(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼにカルボニル試薬又はその塩を共存させることを特徴とするヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼの安定化法。
【請求項２】
ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼにカルボニル試薬又はその塩が共存する試薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼの安定化法及び安定性に優れたヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼを含んでなる試薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヘキソキナーゼ（以下、ＨＫと略記する。）はマグネシウムの存在下でグルコースとアデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略記する。）から、グルコース−６−リン酸及びアデノシン二リン酸（以下、ＡＤＰと略記する。）を産生する反応を触媒する酵素である。また、ＨＫはフルクトース、マンノース、N −アセチルグルコサミン等にも作用して各糖の６−リン酸エステルを産生するので、特異性はあまり高くない。一方、グルコキナーゼ（以下、ＧｌｃＫと略記する。）はＨＫと同様グルコースのリン酸化を触媒する酵素であるが、グルコースに対する特異性が高く、フルクトース、マンノース等には作用しない。この性質を利用して、ＨＫ及びＧｌｃＫは分析試料中のグルコース関連物質の定量や、関連酵素の活性測定に広く使用されている。特に、生体由来試料中の前記物質の測定において重要な役割を担っている。例えば、血中クレアチンキナーゼ（以下、ＣＫと略記する。）測定は現在臨床検査の領域において心疾患、筋疾患等のために、血中及び尿中のグルコース測定は糖尿病の診断のために日常的に行われている重要な項目の一つであるが、いずれもＨＫ又はＧｌｃＫを使用した測定法が多く用いられている。
【０００３】
一方、近年の臨床検査用試薬の動向として、従来の凍結乾燥試薬とその溶解液を組み合わせた試薬形態から、試薬調製に伴う煩わしさや、それに起因する調製ミスを防ぐために、調製不要の液状形態へと要求が変化しつつある。しかし、液状形態では、その流通等の点から、従来の凍結乾燥の形態よりも一段と安定性が必要となっている。
従来、ＨＫを安定化するためにＮ−アセチルシステイン（以下、ＮＡＣと略記する。）、メルカプトエタノール等のチオール基保護剤や金属キレート剤を共存させる方法が用いられてきたが、その安定化効果は十分なものではない。また、近年ＨＫを化学修飾して安定化する方法も提案されているが（特許第2539225 号）、その修飾操作は煩雑で実用的でない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＨＫ又はＧｌｃＫの安定化法及びＨＫ又はＧｌｃＫを含有する安定な試薬組成物を提供することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、このような課題を解決するために鋭意検討の結果、カルボニル試薬又はその塩をＨＫ又はＧｌｃＫに共存させることにより、ＨＫ又はＧｌｃＫの安定性が飛躍的に向上することを見出し、さらに、カルボニル試薬又はその塩を、ＨＫ又はＧｌｃＫを含有する試薬組成物に共存させることにより、試薬組成物中のＨＫ又はＧｌｃＫの安定性が飛躍的に向上し、安定性に優れた試薬組成物が得られることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、ＨＫ又はＧｌｃＫにカルボニル試薬又はその塩を共存させることを特徴とするＨＫ又はＧｌｃＫの安定化法、及びＨＫ又はＧｌｃＫにカルボニル試薬又はその塩が共存する試薬組成物を要旨とするものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明の安定化法及び試薬組成物において、ＨＫ又はＧｌｃＫに共存させるカルボニル試薬及びその塩としては、例えば、塩酸ヒドロキシルアミン、硫酸ヒドロキシルアミン、シュウ酸ヒドロキシルアミン等のヒドロキシルアミン類、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩、ベンゾイルヒドラジン、エチルカルバゼート、４−フェニルセミカルバジド等が挙げられる。
【０００８】
本発明の安定化法では、上記カルボニル試薬及びその塩を少なくとも一種以上、ＨＫ又はＧｌｃＫに共存させればよい。
【０００９】
共存させるカルボニル試薬及びその塩の濃度としては、ＨＫ又はＧｌｃＫの安定化能が生ずる濃度以上であれば良く、例えば、ＨＫ又はＧｌｃＫの存在する溶液中で0.01〜50mM、好ましくは 0.1〜20mMである。
【００１０】
本発明でカルボニル試薬及びその塩を共存させるＨＫ又はＧｌｃＫを含有する試薬組成物としては、特に限定されるものではなく、例えば、公知の試薬組成物等が挙げられる。このような試薬組成物の例としては、ＨＫ又はＧｌｃＫとグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以下、Ｇ６ＰＤＨと略記する。）を用いてＣＫが触媒する式１の反応の右方向の活性を、式２、式３の反応を通して測定する試薬等が挙げられる。
【００１１】
【化１】
0004050384.tif 000002
【００１２】
【化２】
0004050384.tif 000003
【００１３】
【化３】
0004050384.tif 000004
【００１４】
また、式２、式３の反応に示すごとく、ＨＫ又はＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨを用いて試料中のグルコース、又はマグネシウムを定量する試薬組成物にも、カルボニル試薬及びその塩を共存させることにより、試薬組成物中のＨＫ又はＧｌｃＫを安定化することができ、安定性に優れた試薬組成物を得ることができる。
【００１５】
本発明の試薬組成物では、ＨＫ又はＧｌｃＫを含有する試薬組成物に上記カルボニル試薬及びその塩を少なくとも一種以上共存させればよい。
【００１６】
共存させるカルボニル試薬及びその塩の試薬組成物中の濃度としては、ＨＫ又はＧｌｃＫの安定化能が生ずる濃度以上であれば良く、例えば、ＨＫ又はＧｌｃＫの存在する溶液中で0.01〜50mM、好ましくは 0.1〜20mMである。
【００１７】
本発明の試薬組成物としては、ＨＫ又はＧｌｃＫ、ヒドロキシルアミン類等のカルボニル試薬又はその塩と、例えば、ＣＰ、ＡＤＰ、グルコース、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、Ｇ６ＰＤＨ、マグネシウム塩類等を成分として調製されたもの等が挙げられる。
【００１８】
ＨＫとしては、酵母や大腸菌、バチルス属由来のもの等を使用することができ、特にバチルス属由来のものが最も好ましい。
【００１９】
また、ＧｌｃＫとしては、例えば、バチルス  ステアロサーモフィルス、バチルス  サーモプロテオリテイカス、バチルス  アシドカルダリウス等のバチルス属、サーモアクチノマイセス属、サーマス属、サーモミクロビウム属、カルデリア属等の微生物由来のものが挙げられる。これらの中でも特に好ましい微生物としては、バチルス  ステアロサーモフィルスが挙げられ、その具体例としては、ATCC7933、7954、10194 、12980 、NCA1503 、UK563 株（微工研菌寄第7275号、FERM P-7275 、昭和58年９月29日寄託）等が挙げられる。
【００２０】
試薬組成物中のＨＫ又はＧｌｃＫは、公知の測定法で用いられている濃度範囲となるように添加すればよく、例えば、ＣＫ活性測定時の反応液では濃度が 0.5〜20U/ml、好ましくは１〜６U/mlとなるように添加すればよい。
【００２１】
本発明の試薬組成物を使用して各種測定を行うには、公知の操作法に従って行えばよい。
【００２２】
【実施例】
次に、本発明を実施例によって具体的に説明する。
【００２３】
実施例１〜実施例４
〔保存溶液の調製〕
イミダゾール緩衝液 125mM、酢酸マグネシウム 10mM 、ＡＤＰ2.5mM 、ＮＡＤＰ 2.5mM、ＮＡＣ25mM、Ａｐ５Ａ 0.013mM、ＡＭＰ6.25mM、グルコース25mM、アジ化ナトリウム15mM、ＥＤＴＡ２mM、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩10mMとなるように溶解した後、酢酸でｐＨ6.6 （30℃）に調整し、ＨＫ（バチルス属由来、旭化成社製）４U/ml、Ｇ６ＰＤＨ（ベーリンガーマンハイム社製）1.9U/ml を添加した後、25℃で所定期間保存した（実施例１）。
これとは別に、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩10mMに代えて、ベンゾイルヒドラジン（実施例２）、エチルカルバゼート（実施例３）、４−フェニルセミカルバジド（実施例４）をそれぞれ10mMとなるように溶解した溶液を調製し、25℃で所定期間保存した。
〔ＨＫ活性の測定〕
保存前及び25℃で所定期間保存した後の上記各保存液中のＨＫ活性を測定した。ＨＫ活性の測定は、基質としてグルコースとＡＴＰ、補酵素としてＮＡＤＰ、共役酵素としてＧ６ＰＤＨを含む反応液に、測定試料（各保存液）を添加した時のＮＡＤＰＨの生成量を 340nmにおける吸光度変化から測定した。その結果を表１に示す。
【００２４】
比較例１
〔保存溶液〕
イミダゾール緩衝液 125mM、酢酸マグネシウム 10mM 、ＡＤＰ2.5mM 、ＮＡＤＰ 2.5mM、ＮＡＣ25mM、Ａｐ５Ａ 0.013mM、ＡＭＰ6.25mM、グルコース25mM、アジ化ナトリウム15mM、ＥＤＴＡ２mMとなるように溶解した後、酢酸でｐＨ6.6 （30℃）に調整し、ＨＫ（バチルス属由来、旭化成社製）４U/ml、Ｇ６ＰＤＨ（ベーリンガーマンハイム社製）1.9U/ml を添加したものを保存溶液とし、25℃で所定期間保存した。上記溶液は一般的にＣＫ活性測定時に用いられるものである。
〔HK活性の測定〕
保存前及び25℃で所定期間保存した後の上記保存液中のＨＫ活性を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
0004050384.tif 000005
【００２６】
表中の値は、実施例１〜４及び比較例１において保存前に測定したＨＫ活性を 100％とした場合のそれぞれ所定の保存期間を経た保存溶液中のＨＫ活性相対値を示す。
【００２７】
表１の結果から、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩、ベンゾイルヒドラジン、エチルカルバゼート、４フェニルセミカルバジドが顕著にＨＫを安定化することが明らかである。
【００２８】
実施例５〜実施例１１
ＨＫの代わりにＧｌｃＫを使用した以外は、実施例１と同様に保存溶液を調製し、実施例１と同様の方法で保存溶液中のＧｌｃＫの活性を測定した（実施例５）。その結果を表２に示す。
また、実施例５におけるカルボキシメトキシルアミン塩酸塩の代わりに、ベンゾイルヒドラジンを添加したものを実施例６、エチルカルバゼートを添加したものを実施例７、４−フェニルセミカルバジドを添加したものを実施例８、塩酸ヒドロキシルアミンを添加したものを実施例９、硫酸ヒドロキシルアミンを添加したものを実施例１０、シュウ酸ヒドロキシルアミンを添加したものを実施例１１として同様に保存溶液中のＧｌｃＫの活性を測定した。その結果を表２に示す。
【００２９】
比較例２
ＨＫの代わりにＧｌｃＫを使用した以外は、比較例１と同様に保存溶液を調製し、実施例１と同様の方法で保存溶液中のＧｌｃＫの活性を測定した。その結果を表２に示す。
【００３０】
【表２】
0004050384.tif 000006
【００３１】
表中の値は、実施例５〜１１及び比較例２において保存前に測定したＧｌｃＫ活性を 100％とした場合のそれぞれ所定の保存期間を経た保存溶液中のＧｌｃＫ活性相対値を示す。
【００３２】
表２の結果から、塩酸ヒドロキシルアミン、硫酸ヒドロキシルアミン、シュウ酸ヒドロキシルアミン、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩、ベンゾイルヒドラジン、エチルカルバゼート、４−フェニルセミカルバジドが顕著にＧｌｃＫを安定化することが明らかである。
【００３３】
実施例１２〜実施例１４
〔保存溶液の調製〕
トリス緩衝液100mM 、塩酸マグネシウム 12.5mM 、ＮＡＤＰ２mM、ＮＡＣ 6.3mM、ＥＤＴＡ２mM、アジ化ナトリウム15mM、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩10mMとなるように溶解した後、塩酸でｐＨ7.8 （25℃）に調整し、ＨＫ（バチルス属由来、旭化成社製）１U/ml、Ｇ６ＰＤＨ（ベーリンガーマンハイム社製）0.8U/ml を添加したものを保存溶液とし、25℃で所定期間保存した（実施例１２）。
これとは別に、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩10mMに代えて、ベンゾイルヒドラジン（実施例１３）、エチルカルバゼート（実施例１４）をそれぞれ10mMとなるように溶解した溶液を調製し、25℃で所定期間保存した。
〔HK活性の測定〕
保存前及び25℃で所定期間保存した後の上記各保存液中のＨＫ活性を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果を表３に示す。
【００３４】
比較例３
〔保存溶液の調製〕
トリス緩衝液100mM 、塩酸マグネシウム 12.5mM 、ＮＡＤＰ２mM、ＮＡＣ 6.3mM、ＥＤＴＡ２mM、アジ化ナトリウム15mMとなるように溶解した後、塩酸でｐＨ7.8 （25℃）に調整し、ＨＫ（バチルス属由来、旭化成社製）１U/ml、Ｇ６ＰＤＨ（ベーリンガーマンハイム社製）0.8U/ml を添加したものを保存溶液とし、25℃で所定期間保存した。上記溶液は一般的にグルコース濃度測定時に用いられるものである。
〔HK活性の測定〕
保存前及び25℃で所定期間保存した後の上記各保存液中のＨＫ活性を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果を表３に示す。
【００３５】
【表３】
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【００３６】
表中の値は、実施例１２〜１４及び比較例３において保存前に測定したＨＫ活性を 100％とした場合のそれぞれ所定の保存期間を経た保存溶液中のＨＫ活性相対値を示す。
表３の結果から、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩、ベンゾイルヒドラジン、エチルカルバゼートが顕著にＨＫを安定化することが明らかである。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の方法は、ＨＫ又はＧｌｃＫの安定性を飛躍的に向上することが可能である。また、本発明の試薬組成物は、共存するＨＫ又はＧｌｃＫが安定なので、安定性に優れている。