(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質Ｍ１６１Ａｇ又はその遺伝子組換え産物を含有してなるサイトカイン誘発剤であって、誘導されるサイトカイン類がＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及び／又はＴＮＦ−αであるサイトカイン誘発剤。
【請求項２】
蛋白質Ｍ１６１Ａｇ又はその遺伝子組換え産物が、そのＮ末端が脂肪酸でアシル化されたものである請求項１に記載のサイトカイン誘発剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、蛋白質Ｍ１６１Ａｇを含有してなるサイトカイン誘発剤（Cytokine Inducer）、免疫調整剤、免疫療法剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｍ１６１Ａｇは、ヒト骨随性白血病細胞株Ｐ３９（＋）などのマイコプラズマファーメンタンス（Mycoplasma fermentans）の潜伏感染細胞に含まれる膜タンパク質であり、第２補体活性化経路の活性化や補体Ｃ３の吸着などの機能を有する。このタンパク質の単離精製、及びモノクロナール抗体の作製はすでに報告されている（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１，１１５−１２５（１９９５））。また大部分の一次構造も報告されている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，３：１２６６−１２７０（１９９７））（特開平９−１５７２９５号）。
【０００３】
マイコプラズマファーメンタンス（M.fermentans）はＨＩＶ感染患者、白血病や骨髄腫などのがん患者、再生不良性貧血患者など免疫能が低下する病態下で陽性になる細胞内寄生細菌である。主な寄生宿主は、インビトロ（in vitro）でヒト腫瘍細胞株と同定されている。マイコプラズマファーメンタンス（M.fermentans）陽性例ではＭ１６１Ａｇも必ず陽性になることが知られている。
また、マイコプラズマ（Mycoplasma）は別のグループの報告では、リンパ球低下の一因とされ、ＡＩＤＳ発症のコファクターとされてきた。また、マイコプラズマファーメンタンス（M.fermentans）はインビトロ（in vitro）で白血球系を刺激してサイトカインを誘導することが示唆されてきた。これらの現象は他のマイコプラズマ種では起きず、ファーメンタスのみに見られることから、マイコプラズマファーメンタンス（M.fermentans）に特有な遺伝子産物のあるものがリンパ球低下、サイトカイン誘導を指令すると考えられてきた。しかし、いかなる物質がその活性に責任をもつか不明であった。本発見者はマイコプラズマファーメンタンス（M.fermentans）のこれら生物活性を司る物質を精製標品を用いたアッセイで同定、その生物活性の範囲を明確化し、本発明を完成した。
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｍ１６１Ａｇの生理活性・サイトカイン誘導活性を用いて、Ｍ１６１Ａｇからなるサイトカイン誘発剤、免疫調整剤及び免疫療法剤を提供し、各種免疫関連疾患の治療に役立てることにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、Ｍ１６１Ａｇの精製標品を用いて、単球、リンパ球などの免疫担当細胞を刺激し、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６などの炎症サイトカイン、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２のリンパ球活性化サイトカインを効果的に誘導し、また、感染細胞をアポトーシス化で排除することに成功し、本発明を完成した。
本発明は、蛋白質Ｍ１６１Ａｇ又はその遺伝子組換え産物を含有しているサイトカイン誘発剤（Cytokine Inducer）、免疫調整剤又は免疫関連疾患の治療剤に関する。
【０００５】
本発明のＭ１６１ＡｇのＤＮＡは、マイコプラズマファーメンタンス（M.fermentans）を感染・増殖させたヒト骨髄性白血病細胞株Ｐ39、ヒト線維芽細胞株W138などからゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｅ）として得られる。これらのＤＮＡはＴＧＡ（大腸菌、ヒトにおいては終止コドン、マイコプラズマではトリプトファン）を５つ含むので、これらをＴＧＧに置き換えてｐＰＬＨ３などヒスタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）のついた大腸菌の発現べクターに組み込み、菌内で強制発現させる。こうして得られた大量の遺伝子組換え産物をニッケル・セファロースカラムとＭＫ５３（抗Ｍ１６１Ａｇ抗体）セファロース力ラムで精製する。本標品は大腸菌由来のパイロジェン−フリーを確認してある。
【０００６】
こうして精製されたＭ１６１Ａｇは分子量４５ｋＤａでＮ末システィンにパルミチン酸などの脂質が結合している。Ｍ１６１Ａｇを細胞と混合すると、この脂質を介して一部が細胞に取り込まれる。インビトロで末梢血、単球、単球系の細胞株にＭ１６１Ａｇを混合すると、２４時間以内に培養上清にＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、などマクロファージ由来の炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２など、リンパ球のモジュレーター活性をもつサイトカインが同定される。活性をリポポリサッカライド（lipopolysaccharide(ＬＰＳ)）と比較すると、同一重量（例えば１０ｎｇ）を用いた場合、上記全てのサイトカインはＬＰＳよりＭ１６１Ａｇでより強力に誘導される。なお、本実験に用いた単球はエルトリエーションシステム（elutriation system(Beckman)）を用いたカルプ（Karp）らの方法によるもので９５％以上の精製度である。従って、これらのサイトカインはＭ１６１Ａｇが単球を直接刺激して誘導されたと結論しうる。
【０００７】
Ｍ１６１Ａｇが、マイコプラズマ由来でヒトサイトカインを強力に誘導する生理活性物質であることが証明でき、かつ、この作用を通して、ヒト基本免疫系（innate immunity）を活性化し、免疫低下時の宿主免疫を改善すること、さらにリンパ球など感染細胞をアポトーシス死に陥らしめ、アレルギー等の過度の免疫活性化の病態を押さえることが判明した。
以上からＭ１６１Ａｇは単球系を介して多彩な免疫系のモジュレーターとしてのサイトカインを誘導することが証明された。
【０００８】
本発明の蛋白質Ｍ１６１Ａｇで誘発されるサイトカインは種々の生理活性を有することが知られている。例えば、ＩＬ−１は、Ｔ細胞活性化、好中球活性化、抗腫瘍活性の亢進、線維芽細胞増殖、ＡＣＴＨ・ＧＨなどの分泌増加などの作用が知られている。ＴＮＦ−αは細胞の増殖、分化に関与する因子であり、特に腫瘍壊死作用を有する因子である。また、プロスタグランジンや血小板活性化因子の産生を増強し、さらには抗ウイルス作用を有するとの報告もされている。
【０００９】
ＩＬ−６は、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を促進させ、Ｔ細胞やマイクロファージの分化・増殖を促進させる作用を有する。ＩＬ−１０はＴ細胞を増殖させ、ＩＬ−１２は細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）やＮＫ細胞を活性化する作用を有する因子である。
Ｍ１６１Ａｇはサイトカイン誘発活性を種々の免疫関連疾患、がんなどの治療に適用できる。
本発明の有効成分は、ヒト基本免疫系を活性化するものであるから、基本免疫系が関与する各種の免疫関連疾患の治療剤として有用である。免疫疾患としては、例えば、アレルギー疾患、自己免疫疾患などが挙げられる。
【００１０】
本発明の蛋白質Ｍ１６１Ａｇは、細胞株Ｐ３９（＋）などの細胞からの抽出物を使用することもできるが、例えば、特開平９−１５７２９５号などに開示されているＤＮＡを用いて、各種の宿主細胞を用いてこれを発現させたもの（遺伝子組換え産物）を用いてもよい。
本発明の蛋白質Ｍ１６１Ａｇは、その活性を維持できる範囲で、１個以上のアミノ酸が欠失してもよいし、１個以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換していてもよいし、１個以上のアミノ酸が付加していてもよい。
また、本発明のＭ１６１Ａｇは、蛋白質のままで使用することもできるが、Ｎ末端やアミノ酸鎖の適当な位置を脂肪酸などで修飾したものや、癌細胞など細胞に特異的な抗体と結合などの修飾をして使用することもできる。
【００１１】
本発明の有効成分となる蛋白質Ｍ１６１Ａｇの投与量は、患者の状態や疾病の種類によっても異なるが、通常は１日当り、０．０１〜１００ｎｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｎｇ／ｋｇであり、通常は１日１〜３回投与される。
投与方法としては、静脈注射、皮下注射などが好ましいが、舌下錠や直腸投与などの非経口投与であれば特に制限はない。
【００１２】
投与形態としては、通常の蛋白質の製剤化法により製剤化されたものを使用できる。また、リポソーム製剤などの乳化剤として使用することもできる。
【００１３】
【実施例】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
単球系細胞株ＴＨＰ−１（１０6）に６ｎｇ、１２ｎｇのＭ１６１Ａｇを加えた。２４時間後に培養上清を回収し、各種サイトカインをサンドイッチＥＬＩＳＡ法で定量した。ＬＰＳとの比較データも併せて図１に示す。
【００１４】
実施例２
精製末梢血単球（１０6）に２．４ｎｇ、１２ｎｇのＭ１６１Ａｇを加えた。２４時間後に培養上清を回収し、各種サイトカインをサンドイッチＥＬＩＳＡ法で定量した。ＬＰＳとの比較データも併せて図２に示す。
【００１５】
実施例３
精製末梢血単球（１０6）に２．４ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌのＭ１６１Ａｇを加えた。２４時間後に培養上清のＩＬ−１０、ＩＬ−１２を定量した。結果を図３に示す。
【００１６】
【発明の効果】
本発明はマイコプラズマファーメンタンスの膜蛋白質、Ｍ１６１Ａｇの新規な生理活性に基づく薬剤を提供する。Ｍ１６１Ａｇは強力なサイトカイン誘発活性を示し、アレルギー時、免疫低下時などの免疫調節薬として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、単球系細胞株ＴＨＰ−Ｉによる、本発明の蛋白質Ｍ１６１ＡｇのＩＬ−１β、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の誘発作用を示すものである。
図１の左側は細胞溶解物からのデータであり、右側は条件培地でのデータである。
【図２】  図２は、精製末梢血単球による、本発明の蛋白質Ｍ１６１ＡｇのＩＬ−１β、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の誘発作用を示すものである。
図２の左側は細胞溶解物からのデータであり、右側は条件培地でのデータである。
【図３】  図３は、精製末梢血単球による、本発明の蛋白質Ｍ１６１ＡｇのＩＬ−１０（図３左側）及びＩＬ−１２（図３右側）の誘発作用を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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