(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のステップ：
（１）以下の式（Ｉ）：
式（Ｉ）：  ５‘−塩基配列（ａ）−（Ｎ）ｎ−３’
（上記式中、塩基配列（ａ）は核酸結合分子（Ａ）が認識する塩基配列、「Ｎ」はそれぞれ独自に任意のヌクレオチド、及び「ｎ」は自然数を示す。）
で表されるランダムな塩基配列から成る核酸分子のプールを調製し、
（２）核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体と、上記核酸分子のプールとの間で結合反応を行ない、
（３）異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を選択し、及び
（４）選択された核酸分子の塩基配列を同定することにより核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列（５‘−（Ｎ）ｎ−３’）を決定する、
ことから成るＤ−体アミノ酸オリゴペプチドである核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列の決定方法であって、
核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体が、
ホスト−ゲスト包接化合物による錯体形成能を利用して得られるものであり、
核酸結合分子（Ａ）が１０個〜３０個のアミノ酸残基から成るオリゴペプチドであり、
核酸結合分子（Ｂ）が１０個〜３０個のＤ−体アミノ酸残基から成るＤ−体アミノ酸オリゴペプチドである、決定方法。
【請求項２】
ゲルシフトアッセイを用いて異種分子二量体と複合体を形成した核酸分子をその他の核酸分子から分離することにより、異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を選択することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステップ（３）の後に、選択された核酸分子を増幅するステップ（３−１）を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ステップ（２）において、ステップ（３−１）で増幅された核酸分子を核酸分子のプールとして使用し異種分子二量体との間で結合反応を行うことを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ステップ（２）、（３）及び（３−１）を複数回繰り返すことにより異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を濃縮することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
選択された核酸分子をＰＣＲ法により増幅することを特徴とする、請求項３ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（２）において、異種分子二量体と上記核酸のプールとの間の非特異的な結合を抑制するために、ポリｄＩ−ｄＣ存在下で結合反応を行なうことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
核酸結合分子（Ａ）のオリゴポリペプチドが転写活性化因子に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
核酸結合分子（Ａ）のオリゴペプチドが酵母の転写活性化因子である、ＧＣＮ４の塩基性領域に由来する２３個のアミノ酸残基から成るＧ２３である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸結合分子（Ａ）のオリゴポリペプチドがベーシックロイシンジッパータンパク質の塩基性領域に由来する、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
異種分子二量体が各核酸結合分子のＣ末端にホスト又はゲスト包接化合物のいずれか一方を導入することにより調製されることを特徴とする、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
ホスト−ゲスト包接化合物がアダマンタン及びβ−シクロデキストリンの組み合わせである、請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
異種分子二量体が、
核酸結合分子（Ａ）に、アダマンタン又はβ−シクロデキストリンが結合され、
核酸結合分子（Ｂ）に、β−シクロデキストリン又はアダマンタン（ただし、核酸結合分子（Ａ）にアダマンタンが結合されている場合にはβ−シクロデキストリン、核酸結合分子（Ａ）にβ−シクロデキストリンが結合されている場合にはアダマンタン）が結合されてなる、請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
核酸分子が二本鎖ＤＮＡである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
塩基配列（ａ）が３個〜５個のヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
塩基配列（ａ）が５‘−ＡＴＧＡＣ−３’である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
認識塩基配列が既知である核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体であって、
ホスト−ゲスト包接化合物による錯体形成能を利用して得られるものであり、
核酸結合分子（Ａ）が１０個〜３０個のアミノ酸残基から成るオリゴペプチドであり、
核酸結合分子（Ｂ）が１０個〜３０個のＤ−体アミノ酸残基から成るＤ−体アミノ酸オリゴペプチドである、異種分子二量体。
【請求項１８】
核酸結合分子（Ａ）のオリゴポリペプチドが転写活性化因子に由来する、請求項１７に記載の異種分子二量体。
【請求項１９】
核酸結合分子（Ａ）のオリゴペプチドが酵母の転写活性化因子である、ＧＣＮ４の塩基性領域に由来する２３個のアミノ酸残基から成るＧ２３である、請求項１７〜１８のいずれか一項に記載の異種分子二量体。
【請求項２０】
核酸結合分子（Ａ）のオリゴポリペプチドがベーシックロイシンジッパータンパク質の塩基性領域に由来する、請求項１７に記載の異種分子二量体。
【請求項２１】
ホスト−ゲスト包接化合物がアダマンタン及びβ−シクロデキストリンの組み合わせである、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の異種分子二量体。
【請求項２２】
核酸結合分子（Ａ）に、アダマンタン又はβ−シクロデキストリンが結合され、
核酸結合分子（Ｂ）に、β−シクロデキストリン又はアダマンタン（ただし、核酸結合分子（Ａ）にアダマンタンが結合されている場合にはβ−シクロデキストリン、核酸結合分子（Ａ）にβ−シクロデキストリンが結合されている場合にはアダマンタン）が結合されてなる、請求項１７〜２１の何れかに記載の異種分子二量体。
【請求項２３】
請求項１７〜２２の何れかに記載の異種分子二量体、及び、
以下の式（Ｉ）で表されるランダムな塩基配列：
式（Ｉ）：  ５‘−塩基配列（ａ）−（Ｎ）ｎ−３’
（上記式中、塩基配列（ａ）は核酸結合分子（Ａ）が認識する塩基配列、「Ｎ」はそれぞれ独自に任意のヌクレオチド、及び「ｎ」は自然数を示す。）から成る核酸分子のプール、
を含んでなる、
Ｄ−体アミノ酸オリゴペプチドである核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列を決定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質等の各種ＤＮＡ結合分子、特に、短鎖ペプチドが認識する核酸分子の塩基配列の決定方法、並びに、それに用いる異種分子二量体及びキット等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
天然のＤＮＡ結合タンパク質においてＤＮＡと直接接触する部分は単純なαヘリックス構造（ＤＮＡ認識ヘリックス）をとることが多い。現在までの研究で、認識されるＤＮＡの塩基配列（以下、「認識ＤＮＡ配列」ともいう）とＤＮＡ認識ヘリックスのアミノ酸配列との間には一般的な相関関係は見いだされておらず、テーラーメイドに塩基配列認識能を持つタンパク質の設計において重大な問題の一つとなっている。特に、短鎖ペプチドのＤＮＡ結合能は一般に低いため、その認識ＤＮＡ配列を決定することは困難である。
【０００３】
これまでＤＮＡに結合するタンパク質や抗生物質の認識ＤＮＡ配列を決定する方法として、デオキシリボヌクレアーゼＩ又は硫酸ジメチルのようなメチル化剤を用いる修飾アッセイに於けるフットプリンティング法が用いられてきたが、現在の処、選択性・親和性が低いペプチドなどの化合物の認識ＤＮＡ配列を検定できる方法はない。
【０００４】
今後、ＤＮＡに直接作用する薬剤の開発が進むと予想されることからも、ＤＮＡ等の核酸結合分子が認識する塩基配列を簡便に決定する技術の開発が必須である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は上記課題を解決するために、選択性・親和性が低い化合物（ペプチド、糖類、合成有機分子）についても、簡便かつ迅速にその認識ＤＮＡ配列を決定するための技術の開発を試み、その結果、本発明を完成させた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明者は、天然のDNA結合タンパク質は直接ＤＮＡ塩基と接触する部分にαヘリックス構造を多用している。このことから、約２５個のアミノ酸からなるオリゴペプチドはヘリックス構造をとることにより４〜５塩基対の塩基配列を認識することが期待される。しかしながら、約２５アミノ酸からなるオリゴペプチド単体では安定なDNAとの複合体を形成する例はまれであるため、その認識DNA配列を決定することは不可能である。そこで、新しく作製したオリゴペプチドと認識塩基配列が明らかになっているオリゴペプチドと異種二量体を作製し、ペプチド二量体とDNAとの親和性を高めた上で異種二量体の認識DNA配列を決定する、という方法を考えた。
この方法によれば、異種二量体のうち、片方のペプチドが認識するDNA配列はわかっているので、新たに作製したオリゴペプチドがどのようなDNA塩基配列を認識するかは簡単に知ることができる。
【０００７】
本発明は上記方法に基づき完成したものである。即ち、第一に、下記のステップ：
（１）以下の式（Ｉ）で表されるランダムな塩基配列：
式（Ｉ）：  ５‘−塩基配列（ａ）−（Ｎ）ｎ−３’
（上記式中、塩基配列（ａ）は核酸結合分子（Ａ）が認識する塩基配列、「Ｎ」はそれぞれ独自に任意のヌクレオチド、及び「ｎ」は自然数を示す。）
から成る核酸分子のプールを調製し、
（２）核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体と、上記核酸分子のプールとの間で結合反応を行ない、
（３）異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を選択し、及び
（４）選択された核酸分子の塩基配列を同定することにより核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列（５‘−（Ｎ）ｎ−３’）を決定することから成る、核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列の決定方法に係る。
【０００８】
本発明方法のステップ（３）における異種（分子）二量体との親和性が高い核酸分子の選択は、当業者に公知の任意の手段により行なうことが出来る。好適例として、ゲルシフトアッセイを用いて異種分子二量体と複合体を形成した核酸分子を、その他の核酸分子から分離する方法を挙げることが出来る。
【０００９】
本発明方法において、ステップ（３）の後に、選択された核酸分子を増幅するステップ（３−１）、及び、必要に応じて、ステップ（２）において、ステップ（３−１）で増幅された核酸分子を核酸分子のプールとして使用して異種分子二量体との間で結合反応を行うことも可能である。更に、このようなステップ（２）、（３）及び（３−１）を複数回繰り返すことにより異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を濃縮することができる。このような方法はＳＡＡＢ法（Selected And Amplified Binding）と呼ばれる。選択された核酸分子を増幅するには、当業者に公知の任意の方法で行なうことが出来るが、簡便性及び迅速性等の点からＰＣＲ法が好適である。
【００１０】
本発明方法のステップ（２）における、異種分子二量体と核酸分子のプールとの間の結合反応における、溶媒の種類、共存させる塩濃度、及び反応各成分の濃度等の諸条件は、異種分子二量体との親和性が高い核酸分子がより迅速に且つ特異的に選択されるように、当業者がその適宜最適化することができる。例えば、非特異的な結合を抑制するために、ポリｄＩ−ｄＣ存在下で結合反応を行なうことが好ましい。このように選択条件を最適化することで、ステップ（２）、（３）及び（３−１）の反復回数をより少なくすることが出来る。
【００１１】
本発明方法で使用する核酸結合分子には、任意の化合物、例えば、各種ゴペプチド、オリゴ糖類、有機分子等が含まれる。特に、本発明の特徴として、例えば、１０個〜３０個のアミノ酸残基から成る短鎖オリゴペプチドのようなＤＮＡ結合能の低い化合物を核酸結合分子として使用し、該分子が認識する塩基配列を決定することが出来ることである。
このような短鎖オリゴペプチドから成る核酸結合分子(Ａ)の例として、当業者に公知の各種転写活性化因子に由来するもの、例えば、酵母の転写活性化因子であるＧＣＮ４の塩基性領域に由来する２３個のアミノ酸残基から成るオリゴペプチド（以下、「Ｇ２３」と称す）、及び、ベーシックロイシンジッパータンパク質の塩基性領域に由来するもの、例えば、ロイシンジッパータンパク質であるＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）のＤＮＡ結合に由来する２３個のアミノ酸残基から成るオリゴペプチド（以下、「Ｃ２３」と称す）「Ｃ２３」を挙げることができる。
又、認識する塩基配列が未知の核酸結合分子（Ｂ）の一例として、Ｄ−体アミノ酸からなる合成オリゴペプチドを挙げることが出来る。
ここで、核酸結合分子（Ａ）及び核酸結合分子（Ｂ）をそれぞれ構成する分子の種類は互いに異なるものであっても構わない。例えば、核酸結合分子（Ａ）としてオリゴペプチドを用い、核酸結合分子（Ｂ）としてはオリゴ糖類を使用することも可能である。
このような核酸結合分子は市販されているものを使用するか、又は、目的に応じて、当業者に公知の方法により適宜合成することが可能である。
【００１２】
異種（分子）二量体の作成方法に特に制限はないが、好適例として、ホスト−ゲスト包接化合物による錯体形成能を利用して得られるものを挙げることが出来る。これは、異種分子二量体を構成する各核酸結合分子のＣ末端に当業者に公知の任意の方法によりホスト又はゲスト包接化合物のいずれか一方を導入することにより調製することが出来る。このような目的に好適なホスト−ゲスト包接化合物は当業者に公知であり容易に調製することが出来る。一例として、アダマンタン及びβ−シクロデキストリンの組み合わせを挙げることが出来る。
【００１３】
核酸分子の例としては、二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを挙げることが出来る。これらの核酸分子において構成塩基が適宜修飾されていても良い。これらの核酸分子は公知技術に基づいて当業者が任意に調製することが出来る。更に、核酸分子のプールを構成するランダムな塩基配列において、式（Ｉ）における塩基配列（ａ）は、核酸結合分子（Ａ）が認識できる範囲として３個〜５個のヌクレオチド（塩基対）からなるものであることが好ましい。例えば、核酸結合分子（Ａ）としてＧ２３を使用する場合には、塩基配列（ａ）は５‘−ＡＴＧＡＣ−３’であることが好ましい。又、式（Ｉ）中の「Ｎ」はそれぞれ独自にＡ、Ｔ，Ｇ，Ｃ等の任意のヌクレオチドをランダムに表している。好ましくは、各「Ｎ」がＡ、Ｔ，Ｇ，及びＣの全てをとり、塩基配列「（Ｎ）ｎ」全体としてＡ、Ｔ，Ｇ，及びＣからなる全ての組み合わせがプールに存在するように核酸分子を調製する。
例えば、ゲルシフトアッセイを用いて異種分子二量体と複合体を形成した核酸分子を、その他の核酸分子から分離し、異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を選択するためには、核酸分子のプールを構成するランダムな塩基配列は、当業者に公知の任意の方法により、例えば、３２Ｐのような放射性標識でラベル化されていることが好ましい。
【００１４】
本発明は、更に、上記の決定方法で決定された塩基配列（５‘−（Ｎ）ｎ−３’）を有する核酸分子自体、及び、このような核酸分子を含む核酸構築物に係る。ここで「核酸構築物」とは、その他の核酸と結合又は組み合わされ、各種の目的で使用することのできる物質をいい、例えば、該核酸分子を各種プラスミド等内にクローニングして得られるクローニングベクターを挙げることができる。このようなクローニングベクターは大腸菌等の適当な宿主体内で増殖させた後に回収し、上記核酸分子の塩基配列を決定する為に使用することが出来る。
【００１５】
本発明は、又、上記方法で使用する、認識塩基配列が既知である核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体自体に係る。
【００１６】
本発明は、又、以下の式（Ｉ）で表されるランダムな塩基配列：
式（Ｉ）：  ５‘−塩基配列（ａ）−（Ｎ）ｎ−３’
（上記式中、塩基配列（ａ）は核酸結合分子（Ａ）が認識する塩基配列、「Ｎ」はそれぞれ独自に任意のヌクレオチド、及び「ｎ」は自然数を示す。）から成る核酸分子のプール、及び、核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体を含む、核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列を決定するためにキットにも係る。このようなキットには、異種分子二量体と核酸のプールとの間の結合反応、及び、選択された核酸分子の増幅反応等に使用する、価各種の溶媒、塩類、濃度、その他の任意の試薬並びに実験プロトコールなどを更に含むことが出来る。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、核酸結合分子としてオリゴペプチドを用いて、本発明の具体的態様を詳細に説明する。
まず、GCN4のベーシックリージョンG23のＣ末端にアダマンタン(Ad)を導入したG23Adと、非天然アミノ酸を含む新しいDNA認識ペプチドとして、G23を構成するアミノ酸が光学異性体であるD体のアミノ酸であるDG23のＣ末端にβ−シクロデキストリン(Cd)を導入したDG23Cd（図１)を当業者に周知の固相ペプチド合成法を用いて合成した。アダマンタンとシクロデキストリンによる異種二量体形成能を利用して形成されるG23Ad/DG23Cdペプチド二量体は約10塩基対のDNA塩基配列を認識することが期待される。天然のGCN4由来のG23Adは5’-ATGAC-3’という配列を認識することがわかっているが、もう半分の新しく設計した非天然アミノ酸からなるDG23Cdの認識配列は未知である。本発明では、新しく設計したペプチドが結合するDNA塩基配列をA、T、G、Cのすべての組み合わせが存在するようにした4５通りのDNA配列プール中から選びだすという手法の確立を試みた。
【００１８】
その方法として既に述べた ＳＡＡＢ法 という方法を導入した。まず、10塩基対からなる人工二量体タンパク質のDNA結合配列を設計し、その半分をG23が認識する5’-ATGAC-3’ 配列とし、残りの半分をA、T、G、Cのすべての組み合わせが存在するようにランダム化した4５通りの配列(5’-ATGACN１N２N３N４N５-3’)として用いた。4５通りの配列(5’-ATGACN１N２N３N４N５-3’)を含む一本鎖DNAを合成し、これに３２Pで放射標識したプライマーをアニールさせた後、Klenow Fragmentにより伸長反応を起こして二本鎖DNAのランダムプールを作製した。この結果、この二本鎖DNAランダムプール中のDNAはすべてG23ペプチドが結合する配列をもち、その隣にA、T、G、Cのすべての組み合わせをもった配列が存在することになる。
【００１９】
こうして調製されたDNAプールに異種二量体ペプチドをそれぞれ50 nM、100 nM、200 nMの濃度になるように加え、4℃で30分間結合実験を行ったのち、結合混合液を氷上でのゲルシフトアッセイによりDNAとDNA−異種二量体ペプチド複合体に分離し、ホスト−ゲスト錯体形成能により二量化した異種二量体ペプチドが結合したDNAだけを抽出したのち、PCR法によって抽出したDNA配列を増幅させた。その後、この増幅させたDNAを再び結合実験に用い、同様の手順でペプチド二量体に結合したDNAだけを抽出した。以上のような一連の結合、選択、増幅の操作を繰り返すことにより、ペプチド二量体と特異的に結合する配列が4５通りの配列をもつDNAプールの中から濃縮された。
【００２０】
この手法では、二量体ペプチドをDNAと結合させる条件によってDNAプールの中から二量体ペプチドが認識するDNA塩基配列が効率よく選択できるかどうかが決まる。仮に選択の初期の段階で結合条件を厳しくしすぎると、二量体ペプチドとDNAとの結合がほとんど起こらないため、特異的な塩基配列が選ばれてこない可能性がある。また、二量体ペプチドとDNAの間に非特異的な結合が起こりやすい結合条件で結合、選択、増幅の操作を繰り返しても、効率よく二量体ペプチドの特異的な認識塩基配列が選ばれてこないと考えられる。
【００２１】
したがって、すでにどのような配列に結合するかがわかっているGCN4由来のタンパク質に由来するペプチド二量体であるG23Cd/G23AdおよびC/EBP由来のペプチドとGCN4由来のペプチドの異種二量体であるC23Cd/G23Adを用いて一連の結合、選択、増幅実験を行い、期待されるDNA塩基配列が選ばれてくるDNA結合条件を探索した。
【００２２】
各結合・選択・増幅の操作ごとに特異的に結合する配列の濃縮をゲルシフト法による結合バンドの割合によって確認後、結合が強くなった時点で選択されたDNAを３２Ｐでラベル化していないプライマーを用いてPCR法により増幅させ、制限酵素Bam HIおよびEco RIにより二本鎖DNAを切断して、pUC19にクローニングした。生成したコロニーをGCN4由来のタンパク質の同種二量体であるG23Cd/G23AdおよびC/EBP由来のタンパク質とGCN4由来のタンパク質の異種二量体であるC23Cd/G23Ad双方から選択された系に対してそれぞれ数十個ずつ選び、SAAB法により選択された二量体結合部位の塩基配列決定を行った。
【００２３】
SAAB法を用いて二量体形成部位として、β−シクロデキストリン (Cd) とアダマンタン (Ad) のホスト−ゲスト錯体形成能を利用した3種類の二量体ペプチドの認識DNA塩基配列の効率的な決定条件について調べた。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例に則して、本発明を更に説明する。尚、本発明の技術的範囲は以下の実施例に何等拘束されるものではない。
【００２５】
認識DNA塩基配列がわかっているペプチド二量体を用いたSAAB法によるオリゴペプチド認識DNA配列の決定
GCN4由来のペプチドであるG23Ad/G23Cdからなる同種二量体は、回文配列であるCRE（5’-ATGACGTCAT-3’）を特異的に認識して結合し、高い安定性を持つ複合体を形成することが知られている。SAAB法における選択条件を最適化するために、まずこの同種二量体ペプチドに着目し、ランダムDNAプールを用いてSAAB法を行ったときにG23Ad/G23Cdの本来の認識配列であるCRE配列が選択されてくるような結合条件を探索した。この際、選択の初期の段階で結合条件を厳しくしすぎるとG23Ad/G23CdとランダムDNAプールとの結合が起こらず、効率的な特異的な配列の濃縮が起こらない可能性がある。そのため初期の結合条件はG23Ad/G23Cdが高い結合能を有する条件である低塩濃度（4 mM KCl）の条件下で、二量体タンパク質濃度が50 nM、100 nM、200 nMの3種類になるように加えて行った。結合実験後、氷上でのゲルシフトアッセイにより目的の二量体タンパク質とDNAとの結合バンドを分離した後、複合体部分のアクリルアミドゲルを切り出し、DNAを抽出した。この抽出したDNAをPCR法を用いて増幅させ、次の結合実験に用いた。この時、切り出して増幅させた結合バンドは、今回の最初に構築した結合実験系では、目視で結合を確認することができ、かつ加えたペプチド濃度が最も小さいサンプルのものである。
低塩濃度（4 mM KCl）の条件下でSAAB法の結合・選択・濃縮実験を3回繰り返して行った後、選択されてきたDNAの塩基配列を決定した。その結果から、N１の位置にGが選択される可能性が高いことは確認できたが、選ばれてきた塩基配列の種類が多く、この結合条件では特定の塩基配列(5'-GTCAT-3')に収束していないことがわかった。
【００２６】
そこで、５回目の結合・選択・濃縮実験以降、G23Ad/G23Cdの非特異的なDNA結合を抑制するため、DNAプールとG23Ad/G23Cdの結合反応にポリｄＩ−ｄＣを添加した。ポリｄＩ−ｄＣは負電荷のリン酸骨格を持ち、DNA結合タンパク質と静電的な結合を起こし、G23Ad/G23CdのDNAプールに対する非特異的な結合を抑えることが期待される。この条件下で結合・選択・濃縮実験を７回目まで繰り返したのち選択されたDNAの塩基配列を決定した。その結果を解析したところ、N１の位置にGが選択される可能性は以前よりも高くなっており、またN１の位置にGが選択された場合、N２の位置にはTが高確率で選択されるということがわかり、ポリｄＩ−ｄＣの添加によってG23Ad/G23Cd二量体と非特異的な塩基配列との結合を抑制することにより、SAAB法による目的配列の選択が効率的に進むことが確認できた。
【００２７】
８回目のサイクル以降は、更にG23Ad/G23Cdの非特異的なDNA結合を抑制するため、高塩濃度（100 mM KCl）または高塩濃度（100 mM KCl）かつポリｄＩ−ｄＣ添加の条件下で結合・選択・濃縮実験を行い、9回目の結合・濃縮実験終了後に再び選択されたDNAの塩基配列を決定した（表１）。その結果、天然のGCN4においても塩基配列選択性が低いN５の位置のみ複数の塩基が選択さたものを含めて、塩基配列を決定したなかで約8割の高確率で5’-ATGACGTCAN-3’という配列が存在していることがわかった。このことより、以上11回のSAABサイクルを繰り返すことでG23Ad/G23Cdペプチド二量体の認識DNA配列が決定できる系を確立することができた。
【００２８】
【表１】
0004112289.tif 000002
【００２９】
二量体形成部位として、β−シクロデキストリン (Cd) とアダマンタン (Ad) のホスト−ゲスト錯体形成能を利用した二量体ペプチドを用いて、SAAB法を適用することにより、23アミノ酸から成る短鎖オリゴペプチドの認識DNA塩基配列を決定することができることがわかった。ここではG23Cd/G23Ad 二量体タンパク質の認識DNA配列が、更に短期間で収束する系を確立すること目的として、まず、初期の段階から結合条件（表２）を厳しくすることを試みた。また、ランダムプールDNAとペプチド二量体が結合したバンドをアクリルアミドゲルから切り出す際、デンシトメーターで測定した結合割合 (表３) が10％未満のバンドの切り出しは行わず、その値を超える最も小さい数値に対応した結合バンドを切り出し増幅させるという方針を採用し、これにより非特異的に結合したDNA塩基配列がサイクルを重ねても増幅しないように試みた。
【００３０】
【表２】
0004112289.tif 000003
【００３１】
【表３】
0004112289.tif 000004
【００３２】
SAAB法によるオリゴペプチド認識DNA塩基配列決定の条件最適化
新しく考案した結合条件で結合・選択・増幅実験を行った(図２)。その結果、G23Cd/G23Adの二量体ペプチドでは、3回目および5回目の結合・選択・増幅実験後に行った二量体ペプチドの結合塩基配列の決定結果では選択された塩基配列にばらつきが多いのに対し、9回目の結合・選択・増幅実験後に行った結合塩基配列の決定結果からは、選択性が低いN５の位置のみ他の塩基が選択されて来ているのも含めて約8割の高確率で再び5’-ATGACGTCAN-3’という配列が得られていることが確認できた。このことより、G23Ad/G23Cd二量体ペプチドの認識DNA配列を決定するのに要するSAABサイクルを前節で示した条件に比べて2サイクル短縮することが可能であった。
【００３３】
ロイシンジッパータンパク質C/EBPの塩基性領域にあるDNA結合部位に由来する23アミノ酸ペプチド(C23)からなるC23Cd/G23Ad異種二量体ペプチドについても同様の結合条件でSAABサイクルを重ね、認識DNA配列の決定を行った。その結果、11回目の結合・選択・濃縮実験後に行った結合部位の塩基配列の決定から、こちらも選択性が低いN５の位置のみ他の塩基が選択されているのを含めて8割以上の確率で5’-ATGACGCAAN-3’という配列に収束していることが確認できた。
GCN4の同種二量体だけでなく、C/EBPとGCN4の異種二量体についても収束したことで、本節で用いた条件は、今後、ホスト−ゲスト相互作用による人工二量体形成部位を用いて形成した他のDNA結合ペプチドに対しても利用可能であると考えられる。
【００３４】
SAAB法によるD-アミノ酸オリゴペプチドが認識するDNA塩基配列の決定
認識配列が未知であるDG23Cd/G23Adペプチド二量体についても本節で用いたG23Cd/G23AdおよびC23Cd/G23Adペプチド二量体の認識DNA配列が収束したのと同様の条件で結合・選択・増幅の操作を繰り返した。DG23Cd/G23Adペプチド二量体で9回目の結合・選択・濃縮実験後に行った結合塩基配列の決定結果より、5’-ATGACGTNNN-3’と5’-ATGACACNNN-3’という配列に対して再び収束していることが確認できた。また、12回目の結合・選択・増幅の操作の後の認識塩基配列決定の結果では、5’-ATGACACNNN-3’、その中でも5’-ATGACACACN-3’という配列が選択される確率が上がった。これらの結果から、DG23Cd/G23Adペプチド二量体は5’-ATGACACACN-3’という塩基配列に最も高い親和性を示すと考えられる(図３)。
【００３５】
以下に本発明の実施例で使用した各実験方法の実際の手順について記載する。
【実験方法】
ペプチド(DG23)の合成
DG23ペプチド(Ac-DPAALKRARNTEAARRSRARKLQC-NH2)はFmoc固相合成法によって化学合成した。樹脂はFmoc-PAL-PEG resin（0.16 mmol/g）を用いた。縮合は、樹脂に対して2.5当量のＤ−体Fmocアミノ酸、2.5当量のHOBt、2.5当量のPyBOP、そして3.75当量のN-メチルモルフォリンを加え、30から60分撹拝することでおこなった。但し、カルボキシル基がPfp基で活性化されているFmocアミノ酸を用いる場合はHOBtだけを加え、Dhbt基で活性化されているFmocアミノ酸を用いる場合は他には他に何も加えずに縮合反応をおこなった。N末端のアミノ酸のFmoc基を脱保護した後、N−アセチルイミダゾールをもちいてペプチドのN末端をアセチル化した。反応の進行は、各縮合反応終了後、カイザーテストで確かめた。樹脂からの切り出しおよび脱保護は、氷上、窒素雰囲気下にて、TMSBr（1.35 ml）、チオアニソール（1.2 ml）、エタンジチオール（0.6 ml）、m−クレゾール（0.2 ml）を縮合後の樹脂に加え、氷上にて3時間撹拝した。ろ過後、樹脂をトリフルオロ酢酸で洗浄し、ろ液を減圧濃縮した。氷上にて水を加え30分間撹拝し、エーテル抽出で精製した後、ゲルろ過（G−10 Sephadex，5 ％  酢酸−水）を行ない、最後に逆相クロマトグラフィー（移動相A、0.1 ％トリフルオロ酢酸−水；移動相B、0.1 ％トリフルオロ酢酸−水 / 50 ％アセトニトリル；グラジエント、50−75 ％移動相B（40分）；流速、6 ml / min）で精製した。
【００３６】
ホスト分子を導入したペプチド（DG23Cd）の合成
リン酸ニナトリウム溶液（0.5 M，PH9.0，400 μl）、ジメチルホルムアミド（400 μL）、水酸化ナトリウム（1 M，60 μl）に溶かした６−ヨードβシクロデキストリン（124 mg，100 mmol）に、氷上および窒素雰囲気下にて、水（200 μl）に溶かしたDG23ペプチド（10 mg）を加え、撹拝した。反応の進行を逆相クロマトグラフィー（0.05 ％  トリフルオロ酢酸、10-40％  アセトニトリル）で確認した後、2−メルカプトエタノール（100 μl）を加えて撹拝した。15分後、酢酸（100 μl）を加えてpH試験紙で酸性を確認後、ゲルろ過（G-10 Sephadex；5％  酢酸-水）を行なった。ニンヒドリン発色したフラクションを回収し、逆相クロマトグラフィー（移動相A、0.05 ％トリフルオロ酢酸-水；移動相B、0.05 ％トリフルオロ酢酸-水/50 ％アセトニトリル；流速、5 ml / min；グラジエント、20-80 ％ B（35分））を行ない、回収したフラクション（溶出時間、18分）をトリエチルアミンで中和した後、生じた塩をSep-Pak C-18カラムで除いた。凍結乾燥しＤG23Cd（5.5 mg，38％）を得た。この固体をpH8の1/10×TE緩衝液 (Tris-HCl (10 mM)，EDTA (1 mM)) に溶かし、アミノ酸定量分析によって濃度を決定した。最終生成物の同定は１H-NMR、アミノ酸分析およびイオンスプレー式質量分析によって行なった。
【００３７】
ゲスト分子を導入したDG23Adの合成
リン酸緩衝液（pH9.0，0.5 M，600 μl）と水酸化ナトリウム（1 N，50 μl）を混ぜた溶液に、氷上、窒素雰囲気下にて、ジメチルホルムアミド（200 μl）に溶かしたN-(bromoacetyl)-1-adamantanemethylamine（17 mg，60 mmol）を加えた後、さらに、水（200 μl）に溶かしたDG23ペプチド（10 mg，3.6 mmol）を加え、1時間撹拝した。反応液に2-メルカプトエタノール（100 μl）を加えた後、酢酸（10 μl）を加え、ゲルろ過（Sephadex G−10，5 %酢酸−水）によって精製した。ニンヒドリン反応のあるフラクションを回収し、逆相クロマトグラフィーで精製し、ＤG23Ad（8 mg，74 ％）を得た。最終生成物の同定は１H-NMR、アミノ酸分析およびイオンスプレー式質量分析によって行なった。
【００３８】
３２Pでラベル化したプライマー Eの作製
反応条件下(Tris-HCl (50 mM，pH8.0)，MgCl２  (10 mM)，DTT (5 mM))にプライマー E (100 pmol，5'-GATCGAATTCCGGAG-3') と［γ−３２P］ATP (15 μl) とT4 Polynucleotide Kinase (5 μl) を加えて、37 ℃で30分 インキュベートしプライマー E (100 pmol) の5’−末端の放射標識反応を行った。その反応液にEDTA (0.5M ，2 μl) を加えて反応を終結させた後、Sep-pak (平衡化:メタノール (3 ml)，滅菌水 (3 ml)，TEAA (0.1 M，3 ml) にTEAA (0.1 M，3 ml) とともに通し、Milli-Q水 (5 ml) で塩を除去した後、30 % アセトニトリルで目的物を回収して、スピードバックで減圧濃縮を行った。
【００３９】
３２Pでラベル化したランダムDNAプールの作製
３２Pでラベル化したプライマー Eに相補的な結合サイトの半分がランダム化されたN5-3テンプレート(50 pmol) を加え、反応条件下 (Tris-HCl (25 mM)，NaCl (100 mM)，EDTA (1 mM，pH8.0)，dNTP Mixture (0.1 mM)) で95℃、2分間のアニーリング反応を行い、室温に3時間かけて徐冷した。その後Klenow Fragment (0.5 μl) を加えて4℃で2時間反応させた後、反応液と同量のフェノールを加えてVortexし、15,000 rpmで5分間遠心して水層のみを予め分注しておいた同体積のクロロホルムに加えてVortexし、15,000 rpmで2分間遠心して再度水層のみを予め分注しておいた1/10量の酢酸ナトリウム (3M，pH 5.2) に加えた。そこに両者の体積の3倍量のエタノールを加えてVortexし、−20℃で一晩または−80℃で20分間放置した。放置後、15,000 rpmで10分間遠心してDNAを沈澱させ、エタノールのみを廃棄した。更に、そこに冷70 ％ エタノール (500 μl) を加え15,000 rpmで2分間遠心して、塩を除去し、再びDNAを沈澱させ70 ％ エタノールのみを廃棄し、スピードバックで減圧乾燥を行った。乾燥後、Milli-Q水 (10μl)，dye (XCとBPBの混合液，3 μl)，sucrose (60％，2 μl) を加えてVortexし、サンプルを予め150V，30分間Pre-runしておいた10 ％ 非変性アクリルアミドゲルに全量直接ロードし、TBE緩衝溶液中 (Tris-HCl (20 mM)，boric acid (20 mM)， EDTA，(0.1 mM)) で130〜150Vの範囲で約70分間ゲルシフトアッセイを行い、目的の二本鎖DNAと未反応のプライマーなどの不純物を分離し、二本鎖DNAのランダムプールのバンドのみを切り出して回収した。
【００４０】
10％アクリルアミドゲルの作製
ゲル一枚当たり、Milli-Q水 (4.85 ml)、10×TBE (0.15 ml)、30 ％ アクリルアミドストック(アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝29：1，2.5 ml)、TEMED(N,N,N,N-Tetramethyl-ethylenediamine，5 μl) を200 mlのナスフラスコに入れ攪拌し、脱気を行った。その後30 ％ APS(Ammonium Peroxodisulfate，17.5 μl)を加えてよく攪拌し、ゲル板(スぺーサー：selection 0.75 mm、PCR精製 1 mm)に流し込み、コウム(ウェル数: selection 10、PCR精製 6)をセットし、約2時間硬化させた。
【００４１】
SAAB法によるセレクション
氷中で、結合反応条件下にて、二本鎖DNAに二量体タンパク質濃度がそれぞれ50 nM、100 nM、200 nM、になるように加え、全量を10μlとした。4℃で30分間、結合実験を行った後、各反応溶液を予め氷中で60 V，30分間Pre-runしておいた10 ％ 非変性アクリルアミドゲルに全量直接ロードし、氷中でTBE緩衝溶液中 (Tris-HCl (20 mM)，boric acid (20 mM)，EDTA (0.1 mM)) にて90〜110Vの範囲で約200分間ゲルシフトアッセイを行った。泳動後のゲルをラップで包んだ後、Xフィルムに感光させ、二量体タンパク質と二本鎖DNAが結合しているバンドを切り出して回収した。
【００４２】
ゲルシフト電気泳動後のDNA結合解析
現像したフィルムを、DeskscanIIとNIH−Image（version 1.62）で解析し、各バンドの濃さからDNAとタンパク質二量体の結合割合を算出した。
【００４３】
切り出したゲルからの二本鎖DNAの回収
切り出したゲルにelution buffer(NH４OAc (0.5 M)，EDTA (1 mM)，(pH8.0)，PCR 精製後 (150 μl)，Selection後 (100 μl)) を加え、37℃で一晩放置した。15,000 rpmで2分間遠心後、上清のみをSUPRECに回収してこれを15,000 rpmで2分間遠心した。残ったゲルに再びelution buffer (PCR 精製後 (40 μl)，Selection後 (20 μl) を加えて37 ℃で1時間放置し、上清をゲルごと再度先程のSUPRECに回収し、15,000 rpmで2分間遠心した。残ったゲルカスにelution buffer (10 μl) を再度加え、これを再び先程のSUPRECに回収し、15,000 rpmで2分間遠心した。回収した上清にQIAGENのDNA抽出キット (QIAEXＩＩ) のBuffer QX1 をDNA溶液の6倍量とQIAEXＩＩ(10 μl) を加え、2分毎に5回攪拌してDNAを樹脂に吸着させた。これを15,000rpmで2分間遠心し、上清を廃棄して樹脂のみを回収した。回収した樹脂にWash Buffer (Buffer PE，500μl) を加えてVortexを行って洗浄し、15,000rpmで1分間遠心してWash Bufferのみを廃棄した。この洗浄は２回繰り返した。樹脂を自然乾燥後、1/10×TEを20μl加えてVortexを行い30分間静置して1/10×TE緩衝液 (Tris-HCl (10 mM)，EDTA (1 mM)) にDNAを溶出させた後に15,000 rpmで2分間遠心し、上清をSUPRECに回収してこれを15,000 rpmで2分間遠心して目的の二本鎖DNAを回収した。この溶出は２回繰り返した。
【００４４】
PCRによる選択されたDNAの増幅
回収したDNAにPCR反応条件下(Tris-HCl緩衝液 (5 mM，(pH8.2))， EDTA (0.01 mM)，DTT (0.1 mM)，Tween (0.01 %)，Nonidet P-40 (0.01 %)， Glycerol (5 %)，dNTP Mixture (0.2 mM)，sucrose (6 %)) にテンプレートである二本鎖DNA (4 μl)，DNA Polymerase (0.5 μl)，プライマーD (20 pmol，5'-AGACGGATCCATTAG-3') を加え、更にラベル化したプライマーEとラベル化していないプライマーEの総量が20 pmolになるように加えた。反応液の体積は100μlになるように調整した。調整後Mineral oil (75 μl) を加え、PCRサイクル(94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，73 ℃ 1 m) を15回繰り返し、ランダムDNAプールの作製時と同様にフェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈澱、エタノールリンスを行い、ゲルシフトアッセイにより精製した。
【００４５】
SAAB法により選択されたDNAのプラスミドへのクローニング
SAAB法によるセレクション後の二本鎖DNAをcold primer を用いてPCR法で増幅させ、ゲルシフトで精製した二本鎖DNAに反応条件下(Tris-HCl緩衝液 (10 mM，pH 7.5)， MgCl２  (0.7 mM)，2-ME (0.7 mM)，NaCl (5 mM)，BSA (0.001 %) で制限酵素Bam HI (5μl) およびEco RI (5μl) をそれぞれ加え、37℃で2時間インキュベートし、二本鎖DNAを切断した。この際の反応液の総体積は100μlとした。その後ランダムDNAプールの作製時と同様にフェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈澱、エタノールリンスを行い、スピードバックで減圧乾燥を行った。制限酵素処理を行ったインサートDNAを5 ng/μlに調整し、これを予めBam HIおよびEco RI で同様に制限酵素処理しておいたpUC19に濃度がそれぞれ1倍、4倍、10倍になるように加え、DNA溶液と同体積のTaKaRaのLIGATION KIT Ver.2のＩ液を加え、16 ℃で30分間反応させた。反応液の内の1 μlを予め分注しておいたコンピテントセル DH5αＴＭ (20 μl) に加え、氷中で30分間放置した後、42 ℃で90秒、氷中に2分間置き、SOC (180 μl) を加えて、37℃で1時間攪拌した。その内の100 μlをLB-Ampプレートにまき、37℃で一晩コロニーを培養した。
【００４６】
予めLB (5 ml)，Amp (5 μl) 分注しておいた栄研の丸底スピッツに、プレート内で培養したコロニーを殖菌し、37℃で一晩、攪拌しながら培養した。培養後、栄研スピッツを2000rpmで20分間遠心した後、上清を廃棄した。そこにQIAGENのQIAprep Miniprep KITのBuffer P1 (250μl) を加えて攪拌し、大腸菌を溶解させた。1.5mlのエッペンチューブに移した後、Buffer P2 (250μl)、Buffer N3 (350μl) を加えて攪拌し、15,000rpmで10分間遠心した。予めQIAprep spin columuを挿した2ml collection tubeに遠心後の上清のみを加え、15,000rpmで1分間遠心した。collection tubeの透過液を廃棄後、Buffer PE (750μl) を加え15,000rpmで1分間遠心し、collection tubeの透過液を再度廃棄した。更に残留物を除去するために15,000rpmで1分間遠心し、QIAprep spin columuを1.5mlのエッペンチューブに挿した。QIAprep spin columuにTris(10mM，(pH8.0)，50μl) を加えて1分間静置後、15,000rpmで1分間遠心して目的の二本鎖DNAを回収した。この回収は2回繰り返した。
【００４７】
SAAB法により選択されたDNAの塩基配列決定
回収したプラスミド (500 ng)，シークエンス用のプライマー(M13-RV，3.2pmol，0.5 μl)，プレミックス (5×Sequencing Buffer，ｄNTP mix，DyeDeoxy Terminators，AmpliTaq，FS，4 μl) の総量を10μlとし、PCRサイクル(96 ℃ 30 s，50 ℃ 15 s，60 ℃ 4 m)を25回繰り返した。PCR後の反応液に5 ％ CTAB / 0.5 M NaCl (1.25 μl)を加えて15,000 rpmで3分間遠心し上清を捨てた。沈澱物にNaCl (1.2 M，25 μl) を加えてVortexし、エタノール (62.5μl) を加えて再び15,000 rpmで3分間遠心して上清を廃棄した。更に、沈澱物に70 ％エタノール (250 μl) を加えてVortexし、15,000 rpmで3分間遠心して上清を捨てて得た沈澱物をスピードバックで減圧乾燥した(CTAB沈澱法)。乾燥後、ローディングバッファー(脱イオンホルムアミド: ローディング・ダイ＝5:1，3 μl)に溶解させ、95 ℃で2分間ヒートショックを行い、加熱後すぐにサンプルを氷上に置き急冷した。このサンプルの全量の内1.5 μl を予め1200 VでPre-runしておいたシークエンス用ゲルに直接ロードし、TBE緩衝溶液中(Tris-HCl (100 mM)，boric acid (100 mM)，EDTA (0.5 mM)) で1200 Vで7時間泳動し、選択された塩基配列の決定を行った。
【００４８】
シークエンス用ゲル(4 ％アクリルアミド、6 M尿素、1×TBEゲル)の作製
UREA (18.0 g)，Stock溶液(50 ％ Super Reading DNA Sequence Solution，5.0 ml)，10×TBE (5.0 ml)，Mill-Q水 (22 ml) を攪拌し、50 mlにメスアップした。この溶液をろ過、脱気後、10 ％ APS (250 μl) およびTEMED (25 μl) を加えて攪拌してゲル板に流し込み、約3時間硬化させて使用した。
【００４９】
【発明の効果】
本発明方法によって、新しく合成したペプチド、オリゴ糖類、有機分子の認識ＤＮＡ配列を簡便に決定することが出来る。本研究の成果によって、ＤＮＡを標的とする薬剤の開発や新しいＤＮＡチップ素子の開発が効率的に遂行できることが期待される。またＤ−体アミノ酸からなるＤＮＡ結合ペプチドは、新しい遺伝子をターゲットとした医薬のリード化合物となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】GCN4のベーシックリージョンG23のＣ末端にアダマンタン(Ad)を導入したG23Adと、非天然アミノ酸を含む新しいDNA認識ペプチドとして、G23を構成するアミノ酸が光学異性体であるD体のアミノ酸であるDG23のＣ末端にβ−シクロデキストリン(Cd)を導入したDG23Cdを示す。
【図２】本発明方法の結合・選択・増幅実験を示す。
【図３】認識配列が未知であるDG23Cd/G23Adペプチド二量体についてSAABサイクルを重ね、認識DNA配列の決定を行った様子を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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