(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粗製ベロトキシンをｐＨ６.０〜９.５の緩衝液に溶解する工程（ａ）、工程（ａ）で得られたベロトキシン溶液をグロボトリアオシルセラミドまたはガラビオシドを固定化した不溶性担体と接触させる工程（ｂ）、および工程（ｂ）で得られた不溶性担体をｐＨ１.５〜５.５の緩衝液と接触させてベロトキシンを溶出させる工程（ｃ）を含んでなるベロトキシンの精製方法。
【請求項２】
不溶性担体が合成樹脂である請求項１記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアフィニティークロマトグラフィを利用したベロトキシンの精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７は、ベロトキシンを産生する菌体であり、該菌体による食中毒は、ベロトキシンに起因した出血性大腸炎、それに続発する溶血性尿毒症症候群や、血栓性血小板減少性紫斑病を引き起こす。そして、免疫機能の弱い幼児は、該食中毒で死亡に至る可能性が高いと言われている。
ベロトキシンは、該大腸菌の産生する毒素タンパク質であり、その立体構造はＡサブユニットおよびＢサブユニットと呼ばれる２種のタンパク質が結合したホロ毒素の形をとっている。該Ｂサブユニットは、細胞表面に存在する糖脂質と結合して該Ａサブユニットが細胞内へ侵入するのを補助する役目を担っており、該Ａサブユニットは、細胞内でＲＮＡ  Ｎ−グリコシダーゼ活性を発揮し、細胞の６０Ｓリボソームを失活させて細胞のタンパク質合成を阻害することにより毒性を示すといわれている。
また、ベロトキシンは、志賀赤痢菌の産生する志賀毒素と構成アミノ酸配列が同一なベロトキシン１およびこのベロトキシン１と構成アミノ酸配列が５５％同一なベロトキシン２に大別することができる。ベロトキシン２は生物学的性状はベロトキシン１と類似しているが、物理学的性状や免疫学的性状はかなり異なると報告されている（臨床と微生物 Vol.23，（臨時増刊）p785（1996））。
【０００３】
該大腸菌感染による食中毒が疑われるときはベロトキシン産生能の確認による該大腸菌感染を立証し、生体内からのベロトキシン除去等を早期に行うことが治療処置において非常に重要である。このような状況のもとに、多方面で該大腸菌の確認方法やベロトキシン除去方法が検討されている。すなわち、該大腸菌の同定は、従来の微生物培養法に加えて遺伝子解析法が広く用いられているが、より短時間に菌体同定を可能とする方法の研究も盛んに行われている。また、ベロトキシンを除去する方法として、生体内のベロトキシン受容体である糖脂質のＧｂ３をシリカゲルに結合させた吸着剤を利用する臨床研究が進められている（Nihon Rinsho 55(3), 241-247(1997)）。
該大腸菌の産生するベロトキシンに起因した疾患の発症は、原因となるベロトキシンを生体内から除去することが最も有効な治療手段と考えられるが、これらの方法を開発検討するには、まずベロトキシンを定量して除去効果を評価する必要があり、また該治療手段を臨床応用する段階においても、ベロトキシンの定量が効果判定の基準として重要である。すなわち、ベロトキシンの定量は、今後の該大腸菌感染症の治療方法の開発や臨床応用において欠くことができないものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
これまでベロトキシンの定量は、免疫学的手法が一般的に利用されているが、定量の標準物質、免疫学的定量法に用いる抗体の反応性確認、該抗体の特異性確認等には高純度に精製されたベロトキシンが必要である。
高純度に精製されたベロトキシンの標準物質を作るために、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、クロマトフォーカシング等のクロマトグラフィを組み合わせて精製する方法が用いられてきた〔ミクロバイアル パソゲネシス(Microbial Pathogenesis, 2, 339-349 (1987)、エフイーエムエス マイクロバイオロジー  レターズ（FEMS Microbiology Letters 51, 211-216(1988））〕。
しかし、これらの方法は工程数が多く、時間と手間を要し、もともと菌体中の含量が少なく不安定なベロトキシンを速やかに、且つ容易に精製することはできない。
本発明者らはこの問題点を解決する手段として、グロボトリアオシルセラミドおよびガラビオシドとベロトキシンとのアフィニティ結合能に着目した。
【０００５】
グロボトリアオシルセラミドは、３糖から成る１本の糖鎖がセラミドに結合した糖脂質であり、ベロトキシン１とのアフィニティ結合力が強い〔ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリ（Journal of Biological Chemistry 262(18), 8834-8839(1987)）〕。このベロトキシン１とグロボトリアオシルセラミドとの結合力に関しては、Glen D．らの報告〔ザ  ジャーナル  オブ  インフェクシャス  デジィーズ（ The Journal of Infectious Disease 164, 1160-1167（1991））〕がある。
すなわち、ベロトキシン粗抽出品をグロボトリアオシルセラミド結合シリカゲルに結合させた後、０.１Ｍ酢酸または６Ｍ塩酸グアニジンを加えるか、グロボトリアオシルセラミド結合シリカゲルを１０％ＳＤＳ溶液で煮沸する方法が報告されているが、文献に記載の方法では高純度のベロトキシン１を精製することができなかった。
ガラビオシドは４糖から成る１本の糖鎖がセラミドに結合した糖脂質で、ベロトキシン２とのアフィニティ結合が強い。
グロボトリアオシルセラミド、またはガラビオシドとベロトキシン類とのアフィニティ結合能をベロトキシンの精製に応用するためには、グロボトリアオシルセラミド、またはガラビオシドの糖部分がベロトキシンと反応できる状態を保ったまま不溶性担体に固定される条件と、該担体からベロトキシンのみを解離させる溶出条件の探求が必要であるが、このような試みはこれまで全く行われたことはない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ベロトキシンの精製方法について鋭意研究した結果、グロボトリアオシルセラミドまたはガラビオシドを不溶性担体に固定化し、この担体に粗製ベロトキシンの溶液を接触させ、ついで弱酸性緩衝液を用いて不溶性担体に結合したベロトキシン１のみを溶出させることにより、ベロトキシンを高純度に精製できることを見出して本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
（１）粗製ベロトキシンをｐＨ６.０〜９.５の緩衝液に溶解する工程（ａ）、工程（ａ）で得られたベロトキシン溶液をグロボトリアオシルセラミドまたはガラビオシドを固定化した不溶性担体と接触させる工程（ｂ）、および工程（ｂ）で得られた不溶性担体をｐＨ１.５〜５.５の緩衝液と接触させてベロトキシンを溶出させる工程（ｃ）を含んでなるベロトキシンの精製方法、および
（２）不溶性担体が合成樹脂である前記（１）記載の精製方法、
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明においては、まず粗製ベロトキシンがｐＨ６.０〜９.５の緩衝液に溶解される（工程ａ）。
本発明の原料である粗製ベロトキシンは、菌体の由来を特に限定する必要はなく、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７等のベロトキシンを産生する菌体の培養液から得られたものを用いればよい。また、該培養液にポリミキシンＢ、ゲンタマイシン等の抗生物質を添加する方法、培養液を超音波処理して菌体を物理的に破壊する方法等の前処理を行えば、菌体膜が破壊されて菌体内のベロトキシンが培養液に溶出されるので一層効率よくベロトキシンを得ることができる。
該培養液は、そのまま本発明の製造方法の原料として使用することもできるが、培養液に硫酸アンモニウム、ポエチレングリコール類等の沈殿剤を加えて得られたベロトキシンの沈殿物を用いることがより好ましい。該沈殿物は遠心分離方法、濾過法等の生化学分野で汎用されている分離手段を用いて集めることができる。
粗製ベロトキシンを溶解させる緩衝水溶液は、緩衝剤の種類や塩濃度を特に限定する必要はなく、生化学領域で一般的に用いられている緩衝剤、例えば、リン酸塩、炭酸塩、ホウ酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシン等を用いることができるが、特にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが好ましく用いられる。該緩衝水溶液のｐＨ領域は、６.０〜９.５の間であればよく、特にｐＨ７.０〜８.５が好ましい。また、該緩衝水溶液の緩衝剤濃度は、０.１〜０.５Ｍ程度の範囲であればよく、より好ましくは０.１〜０.２Ｍの範囲である。
【０００８】
つぎに工程（ａ）で得られたベロトキシン溶液を、グロボトリアオシルセラミドまたはガラビオシドを固定化した不溶性担体と接触させる（工程ｂ）。
本発明で用いるグロボトリアオシルセラミドまたはガラビオシドの由来は特に限定する必要はなく、ブタ赤血球、ヒト赤血球、ヒト腎臓などの生体試料から抽出されたものでも、化学的に合成されたものでもよい。これらのグロボトリアオシルセラミドまたはガラビオシドは、市販品を用いることもできるが、生体試料からのクロロホルムとプロパノールによる抽出法や化学的な合成法〔カルボハイドレイド  リサーチ（Carbohydrate Research, 202, 177-191（1990））に従って調製した物を用いても良い。
本発明においてグロボトリアオシルセラミドまたはガラビオシドを固定化する不溶性担体は、アフィニティクロマトグラフィの担体に用いられるものならどのようなものでもよいが、特に合成樹脂（たとえば、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、アクリル酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸、メタクリル酸エステル、スチレン、メチルスチレン、ブタジエン、イソプレン、アクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリルなどの重合物もしくは共重合物）製担体が好ましい。担体の形状は特に限定する必要はなく、ビス状、プレート状、チューブ状、ディスク状、スティック状などが使用しうる。該不溶性担体へのグロボトリアオシルセラミドまたはガラビオシドの固定は、クロロホルム、メタノール等の溶媒、すなわち、グロボトリアオシルセラミドまたはガラビオシドの糖構造を維持できる良溶媒に溶解して該不溶性担体と接触させた後、自然蒸発乾固、陰圧条件下での溶媒除去等の適当な方法で該溶媒を除去することにより行うことができる。グロボトリアオシルセラミドを固定化した担体とガラビオシドを固定化した担体は任意に混合して使用することができる。
【０００９】
粗製ベロトキシン１溶液を不溶性担体と接触させる方法としては、たとえば、不溶性担体を充填したカラムに粗製ベロトキシン溶液を通液するいわゆる連続法や、不溶性担体を粗製ベロトキシン溶液に浸漬するいわゆるバッチ法などがあるが、カラムを用いる連続法がより便宜である。
このようにして得られたベロトキシン結合不溶性担体にｐＨ０.５〜５.５の緩衝液を接触させてベロトキシンのみを溶出させる（工程ｃ）。
該不溶性担体からベロトキシンのみを溶出させる緩衝水溶液は、緩衝剤の種類や塩濃度を特に限定する必要はなく、生化学領域で一般的に用いられている緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩等を用いて調製することができるが、特にクエン酸が好ましく用いられる。該緩衝水溶液のｐＨ領域は１.５〜５.５の間であればよく、特にｐＨ２.５〜５.０が好ましい。また、該緩衝水溶液の緩衝剤濃度は、０.１〜０.５Ｍ程度の範囲であればよく、より好ましくは０.１〜０.２Ｍの範囲である。
前述の工程を経て得られた高度に精製されたベロトキシンを含む溶出液は、そのままでも用いることができるが、さらに適当な緩衝塩を添加したり、透析したりして中性近くのｐＨ領域の溶液として保存してもよく、さらに常法により凍結乾燥品としてもよい。
【００１０】
【実施例】
以下、本発明について実施例および比較例をあげてさらに詳細に述べるが、本発明はそれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）グロボトリアオシルセラミド結合不溶性担体の調製
グロボトリアオシルセラミド１００μｇをクロロホルム：メタノール＝２：１の混液５ｍｌに溶解し、ナイロンビーズ（直径３.２ｍｍ）３００個と混合し、室温にて振盪しながら溶媒を自然蒸発させた。
溶媒臭がなくなった後、１％牛血清アルブミン溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.４）１０ｍｌと混合して室温にて２時間静置した。
（２）ベロトキシン１抽出液の調製
ベロトキシン１産生Ｏ−１５７大腸菌をトリプティック  ソイブロス液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３７℃、２４時間培養した後、ポリミキシンＢを６００万単位／１.２リットルづつ添加、菌を破砕して死菌とした。死菌溶液を遠心（８２００ｒｐｍ、３０分）し、菌体成分と上清に分離した。上清について、硫酸アンモニウムが６０％飽和となるように添加し、ベロトキシン１含有タンパク質を沈殿させた。
【００１１】
（３）ベロトキシン１の精製
上記ベロトキシン１含有タンパク質の沈殿物１５ｇを、０.１Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８.０）１５０ｍｌに溶解し、（１）で調製した不溶性担体と混合し、室温で１０分間静置した。
不溶性担体のみを取り出して１０ｍｌのカラムに詰め、０.１Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８.０）で洗浄し、続いて０.１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ３.０）で溶出させた。溶出液について、クーマシー・ブリリアントブルーＲ−２５０を用いた蛋白質定量法により牛血清アルブミンを標準としてベロトキシン１の定量を行ったところ、収量は５６μｇであった。
【００１２】
比較例１
（１）従来法によるベロトキシン１の精製
上記実施例１（２）と同様にして得たベロトキシン１含有タンパク質の沈殿物１５ｇを、０.１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８.５）に溶解し、同緩衝液で平衡化したセファデックス（Sepahdex）Ｇ−２５（ファルマシア社製）カラムに添加して同緩衝液で溶出することにより、硫酸アンモニウムを除去した。
溶出画分を０.１Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８.５）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社製）カラムに添加し、それぞ０.１、０.２、１.０Ｍの塩化ナトリウムを添加した同緩衝液を用いて段階的にベロトキシン１の溶出を行った。
０.１Ｍの塩化ナトリウムを含有した同緩衝液の溶出画分に硫酸アンモニウムの６０％飽和量を添加してベロトキシン１を主に含む画分として沈殿させた。続いて、沈殿物を０.０２５Ｍのイミダゾール緩衝液（ｐＨ７.４）を用いて溶解し、同緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムに添加し、同緩衝液で溶出させ、硫酸アンモニウムを除去した。
０.０２５Ｍのイミダゾール緩衝液（ｐＨ７.４）で平衡化した等電点クロマトグラフィー用樹脂ポリバッファー交換体  ＰＢＥ９４（ファルマシア社製）カラムに緩衝液ポリバッファー７４（ファルマシア社製）（ｐＨ４.０）を５ｍｌ添加した後、該溶出画分を添加した。続いて、ポリバッファー７４（ｐＨ４.０）で溶出させ、ｐＨ７から６の画分を回収した。溶出液についてクーマシー・ブリリアントブルーＲ−２５０を用いたタンパク質定量法により牛血清アルブミンを標準としてベロトキシン１の定量を行ったところ、収量は５６μｇであった。
また、溶出画分について、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、銀染色キット（ナカライテスク社製）を使用し銀染色を行ってベロトキシン１の純度を実施例１で得られたものと比較した結果、両者の純度は同一であった。
【００１３】
実施例２
実施例１と同様にしてグロボトリアオシルセラミド結合不溶性担体を調製した。
ベロトキシン１産生Ｏ−１５７大腸菌をトリプティック  ソイブロス液体培地で３７℃、２４時間培養した後、ポリミキシンＢを１.２リットルの液体培地当たり６００万単位添加して死菌とした。このベロトキシン１産生大腸菌の死菌溶液５リットルとグロボトリアオシルセラミド結合不溶性担体９,０００個を混合し、室温で１０分間静置した。
不溶性担体のみを取り出して１０ｍｌのカラムに詰め、０.１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８.０）を用いて洗浄し、続いて０.１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて溶出させた。溶出液についてクーマシー・ブリリアントブルーＲ−２５０を用いたタンパク質定量法により牛血清アルブミンを標準としてベロトキシンの定量を行ったところ収量は１１μｇであった。また、同液について１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、銀染色キット（ナカライテスク社製）により銀染色を行い純度を確認した。結果は比較例１で得たものと同等であった。
【００１４】
実施例３
（１）  実施例１と同様にしてグロボトリアオシルセラミド結合不溶性担体の調製およびベロトキシン１含有タンパク質沈殿物の調製を行った。
上記ベロトキシン１含有タンパク質の沈殿物０.６０ｇを０.１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ９.０）１０ｍｌに溶解し、前記で得た不溶性担体と混合し、室温で１０分間静置した。
不溶性担体のみを取り出してカラムに詰め、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ９.０）で洗浄し、続いて０.１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させた。
溶出画分について、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、銀染色キット（ナカライテスク社製）を使用し銀染色を行って比較例１のものと同純度であることを確認した。
また、同画分についてクーマシー・ブリリアントブルーＲ−２５０を用いたタンパク質定量法により牛血清アルブミンを標準としてベロトキシン１の定量を行った結果、収量は２.４μｇであった。
（２）  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液のｐＨを８.０にした以外は前記（１）と全く同様にしてクエン酸緩衝液溶出画分を得た。
得られた溶出画分の銀染色法による純度は比較例１のものと同じであった。
また、ベロトキシン１の収量は４．８μｇであった。
（３）  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液のｐＨを７.０にした以外は前記（１）と同様にしてクエン酸緩衝液溶出画分を得た。
得られた溶出画分の銀染色法による純度は比較例１のものと同じであった。
また、ベロトキシン１の収量は１.２μｇであった。
【００１５】
実施例４
（１）  実施例１と同様にしてグロボトリアオシルセラミド結合不溶性担体の調製およびベロトキシン１含有タンパク質沈殿物の調製を行った。
得られたベロトキシン１含有タンパク質の沈殿物０.６０ｇを０.１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８.０）に溶解し、グロボトリアオシルセラミド結合不溶性担体と混合して、室温で１０分間静置した。
ベロトキシン１が結合したグロボトリアオシルセラミド結合不溶性担体と０.１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４.０）を添加して溶出を行った。
溶出画分について、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、銀染色キット（ナカライテスク社製）を使用し銀染色を行って比較例１のものと同純度であることを確認した。
また、同画分についてクーマシー・ブリリアントブルーＲ−２５０を用いたタンパク質定量法により牛血清アルブミンを標準としてベロトキシン１の定量を行った。その結果収量は２．４μｇであった。
（２）  ０.１Ｍクエン酸緩衝液のｐＨを３.０にした以外は前記（１）と全く同様にしてベロトキシン１溶出画分を得た。
得られた溶出画分の銀染色法による純度は比較例１のものと同じであった。
また、ベロトキシン１の収量は４．８μｇであった。
（３）  ０.１Ｍクエン酸緩衝液のｐＨを２.０にした以外は前記（１）と全く同様にしてベロトキシン１溶出画分を得た。
得られた溶出画分の銀染色法による純度は比較例１のものと同じであった。
また、ベロトキシン１の収量は２．４μｇであった。
【００１６】
実施例５
ベロトキシン２産生Ｏ−１５７大腸菌を用いて、実施例１と同様の操作により抽出液の調製、グロボトリアオシルセラミド結合不溶性担体の調製を行った。ついで、ベロトキシン２が結合したグロボトリアオシルセラミド結合不溶性担体を調製し、これに０.１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３.０）を用いて溶出を行った。
溶出画分について、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、銀染色キット（ナカライテスク社製）を使用し銀染色を行って純度を確認した。
また、ベロトキシンのタイプはラテックス凝集テストキット（デンカ生研社製）を用いてベロトキシン２であることを確認した。
【００１７】
実施例６
実施例５と同様にしてベロトキシン２産生Ｏ−１５７大腸菌の培養、抽出液の調製およびガラビオシド結合不溶性担体の調製を行った。
ベロトキシン２が結合したガラビオシド結合不溶性担体を調製し、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３.０）を使用して溶出を行った。
溶出画分について、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、銀染色キット（ナカライテスク社製）を使用して銀染色を行い、実施例５のものと同純度であることを確認した。
また、ベロトキシンのタイプはラテックス凝集テストキット（デンカ生研社製）を用いてベロトキシン２であることを確認した。
実施例７
ベロトキシン１産生Ｏ−１５７大腸菌の培養および抽出液の調製については実施例１と同様にして行った。
グロボトリアオシルセラミド１００μｇをメタノール５ｍｌに溶解し、ポリスチレンビース（直径６.４ｍｍ）１００個と混合した。室温にて振盪しながら溶媒を自然蒸発させた。
ベロトキシン１含有タンパク質の沈殿物を０.１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８.０）に溶解し、グロボトリアオシルセラミド結合不溶性担体と混合して、室温で１０分間静置した。
ベロトキシン１結合グロボトリアオシルセラミド結合不溶性担体に０.１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３.０）を添加して溶出させた。
この溶出画分について、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、銀染色キット（ナカライテスク社製）を使用し銀染色を行って純度を確認した結果比較例１のものと同一であった。
またベロトキシンのタイプはラテックス凝集テストキット（デンカ生研社製）を用いてベロトキシン１であることを確認し、ポリスチレンを担体した場合でも高純度のベロトキシン１を精製できることが確認された。
【００１８】
【発明の効果】
本発明のベロトキシンの精製方法は、従来のクロマトグラフィを組み合わせた方法では５工程以上を要していた精製手順を１工程で実施することが可能であり、精製手段を簡素化するとともに不安定なベロトキシンを短時間で容易に得ることができる。また、得られるベロトキシンの純度、収率は従来法のものと全く変わりがない。