(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−グルカン、α−グルコオリゴ糖、グルコースから選ばれる少なくとも一種を含む糖液に作用して、コージオリゴ糖とニゲロオリゴ糖を含む糖質を産生する特徴を有するパエシロマイセス  ライラキナス(Paecilomyces lilacinus）に属する真菌由来の下記の性質を有するα−グルコシダーゼ。
（１）  基質特異性
マルトース、ニゲロース、コージビオース、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチンおよびグリコーゲンの非還元末端側のα−グルコシド結合を分解し、グルコースを遊離する。更にα−グルコシル基を糖受容体の非還元末端のグルコース残基の２、３、４位に転移する糖転移活性も有する。パラニトロフェニルα−グルコシド、メチルα−グルコシドおよびショ糖には作用しにくい。
（２）  至適ｐＨ    ５．０  （４０℃）
（３）  安定ｐＨ範囲  ４０℃、１時間の処理で４．０−８.０である。
（４）  至適温度  ６５℃  （ｐＨ５．５）。
（５）  温度安定性    ｐＨ５．５、３０分間の処理で５０％の活性を有する温度は６５℃である。
（６）  分子量  ５４，０００（ゲルろ過クロマトグラフィー）、５０，０００（ＳＤＳゲル電気泳動）。
（７）  等電点  ９．１。
【請求項２】
真菌がパエシロマイセス  ライラキナスＨＫＳ−１２４ （ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０６）である請求項１記載のα−グルコシダーゼ。
【請求項３】
真菌パエシロマイセス  ライラキナスＨＫＳ−１２４を好気的に培養し、培養液中に産生した、もしくは、培養した菌体抽出液より、請求項１記載のα−グルコシダーゼを採取することを特徴とするα−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項４】
請求項１または２記載のα−グルコシダーゼをα−グルカン、α−グルコオリゴ糖、グルコースから選ばれる少なくとも一種を含む糖液に対して作用させ、コージオリゴ糖とニゲロオリゴ糖を含む糖質を得ることを特徴とする糖質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコージオリゴ糖とニゲロオリゴ糖を含む糖質の製造方法に関するものであり、更に詳細には、α−グルカン、α−グルコオリゴ糖、グルコースから選ばれる少なくとも一種を含む糖液に作用して、コージオリゴ糖やニゲロオリゴ糖を含む糖質を生成する作用を示す新規なα−グルコシダーゼとその製造方法、ならびにこのα−グルコシダーゼを産生するパエシロマイセス属に属する真菌およびその真菌の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
安価な澱粉を原料にしたオリゴ糖としてマルトオリゴ糖やイソマルトオリゴ糖が知られている。α−１，４−グルコシド結合よりなるマルトオリゴ糖は低甘味性や保湿性が高いなどの特徴を利用して甘味料や各種たれ、ソースなど食品に広く利用されている。
【０００３】
α−１，６−グルコシド結合を分子内に有するイソマルトオリゴ糖は低甘味性や保湿性などのマルトオリゴ糖の特徴に加え、ビフィズス菌の選択増殖活性や虫歯になりにくいなどの生理効果が知られており、その特徴を生かして飲料や菓子など幅広く食品に応用されている。
【０００４】
このように食品物性の改良および生理機能の付与を目的として幅広く利用されている澱粉由来のオリゴ糖であるが、α−１，２−グルコシド結合を有するコージオリゴ糖やα−１，３−グルコシド結合を有するニゲロオリゴ糖についてはその効率的な調製方法に関する報告がまだ少なく、マルトオリゴ糖やイソマルトオリゴ糖ほど広範囲な食品への利用に至っていない。
【０００５】
一方、最近になってコージオリゴ糖やニゲロオリゴ糖が様々な機能性を有することが報告され、新規な澱粉由来のオリゴ糖としての可能性が注目されている。
【０００６】
ニゲロオリゴ糖に特徴的な機能としては、食塩を含む食品の塩かどを緩和し、低食塩下での嗜好性を改良する食品風味改良剤（特許文献１）や、食品用の色素退色防止効果（特許文献２）などの物性改良剤としての用途のほか、生理機能として、ラクトバチルス属由来の菌と併用することによりインターロイキン１２の産生を誘導する免疫賦活効果（特許文献３）やニゲロオリゴ糖を与えることにより、病原菌に暴露された植物が、病原菌に対する自己免疫作用として、抗菌作用を有するファイトアレキシンを植物体内に誘導蓄積させる機能（特許文献４）などが報告されている。
【０００７】
コージオリゴ糖についても、最近になって還元力が弱くメイラード反応性が弱い、う蝕原性菌によって酸醗酵されないなどの機能性（非特許文献１）が報告されている。
【０００８】
このような様々な機能性を有するコージオリゴ糖やニゲロオリゴ糖の効率的な製造方法として、コージオリゴ糖についてはβ−Ｄ−グルコース１-リン酸とグルコースにコージビオースホスホリラーゼを作用させて、コージオリゴ糖を製造する方法（特許文献５）、ニゲロオリゴ糖についてはα−１，４−グルコシド結合したポリサッカライド又はオリゴサッカライドを含む基質に、アクレモニウム属（Acremonium sp.）由来の真菌を培養した培養液から得られるα−グルコシダーゼの転移反応により、ニゲロオリゴ糖を製造する方法（特許文献６）が開示されている。
【０００９】
しかし、このような製造方法は、コージオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖いずれか一方を得るものであるが、両方を効率よく生成する方法ではない。
【００１０】
【特許文献１】
特開平１０−２１０９４９号公報
【特許文献２】
特開２０００−１８９１０１号公報
【特許文献３】
特開平１１−２２８４２５号公報
【特許文献４】
特開平１０−３６２１０号公報
【特許文献５】
特開平１０−３０４８８２号公報
【特許文献６】
特開平７−５９５５９号公報
【非特許文献１】
西本友之他，日本応用糖質科学会２００１年度大会講演要旨集，第４８巻、第４１３頁（２００１年）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
コージオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖を同時に生成する方法としてシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを用いる方法（特許第１７２５１８６号）や、スクロースホスホリラーゼ（特許第３０７３８６４号）による方法、ソバ由来のα-グルコシダーゼ（M. Takahashi et al., Agric. Biol. Chem. , Vol. 33. 1339-1410 (1969)）による方法などが報告されているが、使用する酵素が多量に必要であったり、生成率が糖固形分含量の数％程度と少ないなどの問題点があり、その応用は考えられなかった。
上記のことからコージオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖の有利な製造方法が求められている。本発明はこれらの要望に応えるためのものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは澱粉および澱粉の加水分解物よりコージオリゴ糖とニゲロオリゴ糖を効率的に生成するα−グルコシダーゼを産生する菌株を探索した結果、大阪市内の土壌より本目的に適合する糸状菌、パエシロマイセス属に属する菌株を発見した。
【００１３】
本菌株を適当な条件で培養し、回収された菌体より抽出したα−グルコシダーゼを、α−グルカン、α−グルコオリゴ糖、グルコースから選ばれる少なくとも一種を含む糖液とともに共存させると、反応開始後、５０時間程度で生成物としてコージオリゴ糖とニゲロオリゴ糖が反応液中に蓄積してくることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
【００１４】
本発明はこのように、α−グルカン、α−グルコオリゴ糖、グルコースから選ばれる少なくとも一種を含む糖液より、澱粉由来の機能性糖質であるコージオリゴ糖とニゲロオリゴ糖を含む糖質を製造する方法に関するものである。
【００１５】
詳細には、α−グルカン、α−グルコオリゴ糖、グルコースから選ばれる少なくとも一種を含む糖液に作用して、コージオリゴ糖やニゲロオリゴ糖を含む糖質を生成する作用を示す新規なα−グルコシダーゼとその製造方法、ならびにこのα−グルコシダーゼを産生するパエシロマイセス属に属する真菌およびその真菌の製造方法に関するものである。
【００１６】
なお、本発明においてコージオリゴ糖とは、分子内にα−１，２−グルコシド結合を一箇所以上含むオリゴ糖を意味し、α−１，２−グルコシド結合のみからなるオリゴ糖の他、α−１，２−グルコシド結合とそれ以外の結合とからなるオリゴ糖も含む。具体的には、二糖であるコージビオース[Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル-(１→２)−Ｏ−Ｄ−グルコピラノース]のほか、三糖類であるコージビオシルグルコース[Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル-(１→２)−Ｏ−α−Ｄ− グルコピラノシル−(１→４)−Ｄ−グルコピラノース]などが例示できる。
【００１７】
更に本発明においてニゲロオリゴ糖とは、分子内にα−１，３−グルコシド結合を一箇所以上含むオリゴ糖を意味し、α−１，３−グルコシド結合のみからなるオリゴ糖の他、α−１，３−グルコシド結合とそれ以外の結合とからなるオリゴ糖も含む。具体的には、二糖であるニゲロース[Ｏ−α−Ｄ− グルコピラノシル−(１→３)-Ｏ−Ｄ−グルコピラノース]のほか、三糖類であるニゲロシルグルコース[Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル −(1→3)−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−(１→４)−Ｄ−グルコピラノース]などが例示できる。
【００１８】
本発明におけるα−グルコシダーゼは、微生物由来のものでα−グルカン、α−グルコオリゴ糖、グルコースから選ばれる少なくとも一種を含む糖液に作用して、コージオリゴ糖やニゲロオリゴ糖を含む糖質を生成する作用を示す酵素であればよく、特にパエシロマイセス属に属する真菌、中でもパエシロマイセス  ライラキナスＨＫＳ−１２４ （ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０６）の有するα−グルコシダーゼなどが挙げられる。同酵素の酵素化学的性質は以下のとおりである。
【００１９】
本酵素は基質の非還元末端のα−グルコシド結合をエキソ型に切断するα−グルコシダーゼで、α−１，４−グルコシド結合以外にα−１，２−グルコシド結合、α−１，３−グルコシド結合の加水分解を行う一方、糖供与体からのグルコース残基を糖受容体の非還元末端のグルコース残基の２、３、４位いずれかの水酸基に転移する糖転移反応も行う。また、高濃度のグルコース存在下において、加水分解の逆反応である糖縮合反応も行う。
【００２０】
α−グルコシル基が４位の水酸基に転移した転移生成物は、本酵素によって再び分解されるため、最終的に転移生成物としてα−１，２−グルコシド結合を有するコージオリゴ糖、α−１，３−グルコシド結合を有するニゲロオリゴ糖が蓄積してくる。
【００２１】
本酵素の加水分解反応の基質特異性を表１に示す。マルトースや、コージビオース、ニゲロースなどの二糖類、および、マルトトリオース、マルトペンタオースなどのマルトオリゴ糖、重合度の高い可溶性澱粉や、アミロースなどに作用し、グルコースを生成する。特にα−１，３−グルコシド結合を有するグルコ二糖類であるニゲロースが最も良好な基質である。グリコーゲンや、イソマルトース、パラニトロフェニルα−グルコシド、スクロースなどには作用しにくい。更に、α−シクロデキストリンや、トレハロース、パノースなどのオリゴ糖には全く作用しない。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
本酵素の触媒する転移反応における糖受容体としては、グルコースは勿論、マルトース、ニゲロース、コージビオース、トレハロース、イソマルトースなどのα−グルコ二糖類や、マルトトリオース、マルトテトラオースなどのα−グルコオリゴ糖、セロビオース、ラミナリビオース、ソホロース、ゲンチオビオースなどのβ−グルコ二糖類、スクロースなど、非還元末端にグルコース残基を有しているオリゴ糖が適している。
【００２４】
本酵素の至適ｐＨは図１、２に示したようにマルトース分解活性、糖転移活性ともｐＨ５付近（４０℃）と弱酸性側で、ｐH４−８まで安定（４０℃、１時間インキュベート）であった。
【００２５】
本酵素の至適温度は図３に示したように６５℃（ｐＨ５．５）で、６５℃までは、３０分間のインキュベーション後において５０％以上の残存活性を有する。
【００２６】
ゲルろ過クロマトグラフィー（Superdex 200HR ファルマシアバイオテク社製）により、標準タンパク質との相対溶出時間から分子量を推定した結果、本酵素の分子量は約５４,０００であった。また、ＳＤＳゲル電気泳動により、標準タンパク質との相対移動度から分子量を求めた値は約５０,０００であった。これらの結果より、本酵素は、モノマータンパク質であると推定される。
【００２７】
各金属イオン（Ｎａ+は５０ｍＭ、その他のイオンについては１ｍＭ）およびＥＤＴＡ（５ｍＭ）存在下でのマルトース分解活性に与える影響を調べた結果を表２に示す。本酵素は亜鉛イオンや、水銀イオンなどによりその活性を阻害される。ＥＤＴＡは本酵素のマルトース分解活性には影響を与えない。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
本酵素を等電点既知の標準タンパク質とともに等電点電気泳動（ファストシステム, ファルマシア  バイオテク（株））を行った結果、本酵素の等電点は約９．１であった。
【００３０】
本酵素のマルトースを基質とした加水分解活性は、以下のように測定した。
【００３１】
５ｍＭマルトース０．１ｍLに対して、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む酵素液０．１５ｍLを加え、５０℃で１０分間反応させた後、生成してきたグルコース量を、グルコースＢテストワコー（和光純薬工業製）にて、測定した。１分間に１μｍｏｌのマルトースを分解する酵素量を１Ｕと定義した。
【００３２】
また、本酵素のマルトースを基質とした転移反応は、転移反応によって生じた糖質（コージビオース、コージビオシルグルコース、ニゲロース、ニゲロシルグルコース）を、糖の還元末端を標識化するプレカラム誘導体化法であるＡＢＥＥ標識化法（S. Yasuno et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1944-1946, (1997)）により分析した。
具体的な分析方法は、以下のように行った。
【００３３】
２％マルトース０．５ｍLに対して、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む酵素液０．５ｍLを加え、５０℃、１時間反応させた。沸騰浴槽で１０分間処理することにより、酵素を失活させた後、本反応液より１０μＬ分取し、ＡＢＥＥ標識化キット（ホーネンコーポレーション社製）により、還元糖の標識化を行った。ＡＢＥＥ標識化された還元糖を含む反応液をＨＰＬＣ分析に供し、あらかじめ同条件で分析した、入手可能な標準糖のそれぞれの溶出時間と比較して、それぞれの糖質を同定した。
ＨＰＬＣ測定条件：カラム  ホーネンパック  Ｃ１８
カラム温度：      ３５℃
移動層組成：      １０．５％アセトニトリルを含む０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）
検出：            ＵＶ検出
流速：            １．０ｍL/分
【００３４】
本発明におけるα−グルコシダーゼの生産に用いられる微生物としては、α−グルカン、α−グルコオリゴ糖、グルコースから選ばれる少なくとも一種の糖質を基質としてコージオリゴ糖とニゲロオリゴ糖を含む糖質を産生すればよく、具体的にはパエシロマイセス属に属する真菌、特にパエシロマイセス  ライラキナスが挙げられる。本発明に使用できるパエシロマイセス  ライラキナスとしては、ＡＴＣＣなどに寄託されているＮＲＲＬ８９５株、ＡＴＣＣ２６８３９株、Ｄ２１８株などがあるが、特にオリゴ糖生産に適しているものとしては本発明者らが土壌より分離したパエシロマイセス  ライラキナスＨＫＳ−１２４（ＦＥＲＭＰ−１８４０６）株が挙げられる。
【００３５】
ＨＫＳ−１２４株の菌学的性質は以下に示すとおりである
生育可能培地：ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）、麦芽寒天、ツァペックー酵母エキス寒天（ＣＹＡ）培地において、生育はやや早く、すべての培地において、２５℃、２週間で直径６０ｍｍ以上に達する。
菌糸：菌糸は、最初白色で、直立に盛り上がる。培養開始一週間あたりから、分生子形成に伴い、紫色に変化する。
形態観察：生育ｐＨは４−１０で、最適ｐＨは中性付近、生育温度は、２０−３５℃で、最適生育温度は２０-３０℃である。
形態的特徴：ペニシラス様分生子形成構造が認められ、更にペニシリ様構造は不規則で、一部の分生子柄は柄中腹より分枝が観察される。
【００３６】
以上の形態学的特徴より本菌をパエシロマイセス属の一種と同定した。
【００３７】
更に、本菌株の２８ＳｒＤＮＡ塩基配列を決定し、類似の塩基配列をGenBankより検索した結果、パエシロマイセス  ライラキナス(Paecilomyces lilacinus)の塩基配列と一致した。以上の結果より、本菌株をパエシロマイセス  ライラキナスと同定し、パエシロマイセス  ライラキナスＨＫＳ−１２４株と命名した。
【００３８】
本菌は、平成１２年７月５日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０６として寄託されている。本発明で使用する微生物は野生株に限らず、上記野生株を紫外線、エックス線、放射線、各種薬品［NＴＧ(Ｎ-メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン)、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）等]などを用いる人工的変異手段で変異した変異株もコージオリゴ糖およびニゲロオリゴ糖を含む糖質の産生能を有する限り使用できる。
【００３９】
本酵素を産出する本菌株の培養に用いる培地は、微生物が生育可能で、本酵素を生成するものであればよく、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
【００４０】
培地中に添加する炭素源については、微生物が資化可能なものであればよく、例えばグルコースや澱粉およびその分解物が最も適しているが、それ以外にも、フルクトース、トレハロース、ラクトース、ショ糖、糖蜜なども利用できる。
窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸塩などの無機窒素化合物や、例えば尿素、酵母エキス、大豆ペプトン、カゼイン、ポリペプトン、麦芽エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素含有物などが用いられる。
また、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩などの無機塩がその他に適宜用いられる。
【００４１】
培養条件は微生物が生育し、本酵素が良好に生成する条件であればよく、通常、温度は１５℃から３５℃の範囲で、望ましくは２０℃から３０℃付近でおこなう。培養液のｐＨはｐＨ３．０−９．０の間にあれば敢えて調整する必要がない。培養中は、振とう、通気攪拌などで好気的に行うのが望ましい。培養時間は微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは、７２時間から、１５０時間である。このようにして培養を行った微生物は、遠心分離や、ろ紙、ガラスフィルターによるろ過法などで、菌体と培養液を分離回収する。
【００４２】
【発明の実施の形態】
本発明におけるコージオリゴ糖とニゲロオリゴ糖を含む糖質を産出するためには、このように培養した菌体をそのまま基質であるα−グルカン、α−グルコオリゴ糖、グルコースから選ばれる少なくとも一種に作用させてもよい。その場合、回収された菌体は、分離後直ちに使用しても良いし、−２０−−４０℃で冷凍保存後に、適時解凍し、使用することもできる。
また、以下に示すような手順によって当該酵素を抽出、精製した酵素を用いても良い。
【００４３】
コージオリゴ糖とニゲロオリゴ糖を含む糖質を産出する活性を有するα−グルコシダーゼは、本菌株の培養後期において菌体外の培養液、菌体内抽出液両方にその活性が確認される。しかし、より短期間の培養によって得られる菌体内部に、本目的を達するのに十分な活性が保持されているため、通常菌体内の酵素を用いることとする。
【００４４】
菌体内の酵素は、通常の超音波による破砕法、ガラスビーズなどによる機械的破砕法、フレンチプレスなどによる破砕法などを用いて菌体から抽出してもよいが、本酵素は菌体をｐＨ６．０−１０．０、望ましくはｐＨ７．０−９．０の弱アルカリ性の緩衝液に懸濁し、一晩５−１０℃の低温で放置することにより、酵素液として容易かつ、夾雑物質（タンパク、色素など）を含まない状態で菌体外に抽出することができる。その後ろ過または遠心分離により菌体残渣を除いて得られた菌体内酵素粗抽出液は、各菌体破砕法に比べ、比活性が高くそのままでも十分糖質合成に用いることが可能であるが、必要ならばこれを出発原料として、塩析、アルコール沈殿法、膜濃縮などの通常の手段で濃縮して粗酵素として用いても良いし、更にイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなど各種クロマトグラフィーを用いて精製した後、使用しても良い。本発明におけるコージオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖を含む糖質を産生する酵素の単離、精製の具体例を実施例１に示す。
【００４５】
このようにして菌体から取得したα−グルコシダーゼを、基質であるα−グルカン、α−グルコオリゴ糖、グルコースから選ばれる少なくとも一種に作用させることにより、本発明におけるオリゴ糖を取得することができる。
【００４６】
コージオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖を効率よく生産することのできる基質としてはマルトオリゴ糖、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトトリオース、ニゲロース、コージビオース、マルトースなどα−グルコオリゴ糖、澱粉、アミロース、アミロペクチン，グリコーゲン、粉飴などのα−グルカン、グルコースを使用することができる。
【００４７】
グルコースを基質として用いた場合、他の基質の場合と異なり，加水分解反応の逆反応である縮合反応によって，コージオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖を生産することができるが，その収率は転移反応に比べて低いため、望ましくは、経済性および水への溶解度の点からマルトースを用いるのがよい。
【００４８】
また、α−グルコシル基の受容体としては、非還元末端にグルコース残基を有していればよく、具体的にはグルコース、マルトトリオース、マルトース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、ニゲロース，ニゲロシルグルコース、ニゲロトリオース、コージビオース、コージビオシルグルコース、コージトリオース、セロビオース、ラミナリビオース、ソホロース、ゲンチオビオース、トレハロース、スクロースなどが挙げられる。
【００４９】
基質の濃度は、反応液中に溶解する濃度であればよく、マルトースの場合、１−８０％の範囲ならばよく、より効率よく糖質を得るためには、１0−５０％マルトースの条件で行うのが望ましい。具体的なオリゴ糖の製造方法は、実施例２，３に示す。
【００５０】
反応に用いられる温度としては酵素が反応進行中に安定である温度域ならばよく、３０―８０℃、望ましくは４０℃から７０℃で行うのが適当である。
反応に用いられるｐＨは、通常ｐＨ３．５−７．０、望ましくはｐＨ４．０−６．０で行うのが適当である。反応時間は、反応条件によって変化するが、本酵素は反応初期にはα−１，３−グルコシド結合をもつニゲロオリゴ糖を著量生成するので、ニゲロオリゴ糖を効率よく得る目的ならば反応時間は３−１２時間で終了させる。十分量のコージオリゴ糖を生成させるためには通常２４−１２４時間の反応時間が必要である。
【００５１】
反応に用いる酵素濃度は濃いほうが反応時間の短縮が図れて都合がよい。酵素濃度が薄いとコージオリゴ糖の収率が悪くなる。
具体的にはマルトース１ｇに対して１０Ｕ以上、望ましくは１５Ｕ以上の濃度が適当である。
通常このような条件において、糖固形分中に１０−３０％のニゲロオリゴ糖および１０−２０％のコージオリゴ糖が蓄積する。
こうして得られたコージオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖を含む糖質は、そのまま濃縮してシロップとして利用できるほか、含まれるグルコースを除去するため更に、活性炭カラム、ゲルろ過などの分子分画クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーを用いて、高濃度のオリゴ糖シロップとすることもできる。
【００５２】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００５３】
〔実施例１〕
パエシロマイセス  ライラキナスＨＫＳ−１２４株を、マルトース（５％）、ポリペプトン（１％）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2０（０．０１％）、ＫＣｌ（０．０１％）、Ｋ2ＨＰＯ4（０．０５％）を含む培地（１５０ｍL／５００ｍLフラスコ × ３０本）で、２５℃で、５日間振とう培養した。この培養液を遠心分離し、沈殿した菌体画分を５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で数回洗浄し、回収する。５Ｌの培養液より、湿重量約２００ｇの菌体を得た。
培養によって得られたパエシロマイセス  ライラキナスＨＫＳ−１２４株の菌体画分（２００ｇ）を５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で数回洗浄したのち、１０００ｍLの５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０）に十分懸濁し、５℃で、一晩放置する。その後、遠心分離で上清を回収し、菌体内粗酵素液（０．２Ｕ／ｍL）１０００ｍLを調製した。この方法により菌体内の酵素活性のほぼ９０％を、菌体外に抽出し、回収することができた。本粗酵素液を５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で平衡化したＳＰ−トヨパール６５０Ｍカラム（３０ｍｍ × １８０ｍｍ、東ソー株式会社製）にアプライし、ＮａＣｌ濃度を直線的に上昇させて目的タンパク質の溶出を行った。
【００５４】
このようにして溶出させた酵素活性画分を回収（３８０ｍL、０．３Ｕ／ｍL）し、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で透析を行った。次いで、回収された溶出液に、１．５Ｍになるよう硫酸アンモニウムを加え、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で緩衝化したブチルトヨパールカラム（１８ｍｍ × ２５０ｍｍ、東ソー株式会社製）にアプライし、硫酸アンモニウム濃度を、１．５Ｍから０Ｍに直線的に減少させて溶出してきたマルトース分解活性画分（２２ｍL １．６Ｕ／ｍL）を回収した。回収された活性画分は、限外ろ過により濃縮し、セファクリルＳ−１００（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（３０ｍｍ × １００ｃｍ）を用いて、溶出した活性画分を回収し、電気泳動的に単一な菌体内酵素標品を得た。
活性の回収率は１２％で比活性は８０倍に向上した。
【００５５】
〔実施例２〕
実施例１のようにして調製した菌体内精製酵素０．５ｍL（２０Ｕ/ｍL）を、４５％マルトース１ｍLに作用させ（最終濃度３０％）、５０℃で反応を開始した。、反応開始３時間後に沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。この反応液中の還元糖をＡＢＥＥ標識化キットを用いて標識化し、転移生成物の組成を逆層ＨＰＬＣで分析した。濃度既知の標準還元糖を同様にＡＢＥＥ標識化し、その溶出時間および、ピーク面積から、各成分を定量した。
その結果を表３に示す。反応開始後３時間で全糖固形分中ニゲロオリゴ糖が２６．９％、コージオリゴ糖が７．６％得られた。ニゲロオリゴ糖のうち二糖類であるニゲロースが１２．２％、三糖類であるニゲロシルグルコースが１４．７％、また、コージオリゴ糖のうち二糖類であるコージビオースが２．５％、三糖類であるコージビオシルグルコースが５．１％得られた。このときのオリゴ糖のクロマトグラムを図４に示した。
【００５６】
〔実施例３〕
実施例１のようにして調製した菌体内精製酵素０．５ｍL（２０Ｕ/ｍL）を、４５％マルトース１ｍLに作用させ（最終濃度３０％）、５０℃で反応を開始した。反応開始７８時間後に沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。この反応液中の還元糖をＡＢＥＥ標識化キットを用いて標識化し、転移生成物の組成を逆相ＨＰＬＣで分析した。濃度既知の標準還元糖を同様にＡＢＥＥ標識化し、その溶出時間および、ピーク面積から、各成分を定量した。
その結果を表３に示す。反応開始後７８時間で全糖固形分中ニゲロオリゴ糖が１３．２％、コージオリゴ糖が１５．７％得られた。ニゲロオリゴ糖のうち二糖類であるニゲロースが１１．９％、三糖類であるニゲロシルグルコースが１．３％、また、コージオリゴ糖のうち二糖類であるコージビオースが１３．９％、三糖類であるコージビオシルグルコースが１．８％得られた。このときのオリゴ糖のクロマトグラムを図５に示した。
【００５７】
〔比較例１〕
用いる菌株をパエシロマイセス  ライラキナスＨＫＳ−１２４株の代わりに、パエシロマイセス  ライラキナスＤ２１８株に置き換えて、実施例１のように、粗酵素液を調整した。その粗酵素液（２０Ｕ／ｍＬ） を用いて実施例３と同様に、４５％マルト−スに作用させ、転移生成物の組成を逆相ＨＰＬＣで分析した。その結果を表３に示す。反応開始後７８時間で、全糖固形分中ニゲロオリゴ糖が６．２％、コージオリゴ糖が５．３％得られた。ニゲロオリゴ糖のうち二糖類であるニゲロースが５．８％、三糖類であるニゲロシルグルコースが０．４％、また、コージオリゴ糖のうち二糖類であるコージビオースが４．５％、三糖類であるコージビオシルグルコースが０．８％得られた。
【００５８】
〔実施例４〕
実施例１のようにして調製した菌体内精製酵素０．３ｍL（２０Ｕ／ｍＬ） を、８０％グルコース０．５ｍLに作用させ（最終濃度５０％）、５０℃で反応を開始した。反応開始７２時間後に沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。この反応液中の還元糖をＡＢＥＥ標識化キットを用いて標識化し、転移生成物の組成を逆相ＨＰＬＣで分析した。濃度既知の標準還元糖を同様にＡＢＥＥ標識化し、その溶出時間およびピーク面積から、各成分を定量した。
その結果を表３に示す。グルコースを基質とした縮合反応においても、転移反応と比較すると収率は低いが、ニゲロース、コージビオースを得ることができる
。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
〔実施例５〕
実施例１のようにして調製した酵素液１ｍLを、４５％マルトース２ｍLに作用させ（最終濃度３０％）、５０℃で反応を開始した。経時的に１００μＬ分取し、沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。この反応液中の還元糖をＡＢＥＥ標識化キットを用いて標識化し、転移生成物の組成を逆相ＨＰＬＣで分析した。濃度既知の標準還元糖を同様にＡＢＥＥ標識化し、その溶出時間および、ピーク面積と比較した結果、図６に示したように反応開始直後は、基質であるマルトースにグルコースがα−１，２、α−１，３結合で転移したコージビオシルグルコースやニゲロシルグルコースなどの三糖類が主に生成してくるが、反応開始後２０時間あたりで、これら三糖類は急激に減少する。それに伴いグルコースを糖受容体としてα−１，２、α−１，３結合したコージビオースとニゲロースが主な転移生成物として蓄積してくることが分かる。
【００６１】
【発明の効果】
以上のように、本発明によって開示されたパエシロマイセス属由来の菌が有する新規なα−グルコシダーゼをα−グルカン、α−グルコオリゴ糖、グルコースから選ばれる少なくとも一種を含む糖液に作用させることにより、機能性を期待されるオリゴ糖であるコージオリゴ糖とニゲロオリゴ糖を含む糖質を効率よく産生することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】マルトースを基質としたときの本酵素のｐＨ安定性およびマルトース分解活性におよぼすｐＨの影響を調べた結果を示すグラフである。
【図２】マルトースを基質としたときに本酵素における転移活性（ニゲロシルグルコースの生成量）とｐＨの影響を調べた結果を示すグラフである。
【図３】本酵素の温度安定性、およびマルトースを基質としたときのマルトース分解活性の至適温度を調べた結果を示すグラフである。。
【図４】３０％マルトース溶液と本酵素を５０℃で３時間作用させたときの転移生成物をＡＢＥＥ標識した後ＨＰＬＣで分析したクロマトグラムを示す。
【図５】３０％マルトース溶液と本酵素を５０℃で７８時間作用させたときの転移生成物をＡＢＥＥ標識した後ＨＰＬＣで分析したクロマトグラムを示す。
【図６】３０％マルトース溶液と本酵素を５０℃で作用させたときの転移生成物組成の経時変化をそれぞれの時間の転移生成物をＡＢＥＥ標識した後分析した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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