(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＧ−ＣＳＦタンパク質と対比した置換が、１７Ｌ、２８Ａ、７８Ｆ、８５Ｆ、１０３Ｖ、１１０Ｉ、１１３Ｌ、１５１Ｉ、１５３Ｉおよび１６８Ｆである（配列番号７）、非天然生起型ＧＰＡタンパク質。
【請求項２】
ｈＧ−ＣＳＦタンパク質と対比した置換が、１７Ｌ、２１Ｉ、２８Ａ、７８Ｆ、８５Ｆ、１１０Ｉ、１１３Ｌ、１５１Ｉ、１５３Ｉ、１５７Ｉ、１６０Ｗ、１６１Ｆ、１６７Ａおよび１６８Ｆである（配列番号８）、非天然生起型ＧＰＡタンパク質。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の非天然生起型ＧＰＡタンパク質をコード化している組換え核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の組換え核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の組換え核酸を含んでなる宿主細胞。
【請求項６】
請求項４に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の宿主細胞を、該組換え核酸の発現に適した条件下に培養することを含む、非天然生起型ＧＰＡタンパク質の生成法。
【請求項８】
さらに該ＧＰＡタンパク質を回収することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１または請求項２に記載のＧＰＡタンパク質、および医薬的担体、を含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は１９９９年１月６日出願のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.６０／１１５,１３１および１９９９年２月５日出願のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.６０／１１８,８３１の継続出願である。
【０００２】
（技術分野）
本発明は新規な顆粒球形成活性（ＧＰＡ）タンパク質および核酸に関する。本発明はさらにＧ−ＣＳＦ関連疾患の処置におけるこれらのＧＰＡタンパク質の使用に関する。
【０００３】
（背景技術）
コロニー刺激因子はタンパク質ホルモンの一種であり、顆粒球など特定血液細胞型の増殖と機能を刺激する。顆粒球は微生物侵入者や細胞残渣を呑み込み貪食し、感染応答に重要である。顆粒球は血流中で６〜１２時間の寿命しかなく、それらが機能すると破壊される。従って、血液骨髄幹細胞が迅速に定常的に顆粒球を生成することが必要である。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、顆粒球、特に好中球の増殖と分化にとって必須のタンパク質である。
【０００４】
しかし、その急速な代謝回転の結果として、顆粒球数は骨髄損傷、例えば、化学療法剤と放射線を含む伝統的な癌治療法での治療、またはＡＩＤＳなどの免疫障害などのための骨髄損傷により、急速に顕著に低下する。従って、ｈＧ−ＣＳＦでの治療は癌治療の副作用の一部を最少化すること、同様に抑制された免疫系の治療に有効であることが示されている。
しかし、野生型のｈＧ−ＣＳＦは幾つかの欠点、例えば、貯蔵安定性の問題、並びに血流中での半減期が短いという欠点を有する。
【０００５】
この目的のためには、Ｇ−ＣＳＦの変異体が知られている；参照、例えば、ＵＳＰ５，２１４，１３２；５，３９９，３４５；５，７９Ｏ，４２１；５，５８１，４７６；４，９９９，２９１；４，８１０，６４３；４，８３３，１２７；５，２１８，０９２；５，３６２，８５３；５，８３０，７０５；５，５８０，７５５；５，３９９，３４５および５，４１６，１９５およびそこに引用された文献。
【０００６】
しかし今なお有意な安定性と顆粒球形成活性の両方を示すタンパク質の必要性がある。従って、本発明の目的は好中球障害処置用の顆粒球形成活性（ＧＰＡ）タンパク質、核酸および抗体を提供することにある。
【０００７】
（発明の開示）
上に概説した目的に従い、本発明はｈＧ−ＣＳＦとの同一性が約９５〜９７％以下であるアミノ酸配列を含んでなる非天然型ＧＰＡタンパク質（例えば、該タンパク質は自然界に見出されない）を提供する。該ＧＰＡタンパク質は少なくとも１つのＧ−ＣＳＦタンパク質の生物活性を有する；例えば、該ＧＰＡタンパク質はＧ−ＣＳＦレセプターをもつ細胞を刺激し増殖させる。従って、本発明は図１に示すように、ｈＧ−ＣＳＦ配列と比較して、少なくとも約５個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列のＧＰＡタンパク質を提供する。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は実質的にｈＧ−ＣＳＦの３次元バックボーン構造に相当する３次元バックボーン構造を有する非天然型ＧＰＡコンホーマーを提供する。該コンホーマーのアミノ酸配列とｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列とは同一性が約９５％以下である。一態様において、該コンホーマーは該コンホーマーのコア領域に少なくとも約９０％の非同一アミノ酸を有する。他の態様において、該コンホーマーは該コンホーマーのコア領域に少なくとも約１００％の非同一アミノ酸を有する。
【０００９】
さらなる態様において、変化位置は、１４、１７、２０、２１、２４、２７、２８、３１、３２、３４、３８、７８、７９、８５、８９、９１、９９、１０２、１０３、１０７、１０９、１１０、１１３、１１６、１２０、１４５、１４６、１４７、１４８、１５１、１５３、１５５、１５６、１５７、１６０、１６１、１６４、１６８および１７０から選択される位置でのアミノ酸残基から選択される。好適な態様では少なくとも約５または１０の変異を含む。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は非天然型ＧＰＡタンパク質をコードする組換え核酸、該組換え核酸を含んでなる発現ベクター、および該組換え核酸と発現ベクターとを含んでなる宿主細胞を提供する。
【００１１】
なおさらなる態様において、本発明は本発明のＧＰＡタンパク質の製造方法を提供し、該方法は該核酸の発現に適した条件下に組換え核酸を含んでなる宿主細胞を培養することを含んでなる。該タンパク質は必要に応じて回収し得る。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は本発明のＧＰＡタンパク質と医薬担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。
なおさらなる態様において、本発明は本発明のＧＰＡタンパク質を患者に投与することを含んでなるＧ−ＣＳＦ応答性疾患の処置方法を提供する。このＧ−ＣＳＦ疾患とは骨髄抑制療法、慢性好中球減少症、または末梢血始原細胞収集などであり得る。
【００１３】
（図面の簡単な説明）
（図１）
図１はヒトＧ−ＣＳＦの核酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を描出する。
（図２）
図２は各ＧＰＡセットの可変残基を描出する。
【００１４】
（図３）
図３は幾つかの好適なＧＰＡ配列を描出する。第１行目（配列番号１０）はｈＧ−ＣＳＦ配列である。変化を記していない配列はｈＧ−ＣＳＦ配列と同じままである。第２行目（配列番号３）はＧＰＡタンパク質、ｂｎｄｒｙ４ ２であり、可変境界残基をもつ；２４の異なる位置が変化可能であった。第３行目（配列番号４）はＧＰＡタンパク質、ｂｎｄｒｙ４ コア４であり、可変境界残基をもつ；これは２４の異なる境界位置を利用するが、開始鋳型として設計したコア４の最適配列を用いた。第４行目（配列番号５）はＧＰＡタンパク質、ｂｎｄｒｙ４ ＡＤであり、可変境界残基を有する；しかし、境界残基は外側の２つのヘリックス（ＡとＤ；１４の可変残基位置）上で選択したが、その理由は当初の計算が、ヘリックス傾向の最も顕著な変化がこれらの位置での修飾から生じること、；ヘリックス傾向の改善は安定性を改善させる可能性があることを示唆したからである。第５行目（配列番号６）はＧＰＡタンパク質、ｂｎｄｒｙ４ ＡＤ コア４であり、１４の可変境界残基をもつ；開始鋳型として設計したコア４の最適配列を再度使用した。第６行目（配列番号７）はＧＰＡタンパク質、コア４であり、２６の異なる可変コア位置を利用した。第７行目（配列番号８）はＧＰＡタンパク質、コア４ Ｖ１５３Ａであり、２５の可変コア位置を利用した。第８行目（配列番号９）はＧＰＡタンパク質、コア３であり、３４のコア可変位置を有していた。
【００１５】
（図４）
図４はコア４ＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。例えば、１７位置では、ｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸はシステインであり；ＧＰＡタンパク質では、トップ１０００配列の７３.６％がこの位置がロイシンであり、該配列の２２.９％ではイソロイシンであった。
（図５）
図５はコア４ｖＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。例えば、１７位置では、ｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸はシステインであり；ＧＰＡタンパク質では、トップ１０００配列の６９.７％がこの位置がロイシンであり、該配列の５.１％ではバリンであり、そして該配列の２５.１％ではイソロイシンであった。
【００１６】
（図６）
図６はコア３ＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。
（図７）
図７はｂｎｄｒｙ４ ２ＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。
（図８）
図８はｂｎｄｒｙ４ コア４ＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。
（図９）
図９はｂｎｄｒｙ４ ＡＤ ＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。
（図１０）
図１０はｂｎｄｒｙ４ ＡＤ コア４ＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。
【００１７】
（図１１）
図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは３種のＧＰＡタンパク質に対する遺伝子配列を描出する；図１１Ａはコア３ＧＰＡタンパク質、図１１Ｂはコア４ＧＰＡタンパク質、そして図１１Ｃはコア４ｖＧＰＡタンパク質のものである。
（図１２）
図１２は完全長遺伝子と可能なすべての変異体のＰＣＲによる合成を描出する。完全長遺伝子に対応するオーバーラップオリゴヌクレオチド（黒棒、工程１）を合成し、加熱し、アニーリングする。Ｐｆｕ・ＤＮＡポリメラーゼを、アニーリングしたオリゴヌクレオチドに加えてＤＮＡの５'＠３'合成に至らしめ（工程２）、より長鎖のＤＮＡフラグメントを生成させる（工程３）。加熱とアニーリングの繰返しサイクル（工程４）により一部完全長分子を含む長鎖ＤＮＡの生成に至らしめる。これらは完全長遺伝子の末端に対応するプライマー（矢印）を用い、２度目のＰＣＲにより選択することができる（工程５）。
（図１３）
図１３は円二色性（ＣＤ）分光法による metｈＧ−ＣＳＦおよび数種のＧＰＡタンパク質の熱安定性を描出する。ＣＤはタンパク質の二次構造含量を直接測定し、温度または化学的変性に応答して構造が喪失していくのを追跡することができる。図１３は metｈＧ−ＣＳＦに比べてコア４の熱安定性が上昇していることを示す。
（図１４）
図１４は metｈＧ−ＣＳＦおよび３種のＧＰＡタンパク質に応答する細胞増殖を描出する。ｈＧ−ＣＳＦレセプターを発現するＢａＦ／３細胞の細胞増殖を、ＢrdＵ取込みによりモニターし、タンパク質濃度に対しプロットして示す。ＢrdＵ取込みは蛍光ＥＬＩＳＡにより評価する。図は metｈＧ−ＣＳＦに比較したコア４の生物活性の増大を示す。
（図１５）
図１５は metｈＧ−ＣＳＦとコア４の貯蔵安定性の動力学をサイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣによりモニターして描出する。この２種のタンパク質は５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、０.００４％トゥイーン−８０中、ｐＨ４.０で培養し、５０℃に保存した。タンパク質濃度は３００μｇ／ｍｌであった。単量体タンパク質はそのままと考えられた。
（図１６）
図１６はｈＧ−ＣＳＦおよび本発明新規ＧＰＡタンパク質の一部についての融解温度（Ｔｍ）および吸光係数を描出する。
【００１８】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は顆粒球形成活性を有する新規タンパク質および核酸を目的とする（本明細書では場合により“ＧＰＡタンパク質”および“ＧＰＡ核酸”という）。このタンパク質は、ＷＯ９８／４７０８９およびＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／１２７，９２６（両文献の全文を出典明示により本明細書の一部とする）に記載された既知システムを用いて生成させるが、このシステムはコンピューターモデル化システムであり、タンパク質それ自体の生物機能を必ずしも損なうことなく非常に安定なタンパク質の生成を可能とする。この方法において、新規なＧＰＡタンパク質と核酸を生成するが、これらは野生型の酵素に比較して複数の変異を有しながら、顕著な活性を保持し得るものである。
【００１９】
本発明のＧＰＡタンパク質を生成させ、評価するために使用されるコンピューター計算による方法について以下に簡単に説明する。好適な態様において、一次ライブラリーを生成させるのに使用するコンピューター計算による方法は、以下に記載されたタンパク質設計オートメーション（ＰＤＡ）である；Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.Ｓ６０／０６１，０９７；６０／０４３，４６４；６０／０５４，６７８；０９／１２７，９２６およびＰＣＴ ＵＳ９８／０７２５４（これらの文献はすべてを出典明示により本明細書の一部とする）。簡単に説明すると、ＰＤＡは以下のように説明し得る。既知のタンパク質構造を出発点として用いる。最適化すべき残基を次いで同定するが、それは全配列であってもよいし、その部分セット（群）でもよい。次いで、変異させるべき各位置の側鎖を除去する。タンパク質バックボーンと残りの側鎖からなる得られた構造は鋳型（テンプレート）と呼ぶ。次いで、各可変残基の位置を好ましくは、コア残基、表面残基、または境界残基として分類する；各分類はその位置にとって可能なアミノ酸残基のサブセットを定義する（例えば、コア残基は一般に疎水性残基のセットから選択し、表面残基は一般に親水性残基から選択し、また、境界残基はどちらでもよいとする）。各アミノ酸は各側鎖の可能なすべてのコンホーマー、いわゆる回転異性体の別個のセットにより表すことができる。このように、バックボーンとして最適な配列に到達するためには、すべての可能な回転異性体の配列を選別しなければならず、その場合、各バックボーンの位置はすべてのその可能な回転異性体状態における各アミノ酸またはアミノ酸のサブセットにより、従って回転異性体のサブセットにより占拠され得る。
【００２０】
次いで、２セットの相互作用を各回転異性体についてそれぞれの位置で計算する；回転異性体側鎖とバックボーンのすべてまたは一部との相互作用（“単一”エネルギー、回転異性体／鋳型または回転異性体／バックボーンエネルギーとも呼ぶ）、および回転異性体側鎖とそれぞれ他の位置にあるすべての他の可能な回転異性体との、または他の位置のサブセットとの相互作用（“ダブルス”エネルギー、回転異性体／回転異性体エネルギーとも呼ぶ）。これら相互作用の各エネルギーは様々なスコアリング関数を使用して計算するが、それはファンデルワールス力のエネルギー、水素結合エネルギー、二次構造傾向のエネルギー、表面積溶媒和エネルギー、および静電気などを含む；しかし、これらに限定されるものではない。このように、各回転異性体相互作用の総エネルギーは、バックボーンと他の回転異性体と共に計算し、マトリックスの形状で保存する。
【００２１】
回転異性体セットの個別の性質は、試験すべき回転異性体配列の数の単純な計算を可能とする。各位置当たりｍ個の可能な回転異性体をもつ長さｎのバックボーンは、ｍｎ個の可能な回転異性体配列を有し、その数は配列の長さとともに指数的に増加し、リアルタイムでの計算を扱い難くするか、不可能とする。従って、このコンビナトリアル研究の問題を解消するために、“デッドエンド削除”（ＤＥＥ）計算を実施する。ＤＥＥ計算は、もし第一の回転異性体の最悪の総相互作用が第二の回転異性体の最良の総相互作用よりもなお良いのであれば、第二の回転異性体は全体として最適な解の部分とはなり得ないという事実にもとづいている。回転異性体すべてのエネルギーがすでに計算されているので、ＤＥＥ法は回転異性体を試験し削除するために配列の長さを計算することが必要なだけで、計算は相当にスピードアップする。ＤＥＥは回転異性体の対または回転異性体の組合わせを比較することが可能であり、結局は全体としての最適なエネルギーを表す単一の配列を決定することになる。
【００２２】
全体としての解が見出された以上、モンテカルロの検索を実施し、ＤＥＥ解の近傍の配列についてランク付けしたリストを作成し得る。ＤＥＥの解から出発して、ランダムな位置を他の回転異性体に変化させ、新たな配列のエネルギーを計算する。もし新たな配列が容認基準に合致するならば、それをもう一つの出発跳躍点として使用する。既定数の跳躍に従って、配列についてランク付けしリストを作成する。さらに、当業者が認めるように、モンテカルロ検索は完了していないＤＥＥ操作から実施し得る；すなわち、多くの配列をもつ部分的なＤＥＥ操作を用い、モンテカルロリストを作成する。
【００２３】
Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／１２７，９２６に概説されているように、タンパク質バックボーン（天然型タンパク質では、窒素、カルボニル炭素、α−炭素、およびカルボニル酸素を含んでなり、それらはα−炭素からβ−炭素へのベクトル方向に沿っている）は、コンピューター分析に先立って、超二次構造パラメーターと呼ばれるパラメーターのセットを変えることにより変更し得る。
【００２４】
タンパク質構造バックボーンを作成し（上に概説したような変更により）、コンピューターにインプットすると、ハッキリしている水素をもしその構造内に含めていないならば加える（例えば、その構造がＸ線結晶解析により作成されたのであれば、水素を加えねばならない）。水素を加えた後、構造のエネルギー最少化を行い、水素並びに他の原子、結合角および結合距離を緩和させる。好適な態様において、これは原子配位座の共役勾配最小化（Mayo et al., J. Phys. Chem. 94: 8897 (1990)）の多くの工程を実施することにより実施し、静電気をもたないドライディング（Dreiding）力場を最小とする。一般に、約１０ないし約２５０工程が好ましく、最も好ましいのは５０工程である。
【００２５】
ＧＰＡバックボーン構造は、少なくとも１つの可変残基位置を有する。ｈＧ−ＣＳＦタンパク質と等価位置で異なり得る各ＧＰＡ残基を“可変残基”と呼ぶ。当技術分野で知られているように、一般にタンパク質の残基またはアミノ酸には該タンパク質のＮ−端から始めて順番に番号を付す。従って、そのＮ−端にメチオニンを有するタンパク質は、残基またはアミノ酸の１位にメチオニンを有すると言い、それに隣接する残基は２、３、４、などと言う。野生型（すなわち、天然型）タンパク質は、回転異性体が幾つあっても、各位置に少なくとも２０種のアミノ酸の１つを有している。本明細書において“可変残基位置”とは、特定の残基または回転異性体、一般には野生型ｈＧ−ＣＳＦ残基または回転異性体として、固定的でない、設計しようとするタンパク質のアミノ酸位置を意味する。
【００２６】
好適な態様において、タンパク質の残基位置はすべて可変である。すなわち、それぞれのアミノ酸側鎖は本発明方法において変更し得る。
別の好適な態様においては、タンパク質の残基位置の幾つかのみが可変であり、残りのものは“固定”されている、すなわち、それらは定まったコンホメーションにおいて特定のアミノ酸と３次元構造において同一であるとされるものである。ある実施態様においては、固定位置はその当初のコンホメーションのままとする（これは使用する回転異性体ライブラリーの特定の回転異性体と互いに関連するものでも、しないものでもよい）。あるいは、残基は非野生型残基として固定してもよい；例えば、既知の部位特異的変異誘発技法が、特定の残基が望ましいこと示している（例えば、タンパク質分解部位を除くか、または活性部位を変化させるために）場合には、該残基は特定のアミノ酸として固定してもよい。あるいは、本発明方法は以下に考察するように、あらたな変異を評価するために使用することができる。別の好適な態様において、固定位置は“浮動”していてもよい；その位置のアミノ酸は固定するが、そのアミノ酸の異なる回転異性体について試験する。この態様では、可変性残基は少なくとも１個であるか、または総残基数の０.１％ないし９９.９％で任意の位置であってもよい。従って、例えば、２〜３個（または１個）の残基だけ、またはその間で可能性のあるすべての残基の殆どを変えることも可能である。
【００２７】
好適な態様において、固定し得る残基とは構造的にまたは生物学的に機能する残基であるが、これらに限定されるものではない。例えば、生物活性にとって重要であることの分かっている残基、例えば、結合パートナーに対し結合部位を形成する残基（リガンド／レセプター、抗原／抗体など）、生物機能に重要なリン酸化またはグリコシル化部位、または構造的に重要な残基、例えば、ジスルフィド架橋、金属結合部位、臨界水素結合残基、プロリンまたはグリシンなどのバックボーンコンホメーションにとって重要な残基、パッキング相互作用にとって重要な残基などはすべて、コンホメーション内にまたは単一回転異性体として固定するか、または“浮動”させてもよい。
【００２８】
同様に、可変残基として選択し得る残基は不所望の生物学的寄与を付与する残基、例えば、タンパク質分解に対する感受性、二量化または凝集部位、免疫応答に導き得るグリコシル化部位、望ましくない結合活性、望ましくないアロステリー、結合を保存したままの望ましくない生物活性などを付与する残基であってもよい。
【００２９】
好適な態様において、各可変位置はコア、表面または境界残基位置として分類されるが、ある場合には以下に説明するように、可変位置をグリシンとし、バックボーンの歪みを最小としてもよい。
【００３０】
一態様においては、コア残基のみが可変残基である；別の態様では、コア、境界および表面可変残基；コアおよび表面可変残基；コアおよび境界可変残基；表面および境界可変残基；並びに表面可変残基のみ、または境界可変残基のみを含むＧＰＡタンパク質を設計する方法を利用する。一般に、好適な態様では表面可変残基を利用しないが、それは不所望の抗原性に導き得るからである；しかし、ＧＰＡタンパク質の治療使用に関係しない適用においては、表面残基を変えることが望ましい。
【００３１】
コア、表面または境界の分類は幾つかの方法で実施し得るが、これは当業者も認めることであり、ＷＯ９８／４７０８９（出典明示により本明細書の一部とする）に概説されている。好適な態様において、該分類は側鎖を含む当初タンパク質バックボーン構造の実視走査を介して実施し、タンパク質モデル化の当業者の主観的評価にもとづき分類を割振る。あるいは、好適な態様では鋳型Ｃα原子のみを用いてコンピューター計算した溶媒接近可能な表面に関連づけてＣα−Ｃβベクトルの方向性の評価に利用する。好適な態様においては、標的の折れ曲がりＣα原子のみに溶媒接近可能な表面は、約４ないし約１２Åの範囲のプローブ半径をもつコノリイ（Connolly）アルゴリズムを用いて作成するが、プローブ半径は約６ないし約１０Åが好ましく、８Åが特に好ましい。用いられるＣα半径は約１.６ないし約２.３Åの範囲、好ましくは約１.８ないし約２.１Åの範囲、取分け好ましいのは１.９５Åである。残基は、ａ）そのＣαがＣα−Ｃβベクトルに沿って溶媒接近可能な表面に至る距離が約４〜６Åより大きい場合、特に好ましくは約５.０Åより大きい場合、およびｂ）そのＣβの最近接表面点までの距離が約１.５〜３Åより大きい場合、特に好ましくは約２.０Åより大きい場合に、コア位置と分類される。残りの残基は、そのＣαがＣα−Ｃβベクトルに沿って溶媒接近可能な表面に至る距離とＣβの最近接表面点までの距離の合計が、約２.５〜４Å未満、特に好ましくは約２.７Å未満である場合に、表面位置と分類される。残りすべての残基は境界位置と分類される。
【００３２】
ＧＰＡタンパク質の適切なコアおよび境界位置について以下に概説する。
各可変位置をコア、表面または境界のいずれかに分類した後、アミノ酸側鎖のセット、従って回転異性体のセットを各位置に割り当てる。すなわち、特定の位置でプログラムが考え得る可能なアミノ酸側鎖のセットを選択する。次いで、可能なアミノ酸側鎖を選択した後、特定の位置で評価すべき回転異性体のセットを決めることができる。このように、一般にコア残基は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびメチオニン（一部態様においては、ファンデルワース・スコアリング関数のαスケーリング因子が下記のように低い場合、メチオニンはセットから除く）からなる疎水性残基の群から選択し、各コア位置の回転異性体のセットは潜在的にこれら８種のアミノ酸側鎖に対する回転異性体を含む（もしバックボーン非依存ライブラリーを用いるならば、回転異性体はすべて、またもし回転異性体依存のバックボーンを用いるならば、サブセット）。同様に、表面位置は一般に、アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジンおよびヒスチジンからなる親水性残基の群から選択する。各表面位置の回転異性体のセットは、従って、これら１０種の残基に対する回転異性体を含む。最後に、境界位置は一般に、アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびメチオニンから選択される。各境界位置の回転異性体のセットは、従って潜在的にこれら１７種の残基に対するすべての回転異性体を含む（ただし、システイン、グリシンおよびプロリンは、使用し得るが、使用しないものと仮定する）。さらに、一部の好適な態様においては、１８種の天然型アミノ酸のセット（システインとプロリンはすべて除くが、これらは特に破壊的であることが知られている）を使用する。
【００３３】
このように、当業者も認めるように、残基位置を分類することには、計算回数を減らすという計算上の利点がある。また、承知すべきことは、コア、境界および表面残基のセットは上記のものから変更する場合もあり得ることである；例えば、ある場合には、１個以上のアミノ酸を加えるか、または可能なアミノ酸のセットから差引く。例えば、二量化または多量化する、あるいはリガンド結合部位をもつある種のタンパク質は、疎水性の表面残基を含み得るなどである。さらに、ヘリックス“キャッピング”またはα−ヘリックス双極子と好ましい相互作用を成し得ない残基は、可能な残基のセットから差引いてもよい。このアミノ酸群の修飾は残基毎に実施する。
【００３４】
好適な態様において、プロリン、システインおよびグリシンは可能なアミノ酸側鎖のリストには含めず、従って、これらの側鎖についての回転異性体は使用しない。しかし、好適な態様においては、可変残基位置が０°を超えるФ角（すなわち、１）先行するアミノ酸のカルボニル炭素；２）現下の残基の窒素原子；３）現下の残基のα−炭素；および４）現下の残基のカルボニル炭素；により限定される二面角）をもつとき、その位置はバックボーンの歪みを最小とするようにグリシンに割当てる。
【００３５】
有力な回転異性体の群は各可変残基位置に割振るが、その処理はＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／１２７，９２６およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０７２５４に概説されているように実施する。この処理工程は最適化タンパク質配列を生成させるために、該回転異性体同士の相互作用およびタンパク質バックボーンとの相互作用を分析することを必然的に伴う。非常に単純化すると、この処理は当初多くのスコアリング関数を用い、回転異性体とバックボーンそれ自体との、または他の回転異性体との相互作用エネルギーを計算することからなる。好適なＰＤＡスコアリング関数は、ファンデルワース・ポテンシャル・スコアリング関数、水素結合ポテンシャル・スコアリング関数、原子溶媒和スコアリング関数、二次構造傾向スコアリング関数、および静電気スコアリング関数などであるが、これらに限定されるものではない。さらに以下に説明するように、少なくとも１つのスコアリング関数を用いて各位置に配点するが、スコアリング関数は位置分類により、またはα−ヘリックス双極子との好適な相互作用などの他の考慮により異なってもよい。以下に概説するように、計算に使用する総エネルギーは、特定の位置で用いた各スコアリング関数のエネルギーの総和であり、式１で一般に示される：
式１
Ｅtotal＝ｎＥvdw＋ｎＥas＋ｎＥh-bonding＋ｎＥss＋ｎＥelec
式１において、総エネルギーはファンデルワース・ポテンシャルのエネルギー（Ｅvdw）、原子溶媒和エネルギー（Ｅas）、水素結合エネルギー（Ｅh-bonding）、二次構造エネルギー（Ｅss）および静電気相互作用のエネルギー（Ｅelec）の総和である。記号ｎは０または１であり、該記号を特定残基の位置について考慮すべきか否かにより左右される。
【００３６】
Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.６０／０６１，０９７、６０／０４３，４６４、６０／０５４，６７８、０９／１２７，９２６およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０７２５４に概説されているように、これらスコアリング関数のいずれかの組合わせを、単独でまたは組合わせて使用することができる。使用すべきスコアリング関数を各可変位置について同定した後、計算による分析の好適な第一段階は、各可能な回転異性体と該タンパク質の残余のすべてもしくは一部との相互作用を決定することを含んでなる。すなわち、１つ以上のスコアリング関数によって測定するように、各可変残基位置での各可能な回転異性体とバックボーンまたは他の回転異性体との相互作用エネルギーを計算する。好適な態様においては、各回転異性体と該タンパク質の残余全部、すなわち、全鋳型とすべての他の回転異性体、との相互作用を計算する。しかし、上に概説したように、タンパク質の一部分、例えば、より大きなタンパク質のドメインをモデルとすることのみが可能であり、従って、ある場合には、該タンパク質すべてを考慮する必要はない。
【００３７】
好適な態様において、計算処理の第一段階はすべての位置における各回転異性体の相互作用の２セットについて計算することにより実施する；回転異性体側鎖と鋳型またはバックボーンとの相互作用（“シングルス”エネルギー）、および回転異性体側鎖とすべての他の位置における他の可能な回転異性体との相互作用（“ダブルス”エネルギー）であって、その位置が変化するか、または浮動するかによる。理解すべきことは、この場合のバックボーンがタンパク質構造バックボーンの原子並びにいずれか固定化された残基の原子、両方を含むことであり、その場合、固定化された残基はアミノ酸の特定のコンホメーションと定義される。
【００３８】
このようにして、“シングルス”（回転異性体／鋳型）エネルギーはスコアリング関数の一部または全部を用いて、すべての可変残基位置でのすべての可能な回転異性体とバックボーンとの相互作用を計算する。このように、水素結合スコアリング関数については、回転異性体のすべての水素結合原子とバックボーンのすべての水素結合原子を評価し、すべての可変位置における各可能な回転異性体についてＥＨＢを計算する。同様に、ファンデルワース・スコアリング関数については、回転異性体のすべての原子を鋳型のすべての原子と比較し（一般に、それ自身の残基のバックボーン原子は除く）、すべての可変残基位置における各可能な回転異性体についてＥvsWを計算する。さらに、一般にはファンデルワールス・エネルギーは、もし元素が３つ以下の結合で接合しているならば一般には計算しない。原子溶媒和スコアリング関数については、鋳型表面に対する回転異性体の表面を測定し、すべての可変残基位置における各可能な回転異性体についてＥasを計算する。二次構造傾向スコアリング関数もシングルス・エネルギーと考えられ、従って、総シングルス・エネルギーはＥas項を含む。当業者が認めるように、これらエネルギー項の多くは、回転異性体と鋳型位置間の物理的距離に左右されてゼロに近い；すなわち、２つの部分が遠ざかる程、エネルギーは低下する。
【００３９】
“ダブルス”エネルギー（回転異性体／回転異性体）を計算するには、各可能な回転異性体の相互作用エネルギーをすべての他の可変残基位置においてすべての可能な回転異性体と比較する。このようにして、“ダブルス”エネルギーは、スコアリング関数の一部またはすべてを用いて、すべての可変残基位置におけるすべての可能な回転異性体と、すべての他の可変残基位置におけるすべての可能な回転異性体との相互作用を計算する。このように、水素結合スコアリング関数については、第一回転異性体のすべての水素結合原子とすべての可能な第二回転異性体のすべての水素結合原子を評価し、いずれか２つの可変位置に対する各可能な回転異性体についてＥＨＢを計算する。同様に、ファンデルワース・スコアリング関数については、第一回転異性体のすべての原子をすべての可能な第二回転異性体のすべての原子と比較し、２つごとの可変残基位置における各可能な回転異性体対についてＥvsWを計算する。原子溶媒和スコアリング関数については、第一回転異性体の表面をすべての可能な第二回転異性体の表面に対して測定し、２つごとの可変残基位置における各可能な回転異性体対についてＥasを計算する。二次構造傾向スコアリング関数は“ダブルス”エネルギーとして実施する必要がないが、それは“シングルス”エネルギーの一要素と考えられるからである。当業者が認めるように、これら二重エネルギー項の多くは、第一回転異性体と第二回転異性体間の物理的距離に左右されてゼロに近い；すなわち、２つの部分が遠ざかる程、エネルギーは低下する。
【００４０】
シングルスおよびダブルス・エネルギーを計算し、保存したならば、次の計算処理工程を始め得る。Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／１２７，９２６およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０７２５４に概説されているように、好適な態様ではデッドエンド削除（ＤＥＥ）工程、好ましくは、モンテカルロ工程を利用する。
【００４１】
計算処理は最適化したＧＰＡタンパク質配列のセットを結果として与える。これらの最適化したＧＰＡタンパク質配列は一般にバックボーンとして利用した野生型ｈＧ−ＣＳＦ配列とは有意に異なる。
【００４２】
このように、最も広い意味で、本発明は顆粒球形成活性を有するＧＰＡタンパク質を目的とする。本明細書にて“顆粒球形成活性”または“ＧＰＡ”とは、以下に定義するように、該タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の生物機能の少なくとも１種、好ましくはそれ以上を示すことを意味する。
【００４３】
本明細書にて“タンパク質”とは、少なくとも２つの共有結合により結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを包含する。該タンパク質は天然型のアミノ酸およびペプチド結合ででき上がっているか、または合成ペプチド様構造、一般に合成方法に依存する構造を有する。本明細書にて使用する場合の“アミノ酸”または“ペプチド残基”とは、天然型のアミノ酸および合成アミノ酸両方を意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは本発明のアミノ酸と考えられる。“アミノ酸”はまたプロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も包含する。側鎖は（Ｒ）または（Ｓ）の立体配置いずれでもよい。好適な態様において、アミノ酸は（Ｓ）−またはＬ−立体配置である。もし非天然型側鎖を用いるならば、非アミノ酸置換基を、例えば、生体内での分解を防止するかまたは遅延させるために使用してもよい。非天然型アミノ酸を含むタンパク質は場合により合成してもよいし、組換えにより調製してもよい；参照文献：van Hest et al., FEBS Lett 428: (1-2) 68-70 May 22 1998; Tang et al., Abstr. Pap Am. Chem. S218: U138-U138 Part 2 August 22, 1999（両文献を出典明示により本明細書の一部とする）。
【００４４】
本発明のＧＰＡタンパク質は、Ｇ−ＣＳＦの少なくとも１種の生物機能を示す。本明細書において“顆粒球コロニー刺激因子”または“Ｇ−ＣＳＦ”とは、野生型のＧ−ＣＳＦを意味する。該Ｇ−ＣＳＦは如何なる生体からのものであってもよく、特に哺乳動物からのＧ−ＣＳＦが好ましい。適当な哺乳動物はげっ歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど）、霊長類、畜産動物（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどを包含する）であが、これらに限定されるものではなく、最も好適な態様においては、ヒトからのものである（本明細書においてはこれを場合によりｈＧ−ＣＳＦといい、図１に描出した配列のものである）。当業者が認めるように、ヒト以外の哺乳動物からのＧ−ＣＳＦにもとづくＧＰＡはヒトの疾患の動物モデルに使用し得る可能性がある。様々な哺乳動物種のＧＩ番号は以下のとおりである：ウシ４４２６７１；イヌ４４２６７３；ヒツジ３１０３８２；ネコＣＡＡ６９８５３；ブタ２４１１４６９；マウス３０９２４８；ラット１６８０６５９。
【００４５】
本発明のＧＰＡタンパク質は、少なくとも１種のＧ−ＣＳＦの生物機能を示す。本明細書において“生物機能”または“生物学的性質”とはＧ−ＣＳＦのいずれか１つの性質または機能を意味し、細胞増殖を刺激する能力、特に顆粒球と取分け好中球を産生する造血幹細胞の能力；重度の慢性好中球減少症の治療能力；末梢血始原細胞収集での使用；骨髄移植療法を高める能力；並びにＣＦＵ−Ｇｍ型細胞の刺激を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
好適な態様において、生物機能は顆粒球形成活性（ＧＰＡ）である。ＧＰＡはＧ−ＣＳＦレセプターを有する細胞を刺激し増殖させる化合物の能力と定義する。しかし、ある態様において、ＧＰＡタンパク質はＧＰＡ活性をもたないことがある。
【００４７】
好適な態様において、ＧＰＡの定量に使用するアッセイ・システムは実施例に記載したように、ヒト・クラス１Ｇ−ＣＳＦレセプターをコードする遺伝子を安定的に移入したＢａ／Ｆ３細胞を用いる生体外システムである；参照：Young et al. Protein Sci. 6:1228-1236 (1997)（出典明示によりその全文を本明細書の一部とする）。このシステムにおいて、細胞増殖はＢrdＵ取込みの機能として測定するが、これは増殖する細胞の核酸内に取込まれる。少なくとも約２０％バックグランドを超える増加、好ましくは少なくとも約５０％、そして取分け好ましいのは少なくとも約１００％、５００％および１０００％増加がＧＰＡの標しである。別のアッセイ法としては、Zsebo et al, Immunobiology 172:175-184 (1986)（出典明示によりその全文を本明細書の一部とする）に記載されたＣＦＵ−ＧＭ細胞アッセイ法である。
【００４８】
好適な態様においては、生体内システムがＧＰＡの検定に使用し得る。例えば、適切なシステムはＵＳＰ４，９９９，２９１（出典明示によりその全文を本明細書の一部とする）に記載されているものである。一般に、生体内アッセイ法ではＧＰＡタンパク質（または遺伝子治療の場合にはＧＰＡ核酸）を適切な動物に投与し、次いで該動物の顆粒球数をモニターする（またはある場合にはリンパ球のモニターがなされる）ことが必要である。一般に、好中球、顆粒球またはリンパ球数が、対応する赤血球数の増加なくして増加するのはＧ−ＣＳＦの標しである。同様に、有用な生体内アッセイ・システムは以下のとおりである：オスｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスにシクロホスファミド（ＣＰＡ）２００ｍｇ／ｋｇを単回腹腔内注射して好中球減少症とする。開始から２４時間後、およびＣＰＡ投与の日から４日連続して、マウスに１日１００μｇ／ｋｇのrhＧ−ＣＳＦ、新規顆粒球形成タンパク質、または対照ビークルを静脈内注射投与する。顆粒球形成活性は、５日目に眼窩後から採血し、白血球数と多形核好中球数を計測することにより検定する。参照：Hattori et al., Blood 75:1228-1233 (1990) （出典明示によりその全文を本明細書の一部とする）。
【００４９】
好適な態様において、ＧＰＡタンパク質の宿主動物における抗原性プロフィールは、宿主Ｇ−ＣＳＦの抗原性プロフィールに似ているか、好ましくは一致する；すなわち、ＧＰＡタンパク質は免疫応答に向けて宿主生体（例えば、患者）を有意には刺激しない；すなわち、いずれの免疫応答も臨床的には関連性がなく、アレルギー応答も抗体による該タンパク質の中和もない。すなわち、好適な態様においては、ＧＰＡタンパク質は付加した、またはＧ−ＣＳＦと異なるエピトープを含んでいない。本明細書において“エピトープ”または“決定基”とは抗体を生成するか、および／または抗体に結合するタンパク質の一部分を意味する。このように、殆どの場合、ＧＰＡタンパク質に対し有意な量の抗体は生成しない。一般に、これは以下に概説するように、表面残基を有意に変えるのではなく、新たなグリコシル化が免疫応答を生じさせるように、グリコシル化が起こるようなアミノ酸残基を表面に付加することによって達成する。
【００５０】
本発明のＧＰＡタンパク質および核酸は天然型のＧ−ＣＳＦとは識別し得る。“天然型のＧ−ＣＳＦ”は自然に存在するものであって、対立遺伝子変異体を含んでいる；代表的な配列は図１に示したヒトの配列（ｈＧ−ＣＳＦ）である。認識すべきことは、特に断らない限り、すべての位置表示番号はこのヒトＧ−ＣＳＦ配列に基いている。すなわち、当業者が認めるように、Ｇ−ＣＳＦタンパク質とＧＰＡタンパク質を並列にすると、以下に概説するように、標準的なプログラムを用い、２つのタンパク質間の“等価”の位置を同定することができる。このように、本発明のＧＰＡタンパク質と核酸は非天然型である；すなわち、自然界には存在しない。
【００５１】
このように、好適な態様において、ＧＰＡタンパク質は残基の少なくとも３％、野生型Ｇ−ＣＳＦの配列と異なるアミノ酸配列を有する。すなわち、本発明のＧＰＡタンパク質がＧ−ＣＳＦアミノ酸配列と同一なのは約９７％未満である。従って、もし図１に示したアミノ酸配列に対し該タンパク質配列の全体の相同性が、好ましくは約９７％未満、より好ましくは約９５％未満、さらにより好ましくは約９０％未満、そして最も好ましくは約８５％未満であるならば、タンパク質は“ＧＰＡタンパク質”である。一部の態様において、相同性は約７５〜８０％の低さである。別の言い方をするなら、１７４残基のｈＧ−ＣＳＦ配列にもとづくと、ＧＰＡタンパク質はｈＧ−ＣＳＦ配列とは異なる少なくとも約５個の残基を有する（３％）、すなわち、ＧＰＡタンパク質はｈＧ−ＣＳＦ配列とは異なる５個から３０個までの残基を有する。ある場合に、ＧＰＡタンパク質はｈＧ−ＣＳＦ配列とは３または４個の異なる配列を有する。好適なＧＰＡタンパク質は１０〜２４個の異なる残基を有し、取分け好ましくは約１０〜約１４個である（すなわち、該タンパク質の６〜８％がｈＧ−ＣＳＦに一致しない）。
【００５２】
このコンテキストにおいて相同性とは配列の類似性または同一性を意味するが、好ましくは同一性である。当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、タンパク質（または以下に考察する核酸）が既知の配列に対し配列同一性または類似性を有するか否か同定することができる。配列同一性および／または類似性は技術上既知の標準的技法を用いて決定する；例えば、Smith & Waterman, Adv. APPI. Math., 2:482 (1981)の局部的な配列同定アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)の配列同定整列アルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988)の類似性検索方法、これらアルゴリズムのコンピューター処理実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)、 the Best Fit sequence program described by Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 (1984)に記載された最良近似配列プログラムなどであるが、これらに限定されるものではない；好ましくはデフォルト値設定を用いるか、または精査による。好ましくは、パーセント同一性を以下のパラメーターにもとづき、高速ＤＢにより計算する；不整合ペナルティ１；ギャップ・ペナルティ１；ギャップ・サイズ・ペナルティ０.３３；およびジョイニング・ペナルティ３０；“Current Methods in Sequence Comparsion and Analysis”Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications、pp127-149（1988）, Alan R. Liss, Inc.。
【００５３】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは前進性の一対とした配列を用い、一群の関連配列から多重配列の整列を創り出す。これはまた整列創出に用いたクラスターの関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは Feng ＆ Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)の前進整列法を単純化して使用する；この方法は Higgins & Sharp CABIOS 5:151-153 (1989)が記載の方法と同様である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターはデフォルト・ギャップ重み３.００、デフォルト・ギャップ長さ重み０.１０、および加重エンド・ギャップなどである。
【００５４】
有用なアルゴリズムのもう一つの例は、Aitschul et ai., J. Mol. Bioi., 215, 403410, (1990) および Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:5873-5787 (1993)に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムであって、Altschul et al., Methods in Enzvmoloov, 266:460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blasV README.htmlから得られた。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は幾つかの検索パラメーターを使用し、その殆どがデフォルト値に設定する。調整可能なパラメーターは以下の値に設定する：重なりスパン＝１；重なりフラクション=０.１２５；ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰ ２Ｓのパラメーターは動的値であり、特定の配列の構成と問題の配列を検索している特定のデータベースの構成に従ってプログラムそれ自体により確立する；しかし、その値は調整して感度を上げてもよい。
【００５５】
さらなる有用なアルゴリズムは Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25:3389-3402 に報告されたギャップＢＬＡＳＴである。ギャップＢＬＡＳＴはＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを使用する；閾値Ｔパラメーターは９に設定する；非ギャップ・エクステンションを引き金とするツーヒット法；κのギャップ数に１０＋κのコストを課す；Ｘｕを１６に設定し、Ｘｇはデータベース検索段階では４０に、アルゴリズムの出力段階では６７に設定する。
【００５６】
％アミノ酸配列同一性値は整合同一残基数を整列した領域内の“より長い”配列の残基総数で割ることにより決定する。“より長い”配列とは整列した領域内の最も実際的な配列である（整列スコアを最大とするためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入したギャップは無視する）。
【００５７】
同様の方法で、本明細書にて同定されたポリペプチドのコーディング配列に関し“パーセント（％）核酸配列同一性”は、細胞周期タンパク質のコーディング配列におけるヌクレオチド残基と一致する候補配列のヌクレオチド残基の百分比と定義する。好適な方法では、デフォルト・パラメーターに設定したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用するが、重なりスパンと重なりフラクションをそれぞれ１と０.１２５に設定する。
【００５８】
整列は整列すべき配列内にギャップを導入することを含む。さらに、図１の配列によりエンコードされるタンパク質よりも多いまたは少ないアミノ酸を含む配列については、配列同一性の百分比を、アミノ酸の総数に関連して一致するアミノ酸数にもとづき決定する。このように、例えば、一態様において、図１に示した配列よりも短い配列の配列同一性は、下記に考察するように、より短い配列のアミノ酸数を用いて決定する。パーセント同一性の計算では、相対的な重みを配列の変化、例えば、挿入、欠失、置換などの種々の表徴に割振るものではない。
【００５９】
一態様において、同一性のみ正（＋１）に配点し、ギャップを含む配列変化のすべての形状は“０”の値を割振るが、これが配列類似性の計算に際し、下記のように加重したスケールまたはパラメーターの必要性を排除する。パーセント配列同一性は、例えば、整合する同一残基数を、整列した領域の“より短い”配列の総残基数で割り、１００を掛けることにより計算することができる。“より長い”配列は整列した領域に最も実際的な配列を有する配列である。
【００６０】
このように本発明のＧＰＡタンパク質は図１に示したアミノ酸配列よりもより短くてもより長くてもよい。このように、好適な態様においてＧＰＡタンパク質内に含まれるのは、本明細書に描出した配列の部分またはフラグメントである。ＧＰＡタンパク質のフラグメントは、もしａ）それらが少なくとも１つの抗原エピトープを分け持ち；ｂ）少なくとも指示した相同性を有し；ｃ）そして好ましくは本明細書に定義したＧＰＡ生物活性をもつならば、ＧＰＡタンパク質と考えられる。
【００６１】
好適な態様において、以下に詳細に説明するように、ＧＰＡタンパク質は、野生型Ｇ−ＣＳＦに比較して、本明細書に概説したものよりもさらにアミノ酸の変化を含んでいる。さらに、本明細書に概説したように、本明細書に描出した変化のいずれかは何らかの方法で組合わせてさらなる新規なＧＰＡタンパク質を形成させてもよい。
【００６２】
さらに、ＧＰＡタンパク質は、例えば、エピトープまたは精製タグの付加、本明細書に概説したように、他の融合配列の付加などにより、図面に示したものよりも長鎖に調製することができる。例えば、本発明のＧＰＡタンパク質はＩＬ−１１などの他の治療タンパク質に融合するか、または薬物動態を目的として、Ｆｃまたは血清アルブミンなどの他のタンパク質に融合することができる。参照、例えば：ＵＳＰ５，７６６，８８３および５，８７６，９６９（両文献の全文を出典明示により本明細書の一部とする）。
【００６３】
好適な態様において、ＧＰＡタンパク質はコアおよび境界残基に可変残基を含んでなる。
ｈＧ−ＣＳＦコア残基は以下のとおりである：位置１７、２１、２４、２８、３１、３５、４１、４７、５４、５６、７５、７８、８２、８５、８８、８９、９２、９５、９９、１０３、１０６、１１０、１１３、１１４、１１７、１４０、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５７、１６０、１６１および１６８。従って、好適な態様において、ＧＰＡタンパク質はこれらの位置から選択される可変位置を有する。
【００６４】
好適な態様において、ＧＰＡタンパク質はｈＧ−ＣＳＦのコア残基からのみ選択された可変位置を有する。あるいは、少なくとも主要部（５１％）の可変位置はコア残基から選択され、好ましくは少なくとも約７５％の可変位置が、また特に好ましくは少なくとも約９０％の可変位置がコア残基位置から選択される。特に好ましい態様ではｈＧ−ＣＳＦに比較してコア可変位置のみが変化している。
【００６５】
特に好ましい態様は、ＧＰＡタンパク質がｈＧ−ＣＳＦに比較したときに可変コア位置をもつ場合であって、それを図面に示す。
一態様において、可変コア位置は他の１９種のアミノ酸のいずれかに変化している。好適な態様において、可変コア残基はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＴｙｒおよびＴｒｐから選択する。
【００６６】
ｈＧ−ＣＳＦ境界残基は以下のとおりである：位置１４、２０、２７、３２、３４、３８、７７、７９、８４、９１、９９、１０２、１０７、１０９、１１６、１２０、１４５、１４６、１４７、１５５、１５６、１６４および１７０。従って、好適な態様において、ＧＰＡタンパク質はこれらの位置から選択した可変位置を有する。
【００６７】
好適な態様において、境界コア位置は他の１９種のアミノ酸のいずれかに変化している。好適な態様において、可変境界残基はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＨｉｓ（好ましくはプロトン化Ｈｉｓ）から選択する。
【００６８】
好適な態様において、本発明のＧＰＡタンパク質は少なくとも１個のアミノ酸位置において野生型のＧ−ＣＳＦタンパク質とは異なる配列を有し、その位置は１４、１７、２０、２１、２４、２７、２８、３１、３２、３４、３８、７８、７９、８５、８９、９１、９９、１０２、１０３、１０７、１０９、１１０、１１３、１１６、１２０、１４５、１４６、１４７、１４８、１５１、１５３、１５５、１５６、１５７、１６０、１６１、１６４、１６８および１７０である；アミノ酸位置のセットを略示する図２を参照。
【００６９】
各位置の好適なアミノ酸はｈＧ−ＣＳＦを含み、図３〜１０に示す。このように、例えば、１７位での好適なアミノ酸はＬｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅであり、２１位ではＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＡｌａおよびＴｙｒなどである。
【００７０】
好適な変化は以下のとおりである：Ｌｅｕ１４Ｉ１ｅ；Ｃｙｓ１７Ｌｅｕ；Ｃｙｓ１７Ｌｅｕ；Ｃｙｓ１７Ｉ１ｅ；Ｇｌｎ２０Ｌｅｕ；Ｖａｌ２１Ｉ１ｅ；Ｖａｌ２１Ａｌａ；Ｖａｌ２１Ｐｈｅ；Ｖａｌ２１Ｔｙｒ；Ｉｌｅ２４Ａｌａ；Ｉｌｅ２４Ｖａｌ；Ｉｌｅ２４Ｌｅｕ；Ａｓｐ２７Ｇｌｕ；Ａｓｐ２７Ｓｅｒ；Ｇｌｙ２８Ａｌａ；Ｇｌｙ２８Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３１Ｖａｌ；Ｇｌｎ３２Ｌｅｕ；Ｇｌｎ３２Ｖａｌ；Ｇｌｎ３２I１ｅ；Ｌｙｓ３４Ｇｌｕ；Ｌｙｓ３４Ｇｌｎ；Ｌｙｓ３５Ｉ１ｅ；Ｌｙｓ３５Ｖａｌ；Ｔｈｒ３８Ｈｉｓ；Ｔｈｒ３８Ｖａｌ；Ｔｈｒ３８Ｉ１ｅ；Ｔｈｒ３８Ｇｌｕ；Ｔｈｒ３８Ｌｙｓ；Ｌｅｕ７８Ｐｈｅ；Ｌｅｕ７８Ａｌａ；Ｌｅｕ７８Ｖａｌ；Ｌｅｕ７８Ｉ１ｅ；Ｌｅｕ７８Ｔｙｒ；Ｈｉｓ７９Ｌｅｕ；Ｌｅｕ８２Ａｌａ；Ｌｅｕ８２Ｐｈｅ；Ｔｙｒ８５Ｖａｌ；Ｔｙｒ８５Ｉ１ｅ；Ｔｙｒ８５Ｐｈｅ；Ｔｙｒ８５Ｔｒｐ；Ｌｅｕ８９Ｐｈｅ；Ｌｅｕ８９Ｔｒｐ；Ａｌａ９１Ｌｙｓ；Ｌｅｕ９９Ｇｌｕ；Ｔｈｒ１０２Ｌｙｓ；Ｔｈｒ１０２Ｖａｌ；Ｔｈｒ１０２Ｌｅｕ；Ｔｈｒ１０２Ｉ１ｅ；Ｔｈｒ１０２Ｇｌｕ；Ｔｈｒ１０２Ｇｌｎ；Ｌｅｕ１０３Ｖａｌ；Ｌｅｕ１０３Ｉ１ｅ；Ｌｅｕ１０３Ａｌａ；Ｌｅｕ１０６Ｖａｌ；Ｇｌｎ１０７Ｉ１ｅ；Ｇｌｎ１０７Ｖａｌ；Ｇｌｎ１０７Ｌｅｕ；Ｖａｌ１０９Ｇｌｕ；Ｖａｌ１０９Ａｓｐ；Ｖａｌ１０９Ｇｌｎ；Ｖａｌ１１ＯＡｌａ；Ｖａｌ１１ＯＬｅｕ；Ｖａｌ１１０Ｉ１ｅ；Ｐｈｅ１１３Ａｌａ；Ｐｈｅ１１３Ｌｅｕ；Ｔｈｒ１１６Ｉ１ｅ；Ｔｈｒ１１６Ｖａｌ；Ｔｈｒ１１６Ｌｅｕ；Ｔｈｒ１１６Ｇｌｕ；Ｔｈｒ１１６Ｌｙｓ；Ｉｌｅ１１７Ａｌａ；Ｉｌｅ１１７Ｖａｌ；Ｉｌｅ１１７Ｌｅｕ；Ｉｌｅ１１７Ｐｈｅ；Ｉｌｅｌ１７Ｔｒｐ；Ｇｌｎ１２０Ｌｅｕ；Ｇｌｎ１４５Ｇｌｕ；Ａｒｇ１４６Ｌｙｓ；Ａｒｇ１４６Ｇｌｎ；Ａｒｇ１４７Ｇｌｕ；Ａｒｇ１４７Ｌｙｓ；Ａｌａ１４８Ａｓｐ；Ａｌａ１４８Ｔｈｒ；Ｖａｌ１５１Ｉ１ｅ；Ｖａｌ１５３Ｉ１ｅ；Ｓｅｒ１５５Ｉ１ｅ；Ｈｉｓ１５６Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１５７Ａｌａ；Ｌｅｕ１５７Ｖａｌ；Ｌｅｕ１５７Ｉ１ｅ；Ｐｈｅ１６０Ｔｒｐ；Ｌｅｕ１６１Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１６４Ａｌａ；Ｌｅｕ１５７Ｉ１ｅ；Ｐｈｅ１６０Ｔｒｐ；Ｌｅｕ１６１Ｐｈｅ；Ｌｅｕ１６１Ａｌａ；Ｌｅｕ１６１Ｖａｌ；Ｖａｌ１６７Ａｌａ；Ｌｅｕ１６８Ｐｈｅ；Ｈｉｓ１７０Ａｓｐ；Ｈｉｓ１７０Ｌｅｕ；Ｈｉｓ１７０Ｇｌｕ；Ｈｉｓ１７０Ｇｌｎ；およびＨｉｓ１７０Ｌｙｓ。これらは個々にまたは組合わせて実施し、いずれの組合わせも可能である。しかし、本明細書に概説するように、好適な態様では各ＧＰＡタンパク質において、少なくとも４個の、好ましくはそれ以上の可変位置を利用する。
【００７１】
取分け好適な配列は以下のものからなる群より選択される：［Ｃ１７Ｌ、Ｇ２８Ａ、Ｌ７８Ｆ、Ｙ８５Ｆ、Ｌ１０３Ｖ、Ｖ１１０Ｉ、Ｆ１１３Ｌ、Ｖ１５１Ｉ、Ｖ１５３ＩおよびＬ１６８Ｆ］；［Ｃ１７Ｌ、Ｇ２８Ａ、Ｌ７８Ｆ、Ｙ８５Ｆ、Ｌ１０３Ｖ、Ｖ１１０Ｉ、Ｆ１１３Ｌ、Ｖ１５１Ｉ、Ｖ１５３Ｉ、Ｌ１６８Ｆ、Ｌ１４Ｉ、Ｑ２０Ｌ、Ｄ２７Ｅ、Ｑ３２Ｌ、Ｋ３４Ｅ、Ｔ３８Ｈ、Ｈ７９Ｌ、Ａ９１Ｋ、Ｔ１０２Ｋ、Ｑ１０７Ｉ、Ｄ１０９Ｅ、Ｔ１１６Ｉ、Ｑ１２０Ｌ、Ｒ１４６Ｋ、Ｒ１４７Ｅ、Ａ１４８Ｄ、Ｓ１５５Ｉ、Ｈ１５６Ｌ、Ｓ１６３Ａ]；および［Ｌ１４Ｉ、Ｑ２０Ｌ、Ｄ２７Ｅ、Ｑ３２Ｌ、Ｋ３４Ｅ、Ｔ３８Ｈ、Ｈ７９Ｌ、Ａ９１Ｋ、Ｔ１０２Ｋ、Ｑ１０７Ｉ、Ｄ１０９Ｅ、Ｔ１１６Ｉ、Ｑ１２０Ｌ、Ｒ１４６Ｋ、Ｒ１４７Ｅ、Ａ１４８Ｄ、Ｓ１５５Ｉ、Ｈ１５６Ｌ、Ｓ１６３Ａ］。
【００７２】
好適な態様において、ＧＰＡタンパク質は位置１７、２４、３５、４１、１８、６８、２６、１７４、１７０、１６７、４４、４７、２３、２０、２８、１２７、１３８、１３、１２１または１２４に唯一単一の可変位置を有しない。同様に、ＧＰＡタンパク質の好適な態様では１２７および１３８または３７および４３での２つの可変位置のみを有しない。好適な態様において、ＧＰＡタンパク質は１７、２４および４１；１７、２４および３５；および１７、３５および４１での３つの可変位置のみを有しない。さらに、好適なＧＰＡタンパク質は１７、２４、３５および４１での４つの可変位置のみを有しない。
【００７３】
好適な態様において、本発明のＧＰＡタンパク質はｈＧ−ＣＳＦのコンホーマーである。本明細書にて“コンホーマー”とはタンパク質バックボーン３Ｄ構造が実質的に同じであるが、アミノ酸鎖が有意に異なる構造のタンパク質を意味する。すなわち、本発明のＧＰＡタンパク質はコンホーマーセットを限定し、その場合、セットのタンパク質すべてがバックボーン構造を共有するが、その配列にはなお少なくとも３〜５％の差を有する。このコンテクストにおいて“バックボーン”とは側鎖ではない原子を意味し、その窒素、カルボニル炭素と酸素、およびα−炭素、およびその窒素とα−炭素に付着した水素である。コンホーマーを考察するためには、タンパク質がｈＧ−ＣＳＦ構造からわずかに２Å、好ましくはわずかに１.５Å、取分け好ましいのはわずかに１Åであるバックボーン原子をもたねばならない。一般に、これらの距離は２つの方法で決定し得る。一態様においては、各可能性のあるコンホーマーを結晶化し、その３次元構造を決定する。あるいは、前者には長い時間が掛るので、各可能性のあるコンホーマーの配列をＰＤＡプログラムに掛け、それがコンホーマーであるかどうかを決定する。
【００７４】
ＧＰＡタンパク質はＧＰＡ核酸によりエンコードされているとして同定してもよい。該核酸の場合には、核酸配列全体の相同性がアミノ酸の相同性と釣り合っていても、異なる生体の遺伝子コードとコドンに縮重のあることを考慮する。従って、核酸の配列相同性が該タンパク質配列の相同性よりも低くても高くてもよいが、相同性の低いことが好ましい。
【００７５】
好適な態様において、ＧＰＡ核酸はＧＰＡタンパク質をコードする。当業者が認めるように、遺伝子コードの縮重により、非常に数多い核酸が造られ得るが、そのすべてが本発明のＧＰＡタンパク質をコードする。このように、特定のアミノ酸を同定すると、当業者はＧＰＡのアミノ酸配列を変えることのない方法で１つ以上のコドンの配列を単に改変することにより、異なる核酸を幾らでも造ることができることになる。
【００７６】
一態様において、核酸相同性はハイブリダイゼーションの研究を経て決定する。このように、例えば、図１に示した核酸配列またはその補体に高度緊縮条件下でハイブリダイズし、かつＧＰＡタンパク質をコードする核酸はＧＰＡ遺伝子と考えられる。
【００７７】
高度緊縮条件は技術上既知である；参照、例えば：Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, and Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.（両文献を出典明示により本明細書の一部とする）。緊縮条件は配列依存性であり、異なる環境で異なる。より長い配列はより高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションへの広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)（生化学および分子生物学における技術−−核酸プローブによるハイブリダイゼーション、“ハイブリダイゼーションの原理と核酸アッセイの戦略についての概観”）に見出される。一般に、緊縮条件は規定されたイオン強度とｐＨでの特定配列にたいする熱融点（Ｔｍ）未満の約５〜１０℃となるように選択する。Ｔｍは標的に相補性のプローブの５０％が平衡状態で標的配列（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍにて５０％のプローブが平衡状態で占拠される）に（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）ハイブリダイズする温度である。緊縮条件とは塩濃度がｐＨ７.０〜８.３にて約１.０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０.０１〜１.０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブ（例えば、１０〜５０個のヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０個を超えるヌクレオチド）については少なくとも約６０℃の条件である。緊縮条件はホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによっても達成し得る。
【００７８】
他の態様において、低緊縮ハイブリダイゼーション条件が用いられる；例えば、中庸のまたは低い緊縮条件を、技術上知られているように用いてもよい；参照：Maniatis and Ausubel (上記)および Tijssen (上記)。
【００７９】
本発明のＧＰＡタンパク質および核酸は組換え体である。本明細書にて用いる場合、“核酸”とはＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをいうか、またはデオキシ−およびリボヌクレオチドの双方を含む分子をいう。該核酸とはセンスおよびアンチセンス核酸を含むゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む。かかる核酸はまたそのリボース−リン酸バックボーンに改変を加えて、生理的環境でのかかる分子の安定性と半減期を増大させることができる。
【００８０】
該核酸は二本鎖でも一本鎖でもよく、または二本鎖または一本鎖配列の両方の部分を含んでいてもよい。当業者が認めるように、一本鎖（“ワトソン”Watson）の描写はまた他方の鎖（“クリック”Crick)の配列を規定する；このように、図１に描写した配列は補体の配列をも包含する。本明細書にて“組換え核酸”という用語は、一般にはエンドヌクレアーゼによる核酸の巧みな操作により当初生体外で形成され、天然には通常見出されない形状の核酸を意味する。このように、線形で単離されたＧＰＡ核酸、または正常では結合していないＤＮＡ分子を連結することにより生体外で形成した発現ベクターが本発明の目的である組換え体と考えられる。組換え核酸を調製し、それを宿主細胞または生体に導入すると、それが非組換えにより、すなわち、生体外での操作よりもむしろ宿主細胞の生体内細胞機構を用いて複製する；しかし、かかる核酸は一旦組換えにより産生されると、続いて非組換えにより複製されるが、本発明の目的にとってはなお組換え体と考える。
【００８１】
同様に、“組換えタンパク質”とは組換え技法を用いて、すなわち、上に描写した組換え核酸の発現を介して調製されたタンパク質である。組換えタンパク質は少なくとも１つ以上の特徴により天然型のタンパク質と識別される。例えば、該タンパク質はその野生型宿主と通常会合しているタンパク質および化合物の一部またはすべてから単離または精製することが可能であり、従って、実質的に純粋である。例えば、単離されたタンパク質は自然状態では、通常、所定のサンプル中に総タンパク質重量の好ましくは少なくとも約０.５％、より好ましくは少なくとも約５％を構成する会合物質の少なくとも一部を伴っていない。実質的に純粋なタンパク質は総タンパク質重量の少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、特に好ましくは少なくとも約９０％を含んでなる。この定義は１つの生体から異なる生体または宿主細胞でのＧＰＡタンパク質の生産を包含する。あるいは、該タンパク質は、該タンパク質が上昇した濃度レベルで産生されるように、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターを使用して、通常見られるよりも有意に高い濃度で調製してもよい。さらに、本明細書に概観したＧＰＡタンパク質はすべて、下記に考察するように、アミノ酸の置換、挿入および欠失、好ましくは置換を含むので、自然界には通常見出されない形状である。
【００８２】
本発明のＧＰＡタンパク質の定義には、本明細書中で概説し、図にも示したＧＰＡ配列のアミノ酸配列変種も含まれる。即ち、このＧＰＡタンパク質は、ｈＧ−ＣＳＦと比較して余分の変異し得る位置を有して得。これらの変種は、３種のクラス；置換性、挿入性、または削除性、の１ないしそれ以上のクラスに属する。これらの変種は、通常前記概説のように、当技術分野で周知のカセットまたはＰＣＲ変異生成またはその他の技術を用い、ＧＰＡタンパク質をコードしているＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異性変異生成により、該変種をコードするＤＮＡを生成させ、さらにこのＤＮＡを組換え体細胞培養物中で発現させて調製する。しかしながら、確立されたインビトロ合成技術により、残基が約１００−１５０に及ぶ変種ＧＰＡタンパク質フラグメントを取得できる。アミノ酸配列変種には、変異性質が予め定められている特徴、それにより天然に生起する対立遺伝子型またはＧＰＡタンパク質アミノ酸配列の種間型変異とは異なるものとする性質、がある。これらの変異種は、典型的には、天然に生起する類似体と同じ性質の生物学的活性を顕わすが、以下に詳述するようなさらに修飾された特徴を有する変異種も選択できる。
【００８３】
アミノ酸配列変異を導入する部位または領域は予め定めるとはいえ、変異それ自体を予め定める必要はない。例えば、与えられた部位での変異を最適に達成するために、標的コドンまたは領域においてランダム変異生成を誘起し、発現したＧＰＡ変異種群から所望活性の最適組合わせのものをスクリーンしてもよい。既知配列のＤＮＡ中の予め定められた部位で置換変異を起させる技術、例えば、Ｍ１３プライマー変異生成およびＰＣＲ変異生成は周知である。変異種群のスクリーニングはＧＰＡタンパク質活性のアッセイを用いて行う。
アミノ酸置換は、典型的には単一の残基についてのものであり、挿入は通常約１ないし２０アミノ酸のオーダーであるが、それ以上の相当大きな挿入も許容され得る。削除は約１ないし約２０残基の範囲にあるが、ある場合にはそれ以上となり得る。
【００８４】
置換、削除、挿入またはそれらの任意の組合わせを、最終誘導体に到達するために使用し得る。一般にこれらの変更は僅かのアミノ酸について行い、分子の変化を最小限のものとする。しかしながら、それ以上の大きな変更もある種の環境下では許容され得る。一般的に、ＧＰＡタンパク質の特性における変化が小さいことが望ましい場合は、置換を下記チャートに従って行う：
0004092081.tif 000002
【００８５】
機能および免疫学的同一性における実質的変化を来すには、チャート１に示したものより保守性がより少ない置換分を選択する。例えば、変化させる領域内のポリペプチドバックボーンの構造：例えば、アルファ―ヘリカルまたはベータ―シート構造；標的部位における分子の荷電または疎水性；または側鎖の嵩高さ、に一層顕著に影響する置換は以下のようにして行う。一般にポリペプチドの特性に最大の変化を生じると期待される置換は、（ａ）親水性残基例えばセリルまたはスレオニルを、疎水性残基例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルと（または、により）置換する；（ｂ）システインまたはプロリンを他の任意の残基と（または、により）置換する；（ｃ）陽性荷電側鎖例えばリジル、アルギニル、またはヒスチジルを有する残基を、陰性荷電残基例えばグルタミルまたはアスパルチルと（または、により）置換する；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基例えばフェニルアラニンを、側鎖を有しないもの例えばグリシンと（または、により）置換する、などの置換である。
【００８６】
これらの変異種は、元のＧＰＡタンパク質と、典型的に同じ性質の生物学的活性を顕わし、そして同じ免疫応答を誘発するが、必要なときはＧＰＡタンパク質の特性を修飾した変異種を選択することもできる。あるいは、この変異種を、ＧＰＡタンパク質の生物学的活性を変更するように設計することもできる。例えば、グリコシル化部位を変化させるかまたは除去することができる。同様に、生物学的機能を変化させることができ、例えば、ある場合には顆粒球増強活性を強くまたは弱くさせることが望ましい。
本発明のＧＰＡタンパク質および核酸は、多種の方法で調製できる。当業者には明らかであるが、当技術分野でよく知られている標準的技術を用いてタンパク質を合成することができる。明示的に参照して本明細書の一部とする、Willken et al., Cur. Opin. Biotechnol/ 9:412-26 (1998) を参照。
【００８７】
あるいは、そして好ましくは、これら本発明のタンパク質および核酸は、組換え技術を用いて調製できる。本発明のＧＰＡをコードしている核酸を使用して各種の発現ベクターを調製できる。これらの発現ベクターは、自己複製余分染色体性ベクターであっても、宿主ゲノム中に取込まれるベクターのいずれであってもよい。これらの発現ベクターには、一般に、ＧＰＡタンパク質をコードする核酸に作用可能なように連結した、転写および翻訳調節核酸が含まれる。「対照配列」の用語は、特定宿主生物中に作用可能なように連結したコード化配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。
原核生物に適する対照配列は、例えば、プロモーター、所望によりオペレーター配列、およびリボソ−ム結合部位、を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている
【００８８】
核酸は、他の核酸配列と官能的に関係するように置かれたとき「作用可能なように連結している」。例えば、前駆配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として発現するとき、ポリペプチドのＤＮＡと作用可能なように連結しており；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響するとき、コード化配列と作用可能なように連結している；またはリボソーム結合部位が、それが翻訳を促進するように配置されるとき、コード化配列と作用可能なように連結している。一般に、「作用可能なように連結している」とは、連結しているＤＮＡ配列が接触していること、および分泌リーダーの場合は、接触しかつ読取り段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、接触していなくてもよい。連結は、好適な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、常法に従って使用する。一般に、転写および翻訳調節核酸が、融合タンパク質の発現に使用する宿主細胞には適合する；例えば、Bacillus 属における融合タンパク質の発現には、Bacillus 属由来の転写および翻訳調節核酸配列を好適に使用する。多様な宿主細胞に対して、多様な型の適合する発現ベクター、および適切な調節配列が、当業界でよく知られている。
【００８９】
一般に、転写および翻訳調節配列には、それらに限定するものではないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまたは活性化配列、などが含まれる。好ましい実施態様では、調節配列はプロモーターおよび転写開始および停止配列を含む。  プロモーター配列は、構成的または誘動プロモーターのいずれをもコードする。これらのプロモーターは、天然に生起するプロモーターであっても、ハイブリッドプロモーターであってもよい。１つ以上のプロモーター要素を結合するハイブリッドプロモーターは、当業界によく知られており、本発明に有用である。好ましい実施態様では、これらのプロモーターは、細胞、殊に哺乳動物細胞内で高度な発現を可能とする強力なプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター、特にそれとＴｅｔ調節要素との組合わせ、である。
【００９０】
加えて、発現ベクターは、付加的な要素を含んでいてもよい。例えば、この発現ベクターは、２種の複製システムを有していてもよく、そのようにして２種の宿主生物例えば発現用の哺乳動物または昆虫の細胞中で、およびクローニングおよび増殖用の原核動物宿主中で維持可能としたものであってもよい。さらに、発現ベクターを組込むには、該発現ベクターは、発現構成体の側面に接する、宿主細胞ゲノムとの少なくとも１つの配列相同性、好ましくは２つの相同配列を含有する。組込むベクターは、ベクター中への取り込みに適切な相同配列を選択して宿主細胞中の特定個所を指向するものとしてもよい。組込むベクターに対する構成体は当技術分野で周知である。
加えて、好ましい実施態様では、発現ベクターは選択できる標識遺伝子を含有し、形質転換宿主細胞の選択を可能にする。選択遺伝子は当技術分野でよく知られており、使用する宿主細胞ごとに変る。
【００９１】
好ましい発現ベクター系は、レトロウイルスベクター系であり、いずれも参照して明示的に本明細書の一部とするPCT/US97/01019 およびPCT/US97/01048 に総括的に記載されている。
本発明のＧＰＡ核酸は、細胞中に導入する。「中に導入する」またはその文法的に均等な表現は、該核酸がその後の核酸発現に適した態様で細胞内に入り込むことを意味する。この導入方法は、以下で論じるように、標的細胞型によってほぼ決まってくる。方法を例示すれば、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合、リポフェクチン（登録商標）、電気穿孔(electroporation)、ウイルス感染、その他などがある。本発明のＧＰＡ核酸は、宿主細胞のゲノム中に安定に組込む（例えば、下記概説のレトロウイルスによる導入により）ことができ、あるいは細胞質中に一時的にまたは安定的に（即ち、通常のプラスミッドを使用し、標準調節配列、選択マーカー、その他を利用して）存在させることもできる。
【００９２】
本発明のＧＰＡタンパク質は、ＧＰＡタンパク質をコードしている核酸を含有する発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、ＧＰＡタンパク質の発現を誘起または生起させる適切な条件下に培養することにより生成する。ＧＰＡタンパク質の発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択により変るが、当業者によれば通常の実験によって容易に探知し得る。例えば、発現ベクター中の構成的プロモーターの使用は、宿主細胞の成長および増殖を最適化することが必要とするが、誘導プロモーターの使用では誘導に適した生育条件が必要となる。加えて、ある実施態様では、収穫の時期が重要となる。例えば、昆虫細胞発現で使用するバクロウイルス系では、溶菌性ウイルスであり従って、収穫時期が生成物の収率に決定的であり得る。
適切な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、放線菌、および昆虫、および哺乳類細胞を含む動物細胞が含まれる。特に好適なのは、Drosophila melangaster 細胞、Saccharomyces cerevisiaeおよびその他の酵母、大腸菌、Bacillus subtilis、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Neurospora、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Pichia Pastoris、その他である。
【００９３】
好ましい実施態様では、ＧＰＡタンパク質を哺乳動物細胞中で発現させる。哺乳動物の発現系も当技術分野で既知であり、レトロウイルスの系を含む。哺乳動物のプロモーターは、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼを結合し、ｍＲＮＡ中への融合タンパク質コード配列の下流方向（３’）転写を開始する能力がある全てのＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コード化配列の５’末端近位に配置されている転写開始領域、および、転写開始部位の上流に位置する２５−３０塩基対を使用するＴＡＴＡボックスを有する。このＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが正しい部位でＲＮＡ合成を始めるよう指令しているものと思われる。哺乳動物プロモーターは、典型的にはＴＡＴＡボックスの上流１００ないし２００塩基対内に位置している、上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）をも含有する。上流プロモーターエレメントは、そこで転写が開始する速度を決めており、いずれの方位においても作用し得る。ウイルス性遺伝子は、しばしば高度に発現し広範囲の宿主に適合するので、哺乳動物のウイルス性遺伝子由来のプロモーターが、哺乳動物用プロモーターとして特徴的である。その例には、ＳＶ４０初期プロモーター、マウスの乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヘルペス単式(simplex)ウイルスプロモーター、およびＣＭＶプロモーターなどが含まれる。
【００９４】
典型的には、哺乳動物細胞により認識される、転写終了とポリアデニル化の配列は、翻訳停止コドン方向の３’に位置している調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと一緒にコード化配列に接している。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位―特異的翻訳後開裂およびポリアデニル化により形成する。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０由来のものが含まれる。
好ましい実施態様において、可変位置の組合わせを行う場合は、ＧＰＡタンパク質をコードしている核酸を各種組合わせ技術を用いて作成する。例えば、米国特許第５８１１２３８、５６０５７２１および５８３０７２１号、並びに関連特許群（それらは参照して全て明示的に本明細書の一部としている）に概説されているような「シャフリング」技法
【００９５】
好ましい実施態様では、図１２に一般的に描出したように、プールしたオリゴヌクレオチドを用いて多数回ＰＣＲ反応を行う。この実施態様では、重なり合わせるオリゴヌクレオチドを完全長遺伝子に対応するように合成する。さらにまた、これらのオリゴヌクレオチドは、各可変位置またはサブセットにおいて全ての異なるアミノ酸を代表し得る。
好ましい実施態様では、これらのオリゴヌクレオチドを同じ比率でプールしておき、多数回ＰＣＲ反応を実施して、可変位置の組合わせを含有する完全長配列を創出する。
好ましい実施態様では、異なるオリゴヌクレオチドを、図３−１０に示しているような確率分布表に対応する相対的量で加える（特定位置にある確率論的機会はアミノ酸が異なると異なる）。従って、例えば図４に示しているように、上位１０００配列のうち、１０３位は、バリンであることが３５％、ロイシンであることが２６％、そしてイソロイシンであることが３１％である。多数回ＰＣＲ反応は、このようにして、所望組合わせの各種アミノ酸を所望比率で有する完全長配列を与える。
【００９６】
必要となるオリゴヌクレオチドの総数は、変異させようとする位置の数およびそれらの位置で考慮されようとしている変異数の函数である：
（各所定位置に対するオリゴ数）＋Ｍ１＋Ｍ２＋Ｍ３＋                                ・・・・Ｍｎ＝（必要となるオリゴの総数）
式中Ｍｎは、配列中のｎ位において考慮されているアミノ酸の数である。
【００９７】
好ましい実施態様では、重なり合わせる各オリゴヌクレオチドが変異位置を１個所だけ含むが；別の実施態様では、変異位置がこれを可能とするには互いに近過ぎ、オリゴヌクレオチド毎に多数の変異が全ての可能性の完全組換えを生じてしまうのが常である。即ち、各オリゴは、変異させようとする単一の位置、または変異させようとする１以上の位置に対するコドンを含有できる。変異させようとする多数位置は、オリゴ長が作用不能になるのを防ぐため配列中で近接していなければならない。オリゴヌクレオチド上の多数の可変位置に対しては、その組合わせをコードしているオリゴヌクレオチドを含めたりまたは排除したりすることにより、可変残基の特定組合わせをライブラリー中に含めたりまたは排除したりできる。必要となるオリゴヌクレオチドの総数は、多数の可変位置が単一のオリゴヌクレオチドによりコード化されている場合には増大する。アニーリングした領域は一定のまま残る、即ち参照配列の配列を有するところである。
【００９８】
コドンを挿入または削除したオリゴヌクレオチドを、異なる長さのタンパク質を発現するライブラリーの創出に使用することができる。殊に、挿入または削除のためのコンピューター化配列スクリーニングにより、異なる長さのタンパク質を定義する二次ライブラリーを生成させることができ、それらはプールした異なる長さのオリゴヌクレオチドのライブラリーにより発現させ得る。
好ましい実施態様では、エラー―プローンＰＣＲを実施する。米国特許第５６０５７９３、５８１１２３８、および５８３０７２１号参照（いずれも参照して本明細書の一部とする）。これは、最適配列上でまたはＧＰＡセットの上位メンバー上で実施できる。この実施態様では、コンピューター化スクリーニングにより見出された最適ＧＰＡ配列に対する遺伝子を合成できる。エラー―プローンＰＣＲを、次いで、可変残基を変異位置（バイアスオリゴヌクレオチド）でコードしている最適配列遺伝子上でオリゴヌクレオチドの存在下に実施する。オリゴヌクレオチドの加入は、二次ライブラリー中に変異を導入するのに有利なバイアスを創出する。あるいは、ある種の変異に対するオリゴヌクレオチドのみがライブラリーをバイアス化するのに使用できる。
【００９９】
好ましい実施態様では、エラー―プローンＰＣＲを、図１２に概略を示した重ね合わせオリゴヌクレオチド法と組合わせて実施する。
好ましい実施態様では、エラー―プローンＰＣＲによる遺伝子切り混ぜを、最適配列の遺伝子上で、バイアスオリゴヌクレオチドの存在下に実施し、変異比率を反映したＤＮＡ配列ライブラリーを創出できる。バイアスオリゴヌクレオチドの選択は、多様な方法で行うことができる；それらはその頻度に基づき選択され得、すなわち、高変度頻度の位置をコードするオリゴヌクレオチドを使用し得る；他に、殆どの可変性位置を含むオリゴヌクレオチドを用い得、そのため、多様性が増大する；ＧＰＡタンパク質のセットをランク付けするならば、上部スコアリング位置の数を用い、バイアスオリゴヌクレオチドを生じ得る；無作為の位置を選択し得る；少しはある上部スコアリングおよび少しはある低部スコアリングを選択し得る；などである。重要なことは、好ましい可変性の位置および配列に基く新規配列を作成することである。同様に、ＧＰＡタンパク質の上部のセットを、従来のシャッフルする方法または図１２のオーバーラッピングオリゴヌクレオチド法を使用して“シャッフル”し得る。
【０１００】
哺乳類宿主、および他の宿主に外来性核酸を導入する方法は、当分野に既知であり、使用する宿主細胞により変更される。技術には、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接のマイクロインジェクションが含まれる。本明細書で概要説明するように、特に好ましい方法は、ＰＣＴ ＵＳ９７／０１０１９(引用によりこの文書に加える)に記載に従い、レトロウイルス感染を利用する。
【０１０１】
当業者が認識するように、本発明で使用される哺乳類細胞の型は、広く変化し得る。当業者が認識するように、シュードタイプとすることによる系の修飾は、使用されるすべての真核生物、好ましくは高等真核生物に可能であるが、基本的に、任意の哺乳類細胞を使用し得、マウス、ラット、霊長類およびヒトの細胞が特に好ましい。以下に十分記載するように、スクリーニングは、細胞が生体活性ペプチドの存在下、選択可能な表現型を示すのため、セットアップする。より以下で記載するように、広範囲の種々の病状に含まれる細胞型は、細胞内のペプチドの存在の結果として変化した表現型を示す細胞を選択し得るように適当なスクリーニングを設計し得る限り、特に有用である。
【０１０２】
したがって、適当な細胞型には、すべての型の腫瘍細胞(特に、黒色腫、骨髄白血病、肺、乳、卵巣、結腸、腎臓、前立腺、膵臓および精巣の癌)、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球(Ｔ細胞およびＢ細胞)、マスト細胞、エオシン好性白血球、血管の脈管内膜細胞、肝細胞、単核白血球を含む白血球、造血(haemopoetic)、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓および筋細胞の幹細胞のような幹細胞(分化および脱分化ファクターでのスクリーニングに使用する場合)、破骨細胞、軟骨細胞および他の結合組織細胞、ケラチン生成細胞、メラニン生成細胞、肝細胞、腎細胞、および含脂肪細胞を含むがこれらに限らない。適当な細胞にはまた、JurkatＴ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、Ｃｏｓなどを含むがこれらに限らない既知の研究細胞が含まれる。ＡＴＣＣ細胞系カタログ参照(引用によりこの文書に明白に加える)。
【０１０３】
ある実施態様では、細胞は、さらに遺伝学的に工作され得、すなわち、ＧＰＡ核酸以外の外来性核酸を含み得る。
【０１０４】
好ましい実施態様では、ＧＰＡタンパク質は、細菌性システムにおいて発現される。細菌性発現システムは、当分野では既知である。
【０１０５】
適当な細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼの結合およびｍＲＮＡへのＧＰＡタンパク質のコーディング配列の下流(３')転写を開始し得る任意の核酸配列である。細菌性プロモーターは、コーディング配列の５'末端に近接するように通常おかれる転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的に、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。配列をコードする代謝経路酵素は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、ガラクトース、ラクトースおよびマルトースのような糖代謝酵素から誘導されるプロモーター配列、およびトリプトファンのような生合成酵素から誘導される配列を含む。バクテリオファージ由来のプロモーターもまた、使用され、当分野に既知である。加えて、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた、有用であり、例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。更に、細菌性プロモーターには、細菌性ＲＮＡポリメラーゼを結合し、転写を開始することができる非細菌性起点の天然に生ずるプロモーターが含まれ得る。
【０１０６】
機能性プロモーター配列に加えて、有効なリボゾーム結合部位が望ましい。E.coliでは、リボゾーム結合部位は、シャイン-ダルガルノ(ＳＤ)配列と呼ばれ、開始コドンおよび開始コドンの上流３−１１ヌクレオチドに位置する長さ３−９ヌクレオチド配列を含む。
【０１０７】
発現ベクターはまた、細菌中でＧＰＡタンパク質の分泌を供与するシグナルペプチド配列を含み得る。シグナル配列は、典型的に、当分野に既知であるように、細胞からのタンパク質分泌を指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地(グラム陽性細菌)中か、または細胞の内側と外側の膜の間に位置するペリプラズム空間(グラム陰性細菌)中の何れかへ分泌する。
【０１０８】
細菌性発現ベクターはまた、形質転換された細菌株を選択し得る選択マーカーを含み得る。適当な選択マーカーには、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンのような薬剤に細菌を耐性とする遺伝子が含まれる。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路におけるもののような生合成遺伝子が含まれる。
【０１０９】
これらの構成要素は発現ベクター中にアセンブルされる。細菌の発現ベクターは当分野に既知であり、数ある中で、Bacillus subtilis、E. coli、Streptococcus cremoris、およびStreptococcus lividansのベクターが含まれる。細菌性発現ベクターは、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーションおよび他のもののような当分野に既知の技術を使用して、細菌性宿主細胞中に形質転換される。
【０１１０】
ある実施態様では、ＧＰＡタンパク質は、昆虫細胞中で産生される。昆虫細胞の形質転換用の発現ベクター、および特にバキュロウイルスを基とする発現ベクターが当分野に既知である。
【０１１１】
好ましい実施態様では、ＧＰＡタンパク質は、酵母細胞中で産生される。酵母発現システムは、当分野に既知であり、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicansおよびC. maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilisおよびK. lactis、Pichia guillerimondiiおよびP. pastoris、Schizosaccharomyces pombe、およびYarrowia lipolyticaの発現ベクターを含む。酵母における発現に好ましいプロモーター配列には、誘導性ＧＡＬ１、１０プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ由来のプロモーター、および酸ホスファターゼ遺伝子が含まれる。酵母選択性マーカーには、ツニカマイシンに耐性を供与するＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７；Ｇ４１８に耐性を供与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；および銅イオン存在下で酵母を増殖させ得るＣＵＰ１遺伝子が含み得る。
【０１１２】
加えて、本発明のＧＰＡポリペプチドは、更に他のタンパク質に融合され得、望ましいならば、例えば発現を増加し得る。
【０１１３】
ある実施態様では、本発明のＧＰＡ核酸、タンパク質および抗体は、スカホールド以外の標識で標識する。本明細書で“標識する”とは、化合物が少なくとも１つの要素、放射性同位元素または当該化合物を検出し得るように取付けられた化学的化合物を有することを意味する。通常、標識は、ａ)放射活性を有するかまたは安定同位元素であり得る放射性標識、ｂ)抗体または抗原であり得る抗体標識およびｃ)色の色素または蛍光色素の３つのクラスに分類される。標識は、化合物中の任意の場所に挿入され得る。
【０１１４】
一旦作成すると、ＧＰＡタンパク質は、共有結合的に修飾され得る。１つの型の共有結合性修飾には、ＧＰＡタンパク質の標的アミノ酸残基と、選択した側鎖またはＧＰＡタンパク質のＮもしくはＣ末端残基と反応し得る有機性誘導剤との反応が含まれる。以下に十分に記載するように、二官能性試薬による誘導は、例えば、抗ＧＰＡ抗体の精製またはアッセイのスクリーニングの方法に使用の水不溶性支持体マトリクスまたは表面へのＧＰＡの架橋に有用である。通常使用される架橋剤には、例えば、１,１−ビス(ジアゾアセチル)−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含み、例えば４−アジドサリチル酸、同種二官能性(homobifunctional)イミドエステルを有するエステルであり、３,３'−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)のようなジスクシンイミジルエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１,８−オクタンのような二官能性マレイミドおよびメチル−３−[(ｐ−アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートのような試薬を含む。
【０１１５】
他の修飾には、グルタミルおよびアスパルチル残基それぞれに相当するグルタミニルおよびアスパラギニル残基の脱アミノ化、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシ基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖の"−アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86(1983)]、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および任意のＣ−末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１１６】
本発明の範囲内に含まれるＧＰＡタンパク質の他の型の共有結合性修飾には、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変化させることが含まれる。“天然のグリコシル化パターンを変えること”とは、本明細書において、天然配列のＧＰＡポリペプチドに見られる１つまたはそれ以上の炭水化物成分を検出すること、および／または天然配列のＧＰＡポリペプチドに存在しない１つまたはそれ以上のグリコシル化部位を付加すること、を意味することを目的とする。
【０１１７】
ＧＰＡポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列を変えることにより実施し得る。その変化は、例えば、天然配列のＧＰＡポリペプチドへの１つまたはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加によるか、または天然配列のＧＰＡポリペプチドへの１つまたはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基による置換により、行い得る(Ｏ−連結グリコシル化部位)。ＧＰＡアミノ酸配列は、所望により、ＤＮＡレベルでの変化を介して変化し得、特に、コドンが望ましいアミノ酸に翻訳されるように作成されるように、ＧＰＡポリペプチドをコードするＤＮＡを事前に選択した塩基位置で変異させることにより、変化し得る。
【０１１８】
ＧＰＡポリペプチドにおける炭化水素部分の数を増加する他の方法は、ポリペプチドに対するグリコシドの化学的または酵素学的結合による。その方法は、当分野で述べられており、例えば、１９８７年９月１１日付け発行のＷＯ８７／０５３３０、およびAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に述べられている。
【０１１９】
ＧＰＡポリペプチドに存在する炭化水素部分の除去は、化学的または酵素学的に、またはグリコシル化の標的であるアミノ酸残基をコードするコドンの変異置換により、実施し得る。化学的脱グリコシル化技術は、当分野に既知であり、例えば、Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)およびEdge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)により述べられている。ポリペプチドの炭化水素部分の酵素学的切断は、Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)により述べられているような種々のエンド−およびエキソ−グルコシダーゼの使用により実施され得る。
【０１２０】
ＧＰＡの他の型の共有結合性修飾には、米国特許番号４,６４０,８３５、４,４９６,６８９、４,３０１,１４４、４,６７０,４１７、４,７９１,１９２または４,１７９,３３７に記載の方法により、種々の非タンパク質性ポリマーの１つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンに対しＧＰＡポリペプチドを連結させることを含む。
【０１２１】
本発明のＧＰＡポリペプチドはまた、多少修飾され、他の、異種性ポリペプチドまたはアミノ酸の配列に融合したＧＰＡポリペプチドを含むキメラ分子を形成する。ある実施態様では、そのキメラ分子には、ＧＰＡポリペプチドと、抗−タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを供与するタグポリペプチドとの融合が含まれる。当該エピトープタグは、ＧＰＡポリペプチドのアミノ−またはカルボキシル末端に通常位置する。ＧＰＡポリペプチドのそのエピトープタグ化形成体の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用い検出され得る。また、エピトープタグが提供されると、エピトープタグに結合する抗−タグ抗体または他の型の親和性マトリクスを用いる親和性精製によりＧＰＡポリペプチドが容易に精製され得る。他の態様では、キメラ分子は、ＧＰＡポリペプチドと、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定領域との融合を含み得る。キメラ分子の二価形態の場合、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。
【０１２２】
種々のタグポリペプチドおよびその各抗体は当分野に既知である。例には、ポリヒスチジン(ポリ−ｈｉｓ)またはポリ−ヒスチジン−グリシン(ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ)タグ、ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５[Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165(1988)]、ｃ−ｍｙｃタグおよびその８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体[Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616(1985)]、およびHerpes SimplexウイルスグリコプロテインＤ(ｇＤ)タグおよびその抗体[Paborsky et al., Protein Engineerign, 3(6):547-553(1990)]が含まれる。他のタグポリペプチドには、Ｆｌａｇ−ペプチド[Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210(1988)]、ＫＴ３エピトープペプチド[Martin et al., Science, 255:192-194(1992)]、チュービュリンエピトープペプチド[Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166(1991)]、およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397(1990)]が含まれる。
【０１２３】
好ましい実施態様では、ＧＰＡタンパク質は、発現後精製するかまたは単離する。ＧＰＡタンパク質は、サンプル中に存在する他の成分に依存する当業者に既知の種々の方法で単離するか、精製し得る。標準的な精製方法には、電気泳動、分子、免疫ならびにイオン交換、疎水性、アフェニティーおよび逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含むクロマトグラフの技術、ならびにクロマトフォーカシング(chromatofocusing)が含まれる。例えば、ＧＰＡタンパク質は、標準的な抗−ライブラリー抗体カラムを用い精製し得る。タンパク質濃縮と組合せる、限外濾過およびダイアフィルトレーション技術もまた有用である。適当な精製技術における一般的なガイダンスには、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982)参照。ある程度の精製の必要性は、ＧＰＡタンパク質の使用に依存して変化する。幾つかの例では、精製は必要ない。精製の好ましい方法は、実施例で概略する。
【０１２４】
一旦作成されると、本発明のＧＰＡタンパク質および核酸には多くの適用における使用が見られる。好ましい実施態様では、ＧＰＡタンパク質は、Ｇ−ＣＳＦ−関連疾患を処置する患者に適用される。
【０１２５】
本明細書で用いる“Ｇ−ＣＳＦ関連疾患”または“好中球減少性”または“Ｇ−ＣＳＦ応答性疾患”または“病状”なる語は、ＧＰＡタンパク質を伴う化合物の投与により改善され得る疾患、化学療法および放射線療法を含む癌治療に関連する好中球減少；放射線偶発症候；骨髄移植；骨髄抑制疾患(bone marrow suppression condition)、例えばＡＩＤＳに関連するもの；顆粒球機能異常により特徴付けられる骨髄異形成症候群；重篤な感染症などを含むがこれらに限らない、疾患を意味する。加えて、本発明のＧＰＡタンパク質による処置は、末梢血液前駆細胞の回収の促進に使用され得る。
【０１２６】
好ましい実施態様では、治療的に有効用量のＧＰＡタンパク質を患者に投与する。本明細書における“治療的に有効用量”なる語は、投与目的の効果を生ずる用量を意味する。その正確な用量は、処理の目的に依存し、当業者が既知の技術を用いることにより確かめることができる。好ましい実施態様では、約５μｇ／ｋｇの用量を用い、静脈かまたは皮下で投与する。当分野に既知のように、ＧＰＡ崩壊の調節、全身対局所の送達、および新規プロテアーゼの合成の割合、ならびに年齢、体重、一般的な健康状態、性別、日常の食べ物、投与時間、薬物の相互作用および病状の程度が、必要であり、当業者によって、通常の実験を用い確認することができる。
【０１２７】
本発明の目的の“患者”には、ヒトおよび他の動物、特に哺乳類の両方、および生物が含まれる。そのため、当該方法は、ヒトの治療および獣医学的適用の両方に適用される。好ましい実施態様では、当該患者は、哺乳類であり、最も好ましい実施態様では、患者はヒトである。
【０１２８】
本発明のＧＰＡタンパク質の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮、腹膜内、筋肉内、肺内、膣、直腸、または眼球内を含むがこれらに限らない、種々の経路で行い得る。幾つかの例では、例えば、創傷および炎症の処置において、ＧＰＡタンパク質は、直接、溶液またはスプレーとして適用され得る。
【０１２９】
本発明の医薬組成物には、患者への投与に適当な型のＧＰＡタンパク質を含む。好ましい実施態様では、医薬組成物は、薬学的に許容される塩として存在するような水溶性型であり、それは、酸および塩基、両方の付加塩を含むことを意味する。“医薬的に許容される酸付加塩”なる語は、生物学的に有効な遊離塩基を保持し、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、マレイン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などのような有機酸で形成された、生物学的にまたはその他の理由で望ましくないものではない塩をいう。“医薬的に許容される塩基付加塩”には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などのような無機塩基から誘導されるものが含まれる。特に好ましいものは、アンモニア、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩がである。薬学的に許容される有機性非毒性塩基から誘導された塩には、第一級、第二級および第三級アミン、天然に生ずる置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンのような塩基性イオン交換樹脂、およびエタノールアミンが含まれる。
【０１３０】
医薬組成物はまた、１つまたはそれ以上の以下のものを含み得る：血清アルブミンのような担体タンパク質；ＮａＯＡｃのような緩衝液；微晶質セルロース、ラクトース、コーンおよび他のデンプンのようなフィルター；結合剤；人工甘味料および他の香料剤；着色剤およびポリエチレングリコール。更なるものが当分野に既知であり、種々の製剤に使用される。
【０１３１】
好ましい実施態様では、ＧＰＡタンパク質は、治療薬剤として投与され、上記概要のように製剤化される。同様にＧＰＡ遺伝子(ＧＰＡコーディング領域の全長配列、部分配列、または調節配列の何れも含む)が、当分野で知られるように遺伝子治療の適用で投与され得る。これらＧＰＡ遺伝子には、当業者により評価されるように、遺伝子治療(すなわち、ゲノム中への組み込みのために)またはアンチセンス組成物の何れかとしてのアンチセンス適用が含まれ得る。
【０１３２】
好ましい実施態様では、ＧＰＡタンパク質をコードする核酸はまた、遺伝子治療に使用され得る。遺伝子治療の適用では、遺伝子は、例えば欠損遺伝子の置換に治療的に有効な遺伝的産物のインビトロでの合成を行うため、細胞中に導入される。“遺伝子治療”には、永久的な効果が一回の処置で生じる通常の遺伝子治療、および治療的に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの一度または繰返しの投与を含む遺伝子治療医薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、インビトロで特定遺伝子の発現を阻止する治療医薬として使用され得る。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜による制限的な吸収が原因となる低細胞内濃度にもかかわらず、阻害剤として作用する細胞中に導入され得ることが既に示されている(Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:4143-4146[1986])。オリゴヌクレオチドは、例えば、陰性荷電のリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することにより、吸収を促進するように修飾し得る。
【０１３３】
生存能力のある細胞中に核酸を導入することができる技術が種々存在する。当該技術は、核酸が培養された細胞中にインビトロで導入されるか、または目的宿主の細胞中にインビボで導入されるか、何れかによって変化する。インビトロでの哺乳類細胞中へ核酸を適当に導入する技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用が含まれる。現在、好ましいインビボ遺伝子導入技術には、ウイルス性(典型的にはレトロウイルス)ベクターによるトランスフェクションおよびウイルス性コートタンパク質リポソーム仲介トランスフェクションが含まれる[Dzau et al., Trends in Biotechnology, 11:205-210(1993)]。幾つかの状態では、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなどのような標的細胞を標的とする医薬を伴う核酸源を供与することが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトシスに関連する細胞表面タンパク質に結合するタンパク質をターゲッティングに使用し得、および／または例えば、特定の細胞型に親和性のキャプシッドまたはそのフラグメント、サイクリングの開始となるタンパク質の抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を促進するタンパク質の吸収の促進に使用し得る。レセプター仲介エンドサイトシスの技術は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem., 262:4429-4432(1987)およびWagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:3410-3414(1990)に述べられている。遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコールの概観の場合、Anderson et al., Science, 256:808-813(1992)参照。
【０１３４】
好ましい実施態様では、ＧＰＡ遺伝子は、単一遺伝子またはＧＰＡ遺伝子群の組合せの何れかで、ＤＮＡワクチンとして投与される。裸のＤＮＡワクチン(naked DNA vaccine)は通常当分野で知られている。Brower, Nature Biotechnology, 16:1304-1305(1998)。ＤＮＡワクチンとして遺伝子を使用する方法は、当業者に既知であり、ＧＰＡ患者において発現するためのプロモーター下にＧＰＡ遺伝子またはＧＰＡ遺伝子の一部をおくことが含まれる。ＤＮＡワクチンとして使用するＧＰＡ遺伝子は、全長のＧＰＡタンパク質をコードし得るが、より好ましくはＧＰＡタンパク質から誘導したペプチドを含むＧＰＡタンパク質の一部をコードし得る。好ましい実施態様では、患者は、ＧＰＡ遺伝子から誘導した多数の核酸配列を含むＤＮＡワクチンで免疫する。同様に、本明細書に定義のように多数のＧＰＡ遺伝子またはその部分で患者を免疫可能である。理論と結びつくことなく、ＤＮＡワクチン、細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞および抗体をコードするポリペプチドの発現が誘導され、ＧＰＡタンパク質を発現する細胞を認識し、破壊するかまたは排除する。
【０１３５】
好ましい実施態様では、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンと共にアジュバント分子をコードする遺伝子を含む。そのアジュバント分子には、ＤＮＡワクチンによりコードされるＧＰＡポリペプチドに対する免疫原的応答を増加するサイトカインを含む。更なる、または他のアジュバントは、当業者に既知であり、本発明における使用が見出される。
【０１３６】
以下の実施例は、上記発明を用いる方法をより十分に述べ、本発明の種々の態様の実施を意図する最善の形式を開示するための役割をする。これらの実施例は、本発明の範囲を制限する役割をするものでは決してないが、むしろ例証を目的として存在する。本明細書中で引用のすべての参考文献は、引用によりこの文書にそのまま加える。
【０１３７】
実施例
新規ＧＰＡタンパク質の設計および特性解析
タンパク質の設計
要約：新規な顆粒球生成タンパク質(ＧＰＡタンパク質)は、WO98/47089およびU.S.S.N.09/127,926(それらの両方は引用によりこの文書に、明白に、そのまま加える)に述べられているようなProtein Design Automationを用いタンパク質の埋め込まれたコアの残基を同時に最適化することにより設計した。幾つかのコア設計は、１０２７−１０２８配列の見込みに相当する、考慮された２５−３４残基を備えていた。溶媒にさらされない残基は、分子表面の変化を最小とするため、および設計された新規タンパク質の類似体の抗原性の可能性を制限するため、設計した。計算には、16 Silicon Graphics R10000 CPUで１２−２４時間を必要とした。各設計から全体的に最適化した配列を特性解析に選択した。設計したタンパク質では、合計１７４残基のうち、１０−１４残基が、ｈＧ−ＣＳＦから変化していた。１４−２４の境界位置を最適化し１２−２０変異残基を生じるよう、更なる設計を行った。これらの設計は、鋳型構造としてのコア設計の1つから得られた最適の配列を用い繰返し、１２−２０変異から最適な配列を再び生じた。全体的に最適な配列のみを、ＰＤＡの高緊縮性および非常に低い偽陽性率のために実験用に、選択した。
【０１３８】
コンピュータープロトコール
鋳型構造調製：鋳型構造を、ホモロジーモデリングを用い作成した。ヒトＧ−ＣＳＦの結晶構造はより低い解像度であり、６４位と７４位の間のジスルフィド結合を抑制することを含む鍵となるフラグメントを喪失するため、ウシＧ−ＣＳＦ(ＰＤＢ記録１ｂｇｃ)の結晶構造を、モデリングの開始点として使用した。ウシＧ−ＣＳＦはまた、当該配列が同じ長さであり１７４アミノ酸のうち１４２が同一(８１％)であるため、ヒトＧ−ＣＳＦの良好なモデルとなる。ウシの配列とは異なる３２残基を、これらの位置のヒトの残基で置換し、置換側鎖の立体配座は、ＰＤＡを用い最適化した。当該最適化は、１６７位を除くすべての置換残基上で当初行い、典型的なＰＤＡパラメーターを用いた(ファンデル・ワールススケールファクターを０．９にセットし、十分な深さの可能性あるＨ−結合を８．０ｋｃａｌ／ｍｏｌにセットし、溶媒和ポテンシャルは、２型溶媒和を用い非極性埋め込みエネルギー(nonpolar burial energy)０．０４８ｋｃａｌ／ｍｏｌで、非極性暴露増加係数(nonpolar exposure multiplication factor)１．６で計算した)。１６７位の場合、ウシＧ−ＣＳＦのＧｌｙを、この位置(Ｖａｌ)のヒト残基で置換した。しかし、６４位と７４位の間のジスルフィド結合と１６７位との間の立体的圧迫のために、この位置のＶａｌを、あまり制限されない立体的圧迫を用い最適化した(ファンデル・ワールススケールファクターは典型的な値０．９の代わりに０．７を用いＰＤＡを作動した)。次いで、その全体的構造を、共役傾き最小化およびDreiding IIの力の場を用い、５０のステップで最小化した。この最小化構造をすべての設計の鋳型として使用した。
【０１３９】
設計ストラテジー：コア残基を、これら位置の最適化により安定性が改善され(安定化は同様の他の部位での修飾から得られるけれども)得るため、設計のために選択した。コア設計はまた、分子表面への変化を最小とし、そのため抗原性の設計タンパク質の可能性を制限する。ＰＤＡ計算は、３つのコア設計で行った；コア３は、変化し得る３４コアの位置を有し、コア４は２６を有し、そしてコア４ｖは２５を有する(参照図２)。コア３の可変性位置は、完全長のらせんから選択されるが、コア４およびコア４ｖの可変性位置は、らせんの内部(末端ではない)から選択された。疎水性アミノ酸のみが、可変性コアの位置となり得た。これらには、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＴｙｒおよびＴｒｐを含んでいた。Ｇｌｙはまた、ウシ野生型構造でＧｌｙを有する可変性位置となり得る(２８、１４９、１５０および１６７位)。ＭｅｔおよびＰｒｏはなり得なかった。
【０１４０】
２つの境界設計もまた行った：ｂｎｄｒｙ４ ２は２４の可変性境界残基を有しており、ｂｎｄｒｙ４ ＡＤは１４を有していた(図２参照)。ｂｎｄｒｙ４ ＡＤ設計は外側２つのらせん(ＡおよびＤ)上の境界残基に限定され、これは、らせんの性質の最も明白な変化がこれらの位置での修飾から生じることが当初の計算から示唆されるからであり、我々は、らせんの性質の改善が安定性の改善を導き得ると認識した。２つの更なる境界設計は、同一の境界位置を変化させるが、鋳型としてコア４設計から最適配列を使用し得るように、行った(ｂｎｄｒｙ４ ２ ｃｏｒｅ４およびｂｎｄｒｙ４ ＡＤ ｃｏｒｅ４)。すなわち、これら設計は、コア４ＰＤＡ計算から生ずる１０コア変異(アミノ酸および立体配座)を維持する必要があった(図３参照)。境界設計は、可変性位置で以下のアミノ酸で行うことができた：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＨｓｐ(プロトン化Ｈｉｓ)。Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、および芳香性Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅは行えなかった。
【０１４１】
ＰＤＡ計算
すべての設計のためのＰＤＡ計算は、ａ２ｈ１ｐ０回転異性体ライブラリーを用い行った。このライブラリーは、DunbrackおよびKarplus(Dunbrack and Karplus, 1993)のバックボーン依存回転異性体ライブラリーに基づくが、芳香性および疎水性アミノ酸のより多くの回転異性体を含む；すべての芳香性アミノ酸の回転異性体のＸ１およびＸ２角の値および他の疎水性アミノ酸Ｘ１角の値は、DunbrackおよびKarplusライブラリーで報告されている平均値についての標準偏差は±１の広がりを持っていた。典型的なＰＤＡパラメーターを用いた：ファンデル・ワールススケールファクターを０．９にセットし、十分な深さの可能性あるＨ−結合を８．０ｋｃａｌ／ｍｏｌにセットし、溶媒和ポテンシャルは、２型溶媒和を用い非極性埋め込みエネルギー(nonpolar burial energy)０．０４８ｋｃａｌ／ｍｏｌで、非極性暴露増加係数(nonpolar exposure multiplication factor)１．６で計算し、二次構造スケールファクターを０．０にセットした(二次構造の性質は考慮しなかった)。計算には、16 Silicon Graphics R10000 CPUで１２−２４時間を必要とした。
【０１４２】
最適な配列
各設計のＰＤＡにより選択された最適な配列を図３に示す。コア設計では、１０から１４残基が野生型と比較すると変化しており、その一方、境界設計は、ｂｎｄｒｙ４ ２では２０変異を生じ(すべて設計された４つのらせん)、ｂｎｄｒｙ４ ＡＤでは１２変異を生じた(設計されたＡおよびＤのらせんのみ)。鋳型にコア４の変異を含めると、同じ数の境界変異を生じるが(ｂｎｄｒｙ４ ｃｏｒｅ４では２０；ｂｎｄｒｙ４ ＡＤ ｃｏｒｅ４では１２)、異なるアミノ酸は幾つかの変異位置で選択した。
【０１４３】
モンテ・カルロ分析
ＰＤＡによって得た配列のモンテ・カルロ分析による、基底状態(最適)のアミノ酸、並びにアミノ酸は各変異し得る位置で許容されるアミノ酸とそれらの出現の頻度を示す（図４から１０を参照）。
【０１４４】
クローニングおよび発現
概要：ｍｅｔ ｈＧ−ＣＳＦに関する遺伝子を、伸張した部分的オーバーラップオリゴヌクレオチド（約１００塩基）から合成し、ＰＣＲ増幅した；（図１Ｂ参照）。コドンの取扱いは、Ｅ.Ｃｏｌｉに関して至適化し、いくつかの制限部位を次のクローニングを容易にするように遺伝子導入した。これら一部分の遺伝子をベクター内でクローニングし、配列決定のためにＥ.Ｃｏｌｉに遺伝子導入した。ついで、これら遺伝子断片の数個を、発現ベクター（ｐＥＴ１７もしくはｐＥＴ１７）内で隣接する部位にクローニングし、ｍｅｔ ｈＧ−ＣＳＦ（５２８塩基）に対する完全長遺伝子を形成させ、発現のためにＥ.Ｃｏｌｉに遺伝子導入した。タンパク質を、Ｅ.Ｃｏｌｉで、不溶性の含有体に発現させ(データは示していない)、その同一性を、市販のＭａｂアゴニストｈＧ−ＣＳＦを使用してＳＤＳ‐ＰＡＧＥのイムノブロットによって確認した。全ての新規ＧＰＡのタンパク質に対して類似の方法を行い、全てが発現した（データは示していない）。
【０１４５】
クローニング
遺伝子をクローニングするために、部分的に相補的な対をなしたオリゴヌクレオチドを合成し、１０分間、７０℃に加熱し、室温に冷却するアニーリングを行った。オーバーラップオリゴヌクレオチド（１００量体）を、クレノーフラグメントを使用して、３７℃、１時間、伸張させた。ついで、これらの伸張したオリゴヌクレオチドを、各末端２０ヌクレオチドに相補的なプライマーを用いてＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ産物を、ベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）で製造者の指示に従ってクローニングし、Glico-BRL Subcloning Efficiency E.Coli DH5αに遺伝子導入した。幾つかのコロニーからのＤＮＡを、Qiagen Miniprep Spin Kit を用いて単離し、Applied Biosystem 377XL自動化蛍光ＤＮＡシークエンサーを用いて配列を決定した。
【０１４６】
発現
タンパク質を発現させるために、配列決定した遺伝子をNovagen's pET21a(+) ベクターのＮｄｅｌとＸｈｏｌ部位との間にサブクーローニングを行い、Ｅ.Ｃｏｌｉ ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞に遺伝子導入した。タンパク質の発現を、３７℃で振盪しながら０.５ＯＤ５５０の濃度になるまでCirclegrow 培地(Bio 101)中でＥ.Ｃｏｌｉ細胞を増殖させて誘起させた。ついで、終濃度１ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、増殖をさらに３時間行った。発現タンパク質はＮ末端でＭetを組込んでいる；我われの番号付与はその隣の残基のＴｈｒで開始する。
【０１４７】
タンパク質の発現を確認するために、ＩＰＴＧの添加前と３時間のインキュベーションの終了時に、各１０μｌの試料を採取した。これらの試料を、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を行い、コマジーブルーＲ２５０で染色した。予想分子量を有するタンパク質の発現が、容易に観察し得た。タンパク質がＧ−ＣＳＦであるという確認を、Ｎ末端の２０個のアミノ酸もしくはＣ末端の１８個のアミノ酸残基に指向するモノクローナル抗体を用いるイムノブロット分析によって得た（Santa Cruz Biotechnology）。
【０１４８】
単離および精製
概要：タンパク質は界面活性剤で含有体を可溶化して、該タンパク質を本来のジスルフィド結合の形成を促進するためにＣｕＳＯ４の存在下で再生（リフォールディング）することにより単離した。可溶化されたタンパク質混合物を、サイズ排除カラム(size exclusion colmun)上に重層し、凝集物から単量体タンパク質をおよび調製物から不純物を分離した。単量体のmet ｈＧ−ＣＳＦ含有画分を回収し、逆相ＨＰＬＣによって純度を評価した。９５％以上の純度を確認した。設計したＧＰＡタンパク質は、野生型met ｈＧ−ＣＳＦよりも若干遅く溶出した。
【０１４９】
ＨＰＬＣの精製
該混合物を、サイズ排除カラム(Pharmaciaより購入したSuperdex pep 75樹脂で充填した10mm×300mm)に直接重層し、カラム用緩衝液(１００ｍＭ ＮａＳＯ4, ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ, ｐＨ７.５)を使用して、０.８ｍｌ／分の流速で溶出した。該ピークを、２１４nmおよび２８０nmの二重波長でＵＶ検出器によりモニターした。アルブミン、カーボニックアンヒドレート、シトクロムＣおよびアプロチニンを使用して、溶出時間に対するタンパク質の分子サイズを計算した。各タンパク質に対して予想される溶出時間周辺に溶出する単量体ピークを回収し、生物物理学的特徴付けのために、緩衝液を１０ｍＭ ＮａＯＡＣ（ｐＨ４）にかえた。長期貯蔵用には、５％のソルビトール、０.００４％ トゥィーン80および１０mM ＮａＯＡｃの緩衝液(ｐＨ４)を使用した。該タンパク質は、０.１％ＴＦＥを含むアセトニトリル勾配を使用して、Ｃ４カラム(3.9mm×150mm)で逆相ＨＰＬＣによって＞９８％の純度と判定した。
【０１５０】
含有体からの単離および再生
含有体を単離するため、Ｅ.Ｃｏｌｉ細胞を、Beckman J2-17 ローターにおいて、８０００rpmで遠心分離により沈殿させた。該細胞を、沈殿細胞のｇあたり５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２に再懸濁した。リゾチームを０.１ｍｇ/ｍｌの終濃度で添加し、該細胞を、３０℃、３０分間インキュベーションした。次いで、該細胞を、急速に凍結させて溶かし、ＤＮアーゼ１を１０μg／ｍｌの濃度で添加した。３７℃、３０分間のインキュベーション後、該含有体を、１２０００rpm、３０分間の遠心分離によって単離し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を用いて２回洗浄した。
【０１５１】
該タンパク質沈殿物を洗浄し、２％のサルコシル（sarkosyl）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８.０）に完全に溶解し、次いで、該混合物にＣｕＳＯ4を２０ｕＭの濃度に達するまで添加した。該混合物を、８−１０時間撹拌し、空気酸化下にジスルフィド結合を形成させることにより該タンパク質を再生した。
【０１５２】
分光学的特徴付与
概要：タンパク質構造を円偏光二色性（ＣＤ）分光法により決定した。試験したｈＧ‐ＣＤＦおよびＧＰＡタンパク質に対するＣＤ分光分析は、公表されているmet ｈＧ−ＣＳＦのスペクトルと各々ほぼ同一であった。これらのスペクトルは、ＧＰＡタンパク質とmet ｈＧ−ＣＳＦに対し、高度に類似した２次元構造および３次元折りたたみを示すものであった。温度安定性を、ヘリカルタンパク質構造に対する判別に有用な波長２２２nmでのＣＤシグナルの温度依存性をモニターすることによって評価した。該タンパク質の温度安定性を、met ｈＧ−ＣＳＦよりも約１０℃以上の安定性を有するコア４およびmet ｈＧ−ＣＳＦとほぼ同様の温度安定性を有するコア３およびコア４ｖに関して図１３に示してある。以前に発表されたＰＤＡ設計タンパク質の場合と同様に、安定性の増加の由来は、側鎖の親水性のくぼみとパッキング相互作用との間の改善されたバランスによるものであるようであった。コア変異位置の幾つかを野性型に戻すことによって誘導した別の３つのＧＰＡタンパク質（sm0, fm3およびfm4）の温度安定性を図３に示した。
【０１５３】
分光学的特徴付け
図１６に示した吸光度を用いて、該タンパク質の濃度を２８０nm波長でＵＶ検出器により決定した。ＣＤスペクトルを、ペルチエ(Peltier)温度コントロールユニット を備えたAviv202DS分光器で測定した。楕円率を、(＋)１０‐樟脳硫酸によって計算した。温度推移曲線を、１０mMのＮａＯＡｃ緩衝液中、5秒の平均時間および３分間の平衡で、２２２nmの波長で記録した。各タンパク質の溶解温度（Tm）を、温度に対する２２２nmでの楕円率の微分曲線から誘導した。これらのＴｍ値は、使用した濃度で（〜0.1mg／ml）、同じタンパク質に対して１°以内で再現性があった。温度変性曲線を図１３に示した。コア４とコア４ｖおよびコア３およびそれらから誘導した３つのタンパク質（sm0, fm3およびfm4）に対するＴｍ値のカーブを、図１６に示した。
【０１５４】
インビトロ生物学的活性
概要：図１４は、met ｈＧ−ＣＳＦおよび３つのＧＰＡタンパク質に対する用量作用曲線を示す。マウス白血球を、ヒトＧ−ＣＳＦ受容体に遺伝子導入し、白血球増殖をＧ−ＣＳＦ受容体によるＧ−ＣＳＦシグナル活性に依存性とした。白血球増殖を、ＥＬＩＳＡによって測定した臭化ウラシルの結合（ＢｒｄＵ）によって測定した。ＧＰＡタンパク質の顆粒球生成活性を、タンパク質濃度の関数として増殖細胞を定量して測定した。また、２つのｈＧ−ＣＳＦ試料、一方は明細書中に記載したような方法で得たもの、もう一方はＲ＆Ｄシステムズから市販されているｈＧ−ＣＳＦ、も測した。用量作用曲線は、met ｈＧ−ＣＳＦの約２倍の効力を示したコア４を除いて、全てのタンパク質について非常に類似していた。図１５は、met ｈＧ−ＣＳＦ対照試料の典型的な９６ウェルプレートのＥＬＩＳＡの外観を示す。用量作用アッセイ(８回反復)の統計学的分析により、コア４はその他のＧＰＡタンパク質およびmet ｈＧ−ＣＳＦよりも高度に有意に効力が強かった。該効果の原因は明らかでなく、受容体に対する親和性の増加または細胞培養アッセイ条件におけるコア４の安定性の増加または組み合わせであろう。
【０１５５】
細胞培養
増殖試験で使用した細胞はヒトクラス１Ｇ−ＣＳＦ受容体をコードした遺伝子で安定にトランスフェクションしたＢa/Ｆ３(murine lymphoid)である。これらの細胞を、５％ＣＯ2、３７℃、高湿度RPM1 medium 1640(Gibco-BRL)中で維持した。それらを、２-３日毎に新しい培地で１０倍希釈し継代した。
【０１５６】
細胞増殖アッセイ
Ｇ−ＣＳＦに応答した細胞増殖を、製造者による説明書に従ってＢｒｄＵ特異的ＥＬＩＳＡによって定量した5‐ブロモ−2'‐デオキシウリジン(ＢｒｄＵ)結合体によって検出した。簡単に言うと、１×１０５〜１×１０６Ｂａ/Ｆ３細胞／ｍｌを、Ｇ−ＣＳＦ量（１×１０２pg／ml〜１×１０５pg／ml）を変えて、１０μlのＢｒｄＵの添加前に４２時間インキュベーションした。さらに２２時間インキュベーションした後、該細胞を分解し、FixDenat（Baehringer Manheim）を用いてＤＮＡを変性した。次いで、ＤＮＡへのＢｒｄＵの結合を、ＢｒｄＵに対するペルオキシダーゼ・コンジュゲートモノクローナル抗体を利用するＥＬＩＳＡを用いて定量した。ペルオキシダーゼ活性を、BioRad Model 550マイクロタイターリーダーによって４５０nmで測定した。通常、各試験は、４プレートに広げた８回の反復を含む。データをKaleidagraph(Synergy Software)およびStatistica(Statsoft)によって分析した。
【０１５７】
貯蔵安定性
コア４に関する貯蔵安定性を、Neupogenの市販剤で使用したものと組成が同一の溶液条件下で３７℃および５０℃の両温度でインキュベーションして評価した。凝集がＧ−ＣＳＦの不活性化の主な機構であるので、加速分解をサイズ排除クロマトグラフィーによる単量体タンパク質の消失を観察することにより追跡した。至適化した配合条件であっても、コア４は、met ｈＧ−ＣＳＦ以上にさらに有意に安定であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はヒトＧ−ＣＳＦの核酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を描出する。
【図２】  図２は各ＧＰＡセットの可変残基を描出する。
【図３】  図３は幾つかの好適なＧＰＡ配列を描出する。第１行目（配列番号１０）はｈＧ−ＣＳＦ配列である。変化を記していない配列はｈＧ−ＣＳＦ配列と同じままである。第２行目（配列番号３）はＧＰＡタンパク質、ｂｎｄｒｙ４ ２であり、可変境界残基をもつ；２４の異なる位置が変化可能であった。第３行目（配列番号４）はＧＰＡタンパク質、ｂｎｄｒｙ４ コア４であり、可変境界残基をもつ；これは２４の異なる境界位置を利用するが、開始鋳型として設計したコア４の最適配列を用いた。第４行目（配列番号５）はＧＰＡタンパク質、ｂｎｄｒｙ４ ＡＤであり、可変境界残基を有する；しかし、境界残基は外側の２つのヘリックス（ＡとＤ；１４の可変残基位置）上で選択したが、その理由は当初の計算が、ヘリックス傾向の最も顕著な変化がこれらの位置での修飾から生じること、；ヘリックス傾向の改善は安定性を改善させる可能性があることを示唆したからである。第５行目（配列番号６）はＧＰＡタンパク質、ｂｎｄｒｙ４ ＡＤ コア４であり、１４の可変境界残基をもつ；開始鋳型として設計したコア４の最適配列を再度使用した。第６行目（配列番号７）はＧＰＡタンパク質、コア４であり、２６の異なる可変コア位置を利用した。第７行目（配列番号８）はＧＰＡタンパク質、コア４ Ｖ１５３Ａであり、２５の可変コア位置を利用した。第８行目（配列番号９）はＧＰＡタンパク質、コア３であり、３４のコア可変位置を有していた。
【図４】  図４はコア４ＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。例えば、１７位置では、ｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸はシステインであり；ＧＰＡタンパク質では、トップ１０００配列の７３.６％がこの位置がロイシンであり、該配列の２２.９％ではイソロイシンであった。
【図５】  図５はコア４ｖＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。例えば、１７位置では、ｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸はシステインであり；ＧＰＡタンパク質では、トップ１０００配列の６９.７％がこの位置がロイシンであり、該配列の５.１％ではバリンであり、そして該配列の２５.１％ではイソロイシンであった。
【図６】  図６はコア３ＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。
【図７】  図７はｂｎｄｒｙ４ ２ＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。
【図８】  図８はｂｎｄｒｙ４ コア４ＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。
【図９】  図９はｂｎｄｒｙ４ ＡＤ ＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての出現数を最終列に示す。
【図１０】  図１０はｂｎｄｒｙ４ ＡＤ コア４ＧＰＡ配列のモンテカルロ分析を描出する。左側にｈＧ−ＣＳＦ配列を示す；位置番号は第２列に示し、基底状態の配列は第３列に示し、トップ１０００のモンテカルロ配列に見出されるアミノ酸すべての発現数は最終列に示す。
【図１１】  図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは３種のＧＰＡタンパク質に対する遺伝子配列を描出する；図１１Ａはコア３ＧＰＡタンパク質、図１１Ｂはコア４ＧＰＡタンパク質、そして図１１Ｃはコア４ｖＧＰＡタンパク質のものである。
【図１２】  図１２は完全長遺伝子と可能なすべての変異体のＰＣＲによる合成を描出する。完全長遺伝子に対応するオーバーラップオリゴヌクレオチド（黒棒、工程１）を合成し、加熱し、アニーリングする。Ｐｆｕ・ＤＮＡポリメラーゼを、アニーリングしたオリゴヌクレオチドに加えてＤＮＡの５'＠３'合成に至らしめ（工程２）、より長鎖のＤＮＡフラグメントを生成させる（工程３）。加熱とアニーリングの繰返しサイクル（工程４）により一部完全長分子を含む長鎖ＤＮＡの生成に至らしめる。これらは完全長遺伝子の末端に対応するプライマー（矢印）を用い、２度目のＰＣＲにより選択することができる（工程５）。
【図１３】  図１３は円二色性（ＣＤ）分光法による metｈＧ−ＣＳＦおよび数種のＧＰＡタンパク質の熱安定性を描出する。ＣＤはタンパク質の二次構造含量を直接測定し、温度または化学的変性に応答して構造が喪失していくのを追跡することができる。図１３は metｈＧ−ＣＳＦに比べてコア４の熱安定性が上昇していることを示す。
【図１４】  図１４は metｈＧ−ＣＳＦおよび３種のＧＰＡタンパク質に応答する細胞増殖を描出する。ｈＧ−ＣＳＦレセプターを発現するＢａＦ／３細胞の細胞増殖を、ＢrdＵ取込みによりモニターし、タンパク質濃度に対しプロットして示す。ＢrdＵ取込みは蛍光ＥＬＩＳＡにより評価する。図は metｈＧ−ＣＳＦに比較したコア４の生物活性の増大を示す。
【図１５】  図１５は metｈＧ−ＣＳＦとコア４の貯蔵安定性の動力学をサイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣによりモニターして描出する。この２種のタンパク質は５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、０.００４％トゥイーン−８０中、ｐＨ４.０で培養し、５０℃に保存した。タンパク質濃度は３００μｇ／ｍｌであった。単量体タンパク質はそのままと考えられた。
【図１６】  図１６はｈＧ−ＣＳＦおよび本発明新規ＧＰＡタンパク質の一部についての融解温度（Ｔｍ）および吸光係数を描出する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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