤＮＦ蛋白産生物を産生する能力が高められた組換え細胞などがあり得る。異種動物のＧＤＮＦ蛋白産生物投与を受ける患者における免疫反応の可能性を低下させるため、ＧＤＮＦ蛋白産生物を産生する天然細胞はヒト起源のものとし、ヒトＧＤＮＦ蛋白産生物を産生するようにすることが好ましい。同様に、ＧＤＮＦ蛋白産生物を産生する組換え細胞を、ヒトＧＤＮＦ蛋白産生物をコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換することが好ましい。移植細胞をカプセルに入れて、周囲組織の浸潤を回避することができる。ヒトまたはヒト以外の動物の細胞を、ＧＤＮＦ蛋白産生物の放出を行うことができるが患者の免疫系などの周囲組織からの他の有害要素によるその細胞の破壊を防止する生物適合性で半透性のポリマー性封入物または膜に入れて患者に植え込むことができる。そのような植え込みは例えば、強膜に付着させることで、硝子体液で直接ＧＤＮＦ蛋白産生物を産生・放出するようにすることができる。
患者自身の細胞をex vivoで形質転換することでＧＤＮＦ蛋白産生物を産生させ、カプセル封入せずに直接植え込むことも想到される。例えば、網膜ニューロンを摘出し、その細胞を適切なベクターとともに培養して形質転換し、患者の網膜に移植し戻して、そのニューロンがそこで所望のＧＤＮＦ蛋白またはＧＤＮＦ蛋白変異体を産生・放出するようにすることができる。
核酸構築物その他の適切な搬送ベクターの局部注射を行うことで、標的網膜細胞中にＧＤＮＦ蛋白産生物をコードする遺伝子を導入することによって、in vivoでのＧＤＮＦ蛋白産生物遺伝子療法も想到される（Hefti, J,Neurobiol., 25:1418-1435, 1994）。例えば、ＧＤＮＦ蛋白産生物をコードする核酸配列を、網膜細胞への搬送用のアデノ関連ウィルスベクターまたはアデノウィルスベクターに組み入れることができる。別のウィルスベクターには、レトロウィルスベクター、単純疱疹ウィルスベクターおよび乳頭腫ウィルスベクターなどがあるが、これらに限定されるものではない。リポソーム介在転写、直接注射（裸ＤＮＡ）、受容体介在転写（リガンド−ＤＮＡ複合体）、電気泳動、リン酸カルシウム沈殿または微粒子衝撃（遺伝子銃）によって、適宜にin vivoまたはex vivoでの物理的転写を行うことも可能である。
生存細胞の膜カプセル封入の方法は当業者には熟知されており、患者におけるカプセル封入細胞の製造およびそれの植え込みは必要以上の実験を行わずに行うことができる（例：米国特許４８９２５３８号、５０１１４７２号および５１０６６２７号；これらはそれぞれ、引用によって具体的に本明細書に含まれるものとする）。生存細胞をカプセル封入する系については、ＰＣＴ出願ＷＯ９１／１０４２５号（Aebischer et al.；引用によって具体的に本明細書に含まれるものとする）に記載されている（ＰＣＴ出願ＷＯ９１／１０４７０号（Aebischer et al.）；Winn et al., Exper.Neurol., 113:322-329, 1991；Aebischer et al., Exper.Neurol., 111:269-275, 1991；Tresco et al., ASAIO, 38:17-23, 1992も参照；これらはそれぞれ引用によって具体的に本明細書に含まれるものとする）。リポソーム担体、生物侵食性粒子またはビーズおよび蓄積注射などの他の各種持続性投与または徐放性投与手段を製剤する方法も、当業者には公知である。
本明細書に記載のＧＤＮＦ蛋白産生物製剤は、ヒトでの利用分野だけでなく獣医的利用分野でも使用可能であること、ならびに「患者」という用語は限定的に解釈されるべきではないことは留意すべき点である。獣医的利用分野では、用量範囲は上記のものと同様であるべきである。
本発明の他の態様および利点については、以下の説明のための実施例を考慮することで理解されよう。実施例１は、網膜神経節細胞組織培養系におけるＧＤＮＦ蛋白産生物投与の効果を扱うものである。実施例２は、受容体介在の形でＧＤＮＦ蛋白産生物と結合し、それを取り込み、逆行的に輸送することができるニューロン群について調べるための放射能標識ＧＤＮＦ蛋白産生物の使用を扱うものである。実施例３は、網膜神経節細胞損傷モデルにおけるＧＤＮＦ蛋白産生物投与の効果を取り扱うものである。網膜神経節細胞損傷試験の結果から、ＧＤＮＦ反応性であることがこれまで知られていなかったこのニューロン群について、ＧＤＮＦ蛋白産生物が神経栄養活性を有することがわかる。
実施例
実施例１
ＧＤＮＦ蛋白産生物によるin vitroでの網膜神経節細胞の生存および発達の促進
材料
以下の実施例で使用される材料は、次のように得たものである。
細胞培地
高グルコースダルベッコ調製イーグル培地（DMEM；#11965-092）、ハムのＦ１２培地（F12; #11765-021）、重炭酸ナトリウムを含まないライボビッツ（Leibovitz）のＬ１５培地（#41300-039）、Ｂ２７培地補給剤（#17504-010）、ペニシリン／ストレプトマイシン（#15070-014）、Ｌ−グルタミン（#25030-016）、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS；#14190-052）、カルシウム塩およびマグネシウム塩を加えたハンクス液（HBSS；#24020-026）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（HEPES；#15630-015）、マウスラミニン（#23017-015）、ウシ血清アルブミンおよび分画Ｖ（#110-18-017）はいずれも、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社から入手したものである（Grand Island, NY）。加熱失活ウマ血清は、ハイクローン社（HyClone, Logan ,Utah）から入手したものである。ポリ−Ｌ−オルニチン臭化水素酸塩（P-3655）、ウシインシュリン（I-5500）、ヒトトランスフェリン（T-2252）、プトレシン（P-6024）、プロゲステロン（P-6149）および亜セレン酸ナトリウム（S-9133）はいずれも、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company, Saint-Louis, MO）から入手したものである。パパイン・デオキシリボヌクレアーゼＩ（DNAase）および卵白アルブミン（パパイン解離系）は、ウォーシントン・バイオケミカル社（Worthington Biochemicals, Freehold, NJ）から入手した。ファルコン無菌９６ウェルマイクロプレート（#3072）、組織培養用プラスチック器具およびポリプロピレン製遠心管は、ベックトン−ディッキンソン社（Beckton-Dickinson, Oxnard, CA）から入手した。ナイテックス（Nitex）２０μｍナイロンメッシュ（#460）は、テトコ社（Tetko, Elmsford, NY）から入手した。４インチ解剖鉗子および４インチ剥離鋏は、ロボズ・サージカル社（Roboz Surgical, Washington, DC）から入手した。
抗体および関連の試薬
マウスＴｈｙ−１，２に対するマウス／ラットモノクローナル抗体はベーリンガー・マンハイム社（Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN）から入手した。ウサギポリクローナル抗ラットおよび抗マウスＩｇＧ抗体、ビオチン処理ウマ抗マウスＩｇＧおよびペルオキシダーゼ接合アビジン／ビオチン複合体（ABC Elite;キット PK-6100）は、ベクター・ラボラトリーズ社（Vector Laboratories, Burlingame, CA）から入手した。３’，３’−ジアミノベンジジンは、カッペル・ラボラトリーズ（Cappel Laboratories, West Chester, PA）から入手した。スーパーブロック（Superblock）遮断緩衝剤のＰＢＳ溶液（#37515）は、ピアス社（Pierce, Rockford, IL）から入手した。トリトンＸ−１００（X-100）、ノニデット（Nonidet）Ｐ−４０（N6507）および過酸化水素（３０％、容量基準；H1009）はシグマ社から入手した。他の試薬はいずれも、別段の断りがない限り、シグマ・ケミカル社（Saint-Louis,MO）から入手したものである。
方法
培地の調製
ＤＭＥＭおよびＦ１２培地の１：１混合物として基礎培地を調製し、５０倍濃縮ストック液として加えるＢ２７培地補給剤を補給した。Ｂ２７培地補給剤は、ビオチン、Ｌ−カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ（＋）−ガラクトース、還元グルタチオン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、酢酸レチニル、セレン、Ｔ３（トリヨード−１−チロニン、ＤＬ−α−トコフェロール；ビタミンＥ）、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、ウシ血清アルブミン、カタラーゼ、インシュリン、スーパーオキシド・ジスムターゼならびにトランスフェリンからなるものである。Ｌ−グルタミンを最終濃度約２ｍＭで加え、ペニシリンを約１００  ＩＵ／Ｌ、ストレプトマイシンを約１００ｍｇ／Ｌで加えた。加熱失活ウマ血清を最終濃度約２．５％で加え、Ｄ−グルコースを最終濃度約５ｇ／Ｌで加え、ＨＥＰＥＳ緩衝剤を最終濃度約２０ｍＭで加え、ウシインシュリンを最終濃度約２．５ｍｇ／ｍＬで加え、ヒトトランスフェリンを最終濃度約０．１ｍｇ／ｍＬで加えた。混和後、ｐＨを約７．３に調節し、培地を４℃に維持した。培地は使用直前に新鮮なものを調製して、実験間の変動を小さくした。調製全体を通じてプラスチックのピペットおよび容器を使用して、蛋白吸着を少なくした。
ＧＤＮＦ蛋白産生物溶液
精製ヒト組換えＧＤＮＦ蛋白産生物を、ウシ血清アルブミンを５％含有する濃度１ｍｇ／ｍＬのＤ−ＰＢＳ（蒸留水で調製したリン酸緩衝生理食塩水）溶液として調製した。得られた溶液は−８５℃で小分けして保存した。９６ウェルマイクロプレートで連続希釈液を調製した。１０倍濃縮ＧＤＮＦ蛋白産生物溶液１０μＬを、培地（９０μＬ）を含む細胞培地に加えた。対照培地には、アルブミンを５％含むＤ−ＰＢＳを加えた（１０μＬ）。細胞を接種してから１時間後にＧＤＮＦ蛋白産生物処理を行い、場合によっては２日おきにそれを繰り返した。
培養基層
基層への網膜神経節細胞の付着および神経突起伸長を最大とするために、以下に記載の手順に従ってポリ−Ｌ−オルニチンと次にラミニンによるその順序でのコーティングを行うことで、マイクロタイタープレート表面（培養基層）の修飾を行った。プレート表面を、濃度０．１ｍｇ／ｍＬのポリオルニチンの０．１Ｍホウ酸無菌溶液（ｐＨ８．４）で室温にて１時間以上完全に覆い、次にスーパー−Ｑ水（Super-Q water）を含む無菌洗浄液で覆った。洗浄水を吸引除去し、１μｇ／ｍＬのマウスラミニンのＰＢＳ溶液を加え、３７℃で２時間インキュベーションした。これらの手順は、プレート使用の直前に行って、結果の再現性を確保するようにした。
ラット網膜神経節細胞培養液の調製
７日齢のスプレーグ・ドーリーラット仔（Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maineから入手）を断頭によって屠殺し、眼球を無菌的に切除してＬ１５培地（重炭酸ナトリウムを含まない）に入れた。１回の実験当たり最大２４個の眼球を処理した。眼球は１／２に切開し、水晶体およびガラス質を取り出した。網膜神経を注意深く取り出し、色素上皮が混入しないように切開し、小さい（約１ｍｍ2以下）断片に刻み、氷冷Ｄ−ＰＢＳに入れた。細胞を回収し、分離媒体（パパイン１２０単位およびＤＮＡａｓｅ２０００単位のＨＢＳＳ溶液）１０ｍＬに移し入れた。細胞を回転台振盪器で約２００ｒｐｍにて約３７℃で４５分間インキュベーションした。次に、細胞を火造り毛細管ピペットでの磨砕によって分散させ、２０μｍナイテックスナイロンメッシュで篩って未分離の組織を廃棄し、ＩＥＣ臨床遠心管を用いて２００×ｇで５分間遠心した。得られた細胞ペレットを、卵白アルブミンおよび約５００単位のＤＮＡａｓｅを含むＨＢＳＳに再懸濁させ、４％卵白アルブミン溶液（ＨＢＳＳ溶液）頂部に乗せ、５００×ｇで約１０分間遠心した。最終的に得られたペレットを、２０％ウシ胎仔血清を補給したＤＭＥＭ／Ｆ１２に濃度１０7個／ｍＬで再度懸濁させ、前述の方法（Lehwalder et al., J.Neurosci.Res., 24:329-337, 1989）に従って免疫パニング（immunopanning）することで網膜神経節細胞を精製した。
パニングのために、３５ｍｍ組織培養用プラスチック皿を抗マウスＩｇＧ抗体（ＰＢＳで１：１００に希釈したもの）で室温にて２時間前コーティングし、１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳで３回洗浄し、Ｔｈｙ−１，２に対するマウスモノクローナル抗体（１：１００希釈）とともにインキュベーションした。皿をＤＭＥＭ／Ｆ１２で洗浄した後、網膜細胞懸濁液約１ｍＬを前処理済み培養皿上で室温にて１時間インキュベーションした。培地で繰り返し洗浄することで、付着していない細胞を除去して、強固に付着している細胞のみが残るようにした。結合した細胞をゴム製ポリスマンを用いて回収し、完全培地（前述）に再懸濁した。次に、細胞濃度を約１１０００個／ｍＬに調節し、培地をポリオルニチンおよびラミニンで予めコーティングしておいた９６ウェルマイクロプレートに、６ｍｍウェル当たり約１０００個の密度で、細胞懸濁液９０μＬを接種した。細胞の付着は急速に起こり、平板培養効率は約５０％であった。
網膜神経節細胞の免疫組織化学
ラット網膜神経節細胞の特性決定を行うため、以下のように若干の変更を加えて、ルイスら報告の間接免疫ペルオキシダーゼ法（Louis et al., J.Pharmacol.Exp.Therap., 262:1274-1283, 1992; Science, 259:689-892, 1993）を行った。網膜神経節細胞の培養物を４％パラホルムアルデヒドのＤ−ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）で室温にて約３０分間固定し、次にＤ−ＰＢＳ（６ｍｍウェル当たり２００μＬ）で３回洗浄した。固定化培養物を、１％ノニデットＰ−４０を含むスーパーブロック遮断緩衝剤のＰＢＳ溶液中でインキュベーションして、抗体の浸透を増加させた。次に、マウスモノクローナル抗Ｔｈｙ−１抗体（Boehringer-Mannheim）を同じ緩衝液中１：１００〜１：４００の希釈度で加え、培養液を回転式振盪器で３７℃にて１時間インキュベーションした。Ｄ−ＰＢＳで３回洗浄した後、網膜神経節細胞結合抗体を、希釈度約１：５００のウマ抗マウスビオチン処理ＩｇＧ（Vectastain キット、Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用いて検出した。その二次抗体を、細胞とともに３７℃で約１時間インキュベーションし、次に細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄した。次に二次抗体を、希釈度１：５００のアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体で標識し、細胞を３７℃で約４５分間インキュベーションした。Ｄ−ＰＢＳでさらに３回洗浄した後、標識細胞培養物を、０．０４％３’，３’−ジアミノベンジジン−（ＨＣｌ）４、０．０６％ＮiＣl2および０．０２％過酸化水素を含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．４）中で５〜２０分間反応させた。
網膜神経節細胞生存の測定
各種時間で培養した後（２４時間、３日間および６日間）、ラット網膜神経節細胞培養物を、上記のように固定、処理および免疫染色し、培養物について、倍率２００倍で明光学顕微鏡を用いて検査を行った。６ｍｍウェルに存在するＴｈｙ−１，２−陽性ニューロンを全て数えた。生存網膜神経節細胞は、大きく（直径３０〜４０μｍ）規則正しい形状の細胞体を特徴とし、神経突起が約３倍長く、そのうちの一つが軸索であった。不規則で空胞化した細胞質または寸断された神経突起を有するなどの変性の徴候を示す網膜神経節細胞は、計数から除外した（しかしながら、変性網膜神経節細胞のほとんどは、培養基層から脱離していた）。細胞数は、細胞個数／６ｍｍウェルとして、あるいは対照細胞密度と比較した倍数変化として表現した。
結果
精製ラット網膜神経節細胞の培養物を用いて、生存および形態的成熟に対するＧＤＮＦ蛋白産生物の効果を明らかにした。網膜神経節細胞を、抗Ｔｈｙ−１，２−抗体でコーティングしたプラスチック表面での免疫パニングによって７日齢ラット網膜から精製した。ラット網膜では、Ｔｈｙ−１抗原が網膜神経節細胞に局在していることが知られている（Leifer et al., Exp.Neurol., 113:386-390, 1991）。そこで、得られた網膜神経節細胞培養物の純粋な群を、Ｂ２７培地補給剤、２．５％加熱失活ウマ血清、Ｄ−グルコース、ＨＥＰＥＳ、インシュリンおよびトランスフェリンを補給したＤＭＥＭ／Ｆ１２中、６ｍｍウェル当たり約１０００個の密度で、ポリオルニチン−ラミニンコーティングマイクロプレートへ接種することで、網膜神経節細胞の純粋な培養物を確立した。網膜神経節細胞は、Ｔｈｙ１，２免疫反応性の存在によって確認した。この方法では網膜神経節細胞の収量は比較的低かったが（約５０００個／網膜）、純度は高かった（Ｔｈｙ−１，２−陽性細胞が約９０％）。
ラット網膜神経節細胞培養物について、生存および形態的成熟に対するＧＤＮＦ蛋白産生物投与の効果を評価した。網膜神経節細胞の培養物を、ヒト組換えＧＤＮＦ蛋白産生物（１０ｎｇ／ｍＬ〜１ｐｇ／ｍＬの範囲の連続３倍希釈液）で処理した。培養物を、in vitroで２４時間後、３日後および６日後に固定し、培養物を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｔｈｙ−１，２についての免疫染色を行った。ＧＤＮＦ蛋白産生物で処理しなかった培養物では、２４時間の培養後に生存していたのは、接種した網膜神経節細胞の約３２±４％（ｎ＝６）のみであった。元の網膜神経節細胞接種物で３日後に存在していたのは約１１±３％（ｎ＝６）であり、培養６日後にもなお認められたのは、３±２％（ｎ＝３）のみであった。大腸菌発現組換えヒトＧＤＮＦ蛋白産生物で培養物を処理したところ、培養２４時間後で、生存網膜神経節細胞数に約２．５倍の上昇があった（８０±６、ｎ＝６）。ＧＤＮＦ蛋白産生物存在下での３日間後では、元の数の網膜神経節細胞の約５０±５％（ｎ＝５）が生残し（対照の４．５倍の増加）、６日後には、約３９±４％（ｎ＝３）がなお生存していた（対照の約９．６倍）。in vitroで３日後における網膜神経節細胞生存に対するＧＤＮＦ蛋白産生物の効果は、約３００ｐｇ／ｍＬで最大であり、ＥＤ50は約３０ｐｇ／ｍＬであった。
網膜神経節細胞生存の促進に加えて、ＧＤＮＦ蛋白産生物の添加は、その形態的発達も刺激した。ＧＤＮＦ蛋白産生物で処理することで、網膜神経節細胞の細胞体の大きさならびにそれの神経突起の長さおよび分岐が増加した。in vitroで３日後、ＧＤＮＦ処理培養物中の多くの網膜神経節細胞で神経突起の長さが５００〜１０００μｍであったのに対して、対照培養物で認められた最も長い神経突起は３００μｍ未満であった。
実施例２
網膜神経節細胞におけるＧＤＮＦ蛋白産生物の逆行的輸送
この実験では、125Ｉ−放射能標識ＧＤＮＦ蛋白産生物を成体ラットの脳に注射して、受容体介在型でＧＤＮＦに結合し、それを取り込み、逆行的に輸送することができるニューロン群を確認した。被験ＧＤＮＦ蛋白産生物は組換えヒト［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦであり、ＷＯ９３／０６１１６号に記載されている方法に従って大腸菌で発現させることで製造したものである。精製［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦは、ラクトペルオキシダーゼ法を用いてヨウ素化し、ヤンら報告の方法（Yan et al., J.Neurobiol., 24:1555-77, 1993）に従ってＧ−２５セファデックス（Sephadex）急速スピンカラムを用いて遊離の125Ｉから分離した。４３ｍｇ／ｍＬの塩酸ケタミン、８．６ｍｇ／ｍＬのキシラジン、１．４３ｍｇ／ｍＬのアセプロマジンのカクテルで、用量０．７ｍＬ／ｋｇにて成体スプレーグ・ドーリーラットに麻酔を施した。ラット６匹からなる１群に、125Ｉ−［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦのＰＢＳ／ＢＳＡ溶液５μＬ（計４〜５×１０6ｃｐｍの放射能を含む）または１１１倍過剰の未標識［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦを含む125Ｉ−［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦのＰＢＳ／ＢＳＡ溶液５μＬのいずれかを、５μＬのハミルトン注射器を用いて定位的に右側脳室に注射した。６匹のラットから成る第２の群では、１１１倍過剰の未標識［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦを含むまたは含まない125Ｉ−［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦ  １μＬを右線条に注射した。６匹のラットから成る第３の群では、１１１倍過剰の未標識［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦを含むまたは含まない125Ｉ−［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦ  １μＬを上丘に注射した。注射速度は、いずれの注射においても０．１μＬ／１５秒とした。
２０〜２４時間の生存時間後、動物を屠殺し、４％パラホルムアルデヒドおよび１％グルタルアルデヒドの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液溶液（ｐＨ７．２）で灌流した。脳を摘出し、低温保護した。上丘注射したラットを屠殺し、その眼球を摘出し、同じ固定液で浸漬固定した。眼球の放射能をシンチレーションカウンターで計数した。厚さ２５μｍの脳の冷凍冠状切片を滑走式ミクロトームで切り取り、１０μｍの眼球切片をクリオスタットで切り取った。切片をスライドグラスに載せ、コダックＮＴＢ−３乳剤に浸漬した。曝露時間は１５〜３０日の範囲とした。次にスライドグラスを展開し、トルイジンブルーで対比染色し、顕微鏡下に検査した。
中枢神経系（ＣＮＳ）への線条体内注射または脳室内（ＩＣＶ）注射後、125Ｉ−［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦの取り込みおよび輸送を、黒質および腹側被がい野におけるドーパミン作動性ニューロンにおいて観察した。過剰量の未標識［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦの同時注射によって、125Ｉ−［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦのＩＣＶ注射または線条体内注射のいずれによるニューロン標識も完全に遮断することができた。生理的にＧＤＮＦに対して応答性であるこのドーパミン作動性ニューロンは、取り込みおよび逆行的輸送を行う能力を有する機能的ＧＤＮＦ受容体を発現すると予想された。そのように、ＩＣＶ注射および線条体内注射した125Ｉ−［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦによるそのドーパミン作動性ニューロンの特異的標識は、良好な陽性対照として役立った。
さらに、ニューロンの低レベル標識を、線条体内注射後およびＩＣＶ注射後のいずれにおいても、縫線の直線中心核および縫線の背核で観察した。標識［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦの取り込みは、過剰量の未標識［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦの同時注射によって遮断され、取り込みが受容体介在機序を介して起こっていることを示していた。他の隣接する縫線核や成体ラット脳全体における他のニューロン群では、線条体内注射後およびＩＣＶ注射後のいずれにおいても、ニューロンの標識は認められなかった。
脳室系に通じていないがＧＤＮＦの取り込みおよび逆行的輸送を行うことができると考えられる眼球などの他のニューロン群を見いだすべく、上丘に125Ｉ−［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦを注射した。眼球の直接カウンティング時に認められる放射能は対側眼球に選択的に蓄積されたが、同側眼球では蓄積されなかった。この選択性は、対側上丘への網膜神経節細胞の交差突出によるものであると予想される。放射能蓄積は、過剰量の未標識［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦの同時注射によって遮断され得る。これら眼球の断面のオートラジオグラムは、放射能が網膜神経節細胞と特異的に関連していることを示していた。その結果から、125Ｉ−［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦは受容体介在機序を介して対側網膜神経節細胞に選択的に輸送されるが、同側網膜神経節細胞には輸送されないことが明らかになった。
実施例３
ＧＤＮＦ蛋白産生物投与による網膜神経節細胞生存の促進
この実験では、視神経軸索切断術の動物モデルにおけるＧＤＮＦ蛋白産生物またはビヒクル投与の効果を、マンソール−ロベイらの報告に記載の方法によって評価した（Mansour-Robaey et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 91:1632-1636, 1994）。このモデルでは、視神経の軸索切断術によって、成体ラットにおいて、再現性のある網膜神経節細胞死が生じる。雌成体スプレーグ・ドーリーラットの左および右の両方の上丘表面に、フルオロゴールド（Fluorogold）浸漬したゲルフォーム（Gelfoam）を塗布することで、網膜神経節細胞を前標識した。フルオロゴールド塗布（０日）から１週間後、右視神経を眼球から０．５ｍｍで切断した（各投与でｎ＝３〜６）。左眼は、網膜神経節細胞の標識を示す内部対照として用いた。
第０日または第７日に右眼への眼内注射によって、［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦ（１ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液）または陰性対照としてチトクロムｃのいずれか１μＬを動物に投与した。表２に示したように、軸索切断術および薬剤投与の効果を、視神経切断後第７日または第１４日に調べた。
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眼球を４％パラホルムアルデヒドで１時間浸漬固定した。網膜の位置に印を施した。網膜を切開し、全体をスライドガラスに載せ、蛍光顕微鏡下に検査および写真撮影を行った。次に、写真で網膜神経節細胞数をカウントした。チトクロムｃ（陰性対照）を用いたあるいは用いなかった軸索切断術により、第７日で標識網膜神経節細胞数に大幅な低下が生じ、第１４日ではさらにその数が低下することが認められた。第０日における［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦ投与により、第７日および第１４日に網膜神経節細胞の明瞭な生残が生じた。第０日および第７日での［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦ  １μＬの２回投与により、第１４日での網膜神経節細胞の生存がさらに促進された。これらの結果は、網膜神経節細胞がＧＤＮＦに対して反応性であり、ＧＤＮＦ蛋白産生物投与によって、緑内障における損傷ニューロンの主要群である損傷網膜神経節細胞の生存率が向上することを示している。
本発明の現在好ましい実施態様について前述した内容を考慮して、当業者が本発明の実施において多くの改良および変法を行うことが予想される。従って、本発明の範囲に対する限定は、添付の特許請求の範囲に見られるもののみである。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１３４アミノ酸残基
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の特徴
特徴を表す名称／記号：成熟ヒトＧＤＮＦにおける推定アミノ酸配列
配列
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