(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、セラミド、糖脂質、及びこれらの混合物からなる群から選択される、非層状相を採用することができ、さらに、ポリエチレングリコール−セラミド接合体の存在下で二層構造を取ることができる脂質；及び二層構造において前記脂質を安定化するために前記脂質と可逆的に会合されるポリエチレングリコール−セラミド接合体を含んで成る融合性リポソーム。
【請求項２】
前記脂質がホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲第１項記載の融合性リポソーム。
【請求項３】
前記脂質が不飽和ホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲第２項記載の融合性リポソーム。
【請求項４】
前記脂質がホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンの混合物である請求の範囲第１項記載の融合性リポソーム。
【請求項５】
前記脂質が、カチオン性脂質との混合物として使用されるホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲第１項記載の融合性リポソーム。
【請求項６】
前記カチオン性脂質が、３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド及びＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドから成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第５項記載の融合性リポソーム。
【請求項７】
さらにコレステロールを含んで成る請求の範囲第１項記載の融合性リポソーム。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコールが200〜10,000の範囲の分子量を有する請求の範囲第１項記載の融合性リポソーム。
【請求項９】
前記ポリエチレングリコールが1,000〜8,000の範囲の分子量を有する請求の範囲第１項記載の融合性リポソーム。
【請求項１０】
前記ポリエチレングリコールが2,000〜6,000の範囲の分子量を有する請求の範囲第１項記載の融合性リポソーム。
【請求項１１】
前記ポリエチレングリコール−セラミド接合体が0.05モル％〜50モル％の範囲の濃度で存在する請求の範囲第１項記載の融合性リポソーム。
【請求項１２】
前記ポリエチレングリコール−セラミド接合体が0.05モル％〜30モル％の範囲の濃度で存在する請求の範囲第11項記載の融合性リポソーム。
【請求項１３】
前記ポリエチレングリコール−セラミド接合体が１モル％〜20モル％の範囲の濃度で存在する請求の範囲第11項記載の融合性リポソーム。
【請求項１４】
前記コレステロールが0.02モル％〜50モル％の範囲の濃度で存在する請求の範囲第７項記載の融合性リポソーム。
【請求項１５】
前記リポソームが融合性になる速度が分〜日の範囲の時間の尺度にわたって変化する請求の範囲第１項記載の融合性リポソーム。
【請求項１６】
前記リポソームが融合性になる速度が調節され得る請求の範囲第１項記載の融合性リポソーム。
【請求項１７】
前記リポソームが融合性になる速度が、前記融合性リポソームにおける前記ポリエチレングリコール−セラミド接合体の組成を調節することによって、調節される請求の範囲第16項記載の融合性リポソーム。
【請求項１８】
前記リポソームが融合性になる速度が、前記融合性リポソームにおける前記ポリエチレングリコール−セラミド接合体の濃度を調節することによって、調節される請求の範囲第16項記載の融合性リポソーム。
【請求項１９】
予定された速度で標的細胞に治療化合物を供給するための組成物であって、
ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、セラミド、糖脂質、及びこれらの混合物せからなる群から選択される、非層状相を採用することができ、さらに、ポリエチレングリコール−セラミド接合体の存在下で二層構造を取ることができる脂質、及び治療化合物又は医薬的に許容できるその塩を含む融合性リポソームを含んで成る組成物。
【請求項２０】
前記脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲第19項記載の組成物。
【請求項２１】
前記脂質が、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンの混合物である請求の範囲第19項記載の組成物。
【請求項２２】
前記脂質が、ホスファチジルエタノールアミン及びカチオン性脂質の混合物である請求の範囲第19項記載の組成物。
【請求項２３】
前記融合性リポソームがコレステロールをさらに含んで成る請求の範囲第19項記載の組成物。
【請求項２４】
前記融合性リポソームが静脈内投与される請求の範囲第19項記載の組成物。
【請求項２５】
前記融合性リポソームが非経口投与される請求の範囲第19項記載の組成物。
【請求項２６】
前記宿主に投与される融合性リポソームが単層である請求の範囲第19項記載の組成物。
【請求項２７】
前記単層の融合性リポソームが0.05ミクロン〜0.45ミクロンの平均直径を有する請求の範囲第26項記載の組成物。
【請求項２８】
前記単層の融合性リポソームが0.05ミクロン〜0.2ミクロンの平均直径を有する請求の範囲第27項記載の組成物。
【請求項２９】
非層状相を採用することができる脂質を二層構造において安定化するための方法であって、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、セラミド、糖脂質、及びこれらの混合物せからなる群から選択される、非層状相を採用することができ、さらに、ポリエチレングリコール−セラミド接合体の存在下で二層構造を取ることができる脂質とを組合すことを含んで成り、ここで前記ポリエチレングリコール−セラミド接合体が、交換可能であり又は生物分解できるよう選択され、予定された時間にわたって、前記ポリエチレングリコール−セラミド接合体が前記二層構造から失われ、又は変性され、それにより、前記二層構造を融合性にすることを特徴とする方法。
【請求項３０】
前記脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲第29項記載の方法。
【請求項３１】
前記脂質が、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンの混合物である請求の範囲第29項記載の方法。
【請求項３２】
前記脂質が、ホスファチジルエタノールアミン及びカチオン性脂質の混合物である請求の範囲第29項記載の方法。
【請求項３３】
コレステロールをさらに含んで成る請求の範囲第29項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
局在化された疾病を処理するための最も効果的な方法は影響される部分に医薬又は薬剤（この後、“薬物”と称す）を向けることであり、それにより、全身処理の所望しない毒性効果を回避することが、医学の分野において良く認識されている。身体内の特定の標的部位に薬物を供給するために現在使用されている技法は、薬物がゆっくりと“漏れる”持効性カプセル又はゲルマトリックスの利用、又は筋肉もしくは血流中に薬物を機械的に開放する移植できる“注射器”の使用を包含する。その他の、そしておそらく最とも効果的な供給システムは、適切な薬物又は化学物質を含むリポソームの使用を包含する。封入された薬物を有するリポソームは注目の特定の部分に向けられ、そしてその後、薬物が開放される。この後者の段階の実施が最とも問題のあるものであり、そして実際、薬物キャリヤーとしてのリポソームの使用に対する最大の障害は、注目の標的部位での要求に基づいてリポソームが薬物を開放せしめることに関する。
リポソームは、水性相を封入する１又は複数の同心円的に規則付けられた脂質二層から成る小胞である。それらは通常、漏れやすくはないが、しかし穴又は孔が膜に生じる場合、膜が溶解され又は分解される場合、あるいは膜の温度が相転移温度Ｔcに高められる場合、漏れやすくなる。リポソームを通しての薬物供給の現在の方法は、リポソームキャリヤーが究極的には、透過性になり、そしてその標的部位で封入された薬物を開放するであろうことを必要とする。これは、たとえば、リポソーム二層が身体においての種々の剤の作用を通して、時間と共に分解する受動的態様で達成され得る。あらゆるリポソーム組成物は循環において又は身体における他の部位で特徴的な半減期を有し、そして従って、リポソーム組成物の半減期を調節することによって、二層が分解する速度が幾分、調節され得る。
受動的薬物開放に比較して、活性薬物開放は、リポソーム小胞における透過性変化を誘発する剤を用いることを包含する。リポソーム膜は、それらの環境がリポソーム膜近くで酸性になる場合、それらが不安定になるように構成される（たとえば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 7851（1987）; Biochemistry 28 : 908（1989）を参照のこと）。リポソームが標的細胞によりエンドサイトーシス化される場合、それらはリポソームを不安定化し、そして薬物開放をもたらす酸性エンドソームに送られ得る。他方、リポソーム膜は、酵素がリポソームをゆっくりと不安定化する膜上に被膜として配置されるように化学的に変性され得る。薬物開放の調節は膜に初期に配置された酵素の濃度に依存するので、“要求次第”の薬物供給を達成するよう薬物供給を調節し、又は変更する真の効果的な手段が存在する。できるだけ早くリポソーム小胞が標的細胞と接触し、それが飲み込まれ、そしてpHの低下が薬物開放を導びくであろうpH−感受性リポソームに関して、上記と同じ問題が存在する。
前記方法の他に、身体の温度以上の予定された相転移温度Ｔcを有するリポソームが活性薬物供給を達成するために使用され得る。この方法においては、身体温度は、リポソームが身体に配置される場合、漏れやすくならないようにＴc以下にリポソームを維持するであろう。この薬物供給の方法は、そのようなリポソームが薬物又は化学物質の開放を可能にするそれらのＴcでひじょうに高められた膜透過性を経験するので、“要求次第”の薬物供給ができる。身体においてそのような相転移リポソームから薬物を開放するためには、熱がＴcが達成されるまで適用されるべきである。不運なことには、熱の適用は本質的に身体内に問題を生じさせ、そして時々、熱処理の悪影響が薬物供給ビークルとしてリポソーム用いることの有益な効果よりも高いことがある。さらに、そのようなリポソームは、高度に精製され、且つ高価な相転移温度のリン脂質材料から製造されるべきである。
前述の観点から、現在利用できる方法の欠点を克服する、標的化された薬物供給のための方法の必要性が当業界において存在する。特に、封入された又は関連する薬物又は治療剤の保持性を可能にする静脈内投与に続いて循環において安定できる非経口供給システムが必要とされる。この供給システムは、能動的標的化を通して（たとえばリポソームビークルの表面上に抗体又はホルモンを組込むことによって）又は長期循環性リポソームに関して見られるような受動性標的化を通して標的器官、組織又は細胞で蓄積することができる。標的部位での蓄積に続いて、リポソームキャリヤーは、いづれの外部の刺激の必要性もなしに融合性になり、そして結果的に、標的細胞の付近でいづれかの封入された又は関連する薬物又は治療剤を開放し、又は標的細胞の形質膜と融合し、細胞質中に薬物又は治療剤を導入する。ある場合、形質膜とリポソームキャリヤーとの融合が好ましい。なぜならば、これがより特定の薬物供給を付与し、そして従って、正常で健康な細胞又は組織に対するいづれかの悪影響を最少にするからである。さらに、細胞膜に対して一般的に透過性でない治療剤、たとえばDNA，RNA、タンパク質、ペプチド、等の場合、そのような融合性キャリヤーは、治療剤が作用の必要とされる細胞内部位に供給される機構を提供するであろう。さらに、エンドサイト−シス経路を回避することによって、治療剤は、前記治療剤を不活性化する酸性条件及び／又は分解酵素に暴露されない。まったくの驚くべきことには、本発明はそのような方法を提供することによってこの必要性を満たす。
発明の要約
本発明は、非層状相（non-lamellar phase）を採用することができ、さらに二層安定化成分の存在下で二層構造（bilayer structure）を取ることができる脂質；及び二層構造において前記脂質を安定化するために前記脂質と可逆的に会合する二層安定化成分を含んで成る融合性リポソームを供給する。そのような融合性（fusogenic）リポソームは、それらが融合性になる速度が予定され得るのみならず、また分から日の範囲の時間の規模にわたって必要に応じて変化するので、ひじょうに好都合である。リポソーム融合の調節は二層安定化成分の化学的安定性及び／又は交換能力を変性することによって達成され得る。
本発明の融合性リポソームを形成するために使用され得る脂質は、たとえばカルシウムイオンの存在下で、生理学的条件又は特定の生理学的条件下で非層性相を採用し、そして二層安定化成分の存在下で二層構造体を取ることができるものである。非層性相を採用する脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、セラミド、糖脂質又はそれらの混合物を包含するが、但し、これらだけには限定されない。そのような脂質は、それら自体、二層形成性であるか又は相補的な力学的分子形状のものである二層安定化成分により二層構造体として安定化され得る。より特定的には、本発明の二層安定化成分は二層構造体において脂質を安定化することができ、さらにそれらはリポソームから交換することができ、又は内因性システムにより化学的に変性され得、その結果、時間と共に、それらは二層構造体における脂質を安定化する能力を失ない、それにより、リポソームを融合性にすることができる。リポソーム安定性が失なわれ又は低下する場合でのみ、標的細胞の形質膜とリポソームとの融合が生じる。二層安定化成分の組成及び濃度を調節することによって、二層安定化成分の化学的安定性及び／又は二層安定化成分がリポソームから交換する速度、及びリポソームが融合性になる速度を調節することができる。さらに、他の変数、たとえばpH、温度、イオン強度、等が、リポソームが融合性になる速度を変え、そして／又は調節するために使用され得る。
本発明の融合性リポソームは、多くの治療、研究及び商業的用途に理想的には適合される。治療用途においては、融合性リポソームの初期安定性が、その融合性の状態を達成する前、標的器官又は細胞へのリポソームの接近を可能にし、それにより、投与の直後、非特異的融合を減じる。
さらに、本発明の融合性リポソームは、注目の標的細胞に薬物、ペプチド、タンパク質、RNA，DNA又は他の生物活性分子を供給するためにも使用され得る。この態様においては、標的細胞に供給される化合物又は分子は、融合性リポソームの水性内部に封入され、そして細胞形質膜とリポソームの融合に基づいて細胞質（初期において）中に導入される。他方、分子又は化合物がリポソーム二層内に固定され、そしてこの場合、それらは、融合に基づいて標的の細胞形質膜中に組込まれ得る。
もう１つの態様においては、本発明は、治療化合物を標的細胞に予定された速度で供給するための方法を提供し、ここで、この方法は、二層安定化成分、非層状相を採用でき、さらに二層安定化成分の存在下で二層構造を取ることができる脂質、及び治療化合物又は医薬的に許容できるその塩を含んで成る融合性リポソームを標的細胞を含む宿主に投与することを含んで成る。投与は種々の経路によってであり得るが、しかし好ましくは、治療化合物は静脈内又は非経口投与され得る。宿主に投与される融合性リポソームは、単層であり、0.05〜0.45ミクロン、より好ましくは0.05〜0.2ミクロンの直径を有する。
最後の態様において、本発明は、非層性相を採用することができる、二層構造体における脂質を、その脂質と二層安定化成分とを組合すことによって安定化する方法を提供する。安定化された後すぐに、脂質混合物は本発明の融合性リポソームを形成するために使用され得る。しかしながら、二層安定化成分は、リポソームからのこの成分の損失に基づいて、リポソームが不安定化され、そして融合性になるよう交換できるように選択される。
本発明及びその好ましい態様の他の特徴、目的及び利点が下記の詳細な記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、二層安定化成分（BSC）による二層安定化の濃度依存性を示す。多層小胞が、例に記載されるように、DOPE：コレステロール：DOPE−PEG2000（１：１：Ｎ）（ここでＮは図１に示されるようにDOPE−PEG2000の割合である）の混合物から調製された。31Ｐ−NMRスペクトルが、サンプルが30分間、平衡化された後に20℃で決定された。
図２は、BSCによる二層安定化の温度依存性を示す。多層小胞が、例に記載されるように、DOPE：コレステロール：DOPE−PEG2000（Ａ，１：１：0.1；又はＢ，１：１：0.25の比）の混合物から調製された。サンプルが０℃に冷却され、そして31Ｐ−NMRスペクトルが０℃〜60℃で、10℃間隔で決定された。サンプルは、データ蓄積の前、30分間、個々の温度で平衡化された。
図３は、BSCの二層安定化能力に対する先端基サイズの効果を示す。多層小胞がＡ，DOPE：コレステロール：DOPE−PEG2000，１：１：0.05、又はＢ，DOPE：コレステロール：DOPE−PEG5000，１：１：0.05のいづれかから調製された。他の条件は図２と同じであった。
図４は、BSCの二層安定化能力に対するアシル鎖組成の効果を示す。多層小胞がＡ，DOPE：コレステロール：DMPE−PEG2000，１：１：0.1，Ｂ，DOPE：コレステロール：DPPE−PEG2000，１：１：0.1又はＣ，DOPE：コレステロール：DSPE−PEG2000，１：１：0.1のいづれかから例に記載されるようにして調製された。他の条件は図２と同じであった。
図５は、二層安定化成分として作用するPEG−ゼラミドの能力を示す。多層小胞が、DOPE：コレステロール：卵セラミド−PEG2000（Ａ，１：１：0.1又はＢ，１：１：0.25の比）から、例に記載されるようにして調製された。他の条件は図２についてと同じであった。
図６は、DOPE：コレステロール：DOPE−PEG2000（１：１：0.1）から調製されたMLVの凍結−破損電子顕微鏡写真を示す。サンプルは例に記載されるようにして調製された。バーは500nmを表わす。
図７は、DOPE：コレステロール：DOPE−PEG2000（１：１：0.1）から調製されたMUVの凍結−破損電子顕微鏡写真を示す。サンプルは例に記載されるようにして調製された。バーは500nmを表わす。
図８は、DOPE：コレステロール：DSPE−PEG2000から調製されたLUV及びDSPE−PEG2000から成るミセルの溶離プロフィールを示す。LUVは、微量の14Ｃ−DPPC（Δ）及び3Ｈ−DSPE−PEG2000（●）を伴って、DOPE：コレステロール：DSPE−PEG2000（１：１：0.1）から例に記載されるようにして調製された。それらは、例に記載されるようにしてクロマトグラフィー処理された。別の実験において、ミセルは、3Ｈ−DSPE−PEG2000（○）によりラベルされたDSPE−PEG2000から調製され、そして同じSepharose 4Bカラム上でクロマトグラフィー処理された。
図９は、PEG−PEによる融合の阻害を示す。リポソームは、（ａ）０；（ｂ）0.5；（ｃ）１又は（ｄ）２モル％のDMPE−PEG2000を含む、DOPE及びPOPSの等モル混合物から調製された。上記脂質の他に、ラベルされたリポソームはまた、螢光脂質NBD−PE及びRh−PEを0.5モル％で含んだ。螢光ラベルされたリポソーム（最終濃度60μＭ）が、３倍過剰のラベルされていないリポソームの添加の前、30分間37℃でインキュベートされ、続いて、１分後、CaCl2（最終濃度５mM）,CaCl2が添加された。
図10は、PEG−PE除去の後、融合活性の回復を示す。螢光ラベルされた及びラベルされていない、２モル％のDMPE−PEG2000を含むリポソームの間の融合が、図９に記載されているようにしてアッセイされ、但し、CaCl2の添加の１分後、12倍過剰（ラベルされた小胞に対して）のPOPCリポソーム（曲線ａ）又は等体積の緩衝液（曲線ｂ）が添加された。
図11は、融合性活性の回復の濃度依存性を示す。螢光ラベルされた及びラベルされていない、（ａ）２；（ｂ）３；（ｂ）５又は（ｄ）10モル％のDMPE−PEG2000を含むリポソームが図10に記載されるようにしてアッセイされ、但し、POPCリポソームがラベルされた小胞に対して36倍過剰として添加された。
図12はプログラムできる融合を示す。螢光ラベルされた及びラベルされていない、２モル％の示されるPE−PEG2000を含むリポソームが、図10に記載されているようにしてアッセイされた。％融合率が、例に記載されるようにして計算された。（Ａ）DMPP−PEG2000（●）；DPPE−PEG2000（◆）；DSPE−PEG2000（▲）；及び（Ｂ）DOPE−PEG2000（▲）；卵セラミド−PEG2000（▼）。
図13は、融合に対するPEG分子量の効果を示す。（Ａ）アッセイは、（ａ）０；（ｂ）0.25；（ｃ）0.25又は（ｄ）１モル％のDMPE−PEG5000を含むリポソームを用いて図９に記載されるようにして実施され；そして（Ｂ）アッセイは、１モル％のDMPE−PEG5000（●）；DPPE−PEG5000（◆）又はDSPE−PEG5000（▲）を含むリポソームを用いて図12に記載されるようにして実施された。
図14は、オキシエチレン基の等濃度でのPEG2000に対するPEG2000の比較を示す。リポソームは、２モル％のPEG5000（上方の曲線）又は５モル％のPEG2000（下方の曲線）のいづれかを含んだ。他の条件は図11に記載される通りであった。
図15は、DOPE：DODACリポソームの融合に対する塩濃度の効果を示す。リポソームは、DOPE：DODAC（85：15）から調製された。ドナーリポソームはまた、螢光脂質、NBD−PE及びRh−PEを0.5モル％で含んだ。ドナーリポソーム（最終濃度60μＭ）は、３倍過剰のラベルされていない受容体リポソームの添加の前、30秒間、37℃でインキュベートされ、１分後、NaClにより、示される最終濃度を付与した。
図16はPEG−PEによるDOPE：DODACリポソームの融合の阻害を示す。リポソームは、DOPE：DODAC（85：15）又はDOPE：DODAC：DMPE−PEG2000（83：15：２）のいづれかから調製された。融合が、300mMのNaClを用いて、図１に記載されるようにしてアッセイされた。
図17は、PEG除去の後の回復する融合活性を示す。リポソームは、DOPE：DODAC：セラミド（Ｃ８：０）−PEG2000（83：15：２）又はDOPE：コレステロール：セラミド（Ｃ８：０）−PEG2000（38：45：15：２）のいづれかから調製された。融合を図２に記載されているようにしてアッセイし、但し、示される時間で、POPC又はPOPC：コレステロール（55：45）から成る30倍過剰（ドナーに対して）のリポソームが添加された。
図18は、PEG−脂質除去の速度に対する脂質アンカーの効果を示す。螢光ラベルされた及びラベルされていないリポソームが、DMPE−PEG2000（●）、セラミド（卵）−PEG2000又は（Ｃ14：０）セラミド−PEG2000（◆）を用いて、DOPE：DODAC：PEG−脂質（83：15：２）から調製された。ラベルされたリポソームが、３倍過剰のラベルされていないリポソーム及び300mMのNaClと共に、37℃で暗水浴におけるキュベットにおいて混合された。ゼロ時で、３倍過剰（ラベルされた小胞に対して）のPOPCリポソームが添加され、そして螢光強度が示される時間で測定された。アッセイの最後で、Triton Ｘ−100（最終0.5％）が添加され、エネルギー移動が排除され、そして％融合率がエネルギー移動の効率の変化から計算された。最大融合率が、ラベルされた及びラベルされていないリポソームの完全な混合を仮定して、膜におけるRh−PEのモル分率に対するエネルギー移動効率の標準曲線から計算された。
図19は、DOPE：コレステロール：DODACリポソームとアニオン性リポソームとの間の融合のPEG−セラミドによる阻害を示す。リポソームは、DOPE：コレステロール：DODAC（40：45：15，PEGなし）又はDOPE：コレステロール：DODAC（Ｃ14：０）セラミド−PEG2000（36：45：15：４，４％ PEG）から調製された。受容体リポソームがDOPE：コレステロール：POPS（25：45：30）から調製された。３倍過剰の受容体が30秒後、ラベルされた小胞に添加され、そして螢光が517nmでモニターされ、そして465nmで励起が存在した。
図20はPEG除去に基づいての融合活性の回復を示す。ドナーリポソーム（50μＭ）は、DOPE：コレステロール：DODAC：（Ｃ14：０）セラミド−PEG2000（36：45：15：４）から調製され、そしてDOPE：コレステロール：POPS（25：45：30）から調製された受容体リポソーム（150μＭ）と共に混合された。ゼロ時で、１mMのPOPC：コレステロールリポソーム（▲）又は等量の緩衝液（●）のいづれかが添加された。螢光が517nmでモニターされ、そして465nmで励起した。
図21は、DOPE：コレステロール：DODACリポソームとヤギ赤血球との間の融合のPEG−セラミドによる阻害を示す。リポソームは、DOPE：コレステロール：DODAC（40：45：15，PEGなし）又はDOPE：コレステロール：DODAC：（Ｃ14：０）セラミド−PEG2000（36：45：15：４，４％ PEG）から調製された。ゴースト（50μＭのリン脂質）が30秒後に、ドナー（50μＭの合計脂質）に添加され、そして螢光が517nmでモニターされ、そして465nmで励起が生じた。
図22は、DOPE：コレステロール：DODAC（40：45：15）又はDOPE：コレステロール：DODAC：PEG−セラミド（35：45：15：５）から成る螢光リポソームの融合を示す。DOPE：コレステロール：DODAC（40：45：15）から成るLUVがRBCと融合し（パネルａ及びｂ）；５モル％でLUV中へのPEG−セラミド（Ｃ８：０）の組込みが融合を阻止し（パネルｃ及びｄ）；しかしながら、PEGセラミドのための外因性吸込物が含まれる場合、融合活性が数分以内に回復された（パネルｅ及びｆ）。パネルａ，ｃ及びｅは相対比下での図であり、そして相ｂ，ｄ及びｆは螢光下での同じフィールドでの図である。
図23は、長い脂肪アミド鎖（Ｃ14：０）を有するPEG−セラミドが使用され、そしてリポソームがRBCの添加の前、外因性吸込物と共に予備インキュベートされる場合の結果を示す。RBCの添加の前、融合性LUVと吸込物との５分間の予備インキュベーション後には、融合は観察されず（パネルａ及びｂ）；１時間の予備インキュベーションの後、RBCとのいくらかの融合が観察され（パネルｃ及びｄ）；しかしながら、長いインキュベーション時間（２時間）により、螢光ラベル化のパターンが変化し、そして広範な小さな斑点の螢光が観察された（パネルｅ及びｆ）。パネルａ，ｃ及びｅは相対比下での図であり、そしてパネルｂ，ｄ及びｆは螢光下での同じフィールドでの図である。
図24は、長い脂肪アミド鎖（Ｃ20：０）を有するPEG−セラミドが使用され、そしてリポソームがRBCの添加の前、外因性に吸込物と共に予備インキュベーションされる場合の結果を示す。融合は、吸込物とのLUVの５分間（パネルａ及びｂ）、１時間（パネルｃ及びｄ）又は２時間（パネルｅ及びｆ）の予備インキュベーションの後に観察されなかった。パネルａ，Ｃ及びｅは相対比下での図であり、そしてパネルｂ，ｄ及びｆは螢光下での同じフィールドでの図である。
図25は、PEG2000−DMPE及びPEG2000−セラミド（Ｃ14：０）含有小胞とアニオン性標的との融合をグラフ的に示す。
図26は、血液からのリポソームクリアランスに対する上昇する濃度のPEG−セラミド（Ｃ20）の効果をグラフ的に示す。DOPE（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン），15モル％のDODAC（Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）及び示される濃度のPEG−セラミド（Ｃ20）から成る3Ｈ−ラベルされたリポソームがマウス中にｉ．ｖ．注射された。生物分布が注射の１時間後に試験され、そしてデータがSD（標準偏差）（ｎ＝３）を伴って、血液（上方のパネル）及び肝臓（下方のパネル）における注射された用量の％として表わされた。
図27は、血液におけるリポソームの生物分布に対する上昇する濃度のDODACの効果をグラフ的に示す。DOPE，10（白の四角）又は30（白の三角）モル％のPEG−セラミド（Ｃ20）、及び示される濃度のDODACから成る3Ｈ−ラベルされたリポソームがマウス中にｉ．ｖ．注射された。生物分布が注射の１時間後に試験され、そしてデータが血液における注射された用量の％として表わされた。
図28は、注射の後、種々の時間での血液及び肝臓におけるリポソームレベルをグラフ的に示す。DOPE／DODAC（85：15モル／モル）（０％のPEG−セラミド（Ｃ20）を有する、白丸）、DOPE／DODAC／PEG−セラミド（Ｃ20）（75：15：10モル／モル／モル）（10％のPEG−セラミド（Ｃ20）を有する、白の四角）、及びDOPE／DODAC／PEG−セラミド（Ｃ20）（55：15：30モル／モル／モル）（30％のPEG−セラミドを有する、白の三角）から成る3Ｈ−ラベルされたリポソームが、マウス中にｉ．ｖ．注射された。生物分布が、示される時間で試験され、そしてデータがSD（ｎ＝３）を伴って、血液（上方のパネル）及び肝臓（下方のパネル）における注射された用量の％として表わされた。
発明の詳細な記載及び好ましい態様
本発明の１つの態様においては、非層状相を採用することができ、さらに二層安定化成分の存在下で二層構造を取ることができる脂質；及び二層構造における脂質を安定化するために脂質と可逆的に会合する二層安定化成分を含んで成る融合性（fusogenic）リポソームが供給される。そのような融合性リポソームは、それらが融合性になる速度が予定され得るのみならず、また数分〜数10時間の時間の規模にわたって、必要とされるように変化され得るので、好都合である。たとえば、二層安定化成分の組成及び濃度を調節することによって、リポソームから二層安定化成分が交換する速度、及びリポソームが融合性になる速度を調節することができるが発見された。
組織化されたアセンブルにおける脂質の多型性挙動が、力学的分子形状概念により定性的に説明され得る（Cullia、など.,“Membrone Fusion”（Wilschut, J. and D. Hoekstra（eds.）, Marcel Dekker, Inc., New York,（1991）を参照のこと）。極性先端基の効果的な断面積及び膜内に隠された疎水性領域が類似する場合、脂質は円柱形状を有し、そして二層形状を採用する傾向がある。疎水性成分に少々関連する極性先端基を有する円錐形状の脂質、たとえばホスファチジルエタノールアミンは、非二層性相、たとえば逆転されたミセル又は反六角形相（ＨII）を好む。それらの疎水性ドメインに大きく関連する先端基を有する脂質、たとえばリゾリン脂質は、倒立円錐形状を有し、そして水溶液においてミセルを形成する。従って、混合された脂質システムの相選択は、純粋な力学的分子形状へのすべての成分の寄与に依存する。円錐形状及び倒立円錐形状の脂質の組合せは、脂質が単離され得ない条件下で二層形状を採用することができる（Madden and Cunis, Biochim. Biophys. Acta, 684 : 149-153（1982）を参照のこと）。
より形式化されたモデルは、固有の曲率仮説に基く（たとえば、Kirk、など., Biochemistry, 23 : 1093-1102（1984）を参照のこと）。このモデルは、２つの相反する力によりリン脂質多型性を説明する。弾性的に緩和された単層をもたらす曲率のその固有の又は平衡化された半径（Ｒc）をよじ曲げ、そして採用する脂質単層の天然の傾向は、得られる炭化水素充填抑制により妨害される。固有の曲率半径を低める要因、たとえば二重結合が導入される場合、炭化水素鎖により占有される高められた体積が、Ｈn相形成を促進せしめる傾向がある。逆に言えば、先端基の大きさの上昇はＲcを高め、そして二層形成又は安定化を促進する。逆転された脂質円柱間のボイドを満たすことができる非極性脂質の導入はまた、Ｈn相形成を促進する（Gruner、など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 3665-3669（1989）; Sjoland、など., Biochemistry, 28 : 1323-1329（1989）を参照のこと）。
本発明の融合性リポソームを形成するために使用され得る脂質は、たとえばカルシウムイオンの存在下で、生理学的条件下又は特定の生理学的条件下で非層状相を採用するが、しかし、二層安定化成分の存在下で二層構造を取ることができるものである。そのような脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、セラミド、糖脂質又はそれらの混合物を包含するが、但しこれだけには限定されない。生理学的条件下で非層状相を採用する当業者に知られている他の脂質もまた、使用され得る。さらに、他の脂質が種々の非生理学的変化、たとえばpH又はイオン濃度の変化（たとえばカルシウムイオンの存在下で）により非層状相を採用するように誘発され得、そして従って、それらはまた、本発明の融合性リポソームを形成するためにも使用され得ることは、当業者に明らかであろう。本発明の好ましい態様においては、融合性リポソームは、ホスファチジルエタノールアミンから調製される。ホスファチジルエタノールアミンは飽和化され得、又は不飽和化され得る。本発明の好ましい態様においては、ホスファチジルエタノールアミンは不飽和化される。さらに好ましい態様においては、融合性リポソームは、ホスファチジルエタノールアミン（飽和化又は不飽和化された）及びホスファチジルセリンの混合物から調製される。さらにもう１つの好ましい態様においては、融合性リポソームは、ホスファチジルエタノールアミン（飽和化又は不飽和化された）及びカチオン性脂質の混合物から調製される。
適切なカチオン性脂質の例は、DC−Chol、すなわち３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（Gao、など., Biochem. Biophys. Res. Comm 179 : 280-285（1991）; DDAB、すなわちＮ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ’−ジメチルアンモニウムブロミド；DMRIE、すなちわＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド；DODAC、すなわちＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（1994年９月30日に出願されたアメリカ合衆国特許出願08/316,399を参照のこと、これは引用により本明細書に組込まれる）；DOGS、すなわちジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン；DOSPA、すなわちＮ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート；DOTAP、すなわちＮ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド；及びDOTMA、すなわちＮ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドを包含するが、但しこれだけには限定されない。本発明の好ましい態様においては、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドが、ホスファチジルエタノールアミンと組合して使用される。
本発明によれば、生理学的条件下で非層状相を採用する脂質は、それら自体を形成する二層であるか、又は相補的な力学的形状のものである二層安定化成分により二層構造体において安定化され得る。非二層形成性脂質は、それが二層安定化成分の存在下でその成分と会合される場合にのみ、二層構造体において安定化される。適切な二層安定化成分の選択の場合、二層安定化成分は、リポソームから移行することができ、又は時間と共に、それが二層構造体において脂質を安定化する能力を失なうような外因性システムにより化学的に変性され得ることが不可避である。リポソーム安定性が失なわれ、又は低められる場合のみ、標的細胞の形質膜とのリポソームの融合が生じ得る。従って、二層安定化成分は脂質と“可逆的に会合され”、そしてそれが脂質と会合される場合のみ、脂質は、それが非層状相を他方では採用する条件下で二層構造を採用するように抑制された脂質である。本発明の二層安定化成分は、二層構造体において脂質を安定化することができるべきであり、さらにそれらはリポソームから交換することができ、又は時間と共に、それらが二層構造体における脂質を安定化するそれらの能力を失ない、それによりリポソームが融合性になるように外因性システムにより化学的に変性され得るべきである。
適切な二層安定化成分の例は、脂質誘導体、界面活性剤、タンパク質及びペプチドを包含するが、但し、これだけには限定されない。本発明の好ましい態様においては、二層安定化成分は、ホスファチジルエタノールアミンに接合される、すなわち結合されるポリエチレングリコールである。さらに好ましい態様においては、二層安定化成分は、セラミドに接合されるポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールは、当業者に知られており、そして当業者により使用されている標準の結合反応を用いて、ホスファチジルエタノールアミン又は他方では、セラミドに接合され得る。さらに、好ましいポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン接合体は、Avanti Polar Lipids（Alabaster, Alabama）から市販されている。
種々の分子量のポリエチレングリコールが、本発明の二層安定化成分を形成するために使用され得る。種々の分子量のポリエチレングリコールは、多くの異なった源から市販されており、又は他方では、それらは当業者に良く知られている標準の重合技法を用いて合成され得る。本発明の好ましい態様においては、ポリエチレングリコールは、約200〜約10,000、より好ましくは約1,000〜約8,000及びさらにより好ましくは約2,000〜約6,000の範囲の分子量を有する。一般的に、ポリエチレングリコールの分子量の上昇は、安定化を達成するために必要とされる二層安定化成分の濃度を減じる。
種々の鎖長及び飽和の程度の種々のアシル鎖基を有するポリホスファチジルエタノールアミンは、二層安定化成分を形成するためにポリエチレングリコールに接合され得る。そのようなホスファチジルエタノールアミンは、市販されており、又は当業者に知られている従来の技法を用いて単離され又は合成され得る。Ｃ10〜Ｃ20の範囲の炭素鎖長を有する飽和又は不飽和脂肪酸を含むホスファチジルエタノールアミンが好ましい。一又は二飽和脂肪酸及び飽和及び不飽和脂肪酸の混合物を有するホスファチジルエタノールアミンがまた、使用され得る。適切なホスファチジルエタノールアミンは、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）を包含するが、但しこれだけには限定されない。
ホスファチジルエタノールアミンに関しては、種々の鎖長及び飽和の程度の種々のアシル鎖基を有するセラミドが、二層安定化成分を形成するためにポリエチレングリコールに結合され得る。ホスファチジルエタノールアミンに比べて、セラミドは、その鎖長及び飽和の程度により容易に変化され得るわずか１つのアシル基を有することは当業者に明らかであろう。本発明への使用のために適切なセラミドは市販されている。さらに、セラミドはたとえば、良く知られた単離技法を用いて、卵又は脳から単離され得、又は一方では、それらは、1994年９月30日に出願されたアメリカ特許出願08/316,429号及びそれと同じ日に出願され、そしてアトーニイドケット番号16303−001010を有するアメリカ特許出願に開示される方法及び技法を用いて合成され得、ここで前記特許は引用により本明細書に組込まれる。前記出願に示される合成路を用いて、Ｃ2〜Ｃ31の範囲の炭素鎖長を有する飽和又は不飽和脂肪酸を有するセラミドが調製され得る。
前記の他に、界面活性剤、タンパク質及びペプチドが、二層安定化成分として使用され得る。二層安定化成分として使用され得る界面活性剤は、Triton Ｘ−100、デオキシコレート、オクチルグルコシド及びリゾ−ホスファチジルコリンを包含するが、但しこれだけには限定されない。二層安定化成分として使用され得るタンパク質は、糖タンパク質及びシトクロムオキシダーゼを包含するが、但しこれだけには限定されない。前記二層外に多量のドメインの損失をもたらす、内因性プロテアーゼによるタンパク質の分解は、タンパク質の二層安定化能力を減じることが予測される。さらに、二層安定化成分として使用され得るペプチドは、たとえばペンタデカペプチド、すなわちアラニン−（アミノ酪酸−アラニン）14を包含する。このペプチドは、たとえば前記二層からのその移行を促進するポリエチレングリコールに結合され得る。他方、ペプチド、たとえばカルジオトキシン及びメリチン（両者は、二層における非層状相を誘発することが知られている）はPEGに結合され得、そしてそれにより、PEが、PEGに結合される場合、二層安定剤に非層状相を好む脂質から転換される同じ態様で二層安定剤に転換される。ペプチドとPEGとの間の結合が不安定である場合、その結合の分解は、二層安定化能力の損失及び非層状相の回復をもたらし、それにより、リポソームが融合性になることを引き起こす。
典型的には、二層安定化成分は、約0.05モル％〜約50モル％の範囲の濃度で存在する。好ましい態様においては、二層安定化成分は、0.05モル％〜約25モル％の範囲の濃度で存在する。さらに好ましい態様においては、二層安定化成分は、0.05モル％〜約15モル％の範囲の濃度で存在する。二層安定化成分の濃度は、使用される二層安定化成分及びリポソームが融合性になる速度に依存して変えられ得ることは、当業者に明らかであろう。
二層安定化成分の組成及び濃度を調節することによって、二層安定化成分がリポソームから交換する速度及びリポソームが融合性になる速度を調節することができる。たとえば、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン接合体又はポリエチレングリコール−セラミド接合体が二層安定化成分として使用される場合、リポソームが融合性になる速度は、たとえば、二層安定化成分の濃度を変えることによって、ポリエチレングリコールの分子量を変えることによって、又はホスファチジルエタノールアミン又はセラミド上のアシル鎖基の鎖長及び飽和の程度を変えることによって変えられ得る。さらに、他の変数、たとえばpH、温度、イオン強度、等は、リポソームが融合性になる速度を変え、そして／又は調節するために使用され得る。リポソームが融合性になる速度を調節するために使用される他の方法は、この開示を読んで、当業者に明らかになるであろう。
本発明の好ましい態様においては、融合性リポソームはコレステロールを含む。コレステロールフリーのリポソームがインビボで使用される場合、それらは血漿リポタンパク質及び細胞膜からコレステロールを吸収する傾向を有する。コレステロールのこの吸収は、理論的には、リポソームの融合性挙動を変えるので、コレステロールは本発明の融合性リポソームに含まれ得、その結果、コレステロールの移行はほとんど又はまったく生じない。コレステロールは、含まれる場合、0.02モル％〜約50モル％の範囲の濃度で及びより好ましくは、約35モル％〜約45モル％の範囲の濃度で一般的には存在する。
種々の方法が、下記のものに記載されるようにしてリポソームを調製するために利用できる：たとえば、Szokaなど., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 : 467（1980）；アメリカ特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、第4,946,787号；PCT出願第WO91/17424号；Deamer and Bangham, Biochim. Biophys. Acta, 443 : 629-634（1976）; Fraleyなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 3348-3352（1979）; Hope、など., Biochim. Biophs. Acta 812 : 55-65（1985）; Mayer、など., Biochim. Biophs. Acta 858 : 161-168（1986）; Williams、など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 242-246（1988）; テキストのLiposomes,（Marc J. Ostro（ed.）, Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Chapter 1）；及びHope、など., Chem. Phgs. Lip. 40 : 89（1986）（これらは、引用により本明細書に組込まれる）。適切な方法は、たとえば音波処理、押出し、高圧／均質化、マイクロ流動化、界面活性透析、小さなリポソーム小胞のカルシウム誘発性融合、及びエーテル−融合方法を包含し、これらは当業界において良く知られている。１つの方法は、不均質サイズの多層小胞を生成する。この方法においては、小胞−形成脂質が適切な有機溶媒又は溶媒システムに溶解され、そして真空下又は不活性ガス下で乾燥せしめられ、薄い脂質フィルムが形成される。所望により、前記フィルムは、適切な溶媒、たとえば第三ブタノールに再溶解され、そして次に、凍結乾燥され、水和された粉末様形で存在するより均質の脂質混合物が形成される。このフィルムは水性緩衝溶液により転換され、そして典型的には、撹拌を伴って15〜60分間にわたって水和化される。得られる多層小胞のサイズ分布は、より激しい撹拌条件下で脂質を水和化することによって又は可溶性界面活性剤、たとえばデオキシフレートを添加することによってより小さなサイズに移行され得る。
単層小胞は、音波処理又は押出しにより一般的に調製される。音波処理は一般的には、音波処理機、たとえばBransonチップ音波処理機により氷浴において実施される。典型的には、その懸濁液はいくつかの音波処理サイクルにゆだねられる。押出しは、生物膜押出し機、たとえばLipex Biomembrane Extruderにより実施され得る。押出しフィルターにおける定義された孔サイズが、特定サイズの単層リポソーム小胞を生成することができる。リポソームはまた、非対称セラミックフィルター、たとえばNorton Company, Worcester MAから市販されているCeraflow Microfilterを通しての押出しにより形成され得る。
リポソーム調製に続いて、リポソームは、所望するサイズ範囲及び比較的狭い分布のリポソームサイズを達成するために分類され得る。約0.05ミクロン〜約0.20ミクロンのサイズ範囲は、従来のフィルター、典型的には0.22ミクロンのフィルターを通しての濾過によりリポソーム懸濁液の殺菌を可能にする。フィルター殺菌法は、リポソームが約0.05〜約0.20ミクロンに小さくされる場合、高い処理量に基づいて実施され得る。
いくつかの技法が所望するサイズにリポソームを分類するために利用できる。１つの分類方法は、引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第4,737,323号に記載される。槽又はプローブ音波処理のいづれかによるリポソーム懸濁液の音波処理は、約0.05ミクロン以下のサイズの小さな単層小胞への前進性サイズ低下を生成する。均質化は、大きなリポソームを小さなものに断片化するために剪断エネルギーに頼よるもう１つの方法である。典型的な均質化方法においては、多層小胞は、典型的には約0.1〜0.5ミクロンの選択されたリポソームサイズが観察されるまで、標準のエマルジョンホモジナイザーを通して再循環される。それらの方法の両者においては、粒子サイズの分布は従来のレーザー線粒子サイズ識別によりモニターされ得る。さらに、リポソーム小胞のサイズは、引用により本明細書に組込まれる、Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 10 : 421-450（1981）に記載されるような擬似−電子光散乱（QELS）により決定され得る。リポソームの平均直径は、形成されたリポソームの音波処理により減じられ得る。断続的な音波処理サイクルは、効果的なリポソーム合成を案内するためにQELS評価により変えられ得る。
小さな孔のポリカーボネート膜又は非対称セラミック膜を通してのリポソームの押出しはまた、リポソームサイズを比較的十分に定義されたサイズ分布に減じるための効果的な方法である。典型的には、懸濁液は、所望するリポソームのサイズ分布が達成されるまで、１又は数回、膜を通して循環される。リポソームは連続的に小さな孔の膜を通して押出され、リポソームサイズの徐々の低下が達成される。本発明への使用のためには、約0.05ミクロン〜約0.45ミクロンのサイズを有するリポソームが好ましい。
治療剤の供給のためには、本発明の融合性リポソームは、治療剤により充填され、そして処理を必要とする対象に投与され得る。本発明の融合性リポソームを用いて投与され得る治療剤は、種々の薬物、ペプチド、タンパク質、DNA，RNA又は他の生物活性分子のいづれかであり得る。さらに、カチオン性脂質は、細胞内のあるタンパク質の生成を誘発し、又は阻止するように意図された治療用遺伝子又はオリゴヌクレオチドの供給に使用され得る。核酸は負に荷電されており、そして配合及び細胞供給のために適切な複合体を形成するために正に荷電された実在物と共に組合されるべきである。
カチオン性脂質は、インビボ及びインビトロでの細胞のトランスフェクションに使用されて来た（Wang, C-Y, Huang L.,“pH sensitive immunoliposomes mediates target cell-specific delivery and Controlled expression of a foreign gene in mouse（pH感受性免疫リポソームは、マウスにおける外来性遺伝子の標的細胞特異的供給及び調節された発現を仲介する）”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987 ; 84 : 7851-7855及びHyde, S. C., Gill, D. R., Higgins, C. F., など.,“Correction of the ion transport defect in cystic fibrosis transgenic mice by gene therapy（ノウ胞性線維症のトランスジェニックマウスにおけるイオン輸送欠陥の遺伝子療法による修正）”, Nature, 1993 ; 362 : 250-255）。このトランスフェクションの効率はしばしば、種々の理由のために、所望するよりも低かった。１つは、不満足のキャリヤーを形成する、核酸に複合体化されるカチオン性脂質の傾向である。それらのキャリヤーは、PEG−変性された脂質及び特にPEG−変性されたセラミド脂質の添加により改良される。PEG−変性された脂質の添加は、粒子の凝集を妨げ、そして循環寿命を高め、そして標的細胞への脂質−核酸粒子の供給を高める手段を提供する。さらに、カチオン性脂質は、標的細胞と一層容易に融合し、そして従って、中性に荷電されたPEG−変性されたセラミド脂質の添加はキャリヤーリポソームの正の電荷を遮断せず、又は減じない。
遺伝子及びオリゴヌクレオチド供給のための脂質基材のキャリヤーを生成するために有用なカチオン性脂質は、次のものを包含するが、但し、それらだけには限定されない：３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（DC−Chol）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）；Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）；ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（DOGS）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）；Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）；LIPOFECTIN，DOTMA及びDOPEを含んで成る市販のカチオン性脂質（GIBCO／BRL，Grand Island, N. Y.）アメリカ特許第4,897,355号；第4,946,787号；及び第5,208,036号、Epstein、など.）；LIPOFECTACE又はDDAB（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）（アメリカ特許第5,279,883号、Rose）；LIPOFECTAMINE, DOSPA及びDOPEから成る市販のカチオン性脂質（GIBCO／BRL, Grand Island, N. Y.）；TRANSFECTAM, DOGSを含んで成る市販のカチオン性脂質（Promega Corp., Madison, WI）。
組織における処理されるべき疾病のための適切な処置であるように選択されるいづれかの種々の薬物が、本発明の融合性リポソームを用いて投与され得る。しばしば、薬物は抗新生剤、たとえばビンクリスチン、ドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ストレプトゾシン、及び同様のものであろう。本発明の方法により特定の組織に抗感染剤を供給することがまた所望される。本発明の組成物はまた、次の他の薬物の選択的供給のためにも使用され得るが、但しそれらだけには限定されない：局部麻酔薬、たとえばジブカイン及びクロルプロマジン；β−アドレナリン遮断薬、たとえばプロプラノロール及びラベトロール；抗高血圧剤、たとえばクロニジン及びヒドララジン；抗−抑制剤、たとえばイミパラミン、アミトリプチリン及びドキセピン；抗−痙攣剤、たとえばフェニトイン；抗ヒスタミン、たとえばジフェンヒドラミン、クロルフェニリミン及びプロメタジン；抗菌剤、たとえばゲンタマイシン；抗真菌剤、たとえばミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、ブタコナゾール、クロトリマゾール、イトラコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィン及びアンホテリシンＢ；駆虫剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、免疫変性剤、神経伝達アンタゴニスト、抗緑内障剤、ビタミン、麻酔薬及び像映剤。本発明の組成物により選択的に投与され得る他の特定の薬物は当業者に良く知られている。さらに、複数の治療剤が、所望により、そのような剤が相補的又は相乗的な効果を生成する場合、同時に投与され得る。
リポソーム中に薬物を充填する方法は、封入技法及びトランスメンブランポテンシャル充填法を包含する。１つの封入技法においては、薬物及びリポソーム成分が有機溶媒に溶解され（ここですべての種は混和性である）、そして乾燥フィルムに濃縮される。次に、緩衝液が乾燥されたフィルムに添加され、そして小胞壁中に組込まれた薬物を有するリポソームが形成される。他方、薬物が緩衝液中に配置され、そして脂質成分のみの乾燥されたフィルムに添加される。この態様においては、薬物はリポソームの水性内部に封入されるようになるであろう。リポソームの形成に使用される緩衝液は、たとえば等張塩溶液、リン酸緩衝溶液又は他の低いイオン強度の緩衝液のいづれかの生物学的に相溶性の緩衝溶液であり得る。一般的に、薬物は約0.01ng／ml〜約50mg／mlの量で存在するであろう。水性内部又は膜に組込まれた薬物を有するその得られるリポソームは次に、上記のようにして任意に分類される。
トランスメンブランポテンシャル充填法は、アメリカ特許第4,885,172号、第5,059,421号及び第5,171,578号（この内容は、引用により本明細書中に組込まれる）に詳細に記載されている。手短に言及すれば、トランスメンブランポテンシャル充填法は、弱い酸性又は弱い塩基性特徴を示すいづれかの従来の薬物と共に使用され得る。好ましくは、薬物は親油性であり、その結果、それはリポソーム膜中に分配されるであろう。pHグラジエントが、リポソーム又はタンパク質−リポソーム複合体の二層を通して創造され、そして薬物がそのpHグラジエントに応答してリポソーム中に充填される。pHグラジエントは、外部よりもより酸性又は塩基性の内部を創造することによって（Harrigan、など., Biochem. Biophys. Acta. 1149 : 329-339（1993）、この技法は引用により本明細書中に組込まれる）、又はpHグラジエントの生成を導びくイオン化できる剤、たとえばアンモニウム塩を用いてイオングラジエントを確立することによって（アメリカ特許第5,316,771号（Barenholz）、この技法は引用により本明細書中に組込まれる）、膜を通してのプロトングラジエントを創造することにより生成される。
本発明のある態様においては、特定の細胞型、組織及び同様のものに対して特異的である標的化成分を用いて本発明のリポソームを標的化することが所望される。種々の標的化成分（たとえば、リガンド、受容体及びモノクローナル抗体）を用いてのリポソームの標的化はこれまで記載されている（たとえば、アメリカ特許第4,957,773号及び第4,603,044号を参照のこと、両者は引用により本明細書に組込まれる）。
標的化成分の例は、新生物に関連する抗原、たとえば前立腺癌特異的抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を包含する。腫瘍はまた、腫瘍遺伝子、たとえばras又はｃ−erB2の活性化又は過剰発現に起因する遺伝子生成物を検出することによって診断され得る。
さらに、多くの腫瘍は、胎児組織、たとえばアルファフェトプロテイン（AFP）及び癌胎児性抗原（CEA）により通常発現される抗原を発現する。ウィルス感染の部位は、種々のウィルス抗原、たとえばＢ型肝炎コア及び表面抗原（HBVc，HBVs）、Ｃ型肝炎抗原、Epstein−Barrウィルス抗原、ヒト免疫欠損タイプ−１ウィルス（HIV1）及び乳頭腫ウィルス抗原を用いて診断され得る。炎症は、炎症の部位で発現される表面分子、たとえばインテグリン（たとえば、VCAM−１）、選択受容体（たとえばELAM−１）及び同様のものにより特異的に認識される分子を用いて検出され得る。
リポソームを標的化剤を結合するための標準的方法が使用され得る。それらの方法は一般的に、リポソーム脂質成分、たとえば標的化剤の結合のために活性化され得るホスファチジルエタノールアミン、又は誘導体化された親油性化合物、たとえば脂質誘導体化ブレオマイシン中への組込みを包含する。抗体標的化リポソームは、たとえばプロテインＡを組込むリポソームを用いて構成され得る（Renneisen、など., J. Biol. Chem., 265 : 16337-16342（1990）及びLeonetti、など., Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）87 : 2448-2451（1990）を参照のこと、これらの両者は引用により本明細書に組込まれる）。
標的化機構は一般的に、標的成分が標的、たとえば細胞表面受容体との相互作用のために利用できるように、標的化剤がリポソームの表面上に位置することを必要とする。リポソームは典型的には、連結部分がまず、膜を形成する時点で膜中に組込まれるような手段で形成される。連結部分は、膜に堅く埋封され、そして固定される親油性部分を有すべきである。それはまた、リポソームの水性表面上で化学的に利用できる親水性部分も有すべきである。この親水性部分は、それが後に添加される標的剤と安定した化学結合を形成するために化学的に適切であるように選択される。従って、連結分子は、標的化剤と反応し、そして標的化剤をその正しい位置に保持するために適切な、リポソームの表面から拡張される親油性アンカー及び親水性反応基の両者を有すべきである。ある場合、連結分子に標的化剤を直接的に結合することが可能であるが、しかしほとんどの場合、化学橋として作用する第３分子を用いることがより適切であり、従って、小胞表面から立体的に延長される標的化剤と膜に存在する連結分子とが連結される。
リポソームを含む媒体から遊離薬物を除去するために必要であるような分離段階に続いて、リポソーム懸濁液は、患者又は宿主細胞への投与のため医薬的に許容できるキャリヤーにおいて所望する濃度にされる。多くの医薬的に許容できるキャリヤーが、本発明の組成物及び方法に使用され得る。本発明への使用のための適切な配合法は、Remington’s Pharmaceutical Selences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed.（1985）に見出される。種々の水性キャリヤー、たとえば水、緩衝氷、0.4％塩溶液、0.3％グリシン及び同様のものが使用され得、そして増強された安定性のための糖タンパク質、たとえばアルブミン、リポタンパク質、グロブリン、等を含む。一般的に、通常の緩衝溶液（135〜150mMのNaCl）が医薬的に許容できるキャリヤーとして使用されるが、しかし他の適切なキャリヤーでも十分である。それらの組成物は、従来のリポソーム殺菌技法、たとえば濾過により殺菌され得る。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容できる補助物質、たとえばpH調節及び緩衝剤、緊張調節剤、湿潤剤及び同様のもの、たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、等を含むことができる。それらの組成物は、上記技法を用いて殺菌され得、又は他方では、それらは無菌条件下で生成され得る。得られる水溶液は使用のために包装され、又は無菌条件下で濾過され、そして凍結乾燥され、その凍結乾燥された調製物は投与の前、無菌水溶液と組合される。
キャリヤー中のリポソームの濃度は変化できる。一般的には、その濃度は、約20〜200mg／ml、通常、約50〜150mg／ml、及び最とも通常には、約75〜125mg／ml、たとえば約100mg／mlであろう。当業者は、異なったリポソーム成分による又は特定の患者のための処理を最適化するためにそれらの濃度を変えることができる。たとえば、その濃度は、処理に関連する流体量を低めるために高められ得る。
本発明はまた、宿主の細胞中に治療剤を導入するための方法も提供する。その方法は一般的に、治療化合物を含む融合性リポソームを宿主に投与することを含んで成り、ここで前記融合性リポソームは、二層安定化成分、及び生理的条件下で非層状相を採用し、さらに、前記二層安定化成分の存在下で二層構造を取ることができる脂質を含んで成る。宿主は種々の動物、たとえばヒト、非ヒト霊長類、鳥類、ウマ類、ウシ類、ブタ類、ウサギ類、ゲッ歯類及び同様の動物であり得る。
宿主細胞は、配合物のインビボ投与により本発明のリポソーム調製物に通常、暴露されるが、しかしリポソームへの細胞のエクスビボ暴露がまた、可能である。インビボ暴露は、リポソームの宿主への投与により得られる。リポソームは多くの手段で投与され得る。それらは、投与の非経口路、たとえば静脈内、筋肉内、皮下及び動脈内路を包含する。一般的に、リポソームは、静脈内、又はある場合、吸入投与されるであろう。しばしば、リポソームは、大中心静脈、たとえば上大静脈又は下大静脈中に投与され、高く濃縮された溶液の多量の投与を可能にされる。リポソームは、影響される血管に直接的に高濃度溶液を供給するために血管方法に従って、動脈内投与され得る。多くの場合、リポソームは経口又は経皮投与され得るが、但し、本発明の利点は、非経口投与により最良に実現され得る。リポソームはまた、配置に続いて長期の開放のために移植可能な装置中に組込まれ得る。
上記のように、リポソームは一般的に、本発明の方法においては、静脈内又は吸入を通して投与されるであろう。しばしば、複数の処理が患者に与えられるであろう。処理の投与スケジュールは、疾病、及び患者の状態により決定されるであろう。当業界において良く知られている治療化合物による標準の処理は、治療化合物を含むリポソームによる処理の案内として作用することができる。処理の期間及びスケジュールは、当業者に良く知られている方法により変更され得るが、しかし高められた循環時間及びリポソームの漏れの低下が一般的に、これまで使用されて来た用量よりも少ない用量の調節を可能にする。本発明のリポソームの用量は、処理を受ける動物又は患者の臨床条件及び大きさに依存して変化することができる。封入されない場合、治療化合物の標準の用量は、リポソーム封入された化合物の用量の案内として作用する。その用量は典型的には、処理の間にわたって一定であるが、但し、多くの場合、その用量は変化する。標準の生理学的パラメーターは、本発明のリポソームの用量を変えるために使用され得る処理の間、評価され得る。
リポソームの電荷は血液からのリポソームのクリアランスにおいて重要な決定基であり、そして負に荷電されたリポソームは細網内皮系統によりより急速に摂取され（Juliano, Biochem. Biophys. Res. Commun. 63 : 651（1975））、そして従って、血流において短い半減期を有する。長い循環半減期を有するリポソームは典型的には、治療及び診断使用のために所望される。循環半減期を最大にするためには、二層安定化成分は、それらの接合体が長く続く立体的バリヤーを提供するので、親水性ポリマー、たとえば、長い飽和炭化水素鎖（Ｃ18＞Ｃ16＞Ｃ14）を有する脂質アンカー、たとえばPEsに接合されるPEGであるべきである。前記因子の他にその電荷を変えることによって、当業者は、本発明のリポソームが融合性になる速度を調節することができる。
さらに、リポソーム懸濁液は、貯蔵に基づいて、遊離基及び脂質一過酸化損傷に対して脂質を保護する脂質−保護剤を含むことができる。親油性遊離基消光剤、たとえばアルファトコフェロール及び水溶性鉄−特異的キレート剤、たとえばフェリオキサミンが適切である。
本発明は特定の例により一層詳細に記載されるであろう。次の例は、本発明を例示するものであって、限定するものではない。
例
１．材料及び一般方法
Ａ．材料
螢光プローブ及びPEG−PE接合体を包含するすべてのリン脂質は、Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama, USAから購入された。１−Ｏ−メチル（ポリ（エトキシ）−Ｏ−スクシニル−Ｏ−（卵）セラミドは、Inex Pharmaceuticals Corp., Vancouver, BC. CanadaのDr. L. Cholからの贈与である。ジ−〔１−14Ｃ〕−パルミトイルホスファチジルコリンは、Du Pont, Mississuaga, Ont., Canadaから購入された。〔3Ｈ〕−DSPE−PEG2000は前記のようにして合成された（Parr、など., Biochim. Biophys. Acta, 1195 ; 21-30（1994））。他の試薬は、Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USAから購入された。
Ｂ．多層小胞及び大きな単層小胞の調製
脂質成分を、１〜２mlのベンゼン：メタノール（95：５，ｖ／ｖ）において混合し、そして次に、液体窒素トラップを備えたVirtis凍結乾燥機を用いて、60ミリトル以下の圧力で最低５時間、凍結乾燥せしめた。多層小胞（MLV）を、10mMのHepes−NaOH，pH7.4により緩衝された150mMのNaCl（Hepes−緩衝溶液、HBS）において乾燥脂質混合物を水和化することによって調製した。混合物は、水和化を助けるために、回転せしめられた。大きな単層小胞（LUV）を生成するためには、MLVをまず、液体窒素下で凍結し、そして次に、30℃で５回、融解した。LUVを、100nmの孔サイズの２つの積重ねられたポリカーボネートフィルターを通して10回、凍結され、そして融解されたMLVを30℃で及び200〜500psiの圧力で押出すことによって製造した（Hope、など., Biochim. Biophys. Acta, 812 : 55-65（1985））。
Ｃ．31Ｐ−NMR分光分析法
31Ｐ−NMRスペクトルを、81MHzで作動する、温度調節されたBruker MSL200スペクトロメーターを用いて得た。遊離誘導壊変を、４μｓ、90°のパルス、１秒のパルス間壊変、20KHzのスイープ幅及びWaltz分離を用いて、2000の過渡現象について蓄積せしめた。50Hzのライン広拡化を、Fourier変換の前、データに適用した。サンプルを、データ蓄積の前、30分間、示される温度で平衡化した。30〜70mMの脂質濃度を使用した。
Ｄ．凍結−破損電子顕微鏡
DOPE：コレステロール：DOPE−PEG2000（１：１：0.1）の混合物をHBSにより水和化することによって、MLVを調製した。この混合物の一部を上記のようにして押出し、LUVを生成した。グリセロールを、25％の最終濃度になるようMLV及びLUVの両者に添加し、そしてサンプルを液体フレオン中で急速に凍結した。サンプルを、−110℃及び10-4トル以下で、Balzers BAF400ユニットにおいて破損せしめた。２nmの白金層により45°で増影し、そして20nmの炭素層により90°で被覆することによって、レプリカを調製した。そのレプリカを、48時間、次亜塩素酸塩溶液にソーキングすることによって清浄し、そしてJoel JEM−1200EX電子顕微鏡により可視化した。
Ｅ．LUV及びミセルのゲル濾過
DOPE：コレステロール：DSPE−PEG2000（１：１：0.1）及び微量の14Ｃ−DPPC及び3Ｈ−DSPE−PEG2000から成るLUVを、カラムへの脂質の非特異的な吸着を排除するために槽音波処理によりHBSに懸濁された10mgの卵PCにより予備処理されたSepharose CL−4Bのカラム上で、約0.5ml／分の流速でクロマトグラフィー処理した。DSPE−PEG2000及び微量の3Ｈ−DSPE−PEG2000の混合物をHBSにより水和化することによって、ミセルを調製し、そしてLUVについて記載されるようにしてクロマトグラフィー処理した。
Ｆ．脂質混合アッセイ
脂質混合物を、NMR測定について記載されるようにして調製した。得られる多層小胞（MLV）を液体窒素下で凍結し、そして次に、30℃で５回、融解した。大きな単層小胞（LUV）を、100nmの孔サイズの２つの積重ねられたポリカーボネートフィルターを通して10回、凍結されそして融解されたMLVを30℃で及び200〜500psiの圧力で押出すことによって製造した（Hope、など., Biochim. Biophys. Acta 812 : 55-65（1985））。
脂質混合を、Strnck、など.（Biochemistry 20 : 4093-4099（1981））の螢光共鳴エネルギートランスファー（FRET）アッセイの変法により測定した。螢光脂質、Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（NBD−PE）及びＮ−（リザミンローダミンＢスルホニル）−ジノロルミトイルホスファチジルエタノールアミン（Rh−PE）を0.5モル％で含むLUVを調製した。LUV（50〜60μＭ）及び３倍過剰のラベルされていない標的小胞を、短期間アッセイ（≦１時間）のために37℃で螢光計において混合し、又は長期間アッセイのためには、37℃で暗水浴における密封されたキュベットにおいて混合した。PEG−脂質トランスファーの後の融合の測定のために、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（POPC）から調製された過剰量のリポソームを、PEG−脂質のための吸込み物（sink）として添加された。螢光の発光強度を、Triton Ｘ−100（POPC吸込み物が使用される場合、0.5又は１％の最終濃度）の添加の前後で、465nmでの励起を伴って517nmで測定した。データは、短期間アッセイ（≦１時間）のためには修正されていない螢光強度；又は％融合率のいづれかとして表わされた。光の散乱の調節は、ラベルされていない小胞により0.5モル％のプローブによりラベルされたLUVを置換することによって、実施された。最大の融合が、0.125モル％の個々の螢光プローブを含む模擬融合小胞を用いて決定された。％融合率は、次のようにして計算された：
0004128617.tif 000002
ここで、Ｆ(t)は時間ｔでの螢光強度であり；ＦOは時間ゼロでの螢光強度であり；ＦTはTriton Ｘ−100の存在下での螢光強度である。Ｍ及びＬはそれぞれ、模擬の融合された対照及び光の散乱対照についての同じ測定値を表わす。模擬の融合された対照の螢光の変化は、24時間にわたっての螢光プローブの交換が観察される螢光変化の10％を占めるが、しかし初めの１時間は、無視できることを示唆した。
Ｇ．赤血球細胞とのリポソームの融合
DOPE：コレステロール：DODAC（40：45：15）又はDOPE：コレステロール：DODAC：PEG−セラミド（35：45：15）から成るLUVを、標準の押出し技法により調製した。LUVはまた、１モル％のローダミン−PEを含んだ。LUV（200μＭ）を、１mlの最終体積で50μｌの包装されたRBCと共に37℃でインキュベートした。PEG−脂質の交換の後の融合のアッセイのためには、２mMのPOPC：コレステロール（55：45）の取込み物が含まれた。多くのアッセイにおいては、融合性リポソームが、RBCと混合される前、取込み物と共に予備インキュベートされた（図22〜24についての説明図を参照のこと）。混合物のアリコートを、顕微鏡のガラススライドに移し、カバーガラスにより被覆し、そして相対比及び螢光顕微鏡により試験した。融合を、RBC形質膜の螢光ラベリングとして評価した。図22〜24に関しては、螢光リポソームを、セクション“Ｌ”に記載されるようにして、POPC：コレステロールのリポソーム及び／又はRBCと共にインキュベートした。図22〜24のパネルａ，ｃ及びｅは相対比下での図であり、そしてパネルｂ，ｄ及びｆは螢光下で観察される同じフィールドである。
Ｈ．他の方法
リン脂質の濃度を、Fiske and Subbarow（J. Biol. Chem., 66 : 375-400（1925））の方法を用いて、リン酸についてアッセイすることにより決定した。リポソームのサイズ分布を、Nicompモデル370粒子サイザーを用いて、準弾性光散乱（QELS）により決定した。
II．実験的な発見
Ａ．DOPE及びコレステロールの等モル混合物の多型相性質に対するBSCの影響
31Ｐ−NMRを用いて、DOPE及びコレステロールの等モル混合物の相選択に対する、二層安定化成分（BSC）、この場合、DOPEに接合されるポリ−（エチレングリコール）2000（すなわち、DOPE−PEG2000）の効果を試験した（図１）。BSCの不在下で、前記混合物は、低いフィールドピーク及び高いフィールドショルダーを有する特徴的な31Ｐ−NMRの線形状から決定されるように、20℃で逆六角形相（ＨII）を取った（Cullis and de Kruijff, Biochim. Biophys. Acta 559 : 399-420（1979））。混合物中のBSCの量が高められるにつれて、Ｈn相リン脂質に対応するピークが消出し、そして二層の相リン脂質の特徴的な高いフィールドピーク及び低いフィールドショルダーが現われた（Cullis and de Kruijff、前記、1979）。DOPE−PEG2000がリン脂質の20モル％で存在する場合、混合物はほとんど独占的に二層であり、そしてＨII相脂質の形跡は存在しなかった。
ＨII相及び二層の相に対応するピークの他に、等方性の運動の平均化のしるしである第３ピークが、BSCの存在下で観察された（図１）。等方性シグナルの大きさは、存在するBSCの量及び続く図に示されるように、BSC種の性質により変化した。シグナルは、ＨII及び二層の相の同時存在を可能にするBSCの濃度で最大であり、そしてＨII又は二層の相のいづれかが卓越している場合、減じられた。そのようなシグナルは、NMR時間目盛に基づいて等方性の運動の平均化を可能にする多くのリン脂質相、たとえばミセル状で、小さな小胞の立方体且つひし形のリン脂質相により生成され得る。
Ｂ．DOPE及びコレステロールの等モル混合物の熱互変性質に対するBSCの影響
図２は、DOPE、コレステロール及びBSCの混合物の相性質に対する温度の効果を示す。DOPE−PEG2000が９モル％で存在する場合、すべての温度でそのスペクトルを支配する大きな等方性のシグナルが存在した。０℃での優先的な非等方性相は、二層であった。しかしながら、温度が高められるにつれて、高いフィールドピークは低下し、そしてＨn相の低いフィールドピークに対応するショルダーが現われた。明らかな二層から六角形の相への移行が40〜50℃で生したが、しかし大きな等方性シグナルによりほとんど不明瞭にされた。DOPEは単独で、約10℃の間隔にわたって形状の移行を示す（Tilcock、など., Biochemistry 21 : 4596-4601（1982）における図１を参照のこと）。DOPE、コレステロール及びBSCの混合物における移行は、ほとんど40℃の温度範囲にわたって存在する両相に比較して、遅かった（また、図３を参照のこと）。
混合物を、BSC含有率が20モル％に高められる場合、同じ温度範囲にわたっての二層構造において安定化した（図２）。ＨII相におけるリン脂質の形跡は存在しなかった。さらに、等方性シグナルは、研究されたすべての温度での高いBSC濃度で著しく減じられた。等方性の運動の平均化を受ける脂質の量は、温度がBSCの両濃度のために高まるにつれて上昇した。
Ｃ．BSCの二層安定化性質に対する先端基サイズの効果
BSCの二層安定化性質に対する先端基サイズの影響が図３に示されている。５モル％でのDOPE−PEG2000は、二層安定化能力を限定した。広い二層からＨIIへの移行が約10℃で集中したが、しかし高い割合の脂質は試験されるすべての温度で非層性相を採用した。同じモル割合でDOPE−PEG2000の代わりにDOPE（DOPE−PEG5000）に接合されるポリ−（エチレングリコール）5000を用いることによる先端基の大きさの上昇は、二層安定化の著しい上昇を引き起こした。二層からのＨII移行温度が約30℃に高まり、そして等方性シグナルはかろうじて識別できた。上記の二層からのＨII移行の拡大は、０℃で存在するＨII相脂質及び40℃で存在する二層の相脂質に関して特に明らかである。
Ｄ．BSCの二層安定化性質に対するアシル鎖組成の影響
アシル鎖組成においてのみ異なる３種のBSCの二層安定化能力が図４に示されている。ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DMPE−PEG2000）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE−PEG2000）又はジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE−PEG2000）に接合されるPEG2000は、DOPE及びコレステロールの等モル混合物を安定化する類似する能力を示した。二層からＨII相への移行が、約40〜50℃に高められた。その結果は、同じ濃度で、不飽和アシル基（DOPE−PEG2000）を除いて同じ先端基を有するBSCを用いて得られた、図２に示される結果に類似した。等方性シグナルの大きさは、異なったBSCにより幾分変化し、DSPE−PEG2000により最小の大きさが得られ、そしてDOPE−PEG2000により最大の大きさが得られた（たとえば、図２及び４を参照のこと）。
Ｅ．二層安定化成分としてのPEG−セラミドの使用
図１〜４に示されるスペクトルは、カルバメート結合を通してホスファチジルエタノールアミンに接合されるPEGを用いてすべて得られた。さらに、しかしながら、親水性ポリマーのための代わりのアンカーとしてのセラミドの使用が試験された。PEG2000が、卵セラミドにスクシネート結合を通して接合された。図５は、31Ｐ−NMRスペクトルが０〜60℃の温度範囲にわたってのDOPE：コレステロール：卵セラミド−PEG2000（１：１：0.1及び１：１：0.25）の混合物を用いて得られたことを示す。低モル比のPEG−セラミドで、二層及びＨII相脂質がほとんどの温度で見あたる。しかしながら、より高いPEG−セラミドモル比で、そのスペクトルは、60℃まで独占的に二層であり、この点で、ＨII相脂質に対応する低いフィールドのショルダーが見える。PEG−PEを用いて得られたスペクトルとは異なって、PEG−セラミドが使用される場合、等方性シグナルがほとんど存在しなかった。
Ｆ．凍結−破損電子顕微鏡
いくつかのNMRスペクトルの興味ある特徴の１つは、等方性の運動の平均化を示す、０ppmでの狭いシグナルであった。このシグナルは、多くのリン脂質相、たとえばミセル状で、小さな小胞性の、立方体で且つ斜方形の相構造体から生じ得る。凍結−破損電子顕微鏡を用いて、この観点をさらに試験した。図６は、HBSによりDOPE：コレステロール：DOPE−PEG2000（１：１：0.1）の混合物を室温で水和化することによって調製されたMLVの電子顕微鏡写真を示す。この脂質混合物は、二層、ＨII及び等方性相の形跡を示す図2Aに示されるNMRスペクトルに対応する。
多くの異なった構造が顕微鏡写真に見える。多くの脂質が直径400〜600nmの大きな球状の小胞として存在する。小胞の多くは、いくつかの小胞にランダムに分配されるが、しかし他においては、直線又は曲線状に構成されるように見える識別を有した。先がとがった様な突起部がまた、いくつかの小胞のくぼんだ表面上に見られる。それらの特徴は、通常、脂質粒子として言及され（Verkleij, A. J., Biochim. Biophys. Acta. 779 : 43-92（1984））、そして二層の融合の間、形成される中間構造体を表わすことができる。それらの大きな小胞は、脂質粒子のために狭い等方性シグナルを有する優先的な二層31Ｐ−NMRスペクトルを生ぜしめることが予測される。類似する結果が、Ｎ−メチル化されたPEに関して観察された（Gagne、など., Biochemistry, 24 : 4400-4408（1985））。約100nmの直径の多くの小さな小胞がまた、見出され得る。それらの小胞は水和化に基づいて自発的に形成され、又は大きな小胞の小胞体化により生成され得る。それらの小胞は、脂質の横方面拡散のために十分に小さく、又は小胞の懸濁液におけるダンブリングのために十分に小さく、その結果、NMR時間目盛に基づいて運動の平均化を生成し（Burnell、など., Biochim. Biophys. Acta. 603 : 63-69（1980））、等方性シグナルを生ぜしめる。図６の中央に、いくつかの異なった構造体の形跡を示す大きな凝集体が存在する。凝集体の右側が、密接して充填された脂質粒子であるように見えることによって特徴づけられる。上方の左側は立体的な立方体配列への明確な組織化を示し、そして下方右側の領域はＨII相を取る脂質の特徴を示す積重ねられた管の出現を有する（Hope、など., J. Elect. Micros. Tech., 13 : 277-287（1989））。これは、その対応する31Ｐ−NMRスペクトルと一致する。
図７は、LUVSを生成するために100nmの孔サイズのポリカーボネートフィルターを通しての押出しの後、同じ混合物の出現を示す。脂質は、直径約100nmの小胞中に優先的に組織化される。より接近した調査は、ときおり大きな小胞及びいくつかの管状形状の存在を示す。全体的には、かなり均等なサイズ分布が、リポソームが押出しにより生成される場合に得られる分布の典型である。
脂質ミセルの存在は、凍結−破損電子顕微鏡から真には明らかにならない。しかしながら、ミセル相における脂質はNMRスペクトルに観察される等方性シグナルに寄与し、そしてPEG−PE接合体が、単離において水和化される場合にミセルを形成することが前に示されている（Woodle and Lasic, Biochim. Biophys. Acta. 113 : 171-199（1992））。ミセルの存在を、Sepharose 4B上での分子篩クロマトグラフィーにLUVの懸濁液をゆだねることによって試験した。リポソームは、上記凍結−破損研究のために使用されるのと同じ組成のものであった。但し、DSPE−PEG2000がDOPE−PEG2000の代わりに使用され、そしてそれらは微量の14Ｃ−DPPC及び3Ｈ−DSPE−PEG2000を含んだ。溶離プロフィールが図８に示される。リン脂質及びPEG−PE接合体マーカーの両者を含む単一のピークが、空隙率で見出された。図８にまた示される対照の実験は、PEG−PEが単離において水和化される場合に形成されるミセルが、カラム中に含まれ、そしてリポソーム調製物に存在する場合、明らかに分離されたことを示した。
Ｇ．PE：PSのLUVの融合に対するPE−PEG2000の効果
DOPE：POPS（１：１）から成るラベルされていないLUVが螢光ラベルされたLUVに添加される場合、高められた光の散乱（但し、融合ではない）のために、螢光強度の小さな上昇が存在した（図９，ａ）。５mMのCa2+の添加に基づいて、膜融合の結果として脂質混合と一致する螢光の急速な上昇が存在した。融合は数秒以内で完全であり、そして螢光のゆっくりした下降を伴った。キュベットの観察は、螢光の観察される下降をもたらす、撹拌にかかわらず沈降する目に見える凝集体の存在を示した。ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DMPE−PEG2000）に接合されるPEG2000が両小胞集団に含まれる場合、融合の阻害が観察された。図９に示されるように（ｂ〜ｄ）、阻害は、小胞におけるDMPE−PEG2000の濃度に依存し、そして２モル％ほどで、Ca2+誘発された融合を排除するのに十分である。
Ｈ．融合に対するPE−PEG損失の効果
最近、分子量750〜5,000DaのPEGに接合されるリン脂質がリポソーム間での自発的移行の高められた速度を有することが示されている。それらの接合体の移行のための半減期は、分〜時間で変化し、そしてPEG基の大きさ及び二層に接合体を固定するアシル鎖の性質に依存する。融合を、PEG−脂質がリポソームから移行することが予測される条件下で試験した。Ca2+イオンを、２モル％のDMPE−PEG2000を含むPE：PSリポソームに添加し、続いて12倍過剰（ラベルされた小胞以上）の１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（POPC）リポソームをPEG−PEのための吸込み物として添加した。図10に示されるように（曲線ａ）、融合はDMPE−PEG2000の存在により初期において阻止されるが、吸込み物として作用するPOPCリポソームの添加は短時間の遅れに続いて、十分な融合活性の回復を導びいた。POPCリポソームがPE：PSリポソームに添加される場合に生じる螢光強度の小さな初期の上昇は、高められた光の散乱に起因し、融合によるものではない。対照の実験は、融合はPE：PSリポソームとPOPCリポソームとの間では発生せず（データは示されていない）、そして融合はPOPCリポソームの不在下で発生しない（図10、曲線ｂ）ことを示した。
融合活性の回復がPEG−PEの除去に依存することを確かめるために、融合の前、遅れ相の持続期間に対する初期PEG−脂質濃度の影響を試験した（図11）。等モルのPE及びPSを含むリポソームを、２，３，５又は10モル％のDMPE−PEG2000により調製した。螢光ラベルされた及びラベルされていない小胞を１：３の割合で混合し、そして５mMのCaCl2の添加の後、36倍過剰（ラベルされた小胞以上）のPOPCリポソームを添加した。予測されるように、PEG−脂質濃度の上昇に伴って、融合の前の時間の遅れの上昇が存在した。
Ｉ．融合活性に対する接合体のアシル鎖組成の効果
融合はリポソームからのPEG−PEの前の移行に依存するので、融合活性が回復される速度はPEG−PEの移行の速度に依存すると思われた。リン脂質が１つの膜から他の膜に移行する速度に影響を及ぼす１つの要因は、そのアシル鎖の長さである。融合活性に対する接合体のアシル鎖組成の効果を調べた。そのように実施するためには、２モル％のDMPE−PEG2000を含むPE：PS LUVの融合活性の回復性と、２モル％のDPPE−PEG2000及び２モル％のDSPE−PEG2000を含むPE：PS LUVとを比較した（図12Ａ）。14から16への炭素のアシル鎖の長さの上昇は、融合が開始する前の遅れ期間の劇的な上昇を引き起こした。同じレベルの融合がDMPE−PEG2000又はDPPE−PEG2000のいづれかを用いて生じるが、それは、DMPE−PEG2000が安定剤である場合、40分で、そしてDPPE−PEG2000が使用される場合、24時間で実質的に完全であった。移行の速度におけるその包含される低下（30〜40倍）は、自発的なリン脂質の移行の速度に対するアシル鎖長の効果の前の測定値と一致した。18個の炭素へのアシル鎖長の増加（DSPE−PEG2000、図12Ａ）は、さらに一層、融合における遅れを拡長し、そして24時間後、そのレベルは最大値のわずか20％であった。
二層間のリン脂質の自発的移行の速度に影響を及ぼす第２の要因は、アシル鎖の飽和又は不飽和の程度である。２モル％のDOPE−PEG2000を含むLUVの融合速度は図12Ｂに示される。二重結合の存在は、DOPE−PEG2000のための吸込み物の存在下での融合活性の回復速度を、その対応する飽和種（DSPE−PEG2000、図12Ａ）のその速度よりも早めた。融合の速度は、DPPE−PEG2000に見られる速度に類似した。図12Ｂはまた、天然のPEG−脂質種、すなわち卵セラミド−PEG2000が使用される場合に得られる融合の速度を示す。その速度は、DPPE−PEG2000に観察される速度よりも幾分早かった。２種の脂質末端基と隣接するリン脂質との間の二層における相互作用の差異は、二層間移行速度の直接的な比較を可能にするが、接合体（PE−PEG）上での負の電荷の存在は負に荷電された二層からの接合体の脱着のために必要とされないと思われる。
Ｊ．融合活性に対するPEG分子量の効果
リポソーム表面に接合されるPEGの存在は、隣接した二層の並列状態及び続く融合を阻害する立体的なバリヤーをもたらす。バリヤーの大きさは、PEG分子量の上昇に伴って、上昇すべきである。DMPE−PEG5000がPE：PS（１：１）のLUV中に組込まれる場合、融合の濃度依存性阻害が観察された（図13Ａ）。その結果はDMPE−PEG2000により得られる結果に類似する。但し、わずか１モル％のDMPE−PEG5000が、２モル％のDMPE−PEG2000に比較して、融合を完全に阻害するためには必要とされた。
図13Ｂは、融合に対する大きなPEG−脂質接合体の種々のアシル鎖組成の効果を示す。興味あることには、１モル％のPE−PEG5000により観察される融合の速度は、２モル％のPE−PEG2000による観察に類似した。使用される濃度は、融合を完全に阻害するために十分であることを示された濃度であった（たとえば、図９及び13Ａ）。しかしながら、これは問題ではない。この観点をさらに試験するために、エチレングリコール基の初期表面密度が類似する条件下での融合の速度を比較した。図14は、PEG−脂質のための吸込み物の添加の後、５モル％のDMPE−PEG2000及び２モル％のDMPE−PEG5000を含むPE：PS（１：１）LUVの融合を示す。観察される速度はひじょうに類似し、これは、二層間移行の直接的な結果として立体的バリヤーの損失以外の要因が包含されることを示唆する。
Ｋ．DOPE：コレステロール：DODAC：セラミドを含んで成るプログラム可能な融合性リポソーム
螢光ラベルされたリポソームを、DOPE及びＮ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）の85：15のモル比での混合物から蒸留水において調製した。同じ組成であるが、しかし螢光プローブを含む受容体リポソームの３倍過剰量をラベルされたリポソームに添加し、そして融合をNaClの添加により60秒後に開始せしめた（図15）。融合はイオン強度にびょうに依存した。少々の融合が50mMのNaClで観察されたが、しかし塩濃度の上昇につれて、融合の速度及び程度は劇的に上昇した。300mMのNaClで、融合は、眼に見える凝集体が生じるほど広範であり、そしてそれらの凝集体は懸濁液に保持されず、これは300mMのNaClの曲線について図15に見出される螢光の明らかな低下をもたらす。重要なことには、実質的な融合が、生理学的塩濃度（150mM）で観察された。
上記のように、２モル％のPEG−脂質のPE：PSリポソームにおける包含はCa2+−誘発性融合を阻害するのに十分であった。２モル％のDMPE−PEG2000がDOPE：DODACリポソームに含まれる場合（DOPE：DODAC：DMPE−PEG2000，83：15：２）、同じ阻害効果が観察された（図16）。しかしながら、PE：PSシステムとは異なって、それらのリポソームが高い過剰量のPOPCリポソーム（PEG−PEのための吸込み物として作用する）の存在下で１時間インキュベートされる場合、存在したとしても、少々の融合が観察された。PEG−PEは負に荷電されるので、DODACとの相互作用が二層からの移行の速度の劇的な低下をもたらす。
従って、他の二層安定化成分として、中性のPEG−脂質種、すなわちPEG−セラミドのこのシステムにおける融合を阻害する能力を試験した。PEG−セラミドは、PEG−PEに類似する二層安定化性質を有する。それらの研究のために、PEG2000を、スクシネート結合を通して種々の脂肪アミド鎖のセラミドに接合した。DOPE：DODAC：（Ｃ８：０）セラミド−PEG2000（83：15：２）から調製されたリポソームは、300mMのNaClの存在下で融合しなかった。しかしながら、過剰量のPOPCリポソームが添加される場合、融合は相当急速に生じた（図17）。類似する結果が、コレステロールがリポソーム中に組込まれる場合（DOPE：コレステロール：DODAC：（Ｃ８：０）セラミド−PEG2000，38：45：15：２）に観察された。但し、融合の速度は、コレステロール−フリーのリポソームの速度よりも遅かった（図17）。
システムにおける融合速度が調節され得るかどうかを決定するために、PEG−セラミドの脂質アミド基の鎖長を変えた。（Ｃ14：）セラミド−PEG2000を用いる場合、50％最大融合が、約６時間後に観察された（図18）。これは、図18に示される（Ｃ８：０）セラミド−PEG2000に関する速度よりも劇的な上昇を示し、ここで最大の融合は約40分で達成された。50％最大融合のための時間は、卵セラミド−PEG2000が使用される場合、20時間以上に高められた。卵由来のセラミドは、少量の長い飽和鎖と共に、優先的に、16：０の脂肪アミド鎖長を有する（約78％）。図18はまた、DMPE−PEG2000による延長された時間をも示す。融合の制限された程度（21時間で最大の20％以下）は、荷電反応がPEG−脂質移行速度に対してもたらされる劇的な効果を示す。
カチオン性リポソームを用いるための関係は、アニオン性形質膜との相補的な荷電相互作用がインビボでの細胞とリポソームとの会合及び融合を促進するであろうことである。DOPE：DODACリポソームが負の電荷を担持する膜と融合するのみならず、またPEG−脂質接合体の組込みがプログラム可能な態様で融合を妨げることを確認することは重要である。この能力は図19に示されており、これは、DOPE：コレステロール：DODAC（40：45：15）から成るリポソームが負に荷電されたリポソームと融合し、そしてカチオン性リポソームへのPEG−脂質接合体の包含が融合を阻害することを示す。DOPE：DODACリポソーム間の融合は、２モル％のPEG−脂質が螢光ラベルされた及び受容体のリポソームの両者に存在する場合、妨げられ得る。PEG−脂質が受容体のリポソームから排除される場合、ラベルされた小胞におけるその濃度は、カチオン性リポソームとアニオン性リポソームとの間の融合を阻止するために４〜５モル％に高められるべきであった。
再び、PEG−脂質はこのシステムにおいて融合を阻害できるけれども、そのPEG−脂質がリポソームから移行できる条件下で、融合活性は回復され得る。図20は、これが実際、実例であることを示す。吸込み物として作用する過剰のPOPC：コレステロール（55：45）小胞の存在下で、PE：PSリポソームと共に、DOPE：コレステロール：DODAC：（Ｃ14：０）セラミド−PEG2000（36：45：15：４）のインキュベーションは、融合活性の回復をもたらす。吸込み物の存在下で、融合の遅い速度が観察され、これは、より高い濃度のPEG−脂質がより長い期間にわたって融合を完全に妨げるために必要とされることを示唆する。
カチオン性リポソームとアニオン性リポソームとの間の融合は良好なモデルシステムを提供するが、インビボでの融合は幾分異なっている。受容体膜は脂質のみからは構成されないが、しかし高濃度のタンパク質を含み、この多くは脂質二層から外部に広がり、そして融合を阻止することができる。代表的な膜システムとして赤血球ゴーストを用いる場合、DOPE：コレステロール：DODAC（40：45：15）から成るリポソームが細胞膜と融合することが見出された（図21を参照のこと）。さらに、上記融合のように、このシステムにおける融合はまた、PEG−脂質接合体を用いても阻害され得ることが見出された。この結果は、細胞内薬物供給のためのプログラム可能な融合性キャリヤーとしてのそれらのシステムの有用性を明確に確立する。
Ｌ．赤血球（RBC）とのプログラム可能な融合
DOPE：コレステロール：DODAC（40：45：15）から成るLUVは、RBCと急速且つ広範に融合する（図21、パネルａ及びｂ）。延長されたインキュベーションは、RBCの広範な溶解を引き起こし、そして多くの螢光ラベルされた“ゴースト”が形成された。５モル％のPEG−セラミド（Ｃ８：０）の組込みは融合を阻止し（図22、パネルｃ及びｄ）、そしてこの効果は24時間まで維持された。この効果は幾分驚くべきことであった。なぜならば、（Ｃ８：０）セラミドはリポソーム膜間を急速に（すなわち数分以内）交換できるからである。RBCはPEG−セラミドのための吸込み物として作用することができないか、又は融合を可能にする十分なPEG−セラミドを除去するために不十分なRBCが存在すると思われる。しかしながら、PEG−セラミドのための外因性吸込み物が含まれる場合、融合活性は数分以内に回復された（図22、パネルｅ及びｆ）。
長い脂肪アミド鎖（すなわちＣ14：０又はＣ20：０）を有するPEG−セラミドが用いられる場合、外因性吸込み物の存在下でさえ、24時間にわたってほとんどの融合は存在しなかった。これは再び、実質的な融合が、吸込み物が存在する場合、リポソームシステムにおいてこの時間にわたって観察されるので、驚くべきことであった。吸込み物（POPC／コレステロール）とRBCとの間のいくらかの非特異的相互作用が生じ、これがPEG−セラミドを吸収するPOPC：コレステロールリポソームの能力を妨害するように思えた。図23は、PEG−セラミド（Ｃ14：０）を用いてそれらの条件下で得られる結果を示す。融合は、RBCの添加の前、吸込み物と共に融合性LUVを５分間、予備インキュベーションした後は観察されなかった（図23、パネルａ及びｂ）。しかしながら、１時間の予備インキュベーションの後、RBCとのいくらかの融合が観察され（図23、パネルｃ及びｄ）、これは、それらの条件下で、PEG−セラミドがリポソームから移行し、そして融合性になることを示唆する。より長いインキュベーション（２時間）によれば、螢光ラベリングのパターンが変化した。RBC形質膜の拡散ラベリングよりもむしろ、広範な小さな斑点状の螢光が観察され（図23、パネルｅ及びｆ）、そしてこのパターンは24時間まで維持された。小さな斑点の螢光は細胞と会合するようには見えず、そしてそれは吸込み物と螢光リポソームとの融合を表わし、但しリポソーム−リポソーム融合の前の螢光測定は、これがいづれの適切な程度も生じなかったことを示した。第２の可能性は、長期間にわたっての螢光プローブの交換が吸込み物のラベリングを導びくが、但しこれはRBCの融合及びラベリングを妨げるようにたぶん思えることである。PEG−セラミド（Ｃ20：０）が使用される場合、吸込み物とLUVとの、５分間（図24、パネルａ及びｂ）、１時間（図24、パネルｃ及びｄ）、２時間（図24、パネルｅ及びｆ）、又は24時間まで（結果は示されていない）の予備インキュベーションの後、融合についての形跡は存在しなかった。
図22〜24は、本発明のリポソームが損なわれていない細胞とのプログラム可能な融合を示すことを明確に確立する。最初に、PEG−脂質を含まない、DOPE：コレステロール：DODAC（40：45：15）から成るリポソームは、RBCと急速且つ広範に融合する。第２に、リポソームが５モル％のPEG−脂質を含む場合、融合は、脂質末端基の組成にもかかわらず阻止される。第３に、PEG−脂質が移行できる吸込み物の存在下で、融合活性は、脂質末端基の性質に依存する速度で回復され得る。融合を導びく交換は、PEG−セラミド（Ｃ20：０）が使用される場合、示されないが、これは融合可能性の欠乏よりもむしろアッセイに関して問題があると思われる。インビボで、PEG−脂質交換のためのほとんど無限の吸込み物が存在するであろう。
Ｍ．PEG2000−セラミド（Ｃ14：０）及びPEG2000−DMPEによるトランスメンブランキャリヤーシステム（TCS）融合の阻害
１，２−ジオレオイル−３−ホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、螢光団Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）−１，２−ジオレオイル−sn−ホスファチジルエタノールアミン（NBD−PE）及びＮ−（リサミンローダミンＢスルホニル）−１，２−ジオレオイル−sn−ホスファチジルエタノールアミン（Rh−PE）、並びにPEG2000−セラミド（Ｃ14：０）又はPEG2000−DMPEのいづれかから成るTCSを、100nmの直径のポリカーボネートフィルターを通しての押出しにより調製した（Hope, M. J.,など., Biochim. Biophys. Acts. 812, 35-65（1985））。TCSは、0.5モル％のNBD−PE及び0.5モル％のRh−PE、並びにDOPE：DODAC ： PEG2000−DMPE（80：15：５、モル％）又はDOPE：DODAC ： PEG2000−セラミド（Ｃ14：０）（80：15：５、モル％）のいづれかを含んだ。螢光ラベルされたリポソームを、37℃で、DOPE：POPS（85：15、モル％）から成る３倍過剰量のリポソームと共に、20mMのHEPES, 150mMのNaCl, pH7.4（HBS）において20分間インキュベートした。POPCリポソームを、螢光ラベルされたリポソームの濃度の10倍で添加し、そして脂質混合物を、Slruck, D. K.,など.（Biochemistry 20, 4093−4099（1981））の方法によりアッセイした。使用される励起波長は465nmであり、そして530nmで配置された発光フィルターは、散乱光のために強さを最小にした。融合の割合及び程度を測定し、続いて、535nmの波長でNBD螢光強度の上昇を時間にわたってモニターした。％最大融合率を、関連融合（％ max）（ｔ）＝（Ｆ(t)−ＦO）／（ＦW−ＦO）から決定し、ここでＦOはゼロ時点での初期NBD螢光強度であり、Ｆ(t)は時点ｔでの強度であり、そしてＦWは螢光ラベルされたDOPC：POPSリポソームの完全な脂質混合の条件下での達成できる最大の螢光強度である（Bailey, A. L.,など., Biochemistry 33, 12573-12580（1994））。図25は、DOPC：POPSとDOPE／ DODAC／ PEG2000−DMPEとの混合に比較してのDOPC：POPSとDOPE／ DODAC／ PEG2000−セラミド（Ｃ14：０）との考慮すべき混合を示し、これは、PEG2000−DMPEがTCSから単に最小限度、除去されることを示す。この結果は、アニオン性PEG2000−DMPEと水溶液におけるPEG2000−DMPEのモノマー濃度を効果的に低めるカチオン性DODACとの間の静電相互作用に寄与する。
Ｎ．両親媒性二層安定化成分を用いてのカチオン性脂質を含むリポソームのインビボ安定化
インビボで、カチオン性脂質を含む融合性リポソームを安定化する一連の二層安定化成分（すなわち、PEG−変性された脂質）の能力を、この研究において試験した。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）及びＮ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）から成るリポソームの凍結−破損電子顕微鏡分析は、二層安定化成分、たとえば（PEG−DSPE及びPEG−セラミドの包含が、マウス血清の存在においてリポソーム凝集を効果的に妨げたことを示した。DOPE及びDODACから成り、さらに二層安定化成分（すなわち、両親媒性ポリエチレングリコール（PEG）誘導体）を含む融合性リポソームの生物分布を、脂質マーカーとして3Ｈ−ラベルされたコレステリルヘキサデシルエーテルを用いてマウスにおいて試験した。二層安定化成分は、PEG−DSPE、及びＣ８〜Ｃ24の範囲の異なったアシル鎖長を有する種々のPEG−セラミド（PEG−Cer）を含んだ。DOPE／DODACリポソーム（85：15、モル／モル）は、血液から急速に排除され、そして肝臓に独占的に蓄積することが示された。脂質混合物の5.0モル％での二層安定化成分の包含は、血液中に残存するリポソームレベルの上昇及び肝臓における付随する蓄積の低下をもたらした。種々の二層安定化成分の中で、PEG−DSPEは、DOPE／DODACリポソームの循環時間を延長することに最高の活性を示す。PEG−セラミドの活性は、アシル鎖長に直接的に比例し、すなわちアシル鎖が長いほど、その活性は高くなる。最適なアシル鎖長を示すPEG−セラミド（Ｃ20）の活性は、脂質混合物のその濃度に依存し、そして最大の循環時間は脂質混合物の30モル％で得られた。脂質組成物への二層安定化成分の包含はDOPE／DODACリポソームの高められた循環時間を一般的にもたらすが、カチオン性脂質、すなわちDODACの存在は血液からのそれらの急速なクリアランスを促進するように見えた。
DODACリポソームの調製及び使用は、1994年９月30日に出願されたアメリカ特許出願第08/316,399号に開示されている（この技法は引用により本明細書中に組込まれる）。
１．材料及び方法
ａ．リポソーム調製
DOPE及びDODACから成り、そしてさらに、種々の割合での二層安定化成分を含む小さな単層リポソームを、押出し法により調製した。手短に言及すれば、非交換可能で且つ非代謝性の脂質マーカーとして3Ｈ−ラベルされたCHEを含む溶媒フリーの脂質混合物を、蒸留水により一晩、水和化した。通常、リポソーム懸濁液（１ml当たり５mgの脂質）を、Lipex Biomenbranes, Inc.から入手できる押出し装置を用いて、Nuclepore膜（0.1μｍの孔サイズ）を通して室温で10度、押出し、均質なサイズ分布を有するリポソームを生成した。リポソームサイズは、粒子サイザー用いて準弾性光散乱により決定され、そして標準偏差（SD）を伴って、平均直径として表わされた。
ｂ．リポソーム生物分布の研究
種々の脂質組成を有する3Ｈ−ラベルされたリポソームを、蒸留水0.2mlにおける1.0mgの脂質の用量で、雌のCD−１マウス（生後８〜10週）中にｉ．ｖ．注射した。特定の間隔で、マウスを二酸化炭素への過剰暴露により殺害し、そして血液を1.5mlのマイクロ遠心分離管に心臓を突き刺すことにより集め、そして遠心分離し（12000rpm、２分、４℃）、血液細胞をペレット化した。脾臓、肝臓、肺、心臓及び腎臓を含む主要器官を集め、重量を計り、そして蒸留水中で均質化した。血漿及び組織ホモジネートの画分を、ガラスシンチレーションバイアルに移し、製造業者の説明書に従って50℃でSolvable（NEN）により溶解し過酸化水素により脱色し、そしてBeckmanカウンターによりシンチレーション液体における3Ｈ−放射能を分析した。データは、個々の器官における3Ｈ−ラベルされたリポソームの注射された全用量の％として表わされた。血漿におけるリポソームのレベルを、マウスの血漿体積が全体重の5.0％であると仮定することにより、決定した。
２．結果及び議論
ａ．凍結−破損電子顕微鏡研究
DOPE／DODAC（85：15、モル／モル）、DOPE／ DODAC／ PEG−セラミド（Ｃ20）（80：15：５、モル／モル）及びDOPE／ DODAC／ PEG−DSPE（80：15：５、モル／モル）から成るリポソームが、押出し法により調製され、そしてそれは類似する平均直径（100nm）を有した。３種のリポソーム配合物の凍結−破損電子顕微鏡は、比較的狭いサイズ範囲を有する単層リポソームを示した。しかしながら、37℃で30分間、50％マウス血清中でのDOPE／DODACリポソームのプレインキュベーションは、それらの大量の凝集をたらした。他方、DOPE／ DODAC／ PEG−セラミド（Ｃ20）及びDOPE／ DODAC／ PEG−DSPEリポソームの両者は、それらのリポソームがマウス血清により予備処理される場合、いづれの凝集も示さなかった。従って、それらの結果は、DOPE／DODACリポソームの血清誘発性の急速な凝集を妨げる上で、二層安定化成分の有効性を示す。
ｂ．二層安定化成分、すなわち両親媒性PEG誘導体を含むDOPE／DODAC
リポソームの生物分布
二層安定化成分を有するか又はそれを有さないDOPE／DODACリポソームを、脂質マーカーとして3Ｈ−ラベルされたコレステロールヘキサデシルエーテルを含むように調製し、そしてそれらの生物分布を、注射の１時間後、マウスにおいて試験した。この研究において試験されるリポソームは、DOPE／DODAC（85：15、モル／モル）、DOPE／ DODAC／ PEG−セラミド（80：15：５、モル／モル）及びDOPE／ DODAC／ PEG−DSPE（80：15：５、モル／モル）から構成された。また、リポソームの生物分布に対する疎水性アンカーの効果を試験するために、異なったアシル鎖長を有する種々のPEG−セラミド誘導体を用いた。それらのリポソーム配合物は、89〜103nmの範囲の類似する平均直径を有した。下記表Ｉは、血液、脾臓、肝臓、肺、心臓及び腎臓におけるリポソームのレベル、及びそれぞれの血液／肝臓の割合を示す。DOPE／DODACリポソームが、血液から急速に排除され、そして約0.01の血液／肝臓の割合を伴って、肝臓に優先的に蓄積することが示された。脂質組成物における5.0モル％での二層安定化成分の包含は、それらの高められた血液レベル及び従って、異なった程度での低められた肝臓蓄積をもたらした。DOPE／ DODAC／ PEG−DSPEリポソームは、最高の血液レベル（約59％）、及び最低の肝臓蓄積（約35％）並びに注射の１時間後、約1.7の血液／肝臓割合を示した。異なったアシル鎖長を有する種々のPEG−セラミド誘導体の中で、PEG−セラミド（Ｃ20）−含有リポソームは、最高の血液レベル（約30％）及び約0.58の血液／肝臓割合を示し、そしてPEG−セラミド（Ｃ８）−含有リポソームは最低の血液レベル（約６％）及び約0.1の血液／肝臓割合を示した。異なったPEG−セラミド誘導体の中で、リポソームの血液レベルを高めることにおける活性は、セラミドのアシル鎖長に直接的に比例し；より長いアシル鎖長ほど、その活性は高くなるように思えた。リポソームの血液レベルを高めるための最適な誘導体はPEG−セラミド（Ｃ20）であることがまた明らかになった。
ｃ．延長された循環時間のためのDOPE／DODACリポソームの最適化
DOPE／DODACリポソームの生物分布に対する、脂質組成物中のPEG−セラミド（Ｃ20）の上昇する濃度の効果を試験した。PEG−セラミド（Ｃ20）が脂質組成物において上昇する濃度（０〜30モル％）でDOPE／DODACリポソームに含まれ、そしてDODACの濃度は脂質混合物の15モル％で維持された。リポソームが押出し法により調製され、そして102nm〜114nmの範囲の類似する平均直径を有した。リポソームをマウス中でｉ．ｖ．注射し、そして生物分布を、注射の１時間後に試験した。図26は、PEG−セラミド（Ｃ20）濃度の関数として、注射の１時間後、血液及び肝臓におけるリポソーム・レベルを示す。明らかに、脂質組成物におけるPEG−セラミドの濃度の上昇は、血液におけるリポソームレベルの漸進的な上昇をもたらし、そして肝臓においては、低められた蓄積が付随した。最高の血液レベル（注射の１時間後、約84％）が、約6.5の血液／肝臓割を示すDOPE／ DODAC／ PEG−セラミド（Ｃ20）（55：15：30、モル／モル）に関して得られた。
DOPE／DODACリポソームの生物分布に対するDODACの上昇する濃度の効果をまた試験した。10モル％又は30モル％のPEG−セラミド（Ｃ20）及び種々の濃度（15,30,50モル％）のPEG−セラミドを含むDOPE／DODACリポソームが押出し法により調製され、そして103〜114nmの範囲の類似する平均直径を有した。生物分布を、注射の１時間後に試験し、そしてDODAC濃度の関数として、血液におけるリポソームの％を示した（図27）。図27に示されるように、脂質組成物における上昇するDODAC濃度が、両リポソーム配合物について、血液における低められたレベルをもたらした。従って、脂質組成物におけるカチオン性脂質、すなわちDODACの存在は、血液から急速なクリアランスをもたらした。また、そのようなDODACの効果か、脂質組成物におけるPEG−セラミド（Ｃ20）の濃度を高めることによって妨害され得ることが図27に示される。
図28は、PEG−セラミドを有するか又はそれを有さないDOPE／DODACリポソームの血液からの時間依存性クリアランスを示す。注射されたDOPE／DODACリポソームの少量のみが血液に残存し、そして脂質組成物におけるPEG−セラミド（Ｃ20）の濃度の上昇が血液における延長された循環時間をもたらした。DOPE／ DODAC／ PEG−セラミド（Ｃ20）（75：15：10、モル／モル）及びDOPE／ DODAC／ PEG−セラミド（Ｃ20）（55：15：30、モル／モル）についてのα−相における評価された半減期は、それぞれ、１時間以下及び５時間であった。
３．結論
上記研究は、カチオン性脂質を含む融合性リポソームの生物分布が二層安定化成分の包含により調節され得るいくつかのレベルが存在することを示唆する。表Ｉにおけるデータは、二層安定化成分の疎水性アンカーがDOPE／DODACリポソームの生物分布を決定する上で重要な役割を有することを示す。異なったアシル鎖長を有する種々のPEG−セラミド誘導体を用いての研究は、PEG−セラミドのアシル鎖長が長いほど、DOPE／DODACリポソームの循環時間を延長することにおける活性が高くなることを示した。これらの結果は、二層安定化成分が、疎水性アンカーのサイズに直接的に比例して、リポソーム膜から分離する割合と一致した。従って、長いアシル鎖を有するPEG−セラミド誘導体は、リポソーム膜における他のアシル鎖との強い相互作用を有することができ、そしてリポソーム膜からの分離の減じられた割合を示し、従って、延長された期間、DOPE／DODACリポソームの安定化をもたらし、そして従って、血液におけるそれらの延長された循環時間をもたらした。
二層安定化成分の疎水性アンカーの他に、脂質膜における二層安定化成分の濃度がまた、DOPE／DODACリポソームのインビボ挙動を調節するために使用され得る。図26におけるデータは、脂質組成物におけるPEG−セラミド（Ｃ20）の濃度の上昇が血液における高められたリポソームレベルをもたらしたことを示す。脂質組成物におけるPEG−セラミド（Ｃ20）の最適濃度は、脂質混合物の30モル％であることが見出された。DOPE／ DODAC／ PEG−セラミド（Ｃ20）リポソームの循環時間が２種の脂質組成物、すなわちDODAC及びPEG−セラミドの相対濃度により決定され、リポソーム生物分布に対して反対の効果を示すと思われる。二層安定化成分は血液におけるリポソームの循環時間を延長することにおいて活性を示し、そしてカチオン性脂質、すなわちDODACは、血液からリポソームクリアランスを促進する能力を示す。従って、血液における最大の循環時間のためには、適切な濃度の二層安定化成分及び最少濃度のDODACが使用されるべきである。しかしながら、血液における延長された循環時間のための最適なリポソーム配合物が、ある治療剤の供給においての意図された適用のために適切な配合物であることは必ずしも必要でないことが注目されるべきである。融合性リポソームの薬物動力学及び薬力学の両者が、異なった治療剤を用いて異なった適用のために試験された。
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前記の記載は例示の目的のために提供される。本明細書に記載される方法及び試験装置の操作条件、材料、工程段階及び他のパラメーターは、本発明の範囲内でさらに変性又は置換され得ることは、当業者に明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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