(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的蛋白質がペプチド結合を介してシャペロニンに連結し、かつ、シャペロニンサブユニットにより構成されるリング構造体内に納められた構造を有する融合蛋白質の結晶の３次元構造及び／又は全原子空間配置と、前記シャペロニンサブユニットにより構成されるリング構造体のみからなり前記目的蛋白質が連結されていない蛋白質の結晶の３次元構造及び／又は全原子空間配置とを比較することにより、前記目的蛋白質の３次元構造及び／又は全原子空間配置を解析することを特徴とする蛋白質の構造解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、いかなる蛋白質であっても、可溶性画分に生産した後、均一な条件化で、精製、結晶化、及び、Ｘ線回折による３次元構造の解析を行うことができる新たな蛋白質の構造解析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質はそれぞれ固有の３次元構造を有するが、近年、蛋白質の３次元構造に関する情報が医薬品開発等に重要になってきた。例えば、蛋白質の３次元構造を知ることができれば、その蛋白質と相互作用する物質の設計が確実に行えるため、医薬品の製造に重要な貢献をすることできる。また、これらの知見を病気の機構の解明や、食糧の増産や環境の保全等を図るために役立てることも可能である。
【０００３】
従来、蛋白質のＸ線結晶構造解析を行うには、目的蛋白質ごとに精製条件及び結晶化条件を詳細に検討する必要があった。そのため高純度の目的蛋白質を得るための精製及び結晶化に、多大な労力と時間とが必要とされた。また、目的蛋白質が組み換え蛋白質である場合、発現した目的蛋白質が正しく３次元構造を形成することができず、封入体になったり、宿主に対して毒性を示したり、また、目的蛋白質が可溶性蛋白質であると、宿主プロテアーゼに分解されたりして、その生産性が極めて低い場合も多かった。
このため、組み換え蛋白質の発現、精製、結晶化、構造解析といった一連の工程をスピードアップ化する技術開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、いかなる蛋白質であっても、可溶性画分に生産した後、均一な条件化で、精製、結晶化、及び、Ｘ線回折による３次元構造の解析を行うことができる新たな蛋白質の構造解析方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、１個又は２個以上のシャペロニンサブユニットと目的蛋白質とがペプチド結合を介して連結している融合蛋白質が結晶化された蛋白質の結晶である。以下に本発明を詳述する。
【０００６】
本発明において結晶化される融合蛋白質は、１個又は２個以上のシャペロニンサブユニットと目的蛋白質とがペプチド結合を介して連結しているものである。２個以上のシャペロニンサブユニットと目的蛋白質とがペプチド結合を介して連結している場合、２個以上のシャペロニンサブユニットはペプチド結合を介して一方向に連結されている。
【０００７】
上記シャペロニンとは、細胞に熱ショック等のストレスを与えると、エネルギー物質であるＡＴＰの存在下又は非存在下で蛋白質の折り畳みを支援したり、構造安定化に貢献したりする一般に分子シャペロンと呼ばれる蛋白質群の発現が誘導されるが、このような分子シャペロンの中でも、サブユニットの分子量が約６０ｋＤａのものをいい、バクテリア、古細菌、及び、真核生物の全ての生物に存在し、蛋白質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。
【０００８】
シャペロニンは１０〜２０個のサブユニットよりなる２層のリングからなる構造体、即ち、５〜１０個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層のリング構造体（以下、リングをシャペロニンリングという）を形成し、例えば、大腸菌のシャペロニンは、内径４．５ｎｍ、高さ１４．５ｎｍの空洞（キャビティ）を有する（図１参照）。一層のシャペロニンリングのキャビティは６０ｋＤａの球状蛋白質一つが充分に納まる空間を有する。シャペロニンは、このキャビティに様々な蛋白質の折り畳み中間体や変性蛋白質を一時的に納める機能を有し、蛋白質の折り畳み構造が形成されると、ＡＴＰの分解と共役して、納めていた蛋白質をキャビティから放出する。バクテリア、古細菌由来のシャペロニンは、リング構造を保った状態で大腸菌細胞質可溶性画分に容易に大量生産させることが可能である。このことは、由来の異なる種々のシャペロニンは大腸菌でも自己集合し、１０〜２０量体からなる２層のリング構造をとりうることを示している。
【０００９】
シャペロニンの立体構造は既にＸ線結晶構造解析によって明らかにされており、その解析結果によればシャペロニンのＮ末端及びＣ末端はともにキャビティ側に位置し、フレキシビリティの高い構造となっている。特にＣ末端の少なくとも２０アミノ酸はフレキシビリティの高い構造を示す（Ｇｅｏｒｇｅら、２０００、Ｃｅｌｌ、１００、Ｐ．５６１−５７３）。
【００１０】
本発明で用いられるシャペロニンとしては特に限定されず、バクテリア、古細菌、及び、真核生物のいずれの由来のものでも使用可能である。しかしながら、上記シャペロニンの構造は由来生物によって異なっている。例えば、バクテリア由来のシャペロニンの場合、シャペロニンリングを構成するシャペロニンサブユニットの数は７個であり、古細菌由来のそれは８〜９個、真核生物由来のものは８個である。本発明では、使用するシャペロニンの由来により、融合蛋白質におけるシャペロニンサブユニットと目的蛋白質の数の比を選択することが好ましい。シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との比（シャペロニンサブユニット数：目的蛋白質数）は１：１〜１２：１までとりうるが、好ましくは１：１〜９：１である。目的蛋白質１個に対するシャペロニンサブユニットの数が９を超えるとシャペロニンリングの形成が困難となる可能性が出じる。
【００１１】
具体的には、バクテリア由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニンサブユニットからなるリングの形成のしやすさからシャペロニンサブユニット数：目的蛋白質数が１：１又は７：１である融合蛋白質が好ましく、シャペロニンリングを構成するサブユニット数が８個である古細菌由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニンサブユニットからなるリングの形成のしやすさからシャペロニンサブユニット数：目的蛋白質数が１：１、２：１、４：１又は８：１のものが好ましい。但し、目的蛋白質の形状や分子量によっては上記以外の数比も適する可能性がある。
【００１２】
本発明で用いられる目的蛋白質としては特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、線虫等の動物、病原菌、感染性ウィルス等由来の医薬開発等に重要であり、かつ、構造が未解析である蛋白質が挙げられる。なかでも、７回膜貫通型受容体、Ｇ蛋白質結合受容体、細胞接着因子等の膜貫通型蛋白質；膜結合型蛋白質、蛋白質リン酸化酵素等の情報伝達系関連蛋白質、ウィルス由来プロテアーゼ、核内ホルモン受容体蛋白質、逆転写酵素等が好ましく、膜貫通型蛋白質、膜結合型蛋白質、核内ホルモン受容体蛋白質がより好ましい。
【００１３】
本発明における融合蛋白質のシャペロニンサブユニットと目的蛋白質との連結パターンとしては、目的蛋白質がシャペロニンリングのキャビティ内に納まるように、シャペロニンサブユニットのＮ末端、Ｃ末端、又は、シャペロニンサブユニット同士の連結間に目的蛋白質を配置することが好ましい。
【００１４】
本発明においては、融合蛋白質として発現した目的蛋白質はシャペロニンリングのキャビティ内に納められているので、生体内環境から保護され、プロテアーゼによる消化を受けにくくなる。
【００１５】
本発明においては、目的蛋白質が４個以上のシャペロニンサブユニットにより構成されるリングの内部に格納されていることが好ましい。シャペロニンサブユニットが４個未満であると、目的蛋白質の大きさによってはシャペロニンリングからはみ出してしまうことがある。
【００１６】
目的蛋白質が宿主生物にとって重要な自然機構を阻害する性質を有するものであっても、目的蛋白質はシャペロニンリングにより生体内環境から隔絶されているので、宿主の生理機構に対する阻害作用を発現することもない。また、強力なプロモーターによって発現が誘導されたときにみられるような蛋白質の折り畳み中間体同士が多数会合することはなく、個々にシャペロニンリングのキャビティ内に固定されるため、宿主生物を用いた発現及び無細胞翻訳系に見られる封入体形成を抑制することもできる。シャペロニンは宿主生物の細胞質又は体液等の可溶性画分へ発現するため、シャペロニンリング内に格納された蛋白質が膜結合性の蛋白質であっても膜へ移行し宿主生物の膜構造を破壊することはなく、宿主生物に対する毒性は発現しない。また、いかなる蛋白質も同一のシャペロニンリング内に格納すれば、同一の精製条件で融合蛋白質として精製することが可能である。
【００１７】
本発明において得られた融合蛋白質は、精製された後、結晶化される。
上記融合蛋白質を精製する方法としては特に限定されず、例えば、塩析、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を用いることができる。また、融合蛋白質のＮ末端又はＣ末端に６残基程度のヒスチジン配列を付加させることにより、ニッケルキレート担体を用いるキレートクロマトグラフィーによっても融合蛋白質を精製することが可能である。
【００１８】
また、シャペロニンが耐熱性のものである場合、粗精製物を加熱処理することによってその他の混入蛋白質の多くは沈殿してしまい、遠心分離によって容易に除去できる。この際、シャペロニンは蛋白質の熱変性を抑制する作用を有しているので、シャペロニンリングの内部に格納されている目的蛋白質は、これ自身が耐熱性蛋白質でなくとも、熱変性することなく可溶性の融合蛋白質として得ることができる。
上記目的蛋白質はシャペロニンリング内部に格納されているので、蛋白質の種類によらず、確立した画一的な方法で融合蛋白質として精製することが可能である。
【００１９】
上記融合蛋白質は、いかなる目的蛋白質がシャペロニンリング内部に格納されていようと融合蛋白質の表面の性質は同じであるため、画一的な条件で結晶化することができる。
上記融合蛋白質の結晶化はハンギングドロップ法によって行うことができる。緩衝液に溶かした１０ｍｇ／ｍｌ程度の融合蛋白質溶液１０μｌに、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような沈殿剤を飽和より低い濃度になるように加えて薄いガラス板の上に置き、これを逆さにして小さな容器（リザーバー）の上にのせて密封する。容器中には沈殿剤溶液約１ｍｌを入れておく。蒸気の拡散によって融合蛋白質溶液と容器の中がゆっくりと平衡に達する。融合蛋白質溶液の塩濃度は水がリザーバー中に逃げていくので上昇する。飽和点を過ぎると融合蛋白質がゆっくりと析出してくる。ｐＨや塩濃度条件が適当であると融合蛋白質溶液中に融合蛋白質の結晶が生じてくる。例えば、融合蛋白質に用いられたシャペロニンサブユニットが大腸菌由来のＧｒｏＥＬである場合、２．５ｍＭ  ＡＤＰを含有する１０ｍｇ／ｍｌの融合蛋白質溶液に等容の３．６％ＰＥＧ６Ｋ、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌを含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を添加する条件下で結晶化を行うことができる。
【００２０】
本発明の蛋白質の結晶は、Ｘ線結晶構造解析により、融合蛋白質の３次元構造及び／又は全原子空間配置を解明し得る品質を有することが好ましい。Ｘ線結晶構造解析により、融合蛋白質の３次元構造及び／又は全原子空間配置を解明し得る品質とは、例えば、融合蛋白質がＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドとして検出される程度の品質を意味する。
【００２１】
本発明は、シャペロニンを目的蛋白質の構造解析用の分子容器として用いる思想の上に成り立つものであり、目的蛋白質をシャペロニンから遊離させることなく、融合蛋白質のままで結晶化した後、Ｘ線結晶構造解析に供する。
【００２２】
本発明の蛋白質の結晶にＸ線を照射することにより、融合蛋白質の３次元構造及び／又は全原子空間配置を解析することができる。
Ｘ線源としては実験室レベルでは、銅又はモリブデンに電子を衝突させたときに発生する特性Ｘ線を使用する。特別に強いＸ線や任意の波長のＸ線を使用する場合はシンクロトロン放射光を利用する。また、我が国では第３世代放射光施設であるＳＰｒｉｎｇ−８を利用することで従来より鮮明な回折斑点が得られ、誤差の少ない測定が可能である。Ｘ線回折の強度測定はＸ線フィルムやイメージングプレート（ＩＰ）等の２次元検出器によって行うのが一般的である。Ｘ線を当てながら結晶を回転させることで多くの回折線が発生する。ＩＰを用いる場合、記録された回折パターンをスキャンして数値化し、コンピューターに蓄積させることができる。
【００２３】
得られた結晶の重原子同型置換体結晶を複数作製し、これらに元の結晶と同じ波長のＸ線を当て、重原子を組み込むことによる回折強度変化を利用して元の結晶の反射の位相を決定する。反射の位相が決まれば、電子密度を求めることが可能である。但し、原子位置決定までの解析を行うには少なくとも２．８Åの分解能が要求される。２〜２．８Åの分解能の電子密度図があれば分子モデルを組み立てることが可能となる。
【００２４】
Ｘ線結晶構造解析により解析された融合蛋白質の３次元構造及び／又は全原子空間配置と、シャペロニンリングの３次元構造及び／又は全原子空間配置とを比較することにより、目的蛋白質の３次元構造及び／又は全原子空間配置を解析することができる。
【００２５】
本発明の蛋白質の結晶に対して、上記のような通常の一連のＸ線結晶構造解析の手法を用いることで、目的蛋白質を単離する必要なく、シャペロニンサブユニットからなるリングの内部に格納された状態で、直接目的蛋白質を構造解析することが可能である。
本発明の蛋白質の結晶にＸ線を照射して、融合蛋白質の３次元構造及び／又は全原子空間配置を解析する蛋白質の構造解析方法、並びに、本発明の蛋白質の結晶にＸ線を照射して、融合蛋白質の３次元構造及び／又は全原子空間配置を解析し、解析された前記融合蛋白質の３次元構造及び／又は全原子空間配置と、シャペロニンサブユニットにより構成されるリングの３次元構造及び／又は全原子空間配置とを比較することにより、目的蛋白質の３次元構造及び／又は全原子空間配置を解析する蛋白質の構造解析方法もまた、本発明の１つである。
【００２６】
本発明によれば、目的蛋白質をシャペロニンサブユニットとの融合蛋白質として発現させて、目的蛋白質を確実にシャペロニンリングのキャビティ内部に納めることにより、目的蛋白質の宿主への毒性の発現、プロテアーゼによる分解及び封入体の形成の問題を解決し、可溶性蛋白質として大量発現させることができる。また、本発明によれば、いかなる蛋白質も同一のシャペロニンリングに格納させることにより、同一の条件により、精製、結晶化及び構造解析を行うことができるので、これらの工程を従来よりはるかに迅速に行うことができる。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２８】
［実施例１］
（発現ベクターの作製）
超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ＫＳ−１株のシャペロニンαサブユニット（ＴＣＰα）遺伝子より、ＰＣＲによって５’側にＢｇｌＩＩ切断サイト、３’側にＢａｍＨＩサイトが導入された遺伝子を増幅させ、これをｐＴ７ｂｌｕｅＴベクター（ノバジェン社製）にＴＡクローニングし、挿入配列を確認した。
これよりＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩによる切断によって挿入断片を回収した。回収したＤＮＡ断片に対してＴ４ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行い、反応精製物を再びＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩによって切断し、同一方向にＴＣＰ−α遺伝子が２個連結されたもの（ＴＣＰα）２を電気泳動によって分離し、回収した。この（ＴＣＰα）２をＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ切断及びアルカリフォスファターゼ処理されたｐＴ７ ｂｌｕｅ−Ｔベクターへクローン化し、プラスミドｐＴ７−（ＴＣＰα）２を大量調製した。ｐＴ７−（ＴＣＰα）２より、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩによる切断によって挿入断片を回収した。回収したＤＮＡ断片に対してＴ４ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行い、反応精製物を再びＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩによって切断し、同一方向に（ＴＣＰα）２遺伝子が２つ連結した（ＴＣＰα）４を電気泳動によって分離し回収した。これを再びｐＴ７ ｂｌｕｅ−Ｔベクターへクローン化し、プラスミドｐＴ７−（ＴＣＰα）４を大量調製した。ｐＴ７−（ＴＣＰα）４より、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩによる切断によって挿入断片を回収した。回収したＤＮＡ断片に対してＴ４ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行い、反応精製物を再びＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩによって切断し、同一方向に（ＴＣＰα）４遺伝子が２つ連結した（ＴＣＰα）８を電気泳動によって分離し、回収した。ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩサイトが導入された後、アルカリフォスファターゼ処理されたＴ７プロモーターを有する発現ベクターに（ＴＣＰα）８をクローン化し、ｐＴ（ＴＣＰα）８を構築した。
ｐＴ（ＴＣＰα）８をＢａｍＨＩで処理した後、外来遺伝子のクローニングサイトとなる合成ＤＮＡをライゲーションし、ＢｇｌＩＩで切断し、その後ライゲーション反応によって環状化し、ｐＴＦ８ＴＣＰ−αを構築した。
ｐＴＦ（ＴＣＰα）８は８つ連結したシャペロニンαサブユニットにトロンビン切断配列を介して外来蛋白質がつながった融合蛋白質を発現させるベクターである。
【００２９】
（８ＴＣＰα―ｈＣｙＰの発現）
外来蛋白質としてヒトシクロフィリン（サイクロスポリン結合性蛋白質、ｈＣｙＰ）をコードする遺伝子を、該遺伝子が導入されたｐＴ７ｂｌｕｅ−Ｔベクターより、ＮｈｅＩ及びＳｐｅＩ切断によって回収し、同様の制限酵素処理が施されたｐＴＦ（ＴＣＰα）８にライゲーションさせ、８つのシャペロニンαサブユニットとｈＣｙＰの融合蛋白質（８ＴＣＰα―ｈＣｙＰ）を発現させるｐＴ（ＴＣＰα）８−ｈＣｙＰを構築した。ｐＴ（ＴＣＰα）８−ｈＣｙＰで大腸菌を形質転換させ、１０コロニーを２ＸＹＴ液体培地（バクトトリプトン １６ｇ、酵母エキス １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ）に接種し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下３５℃で培養し、ＯＤ600が０．６〜１．０で１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。更に１０時間培養し、８ＴＣＰα―ｈＣｙＰの発現を誘導した。培養終了後、菌体を回収した。
【００３０】
（８ＴＣＰα―５ＨＴの発現）
上述した８ＴＣＰα―ｈＣｙＰと同様にして、８ＴＣＰαとヒトセレトニン受容体（５−ＨＴ７受容体）の融合蛋白質（８ＴＣＰα―５ＨＴ）を大腸菌にて発現させた。
【００３１】
（精製・結晶化・解析）
それぞれ菌体回収後、６５℃で３０分間の熱処理、２回の陰イオン交換クロマログラフィー及びゲルろ過によって精製した。精製標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一であった。各精製標品を１０ｍｇ／ｍｌ濃度まで限外ろ過で濃縮した後、終濃度２．５ｍＭのＡＴＰを添加した。その後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３．６％ＰＥＧ６Ｋ、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌの条件で結晶化を行った結果、最大０．１ｍｍ角程度の正八面体様結晶が全ての標品で得られた。
また、得られた結晶に対して、Ｘ線発生装置を用いてＸ線回折実験を行ったところ、２．５Åの分解能の回折点が得られた。
【００３２】
［実施例２］
（発現ベクターの作製）
大腸菌のシャペロニンサブユニット（ＧｒｏＥＬ）遺伝子より、ＰＣＲによって５’側にＳｐｅＩ、３’側にＸｂａＩサイトが導入された遺伝子を増幅させ、これをｐＴ７ｂｌｕｅＴベクター（ノバジェン社製）にＴＡクローニングし、挿入配列を確認した。
これよりＳｐｅＩ及びＸｂａＩによる切断によって挿入断片を回収した。回収したＤＮＡ断片に対してＴ４ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行い、反応精製物を再びＳｐｅＩ及びＸｂａＩによって切断し、同一方向にＧｒｏＥＬ遺伝子が２個連結されたもの（ＧｒｏＥＬ）２を電気泳動によって分離し、回収した。この（ＧｒｏＥＬ）２をＳｐｅＩ−ＸｂａＩ切断及びアルカリフォスファターゼ処理されたｐＴ７ ｂｌｕｅ−Ｔベクターへクローン化し、プラスミドｐＴ７−（ＧｒｏＥＬ）２を大量調製した。ｐＴ７−（ＧｒｏＥＬ）２より、ＳｐｅＩ−ＸｂａＩによる切断によって挿入断片を回収した。回収したＤＮＡ断片に対してＴ４ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行い、反応精製物を再びＳｐｅＩ−ＸｂａＩによって切断し、同一方向に（ＧｒｏＥＬ）２遺伝子が２個連結されたもの（ＧｒｏＥＬ）４を電気泳動によって分離し回収した。これを再びｐＴ７ ｂｌｕｅ−Ｔベクターへクローン化し、プラスミドｐＴ７−（ＧｒｏＥＬ）４を大量調製した。ｐＴ７−（ＧｒｏＥＬ）４をＸｂａＩで切断した後、アルカリフォスファターゼ処理し、（ＧｒｏＥＬ）３をライゲーションさせ、シャペロニンサブユニットが７つ連結したｐＴ７−（ＧｒｏＥＬ）７を得た。ｐＴ７−（ＧｒｏＥＬ）７より、ＳｐｅＩ−ＸｂａＩによる切断によって挿入断片を回収した。ＳｐｅＩ及びＸｂａＩサイトが導入された後、アルカリフォスファターゼ処理されたＴ７プロモーターを有する発現ベクターに（ＧｒｏＥＬ）７をクローン化し、ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７を構築した。
ｐＴ（ＧｒｏＥＬ）７をＸｂａＩで処理した後、外来遺伝子のクローニングサイトとなる合成ＤＮＡをライゲーションした後、ＳｐｅＩで切断し、その後ライゲーション反応によって環状化し、ｐＴＦ（ＧｒｏＥＬ）７を構築した。
ｐＴＦ（ＧｒｏＥＬ）７はシャペロニンサブユニットが７つ連結した７回連結体（７ＧＬ）にトロンビン切断配列を介して外来蛋白質がつながった融合蛋白質を発現させるベクターである。
【００３３】
（７ＧＬの発現）
ｐＴＦ（ＧｒｏＥＬ）７を大腸菌に形質転換し、１０コロニーを２ＸＹＴ液体培地（バクトトリプトン １６ｇ、酵母エキス １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ）に接種し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下３５℃で培養し、ＯＤ600が０．６〜１．０で１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。更に１０時間培養し、７ＧＬの発現を誘導した。培養終了後、菌体を回収した。
【００３４】
（７ＧＬ−ＧＦＰの発現）
外来蛋白質としてクラゲ由来緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）コードする遺伝子を、該遺伝子が導入されたｐＴ７ｂｌｕｅ−Ｔベクターより、ＮｈｅＩ及びＳｐｅＩ切断によって回収し、同様の制限酵素処理が施されたｐＴＦ（ＧｒｏＥＬ）７にライゲーションさせ、７つのシャペロニンサブユニットとＧＦＰとの融合蛋白質を発現させるｐＴＦ（ＧｒｏＥＬ）７−ＧＦＰを構築した。
次いで、上述した７ＧＬと同様にして、７ＧＬとＧＦＰの融合蛋白質（７ＧＬ−ＧＦＰ）を大腸菌にて発現させた。
【００３５】
なお、７ＧＬ及び７ＧＬ−ＧＦＰは、ともにＮ末端側にヒスチジンタグ（６残基のヒスチジン配列：６Ｈｉｓ）、Ｃ末端側にＦＬＡＧタグ（シグマ社製）が付加されよう設計された。
【００３６】
（精製・結晶化・解析）
それぞれ菌体回収後、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィー、ニッケルキレーティングクロマトグラフィー及びゲルろ過によって精製した。両精製標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一であった。２．９ｍｇ／ｍｌ濃度の７ＧＬ及び７ＧＬ−ＧＦＰを２．０Ｍ硫安、１％ＰＥＧ８０００及び４ｍＭ  ＣａＣｌ2を含むｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ緩衝液にて結晶化をしたところ、両サンプルで同様の１０〜２０μｍ角程度の微結晶が形成した。
７ＧＬ−ＧＦＰの微結晶を図２及び図３に示した。
【００３７】
［実施例３］
（発現ベクターの作製）
実施例１と同様にして、プラスミドｐＴ７−（ＴＣＰα）４を大量調製した。
ｐＴ（ＴＣＰα）４をＢａｍＨＩで処理した後、外来遺伝子のクローニングサイトとなる合成ＤＮＡをライゲーションし、ＢｇｌＩＩで切断し、その後ライゲーション反応によって環状化し、ｐＴＦ４ＴＣＰ−αを構築した。
ｐＴＦ（ＴＣＰα）４は４つ連結したシャペロニンαサブユニットにトロンビン切断配列を介して外来蛋白質がつながった融合蛋白質を発現させるベクターである。
【００３８】
（４ＴＣＰαの発現）
ｐＴＦ（ＴＣＰα）４を大腸菌に形質転換し、１０コロニーを２ＸＹＴ液体培地（バクトトリプトン １６ｇ、酵母エキス １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ）に接種し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下３５℃で培養し、ＯＤ600が０．６〜１．０で１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。更に１０時間培養し、４ＴＣＰαの発現を誘導した。培養終了後、菌体を回収した。
【００３９】
（４ＴＣＰα−ＧＦＰの発現）
外来蛋白質としてクラゲ由来緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を、該遺伝子が導入されたｐＴ７ｂｌｕｅ−Ｔベクターより、ＮｈｅＩ及びＳｐｅＩ切断によって回収し、同様の制限酵素処理が施されたｐＴＦ（ＴＣＰα）４にライゲーションさせ、４つのシャペロニンαサブユニットとＧＦＰの融合蛋白質（４ＴＣＰα―ＧＦＰ）を発現させるｐＴ（ＴＣＰα）４−ＧＦＰを構築した。
次いで、上述した４ＴＣＰαと同様にして、４ＴＣＰαとＧＦＰの融合蛋白質（４ＴＣＰα−ＧＦＰ）を大腸菌にて発現させた。
【００４０】
（４ＴＣＰα―ｈＣｙＰの発現）
上述した４ＴＣＰα―ＧＦＰと同様にして、４ＴＣＰαとヒトシクロフィリン（サイクロスポリン結合性蛋白質、ｈＣｙＰ）の融合蛋白質（４ＴＣＰα―ｈＣｙＰ）を発現させるｐＴ（ＴＣＰα）４−ｈＣｙＰを構築し、４ＴＣＰα―ｈＣｙＰを大腸菌にて発現させた。
【００４１】
なお、４ＴＣＰαのＣ末端には６Ｈｉｓが付加されよう設計した。２つの融合蛋白質はＮ末端側から、４ＴＣＰα、目的蛋白質、及び、６Ｈｉｓの順に構成されるように設計した。
【００４２】
（精製・結晶化・解析）
それぞれ菌体回収後、ニッケルキレートクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー及びゲルろ過によって精製した。精製標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一であった。各精製標品を１０ｍｇ／ｍｌ濃度まで限外ろ過で濃縮した後、終濃度２．５ｍＭのＡＴＰを添加した。その後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３．６％ＰＥＧ６Ｋ、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌの条件で結晶化を行った結果、最大０．１ｍｍ角程度の正八面体様結晶が全ての標品で得られた。
また、得られた結晶に対して、Ｘ線発生装置を用いてＸ線回折実験を行ったところ、２．８Åの分解能の回折点が得られた。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、いかなる蛋白質も同一のシャペロニンリングに格納させることにより、同一の条件によって、精製、結晶化及びＸ線回折による３次元構造の解析を行うことができるので、これらの工程を従来よりはるかに迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌シャペロニン（ＧｒｏＥＬ）の立体構造を模式的に表す図である。
【図２】実施例２で得られた７ＧＬ−ＧＦＰの微結晶を示す図である。
【図３】実施例２で得られた７ＧＬ−ＧＦＰの微結晶を示す図である。
【図１】
0004066250.tif 000002
【図２】
0004066250.tif 000003
【図３】
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