(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号１における第７９６〜２３６１番目の塩基対からなる塩基配列、
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項３】
耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica) 由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードする請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質が、全ｐＨ領域においてＬｉ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を示さず、中性及びアルカリ性ｐＨ領域においてＣａ２＋／Ｈ＋アンチポーター活性を示すことを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換え発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターによって形質転換された形質転換細菌。
【請求項７】
形質転換体宿主が藍藻である請求項６に記載の形質転換細菌。
【請求項８】
藍藻が海水中で増殖可能な淡水性藍藻である請求項７に記載の形質転換細菌。
【請求項９】
請求項５に記載の発現ベクターによって形質転換された形質転換植物。
【請求項１０】
植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、請求項９に記載の形質転換植物。
【請求項１１】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることから成る、耐塩性植物の創出方法。
【請求項１２】
植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の形質転換細菌を培養し、得られる培養物からＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターを単離及び精製することから成る、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターの調製方法。
【請求項１４】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＮＡにコードされるＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質。
【請求項１５】
請求項１３に記載の調製方法で得られる組換えＮａ＋／Ｈ＋アンチポータータンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子、特に、耐塩性藍藻（らん色細菌：Aphanothece halopytica) 由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子、及び該遺伝子の発現による耐塩性の向上に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日、世界中の耕作地の20％、灌漑地のほぼ半分が高塩度の被害を受けているといわれている。高塩度は植物のイオン不均衡および高浸透圧によるストレスを誘発する。高塩度環境で生き延びる生物は内部浸透圧を調節する特異な機序を有している。そのような機序のひとつが砂糖、ある種のアミノ酸、第四アンモニウム化合物などの低分子量有機化合物の溶質を蓄える能力である。高塩度に適応するもうひとつの機序はＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターおよびＮａ＋-ATPアーゼの一機能として提唱されている細胞からのＮａ＋排出である。塩ストレスは、このような毒性作用のほかに、酸化ストレスも誘発する。従って、近年、遺伝子工学を利用して植物の耐塩性の改善が試みられている。
【０００３】
Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーターは細胞膜を介してＮａ＋をＨ＋に交換する反応を触媒し（Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性）、細胞質内のpH、細胞容積、細胞質内ナトリウム濃度の制御など種々の機能を果たしている（1-3）。Escherichia coliでは、3種のアンチポーター（NhaA, NhaB, ChaA）が知られており、その機能的特徴も十分に解明されている（1）。動物では6種の相同Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター（交換）（NHE1-6）が判明している（2）。植物および酵母では、空胞型（NHX1およびAtNHX1）（4-6）と形質膜型（SOD2およびSOS1）（7,8）のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターが報告されている。E. coliアンチポーターと真核細胞アンチポーターの相同性はきわめて低く、Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子は別々に進化が独立したことが示唆される。
【０００４】
このようなＮａ＋／Ｈ＋ アンチポーター遺伝子を用いると、植物の耐塩性が向上するという報告が、最近（１９９９年、Science、２００１年Nature Biotechnology）にカナダBlumbald他によりなされた。Blumbald他はアラビドプシスの液胞膜のＮａ＋／Ｈ＋ アンチポーター遺伝子を、アラビドプシスの液胞膜(Science 1999)、トマトの液胞膜(2001 Nature Biotechnology)で発現させることにより、ともに０．２Ｍ  ＮａＣｌ中でも生育することを報告している。これは、細胞の中にある液胞膜の内側にＮａＣｌを蓄積させることにより耐塩性を向上させるものである。
【０００５】
このように、遺伝子工学の技術によって植物の耐塩性を改善する少なからぬ努力が行われているが、実用化にこぎつけるほど十分な結果は得られていない。
さて、植物に比べると単細胞のらん食細胞は単純であり、光合成生物における耐塩性を担う因子を解明するためには適切なモデルである。藍藻は太陽エネルギーおよび無機体炭素ＣＯ２を利用して増殖できる酸素を発生する光合成生物である。このような生物はきわめて低濃度から海水よりも高濃度まで塩を含有する水中などほぼすべての生息地で確認される。しかし、どの遺伝子が異なる塩度への適応に関与するのか、不明である。そこで、高塩度に対応するマスター調節遺伝子を同定することは、藍藻の耐塩性の機序を理解するばかりでなく、作物の収穫量を向上させる点で植物への応用にも重要である。
【０００６】
本発明者等はこれまでの試験で（9）、藍藻Synechocystis sp. PCC6803にはＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターSynNhaP１が存在し、真核細胞および原核細胞（Pseudomonas aeruginosa由来NhaP）のアンチポーターと相同であるが、NhaA, NhaBおよびChaAとは相同でないことを明らかにしてきた。さらに、SynNhaPには膜貫通（TM）領域に保存されたＡｓｐ１３８と比較的長いC末端親水性テールがあり、いずれも担体活性に重要であることも示してきた。長いC末端テールは動物の輸送活性を制御する働きがあると考えられている（2,10）。このような知見から、藍藻のアンチポーターは真核細胞のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの構造的特性と機能的特性を試験するためのモデル系になることがわかる。
【０００７】
現在までに、Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター蛋白質ではごくわずかな機能性アミノ酸残基、特に陽イオン輸送に関わるアミノ酸残基が特定されている。SynNhaPのＡｓｐ１３８（9）、NhaAのＡｓｐ１３３, Ａｓｐ１６３, Ａｓｐ１６４（11,12）の重要性が報告されている。Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーターはＨ＋とＮａ＋またはＬｉ＋との間を特異的に交換するが、Ｈ＋とＬｉ＋との交換活性が弱いアンチポーターもいくつかある（13）。E. Coli ChaAはアルカリ性pHでＣａ２＋とＨ＋、Ｎａ＋とＨ＋の交換活性を有すると報告されているが、詳細に調べられたことがない。どの因子によってイオン特異性が決まるのか不明である。Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーターの陽イオン輸送のための保存配列を特定するためには、新たなイオン特異性を有するアンチポーターのクローニングが欠かせない。
【０００８】
Aphanothece halophyticaは0.25〜3.0M ＮａＣｌと広範な塩度条件下で増殖可能な耐塩性藍藻である（15,16）。A. halophyticaは高塩度で浸透圧保護物質グリシンベタインを蓄積し（15）、A. halophyticaのDnaK蛋白は、他のDnaK/Hsp７０ファミリー（17）より長いC末端セグメントを有しており、高塩度できわめて強い蛋白質折りたたみ活性を示すことが報告されている（18）。A. halophytica由来DnaK蛋白によるタバコの形質転換によって、耐塩性が増強されることも判明している（19）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、遺伝子工学の技術によって植物の耐塩性を向上させることのできる有用な遺伝子を見出し、該遺伝子を利用して、耐塩性作物を開発、創出して食料生産の向上に寄与する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、A. halophyticaに独特のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター（ApNhaP）があるかどうか研究した結果、真核細胞に相同であるが、新たなイオン特異性を有するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子を単離することに成功し、更にそのイオン特異性がC末端領域によって変化することも明らかにした。
【００１１】
更に、淡水藍藻Synechococcus sp. PCC7942において8種のプラスミドを過剰発現させ、耐塩性を試験した。その結果、ベタイン合成、カタラーゼおよびシャペロンに関与する遺伝子を比較して、耐塩性藍藻由来のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子を過剰発現することによって、このSynechococcus細胞を0.5M NaClを含有するBG11培地でも海水中でも増殖することが判明し、淡水藍藻の耐塩性を大きく改善することに成功した。
【００１２】
即ち、本発明は、以下の各態様に係る。
（１）耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica) 由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードするＤＮＡ。
（２）全ｐＨ領域においてＬｉ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を実質的に示さず、中性及びアルカリ性ｐＨ領域においてＣａ２＋／Ｈ＋アンチポーター活性を示すことを特徴とする、藍藻由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードするＤＮＡ。
（３）藍藻が耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica)である、２記載のＤＮＡ。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含有するＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質。
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列又はその部分配列を含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号１における第７９６〜２３６１番目の塩基対からなる塩基配列、
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（６）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換え発現ビークル。
（７）大腸菌由来プラスミドベクターである６に記載の組換え発現ビークル。
（８）大腸菌／淡水藍藻シャトルベクターである６に記載の組換え発現ビークル。
（９）６、７又は８に記載の発現ビークルによって形質転換された形質転換体。
（１０）細菌である９に記載の形質転換体。
（１１）大腸菌である１０に記載の形質転換体。
（１２）大腸菌がアンチポーター欠損株である１０に記載の形質転換体。
（１３）Ｎａ＋感受性表現型及びＣａ２＋感受性表現型が相補された１２に記載の形質転換体。
（１４）藍藻である９に記載の形質転換体。
（１５）藍藻が淡水性藍藻である１４に記載の形質転換体。
（１６）海水中で増殖可能な淡水性藍藻である１５に記載の形質転換体。
（１７）植物である９に記載の形質転換体。
（１８）植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、１７に記載の形質転換体。
（１９）Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターを過剰発現することを特徴とする、１４乃至１８のいずれか一項に記載の形質転換体。
（２０）Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性が増加した、１４乃至１８のいずれか一項に記載の形質転換体。
（２１）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることから成る、該宿主の耐塩性を向上させる方法。
（２２）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換え発現ビークルによって宿主を形質転換し、該ＤＮＡを宿主細胞内で発現させることから成る、該宿主の耐塩性を向上させる方法。
（２３）細胞外にＮａＣｌを排出させることにより耐塩性を向上させる、２１又は２２に記載の方法。
（２４）宿主が植物である、２１、２２又は２３に記載の方法。
（２５）植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、２４に記載の方法。
（２６）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることから成る、耐塩性生物の創出方法。
（２７）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換え発現ビークルによって宿主を形質転換し、該ＤＮＡを宿主細胞内で発現させることから成る、耐塩性生物の創出方法。
（２８）宿主が植物である、２６又は２７に記載の方法。
（２９）植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、２８に記載の形質転換体。
（３０）６乃至２０に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターを単離及び精製することから成る、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターの調製方法。
（３１）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡにコードされるタンパク質。
（３２）３０に記載の調製方法で得られる組換えＮａ＋／Ｈ＋アンチポータータンパク質。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica) 由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードするＤＮＡは、以下の実施例に示すように、公知である複数のＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター間に高度に保存された２つのポリペプチド領域をもとにプライマーを作成し、一方、当業者に公知の方法でA. halophytica培養し、それから単離したゲノムを鋳型として、当業者に周知のＰＣＲを用いて調製することが出来る。
【００１４】
本発明ＤＮＡにコードされるＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターは、全ｐＨ領域においてＬｉ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を実質的に示さず、中性及びアルカリ性ｐＨ領域においてＣａ２＋／Ｈ＋アンチポーター活性を示すことを特徴とする。
【００１５】
より具体的には、本発明ＤＮＡは、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含有するＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質、である。
更に、本発明ＤＮＡは、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列又はその部分配列を含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号１における第７９６〜２３６１番目の塩基対からなる塩基配列、
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、である。
ここで、部分配列とは、例えば、上記Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターのＣ末端領域（配列番号２に示されるアミノ酸配列における４０２番目のアミノ酸残基Gluから５２１番目のアミノ酸残基Gluまでの領域）に該当する配列を意味し、この部分はイオン特異性に関与する部分であることが本発明によって明らかにされた領域である。
【００１６】
当業者であれば、本明細書で開示された配列情報に基づいて、当該技術分野における周知手段を用いた化学合成等によっても調製することが可能である。更に、当業者であれば、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性が実質的に保持されるように、配列番号２における特定のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することも、当該技術分野における周知手段を用いて容易に実施することができる。Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性が実質的に保持されるためには、アミノ酸配列における相同性が、６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９．５％より高いものを挙げることができる
【００１７】
本発明において、特定の遺伝子又はＤＮＡは、当業者に周知の緩衝液中で、適当な温度及び塩濃度等の諸条件下のストリンジェントな条件でハイブリダイズさせることができる。このようなストリンジェントな条件下で本発明の遺伝子又はＤＮＡとハイブリダイズし、且つ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性と実質的に同等の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの例として、例えば、それぞれの対応する遺伝子と相同性が、９０％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９．５％より高いようなＤＮＡを挙げることができる。
【００１８】
更に、本発明は別な態様として、上記の本発明遺伝子の少なくとも一つの遺伝子を含有する組換え発現ビークルに係る。組換え発現ビークルには各種ベクター等の当業者に公知の任意のものが含まれるが、特に、大腸菌由来の各種プラスミドベクター、大腸菌／淡水らん食細菌シャトルベクター、及びアグロバクテリウムのＴｉプラスミドベクターが好適である。
該組換え発現ビークルには、遺伝子組換え操作において当業者に公知である様々な配列、例えば、原核細胞である大腸菌等が有する転写因子である各種σサブユニットに対する結合ドメインである各種プロモーター、及びエンハンサーなどの各種転写調節要素、制限酵素部位、並びにカナマイシン耐性マーカー等の選択マーカー（マーカー酵素等）遺伝子を任意に含むことが出来、当業者に公知の方法によって容易に調製することが出来る。
【００１９】
本発明の発現ビークルによって形質転換される宿主としては、特に、大腸菌及び藍藻等の各種細菌、並びにイネ、タバコ等の植物を挙げることが出来る。これらの形質転換体には、本発明のＤＮＡが発現された結果、Ｎａ＋感受性表現型及びＣａ２＋感受性表現型が相補されたものや、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターが過剰発現された結果、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性が増加したもの等がある。
【００２０】
本発明のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることによって、該宿主の耐塩性を向上させることが出来る。耐塩性の向上は、主に、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターによって細胞外にＮａＣｌが排出されることによるものである。導入方法としては、例えば、上記組換え発現ビークルによって宿主を形質転換することによって、本発明ＤＮＡを導入することが出来る。他にも、燐酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、及びパーティクルガン法等、当業者に公知の任意の手段及び条件を用いることが出来る。
【００２１】
このようにして、本発明のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることによって、耐塩性生物、例えば、海水中でも増殖することが出来る淡水藍藻を遺伝子工学的手法によって創出することが出来る。
【００２２】
更に、上記の形質転換体を培養し、得られる培養物からＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターを単離及び精製することによって、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターを調製することが出来る。培養、単離及び精製等に関する諸条件は、使用するベクター、宿主及びその他の各因子の種類等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。
【００２３】
本発明は、上記の本発明ＤＮＡにコードされるタンパク質にかかる。このようなタンパク質は、当業者に公知の方法で、A. halophytica培養物から精製及び単離することができる。或いは、上記調製方法によって、得られる組換えタンパク質として、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターを得ることも可能である。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２５】
【実施例１】
A. halophytica培養
A. halophytica細胞はBG11培地に18 mM ＮａＮＯ３のほか、Turk Island塩溶液を加えて、光独立栄養的に増殖させた。Turk Islandの塩溶液は、培地のＮａＣｌ濃度を適宜0.25〜2.5Mの範囲に調節したことを除き、これまでに発表されている方法で調製した（15-17）。培地200 mlを入れて綿栓をした500 mlの三角フラスコを用いて、濃縮ＣＯ２を補充することなく往復振盪機で振盪した。連続して白色蛍光を照射しながら培養フラスコを28℃でインキュベートした（30 microeinsteins ｍ−２ｓ−１）。
【００２６】
A. halophyticaのＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター単離
A.halophyticaゲノムＤＮＡは発表されている方法で単離した（17）。複数のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター間の高度に保存された2つのポリペプチド領域をもとに、部分的に変性したオリゴヌクレオチドを特定した（9）。正方向のプライマーであるNP-Fはポリペプチドの伸張部Phe-Leu-Pro-Pro-Leu-Leu-Phe-Glu-Alaの後に特定された（SynNhaPのアミノ酸残基73〜81）。逆方向のプライマーであるNP-Rには、Glu-Gly-Glu-Ser-Leu-Phe-Asn-Asp-Glyに相当する相補配列を含む（SynNhaPのアミノ酸残基160〜168）。全プライマーの配列を以下の表１に示す。予測した大きさ（〜0.3 kb）の増幅ＤＮＡ断片を入手し、配列決定した。決定したヌクレオチド配列を用いて、逆転写ポリメラーゼチェーン反応（PCR）法によって未知の隣接ＤＮＡ領域を増幅した（20）。そのために、Sau3AIによる部分消化やEcoRIまたはAseIによる完全消化で得たＤＮＡ断片はアガロースゲル電気泳動で大きさごとに分画した。1〜5 kbの断片はライゲーションキット（宝酒造、滋賀県）を用いて自己連結し、特異なＤＮＡ断片を増幅して配列決定した。A. halophyticaのＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子（apnhaP）の配列全体をカバーする約2.4 kbのヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡ配列はABI310遺伝子分析機（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて決定し、DNASISプログラム（日立ソフトウェアエンジニアリング、神奈川県）によって解析した。
【００２７】
その結果、配列番号１に示される、全体が2431 bpのヌクレオチドが配列決定された（図２）。この配列分析からオープンリーディングフレームと思われる796〜2361に位置するapnhaPが明らかになった。この予測遺伝子産物は配列番号２に示される521個のアミノ酸からなり、分子量は56,881 Daである（ApNhaP）。最初のMetの上流配列には-10（ATGAAT）および-35（TACACT）のコンセンサス配列の存在が明らかになった（図２）。さらに上流領域である185〜676には、光化学系II（チトクロムｃ５５０）に関与する低電位チトクロムcをコード化する別のオープンリーディングフレームがみつかった。ヌクレオチド配列から推定されたチトクロムｃ５５０のアミノ酸配列は、ラン色細菌、藻類および植物から得られた配列と相同性が高かった。
【００２８】
図３に示されるように、ホモロジー検索によってApNhaPが真核細胞（SOS1, NHEs, AtNHX1およびNHX1）と原核細胞（NhaP, SynNhaPおよびSynNhaP2）に由来するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターにきわめて相同していることが明らかになった。SynNhaP2はSynechocystis sp. PCC 6803で確認された2つめのNhaP型アンチポーターである（9）。ApNhaPはSynNhaPと最も相同性が高かった（アミノ酸が61％まで同一）。親水性プロット解析（23）およびTM予測プログラムTopPredII（24）によって、ApNhaPの推定上のTMセグメントを11個特定した。ApNhaPのAsp１３９は膜貫通領域に保存されたイオン化アミノ酸であり、交換活性に対するその重要性はSynNhaPの突然変異誘発による分析で示されている（9）。尚、ApNhaPには長い親水性C末端テールがあるが、これは真核細胞のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの場合であり、P. aeruginosa由来NhaPには認められない。このようなデータは、耐塩性ラン色細菌A. halophyticaに真核細胞に相同なＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターがあることを示唆している。
【００２９】
【表１】
0004132810.tif 000002
【００３０】
【実施例２】
発現プラスミドの構築
apnhaPのコーディング領域をPCR反応により単離した。正方向のプライマーであるANP-NcoIは開始コドンATGとNcoI切断部位を含む。逆方向のプライマーであるANP-HindIIIにはHindIII制限部位が含まれる。増幅断片はpTrcHis2CプラスミドのNcoI/HindIII切断部位に連結した。得られたプラスミドpANhaPはインフレームでヒスチジンヘキサマー融合ApNhaPをコード化し、まずE. coli DH5α細胞に導入し、次にnhaA, nhaB, chaA遺伝子が欠失するTO114細胞に導入した（21）。
【００３１】
このpANhaPのほかpSNhaPをNhaA, NhaB, ChaAが欠失したE. coli宿主細胞（TO114）に発現させた（9,21）。膜分画をウェスタンブロッティング法で分析し、pANhaPおよびpSNhaPで形質転換したE. coli細胞に〜53 kDaに相当する交叉反応を示すバンドがひとつあることが明らかになったが、ベクター単独（pTrcHis2C）で形質転換したE. coli細胞はまったくバンドがなかった。このような結果はApNhaPが発現し、E. coliの膜に集っている可能性を示唆するものである。  尚、SDS-PAGEおよび免疫ブロッティングは公知の方法（17）によって実施し、Lowryらの方法によって蛋白質を定量した（25）。ヒスチジンヒキサマー（His６タグ）に対して産生される抗体はR&D Systems Inc.（Minneapolis, MN）から得た。
【００３２】
pANhaPで形質転換したE. coli TO114細胞がpH 7.0 37℃のLBK培地のなかでpTrcHis2CおよびpSNhaPで形質転換したTO114細胞とほぼ同じ速度で増殖したことを図４（Ａ）に示す。しかし、TO114細胞にはＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子（nhaA, nhaB, chaA）が欠損するため、pTrcHis2Cで形質転換したE. coli細胞は0.2 M ＮａＣｌの存在下で増殖することができない（図４（Ｂ））。これに対して、pANhaPまたはpSNhaPで形質転換したE.coli細胞は増殖可能であった（図４（Ｂ））。興味深いことに、pANhaPで形質転換したTO114細胞はpSNhaPで形質転換した細胞に比べて若干速く増殖した（図４（Ｂ））。
【００３３】
更に、ApNhaPとSynNhaPとでは相補する力が異なることが図４（Ｂ）からわかる。2種のアンチポーターにおける相補性の差をさらに明確にするために他の条件でも試験した。図５（Ａ）では増殖温度を30℃にして、pANhaPで形質転換したTO114細胞がLBK培地のアルカリ性pHのもとpSNhaPで形質転換した細胞よりも若干速く増殖できたことを示す。このような条件下、増殖培地に0.2 M ＮａＣｌを含む場合、ApNhaPはTO114細胞の塩感受性表現型を相補するが、SynNhaPは相補できない（図５（Ｂ）。0.5 M ＮａＣｌの存在下でも、pANhaPで形質転換したTO114細胞は増殖可能であった（図５（Ｃ））。相補性の差はpHが小さいと観察されなかった。上のような結果はApNhaPがアルカリ性pHでSynNhaPに比して効果的に相補できることを示唆する。
【００３４】
【実施例３】
Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性
これまでに発表された方法（9,22）でLBK培地（ＮａＣｌの代わりにKClを用いるLuriaブロス）で増殖させた細胞から調製した反転膜小胞によって、Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性を調べた。簡潔に説明すると、3000×gで4℃、10分間遠心分離してE. coli細胞を収集し、浮遊用緩衝液TCDS（10 mMトリスHCl（pH7.5）、0.14 M塩化コリン、0.5 mMジチオスレイトール、0.25 Mスクロース）で洗浄した。このペレットをTCDS 緩衝液10 mlに浮遊させ、フレンチプレスにかけた（4000 p.s.i.）。次に、この溶液を12,000×gで4℃、10分間遠心分離した。この上清を110,000×gで4℃、60分間遠心分離し、ペレットをTCDS緩衝液600μlに浮遊させた。  アンチポーター活性は、10mMトリス緩衝液（規定pHになるまでHClを加えた）、5 mM ＭｇＣｌ２、0.14 M塩化コリン、1μMアクリジンオレンジ、膜小胞（蛋白質50μg）を含む2 mlの反応混合物に塩を加えて、ΔpH（膜内外のpH勾配）の変化によって評価した。ΔpHは励起492 nmおよび発光525 nmで得られるアクリジンオレンジの蛍光によってモニタリングした。塩を加える前に、呼吸による蛍光クエンチング（Q）を惹起するためにトリス-DL-乳酸（2 mM）を加えた。乳酸は小胞を賦活化し、小胞内にＨ＋を蓄積させるが、これは色素の蓄積と乳酸誘導性蛍光クエンチング（Q）を誘発する。塩（5 mM）の追加によって、アンチポーターによるＨ＋の排出のために蛍光性が増強し、クエンチングしていない蛍光、即ち、塩誘導性蛍光デクエンチング（ΔQ）をモニタリングした。次にＮＨ４Ｃｌ（25 mM）を加えてΔpHを放散させた。
【００３５】
その結果、図６上段に示すように、ApNhaP発現細胞にＮａＣｌを加えるとデクエンチング（ΔQ×100/Q）が観察されたが、対照（pTrcHis2C）細胞では観察されなかった。これはApNhaPがＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性を有することを示している。図６（Ａ）は、pH5〜9の広範囲にわたりApNhaPによる蛍光デクエンチングが観察されたことを示しており、これはSynNhaPによるデクエンチング（9）とほぼ同じであるが、E. coli NhaAによるデクエンチングとはまったく異なる。E. coli NhaAではアンチポーター活性がpH7.5以下で観察されることはなく、pHが上昇するにつれて活性が増強した（1）。
【００３６】
更に、ApNhaPのイオン特異性を調べるために、異なる陽イオンを加えてデクエンチングを測定した。Ｌｉ＋とＨ＋との交換を触媒できるほとんどのＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターに比べて、ApNhaPは種々のpH値でＬｉ＋/Ｈ＋アンチポーターの活性をほとんど示さなかった（図６（Ｂ））。又、ApNhaPが中性及びアルカリ性のpHでＣａ２＋アンチポーター活性を示すことがわかったが（図６（Ｃ））、Ｋ＋/Ｈ＋ではごくわずかなアンチポーター活性を示し、Ｍｇ２＋/Ｈ＋ではまったく示さなかった。このような結果はApNhaPが新たなイオン特異性を有するアンチポーターであることを示唆している。
【００３７】
【実施例４】
上記結果から、ApNhaPがＣａ２＋とＨ＋の交換活性を有するが、Ｌｉ＋とＨ＋の交換活性はないことが示唆されるために、このようなイオン特異性がE. coli変異体細胞の塩感受性表現型を相補するかどうか、さらに試験した。その結果、図７（Ａ）に示されるように、pH 8で4 mM LiClを含むLBK培地でApNhaPを発現するTO114細胞は増殖できないが、SynNhaPを発現するTO114は増殖できた。これに対して図７（Ｂ）に示すように、pH 8.0で0.1 M ＣａＣｌ２を含むトリスE培地ではApNhaPを発現するTO114細胞が良好に増殖するが（26）、SynNhaPを発現するTO114は緩やかに増殖した。いずれも、対照細胞（ベクターのみ）では増殖不能であった。Ｃａ２＋含有培地でのSynNhaP発現細胞の増殖速度はSynNhaPのＣａ２＋/Ｈ＋交換活性から予測される速度より遅いが（図７（Ｂ）及び図６（Ｃ））、このような結果は、実施例３で得られたApNhaPとSynNhaPのＬｉ＋/Ｈ＋およびＣａ２＋/Ｈ＋アンチポーター活性の結果に一致する（図６（Ｂ）及び図６（Ｃ））。
【００３８】
E. coli ChaAはＮａ＋またはＣａ２＋によるプロトン／カチオン交換活性を有するが、Ｌｉ＋またはＫ＋による活性はないと報告されているが（14,21）、これは基本的にApNhaPと同じイオン特異性である。ただし、ChaAはApNhaPと何ら相同性が認めらなかった。ChaAにはカルセケストリン、カルレティキュリンなど複数のＣａ２＋結合蛋白やＮａ＋/Ｃａ２＋イオン交換体に保存される酸性モチーフGlu２００-His-Glu-Asp-Asp-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp２０９を有するが（14）、ApNhaPにはこの酸性モチーフが欠けている。ChaAの親水性プロットによると、ApNhaPでは長い親水性C末端尾部がないことがわかる。ApNhaPは酵母（27）および植物（28）由来の空胞Ｃａ２＋/Ｈ＋交換体とまったく相同していなかった。このようなすべてのデータは、ApNhaPがChaAとは異なる構造を有するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターであることを示している。
【００３９】
【実施例５】
ApNhaPとSynNhaPのキメラ遺伝子構築
これまでに、C末端テールが一部欠失するとSynNhaPのＮａ＋/Ｈ＋対向輸送活性が減弱することがわかっている（9）。ApNhaPはSynNhaPに相同性が最も高いが、この2種のアンチポーターのC末端テールにかかる電荷は有意に異なり、ApNhaPは22個の塩基性アミノ酸と14個の酸性アミノ酸、SynNhaPは15個の塩基性アミノ酸と24個の酸性アミノ酸である。そのためわれわれは、図８に示されるようなASNhaPとSANhaPのキメラアンチポーターを構築し、そのなかでApNhaPの長いC末端テールをSynNhaPのテールに、SynNhaPの長いC末端テールをApNhaPのテールにそれぞれ置換した。反転膜小胞を用いてキメラの交換活性を評価した。
【００４０】
即ち、ApNhaPのTM領域（アミノ酸残基Met１−Ile４０１）とSynNhaPのC末端領域細胞質領域（アミノ酸残基Gln４０１−Ser５２７）をコード化するキメラ遺伝子を次のように構築した（図1）。ApNhaPのTM領域とSynNhaPのC末端領域に相当するヌクレオチドをそれぞれ正方向／逆方向プライマーセットであるANP-NcoI/ANP-N-RおよびSNP-C-F/SNP-C-Rによって増幅した。前者ヌクレオチドの鋳型はpANhaPであり、後者ヌクレオチドの鋳型はsynnhaP遺伝子がpTrcHis2CのNcoI/EcoRI部位に結合したpSNhaPであった（9）。正方向のプライマーであるSNP-C-Fにはポリペプチドの伸長部であるApNhaPのGln３９８-Thr-Val-Ile４０１とSynNhaPのGln４０１-Phe-Val-Leu４０４に相当する配列が含まれており、逆方向のプライマーであるANP-N-RはSNP-C-Fの相補配列である。逆方向のプライマーSNP-C-RにはpSNhaPの終止コドンの直前にEcoRI切断部位がある。両方のPCR産物を合わせて、正方向のANP-NcoIプライマーと逆方向のSNP-C-Rプライマーを用いてキメラ遺伝子apsynnhaPを増幅し、プラスミドpASNhaPを作製したpTrcHis2CのNcoI/EcoRI消化部位に結合させた。
【００４１】
次に、SynNhaPのTM領域（アミノ酸残基Met１−Thr４００）とApNhaPのC末端領域（アミノ酸残基Glu４０２−Glu５２１）をコード化するキメラ遺伝子構築のために、SNP-N-F/SNP-N-RおよびANP-C-F/ANP-HindIIIの正方向／逆方向プライマーセットによって各ヌクレオチドを増幅した。本実施例で用いる逆方向プライマーであるSNP-N-RはANP-C-Fの相補的配列である。両方のPCR産物を合わせて、正方向SNP-N-Fおよび逆方向ANP-HindIIIプライマーを用いてキメラ遺伝子synapnhaPを増幅させ、プラスミドpSANhaPを作製したpTrcHis2CのNcoI/HindIII消化部位に結合させた。
【００４２】
その結果、図９に示すように、ASNhaPキメラは図６に示す親ApNhaPのＮａ＋/Ｈ＋、Ｌｉ＋/Ｈ＋、Ｃａ２＋/Ｈ＋交換活性に匹敵する活性を示した。興味深いことに、ApNhaPではまず検出不能なＬｉ＋/Ｈ＋交換活性が（図６（Ｂ））、ASNhaPキメラでは明らかに観察された（図９（Ｂ））。その一方でSANhaPキメラは親SynNhaPに比して、Ｎａ＋/Ｈ＋およびＬｉ＋/Ｈ＋の両方の交換活性が減弱した（図９と図６）。更に、SANhaPキメラのＣａ２＋/Ｈ＋交換活性はpH依存的で、pHが中性またはアルカリ性の場合に活性の増強が観察されるようである（図９（Ｃ））。これはpHには関係なく相対的に活性が変化しない親SynNhaPでの観察とは対照的である（図６（Ｃ））。活性化のデータには矛盾もみられるが、このような結果はC末端領域がApNhaPおよびSynNhaPのイオン特異性にある種の働きをすることを示唆している。たとえば、SANhaPキメラはApNhaPおよびSynNhaPに比べてＮａ＋/Ｈ＋交換活性が低く（図９（Ａ）と図６（Ａ））、ASNhaPキメラのＣａ２＋/Ｈ＋交換活性はpH依存的であるが、これは親ApNhaPと同じであるがSynNhapとは異なる（図９（Ｃ））。このような結果は、ApNhaPおよびSynNhaPのイオン特異性もTM領域の構造によって変化し、ほとんどのＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターにも同じことが考えられることを示唆している（1）。
【００４３】
キメラの交換活性データは相補性解析によってさらに実証された。図１０に示されるように、ASNhaPキメラはE. coli変異体のＮａ＋、Ｌｉ＋およびＣａ２＋感受性表現型を相補するが、SANhaPキメラがE. coli変異体のＮａ＋およびＬｉ＋感受性表現型を相補することはまずない。SANhaPを発現するE. coli変異体細胞の増殖速度はSANhaPキメラのＣａ２＋/Ｈ＋交換活性から予測される速度よりも遅かった（図１０（Ｃ）及び図９（Ｃ））。
【００４４】
【実施例６】
次に、淡水らん色細菌Synechococcus sp. PCC7942において8種のプラスミドを過剰発現させ、耐塩性を試験した。
即ち、耐塩性らん色細菌Aphanothece halophytica（A. halophytica）由来のＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体ApNhaPの発現プラスミドpUC303-ApNhaP(33)、A. halophytica由来の分子シャペロンDnaKの発現プラスミドpUC303-DnaK(34)、E. coli由来のカタラーゼの発現プラスミドpUC303-KatE(35,36)、E. coli由来のベタイン合成遺伝子の発現プラスミドpUC303-Bet(37,38)と、それを組み合わせたものである。これらはそれぞれイオンホメオスタシス、蛋白質の折りたたみ、活性酸素のクエンチ、浸透圧保護物質として機能すると考えられている。E. coliでは4つの遺伝子がベタイン合成に関与しており(37)、betA, betB、betTがそれぞれコリンデヒドロゲナーゼ、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ、コリン輸送体をコード化し、betIは調節遺伝子をコード化する。発現プラスミドpUC303-DnaK(34)ではgrpEおよびdnaJが部分遺伝子であり、dnaKは機能性蛋白質をコード化する。このすべての遺伝子が自らのプロモーター配列を使用する。Synechococcus sp. PCC7942細胞はpUC303-Bm（対照）、pUC303-ApNhaP, pUC303-KatE, pUC303-Bet, pUC303-DnaK, pUC303-KatE/Bet, pUC303-ApNhaP/KatE, pUC303-ApNhap/KatE/Betプラスミドで形質導入された（図11）。
【００４５】
発現ベクターの構築
発現プラスミドpUC303-DnaKの構築のために、A. halophytica由来dnaK遺伝子(34)を含む3kbpの断片をSspIおよびEcoRVで消化して平滑断端にし、pUC303-BmをEcoRI-およびSalI-二重消化して平滑断端にした部位へ結合させた。耐塩性らん色細菌A. halophytica由来のＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体の発現プラスミドで、自身のプロモーターを含有するプラスミドを次のように調製した。テンプレートとしてpANhaPを用いるPCR法で、apnhaP遺伝子の539位にあるEcoRI切断部位からpTrHis2CのHisタグ配列の直後にある終止コドンまでのＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体断片を増幅した(33)。正方向のプライマーであるApNhEcF1 5’-TGGGAATTCCCCTCGGAA-3’にはEcoRI部位が含まれ、逆方向のプライマーであるApNhBmR1 5’-GTGGATCCTCAATGATGATGATGATG-3’には終止コドンの後にBamHI切断部位が含まれる。増幅断片をpBluescript IISK+のEcoRV部位に結合する。-194からEcoRI切断部位がある539までの別のＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体断片はA. halophyticaをテンプレートとしてゲノム遺伝子を用いたPCR法で増幅した。正方向のApNhEcF 2,5’-CTGAATTCGATCGCGGCTCATATT-3’にはEcoRI切断部位が含まれ、逆方向のプライマーApNhEcR2 5’-GGGAATTCCCACTAATAGA-3’にも539にEcoRI切断部位がある。amnhaP遺伝子のC末端部がすでに結合しているpBluescript II SK+のEcoRI消化部位に増幅断片を結合させた。配向を確認した後、正しく結合したプラスミドpBApNhaPをBamHIによって消化し、E.coli/SynechococcusシャトルベクターpUC303-BmのBamHI消化部位に結合させた(38)。これで得られたプラスミドをpUC303-ApNhaPと呼ぶ。apnhaPおよびkatE遺伝子の共発現のために、E. coli由来のkatE遺伝子をSaII/BamHI消化部位に結合させて、プラスミドpUC303-KatEを用いた。KatE遺伝子はカナダのManitoba UniversityのP.C. Loewen教授から分譲していただいたものである(35)。プラスミドpUC303-KatEをXbaIで消化し、平滑断端にした。apnhaP遺伝子はBamHIでpUC303-ApNhaPを消化し、平滑断端して調製した。得られたapnhaP遺伝子はXbaI消化pUC303-KatEに結合させ、プラスミドpUC303-ApNhaP/KatEを調製した。apnhaP, katEおよびbet遺伝子の共発現のために、プラスミドpUC303-KatE/BeTを用いた。pUC303-KatE/BeTはXbaIで消化して平滑断端してから、そこにBamHIで切断して平滑断端にしたapnhaP遺伝子を結合させた。これで得られたプラスミドをpUC303-ApNhaP/KatE/BeTと呼ぶ。Synechococcus細胞を形質変換するためにこのプラスミドを用いた(38)。
【００４６】
ストレス下でのらん色細菌の増殖
連続白色蛍光を照射（30μＥｍ−２ｓ−１）の下、10μgml−１ストレプトマイシンを補充したBG11液体培地に気泡を送りながら、Synechococcus細胞を30℃で継代培養した(359)。bet遺伝子が発現すると、100μMコリンを添加した。塩ストレスをかけるために、種々の濃度のNaCl（0〜0.6M）を含有する新鮮培地に後期対数増殖期の細胞を移した。この培養物を数日間インキュベートした。この期間中に、Shimadzu UV-160Aを用いて730nmの吸収を測定しながら、細胞増殖をモニタリングした。SDS-PAGEおよび免疫ブロッティング法をこれまでに発表された方法で実施した(34)。6-ヒスチジン（6×Hisタグ）に対して産生される抗体をR&D Systems, Inc.（USA）から得た。DnaK蛋白を免疫ブロッティング法で検出した(34)。TOF-MS（モデルKOMPACT MALDI IV tDE Shimdzu／Kratos）を用いてグリシンベタインを測定し、活性染色によってカタラーゼ活性を評価した(35)。
【００４７】
その結果、すべての形質転換体がほぼ同じ速度で増殖でき、この形質転換体が低塩度条件下で増殖を損なわないことが示された（図１２A）。高塩度では、淡水らん色細菌Synechococcus PCC7942（対照細胞）の増殖速度が低下し、0.375M NaClより高濃度では明らかに増殖が認められなくなった。0.4M NaClでは、対照細胞およびdnaK発現細胞は増殖せず、betまたはkatE発現細胞は増殖できたが、その速度はapnhaP発現細胞よりも遅かった（図１２B）。katEおよびbetを共発現するSynechococcus細胞はkat発現細胞またはBet単独よりも若干増殖が速かった。このような結果はこれまでの報告と一致しており(35,38,39)、betまたはkatEの過剰発現によって塩ストレスに対する耐性を獲得したことを示している。apnhaP, katEおよびbetを共発現した細胞はapnhaP発現細胞に比べて増殖速度が若干低かった。katE(35), bet(38)およびdnaK(34)の発現は上記要領で確認した。NaClの濃度を0.5Mに上げると、種々の形質転換体でさらに増殖速度の低下が観察された。対照およびdnaK発現細胞のほかに、katEおよび／またはbetを発現する細胞も増殖できなかった（図１２C）。apnhaP発現細胞のみが、apnhaPおよびkatE共発現細胞やapnhaP, katEおよびbet共発現細胞に比べて増殖速度が速かった。このようなデータから、ApNhaPの過剰発現によってSynechococcus細胞の耐塩性が向上し、他の関連蛋白によるApNhaPの共発現ではApNhaP発現細胞の耐塩性が向上しなかった。
【００４８】
Ｎａ＋/Ｈ＋対向輸送体活性の測定
ApNhaP蛋白はapnhaP発現細胞で検出されており、0.3M NaClで増殖した対照細胞では検出されなかった（図１3A）。1日でApNhaPの最高濃度に達した。従って、apnhaP発現細胞の高塩度に対する耐性がApNhaP蛋白の活性によるものと考えられる。
そこで、次に、実際に、Ｎａ＋/Ｈ＋活性を基本的にNakamuraら(40)の方法にしたがって測定した。簡潔に説明すると、50ｍMジエタノールアミン-HClを含有する0.15MNaCl（pH9.3）にSynechococcus sp.PCC 7942細胞を浮遊させた。この処置によって、細胞内Ｋ＋はＫ＋/Ｈ＋対向輸送体の働きによってジエタノールアミンに代わった。20mM HEPES-NaOH緩衝液を含む0.15M NaCl（ｐH8.5）を用いて、アミン負荷細胞を洗浄した。この段階で細胞内部はジエタノールアミンの放出によって酸性になり、Ｎａ＋はＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体によってＨ＋に交換しようとする負荷がかかった。Ｎａ＋/Ｈ＋対向輸送体活性を測定する前に、0.2％グルコースを添加して細胞を賦活化し、次に50ｍMのジエタノールアミン-HCl（pH8.5）を加えた。適宜、細胞を濾過によって回収し、Shimdzu Personal Ion Analyzer PIA-1000によってフィルター上のＮａ＋イオンを測定した(35)。
【００４９】
その結果得られた、ジエタノールアミンの添加によるＮａ＋負荷細胞のＮａ＋排出活性を図１３B〜Dに示す840)。中性ジエタノールアミンは細胞を貫通し、プロトン化した。必要なプロトンはＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体を介して、Ｎａ＋の交換によって、細胞外から取り込まなければならない。このようにＮａ＋の排出活性はＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体活性を反映している。対照とApNhaP発現細胞が異なる塩度条件下で異なるＮａ＋排出活性を示すかどうか調べた。図１３B〜Dに、ジエタノールアミンを添加して細胞内Ｎａ＋が最初の数分できわめて急速に減少し、その後緩徐に減少していった。細胞内Ｎａ＋が最も大きく減少したのは、0.3M NaClを含有するBG11培地で増殖する細胞（図１３C）であり、これに続いて何も添加しない培地（図１３B）、次に0.5M NaClを含有する培地（図１３D）で増殖する細胞であった。対照とNaClが不在で増殖したApNhaP発現細胞との間にＮａ＋排出活性の差はなかった（図１３B）。0.3M NaClで増殖させた場合、対照細胞に比して、ApNhaP発現細胞ではやや強いＮａ＋排出活性が観察され（図１３C）、0.5M NaClで増殖させた場合さらに大きい差が観察された（図１３D）。このようなすべての結果から、ApNhaP発現細胞が対照細胞に比して高塩度で対向輸送体活性が高いことが示された。
【００５０】
次に、ApNhaP発現細胞の増殖速度に対する塩の刺激作用を調べた。塩刺激（0.65M NaCl）によって、ApNhaP発現細胞は10時間後まで増殖可能であったが、対照細胞はそれより遅い速度で3時間までしか増殖しなかった（図１４A）。細胞死はApNhaP発現細胞に比べて対照細胞で高速かつ早期に検出された。1.2時間の塩ショック後に、ジエタノールアミンを添加すると対照細胞に比してApNhaP発現細胞で強いＮａ＋排出活性が観察された（30％と75％、15分）（図１４B）。
【００５１】
光合成活性の評価
塩ストレスは数種の光合成生物で光合成活性を損なうことがわかっている(39)。ApNhaPの発現は塩刺激後の光合成活性を増強させるかどうかを調べるために、現在作用している光化学系II（PS II）の割合を以下にしめすように、R値で表して測定した。
即ち、光化学系II（PSII）における見かけ上の量子収量をPAM 蛍光光度計（Walz, Effeltrich,ドイツ）を用いて測定した(35)。650nmのピーク発光で光発光ダイオードからパルス変調励起を得た。変調した蛍光をλ>710nmで測定した（Schott RG9ロングパスフィルタ）。PAM-102およびPAM-103の付属モジュールはそれぞれ照射光（actinic light）と飽和パルスの管理に用いた。測定前に、10分間細胞を暗室におき、連続光（200μＥｍ−２ｓ−１）のもとPSIIの量子収量を測定した。PSIIの量子収量をF/Fm’=（Fm’-F）/Fm’の式で計算した。式中、FおよびFm’はそれぞれ飽和フラッシュ前後の照射下の蛍光レベルを表す。フラッシュの強度と持続時間は、それぞれ7000μＥｍ−２ｓ−１と800msであった。
その結果、図１４Cに示すように、塩刺激前は対照のR値もApNhaP発現細胞のR値もほぼ同じ0.90と0.85であった。しかし、塩刺激から1.2時間後、この値はそれぞれ0.32と0.64に減少した。これを図１４Bの結果と総合すると、光合成活性を強く維持する細胞の力は有効なＮａ＋排出に左右されることが判った。
【００５２】
ApNhaP発現細胞の海水中での増殖
更に、図１５Aに示すように、ApNhaP発現細胞が海水中で増殖できるということを実際に確認した。海水は愛知県三河地方で採取したものであり、その塩度は30.4psuであった。Betおよび／またはKatEのいずれかを発現する形質転換細胞は海水中で増殖できなかった。ApNhaPおよびKatEの共発現はApNhaP発現細胞の増殖速度に比べて速かったが、0.5M NaClを含有するBG11を増殖培地として用いた図１２Cの結果とは対照的である。ApNhaP発現細胞に比べて増殖速度は遅かったものの、ApNhaP, KatEおよびBetを共発現するSynechococcus細胞は海水中でも増殖を維持することができた。このような結果から、ApNhaPの過剰発現によって淡水らん色細菌Synechococcus細胞が海水中で増殖できるほどの耐塩性を獲得したことは明確である。海水中でSynechococcus細胞が増殖する間、対照とApNhaP発現細胞との吸収スペクトルの差が認められた。図１５Bに示すように、ApNhaP発現細胞は630 〜680nmの領域で典型的な吸収速度を示した。これに対して、対照細胞は680nm領域に比べて630nm領域での吸収性は有意に低いことがわかる。この吸収ピークはそれぞれフィコビリソームとクロロフィルを表しているので、上記データは対照細胞のフィコビリソームの変性がクロロフィルよりも早く生じたことを示しており、フィコビリソームが高塩度による損傷を受けやすいターゲットであることがわかる。
【００５３】
Synechococcus細胞は低塩度でのＮａ＋とＨ＋の交換能が十分であることが上記データから判明した。高塩度では、Ｎａ＋排出活性が弱いためにSynechococcus細胞がＮａ＋流入にうまく対応できず、増殖が中止した。Synechococcus細胞でのApNhaPの過剰発現によって、高塩度培地および海水中において増殖を再開できた。これは淡水らん色細菌Synechococcus sp.PCC7942が遺伝子工学によって海水中で生存できたことを示す最初の報告である。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によって、新たなイオン特異性を有するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子を単離することに成功し、該遺伝子で形質転換したアンチポーター欠損株である大腸菌においてＮａ＋感受性表現型及びＣａ２＋感受性表現型が相補されることが判明した。更に、該遺伝子で形質転換された淡水らん色細菌Synechococcus細胞内におけるApNhaPの過剰発現によって、淡水らん色細菌が海水中で増殖できるほどの耐塩性を獲得出来ることが判明した。
従って、本発明は、該遺伝子を利用して、耐塩性作物を開発、創出して食料生産の向上に寄与することの出来る、有力な方法を提供するものである。
【００５５】
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【００５６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  pASNhaPとpSANhaPのキメラプラスミド構築に関する概略図（B）を示す。
【図２】  A. halophyticaのapnhaP座のゲノム構造  A：遺伝子と制限部位  B：apnhaPとチトクロムｃ５５０の接合部のヌクレオチド配列。apnhaPとチトクロムｃ５５０のヌクレオチド配列から演繹したapnhaPの推定上の-10（ATGAAT）および-35（TACACT）コンセンサス配列とアミノ酸配列も示す。
【図３】  Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーターの推定アミノ酸配列の比較  A：8種の生物に由来するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの推定アミノ酸配列のアラインメント。この配列はプログラムClustalWによって整列化した。このアラインメントはSOS1、ヒトNHE1、酵母NHX1のN末端の550個のアミノ酸残基をもとにしている。すべての配列に保存されたアミノ酸残基を黒で強調表示し、保存的置換を点で示した。保存Asp（ApNhaPのAsp１３９）をアスタリスクで示す。予測される膜貫通領域をアラインメントの上に示す。  B：8個のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの系統学的解析。複数の配列アラインメントと系統樹の作製はそれぞれClustalWおよびTreeViewソフトを用いた。
【図４】  3種のE. coli細胞の増殖速度に対するＮａＣｌの作用  LBK培地における対数増殖期の対照細胞と形質転換細胞を指示されたＮａＣｌ濃度を含む新鮮LBK培地（pH 7.0）に移した。  A：LBK培地における増殖の推移  B：0.2 M ＮａＣｌを含有するLBKにおける増殖の推移  丸：対照細胞  四角：ApNhaP発現細胞
三角：SynNhaP発現細胞。各値は3つの測定値の平均である。
【図５】  3種のE. coli細胞の増殖速度に対するpHとＮａＣｌの作用  LBK培地における対数増殖期の対照細胞と形質転換細胞を指示されたＮａＣｌ濃度を含み、指示されたpHの新鮮LBK培地に移した。増殖温度は30℃であった。0 M ＮａＣｌ（A）、0.2 M ＮａＣｌ（B）0.5 M ＮａＣｌ（C）を含むLBK培地での増殖の推移。白四角：ApNhaP発現細胞、pH 8.0。網掛けした四角：pH 8.5。黒四角：pH 9.0。白三角：SynNhaP発現細胞、pH 8.0。網掛けした三角：pH 8.5。黒三角：pH9.0。白丸：対照細胞、pH 8.0。網掛けした丸：ph 8.5。黒丸：pH 9.0。各値は3つの測定値の平均である。
【図６】  アクリジンオレンジ蛍光クエンチング法で測定したＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性  対照E. coli細胞とApNhaPおよびSynNhaPを発現するE. coli細胞を塩を追加することなくLBK培地で増殖させた。この細胞から反転膜小胞を調製した。アンチポーター活性は実施例に記載した要領で測定した。上段にはApNhaP発現細胞と対照細胞（pTrcHis2C）の典型的なクエンチングパターンを示す。A, B, Cにはそれぞれ、Ｎａ＋/Ｈ＋, Ｌｉ＋/Ｈ＋,Ｃａ２＋/Ｈ＋アンチポーター活性のpH依存性を示した。塩（ＮａＣｌ, LiCl, ＣａＣｌ２）の最終濃度は5 mMであった。各値は3つの個別測定値の平均である。
【図７】  3種のE. coli細胞の増殖速度に対するLiClおよびＣａＣｌ２の作用  規定のLiClまたはＣａＣｌ２濃度のLBKまたはトリスE培地に、LBK培地で対数増殖期にある対照細胞および形質転換細胞をそれぞれ移した。他の実験条件は図４の説明に記載したとおりである。各値は3つの個別測定値の平均である。
【図８】  キメラＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの副次的構造モデル  キメラＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターを実施例に記載の要領で構築した。C末端親水性尾部にかかる陽性電荷と陰性電荷の数を示す。
【図９】  キメラアンチポーターの活性  ASNhaPキメラとSANhaPキメラを発現するE. coli細胞は塩を追加することなくLBK培地で増殖させた。この細胞から反転膜小胞を調製した。アンチポーター活性は実施例に記載の要領で構築した。各値は3つの個別測定値の平均である。
【図１０】  ASNhaPキメラとSANhaPキメラを発現するE. coli細胞の増殖速度に対するＮａＣｌ, LiCl, ＣａＣｌ２の作用  LBK培地で対数増殖期にあるASNhaPキメラとSANhaPキメラを発現するE. coli細胞を0.2 M ＮａＣｌを含むLBK培地、0.4 mM LiClを含むLBK培地、0.1 M ＣａＣｌ２を含むトリスE培地に移した。他の実験条件は図４の説明に記載した要領と同じである。各値は3つの個別測定値の平均である。
【図１１】  発現ベクターの概略図を示す。
【図１２】  対照と形質転換Synechococcus細胞の増殖速度に対する塩ストレスの作用。規定のNaCl濃度を含む新鮮培地にBG11培地で対数増殖期にある対照と形質転換細胞を含浸して、塩ストレスをかけた。
【図１３】  ApNhaPの蓄積量（A）とＮａ＋負荷細胞からのＮａ＋排出量（B,C,D）。Aでは、対照とApNhaP発現細胞をBG11培地で増殖し、0.3M NaCl含有培地に移した。規定時間インキュベートした後、細胞を回収し、免疫学的分析を行った。B,C,Dでは、対照（白丸）とApNhaP発現細胞（黒丸）を規定濃度のNaClを含むBG11培地のなかで１日増殖させた。次に、Ｎａ＋排出を誘発するジエタノールアミン（EA）を測定した。
【図１４】  対照とApNhaP発現Synechococcus細胞における増殖速度（A）、Ｎａ＋排出活性（B）、光合成電子輸送活性（C）に対する塩刺激の作用。BG11培地で対数増殖期の対照およびApNhaP発現細胞を回収し、0.65M NaClを含有する新たな培地に移した。
【図１５】  海水中の対照と形質変換Synechococcus細胞の増殖曲線（A）と吸収スペクトル（B）。BG11培地で対数増殖期の対照および形質転換細胞を海水に移した。海水に移して3日後に、対照およびApNhaP発現細胞の吸収スペクトル（B）を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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