(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリーン蛍光タンパク質またはその光放射誘導体をコードするＤＮＡ配列に操作的に連結されたＲＡＤ５４修復遺伝子のプロモーターおよび５’調節配列を含む調節エレメントを含む、組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
調節エレメントが、配列番号１として同定されているＤＮＡ配列を含む、請求項１の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
光放射誘導体をコードするＤＮＡ配列が、グリーン蛍光タンパク質のＳ６５Ｔ誘導体をコードする、請求項１または２の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
光放射誘導体をコードするＤＮＡ配列が、グリーン蛍光タンパク質の酵母増強誘導体（ＹＥＧＦＰ）をコードする、請求項１または２の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項１−４のいずれかのＤＮＡ分子およびＤＮＡベクターを含む組換えベクター。
【請求項６】
ベクターが、細胞質基質で自主的に複製するように設計される、請求項５の組換えベクター。
【請求項７】
ベクターが、２μプラスミドから誘導されたＤＮＡを含有する、請求項６の組換えベクター。
【請求項８】
ベクターが、細胞のゲノムに統合されるように設計される、請求項７の組換えベクター。
【請求項９】
ベクターが、酵母の染色体IV由来のＨＯ遺伝子の部分をコードするＤＮＡを含有する、請求項８の組換えベクター。
【請求項１０】
ベクターがＰＦＡベクターから誘導される、請求項５−９いずれかの組換えベクター。
【請求項１１】
配列番号４の配列のベクター、および配列番号４の配列のベクターのＰａｃ１およびＢａｍＨ１の制限酵素部位の間に挿入された配列番号１の配列の調節エレメントを含む、下記構造を有する組換えベクターＰＡＦ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ−ＲＡＤ５４。
0004163757.tif 000014
【請求項１２】
ベクターのＢａｍＨ１部位で挿入されたＨＯ遺伝子の断片を有する請求項１１の組換えベクターを含む、下記構造を有する組換えベクターｐＷＤＨ４４３、ここで該ＨＯ遺伝子の断片は配列番号５からなる配列を有する。
0004163757.tif 000015
【請求項１３】
Ｐａｃ１およびＡｓｃ１消化によりつくられた配列番号６のグリーン蛍光タンパク質の酵母増強誘導体（ＹＥＧＦＰ）の大きい断片に連結された、Ｐａｃ１およびＡｓｃ１消化によりつくられた請求項１２の組換えベクターの大きい断片を含む、下記構造を有する組換えベクターｙＥＧＦＰ−４４３。
0004163757.tif 000016
【請求項１４】
請求項１２の組換えベクターのＢａｍＨ１およびＰｍｅ１消化からつくられた大きい断片と連結された２μプラスミドの断片を含む、組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１２の組換えベクターのＢａｍＨ１およびＰｍｅ１消化からつくられた大きい断片と連結されたプラスミドｐＲＤＫ２４９から放出される大きいＨｉｎｄIII／ＢａｍＨ１断片を含む、下記構造を有する組換えベクターｐＷＤＨ４４４。
0004163757.tif 000017
【請求項１６】
Ｐａｃ１およびＡｓｃ１消化によりつくられた配列番号６のグリーン蛍光タンパク質の酵母増強誘導体（ＹＥＧＦＰ）の大きい断片と連結された、Ｐａｃ１およびＡｓｃ１消化によりつくられた請求項１５の組換えベクターの大きい断片を含む、下記構造を有する組換えベクターｙＥＧＦＰ−４４４。
0004163757.tif 000018
【請求項１７】
請求項１−４いずれかのＤＮＡ分子を含有する細胞。
【請求項１８】
請求項５−１６いずれかの組換えベクターを含有する細胞。
【請求項１９】
細胞が酵母である、請求項１７または１８の細胞。
【請求項２０】
酵母がサッカロマイセス・セレビシエの株である請求項１９の酵母細胞。
【請求項２１】
半数体形態のＹ４８５である、請求項１９の酵母細胞。
【請求項２２】
半数体形態のＦＦ１８９８４またはＹ４８６と名づけられた、請求項１９の酵母細胞。
【請求項２３】
二倍体形態のＹ４８５／４８６である請求項１９の酵母細胞。
【請求項２４】
以下の工程を含む、ＤＮＡ損傷を起こしたり、強めたりする物質の存在を検出する方法：
(a)グリーン蛍光タンパク質またはその光放射誘導体をコードするＤＮＡ配列に操作的に連結されたＲＡＤ５４修復遺伝子のプロモーターおよび５’調節配列を含む調節エレメントを含む、組換えＤＮＡ分子で形質転換した酵母細胞を、物質に適用する工程、
(b)該酵母細胞由来の光放射レポータータンパク質の発現を監視する工程。
【請求項２５】
光放射誘導体をコードするＤＮＡ配列が、グリーン蛍光タンパク質のＳ６５Ｔ誘導体をコードする、請求項２４の方法。
【請求項２６】
光放射誘導体をコードするＤＮＡ配列が、グリーン蛍光タンパク質の酵母増強誘導体をコードする、請求項２４の方法。
【請求項２７】
物質を、生きている生物が該物質に接触したときに安全であるかを判定するために選別する、請求項２４〜２６いずれかの方法。
【請求項２８】
物質が、候補薬剤、食品添加物または化粧品の可能性があるものである、請求項２４〜２７いずれかの方法。
【請求項２９】
物質が、水源の汚染源である、請求項２４〜２７いずれかの方法。
【請求項３０】
物質が、産業廃棄物の汚染源である、請求項２４〜２７いずれかの方法。
【請求項３１】
光の発現を全細胞から測定する、請求項２４〜３０いずれかの方法。
【請求項３２】
請求項１３または１６の組換えベクターで形質転換された細胞を生育し、その細胞を物質とともに予め定めた時間インキュベートし、該細胞サンプル由来の光放射レポータータンパク質の発現を直接的に監視することを含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
細胞を低蛍光生長培地で生育する、請求項２４〜３２いずれかの方法。
【請求項３４】
低蛍光生長培地がＦ１培地である、請求項３３の方法。
【請求項３５】
光の発現を細胞抽出物から測定する、請求項２４〜３０いずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＤＮＡ損傷を起こしたり、強めたりする物質を検出する方法、および該方法に有益に用いられる分子および形質転換細胞に関する。
ＤＮＡ損傷は、紫外線、Ｘ線遊離基、メチル化剤および他の変異原性化合物など種々の物質によって引き起こされる。これらの物質は、生体の遺伝暗号を含有するＤＮＡに損傷を起こし、遺伝子に変異をもたらす。微生物において、このような変異は、新しい望ましくない微生物株を進化さすことにつながる。例えば、抗生物質や除草剤に対する耐性菌が生じる。動物においては、このような変異は、発癌につながたり、あるいは配偶子を損傷して子孫に先天的な傷害を与えることがある。
これらのＤＮＡ損傷物質は、ＤＮＡを含むヌクレオチドを化学的に修飾したり、ヌクレオチドをつなぐホスホジエステル結合を切断したり、塩基間の結合（Ｔ−ＡまたはＣ−Ｇ）を破壊すると思われる。ＤＮＡ損傷物質に遭遇すると、細胞は多くのメカニズムを発展さす。例えば、大腸菌のＳＯＳ応答は、ＤＮＡ損傷に誘発された細胞の応答として特性がよく知られており、ＤＮＡ修復酵素を含む一連のタンパク質が発現されて、損傷ＤＮＡが修復される。
数多くの環境において、どのような物質がＤＮＡ損傷を起こしたり、強めたりするのかを同定することは、重要である。特に、ＤＮＡ損傷物質にヒトが接触したときに、安全かどうかを確かめるために、その物質の検出が重要である。例えば、これらの物質を検出する方法は、食品添加物、医薬品あるいは化粧品になる可能性のある化合物のスクリーニングにおいて変異形成アッセイとして使用され、問題の化合物がＤＮＡ損傷を誘発するか、どうかを確かめることができる。また、ＤＮＡ損傷物質を検出する方法は、変異原性化合物を含む汚染源で供給水が汚染されていないかを監視するの用いられる。
物質の毒性を測定するのに、Ａｍｅｓ試験などの種々の方法が知られている。ＷＯ９５／００８３４に開示されている最近の開発は、産業排水の毒性を測定するために光放射微生物（特に、細菌Photobacterium phosphoreum）の使用に関する。ＷＯ９５／０７４６３は、グリーン蛍光タンパク質をコードするＤＮＡおよび調節エレメント（重金属により誘発されるプロモーターなど）をコードするＤＮＡから形成された遺伝子構築体を開示しており、汚染の検出に使用され得る。しかしながら、これらの開発においては、ＤＮＡ損傷を起こしたり、強めたりする物質の存在を特異的に監視する方法は、開示されていない。さらに、これらの既知方法は感度が十分でなく、ＤＮＡ損傷を起こしたり、強めたりする物質を低濃度で検出できない。
本発明第１観点によると、調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子が提供される。この調節エレメントは、光放射レポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列に操作的に連結したＤＮＡ損傷に応答して遺伝子発現を活性化するものである。
本発明第２観点によると、本発明第１観点のＤＮＡ分子を含有する組換えベクターおよびＤＮＡベクターが提供される。
本発明第３観点によると、本発明第１観点のＤＮＡ分子または本発明第２観点の組換えベクターを含有する細胞が提供される。
本発明第４観点によると、ＤＮＡ損傷を起こしたり、強めたりする物質の存在を検出する方法が提供される。この方法は、物質に本発明第３観点の細胞を適用し、細胞からの光放射レポータータンパク質の発現を監視することを含む。
「調節エレメント」とは、遺伝子の転写を調節するＤＮＡ配列を意味する（なお、遺伝子はこのＤＮＡ配列が関連する遺伝子である）。
「操作的に連結する」とは、調節エレメントがレポータータンパク質の発現を誘発し得ることを意味する。
「レポータータンパク質」とは、本発明のＤＮＡ分子の調節エレメントに応答して発現したときに、適当なアッセイの手段で検出できるタンパク質を意味する。
本発明第４観点の方法は、ある物質がＤＮＡ損傷を起こし得るかどうかを判定するのに適している。ＤＮＡ損傷物質にヒトが接触したときに、安全かどうかを確かめるために、その物質を検出するのに特に有用である。例えば、この方法は、変異形成アッセイとして使用され、食品添加物、医薬品あるいは化粧品などの、ＤＮＡ損傷を誘導する既知物質のスクリーニングに用いられる。また、本発明の方法は、ＤＮＡ損傷剤を含む汚染源で供給水が汚染されていないかを監視するの用いられる。
本発明第４観点の方法は、ある物質がＤＮＡ損傷を強め得るかどうかを判定するのにも使用される。例えば、ある種の物質は、直接的にはＤＮＡに損傷を加えないが、ＤＮＡ修復を阻害する（例えば、修復タンパク質の発現を防止する）ことによりＤＮＡ損傷を起こすことがある。これらの物質は補助変異原としてしばしば知られ、鉛などが含まれる。
本発明第１観点のＤＮＡ分子の調節エレメントは、ＤＮＡ損傷が起きたとき、レポータータンパク質の発現を活性化する。この調節エレメントは、ＤＮＡ分子に結合するようにＲＮＡポリメラーゼを誘発して、レポータータンパク質をコードするＤＮＡの転写を開始するプロモーター配列を理想的に含む。調節エレメントは他の機能的ＤＮＡ配列をも含み得る。例えば、リボソーム結合のための翻訳開始配列あるいはＤＮＡ損傷後の遺伝子発現を促進する転写因子を結合するＤＮＡがある。調節エレメントは、調節された遺伝子から転写阻害剤を取り除くように働くタンパク質をコードし、もってその遺伝子の転写を増加する。
好ましい調節エレメントは、ＤＮＡ修復タンパク質の発現の調節に本来関係するＤＮＡ配列である。例えば、ＲＡＤ２、ＲＡＤ６、ＲＡＤ７、ＲＡＤ１８、ＲＡＤ２３、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５４、ＣＤＣ７、ＣＤＣ８、ＣＤＣ９、ＭＡＧ１、ＰＨＲ１、ＤＩＮ１、ＤＤＲ４８、ＲＮＲ１、ＲＮＲ２、ＲＮＲ３およびＵＢ１４などの遺伝子から、酵母からの調節エレメントは本発明の第１観点の分子をつくるのに使用される。パンカビの誘発可能切除修復遺伝子、黒穂菌の誘発可能組換え修復遺伝子、哺乳動物細胞のＵＶ誘発照射損傷回復経路遺伝子に関連する調節エレメントも使用され得る。
好ましい調節エレメントは、プロモーターとＲＡＤ５４修復遺伝子の５’調節配列を含む。このような調節エレメントは、酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeから誘導される。最も好ましくは、調節エレメントが、配列番号１に同定されたＤＮＡ配列またはその機能的類似体または断片に対応するプロモーターとＲＡＤ５４修復遺伝子の５’調節配列を有する。
他の好ましい調節エレメントは、プロモーターおよびＲＮＲ２遺伝子の５’調節配列を含む。ＲＮＲ２遺伝子は、Saccharomyces cerevisiaeの染色体Ｘ上に存在する。好ましい調節エレメントは、Saccharomyces cerevisiaeゲノムのデータベース中に同定されているように、染色体Ｘ上のＲＮＲ２遺伝子関連のコオルジネート（co-ordinates）３８７１００と３９８２９９との間から誘導される。データベースはインターネットにより多くの場所で接続される。例えば、http://genome-www.stanford.edu/である。
光放射レポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列は、いかなる光放射タンパク質もコードし得るが、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列が好ましい。
光放射レポータータンパク質をコードする好ましいＤＮＡ配列は、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその光放射誘導体をコードする。ＧＦＰは、クラゲAquorea victoriaに由来し、ブルー光線を吸収し、容易に検出可能なグリーン光線を再放射するので、レポータータンパク質として適している。ＧＦＰは、測定が簡単であり、試薬は不要であり、タンパク質は非毒性であるので、レポータータンパク質としての使用が有利である。
ＧＦＰ誘導体には、光を放射し得るＧＦＰのポリペプチド類似体あるいはポリペプチド断片をコードするＤＮＡ配列が含まれる。これらの誘導体の多くは、Aquorea victoriaに内在するＧＦＰと異なる波長で光を吸収し、再放射する。例えば、本発明の第１観点の好ましいＤＮＡ分子は、ＧＦＰのＳ６５Ｔ誘導体（ＧＦＰのセリン６５がトレオニンで置換されている）をコードするＤＮＡ配列を有する。Ｓ６５Ｔ  ＧＦＰは野生型ＧＦＰよりも明るい（最長の波長ピークで刺激したとき）との利点があり、ただ緩やかな退色を示す。さらに、Ｓ６５Ｔ  ＧＦＰは大きい蛍光量を生産し、蛍光活性細胞ソーターで用いられるアルゴンイオン・レーザーの出力に適合する。Ｓ６５Ｔ  ＧＦＰコードＤＮＡを含有する本発明の第３観点の細胞は、本発明の第４観点の方法に使用される。特に、光放出を細胞抽出物から測定するときに有用である（下記参照）。
他の好ましいＤＮＡ配列は、酵母増強ＧＦＰ（ＹＥＧＦＰ）、例えばCormackら（1997, Microbiology 143, p303-311）発表のＧＦＰ誘導体をコードする。このＹＥＧＥＰは、酵母中での使用に偏したアミノ酸配列を有している。それで、ＹＥＧＦＰは、酵母である本発明第３観点の細胞を形質転換するのに特に適している。さらに、本発明で、このような酵母中のＹＥＧＥＰから放射される光は、Ｓ６５Ｔ誘導体から放射される光よりもさらに大きいことが分かった。例えば、ＹＥＧＥＰをコードするＤＮＡ分子で形質転換した酵母株ＦＦ１８９８４（Ｙ４８６ともいう）からの光出力は、Ｓ６５Ｔ  ＧＦＰをコードするＤＮＡ分子で形質転換したＦＦ１８９８４からの光出力の倍である。ＹＥＧＦＰが本発明の第４観点の方法での使用に特に有用であることが分かった。この方法は、本発明の第３観点の無傷細胞からの光放射を監視することを含んでいる（詳細は下記する）。
ＹＥＧＦＰをコードするＤＮＡも、ＹＥＧＦＰが発生期のＧＦＰより熱に敏感でないので、有用である。
本発明の第１観点の最も好ましいＤＮＡ分子は、ＧＦＰまたはその光放射誘導体をコードするＤＮＡ配列に操作的に連結したＲＡＤ５４調節エレメントを含む。
ＤＮＡ分子は、適当なＤＮＡベクター中に含まれて、本発明の第２観点の組換えベクターを形成する。例えば、ベクターはプラスミド、コスミドあるいはファージである。この組換えベクターは、本発明の第１観点のＤＮＡ分子を複製するときに、大きい有用性を有する。さらに、組換えベクターは、ＤＮＡ分子で細胞を形質転換するのに非常に有用であり、またレポータータンパク質の発現を促進し得る。
組換えベクターは、１以上の選択用マーカーを含み、ＤＮＡベクターでトランスフェクトされた細胞の選択を可能とする。好ましくは、本発明の第１観点のＤＮＡ分子を組み込む組換えベクターを有する細胞の選択を可能にする。このような選択用マーカーの例としては、カナマイシン（すなわちＧ１４８）およびアンピシリンに対する抵抗性を有する遺伝子がある。選択用マーカーには、プロトトロピーを復旧するマーカー、例えば酵母ＵＲＡ３遺伝子がある。
組換えベクターは、ベクターが細胞質基質中で自律的に複製するように設計され得る。この場合、ＤＮＡ複製を誘発するエレメントが組換えベクター中に必要であろう。適当なエレメントは２μプラスミドから誘導される。このような複製用のベクターは、形質転換体中でＤＮＡ分子の多重複製を増加し得るので、レポータータンパク質の高発現（それによる光放射の増加）が必要なときに有用である。
他方、組換えベクターは、ベクターおよび本発明の第１観点のＤＮＡ分子が細胞ゲノム中に統合されるように設計され得る。この統合は複製プラスミドに比して安定性が改善されるという利点を有する。この場合、標的を定めた統合（例えば、相同性組換えによる）をもたらすＤＮＡ配列が望ましい。例えば、Saccharomyces cerevisiaeの染色体ＩＶからのＨＯ遺伝子断片の組換えベクターへの組み込みは、Saccharomyces cerevisiaeまたはそれから誘導される細胞系における標的統合をもたらす。好ましくは、ＨＯ遺伝子の断片は、配列番号５として同定された配列を有するか、またはその誘導体である。統合組換えベクターの複数のコピーをゲノムに挿入するのも可能である。このことにより発現が大きくなり、信号出力がさらに増加する。例えば、リポソームＤＮＡ配置からの配列を用いて、染色体ＸIIに対してベクターを標的とし得る。
好ましい組換えベクターは、公知のＰＦＡベクターまたはその誘導体（Wach et al.（1994）Yeast 10, p1793-1808）から形成され得る。
本発明の第１観点の好ましいＤＮＡ分子は、ＰＦＡベクターから誘導されるＧＦＰまたはその光放射誘導体をコードするＤＮＡ配列を有する。
好ましい組換えベクターは、ＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ−ＲＡＤ５４、ｐＷＤＨ４４３およびｐＷＤＨ４４４であって、実施例に詳記する。本発明の第１観点の好ましいＤＮＡ分子は、ＧＦＰまたはその光放射誘導体をコードするＤＮＡ配列に操作的に連結したＲＡＤ５４調節エレメントを含み、その最も好ましい組換えベクターＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ−ＲＡＤ５４、ｐＷＤＨ４４３およびｐＷＤＨ４４４から誘導される。
組換えベクターＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ−ＲＡＤ５４は、配列番号１に示された配列またはその機能的類似体あるいは断片の調節エレメントを有する配列番号４に示された配列のベクターを含む。調節エレメントは、配列番号４に示された配列のベクターのＰａｃ１とＢａｍＨ１の制限酵素の間に挿入される。
好ましい組換えベクターｐＷＤＨ４４３は、配列番号５に対応するＨＯ遺伝子の断片を有するＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ−ＲＡＤ５４を含む。断片は、ＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ−ＲＡＤ５４の唯一のＢａｍＨ１部位に挿入されたものである。ｐＷＤＨ４４３は、Ｓ６５ＴＧＦＰをコードするＤＮＡを含み、酵母ゲノム中に統合され得る。
好ましい組換えベクターｐＷＤＨ４４４は、ｐＷＤＨ４４３のＢａｍＨ１およびＰｍｅ１消化からつくられた大きい断片と連結した２μプラスミドの断片を含む。２μプラスミドの断片は、プラスミドｐＲＤＫ２４９から放出された大きいＨｉｎｄIII／ＢａｍＨ１に精確に対応し得る。Johnson, A. W. and Kolodner, R. D.の文献（Journal Biological Chemistry, Volume 266, p14049（1991））の図１に記載されている。ｐＷＤＨ４４４中の２μプラスミドからのＤＮＡによって、この組換えベクターが宿主の細胞質基質において自律的に複製するのが可能となり、したがって組換えベクターが高い複製数で存在し得る（ＧＦＰの高発現および光放射能の増加が望まれるとき、利点である）。
他の好ましい組換えベクターは、ｙＥＧＦＰ−４４３およびｙＥＧＦＰ−４４４である（図１１および１２を参照）。
ｙＥＧＦＰ−４４３は、ｐＷＤＨ４４３から誘導され、Ｐａｃ１およびＡｓｃ１消化によりつくられたｐＷＤＨ４４３の大きい断片を、この大きい断片に連結した配列番号６（ＹＥＧＦＰをコードする）のＰａｃ１およびＡｓｃ１消化産物とともに含む。ｙＥＧＦＰ−４４３はＹＥＧＦＰをコードするＤＮＡを含有し、酵母ゲノムへの統合が可能である。
ｙＥＧＦＰ−４４４は、ｐＷＤＨ４４４から誘導され、Ｐａｃ１およびＡｓｃ１消化によりつくられたｐＷＤＨ４４４の大きい断片を、この大きい断片に連結した配列番号６（ＹＥＧＦＰをコードする）のＰａｃ１およびＡｓｃ１消化産物とともに含む。ｙＥＧＦＰ−４４４中の２μプラスミドからのＤＮＡは、この形質転換ベクターが宿主の細胞質基質中で自律的に複製するのを可能とし、よって組換えベクターが高い複製数で存在するのを可能にする（ＧＦＰの高発現および光放射能の増加を望むときに、利点となり得る）。
本発明の第３観点により、ＤＮＡ分子が細胞中に組み込まれる。宿主細胞は原核細胞または真核細胞である。適当な宿主細胞には、細菌、植物、酵母、昆虫および哺乳動物の細胞がある。好ましい宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiaeなどの酵母細胞である。酵母が好ましい理由は、酵母が細菌のように容易に操作でき、しかも真核細胞であり、したがって、その有するＤＮＡ修復系が細菌よりもヒトに密接に関連していることである。このように、本発明方法での該酵母の使用は、Ａｍｓ試験に関するＤＮＡ損傷を検出する方法を改善する。Ａｍｓ試験では細菌（Salmonella typhimurium株）を使用しており、推測ＤＮＡ損傷物質に接触すると遺伝毒性が生じ得る（陽性または陰性）。この結果は、原核細胞と真核細胞との差異のために、ヒトなどの真核細胞におけるＤＮＡ損傷物質の効果を必ずしも表すと限らない。
宿主として酵母細胞を用いる他の利点は、ヒトのＤＮＡ修復系が非常に構成的であるのと異なり、酵母では修復系が誘発されやすいことである。
好ましい酵母細胞には次のものがある。
（ｉ）半数体の形態のＹ４８５
（ii）半数体の形態のＹ４８６（ＦＦ１８９８４ともいう）
（iii）二倍体の形態のＹ４８５／Ｙ４８６
（iv）ＦＹ７３
（ｖ）ＹＬＲ０３０ｗα
（vi）Ｙ３００
これらの株は国立酵母株コレクションに存在する。
用いた酵母株の型がＤＮＡ損傷応答に影響を与えることがある。光放射が用いた酵母株により非常に変り得ることが分かった。この点について、上記の（ｉ）、（ii）、（iii）が本発明方法での使用に特に有用であることを見出した。
本発明のＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質の発現に用いられる宿主細胞は、不安定に形質転換される細胞（一過性体）の使用を予め除去したわけでないが、理想的に安定して形質転換される。
本発明の第３観点の形質転換細胞は、次の過程で形成される。ＰＦＡベクターは適当な出発材料として用いられて、本発明の第１観点のＤＮＡ分子および第２観点の組換えベクターが形成される。既知のＰＦＡベクターは、ＧＦＰまたはその誘導体をコードするＤＮＡを含有するか、あるいは含有するように操作できる。このようなベクターは既知の分子生物学技法で操作されて、ＧＦＰコード配列に近接の適当な調節エレメントを挿入し、本発明の第１観点のＤＮＡ分子を形成する。この分子は本発明の第２観点の組換えベクター内に含まれる。例えば、ｐＷＤＨ４４３、ｐＷＤＨ４４４、ｙＥＧＦＰ４４３、ｙＥＧＦＰ４４４がＰＦＡベクターから誘導される。ＤＮＡ分子が組換えベクターから切除され、より好ましくは、組換えベクター中に含有されたＤＮＡ分子が用いられて、細胞を形質転換し、それによって本発明の第３観点の細胞を形成する。この細胞は理想的には酵母である（例えば、上記した株のひとつ）。この形質転換細胞が本発明の第４観点の方法で用いられて、ある物質がＤＮＡ損傷を誘発または増加するかどうかが検査される。ＧＦＰ発現がＤＮＡ損傷に応じて誘発され、ＧＦＰにより放射された光がＤＮＡ損傷生成の指標として蛍光計で容易に測定される。例えば、ＤＮＡ損傷に応じて５１１ｎｍでＧＦＰにより放射された光（４７５と４９５ｎｍ間、例えば４８８ｎｍでの刺激後）は、確定数の全細胞の懸濁液において、あるいは切断後に細胞から放出される確定数の物質から、検査される。
ＤＮＡ損傷を検出する多くの既知方法（Ａｍｅｓ試験および関連方法を含む）では、終末点として最後に残ったＤＮＡ損傷が、誤修復ＤＮＡ（変異および組換え）の形態か、断片化ＤＮＡ形態の非修復損傷かで検定される。しかし、大部分のＤＮＡ損傷は終末点を測定し得る前に修復されので、条件が非常に厳しくて修復メカニズムが飽和しているときにのみ、最後に残るＤＮＡ損傷が起きる。本発明の第４観点の好ましい方法は、上記終末点に到達するのを防ぐ修復活性を検出するので（実際のＤＮＡ損傷が検出できないときに、検出可能なことを本発明で見出した）、既知方法よりも感度が非常によい。従って、本発明の第４観点の方法を用いると、ＤＮＡ損傷物質またはＤＮＡ損傷強化物質の存在が、現存のＤＮＡ損傷を検出し得る値よりも低い濃度で検出される。
本発明の第４観点の方法は、低濃度でＤＮＡ損傷を誘発する物質を検出するのに特に有用である。この方法を用いると、薬剤や食品添加物、化粧品などになり得る化合物を選別したり、生物、特にヒトがこのような化合物に接触したときに安全かどうかを判定したりできる。
他方、本発明の第４観点の方法は、水の供給源がＤＮＡ損傷物質またはＤＮＡ損傷強化物質により汚染されていないかを調べるのに用いられる。例えば、この方法を用いると、汚染に接触するヒトや他の生物においてＤＮＡ損傷を増加するような汚染原の存在に関して産業廃棄物を監視することができる。
この方法で水の供給源が汚染しているかどうか調べる場合、本発明の第３観点の細胞は理想的には、細菌、藻類、原虫類および特に酵母などの単細胞生物である。
光放射レポータータンパク質の発現は、細胞抽出物（この場合、上記の組換えＤＮＡ分子および／または組換えベクターで形質転換された細胞が使用され得る）から、あるいは無傷の全細胞を含有するサンプル（この場合、ｙＥＧＦＰ４４３およびｙＥＧＦＰ４４４形質転換酵母細胞の使用が好ましい）から、本発明の方法により監視される。
全細胞の使用に関連するいくつかの利点がある。細胞を切開する必要がないので、処理工程数が減少する。抽出物をつくるには、細胞採取、洗浄、ガラスビードでの切断、抽出物の遠心分離が必要となる。処理工程数の減少は、誤操作の危険性を減らしたり、方法を速めたりする。さらに、細胞密度と光放射が同時になされ得るので、より大きい感度が得られる。従って、本発明の方法の好ましい実施は、本発明の第２観点の組換えベクター（ｙＥＧＦＰ−４４３またはｙＥＧＦＰ−４４４など）で形質転換された細胞を生育することであり、ＤＮＡ損傷を起こすかもしれない物質を予め定めた時間内でインキュベートし、細胞サンプルから直接的に光放射レポータータンパク質の発現を監視することである。
全細胞が使用されるとき、低い蛍光の生育培地に含有されるのが好ましい。これにより測定前に細胞を洗浄する必要がなくなり、さらに工程数が減少する。例えば、本発明の第３観点の好ましい酵母は、Ｆ１培地（Walmsley et al.（1983）Mol. Gen. Genet. 192 p361-365に記載）で生育し得る。
本発明方法の好ましい観点により、ＦＦ１８９８４細胞をｙＥＧＦＰ４４４で形質転換し、Ｆ１培地で生育できる。推測ＤＮＡ損傷物質（例えば、食品添加物、可能性ある薬剤、水サンプルまたは廃棄物サンプル中に含有の物質）を細胞含有のＦ１培地に加える。細胞を一定の時間生長せしめた後、サンプルの細胞を取り、それからの蛍光を測定する。この測定の実施では、サンプル中の細胞の濃度と蛍光を比濁計（光散乱）で検査する。例えば、細胞を６００ｎｍで照明し、散乱光（６００ｎｍで）を入射ビームに対し９０度で検査する。ＧＦＰが放射した光は、４９５ｎｍでの励起により測定し、５１８ｎｍで放射された光を入射ビームに対し９０度で測定する。両方の測定が単一のクベットでできる。基準化した光放射は、ＧＦＰ蛍光値を全細胞の光散乱値（６００ｎｍで）で割ることにより計算される。本発明のこの実施には、最少の工程（直接の蛍光測定に続くインキュベーション）で容易になし得るという利点がある。
本発明方法では理想的には、感度のよい蛍光計を用いて、光放射がレポータータンパク質から精確に測定できるように光散乱を低下すべきである。本発明において、感度の改善は、蛍光計のサンプル室と放射検出器との間に置かれた４９５ｎｍフィルターでなすことができる。このようなフィルターは、光散乱の影響をさらに低下し、全細胞含有のサンプルが使用されたときの方法の感度を改善する。
本発明を添付の図を参照して実施例の形で記述する。
図１は、ＲＡＤ５４プロモーターをコードするＤＮＡの模式図で、実施例１で使用されたＰＣＲプライマーがＤＮＡに結合している。
図２は、ＲＡＤ５４プロモーターをコードするＤＮＡの模式図で、実施例１の１．１に記載のようにＰＣＲ増幅で調製される。
図３は、本発明のＤＮＡ分子の調製において実施例１で用いられるＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ構築体の模式図である。
図４は、本発明のＤＮＡ分子を組み込む実施例１のＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ−ＲＡＤ５４組変えベクターの模式図である。
図５は、本発明のＤＮＡ分子を組み込む実施例１のｐＷＤＨ４４３組変えベクターの模式図である。
図６は、本発明のＤＮＡ分子を組み込む実施例１のｐＷＤＨ４４４組変えベクターの模式図である。
図７は、本発明の第３観点の細胞がＤＮＡ損傷物質に接触したときに、細胞中で蛍光の増加が生じることを示すグラフである。
図８は、ｐＷＤＨ４４４で形質転換された細胞についてＤＮＡ損傷物質により明度が促進される時間過程を示すグラフである。
図９は、ｐＷＤＨ４４３で形質転換された細胞についてＤＮＡ損傷物質により明度が促進される時間過程を示すグラフである。
図１０は、ｐＷＤＨ４４４で形質転換された細胞からの抽出物についてＤＮＡ損傷物質による細胞抽出物の明度に対する異なる濃度でのＤＮＡ損傷物質の効果を示すグラフである。
図１１は、本発明のＤＮＡ分子を組込んだ実施例３のｙＥＧＦＰ４４３組換えベクターの模式図である。
図１２は、本発明のＤＮＡ分子を組込んだ実施例２のｙＥＧＦＰ４４４組換えベクターの模式図である。
図１３は、形質転換されていない酵母細胞およびｙＥＧＦＰ４４４で形質転換された酵母細胞について−／＋０．０１％ＭＭＳでの放射スペクトルを示すグラフである。
実施例１
１．１方法
１．１．１  ＲＡＤ５４プロモーターをコードするＤＮＡの調製
ＲＡＤ５４遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を調製し、図２に模式的に示す。
ＲＡＤ５４遺伝子は酵母Saccharomyces cerevisiaeの染色体ＶＩＩに位置する。Saccharomyces cerevisiaeの全ゲノムの配列は、パブリックデータベースから利用可能である。例えば、Saccharomyces cerevisiaeゲノムデータベースは、htp://genome-www.stanford.edu/のようなサイトにおいてインターネットでアクセスし得る。目的のＲＡＤ５４遺伝子および調節エレメントを含む染色体ＶＩＩの適当な領域は、塩基１９３７１０−１９８１４１にある。
ＲＡＤ５４遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片は、ＲＡＤ５４開始コドン（ＡＴＧ）と隣りの遺伝子（ＳＵＴ１）との間のＲＡＤ５４の上流非コーディング領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅することにより調製した。この領域は１７２９塩基対にわたり、ＲＡＤ５４調節（即ち、調節エレメント）に含まれることが知られている全配列を含む。この領域は配列番号１をコードしている。
ＰＣＲ増幅は、配列表の配列番号２および配列番号３にそれぞれ特定されているＢＡＭ５４および５４ＰＡＣと呼ばれる２つのＰＣＲプライマーを用いて、行った。
ＢＡＭ５４には以下の３１塩基を含む：
0004163757.tif 000002
塩基ggatccを含むようにＢＡＭ５４を設計し、ＢＡＭ５４が所望のＤＮＡ断片に結合し得るために、ＰＣＲ産物にはＢａｍＨＩ制限酵素部位およびＳＵＴ１遺伝子の後の最初の２０塩基に相当する塩基gacatacgatgacctcaatgを含むようにした。
５４ＰＡＣには以下の４４塩基を含む：
0004163757.tif 000003
塩基ttaattaaを含むように５４ＰＡＣを設計し、５４ＰＡＣが望ましいＤＮＡ断片と結合し得るために、ＰＣＲ産物にはＰａｃ１制限酵素部位、ＲＡＤ５４遺伝子の最初の２７上流塩基に相当する塩基cagttataaggaaatatatatggtaccを含むようにし、５’塩基cctccgを加えて、Ｐａｃ１により導入部位で切断されるようした。プライマー５４ＰＡＣは増幅した断片のアンチセンス鎖を形成するので、本発明の第１観点のＤＮＡ分子のレポータータンパク質を最終的にコードする５４ＰＡＣ内の塩基は“アンチセンスコドン”であり、塩基catを導入して、本発明の第２観点の組換え体ベクターの開始コドンとして作用するアミノ酸メチオニンを加えた。塩基cctccgttaattaacatもまた“アンチセンス”コーディング配列である。
図１は、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片（１）の５’および３’部分を模式的に表わし、プライマーＢＡＭ５４（２）および５４ＰＡＣ（３）が断片に結合する場所を示している。図１は、さらにＰＣＲ増幅断片（１）に導入したＢａｍＨＩ制限酵素部位（４）およびＰａｃ１部位（５）を示す。転写開始、ＲＡＤ５４プロモーターにより発現するタンパク質の最初の５アミノ酸のコドンおよび転写の方向も示す。
ＰＣＲ増幅に続いて、ＲＡＤ５４プロモーターをコードするＤＮＡをＰＦＡベクターに挿入し、本発明の組換え体ベクターを形成した（１．３参照）。
１．１．２  ＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ構築体
ＰＦＡベクターを用い本発明の組換え体ベクターを構築した。ＰＦＡプラスミドシリーズは、以前から公開されている（Wach et al.,（1994）Yeast 10 p1793-1808）。
プラスミドＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰは、既知プラスミドＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３（Wach et al.の1797頁、図１Ｂ参照）から得た。発明者により使用されたプラスミドにおいて、ＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３のｌａｃＺ配列をＧＦＰ配列で置換して、ＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰを作成した。ＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰの配列は、配列番号４として添付する（図３参照）。
ＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰは、ＧＦＰのＳ６５Ｔ誘導体をコードするＤＮＡ配列を含む。この誘導体はＧＦＰ遺伝子の転写開始コドンの直後にＰａｃ１部位を有する。Ｓ６５ＴをＰａｃ１／Ａｓｃ１断片としてベクターに挿入した。ＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰはまた、カナマイシン耐性を供与し得る遺伝子をコードするＤＮＡ（２６８９ｂｐ）を含む。
１．１．３  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ−ＲＡＤ５４構築体（図４参照）
ＲＡＤ５４プロモーター（１．１参照）およびＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ（１．２参照）をコードするＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰａｃ１で処理した。次いで、ＲＡＤ５４プロモーター（ＢａｍＨＩおよびＰａｃ１接着末端を有する）をコードするＤＮＡを、Ｓ６５Ｔコーディング配列に隣接する特有のＢａｍＨＩとＰａｃ１部位の間の直鎖状ＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰに連結することにより、ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ−ＲＡＤ５４構築体を作成した。また、クローニングを簡単にするために、ＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰをＳｍａＩで処理した。ＰＦＡ  ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰのＳｍａＩ部位は、ＢａｍＨＩとＰａｃ１と間に位置し、それゆえＳｍａＩ処理によりベクターの再環状化を防止する。Ｐａｃ１部位は“フレーム内”存在し、そのためＳ６５Ｔ遺伝子が転写され得る。
１．１．４  ｐＷＤＨ４４３構築体
ＫＡＮＭＸ３ＧＦＰ−ＲＡＤ５４構築体は、特有のＢａｍＨＩ部位で切断し、次いでＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ１）および子ウシ腸ホスファターゼで処理して、平滑末端および自己連結し得ない末端を作成した。次いで、ＨＯ遺伝子のＤｒａＩ断片（配列番号５参照）を、処理したＫＡＮＭＸ３１−ＲＡＤ５４構築体の平滑末端の間に連結し、ｐＷＤＨ４４３構築体を形成した。
ＨＯ遺伝子は酵母の染色体の染色体ＩＶにみられ、配列はSaccharomyces cerevisiaeのゲノムデータベースに所持されている。データベースは、パブリックドメイン内にあって、多くのサイトにおいてインターネットによりアクセスし得る。例えばhttp://genome-www.stanford.edu/。
ＨＯ遺伝子のＤｒａＩ断片は、配列番号５の塩基７１１-７１６のＢａｍＨＩ部位を含み、相同挿入の既知技術によって構築体の酵母ゲノムへの挿入促進に使用した。
ｐＷＤＨ４４３構築体はＢａｍＨＩで切断し、Ｇ４１８選択（カナマイシン誘導体）で酵母（Ｙ４８５／４８６）の形質転換に使用できる。形質転換を既知の酢酸リチウム法で行った
（http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/human_genetics/gietz/Trafo.html参照）。
ｐＷＤＨ４４３構築体はＨＯ配座において酵母ゲノムに挿入する。ｐＷＤＨ４４３は本発明の第２観点の好ましい組換え体ベクターであり、ｐＷＤＨ４４３で形質転換した細胞は本発明の第３観点の好ましい細胞である。
１．１．５  ｐＷＤＨ４４４構築体（図６参照）
次いで、ｐＷＤＨ４４４構築体を（ｐＷＤＨ４４３を操作することにより）発展させ、多コピーとして存在する酵母宿主内で構築体を複製できた。このことをするために、天然に生ずる酵母２μプラスミド由来のシス作用性複製因子をコードする配列を含むＤＮＡ断片（一方を平滑とし、他方をＢａｍＨＩ切断する）と、酵母ＵＲＡ３遺伝子（ウラシル要求性）と、複製能（ＯＲＩ）およびアンピシリン耐性（ＡＭＰｒ）を構築体に供与（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて維持するとき）する細菌性プラスミドｐＢＲ３２２配列とを、ＢａｍＨＩおよびＰｍｅ１で切断したｐＷＤＨ４４３に挿入した。この切断によりＮｏｔＩ部位を含むｐＷＤＨ４４３の断片を除去した。連結混合物をＮｏｔＩで形質転換前に切断して、ｐＷＤＨ４４３の再環状化を防止した。ＨＯ断片内のＢａｍＨＩ部位（上記参照）およびＨＯ断片はｐＷＤＨ４４４内でトランケートされる。
酵母２μオリジン（origin）、ＵＲＡ３遺伝子、ｐＢＲ３２２ＯＲＩ配列およびアンピシリン耐性に相当する配列を含む２μプラスミド断片は、幾つかのプラスミドで隣接する断片である（例えばＹｅｐ４２０と名づけられたシャトルベクター）。発明者らが使用した２μプラスミド断片は、プラスミドｐＲＤＫ２４９から得られた大きなＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩ断片に正確に相当する。プラスミドｐＲＤＫ２４９は、Johnson, A.W. and Kolodner, R,D.の論文、Journal Biological Chemistry, Volume 266, p14049, Figure 1（1991）に記載されている。特に、プラスミドを最初にＨｉｎｄIIIで切断し、次いでＤＮＡポリメラーゼ１で処理して、平滑末端を作成した。次いで、プラスミドをＢａｍＨＩで処理し、一方が平滑であり他方がＢａｍＨＩ末端である断片を作成した。この断片を電気泳動により精製した。
ｐＷＤＨ４４４構築体を用いて、酵母を形質転換し（ｐＷＤＨ４４３で述べたように）、ウラシル要求性（ＵＲＡ３）またはＧ４１８（カナマイシン）耐性の何れかで選択すると、ｐＷＤＨ４４４構築体を酵母で自己複製できた。ｐＷＤＨ４４４は本発明の第２観点の好ましい組換え体ベクターであり、ｐＷＤＨ４４４で形質転換した細胞は本発明の第３観点の好ましい細胞である。
１．２  蛍光検出実験
酵母細胞由来のＧＦＰが５１１ｎｍ（４８８ｎｍでの励起後）で放射する光を蛍光計で測定した。酵母細胞はｐＷＤＨ４４３およびｐＷＤＨ４４４で形質転換し、ＧＦＰを発現する細胞である。測定は、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）のようなＤＮＡ損傷を誘発することが知られる化合物の非存在（対照）または存在下で行った。サンプルは細胞全体としてまたは細胞抽出物としてアッセイした。
１．２．１  株および成長条件
この実施例では、半数体の酵母株Ｙ４８５およびＹ４８６または二倍体の酵母Ｙ４８５／４８６を用いた（上記参照）。
培地は、ＹＰ＋２％グルコース（ＹＰＤ）および合成培地＋２％グルコース（ＳＤ）をKaiser et al.（1994）（Methods in Yeast Genetics Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, NY:Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, NY）に記載のように調製した。
１．２．２．  蛍光アッセイ
ＳＤ培地で増殖した細胞の定常期の培地を接種源として用いた。細胞のアリコート（３０μｌ）を１５ｍｌ試験管中のＳＤ３ｍｌに接種した。次いで、半分の試験管を０．０１％ＭＭＳで満たした（残りの試験管を対照として残した）。試験管を１２０ｒｐｍのシェーカーで１６時間２５℃でインキュベートし、次いで、攪拌を維持しながら氷冷ボックスに移した。次いで、細胞を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、遠心により（１０ｓ）回収し、２回滅菌水で洗浄し、２５０μＬの抽出緩衝液に再懸濁した。
全体的な細胞蛍光測定のために、洗浄した細胞を滅菌水２．７５ｍｌの入ったクベットに直接移した。
細胞抽出物の試験のために、直径４００−６００ｎｍのガラスビーズ１００μｌを細胞のチューブに加え、次いでBIO 101 Fastprep FP120に移し、機械的に細胞を破砕した。３０ｓの遠心の後、上清を滅菌チューブに移した。ビーズのペレットを更に抽出緩衝液２５０μｌで洗浄し、前記の抽出物の上清に添加した。次いで、水３００μｌ中のプール抽出物２００μｌをクベットに移した。
蛍光測定は、Perkin Elmer LS50 Fluorescence Spectrometerで行った。励起および放射波長をそれぞれ４８８ｎｍおよび５１１ｎｍに設定し、１０ｎｍのスリット幅とした。細胞数／タンパク質抽出効率の変化量を補正するため、光吸収は各クベットで６００ｎｍ（全細胞について）または２８０ｎｍ（抽出物について）の何れかで測定した。次いで、蛍光計から得られた蛍光値を吸収値で割ると、“明度値”即ち、サンプル濃度とは独立した任意単位が得られる。詳細を扱う他のデータを文書等において取り扱う。
１．２．３  結果
ｐＷＤＨ４４３形質転換酵母について、接合型（Ｙ４８５およびＹ４８６）および二倍体（Ｙ４８５／４８６）の両方で、０．００２％および０．０１％ＭＭＳにさらすと蛍光が統計学的に有意の増加を示した。
図７に示すように、ｐＷＤＨ４４３形質転換酵母（Ｙ４８５、Ｙ４８６および二倍体［Ｙ４８５／Ｙ４８６］）は、ＤＮＡ損傷剤ＭＭＳ（Ｙ４８５ｉ、Ｙ４８６ｉおよび二倍体ｉ）の存在下で、やはりＭＭＳにさらした非形質転換細胞（Ｙ４８５、Ｙ４８６および二倍体）と比較すると、明度も増加を示した。
蛍光は０．０５％ＭＭＳで誘導後１時間で増加し始めた。図８および図９は、ｐＷＤＨ４４４（Ｙ４８６ｐ+ｍｍｓ）またはｐＷＤＨ４４３（Ｙ４８６ｉ+ｍｍｓ）でそれぞれ形質転換した半数体酵母株Ｙ４８６におけるＭＭＳによる明度誘導の時間的推移を示している。非形質転換細胞（Ｙ４８６+ｍｍｓ）におけるＭＭＳ効果および非処理細胞（Ｙ４８６、Ｙ４８６ｐおよびＹ４８６ｉ）における明度も示す。
図１０により、０．０２％および０．０５％ＭＭＳがｐＷＤＨ４４４（Ｙ８６ｐ）でトランスフェクトした二倍体酵母株Ｙ４８６において蛍光を増加するが、非形質転換の細胞（Ｙ４８６）では有意の効果を示さないことが判る。ＳＤＳは、ＧＦＰからの蛍光をなくするための対照として添加した。
非形質転換の酵母細胞ならびにｐＷＤＨ４４３およびｐＷＤＨ４４４で形質転換した酵母細胞に由来するタンパク質抽出物は、抗ＧＦＰ抗体を用いて、ウエスタンブロット分析に使用した。ＧＦＰは、非形質転換細胞おいて検出されず、非誘導の形質転換細胞において低いレベルで検出されるのみであった。しかしながら、ｐＷＤＨ４４３またはｐＷＤＨ４４４で形質転換した酵母細胞がＭＭＳで誘導されるとき、ＧＦＰ抗体結合が相当増加した。この増加は、測定した蛍光に比例するので、蛍光の増加がＲＡＤ５４プロモーターを誘導するＤＮＡ損傷と、その後のＧＦＰ発現に起因するものであることを明らかにした。
これらのデータにより、ｐＷＤＨ４４３およびｐＷＤＨ４４４で形質転換した酵母はＤＮＡ損傷剤の存在下、蛍光（５１１ｎｍ）の放射を増大することが判る。従って、ｐＷＤＨ４４３およびｐＷＤＨ４４４は、本発明の第２観点から非常に好ましい組換え体ベクターであり、ｐＷＤＨ４４３およびｐＷＤＨ４４４で形質転換した酵母は、本発明の第３観点から非常に好ましい細胞である。これらの形質転換酵母細胞は本発明の第４観点の方法による使用に非常に適切であるが、また、他の組換え体ベクターも本発明の第２観点から構築され、その他の組換え体ベクターで形質転換した細胞が本発明の範囲内に入ることがわかる。
ｐＷＤＨ４４３およびｐＷＤＨ４４４で形質転換した細胞は、薬剤、食品添加物または化粧品等になり得る化合物をスクリーニングする手段として本発明の第４観点による方法において使用し、生物、特にヒトがその化合物に接触したときに安全であるかどうかを評価することができ、また、この細胞を、水源がＤＮＡ損傷剤またはＤＮＡ損傷を増大する物質により汚染されているかどうかの検出に、使用することができる。
実施例２
組換え体ベクターｙＥＧＦＰ−４４４を作成し、酵母細胞の形質転換に使用した。この細胞はＤＮＡ損傷剤（ＭＭＳ）に応答してＹＥＧＦＰを発現した。
２．１  方法
２．１．１  株および増殖条件
この実験に使用する酵母株：
（ｉ）ＦＦ１８９８４（MATα leu2-3、112ura3-52 lys2-I his7-I）
（ｉｉ）ＹＬＲ０３０ｗα（ＭＡＴα his3Δ200 ura3-52）
使用した培地は、１．２．１に記載したのと同じであった。
２．１．２  ＤＮＡ構築体
ｐＷＤＨ４４４（実施例１参照）の分子設計によって、ＧＦＰのＳ６５Ｔ誘導体をＹＥＧＦＰ遺伝子（Cormack et al., 1997 supra）で単に置換し、好ましい組換え体ベクターｙＥＧＦＰ-４４４を作成した（図１２参照）。
フランキングＰａｃ１およびＡｓｃ１制限酵素部位を加えたプライマーを用いてＹＥＧＦＰをＰＣＲ増幅すると、配列番号６のＰＣＲ産物を得た。次いで、このＰＣＲ産物をＰａｃ１およびＡｓｃ１で切断した。
Ｓ６５Ｔ ＧＦＰ遺伝子を、Ｐａｃ１およびＡｓｃ１で切断することによりｐＷＤＨ４４４から得て、ゲル電気泳動を使用し残存するベクター断片（即ち、大きな断片）を精製した。
次いでＰＣＲ産物の、より大きなＰａｃ１およびＡｓｃ１断片をｐＷＤＨ４４４の大きな断片に連結し、ｙＥＧＦＰ−４４４を作成した。
２．２  蛍光検出実験
２．２．１  蛍光アッセイ
細胞全体におけるＧＦＰ蛍光の評価は、基本的には１．２（上記）に記載の通り行った。
２．２．２  結果
プラスミドｙＥＧＦＰ−４４４で形質転換した細胞からの光の出力は、ｐＷＤＨ４４３またはｐＷＤＨ４４４で形質転換した細胞よりもさらに大きかった。実際、表１から、ｐＷＤＨ４４４で形質転換したＦＦ１８９８４と比べてｙＥＧＦＰ−４４４で形質転換したＦＦ１８９８４からは２倍を超える光が出力していることが判る。
0004163757.tif 000004
光産物（ＤＮＡ損傷に応答する）を本発明の第４観点の細胞から得られる細胞抽出物より測定するとき（ノイズに対する良好なシグナルの割合が得られるために）、ｐＷＤＨ４４３およびｐＷＤＨ４４４は、本発明の方法による使用に適当であることが分かる。ｐＷＤＨ４４３およびｐＷＤＨ４４４は、光散乱の影響を部分的に受けて全細胞測定について制限された使用となる。ＧＦＰ評価に使用する励起（４７５-４９５ｎＭ）と放出（約５１２ｎＭ）の波長の間には僅かな違いしかない。高感度の分光光度計と共にｙＥＧＦＰ−４４４を用いると、蛍光スキャンにおいて正確に位置するショルダーとしてのＧＦＰシグナルを見ることができる。
図１３は、ＦＦ１８９８４細胞の０．２ＯＤ６００単位放射スペクトル（４８８ｎｍで励起）を示す。細胞は、非形質転換細胞およびｙＥＧＦＰ−４４４で形質転換した細胞であり、それぞれ−／＋０．０１％ＭＭＳで処理した。細胞を蒸留水で２回洗浄し、１×ＴＥおよび更には希釈液で再懸濁した。最も低いスペクトルは、ＭＭＳで処理した非形質転換細胞の蛍光測定を示し、その次のスペクトルは、ＭＭＳで処理していない非形質転換細胞を示す。真中のスペクトルは、ＭＭＳで処理していない、ｙＥＧＦＰ−４４４構築体での形質転換ＦＦ１８９８４細胞を示し、さらに、その上のスペクトルは、同じ形質転換細胞をＭＭＳで損傷させたときのスペクトルを示す。
他の実験を行い、アッセイを精密にした。光散乱の影響をさらに少なくするために、４９５ｎｍフィルターをサンプル室と放射検出機の間に導入した。これにより、機械の感度が向上し、非誘導細胞と誘導細胞の違いは細胞抽出物で得られた違いと同様となった。さらに細胞をＦ１培地（上述）で増殖させると、分光光度計に移す前に細胞サンプルを洗浄する必要がなくなった。
また、本発明でなした実験によって、本発明の第３観点の細胞からの光出力は、ＤＮＡ損傷に特異的であり、細胞周期表現型に特異的でないことがわかる。これら実験は、形質転換細胞をヒドロキシ尿素およびノコダゾール（nocodazole）にさらすことを含み、この２つの物質は相違する方法で有糸分裂を遅延させ得る。ヒドロキシ尿素は、２段階でＤＮＡ合成を阻害する：リボヌクレオチドレダクターゼを阻害して、ＤＮＡ合成の前駆体の提供を制限し、そして、ＤＮＡバックボーンにおけるニック（シングルストランドブレイク）の修復に応答する酵素であるＤＮＡリガーゼを阻害する。対照的に、ノコダゾールは、微小管形成を阻害して、有糸分裂の間の通常の染色体の分離を防ぐことによって細胞増殖を根本的に阻止する。これら２つの化学物質がＭＭＳ処理において同程度に細胞増殖を阻害する濃度では、ＧＦＰレポーター遺伝子の誘導の検出ができなかった。このことは、細胞周期とは関係なしに、光放射が、ＲＡＤ５４プロモーターの活性化を誘導するＤＮＡ損傷によってもたらされることを示す。
実施例３
ｐＷＤＨ４４３（実施例１参照）の分子設計も開発でき、ＧＦＰのＳ６５Ｔ誘導体をＹＥＧＦＰ遺伝子で単に置換すると、好ましい組換え体ベクターｙＥＧＦＰ−４４３（図１１参照）を作成し得る。
ｐＷＤＨ４４４の代わりにｐＷＤＨ４４３を用いること以外は、実施例２に記載した方法に従い、ｙＥＧＦＰ−４４３を作成し得る。
ｙＥＧＦＰ−４４３で形質転換した細胞はまた、本発明の方法の使用に有用である。
ｙＥＧＦＰ−４４４およびｐＷＤＨ４４４で形質転換した細胞は、検出用に抽出物を作成するために細胞を破砕する必要がなく、ＤＮＡ損傷の検出に特に有用である。ＹＥＧＦＰ遺伝子、感受性宿主株（例えばＦＦ１８９８４）、低い蛍光培地（例えばＦ１）、および所望により検出装置内の光散乱の制限（例えば４９５ｎｍフィルターを用いる）の組み合わせにより、細胞抽出物の時間がかかる複雑なアッセイが取り除かれ、全細胞を含むサンプルの測定が可能となる。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：ザ・ユニバーシティ・オブ・マンチェスター・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー
（Ｂ）通り：ポスト・オフィス・ボックス８８
（Ｃ）市：マンチェスター
（Ｄ）州：グレーター・マンチェスター
（Ｅ）国：イギリス
（Ｆ）郵便番号（ZIP）：Ｍ６０  １ＱＤ
（ii）発明の名称：ＤＮＡ損傷物質の検出
（iii）配列の数：５
（iv）コンピューター読み取り可能形式：
（Ａ）媒体形：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ互換性
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0、Version#1.30(EPO)
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：１７２９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列番号１の記載：
0004163757.tif 000005
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：３１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列番号２の記載：
0004163757.tif 000006
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：４４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：YES
（xi）配列番号３の記載：
0004163757.tif 000007
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：５９０２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：N0
（xi）配列番号４の記載：
0004163757.tif 000008
0004163757.tif 000009
0004163757.tif 000010
0004163757.tif 000011
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：９０９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列番号５の記載：
0004163757.tif 000012
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：７５６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列番号６の記載：
0004163757.tif 000013
【図１】
0004163757.tif 000019
【図２】
0004163757.tif 000020
【図３】
0004163757.tif 000021
【図４】
0004163757.tif 000022
【図５】
0004163757.tif 000023
【図６】
0004163757.tif 000024
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0004163757.tif 000029
【図１２】
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【図１３】
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