(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗エリスロポエチン抗体およびエリスロポエチン受容体蛋白質から選ばれるエリスロポエチン拮抗物質を有効成分として含有する、肥厚性瘢痕、ケロイドまたは慢性関節炎症性疾患予防・治療剤。
【請求項２】
慢性関節炎症性疾患が関節リウマチ、リウマチ類縁疾患、膠原病による関節炎、または腱鞘炎である請求項１記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エリスロポエチン拮抗物質を有効成分として含有する肥厚性瘢痕、ケロイドまたは慢性関節炎症性疾患の予防・治療剤に関する。詳しくは、抗エリスロポエチン抗体やエリスロポエチン受容体蛋白質等のエリスロポエチン拮抗物質を有効成分として含有する、肥厚性瘢痕、ケロイドまたは慢性関節炎症性疾患の予防・治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肥厚性瘢痕（瘢痕ケロイド）は熱傷、手術創や外傷後の皮膚欠損に生じる瘢痕組織の異常増殖である。しかし、患者総数は膨大であると予想され且つ統計は明らかにされていない。手術創の術後の肥厚性瘢痕は外科全科が対象となるが、これ以上は治療できないものとして放置されている場合がかなりあると思われる。治療法はトラニラストの内服、スポンジによる圧迫療法、ステロイドの局所注射、Ｚ形成術や植皮術などの手術療法などがあげられる。トラニラストやステロイドの治療効果は非常に緩やかであるため、高度な肥厚性瘢痕はもっぱら手術療法に頼らざるを得ない。しかし、局所投与で効果を示す軟膏剤や注射剤は知られていなかった。
上記の肥厚性瘢痕と異なり、ケロイド（真性ケロイド）は原因不明の疾患で、一般的には体質が関与しているといわれている。特に、前胸部や肩などに多発するコラーゲン線維の異常増殖で、手術創や外傷の既往がある場合とない場合の両方で発生する。増加傾向にあるかどうかは不明であるが、発症例数は非常に多いと言われている。治療法はトラニラストの内服、スポンジによる圧迫療法、手術療法、放射線療法などがあるが再発傾向が強いためいずれの治療も決定的ではない。この疾患のための軟膏剤や注射剤も未だ知られていない。
【０００３】
肥厚性瘢痕およびケロイド（両者を併せてケロイドと総称することがある）は、真皮中の膠原質（コラーゲン）の過剰増殖によって生ずる進行性に拡大する瘢痕で、腫瘤状の隆起を示す。肥厚性瘢痕は、初発の損傷の部域に限局して生ずる瘢痕である。これらの瘢痕の成因や原因は不明であるが、コラーゲン線維の蓄積、コラーゲン線維の複雑な交錯およびＩＩＩ型コラーゲンとＩ型コラーゲンの比（ＩＩＩ型／Ｉ型）が増大することは判明している。
【０００４】
関節リウマチは加齢により発症数が増加する。従って、平均年齢が延びるに従い、発症例数が増加する。約０．５％の人間がこの疾患にかかるとされているので、世界人口５９億（１９９８年国連統計）の内約３０００万人の関節リウマチ患者が存在すると予測される。我国では、人口が１億２０００万人であるので、約６０万人の患者が存在すると予測される。典型的なもの以外の関節リウマチ疾患を含めると人口の１〜１．５％が罹患していると考えられ、約２００万人となる。さらに、寿命延長で年々増加傾向にある。
【０００５】
関節リウマチの治療は主に手術と薬物による方法がある。薬物は非ステロイド抗炎症薬、疾患修飾性抗リウマチ薬、ステロイド薬等が用いられている。最初に非ステロイド抗炎症薬が使用されることが多い。非ステロイド抗炎症薬は、炎症の程度を低下させ鎮痛効果は速やかに得られるが、症状の進行や関節の破壊を防御することは出来ない。疾患修飾性抗リウマチ薬は、免疫異常を是正することによりリウマチ異常を緩快させる薬で現在９種類あるが、鎮痛効果はなく遅効性であり、効果の発現が一定しないので、全ての患者に効力がある訳ではない。ステロイド剤はリウマチの炎症を軽減させる効果はあるが、その効果、特に鎮痛効果が顕著な為、投薬の中断が困難となり、その結果、副作用の為、患者は生命の予後を短縮させることもある。これらの薬物は関節リウマチの発症原因に対する原因療法ではないので、所謂対症療法の域を出ていないのが現状である。
【０００６】
関節リウマチは、滑膜の絨毛性増殖および肥厚とその滑膜絨毛へのリンパ球および増殖している毛細血管周辺の単球やマクロファージなどの強度の浸潤を特徴とする慢性関節炎症性疾患である。更に随伴症状として血管内皮の炎症性病変・壊死が現れる。これらの浸潤細胞でＩＬ１が産生され分泌されて、更に病状が悪化・進行する。この病変の原因は不明であるが、病理組織像の本態である滑膜の増殖に伴う膠原質産生を抑制すること、さらにＩＬ１分泌細胞を死滅させれば、症状が改善されると考えられる。また、同様の関節の症状を呈するリウマチ類縁疾患、膠原病による関節炎、腱鞘炎等の慢性関節炎症性疾患にも有効であると考えられる。
【０００７】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、血球の増殖と分化に関与し、他のサイトカインとは異なり血球では産生されず、腎臓または肝臓で産生され血液中に放出される。エリスロポエチンは赤血球前駆細胞の内、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）と赤芽コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）に作用し、その分化と増殖を促進し、赤血球の産生を誘導していると考えられている（Krantz S.B.,Blood,Vol.77,pp419-434(1991)）。エリスロポエチンが前駆細胞の細胞膜に存在するエリスロポエチン受容体と結合すると、シグナルが細胞核内に伝達され、赤血球の分化、即ちグロビンｍＲＮＡの細胞内集積、ヘモグロビンの産生、赤血球の分化が起こるとされている（D’Andrea A.D.et al.,Cell,Vol.57,pp277-285(1989)）。しかし、そのメカニズムの詳細についてはまだ解明されておらず、今後解決すべき点が多い。
【０００８】
エリスロポエチンが腎、肝臓以外の組織でその遺伝子を発現している部位として、着床直後の胚体（Yasuda Y.et al.,Develop.Growth Differ.,Vol.35,pp711-722(1993)）、ヒト、サル、およびマウスの脳（Marti H.H.et al.,Eur.J.Neu.Sci.,Vol.8,pp666-676(1996)）が知られている。また、本発明者らは、エリスロポエチン受容体遺伝子が赤芽球系以外にマウス脱落膜に発現していることを見出した（Yasuda Y.et al.,Develop.Growth Differ.,Vol.35,pp711-722(1993)）。これらの血球系以外の部位におけるエリスロポエチンあるいはエリスロポエチン受容体遺伝子の機能については、明らかにされていないのが現状である。
【０００９】
エリスロポエチンは遺伝子組換えによって製造され、貧血治療、特に腎透析患者の貧血治療や外科手術時の自己血輸血の準備にも有効に使用されている。エリスロポエチン受容体については、貧血症に対するアゴニストまたは赤血球増加症などのアンタゴニストとしての用途が期待されており（ＷＯ９０／０８８２２号公報）、エリスロポエチン過剰症、高エリスロポエチン血症に利用され得るとの記載がある。また、特定のドメインにおいてエリスロポエチン受容体に結合する物質が慢性関節リウマチの治療に利用され得るとの記載がある（ＷＯ００／６６６３２号公報）。
しかし、抗エリスロポエチン抗体やエリスロポエチン受容体蛋白質などのエリスロポエチン拮抗物質（エリスロポエチンと結合する物質）については、癌などの増殖性臓器疾患に対して治療効果を示すことが知られているものの（特開平１０−１０１５７４号公報）、肥厚性瘢痕もしくはケロイド等の膠原質性過剰増殖、および関節リウマチ等の慢性関節炎症性疾患に対する予防・治療効果については全く知られていない。
【００１０】
【発明の解決しようとする課題】
したがって、本発明は、肥厚性瘢痕もしくはケロイド等の膠原質性過剰増殖、または関節リウマチ等の慢性関節炎症性疾患に対し優れた効果を有する予防・治療剤を提供することを目的とする。
【００１１】
【発明を解決するための手段】
上記課題に鑑み、本発明者らは、鋭意研究の結果、エリスロポエチン拮抗作用を有する抗エリスロポエチン抗体などに膠原質の進行性過剰増殖、特に肥厚性瘢痕あるいはケロイドなどを改善する作用があること、ならびに関節リウマチなどを改善する作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）エリスロポエチン拮抗物質（エリスロポエチン拮抗物質とはエリスロポエチンに結合性を有する物質）を有効成分として含有する、肥厚性瘢痕、ケロイドまたは慢性関節炎症性疾患予防・治療剤、
（２）エリスロポエチン拮抗物質が抗エリスロポエチン抗体である、上記（１）記載の剤、
（３）エリスロポエチン拮抗物質がエリスロポエチン受容体蛋白質である、上記（１）記載の剤、
（４）エリスロポエチン受容体蛋白質が可溶性エリスロポエチン受容体蛋白質である、上記（３）記載の剤、
（５）慢性関節炎症性疾患が関節リウマチ、リウマチ類縁疾患、膠原病による関節炎、またまたは腱鞘炎である、上記（１）記載の剤、
（６）肥厚性瘢痕、ケロイドまたは慢性関節炎症性疾患予防・治療剤の製造のためのエリスロポエチン拮抗物質の使用、
（７）哺乳動物にエリスロポエチン拮抗物質の有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における肥厚性瘢痕、ケロイドまたは慢性関節炎症性疾患の予防・治療方法、等を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の肥厚性瘢痕、ケロイドまたは慢性関節炎症性疾患治療剤（以下、「本発明の剤」と略記する）の成分、特に有効成分としては、エリスロポエチン拮抗物質が用いられる。本発明におけるエリスロポエチン拮抗物質は、一般的に抗体が抗原に結合する程度の強さ、あるいは受容体がリガンドと結合する程度の強さでヒトエリスロポエチンに結合性を有し、エリスロポエチンのオートクライン（自己分泌）の産生を抑制するもの、すなわち、エリスロポエチンのアンタゴニストであればよい。このようなエリスロポエチン拮抗物質には、抗エリスロポエチン抗体、エリスロポエチン受容体蛋白質などがある。
【００１４】
抗エリスロポエチン抗体は、エリスロポエチンもしくはその部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
抗エリスロポエチン抗体は、エリスロポエチンもしくはその部分ペプチドまたはその塩を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法（例えば特開平１−２２８４９２号公報に記載の方法）に従って製造することができる。
エリスロポエチンもしくはその部分ペプチドの塩としては、酸（例えば無機酸、有機酸など）または塩基（例えばアルカリ金属塩など）との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
以下に、抗エリスロポエチン抗体の一般的製造法を説明する。
【００１５】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（a）モノクローナル抗体産生細胞の作製
エリスロポエチンもしくはその部分ペプチドまたはその塩は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤などとともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが挙げられるが、マウスおよびラットなどが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化エリスロポエチン等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、256巻、495頁（1975年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。
ミエローマ細胞としては、例えば、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、SP2/0などが挙げられるが、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１などが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数とミエローマ細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００１６】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、エリスロポエチン等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したエリスロポエチン等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００１７】
（b）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００１８】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（エリスロポエチン等の抗原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物からエリスロポエチン等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤などとともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液などから採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００１９】
エリスロポエチン受容体蛋白質は、公知の方法（ＷＯ９０／０８８２２号公報；特開平６−３８７８７号公報；化学と生物，３１（４），２７０−２７４頁（１９９３）；米国特許第５２９２６５４５号明細書など）により得ることができる。エリスロポエチン受容体蛋白質のなかで、特に好ましくは可溶性エリスロポエチン受容体蛋白質が用いられる。可溶性エリスロポエチン受容体蛋白質は、特開平６−３８７８７号公報記載の方法等の公知の方法により得ることができる。
これらのエリスロポエチン受容体蛋白質も抗エリスロポエチン抗体も臓器あるいは組織内でエリスロポエチンと結合し、エリスロポエチンとエリスロポエチン受容体との結合を遮断する作用を有し、機能的に互いに同等な物質であると考えられる。
【００２０】
上記のようにエリスロポエチン受容体蛋白質は公知の蛋白質であり、また上述の特許公報あるいはその他の文献にそのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が記載されている。本発明におけるエリスロポエチン受容体蛋白質は、一般的に受容体がリガンドと結合する程度の強さで、好ましくは可逆的にヒトエリスロポエチンに結合性を有し、エリスロポエチンのオートクライン（自己分泌）の産生を抑制するもの、すなわちエリスロポエチンのアンタゴニストであればよい。従って、ヒトエリスロポエチン受容体蛋白質もしくはエリスロポエチン親和性フラグメント、ヒトエリスロポエチン受容体蛋白質と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する非ヒト哺乳動物（例えばマウスなど）のエリスロポエチン受容体蛋白質やそのフラグメント、あるいはこれらの類縁体でもよい。
【００２１】
本発明の剤は、ヒトおよび動物に対し、非経口的（例えば局所投与、静脈投与、経皮投与、経直腸投与、経鼻投与、経膣投与、経口腔粘膜投与、経肺粘膜投与など）に安全に投与される。製剤の形態としては、注射用製剤、点滴用製剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤、外用剤、徐放剤、粉末吸入剤などが挙げられる。これらの製剤のうち固形のものは、公知の製剤学的製法に準じ、製剤として薬理学的に許容され得る担体として、賦形剤（例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸など）、安定剤、着色剤、界面活性剤、結合剤（例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、トラガント、アラビアゴムなど）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなど）、その他添加剤などを用いることにより、目的とする製剤とすることができる。
液状製剤の場合は、有効成分エリスロポエチン拮抗物質の薬理学的有効量および製剤学的に許容しうる賦形剤／賦活剤と溶剤（例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油など）との混合物とし、その中にアミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチンなどの塩基性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸など）、糖類（例えばグルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトールなど）、セルロース誘導体、無機塩（例えば塩化ナトリウムなど）およびその他の有機／無機化合物などの一般的に注射用組成物に添加される賦形剤／賦活剤（あるいは等張化剤）を用いても良い。また、有効成分とこれらの賦形剤／賦活剤を用い注射剤を調製する場合は、必要に応じてｐＨ調整剤（例えば炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウムなど）、緩衝剤（例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩など）、安定化剤（例えばヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸など）、可溶化剤（例えばアルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０）など）、無痛化剤（例えば塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、保存剤（例えばベンジルアルコール、フェノールなど）、抗凝固剤（例えばデキストラン硫酸、ヘパリンなど）、防腐剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸など）、酸化防止剤（例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸など）などを添加して常法によって各種注射剤とすることができる。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。投与に当たっては、上記の注射用組成物を慣用の水性希釈剤中で溶解し、液剤として用いることができる。水性希釈剤としてはぶどう糖水溶液、生理食塩水、リンゲル液、栄養補給剤液などが含まれる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【００２２】
注射剤にリン酸またはその塩が含まれる場合、その注射剤中のリン酸ナトリウムあるいはリン酸カリウムの濃度は約０.１ｍＭないし５００ｍＭであり、約１ｍＭないし１００ｍＭのときが好ましい。
無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２３】
常法に従って有効成分を分散させた懸濁液を溶解し、マイクロカプセル、球状、棒状、針状、ペレット状、フイルム状等に賦形して本発明の剤を製造することもできる。また本発明の剤は、有効成分と生体内分解性高分子化合物とを含む徐放剤に成形してもよい。該徐放剤の調製は、特開平９−２６３５４５号公報に記載の方法に準ずることができる。
【００２４】
本発明の剤において、エリスロポエチン拮抗物質の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１〜１００重量％、好ましくは約１０〜９９．９重量％、さらに好ましくは約２０〜９０重量％程度である。
本発明の剤において、エリスロポエチン拮抗物質以外の成分の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約１０〜９９．９重量％、好ましくは約２０〜９０重量％程度である。
【００２５】
本発明の剤が肥厚性瘢痕およびケロイドの予防・治療剤である場合、本発明の剤は具体的には、例えば手術後瘢痕、熱傷ケロイド、ケロイド、外傷後の瘢痕、経冠動脈血管形成術後の再狭窄、肥厚性瘢痕パンヌス等の予防、治療、改善に用いることができ、本発明の剤は注射剤あるいは軟膏等の外用剤として局所的に直接投与することが特に好ましい。
外用剤としては、固状、半固状または液状のいずれでもよく、例えば固状の外用剤は、エリスロポエチン拮抗物質をそのまま、あるいは賦形剤（例えばグリコール、マンニトール、デンプン、結晶セルロースなど）、増粘剤（例えば天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体など）などを添加、混合して粉状の組成物とすることにより製造される。半固状の外用剤の場合には、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏状として用いることが好ましい。液状の外用剤は、注射剤の場合とほとんど同様で、油性あるいは水性懸濁剤とすることにより製造される。上記した固状、半固状または液状の外用剤に、ｐＨ調整剤（例えば炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウムなど）、防腐剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムなど）などを加えてもよい。具体的には、例えばワセリン、ラノリンなどを基剤として、１ｇあたりエリスロポエチン拮抗物質を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１〜５０ｍｇ含有する軟膏剤として、皮膚あるいは粘膜等に用いる。
投与量は疾患の程度、年齢、体重、剤形、投与方法、投与期間、投与対象動物（例えばヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ブタなどの哺乳動物）により異なるが、例えば、成人（体重６０ｋｇ）１人あたり１回にエリスロポエチン拮抗物質として約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１〜５０ｍｇ、より好ましくは２〜２０ｍｇ程度を、１日１回から３回程度投与すれば良い。
【００２６】
本発明の剤が慢性関節炎症性疾患予防・治療剤である場合、本発明の剤は関節に炎症症状を呈する総ての関節炎、具体的には例えば慢性関節リウマチによる関節炎、リウマチ類縁疾患、膠原病による関節炎症状、あるいは腱鞘炎等の予防、治療、改善に用いることができ、本発明の剤は特に好ましくは注射剤等の液剤の形態として局所的に直接投与する。
関節腔内へ局所投与剤として直接投与するような場合には、注射用ヒアルロン酸製剤（例えば、科研製薬製：アルツ注）を分散媒として、有効成分を分散することにより調製することができる。分散媒中に用いられるヒアルロン酸は、その非毒性塩を用いてもよく、その例としてはナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属塩があげられ、とりわけナトリウム塩が好ましく用いられる。ヒアルロン酸およびその非毒性塩としては分子量約２０万ないし５００万（粘度法）、好ましくは約５０万ないし３００万、さらに好ましくは約７０万ないし２５０万のものが用いられる。
本分散剤におけるヒアルロン酸またはヒアルロン酸ナトリウムの最終濃度は１％（Ｗ／Ｖ）未満が粘度として適当であり各種操作、投与の容易さなどの点で好ましく、とりわけ約０.０２ないし１％未満が好ましく、さらに好ましくは約０.１ないし１％（Ｗ／Ｖ）である。
【００２７】
上記分散媒には、自体公知の方法により、ｐＨ調節剤、局所麻酔剤、抗生物質、溶解補助剤、等張化剤、吸着防止剤、グリコサミノグリカン、多糖類などを含有させてもよい。その好ましい例としては、マンニトール、ソルビトール、食塩、グリシン、酢酸アンモニウム、あるいは実質的に薬理活性を示さずに体液内に注入しうる水溶性蛋白などが挙げられる。該グリコサミノグリカンとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケウタン硫酸などが挙げられる。該多糖類としては、アルギニン酸のような酸性多糖類が挙げられる。
上記水溶性蛋白としては、水、生理食塩水または緩衝液に溶解するものであればよく、例えばヒト血清アルブミン、ヒト血清グロブリン、コラーゲン、ゼラチンなどがあげられる。上記ｐＨ調節剤としては、例えばグリシン、酢酸アンモニウム、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウムなどがあげられる。上記局所麻酔剤としては、例えばクロロブタノール、塩酸キシロカインなどがあげられる。上記抗生物質としては、例えばゲンタマイシンなどがあげられる。上記溶解補助剤としては、例えばグリセリン、ポリエチレングリコール４００などがあげられる。上記等張化剤としては、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどがあげられる。上記吸着防止剤としては、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどがあげられる。
さらに分散媒中に水溶性蛋白を含有する場合の該水溶性蛋白の含有量としては、一回投与の製剤あたり、好ましくは０.０５〜５０ｍｇ、さらに０.５〜２０ｍｇが好ましく、より好ましくは０.７５〜１０ｍｇである。該製剤は、リン酸またはその塩（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）を含有していてもよい。
【００２８】
本発明の剤が慢性関節炎症性疾患予防・治療剤である場合、投与量は疾患の程度、年齢、体重、剤形、投与方法、投与期間、投与対象動物（例、ヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ブタ等の哺乳動物）により異なるが、肩または膝関節部内には、例えば、成人（体重６０ｋｇ）１人あたりエリスロポエチン拮抗物質約１００〜４０００μｇ／ｍｌの濃度に調製した製剤を１回に約１〜１０ｍｌ、好ましくは約２．５ｍｌ程度、１日１回から３回程度投与すれば良い。手関節、肘関節、足関節には約０．５〜５ｍｌ、好ましくは約１．５ｍｌ、手および足の伸筋屈節腱鞘内には約０．５〜５ｍｌ、好ましくは約１ｍｌ、指節関節には約０．１〜１ｍｌ好ましくは約０．５ｍｌを１日１回から３回程度注入すれば良い。
【００２９】
本発明の剤が徐放剤である場合の投与量は、エリスロポエチン拮抗物質の種類と含量、剤形、薬物放出の持続時間、投与対象動物（例、ヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ブタ等の哺乳動物）、投与目的により種々異なるが、例えば非経口投与により適用する場合には、1週間に約０．１から約１００ｍｇのエリスロポエチン拮抗物質が投与製剤から放出されるように投与すればよい。
【００３０】
本発明の剤は、活性成分としてエリスロポエチン拮抗物質以外の他の医薬成分を含有または併用していてもよい。このような医薬活性成分としては、抗アレルギー剤（例えばケトチフェン、テルフェナジン、アゼラスチン、エピナスチンなど）、抗菌剤（例えばセフィキシム、セフジニル、オフロキサシン、トスフロキサシンなど）、抗真菌剤（例えばフルコナゾール、イトラコナゾールなど）、抗炎症ステロイド剤（例えばプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾンなど）、非ステロイド性消炎鎮痛剤（例えばインドメタシン、ジクロフェナク、ロキソプロフェン、イブプロフェン、アスピリン、ピロキシカム、スリンダク、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばセレコキシブ、ロフェコキシブなど）など）、疾患修飾性抗リウマチ薬および免疫薬（例えばメトトレキセート、レフルノミド、プログラフ、スルファサラジン、Ｄ−ペニシラミン、経口金剤など）、ヒアルロン酸製剤（例えばヒアルロン酸ナトリウムなど）などが挙げられる。これらの成分は本発明の目的が達成される限り特に限定されず、非ペプチド性またはペプチド性のいずれであってもよく、適宜適当な配合割合で使用が可能である。
【００３１】
本発明の剤と併用薬との併用に際しては、本発明の剤と併用薬の投与時期は限定されず、本発明の剤と併用薬とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。併用薬の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象、投与ルート、疾患、組み合わせ等により適宜選択することができる。
本発明の剤と併用薬の投与形態は、特に限定されず、投与時に、本発明の剤と併用薬とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）本発明の剤と併用薬とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）本発明の剤と併用薬とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）本発明の剤と併用薬とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）本発明の剤と併用薬とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）本発明の剤と併用薬とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、本発明の剤→併用薬の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）などが挙げられる。以下、これらの投与形態をまとめて、本発明の併用剤と略記する。
【００３２】
本発明の併用剤は、毒性が低く、例えば、本発明の剤または（および）上記併用薬を自体公知の方法に従って、薬理学的に許容される担体と混合して医薬組成物とすることができる。
本発明の併用剤の製造に用いられてもよい薬理学的に許容される担体としては、上記した本発明の医薬組成物に使用されるものと同様のものを使用することができる。
本発明の剤および併用薬とを同時に製剤化して単剤として使用する場合、本発明の併用剤におけるエリスロポエチン拮抗物質の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１〜１００重量％、好ましくは約１０〜９９．９重量％、さらに好ましくは約２０〜９０重量％程度である。
また、本発明の併用剤における併用薬の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１〜１００重量％、好ましくは約１０〜９９．９重量％、さらに好ましくは約２０〜９０重量％程度である。
本発明の併用剤において、エリスロポエチン拮抗物質および併用薬以外の成分の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約１０〜９９．９重量％、好ましくは約２０〜９０重量％程度である。
本発明の併用剤におけるエリスロポエチン拮抗物質と併用薬との配合比は、投与対象、投与ルート、疾患等により適宜選択することができる。
本発明の併用剤の投与量は、エリスロポエチン拮抗物質および併用薬の種類、投与ルート、症状、患者の年令などによっても異なるが、例えば、ケロイドを治療する目的で局所に投与する場合、成人（体重６０ｋｇ）１人あたり１回にエリスロポエチン拮抗物質および併用薬として約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１〜５０ｍｇ、より好ましくは２〜２０ｍｇ程度を、１日１回から３回程度に分けて投与すれば良い。
【００３３】
本発明の剤に含有されるエリスロポエチン拮抗物質および併用薬物をそれぞれ別々に製剤化する場合も同様の含有量でよい。
本発明の剤に含有されるエリスロポエチン拮抗物質と併用薬をそれぞれ別々に製剤化して併用投与するに際しては、本発明の剤と併用薬を含有する医薬組成物とを同時期に投与してもよいが、併用薬を含有する医薬組成物を先に投与した後、本発明の剤を投与してもよいし、本発明の剤を先に投与し、その後で併用薬を含有する医薬組成物を投与してもよい。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法により異なるが、例えば、併用薬を含有する医薬組成物を先に投与する場合、併用薬を含有する医薬組成物を投与した後１分〜３日以内、好ましくは１０分〜１日以内、より好ましくは１５分〜１時間以内に本発明の剤を投与する方法が挙げられる。本発明の剤を先に投与する場合、本発明の剤を投与した後、１分〜１日以内、好ましくは１０分〜６時間以内、より好ましくは１５分から１時間以内に併用薬を含有する医薬組成物を投与する方法が挙げられる。
【００３４】
【実施例】
以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示したのみであり、これらによって本発明は何ら限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
抗エリスロポエチン抗体の生産
▲１▼抗原ＥＰＯの調製：
特開昭６０−４１６１４号公報に記載の方法に従って、貧血患者尿より分離したＥＰＯ（貧血患者尿濃縮物をＳＤＳ処理後、抗体吸着処理およびゲル濾過により取得したＥＰＯ標品）のＰＢＳ溶解物を氷冷し、−２０℃に冷却した９９．５％エタノールの９倍量を添加してＥＰＯを沈殿させた。この沈殿を−２０℃の９０％エタノール溶液で洗浄した後、減圧下に乾燥し、０．０１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ  Ｎａｐｉバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、予め同じバッファーで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに通し、非吸着画分にＥＰＯを回収した。得られたＥＰＯの純度は９９％であった。このＥＰＯを用いて、特開平１−２２８４９２号に記載の方法に従って、以下のように抗ＥＰＯ抗体を調製した。
【００３６】
▲２▼上記ＥＰＯによる実験動物の免疫：
上記の方法にて調製した純化ＥＰＯを抗原として使用し、実験動物としてマウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス）を用い、このマウスに対し、次のとおり２週間間隔で３回免疫を行った。
第１回免疫：
ＰＢＳ中に純化ＥＰＯタンパク質を１ｍｇ／ｍｌで溶解し、これに等量のフロイント完全アジュバントを混合して得たエマルジョン０．２ｍｌをマウスに対し腹腔内注射で投与した。
第２回免疫：
２週間後に同上のエマルジョン液１００μｌをマウスに対し腹腔内注射で投与した。
第３回免疫：
ＰＢＳ中に純化ＥＰＯを０．５ｍｇ／ｍｌで溶解し、１００μｌをマウスに対し、２週間後に腹腔内投与した。
【００３７】
▲３▼抗ＥＰＯ抗体産生ハイブリドーマの調製：
ｉ）細胞融合の作製
上記免疫処理終了から３日後に免疫マウスの脾細胞を無菌的に摘出し、合成培地（ＰＲＭＩ１６４０；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）と１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）との混合液で洗浄後、該混合液中で脾臓細胞をハサミで細断して単細胞化を行い、該混合液で２回洗浄した後、単細胞化した細胞をＲＰＭＩ１６４０液に分散した。細胞数は８×１０８個であった。別にマウスのミエローマ細胞（Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１）を上記ＲＰＭＩおよびＦＣＳの混合溶液中で培養し、増殖した細胞をＲＰＭＩ１６４０液で洗浄した。細胞数は４×１０８個であった。
次に上記で調製した免疫マウス脾細胞とマウスミエローマ細胞とをＲＰＭＩ１６４０液に分散し混合した後、遠心し上清を除去した。混合細胞をポリエチレングリコール１５００の５０％溶液中で細胞融合させた後、融合細胞をＨＴ培養液（ヒポキサンチン、チミジンおよび１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０液）に混合し、混合液を８枚の９６穴マイクロタイタープレートにまいて２日目以降、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンおよび１５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０液）を添加して、各穴で２週間培養してＨＡＴ選択を行った。増殖したハイブリドーマ細胞を確認した。
【００３８】
ｉｉ）上記ハイブリドーマ細胞のスクリーニングによる選出
上記で得たハイブリドーマより特定の細胞、即ち、ＥＰＯと特異的に結合し得る抗体を産生するハイブリドーマを選び出すために、１２５Ｉ−ＥＰＯ（ヒト尿由来純化ＥＰＯをＩＯＤＯ−ＧＥＮ法にて１２５Ｉで標識したもの；９８μＣｉ／μｇＥＰＯ）を用いて１２５Ｉ−ＥＰＯと特異的に結合する抗体が、ハイブリドーマ培養液中に存在することを確認して選出した。
その結果、目的に適合したものとして２５種類の細胞が選出され、その内１２５Ｉ−ＥＰＯとの結合値の高かったもの８種についてハイブリドーマの継代培養を続け、限界希釈法によりモノクローン化を行い、安定的に抗体産生を行う５種のハイブリドーマ細胞を得た。この５種類のうち、ＥＰＯ活性の吸着、溶出の最も良好な細胞（ｎ−＃２）を採用してモノクローナル抗ＥＰＯ抗体の産生を行った。
【００３９】
▲４▼モノクローナル抗ＥＰＯ抗体の生産：
上記のハイブリドーマ細胞ｎ−＃２を用いて、抗体産生を行った。すなわち、上記と同様にマウス腹腔内で抗体を生産させ、５０％硫安分画に付した後、ＤＥ５２（ＤＥＡＥ−セルロース；ワットマン社）充填カラムを通し、０．１Ｍ〜０．２Ｍ  ＮａＣｌ画分として精製免疫グロブリン（ＩｇＧ）を得た。マウス３０匹を用い、９００ｍｇの精製モノクローナル抗体（Ｒ２）を得た。
【００４０】
実施例２
可溶性エリスロポエチン受容体蛋白質の生産
特開平６−３８７８７号公報の実施例３の方法に従ってｓＥＰＯ−Ｒ発現ベクターｐｃｍＥＰＲ  ｓｏｌ・ｄｈｆｒを構築し、この遺伝子を大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３にトランスフェクションした（この菌株は微工研（現工業技術院生命工学工業技術研究所）に微工研菌寄第１２８１４号として寄託されている）。本発明では、これらの大腸菌から上記プラスミドを取り出して、ＣＨＯ・ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクションした。即ち、ｓＥＰＯ−Ｒ発現ベクターｐｃｍＥＰＲｓｏｌ・ｄｈｆｒをリン酸カルシウム法によりＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞に導入し、可溶型エリスロポエチン受容体蛋白質（ｓＥＰＯ−Ｒ）生産細胞を選出した。メトトレキセート（ＭＴＸ）によるｓＥＰＯ−Ｒ遺伝子の増幅を行い、ｓＥＰＯ−Ｒの高生産細胞株Ｎ１４．２を得た。得られた細胞株を、核酸非含有α−ＭＥＭ合成培地に透析ウシ胎児血清１０％、ＭＴＸを１００ｎＭ添加した培養液中で増殖させた後、０．５％透析ウシ胎児血清を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地（ギブコ製）に交換し、ｓＥＰＯ−Ｒの生産を行った。得られた培養液２００ｍｌに６ｍｌのＥＰＯ固定化ＣＨ−セファロース４Ｂ（１５ｍｇ  ＥＰＯ／ｍｌ  ｇｅｌ）を加え、４℃で一晩穏やかに接触させた後、固定化担体を１０倍量のＰＢＳで洗浄後、担体に吸着したｓＥＰＯ−Ｒを１．５Ｍ  ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳで溶出した。溶出液を限外濾過法で濃縮およびＰＢＳに溶媒置換した後、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（東ソー製）を使用したＨＰＬＣにより分子量分画を行い、部分精製ｓＥＰＯ−Ｒ（０．６ｍｇ）を得た。得られたｓＥＰＯ−ＲはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびセファデックスＧ−７５ゲル濾過法を用いて分子量測定を行ったところ約３３ｋＤａを示した。
【００４１】
実施例３
軟膏の製造
実施例１で得られた抗エリスロポエチン抗体をワセリンに混入し、１％の軟膏を得た。
【００４２】
実施例４
注射剤の製造・１
実施例１で得られた抗エリスロポエチン抗体を生理的食塩水に溶解し、１ｇ／ｍｌまたは１０ｇ／ｍｌの溶液とした。これを濾過し、滅菌ミクロチューブに２００μｌずつ分注し、凍結保存して注射剤とした。使用時には、これを生理食塩水で溶解して使用する。
【００４３】
実施例５
注射剤の製造・２
実施例２で得られたエリスロポエチン受容体蛋白質を生理的食塩水に溶解し、２００μｇ／ｍｌの溶液とした。これを濾過し、滅菌ミクロチューブに２００μｌずつ分注し、凍結保存して注射剤とした。使用時には、これを生理食塩水で溶解して使用する。
【００４４】
実施例６
エリスロポエチン拮抗物質（抗エリスロポエチン抗体）のケロイドに対する効果
１）免疫染色
組織検索材料として、ケロイド患者より４例、肥厚性瘢痕患者より２例の摘出試料を固定液（Zamboni;Zamboni L.and DeMartino C.,J.Cell Biot.,Vol.35,p148A(1967)）にて６時間固定後、２５％蔗糖溶液に入れ冷暗所で保存した。これらの試料片をＯＣＴ剤（マイル社）で包埋し、液体窒素で凍結し、クリオスタットで７μｍの凍結切片とした。切片を、１次抗体として抗エリスロポエチン抗体（Genzyme社）、抗エリスロポエチン受容体抗体（Yasuda Y.et al.,Develop.Growth Differ.,Vol.35,pp711-722(1993)）、抗ＦａｃｔｏｒＶＩＩＩ抗体（Dako社）、抗コラーゲンＩＩＩ抗体（Chemicon社）、抗コラーゲンＩ抗体（Chemicon社）、および２次抗体としてビオチン化抗ウサギ抗体（Vector社）を反応させた。次いでＡＢＣキット（Vector社）を用いて、ＤＡＢ反応で発色し検鏡に供した。
【００４５】
２）組織移植
ヌードマウスにケロイド組織を移植し、本発明薬剤がケロイド増殖を抑制する効果を確認した。移植材料として、ケロイド患者より摘出した組織片を移植するまで培養液中（ＭＥＭ＋１０％  ＦＣＳ＋ＰＣ＋ＳＭ）に入れて、冷暗所に保存した。次に、ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、Ｊｃｌ−ｎｕ、日本クレア社）を６週齢で、麻酔下で細切ケロイド組織片を肩甲骨間に皮下に１匹に１片ずつ５匹のマウスに移植した。移植後、週に３回ケロイド組織の増殖した腫瘍の大きさ（長径×短径×高さ）をノギスで測定した。腫瘍の大きさが安定した３ケ月目に５匹のマウス腫瘍にエリスロポエチンの４００Ｕまたは８００Ｕ／ｍｌ溶液を２００μｌ、１時間間隔で３回注入した。更に３ケ月後に２匹のマウスの腫瘍に、外皮より実施例１で得られた抗エリスロポエチン抗体（Ｒ２）の８ｍｇ／ｍｌ溶液を２００μｌ、１時間間隔で注入した。対照マウス２匹には生理食塩水またはマウスの全血清をそれぞれ２００μｌずつ同様に３回局注した。残りの１匹のマウスは注入しなかった。注入１週間後にＲ２注入マウスと血清注入マウスより腫瘍を取り出し固定した。注入４週で残存のＲ２注入マウスと生理食塩水注入マウスより腫瘍を取り出し固定した。結果を以下に示す。
【００４６】
１．ケロイド組織の病理組織検査
ａ）ケロイドの組織におけるエリスロポエチンの発現
膠原質を産生する多数の線維芽細胞および毛細血管内皮細胞はエリスロポエチン受容体抗体に陽性反応を示している（図１）。これらの所見により、線維芽細胞と毛細血管内皮細胞はエリスロポエチンに応答していることが明らかとなった。
ｂ）ケロイド組織のコラーゲンＩＩＩ型線維の存在
線維芽細胞は抗コラーゲンＩＩＩ型抗体に強陽性を示した（図２）。コラーゲン線維束も陽性反応を示すが辺縁に存在する線維芽細胞と比較して反応は弱い（図２）。
ｃ）ケロイド組織の血管の分布
多数の毛細血管内皮および内皮細胞が、内皮細胞の同定に用いる抗体である抗ＦａｃｔｏｒＶＩＩＩ（第８因子）抗体に陽性反応を示した（図３）。
【００４７】
２．ケロイド組織の移植
ａ）移植後の経過
ケロイド組織片を皮下に移植し、移植後腫瘍化した組織（腫瘍）を観察した。移植時に比べて、成長が低下した時点（１６週後）で、各腫瘍にエリスロポエチン４００Ｕあるいは８００Ｕを１時間毎に３回局所注入した所、成長度の上昇を認めた（表１）。投与１０日後に１例の腫瘍を除去したが、３週後に腫瘍が出現した。移植後２８週で、Ｒ２の局所注入を１時間間隔で３回行い、１週間あるいは４週間後に腫瘍を摘出した。
ｂ）エリスロポエチン投与による移植腫瘍の増大
表１に示す通り、２例においてエリスロポエチン投与後１２時間と２４時間の時点で腫瘍が投与前の大きさと比べてそれぞれ６倍〜９倍、８倍〜７．５倍の大きさに増大し、４日後においても３倍の大きさを示した。また、投与濃度による増大の差は認められなかった。
ｃ）抗エリスロポエチン抗体注入による移植腫瘍の抑制
表２に、抗エリスロポエチン抗体投与前と投与後の、腫瘍の大きさの変化を示した。抗体投与マウス（３番）で軽度の抑制が認められ、また４番のマウスでは腫瘍の柔軟性を欠き硬化塊の腫隆と変化していた。尚、３番マウスの増殖腫瘍および４番マウスの残存軟部組織の病理組織観察では、以下に述べるように明確なケロイド様の病理観察像は認められず、移植組織の破壊および石灰沈着から腫瘍塊の３／４の組織石灰化が認められた。
【００４８】
【表１】
0004081281.tif 000002
【００４９】
【表２】
0004081281.tif 000003
【００５０】
病理組織像
ａ）移植腫瘍における抗エリスロポエチン抗体注入による変化
ｉ）Ｒ２処置でコラーゲンＩＩＩ型の線維束の断裂が著しい。断裂束は白血球やマクロファージ、ＮＫ様細胞の攻撃を受け融解、消失して線維のみになっている。線維芽細胞は核濃縮を示し、死細胞の集積も認められる（図４）。
ｉｉ）対照処置において、増殖したコラーゲン線維束の存在が認められる。線維芽細胞や線維細胞は変性を示してない（図５）。
ｂ）移植腫瘍ではコラーゲン束の近傍の血管は移植前と比べて、密度は少ない。ｉ）Ｒ２処置の腫瘍では内皮細胞死を認めた（図６）。
ｉｉ）対照処置の腫瘍では内皮細胞の存在が認められた（図７）。
ｃ）移植片の石灰沈着
ｉ）Ｒ２処置では全てに石灰沈着を認め、４番では腫隆の３／４の組織が石灰化を示し、石灰化近傍のコラーゲン束は断裂し、断裂コラーゲンが石灰化していく像であった（図８）。
ｉｉ）生理食塩水処置では１腫瘍に認められたが、石灰化近傍のコラーゲン束は変化なく増殖像を示した。
これらの結果を表３にまとめた。無処置群、対照群では組織の変化は殆ど無かったが、抗エリスロポエチン抗体処置群では、線維芽細胞の変性、コラーゲン束の断裂、消失、石灰質沈着から組織石灰化、膠原質産生の抑制を誘導した。これらの結果より、抗エリスロポエチン抗体はケロイドの増殖を抑制することが確認された。
【００５１】
【表３】
0004081281.tif 000004
【００５２】
実施例７
エリスロポエチン拮抗物質（エリスロポエチン受容体蛋白質）のケロイドに対する効果
実施例６と同様に、抗エリスロポエチン抗体の代わりに実施例２で得られたエリスロポエチン受容体蛋白質を用いて同様の実験を行った。抗体を用いた時の結果と同様に、エリスロポエチン受容体蛋白質もケロイドの増殖を抑えることが確認された。
【００５３】
実施例８
エリスロポエチン拮抗物質（抗エリスロポエチン抗体）の関節リウマチに対する効果
１）免疫染色
組織検索材料として、関節リウマチ患者５症例より、手術により摘出された増殖性滑膜片を約２０ｍｍ×１０ｍｍ×５ｍｍの大きさに細切し、固定液（Zamboni液； Zamboni L. and DeMartino C., J. Cell Biot., Vol.35, p148A（1967））にて６時間固定後、２５％蔗糖添加ＰＢＳに入れ替え、冷暗所にて保存した。これらの試料片をＯＣＴ剤（マイル社）で包埋し、液体窒素で凍結し、クリオスタットで７μｍの凍結切片とした。切片を、第１抗体としてｉ）抗エリスロポエチン受容体抗体（Yasuda Y. et al., Develop. Growth Differ., Vol.35, pp711-722（1993））、ii）抗ＩＬ１α抗体（Genzyme社）、iii）抗コラーゲンＩＩＩ抗体（Chemicon社）、iv）抗エストロゲン受容体抗体（Chemicon社）、ｖ）抗第８因子抗体（Dako社）の５種類の抗体をそれぞれ反応させた。次に、ｉ）、iii）とｖ）で反応させたものには、ビオチン化抗ウサギ抗体（Vector社）を、また、ii）とiv）で反応させたものには、ビオチン化抗マウス抗体（Chemicon社）を第２抗体として反応させた。発色はＤＡＢ（同仁製薬、和光純薬）を用いて反応させ検鏡に供した。
【００５４】
２）器官培養
器官培養材料として、上記のうち３症例については、術後直ちに摘出試料を培養液（ＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳ、ＰＣ １００Ｕ／ｍｌ、ＳＭ１００μｇ／ｍｌ）に入れ洗浄し、洗浄後同液中で培養開始まで冷暗所に保存した。
このようにして準備された新鮮滑膜片（術後１０〜２４時間以内）を２×５×１０ｍｍの大きさ、重量５０〜１００ｍｇに細切し、１個の組織片を６０ｍｍのシャーレ（３０４２；Falcon社）に入れ、重量を測定した。このシャーレに、実施例１で得られた抗エリスロポエチン抗体（Ｒ２）の生理食塩水溶液１６ｍｇ／ｍｌにEvans blueを０．２５％加えて着色した溶液を注入した。また、対照としては、Evans blueを加えた生理食塩水（大塚製薬社）を用いた。注入は、ハミルトンの３２ゲージ注射針（９０１３１）と注射筒（７２５）を用いて、組織重量ｍｇ当たり０．５μｌ、即ち０．５μｌ／ｍｇ重量のＲ２あるいは生理食塩水を、組織片に複数ヵ所注入した。注入後シャーレに蓋をして、５％ＣＯ２、９５％空気、３７℃で、６０分シャーレ内で反応させた。この操作を繰り返して、Ｒ２あるいは生理食塩水処理を３ないし４回処理した後、組織片をＭＥＭ＋１０％  ＦＣＳの培養液で２４穴の培養皿（３０４７；ファルコン社）で、１片ずつメッシュ（３０１４；ファルコン社）にのせ、５％ＣＯ２、９５％空気、３７℃の条件で６時間から８時間、器官培養した。尚、培養時間はＲ２処理開始時より１２時間をもって終了するため、時間差がある。
培養片をZamboni液で固定し、６時間後に２５％蔗糖添加ＰＢＳに入れ替え冷暗所に保存し、病理組織検索用に供した。組織検索の結果を以下に示す。
【００５５】
関節リウマチの滑膜組織の特性
１）滑膜絨毛におけるエリスロポエチン反応部位
膠原質を産生する線維芽細胞、線維束や滑膜絨毛に浸潤するマクロファージ、単球、および毛細血管内皮細胞がエリスロポエチン反応部位である（図９、１０、１１）。
２）滑膜絨毛におけるＩＬ１αの発現
膠原質を産生する線維芽細胞、浸潤している単球、マクロファージ、リンパ球に認められる（図１２）。
３）滑膜絨毛の血管分布
絨毛には毛細血管と細血管が多数存在し、多数の単球、リンパ球が血管周辺に浸潤している（図１３）。
４）滑膜絨毛の膠原質
絨毛の膠原質はコラーゲンＩＩＩを主体とした線維に富んでする。線維芽細胞は卵型の網目状の染色質を持つ核でコラーゲンＩＩＩを持つ細胞質を示す（図１４）。
５）滑膜絨毛のエストロゲン受容体の発現
絨毛においてエストロゲン反応部位（図１５右）はエリスロポエチン受容体（図１５、１６左）とＩＬ１α陽性部位（図１６右）に相当し、これら３者は共存している（図１５、１６）。
【００５６】
Ｒ２処置による滑膜絨毛片の変化
１）線維芽細胞の死
Ｒ２の３回処置（図１７）および４回処置（図１８）で、多数の死んだ線維芽細胞が認められた。核は網目状の染色質が凝縮・濃縮され、細胞質は消失していた。この現象はＲ２の４回処置において、３回処置よりも顕著であり、アポトーシス死と考えられる。対照群では、線維芽細胞は変化を示さなかった（図１９）。
２）単球、リンパ球、マクロファージの死
細胞浸潤の多い毛細血管周辺で多数の核濃縮で死亡したリンパ球、単球マクロファージを認めた（図２０）。この現象はＲ２の４回処置の方が程度が強く（図２０）、培養片のＩＬ１α陽性細胞の減少を認めた。対照群の培養片ではこれらの浸潤細胞に変化を認めなかった（図２１）。
３）毛細血管の崩壊
Ｒ２の３回処置および４回処置において毛細血管の消失を認めた（図２２）。対照群では、多数の毛細血管が存在していた（図２３）。
４）コラーゲン線維の変化
Ｒ２の３回処置（図１７）および４回処置（図１８）では、コラーゲン束の断裂と希薄を認めた。対照群の組織片では、コラーゲン線維の断裂や希薄は認めなかった（図１９）。
以上の結果を表４にまとめた。抗エリスロポエチン抗体は、関節リウマチ等の疾患の主要症状である滑膜の増殖に伴う膠原質産生の抑制（線維芽細胞の変性、壊死、コラーゲン束の消失）、毛細血管の消失、ＩＬ−１分泌細胞の壊死（単球、マクロファージの壊死）を誘導した。これらの結果より、抗エリスロポエチン抗体は、関節リウマチの炎症を抑えることが確認された。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
実施例９
エリスロポエチン拮抗物質（エリスロポエチン受容体蛋白質）の関節リウマチに対する効果
実施例８と同様に、抗エリスロポエチン抗体の代わりにエリスロポエチン受容体蛋白質を用いて同様の実験を行った。この結果、抗体を用いた時の結果と同様に、エリスロポエチン受容体蛋白質も炎症を抑えることが確認された。
【００５９】
実施例１０
ケロイド組織サンプルにおけるエリスロポエチンおよびエリスロポエチン受容体ｍＲＮＡの発現
ケロイド瘢痕５例、萎縮瘢痕１例および赤色瘢痕３例の組織よりＲＮＡを抽出し、それらのＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法により、エリスロポエチンおよびエリスロポエチン受容体ｍＲＮＡの検出を試みた。  全例においてエリスロポエチン受容体ｍＲＮＡの発現が認められた。エリスロポエチンｍＲＮＡはケロイド瘢痕および赤色瘢痕に発現が認められたが萎縮瘢痕では非常に弱い、あるいは無い発現であった（図２４）。採取ＲＮＡの状態はベータアクチンのｍＲＮＡの増幅が弱くないので、良好と考えられる。
【００６０】
実施例１１
滑膜組織におけるエリスロポエチンおよびエリスロポエチン受容体ｍＲＮＡの発現
８例の患者の滑膜よりＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ法によりそれぞれのｍＲＮＡの検出を試みたところ、発現に強弱はあるが、全例にエリスロポエチンとその受容体の発現が認められた（図２５）。
【００６１】
実施例１２
滑液中のエリスロポエチン含有量
リウマチ患者９例と変形性関節症の患者５例の滑液を用いて、総タンパク量（ｍｇ／ｍｌ）とエリスロポエチン量（ｍＵ／ｍｌ）を測定したところ、両症例においてタンパク量には変化がなかったがエリスロポエチン量は有意にリウマチ症例で変形性関節症よりも高値を示した。
結果を表５に示す。
【表５】
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【００６２】
【発明の効果】
以上から明らかなように、本発明により、肥厚性瘢痕もしくはケロイド等の膠原質性過剰増殖、または関節リウマチ等の慢性関節炎症性疾患に対し優れた効果を有する予防・治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  患者より摘出したケロイド片における多数の線維芽細胞のエリスロポエチン受容体抗体に対する陽性反応を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は線維芽細胞を、矢尻は血管内皮細胞を、＊は線維束の部域を示す。（倍率：１８０倍）
【図２】  患者より摘出したケロイド片における多数の線維芽細胞のコラーゲンＩＩＩ型抗体陽性反応を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は線維束を、小さい矢印は線維芽細胞を示す。（倍率：１８０倍）
【図３】  患者より摘出したケロイド片における第８因子抗体に陽性反応を示す多数の毛細血管の分布を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は血管内皮細胞を示す。（倍率：１８０倍）
【図４】  ヌードマウスに移植したケロイド腫瘍にエリスロポエチン抗体を３回連続投与し、１週間後に摘出した腫瘍片の、石灰化組織の周辺部の組織像を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、矢尻は断裂して小さく分解されたコラーゲン像を、＊は分解して消失していくコラーゲン像を示す。（倍率：３６０倍）
【図５】  ヌードマウスに移植したケロイド腫瘍にマウス血清を３回連続投与し、１週間後に摘出した腫瘍片の組織像を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←はコラーゲン束の１束を示す。（倍率：３６０倍）
【図６】  図４と同一標本（Ｒ２の３回処置）の第８因子抗体陽性反応を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は点状に粉砕された内皮細胞の核断片を示す。（倍率：７２０倍）
【図７】  図５と同一標本（マウス血清３回処置）の第８因子抗体陽性反応を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は内皮細胞質の突起を示す。（倍率：７２０倍）
【図８】  図４と同一標本（Ｒ２の３回処置）のｖａｎ  Ｋｏｓｓａ染色により、組織石灰化の組織像を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←はコラーゲン断裂塊の石灰沈着を示す。（倍率：７２倍）
【図９】  患者Ａより摘出した滑膜絨毛片における、エリスロポエチン受容体抗体に陽性部位を示す細胞（矢印）と細胞性浸潤を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は線維芽細胞を、←←はマクロファージを示す。（倍率：１５０倍）
【図１０】  患者Ｂより摘出した滑膜絨毛片のエリスロポエチン受容体抗体に陽性部位を示す強拡大の像を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は毛細血管周辺の単球を、←←はマクロファージを、矢尻は線維芽細胞を示す。（倍率：６００倍）
【図１１】  図１０と同一患者の組織切片のエリスロポエチン受容体抗体に陽性反応を示す線維芽細胞像を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は線維芽細胞を示す。（倍率：６００倍）
【図１２】  図１０と同一患者の組織片のＩＬ１α抗体に陽性反応を示す線維芽細胞と浸潤細胞群を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は線維芽細胞の核を、←←はマクロファージを示す。（倍率：３００倍）
【図１３】  図９と同一患者の組織切片の第８因子抗体に反応する毛細血管の存在を示す像を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は第８因子抗体に陽性を示す毛細血管内皮細胞を示す。（倍率：１５０倍）
【図１４】  図１０と同一患者の組織片のコラーゲンＩＩＩ抗体に陽性反応を示す線維芽細胞像を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は線維芽細胞を示す。（倍率：６００倍）
【図１５】  図１０と同一患者の組織片のエリスロポエチン受容体抗体（左図）とエストロゲン受容体α抗体（右図）の二重染色像を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は線維芽細胞を、矢尻は単球を示す。（倍率：４８０倍）
【図１６】  図１０と同一患者の組織片のエリスロポエチン受容体抗体（左図）とＩＬ１α抗体（右図）の二重染色像を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は線維芽細胞を、矢尻は単球を示す（倍率：４８０倍）
【図１７】  図９と同一患者の組織片にＲ２を３回、１時間間隔で処置（処置開始より１２時間後に固定したもののコラーゲンＩＩＩ抗体陽性部位を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は死亡した線維芽細胞の核を、←←は死亡したマクロファージの核を示す。（倍率：１８０倍）
【図１８】  図１０と同一患者の組織片にＲ２を４回、１時間間隔で処置し、処置開始より１２時間後に固定したものの、コラーゲンＩＩＩ抗体陽性部位を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は死亡した線維細胞の核を、矢尻は死亡細胞周辺のコラーゲン線維質の抜けた部位を示す。（倍率：１５０倍）
【図１９】  図１０と同一患者の組織片に生食を４回、１時間間隔で処置し、処置開始より１２時間後に固定したものの、コラーゲンＩＩＩ抗体陽性部位を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は線維芽細胞の核を、←←はコラーゲンＩＩＩの線維束を示す。（倍率：３００倍）
【図２０】  図１８と同一培養切片（Ｒ２の４回処置）のＩＬ１α抗体陽性部位を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は死亡した線維芽細胞の核を、←←は核の断片を示す。（倍率：２４０倍）
【図２１】  図１９と同一培養片（生食４回処置）のＩＬ１α抗体陽性部位を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は線維芽細胞を、←←はマクロファージを示す。（倍率２４０倍）
【図２２】  図１７と同一培養片（Ｒ２の３回処置）の第８因子陽性部位を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は破損している血管壁を、←←は核濃縮を示す内皮細胞の核を示す。（倍率：３６０倍）
【図２３】  図１９と同一培養片（生食４回処置）の第８因子陽性部位を示す顕微鏡写真を表す図である。図中、←は血管内皮細胞を、←←は単球を、矢尻は線維芽細胞の核を、矢尻２個はリンパ球を示す。（倍率：３６０倍）
【図２４】  ケロイド組織サンプルにおけるエリスロポエチンおよびエリスロポエチン受容体ｍＲＮＡの発現結果を示す電気泳動図である。図中、
１〜５レーンはケロイド瘢痕患者、６レーンは萎縮瘢痕、７から９レーンは赤色瘢痕を示す。
EPO  RT＋は、逆転写酵素を加えたＲＮＡサンプルにおけるエリスロポエチンｃＤＮＡの増幅を示す。
EPO  RT−は、逆転写酵素を加えなかったＲＮＡサンプルではエリスロポエチンｃＤＮＡの増幅は確認されなかったことを示す。
EPOR  RT＋は、逆転写酵素を加えたＲＮＡサンプルにおけるエリスロポエチン受容体ｃＤＮＡの増幅を示す。
EPOR  RT−は、逆転写酵素を加えなかったＲＮＡサンプルではエリスロポエチン受容体ｃＤＮＡの増幅は確認されなかったことを示す。
ベータアクチンは、サンプル間におけるＲＮＡ量差を考慮するため、内部標準としてベータアクチンを用い、その増幅を示している。
各バンドの上の表示は患者識別を示す。
【図２５】  滑膜組織のエリスロポエチンおよびエリスロポエチン受容体のｍＲＮＡ発現結果を示す電気泳動図である。図中、
EPO  RT＋は、逆転写酵素を加えたＲＮＡサンプルにおけるエリスロポエチンｃＤＮＡの増幅を示す。
EPO  RT−は、逆転写酵素を加えなかったＲＮＡサンプルではエリスロポエチンｃＤＮＡの増幅は確認されなかったことを示す。
EPOR  RT＋は、逆転写酵素を加えたＲＮＡサンプルにおけるエリスロポエチン受容体ｃＤＮＡの増幅を示す。
EPOR  RT−は、逆転写酵素を加えなかったＲＮＡサンプルではエリスロポエチン受容体ｃＤＮＡの増幅は確認されなかったことを示す。
ベータアクチンは、サンプル間におけるＲＮＡ量差を考慮するため、内部標準としてベータアクチンを用い、その増幅を示している。
各バンドの上の表示は患者識別を示す。
【図１】
0004081281.tif 000007
【図２】
0004081281.tif 000008
【図３】
0004081281.tif 000009
【図４】
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【図５】
0004081281.tif 000011
【図６】
0004081281.tif 000012
【図７】
0004081281.tif 000013
【図８】
0004081281.tif 000014
【図９】
0004081281.tif 000015
【図１０】
0004081281.tif 000016
【図１１】
0004081281.tif 000017
【図１２】
0004081281.tif 000018
【図１３】
0004081281.tif 000019
【図１４】
0004081281.tif 000020
【図１５】
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【図１６】
0004081281.tif 000022
【図１７】
0004081281.tif 000023
【図１８】
0004081281.tif 000024
【図１９】
0004081281.tif 000025
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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