(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞のパッケージング細胞系である２９３細胞系またはＨＴ１０８０細胞系から作製され、レトロウイルスに由来するgag/pol遺伝子およびenv遺伝子を含んでなり、かつ複製コンピテントウイルスにより実質的に汚染されていないベクター粒子を生成できるレトロウイルスパッケージング細胞系であって、標準的なマウス両向性パッケージング細胞系ＰＡ３１７と比較して、少なくとも同じベクター力価、または少なくとも１０倍高いベクター力価を生成することができる、上記パッケージング細胞系。
【請求項２】
前記細胞株が異種向性パッケージング細胞系である、請求項１に記載のパッケージング細胞系。
【請求項３】
前記細胞系が多向性パッケージング細胞系である、請求項１に記載のパッケージング細胞系。
【請求項４】
前記細胞系が両向性パッケージング細胞系である、請求項１に記載のパッケージング細胞系。
【請求項５】
２９３細胞系である、請求項１に記載のパッケージング細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般にレトロウイルス、そしてより詳しくは、感受性標的細胞にベクター構造体を搬送することのできる組換えレトロウイルスに関する。これらのベクター構造体は典型的には標的細胞において所望のタンパク質を発現するようにデザインされており、このタンパク質には、数多くの手段における治療的作用を有することがあり、それ故、細胞の中へのタンパク質（又はＲＮＡ）の輸送を可能とする「薬剤」輸送系を構成するタンパク質が含まれる。酵素反応、細胞成分との結合性、免疫学的作用又はその他の生物学的作用に関するタンパク質（又はＲＮＡ）の特異性は、もしこのタンパク質又はＲＮＡ分子が細胞の中に輸送されうるなら、標的細胞に関連の特異的作用を及ぼすことを可能とする。かかる作用には遺伝的欠陥の修復、細胞プロセスをブロックするためのアンチセンスＲＮＡの生産、プロドラッグの酵素的潜在化、及び細胞免疫系の刺激、並びにタンパク質の細胞内生産に基づくその他のあらゆる治療が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
レトロウイルスは複製し、そしてＤＮＡ中間体を介して宿主細胞のゲノムの中に組込まれることのできるＲＮＡウイルスである。このＤＮＡ中間体又はプロウイルスは、宿主の細胞ＤＮＡの中に安定に組込まれうる。宿主細胞の中へのそれらの組込まれる効率性に基づき、レトロウイルスは人遺伝子治療における利用にとって最も有望とされるベクターのうちの一つである。これらのベクターは、それらが疾患の遺伝的治療にとって最も有望である技術の一つであると考えられるようにするいくつかの特徴を有している。これには：（１）紹胞の中への遺伝子物質（ベクターゲノム）の効率的な侵入；（２）標的細胞の核への侵入に現実的に有効なプロセス；（３）比較的高いレベルの遺伝子発現；（４）標的細胞に及ぼす最小の病理学的作用；及び（５）特定の細胞サブタイプを標的にする能力が含まれ、これらはベクター−標的細胞結合のコントロール及び遺伝子発現の組織特異的コントロールを介する。例えば、対象の外来遺伝子を、正常のレトロウイルスＲＮＡと置き換えてレトロウイルスの中に組込むことができる。レトロウイルスがそのＲＮＡを細胞の中に注入すると、この外来遺伝子も細胞の中に導入され、そしてそれらがあたかもレトロウイルス自体であるかのように宿主の細胞ＤＮＡの中に組込まれうる。宿主内でのこの外来遺伝子の発現は宿主細胞による外来タンパク質の発現をもたらす。
【０００３】
遺伝子治療のために開発されてきたほとんどのレトロウイルスはネズミのレトロウイルスである。簡単に述べると、これらのレトロウイルスは二つの型、即ち、宿主の細胞ＤＮＡの中に組込まれるプロウイルスとして、又は遊離ビリオンとして存在する。ビリオンは、レトロウイルスの構造及び酵素タンパク質（逆転写酵素を含む）、ウィルスゲノムの２つのＲＮＡコピー、並びにウイルスのエンベロープ糖タンパク質が埋まっている細胞の形質膜の部分を含むウイルスを形成する。このゲノムは４つの主要領域：長い末端反復（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ：ＬＴＲ）、並びにｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を編制する。ＬＴＲはプロウイルスゲノムの両端に見い出せることができ、ＲＮＡゲノムの５’及び３’末端の構成成分であり、そして転写の開始及び終結にとって必須なシス作用因子を含む。３種の遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖは末端のＬＴＲの間に位置する。ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子はそれぞれ内部ウイルス構造及び酵素タンパク質をコードする。ｅｎｖ遺伝子はエンベロープ糖タンパク質をコードし、これはウイルスに感染性及び宿主域特異性を授ける。
【０００４】
遺伝子治療のためにレトロウイルスを用いるうえでの重要な概念は「安全」なレトロウイルスの利用である。パッケージング細胞系はこの概念に合うように開発されている。簡単に述べると、この方法論は２つの成分、即ち、レトロウイルスベクターとパッケージング細胞の利用を採用する。レトロウイルスベクターは長い末端反復（ＬＴＲ）、転移させるべき外来ＤＮＡ及びパッケージング配列（φ）を含む。このレトロウイルスベクターはそれ自体によって再生することはなく、その理由は携造及びエンベレロープタンパク質をコードする遺伝子がこのベクターの中に含まれていないからである。このパッケージング細胞はｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質をコードする遺伝子を含むが、しかしパッケージングシグナル「φ」は含まない。従って、パッケージング細胞はそれ自体によっては空のビリオン粒子しか形成できない。一般方法においては、レトロウイルスベクターをパッケージング細胞の中に導入し、これによって「生産細胞」を作り上げている。この生産細胞はレトロウイルスベクター（外来）のＤＮＡのみを含むビリオン粒子を製造し、従って治療的利用にとって安全なレトロウイルスであると従来から考えられている。
【０００５】
この手法の現状の利用においていくつかの欠点がある。１つの問題は生産細胞系による「生存ウイルス」（即ち、コンピテント複製性レトロウイルス）の発生が含まれる。レトロウイルスで汚染された人の治療のための調製物は、人の治療における利用に適切でないと現状考えられている．例えば、イメージング及び治療のためのモノクローナル抗体のレトロウイルス汚染の排除のためにかなりの手段が取られている。生存ウイルスは、（１）ベクターゲノムとヘルパーゲノムが互いに組換えし合うとき；（２）ベクターゲノム又はヘルパーゲノムが生産細胞の中で相同性の未解明な内因性レトロウイルス因子と組換えしたとき；又は（３）未解明の内因性レトロウイルス因子が再活性化したとき（例えばマウス細胞における異種向性（ゼネトロピック）レトロウイルス）に常用の生産細胞の中にあることがある。
【０００６】
他の問題はマウスを基礎とする生産細胞の、それらが所望のベクターをパッケージするのと近い効率で内因性レトロウイルス−ベクター様因子（これはｏｎｃ遺伝子配列を含むことができる）をパッケージする性質にある。かかる因子は、そのベクター様構造のため、所望のベクター配列の転移と匹敵する頻度にて標的処理細胞に伝達される。
【０００７】
第３の問題は、（１）大量の細胞（例えば１０８−１０１０個）の処理；及び（２）商業的に有用な価格でのベクター粒子の製造、のために十分なベクター粒子を適切な濃度で作製する能力にある。最後に、人細胞への遺伝子の輸送に現状利用されている唯一の生産細胞は、名祖であるネズミレトロウイルスエンベロープ遺伝子に関して知られている両向性生産細胞であり、これはほとんどの人細胞におけるレセプターを有している。
【０００８】
より安全なパッケージング細胞を作製するため、研究者は３’ＬＴＲ及び５’ＬＴＲの部分において更なる欠失を行った（非特許文献１を参照のこと）。かかる細胞を用いたとき、野生型ゲノムを形成するには２回の組換え現象が必要となる。にもかかわらず、いくつかの研究室の結果は、たとえ複数の突然変異が存在している場合でさえも、野生型ウイルスがいまだ残っていることがあることを示唆している（非特許文献２；非特許文献３を参照のこと）。
【０００９】
現在までに詳細されている数多くのヘルパー細胞系はネズミ、鳥類、ラット及びイヌ細胞の一定の宿主域に限定されている。最近のヘルパー細胞系は人細胞及び広域のその他の哺乳動物細胞に感染できる両向性レトロウイルスベクター系を用いて作製されているが（非特許文献４を参照のこと）、これにより開発された両向性パッケージン系にはウイルスＬＴＲの１又は複数の部分が残っており、従ってたとえ複数の突然変異が存在していたとしても、複製−コンピテントゲノムが生ずる可能性が残っている。複数の突然変異を有し、且つ感染性ウイルスを作製する傾向の低い両向性ベクター系は一般に不満足たる低い力価のレトロウイルス粒子を示す。
【００１０】
より安全なパッケージング細胞系を作製するためのより最近になっての手法の一つは、一方がｇａｇ及びｐｏｌを含み、そして他方がｅｎｖを含む２つの別々のプラスミドに分割したヘルパーウィルスの相補部分の利用を含む（非特許文献５及び非特許文献６を参照のこと）。この二重プラスミド系の１つの利点は、複製コンピテントゲノムが生ずるのに３回の組換え現象が必要であることにある。にもかかわらず、これらの二重プラスミドベクターもレトロウイルスのＬＴＲの部分を含む欠点に悩まされ、従って感染性ウイルスを生産する能力が残っている。３’及び５’ＬＴＲ欠失の両方を含む細胞系が作られているが、しかしながらこれによっても有用に改善されておらず、その理由はそれらが比較的低い力価を提供するからである（非特許文献７）。
【００１１】
本発明は従来のパッケージング細胞系の困難さを解決し、そして更に関連の利点を提供する。
【非特許文献１】ＭｉｌｌｅｒとＢｕｔｔｉｍｏｒｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５−２９０２
【非特許文献２】Ｂｏｓｓｅｌｍａｎら著，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７９７−１８０６，１９８７
【非特許文献３】ＤａｎｏｓとＭｕｌｌｉｇａｎ著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６０−６４６４，１９８８
【非特許文献４】Ｓｏｒｇｅら著，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１７２０−１７３７，１９８４
【非特許文献５】Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０−１１２４
【非特許文献６】Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら著，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６７：６００−６０６，１９８８
【非特許文献７】Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３２０９−３２１２，１９８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明は、より安全である生成体細胞からの組換えレトロウイルス（レトロウイルスベクター粒子）及び正常よりも高い力価の生成を可能にする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つの局面において、本発明は、パッケージングタンパク質及び対象の遺伝子生成物から選択される高レベルの主要因子を生成するパッケージング細胞を選択する方法であって：
（ａ）そこで主要因子を発現する主要遺伝子を含んで成るゲノム、及び上記主要因子よりも低いレベルでそこで選択可能タンパク質を発現する選択可能遺伝子をパッケージング細胞に供給し（ここで上記主要遺伝子及び選択可能遺伝子の発現レベルは比例し）；
（ｂ）臨界レベルで選択可能タンパク質を発現するそれらの細胞の同定を可能にする選択因子に上記パッケージング細胞を暴露し；そして
（ｃ）高レベルの主要因子を発現するそれらのパッケージング細胞を検出することを含んで成る方法を提供する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって：
ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖタンパク質を生成できる組換えウイルスにより感染された大細胞系から上記タンパク質を生成し；そして
ウイルスベクターＲＮＡを担持する組換えレトロウイルスを生成するために、粒子アセンブリーのための欠失機能を補足するウイルスベクターＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リポソーム及び細胞抽出物と上記タンパク質とを接触せしめることを含んで成る方法を提供する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって：
（ａ）別々に又は組合して、ｇａｇ／ｐｏｌ、ｅｎｖ及びレトロウイルスベクターゲノムをコードする組換えウイルスベクターを生成し；
（ｂ）高い力価のストックを生成し；そして
（ｃ）組換えレトロウイルスベクターを生成するために主要又は他の細胞を同時感染せしめることを含んで成る方法を提供する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって、
（ａ）対象の遺伝子及び第１のレトロウイルス表現型のパッケージングシグナル；
（ｂ）パッケージングシグナルを欠く、上記第１のレトロウイルス表現型のｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子；
（ｃ）パッケージングシグナルを欠くハイブリッドｅｎｖ遺伝子（ここで上記第１のレトロウイルス表現型の細胞質セグメント及び上記第１のレトロウイルス表現型に対して外因性の結合セグメントを含んで成る）；を含んで成るゲノムを有する生成体細胞を増殖することを含んで成る方法を提供する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって、
（ａ）対象の遺伝子及び第１のレトロウイルス表現型のパッケージングシグナル；
（ｂ）パッケージングシグナルを欠く、上記第１のレトロウイルス表現型のｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子；
（ｃ）生成体細胞の表面上で発現され、そして続いて、ベクター粒子の表面上に表わされるリガンドをコードする遺伝子を含んで成るゲノムを有する生成体細胞を増殖することを含んで成る方法を提供する。
【００１８】
１つの実施形態において、上記リガンドはＣＤ４であり得る。
【００１９】
別の局面において、本発明は、標的細胞に対象の遺伝子を選択的に担持できるレトロウイルスを調製するために有用なハイブリッドｅｎｖ遺伝子であって：
（ａ）第１のレトロウイルス表現型の細胞質セグメント；及び
（ｂ）上記第１のレトロウイルス表現型に対して外因性の結合セグメント（ここで上記結合セグメントは標的細胞に選択的に結合できる）；
をコードすることを特徴とする遺伝子を提供する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、標的細胞のゲノム上の予備選択された部位中にそのゲノムを組込むことができる組換えレトロウイルスの生成方法であって：
カプシド及びエンベロープにベクターをパッケージングし、そして予備選択された部位中にレトロウイルスゲノムを組込むことができる変性形インテグラーゼをウイルス粒子に包含することを含んで成る方法を提供する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって：
ｇａｇ／ｐｏｌ−ｅｎｖウイルス構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫と、プロモーターを含むベクター構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫とを交配し；
上記トランスジェニック動物又は昆虫の子孫を単離し；
上記子孫から選択された細胞を単離し；
適切な培地において上記細胞を増殖し；そして
上記細胞から組換えレトロウイルスを単離することを含んで成る方法を提供する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、トランスジェニックパッケージング動物又は昆虫の生成方法であって：
パッケージングのために必要な、いくらかの（但しすべてではない）ウイルスタンパク質をコードするベクター構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫と、上記必要なウイルスタンパク質の残りをコードするベクター構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫とを交配し；そして
上記トランスジェニック動物又は昆虫の子孫を単離することを含んで成る方法を提供する。
【００２３】
１つの実施形態において、上記方法は、高い力価の組換えレトロウイルスを生成できる主要細胞を生成するために、ベクター構成体を含むトランスジェニック動物又は昆虫と上記子孫とを交配する段階をさらに含み得る。
【００２４】
別の実施形態において、上記方法は、高い力価の組換えレトロウイルスを生成できる主要細胞を生成するために、ベクター構成体を含む組換えレトロウイルスにより、上記子孫から外植された細胞を感染せしめる段階をさらに含み得る。
【００２５】
別の局面において、本発明は、標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較して、ウイルスパッケージングタンパク質において少なくとも１０倍高く生成する非マウスパッケージング細胞系を提供する。
【００２６】
１つの実施形態において、上記ウイルスパッケージングタンパク質は、ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質であり得る。
【００２７】
別の実施形態において、上記細胞系が両向性パッケージング細胞系であり得る。
【００２８】
好ましい実施形態において、上記パッケージング細胞系は、ベクター構成体の導入に基づいて、標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較してベクター力価において少なくとも１０倍高く生成し得る。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、上記パッケージング細胞系は、ベクター構成体の導入に基づいて、ヒト細胞を感染できるベクター粒子を生成し得る。
【００３０】
別の局面において、本発明は、ベクター構成体の導入に基づいて、複製コンピテントウイルスにより実質的に汚染されていないベクター粒子を生成できる異種向性パッケージング細胞系を提供する。
【００３１】
１つの実施形態において、上記細胞系は、ＨＴ１０８０細胞が感染される場合、標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較して、少なくとも同じベクター力価を生成し得る。
【００３２】
別の局面において、本発明は、多向性パッケージング細胞系を提供する。
【００３３】
１つの実施形態において、上記細胞系は、ベクター構成体の導入に基づいて、複製コンピテントウイルスにより実質的に汚染されていないベクター粒子を生成し得る。
【００３４】
別の実施形態において、上記パッケージング細胞系は、２９３細胞が感染される場合、ベクター構成体の導入に基づいて、標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較してベクター力価において少なくとも１０倍高く生成し得る。
【００３５】
別の局面において、本発明は、パッケージング細胞系が、ベクター構成体の導入に基づいて、腎臓系統の細胞（但し、線維芽細胞、上皮、Ｔ細胞又は単球系統の細胞ではない）を感染できるベクター粒子を生成する多向性パッケージング細胞系を提供する。
【００３６】
別の局面において、本発明は、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖのための遺伝子を別々のオペロン上に担持し（上記オペロンはレトロウイルスＬＴＲ配列を欠き）、そしてＮ２型ベクター構成体の導入に基づいて、少なくとも２０日間の培養継代の後、実質的にヘルパーウィルスを生成しない非マウスパッケージング細胞系を提供する。
【００３７】
１つの実施形態において、上記細胞系は、両向性パッケージング細胞系であり得る。
【００３８】
別の実施形態において、上記細胞系は、多向性パッケージング細胞系であり得る。
【００３９】
別の実施形態において、上記細胞系は、異種向性パッケージング細胞系であり得る。
【００４０】
別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって：
ａ）レトロウイルスベクターシステムによりパッケージできる転写体を生成する内因性プロウイルスを実質的に有さない細胞系中にレトロウイルスベクターシステムからのパッケージング遺伝子を導入し；そして
ｂ）標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較して、ウイルスパッケージングタンパク質において少なくとも１０倍高く生成し、そしてベクター構成体の導入に基づいて、標準のマウス両向性パッケージング細胞系に比較して、ベクター力価において少なくとも１０倍高く生成する細胞について選択することを含んで成る方法を提供する。
【００４１】
別の局面において、本発明は、組換えレトロウイルスの生成方法であって：
ａ）レトロウイルスベクターシステムによりパッケージできる転写体を生成する内因性プロウイルスを実質的に有さない細胞系中に、ヒト細胞を感染できるレトロウイルスベクターシステムからのパッケージング遺伝子を導入し；そして
ｂ）ベクター構成体の導入に基づいて、標準のマウス両向性パッケージング細胞系の力価に少なくとも等しいベクター力価を生成し、そしてヒト細胞を感染できるベクター粒子を生成する細胞について選択することを含んで成る方法を提供する。
【００４２】
別の局面において、本発明は、ＣＡ、２Ａ、ＤＡ、ＤＡ２、ＤＸ、Ｄ１７  ＸＥＮＯ、ＨＸ、ＨＴ１０８０  ＸＥＮＯ、ＨＰ及びＨＴ１０８０  ＰＯＬＹから成る群から選択された細胞系を提供する。
【００４３】
別の局面において、本発明は、選択された細胞型を感染できるベクターの生成方法であって：
ａ）ウイルスが遺伝子的に変異誘発し、そして卓越して早く増殖する株が生成するまで、選択された細胞型の細胞においてウイルスを連続的に継代し；
ｂ）上記変異誘発され、そして早く増殖する株を単離し；
ｃ）上記変異誘発されたウイルスの選択的増殖を担当できる上記変異誘発された株の成分を同定し、そして単離し；
ｄ）連続した継代の前、上記ウイルスに基づかれる生成体細胞における対応する成分のための置換体として上記同定され、そして単離された成分を、挿入し、そして、
ｅ）上記ベクターを生成せしめるために上記生成体細胞を培養することを含んで成る方法を提供する。
【００４４】
（発明の概要）
本発明は、レトロウイルスゲノムが好ましくはパッケージング細胞の利用を介してカスピド及びエンベロープの中にパッケージされている組換えレトロウイルスを生産するための方法を提供する。このパッケージング細胞には、生存レトロウイルス粒子の生産に必要な全てのタンパク質を生産する細胞のゲノムの中に組込まれる、好ましくは２つのプラスミドの形態におけるウィルスタンパク質コード化配列、所望の遺伝子を保有するであろうＲＮＡをコードするＤＮＡウイルス構造体が、レトロウイルス粒子へとＲＮＡのパッケージングを誘発するであろうパッケージングシグナルと共に備っている。
【００４５】
本発明は更に組換えレトロウイルスを生産するためのいくつかの技術を提供し、このレトロウイルスは：
ｉ）パッケージング細胞からのより高力細物の生産；
ｉｉ）非ネズミ系であり（組換え体又は内因的に活性化されたレトロウイルスの生産を回避するため、及び欠陥ネズミレトロウイルス配列のパッケージングを回避するため）、且つ人細胞に感染するであろうパッケージング細胞系からの高力価の無ヘルパー組換え体の生産；
ｉｉｉ）択一的に非ハイブリドエンベロープ、例えば両向性又は多向性（ポリトロピック）エンベロープタンパク質を用いること（両向性組換えレトロウイルスに対する感染性の劣る細胞の感染を可能とするため、及び細胞のタイプの感染性の特異性を可能とするため）による、高力価を有する無ヘルパー組換えレトロウイルスの生産；
ｉｖ）パッケージング細胞の利用を含まない手段によるベクター構造体のパッケージング；
ｖ）予備選択細胞系を標的とすることのできる組換えレトロウイルスの生産；
ｖｉ）組織特異性（例えば腫瘍）プロモーターを有するレトロウイルスベクターの作製；並びに
ｖｉｉ）細胞ゲノムの中の予備選択した（複数の）部位の中へのプロウイルス構造体の組込み；
を促進することができる。
【００４６】
パッケージング細胞からの高力価物の生産のための一技術はパッケージング細胞からの力価を制限することのできる数多くの要因の発見を利用している（最も制限されるものはパッケージングタンパク質、即ち、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質の発現レベル、並びにプロウィルスベクターからのレトロウイルスベクターＲＮＡの発現レベルである）。この技術は、上記のパッケージングタンパク質及びベクター構造体ＲＮＡの高レベルな発現性（即ち、高濃度で生産）を有するパッケージング細胞の選別を可能にする。より詳しくは、この技術は、パッケージングタンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質）又は標的細胞のゲノムの中に搬送すべき対象の遺伝子（典型的にはベクター構造体として）のいづれかである、本明細書で「主要因子」として称するものを高レベルで生産するパッケージング細胞の選択を司能にする。このことは、パッケージング細胞において主要因子を発現せしめる遺伝子（「主要遺伝子」）を好ましくはこの主要遺伝子の下流の選択遺伝子と共に保有するゲノムをパッケージング細胞に付与することによって達成される。この選択遺伝子はパッケージング細胞において選択タンパク質、好ましくは何らかの細胞毒性薬剤に対する耐性を授けるものを発現させる。次にこの細胞を好ましくは細胞毒性薬剤である選択試薬に暴露する。これは選択タンパク質を臨界レベルで発現する細胞の同定を司能にする（即ち、細胞毒性薬剤の場合、生存のために必要とされる耐性タンパク質を一定レベルで生産しない細胞を殺すことによる）。
【００４７】
好ましくは、簡単に上述した技術において、選択及び主要遺伝子の両方の発現は同一のプロモーターによりコントロールされる。この観点において、非一ＭＬＶレトロウイルス５’ＬＴＲを利用することが好ましいことがある。パッケージング細胞からの組換えレトロウイルスの力価を最大とするため、この技術はまず要望される全てのパッケージングタンパク質を高レベルで発現するパッケージング細胞の選択のために用いられ、次に所望のプロウイルス構造体による感染の後に、最も高力価の組換えレトロウイルスを生産する細胞の選択のために用いられる。
【００４８】
非ネズミ細胞において高力価の無ヘルパー組換えレトロウイルスを生産する細胞を選択する技術も提供する。かかる細胞系は効率的に人細胞に感染することのできる組換えレトロウイルスを生産する。これらの技術は、複製ウイルスの存在下において組換えレトロウイルスを生産できる有効な親細胞のスクリーニングを包括する．次に、上記の手順により選んだ候補の細胞系の未感染培養物に、レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌを発現するベクターを感染させ、そして高レベルのｇａｇ／ｐｏ１を合成するクローンを同定する。このタイプのクローンを次にｅｎｖを発現するベクターにより再感染させ、そして高レベルのｅｎｖ（及びｇａｇ／ｐｏｌ）を発現するクローンを同定する。本発明の範囲において、「高レベル」はウェスタンプロット分析により標準のマウスパッケージング系、ＰＡ３１７において見い出せるものよりも有意に高いことを意味する。数多くの非マウス細胞系、例えば人又はイヌは、自発的にコンピテントレトロウイルスを作ることが知られておらず、組換えネズミレトロウイルスパッケージング又は遺伝子配列のための可能な組換えパートナーを保有せず、そしてＭＬＶ系によりパッケージされうるＲＮＡを作る遺伝子を保有していない。上記したものと類似の技術による、異種向性又は多向性のようなエンベロープを択一的に用いる高力価の組換えレトロウイルスを生産する細胞系を作る技術を提供する。かかるレトロウイルスは、両向性耐性細胞（異種向性エンベロープ）を感染せしめるのに、又はサブセットの細胞（多向性）のみを感染せしめるのに用いることができる。
【００４９】
予備選択細胞系を標的とすることのできる組換えレトロウイルスを生産するのに適切な技術は：第一レトロウイルス表現型の細胞質セグメント、及びこの第一レトロウイルス表現型に対して外因性の細胞外結合セグメントを含んで成るｅｎｖ遺伝子（この結合性セグメントは第二ウイルス表現型に由来するか、又は所望の結合特性を有するその他のタンパク質に由来し、これは所望の標的に結合するであろうペプチドとして発現されるように選ばれる）；その他のウィルスエンベロープタンパク質；正常エンベロープタンパク質に代わるその他のリガンド分子；又は標的細胞タイプの感染をもたらさないエンベロープタンパク質を伴うその他のリガンド分子；のうちの１又は複数のものを有する組換えレトロウイルスを利用する。好ましくは、簡単に上述した技術において、レトロウイルス表現型の細胞質セグメントを含んで成るｅｎｖ遺伝子を、レセプター結合性ドメインを有するタンパク質をコードする外因遺伝子と組合せて、標的とする細胞タイプ、例えば腫瘍細胞に特異的に結合する組換えレトロウイルスの能力を向上させる。この観点において、標的細胞の表層において高レベルで発現されたレセプターに結合するレセプター結合性ドメインを利用する、又は択一的に、特定の組織細胞タイプ（例えば乳癌における上皮細胞、管上皮細胞、他）において比較的高レベルで発現されたレセプターに結合するレセプター結合性ドメインを利用することが好ましいことがある。成長因子又は活性化レセプター（例えばＥＧＦ又はＣＤ３レセプター）に特異性を有するハイブリドエンベロープを標的とするある潜在的な利点は、ベクター自身の結合が、ウイルスの組込み及び発現にとって必須な細胞周期をもたらしうることにあることがある。この技術において、一定の腫瘍に対する特異性を有する組換えレトロウイルスを改善及び遺伝子的に変えることが、腫瘍細胞における複製組換えレトロウイルスの反復継代により；又はベクター構造体を薬剤耐性遺伝子に連結させ、次いで薬剤耐性物を選択することによって可能となりうる。
【００５０】
標的細胞のＤＮＡの中の特定の部位にレトロウイルスゲノムを組込むための技術は、相同組換えの利用、又はそうそなければこの標的細胞ゲノム上の特定の部位を認識するであろう改質化インテグラーゼ酵素の利用を包括する。かかる部位特異的挿入は標的細胞のＤＮＡ上の部位に遺伝子が挿入されることを可能とし、これは挿入突然変異誘発の機会を最小にし、このＤＮＡ上の他の配列による干渉を最小にし、そして特定の標的部位での配列の挿入を可能として、標的細胞のＤＮＡにおける所望されない遺伝子（例えばウィルス遺伝子）の発現を下げる又はなくすことができうる。
【００５１】
上述した任意の技術は特定の状況において他のものと独立して利用されることができ、又は１又は複数の残りの技術と組合せて利用できることが予想されうる。
【００５２】
本発明のこれら及びその他の観点は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照することによって明らかとなるであろう。
【００５３】
（発明の詳細な説明）
第１の観点において本発明は、パッケージング細胞系（ＰＣＬ）からの低力価組換えウイルスの主要原因及びかかる原因を修復するための技術の発見にある程度基づく。基本的に、少なくとも５つの要因が低力価組換えウイルスの原因として考えられうる：
１．ウイルスパッケージングタンパク質の限られた有用性；
２．レトロウイルスベクターＲＮＡゲノムの限られた有用性；
３．組換えレトロウイルスの発芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）のための細胞膜の限られた有用性；
４．レトロウイルスベクターゲノムの限られた固有パッケージング効率；及び
５．一定のレトロウイルスのエンベロープに対して特異的なレセプターの密度。
６．宿主細胞構成物の限られた有用性（例えばＲＮＡ、又はミリストイル化、リン酸化、グリコシル化もしくはタンパク質分解機能）。
【００５４】
上記した通り、ウイルスパッケージングタンパク質の限られた有用性は、パッケージング細胞からの組換えレトロウイルスの生産における初期の制限された要因にある。パッケージング細胞中のパッゲージングタンパク質のレベルが上昇すると、力価は約１０５感染性単位／ミリリットルにまで上昇するが、引き続きパッケージングタンパク質レベルの上昇は力価に更なる影響を及ぼさない。しかしながら、力価はパッケージングのために有用なレトロウイルスベクターゲノムのレベルを上昇させることによっても更に増大されうる。
従って、最大レベルでパッケージングタンパク質及びレトロウイルスゲノムを製造する生産細胞を選ぶことが有利である。最初の頃に表題「発明の背景」の章に記載したパッケージング細胞及び生産細胞を固定する、それ故選択する方法は、下記の理由のために低力価物を生産する数多くの生産細胞の選択を紹きがちであることが発見された。
【００５５】
本発明は、５’ＬＴＲ又はその他のプロモーターより下流にあり、介在配列によりそれらから隔てられている遺伝子のタンパク質発レベルが、介在遺伝子が存在していないときよりも実質的に低いという従来の欠点を利用する。本発明において、この選択遺伝子はパッケージングゲノムの遺伝子又はベクター構造体により保有された対象の遺伝子の下流に位置するが、しかしながらウイルス５’ＬＴＲ又はその他のプロモーターのコントロール下で、任意のスプライスドナー又はスプライス受容部位を伴わずに転写され続けられる。このことは２つのことを成就せしめる。第一に、パッケージング遺伝子又は対象の遺伝子が今、それらとプロモーターとの間に介在遺伝子を有さずに上流にあるため、その関連のタンパク質は選択タンパク質よりも高レベル（５〜２０倍）で発現されうる。第二に、この選択タンパク質は低レベルで平均的に発現され、その発現レベルの分布は低レベルにシフトしている。しかしながらフレオマイシン耐性に関する選択レベルは同じであり続け、従って最上発現性細胞は生存し続ける。パッケージングタンパク質又は対象のタンパク質のレベルはこの場合においてのみ比例し続け、高いレベルの選択タンパク質がより高いレベルのパッケージングタンパク質又は対象のタンパク質に対応する。
【００５６】
好ましくは、上記の手順はプロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ又はｅｎｖパッケージング遺伝子のうちのいづれかを、第一選択遺伝子と共に保有するプラスミドを用いて実施する。次にこれらの細胞を、最も高いレベルでこのタンパク質を生産する細胞について、ｇａｇ／ｐｏｌ（又は可能としてｅｎｖ）に対する抗体、第二酵素又は標識抗体との反応によりスクリーンし、次いで蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）において選別するか又はウェスタンプロットにおいて検定する、他方、タンパク質レベルに関するその他の試験が利用できる。次に、これらの選択細胞、並びにｇａｇ／ｐｏｌ又はｅｎｖパッケージング遺伝子のその他のものを利用してこの手順及びスクリーニングを繰り返す。この工程において、パッケージング遺伝子から下流に第二選択遺伝子（第一と異なるもの）が必要とされ、そしてこの第二ウィルスタンパク質を最大量で生産する細胞を選別する。この細胞系は任意の有用なベクターと共に用いることができるパッケージング細胞系（ＰＣＬ）である。次に、対象の遺伝子を抱えるプロウィルスベクター構造体を保有するプラスミド及びこの第一又は第二選択遺伝子とは異なる第三選択遺伝子を有する生存細胞を用いてこの手順及びスクリーニングを繰り返す。この手順の結果、所望の組換えレトロウイルスを高力価で生産する細胞が選ばれ、そしてこれらは組換えレトロウイルスを供給するために必要なだけ培養することができる。更に、ｇａｇ及びｐｏｌを独立して導入して選別することができる。
【００５７】
例１はこの手順を利用するのにデザインされたｇａｇ／ｐｏ１及びｅｎｖプラスミドの作製を詳細する。
【実施例】
【００５８】
（例１：高レベルのパッケージングタンパクを作るようにデザインされたプラスミド（図１））
１．両向性ｅｎｖセグメントを含むｐＰＡＭ由来の２．７ｋｂのＸｂａＩフラグメント（Ｈｉｌｌｅｒら著，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１，１９８５）を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｖｕＩＩにより切断したベクターｐＲＳＶｎｅｏ（Ｇｏｒｍａｎら著，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１０４４；Ｓｏｕｔｈｅｒら著，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７，１９８２）にクローンしてｐＲＳＶｅｎｖを作った。プラスミドｐＵＴ５０７（Ｈｕｌｓａｎｔら著，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅ１１．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１４：２４３，１９８８）由来の、ＢｓｔＩＩ末端が補完された０．７ｋｂのＢａｍＨＩ〜ＢｓｔＥ  ＩＩフラグメントはｐｈｌｅｏ耐性コード配列を保有する。４．２ｋｂのＢａｍＨＩ〜ＸｂｏＩフラグメント、隣接のＲＳＶｅｎｖに由来する１．６ｋｂのＸｂｏＩ〜ＸｂａＩ（ＸｂａＩは補完済）及びｐｈｌｅｏフラグメントをリゲートさせて、ｐＲＳＶｅｎｖ−ｐｈｌｅｏを得た。
【００５９】
２．ＭＬＶ（ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，第ＩＩ巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８５）の５６３番目のヌクレオチドでのＰｓｔＩ部位から５８７０番目のＳｃａＩ部に至るフラグメントはｐＭＬＶ−Ｋ（Ｍｉｌｌｅｒら著，１９８５，前掲）に由来しており、そしてＳＶ４０プロモーター，ｐＢＲ３２２アンピシリン耐性及び複製起点、並びにＳＳＶ４０ポリＡ部位を有するｐ４ａＡ８（Ｊｏｌｌｙら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４７７，１９８３）に由来するＰｓｔＩ〜ＢａｍＨＩ（ＢａｍＨＩ補完済）フラグメントの中にクローンした。これによりｐＳＶｇｐが得られた。ｐＳＶｇｐＤＨＦＲは以下のフラグメントを用いて作った：ＳＶ４０プロモーターとＭＬＶｇａｇ及びｐｏｌ配列の一部を含む、ｐＳＶｇｐに由来する３．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ〜ＳａｌＩフラグメント；残りのｐｏｌ遺伝子を有する、ｐＭＬＶ−Ｋに由来する２．１ｋｂのＳａｌＩ〜ＳｃａＩフラグメント；ＤＨＦＲ遺伝子と、ポリＡ部位、ｐＢＲ３２２起点及びアンピシリン耐性遺伝子の半分を有する、ｐＦ４００に由来する３．２ｋｂのＸｂａＩ（ＸｂａＩは補完済）〜ＰｓｔＩフラグメント；アンピシリン耐性遺伝子の残りの半分を有する、ｐＢＲ３２２に由来の０．７ｋｂのＰｓｔＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント。これはＰＳＶｇｐ−ＤＨＦＲを提供する。これらの構造体全てを図１に示す。これらのプラスミドは３Ｔ３細胞又はその他の細胞の中にトランスフェクトすることができ、そして高レベルのｇａｇ，ｐｏｌ又はｅｎｖが得られる。
【００６０】
選択を成就するための他の方法は、第一ラウンドにおいて遺伝子選択を、そして次のラウンドにおいてそのアンチセンスを用いる。例えば、ｇａｇ／ｐｏｌをＨＰＲＴ遺伝子と共にＨＰＲＴ欠損細胞の中に導入し、そしてプリンの利用のためにＨＰＲＴを必要とする培地を利用してこの遺伝子の存在について選択する。次のラウンドにおいて、ＨＰＲＴに対するアンチセンスはｅｎｖの下流に導入することができ、そして細胞はＨＰＲＴ一欠損表現型について６チオグアニンの中で選択される。逆転写が起きないことを確実にしてＨＰＲＴ遺伝子転写体を不活性化するためには、大量のアンチセンスＨＰＲＴが必要とされるであろう。選択を成就する更なる方法を以下に詳細する。独立した選択マーカーよりも１０ｘの化学量論過剰な発現ベクターの同時トランスフェクションは、薬剤耐性細胞クローンにおける発現ベクターの高いコピー数を保障する。本明細書に記述するほとんどの例において、ｇａｇ／ｐｏｌとエンベロープ発現ベクターは独立に（即ち、別々のトランスフェクション）導入しており、従ってこの２つの構造遺伝子は組換え又はコンカテマー化せず（トランスフェクト組込みされたＤＮＡがしがちであるように）、ゲノムの中でこれらの遺伝子が連結しないことを保障する。細胞内のＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖの定常レベルはタンパク質イムノブロッティングにより決定される。比較的容易な、高感度な、そして再現性のあるイムノブロッティングは、ＭＬＶ構造タンパク質（特にｇａｇ／ｐｏ１）の過剰発現を同定するために必要である、大量の細胞クローンの迅速で定量的な分析を可能とする（例２参照）。
ＭｏＭＬＶの５６３番目のヌクレオチドで出発するｇａｇ／ｐｏｌ発現構造体の他に、上流リード配列を含むいくつかのその他のものが作製できる、Ｐｒａｔｓら（ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）により、ｇａｇタンパク質のグリコシル化形態は３５７番目のヌクレオチドで開始し、そして転写エンハンサー地図は２００−２７０番目のヌクレオチドの間の領域にあることが認められた、従って、ｇａｇ／ｐｏｌ発現構造体は、かかる上流因子を含み、且つベクター生産を高めようとするために、ＢａｌＩ部位（ヌクレオチド２１２）又はＥａｇ部位（ヌクレオチド３４６）にて開始するように作製されうる。これを成就する好ましい方法は、核酸のコード能力に影響を及ぼすことなく、ここで見い出せたパッケージングシグナルを不活性化するように変性突然変異を包含することにある。
【００６１】
（エンベロープ置換）
ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ機能を発現する能力はそれぞれ、独立的にそれらの機能の操作に備える。十分な量のｇａｇ／ｐｏｌを発現する細胞は、例えば、ｅｎｖについての力価の問題を扱うことができる。低力価を生じる１つの要因は、標的細胞または組織上の適当なレセプター分子の密度である。第二の要因は、ウィルスエンベロープタンパク質に対するレセプターの親和力である。ｅｎｖ発現が別個の単位からであるとすれば、種々のエンベロープ遺伝子（異なるレセプタータンパク質を要求する）、例えば多様な種からの異種向性、多向性または両向性ｅｎｖを特定の標的組織上で最大力価について試験することができる。
【００６２】
或るレトロウイルスからのエンベロープタンパク質は、しばしば、別のレトロウイルスのものと、様々な程度で置換することができる。例えば、マウスウィルス４０７０Ａ，ＨＴＬＶＩ，ＧＡＬＶおよびＢＬＶのエンベロープは、低効率にもかかわらず、各々ＭｏＭＬＶのものと置換することができる（ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８１：６３４９−５３，１９８４；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，２３７４−７８，１９８９；Ｂａｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１９８７−９３，１９８９）。ＭＬＶ系ベクターにより感染せしめることができる細胞の数を増加させるために、両向性、異種向性または多向性エンベロープのいずれかを個々に発現するＰＣＬを作製した。それらのＰＣＬのいずれかから生産されたベクターを使って、対応する個別のレセプターを含む任意の細胞を感染せしめることができる（ＲｅｉｎおよびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３６：１４４−５２，１９８４）。幾つかの細胞型は、例えば、両向性レセプターを欠いており従って両向性ベクターによる感染に耐性であるが、異種向性レセプターを発現するので異種向性ベクターにより感染させることができる。１つの報告は、異種向性ベクターが複製能のある異種向性ウイルスの存在下で、ピト造血始原細胞を一層効率的に感染せしめることができると示唆している（Ｅｇｌｉｔｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６９：８０−１４，１９９０）。従って、異種向性ＰＣＬはそれらの種において獣医学目的に有用であろう。別の例は、エリスロポイエチンレセプターを含む細胞への標的指向を可能にする脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）エンベロープ遺伝子の利用である（Ｊ．Ｐ．Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４３：７６２−７６４，１９９０）。特定例として、本明細書中に記載の両向性ＰＣＬの全体（イヌおよびヒト繊維芽細胞）が異種向性ベクターにより感染され得るが、おそらく「ウイルス干渉」の現象のため、両向性ベクターによる感染には耐性である（Ａ．Ｒｅｉｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２０：２５１−５７，１９８２を参照のこと）。従って異種向性ＰＣＬは、それらの両向性ＰＣＬの容易な感染を可能にし、これが次いでベクターを他の手段により導入したＰＣＬよりも１０〜１００倍高い力価を生じる（Ｈｉｌｌｅｒら、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅ１１．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１７５−８３，１９８６）。理論上は、ＭＬＶベクターおよびパッケージング系を使って機能することができ且つ与えられたＰＣＬ中に対応する細胞レセプターが見つかる任意のウィルスエンベロープを発現するＰＣＬが、そのＰＣＬのベクター感染を可能にするために有用である。
【００６３】
本明細書中に記載の多向性ＰＣＬから生産されたベクターは、両向性または異種向性ＰＣＬのいずれかから生産されたベクターよりも、ヒト細胞に対してより一層制限された宿主範囲を有する（下記のデータを参照のこと）。従って多向性ＰＣＬは、特定のヒト細胞型にベクターを標的指向せしめるのに特に有用であろう。異種向性エンベロープおよび多向性エンベロープと、ＭｏＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌおよび該ベクターとの間の相同性が低いため、それらのＰＣＬは相同組換えにより複製能のあるレトロウイルスを生産する可能性が両向性ＰＣＬよりも低い。
【００６４】
更に、非マウスレトロウイルス源からのエンベロープは、ベクターを擬似分類するのに用いることができる。擬似分類の正確な規則、即ち、エンベロープタンパク質が細胞膜の細胞質側でベクター粒子と相互作用して生存可能なウイルス粒子を与えるであろうもの（Ｔａｔｏ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８８：７１，１９７８）と与えないであろうもの（Ｖａｎａ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３６，１９８８）とを擬似分類するための規則は、十分に特徴付けられていない。しかしながら、細胞膜の一片が発芽してウィルスエンベロープを形成し、通常は細胞膜中の分子がウィルスエンベロープ上に次々に運ばれる。こうして、ベクターが生産されるｇａｇおよびｐｏｌ生成細胞系を操作するかまたは特定の表面マーカーを有する様々な型の細胞系を選択することにより、ウィルスベクターの表面上に多数の異なる潜在的リガンドを取りつけることができる。ヘルパー細胞中で発現させることができ且つ有用なベクター一細胞相互作用を与えることができる表面マーカーの１つの形は、別の潜在的に病原性のウイルスのレセプターである。病原性ウイルスは、感染した細胞表面上に、通常は細胞表面マーカーまたはレセプターと相互作用してウイルス感染を提供するウイルス特異的タンパク質（例えばｅｎｖ）を提示する面これは、同じウィルスタンパク質一レセプター相互作用を使うがベクター上のレセプターと細胞上のウィルスタンパク質を用いることにより、潜在的に病原性のウイルスに関するベクターの感染の特異性を逆転させる。
【００６５】
生産されるベクターによる標的細胞の感染を引き起こさないが感染性ウイルス粒子の形成を促進する無関係のエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含めることが望ましいかもしれない。例えば、ヘルパー形としてヒトＳｕｐＴ１細胞を使用することができる。このヒト丁細胞系は、高レベルで表面上にＣＤ４分子を発現する。これからヘルパー系中への遺伝子変換は、適当な発現ベクターと、必要ならば無関係の（ヒト細胞にとって無関係の）エンベロープタンパク質としてモロニー異所性ｅｎｖ遺伝子産物（モロニー異所性ｅｎｖはマウス細胞の感染のみを引き起こす）とを使って、ｇａｇ／ｐｏｌを発現せしめることによって達成することができる。そのようなヘルパー系から生産されたベクターは、それらの表面上にＣＤ４分子を有し、従ってＨＩＶｅｎｖを発現する細胞、例えばＨＩＶ一感染細胞のみを感染することができるであろう。
【００６６】
加えて、同じくハイブリッドエンベロープ（後述）も、レトロウイルスベクターの向性を適合させる（そして効率的に力価を増加させる）ために、この系において使うことができる。十分な量の特定のエンベロープ遺伝子を発現する細胞系は、ｇａｇおよびｐｏｌに関する力価の問題を扱うために使うことができる。更に、ウイルス粒子に対して異種のリガンド分子を加えることも可能であり、それ自体を脂質エンベロープ中に組み込むかまたは脂質もしくはタンパク質構成物に化学的に結合させることができる。
【００６７】
（細胞系）
ＭｏＭＬＶベクター系（ｐｓｉ２，ＰＡ１２，ＰＡ３１７）に使われる最も一般的なパッケージング細胞系はマウス細胞系由来である。マウス細胞系がヒト治療用ベクターの生産に最適でない幾つかの理由がある：
１．それらは、その幾つかがここで使用するＭＬＶベクター系に配列とウイルス型が密接に関連する内因性レトロウイルスを含むことが知られている、
２．それらは、効率的にパッケージングすることが知られている非レトロウイルスまたは欠陥レトロウイルス配列を含む。
３．マウス細胞膜成分の存在下で有害な影響が生じる場合がある。幾つかの非マウス細胞系はパッケージング系の有用な源である。それらとしては、ヨーロッパでポリオワクチンを調製するために使われているＶｅｒｏ細胞、合衆国でワクチン製造に使われているＷＩ３８、合衆国でＴＰＡ調製に使われているＣＨＯ細胞、内因性ウイルスを持たないＤ１７または他のイヌ細胞、および実施例２に記載の細胞が挙げられる。
【００６８】
レトロウイルスベクターの製造の際の最も重大な安全性への懸念は、ベクター導入後に複製能のあるレトロウイルスを生じるレトロウイルスＰＣＬの固有の性質である（Ｍｕｎｃｈａｕら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：２６２．６５，１９９０）。これは少なくとも２つの経過で起こり得る。１）治療用プロウイルスＤＮＡとＰＣＬ中に存在するＭｏＭＬＶ構造遺伝子（“ｇａｇ／ｐｏｌ”および“ｅｎｖ”）をコードするＤＮＡとの間で相互組換えが起こり得る（下記の「ＰＣＬの作製」のところで論じる）；および２）プロウイルスＤＭとマウス細胞中に見つかる非常の多数の内因性欠陥プロウイルスとの相同組換えによる複製能のあるウイルスの生成（ＳｔｅｆｆｅｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃｅｌｌ  １５：１００３−１０，１９７８；ＣａｎａａｎｉおよびＡａｒｏｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ７６：１６７７−８Ｌ１９７９；ＳｔｏｙｅおよびＣｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：２６５９−６９，１９８７）．加えて、ベクターを欠くマウス細胞でさえも、自発的にまたは誘導後にウイルスを生産し得る（例えば、ヒト細胞中で複製することができる異種向性ウイルス、ＡａｒｏｎｓｏｎおよびＤｕｎｎ，Ｊ．Ｖｉｔｏｌ．１３：１８１−８５，１９７４；ＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎおよびＡａｒｏｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４５８：３２３−５４，１９７６）。マウスレトロウイルスベクターの生産のためのマウス細胞の使用に伴う別の安全性の懸念は、マウスゲノム中の多数の内因性プロウイルス遺伝子（レトロウイルス様遺伝子）の幾つかが発現され、マスウＰＣＬのレトロウイルス構造遺伝子産物により認識され、そして標的細胞中に輸送されて少なくとも所望のベクターの効率に匹敵する効率で発現されるという知見である（Ｓｃｏｌｎｉｃｋら、Ｊ．，Ｖｉｔｏｌ．２９：９６４−７２，１９７９；Ｓｃａｄｄｅｎら、Ｊ．Ｖｉｔｏｌ．６４：４２４−２７，１９９０）。それらの知見は、マウス細胞系がヒト治療用のマウスレトロウイルスベクターの生産にとって不安な選択であることを強く示唆している。マウス細胞に関係する固有の安全性問題を回避するために、ハイブリダイゼーション分析によるＭｏＭＬＶのゲノム配列に相同なゲノム配列を欠くことが知られている（データは示してない）非マウス細胞系（例えば、イヌおよびヒト細胞系）からのみＰＣＬが生産されている（Ｈａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：４８９２−９６，１９８１）。当業者らは、本明細書中に記載のパッケージング細胞が、低効率であるけれども任意のＲＮＡ分子をパッケージングする能力を有するだろうと理解するであろう。そのようなＲＮＡ分子は擬似感染した標的細胞に永久に伝達されないだろう。
【００６９】
安全性の問題に加えて、ＰＣＬのための宿主細胞系の選択が重要である。というのは、レトロウイルス粒子の物理学的性質（例えば安定性）および生物学的性質（例えば力価）の多くが、宿主細胞の性質により規定されるからである。例えば、宿主細胞はベクターＲＮＡゲノムを効率的に発現し、細胞性ｔＲＮＡにより第一鎖合成に備えてベクターをプライムし、ＭＬＶ構造タンパク質を寛容しそして共有結合的に修飾し（タンパク質分解、グリコシル化、ミリスチル化およびリン酸化）、成熟ウイルス粒子を細胞膜から発芽させ、それを使って多数の膜成分を運ばなければならない。例えば、マウスパッケージング系ＰＡ３１７から生産されたベクターは０．３ミクロンフィルターにより保持されるが、一方で本明細書中に記載のＣＡ系から生産されたベクターは素通りすることがわかった。
【００７０】
（実施例２）
（パッケージング胞の選択）
（Ａ．ＭＬＶ構造遺伝子発現ベクター）
ＭＬＶプロウィルスベクターＤＮＡとＰＣＬの構造遺伝子との間の遺伝子相互作用によって複製能を有するウイルスが生じる可能性を減らすために、各々ウイルスＬＴＲを欠く別々のベクターを作製してｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子とｅｎｖ遺伝子とを独立的に発現せしめた。更にＭＬＶベクターとの相同組換えおよびその結果としての複製能を有するウイルスの生成の可能性を減らすために、タンパク質コード配列以外の最小配列を使った。宿主細胞中で高レベルのＭＬＶ構造タンパク質を発現せしめるために、強力な転写プロモーター（ＣＭＶ初期プロモーターおよびＡｄ５主要後期プロモーター）を使った。ＭｏＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌ発現ベクター（ｐＳＣＶ１０，図１Ｂ．１参照）の作製例は次の通りである：
１．ヒトシトメガロウィルス（ＣＭＶ）初期転写プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅ１ｌ  ４１：５２１−３０，１９８５）を包含する０．７ｋｂ  ＨｉｎｃＩＩ／ＸｍａＩＩＩ断片を単離した。
２．全ｇａｇ／ｐｏｌコード領域を包含する５．３ｋｂＰｓｔｌ（一部）／ＳｃａＩ断片をＭｏＭＬＶプロウィルスプラスミドＭＬ−Ｋ（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ１．５：５３１，１９８５）から単離した。
３．ＳＶ４０  ＤＮＡからＳＶ４０後期転写終結シグナルを包含する０．３５ｋｂ  ＤｒａＩ断片（残基２７１７−２３６３）を単離した。
４．リンカーおよび他の標準的組換えＤＮＡ技術を使って、ＣＨＶプロモーター一ＭｏＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌ−ＳＶ４０終結シグナルをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターＳＫ＋中に連結せしめた。
【００７１】
ＭＬＶ両向性エンベロープ発現ベクター（ｐＣＨＶｅｎｖＡｍＤｒａ，図１Ｂ．２参照）の作製例は次の通りである：
１．４０７０Ａプロウィルスクローン（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３９：７７７−９１，１９８１）から両向性エンベロープのコード配列を含む２．７ｋｂＸｂａＩ／Ｎｈｅｌ断片を単離した
２．リンカーおよび他の標準的ＤＮＡ技術を使って、ｇａｇ／ｐｏｌ発現（ｐＳＣＶ１０）について上述したＣＭＶ初期プロモーターおよびＳＶ４０後期終結シグナルをＣＭＶプロモーター一エンベロープ−終結シグナルの順序で連結せしめた。
【００７２】
ＭＬＶ両向性エンベロープ発現ベクター（ｐＣＨＶｅｎｖＡｍＮｈｅ，図１Ｂ．３参照）の作製の第二の例は次の通りである。
１．上述の４０７０Ａプロウィルスクローンから両向性エンベロープのコード配列を含む２．７ｋｂＸｂａｌ／ＮｈｅＩ断片を単離した。
２．リンカーおよび他の標準的組換えＤＮＡ技術を使って、ｇａｇ／ｐｏ１発現（ｐＳＣＶ１０）について上述したＣＭＶ初期プロモーターをプラスミドｐＵＣ１８中にＣＭＶプロモーター一エンベロープの順序で連結せしめた（終結シグナルは加えなかった）。
【００７３】
ＭＬＶ両向性エンベロープ発現ベクター（ｐＭＬＰｅｎｖＡｍＳｐｈ，図１Ｂ．４参照）の作製の第三の例は次の通りである。
１．アデノウイルス５左端、主要後期転写プロモーターおよび三分節系リーダー配列を含む０．９ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離した。
２．クローンｐＪＤ２０４（Ｄｅ  Ｗｉｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：７２５−３７，１９８７）からＳＶ４０スモールｔイントロンと転写終結シグナルを含む０．８５ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片を単離した。
３．上述の４０７０Ａプロウィルスクローンから両向性エンベロープのコード配列を含む３ｋｂ  ＳｐｈＩ／ＳｍａＩ断片を単離した、
４．リンカーおよび他の標準的組換えＤＮＡ技術を使って、ＭＬＰ、両向性エンベロープおよびＳＶ４０終結シグナルをプラスミドｐＢＲ３２２中にＭＬＰ−エンベロープ−ＳＶ４０の順序で連結せしめた。
【００７４】
ＭＬＶ異種向性エンベロープ発現ベクター（ｐＣＭＶｘｅｎｏ，図１Ｂ．５参照）の作製例は次の通りである。
１．クローンＮＺＢ９−１（０’Ｎｅｉｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．５３：１００−１０６，１９８５）から得られる異種向性エンベロープのコード領域を含む２．２ｋｂ  ＮａｅＩ／ＮｈｅＩ断片を単離した。
２．リンカーおよび他の標準的組換えＤＮＡ技術を使って、ｇａｇ／ｐｏｌ発現（ｐＳＣＶ１０）について上述したＣＭＶ初期プロモーターとＳＶ４０後期終結シグナルをＣＭＶプロモーター−エンベロープ−終結シグナルの順序で連結せしめた。
【００７５】
ＭＬＶ多向性エンベロープ発現ベクター（ｐＣＨＶＭＣＦ，図１Ｂ．６参照）の作製例は次の通りである。
１．クローンＭＣＦ−２４７Ｗ（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：１５２−１５７，１９８５）から得られる多向性エンベロープのコード領域を含む２ｋｂ  ＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩ断片を単離した。
２．リンカーおよび他の標準的組換えＤＮＡ技術を使って、ｇａｇ／ｐｏｌ発現（ｐＳＣＶ１０）について上述したＣＭＶ初期プロモーターとＳＶ４０後期終結シグナルをＣＭＶプロモーター−エンベロープ−終結シグナルの順序で連結せしめた。
【００７６】
ＭＬＶａｍｐｈｏ  ｅｎｖ  Ｎｅｏ＋レトロウイルスベクター（ｐＬＡＲＮＬ，図１Ｂ．７参照）の作製例は次の通りである。
１．ベクターｐＬＡＲＮＬ（Ｅｍｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１２０２−１２０７，１９９１）をＢａｍＨＩで消化した。
２．レトロウイルス４０７０Ａのエンベロープタンパク質コード領域を含む２．７ｋｂ  ＸｂａＩ断片（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３９：７７７−９１，１９８１）を単離した、
３．手順１と２から得られた断片を連結せしめた。
【００７７】
（Ｂ．宿主細胞の選択）
ｇａｇ／ｐｏ１およびｅｎｖ構造遺伝子を産生する複製能のあるレトロウイルス（“ＭＡ’ウィルス）を使って、薬剤耐性レトロウイルスベクター（ＡｄＮ２）を効率的に（高力価で）救済する能力について宿主細胞をスクリーニングした。培地交換の１６時間後の周密的単層から、６ｃｍの組織培養プレート上で４μｇ／漉のポリブレンの存在下で濾過済上清（０．４５μｍフィルター）を５×１０４個のＮＩＨ  ３Ｔ３  ＴＫ−細胞に添加し次いでＧ４１８中で選別を行うことにより、力価を測定した、スクリ一二ング工程のデータを図２に示す。高力価でＭｏＭＬＶ系ベクターをパッケージングする能力を示す非マウス細胞系は、ＣＦ２，ｄ１７，２９３およびＴＨ１０８０である。それらの細胞系を例として本発明において使ったが、任意の他の細胞をそのような手法により試験することができる。
【００７８】
（Ｃ．パッケージング細胞の作製）
（ｉ）ｇａｇ／ｐｏｌ中間体
ＰＣＬ生産用のｇａｇ／ｐｏｌ中間体の作製の例として、Ｄ１７、２９３およびＨＴ１０８０を、１μｇのメトトレキセート耐性ベクターｐＦＲ４００（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−６７，１９７３）および１０μｇのＭｏＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌ発現ベクターｐＳＣＶ１０（前記）を用いて、リン酸カルシウム共沈（Ｄ１７とＨＴＩ０８０、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−６７，１９７３を参照のこと）またはリポフェクション（２９３、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−１７，１９８７を参照のこと）により、同時トランスフェクトせしめた。薬剤ジピリミドールとメトトレキセートの存在下でのトランスフェクト細胞の選別後、個々の薬剤耐性細胞コロニーを増殖させ、そして細胞外逆転写酵素（ＲＴ）活性によりＭｏＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌ発現について（Ｇｏｆｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．３８：２３９−４８，１９８１）および抗ｐ３０抗体（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからのヤギ抗血清＃７７Ｓ００００８７）を使ったウェスタンプロットにより細胞内ｐ３０ｇａｇについて分析した。この方法は、各細胞型の個々の細胞クローンが標準的マウス両向性ＰＣＬであるＰＡ３１７のものに比べて１０〜５０倍高いレベルの両タンパク質を発現することを同定した（図１０および表１）。
【００７９】
【表１】
0004092278.tif 000002
それらのタンパク質の生物学的活性は、両向性エンベロープと薬剤耐性Ｇ４１８に対する耐性を付与するＮｅｏ＋マーカーの両方を発現するレトロウイルスベクターＬＡＲＮＬ（図１Ｂ参照）を導入することによって試験した。どの場合でも、ベクター由来のｅｎｖと細胞系中のｇａｇ／ｐｏｌとの同時発現は、３Ｔ３細胞へのＧ４１８耐性の無細胞伝達により（力価を）測定すると、ベクターの効率的パッケージングを可能にした。力価は、培地交換の１６時間後の周密的単層から、４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で６ｃｍの組織培養プレート上の５×１０４個のＮＩＨ３Ｔ３  ＴＫ−細胞に濾過済上清（０．４５μｍフィルター）を添加し次いでＧ４１８中で選別を行うことにより測定した。有意にも、細胞系からのベクター力価がｐ３０ｇａｇのレベルと相関関係を有した（表１）。ｅｎｖのレベルは各クローンで同じであり、ＰＡ３１７において認められるレベルと同等であるので（データは示してない）、力価がそれらの細胞（ＰＡ１７を含む）中のｇａｇ／ｐｏｌのレベルにより制限されたことを示す。該力価はＲＴのレベルよりもｐ３０ｇａｇのレベルと一層密接な相関関係を有した。
（ｉｉ）両向性パッケージング系へのｇａｇ／ｐｏｌ系の転換
両向性ＰＣＬの生成の例として、２９３（２−３と称する）及びＤ１７（４−１５と称する）のためのｇａｇ／ｐｏ１過剰−発現体が、上記と同じ技法により同時トランスフェクトされ、但し、耐フレオマイシン性ベクター、すなわちｐＵＴ５０７（Ｍｕｌｓａｎｔなど，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１４：２４３−５２，１９８８）１μｇ及び両向性エンベロープ発現ベクター、すなわちｐＭＬＰｅｎｖＡｍＳｐｂ（２−３）又はｐＣＭＶｅｎｖＡｍＮｈｅ（４−１５）１０μｇが使用された。フレオマイシンの存在下でのトランスフェクトされた細胞についての選択の後、個々の耐薬物性細胞コロニーを拡張し、そして抗ｇｐ７０（Ｎ．Ｃ．Ｉからのヤギ抗血清＃７９Ｓ０００７７１）を用いてウェスタンプロットにより細胞内ｇｐ８０ｅｎｖ発現について分析した、比較的高レベルのｇａｇ／ｐｏｌ及びａｍｐｌｏｅｎｖ（ＰＣＬ，代表的なデータについては図１を参照のこと）を発現するいくつかのクローンを同定した。
【００８０】
ａｍｐｈｏＰＣＬの生成のもう１つの例においては、ＣＦ２細胞を、２μｇの耐フレオマイシン性マーカー、ｐＵＴ５０７、１０μｇのｐＳＣＶ１０（上記）及び１０μｇのｐＣＭＶｅｎｖＡｍＮｈｅ（上記）によりエレクトロポレートした（たとえば、Ｃｈｕなど．，Ｎａｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：１３１１〜２６，１９８７を参照のこと）。フレオマイシンの存在下でのトランスフェクトされた細胞についての選択の後、個々の耐薬物性細胞コロニーを拡張し、そして特異的抗血清を用いてウェスタンブロットによりＭＬＶｐ３０ｇａｇ及びｇｐ８０ｅｎｖタンパク質の細胞内発現について分析した。比較的高レベルのｇａｇ／ｐｏｌ及びａｍｐｈｏｅｎｖを発現するクローンを同定した（図１Ｅ）。
（ｉｉｉ）両向性パッケージング細胞系の性能．
多くのそれらのａｍｐｈｏＰＣＬを、レトロウイルスベクターの導入後、力価を測定することによってレトロウイルスベクターをパッケージするそれらの能力について試験した（図２）。測定は、前記系統の平均的性能を計算するために、クローンされていないＰＣＬを用いて行なわれた。
【００８１】
【表２】
0004092278.tif 000003
ａ  ｃｆｕ／ｍｌ
ｂ  正の対照としてＭＡウイルスによるマーカー救助アッセイにより判断されるような
ｃ  培養において２０日後
ｄ  培養において６０日後
ｅ  培養において９０日後
最高の力価は、レトロウイルスベクターが感染によりＰＣＬ中に導入された場合に得られる（Ｈｉｌｌｅｒなど．，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅ１１．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１７５〜８３，１９８６）。しかしながら、両向性ＭＬＶベクターは、それらの宿主細胞型を感染することが知られているが、ＰＣＬは、それらがａｍｐｈｏ  ｅｎｖを発現するので、ａｍｈｏベクターによる感染のために阻止される（“ウイルス干渉”）。この問題を克服するために、他のエンベロープ（たとえば、ａｍｐｈｏレセプター以外の細胞レセプターに結合する異種向性ｅｎｖ又はＶＳＶ  Ｇタンパク質）を含むベクターを次の態様で生成した。対象のベクターＤＮＡ  １０μｇを、高レベルのＭｏＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌ，たとえば２−３細胞（上記を参照のこと）を発現する細胞系上にｘｅｎｏｅｎｖ（ｐＣＭＶｘｅｎｏ，上記）又はＶＳＶ  Ｇタンパク質発現ベクターのいづれかを発現するＤＮＡ  １０μｇにより同時トランスフェクトした。それぞれ異種向性ｅｎｖ又はＶＳＶ  Ｇタンパク質を含むその得られたベクターを、前記同時トランスフェクトされた細胞において一時的に生成し、そして２日後、細胞を含まない上清液を前記可能性あるＰＣＬに添加し、そしてベクター感染された細胞をＧ４１８における選択により同定した。両タイプのベクターは、ａｍｐｈｏ阻害された細胞を効果的に感染し、そしてＧ４１８の選択の後、細胞を含まない上清液を集密的細胞単層から集め、そして上記のようにしてＭＨ３Ｔ３  ＴＫ−細胞に対して力価定量を行なった。最高の力価を有する細胞クローンをＰＣＬとして選択し、そしてＤＡ（Ｄ１７ａｍｐｈｏ），２Ａ（２９３ａｍｐｈｏ）及びＣＡ（ＣＦ２ａｍｐｈｏ）としてそれぞれ言及した。高い可能性の生成ヘルパーウィルス（Ａｒｍｅｎｔａｎｏなど，Ｊ．Ｖｉｒｏ１．６２：１６４７−５０，１９８７）を有するレトロウイルスベクター（Ｎ２）がＰＣＬ中に導入され、そしてその細胞が２ヵ月間もの間（ベクターＫＴ−３のためには３ヵ月）、継代される場合でさえ、現在記載されるＰＣＬにはヘルパーウィルスは決して検出されなかった、他方、ＰＡ３１７細胞系中に導入された同じベクターは、連続３週間以内の継代でヘルパーウィルスを生成した。
（ｉｖ）異種向性パッケージング細胞系へのｇａｇ／ｐｏｌ系の転換
異種向性ＰＣＬの生成の例として、ＨＴ１０８０（ＳＣＶ２１）及びＤ１７（４−１５と称する）のためのｇａｇ／ｐｏｌ過剰−発現体が、上記と同じ技法により同時トランスフェクトされ、但し、耐フレオマイシン性ベクター、すなわちｐＵＴ５０７（ＳＣＶ２１のための又は耐ヒグロマイシンＢマーカー，ｐＹ３（４−１５，Ｂｌｏｃｈｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄｉｇｇｅｌｍａｍｍ，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：２９２９−３１，１９８４）及び異種向性エンベロープ発現ベクター、すなわちｐＣＭＶｘｅｎｏ（上記）１０μｇが使用された。フレオマイシン又はヒグロマイシンの存在下でのトランスフェクトされた細胞についての選択の後、個々の耐薬物性細胞コロニーを拡張し、そして特異的抗血清を用いてウェスタンブロットによりＭＬＶ  ｐ３０ｇａｇ及びｇｐ７５ｅｎｖタンパク質の発現について分析した。比較的高レベルのｇａｇ／ｐｏｌ及びｘｅｎｏｅｎｖの両者を発現するクローンを選択した（図１Ｆ）。
（ｖ）異種向性パッケージング細胞系の性能
多くのそれらの可能性あるｘｅｎｏＰＣＬを、レトロウイルスベクターの導入後、力価を測定することによってレトロウイルスベクターをパッケージするそれらの能力について試験した（表３）。
【００８２】
【表３】
0004092278.tif 000004
上記のようにして、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を含むベクターを、２−３細胞において一時的に生成した。２日後、細胞を含まない上清液をｘｅｎｏＰＣＬに添加し、そしてＧ４１８の選択の後、細胞を含まない上清液を集密的細胞単層から集め、そして上記のようにして力価を測定し、但し、ｘｅｎｏベクターによる感染性であるＨＴ１０８０細胞を、ｘｅｎｏベクターに対して耐性であるＮＩＨ３Ｔ３  ＴＫ−細胞の代わりに使用した。最高の力価を有する細胞クローンをＰＣＬとして選択し、そしてそれぞれＤＸ（Ｄ１７ｘｅｎｏ）及びＨＸ（ＨＴ１０８０ｘｅｎｏ）として言及した。
【００８３】
ヘルパーウィルスを生成するＰＣＬの傾向を、ベクターＮ２を含むａｍｐｈｏ及びｘｅｎｏＰＣＬを同時培養することによってさらに一層、厳密に試験した。ａｍｐｈｏベクターはｘｅｎｏＰＣＬを感染し、そして逆もまた同様であるので、これは連続した交叉感染出来事を可能にし、ここで個々の出来事はヘルパーウィルスを生成する可能性を高める。例として、Ｎ２を含む２Ａ細胞を、再２を含むＨＸ細胞と共に同時培養した。
２３日後、その培養物は、２９３又はＭｕｓ  ｄｕｎｎｉ細胞に対するベクター救済アッセイにより判断する場合、ａｍｐｈｏ及びｘｅｎｏウイルスをまだ有さず、前記両細胞は、ａｍｐｈｏ及びｘｅｎｏウイルスを検出することができる（表４）。
【００８４】
【表４】
0004092278.tif 000005
（ｖｉ）多向性パッケージング細胞系へのｇａｇ／ｐｏｌ系の転換
多向性ＰＣＬの生成の例として、ＨＴ１０８０（ＳＣＶ２１）のためのｇａｇ／ｐｏｌ過剰−発現体が、上記と同じ技法により同時トランスフェクトされ、但し、１μｇの耐フレオマイシン性ベクター、すなわちｐむＴ５０７及び１０μｇの多向性エンベロープ発現ベクター、すなわちｐＣＭＶＭＣＦ（上記）が使用された。フレオマイシンの存在下でのトランスフェクトされた細胞についての選択の後、個々の耐薬物性細胞コロニーを拡張し、そして特異的抗血清を用いてウェスタンブロットによりＭＬＶ  ｇｐ７０ｅｎｖタンパク質の細胞内発現について分析した、比較的高レベルのｇａｇ／ｐｏ１（示されていない）及び多向性ｅｎｖ（図１Ｇ）を発現するクローンを同定した。
（ｖｉｉ）多向性パッケージング細胞系の性能
これらの可能性あるポリＰＣＬの１つを（クローン３）を、レトロウィルスベクターの導入の後、力価を測定することによってレトロウイルスベクターをパッケージする能力について試験した（表５）。
【００８５】
【表５】
0004092278.tif 000006
この細胞クローンをＰＣＬとして選択し、そしてＨＰ（ＨＴ１０８０  Ｐｏｌｙ）として言及した。上記のようにして、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を含むベクターを、２−３細胞において一時的に生成し、そして２６日後、細胞を含まない上清液を多向性ＰＣＬ（ＨＰ）に添加した。Ｇ４１８の選択の後、細胞を含まない上清液を集密的細胞単層から集め、そして種々の細胞系に対して上記のようにして力価を測定した。ヒト細胞の感染をひじょうに制限し、そして試験されたすべての細胞系は陰性であり、但し２９３細胞を除く。
【００８６】
レトロウイルスベクターにより特定細胞タイプの効果的感染を導びく因子は完全には理解されていないけれども、それらの比較的に高い成熟速度のために、レトロウイルスは、その細胞タイプ（アダプター細胞）におけるウイルスの連続した再感染及び増殖により、初期増殖が良好でない細胞タイプにおいて著しく改良された増殖のために適合され得ることが明白である。これはまた、いくつかのウイルス機能（たとえばｅｎｖ）をコードし、そして感染性ベクター粒子（たとえばｇａｇ／ｐｏ１）を付与するためにベクターの機能を補足する必要がある機能を有するように構築された特定タイプの細胞において連続的に通されるウィルスベクターを用いて達成され得る、たとえば、主要細胞培養物又は永久細胞系、たとえばＳｕｐ  Ｔ１（Ｔ−細胞）又はＵ９３７（単球）のいづれかの連続した増殖及び再感染によりヒトＴ−細胞又は単球にネズミ両向性ウイルス４０７０Ａを適合することができる、最大の増殖が達成された後すぐに、逆転写酵素レベル又はウイルス生成の他のアッセイにより測定される場合、ウイルスは多くの標準的方法のいづれかによりクローンされ、そのクローンは活性（すなわち、アダプター細胞型中へのトランスフェクションに対して特徴的な同じ最大の増殖を付与する能力）、及び適切に製造されたヘルパー又は生成体系においては、高い効率（１０７〜１０９感染単位／ｍｌ）を有するアダプター細胞において感染し、そして発現するウィルスベクター粒子の生成を導びくであろう欠陥ヘルパーゲノム及び／又はベクターを製造するために使用されるこのゲノムについて調べられる。
【００８７】
（ＶＩＩ．他のウィルスベクターパッケージング技法）
２種の追加の他のシステムを用いて、ベクター構成体を担持する組換えレトロウイルスを生成することができる。これらのシステムの個々は、昆虫ウイルス、バキュロウィルス及び哺乳類ウイルス、ワクシニア及びアデノウイルスが、遺伝子がクローンされた多量のいづれかの一定タンパク質を製造するために最近、適合された事実の利点を有する。たとえば、Ｓｍｉｔｈなど．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１２，１９８３）；Ｐｉｃｃｉｎｉなど（Ｍｔｈ．Ｅｎｚｍｏｌｏｇｙ，１５３：５４５，１９８７）；及びＭａｎｓｏｕｒなど（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２；１３５９，１９８５）を参照のこと。
【００８８】
このウィルスベクターは、ウィルスベクター中への適切な遺伝子の挿入により組織培養細胞においてタンパク質を生成するために使用され得、そして従って、レトロウイルスベクター粒子を製造するために適合され得る。アデノウイルスベクターは核複製ウイルスに由来し、そして欠陥性であり得る。遺伝子がベクター中に挿入され、そしてインビトロ構成（Ｂａｌｌａｙなど，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：３８６１，１９８５）により又は細胞における組換え（Ｔｈｕｍｍｅｌなど，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １：４３５，１９８２）により哺乳類細胞にタンパク質を発現するために使用され得る。
【００８９】
１つの好ましい方法は、（１）ｇａｇ／ｐｏｌ、（２）ｅｎｖ、（３）変性されたウィルスベクター構成体を駆動するアデノウイルスのＭａｊｏｒ  Ｌａｔｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＭＬＰ）を用いてプラスミドを構成することである。変性されたウィルスベクター構成体は、ウィルスベクタープロモーターを含む、５’ＬＴＲのＵ３領域が他のプロモーター配列により置換され得るので可能である（たとえば、Ｈａｒｔｍａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：９３４５，１９８８を参照のこと）。この部分は、３’ＬＴＲからのＵ３により１ラウンドの逆転写酵素の後に置換されるであろう、次に、これらのプラスミドは、インビトロでアデノウイルスゲノムを製造するために使用され（Ｂａｌｌａｙなど，ｏｐ．ｃｉｔ．）、そしてこれらは２９３細胞にトランスフェクトされ（アデノウイルスＥＩＡタンパク質を製造するヒト細胞系）、このためには、アデノウイルスベクターは、欠陥アデノウイルスベクターにおいて別々に担持されるｇａｇ／ｐｏｌ，ｅｎｖ及びレトロウイルスベクターの純粋なストックを生成するために欠陥性である。そのようなベクターの力価は典型的には１０７−１０１１／ｍｌであるので、これらのストックは、高い多重度で組織培養細胞を同時に感染せしめるために使用され得る。次に、その細胞は、高レベルでレトロウイルスタンパク質及びレトロウイルスベクターゲノムを生成するためにプログラムされるであろう、アデノウイルスベクターは欠陥性であるので、多量の直接的な細胞溶解物は生ぜず、そしてレトロウイルスベクターは前記細胞上清液から収穫され得る。
【００９０】
他のウィルスベクター、たとえば無関係なレトロウイルスベクター（たとえばＲＳＶ，ＭＭＴＶ又はＨＩＶ）に由来するベクターが、主要細胞からのベクターを生成するために同じ態様で使用され得る。１つの態様において、これらのアデノウイルスベクターは、一次細胞と共に使用され、主要細胞からレトロウイルスベクター調製物を生ぜしめる。
【００９１】
多くの場合、他のウイルスからの遺伝子生成物は、レトロウイルスパッケージングシステムの性質を改良するために使用され得る．たとえば、ＨＩＶｒｅｖタンパク質は、ＨＩＶｅｎｖ又はＨＩＶｇａｇ／ｐｏｌ  ＭＬＶベクターのスプライシングを妨ぐために包含され、又はＨＩＶｓｏｒは、それがＨＩＶにより高まるように遊離ウイルスによりＴ細胞の感染性を高めることができる（Ｆｉｓｃｈｅｒなど．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：８８８−８９３，１９８７を参照のこと）．他のシステム（より実際的に細胞外性である）においては、次の成分が使用される：
１．Ｓｍｉｔｈなど（前記）に記載されるのに類似する態様でバキユロウィルスシステム（又は他のタンパク質生成システム、たとえば酵母又はＥ．コリ）に製造されるｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質；
２．既知のＴ７又はＳＰ６又は他のインビトロＲＮＡ−生成システムに製造されるウィルスベクター（たとえば、Ｆｌａｍａｎｔ  ａｎｄ  Ｓｏｒｇｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１８２７，１９８８を参照のこと）；
３．（２）におけるようにして製造され、又は酵母又は哺乳類組織培養細胞から精製されたｔＲＮＡ；
４．リボソーム（固定されたｅｎｖタンパク質を有する）；及び
５．細胞抽出物又はｅｎｖプロセッシングを提供するために必要な精製された成分，（同定される場合）（典型的にはマウス細胞から）、及びいづれか又は他の必要な細胞由来の機能。
【００９２】
この工程的で、（１），（２）及び（３）が混合され、そして次に、ｅｎｖタンパク質、細胞抽出物及びプレ−リボソーム混合物（適切な溶媒における脂質）が添加される。しかしながら、（１），（２）及び（３）の混合物に前記得られたリボソーム固定されたｅｎｖを添加する前、リボソームにｅｎｖタンパク質をより早く固定することが必要である。その混合物は、Ｃｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅなど．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４８：１５，１９８５に記載されているようにして、医薬のリボソームカプシド化のための態様に類似する態様で脂質及び固定されたｅｎｖタンパク質による新生ウイルス粒子のカプシド化を可能にするために、処理される（たとえば高波処理、温度操作又は回転透析により）。この方法は、病原性レトロウイルス又は複製コンピテントレトロウイルスによる汚染を伴わないで高い力価の複製インコンピテント組換えレトロウイルスの生成を可能にする。
【００９３】
（ＶＩＩＩ．胞系−特異性レトロウイルス−“ハイブリッドエンベロープ”）
レトロウイルスの宿主細胞範囲特異性がＣＭＶ遺伝子生成物により一部決定される。たとえば、Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．（ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｎｓｅｓ  ２：２５〜２７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｒｂｏｒ，１９８５）は、ネズミ自血病ウイルス（ＭＬＶ）及びＲｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａウィルス（ＲＳＶ）からのタンパク質の細胞外成分が特異的レセプター結合を担当することを示す。他方、エンベロープタンパク質の細胞質ドメインは、ビリオン形成において役割を演じることが理解される。プソイドタイピング（Ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）（すなわち他の種のウィルスタンパク質により１つの種からのウイルスＲＮＡのカプシド化）は低い頻度で生じるが、エンベロープタンパク質は、一定のレトロウイルスのビリオン形成に対してある特異性を有する。本発明は、ハイブリッドｅｎｖ遺伝子生成物（すなわち特に、天然においての同じタンパク質分子に存在しない細胞質領域及び外因性結合領域を有するｅｎｖタンパク質）を創造することによって、宿主範囲の特異性が細胞質機能から無関係に変更され得ることを認識する。従って、予備選択された標的細胞に特異的に結合するであろう組換えレトロウイルスが生成され得る。レセプター結合成分及び細胞質成分が異なったレトロウイルスからであるハイブリッドタンパク質を製造するためには、組換えのための好ましい位置は、細胞質成分の膜拡張領域内に存在する。実施例１０は、ＭＬＶエンベロープタンパク質の細胞質ドメインに結合されるＨＩＶエンベロープタンパク質のＣＤ４結合部分を有するタンパク質を発現するハイブリッドｅｎｖ遺伝子の構成を記載する。
【００９４】
（実施例３：ハイブリッドＨＩＶ−ＭＬＶエンベロープ）
ハイブリッドエンベロープ遺伝子を、結合の適切な点で新しい制限部位を導入するためにインビトロ変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８〜４９２，１９８５）を用いて調製する。他方、２つのエンベロープ配列が同じプラスミド上に存在する場合、それらはインビトロ変異誘発を用いていづれか所望する点で直接的に結合され得る。いづれかの場合において、その末端結果物は、ＨＩＶｇｐ１６０の５’端及びＭＬＶｐ１５Ｅの３’端を含むハイブリッド遺伝子である。その得られる組換え遺伝子により発現されるハイブリッドタンパク質は、図２に例示され、そしてＨＩＶｇｐ１２０（ＣＤ４レセプター結合タンパク質）、ＨＩＶｇｐ４１の細胞外部分（ｇｐ１２０結合及び融合性領域）及びＭＬＶｐ１５Ｅの細胞質部分、並びに宿主膜内でのいづれかのいくつかの点で生じる結合を含む。細胞質表面で融合結合（図２における結合Ｃ）を有するハイブリッドは、ＳｕｐＴｌ細胞に発現される場合、融合細胞を引き起こす。明らかな融合細胞の数は、同じ発現ベクターにおける非ハイブリッドＨＩＶエンベロープ遺伝子の数の約１／５である。ハイブリッドを有する融合細胞は、ｒｅｖタンパク質がトランス型で同時発現される場合にのみ生じる。細胞外表面で融合結合（図２における結合Ａ）を有するハイブリッドは融合細胞を付与しないが、ハイブリッドＢ（トランスメンプラン領域の中央に）は、ハイブリッドＣよりも約５倍低い融合細胞をＳｕｐＴ１細胞上に付与する。
【００９５】
実施例３は２つの異なったレトロウイルスから生成される１つのハイブリッドタンパク質を例示するが、その可能性はレトロウイルス又は他のウイルスに制限されない。たとえば、ヒトインターロイキン−２のレセプター結合部分は、ＩＬ−２レセプターを有する細胞にベクターを向けるためにＭＬのエンベロープタンパク質と組合され得る。この場合、組換えは好ましくは、ＭＬＶｅｎｖ遺伝子のｇｐ７０部分に位置し、損なわれていないｐ１５Ｅタンパク質を放す、さらに、前記技法は、抗体Ｆｃセグメントを認識するエンベロープタンパク質を有する組換えレトロウイルスを創造するために使用され得る。次に、予備選択された標的細胞のみを認識するモノクローナル抗体は、レトロウイルスがそれらの予備選択された標的細胞のみに結合し、そして感染せしめるようなエンベロープタンパク質を示すそのような組換えレトロウイルスに結合され得る。他方、アビジンの結合ドメインを有するハイブリッドエンベロープは、ビオチン化された抗体又は他のリガンドを有する患者又は動物における細胞の“像”を標的化するために有用である。患者はまず、抗体により満たされ、そして次に、ベクターを投与する前、非特異的に結合する抗体を患者のシステムから清浄される。次に、ビオチンのためのアビジン結合部位の高親和性（１０−１５）が、モノクローナル“像”により同定される元の組織への正確且つ効果的な標的化を可能にする。
【００９６】
そのアプローチはまた、３種のレベルのレトロウイルスベクター特異性、すなわち細胞侵入、遺伝子発現及び発現されたタンパク質の選択を利用することによって、腫瘍特異的標的化及び殺害を達成するために使用され得る。レトロウイルスベクターが細胞に入り、そして細胞内部位でそれらの効果を付与する。この点で、それらの作用はひじょうにユニークである。この性質及び３種のレベルの天然のレトロウイルス特異性（上記）を用いれば、レトロウイルスベクターが、腫瘍細胞を標的化し、そして殺害するために構築され得る。
【００９７】
腫瘍細胞へのレトロウイルスの標的化の全体の目的は、２つの主な実験的ルート；すなわちａ）腫瘍細胞において選択的に増殖するレトロウイルスのための組織培養（又は動物）においての選択；又はｂ）インビトロ継代により製造される改良点を伴って、組織（腫蕩）−特異的プロモーターによるレトロウイルスベクターの構成、及び陰性及び陽性薬物−感受性選択により達成され得る。選択された細胞タイプ、たとえば腫瘍細胞を選択的に感染せしめるために適切なベクターは一般的に、（ａ）ウイルスが遺伝子的に変異誘発され、そして卓越した早く増殖する株が生成されるまで選択された細胞タイプの細胞にウイルスを連続的に継代し；（ｂ）変異誘発され、そして早く増殖する株を単離し；（ｃ）変異誘発されたウイルスの好ましい増殖を担当する変異誘発された株の成分を同定し、そして単離し；（ｄ）ウイルスに基づいての生成体細胞における対応成分のための置換体として前記同定され、そして単離された成分を挿入し（連続的継代の前）；そして（ｅ）ベクターを生成するために前記生成体細胞を培養することによって調製され得る。
【００９８】
少なくとも次の４種の選択的手段が、腫瘍細胞において選択的に増殖するレトロウイルスを選択するために使用され得る；すなわち
１）“インビトロ継代によるＥｎｖ選択”、ここで改良された複製増殖能力を有するレトロウイルスの選択は腫瘍細胞におけるくり返しての継代により達成される；２）“耐薬物性遺伝子による選択”、ここで腫瘍“特異的”レトロウイルスのための遺伝子選択が結合された耐薬物性遺伝子を含むウイルス構造体に基づかれている；３）“ハイブリッド−Ｅｎｖ”、ここで腫瘍−“特異性”を有するレトロウイルスの選択（上記＃１又は＃２手段による）は、腫瘍レセプター遺伝子（すなわちｅｎｖと融合される抗−腫瘍抗体Ｈ−鎖  Ｖ−領域遺伝子；又はｅｎｖと融合される増殖レセプター）の融合であるハイブリッドエンベロープ遺伝子を含む構造体から開始される；この場合、選択は好ましい開始点、たとえば腫瘍細胞に対してある特異性を有するｅｎｖで始まる；又は４）“インビトロでの継代による選択及び正常細胞による同時培養による逆選択”、ここで腫瘍細胞における増殖が耐薬物性腫瘍細胞及び薬物感受性正常細胞の混合物におけるくり返しての継代により選択される。
【００９９】
組織（腫瘍）−特異性プロモーターを担持するレトロウイルスベクター構造体に関して、種々のレベルの組織特異性を有する生化学的マーカーは良く知られており、そして組織−特異性プロモーターを通しての遺伝子制御がいくつかのシステムにおいて理解される。転写プロモーター要素（すなわちトランスファーレセプター、チミジンキナーゼ、等）が急速に増殖する細胞において比較的活性的である多くの遺伝子及びプロモーター／エンハンサー要素（すなわち肝臓のためのＨＢＶエンハンサー、前立腺のためのＰＳＡプロモーター）が組織特異性である他の遺伝子が存在する。レトロウイルスベクター及び組織特異的プロモーター（内部プロモーターとして又はＬＴＲ内に存在する）は、選択可能マーカー及び細胞サイクル遺伝子（すなわち薬物感受性、Ｅｃｏ  ｇｐｔ；又はＴＫ−細胞におけるＨＳＶＴＫ）の発現を駆動することができる。これらの遺伝子の発現は、それぞれミロフェノール酸又はＨＡＴを含む培地において選択され得る、この態様において、耐薬物性遺伝子を活性的に発現する組込まれたプロウイルスを含む腫瘍細胞が生存するであろう。このシステムにおける選択は、組織−特異的プロモーター及びウイルスＬＴＲの両者のための選択を包含する。他方、腫瘍細胞における、及び正常細胞においてではない特異的発現は、正常細胞上に定期的にウイルスを継代し、そしてそれらの細胞においてＥｃｏ  ｇｐｔ又はＨＳＶｔｋ（薬物感受性）を発現するウイルスに対して選択する（チオキサンチン又はアシルクロバーにより）ことによって逆選択され得る。Ｅｃｏ  ｇｐｔ又まｔｋ表現型を発現する組込まれたプロウイルスを含む感染された細胞は死亡し、そして従って、その細胞タイプにおけるウイルスが選択されるであろう。
【０１００】
（ＩＸ．部位−特異的組込み）
染色体上での予定された遺伝子座へのレトロウイルスベクターの標的化は、遺伝子運搬システムの利益を高める。安全性の測定は、染色体上の“安全”スポット、すなわちベクターの挿入から有害な効果を有さないことがわかっているスポットヘの直接的な組込みにより得られる。もう１つの可能性ある利点は、その発現が最大化される、染色体の“開放”領域に遺伝子を向ける能力である。特異的部位でのレトロウイルスを組込むための２種の技法が下記に説明される。
（ｉｉ）インテグラーゼ変性
標的細胞のゲノムの予備選択された特異的部位中にベクター構成体を組込むためのもう１つの技法はインテグラーゼ変性を包含する。レトロウイルスｐｏｌ遺伝子生成物は一般的に、４種の部分：
（ｉ）ウイルスｇａｇ及びｐｏｌ生成物を処理するプロテアーゼ；（ｉｉ）逆転写酵素；及び（ｉｉｉ）ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のＲＮＡを変性するＲＨアーゼＨ；及び（ｉｖ）エンドヌクレアーゼ又は“インテグラーゼ”に処理される。
【０１０１】
一般的なインテグラーゼ構造は、Ｊｏｈｎｓｏｎなど．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７６４８〜７６５２，１９８６）により分析された。このタンパク質は、レトロウイルス配列を組込む前、宿主ＤＮＡと相互作用する亜鉛結合フィンガーを有することが提案されている。他のタンパク質において、そのような”フィンガー”は、特定な配列でＤＮＡへの前記タンパク質の結合を可能にする。１つの典型的な例は、ステロイドレセプターである、この場合、エストロゲンレセプター遺伝子におけるエストロゲンレセプターフィンガーセグメントの代わりにグルココルチコイドレセプター“フィンガー”（すなわちＤＮＡ結合セグメント）を単純に置換することによって、エストロゲンに対応するエストロゲンレセプターがグルココルチコイドに対応するグルココルチコイドレセプターの効果を有するようにすることができる。この例においては、タンパク質が標的化されるゲノムにおける位置が変更された。そのような方向づけ配列はまた、存在する亜鉛フィンガーの代わりにインテグラーゼ遺伝子中に置換され得る。たとえば、ヒトエストロゲンレセプター遺伝子のＤＮＡ結合領域をコードするセグメントが、パッケージングゲノムにおいてインチダラーゼのＤＮＡ結合領域の代わりに置換され得る。初めに、特異的組込みが、インビトロ組込みシステム（Ｂｒｏｗｎなど．，（Ｃｅｌｌ  ２９：３４７〜３５６，１９８７）により試験される、特異性がインビボに見られることを確保するために、このパッケージングゲノムが、感染性ベクター粒子を製造するために使用され、そしてエストロゲン感受性及びエストロゲン非感受性細胞の感染及びそれらの細胞中への組込みが培養において比較される。
【０１０２】
この技法の使用により、到来するウィルスベクターが、インテグラーゼゲソム中にスプライスされる部位特異的ＤＮＡ−結合タンパク質セグメントのゲノム結合性質により指図される、標的細胞のゲノム上での予備選択された部位中への組込みに向けられ得る。組込み部位は、実際、変性されたインテグラーゼのフィンガーをよく受け入れるべきであることが当業者により理解されるであろう、たとえば、ほとんどの細胞は、グルココルチコイドに対して感受性であり、そして従って、それらのクロマチンは、グルココルチコイドレセプターのための部位を有する。従ってほとんどの細胞のためには、グルココルチコイドレセプターフィンガーを有する変性されたインチダラーゼは、それらのグルココルチコイドレセプター結合部位でプロウィルスベクター構成体を組込むために適切であろう。
【０１０３】
（Ｘ．トランスジェニック動物における組換えレトロウイルスベクターの生成）
レトロウイルスベクターのヘルパー系生成に関してこれまで記載される２つの問題は次のことである：（ａ）多量のベクターの生成の困難性；及び（ｂ）ベクターを製造するために一次細胞の代わりに永久的細胞を使用する現在の必要性。これらの問題は、トランスジェニック動物に生成される生成体又はパッケージング系により克服され得る。これらの動物は、パッケージングゲノム及びレトロウイルスベクターゲノムを担持する。現在の技法は、それらの限定された寿命により主要細胞におけるパッケージング細胞系及び所望するベクター生成系の生成を可能にしない。現在の技法は、老衰のために主要細胞の使用を除外する、広範な特徴づけが必要であるような技法である。しかしながら、トランスジェニック動物の個々の系統が、パッケージング機能、たとえばｇａｇ，ｐｏ１又はｅｎｖを生成する本明細書に供給される方法により生成され得る。次に、これらの動物系は、パッケージング機能を転写するために組織特異的プロモーター又はハウスキーピングの選択的使用により完全な動物又は標的化された組織のいづれかにおける発現のために特徴づけられる。開放されるべきベクターはまた、組織−特異的又はハウスキーピングプロモーターを有するトランスジェニック動物の系統中に挿入される。上記で論じられたように、ベクターは、５’ＬＴＲのＵ３領域を置換するそのようなプロモーターを開放され得る（図３）。このトランス遺伝子は、その発現において誘発性であり、又は遍在性であるしかしながら、このベクターはパッケージされない。次に、これらの動物系をｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ動物に対合し、そして続く子孫がパッケージングされたベクターを生成する。実質的に同一である子孫が特徴づけられ、そして主要生成細胞の無限の源を提供する。他方、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖを製造し、そしてトランスジェニック動物に由来する主要細胞が、主要細胞生成体系を製造するために多量のレトロウイルスベクターにより感染され又はトランスフェクトされ得る。多くの異なったトランスジェニック動物又は昆虫、たとえばマウス、ラット、ニワトリ、ブタ、ウサギ、ウシ、羊、魚及びハエは、それらのベクターを生成する。そのベクター及びパッケージングゲノムが、組織−特異性プロモーター及び種々のエンベロープタンパク質の使用により種感染特異性及び組織−特異性発現のために構成される。そのような方法の例は、図４に示される。主要パッケージング系のトランスジェニック生成の次の例はマウスに関してのみ記載されているが、それらの方法は当業者により他の種に拡張され得る。それらのトランスジェニック動物は、マイクロインジェクション又は遺伝子トランスファー技法により生成され得る。マウスゲノムにおけるＭＬＶ配列に対しての相同性を付与する場合、好ましい最終動物はマウスではない。
【０１０４】
（実施例４：トランスジェニック動物における遍在性発現のためのハウスキーピングプロモーターを用いてのｇａｇ／ｐｏｌタンパク質の生成）
良く特徴づけられたハウスキーピングプロモーターの例はＨＰＲＴプロモーターである。ＨＰＲＴは、すべての組織において発現するプリンサルベージ酵素である。（Ｐａｔｅｌなど．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：３９３〜４０３，１９８６及びＭｅｌｔｏｎなど．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：２１４７〜２１５，１９８４を参照のこと）。このプロモーターは、組換えＤＮＡ技法（Ｍａｎｉａｔｉｓなど，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃ１ｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８２を参照のこと）を用いて、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）にクローン化される種々のｇａｇ／ｐｏｌフラグメント（たとえばＢａｌＩ／ＳｃａＩ；ＡａｔＩＩ／ＳｃａＩ；ＭｏＭＬＶのＰｓｔＩ／ＳｃａＩ；ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８５を参照のこと）の前方に挿入される。得られたプラスミドは、精製され（Ｍａｎｉａｔｉｓなど．，ｏｐ．ｃｉｔ．）、そして適切な遺伝子情報がＧｅｎｅｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ  １０１）又は電気溶出（Ｈｏｇａｎなど．Ｍａｎｉｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８６を参照のこと）を用いて単離される。
【０１０５】
これらの十分に特徴づけられたＤＮＡは、２μｇ／ｍｌの濃度で、受精されたマウス卵の前核にマイクロインジェクトされる。生存する生まれたマウスをテイルブロット分析（Ｈｏｇａｎなど．，ｏｐ．ｃｉｔ．を．参照のこと）によりスクリーンする。トランスジェニック−陽性動物を、放射性ラベルされた一次細胞、たとえば線維芽細胞の免疫沈殿法によりｇａｇ／ｐｏｌタンパク質の発現レベルについて特徴づける（Ｈａｒｌｏｗなど．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａ１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８を参照のこと）、次に、動物は、特徴づけられたレベルのｇａｇ／ｐｏ１を生成する動物系の確立のためにホモ接合度に繁殖する。
【０１０６】
（実施例５：トランスジェニック動物における遍在性現のためのハウスキーピングプロモーターを用いてのｅｎｖタンパク質／ハイブリッドエンベロープタンパク質の生成）
この例は、エンベロープ又はハイブリッドエンベロープタンパク質のいづれかの発現のためにＨＰＲＴプロモーターを使用する。エンベロープタンパク質は、ＭＬＶの場合、適切なｇａｇ／ｐｏｌを補足できるいづれかのレトロウイルスからであり得る。例として、エコトロピック（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）ＭＬＶ，両向性ＭＬＶ，異種向性ＭＬＶ，多向性ＭＬＶ又はハイブリッドエンベロープを挙げることができる。上記のようにして、エンベロープ遺伝子を、組換えＤＮＡ技法（Ｍａｎｉａｔｉｓなど．，ｏｐ．ｃｉｔ．を参照のこと）を用いてＨＰＲＴプロモーターの後ろにクローン化する。その得られる“ミニ遺伝子”を単離し（Ｈｏｇａｎなど．，ｏｐ．ｃｉｔ．を参照のこと）、そしてエンベロープタンパク質の発現を決定する（Ｈａｒｌｏｗなど，ｏｐ．ｃｉｔ．）。トランスジェニックエンベロープ動物を、十分に特徴づけられたエンベロープ動物を確立するためにホモ接合度に繁殖する。
【０１０７】
（実施例６：トランスジェニック動物における遍在性のためのハウスキーピングプロモーターを用いてのｇａｇ／ｐｏｌ−ｅｎｖ動物の生成）
これは、十分に特徴づけられたｇａｇ／ｐｏｌ動物、並びに永久的なｇａｇ／ｐｏ１／エンベロープ動物系の確立のための動物を使用する。これは、ホモ接合度への繁殖及び十分に特徴づけられた系統の確立を包含する。次に、これらの系統は、組織培養においてベクターをパッケージするために使用され得る主要マウス胚系を確立するために使用される。さらに、レトロウイルスベクターを含む動物をこの系統中に繁殖する。
【０１０８】
（実施例７：トランスジェニック動物におけるｇａｇ／ｐｏ１−ｅｎｖ又はハイブリッドエンベロープの組織−特異的発現の生成）
この例は、特異的組織、たとえばＴ−細胞におけるｇａｇ／ｐｏｌ，エンベロープ又はハイブリッドエンベロープの高レベル発現を示す。これは、位置及びコピー数独立性を付与するＣＤ２配列（Ｌａｎｇなど．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１６７５〜１６８２，１９８８を参照のこと）の使用を包含する。ＣＤ２遺伝子からの１．５ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、組換えＤＮＡ技法を用いてｇａｇ／ｐｏｌ，エンベロープ又はハイブリッドエンベロープフラグメントの前方に挿入する。これらの遺伝子をマイクロインジェクションにより授精されたマウス卵中に挿入する。トランスジェニック動物を前記のようにして特徴づける。Ｔ−細胞における発現を確立し、そして動物をトランスジェニック動物の十分に特徴づけられた系統を確立するためにホモ接合性に繁殖する。ｇａｇ／ｐｏｌ動物とエンベロープ動物とを交配し、Ｔ−細胞のみにおいて発現するｇａｇ／ｐｏｌ−ｅｎｖ動物を確立する。次に、それらの動物のＴ−細胞はレトロウイルスベクターをパッケージングできるＴ−細胞のための源である。再び、ベクター動物をそれらのｇａｇ／ｐｏｌ−ｅｎｖ動物に繁殖し、前記ベクターを発現するＴ−細胞を確立する。
【０１０９】
この技法は、他の組織特異性プロモーター、たとえば乳汁−特異性（乳漿）、膵臓（インシュリン又はエラスターゼ）又はニューロン（ミエリン塩基性タンパク質）プロモーターの使用を可能にする。プロモーター、たとえば乳汁−特異性プロモーターの使用を通して、組換えレトロウイルスは、その子孫の生物学的流体から直接的に単離され得る。
【０１１０】
（実施例８：トランスジェニック動物におけるハウスキーピング又は組織特異的レトロウイルスベクターの生成）
トランスジェニック動物の生殖細胞系へのレトロウイルス又はレトロウイルスベクターの挿入は、ほとんど又はまったくの発現をもたらさない。Ｊａｅｎｉｓｃｈ（Ｊａｈｎｅｒなど，Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：６２３〜６２８，１９８２を参照のこと）により記載されるこの効果は５’レトロウイルスＬＴＲ配列のメチル化に寄与する。この技法は、レトロウイルスベクター／レトロウイルスを発現するためにハウスキーピング又は組織特異的プロモーターのいづれかを置換することによってメチル化効果を克服する。エンハンサー要素を含む、５’ＬＴＲのＵ３領域を、ハウスキーピング又は組織特異的プロモーターからの調節配列により置換する（図２０を参照のこと）。３’ＬＴＲは、それがウイルスＲＮＡのポリアデニル化及び組込みのために必要な配列を含むので、十分に保持される。レトロウイルス複製のユニークな性質の結果として、組込まれたプロウイルスの５’ＬＴＲのＵ３領域が、感染性ウイルスの３’ＬＴＥのＵ３領域により生成される。従って、３’は必要であるが、ところが５’Ｕ３はなくても済む。プロモーターと５’ＬＴＲ  Ｕ３配列との置換及びトランスジェニック動物の生殖細胞系中への挿入は、レトロウイルスベクター転写体を生成できる動物の系統をもたらす。次に、それらの動物とｇａｇ／ｐｏｌ−ｅｎｖ動物とを交配し、レトロウイルス生成動物を生成する（図４を参照のこと）。
【０１１１】
前述から、本発明の特定の態様を例示目的で記載して来たが、種々の変性が本発明の範囲内で行なえる。従って、本発明は制限的ではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１Ａ】図１Ａは哺乳動物細胞においてレトロウイルスタンパク質を発現するようにデザインされた４種のプラスミドを示す。ｐＳＶｇｐ及びｐＲＳＶｅｎｖは選択マーカーによって共トランスフェクトされており、そしてｐＳＶｇｐ−ＤＨＦＲ及びｐＲＳＶｅｎｖ−ｐｈｌｅｏは、ウイルスタンパク質コード領域の下流に位置する選択マーカーを有する等価のプラスミドである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１．ＭＬＶコアタンパク質（ｐＳＣＶ１０）；２−４．ＭＬＶ両向性ｅｎｖ（ｐＣＭＶｅｎｖ  ＡｍＤｒａ，ｐＣＭＶｅｎｖ  ＡｎＮｈｅ，ｐＭＬＰｅｎｖ  ＡｍＳｐｈ）；５．ＭＬＶ異種向性ｅｎｖ（ｐＣＭＶｘｅｎｏ）；６．ＭＬＶ  ＭＣＦｅｎｖ（ｐＣＭＶ  ＭＣＦ）；７．レトロウイルスベクターとしてのＭＬＶ両向性ｅｎｖ（ｐＬＡＲＮＬ）、の発現をもたらすベクターを示している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヘルパーウィルスの存在下においてレトロウイルスベクターを作製する細胞系の固有能力を評価するスクリーニング手順の結果を示す（実施例２Ｂ）。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ウェスタンプロットによる、ｐＳＣＶ１０が導入された細胞のクローンの選別、及びｐＡ３１７と比較したこれらのクローンのｇａｇ生産についての評価の結果を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＤＡ、ＣＡ、２Ａ及びＰＡ３１７由来の細胞リゼートにおける両向性ｅｎｖのレベルを比較したウェスタンブロット実験の結果を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ＣＦ  ｇａｇ／ｐｏｌの一過性トランスフェクション体、並びに永久発現性系ＸＦ７、Ｘ６、Ｘ１０及びＰ３１７（ａｍｐｈｏ  ｅｎｖ）由来の細胞リゼートにおける異種向性ｅｎｖのレベルを比較したウェスタンブロット実験の結果を示す。
【図１Ｇ】図１ＧはＨＴ１０８０に由来するクローンｐＡ３１７（両向性ｅｎｖ）及びＨＸ（異種向性ｅｎｖ）におけるＭＣＦ（多向性）ｅｎｖのレベルを比較したウェスタンブロット実験の結果を示す。
【図２】図２は、部位特異的突然変異誘発後のＨＩＶｅｎｖ及びＭｏＭＬＶの融合体の３つの部位を示す。トランスメンブラン領域の細胞外縁での連結をＡとして示し、そしてＢ及びＣはトランスメンブラン領域及び細胞質縁のそれぞれの中央での連結の位置を示す。数字はヌクレオチドの数に関する（ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、第ＩＩ巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８５）。ＳＴ、ＳＲ、ＳＥは、ｔａｔ  ｒｅｖ及びｅｎｖの起点であり、そしてＴＴ、ＴＲ及びＴＥは対応の終結部位である。
【図３】図３は、外来性プロモーター／エンハンサーによる５’ＬＴＲにおけるＵ３の置換を示し、これはＳａｃＩ、ＢｓｓｈＩＩ又はこの領域におけるその他の部位にて融合されることができる。
【図４】図４は、ウイルスタンパク質又はベクターＲＮＡを発現する遺伝子導入マウスを交配する代表的な方法を例示する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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