(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
0004171088.tif 000017
（式中、Ｒ1およびＲ2のいずれか一方はβ−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ3は還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、波線はα配位またはβ配位であることを示し、ｎは０〜７の整数を示す。）で表されるオリゴ糖誘導体（但し、1pO-ニトロフェニル  β−ガラクトシル−ガラクトシル−α−マルトペンタオシドは除く）。
【請求項２】
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−マルトシド。
【請求項３】
一般式（１）
【化２】
0004171088.tif 000018
（式中、Ｒ1およびＲ2のいずれか一方はβ−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ3は還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、波線はα配位またはβ配位であることを示し、ｎは０〜７の整数を示す。）で表されるオリゴ糖誘導体を含有してなる、α−アミラーゼ活性測定試薬。
【請求項４】
請求項３記載のα−アミラーゼ活性測定試薬を、α−アミラーゼを含有する試料と接触させることにより、一般式（１）
【化３】
0004171088.tif 000019
（式中、Ｒ1およびＲ2のいずれか一方はβ−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ3は還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、波線はα配位またはβ配位であることを示し、ｎは０〜７の整数を示す。）で表される前記オリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質の量を測定することを特徴とする試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。
【請求項５】
一般式（３）
【化４】
0004171088.tif 000020
（式中、Ｒ1およびＲ2のいずれか一方はβ−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ4はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、ｐは０〜１の整数を示す。）で表されるオリゴ糖誘導体を含有し、追随酵素を含有しない、α−アミラーゼ活性測定試薬。
【請求項６】
請求項５記載のα−アミラーゼ活性測定試薬を、α−アミラーゼを含有する試料と接触させることにより、一般式（３）で表される前記オリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質の量を測定することを特徴とする試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。
【請求項７】
一般式（４）
【化５】
0004171088.tif 000021
（式中、Ｒ1およびＲ2のいずれか一方はβ−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ5はα−アミラーゼもしくは追随酵素によって切断されうる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、波線はα配位またはβ配位であることを示し、ｑは１〜７の整数を示す。）で表されるオリゴ糖誘導体および追随酵素を含有する、α−アミラーゼ活性測定試薬。
【請求項８】
請求項７記載のα−アミラーゼ活性測定試薬を、α−アミラーゼを含有する試料と接触させることにより、一般式（４）で表される前記オリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質の量を測定することを特徴とする試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、α−アミラーゼ活性測定用基質として用いることができる新規なオリゴ糖およびその糖誘導体、ならびに該オリゴ糖またはその糖誘導体を含有するα−アミラーゼ活性測定試薬、ならびに当該試薬を用いたα−アミラーゼ活性測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より膵液や尿などの体液に含有されるα−アミラーゼ活性を測定することにより、急性や慢性の膵臓炎症、膵臓癌、耳下腺炎などの各種疾患の診断が行われており、臨床診断上の重要な指標の一つとなっている。
【０００３】
α−アミラーゼ活性測定の方法は各種知られているが、近年、構造が決定されており、かつα−アミラーゼの作用状態が明確となっているマルトオリゴ糖またはマルトオリゴ糖誘導体を基質として用いる方法が主流になっている。
【０００４】
すなわち、マルトオリゴ糖またはマルトオリゴ糖誘導体に、追随酵素としてα−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼの存在下に、α−アミラーゼを含有する検体を作用させ、生成するグルコースまたはオリゴ糖誘導体の還元末端から遊離するアグリコンの量を光学的に測定することにより、α−アミラーゼ活性を測定する方法が汎用されている。
【０００５】
しかしながら、α−グルコシダーゼなどの追随酵素は、α−アミラーゼの反応に関係なく僅かではあるが基質に作用するため、測定液が不安定でブランク値が上昇するため調整した測定液の保存が困難であるといった欠点があった。
【０００６】
この欠点を解決するため、マルトオリゴ糖またはマルトオリゴ糖誘導体の非還元末端グルコースを修飾し、追随酵素の作用を受けないようにした基質を用いることが試みられている。
【０００７】
例えば、特開昭６０−５４３９５号、同６０−８７２９７号、同６０−２３７９９８号、同６１−６３２９９号、同６３−３０１８９２号、特開平１−１５７９９６号の各公報などに、非還元末端のグルコースの４位および／または６位の水酸基を、ハロゲン原子、アルキル基、フェニル基、ピリジル基、ベンジリデン基、エチリデン基、イソプロピリデン基、または３−オキソブチリデン基などで置換し、還元末端グルコースにアグリコンを結合させたマルトオリゴ糖誘導体を基質として用いる方法が記載されている。
【０００８】
しかし、これらの非還元末端を非糖質で修飾する方法では、その水溶性の問題や、本来澱粉やアミロースなどのグルコース鎖を認識し切断するα−アミラーゼとの親和性が充分でなく、充分な感度が得られないといった欠点があった。
【０００９】
一方、特開平３−２６４５９６号、同４−２７９５９６号、同５−２０８９８９号、同６−３１５３９９号の各公報などに、非還元末端グルコースの６位または４位の水酸基に、ガラクトシル基を導入したマルトオリゴ糖またはその誘導体を基質として用いる方法を記載している。
【００１０】
これらのガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体基質は、理論的には水溶性、ブランク値の上昇といった問題を回避してしているものの、実際には製造上分離困難である、非還元末端が修飾されていない、原料由来のマルトオリゴ糖誘導体が不純物として若干含まれるために、多少ブランク値が上昇するといった問題があり、また感度も充分ではなかった。
【００１１】
特開昭６３−１８３５９５号、特開平６−３１５３９９号の各公報などは、追随酵素を必要としない２−クロロ−４−ニトロフェニル  マルトトリオシド
【００１２】
【化５】
0004171088.tif 000002
【００１３】
や、２−クロロ−４−ニトロフェニル  ガラクトピラノシルマルトシド
【００１４】
【化６】
0004171088.tif 000003
【００１５】
を基質とする方法を記載している。
【００１６】
この２−クロロ−４−ニトロフェニル  マルトトリオシドや２−クロロ−４−ニトロフェニル  ガラクトピラノシルマルトシドを基質とする方法では、ブランク値上昇の問題は少ないものの、糖鎖が短いためアミラーゼとの親和性が充分とはいえず、また感度も充分でないといった問題があった。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来のα−アミラーゼ活性測定基質の欠点を解消しようとするもので、その目的は、水溶性に優れ、追随酵素による影響を受けず、α−アミラーゼとの親和性に優れ、その切断点も特異的な選択性を持ち、かつ高感度である糖誘導体、またこれを基質として用い、α−アミラーゼ活性を精度よく測定する試薬およびα−アミラーゼ活性測定方法を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、水溶性に優れ、追随酵素により影響を受けず、α−アミラーゼとの親和性に優れ、その切断点も特異的な選択性を持ち、かつ高感度な新規オリゴ糖ならびにその誘導体を得ることに成功し、さらに、当該オリゴ糖および／またはその誘導体を含有するα−アミラーゼ活性測定試薬、およびその測定方法を確立し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
１）一般式（１）
【００１９】
【化７】
0004171088.tif 000004
【００２０】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ3 は還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、波線はα配位またはβ配位であることを示し、ｎは０〜７の整数を示す。）で表されるオリゴ糖誘導体。
２）一般式（２）
【００２１】
【化８】
0004171088.tif 000005
【００２２】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、波線はα配位またはβ配位であることを示し、ｎは０〜７の整数を示す。）で表されるオリゴ糖。
３）一般式（１）で表されるオリゴ糖誘導体を含有してなる、α−アミラーゼ活性測定試薬。
４）上記３）記載のα−アミラーゼ活性測定試薬を、α−アミラーゼを含有する試料と接触させることにより、一般式（１）で表される前記オリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質の量を測定することを特徴とする試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。
５）一般式（３）
【００２３】
【化９】
0004171088.tif 000006
【００２４】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ4 はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、ｐは０〜１の整数を示す。）で表されるオリゴ糖誘導体を含有し、追随酵素を含有しない、α−アミラーゼ活性測定試薬。
６）上記５）記載のα−アミラーゼ活性測定試薬を、α−アミラーゼを含有する試料と接触させ、一般式（３）で表される前記オリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質の量を測定することを特徴とする、試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。
７）一般式（４）
【００２５】
【化１０】
0004171088.tif 000007
【００２６】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ5 はα−アミラーゼもしくは追随酵素によって切断されうる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、波線はα配位またはβ配位であることを示し、ｑは１〜７の整数を示す。）で表されるオリゴ糖誘導体および追随酵素を含有する、α−アミラーゼ活性測定試薬。
８）上記７）記載のα−アミラーゼ活性測定試薬を、α−アミラーゼを含有する試料と接触させ、一般式（４）で表される前記オリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質の量を測定することを特徴とする、試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。
【００２７】
本発明のオリゴ糖誘導体である一般式（１）で表される化合物は、
ガラクトシル−マルトース、
ガラクトシル−マルトトリオース、
ガラクトシル−マルトテトラオース、
ガラクトシル−マルトペンタオース、
ガラクトシル−マルトヘキサオース、
ガラクトシル−マルトペプタオース
などのオリゴ糖の非還元末端ガラクトースの４位または６位の水酸基に修飾基であるガラクトピラノシル基がβ配位で結合し、さらに、当該オリゴ糖還元末端グルコースと結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基Ｒ3 で示されるアグリコンを有する。
【００２８】
Ｒ3 は還元末端グルコースの１位の炭素原子に結合した酸素原子と結合している。このグリコシド結合はα配位もしくはβ配位のいずれでもよい。
このグリコシド結合は、α−アミラーゼや、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼなどの追随酵素によって切断され得る結合であり、該結合が切断されることによって、Ｒ3 は測定可能な物質となり、α−アミラーゼ活性測定に用いることができる。
【００２９】
Ｒ3 で表される基としては、一般式（５）
【００３０】
【化１１】
0004171088.tif 000008
【００３１】
（式中、Ｒ6 およびＲ7 は、同一または異っていてもよく、それぞれ水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基を示す。）で表される置換または無置換のフェニル基を示し、例えば、ｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、ｍ−ニトロフェニル、２−クロロ−４−ニトロフェニル、２−フルオロ−４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、２，４−ジクロロフェニル基などを挙げることができる。また、４−メチルウンベリフェニルなどの蛍光性基なども挙げられる。
【００３２】
一般式（１）中のｎは０〜７のいずれの整数でもよい。
【００３３】
本発明の新規オリゴ糖およびその誘導体は、酵素転移反応を利用した方法より得られる。すなわちガラクトシル残基を持つ糖をドナーとし、ガラクトシル−マルトオリゴ糖およびその誘導体をアクセプターとする糖転移反応をβ−ガラクトシダーゼを用いて行い、目的とする新規オリゴ糖およびその誘導体を合成するものである。
【００３４】
以下にこの方法について説明する。
ガラクトシル残基を持つ糖とは、例えばラクトース、ラフィノース、メリビオース、スタキオース、ガラクタンなどを挙げることができる。好ましくは安価で入手の容易なラクトースが好適である。
【００３５】
アクセプターとして用いられるガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体としては、一般式（６）
【００３６】
【化１２】
0004171088.tif 000009
【００３７】
（式中、Ｒ3 は還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、波線はα配位またはβ配位であることを示し、ｎは０〜７の整数を示す。）で表される。
一般式（６）で表される化合物の好ましい例は、例えば、Ｒ3 が置換フェニル基である２−クロロ−４−ニトロフェニル基である化合物であり、その具体例としては、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトトリオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトトリオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトテトラオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトテトラオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトペンタオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトヘキサオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘプタオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトヘプタオシド
などが挙げられるがこれに限るものではない。
【００３８】
アクセプターとして用いられるガラクトシル−マルトオリゴ糖としては、一般式（７）
【００３９】
【化１３】
0004171088.tif 000010
【００４０】
（式中、波線はα配位またはβ配位であることを示し、ｎは０〜７の整数を示す。）で表される化合物が挙げられる。
一般式（７）で表される化合物の具体例としては、
ガラクトシル−マルトース、
ガラクトシル−マルトトリオース、
ガラクトシル−マルトテトラオース、
ガラクトシル−マルトペンタオース、
ガラクトシル−マルトヘキサオース、
ガラクトシル−マルトヘプタオース
などが挙げられるがこれに限るものではない。
【００４１】
本発明において、用いられるβ−ガラクトシダーゼは、いずれの起源のものでもよく、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｒａｎｓ、Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．などの由来のものが挙げられる。
【００４２】
本発明の酵素を用いた転移反応は水および親水性有機溶媒との混合溶媒中で行う。混合溶媒中での反応は、目的とする転移反応の選択性を高めたり、目的物質の収率を向上させることができるので特に好ましい。
【００４３】
親水性有機溶媒としては特に限定はなく、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどが挙げられる。これらの溶媒は、単独または２種以上を混合してもよい。
【００４４】
水との混合溶媒における親水性有機溶媒の割合は、糖及び糖誘導体の種類や使用する酵素の起源や親水性有機溶媒の種類によっても異なるが、約１〜８０％、好ましくは２０〜６０％が良い。
【００４５】
糖供与体であるガラクトシル残基を持つ糖とガラクトシル−マルトオリゴ糖及びその誘導体の混合液は、溶液または懸濁液として用いられ、溶液または懸濁液の全量に対して、ガラクトシル−マルトオリゴ糖およびその誘導体は１〜４０％、好ましくは２０〜４０％の濃度である。また、ガラクトシル残基を持つ糖の投入量は、ガラクトシル−マルトオリゴ糖およびその誘導体に対して、０．１〜１０倍、好ましくは１〜５倍が適当である。
【００４６】
反応時間は１０分〜１２０時間、好ましくは１〜４０時間程度、反応温度は２０〜６０℃、ｐＨ４〜８、好ましくは５〜７が適当である。反応終了後、反応液のｐＨ調整または加熱により反応を停止し、カラムクロマトグラフィーにより分画精製することなどにより、一般式（１）およびこれに包含される一般式（３）、（４）〔以下、特に言及しない限り、一般式（１）についての説明は一般式（３）および（４）についての説明をも包含する〕ならびに一般式（２）により表される新規オリゴ糖およびその誘導体を得ることができる。
【００４７】
アクセプターとして一般式（６）により表されるガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体を用いた場合には、上記の糖転移反応により一般式（１）の化合物が得られ、アクセプターとして一般式（７）により表されるガラクトシル−マルトオリゴ糖を用いた場合には、上記の糖転移反応により一般式（２）の化合物が得られる。この場合、一般式（２）の化合物を、公知の方法によりグルコシド化することにより、一般式（１）の化合物とすることができる。したがって、一般式（２）の化合物は、一般式（１）の化合物の原料として用いることができる。
【００４８】
本発明の一般式（１）で表される化合物の好ましい例は、例えば、Ｒ3 が置換フェニル基である２−クロロ−４−ニトロフェニル基である化合物であり、その具体例としては、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトトリオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトトリオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトテトラオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトテトラオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトペンタオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトヘキサオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘプタオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトヘプタオシド
などが挙げられるが、これに限るものではない。
【００４９】
上記には、Ｒ3 が、２−クロロ−４−ニトロフェニル基である例を挙げたが、２−クロロ−４−ニトロフェニル基の代りに、該グリコシド結合が切断された時に発色性の物質となる基であればよく、例えば、上記のｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、ｍ−ニトロフェニル、２−クロロ−４−ニトロフェニル、２−フルオロ−４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、２，４−ジクロロフェニル基などであってもよい。また、４−メチルウンベリフェニルなどの蛍光性基などであってもよい。
【００５０】
本発明の一般式（２）の化合物としては、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトシド、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトシド、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトトリオシド、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトトリオシド、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトテトラオシド、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトテトラオシド、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトペンタオシド、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトヘキサオシド、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘプタオシド、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトヘプタオシド
などが挙げられるが、これに限るものではない。
【００５１】
本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬は、上記一般式（１）記載のオリゴ糖誘導体を基質として含有するものである。また、必要に応じて追随酵素として、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、β−グルコシダーゼ等を適宜に組み合わせて用いることもでき、これら酵素の起源は特に限定されるものではない。また必要に応じてアジ化ナトリウム、チオシアン酸カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸カルシウムなどの添加剤を含有しても良い。追随酵素を含有する場合、それらの種類、含有量等は使用する基質の種類、量などに応じて異なるが、一般的にはα−グルコシダーゼであれば０．０１〜４００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌ、グルコアミラーゼであれば０．０１〜４００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌ、β−グルコシダーゼであれば０．１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは２〜２０Ｕ／ｍｌ程度であり、組み合わせて用いる場合はその組み合わせに応じて適宜増減する。
上記の基質ならびに必要に応じて用いられる追随酵素、緩衝液および添加剤等の必要量、ならびに反応に使用する容器等を一緒に梱包してキットとすることもできる。
【００５２】
α−アミラーゼ活性測定試薬の基質として本発明化合物を用いる場合、基質濃度は約０．１〜１０ｍＭの範囲とすることが好ましく、反応温度は２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃が適当である。至適ｐＨは５．５〜８であり、各種緩衝剤を用いてｐＨを維持することが好ましい。
【００５３】
追随酵素を含有しない場合には、一般式（３）で表される、ｐが０または１であり、Ｒ4 はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、具体的には上記Ｒ3 で説明した基と同様の基であるオリゴ糖誘導体を使用することができる。
本発明の一般式（３）で表される化合物の好ましい例は、例えば、Ｒ4 が置換フェニル基である２−クロロ−４−ニトロフェニル基である化合物であり、その具体例としては、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトトリオシド
などが挙げられるが、これに限るものではない。
【００５４】
また、追随酵素を含有する場合には、一般式（４）で表される、ｑが１〜７であり、Ｒ5 はα−アミラーゼもしくは追随酵素によって切断されうる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、上記Ｒ3 で説明した基と同様の基のオリゴ糖誘導体を使用することができる。
本発明の一般式（４）で表される化合物の好ましい例は、例えば、Ｒ5 が置換フェニル基である２−クロロ−４−ニトロフェニル基である化合物であり、その具体例としては、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトトリオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトトリオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトテトラオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトテトラオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトペンタオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトヘキサオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘプタオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトヘプタオシド
などが挙げられるが、これに限るものではない。
【００５５】
【実施例】
以下に、実施例を示し本発明をより詳細に説明する。本実施例においては、ガラクトシル基を Gal、グルコシル基を Glu、クロロニトロフェニル基を CNPとも略記し、各オリゴ糖およびオリゴ糖誘導体の名称の後に、それらを構成する糖残基や基、ならびにそれらの結合の様子の概略を示す。
合成例１
ラクトース７００ｍｇと、２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド（Gal-Glu-Glu-α-CNP）３００ｍｇを、５０％イソプロパノール／６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）混合液５．０ｍｌに溶解し、これにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｒａｎｓ由来のβ−ガラクトシダーゼ（大和化成株式会社製、商品名「β−１，４−ガラクトシダーゼ」）を０．４ｍｇ添加し、４０℃で３時間反応させた。
反応終了後、９０℃で１０分間加熱することで反応を停止し、有機溶媒を留去後、ＹＭＣ株式会社製ＯＤＳカラム（ＹＭＣ−ＰＡＣＫ（Ｒ−３５５−５０））を用いて精製することにより、目的物３２ｍｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図１）、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図２）およびＦＡＢ−ＭＳスペクトル（図３）による構造分析により、２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド（Gal-Gal-Glu-Glu-α-CNP）であることを確認した。
【００５６】
合成例２
ラクトース５００ｍｇと、２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド（Gal-Glu-Glu-Glu-β-CNP）３００ｍｇを、５０％イソプロパノール／６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）混合液５．０ｍｌに溶解し、これにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｒａｎｓ由来のβ−ガラクトシダーゼ（大和化成株式会社製、商品名「β−１，４−ガラクトシダーゼ」）を０．４ｍｇ添加し、４０℃で３時間反応させた。
反応終了後、９０℃で１０分間加熱することで反応を停止し、有機溶媒を留去後、ＹＭＣ株式会社製ＯＤＳカラム（ＹＭＣ−ＰＡＣＫ（Ｒ−３５５−５０））を用いて精製することにより目的物３３ｍｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図４）、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図５）およびＦＡＢ−ＭＳスペクトル（図６）よる構造分析により２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド（Gal-Gal-Glu-Glu-Glu-β-CNP）であることを確認した。
【００５７】
合成例３
ラクトース５００ｍｇと、２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシド（Gal-Glu-Glu-Glu-Glu-β-CNP）３００ｍｇを、５０％イソプロパノール／６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）混合液５．０ｍｌに溶解し、これにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｒａｎｓ由来のβ−ガラクトシダーゼ（大和化成株式会社製、商品名「β−１，４−ガラクトシダーゼ」）を０．４ｍｇ添加し、４０℃で３時間反応させた。
反応終了後、９０℃で１０分間加熱することで反応を停止し、有機溶媒を留去後、ＹＭＣ株式会社製ＯＤＳカラム（ＹＭＣ−ＰＡＣＫ（Ｒ−３５５−５０））を用いて精製することにより目的物３６ｍｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図７）、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図８）およびＦＡＢ−ＭＳスペクトル（図９）よる構造分析により２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシド（Gal-Gal-Glu-Glu-Glu-Glu-β-CNP）であることを確認した。
【００５８】
合成例４
ラクトース７００ｍｇと、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−マルトシド（Gal-Glu-Glu 〜OH）３００ｍｇを６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５．０ｍｌに懸濁し、これにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｒａｎｓ由来のβ−ガラクトシダーゼ（大和化成株式会社製、商品名「β−１，４−ガラクトシダーゼ」）を０．４ｍｇ添加し、４０℃で５時間反応させた。
反応終了後、１００℃で１０分間加熱することで反応を停止し、昭光通商株式会社製Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−９０  ２Ｆカラムを用いて精製することにより目的物２８ｍｇを得た。
13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図１０）およびＦＡＢ−ＭＳスペクトル（図１１）で以下のピークを検出することにより、構造解析することで４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−マルトシド（Gal-Gal-Glu-Glu〜OH）であることを確認した。
ＦＡＢ−ＭＳスペクトル
（Ｃ24Ｈ42Ｏ21＝６６６）
６６７［Ｍ＋Ｈ］+
６８９［Ｍ＋Ｎａ］+
【００５９】
試験例１
前記合成例１で得られたオリゴ糖誘導体を基質として用い、下記組成からなるα−アミラーゼ活性測定用試薬をそれぞれ調整した。
５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ６．０）
酢酸カルシウム                  ５ｍＭ
塩化ナトリウム                ５０ｍＭ
アジ化ナトリウム            １５０ｍＭ
基質                            ２ｍＭ
表１に記載した基質を各々用い上記条件で調整した各試薬３ｍｌに、α−アミラーゼ活性測定用管理血清（第一化学薬品株式会社製、商品名「ファデバスヒューミラーゼコントロール」）をそれぞれ０．０２０ｍｌ添加し、３７℃で１０分間経時的に４０５ｎｍの吸光度を測定した。本測定における１分間当たりの吸光度変化を算出し結果を表２に示した。なお各試薬ブランクの１分間当たりの吸光度変化も併せて表２に記載した。
【００６０】
【表１】
0004171088.tif 000011
【００６１】
【表２】
0004171088.tif 000012
【００６２】
試験例２
前記合成例２で得られたオリゴ糖誘導体を基質として用い、下記組成からなるα−アミラーゼ活性測定用試薬をそれぞれ調整した。
試薬組成Ａ
５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０）
β−グルコシダーゼ              ５Ｕ／ｍｌ
酢酸カルシウム                  １ｍＭ
塩化ナトリウム                ２０ｍＭ
基質                            ２ｍＭ
表３に記載した基質を用い上記条件で調整した各試薬３ｍｌに、α−アミラーゼ活性測定用管理血清（商品名；ファデバスヒューミラーゼコントロール，第一化学薬品株式会社製）をそれぞれ０．０２０ｍｌ添加し、３７℃で１０分間経時的に４０５ｎｍの吸光度を測定した。本測定における１分間当たりの吸光度変化を算出し結果を表４に示した。なお各試薬ブランクの１分間当たりの吸光度変化も併せて表４に記載した。
【００６３】
【表３】
0004171088.tif 000013
【００６４】
【表４】
0004171088.tif 000014
【００６５】
試験例３
前記合成例２および合成例３で得られたオリゴ糖誘導体を基質として用い、下記組成からなるα−アミラーゼ活性測定用試薬をそれぞれ調整した。
試薬組成Ａ
５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０）
α−グルコシダーゼ              １０Ｕ／ｍｌ
β−グルコシダーゼ                ５Ｕ／ｍｌ
酢酸カルシウム                    １ｍＭ
塩化ナトリウム                  ２０ｍＭ
基質                              ２ｍＭ
表５に記載した基質を用い上記条件で調整した各試薬３ｍｌに、α−アミラーゼ活性測定用管理血清（第一化学薬品株式会社製、商品名「ファデバスヒューミラーゼコントロール」）をそれぞれ０．０２０ｍｌ添加し、３７℃で１０分間経時的に４０５ｎｍの吸光度を測定した。本測定における１分間当たりの吸光度変化を算出し結果を表６に示した。なお各試薬ブランクの１分間当たりの吸光度変化も併せて表６に記載した。
【００６６】
【表５】
0004171088.tif 000015
【００６７】
【表６】
0004171088.tif 000016
【００６８】
【発明の効果】
本発明の新規オリゴ糖誘導体を用いると、ブランク値の上昇を抑え、溶解性に優れ、より高感度なα−アミラーゼ活性測定試薬を提供することができ、ヒト体液などのα−アミラーゼ活性の測定に大変有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】合成例１で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図２】合成例１で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの13Ｃ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図３】合成例１で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドのＦＡＢ−ＭＳスペクトル図を示す。
【図４】合成例２で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシドの 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図５】合成例２で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシドの13Ｃ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図６】合成例２で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシドのＦＡＢ−ＭＳスペクトル図を示す。
【図７】合成例３で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドの 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図８】合成例３で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドの13Ｃ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図９】合成例３で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル  ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドのＦＡＢ−ＭＳスペクトル図を示す。
【図１０】合成例４で得られた４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−マルトシドの13Ｃ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図１１】合成例４で得られた４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−マルトシドのＦＡＢ−ＭＳスペクトル図を示す。
【図１】
0004171088.tif 000022
【図２】
0004171088.tif 000023
【図３】
0004171088.tif 000024
【図４】
0004171088.tif 000025
【図５】
0004171088.tif 000026
【図６】
0004171088.tif 000027
【図７】
0004171088.tif 000028
【図８】
0004171088.tif 000029
【図９】
0004171088.tif 000030
【図１０】
0004171088.tif 000031
【図１１】
0004171088.tif 000032