(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小透析プローブと、グルタメートオキシダーゼ／グルタメートデヒドロゲナーゼの同時固定相からなる酵素リアクターと、から成り、
前記微小透析プローブからの回収液を前記酵素リアクターに供給して、Ｌ−グルタメートの基質サイクリング反応を生じさせ、このサイクリング反応でＬ−グルタメート量に対応して増幅された過酸化水素の発生量を検出することにより、Ｌ−グルタメート量をリアルタイムで測定することを特徴とするフローシステムであって、
前記グルタメートオキシダーゼが、グルタメートオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．１１）であって、その固定化の前にＨＣｌ（ｐＨ３．０）の溶媒中に混和されて、ＮＡＤＨオキシダーゼが不活性化されたものであることを特徴とするフローシステム。
【請求項２】
前記酵素リアクターに固定するグルタメートデヒドロゲナーゼを、グルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．４）とし、その補酵素としてＮＡＤＰＨを用いることを特徴とする請求項１に記載のフローシステム。
【請求項３】
前記酵素リアクターが、前処理として６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンを流すことにより、グルタミナーゼが不活性化されたものであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のフローシステム。
【請求項４】
回収液を前記酵素リアクターに送るためのフロー溶媒として、リン酸アンモニウム緩衝液を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のフローシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内で発生するＬ−グルタメートを、オンラインリアルタイム方式で測定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−グルタメートは生体内で重要な働きをする成分であり、特に脳細胞から遊離されるＬ−グルタメートは、興奮性神経伝達成分としての役割があり、生化学分野において永年研究対象とされてきた。従来、脳細胞から遊離されたＬ−グルタメートを測定するには、ラット等の脳内に微小透析プローブを挿入して、遊離されたＬ−グルタメートを脳外に取り出してから測定するものであるが、分析感度が低く、積算測定しても数分間が限度であり、また分析の手間と時間がかかり、研究促進の障害となっていた。
【０００３】
一方、Ｌ−グルタメート測定の感度が上がれば、その測定値の変化を監視し、生体に加えられた外的刺激との関係等を、より詳しく検討することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｌ−グルタメート測定の感度を高め、生体からの遊離量を連続的にリアルタイムでモニターする方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本発明は、生体に適用された微小透析プローブからの回収液を、フローシステムに組み込んだグルタメートオキシダーゼ／グルタメートデヒドロゲナーゼの同時固定相からなる酵素リアクターに供給して、Ｌ−グルタメートの基質サイクリング反応を生じさせ、このサイクリング反応でＬ−グルタメート量に対応して増幅された過酸化水素の発生量を検出することにより、生体が発生したＬ−グルタメート量をリアルタイムで測定することを特徴とするものである。
【０００６】
本発明は更に、上記の酵素リアクターに固定するグルタメートデヒドロゲナーゼを、グルタメートデヒドロゲナーゼ（EC1.4.1.4 ）とし、その補酵素としてＮＡＤＰＨを用いることにより、Ｌ−グルタメート基質サイクリング反応による過酸化水素増幅率を高めようとするものである。
【０００７】
本発明は更に、酵素リアクターに固定するグルタメートオキシダーゼを、グルタメートオキシダーゼ（EC1.4.3.11）とし、その固定化の前に２０ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ３．０）の溶媒中に３０分間混和し、ＮＡＤＨオキシダーゼを不活性化し、この酵素が活性状態において過酸化水素を生ずることによる測定誤差を防止するものである。
【０００８】
本発明は更に、酵素リアクターに、前処理として６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンを流すことにより、不純物酵素であるグルタミナーゼを不活性化し、採取試料中のグルタミンからＬ−グルタメートが生成されることを防止するものである。
【０００９】
本発明は更に、回収液を酵素リアクターに送るためのフロー溶媒に、リン酸アンモニウム緩衝液を用いることにより、基質リサイクリング反応によるＬ−グルタメートの高い増幅率を維持しようとするものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
上述の構成において用いられる本発明の基質サイクリング反応は、図１に示すような構造を有している。酵素リアクター１は、グルタメートオキシダーゼ（ＧｌＯＤ）／グルタメートデヒドロゲナーゼ（ＧｌＤＨ）を被着固定した微小ガラス球を、内径１．５ｍｍのチューブ内において、長さ１０ｍｍにわたり充填したものである。この酵素リアクター１に流入した試料中のＬ−グルタメートは水及び溶存酸素とともに、ＧＩＯＤの酵素作用によって２−オキソグルタレート＋ＮＨ3 に変わり、同時に過酸化水素が生成される。
【００１１】
２−オキソグルタレート＋ＮＨ3 はまた、補酵素としてのβ−ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド還元型又はβ−ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・フォスフェート還元型（ＮＡＤＰＨ）とともに、ＧｌＤＨの酵素作用によって元のＬ−グルタメートに変わり、同時にＮＡＤ（Ｐ）＋が生成される。再生されたグルタメートはＧＩＯＤによって、再び2-オキソグルタレートと過酸化水素を生成する。この反応はいずれも速いので、リアクター内で何回も生じ、結果的に、１分子のＬ−グルタメートから数十分子の過酸化水素を生成することになる。
【００１２】
従って、本発明では電気化学的に検出容易な過酸化水素量の測定値に係数を掛ける形でL-グルタメート量を特定するものである。
【００１３】
上記のとおり、酵素リアクターにおいては補酵素としてＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが必要である。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨのどちらを用いるかは、連携する主酵素ＧｌＤＨの種類（酵素番号:EC.No.)に応じて定まる。ＧｌＤＨには２種類（EC1.4.1.3、及びEC 1.4.1.4）あり、ＧＩＤＨ（EC 1.4.1.3）の場合には、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨのいずれでも使用できる。またＧｌＤＨ（EC 1.4.1.4）の場合にはＮＡＤＰＨしか使用できない。実験の結果、酵素サイクリングの増幅率はＧｌＤＨ（EC 1.4.1.4）−ＮＡＤＰＨの組み合わせで最も高い値が得られた。
【００１４】
実験結果より、酵素リアクターの一翼を担うＧｌＯＤに、微量のβ−ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）オキシダーゼが含まれることが判明した。このオキシダーゼが存在すると、他方の酵素（ＧｌＤＨ）と連携する補酵素（ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ）の存在故に発生する過酸化水素が、その微量酵素による加算分を含むため、測定に支障を来すことになる。そのため、ＧｌＯＤの活性を保持したまま、ＮＡＤＨオキシダーゼを選択的に不活性化する必要があり、この処理として２０ｍＭ ＨＣｌ ｐＨ３．０の溶液に、ＧｌＯＤを３０分間混和することが有効であった。
【００１５】
実験結果より、ＧｌＯＤ又はＧｌＤＨには微量不純物酵素としてグルタミナーゼを含むことが判明した。グルタミンが存在すると、Ｌ−グルタメートが生成され、生体から採取したＬ−グルタメートに加わって、測定値に大きな誤差を生じることになる。一方、グルタミナーゼについては、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン（ＤＯＮ）が、これを特異的に不活性化することは既によく知られている。従って、主酵素ＧｌＯＤ／ＧｌＤＨをリアクター構造に同時固定した後、２ｍＭ  ＤＯＮ／１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を１００μｌ／ｍｉｎの流速で、３０分間流すことで、この不活性化を行うことができた。
【００１６】
なお、酵素中の微量のカタラーゼは、生成した過酸化水素の分解を促進する。従って、本発明の実施においては１０ｍＭのアジ化ソーダを含む溶液を連続的に流すことにより、その影響を抑えることとした。
【００１７】
生体からの回収液を酵素リアクターに流通させるフロー系で用いる緩衝液として、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸アンモニウム緩衝液について検討したところ、前二者に関してサイクリング増幅率は低いが、リン酸アンモニウム緩衝液では十分な増幅率を得ることができた。但し、前二者についても５０ｍＭのＮＨ4 Ｃｌを共存させることによって、リン酸アンモニウムと同等の増幅率を得ることができた。このことは、図１の基質サイクリング反応においても、アンモニウムイオンの循環生成が含まれるという事実から、よく理解されるであろう。
【００１８】
ＧｌＯＤ／ＧｌＤＨ（EC 1.4.1.4）同時固定化リアクターに対する最適溶媒と温度の検討：
溶液ｐＨ６．０〜８．５、補酵素ＮＡＤＰＨ含有量０〜１．５ｍＭ、温度を２７〜４５℃の範囲で検討した結果、１００ｍＭリン酸アンモニウム緩衝液ｐＨ７．５を用いて試料をフローさせ、ＮＡＤＰＨを０．３ｍＭ添加し、これらの酵素リアクター流通系の温度を３７℃に設定したとき、最も好ましい結果を得ることができた。
【００１９】
ＧｌＯＤ／ＧｌＤＨ（EC 1.4.1.4）同時固定化リアクターに対する流速の影響の検討：
上記の最適溶媒を用い、後述する実施例の流路構成において適用した上記リアクターに、５〜６０μｌ／ｍｉｎの流速で、Ｌ−グルタメート含有試料を供給したときの、Ｌ−グルタメート量に対応する電極反応（ピーク電流）は図２に示すとおりであり、流速が遅いほどリサイクリング増幅率は向上するが、５〜２０μｌ／ｍｉｎの範囲では、比較的なだらかな高い値を示している。
【００２０】
ＧｌＯＤ／ＧｌＤＨ（EC 1.4.1.4）同時固定化リアクターであっても、補酵素が添加されない（サイクリング増幅が生じない）場合：
最適溶媒条件下、流速１０μｌ／ｍｉｎで、補酵素ＮＡＤＰＨを添加した場合（○）、及び添加しなかった場合（●）の検量線は、図３に示すとおりである。補酵素を添加して、サイクリング増幅を生じさせた場合の定量下限は、０．８×１０-7Ｍであったのに対し、補酵素を添加せずに、サイクリング増幅を生じさせた場合の定量下限は、１０-5Ｍであり、サイクリング増幅により感度が約１００倍に上昇したことが分かる。
【００２１】
ＧｌＯＤ／ＧｌＤＨ（EC 1.4.1.4）同時固定化リアクターの安定性について、これを１日４時間の連続使用を３０日繰り返した結果、感度低下は約２０％程度であり、きわめて実用的な安定性を有することが確認された。
【００２２】
【実施例】
図４は本発明のフロー分析に用いる流路構成の実施例を示している。図４において、２はラット脳に差し込まれた微小透析プローブであり、シリンジポンプ３から２μｌ／ｍｉｎの流速で供給されるリンゲル液を、三方ジョイント４を介してラット脳の透析に用い、プローブ２で採取した脳細胞分泌液を、二重プランジャーμｌポンプ５により８μｌ／ｍｉｎの流速で供給される最適溶媒に合流させて混合し、ＧｌＯＤ／ＧｌＤＨ酵素リアクター６に供給するようになっている。酵素リアクター６及びその入口流路は３７℃の恒温槽７内に配置される。
【００２３】
これにより、酵素リアクター６は前述のとおり、基質としてのＬ−グルタメートがサイクリング生成され、リアクター排出流中でこのサイクリング反応に対応して存在する過酸化水素量が、電気化学検出器の電極８によって測定される。この電極８は、ポリ（1,2-ジアミノベンゼン）フィルムを被覆した白金電極であり、対極との間に＋０．５Ｖ（ｖｓ−Ａｇ／ＡｇＣｌ）印加されるものである。電極８のフィルムは、生体内の還元性成分（例えば、アスコルビン酸、カテコールアミン代謝物）などの白金表面への透過を阻止し、過酸化水素を選択的に透過させる。
【００２４】
図５は、リンゲルを介してラット脳にカリウム刺激を行ったときに分泌されるグルタメート濃度をモニターした結果を示すグラフである。このグラフにおいて、平坦部a1、a2、a3、及びa4は、リンゲル中のカリウム濃度がそれぞれ２．７ｍＭ／ｄｍ3 、１０ｍＭ／ｄｍ3 、２０ｍＭ／ｄｍ3 、及び１００ｍＭ／ｄｍ3 の場合であり、この結果はカリウム濃度によって、Ｌ−グルタメートの遊離量が上昇するという過去の実績に見合うものである。
【００２５】
なお、生体中には２−オキソグルタレートが存在し、この物質も図１に示したサイクリング増幅系の基質になる。この２−オキソグルタレートを排除するため、図４の酵素リアクター６の前にサッカロピン・デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）の固定化リアクター（図示せず）を配置し、ＮＡＤＨを補酵素として２−オキソグルタレート＋Ｌ−リジン＋ＮＡＤＨ  →  サッカロピン＋ＮＡＤ＋の反応により、２−オキソグルタレートを除去してから、試料液を酵素リアクター６に供給する実験を行った。
【００２６】
この２−オキソグルタレート除去試料のＬ−グルタメート測定値を、除去工程を経ない図４の流路構成によりＬ−グルタメート測定値と比較した結果には大差がなく、これは、細胞外液中の２−オキソグルタレート濃度は、発生するＬ−グルタメート量に比して、極めて低いことを意味し、ＳＤＨ固定化リアクターを系内に配置する必要はないものと考えられる。
【００２７】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、生体内で遊離されるＬ−グルタメート測定の感度を飛躍的に高め、その測定値を連続的にリアルタイムでモニターする方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において適用されるＬ−グルタメート・オキシダーゼ／グルタメート・デヒドロゲナーゼ同時固定化（酵素）リアクターにおけるＬ−グルタメートの基質リサイクリング反応を示す反応構造図である。
【図２】上記の酵素リアクターに、Ｌ−グルタメートを含む生体採取試料を、補酵素ＮＡＤＰＨを含む緩衝液と合流させて供給した場合の応答をピーク電流／流量の関係で示すグラフである。
【図３】Ｌ−グルタメートを含む生体採取試料を、上記の酵素リアクターに供給して測定した場合（○）と、酵素リアクターに供給せず（増幅なしで）測定した場合（●）のＬ−グルタメート量検量線である。
【図４】本発明を適用して、ラット脳から採取したＬ−グルタメートをリアルタイムで連続測定するために、グルタメート・オキシダーゼ／グルタメート・デヒドロゲナーゼ同時固定化リアクターに供給し、電気化学検出器に供給する実施例の流路行為を示す流路構成図である。
【図５】図４の流路構成を用い、種々のカリウム濃度でラット脳を刺激した場合の信号電流を示すグラフである。
【符号の説明】
１  酵素リアクター
２  ラット脳に埋め込まれた微小透析プローブ
３  シリンジポンプ
４  三方ジョイント
５  二重プランジャーμｌポンプ
６  ＧｌＯＤ／ＧｌＤＨ酵素リアクター
７  ３７℃恒温槽
８  電気化学検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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