(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低ウイルス活性および低抗補体活性を有する抗体溶液の製造方法であって、
ａ）第一の抗体溶液を、第一の抗体溶液中に存在する脂質包膜をもつウイルスの力価が少なくとも４ｌｏｇ10または検出できないレベルまで低下するようにリン酸トリアルキルおよび界面活性剤と接触させて第二の抗体溶液を生成する工程、
ｂ）第二の抗体溶液からリン酸トリアルキルおよび界面活性剤を除去して第三の抗体溶液を生成する工程、
ｃ）３．５〜５．０の範囲内に維持されたｐＨ、２℃〜５０℃の範囲内の温度および０．００１未満のイオン強度にて少なくとも１０日間第三の抗体溶液をインキュベーションして低ウイルス活性および低抗補体活性を有する抗体溶液が製造されるように第三の抗体溶液の抗補体活性を低下する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
第一の抗体溶液が、抗体の少なくとも８５％がγ−グロブリンの７Ｓ種である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗体溶液の抗補体活性が６０ＣＨ50単位／ｍｌ未満である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
抗体溶液が、５（重量／重量）％の抗体を有し、そして抗補体活性が４５ＣＨ50単位／ｍｌ未満である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抗体溶液が、１０（重量／重量）％の抗体を有し、そして抗補体活性が６０ＣＨ50単位／ｍｌ未満である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に、静脈内注射可能な免疫グロブリン産物に関し、そしてより具体的には、ウイルス不活化段階にかけられ、低レベルの抗補体活性をもつ静脈内注射可能な免疫血清グロブリン（ＩＧＩＶ）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫血清グロブリンの初期の医薬製剤は、有害反応の許容できないほどの高い発生のために、静脈内に投与することができなかった。これらの有害反応は、血清の補体レベルにおける減少に関連していて、明らかに、投与されたγ−グロブリンに結合する補体によって引き起こされる（１）。γ−グロブリンの補体結合能、またはその抗補体活性（ＡＣＡ）は、分画操作の間にもたらされる変性の結果として非常に増進される。いくつかのアプローチが、静脈内投与に安全なＩＳＧを与えるという問題を目指して取られてきた（（２）および本明細書に組み入れられる引用文献、参照）。Tenoldは、静脈内注射によって投与できる低ＡＣＡをもつ免疫血清グロブリン（ＩＳＧ）を調製する方法を報告した（２、引用によって本明細書に組み入れられる）。Ｔｅｎｏｌｄ’６０８法は、低イオン強度（好ましくは、約０．００１未満）および低ｐＨ（３．５〜５．０）において、ＩＳＧを製剤化することを必要としている。
【０００３】
マルトースのような炭水化物による安定化を含む、静脈内注射可能な免疫血清グロブリン（ＩＧＩＶ）を調製する他の方法も、報告されている（３）。ｐＨ４．０で３７℃におけるＩＳＧのインキュベーションを含む方法（４）は、静脈内注射によって投与できる低ＡＣＡをもつ生産物をもたらす；しかしながら、保存中に、その生産物は高いＡＣＡを取り戻す。また、ＩＧＩＶは、ＩＳＧの共有結合の改変によって、例えば、タンパク質分解（５）によるか、またはジスルフィド結合の還元に続く遮断剤との反応（１，６）によって調製された。
【０００４】
抗体調製物は、それらが単離された血液産物であるが故に、ウイルスの介在する疾病を伝達するという本質的危険性を有している。ウイルスの不活化は、安全なそして有効な血液産物を生産する上で、重要な段階である。引用によって本明細書に組み入れられるNeurathらによる米国特許第4,540,573号は、リン酸トリアルキルと界面活性剤処理を用いるウイルス不活化法（以下、溶剤／界面活性剤工程、またはＳＤ工程）を述べている（７）。その溶剤／界面活性剤法は、生物学的活性や血液産物プロフィルに限られた悪影響を及ぼす脂質外皮ウイルスの不活化に有効であるとして、受け入れられた（８，１５；また、種々のウイルスの不活化処理の検討に関する１２、参照）。
【０００５】
現在、市場にある抗体調製物は、一般に、ウイルス汚染に関して安全であるとみなされてきた（９）。これは、これらの血液産物を単離するために使用される分画工程の特色によると考えられる。しかしながら、生産工程において明白なウイルス不活化段階を含むことによって、抗体調製物の安全性をさらに確実にすることが望ましいであろう。ＩＧＩＶ溶液におけるウイルス活性の確実な低下が、種々のウイルスについて、いくつかの異なるウイルス不活化方法を用いて報告された（１６，１７）。レトロウイルスを実質的に含まない免疫グロブリンの調製方法が報告されたが、それは、時間、温度およびｐＨの制御条件下でのＩＳＧのインキュベーションを含む。その方法は、冷エタノールによる血漿分画工程を通してＩＳＧを単離し、次いで、２つの貯蔵条件：（ａ）ｐＨ≦４．２５、温度２７℃、少なくとも３日間、または（ｂ）ｐＨ≦６．８、温度４５℃、少なくとも６時間、の１つの条件下でＩＳＧを貯蔵することを伴う（１０）。
【０００６】
本発明者らは、ＩＳＧ調製物、特にＴｅｎｏｌｄ’６０８特許にしたがって後続して製剤化されるものを処理するために、ＳＤ工程を用いることが、許容できるまで不活化されたウイルスをもつが、許容できないほど高いレベルのＡＣＡをもつ生産物をもたらすことを発見した。上昇したＡＣＡレベルは、工程の規模に拘わらず、すべてのリン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴＮＢＰ）／界面活性剤処理されたＩＧＩＶ調製物の無菌バルク段階において（すなわち、５％または１０％ＩＧＩＶとして製剤化し、そして０．２μｍ無菌フィルターにより濾過した後）、常に検出された。高いＡＣＡレベルをもつＩＳＧ調製物は、静脈内注射にとって不適切であり、その代わりに、他の経路、例えば筋肉内（ＩＭ）注射を通して投与されねばならない。しかしながら、ＩＧＩＶ調製物は、血流中で直ちに利用され、そしてＩＭ注射に伴う損失にはかかわらないので、それらはより望ましいものである。かくして、ＡＣＡにおいてもともに低く、ウイルス不活化段階にかけられたＩＧＩＶ生産物を得ることが望まれる。
【０００７】
【発明の構成】
本発明は、脂質外皮をもつウイルスを実質的に不含にするために化学的に処理された、低い抗補体活性をもつ静脈内注射可能な免疫血清グロブリン（ＩＧＩＶ）を生産する方法である。本方法は、溶剤／溶剤界面活性剤によるウイルス不活化段階と、それに続くインキュベーション段階を含む。本発明者らは、インキュベーション段階が、ＩＳＧを静脈内注射により投与可能とするのに、十分低い許容できるＡＣＡレベルを達成するために必要であることを発見した。インキュベーション段階は、制御された時間、ｐＨ、温度およびイオン強度下で実施されねばならない。好ましくは、ｐＨは、約３．５〜約５．０に維持する必要があり、温度は、約２〜約５０℃の範囲内の必要があり、そしてイオン強度は、約０．００１未満の必要がある。好適な実施態様では、ＩＳＧ調製物のＡＣＡは、ＩＳＧが、ｐＨ約４．２５、低イオン強度（約０．００１未満）に維持される場合、少なくとも約１０日の期間にわたって徐々に減少し、そしてウイルス不活化段階（模範的系において）は、脂質外皮ウイルスの力価において実質的な低下（すなわち、少なくとも対数で４）をもたらす。
【０００８】
材料および方法
本発明の方法のための出発材料は、未改変のヒト免疫血清グロブリンである。本明細書および特許請求の範囲では、用語「免疫血清グロブリン」は、また、γ−グロブリン、ＩｇＧおよび免疫グロブリンＧとして、文献においてさまざまに呼ばれる物質を定義するために使用される。それは、主として、そして好ましくは、分子量約１６０，０００をもつγ−グロブリンの７Ｓ種、少なくとも約８５％からなる。その他の残りのものは、好ましくは、分子量約３００，０００の９Ｓ種である。標準免疫および高度免疫の両血清グロブリン、例えば破傷風、狂犬病および肝炎免疫血清グロブリンは、それぞれ免疫および高度免疫ＩＳＧである溶剤／界面活性剤処理された生産物を用いることができる。かくして、本発明の方法のための適切な出発材料は、コーン（Ｃｏｈｎ）の画分ＩＩまたは画分ＩＩＩ濾液である（引用文献１３，１４、参照）。
【０００９】
画分ＩＩは、超遠心試験によって、主として（約８５％）、平均分子量１６０，０００をもつγ−グロブリンの７Ｓ（沈降定数７）種である。その残りのタンパク質は、本質的に、Ｍ．Ｗ．約３００，０００をもつ９Ｓ物質である。湿潤画分ＩＩペースト（固形分約３０％）は、通常、凍結乾燥されて、乾燥ＩＳＧ末を得るが、それは、次に溶解され、１６．５％無菌溶液として筋肉内注射用に調製される。湿潤画分ＩＩペーストも乾燥ＩＳＧ末もいずれも、本発明の方法のための適切な出発材料である。
【００１０】
本質的に、Ｃｏｈｎ画分ＩＩまたは画分ＩＩＩ濾液に見いだされるようなタンパク質成分の同じ組成をもつ、すべての方法によって得られるγ−グロブリンも、本方法における出発材料として使用することができる。標準免疫血清グロブリンおよび高度免疫血清グロブリンの両方とも、出発材料として用いられる。周知のように、後者は、平均的集団に通常見いだせるよりも、特異抗体に対するはるかに高い力価をもつ選ばれた献血者から得られる血漿または血清から生成される。これらの献血者は、最近、特定のワクチンにより免疫化されたか、あるいは、彼らは、最近、感染または病気から回復したかのいずれかである。これらの高力価血清や血漿は、保存され、そして画分ＩＩを単離する時点までの通常のＣｏｈｎ分画操作にかけられる。
【００１１】
さらにまた、目的の免疫応答を達成するために必要な抗体量は、静脈内に投与された場合には実質的に少ないので、静脈内用量が、同じ血清抗体価を産むであろう筋肉内用量よりも実質的に低いことは、明らかである。かくして、筋肉内のＩＳＧと高度免疫血清グロブリンの用量は、同じ抗体活性のグロブリンが静脈内に投与される場合には、同じ血清抗体価を達成するために必要な用量よりも高くなければならない。
【００１２】
出発材料の湿潤ペーストまたは凍結乾燥粉末は、一定容量の水または他の生理学的に許容できるキャリアー中に溶解されて、濃度約０．５〜２０％、好ましくは約５〜１０％のタンパク質溶液を与える。もし、画分ＩＩＩ濾液が使用される場合には、水溶液は、目的のタンパク質濃度まで慣用の技術により濃縮されねばならない。この方法では、いかなるタンパク質濃度が使用されてもよい；しかしながら、上記範囲が、実用的観点から好適である。
【００１３】
タンパク質が、溶解または濃縮された後、その溶液は、塩酸のような生理学的に許容できる酸の添加によって、ｐＨ約３．５〜５．０、好ましくは約３．８〜４．２に調整される。一般に、ｐＨは、タンパク質溶液中の単量体材料が、最大量に保たれる点に調整される。しかしながら、ｐＨは、ゲル化を生じるほど低くてはならない。温度は、ＩＳＧ材料に有害であってはならない。良好な結果は、温度範囲約０〜２０℃内で得られる。そのように調整された材料を、次の段階前に、いずれか時間を置くことは不要である；しかしながら、必要ならば、その材料は、悪い影響もなく保存されるであろう。
【００１４】
適当なｐＨ（好ましくは、３．８〜４．２）におけるタンパク質溶液は、少なくとも４倍量の交換水を用いて透析濾過されてもよく、アルコール濃度は約１７％（濾液ＩＩＩ）から約２％アルコールまで低下される。ウイルス不活化法としての溶剤／界面活性剤の効力は、周囲温度またはそれ以上で、より一層良好である；しかしながら、これらの温度における高アルコール濃度は、ＩｇＧ分子を変性するであろう。かくして、この不活化は、低アルコール濃度において実施されねばならない。
【００１５】
次に、そのように処理された材料のタンパク質濃度は、ＴＮＢＰ／界面活性剤によるインキュベーションに望ましいレベル、一般には、最大のウイルス不活化のためにはタンパク質１０％未満に調整される。この調整は、ＩｇＧにとって有害ではない慣用技術、例えば限外濾過、逆浸透、昇華、蒸発等によって行われる。ＴＮＢＰ／界面活性剤の添加前に、ｐＨは、使用される界面活性剤に応じて広い範囲内で調整されてもよい。トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を用いる場合には、ｐＨは、ＩｇＧが不安定になり始める３．５と同じぐらい低くてもよい。コール酸塩では、ＴＮＢＰ／界面活性剤の添加前に、ｐＨは、範囲５．０〜６．４内、好ましくは約５．６に調整される。インキュベーションの間の満足できるコール酸塩の溶解度は、ＴＮＢＰとコール酸ナトリウムの添加前に、ｐＨ５．５またはそれ以上に、免疫グロブリン溶液を調整することによって達成された。ＩｇＧ溶液をｐＨ値５．５以下に調整することは、適切ではない、何故ならば、コール酸ナトリウムの溶解度は、強くｐＨに依存し、ｐＨ５．５以下では低いからである。さらにまた、ＴＮＢＰ／コール酸塩を用いるインキュベーションの間の最大のウイルス不活化は、ＩｇＧ溶液中に阻止されるモデル・ウイルスを用いる実験において、ｐＨ値６．０未満で観察された。ＨＩＶ−１およびＢＶＤＶ（Ｃ型肝炎のモデルとして用いられたウシのウイルス性下痢ウイルス）の不活化は、ｐＨ５．８で加速され、１〜２時間で検出限界までの不活化が起きたが、一方ｐＨ７条件が使用された場合には、検出限界までの不活化は、最小でも６時間を要した。
【００１６】
次に、ＴＮＢＰ／界面活性剤が、徹底的に混合されるタンパク質溶液（好ましくは、８％未満［ｗ／ｗ］，ｐＨ５．８）に添加され、次いで、連続撹拌または混合しつつ、周囲温度以上、例えば３０℃でインキュベートされる。インキュベーション段階の間、最適なウイルス不活化のための標的ＴＮＢＰ／コール酸塩レベルは、Edwardsら（８）により定められたようにＴＮＢＰ＞３ｍｇ／ｍｌおよびコール酸塩＞２ｍｇ／ｍｌでなければならない。さらに、効果的なウイルス不活化では、溶剤／界面活性剤とＩｇＧ溶液の混合を通じて促進するために、溶液は、実質的に粒子を含まないことが重要である。これらの条件下でＴＮＢＰ／コール酸塩によるインキュベーションの後、ＨＩＶ−１では対数で５．２を超える低下そしてＢＶＤＶでは対数で４．０を超える低下が認められた。
【００１７】
ウイルスを不活化させるインキュベーションの終了後、静脈内投与に適切な低レベルの残留ＴＮＢＰとコール酸塩を含む最終産物を得るために、溶剤と界面活性剤分子が除去されねばならない。一般に、界面活性剤を除去する操作は、ＴＮＢＰを除去するのにも有効であり、そしてその逆も言える。最終容器中の非常に低レベルのＴＮＢＰおよびコール酸塩は、濾過、透析濾過および疎水的クロマトグラフィーの組み合わせによって達成できる。インキュベーション終了後、溶液が、予め４．０のような低ｐＨ値に調整されれば、コール酸ナトリウムは、そのようなｐＨで水溶液に容易に溶解するので、コール酸塩（およびＴＮＢＰ）の大部分が、濾過によってタンパク質溶液から除去できる。さらに、ＩｇＧ分子は、低イオン強度の溶液においてはｐＨ値３．５〜５．０で、より安定である（２）ので、溶剤／界面活性剤インキュベーションに続くすべての処理は、低ｐＨ値（すなわち４．０）において実施される。かくして、ＴＮＢＰ／コール酸塩によるインキュベーション後、タンパク質溶液は、ほぼｐＨ４．０に調整され、そしてコール酸塩の沈殿を促進するために，０〜８℃でインキュベートされる。次に、濾過が行われて、ＩｇＧ溶液から沈殿したコール酸塩が除去される。
【００１８】
そのように処理された溶液は、少なくとも４倍交換量の水で透析濾過されて、イオン強度を低下し、そしてさらなるＴＮＢＰおよびコール酸塩を除去される。上記処理の後、または処理中、ｐＨが測定され、範囲約３．５〜５．０に維持される。そのように処理された材料のタンパク質濃度は、ＩＳＧに無害な慣用技術、例えば限外濾過、逆浸透、昇華、蒸発などによって、１０〜３０％、通常は１３％（ｗ／ｖ）に調整される。再び、調製物のｐＨは、範囲約３．５〜５．０、好ましくは、約３．８〜４．２に維持される。
【００１９】
本発明では、疎水的クロマトグラフィーが、濾過や透析濾過段階によって除かれないＴＮＢＰとコール酸塩を除去するために実施され、その結果、静脈内投与に適切な低レベルの残留ＴＮＢＰおよびコール酸塩を含む最終産物を提供する。疎水的クロマトグラフィーは、オイル抽出、イオン交換またはアフィニティークロマトグラフィーのような他に利用できる方法よりも、より欠点と制約の少ない、タンパク質溶液からのＴＮＢＰ除去の方法である。これは、いくぶんか、目的のタンパク質（ＩｇＧ）が、ＴＮＢＰ除去工程を通して溶液中に残留するからである。本発明者らは、シリカに基づくＣ−１８樹脂のような他の樹脂より優れているポリスチレンに基づく樹脂（典型的には、ＰＬＲＰ−Ｓ、Polymer Laboratory, Amherst, MA）を見いだしたので、ポリスチレンに基づく樹脂が、溶液から溶剤／界面活性剤を除去するのに使用された。
【００２０】
次に、ＩＳＧ調製物は、５％または１０％タンパク質に調整され、そしてそれを等張（ｔｏｎｉｃ）にするため、すなわちそれを生理学的条件に適合させるか、または注射において生理学的に許容できるようにするために処理される。好適な実施態様では、張性は、約２３０〜約４９０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ溶媒に調整される。より好ましくは、張性範囲は、約２５０〜約３５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ溶媒であり、そしてもっとも好ましくは、張性範囲は、約２６０〜約３２５ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ溶媒である。５％製剤（５％ＩＧＩＶ）は、１０％マルトースの添加によって等張にされる。１０％製剤は、大量の糖を含まない等張な調製物を得るために０．２Ｍグリシンを含む。いずれの製剤化（Ｇａｍｉｍｕｎｅ（商標）Ｎ５％またはＧａｍｉｍｕｎｅ（商標）Ｎ１０％）経過をもつ生産物も、低ｐＨ溶液のイオン強度が高められる場合には、分子分布（抗体凝集）を起こす。それ故、しばしば等張化に使用される塩化ナトリウムは、使用されるべきでない。
【００２１】
そのように処理された溶液は、ＡＣＡレベルを低下するために、低イオン強度条件下、ｐＨ４．２５でインキュベート（好適には、２０〜２７℃でＮＬＴ２１日）される。イオン強度は、Perrinの方法（１８）により測定され、そして好適な実施態様では、イオン強度は、約０．００１未満であるべきである。上昇したＡＣＡレベルは、常に、すべてのＴＮＢＰ／コール酸塩処理されたＩＧＩＶ調製物（工程規模に拘わらず）のこの段階で検出された；しかしながら、ＡＣＡレベルは、低イオン強度条件下、ｐＨ４．２５でのインキュベーションによって徐々に低下される（表３，５〜７）。ＡＣＡレベルが、静脈内投与に適切な許容レベルであるよう十分低い場合には、検出についての厳格な法則は存在しないが、ＩＧＩＶ調製物は、出来るだけ低いＡＣＡレベルをもつべきである。
【００２２】
図は、ＳＤ処理に続く５％ＩＧＩＶ溶液で観察されるＡＣＡの典型的な平均的減少を図示する。５％ＩＳＧ製剤では、静脈内投与に適切な許容レベルは、好ましくは、約４５ＣＨ50単位／ｍｌ未満であり、より好ましくは、約３０ＣＨ50単位／ｍｌ未満であろう。１０％ＩＳＧ製剤では、静脈内投与に適切な許容レベルは、好ましくは、約６０ＣＨ50単位／ｍｌ未満であり、より好ましくは、約４５ＣＨ50単位／ｍｌ未満であろう。本明細書に使用されるように、ＡＣＡ活性の１単位（１ＣＨ50単位）は、最適力価の補体および赤血球細胞／溶血系において、補体の５０％を活性化できるタンパク質量として定義される。アッセイは、標準量の補体とタンパク質の混合物によって結合される補体量を測定する。そのアッセイの検討については、引用文献１９〜２０参照。簡単には、赤血球細胞抗体とのプレインキュベーションによって感作された赤血球細胞が、補体／タンパク質混合液に添加される。遊離の補体（タンパク質とまだ未結合の）の存在下で、これらの感作細胞は溶解され、溶解の程度の測定値として定量化できるヘモグロビンを放出する。平行して、感作された赤血球細胞は、溶解の程度が１００％と定められるバッファー対照−補体混合液にも添加される。１００％溶解を与えるのに必要な補体の実量とタンパク質の存在下で未結合のまま残っている補体量の差は、タンパク質によって実際に結合された補体量、または抗補体活性に等しい。
【００２３】
【実施例】
ウイルス不活化工程から得られるＩＳＧの抗補体活性
Ｔｅｎｏｌｄ’６０８特許にしたがって製剤化されるＩＳＧを含む溶液に及ぼす、ＳＤウイルス不活化工程の効果を確立するために、表１に示す実験を実施した。出発材料（ＳＭ）は、約５％タンパク質まで限外濾過され、次いで、４倍量の水で透析濾過されたＣｏｈｎ法濾液ＩＩＩであった。
【００２４】
対照実験、インキュベーション（−）／ＳＤ（−）では、ＳＭを、いかなるインキュベーションまたは溶剤／界面活性剤処理にもかけなかった。インキュベーション（＋）／ＳＤ（−）実験では、ＳＭのｐＨを７．０に調整し、溶液を３０℃で１０時間インキュベートし、次いで、ｐＨを４．０まで下げた。インキュベーション（＋）／ＳＤ、ＴＮＢＰ＆Ｔｗｅｅｎ８０（＋）実験では、ＳＭのｐＨを７．０に調整し、ＴＮＢＰ３ｍｇ／ｍｌおよびＴｗｅｅｎ８０  ２ｍｇ／ｍｌを溶液に添加し、溶液を３０℃で１０時間インキュベートし、次いで、ｐＨを４．０まで下げた。インキュベーション（＋）／ＳＤ、ＴＮＢＰ＆コール酸塩（＋）実験では、ＳＭのｐＨを７．０に調整し、ＴＮＢＰ３ｍｇ／ｍｌおよびコール酸塩２ｍｇ／ｍｌを溶液に添加し、溶液を３０℃で１０時間インキュベートし、次いで、ｐＨを４．０まで下げた。各実験における溶液を、次に、４倍量のＣＷＦＩ（注射用冷水、ｃｏｌｄ  ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を用いて透析濾過し、限外濾過で濃縮した。１０％ｗ／ｖまで乾燥マルトースを添加した後、５％ＩＧＩＶ溶液（ｐＨ４．２５）を、０．２μｍフィルターを通して濾過した。
【００２５】
【表１】
0004036494.tif 000002
【００２６】
表１に挙げた結果は、ＡＣＡのレベルが、ＴＮＢＰ／コール酸塩またはＴＮＢＰ／Ｔｗｅｅｎ８０を用いるインキュベーション後、ＩｇＧサンプルにおいて増大することを示している。ＡＣＡレベルは、溶剤／界面活性剤不在下で３０℃、１０時間インキュベートしたＩｇＧサンプルでは増大しなかった。これらの結果は、ＩＧＩＶサンプルのＡＣＡレベルは、溶剤／界面活性剤不在下では、処理操作や、３０℃１０時間のインキュベーションのいずれによっても上昇しなかったことを示唆する。
【００２７】
【表２】
0004036494.tif 000003
【００２８】
さらにまた、阻止実験（ＴＮＢＰおよびコール酸Ｎａによる）は、上昇した抗補体活性レベルが、痕跡レベルのＴＮＢＰ／コール酸Ｎａの存在下で抗補体アッセイを実施することによって、引き起こされた人為産物でないことを例証した。かくして、ＩＳＧを含む溶液のウイルス不活化に対して先行技術のＳＤ工程を用い、続いてＴｅｎｏｌｄ’６０８特許にしたがって製剤化することが、高いＡＣＡをもち、そして静脈内投与に不適切である生産物を生じる。同様な実験で、インキュベートされなかったＳＤ処理サンプル（表３、始発試験）は、１００単位を超えるＡＣＡレベルを有した。
【００２９】
【表３】
0004036494.tif 000004
【００３０】
しかしながら、並列のＳＤ処理サンプルを、長時間（５℃で６週間および２２℃で３週間）インキュベートした場合、ＡＣＡレベルは、顕著に減少した（表３、インキュベーション後）。このことは、この驚くべき観察のさらなる検討へと導いた。
【００３１】
ＴＮＢＰ／コール酸塩に曝されたＩＳＧの凝集物含量
先の実験（表３、始発試験）のサンプルを、開始時点におけるＩＧＩＶの凝集程度を測定するために、製剤化直後にサイズ排除（ゲル浸透）ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣ分析は、サンプル中、ほとんど完全な単量体含量を示している（表４）。
【００３２】
【表４】
0004036494.tif 000005
【００３３】
先に、高いレベルのＩｇＧ凝集物は、高い抗補体活性と相関することが示された。しかしながら、サンプルの分析から得られた結果は、１００単位を超えるサンプル中のＡＣＡレベルを示している（表３、始発試験）。ＨＰＬＣ分析は、ＴＮＢＰ／コール酸塩処理に続く高ＡＣＡが、凝集したＩｇＧ分子の存在によるものではないことを示している。
【００３４】
時間および温度の種々の条件
ＳＭは、前記実験と同じであり、そして実験条件は、次の変更のとおりであった。溶液を、ＴＮＢＰ／コール酸塩を用いてｐＨ７．０で処理し、次いで、前記のように５％ＩＧＩＶ、１０％マルトース、ｐＨ４．２５に製剤化した。ＡＣＡを、最終製剤化後、５℃、９日間の第１のインキュベーション後、および２２℃か５℃のいずれかで、２１日間の第２のインキュベーション後、直ぐにアッセイした。
【００３５】
【表５】
0004036494.tif 000006
【００３６】
ＴＮＢＰ／コール酸塩によりｐＨ７．０で処理した始発の無菌バルクサンプルでは、ＡＣＡレベルは、開始時点について再び１００単位を超えており、表３に見られた観察が確認された。５℃で９日間のインキュベーションでは、ＡＣＡは、１００単位を超えたままであった。５℃か２２℃のいずれかにおける最終インキュベーション段階は、ＡＣＡの減少が、より高温で観察されるＡＣＡのより速い減少のように温度に依存することを示す。
【００３７】
ＡＣＡに及ぼす溶剤／界面活性剤処理中のｐＨの影響
比較的良好な殺ウイルス力は、６．０未満のｐＨ値で観察されたので、ＡＣＡレベルを、ＴＮＢＰ／コール酸塩によるｐＨ５．８のインキュベーション後に評価した。一般に、ｐＨ５．８でインキュベートされた材料のインキュベートされない無菌バルクサンプルは、ｐＨ７．０サンプルよりも低いＡＣＡレベルをもつが、インキュベーションにおけるＡＣＡ減少の傾向は、ｐＨ５．８サンプルにおいても繰り返された。事実、ＴＮＢＰ／コール酸塩によるｐＨ５．８のインキュベーション後、始発時にＡＣＡレベルを上昇したサンプルにおいては、ＡＣＡレベルは、２１日間インキュベーションを超えて低下し続ける（表６）。ｐＨ７．０でインキュベートされたサンプルで既に見られたように、ＡＣＡの減少は、凝集したＩｇＧ分子レベルの低下によるものではない。何故ならば、ｐＨ５．８で処理した材料は、２２℃のインキュベーション前に、実質的に単量体ＩｇＧであったからである（ＨＰＬＣ分析、サンプルＡ４、表８）。
【００３８】
【表６】
0004036494.tif 000007
【００３９】
同様の結果は、無菌バルク段階において１０％ＩＧＩＶ、０．２Ｍグリシンに製剤化したサンプルによって得られた。低イオン強度でｐＨ４．２５、１０および２１日間のインキュベーションにおいて、ＡＣＡレベルは、５％ＩＧＩＶサンプルおよび１０％ＩＧＩＶサンプルの両方で下降することが分かった（表７）。かくして、ＡＣＡの減少は、溶剤／界面活性剤処理の際のＩＳＧ濃度およびｐＨ値の広い範囲にわたって観察できる（表３，５，７）。表７に示される無菌バルクサンプルのＨＰＬＣ分析（表８）は、上昇したＡＣＡレベルが、ＩＳＧ分子の凝集によるものではないことを確認した。
【００４０】
【表７】
0004036494.tif 000008
【００４１】
総括すると、上記結果は、望ましくないＡＣＡの増加を生じる溶剤／界面活性剤ウイルス不活化工程にかけられたＩＳＧ産物が、許容できるレベルまでＡＣＡを減少させるべき本明細書記載の条件下の付加的なインキュベーション段階を組み入れることによって、ＩＶ投与に適切なものに作成できることを示唆する。
【００４２】
【表８】
0004036494.tif 000009
【００４３】
ＩＧＩＶ（抗体）溶液の溶剤／界面活性剤処理から生じるＡＣＡの増加は、その溶液のウイルスを不活化すべきＴＮＢＰ／界面活性剤処理の避けられない２次的影響であると考えられる。本発明者は、低ｐＨ（４．２５）と低イオン強度（０．００１）において比較的長期間（少なくとも約１０日間）、ＩＧＩＶ溶液をインキュベートすることによって、ＡＣＡが、インキュベーションの間にわたって徐々に減少することを発見した。
【００４４】
先行技術は、低ｐＨと低イオン強度を用いるＩＧＩＶの生産方法（Ｔｅｎｏｌｄ’６０８特許）を開示している。Ｔｅｎｏｌｄ’６０８法は、ウイルス不活化段階を略し、それによりＡＣＡ増加の問題を回避するが、ウイルス活性の可能性は残っている。Ｔｅｎｏｌｄとは異なり、インキュベーションは、ＡＣＡを減少させるための本発明の本質的態様である。
【００４５】
Ｎｅｕｒａｔｈら’５７３特許は、溶剤／界面活性剤ウイルス不活化段階を教示する。しかしながら、Ｎｅｕｒａｔｈ’５７３は、ｐＨを調整することを述べてないし、またＡＣＡに関する工程の影響も何ら述べていない。上昇したＡＣＡレベルは、ＴＮＢＰ／コール酸塩処理したＩＧＩＶ調製物の無菌バルク段階において検出された。しかしながら、ＡＣＡレベルは、ｐＨ４．２５、低イオン強度、そして約２０℃以上で、少なくとも約１０日間のインキュベーションにおいて低下した（表５〜７参照）。先行技術は、ＩｇＧ凝集物の除去を含む、精製ＩｇＧ調製物のＡＣＡレベルを低下させるためのいくつかのアプローチを述べている（１１）。ＩｇＧ凝集物は、イン・ビボで補体系を活性化すると考えられてきた（１）。しかしながら、本発明においては、これらのＴＮＢＰ／コール酸塩処理されたＩＧＩＶ調製物は、先の条件下でのインキュベーション前に低レベルの凝集ＩｇＧ（ＨＰＬＣによって測定されたように、表４，８）を含んでいたので、ＩｇＧＡＣＡの減少は、ＩｇＧ凝集物レベルの低下に因るものではなかった。
【００４６】
実質的にウイルス不含ＩＧＩＶを生産することが期待されるけれども、先行技術にしたがうことは、許容できないＡＣＡレベルをもつ生産物をもたらす。Ｔｅｎｏｌｄ’６０８では、生産物は、実質的にＡＣＡ不含であるが、Ｔｅｎｏｌｄ’６０８と組み合わせたＳＤ工程の使用が、高レベルのＡＣＡをもたらすと述べていることは注目すべきである：本明細書に報告された実験結果は、ＳＤ工程によりＩＳＧ溶液を処理し、次いで、Ｔｅｎｏｌｄ’６０８特許にしたがって製剤化することが、高いＡＣＡをもつ生産物を生むことを示している（表１，３，５〜７）。ここで報告された驚くべき発見は、後続の（最終の）インキュベーション段階が、溶剤／界面活性剤処理された溶液のＡＣＡを低下させることである。ＳＤ工程により処理され、そして後続のインキュベーションをした場合としない場合の、５％ＩＧＩＶ溶液について観察された典型的な平均ＡＣＡレベルは、図において比較される。かくして、本発明は、ｐＨ、温度およびイオン強度の制御条件下で一定期間、インキュベートすることによって、ＡＣＡを低下させ、それによって生産物を静脈内注射により投与可能にする、以前には見られなかった方法を含む。
【００４７】
Ｍｉｔｒａ’７１４は、Ｓ／Ｄ工程の使用を示唆していないが、その代わり、同様な条件下でＩＳＧ産物の比較的短時間のインキュベーションが、実質的にウイルス不含の調製物をもたらすことを報告している（１０）。しかしながら、そのような条件下でインキュベーションを行って抗補体活性を低下させることは、外皮ウイルスの不活化のために、ＩＧＩＶ法において以前に使用されたこれらのインキュベーション条件の新規な応用である。
【００４８】
国際的に受け入れられた付加的なウイルス不活化操作（ＴＮＢＰ／コール酸塩による処理）を含む、本明細書に報告の新しく開発されたＩＧＩＶ法は、低いＡＣＡレベルをもち、ＩＶ投与に適切であるＩｇＧ調製物を生み出す。主要な利点は、改善された安全性をもつＩＧＩＶ産物が、ウイルス不活化のＴＮＢＰ／コール酸塩処理と、そしてＩＶ投与に適切な低いＡＣＡレベルを与える条件下でのインキュベーションを含む２段階工程によって得ることができることである。  前記開示は、本発明を具体的に説明することを意図し、そして種々の変法が、当業者に起こるであろうと考えられる。したがって、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきであることを意図する。
【００４９】
本発明の特徴および態様は以下のとおりである。
【００５０】
１．  ウイルス活性をもつかもしれない抗体溶液を処理する方法であって、
ａ）いかなるウイルス活性をも実質的に低下させるのに十分な条件下で、溶液を、リン酸トリアルキルおよび界面活性剤と接触させ、そして一定レベルの抗補体活性をもたらすこと；そして
ｂ）次に、溶液の抗補体活性が、静脈内投与に適切な許容レベルまで低下されるように、制御された時間、ｐＨ、温度およびイオン強度の条件下で、段階ａ）の溶液をインキュベートすることを含む方法。
【００５１】
２．  抗補体活性が、約６０ＣＨ50単位／ｍｌ未満まで低下される、第１項の方法。
【００５２】
３．  溶液が、約５％ｗｔ．／ｗｔ．抗体を含み、そして抗補体活性が、約４５ＣＨ50単位／ｍｌ未満である、第１項の方法。
【００５３】
４．  溶液が、約５％ｗｔ．／ｗｔ．抗体を含み、そして抗補体活性が、約３０ＣＨ50単位／ｍｌ未満である、第３項の方法。
【００５４】
５．  溶液が、約１０％ｗｔ．／ｗｔ．抗体を含み、そして抗補体活性が、約６０ＣＨ50単位／ｍｌ未満である、第１項の方法。
【００５５】
６．  溶液が、約１０％ｗｔ．／ｗｔ．抗体を含み、そして抗補体活性が、約４５ＣＨ50単位／ｍｌ未満である、第５項の方法。
【００５６】
７．  インキュベーションが、少なくとも約１０日間である、第１項の方法。
８．  ｐＨが、約３．５〜約５．０の範囲内に維持される、第１項の方法。
【００５７】
９．  温度が、約２℃〜約５０℃の範囲内に維持される、第１項の方法。
【００５８】
１０．イオン強度が、約０．００１未満である、第１項の方法。
【００５９】
１１．抗体の少なくとも約９９％が、単量体である、第１項の方法。
【００６０】
１２．イオン強度が有意に変化されないような条件下で、溶液の張性を生理的な値に調整するというさらなる段階を含む、第１項の方法。
【００６１】
１３．溶液の張性が、溶液に炭水化物を添加することによって調整される、第１２項の方法。
【００６２】
１４．使用される炭水化物がマルトースである、第１３項の方法。
【００６３】
１５．溶液の張性が、約２３０〜約４９０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ溶媒の範囲に調整される、第１２項の方法。
【００６４】
１６．溶液の張性が、約２７４〜約３０９ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ溶媒の範囲に調整される、第１５項の方法。
【００６５】
１７．溶液の張性が、溶液にアミノ酸を添加することによって調整される、第１２項の方法。
【００６６】
１８．使用されるアミノ酸がグリシンである、第１７項の方法。
【００６７】
１９．リン酸トリアルキルが、リン酸トリ−ｎ−ブチルであり、そして界面活性剤が、ポリソルベート８０およびコール酸ナトリウムから選ばれる、第１項の方法。
【００６８】
２０．溶液が、段階ａ）の間ｐＨ約３．５〜約６．０をもつ、第１項の方法。
２１．調製物が、イオン強度約０．００１未満、ｐＨ約３．５〜約５．０、抗体濃度約５％ｗｔ．／ｗｔ．およびマルトース濃度約１０％ｗｔ．／ｗｔ．をもつ、第１項の方法によって生産され、そして実質的に脂質外皮ウイルスを含まない静脈内注射可能な免疫血清グロブリン調製物。
【００６９】
２２．ｐＨが約４．２５である、第２１項の調製物。
【００７０】
２３．調製物が、イオン強度約０．００１未満、ｐＨ約３．５〜約５．０、抗体濃度約１０％ｗｔ．／ｗｔ．およびグリシン濃度約０．２Ｍをもつ、第１項の方法によって生産され、そして実質的に脂質外皮ウイルスを含まない静脈内注射可能な免疫血清グロブリン調製物。
【００７１】
２４．ｐＨが約４．２５である、第２３項の調製物。
【００７２】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＤ工程にしたがって処理され、そして本発明の後続のインキュベーションを実施するか、しない場合の、５％ＩＧＩＶ溶液の典型的な平均ＡＣＡレベルの比較を示す。
【図１】
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