(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性の分析方法であって、
（１）下記のいずれかのサイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞に被験物質を接触させる第一工程、及び
（２）前記第一工程後に、前記形質転換細胞内で発現されたサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の有無又はその量を測定する第二工程
を有することを特徴とする分析方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１９６から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号５０から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号３２から１０３６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｈ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
【請求項２】
前記形質転換細胞が、サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達によって細胞生育が直接的に制御される機能を有する細胞であって、前記細胞内信号伝達の有無又はその量を、前記形質転換細胞の生育量を指標として測定することを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
前記形質転換細胞が、細胞固有のヒスチジンキナーゼ活性よりも低いヒスチジンキナーゼ活性を有するように改良された宿主細胞に下記のいずれかのサイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１９６から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号５０から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号３２から１０３６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｈ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
【請求項４】
前記形質転換細胞が、一つ以上のヒスチジンキナーゼを欠失させることにより細胞固有のヒスチジンキナーゼ活性よりも低いヒスチジンキナーゼ活性を有するように改良された宿主細胞に下記のいずれかのサイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１９６から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号５０から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号３２から１０３６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｈ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
【請求項５】
前記形質転換細胞が、サイトカイニン受容体を有さない宿主細胞に下記のいずれかのサイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１９６から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号５０から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号３２から１０３６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｈ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
【請求項６】
前記形質転換細胞が酵母であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項７】
前記形質転換細胞が出芽酵母であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項８】
異なる２種以上の被験物質のアゴニスト活性を請求項１記載の分析方法により各々分析し、各被験物質と接触した形質転換細胞について測定されたサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の有無又はその量を比較することにより得られる差異に基づき、前記物質のサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を評価することを特徴とするサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性の検定方法。
【請求項９】
異なる２種以上の被験物質のうち、少なくとも一つの物質がサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有さない物質であることを特徴とする請求項８記載の検定方法。
【請求項１０】
請求項８記載の検定方法により評価されたサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性に基づきサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有する物質を選抜することを特徴とするサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サイトカイニン受容体に対する被験物質のアゴニスト活性の分析方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
サイトカイニンは、高等植物の細胞分裂と分化に関する植物ホルモンであり、高等植物細胞の分裂の誘起、カルスや髄から茎葉への分化、葉の黄化や落葉、落果等の防止、頂芽優先の打破等の作用を示すことが知られている重要な生理活性物質である〔Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function, CRC Press (1994)〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
サイトカイニン様活性を有する物質は、植物生長調節剤、例えば、果樹であるリンゴ、ミカンなどの落果防止剤、植物の草丈を調節することによるイネ、ムギなどの倒伏防止剤、収穫後の果実の甘味増強剤などとして利用可能である。
このようなサイトカイニン様活性を有する物質を見出す方法として、被験物質を植物個体に直接散布してその生理的な変化を観察、評価する方法を用いることができる。当該方法は、植物個体に直接散布するに足る量の被験物質を準備することを必要とし、また前記植物個体の育成や被験物質散布後の植物個体の生理的変化の観察、評価に多大な時間を要する、といった問題があった。そこで、少量の被験物質で迅速にサイトカイニン様活性を有する物質を見出すための種々な方法の開発が求められていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、サイトカイニン受容体として機能するタンパク質を見出し、そして当該サイトカイニン受容体を利用することによってサイトカイニン受容体に対する被験物質のアゴニスト活性の分析が可能であること、及び、当該分析方法を使用することでサイトカイニン様活性を有する物質を少量のサンプルでかつ迅速に探索することが可能となることを見出して本発明に至った。
【０００５】
即ち、本発明は、
１．サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性の分析方法であって、
（１）下記のいずれかのサイトカイニン受容体（以下、本サイトカイニン受容体と記すこともある。）をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞に被験物質を接触させる第一工程、及び
（２）前記第一工程後に、前記形質転換細胞内で発現されたサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の有無又はその量を測定する第二工程
を有することを特徴とする分析方法（以下、本発明分析方法と記すこともある。）；
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｃ）天然型サイトカイニン受容体が有する複数の膜貫通領域のうち、その一部の膜貫通領域が欠失しているものであって、かつ膜貫通領域を少なくとも１個以上有するサイトカイニン受容体
（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１９６から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号５０から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号３２から１０３６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｇ）互いにホモな由来であるサイトカイニン受容体の細胞外領域、サイトカイニン受容体の膜貫通領域及びサイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域と、前記領域に対してヘテロな由来であるヒスチジンキナーゼのレシーバー領域とから構成されるキメラ型サイトカイニン受容体
（ｈ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
２．前記形質転換細胞が、サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達によって細胞生育が直接的に制御される機能を有する細胞であって、前記細胞内信号伝達の有無又はその量を、前記形質転換細胞の生育量を指標として測定することを特徴とする前項１記載の分析方法；
３．前記形質転換細胞が、細胞固有のヒスチジンキナーゼ活性よりも低いヒスチジンキナーゼ活性を有するように改良された宿主細胞に本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞であることを特徴とする前項１記載の分析方法；
４．前記形質転換細胞が、一つ以上のヒスチジンキナーゼを欠失させることにより細胞固有のヒスチジンキナーゼ活性よりも低いヒスチジンキナーゼ活性を有するように改良された宿主細胞に本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞であることを特徴とする前項１記載の分析方法；
５．前記形質転換細胞が、サイトカイニン受容体を有さない宿主細胞に本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞であることを特徴とする前項１記載の分析方法；
６．前記形質転換細胞が酵母であることを特徴とする前項１記載の分析方法；
７．前記形質転換細胞が出芽酵母であることを特徴とする前項１記載の分析方法；
８．異なる２種以上の被験物質のアゴニスト活性を請求項１記載の分析方法により各々分析し、各被験物質と接触した形質転換細胞について測定されたサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の有無又はその量を比較することにより得られる差異に基づき、前記物質のサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を評価することを特徴とするサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性の検定方法；
９．異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質がサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有さない物質であることを特徴とする前項８記載の検定方法；
１０．前項８記載の検定方法により評価されたサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性に基づきサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有する物質を選抜することを特徴とするサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質の探索方法；および
１１．前項１０記載の探索方法により選抜された物質を有効成分として含有することを特徴とする植物生育調節剤；
を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、詳細に本発明を説明する。
サイトカイニン受容体は、例えば、カイネチン、ゼアチン等のプリン系サイトカイニン、Ｎ−フェニル−Ｎ’−（４−ピリジル）ウレア等のウレア系サイトカイニン等のサイトカイニンに特異的に結合し、Two-Component regulatory system(又はHis to Asp phosphorelay system)と呼ばれる細胞内信号伝達メカニズムによって高等植物細胞の増殖、分化を制御する機能を有するタンパク質である。本発明で用いられるサイトカイニン受容体とは、ヒスチジンキナーゼファミリーに属しており、細胞外領域、膜貫通領域、ヒスチジンキナーゼ領域（細胞内でヒスチジンキナーゼ活性を有しかつ活性部位となるHis残基を保持する領域）及びレシーバー領域（リン酸基転移の受容部を有しかつ活性部位となるAsp残基を保持する領域）から構成されているタンパク質である。
【０００７】
サイトカイニン受容体の具体的な例としては、例えば、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体、後述する膜貫通領域一部欠失型サイトカイニン受容体、後述するキメラ型サイトカイニン受容体等を挙げることができる。ここで、「複数のアミノ酸」とは、より具体的には、２個〜約２０個程度のアミノ酸を意味し、例えば、２個〜約１０個のアミノ酸、２個〜５個のアミノ酸を一例としてあげることができる。また、「１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、欠失、置換もしくは付加される前のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を一例としてあげることもできる。
これらの「アミノ酸が欠失、置換もしくは付加」や「８０％以上の配列同一性」には、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が細胞内で受けるプロセシング、該タンパク質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異等が含まれる。
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つのタンパク質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又はタンパク質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
【０００８】
前記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×SSC（1.5M  NaCl、0.15M  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）溶液中で６５℃にてハイブリッドを形成させた後、1×SSCで室温にて洗浄するような条件等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、１×SSCで室温の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．１×SSCで室温の条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６８℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【０００９】
（本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞の作製）
本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞は、本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡ、即ち、本サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ等を、以下のようにして宿主細胞に導入・発現させることにより得ることができる。以下、該形質転換細胞の作製方法についてその一例を示す。
【００１０】
（１）ｃＤＮＡの調製
まず、例えば、J.,Sambrook, E.,F.,Frisch, T.,Maniatis著、モレキュラークローニング第 2 版（Molecular Cloning 2nd edition）記載の方法に準じて、高等植物等の植物等から全ＲＮＡを調製する。具体的には、例えば、イネ、トウモロコシ、ムギ等の単子葉植物、タバコ、ダイズ、アラビドプシス等の双子葉植物等である高等植物からその組織の一部を採取した後、当該組織を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢などにより物理的に磨砕し、(a)得られた磨砕物に、塩酸グアニジンとフェノールとを含む溶液又はSDSとフェノールとを含む溶液を添加して全RNAを得る方法、(b)前述の磨砕物にグアニジンチオシアネートを含む溶液を添加して、さらにCsClを加え遠心分離することにより全RNAを得る方法等を用いればよい。当該操作には、例えば、ISOGEN（ニッポンジーン社製）、RNeasy Total RNA Purification Kit（QIAGEN社製）などの市販のキットを用いることもできる。
【００１１】
次いで、全RNAからmRNAを調製する。例えば、セルロース又はラテックスに結合されたオリゴdT鎖とmRNAのポリA鎖とのハイブリダイゼーションを利用した方法等を用いることができる。当該操作には、例えば、mRNA Purification Kit（アマシャムファルマシア社製）、OligotexTM−dT30〈Super〉（宝酒造社製）等の市販のキットを用いることができる。
さらに、このようにして調製されたmRNA（ポリA鎖を有するmRNA）を用いてcDNAを作製する。例えば、オリゴdT鎖又はランダムプライマーをmRNAにアニールさせた後に、逆転写酵素を作用させることによりcDNAを作製すればよい。またさらに、当該cDNAに、例えば、RNaseH、DNA PolymeraseIを作用させることにより、2本鎖cDNAを作製することができる。当該操作には、SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit（クロンテック社製）、cDNA Synthesis Kit（宝酒造社製）、cDNA Synthesis Kit（アマシャムファルマシア社製）、ZAP-ｃDNA Synthesis Kit(Stratagene社製)等の市販のキットを用いることができる。
【００１２】
（２）クローニング
このように調製されたｃＤＮＡから、例えば、配列番号１又は３で示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いるポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）や、配列番号１又は３で示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡを取得することができる。
【００１３】
ＰＣＲを用いる場合には、約20bpから約40bp程度の塩基配列、例えば、配列番号１又は３で示される塩基配列の５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域からそれぞれ選択した塩基配列に基いて設計、合成したＤＮＡをプライマーセットとして用いることができる。当該プライマーセットとしては、例えば、配列番号９で示される塩基配列からなるDNAと配列番号１０で示される塩基配列からなるDNAとのセットをプライマーセットを挙げることができる。用いられるPCR反応液は、cDNA250ngにキット指定の反応液を添加することにより調製すればよい。PCR反応条件としては、使用するプライマーセットによって適宜変更することができるが、例えば、94℃で2分間保温し、次に約８℃で3分間保温した後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で4分間のサイクルを４０サイクル程度繰り返す条件や、94℃で5秒間次いで72℃で4分間の保温を1サイクルとしてこれを5から10サイクル行い、さらに、94℃で5秒間保温し、次いで70℃で4分間保温するサイクルを1サイクルとしてこれを20から40サイクル程度繰り返す条件をあげることができる。当該操作には、例えば、Takara HeraculaseTM（宝酒造社製）、Advantage cDNA PCR Kit（クロンテック社製）に含まれるＤＮＡポリメラーゼ、TAKARA Ex Taq（宝酒造社製）、PLATINUMTM PCR SUPER Mix（ライフテックオリエンタル社製）等の市販のキットを用いることができる。
【００１４】
ハイブリダイゼーション法を用いる場合には、例えばクローニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社1989年）記載の方法に準じてクローニングを行うことができる。
用いられるプローブは、配列番号１又は３で示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡ（約２００塩基〜約５００塩基程度の鎖長）を合成し、当該ＤＮＡを、例えば、Random Primed DNA Labelling Kit（ベーリンガー社製）、Random Primer DNA Labelling Kit Ver.2（宝酒造社製）、ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Ditection System（アマシャムファルマシア社製）、Megaprime DNA-labelling system（アマシャムファルマシア社製）等を用いた公知の方法に準じてラジオアイソトープ標識又は蛍光標識することにより得ることができる。ハイブリダイゼーション条件としては、例えば、ストリンジェントな条件をあげることができ、具体的には、例えば、6×SSC（0.9M NaCl、0.09Mクエン酸三ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1%(w/v) フィコール400、0.1%(w/v) ポリビニルピロリドン、0.1%BSA）、0.5%(w/v) SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNA存在下に、又は100μg/ml変性サケ精子DNAを含むDIG EASY Hyb溶液（ベーリンガーマンハイム社）中で、65℃で保温し、次いで１×SSC（0.15M NaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウム）及び0.5%SDS存在下に、室温で15分間の保温を2回行い、さらに0.1×SSC（0.015M NaCl、0.0015Mクエン酸三ナトリウム）及び0.5%SDS存在下に、68℃で30分間保温する条件をあげることができる。
シロイヌナズナのサイトカイニン受容体をコードするＤＮＡを得るためには、まずシロイヌナズナcDNAライブラリーファージ液 (約1000000pfu)を鋳型にして、TAKARA LA taqTM（宝酒造社製）を用いて、配列番号11に示されるDNAと配列番号12に示されるDNAとをプライマーセットとしてPCRを行うことによりプローブとするDNAを増幅し、これを取得すればよい。用いられるPCR反応液は、DNAライブラリー250ngにキット指定の反応液を添加することにより調製すればよい。
PCR反応条件としては、例えば、94℃で2分間保温し、次に８℃で3分間保温した後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で５分間のサイクルを40サイクル繰り返すことにより増幅を行う条件をあげることができる。
次に、増幅・取得されたDNAを鋳型にして、Megaprime DNA-labelling system（アマシャムファルマシア社製）を用いて、当該キット指定の反応液を用いることにより32Pでラベルされたプローブを作製することができる。このようにして作製されたプローブを用いて通常の方法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行い、6×SSC（0.9M NaCl、0.09Mクエン酸三ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1%(w/v) フィコール400、0.1%(w/v) ポリビニルピロリドン、0.1%BSA）、0.5%(w/v) SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNA存在下に、又は100μg/ml変性サケ精子DNAを含むDIG EASY Hyb溶液（ベーリンガーマンハイム社）中で、65℃で保温し、次いで１×SSC（0.15M NaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウム）及び0.5%SDS存在下に、室温で15分間の保温を2回行い、さらに0.1×SSC（0.015M NaCl、0.0015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5%SDS存在下に、68℃で30分間保温することにより当該プローブにハイブリダイズするクローンを得ることができる。
【００１５】
また、本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１又は３で示される塩基配列に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
【００１６】
上記のようにして得られた本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡは、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols In Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常の方法に準じてベクターにクローニングすればよい。用いられるベクターとしては、例えば、pBlueScriptIIベクター（Stratagene社製）、pUC18/19ベクター（宝酒造社製）、TAクローニングベクター（Invitrogen社製）等をあげることができる。
尚、クローニングされたＤＮＡの塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977 等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される）等により確認すればよい。当該操作には、例えば、Termo Seqenase II dye terminator cycle sequencing kit（アマシャムファルマシア社製）、Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（PEバイオシステムズジャパン社製）等の市販キットを用いることができる。
【００１７】
（３）発現ベクターの構築
本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡの発現ベクターの構築は、通常の方法（例えば、J.,Sambrook, E.,F.,Frisch, T.,Maniatis著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて行えばよい。
例えば、形質転換する宿主細胞において利用可能なベクター、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるベクターであって、さらに、宿主細胞からの単離・精製が可能であり、検出可能なマーカーを持っていてもよいベクター（具体的には、大腸菌等の細菌を宿主細胞とする場合には、例えば、プラスミドpUC119(宝酒造（株）製)やファージミドpBluescriptII(ストラタジーン社製)等を使用すればよい。酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、プラスミドpACT2(Clontech社製)等を使用すればよい。植物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、プラスミドpBI221 （Clontech 社）等を使用すればよい。）に、本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡを組み込むことにより構築すればよい。
【００１８】
本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡの上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合する形で前記ベクターに組み込むことにより、本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡを宿主細胞で発現させることが可能となる発現ベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、宿主細胞においてプロモーターの制御下に本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが発現するように、当該プロモーターと本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡとを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（lacP）、トリプトファンオペロンのプロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモーター(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(galP)、tacプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげることができる。また、宿主細胞が酵母である場合には、ADH1プロモーター（尚、ADH1プロモーターは、例えばADH1プロモーター及び同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターpAAH5 〔Washington Research Fundation から入手可能、Ammerer ら、Method in Enzymology、101 part（p.192-201）〕から通常の遺伝子工学的方法により調製することができる。ADH1プロモーターは、Washington Research Fundation の米国特許出願第299,733 に含まれており、米国において、工業的、商業目的で使用する場合は、権利者からの権利許諾を必要とする。）等をあげることができる。宿主細胞が植物細胞である場合には、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子（OCT）プロモーター、カリフラワーモザイクウィルス(CaMV)由来19Sプロモーター、CaMV由来35Sプロモーター等をあげることができる。
【００１９】
また、本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡを、宿主細胞において機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベクターに組み込む場合には、当該ベクターが保有するプロモーターと本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡとが機能可能な形で結合するように、当該プロモーターの下流に本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡを挿入すればよい。例えば、前述の酵母用プラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、当該プラスミドのADH1プロモーターの下流に本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡを挿入すれば、本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡを、例えば、CG1945(Clontech社製)等の酵母内で発現させることが可能となる発現ベクターを構築することができる。
【００２０】
（４）形質転換細胞の作製
構築された発現ベクターを宿主細胞に通常の方法に準じて導入することにより、本発明において用いられる形質転換細胞を作製することができる。形質転換細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、例えば、細菌、酵母、植物細胞等を挙げることができる。細菌としては、例えば、大腸菌、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属等に属する細菌を挙げることができる。酵母としては、出芽酵母、分裂酵母を挙げることができ、さらに具体的には、例えば、サッカロマイセス属、スキゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。植物細胞としては、例えば、タバコの培養細胞であるBY-2 株、トウモロコシ（Black Mexican Sweet）の培養細胞であるBMS 株等を挙げることができる。
発現ベクターを上記の宿主細胞に導入する方法としては、形質転換される宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、宿主細胞として細菌を用いる場合には、「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の導入方法を用いることにより前記発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。宿主細胞として酵母を用いる場合には、例えば、リチウム法を基にしたYeast transformation kit(Clontech社製)等を用いることにより前記発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。また、宿主細胞として植物細胞を用いる場合には、例えば、アグロバクテリウム感染方法（特公平2-58917及び特開昭60-70080）、プロトプラストへのエレクトロポレーション方法（特開昭60-251887及び特開平5-68575）、パーティクルガン方法（特表平5-508316及び特開昭63-258525）等の通常の導入方法を用いることにより前記発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。
【００２１】
（膜貫通領域一部欠失型サイトカイニン受容体−膜貫通回数変異型サイトカイニン受容体−を発現させた形質転換細胞）
本発明において用いられるサイトカイニン受容体としては、天然型サイトカイニン受容体が有する複数（通常２個〜４個程度）の膜貫通領域のうち、その一部の膜貫通領域が欠失しているものであって、膜貫通領域を少なくとも１個以上有するサイトカイニン受容体（尚、本願中では、膜貫通領域一部欠失型サイトカイニン受容体と記すこともある。）を挙げることもできる。ここで、「天然型サイトカイニン受容体」とは、同種の生物間において最も高い頻度で存在しているアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体を意味しており、一般的に野生型サイトカイニン受容体とも呼ばれているものである。
このような膜貫通領域一部欠失型サイトカイニン受容体としては、より具体的には、天然型サイトカイニン受容体から膜貫通領域の一部分、例えば膜貫通領域1個〜2個程度、が欠失しており、天然型サイトカイニン受容体が有する膜貫通領域の個数よりも少ない個数の膜貫通領域を保持するようなサイトカイニン受容体などをあげることができる。サイトカイニン受容体の膜貫通領域の構造は、例えば、配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列について、http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html から利用可能である構造予測ソフトウエア等を用いて推定することができる。
【００２２】
具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１９６〜１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体（膜貫通領域２個）、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号５０〜１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体（膜貫通領域３個）、配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号３２〜１０３６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体（膜貫通領域２個）、これらのサイトカイニン受容体が有するアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体、例えばこれらのアミノ酸配列のアミノ末端に１つのメチオニンが付加されたアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体等を挙げることができる。
【００２３】
上記の本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡは、例えば、天然型サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡを、該受容体の膜貫通領域の一部をコードする塩基配列が欠失し、かつ天然型サイトカイニン受容体が有する膜貫通領域の個数よりも少ない個数の膜貫通領域をコードする塩基配列が保持されるように、通常の遺伝子工学的手法を用いて切断・結合することにより構築することができる。
当該サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞の作製は、前述の“（本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞の作製）”に準ずればよい。
【００２４】
（キメラ型サイトカイニン受容体を発現させる形質転換細胞）
本発明において用いられるサイトカイニン受容体としては、互いにホモな由来であるサイトカイニン受容体の細胞外領域、サイトカイニン受容体の膜貫通領域及びサイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域と、前記領域に対してヘテロな由来であるヒスチジンキナーゼのレシーバー領域とから構成されるキメラ型サイトカイニン受容体を挙げることもできる。具体的には例えば、CRE1、AHK2、AHK3のいずれかのサイトカイニン受容体に由来する細胞外領域、膜貫通領域及びヒスチジンキナーゼ領域と、出芽酵母のSln1遺伝子にコードされるヒスチジンキナーゼに由来するレシーバー領域とから構成されるキメラ型サイトカイニン受容体を挙げることができる。
【００２５】
サイトカイニン受容体をはじめとするヒスチジンキナーゼファミリーのタンパク質は、高等植物等の植物、微生物に共通して次のような配列を有している。即ち、細胞外領域、膜貫通領域（通常２個〜４個程度）、細胞内でヒスチジンキナーゼ活性を有しかつ活性部位となるHis残基を保持するヒスチジンキナーゼ領域及びリン酸基転移の受容部を有しかつ活性部位となるAsp残基を保持するレシーバー領域からなる。上記のキメラ型サイトカイニン受容体では、細胞外領域、膜貫通領域及びヒスチジンキナーゼ領域がいずれも同一のサイトカイニン受容体由来であるが、これに対してレシーバー領域が前者のサイトカイニン受容体とは異なるヒスチジンキナーゼファミリータンパク質に由来することが重要である。
当該キメラ型サイトカイニン受容体のレシーバー領域は、ヒスチジンキナーゼ領域からの信号伝達を受け取り、これを次のステップに伝えるような機能を有していればよく、サイトカイニン受容体の細胞外領域、膜貫通領域及びヒスチジンキナーゼ領域からなる領域に対してホモな由来であるレシーバー領域が本来有する機能を相補又は改良できるものであればよい。
このようなレシーバー領域としては、例えば、微生物由来のヒスチジンキナーゼが有するレシーバー領域（例えば、酵母、大腸菌等の微生物由来のヒスチジンキナーゼが有するレシーバー領域、さらに具体的には、出芽酵母由来のSln1遺伝子にコードされるヒスチジンキナーゼが有するレシーバー領域（例えば、配列番号７に示すアミノ酸配列を参照）、サルモネラ由来のChey遺伝子にコードされるヒスチジンキナーゼが有するレシーバー領域、大腸菌のハイブリッドセンサーであるRcsC遺伝子にコードされるヒスチジンキナーゼが有するレシーバー領域（Maeda T et al. Nature:369 242-245(1994)、例えば、配列番号８に示すアミノ酸配列を参照）、分裂酵母の細胞周期制御にかかわるPhks遺伝子にコードされるヒスチジンキナーゼが有するレシーバー領域（Shieh,JC et al, Gene Dev. 11, 1008-1022 (1997)）等を用いることができる。
【００２６】
ここで、サイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域とは、例えば、複数の膜貫通領域の中で最もC末端側に存在する膜貫通領域のC末端側下流に存在する領域であって、Annual Review of Genetics 23:311-336(1989)、Microbiological Reviews 53(4): 450-490(1989)、Science 262:539-544(1993)およびScience 274:982-985(1996)に記載のように一般的なヒスチジンキナーゼに共通の５つの保存モチーフを有することを特徴とする領域であり、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体（AHK2）では配列番号２の587番目のアミノ酸から844番目のアミノ酸までを含む領域であり、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体（AHK3）では配列番号４の450番目のアミノ酸から700番目のアミノ酸までを含む領域であり、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体（CRE1）では配列番号６の449番目のアミノ酸から714番目のアミノ酸までを含む領域である。
サイトカイニン受容体のレシーバー領域とは、例えば、ヒスチジンキナーゼ領域とサイトカイニン受容体のC末端との間に存在する領域であって、Annual Review of Genetics 23:311-336 (1989)、Science 262:539-544 (1993)およびScience 274:982-985 (1996)に記載のように一般的なヒスチジンキナーゼに共通の３つの保存モチーフを有することを特徴とする領域であり、例えばAHK2では配列番号２の891番目のアミノ酸から1163番目のアミノ酸までを含む領域であり、AHK3では配列番号４の746番目のアミノ酸から1018番目のアミノ酸までを含む領域であり、CRE1では配列番号６の763番目のアミノ酸から1038番目のアミノ酸までを含む領域である。
細胞外領域の少なくともひとつは、最もC末端側に存在する膜貫通領域と該膜貫通領域よりもひとつN末端側に存在する膜貫通領域との間に存在する領域（サイトカイニン認識に関与する領域）であって、Plant and Cell Physiology 42(2):231-235(2001)に記載のようにAHK2、AHK3、CRE1の３者間で50％以上保存されている領域であり、AHK2では配列番号２の259番目のアミノ酸から536番目のアミノ酸までを含む領域であり、AHK3では配列番号４の120番目のアミノ酸から399番目のアミノ酸までを含む領域であり、CRE1では配列番号６の132番目のアミノ酸から398番目のアミノ酸までを含む領域である。
【００２７】
キメラ型サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡは、サイトカイニン受容体の細胞外領域、サイトカイニン受容体の膜貫通領域、サイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域及びヒスチジンキナーゼのレシーバー領域の各領域をコードするＤＮＡをそれぞれ調製し、これらを途中に終止コドンが現れないように、かつフレームがずれないように、必要に応じて適当なリンカーを挿入して、通常の遺伝子工学的手法を用いて連結することによって構築することができる。尚、サイトカイニン受容体の細胞外領域及びサイトカイニン受容体の膜貫通領域をコードするＤＮＡや、サイトカイニン受容体の細胞外領域、サイトカイニン受容体の膜貫通領域及びサイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域コードするＤＮＡを、一分子のＤＮＡとして調製して、キメラ型サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡの構築に用いてもよい。
【００２８】
尚、前記各領域をコードするＤＮＡは、公知の方法を用いてそれぞれ作製することができる。例えば、ＰＣＲによって作製する場合には、まず、増幅しようとする各領域をコードするＤＮＡの5'端領域の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（5'側プライマー）及び3'端領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（3'側プライマー）をそれぞれ設計し、合成する。該プライマーは、通常14塩基程度以上35塩基程度以下のオリゴヌクレオチドであればよく、さらにこのプライマーの5'端側には、PCRによって増幅されたＤＮＡどうしの連結又はこれらＤＮＡとベクターとの連結の際に利用しうる制限酵素認識配列を設けておいてもよい。次いで、当該プライマーを用いてかつｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲに使用する通常の反応条件下で増幅反応を行えばよい。サイトカイニン受容体の細胞外領域、サイトカイニン受容体の膜貫通領域もしくはサイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域をコードするＤＮＡを調製する場合に使用される鋳型としては、例えば、高等植物等の植物由来のｃＤＮＡのライブラリーをあげることができる。また、ヒスチジンキナーゼのレシーバー領域をコードするＤＮＡの調製の場合に使用される鋳型としては、例えば、通常の方法で調製された微生物由来のｃＤＮＡライブラリー又は全ＤＮＡがあげられる。
【００２９】
当該キメラ型サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞の作製は、前述の“（本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞の作製）”に準ずればよい。
【００３０】
（サイトカイニンに関わる細胞内信号伝達系）
本発明において、前述のようにして作製された形質転換細胞内で発現されたサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の有無又はその量を測定するには、形質転換細胞を作製するために使用される宿主細胞が本来有している細胞内信号伝達系を利用すればよい。また、当該宿主細胞に、Two-Component regulatory systemと呼ばれる細胞内信号伝達機能を担うレギュレーター及び／又はメディエーターをコードするＤＮＡを導入・発現させ、これを細胞内信号伝達系として利用してもよい。利用可能なTwo-Component regulatory systemとしては、例えば、シロイヌナズナが有する5種類の受容体  ETR1、ETR2、ERS1、ERS2及びEIN4（Chang et al. Science 262:539-544(1993)、Hua  et al. Science 269:1712-1714(1995)、Sakai et al. Plant Cell Physiol 39:1232-1239（1998））や浸透圧のセンサー機能を有するAtHK1（Urao  Plant Cell 11:1743-1754（1999））に対応したTwo-Component regulatory system等を挙げることができる。
【００３１】
また、このような形質転換細胞を作製するために使用される宿主細胞として、宿主細胞固有のヒスチジンキナーゼ活性よりも低いヒスチジンキナーゼ活性を有するように改良された宿主細胞を使用することもできる。例えば、天然の宿主細胞から一つ以上のヒスチジンキナーゼを欠失させることにより細胞固有のヒスチジンキナーゼ活性よりも低いヒスチジンキナーゼ活性を有するように改良された宿主細胞があげられる。ヒスチジンキナーゼ活性が低いとは、ヒスチジンキナーゼ領域の活性部位となるHis残基からレシーバー領域の活性部位となるAsp残基へのリン酸基の転移量が少ないことであり、その結果細胞内信号伝達の量が減少する。宿主細胞固有のヒスチジンキナーゼ活性よりも低いヒスチジンキナーゼ活性を有するように改良された宿主細胞では、例えば生育量の変化、形態の変化、形状の変化、細胞内での特定物質の生合成量の変化、特定物質の代謝量の変化などが起こることがある。具体的には、Saccharomyces cerevisiae等の出芽酵母由来の浸透圧センサー機能を有するタンパク質をコードするSln1遺伝子を欠損させた株（Maeda T et al. Nature:369 242-245(1994)）等を挙げることができる。この株は、Saccharomyces cerevisiae に存在するヒスチジンキナーゼを欠失しているため、生育量が減少し、本サイトカイニン受容体を導入すると、該受容体からの細胞内信号伝達の有無又はその量を宿主細胞の生育量を指標としてより明確に検出できる。また、大腸菌由来のハイブリッドセンサーであるRcsC遺伝子の欠損株や分裂酵母の細胞周期制御にかかわるPhks遺伝子の欠損株等も好ましい態様の一例としてあげることができる。
【００３２】
（サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性の分析方法）
サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性の分析方法において、本サイトカイニン受容体をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞に被験物質を接触させる第一工程の具体的な例としては、例えば、当該形質転換細胞を、被験物質を含む培地で培養する方法をあげることができる。当該形質転換細胞の培養は、液体培地中にて培養する液体培養や、前記液体培地に寒天等を加えた固体培地上にて培養する固体培養等いずれの形態であってもよい。前記培地中の被験物質の濃度としては、例えば、約１ｎＭ〜約１ｍＭをあげることができ、好ましくは、約１０ｎＭ〜約１００μＭがあげられる。培養時間としては、例えば、１時間以上3日間程度までをあげることができ、好ましくは、25時間から２日間程度までがあげられる。尚、サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を分析する場合には、被験物質を含む培地はサイトカイニン非添加培地を使用すればよい。
前記第一工程後に、前記形質転換細胞内で発現されたサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の有無又はその量を測定し、得られた測定値を指標として、サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を分析する。
【００３３】
具体的には、例えば、PTP2 Tyrosine  phosphatase遺伝子（Ota et al, Proc.N.A.sci.USA, 89, 2355-2359 (1992)）を導入したSln1遺伝子欠損株であるTM182（sln1Δ）株（Maeda T et al. Nature:369 242-245(1994)）を宿主細胞として作製された形質転換細胞（即ち、サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達によって細胞生育が直接的に制御される機能を有する形質転換細胞）を使用する場合には、炭素源としてグルコースを用いた培地（寒天培地又は液体培地）、例えば、DOLU+Glu培地での当該形質転換細胞の生育量を指標としてサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を測定すればよい。被験物質を加えたDOLU+Glu培地（サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有する物質を含まない培地）を用いた場合、当該形質転換細胞を生育させうる被験物質はサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有すると評価することができる。尚、対照として、炭素源としてグルコースの替わりにガラクトースを用いた培地、例えばDOLU+Gal培地、での当該形質転換細胞の生育が、被験物質の有無に関わらず認められることを調べてもよい。
【００３４】
また、Phks遺伝子欠損株である分裂酵母を宿主細胞として作製された形質転換細胞（即ち、サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達によって細胞生育が直接的に制御される機能を有する形質転換細胞）を使用する場合には、当該分裂酵母の分裂様式を顕微鏡下に観察すればよい。被験物質を含みかつサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有する物質を含まない培地を用いた場合、当該形質転換細胞を正常に分裂増殖させうる被験物質はサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有すると評価することができる。
cps-LacZを導入したRcsC遺伝子欠損大腸菌を宿主細胞として作製された形質転換細胞を使用する場合には、X-Galの発色を寒天培地又は液体培地で観察すればよい（Suzuki et al. Plant Cell Physiol 42:107-113(2001)）。被験物質を含みかつサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有する物質を含まない培地を用いた場合、当該形質転換細胞を青色に着色させうる被験物質はサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有すると評価することができる。
【００３５】
さらに、かかるサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性の分析方法により、異なる２種以上の物質（例えば、異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質がサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有さない物質であることが好ましい。）のアゴニスト活性を各々分析し、各被験物質と接触した形質転換細胞について測定されたサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の有無又はその量を比較することにより得られる差異に基づき、前記物質のサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を評価・検定することもできる。
【００３６】
そして、上述の検定方法により評価されたサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性に基づきサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有する物質を選抜することにより、サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質を探索することもできる。
【００３７】
上述の探索方法により選抜されたアゴニスト活性物質は、植物生育調節剤の有効成分として利用してもよい。
上記の植物生長調節剤の処理の対象となる植物としては、例えば、花卉・観葉植物等の鑑賞用植物、穀類・野菜・果樹等の作物、繊維植物、樹木、芝等が挙げられる。
当該植物生長調節剤は、通常、固体担体、液体担体等と混合し、必要により界面活性剤、その他の製剤用補助剤等を添加して、乳剤、水和剤、懸濁剤、水溶剤等に製剤化して用いられる。これらの製剤中にサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質が一般に０．５〜９０重量％、好ましくは１〜８０重量％含有される。
【００３８】
製剤化するに際し用いられる固体担体としては、例えば粘土類（カオリナイト、珪藻土、合成含水酸化珪素、フバサミクレー、ベントナイト、酸性白土等）、タルク、その他の無機鉱物（セリサイト、石英粉末、硫黄粉末、活性炭、炭酸カルシウム等）化学肥料（硫安、燐安、硝安、塩安、尿素等）などの微粉末や粒状物が挙げられ、液体担体としては、例えば水、アルコール類（メタノール、エタノール等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン等）、芳香族炭化水素類（トルエン、キシレン、エチルベンゼン、メチルナフタレン等）、非芳香族炭化水素類（ヘキサン、シクロヘキサン、ケロシン等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、ニトリル類（アセトニトリル、イソブチロニトリル等）、エーテル類（ジオキサン、ジイソプロピルエーテル等）、酸アミド類（ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等）、ハロゲン化炭化水素類（ジクロロエタン、トリクロロエチレン等）などが挙げられる。
界面活性剤としては、例えばアルキル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリ−ルスルホン酸塩、アルキルアリールエーテル類及びそのポリオキシエチレン化物、ポリエチレングリコールエーテル類、多価アルコールエステル類、糖アルコール誘導体などが挙げられる。
その他の製剤用補助剤としては、例えばカゼイン、ゼラチン、多糖類（澱粉、アラビアガム、セルロース誘導体、アルギン酸等）、リグニン誘導体、ベントナイト、合成水溶性高分子（ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸等）などの固着剤や分散剤、ＰＡＰ（酸性リン酸イソプロピル）、ＢＨＴ（２，６−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）、ＢＨＡ（２−／３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール）、植物油、鉱物油、脂肪酸、脂肪酸エステルなどの安定剤が挙げられる。
【００３９】
このようにして製剤化されたサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質は、そのままで、又は、水等で希釈して、植物の茎葉部・枝葉部・花実部への散布処理、果実への浸漬処理、果実への塗布処理に用いる。また、当該植物生長調節剤は、対象植物に対して、１回もしくは複数回処理する。
上記の植物生長調節剤を果実の落下抑制を目的として用いる場合は、例えば、当該植物生長調節剤を水に希釈し、これを収穫前に果樹の果実部及び枝葉部に散布する。
上記の植物生長調節剤を綿のボール落下抑制を目的に使用する場合は、例えば、当該植物生長調節剤を水に希釈し、これを収穫前に綿のボール及び茎葉部に散布する。
上記の植物生長調節剤は、生育中の植物に対して処理してもよいし、収穫後の植物に対して処理してもよい。
【００４０】
上記の植物生長調節剤におけるサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質の施用量は、製剤形態、施用時期、施用方法、施用場所、対象植物により変わり得るが、１ヘクタール当り通常１〜８０００ｇである。また、当該植物生長調節剤を水に希釈して用いる場合の使用濃度としては、製剤形態、施用時期、施用方法、施用場所、対象植物により変わり得るが、一般には０．０００１〜１０００ｍＭで、望ましくは０．００１〜１０ｍＭである。
【００４１】
次に、サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質を製剤化して、上記の植物生長調節剤とした例を、以下に製剤例として示す。以下の例において部は重量部を表す。
製剤例１
サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質５０部、リグニンスルホン酸カルシウム３部、ラウリル硫酸ナトリウム２部及び合成含水酸化珪素４５部をよく粉砕混合して水和剤を得る。
製剤例２
サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質７０部、リグニンスルホン酸カルシウム３部、ラウリル硫酸ナトリウム２部及び合成含水酸化珪素２５部をよく粉砕混合して水和剤を得る。
製剤例３
サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質４０部、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート３部、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）３部及び水５２部を混合し、粒度が５ミクロン以下になるまで湿式粉砕して懸濁剤を得る。
【００４２】
【実施例】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
（参考例１）CER1クローニング用シロイヌナズナcDNAファージライブラリーの作成
シロイヌナズナのWassilewskija系統の種子を70%のエチルアルコールで1分殺菌し、さらに1.5%の次亜塩素酸ナトリウムで10分間殺菌した。これを滅菌水でよく洗った後、GM培地（4.3g Murashige and Skoog's basal salt mixture, 1% ssucrose, 10ml of 5% MES-KOH (pH5.7), 0.3％PhytagelTM (SIGMA)）で2週間培養後、5ｇの植物を得た。これを液体窒素中で凍結させた後、乳鉢により物理的に磨砕した。得られた磨砕物に10mlの抽出バッファー（200ｍＭ Tris−HCl（pH8.5）、100mM NaCl、10mM EDTA、0.5% SDS、14mM βメルカプトエタノール）と10ｇのフェノールの混合液を加えた。Voltex  ミキサーで攪拌した後、さらに10mlのクロロホルムを加えて激しく攪拌し、10000回転で20分間遠心した。回収された水層にLiClを最終濃度2Mとなるように加え、-80℃で3時間放置した後、解凍し、10000回転で20分間遠心し、沈殿を回収した。回収された沈殿を2mlのTE (10mM Tris-HCl(pH 8.0) 1mM EDTA)に溶かした後、0.2mlの3M 酢酸ナトリウム(pH5.2)と5mlのエタノールを加えて遠心し、RNAを沈殿として回収した。さらに回収された沈殿（ＲＮＡ）を、OligotexTM dT30super(日本ロッシュ社製)を用いてpolyAが結合したRNAを抽出した。
抽出されたpolyAが結合したRNAからのファージcDNAライブラリーの作製は、ZAP-cDNARSynthesis Kit（Stratagene社製）を用い、説明書に従って作製した。作製されたファージcDNAライブラリーの力価は500000PFUであった。
【００４４】
（参考例２）CRE１のＤＮＡプローブの作製
参考例１で作製されたファージcDNAライブラリーのファージ液（約1000000PFU）を鋳型として、TAKARA LA TaqTMキット（宝酒造社製）を用い、配列番号11に示されたDNA及び配列番号12に示されたDNAをプライマーとしてPCR反応を行い、DNAを増幅した。詳細を以下に述べる。
ファージ1000000pfu、プライマーDNA各々0.2μMにキット説明書に従ってｄNTP等の反応組成物を添加してPCR反応液を調製し、PCRの条件として、94℃で2分間保温し、94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で５分間のサイクルを40サイクル繰り返す増幅条件下でPCRを行うことにより、目的のDNA断片の増幅を行った。次に増幅されたDNA断片を鋳型にしてMegaprime DNA-labelling system  キット（アマシャムファルマシア社製）を用いて32Ｐでラベルしたプローブを調製した。尚、反応液（25μl）は、増幅されたDNA断片25ngに32PdCTP 2.0 MBqを添加し、キットに指定される反応組成物を添加することにより調製された。ラベル化反応は、37℃10分間で行われた。
【００４５】
（参考例３）CRE1遺伝子を保持するファージcDNAクローンの取得
参考例２で調製されたプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより目的とするCRE1遺伝子をクローニングした。詳細を以下に述べる。
参考例１で作製されたファージcDNAライブラリーを用いて、ZAP-cDNARSynthesis Kitの説明書に従い 、プラークを形成させた。形成されたプラークからニトロセルロースフィルター上にDNAを吸着させた後、紫外線処理をすることにより、フィルター上にDNAを固定させた。このようにして調製されたフィルターを用いて、6×SSC（0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1%(w/v) フィコール400、0.1%(w/v) ポリビニルピロリドン、0.1%BSA）、0.5%(w/v) SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNA存在下に、又は100μg/ml変性サケ精子DNAを含むDIG EASY Hyb溶液（ベーリンガーマンハイム社）中に65℃で保温した後、１×SSC（0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5%SDS存在下に室温で15分間の保温を2回行い、さらに0.1×SSC（0.015M NaCl、0.0015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5%SDS存在下に、68℃で30分間保温することによりハイブリダイズするファージcDNAクローンを得た。
【００４６】
（参考例４）CRE1 cDNAのクローニング
参考例３で得られたファージcDNAクローンのcDNAを鋳型として、配列番号13に示されるDNA及び配列番号14に示されるDNAをプライマーとしてPCR反応を行い、配列番号５で示される塩基配列を有するDNAを増幅した。詳細を以下に述べる。PCR反応は、Herculase Enhanced DNA Polymerase (TOYOBO社製)を用いて、94℃で1分間保温し、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で4分間のサイクルを25サイクル繰り返す増幅条件下で行われた。尚、PCR反応液（50μl）は、ファージcDNAクローンのcDNA500ng、プライマーDNA各々100ngにキット説明書に従ってｄNTP等の反応組成物を添加することにより調製された。
このようにして目的のDNA断片の増幅を行った。
【００４７】
（参考例５）CRE1発現ベクターの構築
酵母発現ベクターであるp415CYC１（Munberg et al. Gene:156 119-122(1995)、ATCCライブラリー （No.87382）から入手可能）を制限酵素SmaＩで切断した後、T4 DNA Ligaseを用いて、参考例４で得られた配列番号５で示される塩基配列を有するDNAを発現ベクターp415CYC1のCYC1プロモータ配列に結合することにより、酵母において目的タンパク質が発現されるように組み込んだ。挿入されたDNAの配列が正しい向きであり、ＤＮＡ配列が配列番号５に示された塩基配列であることを自動塩基配列決定装置を用いて確認し、発現プラスミドp415CYC-CRE１を得た。
【００４８】
（実施例１）  AHK3(AAF99730)cDNAのクローニング
シロイヌナズナのWassilewskija系統の種子を70%のエチルアルコールで1分殺菌し、さらに1.5%の次亜塩素酸ナトリウムで10分間殺菌した。これを滅菌水でよく洗った後、GM培地（4.3g Murashige and Skoog's basal salt mixture, 1% ssucrose, 10ml of 5% MES-KOH (pH5.7), 0.3％PhytagelTM (SIGMA)）で2週間培養することにより、5ｇの植物を得た。これを液体窒素中で凍結させた後、乳鉢により物理的に磨砕した。得られた磨砕物に10mlの抽出バッファー（200ｍＭ Tris−HCl（pH8.5）、100mM NaCl、10mM EDTA、0.5% SDS、14mM βメルカプトエタノール）と10ｇのフェノールの混合液を加えた。Voltexミキサーで攪拌した後、さらに10mlのクロロホルムを加えて激しく攪拌し、10000回転で20分間遠心した。回収された水層にLiClを最終濃度2Mとなるように加え、-80℃で3時間放置した後、解凍し、10000回転で20分間遠心し、沈殿を回収した。回収された沈殿を2mlのTE (10mM Tris-HCl(pH 8.0) 1mM EDTA)に溶かした後、0.2mlの3M 酢酸ナトリウム(pH5.2)と5mlのエタノールを加えて遠心し、RNAを沈殿として回収した。さらに回収された沈殿（RNA） 40 μgから、30unitのFPLCpureTM  DnaseI(Amersham-Pharmacia)と60unitのSuperace(Ambion)を加えることにより、混在するゲノムDNAを除去した後、これをフェノール／クロロホルム処理、及びエタノール処理により精製した。次に、精製されたRNAを鋳型として、かつoligo(dT)12-18 (amersham-Pharmacia)をプライマーとして用いたRT-PCR反応を行った。RT-PCR反応は、SuperscriptII（GIBCO BRL社製）を用いて、42℃で40分間行われた。尚、PT-PCR反応液は、SuperscriptII の説明書に指定される方法に従い調製された。
このようにして目的とするcDNAを増幅した。
増幅されたcDNAを鋳型として、配列番号16に示されるDNA及び配列番号17に示されるDNAをプライマーとして用いたPCR反応を行い、配列番号３で示される塩基配列を有するDNAを増幅した。PCR反応は、Herculase Enhanced DNA Polymerase (TOYOBO)を用いて、94℃で1分間保温し、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で4分間のサイクルを41サイクル繰り返す増幅条件下で行われた。尚、PCR反応液（50μl）は、鋳型DNA500ng、プライマーDNA各々100ngにキット説明書に従ってｄNTP等の反応組成物を添加することにより調製された。
このようにして目的のDNA断片の増幅を行った。
【００４９】
（実施例２）pHM-1の構築
p415CYC1（Munberg et al. Gene:156 119-122(1995) 、ATCCライブラリー （No.87382）から入手可能）を制限酵素SpeＩとBamHＩで消化した後、T4 DNA Ligaseを用いて、配列番号１８及び１５に示される合成DNA断片（リンカー）を挿入し、プラスミドp415CYC1に新たに制限酵素サイトSacＩＩ、ApaＩ、NheＩを付加し、ｐHM-1を構築した。
【００５０】
（実施例３）AHK3発現ベクターの構築
pHM-1を制限酵素SalＩとSacＩＩを用いて切断した後、T4 DNA Ligaseを用いて、配列番号３で示される塩基配列を有するDNAを発現ベクターpHM-1のCYC1プロモーター配列に結合することにより、酵母において目的タンパク質が発現されるように組み込んだ。挿入されたDNAの塩基配列の配列及び向きが正しいことを自動塩基配列決定装置を用いて確認し、発現プラスミドp415CYC-AHK3を得た。
【００５１】
（実施例４）AHK2(BAB09274)cDNAのクローニング
実施例１で調製されたDNA断片（全RNAより逆転写によって調整したcDNA）を鋳型として、配列番号19に示されるDNA及び配列番号20に示されるDNAをプライマーとして用いたPCR反応を行い、配列番号１で示される塩基配列を有するDNAを増幅した。PCR反応は、TAKARA  Pfu Turbo denature（宝酒造社製）を用いて、94℃で1分間保温し、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で4分間のサイクルを30サイクル繰り返す増幅条件下で行われた。尚、PCR反応液（50μl）は、鋳型DNA500ng、プライマーDNA各々50ngに説明書に従ってｄNTP等の反応組成物を添加することにより調製された。
このようにして目的のDNA断片の増幅を行った。
【００５２】
(実施例５) AHK2(BAB09274)Δ  cDNAのクローニング
実施例１で調製されたDNA断片（全RNAより逆転写によって調整したcDNA）を鋳型として、配列番号21に示されるDNA及び配列番号22に示されるDNAをプライマーとして用いたPCR反応を行い、配列番号１で示される塩基配列のうち、塩基番号５８６〜３５３１で示される塩基配列の５’末端にATGを付加した塩基配列を有するDNAを増幅した。PCR反応は、TAKARA  Pfu Turbo denature（宝酒造社製）を用いて、94℃で1分間保温し、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で4分間のサイクルを30サイクル繰り返す増幅条件下で行われた。尚、PCR反応液（50μl）は、鋳型DNA500ng、プライマーDNA各々50ngに説明書に従ってｄNTP等の反応組成物を添加することにより調製された。
このようにして目的のDNA断片の増幅を行った。
【００５３】
（実施例６）AHK2及びAHK2Δ発現ベクターの構築
pHM-1を制限酵素SacＩＩとNheＩを用いて切断した後、実施例４及び実施例５で得られたDNA断片をT4 DNA Ligaseを用いて発現ベクターpHM-1のCYC1プロモータ配列に結合することにより、酵母において目的タンパク質が発現されるように組み込んだ。挿入されたDNAの塩基配列の配列及び向きが正しいことを自動塩基配列決定装置を用いて確認し、発現プラスミドp415CYC-AHK2及びp415CYC-AHK2Δを得た。
【００５４】
（実施例７）形質転換細胞TM182-CRE1、TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3の作製
得られた発現プラスミドp415CYC-CRE1（参考例５）、p415CYC-AHK2（実施例６）、p415CYC-AHK2Δ（実施例６）及びp415CYC-AHK3（実施例３）をそれぞれ用いて、Sln1遺伝子欠損株であるTM182（sln1Δ）（Maeda T et al. Nature:369 242-245(1994)）を形質転換した。形質転換は、Polyethylene glycol/lithium acetate (PEG/LiAc)-mediated transformation 法を用い、CLONTECH社：MATCHMAKER Two-Hybrid System 3 User Manual 22ページに記載される VII.Library Transformation & Screening Protocolsに従って行った。得られる形質転換細胞では、ロイシンの栄養要求性が消失することを利用し、DOLU+Gal培地で生育する形質転換酵母を選択し、形質転換細胞TM182-CRE1、TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3を作製した。
【００５５】
（実施例８）形質転換細胞TM182-CRE1、TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3のサイトカイニン応答（その１）
実施例７で作製された形質転換細胞TM182-CRE１、TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3の培養液10μl（酵母約800個体）を、濃度10μMのtrans-zeatinを添加したDOLU+Glu寒天培地上にスポットして、30℃で30時間培養を行った。培養終了後、当該形質転換細胞の生育状態を観察し、デジタルカメラにて写真を撮影した。
その結果、TM182-CRE1、TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3のいずれの形質転換細胞も、trans-zeatinを添加したDOLU+Glu寒天培地の場合には、trans-zeatinを添加しないDOLU+Glu寒天培地の場合に比べて高い増殖度を示した。このことから、形質転換細胞がサイトカイニンに対して応答し、DOLU+Glu寒天培地での生育が可能であることを示している。また、形質転換細胞が、trans-zeatin存在の有無に関わらずDOLU+Gal培地で生育可能であることも確認した。
【００５６】
（実施例９）形質転換細胞TM182-CRE1、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK2のサイトカイニン応答（その２）
実施例７で得られた形質転換細胞TM182-CRE1、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK2形質転換細胞の培養液を種々の濃度（１nM、１０nM、１００nM、１μM、１０μM、１００μM）のサイトカイニンを含むDOLU+Glu寒天培地上にスポットして、30℃で30時間培養を行った。培養終了後、生育状態を観察し、デジタルカメラにて写真を撮影した。表１に、各形質転換細胞が生育可能であったtrans-zeatin及びcis-zeatin  の最低濃度を示した。
【００５７】
【表１】
0004161597.tif 000002
【００５８】
（実施例１０）サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有する物質の探索方法（その１）
実施例７で得られた形質転換細胞TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3をDOLU+Gal培地200mlに植菌し、30℃で36時間前培養を行い、この培養液をDOLU＋Glu培地でOD600＝0.100に希釈し、さらにそれをDOLU＋Glu培地で200分の１に希釈したものを、希釈前培養液とした。
96穴プレートの各ウエルに、濃度10mMに調製した被験物質（Abscisic acidまたは6-Benzyl aminopurine）のDMSO溶液をDOLU+Glu培地にて100倍に希釈した溶液（100μＭ）を20μl添加したアッセイプレートを準備した。同時に、DMSO  20μlをDOLU+Glu培地にて100倍に希釈した溶液を20μl入れたアッセイプレートを対照区として準備した。
上記の希釈前培養液を200μlずつ両アッセイプレートの各ウエルに添加し、30℃で24時間培養した後、プレートリーダーを用いて各ウエルの濁度を測定した。該濁度を対照区における濁度と比較することにより、被験物質のサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を検定した。表２に、各被験物質を添加した各形質転換細胞培養液のOD620の吸光度を示した。6-Benzyl aminopurineを添加した試験区における濁度が対照区における濁度に比べて高い値を示したことから、6-Benzyl aminopurineを、サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質として選抜した。
【００５９】
【表２】
0004161597.tif 000003
【００６０】
（実施例１１）サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質の探索方法（その２）
実施例７で得られた形質転換細胞TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3 をDOLU+Gal培地200mlに植菌し、30℃で30時間前培養を行う。実施例１０で選抜されたサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質の供試濃度が10ｎＭから100μＭとなるように種々変化させて添加したDOLU+Glu寒天培地に、前培養した形質転換細胞（TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3）10μlをスポットして30℃で30時間培養する。培養終了後、形質転換細胞（TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3）の増殖状態が観察される最低供試濃度から当該供試物質のサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性の強度を検定・確認する。
【００６１】
以下に、本発明において使用される培地の組成を記す。
（ａ）DOLU+GLU培地
Bacto-yeast nitrogen base without amino acids           6.7g
Glucose                                                20g
Drop-out mix（ｘ）                                      2.0g
Distilled water                                      1000ml
（ｂ）DOLU+GAL培地
Bacto-yeast nitrogen base without amino acids           6.7g
Glucose                                                20g
Drop-out mix（ｘ）                                      2.0g
Distilled water                                      1000ml
（ｘ）Drop-out mix:
Adenine          0.5g            Lysine                  2.0g
Alanine          2.0g            Methionine              2.0g
Arginine         2.0g            para-Aminobenzoic acid  0.2g
Asparagine       2.0g            Phenylalanine           2.0g
Aspartic acid    2.0g            Proline                 2.0g
Cysteine         2.0g            Serine                  2.0g
Glutamine        2.0g            Threonine               2.0g
Glutamic acid    2.0g            Tryptophan              2.0g
Glycine          2.0g            Tyrosine                2.0g
Histidine        2.0g            Valine                  2.0g
Inositol         2.0g            Isoleucine              2.0g
Distilled water  1000ml
（ｃ）DOLU+GLU寒天培地
培地（ａ）に２％（Ｗ／Ｖ）の寒天が添加された固体培地。
（ｄ）DOLU+GAL寒天培地
培地（ｃ）に２％（Ｗ／Ｖ）の寒天が添加された固体培地。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によって、サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性の分析方法が提供可能となり、さらに当該分析方法を使用することでサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有する物質を少量のサンプルでかつ迅速に見出す方法等が提供可能となる。
【００６３】
「配列表フリーテキスト」
配列番号９
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００６４】
【配列表】
0004161597.tif 000004
0004161597.tif 000005
0004161597.tif 000006
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