(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつポリエステルを含む繊維を改質する特性のあるラッカーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
配列表の配列番号２で表される塩基配列を含む請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、タンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするポリエステルを含む繊維を改質する特性のあるラッカーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載のラッカーゼを生産する新規な微生物KL112（FERM P-19071）。
【請求項８】
請求項７に記載の微生物を培養し、酵素を生産せしめ、培養物から該酵素を採取することを特徴とするラッカーゼの製造方法。
【請求項９】
ポリエステルを含む繊維の改質方法であって、請求項１に記載のラッカーゼを作用させる工程を含む改質方法。
【請求項１０】
改質が、帯電性の低減及び／又は吸水性の増加である請求項９記載の改質方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリエステルを含む繊維を改質する特性に優れた新規ラッカーゼ及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ラッカーゼは、ｐ−ジフェノール オキシダーゼとも言われ、ヒドロキノン、ポリフェノール、ｐ−フェニレンジアミン、アスコルビン酸、シアニン色素などを酸化する酵素で、製紙工業におけるパルプ中のリグニンの分解、繊維産業におけるインディゴ染料の脱色、各種洗剤への添加などや、最近ではダイオキシンやＰＣＢを直接分解するという環境浄化の可能性も示され、ますます産業上の有用性が期待される酵素である。
【０００３】
ところで、世界中で最も汎用される合成繊維のポリエステル繊維は、一般に苛性ソーダによるアルカリ減量加工で加工処理されている。この方法は、濃厚な苛性ソーダ溶液を用い、ポリエステル繊維を最高約３０％まで減量することによりドレープ性を出し、ポリエステル繊維に絹のような風合いを付与するものである。しかし、この方法によれば、ポリエステル分解物を含む大量の高濃度の苛性ソーダ廃液が生じ、その処理が大きな問題となっている。また、この方法によっても、ポリエステル衣料に見られる、べとつき感（吸水性が低い）、まとわりつき（帯電性）などの欠点は依然として改善されない。
【０００４】
また、このようなポリエステル繊維の風合い加工、凹凸加工、吸湿加工、帯電防止加工などの諸機能を改質する技術についても、様々な技術が開発されている。これらの技術は、所望の特性を付与するために種々の仕上加工剤を用いる。例えば、帯電防止加工は、帯電防止剤を樹脂などと併用して繊維表面に付与する方法であるが、仕上加工剤を付与された繊維は、洗濯などに対する耐久性に乏しく、一時的な改質方法に過ぎない。
【０００５】
一方、酵素を用い永続的にポリエステル繊維を改質する方法も提案されている。布繊維をペクチナーゼ類、セルラーゼ類、プロテアーゼ類、リパーゼ類またはこれの混合物で処理する方法がある（特許文献１参照）。また、脂肪族ポリエステルをリパーゼで処理する方法がある（特許文献２参照）。しかし、従来の酵素を用いたポリエステル加工技術は、脂肪族ポリエステル又はこれを部分的に含む芳香族ポリエステルに対してリパーゼなどの酵素を作用させる方法であり、１００％芳香族ポリエステル、又はその混紡の改質は工業的規模で行うのが困難であった。
【０００６】
【特許文献１】
特表２００１−５０２０１４号公報
【特許文献２】
特開平５−３４４８９７号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、ポリエステル、特には芳香族ポリエステルを含む繊維の帯電性や吸水性などを改質する特性に優れた新規ラッカーゼ及びその製造方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために土壌試料について、ポリエステルを含む繊維を改質させる特性とラッカーゼ活性を指標にスクリーニングを行った結果、新規ラッカーゼを生産する新規な微生物を見出し、該新規ラッカーゼの遺伝子をクローニングすることに成功し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、以下の要旨の発明が提供される。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつポリエステルを含む繊維を改質する特性のあるラッカーゼ活性を有するタンパク質。
（２）（１）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）配列表の配列番号２で表される塩基配列を含む（２）に記載のＤＮＡ。
（４）（２）又は（３）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（５）（４）に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（６）（５）に記載の形質転換体を培養し、タンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするポリエステルを含む繊維を改質する特性のあるラッカーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
（７）（１）に記載のラッカーゼを生産する新規な微生物KL112（FERM P-19071）。
（８）（７）に記載の微生物を培養し、酵素を生産せしめ、培養物から該酵素を採取することを特徴とするラッカーゼの製造方法。
（９）ポリエステルを含む繊維の改質方法であって、（１）に記載のラッカーゼを作用させる工程を含む改質方法。
（１０）改質が、帯電性の低減及び／又は吸水性の増大である（９）記載の改質方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の新規ラッカーゼは、土壌中から見出された新規な微生物の培養産物として見出された。新規な微生物は、ポテトデキストロース寒天（PDA）、オートミール寒天（OA）及び2%麦芽寒天（MEA）の各プレートに接種し、25℃で最長１２週間の培養を行った形態学的観察において、子嚢果などの有性生殖器官の形成は認められず、また分生子柄などの無性生殖器官も観察されず、３種類の寒天プレート上のコロニー性状及び分生子形成構造体の形態的特徴から具体的に同定できなかったが高等菌類（担子菌類あるいは子嚢菌類）に属するものと推定された。
【００１０】
また、新規な微生物に係る配列表の配列番号７の18SrRNA遺伝子に基づく分子遺伝学的手段によれば、90%以上の相同性が認められ、Paraphaeosphaeria michotiiに最も近縁であることが示唆されたが、また、広範囲な系統関係を導くためParaphaeosphaeria属及びKL112株に分子遺伝学的に近縁と推定される株を選定し、図１に示す系統樹を作成した。その結果、Paraphaeosphaeria属、Paraphaeosphaeria属に近縁な菌株は図２に示すように大きくA、B、Cの３つの系統に分けられるが、KL112株はBの系統群に属し、B群にParaphaeosphaeria属以外にCucurbidothis属、Letendraea属、Bimuria属の３属の菌株が含まれる。以上の点から考察すると、KL112株はParaphaeosphaeria属の新種、あるいはCucurbidothis属、Letendraea属、Bimuria属の中の新種、あるいは新属新種であると示唆された。この新規なラッカーゼを生産する新規な微生物は、KL112として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託され、その受託番号はFERM P-19071である。
【００１１】
上記の微生物の培養は、通常行われる条件で行えば良く、大量に培養するには液体培地を用い、振とう培養又は通気撹拌培養により好気的条件下で行うことが好ましい。炭素源としては、ポテトデキストロース、グルコース、スクロース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等、窒素源としては、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機塩若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、肉エキス等が用いられる。また、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、硫酸銅等の銅塩等の無機塩あるいはビタミン類等を添加したものを用いることができる。
【００１２】
培養法は、液体培養に限定されず固体培養でも良い。培地のｐＨは、例えば約2.0〜12.0、好ましくは約4.0〜8.0程度に調整し、培養温度は約20〜40℃好ましくは約30℃程度で、5〜20日間、好ましくは10〜15日間程度好気的条件下で培養する。
【００１３】
上記培養条件に従い培養された培養物からラッカーゼを分離、回収する。培養物からの粗酵素液の採取は公知の方法で行うことができ、培養物の遠心分離、ろ過等により粗酵素液を容易に得ることができる。得られた粗酵素液は、公知の精製法により精製される。公知の精製法は、塩析、有機溶媒による分別沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、その他の各種のクロマトグラフィー、電気泳動等を例示でき、これらを単独であるいは組み合わせて用いることができる。
【００１４】
得られたタンパク質が目的の本発明の酵素活性を有するかどうかを確認するには、ラッカーゼ活性を測定することにより行うことができる。酵素活性の測定は、グアイアコールの側鎖の酸化反応後、培養液の430nmにおける吸光度の変化を測定して行うことができる。
【００１５】
上記で得られた精製ラッカーゼをコードする遺伝子は、例えば以下に記載するような方法で該遺伝子のクローニングを行うことによって取得することができる。
部分アミノ酸配列決定方法としては、例えば、精製した酵素を直接常法に従ってエドマン分解法（ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第25巻、第7990〜7997頁（1981））によりアミノ酸配列分析（プロテイン−シーケンサ476A、アプライド  バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製等）に供しても良いし、あるいは蛋白質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し、得られた精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うことができる。
【００１６】
こうして得られる部分アミノ酸配列の情報を基に、本発明の酵素をコードする遺伝子をクローニングする。一般的にPCRを用いる方法あるいはハイブリダイゼーション法を利用してクローニングを行うことができる。
ハイブリダイゼーション法を利用する場合、例えば、モレキュラー  クローニング、ア  ラボラトリー  マニュアル（Molecular cloning、A Laboratory Manual、T．マニアティス（T．Maniatis）他著、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1989年発行）に記載される方法を用いることができる。
また、PCR法を利用する場合、以下のような方法を用いることができる。
まず、本発明の酵素を産生する微生物のゲノムDNAを鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR反応を行い、目的の遺伝子断片を得る。PCR法は、PCRテクノロジー（PCR Technology、エルリッヒ（Erlich）HA編集、ストックトンプレス社（Stockton press）、1989年発行）に記載の方法に準じて行うことができる。更に、この増幅DNA断片について通常用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外に本発明の酵素の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的とする本発明の酵素遺伝子の一部を取得することができる。もちろん得られた遺伝子断片をプローブとして更にハイブリダイゼーション法等を行うことによって本発明の酵素全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。
【００１７】
本発明では、ポリエステルを含む繊維を改質する特性に優れたKL112株について、PCR法を利用して、ラッカーゼをコードする遺伝子を分離し、その塩基配列を決定した。
本発明のラッカーゼをコードする遺伝子の全塩基配列は、配列表の配列番号２に記載したものであり、これによってコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載したものであると推定された。なお、配列番号１に記載したアミノ酸配列に対応する塩基配列は配列番号２に記載したもの以外に無数存在するが、これらはすべて本発明の範囲に含まれる。
【００１８】
配列番号１に記載のアミノ酸配列や配列番号２に記載の塩基配列の情報を基にして、化学合成によって目的の遺伝子を得ることもできる（参考文献：ジーン  （Gene）、第60(1)巻、第115-127頁(1987)）。
【００１９】
また、本発明の酵素タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、ポリエステルを含む繊維を改質するラッカーゼ活性を有する限り、１又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加の少なくとも１つがなされているアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【００２０】
本発明の酵素遺伝子を用いて、ラッカーゼ活性を有するタンパク質を生産するには以下の方法が便宜である。
まず、目的の本発明の酵素遺伝子を含むベクターを用いて宿主の形質転換を行い、次いで該形質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、本発明の酵素活性を有するポリペプチドを生産させることができる。
また、宿主としては微生物、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。微生物としては、大腸菌、バチルス（Bacillus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属等の細菌、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属等の酵母、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、リゾプス（Rhizopus）属等の糸状菌が挙げられる。動物細胞としては、昆虫細胞、例えばカイコの細胞、哺乳類培養細胞、例えばCOS細胞等が挙げられる。
微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。
また、発現の確認や発現産物の確認は、本発明の酵素に対する抗体を用いて行うことが簡便であるが、本発明の酵素活性を測定することにより発現の確認を行うこともできる。
【００２１】
形質転換体の培養物から本発明の酵素を精製するには上述のように、遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを組み合わせて行うことができる。
【００２２】
また、本発明により本発明の酵素の一次構造及び遺伝子構造が明らかとなったことにより、本発明の遺伝子を用いて、ランダム変異あるいは部位特異的変異を導入し、天然の本発明の酵素のアミノ酸配列中に、１又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換、付加の少なくとも１つがなされている遺伝子を得ることが可能である。これにより、本発明の酵素活性を有するが、至適温度、安定温度、至適ｐＨ、安定ｐＨ、基質特異性等の性質が少し異なった本発明の酵素をコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子工学的にこれら本発明の酵素を製造することが可能となる。
【００２３】
このように、本発明により、本発明の酵素の一次構造及び遺伝子構造が提供されたことにより、本発明のラッカーゼの安価で高純度な遺伝子工学的な製造が可能となる。
なお、本明細書では種々の文献等を引用したが、これらはすべて参考として本明細書中に組み込まれるものである。
【００２４】
【実施例】
次いで、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２５】
〔実施例１〕ラッカーゼ生産菌の分離
土壌試料約１gを0.01% Tween80溶液10mlに懸濁後、懸濁液100μlを１mMカフェ酸及び10μM CuSO4を添加したポテトデキストロース（PD）寒天培地に塗抹した。30℃で一週間培養後、コロニーの周りに褐変物質生成によるハロー形成が認められる菌株を0.01% Tween80溶液10mlに懸濁し、懸濁液100μlを１mMカフェ酸及び10μM CuSO4を添加したPD寒天培地に塗抹し、ラッカーゼ生産菌の純化を行った。
【００２６】
上記の処理を40ヶ所の土壌試料に行い、コロニーの形態の異なる82株分離した。
得られた82株を1mMエチレングリコールジベンゾエート(EDB)、1mMヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）及び10μM CuSO4を添加したPD寒天培地に接種し、30℃で３日間培養後、EDB分解によりコロニーの周りに褐変物質を生成する菌株を11株取得した。選択された11菌株を10μM CuSO4を添加したPD培地（PDC培地）中で30℃、７日間培養した後、培養液中のラッカーゼ活性を測定した。表１に示すように、11株中10株の培養液中にラッカーゼ活性が認められた。なお、ラッカーゼ活性は叙述の方法、具体的には2.4mlの1mMグアイアコール／50mM酢酸緩衝液  （pH6.0）に培養液0.1mlを加え、40℃、10分間反応させた後、430nmにおける吸光度の変化を測定して算出した。酵素活性は、前記方法において1分間にO.D.を１変化させる酵素量を1単位とした。
【００２７】
【表１】
0004159340.tif 000002
【００２８】
〔実施例２〕PET繊維分解に適したラッカーゼの取得
以下の実施例では、ポリエステルとしてPET繊維を用い、その改質特性のあるラッカーゼをスクリーニングした。
【００２９】
上記10株の培養液20mlに1mM HOBTとなるように加えた粗酵素液に約１×3cmのPET布（JIS L 0803準拠）を浸し、40℃、20時間緩やかに振とうした。PET布を100℃、10分間処理し、蒸留水で十分洗浄後、乾燥させて走査型電子顕微鏡観察用試料とした。PET布の表面観察は、イオンスパッタリング装置JFC-1100E（日本電子製）により白金コーティングした後、走査型電子顕微鏡JSM-820（日本電子製）を用いて加速電圧10kVで行った。その結果、４菌株（KL34、KL52、KL112、KL128）の生産するラッカーゼがPET布の表面変化を引き起こしていた。
【００３０】
選択された4菌株をPDC培地中で30℃、７日間培養した後、培養上清に80%飽和となるように硫安を加え、沈殿してきたタンパク質を10mM酢酸緩衝液（pH6.0）で一晩透析して粗酵素液を調製した。ラッカーゼ粗酵素液20mlにフサリウム・エスピー（Fusarium sp.）5112株の生産するリパーゼで処理したPET布（約１×3cm）を浸し、40℃、20時間緩やかに振とうした。PET布を100℃、10分間処理し、蒸留水で十分洗浄後、乾燥させて帯電特性及び吸水性の評価を行った。酵素処理したPET布の帯電特性は、スタチックオネストメータH-1100（シシド静電気製）を用い、織物及び編物の帯電性試験方法(JIS L 1094 A法)で評価した。ただし、相対湿度については65%とした。半減期とは、試料に1万ボルトを印加し、印加を止めた後試料の帯電圧が半分に減衰するまでの時間のことである。
吸水性はJIS L 1096 A法に規定されている滴下法で評価した。具体的には、試料表面に水滴を滴下し、水滴が特別な反射をしなくなるまでの（試料が水滴を吸収して鏡面反射が消えるまで）時間を測定した。測定結果は、表２と表３に示した。
【００３１】
【表２】
0004159340.tif 000003
【００３２】
【表３】
0004159340.tif 000004
【００３３】
表２及び表３から明らかなように、KL112株の産生するラッカーゼが最も帯電特性と吸水性に優れ、ポリエステルを含む繊維の改質に好適であることが判明した。
【００３４】
KL112株の18SrRNA遺伝子の塩基配列は次のように行い決定した。
すなわち、Raederらの方法（U.Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb.,1, 17-20(1985)）に従って調製したKL112株の染色体DNA、約0.1μgを鋳型DNAとして、Camaraらの方法（M. P. S. Camara, M. E. Palm, P. van Berkum and E. L. Stewart, Mycol. Res., 105, 41-56(2001)）に従ってNS1プライマー及びITS4プライマーを用い、PCR反応を30サイクル行った。その結果、2355bpの18SrRNA遺伝子断片が特異的に増幅された。増幅された18SrRNA遺伝子断片の塩基配列をThermo Sequnase蛍光シーケンサー用サイクルシーケンシングキット (アマシャムバイオサイエンス製)及びDNAシーケンサーModel 4000LS（LI-COR製）を使用して配列番号7と決定した。
【００３５】
〔実施例３〕KL112株のラッカーゼ遺伝子の解析
帯電特性と吸水性に優れ、ラッカーゼ活性の高いKL112株をPDC培地中で30℃、10日間培養して得られた培養上清１Lを20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）１Lと混合した。混合液中のタンパク質をSTREAMLINE DEAE(アマシャムバイオサイエンス製)に吸着後、1M NaCl溶液で吸着タンパク質を溶出させ、ラッカーゼ活性画分を回収した。ラッカーゼ活性画分を20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で５倍希釈した後、Q-Sepharose FF(アマシャムバイオサイエンス製)にタンパク質を吸着させ、0Mから0.5MまでのNaClの濃度勾配で吸着タンパク質を溶出させた。ラッカーゼ活性画分を集め、10mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で一晩透析を行った。透析液中のタンパク質をQ-Sepharose FF(アマシャムバイオサイエンス製)に吸着させ、0Mから0.5MまでのNaClの濃度勾配で吸着タンパク質を溶出させた。ラッカーゼ活性画分をHiLoad 26/60 Superdex 200pgにかけ、ラッカーゼ活性画分を集め、10mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で一晩透析を行い、精製ラッカーゼを得た。
【００３６】
精製酵素の凍結乾燥品30μgに25μlの8M尿素・0.4M重炭酸ナトリウム溶液を加え、2.5μlの45mMジチオスレイトールを加え、50℃、15分間処理を行い、2.5μlの100mMヨードアセトアミドを加え、15分間放置した。70μlの蒸留水を加え、30μlの10μg/mlエンドプロテイナーゼLys-C（ロッシュ・ダイアグノスティックス製）を添加後、37℃、24時間インキュベートした。これにより得た断片化した酵素タンパク質をHPLCにより分離し、各ペプチド断片を取得した。その各断片のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（島津製作所製  PPSQ-21）を用いて解析した。その結果、以下の配列が得られた。
断片(1)    HNGTSFHWHGLRQLHSNTEDGV  （配列番号２２）
断片(2)    NKPVYPQDDSGL            （配列番号２３）
断片(3)    DCWLPGFDATTDMYNSWPDTGR  （配列番号２４）
断片(4)    LVNPSIDIAVR             （配列番号２５）
断片(4)よりP1プライマー及びP2プライマーを設計した。断片(2)よりP3プライマーを設計した。
センス・プライマー
P1プライマー:  5’-  GTYAAYCCYTCYATYGARAT -3’  （配列番号８）
センス・プライマー
P2プライマー:  5’-  CCYTCYATYGARATYGCYGT -3’  （配列番号９）
アンチセンス・プライマー
P3プライマー:  5’-  TGRGGRTARACRGGYTTRTT -3’  （配列番号１０）
【００３７】
KL112株の染色体DNA、約0.1μgを鋳型DNAとしてP1プライマー及びP3プライマーを用い、PCR反応を30サイクル行った。さらに100倍希釈したPCR反応液を鋳型DNAとしてP2プライマー及びP3プライマーをそれぞれ使用してPCR反応をさらに30サイクル行った。その結果、988bpのDNA断片が特異的に増幅された。988bpのDNA断片をpUC119にサブクローニングし、E.coli DH5α株（宝酒造製）を形質転換した。そして、サブクローニングされたDNA断片の塩基配列をThermo Sequnase蛍光シーケンサー用サイクルシーケンシングキット (アマシャムバイオサイエンス製)及びDNAシーケンサーModel 4000LS（LI-COR製）を使用して配列表の配列番号３（配列番号６の1515〜2502番目までの塩基配列）を決定した。（以後の塩基配列決定はすべて同様な方法を用いた。）
【００３８】
５'側上流域のDNA断片の増幅は、以下のようにして行った。KL112株の染色体DNA、約5.0μgを制限酵素XhoIで消化した後、宝酒造製LA-PCR in vitro Cloning kitを用いて、Cassette Ligation-Mediated PCRを行った。すなわち制限酵素処理断片にSalIカセット（宝酒造製）を結合させ、このDNAを鋳型DNAとしてC1プライマー（宝酒造製）及び後記のP4プライマーをそれぞれ使用して、PCR反応を30サイクル行った。100倍希釈した反応液を鋳型DNAとしてC2プライマー（宝酒造製）及び後記のP5プライマーを使用して、PCR反応をさらに30サイクル行った。その結果、1630 bpのDNA断片が特異的に増幅された。増幅されたDNA断片を同様にpUC119にサブクローニングした後、その塩基配列を配列表の配列番号４（配列６の1〜1630番目の塩基配列）と決定した。
【００３９】
３’側下流域のDNA断片の増幅は、以下のようにして行った。KL112株の染色体DNA、約5.0μgを制限酵素PstIで消化した後、宝酒造製LA-PCR in vitro Cloning kitを用いて、Cassette Ligation-Mediated PCRを行った。すなわち制限酵素処理断片にPstIカセット（宝酒造製）を結合させ、このDNAを鋳型DNAとしてC1プライマー（宝酒造製）及び後記のP6プライマーをそれぞれ使用して、PCR反応を30サイクル行った。100倍希釈した反応液を鋳型DNAとしてC2プライマー（宝酒造製）及び後記のP7プライマーを使用して、PCR反応をさらに30サイクル行った。その結果、972 bpのDNA断片が特異的に増幅された。増幅されたDNA断片を同様にpUC119にサブクローニングした後、その塩基配列を配列表の配列番号５（配列６の2380〜3351番目の塩基配列）と決定した。配列３、配列４および配列５をつなぎ合わせて、ラッカーゼ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号６と決定した。
なお、P4プライマー、P5プライマー、P6プライマー及びP7プライマーは配列番号３の塩基配列から設計した。
P4プライマー：5’- GGTAAATATGACATGCTAGCGTTG -3’  （配列番号１１）
P5プライマー：5’- CCAATACCAATGAGAACGTAGTTC -3’  （配列番号１２）
P6プライマー：5’- TCAACACGTGTAACAACTACGGT -3’   （配列番号１３）
P7プライマー：5’- AGAACAGCGAGTGGTTCAACAC -3’    （配列番号１４）
【００４０】
ラッカーゼ遺伝子cDNA部分配列の取得は以下のように行った。KL112株をPDC培地で30℃、5日間振とう培養後の菌糸からライフテックオリエンタル社製TRIZOL Reagentを用い、そのプロトコールに従って全RNAを抽出した。約1μgの全RNAから３'-Full RACE Core Set（宝酒造製）を用いて、プロトコールに準じた条件でcDNAの合成を行った。そのcDNAを鋳型DNAとしてプライマーに3 site Adaptor   Primer（宝酒造製）及び後記のP8プライマーを用い、PCR反応を30サイクル行った。その結果、ポリＡ配列を除いて2144 bpのDNA断片が特異的に増幅された。増幅されたDNA断片を同様にpUC119にサブクローニングした後、その塩基配列を配列表の配列番号２と決定した。
なお、P8プライマーは配列番号６の塩基配列から設計した。
センス・プライマー
P8プライマー：5’-  ATGAAGTTCTTTATCATTGGAG -3’  （配列番号１５）
また、配列番号２の塩基配列から新規なラッカーゼについて配列表の配列番号１のアミノ酸配列を推定した。
【００４１】
〔実施例４〕ラッカーゼ遺伝子の麹菌での高発現
麹菌（アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryaze）、以下、A. oryaze）のpyrG遺伝子(北本則行、吉野庄子、醤研、25, 21-26 (1999))の塩基配列からpyrGMFプライマー及びpyrGMRプライマーを作製した。
pyrGMFプライマー：5’- GGAGGGATGGGACGCTTACCTGAAGCGT -3’
（配列番号１６）
pyrGMRプライマー：5’- ACGCTTCAGGTAAGCGTCCCATCCCTCC -3’
（配列番号１７）
また、pyrG遺伝子からPyrFプライマー及びPyrRプライマーを作製した。
PyrFプライマー：5' - TATGTCGACCCAAGCCGCTGCTGGAATTGA -3'
（配列番号１８）
PyrRプライマー：5' - GAAAAGCTTGATCAATACCGTACGGGAGAT -3'
（配列番号１９）
プラスミドpYRG100を鋳型DNAとしてPyrFプライマー(北本則行、吉野庄子、醤研、25,21-26(1999))及びpyrGMRプライマーを使用して、PCR反応を30サイクル行った。プラスミドpYRG100を鋳型DNAとしてPyrRプライマー(北本則行、吉野庄子、醤研、25,21-26(1999))及びpyrGMFプライマーを使用して、PCR反応を30サイクル行った。10倍希釈した２種類のPCR反応液を鋳型DNAとしてPyrFプライマー及びPyrRプライマーを使用して、再度PCR反応を30サイクル行った。その結果増幅された1871bpのDNA断片をpUC119にサブクローニングして、pYRM200を作製した。pTAP200(N. Kitamoto, M. Go, T. Shibayama, T. Kimura, Y. Kito, K. Ohmiya, N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol.,46, 538-544(1996))を制限酵素EcoRI及びSacIで消化することによって切り出されたタカアミラーゼ遺伝子プロモーターを制限酵素EcoRI及びSacIで消化したpYRM200に組み込んで、麹菌用発現ベクター、pYRMTA100を作製した。なお、上記のpYRG100は、以下の様に作製した。  PyrFとPyrRを用いて、A.oryzaeKBN616株（FERM P-17333）の染色体DNAを鋳型としてPCR反応を行い、約1.9KbのDNA断片を得た。得られたDNA断片をSalIとHindIIIで切断して得られる約1.9KbのDNA断片をpUC119のSalIとHindIIIで切り出されるプラスミドDNAへ挿入してpYRG100を作製した。
【００４２】
KL112株の染色体DNAを鋳型DNAとして後記のP11プライマー及びP12プライマーを使用して、PCR反応を30サイクル行った。増幅されたDNA断片を制限酵素EcoT22I及びSacIで消化した後、制限酵素EcoT22I及びSacIで消化したpYRMTA100に組み込みラッカーゼ遺伝子高発現ベクターｐTALAC100を作製した。pTALAC100で  A. oryzae P5株（PyrG欠損株）（Mol.Gen.Genet.(1987)210:460-461に従い、上記のA.oryzaeKBN616株（FERM P-17333）を親株として5-フルオロオロチン酸（5-FOA）の耐性菌を分離してウリジン要求性変異株を得ることで容易に取得できる）を形質転換したところ、ラッカーゼ高生産麹菌、A. oryzaeMY001株を得ることができた。A.oryzae MY001株を米ぬか培地（米ぬか３％、ポリペプトン1％、NaNO3 1%、KCl 0.2%、KH2PO4 0.1%、CuSO4 0.0025%、MgSO4 0.05%）50mlで、30℃、７日間振とう培養を行ったところ、培養上清中に158 units/mlのラッカーゼ活性を検出した。
P11プライマー及びP12プライマーは配列番号６の塩基配列から設計した。
センス・プライマー
P11プライマー：5’- CCATGCATTTCTTTATCATTGGAG -3’（配列番号２０）
アンチセンス・プライマー
P12プライマー：5’- CCGAGCTCTGGTATAGTATCTTGAATGTATC -3’
（配列番号２１）
【００４３】
A. oryzaeMY001株を米ぬか培地中で30℃、７日間培養して得られた培養上清15mlを20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）30mlと混合した。混合液中のタンパク質をQ-Sepharose FF(アマシャムバイオサイエンス製)に吸着させ、0Mから0.5MまでのNaClの濃度勾配で吸着タンパク質を溶出させた。ラッカーゼ活性画分を集め、20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で５倍希釈した後、Q-Sepharose FF(アマシャムバイオサイエンス製)にタンパク質を吸着させ、0Mから0.5MまでのNaClの濃度勾配で吸着タンパク質を溶出させた。ラッカーゼ活性画分を集め、10mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で一晩透析を行い、精製組換えラッカーゼを得た。
【００４４】
〔実施例５〕PET繊維のラッカーゼによる処理効果
（１）KL112株由来の組換えラッカーゼの調製
実施例４で得られた麹菌、A. oryzaeMY001株の分生胞子3.6×106 を100mlのD培地（2% デンプン、1%ポリペプトン、0.5%サングレイン、0.2%KCl、0.1%KH2PO4、CuSO40.0025%、MgSO40.05%）に接種し30℃、7日間振盪培養した。2400mlの培養上清を分画分子量6000の限外ろ過膜にて300mlまで濃縮し、凍結乾燥して5.6gのKL112粗ラッカーゼを得た。
（２）ラッカーゼによるPET繊維の処理
PET布（JIS L 0803準拠）1gに対し260単位のKL112粗ラッカーゼとラッカーゼダイワ（大和化成株式会社製）を作用させた。反応温度は40℃で、5時間緩やかに振とうしつつ作用させた。反応終了後、蒸留水でPET布を洗浄し、乾燥させ、特性評価に供した。
KL112粗ラッカーゼとラッカーゼダイワ（大和化成株式会社製）をPET繊維に作用させたときの繊維特性の違いについて帯電特性と吸水性を調べた。
酵素処理したPET布の帯電特性は、スタチックオネストメータH-1100（シシド静電気製）を用い、織物及び編物の帯電性試験方法(JIS L 1094 A法)で評価した。ただし、相対湿度については65%とした。半減期とは、試料に1万ボルトを印加し、印加を止めた後試料の帯電圧が半分に減衰するまでの時間のことである。
吸水性はJIS L 1096 A法に規定されている滴下法で評価した。具体的には、試料表面に水滴を滴下し、水滴が特別な反射をしなくなるまでの（試料が水滴を吸収して鏡面反射が消えるまで）時間を測定した。測定結果は、表４に示した。
【００４５】
【表４】
0004159340.tif 000005
【００４６】
ラッカーゼで処理することによりPET繊維の帯電特性の半減期と吸水速度のいずれもが速くなった。KL112ラッカーゼは、既存の担子菌由来のラッカーゼダイワよりもPET繊維の帯電特性、吸水性の改良効果が顕著であった。
【００４７】
【発明の効果】
本発明によれば、新規な微生物が生産するポリエステルを含む繊維を改質する特性に優れた新規ラッカーゼを量産できる。また、本ラッカーゼによりポリエステル繊維の表面構造が改変でき、吸水性や帯電性などの物性を容易かつ永続的に改質することができる。更に、新規ラッカーゼは、パルプ中のリグニンの分解、インディゴ染料の脱色、洗剤への添加、環境浄化などに広く利用が期待でき、産業上有用である。
【００４８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】KL112株に分子遺伝的に近縁と推定されるParaphaeosphaeria属の菌株の系統樹である。
【図２】Paraphaeosphaeria属、Paraphaeosphaeria属に近縁の菌株及びKL112株の系統的分類図である。
【図１】
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【図２】
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