(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の菌学的性質を有するカンジダ  ハイドロカーボフマリカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｆｕｍａｒｉｃａ）ＭＫ−０１株
（１）栄養細胞の形態：楕円〜円筒
（２）栄養増殖法：多極出芽
（３）培養液の性状：底部に沈殿と表面に皮膜の形成を認める
（４）子のう胞子：形成しない
（５）偽菌糸：形成する
（６）菌糸：形成しない
（７）グルコース発酵性：陰性
（８）ガラクトース発酵性：陰性
（９）マルトース発酵性：陰性
（１０）ラクトース発酵性：陰性
（１１）ラフィノース発酵性：陰性
（１２）トレハロース発酵性：陰性
（１３）グルコース資化性：陽性
（１４）ガラクトース資化性：陽性
（１５）ソルボース資化性：陽性
（１６）スクロース資化性：陽性
（１７）マルトース資化性：陽性
（１８）セロビオース資化性：陽性
（１９）トレハロース資化性：陽性
（２０）ラクトース資化性：陽性
（２１）メリビオース資化性：陰性
（２２）ラフィノース資化性：陽性
（２３）メルジトース資化性：陽性
（２４）デンプン資化性：陽性
（２５）Ｄ−キシロース資化性：陽性
（２６）Ｌ−アラビノース資化性：陽性
（２７）Ｄ−リボース資化性：陰性
（２８）Ｌ−ラムノース資化性：陰性
（２９）グリセロール資化性：陽性
（３０）エリスリトール資化性：陽性
（３１）マンニトール資化性：陽性
（３２）サリシン資化性：陰性
（３３）乳酸資化性：陽性
（３４）コハク酸資化性：陽性
（３５）クエン酸資化性：陽性
（３６）イノシトール資化性：陽性
（３７）アルブチン分解性：陽性
（３８）硝酸塩資化性：陰性
（３９）ビタミンフリー培地での培養：生育
（４０）３７℃下での培養：生育
（４１）ウレアーゼ：陽性
（４２）グルコースまたはスクロースを主炭素源とする液体培地で好気条件下において培養した場合、エリスリトールを産生し、かつエリスリトール以外のポリオール類をほとんど副生しない
（４３）通気撹拌培養中の発泡：ほとんど認められない
【請求項２】
カンジダ  ハイドロカーボフマリカＭＫ−０１株を、主炭素源としてグルコースまたはスクロースを含む培地に接種し、好気的に培養して培養液中にエリスリトールを生成蓄積させることを特徴とするエリスリトールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】
本発明はエリスリトール産生能を有するカンジダ  ハイドロカーボフマリカ（Ｃａｎｄｊｄａ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｆｕｍａｒｊｃａ）ＭＫ−０１株およびそれを用いたエリスリトールの製造方法に関する。
【従来の技術】
発酵によるエリスリトールの製造方法としては、トルロプシス・ハマタまたはカンジダ・ポリモルフォアを用い、グルコース等を主炭素源とするもの（特公昭３７−３５４７号公報）やトリゴノプシス・バリアビリスまたはカンジダ・ムスコラムを用い、グリセロールを主炭素源とするもの（特公昭４７−４１５４９号公報）等がある。しかし、前者においてはエリスリトールと同時に多量生成されるＤ−アラビトールとの分離精製過程を要し、後者においては使用される炭素源が実際の工業的生産において必ずしも適当でない。また、モニリエラ・トメントサ・バール・ポリニスを用い、グルコース等の糖質を炭素源とする製造法（特公昭６０−１１０２９５号公報）がすでに知られている。この方法は安価なグルコースを使用し、生産性も高いという利点があるが、通常使用される消泡剤では間に合わないほど培養中の発泡が著しいため、高価なキサンタガムを多量に添加しなければならないという、工業的生産において不利な点がある。
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安価な原材料から高収率でエリスリトールを生成する微生物およびそれを利用したエリスリトールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
本発明者は、安価な原材料からエリスリトールを高収率で生成し、かつ他のポリオール類の副生が少ないという特長をもつ微生物を環境中より検索した。その結果、グルコースあるいはスクロースを主炭素源とした液体培地に接種・培養することにより、培地中にエリスリトールを高収率で生成・蓄積し、かつエリスリトール以外のポリオール類をほとんど生成しない微生物が、野外に自生する花より新規に分離された。この微生物は、菌学的性質よりカンジダ・ハイドロカーボフマリカであると同定され、本発明者によりＭＫ−０１株と命名された。以下に本菌株の菌学的性質を示す。
形態的性状
栄養細胞の形態：楕円〜円筒
栄養増殖法：多極出芽
培養液の性状：底部に沈殿と表面に皮膜の形成を認める
子のう胞子：形成しない
偽菌糸：形成する
菌糸：形成しない
糖発酵性
グルコース：陰性
ガラクトース：陰性
マルトース：陰性
ラクトース：陰性
ラフィノース：陰性
トレハロース：陰性
炭素源資化性
グルコース：陽性
ガラクトース：陽性
ソルボース：陽性
スクロース：陽性
マルトース：陽性
セロビオース：陽性
トレハロース：陽性
ラクトース：陽性
メリビオース：陰性
ラフィノース：陽性
メルジトース：陽性
デンプン：陽性
Ｄ−キシロース：陽性
Ｌ−アラビノース：陽性
Ｄ−リボース：陰性
Ｌ−ラムノース：陰性
グリセロール：陽性
エリスリトール：陽性
マンニトール：陽性
サリシン：陰性
乳酸：陽性
コハク酸：陽性
クエン酸：陽性
イノシトール：陽性
アルブチン分解性：陽性
硝酸塩資化性：陰性
ビタミンフリー培地での培養：生育
３７℃下での培養：生育
ウレアーゼ：陽性
Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ：  ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ  第３版（Ｎ．Ｊ．Ｗ．Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ  Ｒｉｊ編）によれば、以上の菌学的性質は、本菌株がカンジダ・ハイドロカーボフマリカであることを示すものである。
即ち本菌株は野外に自生する花より分離されたもので、液体培養では表面に皮膜の形成が認められ、栄養細胞の形態は楕円〜円筒で、多極出芽により増殖する。プレート上では古くなると淡黄褐色から茶褐色へ着色が認められ、偽菌糸を形成し、子のう胞子を形成しない。硝酸非還元であり、糖発酵性は持たず、ほとんどの糖類を資化し、グルコースおよびスクロースを高収率でエリスリトールに変換する能力を持つ。本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に「ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８９０」として寄託されている。
本発明で用いるカンジダ・ハイドロカーボフマリカＭＫ−０１株は、発酵によるエリスリトールの製造方法に関する従来の技術が持つ欠点を解決する、以下のような特長を示す。即ち、主炭素源として安価なグルコースまたはスクロースを使用し、これらを含む液体培地で好気的に培養せしめた場合、高収率でエリスリトールを生成する。また、本菌株はエリスリトールの生成過程において、グリセロールその他のポリオール類の副生がほとんど見られないため、その後のエリスリトールの精製工程が簡便である。さらに、しばしば問題となる通気撹拌培養中の発泡についても、本菌株においては培養の初期若干の泡の発生が見られるのみであり、その後泡は自然に消失するため、消泡剤の添加等の特別な処置を必要としない。
以下に本発明に係わるエリスリトールの製造方法について述べる。
培養方法は、液体培地を用いた通気撹拌培養が望ましい。液体培地の炭素源としては１０〜４０％濃度のグルコースまたはスクロースが用いられるが、１０〜２０％程度の濃度が望ましい。窒素源としては、１〜２％の乾燥ブイヨン、酵母エキス、トリプトン等が添加される。また、必要に応じて、酵母の生育に必要な各種有機物、無機物を添加してもよい。培地の初発ｐＨは、４．０〜６．５の範囲がよい。培養温度は２７〜３３℃であることが望ましい。培養液中のエリスリトールおよび添加糖類の濃度は、高速液体クロマトグラフィーによって速やかに測定することが可能であるので、添加糖類がほぼ消費され、かつエリスリトール濃度が最大となった時点で培養を終了とする事が出来る。
培養液は遠心分離・濾過することで菌体を除去し、その後活性炭による脱色およびイオン交換樹脂によるイオン性不純物の除去を行う。さらに加熱濃縮、アルコール抽出、結晶化等を行うことで最終的に高純度のエリスリトール結晶を得ることが出来る。
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１
滅菌済みの樹脂製チューブに、別個に蒸気滅菌した蒸留水、乾燥ブイヨン溶液、グルコース溶液を混合して、１％（重量／体積％、以下同じ）乾燥ブイヨン、１９．７％グルコースを含む培地１０ｍｌを調製した。軟寒天培地上のカンジダ・ハイドロカーボフマリカＭＫ−０１保存菌株を白金耳で掻き取って培地に植菌し、３０℃で３日間振とう培養したものを前培養とした。上記と同様にして、滅菌済みの１００ｍｌ容の三角フラスコに１％乾燥ブイヨン、２０％グルコースを含む培地５０ｍｌを調製し、前培養液５０μｌを植菌した。通気性のある樹脂製の蓋をして、３０℃、１５０ｒｐｍで９００時間回転培養した。培養上清には４．３％のエリスリトールが蓄積し、糖消費量に対する収率は２２％であった。
実施例２
上記と同様にして、滅菌済みの１００ｍｌ容の三角フラスコに１％乾燥ブイヨン、１４．６％グルコースを含む培地５０ｍｌを調製し、前培養液５０μｌを植菌した。通気性のある樹脂製の蓋をして、３０℃、１５０ｒｐｍで９００時間回転培養した。培養上清には３．１％のエリスリトールが蓄積し、糖消費量に対する収率は２１％であった。
実施例３
上記と同様にして、滅菌済みの１００ｍｌ容の三角フラスコに１％乾燥ブイヨン、１４．２％スクロースを含む培地５０ｍｌを調製し、前培養液５０μｌを植菌した。通気性のある樹脂製の蓋をして、３０℃、１５０ｒｐｍで回転培養した。添加したスクロースは培養開始１２０時間程度で完全にグルコースとフルクトースに分解された。培養９００時間後の上清には３．２％のエリスリトールが蓄積し、糖消費量に対する収率は２３％であった。
実施例４
上記と同様にして、滅菌済みの１００ｍｌ容の三角フラスコ４本に１％乾燥ブイヨン、２０％グルコースを含む培地５０ｍｌを調製し、前培養液５０μｌをそれぞれに植菌した。通気性のある樹脂製の蓋をして、３０℃、１５０ｒｐｍで９００時間回転培養した。４％前後のエリスリトールを含む培養液を遠心分離し固形物をろ別した。ろ液に活性炭を加えて脱色し、陰イオン交換樹脂（ＢＩＯＲＡＤ社製ＤＥＡＥ  Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ａ）、次いで陽イオン交換樹脂（同ＣＭＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ａ）で脱塩した後、湯浴中で加熱濃縮した。得られたシロップ状溶液にエタノールを加えて加熱後、４℃まで冷却して得られた結晶を熱エタノールに溶解させ、再度冷却して白色結晶を得た。
この結晶はさわやかな甘味を呈し、ＦＡＢ−ＭＡＳＳによる質量分析の結果、分子量は１２２であり、ＨＰＬＣによる分析では保持時間がエリスリトールと完全に一致する単一のピークを示した。以上より、得られた白色結晶はエリスリトールであると同定された。