(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子又はヒトＳＭ２２α遺伝子のプロモーターを含む領域と、前記プロモーターを含む領域の下流に組み込まれたヘルペスウイルスの複製開始に必要な転写因子をコードするＩＣＰ４遺伝子及びマーカー遺伝子、並びに前記プロモーターを含む領域の上流に組み込まれた前記マーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子と、チミジンキナーゼ遺伝子を含む成体正常細胞に作用しない細胞特異的単純ヘルペスウイルスベクター（ＨＳＶベクター）であって、前記プロモーターを含む領域とＩＣＰ４遺伝子と２種類のマーカー遺伝子とを含むＤＮＡ断片がリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子座に組み換えにより挿入されており、前記２種類のマーカー遺伝子の発現を指標にして得られる、チミジンキナーゼ遺伝子を利用して所望の時期にその複製を抑制しうることを特徴とする成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター。
【請求項２】
ヒトカルポニン遺伝子のプロモーターを含む領域が、配列番号２に示される塩基配列からなるヒトカルポニン遺伝子プロモーターを含む領域であることを特徴とする請求項１記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター。
【請求項３】
配列番号２に示される塩基配列を含む領域が、配列番号３に示される塩基配列を含む領域であることを特徴とする請求項２記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター。
【請求項４】
細胞特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子のプロモーターを含む領域が、配列番号２又は配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有する塩基配列を含む領域であることを特徴とする請求項１記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター。
【請求項５】
プロモーターを含む領域の上流にエンハンサーが組み込まれていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター。
【請求項６】
エンハンサーが４Ｆ２エンハンサーであることを特徴とする請求項５記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター。
【請求項７】
ＩＣＰ４遺伝子のさらに下流に、目的タンパク質をコードするＤＮＡが連結され、前記プロモーターを含む領域の制御下に目的タンパク質を発現することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター。
【請求項８】
目的タンパク質をコードするＤＮＡが、ＩＲＥＳ（internalribosomal entry site）を介してＩＣＰ４遺伝子に連結されていることを特徴とする請求項７記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター。
【請求項９】
目的タンパク質をコードするＤＮＡが、アポトーシス関連遺伝子であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター。
【請求項１０】
目的タンパク質をコードするＤＮＡが、血管新生抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター。
【請求項１１】
目的タンパク質をコードするＤＮＡが、癌転移抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター。
【請求項１２】
目的タンパク質をコードするＤＮＡが、癌抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター。
【請求項１３】
細胞特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子のプロモーターを含む領域と、前記プロモーターを含む領域の下流に組み込まれたヘルペスウイルスの複製開始に必要な転写因子をコードするＩＣＰ４遺伝子及びマーカー遺伝子、並びに前記プロモーターを含む領域の上流に組み込まれた前記マーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子と、チミジンキナーゼ遺伝子を含む成体正常細胞に作用しない細胞特異的単純ヘルペスウイルスベクター（ＨＳＶベクター）であって、前記プロモーターを含む領域とＩＣＰ４遺伝子と２種類のマーカー遺伝子とを含むＤＮＡ断片がリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子座に組み換えにより挿入されており、前記２種類のマーカー遺伝子の発現を指標にして得られる、チミジンキナーゼ遺伝子を利用して所望の時期にその複製を抑制しうる成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターを含むことを特徴とする治療薬。
【請求項１４】
ヒトカルポニン遺伝子のプロモーターを含む領域が、配列番号２に示される塩基配列からなるヒトカルポニン遺伝子プロモーターを含む領域であることを特徴とする請求項１３記載の治療薬。
【請求項１５】
配列番号２に示される塩基配列を含む領域が、配列番号３に示される塩基配列を含む領域であることを特徴とする請求項１４記載の治療薬。
【請求項１６】
細胞特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子のプロモーターを含む領域が、配列番号２又は配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有する塩基配列を含む領域であることを特徴とする請求項１３記載の治療薬。
【請求項１７】
プロモーターを含む領域の上流にエンハンサーが組み込まれていることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか記載の治療薬。
【請求項１８】
エンハンサーが４Ｆ２エンハンサーであることを特徴とする請求項１７記載の治療薬。
【請求項１９】
ＩＣＰ４遺伝子のさらに下流に、目的タンパク質をコードするＤＮＡが連結され、前記プロモーターを含む領域の制御下に目的タンパク質を発現することを特徴とする請求項１３〜１８のいずれか記載の治療薬。
【請求項２０】
目的タンパク質をコードするＤＮＡが、ＩＲＥＳ（internalribosomal entry site）を介してＩＣＰ４遺伝子に連結されていることを特徴とする請求項１９記載の治療薬。
【請求項２１】
目的タンパク質をコードするＤＮＡが、アポトーシス関連遺伝子であることを特徴とする請求項１３〜２０のいずれか記載の治療薬。
【請求項２２】
目的タンパク質をコードするＤＮＡが、血管新生抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１３〜２０のいずれか記載の治療薬。
【請求項２３】
目的タンパク質をコードするＤＮＡが、癌転移抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１３〜２０のいずれか記載の治療薬。
【請求項２４】
目的タンパク質をコードするＤＮＡが、癌抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１３〜２０のいずれか記載の治療薬。
【請求項２５】
細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターを含む領域が活性化され得る細胞又は該遺伝子を発現する細胞に、細胞特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子又はヒトＳＭ２２α遺伝子のプロモーターを含む領域と、前記プロモーターを含む領域の下流に組み込まれたヘルペスウイルスの複製開始に必要な転写因子をコードするＩＣＰ４遺伝子と、チミジンキナーゼ遺伝子を含む細胞特異的単純ヘルペスウイルスベクター（ＨＳＶベクター）であって、前記プロモーターを含む領域とＩＣＰ４遺伝子を含むＤＮＡ断片がリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子座に組み換えにより挿入されている組み換え後のウイルス混合液を感染させ、ベクター内に組み込んだ前記プロモーターをもつマーカー遺伝子と、前記プロモーターとは異なるプロモーターをもつ前記マーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子の２種類のマーカー遺伝子の発現を指標にして、アガロースゲルオーバーレイ法を用いず、単一クローンにまで精製することを特徴とする細胞特異的発現複製ベクターの製造方法。
【請求項２６】
細胞が、ＩＣＰ４（−）細胞であることを特徴とする請求項２５記載の細胞特異的発現複製ベクターの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の細胞に特異的に遺伝子を発現させ自己複製する成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクター、特にその発現複製後の所望の時期に発現複製を抑制することができる細胞特異的発現複製ベクター、更には前記ベクターを用いて、特定の生体細胞で遺伝子を発現する方法、あるいは特定の細胞を破壊する方法等に関し、詳しくは、（１）癌の遺伝子治療分野において、特定の癌細胞そのものあるいは腫瘍内新生血管の増殖平滑筋細胞を特異的に破壊するために、遺伝子の発現を細胞特異的に行い得る発現複製ベクターを作製し、正常細胞には傷害を与えることなく治療を可能とし、治療終了後、ベクター感染細胞を完全に除去することができる安全性の高い細胞特異的発現複製ベクターの構築や、（２）肺や肝臓などの線維症に対する遺伝子治療の分野において、増殖筋線維芽細胞を特異的に破壊するために、遺伝子の発現を細胞特異的に行い得る発現複製ベクターを作製し、正常細胞には傷害を与えることなく治療を可能とし、治療終了後、ベクター感染細胞を完全に除去することができる安全性の高い細胞特異的発現複製ベクターの構築や、（３）ステント留置後や臓器移植後の血管狭窄や動脈硬化症、糖尿病性網膜症などの遺伝子治療分野において、増殖血管平滑筋細胞を特異的に破壊するために、遺伝子の発現を細胞特異的に行い得る発現複製ベクターを作製し、正常細胞には傷害を与えることなく治療を可能とし、治療終了後、ベクター感染細胞を完全に除去することができる安全性の高い細胞特異的発現複製ベクターの構築や、（４）糸球体腎炎の遺伝子治療の分野において、増殖メサンギウム細胞を特異的に破壊するために、遺伝子の発現を細胞特異的に行い得る発現複製ベクターを作製し、正常細胞には傷害を与えることなく治療を可能とし、治療終了後、ベクター感染細胞を完全に除去することができる安全性の高い細胞特異的発現複製ベクターの構築等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
正常細胞には影響を与えず、癌細胞のみを選択的に傷害することができる、副作用の少ない理想的な癌の治療法が近年求められている。その一つとして遺伝子治療法が挙げられるが、かかる治療法は癌細胞に導入する遺伝子の細胞選択性や発現プロモーターの活性、ウイルスベクターの感染導入法など、いろいろなレベルで癌細胞選択性を高めることが可能であり、将来の有望な治療法として注目されている。しかし、すべての癌細胞において治療遺伝子を導入できないという共通の問題がある。一方、癌の免疫細胞療法も、正常組織にもわずかながら組織特異的分化抗原の発現が認められることから、正常細胞に対する副作用が問題となっている。また、突然変異に基づく癌抗原は、個々の癌にその変異が限られるという欠点をもっていることから、それを分子標的とした癌の免疫細胞療法として一般化するには適しているとはいえない。
【０００３】
最近、感染と複製によって次々と増殖細胞のみを選択的に傷害する複製可能型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターを用いた悪性脳腫瘍の遺伝子治療臨床研究が米国と英国で行われている（Gene Ther. 7, 859-866, 2000、Gene Ther. 7, 867-874, 2000）。複製可能型ＨＳＶベクターは、ウイルス複製に必須なRibonucleotide reductase（ＲＲ）又はThymidine kinase（ＴＫ）を欠失したベクターであり、これらの酵素は正常細胞では増殖時にのみ発現するが、腫瘍細胞では構成的に発現している。そのため、このＨＳＶベクターは、正常細胞であれ腫瘍細胞であれ増殖の盛んな細胞に感染すると、細胞由来のＲＲやＴＫを利用して複製され細胞溶解活性を示す。一方、国内では動物実験で、前立腺癌や膵臓癌に対する複製可能型ＨＳＶベクターの抗腫瘍効果が報告されている（J. Surg. Oncol. 72, 136-141, 1999）が、これらも細胞選択性がなく、安全性が低い。従って、血液脳関門があり、循環血液中にベクターが拡散しない脳ではヒトの治療に用いることができたが、脳以外の臓器での治療には適さないという問題点があった。
【０００４】
上記のことから、ＨＳＶベクターの傷害活性を標的細胞特異的にコントロールできれば、さらに有効で安全な治療法になると考えられている。これまでに、米国のMartuzaらによって、アルブミンプロモーターを用いた肝腫瘍選択的な複製可能型ＨＳＶベクターが報告されている（J. Virol. 71, 5124-5132, 1997）。しかし、かかるベクターを用いると肝細胞癌ではアルブミン遺伝子の発現が低下し、また正常な再生肝細胞をも傷害することなどからヒトでの臨床応用には適さないと考えられている。その他、米国特許第５７２８３７９号明細書（「腫瘍あるいは細胞特異的単純ヘルペスウイルスの複製」）では、中皮腫に対する応用の可能性を述べているが、平滑筋肉腫や骨肉腫、消化管ストローマ腫瘍 (GIST) などのヒトの肉腫全般、腫瘍血管、増殖性血管病変、増殖性糸球体腎炎、肺、肝臓等の線維症あるいは悪性腫瘍の間質で増殖する筋線維芽細胞に対する治療への応用可能性の記述はなされていない。
【０００５】
肉腫の病因と病態に関する遺伝子解析により、一部の腫瘍でｐ５３とＲｂの変異や融合遺伝子の存在が報告されているが、まだ広く治療に応用できる段階に至ってはいない。ヌードマウスを用いた動物実験で、Milasらは複製能を持たないアデノウイルスベクターを用いて平滑筋肉腫細胞にｐ５３遺伝子を導入し、腫瘍の増殖遅延効果があることを報告している（Cancer Gene Ther. 7, 422-429, 2000）。その他、オステオカルシン遺伝子のプロモーターを用いて、自殺遺伝子であるチミジンキナーゼを骨肉種に導入発現させる方法が報告されている（Cancer Gene Ther. 5, 274-280, 1998）が、これは複製能を欠失したウイルスベクターを用いたものであり、遺伝子導入の効率が悪く、骨肉腫以外の肉腫には適用できない。特に、Milasらの報告では、本発明者らによる報告（Cancer Res. 61, 3969-3977, 2001）に記載されているのと同じ、ヒト平滑筋細胞株SK-LMS-1を用いた実験例を示しているが、上記報告において使用したウイルスベクターの粒子量の１００〜１０００倍多くのウイルス粒子を使用し、効果は上記報告におけるものよりも劣っている。従って、Milasらの結果は、体内に注入するウイルス粒子の数をできるだけ少なくして副作用を押さえるという観点から、好ましいとは言えない。
【０００６】
また、癌の血管新生抑制療法としては、米国のFolkmanのグループによるマウスの実験系で、アンジオスタチンやエンドスタチンなどのペプチド性抑制因子の劇的な抗腫瘍効果が報告されている（Cell 79, 315-328, 1994、Cell 88, 277-285, 1997）。我国においても中村らによって、肝細胞増殖因子の分子内断片であるＮＫ4の血管新生抑制作用が報告されている（Biochem. Biophys. Res. Commun. 279, 846-852, 2000）。しかしこれらの方法は、大量のペプチドを必要とすること、エンドスタチンに関しては再現性が低いという報告があること、作用メカニズムが不明であること、さらにヒトでの有効性がまだ確認されていないこと、などの問題点がある。現在臨床試験中の血管新生阻害剤は、細胞選択性がなく、阻害効率も低い。米国のChereshらが報告した、内皮細胞の表面のインテグリンの作用を阻害するペプチドも同様に細胞選択性がなく、阻害効率が低い（J. Clin. Invest. 103, 1227-1230, 1999）。これらの研究は、すべて血管内皮細胞を標的にした治療であるが、腫瘍血管を構成する増殖血管平滑筋細胞を標的にした細胞選択的治療剤は未だ知られていない。実際、平滑筋細胞の増殖と遊走を促進する血小板由来増殖因子受容体の拮抗剤が強力な腫瘍新生血管抑制作用をもつことが報告され（Cancer Res. 60, 4152-4160, 2000）、腫瘍血管新生を抑制するために血管平滑筋を攻撃することの重要性が推測されるが、この方法は細胞非選択的であり、副作用も予想される。
【０００７】
また、増殖性血管病変特に、ステント留置後や心臓移植後の血管狭窄に対しては、新生内膜の平滑筋増殖を抑制する種々の薬剤が試みられているが、いずれも狭窄の予防には成功していない。最近の遺伝子治療の試みとしては、複製能を欠くアデノウイルスベクターを用いて、カルポニンの相同遺伝子であるＳＭ２２αのプロモーターの制御下にＬａｃＺ遺伝子をバルーン傷害後のラット頚動脈の平滑筋細胞に選択的に導入したLeidenらの報告がある（J. Clin. Investi. 100, 1006-1014, 1997）。しかし、この実験ではＬａｃＺ遺伝子が導入されたのは、標的細胞である内膜の増殖平滑筋ではなく中膜の平滑筋で、導入効率も極めて低いものであった。また、Nabelらも複製能のないアデノウイルスベクターを用いてＳＭ２２αのプロモーターの制御下にＬａｃＺ遺伝子をＣＡＴ（chloramphenicol acetyltransferase）遺伝子をブタの動脈に導入する実験を行ったが、内膜の平滑筋細胞の２．２％、中膜平滑筋細胞の０．５６％に遺伝子発現が認められたにすぎなかった（Mol. Med. 6, 983-991, 2000）。一方、複製可能型ＨＳＶベクターを用いてバルーン傷害後のラット頚動脈に感染させた宮武らの報告（Stroke 30, 2431-2439, 1999）では、ウイルスの複製は主に内膜の増殖平滑筋で観察され、複製可能型ウイルスベクターを用いることの有用性が推測されるが、このベクターは細胞非選択的であり、内皮細胞や外膜線維芽細胞の破壊などの副作用も予想される。その他にもデコイやアンチセンスＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドを血管に直接導入する方法も発表されているが、導入効率が低く、血管平滑筋増殖の十分な抑制効果は期待できない。
【０００８】
また、増殖性糸球体腎炎に対する最近の遺伝子治療の試みとしては、ＴＧＦβ１の阻害作用をもつデコリン（decorin）やＴＧＦβ受容体とＩｇＧ  Ｆｃ領域のキメラ遺伝子、またＮＦkappaＢのデコイをリポソームベクターを用いて腎糸球体に導入する方法が報告されている（Nature  Med. 2, 418-423, 1996; Kidney Int. 55, 465-475, 1999; Gene Ther. 7, 1326-1332, 2000）が、この方法は細胞非選択的であり、副作用も予想される。また、腎糸球体に選択的に遺伝子を導入するために、複製能を欠くアデノウイルスベクターをポリスチレンの微小球（microsphere）に結合させてラットの大動脈に投与する方法が発表されている（Kidney Int. 58, 1500-1510, 2000）が、増殖性糸球体腎炎の原因となるメサンギウム細胞以外に血管内皮細胞にも導入遺伝子の発現が認められ、治療の標的化は未だ不完全である。さらに、アデノウイルスは免疫原性が強く、それ自体が糸球体腎炎の原因となる免疫反応を惹起する危険性も指摘されている（Kidney Int. 61, S85-S88, 1997）。
【０００９】
他方、本発明者らは、ヒト由来の肉腫の腫瘍細胞に平滑筋の分化マーカーとされるカルポニン遺伝子が発現していることを見い出し、はじめて報告した（Int. J. Cancer 79, 245-250, 1998、Sarcoma 3, 107-113, 1999、Intern. J. Cancer 82, 678-686, 1999）。その後、骨・軟部肉腫に加えて消化管ストローマ腫瘍（ＧＩＳＴ）や唾液腺肉腫、繊維肉腫、悪性神経鞘腫など２０種類近い間葉系細胞由来のヒト悪性腫瘍で、カルポニン遺伝子が異常発現していることが国内外で相次いで報告されている。上記カルポニン（ｈ１又はbasic）は、Ｘ線結晶構造と、インビトロ及びインビボの機能解析により、アクチン分子のＣ末端に結合して、アクチン・ミオシンの滑り運動を抑制することが明らかにされている（Biochem. Biophys. Res. Commun. 279, 150-157, 2000、J. Physiol. 529, 811-824, 2000）。カルポニン遺伝子は、成体では、平滑筋細胞に選択的に発現し、血管の分化のマーカーと考えられている（Physiol. Rev. 75, 487-517, 1995）。
【００１０】
また、上記米国特許第５７２８３７９号明細書や本発明者らによる報告（Cancer Res. 61, 3969-3977, 2001）においては、ＨＳＶのチミジンキナーゼ（Thymidine kinase）をコードするＤＮＡを欠失している複製可能型ベクターについて記述されているが、チミジンキナーゼを欠失しているＨＳＶは、抗ヘルペスウイルス薬であるアシクロビル（aciclovir）やガンシクロビル（ganciclovir）に対する感受性がなく、これらベクターをヒトの治療に応用する場合には、予期せぬウイルス感染の拡大を防ぐという安全対策の面において問題がないとはいえなかった。
【００１１】
その他、神経細胞での複製に関与するgamma３４．５遺伝子を２コピーとも欠失し、ＬａｃＺ遺伝子がRibonucleotide reductase（ＩＣＰ６）−ｌｏｃｕｓに挿入されている複製可能型ＨＳＶ−１ベクターＧ２０７（Nature Med. 1, 938-943, 1995）や、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーによって発現するautofluorescent proteinとcytosine deaminaseをＩＣＰ６−ｌｏｃｕｓに相同組換え法で挿入した複製可能型ＨＳＶ−１ベクターＨＳＶ１ｙＣＤ（Cancer Res. 61, 5447-5452, 2001）は知られていたが、ともにRibonucleotide reductaseが欠失する結果、増殖細胞でのみ複製可能であるが、細胞選択性をもたない。また、肺や肝臓などの線維症における増殖筋線維芽細胞を標的にして、選択的に破壊する治療法の報告はない。また、悪性腫瘍の間質で増殖する筋線維芽細胞を標的にした治療法もこれまで報告がない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、悪性腫瘍等の治療に用いるために、悪性腫瘍等の特定の細胞で特異的に遺伝子を発現しつつ複製し、かつ正常細胞には損傷を与えないような、細胞特異的発現複製ベクター、特にその発現複製後の所望の時期に発現複製を抑制することができる細胞特異的発現複製ベクターを構築すること、更には、該ベクターを悪性腫瘍等の特定の生体細胞に導入し発現させて治療する方法などを提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、特定の腫瘍細胞や平滑筋細胞に特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子の該細胞内における転写開始制御領域を取得し、ウイルス複製関連遺伝子の複製開始に必要な転写因子をコードする遺伝子の上流に組み込んで、これをウイルスＤＮＡの複製に必須の酵素であるＴＫ遺伝子と置き換えることによって、悪性腫瘍細胞や腫瘍内新生血管の増殖平滑筋細胞等の特定の細胞で該遺伝子を発現させ、ウイルス複製を誘導し得る成人正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターを構築した。この構築した細胞特異的発現複製ベクターを悪性腫瘍組織に導入したところ、腫瘍細胞や腫瘍新生血管の増殖平滑筋を選択的に傷害することを報告している（Cancer Res. 61, 3969-3977, 2001；特願２００１−１４３９９９）。
【００１４】
上記本発明者らが報告したカルポニンプロモーターをもつ複製可能型ＨＳＶ−１ベクター（Cancer Res. 61, 3969-3977, 2001；特願２００１−１４３９９９）や、前記米国のMartuzaらによる、アルブミンプロモーターを用いた肝腫瘍選択的な複製可能型ＨＳＶ−１ベクター（J. Virol. 71, 5124-5132, 1997；米国特許５７２８３７９）が、これまでに発表された細胞特異的に複製可能なＨＳＶ−１ベクターであるが、どちらもウイルス複製に必須の転写因子であるＩＣＰ４をコードする遺伝子を２つとも欠失したＨＳＶ−１変異体ウイルスｄ１２０を親株とし、プロモーターの上流にＬａｃＺ ｃＤＮＡを、下流にＩＣＰ４ ｃＤＮＡを接続し、ｄ１２０のチミジンキナーゼ（Thimidine kinase）遺伝子座（ＴＫ−ｌｏｃｕｓ）に相同組み換えしたものである。したがって、ベクター精製の過程で指標となるＬａｃＺ遺伝子の発現はＴＫ遺伝子のプロモーターの制御下にある。
【００１５】
かかるチミジンキナーゼをコードするＤＮＡを欠失している複製可能型ＨＳＶ−１ベクターは、抗ヘルペスウイルス薬であるアシクロビル（aciclovir）やガンシクロビル（ganciclovir）に対する感受性が欠如している。したがって、ベクターを単一クローンにまで精製する方法は、相同組み換え後のウイルス混合液をＩＣＰ４ｃＤＮＡを導入したＶｅｒｏＥ５細胞に感染させ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）アガロースオーバーレイ法でＬａｃＺ遺伝子の発現を示す青色の染色によって、複数、好ましくは少数のプラークを回収し、ガンシクロビル（ganciclovir）の存在下でＶｅｒｏＥ５細胞に再び感染させるというプラーク精製のサイクルを繰り返すことによって行われてきた。抗ヘルペスウイルス薬によってＴＫ−ｌｏｃｕｓで組み換えが起こらなかったウイルスすなわちＴＫ遺伝子をもつウイルスを排除するこの方法は、当然のことながらＴＫ遺伝子をもつ細胞特異的発現複製ベクターの精製には適用することができない。
【００１６】
また、Ｘ−ｇａｌアガロースオーバーレイ法は、スクリーニングの初期段階では単一のプラークを回収することは不可能である。さらに、この方法ではアガロースをオーバーレイした時点で、細胞の分裂増殖が停止するとともにウイルスの複製も停止する結果、それ以降はウイルス粒子の数が増加しない。この場合、リボヌクレオチド還元酵素（Ribonucleotide reductase，ＲＲ）遺伝子のプロモーターなどＴＫ遺伝子のプロモーターより活性の強いプロモーターによって発現されるＬａｃＺ遺伝子をもつ複製可能型ベクターでは、ベクター自身の複製能が高くない場合、ＴＫ遺伝子のプロモーターによって発現されるＬａｃＺ遺伝子をもつ複製可能型ベクターのものと同程度に青色に染色された細胞１個あたりのウイルス数が少ない。そのため、次のスクリーニングに向けて複製能力のあるベクターを回収することが困難である。
【００１７】
さらに、細胞特異的発現複製ベクターとして、ＩＣＰ４ ｃＤＮＡとＩＲＥＳ（internal ribosomal entry site）の下流に挿入した任意の遺伝子（蛍光を発するGreen Fluorescent Proteinを発現するｃＤＮＡを好適に例示することができる）を連結させると、上記任意の遺伝子を細胞特異的な転写開始制御領域の制御下に発現させ、この任意の遺伝子の発現とＬａｃＺ遺伝子の発現の両方を指標にしてスクリーニングすることが可能となり、目的の場所に相同組み換えが起こったウイルスベクターをより確実にしかも迅速に単離することができるとの知見を得た。
【００１８】
また、相同組み換え後の最初のスクリーニングに、細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターすなわち転写開始制御領域が活性化され得るＩＣＰ４（−）細胞又は該遺伝子を発現するＩＣＰ４（−）細胞に、細胞特異的発現複製ベクターを含む相同組み換え後のウイルス混合液を感染させ、前記ウイルスを複製・増殖させた後、ベクター内に組み込んだ遺伝子の発現を指標にして、限界希釈法によって単一クローンにまで精製する方法を用いることによって、細胞特異的プロモーターの制御下にＩＣＰ４を発現するという目的の組み換えが起こったベクターを選別濃縮することができることを見い出した。さらに、チミジンキナーゼを温存した細胞特異的発現複製ベクターは、アシクロビル（aciclovir）やガンシクロビル（ganciclovir）によってその感染細胞とともにウイルスを死滅させることが可能であり、予期せぬウイルス感染の拡大を防ぐという安全対策の面で優れた特性を有しているとの知見を得た。一方、チミジンキナーゼを欠失することを特徴とする細胞特異的複製可能型ＨＳＶ−１ベクターである米国特許５７２８３７９号の発明および先に出願した特願２００１−１４３９９９号の発明の実施例は、ヒトの治療への応用には適さないとも考えられる。そして、細胞特異的発現複製ベクターが、実際にヒト軟部肉腫の中で最も頻度の高い悪性線維性組織球種（Malignant Fibrous Histiocytoma；ＭＦＨ）や、ヒト消化管肉腫の中で最も頻度の高い消化管ストローマ腫瘍（Gastrointestinal stromal tumor；ＧＩＳＴ）や、婦人科領域で最も頻度の高い子宮筋腫に対して治療効果をもつことをインビトロの細胞培養系または動物実験系で確認した。本発明は上記の知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１９】
すなわち本発明は、（１）細胞特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子又はヒトＳＭ２２α遺伝子のプロモーターを含む領域と、前記プロモーターを含む領域の下流に組み込まれたヘルペスウイルスの複製開始に必要な転写因子をコードするＩＣＰ４遺伝子及びマーカー遺伝子、並びに前記プロモーターを含む領域の上流に組み込まれた前記マーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子と、チミジンキナーゼ遺伝子を含む成体正常細胞に作用しない細胞特異的単純ヘルペスウイルスベクター（ＨＳＶベクター）であって、前記プロモーターを含む領域とＩＣＰ４遺伝子と２種類のマーカー遺伝子とを含むＤＮＡ断片がリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子座に組み換えにより挿入されており、前記２種類のマーカー遺伝子の発現を指標にして得られる、チミジンキナーゼ遺伝子を利用して所望の時期にその複製を抑制しうることを特徴とする成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターや、（２）ヒトカルポニン遺伝子のプロモーターを含む領域が、配列番号２に示される塩基配列からなるヒトカルポニン遺伝子プロモーターを含む領域であることを特徴とする上記（１）記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターや、（３）配列番号２に示される塩基配列を含む領域が、配列番号３に示される塩基配列を含む領域であることを特徴とする上記（２）記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターや、（４）細胞特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子のプロモーターを含む領域が、配列番号２又は配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有する塩基配列を含む領域であることを特徴とする上記（１）記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターや、（５）プロモーターを含む領域の上流にエンハンサーが組み込まれていることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターや、（６）エンハンサーが４Ｆ２エンハンサーであることを特徴とする上記（５）記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターや、（７）ＩＣＰ４遺伝子のさらに下流に、目的タンパク質をコードするＤＮＡが連結され、前記プロモーターを含む領域の制御下に目的タンパク質を発現することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターや、（８）目的タンパク質をコードするＤＮＡが、ＩＲＥＳ（internalribosomalentry site）を介してＩＣＰ４遺伝子に連結されていることを特徴とする上記（７）記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターや、（９）目的タンパク質をコードするＤＮＡが、アポトーシス関連遺伝子であることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターや、（１０）目的タンパク質をコードするＤＮＡが、血管新生抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターに関する。
また本発明は、（１１）目的タンパク質をコードするＤＮＡが、癌転移抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターや、（１２）目的タンパク質をコードするＤＮＡが、癌抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターや、（１３）細胞特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子のプロモーターを含む領域と、前記プロモーターを含む領域の下流に組み込まれたヘルペスウイルスの複製開始に必要な転写因子をコードするＩＣＰ４遺伝子及びマーカー遺伝子、並びに前記プロモーターを含む領域の上流に組み込まれた前記マーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子と、チミジンキナーゼ遺伝子を含む成体正常細胞に作用しない細胞特異的単純ヘルペスウイルスベクター（ＨＳＶベクター）であって、前記プロモーターを含む領域とＩＣＰ４遺伝子と２種類のマーカー遺伝子とを含むＤＮＡ断片がリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子座に組み換えにより挿入されており、前記２種類のマーカー遺伝子の発現を指標にして得られる、チミジンキナーゼ遺伝子を利用して所望の時期にその複製を抑制しうる成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターを含むことを特徴とする治療薬や、（１４）ヒトカルポニン遺伝子のプロモーターを含む領域が、配列番号２に示される塩基配列からなるヒトカルポニン遺伝子プロモーターを含む領域であることを特徴とする上記（１３）記載の治療薬や、（１５）配列番号２に示される塩基配列を含む領域が、配列番号３に示される塩基配列を含む領域であることを特徴とする上記（１４）記載の治療薬や、（１６）細胞特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子のプロモーターを含む領域が、配列番号２又は配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有する塩基配列を含む領域であることを特徴とする上記（１３）記載の治療薬に関する。
さらに本発明は、（１７）プロモーターを含む領域の上流にエンハンサーが組み込まれていることを特徴とする上記（１３）〜（１６）のいずれか記載の治療薬や、（１８）エンハンサーが４Ｆ２エンハンサーであることを特徴とする上記（１７）記載の治療薬や、（１９）ＩＣＰ４遺伝子のさらに下流に、目的タンパク質をコードするＤＮＡが連結され、前記プロモーターを含む領域の制御下に目的タンパク質を発現することを特徴とする上記（１３）〜（１８）のいずれか記載の治療薬や、（２０）目的タンパク質をコードするＤＮＡが、ＩＲＥＳ（internalribosomalentry site）を介してＩＣＰ４遺伝子に連結されていることを特徴とする上記（１９）記載の治療薬や、（２１）目的タンパク質をコードするＤＮＡが、アポトーシス関連遺伝子であることを特徴とする上記（１３）〜（２０）のいずれか記載の治療薬や、（２２）目的タンパク質をコードするＤＮＡが、血管新生抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする上記（１３）〜（２０）のいずれか記載の治療薬や、（２３）目的タンパク質をコードするＤＮＡが、癌転移抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする上記（１３）〜（２０）のいずれか記載の治療薬や、（２４）目的タンパク質をコードするＤＮＡが、癌抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする上記（１３）〜（２０）のいずれか記載の治療薬や、（２５）細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターを含む領域が活性化され得る細胞又は該遺伝子を発現する細胞に、細胞特異的に発現するヒトカルポニン遺伝子又はヒトＳＭ２２α遺伝子のプロモーターを含む領域と、前記プロモーターを含む領域の下流に組み込まれたヘルペスウイルスの複製開始に必要な転写因子をコードするＩＣＰ４遺伝子と、チミジンキナーゼ遺伝子を含む細胞特異的単純ヘルペスウイルスベクター（ＨＳＶベクター）であって、前記プロモーターを含む領域とＩＣＰ４遺伝子を含むＤＮＡ断片がリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子座に組み換えにより挿入されている組み換え後のウイルス混合液を感染させ、ベクター内に組み込んだ前記プロモーターをもつマーカー遺伝子と、前記プロモーターとは異なるプロモーターをもつ前記マーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子の２種類のマーカー遺伝子の発現を指標にして、アガロースゲルオーバーレイ法を用いず、単一クローンにまで精製することを特徴とする細胞特異的発現複製ベクターの製造方法や、（２６）細胞が、ＩＣＰ４（−）細胞であることを特徴とする上記（２５）記載の細胞特異的発現複製ベクターの製造方法に関する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターとしては、細胞特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域を所定の遺伝子の上流に組み込んだ成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターにおいて、前記細胞特異的発現複製ベクターに存在するチミジンキナーゼ（Thymidine kinase）遺伝子を利用して所望の時期にその複製を抑制しうるベクターであれば特に制限されるものではないが、腫瘍細胞特異的、腫瘍新生血管の増殖平滑筋特異的、増殖性血管病変における増殖平滑筋特異的、糸球体腎炎における増殖メサンギウム細胞特異的、又は線維症における増殖筋線維芽細胞特異的な発現複製ベクターが好ましく、上記細胞特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域としては、細胞特異的に発現している遺伝子のプロモーター領域や該プロモーターの一部の領域を挙げることができ、より具体的には、カルポニン遺伝子のプロモーターの−２６０から−２１９までの配列番号１に示される塩基配列を含む領域、好ましくは配列番号２に示される塩基配列からなるヒトカルポニン遺伝子プロモーター、より好ましくは配列番号３に示される塩基配列からなるヒトカルポニン遺伝子プロモーターとその構造遺伝子の一部を含む領域を例示することができる。また、細胞特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域として、上記配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ転写開始制御活性を有する塩基配列、例えばマウス、ラット及びブタ由来のカルポニンプロモーターのそれに相同な領域を含む領域を例示することができる。
【００２３】
上記の他、細胞特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域として、増殖平滑筋細胞を攻撃の標的にする場合は、ＳＭ２２α遺伝子のプロモーター領域（ヒトＳＭ２２α遺伝子では−４８０から−２６までの配列；GenBank accession# D84342-D84344、マウスやラットあるいはその他の哺乳動物由来のＳＭ２２α遺伝子ではそれに相同な領域）、内皮細胞を標的にする場合は、Ｆｌｋ−１のプロモーター領域又はＦｌｔ−１遺伝子など内皮細胞特異的遺伝子のプロモーター領域を用いることができる。これらの場合にも、一部構造遺伝子を含む領域を転写開始制御領域とすることもできる。
【００２４】
上記細胞特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域の上流に、転写を著しく活性化するエンハンサーを連結することが好ましく、かかるエンハンサーとしてはアデノウイルス初期遺伝子のエンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルス末端反復配列のエンハンサー、ヒストンＨ２Ａ遺伝子エンハンサー、免疫グロブリンエンハンサー、インスリン遺伝子エンハンサー、ｃ−ｆｏｓ遺伝子エンハンサー、Ｔ細胞抗原受容体遺伝子エンハンサー、筋型クレアチンキナーゼ遺伝子エンハンサー、ヒト４Ｆ２重鎖（ヘビーチェイン）転写エンハンサー等のエンハンサーであれば特に制限されないが、細胞特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域が、カルポニン遺伝子のプロモーターの−２６０から＋７３までの配列を含む領域の場合、アミノ酸トランスポーターの活性化因子であると考えられている膜貫通構造を一回しか持たない二型膜糖タンパク質である４Ｆ２ヘビーチェイン遺伝子のエンハンサーであるヒト４Ｆ２重鎖転写エンハンサー（配列番号４）等の４Ｆ２エンハンサーが転写効率を著しく高めうる点で好ましい。
【００２５】
本発明の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターの作製に用いられる所定の遺伝子としては、ウイルスの複製の開始又は維持に必要な遺伝子であれば特に制限されるものではなく、例えば、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子、ＩＣＰ６（Ribonucleotide reductase）遺伝子などのウイルス複製関連遺伝子を挙げることができ、中でもヘルペスウイルスの複製開始に必要な転写因子をコードする遺伝子（ＩＣＰ４）を好適に例示することができる。また、これら遺伝子は、転写開始制御領域の下流に位置する本来の構造遺伝子の一部又は全部と上記所定の遺伝子がインフレームで結合したものでもよく、例えば、カルポニン蛋白質のＮ末側の一部とＩＣＰ４蛋白質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを具体的に挙げることができる。
【００２６】
本発明の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターとして、所定の遺伝子のさらに下流に、所定の遺伝子とは異なる目的タンパク質をコードするＤＮＡが連結され、前記転写開始制御領域の制御下に目的タンパク質を発現することができる細胞特異的発現複製ベクター、具体的には、上記目的タンパク質をコードするＤＮＡが、ＩＲＥＳ(internal ribosomal entry site;米国特許第４９３７１９０号明細書)を介して所定の遺伝子に連結されている細胞特異的発現複製ベクターを好適に挙げることができる。このＩＲＥＳ部分にカルポニンのホモログであるＳＭ２２α遺伝子のプロモーターを連結することもできる。かかるヒトＳＭ２２αプロモーター配列は本発明者らが最初にクローニングし、報告しており(J. Biochem. (Tokyo) 122, 157-167, 1997)、プロモーター活性に重要な部分（ヒトＳＭ２２αプロモーター領域のＢａｍＨＩ−ＤｒａＩ断片４４５ｂｐ）の塩基配列を配列番号５として示す。その他、ＩＲＥＳに代えて、ＣＭＶプロモ−タ−やＣＡＧ プロモーター エンハンサーを用いると、カルポニンのプロモーターの制御から外れ、細胞非選択的に下流の目的タンパク質をコードする遺伝子を発現させることができる。
【００２７】
上記目的タンパク質をコードするＤＮＡとしては、アポトーシスの促進に関連する遺伝子や、血管新生抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡや、癌転移抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡや、癌抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡ等を挙げることができ、これらは２以上連結してもよい。上記アポトーシス関連遺伝子としては、Ｂｃｌ−ｘｓ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂｃｌ−Ｇｓ／Ｂｒａ、Ｂｃｌ−ＧＬ、Ｂｃｌ−Ｒａｍｂｏ、Ｈｒｋ／ＤＰ５、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ／Ｂｌｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、ＢｉｍＬ，Ｓ，ＥＬ／ＢｏｄＬ，Ｍ，Ｓ、Ｎｏｘａ／ＡＰＲ、Ｐｕｍａ等のアポトーシス促進遺伝子を、血管新生抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡとしては、アンジオスタチン、エンドスタチン、可溶性Ｆlk-１、可溶性Ｆlt-１、可溶性ＦＬＴ４、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２などのドミナントネガティブ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを、癌転移抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡとしては、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤、ウシラクトフェリン（ｂＬＦ）などのタンパク質をコードするＤＮＡを、癌抑制作用をもつタンパク質をコードするＤＮＡとしては、ｐ２１、ｐ１６、ｐ１５等の細胞周期抑制物質や、ｐ５３、Ｒｂ、ＩＲＦ−１、ＡＰＣ等の細胞増殖抑制物質をコードするＤＮＡを、それぞれ具体的に例示することができるがこれらに限定されるものではない。
【００２８】
上記目的タンパク質をコードするＤＮＡとして、ＥＧＦＰ ｃＤＮＡや、ルシフェラーゼ（Luciferase）遺伝子等のマーカータンパク質をコードする遺伝子を挙げることができ、これらマーカータンパク質を発現することができる細胞特異的発現複製ベクターは、スクリーニングや各種実験等においてきわめて有用である。
【００２９】
本発明の成体では正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターの作製に用いられるウイルスベクターの骨格としては、骨・軟部肉腫、平滑筋肉腫、消化管ストローマ腫瘍（ＧＩＳＴ）、悪性中皮腫、悪性繊維性組織球腫（ＭＦＨ）、繊維肉腫、悪性髄膜腫、子宮筋腫、神経鞘腫等の腫瘍細胞又は腫瘍新生血管の増殖平滑筋あるいは血管周細胞に感染又は遺伝子を導入し発現することができるベクターが好ましく、かかるベクターとしては、染色体、エピソーム、リポソーム及びウイルスに由来する発現ベクターを例示することができるが、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、単純ヘルペスウイルスベクター（ＨＳＶベクター）等のウイルスベクターが好ましく、中でも、ＨＳＶベクターとアデノウイルスベクター、特に条件付き複製可能型ＨＳＶベクター、又は条件付き複製可能型アデノウイルスベクターが、遺伝子発現の高効率性、増殖細胞特異的細胞傷害活性などの点で好ましい。上記条件付き複製可能型ＨＳＶベクターとして、例えば、リボヌクレオチドリダクターゼ（Ribonucleotide reductase）をコードするＤＮＡが欠失しているベクターを用いることにより、本発明の成体正常細胞に作用せず、ベクターの複製と遺伝子の発現を制御できる細胞特異的発現複製ベクターを好適に作製することができる。
【００３０】
本発明の成体では正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターの発現複製方法としては、前記の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターを、生体細胞組織、好ましくは骨・軟部肉腫、平滑筋肉腫、消化管ストローマ腫瘍、悪性中皮腫、悪性繊維性組織球腫、繊維肉腫、悪性髄膜腫、神経鞘腫等の腫瘍が生じている組織の他、ステント留置後や臓器移植後の血管狭窄組織若しくは動脈狭窄組織、腎炎組織又は線維症組織、又はこれら組織を含む器官に直接導入又は腫瘍を養う血管系から注入、又は血管内にステント等を用いて直接注入し発現複製させる方法、又は腫瘍新生血管の増殖平滑筋を攻撃の標的とする場合は、悪性固形腫瘍の種類がいかなるものであれ、直接導入又は腫瘍を養う血管系から注入し、発現複製させる方法であれば、特に制限されるものでない。また、本発明の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターの遺伝子、タンパク質又はペプチドの発現複製・抑制方法としては、前記の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターを、上記生体細胞組織に導入して発現複製させ、その後の所望の時期に、例えば、アシクロビル（aciclovir）、ガンシクロビル（ganciclovir）等の抗ウイルス薬を用いて、細胞特異的発現複製ベクターの発現複製を抑制する方法であれば、特に制限されるものでない。そしてまた、本発明の治療薬としては、前記本発明の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターを有効成分として含むものであればどのようなものでもよく、かかる治療薬としては生体細胞組織、好ましくは上記悪性腫瘍、線維症、増殖性血管病変、増殖性糸球体腎炎等に対する治療薬を具体的に例示することができる。
【００３１】
本発明の線維症及び悪性腫瘍の治療方法としては、前記本発明の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターを、肺、肝臓などの線維症組織又は乳がん、胃がん、膵臓がんなどの悪性腫瘍組織に導入し、遺伝子、タンパク質又はペプチドを発現させる方法であれば特に制限されず、なかでも、増殖筋線維芽細胞だけを選択的に破壊する方法や、腫瘍新生血管の増殖平滑筋又は血管周細胞だけを選択的に破壊する方法が好ましい。悪性腫瘍が生じている組織に導入する方法としては、悪性腫瘍に上記細胞特異的発現複製ベクターを直接注入する方法又は動静脈投与等の腫瘍を潅流する血管系に注入する方法を好適に例示することができる。本発明の増殖性血管病変の治療方法としては、前記本発明の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターを、血管狭窄組織又は動脈硬化組織、糖尿病性網膜症組織に導入し、遺伝子、タンパク質又はペプチドを発現させる方法であれば特に制限されず、なかでも、増殖平滑筋細胞又は血管周細胞だけを選択的に破壊する方法を好適に例示することができる。また、本発明の増殖性糸球体腎炎の治療方法としては、前記本発明の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターを、腎炎組織に導入し、遺伝子、タンパク質又はペプチドを発現させる方法であれば特に制限されず、なかでも、増殖メサンギウム細胞だけを選択的に破壊する方法を好適に例示することができる。そして、本発明の上記治療方法においては、細胞特異的発現複製ベクターの発現複製を、治療終了後等の所望の時期に、抑制することを大きな特徴としている。
【００３２】
本発明の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターの生体内分布を検出する方法としては、前記本発明の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターを、生体細胞組織に導入し、発現複製させて前記細胞特異的発現複製ベクターによるチミジンキナーゼ活性を検出・測定することを特徴とし、具体的には、124Ｉでラベルしたウラシル誘導体ＦＩＡＵを生体に投与し、Positron Emission Tomographyにより124Ｉを検出・測定することにより、細胞特異的発現複製ベクターの生体内分布を検出することができる(Nature Med. 7, 859-863,
2001)。
【００３３】
本発明の細胞特異的発現複製ベクターの製造方法としては、細胞特異的に発現する遺伝子の転写開始制御領域が活性化され得る細胞又は該遺伝子を発現する細胞、好ましくはＩＣＰ４（−）細胞に、前記本発明の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターを含む相同組み換え後のウイルス混合液を感染させ、ベクター内に組み込んだ遺伝子の発現を指標にして、限界希釈法によって単一クローンにまで精製するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではなく、かかるスクリーニングによる本発明の細胞特異的発現複製ベクターの製造方法の確立により、前記本発明の成体正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターをはじめて得ることができる。
【００３４】
【実施例】
以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例Ａ［方法と材料］
Ａ−１（細胞、培養方法、抗体、及びウイルス）
ヒト平滑筋肉腫細胞株ＳＫ−ＬＭＳ−１（ＨＴＢ−８８）、及びベロ細胞（ＣＣＬ−８１）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culuture Collection）から購入した。ヒト骨肉腫細胞株ＯＳＴ（ＲＣＢ０４５４）は、理研ジーンバンク（RIKEN GENE BANK）から購入した。ＩＣＰ４遺伝子を導入したベロ細胞、Ｅ５細胞は、N. Deluca（University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh）から供与されたものを用いた。ヒト悪性線維性組織球種細胞株（ＭＦＨ−ＡＩ）は、神奈川県立がんセンターの矢野間博士より供与されたものを用いた。ヒト消化管ストローマ腫瘍（ＧＩＳＴ）細胞とヒト子宮筋腫細胞は、カルポニンタンパク質を発現していることを免疫組織化学によって確認した手術標本から腫瘍塊を無菌的に摘出し、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ；Sigma Cat.# C-9722）溶液で処理し、初代培養細胞を分離し、ベクターの感染実験にはＲＰＭＩ１６４０培地で３〜４世代継代培養したものを用いた。ＳＫ−ＬＭＳ−１は１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したイーグルＭＥＭで培養した。ＯＳＴ、ベロ及びＥ５細胞は、ＤＭＥＭで培養した。ＭＦＨ−ＡＩはＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。全ての培地には、最終濃度で１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（Upstate Biotechnologies）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンがそれぞれ含まれている。また、上記全ての細胞は、加湿された５％のＣＯ2条件下で３７℃にて培養した。
【００３５】
上記ＭＦＨ−ＡＩ細胞を、６週齢の雌の無胸腺症ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ−ｎｕ／ｎｕ）（日本ＳＬＣ社製）の体側部に皮下注射して、腫瘍を定着させた。２ヶ月後に解剖し、肺に転移した腫瘍塊を無菌的に摘出し、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ；Sigma Cat.# C-9722）溶液で処理し、細胞を分離した。この細胞１×１０6個を６週齢雌の無胸腺症ヌードマウスの尾静脈から注入した。１ヶ月後再び肺に転移した腫瘍塊から前回と同様の方法で個々の腫瘍細胞を分離した。この操作をさらにもう１回繰り返し、ヒト悪性線維性組織球種ＭＦＨ−ＡＩ細胞の高肺転移性の細胞株ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞を分離した。
【００３６】
ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２のＩＣＰ４タンパク質に対するモノクローナル抗体（clone No.1101）は、Goodwin Institute for Cancer Researchのものを用いた。イムノブロット分析は、文献（Int. J. Cancer 79, 245-250, 1998）記載の方法と同様に行った。化学ルミネッセンス（ＥＣＬ；Amersham Pharmacia Biotech社製）は、製造者のプロトコルに従って結合抗体を視覚化した。また、それぞれＩＣＰ４導入Ｖｅｒｏ Ｅ５細胞又はベロ細胞に低多重度で感染させることにより生成した、ＨＳＶのＩＣＰ４欠損変異体ｄ１２０（J. Virol. 56, 558-570, 1985）及びＨＳＶのＩＣＰ６（ribonucleotide reductase）欠損変異体ｈｒＲ３は、N. Deluca又はS. Weller博士（University of Connecticut Health Center, Farmington）からそれぞれ供与されたものを用いた。
【００３７】
Ａ−２（ＲＮＡの調製とＲＴ−ＰＣＲ分析）
全ＲＮＡはIsogene RNA extraction kit（Nippon Gene社製）を用いて培養した細胞又は組織からそれぞれ抽出し、文献（Int. J. Cancer 79, 245-250, 1998）記載の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＰＣＲ増幅の条件としては、９４℃で４０秒間変性させ、６０℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で９０秒間伸長反応させるというサイクルを３０回繰返し行った。ヒトカルポニンプライマーとしては、5'-gagtgtgcagacggaacttcagcc-3'［フォーワードプライマー１（ＦＰ１）；nt# 10-33 GenBank D17408；配列番号６］と5'-gtctgtgcccagcttggggtc-3'［リバースプライマー１（ＲＰ１）；nt# 660-680；配列番号７］を、コントロールとしてのＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）のプライマーとしては、5'-cccatcaccatcttccagga-3'［フォーワードプライマー２（ＦＰ２）；nt# 342-360；配列番号８］と5'-ttgtcataccaggaaatgagc-3'［リバースプライマー２（ＲＰ２）；nt# 1052-1070；配列番号９］を用いて、それぞれ６７１ｂｐと７３１ｂｐのＤＮＡを増幅させた。
【００３８】
Ａ−３（ヒトカルポニンプロモーターの単離）
文献（J. Biochem. 120, 18-21, 1996）記載の方法に従い、ヒトゲノムλＥＭＢＬ３ファージライブラリーのスクリーニングを行って、ヒトカルポニン遺伝子の５′上流側を含むゲノムクローンを単離した。５′側が欠失した断片であるｐ−１１５９Ｌｕｃ、ｐ−３８５Ｌｕｃ、ｐ−３４３Ｌｕｃ、ｐ−３１０Ｌｕｃ、ｐ−２９９Ｌｕｃ、ｐ−２８８Ｌｕｃ、ｐ−２６０Ｌｕｃ、ｐ−２３９Ｌｕｃ、ｐ−２１９Ｌｕｃ、ｐ−２０１Ｌｕｃ、ｐ−１７６Ｌｕｃ、ｐ−１５３Ｌｕｃをゲノムクローンを鋳型にしてＰＣＲ法で増幅することにより作製した。番号は、以後＋１と表示されるＡＴＧ翻訳開始コドンの上流に位置するＤＮＡ断片の５′末端を示している。欠失したこれらの断片は＋７３の位置に共通の３′末端を有している。DQS-2000L DNA sequencer（SHIMADZU社製）を製造者のプロトコールに従って使用し、該クローン断片のヌクレオチド配列を決定し、その配列は文献（J. Biochem. 120, 18-21, 1996）に記載の配列（DDBJ/GenBankTM/ EMBL database；accession No. D85611）と同一であることを確認した。文献（Cancer Res. 61, 3969-3977, 2001）に記載の方法によって、最小の発現調節領域（−２６０〜＋７３）を同定した。
【００３９】
Ａ−４（トランスフェクション及びルシフェラーゼ分析）
トランスフェクションする２４時間前に、あらかじめ培養した細胞を分割し、プレート上に播いた。製造者のプロトコルに従い１ウエル当たり、１．２μｇのプロモータープラスミドと、０．３μｇのpCAGGS/β-gal 関連プラスミドと、３．７５μｌのＦｕＧＥＮＥTM６トランスフェクション試薬（Roche社製）とを６ウエルディッシュに注入し、細胞（５×１０4）をトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、１００μｌ／ウエルの細胞溶解緩衝液（PicaGeneTM ルシフェラーゼ分析システム、Toyo Ink社製）中で細胞を回収した。４℃で１２０００ｇ×５分間の遠心分離を行った後、上清（２０μｌ又は３０μｌ）をルシフェラーゼアッセイ及びβ−ガラクトシダーゼアッセイにそれぞれ使用した。ルシフェラーゼ活性はBLR-201 luminescence reader（Aloka社製）を用いて測定した。β−ガラクトシダーゼアッセイは、文献（J. Biochem. (Tokyo) 122, 157-167, 1997）記載の方法に準じてβガラクトシダーゼ酵素分析システム（Promega社製）を用いて行った。再現性を確認するため、全実験は最低三回繰り返した。細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することによりトランスフェクション効率を決定し、その値に応じて、ルシフェラーゼ活性（光ユニット）を補正した。ＳＶ４０エンハンサー及びＳＶ４０プロモーターを含むｐＳＶ２−Ｌｕｃ遺伝子の発現を比較することにより、種々の細胞株のトランスフェクション効率を評価した。データは、ｐＳＶ２−Ｌｕｃの値に対してノーマライズした吸光度±Ｓ．Ｅ．を％として表している。
【００４０】
Ａ−５（ウィルスの調製）
ＩＣＰ４のコード領域を含むｐＧＨ１０８（J. Virol. 56, 558-570, 1985）由来の４．１ｋｂの平滑末端ＳａｌＩ−ＭｓｅＩ断片（Johns Hopkins School of MedicineのHayward博士より提供）を、ｐＡＭＰ１プラスミドにクローニングした３３３ｂｐヒトカルポニンプロモーター（−２６０〜＋７３）の下流の平滑末端ＢａｍＨＩサイトに挿入し、及びかかるプラスミドのＳｍａＩサイトにヒト４Ｆ２重鎖転写エンハンサー（Mol. Cell Biol. 9, 2588-2597, 1989）（Harvard Medical SchoolのLeiden氏より提供）の４４４ｂｐのＮｏｔＩ断片をサブクローンした。このｐＡＭＰ１／ＣＡＬＰ−ＩＣＰ４プラスミドの３'側にあるＨｉｎｄIIIサイトを平滑化し、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰプラスミド（Clontech社）を、ＢａｍＨＩとＡｆｌIIとを用いて二重消化させることにより得られた１５７６−ｂｐ断片をサブクローンした。このＢａｍＨＩ−ＡｆｌII断片は、ＩＲＥＳ配列（米国特許第４９３７１９０号明細書）とＥＧＦＰ配列（米国特許第５６２５０４８号及び第５８０４３８７号明細書）およびＳＶ４０由来ポリＡシグナルから構成されている。次に、ｐＡＭＰ１／ＣＡＬＰ−ＩＣＰ４−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰプラスミドをＥｃｏＲＩとＳｐｈＩとを用いて二重消化させることにより得られた６．７−ｋｂ断片を平滑化し、ｐＫＸ２βＧ３組換えベクターのＳｔｕＩ平滑末端サイトにサブクローニングした（ｐＫＸ２βＧ３／ＣＡＬＰ−ＩＣＰ４−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ）。ｐＫＸ２βＧ３組換えベクター（Coneticut大学のWeller氏より提供）は、ＩＣＰ６コード配列の２．３−ｋｂＸｈｏＩ断片（ｐＫｐＸ２）とそのＢａｍＨ１サイトに挿入された３．０−ｋｂの大腸菌（Escharicia coli）由来のＬａｃＺ配列及びｐＵＣ１９のバックボーンからなる（J. Virol. 62, 196-205, 1988）。
【００４１】
続いて、上記プラスミドｐＫＸ２βＧ３／ＣＡＬＰ−ＩＣＰ４−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰをＸｈｏＩサイト（ｐＫＸ２βＧ３の５’側ＩＣＰ６配列の５’側にあるＸｂａＩサイトと３’側ＩＣＰ６配列の３’側にあるＨｉｎｄIIIサイトをともにＸｈｏＩサイトで置換したもの）で線状化し、ｐＵＣ１９配列を除去したｐＲＲΔ−ＣＡＬＰ−ＩＣＰ４−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰとｄ１２０ウイルスＤＮＡとを、製造者のプロトコルに従ってLipofectamineTM（GIBCO/BRL社製）を使用し、６ウエル組織培養プレート中のICP4cDNAを導入したＶｅｒｏＥ５細胞（２．５×１０5／ｗｅｌｌ）のサブコンフルエント単層培養にコトランスフェクションした。トランスフェクション３時間後に２０％ＤＭＥＭ培養液１ｍｌを添加し、９６時間後まで、4-hydroxymethylbenzoic acid（ＨＭＢＡ）０．５ｍｇ／ｍｌを含む前記培養液（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）で培養した。プラーク形成を確認した後、ＨＭＢＡを含まない１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで２４時間培養した。５００μｌ／ウエルのコールドウイルスバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）に細胞を懸濁し、凍結保存した。
【００４２】
超音波処理（３０秒間を３回）を組み合わせた凍結処理と解凍処理を三回行い，上記懸濁液を溶解した。懸濁液を段階的に希釈し、９６ウエル組織培養プレートのサブコンフルエント単層培養ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞に感染させた。感染後９６時間１ウエルあたり１００μｌの１１．３μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Lab.社製）を含む１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで培養した。プラーク形成を確認し得たウエルを蛍光顕微鏡下でのＧＦＰの発現を指標にしてスクリーニングした。ＧＦＰ陽性のプラークを含むウエルのＳＫ−ＬＭＳ−１単層培養細胞を前記培養液１００μｌに懸濁し、そのうちの６μｌを用いて、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を基質にしたβガラクトシダーゼ酵素活性を、βガラクトシダーゼ酵素分析システム（Promega社製）を用いて測定した。βガラクトシダーゼ酵素活性陽性のウエルのＳＫ−ＬＭＳ−１細胞懸濁液を５０００回転で５分間遠心し、ペレットを１００μｌ／ウエルのコールドウイルスバッファーに懸濁した。９６ウエル組織培養プレートを用いた同様の限界希釈感染・βガラクトシダーゼ酵素活性測定法をＶｅｒｏＥ５細胞を用いてさらに２回繰り返し、組換えウィルスベクターｄ１２・ＣＡＬＰ・ΔＲＲを単一のプラークとして精製した。ウイルスＤＮＡを精製した後、制限酵素ＸｈｏＩで消化し、ＩＣＰ６ｃＤＮＡのＸｈｏＩ断片（２．３−ｋｂ）をプローブにしたサザンブロット分析によりリボヌクレオチド還元酵素遺伝子座（ＩＣＰ６  ｏｒ  ＲＲ−ｌｏｃｕｓ）での組換えを確認し得た（図１）。
【００４３】
１０〜２０個の１５０ｃｍ2／tissue culture flasks（IWAKI CLASS社製）中のＥ５細胞に感染させ、４８時間後に剥離した細胞を回収することにより、ウィルスを調製した。４℃で５分間、４００×ｇで遠心分離を行って細胞を収集し、１０ｍｌのコールドウィルスバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）に懸濁した。超音波処理（３０秒間を３回）を組み合わせた凍結処理と解凍処理を三回行い、上記細胞を溶解した。４℃で５分間、１５００×ｇで遠心分離を行ったあと、その上清に対してさらに４℃で４５分間、１５０００×ｇで遠心分離を行った。その結果得られたペレットをコールドウィルスバッファーに懸濁し、ＶｅｒｏＥ５細胞におけるプラークアッセイにより精製したｄ１２・ＣＡＬＰ・ΔＲＲウィルスベクターの力価を決定した。
【００４４】
Ａ−６（インビトロでの細胞崩壊分析及びウィルス複製分析）
１％の熱不活性ＦＢＳ／ＰＢＳ中で、感染多重度（ＭＯＩ）が０．１〜０．００１ｐｆｕ／ｃｅｌｌで、６ウエル組織培養プレート中の細胞のサブコンフルエント単層培養にｄ１２・ＣＡＬＰ・ΔＲＲウィルスベクターを感染させた。かかる感染細胞を３７℃で１時間インキュベートし、その後、１％のＦＢＳと１１．３μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Lab.社製）を含む前記培地で培養した。感染の４８時間後、プラーク／ウエルの数を計測した。ウィルス複製分析のために、１２ウエル組織培養プレート中のＳＫ−ＬＭＳ−１細胞又はＯＳＴ細胞の単層培養（２×１０5細胞／ｗｅｌｌ）に、１％のＦＢＳ／ＰＢＳ中にて、感染多重度（ＭＯＩ）が０．１となるようにｄ１２・ＣＡＬＰ・ΔＲＲウィルスベクターを感染させた。接種したウィルスを１時間後に取り除き、上記細胞を前記培地でインキュベートした。所定の時間（１２時間、２４時間、４８時間）に、１００μｌのウィルスバッファーを用いて感染細胞をウエルから剥がした。細胞懸濁液（１μｌ）を１０-3、１０-4及び１０-5に希釈し、その後ＶｅｒｏＥ５細胞におけるウィルスの力価を決定した。
【００４５】
また、１％の熱不活性ＦＢＳ／ＰＢＳ中で、感染多重度（ＭＯＩ）が０．０１ｐｆｕ／ｃｅｌｌで、６ウエル組織培養プレート中のＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞（ヒト悪性線維性組織球種ＭＦＨ−ＡＩ細胞の高肺転移性細胞株）のサブコンフルエント単層培養にｄ１２・ＣＡＬＰ・ΔＲＲウィルスベクターを感染させた。また、感染多重度（ＭＯＩ）が０．１／ｃｅｌｌ又は０．０１／ｃｅｌｌで、６ウエル組織培養プレート中のヒトＧＩＳＴ細胞及びヒト子宮筋腫培養細胞のサブコンフルエント単層培養にｄ１２・ＣＡＬＰ・ΔＲＲウィルスベクターをそれぞれ感染させた。かかる感染細胞を３７℃で１時間インキュベートし、その後、１％のＦＢＳと１１．３μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Lab.社製）を含む前記培地で培養した。感染の７２時間後、Ｘ−Ｇａｌ染色しプラーク／ウエルの数を計測した。
【００４６】
Ａ−７（インビトロでのウィルス複製の抗ヘルペスウイルス剤ガンシクロビル(ganciclovir)に対する感受性分析）
１％の熱不活性ＦＢＳ／ＰＢＳ中で、感染多重度（ＭＯＩ）が０．０１ｐｆｕ／ｃｅｌｌで、２４ウエル組織培養プレート（５×１０4／ｗｅｌｌ）または６ウエル組織培養プレート（２．５×１０5／ｗｅｌｌ）中のＳＫ−ＬＭＳ−１細胞のサブコンフルエント単層培養にウィルスを感染させた。かかる感染細胞を３７℃で１時間インキュベートし、その後、１％のＦＢＳと１１．３μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Lab.社製）、種々の濃度（０〜１μｇ／ｍｌ）のガンシクロビル(ganciclovir)（和光純薬社製）を含む前記培地で培養した。感染の４８時間後に１ウェルあたりのプラーク数を計測した。
【００４７】
ＩＣＰ４発現のイムノブロット分析のため、ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞及びＯＳＴ細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）が０．０１となるようにｄ１２．ＣＡＬＰ又はウィルスバッファーのみをそれぞれ感染させ、２２時間培養したのち回収した。同量のタンパク質を９％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜（Bio-Rad社製）に移した。５％のスキムミルク（DIFCO Laboratories社製）を用いて、膜を室温で２時間ブロッキングし、その後、抗ＩＣＰ４抗体（希釈率１：１０００）を用いて、４℃で一晩インキュベートした。
【００４８】
Ａ−８（インビボでの処理及び組織学的分析）
ヒト皮下移植腫瘍に対するｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターの１回静脈内投与による治療効果を検討するために、ヒト悪性線維性組織球種ＭＦＨ−ＡＩ細胞１×１０7個を、６週齢の雌の無胸腺症ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕ）（日本ＳＬＣ社製）の体側部に皮下注射して、腫瘍を定着させた。腫瘍は、ヌードマウスに移植後１９日で直径６から７ｍｍ程度（５０〜７０ｍｍ3）に成長した。１×１０7ｐｆｕ／マウスのｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターを含む１００μｌのウィルス懸濁液（ｎ＝６）、あるいは同量のウィルス緩衝液（ｎ＝６）を、３０ゲージの針を用いてそれぞれ尾静脈内に１回注入した。注入後所定の時間に腫瘍を測定し、式［０．５３×長さ×幅の２乗］を用いて腫瘍容積を計算した。
【００４９】
また、ヒト肺転移腫瘍に対するｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターの静脈内投与による治療効果を検討するために、ヒト悪性線維性組織球種ＭＦＨ−ＡＩ細胞の高肺転移性の細胞株ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞１×１０6個を６週齢の雌の無胸腺症ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕ）（日本ＳＬＣ社製）の尾静脈から１回注射して肺転移腫瘍モデルを作製した。ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞を静脈注射した１４日後、組織学的研究のため、１×１０7ｐｆｕ／マウスのｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターを含む１００μｌのウィルス懸濁液を、３０ゲージの針を用いて１回静脈内投与し、その１３日後にマウスを絶命させ、肺転組織全体並びに脳、肝臓、腎臓、心臓、小腸、子宮及び卵巣を取り出し標本とした。これら標本を、２％のパラホルムアルデヒド、０．５％のグルタルアルデヒドを用いて、１ｍＭのＭｇＣｌ2を含むＰＢＳで、４℃で１晩固定した。続いて、Ｘ−Ｇａｌ（１ｍｇ／ｍｌ）、５ｍＭのＫ3Ｆｅ（ＣＮ6）、５ｍＭのＫ4Ｆｅ（ＣＮ6）及び１ｍＭのＭｇＣｌ2をＰＢＳ中に含む基質溶液に、該腫瘍を３７℃で４時間浸し、その後、３％のＤＭＳＯを含むＰＢＳで洗浄し、Ｘ−Ｇａｌ染色を行った。また、上記肺転組織全体の標本をブアン溶液［１５％（ｖ／ｖ）の飽和ピクリン酸溶液、１．６５％（ｖ／ｖ）のホルマリン、及び１％（ｖ／ｖ）の酢酸／ＰＢＳ］で固定し、パラフィンに包埋した。ポリ−Ｌ−リジンでコートしたマイクロスライドに、厚さ４μｍの切片をのせ、キシレン中で処理し、段階的濃度のアルコール溶液で脱水した。その後、Hematoxylin-Eosin染色を行い、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターによる腫瘍組織の破壊を倒立型顕微鏡（オリンパスＢＸ−５０）を用いて観察した。
【００５０】
次に、ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞１×１０6個又は５×１０5個を６週齢の雌の無胸腺症ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕ）（日本ＳＬＣ社製）の尾静脈から注射して肺転移腫瘍モデルを作製した。ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞を静脈注射した１７日目、２７日目及び３４日目に、１×１０7ｐｆｕ／マウスのｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターを含む５０μｌのウィルス懸濁液を、３０ゲージの針を用いて３回静脈内投与し、１３日後にマウスを絶命させ、肺転移腫瘍組織全体を取り出し、２％のパラホルムアルデヒド、０．５％のグルタルアルデヒドを用いて、１ｍＭのＭｇＣｌ2を含むＰＢＳで、４℃で１晩固定し、ヒト肺転移腫瘍に対するｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターの静脈内投与による治療効果を調べた。
【００５１】
Ａ−９（統計学的分析）
無対のＳｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを使って、統計的差異を確認した。差異はｐ＜０.０５で、統計的に有意であると考えられた。
【００５２】
実施例Ｂ［結果］
Ｂ−１（カルポニン陽性細胞における組換えＨＳＶベクターのインビトロでの選択的複製）
カルポニン陽性細胞及び増殖細胞中で選択的に複製するＨＳＶベクターを構築するため、４Ｆ２エンハンサー／−２６０カルポニンプロモーター／ＩＣＰ４／ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを含むＤＮＡ断片を、ＩＣＰ４-ＨＳＶ変異体ｄ１２０（J. Virol. 56, 558-570, 1985）のＲＲ(ICP6)遺伝子座（ＵL３６）に相同組み換え法を用いて挿入し、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターを作製した。ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターは、ＩＣＰ６プロモーターの制御下にβ−ガラクトシダーゼを発現し、カルポニンプロモーターの制御下にＩＣＰ４タンパク質とＥＧＦＰたんぱく質を発現させることが可能である（図１）。カルポニン発現ヒト平滑筋肉腫細胞株（ＳＫ−ＬＭＳ−１）とカルポニン非発現ヒト骨肉腫細胞株（ＯＳＴ）を使用して、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターのウィルス複製の細胞選択性を評価した。
【００５３】
ウィルス力価を感染多重度０．１（２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）のシングルステップグロースアッセイで評価した。ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターは、カルポニン陽性ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞中で複製したが、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲの力価は感染の７２時間後のカルポニン陰性ＯＳＴ細胞中ではＳＫ−ＬＭＳ−１細胞に比べて１／１０5程度に減少した（図２；参考写真１）。両細胞の増殖速度は同程度であった。感染２２時間後の細胞抽出物のイムノブロット分析を行った結果、ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞ではＩＣＰ４タンパク質が発現しているが、ＯＳＴ細胞ではＩＣＰ４タンパク質が発現していないことがわかった。これはウィルス複製分析結果と一致していた。これに対し、相同組み換えの親株であるｄ１２０ウィルスベクターは、ＳＫ−ＬＭＳ−１及びＯＳＴの培養物において子孫ウィルスの産生はまったく見られなかった。
【００５４】
６ウェルディッシュ中のＳＫ−ＬＭＳ−１細胞にｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターを感染させ、感染の９６時間後に、Ｘ−ｇａｌアガロースオーバーレイでβ−ガラクトシダーゼ発現細胞を青色に染色し、同時に倒立型蛍光顕微鏡で、ＥＧＦＰの発現を検証した。崩壊し死滅しつつある腫瘍細胞にβ−ガラクトシダーゼが発現し、その周囲の生細胞にＥＧＦＰが発現していることが確認できた（図３；参考写真２）。１個の細胞に、両者の発現が同時に存在する例も多数観察された。
【００５５】
Ｂ−２（組換えＨＳＶ−１ベクターの抗ヘルペスウイルス剤ガンシクロビル(ganciclovir)に対する感受性）
ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターをヒト悪性腫瘍の治療に応用する場合、最も重要な特性は、ＴＫ遺伝子をインタクトな状態でもつため、抗ヘルペスウイルス剤であるガンシクロビル(ganciclovir)に感受性を示すことである。２４ウェル（５×１０4／ｗｅｌｌ）ディッシュ中のＳＫ−ＬＭＳ−１細胞に、種々の濃度（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）のガンシクロビル(ganciclovir)存在下で、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターを多重感染度０．０１で感染させ、感染の４８時間後に、Ｘ−ｇａｌを基質にして染色し、１ウェルあたりのβ−ガラクトシダーゼ陽性のプラーク数を計測した。また、６ウェルディッシュ中のＶｅｒｏＥ５細胞（２．５×１０5／ｗｅｌｌ）に１μｇ／ｍｌのガンシクロビル(ganciclovir)存在下と非存在下で、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターを感染させ、感染の４８時間後に、Ｘ−ｇａｌを基質にして染色した（図４；参考写真３）。
【００５６】
ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞、ＩＣＰ４ ｃＤＮＡを導入したＶｅｒｏＥ５細胞共に、ガンシクロビル(ganciclovir)の存在下でｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターの複製が抑制された。ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞では、４０ｎｇ／ｍｌのガンシクロビル(ganciclovir)存在下で完全に抑制された。ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターは、野性型ウイルスよりも同薬剤に感受性が高いことが報告されている（Cancer Res. 54, 3963-3966, 2001）複製可能型ＨＳＶ−１変異体ｈｒＲ３と同等のガンシクロビル(ganciclovir)に対する感受性を示した。この結果は、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターが治療後にガンシクロビル(ganciclovir)またはアシクロビル(aciclovir)でウイルス感染細胞を除去できる安全策を備えていることを示している。
【００５７】
Ｂ−３（インビボでの処理及び組織学的分析）
ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞株がカルポニンのｍＲＮＡを発現しているかどうかを、ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞株の全ＲＮＡを対象とするＲＴ−ＰＣＲ分析により調べたところ、ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞株がカルポニンのｍＲＮＡを発現していることが確認された（図５ａ；参考写真４）。また、上記ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞株に、感染多重度０．０１のｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターを７２時間感染させた。ベクターの複製は、Ｘ−Ｇａｌ染色しプラーク形成を指標として評価した（図５ｂ；参考写真４）。その結果、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターはＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞内で複製され、ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞に対して細胞溶解活性を示すことが確認された。さらに、ＧＩＳＴ細胞及び子宮筋腫培養細胞に、感染多重度０．０１又は０．１のｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターをそれぞれ７２時間感染させた。ベクターの複製は、Ｘ−Ｇａｌ染色しプラーク形成を指標として評価した（図６；参考写真５）。その結果、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターはＧＩＳＴ細胞（６図ａ，ｂ）及び子宮筋腫培養細胞（６図ｃ，ｄ）内で複製され、０．０１ＭＯＩ（６図ａ，ｃ）及び０．１ＭＯＩ（６図ｂ，ｄ）の結果から投与量に依存して細胞溶解活性を示すことが確認され、特に、０．１ＭＯＩ（６図ｂ，ｄ）の投与では視野中のすべての腫瘍細胞へのｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターの感染が認められた。
【００５８】
ＭＦＨ−ＡＩ細胞により定着した皮下腫瘍に対するｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターのインビボでの抗腫瘍効果を調べた。ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞株の皮下移植腫瘍に対するｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターの１回静脈内投与による治療効果を経時変化として表した（図７）。０日に１×１０7ｐｆｕ／マウスのｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲを尾静脈から注入した。静脈注射後２９日目の治療（ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲ投与）群と未治療（ＰＢＳ投与）群の腫瘍体積（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．，ｎ＝６）は、それぞれ５００±１３６ｍｍ3と１８３±３３ｍｍ3であった。治療群は未治療群に比べて有意な抗腫瘍効果を示した。
【００５９】
ヒト肺転移腫瘍に対するｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲの静脈内投与によるインビボでの治療効果を調べた（図８；参考写真６）。ヒト悪性線維性組織球種ＭＦＨ−ＡＩ細胞の高肺転移性株ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞を用いた肺転移腫瘍モデルマウスの尾静脈から、１×１０7ｐｆｕ／マウスのｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターを注入後１３日目の肺転移腫瘍（図８ａ、ｂ）及び正常組織である脳（図８ｃ）、心臓（図８ｄ）、肝臓（図８ｅ）のＸ−Ｇａｌ染色、並びに、Hematoxylin-Eosin染色による肺転移腫瘍の組織学的解析（図８ｆ、ｇ）を行った。ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターの１回静脈内投与によって、肺転移巣にｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターの複製を示すＸ−Ｇａｌ染色と組織学的に腫瘍の壊死が認められたが、脳、心臓、肝臓などの正常組織ではベクターの感染と複製を示すＸ−Ｇａｌ染色は認められなかった。
【００６０】
次に、ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞の投与細胞数を１×１０6個又は５×１０5個とし、ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ細胞の投与後１７日目、２７日目及び３４日目に１×１０7ｐｆｕ／マウスのｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターを計３回静脈内投与した場合のヒト肺転移腫瘍の治療効果を調べた（図９；参考写真７）。ＭＦＨ−ＡＩ−ＬＭ腫瘍細胞１×１０6個又は５×１０5個を尾静脈から注射して作製した肺転移腫瘍モデルのいずれに対しても、ｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクター投与の治療群の肺転移腫瘍抑制効果は明らかであった。また、Hematoxylin-Eosin染色による組織学的解析によっても治療群での転移抑制効果が確認された。
【００６１】
【発明の効果】
間葉系細胞由来の悪性腫瘍すなわち肉腫は、化学療法や放射線療法に抵抗性で、外科的切除後も再発を繰り返し、最終的には肺、肝、腹膜などに転移し予後が悪い。わが国における症例数は、消化器外科領域のストローマ腫瘍（ＧＩＳＴ）、整形外科領域の骨・軟部肉腫を中心に婦人科領域の平滑筋肉腫、胸部・消化器外科領域の悪性中皮腫、脳外科領域の繊維肉腫、悪性髄膜腫、悪性神経鞘腫等を合わせて年間５０００例前後の初発例がある。全がんのおよそ１〜２％と少ないものの、若年者にも多発し化学療法に感受性のある一部の症例を除いては有効な治療法がないことから、新治療法の開発を切望する社会的要請が強い。肉腫の病因、病態に関連する遺伝子解析は、骨肉腫や平滑筋肉腫でｐ５３とＲｂ遺伝子、ＧＩＳＴでＫＩＴ遺伝子の変異、Ｅｗｉｎｇ肉腫や滑膜肉腫、脂肪肉腫で融合遺伝子の存在が報告されているが、まだ治療に応用できる段階にはない。また、これまでの動物実験で、ｐ５３やサイトカイン、自殺遺伝子である単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）などを種々のベクターを用いて肉腫細胞に直接導入する方法が試みられたが、十分な治療効果が得られていない。
【００６２】
遺伝子治療は、がん細胞に導入する遺伝子の細胞選択的な作用や発現プロモーターの活性、ウイルスベクターの感染導入など、いろいろなレベルでがん細胞選択性を高めることが可能であり、肉腫に対しても有望な治療法として注目されている。実際、オステオカルシンのプロモーターを用いてＨＳＶ−ｔｋを複製能力のないアデノウイルスベクターで骨肉腫選択的に発現させることにより、静脈内投与でも肺転移巣を有意に抑制し得ることが報告された（Cancer Gene Ther. 5, 274-280, 1998）。しかし、オステオカルシンは分化段階にある正常な骨芽細胞にも発現しているので、導入遺伝子の発現を制御するだけでは、がん細胞選択性を高めるには不十分である。加えて、分化のマーカー遺伝子のプロモーターによって細胞選択性を高めることは、一方でベクターの汎用性を低下させることであり、多種多様な組織、細胞に由来し、それぞれの症例数が限られている肉腫の場合、ベクター開発の費用対効果の面で不利である。
【００６３】
さらに、これまでの肉腫に対する実験的遺伝子治療に用いられた複製能力を欠如したウイルスベクターやリポソームベクターでは、すべてのがん細胞に治療遺伝子を導入することは不可能である。したがって、動物実験で延命効果は得られるものの持続的な抗腫瘍効果は期待できない。また、がん細胞への遺伝子導入効率が低ければ、それだけ大量のウイルスベクターが必要であり、過剰な免疫反応やアレルギー反応が起きる危険性も高まる。
【００６４】
難治性肉腫の治療には、何か従来の方法とは異なる全く新しいアプローチが必要であると考えられてきたが、その手がかりは得られていなかった。本発明の実施例はかかる要望等に応えうるものであり、本発明によると、肉腫に限らず悪性腫瘍等の特定の細胞で複製し腫瘍細胞を破壊しつつ特異的に治療遺伝子を発現する、正常細胞に作用しない細胞特異的発現複製ベクターを提供することができる。治療終了後に薬剤でウイルスの複製を停止させることができる安全策を備えたかかる細胞特異的発現複製ベクターを用いることにより、世界で最初のヒトを対象にした細胞選択的な発現複製ベクターを用いた遺伝子治療が可能となる。
カルポニン遺伝子は成体では主として平滑筋細胞に発現しており、特に血管平滑筋細胞の増殖は、腫瘍血管新生やステント留置後の血管狭窄、糖尿病性網膜症などの増殖性血管病変の原因であるため、本発明によって提供されるカルポニンプロモーターをもつ平滑筋細胞特異的発現複製ベクターで、増殖する平滑筋細胞を選択的に破壊することにより、これらの疾患をも治療することが可能である。中でも、本発明によってはじめて可能となる腫瘍血管平滑筋を選択的に破壊する治療法は、すべての固形癌に有効ながん治療法として、画期的な効果をもたらす可能性がある。さらに、カルポニンを発現するメサンギウム細胞の増殖によっておこる増殖性糸球体腎炎や、カルポニンを発現する筋線維芽細胞の増殖によっておこる肺や肝臓などの線維症に対する治療剤としても有効に作用し得るものである。
【００６５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｄ１２・ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクター作製の手順とその構造を示す図である。左は、ｐＫｐＸ２（ＩＣＰ６のＸｈｏＩ断片）とＩＣＰ６のＳｔｕＩ−ＸｈｏＩ断片をＤＩＧ標識プローブにしたサザンブロットの結果を示す。ｄ１２０は相同組み換えを行った親株で、２つのＩＣＰ４遺伝子をともに欠失したＫＯＳ株由来の変異体である。ｈｒＲ３は、野性型であるＫＯＳ株のRibonucleotide reductase (ＩＣＰ６)遺伝子のＢａｍＨＩサイトにＬａｃＺ遺伝子が挿入され（ｐＫＸ２βＧ３）、結果としてＩＣＰ６を欠失している。
【図２】インビトロでのカルポニン陽性悪性腫瘍細胞（ＳＫ−ＬＭＳ−１平滑筋肉腫）に対するｄ１２・ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターの選択的細胞傷害活性を示す図である。左上は、ＲＴ−ＰＣＲでカルポニンｍＲＮＡの発現をみたもので、ＯＳＴ骨肉腫細胞では、カルポニンはほとんど発現していない。右はプラークのＸ−Ｇａｌ染色である。
【図３】インビトロでのカルポニン陽性悪性腫瘍細胞（ＳＫ−ＬＭＳ−１平滑筋肉腫）におけるｄ１２・ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターの複製をＬａｃＺ遺伝子の発現を示すＸ−Ｇａｌ染色で示し、カルポニンプロモーターの制御下に発現するＥＧＦＰ蛋白を蛍光顕微鏡で観察した図である。ＬａｃＺとＥＧＦＰが共に発現している細胞を多数観察することができる。
【図４】インビトロでのカルポニン陽性悪性腫瘍細胞（ＳＫ−ＬＭＳ−１平滑筋肉腫）およびＩＣＰ４ｃＤＮＡを導入したＶｅｒｏＥ５細胞におけるｄ１２・ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターの複製と細胞傷害活性のガンシクロビル(ganciclovir)感受性を示す図である。左はガンシクロビル(ganciclovir)高感受性のｈｒＲ３と比較したものであり、右は、チミジンキナーゼを欠失するｄ１２・ＣＡＬＰ（特願２００１−１４３９９９）と比較したもので、１μｇ／ｍｌのガンシクロビル(ganciclovir)存在下で細胞傷害活性をみたものである。ｄ１２・ＣＡＬＰはガンシクロビル(ganciclovir)に感受性がない。
【図５】カルポニンｍＲＮＡの発現及びインビトロでの細胞崩壊分析及びベクター複製分析を示す図である。ａは、ヒト肉腫（悪性線維性組織球腫）におけるカルポニン（ｈ１）ｍＲＮＡの発現を示す。ｂは、腫瘍に対してｄ１２．ＣＡＬＰ△ＲＲウィルスベクター０．０１ＭＯＩを感染させたときのプラークのＸ−Ｇａｌ染色である。
【図６】インビトロでの細胞崩壊分析及びベクター複製分析を示す図である。ａは、ＧＩＳＴ細胞に対して０．０１ＭＯＩの、ｂは、ＧＩＳＴ細胞に対して０．１ＭＯＩの、ｃは、子宮筋腫培養細胞に対して０．０１ＭＯＩの、ｄは、子宮筋腫培養細胞に対して０．１ＭＯＩの、ｄ１２．ＣＡＬＰ△ＲＲウィルスベクターをそれぞれ感染させたときのプラークのＸ−Ｇａｌ染色である。
【図７】インビボでの皮下腫瘍に対する抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図８】インビボでの肺転移腫瘍におけるｄ１２．ＣＡＬＰ△ＲＲウィルスベクターの１回静脈内投与における複製の分析及び抗腫瘍効果を示す図である。
【図９】インビボでのｄ１２．ＣＡＬＰΔＲＲウィルスベクターの３回静脈内投与によるヒト肺転移腫瘍の治療効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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