(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的原料の処理により、二本鎖核酸から単鎖核酸を分離するための方法であって、前記処理が以下の工程を含む方法：
ａ）前記生物学的原料を塩、及びアルコール基を含む物質を含む水溶液に溶解する工程
ｂ）前記の生物学的原料を溶解した水溶液における、塩、及びアルコール基を含む物質を、全核酸（単鎖核酸及び二本鎖核酸）が無機支持体に吸着される濃度に調整し、この濃度に調整した水溶液を無機支持体に供給し全核酸を無機支持体に吸着させる工程
ｃ）前記無機支持体を任意に洗浄する工程、
ｄ）より低いイオン強度及びアルコール基を有する物質のより低い濃度の溶液により二本鎖核酸を前記無機支持体から選択的に溶出する工程、および
ｅ）任意に単鎖核酸を前記無機支持体から溶出する工程。
【請求項２】
生物学的原料の処理により、単鎖核酸から二本鎖核酸を分離するための方法であって、前記処理が以下の工程を含む方法：
ａ）前記生物学的原料を塩、及びアルコール基を含む物質を含む水溶液に溶解する工程
ｂ）前記の生物学的原料を溶解した水溶液における、塩、及びアルコール基を含む物質を、全核酸（単鎖核酸及び二本鎖核酸）が無機支持体に吸着される濃度に調整し、この濃度に調整した水溶液を無機支持体に供給し全核酸を無機支持体に吸着させる工程
ｃ）前記無機支持体を任意に洗浄する工程、
ｄ）アルカリ土類金属イオンを結合する物質及び／又は湿潤剤、洗浄剤、若しくは分散剤並びに１種以上の塩を含む溶液により単鎖核酸を前記無機支持体から選択的に溶出する工程、および
ｅ）任意に二本鎖核酸を前記無機支持体から溶出する工程。
【請求項３】
アルカリ土類金属イオンを結合する物質が、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）又はＥＧＴＡであり、湿潤剤、洗浄剤又は分散剤がサルコシネートである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記水溶液を無機支持体に供給する前に、前記生物学的原料を０．１〜１０Ｍの濃度のカオトロピック物質で細胞溶解する工程をさらに含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
無機支持体に供給される前記水溶液中の塩が、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、塩化マグネシウム、尿素及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、０．１〜１０Ｍの濃度である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
アルコール基を含む物質が１〜９０容量％の濃度の低級脂肪アルコールである請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
単鎖核酸がRNAであり、二本鎖核酸がDNAである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、全核酸を同時に無機支持体に吸収させ、分別溶出により二本鎖核酸及び単鎖核酸に分離するか、液体試料の二本鎖核酸または単鎖核酸を無機支持体に選択的に吸収させることによる、核酸混合物のその二本鎖及び単鎖フラクションへのクロマトグラフィー分離のための方法、並びに本発明の方法を実施するための溶液及びキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
RNA及びDNAの両者を含む核酸の製造は益々重要なものとなってきている。これは例えば、RNAあるいはDNAを単離する生物学的原料を例えば機械的作用あるいは化学的作用、例えば洗剤による処理、により溶解することを含む。そして核酸の回収のための細胞溶解の後、通常は塩化セシウム密度勾配遠心分離、あるいはフェノール抽出を行う。これらの方法は核酸の単離のために有用であるが、その使用を困難にする欠点を有している。即ち、塩化セシウム密度勾配遠心分離は時間と費用のかかる超遠心分離の使用を必要とし、一方フェノールで処理することは作業者の保護の観点から問題である。
【０００３】
そこで、核酸の単離を簡易化するための試みが過去に多くある。
DE 36 39 949 A1 、DE 40 34 036 A1 あるいはDE 41 39 664 A1 は、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のような多くの装置を要する方法を避けながらクロマトグラフィー法による核酸の精製を改良することに関する。これらの方法は例えば超遠心分離やフェノール抽出よりは進歩しているが、技術的にまだ複雑であり、労力を要するものである。分画化には多くの連続的な精製段階を必要とすることが多いので、例えば物質の損失の面から、少量の試料を処理することには特に問題が多い。
【０００４】
EP 0 389 063 A2 も核酸の単離方法に関する。核酸を含む原料はカオトロピックイオンの存在下に溶解され、次いでそのような条件下に核酸を吸着するような物質で処理される。そのような物質としては、珪藻土あるいはその他のシリカ含有無機支持体が挙げられている。EP 0 389 063 A2 に挙げられた方法によればRNAとDNA、及びRNAとssRNAを同時に分離することができる。しかし、二酸化ケイ素支持体に結合した核酸のDNAとRNAフラクションへの所望の分画化は達成されていない。RNAはその後RNアーゼを添加することにより分解し、DNAを残すことができる。
【０００５】
米国特許5,155,018 号において、ギレスピイ(Gillespie)らは、RNA、DNA及びその他の細胞内容物を含む生物学的原料から、生物学的に活性なRNAを単離及び精製する方法を開示している。RNAを含む原料は、例えば細かく粉砕されたガラスのような材料を含むシリカゲルからなる粒子と接触させられる。そこからRNAが前記物質に吸着される結合バッファーはカオトロピック塩を含む酸性化溶液である。そのような条件下、RNAはシリカ物質に結合するが、DNAはしない。酸性化カオトロピックバッファーの使用は、グアニジニウムチオシアネート(GTC) を含む結合バッファーの酸性化がシアン化水素の生成の危険を伴い、従って特に注意を払う必要があるという欠点を有する。また、DNAが酸の作用により破壊される。さらに、この方法では本来の試料からDNAを精製することはできない。
【０００６】
米国特許第5,075,430 号において、リトル(Little)はDNAをカオトロピック剤の存在下に珪藻土に固定し、水または低塩含量のバッファーによりDNAを溶出することによる単鎖及び二本鎖のプラスミドあるいはその他のDNAの精製方法を記載しているが、この方法ではDNA/RNAの精製は不可能である。
“アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)" 121, p.382-387 (1982) において、M.A.マルコ(M.A. Marko)らは、アルカリ抽出及びガラス粉末に対する結合を使用した、高度に精製されたプラスミドDNAの大規模な単離のための方法を記載しているが、単一の試料からのRNAとDNAの分画化及び別々の精製については記載していない。
【０００７】
核酸の未処理の調製物にその後の反応を行うが、これらのその後の反応については、単離手順及び単離された核酸の純度と完全性の両者について一定の要件が課される。特に、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応) 、LCR(リガーゼ連鎖反応) 、NASBA(核酸配列をベースとする増幅) あるいは3SR(自己維持配列複製) 等の酵素的増幅反応を行う場合には、他の試料との相互の汚染の危険なく核酸調製物を得ることが可能でなければならず、単離された核酸が阻害細胞成分及び／または代謝物を含まないものでなければならない。その特異性及び感度により、DNAの酵素的増幅 (例えばPCR)あるいはRNAの酵素的増幅 (例えばRNA-PCR)は、基礎研究の分野だけでなく、例えば微量の細胞及び／または組織あるいはバイオプシー材料からの核酸配列の検出、あるいは血液もしくは血漿からのウイルス核酸の検出等のための医療分野及び診断用途の分野においても重要度を増しつつある。これらの用途は、上記に挙げた要件の他、核酸の単離方法の収率と再現性について最も高度な要件を課すものである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の一つの目的は、細胞溶解物及び組織溶解物のような、同一の生物学的試料からRNA及びDNAを別々に精製することだけでなく、一般的に単鎖核酸から二本鎖のものを分離することもできる方法を提供することである。そのような方法の実施は、例えば安価な非修飾分離材料を使用することにより、できるだけ安価なものであるべきである。加えてそのような方法は、診断用の試料調製に適し、種々の増幅方法にも適合したものであるべきである。さらに先行技術について述べたような欠点を有していないことが必要である。
【０００９】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
驚くべきことに、本発明の目的は、請求項１又は２に記載の方法により達成される。請求項３〜１９は本発明の方法の好ましい態様に係わり、請求項２０は本発明の方法を実施するのに必要な成分を含むキットに係わる。
より詳細には、生物学的原料からの二本鎖及び単鎖核酸構造物を分画化するための本発明の方法は、以下の択一的方法により表される。
【００１０】
本発明の方法の第１の態様においては、単鎖核酸及び二本鎖核酸の分離のための処理条件は、アルカリ土類金属イオンを錯化する物質がアルコール基を含む物質の存在しない前記溶液中に含まれ、前記単鎖核酸は第１の無機支持体に吸着されず、試料の残りから分離できるように調整される。分離された単鎖核酸はそれ自体公知の方法によりさらに処理することができる。これに対し二本鎖核酸は第１の無機支持体に主として結合し、任意に行われる洗浄段階の後、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができる。このようにして得られる二本鎖核酸はその後それ自体公知の方法でさらに精製することができる。
【００１１】
回収される非吸着単鎖核酸はその後、特にアルコール基を有する物質を添加することにより、単鎖核酸が第２の無機支持体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができるようになる条件に調整することができる。
【００１２】
処理条件を、溶液に湿潤剤、洗浄剤あるいは分散剤が含まれ、アルコール基を有する物質が存在しないように調整すると、そのような条件下では単鎖核酸は第１の無機支持体に吸着されず、従って試料の残りから分離し、さらに処理することができる。これに対し二本鎖核酸は第１の無機支持体に主として結合し、任意に行われる洗浄段階の後、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができる。溶出された二本鎖核酸はその後それ自体公知の方法でさらに精製することができる。
【００１３】
回収される非吸着単鎖核酸はその後、好ましくはアルコール基を有する物質を添加することにより、単鎖核酸が第２の無機支持体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができるようになる条件に調整することができる。
【００１４】
本発明の方法の別の態様においては、両者とも結合された単鎖核酸及び二本鎖核酸の分画化を行う。これは、塩、特にカオトロピック物質、及びアルコール基を有する物質の適当な水性混合物で、処理条件を、単鎖核酸及び二本鎖核酸からなる全核酸が無機支持体に吸着されるようになるように調整し、次いで第１の支持体に結合した二本鎖／単鎖核酸を、より低いイオン強度及びアルコール基を有する物質のより低い濃度の溶液で処理することにより二本鎖核酸を選択的に溶出するか、あるいはアルカリ土類金属イオンを錯化する物質及び／または湿潤剤、洗浄剤もしくは分散剤並びに１種以上の塩、特にカオトロピック剤を含む溶液で単鎖核酸を溶出することにより分画化することを含む。最初の場合においては、単鎖核酸は支持体に結合して残り、これに対し２番目の場合は二本鎖核酸が無機支持体に結合して残る。それぞれの溶出フラクションはその後それ自体公知の方法によりさらに処理することができる。
【００１５】
本発明によれば、核酸の分離のためのアルコール基を有する物質及び塩、特にカオトロピック物質での処理条件の調整は、本明細書において初めて規定される以下の物理化学的原則に基づいて実施される。
【００１６】
尚、本願請求項に記載された本発明の方法以外に、以下の方法もあり得る。
分離するべき核酸の種類（単鎖及び二本鎖のもの）を含む試料を少なくとも１種の無機支持体で処理し、ここで処理条件は、塩、特にカオトロピック物質、及びアルコール基を含む物質の適当な水性混合物により、単鎖核酸フラクションが主として第１の無機支持体に吸着され、二本鎖核酸は吸着されないように調整する。その後流出する二本鎖核酸はそれ自体公知の方法によりさらに処理することができる。任意に洗浄段階を行った後、第１の無機支持体上に吸着された単鎖核酸を低イオン強度条件下に、あるいは水で溶出する。回収された非吸着二本鎖核酸は、例えば、その後に塩、特にカオトロピック物質、及びアルコール基を有する物質の適当な水性混合物で、二本鎖核酸が第２の無機支持体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができるようになる条件にフラクションを調整することによりさらに精製することができる。
【００１７】
図１は、単鎖RNA及び二本鎖DNAにより例示される単鎖/二本鎖核酸の結合を示す。ここに記載するのは、アルコール基を有する物質 (ここではエタノール) とカオトロピック物質 (ここではGTC)の濃度の関数としての組織溶解物からのRNA/DNAの無機支持体への結合である。アルコールまたはカオトロピック剤のいずれかの物質の濃度を一定とする条件下では、高いアルコール濃度及び／またはカオトロピック物質の量において、両方の種類の核酸(RNA/DNA) が無機支持体に結合することが判った。一方または両方の物質 (アルコールまたはカオトロピック剤) の濃度が規定値よりも低くなると、実質的な程度で無機支持体に結合する核酸はない。驚くべきことに、その中間においては、RNA及びDNAが、核酸の分離に利用できるような異なる程度で無機支持体に結合する。従って、細胞から開始して、高い濃度のカオトロピック物質による細胞の溶解の後、カオトロピック物質とアルコール基を有する物質の濃度を、その後にアルコール基を有する物質またはアルコール基を有する物質及び水もしくはバッファーの混合物を加えることにより、RNAの選択的結合を得、一方DNAは通過物中に残るように調整できる。図１による実施例においては、1.75 M GTC及び30容量% のエタノールの濃度を選択して分別結合によりDNAからのRNAの分離を得るものである。
【００１８】
一方、単鎖核酸及び二本鎖核酸の無機支持体への同時の結合は、アルコール基を有する物質の高い濃度及び／またはカオトロピック物質の高い濃度の条件下で得られ、二本鎖核酸の脱着は、最初にアルコール基を有する物質及び／またはカオトロピック物質の濃度を低下させることにより開始できる。単鎖核酸は結合したまま残り、一方または両方の物質がさらに減少したときに溶出される。図１による実施例においては、1.75 M GTC及び45容量% のエタノールの濃度を選択して全核酸の結合を得るものである。実施例８において説明するように、DNAの選択的脱着のためには0.3 MのGTC及び10容量%のエタノールの濃度を選択する。
このように、無機支持体への吸着によりRNA及びDNAを分離でき、あるいは全核酸を最初に無機支持体に吸着させ、次いで単鎖核酸または二本鎖核酸を選択的に溶出することができる。
【００１９】
任意に、それぞれの核酸 (単鎖核酸または二本鎖核酸) の溶出の前に洗浄段階を行うこともできる。
次いで、低イオン強度条件下あるいは水で溶出をそれぞれ行う。無機支持体から最初に脱着される核酸は、後にイオン強度及び／またはアルコール基を含む物質の濃度を増加させることにより、二本鎖核酸または単鎖核酸が第２の無機支持体に吸着され、任意に行われる洗浄段階の後、低イオン強度条件下あるいは水で溶出されるように調整することができる。
【００２０】
核酸は、例えば塩化ナトリウム／エタノール混合物中で無機支持体に吸着し、低イオン強度条件下あるいは水で溶出できるので、本発明の方法に使用される塩溶液は必ずしもカオトロピック塩を含む必要はなく、任意の塩溶液をアルコール基を含む物質と組み合わせて使用することができると考えられる。
【００２１】
本発明の方法は、少量の試料の処理を可能とし、取り扱いが簡単で安全であり沈殿段階がないので有利である。さらに本発明の方法は比較的安価に人手をあまり必要とせず行うことができ、多数の試料を同時の処理を容易に可能とする。本発明の方法は融通性があり取り扱いが容易であることから、操作を自動化するのにも適している。
【００２２】
本発明の方法により、二本鎖/単鎖核酸構造物を核酸構造物を含む原料から分離することができる。分離される核酸構造物を含み得る原料は、例えば請求項７に挙げた原料を含む。それらは特に、細胞培養物、あらゆる種類の組織、体液、例えば血液、血漿、血清、尿、糞便；微生物、例えば細菌、ウィルス、例えばサイトメガロウィルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、δ型肝炎ウィルス；植物、植物の部分、胎児、胚、果実、あるいは例えばin vitro転写及び／またはcDNA合成及び／または逆転写のような酵素反応とその後のポリメラーゼ連鎖反応(PCR) の後の核酸を含む混合物である。
【００２３】
好ましくは、細胞は最初に、カオトロピック物質及び／またはその他の塩を含む水性溶解系中で、最も簡単な場合においてはそれを細胞に添加することにより溶解される。この溶解工程は任意に機械的作用により促進してもよい。
その後、このように処理された試料を課題に応じて、即ちどの種類の核酸をその他のものから分離したいかにより、請求項１又は２に記載したようにさらに処理する。
【００２４】
例えば細菌のような、挙げられた材料のいくつかのものはその細胞壁の状態によりカオトロピック物質を含む水性系では直接溶解することができない。そこでこれらの出発材料については、本発明の方法に使用する前に、例えば溶解酵素により前処理しなければならない。
核酸を含む原料を溶解するための系は、好ましくは、0.1 〜10 Mの濃度のカオトロピック物質の溶液である。カオトロピック物質としては、特に、塩、例えば過塩素酸ナトリウム、塩化グアニジニウム、グアニジニウムイソチオシアネート/グアニジニウムチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、及び／またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２５】
塩、例えば塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、塩化マグネシウムを0.1 〜10 Mの濃度で含む水溶液、または尿素を対応する0.1 〜10 Mの濃度で含む水溶液、及び／またはそのような物質の組み合わせも、核酸を含む原料を溶解しあるいは結合するための水性系として使用することができる。
【００２６】
アルコール基を含む物質は好ましくは１〜５の炭素原子を有する低級脂肪アルコール、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール及びペンタノールである。これらは好ましくは１〜90容量% の濃度で使用される。
【００２７】
無機支持体は好ましくは、多孔質あるいは非多孔質の金属酸化物あるいは混合金属酸化物、シリカゲル、主としてガラスからなる物質、例えば非改変ガラス粒子、粉末化ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタン、二酸化ジルコニウムからなり、無機支持体の粒子径は0.1μm 〜1000μmであり、孔径は2 〜1000μmである。前記多孔質あるいは非多孔質の支持体材料は、緩くパックされた形態であってもよく、あるいはガラス、石英あるいはセラミックからなるフィルター層、及び／またはシリカゲルが配置された膜、及び／または無機支持体から形成される粒子または繊維、及び石英またはグラスウールの織物、並びに官能基を有しているか有していないラテックス粒子、あるいはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオリド、特に超高分子量ポリエチレン、高密度ポリエチレンからなるフリット材料の形態とすることができる。
【００２８】
アルカリ土類金属イオンを結合する物質としては、特に、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)あるいはEGTAを使用することができ、サルコシネートを湿潤剤、洗浄剤または分散剤として使用できる。
【００２９】
所望ならば、本発明により得られた核酸を、アニオン交換クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法によりさらに精製することができる。
【００３０】
本発明の方法においては、RNA、特に単鎖核酸としてのRNAを二本鎖核酸(DNA) から分離できる。DNAが単鎖形態で存在する場合には、そのようなDNAも二本鎖DNA並びに二本鎖RNAから分離できる。
【００３１】
本発明の方法に使用される溶液もまた本発明の主題である。溶解バッファー及び／または結合バッファーとして、本発明に従い、特に0.5〜8.0M のグアニジニウムイソチオシアネート/グアニジニウムチオシアネート、及び／または塩化グアニジニウム、及び0 〜50%のエタノール及び／またはイソプロパノールを含む水溶液を使用することができる。
【００３２】
無機支持体に結合した核酸を洗浄除去または溶出するための溶液としては、0.1 〜3 Mのグアニジニウムイソチオシアネート/グアニジニウムチオシアネート、及び／または塩化グアニジニウムを、1 〜30%のエタノール及び／またはイソプロパノールとともに含む水溶液を使用することができる。
【００３３】
二本鎖核酸を無機支持体に結合するために使用する水性溶液系としては、1〜5Mのグアニジニウムイソチオシアネート、及び／または1〜8Mの塩化グアニジニウムを、0.1〜5%のサルコシネート、または5mM〜200mMのEDTAとともに含む水溶液を使用することができる。二本鎖核酸を結合するためには、1〜5Mのグアニジニウムチオシアネート、及び／または1〜8Mの塩化グアニジニウム及び5mM〜200mMのEDTAまたはEGTAを含む水溶液も使用することができる。
【００３４】
前記方法を実施するための本発明による成分のキットは、特に、１以上の無機支持体を上記したような形態でその中に配置する通過流路に適した中空体を含む。無機支持体は、２つの手段の間に固定された緩くパックされたものの中にあってもよく、あるいは中空体内部に配置された膜の形態であってもよい。さらにキットは、溶液を含んでもよく、あるいはそのような溶液を配合するための成分は濃縮形態であってもよい。ユーザーは必要な溶液をそれぞれ必要な濃度で調製することができる。
【００３５】
キットのその他の成分として有利なものは、細胞溶解物の溶液を均質化するための装置である。均質化のための特に好ましい装置は国際特許出願WO95/18851に提案されている。この装置は、本質的に少なくとも２つの多孔質層からなり、その多孔質層は層中の流れの方向にみて減少する孔径を有するものである。細胞溶解物が減少する孔径を通過すると、細胞溶解物の粘性の溶液が均質化される。
【００３６】
【実施例】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
材料及び方法
1.  シリカ支持体材料
シリカ支持体材料は膜あるいは懸濁粒子の形態で使用した。
1.1.  シリカ膜
シリカ膜（例えばワットマン(Whatman)社の繊維ガラスフィルター) の２層をP 43 21 904 に記載されたように遠心分離クロマトグラフィーカラム（「スピンカラム」）中に固定した。膜形態の支持体材料については標準プロトコルの「スピン法」を行った(cf. 4.1) 。
1.2.  シリカ粒子
いくつかの種類のシリカ粒子（例えば、ダルムスタット(Darmstadt)、ドイツのメルク(Merck)社及びセントルイス(St. Louis)のシグマ(Sigma)社のもの) をそれぞれ使用した溶解バッファー(cf. 3.1.)中の50%懸濁物として使用した。平均粒子径は材料により0.5〜50μmであった。標準プロトコルの「バッチ法」を行った(cf. 4.2) 。
【００３７】
2.  核酸を含む原料
2.1.  組織
調製に使用した組織は収集した直後に液体窒素中で凍結し、-70℃で貯蔵した。あるいは新鮮組織を使用した。
2.2.  植物
葉を液体窒素下に乳鉢ですりつぶし、微細な粉末を得、調製に直接使用するか-70℃で貯蔵した。
2.3.  細胞培養物
細胞を回収した後、PBSで２回洗浄し、ペレット化した。適当な数(トーマ(Thoma)チャンバー中で計数して測定した) の細胞を含むアリコートを、調製に新鮮なまま使用するか、-20℃で貯蔵した。
あるいは、固着増殖した細胞を培養皿中で洗浄し、それぞれの溶解バッファー(cf. 3.1.)を添加することにより培養皿中で直接溶解してもよい。
2.4.  血漿
ACD血液を3000xgで10分間遠心分離し、上清を取って再度同様に遠心分離した。２回目の遠心分離の後に得られた上清からアリコートを作製し、-70℃で貯蔵した。
2.5.  細菌
培地に一晩培養物を接種し、0.5 〜0.8のOD600まで増殖させた。適当な数の細胞(1 OD600=109細胞/ml)を含むアリコートをペレット化し、細胞ペレットを-20℃で貯蔵するか、新鮮なまま調製に使用した。
【００３８】
3.  試薬
3.1.  溶解バッファー
L1    4.5 M GTC（グアニジウムチオシアネート）, 25mMクエン酸ナトリウム, pH 7.5, 0.7%β-メルカプトエタノール(MSH)
L2    4.0 M GTC, 25mMクエン酸ナトリウム, pH 7.5, 0.7%β-MSH
L3    5.0 M GTC, 50mMトリス/HCl, pH 7.0
L4    3.5 M GTC, 25mMクエン酸ナトリウム, pH 7.5, 1%β-MSH
L5    2.5 M GTC, 25mMクエン酸ナトリウム, pH 7.5, 1%β-MSH, 30%エタノール
L6    8.0 M GuHCl（塩化グアニジニウム）, 20mM MOPS, pH 7.0, 0.7% β-MSH
L7    3.0 M GTC, 25mMクエン酸ナトリウム, pH 7.5, 1%β-MSH
L8    4.0 M GTC, 50mMトリス/HCl, pH 7.5, 1%サルコシル
L9    4.0 M GTC, 50mMトリス/HCl, pH 7.5, 25 mM EDTA
3.2.  結合バッファー
B1    エタノール
B2    n-ブタノール
B3    イソプロパノール
B4    水中70% エタノール
B5    5.9 M GTC
3.3.  洗浄バッファー
W1    2.0 M GTC, 25mMトリス/HCl, pH 7.5, 30%エタノール
W2    4.0 M GTC, 40mMトリス/HCl, pH 7.5, 20%イソプロパノール
W3    1.0 M GTC, 25mMトリス/HCl, pH 7.5, 20%エタノール
W4    5.0 M GuHCl, 15mM MOPS, pH 7.0, 37%エタノール
W5    0.5 M GTC, 25mMトリス/HCl, pH 7.5, 10%エタノール
【００３９】
4.  標準プロトコル
4.1.  「スピン法」
1)  溶解バッファー(cf. 3.1.)を核酸を含む原料に加え、ハンドホモジナイザーにより完全に均質化する。
2)  結合試薬(cf. 3.2.)を加えそれぞれの結合条件を調整する。
3)  溶解物をスピンカラムにピペットで取り、卓上遠心分離器で10,000rpmで15秒間、スピンカラムの膜を通して遠心分離する。溶解物の容量がスピンカラムの最大容量よりも多い場合は、この結合段階を繰り返す。
4)  カラム通過物を所望の場合にはさらに処理し、あるいは捨てる。
5)  700μl の洗浄バッファー(cf. 3.3.)をスピンカラムにピペットで取り、3)に記載したようにして遠心分離して混入細胞成分を除去する。
6)  5)のように行って膜に結合した核酸を700μl の水中の80%エタノールで２回洗浄し、塩を含まないようにする。
7)  スピンカラムを最大回転数で２分間遠心分離し、エタノールを完全に除去する。
8)  80℃に加熱した50〜100μl の水をスピンカラムの膜上に直接ピペットで取り、最大回転数で１分間遠心分離し、核酸を溶出する。必要な場合には溶出段階を繰り返す。
4.2.  「バッチ法」
1)  溶解バッファー(cf. 3.1.)を核酸を含む原料に加え、ハンドホモジナイザーにより完全に均質化する。
2)  結合試薬(cf. 3.2.)を加えそれぞれの結合条件を調整する。
3)  50μl のシリカ懸濁物 (溶解バッファー中50%)を加え、繰り返し攪拌しながら室温で10分間インキュベートして核酸を結合させる。
4)  卓上遠心分離器で10,000rpmで15秒間遠心分離し、シリカ材料をぺレット化する。
5)  上清をピペットで取り、所望の場合にはさらに処理し、あるいは捨てる。
6)  700μl の洗浄バッファー(cf. 3.3.)をペレットに加え、ペレットが完全に再懸濁されるまで攪拌し、4)に記載したように遠心分離する。
7)  700μl の水中の80%エタノールで6)の洗浄段階を２回繰り返し、シリカ材料を塩を含まないように洗浄する。
8)  ふたを開けて56℃で10分間ペレット化したシリカ材料を乾燥する。
9)  50〜100μl の水を加え、攪拌することによりペレットを完全に再懸濁し、繰り返し攪拌しながら56℃で10分間インキュベートする。必要な場合にはこの溶出段階を繰り返す。
10) 最大回転数で１分間遠心分離し、上清を新しい反応容器に移す。
【００４０】
5.  電気泳動法
単離された核酸をアガロースゲル上でエチジウムブロミドにより染色して分析した。この目的のため、1.2%ホルムアルデヒドまたは1.2% 1 x TBEゲルを調製した。
ゲル上を流した後、ホルムアルデヒドゲルを水中で3〜4時間攪拌し、その後10μg/ml RN アーゼA 中で一晩攪拌してRNAを消化し、DNAをより容易に可視化できるようにした。TBEゲルは予め平衡化することなくRNアーゼ消化した。
【００４１】
以下に記載する実施例は本発明の方法の性能を示すものである。これに従って単離した全ての核酸は電気泳動により分析し、分光分析により定量した。全ての溶出物についてOD260/280値は1.7〜2.0の間であった。
【００４２】
参考例１〜５
全核酸の単離
以下の参考例１〜５においては、DNA及びRNAの両方が無機支持体に結合し、一緒に溶出されるように、結合、洗浄及び溶出条件のそれぞれを選択した。
これらの例はいくつかの異なるアルコール（エタノール、イソプロパノール、ブタノール）の結合試薬としての使用を説明するものである。
【００４３】
参考例１
腎臓組織からの全核酸の単離
15mgの腎臓組織（ラット）から、標準プロトコル4.1に従って全核酸を単離した。組織を400μl のL1と混合し、均質化し、その後280μlのB1を加えた。第１の洗浄段階はW1で行い、溶出容量は2x50μlであった。
【００４４】
参考例２
肝臓組織からの全核酸の単離
7mgの肝臓組織（ラット）から、標準プロトコル4.1に従って全核酸を単離した。組織を300μlのL2と混合し、均質化し、その後200μlのB2を加えた。第１の洗浄段階はW1で行い、溶出容量は2x50μl とした。
【００４５】
参考例３
HeLa細胞からの全核酸の単離
1x106のHeLa細胞から、標準プロトコル4.1に従って全核酸を単離した。細胞を400μlのL2と混合し、均質化し、その後200μlのB1を加えた。第１の洗浄段階はW1で行い、溶出容量は1x50μlとした。
【００４６】
参考例４
血漿からの全核酸の単離
標準プロトコル4.1及び4.2にそれぞれ従って、２つの並行した実験において全核酸を血漿から単離した。それぞれの場合、800μlのL3及び660μlのB2を200μlの血漿に加え、混合した。この場合、均質化は必要なかった。「バッチ法」(4.2) のための混合物にさらに40μlのシリカ懸濁物を加えた。両方の実験において、第１の洗浄段階はW2で行い、溶出容量は2x100μlとした。
【００４７】
実施例１
一定のGTC濃度及び増加するエタノール濃度によるRNA及びDNAの分別結合
一定のGTC濃度及び増加するエタノール濃度によるRNA/DNAの無機支持体への結合の依存性を、各試料の実験について10mgの腎臓組織を350μlのL4中で溶解し、各実験について350μlのエタノール/水混合物を加えてエタノールの濃度を調整することにより示した。前記混合物のエタノール含量は水中に20〜90%のエタノールであった。別のバッチに350μlの無水エタノールを加えた。それぞれの実験において、これは1.75Mの一定のGTC濃度及び10〜50% の範囲で増加するエタノール濃度に対応した(cf.図1)。
最初のシリーズの実験においては、このように調整した溶解物のそれぞれに、150,000cpmの32P-標識0.9kb in vitro転写物を加え、溶解物をスピンカラム上に固定した無機支持体上にピペットで取った。卓上遠心分離器で10,000rpmで15秒間遠心分離し、カラムに結合した放射能及びカラム通過物中に存在する放射能をチェレンコフ計数により測定した。
32P-標識RNAの代わりに、150,000cpmの、クレノウ充填反応により32P-標識した直線化pTZプラスミドを添加して一連の実験を繰り返した。
図１に示すように、RNAフラクションは、すでに記載した条件下において25%より高いエタノール濃度から無機支持体に結合するが、DNAフラクションは40%より高いエタノール濃度からしか結合しない。
【００４８】
実施例２〜８
全RNAの単離
以下の実施例においては、無機支持体への結合のためのアルコール／塩混合物を、RNAの選択的な結合が得られるように選択した(cf.図１）。
結合条件は、それぞれ溶解された材料の種類（組織、細胞培養物、植物、細菌）に合わせた。
これらの実施例は、出発材料の溶解のためのGTC、GuHClまたはGTC/エタノール混合物の使用を説明するものである。単離されたRNAの完全性はノーザンブロッティングまたはRT-PCRにより確認した。
これらの実施例においては、支持体に結合しなかったDNAはさらに処理しなかった。カラム通過物からのDNAのその後の精製については実施例12に示す。またDNAは、結合条件を参考例１〜５において選択したものに調整することによりさらに精製してもよい。
【００４９】
実施例２
脾臓組織からの全RNAの単離
15mgの脾臓組織（マウス）から、標準プロトコル4.1に従って全RNAを単離した。組織を350μlのL4と混合し、均質化し、その後350μlのB4を加えた。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は1x 50μlとした。
【００５０】
実施例３
肝臓組織からの全RNAの単離(A)
この実施例においては、エタノール含有溶解バッファーを使用して標準プロトコル4.1 を若干改変した。
8mgの肝臓組織（ラット）を700μlのL5と混合し、均質化した。溶解物をスピンカラムにピペットで取り、標準プロトコル4.1を段階3)から実施した。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は1x 50μlとした。
【００５１】
実施例４
肝臓組織からの全RNAの単離(B)
15mgの肝臓組織（ラット）から、標準プロトコル4.1 に従って全RNAを単離した。組織を300μlのL6と混合し、均質化し、その後175μlのB1を加えた。第１の洗浄段階はW4で行い、溶出容量は1x 50μlとした。
【００５２】
実施例５
HeLa細胞からの全RNAの単離
1x107のHeLa細胞から、標準プロトコル4.1及び4.2にそれぞれ従って、２つの並行した実験において全RNAを単離した。それぞれの場合、細胞を350μlのL7と混合し、均質化し、その後350μlのB4を加えた。「バッチ法」(4.2) の混合物にさらに50μlのシリカ懸濁物を加えた。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は1x50μlとした。
【００５３】
実施例６
タバコからの全RNAの単離
植物からの全RNAの単離のためには標準プロトコル4.1を少し改変する。該プロトコルの段階1)（溶解）の後、卓上遠心分離器による5000rpmでの遠心分離を加え、繊維残留物のような非溶解細胞成分を分離する。上清を除去し、結合試薬と混合し、前記標準法の段階2)からに従ってさらに処理する。
100mgのタバコ葉から、植物用に改変した標準プロトコル4.1により全RNAを単離した。粉末化した細胞材料を600μlのL2と混合し、均質化し、その後350μlのB4を加えた。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は1x50μlとした。
【００５４】
実施例７
大腸菌からの全RNAの単離
細菌からの全RNAの単離については、細菌の細胞壁を溶解するために前記標準プロトコルを行う前に追加の段階を加える。細胞ペレットをTE中の400μg/mlリゾチーム中に再懸濁し、氷上で５分間、そして室温で10分間インキュベートする。その後これを標準法により溶解する。
1x109の大腸菌細胞から、細菌用に改変した標準プロトコル4.1により全RNAを単離した。ペレットを80μlのTE中の400μg/mlリゾチーム中に再懸濁し、上記のようにインキュベートした。その後これに270μlのL2を加え、均質化し、350 μl のB4を加えた。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は2x50μlとした。
【００５５】
実施例８
洗浄バッファーを最適化することによる選択的RNA結合
この実施例に示すように、第１の洗浄段階（標準プロトコル4.1.5)で使用する洗浄バッファーを最適化することにより、特異的に結合したRNAからDNA混入物を除去することができる。
標準プロトコル4.1に従い、それぞれの場合について1x106のHeLa細胞を350μlのL4中で溶解し、350μlのB4と混合し、シリカ支持体に結合した。その後第１の洗浄段階において試料を以下の洗浄バッファーで洗浄した。
【００５６】
【表１】
0004036625.tif 000002
【００５７】
標準プロトコルによりその後の段階を行った。溶出容量は1x50μlとした。
溶出物の半分を1.2%ホルムアルデヒドゲル上で分析した(cf.図２)。次にゲルを「電気泳動法」で記載したようにしてRNアーゼAで処理した(cf.図３)。
【００５８】
図２及び３の説明
図２：実施例８からの溶出物を分析するための1.2%ホルムアルデヒドゲル、結合条件: 1.75M GCT, 12.5分; クエン酸ナトリウム, pH 7.5, 35%エタノール、洗浄条件: cf. 表１。トラックの番号は表１の試料の番号に対応する。
図３：図２のゲルのRNアーゼ消化物
【００５９】
実施例９及び10
DNAの単離
以下の実施例９及び10においては、DNAだけが無機支持体に結合でき、RNAは通過するように結合条件を選択した。
これらの実施例においては、支持体に結合しなかったRNAはさらに処理しなかった。カラム通過物からのRNAのその後の精製については実施例11に示す。さらにカラム通過物中のRNAは、結合条件を実施例２〜８において選択したものに調整することによりさらに精製してもよい。
DNAの選択的結合はアルコールの非存在下で溶解バッファー中で行う。即ち、標準プロトコル4.1及び4.2の段階2)を省略する。
【００６０】
実施例９
腎臓組織からのゲノムDNAの単離
10mgの腎臓組織（ラット）を700μlのL8中で溶解した。DNAは結合試薬の添加なしで無機支持体に結合し、第１の洗浄段階で700μlのL8で洗浄した。その後標準プロトコル4.1 を段階6)から行った。溶出容量は2x50μlとした。
【００６１】
実施例10
HeLa細胞からのゲノムDNAの単離
1x107のHeLa細胞を700μlのL9中で溶解した。DNAは結合試薬の添加なしで無機支持体に結合し、第１の洗浄段階で700μlのL9で洗浄した。その後標準プロトコル4.1を段階6)から行った。溶出容量は2x50μlとした。
【００６２】
実施例11〜13
全RNA及びゲノムDNAの分離
同じ細胞溶解物からのRNA及びDNAの別々の処理についての以下の実施例11〜13は、RNA、DNAあるいは全核酸分離についての上記の例の組み合わせである。
分離は、RNA及びDNAの分別結合あるいは分別溶出により行うことができる。
【００６３】
実施例11及び12
分別結合による全RNA及びゲノムDNAの分離
分別結合については、やはり２つの可能性がある。
溶解の後、DNAが最初に無機支持体に結合するように条件を選択するか（実施例11）、RNAが第１の結合段階で吸着され、DNAは通過物から別途処理されるようにすることができる（実施例12）。
【００６４】
実施例11
腎臓組織からのゲノムDNA及び全RNAの単離
10mgの腎臓組織（ラット）を350μlのL8中で溶解し、DNAを溶解バッファー中で無機支持体に結合させた。カラム通過物に350μlのB4を加え、実施例3.1に従って全RNAを単離した。ゲノムDNAの単離は参考例１のようにして行った。
【００６５】
実施例12
肺組織からの全RNA及びゲノムDNAの単離
20mgの肺組織（ラット）から、全RNAを実施例２のようにして単離した。カラム通過物中の結合しなかったゲノムDNAを、標準プロトコル4.1に記載したように、350μlのB1及び350μlのB5を添加し、DNAを無機支持体に結合することにより単離した。第１の洗浄段階はW1で行い、溶出容量は2x50μl とした。
【００６６】
実施例13
分別溶出による全RNA及びゲノムDNAの分離
以下の実施例は、無機支持体に結合した全核酸のDNAフラクションの選択的溶出を説明するものである。
結合条件は、全核酸が無機支持体に結合するように選択した。その後DNAフラクションを溶出し、RNAフラクションは結合されたままとなるようにした。溶出されたDNAは、DNA結合条件を再調整することによって別の無機支持体に結合させ(cf.図１）、さらに処理する。
肝臓組織からのゲノムDNA及び全RNAの単離
標準プロトコル4.1, 1) 〜4)に従い、15mgの肝臓組織（ブタ）を300μlのL2中で溶解し、250μlのB1と混合し、全核酸を無機支持体に結合させた。DNAフラクションは300μlのW5で溶出し、RNAフラクションを結合したままの無機支持体を標準プロトコル4.1 の5)からに従って処理した。標準プロトコル4.1 に従って350μlのB1及び250μlのB5を加え、別の無機支持体に結合させることによりDNAフラクションを溶出物から単離した。
【図面の簡単な説明】
【図１】単鎖RNA及び二本鎖DNAにより例示される単鎖/二本鎖核酸の結合を示す。
【図２】実施例８からの溶出物を分析するための1.2%ホルムアルデヒドゲルを示す。
【図３】図２のゲルのRNアーゼ消化物を示す。
【図１】
0004036625.tif 000003
【図２】
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【図３】
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