(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識としての磁性体を抗原抗体反応により検体に結合させ、該標識を磁化した上で、磁気センサとしてのＳＱＵＩＤにより該標識を検出する免疫検査方法において、該標識を磁化するための磁界が、該ＳＱＵＩＤの検出する磁束の方向と直角であることを特徴とする免疫検査方法。
【請求項２】
前記標識を磁化する磁界が、直流磁界であることを特徴とする請求項１に記載された免疫検査方法。
【請求項３】
前記ＳＱＵＩＤが、該ＳＱＵＩＤの磁束検出領域内を移動する検体に結合された標識により生じた磁界の変化を測定することを特徴とする請求項１または請求項２に記載された免疫検査方法。
【請求項４】
前記検体の移動方向が、前記磁界の方向と平行な方向であることを特徴とする請求項３に記載された免疫検査方法。
【請求項５】
抗原抗体反応により標識としての磁性体を結合された検体の免疫検査を行う装置であって、該標識を磁化する磁化用磁界を発生する磁界発生手段と、該磁化用磁界と直角な方向の磁束を検出するように配置されたＳＱＵＩＤとを備え、
該検体に結合された該標識が、該磁界発生手段により印加された磁界で磁化された上で、該ＳＱＵＩＤにより検出されるように構成されていることを特徴とする免疫検査装置。
【請求項６】
前記磁化用磁界が直流磁界であることを特徴とする請求項５に記載された免疫検査装置。
【請求項７】
前記検体を、前記ＳＱＵＩＤの磁束検出領域内で移動させる手段を備えることを特徴とする請求項５または請求項６に記載された免疫検査装置。
【請求項８】
前記検体の移動方向が、前記磁化用磁界と平行な方向であることを特徴とする請求項７に記載された免疫検査装置。
【請求項９】
前記磁界発生手段が、前記ＳＱＵＩＤの検出する磁束と平行な方向の磁界を打ち消す磁界を発生する補償用磁界発生手段を更に備えることを特徴とする請求項５から請求項８までの何れか１項に記載の免疫検査装置。
【請求項１０】
前記検体が基板上に支持されており、該基板が前記直流磁界および前記ＳＱＵＩＤの検出領域よりも十分に広い面積を有することを特徴とする請求項５から請求項９までの何れか１項に記載された免疫検査装置。
【請求項１１】
前記ＳＱＵＩＤが、酸化物超電導体薄膜により形成されたＳＱＵＩＤであることを特徴とする請求項５から請求項１０までの何れか１項に記載された免疫検査装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、免疫検査方法とそれを実施する装置に関する。より詳細には、本発明は、磁性体を標識として用い、標識の検出に超電導量子干渉素子を用いた新規な免疫検査方法と、その方法を実施するために用いる装置の構成に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗原抗体反応を利用して検出すべき抗原または抗体（以下、「検体」と記載する）に標識を結合させ、この標識を検出することによって検体を同定あるいは計量する免疫検査法がある。このような免疫検査法は、標識の種類と検出方法により多くの方法が提案され、あるいは実施されている。
【０００３】
現在広く実施されている免疫検査法としては、有色のあるいは何らかの方法で発色または蛍光する標識を用い、光学的に標識検出を行う方法が多い。しかしながら、この種の光学的な検出を利用した方法では十分な検出感度が得られておらず、より感度の高い他の方法が模索されている。また、標識として放射性物質を用いる方法も知られているが、主に安全性の観点から、広く一般に利用できる方法とは言えない。
【０００４】
更に、近年は、磁性体を標識とする免疫検査方法が開発されている。このような方法としては、残留磁気測定法や磁気緩和法等が知られていが、標識としての磁性体の粒径が測定値に指数関数的に影響するので、十分な測定精度が得られていない。
【０００５】
一方、近年、超電導量子干渉素子（以下「ＳＱＵＩＤ」と記載する）と呼ばれる素子が実用化されている。即ち、ＳＱＵＩＤは、１個または２個のジョセフソン接合を含む環状の超電導電流路からなるデバイスで、従来から知られているホール素子やフラックスゲートに比べて桁違いに高感度な磁気センサとして使用することができる。
【０００６】
そこで、免疫検査における標識として磁性体を用い、これをＳＱＵＩＤで検出することにより精度の高い免疫検査が可能になると考えられている。ただし、実用的に使用可能なものはまだ開発されていない。
【０００７】
即ち、検体に付着させた標識としての磁性体は、そのままではＳＱＵＩＤで検出できず、検出に先立ってこれを磁化しなければならない。ところが、検体の磁化には強力な磁場(数十ガウス程度)を発生させる必要があり、非常に鋭敏な磁気センサであるＳＱＵＩＤがこの磁化用磁場の影響を受けてしまうという深刻な問題がある。
【０００８】
また、実際の作業では、検体は、何らかの支持体（以下「基板」と記載する）上に付着させた状態で取り扱われるが、微小な標識用磁性体を磁化できるような強力な磁場は、ガラスやプラスチック等の基板まで磁化してしまう。このため、単純にＳＱＵＩＤで検出しても正確な測定は難しい。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上記従来技術の問題点を解決し、標識として磁性体を、検出手段としてＳＱＵＩＤを用いつつ、十分な測定精度が得られる新規な免疫方法と、その方法を実施する装置を提供することをその目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明により、標識としての磁性体を抗原抗体反応により検体に結合させ、該標識を磁化した上で、磁気センサとしてのＳＱＵＩＤにより該標識を検出する免疫検査方法において、該標識を磁化するための磁界が、該ＳＱＵＩＤの検出する磁束の方向と直角であることを特徴とする免疫検査方法が提供される。
【００１１】
また、上記本発明に係る方法において、前記標識を磁化する磁界は直流磁界であることが好ましい。
【００１２】
また更に、上記本発明に係る方法において、前記ＳＱＵＩＤがその磁束検出領域内を移動する検体に結合された標識により生じた磁界の変化を測定すること、そして、該検体の移動方向が、前記磁界の方向と平行な方向であることが好ましい。
【００１３】
更に、上記本発明に係る方法を実施するための装置として、本発明により、抗原抗体反応により標識としての磁性体を結合された検体の免疫検査を行う装置であって、該標識を磁化する磁化用磁界を発生する磁界発生手段と、該磁化用磁界と直角な方向の磁束を検出するように配置されたＳＱＵＩＤとを備え、該検体に結合された該標識が、該磁界発生手段により印加された磁界で磁化された上で、該ＳＱＵＩＤにより検出されるように構成されていることを特徴とする免疫検査装置が提供される。
【００１４】
また、上記本発明に係る装置においても、前記磁化用磁界が直流磁界であること、前記ＳＱＵＩＤの磁束検出領域内で検体を移動させる手段を備えること、この検体の移動方向が前記磁化用磁界と平行な方向であること等がそれぞれ好ましい。
【００１５】
また更に、上記装置において、前記磁界発生手段が、前記ＳＱＵＩＤの検出する磁束と平行な方向の磁界を打ち消す磁界を発生する補償用磁界発生手段を更に備えることが有利である。
【００１６】
また、上記装置において、前記ＳＱＵＩＤは、酸化物超電導体薄膜により形成されていることが有利である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明に係る免疫検査法は、標識として用いる磁性体微粒子を磁化する際に、ＳＱＵＩＤの検出する磁束の方向とは直角な磁界を用いる点にその第１の主要な特徴がある。
【００１８】
即ち、従来提案されていた磁性体標識による免疫検査では、主に感度を重視して、標識の磁化に用いる磁界とＳＱＵＩＤの検出する磁束の方向を一致させていた（平行にしていた）。これに対して、本発明に係る方法では、ＳＱＵＩＤの磁界検出方向と磁化用磁界とを直交させている。ＳＱＵＩＤは、それを構成する環状の超電導電流路の形成された平面と交差する方向の磁束を検出するので、この平面と平行な磁束に対しては事実上感度が無い。従って、上記のような方法により、磁化用磁界の影響を排除することが可能になる。
【００１９】
また、ＳＱＵＩＤを用いた従来の検出方法では、磁化用磁界によるＳＱＵＩＤへの影響を排除するために、磁化用磁界として交流磁界を用い、ロックインアンプによりノイズと相殺させるように構成されていた。しかしながら、上記のような構成により、磁化用磁界として直流磁界を用いることが可能になる。
【００２０】
但し、実際には、磁化用磁界を、ＳＱＵＩＤと完璧に平行に限定することはできない。このため、磁化用磁界の一部がＳＱＵＩＤと交差するが、ＳＱＵＩＤの検出感度からすると、これは決して無視し得ないものとなる。そこで、補償用のコイルを設けて交差磁界を打ち消すように構成することができる。
【００２１】
更に、上記のような補償用コイルによっても、交差磁界の影響を完璧に排除することは難しい。そこで、本発明の好ましい１実施態様に従うと、検体がＳＱＵＩＤの測定領域を通過する際の移動中に測定を行う。このような方法では、磁界の空間分布を測定することになるので、交差磁界の影響を受けずに測定を行うことが可能になる。
【００２２】
尚、実際には、検体は何らかの支持体（基板）に支持された状態で免疫検査に供される。ところが、ガラス板やプラスチック板である基板も、ＳＱＵＩＤの検出精度のレベルでは僅かではあるが磁化されるので、測定値に影響を与える恐れがある。
【００２３】
そこで、本発明の１実施態様に従うと、十分に大きな面積を有する基板を用いることが提案される。即ち、十分に広い基板を用い、基板上の検体の無い領域と検体を支持した領域とが順次センサに測定されるように構成することで、基板の磁化に起因する測定値の変化を補償できる。また、ＳＱＵＩＤの検出領域と磁化用磁界の全体に、検体の有無に関わらず常に存在するような大きな基板を用いることにより、磁界内での基板の影響は一様になり、基板の磁化は実質的に検出されなくなる。
【００２４】
尚、磁化された磁性体微粒子により生ずる微小な磁界の強度は、距離の３乗に比例して減衰する。このため、測定対象となる検体とセンサとしてのＳＱＵＩＤの間隔は小さければ小さいほど好ましい。この点、液体窒素による冷却で超電導体となる酸化物超電導体を用いて作製したＳＱＵＩＤでは冷却装置の構造を簡略化できるので、試料との間隔を短縮することができる。
【００２５】
以下、図面を参照して本発明をより具体的に説明するが、以下の開示は本発明の一実施例に過ぎず、本発明の技術的範囲を何等限定するものではない。
【００２６】
図１は、本発明に係る免疫検査方法の特徴を模式的に示す図である。
【００２７】
同図に示すように、本発明に係る方法では、基板１の上に支持された検体２を磁化した上でＳＱＵＩＤ３により検出する。このとき、検体２を磁化するための磁界は、図中に矢印Ａにより示すように、基板１の表面と平行な磁界である。
【００２８】
ＳＱＵＩＤ３は、その環状電流路を含む面が基板と平行になるように配置されている。このようなＳＱＵＩＤは、自身の形成されている面に対して直角な磁束を極めて高感度に検出する。一方、ＳＱＵＩＤ３は、自身の形成されている面と平行な磁束には感度が無い。従って、検体２を磁化するための磁界Ａによる影響は受けない。
【００２９】
また、基板１は、この磁界Ａと平行に、図中で左から右へ一定の速度ｘで移動する。従って、磁化された検体２がＳＱＵＩＤ３の直下を通過したときに、ＳＱＵＩＤ３には磁束の変化が検出される。このとき、基板１が十分に大きければ、測定に際して基板１の磁化の影響を除くことができる。即ち、基板１が移動し始めたときから、検体２がＳＱＵＩＤ３の直下を通過し、更に、検体２がＳＱＵＩＤ３の直下を完全に通り過ぎるまで、基板１の一部が常にＳＱＵＩＤ３の下方に存在している長さｌを有しており、且つ、基板１がＳＱＵＩＤよりも十分に大きな幅ｗを有していれば、ＳＱＵＩＤ３の磁束検出領域には常に基板１が存在しており、基板１の磁化に起因する磁束の変化は生じない。
【００３０】
図２は、上記のような本発明に係る免疫検査方法を実施する際に使用できる装置の構成を模式的に示す図である。
【００３１】
同図に示すように、この装置は、磁気遮蔽101ａ、101ｂの内側で測定を行うように構成されており、底を有する磁気遮蔽101ａ、101ｂの内部には、ＳＱＵＩＤ103を収容した冷却媒体容器102、１対の磁化コイル106ａ、106ｂ、補償コイル107が収容されている。ここで、ＳＱＵＩＤ103は、冷却媒体容器102の底部に水平に収容されており、また、冷却媒体容器102に満たされた液体窒素102ａに浸漬されている。一方、磁化コイル106ａ、106ｂは、それぞれＳＱＵＩＤ103と直角を成すように、また、互いに平行になるように配置されている。これに対して、補償コイル107は、ＳＱＵＩＤ103の下方に、ＳＱＵＩＤ103と平行に配置されている。
【００３２】
尚、ＳＱＵＩＤ103が測定対象とする領域には、複数の磁化コイル106ａ、106ｂにより概ね水平な磁界が形成されている。ここで、磁化コイル106の発生する磁界の垂直成分は、補償コイル107が発生する磁界により打ち消され、ＳＱＵＩＤ103の直下には、実質的に水平な一様な磁界が形成されている。
【００３３】
上記のようにレイアウトされた装置に対して、Ｘ−Ｙ方向に変位させることができるアームを備えた搬送手段105によって、磁気遮蔽101ａ、101ｂの側面から試料104が装入される。このとき、試料104は、磁化コイル106の内側を通過した後、ＳＱＵＩＤ103の直下を通過するように構成されている。
【００３４】
なお、実際に作製した免疫検査装置で磁気センサとして使用したＳＱＵＩＤ３は、超電導材料としてSrTiＯ3基板上に被着させた酸化物超電導薄膜をパターニングして形成したものである。また、磁気遮蔽はパーマロイ製の円筒形のものを２重に用いた。
【００３５】
また、基板１としては20mm×80mmのガラス製基板（米国、Nalge Numc International社製）を用い、ＳＱＵＩＤ３の下方1.5mmの位置を、秒速８mmで通過するように設定した。また、磁化用磁界としては８×10-4Ｔの磁界を発生させた。
【００３６】
図３は、本実施例において検体を標識するために用いた抗体の構成を示す図である。
【００３７】
本実施例では、２種類の検出用抗体を用いた。ひとつは、同図(a)に示すように、独国のMiltenyi Biotec社からMACSとして販売されているγ−Fe2Ｏ3超微粒子14ａをポリマー製コーティング材14ｂで包んだ上で抗体14を付着させたＡ型である。Ａ型検出用抗体14は平均粒径50nmで、約４×10-16ｇの質量を有する。もうひとつの検出用抗体は、同図(b)に示すように、ノルウェーのDynal社から販売されているdynabeadsで、複数の磁性体超微粒子14ａを含むポリマー粒14ｃに抗体14を付着させたＢ型である。Ｂ型検出用抗体は平均粒径4.5μｍで、約14.3×10-12ｇの質量を有する。
【００３８】
図４は、上記のような標識された抗体を、図２に示した装置で検出した際のＳＱＵＩＤの出力信号を示すグラフである。
【００３９】
具体的には、ラット・抗ネズミIgＧ１を付着させた上記Ａ型検出用抗体の分散液を用いた。原液では0.2mg／mlと表示されており、平均粒径50nm、5.2g／cm3であることから推測すると、磁性体微粒子単体の質量は3.4×10-16ｇであり、原液中に5.8×1011個／mlの磁性体微粒子が含有されていると推測される。そこで、この原液をＰＢＳで１／10に希釈し、基板上の直径２mmの領域に２μｌを載せて測定に供した。従って、この検体には、1.2×108個、総質量40nmの磁性体微粒子が含有されていると考えられる。
【００４０】
上記のような検体に対して、図４に示されているのは、８×10-4Ｔの磁界を磁化用に印加して検体を秒速８mmで移動させたとき、0.1Hzから５Hzまでのバンドパスフィルタを介して出力されたＳＱＵＩＤの出力信号である。同図に示すように、極めて明瞭な磁界の変化が検出された。尚、ＳＱＵＩＤの出力信号の強度はＳＱＵＩＤと検体の距離に依存するので、磁化用磁界とＳＱＵＩＤのピックアップコイルを適切に設計することにより所望の感度が得られる。
【００４１】
図５は、図３に示した標識した抗体の濃度とＳＱＵＩＤによる検出結果との相関を示すグラフである。
【００４２】
同図において、円でプロットされているのは、前記Ａ型の標識された抗体の分散液をＰＢＳで希釈して標識の量を変化させたものを測定した結果を示している。また、同図において四角形によって示されるのは、前記Ｂ型の磁性体で標識されたラット・抗ネズミIgＧ１の分散液について同様の測定を行ったものである。同図に示すように、いずれの試料でも、標識された抗体の量と検出結果には極めて高い相関が見られる。このように、本発明に係る方法による検出結果は、検体の濃度を良く反映している。
【００４３】
図６は、図３に示した標識用抗体を用いて調製した検体の構成を模式的に示す図である。
【００４４】
同図に示すように、本来検出すべき抗原11は、表面に付着させた固定用抗体12により基板１に固定される。また、抗原11に対しては、この抗原に選択的に結合する第１検出用抗体13を介して第２検出用抗体14が結合される。このとき、第２検出用抗体14には磁性体14ａが標識されている。従って、磁性体標識14ａを磁化した上で検出することにより、実質的に抗原11を検出することができる。
【００４５】
尚、実際の検体の調製は、前記基板１上の中央の８mmの円内に固定用抗体として「マウス・抗ヒト・インターフェロンβモノクローナル抗体（日本、ヤマサ社製)を被着させた後、抗原としてヒト−インターフェロンβを37℃で３時間かけて反応させ、更に、第１検出用抗体13としてウサギ−抗ヒト・インターフェロンβ・ポリクローナル抗体（米国、Bio-Rad社製）を、最後に第２検出用抗体として、前記磁性体超微粒子で標識したヤギ・抗ウサギIgＧを37℃、１時間反応させた。
【００４６】
図７は、図６に示した検体を用いて、抗原抗体反応を検出した結果を示すグラフである。尚、図中で、円でプロットされているのが図３に示した本発明に係る装置で検出した結果である。
【００４７】
一方、図中で四角形でプロットされているのは、同じ検体を従来の典型的な光学的免疫検査方法であるBiotrak社製のELISAシステム・タイプIIで検出した結果である。この方法では、検出用抗体を抗原抗体反応させた後に基質を加えることにより発色させ、この色を光学的に検出する免疫検査方法方法であり、ここでは比較のために、検出用抗体として同じヤギ・抗ウサギIgＧを用いている。
【００４８】
同図に示すように、光学的な測定では、１単位／ml以上の濃度では良い相関を示しているが、それ以下の範囲では検体の濃度との関係が低下していく。一方、本発明の実施例では検体の濃度と検出された磁束の直線的な相関関係が維持されていおり、本発明に係る方法が光学的な方法に対して優れていることは一目瞭然である。
【００４９】
即ち、本発明に係る方法は、600pg以下の微小な磁性体を検出することが可能であり、既に、従来の光学的な検出方法に勝っている。また、今後の装置の最適化により、更に性能を向上させることは容易であると予想される。
【００５０】
以上詳細に説明したように、本発明によれば、磁化用磁界や基板の磁化の影響を排除して、ＳＱＵＩＤ本来の高い感度を活かした高精度な免疫検査を行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る免疫検査法の特徴を模式的に説明するための図である。
【図２】本発明に係る免疫検査法を実施するために使用する装置の構成を模式的に示す図である。
【図３】本発明の実施例で検体を標識するために用いた磁性体標識と抗体の構成を模式的に示す図である。
【図４】上記の標識された抗体を用いて、図２に示した装置を動作させたときのＳＱＵＩＤの出力信号を示すグラフである。
【図５】図３に示した標識された抗体の濃度とＳＱＵＩＤの出力との関係を示すグラフである。
【図６】図３に示した抗体を用いて調製した検体の構成を模式的に示す図である。
【図７】本発明に係る方法で測定した場合の測定結果を、従来の光学的な方法で測定した場合と比較して示すグラフである。
【符号の説明】
Ａ・・・磁化用磁界、
１・・・基板、
２・・・検体、
３・・・ＳＱＵＩＤ、
11・・・抗原、
12・・・固定用抗体、
13・・・第１検出用抗体、
14・・・第２検出用抗体、
14ａ・・磁性体標識、
14ｂ・・コーティング材、
14ｃ・・ポリマー、
101ａ、101ｂ・・・磁気遮蔽、
102・・・冷却媒体容器、
102ａ・・液体窒素、
103・・・ＳＱＵＩＤ、
104・・・試料（基板）、
105・・・搬送手段、
106・・・磁化コイル、
107・・・補償コイル、
【図１】
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【図２】
0004171139.tif 000003
【図３】
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【図４】
0004171139.tif 000005
【図５】
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【図６】
0004171139.tif 000007
【図７】
0004171139.tif 000008