(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）
0004128225.tif 000039
（上記式中、
Ｘ1は、水素、またはアシルであり、
Ｘ2は、Ｇ、またはサルコシン（Ｓａｒ）であり、
Ｘ3は、Ｒ、Ａ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、またはＮ−アセチルリシン（Ａｃ−Ｌｙｓ）であり、
Ｘ4は、Ｑ、またはＥであり、
Ｘ5は、Ｗ、Ｌ−１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）、またはＦであり、
Ｘ6は、Ａ、５−アミノペンタン酸（Ａｖａ）、または２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）であり、
Ｘ7は、Ａ、ジフェニルアラニン（Ｄｉｐｈｅ）であるか、またはＸ7は存在せず、
Ｘ8は、ｐ−アミノフェニルアラニン（ｐ−アミノ−Ｐｈｅ）、Ｎ−アセチルリシン（Ａｃ−Ｌｙｓ）であるか、またはＸ8は存在せず、
Ｘ9およびＸ9′は同一であるかまたは異なっており、Ａ、βＡ、ｎ−メチルアラニン（ｎ−Ｍｅ−Ａｌａ）、サルコシン（Ｓａｒ）であるか、またはＸ9およびＸ9′は存在せず、
Ｘ10およびＸ10′は同一であるかまたは異なっており、βＡであるか、または
Ｘ10およびＸ10′は存在しない）
を有する化合物、および
その薬学上許容可能な誘導体であって、
但し、化合物
0004128225.tif 000040
を除くもの。
【請求項２】
0004128225.tif 000041
0004128225.tif 000042
0004128225.tif 000043
それらの薬学上許容可能な誘導体から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
上記化合物が親水性ポリマーに共有結合している、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
上記親水性ポリマーの平均分子量が約５００〜約４０，０００ダルトンである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
上記親水性ポリマーの平均分子量が約５，０００〜約２０，０００ダルトンである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
上記親水性ポリマーがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、およびそれらのコポリマーからなる群から選択される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
上記ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
上記化合物の二量体サブユニットのそれぞれが親水性ポリマーに共有結合している、請求項３〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
0004128225.tif 000044
および
それらの薬学上許容可能な誘導体から選択される化合物。
【請求項１０】
親水性ポリマーに共有結合した化合物
0004128225.tif 000045
【請求項１１】
化合物
0004128225.tif 000046
（式中、ｎは約４５０である）。
【請求項１２】
（Ｈ）−ＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦ（Ａｖａ）ＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦ（ＮＨ2）、および
0004128225.tif 000047
および
その薬学上許容可能な誘導体
から選択される化合物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物と、薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１４】
治療に用いるための請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
トロンボポエチン作動薬が介在する症状の治療用の、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
トロンボポエチン作動薬が介在する症状の治療に用いる医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、トロンボポエチンレセプター（ｃ−ｍｐｌまたはＴＰＯ−Ｒ）に結合して活性化する、あるいはＴＰＯ作動薬として作用するペプチドおよび化合物に関する。本発明は、生化学および医化学の分野で用いられ、特にヒトの疾患の治療に用いられるＴＰＯ作動薬を提供する。
トロンボポエチンレセプターに結合して活性化するペプチドおよび化合物は、ＷＯ９６／４０７５０号明細書に記載されている。
血小板減少症に罹っている患者の血小板濃度の回復が遅いことは重要な問題であり、血小板再生を促進することができる血液成長因子を見出だすことが緊急の課題となっている。本発明は、このような作動薬を提供するものである。
発明の概要
本発明は、式（I）
0004128225.tif 000002
（上記式中、
Ｘ１は、水素、またはアシルであり、
Ｘ２は、Ｇ、またはサルコシン（Ｓａｒ）であり、
Ｘ３は、Ｒ、Ａ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、またはＮ−アセチルリシン（Ａｃ−Ｌｙｓ）であり、
Ｘ４は、Ｑ、またはＥであり、
Ｘ５は、Ｗ、Ｌ−１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）、またはＦであり、
Ｘ６は、Ａ、５−アミノペンタン酸（Ａｖａ）、または２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）であり、
Ｘ７は、Ａ、ジフェニルアラニン（Ｄｉｐｈｅ）であるか、またはＸ７は存在せず、
Ｘ８は、ｐ−アミノフェニルアラニン（ｐ−アミノ−Ｐｈｅ）、Ｎ−アセチルリシン（Ａｃ−Ｌｙｓ）であるか、またはＸ８は存在せず、
Ｘ９およびＸ9′は同一であるかまたは異なっており、Ａ、βＡ、ｎ−メチルアラニン（ｎ−Ｍｅ−Ａｌａ）、サルコシン（Ｓａｒ）であるか、またはＸ９およびＸ9′は存在せず、
Ｘ10およびＸ10′は同一であるかまたは異なっており、βＡであるか、またはＸ10およびＸ10′は存在しない）
を有する化合物、および
その薬学上許容可能な誘導体であって、
但し、化合物
0004128225.tif 000003
を除くものを提供する。
本発明は、化合物
（Ｈ）−ＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦ（Ａｖａ）ＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦ（ＮＨ２）、および
0004128225.tif 000004
および
その薬学上許容可能な誘導体も提供する。
上記の定義および以下において、記号Ａ、βＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、Ｔは、通常のアミノ酸に対する標準的な一文字コード、すなわち
Ａ    アラニン
Ｃ    システイン
Ｄ    アスパラギン酸
Ｅ    グルタミン酸
Ｆ    フェニルアラニン
Ｇ    グリシン
Ｉ    イソロイシン
Ｋ    リシン
Ｌ    ロイシン
Ｐ    プロリン
Ｑ    グルタミン
Ｒ    アルギニン
Ｓ    セリン
Ｗ    トリプトファン
Ｔ    トレオニン
である。
重複をさけるため、略号
0004128225.tif 000005
を本明細書で用いるときには、構造
0004128225.tif 000006
を示すことを意味する。
式（I）の化合物の適当な薬学上許容可能な誘導体としては、薬学上許容可能な塩および酸付加塩、薬学上許容可能なエステル、薬学上許容可能なアミド、標識化合物、および以下に定義される各種の親水性ポリマーの１種類以上に共有結合している化合物が挙げられる。
式（I）の化合物は、各種の親水性ポリマーの１種類以上、例えば１種類に共有結合しているのが好ましい。（複数の）親水性ポリマーは、例えば式（I）の化合物のペプチド鎖の一方または両方に結合することができる。親水性ポリマーが両方のペプチド鎖に結合しているときには、親水性ポリマーは同一でもまたは異なっていてもよく、好ましくはそれらは同一である。当業者であれば、式（I）の化合物がＸ１で各種の親水性ポリマーの１種類以上に共有結合するときには、Ｘ１はアシルではないことを理解されるであろう。
式（I）の化合物の好ましい群は、
0004128225.tif 000007
0004128225.tif 000008
0004128225.tif 000009
0004128225.tif 000010
それらの薬学上許容可能な誘導体であって、キラルアミノ酸が好ましくはＬ型をしているものである。
式（I）の化合物の更に好ましい群としては、
0004128225.tif 000011
特に
0004128225.tif 000012
その薬学上許容可能な誘導体であって、キラルアミノ酸が好ましくはＬ型であるものが挙げられる。
本発明による化合物という以後の表現は、式（I）の化合物およびそれらの薬学上許容可能な誘導体の両方を包含する。
式（I）の化合物は多数のキラル中心を含んでいるので、光学異性体の対（すなわち、鏡像異性体）、およびラセミ体混合物などのそれらの混合物の形態で存在することが、当業者によって理解されるであろう。式（I）の化合物の総ての異性体およびラセミ体混合物などのそれらの混合物は、本発明の範囲内に包含される。キラルアミノ酸はＬ型であるのが好ましい。
式（I）の化合物はＴＰＯ−Ｒに対する強力な結合特性を有し、ＴＰＯ−Ｒを活性化することができる。従って、このような化合物は、例えば血小板、巨核球および他の幹細胞上で、ＴＰＯレセプターの刺激によって改善することができる症状、例えば化学療法（導入補助化学療法、地固め療法、または維持化学療法など）、放射線療法、自己、同種および同系骨髄移植、末梢血前駆細胞および臍帯血前駆細胞移植、悪性および非悪性疾患に対する生物学的または他の治療（例えば、インターフェロンおよび他のサイトカイン）、転移腫瘍および白血病による骨髄浸潤、非悪性疾患（例えば、骨粗鬆症、ゴシェ病）での骨髄浸潤または浸食、再生不良性貧血、骨髄形成異常症候群、骨髄線維症および関連症候群（原発性および二次的）、自己免疫および異種免疫血小板減少症などの免疫および特発性疾患、および薬剤によって誘導される免疫血小板減少症、薬剤によって誘導される血小板減少症（例えば、ＨＩＶ陽性患者での抗レトロウイルス療法による）、慢性肝疾患（例えば、アルコール性または他の形態の肝硬変）および慢性腎不全、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群および他の細小血管障害などの過剰血小板破壊、および脾機能亢進症、欠陥または異常血小板による出血が起こる先天性症候群、例えばグランツマン血小板無力症、アブセント・レイディアス血小板減少症（ＴＡＲ）症候群（thrombocytopenia with absent radius（TAR）syndrome）、灰色血小板症候群（gray platelet syndrome）、肝移植、大動脈瘤の修復、大動脈内バルーンカウンターパルセーション、冠状動脈バイパス移植および体外循環および／または多量の輸血を必要とする他の外科的処置、またはＨＩＶ関連の血小板減少症、悪性および非悪性疾患（上記）の化学療法、放射線療法および他の療法などの結果見られることがある顆粒球減少症および貧血、悪性、前悪性および非悪性疾患（上記）における骨髄浸潤、免疫および非免疫の特発性および薬剤に関連した貧血および顆粒球減少症の治療、または血液学的悪性疾患自体の治療における治療目的に有用である。本発明による化合物は、例えば血小板、巨核球および他の幹細胞上で、ＴＰＯレセプターの刺激が、例えば自己、同種および同系移植のための末梢血前駆細胞の可動化、血小板および他の血液供与体からの収率の増加、エクス・ビボでの血小板生存および品質の向上、血小板および／またはイン・ビトロでの前駆細胞の産生または増大に望ましいものであり、造血機構の検討における診断目的、および巨核球および上記前駆細胞のイン・ビトロでの増大に望ましい治療、診断および研究目的に用いることもできる。
本発明の化合物は、低めのＩＣ50がＴＰＯ−Ｒに対するより強力な結合親和性に相関する下記の実施例３に記載の結合親和性分析によって測定したＩＣ50が約２ｍＭ以下である。好ましくは、診断目的には、本発明による化合物はＩＣ50が約２ｍＭ以下であり、医薬目的には、本発明による化合物は約１００μＭ以下である。
診断目的に用いるときには、本発明による化合物は検出可能な標識で標識されるので、このような標識のない本発明の化合物は標識化合物の調製における中間体として用いられる。
本発明による化合物を本明細書に記載の親水性ポリマーで誘導体形成するときには、このような化合物の分子量は約５００〜約１２０，０００ダルトン、更に好ましくは約８，０００〜約８０，０００ダルトンの範囲とすることができる。
上記のように、更に好ましい態様では、式（I）の化合物は、各種の親水性ポリマーの１種類以上に共有結合している。一般に、このような親水性ポリマーの平均分子量はやく５００〜約１００，０００ダルトンの範囲であり、例えば約５００〜約４０，０００ダルトンであり、好ましくは約２，０００〜約４０，０００ダルトンであり、更に好ましくは約５，０００〜約４０，０００であり、更に一層好ましくは約５，０００〜約２０，０００ダルトンであり、例えば約１８，０００〜約２２，０００ダルトンである。好ましい態様では、このような親水性ポリマーの平均分子量は約５，０００ダルトン、１０，０００ダルトンおよび２０，０００ダルトンである。親水性ポリマーは、分岐状であってもまたは分岐状でなくてもよい。
適当な親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのようなポリアルキルエーテル、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体、およびそれらのコポリマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのようなポリアルキルエーテル、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、およびそれらのコポリマーが挙げられる。意外なことには、ペプチド化合物がこのようなポリマーで誘導体形成されると、それらの溶解度および循環半減期は増加するが、その結合活性はほとんど減少せず、もしあったとしてもわずかであり、その免疫原性は遮蔽されることを見出だした。好ましい態様では、式（I）のペプチド化合物の二量体性サブユニット（ペプチド鎖）のそれぞれは、親水性ポリマーに共有結合している。更に好ましい態様では、本発明の化合物はＰＥＧ化しており、すなわちポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合している。
ＰＥＧは、２個の末端ヒドロキシル基を有するエチレンオキシド繰返し単位の線状の水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、典型的には約５００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの範囲であり、例えば５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００または４０，０００ダルトン（５Ｋ、１０Ｋ、２０Ｋ、３０Ｋ、または４０Ｋ）の分子量によって分類される。現在のところ好ましい態様では、使用されるＰＥＧの分子量は５，０００〜約２０，０００ダルトンの範囲である。本発明のペプチド化合物にカップリングしたＰＥＧは、分岐状であってもまたは分岐状でなくてもよい。（例えば、Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem., 6: 62-69（1995）を参照されたい）。このようなＰＥＧとしては、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、およびモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明による化合物はモノ−またはジーペジル化（pegylated）していてもよく、例えば高分子量のＰＥＧを用いる場合には、モノペジル化が好ましい。
式（I）の化合物に結合することができるＰＥＧ鎖の例としては、
0004128225.tif 000013
（但し、ｎは例えば約４５０である）
0004128225.tif 000014
（但し、ｎは例えば約１１２〜９００であり、例えば約１１２、２２５、４５０、（例えば、４２５〜５００）、６７５または９００である）
0004128225.tif 000015
（但し、ｎは例えば約１１２〜４５０であり、例えば約１１２、２２５または４５０である）
0004128225.tif 000016
（但し、ｎは例えば約１１２〜４５０であり、例えば約１１２、２２５または４５０である）
が挙げられる。
本発明の好ましいＰＥＧ化した化合物の例としては、下記の
0004128225.tif 000017
0004128225.tif 000018
0004128225.tif 000019
および
それらの薬学上許容可能な誘導体であって、キラルアミノ酸が好ましくはＬ型であり、「ｎ」が約５〜約１０００の範囲の値、例えば１０〜約１０００、更に好ましくは約１００〜約９００であり、更に一層好ましくは約１１０〜約９００であり、例えば約１１２、２２５、４５０（例えば、４２５〜５００）、６７５または９００であるものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アルデヒド結合（ＡＬＤＨ）ＰＥＧについては、ｎは例えば約４５０であり、例えば３４８〜４５２であり、エステル結合（ＳＰＡ）ＰＥＧについては、ｎは例えば約１１２〜９００であり、例えば約１１２、２２５、４５０（例えば、４２５〜５００）、６７５または９００であり、分岐状ＰＥＧについては、ｎは例えば約１１２〜４５０であり、例えば約１１２、２２５または４５０であり、ＳＳ  ＰＥＧについては、ｎは例えば約１１２〜４５０であり、例えば約１１２、２２５または４５０である。
本発明による特に好ましい化合物は、
0004128225.tif 000020
であって、ｎが約４５０であり、例えば約４２５〜５００であるもの、およびその薬学上許容可能な誘導体であって、キラルアミノ酸が好ましくはＬ型であるものである。
上記のように、本発明による化合物は、ＴＰＯが介在する疾患、例えば血小板減少症、顆粒球減少症、および貧血のような血液学的障害の予防および治療、および血液学的悪性疾患の治療に有用である。従って、本発明は、トロンボポエチン作動薬による治療の影響を受けやすい疾患に罹っている患者の治療法であって、患者に治療上有効投与量または量の本発明の化合物を投与することを含んでなる方法も提供する。
本発明は、治療、特にヒトの医療に用いる本発明による化合物も提供する。
本発明の別態様として、トロンボポエチン作動薬が介在する症状の治療に用いられる医薬の製造における本発明による化合物の使用も提供される。
治療という表現は、予防並びに発症した症状の緩和を包含することを意図するものであることが理解されるであろう。
本発明は、本発明に記載の１種類以上の化合物および生理学的に許容可能なキャリヤーを含んでなる医薬組成物も提供する。これらの医薬組成物は、経口投与形態、並びに吸入粉末および溶液、および注射用および輸液用溶液など様々な形態であることもできる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒト血清中でのＡＦ１３９４８およびＧＷ３５０７８１（ジ−ＰＥＧ（５Ｋ）−ＡＦ１３９４８）の安定性を示し、ＰＥＧ化化合物が非ＰＥＧ化化合物と比較して安定性が増加しており、すなわち半減期が増加していることを示している。
第２図は、ＰＥＧで様々に誘導体形成した本発明のペプチド化合物の薬物動態プロフィールを示している。この実験では、ペプチドＡＦ１５７０５を、分岐状ＰＥＧ（ＰＥＧ２）、エステル結合ＰＥＧ（ＳＰＡ）、およびアルデヒド結合ＰＥＧ（ＡＬＤＨ）で誘導体形成した。得られた結果は、ＰＥＧで様々に誘導体形成した３種類のペプチド化合物総てが良好な薬物動態プロフィールを有することを示している。
第３〜４図は、マウスでのカルボプラチン（ＣＢＰ）によって誘発される血小板減少症に対する本発明のＰＥＧ化したペプチド化合物の効果を示している。第３図は、ＧＷ３５０７８１（ジ−ＰＥＧ（５Ｋ）−ＡＦ１３９４８）がマウスモデルでの血小板減少症を緩和することができることを示している。第４図は、ＧＷ３５０８０５（ジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）−ＡＦ１３９４８）も血小板減少症を緩和することができ、これはＧＷ３５０７８１よりも強力であることを示している。
第５〜６図は、正常マウスでの血小板増加症に対するＧＷ３５０７８１およびＧＷ３５０８０５の効果を示している。得られた結果は、本発明のＰＥＧ化したペプチド化合物が血小板増加症に対して良好な効果を有し、２０Ｋ−ジＰＥＧ化したペプチドが５Ｋ−ジＰＥＧ化したペプチドより約１００倍強力であることを示している。
第７〜８図は、正常マウスでの血小板濃度に対するＧＷ３５０７８１およびＧＷ３５０８０５の様々な投与量の効果を示している。これらのデータは、本発明のＰＥＧ化したペプチド化合物が正常マウスの血小板濃度を増加することができることを示している。
第９図は、正常マウスでの血小板濃度に対するＧＷ３５０８０５の単回投与量対複数回投与量の効果を示している。
第１０図は、β−Ａｌａを有する二量体ペプチドを製造するための一般的合成工程図を示している。
第１１図は、β−Ａｌａを持たない二量体ペプチドを製造するための一般的合成工程図を示している。
具体的態様の説明
下記の定義は、本発明の説明に用いる様々な用語の意味および範囲を例示し、定義する目的で提示されている。
「作動薬」とは、相補的な生物学的に活性なレセプターに結合し、これを活性化してレセプターに生物学的応答を引起させ、またはレセプターの先在的生物学的活性を増強させる生物学的に活性なリガンドを表す。
「薬学上許容可能な塩」とは、医薬産業でよく用いられるナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムおよびプロタミン亜鉛塩などの非毒性アルカリ金属、アルカリ土類金属およびアンモニウム塩であって、当該技術分野で公知の方法によって調製されるものを表す。この用語は、非毒性酸付加塩であって、通常は本発明の化合物を適当な有機または無機酸と反応させることによって調製されるものも包含する。代表的な塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプシル酸塩などが挙げられる。
「薬学上許容可能な酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的などに望ましくないものでない、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸を用いて形成した塩を表す。プロドラッグとしての薬学上許容可能な酸付加塩の説明については、上記のBundgaard, H.を参照されたい。
「薬学上許容可能なエステル」とは、エステル結合を加水分解したときに、カルボン酸またはアルコールの生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的などに望ましくないものでないエステルを表す。プロドラッグとしての薬学上許容可能なエステルの説明については、Bundgaard, H.監修「プロドラッグのデザイン（Design of Prodrugs）」, Elsevier Science Publishers, アムステルダム（１９８５年）を参照されたい。これらのエステルは、典型的には相当するカルボン酸とアルコールから形成される。一般に、エステル形成は、通常の合成法によって行うことができる。（例えば、March, 最新有機化学（Advanced Organic Chemistry），第４版，John Wiley & Sons, ニューヨーク（１９９２年），３９３〜３９６頁およびそこに引用されている文献、およびMark et al., 化学技術の百科事典（Encyclopedia of Chemical Technology）, John Wiley & Sons, ニューヨーク（１９８０年）を参照されたい。）エステルのアルコール成分は、一般に（i）１個以上の二重結合を含むことができるまたはできない、かつ分岐状炭素を含むことができるまたはできないＣ２〜Ｃ12脂肪族アルコール、またはＣ７〜Ｃ12芳香族または複素芳香族アルコールを含んでなる。本発明は、本明細書に記載されているエステル、および同時にそれらの薬学上許容可能な酸付加塩である組成物の使用も意図しているものである。
「薬学上許容可能なアミド」とは、アミド結合を加水分解したときに、カルボン酸またはアミンの生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的などに望ましくないものでないアミドを表す。プロドラッグとしての薬学上許容可能なアミドの説明については、Bundgaard, H.監修「プロドラッグのデザイン（Design of Prodrugs）」, Elsevier Science Publishers, アムステルダム（１９８５年）を参照されたい。これらのアミドは、典型的には相当するカルボン酸およびアミンから形成される。一般に、アミド形成は、通常の合成法によって行うことができる。（例えば、March, 最新有機化学（Advanced Organic Chemistry），第４版，John Wiley & Sons, ニューヨーク（１９９２年），３９３頁、およびMark et al., 化学技術の百科事典（Encyclopedia of Chemical Technology）, John Wiley & Sons, ニューヨーク（１９８０年）を参照されたい。）本発明は、本明細書に記載されているアミド、および同時にそれらの薬学上許容可能な酸付加塩である組成物の使用も意図しているものである。
「薬学上または治療上許容可能なキャリヤー」とは、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げずかつ宿主または患者にとって毒性でないキャリヤー媒質を表す。
「立体異性体」とは、もう一方のものと分子量、化学組成および構成が同じであるが、原子を異なるグループ分けをした化合物を表す。すなわち、ある種の同一の化学残基同士は空間的に異なる配向をしており、従って、純粋なときには、偏光面を回転させる能力を有する。しかしながら、幾つかの純粋な立体異性体では、旋光が現在の装置では検出することができないほどわずかであることがある。本発明の化合物は、１個以上の不整炭素原子をし、従って様々な立体異性体を包含することがある。総ての立体異性体は、本発明の範囲内に包含される。
本発明の組成物に適用される「治療上または薬学上有効量」とは、所望な生物学的結果を誘発するのに十分な組成物の量を表す。この結果は、疾患の徴候、症状または原因の緩和、または生物学的系の任意の他の所望な変更であることができる。本発明において、本発明において、この結果は、典型的には感染症または組織損傷に対する免疫学的および／または炎症反応の減少を伴う。
下記の略号を用いる。
ＯｔＢｕおよびｔＢｕは、両方とも第三−ブチルオキシであり（ＯｔＢｕは３文字アミノ酸略号と共に慣習的に用いられ、ｔＢｕは１文字アミノ酸略号と共に慣習的に用いられる）、Ｂｚｌはベンジルであり、Ａｃはアセチルであり、Ｍｅはメチルであり、Ａｂｕは２−アミノ酪酸であり、Ｔｈｉはチエニルアラニンであり、Ａｃ−ＬｙｓはＮ−アセチルリシンであり、ｐ−アミノ−Ｐｈｅはｐ−アミノフェニルアラニンであり、Ｎ−メチル−ＡｌａはＮ−メチルアラニンであり、Ｄｉｐｈｅはジフェニルアラニンであり、Ｓａｒはサルコシンであり、Ａｖａは５−アミノペンタン酸であり、Ｎｌｅはノルロイシンであり、ｔｒｔはトリチルである。
「検出可能な標識」とは、本発明のペプチドおよびペプチド類似体に共有結合するとき、このペプチドまたはペプチド類似体を投与した患者でイン・ビボでペプチドおよびペプチド類似体を検出することができる材料を表す。適当な検出可能な標識は当該技術分野で公知であり、例えば放射性同位体、蛍光標識（例えば、フルオレセイン）などが挙げられる。用いられる特定の検出可能な標識は決定的なものではなく、用いる標識の量並びに用いた標識の量での標識の毒性に対して選択される。このような因子に対する標識の選択は、完全に当該技術分野の技術の範囲内である。
ペプチドまたはペプチド類似体への検出可能な標識の共有結合は、当該技術分野で公知の従来法によって行う。例えば、放射性同位体125Ｉを検出可能な標識として用いるときには、125Ｉのペプチドまたはペプチド類似体への共有結合は、アミノ酸チロシンをペプチドまたはペプチド類似体へ配合した後、ペプチドをヨウ素化（iodimating）することによって行うことができる（例えば、Weather et al., 同位体標識化合物の合成および応用（Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds），１３７〜１４０頁（１９９４年）を参照されたい）。チロシンがペプチドまたはペプチド類似体に含まれていないときには、公知の化学によってペプチドまたはペプチド類似体のＮまたはＣ末端にチロシンを配合することができる。同様に、32Ｐをリン酸残基としてのペプチドまたはペプチド類似体に、例えば従来の化学的方法を用いてペプチドまたはペプチド類似体のヒドロキシル基を介して配合することができる。
本発明は、ＴＰＯ−Ｒに結合して活性化する、あるいはＴＰＯ作動薬として作用する化合物を提供する。これらの化合物としては、「先導（lead）」ペプチド化合物、および先導化合物と同一または同様な分子構造または形状を有するように構築されているが、加水分解またはタンパク質分解に対する感受性に関しおよび／またはレセプターに対する親和性の増加のような他の生物学的特性に関して先導化合物と異なる「誘導体」化合物が挙げられる。本発明は、ＴＰＯ作動薬、更に具体的には血液学的疾患、特に化学療法、放射線療法、または骨髄輸液に関連した血小板減少症の治療に有用な化合物の有効量を含んでなる組成物も提供する。
様々な方法を、ＩＣ50値を評価するのに用いることができる。例えば、ＭＢＰ−ＴＰＯまたはｌａｃＩ−ペプチドトレーサーを用いる平衡結合ＥＬＩＳＡ分析法を用いて、ペプチドがＴＰＯレセプターの細胞外ドメインへのＴＰＯの結合を阻害するかどうかを決定した。ＩＣ50値は、遊離ペプチドであって、場合によってはＣ末端をアミド化することができるまたはエステルまたは他のカルボキシアミドとして調製することができるものを用いて決定することができる。
ＩＣ50およびＥＣ50値は、本発明では符号「−」、「＋」および「＋＋」によって象徴的に表す。例えば、２００μＭを上回るＩＣ50値を示すペプチドは、「−」で表される。ＩＣ50値が２００μＭ以下のペプチドには、「＋」が与えられ、ＩＣ50値が５００ｎＭ以下のものは、「＋＋」で示される。特定の符号について切断点またはその付近のＩＣ50値を与えたペプチドは、ハイブリッド表示（hybrid designator）、例えば「＋／−」で示される。ＩＣ50値が決定されなかったペプチドは、「Ｎ．Ｄ．」として示す。
本発明のペプチドおよびペプチド類似体は、下記の実施例２に更に詳細に記載されているトロンボポエチン依存細胞増殖分析法でも評価した。細胞増殖は、細胞増殖の指標としての３Ｈ−チミジン取り込みと相関しているＭＴＴ分析法のような当該技術分野で知られている手法によって測定される（Mossmann,J. mmunol. Methods, 65: 55（1983）を参照されたい）。
第３〜４図は、本発明のペプチドおよびペプチド類似体の活性を評価する他の分析法の結果を示している。この分析法では、マウスをカルボプラチンを用いて血小板減少症とする。Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、０日目にカルボプラチン（１２５ｍｇ／Ｋｇ腹腔内）を投与する。これらの結果は、本発明のペプチドがマウスモデルの血小板減少症を緩和することができることを示している。
本発明のペプチドの結合および活性の特異性も、ＷＯ９６／４０７５０号明細書に記載の方法によるエリトロポエチンレセプター（ＥＰＯ−Ｒ）に対するペプチドの交差反応を検討することによって検討した。
ペプチドおよびペプチド類似体の調製
固相合成
本発明のペプチドは、当該技術分野で知られている古典的方法、例えば標準的固相法を用いることによって調製することができる。標準的方法としては、独占的固相合成、部分的固相合成法、断片縮合、古典的溶液合成、および組換えＤＮＡ技術による方法が挙げられる。例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149（1963）を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。固相では、合成は、α−アミノ保護樹枝を用いるペプチドのＣ−末端から開始される。適当な出発材料は、例えば必要なα−アミノ酸をクロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂またはベンズヒドリルアミン樹脂に結合することによって調製することができる。このようなクロロメチル化樹脂はBIO-BE ADS SX-1（Bio Rad Laboratories，リッチモンド，カリフォルニア）という商品名で発売されており、ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Bodonszky, et al., Chem. Ind.（London）, 38: 1597（1966）に記載されている。ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂はPietta and Marshall, Chem. Commn., 650（1970）に記載されており、Beckman Instruments, Inc., パロアルト，カリフォルニアから塩酸塩の形態で市販されている。
従って、本発明の化合物は、Gisin, Helv. Chim. Acta., 56:1467（1973）に記載の方法に従って、例えば重炭酸セシウム触媒を用いてα−アミノ基を保護したアミノ酸をクロロメチル化樹脂にカップリングすることによって調製することができる。最初のカップリングの後、α−アミノ保護基を、有機溶媒中室温にてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または塩酸（ＨＣｌ）溶液などの試薬の選択によって除去する。
α−アミノ保護基は、ペプチドの段階的合成の技術において有用であることが知られているものである。アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基（例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）および置換Ｃｂｚ）、脂肪族ウレタン保護基（例えば、第三ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル）、およびアルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が挙げられる。ＢｏｃおよびＦｍｏｃは、好ましい保護基である。側鎖保護基はカップリング中は完全な儘であり、アミノ末端保護基の脱保護中またはカップリング中は開裂しない。側鎖保護基は、最終的なペプチドの合成が完了した時点および標的ペプチドを変化させない反応条件下で除去されねばならない。
Ｔｈｒ（Ｔ）およびＳｅｒの側鎖保護基としては、アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、およびＣｂｚが挙げられる。Ａｒｇ（Ｒ）の側鎖保護基としては、ニトロ、トシル（Ｔｏｓ）、Ｃｂｚ、アダマンチルオキシカルボニル  メシトイルスルホニル（Ｍｔｓ）、ＰｍｃまたはＢｏｃが挙げられる。Ｌｙｓ（Ｋ）の側鎖保護基としては、Ｃｂｚ、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｃｂｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−ＢｒＣｂｚ）、Ｔｏｓ、またはＢｏｃが挙げられる。
α−アミノ保護基を除去した後、残りの保護基を所望の順序で段階的にカップリングする。それぞれの保護されたアミノ酸の過剰量を、通常は例えば塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合物のような溶液中でジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような適当なカルボキシル基活性剤と共に用いる。
所望なアミノ酸配列を完了した後、樹脂からペプチドを開裂するだけでなく、総ての残りの側鎖保護基も開裂するトリフルオロ酢酸またはフッ化水素（ＨＦ）のような試薬で処理することによって、所望なペプチドを樹脂支持体から脱カップリングする。クロロメチル化樹脂を用いるときには、フッ化水素処理により、遊離ペプチド酸が形成される。ベンズヒドリルアミン樹脂を用いるときには、フッ化水素処理により直接遊離ペプチドアミドを生じる。あるいは、クロロメチル化樹脂を用いるときには、側鎖を保護したペプチドをアンモニアで処理して脱カップリングして所望な側鎖を保護したアミドを得、またはアルキルアミンで処理して側鎖を保護したアルキルアミンまたはジアルキルアミドを得ることができる。次いで、フッ化水素で処理することによる通常の方法で側鎖保護を外し、遊離のアミド、アルキルアミドまたはジアルキルアミドを得る。
これらの固相ペプチド合成法は当該技術分野で公知であり、John Morrow Stewart and Janis Dilaha Young, 固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Syntheses）（第２版，Pierce Chemical Company, １９８４年）に更に記載されている。
本発明の化合物は、１９９０年３月７日出願の米国特許出願連続番号第０７／４９２，４６２号明細書、１９９０年１２月６日出願の第０７／６２４，１２０号明細書、および１９９１年１２月６日出願の第０７／８０５，７２７号明細書に記載の「コードした合成ライブラリー」または「大規模固定ポリマー合成」系を用いて製造することもできる。
Ｂ．合成アミノ酸
これらの方法を用いて、２０種類の天然に存在する遺伝学的にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸が本発明の化合物のいずれかの１、２またはそれ以上の位置で置換されているペプチドを合成することもできる。例えば、ナフチルアラニンをトリプトファンの代わりに用いて、合成を促進することができる。本発明のペプチドに置換することができる他の合成アミノ酸としては、β−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、および天然には存在しない合成アミノ酸が挙げられる（例えば、Roberts, et al., Unusual Amino Acids in Peptide Synthesis, 5（6）: 341-449（1983）を参照されたい）。
Ｎ−末端修飾
ペプチドは、典型的には遊離酸として合成されるが、上記のように、アミドまたはエステルとして容易に調製することができる。また、本発明のペプチド化合物のアミノおよび／またはカルボキシ末端を修飾して、本発明の他の化合物を生成させることもできる。アミノ末端修飾としては、メチル化（すなわち、−ＮＨＣＨ３または−ＮＨ（ＣＨ３）２）、アセチル化、ベンジルオキシカルボニル基の付加、またはアミノ末端のＲＣＯＯ−（但し、Ｒはナフチル、アクリジニル、ステロイジル、および同様な基からなる群から選択される）によって定義されるカルボキシレート官能基を含む任意のブロッキング基でのアミノ末端のブロッキングが挙げられる。カルボキシ末端修飾としては、遊離酸のカルボキサミド基による置換、または構造的束縛を導入するためのカルボキシ末端における環状ラクタムの形成が挙げられる。
アミノ末端修飾は、上記に引用されている通りであり、アルキル化、アセチル化、カルボベンゾイル基の付加、スクシンイミド基の形成などが挙げられる（例えば、Murray, et al., ブルガーの医化学および薬剤発見（Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery），第５版，第１巻，Manfred E. Wolf監修，John Wiley and Sons, Inc.（１９９５年）を参照されたい）。具体的には、次にＮ−末端アミノ基を下記のようにして反応させることができる。
（a）酸ハロゲン化物［例えば、ＲＣ（Ｏ）Ｃｌ］または非対称無水物と反応させることによる式ＲＣ（Ｏ）ＮＨ−（式中、Ｒは上記で定義した通りである）のアミド基の形成。典型的には、反応は、等モルまたは過剰量（例えば、約５当量）の酸ハロゲン化物を、好ましくは、過剰（例えば、約１０当量）のジイソプロピルエチルアミンのような第三アミンを含む不活性希釈剤（例えば、ジクロロメタン）中でペプチドに接触させて、反応中に生成した酸を除くことによって行うことができる。反応条件は、ほかの点では通常のものである（例えば、室温３０分間）。低級アルキルＮ−置換を提供するための末端アミノのアルキル化の後、上記のように酸ハロゲン化物と反応させると、式ＲＣ（Ｏ）ＮＲ−のＮ−アルキルアミド基を生じる。
（b）無水コハク酸と反応させることによるスクシンイミド基の形成。上記と同様に、無水コハク酸を約等モル量または過剰量（例えば、約５当量）を用いることができ、アミノ基を適当な不活性溶媒（例えば、ジクロロメタン）中で過剰（例えば、約１０当量）のジイソプロピルエチルアミンのような第三アミンの使用などの当該技術分野で公知の方法によってスクシンイミドに転換する。例えば、Wollenberg et al.の米国特許第４，６１２，１３２号明細書を参照されたい。この特許明細書の内容は、全体がその開示の一部として本明細書に引用される。コハク酸基は、ペプチドのＮ−末端で置換スクシンイミドを提供するための通常の方法で調製されるＣ２〜Ｃ６アルキルまたは−ＳＲ置換基で置換することができることが理解される。このようなアルキル置換基は、Wollenberg et al., 上記引用に記載の方法で低級オレフィン（Ｃ２〜Ｃ６）を無水マレイン酸と反応させることによって調製され、−ＳＲ置換基はＲＳＨと無水マレイン酸との反応（但し、Ｒは上記で定義した通りである）によって調製される。
（c）好ましくは第三アミンを含む適当な不活性希釈剤（例えば、ジクロロメタン）中で約当量または過剰量のＣＢＺ−Ｃｌ（すなわち、ベンジルオキシカルボニルクロリド）または置換ＣＢＺ−Ｃｌと反応させることによるベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−または置換ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−基を形成して、反応中に生成する酸を除くこと。
（d）適当な不活性希釈剤（例えば、ジクロロメタン）中で当量または過剰量（例えば、５当量）のＲ−Ｓ（Ｏ）２Ｃｌとの反応によるスルホンアミド基を形成し末端アミンをスルホンアミド（但し、Ｒは上記で定義した通りである）に転換すること。好ましくは、不活性希釈剤は、ジイソプロピルエチルアミンのような過剰の第三アミン（例えば、１０当量）を含み、反応中に生成した酸を除去する。反応条件は、ほかの点では通常のものである（例えば、室温３０分間）。
（e）適当な不活性希釈剤（例えば、ジクロロメタン）中で当量または過剰量（例えば、５当量）のＲ−ＯＣ（Ｏ）ＣｌまたはＲ−ＯＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｈ４−ｐ−ＮＯ２との反応によりカルバメート基を形成し、末端アミンをカルバメート（但し、Ｒは上記で定義した通りである）に転換すること。好ましくは、不活性希釈剤は、過剰量（例えば、約１０当量）のジイソプロピルエチルアミンのような第三アミンを含み、反応中に生成した酸を除去する。反応条件は、ほかの点では通常のものである（例えば、室温３０分間）。
（f）適当な不活性希釈剤（例えば、ジクロロメタン）中で当量または過剰量（例えば、５当量）のＲ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏとの反応により尿素基を形成し、末端アミンを尿素（但し、Ｒは上記で定義した通りである）に転換すること。好ましくは、不活性希釈剤は、過剰量（例えば、約１０当量）のジイソプロピルエチルアミンのような第三アミンを含み、反応中に生成した酸を除去する。反応条件は、ほかの点では通常のものである（例えば、室温３０分間）。
もう一つの別態様では、Ｃ−末端カルボキシル基またはＣ−末端エステルをそれぞれカルボキシル基またはエステルの−ＯＨまたはエステル（−ＯＲ）をＮ−末端アミノ基で内部置換することにより環化を誘発して、環状ペプチドを形成することができる。例えば、合成および開裂を行い、ペプチド酸を得た後、遊離酸は、溶液中、例えば塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合物中でジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような適当なカルボキシル基活性剤によって活性化エステルに転換される。次いで、環状ペプチドを、活性化エステルをＮ−末端アミンで内部置換することによって形成する。重合とは異なり内部環化は、極めて稀薄な溶液を用いることによって増進することができる。このような方法は、当該技術分野で公知である。
本発明のペプチドを環化し、またはペプチドの末端にデスアミノまたはデスカルボキシ残基を組み込み、プロテアーゼに対する感受性を減少させまたはペプチドの配置を制限するための末端アミノまたはカルボキシル基がないようにすることもできる。本発明の化合物のＣ−末端官能基としては、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、およびカルボキシ、およびそれらの低級エステル誘導体、およびそれらの薬学上許容可能な塩が挙げられる。
上記のＮ−末端およびＣ−末端修飾に加えて、本発明の化合物は、上記定義の様々な親水性ポリマーの１種類以上により有利に修飾し、または共有結合することができる。
本発明のペプチド化合物は、Zallipsky, S., Bioconjugate Chem., 6: 150-165（1995）、Monfardini, C. et al., Bioconjugate Chem., 6: 62-69（1995）、米国特許第４，６４０，８３５号明細書、米国特許第４，４９６，６８９号明細書、米国特許第４，３０１，１４４号明細書、米国特許第４，６７０，４１７号明細書、米国特許第４，７９１，１９２号明細書、米国特許第４，１７９，３３７号明細書、またはＷＯ９５／３４３２６号明細書に記載の方法のいずれかを用いて上記ポリマーと誘導体形成しまたはこれにカップリングすることができ、上記文献の内容は、全体がその開示の一部として本明細書に引用される。ＰＥＧは、Shearwater Polymers, Inc.（ハンツビル、アラバマ）、Sigma Chemical Co.、および他の会社から市販されている。
現在のところ好ましい態様では、本発明のペプチド化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体形成される。
簡単には、一つの代表的な態様では、用いられる親水性ポリマー、例えばＰＥＧは、メトキシまたはエトキシ基のような未反応基によって一端をキャッピングするのが好ましい。次いで、ポリマーを他端でハロゲン化シアヌル酸（例えば、塩化、臭化またはフッ化シアヌル酸）、ジイミダゾール、無水試薬（例えば、無水ジブロモコハク酸のような無水ジハロコハク酸）、アシルアジド、ｐ−ジアゾニウムベンジルエーテル、３−（ｐ−ジアゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルエーテル）などの適当な活性剤と反応させることによって活性化する。次に、活性化ポリマーを本発明のペプチド化合物と反応させて、ポリマーで誘導体形成したペプチド化合物を生成する。本発明の化合物のペプチドアームの一つが例えばアシル基によって保護されていると、モノペジル化化合物が形成される。あるいは、本発明のペプチド化合物の官能基をポリマーで活性化して反応させ、または２個の基を既知のカップリング法を用いて協奏カップリング反応で結合することができる。反応工程図１〜４は、本発明のペプチド化合物を例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて誘導体形成するための代表的な反応工程図を示している。本発明のペプチド化合物を、当業者に知られておりかつ用いられている幾多の他の反応工程図を用いてＰＥＧと誘導体形成することができることが容易に理解されるであろう。
本発明のペプチド化合物の親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）による誘導体形成に加えて、他の小さなペプチド、例えばレセプターに結合する他のペプチドまたはリガンドも、このような親水性ポリマーと誘導体形成して、生物学的活性（例えば、結合活性、作動薬活性、拮抗薬活性など）の損失があったとしても僅かにすることができることを見出だした。これらの小さなペプチドを親水性ポリマーで誘導体形成するときには、その溶解度および循環半減期が増加し、その免疫原性が減少することを見出だした。また、極めて意外なことには、上記のことは、生物学的活性をほとんど損失することなく、あったとしてもごく僅かの損失で行うことができる。好ましい態様での脂肪では、誘導体形成したペプチドの活性は、未修飾ペプチドの０．１〜０．０１倍である。更に好ましい態様では、誘導体形成したペプチドの活性は、未修飾ペプチドの０．１〜１倍である。更に一層好ましい態様では、誘導体形成したペプチドは、未修飾ペプチドより大きな活性を有する。
この態様で使用するのに適したペプチドとしては、一般に、例えばＴＰＯ、ＥＰＯ、ＩＬ−１、Ｇ−ＣＳＦ、およびＩＬ−５レセプター、造血成長因子レセプター、サイトカインレセプター、Ｇ−タンパク質結合レセプター、細胞表面レセプターなどのレセプターに結合するペプチド、すなわちリガンドが挙げられる。このようなペプチドは、典型的には約１５０個以下のアミノ酸残基、更に好ましくは約１００個以下のアミノ酸残基（例えば、約１０〜１２ｋＤａ）を含んでなる。本発明で用いるのに適当な親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールによって代表されるようなポリアルキルエーテル、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体などが挙げられるが、それらに限定されない。一般に、このような親水性ポリマーの平均分子量は約５００〜約１００，０００ダルトンの範囲であり、更に好ましくは約２，０００〜約４０，０００ダルトンであり、更に一層好ましくは約５，０００〜約２０，０００ダルトンである。好ましい態様では、このような親水性ポリマーの平均分子量は、約５，０００ダルトン、１０，０００ダルトン、および２０，０００ダルトンである。この態様によるペプチド化合物は、上記および引用文献の方法を用いて誘導体形成することができる。
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ジスルフィド結合の形成
本発明の化合物
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は、システインのチオール基の間に分子内ジスルフィド結合を有する。この化合物は、当該技術分野で知られている方法を用いて分子内置換によって作成することができる（例えば、Frank A. Robey, Meth. in Mol. Bio., 35（6）: 73-90（1990）を参照されたい）。
もう一つの態様によれば、本発明は、元から生理学的活性を有するポリペプチドから生理学的に活性であり、実質的に非免疫原性の水溶性ポリペプチドの製造法であって、
（a）分子量が約５００〜約２０，０００ダルトンのポリマーのヒドロキシ基を有する少なくとも１個の末端炭素原子を活性化し、上記ポリマーが未置換であるか、またはアルコキシまたはアルキル基によって置換されており、上記アルコキシまたはアルキル基が５個未満の炭素原子を有し、
（b）式（I）の生理活性ポリペプチドを上記ポリマーの反応性末端基にカップリングすることによって、上記ポリペプチドを、ポリペプチド１モル当たり上記活性化ポリマー１０〜１００モルと反応させて、上記の生理学的に活性であり、実質的に非免疫原性の水溶性ポリペプチド組成物を提供する
段階を含んでなる方法を提供する。好ましくは、ポリマーは、ポリエチレングリコールである。好ましくは、カップリング剤は塩化シアヌル酸である。
有用性
本発明の化合物は、ＴＰＯの産生およびレセプター結合工程に影響しかつこれによって影響されると考えられる多くの因子の評価など、ＴＰＯの生物学的役割を理解するための独特な手段としてイン・ビトロで有用である。
これらの化合物は、新規なＴＰＯレセプター作動薬をスクリーニングするための分析法における競合的結合剤としても有用である。このような分析法の態様では、本発明の化合物は修飾なしに用いることができ、または様々な方法で、例えば検出可能な信号を直接または間接的に提供する残基を共有的にまたは非共有的に結合することのような標識によって修飾することができる。これらの分析法のいずれかでは、そのための材料を直接または間接的に標識することができる。直接標識の可能性としては、125Ｉのような放射能標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼのような酵素（米国特許第３，６４５，０９０号明細書）、および蛍光強度、波長シフトまたは蛍光分極の変化を監視することができる蛍光標識（米国特許第３，９４０，４７５号明細書）のような標識基が挙げられる。間接標識の可能性としては、１成分のビオチン化の後、上記標識基の一つにカップリングしたアビジンへの結合が挙げられる。これらの化合物としては、化合物が固形支持体へ結合させる場合には、スペーサーまたはリンカーを挙げることもできる。
更に、ＴＰＯレセプターへ結合する能力に基づいて、本発明のペプチドを、生物学的流体中、組織ホモジネート中、精製した天然の生物学的材料などでの生活細胞、固定細胞上でＴＰＯレセプターを検出するための試薬として用いることができる。例えば、これらのペプチドを標識することによって、表面にＴＰＯ−Ｒを有する細胞を同定することができる。更に、ＴＰＯレセプターを結合する能力に基づいて、本発明のペプチドをイン・シトゥ染色、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分類）、ウェスタン・ブロット法、ＥＬＩＳＡなどに用いることができる。また、ＴＰＯレセプターに結合する能力に基づいて、本発明のペプチドをレセプター精製、または細胞表面上（または透過性にした細胞内部）でＴＰＯレセプターを発現する細胞の精製に用いることができる。
本発明の化合物を、様々な医学研究および診断目的の商業的試薬として用いることもできる。このような用途としては、（1）様々な機能分析における候補のＴＰＯ作動薬の活性を定量するための較正標準としての使用、（2）ＴＰＯ依存性細胞系の増殖および成長を保持するための使用、（3）同時結晶化によるＴＰＯ−レセプターの構造分析における使用、（4）ＴＰＯ信号の形質導入／レセプター活性化の機構を検討するための使用、および（5）ＴＰＯ−レセプターを好ましくは活性化し、またはこのような活性化が、既知量のＴＰＯ作動薬に対して好都合に較正する、他の研究および診断用途が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の化合物を用いて、いずれも付加サイトカインと結合したまたはそれら自身の巨核球および上記前駆細胞をイン・ビトロで増大させることができる。DiGiusto et al., ＰＣＴ公表第９５／０５８４３号明細書を参照されたい。上記の特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。化学療法および放射線療法は、巨核球の速やかに分割し、一層成熟した個体を殺すことによって血小板減少症を引起す。しかしながら、これらの治療法により、未成熟で有糸分裂活性が大きくない巨核球前駆体細胞の数および成育可能性を減少させることもできる。従って、ＴＰＯまたは本発明の化合物による血小板減少症の緩和は、イン・ビトロ培養によって巨核球および未成熟前駆体数が増加した化学療法または放射線療法の後の患者自身の細胞をこの患者に輸液することによって速めることができる。
本発明の化合物を、ヒトなどの温血動物に投与して、ＴＰＯ−Ｒをイン・ビボで活性化することもできる。従って、本発明は、ＴＰＯ関連疾患の治療法であって、本発明の化合物をイン・ビボでのＴＰＯ−Ｒに対するＴＰＯの効果を模倣するのに十分な量で投与することを含んでなる方法を包含する。例えば、本発明のペプチドおよび化合物は、上記に定義したように、様々な血液学的疾患を治療する目的で投与することができる。
本発明の幾つかの態様では、ＴＰＯ拮抗薬を、化学療法または放射線療法を行う患者に最初に投与した後、本発明のｔｐｏ作動薬を投与するのが好ましい。
本発明の化合物の活性は、McDonald, Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14: 8-21（1992）に記載の多数のモデルの一つでイン・ビトロまたはイン・ビボで評価することができ、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
一態様によれば、本発明の組成物は、骨髄輸液、放射線療法、または化学療法と組合わせた血小板減少症の治療に有用である。化合物は、典型的には化学療法、放射線療法、または骨髄移植の前に、またはそのような暴露の後に予防的に投与される。
従って、本発明は、活性成分として、本発明のペプチドまたはペプチド類似体の少なくとも１種類を、医薬キャリヤーまたは希釈剤と組合わせて含んでなる医薬組成物も提供する。本発明の組成物は、経口、肺、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、吸入（微粉末処方物による）、経皮、鼻内、腔内、直腸、または舌下投与経路によって投与することができ、またそれぞれの投与経路に適当な投与形態に処方することができる。例えば、Bernstein et al., ＰＣＴ特許公表第ＷＯ９３／２５２２１号明細書、Pitt et al., 特許公表第ＷＯ９４／１７７８４号明細書、およびPitt et al., 欧州特許出願第６１３，６８３号明細書を参照されたい。上記の特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
経口投与のための固形投与形態としては、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、および顆粒が挙げられる。このような固形投与形態では、活性化合物を、スクロース、ラクトース、または澱粉のような少なくとも１種類の不活性な薬学上許容可能なキャリヤーと混合する。このような投与形態は、通常の実施がそうであるように、不活性希釈剤以外の添加物質、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤を含んでなることもできる。カプセル、錠剤および丸薬の場合には、投与形態は緩衝剤を含んでなることもできる。錠剤および丸薬は、更に腸溶性コーティングを施して調製することもできる。
経口投与用の液体投与形態としては、薬学上許容可能なエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および水のような当該技術分野で一般的に用いられる不活性希釈剤を含むエリキシルが挙げられる。このような不活性希釈剤の他に、組成物は、湿潤剤、乳化および懸濁剤、および甘味料、香味料および香料のようなアジュバントを挙げることもできる。
非経口投与用の本発明による製剤としては、滅菌した水性または非水性溶液、懸濁液またはエマルションが挙げることができる。非水性溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロコシ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。このような投与形態は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、静菌剤および分散剤、酸化防止剤、緩衝剤、懸濁剤、増量剤、凍結防止剤のようなアジュバントを含むこともできる。それらは、例えば細菌保持フィルターを介する濾過、組成物への滅菌剤の配合、または組成物の加熱によって滅菌することができる。それらは、使用直前に、滅菌水やある種の他の滅菌注射用媒質を用いて製造することもできる。
あるいは、化合物を、（注射用）水、食塩またはデキストロース溶液で再構成するための凍結乾燥固形物として提供することもできる。このような処方物は、通常はバイアル、アンプル、または使い捨て注射装置のような単位投与形態で提供される。それらは、適当な投与量を取り出すことができるボトルのような複数投与形態で提供することもできる。
直腸または腔内投与用の組成物は、好ましくは活性成分の他に、カカオ脂または座薬ワックスのような賦形剤を含むことができる座薬である。鼻内または皮下投与用の組成物は、当該技術分野で公知の標準的な賦形剤を用いて調製される。
化合物を含む組成物は、予防治療および治療の目的で投与することができる。治療目的では、組成物は、上記のような疾患に既に罹っている患者に、その疾患およびその合併症の症状を治癒しまたは少なくとも部分的に抑制するのに十分な量で投与される。これを行うのに適する量は、「治療上有効量」として定義される。この使用に有効な量は、疾患の重篤さおよび患者の体重および一般的状態によって変化する。
本発明の組成物は、例えばTiceとBibiの方法（制御薬剤送達に関する論文（Treatise on Controlled Drug Delivery）, A. Kydonieus監修，Marcel Dekker, ニューヨーク（１９９２年），３１５〜３３９頁）によってマイクロカプセル化することもできる。
予防目的では、本発明の化合物を含む組成物を特定の疾患に対して感受性を有するあるいはその危険性のある患者に投与する。このような量は、「予防上有効量」と定義される。この使用では、正確な量は患者の健康状態および体重によって変化する。
効果的な治療に要するＴＰＯ作動薬の量は、投与の手段、標的部位、患者の生理状態、および投与される他の医薬などの多くの様々な要因によって変化する。従って、治療投与量は、安全性および有効性を最適にするように決定すべきである。典型的には、イン・ビトロで用いられる投与量は、これらの試薬のイン・シトゥ投与で有用な量の有用な指標を提供することができる。特定の疾患の治療のための有効投与量の動物試験により、更にヒトでの投与量が予想される。様々な考察が、例えばGilman et al.監修，Goodman and Gilmanの治療薬の薬理学的基礎（Goodman and Gilman′s: The Phamacological Basis of Therapeutics），第８版，Pergamon Press（１９９０年）、およびRemingtonの薬科学（Remington′s Pharmaceutical Science），第７版，Mack Publishing Co., イーストン，ペンシルバニア（１９８５年）に記載されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
本発明のペプチドおよびペプチド類似体は、１日当たり約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与範囲で投与するとき、ＴＰＯが介在する症状の治療に有効である。用いられる具体的投与量は、治療を行う特定の症状、投与経路、並びに症状の重篤度、患者の年齢および一般症状などの要因により担当医師の判断によって調整される。
ヒトに投与するのに適当な非経口医薬製剤は、好ましくは溶液または複数投与量バイアル用の複数の溶液中に式（I）の化合物またはその薬学上許容可能な誘導体を１〜５０ｍｇ／ｍｌ含む。
好ましい処方物は、式（I）の化合物を水、塩水またはデキストロース溶液に溶解したものである。特に好ましい溶液は、ｐＨが約４．０〜５．０である。
別態様によれば、本発明は、生理学的に活性であり、実質的に非免疫原性の水溶性ポリペプチド組成物であって、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールからなる群から選択される分子量が約５００〜約２０，０００ダルトンであるポリマーにカップリング剤を用いてカップリングした式（I）の化合物を含んでなり、上記ポリマーが未置換であるか、またはアルコキシまたはアルキル基によって置換されており、上記アルコキシまたはアルキル基が５個未満の炭素原子を有する組成物を提供する。好ましくは、上記ポリマーの分子量は約７５０〜約１５，０００ダルトンであり、更に好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンである。好ましくは、上記ポリマーはポリエチレングリコールである。
本発明の好ましい態様のみを上記に具体的に記載したが、本発明の修飾および変更は、本発明の精神および意図する範囲から離反することなく可能であることが理解されるであろう。
実施例１
固相ペプチド合成
本発明の様々なペプチドを、手動操作により、またはApplied Biosystems Inc. Model 431Aまたは433Aペプチド合成装置を用いて、Merrifield固相合成法（Steward and Young, 固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis），第２版，Pierce Chemical, ロックフォード，イリノイ（１９８４年）、およびMerrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149（1963）を参照されたい）を用いて合成した。ペプチドを、
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の標準的プロトコールを用いて集めた。実施例に特に記載しない限り、それぞれのカップリングは、ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンザトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロ−ホスフェート）およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いて２×３０分間行った。
使用した樹脂は、ＨＭＰ樹脂（ｐ−ヒドロキシメチルフェノキシメチル）ポリスチレン樹脂、または架橋剤としての５−（４′−Ｆｍｏｃ−アミノメチル−３，５′−ジメチルオキシフェノキシ）吉草酸で架橋したポリスチレン樹脂であるＰＡＬ（Milligen/Biosearch）であった。ＰＡＬ樹脂を使用すると、樹脂からペプチドを開裂させるとカルボキシル末端アミド官能基が生じる。開裂を行うと、ＨＭＰ樹脂は最終生成物のＣ−末端にカルボン酸残基を生成する。ほとんどの試薬、樹脂および保護されたアミノ酸（遊離または樹脂上）は、MilliporeまたはApplied Biosystems Inc.から購入した。
Ｆｍｏｃ基は、カップリング処理の際にアミノ保護に用いた。アミノ酸の第一アミンの保護はＦｍｏｃで行い、側鎖保護基は、セリン、グルタミン酸およびトレオニンについては第三ブチルであり、グルタミンについてはトリチルであり、アルギニンについてはＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）であり、トリプトファンについてはＮ−第三−ブチルオキシカルボニルであり、システインについてはＳ−トリチルであった。
樹脂からのペプチドの除去および側鎖官能基の同時脱保護は、試薬Ｋまたはそれを若干修飾したもので処理することによって行った。あるいは、アミド化したカルボキシル末端を有するペプチドの合成において、完全に集めたペプチドを９０％トリフルオロ酢酸、５％エタンジチオールおよび５％水で、最初は４℃で、徐々に室温まで増加させて開裂した。総ての場合に、精製は、Ｃ18結合シリカゲルカラム上で、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／水のグラディエントを用いて調製用の逆相高性能液体クロマトグラフィーによって行った。均質なペプチドは、迅速原子衝撃マススペクトル分析法または電子スプレーマススペクトル分析法、および適用可能な場合にはアミノ酸分析によって特性決定した。
好ましい態様では、本発明のペプチドは、当業者に知られておりかつ用いられている標準的合成法を用いて二量体化される。本発明の二量体ペプチド化合物を製造するための代表的な合成工程図を、第１０および１１図に示す。これらの合成工程図に従って、当業者は、本発明による二量体ペプチド化合物を容易に調整することができる。また、二量体サブユニットは、第１０および１１図に記載されている方法および架橋剤を用いて容易に結合することができることは、当業者には容易に明らかになるであろう。
Ａ．  ＡＦ１５７０５の合成
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Ｆｍｏｃ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）Ｌ−ＯＨの合成
１リットルのペプチドチャンバーに、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＨＭＰＢ−ＢＨＡ［４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）−酪酸ベンズヒドリルアミン］樹脂（３５ｇ，１８．９ミリモル）と、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）を充填した。樹脂を溶媒中で窒素攪拌を行いながら約３０分間コンディショニングし、ビーズを膨潤させた。末端アミンからのＦｍｏｃ（９−フルオロメチルオキシカルボニル）の除去は、ＮＭＰ中ピペリジンの３０％溶液２×２５０ｍｌを用いてそれぞれ１０分間行った。次に、陰性クロラニル試験によって決定されるように、樹脂を６×３００ｍｌのＮＭＰで洗浄して、Ｆｍｏｃ副生成物（ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物）を除去した。Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（１５．０ｇ，２当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（５．８ｇ，２当量）を、室温でＮＭＰ２５０ｍｌに溶解した。溶液を氷浴で０〜５℃まで冷却した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（８．２ｍｌ，２．５当量）を加え、３〜５分間攪拌した。Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１４．３ｇ，２当量）およびジクロロメタン（ＤＣＭ）７５ｍｌを加え、約５分間攪拌溶解した。活性化酸の溶液を、排液した樹脂上に加えて、Ｎ２を通じながら１時間攪拌した。カップリングの完了を、ニンヒドリン試験によって監視した。樹脂から排液し、３×３００ｍｌのＮＭＰで洗浄した。
次いで、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（１２．８ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１１．２ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１６．８ｇ）、およびＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（１３．４ｇ）を用いてサイクルを反復し、ペプチド断片の次のマーを得た。最終的なカップリング反応の後、樹脂をＮＭＰ４×３００ｍｌで、次にＤＣＭ４×３００ｍｌで洗浄した。
ペプチドを、１％トリフルオロ酢酸／ＤＣＭを用いて樹脂から開裂した。画分を集めて、生成物含量についてＨＰＬＣによって分析した。４個の３００ｍｌ画分、４個の５００ｍｌ画分、次いで６個の２５０ｍｌ画分を集めて、分析した。画分３〜９をピリジンでｐＨ約３〜４に調整した後、合わせて、ロータリーエバポレーター上で濃縮し、ほぼ乾固した。エタノール約２００ｍｌをフラスコに加え、濃縮を継続して、残留ＤＣＭを除去した。生成する部分溶液を蒸気浴上で加熱して、完全な溶液を得た。溶液を氷浴で０〜５℃まで冷却し、水４００ｍｌを激しく攪拌しながら加えた。粘稠なスラリー状生成物を氷浴で約１時間攪拌し、濾過して、水１００ｍｌで洗浄した。生成物を、漏斗を介して気流を一晩引くことによって漏斗上で風乾し、定量的収率およびＨＰＬＣによる９８．３面積％の純度でＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−ＯＨを１８．８ｇ（１９．５ミリモル）得た。
ＦｍｏｃＲ（Ｐｂｔ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡ−ＯＨの合成
１リットルのペプチドチャンバーに、ＨＭＰＢ−ＢＨＡ（３５ｇ，３０．８ミリモル）と、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）を充填した。樹脂を溶媒中で窒素攪拌を行いながら約３０分間コンディショニングし、ビーズを膨潤させた。一方、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（２８．８ｇ，３当量）をＮＭＰ２００ｍｌに室温で溶解した。溶液をメタノール／水／氷浴で−５℃〜０℃まで冷却した後、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（７５０ｍｇ，０．２当量）を加えて溶解させた。ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１４．３ｍｌ，３当量）およびジクロロメタン（ＤＣＭ）１００ｍｌを加え、溶液を約０℃で２０〜３０分間攪拌した。明黄色溶液を得た。樹脂を排液し、活性化したアミノ酸の溶液をチャンバーに充填した。混合物をＮ２を通じて５時間攪拌した。樹脂を排液し、ＮＭＰ３×３００ｍｌで洗浄した。試料を取り出し、ＮＭＰおよびＤＣＭで十分に洗浄し、一晩乾燥した。樹脂を、無水安息香酸（２０．９ｇ，３当量）とピリジン７．５ｍｌ（３当量）をＮＭＰ２５０ｍｌに溶解したもので末端キャッピングした。スラリーを室温で１．５時間攪拌した。樹脂を排液し、ＮＭＰ３×３００ｍｌで洗浄した。末端アミンからのＦｍｏｃ（９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル）の除去は、ピペリジンをＮＭＰに溶解した３０％溶液２×２５０ｍｌを用いてそれぞれ１０分間行った。次いで、陰性クロラニル試験によって決定されるように、樹脂を６×３００ｍｌのＮＭＰで洗浄して、Ｆｍｏｃ副生成物（ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物）を除去した。
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（２１．８ｇ，２当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（９．４ｇ，２当量）を、室温でＮＭＰ２２５ｍｌに溶解した。溶液を氷浴で０〜５℃まで冷却した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１３．４ｍｌ，２．５当量）を加え、３〜５分間攪拌した。Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（２３．４ｇ，２当量）およびＤＣＭ７５ｍｌを加え、約５分間攪拌溶解した。活性化酸の溶液を、排液した樹脂上に加えて、Ｎ２を通じながら１時間攪拌した。カップリングの完了を、ニンヒドリン試験によって監視した。樹脂から排液し、３×３００ｍｌのＮＭＰで洗浄した。
次いで、Ｆｍｏｃ−（１−Ｎａｌ）−ＯＨ（２７．０ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−ＯＨ（３７．６ｇ）、およびＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（４０．０ｇ）を用いてサイクルを反復し、ペプチド断片の次のマーを得た。最終的なカップリング反応の後、樹脂をＮＭＰ４×３００ｍｌで、次にＤＣＭ４×３００ｍｌで洗浄した。
ペプチドを、１％トリフルオロ酢酸／ＤＣＭを用いて樹脂から開裂した。画分を集めて、生成物含量についてＨＰＬＣによって分析した。４個の２００ｍｌ画分、３個の５００ｍｌ画分、次いで５個の２５０ｍｌ画分を集めて、分析した。画分５〜１１をピリジンでｐＨ約３〜４に調整した後、合わせて、ロータリーエバポレーター上で濃縮し、ほぼ乾固した。エタノール約２００ｍｌをフラスコに加え、濃縮を継続して、残留ＤＣＭを除去した。生成する部分溶液を蒸気浴上で加熱して、完全な溶液を得た。溶液を氷浴で０〜５℃まで冷却し、０．１Ｎ  ＨＣｌ  ２００ｍｌを加えた後、水２００ｍｌを加えた。粘稠なスラリー状生成物を氷浴で約１時間攪拌し、濾過して、水１００ｍｌで洗浄した。生成物を、漏斗を介して気流を一晩引くことによって漏斗上で風乾し、樹脂からの収率７４％（分析した樹脂からの収率＞９５％）およびＨＰＬＣによる９４．８面積％の純度でＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−（１−Ｎａｌ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ（３１．９ｇ，２２．８ミリモル）を得た。
Ｈ−ＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＢｚＩの合成
ＦｍｏｃＡｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（３当量）、ジメチルアミノピリジン（０．３当量）およびジイソプロピルカルボジイミド（３当量）を攪拌して、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ，１０容）中で室温にて溶解した。溶液を、ペプチドチャンバー中の［４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）−酪酸］（ＨＭＰＢ）樹脂に加え、Ｎ２を通じながら３〜６時間攪拌した。添加効率を、開裂試料の定量的ＨＰＬＣ分析によって測定した。樹脂に結合したＦｍｏｃＡｒｇ（Ｐｂｆ）を３０％ピペリジン／ＮＭＰ（２×１０容）に１０〜１５分間暴露し、末端アミンを脱保護した。樹脂をＮＭＰ（６０〜８０容）で洗浄し、ピペリジンの陰性クロラニル試験を行った。ＦｍｏｃＡｌａ−ＯＨ（２当量）を、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ，２当量）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ，２当量）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ，２．１当量）を用いてＮＭＰ（５〜１０容）中で０〜５℃で予備活性化した後、樹脂混合物に移し、窒素置換を行いながら３０〜９０分間攪拌した。カップリング効率をニンヒドリン試験により監視した。樹脂をＮＭＰ（２５〜３０容）で洗浄し、カップリングサイクルを繰返し、側鎖が完全に保護された樹脂結合ペプチドを得た。樹脂を塩化メチレン（ＤＣＭ，４０〜６０容）で洗浄してＮＭＰを除去した後、ペプチドを開裂した。側鎖が保護された断片を、樹脂から１％トリフルオロ酢酸／ＤＣＭ（２０容）で数回洗浄することによって除いた。ペプチドを放出すると、樹脂は暗紫色に変化した。開裂断片をＨＰＬＣによって監視した後、ピリジンで中和し、濃縮して固形残渣とし、これを更に精製した。固形生成物に、水３０ｍｌを加えた。溶液のｐＨを０．１Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍｌ）で２に調整した。懸濁液を酢酸エチル（２×３００ｍｌ）で洗浄した。合わせた酢酸エチル抽出物を飽和塩化ナトリウム水溶液（１５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮してフォーム状生成物とした。フォーム状生成物を粉砕し、メチル第三−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ，１００ｍｌ）で粉砕した。生成する固形生成物を集めて、乾燥し、ＦｍｏｃＡＲ（Ｐｂｆ）−ＯＨを樹脂から約１００％の収率で得た。
ＦｍｏｃＡＲ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（１当量）、ＳａｒＯＢｚＩ、トシレート塩（１当量）、ＨＯＡＴ（１．２当量）、およびＤＩＰＥＡ（２．５当量）をＤＭＦ（１３容）に溶解したものを０℃に冷却し、ＨＢＴＵ（１．２当量）を加えた。溶液を０℃で１０分間攪拌した後、周囲温度まで加熱し、４０分間攪拌した。ペプチドを沈澱させるため、塩水／水の１：１溶液（４０容）を加えた。固形生成物を集めて、メタノール（８容）に溶解し、水（１０容）で沈澱した。溶媒を粘稠な半固形生成物から傾瀉によって除去し、半固形生成物を真空乾燥してフォーム状生成物とした。フォーム状生成物を粉砕し、ＭＴＢＥ（８容）で粉砕した。溶媒を傾瀉によって除去し、固形生成物を乾燥した。収率１５．２ｇ、樹脂から９２％、ＨＰＬＣにより９９面積％。生成物を９：１ＴＨＦ／ピペリジン（１０容）に溶解し、周囲温度で５０分間攪拌した。ペプチドを沈澱させるため、ＭＴＢＥ（２６容）とヘキサン（３３容）を加えた。溶媒を半固形生成物から傾瀉によって除去し、半固形生成物（空気に暴露するとゴム状になる）を真空乾燥して、フォーム状生成物とした。フォーム状生成物を粉砕し、ＭＴＢＥ（１０容）で粉砕し、溶媒を傾瀉により除去した。粉砕を２回繰返し、生成物を乾燥した。収率９３％、ＨＰＬＣ純度，９５面積％。
第三−Ｂｏｃ保護を用いるＨ−ＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＢｚＩの交互溶液合成
Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ・ＤＣＨＡ（４．９６ｇ）を、酢酸エチル５０ｍｌと０．２５Ｍクエン酸の２回の４０ｍｌ分量との間で分配した。有機相を水３０ｍｌの容積で２回、塩水３０ｍｌで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥して、蒸発させ、フォーム状生成物とした。このフォーム状生成物、Ｓａｒ−ＯＢｚＩトシレート塩（２．７１ｇ）およびＨＯＡｔ（０．９８ｇ）を、塩化メチレン５０ｍｌに溶解した。溶液を氷浴で冷却し、ＣＤＤ（１．５０ｇ）およびＤＩＰＥＡ（１．８ｍｌ）を加えた。反応混合物を低温で１／２時間攪拌した後、室温で１８時間攪拌した。混合物を濾過して、沈澱したＤＣＵを除去し、塩化メチレンを真空留去した。残渣の油状生成物を酢酸エチルに溶解し、０．１Ｍクエン酸、水、重炭酸ナトリウム溶液、水および塩水で繰返し洗浄した。洗浄溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥して、濾過し、蒸発させて、ガラス状のフォーム状生成物（４．１５ｇ）とした。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓａｒ−ＯＢｚＩ（３．８０ｇ）を塩化メチレン２０ｍｌに溶解し、この溶液にＨＣｌをＭＴＢＥ（１０ｍｌ）に溶解したものを加えた。混合物を、ＴＬＣ分析により出発材料が検出されなくなるまで少なくとも１時間攪拌した。溶液を蒸発乾固し、高真空下に一晩保持した。フォーム状生成物、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１．１４ｇ）およびＨＯＡｔ（０．８１ｇ）を、塩化メチレン２０ｍｌに溶解した。溶液を氷浴で冷却し、ＤＣＣ（１．２４ｇ）およびＤＩＰＥＡ（１．５ｍｌ）で処理した。反応混合物を低温で０．５時間攪拌した後、室温で１．５時間攪拌した。沈澱したＤＣＵを濾去し、塩化メチレンを酢酸エチル５０ｍｌで置換し、溶液をクエン酸、水、重炭酸塩溶液、水、および塩水で洗浄した。洗浄した有機溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発してフォーム状生成物（３．６６ｇ）とした。フォーム状生成物を、ジペプチドについて上記したようにＨＣｌで処理し、Ｈ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓａｒ−ＯＢｚＩを塩酸塩として得た。
Ｈ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＢｚＩの合成
ＦｍｏｃＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡ−ＯＨ（１当量）、Ｈ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓａｒ−ＯＢｚＩ（１当量）、ＨＯＡＴ（１．２当量）およびＤＩＰＥＡ（２．２当量）をＤＭＦ（１２容）に溶解したものを０℃に冷却し、ＨＢＴＵ（１．２当量）を加えた。溶液を周囲温度まで加熱し、５０分間攪拌した。この溶液に水（２５容）を加えて、ペプチドを沈澱させた。固形生成物を濾過によって集めた。湿りの残っている固形生成物を熱エタノール（１５容）に溶解した後、３０℃まで冷却しながら攪拌した。生成する固形生成物を濾過によって集め、乾燥して、生成物を７５％の収率で得た。ＨＰＬＣ純度９１面積％。固形生成物を９：１ＴＨＦ／ピペリジン（１５容）に溶解し、周囲温度で５０分間攪拌した。ペプチドを沈澱させるため、ＭＴＢＥ（１５容）を加えた。固形生成物を濾過によって集めた後、温エタノール（８容）で粉砕した。攪拌しながら周囲温度まで冷却した後、固形生成物を集めて、乾燥した。収率，９２％。ＨＰＬＣ純度，９３面積％。
ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＢｚＩの合成
ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）Ｌ−ＯＨ（１当量）、Ｈ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＢｚＩ（１当量）、ＨＯＡＴ（１．２当量）、およびＤＩＰＥＡ（２当量）をＤＭＦ（１３．５容）に溶解したものを０℃に冷却し、ＨＢＴＵを加えた。溶液を周囲温度まで加温し、１時間攪拌した。水（２０容）を加えて、ペプチドを沈澱させた。固形生成物を集め、メタノール（８容）で粉砕した。固形生成物を集めて、乾燥し、９８／２  ＤＣＭ／メタノール（５容）に溶解した。溶液を、９８／２  ＤＣＭ／メタノール中シリカゲル７００ｇを含むカラムに加えた。カラムを、９８／２  ＤＣＭ／メタノール１．６リットル、次いで９７／３  ＤＣＭ／メタノール１リットル、および９５／５  ＤＣＭ／メタノール８リットルで溶出した。生成物を含む画分を合わせて、濃縮し、フォーム状生成物とした。収率，８０．７％，ＨＰＬＣ純度，８５面積％。
ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＨの合成
ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＢｚＩを８：１ＤＣＭ／エタノール（１５容）に溶解したものを、Ｐｄ／Ｃ（０．４重量，Degussa型Ｅ１０１，１０％乾燥重量，５０％水）と共に充填した。反応容器を窒素置換および排気を３回行った後、水素雰囲気下に置き（バルーン）、周囲温度で２０時間攪拌した。スラリーを、セライトの密に充填したベッドで濾過した。濾液を約２容まで濃縮し、ＭＴＢＥ（１０容）を加えて、ペプチドを沈澱させた。固形生成物を集めて、乾燥して灰色固形生成物とした。収率９６％、ＨＰＬＣ純度，８５．５面積％。
［ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）］２ＬｙｓＮＨ２の合成
ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）−ＯＨ（２．４当量）、（ＨＣｌ）２ＬｙｓＮＨ２（１当量）、ＨＯＢＴ（２．５当量）、およびＥｔＰｒ２Ｎ（４．８当量）をＤＭＦ（１５容）にスラリーにしたものを、総ての固形物が溶解するまで（５分）周囲温度で攪拌した。溶液にＨＢＴＵ（２．５当量）を加えた。周囲温度で２時間攪拌した後、水（３０容）を加えて、ペプチドを沈澱させた。粗製ペプチドを濾過によって集めた。湿り残る固形生成物を熱エタノール（１２．５容）に溶解した後、一晩攪拌しながら周囲温度まで冷却した。固形生成物を集めて、乾燥し、生成物を定量的収率で、ＨＰＬＣ純度８０面積％で得た。
ＡＦ１５７０５の合成
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［ＦｍｏｃＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）］２ＬｙｓＮＨ２を９：１ＮＭＰ／ピペリジン（１０容）に溶解したものを、周囲温度で１〜２時間攪拌した。水（１２容）を加えて、ペプチドを沈澱させた。固形生成物を集め、水（５容）で洗浄して、乾燥した。乾燥固形生成物をＭＴＢＥ（１２容）で粉砕した後、ＡｃＣＮ（８容）で粉砕し、残留ピペリジン、フルベンおよびピペリジン・フルベン付加生成物を除去した。固形生成物を真空濾過によって集め、乾燥した。収率９７％。９５／５ＴＦＡ／水溶液（１３容）を窒素置換した後、０℃まで冷却した。これに、上記で得た［Ｈ−ＩＥ（ｔＢｕ）ＧＰＴ（ｔＢｕ）ＬＲ（Ｐｂｆ）Ｑ（ｔｒｔ）（１−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｐｂｆ）（Ｓａｒ）］２ＬｙｓＮＨ２（１重量）を加えた。懸濁液を、総ての固形物が溶解するまで（３０分）０℃で攪拌した後、周囲温度まで加温し、１００分間攪拌した。溶媒容積をロータリーエバポレーターを用いて５０％だけ減少させた後、氷／水（１５０容）を加えた。懸濁液を０℃で１．５時間攪拌して、ペプチドを溶解させた後、焼結ガラスで濾過した。ガラス器を水（５０ｍｌ）で洗浄した後、これを濾過し、生成物溶液に加えた。水溶液を凍結し、凍結乾燥して固形物とし、これを０℃で保管した後、精製した。生成物を、Ｃ１８改質シリカゲル（１００Å細孔度、１０μｍ球状粒子）のカラムに加え、約３０％〜約３５％アセトニトリル／水のグラディエントであって、いずれの溶媒も０．１％ＴＦＡを含むもので溶出した。少なくとも９０％ＡＵＣの所望なペプチドを含む画分を合わせ、濃縮して、凍結乾燥した。完全に保護された前駆体からの精製ペプチドの収率は、通常は１０％〜２５％程度である。
集めたペプチドＡＦ１５７０５の端緒になる実施例１Ａにおけるペプチド断片の構造の確認。マススペクトル分析法（ＭＳ）による分子量の確認、アミノ酸分析（ＡＡＡ）による組成、およびEdman分解によるペプチド配列情報。
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ペプチドのＰＥＧ化
Ｂ．  ＰＥＧ２分岐状ＰＥＧを用いるジ−ＰＥＧ化ＡＦ１３９４８，分子量２０，０００の調製（工程図１を参照されたい）
ＡＦ１３９４８を１００ｍＭのビシン，ｐＨ８．０に１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、１．２５倍モル過剰量の粉末状ＰＥＧ２（Shearwater Polymers, Inc.（ハンツビル，アラバマ）から市販されている）に加え、反応が完結するまで、典型的には１〜２時間室温で攪拌した。反応をYMC ODS AQカラムを用いて、４０〜６５％アセトニトリルのグラディエントを用いて逆相ＨＰＬＣによって監視した。反応が完了したならば、溶液を第二の１．２５モル過剰量の粉末状ＰＥＧ２に加え、ＡＦ１３９４８の各１モルについて、ＰＥＧ２を全部で５モル用いて工程を４回反復した。溶液をＰＢＳで２倍に希釈して粘度を減少させ、予めＰＢＳで平衡にして溶出したsuperdex 200カラム（Pharmacia）に加えた。サイズ排除カラムからの画分を、逆相ＨＰＬＣによって分析した。任意のモノ−ＰＥＧ−ＡＦ１３９４８の前に溶出したジ−ＰＥＧ−ＡＦ１３９４８を含む画分をプールし、５℃で保管し、または凍結乾燥した。
Ｃ．  ＳＰＡ−ｍＰＥＧを用いるジ−ＰＥＧ化ＡＦ１３９４８，分子量２０，０００の調製（工程図３を参照されたい）。
ＡＦ１３９４８を１００ｍＭのビシン，ｐＨ８．０に１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、５倍モル過剰量の粉末状ＳＰＡ−ｍＰＥＧ（Shearwater Polymers, Inc.（ハンツビル，アラバマ）から市販されている）に加え、反応が完結するまで、典型的には２時間室温で攪拌した。反応を逆相（YMC ODS AQ）ＨＰＬＣにより監視し、反応が完結したとき、溶液を脱イオン水で１０倍に希釈し、ｐＨ７．０の２ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡にしたＳＰ−セファロースカラムに加えた。未反応ＰＥＧおよびＮＨＳは、カラム中を流れた。次いで、ＰＥＧ化したＡＦ１３９４８を０〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌグラディエントを用いて溶出し、ジ−ＰＥＧ化体はモノ−ＰＥＧ化体の前に溶出した。画分を逆相ＨＰＬＣによって分析し、適当な画分を合わせた。ジ−ＰＥＧ−ＡＦ１３９４８は、緩衝液をＰＢＳに交換し、５℃で保管するかまたは凍結乾燥した。
Ｄ．  ｍＰＥＧアルデヒドを用いるジ−ＰＥＧ化ＡＦ１３８４８，分子量２０，０００の調製（工程図２を参照されたい）
ＡＦ１３９４８を１００ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、６倍モル過剰量の粉末状ＰＥＧアルデヒド（Shearwater Polymers, Inc.（ハンツビル，アラバマ）から市販されている）に加え、１Ｍ水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、最終水素化シアノホウ素ナトリウム濃度を１００ｍＭとした。溶液を室温で１８時間攪拌した後、3K（Amicon YM）限外濾過膜を用いて緩衝液をＰＢＳに交換した。溶液をＰＢＳで２倍に希釈して、粘度を減少させ、予めＰＢＳで平衡にして溶出したsuperdex 200カラム（Pharmacia）に加えた。サイズ排除カラムからの画分を、逆相ＨＰＬＣによって分析した。任意のモノ−ＰＥＧ−ＡＦ１３９４８の前に溶出したジ−ＰＥＧ−ＡＦ１３９４８を含む画分をプールし、５℃で保管し、または凍結乾燥した。
Ｅ．  ＳＰＡ−ｍＰＥＧを用いるジ−ＰＥＧ化ＡＦ１５７０５，分子量２０，０００（ジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）ＡＦ１５７０５）の調製
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ＡＦ１５７０５（重量２．３０ｇ）を、攪拌およびＮ２置換を備えたフラスコに入れ、室温に保持した。MilliQ Water（177ml）を加え、材料を溶解するまで攪拌した。２０μ１分量を取り出して、水で１ｍｌに希釈し、２８４ｎｍにおけるＵＶの読みから、濃度を測定した（９．３６ｍｇ／ｍｌ）。重炭酸ナトリウム（０．２９２１ｇ）を加えて、総て溶解するまで溶液を攪拌した（測定ｐＨは８）。Ｎ２下でのグローブ・バッグにおいて、４分量のＭ−ＳＰＡ−ＰＥＧ−２０ｋ（Shearwater Polymers, Inc.）を密封ボトルに秤量した（それぞれの分量は８．６７ｇ）。これらを密封したプラスチックバッグに入れ、反応に添加するまで５℃に保持した。重炭酸ナトリウムが溶解した直後に１分量を加え、第二は０．５時間後に加えた。第三分量は二回目の添加の１時間後に加え、第四分量は第三分量を加えてから１時間後に加えた。反応物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を５％ＥｔＯＨ水溶液で９倍に希釈し、０．４５ミクロンの硝酸セルロースフィルターで濾過した。この材料を、強カチオン交換カラム（SP Sepharose Fast Flow, １０ｃｍ×５３ｃｍ）に２０ｍｌ／分で送液した。材料を、２ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ６．０  ９０分の後、２ｍＭリン酸ナトリウムから１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ６．０への６０分の傾斜、および最後に１０ｍＭリン酸ナトリウムから１００％ＰＢＳ，ｐＨ７．０までの９０分の傾斜からなるグラディエントを用いてカラムから溶出した。このクロマトグラフィーの流速は１００ｍｌ／分であり、検出器は２１５ｎｍに設定した。カラム画分を、直列のG3000SWxlおよびG4000SWxl TSKカラムを用いるＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。＞９５％生成物を含む画分をプールし、A/G Technologies UFP-30-C-6A中空繊維カートリッジを用いて３３ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。保持物を５℃の循環浴で冷却し、Ｎ２置換した。生成物溶液を、６保持物容を交換するMilliQ水に緩衝液交換した後、更に濃縮して６６ｍｇ／ｍｌとした。合成、精製および限外濾過の後に、生成物２１ｇを回収した。MALDI-TOF（マトリックス・アシステド・レーザー・デソープション・タイム・オブ・フライト（matrix assisted laser desorption time of flight））マススペクトル分析法による分析で、生成物は４６０００ダルトンを中心とする広汎な分子量分布を有することを決定した。生成物をトリプシン症かした後、逆相または混合様式ＨＰＬＣを行い、ＰＥＧＫ結合部位（両Ｎ−末端）、および基礎になっているペプチドは分解しなかったことが明らかになった。
（注：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、出発ＰＥＧは公示されている２０ｋｄよりは２１．５ｋｄであることを示しており、従って分子量＝２１５００（ＰＥＧ）×２＋３２９５（ＡＦ１５７０５）＝４６０００である。）
実施例２
バイオアッセイ
ペプチドの生物活性は、トロンボポエチン依存性細胞増殖分析法を用いて測定することができる。ネズミＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞を、全長のヒトＴＰＯ−Ｒでトランスフェクションした。ＩＬ−３が存在しない場合（ＷＥＨＩ−３でコンディショニングした培地）では、これらの細胞は、増殖についてはＴＰＯ依存性である。親の未トランスフェクション細胞系は、ヒトＴＰＯには反応しないがＩＬ−３依存性のままである。
バイオアッセイは、上記の細胞系の両方について本発明による化合物を用いて行った。細胞を、１０％ＷＥＨＩ−３でコンディショニングした培地を含む完全ＲＰＭＩ−１０培地で成長させた後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＷＩＨＩ−３でコンディショニングした培地を欠いた培地に再懸濁し、ペプチドまたはＴＰＯの希釈物を２×１０４個／ウェルで含むウェルに加えた。細胞を、かつ下５％ＣＯ２雰囲気で３７℃で４８時間インキュベーションし、代謝活性をＭＴＴのホルマザンへの還元によって測定し、５７０ｎｍでの吸収はＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。試験したペプチドは、第１表に示すように用量依存的にＴＰＯ−ＲでトランスフェクションしたＢａ／Ｆ３細胞の増殖を促進した。これらのペプチドは、親細胞系には効果を示さない。
実施例３
結合親和性
本発明による化合物のＴＰＯ−Ｒに対する結合親和性を競合結合分析法で測定した。マイクロタイター・プレートのウェルに１ｍｇのストレプトアビジンをコーティングし、ＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロックした後、ビオチン化抗レセプター固定化抗体（Ａｂ１７９）５０ｎｇでブロックした。次に、ウェルを、可溶性ＴＰＯ−Ｒ回収物の１：１０希釈物で処理した。様々な濃度の試験化合物を、マルトース結合タンパク質のＣ−末端に融合した残基１〜１５６からなるＴＰＯの切断型（ＭＢＰ−ＴＰＯ156）の一定量と混合した。ペプチドＭＢＰ−ＴＰＯ156混合物をＴＰＯ−Ｒをコーティングしたウェルに加え、４℃で２時間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄した。平衡で結合したＭＢＰ−ＴＰＯ156の量を、ＭＢＰに対するウサギ抗血清を加えた後、アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ウサギＩｇＧを加えた。次に、それぞれのウェルにおけるアルカリ性ホスファターゼの量を、標準的方法を用いて測定した。
分析は、試験化合物の濃度範囲に亙って行い、結果をグラフに表し、ｙ軸が結合したＭＢＰ−ＴＰＯ156を表し、x軸が試験化合物の濃度を表すようにする。次いで、固定化ＴＰＯ−Ｒに結合したＭＢＰ−ＴＰＯ156の量の５０％（ＩＣ50）だけ還元する濃度を測定することができる。
実施例４
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この実施例では、対照化合物ＡＦ１３９４８に対する各種の置換、欠失および付加を、３種類の分析法を用いて分析した。第一に、ＭＴＴ細胞増殖分析を、上記の方法で行った。第二に、マイクロフィジオメーター（microphysiometer）分析法を行った（Molecular Devices Corp.）。基本的には、この分析法では、本発明の化合物によるＴＰＯレセプター刺激に反応する細胞外培地の酸性化の速度を測定した。ＥＣ50の範囲を、上記のＩＣ50についてと同様に象徴的に示す。最後に、レセプター分析法を行った。ｃ−ｆｏｓ／ルシフェラーゼリポータープラスミドでトランスフェクションしたＢａＦ３／ＴＰＯＲ細胞を０．１％ＷＥＨＩ−３でコンディショニングした培地を含む完全ＲＰＭＩ−１０培地で一晩絶食（starved）した後、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＷＥＨＩ−３でコンディショニングした培地を欠いている培地に再懸濁し、５×１０５個／ウェルのペプチドの連続希釈物を含むウェルに加えた。細胞を、加湿した５％ＣＯ２雰囲気で３７°で２時間インキュベーションし、ルシフェラーゼ発現を、ルシフェリン基質を添加した後発光計で測定した。
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実施例５
この実施例では、様々なＰＥＧ化ペプチドの薬物動態挙動を決定した。化合物の薬物動態は、その薬理活性の重要な決定基である。薬物動態プロフィールの重要な成分は、実験室動物の血漿中の化合物の持続性である。この持続性は、通常は投与後の時間の関数として血漿中の化合物濃度に関して表される。
これらの実験を通じて、雄の２０〜２５ｇｋＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。２０００ｍｌの容量を、ＩＶまたはＳＣ注射した。ビヒクルはDulbeccoのＰＢＳ、５％ＤＭＳＯ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡであった。血漿は、凝固防止剤としてヘパリンを用いて屠殺時に回収した。
化合物濃度を、リポーター細胞分析法を用いて測定した。血漿の希釈物を、Ｂａｆ／３  ＴＰＯｒ／ｆｏｓ／ｌｕｘ構築物３に加えた。ルシフェラーゼ発現を、ルシフェリン基質を添加した後に、発光計で測定した。個々の血漿試料の刺激活性を、血漿の容積当たりの化合物のペプチド当量として表した濃度に変換した（ｎＭまたはｎｇ／ｍｌ）。この濃度は、親化合物を用いるリポーター分析法で構築した標準曲線と比較することによって得た。
第３表に、化合物ＡＦ１３９４８およびジ−ＰＥＧ化ＡＦ１３９４８（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）平均分子量＝５０００Ｄ）の血漿中の濃度を７００μｇペプチド当量／ｋｇの注射後の時間の関数として示す。ＡＦ１３９４８を投与することによって、６０分ＰＩまでビヒクルを注射したマウスに存在する濃度を上回って検出可能な血漿中の活性を生じる。５Ｋ  ＰＥＧを付加すると、血漿中濃度が１００倍を上回って増加し、血漿中で検出することができる時間が少なくとも２４０分ＰＩまで延長される。
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第４表に、５００μｇペプチド当量／ｋｇの注射後の時間の関数としての化合物ジ−ＰＥＧ（５Ｋ）−ＡＦ１３９４８およびジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）−ＡＦ１３９４８の血漿中濃度を示す。２０Ｋ  ＰＥＧで修飾した化合物の血漿中の濃度および持続性は、ジ−ＰＥＧ（５Ｋ）−ＡＦ１３９４８のものより著しく増加する。
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第５表は、１００、１０および１μｇペプチド当量の注射後の化合物ジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）−ＡＦ１３９４８の血漿中濃度を示し、観察の時間を１２０時間ＰＩまで延長する。血漿中に観察された濃度は、投与用量に比例することが分かった。化合物を１００μｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与量を投与すると、少なくとも９６時間ＰＩ血漿中濃度が上昇した。
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第６表は、ジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）−ＡＦ１３９４８の１０μｇペプチド当量をＳＣおよびＩＶ注射した後の血漿中濃度を示す。単回１０μｇペプチド当量／ｋｇ用量のＳＣ注射により、９６時間ＰＩ血漿中活性が増加した。２つの投与経路で得られた血漿中濃度のプロフィールは、ＳＣ投与したジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）−ＡＦ１３９４８のバイオアベイラビリティが良好であることを示している。
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また、第１図は、ＧＷ３５０７８１またはジ−ＰＥＧ（５Ｋ）−ＡＦ１３９４８が、ペプチドの非ＰＥＧ化体と比較して高い安定性を有する、すなわち半減期が長いことを示している。それだけで、第１図は、ＰＥＧ化ペプチドがヒト血清中で良好なバイオアベイラビリティを有し、安定性が高いことを示している。
実施例６
上記の分析法を用いて、ＰＥＧで様々に誘導体形成したペプチドの薬物動態プロフィールを決定した。この実験では、ペプチドは、工程図１〜３に示されるように分岐状ＰＥＧ２（２０Ｋ）、エステル結合ＰＥＧ（ＳＰＡ）、およびアルデヒド結合ＰＥＧ（ＡＬＤＨ）を用いて誘導体形成した。第２図は、１０μｇペプチド当量／ｋｇをＳＣ注射した後の血漿中濃度を示す。第２図から、ＰＥＧで様々に誘導体形成した３種類のペプチド化合物は総て、好ましい薬物動態プロフィールを有することが明らかである。
実施例７
この実験では、ＰＥＧ化ペプチドを、マウスモデルでの血小板減少症に対する効果を評価した。この分析法では、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、０日目にカルボプラチン（９０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）を投与することによって、マウスを血小板減少症にする。ＧＷ３５０７８１（１ｍｇ／ｋｇ／日）、またはジ−ＰＥＧ（５Ｋ）−ＡＦ１３９４８、およびＧＷ３５０８０５（３２．５μｇ／ｋｇ／日）、またはジ−ＰＥＧ（２０Ｋ）−ＡＦ１３９４８を、１〜９日目に投与した（ｓ．ｃ，ｑｄ）。第３〜４図から、ＰＥＧ化ペプチドは、約１０日目にはカルボプラチンによって誘発される血小板減少症を緩和することが明らかである。これらの結果は、明らかに、本発明のＰＥＧ化ペプチドは、マウスモデルでの血小板減少症を緩和することができることを示している。
実施例８
この実験では、ＰＥＧ化ペプチドを、正常マウスでの血小板濃度についての効果を評価した。一態様では、ＧＷ３５０７８１（１ｍｇ／ｋｇ／日）、およびＧＷ３５０８０５（３２．５μｇ／ｋｇ／日）を１〜９日目に投与した（ｓ．ｃ．，ｑｄ）。１〜１５日目に、血液を尾静脈出血によって間隔を置いて採取した。第５〜６図から、ＰＥＧ化ペプチドは血小板減少症に効果があり、２０Ｋ−ジＰＥＧ化ペプチドＧＷ５０８０５は５Ｋ−ＰＥＧ化ペプチドＧＷ３５０７８１より約１００倍強力であることが明らかである。
もう一つの実験では、ＧＷ３５０７８１およびＧＷ３０５８０５を１〜５日目に投与した（ｓ．ｃ．，ｑｄ）。６日目に、動物を屠殺し、末梢血の血小板数を得た。第７〜９図は、ＰＥＧ化ペプチドの様々な用量の効果並びに複数回投与に対する単回投与の効果を示している。これらの結果は、本発明のＰＥＧ化ペプチドをマウスモデルでの血小板を増加するのに用いることができることを明らかに示している。
特許明細書などの総ての著書および文献の本願における開示は、総ての内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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