(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドフラグメントであって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号１０または１４の配列と少なくとも８０％の同一性を共有することを特徴とするポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項２】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項１記載のポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項３】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９のヌクレオチド６３〜１６９１または配列番号１３のヌクレオチド１３９〜１８６９を含む請求項１記載のポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項４】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９のヌクレオチド６３〜７２１を含む請求項１記載のポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項５】
該ポリヌクレオチドが配列番号９または１３に記載したとおりのものである請求項１記載のポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項６】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４に記載したアミノ酸配列を含むものである請求項１記載のポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項７】
該ポリヌクレオチド配列が二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群より選択されるものである請求項１記載のポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項８】
ポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドフラグメントであって、該ポリヌクレオチド配列が、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号９または１３の配列と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするものであることを特徴とするポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項９】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９または１３の配列と少なくとも９０％の相同性を共有する、請求項８記載のポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項１０】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９または１３に記載したとおりのものである請求項８記載のポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項１１】
ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるベクターであって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号１０または１４の配列と少なくとも８０％の同一性を共有することを特徴とするベクター。
【請求項１２】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項１１記載のベクター。
【請求項１３】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９のヌクレオチド６３〜１６９１または配列番号１３のヌクレオチド１３９〜１８６９を含む請求項１１記載のベクター。
【請求項１４】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９のヌクレオチド６３〜７２１を含む請求項１１記載のベクター。
【請求項１５】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９または１３に記載したとおりのものである請求項１１記載のベクター。
【請求項１６】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４に記載したアミノ酸配列を含むものである請求項１１記載のベクター。
【請求項１７】
該ポリヌクレオチド配列が二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群より選択されるものである請求項１１記載のベクター。
【請求項１８】
該ベクターがバキュロウイルスベクターである請求項１１記載のベクター。
【請求項１９】
ポリヌクレオチド配列を含んでなるベクターであって、該ポリヌクレオチド配列が、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号９または１３の配列と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするものであることを特徴とするベクター。
【請求項２０】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９または１３の配列と少なくとも９０％の相同性を共有する、請求項１９記載のベクター。
【請求項２１】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９または１３に記載したとおりのものである請求項１９記載のベクター。
【請求項２２】
ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列含有の外来性ポリヌクレオチドフラグメントを含んでなる宿主細胞であって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号１０または１４の配列と少なくとも８０％の同一性を共有することを特徴とする宿主細胞。
【請求項２３】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２４】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９のヌクレオチド６３〜１６９１または配列番号１３のヌクレオチド１３９〜１８６９を含む請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２５】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９のヌクレオチド６３〜７２１を含む請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２６】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９または１３に記載したとおりのものである請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２７】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４に記載したアミノ酸配列を含むものである請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２８】
該ポリヌクレオチド配列が二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群より選択されるものである請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２９】
該細胞が昆虫細胞である請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項３０】
ポリヌクレオチド配列を含んでなる宿主細胞であって、該ポリヌクレオチド配列が、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号９または１３の配列と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするものであることを特徴とする宿主細胞。
【請求項３１】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９または１３の配列と少なくとも９０％の相同性を共有する、請求項３０記載の宿主細胞。
【請求項３２】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号９または１３に記載したとおりのものである請求項３０記載の宿主細胞。
【請求項３３】
ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含んでなる組換えタンパク質であって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号１０または１４の配列と少なくとも８０％の同一性を共有することを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項３４】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項３３記載の組換えタンパク質。
【請求項３５】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４に記載したとおりのものである請求項３３記載の組換えタンパク質。
【請求項３６】
ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタンパク質を活性成分として含んでなる製剤組成物であって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号１０または１４の配列と少なくとも８０％の同一性を共有することを特徴とする製剤組成物。
【請求項３７】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項３６記載の製剤組成物。
【請求項３８】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４に記載したとおりのものである請求項３６記載の製剤組成物。
【請求項３９】
ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタンパク質を活性成分として含み、ヘパリン結合増殖因子、ヘパリン結合増殖因子およびサイトカインへの細胞性応答、血漿リポタンパク質との細胞相互作用、ウイルス、原生動物および細菌感染に対する細胞の感受性、または神経変性プラークの分解のモジュレーターであって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号１０または１４の配列と少なくとも８０％の同一性を共有することを特徴とするモジュレーター。
【請求項４０】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項３９記載のモジュレーター。
【請求項４１】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４に記載したとおりのものである請求項３９記載のモジュレーター。
【請求項４２】
ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタンパク質を活性成分として含有する医療装置を含んでなる医療機器であって、該ポリペプチドが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号１０または１４の配列と少なくとも８０％の同一性を共有することを特徴とする医療機器。
【請求項４３】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項４２記載の医療機器。
【請求項４４】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４に記載したとおりのものである請求項４２記載の医療機器。
【請求項４５】
組換えヘパラナーゼを発現する宿主細胞であって、該組換えヘパラナーゼが、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号１０または１４の配列と少なくとも８０％の同一性を共有するポリペプチドであることを特徴とする宿主細胞。
【請求項４６】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項４５記載の宿主細胞。
【請求項４７】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４に記載したとおりのものである請求項４５記載の宿主細胞。
【請求項４８】
該細胞が昆虫細胞である請求項４５記載の宿主細胞。
【請求項４９】
請求項２２〜３２および４５〜４８のいずれかに記載の宿主細胞の抽出物または培地を含んでなる細胞抽出物もしくは調整細胞培地または部分精製細胞抽出物もしくは調整細胞培地。
【請求項５０】
請求項４９記載の細胞抽出物もしくは調整細胞培地または部分精製細胞抽出物もしくは調整細胞培地を含んでなるヘパラナーゼインヒビター・スクリーニングシステム。
【請求項５１】
請求項３３〜３５のいずれかに記載の組換えタンパク質を含んでなるヘパラナーゼインヒビター・スクリーニングシステム。
【請求項５２】
ヘパラナーゼ触媒活性を過度に発現する細胞および培地を含んでなるヘパラナーゼ過度発現システムであって、該ヘパラナーゼ触媒活性が、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号１０または１４の配列と少なくとも８０％の同一性を共有するヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドによって達成されることを特徴とするヘパラナーゼ過度発現システム。
【請求項５３】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項５２記載のシステム。
【請求項５４】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４に記載したとおりのものである請求項５２記載の発現システム。
【請求項５５】
染色体スプレッドのヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域を同定する方法であって、
（ａ）該染色体スプレッドを、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのデフォールトパラメーターを用い定量したときに、配列番号９または１３の配列と少なくとも８０％の相同性を有する標識ポリヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させる工程であって、前記ポリヌクレオチドプローブはヘパラナーゼ遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができる工程、
（ｂ）染色体スプレッドを洗浄し、過剰のハイブリッド非形成プローブを除去する工程、および
（ｃ）当該ハイブリッド形成した標識ポリヌクレオチドプローブと会合したシグナルを検索し、検出されたシグナルがヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域の指標であるとする工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５６】
該ポリヌクレオチドプローブが配列番号９または１３の配列と少なくとも９０％の相同性を共有する、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
配列番号９のヌクレオチド２２６ないし７２１により規定されるポリヌクレオチド鎖に相補的なポリヌクレオチド配列を含んでなる一本鎖ポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項５８】
配列番号１０または１４の配列と少なくとも８０％の同一性を共有するヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項５９】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項５８記載の抗体。
【請求項６０】
前記ポリペプチドの少なくとも1つのエピトープによって誘発される、請求項５８または５９記載の抗体。
【請求項６１】
前記ポリペプチドが組換えである、請求項５８〜６０のいずれかに記載の抗体。
【請求項６２】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項５８〜６１のいずれかに記載の抗体。
【請求項６３】
ポリクローナル抗体が、アフィニティー精製ポリクローナル抗体を含む、請求項６２記載の抗体。
【請求項６４】
請求項５８〜６３のいずれかに記載の抗体を含む、癌または転移を検出するためのアッセイキット。
【請求項６５】
癌または転移の診断または予後のための、請求項６４記載のキット。
【請求項６６】
前記転移が微小転移を含む、請求項６４または６５記載のキット。
【請求項６７】
請求項５８〜６３のいずれかに記載の抗体を含む、自己免疫病変を検出するためのアッセイキット。
【請求項６８】
請求項５８〜６３のいずれかに記載の抗体を含む、腎不全を検出するためのアッセイキット。
【請求項６９】
癌または転移の検出に利用するために身体から採取したサンプルにおいて請求項５８〜６３のいずれかに記載の抗体を用いてヘパラナーゼ活性をアッセイする方法。
【請求項７０】
癌または転移の診断または予後に利用するための、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記転移が微小転移を含む、請求項６９または７０記載の方法。
【請求項７２】
自己免疫病変の検出に利用するために身体から採取したサンプルにおいて請求項５８〜６３のいずれかに記載の抗体を用いてヘパラナーゼ活性をアッセイする方法。
【請求項７３】
腎不全の検出に利用するために身体から採取したサンプルにおいて請求項５８〜６３のいずれかに記載の抗体を用いてヘパラナーゼ活性をアッセイする方法。
【請求項７４】
請求項５８〜６３のいずれかに記載の抗体を含む、身体から採取したサンプルにおいて炎症性の応答を検出するためのアッセイ方法。
【請求項７５】
前記身体から採取したサンプルが、生検標本、血液サンプル、血漿サンプル、および体液の少なくとも1つを含む、請求項６９〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
身体から採取したサンプルにおいてヘパラナーゼを検出するための、請求項５８〜６３のいずれかに記載の抗体のインビトロの使用。
【請求項７７】
配列番号９の配列と少なくとも８０％の相同性を共有する配列を有し、ヘパラナーゼ触媒活性を有するポリペプチドをコードする核酸と特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、アンチセンス核酸。
【請求項７８】
前記核酸配列が、配列番号９に含まれる配列を含む、請求項７７記載のアンチセンス核酸。
【請求項７９】
配列番号９の配列と少なくとも８０％の相同性を共有し、ヘパラナーゼ触媒活性を有するポリペプチドをコードする配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項８０】
配列番号９の配列と少なくとも９０％の相同性を共有する配列とハイブリダイズすることができる、請求項７９記載のポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項８１】
前記ポリヌクレオチドが、ｈｐａ  ｃＤＮＡを含む、請求項７９記載のフラグメント。
【請求項８２】
前記ｈｐａ  ｃＤＮＡが配列番号９に示される配列を含む、請求項８１記載のフラグメント。
【請求項８３】
前記配列が配列番号９のヌクレオチド１〜７２１を含む、請求項８２記載のフラグメント。
【請求項８４】
生物サンプルにおいて、ヘパラナーゼ発現を検出する方法であって、
（ａ）生物サンプルと請求項７９〜８３のいずれかに記載のフラグメントとを反応させる工程、および
（ｂ）フラグメントを検出する工程
を含む方法。
【請求項８５】
前記フラグメントが標識を有する、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
前記標識が蛍光標識を含む、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
生物サンプルにおいて、ヘパラナーゼ発現を検出する方法であって、
（ａ）生物サンプルと配列番号９の配列と少なくとも８０％の相同性を共有するヘパラナーゼをエンコードする核酸に特異的な核酸配列を含む1つまたは複数のプローブとを反応させる工程、および
（ｂ）該反応により、ヘパラナーゼの発現を検出する工程
を含む方法。
【請求項８８】
該ヘパラナーゼをエンコードする核酸が配列番号９の配列と少なくとも９０％の相同性を共有する、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
前記反応が、生物サンプルにおけるＲＮＡ増幅を含む、請求項８７記載の方法。
【請求項９０】
前記ヘパラナーゼをエンコードする核酸がｈｐａ  ｃＤＮＡを含む、請求項８７〜８９記載の方法。
【請求項９１】
前記ｈｐａ  ｃＤＮＡが配列番号９に示される配列を含む、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
配列番号１０もしくは１４の配列と少なくとも８０％の同一性を共有するヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチド。
【請求項９３】
ポリペプチドが、配列番号１０または１４の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項９２記載のポリペプチド。
【請求項９４】
配列番号１０または１４に記載したアミノ酸配列を含む請求項９２記載のポリペプチド。
【請求項９５】
請求項９２〜９４のいずれかに記載の単離精製されたポリペプチド。
【請求項９６】
請求項９２〜９５のいずれかに記載の単離されたタンパク質／ポリペプチドを活性成分として含み、および薬学的に許容される担体を含む、製剤組成物。
【請求項９７】
配列番号１０もしくは１４の配列と少なくとも８０％の同一性を共有するヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって、組換えヘパラナーゼを発現する細胞を遺伝子的に改変する工程を含む、組換えヘパラナーゼタンパク質を製造する方法。
【請求項９８】
該ポリペプチドが配列番号１０または１４の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する、請求項９７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野および背景】
【０００１】
本発明はヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド（以下、ｈｐａという）、該ペプチドを含むベクターおよびヘパラナーゼを発現する移入細胞に関する。本発明はさらにヘパラナーゼ活性を有する組換えタンパク質に関する。
【０００２】
ヘパラン硫酸プロテオグリカン
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は脊椎動物および無脊椎動物組織の広範な細胞の細胞表面と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と会合している偏在性高分子である（１〜４）。基本的なＨＳＰＧ構造はタンパクコアから構成され、それに幾つかの線状ヘパラン硫酸鎖が共有結合している。これら多糖鎖は一般に様々な程度でＮ−およびＯ−結合硫酸部分およびＮ−結合アセチル基により置換されたヘキスロン酸およびＤ−グルコサミン二糖単位の繰返しから構成される（１〜４）。細胞の付着、増殖および分化におけるＥＣＭ分子の関与に関する研究は、胎児性形態形成、脈管形成、軸索派生および組織修復におけるＨＳＰＧの中心的役割を明らかにした（１〜５）。ＨＳＰＧは血管の顕著な成分である（３）。大型の脈管ではそれらが殆ど動脈内膜と血管中脈に濃縮しているが、一方、毛管ではそれが内皮下の基底膜に主に見出される。そこでＨＳＰＧは内皮細胞の増殖と移動を支え、毛管壁の構造を安定化する。コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンなどのＥＣＭ高分子と相互作用する、また、血漿膜上の異なる付着部位と相互作用するＨＳＰＧの能力は、ＥＣＭ成分の自己集合と不溶性においての、ならびに細胞の付着と運動においての、このプロテオグリカンの重要な役割を示唆している。従って、ヘパラン硫酸（ＨＳ）の切断は内皮下ＥＣＭの分解に至り、それ故、血液由来細胞の血管外遊出において決定的な役割を演じている可能性がある。ＨＳ異化作用は炎症、外傷修復、糖尿病、および癌転移において観察され、ＨＳを分解する酵素が病状の経過において重要な役割を演じていることを示唆している。ヘパラナーゼ活性は活性化免疫系細胞および高度転移癌細胞において説明されているが（６〜８）、ヘパラナーゼが病的症状の潜在的引き金の役割を果たしているか否か探究するための生物学的手段が欠如するために、研究のハンディキャップとなっている。
【０００３】
腫瘍細胞浸襲と転移におけるヘパラナーゼの関与：
異なる器官の毛管床に捕捉された循環腫瘍細胞は内皮細胞内膜に浸襲し、その下にある基底膜（ＢＭ）を分解して血管外組織に逃れようとするが、そこで腫瘍細胞は転移を確立する（９、１０）。転移腫瘍細胞は多くの場合隣接する内皮細胞間の細胞間接合部位またはその近傍に接着する。転移細胞のかかる接着は、接合部の離断、内皮細胞縁の退縮、内皮の裂け目を通して露呈された下層ＢＭへの移動へと続く（９）。内皮細胞とＢＭとの間に位置した浸襲細胞は、脈管区画外へ移動するために、ＢＭ内皮下の糖タンパク質およびプロテオグリカンを分解しなければならない。数種の細胞性酵素（例えば、コラゲナーゼＩＶ、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシンＢ、エラスターゼなど）はＢＭの分解に関与していると考えられている（１０）。これらの酵素の内、特定の鎖内部位でＨＳを切断するのがエンド−β−Ｄ−グルクロニダーゼ（ヘパラナーゼ）である（６、８、１１）。ＨＳ分解ヘパラナーゼの発現は、マウスのリンパ腫（１１）、線維肉腫、および黒色腫（メラノーマ）（８）細胞の転移潜在力と相関することが見出された。さらに、上昇したヘパラナーゼのレベルは転移腫瘍担持動物とメラノーマ患者の血清（８）および癌患者の腫瘍生検（１２）に検出された。
【０００４】
局所の微小環境による細胞増殖および腫瘍の進行の制御は、培養した角膜および脈管内皮細胞により産生される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と細胞との相互作用に焦点を絞り、本発明者らにより以前に検討された。この培養ＥＣＭはその形態学的な外観および分子組成においてin vivoでは内皮下層によく似ている。このものはコラーゲン（殆どがタイプIIIおよびIVであり、少量のタイプＩおよびＶを含む）、プロテオグリカン（殆どがヘパラン硫酸−およびデルマタン硫酸−プロテオグリカンであり、少量のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを含む）、ラミニン、フィブロネクチン、エンタクチンおよびエラスチンを含んでいる（１３，１４）。細胞が培養ＥＣＭにおいてＨＳを分解する能力については、細胞が代謝により硫酸標識されたＥＣＭと相互作用するようにして、次いで培地中に放出された分解産物をゲル濾過（セファロース６Ｂ）により分析することにより検討した（１１）。未変化のＨＳＰＧがカラムのボイド容量の次に溶出される（Ｋａｖ＜０．２、Ｍｒ〜０．５×１０６）一方、ＨＳ側鎖の標識された分解フラグメントはカラムのよりＶｔ方向で溶出される（０．５＜ｋａｖ＜０．８、Ｍｒ＝５〜７×１０３）（１１）。
【０００５】
血液由来細胞の血管外遊出防止に潜在的に使用し得る種々非抗凝血性種ヘパリンのヘパラナーゼ阻害効果についても本発明者らが検討した。ヘパラナーゼの阻害作用は、１６以上の糖単位を含み、N位置とO位置双方に硫酸基を有するヘパリン類により最適に達成された。O−脱硫酸化がヘパリンのヘパラナーゼ阻害効果を無効にする一方、O−硫酸化、N−アセチル化ヘパリンは、該N−置換分子が約４，０００ダルトン以上の分子サイズ有する場合に、高い阻害活性を維持した（７）。実験動物をヘパラナーゼ・インヒビター（例えば、ヘパリンの非−抗凝血種）で処理すると、Ｂ１６メラノーマ、ルイス肺癌および乳房腺癌の細胞により誘発される肺転移の発生率を顕著に減少させた（＞９０％）（７、８、１６）。抗トロンビンIIIに対し高度および低度親和性を有するヘパリンフラクションは同等の高い抗転移活性を示したが、このことは、ヘパリン活性を阻害するヘパラナーゼが、その抗凝血活性よりもむしろ、多糖の抗転移性において役割を果たしていることを示している（７）。
【０００６】
癌患者尿のヘパラナーゼ活性：
ヘパラナーゼの腫瘍進行への関わりとそのヒト癌との関連性をさらに解明するために、ヘパラナーゼ活性用尿サンプルについてスクリーニングを試行した（１６ａ）。ヘパラナーゼ活性はすべてではないが、一部癌患者の尿に検出された。高レベルのヘパラナーゼ活性が攻撃性転移疾患患者尿に定量されたが、健常提供者尿には検出し得る活性はなかった。
【０００７】
ヘパラナーゼ活性は正常者および微量アルブミン尿インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）患者の２０％の尿にも検出されたが、その殆どが糖尿病性腎症によると思われるもので、成人では腎不全に至る最も重要な独立の障害である。
【０００８】
腫瘍脈管形成におけるヘパラナーゼ関与の可能性
線維芽細胞増殖因子はヘパリンに対する高い親和性により特徴づけられる一群の構造的に関連するポリペプチドである（１７）。これらは血管内皮細胞にとって高度に分裂促進性であって、血管新生の最も強力な誘発物質の一つである（１７，１８）。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）はin vitroで産生される内皮下のＥＣＭから（１９）、また、角膜のＢＭから（２０）抽出されるが、このことはＥＣＭがｂＦＧＦの貯臓所としての役割を担っている可能性を示唆している。免疫組織化学染色は多様な組織および血管の基底膜にｂＦＧＦが局在していることを明らかにした（２１）。ｂＦＧＦが正常組織の至る所に存在しているにもかかわらず、これら組織の内皮細胞増殖は通常非常に低く、ｂＦＧＦがその作用部位から幾分隔離されていることを示唆している。ｂＦＧＦとＥＣＭの相互作用に関する研究が解明したところによると、ｂＦＧＦはＥＣＭのＨＳＰＧに結合し、ＨＳ分解酵素により活性型として放出される（１５、２０、２２）。血小板、肥満細胞、好中球およびリンパ腫細胞により発現されるヘパラナーゼ活性はＥＣＭおよび基底膜からの活性なｂＦＧＦ放出に関与しているが（２３）、これはヘパラナーゼ活性が細胞移動と浸襲において機能するばかりではなく、間接的に血管新生応答を生じていることをも示唆している。これらの結果は、ＥＣＭ ＨＳＰＧがｂＦＧＦおよび恐らく他のヘパリン結合増殖促進因子の天然保存貯蔵所を提供していることを示唆する（２４，２５）。従って、基底膜とＥＣＭ内のその貯蔵庫からｂＦＧＦを置換えることで、正常状態および病的状態での血管新生誘発に対する新しいメカニズムを提供し得る可能性がある。
【０００９】
最近の研究が示すところによると、ヘパリンとＨＳはｂＦＧＦが高親和性細胞表面レセプターに結合する際に、またはｂＦＧＦ細胞のシグナリングに関与している（２６、２７）。さらに、最適効果に必要なＨＳサイズはヘパラナーゼにより放出されるＨＳフラグメントのサイズに類似していた（２８）。同様の結果が脈管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）により得られたが（２９）、これはヘパリン結合増殖因子との細胞相互作用にＨＳを巻き込む二重レセプターメカニズムの作用を示唆している。したがって、ＥＣＭの内皮細胞増殖因子を制限することで脈管内皮に対する全身作用を防止し、結果として非常に緩やかな内皮細胞交替と脈管増殖を維持しているのだとする提案がなされている。他方、ＨＳフラグメントとの複合体としてｂＦＧＦのＥＣＭ貯蔵庫からの放出が、外傷修復、炎症および腫瘍成長などの過程において、局在化した内皮細胞増殖と血管新生を促す可能性もある（２４、２５）。
【００１０】
免疫系細胞によるヘパラナーゼの発現
ヘパラナーゼ活性は循環系に遊離する免疫系の活性化細胞能力と相関し、炎症と自己免疫応答の両方を引き出す。血小板、顆粒球、ＴおよびＢリンパ球、マクロファージおよび肥満細胞と内皮下ＥＣＭとの相互作用は、特異的なヘパラナーゼ活性によるヘパラン硫酸（ＨＳ）の分解と関係している（６）。酵素は種々の活性化シグナル（例えば、トロンビン、カルシウムイオノホア、免疫複合体、抗原、分裂促進因子など）に応答して細胞内画分（例えば、リソソーム、特異顆粒など）から放出されるが、これは炎症と細胞免疫性においてそれが調整されて関与していることを示唆している。
【００１１】
ヘパラナーゼ酵素に関する幾つかの所見が文献番号６に概括されており、リストにすると以下のとおりである
第一に、タンパク分解活性（プラスミノーゲン活性化因子）およびヘパラナーゼは炎症性白血球と悪性腫瘍細胞によるＥＣＭ ＨＳＰＧの連続的分解に相乗的に関与する。
【００１２】
第二に、血小板ヘパラナーゼの大型の集団は、潜伏性の形状で、恐らくコンドロイチン硫酸との複合体として存在する。潜伏性酵素は腫瘍細胞誘導因子により活性化され、次いで腫瘍転移の過程で脈管内皮を通過する細胞浸襲を容易にする。
【００１３】
第三に、α−顆粒からの血小板ヘパラナーゼ放出は強力な刺激因子（すなわち、トロンビン）により誘発されるが、ＥＣＭ上の血小板活性化には応答しない。
【００１４】
第四に、好中球ヘパラナーゼは閾値活性化に応答して、また、ＥＣＭ上の細胞培養にもとづいて優先的に容易に放出される。
【００１５】
第五に、好中球とＥＣＭの接触は有害な酵素（プロテアーゼ、リゾチーム）と酸素ラジカルの放出を阻害するが、血管外遊出を可能とする酵素（ヘパラナーゼ、ゲラチナーゼ）の放出は阻害しない。この内皮下ＥＣＭの防御的役割は、細胞を可溶性因子により刺激したときには観測されるが、貪食性刺激因子では観測されなかった。
【００１６】
第六に、細胞内ヘパラナーゼはＴ細胞系を特異抗原に露呈して後、数分以内に分泌される。
【００１７】
第七に、分裂促進因子（ＣｏｎＡ、ＬＰＳ）はin vitroで維持された正常ＴおよびＢリンパ球によるヘパラナーゼの合成と分泌を誘導する。Ｔリンパ球ヘパラナーゼはin vivoにおいて抗原での免疫によっても誘導される。
【００１８】
第八に、ヘパラナーゼ活性はプレ−Ｂリンパ腫およびＢリンパ腫によって発現されるが、プラズマ細胞腫および休止正常Ｂリンパ球によっては発現されない。
【００１９】
第九に、ヘパラナーゼ活性はＥＣＭとの培養において活性化マクロファージにより発現されるが、培養媒体中への該酵素は放出がわずかであるか、あるいは放出されない。同様の結果が成熟マクロファージに分化するよう誘発されたヒト骨髄性白血病細胞により得られた。
【００２０】
第十に、Ｔ細胞介在遅延型過敏症および実験的自己免疫はヘパラナーゼ阻害性非抗凝集性種ヘパリンの低用量により抑制される（３０）。
【００２１】
第十一に、血小板、好中球および転移性腫瘍細胞により発現されるヘパラナーゼ活性はＥＣＭおよび基底膜から活性ｂＦＧＦを放出する。ＥＣＭに貯留されたｂＦＧＦが放出されると、外傷の修復、炎症および腫瘍発生などの工程において局在化した血管新生応答を誘導する可能性がある。
【００２２】
第十二に、in vivoでのＴ細胞介在炎症を阻害し得る三硫酸化二糖はヘパラナーゼにより生成したＥＣＭの分解産物の一つである（３１）。この阻害は活性化Ｔ細胞によるin vitro生物活性ＴＮＦαの産生における該二糖の阻害効果と関連づけられた（３１）。
【００２３】
その他の有力な治療応用
腫瘍細胞転移、炎症および自己免疫にヘパラナーゼが関与していることとは別にして、哺乳動物ヘパラナーゼは、ヘパリン結合増殖因子の生物利用能を調整すること（１５）、ヘパリン結合増殖因子（例、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ）およびサイトカイン（ＩＬ−８）への細胞性応答を調整すること（３１ａ、２９）、血漿リポタンパク質との細胞相互作用を調整すること（３２）、特定のウイルス性、ある種細菌性および原生動物性感染に対する細胞の感受性を調整すること（３３、３３ａ、３３ｂ）、およびアミロイド・プラークの分解を調整すること（３４）などに応用し得る。このように、ヘパラナーゼは外傷修復、脈管形成、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、炎症、神経変性疾患およびウイルス感染などの症状に有用であることが分かる。哺乳動物ヘパラナーゼは血漿ヘパリンを中和するための有力なプロタミン置換体として使用することができる。抗ヘパラナーゼ抗体は、生検標本、血漿サンプルおよび体液における微小転移、自己免疫病変および腎不全の免疫検出および診断に応用し得る。基礎研究における一般的な使用も期待される。
【００２４】
ヘパラナーゼ酵素をエンコードするｈｐａ遺伝子の同定は異種発現系での組換え酵素産生を可能とする。組換えタンパク質を利用し得ることは、タンパク質の構造機能を解明する方法を確かなものとし、新規なインヒビターの開発手段を提供することとなる。
【００２５】
ウイルス感染
細胞表面にヘパラン硫酸が存在することは、単純ヘルペス（３３）およびデング熱ウイルス（３３ａ）の結合にとって、また細胞の引続く感染にとっての主要な要件であることが示されている。したがって、ヘパラナーゼにより細胞表面ヘパラン硫酸を除去することがウイルス感染を妨げることになる。事実、（ヘパラン硫酸を分解する）細菌性ヘパリチナーゼまたは（ヘパランを分解する）ヘパリナーゼで細胞を処理すると、２種の関連する動物ヘルペスウイルスが細胞に結合するのを減少させ、かつ、ウイルス感染に対して細胞が少なくとも部分的に抵抗するようになった（３３）。細胞表面ヘパラン硫酸はＨＩＶ感染にも関与しているという幾つかの徴候がある（３３ｂ）。
【００２６】
神経変性疾患
ヘパラン硫酸プロテオグリカンはゲルストマン−シュトロイスラー症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病およびスクラピーのプリオンタンパク質アミロイドプラーク中に同定された（３４）。ヘパラナーゼはこれらのアミロイドプラークを分解させるが、該プラークはアルツハイマー病の病因的役割を演じるとも考えられる。
【００２７】
再狭窄およびアテローム性動脈硬化症
内皮傷害に応答した動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖とコレステロールに富むリポタンパク質の蓄積は、アテローム性動脈硬化症と再狭窄の病因における基本的事象である（３５）。ＨＳがＳＭＣ増殖に関与すること（すなわち、ヘパリン結合増殖因子に対する低親和性レセプター）とは別に、ＨＳはリポタンパク質の結合、保持および取込みにも関与している（３６）。ＨＳＰＧおよびリポタンパク質リパーゼは、コレステロールに富むリポタンパク質の実質的細胞内および腸内蓄積を可能とする新しい異化経路に関わっていることが証明された（３２）。後者の経路はアポＢおよびアポＥに富むリポタンパク質（すなわち、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、キロミクロン）の蓄積を促進することにより高度にアテローム発生的であると予測されるが、細胞ステロール含有によるフィードバック阻害からは独立している。したがって、ヘパラナーゼによりＳＭＣ ＨＳを除去すると、ＳＭＣ増殖と脂質蓄積の両方が阻害されると期待され、したがって、再狭窄およびアテローム性動脈硬化症の進行を停止させる可能性がある。
【００２８】
このように、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド、それを保持するベクター、ヘパラナーゼを発現する形質導入細胞、およびヘパラナーゼ活性を有する組換えタンパク質に対する必要性が広く認識され、それらを所有することが非常に有利となろう。
【００２９】
【発明の概要】
本発明によると、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド（以下では、ｈｐａ、ｈｐａ ｃＤＮＡまたはｈｐａ遺伝子という）、それを保持するベクター、ヘパラナーゼを発現する形質導入細胞、およびヘパラナーゼ活性を有する組換えタンパク質が提供される。
【００３０】
ヘパラナーゼをエンコードするヒトｈｐａ遺伝子のクローニングおよび形質導入宿主細胞による組換えヘパラナーゼの発現を報告する。
【００３１】
ヒト肝癌細胞から単離したヘパラナーゼの精製調製物をトリプシン消化およびミクロ配列決定に付した。解明したＹＧＰＤＶＧＱＰＲ（配列番号８）配列は、対応する逆翻訳ＤＮＡ配列に対する相同性についてのＥＳＴデータベースをスクリーニングするのに用いた。２つの密接に関連するＥＳＴ配列を同定し、その後同一であることを見出した。両クローンは１０２０ｂｐの挿入断片を含んでおり、該挿入断片は９７３ｂｐのオープン読み枠を含み、それに引き続いて２７ｂｐの３’非翻訳領域とポリＡ尾部を含んでいた。翻訳開始部位は同定されなかった。
【００３２】
５’末端欠如ｈｐａのクローニングは、胎盤マラソン（Marathon）ＲＡＣＥｃＤＮＡ複合体からのＤＮＡのＰＣＲ増幅により、ＥＳＴクローン配列に従い選択したプライマーと複合体のリンカーを用い実施した。同定した３’エンコードＥＳＴクローンと一部重なり合っている９００ｂｐのＰＣＲフラグメントが得られた。接合したｃＤＮＡフラグメント（ｈｐａ）（１７２１ｂｐの長さ、配列番号９）は、６１，１９２ダルトンの計算値分子量を有する５４３アミノ酸のポリペプチド（配列番号１０）をエンコードするオープン読み枠を含んでいた。
【００３３】
伸長した５’配列のクローニングは、マラソンＲＡＣＥを用いるＰＣＲ増幅によりヒトＳＫ−ｈｅｐ１細胞系から可能であった。ＳＫ−ｈｅｐ１ ｈｐａ ｃＤＮＡの５’伸長配列はヒト胎盤から単離したｈｐａ ｃＤＮＡの配列と統合した（配列番号９）。統合した配列は、６６，４０７ダルトンの計算値分子量を有する５９２アミノ酸のポリペプチド（配列番号１４と１５に示した）をエンコードするオープン読み枠（配列番号１３および１５）を含んでいた。
【００３４】
in vitroアッセイにおいてヘパラン硫酸の分解を触媒するｈｐａ遺伝子産物の能力を、バキュロウイルス発現系を用い、昆虫細胞においてｈｐａ全オープン読み枠を発現することにより試験した。ｈｐａ遺伝子含有ウイルスで感染させた細胞の抽出物と調整培地が、可溶性ＥＣＭ誘導ＨＳＰＧおよび未処理ＥＣＭに対する高レベルのヘパラン硫酸分解活性を示した。この分解活性は、ヘパラナーゼのもう一つの基質であるヘパリンにより阻害された。ｈｐａ遺伝子不含の同様の構築物を感染させた細胞はかかる活性を示さず、非感染細胞の活性をも示さなかった。伸長した５’クローンから発現したヘパラナーゼのヘパリンに対する能力は哺乳動物発現系において証明された。
【００３５】
種々の組織および細胞系におけるｈｐａＲＮＡの発現パターンは、ＲＴ−ＰＣＲにより検討した。ヘパラナーゼ活性を有することがすでに知られている組織および細胞においてのみ発現されることが判明した。
【００３６】
単一染色体ヒト／ＣＨＯとヒト／マウス体細胞ハイブリッドのパネルを用い、ヒト染色体４にヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を位置づけた。新たに単離したヘパラナーゼ配列を用い、染色体スプレッドのヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域を同定することができる。
【００３７】
以下に記載の本発明の好適な態様におけるさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性を有するポリペプチドエンコードポリヌクレオチド配列を包含するポリヌクレオチドフラグメントが提供される。
【００３８】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、該ポリヌクレオチドフラグメントとは、全ヒトヘパラナーゼ酵素をエンコードする配列番号９のヌクレオチド６３〜１６９１または配列番号１３のヌクレオチド１３９〜１８６９である。
【００３９】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ｈｐａ ｃＤＮＡ、特に配列番号９のヌクレオチド１〜７２１とハイブリッド形成し得るポリヌクレオチド配列を包含するポリヌクレオチドフラグメントが提供される。
【００４０】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号９または１３と少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも７０％の相同性、より好ましくは少なくとも８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。
【００４１】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、本発明によるポリヌクレオチドフラグメントは配列番号９または１３の一部（フラグメント）を包含する。例えば、かかるフラグメントはヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードする配列番号９のヌクレオチド６３〜７２１および／または配列番号９のセグメントを包含し得た。
【００４２】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、該ポリヌクレオチドフラグメントによりエンコードされるポリペプチドは配列番号１０または１４に記載のアミノ酸配列またはその機能的部分を包含する。
【００４３】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、該ポリヌクレオチド配列はヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードし、該ポリペプチドは配列番号１０または１４と少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも７０％の相同性、より好ましくは少なくとも８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。
【００４４】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、該ポリヌクレオチドフラグメントはヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードし、該ポリペプチドは、したがって、配列番号１０または１４に記載のアミノ酸配列の対立遺伝子、種および／または誘発変異体であってもよい。かかる変異体はいずれも相同体とも見なし得ると理解される。
【００４５】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、上記ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド鎖の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドフラグメントが提供される。
【００４６】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列包含のベクターが提供される。
【００４７】
該ベクターはファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクミドまたは人工染色体をも含む適切な形状のいずれであってもよいが、これらに限定されるものではない。ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列は上記のポリヌクレオチドフラグメントのいずれをも包含する。
【００４８】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列包含の外来性ポリヌクレオチドフラグメントを包含する宿主細胞が提供される。
【００４９】
該外来性ポリヌクレオチドフラグメントは上記フラグメントのいずれであってもよい。該宿主細胞は原核細胞、真核細胞、細胞系、または多細胞性生物の一部としての細胞（例、形質転換生物の細胞）などのいずれの形状であってもよい。
【００５０】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタンパク質が提供される。
【００５１】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性保有組換えタンパク質を活性成分として含んでなる製剤組成物が提供される。
【００５２】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性保有組換えタンパク質を活性成分として含む医療用装置からなる医療用機器が提供される。
【００５３】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、ヘパラナーゼ触媒活性の過剰発現細胞を含んでなるヘパラナーゼ過剰発現系が提供される。
【００５４】
記載した好適な態様におけるなおさらなる特徴によると、染色体スプレッドのヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域を同定する方法であって、（ａ）該染色体スプレッドを、ヘパラナーゼをエンコードする標識ポリヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させる工程、（ｂ）染色体スプレッドを洗浄し、過剰のハイブリッド非形成プローブを除去する工程、および（ｃ）当該ハイブリッド形成した標識ポリヌクレオチドプローブと会合したシグナルを検索し、検出されたシグナルがヒトヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域の指標であるとする工程からなる方法が提供される。
【００５５】
本発明を用い、腫瘍細胞転移、炎症および自己免疫を阻害する新薬を開発することができる。ヘパラナーゼ酵素をエンコードするｈｐａ遺伝子の同定が異種発現系においての組換え酵素産生を可能とする。
【００５６】
【好適な実施例の説明】
本発明は、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド（以下では置換え可能なものとして、ｈｐａ、ｈｐａ ｃＤＮＡまたはｈｐａ遺伝子という）、それを保持するベクター、ヘパラナーゼを発現する形質導入細胞、およびヘパラナーゼ活性を有する組換えタンパク質に関する。
【００５７】
本発明の少なくとも一つの態様を詳細に説明する前に、本発明はその応用に当って、以下の説明で述べた、あるいは図面で説明した成分の構築および配列の細部に限定されるものではないことを理解すべきである。本発明は様々な方法で具体化され、または実用化され、または実施され得る。また、本明細書で採用した表現法および用語法は説明を目的とするものであり、制限することを意図したものではないことを理解すべきである。
【００５８】
本発明を用い、種々疾患の治療法を開発し、これら疾患に対する診断アッセイ法を開発し、また、基礎研究、とりわけ医薬・生物学の領域における基礎研究のための新しい手段を提供することができる。
【００５９】
特に、本発明を用い、腫瘍細胞転移、炎症および自己免疫を阻害するための新薬を開発することができる。ヘパラナーゼ酵素をエンコードするｈｐａ遺伝子の同定が異種発現系においての組換え酵素産生を可能とする。
【００６０】
さらに、本発明を用い、ヘパリン結合増殖因子の生物利用能、ヘパリン結合増殖因子（例、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ）およびサイトカイン（ＩＬ−８）への細胞性応答、血漿リポタンパク質との細胞相互作用、ウイルス性、原生動物性およびある種細菌性感染に対する細胞の感受性、および神経変性プラークの分解などを調整することができる。このように、組換えヘパラナーゼは外傷修復、脈管形成、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、炎症、神経変性疾患（例えば、ゲルストマン−シュトロイスラー症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病、スクラピーおよびアルツハイマー病など）および特定のウイルス感染およびある種細菌性および原生動物性感染などの有力な治療手段である。組換えヘパラナーゼは血漿ヘパリンを中和するための有力なプロタミン置換体として使用することができる。
【００６１】
本明細書において使用する用語「調整する」とは、疾患の進行を実質的に阻害すること、減速すること、または逆行させること、あるいは疾患または症状の臨床症候を実質的に改善すること、あるいは疾患または症状の臨床症候発現を実質的に防止することを意味する。したがって、「モジュレーター」とは疾患または症状を調整し得る作因物質を意味する。ウイルス性、原生動物性および細菌性感染の調整とは、ウイルス、細菌または原生動物の活性および／またはウイルス、細菌または原生動物の生活環期を実質的に中断、防止または低下させる効果、あるいはヒトまたは他の動物などの被験体においてウイルス、細菌または原生動物による感染を低下または防止する効果を意味する。
【００６２】
本明細書において使用する用語「外傷」とは、被験者身体のいずれかの部位に対する傷害を意味し、急性症状、例えば、熱傷、化学傷、放射線熱傷、日焼けなどの紫外線照射に過度に露出したことによる熱傷など、身体組織の損傷、例えば、分娩および出産の結果による会陰損傷などの医療処置に際し被る損傷、例えば、会陰切開、切傷などの外傷誘発損傷、例えば、自動車事故および他の機械事故において被る損傷、および弾丸、ナイフ、その他の武器類、および術後損傷など、ならびに慢性的症状、例えば、褥瘡、床擦れ、糖尿病および循環不全に関連する症状、およびすべてのタイプのざ瘡（にきび）などを意味するが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
組換え酵素に対して作製した抗ヘパラナーゼ抗体は、生検標本、血漿サンプルおよび体液における微小転移、自己免疫病変および腎不全の免疫検出および診断に有用である。かかる抗体はヘパラナーゼ活性に対する中和剤としても作用する。
【００６４】
ヘパラナーゼをエンコードするヒトｈｐａ遺伝子のクローニングおよび形質導入細胞による組換えヘパラナーゼの発現を本明細書に報告する。これはクローン化される最初の哺乳動物ヘパラナーゼ遺伝子である。
【００６５】
ヒト肝癌細胞から単離したヘパラナーゼの精製調製物をトリプシン消化およびミクロ配列決定に付した。
【００６６】
解明したＹＧＰＤＶＧＱＰＲ（配列番号８）配列は、対応する逆翻訳ＤＮＡ配列に対する相同性についてのＥＳＴデータベースをスクリーニングするのに用いた。２つの密接に関連するＥＳＴ配列を同定し、その後同一であることを見出した。
【００６７】
両クローンは１０２０ｂｐの挿入断片を含んでおり、該挿入断片は９７３ｂｐのオープン読み枠を含み、それに引き続いて２７ｂｐの３’非翻訳領域とポリＡ尾部を含んでいた。翻訳開始部位は同定されなかった。
【００６８】
５’末端欠如のクローニングは、胎盤マラソン（Marathon）ＲＡＣＥｃＤＮＡ複合体からのＤＮＡのＰＣＲ増幅により、ＥＳＴクローン配列に従い選択したプライマーと複合体のリンカーを用い実施した。
【００６９】
同定した３’エンコードＥＳＴクローンと一部重なり合っている９００ｂｐのＰＣＲフラグメントが得られた。接合したｃＤＮＡフラグメント（ｈｐａ）（１７２１ｂｐの長さ、配列番号９）は、図１および配列番号１１に示すように、６１，１９２ダルトンの計算値分子量を有する５４３アミノ酸のポリペプチド（配列番号１０）をエンコードするオープン読み枠を含んでいた。
【００７０】
ＥＳＴとＰＣＲ増幅ｃＤＮＡとの間の７９９位（ＡからＴ）に単一ヌクレオチドの差異が観察された。この差異は１個のアミノ酸置換（ＴｙｒからＰｈｅ）に至る（図１）。さらに、公開されたＥＳＴ配列は未同定ヌクレオチドを含んでいたが、ＥＳＴクローン両方のＤＮＡ配列決定により２個のヌクレオチドに分解した（それぞれ、配列番号９の１６３０位および１６３１位のＧおよびＣ）。
【００７１】
in vitroアッセイにおいてヘパラン硫酸の分解を触媒するｈｐａ遺伝子産物の能力を、バキュロウイルス発現系を用い、昆虫細胞中全オープン読み枠を発現することにより試験した。
【００７２】
ｈｐａ遺伝子含有ウイルスで感染させた細胞の抽出物と調整培地が、可溶性ＥＣＭ誘導ＨＳＰＧおよび未処理ＥＣＭに対する高レベルのヘパラン硫酸分解活性を示したが、この分解活性は、ヘパリンにより阻害された。一方、ｈｐａ遺伝子不含の同様の構築物を感染させた細胞はかかる活性を示さず、非感染細胞の活性をも示さなかった。
【００７３】
種々の組織および細胞系におけるｈｐａＲＮＡの発現パターンは、ＲＴ−ＰＣＲにより検討した。ヘパラナーゼ活性を有することがすでに知られている組織および細胞においてのみ発現されることが判明した。
【００７４】
伸長した５’配列のクローニングは、マラソンＲＡＣＥを用いるＰＣＲ増幅によりヒトＳＫ−ｈｅｐ１細胞系から可能であった。ＳＫ−ｈｅｐ１ ｈｐａ ｃＤＮＡの５’伸長配列はヒト胎盤から単離したｈｐａ ｃＤＮＡの配列と統合した（配列番号９）。統合した配列は、６６，４０７ダルトンの計算値分子量を有する５９２アミノ酸のポリペプチド（配列番号１４と１５に示した）をエンコードするオープン読み枠（配列番号１３および１５）を含んでいた。このオープン読み枠は哺乳動物細胞発現系において触媒的に活性なヘパラナーゼの発現を指向していることが示された。発現されたヘパラナーゼは抗ヘパラナーゼ抗体によりウエスターンブロット分析において検出し得た。
【００７５】
単一染色体ヒト／ＣＨＯとヒト／マウス体細胞ハイブリッドのパネルを用い、ヒト染色体４にヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を位置づけた。したがって、新たに単離したヘパラナーゼ配列を用い、染色体スプレッドのヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を包含する染色体領域を同定することができる。
【００７６】
このように、本発明によりヘパラナーゼ触媒活性を有するポリペプチドエンコードポリヌクレオチド配列を包含するポリヌクレオチドフラグメント（ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖）が提供される。
【００７７】
用語「ヘパラナーゼ触媒活性」またはその等価の用語「ヘパラナーゼ活性」とは両方ともに、ヘパランまたはヘパラン硫酸プロテオグリカン基質に特異的な哺乳動物エンドグリコシダーゼ水解活性をいい、ヘパリンまたはヘパラン硫酸をβ−脱離により分解する細菌酵素（ヘパラナーゼＩ、IIおよびIII）の活性に対立するものである（３７）。
【００７８】
本発明の好適な態様において、ポリヌクレオチドフラグメントは、全ヒト・ヘパラナーゼ酵素をエンコードする配列番号９のヌクレオチド６３〜１６９１または配列番号１３のヌクレオチド１３９〜１８６９である。
【００７９】
しかし、本発明の範囲は、ヒト・ヘパラナーゼが哺乳動物ヘパラナーゼをエンコードするオープン読み枠（ＯＲＦ）の最初の開示である以上、ヒト・ヘパラナーゼに限定されるものではない。ｈｐａ ｃＤＮＡ、その一部またはその配列に従って設計した合成オリゴヌクレオチドを用いることは、当業者が他の哺乳動物種の相同配列を含むゲノムおよび／またはｃＤＮＡクローンの同定を可能とする。
【００８０】
それゆえ、本発明は、ｈｐａ ｃＤＮＡ、とりわけ配列番号９のヌクレオチド１〜７２１とハイブリッド形成し得る（緊縮または許容ハイブリッド形成の条件下対合する塩基であって、例えば、サムブルーク、フリッシュ、マニアティス（Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.）（１９８９）分子クローニング。実験室マニュアル。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク）ポリヌクレオチド配列を包含するポリヌクレオチドフラグメントをさらに目的とする。
【００８１】
事実、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードし、配列番号９または１３と少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも７０％の相同性、より好ましくは少なくとも８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するポリヌクレオチド配列は、本発明範囲内のものである。
【００８２】
本発明によるポリヌクレオチドフラグメントは配列番号９または１３のいずれの部分を包含してもよい。例えば、新規配列である配列番号９のヌクレオチド６３〜７２１を包含する。しかし、ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードする配列番号９または１３のセグメントも包含する。
【００８３】
「ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードする」という文言を本文および下記請求項で用いる場合、それはポリペプチドの合成を指向する能力をいい、その活性を必要とする場合には、翻訳後修飾、例えば、これらに限定されるものではないが、タンパク質分解（例、シグナルペプチドの除去およびプロ−またはプレ−タンパク質配列の除去）、メチオニン修飾、糖化、アルキル化（例、メチル化）、アセチル化などの後に、例えば、ＥＣＭおよび細胞表面会合ＨＳの分解において触媒的に活性となるポリペプチドの合成指向能力をいう。
【００８４】
本発明の好適な態様において、ポリヌクレオチドフラグメントによりエンコードされるポリペプチドは、配列番号１０または１４に示したアミノ酸配列またはその機能的部分、すなわちヘパラナーゼ触媒活性を有する部分を含む。
【００８５】
しかし、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドフラグメントは本発明の範囲内のものである。したがって、該ポリペプチドは配列番号１０または１４に記載のアミノ酸配列またはその機能的部分の対立遺伝子、種および／または誘発変異体であってもよい。
【００８６】
事実、ヘパラナーゼ活性保有ポリペプチドをエンコードし、配列番号１０または１４と少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも７０％の相同性、より好ましくは少なくとも８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するポリヌクレオチド配列は、本発明範囲内のものである。
【００８７】
また、本発明は上記ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド鎖の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドフラグメントの提供をも目的とする。本明細書にて使用する「相補的」という用語は塩基が対合する能力をいう。
【００８８】
一本鎖ポリヌクレオチドフラグメントはＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、あるいはヌクレオチド類似体（例、チオ化ヌクレオチド）を含んでいてもよく、それは合成オリゴヌクレオチドであっても、形質導入宿主細胞により作製されたものであってもよく、特異的な塩基対合を供与する限り所望の鎖長のものであってもよく（例えば、８または１０、好ましくはより長いヌクレオチド）、また、塩基対合を妨害しない限りミスマッチを含んでいてもよい。
【００８９】
本発明はさらにヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を包含するベクターの提供を目的とする。
【００９０】
ベクターはどのタイプのものであってもよい。例えば、細菌に感染するファージまたは真核細胞に感染するウイルである。また、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクミド、または人工染色体であってもよい。ヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列は、上記ポリヌクレオチドフラグメントのいずれを含んでいてもよい。
【００９１】
本発明はさらにヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードする外来性ポリヌクレオチドフラグメントを包含する宿主細胞の提供を目的とする。
【００９２】
外来性ポリヌクレオチドフラグメントは上記フラグメントのいずれであってもよい。該宿主細胞はどのタイプのものであってもよい。例えば、それは原核細胞、真核細胞、細胞系、または生物の一部としての細胞である。外来性ポリヌクレオチドフラグメントは該細胞中に永続的に、または一過性に存在するものであってよい。換言すると、安定的または一過性のトランスフェクション、形質転換または形質導入により得られる形質導入細胞はすべて本発明範囲内のものである。本明細書に用いる「外来性」という用語は、ポリヌクレオチドフラグメントが外部から細胞に導入されるという事実をいう。そこで該フラグメントは複数コピーの一つに存在してもよく、また、１以上の染色体のいずれの部位に集積していてもよく、また、染色体外物質として存在してもよい。
【００９３】
本発明はさらにヘパラナーゼ触媒活性を過度に発現する細胞を含むヘパラナーゼ過度発現系の提供を目的とする。該細胞はヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列とヘパラナーゼ過度発現指向の適切なプロモーターおよびエンハンサー配列を含む適切なベクターを一過性にまたは安定的に移入したまたは形質転換した宿主細胞である。しかし、過度発現細胞は、発現細胞の内因性ヘパラナーゼ遺伝子下流のプロモーターおよび／またはエンハンサー配列挿入断片からの（例えば、相同性組換えによる）産物でもあり、該内因性遺伝子からの過度発現を指向する。本明細書本文および請求項にて使用する「過度発現」という用語は、発現のレベルが、他の点で同一の条件下にある所定の細胞を典型的に特徴づける基礎発現レベルよりも高いものをいう。
【００９４】
本発明はさらにヘパラナーゼ触媒活性保有ポリペプチドを含む組換えタンパク質の提供を目的とする。
【００９５】
該組換えタンパク質は簡便なタンパク質精製手法により均一に近い状態まで精製することおよび／または添加物と混合することが可能である。該組換えタンパク質は上記細胞のいずれかを用い生産することができる。該組換えタンパク質はいかなる形状であってもよい。それは結晶形、脱水粉末形または溶液でもよい。該組換えタンパク質は純粋なヘパラナーゼを得るのに有用であり、さらに抗ヘパラナーゼ抗体、すなわちポリまたはモノクローナル抗体の誘出に、また、抗ヘパラナーゼインヒビターまたは薬物スクリーニング検定またはシステムにおけるスクリーニング活性成分として有用である。
【００９６】
本発明はさらにヘパラナーゼ触媒活性保有組換えタンパク質を活性成分として含む製剤組成物の提供を目的とする。
【００９７】
局所投与用製剤はローション、軟膏、ゲル剤、クリーム、坐剤、ドロップ、液剤、噴霧剤および粉剤を包含するが、これらに限定されるものではない。常套の製剤担体、水剤、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要な場合、また望ましい場合もある。被覆コンドーム、ステント、活性パッド、および他の医療装置もまた有用である。事実、本発明の範囲はヘパラナーゼ触媒活性保有組換えタンパク質を活性成分として含む医療装置などの医療機器を包含する。
【００９８】
経口投与用組成物は粉剤または顆粒、水中または非水媒体中懸濁液または溶液、薬包、カプセルまたは錠剤などを包含する。増粘剤、希釈剤、矯味剤、分散剤、乳化剤または結合剤などが望ましい場合がある。
【００９９】
非経口投与用製剤は、緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加物をも含み得る無菌水溶液を包含するが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
投与は治療すべき症状の重度および感受性にもよるが、通常、一日一回または数回、数日ないし数ヶ月、または治療効果が現われるまでの、あるいは病状の衰退が達成されるまでの連続した治療方針をもって実施する。当業者は最適の用量、投与方法および反復度数を容易に決定することができる。
【０１０１】
さらに本発明によると、染色体スプレッド中にヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を含んでいる染色体領域の同定方法が提供される。該方法は以下の方法工程を満たして実施される。最初の工程においては、染色体スプレッド（静止期または中期いずれかのスプレッド）を、ヘパラナーゼをエンコードする標識ポリヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させる。該標識は、好ましくは、蛍光標識である。本方法の第二工程において、染色体スプレッドは洗浄して、過剰のハイブリッド非形成プローブを除去する。最後に、ハイブリッド形成した標識ポリヌクレオチドプローブと会合したシグナルを検索し、ヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を含んでいる染色体領域の標であるシグナルを検出する。当業者は適切な標識反応に際し本明細書に開示の配列をどのように用いるか、また、in situハイブリッド形成により、ヒト・ヘパラナーゼ遺伝子を含んでいる染色体領域を検出するために標識プローブをどのように用いるかを知悉しているはずである。
【０１０２】
以下に実施例について言及するが、これらは上記説明とともに本発明を例証するものであり、限定しようとするものではない。
【０１０３】
【実施例】
以下のプロトコールおよび実験の詳細を引続く実施例にて言及する。
【０１０４】
ヒト肝癌細胞系およびヒト胎盤からのヘパラナーゼの精製と特性化
ヒト肝癌細胞系（Ｓｋ−ｈｅｐ−１）をヒト腫瘍誘導ヘパラナーゼの精製源として選定した。精製は実質的にフックス（Fuks）の米国特許第５，３６２，６４１号（本明細書に全文引用したものとして、参照により組込む）記載どおりとした。手短に説明すると、５×１０１１個の細胞を５００リットル懸濁液中増殖し、以下の工程に付して約２４０，０００倍まで精製した。(i) カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−セファデックス）をｐＨ６．０、０．３〜１．４Ｍ ＮａＣｌ勾配で実施した。（ii）カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−セファデックス）をｐＨ７．４、０．１％ＣＨＡＰＳの存在下に０．３〜１．１Ｍ ＮａＣｌ勾配で実施した。(iii)ヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーをｐＨ７．４、０．１％ＣＨＡＰＳの存在下に０．３５〜１．１Ｍ ＮａＣｌ勾配で実施した。(iv)ＣｏｎＡ−セファロース・クロマトグラフィーをｐＨ６．０、０．１％ＣＨＡＰＳおよび１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液にて実施し、０．２５Ｍα−メチルマンノシドにより溶出した。（ｖ）ＨＰＬＣカチオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ−Ｓ）をｐＨ７．４、０．１％ＣＨＡＰＳの存在下に０．２５〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配で実施した。
【０１０５】
活性フラクションをプールし、ＴＣＡで沈殿させ、次いで沈殿物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および／またはトリプシン消化および逆相ＨＰＬＣに付した。精製タンパク質のトリプシンペプチドを逆相ＨＰＬＣ（Ｃ８カラム）により分離し、均一のピークをアミノ酸配列分析に付した。
【０１０６】
精製した酵素を逆相ＨＰＬＣに付し、次いでアミノ酸配列決定装置によりＮ−末端アミノ酸配列決定に付した（アプライド・バイオシステムズ）。
【０１０７】
細胞
ウシ角膜内皮細胞（ＢＣＥＣ）の培養を既に記載されたとおりに去勢ウシの眼球から確立した（１９、３８）。保存培養株を１０％ウシ新生仔血清、５％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ（１ｇグルコース／リットル）中で維持した。活性細胞増殖期に一日おきにｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）を添加した（１３、１４）。
【０１０８】
ＥＣＭ被覆皿の調製
ＢＣＥＣ（２〜５回継代）を初期密度２×１０５細胞／ｍｌとして４−穴プレートに塗付し、硫酸不含フィッシャー培地および５％デキストランＴ−４０中、１２日間培養した。植え付け後１日目および５日目にＮａ３５ＳＯ４（２５μＣｉ／ｍｌ）を加え、培養物は培地を換えることなく標識とともに培養した。内皮下ＥＣＭは０．５％トリトンＸ−１００および２０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ含有ＰＢＳにより細胞層を溶解することで露出し（５分間、室温）、次いでＰＢＳにより４回洗浄した。ＥＣＭは未変化のままで細胞性残屑を含まず、組織培養皿全体に強固に付着した（１９、２２）。
【０１０９】
可溶性硫酸標識プロテオグリカン（ピークＩの物質）を調製するために、ＥＣＭをトリプシンで消化し（２５μｇ／ｍｌ、６時間、３７℃）、消化物を逆浸透により濃縮し、濃縮物をセファロース６Ｂゲル濾過カラムに負荷した。得られる高分子量物質（Ｋａｖ＜０．２、ピークＩ）を収集した。８０％を超える標識物質がヘパラン硫酸プロテオグリカンから構成されていると判明した（１１、３９）。
【０１１０】
ヘパラナーゼ活性
細胞（１×１０６／３５ｍｍ皿）、細胞溶解物または調整培地を３５Ｓ−標識ＥＣＭの上部で２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．２）の存在下に培養した（１８時間、３７℃）。細胞溶解物および調整培地はまた、硫酸標識ピークＩ物質（１０〜２０μｌ）とともに培養した。培地を収集し、遠沈（１８，０００×ｇ、４℃、３分間）して、硫酸標識物質をセファロースＣＬ−６Ｂカラム（０．９×３０ｃｍ）上のゲル濾過により分析した。フラクション（０．２ｍｌ）を５ｍｌ／時間の流速でＰＢＳにより溶出し、バイオ−フルオア・液体シンチレーションにより放射活性をカウントした。排除した容量（Ｖｏ）はブルーデキストランでマークされ、全量がフェノールレッドによる容量（Ｖｔ）を含んでいた。後者は遊離の硫酸エステルとともに移動することが示された（７、１１、２３）。ＨＳ側鎖の分解フラグメントはセファロース６Ｂより、０．５＜Ｋａｖ＜０．８（ピークII）で溶出した（７、１１、２３）。トリプシンによりＥＣＭから遊離された殆ど未変化のＨＳＰＧが（ＰＢＳのみでの培養ではより低い程度で）Ｖｏの次に溶出された（Ｋａｖ＜０．２、ピークＩ）。カラム上に負荷した標識物の回収率は異なる実験において８５％ないし９５％であった（１１）。各実験とも少なくとも３回実施したが、溶出位置の変動（Ｋａｖ値）は±１５％を超えなかった。
【０１１１】
ｈｐａ ｃＤＮＡのクローニング
ｃＤＮＡクローン２５７５４８および２６０１３８はＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．協会（２１３０メモリアルパークウエイＳＷ、ハンストビル、アラバマ３５８０１）より入手した。該ｃＤＮＡは当初プラスミドベクターｐＴ３Ｔ７Ｄ−ＰａｃのＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩクローニング部位でクローン化された。これらのクローンは多少異なっていると報告されているが、ＤＮＡ配列決定が示すところによるとこれらクローンは互いに一致する。マラソンＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）ヒト胎盤（ポリ−Ａ）ｃＤＮＡ複合体は、テルアビブ大学のヨッシ・シロー（Yossi Shiloh）教授からの恵与であった。この複合体はベクター不含であり、逆転写ｃＤＮＡフラグメントを含んでいて、該フラグメントの両側に二本鎖接着体、部分的には一本鎖接着体が結合している。採用した特異複合体の構築は文献３９ａに記載されている。
【０１１２】
ｈｐ３ ＰＣＲフラグメントの増幅はクロンテック・ラボラトリーの提供によるプロトコールに従い実施した。増幅に使用した鋳型は上記複合体から取出したサンプルであった。増幅に使用したプライマーは以下のとおりである：
【０１１３】
第一工程：５’−プライマー：ＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１）；３’−プライマー：ＨＰＬ２２９：５’−ＧＴＡＧＴＧＡＴＧＣＣＡＴＧＴＡＡＣＴＧＡＡＴＣ−３’（配列番号２）。
【０１１４】
第二工程：巣化５’−プライマー：ＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’（配列番号３）；巣化３’−プライマー：ＨＰＬ１７１：５’−ＧＣＡＴＣＴＴＡＧＣＣＧＴＣＴＴＴＣＴＴＣＧ−３’（配列番号４）。ＨＰＬ２２９およびＨＰＬ１７１はＥＳＴクローンの配列に従い選択した。それらはそれぞれ配列番号９のヌクレオチド９３３〜９５６および８７６〜８９７を包含する。
【０１１５】
ＰＣＲプログラムは９４℃−４分、次いで９４℃−４０秒、６２℃−１分、７２℃−２．５分を３０サイクルとした。増幅はエキスパンド・ハイ・フィデリティ（ベーリンガーマンハイム）により実施した。得られた約９００ｂｐのｈｐ３ＰＣＲ産物をＢｆｒＩおよびＰｖｕIIにより消化した。クローン２５７５４８（ｐｈｐａ１）をＥｃｏＲＩで消化し、エンド・フィリングし、さらにＢｆｒＩで消化した。その後、ｈｐ３ ＰＣＲ産物のＰｖｕＩＩ−ＢｆｒＩフラグメントをクローンｐｈｐａ１の平滑断端−ＢｆｒＩ末端にクローン化し、ｐＴ３Ｔ７−ｐａｃベクターにクローン化した全ｃＤＮＡを保有するに至らしめ、ｐｈｐａ２と命名した。
【０１１６】
ＤＮＡ配列決定
配列決定は自動化ＤＮＡ配列決定装置（アプライド・バイオシステムズ、モデル３７３Ａ）を使用し、ベクター特異および遺伝子特異プライマーにより実施した。各ヌクレオチドを少なくとも２つの独立したプライマーから読み取った。
【０１１７】
配列のコンピューター分析
配列類似性についてのデータベース検索をブラスト（Blast）ネットワークサービスにより実施した。ＤＮＡおよびタンパク質配列の配列分析と整列化を、ウイスコンシン大学、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）の開発したＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージを用い実施した。
【０１１８】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡはＴＲＩ−試薬（モレキュラー・リサーチセンター・インク）を用い、製造業者の指示書に従い調製した。１．２５μｇを採り、ＭｕＭＬＶ逆転写酵素（ギブコＢＲＬ）およびオリゴ（ｄＴ）１５プライマー（配列番号５）（プロメガ）を用いて逆転写反応を実施した。得られた第一鎖ｃＤＮＡの増幅はＴａｑポリメラーゼ（プロメガ）により実施した。以下のプライマーを使用した：
ＨＰＵ−３５５：５’−ＴＴＣＧＡＴＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＴＣＡＡＣ−３’（配列番号６、配列番号９または１１のヌクレオチド３７２〜３９４）。
ＨＰＬ−２２９：５’−ＧＴＡＧＴＧＡＴＧＣＣＡＴＧＴＡＡＣＴＧＡＡＴＣ−３’（配列番号７、配列番号９または１１のヌクレオチド９３３〜９５６）。
ＰＣＲプログラムは９４℃−４分、次いで９４℃−４０秒、６２℃−１分、７２℃−１分を３０サイクルとした。
【０１１９】
昆虫細胞における組換えヘパラナーゼの発現
細胞、ハイ・ファイブおよびＳｆ２１昆虫細胞系をＳＦ９００II−ＳＦＭ培地（ギブコＢＲＬ）中、単層培養として維持した。
【０１２０】
組換えバキュロウイルス
ｈｐａ遺伝子を含む組換えウイルスを、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（ギブコＢＲＬ）を用い構築した。伝達ベクターｐＦａｓｔＢａｃをＳａｌＩとＮｏｔＩにより消化し、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで消化したｐｈｐａ２の１．７ｋｂフラグメントと接合した。得られるプラスミドをｐＦａｓｔｈｐａ２と命名した。ｐＦａｓｔｈｐａ４と命名した同一のプラスミドを複製として調製し、両方はそれぞれにさらなる実験に使用した。組換えバクミドを製造業者の指示書に従い、ｐＦａｓｔｈｐａ２、ｐＦａｓｔｈｐａ４により、またｐＦａｓｔＢａｃにより生成させた。後者は陰性対照として用いた。組換えバクミドＤＮＡをＳｆ２１昆虫細胞中に移入した。トランスフェクションの５日後に、組換えウイルスを採取し、Ｔ−２５フラスコ中、ハイ・ファイブ昆虫細胞３×１０６個に感染させるために用いた。感染の２〜３日後に細胞を採取した。細胞４×１０６個を遠心分離し、２０ｍＭリン酸・クエン酸バッファーと５０ｍＭ ＮａＣｌ含有の反応バッファーに再懸濁した。細胞に３サイクルの凍結・融解を施し、溶解物を−８０℃に保存した。調整培地は４℃に保存した。
【０１２１】
組換えヘパラナーゼの部分精製
組換えヘパラナーゼの部分精製はヘパリン−セファロース・カラムクロマトグラフィーと引続くスーパーデックス７５カラム・ゲル濾過により実施した。ｐＦｈｐａ４ウイルス感染Ｓｆ２１細胞の培地（１５０ｍｌ）をヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーに付した。フラクション１ｍｌの溶出は、１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）中０．１％ＣＨＡＰＳおよび１ｍＭ ＤＴＴの存在下に０．３５〜２Ｍ ＮａＣｌ勾配により実施した。各フラクションのサンプル２５μｌにつきヘパラナーゼ活性を試験した。ヘパラナーゼ活性は０．６５〜１．１Ｍ ＮａＣｌ（フラクション１８〜２６、図１０ａ）の範囲に溶出された。各フラクション５μｌを１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、次いで硝酸銀染色した。ヘパリン−セファロースから溶出された活性フラクション（図１０ａ）をプールし、ＹＭ３カットオフ膜上濃縮した（×６）。濃縮物０．５ｍｌを、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴおよび０．１％ＣＨＡＰＳ含有１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したスーパーデックス７５ＦＰＬＣカラム３０ｍｌに負荷した。フラクション（０．５６ｍｌ）を０．７５ｍｌ／分の流速で収集した。各フラクションの一部につきヘパラナーゼ活性を試験し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、次いで硝酸銀染色した（１１ｂ）。
【０１２２】
【実施例１】
ｈｐａ遺伝子のクローニング
ヒト肝癌細胞（ＳＫ−ｈｅｐ−１）から単離したヘパラナーゼの精製フラクションをトリプシン消化およびミクロ配列決定に付した。ＥＳＴ（Expressed Sequence Tag; 発現配列標識）データベースをスクリーニングし、得られたペプチドに相当する逆翻訳ＤＮＡ配列についての相同性を探査した。２つのＥＳＴ配列（受託番号Ｎ４１３４９およびＮ４５３６７）はＹＧＰＤＶＧＱＰＲ（配列番号８）のペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を含んでいた。これら２つの配列は８ないし９週の胎盤ｃＤＮＡライブラリー（ソアーズ）から調製したクローン２５７５４８および２６０１３８（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．協会）から誘導した。同一であることの判明した両クローンは１０２０ｂｐの挿入断片を含んでおり、この断片は９７３ｂｐのオープン読み枠（ＯＲＦ）とそれに続く２７ｂｐの３’非翻訳領域とポリＡ尾部を含んでいた。これらクローンの５’末端には翻訳開始部位（ＡＵＧ）が確認されなかった。
【０１２３】
欠失５’末端のクローニングは胎盤マラソンＲＡＣＥｃＤＮＡ複合体からのＤＮＡのＰＣＲ増幅により実施した。同定された３’エンコードＥＳＴクローンと一部重なり合う９００ｂｐのフラグメント（ｈｐ３と命名）が得られた。
【０１２４】
接合したｃＤＮＡフラグメントは１７２１ｂｐの鎖長（配列番号９）であり、６１，１９２ダルトンの計算値分子量を有する５４３アミノ酸のポリペプチド（配列番号１０）をエンコードするオープン読み枠を含んでいた（図１および配列番号１１参照）。クローン２５７５４８および２６０１３８に含まれる部分ｃＤＮＡ挿入断片の３’末端は配列番号９および図１のヌクレオチドＧ７２１に開始点があった。
【０１２５】
図１にさらに示すように、ＥＳＴクローンとＰＣＲ増幅配列との間には一個の配列不一致があり、それによってアミノ酸が増幅ｃＤＮＡにおいてＥＳＴのＴｙｒ２４６からＰｈｅ２４６に置換されていた。ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列は２つの個々の増幅産物から確認した。新しい遺伝子をｈｐａと命名した。
【０１２６】
上記のように、ＥＳＴクローン２５７５４８および２６０１３８に含まれる部分ｃＤＮＡ挿入断片の３’末端は、ｈｐａのヌクレオチド７２１（配列番号９）に開始点があった。安定な二次構造、例えば７２１位前後のヌクレオチドストレッチを含む基部およびループを形成するｈｐａ ｃＤＮＡの能力をコンピューターモデル化により検討した。安定な基部およびループ構造はヌクレオチド６９８〜７２４（配列番号９）が関与して形成されるらしいことが判明した。さらに、７０％までの高ＧＣ含量はｈｐａ遺伝子の５’末端領域を特徴づけるが、３’領域の高々約４０％と対照的である。これらの知見はＥＳＴクローンの未成熟終止とそれ故の５’末端欠如を説明する。
【０１２７】
in vitroアッセイにおいてヘパラン硫酸の分解を触媒するｈｐａ遺伝子産物の能力を試験するために、全オープン読み枠を、バキュロウイルス発現系により昆虫細胞で発現させた。ｈｐａ遺伝子含有ウイルスを感染させた細胞の抽出物は高レベルのヘパラン硫酸分解活性を示したが、ｈｐａ遺伝子不含の同様構築物を感染させた細胞はかかる活性を示さず、非感染細胞とも違った。これらの結果はさらに以下の実施例でも証明される。
【０１２８】
【実施例２】
可溶性ＥＣＭ誘導ＨＳＰＧの分解
ハイ・ファイブ細胞の単層培養物をｐＦａｓｔｈｐａプラスミド含有組換えバキュロウイルスにより、または挿入断片不含プラスミド含有対照ウイルスにより感染させた（７２時間、２８℃）。細胞を収集し、ヘパラナーゼ反応バッファー中３サイクルの凍結・融解により溶解した。細胞溶解液を次いで硫酸標識ＥＣＭ誘導ＨＳＰＧ（ピークＩ）とともに培養し（１８時間、３７℃）、引き続き反応混合物のゲル濾過分析（セファロース６Ｂ）を実施した。
【０１２９】
図２に示すように、基質はＶｏの次に溶出された殆ど全部の高分子量（Ｍｒ）物質のみを含んでいた（ピークＩ、フラクション５〜２０、Ｋａｖ＜０．３５）。同様の溶出パターンは、ＨＳＰＧ基質を対照ウイルス感染細胞の分解液と培養した場合に得られた。これに対し、ｈｐａ含有ウイルス感染細胞の溶解液でＨＳＰＧ基質を培養すると、高Ｍｒ基質が完全に低Ｍｒ標識分解フラグメントに変換された（ピークII、フラクション２２〜３５、０．５＜Ｋａｖ＜０．７５）。
【０１３０】
ピークIIに溶出されたフラグメントがヘパラン硫酸の分解産物であることは、それらが (i) アルカリ性水素化ホウ素またはパパインで処理することによりＥＣＭから放出された完全ヘパラン硫酸側鎖（Ｋａｖ約０．３３）よりも５ないし６倍小さいこと、また、(ii)パパインまたはコンドロイチナーゼＡＢＣによるさらなる消化に抵抗し、硝酸による脱アミノ化を受けやすいことにより示された（６、１１）。
【０１３１】
同様の結果（未開示）はＳｆ２１細胞についても得られた。再度、ｈｐａ含有ウイルス（ｐＦｈｐａ）により感染した細胞にはヘパラナーゼ活性が検出されたが、対照ウイルス（ｐＦ）によるものでは検出されなかった。この結果は２つの個々に生成させた組換えウイルスによって得られた。対照の未感染ハイ・ファイブ細胞の溶解液ではＨＳＰＧ基質を分解し得なかった。
【０１３２】
引続く実験においては、標識ＨＳＰＧ基質を感染ハイ・ファイブまたはＳｆ２１細胞により調整した培地で培養した。
【０１３３】
図３ａ〜ｂに示すように、ヘパラナーゼ活性は、高ＭｒピークＩ基質がＨＳ分解フラグメントを表す低ＭｒピークIIへ変換したことの反映であり、これがｐＦｈｐａ２またはｐＦｈｐａ４ウイルス感染細胞の培養培地中に見出されたが、対照のｐＦ１またはｐＦ２ウイルスによるものでは認めなかった。対照の非感染ハイ・ファイブまたはＳｆ２１細胞の培養培地にはヘパラナーゼ活性が検出されなかった。
【０１３４】
ｐＦｈｐａ４ウイルス感染細胞の培地を５０ｋＤａカットオフ膜に通し、大まかに見積もった分子量の組換えヘパラナーゼ酵素を得た。図４に示したように、酵素活性すべてが上部画部に保持されており、流下（＜５０ｋＤａ）物には活性がなかった。この結果は予期した分子量のｈｐａ遺伝子産物と矛盾がない。
【０１３５】
ｈｐａ産物をさらに特性化するために、ヘパラナーゼ介在ＨＳ分解の強力なインヒビター（４０）であるヘパリンの阻害効果を試験した。
【０１３６】
図５ａ〜ｂに示すように、ピークＩ基質がピークIIのＨＳ分解フラグメントに変換されるのは、ヘパリンの存在下、完全に阻止された。
【０１３７】
これらの結果を総括すると、ヘパラナーゼ酵素は、新たに同定したヒトｈｐａ遺伝子含有バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞により活性型で発現されることが示される。
【０１３８】
【実施例３】
未処理ＥＣＭ中ＨＳＰＧの分解
次いで、未処理天然産ＥＣＭにおいてＨＳを分解する未処理感染昆虫細胞の能力を検討した。この目的のためにハイ・ファイブまたはＳｆ２１細胞を、代謝的に硫酸標識したＥＣＭ上に播種し、次いで、ｐＦｈｐａ４または対照ｐＦ２ウイルスを感染させた（４８時間、２８℃）。次いで、培地のｐＨを６．２〜６．４に調整し、細胞をさらに標識したＥＣＭとともに２８℃で４８時間または３７℃で２４時間培養した。培養培地中に放出された硫酸標識物をセファロース６Ｂ上のゲル濾過により分析した。
【０１３９】
図６ａ〜ｂおよび７ａ〜ｂに示すように、ＥＣＭを対照ｐＦ２ウイルス感染細胞とともに培養すると、殆ど全部（＞９０％）がＶｏとともにあるいはその次に溶出される高Ｍｒフラグメント（ピークＩ）からなる標識物を定常的に放出するに至った。ＥＣＭそれ自体に存在するおよび／または細胞により発現されるタンパク質分解活性が、高Ｍｒ物質の放出によるものであることはすでに示されていた（６）。殆ど未処理のＨＳＰＧは引続くヘパラナーゼによる分解の可溶性基質であり、そのことはまたヘパラナーゼ酵素をヘパリンにより阻害したときに蓄積する比較的大量のピークＩ物質によっても示されている（６、７、１２、図９）。他方、標識したＥＣＭをｐＦｈｐａ４ウイルスで感染した細胞と培養すると、６０〜７０％のＥＣＭ会合放射活性を低Ｍｒ硫酸標識フラグメントの形で放出するに至るが（ピークII、０．５＜Ｋａｖ＜０．７５）、これは感染細胞とＥＣＭとの培養を２８℃で行ったか３７℃で行ったかには関係ない。対照の未処理非感染Ｓｆ２１またはハイ・ファイブ細胞はＥＣＭ ＨＳ側鎖を分解しなかった。
【０１４０】
引続く実験においては、図８ａ〜ｂに示すように、ハイ・ファイブまたはＳｆ２１細胞をｐＦｈｐａ４または対照ｐＦ１ウイルスで感染させ（９６時間、２８℃）、培地を硫酸標識ＥＣＭとともに培養した。低Ｍｒ ＨＳ分解フラグメントはｐＦｈｐａ４で感染した細胞により調整した培地と培養したときにのみＥＣＭから放出された。図９に示すように、これらフラグメントの産生はヘパリン存在下に阻止された。対照の非感染細胞培養培地にはヘパラナーゼ活性が検出されなかった。これらの結果が示すのは、ｐＦｈｐａ４ウイルス感染細胞により発現されるヘパラナーゼ酵素が、天然産未処理ＥＣＭの他の巨大分子成分（すなわち、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン）に複合体形成したときにＨＳを分解し得るということであり、その様式は高度転移腫瘍細胞または免疫系の活性化細胞について報告されているものと同じである（６，７）。
【０１４１】
【実施例４】
組換えヘパラナーゼの精製
組換えヘパラナーゼをヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーによりｐＦｈｐａ４感染Ｓｆ２１細胞の培地から部分精製し（図１０ａ）、次いでプールした活性フラクションをＦＰＬＣスーパーデックス７５カラム上ゲル濾過した（図１１ａ）。〜６３ｋＤａのタンパク質を観測し、その量を銀染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出し、関連するカラムフラクションのヘパラナーゼ活性と相関させた（それぞれ、図１０ｂおよび１１ｂ）。このタンパク質は対照ｐＦ１ウイルス感染細胞の培養培地には検出されず、ヘパリン−セファロース上同様の分別に付した（未開示）。
【０１４２】
【実施例５】
種々の細胞型、器官および組織におけるｈｐａ遺伝子の発現
図１２ａ〜ｅに関して、ＲＴ−ＰＣＲを適用し、種々の細胞型および組織によるｈｐａ遺伝子の発現を評価した。この目的のために、全ＲＮＡを逆転写し、増幅した。予測した５８５ｂｐ鎖長のｃＤＮＡが、ヒト腎臓、胎盤（８および１１週）および母斑組織に、ならびに単離したばかりの短時間（１．５〜４８時間）培養ヒト胎盤細胞栄養層細胞（図１２ａ）に明瞭に証明されたが、これらはすべて高いヘパラナーゼ活性を示すことが知られている（４１）。ｈｐａ転写物は正常ヒト好中球によっても発現された（図１２ｂ）。これに対し、胎児性ヒト筋肉組織、胸腺、心臓および副腎には検出し得るｈｐａ ｍＲＮＡの発現がなかった(図１２ｂ)。ｈｐａ遺伝子は、これらがすべてではないが数種のヒト膀胱癌細胞系（図１２ｃ）、ＳＫ肝臓癌（ＳＫ−ｈｅｐ−１）、卵巣癌（ＯＶ１０６３）、乳癌（４３５，２３１）、メラノーマおよび巨核球（ＤＡＭＩ、ＣＨＲＦ）ヒト細胞系により発現された（図１２ｄ〜ｅ）。
【０１４３】
上記ｈｐａ転写物の発現パターンは、種々の組織および細胞型において定量されたヘパラナーゼ活性レベルと非常に良好な相関関係にあることが決定された（未開示）。
【０１４４】
【実施例６】
ｈｐａ相同遺伝子
ＥＳＴデータベースによりｈｐａ遺伝子に相同の配列をスクリーニングした。３種のマウスＥＳＴを同定し（受託番号Ａａ１７７９０１（マウス脾臓から）、Ａａ０６７９９７（マウス皮膚から）、Ａａ４７９４３（マウス胚から））、６２９ｂｐの部分的オープン読み枠（５’末端欠失）および１９５ｂｐの３’非翻訳領域（配列番号１２）を含む８２４ｂｐのｃＤＮＡフラグメントに組込んだ。図１３に示すように、コード領域はｈｐａ ｃＤＮＡ配列の３’末端に８０％類似している。これらＥＳＴ類は恐らくマウスヘパラナーゼをエンコードするマウスｈｐａ同族体のｃＤＮＡフラグメントである。
【０１４５】
共通タンパク質ドメインを検索して、ヘパラナーゼと数種の前駆体タンパク質、例えば、プロコラーゲンアルファ１前駆体、チロシン−タンパク質キナーゼ−ＲＹＫ、フィブリン−１、インシュリン様成長因子結合タンパク質およびその他数種との間のアミノ末端相同性を明らかにした。アミノ末端基は高度に疎水性であり、潜在的なトランスメンブランドメインを含む。既知シグナルペプチド配列に対する相同性は、それがタンパク質局在化のためのシグナルペプチドとして機能し得ることを示唆する。
【０１４６】
【実施例７】
ヒトＳＫ−ｈｅｐ１細胞系からのｈｐａ ｃＤＮＡ伸長５’末端の単離
マラソンＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）キット（クロンテック）を用い、ｈｐａ ｃＤＮＡの５’末端をヒトＳＫ−ｈｅｐ１細胞系から単離した。全ＲＮＡはＴＲＩ−試薬（モレキュラー・リサーチセンター・インク）を用い、製造業者の指示書に従いＳＫ−ｈｅｐ１細胞から調製した。ポリＡ＋ＲＮＡをｍＲＮＡ分離機キット（クロンテック）を用い単離した。
【０１４７】
マラソンＲＡＣＥ ＳＫ−ｈｅｐ１ｃＤＮＡ複合体は製造業者の推奨に従い構築した。初回増幅はアダプター特異プライマーＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１）および配列番号９のヌクレオチド１１９〜９９に相当するｈｐａ特異アンチセンスプライマーｈｐｌ−６２９：５’−ＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１７）を用い実施した。得られたＰＣＲ産物を第２回の増幅に付し、その際アダプター特異巣化プライマーＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’（配列番号３）および配列番号９のヌクレオチド８３〜６３に相当するｈｐａ特異アンチセンス巣化プライマーｈｐｌ−６６６：５’−ＡＧＧＣＴＴＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴ−３’（配列番号１８）を用いた。ＰＣＲプログラムは以下のとおりとした：９４℃−１分間のホットスタート、次いで９０℃−３０秒、６８℃−４分を３０サイクルとした。得られる３００ｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから抽出し、ベクターｐＧＥＭ−Ｔイージー（Easy）（プロメガ）にクローン化した。得られる組換えプラスミドをｐＨＰＳＫ１と命名した。
【０１４８】
ｐＨＰＳＫ１挿入断片のヌクレオチド配列を決定し、それが胎盤ｈｐａ ｃＤＮＡの５’末端６２ヌクレオチド（配列番号９）およびさらに配列番号１３おおび１５の最初の１７８ヌクレオチドである上流１７８ヌクレオチドを含むことが判明した。
【０１４９】
１個のヌクレオチドの相違はＳＫ−ｈｅｐ１ｃＤＮＡと胎盤ｃＤＮＡとの間で一致した。胎盤ｃＤＮＡの９位（配列番号９）の「Ｔ」誘導体をＳＫ−ｈｅｐ１ｃＤＮＡの対応する１８７位（配列番号１３）において「Ｃ」誘導体に置換えた。
【０１５０】
この相違は胎盤から単離された数種のさらなるｃＤＮＡクローンの配列分析により確認されるように、胎盤ｃＤＮＡクローンの５’末端での突然変異によると思われるが、これはＳＫ−ｈｅｐ１ｃＤＮＡ同様、配列番号９位のＣを含んでいた。
【０１５１】
ＳＫ−ｈｅｐ１ ｈｐａ ｃＤＮＡの５’伸長配列をヒト胎盤から単離したｈｐａ ｃＤＮＡの配列（配列番号９）に組入れた。組み上げた配列は、配列番号１４および１５に示すように、６６，４０７ダルトンの計算値分子量を有する５９２アミノ酸のポリペプチドをエンコードするオープン読み枠を含んでいた。この読み枠は９３ｂｐの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接していた。
【０１５２】
【実施例８】
ｈｐａ遺伝子の上流ゲノム領域の単離
ｈｐａ遺伝子の上流領域をゲノム・ウオーカーキット（クロンテック）により製造業者の推奨に従い単離した。該キットは５種のヒトゲノムＤＮＡサンプルを含み、それぞれのサンプルは異なる制限エンドヌクレアーゼ（ＥｃｏＲＶ、ＳｃａＩ、ＤｒａＩ、ＰｖｕIIおよびＳｓｐI）で消化して平滑末端を創出してある。
【０１５３】
平滑末端ＤＮＡを部分的に一本鎖としたアダプターに結合する。ゲノムＤＮＡサンプルは、アダプター特異プライマーおよび遺伝子特異プライマーを用い、ＰＣＲ増幅に付した。増幅はエキスパンド・ハイ・フィデリティ（ベーリンガーマンハイム）により実施した。
【０１５４】
初回増幅はａｐ１プライマー：５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１９）および配列番号９のヌクレオチド８３〜６３に相当するｈｐａ特異アンチセンスプライマーｈｐｌ−６６６：５’−ＡＧＧＣＴＴＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴ−３’（配列番号１８）を用い実施した。ＰＣＲプログラムは以下のとおりとした：９４℃−３分間のホットスタート、次いで９４℃−４０秒、６７℃−４分を３６サイクルとした。
【０１５５】
初回増幅のＰＣＲ産物を１：５０に希釈した。希釈したサンプル１μｌを２回目の増幅の鋳型として用い、該増幅には巣化アダプター特異プライマーａｐ２：５’−ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴ−３’（配列番号２０）および配列番号９のヌクレオチド６２〜４２に相当するｈｐａ特異アンチセンスプライマーｈｐｌ−６９０：５’−ＣＴＴＧＧＧＣＴＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣ−３’（配列番号２１）を用いた。得られる増幅産物はアガロースゲル電気泳動により分析した。５種の異なるＰＣＲ産物を５回の増幅反応により得た。ＳｓｐＩ消化ＤＮＡから得た約７５０ｂｐのＤＮＡフラグメントをゲル抽出した。精製したフラグメントをプラスミドベクターｐＧＥＭ−Ｔイージー（プロメガ）に結合した。得られる組換えプラスミドをｐＧＨＰ６９０５と命名し、ｈｐａ挿入断片のヌクレオチド配列を決定した。
【０１５６】
５９４ヌクレオチドの部分配列を配列番号１６に示す。配列番号１３の最終ヌクレオチドは配列番号１３のヌクレオチド９３に相当する。配列番号１６のＤＮＡ配列はｈｐａ ｃＤＮＡの５’領域およびｈｐａ遺伝子のプロモーター領域を含むと予測されるゲノム上流領域の５０１ヌクレオチドを含んでいる。
【０１５７】
【実施例９】
ヒト２９３細胞系における５９２アミノ酸ＨＰＡポリペプチドの発現
５９２アミノ酸のオープン読み枠（配列番号１３および１５）はＳＫ−ｈｅｐ１ ｈｐａ ｃＤＮＡの５’末端に相当する１１０ｂｐを胎盤ｃＤＮＡと結合させることにより構築した。より詳しくは、胎盤ｈｐａＤＮＡのマラソンＲＡＣＥ−ＰＣＲ増幅産物をＳａｃＩで消化し、約１ｋｂのフラグメントをＳａｃＩ−消化ｐＧＨＰ６９０５プラスミドに結合した。得られるプラスミドをＥａｒＩおよびＡａｔIIで消化した。ＥａｒＩ粘着性末端は平滑であり、約２８０ｂｐのＥａｒＩ／平滑−ＡａｔIIフラグメントを単離した。このフラグメントをＥｃｏＲＩで消化したｐＦａｓｔｈｐａ（クレノウフラグメントにより平滑末端とし、さらにＡａｔIIで消化した）と結合した。得られるプラスミドは１８２７ｂｐの挿入断片を含み、該断片は１７７６ｂｐのオープン読み枠、３１ｂｐの３’ＵＴＲおよび２１ｂｐの５’ＵＴＲを含んでいた。このプラスミドをｐＦａｓｔＬｈｐａと命名した。
【０１５８】
哺乳動物発現ベクターを構築し、ヒト細胞において５９２アミノ酸のヘパラナーゼポリペプチドの発現を稼動させた。ｈｐａ ｃＤＮＡをＢｓｓＨIIおよびＮｏｔＩによりｐＦａｓｔｈｐａから切り出した。得られる１８５０ｂｐのＢｓｓＨII−ＮｏｔＩフラグメントをＭｌｕＩおよびＮｏｔＩで消化した哺乳動物発現ベクターｐＳＩ（プロメガ）に結合した。得られる組換えプラスミドｐＳＩｈｐａＭｅｔ２をヒト２９３胎児性腎臓細胞系に移入した。
【０１５９】
５９２アミノ酸ヘパラナーゼの一過性発現をウエスターンブロット分析により検討し、酵素活性をゲルシフトアッセイにより試験した。これらの手法は両方とも１９９８年５月１日出願の米国特許出願０９／０７１，７３９にすべて記載されている（本出願を本明細書に全文記載したものとして参照により組込む）。トランスフェクションの３日後に細胞を取得した。取得した細胞を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＰＭＳＦおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（ベーリンガーマンハイム）を含む溶解バッファーに再懸濁した。タンパク質抽出サンプル４０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離に用いた。タンパク質をＰＶＤＦハイボンド−Ｐ膜（アマシャム）に移した。該膜を米国特許出願０９／０７１，７３９記載のとおりにアフィニティ精製ポリクローナル抗ヘパラナーゼ抗体と培養した。約５０ｋＤａの主バンドを移入膜に観察し、同様に約６５ｋＤａのマイナーバンドを観察した。同様のパターンを米国特許出願０９／０７１，７３９に示されたとおりにｐＳｈｐａを移入した細胞の抽出物に観察した。これら２つのバンドは恐らく移入細胞により産生された組換えヘパラナーゼタンパク質の２つの形状を表している。６５ｋＤａのタンパク質は恐らくヘパラナーゼ前駆体を表しており、５０ｋＤａのタンパク質がここでは処理工程を経たあるいは成熟した形状であることを示唆している。
【０１６０】
ｐＳｈｐａＭｅｔ２移入細胞に発現された組換えタンパク質の触媒活性をゲルシフトアッセイにより試験した。移入細胞抽出物および偽移入細胞抽出物を、２０ｍＭリン酸・クエン酸バッファー（ｐＨ５．４）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴおよび５０ｍＭ ＮａＣｌの存在下にヘパリン（各反応において６μｇ）と３７℃で一夜培養した。反応混合物を次いで１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。組換えヘパラナーゼの触媒活性は、移入細胞抽出物で培養したヘパリン分子が、対照に比較して、より速く移動することにより明瞭に証明された。急速な移動は高分子量ヘパリン分子の消失と低分子量分解産物の生成を示す。
【０１６１】
【実施例１０】
ｈｐａ遺伝子の染色体局在化
ｈｐａ遺伝子の染色体地図化を、ＵＫ ＨＧＭＰリソースセンター（ケンブリッジ、英国）から入手した単一染色体ヒト／ＣＨＯとヒト／マウス体細胞ハイブリッドのパネルを用いて実施した。
【０１６２】
体細胞ハイブリッドＤＮＡ各４０ｎｇをＰＣＲ増幅に付したが、その際、配列番号９のヌクレオチド５６４〜５８６に相当するｈｐａプライマー：ｈｐｕ５６５：５’−ＡＧＣＴＣＴＧＴＡＧＡＴＧＴＧＣＴＡＴＡＣＡＣ−３’（配列番号２２）および配列番号９のヌクレオチド８９７〜８７６に相当するアンチセンスプライマーｈｐｌ１７１：５’−ＧＣＡＴＣＴＴＡＧＣＣＧＴＣＴＴＴＣＴＴＣＧ−３’（配列番号２３）を使用した。
【０１６３】
ＰＣＲプログラムは以下のとおりとした：９４℃−３分間のホットスタート、次いで９４℃−４５秒、６６℃−１分、６８℃−５分を７サイクルとし、次いで９４℃−４５秒、６２℃−１分、６８℃−５分を３０サイクルとし、７２℃での最終拡張１０分とした。
【０１６４】
反応はエキスパンド・ロングＰＣＲ（ベーリンガーマンハイム）により実施した。得られる増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。図１４に示したように、約２．８Ｋｂの単一バンドが染色体４から、同様に対照のヒトゲノムＤＮＡから得られた。２．８ｋｂの増幅産物はゲノムｈｐａクローンの増幅に基づくと期待される（データ未開示）。ハムスターおよびマウスの対照ＤＮＡサンプルにも、他のヒト染色体の体細胞ハイブリッドにも増幅産物は得られなかった。
【０１６５】
本発明をその特定の態様と関連づけて記載したが、多くの代替法、変更、および変法が当業者に明らかであることがはっきりしている。したがって、添付の特許請求の範囲の精神と広範な範囲に含まれるかかる代替法、変更、および変法をも包含することを意図するものである。
【０１９８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ｈｐａ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を表す。ＥＳＴ（発現配列標識）とＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ（逆転写ＲＮＡ）との間の７９９位（ＡからＴ）の１個のヌクレオチドの差異および得られるアミノ酸置換（ＴｙｒからＰｈｅ）について、それぞれ上と下に置換した単位示す。システイン残基とポリアデニル化共通配列に下線を付す。星印は停止コドンＴＧＡを示す。
【図２】  ｐＦｈｐａ２ウイルス感染ハイ・ファイブ（High Five）細胞の溶解による可溶性硫酸標識ＨＳＰＧ基質の分解を示す。ｐＦｈｐａ２ウイルス感染したハイ・ファイブ細胞の溶解物（●）または対照ｐＦ２ウイルス（□）は硫酸標識ＥＣＭ誘導可溶性ＨＳＰＧ（ピークＩ）と培養した（１８時間、３７℃）。培養した培地を次いでセファロース６Ｂ上ゲル濾過に付した。低分子量ＨＳ分解フラグメント（ピークII）はｐＦｈｐａ２感染細胞との培養に際してのみ産生されたが、ｐＦ２感染細胞の溶解によるＨＳＰＧ基質の分解（◇）はなかった。
【図３ａ−ｂ】  ｐＦｈｐａ２およびｐＦｈｐａ４感染細胞の培地による可溶性硫酸標識ＨＳＰＧ基質の分解を示す。ｐＦｈｐａ２（３ａ）またはｐＦｈｐａ４（３ｂ）ウイルス感染したハイ・ファイブ細胞の溶解物（●）または対照ｐＦ２ウイルス（□）は硫酸標識ＥＣＭ誘導可溶性ＨＳＰＧ（ピークＩ、◇）と培養した（１８時間、３７℃）。培養した培地を次いでセファロース６Ｂ上ゲル濾過に付した。低分子量ＨＳ分解フラグメント（ピークII）はｈｐａ遺伝子含有ウイルスとの培養に際してのみ産生された。対照ウイルス感染細胞の培地によるＨＳＰＧ基質の分解はなかった。
【図４】  ｐＦｈｐａ２感染細胞により発現されるヘパラナーゼ活性のサイズ分画を示す。ｐＦｈｐａ２感染ハイ・ファイブ細胞の培地を５０ｋＤａカットオフ膜に負荷した。ヘパラナーゼ活性（ピークＩ基質（◇）のピークII ＨＳ分解フラグメントへの変換）は高分子量部（＞５０ｋＤａ）（●）に見出されたが、低分子量部（＜５０ｋＤａ）（○）には認めなかった。
【図５ａ−ｂ】  ｐＦｈｐａ２およびｐＦｈｐａ４感染ハイ・ファイブ細胞により発現されるヘパラナーゼ活性に対するヘパリンの影響を示す。ｐＦｈｐａ２（５ａ）およびｐＦｈｐａ４（５ｂ）感染ハイ・ファイブ細胞の培地を、ヘパリン１０μｇ／ｍｌの不存在下（●）または存在下（△）に、硫酸標識ＥＣＭ誘導可溶性ＨＳＰＧ（ピークＩ、◇）と培養した（１８時間、３７℃）。低分子量ＨＳ分解フラグメントの産生はヘパラナーゼ活性の強力なインヒビターであるヘパリンの存在下に完全に消滅していた（６、７）。
【図６ａ−ｂ】  ウイルス感染ハイ・ファイブ細胞およびＳｆ２１細胞による硫酸標識ＥＣＭの分解を示す。ハイ・ファイブ細胞（６ａ）およびＳｆ２１細胞（６ｂ）を硫酸標識ＥＣＭ上に塗付し、ｐＦｈｐａ４（●）または対照ｐＦ１（□）ウイルスとともに培養した（４８時間、２８℃）。対照非感染Ｓｆ２１細胞（Ｒ）を同様に標識したＥＣＭ上に塗付した。培養した培地のｐＨを６．０〜６．２に調整し、３７℃で２４時間培養した。培養培地中に放出された硫酸標識物質をセファロース６Ｂ上ゲル濾過により分析した。ＨＳ分解産物はｈｐａ含有ウイルス感染細胞によってのみ産生された。
【図７ａ−ｂ】  ウイルス感染細胞による硫酸標識未処理ＥＣＭの分解を示す。ハイ・ファイブ細胞（７ａ）およびＳｆ２１細胞（７ｂ）を硫酸標識ＥＣＭ上に塗付し、ｐＦｈｐａ４（●）または対照ｐＦ１（□）ウイルスで感染させた（４８時間、２８℃）。対照非感染Ｓｆ２１細胞（Ｒ）を同様に標識したＥＣＭ上に塗付した。培養した培地のｐＨを６．０〜６．２に調整し、２８℃で４８時間培養した。培養培地中に放出された硫酸標識分解フラグメントをセファロース６Ｂ上ゲル濾過により分析した。ＨＳ分解フラグメントはｈｐａ含有ウイルス感染細胞によってのみ産生された。
【図８ａ−ｂ】  ｐＦｈｐａ４感染細胞の培養培地による硫酸標識未処理ＥＣＭの分解を示す。ｐＦｈｐａ４（●）または対照ｐＦ１（□）ウイルスで感染したハイ・ファイブ細胞（８ａ）およびＳｆ２１細胞（８ｂ）の培養培地を未処理硫酸標識ＥＣＭとともに培養した（４８時間、３７℃、ｐＨ６．０）。ＥＣＭも対照非感染Ｓｆ２１細胞（Ｒ）の培地とともに培養した。反応混合物中に放出された硫酸標識物をゲル濾過分析に付した。ヘパラナーゼ活性はｐＦｈｐａ４感染細胞の培養培地にのみ検出された。
【図９ａ−ｂ】  ｐＦｈｐａ４感染細胞の培養培地におけるヘパラナーゼ活性に対するヘパリンの影響を示す。硫酸標識ＥＣＭをｐＦｈｐａ４感染ハイ・ファイブ細胞（９ａ）およびＳｆ２１細胞（９ｂ）とともに、ヘパリン１０μｇ／ｍｌの不存在下（●）または存在下（Ｖ）に培養した（２４時間、３７℃、ｐＨ６．０）。培地中に放出された硫酸標識物をセファロース６Ｂ上のゲル濾過に付した。ヘパラナーゼ活性（ピークII ＨＳ分解フラグメントの産生）はヘパリンの存在下に完全に阻害された。
【図１０ａ−ｂ】  ヘパリン−セファロース上の組換えヘパラナーゼの精製を示す。ｐＦｈｐａ４ウイルス感染Ｓｆ２１細胞の培養培地をヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーに付した。フラクションの溶出を０．３５〜２Ｍ ＮａＣｌ勾配により実施した（◇）。溶出フラクションのヘパラナーゼ活性を図１０ａに示す（●）。フラクション１５〜２８を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、次いで硝酸銀染色した。フラクション１９〜２４の主要タンパク質バンド（ＭＷ〜６３，０００）およびヘパラナーゼ活性間には相関が示される。
【図１１ａ−ｂ】  スーパーデックス７５ゲル濾過カラム上の組換えヘパラナーゼの精製を示す。ヘパリン−セファロースから溶出した活性フラクション（図１０ａ）をプールし、濃縮してスーパーデックス７５ＦＰＬＣカラムに負荷した。フラクションを収集し、各フラクションの一部につきヘパラナーゼ活性を試験し（Ｃ、図１１ａ）、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、次いで硝酸銀染色した（図１１ｂ）。フラクション４〜７の主要タンパク質バンド（ＭＷ〜６３，０００）の出現とヘパラナーゼ活性間には相関が見られる。
【図１２ａ−ｅ】  ヒト胚組織（１２ａ）、ヒト胚外組織（１２ｂ）および他起源細胞系（１２ｃ〜ｅ）からの全ＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲによるｈｐａ遺伝子の発現を示す。ｈｐａ特異プライマー（Ｉ）、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子用プライマー（II）、および逆転写酵素なしの対照反応は、ＲＮＡサンプル（III）中にゲノムＤＮＡあるいは他の汚染物が存在しないことを示している。Ｍ：ＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（ベーリンガー・マンハイム）。図１２ａについて：レーン１：好中球細胞（成人）；レーン２：筋肉；レーン３：胸腺；レーン４：心臓；レーン５：副腎。図１２ｂについて：レーン１：腎臓；レーン２：胎盤（８週）；レーン３：胎盤（１１週）；レーン４〜７：母斑（完全水胞型母斑）；レーン８：栄養膜細胞層細胞（新鮮単離）；レーン９：栄養膜細胞層細胞（in vitro１．５時間）；レーン１０：栄養膜細胞層細胞（in vitro６時間）；レーン１１：栄養膜細胞層細胞（in vitro１８時間）；レーン１２：栄養膜細胞層細胞（in vitro４８時間）。図１２ｃについて：レーン１：ＪＡＲ膀胱細胞系；レーン２：ＮＣＩＴＴ睾丸腫瘍細胞系；レーン３：ＳＷ−４８０ヒト肝癌細胞系；レーン４：ＨＴＲ（ＳＶ４０により形質転換した栄養膜細胞層）；レーン５：ＨＰＴＬＰ−Ｉ肝細胞癌細胞系；レーン６：ＥＪ−２８膀胱癌細胞系。図１２ｄについて：レーン１：ＳＫ−ｈｅｐ１ヒト肝癌細胞系；レーン２：ＤＡＭＩヒト骨髄巨核球細胞系；レーン３：ＤＡＭＩ細胞系＋ＰＭＡ；レーン４：ＣＨＲＦ細胞系＋ＰＭＡ；レーン５：ＣＨＲＦ細胞系。図１２ｅについて：レーン１：ＡＢＡＥウシ大動脈内皮細胞；レーン２：１０６３ヒト卵巣細胞系；レーン３：ヒト乳癌ＭＤＡ４３５細胞系；レーン４：ヒト乳癌ＭＤＡ２３１細胞系。
【図１３】  ヒトｈｐａのヌクレオチド配列とマウスＥＳＴｃＤＮＡフラグメント（配列番号１２）の比較を表し、後者がヒトｈｐａの３’末端（配列番号９のヌクレオチド１０６６から開始）に対し８０％の相同性を示す。整列化した終止コドンに下線を付す。
【図１４】  ｈｐａ遺伝子の染色体局在を示す。ハムスター、マウスおよびヒトの体細胞ハイブリッドから誘導されるＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物をｈｐａ特異プライマーでの増幅後、０．７％アガロースゲル上分離した。レーン１：ＢｓｔＥIIで消化したラムダＤＮＡ；レーン２：ＤＮＡ不在対照；レーン３〜２９：ＰＣＲ増幅産物。レーン３〜５：それぞれ、ヒト、マウスおよびハムスターゲノムＤＮＡ。レーン６〜２９：それぞれ、染色体１〜２２およびＸとＹを表すヒト単一染色体体細胞ハイブリッド。レーン３０：ＢｓｔＥIIで消化したラムダＤＮＡ。約２．８Ｋｂの増幅産物がレーン５および９にのみ観察されるが、これらはそれぞれヒトゲノムＤＮＡおよびヒト染色体４を担持する細胞ハイブリッドから誘導されるＤＮＡを表す。これらの結果はｈｐａ遺伝子がヒト染色体４に局在していることを示している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１４】
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