(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
休眠状態にある糸状菌胞子を、７０〜８０℃の温度範囲に５〜６０分間保持する糸状菌胞子の活性化方法。
【請求項２】
糸状菌が、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する糸状菌である請求項１記載の糸状菌胞子の活性化方法。
【請求項３】
糸状菌が、タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）菌である請求項１記載の糸状菌胞子の活性化方法。
【請求項４】
糸状菌が、タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）Ｙ−９４０１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８１６）である請求項１記載の糸状菌胞子の活性化方法。
【請求項５】
休眠状態にある糸状菌胞子を、乾熱器中において７０〜８０℃の温度範囲に５〜６０分間保持する糸状菌胞子の活性化方法。
【請求項６】
休眠状態にある糸状菌胞子の水懸濁液を、乾熱器中において７０〜８０℃の温度範囲に５〜６０分間保持して活性化した糸状菌胞子を製造する活性化糸状菌胞子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、休眠状態にある糸状菌胞子を活性化する方法に関する。さらに詳しくは、休眠状態にある糸状菌胞子に特定条件下に熱を与えて、その休眠状態を打破することにより糸状菌胞子を活性化し、発芽条件においてほとんど全ての糸状菌胞子を発芽させるようにする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、環境保全の観点から、農業や畜産をはじめ、公園やゴルフ場などにおける農薬の散布量を低減する方策が推進されている。また、一方において、化学合成された農薬に較べて環境負荷の小さい、微生物を用いた生物農薬の開発が試みられている。このような微生物として糸状菌が特に期待されている。
【０００３】
また、発酵生産の分野においても、有効代謝産物などの生産に、各種の糸状菌が用いられている。
これら糸状菌は、通常、固体培地を用いて菌を培養した後、その培養の終期において胞子化条件下で胞子を形成させ、ついで胞子化した糸状菌培養物を乾燥し、さらに篩分けなどの操作によって、乾燥胞子とする。この乾燥胞子は、その水分含有割合が約１０重量％未満であり、休眠状態にある。そして、このような乾燥胞子の形態において、これら糸状菌の保存や輸送をし、糸状菌を使用する必要が生じたとき、この乾燥胞子を培地に接種して、水分や栄養分を吸収させて活性化させ、胞子からの発芽を促すようにしている。
【０００４】
ところで、このような従来の手法による乾燥胞子からの発芽においては、発芽率が１０％程度と低く、乾燥胞子のうちの約９０％もの胞子が休眠状態のままで、有効に利用されないままになっているという問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、乾燥胞子として保存されている糸状菌を、その使用時に、特定条件下での活性化処理をして、該胞子の休眠状態を打破することにより、効率よく糸状菌胞子を活性化する方法を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、休眠状態にある糸状菌胞子に特定条件下での熱処理を施すことによって、きわめて効率よく休眠状態の糸状菌胞子を活性化することができるということを見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、下記のとおりである。
（１）休眠状態にある糸状菌胞子を、７０〜８０℃の温度範囲に５〜６０分間保持する糸状菌胞子の活性化方法。
（２）糸状菌が、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する糸状菌である前記（１）記載の糸状菌胞子の活性化方法。
（３）糸状菌が、タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）菌である前記（１）記載の糸状菌胞子の活性化方法。
（４）糸状菌が、タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）Ｙ−９４０１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８１６）である前記（１）記載の糸状菌胞子の活性化方法。
（５）休眠状態にある糸状菌胞子を、乾熱器中において７０〜８０℃の温度範囲に５〜６０分間保持する糸状菌胞子の活性化方法。
（６）休眠状態にある糸状菌胞子の水懸濁液を、乾熱器において７０〜８０℃の温度範囲に５〜６０分間保持して活性化した糸状菌胞子を製造する活性化糸状菌胞子の製造方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において、休眠状態にある胞子を活性化することのできる糸状菌としては、とくに制限はなく、たとえばタラロマイセス属やトリコデルマ属、ペニシリウム属、ケトミウム属に属するものが好適である。  さらに具体的には、タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）、トリコデルマ・ビリディー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアータム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、ペニシリウム・ファニキュローサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・アスペロスポラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｓｐｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、ペニシリウム・クラストサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）、ペニシリウム・ベルキュローサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・ジャンシネーラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）、ケトミウム・ビレッセンス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ケトミウム・リフレクサム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｒｅｆｌｅｘｕｍ）、ケトミウム・ピルリフェラム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ）、ケトミウム・グラシル（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｒａｃｉｌｅ）、ケトミウム・インディカム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ）、ケトミウム・グロボッサム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、ケトミウム・ドリコトリカム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｄｏｌｉｃｈｏｔｒｉｃｈｕｍ）などである。
【０００９】
これら糸状菌の培養は、通常用いられている固体培地を用いて、それぞれの糸状菌の最適な生育条件で培養を行えばよい。これら糸状菌の固体培養に用いる培地成分としては、有機質土壌改良材、無機質土壌改良材またはこれらの混合物が好適なものとして挙げられる。
この有機質土壌改良材としては、穀物の粉砕物や油かす、米ぬか、小麦ふすま、おから、廃糖蜜、ピートモス、パルプ、木炭などが使用できる。そして、これらは、１種単独で用いてもよいし、様々な配合比率で２種以上のものを混合した混合物の形態で用いてもよい。
【００１０】
また、無機質土壌改良材としては、アタパルジャイト、モンモリロナイト、ゼオライト、バーミキュライト、パーライトなどを用いることができる。これら無機質土壌改良材についても、１種単独で用いてもよいし、様々な配合比で２種以上を混合した混合物の形態で用いてもよい。
さらに、これら有機質土壌改良材と無機質土壌改良材との組合せからなる任意の混合比率での混合物の形態て用いることもできる。
【００１１】
そして、これら固体培地成分を用いて培地を製造する際には、これに適量の水分を加えて固体培養に適した培地とする。この場合、さらに高分子保水剤を配合して、水分の含有割合の変動を抑制するようにしてもよい。また、このように培地の水分含有割合を調整した後、この培地を予め殺菌しておいた方がよい。この培地の殺菌には、たとえば蒸気殺菌、乾燥殺菌、放射線殺菌、化学薬品による殺菌などの方法を採用することができる。この蒸気殺菌をする場合には、１２０℃以上の温度で１５分間程度の処理をすれば完全に殺菌をすることができる。また、乾燥殺菌する場合には、前記固体培地を１１０℃以上で３時間以上乾燥させるだけで充分である。さらに、放射線殺菌では、ガンマ線の照射が有効であり、化学薬品による殺菌では、メチルブロマイドやクロルピクリン、エチレンオキサイドなどを使用することができる。
【００１２】
つぎに、このようにして調製した固体培地を用いて糸状菌の培養を行うが、この場合には、糸状菌の種菌を接種して、１５℃〜４０℃の温度において、２〜３０日間、好気的条件下に培養すればよい。ここでの糸状菌培養物の菌体の濃度は、固体培地１ｇ当たりの糸状菌のコロニー形成単位が、１×１０3 〜１×１０10ＣＦＵの範囲となるようにするのが好ましい。そして、この培養の終期において、糸状菌を胞子化させる。この糸状菌を胞子化は、培地のｐＨや水分含有割合、酸素濃度、培養温度、培地成分の組成を、その糸状菌の胞子形成条件に適合させるように調整をすることが好ましい。
【００１３】
ついで、このようにして胞子を形成した糸状菌培養物の水分含有割合を調整し、乾燥状態において、篩分けなどにより乾燥胞子を得るようにする。この糸状菌培養物の水分含有割合の調整は、例えばこの培養物に乾燥空気を通気して水分を蒸発させて、水分含有率を低減させることができる。
本発明においては、このようにして得られた糸状菌の乾燥胞子を、発芽させて利用する前に、予め、加熱処理することによって休眠状態を打破し、糸状菌胞子を活性化するのである。
【００１４】
この休眠状態にある糸状菌胞子を活性化するための加熱処理条件は、その糸状菌胞子の温度を、７０〜８０℃に昇温し、この状態で５〜６０分間保持すればよい。ここでの加熱処理温度は、７０〜７５℃とするのがさらに好ましく、７５℃とするのが最も好ましい。そして、この加熱処理温度での保持時間は、１５〜６０分間とするのがさらに好ましい。この場合の昇温速度は、とくに制約はないが、５〜５０℃／分間程度とするのが好ましい。そして、この加熱処理温度は、７０℃未満の温度においても糸状菌胞子の活性化は促されるのであるが、長時間を要することから経済的でなく、また、８０℃を超える温度においては、糸状菌が死滅するおそれが増大する。糸状菌の種類によっては８０℃を幾分超える温度においても耐性を有するものもあり、例えば、５分間以内程度の短時間の加熱処理で活性化される場合もある。また、この加熱処理時間については、５〜６０分間とするが、この加熱処理時間の設定は、上記加熱処理温度範囲の中で低い温度領域で行う場合には長時間とし、高目の温度領域で行う場合には短時間とするようにするのがより効果的である。通常、この加熱処理時間を５分間未満としたのでは、糸状菌胞子の活性化が充分に進行せず、また、６０分間を超えて行ってみても、６０分間以内の加熱処理を上回る効果が得られることはなく、かえって不経済になるので好ましくない。
【００１５】
この糸状菌胞子の加熱処理を行う際の加熱は、特に制約はないが、一般に用いられる加熱炉や恒温槽に装入して行ってもよいし、また、一旦水に懸濁したものについては、湯浴中において、上記の条件に温度調節をすればよい。また、この糸状菌胞子の加熱処理は、粉末状の糸状菌胞子をそのまま容器に収納して加熱してもよいが、これを水に懸濁した水懸濁液の状態で加熱処理をすると、均一な温度調節ができることから好ましい。この糸状菌胞子の加熱処理の終了後は、室温に降温するが、この場合の降温方法には特に制約はなく、放冷してもよいし、冷却水などを用いて急冷してもよい。
【００１６】
このようにして活性化した糸状菌胞子は、これを発芽させるに適した培地に接種して、その糸状菌の生育温度に維持し、水分含有割合などの生育条件を調整して、糸状菌胞子からの発芽および菌糸の伸長を促して、酵素生産の分野においては有効代謝産物の生産への利用をはかり、また生物農薬の分野においては植物の病害防除効果を発現させる。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明する。
〔実施例１〕
（１）糸状菌の培養
クリーンルーム内において、小麦ふすまを一晩水に漬けた後、水を切り、再度これに水を加えて初発水分含量が５５重量％となるように調整し、これを担体として用いた。この担体を、１２１℃において１５分間にわたり蒸気殺菌し、室温まで放冷した。
【００１８】
つぎに、種菌として、タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）Ｙ−９４０１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８１６）を用い、この種菌の濃度が担体１ｋｇあたり１０8 ｃｆｕとなるように胞子懸濁液を調製し、全体が均一になるよう混合して接種した。ついで、これを滅菌した金属トレー（３０ｃｍ×５０ｃｍ；深さ５ｃｍ）に、厚さ１ｃｍとなるように敷きつめ、滅菌した大型スパチュラでよくほぐして、担体内への空気の通りを確保した後、除菌通気口を備えた蓋をした。
【００１９】
つぎに、この金属トレーをクリーンルームより取り出して、湿度９５％、温度３０℃に設定されている恒温恒湿槽に装入して１週間にわたって培養した。ここでの培養期間中、１日おきに上記スパチュラにより培地をほぐすとともに、培地の水分の含有量を測定した。この水分含量は、発酵熱による蒸発により変動するので、その値が４０〜５０重量％に維持されるように、二次加水することによって調整しながら培養した。
培養の終了後、上記金属トレーの除菌通気口を備えてある蓋を外して、この除菌通気口を濾紙で覆い、４０℃に設定された恒温槽（乾燥器）に入れて３６時間乾燥することにより、水分含有量７重量％の乾燥培養物を得た。
【００２０】
（２）糸状菌乾燥胞子の製造
上記乾燥培養物をよくほぐした後、乾物ミキサーにより５分間破砕し、その破砕物を電動ふるい器（興和工業所製：ＫＧＯ−５００）により、ウェイト位相８０、テフロン製タッピングボール５０個とともに、２００メッシュの篩にかけて糸状菌乾燥胞子を採取した。得られた糸状菌乾燥胞子は、乾燥培養物１ｋｇあたり７０ｇであった。
ここで得られた糸状菌乾燥胞子を含む篩分け物の菌濃度は、トーマ血球計数器で測定したところ、４×１０9 個／ｇであった。そして、ポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）プレートを用いて行った生菌数の測定結果では、４×１０6 ｃｆｕ／ｇであった。したがって、この糸状菌乾燥胞子の発芽率は、１％であった。
【００２１】
（３）糸状菌乾燥胞子の加熱処理による活性化
上記（２）で得られた糸状菌乾燥胞子５０ｇを、金属トレー（３０ｃｍ×５０ｃｍ；深さ５ｃｍ）に薄く敷きつめた状態で、これを７０℃の恒温槽に入れ、１５分間加温した。加熱処理の終了後、このトレーを恒温槽から取り出し、室温において１時間放置して室温まで降温させた。
この糸状菌乾燥胞子の加熱処理については、さらに、各個別の試料について加熱処理時間を３０分間、４０分間、６０分間に変更して処理を行った。
【００２２】
（４）活性化した糸状菌乾燥胞子の発芽
上記（３）において、加熱処理時間を種々変更して加熱処理した各活性化糸状菌乾燥胞子について、ＰＤＡプレートを用いた平板希釈法により生菌数を測定し、その発芽率を算出した結果を第１表に示す。
【００２３】
〔実施例２〕
実施例１と同様にして得た糸状菌乾燥胞子について、その活性化のための加熱処理温度を７５℃に変更した他は、実施例１と同様にした。
活性化糸状菌乾燥胞子の発芽率の算出結果を第１表に示す。
【００２４】
〔実施例３〕
実施例１と同様にして得た糸状菌乾燥胞子について、その活性化のための加熱処理温度を８０℃に変更した他は、実施例１と同様にした。なお、この加熱処理温度を８０℃とする場合にはより短時間での処理を行う方が有利であることが確認された。
活性化糸状菌乾燥胞子の発芽率の算出結果を第１表に示す。
【００２５】
〔比較例１〕
実施例１と同様にして得た糸状菌乾燥胞子について、その活性化のための加熱処理温度を６５℃に変更した他は、実施例１と同様にした。
活性化糸状菌乾燥胞子の発芽率の算出結果を第１表に示す。
〔比較例２〕
実施例１と同様にして得た糸状菌乾燥胞子について、その活性化のための加熱処理温度を６０℃に変更した他は、実施例１と同様にした。
活性化糸状菌乾燥胞子の発芽率の算出結果を第１表に示す。
【００２６】
【表１】
0004159688.tif 000002
【００２７】
〔実施例４〕
実施例１の（２）において得られた糸状菌乾燥胞子を、その濃度が５重量％となるように水に懸濁した後、７０℃の湯浴中で加温し、経時的にその１部を取り出して水浴に入れ、室温まで降温して、発芽率を測定した。
この場合の加温時間と発芽率の関係を、図１に示す。
【００２８】
〔実施例５〕
実施例４における湯浴の温度を８０℃とした他は、実施例４と同様にした。
【００２９】
この場合の加温時間と発芽率の関係を、図１に示す。
〔比較例３〕
実施例４における湯浴の温度を６５℃とした他は、実施例４と同様にした。
この場合の加温時間と発芽率の関係を、図１に示す。
〔比較例４〕
実施例４における湯浴の温度を６０℃とした他は、実施例４と同様にした。
この場合の加温時間と発芽率の関係を、図１に示す。
【００３０】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、糸状菌の乾燥胞子を発芽させる前に加熱処理するだけの簡単な処理をするだけで、休眠状態にある糸状菌の乾燥胞子を活性化させることができ、加熱処理をしない場合に較べて、活性胞子密度を１０〜５０倍に増大させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、休眠状態にある糸状菌胞子の活性化処理時間と処理温度および活性化処理後の発芽率の関係を示すグラフである。
【図１】
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