(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする発がんプロモーター作用の測定法。
（１）被検物質を非ヒト動物に投与する工程
（２）非ヒト動物から肝臓を摘出する工程
（３）摘出した肝臓の表層に切開面を作製する工程
（４）切開面にギャップ結合通過性の色素を注入する工程
（５）注入した色素の切開面からの移行度から被検物質の発がんプロモーター作用を測定する工程
【請求項２】
ギャップ結合通過性の色素と共にギャップ結合非通過性の色素を注入し、ギャップ結合通過性の色素の移行度とギャップ結合非通過性の色素の移行度との差から被検物質の発がんプロモーター作用を測定することを特徴とする請求項１記載の測定法。
【請求項３】
以下の工程を含むことを特徴とする抗発がんプロモーター作用の測定法。
（１）被検物質と発がんプロモーター作用を有する物質とを非ヒト動物に投与する工程
（２）非ヒト動物から肝臓を摘出する工程
（３）摘出した肝臓の表層に切開面を作製する工程
（４）切開面にギャップ結合通過性の色素を注入する工程
（５）注入した色素の切開面からの移行度から被検物質の抗発がんプロモーター作用を測定する工程
【請求項４】
ギャップ結合通過性の色素と共にギャップ結合非通過性の色素を注入し、ギャップ結合通過性の色素の移行度とギャップ結合非通過性の色素の移行度との差から被検物質の抗発がんプロモーター作用を測定することを特徴とする請求項３記載の測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発がんプロモーター作用を簡易かつ高い精度で測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の発がん研究で、環境中には遺伝子変異を起こさない機構で発がんプロモーター作用のある化学物質（以下、「発がんプロモーター」という）が多く存在することが明らかになり、これらを早期に検出するための信頼性の高い試験法の開発が望まれている。その方法の１つに、隣接した細胞間同士の情報交換を担うギャップ結合細胞間連絡（gap junctional intercellular communication、以下「GJIC」という）の阻害を指標とした検出法の有用性が示唆されている。ギャップ結合とは、コネクシンと呼ばれる構成蛋白のサブユニットからなるコネクソンが、細胞間で組み合わさったチャンネル構造であり、多細胞生物の生理的機能を担っている（図１）。このGJICが発がんプロモーターにより阻害を受けることが、主として培養細胞を用いた実験系で明らかとされてきた。また、動物においても、その関連が示唆されつつあるが、現在その例は少ない。
従来から行われていたGJIC解析法には、死んだ細胞または組織標本を用いてギャップ結合蛋白・mRNAの定量を行う手法と、生きた状態の細胞における実質的なGJIC機能を調べる手法とがある。
【０００３】
GJIC機能の解析法の中で、発がんプロモーターによる阻害作用の研究で多く利用されているものとして、代謝共同阻害試験法（Yotti,L.,et al., 1979, Science, 206, 1089-1091）、色素移行法があるが、特に後者は適用範囲が広く利用が増えている。この色素移行法は、ギャップ結合を通過する蛍光色素を細胞に取りこませ、これの移行の程度を指標とする解析手法である。この色素移行法の原理を利用した手法に、培養細胞を用いた３種類の解析法と、動物の肝スライスを用いる手法とがある。培養細胞の場合、一個の細胞内に針で色素を注入するマイクロインジェクション法(Enomoto et al.,1984,J.Cell Physiol., 121, 323-333)、またあらかじめ細胞全体に蛍光色素を取り込ませた後、レーザー照射で一個の細胞の蛍光を消光させる光退色法(Wade,et al.,1986,Science,232,525-528)、細胞の割裂部位より色素を注入するscrape loading/dye transfer(SL/DT)法(EL-Fouly et al.,1987,Exp.Cell Res.,168,422-430)がある。このSL/DT法は適用できる細胞の範囲が広く、迅速な方法であることから現在スクリーニング法としての有用性が期待され、Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD)のガイドラインに採用されている。また、ラットの摘出肝を用いた例では、肝スライスの上部から針で内層の細胞内へ色素を注入し、凍結標本切片から最大に色素が拡散した切片を選択し、これの最大面積を測定するin vivoマイクロインジェクション法(Krutovskikh, et al., 1991, Carcinogenesis, 12, 1701-1706)がある。
【０００４】
しかし、前者の培養細胞を用いる方法も後者のラットの肝スライスを用いる方法もいずれも幾つかの問題点を有している。一般に、発現しているギャップ結合蛋白の種類及び発現調節機構は、株化細胞と動物の発がん標的細胞とでは異なっていることが知られ、また投与した物質に対する生体反応は、動物個体として生存している細胞と、培養条件下に置かれた細胞とでは必ずしも一致しないことも知られている。従って前者の培養細胞を用いた方法によって得られた知見が、そのまま動物またはヒトに関する知見として利用できないという問題がある。また、後者のラット肝スライスを用いる方法は、特殊な装置（スライサー、マニュピュレーター、クリオスタット等）とその技術的熟練を要するため一度の色素注入処理数が限られる点、また色素移行が最大に達した面積を解析対象とするため、凍結標本切片を多数作製し、これらの面積から最大のものを選択する労力と時間を要する点で、スクリーニング手法として不適切な面がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように従来のGJICを利用した発がんプロモーター作用の検出方法には、様々な問題が存在する。
本発明は、これらの問題を解決し、簡易かつ精度の高い発がんプロモーター作用の測定方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、摘出した肝臓の表層に作製した境界面に色素を注入し、その移行度を計測するといった簡易な手法により高い精度で被検物質のプロモーター作用を測定できることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、以下の工程を含むことを特徴とする発がんプロモーター作用の測定法である。
【０００７】
（１）被検物質を非ヒト動物に投与する工程
（２）非ヒト動物から肝臓を摘出する工程
（３）摘出した肝臓の表層に切開面を作製する工程
（４）切開面にギャップ結合通過性の色素を注入する工程
（５）注入した色素の切開面からの移行度から被検物質の発がんプロモーター作用を測定する工程
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の発がんプロモーター作用の測定法は、以下の工程を含むことを特徴とするものである。
【０００９】
（１）被検物質を非ヒト動物に投与する工程
（２）非ヒト動物から肝臓を摘出する工程
（３）摘出した肝臓の表層に切開面を作製する工程
（４）切開面にギャップ結合通過性の色素を注入する工程
（５）注入した色素の切開面からの移行度から被検物質の発がんプロモーター作用を測定する工程
【００１０】
以下、各工程について説明する。
（１）被検物質を非ヒト動物に投与する工程
この工程では、被検物質を非ヒト動物に投与する。非ヒト動物としては、ヒト以外の動物であれば特に限定されず、例えば、マウス、ラットなどの発がん性試験に用いられている動物を使用することができる。また、遺伝子改変動物や疾患モデル動物などを使用することもできる。
被検物質の投与は、通常経口的に投与するが、これ以外の方法によって投与してもかまわない。
【００１１】
本発明の測定方法は、発がんプロモーターのスクリーニングや既に発がんプロモーター作用が確認されている物質の有効量決定などの目的に利用できるので、投与する物質はその目的に応じて決めればよい。例えば、スクリーニングの目的に利用するのであれば、発がんプロモーター作用を有する疑いのある物質を被検物質として投与すればよく、有効量決定の目的に利用するのであれば、同一の物質を投与量を変えてそれぞれ動物に投与すればよい。
また、本発明の測定方法の応用例としては、既に発がんプロモーター作用が確認されている物質と共に抗発がんプロモーター作用を有する可能性のある物質（被検物質）を投与し、その被検物質の抗プロモーター作用を測定することも可能である。
【００１２】
（２）非ヒト動物から肝臓を摘出する工程
この工程では、被検物質を投与した動物から肝臓を摘出する。
肝臓を摘出する時期は、対象とする動物や被検物質の種類等に応じて決めればよく、例えば、マウスの場合、投与から１〜２週間後に摘出した肝でも、プロモーター検出が可能である。
非ヒト動物から肝臓の摘出は、常法に従って行うことができ、特別な方法を用いる必要はない。
【００１３】
（３）摘出した肝臓の表層に切開面を作製する工程
この工程では、摘出した肝臓から適当な大きさの小片を切り出し（図２▲１▼）、その小片の表層に切開面を作製する（図２▲２▼）。
切開面の作製は、実施例にで記載したように、試験管などの適当な固定物の上に載せ、カミソリ刀などを用いて行うことができる。切開面の大きさは特に限定されないが、深さ0.5〜1mm、長さ7〜8mm程度が好ましい。
【００１４】
（４）切開面にギャップ結合通過性の色素を注入する工程
この工程では、切開面にギャップ結合通過性の色素を注入する。
ギャップ結合通過性の色素としては、一般に頻用されているlucifer yellowなどの蛍光色素を使用することができる。切開面に注入する色素は、ギャップ結合通過性の色素のみでもよいが、好ましくはギャップ結合非通過性の色素も注入する。
ギャップ結合非通過性の色素としては、一般に頻用されているrhodamine dextran(MW 10,000)などが利用できる。
【００１５】
（５）移行度から被検物質の発がんプロモーター作用を測定する工程
この工程では、注入した色素の切開面からの移行度から被検物質の発がんプロモーター作用を測定する。
切開面からの色素の移行度は、色素を注入した肝臓の小片をホルマリンで固定した後、パラフィンに包埋し、これから切開面と垂直な切片を作製し（図２▲３▼）、その切片を観察することにより求めることができる。
【００１６】
発がんプロモーター作用を有する物質が動物に投与された場合、その動物のGJICが阻害されるため色素の移行度が小さくなる。従って、対照動物における色素の移行度と比較し、投与した物質がどの程度発がんプロモーター作用を有するかを知ることができる。GJICが阻害されるということは、ある細胞から他の細胞への色素の移動が阻害されるということであるから、上記「移行度」とは、本来切開面を基点としたギャップ結合通過性色素で染色された細胞の個数を意味するが、細胞の形態やサイズが均一である場合、細胞の個数と色素の移動距離はほぼ等しいので、「移行度」には色素の移動距離も含まれる。
【００１７】
色素を注入する工程において、ギャップ結合通過性の色素のほか、ギャップ結合非通過性の色素を注入した場合、色素を注入した細胞及び操作時に細胞障害により非特異的に色素が漏出した細胞を確認することができるので、これをギャップ結合通過性の色素の移行度から差し引くことにより、正味のギャップ結合通過の移行度を求めることができる（図２▲４▼）。これにより更に高い精度で発がんプロモーター作用を測定することが可能になる。なお、図３にギャップ結合通過性の色素（lucifer yellow）のみを蛍光させた場合（左）、ギャップ結合非通過性色素（rhodamine dextran）のみを蛍光させた場合（中央）、両者を蛍光させた場合（右）の蛍光顕微鏡写真を示す。
【００１８】
本発明において「プロモーター作用の測定」とは、被検物質のプロモーター作用の強度を測定することを意味するのはもちろんであるが、被検物質がプロモーター作用を有するかどうか調べることをも包含する意味である。
本発明の発がんプロモーター作用の測定法は、従来の方法に比べ以下のような利点を持っている。
【００１９】
i)本測定法は、被検物質投与後の摘出肝を用いるため、生きた動物のGJICの変化を調べることができ、培養細胞等を用いる方法に比べ、高い精度で被検物質の発がんプロモーター作用を知ることができる。
ii)本測定法は、肝臓の切開面に色素を注入するため、色素を注入するための特殊な装置や熟練された技術が不要である。
iii)本測定法は、色素処理の肝臓を固定後、パラフィンで包埋し、切開面に対し垂直な切り出し面で切片を作製し、切開面から垂直方向の色素移行度（距離・細胞数）を計測するが、切開面から垂直方向の色素移行度は全て画一なので、従来の方法のように多数の切片を作製し、面積を求めなくても、任意の切片を計測に使用できる。
【００２０】
【実施例】
［実施例１］
B6C3F1雄マウス（６週齢）に300ppm又は600ppmのペンタクロロフェノール（以下「PCP」という）を餌に混ぜて投与した。PCPは既に本発明者らにより発がんプロモーター作用を持つことが確認された物質である。
【００２１】
PCP投与開始から２週間後にこのマウスをエーテル麻酔下で屠殺し、肝臓を摘出した。摘出した肝臓は生理食塩水で洗浄した後、一部（外側左様の先端１cm程度）を切り出し、湿らせたガーゼを巻いた試験管（直径１cm程度）上に置き、刃渡りを１mm程度に調節したカミソリ刀で表層面を切開した。この切開部に0.5% lucifer yellowを含むリン酸緩衝液を滴下し、保湿したシャーレ内で３分間放置した。
【００２２】
次に、放置後の肝臓小片を生理食塩水で表面の色素を洗浄し、直ちに10％中性ホルマリンで固定し（24時間程度）、パラフィン包埋した（水洗浄は１分程度とし、パラフィン包埋は自動包埋装置で19時間の行程時間で行った）。パラフィン包埋した肝臓小片を切開部に垂直な方向に切断していき、２〜５mm程度の切片を作製した。
【００２３】
Ｂ励起フィルターによりlucifer yellowを蛍光させ、上記で作製した切片を蛍光顕微鏡で観察した。図４にPCPを投与したマウスの肝切片の写真（右）と対照マウスの肝切片の写真（左）を示す。また、図５に上記切片における色素移行距離と色素が移行した細胞の数を示す。色素移行距離は、対照マウスの肝切片における色素移行距離を1.0とした場合の相対距離で表している。図５に示すように、色素移行距離については、PCP投与により対照の約70％に減少した。また、PCPを投与したマウスでは肝細胞が腫大していただめ、色素が移行した細胞の数についてはより大きな減少が見られ、対照の約50％に減少した。
【００２４】
［実施例２］
B63CF1雄マウス（６週齢）に300ppm又は600ppmのPCPを２週間餌に混ぜて投与し、緑茶浸出液をPCP投与の１週間前から水の代わりに投与した。緑茶浸出液は、本発明者らによってPCPによる肝発がんプロモーター作用を抑制することが確認されている。
肝臓の摘出から切片作製までの操作は基本的には、実施例１と同様に行ったが、注入する色素は、0.5% lucifer yellowと0.5% rhodamine dextranとを含むリン酸緩衝液を使用した。
【００２５】
Ｂ励起フィルター及びＧ励起フィルターによりlucifer yellowとrhodamine dextranを蛍光させ、作製した切片を蛍光顕微鏡で観察した。図６にPCP(600ppm)を投与したマウスの肝切片の写真（左下）、対照マウスの肝切片の写真（左上）、緑茶浸出液のみ投与したマウスの肝切片の写真（右上）、緑茶浸出液及びPCP(600ppm)の両者を投与したマウスの写真（右下）を示す。また、図７に上記肝切片における色素移行距離と色素が移行した細胞の数を示す（但し、PCPについては300ppm(L)600ppm(H)の二通りの濃度を投与した。）。図７に示すように、色素移行距離については、300ppmのPCPを投与した場合対照の55％に減少し、600ppmのPCPを投与した場合対照の40%に減少した。緑茶浸出液を投与した場合、PCPによる色素移行距離の阻害は軽減され、それぞれ対照の90%、85％となった。色素が移行した細胞の数についても、300ppmのPCPを投与した場合対照の46%に減少し、600ppmのPCPを投与した場合対照の35%に減少した。緑茶浸出液を投与した場合、その阻害は軽減され、それぞれ対照の80％、82％となった。
【００２６】
【発明の効果】
本発明の発がんプロモーター作用及び抗発がんプロモーター作用の測定法により、簡易かつ高精度で発がんプロモーター及び抗発がんプロモーター作用を有する物質のスクリーニングが可能になる。また、本測定法は、発がん性試験での用量設定にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ギャップ結合の構造を模式的に表した図である。
【図２】本測定法の操作の概要を示す図である。
【図３】  lucifer yellowとrhodamine dextranで染色した肝切片の写真である。
【図４】  PCP投与による色素移行度の変化を示した写真である。
【図５】  PCPの投与と色素の移行距離及び細胞数の変化との関係を示す図である。
【図６】  PCP及び緑茶投与による色素移行度の変化を示した写真である。
【図７】  PCP及び緑茶の投与と色素の移行距離及び細胞数との変化の関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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