(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
白鶴霊芝の水および／または有機溶媒抽出物を主成分とすることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は白鶴霊芝の溶媒抽出物を用いる抗アレルギー剤、とくにアナフィラキシー型アレルギー（Ｉ型アレルギー）に有効な抗アレルギー剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アナフィラキシー型アレルギーは花粉症に代表されるアレルギー反応であり、空気中の少量の花粉でも過敏症者は目の周囲が痒くなり、鼻水を出し、くしゃみをしたりし、ときには蕁麻疹や喘息まで起したりする。
このようなアナフィラキシー型アレルギーの免疫学的メカニズムは、主に免疫グロブリンＥの抗原抗体反応により説明される。即ち、初期感作が成立した肥満細胞における抗原抗体反応および細胞外にあるカルシウムイオンの肥満細胞内流入が生じ、不活性型で存在しているヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）の活性化が生じて細胞のレスポンスが起こる。これにより細胞から顆粒が脱出し、顆粒中に含まれる化学伝達物質が遊離して痒み、湿疹等、前述のさまざまな症状が現れるのである。
【０００３】
この免疫学的メカニズムの中でヒアルロニダーゼは重要な役割を果たす酵素である。この酵素を炎症性の細胞（白血球など）が多く持っており、とくに炎症部位では非常に高濃度になることが多く、細胞膜の構成成分であるヒアルロン酸を分解して炎症を増強するといわれている。このためヒアルロニダーゼ酵素を阻害すれば抗アレルギー効果が期待できるというので、これまでに様々な化合物がヒアルロニダーゼ阻害活性をテストされている（Ｈ．Ｋａｋｅｇａｗａ，Ｎ．Ｍｉｔｓｕｏ他，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３［９］３７３８−３７４４（１９８３）、Ｈ．Ｋａｋｅｇａｗａ，Ｈ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ他，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３［２］６４２−６４６（１９８５）、Ｈ．Ｋａｋｅｇａｗａ，Ｎ．Ｍｉｔｓｕｏ他，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３［２］６４２−６４６（１９８５）、Ｓ．Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｌ．Ｒ．Ｓｉｍｐｏｌ他，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３９［１］１０５−１１０（１９９５）、前田有美恵他，静岡県衛生環境センター報告［３０］４１−４５（１９８７））。
【０００４】
白鶴霊芝（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔａ（Ｌ．）Ｋｕｒｚ）は、インド南部デカン高原の原産とされるリナカンサス属きつねのまご科に属する常緑小低木であり、その全草（リナカンツス草）は駆虫、消炎、皮膚真菌に対する抗菌作用のあることが知られ（原色牧野和漢薬草大図鑑、４９２頁、北隆館、１９８８年）、主に中国、台湾等において、また最近では日本国においても漢方薬として用いられている。その他、本出願人による以前の出願で、この白鶴霊芝に活性酸素消去能があること（特開平９−１４３０９１号、活性酸素消去能を有する組成物）および排泄促進作用があること（特開平９−１６９６６２号、排泄促進剤）を開示している。
しかしながら、この白鶴霊芝乃至白鶴霊芝の水および／または有機溶媒抽出物に抗アレルギー作用があることは知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、アナフィラキシー型アレルギーに有効な抗アレルギー効果を有する物質につき鋭意研究の結果、従来漢方薬、排泄促進剤および健康食品として使用されている白鶴霊芝の水および／または有機溶媒抽出物が有効であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、白鶴霊芝の水および／または有機溶媒抽出物を主成分とすることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明に使用する白鶴霊芝は、市販されている葉、全草（地上部）、根あるいはこれらのものの混合物を使用すればよい。好ましくはこれらのものを天日乾燥および／またはドラム乾燥し、粉砕機にかけて１２メッシュ以上、好ましくは２０メッシュ以上に粉砕して用いる。
必要によりこの白鶴霊芝は、天日乾燥および／またはドラム乾燥したものを焙煎器により焙煎したものを用いてもよい。
【０００８】
このようにして得られた白鶴霊芝を水および／または有機溶媒で抽出して本発明抗アレルギー剤である抽出物を得る。
【０００９】
本発明において、抽出に使用する水には冷却水、常温水および熱水が包含される。この水は次に挙げる有機溶媒と混合して使用することもできる。
【００１０】
本発明において、抽出に使用する有機溶媒としては、エタノール、メタノール、プロパノール、１，３−ブチレングリコール等のアルコール類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル等のエーテル類、アセトン等のケトン類、ベンゼン等のフェノール類、ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン、スクワラン等の炭化水素類、その他が挙げられ、これらを単独でまたは２種以上を混合して使用することができる。
【００１１】
得られる白鶴霊芝の水および／または有機溶媒抽出物は無臭乃至僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた透明で緑褐色乃至深い緑色の液体であり、これをそのまま使用してもよいが、好ましくは濾過、遠沈、その他の方法で精製し、必要によりさらに蒸留等の手段により適度に濃縮して用いる。またこの抽出液をさらに蒸留乾固、凍結乾燥等の手段で処理して得られる無臭乃至僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた透明で緑褐色乃至深い緑色の微粉末として用いることも可能である。
【００１２】
次に本発明の実施例および試験例を挙げて説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【実施例】
実施例１
天日乾燥し、次いでドラム乾燥した白鶴霊芝の葉（大協物産有限会社販売、以下白鶴霊芝の購入先は同じ）１ｋｇを粉砕機にて粉砕し、焙煎器にて焙煎後、さらに粉砕し、得られた粉砕物を篩にかけて１２メッシュで分級して白鶴霊芝葉粉砕物約０．８ｋｇを得た。
この白鶴霊芝葉粉砕物２．５ｇを熱水１００ｍｌに浸漬、濾過してジャスミン様の僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた緑褐色の透明な液状の抽出物を得た。
【００１３】
実施例２
白鶴霊芝の全草粉砕物２．５ｇを水１００ｍｌに浸漬、濾過して僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた深い緑色の透明な液状の抽出物を得た。
【００１４】
実施例３
白鶴霊芝の全草粉砕物２．５ｇをエタノール１００ｍｌに浸漬、濾過して僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた深い緑色の透明な液状の抽出物を得た。
【００１５】
実施例４
白鶴霊芝の葉、茎および根の粉砕物２．５ｇを１，３−ブチレングリコール１００ｍｌに浸漬、濾過して僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた深い緑色の透明な液状の抽出物を得た。
【００１６】
実施例５
天日乾燥し、次いでドラム乾燥した白鶴霊芝の葉および根の粉砕物３ｇを１：１エタノール水１００ｍｌに浸漬、濾過して僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた深い緑色の透明な液状の抽出物を得た。
【００１７】
実施例６
白鶴霊芝葉粉砕物２．５ｇを熱水１００ｍｌに浸漬、濾過して僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた緑褐色の透明な液状の抽出物を得た。
【００１８】
実施例７
エタノールの代わりにアセトンを使用する他は実施例３と同様に処理して、僅かな芳香を有し、独特のコクのある味を帯びた深い緑色の透明な液状の抽出物を得た。
【００１９】
実施例８
エタノールの代わりにエーテルを使用する他は実施例３と同様に処理して、僅かな芳香を有し、独特のコクのある味を帯びた深い緑色の透明な液状の抽出物を得た。
【００２０】
実施例９
エタノールの代わりにベンゼンを使用する他は実施例３と同様に処理して、僅かな芳香を有し、独特のコクのある味を帯びた深い緑色の透明な液状の抽出物を得た。
【００２１】
実施例１０
天日乾燥し、次いでドラム乾燥した白鶴霊芝全草および根１ｋｇを粉砕機にて粉砕し、焙煎器にて焙煎後、さらに粉砕し、得られた粉砕物を篩にかけて１２メッシュで分級して白鶴霊芝全草および根の粉砕物約０．８ｋｇを得る他は、実施例１と同様に処理して僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた緑褐色の透明な液状の抽出物を得た。
【００２２】
実施例１１
実施例１と同様に処理して得られた抽出物１０００ｍｌを凍結乾燥して、僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた緑褐色の微粉末約１０ｍｇを得た。
【００２３】
実施例１２
実施例２と同様に処理して得られた抽出物１０００ｍｌを凍結乾燥して、僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた緑褐色の微粉末約１０ｍｇを得た。
【００２４】
実施例１３
実施例３と同様に処理して得られた抽出物１０００ｍｌを凍結乾燥して、僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた深い緑色の微粉末約１０ｍｇを得た。
【００２５】
実施例１４
実施例４と同様に処理して得られた抽出物１０００ｍｌを凍結乾燥して、僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた深い緑色の微粉末約１０ｍｇを得た。
【００２６】
実施例１５
実施例５と同様に処理して得られた抽出物１０００ｍｌを凍結乾燥して、僅かな芳香、独特のコクのある味を帯びた深い緑色の微粉末約１０ｍｇを得た。
【００２７】
試験例１
実施例１１と同様にして得られた白鶴霊芝葉熱水抽出物微粉末を用いてヒアルロニダーゼ阻害活性を試験した。試験は超純水に溶解した試料に、順に各々緩衝液に溶解しておいたヒアルロニダーゼ、活性化剤およびヒアルロン酸（基質）を混合し、分解されたヒアルロン酸量をモルガン−エルソン（Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ）法にて測定することにより行い、対照溶液（コントロール）との比較で阻害率を産出した。
試験方法
（１）試料調製
１）白鶴霊芝
▲１▼白鶴霊芝熱水抽出物：白鶴霊芝葉熱水抽出物微粉末を超純水に溶解し１０００ｐｐｍとする。
▲２▼白鶴霊芝熱水抽出物水画分：白鶴霊芝葉熱水抽出物微粉末をカラムクロマトグラフィー処理して得た水画分を超純水に溶解し１０００ｐｐｍとする。
▲３▼白鶴霊芝熱水抽出物３０％メタノール水画分：白鶴霊芝葉熱水抽出物微粉末をカラムクロマトグラフィー処理して得た３０％メタノール水画分を超純水に溶解し１０００、５００、１００ｐｐｍとする。
▲４▼対照溶液：超純水を使用する。
２）ヒアルロニダーゼ
ヒアルロニダーゼ溶液：ヒアルロニダーゼＩＶ−Ｓ型（牛睾丸由来：ＳＩＧＭＡ社製）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）［以下、緩衝液という］に溶解し、最終酵素活性約１５０Ｕ／ｍｌの緩衝液とする。
３）ヒアルロン酸
ヒアルロン酸カリウム溶液：ヒアルロン酸カリウム塩（雄鶏のとさか由来：和光純薬社製）を緩衝液に溶解し、最終酵素活性約０．４ｍｇ／ｍｌの緩衝液とする。
４）活性化剤
カンパウンド４８／８０（ＳＩＧＭＡ社製）、ＣａＣｌ２およびＮａＣｌの濃度がそれぞれ０．５ｍｇ／ｍｌ、１２．５ｍＭ、０．７５Ｍとなるように緩衝液に溶解し、これらの混合液を使用直前に１／３に希釈する。
（２）試薬（Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法）
１）ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ｐ−ＤＡＢＡ）試薬：ｐ−ＤＡＢＡ（和光純薬社製）１０ｇおよび１０Ｎ塩酸溶液１２．５ｍｌに酢酸を加えて１００ｍｌにし、使用直前に酢酸で１／１０に希釈する。
２）ホウ酸溶液：ホウ酸（和光純薬社製）４．９５ｇに超純水５０ｍｌを加え、１Ｎ  ＮａＯＨ溶液でｐＨ９．１に調製した後、超純水を加えて１００ｍｌとする。
（３）試験手順
試験は上記試料および試薬を用い、スクリュー蓋つき試験管をインキュベーション中は蓋を閉めるようにして使用して下記手順で実施した。なお、阻害率の算定は、分光光度計（日立製作所製  １５０−２０形ダブルビーム分光光度計）を用いて５８５ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．５８５）を測定し、次式により算定した。
阻害率（％）＝［１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）］×１００
［式中、Ａ＝対照溶液のＯ．Ｄ．５８５、Ｂ＝対照溶液のブランクのＯ．Ｄ．５８５、Ｃ＝試料溶液のＯ．Ｄ．５８５、Ｄ＝試料溶液のブランクのＯ．Ｄ．５８５である。］
0004036415.tif 000002
0004036415.tif 000003
試験結果
試験の結果を表１に示すが、白鶴霊芝熱水抽出物は優れた抗アレルギー効果を示すことが明らかである。
0004036415.tif 000004
【００２８】
試験例２
試験例１において、白鶴霊芝葉熱水抽出物微粉末を用いる代わりに実施例１５と同様に処理して得られた白鶴霊芝葉根１：１エタノール水抽出物微粉末の６０％および３０％メタノール水画分を使用する他は同様にしてヒアルロニダーゼ阻害活性を試験した。
結果を表２に示す。白鶴霊芝１：１エタノール水抽出物は優れた抗アレルギー効果を示すことが明らかである。
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【００２９】
【発明の効果】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、アナフィラキシー型アレルギーに対して有効であり、花粉症や蕁麻疹、喘息の治療および予防効果が期待できる。さらに、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、天然物の水および／または有機溶媒抽出物であるから安全性が高く、長期連用しても人体に有害な作用を及ぼさない利益がある。