(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号Ｉ−２５８２でＣＮＣＭに寄託されているハイブリドーマによって産生される免疫グロブリンＣＤ２８．３の重鎖と軽鎖のＣＤＲの全てを少なくとも含み、前記ＣＤＲが以下の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列番号２の２９〜３２残基のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２の４７〜６３残基のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２の９６〜１０８残基のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２の１６６〜１７４残基のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２の１８６〜１９２残基のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２の２２５〜２３１残基のアミノ酸配列
のアミノ酸配列であることを特徴とする、ＣＤ２８レセプターに特異的に結合でき、ＣＤ２８／Ｂ７相互作用を阻害できるタンパク質。
【請求項２】
ａ）  受託番号Ｉ−２５８２でＣＮＣＭに寄託されているハイブリドーマによって産生される抗体ＣＤ２８．３；
ｂ）  抗体ＣＤ２８．３のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２又はｓｃＦｖフラグメント；
ｃ）  ＣＤ２８．３の可変領域から得られるキメラ又はヒト化抗体；
ｄ）  抗体ｂ）のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２又はｓｃＦｖフラグメント；
ｅ）  フラグメントｂ）又はｄ）及び異種ポリペプチドからなる組換えタンパク質
から選択される請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１及び２のいずれかひとつに記載のタンパク質をエンコードする核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項５】
受託番号Ｉ−２７６２でＣＮＣＭに寄託されているＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに含まれるプラスミド。
【請求項６】
請求項１又は２のいずれか１つに記載のタンパク質を発現するハイブリドーマ。
【請求項７】
受託番号Ｉ−２５８２でＣＮＣＭに寄託されている、請求項６に記載のハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項１又は２のいずれか１つに記載のタンパク質を発現する形質転換された細胞。
【請求項９】
請求項３に記載の核酸分子で形質転換された細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項６若しくは７に記載の少なくともひとつのハイブリドーマ又は請求項８若しくは９に記載の少なくともひとつの細胞を培養し、該培養物からタンパク質を回収することを特徴とする、請求項１又は２のいずれかひとつに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１１】
医薬品を得るための請求項１又は２のいずれか１つに記載のタンパク質の使用。
【請求項１２】
タンパク質がＣＤ２８レセプター−結合部位を１つ有し、医薬品がＣＤ２８レセプターを介してＴ細胞の活性化を選択的に阻害する免疫抑制剤であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
医薬品が、移植拒絶、移植片−対−宿主疾患、Ｔ−リンパ球−媒介自己免疫疾患、アレルギー現象及び慢性炎症性疾患から選択される病状の治療用であることを特徴とする、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、CD28リンパ球レセプターに対する抗体とそのフラグメント、及び特にT細胞活性化制御に関連したその治療用途に関する。
【０００２】
T細胞の異常活性化は、多くの自己免疫疾患の病因、また生長するように移植された臓器に対して免疫反応を引き起こす移植拒絶現象に関わっている。
Tリンパ球の活性化は、クラスII主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と結合し、抗原提示細胞(APC)によって提示された抗原のTレセプター(TCR)による認識で誘導される活性化シグナルを要する。しかし、この活性化は、他の共刺激系も活性化されると、T細胞の増殖及び特異的な免疫調節サイトカイン(例えばインターロイキン2、ガンマインターフェロン又はインターロイキン4)の分泌のみを引き起こす。
【０００３】
Tリンパ球の活性化を制御する最も重要な系のひとつは、分子系B7/CD28/CTLA4である。この系は、例えば移植拒絶の機序に本質的な役割を果たしている[Woodwardら、Transplantation, 66, 14-20, (1998)]。APCによって担持される分子B7.1 (CD80)及びB7.2 (CD86)は、 CD28レセプター、またTリンパ球のCTLA4レセプターを活性化できる。CD28の活性化は、細胞を刺激する陽性シグナルをTリンパ球に送る;他方、CTLA4の活性化は、無-反応(アネルギー)をもたらす陰性シグナルを送る[FALLARINOら、J. Exp. Med., 188, 205-210, (1998)]。
潜伏Tリンパ球は、大量のCD28を発現し、CTLA4をほとんど発現しない。APCとTリンパ球とに最初の認識接触がある際には、細胞を活性化するCD28/B7相互作用が好まれる。CTLA4の膜発現増加によって、活性化の開始からわずか数時間後に、B7に対する親和性が、CD28の5〜10倍となり、B7/CD28相互作用が、B7/CTLA4相互作用のためにシフトする。
【０００４】
現在、サイクロスポリンは、特に臓器移植の関連で主にTリンパ球活性化を阻害するために用いられている。しかし、この医薬品の有効性にもかかわらず、それは絶対的な保護を付えない。さらに、それはカルシウム-依存性細胞の活性化経路を全て阻害することによって作用し、このために厳密にはTリンパ球に特異的でない生物活性を有し、相当数の副作用をもたらす。したがって、所定の作用法と大きな特異性を有する新規な免疫抑制剤を開発することが望ましい。
CD28/B7相互作用の特異的な阻害を介して完全なCTLA4/B7対からなるアンタゴニスト系を残すので、CD28によってT細胞に与えられるアゴニストシグナルの選択的阻害は、Tリンパ球活性化を妨げられるものと仮定される。CD28/B7相互作用のこのような特異的な阻害は、CD28に対する抗体を用いて生ずることができる。
【０００５】
B7へのCD28の結合を妨げることのできる抗-CD28抗体は、公知である。しかし、それらは、二価の天然型で用られる際、このレセプターとの結合を介して二量体を生じ、CD28の活性化を生じるという欠点を有する。しかし、これらの抗体由来の一価のフラグメントは、それを活性化せずにCD28レセプターを阻害することができる[DAMLEら、J. Immunol. 140, 1753-1761, (1988); NUNESら、Int. Immunol., 5, 311-315 (1993); PAGESら、J. Biol. Chem., 271, 9403, (1996)]。
したがって、抗-CD28抗体由来のFabフラグメントは、ミエリンの投与又は冒されている動物由来のT細胞の転移によってマウスに誘導される実験的な自己免疫脳炎の臨床的な症状を抑制できることが報告されている[PERRINら、J. Immunol. 163, 1704-1710, (1999)]。
【０００６】
抗-CD28抗体由来の一価のFab又はscFvフラグメントを用い、CD28/B7相互作用の特異的阻害を介してTリンパ球の活性化を妨げることのできる可能性がある。
Fabフラグメントは、免疫グロブリン分子に対するパパインの作用から生じ、各々が軽鎖と最初の半分の重鎖を含む; scFvフラグメントは、可変リンカーを介して互いに結合される抗体の重鎖と軽鎖の可変部分からなり[CLACKSONら、Nature, 352, 624-628, (1991)]、この結果、単鎖タンパク質を形成する。
これらの一価フラグメントは、しばしば天然の抗体よりも抗原に親和性を示さず、診断又は治療上の用途で用いるためのその可能性を制限し得る。
【０００７】
本発明者らは、CD28抗原を認識する種々の抗体から、その一価フラグメントが抗原に十分な親和性を示し、インビトロ又はインビボで用いてCD28レセプターを活性化することなくこのレセプターを阻害できる、CD28/B7相互作用を阻害しうる抗体の選択に成功している。
CD28.3と称されるこの抗体は、番号I-2582でCNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15)に2000年11月28日にブダペスト条約にしたがって寄託されたハイブリドーマによって生産される。
【０００８】
この発明の対象は、免疫グロブリンCD28.3の重鎖と軽鎖のCDRを少なくとも含むことを特徴とする、CD28リンパ球のレセプターに特異的に結合でき、CD28/B7相互作用を阻害できるタンパク質である。
CDR(相補性決定領域)は、抗原認識特異性に関わる免疫グロブリンの可変領域の部分である。
【０００９】
したがって、本発明によるタンパク質には、特に
a)  ハイブリドーマCNCM I-2582によって産生される抗体CD28.3;
b)  抗体CD28.3のFv、Fab、Fab'2 又はscFvフラグメント;
c)  CD28.3の可変領域から得られるキメラ又はヒト化抗体;
d)  抗体CD28.3のCDRと一価の Fv、FabもしくはscFvフラグメント、又は二価のFab'2フラグメントからなる上記の抗体b)のフラグメント;
e)  フラグメントb) 又はd)及び異種ポリペプチドからなる組換えタンパク質
が包含される。
【００１０】
それらは、例えば以下であってもよい：
-  scFv フラグメントの二価又は多価誘導体、例えば2又は3個のscFvフラグメントの結合から生じる「ジアボディ(diabodies)」又は「トリアボディ(triabodies)」;
-  抗体CD28.3のCDRからなる少なくともひとつの抗体フラグメントを、特異性の異なる抗体のCDRからなる少なくともひとつの抗体フラグメントと組み合わせているタンパク質; 例として、二重特異性免疫グロブリン、CD28.3 のCDRを含むFv又はFabフラグメントの特異性の異なる抗体のFv又はFabフラグメントとの接合体、及びCD28.3 のCDRを含むscFvフラグメントの特異性の異なる抗体のFv又はFabフラグメントとの結合から生じる「二重特異性ジアボディ」が挙げられる;
-  抗体CD28.3のCDRからなる少なくともひとつの抗体フラグメントを、薬理活性を有する分子(例えば毒素)又はエフェクター特性を有する分子(例えばFcフラグメント)と組み合わせているタンパク質;
【００１１】
-  抗体CD28.3のCDRからなる少なくともひとつの抗体フラグメントを、インビボでの投与時にその血漿半減期を延長しうる分子と組み合わせているタンパク質; 例えば該抗体フラグメントを、融合ポリペプチドの分子量に対し十分な分子量の水溶性ポリペプチドと組み合わせ、腎臓ろ過の閾値より大きくなるように得ることができる。この場合、Fcフラグメントと異なって、二量体のように結合できず、望ましくない副作用を生じがちな自身のエフェクター活性を有しないポリペプチドが、選択されるであろう。これらの性質を有するポリペプチドは、抗-CD28抗体由来のscFvフラグメントとの融合タンパク質を製造するために、水溶性血清タンパク質、つまり、特に血清アルブミン、ハプトグロブリン、ITIH2 (インター-α(グロブリン)阻害剤、H2ポリペプチド)、トランスフェリン、CBG (コルチコステロイド結合グロブリン)、α1-抗トリプシン、ITIH4 (インター-α(グロブリン)阻害剤、H4ポリペプチド)、 AACT (α-1-抗キモトリプシン)、TBG (チロキシン結合グロブリン)、フィブリノーゲン及びプロトロンビンから有利に得ることができる。また、本発明によるタンパク質を、ポリオール、例えば米国特許4,179,337に記載されるようなポリエチレングリコールと接合することができる。
【００１２】
本発明によるタンパク質の例を、図1に示す。これは、抗体CD28.3由来のscFvフラグメントを示す。抗体CD28.3のCDRの配列は、図1で示す配列中、囲んでいる。
このscFvフラグメントをエンコードするヌクレオチド配列は、番号SEQ ID No. 1で別紙の配列リストに示しており、対応するペプチド配列は、番号SEQ ID No. 2で示している。
本発明によるFv、Fab又はFab'2フラグメントは、抗体CD28.3から酵素消化の従来技術によって得ることができる。
【００１３】
α1-抗トリプシンの53〜425アミノ酸をエンコードするポリヌクレオチドに融合したCD28.3のscFvフラグメントをエンコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを、番号I-2762でCNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15)に2001年12月11日にブダペスト条約の下で寄託した。
本発明によるタンパク質、例えばキメラ又は組換え抗体、scFvフラグメント及びその誘導体などは、従来の遺伝子工学技術、例えば SAMBROOKら [MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]によって記載される技術によって得ることができる。
【００１４】
抗-CD28.3抗体の可変領域をエンコードするポリヌクレオチドは、例えばハイブリドーマCD28.3のcDNAライブラリー又はプラスミドCNCM I-2762由来の可変領域をクローニングして得ることができる。また、それらは、該可変領域のヌクレオチド配列に基づいて、核酸合成によって、完全に又は部分的に調製することができる。例えば、CD28.3のCDRをエンコードするポリヌクレオチドを合成し、それらを別の抗体、特にヒト由来の抗体のフレームワーク領域(FR)に、CDRグラフティングのそれ自体公知の技術、例えばROUTLEDGEら ["Reshaping antibodies for therapy", in Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, 13-44, Academic Titles, Nottingham, England (1993)]又はROGUSKAら [Protein Engineering, 9(10), 895-904, (1996)]によって記載される技術を用いて組み込むことができる。
【００１５】
本発明の対象は、抗体CD28.3のCDRからなる本発明によるタンパク質をエンコードするいずれかの核酸分子、また該核酸分子からなるいずれかの組換えベクター、特にいずれかの発現ベクターである。
また、本発明の対象は、抗体CD28.3のCDRからなる本発明によるタンパク質を発現するいずれかの細胞である。これは、特にハイブリドーマCNCM I-2582、またこの発明による核酸分子で形質転換された宿主細胞を包含する。
【００１６】
本発明による核酸分子は、本発明によるタンパク質をエンコードする配列に加えて、該タンパク質を分泌できるシグナルペプチドをエンコードする配列を有利に含んでいてもよい; それらは、該タンパク質の検出、及び/又は精製の容易化のため、1以上のマーカーペプチドをエンコードする1以上の配列を含んでいてもよい。
本発明による発現ベクターは、選択された宿主細胞で活性な転写-及び翻訳-制御要素と結合した本発明によるタンパク質をエンコードする少なくともひとつの核酸配列を含む。本発明による発現ベクターを構築するのに使用できるベクターは、それ自体公知であり、特に用いられる宿主細胞の機能として選択されるであろう。
【００１７】
本発明に関連して使用できる宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であってもよい。使用できる真核細胞には、特に植物細胞、酵母、例えばサッカロミセス由来の細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ(Drosophila)又はヨトウ(Spodoptera)の細胞、及び哺乳動物細胞、例えばHeLa、CHO、3T3、C127、BHK、COSなどの細胞が挙げられる。
本発明による発現ベクターの構築と宿主細胞の形質転換は、分子生物学の従来技術によって行うことができる。
この発明の対象は、本発明による少なくともひとつの細胞を培養し、該培養物から本発明によるタンパク質を回収することからなることを特徴とする、本発明によるタンパク質の製造方法である。
【００１８】
タンパク質が分泌されれば、培養培地から直接回収することができる; そうでなければ、あらかじめ細胞溶解が行われるであろう。
次いで、タンパク質を、当業者にそれ自体公知の従来法、例えば分画沈澱、特に硫酸アンモニウムでの沈澱、電気泳動、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィーなどによって、培養培地又は細胞溶解物から精製することができる。
本発明によるタンパク質をインビトロで用いて、抗原性、ウイルス性、同種異系又は異種性の刺激に応じたTリンパ球の増殖応答又は分化をインビトロで研究することができる。また、それらを用いて、インビトロで患者から採取したTリンパ球の分化、例えばインビボで後に再投与が意図された抗原又はアロ抗原に対する耐性の誘導を誘導できる。
【００１９】
また、それらを用いて、医薬品又は診断試薬を得てもよい。
二価、つまりCD28レセプター-結合部位を2個有し、そのためにこのレセプターの二量体化を誘導できる本発明によるタンパク質は、このCD28レセプターの活性化、つまり抗原に対するTリンパ球反応の増強が望まれる全ての状況で使用することができる。
一価、つまりCD28レセプター結合部位を1個有する本発明によるタンパク質は、免疫抑制を誘導するために、活性化することなくこのレセプターを選択的に阻害することが望まれる全ての状況で用いることができる。
【００２０】
抗-CD28 抗体由来の一価のフラグメントからなる本発明によるタンパク質を特に用いて、CD28レセプターに関わるT細胞の活性化現象を選択的に阻害し、サイクロスポリンのような既知の免疫抑制剤の欠点を有しない免疫抑制医薬品を得ることができる。
本発明によるタンパク質を用いるCD28の選択的阻害によるT免疫抑制は、全てのTリンパ球-依存性病状に適用性を有する。
これらは、本質的に、移植拒絶、移植片-対-宿主疾患、Tリンパ球-媒介自己免疫疾患、例えばI型糖尿病又多発硬化症、及びアレルギー性の現象、また病原性剤での感染後の慢性炎症性疾患(特にハンセン病、結核症、リーシュマニア症、リステリア病など)の病因に関わるIV型過敏症である。
【００２１】
本発明は、本発明による抗体の製造及び使用の非制限的な例に言及する以下のさらなる記載からより明らかに理解されるであろう。
実施例1: 一価フラグメントを生じる抗体の選択、CD28.3由来一価Fabフラグメントの性質
幾つかの抗-CD28抗体(CD28.1、CD28.2、CD28.3、CD28.4、CD28.5及びCD28.6)の性質のいくつかは、NUNESら[Int. Immunol., 5, 311, (1993)]によって文献に記載されている。一般には入手できないこれらの種々の抗体は、Daniel OLIVE (INSERM)の研究室によって提供された。これらの種々の抗体の一価のFabフラグメントの抗原結合性を比較した。
【００２２】
これらの各抗体の5 mgのFabフラグメントは、24時間37℃でパパインで消化(パパイン/抗体モル比=1/100)し、0.03Mヨードアセトアミドで酵素を不活化し、PBSに透析して、ヨードアセトアミドを除くことにより調製した。
1) CD28+ Jurkat T 細胞へのFabフラグメントの結合:
100μl中100,000個のCD28+ Jurkat細胞を、抗-CD28抗体又はそのFabフラグメントの濃度を増しながら、4℃で30分PBS-1% BSA-0.1% NaN3でインキュベートする。洗浄後、細胞をFITC-接合抗-マウスIgG ヤギ抗体と同様にインキュベートし、洗浄し、サイトフルオロメトリーで分析する。
【００２３】
結果を図2に示す:
【式１】
0004066166.tif 000002
【００２４】
これらの結果は、Fabフラグメントのうち、CD28.3由来のフラグメントのみがCD28+ Jurkat細胞に10μg/ml未満の濃度で有意に結合できることを示している。
【００２５】
2) B7-1分子を発現するトランスフェクトしたマウスのL細胞に対するCD28+ Jurkat T 細胞の付着に対するFabフラグメントの作用:
ヒトB7.1でトランスフェクトした105個の付着性のLTK- 又はLB7+ 細胞 (マウス線維芽細胞)[PAGESら、J. Biol. Chem., 271, 9403, (1996)]を予め24時間播種したマイクロタイタープレートで、51Crでラベルした4×105個のヒトT細胞(Jurkat, CD28-陽性)を2時間インキュベートする。これらのインキュベーションを、Ca2+ 又はMg2+のないPBS緩衝液で種々の希釈液に希釈した抗体CD28.1〜CD28.6由来のFabフラグメント又は抗体CD28.3の存在下で行う。ベータカウンター(PACKARD TOPCOUNT)で残留放射活性を読みとって、洗浄後の付着細胞を定量する。
【００２６】
結果を図3に示す:
【式２】
0004066166.tif 000003
【００２７】
これらの結果は、CD28.3由来のFabフラグメントが、CD28/B7相互作用の阻害にもっとも有効であることを示している。それらは、3μg/mlの濃度で付着の90％を阻害し、全抗体 CD28.3の阻害に匹敵する有効性を有するが、この濃度では、他の抗体由来のFabフラグメントは、付着阻害が50％未満である。
3)  混合されたリンパ球反応での増殖に対するFabフラグメントの作用:
105個の末梢血液単核細胞(PBMC)を、抗体CD28.1〜CD28.6又はこれらの抗体由来のFabフラグメントの種々の濃度の存在下で、35 Gyで照射した105個の同種異系の単核細胞と混合する。これらの培養物における増殖反応を、16時間(3H)チミジンを導入することにより3日後に評価する。
【００２８】
結果を図4に示す:
【式３】
0004066166.tif 000004
【００２９】
これらの結果は、CD28.3又はCD28.6由来のFabフラグメントが、単核細胞の増殖阻害にもっとも有効であることを示している。同時に試験された全抗体CD28.1〜CD28.6は阻害作用を有さず、実際にCD28に対する刺激作用によって増殖を刺激する。
【００３０】
スーパー抗原によって誘導される増殖に対するCD28.3由来Fabフラグメントの作用
この実験のため、抗体の不在下又は抗-B7-1 (1μg/ml)、抗-B7-2 (0.5μg/ml)、CTLA4Ig (10μg/ml)又はCD28.3 由来のFabフラグメント(10μg/ml)の存在下でVβ2+ T細胞を特異的に刺激する50 ng/mlの毒性ショック症状毒素-1 (TSST-1)の存在下、応答個体のCD4+ T細胞を照射した同質遺伝子性PBMCと混合した。
これらの培養物における増殖反応を、16時間(3H)チミジンを導入することにより1、3、6及び8日後に評価する。
【００３１】
結果を図5に示す:
【式４】
0004066166.tif 000005
【００３２】
TSST-1は、かなりCD4+ T細胞の増殖を誘導する。抗-B7、CTLA4Ig又はCD28.3のFabフラグメントの存在下で、この増殖の70%阻害が、6日後に認められる。
【００３３】
サイトカインの産生に対するCD28.3由来Fabフラグメントの作用
CD28.3 由来のFabフラグメントがインビトロで免疫偏向を誘導しうるかどうかを決定するために、混合されたリンパ球反応(ドナーA由来PBMC/ドナーB由来照射PBMC)を、CD28.3由来のFabフラグメントの存在下で行なった。ドナー由来の105個の末梢血液単核細胞を、35 Gy で照射した105個の同種異系単核細胞と混合し、抗体CD28.3由来Fab 10 μg/ml の存在又は不在下で5日間培養する。
【００３４】
応答個体の細胞のRNAを抽出し、TaqMan (Perkin Elmer)を用いてHPRTの量に関連した転写物量の定量測定によりサイトカインmRNAの量を評価した。
CD28.3由来Fabフラグメントの存在下で、γIFN及びIL2の産生低下及びIL10の産生増加が認められる。免疫反応のこの偏向は、Th2-型反応に対する配向を示唆している。CTLA4 (CD28のみの阻害に介在すると考えられる)の関与がTh1-型反応をもたらすことが報告されている限りでは、この結果は意外である。
【００３５】
ヒトT細胞による、抗体CD28.3ならびにそれ由来のFabフラグメントのインビトロプロセシング
ヒトT細胞における抗体CD28.3のFabフラグメントの潜在的な内在化を、全抗体CD28.3と比較して研究した。
Jurkat T細胞を、100μg/mlの抗体CD28.3とともに37℃又は0℃で培養培地でインキュベートした。種々の時間で、0.1%ウシ血清アルブミンとNaN3を含む冷PBS緩衝液で細胞を洗浄し、膜運動性を阻害した。結合した抗体を、フルオレセイン-ラベルしたヤギ抗-マウス二次抗体を用いて顕在化した。細胞をMOVIOLに載せ、共焦顕微鏡で分析した。
【００３６】
この結果、Jurkat T 細胞に結合する全CD28.3抗体が捕捉され、37℃で細胞表面から消失するが、0℃では消失しないことが認められる。他方、Fabフラグメントは細胞表面に付着したままである。これは、二価抗体 CD28.3の付着がCD28の二量体化をもたらし、細胞への侵入を生じるが、この二量体化を誘導しない一価のFabフラグメントは表面に残ったままであることを示している。
【００３７】
実施例2: 抗体CD28.3由来のscFvフラグメントの性質
図1は、抗体CD28.3由来scFvフラグメントのポリペプチド配列を示す。重鎖と軽鎖の可変フラグメントに相当するこの配列の部分は、大文字で示している。また、軽鎖の可変フラグメントに相当する配列に、下線を付している。リンカーの配列は、斜体で示している。重鎖と軽鎖のCDR配列は、囲んでいる。
このscFvフラグメントをエンコードするヌクレオチド配列は、番号 SEQ ID No.1で別紙の配列リストに示している。
【００３８】
このscFvフラグメントをエンコードするcDNAを、ベクターpIG6 (Biochemisches Institut, University of Zurich)に挿入した。このベクターは、特にアンピシリン耐性マーカー及び誘導性lacプロモーターの制御下にあるompAシグナルペプチドをエンコードする配列、配列(1-文字コード) DYKDのマーカーペプチドをエンコードする配列、c-myc マーカーペプチドをエンコードする配列及びポリヒスチジン-5 マーカーをエンコードする配列からなる発現カセットを含む。
上記のscFvフラグメントをエンコードするcDNAを、pIG6のEcoRI〜EcoRVの部位間、ペプチドDYKDをエンコードする配列の下流ならびにc-mycマーカーをエンコードする配列の上流に導入した。
得られた構築物を、pIg6-28.3と称する。
【００３９】
原核細胞での生産
ベクターpIg6-28.3を用いて、E.coli JM83 細胞を形質転換した。細胞を、0.5のOD550まで25℃で培養する。IPTGで誘導後、scFvフラグメントをペリプラズムに可溶性形態で産生する。電気泳動し、ウエスタンブロッティングした後、約30 kDaでバンドの形態が見られる。
それを細菌のペリプラズム抽出物から精製し、50 mM Tris-Cl での浸透ショック、Ni-NTAマトリクスでのクロマトグラフィーによる不溶性物質の超遠心分離及びDEAE-セファロースでのイオン交換後に得る。
NiNTAカラムの溶出液中に存在するscFvフラグメントのCD28+ Jurkat細胞への結合は、パパインでの消化による抗体CD28.3 から得たFabフラグメントを用いて得られるものに匹敵する。
【００４０】
真核細胞での生産
ベクターpSec-28.3を用いて、Cos細胞をトランスフェクトした。細胞を37℃で3日間培養する。scFvフラグメントは、上清中に可溶性形態で生産される。この上清は、混合されたリンパ球反応を阻害する: 健康なドナー由来の105個の末梢血液単核細胞を、別の健康な同種異系ドナー由来の105個の末梢血液単核細胞と混合する。これらの培養物における増殖反応を、16時間の(3H)チミジンの導入により5日後に評価する。使用した上清の希釈物に応じたかなりの導入阻害が、認められる。対照の上清は、増殖-阻害活性を示さない。
【００４１】
実施例 3: CD28.3のscFvフラグメントからなる融合タンパク質の生産
実施例2に記載されるscFvフラグメントをエンコードするヌクレオチド配列を、配列VAAPSのヒンジペプチドを介して、アミノ酸53〜425に相当するヒトα1-抗トリプシン(GENBANK アクセス番号K01396)のcDNAの一部の5'末端に連結した。得られた配列を番号 SEQ ID No. 3で別紙の配列リストに示し、相当するポリペプチドを番号SEQ ID No. 4で示す。
【００４２】
実施例4: α1-抗トリプシンをエンコードする配列からなり、scFv フラグメントをエンコードする配列を導入できる発現ベクターの構築
原核細胞発現ベクター:
ベクターpIG6を用いた(Biochemisches Institut, University of Zurich)。このベクターは、特にアンピシリン耐性マーカー及び誘導性lacプロモーターの制御下にある ompAシグナルペプチドをエンコードする配列、配列(1-文字コード)のDYKDのマーカーペプチドをエンコードする配列、c-mycマーカーペプチドをエンコードする配列及びポリヒスチジン-5マーカーをエンコードする配列からなる発現カセットを含む。
アミノ酸53〜425に相当するヒトα1-抗トリプシンのフラグメントをエンコードするcDNAを、pIg6のEcoRI〜EcoRV部位の間、ペプチドDYKDをエンコードする配列の下流及びc-mycマーカーをエンコードする配列の上流に導入した。
得られた構築物を、pIg6-Haatと称する。
【００４３】
真核細胞発現ベクター:
ベクターpSECTagB (Invitrogen, De Schelp, The Netherlands)を用いた。このベクターは、特にアンピシリン耐性マーカー、ゼオシン耐性マーカー及びCMVプロモーターの制御下にあるIgGκ軽鎖のシグナルペプチドをエンコードする配列、c-mycマーカーペプチドをエンコードする配列及びポリヒスチジン-6マーカーをエンコードする配列からなる発現カセットを含む。
アミノ酸53〜425に相当するヒトα1-抗トリプシンのフラグメントをエンコードするcDNAを、ベクターPSEC B TagのBamHI 〜EcoRI部位の間、c-mycマーカーをエンコードする配列の上流に導入した。
得られた構築物を、pSecHaatと称する。
【００４４】
実施例5: CD28.3 scFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質をエンコードする配列を組み込む発現ベクターの構築
原核細胞発現ベクター:
上記の実施例3に記載されるCD28.3 ScFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質をエンコードするcDNAを、pIG6のEcoRI〜XhoI部位の間、ペプチドDYKDをエンコードする配列の下流及びc-mycマーカーをエンコードする配列の上流に導入した。
得られた構築物を、pIg6-28.3Haatと称する。
【００４５】
真核細胞発現ベクター:
上記実施例3に記載されるCD28.3 ScFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質をエンコードするcDNAを、ベクターPSEC B TagのBamHI〜XhoI部位の間、c-mycマーカーをエンコードする配列の上流に導入した。
得られた構築物を、pSec-28.3Haatと称する。
E.coli DH5αに保有されるこのベクターを、番号I-2762で2001年12月11日にCNCMに寄託した。
【００４６】
実施例6: 融合タンパク質の発現と精製
原核細胞で:
ベクターpIg6-28.3Haatを用い、E. coli JM83細胞を形質転換した。0.5のOD550まで、細胞を25℃で培養する。IPTGで誘導後、タンパク質がペリプラズムで可溶性形態で生産される。電気泳動及びウエスタンブロッティングの後、約74 kDaでバンドの形態が見られる。
それを、NI-NTA アフィニティクロマトグラフィーマトリクス及び/又は抗-c-myc アフィニティクロマトグラフィーマトリクスを用いて、ペリプラズム抽出物から精製することができる。また、抗-α1-抗トリプシンアフィニティカラムを用いて、それを精製することができる。
【００４７】
真核細胞で:
ベクターpSec-28.3Haatを用いて、リポフェクションによりCHO細胞をトランスフェクトした。10％ウシ胎児血清を含むMEM 培地中200μg/mlのゼオシンの存在下で、細胞を培養する。
タンパク質が、培養培地に分泌される。
電気泳動による分離、ウエスタンブロッティング及び抗-c-myc抗体での顕在化後、約80 kDaでバンドの形態が見られる。
【００４８】
実施例7: scFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質の活性についてのアッセイ
上記実施例6で得たCD28.3 scFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質の抗-CD28活性を、CD28分子又は膜上のCD28発現細胞への結合、ならびにCD28を発現しない細胞への結合の欠失によって評価した。
上記実施例6で得たCD28.3 scFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質の免疫抑制活性は、B7への付着阻害及びTリンパ球の誘導活性化阻害によって評価される。
【００４９】
これらの抗-CD28及び免疫抑制活性は、以下のアッセイを用いて測定した:
抗-CD28活性
CD28-結合パラメータのバイオセンサー測定:
組換えヒトCD28を、バイオセンサー(BIACORE)検出器で固定した。上記の実施例6に記載されるようにして得たCD28.3 scFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質を、検出器に接触させた。結合パラメータは、 KA (1/M)2.86e9; KD (M): 3.49e-10である。比較として、抗体CD28.3 のFabフラグメントについて測定されるこれらのパラメータは、KA (1/M): 9.69e8; KD (M): 1.03e-9である。したがって、抗体CD28.3 のFabフラグメントならびに融合タンパク質のCD28の親和性は、比較できる。
【００５０】
CD28の特異的な認識についてのサイトフルオロメトリーアッセイ:
105個のJurkat (Cd28+)及びU937 (CD28-)細胞を、CD28.3 scFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質の濃度を増しながら、4℃で1時間PBS-1% BSA-0.1% NaN3中でインキュベートする。洗浄後、細胞を抗-α-1-抗トリプシンウサギ抗体と、次いでFITC-接合ヤギ抗-ウサギ抗体とインキュベートし、洗浄し、サイトフルオロメトリーで分析する。Jurkat細胞の用量に応じた結合(CD28+)とU937への非結合(CD28-)細胞が、認められた。これは、CD28分子に対する融合タンパク質の特異性と、ヒト造血細胞によって発現される他の分子に対する反応性欠如を示している。
【００５１】
免疫抑制活性
CD28/B7-依存性付着アッセイ:
105個の付着性LTK- 又はLB7+ 細胞 (ヒトB7.1 [PAGESら、J. Biol. Chem., 271, 9403 (1996)]でトランスフェクトしたマウス線維芽細胞)を予め24時間播種したマイクロタイタープレートで、51Cr でラベルした4×105個のヒトT細胞(CD28-陽性Jurkat細胞)を2時間インキュベートする。これらのインキュベーションを、Ca2+ 又はMg2+のないPBS緩衝液で種々の濃度に希釈したCD28.3 scFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質の不在又は存在下で行う。ベータカウンター(PACKARD TOPCOUNT)を用いて残留放射活性を読み取ることで、洗浄後の付着細胞を定量する。CD28.3 scFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質の存在下における付着阻害が認められる。この阻害は、使用した融合タンパク質の用量に直接依存している。
【００５２】
活性化阻害:
5×104個のT細胞(CD11b細胞の涸渇したヒトポリクローナル細胞)を、1×104 個の照射OKT3 ハイブリドーマ細胞(抗-CD3)、又は同種異系のCD28- B細胞(CD28+細胞を涸渇)とともに、種々の量のCD28.3 scFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質の不在又は存在下で刺激する。これらの培養での増殖反応を、抗-CD3を用いる刺激を行ってから3日後、又は同種異系細胞を用いる刺激を行ってから7日後に、16時間の (3H)チミジンの導入により評価する。かなりの導入阻害が、CD28.3 scFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質の存在下で観察される。その阻害は、使用した融合タンパク質の用量に直接依存している。
【００５３】
混合されたリンパ球反応の阻害:
健康なドナー由来の105個の末梢血液単核細胞を、別の同種異系の健康なドナー由来の105個の末梢血液単核細胞と混合する。これらの培養における増殖反応を、16時間の(3H)チミジンの導入により5日後に評価する。かなりの導入阻害が、CD28.3 scFv/α1-抗トリプシン融合タンパク質の存在下で観察される。その阻害は、使用した融合タンパク質の用量に直接依存している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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