(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下記の工程を含み、真核生物における疾患もしくは症状またはその段階に特徴的なパターンを調製するための遺伝子転写産物パターンプローブキットを調製する方法：
ａ）1以上の正常な真核生物の血液（正常サンプル）からmRNAを単離する工程；
ｂ）問題の疾患もしくは症状またはその段階を有する、工程a)の1以上の生物の血液を、当該の疾患もしくは症状またはその段階の問題の部位から遠方にある該生物体の部分から得て、該血液（罹患サンプル）からmRNAを単離する工程；
ｃ）工程ａ）およびｂ）のmRNAを分離して、さらにはこれをcDNAに逆転写してもよい工程；
ｄ）正常サンプルおよび罹患サンプル中に異なったレベルで存在する２以上のmRNA種またはcDNA種を、mRNA種またはcDNA種の各々に対応するシグナルを同定することにより選択する工程；
ｅ）工程ｄ）において同定されたmRNA種またはcDNA種を単離する工程；および
ｆ）工程ｅ）のmRNAまたはcDNAのプローブを１以上の固体支持体上に固定化する工程。
【請求項２】
工程e）の前記mRNA種またはcDNA種が、工程ｆ）における固定化に先立って増幅されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の工程ｃ）における単離が非配列ベースの分離技術により実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかによって単離できる２以上のプローブが、１以上の固体支持体上に固定化されることを特徴とする、真核生物における疾患もしくは症状またはその段階を診断し、または同定するための遺伝子転写産物パターンプローブキットを調製する方法。
【請求項５】
前記プローブが前記の1以上の固体支持体上に固定化される前に増幅されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）およびｂ）、あるいはｄ）およびe）のmRNAが、ｃDNAに逆転写されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ｃDNAが増幅されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）およびｂ）のmRNAから生成された前記cDNAが標識を取り込んでいることを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
10〜500個のmRNAまたはcDNAプローブが単離されることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
50〜100個のmRNAまたはcDNAプローブが単離されることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記分離技術がゲル電気泳動であることを特徴とする請求項１〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも下記の工程を含み、真核生物における疾患もしくは症状またはその段階の特性を示す標準診断用遺伝子転写産物パターンを調製するための方法：
ａ）疾患もしくは症状またはその段階を有する1以上の前記生物の血液を、当該の疾患もしくは症状またはその段階の問題の部位から遠方にある該生物体の部分から得て、該血液から、mRNAを単離し、さらにはこれをcDNAに逆転写してもよい工程；
ｂ）請求項１〜11のいずれかの方法により遺伝子転写産物パターンプローブキットを調製する工程、ここでそのキットの該プローブは調査下の生物に対応して１の生物の血液における前記疾患もしくは症状またはその段階に特異的であり；
ｃ）工程ｂ）で調製された該キットに、工程ａ）のmRNAまたはcDNAをハイブリダイズさせる工程；および
ｄ）前記固体支持体（１以上）上の前記プローブの各々にハイブリダイズして、前記プローブに対応する１以上の選択された遺伝子の疾患、症状またはその段階を有するサンプルにおける遺伝子発現を反映する特性的パターンを生成させるmRNAまたはcDNAの量を評価する工程。
【請求項１３】
少なくとも下記の工程を含み、真核生物から患者に特異的な遺伝子転写産物パターンを調製するための方法：
ａ）疾患もしくは症状またはその段階を有する、1以上の前記生物の血液を、当該の疾患もしくは症状またはその段階の問題の部位から遠方にある該生物体の部分から得て、それらの血液から、mRNAを単離し、さらにはこれをcDNAに逆転写してもよい工程；
ｂ）請求項１〜11のいずれかの方法により遺伝子転写産物パターンプローブキットを調製する工程、ここでそのキットの該プローブは調査下の生物に対応して１の生物の血液における前記疾患もしくは症状またはその段階に特異的であり；
ｃ）工程ｂ）で調製された該キットに、工程ａ）のmRNAまたはcDNAをハイブリダイズさせる工程；および
ｄ）前記固体支持体（１以上）上の前記プローブの各々にハイブリダイズして、前記プローブに対応する１以上の選択された遺伝子の疾患、症状またはその段階を有するサンプルにおける遺伝子発現を反映する特性的パターンを生成させるmRNAまたはcDNAの量を評価する工程。
【請求項１４】
工程ａ）およびｂ）の前記mRNAが、cDNAに逆転写されることを特徴とする請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
前記のmRNAまたはcDNAが標識を取り込んでいることを特徴とする請求項12または13に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｃDNAが増幅されることを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
生物における疾患もしくは症状またはその段階の同定用または診断用の臨床データを提供するための標準診断用遺伝子転写産物パターンの使用方法であって、請求項12、14〜16のいずれかに従って標準診断用遺伝子転写産物パターンを調製する工程を少なくとも含むことを特徴とする使用方法。
【請求項１８】
少なくとも下記の工程を含み、真核生物における疾患もしくは症状またはその段階を診断し、または同定するための臨床データを提供する方法：
ａ）前記生物の血液を、当該の疾患もしくは症状またはその段階の問題の部位から遠方にある該生物体の部分から得て、それらの血液からmRNAを単離し、さらにはこれをcDNAに逆転写してもよい工程；
ｂ）請求項１〜11のいずれかの方法により遺伝子転写産物パターンプローブキットを調製する工程、ここでそのキットの該プローブは調査下の生物に対応して１の生物の血液における前記疾患もしくは症状またはその段階に特異的であり；
ｃ）工程ｂ）で調製された該キットに、工程ａ）のmRNAまたはcDNAをハイブリダイズさせる工程；
ｄ）前記固体支持体上で前記プローブの各々にハイブリダイズして、前記プローブに対応する１以上の選択された遺伝子の遺伝子発現を反映する特性的パターンを生成させるmRNAまたはcDNAの量を評価する工程；および
e）調査下の前記疾患もしくは症状またはその段階を有する調査下の前記生物に対応する1以上の生物からの血液を用いて、請求項12、14〜16のいずれかに従って標準診断用遺伝子転写産物パターンを調製すること、次いで該標準診断用パターンと工程ｂ）で調製されたパターンとを比較して、前記調査下の生物における前記疾患もしくは症状またはその段階の存在の指標となる相関関係の程度を決定する工程。
【請求項１９】
工程ａ）およびｂ）の前記mRNAが、cDNAに逆転写されていることを特徴とする請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物がヒトであることを特徴とする請求項１〜16、18、19のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記固体支持体がフィルターであることを特徴とする請求項１〜16、18〜20のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患が癌であることを特徴とする請求項１〜16、18〜21のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患が、胃癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌または皮膚癌であることを特徴とすることを請求項１〜16、18〜22のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患がアルツハイマー病であることを特徴とする請求項１〜16、18〜23のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記生物がヒトであることを特徴とする請求項17に記載の使用。
【請求項２６】
前記固体支持体がフィルターであることを特徴とする請求項17または25に記載の使用。
【請求項２７】
前記疾患が癌であることを特徴とする請求項17、25、26のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
前記疾患が胃癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌または皮膚癌であることを特徴とする請求項17、25〜27のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
前記疾患がアルツハイマー病であることを特徴とする請求項17、25〜28のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、標準診断用遺伝子転写産物パターンの調製方法、診断用のプローブキット、およびこのようなキットを使用する診断方法に関する。
物理的試験、解剖学的試験および挙動試験、および／または生化学的、電気的または電磁気的研究および／またはアッセイを含む診断方法の多くの例がある。
これらの診断方法は良く開発されており、多くの病理学的症状（状態）を同定するのにしばしば有効な手段である。これらは最近の開発および研究に基づいているだけでなく、少なくとも6000年にわたるヒト、その他の動物および植物の疾患に関係する保健衛生研究者により記録された観察、経験および実験データに基づいている。
診断手段の蓄積は、以前には現在よりも決して大きくなかったが、それにしても、病気およびその他の状態の不正確な診断が依然としてありきたりである。
活性物質または生物だけでなく暴露される生物の両方における環境の変化もしくは突然変異またはその他の変化に関連し得る新しい病気および症状が見られる。加えて、スポーツに使用され、また薬物常用者により使用される多数の新旧の非合法物質には、それらの存在についての適切な診断試験法がない。
幾つかの症状は利用可能な方法で容易に同定されず、かつ／または疾患または症状の最終的同定に到達するのは、適当な矯正治療にはあまりにも遅いことがある。
完全な診断操作にしばしば見られる膨大な時間のために、不正確な抗生物質治療が、最終的診断に達する前に、しばしば早まって開始される。この医療慣例は抗生物質に耐性の細菌株の重大な発生を増長させ得る。
従って、多数の区別化診断方法が開発されてきたとしても、低コストで迅速、安全かつ確実な同定に抵抗するかなりの数の密接に関係する症状、または症状の組み合わせが依然として存在している。
更に、多数の診断方法は、観察下の生物への異種液体の注射または診断助剤のその他の種類の移入に依存するか、またはバイオプシーを必要とする。しばしば容易に接近できない生物の一部からサンプル組織を除去することもまた、同定および治癒のプロセスそれ自体に有害な作用を有するかもしれない。
ある種の疾患は、異なる遺伝子の高められた発現をもたらし、これは場合によっては当該疾患または症状の病原性の原因であり得ることが知られている。こうして、疾患の存在の指標としての特別な転写産物の存在についてスクリーニングすることが文献に記載されている（例えば、Enderlinら, FEBS Letters, (1997), 412, p629-632を参照のこと）。遺伝子ライブラリーに由来するcDNAへの結合、または配列決定およびその他のライブラリーとの電子的比較による異なった転写産物のレベルを定量する方法は、例えば、Schenaら, (1996), PNAS USA, 93, p10614-10619; Schenaら, (1995), Science, 270, p467-470、Hellerら, (1997), PNAS USA, 94, p2150-2155および国際特許出願WO 95/20681に記載されている。
しかしながら、診断および／または予後の手段として疾患もしくはその他の症状またはその段階における遺伝子発現の特徴的パターンを使用する迅速かつ簡単な方法、特に疾患の特徴、関係する遺伝子またはその配列の知識を必要としない方法は、文献に記載されていなかった。
驚くことに、疾患または症状またはその段階を診断する簡単な方法は、その疾患／症状に特徴的な遺伝子転写産物パターン標準またはフィンガープリント（標準診断プローブパターン）を調製し、続いてこのパターンを、研究中の患者または生物の転写産物パターンと比較することにより行い得ることが今見出された。標準は、同定すべき疾患または症状またはその段階に関する1組のマーカーとして役立つ多数の特異的かつ有益なプローブの同定により調製される。これらのプローブは固体担体に結合され、次いで場合により逆転写および／または増幅される。異なるプローブに結合する核酸材料の量が評価され、その疾患または症状またはその段階の転写産物パターン標準が一緒に形成される。
こうして、ヒト、動物、植物および全てのその他の生きている真核生物および原核生物において、他の生物、毒素、ストレス、老化、環境変化等により引き起こされた疾患、倦怠感またはその他の症状を同定するために、標準に対する一種以上の有益な遺伝子からの転写産物量の標準プローブパターンの組を開発することができ、このような標準プローブパターンの各々は一種の病気または症状および／またはこのような病気の段階に特徴的である。続いて、これらの標準プローブパターンは、診断すべき患者から集められた組織または体液の最近のサンプルから調製された同じプローブを使用して、転写産物レベルのパターンと比較される。このようなパターンは患者の現在の症状に特異的である。
通常、感染、毒素または悪化に対する反応は幾つかまたは多数の遺伝子の活性レベルの変化を伴う。相対的に高くても低くてもよいこれらの活性レベルは、遭遇する症状の型に対して一緒に特異的である。正常な活性および変化（変質）した活性は、存在する特異的転写産物またはmRNAの量により大きな程度まで測定し得る。こうして、分析用に標準化されたプローブを設計することができ、これらのプローブは、同定または診断すべき夫々の症状または症状の組み合わせに特徴的である活性のパターンを有する。これらの標準化されたプローブは、この標準化プローブパターンを、研究すべき生存患者または生物から同様の方法で調製され、かつ得られた組織または体液サンプルからの転写産物パターンと比較するのに使用することができる。
本発明を実際に使用するためには、2種の実質的に同様に開発された診断プローブを比較のために利用できる必要がある。
1．  当該症状または疾患またはその段階を有する一種以上の生物から開発された、疑われる病気に特徴的である標準診断プローブパターン(SDPP)。
および
2．  研究すべき生物から最近得られた組織または体液のサンプルから開発される患者特異的プローブパターン(PSPP)。
本発明を特定の症状に適用するために、疑われる病気またはその段階に特徴的なSDPPのパターンを前もって開発しておく必要がある。加えて、患者からの組織または体液の最近の良く保存されたサンプルを利用して、疑われる病気およびその異なる段階の数に関する一種または数種の異なるSDPPと比較するために、PSPPを開発できることが必要である。
ある病気に特徴的なSDPPに関するパターンを設計し、開発するために、mRNAの単離、cDNAの構築および増幅、区別化ハイブリダイゼーションおよび区別化表示による選択の既知技術を使用することができる。
当該病気が最終的に診断された一人以上の患者からの選択された有益なmRNAまたはcDNAプローブが単離され、増幅される。これらのSDPPは、PSPPがSDPPに類似するかどうかを比較するのに一緒に使用されるであろう。幾つかのこのような特徴的SDPPを開発して、同じ病気の異なる段階を表すことができる。
多数の病気およびこのような病気の異なる段階に関するこのような標準プローブのパターンをデータベースに蓄積し、必要時に研究所の求めに応じられるようにすることができる。
従って、一つの局面に鑑みて、本発明は、原核生物または真核生物の疾患または症状またはその段階を診断または同定するための遺伝子転写産物パターンプローブキットの調製方法を提供し、この方法は少なくとも下記の工程を含む：
a)  正常な原核生物または真核生物の組織、細胞または体液（正常サンプル）からmRNAを単離する工程；
b)  問題の疾患または症状またはその段階を有する工程a)の生物の対応する組織、細胞または体液（罹患サンプル）からmRNAを単離する工程；
c)  場合によりcDNAに逆転写されてもよい、工程a)およびb)のmRNAを非配列ベースの分離技術により分離する工程；
d)  正常および罹患サンプル中に異なるレベルで存在する2種以上のmRNA種またはcDNA種を選択する工程；
e)  工程d)で同定されたmRNA種またはcDNA種を単離する工程；
f)  場合により、工程d)またはe)のmRNAをcDNAに逆転写する工程(これが工程c)で既に行なわれなかった場合）；および
g)  工程e)またはf)のmRNAプローブまたはcDNAプローブを一種以上の固体担体に固定する工程。
本明細書で使用される疾患または症状は、いずれかまたは全ての真核生物または原核生物の有益な遺伝子の活性の相対的な増加または減少をもたらす、あらゆる症状（状態）、疾患、病気または反応であってよく、これらの変化は、細菌、ウイルス、プリオン、寄生虫、菌類、放射線、天然もしくは人工の毒素、薬物またはアレルゲン、例えばストレスによる精神状態、生物の老化によるノイローゼ、精神病または衰弱、および原因不明の症状または疾患の影響により生じたか否かとは無関係である。
このような疾患としては、代謝変化または生理変化をもたらす疾患、例えば、発熱と関連する疾患、例えばインフルエンザまたはマラリアが挙げられる。検出し得るその他の疾患としては、ニ三挙げると、例えば、黄熱病、性的感染症、例えば淋病、線維筋肉痛(fibromyalgia)、カンジダ関連複合症、癌（例えば、胃、肺、胸、前立腺、膀胱、皮膚等の）、アルツハイマー病、レトロウイルスにより生じた疾患、例えばHIV、老人性痴呆、多発性硬化症およびCreutzfeldt-Jakob病が挙げられる。
また、本発明は、精神病または心身症、例えば精神分裂症および摂食障害の患者を同定するのに使用することもできる。既知の診断方法により容易に検出できない疾患またはその段階、例えばHIV（これは一般的に、感染後１〜４ヶ月間は既知の技術を使用して検出できない）を検出するためのこの方法の使用が特に重要である。同定し得る症状としては、例えば、薬物乱用、例えば麻酔薬、アルコール、ステロイドまたは性能増進薬の使用が挙げられる。診断方法は、他の診断技術の別法として単独で、またはこのような技術に加えて使用することができる。例えば、本発明の方法は、例えば腫瘍の同定および／または診断において、イメージング技術、例えば磁気共鳴イメージング(MRI)、超音波イメージング、核イメージングまたはＸ線イメージングを使用する診断の別法として、または追加の診断手段として使用できる。
その“段階”は、特別な生理変化または代謝変化を示してもよく、示さなくてもよいが、変化した遺伝子発現として検出し得る遺伝子レベルの変化を示す、疾患または症状の異なる段階（期）を指す。疾患または症状の進行中に、異なる転写産物の発現は変化し得ることが理解されるであろう。従って、異なる段階では、変化した発現は、“正常な”サンプルと比較して特別な転写産物について示されない場合がある。しかしながら、有益なプローブは、疾患の進行を通して一つ以上の段階で変化した発現を示すこれらの転写産物から選択され、これらを他の転写産物のレベルに関する情報と一緒に使用して、疾患の特別な段階の指標である特徴的パターンを提供することができる。このような有益なプローブは、上記方法に従って、正常なサンプルの転写産物を疾患または症状の一つ以上の段階からの罹患サンプルの転写産物と比較することにより、または疾患または症状の異なる段階を互いに比較することにより同定することができる。
本明細書で使用されるように、原核生物または真核生物は、あらゆる真核生物、例えばヒト、その他の哺乳類および動物、鳥、昆虫、魚および植物、およびあらゆる原核生物、例えば細菌であってもよい。
本明細書で使用されるように、“組織”は、手術中に、例えばバイオプシーまたはその他の手段により得られた組織であってもよい。“細胞”は、組織または体液または生体老廃物から単離された細胞、または原核生物の場合には生物それ自体を包含する。“体液”は、尿、血液、精液等を包含する。しかしながら、本発明の標準転写産物パターンの調製方法および診断方法はまた、真核生物の生きている部分、例えば細胞ラインおよび臓器培養物および外植体についての使用に適用し得ることが理解されるであろう。
本明細書で使用されるように、“正常”は、比較目的に使用される生物またはサンプルを指す。これらの生物またはサンプルは、遺伝子発現に影響する如何なる疾患または症状の指標をも示さないか、あるいはその疾患または症状を有しないと信じられるという意味で、特にこれらの生物またはサンプルを、疾患に対して標準として用いようとするその疾患に関して、“正常”であることが好ましい。しかしながら、疾患または症状の異なる段階を比較してもよく、このような場合に、“正常な”サンプルは疾患または症状の早期段階に相当することが理解されるであろう。“疾患（罹患）”サンプルおよび生物としては、病気または特別な症状にかかったサンプルおよび生物が挙げられ、研究中の疾患または症状またはその段階を有することが知られているか、またはこれらを示すものである。
“相補ストランド”は、普通の意味で使用され、夫々の塩基において鋳型cDNA（これから相補ストランドが誘導される）に相補性であるDNAのストランドを指す。本明細書で言及される“cDNA”は、RNAの逆転写により生成された第一ストランドcDNAおよびこの第一ストランドcDNAに相補性のストランド、即ち、第二ストランドcDNAを包含する。
核酸種の“異なるレベル”は、区別化発現を示唆する定量的または定性的な差を指す。“プローブ”は、同一であってもよく、または異なっていてもよい（即ち、混合物であってもよい）が、全体として正常なサンプルおよび罹患サンプル中で区別可能に発現される一種以上の核酸分子であってもよい。疾患／症状の異なる段階が研究される場合、プローブに相当する転写産物の区別化発現は、非罹患サンプルに対して、または疾患／症状の異なる段階に対して示されるべきである。一般的に、このようなプローブは、mRNAから逆転写されたcDNA、またはその相補ストランドであるが、mRNAそれ自体を使用してもよい。これは、例えば、プローブの鋳型としてのDNA断片を使用して、T3プロモーターまたは同様のプロモーターの後でベクター中に挿入することにより達成し得る。しかしながら、この核酸材料は、サンプル核酸分子へのハイブリダイゼーションが依然として可能であることを条件として、本発明の性能に影響しないで修飾されていてもよいことが理解されるであろう。こうして、本明細書で言及される核酸分子、例えばmRNAおよびcDNAは、修飾（例えば、メチル化）されている分子を包含するか、またはcDNAの調製中または増幅中に使用し得る修飾塩基もしくは非天然塩基を含む分子を包含する。同様の考慮は本明細書に記載されたあらゆる核酸分子に適用される。こうして、例えば、サンプル中に存在する転写産物は、RNAの形態であってもよく、またはRNAおよび／またはDNAの修飾形態または未修飾形態、および／または特に標的プローブへの特異的ハイブリダイゼーションにより標的プローブを認識し、かつ結合するプライマー、抗体もしくはその他の分子の形態に変化されていてもよい。
本明細書で使用される“評価”は、絶対的または相対的に測定し得る定量的評価および定性的評価の両方を指す。この技術により調製された特徴的（特性的）“パターン”は、例えば、表またはグラフの形で表し得る情報を指し、2種以上のプローブと関連するシグナルについての情報を運ぶ。
本明細書で使用されるように、“相当（対応）する”組織等への言及は、同じ組織、細胞または液体を指すことが好ましいが、標準を調製する目的でよく類似する組織、細胞または液体をも包含する。プローブに“相当（対応）する”遺伝子に関して使用される場合、これは、配列（相補性であってもよい）によりプローブに関連している遺伝子を指すが、プローブは発現の異なるスプライシング生成物を反映してもよい。こうして、同じ遺伝子から転写されるが、異なるスプライシングイベントを反映する2種の別個のプローブを、単一疾患について開発することができる。しかしながら、2種以上の異なる遺伝子の変化した遺伝子発現を反映するプローブの使用が好ましい。
本発明は、真核生物または原核生物の疾患、倦怠感および症候群の診断原理および同定方法の両方に関するだけでなく、特定の診断への到達または関連症状の同定に必要な相対的測定に使用される診断用プローブを設計および開発するための関連する方法に関する。
本発明は、観察下の生物のあらゆる特別な症状に特異的であるパターンにおいて遺伝子の活性の変化を引き起こすあらゆる疾患または症状の迅速かつ正確な診断方法である。
それ故、現在同定し難い従来の症状を同定するために診断用標準プローブを設計する能力だけでなく、症状が同定されると直ぐに現れるかもしれない新たな症状を同定するための新しいプローブを調製するためにその設計を迅速に適合させる能力もまた、多いに重要であろう。
感染症、毒性物質、老化により生じた疾患または生きている真核生物のクオリティーオブライフを変えるその他の症状の極めて早期段階から、生物全体は変化した症状に応答する。たとえ生物のごく一部のみが冒されているように見えるとしても、応答は生物全体にわたって生じる。症状が治癒されるまで、または冒された生物が死ぬまで、応答は続く。
本発明の利点は、一次的性質および二次的性質の両方である。組織または体液のサンプルは観察下の症状により冒されていない生物の一部から得ることができる。一種のサンプルだけで完全な同定に十分であり、こうして、ヒト患者およびその他の動物患者について行なわれる通常の広い範囲の診断試験中に入院を回避することにより、コスト、時間および不便の大きな低減を得ることができる。
症状の同定を助けるために観察下の生物に外来物質を導入する必要がないので、本発明は、このような誘導された診断物質に対する過敏症反応のリスクを低減するであろう。
本発明は、身体的、精神身体的および精神的な形質の殆どの疾患および症候群を検出するだけでなく、生物の老化による悪化を検出する潜在能力を有する。加えて、本方法は、毒性物質、放射線、寄生虫、抗生物質、薬物、アレルゲンおよび数種のこのような症状の組み合わせに対する生物の反応を検出するのに使用することができる。
更に、本発明は、生物の疾患または望ましくない症状を極めて早期の段階で、その他の主観的または客観的な症候が現れ得る何年も前でさえも、検出することを可能にするであろう。
患者が従来同定されなかった症状により死亡し、法医学的死後の試験が行なわれるまで死亡原因が証明されない場合でさえも、その原理は有益であろう。死亡前に患者を診断しようと試みて、一連の患者特異的プローブパターンを開発した場合、これらのプローブは、同様の症状のその後の発生を診断するのに使用し得る新しい標準プローブパターンの設計に使用することができる。
本発明を使用するのに必要な分析装置および器機は、標準的な生化学研究およびバイオテクノロジー研究に携わる研究所で容易に入手し得る。
遺伝子転写産物パターンプローブキットの調製を開始するために、mRNAは、正常な個体または生物から既知技術（例えば、Sambrookら(1989), Molecular Cloning: A laboratory manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと）に従って、組織、細胞または体液から抽出される。
また、mRNAは、標準診断用パターンを調製すべきである疾患または症状を有する相当する個体または生物の同じ身体部分から抽出されることが好ましい。RNAを用いて研究する際の困難のために、RNAはこの段階で逆転写されて第一ストランドcDNAを形成することが好ましいが、cDNAプローブを生成すべき場合、これは問題の転写産物の分離および同定後に行なうこともできる。しかしながら、cDNAのクローニング、またはcDNAライブラリーからの選択またはcDNAライブラリーを用いた選択は、本発明のこの方法またはその他の方法には必要でない。
第一ストランドcDNAの相補ストランド、即ち、第二ストランドcDNAを合成することが好ましいが、これは、どのストランドをプローブとして使用すべきかの提案に、また、診断方法中に探査すべきサンプル中の核酸分子の性質に依存するであろう。第二ストランドcDNAストランドは、サンプルmRNAの逆転写により生成されたcDNAストランドを探査するのに使用することが好ましい。
cDNAストランドは、適当なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の如き既知の増幅技術により増幅されることが好ましい。あるいは、cDNAストランドをベクターでクローン化し、E.coliの如き細菌を形質転換するのに使用することができ、次いでこの細菌を成長させて核酸分子を増殖できる。cDNAの配列が知られていない場合、導入された核酸分子の領域にプライマーを誘導してもよい。こうして、例えば、本明細書の実施例に記載されるように、アダプターをcDNA分子につなぎ、cDNA分子の増幅のためにプライマーをこれらの部分に誘導してもよい。あるいは、真核生物サンプルの場合、ポリＡテールおよびRNAのキャップを適当なプライマーの調製に利用することができる。
正常サンプルおよび疾患サンプルのmRNAまたはcDNAの分離は、配列をベースとしない分離技術により夫々のサンプルについて別々に行なわれる。この分離技術は、異なる転写産物／cDNA間で識別するために特別な転写産物の配列情報の使用を伴わないで、転写産物またはそれらの相当するcDNAの間の識別を可能にするあらゆる好適な技術である。しかしながら、転写産物を識別する目的に使用されない転写産物の全部または殆どに共通の配列にプローブを誘導する場合、上記のことは、例えば標識を有するプローブを使用して転写産物についてシグナルを形成する可能性を除外するものではない。従って、好都合には、mRNAまたはcDNAを、アガロースゲルもしくはポリアクリルアミドゲル、または核酸分子の分離に適した同様のゲル上での電気泳動分離により分離できる。あるいは、生成物はガスクロマトグラフィーもしくはHPLCまたは同様の技術により分離できる。（配列に基づく分離技術（これらは除外される）は、例えば、ハイブリダイゼーションまたは配列決定それ自体により異なる配列に誘導されたプローブでの捕獲を包含する。）
このような方法は、本発明の方法に使用されるプローブが同定され、転写産物またはcDNAの全集団から選択されるという利点を与える。なぜならば、分離の前に、例えばコントロールサンプルからの固定化核酸へのハイブリダイゼーションにより、プローブの配列に基づく選択は行われないからである。こうして、転写産物の同定は、全転写産物のサブセットからの特別な転写産物の選択に対してバイアスされない。
サンプル間の比較を可能にするために、転写産物／cDNAの分離は、例えば連続実験または同じゲルにより、できるだけ同時に、正常なサンプルおよび疾患サンプルについて行なわれるべきである。
異なる転写産物またはcDNAを同定するために、夫々の転写産物／cDNAに相当するシグナルを同定することが必要である。好都合には、これは、cDNA調製中または増幅中に取り込み得る放射性標識またはその他の標識の使用により行うことができる。
適当な標識は、転写産物／cDNAの存在の検出または測定を直接または間接に可能にする標識である。このような標識としては、例えば放射性標識、化学標識、例えば発色団もしくは発蛍光団（例えばフルオレセインおよびローダミンの如き色素）、または高電子密度の試薬、例えばフェリチン、ヘモシアニンもしくは金コロイドが挙げられる。あるいは、標識は、酵素、例えばペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼであってもよく、その酵素の存在は、好適な物体、例えば基質とのその相互作用により視覚化される。また、標識は、シグナリング対の一部を形成してもよく、この対の別のメンバーは転写産物／cDNAが結合する標的プローブに、またはそれに接近して存在し、例えば蛍光性化合物および消蛍光性基質を使用できる。また、標識は、転写産物／cDNAに付着された、例えば合成または増幅中に使用された塩基に付着されたペプチド部分を認識する異なる物体、例えば、抗体に施されてもよい。
シグナルは、分離工程前、該工程中または該工程後に、標識を組み込むことにより達成できる。従って、例えば、転写産物が分離されたゲルは標識化ポリTオリゴヌクレオチドでプローブすることができ、またはcDNAは、標識化ポリAオリゴヌクレオチドでプローブできるほか、連結（ligation）および／または増幅によって導入された配列に対応する標識オリゴヌクレオチドでプローブすることもできる。あるいは、分離のためにガスクロマトグラフィーまたはHPLCなどの技術が用いられた場合、転写産物の存在は、他の技術、例えばその吸光度などによって同定することができる。
分離に使用される技術に応じて、異なる転写産物またはそのcDNAに対するシグナルは、重複し、完全に分析できないかもしれない。プローブは、転写産物またはそのcDNAの混合物を含んで（但し、その混合物は全体として、正常および罹患サンプルにおいて異なる発現を示す）製造できる一方で、場合により、転写産物／cDNAの混合物は、抽出してもよく、繰り返しまたは他の分離技術に付して、変質発現を示す転写産物／cDNAのより小さな集団を単離してもよい。
正常対罹患サンプルにおいて、または疾患の段階の少なくとも一つにおいて区別化発現を示す核酸種が同定される。これには、正常および疾患サンプルにより作られたシグナル間の比較が必要である。問題の転写産物／cDNAは、異なるシグナル量によって示されるように、異なるサンプルにおいて区別可能に発現される。これは正常サンプルではなく、疾患サンプルに存在する種に対応することがあり、その逆も同様である。このようにして、発動する遺伝子発現および停止する遺伝子発現の両方が反映される。このことは、変質した遺伝子発現が、正常サンプルと比較して同定される従来技術（ここでは、正常ライブラリーからのcDNAが、サンプルmRNAを結合するハイブリダイゼーション鋳型として使用され、「正常」および「罹患」サンプル間の相対的相違が測定される）よりも、多大な利点を提供する。したがって、本発明の方法は、正常サンプルにおいて基本的に発現しないか、または非常に低レベルでしでしか発現しないが、問題の疾患／状態、または少なくとも一つの疾患／状態段階で活性化される遺伝子を同定できる。
発現の程度の変動を反映する転写産物／cDNAを用いることができるが、顕著な相違、例えば代謝産物／cDNAの欠落または存在などの顕著な違いを反映する種を使用することが好ましい。
一旦同定されると、mRNAまたはcDNA種（異なる配列を有する分子の混合物であってよい）が単離される。標準診断用パターンを調製するために、少なくとも一つの疾患段階または状態段階での変質した遺伝子発現を反映する２種以上の種（プローブ）を単離することができる。ある場合には、特定の状態または疾患またはその段階のための標準診断用パターンを作成するために、たった二つのプローブで十分であり得る一方、プローブ数の増加が、問題の特定遺伝子の発現を同様に変質させる他の疾患との比較による診断ミスの可能性を防止するであろうことが理解できるであろう。したがって、好ましくは2〜1000個のプローブ種、更に好ましくは10〜500個、特に好ましくは50〜100個、例えば70個のプローブ種が単離のために選択される。これらのプローブは、問題の疾患または状態での発現を変質した遺伝子を反映するか、あるいは疾患または状態の特定段階は、研究下にある生物内のその特定疾患のために”有益である”と考えられ、この有益な性質を有するこれらプローブだけが選択される。
単離は、例えばカラムで分離が行われるならば適当な断片の選択によるか、または分離用マトリックス、例えば問題の核酸種を含むゲル薄片の切り出し物からの物理的な除去によってもよい。次いで、そこに含まれる核酸分子を単離し、必要ならば続く工程用に、好ましくは増幅を用いて精製する。
転写産物自身が分離および単離されている場合において、これらは好ましくは増幅を用いてcDNAに変換することができる。
次いで、前記の方法にしたがって生産されたmRNAまたはcDNAプローブ種を、それぞれ固体支持体上に固定して、疾患または状態のプローブキット、または遺伝子転写産物パターン（またはフィンガープリント）プローブキットを調製する。核酸分子の固定化部分として好適な多くの固体支持体は、この技術においてよく知られており、文献に広く記載されている。概して言えば、固体支持体は、化学的または生化学的な手順における固定化、分離などのために現在広く用いられ、または提案されている、よく知られた支持体またはマトリックスのいずれであってもよい。したがって、例えば固定化部分は、例えば高分子材料、例えばアガロース、セルロース、アルギン酸塩、テフロン、ラテックスまたはポリスチレンでできた、粒子状、シート状、ゲル状、フィルター状、膜状、ミクロ繊維状、細片状、管状または板状、繊維状または毛細管状の形態をとることができる。粒子状材料、例えばビーズが、一般的に好ましい。好都合には、固定化部分は、磁性粒子、例えば超常磁性粒子からなっていてもよい。
固体支持体への核酸分子の付着は、直接的または間接的に行うことができる。例えば、フィルターを用いる場合、付着はUV-誘発架橋により行うことができる。あるいは、付着は、核酸分子および／または固体支持体に担持された付着部分を用いて間接的に行うこともできる。したがって、例えば、アフィニティ結合パートナーの対、例えばアビジン、ストレプトアビジンまたはビオチン、DNAまたはDNA結合タンパク質（例えばlac Iリプレッサータンパク質またはこれが結合するlacオペレーター配列）、抗体（モノクローナルまたはポリクローナルであってよい）、抗体断片、あるいは抗体のエピトープまたはハプテンを用いることができる。これらの場合において、結合対の一方のパートナーは固体支持体に付着されており（または本来的にその一部であり）、他方のパートナーは核酸分子に付着されている（または本来的にその一部である）。
適当な官能基の固体支持体への付着は、この技術でよく知られた方法で行うことができ、これらには、例えば固体支持体を処理して好適な表面被覆を提供することにより提供される、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒドまたはアミノ基を介した付着が含まれる。本発明の適当な官能基の核酸分子への付着は、連結反応により行うことができ、あるいは合成または増幅の間に、適当な部分、例えばビオチンまたは捕獲用の特定配列を担持するプライマーを用いて導入することができる。
個々のプローブは、キットのモジュールを形成し、かつ、一つ以上の固体支持体上に存在してもよい。異なるモジュールの固体支持体は、物理的に会合していることが好都合であるが、各プローブのシグナルは別々に測定可能でなければならない。したがって、例えば多くのウェルを有するプレートを、異なるウェル中に異なるプローブを有する固体支持体として用いてもよく、あるいは固体支持体の複数の領域が異なるモジュールを含んでいてもよく、例えば異なるmRNAまたはcDNAプローブが個々の部位でフィルターに結合されていてもよい。
従って、好ましい観点において、本発明は、原核性または真核性生物における疾患または状態またはその段階を診断または同定するための遺伝子転写産物パターンプローブキットの調製方法を提供し、この方法は少なくとも下記の工程を含む：
ａ）正常な原核性または真核性生物の組織、細胞または体液（正常サンプル）から、mRNAを単離する工程；
ｂ）問題の疾患または状態またはその段階を有する、工程a)の生物の対応する組織、細胞または体液（罹患サンプル）からmRNAを単離する工程；
ｃ）工程ａ）またはｂ）のmRNAをcDNAにハイブリダイズさせる工程；
ｄ）場合により、前記ストランドを増幅し、場合により該ストランドに標識を導入する工程；
ｅ）工程ｄ）のcDNAを非配列ベースの分離技術により分離する工程；
ｆ）正常および罹患サンプル中に異なったレベルで存在するの２以上のcDNAを選択する工程；
ｇ）工程ｆ）において同定されたcDNA種を単離する工程；および
ｈ）工程ｇ）のcDNAプローブを１以上の固体支持体上に固定化する工程。
特定の個体／生物における特定の疾患／状態またはその段階を診断または同定するための、または標準診断用遺伝子転写産物パターンを調製するための前記方法に従って調製された遺伝子転写産物パターンプローブキットは、本発明のもう一つの観点を形成する。
従って、もう一つの観点から見て、本発明は、原核性または真核性生物における疾患または状態またはその段階の標準診断用遺伝子転写産物パターンを診断、同定または調製するための遺伝子転写産物パターンプローブキットを提供し、このキットは少なくとも下記のものを含む：
ａ）調査下の生物における状態または疾患またはその段階に特性的な１以上の選択された遺伝子の遺伝子発現を反映する転写産物に対応する、本発明に係る２以上のプローブ種を担持した１以上の固体支持体。
場合により、キットは、正常または罹患サンプル、標準化用材料、例えば比較目的のための正常および／または罹患サンプルからのmRNAまたはcDNA、cDNAに導入するための標識、増幅目的で核酸配列を導入するためのアダプター、増幅ためのプライマー、および／または適当な酵素、緩衝剤および溶液によって発生されたシグナルに関連した情報をも含むことができる。
このようなキットの、標準診断用遺伝子転写産物パターンの調製への使用は、本発明のもう一つの観点を形成する。
さらにもう一つの観点において、本発明は、原核性または真核性生物における疾患または状態またはその段階の特性を示す標準診断用遺伝子転写産物パターンを調製する方法を提供し、この方法は少なくとも下記の工程を含む：
ａ）疾患または状態またはその段階を有する前記生物の組織、細胞または体液から、場合によりcDNAに逆転写されていてもよいmRNAを単離する工程；
ｂ）工程ａ）のmRNAまたはcDNAを、調査下の生物に対応する生物において前記疾患または状態またはその段階に特異的な本発明に係るキット上のmRNAまたはcDNAプローブにハイブリダイズさせる工程；および
ｃ）前記固体支持体（１以上）の上の前記プローブの各々にハイブリダイズして、前記プローブに対応する１以上の選択された遺伝子の疾患、状態またはその段階を有するサンプルにおける遺伝子発現を反映する特性的パターンを生成させるmRNAまたはcDNAの量を評価する工程。
特定の疾患または状態またはその段階のための標準診断用遺伝子転写産物パターンまたはフィンガープリントを調製するために、前記で調製されたプローブキットを用いて罹患サンプルのmRNAまたはcDNAが探査され、固体支持体、すなわちキットモジュールに結合した各々の特定プローブ種へのハイブリダイゼーションに関するシグナルが与えられる。標準コントロール遺伝子転写産物パターンは、所望により、正常サンプルからのmRNAを用いて調製することができる。従って、前記と同様の方法で単離された総mRNA、または罹患サンプル（プローブが向けられる疾患に対応する）（また、場合により正常サンプル）のcDNA（プローブキットモジュール上のプローブ種の相補性に依存する）は、適当な条件下で、プローブキットモジュール上のプローブ種にハイブリダイズされる。両方のサンプルが探査される場合、これは、同じプローブキットモジュール上で、対応するプローブキットのモジュールに同時にハイブリダイズさせることにより、連続的に行うことかできる。
プローブキットモジュールに結合された転写産物／cDNA分子の数の指標を得るために、転写産物がハイブリダイズしたときに生成するシグナルが検出される（例えば、２重ストランド核酸分子の検出、または例えば洗浄して未結合分子を除去した後、結合された分子の数の検出による）。後者の場合、好ましくは、標識されたmRNA/cDNA分子は、例えば逆転写中に放射性標識を導入するか、相補cDNA標準を調製するか、または増幅させることにより、サンプルとして用いられる。次いで、シグナルの量が各プローブキットモジュールについて評価される。評価は定量的であっても定性的であってもよく、各プローブへの単一転写産物種の結合、転写産物の組み合わせ、あるいは転写産物の代表的形態、例えばcDNAまたは前記のような修飾核酸分子に基づいてもよい。定量的結果は、収集された疾患のフィンガープリントに関する更なる情報を提供するであろうことが理解されるであろう。このデータは絶対値で表してもよく、あるいは特定の標準またはプローブモジュール結果に相対して決定してもよい。正常サンプルからのシグナルの値は、これが決定されている場合には、疾患サンプルから減算してもよいが、試験サンプルからの結果を、生成した未標準化疾患フィンガープリントと比較することが好ましい。
さらに、標準診断用遺伝子パターン転写産物を、１以上の罹患および／または正常サンプルの結果を用いて調製して、プローブキット用のプローブを同定することができること、また、１以上の罹患サンプル（および使用する場合は正常サンプル）を用いてハイブリダイゼーション工程を行い、標準診断用遺伝子転写産物パターンを得ることができることが理解されるであろう。
このようなキットおよび標準診断用遺伝子パターンを、特定の生物における特定の疾患または状態またはその段階を同定または診断する目的で使用することは、本発明のもう一つの観点を形成する。
選択されたプローブ種を用いて、標準診断用フィンガープリントまたはパターンが特定の疾患または状態について一旦決定されると、この情報を用いて、異なる生物または個体におけるその疾患の存在、不存在または程度を同定することができる。
従って、もう一つの観点から見て、本発明は、原核性または真核性生物における疾患または状態またはその段階を診断または同定する方法を提供し、この方法は下記の工程を含む：
ａ）前記生物の組織、細胞または体液から、場合によりcDNAに逆転写されていてもよいmRNAを単離する工程；
ｂ）工程a)のmRNAまたはcDNAを、調査下の生物に対応する生物において前記疾患または状態またはその段階に特異的な本発明のキットにハイブリダイズさせる工程；
ｃ）前記固体支持体上で前記プローブの各々にハイブリダイズして、前記プローブに対応する１以上の選択された遺伝子の遺伝子発現を反映する特性的パターンを生成させるmRNAまたはcDNAの量を評価する工程；
ｄ）前記パターンを、調査下の前記疾患または状態またはその段階を有する調査下の前記生物に対応する生物からのサンプルを用いて本発明の方法により調製された標準診断用パターンと比較して、前記調査下の生物における前記疾患または状態またはその段階の指標となる相関関係の程度を決定する工程。
疾患または状態を確認するために必要な相関関係の程度は、正常および罹患サンプルについて得られた値の範囲を必然的に考慮に入れている。これは、プローブに結合して標準を開発する幾つかの代表的なサンプルに関する標準偏差を得ることによって確立できるが、試験サンプルがその標準との密接で充分な相関関係を示すならば、個々のサンプルだけで、疾患を同定するための標準パターンを形成するのに充分であり得ることが理解されるであろう。
この診断方法は、疾患、状態または病気、またはその段階または進行、例えばヒトにおける癌、または畜牛におけるウシ海綿状脳症を同定、定量または診断するために使用することができる。また、本発明の方法は、植物の症状／状態を監視するため、例えば汚染の影響を監視するため、または原核生物の場合は、発酵のような過程中または汚水処理中の原核生物の状態を監視するためにも使用できる。
特定の外因性ファクターまたは疾患がボディーの全ての部分に及ぶという効果のため、すなわち、遺伝子発現効果が明らかな疾患領域に隔離されないため、問題の部位、例えば腫瘍から離れたボディー部分を分析することができる。従って、試験用のサンプルは、非侵入的方法で得ることができ、例えば血液のような体液等であってよい。サンプルはボディーの異なった部分に由来してもよく、これら部分がその転写産物においてある差異を示すことがあるので、好ましくは、標準の調製に用いられるサンプルと試験サンプルとをマッチさせるべきである。本発明の診断方法において、三つの異なるサンプルが関連し、これらは異なる源から誘導できるであろう。これらは、プローブの調製に用いられるサンプル、標準パターンの調製に用いられる疾患サンプル、および試験サンプルである。全てのサンプルは比較可能な源から誘導されることが好ましいが、少なくとも標準診断用パターンの調製に用いられる疾患サンプルおよび試験サンプルは、対応する源から誘導されることが特に好ましい。
以下の実施例は、説明としてのみ記載される。そこで言及される図面は下記のとおりである。
図１は、アラビドプシス（Arabidopsis）の疾患用図形の標準診断遺伝子発現パターンを示し、
図２は、７つの異なるプローブに対する異なるタイプのストレスで免疫性のテストをしたピセアアビエス（Picea abies）から単離したcDNAの結合の程度を示す。
実施例１：アルツハイマー症候群
血液サンプルを、病気にかっかていると推測される患者から採取する。このサンプルを、直ちに液体窒素中に保存し、サンプルのmRNAの分解を予防する。
このサンプルを分析用に移し、mRNAをcDNAに変換し、PCR(Polymerase Chain Reaction: ポリメラーゼ連鎖反応)により増幅し、適当な放射性ヌクレオチドで標識する。
標識したcDNAを、フィルター上に固定化された幾つかの診断用DNAプローブとハイブリダイズさせる。
PSPPフィルターからの放射性シグナルを、Instant Imagerを用いて定量化し、異なるプローブの各々から相対的なシグナル値を決定する。
異なるプローブからの相対的な値は、一緒になって患者の病気に特異的なパターン、PSPPを創り出す。
患者に特異的なこのパターンを、異なる段階におけるアルツハイマー症候群に特徴的なSDPPと比較する。SDPPのパターンとPSPPのパターンとが一致する場合は、病気およびその段階は極めて確実に診断される。
これらのパターンが一致しない場合には、病気を除外することができ、一致が見いだされるまで、同じPSPPを多数の入手可能なSDPPと手動であるいは自動的に比較することができる。
実施例２：老人性痴呆
患者に特異的なサンプルを採取し、保存し、実施例1と同様にして、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、増幅し、かつ標識する。
比較ハイブリダイゼーションを、老人性痴呆の異なる種類と段階とを識別するために開発された異なるセットのSDPPを用いて行う。
実施例３：広範囲スペクトルの健康状態
患者に特異的なサンプルを採取し、保存し、実施例1と同様にして、mＲＮＡをcＤＮＡに変換し、増幅し、かつ標識する。
転写産物のセットを検出するためのプライマーを、標識に用いる。
標識したサンプルを、ゲル電気泳動により分離し、全てのＤＮＡ断片を検出し、定量化する。
得られた患者に特異的なパターンPSPPを、次に若干の異なる疾患のSDPPと比較する。対抗するミスマッチごとに、結合した病気を除外することができる。
実施例４：アラビドプシス（Arabidopsis）の疾患／状態の診断
診断は、２段階に分けることができる。
診断される疾患／状態に典型的で再現可能な発現パターン（フィンガープリント）の開発。
未診断患者または生物からのサンプルに開発された
方法を適用し、
発現したパターンを疾患／状態用に開発された
パターンと比較する。
4.1     診断される疾患／状態に典型的で再現可能な発現パターンの開発
4.1.1   アラビドプシス（Arabidopsis）の葉からの全てのRNAの抽出
診断された疾患を有する植物と健康な植物とからの各々の葉のサンプル15gを採取し、直ちに液体窒素中で凍結させる。各サンプルを２つのアリコートに分ける。
各サンプルからの2つのアリコートの１つからの葉を、液体窒素中で乳鉢と乳棒で粉砕し微粉末とする。各サンプルの第２のアリコートを、−70℃で保存する。
粉砕した葉を、直ちに粉砕バッファー（0.18M Tris-HCL、PH8.2、0.09M LiCl、4.5mM EDTA、１％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)150mlとTLE−平衡フェノール(TLE＝0.2M Tris-HCL、PH8.2、0.1M LiCl、5mM EDTA)50mlとが入っている500mlのビーカーに移す。
混合物を、ポリトロン(polytron)を用いて適度の速さ（設定５−６）で2分間均質化する。クロロホルム50mlを、ポリトロンを用いて均質物に加え、混合する。このスラリーを、遠心ボトルに入れて、50℃で20分間加熱する。次いで、これを17 700xg、4℃で20分間遠心する。
遠心の後、界面を乱すことなく可能な限り多くの水相を除去し、新しい遠心ボトルの中で、この相をTLE−平衡フェノール50mlとともに振盪して混合する。次いで、クロロホルム50mlを加え、ボトルを激しく振盪した後、17 700xg、4℃で15分間遠心する。
遠心の後、水相を除去し、界面がなくなるまでTLE−平衡フェノールで再抽出する。水相を、クロロホルムで1回抽出する。
水相を、清潔な遠心ボトルに移し、8M LiClを加えて最終濃度を2M LiClとする。RNAを、4℃で一晩沈殿させる。
次いで、これを15 300xg、4℃で20分間遠心する。ペレットを、数mlの2M LiClでリンスする。ペレットを水5ml中に再懸濁し、遠心管に移す。8M LiClを加え最終濃度を2M LiClとし、RNAを4℃で3時間沈殿させる。RNAを12 100xg、4℃で20分間遠心してペレット化する。ペレットを2M LiClでリンスし、水2ml中に再懸濁する。3M Na−アセテート200μlと100％エタノール5.5mlを加え、RNAを−20℃で一晩沈殿させる。
RNAを、17 700xg、4℃で15分間遠心してペレット化する。ペレットを乾燥し、水1ml中に再懸濁する。
RNAの濃度を計算し、260nm、280nm、230nmおよび320nmの吸光度を用いて、ストックの1:100希釈物における純度を評価する。読み取る前に、pHを濃Na2HPO4で調整し1mMにする。
各サンプルからの約1μgを、アガロースゲル上で分離し、検出可能なDNA汚染およびRNA分解の程度を決定する。サンプルは、-70℃で保存する。
4.1.2   第１ストランドcDNAの合成
mRNAを、製造業者の使用説明書に従って常磁性ビーズ（DYNALA.S., Oslo, Norway）を用いて、全RNA 4μgから単離する。
水20μlを、各サンプルに加えて、mRNAを65℃で2分間ビーズから溶離する。上澄み液を、新しい試験管に回収し、溶離を繰り返す。2つの溶出液をプールする。
Oligo dT(12-18)（500ng）1μlと、mRNA 5μl（≧全RNA 1μg）と水12μlとを一緒に混合する。この混合物を、70℃で10分間加熱し、直ちに氷の上で冷却し、短時間遠心して試験管壁から濃縮溶液を除去する。
第１ストランドバッファー（250mM Tris-HCl、pH8.3、375mM KClおよび15mM MgCl2）4μlと、0.1mMジチオトレイトール2μlと、dNTPミックス（dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを各々10mM）1μlとを加える。これを穏やかに混合し、37℃で2分間培養する。逆転写酵素（Superscript）1μl（200U）を加え、37℃で1時間培養する。次いで、試験管を氷の上に置く。
4.1.3   第２（相補的）ストランドcDNAの合成
サンプルに、水91.8μl、第２ストランドバッファー（100mM Tris-HCl、pH7.5、500mM KCl、25mM MgCl2、0.25ｍg/mlウシ血清アルブミンおよび500mM(NH4)2SO4）32μlと、dNTPミックス3μlと、0.1Mジチオトレイトール6μlと、E.coli DNAリガーゼ（10U/μl）2μlと、E.Coli  DNAポリメラーゼ（10U/μl）4μlと、E.coli  RNase H（1U/μl）0.7μlとを加える。これを16℃で2時間インキュベートし、次いでT4 DNAポリメラーゼ（10U）/μg  2μlを加える。これを、さらに16℃で5分間インキュベートする。
次いで、これを水飽和フェノール１容量で一回抽出し、次いでフェノール0.5容量と、クロロホルム：イソアミルアルコール（39:1）0.5容量とで一回抽出する。3M酢酸ナトリウムpH5.2を加え、最終濃度を0.3Mとし、穏やかに混合する。96％エタノール（-20℃）2.5容量を加え、混合物を10 000xg、4℃で30分間遠心する。
上澄み液を廃棄し、75％エタノール（-20℃）100μlをペレットに加える。この混合物を10 000xg、4℃で5分間遠心する。上澄み液を廃棄し、ペレットを乾燥するまで室温に保つ。次いで、ペレットを水15μl中に再懸濁する。
4.1.4   アダプターアニーリング
２つのTaqIアダプターと２つのAseIアダプターの各々5pmol/μlを、予備混合する。
0004163758.tif 000002
混合物を70℃で2時間加熱し、徐々に30℃まで冷却する。
4.1.5   cDNAへのアダプターの連結反応
cDNA（上記工程4.1.3に従って調製）の2つのサンプルを、TaqIおよびAseIで消化する。サンプル15μlを、バッファー（50mM Tris-HCl、pH7.9、10mM MgCl2、50mM NaCl、1mM ジチオトレイトール）3μlと、ウシ血清アルブミン（10mg/ml）0.3μlと、AseI（10U）1μlと、TaqIα（10U）1μlとともに混合する。混合物を、37℃で少なくとも2時間インキュベートする。
濃縮物をスピンダウンし、65℃で少なくとも1.5時間インキュベートする。AseIアダプター（5pmol）1μlと、TaqIアダプター（50pmol）1μlと、リガーゼバッファー（50mM Tris-HCl、pH7.8、10mM MgCl2、10mMジチオトレイトールおよび25μg/mlウシ血清アルブミン）4μlと、水3μlと、T4 DNAリガーゼ（1U）1μlとを加える。これを、37℃で3時間インキュベートする。次いで、混合物をTE、8.0（10mM Tris、pH8.0、1mM−EDTA）で500μlに希釈する。
4.1.6予備増幅
前の工程からの各サンプル5μlを、増幅バッファー（0.1M Tris−HCl、pH8.3、0.5M KCl、15mM MgCl2および0.1％（w/v）ゼラチン）2.5μlと、AseI予備増幅プライマー（5ng）1μlと、TaqI予備増幅プライマー（30ng）1μlと、dNTPミックス1μlと、水13.5μlと、TaqI DNAポリメラーゼ（1U）1μlとともに混合する。
0004163758.tif 000003
94℃で30秒間、56℃で30秒間および72℃で1分間の温度サイクルを、25サイクル行う。
4.1.7増幅
予備増幅工程からの各サンプル5μlを、AseIプライマー（5ng）1μlと、TaqIプライマー（30ng）1μlと、Taqポリメラーゼ（1U）0.2μlと、増幅バッファー４μlと、dNTPミックス0.4μlと、水8.4μlとともに混合する。これらのプライマーを、最終的にγ32P-ATPで標識する。
0004163758.tif 000004
（Nは、４つのデオキシヌクレオチドのいずれかを示す）
温度サイクルは、65℃で30秒間、72℃で1分間および94℃で30秒間により開始される最初の11サイクルの第1工程において、0.7°減少する処理である。初期11サイクルの後、サイクリングを、さらに65℃で30秒間、72℃で1分間および94℃で30秒間により23サイクル行う。サンプルを、4℃で保存する。
4.1.8区別的表示
6％シークエンス型ポリアクリルアミドのゲルを注入し、シークエンスゲル装置を始動させる。ゲルを、55℃に達するまで予備処理する。
各サンプル５μlを、シークエンスサンプル染料（95％ホルムアミド、20mM EDTA、0.05％ブロモフェノールブルーおよび0.05％キシレンシアノールFF）5μlと混合する。サンプルを75-80℃で2分間加熱し、直ちにゲル上に載せる。サンプルは、ゲル上で互いに近接するように配置する。
ゲルを、キシレンシアノールFFバンドが溶離するまで55℃で処理する。ゲルを乾燥し、オートラジオグラムをゲルの上部に配置する。フィルムを暗中で一晩露出する。フィルムと乾燥ゲルの両方をマークし、次の手順のために完全な適合が得られるようにする。フィルムを、現像する。
4.1.9   プローブとして区別可能に発現されたcDNAクローンの選択
二つのサンプル（正常および罹患）間のパターンを比較し、これらサンプルの一方に明確に存在するが、他方には存在しないサンプルを選択する。フィルムを乾燥ゲル上に正確に配置する。フィルム上の選択された断片（これは転写産物を表す）に対応するゲル切片を切り抜き、試験管に２μlの水および切断線内の選択された各断片に0.5μlの水を加え、メスを用いて断片を掻き取り、かつ断片を試験管に移すことにより、ゲル切片を試験管中に採取する。特異的プライマーとの各反応からの１〜10の断片をこのようにして採取することができる。各増幅プライマー上でＮの符号が付されたヌクレオチドの両方は、四つの可能なヌクレオチドのうちの一つなので、増幅に使用できる４4すなわち256の可能な組み合わせがある。ただ一つのプライマーを用いて、個々の増幅から１〜10の断片を採集できるので、増幅プライマーの全ての入れ替えを用いて、一つのサンプルから合計で256〜2560の断片を採集することができる。
熱サイクルは、プライマー濃度を１μMに、dNTDミックス濃度を200μMに高め、40サイクル行う以外は、前記の未標識増幅プライマーを用いた場合のように行う。
30ngの増幅断片（プローブ）を、ドットブロット装置を用いて、Hybond Nフィルターに塗布する。フィルターの少なくとも二つのレプリカを作成する。DNAをUV架橋によりフィルターに固定する。
4.1.10  プローブcDNAを有するフィルターへの試験サンプルcDNAのハイブリダイゼーション
診断された疾患を有する植物および健康な植物からの葉の第二アリコートを用いて、前記のようにしてRNAを単離する。５μlの水の代わりに５μlの[32P]αdCTP（比活性＝10mCi/ml）を加えて標識サンプルDNAを調製する以外は、前記のように第一ストランドcDNAを調製する。フィルターを、4.8xSSC (4.2%(w/v) NaCl, 2.1%(w/v)クエン酸Na, pH7.0)、1xDenhardt (0.02%(w/v)Ficoll 400, 0.02%(w/v), ポリビニルピロリドン40, 0.02%(w/v) Bovine Serum Albumin, Fraction V)、50%(w/v)Formatted, 0.2M Tris-HCl, pH7.6、5%(w/v)硫酸デキストラン、0.1%ドデシル硫酸Naの溶液中で、ハイブリダイゼーションオーブン内にて42℃で少なくとも２時間プレハイブリダイズさせる。標識サンプルDNAを、３分間煮沸し、直ちにプレハイブリダイゼーション溶液に加える。これを、ハイブリダイゼーションオーブン内にて42℃で少なくとも６時間又は一夜インキュベートする。
次いでフィルターを、2xSSC、0.1%  SDS中で50℃にて10分間２回洗浄した後、1xSSC、0.1% SDS中で50℃にて10分間２回洗浄し、次いで0.1xSSC、0.1% SDSで50℃にて10分間２回洗浄する。フィルムをInstant Imager中で露出する。
4.1.11  標準の創作
シグナル（一つのサンプルを、フィルターにハイブリダイズさせたプローブの一つから得られる）の一つは、標準と考えられる。フィルター上の他の全てのシグナルに関する比を、この標準シグナルに対して決定する。
疾患を有する植物と同じ疾患を有しない植物との間での対応するシグナルの比を比較する。
結果
９の選択されたcDNAに関する結果は、図１に示されている。P1は標準として使用された。「健康」は健康な植物からのサンプルを指し、「疾患」は問題の疾患を有する植物からのサンプルを指す。
4.2  未診断植物への開発した方法の適用
研究中の植物から葉のサンプル2gを採取し、２つの2gアリコートで直ちに凍結させる。１つのアリコートから、前述したようにRNAを抽出する。
前述したように第１ストランドcDNAを合成し、合成中に［32P］αdCTPを含ませることで標識する。
標識したサンプルを、上述したように、選択されたcDNAプローブを担持するフィルターにハイブリッド化させ、洗浄し、Instant Imager上でシグナル検出する。
フィルター上の異なるプローブからの担持シグナルパターンを、健康な植物からのパターン及び罹患した植物からのパターンと比較し、新しい植物においてこの疫患が存在するか又は存在をしないかを診断する。
実施例５：ヒトにおける疾患／状態の診断
診断は二つの工程に分けることができる：
−    診断すべき疾患／状態に典型的で再現可能な発現パターン（フィンガープリント）の開発。
−    開発した方法を、患者からのサンプルに適用し、発現パターンを、疾患／状態について開発したパターンと比較する。
5.1   診断すべき疾患／状態に典型的で再現可能な発現パターンの開発
5.1.1   血液からの総RNAの抽出
問題の疾患を有すると診断された患者から、およびこの疾患を有しないが、その他の点で年令、性および結果に影響を与えることのある他の要因が可能な限り類似している患者から、10mlの血液を採取する。各サンプルを二つのアリコートに分け、これらを直ちに液体窒素中で凍結させる。
各サンプルの一方のアリコートを用い、解凍した後、アリコートを10 000xgで５分間遠心して細胞のペレットにする。これらのペレットを、１mlの溶液Ａ（4Mグアニジンチオシアネート, 25mMクエン酸Na, pH7.0, 0.5%(w/v) N-ラウリルサルコシン, 0.1M 2-メルカプトエタノール）に再懸濁させ、溶解物を７〜10回ピペットに通過させる。0.1mlの２M酢酸Na、pH4をを加え、反転させてよく混合する。１mlの水飽和フェノールを加え、よく混合する。0.2mlの49:1クロロホルム／ブロモクロロプロパンを加え、よく混合し、０℃〜４℃で15分間インキュベートする。この混合物を10 000xgで20分間遠心し、上の水相を清潔な試験管に移す。
１ml(1vol)の100%イソプロパノールを加えてRNAを沈殿させ、サンプルを-20℃で30分間インキュベートし、次いで10 000xgで４℃にて10分間遠心する。
RNAペレットを0.3mlの溶液Ａに溶解させる。次いで0.3ml (1vol)の100%イソプロパノールを用い、-20℃で30分間RNAを沈殿させる。これを10 000xgで４℃にて5分間遠心し、上澄み液を捨てる。RNAペレットを75%エタノールに再懸濁させ、回転させ、室温で10〜15分間インキュベートする。これを10 000xgで４℃にて5分間遠心し、上澄み液を捨てる。ペレットを室温で約10〜15分間乾燥する。ペレットを100μlの水に再懸濁させ、55°〜60℃で約10〜15分間インキュベートする。
RNA濃度を計算し、ストックの1:100希釈物において、260nm、280nm、230nmおよび320nmでの吸光度を用いて純度を評価する。PHを、読み取り前に濃Na2HPO4で１mMに調節する。
各サンプルからの約１μgをアガロースゲル上に分離して、検出可能なDNA夾雑およびRNA分解の程度を決定する。サンプルは-70℃で保存する。
5.1.2  プローブとして区別可能に発現されたcDNAクローンを選択するための第一ストランドcDNAの合成
これらの工程は上記のパラグラフ4.1.2〜4.1.9に記載されたように行われる。
5.1.3  プローブcDNAを有するフィルターへの試験サンプルcDNAのハイブリダイゼーション
正常および罹患患者からの血液の第二のアリコートを用い、パラグラフ4.1.10に記載されたようにして、RNAを単離し、標識された第一ストランドcDNAを調製し、プローブを担持したフィルターへのハイブリダイゼーションを行い、フィルムを露出する。
5.1.4  標準の創作
結果を、4.1.11に記載されたようにして、単一シグナルに対して標準化する。
疾患を有する患者と同じ疾患を有しない患者との間での対応するシグナルの比を比較する。
結果
図１に説明されているのと同様の結果が得られる。
5.2  未診断患者への開発した方法の適用
２mlの血液サンプルを患者から採取し、二つの１mlアリコートとして直ちに凍結させる。RNAを、一方のアリコートから解凍後に前記のようにして抽出する。
第一ストランドcDNAを前記のようにして合成し、合成に[32P]αdCTPを含めることにより標識する。
標識サンプルを、選択されたcDNAプローブを担持したフィルターにハイブリダイズさせ、洗浄し、シグナルを前記のようにしてInstant Imagerで検出する。
フィルター上の異なるプローブからの相対的シグナルのパターンを、健康患者および罹患患者からのパターンと比較し、この疾患が新たな患者に存在するかまたは存在しないかの診断を行う。
実施例６：  異なった型のストレスで攻撃されたノルウェートウヒ(Picea abies)の根に見出される７の選択されたプローブの異なった相対的発現パターン
方法
１．  ７の異なった有益なcDNAプローブをナイロン膜に貼り付けた。クローンの大部分を、真菌性病原体ピチウム・ディモルフム(Pythium dimorphum)に感染したノルウェートウヒの減算cDNAライブラリーから単離した（実施例４に記載の方法による）。一方、他のクローンは、他の型のストレスで攻撃されたノルウェートウヒから同様の方法で単離した。減算ライブラリーを、Loenneborg et al. (1995), PCR Meth. Applic., 4, 編集者David Bentley, Richard Gibbs, Eric Green, Richard Myers, コールドスプリングハーバー・ラボラトリー  プレス、NY pS168-177に記載された方法により作成した。これらクローンの全ては、少なくとも一つの型のストレスにより誘導されたことが知られていた。
２．  ノルウェートウヒを、栽培室内で、500μmoles x m-2 x sec-1の12時間／12時間の光強度昼／夜サイクルにて、最適栄養での毎日１回の給水で栽培した。次いで植物を、前と同じ栄養（コントロール）、マルトース培養液、24mg（新鮮重量）のPythium dimorphum、あるいは24mg（新鮮重量）のリゾクトニア・エスピー(Rhizoctonia sp.)の何れかで攻撃した。植物を４日間または８日間攻撃した。攻撃の後、根および上部を直ちに凍結させた。
３．  残りの工程４〜10を、本質的に実施例４に記載されたように行った。
４．  RNAを根および上部から抽出し、質および収率について調査した。
５．  第一および第二ストランドcDNAを、ポリTプライマーおよび5’キャップの存在に基づくプライマーを用いて合成した。このようにして、複数の開始部位があるための交差合成の危険性を回避して、完全長のクローンだけが合成された。
６．  全てのcDNAを、PCR技術を用い、かつ同じ組のプライマーを用いて増幅した。
７．  cDNAプールを、ポリTプライマーを用いて標識した。
８．  各々７のプローブを担持したフィルターを、65℃で６時間プレハイブリダイズさせ、標識cDNAサンプルをそれぞれ一つのフィルターに加え、固定化フィルターを65℃で一夜ハイブリダイズさせた。
９．  フィルターを洗浄して非特異的にハイブリダイズした標識を除去した。
１０．  各フィルター上の個々のプローブの放射性シグナルを、Instant Imagerを用いて計数し、相対的シグナルを計算した。
結果
コントロール（４日目）、マルトース（４日目および８日目）、Pythium dimorphum（４日目および８日目）、Rhizoctonia sp.（４日目）からの根、およびコントロール（４日目）およびPythium dimorphum（４日目）からの針状葉を有するフィルターについて作成したパターンを、図２に示す。４日目のマルトースでは、独立した２重の手順を行い、この実験の再現可能性を示した。
結果は、これらの攻撃の各々がこの組のプローブを用いて別個のパターンを創り出すことを示している。ストレスは植物を全身的に刺激し、アッセイのために植物の異なった部分の使用を許容することも認められる。さらに、ストレスの異なった段階における特定の転写産物が区別可能に発現されることもまた、認められる。
【図１】
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【図２】
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