(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｙｒ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物及びＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つを有効成分として含むアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項２】
Ｔｙｒ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物及びＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つを、無機酸若しくは有機酸若しくは無機塩基若しくは有機塩基とで形成してなる塩とし、有効成分として含むアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項３】
サメ軟骨又はその処理物を、蛋白質分解酵素で分解し、その分解液から得られるＴｙｒ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物及びＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列からなるペプチド化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つを有効成分として含むアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項４】
サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素と反応させて分解させ、分解液から分離処理することを特徴とするＴｙｒ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物及びＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列からなるペプチド化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つを有効成分として含むアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血圧の上昇を調節できるとされるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物及びそれを含有する組成物に関するもので、高血圧症を予防したり治療するための医薬品や医薬部外品や機能性食品等に広く利用できるものである。
【背景技術】
【０００２】
突然死を引き起こす可能性のある心筋梗塞などの冠動脈疾患の危険因子は、高血圧症、高脂血症、耐糖能低下、肥満の４つであり、死の四重奏とも言われている。当該危険因子の内の１つである高血圧症は、日本高血圧学会によれば我が国では３３００万人の患者がいるとされている。高血圧症は治療を受けずに放置しておくと、重症でない限り多くの場合無症状で進行し死に至る事が少なくない事から、サイレントキラ−と呼ばれている。このような高血圧症を改善する要請が強いため、様々な降圧剤や血圧を調節する機能性食品の開発が進められている。
【０００３】
生体において血圧を調節するメカニズムの１つには、昇圧系であるレニン−アンジオテンシン系と、降圧系であるカリクレイン−キニン系がある。前者のレニン−アンジオテンシン系では、酵素レニンが腎臓の旁糸球体細胞から循環血液中に分泌され、肝臓で生合成され血液中に存在する基質アンジオテンシノ−ゲンに働いてアンジオテンシンＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を生成する。このアンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）に変換する酵素は、主として血管内皮細胞や肺、腎臓近位尿細管に存在するアンジオテンシンＩ変換酵素である。このようにして生じたアンジオテンシンＩＩは、血管平滑筋を収縮させる作用がある。また、当該アンジオテンシンＩＩは副腎皮質に作用してアルドステロンの生成と分泌を促進すると共に、腎臓近位尿細管に働いて腎糸球体で濾過されたナトリウムの再吸収を高める作用がある。その結果、血圧は上昇する。
【０００４】
一方、後者のカリクレイン−キニン系では、酵素カリクレインが基質キニノ−ゲンに作用してキニンを生じる。そのキニンは血管平滑筋を拡張させて血圧を下げる働きがあるが、アンジオテンシンＩ変換酵素は当該キニンを分解する事が知られている。この様にアンジオテンシンＩ変換酵素は、昇圧系であるレニン−アンジオテンシン系の活性化と、降圧系であるカリクレイン−キニン系の不活性化を同時に行う作用を有しており、結果として血圧を上昇させる作用がある。従って、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を阻害する物質は、血圧の上昇を調節する事が期待できるので、各方面でこれに着目した医薬品及び機能性食品の開発が行われている。
【０００５】
アンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質としては、１９７７年にOndettiらが発表したカプトプリル（Ｄ−３−メルカプト−２−メチルプロパノイル−Ｌ−プロリン）に代表される合成化合物が医薬品として実用化されている。又その他、近年、種々の食品中から多数のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドが見出され、これらの内、牛乳カゼイン、発酵乳、魚肉由来のペプチドを添加した食品が特定保健用食品として実用化されている（特許文献１〜６）。
【特許文献１】特開昭５８−１０９４２５号公報（特公昭６０−２３０８５号）発明の名称「アンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤」（牛由来カゼインから得られた。）
【特許文献２】特開昭５９−４４３２３号公報（特公昭５９−４４３２４号）発明の名称「アンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤」（牛由来カゼインから得られた。）
【特許文献３】特開昭５９−４４３２４号公報（特公昭６１−４４３２４号）発明の名称「アンジオテンシン変換酵素阻害剤」（牛由来カゼインから得られた。）
【特許文献４】特開昭６１−３６２２６公報（特公昭６１−５１５６２号）発明の名称「アンジオテンシン変換酵素阻害剤」（牛由来カゼインから得られた。）
【特許文献５】特開昭６１−３６２２７公報（特公昭６１−５１５６４号）発明の名称「アンジオテンシン変換酵素阻害剤」（牛由来カゼインから得られた。）
【特許文献６】特開平５−２７１２９７号公報、発明の名称「新規ペプチドα−１０００」魚肉由来の新規ペプチドα−１０００、新規ペプチドα−１０００を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤、特定保健用食品、その製造方法。
【０００６】
上述のようにアンジオテンシン変換酵素阻害物質は既に多数報告されているが、医薬品にあっては合成法で作られているため高価である。又、合成法で作られている当該アンジオテンシン変換酵素阻害物質は、強力な降圧作用を有するものの用量が不適切であると腎機能障害や低血圧をもたらす事から、医師の管理下において慎重に使用する事が求められている。
【０００７】
一方、食品由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドは数多く知られているが、これらの中で実用化されているものは、上述の如くごく僅かである。その理由としては、経口摂取時の作用効果が弱かったり、味、臭い、色等にそれぞれ特徴があって、実用に適していない事が多い等が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、血圧の上昇を調節できる食品由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質ペプチドを見つけ出すべく鋭意研究を進めたところ、サメ軟骨を蛋白質分解酵素で処理した蛋白質分解酵素処理物がアンジオテンシンＩ変換酵素を強く阻害することに気付き、当該蛋白質分解酵素処理物中に７種類の強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドを見出した。
【０００９】
それは、下記（１）乃至（７）のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物であった。
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ（１）、
Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（２）、
Ｐｈｅ−Ａｌａ（３）、
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（４）、
Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（５）、
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（６）、
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（７）。
【００１０】
上記７種類のアミノ酸配列で示されるペプチド化合物のうち、特に（５）のＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙは、文献未記載の新規なペプチド化合物である。その他の６種類のペプチド化合物は、蛋白質分解酵素処理法やペプチド合成や遺伝子工学手法等により得られることが報告されているが、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（２）とＰｈｅ−Ａｌａ（３）を除いて、それらにアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性があるとの報告はされていない。
【００１１】
そこで本発明者らは、これらサメ軟骨由来の７種類のアミノ酸配列で示されるペプチド化合物について、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を測定したところ、それぞれに血管内への吸収性、安定性、安全性が高い強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有することを見出した。そこで、発明者らは、サメ軟骨由来の７種類のアミノ酸配列で示されるペプチド化合物（１）〜（７）のうちＰｈｅ−Ｔｙｒ（２）、Ｐｈｅ−Ａｌａ（３）、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（６）及びＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（７）を除いた、新たに見出した３種類のサメ軟骨由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド化合物を利用して、高血圧症を改善したり治療するためのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤や医薬品（医薬原料を含む）や医薬部外品や食品を開発し提供せんとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記課題を解決する為に、サメ軟骨の蛋白質分解酵素処理物中に存在する７種の強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド化合物を見出したが、そのうちの３種のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド化合物を利用してアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤とその製造方法の発明を完成するに至ったものである。
【００１３】
本発明は、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ（１）で表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（４）で表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（５）で表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、及びその薬学的に許容される塩の少なくとも１つを有効成分として含有する事を特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤、及びその製造方法に関する。
【００１４】
尚、本明細書中で、Ｔｙｒはタイロシン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ａｌａはアラニン、Ｌｅｕはロイシン、Ｖａｌはバリン、Ｇｌｙはグリシン、Ｉｌｅはイソロイシンを意味し、その他のアミノ酸残基を表す各記号もアミノ酸化学における慣用の表示法に基づくものである。又、これらアミノ酸は特に表記しない限りは何れもＬ体である。
【００１５】
即ち、特許を受けようとする第１発明は、下記（１）、（４）及び（５）の少なくとも１種以上のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物を有効成分として含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤である。
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ（１）、
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（４）、
Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（５）。
【００１６】
当該３種類のアミノ酸配列で示されるペプチド化合物は、それぞれに血管内への吸収性、安定性、安全性が高い強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有している。従って、第１発明に係るアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の１種でもよいし、２種以上を適宜組み合せたものであってもよい。
【００１７】
また、当該３種類のアミノ酸配列で示されるペプチド化合物は、当該化合物と同じアミノ酸配列を有する蛋白質から上記と同様の蛋白質分解酵素処理にても得られるが、これらのペプチドはアミノ酸を段階的に導入する一般的な有機化学的液相又は固相法によるペプチド合成や遺伝子工学手法等によっても得ることができる。
【００１８】
本発明において用いられる蛋白質分解酵素としては、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等）の産生する酵素、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｎｓ等）の産生する酵素、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属（例えばＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ等）の産生する酵素、ペプシン、パンクレアチン、パパイン等が挙げられる。これらの酵素は単独、又は２種以上を組み合わせてもよい。
【００１９】
特許を受けようとする第２発明は、Ｔｙｒ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物及びＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物からなる群より選ばれる少なくとも１を、無機酸若しくは有機酸若しくは無機塩基若しくは有機塩基とで形成してなる塩とし、有効成分として含むアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤である。
【００２０】
第２発明に記載するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、第１発明に記載するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の群より選ばれる少なくとも１つと、無機酸若しくは有機酸又は無機塩基若しくは有機塩基とで形成してなる薬学的に許容される塩を有効成分として含むものである。
当該第２発明に記載する有効成分は、由来を問わずに得られた（蛋白質分解酵素処理やペプチド合成や遺伝子工学手法で得られるものを含む。）アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物とその薬学的に許容される塩である。当該ペプチド化合物には、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有することを、新たに見出し、本発明を完成したものである。
【００２１】
本発明で得られるペプチド化合物は必要に応じて無機酸若しくは有機酸との塩や無機塩基若しくは有機塩基との塩を形成させる事ができるが、薬学的に許容される塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、更にはシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、又はフマル酸等のジカルボン酸との塩、更に、酢酸、プロピオン酸、又は酪酸等のモノカルボン酸との塩等を挙げる事ができる。又、本発明で得られるペプチド化合物の塩の形成に適した無機塩基は、例えば、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩等である。有機塩基との塩としては、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミンの様なモノ−、ジ−及びトリ−アルキルアミン塩、モノ−、ジ−及びトリ−ヒドロキシアルキルアミン塩、グアニジン塩、Ｎ−メチルグルコサミン塩等を挙げる事ができる。
【００２２】
特許を受けようとする第３発明は、サメ軟骨又はその処理物を、蛋白質分解酵素で分解し、その分解液から得られるＴｙｒ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物及びＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列からなるペプチド化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つを有効成分として含むアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤である。
【００２３】
当該第３発明は、サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素で分解し、分解液から得られる３種のアミノ酸配列で示されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の群より選ばれる少なくとも１つを有効成分として含むアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤である。
【００２４】
当該第３発明に係るアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤の有効成分であるサメ軟骨由来の３種のペプチド化合物は、それぞれ強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有しているので、その１種でもよいし、２種以上を適宜組合せたものであってもよいこと勿論である。
【００２５】
ここで当該ペプチド化合物を得るサメの種類は特に限定されないが、ヨシキリザメ(Ｐｒｉｏｎａｃｅ  ｇｌａｕｃａ)、ネズミザメ（Ｌａｍｎａ  ｄｉｔｒｏｐｉｓ）、ネコザメ（Ｈｅｔｅｒｏｄｏｎｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アオザメ（Ｉｓｕｒｕｓ  ｏｘｙｒｉｎｃｈｕｓ）、アカシュモクザメ（Ｓｐｈｙｒｎａ  ｌｅｗｉｎｉ）、メジロザメ（Ｃａｒｃｈａｒｈｉｎｕｓ  ｐｌｕｍｂｅｕｓ）、ホシザメ（Ｍｕｓｔｅｌｕｓ  ｍａｎａｚｏ）、マオナガ（Ａｌｏｐｉａｓ  ｖａｌｐｉｎｕｓ）、ヒラガシラ（Ｒｈｉｚｏｐｒｉｏｎｏｄｏｎ  ａｃｕｔｕｓ）、フジクジラ（Ｅｔｍｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｕｃｉｆｅｒ）等が好適に用いられる。
【００２６】
また、当該第３発明における蛋白質分解酵素は、第１発明の説明に記載したのと同様の蛋白質分解酵素であり、これらの酵素は単独、又は２種以上を組み合わせてもよいこと勿論である。
【００２７】
Ｔｙｒ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物及びＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙで示されるアミノ酸配列からなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物、又はそれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１つを有効成分として医薬品とすることができる。
【００２８】
前記アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有する３種類のペプチド化合物やその薬学的に許容される塩は、強い血圧降下作用、ブラジキニン不活性化抑制作用を有するので、高血圧症を改善したり治療するための医薬品として利用できるものである。
【００２９】
本発明で用いられているペプチド化合物は必要に応じて適宜賦形剤等の添加剤と混合して例えば注射剤、経口用液剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、坐剤、軟膏、点鼻剤、貼付剤等の形態で製剤化する事ができる。
【００３０】
上記の各種製剤で用いられる添加剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、乳糖、デキストリン、デンプン類、メチルセルロース、脂肪酸グリセリド類、水、プロピレングリコール、マクロゴ−ル類、アルコ−ル、結晶セルロ−ス、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロ−ス類、ポピドン、ポリビニルアルコール、ステアリン酸カルシウム等を挙げる事ができる。この際、必要に応じて、着色剤、安定化剤、抗酸化剤、防腐剤、pH調節剤、等張化剤、溶解補助剤及び／又は無痛化剤等を添加する事ができる。顆粒剤、錠剤、又はカプセル剤は、コーティング基剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等によってコ−ティングする事もできる。これらの製剤は本発明で得られるペプチド化合物を０．０１％以上、好ましくは０．１〜７０％の割合で含有する事ができる。
【００３１】
製剤の調製に際しては必要に応じメント−ル、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いる事ができる。更に、本発明で得られるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤は治療上有用な他の成分、例えばカプトプリル、エナラプリル等の公知の降圧剤を含有、又は併用する事もできる。
【００３２】
本発明で用いられているペプチド化合物の少なくとも１つを有効成分として含有する医薬品は、ヒトを含めた哺乳動物に経口的又は非経口的（例えば経皮、静脈内、腹腔内等）に投与される。投与量は動物種、対象となる患者の人種、性別、症状、体重、年齢、血圧の程度、投与方法等によって異なり一概には言えないが、一般的なヒトの成人に経口投与する場合は、通常、１日につき体重１kgあたり０．１〜２００ｍｇ、好ましくは１〜１５０ｍｇであり、これを通常１日１回又は２〜３回に分けて投与する。しかしながらその投与量は症状の程度に応じ適宜選択する事ができる。
【００３３】
Ｔｙｒ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物及びＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙで示されるアミノ酸配列からなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物、又はそれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１つを含有させて医薬部外品とすることができる。
【００３４】
Ｔｙｒ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物及びＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙで示されるアミノ酸配列からなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物、又はそれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１つを食品に用いることができる。
【００３５】
本発明に用いる３種のペプチド化合物は、優れたアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有し、血圧降下作用、ブラジキニン不活性化抑制作用を示す。しかも本発明で得られる３種のペプチド化合物は臭い、味、色に特異な厭味が認められない事から経口摂取が容易である。その為、本発明で得られるペプチド化合物、あるいはその塩を、医薬品としてだけでなく、例えば、ゼリ−、飴、顆粒菓、錠菓、飲料、ス−プ、麺、煎餅、和菓子、洋菓子、冷菓、焼き菓子等の食品に配合、添加し提供する事ができるし、化粧品又は医薬部外品として提供することもできる。
【００３６】
特許を受けようとする第４発明は、サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素と反応させて分解させ、分解液から分離処理することを特徴とするＴｙｒ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物及びＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列からなるペプチド化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つを有効成分として含むアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤の製造方法である。
【００３７】
本発明に用いられるペプチド化合物を、サメ軟骨又はその処理物より製造する方法を具体的に説明する。サメ軟骨又はその処理物を蛋白質分解酵素にて分解する方法は、常法に従って行う。例えば所望によりサメ軟骨を粉砕後、精製水を加え、必要に応じてｐＨと温度を至適値に調整し、適当な蛋白質分解酵素を添加してインキュベ−トする。次いで必要に応じて中和した後、酵素を失活させて酵素分解液を得る。分解液を例えば濾紙及び／又は濾過助剤等を用いて濾過する事によって不溶物を除去し、得られた濾液を限外濾過等で処理して分子量５〜１万以下の粗ペプチド画分を得る。得られた粗ペプチド画分は必要に応じて活性炭処理、濾過後濃縮して粗ペプチド混合物を得る。粗ペプチド混合物は所望により液液分配等を経てカラムクロマトグラフィ−にて分画し、優れたアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物を得ることができる。本発明は、このようにして得たＴｙｒ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列で示されるペプチド化合物及びＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列からなるペプチド化合物またはそれらの塩からなる群より選ばれる１種でもよいし、２種以上を適宜組み合せたものを有効成分として含ませるようにしたアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤の製造方法である。
【発明の効果】
【００３８】
本発明に用いるペプチド化合物は、強いアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有し、強い血圧降下作用、ブラジキニン不活性化抑制作用を示す。従って本発明は、例えば本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、治療剤、これら疾患の診断薬、各種病態で用いられる降圧剤、心筋梗塞の減少、うっ血性心不全における病態の改善剤等として有用である。
【００３９】
また、本発明で用いられるペプチド化合物は、臭い、味、色に特異な厭味が認められない事から経口摂取が容易である。その為、本発明で得られるペプチド化合物、あるいは当該化合物を含有する各種製剤を、例えば、ゼリ−、飴、顆粒菓、錠菓、飲料、ス−プ、麺、煎餅、和菓子、洋菓子、冷菓、焼き菓子等の食品に配合、添加し提供する事ができる。また上記の様な有用な作用を有する健康食品や特定保健用食品、機能性食品としての利用が可能である。更に、化粧品や医薬部外品としても提供することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下、本発明の実施例について詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではないこと勿論である。
【００４１】
（実施例１）
＜製造例１＞アンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド化合物の製造
ヨシキリザメ（Ｐｒｉｏｎａｃｅ  ｇｌａｕｃａ）軟骨３kgを粉砕、精製水９kgを加え５５℃に加温した後、パパイン（Ｃａｒｉｃａ  Ｐａｐａｙａ）７．５gを添加して１４時間攪拌し酵素分解反応を行った。反応液を９５℃に加温して酵素活性を失活させ、冷却後、中間孔径７ミクロンのセライトを用いて濾過した。濾液を限外濾過膜（ロミコンＨＦ１．０−４３−ＰＭ５０）を透過させて分子量５万以上の画分を除いた後、噴霧乾燥してアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド混合物２６０ｇを得た。
【００４２】
上記の方法により得たアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド混合物粗体を下記条件でＨＰＬＣ分析したところ図７に示すようなクロマトグラムを得た。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム          Ｗａｔｅｒｓ
μＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ  Ｃ１８  ３．９×１５０ｍｍ
カラム温度      ４０℃
移動相Ａ        Ｈ2Ｏ(０.１ＴＦＡ含有)
移動相Ｂ        アセトニトリル(０．１ＴＦＡ含有)
グラジエント    ０〜６０分にかけてＡ液５％からＢ液４０％へのリニアグラジェント６０〜７５分にかけてＢ液４０％
分析時間        ７５分
流量            ０．４ｍｌ／ｍｉｎ
注入量          １５μL
検出            ＵＶ２２０nm
【００４３】
その結果、図７に示すように、サメ軟骨を蛋白質分解酵素で処理した蛋白質分解酵素処理物から得たアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド混合物粗体中に７種類の強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドが含まれていることを確認した。
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ（１）、
Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（２）、
Ｐｈｅ−Ａｌａ（３）、
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（４）、
Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（５）、
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（６）、
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（７）。
【００４４】
そこで、前記ペプチド混合物粗体中に含有している７種類の強力なアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドの夫々を分離処理することとした。
【００４５】
まず、上記ペプチド混合物６０．０ｇを水１２００ｍＬに溶解させ１Ｍ塩酸にてｐＨを２．０に調整した。この水溶液をｎ−ブタノ−ル１２００ｍＬで抽出し、水層を更にｎ−ブタノ−ル６００ｍＬで２回抽出した。ｎ−ブタノ−ル層を減圧下濃縮して抽出物１０．３ｇを得た。
【００４６】
この抽出物５．７８ｇを
シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（富士シリシア化学、ＢＷ−８２０ＭＨ、展開溶媒：ｎ−ブタノ−ル−ピリジン−水−酢酸１０：１：２：１）、
シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（ＢＷ−８２０ＭＨ、展開溶媒：エタノ−ル−水１０：１）、
イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィ−（アルドリッチ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＣＧ−５０、展開溶媒：メタノ−ル）、
シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（関東化学、シリカゲル６０Ｎ  フラッシュクロマトグラフィ−用、展開溶媒：ｎ−ブタノ−ル−エタノ−ル−クロロホルム−５％  アンモニア水６：４：２：１）
にて分画し、高いアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を示す画分Ａ：４５ｍｇ及び画分Ｂ：３０ｍｇを得た。
【００４７】
画分Ａ：２９ｍｇを、５％塩化水素−メタノ−ル０．８７ｍＬに溶解し、室温にて２０時間静置した後、減圧下濃縮乾固して、残留物を３２ｍｇ得た。
【００４８】
これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（ＢＷ−８２０ＭＨ、展開溶媒：ｎ−ブタノール−エタノール−クロロホルム−水８：１：２：１）にて分離し、画分Ａ２：６．６ｍｇを得た。画分Ａ２：４．３ｍｇを水０．２２ｍＬに溶解した後、炭酸水素ナトリウム４．５ｍｇを加えた。これにベンジルオキシカルボニル（以下Zと略記する）クロリド３.８μLのテトラヒドロフラン溶液４３μLを滴加し、室温にて６時間攪拌後、テトラヒドロフランを留去した。酢酸エチル０.２mLで２回抽出し、合わせた有機層を減圧下濃縮乾固して残留物を６.５mg得た。
【００４９】
これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（BW−８２０MH、展開溶媒：トルエン−酢酸エチル２:１及び５:１）にて分離し画分Ａ３：０.８ｍｇを得た。製造例４に記載の合成化合物と1Ｈ−ＮＭＲを比較した結果、画分Ａ３の構造をＺ−Ｔｙｒ(Ｚ)−Ｐｈｅ−メチルエステル（以下、ＯＭｅと略記する）と確定した。当該画分Ａ３から一般的有機化学手法によりＴｙｒ−Ｐｈｅを得る事ができる。このＴｙｒ−Ｐｈｅは、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ(１９８０),６２５(２),２６６−２７３に記載されたペプチド化合物と同一である事が判明したが、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性は報告されていない。
【００５０】
（実施例２）
次に、画分Ｂ：２３ｍｇを５％塩化水素−メタノ−ル０．７０ｍＬに溶解し、室温にて１６時間静置したのち、減圧下濃縮乾固して、残留物を２８ｍｇ得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（ＢＷ−８２０ＭＨ、展開溶媒：ｎ−ブタノール−エタノール−クロロホルム−水８:１:２:１）にて分離し、画分Ｂ２：４.６ｍｇ、Ｂ３：６.１ｍｇを得た。画分Ｂ２：３.５ｍｇを水０.２５ｍＬに溶解したのち、炭酸水素ナトリウム７.３ｍｇを加えた。これにZクロリド６.２μLのテトラヒドロフラン溶液３１μLを滴加し、室温にて５時間攪拌した後、テトラヒドロフランを留去した。その後、酢酸エチル０.３ｍＬで２回抽出し、合わせた有機層を減圧下濃縮乾固して残留物を５.８ｍｇ得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（ＢＷ−８２０ＭＨ、展開溶媒：トルエン−酢酸エチル１：１）にて分離し、画分Ｂ２１：０．４ｍｇを得た。当該合成化合物と1Ｈ−ＮＭＲを比較した結果、画分Ｂ２１の構造をＺ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅと確定した。画分Ｂ２１から一般的有機化学手法によりＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙを得る事ができる。Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙは文献未記載の新規ペプチド化合物である。
【００５１】
（参考例１）
次に、画分Ｂ３：５．１ｍｇを水０．２５ｍＬに溶解したのち、炭酸水素ナトリウム５.４ｍｇを加えた。これにＺクロリド４.６μLのテトラヒドロフラン溶液２５μLを滴加し、室温にて４時間攪拌した後、テトラヒドロフランを留去した。その後、酢酸エチル０．２ｍＬで２回抽出し、合わせた有機層を減圧下濃縮乾固して残留物を７.０ｍｇ得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（ＢＷ−８２０ＭＨ、展開溶媒：トルエン−酢酸エチル１：１→トルエン−酢酸エチル１:３）にて分離し、画分Ｂ３１：０.７ｍｇ、画分Ｂ３２：１.０ｍｇを得た。製造例５に記載の合成化合物と1Ｈ−ＮＭＲを比較した結果、画分Ｂ３１の構造をＺ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯＭｅと確定した。当該画分Ｂ３１から一般的有機化学手法によりＰｈｅ−Ａｌａを得る事ができる。当該Ｐｈｅ−ＡｌａはＳｃｉｅｎｃｅ，(１９８１)２１２(４４９９),１１５３−１１５５に記載されたペプチド化合物と同一である事が判明したが、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性は報告されていない。
【００５２】
（実施例３）
また、前記の方法で得た画分Ｂ３２の構造をＺ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＭｅと確定した。当該画分Ｂ３２から一般的有機化学手法によりＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを得る事ができる。このＬｅｕ−Ｖａｌ−ＧｌｙはＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ(１９８５),１６１(４),８０５−８１５に記載されたペプチド化合物と同一である事が判明したが、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性は報告されていない。
【００５３】
（実施例４）
上記と同様の方法により、画分Ａと画分Ｂとの混合物０.１２ｇを得た。これを５％塩化水素−メタノ−ル３.６ｍＬに溶解し、室温にて２４時間静置した後、減圧下濃縮乾固して、残留物を０.１３ｇ得た。これを３３%ジオキサン水４.０ｍＬに溶解し、炭酸水素ナトリウム０.１１ｇとZクロリド９２μLを加えて室温にて１６時間攪拌した。溶媒を取り除き残留物を９５ｍｇ得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（関東化学、シリカゲル６０Ｎ  フラッシュクロマトグラフィ−用、展開溶媒：トルエン−酢酸エチル２:１→トルエン−酢酸エチル１:３→酢酸エチル→メタノール）にて分離し、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ(Ｚ)−ＯＭｅとＺ−Ｔｙｒ(Ｚ)−Ｐｈｅ−ＯＭｅの混合物１０ｍｇ、及びＺ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＯＭｅとＺ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの混合物２.３ｍｇを得た。尚、これらの構造は製造例３及び製造例４に記載の合成化合物と1Ｈ−ＮＭＲを比較し確定した。これらから、一般的有機化学手法によりそれぞれＰｈｅ−Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅを得る事ができる。Ｐｈｅ−ＴｙｒはＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(１９９８),９(７),４１５−４１９にニンニク由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドとして報告されている化合物と同一である事が判明した。
【００５４】
（参考例２）
アンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド混合物粗体を下記条件でＨＰＬＣ分析したところ図７のクロマトグラムを得た。そこで、ＨＰＬＣ条件にて、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌを分取したうえ、これを製造法８で合成した表品と比較して、その構造を決定した。しかるにこのＬｅｕ−Ｇｌｙ−ＶａｌについてアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性は報告されていない。
【００５５】
（参考例３）
＜製造例２＞Ｐｈｅ−Ｔｙｒの合成
Ｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ  ３０mgをジオキサン１．２ｍＬに溶解し、水０．６ｍＬを加えた。１０％パラジウム−炭素６ｍｇを加えた後、水素雰囲気下４時間攪拌した。綿栓濾過にて触媒を取り除いた後、濾液を減圧下で濃縮乾固して残留物を２４ｍｇ得た。これをＧ−２５カラムクロマトグラフィ−（１.２ｇ、展開溶媒：水−酢酸２０:１、１分画０．３ｍＬ）にて精製して、Ｐｈｅ−Ｔｙｒを１７ｍｇ得た（収率８１%）。
【００５６】
（参考例４）
＜製造例３＞Ｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ(Z)−ＯＭｅの合成
Ｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ  １０ｍｇを５％塩化水素メタノール溶液０．５０ｍＬに溶解し、室温にて２時間静置した後、減圧下濃縮乾固してＺ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＯＭｅを１０ｍｇ得た（収率定量的）。Ｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＯＭｅ  １０ｍｇをテトラヒドロフラン０.５０ｍＬに溶解し、０℃にてトリエチルアミン７μLとZクロリド６μLを加えて、室温にて３０分間攪拌した。減圧下で濃縮してテトラヒドロフランを留去した後、酢酸エチル２ｍＬ、水０.５ｍＬ、飽和硫酸水素カリウム水溶液０.２ｍＬを加えて、有機層を分離した。水層を酢酸エチル１ｍＬで１回抽出した後、合わせた有機層を減圧下で濃縮乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＢＷ−８２０ＭＨ  １.０ｇ、トルエン−酢酸エチル４:１、１分画０.５ｍＬ）にて精製し、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（Ｚ）−ＯＭｅを６.２mg得た（収率４８％）。
【００５７】
（実施例５）
＜製造例４＞Ｚ−Ｔｙｒ（Ｚ）−Ｐｈｅ−ＯＭｅの合成
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ  ２０ｍｇを５％塩化水素メタノール溶液０．６０ｍＬに溶解し、室温にて１２時間静置した後、減圧下濃縮乾固してＴｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣｌを２３ｍｇ得た（収率定量的）。当該Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣｌ  ２３ｍｇをジクロロメタン０.６０ｍＬに溶解し、０℃にてトリエチルアミン２３μLとZクロリド２１μLを加えて、室温にて３.５時間攪拌した。トリエチルアミン２３μLを追加して室温にて３０分間撹拌し、減圧下濃縮してジクロロメタンを留去した後、酢酸エチル２mL、飽和硫酸水素カリウム水溶液０.５ｍＬを加えて、有機層を分離した。水層を酢酸エチル１mLで１回抽出した後、合わせた有機層を減圧下濃縮乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＢＷ−８２０ＭＨ  １.９g、クロロホルム−酢酸エチル１０:１、１分画１ｍＬ）にて精製し、Ｚ−Ｔｙｒ（Ｚ）−Ｐｈｅ−ＯＭｅを１１ｍｇ得た（収率３０%）。
【００５８】
（参考例５）
＜製造例５＞Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯＭｅ及びＰｈｅ−Ａｌａの合成
Ｐｈｅ  ０.３１gを水３.１ｍＬに懸濁し、０℃にて炭酸水素ナトリウム０.３２ｇとZクロリド０.２７ｍＬを加えた。０℃にて１時間、室温にて１８時間攪拌した。ジエチルエーテル４ｍＬで１回洗浄し、２Ｍ塩酸３ｍＬを加えて、酢酸エチル８ｍＬで１回抽出し、減圧下で濃縮乾固して、Ｚ−Ｐｈｅを０.４９ｇ得た（収率８８%）。Ｚ−Ｐｈｅ  ０.４９ｇをテトラヒドロフラン１５ｍＬに溶解し、市販のＡｌａ−ＯＭｅ・ＨＣｌ  ０.２２ｇを加えた。０℃にて１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣＩ・ＨＣｌと略記する）０.３１g、トリエチルアミン０.２２ｍＬを加えて、０℃にて２時間、室温にて６３時間攪拌した。水２ｍＬを加えた後、減圧下で濃縮してテトラヒドロフランを留去した。酢酸エチル２０ｍＬ、水１ｍＬ、飽和硫酸水素カリウム水溶液０.５ｍＬを加えて、有機層を分離した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液４ｍＬで１回、飽和塩化ナトリウム水溶液４ｍＬで１回洗浄し、減圧下で濃縮乾固した。
【００５９】
残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＢＷ−８２０ＭＨ  １５g、トルエン−酢酸エチル  ３:２、１分画４ｍＬ）にて精製し、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯＭｅを０.３４ｇ得た（収率５３％）。Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯＭｅ  ０.１５ｇをテトラヒドロフラン６ｍＬに溶解した後、水１.５ｍＬを加えた。更に、水酸化リチウム９ｍｇを加えて、室温にて２.５時間攪拌した後、水酸化リチウム１ｍｇを追加して、室温にて６時間攪拌した。水酸化リチウム１ｍｇを追加して、更に室温にて１０時間攪拌した後、減圧下で濃縮乾固した。残留物に酢酸エチル５ｍＬ、水１ｍＬ、飽和硫酸水素カリウム水溶液０.５ｍＬを加えて、有機層を分離した。水層を酢酸エチル２ｍＬで１回抽出した後、合わせた有機層を減圧下で濃縮乾固して、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａを０.１４ｇ得た（収率定量的）。
【００６０】
Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ  ５０ｍｇをジオキサン２ｍＬに溶解し、水１ｍＬを加えた。１０％パラジウム−炭素１０ｍｇを加えた後、水素雰囲気下で３時間攪拌した。綿栓濾過にて触媒を取り除いた後、濾液を減圧下で濃縮乾固して残留物を３８ｍｇ得た。これをＧ−２５カラムクロマトグラフィー（１.２ｇ、水のみ、１分画０.４ｍＬ）にて精製して、Ｐｈｅ−Ａｌａを３２ｍｇ得た（収率定量的）。
【００６１】
（実施例６）
＜製造例６＞Ｚ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ及びＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの合成
Ｖａｌ  ０.２５ｇを水２.５ｍＬに懸濁し、０℃にて炭酸水素ナトリウム０.３５ｇとＺクロリド０.３０ｍＬを加えた。０℃にて１時間、室温にて１８時間攪拌した。ジエチルエーテル４ｍＬで１回洗浄し、２Ｍ塩酸３ｍＬを加えて、酢酸エチル８ｍＬで１回抽出し、減圧下濃縮乾固して、Ｚ−Ｖａｌを０.５４ｇ得た（収率定量的）。
【００６２】
当該Ｚ−Ｖａｌ  ０.５４ｇをテトラヒドロフラン１６ｍＬに溶解し、市販のＧｌｙ−ＯＭｅ・HCl  ０.３０ｇを加えた。０℃にてＥＤＣＩ・ＨＣｌ  ０.４９ｇ、トリエチルアミン０.３６ｍＬを加えて、０℃にて２時間、室温にて１７時間攪拌した。水２ｍＬを加えた後、減圧下濃縮してテトラヒドロフランを留去した。酢酸エチル１５ｍＬ、水２ｍＬ、飽和硫酸水素カリウム水溶液０.５ｍＬを加えて、有機層を分離した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３ｍＬで１回、飽和塩化ナトリウム水溶液３ｍＬで１回洗浄し、減圧下濃縮乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＢＷ−８２０ＭＨ  １３ｇ、トルエン−酢酸エチル３:２、１分画４ｍＬ）にて精製し、Ｚ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＭｅを０.３２ｇ得た（収率４６％）。Ｚ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ７３ｍｇを３３％臭化水素−酢酸溶液０.５１ｍＬに溶解し、室温にて２.５時間静置した後、減圧下濃縮した。
【００６３】
残留物にジエチルエ−テル２ｍＬを加え、良く振とうして静置した後、上澄み液を取り除いて、メタノール１ｍＬに溶解した。この溶液のｐＨは４であった。これを減圧下濃縮乾固して、クル−ドのＶａｌ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ・ＨＢｒを６９ｍｇ得た（粗収率１１３％）。Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ・ＨＢｒ  ６８ｍｇに、Ｚ−Ｌｅｕ  ６７ｍｇのテトラヒドロフラン溶液２ｍＬを加えた。０℃にてＥＤＣＩ・ＨＣｌ  ５８ｍｇ、トリエチルアミン４２μLを加えて、０℃にて２時間、室温にて２４時間攪拌した。水１ｍＬを加えた後、減圧下濃縮してテトラヒドロフランを留去した。酢酸エチル４ｍＬ、水１ｍＬ、飽和硫酸水素カリウム水溶液０.２ｍＬを加えて、有機層を分離した後、減圧下で濃縮乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＢＷ−８２０ＭＨ  ４.３ｇ、トルエン−酢酸エチル１:１、１分画１.５ｍＬ）にて精製し、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＭｅを３９ｍｇ得た（収率３５％）。
【００６４】
Ｚ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ３０ｍｇをテトラヒドロフラン１.２ｍＬに溶解した後、水０.３ｍＬを加えた。水酸化リチウム２ｍｇを加えて、室温にて１.５時間攪拌した後、減圧下濃縮乾固した。残留物に酢酸エチル１ｍＬ、水０.３ｍＬ、飽和硫酸水素カリウム水溶液０.１ｍＬを加えて、有機層を分離した。水層を酢酸エチル１ｍＬで１回抽出した後、合わせた有機層を減圧下で濃縮乾固して、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを２９ｍｇ得た（収率定量的）。
【００６５】
（実施例７）
Ｚ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ  ２８ｍｇをジオキサン１.２ｍＬに溶解し、水０.６ｍＬを加えた。１０％パラジウム−炭素６ｍｇを加えた後、水素雰囲気下で４時間攪拌した。綿栓濾過にて触媒を取り除いた後、濾液を減圧下で濃縮乾固して残留物を２３ｍｇ得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（BW−８２０MH１.２ｇ、ｎ−ブタノール−エタノール−クロロホルム−水を６:４:２:１、１分画０．６ｍＬ）にて精製して、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを１０ｍｇ得た（収率５２％）。
【００６６】
（参考例６）
＜製造例７＞Ｚ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＯＭｅ及びＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌの合成
ターシャリーブトキシカルボニルオキシ（以下Ｂｏｃと略記する）−Ｇｌｙ  ０.８８ｇをテトラヒドロフラン２６ｍＬに溶解し、市販のＶａｌ−ＯＭｅ・HCl  ０.８４ｇを加えた。０℃にてＥＤＣＩ・ＨＣｌ  ０.９６ｇ、トリエチルアミン０.６９ｍＬを加えて、０℃にて２時間、室温にて２０時間攪拌した。水５ｍＬを加えた後、減圧下濃縮してテトラヒドロフランを留去した。酢酸エチル３０ｍＬ、飽和硫酸水素カリウム水溶液１ｍＬを加えて、有機層を分離した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５ｍＬで１回洗浄し、減圧下で濃縮乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＢＷ−８２０ＭＨ１４ｇ、トルエン−酢酸エチル１:１、１分画４ｍＬ）にて精製し、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＯＭｅを１.２g得た（収率８６％）。
【００６７】
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＯＭｅ  ０.５０ｇをトリフルオロ酢酸５.０ｍＬに溶解し、室温にて２０分間静置した後、減圧下濃縮乾固して、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＯＭｅ・ＴＦＡを０.６４ｇ得た（粗収率１２３％）。Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＯＭｅ・ＴＦＡ  ０.６４ｇにＺ−Ｌｅｕ０.４３ｇのテトラヒドロフラン溶液１３ｍＬを加えた。０℃にてＥＤＣＩ・ＨＣｌ  ０.４０ｇ、トリエチルアミン０.２９ｍＬを加えて、０℃にて２時間、室温にて１４時間攪拌した。水２ｍＬを加えた後、減圧下で濃縮してテトラヒドロフランを留去した。酢酸エチル１５ｍＬ、水２ｍＬ、飽和硫酸水素カリウム水溶液０.５ｍＬを加えて、有機層を分離した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３ｍＬで１回洗浄し、減圧下濃縮乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＢＷ−８２０ＭＨ  ２３ｇ、トルエン−酢酸エチル１:２、１分画８ｍＬ）にて精製し、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＯＭｅを０.５９ｇ得た（収率８４％）。
【００６８】
Ｚ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＯＭｅ  １００ｍｇをテトラヒドロフラン４ｍＬに溶解した後、水１ｍＬを加えた。水酸化リチウム６ｍｇを加えて、室温にて１６時間攪拌した後、水酸化リチウム３ｍｇを追加して、室温にて６時間攪拌した。それに水酸化リチウム２ｍｇを追加して、更に室温にて２２時間攪拌した後、減圧下で濃縮乾固した。残留物に酢酸エチル３ｍＬ、水１ｍＬ、飽和硫酸水素カリウム水溶液０.５ｍＬを加えて、有機層を分離した。水層を酢酸エチル２ｍＬで１回抽出した後、合わせた有機層を減圧下濃縮乾固して、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＢＷ−８２０ＭＨ  ５.０ｇ、酢酸エチルのみ、１分画１ｍＬ）にて精製し、７０％程度の純度のＺ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌを３１mg得た（収率２３％）。
【００６９】
（参考例７）
更に、７０％程度の純度のＺ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ  ２９ｍｇをジオキサン１.２ｍＬに溶解し、水０.６ｍＬを加えた。１０％パラジウム−炭素６ｍｇを加えた後、水素雰囲気下で４時間攪拌した。綿栓濾過にて触媒を取り除いた後、濾液を減圧下で濃縮乾固して残留物を２２mg得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＢＷ−８２０ＭＨ  １.１ｇ、ｎ−ブタノール−エタノール−クロロホルム−水６:４:２:１、１分画０.４ｍＬ）にて精製して、純粋なＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌを８ｍｇ得た（収率３６％）。Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌは特表２００３−５０４０６２号に記載されたペプチド化合物と同一である事が判明したが、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性は報告されていない。
【００７０】
＜試験例１＞アンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質の阻害活性の測定
アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド化合物の阻害性の測定は、Ｃｕｓｈｍａｎｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ,２０,１６３７−１６４８（１９７１）を一部改変して行った。
【００７１】
即ち、１.５ｍＬエッペンドルフチューブに５ｍＭのＢｅｎｚｏｙｌ−Ｇｌｙｃｙl−Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ（ペプチド研究所製）の０.２Ｍホウ酸−リン酸カリウム緩衝液（０.４ＭのＮａＣｌ含有、ｐＨ８.３）を２５０μＬ、所定濃度に調製した供試化合物水溶液３０μＬを加え、３７℃で５分間プレインキュベーションした。この溶液に対して、アンジオテンシンＩ変換酵素（ウサギ肺由来、シグマ社製、酵素番号ＥＣ３.４.１５.１）溶液（６０ｍＵ/ｍＬ０.２M  ホウ酸−リン酸カリウム緩衝液）を添加し、酵素反応を開始した。３７℃で６０分間、シェーカー−バス内で１００ｒｐｍにて反応を行った後、１N塩酸２５０μLを加え、反応を停止した。これに酢酸エチル５８０μＬを加え、４５秒間振とうさせた後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行い、上清の酢酸エチル層を５００μＬ採取した。水層へ更に５２０μＬの酢酸エチルを加え、２０秒間振とうさせた後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清の酢酸エチル層を５００μＬ採取した。この操作を再度繰返し、得られた酢酸エチル層合計１.５ｍＬを遠心エバポレーターにて３０００ｒｐｍで３０分間、減圧条件下にて乾固し、酢酸エチルを完全に除去した。乾固物を高速液体クロマトグラフィー緩衝液（２０％アセトニトリル/０.１％トリフルオロ酢酸水溶液）３ｍＬに溶解した。
【００７２】
生成した馬尿酸を逆相系高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析し、酵素反応で生成した馬尿酸のピーク面積を２２８ｎｍの吸光度を測定する事で求めた。又、酵素反応時に予め１Ｎ塩酸を添加して同様の操作を行ったものをブランクとして作成した。ＨＰＬＣはカラムにμＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ  Ｃ１８  Φ３.９×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を、移動相に２０％アセトニトリル/０.１％トリフルオロ酢酸水溶液を用い
た。
【００７３】
阻害率は次式を用いて算出した。
アンジオテンシンＩ変換酵素阻害率（％）＝｛１−Ｂ−Ｃ）÷Ａ｝×１００
Ａ：蒸留水添加時のピーク面積（２２８ｎｍ）
Ｂ：阻害剤添加時のピーク面積（２２８ｎｍ）
Ｃ：阻害剤添加時のブランクのピーク面積（２２８ｎｍ）
【００７４】
表１に実施例１及び実施例２に記載した各試料６０μg/ｍＬにおけるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害率（％）を示した。
【００７５】
【表１】
0004187633.tif 000002
【００７６】
＜試験例２＞自然発症高血圧ラットに対する尾静脈投与による降圧効果
試験には体重２５０±５０ｇ、収縮期血圧２００±２０ｍｍＨｇ、心拍数４００±５０回/分の雄性自然発症高血圧ラット（Ｗｉｓｔｅｒ−Ｏｋａｍｏｔｏ  ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  Ｒａｔ、以下ＳＨＲと記す）を用いた。試験開始前に明暗周期１２時間（午前９時〜午後９時点灯）、室温２１〜２３℃、湿度５０〜７０％、飼料（ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  社製Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ）及び飲水（水道水質基準適合自家揚水）自由摂取の環境下で４５×２３×２１ｃｍのケージにＳＨＲ６匹を入れ１週間馴化飼育した。製造例１で得られたペプチド混合物のｎ−ブタノ−ル抽出液濃縮物をＳＨＲ体重１ｋｇあたり３０ｍｇの用量で、ＳＨＲ体重１ｋｇあたり５ｍＬの０.９％食塩水に溶解し、ＳＨＲ（１群３匹）に対して尾静脈単回投与して３２±１℃の環境下で飼育した。対照群としてはSHR（１群３匹）に同用量の０.９％食塩水のみを尾静脈投与した。試料投与直前、及び投与３０、６０、２４０分後に血圧を非観血血圧測定装置（Ｍｏｄｅｌ  ５９，ＩＩＴＣ,ＣＡ,ＵＳＡ）を用いて測定した。表２には、その収縮期血圧の経時的変化を示した。
【００７７】
＜試験例３＞ＳＨＲに対する強制経口投与による降圧効果
試験例１と同様の方法でＳＨＲを用意し、製造例１で得られたペプチド混合物のｎ−ブタノール抽出液濃縮物をＳＨＲ体重１ｋｇあたり３００ｍｇの用量で、ＳＨＲ体重１ｋｇあたり１０ｍＬの０.９％食塩水に溶解し、ＳＨＲ（１群３匹）に対して経口単回投与して３２±１℃の環境下で飼育した。対照群としてはＳＨＲ（１群３匹）に同用量の０.９％食塩水のみを経口投与した。試料投与直前、及び投与３０、６０、２４０分後に血圧を非観血血圧測定装置（Ｍｏｄｅｌ  ５９,ＩＩＴＣ,ＣＡ,ＵＳＡ）を用いて測定した。表２に収縮期血圧の経時的変化を示した。
【００７８】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明に用いられるサメ軟骨由来のペプチド化合物は、強力なアンジオテンシンＩ変換
酵素阻害活性を有し、強い降圧作用を示すため、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、治療剤、これら疾患の診断薬、各種病態で用いられる降圧剤、心筋梗塞の減少、うっ血性心不全における病態の改善剤等の医薬品として有用であるとともに、本発明のペプチド化合物は、経口摂取が可能である事から、上記の様な有用な作用を有する健康食品や特定保健用食品や機能性食品としての利用が可能であるし、化粧品や医療部外品として用いることもが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ペプチド化合物Ｐｈｅ−Ｔｙｒの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】ペプチド化合物Ｐｈｅ−Ａｌａ1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】ペプチド化合物Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】ペプチド化合物Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】ペプチド化合物Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】ペプチド化合物Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図７】ペプチド化合物粗体のＨＰＬＣ分析した際のクロマトグラムを示す。
【図８】ペプチド化合物Ｔｙｒ−Ｐｈｅ誘導体Ｚ−Ｔｙｒ（Ｚ）−Ｐｈｅ−ＯＭｅの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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