(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロバクター属あるいはセラチア属に属し、下記の性質（ａ）を有し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
（ａ）クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼのすべての活性が高められている。
【請求項２】
前記微生物が、さらに下記（ｂ）の性質を有する、請求項1に記載の製造法。
（ｂ）α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が低下または欠損している。
【請求項３】
前記微生物がエンテロバクター・アグロメランスまたはセラチア・リクエファシエンスに属する、請求項１または２に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＬ−グルタミン酸生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８５７号）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（特公昭３２−９３９３号）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（特開平５−２４４９７０号）等が知られている。
【０００３】
上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、高いＬ−グルタミン酸生産能を有する新規なＬ−グルタミン酸生産菌を見出し、安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発につなげることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、従来の微生物とは異なった微生物であって、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を広く検索、研究した結果、エンテロバクター属あるいはセラチア属に属する微生物由来の誘導株が高いＬ−グルタミン酸生産能を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００７】
（１）エンテロバクター属あるいはセラチア属に属し、下記の性質の少なくとも一方を有し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物：
（ａ）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められている、  （ｂ）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している。
【０００８】
（２）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素が、クエン酸シンターゼ（以下「ＣＳ」と略す）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（以下「ＰＥＰＣ」と略す）、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下「ＧＤＨ」と略す）から選ばれる前記（１）の微生物。
【０００９】
（３）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素が、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼのすべてである（２）の微生物、
【００１０】
（４）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素がα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下「αＫＧＤＨ」と略す）である前記（１）〜（３）のいずれかの微生物。
【００１１】
（５）微生物がエンテロバクター・アグロメランスまたはセラチア・リクエファシエンスに属する（１）〜（４）のいずれかの微生物。
【００１２】
（６）前記（１）〜（５）のいずれかの微生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の微生物は、エンテロバクター属あるいはセラチア属に属す微生物であって、下記の性質の少なくとも一方を有する微生物である。
（ａ）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められている。
（ｂ）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している。
【００１４】
このような微生物は、エンテロバクター属あるいはセラチア属に属す微生物を親株として用い、前記（ａ）および／または（ｂ）の性質を付与することにより得られる。親株として使用されるエンテロバクター属あるいはセラチア属に属す微生物には、以下のようなものがある。
【００１５】
エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）
エンテロバクター・アムニゲナス（Enterobacter amnigenus）
エンテロバクター・アスブリア（Enterobacter asburiae）
エンテロバクター・クロエッケ（Enterobacter cloacae）
エンテロバクター・ディソルベンス（Enterobacter dissolvens）
エンテロバクター・ジェルゴビア（Enterobacter gergoviae）
エンテロバクター・ホルマエッケ（Enterobacter hormaechei）
エンテロバクター・インターメディウス（Enterobacter intermedius）
エンテロバクター・ニミプレスラリス（Enterobacter nimipressuralis）
エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）
エンテロバクター・テイロレ（Enterobacter taylorae）
セラチア・リクエファシエンス（Serratia liquefacience）
セラチア・エントモフィラ（Serratia entomophila）
セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）
セラチア・フォンティコーラ（Serratia fonticola）
セラチア・グリメシ（Serratia grimesii）
セラチア・プロテアマキュランス（Serratia proteamaculans）
セラチア・オドリフェラ（Serratia odorifera）
セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）
セラチア・ルビダエ（Serratia rubidaea ）
【００１６】
さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げられる。
エンテロバクター・アグロメランス  ＡＴＣＣ１２２８７
エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５
セラチア・リクエファシエンス  ＡＴＣＣ１４４６０
【００１７】
エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４が付与されている。また、エンテロバクター・アグロメランス  ＡＴＣＣ１２２８７、セラチア・リクエファシエンス  ＡＴＣＣ１４４６０は、ＡＴＣＣより分譲を受けることができる。
【００１８】
エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５株は静岡県磐田市の土壌から分離された株である。
ＡＪ１３３５５の生理的性質を記す。
【００１９】
（１）グラム染色性：陰性
（２）酸素に対する挙動：通性嫌気性
（３）カタラーゼ：ネガティブ
（４）オキシダーゼ：ポジティブ
（５）硝酸還元能：ネガティブ
（６）フォゲス−プロスカウエル試験：ポジティブ
（７）メチルレッド試験：ネガティブ
（８）ウレアーゼ：ネガティブ
（９）インドール生成：ポジティブ
（１０）運動性：有り
（１１）ＴＳＩ培地での硫化水素生成：微弱な活性あり
（１２）β−ガラクトシダーゼ：ポジティブ
【００２０】
（１３）糖資化性：
アラビノース：ポジティブ
シュークロース：ポジティブ
ラクトース：ポジティブ
キシロース：ポジティブ
ソルビトール：ポジティブ
イノシトール：ポジティブ
トレハロース：ポジティブ
マルトース：ポジティブ
メリビオース：ポジティブ
アドニトール：ネガティブ
ラフィノース：ポジティブ
サリシン：ネガティブ
メリビオース：ポジティブ
【００２１】
（１４）グリセロース資化性：ポジティブ
（１５）有機酸資化性：
クエン酸：ポジティブ
酒石酸：ネガティブ
グルコン酸：ポジティブ
酢酸：ポジティブ
マロン酸：ネガティブ
（１６）アルギニンデヒドラターゼ：ネガティブ
（１７）オルチンデカルボキシラーゼ：ネガティブ
（１８）リジンデカルボキシラーゼ：ネガティブ
（１９）フェニルアラニンデアミナーゼ：ネガティブ
（２０）色素形成：黄色
（２１）ゼラチン液化能：ポジティブ
（２２）生育ｐＨ  ｐＨ４生育不良、ｐＨ４．５〜７生育良好
（２３）生育温度  ２５℃生育良好、３０℃生育良好、３７℃生育良好、４２℃生育可、４５℃生育不可
【００２２】
これらの菌学的性質からＡＪ１３３５５はエンテロバクター・アグロメランスと判定された。
【００２３】
後述の実施例では、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高めらた株、あるいはＬ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損して株を取得するための出発親株として、エンテロバクター・アグロメランス  ＡＴＣＣ１２２８７、エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５、あるいはセラチア・リクエファシエンス  ＡＴＣＣ１４４６０を用いた。しかし、エンテロバクター属あるいはセラチア属に属する細菌による糖の代謝はいずれもエムデン−マイヤーホフ経路を経て行われ、同経路で生成するピルビン酸は好気的条件下ではトリカルボン酸サイクルにて酸化される。Ｌ−グルタミン酸は、トリカルボン酸サイクルの中間体であるα−ケトグルタル酸より、ＧＤＨあるいはグルタミンシンセターゼ／グルタミン酸シンターゼによって生合成される。このように、これらの微生物ではＬ−グルタミン酸生合成経路は共通のものであり、本発明においては、エンテロバクター属およびセラチア属に属する微生物は単一の概念を形成する。従って、上記した種または菌株以外のエンテロバクター属およびセラチア属に属する微生物も本発明に含まれる。
【００２４】
本発明の微生物は、上記のようなエンテロバクター属またはセラチア属に属する微生物であって、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物である。ここで「Ｌ−グルタミン酸生産能を有する」とは、培養したときに培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有することをいう。本発明においては、Ｌ−グルタミン酸生産能は、下記の性質の一方または両方を付与することにより付与される。
【００２５】
（ａ）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性が高められている。
（ｂ）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している。
【００２６】
エンテロバクター属またはセラチア属微生物のＬ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素としては、ＧＤＨ、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、ＣＳ、ＰＥＰＣ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種または２種もしくは３種が好ましい。さらに、本発明の微生物においては、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの３種の酵素の活性がともに高められていることが好ましい。細胞中の目的酵素の活性が増加していること、および活性の増加の程度は、微生物の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株または親株と比較することによって確認できる。
【００２７】
本発明で使用されるエンテロバクター属あるいはセラチア属に属し、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素のいずれか１種、または２種以上の活性が高められた微生物は、例えば、前記の微生物を出発親株に用い、これらの酵素をコードする遺伝子に変異を生じた変異株として、または遺伝子組換え株として取得することができる。
【００２８】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、例えば、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードする遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿主となる上記出発親株を形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨをコードする遺伝子（以下、おのおのをこの順に「ｇｌｔＡ遺伝子」、「ｐｐｃ遺伝子」、「ｇｄｈＡ遺伝子」と略する）のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性が高められる。
【００２９】
クローニングされたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、単独または任意の２種または３種の組合わせで、上記出発親株に導入される。２種または３種の遺伝子を導入する場合には、一種類のプラスミド上に２種又は３種の遺伝子がクローン化されて宿主に導入されるか、あるいは共存可能な２種類または３種類のプラスミド上に別々にクローン化されて宿主に導入される。
上記プラスミドとしては、エンテロバクター属あるいはセラチア属に属する微生物の細胞中で自律複製可能なプラスミドであれば特に制限されないが、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
【００３０】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めることは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子を、宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。エンテロバクター属、あるいはセラチア属に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子を多コピーで導入するには、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピート等、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列が利用できる。あるいは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子をトランスポゾンに搭載して、これを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。形質転換株の細胞内のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められる。
【００３１】
コピー数を上昇させるｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子の供給源となる生物としては、ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性を有する生物ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細菌、たとえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エルビニア属、パントエア属、セラチア属、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生物の染色体ＤＮＡより得ることができる。
【００３２】
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣもしくはＧＤＨ活性を欠失した変異株を用いてその栄養要求性を相補するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離することによって取得できる。またエシェリヒア属のこれら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。
【００３３】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、上記の遺伝子増幅による以外にも、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の発現が強化されることによって達成される。例えば、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターをそれよりも強力な他のプロモーターに置換することによって発現が強化される。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターが置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子は、プラスミド上にクローニングされて宿主微生物に導入されるか、またはレペッティブＤＮＡ、インバーティッド・リピート、またはトランスポゾン等を用いて宿主微生物の染色体ＤＮＡ上に導入される。
【００３４】
また、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高めるには、染色体上のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを、それらよりも強力なプロモーターで置換する（ＷＯ８７／０３００６号、特開昭６１−２６８１８３号参照）か、またはそれぞれの遺伝子のコード配列の上流に、強力なプロモーターを挿入すること（Gene, 29, (1984) 231-241参照）によっても達成することができる。具体的には、強力なプロモーターに置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子もしくはｇｄｈＡ遺伝子またはそれらの一部を含むＤＮＡと、染色体上の対応する遺伝子との間で相同組換えを起こさせればよい。
【００３５】
ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められたエンテロバクター属またはセラチア属に属する微生物として具体的には、エンテロバクター・アグロメランス  ＡＴＣＣ１２２８７／ＲＳＦＣＰＧ、エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５／ＲＳＦＣＰＧ、およびセラチア・リクエファシエンス  ＡＴＣＣ１４４６０／ＲＳＦＣＰＧが挙げられる。
【００３６】
Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、αＫＧＤＨ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等がある。これらの酵素の中では、αＫＧＤＨが好ましい。
【００３７】
エンテロバクター属またはセラチア属に属する微生物において、上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。
【００３８】
変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。
【００３９】
また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子（欠陥遺伝子）を作製する。次いで、この欠陥遺伝子をエンテロバクター属またはセラチア属に属する微生物の細胞に導入し、相同組み換えを利用して染色体上の目的遺伝子を前記欠陥遺伝子に置換する（遺伝子破壊）。
【００４０】
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株または親株と比較することによって確認することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性は、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って酵素活性を測定することができる。
【００４１】
また、目的とする酵素によっては、変異株の表現型によって目的変異株を選択することができる。例えば、αＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株は、好気的培養条件ではグルコースを含む最少培地、あるいは、酢酸やＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として含む最少培地で生育できないか、または生育速度が著しく低下する。ところが、同一条件でもグルコースを含む最少培地にコハク酸またはリジン、メチオニン、及びジアミノピメリン酸を添加することによって通常の生育が可能となる。これらの現象を指標としてαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の選抜が可能である。
【００４２】
相同組換えを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのαＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作製法は、ＷＯ９５／３４６７２号に詳述されており、エンテロバクター属およびセラチア属に属する微生物にも同様の方法を適用することができる。
その他、遺伝子のクローニング、ＤＮＡの切断、連結、形質転換法等の技術については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)）等に詳述されている。
【００４３】
以上のようにして得られるαＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては、エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５６が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５６は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６４５として寄託され、平成１１年１月１１日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５が付与されている。
【００４４】
エンテロバクター属またはセラチア属に属し、前記性質（ａ）および（ｂ）の少なくとも一方を有し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物を液体培地に培養することにより、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させることができる。
【００４５】
前記培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は、培養する菌株の利用可能なものならばよい。
【００４６】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００４７】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００４８】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
【００４９】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養方法は、発酵温度２０ないし４２℃、ｐＨを４ないし８に制御しつつ通気培養を行う。かくして１０時間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
【００５０】
培養終了後、培養液中に蓄積されたＬ−グルタミン酸を単離する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。
【００５１】
【実施例】
次に、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。
【００５２】
（１）ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作製
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作成の手順を、図１〜５図に基づいて説明する。
【００５３】
エシェリヒア・コリ由来のｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＢＲＧＤＨ（特開平７−２０３９８０号）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理で両末端を平滑末端にした後、ｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収した。一方、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子およびｐｐｃ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰ（ＷＯ９７／０８２９４号）をＸｂａＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで両末端を平滑末端にした。これに、上で精製したｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ｐＭＷＣＰに更にｇｄｈＡ遺伝子を搭載したプラスミドｐＭＷＣＰＧを得た（図１）。
また、ｐＢＲＧＤＨをＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ消化して得られたｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収後、プラスミドｐＳＴＶ２９（宝酒造（株）より購入）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩサイトに導入することによって、プラスミドｐＳＴＶＧを得た（図２）。
【００５４】
同時に、広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点を有するプラスミドｐＶＩＣ４０（特開平８−０４７３９７号）をＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものと、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＴ１４１消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものとを混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ１０１０の複製起点及びテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドＲＳＦ−Ｔｅｔを得た（図３）。
【００５５】
次に、ｐＭＷＣＰＧをＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収し、ＲＳＦ−Ｔｅｔを同様にＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ＲＳＦ１０１０の複製起点を有するＤＮＡ断片を精製回収したものと混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ−Ｔｅｔ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を搭載したプラスミドＲＳＦＣＰＧを得た（図４）。得られたプラスミドＲＳＦＣＰＧがｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を、ｐＳＴＶＧがｇｄｈＡ遺伝子を発現していることは、エシェリヒア・コリのｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、あるいはｇｄｈＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の相補と各酵素活性の測定によって確認した。
【００５６】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドは、以下のようにして構築した。コリネバクテリウム・グルタミカムのｇｌｔＡ遺伝子の塩基配列（Microbiology, 1994, 140, 1817-1828）をもとに、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するプライマーＤＮＡを用い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子断片を得た。この断片をＳｍａＩ消化したプラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）より購入）に挿入し、プラスミドｐＨＳＧＣＢを得た（図５）。次に、ｐＨＳＧＣＢをＨｉｎｄＩＩＩで切断し切り出された約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩ消化したプラスミドｐＭＷ２１８（ニッポンジーン（株）より購入）に挿入し、プラスミドｐＭＷＣＢを得た（図５）。得られたプラスミドｐＭＷＣＢがｇｌｔＡ遺伝子を発現していることは、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５株中での酵素活性の測定によって確認した。
【００５７】
（２）エンテロバクター・アグロメランスあるいはセラチア・リクエファシエンスへのＲＳＦＣＰＧ、ｐＭＷＣＢ及びｐＳＴＶＧの導入とＬ−グルタミン酸生産性の評価
ＲＳＦＣＰＧ、ｐＭＷＣＢ及びｐＳＴＶＧを用い、エンテロバクター・アグロメランス  ＡＴＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５株、あるいはセラチア・リクエファシエンス  ＡＴＣＣ１４４６０を、エレクトロポレーション（Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook" Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1992）によって形質転換し、テトラサイクリン耐性を示す形質転換株を取得した。
【００５８】
得られた形質転換株あるいは各親株を、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌを含有する培地５ｍｌを注入した５０ｍｌ容大型試験管に接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。ただし、ＡＪ１３３５５／ｐＭＷＣＢ株及びＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶＧ株は、糖消費速度が遅かったため、親株ＡＪ１３３５５と同様の培養時間１５時間にて約１０ｇ／Ｌの糖を消費した時点で培養を打ち切った。形質転換体の培養については、テトラサイクリン２５ｍｇ／Ｌを添加した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸を測定した結果を表１に示した。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
エンテロバクター・アグロメランス  ＡＴＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５株、あるいはセラチア・リクエファシエンス  ＡＴＣＣ１４４６０株はＬ−グルタミン酸を蓄積しなかったが、ＲＳＦＣＰＧを導入することによってＣＳ、ＰＥＰＣ、およびＧＤＨ活性を増幅した株では、それぞれ６．１ｇ／Ｌ、３．３ｇ／Ｌ、２．８ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を蓄積した。また、ＡＪ１３３５５株のＣＳ活性のみを増幅することによって０．８ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を、ＧＤＨ活性のみを増幅することによっても０．８ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を蓄積した。
【００６１】
（３）エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５株のαＫＧＤＨ遺伝子（以後「ｓｕｃＡＢ」という）のクローニング
エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５株のｓｕｃＡＢ遺伝子は、エシェリヒア・コリのαＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニット遺伝子（以後「ｓｕｃＡ」という）欠損株の酢酸非資化性を相補するＤＮＡ断片を、エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５株染色体ＤＮＡより選択することによって、クローニングした。
【００６２】
エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５株の染色体ＤＮＡは、エシェリヒア・コリにおいて通常染色体ＤＮＡを抽出するのに使用されるのと同様の方法（生物工学実験書、日本生物工学会偏、９７−９８頁、培風館、１９９２年）で単離した。ベクターとして使用したｐＴＷＶ２２８（アンピシリン耐性）は宝酒造社製の市販品を用いた。
【００６３】
ＡＪ１３３５５株の染色体ＤＮＡをＥｃｏＴ２２１で消化したもの、およびｐＴＷＶ２２８をＰｓｔＩで消化したものをＴ４リガーゼにより連結し、ｓｕｃＡ欠損のエシェリヒア・コリ  ＪＲＧ４６５株（Ｈｅｒｂｅｒｔ  Ｊ．ら  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９６９，１０５巻、１８２頁）を形質転換した。こうして得た形質転換株より、酢酸最少培地にて生育する株を選択し、これよりプラスミドを抽出してｐＴＷＶＥＫ１０１と命名した。ｐＴＷＶＥＫ１０１を持つエシェリヒア・コリ  ＪＲＧ４６５株は酢酸非資化性という形質の他にコハク酸もしくはＬ−リジンおよびＬ−メチオニンの要求性も回復していた。このことよりｐＴＷＶＥＫ１０１にはエンテロバクター・アグロメランスのｓｕｃＡ遺伝子が含まれていると考えられる。
【００６４】
ｐＴＷＶＥＫ１０１のエンテロバクター・アグロメランス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図６に示した。図６の斜線にて示した部分の塩基配列を決定した結果を配列番号１に示した。この配列の中には、２つの完全長のＯＲＦと、２つのＯＲＦの部分配列と思われる塩基配列が見いだされた。これらのＯＲＦまたはその部分配列がコードし得るアミノ酸配列を、５’側から順に配列番号２〜５に示す。これらのホモロジー検索をした結果、塩基配列を決定した部分は、サクシネートデヒドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイン遺伝子（ｓｄｈＢ）の３’末端側の部分配列、完全長のｓｕｃＡとαＫＧＤＨ−Ｅ２サブユニット遺伝子（ｓｕｃＢ遺伝子）、サクシニルＣｏＡシンセターゼβサブユニット遺伝子（ｓｕｃＣ遺伝子）の５’末端側の部分配列を含んでいることが明らかとなった。これらの塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれエシェリヒア・コリのもの（Eur.J. Biochem., 141, 351-359 (1984)、Eur.J. Biochem., 141, 361-374 (1984)、Biochemistry, 24, 6245-6252 (1985)）と比較した結果を図７〜９に示す。このように各アミノ酸配列は非常に高い相同性を示した。また、エンテロバクター・アグロメランス染色体上でもエシェリヒア・コリと同様に（Eur.J. Biochem., 141, 351-359 (1984)、Eur.J. Biochem., 141, 361-374 (1984)、Biochemistry, 24, 6245-6252 (1985)）、ｓｄｈＢ−ｓｕｃＡ−ｓｕｃＢ−ｓｕｃＣとクラスターを構成していることが判明した。
【００６５】
（４）エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５株由来のαＫＧＤＨ欠損株の取得
上記のようにして取得されたエンテロバクター・アグロメランスのｓｕｃＡＢ遺伝子を用い、相同組換えによりエンテロバクター・アグロメランスのαＫＧＤＨ欠損株の取得を行った。
【００６６】
まず、ｐＴＷＶＥＫ１０１をＢｇｌＩＩにて切断し、ｓｕｃＡ遺伝子のおよそ半分に当たるＣ末端側領域とｓｕｃＢ遺伝子の全長を取り除いた。続いてそこにｐＨＳＧ３９９（宝酒造社製）よりＡｃｃＩによって切り出したクロラムフェニコール耐性遺伝子断片を挿入した。こうしてできたｓｄｈＢ−ΔｓｕｃＡＢ：：Ｃｍr−ｓｕｃＣの領域をＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩにて切り出した。得られたＤＮＡ断片を用いて、エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５５株を、エレクトロポレーションによって形質転換し、クロラムフェニコール耐性である株を取得して、染色体上のｓｕｃＡＢ遺伝子がｓｕｃＡＢ：：Ｃｍrに置換されたと考えられるｓｕｃＡＢ欠損株エンテロバクター・アグロメランス  ＡＪ１３３５６株を取得した。
【００６７】
以上のようにして得られたＡＪ１３３５６株がαＫＧＤＨ活性を欠損していることを確認するために、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って酵素活性を測定した。その結果、表２に示すようにＡＪ１３３５６株ではαＫＧＤＨ活性を検出できず、目的通りｓｕｃＡＢが欠損していることが確かめられた。
【００６８】
【表２】
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【００６９】
（５）エンテロバクター・アグロメランス  αＫＧＤＨ欠損株のＬ−グルタミン酸生産性の評価
ＡＪ１３３５５、ＡＪ１３３５６両株を、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸塩２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−α，ε−ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）２００ｍｇ／Ｌを含有する培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容フラスコに接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸及びα−ケトグルタール酸（以後「αＫＧ」と略す）を測定した結果を表３に示した。
【００７０】
【表３】
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【００７１】
αＫＧＤＨ活性が欠損したＡＪ１３３５６株は、Ｌ−グルタミン酸を１．５ｇ／Ｌ蓄積した。また同時に３．２ｇ／ＬのαＫＧを蓄積した。
【００７２】
（６）エンテロバクター・アグロメランス  αＫＧＤＨ欠損株へのＲＳＦＣＰの導入とＬ−グルタミン酸生産性の評価
ＡＪ１３３５６株をＲＳＦＣＰＧを用いて形質転換を行い、得られたＲＳＦＣＰＧ導入株ＡＪ１３３５６／ＲＳＦＣＰＧを、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、テトラサイクリン２５ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸塩２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−α，ε−ＤＡＰ２００ｍｇ／Ｌを含有する培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容フラスコに接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸及びαＫＧを測定した結果を表４に示した。
【００７３】
【表４】
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【００７４】
ＲＳＦＣＰＧを導入してＣＳ、ＰＥＰＣ、およびＧＤＨ活性を増幅した株では、αＫＧ蓄積量が減少し、Ｌ−グルタミン酸蓄積が更に向上した。
【００７５】
【発明の効果】
本発明の微生物は、高いＬ−グルタミン酸生産能を有することから、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌で従来知られている育種手法等を用いてさらに高い生産能を付与できると考えられ、また培養条件等の検討により、安価で、効率の良いＬ−グルタミン酸製造法の開発につながるものと期待される。
【００７６】
【配列表】
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【００７７】
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0004144098.tif 000008
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
0004144098.tif 000026
【００８２】
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【００８３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰＧの構築を示す図。
【図２】  ｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＳＴＶＧの構築を示す図。
【図３】  広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点とテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドＲＳＦ−Ｔｅｔの構築を示す図。
【図４】  広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起点、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドＲＳＦＣＰＧの構築を示す図。
【図５】  ｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＢの構築を示す図。
【図６】  ｐＴＷＶＥＫ１０１のエンテロバクター・アグロメランス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図。
【図７】  エンテロバクター・アグロメランス由来のｓｕｃＡ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。上段：エンテロバクター・アグロメランス、下段：エシェリヒア・コリ（以下、同様）。
【図８】  エンテロバクター・アグロメランス由来のｓｕｃＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
【図９】  エンテロバクター・アグロメランス由来のｓｕｃＣ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
【図１０】  エンテロバクター・アグロメランス由来のｓｄｈＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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