(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワックスシンターゼ活性を有するホホバアシルトランスフェラーゼをコードし、かつ下記に示す核酸配列を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【化１】
0004126102.tif 000011
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換えDNA構築物。
【請求項３】
プロモーターをさらに含んでなる請求項２に記載の構築物。
【請求項４】
前記プロモーターが前記ホホバアシルトランスフェラーゼの植物細胞中の発現を提供する請求項３に記載の構築物。
【請求項５】
前記植物細胞が植物胚種子細胞である請求項４に記載の構築物。
【請求項６】
前記プロモーターが前記ホホバアシルトランスフェラーゼの細菌細胞中の発現を提供する請求項５に記載の構築物。
【請求項７】
前記プロモーターが植物種子胚細胞に優先的に発現される遺伝子由来である請求項６に記載の構築物。
【請求項８】
請求項２に記載の構築物を含んでなる細胞。
【請求項９】
請求項２に記載の構築物を含んでなる植物細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む組換え構築物を含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が植物細胞である請求項10に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記植物細胞がアブラナ（Brassica）植物細胞である請求項11に記載の植物細胞。
【請求項１３】
請求項２に記載の構築物を含んでなるアブラナ（Brassica）植物細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含んでなる原核細胞。
【請求項１５】
宿主細胞中にワックスエステルを産生する方法であって、以下の工程、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含んでなり、該ポリヌクレオチドが該細胞中で機能する調節エレメントの制御下にある組換え構築物を含んでなる宿主細胞を、該ホホバアシルトランスフェラーゼの発現を引き起こす条件下で、増殖させる工程、を含んでなる前記方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞が原核細胞である請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞が種子植物胚細胞である請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記種子植物がアブラナ（Brassica）である請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
ワックスエステルの形成に活性がある、下記に示す核酸配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるホホバアシルトランスフェラーゼ。
【化２】
0004126102.tif 000012
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、酵素、その酵素を精製して得る方法、それに関係するアミノ酸および核酸配列を精製して得る方法、ならびにこのような組成物の遺伝子操作応用に使用する方法に関する。
序論
背景
植物遺伝子操作技術の発展を通じて、様々な植物種を形質転換し再生して新規かつ所望の特徴を有する植物を提供することが可能である。このような植物遺伝子操作技術の目的領域の1つは、植物組織における高価な産物の産生である。このような応用では、所望の産物を産生する植物を作製する形質転換事象に使用するために様々なDNA構築物および核酸配列の使用が必要である。例えば、遺伝子配列の適切な発現には、その発現が全植物または選択された植物組織のいずれであろうと、植物機能プロモーターが必要である。さらに、形質転換植物材料を確認するために選択マーカー配列がしばしば使われる。このような植物プロモーターと選択マーカーは、新規の植物を得る上で有用な価値あるツールを提供する。
このような遺伝子操作技術に関わる望ましい目標は、ワックスエステルの好都合なソースを有する作物植物を提供する能力である。ワックスエステルは、医薬品、化粧品、界面活性剤、プラスチック、および潤滑剤を含む各種の産業的応用に必要とされている。このような産物、特に長鎖ワックスエステルは、かっては、危機に瀕する種であるマッコウクジラ、または、もっと最近では、砂漠低木、ホホバ（jojoba）から取得されている。これらのソースはいずれもワックスエステルの供給に好都合ではない。したがって、このような化合物の信頼できるソースを得るために、増殖、栽培および産物の抽出の点で容易に取扱える作物植物の形質転換が望ましい。
しかし、このような形質転換した植物を得るためには、所望のワックスエステル産物の生合成に関わる遺伝子を先ず得る必要がある。ワックスエステル産生は、少なくとも2つの酵素活性、脂肪アシルレダクターゼおよび脂肪アシル：脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼもしくはワックスシンターゼの作用からもたらされる。さらに、β-ケトアシル-ACPシンターゼも、レダクターゼおよびワックスシンターゼ酵素反応に非常に長い鎖状脂肪アシルCoA基質を提供することによってワックス生合成に関わる。このような酵素による予備的研究、ならびに脂肪アシルレダクターゼの広範な分析および精製は、これらのタンパク質が膜に関係することを示すが、しかしワックス生合成における脂肪アシル：脂肪アルコール連結反応を担う酵素は特性がよく決定されていない。したがって、さらなる研究そして最終的に、酵素活性をコードする遺伝子配列を得るためにこの酵素の精製が必要である。
それ故に、ワックスシンターゼタンパク質を取得し、アミノ酸配列を決定し、および／またはワックス合成に特異的な抗体を取得することができる精製プロトコルを工夫することが望まれている。このやり方で、ライブラリースクリーニング、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または免疫学技術を、ワックスシンターゼタンパク質を発現するクローンを確認するために使うことができる。このやり方で取得したクローンを、ワックスシンターゼ活性に対応する核酸配列を確認するために分析することができる。その後、ワックスシンターゼ核酸配列を、トランスジェニック宿主細胞に由来するかまたは組換え技術により供給されるいずれかの脂肪アシルレダクターゼタンパク質と共に、宿主細胞中のワックスエステル産生のために用いることができる。
関連文献
発育中のホホバ胚由来の無細胞ホモジネートは、アシル-CoA：脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ活性を有すると報じられた。その活性は、示差遠心分離（differential centrifugation）により形成される浮遊ワックスパッドに関連する（Pollardら，（1979）前掲；Wuら，（1981）前掲）。
脂肪アシル-SCoAトランスアシラーゼ活性を有するEuglena gracilis由来の多酵素複合体の可溶化は、ウィルドナーおよびハリック（WildnerおよびHallick,The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting,April 22-24,1990,Las Cruces,NM.からの抄録）により報じられている。
ホホバアシル-CoA:アルコールトランスアシラーゼタンパク質の10倍精製は、プシュニクら（Pushnikら，The Southwest Consortium Fourth Annual Meeting,February 7,1989,Riverside,Ca.からの抄録）により報じられている。
ホホバアシル-CoA:アルコールトランスアシラーゼ活性のアッセイは、ガルバーら（Garverら,Analytical Biochemistry（1992）207:335-340）により報じられている。
WO 93/10241は植物脂肪アシル-CoA：脂肪アルコール-O-アシルトランスフェラーゼに関する。ホホバ57kDタンパク質はホホバ脂肪アシル-CoA：脂肪アルコール-O-アシルトランスフェラーゼ（ワックスシンターゼ）と確認されている。本発明者らは後に、ホホバからの57kDタンパク質は、非常に長鎖脂肪酸の生合成に関わるβ-ケトアシル-CoAシンターゼであると報じた（Lassnerら，（The Plant Cell（1996）8:281-292））。
アシル-CoA:脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼであると推定される57kDホホバ種子ポリペプチドの光親和性標識はショッキーら（Shockeyら．Plant Phys.（1995）107:155-160）によっても報じられている。
図の簡単な説明
図1は、第1のワックスシンターゼ精製プロトコルからのカラム画分中のワックスシンターゼ活性の分析結果を示す。図1AはブルーAアガロースクロマトグラフィーの結果を示す。図1Bは、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果を示す。図1Cは、Sephracryl S-100サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。図1Aは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果を示す。
図2は、第2のワックスシンターゼ精製プロトコルからのカラム画分中のワックスシンターゼ活性の分析結果を示す。図2AはブルーAアガロースクロマトグラフィーの結果を示す。図2Bは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果を示す。図2Cは、Superdex 75サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。
図3は、プライマーWSPEP14-F1およびWSPEP33-R2からのPCR産物のヌクレオチド配列（図3A）および5’および3’RACE産物から推定したホホバからの脂肪アシル-CoA:脂肪アルコール-O-アシルトランスフェラーゼの完全ヌクレオチド配列（図3B）を提供する。
図4は、TLCプレートのX線画像（Radioimage）を提供し、pCGN8559により形質転換したシロイヌナズナ（arabidopsis）の発育種子から調製したペレット画分のアッセイにおいて、1-14C 16:0 CoAがワックス中に結合していることを示す。発育ホホバ種子からの膜画分はポジティブ対照である。バックグラウンド活性は、シロイヌナズナ（arabidopsis）植物8612-3および8613-2のアッセイに示される。
発明の概要
本発明により、脂肪アシル-CoA：脂肪アルコール-O-アシルトランスフェラーゼタンパク質（脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ、E.C.2.3.1.75）をコードする核酸配列が提供され、該タンパク質は脂肪アルコールおよび脂肪アシル基質からのワックスエステルの形成に活性がある。この脂肪アシル-CoA：脂肪アルコールO-アシルトランスフェラーゼは、本明細書で「ワックスシンターゼ」とも呼ばれる。本発明のワックスシンターゼは、アシル-CoAおよびアシル-ACPを含む各種の脂肪アシルおよび脂肪アルコール基質に活性がありうる。これらの基質の炭素鎖長は変化しうるが、所与のワックスシンターゼは、特定の鎖長を有するアシルおよびアルコール基質に優先性を示しうるしまたは広範囲の炭素鎖長を有するアシルおよびアルコール基質に活性を有しうる。
一般的に、本発明のワックスシンターゼは、少なくとも8〜26炭素の鎖長を有するアシルおよびアルコール基質に活性を有するが、他のアシルまたはアルコール基質を試験してさらに活性を発見することがありうる。加えて、本発明のワックスシンターゼタンパク質を得た後、今回、以下にさらに詳細に記載したようにさらなる操作が可能になった。これらの操作により、他の関連ワックスシンターゼの産生または発見がなされるであろう。
本発明の1つの重要な様態では、ワックスシンターゼをコードする核酸配列が提供される。これらの配列を本発明のワックスシンターゼタンパク質のアミノ酸配列から確認し取得することができる方法が記載される。他のワックスシンターゼ配列の単離のため、ならびに組換え構築物においてワックスシンターゼ核酸配列の転写および／または宿主細胞におけるワックスシンターゼタンパク質の発現のための、構造遺伝子配列の使用が記載される。ワックスシンターゼタンパク質に関連して、5’および3’非コード領域の使用のような他の核酸配列の使用も考慮されている。
したがって、本発明は、植物ワックスシンターゼ核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびに植物ワックスシンターゼ遺伝子配列の分析および回収のためにワックスシンターゼをコードする配列を含有するオリゴヌクレオチドの調製に、これらの核酸配列を使用することを包含する。植物ワックスシンターゼをコードする配列は、意図する用途に応じて、完全なまたは部分的な配列をコードすることができる。ゲノム配列の全てまたは部分、またはcDNA配列が意図される。
特に目的としているのは、植物ワックスシンターゼ配列の転写または転写および翻訳（発現）を提供する組換えDNA構築物である。特に、植物宿主細胞の転写または転写および翻訳の能力がある構築物が好ましい。ある応用では、植物ワックスシンターゼの低減が望ましいことがある。したがって、アンチセンス配列の発現のために逆方向に植物ワックスシンターゼ配列を有する組換え構築物を設計することができるし、または「トランスィッチ（transwitch）」として知られる同時抑制構築物の使用が有用でありうる。このような構築物は、植物種子組織に好んで発現される遺伝子から得られる転写開始領域を含む様々な調節領域を有することができる。ある用途では、ワックスシンターゼをコードする配列を伴なうかまたは異種（heterologous）配列の転写および翻訳を指令するワックスシンターゼ遺伝子の転写および翻訳開始領域を使うことが望ましいかもしれない。
さらに異なる様態では、本発明は、細胞内の構築物の発現を介して宿主細胞またはその子孫にワックスシンターゼを産生する方法に関する。植物ワックスシンターゼをコードする配列産生の結果として、ワックスシンターゼを含有する細胞も本発明に包含される。このような構築物は、ワックスエステルおよび／または様々な脂肪アシル種の産生に関わるタンパク質をコードする他の核酸配列を用いることができる。
さらに、本発明のワックスシンターゼは、ワックスシンターゼの脂肪アシルおよび脂肪アルコール基質を含有する宿主細胞においてワックスエステルの産生に応用しうることも認識できる。このような宿主細胞は、天然に存在しうるし、または脂肪アシルレダクターゼをコードする核酸構築物で形質転換することにより得ることができる。脂肪アシルレダクターゼまたは「レダクターゼ」は、対応するアルコールの脂肪アシル基の還元を触媒する活性がある。本明細書に参照により組み入れられる同時係属中の米国特許出願07/659,975（1991年2月22日出願）、07/767,251（1991年9月27日出願）および07/920,430（1992年7月31日出願）は、これらのレダクターゼタンパク質に関する。この情報は、公開されたPCT特許出願WO 92/14816にも提供されている。さらに、本明細書は、同様にレダクターゼタンパク質の望ましいソースであるワックスシンターゼタンパク質の他のソースを記載する。
本発明のこの様態で特に考えられているのは、本明細書に記載したホホバワックスシンターゼの好ましいアルコール基質を含有する植物細胞である。脂肪アシルレダクターゼ核酸配列をコードする組換え核酸構築物により該細胞を形質転換して、このようなアルコール基質をもつ植物細胞を提供する方法が考えられている。したがって、通常はワックスシンターゼに利用される相当な量のアルコール基質を含有しない植物宿主を、レダクターゼ構築物により形質転換して該アルコールを産生させることができる。このやり方で、宿主細胞中に存在する脂肪アシル基は、ワックスエステル合成でワックスシンターゼに利用される脂肪アルコール基質のソースも同様に提供するであろう。ワックスシンターゼおよびレダクターゼタンパク質を特定することに依って、このやり方で、様々な所望のワックスエステル産物を産生する植物細胞が得られることは認められるであろう。このような産物は、脂肪アルコールおよび脂肪酸基の鎖長および飽和度に依って様々な物性を有するであろう。このようにして、本明細書の方法により産生されるワックスエステル産物は宿主細胞から回収することが可能であり、これも本発明で考えられている。
同様に本発明で考えられているのは、本発明の植物ワックスシンターゼ配列およびタンパク質の発現により得られる改変した植物、種子およびワックスエステルである。
発明の詳細な説明
本発明によって、ワックスエステルを産生するための脂肪アシル基による脂肪アルコールのエステル化を触媒する活性があるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド断片のアミノ酸をコードする核酸配列が提供される。このようなタンパク質は脂肪アシル-CoA：脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ（E.C.2.3.1.75）として知られている。本発明のアシル-CoA：アルコールアシルトランスフェラーゼは、今後、「ワックスシンターゼ」とも呼ばれる。
典型的にはアシル-CoA：アルコールアシルトランスフェラーゼと呼ばれるが、本発明のワックスシンターゼは、脂肪アシル-CoAおよび脂肪アシル-ACP分子を含む様々なアシル基質に活性を示すことができる。さらに、ワックスシンターゼが作用するアシルおよびアルコール基質は共に、様々な炭素鎖長および飽和度を有しうるが、ワックスシンターゼはある特定の分子に対して優先的な活性を示すことができる。
多くの様々な生物がアルコールとアシル基質からワックスエステルを産生し、本発明のワックスシンターゼタンパク質の望ましいソースとなる。例えば、植物は、表皮またはクチクラワックスを産生し（Kolattukudy（1980）,The Biochemistry of Plants（Stumpf,P.K.およびConn,E.E.編）Vol.4,p.571-645）、そして砂漠低木ホホバは種子貯蔵ワックスを産生する（Ohlroggeら，（Lipids（1978）13:203-210）。ワックス合成は、また、アシネトバクター（Acinetobacter）（Fixterら，（1986）J.Gen.Microbiol.132:3147-3157）およびミクロコックス（Micrococcus）（Lloyd（1987）Microbios 52:29-37）のような様々な細菌種、ならびに単細胞生物では、ミドリムシ（Euglena）（KhanおよびKolattudkudy（1975）Arch.Biochem.Biophys.170:400-408）にも観察されている。さらに、ワックス産生およびワックスシンターゼ活性はウシマイボーム腺（meibomian glands）（Kolattukudyら，（1986）J.Lipid Res.27:404-411）、トリ尾脂腺（uropygial glands）、および各種の昆虫および海洋生物からのミクロソーム調製物に報じられている。それ故に、様々な性質を有する多くの異なるワックスエステルを本発明のワックスシンターゼにより産生させることができ、酵素の活性および産生されるワックスエステルのタイプは、利用できる基質または対象となる特定のワックスシンターゼの基質特異性に依存しうる。
エステル化反応に使用するためのワックスシンターゼタンパク質の信頼できるソースを得るために、ワックスシンターゼに関連した核酸配列を単離し、該配列をワックスシンターゼ酵素を産生するための宿主細胞にクローニングすることが望ましい。例えば、ワックスシンターゼタンパク質の手近なソースを提供するため、ワックスシンターゼタンパク質をコードする核酸配列を大腸菌（E.coli）細胞発現用のベクターにクローニングすることができる。こうして産生したワックスシンターゼタンパク質は、様々なソースから、特に植物からの関連ワックスシンターゼタンパク質の同定と精製に使用するため、ワックスシンターゼタンパク質に対する抗体を生じさせるために使うこともできる。加えて、ワックスシンターゼタンパク質のさらなる研究により、特徴づけをさらに行ってその触媒特性を改良するかまたはその脂肪アルコールもしくは脂肪アシル基質特異性を改変するための部位特異的突然変異誘発反応を行うことができる。基質特異性が改変されたワックスシンターゼは、他のFAS酵素と共に使用することができる。
本発明の前には、ワックスシンターゼタンパク質の核酸およびアミノ酸配列は未知であった。したがって、ワックスシンターゼに関係する核酸配列を得るために、ワックスシンターゼ核酸配列の単離に使用する適切なプローブを調製できるように、まずタンパク質を利用可能なソースから精製し、少なくとも部分的なアミノ酸配列を決定することが必要であった。
砂漠低木、Simmondsia chinensis（ホホバ（jojoba））を候補ワックスシンターゼタンパク質のソースとして確認した。初期の研究で、ホホバワックスシンターゼは膜内在性タンパク質で元来疎水性であることが明らかにされた。一般的に、膜に結合したタンパク質は、それを可溶化すると、すなわちそれが通常機能している膜環境から分離すると、酵素活性を失いやすいので精製が困難である。膜内在性タンパク質を可溶化するために使われている技術は、適切な膜画分の調製物への界面活性剤または有機溶媒の添加を含む。目的のタンパク質が特定の酵素アッセイを用いて測定することができる機能活性を依然保持しているという前提で、その後、沈降、イオン交換、ゲル濾過およびアフィニティクロマトグラフィーのようなさらなる通常の精製技術を用いることができる。
典型的には、可溶化膜タンパク質を得るための第1の工程として、ワックスシンターゼ活性を含有するミクロソーム膜調製が望ましい。標準的なミクロソーム膜調製は、全細胞、核および溶解タンパク質を含まない膜画分を得るために、無細胞ホモジネート（CFH）の示差遠心分離を利用する（例えば、Mooreら，（1987）Biological Membranes:A Practical Approach,pp.37-72,FinalayおよびEvans編、を参照すること）。油種子（oil seed）では、最初の遠心分離工程では、典型的にはペレット、上清および浮遊脂肪パッドが得られ、その後、上清をさらに遠心分離してミクロソーム膜を回収することができる。
ホホバのワックスエステル形成に関わるもう一つの酵素である、脂肪アシルレダクターゼに関連する酵素活性を良い収率で回収できるホホバ膜画分を取得するプロトコルが、米国特許第5,403,918号に記載されている。この方法は、以下の実施例で詳細に記載されるワックスシンターゼ活性を有する膜画分も提供する。さらに、ホホバからのミクロソーム調製はラスナーら（Lassnerら、前掲）にも記載されている。他の方法も当業者には公知であり、同様な膜調製物を得るために用いることができる。さらに、このような調製物のワックスシンターゼ活性をアッセイする方法が実施例1に記載される。
さらなる酵素の特性決定および精製のための重要な段階は、その天然の脂質二重層膜環境から分離されるが、相当量の測定可能なワックスシンターゼ酵素活性を保持する可溶化ワックスシンターゼタンパク質を得る段階である。脂質二重層からの膜内在性タンパク質の分離は、典型的には、両親媒性界面活性剤の水溶液を使って実施されるが、いくつかの事例では有機溶媒も使用されてきた。膜タンパク質の可溶化に関する多くの異なる界面活性剤と方法が当業者には公知であり、ノイゲバウエル（Neugebauer,Methods Enzymol.（1990）182:239-253）およびエルミランド（Hjelmiland,Methods Enzymol.（1990）182:253-264）により概説されている。
膜タンパク質を可溶化するために使われる界面活性剤は、しばしば目的タンパク質の酵素活性を阻害することがわかっている。ホホバワックスシンターゼの可溶化のために複数の界面活性剤が試験され、その中に含まれるCHAPS（3-［（3-コラミドプロピル）-ジメチル-アンモニオ］-1-プロパンスルホネート）はホホバからの脂肪アシルレダクターゼの精製に有用であることが米国特許第5,403,918号で実証された。全てがワックスシンターゼ酵素活性を阻害することが見出された。CHAPSによる強い阻害は、CMCを超える濃度で観察されたが、L-ホスファチジルコリンのようなリン脂質の添加とCHAPS濃度の1.0〜0.2%への、すなわちCMC未満への調節により、ワックスシンターゼ活性の一部分が再構築されることが見出された。ワックスシンターゼ活性の再構築の主な要件は、界面活性剤の除去または希釈の間、リン脂質が存在してワックスシンターゼタンパク質がリン脂質小胞に取り込まれることである。これは、リン脂質の添加を必要としないホホバレダクターゼ活性の再構築のために開発されたプロトコルと異なる。したがって、もしミクロソーム膜画分からの調製物のようにリン脂質がワックスシンターゼ調製物中に存在すれば、単に界面活性剤を除去または希釈することにより活性を検出することができる。しかし、さらに精製されたワックスシンターゼ調製物では、活性を検出するためにリン脂質を加えなければならない。最適な活性回収は、アッセイにおいてCHAPS対PLの比が2.8/1（w/w）であるときに得られる。可溶化ワックスシンターゼ調製物のワックスシンターゼ活性を再構築してアッセイする方法は、実施例1に記載される。
可溶化ワックスシンターゼタンパク質が得られたら、基質特異性、補因子（cofactor）要件および可能な活性阻害剤について酵素を特性決定するためのさらなる実験を、次に実施できることがわかる。例えば、本発明のホホバワックスシンターゼは、アシル-ACPおよびアシル-CoA分子を含む広範囲のアシル基質を有することが見出されている。さらに、アシルおよび脂肪アルコール基質は広いサイズ範囲の炭素鎖長を有することができる。例えば、C12〜C24の炭素鎖長を有する基質を使って活性を試験したところ、全てが酵素に利用されることが示された。さらに、様々な不飽和度の脂肪アシルおよび脂肪アルコールに関して活性が示された。
植物ワックスシンターゼの濃縮調製物を得るために、クロマトグラフィー技術を利用することができる。このような精製工程の1つは、本発明に使われたCibacron Blue F3GA（ブルーA）のような固定した反応性染料マトリックス上のクロマトグラフィーを含む。ほぼ0.3M NaClを含有するバッファー中で送液すると、ホホバワックスシンターゼ活性はこのカラムに結合するが、約85%以上の他のタンパク質は通過するかまたはその後の洗浄で除去される。米国特許第5,403,918号に記載されたように、レダクターゼ活性もこの条件でブルーAカラムに結合する。本明細書では、ブルーAカラムに送液されたワックスシンターゼ活性のほぼ70%が、2.0M NaClバッファー洗液による溶出により回収できることが実証される。ホホバレダクターゼおよびβ-ケトアシル-CoAシンターゼ（KCS）タンパク質もこのブルーA溶出物中に存在する。
ブルーA溶出物のさらなる精製は、サンプルを結晶質ヒドロキシアパタイト（HA）カラムに送液することによって行われる。ワックスシンターゼ活性は、このカラムと結合せず、通過流および洗液中に見出される。レダクターゼおよびKCS活性の大部分はサンプル中の大部分のタンパク質と同じように、カラムに結合する。ワックスシンターゼ活性を濃縮したHA画分はサイズ排除クロマトグラフィーに使うことができ、Superdex 75サイズ排除カラムを使用すると、ホホバワックスシンターゼタンパク質は48kDの分子量を有すると見積られた。
このような精製技術を使い、ホホバワックスシンターゼタンパク質を実質的に精製したタンパク質調製物として回収することができ、そしてアミノ酸配列を得ることができる。同様に、ワックスシンターゼ酵素の脂肪アルコール基質の疎水性のため、他のワックスシンターゼもそれらの元の細胞では膜に結合していると推測され、したがって、本明細書に記載したホホバワックスシンターゼに対する精製技術は、他のワックスシンターゼタンパク質の精製調製物の回収にも有用でありうる。
例えば、Euglena gracilisは、脂肪アシル-CoAレダクターゼおよび脂肪アシル-CoAアルコールトランスアシラーゼ、つまりワックスシンターゼの酵素作用を介して、ワックスを産生する。この生物には、典型的に24〜32の範囲の炭素鎖長を有するワックスが検出される。ホホバについて上に記載したように、Euglenaワックスシンターゼ酵素はCHAPS/NaCl溶液を使って可溶化することができ、染料-リガンド、HAおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって部分精製したワックスシンターゼ調製物が得られる。
アシネトバクター（Acinetobacter）種もワックスエステル組成物を産生することが知られているが、その機構は明確には定義されていない。本明細書に記載したように、脂肪アシル-CoAアルコールトランスアシラーゼ、つまりワックスシンターゼ活性がアシネトバクター（Acinetobacter）種に検出される。このワックスシンターゼ活性はCHAPS/NaCl溶液を使って可溶化し、ブルーAカラムクロマトグラフィーにより濃縮し、さらにサイズ排除クロマトグラフィーのような技術により精製することができる。
本発明のワックスシンターゼをコードする核酸配列を得る目的で、精製タンパク質を含有するバンドをSDSゲルから切り出してアミノ酸配列決定反応に使う。ホホバワックスシンターゼタンパク質をブロットし膜に結合させる条件がわかっていないので、タンパク質のニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜への移行のような好都合な方法をとらずに、ゲル内消化（in gel digestion）を使った。ゲル内消化およびその後のタンパク質配列決定によりホホバタンパク質のアミノ酸配列を決定するために使用する精製ホホバワックスシンターゼタンパク質を含有するゲル切片は、商業実験室、W.M.Keck Foundation/Yale Universityから供給を受けた。このやり方で作製されたペプチド配列を、以下の実施例でさらに詳細に記載される、PCR遺伝子単離技術およびcDNAライブラリースクリーニングに使うことができる。
さらにワックスシンターゼの正体を確証するために、大腸菌（E.coli）におけるタンパク質発現のような実験も望ましい。該ワックスシンターゼはこのような細胞中で脂肪アシルおよび脂肪アルコール基質に作用してワックスエステルを産生することができ、これを各種の分析法で検出することができる。もし宿主細胞がワックスシンターゼのアルコール基質を含有しなければ、活性は細胞抽出物をアッセイすることで実証することができる。あるいは、ワックスシンターゼタンパク質を、ワックスシンターゼ核酸配列および市販の翻訳キットを使ってin vitro翻訳により調製することができる。もし活性に膜挿入が不可欠であれば、活性ワックスシンターゼタンパク質を得るために、in vitro翻訳サンプルにミクロソーム膜調製物を添加することが必要であろう。他の試験は免疫学的アッセイを含み、この方法では、候補タンパク質に特異的な抗体を調製して、タンパク質調製物中のワックスシンターゼ活性を阻害することを見る。
したがって、以下の実施例にさらに詳細に記載するように、ワックスシンターゼタンパク質の正体を確証するために、ならびに原核生物もしくは真核生物いずれかの宿主細胞内での該配列の転写および／または該タンパク質の発現を提供するために、ワックスシンターゼ活性に関連したタンパク質に対して決定されたアミノ酸配列を使って核酸配列を単離する。
ワックスシンターゼは膜結合タンパク質であるので、活性を実証するために植物細胞において候補タンパク質を発現させることが望ましい。一過性発現のための植物組織のエレクトロポレーションまたはボンバードメント（bombardment）が、この目的には有用である。最終的に、この酵素により認識される基質を産生する植物における安定した植物発現が望まれる。もしワックスシンターゼ配列による形質転換の標的となった植物が自然界でこの酵素の脂肪アルコールおよび脂肪アシルエステル基質を含有しなければ、植物抽出物を調製し、ワックスシンターゼの基質を該抽出物に添加してワックスシンターゼ活性をアッセイすることもできる。ワックスシンターゼ配列による植物宿主の形質転換のための構築物および方法は以下でさらに詳細に論じられる。
本発明のワックスシンターゼ核酸は、ゲノムDNAでもcDNAでもよく、そしてcDNAもしくはゲノムライブラリーから単離したり、単離した植物DNAから直接単離することができる。さらに詳細に以下の実施例で記載するように、開示したホホバワックスシンターゼペプチドに特異的なプライマーからPCRによりホホバワックスシンターゼのための核酸配列を得る方法が、本明細書において提供される。
本発明のワックスシンターゼ核酸配列は、ホホバワックスシンターゼタンパク質に対応する核酸配列、ならびにホホバタンパク質または核酸配列から得られる配列を含む。「対応する（correponding）」は、ホホバワックスシンターゼタンパク質またはその一部分をコードする配列、該コード配列の5’側または3’側にあってホホバ胚のワックスシンターゼの転写または転写と翻訳（発現）を指令する調節配列、cDNAに存在しないイントロン配列、ならびに小胞体（endoplasmic reticulum）膜への挿入に必要でありうるが成熟ワックスシンターゼ酵素中に見出されない前駆体ワックスシンターゼタンパク質のリーダーまたはシグナルペプチドをコードする配列を含めて、DNAもしくはRNAいずれかの核酸配列を意味する。
ホホバ配列またはタンパク質から「得られる（obtainable）」配列は、ホホバワックスシンターゼアミノ酸配列から合成されるか、または代りに様々な生物中で確認され、プローブとしてホホバワックスシンターゼ核酸配列もしくはホホバワックスシンターゼタンパク質に対する抗体を使って単離された、所望のワックスシンターゼタンパク質に関連する核酸配列を意図する。このやり方で、ワックスシンターゼタンパク質に関連する核酸配列を追加のソース（source）から単離するために、これらの他のワックスシンターゼの配列も同じ様に使うことができることがわかる。
核酸配列を単離するために、プラスミドまたはウイルスベクターおよび当業者に周知の方法を使って、cDNAまたはゲノムライブラリーを調製することができる。所望の配列をスクリーニングするために使うことができる有用な核酸ハイブリダイゼーションおよび免疫学的方法も当業者に周知であり、例えば、マニアティスら（Maniatisら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition（1989）Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New Yor）により記載されている。
典型的には、核酸プローブの使用により得られる配列は、標的配列と目的のワックスシンターゼ酵素をコードする所与の配列の間で60〜70%の配列同一性を示すであろう。しかし、50〜60%ほどの配列同一性をもつ長い配列も得ることができる。核酸プローブは核酸配列の長い断片であっても、またはより短い、オリゴヌクレオチドプローブであってもよい。より長い（ほぼ100bpより大きい）核酸断片をプローブとして使う場合、プローブとして使った配列から20〜50%外れた（すなわち、50〜80%の配列相同性を示す）配列を標的サンプルから得る目的で、より低いストリンジェンシーでスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、ワックスシンターゼ酵素をコードする全核酸配列よりかなり短くすることができるが、少なくとも約10、好ましくは少なくとも約15、そしてさらに好ましくは約20ヌクレオチドであるべきである。より長い領域と対照的により短い領域を使う場合は、より高度の配列同一性が望ましい。したがって、相同遺伝子を検出するオリゴヌクレオチドプローブを設計するにあたって、アミノ酸配列同一性が高い酵素活性部位を確認することが望ましい。
関係する遺伝子が所与の配列とのハイブリダイゼーションにより単離されるかを確認するために、典型的には放射能で配列を標識して検出できるようにするが、他の方法も利用することもできる。標識したプローブをハイブリダイゼーション溶液に加え、所望の核酸を含有するフィルター、すなわち（相同性について所望のソースをスクリーニングするための）ノーザンもしくはサザンブロットまたはスクリーニングすべきcDNAもしくはゲノムクローンを含有するフィルターとともにインキュベートする。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、プローブと目的の配列とのハイブリダイゼーションを最適化するように変えることができる。温度が低いほどかつ塩濃度が高いほど、より遠縁の配列（低ストリンジェンシー）のハイブリダイゼーションが可能となる。もし低ストリンジェンシー条件下でバックグラウンドハイブリダイゼーションが問題であれば、ハイブリダイゼーションもしくは洗浄工程の温度を上げてかつ／また塩含量を低下させて、特異的にハイブリダイズする配列の検出を改良することができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、ベルツら（Beltzら，Methods in Enzymology（1983）100:266-285）が述べるように、プローブの予測融点に基いて調節することができる。
有用なプローブならびに適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が上記のように確認されたら、cDNAまたはゲノムライブラリーを標識配列および最適条件を使ってスクリーニングする。最初にライブラリーを固相寒天培地上にプレートし、DNAを適切なメンブラン、通常はニトロセルロースもしくはナイロンフィルターにリフトする。その後、これらのフィルターを標識プローブでハイブリダイズし、上述のように洗浄して関係する配列を含有するクローンを確認する。
免疫学的スクリーニングについては、ホホバワックスシンターゼに対する抗体を、ウサギまたはマウスに精製タンパク質を注射することにより調製することができる。抗体を調製する方法は、当業者には周知であり、抗体作製を専門とする会社も利用できる。モノクローナルまたはポリクローナル抗体を作製することができるが、典型的にはポリクローナル抗体が遺伝子単離にはより有用である。
所望の植物種をスクリーニングするためには、ウェスタン分析を実施して、ホホバワックスシンターゼに対する抗体と交差反応する関連タンパク質が粗抽出物中に存在することを確認する。これは植物抽出物タンパク質を、通常、ニトロセルロースの膜上に固定し、続いて電気泳動、そして抗体とのインキュベーションによって達成される。ニトロセルロースフィルター上の抗体／タンパク質複合体を検出するための多くの異なる検出系が利用可能であって、それには抗体の放射能標識および第2抗体／酵素コンジュゲート検出系が含まれる。利用できる検出系はオーベルフェルダ（Oberfelder,Focus（1989）BRL/Life Technologies,Inc.11:1-5）により記載されている。もし最初の実験が関連タンパク質の検出に失敗すれば、他の検出系およびブロッキング剤を利用することができる。交差反応性が観察されれば、所望の植物種を表す発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、関係するタンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。発現ライブラリーは、マニアティスら（Maniatisら，前掲）が記載したように、λgt11を含めて様々な市販のベクター中に構築することができる。
上に記載したようにDNAハイブリダイゼーションまたは免疫学的スクリーニング技術を使って確認したクローンは、その後、精製され、DNAを単離され、そして公知の技術を使って分析される。このやり方で、該クローンが関係したワックスシンターゼタンパク質をコードすることが実証される。ホホバワックスシンターゼを使ったのと同じやり方で、「新しい」ワックスシンターゼを使用して他のワックスシンターゼを得ることができる。
当業者であれば、本発明のワックスシンターゼ核酸配列は部位特異的変異もしくはPCRの標準技術を使って修飾することができ、または該配列の修飾は合成核酸配列を作製する際に達成できることを認めるであろう。これらの修飾配列も、本発明のワックスシンターゼ核酸配列であると考えられる。例えば、コドンのゆらぎ（wobble）位置は、核酸配列が同じアミノ酸配列をコードするように変えるか、あるいはまた、コドンが同類アミノ酸置換をもたらすように変えることができる。いずれの場合も、ペプチドまたはタンパク質は所望の酵素活性を維持し、したがって本発明の一部であると見なされる。
本発明のワックスシンターゼ酵素の核酸配列は、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、から誘導されたDNAまたはRNA配列であってよいし、または全体的にまたは部分的に合成されてもよい。例えば、該遺伝子配列をクローニングするには、適切なソースからゲノムDNAを単離し、そして、目的の配列をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使って増幅しかつクローニングする。あるいは、特に植物優先配列を提供することが望ましい場合、該遺伝子配列を完全にまたは部分的に合成することができる。したがって、所望の構造遺伝子（ワックスシンターゼタンパク質をコードする遺伝子の部分）の全てまたは部分を、選択した宿主により優先されるコドンを使って合成することができる。宿主優先コドンは、例えば、所望の宿主種において発現されるタンパク質に最も高頻度に使われるコドンから決定することができる。
ワックスシンターゼタンパク質と関連する核酸配列は多くの用途がわかっている。例えば、プローブとして使うことができるかまたは宿主細胞でのワックスシンターゼタンパク質の発現をもたらす組換え構築物を調製することができる。意図する用途に応じて、構築物は、ワックスシンターゼ全体、またはその部分をコードする配列を含むことができる。例えば、活性部位のようなワックスシンターゼの重要な領域を同定することができる。かくして、さらに所望のワックスシンターゼ活性に必要なアミノ酸をコードするワックスシンターゼ配列の一部分のみを含有する構築物を調製することができる。
本発明のワックスシンターゼ配列の発現に有用な系は、大腸菌（E.coli）のような原核細胞、酵母細胞、および植物細胞を含み、そして維管束（vascular）および非維管束両方の植物細胞が望ましい宿主である。このやり方で、ワックスシンターゼタンパク質の反応特性にあたえる特異的変異誘発の影響を分析するための、コード配列の部位特異的変異誘発のような研究をさらに可能にするために、ワックスシンターゼタンパク質を産生させることができる。
本発明のワックスシンターゼをコードするDNA配列は、色々な方法で、外来のDNA配列と組合せることができる。「外来の（foreign）」DNA配列とは、天然ではワックスシンターゼ配列と結合して見出されないDNA配列を意味し、天然ではワックスシンターゼ配列と結合して見出されない同じ生物由来のDNA配列を含む。ワックスシンターゼをコードする配列を利用するセンスおよびアンチセンス両方の構築物が考えられ、その際、センス配列は、宿主細胞におけるワックスシンターゼの発現に使われ、かつアンチセンス配列は、標的生物により天然に産生される相同的なワックスシンターゼタンパク質の内在性レベルを低下させるために使われうる。さらに、本発明のワックスシンターゼ遺伝子配列は、調節または膜標的配列のような通常ワックスシンターゼと関連する配列の全てまたは部分と一緒に、外来宿主内で用いることができる。
その構成部分において、ワックスシンターゼをコードするDNA配列は、5’から3’への転写方向に向かって、宿主細胞内での転写および翻訳を促進する能力のある転写開始制御領域、ワックスシンターゼをコードする核酸配列、および転写終結領域を有する組換え構築物中に結合されている。宿主に応じて調節領域は様々であり、ウイルス、プラスミドまたは染色体遺伝子、その他に由来する領域を含むことができる。原核または真核微生物、特に単細胞宿主における発現では、多種多様な構成的または調節可能プロモーターを用いることができる。微生物における発現は、植物酵素の手近なソースを提供することができる。文献記載されている転写開始領域の中には、大腸菌（E.coli）、枯草菌（B.subtilis）、Saccharomyces cerevisiaeのような細菌および酵母宿主由来の領域があり、βガラクトシダーゼ、T7ポリメラーゼ、トリプトファンE、その他のような遺伝子を含む。
多くの場合、組換え構築物は、機能的ワックスシンターゼタンパク質を産生するためのワックスシンターゼ遺伝子の発現をもたらす植物において機能的な調節領域を含む。植物ワックスシンターゼまたはその機能的断片をコードするオープンリーディングフレームは、その5’末端が天然にワックスシンターゼ構造遺伝子の5’側上流に見出される野生型配列のような転写開始調節領域に結合するであろう。構造遺伝子配列の多様な構成的または調節可能な発現をもたらす元来の植物遺伝子からの数多くの他のプロモーター領域を利用することができる。
元来の植物遺伝子由来の配列に加えて、他の配列が、ノパリンシンターゼ（nopaline synthase）（Nos）、マンノピンシンターゼ（mannopine synthase）（Mas）またはオクトピンシンターゼ（octopine synthase）（Ocs）遺伝子に関連した領域を含むアグロバクテリア菌（Agrobacterium）遺伝子に関連した調節領域のような植物における構成的遺伝子発現を提供することができる。カリフラワーモザイクウイルス（cauliflower mosaic virus）（CaMV）の第35Sおよび19S領域のようなウイルス遺伝子の発現を制御する領域も有用である。本明細書中に使われる構成的（constitutive）という用語は、必ずしも或る遺伝子が全細胞型で同じレベルで発現されることを示すものではなく、存在量の多少のバラツキが検出されるかもしれないが、遺伝子が広範囲の細胞型で発現されることを示す。他の有用な転写開始領域は、ナピン、種子もしくは葉ACP、RUBISCOの小サブユニットなどに由来する転写開始領域のように、選好的にある特定の組織またはある特定の増殖条件下で転写を行わせる。
植物宿主内でワックスシンターゼタンパク質の発現が望まれる実施様態では、完全植物ワックスシンターゼ遺伝子の全てまたは部分の使用が望ましく、すなわち構造遺伝子配列および3’側下流非コード領域と一緒に5’側上流非コード領域（プロモーター）を用いることができる。もし、目的の植物宿主元来のプロモーター、または修正した、すなわち1つの遺伝子ソースから誘導された転写開始領域および異なる遺伝子ソースから誘導された翻訳開始領域を有するプロモーター、またはダブル35S CaMVプロモーターのような増強されたプロモーター（enhanced poromoter）のような異なるプロモーターが所望であれば、標準的技術を使って該配列を一緒に結合することができる。さらに、高度に発現された植物遺伝子由来の5’側非翻訳領域は、本明細書に記載されたワックスシンターゼタンパク質の発現の増大をもたらすのに有用でありうる。
植物においてワックスシンターゼを発現するDNA構築物は、非常に多様な植物生物、特にはアブラナ（Brassica）のようなワックスシンターゼ酵素の脂肪アシル-CoA基質を産生する植物で用いることができる。他の目的の植物は、中鎖または長鎖脂肪アシル分子のような望ましい脂肪アシル基質を産生し、そのような脂肪アシル基質としては、限定しようとするものではないが、ナタネ（キャノーラ変種）、ヒマワリ、サフラワー、綿、Cuphea、ダイズ、ピーナッツ、ココナッツおよびオイルパーム、ならびにトウモロコシが挙げられる。特に興味のあるのは、アブラナ（Brassica）（HEAR）の高エルカ酸（erucic acid）変種におけるかかる構築物の長鎖液体ワックス産生への使用である。HEAR植物についてさらに想定される用途は、エルカ酸に対し通常種子TAG中に貯蔵される追加のワックス「シンク（sink）」をあたえることにより実質的に増大したレベルのエルカ酸を含有する変種の作製を含む。
ワックスシンターゼ酵素の脂肪アルコール基質については、ホホバ以外に、少量はワックスシンターゼ酵素に利用可能であるかもしれないが大量の脂肪アルコールを産生する種子植物は知られていない。それゆえに、本発明のワックスシンターゼ構築物と一緒に、宿主細胞中に存在する脂肪アシル分子から脂肪アルコールを産生する能力をもつ標的宿主細胞を提供することが望ましい。例えば、植物脂肪アシルレダクターゼおよび該レダクターゼ酵素を植物細胞内で発現させる方法は、米国特許第5,370,996号に記載されている。ホホバレダクターゼの核酸配列および翻訳されたアミノ酸配列は、該特許の図1に示されている。したがって、ワックスシンターゼタンパク質およびレダクターゼタンパク質の両方を宿主植物細胞にあたえることにより、脂肪アルコールおよび脂肪アシル基質からワックスエステルを得ることができる。さらに、ワックスシンターゼおよびレダクターゼタンパク質の発現と一緒にβ-ケトアシル-CoAシンターゼの発現が本発明で考えられている。このやり方で、これらの酵素の非常に長鎖の脂肪酸基質の産生を標的植物種中で増大させることができる。
ホホバレダクターゼに加えて、他の生物由来のレダクターゼ酵素が、本発明のワックスシンターゼと共に有用である。レダクターゼ酵素の他の可能性のあるソースは、ミドリムシ（Euglena）、アシネトバクター（Acinetobacter）、ミクロコッカス（Micrococcus）、ある特定の昆虫および海洋生物、ならびにウシマイボーム腺（meibomian glands）、トリ尾脂腺（uropygial glands）のような、ワックスエステルを含むことが知られている特殊化した哺乳類またはトリ組織を含む。レダクターゼタンパク質の他の可能性のあるソースは、脂肪アルコールを産生する能力、または、ワックスシンターゼも存在する場合にはワックスエステルを産生する能力により同定できる。
ワックスシンターゼおよびレダクターゼの配列は同じ形質転換事象の間に提供されるか、あるいはまた、2つの異なるトランスジェニック植物系、つまりワックスシンターゼ構築物を有するものとレダクターゼ構築物を有するもの、を各種の構築物による形質転換によって作製することができる。次いで、これらの植物系を、公知の植物育種技術により交雑して、ワックスエステル産物を産生するための、ワックスシンターゼおよびレダクターゼを含有する植物を提供することができる。
さらに、非常に長鎖の脂肪酸の形成に関与する酵素をコードする他の核酸配列も植物宿主内でのワックスエステルの産生のための本発明のDNA構築物に用途を見出しうる。このような核酸配列は当業界では公知であり、米国特許第5,679,881号に記載されている。例えば、下記の実施例に記載されるとおり、本発明のワックスシンターゼは、脂肪酸エロンガーゼ（その全文が本明細書に参照により組み入れられる米国特許第5,679,881号に記載）およびアシル-CoAレダクターゼ（その全文が本明細書に参照により組み入れられる米国特許第5,403,918号に記載）をコードする核酸配列と共に、植物発現構築物内で使われる。このような植物発現構築物は、トランスジェニック・シロイヌナズナ種Arabidopsis thaliana植物においてワックスエステルを産生させる。
ワックスエステルの産生につながる用途の場合、種子成熟期間に調節された遺伝子から得た5’上流非コード領域、特に、ACP、オレオシン（LeeおよびHuang（1991）Plant Physiol.96:1395-1397）およびナピン調節領域から誘導される領域のような植物胚組織で優先的に発現されるものが望ましい。種子組織において優先的に発現する、すなわち植物の他の部分では検出されない転写開始領域は、植物の他の部分における遺伝子産物の破壊的または悪影響を最低限に抑えるために、ワックスエステル産生にとって望ましいと考えられる。さらに、このような植物の種子は収穫し、これらの種子の脂質貯蔵物は回収されて、ワックスエステルの容易なソースを提供することができる。このようにして、本明細書に記載のワックスシンターゼ構築物による形質転換が起こらない、種子脂質貯蔵の一成分としてワックスエステルを産生しないことがわかっている油種子（oilseed）植物において、新規の種子産物を産生させることができる。
このような「種子特異的プロモーター」は、米国特許第5,420,034号および米国特許第5,430,194号の教示にしたがって取得して使うことができる。さらに、ホホバレダクターゼおよびワックスシンターゼのような植物遺伝子を発現させる場合、シロイヌナズナ（Arabidopsis）またはアブラナ（Brassica）のような形質転換植物種におけるホホバ遺伝子発現のために、5’および3’調節領域ならびにコード配列中に存在するイントロンを含む植物遺伝子の全体を使うことが望ましいであろう。
本発明の組換え構築物に、調節転写終結領域を提供することもできる。転写終結領域は、植物ワックスシンターゼをコードするDNA配列または各種の遺伝子ソースから誘導される好都合な転写終結領域、特に天然に転写開始領域に関連した転写終結領域により提供することができる。転写終結領域は構造遺伝子の3’側に少なくとも約0.5kb、好ましくは約1〜3kbの配列を含有するであろう、そしてそこから該終結領域が誘導される。
追加の植物遺伝子領域を用いて、植物組織におけるワックスシンターゼおよびレダクターゼ遺伝子の発現を最適化することができる。例えば、DNAコード配列の5’側に挿入されたRuBP-カルボキシラーゼの小サブユニット（SSU）領域のように、高度に発現された遺伝子の5’非翻訳領域は翻訳効率を増加させ得る。SSUリーダタンパク質をコードする部分（例えば、最初の6つのアミノ酸をコードする部分）も、このような構築物で使うことができる。さらに、植物プラスチド小器官へのターゲッティングが望ましい用途では、SSUまたは他の核コードされた（nuclear-coded）葉緑体タンパク質由来の輸送ペプチド（transit peptide）コード配列を、ワックスシンターゼおよびレダクターゼ配列と共に使用してもよい。
DNA発現構築物を宿主細胞に導入する方法によっては、他のDNA配列が必要になることがある。重要なことは、本発明が、双子葉および単子葉種にも同様に適用可能であり、新しいおよび／または改良された形質転換および再生技術に容易に応用し得ることである。
組換え構築物の開発において、該構築物またはその断片の様々な構成成分は、通常、細菌宿主例えば大腸菌（E.coli）内で複製能を有する好都合なクローニングベクターに挿入される。多数のベクターが存在し、それらは文献に記載されている。それぞれのクローニングの後、該プラスミドを単離し、制限酵素切断、新しい断片の挿入、連結、欠失、挿入、切除などのさらなる操作を行って、所望の配列の構成成分に仕立てることができる。構築物が完成したら、次いで、該構築物は、宿主細胞の形質転換のやり方にしたがって、さらなる操作のために適切なベクターに移入される。
通常、組換え構築物に含まれるのは、宿主での発現に必要な調節領域を有し、形質転換細胞に選択性を付与する構造遺伝子である。この遺伝子は、細胞障害剤（例えば抗生物質、重金属、毒素など）への耐性、栄養要求性宿主へ原栄養を与える補完、ウイルス免疫性などを付与することができる。同様に、GUSのような色変化またはルシフェラーゼのような発光により確認できる化合物を生産させるために提供される酵素をコードする遺伝子も有用である。発現構築物またはその成分を導入する異なる宿主種の数に応じて、1つ以上のマーカーを用いることができ、この場合、異なる宿主に対して異なる選択条件を使いる。
ワックスシンターゼ配列の転写を提供するための配列に加えて、本発明のDNA構築物は、そのタンパク質産物がワックスシンターゼと一緒に作用して有用な最終産物を産生する追加の1つ以上の遺伝子の発現ももたらし得る。例えば、上記で述べたように、形質転換した宿主でワックスエステルが産生されるように、ワックスシンターゼおよび脂肪アシルレダクターゼの発現を提供するDNA構築物が、本発明では考慮される。さらに、様々な炭素鎖長と飽和度を有する異なるワックスエステルの産生が望まれており、様々な鎖長の脂肪アルコールまたは脂肪アシル基質を有する宿主植物を形質転換することにより提供することができる。このような植物は、例えば、様々なチオエステラーゼ遺伝子およびかかる遺伝子を使って形質転換した植物宿主内で様々な鎖長を有する脂肪アシル基質を産生する方法を記載した、公表国際特許出願番号PCT WO 91/16421に記載の方法により提供される。
さらに、油種子植物宿主内でのワックスエステルの産生を最適化するために、通常はこのような植物の種子内で産生されるトリアシルグリセライド油の産生を低下させたいときがある。これを達成する1つの方法は、このプロセスに重要であるがワックスエステルの産生に必要でない遺伝子をアンチセンス化することである。このような遺伝子標的は、ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼおよびトリアシルグリセロールの合成を触媒する他の酵素を含む。さらに、ワックスエステルを栄養ソースとして分解するために使い得る酵素をもつ油種子植物の提供が望まれる場合があり、このような酵素はホホバまたは様々な他のワックス産生生物から単離することができる。このやり方で、種子植物宿主中のワックスエステルの最大の産生を達成することができる。
本明細書に記載の方法で産生されるワックスエステルは、ホホバからのワックスエステル抽出の技術を使いて、または様々な油種子作物から油産物を得るために使われる様々な生産方法により、回収することができる。こうして得られたワックスは、医薬品、化粧品、洗剤、プラスチック、および潤滑剤を含む多くの産業で用途を見出すであろう。用途は、ワックスエステル成分の鎖長および飽和度に応じて様々である。例えば、それぞれの炭素鎖に1つの二重結合を有する長鎖ワックスは室温で液体であるが、飽和炭素鎖成分を有するワックスは、特にもし飽和炭素鎖が長い炭素鎖であれば室温で固体である。
形質転換の方法は本発明にとって重要でなく、植物形質転換の様々な方法を、現在利用することができる。作物を形質転換するためにさらに新しい方法が利用できれば、以下において直接適用できる。例えば、天然ではアグロバクテリア菌（Agrobacterium）感染に感受性のある多くの植物種は、アグロバクテリア菌（Agrobacterium）を介する形質転換の3部構成または2成分ベクター法により、成功裏に形質転換させることができる。宿主植物細胞への核酸配列の移入をもたらすのに有用な他の配列は、植物病原性ウイルスまたは植物転移性エレメントから誘導することができる。さらに、マイクロインジェクション、DNA粒子照射、エレクトロポレーションの技術が開発されており、これらにより様々な単子葉および双子葉植物種の形質転換が可能になる。
さて、本発明は全般的に説明したが、以下の実施例を参照すればさらに容易に理解されるであろう、しかし、これらの実施例は単に説明のためだけに含まれるものであり、特に記載の無い限り、本発明を制限しようとするものではない。
実施例
実施例１-ワックスシンターゼアッセイ
ミクロソーム膜調製物または可溶化タンパク質調製物のワックスシンターゼ活性についてのアッセイの方法を説明する。
A.放射能標識材料
ワックスシンターゼアッセイに一般的に使われる基質の［1-14C］パルミトイル-CoAは、Amersham（Arlington Heights,IL）から購入する。他の鎖長の基質は、鎖長特性の研究を実施するために合成する。長鎖［1-14C］脂肪酸（比活性（specificactivity）51〜56Ci/mole）、すなわち11-cis-エイコセン酸、13-cis-ドコセン酸および15-cis-テトラコセン酸は、［14C］シアン化カリウムと対応するアルコールメシレートとの反応、続いてアルコールニトリルの遊離脂肪酸への塩基加水分解により調製する。遊離脂肪酸を、エーテル-ジアゾメタンでそのメチルエステル型に転化し、調製用硝酸銀薄層クロマトグラフィー（TLC）により精製する。脂肪酸メチルエステルを加水分解して遊離脂肪酸に戻す。放射能化学純度を3つのTLC法：順相シリカTLC、硝酸銀TLCおよびC18逆相TLCで評価する。これらの方法により測定した放射能化学純度は92〜98%であった。長鎖［1-14C］アシル-CoAを対応する［1-14C］遊離脂肪酸からYoungおよびLynenの方法（J.Bio.Chem.（1969）244:377）で調製して、10Ci/moleの比活性を得る。［1-14C］ヘキサデカナールは、PletcherおよびTateの方法（Tet.Lett.（1978）1601-1602）をミクロスケールに修正して、［1-14C］ヘキサデカン-1-オールの二クロム酸塩酸化により調製する。該生成物を調製用シリカTLCにより精製し、使用までヘキサン溶液として-70℃で貯蔵する。
B.ミクロソーム膜中のワックスシンターゼ活性のアッセイ
調製
ミクロソーム膜調製物のワックスシンターゼ活性は、40μM［1-14C］アシル-CoA（通常はパルミトイル-CoA、比活性5.1〜5.6mCi/mmol）および200mMオレイルアルコールを、アッセイするサンプルと共に全容積0.25mlでインキュベーションにより測定する。インキュベーション混合物はさらに、25mM HEPES（4-［2-ヒドキシエチル］-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、pH7.5、バッファー剤として20％w/vグリセロール、1mM DTT、0.5M NaClまたは25mMトリシン-NaOH、pH7.8、バッファー剤として0.28M NaCl、10％グリセロール、および2mM β-メルカプトエタノールを含有する。最初の研究は、pHをアシル-CoAレダクターゼ酵素の優先性に適合するよう選択して、第1のバッファー系を用いて実施した。膜調製物は、後に、ワックスシンターゼのより高いpH最適値に適合するよう、第2バッファー系に変えた。
基質混合物は、ガラス製バイアル中で、使用直前にオレイルアルコールを加えて調製し、サンプルに加える。インキュベーションは30℃で1時間まで実施した。アッセイはアッセイチューブを氷上に置き、直ちに0.25mlイソプロパノール：酢酸（4:1 v/v）を加えて終結させる。無標識ワックスエステル（0.1mg）およびオレイルアルコール（0.1mg）を担体として加える。［1-14C］脂質をHaraおよびRadinの方法（Anal.Biochem.（1978）90:420）のスケールダウンプロトコルにより抽出する。2mlのヘキサン／イソプロパノール（3.2,v/v）を終結したアッセイ物に加える。サンプルをボルテックス攪拌し、1mlの硫酸ナトリウム水溶液（6.6%（w/v））を加え、そしてサンプルを再びボルテックス攪拌する。
C.可溶化ワックスシンターゼ活性のアッセイ
可溶化ワックスシンターゼを50μlまでのサンプルを使い、40μM 1-14C-16:0 CoA（5Ci/mol）、200μM 18:1-OH、0.07%ダイズリン脂質（Sigma,P-3644）、0.2%CHAPS、280mM NaCl、25mMトリシン-NaOH、pH7.8、2mM β-MEおよび5.6%グリセロールを含有する250μlアッセイ物中でアッセイする。リン脂質（0.5%CHAPS中の50mg/ml）を直接、サンプル（1%CHAPS中）に加え、その後、残りのアッセイ成分を含有する反応溶液（cocktail）により希釈する。ワックスシンターゼのリン脂質小胞への取込みに基く活性の再構築が推定される。ワックスシンターゼは、界面活性剤に感受性であり、アッセイの最大感度を得るにはリン脂質（PL）と界面活性剤（CHAPS）の量を2.8/1（CHAPS/PL,w/w）にバランスさせる必要がある。限外濾過により濃縮したサンプルのワックスシンターゼ活性についてのアッセイは、CHAPSの濃度のためにアッセイするサンプル容積の再調整が必要である。過剰のCHAPSをアッセイ物に導入すると、活性の阻害が起こる。もしサンプルを限外濾過により濃縮すれば、小量のサンプルを使ってアッセイのCHAPSの濃度曲線を作成し、リン脂質とNaClの固定した濃度でアッセイすることにより、アッセイするサンプルの最適容量を再確立することができる。ワックスシンターゼは、PL濃度の変化に対しては、CHAPS濃度の変化に対するよりも感受性が低い。
D.アッセイ産物の分析
ミクロソーム膜調製物ワックスシンターゼアッセイまたは可溶化ワックスシンターゼアッセイの産物を分析するために、2つのプロトコルを開発した。以下に「広範アッセイ（extensive assay）」と記載した1つのプロトコルは、より時間がかかるが、より高度に定量的な結果を生じる。以下に「迅速アッセイ（quick assay）」と記載した他方のプロトコルもワックスシンターゼ活性の測定結果を与えるが、迅速かつより便利で、定量性は低い。
1.広範アッセーブ：硫酸ナトリウムを加え、サンプルをボルテックス攪拌した後、上層有機相を取除いて下層水相を4mlヘキサン／イソプロパノール（7:2 v/v）で洗浄する。有機相をプールし、窒素下で蒸発乾固する。脂質残渣を小容積のヘキサン中に再懸濁し、アリコートを放射能活性に対して液体シンチレーションカウンティングによりアッセイする。サンプルの残りは、標識したクラスのTLC分析に使うことができ、それにより産生した全ワックスの測定結果を与える。
脂質クラス分析については、該サンプルをシリカTLCプレートにアプライし、プレートをヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（80:20:1または70:30:2v/v/v）で展開する。脂質クラス、すなわちほとんどワックスエステル、遊離脂肪酸、脂肪アルコール、および起点の極性脂質、の間の放射能分布を、AMBIS放射能分析画像システム（AMBIS Systems Inc.,San Diego,CA）を使い測定する。もし必要であれば、個別の脂質クラスをTLCプレートから回収してさらに分析することができる。メタノール中に展開したC18プレートを使う逆相TLCシステムも分析に使うことができる。
2.迅速分析：硫酸ナトリウムを加え、サンプルをボルテックス攪拌した後、既知の割合の有機相を取出して、液体シンチレーションカウンティングによりカウントする。この計算を使って有機相中の全カウントを概算する。その後、有機相の他の部分を取出して窒素下で乾燥し、ヘキサンに再溶解してTLCプレート上にスポットし、展開し、そして詳細なアッセイで記載したとおり走査する。このやり方で、ワックスに結合した全カウントの百分率が測定される。
実施例２-ワックスシンターゼ活性を特性決定するさらなる研究
A.種子発生およびワックスシンターゼ活性プロフィール
胚発育は、2回の夏にわたりDavis、CAで５植物について追跡した。胚の新鮮乾燥重量は、約80日から約130日まで、かなり安定した速度で増加するのが観察された。脂質抽出は、胚の新鮮重量が約300mgに達する（約80日）と、脂質重量対乾燥重量は最高レベルの50%に達することを示す。
ワックスシンターゼ活性を、発育中の胚について、実施例１Bに記載したように測定した。ホホバ種皮は阻害因子のソースであることが確認されていたので、種皮を除去した後、胚を液体窒素中、-70℃で貯蔵のために凍結した。
無細胞ホモジネートまたは膜画分のいずれかで測定したワックスシンターゼ活性の発生プロフィールは、活性の大きな誘導を示し、それは開花（anthesis）後約110〜115日にピークに達する。したがって、酵素学研究のための胚は、ワックスシンターゼ活性は高く、脂質蓄積は最高レベルに達せず、そして種皮が容易に除去されるとき、すなわち開花後約90〜110日に収穫された。ワックスシンターゼ活性の増加の比率（rate）の最高速度は、開花後80〜90日に観察される。したがって、cDNAライブラリー構築のための胚は、ワックスシンターゼタンパク質のシンターゼの比率が恐らく最高であるとき、すなわち開花後約80〜90日に収穫された。対応して、ワックスシンターゼをコードするmRNAのレベルはこの段階で最高であると推定される。
B.ミクロソーム膜調製
ホホバ胚は、開花（flowering）後約90〜110日に収穫され、測定により胚の水含量を求める（45〜70%）。外殻と種皮を除去し、子葉を速やかに液体窒素で凍結して-70℃で将来の使用のために貯蔵する。最初のタンパク質調製のために、凍結した胚を、液体窒素温度で鋼乳鉢および乳棒でよく叩いて粉末にする。典型的な実験では、70gの胚を処理する。
該粉末を、胚70gあたり溶液280mlの比で、次の高塩類溶液に加える:3M NaCl,0.3Mスクロース、100mM HEPES、2mM DTT、およびプロテアーゼ阻害剤、1mM EDTA、0.7mg/mlロイペプチン、0.5mg/mlペプスタチンおよび17mg/ml PMSF。粉末胚をバッファー中に組織ホモジナイザー（Kinematica,Switzerland;model PT10/35）により約30秒間分散させ、その後、3層のミラクロス（Miracloth）（CalBioChem,LaJolla,CA）を通して濾過することにより、無細胞ホモジネート（CFH）を作製する。濾液を100,000 x gで1時間遠心分離する。
得られたサンプルは、ペレット、上清および浮遊脂肪パッドからなる。脂肪パッドを除去し上清画分を採取し、一夜（バッファー溶液を3回取替えて）、1M NaCl、100mM HEPES、2mM DTTおよび0.5M EDTAを含有する溶液に対して透析する。透析液を200,000 x gで1.5時間遠心分離してペレット、DP2を得る。ペレットを25mM HEPESおよび10%グリセロール中に、元のCFH容積の1/20に懸濁してミクロソーム膜調製物を得る。
活性を、実施例1に記載のようにアッセイする。ワックスシンターゼ活性の回収を無細胞ホモジネート中の元の活性の34%と評価する。この調製物のワックスシンターゼ活性は、-70℃で貯蔵すると安定である。
C.基質特異性
ホホバワックスシンターゼにより認識される基質の範囲を測定するために、炭素鎖長および不飽和度に変化のあるアシル-CoAおよびアルコール基質を、上に記載のように調製したミクロソーム膜画分に加えた。ワックスシンターゼ活性を、実施例１Bに記載のとおり、アシル特異性については80mMのアシル-CoA基質および100mMの放射能標識したオレイルアルコールを使って測定した。アルコール特異性は100mMのアルコール基質および40mMの放射能標識したエイコセノイル-CoAを使って測定した。これらの実験の結果を下の表1に掲げる。
0004126102.tif 000002
上の結果は、ホホバワックスシンターゼは広範囲の脂肪アシル-CoAおよび脂肪アルコール基質を利用することを示す。
さらに、様々なアシル-チオエステル基質に対するワックスシンターゼ活性を、アシル基質としてパルミトイル-CoA、パルミトイルACPおよびN-アセチル-S-パルミトイルシステアミンを使って同様に試験した。最大の活性は、アシル-CoA基質で観察された。アシル-ACPで有意な活性（アシルCoAの場合の〜10%）が観察されたが、N-アセチル-S-パルミトイルシステアミン基質では活性は検出できなかった。
D.活性の効果器（effector）
様々なスルフィドリル剤を、ワックスシンターゼ活性にあたえる影響についてスクリーニングした。有機水銀化合物は活性を強く阻害することが示された。ヨードアセトアミドおよびN-エチルマレアミドは遥かに効果が低かった。p-ヒドロキシメルクリ安息香酸による阻害が観察されたが、この阻害はその後のDDTの添加により逆転することができた。これらの結果は、p-ヒドロキシメルクリ安息香酸による阻害が本質的なスルフィドリル基のブロッキングに関わることを実証する。
実施例３-ホホバワックスシンターゼの精製
ワックスシンターゼ活性を有するホホバ膜調製物の単離、ワックスシンターゼ活性の可溶化、およびワックスシンターゼタンパク質のさらなる精製に使うことができる方法を記載する。
A.ミクロソーム膜調製
実施例2に記載した方法に次の修正を施して、可溶化膜からのワックスシンターゼの精製に有用な改良された膜画分を提供する。
典型的には、100gのホホバ胚を400mlの抽出バッファー（40mMトリシン-NaOH、pH7.8、200mM KCl、10mM EDTA、5mM β-メルカプトエタノール）に加え、ブレンダー内で粉砕し、ポリトロン（Polytron）組織破壊器でホモジナイズする。以後の全工程は4℃で実施する。ブレンドした材料をミラクロス（Miracloth）（CalBioChem）を通して濾過する。濾液を遠心分離（20,000 x g;20分）して浮遊ワックス層、濁った上清画分および暗緑色ペレットを得た。上清画分を捕集し、遠心分離（100,000 x g;2時間）して膜ペレットを得て、その後、これを50%（w/v）スクロースを含有する40mlのバッファーA（25mM トリシン-NaOH、pH7.8、200mM KCl、5mM EDTA、5mM β-メルカプトエタノール）中に再懸濁する。このホモジネートを4つのSW28遠心管（Beckman）中に分配し、それぞれを20%スクロースを含有する10mlバッファーAでオーバーレイし、その後、13mlバッファーAでオーバーレイする。遠心分離（28,000rpm;2時間）後、膜画分を20%/50%スクロース界面から捕集し、4容積のバッファーAで希釈し、遠心分離（200,000 x g;1時間）により捕集する。その後、膜を10ml貯蔵バッファー［25mMトリシン-NaOH、pH7.8、1M NaCl、10%（w/v）グリセロール、5mM β-メルカプトエタノール］中でホモジナイズする。このプロトコルで調製される膜のタンパク質濃度は、典型的には7〜9mg/mlである。タンパク質濃度は、ブラッドフォード（Bradford,1976）が記載したとおり、BSAをタンパク質標準に使って求めた。
B.ワックスシンターゼタンパク質の可溶化
膜懸濁物を、貯蔵バッファー（25mMトリシン-NaOH、pH7.8、1M NaCl、10%グリセロール、5mM β-メルカプトエタノール）で希釈して、mlあたり約0.83mgのタンパク質に調節した。固体の3-（［3-コラミドプロピル］ジメチル-アンモニオ）-1-プロパンスルホン酸（CHAPS）を加えて、最終濃度2%（w/v）および洗剤対タンパク質比を24:1とする。氷上で1時間インキュベーション後、サンプルを遠心分離（200,000 x g;1時間）して上清画分を捕集する。
C.ワックスシンターゼ活性の精製
200,000g上清画分を（0.57% CHAPS、25mMトリシン-NaOH、pH7.8、20%グリセロールで）希釈して、NaClおよびCHAPSの最終濃度をそれぞれ0.3Mおよび1%とする。該サンプルを、0.3M NaClを含有するバッファーB（25mMトリシン-NaOH、pH7.8、1%CHAPS、20%グリセロール）で平衡化しておいたブルーA-アガロース（Amicon,Inc.,Beverly,MA）カラムに送液する。平衡バッファーで洗浄後、ワックスシンターゼ活性を2M NaClを含有するバッファーBで溶出する。ブルーAカラムから溶出した活性画分をプール（ブループール）して、さらにクロマトグラフィーに使う。
ワックスシンターゼタンパク質のバンド同定およびさらなる精製には、2つの精製プロトコルを使った。プロトコル1（図1）では、ブループールをYM30膜（Amicon,Inc.,Beverly,MA）を備えた圧力セル中の限外濾過により5.4倍に濃縮した。濃縮物の2分の1を、2M NaClを含有するバッファーBに平衡化したセラミックヒドロキシアパタイト（CHT）カラム（Bio-Scale CHT-2;Bio-Rad,Hercules,CA）にアプライした。カラムを6カラム容積の平衡バッファーで洗浄し、結合したタンパク質を0.1Mリン酸二カリウムおよび2M NaClを含有するバッファーBで溶出した。CHTカラムの再平衡化後、ブループールの残りの2分の1を同じやり方でクロマトグラフィーにかけた。活性を検出するために、ワックスシンターゼを限外濾過により濃縮したサンプルに対するプロトコルによってアッセイした。CHT-ラン1で測定して、ワックスシンターゼ活性は通過流中および洗浄液中に見出された。2つのCHTランのタンパク質プロフィールは同一であったので、CHT-ラン2はアッセイしなかった。2つのCHTランからの活性画分をプールし、10倍濃縮し、1.0M NaClを含むバッファーBで平衡化したSephacryl S100 HRカラム（2.5 x 90cm）にアプライした。タンパク質および活性を測定し、活性が最大でかつタンパク質が最小であるランの保持部分から活性画分を選択した。S100プール（画分64〜70）を、1M NaClを含むバッファーBで平衡化した結晶ヒドロキシアパタイト（HA）カラム（Bio-Gel HT;Bio-Rad,Hercules,CA,1 x 19.3cm）にアプライした。再び、ワックスシンターゼ活性の大部分は、通過流中および洗浄液に存在した。結合したタンパク質を、0.1Mリン酸二カリウムおよび1M NaClを含むバッファーBで溶出した。最終のHAランからの画分をSDS-PAGEで試験した。SDS−PAGE上で33kDに移動する単一のタンパク質は、ワックスシンターゼ活性の存在と関係づけられた。
第2の調製物（プロトコル2、図2）では、ブループールを濃縮せずに、1M NaClを含むバッファーBで平衡化した結晶HAカラム（1 x 11.7cm）に直接アプライした。25mMトリシン-NaOH、pH7.8、1%CHAPS、20%グリセロール、1M NaClで平衡化したSuperdex 75 HR 10/30カラム（Bio-Rad,Hercules,CA;サイズ範囲:5000〜75,000ダルトン）上のサイズ排除クロマトグラフィーにより、さらに精製するための2つの画分を選択した。ワックスシンターゼ活性は、実施例1Cの可溶化サンプルに対して記載されたプロトコルによって測定した。1つの画分はHAカラムの通過流中に早期に溶出し（画分31）、他の画分は洗浄液中に溶出した（画分67）。SDS-PAGE分析に基く両画分のタンパク質プロフィールは異なった。両方のSuperdex 75ランを勾配SDS-PAGEにより試験し、活性をもつクロマトグラフィー分離された、約33kDのタンパク質であることを確認した。同じバッファーとカラム条件下でクロマトグラフィーにかけた分子量標準を使って較正曲線を作成した。ワックスシンターゼ活性のピークの溶出容積をこの標準曲線と比較すると、可溶化酵素の分子量として48kDaの値を得た。
プロトコル1からのワックスシンターゼの精製を表すチャート（表2）は、可溶化タンパク質画分からの酵素の150倍精製を示す。
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D.SDS-PAGE分析
カラム画分からのサンプルを、SDS-PAGEサンプルバッファー（1 xバッファー=2%SDS、250mM β-メルカプトエタノール、0.0025%ブロモフェノールブルー）に希釈し、電気泳動法で分析した。すなわち、ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動（10〜13%）を、デレプレール（Delepelaire,Proc.Nat.Acad.Sci.（1979）76:111-115）の修正のいくつかを施したレムリ（Laemmli,Nature（1970）227:680-685）の方法によって実施した。ドデシル硫酸ナトリウムを0.1%で上層貯蔵バッファーに使ったが下層貯蔵バッファー、堆積および溶解ゲルからは省いた。堆積ゲルは、5%の30%アクリルアミドストック（29.2%アクリルアミド、0.8%N,N’-ビス-メチレンアクリルアミド、w/v）、0.06%過硫酸アンモニウム（w/v）、および0.1%TEMED（v/v）を含有した。溶解ゲルは、スクロースの0〜10%直線勾配で安定化されたアクリルアミドストックの10〜13%直線勾配を含有した。電気泳動は、室温、150V、定電圧で、9〜10時間実施した。タンパク質をブラムら（Blumら，Electrophoresis（1987）8:93-99）の方法によって銀で、またはクーマシーブルー（0.1% Coomassie Blue R-250,50%メタノール、10%酢酸）で染色して可視化した。ワックスシンターゼと確認された33kDaタンパク質は、ヒドロキシアパタイトカラムを通す精製までは、活性画分の主要成分とは見えない。精製プロトコル1（実施例3C）の後、最終カラム上の活性に関係づけられるタンパク質は、33kDaの1つだけである。
実施例４  In-Gel消化のためのタンパク質の調製
A.濃縮によるSDS-PAGE用サンプルの調製
最終HAカラム（プロトコル1）の流通／洗浄物からの奇数画分をプールしてYM30膜を備えた圧力セル（Amicon,Inc.,Beverly,MA）中で限外濾過により3倍濃縮した。該サンプルをさらに2つのCentricon-30ユニット（Amicon,Inc.,Beverly,MA）を使って約50μlの容積に濃縮した。各サンプルを、6μl SDSカクテル（4μl 20%SDS、1μl 14.3M β-メトカプトエタノール、および1μl 0.1%ブロモフェノール  ブルー）で処理した。室温で15分間おいた後、サンプルを10〜13%アクリルアミド勾配ゲル（実施例3D）（16 x 16cm x 1mm厚み）にアプライし、タンパク質を電気泳動により150V、定電圧で、9.5時間分離した。ゲルを、50%メタノール、10%酢酸中の0.1%クーマシーブルーで15分間染色し、その後、50%メタノール、10%酢酸中で、2 x 20分間脱染した。33kDワックスシンターゼバンドをゲルから切取り、50%エタノール中で3 x 20分間脱染した。1つのレーンはタンパク質のストリーク（streak）を含有し、最後の消化に使わなかった。
B.沈降によるSDS-PAGE用サンプルの調製
最終HAカラム（プロトコル1）からの偶数番号画分アリコート（0.8ml）は、カラムプロフィール全体を3群にプールした。それらのプールを、3つの1.5mlバイアル中に等分した。0.2ml 40%TCAを加えてタンパク質を沈降させた。サンプルを、氷上に30分おいた後、遠心分離（12,000 x g、15分間、4℃）して沈降タンパク質のペレットを得た。上清液を除去しペレットを２回0.6ml氷冷アセトンで洗浄した。プールしたサンプルセットそれぞれの最後の3ペレットを、同じ50μlのSDSサンプルバッファーで、バッファーを1つのバイアルから次のバイアルに移すことにより再懸濁した。既に再懸濁が終った空のバイアルは、10μlのサンプルバッファーを使って洗浄し、プールしたサンプルのそれぞれを60μlの全再懸濁容積とした。該サンプルを12%アクリルアミドTris/Glycin mini-gel（Novex,San Diego,CA,1.5mm x 10ウエル）にアプライし、タンパク質を電気泳動により150V、定電圧で、ゲルの下部からの染料の溶出が過ぎて20分間、分離した。ゲルをクーマシーブルーで染色し、ゲルクリア（Gel-Clear;Novex,San Diego,CA）を使い脱染した。ワックスシンターゼを、ピークおよびカラムからのテーリング画分を表すゲル上の3つの非等価レーンから切取った。ゲル切片を1.5mlバイアル中に置き、1mlの50%メタノール、10%酢酸で2時間脱染した。脱染溶液を除去し、ゲル切片を液体窒素中で凍結し、ドライアイス上で一夜、W M Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory at Yale Universityに、インゲル消化（in-gel-digestion）のために送付した。限外濾過により濃縮したサンプルからの1つのゲル切片、および沈降により濃縮したサンプルからの3つのゲル切片を、インゲルトリプシン消化のためにプールした。
実施例5-アミノ酸配列の決定
タンパク質配列決定を、W.M.Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory at Yale Universityで実施した。方法は、定量およびアミノ酸組成確認のためのゲル切片の一部分（10〜15%）のアミノ酸分析、タンパク質分解酵素（トリプシンまたはリシルエンドペプチダーゼ）の1つによるタンパク質の消化、および逆相HPLCによる該産物の分画を含む。HPLCランから吸収ピークを選択し、レーザ脱離質量分光分析計にかけて、タンパク質の配列決定の前にペプチドの存在、量、および質量を測定する。ミクロ配列決定のために最長ペプチドを選択する。
トリプシン消化により得たホホバワックスシンターゼペプチドのアミノ酸配列を、1文字コードを使い以下の表3に掲げる。
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実施例６-追加のワックスシンターゼおよびレダクターゼの精製
A.他生物からワックスシンターゼの部分的に精製した調製物を得るための、ホホバワックスシンターゼ可溶化および精製法の適用を記載する。
アシネトバクター（Acinetobacter）
アシネトバクター種Acinetobacter calcoaceticus株BD413（ATCC #33305）の細胞をECLB（大腸菌ルリアブロス（E.coli luria broth））上で増殖し、対数増殖期に捕集し、0.1M NaCl、1mM DDTおよびプロテアーゼ阻害剤中にHEPES-NaOH、pH7.5、またはトリシン-NaOH、pH7.8を含有するバッファーで洗浄する。洗浄した細胞を新鮮なバッファーに再懸濁し、フレンチ圧力セル（French pressure cell）を（〜16,000p.s.i.で2パス）通過させて破裂させた。非破壊細胞を5000 x gで10分間遠心分離して除去し、膜を100,000 x gで1時間遠心分離して捕集する。膜ペレットを貯蔵バッファー（10%（w/v）グリセロール、100mM NaCl中の、25mM HEPES-NaOH、pH7.5、または25mMトリシン-NaOH、pH7.8）中でホモジナイズする。これらの膜中のワックスシンターゼ活性は、実施例1Bでホホバ酵素に対して記載したアッセイ条件を使い、［1-14C］パルミトイル-CoAおよび18:1アルコールを基質として検出する。
ワックスシンターゼ活性は、0.5M NaClの存在で、5：1の洗剤対タンパク質比で、膜の2%CHAPSとのインキュベーションにより可溶化する。該活性の可溶化は、200,000gで1時間の遠心分離後、上清画分中のワックスシンターゼ酵素活性を検出することにより、およびサイズ排除クロマトグラフィーにより（すなわち、活性はカラムから対称ピークの保持画分中に溶出する）、実証される。可溶化酵素の活性は、CHAPS濃度の〜0.3%（すなわちそのCMC未満）への単純希釈により検出される。可溶化活性を検出するために、酵素のリン脂質小胞への取込みは必要でない。
精製のために、可溶化アシネトバクター（Acinetobacter）ワックスシンターゼ活性を、ホホバワックスシンターゼについて記載したのと同じ様にクロマトグラフィー操作にかける。あるプロトコルでは、可溶性タンパク質調製物をブルーAアガロースカラムに、低塩分条件（0.75%%CHAPS、10%グリセロール、25mM HEPES-NaOH、pH7.5を含有するカラムバッファー中の100mM NaCl）下で送液し、カラムバッファー中の1.0M NaClを使ってカラムから溶出する。
元来の酵素のサイズを評価するには、Superose 12（Pharmacia;Piscataway,NJ）媒質上のサイズ排除クロマトグラフィーを使う。同一の条件下でクロマトグラフィー分離した分子量標準と比較して、可溶化ワックスシンターゼに対して〜40kDaの見かけ分子量を得た。
他のプロトコルでは、可溶化タンパク質を、0.1M NaClを含有する25mMトリシン-NaOH、pH7.8、1%CHAPS、20%グリセロールで平衡化したブルーAカラムに送液し、1.0M NaClを含有する同じバッファーで溶出する。その後、溶出した物質を、1.0M NaClを含有するカラムバッファーに平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに送液し、そしてホホバワックスシンターゼと異なって、アシネトバクター（Acinetobacter）ワックスシンターゼ活性はカラムと結合し、1〜100mMリン酸二カリウムの勾配で溶出させる。SDS-PAGEにより試験すると、いくつかの候補タンパク質をワックスシンターゼ活性と関係づけることができる。
ミドリムシ属（Euglena）
ミドリムシ（Euglena gracilis）、株Z（ATCC No.12716）を、暗所で従属栄養により〜26℃で穏かに振とうして増殖させる（Taniら，（1987）Agric.Biol.Chem.51:225-230）。細胞を回収し、25mMビス-トリス-プロパン、pH7.0、0.25M NaClおよび1mM EDTAを含有するバッファーで洗浄する。洗浄した細胞を、新鮮なバッファー中に再懸濁させ、フレンチ圧力セル（French pressure cell）（〜16,000psiで2パス）を通過させて破裂させる。非破壊細胞、細胞デブリスおよび核を20,000 x gで20分間遠心分離して除去し、ミクロソーム膜を200,000 x gで1時間遠心分離して回収する。膜ペレットを貯蔵バッファー（25mMビス-トリス-プロパン、pH7.0、0.25M NaCl、10%（w/v）グリセロールおよび1mM EDTA）中でホモジナイズする。これらの膜中のワックスシンターゼ活性を、ホホバ酵素に対して記載したアッセイ条件を使って検出する。放射標識した基質はホホバの実施例と同じ（すなわち、［1-14C］パルミトイル-CoA）であるが、アルコール受容体として18:1よりむしろ16:0を使い、pH7.0のビス-トリス-プロパンバッファーを用いる。
ミドリムシワックスシンターゼ活性は、0.5M NaClの存在下で2%CHAPSによる膜のインキュベーションにより可溶化する。該タンパク質の可溶化は、200,000 x gで1時間の遠心分離後の上清画分中の酵素活性の検出により実証される。可溶化酵素の活性は、CHAPS濃度を〜0.3%へ（すなわちそのCMCより低く）希釈すると検出される。可溶化ホホバワックスシンターゼの場合のように、酵素のリン脂質小胞への組み込みは必要でない。
部分精製するために、可溶化したミドリムシワックスシンターゼ活性を、ブルーA-アガロース媒質上でクロマトグラフィー分離にかける。カラムを、25mMビス-トリス-プロパン、pH7.0、20%（w/v）グリセロール、0.75％CHAPSおよび1mM EDTAを含有するカラムバッファー中の0.1M NaClで平衡化する。可溶化ワックスシンターゼ活性を含有するサンプルを、0.1M NaClに希釈して1 x 7cmカラム（5.5mlベッドボリューム）にのせる。カラムを平衡バッファーで洗浄し、カラムバッファー中で線状NaCl勾配（0.1M〜1.0M NaCl）にかける。ワックスシンターゼ活性は、塩勾配の後半に広いピークとして溶出する。
カラム画分のSDS-PAGE分析は、カラムから溶出される該活性のポリペプチドの複雑性がのせられた物質と比較して非常に減少することを表す。〜41kDの見かけ分子量をもつポリペプチドがカラム画分中のワックスシンターゼ活性と完全に一致することが観察された。ワックスシンターゼ活性が〜41kDペプチドと関連することを確かめるため、ホホバおよびアシネトバクター（Acinetobacter）に対して記載したようなさらなる精製技術を実施する。
ミドリムシのワックスシンターゼ活性をさらに分析するため、サイズ排除クロマトグラフィーを次のとおり実施した。ミクロソーム膜調製物を、液体の従属栄養培地上、暗所で増殖したミドリムシ細胞から得た（Taniら，前掲）。ワックスシンターゼ活性は、この膜をバッファー溶液（25mMビス-トリス、pH7,0、1mM EDTAおよび10%（w/v）グリセロール）中の2%（w/v）CHAPSおよび500mM NaClで1時間氷上で処理することにより可溶化した。希釈バッファーを添加してCHAPSを0.75%に、およびNaClを200mMに希釈した後、該サンプルを〜200,000 x gで1.5時間遠心分離した。上清画分を、200mM NaClも含有するカラムバッファー（25mMビス-トリス、pH7.0、1mM EDTA、10%グリセロール、0.75％CHAPS）で予め平衡化したブルーA染料カラムにのせた。カラムを、200mM NaClを含有するカラムバッファーで、溶出物のA280がのせる前の値に戻るまで洗浄した。カラムに結合していたワックスシンターゼ活性は、カラムバッファーのNaCl濃度を1.5Mまで増加することによって遊離した。1.5M NaCl（合わせて〜20mlの容積）により遊離されたワックスシンターゼ活性を含有するブルーAカラムからの画分をプールし、限外濾過（YM30膜を備えたAmicon圧力セル）を介してほぼ30倍濃縮した。ブルーAカラムからの濃縮物質を、Superose12媒質（Pharmacia）上のサイズ排除クロマトグラフィーを介する分離のためのサンプルとして使用した。
サンプルのほぼ200μlを、0.5M NaClを含有するカラムバッファーで予め平衡化したSuperose 12カラム（HR 10/30）にのせ、0.1ml/分の流速で展開した。ワックスシンターゼ活性は、カラムからなめらかなピークとして溶出した。ワックスシンターゼ活性の溶出容積を分子量標準タンパク質の溶出プロファイルと比較して、酵素の見かけ分子量は166kDと見積られた。ワックスシンターゼ活性を含有する画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を介して銀染色により分析した。様々な画分のポリペプチドプロファイルの予備分析は、100kD以上の分子量をもち、その染色強度が活性プロファイルに整合すると思われるいかなるタンパク質をも示さなかった。ワックスシンターゼポリペプチドは、銀染色ゲルで容易に検出できないサンプル混合物中の微量成分として存在するのかも知れない。あるいは、該酵素はSDS-PAGE中で解離されるサブユニットからなるのかも知れない。
B.図1に提供した配列によりコードされるようなホホバレダクターゼに加えて、他のソースからのレダクターゼタンパク質を本発明のワックスシンターゼタンパク質と一緒に使用することも望ましい。そのようなタンパク質は、アルコールおよびアシル基質からワックスエステルを産生することが知られている生物から同定し、得ることができる。
例えば、NADH依存性脂肪（fatty）アシル-CoAレダクターゼ活性を、ミドリムシ（Euglena gracilis）から単離されるミクロソーム膜から得ることができる。ミクロソーム膜を単離するために使いうる方法は、例えば公表されたPCT特許出願WO 92/14816（出願番号PCT/US92/03164、1992年2月21日出願）に記載されている。ホホバレダクターゼおよびワックスシンターゼに使った同じ方法を使い、レダクターゼ活性はこれらの膜から可溶化される。膜を、様々な量の洗浄剤、CHAPSとともに、25mMビストリス、pH6.9、250mM NaCl、10%グリセロールおよび1mM EDTAからなるバッファー溶液中で、1時間氷上でインキュベートする。次いで該サンプルを200,000 x gで1時間遠心分離し、上清とペレット画分をNADH依存性レダクターゼ活性について、放射標識したパルミトイル-CoAおよびNADHを基質として使いアッセイする。レダクターゼ活性に好都合なアッセイは、PCT特許出願WO 92/14816に記載されている。0.3、0.5または0.7%（w/v）CHAPSによる膜のインキュベーションによりレダクターゼ活性が上清画分に保持され、酵素の可溶化を示す。もしインキュベーションおよび遠心分離中にCHAPSを省くと、レダクターゼ活性は全てペレット画分に見出される。インキュベーション中に存在するCHAPSを希釈するために、アッセイの前に全サンプルをこの同じバッファー溶液に10倍希釈する。アッセイ中にCHAPSがCMC（ほぼ0.5%（w/v））を越えるレベルで存在すると、酵素活性の阻害をもたらす。バッファー溶液中のグリセロール濃度を20%に増加することにより、2%までのCHAPS中のレダクターゼ活性の安定性を改良することができる。レダクターゼ活性は、CHAPSをCMC未満に希釈すると回復する。
実施例７-ワックスシンターゼ核酸配列の単離
ワックスシンターゼペプチドをコードするDNA配列は、ワックスシンターゼペプチド配列から設計した合成オリゴヌクレオチドを使って、ホホバから得られる。該ワックスシンターゼ核酸配列は、オリゴヌクレオチドをプライマーとして使うポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるDNA増幅により、または代りに、プローブとして使うオリゴヌクレオチドもしくは先に単離した配列を放射能標識してcDNAまたはゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、得ることができる。
A.ホホバcDNAライブラリーの構築
JacksonおよびLarkins（Plant Physiol.（1976）57:5-10）により最初に記載され、Goldbergら（Developmental Biol.（1981）83:201-217）により修正されたポリリボソーム単離法を使って、開花後80〜90日に集めたホホバ胚からRNAを単離する。この方法では、全工程は、特に記載のない限り、4℃で実施される。組織の10mgを、液体窒素中、ワーリング・ブレンダー（Waring blender）中で組織が微粉になるまで摩砕する。液体窒素が蒸発した後、抽出バッファー（200mMトリスpH9.0、160mM KCl、25mM EGTA、70mM MgCl2、1%Triton X-100、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1mMスペルミジン、10mM β-メルカプトエタノール、および500mMスクロース）の170mlを加え、組織をほぼ2分間ホモジナイズする。ホモジネートを滅菌ミラクロス（miracloth）を通して濾過し、12,000 x gで20分間遠心分離する。上清を500ml無菌フラスコにデカントし、1/19容積の20洗浄剤溶液（20%Brij 35、20%Tween 40、20%Noidet p-40 w/v）を室温で加える。この溶液を4℃で30分間穏かな速度で攪拌し、その後、上清を12.000 x gで30分間遠心分離する。
ほぼ30mlの上清を無菌Ti 60遠心チューブにアリコートし、40mMトリスpH9.0、5mM EGTA、200mM KCl、30mM MgCl2、1.8Mスクロース、5mM β-メルカプトエタノールを含有する7mlの溶液を上にのせる（underlaid）。チューブを頂部まで抽出バッファーで満たし、60,000rpm、4時間、4℃で、Ti60ローターに入れて回転する。遠心分離後、上清を吸い取り、0.5mlの再懸濁バッファー（40mMトリスpH9.0、5mM EGTA、200mM KCl、30mM MgCl2、5mM β-メルカプトエタノール）を各チューブに加える。チューブを氷上、10分間放置し、その後、ペレットを十分に再懸濁してプールする。その後、上清を120 x gで10分間遠心分離して不溶物質を除く。20mMトリスpH7.6、200mM EDTA、2%N-ラウリル-サルコシネート中の自己消化1mg/mlプロテイナーゼKの１容積を上清に加えて、混合物を室温で30分間インキュベートする。
1/10容積の酢酸ナトリウムと2容積のエタノールを加えて、RNAを沈降させる。-20℃で数時間おいた後、RNAを12,000 x g、4℃で30分間遠心分離してペレット化する。該ペレットを10mlのTEバッファー（10mMトリス、1mM EDTA）中に再懸濁し、等容積のトリスpH7.5飽和フェノールで抽出する。この相を10,000 x g、20分間、4℃で遠心分離して分離させる。水相を除去し、有機相を１容積のTEバッファーで再抽出する。その後、水相をプールし、１容積のクロロホルムで抽出する。この相を再び遠心分離して分離し、水相エタノールを先に記載の通り沈降させて、ポリリボソームRNAを得る。
このRNAを高塩分バッファー（0.5M NaCl、20mMトリスpH7.5、1mM EDTA、0.1%SDS）中でセルロースカラム（Sigma-cell 50）を通過させ、ポリリボソームRNA調製物中の多糖類夾雑物（contaminants）を除去する。夾雑物はカラムに結合し、RNAが溶出物中に回収される。溶出画分をプールし、RNAをエタノール沈降させる。その後、沈降した全RNAをより少ない容積中に再懸濁し、オリゴd（T）セルロースカラムにアプライしてポリアデニル化RNAを単離する。
ポリアデニル化RNAを使って、市販クローニングベクターBluescribe M13-（Stratagene Cloning Systems;San Diego,CA）から誘導され、以下のように作られたプラスミドクローニングベクターpCGN1703中に、cDNAライブラリーを構築する。Bluescribe M13-のポリリンカーを、BamHI消化、緑豆（mungbean）エンドヌクレアーゼ処理、及び平滑末端連結反応によって改変して、BamHI欠失プラスミド、pCGN1700を作製する。pCGN1700をEcoRIおよびSstI（隣接制限酵素切断部位）で消化し、BamHI、PstI、XbaI、ApaIおよびSmaIの制限酵素切断部位を有する合成リンカー、AATTの5’オーバーハング、ならびにTCGAの3’オーバーハングでアニーリングする。リンカーをpCGN1700に挿入すると、EcoRI部位は除去され、Bluescribe中に見出されるSstI（本明細書では時々「SacI」とも呼ぶ）部位が再作製され、そしてリンカーが有する新しい制限酵素切断部位が加えられる。得られるプラスミドpCGN1702をHindIIIで消化し、かつクレノウ（Klenow）酵素でブラント末端にし；線状DNAを部分的にPvuIIで消化し、希釈溶液中でT4 DNAワックスシンターゼと連結させる。lacプロモーター領域を欠失させた形質転換体を選択し（pCGN1703）、プラスミドクローニングベクターとして使う。
簡単に説明すると、cDNA合成のためのクローニング方法は次のとおりである。プラスミドクローニングベクターをSstIで消化し、得られた3’オーバーハング粘着末端上にホモポリマーT-テールを、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使って作製する。仕立てたプラスミドを非消化または無テールプラスミドからオリゴ（dA）-セルロースクロマトグラフィーにより分離する。得られたベクターは、ベクタープラスミドのいずれかの末端に共有結合するcDNA第1鎖の合成でプライマーの役割を果す。cDNA-mRNA-ベクター複合体を、末端トランスフェラーゼによりデオキシグアノシン三リン酸の存在下で処理して、cDNA鎖の末端にG-テールを作製させる。BamHI部位に隣接する余分のcDNA-mRNA複合体をBamHI消化により除去し、一方の末端にBamHI粘着末端を、かつ他方にG-テールを有するcDNA-mRNA-ベクター複合体を残させる。この複合体を、5’BamHI粘着末端、制限酵素NotI、EcoRIおよびSstIに対する認識配列ならびに3’C-テール末端を有するアニールした合成環状化リンカーを使って、環状化させる。連結反応と修復の後、環状複合体を大腸菌（E.coli）株DH5a（BRL,Gaithersburg,MD）中に形質転換させてcDNAライブラリーを作製する。ホホバ胚cDNAバンクは、ほぼ500塩基対の平均cDNA挿入サイズをもつほぼ1.5 x 106クローンを含有する。
さらに、ホホバポリアデニル化RNAも、クローニングベクターlZAPII/EcoRI（Stratagene,San Diego,CA）のcDNAライブラリーを構築するために使うことができる。該ライブラリーは、製造業者から供給されるプロトコル、DNAおよび細菌株を使って構築する。クローンは、Gigapack Goldパッケージング抽出物（Stratagene）を使い、製造業者の推奨に従ってパッケージする。このやり方で構築したcDNAライブラリーは、ほぼ400塩基対の平均cDNA挿入サイズをもつほぼ1 x 106クローンを含有する。
B.合成オリゴヌクレオチド
全般的に、PCRプライマーとして使用するため、mRNAから逆転写した1本鎖DNA鋳型から、ワックスシンターゼペプチドをコードする配列に対応するセンス方向の配列を含有するオリゴヌクレオチドを調製する。これらのオリゴヌクレオチドを「フォワード」増幅反応のプライマーとして使ってセンス鎖DNAを作る。
非コードDNA鎖の増幅のための「リバース」反応については、オリゴヌクレオチドを、PCR用のDNA鋳型を調製するために使ったプライマーの一部分と同一であるように設計することができる。あるいは、ワックスシンターゼペプチドをコードする配列に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドを、上に記載した「フォワード」ワックスシンターゼオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて使うことができる。
ワックスシンターゼペプチド配列が、複数の異なるコドンによりコードされ得るアミノ酸を含有すれば、該フォワードまたはリバースプライマーは「縮重」オリゴヌクレオチド、すなわち特定のペプチド領域に対する可能なコード配列の全てまたはいくつかの混合物を含有するオリゴヌクレオチドでありうる。このような混合物中に存在する異なるオリゴヌクレオチドの数を低減するために、PCRプライマー用に合成オリゴヌクレオチドを調製するとき、最小の可能なコード配列数を有するペプチド領域を選択することが望ましい。同様に、合成オリゴヌクレオチドを使ってワックスシンターゼ配列についてライブラリーを直接スクリーニングする場合、より低い縮重度のオリゴヌクレオチドが好ましい。
以下は、ペプチドWSPEP33の配列（中心行）ならびにペプチドWSPEP33をコードするフォワード（上の行）およびリバース（下の行）DNA配列の一例である。
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以下は、ペプチドWSPEP29の配列（中心行）ならびにペプチドWSPEP29をコードするフォワード（上の行）およびリバース（下の行）DNA配列の一例である。
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以下は、ペプチドWSPEP14の配列（中心行）ならびにペプチドWSPEP14をコードするフォワード（上の行）およびリバース（下の行）DNA配列の一例である。
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以下は、ワックスシンターゼ配列を得るために使うことができる合成オリゴヌクレオチドの配列である。オリゴヌクレオチド名は、実施例５に掲げた特定のワックスシンターゼペプチド断片番号を反映する。オリゴヌクレオチド名中の文字「F」は、PCRフォワード反応プライマーを表す。文字「R」はPCRリバース反応プライマーを表す。
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上のオリゴヌクレオチドをコードするヌクレオチド塩基コードは、次の通りである。
A＝アデニン      T＝チミン      Y＝シトシンまたはチミン
C＝シトシン      U＝ウラシル    R＝アデニンまたはグアニン
G＝グアニン      I＝イノシン    O＝イノシンまたはシトシン
H=アデニン、シトシンまたはチミン
N=アデニン、シトシン、グアニンまたはチミン
W＝アデニンまたはチミン
S＝グアニンまたはシトシン
B＝グアニン、シトシンまたはチミン
K＝グアニンまたはチミン
M＝アデニンまたはシトシン
C.PCR反応
ポリ（A）＋RNAを、上に記載したようにホホバ組織から調製した全RNAから単離する。cDNAを、Marathon cDNA増幅キット（Clontech Laboraties Inc.）を使い、製造業者の指示にしたがってポリ（A）＋または全RNAから逆転写により、調製する。ホホバcDNAは以下に示したPCR反応１〜16に使われる。
PCRを、Perkin Elmer Cetus GeneAmp PCR System 9600 PCR装置で、逆転写された1本鎖cDNAを鋳型として使い実施する。市販のPCR反応および最適化試薬を製造業者の仕様書に従って使用する。
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PCR増幅に使った温度プログラムは次の通りである：95℃2分間の１サイクル；95℃30秒間、60℃1分間および72℃4分間の4サイクル；95℃30秒間、57℃1分間、および72℃4分間の4サイクル;95℃30秒間、54℃1分間および72℃4分間の4サイクル；95℃30秒間、51℃1分間、および72℃4分間の4サイクル；ならびに95℃30秒間、48℃1分間、および72℃4分間の25サイクル。
反応3および4から、長さでほぼ700ヌクレオチドのPCR産物を検出した。該PCR産物をゲル電気泳動を使って精製し、pCR2.1にTopo TAクローニングキット（Invitrogen Corp.）を使ってクローニングした。クローニングしたPCR産物のDNA配列を決定し、708ヌクレオチド長であった（図3）。
全cDNAは、5’および3’RACE（Frohmanら，1988）を使い、Marathon cDNA増幅キット（Clontech Laboraties Inc.）を使って製造業者の指示に従い増幅することができる。プライマーWSPEP14-F1およびWSPEP33-R2を使って誘導される708ヌクレオチドPCR断片の配列から、次のプライマーを合成した。
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3’RACE反応は、プライマーWSRACEF1、WSRACEF2、およびWSRACEF3を使って設定した。5’RACE反応は、プライマーWSRACER1、WSRACER2、およびWSRACER3を使って設定した。PCR反応は、製造業者のプロトコル（Clontech Laboraties Inc.）にしたがって実施した。全6PCR反応により、ほぼ700ヌクレオチド〜1000ヌクレオチドの範囲のサイズの可視PCR産物を得た。PCR産物をゲルで精製し、製造業者のプロトコル（Invitrogen Corp.）にしたがってpCR2.1にクローニングした。5’および3’両方のRACE反応物からの複数クローンのDNA配列ならびにプライマーWSPEP14-F1およびWSPEP33-R2から誘導された前のPCR産物のDNA配列を、Sequencherソフトウエア（Gene Codes Corp.）を使って整理した（assembled）。全PCR産物を整理した配列はcDNA配列のコード領域を含有する。
植物脂質改変用の発現カセットにワックスシンターゼ遺伝子をクローニングするのに適切な遺伝子断片を単離するため、遺伝子のコード領域をプライマーWAXSYNFORおよびWASXYNREVを使ってcDNAから増幅することができる。WAXSYNFORの配列は、
GGATCCGTCGACACAATGGAGGTGGAGAAGGAGCTAAAGであり、そして
WASXYNREVの配列は、
GCATGCAGATCTCACCACCCCAACAAACCCATCである。PCR反応は、Marathon cDNA増幅キット（Clontech Laboraties Inc.）を使い製造業者の指示に従って遂行される。PCRプログラムは、94℃15秒間、60℃1分間、72℃2分間の30サイクルからなる。PCR産物は、製造業者のプロトコル（Invitrogen Corp.）にしたがってpCR2.1にクローニングした。得られたプラスミドをpCGN8538と名付けた。
実施例8  ワックスシンターゼcDNAを含有するトランスジェニック植物の作製
2つの植物2成分ベクターを構築した。プラスミドpCGN8559は、ワックス生合成に必要な次の3遺伝子を含有する：脂肪酸を18炭素以上の鎖長に伸長することに関わる縮合酵素（KCS）、脂肪アルコールの形成に関わるアシル-CoAレダクターゼ、およびワックスシンターゼ。対照プラスミドのpCGN8557は、KCSおよびアシル-CoAレダクターゼ遺伝子を含有する。ナピン調節配列の制御下にあるホホバアシル-CoAレダクターゼを含有するpCGN7698のAsp718断片を、2成分ベクターpCGN5139のAsp718部位にクローニングしてpCGN8555を作った。ナピン調節配列の制御下にあるルナリア（Lunaria）KCSを含有するpCGN7844のNotI断片を、pCGN8555のNotI部位にクローニングしてpCGN8557を作った。ホホバワックスシンターゼ遺伝子のコード領域を含有するpCGN8538からのSalI-BglII断片を、同じ2つの制限的エンドヌクレアーゼで消化したpCGN7770のナピン発現カセット中にクローニングして、pCGN8553を作った。ナピン調節配列の制御下にあるホホバワックスシンターゼ遺伝子のコード領域を含有するpCGN8553からのSse8387断片を、pCGN8557のSse8387部位にクローニングして、pCGN8559を作った。これら2成分ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）EHA105にエレクトロポレーションを介して導入した。Bentら（1994,Science 265:1856-1860）の真空侵潤（vacuuminfiltration）プロトコルにしたがい、該ベクターを使ってシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）生態型No-0を形質転換した。
実施例9  種子油の分析
様々な発育段階の、pCGN8559で形質転換した7つのシロイヌナズナ（arabidopsis）植物から、長角果を収穫した。各植物から回収した10個の長角果から発育中の種子を取出して、275μlのバッファー（100mM HEPES/NaOH pH7.5,250mM NaCl）中にホモジナイズした。ホモジネートの一部分（200μl）を16,000 x gで20分、４℃で遠心分離して上清およびペレットを得た。ペレットを200μlの同じバッファー中に再懸濁した。ホモジネートと2画分を、実施例1Bに詳細を記載したプロトコルによって、ワックスシンターゼ活性についてアッセイした。1アッセイあたり25μlのサンプルを使い、最終容積250μlとした。アッセイバッファーは、40μM 1-14C 16:0-CoA（比活性5μCi/μmol）、200μM 18:1アルコール、50mM HEPES/NaOH pH7.5、250mM NaClおよび2mM β-メルカプトエタノールを含有した。TLC分析は、分析した7植物の5つで、1-14C 16:0-CoAからの放射標識がワックス標準とともに移動するバンドに組み込まれていることを示した（図4）。この活性は、ホモジネートおよびペレット画分に検出されたが、上清画分には検出されなかった。これらのサンプルに検出されたワックスシンターゼ活性は、発育中のシロイヌナズナ種子に存在することが先に示された内在性ワックスシンターゼ活性より数オーダー高い値である。8612-3および8613-2に検出された活性は、この内在性「バックグラウンド」活性を示すものである。ワックス活性に対する陽性対照は、ホホバ（DP2）膜画分であった。
以上の結果は、部分的に精製したワックスシンターゼタンパク質から得た核酸配列が脂肪アルコールおよび脂肪アシル基質からのワックスエステルの形成に活性のあることを実証する。ワックスシンターゼタンパク質およびそれらのアミノ酸，配列を得る方法が提供される。かかる核酸配列を操作して、宿主細胞中にワックスシンターゼタンパク質の配列の転写および／または発現を行わせることができ、該タンパク質を様々な応用に使うことができる。このような応用は、ワックスシンターゼが脂肪アルコール基質のソースを有する宿主細胞中で使われるときはワックスエステル化合物の産生を含み、その脂肪アルコール基質は、宿主細胞に元来あるか、または脂肪アシル基質からのアルコール形成に活性のある脂肪アシルレダクターゼタンパク質をコードする組換え構築物を使って供給されてもよい。
本明細書に引用した全ての出版物および特許出願は、それぞれ個別の出版物または特許出願が特定的におよび個別に参照により組入れられるべきことが示されたかのように、本明細書に参照により組み入れられる。
以上の発明は明解および理解の目的で説明および実施例の方法で詳細に記載されているが、本発明の開示に照らして請求の範囲の思想または範囲から離れることなくある特定の変更または改変がなされうることは当業者には容易に明らかである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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