(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのビニルモノマー、前記モノマーおよび前記モノマーのポリマーと反応性で前記ポリマーを架橋させるのに充分である少なくとも一つのビニル基を含む架橋剤、および少なくとも一つの予備形成ポリマーを混合させた状態で、前記モノマーおよび前記架橋剤をフリーラジカル重合させて生じるフリーラジカル重合反応生成物を含んでなる、高分子量分子の電気泳動分離において用いるのに適したゲルであって、前記モノマーおよび前記架橋剤の合計濃度は少なくとも約４％（ｗ／ｖ）であり、前記予備形成ポリマーの濃度が約０．００５〜２％（ｗ／ｖ）であり；
約１００ｂｐ〜３，０００ｂｐの範囲の鎖長を有し電気泳動移動距離が測定可能であるＤＮＡ断片のうち、最も大きなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度に対する最も小さなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度の比が、前記予備形成ポリマーを含まないこと以外は前記ゲルと同じ濃度および組成のゲル中における同じ条件下での、前記最も大きなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度に対する前記最も小さなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度の比と比べて少なくとも５倍大きくなる、大きなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度を選択的に遅延させるゲル。
【請求項２】
一つのモノマーを含む請求項１に記載のゲル。
【請求項３】
モノマーがＮ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである請求項２に記載のゲル。
【請求項４】
モノマーがアクリルアミドである請求項２に記載のゲル。
【請求項５】
モノマーがＮ−アクリロイル−１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−ガラクチトールである請求項２に記載のゲル。
【請求項６】
２種以上のモノマーを含む請求項１に記載のゲル。
【請求項７】
モノマーがアクリルアミドおよびＮ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである請求項６に記載のゲル。
【請求項８】
一つの架橋剤を含む請求項１に記載のゲル。
【請求項９】
架橋剤がＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドである請求項８に記載のゲル。
【請求項１０】
架橋剤がジヒドロキシエチレン−ビス−アクリルアミドである請求項８に記載のゲル。
【請求項１１】
架橋剤がピペラジンジアクリルアミドである請求項８に記載のゲル。
【請求項１２】
２種以上の架橋剤を含む請求項１に記載のゲル。
【請求項１３】
架橋剤がＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドおよびジヒドロキシエチレン−ビス−アクリルアミドである請求項１２に記載のゲル。
【請求項１４】
一つのポリマーを含む請求項１に記載のゲル。
【請求項１５】
ポリマーが多糖類である請求項１４に記載のゲル。
【請求項１６】
ポリマーがヒドロキシエチルセルロースである請求項１５に記載のゲル。
【請求項１７】
ポリマーがヒドロキシプロピルメチルセルロースである請求項１５に記載のゲル。
【請求項１８】
ポリマーがメチルセルロースである請求項１５に記載のゲル。
【請求項１９】
ポリマーがアガロースである請求項１５に記載のゲル。
【請求項２０】
ポリマーがヒドロキシエチルアガロースである請求項１５に記載のゲル。
【請求項２１】
ポリマーがガラクトマンナンである請求項１５に記載のゲル。
【請求項２２】
ポリマーがデキストランである請求項１５に記載のゲル。
【請求項２３】
前記予備形成ポリマーが多分散性を有し、前記ポリマーがその多分散性を低下させるのに充分な条件下において分別されたものである請求項１５に記載のゲル。
【請求項２４】
分別法がゲル濾過である請求項２３に記載のゲル。
【請求項２５】
ポリマーがヒドロキシエチルセルロースである請求項２３に記載のゲル。
【請求項２６】
２種以上のポリマーを含む請求項１に記載のゲル。
【請求項２７】
ポリマーがヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシエチルアガロースである請求項２６に記載のゲル。
【請求項２８】
合成ポリマーを含む請求項１に記載のゲル。
【請求項２９】
ポリマーがポリアクリルアミドである請求項２８に記載のゲル。
【請求項３０】
ポリマーがポリ−Ｎ−アクリロイル−リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである請求項２８に記載のゲル。
【請求項３１】
予備形成ポリマーの濃度が約０．００５〜２％（ｗ／ｖ）およびビニルモノマーとビニル基を含む架橋剤との合計濃度が少なくとも４％（ｗ／ｖ）となるような量で少なくとも一つのビニルモノマー、少なくとも一つのビニル基を含む架橋剤および少なくとも一つの予備形成ポリマーを相互溶媒に溶解することからなる工程；および
ゲルを形成するのに充分な前記ビニル基を介して前記溶液中で前記モノマーおよび前記架橋剤をフリーラジカル重合および架橋する工程；
を含んでなる高分子量分子の電気泳動分別において用いるのに適したゲルを調製する方法であって、
前記重合は、約１００ｂｐ〜３，０００ｂｐの範囲の鎖長を有し電気泳動距離が測定可能であるＤＮＡ断片のうち、最も大きなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度に対する最も小さなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度の比が、前記予備形成ポリマーを含まないこと以外は前記ゲルと同じ濃度および組成のゲル中における同じ条件下での、前記最も大きなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度に対する前記最も小さなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度の比と比べて少なくとも５倍大きくなる、大ききなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度を選択的に遅延させるゲルを形成するのに充分な条件下に行う方法。
【請求項３２】
ゲルが一つのモノマーを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
モノマーがＮ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
モノマーがアクリルアミドである請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
モノマーがＮ−アクリロイル−１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−ガラクチトールである請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
ゲルが２種以上のモノマーを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
モノマーがアクリルアミドおよびＮ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ゲルが一つの架橋剤を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
架橋剤がＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
架橋剤がジヒドロキシエチレン−ビス−アクリルアミドである請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
架橋剤がピペラジンジアクリルアミドである請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ゲルが２種以上の架橋剤を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
架橋剤がＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドおよびジヒドロキシエチレン−ビス−アクリルアミドである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ゲルが一つのポリマーを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
ポリマーが多糖類である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ポリマーがヒドロキシエチルセルロースである請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ポリマーがヒドロキシプロピルメチルセルロースである請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
ポリマーがメチルセルロースである請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
ポリマーがアガロースである請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
ポリマーがヒドロキシエチルアガロースである請求項４５に記載の方法
【請求項５１】
ポリマーがガラクトマンナンである請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
ポリマーがデキストランである請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポリマーの多分散性を低下させるのに充分な条件下に、前記予備形成ポリマーを前記モノマーおよび前記架橋剤に組み合わせる前に、前記予備形成ポリマーを多分散させる工程をさらに含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
分別法がゲル濾過である請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ポリマーがヒドロキシエチルセルロースである請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
ゲルが２種以上のポリマーを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項５７】
ポリマーがヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシエチルアガロースである請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ゲルが合成ポリマーを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項５９】
ポリマーがポリアクリルアミドである請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ポリマーがポリ−Ｎ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである請求項５８に記載のゲル。
【請求項６１】
略ＤＮＡの寸法および電荷の大きな分子を電気泳動分別する方法であって、
少なくとも一つのビニルモノマー、前記モノマーおよび前記モノマーのポリマーと反応性で前記ポリマーを架橋させるのに充分である少なくとも一つのビニル基を含む架橋剤、および少なくとも一つの予備形成ポリマーの混合物であって、前記モノマーおよび前記架橋剤の合計濃度は少なくとも約４％（ｗ／ｖ）であり、前記予備形成ポリマーの濃度が約０．００５〜２％（ｗ／ｖ）である混合物中で前記モノマーおよび前記架橋剤をフリーラジカル重合させることにより生じるフリーラジカル重合反応生成物を含んでなるゲルを形成する工程；
前記ゲルを電気泳動通過手段内に形成する工程；
前記通過手段の一端に前記分子の混合物を配する工程；および
前記分子の混合物を、前記分子の分子量の係わる距離だけ前記分子を前記ゲルを通過させるのに充分な温度で充分な時間、電気泳動電流および電圧に付する工程；
を含み、
前記ゲルは、約１００ｂｐ〜３，０００ｂｐの範囲の鎖長を有し電気泳動移動距離が測定可能であるＤＮＡ断片のうち、最も大きなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度に対する最も小さなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度の比が、前記予備形成ポリマーを含まないこと以外は前記ゲルと同じ濃度および組成のゲル中における同じ条件下での、前記最も大きなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度に対する前記最も小さなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度の比と比べて少なくとも５倍大きくなる、大きなＤＮＡ断片の電気泳動移動速度を選択的に遅延させるゲルである、方法。
【請求項６２】
ゲルが一つのモノマーを含む請求項６１に記載の電気泳動的方法。
【請求項６３】
モノマーがＮ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである請求項６２に記載の電気泳動的方法。
【請求項６４】
モノマーがアクリルアミドである請求項６２に記載の電気泳動的方法。
【請求項６５】
モノマーがＮ−アクリロイル−１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−ガラクチトールである請求項６２に記載の電気泳動的方法。
【請求項６６】
ゲルが２種以上のモノマーを含む請求項６１に記載の電気泳動的方法。
【請求項６７】
モノマーがアクリルアミドおよびＮ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである請求項６６に記載の電気泳動的方法。
【請求項６８】
ゲルが一つの架橋剤を含む請求項６１に記載の電気泳動的方法。
【請求項６９】
架橋剤がＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドである請求項６８に記載の電気泳動的方法。
【請求項７０】
架橋剤がジヒドロキシエチレン−ビス−アクリルアミドである請求項６８に記載の電気泳動的方法。
【請求項７１】
架橋剤がピペラジンジアクリルアミドである請求項６８に記載の電気泳動的方法。
【請求項７２】
ゲルが２種以上の架橋剤を含む請求項６１に記載の電気泳動的方法。
【請求項７３】
架橋剤がＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドおよびジヒドロキシエチレン−ビス−アクリルアミドである請求項７２に記載の電気泳動的方法。
【請求項７４】
ゲルが一つのポリマーを含む請求項６１に記載の電気泳動的方法。
【請求項７５】
ポリマーが多糖類である請求項７４に記載の電気泳動的方法。
【請求項７６】
ポリマーがヒドロキシエチルセルロースである請求項７５に記載の電気泳動的方法。
【請求項７７】
ポリマーがヒドロキシプロピルメチルセルロースである請求項７５に記載の電気泳動的方法。
【請求項７８】
ポリマーがメチルセルロースである請求項７５に記載の電気泳動的方法。
【請求項７９】
ポリマーがアガロースである請求項７５に記載の電気泳動的方法。
【請求項８０】
ポリマーがヒドロキシエチルアガロースである請求項７５に記載の電気泳動的方法。
【請求項８１】
ポリマーがガラクトマンナンである請求項７５に記載の電気泳動的方法。
【請求項８２】
ポリマーがデキストランである請求項７５に記載の電気泳動的方法。
【請求項８３】
前記モノマーおよび前記架橋剤と混合する前に、前記ポリマーの多分散性を低下させるのに充分な条件下に、前記予備形成ポリマーを分別させておく請求項７５に記載の電気泳動的方法。
【請求項８４】
分別法がゲル濾過である請求項８３に記載の電気泳動的方法。
【請求項８５】
ポリマーがヒドロキシエチルセルロースである請求項８３に記載の電気泳動的方法。
【請求項８６】
ゲルが２種以上のポリマーを含む請求項６１に記載の電気泳動的方法。
【請求項８７】
ポリマーがヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシエチルアガロースである請求項８６に記載の電気泳動的方法。
【請求項８８】
ゲルが合成ポリマーを含む請求項６１に記載の電気泳動的方法。
【請求項８９】
ポリマーがポリアクリルアミドである請求項８８に記載の電気泳動的方法。
【請求項９０】
ポリマーがポリ−Ｎ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである請求項８８に記載の電気泳動的方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
ゲル電気泳動においては、帯電種の混合物は、電場をかけられた状態でのこれらの異なる可動性によりその成分に分別される。可動性は、主に、使用するゲルおよび、正味の表面電荷、寸法および形状を含むイオンそのものの特性に依存する。現在、ゲル電気泳動は、タンパク、核酸およびそれらの誘導体のような生物学的マクロ分子の分別に最も用いられている。ゲルは、天然または合成ポリマーからできている。作られる材料に関係なく、ゲルは、適当な電気泳動チャンバー内を垂直または水平に流すことができる、またはキャピラリー方式で用いることができる。各特定の方式は有利な点および不利な点を有するが、分別が成功する主な決定因子はゲルそのものである。
最近、多くの新しいゲル材料が化学文献に記載または特許に開示されている。これらは、新規モノマーまたはモノマーと架橋剤との組み合わせからなるポリマー、または変性された天然ポリマーを含む。新規材料からなるこれらの新規ゲルの一部は、実質的に異なる特性を示し、それにより電気泳動的分別の重要な向上に至る。
タンパクと核酸の分析のために、新規合成マトリクスが導入された（米国特許第５，３１９，０４６号）。このマトリクスは、アクリル系モノマーのＮ−アクリロイルトソス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＮＡＴ）を基本材料とする。ポリ（ＮＡＴ）ゲルは、以前に用いられてきたポリアクリルアミドゲルよりも親水性がより高く、大きな分子の分解能が優れている。新規モノマーおよびゲルから製造される一連のより親水性の高いポリマーも開示された（米国特許第５，１８５，４６６号および第５，２０２，００７号）。これらのゲルは、ＤＮＡ制限断片およびタンパクの分別に特に適していた。もう一つのゲルタイプが米国特許第５，３７１，２０８号に開示された。これらのゲルは、ポリマーのヒドロキシル基と反応してエーテル架橋を形成する架橋剤と架橋した線状ポリマーからなっていた。
電気泳動のためのゲルは、フリーラジカル重合、熱誘導ゲル化、およびゲル化と同時に起こる架橋反応により調製することができる。現在では、これらの各プロセスは、電気泳動のための予備注型ゲルの製造に用いられている。多くの出発材料が存在すると、これらの材料の異なる組み合わせを用いることにより非常に様々なゲルを製造することができる。形成されたゲルまたはゲル化溶液に添加剤を添加することからなる、電気泳動で用いるのに適したゲルの特性が変化するさらなる可能性がある。添加剤は、添加剤が添加されるゲルの特定の特性を向上させるように選択される。例えば、低濃度（３〜５％）のポリアクリルアミドゲルの機械的特性は低いことが知られている。機械的安定性は、そのようなゲルがアガロースの存在下に重合されるときに向上され得る。何故なら、アガロースゲルは低濃度において優れた機械的安定性を有するからである。そのような複合ゲルが引用１に記載されている。ポリアクリルアミドゲルの弾性は、別の予備形成されたポリマーを重合溶液に添加することにより向上させることができ、そのようなゲルはデュラクリル（Ｄｕｒａｃｒｙｌ）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍｓ製）の商品名で市場で知られている。添加剤ポリマーの正確な性質が開示された。ポリアクリルアミドゲルと共に用いられていた他の添加剤は、低分子量ポリオールを含む（米国特許第５，１５９，０４９号）。
添加剤は、同様にアガロースゲルと組み合わされた用いられていた。アガロースゲルは、ポリアクリルアミドゲルと比べて劣る光学的特性を有している。この欠点は、ゲル化の前にアガロース溶液に別の多糖類を添加することにより部分的に修正することができる（米国特許第５，２３０，８３２号）。さらに、液体ポリアクリルアミドを含むアガロースゲルも知られており、これらのゲルにおいて、アガロースは機械的安定性を提供し、一方、ポリアクリルアミドはふるい媒体として作用した（引用２および３）。もう一つの例は、酢酸セルロースゲルのような予備形成ゲルにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することを含む。この組み合わせにおいて、酢酸セルロースは安定化媒体として作用し、一方、ＰＥＧはふるい媒体であった（引用４）。架橋線状多糖類ゲル中に組み込まれた分岐多糖類（米国特許第５，３７１，２０８号）を添加剤として考えることができる。
米国特許第５，３１９，０４６号において、ポリ（ＮＡＴ）ゲルがさらにポリアクリルアミドまたはアガロースを含んでよいことが開示された。後者は、添加剤としてみなすことができるが、前者はみなすことはできない。ゲル重合中に二つのアクリル系モノマーが存在していると、それらは共重合して、二つのモノマーの各々から誘導される単位を含む一本のポリマー鎖が得られる。一方、添加剤の存在下における重合により形成されるポリマー間において関係はより複雑である。何故なら、ある場合には、新しく形成されたポリマーおよび予備形成添加剤が、フリーラジカル重合中の連鎖移動反応により共有結合されるからである。これは、添加剤がビニル基を含まない場合でも起こり得る。一方、熱誘導ゲルにおいては、予備形成ポリマー添加剤がゲルポリマーに共有結合することは予想されない。フリーラジカル重合により形成されたもの、または熱誘導ゲル化により製造されたもののいずれのタイプのゲルにおいても、ポリマー添加剤はゲル化ポリマー間に強く挿入されるので、全ての実際の適用において、それはゲルマトリクスの一部と考えられ得る。また、添加剤がゲルポリマーと緩くしか結合されない、またはゲル間空間に残り、ゲルから容易に拡散することもある。
従来技術で知られているゲル中で分析した分子の電気泳動可動性への添加剤の影響を考慮することが重要である。アガロースで安定化した少ない割合のポリアクリルアミドゲルにおいて、分別は主にゲルのアクリルアミド成分に依存する（引用１）。アガロース−液体ポリアクリルアミドゲルにおいて、ゲルを通過する分子の可動性はポリアクリルアミドの濃度の関数であるので、アガロースポリマーは非ふるい性であると考えられていた（引用２および３）。ポリマー（Ｄｕｒａｃｒｙｌ）の添加により弾性の向上したポリアクリルアミドゲルにおいて、製造者によれば、電気泳動可動性は、通常はタンパクの２次元電気泳動である同じ目的で用いられる単純ポリアクリルアミドゲルにおいて見られるものに等しい。予備形成ゲル中に導入される添加剤に関しては、一部の低分子量ポリオールは分析された分子の可動性を変化させ、他のものは変化させなかった（米国特許第５，１５９，０４９号）。ＰＥＧ添加酢酸セルロースゲルにおいて、ＳＤＳタンパク複合体はＰＥＧを添加した場合にのみ分別することができた、すなわち、予め存在している酢酸セルロースマトリックスは安定化媒体としてしか作用しなかった（引用４）。
近年、ＰＥＧ添加ポリアクリルアミドゲルにおいて幾つかのレポートが出された（引用５、６および国際出願ＷＯ９３／１１１７４）。重合前にアクリルアミド−Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド（Ｂｉｓ）溶液にＰＥＧを添加すると、驚くほど異なる特性を有するゲルが得られた。第１に、ゲルの光学的特性が変化した。ゲルが強度の不透明になった。第２に、電気泳動可動性が大きく変化し、これらの新規ゲル中において、より大きなＤＮＡ分子がより速く動いた。すなわち、増加したＤＮＡ移動速度は、ゲルの光度の不透明性に一致する。結果は、ポリアクリルアミド繊維の側方凝集による大きな孔の形成に一致するようである（引用５および６）。Ｂｉｓの濃度が約５％上昇するがアクリルアミドとＢｉｓとを合わせた濃度が一定に維持される場合、添加剤無しで不透明なポリアクリルアミドゲルが形成される（引用７および８）。ここで、ゲル成分の濃度は常に体積当りの重量で表される。合計ゲル濃度Ｔおよび架橋剤濃度Ｃは、従来技術において一般的であるように定義され、それにより、Ｔはモノマーと架橋剤との重合の合計に関係し、ＣはＴに対する架橋剤の％を表す。高Ｂｉｓ濃度で形成される不透明ポリアクリルアミドゲルにおいてマクロ分子はより速い速度で移動することが知られており、そのようなゲルは、ふるい性の低いまたは無いマトリクスを必要とする電気泳動用途において有用である。最初に、それらは、多相領域電気泳動における積層ゲル用に薦められた（引用９）。何故なら、積層ゲルはできるだけ少ないふるい性を付与するからである。不透明なポリアクリルアミドＢｉｓゲルは重大な欠点を有する。それらは脆く、取り扱いが困難である。さらに、それらは、アクリルアミドよりも疎水性であるＢｉｓの割合が大きいために疎水性であり、そのためにゲルは水を排斥する（引用１０）。不透明ゲルは、ＮＡＴのような親水性の高いモノマー、または糖アルコール誘導モノマーを用いても、高いＢｉｓ比において形成することができる。多くのモノマーと架橋剤の組み合わせが米国特許第５，３１９，０４６号および第５，１８５，４６６号に開示された。高度に不透明なゲルが、多くの組み合わせにおいて得られた。通常、不透明ゲルは、電気泳動用マトリクスとして用いる場合に不利益を有する。なぜなら、分別領域の検出が、高度のバックグラウンド不透明性故に困難だからである。従って、充分に透明なゲルが好ましいが、アガロースゲルの広い許容性により明らかであるように、実際にはある程度のゲルの不透明性は許容され得る。
近年、ゲル電気泳動の機構を記載している幾つかのモデルがある。拡張オグストン（Ｏｇｓｔｏｎ）モデルによれば、マクロ分子の電気泳動可動性は、マクロ分子が入ることのできるゲルの孔の体積割合に比例している（引用１１および１２）。測定された電気泳動可動性μは、半径Ｒの移動分子の溶液中での自由可動性μo、およびゲル％Ｔ、ゲル繊維の合計長さｌ’、および繊維半径ｒに関係し得る。
ｌｏｇμ＝ｌｏｇμo−πｌ’（ｒ＋Ｒ）2Ｔ            （１）
または
ｌｏｇμ＝ｌｏｇμo−Ｋr．Ｔ                        （２）
ここで、遅延計数Ｋrは次のように定義される。
Ｋｒ＝πｌ’（ｒ＋Ｒ）2                             （３）
種々のタイプのマクロ分子の遅延計数は、それらを異なる割合のポリアクリルアミドゲル中を流すことにより決めた。すなわち、分子量６７０，０００までの天然タンパクのＫr値は約０．０４から０．２０に変化した（図２、引用１１）。遅延計数がわかると、ゲル濃度の変化後に、タンパクの電気泳動可動性の相対的変化を計算することができる。例えば、ゲル濃度を１０％増加させることにより、例えば、Ｔ＝１０％からＴ＝１１％にすることにより、Ｋr＝０．０４の最も小さいタンパクの可動性が８．８％変化する。この計算のために、実際の可動性を知る必要がない。何故なら、
μ＝μo・１０-Kr.T
μ＝μo・１０-0.04.10＝μo・０．０３９８            （４）
であり、Ｔ＝１１％において、
μ＝μo・１０-0.04.11＝μo・０．０３６３
であり、そのためにＴ＝１１％において可動性は以下のように低下するからである。
（０．３９８−０．３６３）・１００／０．３９８＝８．８％
Ｋrが０．２の最も大きなタンパクは、ゲル濃度が１０％から１１％に増加した後、３６．９％低い可動性で移動する。低いＴ値においてゲル濃度を１０％変化させると可動性の変化が小さく、高いＴ値において変化はより大きいことに注目すべきである。ゲル電気泳動の実際において、大きなマクロ分子の分析に低ゲル濃度が用いられる。高濃度においては、ほとんど移動できず、分析時間が許容できないほど長くなるからである。
ＳＤＳタンパク複合体の遅延計数が、ポリアクリルアミドゲルにおいて０．０６から０．１６に変化する（引用１３）。１０％から１１％へのゲル濃度の１０％の増加により最も小さなタンパクの可動性が１２．８％減少し、最も大きなタンパクでは３０．８％減少する。
Ｋr値は、ポリアクリルアミドゲル中の２本鎖ＤＮＡ断片についても決められた（引用１４）。約４０から４０００ｂｐへの１００倍の寸法範囲において、遅延計数は０．１６から０．３６に変化する。ゲル濃度の１０％から１１％への１０％の変化により、最も小さなＤＮＡ断片の可動性が３０．８％低下し、最も大きな断片では５６．３％低下する。キロ塩基ＤＮＡ断片は標準的１０％または１１％ポリアクリルアミドゲルにおいてほとんど変化しないことに注目すべきである。そのような断片の分析には、低い割合のゲルを用いなくてはならず、低いＴ値においては、可動性の相対的変化はここで１０〜１１％低い。異なるタイプのマクロ分子に係わる前記計算から、最も一般的に使用される範囲のゲル濃度においてゲル濃度が１０％変化した後、せいぜい２倍の移動速度の変化を予想することができる。
最近、ドア−回廊（ＤＣ）モデルと呼ばれるゲル電気泳動のもう一つのモデルが提案された（引用１５〜１９）。このモデルによれば、電気泳動中に、マクロ分子が存在するゲル孔を通って移動しないが、その代わりに、移動するときにゲルポリマーを押しのける。ゲルは、移動分子により一時的に押し除かれ得るポリマーを含まなくてはならない。マクロ分子は不連続工程で移動し、各工程において、それらは一つのゲル層を通過する。ＤＣモデルの本質的特徴は、マクロ分子がゲル層を通過することのできる方法が二つある、すなわちドアを通過するまたは回廊を通過するという概念がある。ドアは、ポリマー鎖が高い動作自由度を有するゲル層の領域で形成される開口である。ドアの形成は、他のゲル層のポリマーに影響を与えない。回廊は、ポリマーが低い動作自由度を有するゲル層の領域で形成される開口である。回廊を形成するためには、一またはそれ以上のポリマー端部またはポリマーがあまり架橋されないまたは絡まらない場所で開口ができるまでゲル層を移動分子が変形させなくてはならない。一つのゲル層の変形には、上側および下側の少なくとも一つの層におけるポリマーの分別が伴い、次の層上で、移動しているマクロ分子が同様の領域に遭遇すると、再び回廊を開く。二つの回廊が一緒になって幾つかのゲル層に渡る一つの長い回廊を形成することができる。大きな回廊を開くために、移動している分子は、異なるゲル層のポリマーを充分に押しのけることができなくてはならない。特定の移動マクロ分子により主にドアまたは回廊が開かれる選択は、二つの力のバランスに依存する。第１の力は電気動的なものであり、電場中を移動する全てのマクロイオンによりゲル層に付与される。この力は、ゲル層中のポリマーの抵抗により発生し、それにより、ＤＮＡの可動性と二つの力との関係は以下のようになる。
μ1＝μ．ｅ-Fr/Fe                                   （５）
ここで、μ1は移動分子の単位寸法の可動性であり、Ｆrはゲルポリマーの抵抗であり、Ｆeは開口を形成するために分子が用いる電気動的力である。ＤＣモデルにおいて、マクロ分子の可動性は分子の最も小さいセグメントの可動性μ1に比例し、二本鎖ＤＮＡの一つの塩基対に等しい。
ゲルポリマーがマクロ分子の移動に抵抗する力は、通常、高い合計ゲル濃度で増加し、それにより分子の可動性は低下する。これは、多くの経験的発見事項に従う。しかしながら、同じポリマーを同じ濃度で含む二つのゲルにおいて、これらのポリマーの配置が異なる場合、抵抗は異なり得る。例えば、ＤＮＡ断片の可動性は、同じ量のポリマーを含むが、異なる温度で架橋したアガロースゲルにおいて大きく変化した（米国特許第５，３７１，２０８号）。等しいＴおよびＣのポリ（ＮＡＴ）ゲルを含むもう一つの場合において、直鎖状ポリマー架橋剤を有するゲル中でのＤＮＡ移動速度は、直鎖状のものから調製した分岐状架橋剤を有するゲル中での速度から異なっていた（引用１５）。第２のゲル中で可動性が低いのみならず、分離も失われた（引用１５）。分離の損失は、移動しているＤＮＡ分子がゲル繊維を充分に押しのけられないからと解される。結果は、ＤＮＡ断片の電気泳動分別が、ポリマーが充分に押しのけられて回廊を開かせ得るゲル中においてしか可能でないことを示した。分岐架橋剤を有するゲル中での充分に低下した移動速度に関する引用された発見のもう一つの局面は、実用的に重要でないようである。低下した可動性には、分別の損失が伴うからである。それにも拘わらず、結果は、ゲルポリマーの変化またはその配列の変化が、ＤＣモデルに従うマクロ分子の電気泳動挙動に大きな影響を有し得ることを示した。
従来技術において、特定の組成を有し特定の合計濃度を有するゲルが、限定された寸法範囲においてしかマクロ分子の最適分別を提供しないことが知られている。所定のゲルにおいてどの分子が最適に分別されるかに関して異なる定義があるが（引用１９）、特定の寸法範囲外において、分別が乏しいことが一般的に知られている。より小さい分子は広いバンドを与えるが、大きな分子は充分に移動して有意な流動時間内に分別されることがない。すなわち、低寸法範囲における分別能は分別により効果的に制限され、高寸法範囲においては分別により選択的に制限される。分別効率は、例えば引用２０に定義されているように、移動経路と領域の幅との比に強く関係する。ゲルの端部における鋭敏なバンドに等しい、長い移動経路後に観察される狭い領域幅は、高い分別効率に特徴的である。選択性は、隣接バンド間の距離に関係し、距離が増加すると良好となり、ゲルの分別能が、効率または選択性あるいは両方を向上させることにより改良し得ることが明らかである。
ＤＮＡ断片の可動性とその寸法との間の関係は種々の方法で示すことができ、そのうち最も一般的なものは、ＤＮＡ断片寸法のｌｏｇに対する可動性のプロットである。ＤＮＡ分子の寸法に対する可動性の逆数のプロットも頻繁に用いられる。前者のプロットにおいて、例えば引用１６の図１に示されるようにＳ字状曲線が常に得られる。このプロットから、大きなＤＮＡ分子が全て等しい速度で移動し得ることが明らかである。一部の例においては、大きな分子が小さな分子よりも素早く移動することができ、「バンド逆転」と呼ばれる現象を引き起こす。「バンド逆転」について異なる説明が可能である（引用１９）が、大きなＤＮＡ分子のこの速い移動速度はその分別の可能性を制限することが明らかである。この制限を理解し克服するために多くの努力がなされた。パルス電場を導入することにより２０，０００ｂｐよりもＤＮＡ分子を分別する性能が実質的に進歩した。この改良は、例えば引用２１および２２に記載されているＤＮＡゲル電気泳動の歩行モデルの理論的構成に依存している。このモデルによれば、ＤＮＡ分子そのものは電場の方向に配向し、配向の程度は、ＤＮＡの寸法およびかけられた電場強度に依存する。一旦配向されると、分子はゲル中を歩行する。この可動性は、寸法に依存しなくなり、分別は失われる。通過モデルに基づく改良されたＤＮＡ分別を意図する大部分の作業は１０００ｂｐより大きなＤＮＡ断片を用いて行われたが、小さいＤＮＡ分子の分別を改良する目的でモデルを用いた報告もされている。例えば、ゲル配列においてＤＮＡ分別を向上させるためにパルス電話を用いた（引用２３）。さらに、ボール状分子を一つのＤＮＡ末端に結合させることによりＤＮＡ分子が移動の歩行モデルに推定されない可能性が実際上と理論上の両方で研究された（引用２４および２５）。
歩行モデルによれば、ゲル繊維の主な役割はＤＮＡ分子の側方動作を防止することであり、それによりＤＮＡの電場の方向への配向が維持される。ゲル繊維がさらに分別して配される場合、ＤＮＡ配向度は低く、分別はより優れる。すなわち、歩行モデルは、低い割合の大きな孔を有するゲルが、大きなＤＮＡ分子の分別に常に良好であることを予想する。この予想に基づき、高多孔性の新規ゲルの発見に多くの努力が払われた。最も最近の研究は、アリルグリシジルエーテルを用いて誘導されたアガロースと架橋された低濃度（３〜４％）のポリアクリルアミドゲルに関するようである（引用２６）。電場におけるＤＮＡ分子の配向が、大きな寸法範囲における分別の損失の主な原因である場合、ゲル濃度を増加させることによる、またはＤＮＡ可動性を低下させるゲルポリマー（有効多孔性）を変化させることによる改良は期待できない。
ゲル電気泳動のＤＣモデルは、より大きなＤＮＡ寸法について観察される分別の損失のもう一つの説明を提供する。このモデルは、大きなＤＮＡ分子が、幾つかのゲル層に及ぶ長い回廊を形成するので、分別が損失されることを予想する。これは、ゲルポリマーが移動分子に充分な抵抗を与えられない場合に起こる。この説明が正しい場合、ゲルポリマーのタイプおよび配置が決定的役割を果たし、ゲル抵抗を増加させる方法の発見がゲルの分別能を向上させるはずである。すなわち歩行モデルの予想は、ＤＣモデルのものに対立する。移動速度が低下したために、前記分岐状マクロ分子架橋剤を含むポリ（ＮＡＴ）ゲルにおいてゲル抵抗が増加した。しかしながら、移動速度の低下に分別の損失が伴った。これはおそらく、移動しているＤＮＡ分子がゲルポリマーを充分に押しのけることができるからである。すなわち、充分なポリマー分別が、ゲル電気泳動によるＤＮＡ分子の良好な分別のための必要条件である。
移動しているＤＮＡ分子に高い抵抗を与え、ゲル層中での長い回廊の形成を望ましく防止するゲルを開発することを目的として、さらなる研究がなされた。望ましいゲルは、大きな力を与えた後にしか、または力を長時間与えた後にしかポリマーが押しのけられないトポロジーを有すべきである。そのようなゲルをつくることができるかどうかは不明であった。何故なら、前述の初期結果は、より安定な状態でゲルポリマーを結合させることはゲル分別力の損失につながり得ることを明らかに示しているからである。アガロース以外のポリマーを用いる新規架橋剤をスクリーニングした。種々の数のビニル基を有するポリマー架橋剤を調製し、分別の損失を引き起こすことなくゲル抵抗を増加させるのに充分な数のビニル基を有する架橋剤を発見し得ることの裏付けとした。一組の実験において、アリルグリシジルエーテルと反応させることにより重合性二重結合が導入されたヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）を出発ポリマーとして用いた。そのような架橋剤を含むポリ（ＮＡＴ）ゲルを調製し流した。対照として、いかなる変性もしていないＨＥＣを用いてゲルを調製した。一部の対照ゲルは、重合後にかなり不透明になった。一つのそのようなゲルにおいてＤＮＡ断片を電気泳動した後、二つの予想外の発見事項が見られた。第１として、移動速度が、ＨＥＣを用いない対応ゲルにおけるよりも低かった。従来技術に基づくと、透明性が増加したゲルについて高い移動速度が予想される。第２に、より大きなＤＮＡ断片の移動速度が、より小さい断片よりも比例的に低下し、分別選択性が向上した。これらの予想外の結果が一旦認識されると、観察された現象を理解し、新規ゲルが実用的であり得るかどうか調べるために、他の天然および合成のポリマーをスクリーニングすることが合理的であった。以下に開示されるように、一部のポリマーのみが、同じ効果を生じることができ、すなわち、選択性の高いゲルが提供される。さらに、架橋剤、モノマーおよびポリマーの間の特定の範囲内においてのみ、向上した選択性を達成することができた。この臨界範囲を外れると、三つの本質的ゲル成分、モノマー、架橋剤およびポリマーを最適にしても向上した選択性は得ることができなかった。
本発明の目的
本発明の目的は、選択性の向上した電気泳動ゲルを提供することである。
本発明のもう一つの目的は、１〜４塩基対異なる幾つかの二本鎖ＤＮＡ断片が１０ｃｍ以下の移動後に分別されるような向上した選択性を有する電気泳動ゲルを提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、１０００塩基対以下のサイズのＤＮＡ分子を改良された分解能を有する電気泳動ゲルを提供することである。
さらなる目的は、二本鎖ＤＮＡ断片の配列依存可動性が本質的に除かれている電気泳動ゲルを提供することである。
本発明のもう一つの目的は、電気泳動媒体として本発明のゲルを用いる新規ゲル電気泳動法を提供することである。
さらなる目的は、選択性の向上した電気泳動ゲルの調製方法を提供することである。
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面と共に読むと以下の明細書の説明からより明らかとなる。
本発明の幾つかの局面の簡単な説明
これらの目的に従い、また目的を達成するために、本発明の一つの局面は、電気泳動分別において用いるのに適しているが、他の重要な用途も有し得る新規ゲルである。このゲルは、同じまたは異なるモノマーからなるポリマーであり得る予備形成ポリマーの存在下に溶液中でモノマーおよび架橋材を重合するポリマー反応生成物である。本発明のポリマーゲルの形成において用いられるモノマーおよび架橋剤は、電気泳動分別において用いるのに適しているゲルの形成において有用であると一般的に知られているものを含む。これは、電気泳動分別において有用であるポリマーの形成において有用であると未だ認識されていなかった他のモノマーも含む。モノマーおよび架橋剤は、個々の成分として、または適当な化合物の混合物として用いることができる。必要により、適当な従来のフリーラジカル開始剤を重合溶液混合物に添加することができる。予備形成ポリマーは、好ましくは１種の材料または材料の混合物である。これは、重合溶液の約０．００５〜２％（ｗ／ｖ）を構成する。モノマーおよび架橋剤の混合物は、溶液の少なくとも４％（ｗ／ｖ）を構成すべきである。溶媒は、モノマー、ポリマーおよび架橋剤のための相互溶媒である任意の１種またはそれ以上の材料であるが、重合反応を干渉しないものである。従来のフリーラジカル重合条件が用いられる。
本発明のもう一つの重要な局面に従い、このゲルは、電気泳動分別における床として最も有用である。電気泳動は、重要な変化のみはゲル床に特異的な性質にして、従来の方法で行われる。本発明によれば、本発明の特別のゲルの使用により、ＤＮＡ断片のような大きな複雑な分子の混合物の電気泳動分別が可能になる。これらのゲルの使用により達成された予想されない結果は、大きな分子の電気泳動移動が、小さな分子の電気泳動移動に対して遅延されることである。すなわち、分子の混合物の成分が、従来可能であったよりもゲル中でより広がる。過去においては、実際、１００〜３，０００ｂｐの寸法範囲のＤＮＡ断片を、本発明のゲルを用いる電気泳動に付すると、重合反応中に予備形成ポリマーが存在しない以外は正確に同じポリマーゲルを用いる同一の条件下に電気泳動を行ったときの混合物中の小さい分子の移動と比べて混合物中の大きな分子の移動速度が少なくとも５倍低下する。
電気泳動分別における本発明のポリマーゲルの性能が、本発明によりこれらの材料を適用する使用の指示ではないことを理解すべきである。本発明の発見により電気泳動におけるこれらのゲルの使用が特に薦められるが、決して請求の範囲の生成物の範囲を限定することを意味するのもではない。しかしながら、前述の寸法の混合ＤＮＡ分子の電気泳動分別を行う結果は、本発明の要求が満たされたかを決める非常に優れた試験である。
【図面の簡単な説明】
図１は、１２％Ｔおよび２．６％ＣのＮＡＴ−Ｂｉｓ溶液に添加されたヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）の％に対する６０〜１，０００ｂｐＤＮＡ断片の移動距離のプロットである。ゲルは、実施例１に記載のように１０Ｖ／ｃｍにて２０℃で４時間流した。
図２Ａ〜Ｆは、０（図２Ａ）、０．０５（図２Ｂ）、０．１０（図２Ｃ）、０．１５（図２Ｄ）、０．２０（図２Ｅ）および０．３０（図２Ｆ）を含む種々の％（ｗ／ｖ）の添加ＨＥＣを含む１２％Ｔ、２．６％Ｃのポリ（ＮＡＴ）−Ｂｉｓゲルのスペクトルを示す。
図３は、０．２％シープラク（Ｓｅａ  Ｐｌａｑｕｅ）アガロースを含み１０Ｖ／ｃｍにて２０℃で４時間流した１２％Ｔ、２．６％Ｃのポリ（ＮＡＴ）−Ｂｉｓゲルにおいて決めた可動性の逆数に対するＤＮＡ断片寸法のプロットを示す。
図４は、μ値が図３のものと同じμ1/3に対するＤＮＡ断片寸法のプロットである。
図５は、０．１％の線状ポリアクリルアミド（分子量１０，０００）を含む１２％Ｔ、２．６％Ｃのポリ（ＮＡＴ）−Ｂｉｓゲルにおいて決めた可動性を有して得られたμ1/3に対するＤＮＡ寸法のもう一つのプロットである。ゲルは１０Ｖ／ｃｍにて２０℃で４時間流した。
図６は、１０Ｖ／ｃｍにて２０℃で１２時間電気泳動した、０．３％（ｗ／ｖ）のポリ（ＮＡＴ）を含む１２％Ｔ、２．６％Ｃのポリ（ＮＡＴ）−Ｂｉｓゲルの図面である。以下のＤＮＡサンプルをゲルに適用した：レーン１、５０ｂｐラダー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）；レーン２、ｐＢＲ３２２／Ｈｈａｌ；レーン４、ｐＢＲ３２２／Ｍｓｐｌ；レーン５、ｐＢＲ３２２／ＨａｅＩＩＩ；レーン３、三つのｐＢＲ３２２消化物の混合物；レーン６、２０ｂｐラダー（Ｇｅｎｓｕｒａ社製）；レーン７、１００ｂｐラダー（Ｇｅｎｓｕｒａ社製）、ｍおよびレーン８、１ｋｂラダー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）。
図７は、１０Ｖ／ｃｍにて６２℃で２．５時間流した、０．２％のシープラクアガロースを含む１２％Ｔ、２．６％Ｃのポリ（ＮＡＴ）−Ｂｉｓゲルの図面である。ＤＮＡサンプル：レーン１、５０ｂｐラダー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）；レーン２、ｐＢＲ３２２／Ｈｈａｌ；レーン３、ｐＢＲ３２２／ＨａｅＩＩＩおよびｐＢＲ３２２／Ｍｓｐｌを含む二つのｐＢＲ３２２消化物の混合物；レーン４、三つのｐＢＲ３２２消化物の混合物；レーン５、ｐＢＲ３２２／ＨａｅＩＩＩ；レーン６、ｐＢＲ３２２／Ｍｓｐｌ；およびレーン７、５０ｂｐラダー。
発明の詳細な説明
米国特許第５，３７１，２０８号においては、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）が、架橋反応によるゲルの調製に用いられた。この反応はゲル化と同時に生じるものである。この同じＨＥＣポリマーが、その重合前に、１２％Ｔ及び２．６％ＣのＮＡＴ＋Ｂｉｓ溶液に対して異なる濃度で添加された。実施例１に記載されているように、ＨＥＣを含むゲルの透明度は、重合溶液中に存在するポリマーの量に応じて低下した。キュベットで重合された１ｃｍ厚さのゲルの吸光度測定は、６００ｎｍで行なわれた。この波長は可視スペクトルの真中にあるので、これが選ばれた。最低のＨＥＣ濃度、すなわち０．０５％（容積あたりの重量）において、吸光度は０．１２１であった。最高のＨＥＣテスト濃度、すなわち０．３％において、これは２．２３９であった。ＨＥＣを含まない対照ゲルは、吸光度が０．０１７であった。従ってゲル重合中のＨＥＣポリマーの存在は、ゲル透明度に大きな変化を生じた。様々なサイズのＤＮＡ断片の電気泳動に従って、比較的大きいＤＮＡの顕著な遅滞（ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）が見られた。移行距離が実施例１に示されており、図１はこれを図で示している。この図面は代表的なものであるが、その理由は、これと同様のパターンが下記のその他の多くのポリマーについても得られたからである。６０ｂｐ〜３００ｂｐ断片間の移行距離の比は、ゼロＨＥＣにおいて３．３２（７．３／２．２）である。０．２％ＨＥＣにおいて、この比は１０倍以上も高く、３４．５（６．９／０．２）である。１００ｂｐ〜２００ｂｐのサイズ範囲において、この比は、１．６９から５．１１まで３倍増加した。対照ゲルにおいて、８．７ｃｍの移行経路では、２００ｂｐ断片は、１００ｂｐ断片がゲルの末端に到達する時まで５．１ｃｍ移行すると計算することは容易である。０．２％ＨＥＣを含む等しい長さのゲルにおいて、２００ｂｐ断片は、１００ｂｐ断片がゲルの末端に来る時に、１．７ｃｍだけ移行したであろう。従ってこれら２つの断片間の距離は、３．６ｃｍから７．０ｃｍに増加するであろう。この向上した選択性は、ゲルの分解能が１００〜２００ｂｐ範囲において２倍だけ増加したことを意味する。
Ｔは同一（１２％）であるが、架橋度が様々なポリ（ＮＡＴ）ゲルが、等しい量（０．２％）のＨＥＣの存在下に重合された場合、６００ｎｍにおける吸光度は、架橋度と共に増加した（実施例３）。Ｂｉｓを含有するゲルにおいて、これは、１％Ｃで０．１０３であり、１．５％では０．３２１、２．０％では０．７２０であった。この結果は次のことを示していた。すなわち、光を吸収又は散乱させる種の形成については、モノマー分子よりも架橋剤分子の方が、より多くその原因になるということである。この仮定をさらに支持したものは、次の実験から生じた。すなわちＮＡＴの１２％溶液が、０．２％ＨＥＣの存在下ではあるが、Ｂｉｓの不存在下に重合したという実験である。その結果生じた粘性の高い溶液の不透明度の増加は、視覚的には観察されなかった。１．５％及び２．０％Ｃにおける不透明度の実質的な増加はあるが、ゲルの選択性はわずかしか改良されなかったということに注目すべきであろう。これらのゲルに関して、移動度における最大の変化は、キロベースのＤＮＡ分子の場合に２％Ｃにおいて見られた。これらはいずれにしても、このように高いＴ値のゲルにおいてはあまり分解されない。従って１〜２％Ｃの３つのゲルは、実際にはまったく利点がなかった。
ＨＥＣ濃度と架橋度を変えることによって得られた発見事項が意味するところを考慮すべきであろう。可視光線の吸光度又は散乱の増加は、文献において、ポリマー凝集体又は束の形成と関連していた。これらのサイズは、可視光線の波長、すなわち４００ｎｍ〜８００ｎｍのサイズに対応する。この解釈が正しいと仮定すると、その場合には前記発見事項が示唆することは、ＨＥＣ及び架橋剤の濃度が増加する時、より多数のこのような凝集体が形成されるということである。架橋剤がなければ凝集体は形成されない。ＨＥＣの存在下になぜこれらの凝集体が形成されるのかという疑問がある。もう１つの疑問は、これらの構造はどんなものかである。第三の疑問は、これらの凝集体を含むゲルが、なぜ向上した選択性を示すのかということである。
２つの追加の架橋剤、すなわちジヒドロキシエチレン−ビス−アクリルアミド（ＤＨＥＢＡ）とピペラジン−ジ−アクリルアミド（ＰＤＡ）もまた、ＨＥＣの存在下にＮＡＴと共重合された（実施例４）。吸光度が、比較的高い架橋剤濃度において増加する場合、同じ一般的パターンが観察され、これらのゲルは向上した選択性を示した。しかしながらこれらの架橋剤間には１つの重要な差があった。様々な架橋剤濃度において、同様な吸光度の値に達した。５％Ｃにおいて、ＤＨＥＢＡは、吸光度が１．３０２の中程度に不透明なゲルを生じた。架橋剤としてＢｉｓを用いた場合、２．６％Ｃでは吸光度は１．７８０であった。架橋剤としてＰＤＡを用いた場合、１．５％Ｃでは吸光度は１．９９８であった。３つの架橋剤のうち、ＤＨＥＢＡが最も親水性の高いものであり、次にＢｉｓ、そしてＰＤＡであるので、凝集体の形成は、架橋剤の親水性に応じたものであるように見える。しかしながら３つの架橋剤の二重結合が異なる速度で重合しうるという可能性を無視すべきでない。二重結合の反応性は、３つの架橋剤の親水性と一致していることもありうる。いずれにせよ、すべての場合に重合溶液中に存在するＨＥＣポリマーは、ゲルポリマーの配置にある変化を引起こしたことは明白である。これは、ゲル不透明度の変化として検知しうるものである。
ＨＥＣポリマーの存在がゲル構造にどのようにしてこの変化を引起こしたかについては、いくつかの可能性がある。例えば架橋剤分子は、ＨＥＣポリマーに親和性を有することがあり、従って架橋剤の局部濃度は、ポリマーの近くではより高いことがある。もう１つの可能性は、重合プロセス中に、ＨＥＣが、架橋剤に富むポリマーの沈殿を生じるということである。第三の可能性は、ＨＥＣポリマーが、次のようにして重合プロセスの動力学を変えるということである。すなわち架橋剤分子が、モノマーとではなく、それ自体の間で優先的に反応するようにしてである。これら３つの可能性の組合わせもありうる。実際のメカニズムとは無関係に、これらの結果が示しているのは、凝集体の形成は、架橋剤の種類のみならず、その濃度にも依るということである。ある濃度（これは各架橋剤について異なるが）以下では、ＨＥＣを含むゲルは、ＨＥＣを含まないゲルの力と同様な力でＤＮＡ断片を分解した。
異なる分子量のＨＥＣポリマーが、ＮＡＴとＢｉｓとを含む重合溶液に添加された。実施例７に記載されているように、すべてのＨＥＣポリマーは、ゲル不透明度の増加を引起こすことが可能であった。しかしながら、ポリマーがゲル選択性を向上させる能力には大きな差があった。分子量が２４，０００〜２７，０００の最も短いＨＥＣポリマーは、ゲル分解能において小さい改良しか生じなかった。フルカ社（Ｆｌｕｋａ）から購入されたＨＥＣポリマーは、製造業者によって分子量が明記されていないが、これらのポリマーは、有意な改良を引起こすことが可能であった。より高い分子量、すなわち９０，０００〜１０５，０００、及び１６０，０００のＨＥＣポリマー（ポリサイエンス社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）から購入されたもの）についても同じことがあてはまった。これらの結果が示すことは、凝集体の形成は、向上した選択性を得るのに十分な条件ではないということである。分子量２４，０００〜２７，０００のＨＥＣを含むゲルに形成された凝集体は、これより長いＨＥＣポリマーの存在下に形成されたものとは異なる挙動を示した。束になったゲルポリマーの組成、あるいはこれらのからみ合わされ方に、ある違いが存在することがある。しかしながら１つの特定のポリマーの存在下に形成された束は、同一の組成及び構造を有する可能性の方が高いように思える。そうであれば、その場合は選択性における大きな差が示すことは、短いＨＥＣポリマーが、移行ＤＮＡ分子の通過中に凝集体を橋掛けしたり、これらをまとめておくことはできないということである。ポリマーは、そうするためにはある最小限の長さを有する必要がある。この結論は次の発見事項によるものである。すなわち、実施例７に開示されているように、選択性の大きな向上を得るためには、より長いＨＥＣポリマーのはるかに低い濃度で十分であったという発見事項である。
ＨＥＣは、セルロースへの酸化エチレンの作用によって調製された工業用ポリマーである。この反応はかなり強烈な条件下で実施され、副反応が生じることが予測される。このような副反応は、ポリマーに他の官能基を導入することがある。例えば脱離反応は、ＨＥＣポリマーに二重結合を導入しうるであろう。これらの二重結合は、ＮＡＴ及びＢｉｓと共重合し、従ってＨＥＣは、ゲルマトリックスに共有結合的に結合されるであろう。さらには様々な製造業者によって、あるいは様々なバッチ及びポリマーサイズから製造されたＨＥＣは、様々な量の置換基を有するであろう。見られる差は、実際には様々な分子量と関連しているのではなく、ポリマーの何か他の性質と関連したものであると想像することができる。この問題を解決するために、ＨＥＣ配合物は、実施例１８に記載されているようにセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ６Ｂ上のゲル濾過に付された。３つのゲルが、分別ＨＥＣと重合された。１つは最初に溶離する長いポリマーと、２つ目は中間のフラクションと、３つ目は最後に溶離するＨＥＣポリマーと重合された。最長ポリマーを含むゲルだけが、選択性の大きな改良を示したが、一方、最短ポリマーを含むゲルは、対照ゲルと比較して、変化を示さなかった。両方のポリマーフラクションが同じＨＥＣサンプルから生じたものなので、ポリマーの化学構造は同じであろう。従ってこの実験は、ポリマーの分子量がゲル特性に対して大きな影響を有することをしっかりと立証した。
ゲル濾過実験のもう１つの側面についても記載する価値がある。ＨＥＣは非常に幅広いピークとして溶離され、このＨＥＣ配合物におけるポリマーサイズ分布が非常に幅広いことを示している。同様のことが、おそらく他のＨＥＣ配合物についてもあてはまる。さらには、ポリサイエンス社製の９０，０００〜１０５，０００ＨＥＣは、はるかに高い分子量のポリマーを含んでいることが最近報告された（引例２７）。従って製造業者が示した分子量の値はここではそのまま取上げられているが、これらの値は、条件付きで考慮されるべきであろう。多分散性（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ）は、所望であればゲル濾過又はその他の分別方法によって減少させることができる。実施例１８に示されでいるように、向上した選択性を有するゲルの調製には、このようにより均質なポリマー配合物も適している。
向上した選択性を有するゲルはまた、実施例５に記載されているように、ＮＡＴの代わりにその他のモノマーを用いて調製することもできる。モノマーとしてアクリルアミド、架橋剤としてＢｉｓ、予め形成されたポリマーとしてＨＥＣが用いられる場合、モノマーとしてＮＡＴを用いる場合よりも高い架橋度が必要であった。モノマーとしてＮ−アクリロイル−１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−ガラクチトールを用いても、向上した選択性が得られるであろう（実施例５）。これらの発見事項が証明していることは、新しいゲルにおける比較的大きいＤＮＡ分子の選択的遅滞は、特定のモノマーとは関連していないということである。これはまた、特定の架橋剤とも関連していない。その理由は、ＤＨＥＢＡ及びＰＤＡで架橋されたゲルもまた、前記のように向上した選択性を示したからである。従って観察された現象は一般的であるように見えるが、ゲルトポロジーを変更することによって選択性の所望の向上が生じるようなモノマー及び架橋剤の濃度範囲は限定されていることを認識することが重要である。この条件が満たされた場合、多くの様々のモノマー及び架橋剤が適したものになる。実施例６に記載されているように、１つ以上のモノマーと１つ以上の架橋剤とを重合溶液に溶解することも可能である。このような複合ゲルもまた、向上した選択性を示した。
当初からＮＡＴ及びＢｉｓと組合わされて用いられたＨＥＣは、ＤＮＡ特異性染料で染色した後、高いバックグラウンドのゲルを生じることが多かった。このバックグラウンドは、より高いＨＥＣ濃度においてより顕著であったので、セルロース中に存在する内生ＤＮＡがその原因であろうと推論された。このバックグラウンドは、実施例２に記載されているように、ＤＥＡＥ−セファロース上でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製されたＨＥＣを含むゲルにおいては、実際により低かった。しかしながらこれらのゲルはその分解能を失った。同じことがＤＥＡＥ−セルロース（サーバ社（Ｓｅｒｖａ））上で精製されたＨＥＣを用いた場合も生じた６ＤＥＡＥ−セファロース上で精製されたＨＥＣをＣＭ−セファロース上に通過させた時に、分解能が回復したので、いくつかの正電荷アガロースポリマーが、ＤＥＡＥ−セファロースから解放されたように思われる。架橋セファロースビーズが用いられたので、これらの量は比較的低いと予測される。ゲル分解能の、少量のポリカチオンの存在に対する感受性を、商業用イオン交換器からの漏れをチェックするための分析的方法として用いることができる。少量の負電荷アガロースポリマーが、ＣＭ−セファロースから漏れたようである。ＤＮＡ分子もポリアニオンであるので、これらはＤＮＡ分離に影響を与えないと予測される。電気泳動に用いられるアガロースゲルには、少量の負電荷が存在することが知られており、これは不利な影響を伴なわない。実施例２に記載された精製方法は、電気泳動用のゲルにおいてこれらを使用する前、他の多糖類の精製に適している。
セルロースのその他の誘導体も、向上した選択性を有するゲルの調製に適している（実施例８）。メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースは、ＮＡＴ及びＢｉｓと組合わせた場合、大きなＤＮＡ断片の向上した遅滞を示すゲルを生じた。これらの結果が示すことは、セルロースと結合した様々な基が、例えば溶解性、粘性、及び疎水性を含むその特性のいくつかに影響を与えることが知られているが、セルロースポリマーに存在する基の種類は、あまり重要ではないということである。
様々なセルロース誘導体の記載されているような能力があるとすれば、その他の多糖類をテストするのも合理性のあるものであった。アガロースはまた、ゲルが向上した選択性を示すように、ＮＡＴ−Ｂｉｓゲルの特性を変えることができた。実施例１０に開示されているように、誘導体化アガロースにも同じことがあてはまった。様々な種類のアガロース間にはいくつかの大きな差があった。同じ遅滞効果を得るには、例えばヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）アガロースよりはるかに低い濃度のシープラク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）アガロースが必要であった。さらには選択的遅滞は、高い温度で操作されるヌシーブ含有ゲルではほぼ完全に失われているが、一方同じ操作条件下において、シープラクアガロースを含むゲルは、その向上した選択性を保持した。ヌシーブアガロースとシープラクアガロースのどちらも、ヒドロキシエチル基を含むアガロース誘導体である（米国特許第３，９５６，２７３号及び第４，３１９，９７５号）が、ヌシーブアガロースにおけるポリマーの長さはより低い。従ってアガロースポリマーの分子量は、ＨＥＣポリマーに関して既に見られているように、重要な役割を果たした。アガロースとセルロースとは、どちらも線状ポリマーである点で似ている。これらは、糖成分、グリコシド結合、及びゲル形成能力において異なる。誘導体化セルロースは、高温及び低温において溶液のままに止まるが、アガロースポリマーは熱可逆ゲルを形成する。アガロースポリマーの会合状態は温度依存性であるので、重合温度を変えることによって様々な選択性を有するゲルを製造しうると予測されよう。等しい量のシープラクアガロースを含有するが、様々な温度で重合されたポリ（ＮＡＴ）−Ｂｉｓゲルの場合に、このことが実際に観察された。最良の結果は、約３５℃で重合されたゲルの場合に得られた。この温度は、このアガロースのゲル化温度よりも高い。非常に多くの場合、様々なアガロース誘導体を含むゲルに擾乱が見られた。これらの擾乱は、大部分、波状の裂けたバンドの形態で現われた。これらの起源はおそらく、重合中のゲルの長さ又は厚さにおける温度変動と関連しているであろう。遊離基重合は、発熱反応であり、局部温度変動が、アガロースポリマーの会合状態に影響を与えることもあろう。このことが今度は、ゲルポリマーのトポロジーに影響を与えることもありうる。それにもかかわらず、向上した選択性を有する最良のゲルの１つは、０．２％シープラクアガロースを含む１２％Ｔ、２．６％Ｃゲルであった。ゲル化多糖類が用いられる時、重合条件はより正確に制御される必要があるが、様々な重合温度を選択することによってゲル特性を変えることは、向上した選択性を有するゲルを目的に合わせて作るためのもう１つの方法である。
実施例１１に記載されているように、その他の多糖類も用いられた。これらには、デキストラン、イナゴマメから生じた多糖、及びカルビン型のガラクトマンナンが含まれる。イナゴマメの多糖はガラクトマンナンでもあり、これはイナゴマメガムから抽出した後でさらに精製することなく用いられた。これらの３つのものはすべて、枝分かれ多糖類である。デキストランは、分子量が５００，０００であり、一方イナゴマメから生じたガラクトマンナンは、それぞれの製造業者が明記しているように、分子量が３００，０００であった。デキストランは高度に枝分かれしたグルコースポリマーであるが、ガラクトマンナンは、２つの別々の単糖類、すなわちガラクトースとマンノースとを含んでいる。ガラクトース残さは、ポリマンノースバックボーン上の枝として生じる。ポリマーはすべて、向上した選択性を有するゲルを生じることが可能であった。しかしながらデキストランの必要とされる濃度は、ガラクトマンナンのものよりもはるかに高かった。後者の場合、ポリマー０．０１％（カルビンガラクトマンナン）又は０．０２％（イナゴマメのガラクトマンナン）のみを含むゲルにおいて強い遅滞があった（実施例１１）。その他のいくつかのポリマーの場合、向上した選択性を有するゲルは、０．０１％より低い濃度においてさえ、あるいは別のＴ値において、あるいは別のモノマー又は架橋剤を用いてでさえ得ることができることもありうる。より高いテスト濃度において、イナゴマメのガラクトマンナンは、ＤＥＡＥ−セファロース上を通過させられたＨＥＣの場合に見られたものと同様なゲル分解能の減少を生じたことは興味深いことである。この減少を生じた原因は、詳細には調査されなかった。重要な事実は、テストされたすべての多糖類は、向上した選択性を有するゲルを生じうるということである。実施例に記載されているように、多くの様々な多糖類が用いられたが、適したものになりうるものが他にもある。これらには、スターチ、レバン、グルカン、マンナン、キシラン、及びその他の多糖類が含まれる。向上した選択性を有するゲルは、実施例１３に示されているように、１つ以上のポリマーを含んでいてもよい。
合成ポリマーも重合溶液に添加された。２つの分子量（４，０００及び８，０００）のポリエチレングリコールは、向上した選択性を有するゲルを生じなかった。ただしゲル不透明度は、２％のＰＥＧ８，０００を含むゲルにおいて実質的に増加した（実施例１４）。分子量３６０，０００のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は、０．５％までの濃度で重合溶液に添加された時に、ゲル不透明度の顕著な増加を生じなかった。ＰＶＰを含むゲルにおけるＤＮＡ移行距離は、対照ゲルのものと同様であった。分子量２２，０００のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）がポリマーとして用いられた場合、ゲル不透明度は、ＰＶＡ濃度に応じて変化した。しかしながら選択性の増加はなかった。実際には選択性の減少があり、ＤＮＡバンドは、対照ゲルにおいてよりもＰＶＡを含むゲルにおいて、より広がっていた（実施例１４）。これらの結果は次の結論を確認している。すなわち、ゲル不透明度の増加は、向上した選択性を有するゲルを得るのに十分な条件ではないということである。３つの合成ポリマーは、その構造において、及びその平均分子量においても異なっていた。重合溶液中のＰＶＰの存在は、用いられた方法によって検知しうるゲルポリマーの新たな配置を、結果として生じなかった。これはＰＥＧ及びＰＶＡの存在下に生じたが、これらの凝集体は次のような構造のものであり、あるいは次のように結合されていた。すなわち、ゲル選択性の増加が得られないようなものである。
線状ポリアクリルアミドもポリマーとして用いられた。用いられたポリマーは、分子量が１０，０００であった（ポリサイエンス社）。１２％Ｔ、２．６％Ｃ  ＮＡＴ−Ｂｉｓ溶液中のポリアクリルアミドの存在によって、実施例１５に記載されているように、ゲル透明度に大きな変化が生じた。同様に、ポリアクリルアミドを含むゲルにおいて、比較的大きいＤＮＡ分子の強力な遅滞があった。この発見事項は、その他の合成ポリマーの場合に得られた結果を見ると驚くべきことであった。ポリアクリルアミドを含むゲルはまた、高温で操作された場合もその向上した選択性を保持した。
ポリアクリルアミドの場合の予期されなかった発見事項に従って、ポリ（ＮＡＴ）ポリマーがテストされた。これは、重合前にＮＡＴ＋Ｂｉｓ溶液に添加された場合、これらのゲルが向上した選択性を示すような変化を、ゲルポリマーの配置に引起こした。従って、この発明の予め形成されたポリマーは、ゲルポリマーと同じ反復モノマー単位から構成されていてもよい。しかしながらこのポリマーは、その存在が新たに規定された特性を有するゲルの形成を生じるような比で、モノマー及び架橋剤に添加されなければならない。当業者なら、適したものになりうるような多くの合成ポリマーがあることを理解するであろう。第一にこれらには、米国特許第５，１８５，４６６号に記載されているもののような、その他のＮ−ヒドロキシアルキルアクリルアミドが含まれる。その他のＮ−ヒドキシアルキルアクリルアミド、並びにその他のビニルモノマーも、文献から知られている。このポリマーはまた、１つ以上のモノマーから誘導された単位を含んでいてもよい。このようなポリマーの調製は、様々なモノマーの重合率が匹敵しうるものである場合、簡単である。本発明のゲルの調製のためには、ポリマーは、モノマー及び架橋剤が溶解されているのと同じ溶媒中に可溶である必要がある。大部分の場合、水は優れた溶媒であろうが、その他の溶媒又は溶媒混合物も用いることができる。
新しいゲルにおける選択的遅滞の規模は最も驚くべきことである。ゲル濃度全体を増加させた時に、移行分子が遅滞させられることが予測できる。しかしながら前記のように、ゲル濃度を１０％増加させた後、拡大オガトンモデルに基づいた場合、移行速度のせいぜい２倍の減少を予測するのが合理性のあるものであった。この有名なモデルによって、ゲル濃度に伴なう電気泳動移動度の変化について予測することはできない。新しいゲルにおいて、例えば０．１％ポリマーを含む１２％Ｔゲルにおいては、総ゲル濃度は多くの場合、１％以下しか増加しなかったが、より長いＤＮＡ断片の移行速度は、１桁以上の程度の規模だけ変化することが多かった。実際に、１０Ｖ／ｃｍにおいて１５時間もの長さの電気泳動後に、いくつかのゲルにおいて、１００倍以上も低いＤＮＡ移動度が検知された。一晩の操作後に数ミリメートルだけ移行したＤＮＡ断片が、鋭いバンドを示したことは注目すべきである。従って、高分子の枝分かれ架橋剤を含んでいたゲルを用いた初期の場合のように、強力な遅滞はゲル分解能の減少とは関連していなかった（引例１５）。
前記ゲル電気泳動の３つのモデルに加えて、４つ目のモデルは次のことを提案している。すなわち高分子の電気泳動移行は、ゲル粘度として記載することができるということである（引例２８及び２９）。従って重合溶液に添加された様々なポリマーの粘度を測定することは有利であった。これらの測定は、２０℃で、通常は落球粘度計（ギルモント社（Ｇｉｌｍｏｎｔ））を用いて、ゲル中のものと同一のポリマー濃度において実施された。この粘度計は、水でキャリブレーションされた。精製ＨＥＣ（フルカ社（Ｆｌｕｋａ））溶液は、０．２％において粘度が１．５ｃｐｓであった。精製ＨＥＣ（分子量９０，０００〜１０５，０００、ポリサイエンス社）溶液は、０．２％において２．９ｃｐｓの粘度を示した。０．５％ＰＶＰ（分子量３６０，０００）の粘度は、１．４ｃｐｓ、ガラクトマンナン０．２％溶液（カルビン型、セン・ケミカルズ社（Ｓｅｎｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））は、４．５ｃｐｓ、２％ＰＥＧ８，０００については１．５ｃｐｓであった。従ってＨＥＣ（フルカ社）、ＰＶＰ、及びＰＥＧ溶液は、同様な粘度を有していたが、これらのポリマーを含んでいるゲルは、各実施例に開示されているように、非常に異なる選択性を有していた。従って粘度測定に基づいた場合、ポリマーが向上した選択性を有するゲルを生じるかどうかを予測することはできない。他方で、ゲル選択性の改良を生じたポリマー群において、比較的大きい分子の選択的遅滞は、より高い粘度のポリマーの場合により強かった。ＨＥＣの場合、粘度がポリマーサイズに比例し、かつ以前の実験では比較的長いポリマーがより強い遅滞効果を生じることが立証されているので、このことは予期されていたことである。一般にポリマーを含む重合溶液の粘度は、ポリマーを含まない対照溶液の粘度よりもせいぜい数倍高いだけであるということに注目することは重要である。いくつかのＤＮＡ分子の移動度が、１桁以上の程度の規模だけ減少することが多かったので、ＤＮＡ分子の移動度と重合溶液の粘度とを相互に関連させることはできない。
本発明の実施において、ゲル重合中に存在するポリマーは、大きいＤＮＡ分子が低下した速度で移行するというような変化をゲル構造に引起こす。ゲル構造における変化は、ゲル不透明度、あるいは透明度として測定された。不透明度における変化は、新しいゲルにおいて常に見られたが、実施例に開示されているように、この変化の規模は大きく異なっていたことは注目に値する。その規模からすると、ゲルが向上した選択性を有するかどうかについて言うことは不可能であった。いくつかの場合に、不透明度が少しだけ増加したゲルは、良好な選択性を示した。例えば０．０２％イナゴマメガム又は０．０１％カルビン型ガラクトマンナンを含むゲルである（実施例１１）。これらのゲルの６００ｎｍにおける吸光度は、約０．０８に過ぎなかった。光学的性質においてより小さい変化のあるゲルでさえ、あるいは検知しうる変化のないゲルもまた、改良された選択性を示すことはありうる。さらにはポリマートポロジーにおける変化を検知するもう１つの方法は、これらの変化と向上した選択性とを相互に関連させるのにより適しているであろう。幅広い波長範囲において記録されたスペクトルは、単一の波長における吸光度測定よりも多くの情報を与えてくれる。４００〜８００ｎｍの範囲において多くのスペクトルが記録された。どちらのゲルもキュベットで重合され、３ｍｍ厚さのゲルピースのものである。図２は、１２％Ｔ、２．６％Ｃポリ（ＮＡＴ）−Ｂｉｓゲルのこのようなスペクトルを示しており、ＨＥＣを含まないもの（図２Ａ）、あるいは０．０５％ＨＥＣを含むもの（図２Ｂ）、０．１０％ＨＥＣを含むもの（図２Ｃ）、０．１５％ＨＥＣを含むもの（図２Ｄ）、０．２０％ＨＥＣを含むもの（図２Ｅ）、及び０．３％ＨＥＣを含むもの（図２Ｆ）を示している。ＨＥＣ濃度を増した場合のゲル不透明度の強い増加は明白である。その他の多くのポリマーを用いて、同様なスペクトルが得られた。このスペクトルから、どのゲルが向上した選択性を示すかを予測することは不可能であった。様々なポリマーを含んでいる同様なスペクトルを有するゲルは、多くの場合、大きく異なる選択性を示した。あるケースでは、ＰＶＡがポリマーとして用いられた場合、４００〜８００ｎｍ範囲における吸光度の増加は、選択性の悪化と関連していた（実施例１４）。スペクトルからは、ゲルが向上した選択性を有するかどうかを予測することはできなかったが、どのゲルが幅広いバンドによって低い分解能を有するかを予測することはできた。実験したすべてのケースにおいて、ＤＮＡバンドは、ゲルの吸光度が４００〜８００ｎｍ範囲全体において２．０以上である場合に常に幅広く分散していた。このようなゲルは、強いバックグラウンド染色を示すことが多かった。さらには可視領域におけるスペクトルから、４００ｎｍ及び８００ｎｍにおける吸光度比は一般に、ポリマー濃度の増加と共に減少したことが観察された。この比は、ポリマーがまったく添加されていないゲルの場合に最高であったが、絶対吸光度の値は最低であった。例えば１２％Ｔ、２．６％Ｃ  ＮＡＴ−Ｂｉｓ対照ゲルは、４００ｎｍ及び８００ｎｍにおける吸光度が各々０．１０９と０．００８であり、一方、吸光度の値は、０．０２���カルビン型ガラクトマンナンを含む等しいＴ及びＣのゲルについては、０．６５６と０．１０１であった。その他の多くのゲルについても同じ挙動が見られた。この発見事項が示すことは、比較的大きい凝集体の量は、比較的小さい凝集体の量よりもさらに比例的に増加したということである。しかしながら絶対的な意味では、すべてのゲルにおいて８００ｎｍにおいてよりも４００ｎｍにおいての方が吸光度がより高いことから判断して、比較的小さい凝集体の量は、比較的大きい凝集体の量より常に多かった。
ゲル不透明度の増加として検知された、ゲルポリマー配置における変化は、前記のように、向上した選択性を有するゲルの製造にとって十分なものではない。選択性を改良することなく、ゲル不透明度における顕著な変化を生じた１つのポリマーは、ＰＥＧ８，０００であった。ＰＥＧは、小さい−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−反復単位から構成されている線状ポリマーである。このようなポリマーが、他のポリマーのネットワークを通して引張られる時には摩擦はほとんどないであろう。構造−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−を有するポリビニルアルコールもまた、小さい反復単位を含んでいる。ＰＶＡを含むゲルの不透明度は増加したが、選択性は増加しない（実施例１４）。これらの発見事項が示すことは、本発明のポリマーは、向上した選択性を生じるためには、ある最小サイズの反復単位を有する必要があるということである。ポリアクリルアミド、すなわち−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＯＮＨ2）−は、向上した選択性を有するゲルを生じるので、既にこの基準を満たしている（実施例５）。嵩高い反復単位を有するポリマーは、一般に効果的であった。例外はポリビニルピロリドンであったが、このポリマーは、最初はゲル不透明度に重要な変化を生じなかった。たとえポリマー構造が適切であっても、ポリマー鎖が短すぎるならば、選択性の向上はないであろうということに注目することが重要である。これは、分子量２４，０００〜２７，０００のＨＥＣが、十分に向上した選択性を有するゲルを生じることができないということによって例証されている。
正しい構造及び分子量のポリマーは、ゲル重合中にこれが存在することによって、大きなＤＮＡ分子の移行速度の大きな減少を特徴とするゲルを生じるようなものである。この減少は、ゲルポリマー間のより高い摩擦と関連することもあろう。ＤＣモデルによって提案されているように、ゲル電気泳動中にＤＮＡ分子がゲルポリマーを置換するならば、その場合にはゲルポリマー間の摩擦の増加によってＤＮＡの運動が減速されるであろう。小さいＤＮＡ断片は、２〜３のポリマーだけしか置換する必要がない。大きい断片は、これらが移行する開口部を形成するために、多くのものを押しのける。ゲルがポリマー凝集体を含んでいる時、その場合には大きいＤＮＡ分子はこれらの凝集体を置換する。これらの凝集体が別のポリマーによって連結されるならば、その場合には移行ＤＮＡは、ゲル繊維と、凝集体を結合している予め形成されたポリマーとの間の、凝集体内部の高い摩擦によって、凝集体を置換させることはできないかもしれない。従って新しいゲルは、移行ＤＮＡ分子に適切な抵抗性を与えることができる。このような摩擦の増加を発生させうるということは現実的であろうか。最近の論文において（引例３０）、狭い空間へと閉じ込められたポリマーの挙動が考察されている。有効空間がポリマーサイズの空間に近付く時に、新しい動的挙動が生じる。現在、ナノレオロジーをよりよく理解する方向へ、多くの研究活動が向けられている。すなわち、分子の大きさの空間へと閉じ込められた物質の変形のことである（引例３０）。記載されている引例において取扱われている状況は、電界及び移行分子が存在しないので、本発明のものとは異なる。それにもかかわらずこれは、ポリマーのディスロケーションのための空間が制限されている時に、摩擦の非常に大きな増加が生じうるという見解への支持を与える。このような状況がゲル凝集体にも存在することが、ここで提案されている。ポリマーの存在下に形成された凝集体は、前記のように、おそらく架橋剤に富むものであろう。架橋剤のレベルの増加によって、及びゲルポリマーの高い局部濃度によって、凝集体の内部では、加えられたポリマーはほとんど自由空間を有していない。さらにはこれらの長さに沿って、ゲルポリマーとからみ合ったループ及びヘアピン構造があることがある。２つの凝集体の置換によって、加えられたポリマーが、これらのうちの１つから引張られる必要がある。もしこのことが、移行ＤＮＡが有する以上の力を必要とするならば、その場合にはＤＮＡはまったく移行しないであろう。サンプルのくぼみ（ｗｅｌｌ）の壁に残っっているＤＮＡバンドは、実施例に記載されているように、この発明の多くのゲルにおいて見られた。
これらの新しいゲルにおいて、ゲルポリマーと移行ＤＮＡ分子との間に比較的高い摩擦があるならば、その結果としてＤＮＡサイズと可動性との間に異なる関係が生じることもあろう。実際、ＤＮＡ断片のサイズ対これらの可動性の相互関係をプロットした後でこのことに気が付いた。天然及び合成ポリマーから構成されるものを含む、多くの様々な化学組成の標準的ゲルにおいては、以前に報告されているように（引用１６〜１８）、ＤＮＡサイズとこれらの可動性の相互関係との間に直線的関係がある。この関係は、新しいゲルのいくつかについてのみ詳細に調査された。０．２％シープラクアガロースを含む１２％Ｔ、２．６％Ｃゲルにおいて、ＤＮＡサイズ対可動性の相互関係のプロットは、強い湾曲を示す（図３）。図４においてＤＮＡサイズがμ1/3に対してプロットされた時に、はるかに良好な直線性が見られた。図５に示されているように、０．１％ポリアクリルアミド（分子量１０，０００）を含む１２％Ｔ、２．６％Ｃゲルの場合も直線が得られた。従って本発明のゲルには、ＤＮＡ断片サイズとこれらの可動性との間に新たな関係が存在する。図４及び５に示されているプロットから、外挿による値μ1を評価することができ、ついで方程式５を用いて、移行ＤＮＡ分子とゲル繊維との間の摩擦を、以前に記載されているように（引用１６〜１９）計算することができる。計算された摩擦は、古いゲルよりもはるかに高かったが、その詳細は本発明の範囲外である。
異常な配列依存性ＤＮＡ可動性は、ゲル電気泳動によるＤＮＡサイズ評価の主な限界である。驚くべきことに、新しいゲルのいくつかにおいて、ゲルが２０℃で流された場合でさえ、異常な可動性は大幅に抑制されることが観察された。このようなゲルの例は、０．２％シープラクアガロースを含むポリ（ＮＡＴ）−Ｂｉｓ（１２％Ｔ、２．６％Ｃ）ゲル、及びポリ（ＮＡＴ）を含む同じゲルである。図６は、１０Ｖ／ｃｍにおいて、２０℃で１２時間電気泳動された、０．３％のポリ（ＮＡＴ）が加えられたゲルを示している。異常な可動性は、ゲルが５５〜６５℃で電気泳動された時に完全に取り除かれる。これは、０．２％シープラクアガロースを含む１２％Ｔ、２．６％Ｃゲルの隣接レーンにおいて操作された３つの別々のｐＢＲ３２２消化から判断したものである（図７）。ゲルは１０Ｖ／ｃｍにおいて、６２℃で２．５時間流された。様々な制限酵素でのｐＢＲ３２２の消化によって得られたＤＮＡ断片のサイズは、「分子生物学ラブファックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ）」（Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ，Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）から取られたものである。これらの異常な可動性の原因になるメカニズムに関して、現在は２つの見解がある。１つの意見では、異常な移行ＤＮＡ分子は曲がっていると規定しているが、もう一方の意見では、このような分子がいくつかの接点において増加した柔軟性を示すと考えられている。どちらの意見が本発明の結果によって支持されるかについての考察は、この発明の範囲から外れるが、ＤＮＡ断片サイズの正確な評価を必要とするような用途にとって新しいゲルが有利なものであると認識することが重要である。
新しいゲルにおいては、異常な可動性が大幅に取り除かれているだけでなく、これらのゲルはまた、１００ｂｐ範囲においてＤＮＡ断片間の１ｂｐ差を分離（ｒｅｓｏｌｖｅ）することができる。このような分離は図６に示されている。ここでは、１３１及び１３２ｂｐの断片、及びまた１５１、１５２、及び１５３ｂｐの断片も、ｐＢＲ３２２／Ｈｈａｌ消化において分解されている（レーン２及び３）。従って選択性の向上によって、以前に可能であったものよりもはるかに短いゲル長さに関して良好な分解が可能にされた。２００ｂｐ範囲における４ｂｐ差は、ＤＮＡ断片が約２ｃｍだけ移行した後で分解されたことは注目に値する。これもまた向上した選択性を証明している（図６、レーン３）。新しいゲルのゲル長さは、ここで例に挙げられているものより長くなりうるのは明らかである。重要な事実は、実質的により短いゲルでも、より長い古いゲルと比較して、同じ分離を得るには十分であるということである。短いゲルが好ましいのは、注型及び取扱いがより容易であるからだけでなく、ゲル調製のため及び分離されたバンドの検知のために必要な試薬がより少ないからである。さらにはバンド幅が移行距離と共に増加するので、短いゲルにおいてバンドはより鋭い。
本発明のゲルは、従来技術において知られている様々なフォーマットで操作しうる。添付実施例において開示されているように、大部分のゲルは、液内ゲル電気泳動方法で操作されたが、垂直に操作されたものもあった（実施例９）。同様に平台及び毛管方法でこれらを操作することも可能である。これらの方法の各々は、特定の用途に対して利点がある。当業者は、ある電気泳動法を別の方法に変える時に行なわなければならない通常の適応方法を知っている。ゲルは様々な電界強度で操作することができる。大部分の本発明のゲルは、様々なゲルの比較を容易に行なうことができるように、１０Ｖ／ｃｍで電気泳動にかけられた。同様に、より低い電圧で操作されたゲルもあり（実施例８）、より高い電圧のものもある。１５Ｖ／ｃｍでの液中方法において、ＨＥＣ、ポリアクリルアミド、及びポリ（ＮＡＴ）を含むテストゲルは、その向上した選択性を保持していた。薄いゲル又はゲル充填毛管を用いる時は、より高い電場強度を用いることができる。これらのゲルは、多くの実施例によって示されているように、様々な温度で用いることができる。本発明のゲルは、ここでは分析的用途に用いられたが、これらは製造のための用途にも用いることができる。電気泳動中、移行分子は新しいゲル全体を通って移行することもあり、あるいは新しいゲルは分離マトリックスの一部のみを表わすこともある。ゲル長さは、特定の分離ニーズの必要条件を満足させるために様々なものであってもよい。新しいゲルの高い選択性によって、長さ１ｍｍ又はそれ以下の非常に短いゲルは、必要とされる分離を生じうる。ゲルの濃厚さも様々であってもよい。速い操作には非常に薄いゲルが一般に最も適している。ゲルは膜の形態で製造されてもよい。総ゲル濃度は、分析されるサイズ範囲に従って様々である。最低のゲル濃度は、モノマーの重合効率によって制限されており、これは大部分の場合、約４％であろう。最も高いゲル濃度はまた、分離される分子のサイズ範囲によって、及びモノマーの溶解性によっても決定される。ゲル濃度はその長さに沿って様々であってもよい。このような勾配のゲルは、いくつかの用途においては有益であろう。同様に、ポリマー濃度勾配を有するゲルを作ることも可能である。
新しいゲルは添加剤及び変性剤を含んでいてもよい。これらの向上した選択性は、実施例１７に開示されているように、変性剤のウレアの存在下に保持された。変性条件下の電気泳動が、ＤＮＡ配列のために用いられ、この用途もまた、向上したゲル選択性から利益を得る。重合が実施例１７に記載されているように変性剤の存在下に実施される場合、必須ゲル成分の比は調節する必要があるであろうということに留意することが大事である。
本発明のゲルにおいて、選択的遅滞は、ＤＮＡ分子の場合にのみ詳細に調査された。その他の高分子も同様な挙動を示すであろう。大きなタンパク質も選択的に遅滞されるかどうかを解明することは有利なことであった。バイオ−ラッド・ミニプロテアン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ）電気泳動装置を用い、垂直フォーマットで電気泳動を実施した。サイズ範囲６６０，０００Ｄａ〜６６，０００Ｄａの天然タンパク質（ファーマシア・ハイ・モレキュラー・ウエイト・マーカーズ社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｈｉｇｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒｓ））が、０．０６％ＨＥＣ（分子量９０，０００〜１０５，０００）を含む９％Ｔ、２．６％Ｃポリ（ＮＡＴ）−ＢＩｓゲルにおいて操作された場合、ＨＥＣを含まない対照ゲルと比較して、移行距離にはほとんど差はなかった。大きなＤＮＡ分子は、同じ組成のゲルにおいて強く遅滞された。必須ゲル成分の比がタンパク質分離に最適なものでなかったこともありうるが、前記発見事項が示しうることは、ゲルを通るタンパク質移行のメカニズムが、ＤＮＡ移行のメカニズムとは異なるということである。この仮定は、様々なポリマーを含むポリアクリルアミドゲルにおけるＳＤＳ−タンパク質の電気泳動に関する論文に記載されている結果と一致しているように思われる（引用３１）。ここでは天然タンパク質が操作され、引用の出版物では変性タンパク質が操作されたことに注目すべきであろう。選択性の中程度の変化だけが引用３１において報告された。興味深いことには、比較的小さいＳＤＳ−タンパク質が比較的大きいものよりもさらに比例的に遅滞させられた。この結果は、ここに記載された発見事項とは正反対である。ここでは比較的大きいＤＮＡ分子は、小さいものよりもより多く遅滞させられた。この引用において、ポリアクリルアミド−Ｂｉｓゲルの架橋度は、この研究においてＤＮＡ分離に最適であると分かったものよりもはるかに低かった（２．６６％）。さらにはゲルの不透明度は測定されず、従って不透明性についての比較を行なうことはできない。低い架橋度は、この研究の結果と引用の出版物の結果との差の主な理由でありうる。同様に、ＳＤＳ−タンパク質複合体の電気泳動移行のメカニズムは、ＤＮＡ移行のメカニズムとは異なることもありうる。その場合、ＳＤＳ−タンパク質の場合に得られた結果は、ＤＮＡにはあてはまらないし、逆も同じである。この問題を明確にするには、さらなる研究が必要である。
ポリアクリルアミド−Ｂｉｓゲルの分離選択性が実質的に改良されうるであろうという本発明の発見は、長年にわたるこのマトリックスの広範な研究から考えれば驚くべきことである。ここに記載された実験的研究が完成した時、文献をさらに調べた結果、２つの興味深い論文が発見された。第一の論文（引用３２）において研究者らは、アガロースを非制限的濃度で含むポリアクリルアミドゲルを用いることによって、自由可動性を測定する可能性について研究していた。アガロースの濃度は０．４％であり、架橋度は２．５％であり、Ｔは、０〜１０％の様々なものであった。タンパク質とＤＮＡは、様々な組成のゲルにおいて操作された。これらの可動性が測定され、ファーグスン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）プロットを構成するのに用いられた。引用の図７は、アガロースを含むゲルと含まないゲルにおいてファーグスンプロットを比較している。アガロースを含むゲルの向上した選択性は明らかである。これは、１．３ｋｂｐ断片の移行が、アガロースを含むゲルにおいて約８倍も少なかったからである。しかしながら、引用の出版物において、ＤＮＡは、電気泳動中に記録することができるように、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で予め染色されていたことに留意すべきであろう。従って引用の図７は、ＤＮＡ−ＥｔＢｒ複合体の可動性を示しているのであって、純粋ＤＮＡの可動性を示しているのではない。本発明において、ＤＮＡは常に電気泳動後に染色され、従って移行速度は、純粋ＤＮＡ断片に関するものである。ＥｔＢｒの結合は、ＤＮＡ可動性を減少させることが知られている。さらには、約５％以上の高いゲル濃度において、ＥｔＢｒは、電気泳動中にＤＮＡから解離する。この結果、異常な移行速度と広がったバンドとが生じる。従って引用３２の結果と本発明の結果とを直接比較することはできない。さらにはゲルの光学的性質に関するデータは引用には示されていない。実施例５に記載された結果に基づく場合、２．５％の架橋度は、向上した選択性を有するポリアクリルアミド−Ｂｉｓゲルを得るのに最適ではない。同様にこれらの研究者らは、調査されたゲルのどれに関しても、向上した選択性、あるいはよりよい分解能について言及していないことにも注目すべきであろう。
ファーグスンプロットを用いたポリアクリルアミドゲルの細孔サイズの評価に関する研究において（引用３３）、架橋度３％のポリアクリルアミド−Ｂｉｓゲルに、アガロースが０．５％で添加された。アガロースを含むゲルの細孔サイズは、アガロースを含まないゲルの細孔サイズの約１／２であったと報告された。
アガロースを含むゲルの光学的性質は、アガロースを含まないゲルのものと異なるという指摘はなかった。さらには様々なゲルの分解能については扱われていなかった。ＤＮＡゲル可動性の第一の決定要因は、総アクリルアミド濃度であることが示唆されていた（引用３３）。これに対して本発明の結果は、モノマー及び架橋剤に、あるい一定の割合でポリマーを添加することによって、ゲル濃度を少し増加させると、ＤＮＡ分子の電気泳動可動性を大きく変えることができることを示した。
引用
１．Ｐｅａｃｏｃｋ，Ａ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｄｉｎｇｍａｎ，Ｃ．Ｗ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，６６８−６７４
２．Ｂｏｄｅ，Ｈ．Ｊ．（１９７７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８３，２０４−２１０
３．Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｐ．Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｇ．Ａ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｄ．（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４３，３３３−３４０
４．Ｂｏｄｅ，Ｈ．Ｊ．（１９７６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，６５，５６−５８
５．Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，Ｐ．Ｇ．，Ｃａｇｌｉｏ，Ｓ．，Ｓａｒａｃｃｈｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｑｕａｒｏｎｉ，Ｓ．（１９９２）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１３，５８７−５９５
６．Ａｓｎａｇｈｉ，Ｄ．，Ｇｉｇｌｉｏ，Ｍ．，Ｂｏｓｓｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，Ｐ．Ｇ．（１９９５）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１０２，９７３６−９７４２
７．Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，Ｐ．Ｇ．，Ｂｒｏｓｔ，Ｂ．Ｃ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｓ．（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４，３４７−３６３
８．Ｇｅｌｆｉ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，Ｐ．Ｇ．（１９８１）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２，２１３−２１９
９．Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｊ．（１９６４）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２１，４０４−４２７
１０．Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，Ｐ．Ｇ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９，１−２０
１１．Ｒｏｄｂａｒｄ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｃｈｒａｍｂａｃｈ，Ａ．（１９７０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６５，９７０−９７７
１２．Ｔｉｅｔｚ，Ｄ．（１９８８）Ａｄｖ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２，１０９−１６９
１３．Ｗｙｃｋｏｆｆ，Ｍ．，Ｒｏｄｂａｒｄ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｃｈｒａｍｂａｃｈ，Ａ．（１９７７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７８．４５９−４８２
１４．Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ，Ｎ．Ｃ．（１９８７）Ａｄｖ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１．１７９−２２８
１５．Ｋｏｚｕｌｉｃ，Ｂ．（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，４，１１７−１２３
１６．Ｋｏｚｕｌｉｃ，Ｂ（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，４，１２５−１３６
１７．Ｋｏｚｕｌｉｃ，Ｂ（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，４，１３７−１４８
１８．Ｋｏｚｕｌｉｃ，Ｂ（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，４，１４９−１５９
１９．Ｋｏｚｕｌｉｃ，Ｂ（１９９５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２３１，１−１２
２０．Ｇｉｄｄｉｎｇｓ，Ｊ．Ｃ．（１９９１）Ｕｎｉｆｉｅｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
２１．Ｌａｉ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｂｉｒｒｅｎ，Ｂ．Ｗ．（Ｅｄｓ．）（１９９０）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
２２．Ｂｉｒｒｅｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｌａｉ，Ｅ．（１９９３）Ｐｕｌｓｅｄ  ｆｉｅｌｄ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
２３．Ｂｒａｓｓａｒｄ，Ｅ．，Ｔｕｒｍｅｌ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｎｏｏｌａｎｄｉ，Ｊ．（１９９２）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１３，５２９−５３５
２４．Ｕｌａｎｏｖｓｋｙ，Ｌ．，Ｄｒｏｕｉｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３，１９０−１９１
２５．Ｄｅｓｒｕｉｓｓｅａｕｘ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｓｌａｔａｒ，Ｇ．（１９９６）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１７，６２３−６３２
２６．Ｃｈｉａｒｉ，Ｍ．，Ｃａｍｐｏｌｅｏｎｉ，Ａ．，Ｃｏｎｔｉ，Ｐ．，Ｆｅｌｌｉ，Ｃ．，Ｐａｔｒｏｓｓｏ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｇｒｅｎ，Ｃ．Ｈ．（１９９６）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１７，４７３−４７８
２７．Ｂａｒｒｏｎ，Ａ．Ｅ．Ｓｕｎａｄａ，Ｗ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｌａｎｃｈ，Ｈ，Ｗ．（１９９６）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１７，７４４−７５７
２８．Ｂｏｄｅ，Ｈ．Ｊ．（１９７９）Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，３４ｃ，５１２−５２８
２９．Ｂｏｄｅ，Ｈ．Ｊ．（１９８０）Ｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ’７９（Ｒａｄｏｌａ，Ｂ．Ｊ．，Ｅｄ．）Ｗ．ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，ｐｐ．３９−５２
３０．Ｃａｉ，Ｌ．Ｌ．，Ｐｅａｎａｓｋｙ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｇｒａｎｉｃｋ，Ｓ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，４，４７−５１
３１．Ｇｅｒｓｔｅｎ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｉｊｗａａｒｄ，Ｋ．Ｅ．（１９９２）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１３，２８２−２８６
３２．Ｐｏｓｐｉｃｈａｌ，Ｊ．，Ｖｉｃｃｈｉｏ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｃｈｒａｍｂａｃｈ，Ａ．（１９９１）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１２，２４７−２５３
３３．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ，Ｎ．Ｃ．（１９９１）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１２，６１２−６１９
実施例
ゲルは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）と過硫酸ナトリウムを開始剤として用い、フリーラジカル重合により調製した。ほとんどの場合、モノマー−架橋剤溶液２０ｍｌに、ＴＥＭＥＤ４５μｌおよび過硫酸ナトリウム６０μｌ（１１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。別に記載しない限り、ＮＡＴをモノマーとして、Ｂｉｓを架橋剤として用いた。ゲルは、厚さ３ｍｍ、長さ９２ｍｍであった。ほとんどの場合、引き続き行う生成ゲルの吸光度測定用に、重合溶液２ｍｌアリコートを１ｃｍの使い捨てプラスチック製キュベットに入れた。重合中に、電気泳動用ゲルをプラスチック支持物（ゲルボンドフィルム、ＦＭＣ社）に共有結合にて固定した。ゲルは浸漬電気泳動モードで実験を行い、したがって、そのイオン組成は、米国特許第５，４５８，７６０号に従って調整した。電気泳動には、Ｇｕｅｓｔ  Ｅｌｃｈｒｏｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  のＳＥＡ  ２０００浸漬電気泳動装置を用いた。この装置の特徴は、米国特許第５，２５９，９４３号で開示されたように、電場の直線性、緩衝液の再循環および温度制御が改善されたことである。すべての電気泳動実験は、設定時間後に自動停止するプログラム可能な電源を用いて行った。大半の実験で、泳動緩衝液の温度は、泳動緩衝液中に配置した温度プローブを用いて制御した。このプローブは循環水浴（ドイツ、Ｈｕｂｅｒ）に接続した。電気泳動の開始時のアンダーシュートに続く２、３℃のオーバーシュートの後、温度は通常、設定値の１℃以内で安定した。１台の電気泳動装置では、典型的に、ゲル３〜４個で実験した。別に記載しない限り、０．２〜０．４μｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液で染色した。同一バッチのゲルから測定したＤＮＡ泳動度の再現性は、５％以内であった。指定された組成のゲルを重合し、別の日に別の装置で実験すると、移動度の変化が５％を超える場合もあった。
実験したＤＮＡサンプルは、複数の市販マーカー及びプラスミドダイジェストを含む。１００ｂｐラダーおよび２０ｂｐラダーはＧｅｎＳｕｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより、１ｋｂラダーはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより、５０ｂｐラダーはＰｈａｒｍａｃｉａより入手した。プラスミドｐＢＲ３２２は、さらにＤＮＡ断片を与えるために、ＨａｅIII、ＭｓｐＩまたはＨｈａＩを用いて消化した。ＨａｅIIまたはＨａｅIIIを用いて消化したＬａｍｂｄａ  ＤＮＡも、一部のゲルに加えた。
実施例１  異なる量のヒドロキシエチルセルロースを用いたポリ（ＮＡＴ）ゲル  ＨＥＣ（Ｆｌｕｋａ、試薬番号５４２９０、Ｃｅｌｌｏｓｉｚｅ  ４０−Ｗ、中粘度）の２％溶液を、ｐＨ８のトリス−アセテート−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液に、磁気スターラを用いて一晩攪拌して溶解させた。この溶液を、多孔度２の焼結ガラスフィルタでろ過した。この溶液はやや褐色を帯びていた。ゲルの組成は、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％であった。モノマー−架橋剤溶液のＨＥＣ濃度は、それぞれ、０．０５％、０．１０％、０．１５％、０．２０％、０．３０％であった。対照ゲルは、ＨＥＣを含まなかった。ＨＥＣを含まないゲルの６００ｎｍでの吸光度は、０．０１７であり、ＨＥＣを含むゲルの吸光度はそれぞれ、０．１２１、０．４７４、１．０２０、１．７８０および２．２３９であった。４００〜８００ｎｍ範囲におけるゲルのスペクトルを、図３に示す。ゲルは、２０℃で４時間、１０Ｖ／ｃｍにて泳動を行った。ＨＥＣを含まないゲルの場合、２０ｂｐ断片による６０ｂｐ断片は７．３ｃｍ、１００ｂｐ断片は５．４ｃｍ、２００ｂｐ断片は３．２ｃｍ、３００ｂｐ断片は２．２ｃｍ、５００ｂｐ断片は１．２ｃｍ、１０００ｂｐ断片は０．５ｃｍ移動した。ＨＥＣを０．０５％含むゲルの場合、同じ断片がそれぞれ、７．１ｃｍ、５．１ｃｍ、２．７ｃｍ、１．５ｃｍ、０．４ｃｍ、０．１ｃｍ移動した。ＨＥＣが０．１％の移動距離は、６．９ｃｍ、４．７ｃｍ、１．８ｃｍ、０．７ｃｍ、０．１ｃｍ、０．１ｃｍ未満であった。ＨＥＣが０．１５％のゲルでは、６０、１００、３００、５００ｂｐ断片の移動距離は、７．１ｃｍ、４．６ｃｍ、１．３ｃｍ、０．３ｃｍおよび１ｍｍ未満であった。ＨＥＣ０．２％における距離は、６．９ｃｍ、４．１ｃｍ、０．９ｃｍ、０．２ｃｍ、０．１ｃｍ未満であった。ＨＥＣ０．３％の場合、同じＤＮＡ分子がそれぞれ、６．４ｃｍ、３．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．２ｃｍ、０．１ｃｍ未満であった。このＨＥＣ調製品で、さらに多くのゲルを重合した。泳動および染色後、特に、分離されたＤＮＡの検出にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂａｓ）を用いた場合に、高いバックグラウンドがよく見られた。これは、このバックグラウンドがＨＥＣに存在する内因性ＤＮＡに由来するものであるため、実施例２で説明するようにＨＥＣ溶液の精製を行った。
実施例２  ＨＥＣの精製
１５ｍＭ  ＴＡＥ緩衝液によるＨＥＣ  １％溶液（Ｆｌｕｋａ）を、直径５ｃｍのカラムに充填したＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ  ６Ｂに、流速  約４０ｍｌ／時で通過させた。このイオン交換剤は、最初に同じ緩衝液で平衡させた。この交換剤は、ＨＥＣ調製品に存在する褐色を帯びた不純物と結合した。このＨＥＣ溶液を使用した場合、ゲルの示すバックグラウンドの染色は無視できるほどであった。しかし、ＤＮＡ断片がスメアー状で特にサイズの小さい範囲を移動すると、ゲルの分解能はほぼ完全に消失した。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによって精製したＨＥＣ溶液を、直径５ｃｍで、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を１００ｍｌ充填した別のカラムに通過させた。この２度目のクロマトグラフィーの後、精製したＨＥＣをＮＡＴ−Ｂｉｓ溶液に添加した。ゲルの分解能は回復した。上の結果が示すのは、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅから放出された微量のカチオン性ポリマーが、電気泳動ゲルの分解能を失わせることが可能なことである。放出されたポリマーは、陽イオン交換剤であるＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合する。高分子量のＨＥＣ調製品は、粘度を低下させるためにポリマー濃度を下げて、同様の方法で精製した。精製済みのＨＥＣを用いて、多くのゲルを重合した。これらのゲルは一貫して、バックグラウンドが低下した。精製ＨＥＣによる、全体的に向上した選択性は、上記の精製処理を行わないＨＥＣによる選択性と類似していた。０．２％の精製ＨＥＣを含むゲルは、特に選択性が大きく向上した。これらのゲルに対して、さまざまな電気泳動条件によって実験を行った。たとえば、ＨＥＣ０．２％を含む  Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルにより、６０℃で２．５時間、１０Ｖ／ｃｍの条件で泳動を行った場合、１００、２００、３００、４００、５００ｂｐ  断片の移動距離はそれぞれ、８．５ｃｍ、３．２ｃｍ、１．１ｃｍ、０．４ｃｍ、０．２ｃｍであった。
実施例３  架橋剤の量を変化させた、同量の精製ＨＥＣを含む、Ｔ  １２％のポリ（ＮＡＴ）ゲル
ポリ（ＮＡＴ）ゲルは、０．２％のＨＥＣと、１％、１．５％、２．０％のＢｉｓで調製した。別の３種類のゲルは、モノマーおよび架橋剤濃度は同一であるが、ＨＥＣを含まなかった。３個の対照ゲルの６００ｎｍでの吸光度は０．０１０未満であったが、０．２％のＨＥＣを含むゲルの吸光度はこれよりも高かった。Ｂｉｓ  １％では、０．１０３、１．５％では０．３２１、２．０％では、０．７２０であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。Ｃ  １％のゲルではどちらも、１ｋｂによる１５４ｂｐおよび３，０５４ｂｐ断片は、実質的に同じ距離だけ移動した。ＨＥＣを含むＣ  １．５％のゲルでは、１００ｂｐラダーによる１００ｂｐ断片および１ｋｂラダーによる３，０５４ｂｐバンドは、ＨＥＣを含まない対照ゲルよりも約１０％移動距離が短かった。ＨＥＣを含むＣ  ２．０％ゲルでは、１００ｂｐ断片の移動度は、ＨＥＣを含まない対照ゲルよりも約１０％小さかったが、３，０５４ｂｐ断片は、ＨＥＣを含むゲルは含まないゲルと比べて、移動距離は半分以下であった。これらすべてのゲルで、ＤＮＡバンドは、Ｃ  ２．６％のゲルよりも鮮明ではなかった。ＨＥＣを含むゲルについて、４００ｎｍ〜８００ｎｍの可視スペクトルを記録し、架橋剤  １．５％および２．０％でキャラクタリゼーションを行った。２．０％のゲルの４００ｎｍでの吸光度は、６００ｎｍでの吸光度よりも約２倍で、８００ｎｍでは、６００ｎｍでの測定値の約半分であった。
実施例４  ＨＥＣとＢｉｓ以外の架橋剤を含むポリ（ＮＡＴ）ゲル
１，２−ジヒドロキシエチレン−ビス−アクリルアミド（ＤＨＥＢＡ、Ｆｌｕｋａより購入）を架橋剤として用いて、１２％のポリ（ＮＡＴ）ゲル６種類を調製した。各ゲルは、Ｃを３％、４％、５％を含み、ＨＥＣを含むものと含まないものがある。Ｃ  ３％を含むゲルの６００ｎｍでの吸光度は、０．０１８、Ｃ  ４％では０．０３１、５％では０．０７６であった。ＨＥＣ  ０．２％を含む各ゲルの吸光度は、０．３２０、０．７５５、１．３０２であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。３％では、ＤＮＡバンドは、ＨＥＣ  ０．２％を含むゲルのほうが鮮明であった。１００ｂｐ  ラダーによる２００ｂｐ断片の移動距離は、ＨＥＣを含むゲルよりも約３０％短かった。３，０５４ｂｐバンドの移動距離は、ＨＥＣを含まないゲルの移動距離の半分未満であった。Ｃ  ４％の場合、１００ｂｐ断片は、実質的に移動距離が同じであった。３，０５４ｂｐ断片は、ＨＥＣを含まないゲルでは明確に分解されたが、ＨＥＣを含むゲルでは、ほとんど移動しないクラスターのままであった。ｐＢＲ３２２／ＨａｅIII消化による５８７ｂｐ断片は、ＨＥＣを含むゲルでは約５分の１（２．４ｃｍに対して０．５ｃｍ）の移動距離であった。Ｃ  ５％では、５０ｂｐラダーによる５０ｂｐ断片は、どちらのゲルも同じ距離（８．４ｃｍ）移動した。１，０００ｂｐの移動距離は、ＨＥＣを含まないゲルでは０．７ｃｍであったが、ＨＥＣを含むゲルの断片は全く移動せず、すなわちＤＮＡはサンプルのくぼみの入口前端に残留した。５８７ｂｐ断片は、ＨＥＣを含まないゲルでは１．１ｃｍ、ＨＥＣを含むゲルでは０．１ｃｍ移動した。
ピペラジン−ジ−アクリルアミド（ＰＤＡ、Ｂｉｏ−Ｒａｄより購入）を用いて、１２％のポリ（ＮＡＴ）ゲル６種類を重合した。各ゲルは、Ｃを１％、１．５％、２％を含み、ＨＥＣ  ０．２％を含むものと含まないものがある。ＨＥＣを含まないゲルの６００ｎｍでの吸光度はそれぞれ、０．０１０、０．０４５、０．２３８であった。ＨＥＣを含むゲルの吸光度は、０．８０７、１．９９８、２．３５８である。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。Ｃ  １％の場合は、どちらのゲルでも、１００ｂｐ断片は約７ｃｍ移動した。同一のラダーによる１，０００ｂｐの断片は、ＨＥＣを含まないゲルでは１．８ｃｍ移動し、ＨＥＣを含むゲルではわずか０．３ｃｍしか移動しなかった。Ｃが１．５％の場合、ＨＥＣを含まない対照ゲルでは、１００ｂｐ断片は６．３ｃｍ移動し、同じラダーによる１，０００ｂｐ断片は０．８ｃｍ移動した。ＨＥＣを含むゲルでは、１００ｂｐ断片の移動距離は５．５ｃｍで、１，０００ｂｐ断片はサンプルのくぼみから移動しなかった。５８７ｂｐ断片は、約１ｍｍ移動した。Ｃが２％の場合、ＨＥＣを含むゲルと含まないゲルでの、ＤＮＡの大型断片の相対移動度は、Ｃが１．５％の場合と同様であった。しかし、Ｃが２％の場合、ＨＥＣを含むゲルのほうがバックグラウンドが強く、このシリーズの他のゲルよりもバンドが広がっていた。このゲルの可視スペクトルは、４００〜８００ｎｍの全波長において、２．０を超える高い吸光度を示した。
ＤＨＥＢＡおよびＰＤＡでの上の結果により、異なる架橋剤によって、より高い選択性を備えたゲルが得られることがわかった。
実施例５  ＮＡＴ以外のモノマーより成る、向上した選択性を有するゲル
Ｂｉｓを架橋剤として、１２％のポリアクリルアミドゲルを４種類重合した。架橋度は、５％および６％で、２種類のゲルは０．２％ＨＥＣを含む。ＨＥＣを含まないゲルの６００ｎｍでの吸光度は、Ｃが５％の場合は０．０１９、６％の場合は０．０６９であった。ＨＥＣを含むゲルでは、Ｃが５％の場合は１．５０７、６％の場合は２．２４７であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。Ｃが５％の場合、ＨＥＣを含まないゲルでは、２０ｂｐラダーの２０ｂｐ断片はゲルの底部（８．７ｃｍ）にあったが、同じラダーによる５００ｂｐ断片は０．５ｃｍ移動した。該当するＨＥＣを含むゲルでは、２０ｂｐ断片の移動距離は８．６ｃｍであった。５００ｂｐ断片は全く移動しなかった。実際、３００ｂｐを超える断片の移動距離は、目に見えてわかるほどではなかった。Ｃが６％の場合、ＨＥＣを含まないゲルでは、２０ｂｐ断片は８．４ｃｍ、２００ｂｐ断片は０．７ｃｍ、３００ｂｐ断片は０．４ｃｍ移動した。ＨＥＣを含むゲルでは、２０ｂｐ断片の移動距離は７．９ｃｍであったが、２００ｂｐ断片は約１ｍｍ移動した。３００ｂｐ断片は、それより大きい断片と同様、全く移動しなかった。ゲルは高いバックグラウンドを有し、ＤＮＡバンドは他の３種類のゲルよりも広がっていた。
Ｂｉｓで架橋した、ポリアクリルアミドの割合がさらに低いゲルも、ＨＥＣを含まない溶液またはＨＥＣを０．２％含む溶液から調製した。Ｔが９％のゲルの架橋度は、２％、３％、４％、５％、６％であった。ＨＥＣを含まないゲルの６００ｎｍにおける吸光度はそれぞれ、０．０００、０．００４、０．０１７、０．０６６、０．２７９であった。ＨＥＣを含むゲルでは、０．１３６、０．４６６、１．３７４、２．１３１、２．３００であった。すべてのゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。Ｃが２％の場合、ＤＮＡ断片のサイズ範囲が２００〜２０００ｂｐの範囲では、ＨＥＣを含むゲルと含まないゲルの移動度の差は１０％未満であった。Ｃが３％の場合、ＨＥＣを含むゲルでは１００ｂｐ断片は８．０ｃｍ移動し、１，０００ｂｐ断片は１．９ｃｍ移動した。該当するＨＥＣを含まないゲルでは、１００ｂｐ断片は７．５ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は０．１ｃｍ移動した。Ｃが４％の場合、２０ｂｐラダーの８０ｂｐ断片は６．５ｃｍ移動し、５００ｂｐ断片は１ｍｍ未満であった。Ｃが５％では、６０ｂｐ断片の移動距離は８．１ｃｍ、４００ｂｐ断片の移動距離は１．０ｃｍであった。ＨＥＣを含むゲルでの移動距離は、同じ２種類のＤＮＡ断片について、６．１ｃｍおよび０．１ｃｍであった。５００ｂｐより長いＤＮＡ分子は、全く移動しなかった。Ｃが６％の場合は、６０ｂｐ断片は７．１ｃｍ移動し、４００ｂｐ断片は０．３ｃｍ移動した。ＨＥＣを含むゲルでは、６０ｂｐ断片は５．６ｃｍ、４００ｂｐ断片は０．２ｃｍ移動した。ゲルは強いバックグラウンドを示し、ＤＮＡバンドはやや広がっていた。可視スペクトルは、４００〜８００ｎｍ範囲全体に渡る（２．０を超える）高い吸光度値が特徴であった。
別のモノマーであるＮ−アクリロイル−１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−ガラクチトールも、Ｂｉｓを架橋剤として重合した。Ｔ  ９％とＣ  ３％のゲルの吸光度は、６００ｎｍで０．００９であった。ＴとＣの量は同じで、分子量９０，０００〜１０５，０００のヒドロキシエチルセルロース０．１％を含むゲルの吸光度は、０．８７３であった（供給者であるＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  が示す分子量、実施例２で説明したように精製したＨＥＣ）。どちらのゲルも、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。ＨＥＣを含まないゲルでは、３００ｂｐ断片は８．１ｃｍ、５００ｂｐ断片は６．１ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は３．９ｃｍ、５，０９０断片は１．１ｃｍ移動した。ＨＥＣを含むゲルでは、３００ｂｐ断片は５．６ｃｍ、５００ｂｐ断片は２．１ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は０．２ｃｍ移動したが、５，０９０断片はサンプルのくぼみから約３ｍｍ広がったクラスタにとどまっていた。
実施例６  ２種類以上のモノマーと２種類以上の架橋剤より成る、向上した選択性を有するゲル
ＮＡＴとアクリルアミドをモノマーとして、Ｂｉｓを架橋剤として含む４種類の複合ゲルを調整した。２種類のゲルは、１０％のＮＡＴと２％のアクリルアミド（ＡＡ）を含み、残りの２種類のゲルは、１１％のＮＡＴと１％のＡＡを含んでいた。架橋度はすべてのゲルで２．６％であった。各複合ゲルは、０．２％の精製ＨＥＣを含んでいた。１０％ＮＡＴ−２％ＡＡのゲルの６００ｎｍの吸光度は、０．０１０であり、ＨＥＣを含む該当するゲルの吸光度は１．１７３であった。１１％ＮＡＴ−１％ＡＡゲルの吸光度は０．０１３で、ＨＥＣを含むゲルでは１．１２９であった。すべてのゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。１０％ＮＡＴ−２％ＡＡの対照ゲルでは、４０ｂｐ断片は８．５ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は１．３ｃｍ移動した。ＨＥＣを含むゲルでは、４０ｂｐ断片は８．６ｃｍ移動したが、１，０００ｂｐ断片の移動距離は１ｍｍであった。１１％ＮＡＴ−１％ＡＡの対照ゲルでは、６０ｂｐ断片の移動距離は、７．７ｃｍ、１，０００ｂｐ断片の移動距離は１．３ｃｍであった。ＨＥＣを含むゲルでは、６０ｂｐ断片は７．８ｃｍ移動したが、１，０００ｂｐ断片の移動距離は０．１ｃｍであった。
２種類の架橋剤を含む複合ゲルも調製した。１つはＤＨＥＢＡ３％とＢｉｓ１％を含む１２％のポリ（ＮＡＴ）がＨＥＣなしで重合させ、他の１つは０．２％のＨＥＣ存在下で重合した。ＨＥＣを含まないゲルの８００ｎｍにおける吸光度は０．０４１で、ＨＥＣを含むゲルは、１．８３５であった。どちらのゲルも、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。ＨＥＣを含まないゲルでは、６０ｂｐＤＮＡ断片は７．６ｃｍ、５００ｂｐ断片は１．６ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は０．８ｃｍ移動した。ＨＥＣを含むゲルでは、６０ｂｐ断片は７．４ｃｍ、５００ｂｐ断片は０．１ｃｍ移動したが、１，０００ｐ断片は実質的には入口点にとどまった。
実施例７  分子量の異なるＨＥＣを含む、向上した選択性を有するゲル
使用した４種類のＨＥＣ調製品は、（製造者のＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅによる表示、試薬番号０５５７０）分子量２４，０００〜２７，０００のＨＥＣ、中粘度のＨＥＣ（Ｆｌｕｋａ、実施例２で説明したように精製）、分子量９０，０００〜１０５，０００のＨＥＣ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、試薬番号０５５６９、精製済み）、高分子量のＨＥＣ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、試薬番号０５５６８）であった。最初のシリーズでは、異なるＨＥＣ調製品の量を変化させて、ポリ（ＮＡＴ）９％と２．６％のＢｉｓのゲルを調製した。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。４種類のゲルは、ＨＥＣ  ２４，０００〜２７，０００を０．１％、０．２％、０．３％、０．４％含む。６００ｎｍの吸光度値はそれぞれ、０．０６８、０．２１４、０．５２１、０．９９５であったが、ＨＥＣを含まない対照ゲルの吸光度は、０．０２３であった。対照ゲルでは、２０ｂｐラダーの１４０ｂｐ断片は８．３ｃｍ、５００ｂｐ断片は３．４ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は１．６ｃｍ移動した。ＨＥＣ（２４，０００〜２７，０００）が０．１％のゲルでは、１４０ｂｐ断片は７．５ｃｍ、５００ｂｐ断片は２．６ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は１．３ｃｍ移動した。ＨＥＣ  ０．２％のゲルでは、３つの断片の移動距離は、７．４ｃｍ、２．０ｃｍ、０．８ｃｍであった。ＨＥＣ  ０．３％のゲルの移動距離は、７．２ｃｍ、１．７ｃｍ、０．５ｃｍであった。ＨＥＣ  ０．４％のゲルの移動距離は、６．８ｃｍ、１．５ｃｍ、０．５ｃｍであった。ＨＥＣが０．３％と０．４％のゲルは、高いバックグラウンドを示した。上記の移動距離から、ゲルの不透明度は大きく変化したが、選択性はほとんど変わらないことが明らかである。
９％のＴと２．６％のＣを含む３種類のゲルを、別のＨＥＣ（Ｆｌｕｋｅ製）を０．１％、０．１５％、０．２％含む溶液から重合した。６００ｎｍにおける吸光度は、０．３８９、０．８８３、１．５０９であった。１４０ｂｐ、５００ｂｐ、１，０００ｂｐ断片の移動距離はそれぞれ、８．３ｃｍ、３．４ｃｍ、１．６ｃｍであった。ＨＥＣを０．１％含むゲルの移動距離は、７．５ｃｍ、１．３ｃｍ、０．２ｃｍであった。ＨＥＣを０．１５％含むゲルの移動距離は、７．０ｃｍ、０．７ｃｍ、および０．１ｃｍ未満であった。ＨＥＣ  ０．２％のゲルでは、１４０ｂｐ断片は６．７ｃｍ、５００ｂｐ断片は０．５ｃｍ、８００ｂｐを超える長さのＤＮＡ断片は、移動距離が１ｍｍ未満のクラスタに残留した。
９％のＴと２．６％のＣを含む６種類のゲルを、分子量９０，０００〜１０５，０００のＨＥＣを０．０４％、０．０６％、０．０８％、０．１０％、０．１５％含む溶液で調製した。６００ｎｍにおける吸光度は、０．１５１、０．４８０、０．９４２、１．３９２、１．４３８、１．９０３であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。対照ゲルは、６００ｎｍの吸光度が０．０２３で、１４０ｂｐ  ＤＮＡ断片は８．３ｃｍ、３００ｂｐ断片は５．１ｃｍ、５００ｂｐ断片は３．４ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は１．６ｃｍ移動した。ＨＥＣ  ０．０２％のゲルでは、１４０ｂｐ断片は６．６ｃｍ、５００ｂｐ断片は０．４ｃｍ移動し、１，０００ｂｐ断片は測定できるほど移動しなかった。ＨＥＣ  ０．０４％のゲルでは、１４０ｂｐ断片は５．７ｃｍ、３００ｂｐ断片は１．１ｃｍ、５００ｂｐ断片は０．２ｃｍそれぞれ移動した。ＨＥＣ  ０．０６％のゲルでは、同じ３つの断片の移動距離は、５．０ｃｍ、０．７ｃｍ、０．１ｃｍであった。ＨＥＣ  ０．０８％のゲルでは、移動距離は、５．２ｃｍ、０．８ｃｍ、０．１ｃｍであった。ＨＥＣ  ０．１％のゲルでは、１４０ｂｐ断片は７．５ｃｍ、３００ｂｐ断片は２．６ｃｍ、５００ｂｐ断片は０．６ｃｍそれぞれ移動した。ＨＥＣ  ０．１５％のゲルでは、３つの断片はそれぞれ、６．８ｃｍ、３．１ｃｍ、０．９ｃｍ移動した。このように、ＨＥＣ濃度がある値を超えた場合、ＤＮＡの断片が長くなると、移動度は上昇した。２０℃で見られた選択性の向上は、高温で実験したゲルにも認められた。たとえば、ＨＥＣ  ０．０４％のゲルについて、１０Ｖ／ｃｍ、５５℃で２時間電気泳動を行うと、２００ｂｐ  ＤＮＡ断片はゲルの端まで移動したが、１，０００ｂｐ断片の移動距離は２ｍｍ未満であった。
高分子量のＨＥＣ（ＰｏＩｙｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、このポリマーを０．０２％、０．０４％、０．１％、０．２％を含む４種類のゲルを調整した。６００ｎｍで測定した吸光度値は、０．１６６、０．５０１、１．７６５、２．０３７であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。ＨＥＣを含まない９％のＴと２．６％のＣのゲルと比べると、ＨＥＣを含むゲルでは、分子が大きいほど、顕著な遅延が見られた。このように、ＨＥＣ  ０．０２％のゲルでは、１４０ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐのＤＮＡ断片の移動距離はそれぞれ、８．１ｃｍ、３．８ｃｍ、１．１ｃｍ、０．１ｃｍであった。ＨＥＣ  ０．０４％では、移動距離は、７．４ｃｍ、２．４ｃｍ、０．４ｃｍ、および１ｍｍ未満であった。ＨＥＣ  ０．１％の場合、移動距離は、６．８ｃｍ、１．３ｃｍ、０．４ｃｍ、および１ｍｍ未満であった。ＨＥＣ  ０．２％では、１４０ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、１，０００ｂｐの断片の移動距離はそれぞれ、８．０ｃｍ、４．３ｃｍ、１．９ｃｍ、０．３ｃｍであった。したがって、この場合も、ＨＥＣ濃度が高くなると、移動度が上昇した。ＨＥＣ  ０．２％のゲルはバックグラウンドが高く、ＤＮＡバンドはやや広がっていた。
上記のＴ  ９％、Ｃ  ２．６％のポリ（ＮＡＴ）ゲルに加え、異なる分子量のＨＥＣを用いて、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルも調製した。他の架橋度のゲルも同じく重合した。これらのゲルで得られた結果は、ここでは詳細に説明しない。同様の一般的なパターンが見られたと言えば十分である。ＤＮＡの移動度は、重合溶液に存在するＨＥＣの量と関連して低下した。遅延効果は、ＨＥＣポリマーの分子量が大きくなるほど顕著になった。
実施例８  向上した選択性を有する、低い割合のポリ（ＮＡＴ）ゲル
Ｃが２．６％で、架橋剤としてＢｉｓを含む、６％のポリ（ＮＡＴ）ゲル４種類を調製した。３種類のゲルは、分子量９５，０００〜１０５，０００のＨＥＣを０．０５％、０．１０％、０．２％含んでいた。４種類のゲルはすべて、７Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。対照ゲルでは、２０ｂｐラダーによる２２０ｂｐＤＮＡ断片は８．６ｃｍ、同じラダーの１０００ｂｐ断片は３．５ｃｍ移動し、１ｋｂラダーの３，０５４ｂｐ断片は１．７ｃｍ移動した。このラダーの５，０９０バンドは、他のバンドからはっきりと分解された。ＨＥＣ  ０．０５％を含むゲルでは、２２０ｂｐ断片は７．５ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は０．５ｃｍ、３，０５４ｂｐ断片は０．３ｃｍ未満移動した。この断片は、他の２，０００ｂｐを超える断片と同様、前端が３ｍｍ移動したクラスタのまま分解されなかった。ＨＥＣ  ０．１％のゲルでは、２２０ｂｐ断片は７．３ｍｍ、１，０００ｂｐ断片は０．９ｃｍ移動したが、３，０５４バンドは分解されなかった。ＨＥＣ  ０．２％のゲルでは、２２０ｂｐ断片は８．０ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は２．９ｃｍ、そして部分的に分解した３，０５４ｂｐ断片は１．１ｃｍ移動した。ゲル中の移動距離が長くなるほど、特に１，０００ｂｐを超えるサイズ範囲では、バンドがさらに広がった。これにより、あるレベル以上にＨＥＣ濃度が上昇すると、６％  ポリ（ＮＡＴ）ゲルでもＤＮＡの移動がさらに高速になる。
実施例７では、向上した選択性を有するゲルは、乾燥重量が約９％であり、本例では、そのようなゲルの乾燥重量は６％であった。
実施例９  他のセルロースポリマーを含む、向上した選択性を有するゲル
メチルセルロース（ＭＣ、Ｆｌｕｋａ製、試薬番号６４６２０）を０．０５％、０．１０％、０．１５％、０．２０％の濃度で含む、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲル４種類を調製した。６００ｎｍの吸光度はそれぞれ、０．２２５、０．７５７、１．５３３、２．０５３であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。ＭＣ  ０．０５％を含むゲルでは、６０、１００、３００、５００、１，０００ｂｐのＤＡＮ断片の移動度はそれぞれ、７．５ｃｍ、５．９ｃｍ、２．８ｃｍ、１．５ｃｍ、０．６ｃｍであった。ＭＣ  ０．１％では、同じ分子が、６．８ｃｍ、５．６ｃｍ、１．９ｃｍ、０．６ｃｍ、０．１ｃｍであった。ＭＣ  ０．１５％では、各断片は、６．５ｃｍ、５．４ｃｍ、０．９ｃｍ、０．２ｃｍ、そして１ｍｍ未満であった。ＭＣ  ０．２％では、６０、１００、３００、５００ｂｐの断片の移動距離はそれぞれ、６．８ｃｍ、４，９ｃｍ、０．８ｃｍ、０．２ｃｍであった。
ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ、Ａｌｄｒｉｃｈ製、試薬番号２９，４４１−１）をポリマーとして用いて、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲル４種類を調製した。ＨＰＭＣの濃度は、０．０５％、０．１０％、０．１５％、０．２０％であった。１ｃｍのキュベットで重合したゲルの６００ｎｍにおける吸光度はそれぞれ、０．０５２、０．２１５、０．５２４、１．００６であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。ＨＰＭＣ  ０．０５％のゲルでは、６０、１００、３００、５００、１，０００ｂｐのＤＡＮ断片の移動距離はそれぞれ、７．５ｃｍ、５．８ｃｍ、２．９ｃｍ、１．８ｃｍ、０．９ｃｍであった。ＨＭＰＣ  ０．１％の場合は、７．５ｃｍ、５．８ｃｍ、２．６ｃｍ、１．４ｃｍ、０．５ｃｍであった。０．１５％の場合は、同じ断片が、７．３ｃｍ、５．６ｃｍ、２．２ｃｍ、０．９ｃｍ、０．２ｃｍ移動した。ＨＭＰＣ  ０．２％のゲルでは、５種類の断片は、７．４ｃｍ、５．７ｃｍ、１．７ｃｍ、０．５ｃｍ、０．１ｃｍ移動した。
実施例１０  アガロースおよびアガロース誘導体を含む、向上した選択性を有するゲル
異なる濃度のアガロース（Ｓｅｒｖａ、試薬番号１１４０１）を含む溶液で、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルを３種類重合した。最初にアガロースを、３０ｍＭ  ＴＡＥ緩衝液に１％の濃度で沸騰させて溶解した。約６０℃に冷却後、この溶液の適量を、アガロース濃度が最終的に０．１％、０．１５％、０．２％となるように、モノマーおよび架橋剤溶液と混合した。３種類のゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。アガロースが０．１％の場合は、６０ｂｐ  ＤＮＡ断片は８．３ｃｍ、１００ｂｐ断片は５．５ｃｍ、２００ｂｐ断片は１．２ｃｍ、３００ｂｐ断片は０．２ｃｍ移動し、それ以上長いＤＮＡ分子はほとんど移動しなかった。アガロースが０．１５％のゲルでは、同じ断片がそれぞれ、７．５ｃｍ、４．６ｃｍ、０．８ｃｍ、０．２ｃｍ移動した。アガロースが０．２％の場合は、６０、１００、２００、３００ｂｐ断片の移動距離はそれぞれ、８．０ｃｍ、５．０ｃｍ、１．３ｃｍ、０．４ｃｍであった。
ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース（ＦＭＣ社）はポリマーとして、ＮＡＴおよびＢｉｓと組み合わせて使用した。ＳｅａＰｌａｑｕｅ  ０．０５％を含むＴ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルに対し、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行うと、６０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ断片の移動距離はそれぞれ、７．３ｃｍ、５．６ｃｍ、２．６ｃｍ、０．８ｃｍであった。ＳｅａＰｌａｑｕｅが０．１％の場合の距離は、７．３ｃｍ、４．６ｃｍ、０．６ｃｍ、０．１ｃｍであった。ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロースが０．２％のゲルでは、６０ｂｐ断片は６．５ｃｍ、１００ｂｐ断片は２．９ｃｍ、２００ｂｐ断片は０．２ｃｍ移動した。３００ｂｐを超える大きさのＤＮＡ分子の移動距離は、１ｍｍ未満であった。
ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロースを０．２％含み、上記と同量のＴとＣのゲルを、１５〜３５℃の異なる温度の重合溶液により、６種類のバッチで重合した。重合溶液は、ゲルが生成する前に、１５℃でやや不透明となった。この場合のＤＮＡバンドは、これより高い温度で重合したゲルよりも鮮明でなかった。３５℃で重合したゲルは、これより低い温度で重合したゲルよりも、透明度が高かった。すべてのゲルは、重合温度とは関係なく、すべてのゲルにおいて５００ｂｐ断片の移動距離が０．３ｃｍというように、選択性が向上した。しかし、バンドの鮮明度と選択的遅延の程度は異なり、３５℃で重合したゲルで最も高い値となった。さらに、ゲルは、３０〜６２℃に温度を上げて電気泳動を行った。６０℃で泳動を行った場合、２０〜３５℃で重合したゲルでは、３００ｂｐを超えるＤＮＡ断片の移動度に著しい違いが見られた。２０℃で重合したゲルのほうが移動度が大きかった。１０Ｖ／ｃｍ、６２℃で２．５時間泳動を行った後、３５℃で重合したゲルでは、ｐＢＲ３２２／ＭｓｐＩの１０４ｂｐ断片はゲルの底部にあったが、６２２ｂｐ断片は約１ｍｍ移動した。
ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロースを０．２％含む、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルを、２枚のガラス板の間（ゲル厚  ０．７ｍｍ）で重合し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＥ−２／４装置を用いて、垂直形式で泳動を行った。このゲルでも、同じ組成の浸漬ゲルと同様、向上した選択性が見られた。
別のアガロース誘導体、ＮｕＳｌｅｖｅ（ＦＭＣ社）も、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のポリ（ＮＡＴ）−Ｂｉｓゲルで、ポリマーとして使用した。重合溶液におけるＮｕＳｌｅｖｅの濃度は、０．０５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％であった。すべてのゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。ＮｕＳｌｅｖｅアガロース０．０５％を含むゲルでは、６０ｂｐ断片は８．０ｃｍ、１００ｂｐ断片は６．２ｃｍ、２００ｂｐ断片は４．０ｃｍ、３００ｂｐ断片は２．９ｃｍ、５００ｂｐ断片は１．７ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は０．９ｃｍ移動した。ＮｕＳｌｅｖｅ  ０．１％のゲルでは、同じ断片がそれぞれ、８．２ｃｍ、６．２ｃｍ、３．８ｃｍ、１．３ｃｍ、０．６ｃｍ移動した。ＮｕＳｌｅｖｅ  ０．１５％の移動距離は、８．２ｃｍ、６．０ｃｍ、３．１ｃｍ、１．７ｃｍ、０．６ｃｍ、０．２ｃｍであった。ＮｕＳｌｅｖｅ  ０．２％では、６０、１００、２００、３００、５００ｂｐ断片はそれぞれ、７．１ｃｍ、５．０ｃｍ、１．７ｃｍ、０．４ｃｍ、０．１ｃｍ移動した。ＮｕＳｌｅｖｅ  ０．３％の場合、６０、１００、２００ｂｐ断片の移動距離はそれぞれ、６．８ｃｍ、３．５ｃｍ、０．４ｃｍであった。これより大きいＤＮＡ分子すべての移動距離は、０．２ｃｍ未満であった。ＮｕＳｌｅｖｅ  ０．４％では、３種類のＤＮＡ分子の移動距離は、６．６ｃｍ、３．０ｃｍ、０．２ｃｍであり、ＮｕＳｌｅｖｅ  ０．５％ではそれぞれ、５．８ｃｍ、２．３ｃｍ、０．１ｃｍであった。
電気泳動を温度を上げて行うと、ＳｅａＰｌａｑｕｅおよびＮｕＳｌｅｖｅを含むゲルの挙動に著しい違いが見られた。ＮｕＳｌｅｖｅを含むゲルでは、ＮｕＳｌｅｖｅ  ０．３％のゲルにおいて、１０Ｖ／ｃｍ、６５℃で３時間泳動を行うと、５００ｂｐ断片が２．７ｃｍ移動したように、大きい分子の遅延が著しく低下した。
第３のアガロース誘導体、ＳｅａＰｒｅｐ（ＦＭＣ社）も、ＮＡＴおよびＢｉｓと組み合わせて使用した。Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルは、ＳｅａＰｒｅｐアガロースを０．０５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．４％含んでいた。これらのゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。ＳｅａＰｒｅｐ  ０．０５％のゲルでは、６０、１００、２００、３００、５００、１，０００ｂｐ  ＤＮＡ断片の移動距離はそれぞれ、８．４ｃｍ、６．６ｃｍ、４．１ｃｍ、２．９ｃｍ、１．６ｃｍ、０．７ｃｍであった。ＳｅａＰｒｅｐ  ０．１％のゲルでは、同じ断片が８．２ｃｍ、６．１ｃｍ、３．４ｃｍ、１．９ｃｍ、０．７ｃｍ、０．２ｃｍ移動した。ＳｅａＰｒｅｐ０．１５％では、移動距離は８．０ｃｍ、５．８ｃｍ、２．５ｃｍ、１．０ｃｍ、０．３ｃｍ、および０．１ｃｍ未満であった。ＳｅａＰｒｅｐ  ０．２％では、６０、１００、２００、３００ｂｐ断片がそれぞれ、７．７ｃｍ、５．４ｃｍ、１．７ｃｍ、０．５ｃｍ移動した。０．２５％ではそれぞれ７．５ｃｍ、４．９ｃｍ、１．２ｃｍ、０．３ｃｍであった。０．３％での移動距離は、７．４ｃｍ、４．６ｃｍ、０．９ｃｍ、０．３ｃｍであり、０．４％では、７．１ｃｍ、４．３ｃｍ、０．９ｃｍ、０．３ｃｍであった。この０．４％のゲルでは、ＤＮＡバンドがやや広がり、高いバックグラウンドを示した。
実施例１１  他の多糖類を含む、向上した選択性を有するゲル
分子量５００，０００のデキストラン（Ｆｌｕｋａ、試薬番号３１３９２）の量を変化させて、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルを４種類重合した。ゲルは、デキストランを０．４％、０．６％、０．８％、１．０％含む。通常通り１ｃｍのキュベットで重合したゲルの、６００ｎｍでの吸光度はそれぞれ、０．３４５、０．７７９、１．６３９、２．１６７であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。デキストラン０．４％のゲルでは、６０、１００、２００、５００、１，０００ｂｐ断片の移動距離はそれぞれ、７．３ｃｍ、５．２ｃｍ、２．３ｃｍ、０．４ｃｍ、および１ｍｍ未満であった。デキストラン０．６％では、７．２ｃｍ、４．９ｃｍ、１．９ｃｍ、０．３ｃｍ、０．１ｃｍ未満であった。デキストラン０．８％では、同じ断片が、６．９ｃｍ、４．５ｃｍ、１．６ｃｍ、０．３ｃｍ、０．１ｃｍ未満移動した。デキストラン１．０％では、各断片が６．７ｃｍ、４．４ｃｍ、１．８ｃｍ、０．４ｃｍ、０．１ｃｍ移動した。このように、デキストラン１．０％のゲルでは、３００〜１，０００ｂｐ断片の移動度がわずかに上昇した。このゲルではＤＮＡバンドがやや広がり、バックグラウンドも顕著であった。
イナゴマメガム（Ｓｉｇｍａ製、試薬番号Ｇ−０７５３）も、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のＮＡＴ−Ｂｉｓゲルの重合時に存在するポリマーとして使用した。未精製のポリマーは０．５％の濃度で、沸騰した３０ｍＭ  ＴＡＥ緩衝液に部分的に溶解させ、濁った溶液を焼結ガラスフィルタ（多孔度４）で濾過した。透明な濾液は、放置すると再び不透明になった。ゲル中のこのポリマーの濃度は、溶解および濾過時のロスがないという前提で、０．０２％、０．０３％、０．０５％、０．１％、０．１５％であった。ゲルの６００ｎｍにおける吸光度はそれぞれ、０．０７６、０．１４７、０．３７２、１．２４０、１．８１１であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％の対照ゲルでは、６０、１００、２００、３００、５００、１，０００ｂｐのＤＮＡ断片はそれぞれ、８．０ｃｍ、６．２ｃｍ、４．２ｃｍ、３．１ｃｍ、１．９ｃｍ、１．０ｃｍ移動した。イナゴマメガム  ０．０２％では、同じ断片が７．５ｃｍ、５．７ｃｍ、３．２ｃｍ、１．６ｃｍ、０．３ｃｍ、０．１ｃｍ未満移動した。０．０３％での移動距離は、７．４ｃｍ、５．５ｃｍ、２．７ｃｍ、１．０ｃｍ、０．１ｃｍ、０．１ｃｍ未満であった。イナゴマメガム  ０．０５％では、規定のＤＮＡ断片は、８．４ｃｍ、６．４ｃｍ、３．１ｃｍ、１．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．１ｃｍ未満であった。このゲルは、特に２００ｂｐ未満の断片では、バックグラウンドの染色が顕著で、ＤＮＡバンドはやや広がっていた。イナゴマメガムを０．１％含むゲルでは、３００ｂｐ未満のＤＮＡバンドはすべて大きく広がり、ゲルの分解能は非常に低下した。５００ｂｐを超えるＤＮＡ断片はほとんど移動せず、バックグラウンドは強度であった。イナゴマメガム０．１５％では、約３００ｂｐ未満の範囲では、分解能は完全に消失し、すべてのバンドは広がり、バックグラウンドは強度であった。５００ｂｐ断片は、０．３ｃｍ移動した。
もうひとつのガラクトマンナン（カルビン型、Ｓｅｎｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製、試薬番号２４０２４）もテストした。この多糖類は、３０ｍＭ  ＴＡＥ緩衝液中で、０．２％の濃度で煮沸して溶解させた。ガラクトマンナンをそれぞれ０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％含む、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルを４種類調製した。４種類のゲルの６００ｎｍにおける吸光度はそれぞれ、０．０７９、０．２１８、０．４３１、０．６９７であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。対照ゲルは、吸光度が０．０２３で、６０ｂｐ断片が７．１ｃｍ、１００ｂｐ断片が５．２ｃｍ、２００ｂｐ断片が３．０ｃｍ、５００ｂｐ断片が１．１ｃｍ移動した。ガラクトマンナン０．０１％のゲルでは、同じ断片が７．０ｃｍ、４．９ｃｍ、２．２ｃｍ、０．１ｃｍ移動した。０．０２％での移動距離は、６．９ｃｍ、４．６ｃｍ、１．２ｃｍ、０．１ｃｍ未満であった。０．０３％では、断片は６．８ｃｍ、４．２ｃｍ、０．８ｃｍ、１ｍｍ未満移動した。ガラクトマンナン０．０４％の場合、６０、１００、２００ｂｐ断片はそれぞれ、６．９ｃｍ、４．１ｃｍ、０．７ｃｍ移動した。
実施例１２  ２種類以上のポリマーを含む、向上した選択性を有するゲル
精製したＨＥＣ（Ｆｌｕｋａ）およびＳｅａＰｌａｑｕｅアガロースの混合物を用いて、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲル６種類を重合した。ＨＥＣおよびアガロースの最終濃度はそれぞれ、０．１５％と０．１％になるようにした。ひとつのゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、４０℃で３時間電気泳動を行った。これらの条件では、６０ｂｐ  ＤＮＡ断片はゲル外に移動し、８０、１００、２００、３００ｂｐ断片の移動距離はそれぞれ、７．６ｃｍ、５．８ｃｍ、１．２ｃｍ、０．３ｃｍであった。５００ｂｐより大きい断片は、ほとんど移動しなかった。もうひとつのゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、６０℃で２．５時間電気泳動を行った。１００、２００、３００、５００ｂｐ断片はそれぞれ、８．５ｃｍ、２．８ｃｍ、０．９ｃｍ、０．２ｃｍ移動した。ｐＢＲ３２２／ＨｈａＩ消化物では、１３１および１３２断片が分離された。
実施例１３
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含むゲル
分子量の異なるＰＥＧの調製品２種類をテストした。ＰＥＧの分子量は４，０００（Ｍｅｒｃｋ）と８，０００（Ｓｉｇｍａ）であった。Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルとＰＥＧ  ４，０００では、ＰＥＧ濃度を上昇させても、６００ｎｍの吸光度はほとんど変化しなかった。２％ＰＥＧを用いたゲルの吸光度は、０．０７３であった。同じ割合のＴとＣで、ＰＥＧ  ８，０００を２％含むゲルの吸光度は、０．４００であった。どちらのゲルも、ＰＥＧを含まないゲルとともに、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。ＰＥＧ  ４，０００ゲルの１００、２００、５００、１，０００ｂｐ断片の移動距離はそれぞれ、７．２ｃｍ、５．０ｃｍ、２．４ｃｍ、１．２ｃｍであった。ＰＥＧ  ８，０００を２％含むゲルでは、同じ断片が、７．７ｃｍ、５．６ｃｍ、２．７ｃｍ、１．３ｃｍ移動した。ＤＮＡバンドは、ＰＥＧ  ８，０００を２％含むゲルのほうが広がっており、このゲルは高いバックグラウンドを示した。対照ゲルの移動距離は、７．０ｃｍ、４．９ｃｍ、２．４ｃｍ、１．３ｃｍであった。このように、ＤＮＡ断片の移動距離は、ＰＥＧを重合溶液に加えた後に、わずか１０〜２０％しか変化しなかった。
分子量３６０，０００のＰＶＰ（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルを重合した。ひとつのゲルは０．２％のＰＶＰを、もう一方のゲルは０．５％のＰＶＰを含有していた。肉眼ではゲルの不透明度に変化は見られなかった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。ＰＶＰ  ０．２％では、１００、２００、５００、１，０００ｂｐ断片はそれぞれ、７．０ｃｍ、４．８ｃｍ、２．２ｃｍ、１．２ｃｍ移動した。０．５％での移動距離は、５．９ｃｍ、４．１ｃｍ、１．９ｃｍ、１．０ｃｍであった。このように、ＰＶＰ  ０．５％のゲルにわずかな遅延効果があったが、大小のＤＮＡ断片が両方とも同程度遅延されたため、選択性は向上しなかった。ＰＶＰ  ０．５％のゲルでは、ブロムフェノールブルー追跡用色素は、対照ゲルと比べて約１／３しか移動しなかった。
分子量２２，０００のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（Ｆｌｕｋａ、試薬番号８１３８２）を、濃度が０．２％、０．４％、０．６％、０．８％となるように、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルに添加した。対照ゲルの６００ｎｍにおける吸光度は０．０１１であり、ＰＶＡを含むゲルは、ＰＶＡの少ない順に、０．０１７、０．０２６、０．０４２、０．０６４であった。４００ｎｍでは、同じ５種類のゲルの吸光度値はそれぞれ、０．０５９、０．０８１、０．１１９、０．１８１、０．２７１であった。８００ｎｍでの測定値は、０．００５、０．００７、０．０１０、０．０１６、０．０２４であった。対照ゲルと比較すると、ＰＶＡを含むゲルすべての吸光度は高くなっているが、興味深いことに、４００ｎｍと８００ｎｍの吸光度の比は、すべてのゲルで実質的には変わらなかった。他のポリマーの場合は、この比はポリマー濃度とともに減少した。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。対照ゲルでは、６０ｂｐ断片は７．０ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は１．１ｃｍ移動した。ＰＶＡ  ０．２％では、これら２種類の断片はそれぞれ、６．９ｃｍ、１．２ｃｍ移動した。ＰＶＡ  ０．４％では、移動距離は、６．９ｃｍおよび１．４ｃｍであった。０．６％ではそれぞれ、６．９ｃｍおよび１．６ｃｍであった。ＰＶＡ  ０．８％のゲルでは、６０ｂｐ断片は７．２ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は１．９ｃｍ移動した。このように、ＰＶＡは、６００ｎｍでの吸光度が対照ゲルより高いが、ゲルの選択性を低下させた。ＰＶＡを含むゲルのほうが、ＤＮＡバンドも広がっていた。
実施例１４  ポリアクリルアミドを含む、向上した選択性を有するゲル
分子量１０，０００のポリアクリルアミド（ＰＡＡ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、試薬番号１７２７１）を加えて、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルを重合した。このポリマーは、０．０５％、０．１０％、０．１５％、０．２％の濃度で使用した。キュベットで重合したゲルの６００ｎｍでの吸光度はそれぞれ、０．３２０、０．８６２、１．３７５、１．７３２であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。ＰＡＡを０．０５％含むゲルでは、６０、１００、２００、３００、５００ｂｐ断片はそれぞれ、６．６ｃｍ、４．５ｃｍ、１．０ｃｍ、０．２ｃｍおよび０．１ｃｍ未満であった。ＰＡＡ  ０．１％では、断片は６．７ｃｍ、４．１ｃｍ、０．７ｃｍ、０．２ｃｍおよび０．１ｃｍ未満移動した。ＰＡＡ  ０．１５％では、断片は、６．７ｃｍ、３．９ｃｍ、０．６ｃｍ、０．１ｃｍ移動した。ＰＡＡ  ０．２％の移動距離は、７．０ｃｍ、４．２ｃｍ、１．０ｃｍ、０．３ｃｍであった。このように、移動度は、ＰＡＡ  ０．２％を含むゲルのほうが、０．１５％含むゲルよりも大きかった。
実施例１５  ポリマーがゲルと同じモノマーを含む、向上した選択性を有するゲル
ポリ（ＮＡＴ）ゲルは、５％ＮＡＴを加えた８０ｍＭ  ＴＡＥ緩衝液１００ｍｌを、アルゴン雰囲気下で約４５分攪拌しながら重合させて調製した。生成したポリマーは、ＮＡＴとＢｉｓを含む溶液に添加した。あるシリーズでは、最初の濃度は  ＮＡＴが９％、Ｃが２．６％であり、上記の重合が１００％完了したという前提で、溶液には０．５％、１％、２％のポリ（ＮＡＴ）も含まれていた。対照用として、ＮＡＴモノマーをポリマーの代わりにそれぞれ、０．５％、１％、２％添加した。したがって、最終的なＴの値は、９．５％、１０％、１１％であった。Ｃの値は、添加したモノマーまたはポリマーが架橋剤を希釈するにつれて、減少した。ポリ（ＮＡＴ）を含まないゲルの６００ｎｍでの吸光度は無視しうる値であったが、ポリ（ＮＡＴ）が０．５％のゲルの吸光度は１．０６３、１％のゲルは１．９２２、２％の場合は２．０９３であった。すべてのゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。ポリ（ＮＡＴ）を含まない９．５％のゲルでは、１２０ｂｐ断片は８．７ｃｍ、２２０ｂｐ断片は６．５ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は２．３ｃｍ移動したが、５０９０ｂｐ断片は０．８ｃｍ移動した。ポリ（ＮＡＴ）０．５％を含む９．５％のゲルは、１２０ｂｐ断片は５．２ｃｍ、２２０ｂｐ断片は１．３ｃｍ、５００ｂｐを超える大きさの分子はすべてほとんど移動しなかった（１ｍｍ未満）。ポリマーを添加しない、Ｔ  が１０％のゲルで測定した移動距離は、Ｔが９．５％のゲルよりも少しだけ小さく、Ｔが１１％の場合はさらに少し減少した。ポリ（ＮＡＴ）を１％添加したＴが１０％のゲルでは、ＤＮＡ断片の移動度は、ポリ（ＮＡＴ）０．５％を含む９．５％のゲルよりも大きかった。たとえば、１２０ｂｐ断片は５．８ｃｍ移動し、２２０ｂｐ断片は３．１ｃｍ移動した。５００ｂｐのＤＮＡ分子は約０．７ｃｍ移動した。ポリ（ＮＡＴ）を２％添加したゲルの場合は、すべてのＤＮＡ断片の移動度がさらに増大し、１，０００ｂｐ断片は約１．３ｃｍ移動した。ポリマーを１％および２％添加したゲルは、バックグラウンドが高く、ＤＮＡバンドは、ポリ（ＮＡＴ）を０．５％添加したゲルよりも広がった。
実施例１６  変性条件下で電気泳動を行った、向上した選択性を有するゲル
ポリ（ＮＡＴ）ゲルは、６Ｍの尿素の存在下で重合した。精製ＨＥＣ（Ｆｌｕｋａ製）を０％、０．１５％、０．２％、０．３％、０．４％用いて、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルを５種類重合した。この５種類のゲルの６００ｎｍでの吸光度はそれぞれ、０．０００、０．０５０、０．１０５、０．２９５、０５６２であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、５５℃で２時間、６Ｍの尿素を含むＴＡＥ緩衝液中で電気泳動を行った。これらの泳動条件下で、大半のＤＮＡ断片は、種々のメーカーの特性バンドパターンで判定されたように、二本鎖のままであった。あるＤＮＡ断片は部分的に、また、ある断片は完全に変性していた。これは、ある断片がバンドがさらに広がっていたことと、あるバンドが通常の位置になかったことから判定された。たとえば、１ｋｂラダーでは、１，０１８ｂｐ断片、２，０３８およびさらに分子量の大きい断片は、大部分が消失した。それらの場所には、数ミリメートルしか移動していないスメアーが見られた。このラダーの５１７ｂｐ断片も消失した。ＭｓｐＩ、ＨａｅIII、ＨｈａＩで消化したｐＢＲ３３２消化物では、新しい鮮明なバンドが高分子量領域に出現した。これらのバンドの同定は行われなかった。ＨＥＣを含まないゲルでは、１００ｂｐラダーの１００ｂｐ断片は５．９ｍｍ、５００ｂｐ断片は２．５ｃｍ、１，０００ｂｐ断片は１．４ｃｍ移動した。ＨＥＣを０．１５％含むゲルでは、これらの３種類の断片の移動距離はそれぞれ、５．９ｃｍ、２．４ｃｍ、１．３ｃｍであった。ＨＥＣ  ０．２％では、移動距離は、５．７ｃｍ、２．１ｃｍ、１．１ｃｍであった。ＨＥＣ  ０．３％では、断片は、５．４ｃｍ、１．４ｃｍ、０．４ｃｍ移動した。ＨＥＣ  ０．４％を含むゲルでは、３種類のゲルはそれぞれ、５．３ｃｍ、０．８ｃｍ、０．３ｃｍ移動した。ＨＥＣ  ０．３％および０．４％のゲルにおける１，０００ｂｐバンドの同定は、ラダーに複数の新しいバンドが出現したため、確実ではなかった。
ＨＥＣ（Ｆｌｕｋａ）０．２％を含む、さらに架橋度の大きい４種類のＴ  １２％のゲルも同様に重合した。２種類のゲルでの架橋度は３．４％で、残りの２種類のゲルでは、４．０％であった。ＨＥＣを含まない場合、どちらのＣの値においても、ゲルの６００ｎｍでの吸光度は無視し得る値であった。吸光度は、Ｃが３．４％の場合は０．２６３、４．０％の場合は０．４８３であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、５５℃で２時間、６Ｍの尿素を含むＴＡＥ緩衝液中で電気泳動を行った。Ｃが３．４％の対照ゲルでは、１ｋｂラダーの７５ｂｐ断片は５．９ｃｍ、５０６ｂｐ断片は１．６ｃｍ、１，６３６ｂｐ断片は０．６ｃｍ移動した。ＨＥＣを含むゲルにおいて、３種類の断片はそれぞれ、５．７ｃｍ、０．３ｃｍ、０．１ｃｍ移動した。Ｃが４．０％の場合、対照ゲルでは、７５ｂｐ、５０６ｂｐ、１，６３６ｂｐのＤＮＡ断片の移動距離はそれぞれ、５．２ｃｍ、１．１ｃｍ、０．４ｃｍであった。ＨＥＣを含むゲルでは、７５ｂｐ断片は４．２ｃｍ移動したが、５０６ｂｐ、１，６３６ｂｐ断片の移動距離は、１ｍｍ未満であったため測定できなかった。
実施例１７  ゲル濾過により分別したＨＥＣを用いて調製した、向上した選択性を有するゲル
直径５ｍｍのカラムにＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ  ６Ｂ  ５００ｍｌを満たし、３０ｍＭ  ＴＡＥ中で平衡させた。実施例２で説明したように精製した１％ＨＥＣ（Ｆｌｕｋａ）のサンプル５０ｍｌをこのカラムに注ぎ、約１００ｍｌ／時間の流速でクロマトグラフィを行った。約１１．５ｍｌのフラクションを収集した。代わりのフラクションは、オルシノール−硫酸法によって糖度を分析した。溶出液はフラクション１８から糖が陽性で、それ以降検査したフラクション４２まですべてに糖が検出された。フラクション中のＨＥＣ濃度は、開始時のＨＥＣ溶液にて作成した標準曲線より決定した。異なるフラクションのＨＥＣを用いて、Ｔ  １２％、Ｃ  ２．６％のゲルを３種類調製した。最初のゲルにはフラクション１８および１９、２番目のゲルにはフラクション３０および３１、３番目のゲルにはフラクション４０および４１を使用した。糖測定に基づく、３種類のゲル中のＨＥＣ最終濃度はそれぞれ、０．０８％、０．１９％、０．０８％であった。６００ｎｍにおける吸光度は、１．０１９、０．４５５、０．０２８であった。ゲルは、１０Ｖ／ｃｍ、２０℃で４時間電気泳動を行った。フラクション１８−１９によるＨＥＣを含むゲルでは、６０、１００、２００、５００および１，０００ｂｐ断片はそれぞれ、７．８ｃｍ、５．６ｃｍ、２．３ｃｍ、０．１ｃｍ、０．１ｃｍ未満移動した。フラクション３０および３１によるＨＥＣを含むゲルでは、同じ分子の移動距離は、７．８ｃｍ、６．１ｃｍ、３．８ｃｍ、１．１ｃｍ、０．３ｃｍであった。フラクション４０および４１によるＨＥＣを含むゲルでは、同じＤＮＡ断片が、７．８ｃｍ、６．２ｃｍ、４．２ｃｍ、２．１ｃｍ、１．１ｃｍ移動した。このように、ＨＥＣポリマーの分子量が減少するにつれ、選択性は低下した。
前記発明は、かなり詳細に説明した。実験結果は、現在の全結果および先行技術に、最も矛盾しないと考えられる方法で解釈したが、この解釈はあらゆる点で限定されないものと考えるべきである。以下の請求の範囲で説明するように、発明の概念および範囲から外れずに、利用される手順および材料を修正および変更可できることは、当業者にとっては明白なことである。
【図１】
0004036392.tif 000002
【図２Ａ】
0004036392.tif 000003
【図２Ｂ】
0004036392.tif 000004
【図２Ｃ】
0004036392.tif 000005
【図２Ｄ】
0004036392.tif 000006
【図２Ｅ】
0004036392.tif 000007
【図２Ｆ】
0004036392.tif 000008
【図３】
0004036392.tif 000009
【図４】
0004036392.tif 000010
【図５】
0004036392.tif 000011
【図６】
0004036392.tif 000012
【図７】
0004036392.tif 000013