(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物または組織培養物中の植物細胞における標的遺伝子の発現を抑制し、遅延させ、又はその他の方法で低減させる方法であって、（ａ）前記標的遺伝子のコード領域またはその一部と同一な２０ヌクレオチドより長いヌクレオチド配列の多重コピーを含む、分散した核酸分子又は外来性核酸分子の一つ以上を提供する工程であり、前記コピーの少なくとも一つがセンス方向であり且つ別のコピーの少なくとも一つがアンチセンス方向であって、前記センス方向のコピーおよびアンチセンス方向のコピーが前記植物細胞中で機能可能な単一のプロモーター配列の制御下に機能可能に接続されている前記工程、及び（ｂ）前記分散した核酸分子又は外来性核酸分子を前記細胞培養物または組織培養物中の植物細胞に導入する工程を含む方法。
【請求項２】
多重コピーが分断されたパリンドローム配列として存在する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヌクレオチド配列の多重コピーが、ヌクレオチド配列を含むスタッファー断片により互いに隔てられているものである、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
スタッファー断片がイントロンとして機能する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ヌクレオチド配列が２０ヌクレオチドより長く１００ヌクレオチド長までの長さである、請求項１〜請求項４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
標的遺伝子が植物細胞の内在性遺伝子である、請求項１〜５のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
細胞培養物または組織培養物中の植物細胞中の標的遺伝子の発現を抑制し、遅延させ又はその他の方法で低減させる方法であって、
（ｉ）  20ヌクレオチドよりも長く、標的遺伝子のコード領域又はその一部と同一なヌクレオチド配列の多重コピーを含む分散した核酸分子又は外来性核酸分子の一つ以上を選択する工程、
（ii）  前記分散した核酸分子又は外来性核酸分子を含む合成遺伝子であって、前記コピーの少なくとも一つがセンス方向であり且つ別のコピーの少なくとも一つがアンチセンス方向で前記細胞中で機能する単一のプロモーターの制御下に機能可能に連結されている、前記合成遺伝子を製造する工程、
（iii）前記細胞培養物または組織培養物中の植物細胞に前記合成遺伝子を導入する工程、及び
（iv）  前記細胞を、前記合成遺伝子を発現させるための時間及び条件の下に置く工程
を含む方法。
【請求項９】
前記多重コピーが分断されたパリンドローム配列として存在する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
多重コピーがヌクレオチド配列を含むスタッファー断片により隔てられているものである請求項８に記載された方法。
【請求項１１】
スタッファー断片がイントロン配列として機能する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
標的遺伝子がウイルスのレプリカーゼ、ポリメラーゼ、コートタンパク質又は脱外被タンパク質をコードする、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
標的遺伝子が細胞の内在性遺伝子である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
トランスフェクトされた植物細胞において標的遺伝子の発現を遅延させ、抑制し又他の方法で低減させ得る遺伝子構築物であって、前記標的遺伝子のコード領域又はその一部と同一な、２０ヌクレオチドより長いヌクレオチド配列の多重コピーを含み、且つ前記多重コピーの少なくとも１つのコピーがセンス方向にあり、少なくとも１つの他のコピーがアンチセンス方向にあって、前記多重コピーが前記植物細胞で機能しうる単一のプロモーターの制御の下で機能しうるように配置されている、前記遺伝子構築物。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列の多重コピーがヌクレオチドの配列を含むスタッファー断片により互いに隔てられているものである、請求項１４記載の遺伝子構築物。
【請求項１６】
スタッファー断片がイントロン配列として機能する、請求項１４記載の遺伝子構築物。
【請求項１７】
多重コピーが分断されたパリンドローム配列として存在する、請求項１４に記載の遺伝子構築物。
【請求項１８】
ヌクレオチド配列が２０ヌクレオチドより長く１００ヌクレオチド長までである、請求項１４〜１７のいずれか1項に記載の遺伝子構築物。
【請求項１９】
標的遺伝子が植物細胞の内在性遺伝子である請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の遺伝子構築物。
【請求項２０】
標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項１４〜１８のいずれか1項に記載の遺伝子構築物。
【請求項２１】
請求項１４〜請求項２０いずれか１項に記載の遺伝子構築物を含む、単離された植物細胞。
【請求項２２】
請求項１４〜２０のいずれか1項に記載の遺伝子構築物、及び担体、賦形剤又は希釈剤を含む組成物。
【請求項２３】
植物の病気の治療及び／又は予防のための合成遺伝子の調製における、植物細胞の標的遺伝子のコード領域又は一部と同一である２０ヌクレオチドより長いヌクレオチド配列の多重コピーを含む一つ以上の分散した核酸分子又は外来性核酸分子の使用であって、前記多重コピーの少なくとも一つがセンス方向を向いており且つ前記コピーの別の少なくとも一つがアンチセンス方向を向いており、前記センス方向およびアンチセンス方向を向いているコピーが前記植物細胞中で機能し得る単一のプロモーター配列の制御の下で機能しえるように置かれている、前記使用。
【請求項２４】
多重コピーが分断されたパリンドローム配列として存在する、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
多重コピーがヌクレオチド配列を含むスタッファー断片により隔てられているものである、請求項２３記載の使用。
【請求項２６】
スタッファー断片がイントロン配列として機能する、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
ヌクレオチド配列が２０より長く１００ヌクレオチドまでのヌクレオチド長である、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
植物細胞に導入すると、前記植物細胞の標的遺伝子の発現を少なくとも部分的には転写後に抑制し、遅延し又他の方法で低減させるための合成遺伝子の調製における、植物細胞の標的遺伝子のコード領域又はその一部と同一な、２０ヌクレオチドより長いヌクレオチド配列の多重コピーを含む一つ以上の分散した核酸分子又は外来性核酸分子の使用であって、前記多重コピーの少なくとも一つがセンス方向を向いており且つ前記多重コピーの少なくとも別の一つがアンチセンス方向を向いており、前記センス方向およびアンチセンス方向を向いているコピーが前記植物細胞中で機能し得る単一のプロモーター配列の制御下で機能し得るように置かれている、前記使用。
【請求項２９】
多重コピーが分断されたパリンドローム配列として存在する、請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
多重コピーがヌクレオチド配列を含むスタッファー断片により隔てられているものである、請求項２８記載の使用。
【請求項３１】
スタッファー断片がイントロン配列として機能する、請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
標的遺伝子が、植物細胞の内在性遺伝子である、請求項２８〜３１のいずれか1項記載の使用。
【請求項３３】
標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項２８〜３１のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に、トランスジェニック生物、特にトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物の細胞、組織又は器官における遺伝子発現を改変する方法並びに内因性遺伝子の発現を改変するための合成遺伝子に関する。より具体的には、本発明は、細胞、組織、器官又は全生物体における標的遺伝子の発現を転写後に改変又は調節するために、組換えＤＮＡ技術を利用し、それにより新規な表現型を創り出す。生物に導入された場合、該生物における内因性遺伝子又は標的遺伝子の発現を抑制し、遅延させ又はその他の方法で低減させることのできる新規な合成遺伝子並びに遺伝子構築物も提供される。
【０００２】
一般事項
本明細書で言及される刊行物の書誌的詳細は本記載の末尾に収集される。
【０００３】
本明細書で使用されるとき、「から由来する」という用語は、記載された完全体が、必ずしも直接的にとは限らないが、記載された特定の源又は種から得られうることを示すものと解釈されるべきである。
【０００４】
本明細書を通して、文脈が他の意味を要求しない限り、「含む（comprise）」という用語、又は「含む（comprises ）」若しくは「含む（comprising）」などの変形は、述べられた工程、又は要素、又は完全体、又は工程、若しくは要素若しくは完全体の集合を含むことを意味するが、他の任意の工程、又は要素、又は完全体、又は要素若しくは完全体の集合を排除することを意味するわけではないことが理解されよう。
【０００５】
当業者は、本明細書に記載される発明が具体的に記述されるもの以外に変形及び改変され得ることを理解する筈である。本発明は全てのこのような変形物及び改変物を包含することが理解されるべきである。本発明は、本明細書で個々に又はまとめて言及される又は示される工程、特徴、組成物及び化合物の全て、及び任意の組み合わせ、及び該工程若しくは特徴の全ての組み合わせ、又は任意の二つ以上の組合せをも包含する。
【０００６】
本発明は、例示目的のみを意図して本明細書に記載される具体的な態様により範囲が限定されるものではない。機能的に等価な産物、組成及び方法は、本明細書に記載されるように明らかに本発明の範囲内にある。
【０００７】
本明細書に含まれるヌクレオチド及びアミノ酸の配列情報を含む配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ. ）は要約書の後に集められ、パテントイン第二版のプログラムを用いて作製された。各々のヌクレオチド又はアミノ酸の配列は、数値指標（＜２１０＞）とそれに続く配列識別子（例えば＜２１０＞１、＜２１０＞２等）により配列表中で同定される。各々のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に対する配列の長さ、型（ＤＮＡ、タンパク質（ＰＲＴ）等）及び起源となった生物は、それぞれ、数値指標欄の＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３＞で提供される情報により示される。本明細書で言及されるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、数値指標欄の＜４００＞とそれに続く配列識別子（例えば＜４００＞１、＜４００＞２等）中で提供される情報によって定義される。
【０００８】
本明細書で言及されるヌクレオチド残基の名称は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨されるものであり、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｙはピリミジン残基を表し、Ｒはプリン残基を表し、Ｍはアデニン又はシトシンを表し、Ｋはグアニン又はチミンを表し、Ｓはグアニン又はシトシンを表し、Ｗはアデニン又はチミンを表し、Ｈはグアニン以外のヌクレオチドを表し、Ｂはアデニン以外のヌクレオチドを表し、Ｖはチミン以外のヌクレオチドを表し、Ｄはシトシン以外のヌクレオチドを表し、そしてＮは任意のヌクレオチド残基を表す。
【０００９】
本明細書で言及されるアミノ酸残基の名称は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨されたもので、表１に列挙する。
【００１０】
【表１】
0004187413.tif 000002
【００１１】
発明の背景
真核生物の代謝経路を制御することは、該生物において新規な特性を作りだすため又は該生物の特定の細胞、組織若しくは器官に新規な特性を導入するために望ましい。組換えＤＮＡ技術は真核性遺伝子発現を調節する機構の理解に重要な進展をもたらしてきたが、新規な特性を作りだすための遺伝子発現の実際の操作においてはほとんど進展はなかった。さらに、ヒトの介入により真核性遺伝子発現レベルを調節しうる手段はごく限られている。
【００１２】
遺伝子発現を抑制し、遅延させ又はその他の方法で低減させるための一つのアプローチは、核遺伝子の相補鎖から正常に転写され且つポリペプチドに翻訳され得るものへと転写されるｍＲＮＡ分子を利用する。このアプローチに関与する正確な機構は確立されていないが、相補的なヌクレオチド配列間における塩基対形成により二本鎖のｍＲＮＡが生じ、低い効率で翻訳され及び／又は翻訳される前に細胞内リボヌクレアーゼ酵素により分解される複合体を産生すると仮定されてきた。
【００１３】
または、細胞、組織又は器官における内因性遺伝子の一以上のコピー又は実質的に同様な遺伝子の一以上のコピーが該細胞に導入される場合、該遺伝子の発現は抑制されうる。この現象に関与する機構は確立されていないが、機構的に異種の工程が関与するらしい。例えば、このアプローチには、クロマチンの体細胞遺伝性の抑制状態が形成される、転写抑制が関与する、又はそうではなくて、通常転写の開始は起きるが共抑制された遺伝子のＲＮＡ産物がその後除外される、転写後サイレンシング（post-transcriptional silencing) が関与すると仮定されてきた。
【００１４】
特定遺伝子の発現の標的化におけるこれらの両アプローチの効率は非常に低く、通常、極めて多様な結果が得られる。遺伝子発現を標的化するために、遺伝子の異なる領域、例えば、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、コード領域又はイントロン配列を用いることにより、一貫性のない結果が得られる。従って、現在のところ、既存の技術を用いて遺伝子発現を抑制し、遅延させ又はその他の方法で低減させるための最も効率の良い手段を与える遺伝的配列の性質に関しては意見の一致は存在しない。さらに、世代間でこのような高い程度の差異が存在するため、遺伝子発現が著しく改変された生物の子孫における特定遺伝子の抑制レベルを予測することはできない。
【００１５】
最近、ドレルとヘニコッフ（１９９４年）は、ショウジョウバエのゲノムにおける縦列反復した遺伝子コピーのサイレンシング並びにポリコーム（Polycomb) 遺伝子（即ち、Ｐｃ−Ｇ系；パル−バハドラら、１９９７年）による分散されたショウジョウバエのＡｄｈ遺伝子の転写抑制を証明した。しかし、特定遺伝子の発現を標的化できる配列がゲノムの分散された位置に導入され、このアプローチと遺伝子標的化技術との組み合わせを欠いている場合は、縦列反復した遺伝子コピーのこのようなサイレンシングは、動物細胞で組換え手段により遺伝子発現を操作する試みにおいてほとんど有用性がない。理論的には可能であるが、このような組み合わせは、単独で用いられる遺伝子標的化アプローチの低い効率に基づけば低効率でしか作用しないと予想され、さらに複雑なベクター系を必要とするであろう。さらに、ショウジョウバエのＰｃ−Ｇ系のような転写抑制の利用は、任意の特定標的遺伝子の発現を調節できる調節機構についての何らかの知識を要するようであり、結果として、動物細胞において遺伝子発現を抑制し、遅延させ又は低減させるための一般的技術として実際に実行するのは困難であろう。
【００１６】
これらの現象に関与する機構についての理解の乏しさは、遺伝子発現のレベルを調節するための技術、特に組換えＤＮＡ技術を用いて特定遺伝子の発現を遅延させ、抑制し又はその他の方法で低減させるための技術の改良がほとんどなかったことを意味する。さらに、これらのアプローチが予測不可能である結果として、現在、真核生物又は原核生物における特定遺伝子の発現レベルを調節するための商業的に実行可能な手段はない。
【００１７】
従って、動物細胞へ新規な表現型特性を導入するために、遺伝子発現を調節する、特に動物細胞における遺伝子発現を抑制し、遅延させ又はその他の方法で低減させる改良された方法に対する必要性が存在する。特に、これらの方法は、同時に遺伝子標的化アプローチを行う必要なく、表現型の改変のための一般的手段を提供すべきである。
【００１８】
本発明の概要
本発明は、一つ以上の望ましい特性を示す細胞を作成でき、しかもプロモーターに機能的に連結された核酸分子を含む形質転換細胞からそれを選択し得るという本発明者らによる驚くべき発見であって、該核酸分子の転写産物がその発現を調節しようと意図する内因性又は非内因性標的遺伝子の転写産物のヌクレオチド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含むものである発見に一部基づいている。この形質転換された細胞は、新規な特性、具体的にはウイルス耐性、及び内因性遺伝子の改変された発現を示すことのできる全組織、全器官又は全生物へと再生される。
【００１９】
従って、本発明の一つの側面は、動物の細胞、組織又は器官における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、標的遺伝子のｍＲＮＡ産物の翻訳が改変されるのに充分な時間及び条件の下で、該ｍＲＮＡ産物の転写が必ずしも抑制又は低減されるとは限らないことを条件として、該標的遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列又はその一領域又はそれに相補的な配列の多重コピーを含む一つ以上の分散した核酸分子又は外来性核酸分子を該細胞、組織又は器官に導入する工程を少なくとも含む方法を提供する。
【００２０】
特に好ましい態様において、分散した核酸分子又は外来性核酸分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡ産物のヌクレオチド配列と実質的に同一なｍＲＮＡ分子の多重コピーをコードするヌクレオチド配列を含む。標的分子の該複数コピーは縦列直列反復配列であることがより好ましい。
【００２１】
より具体的に好ましい態様において、分散した核酸分子又は外来性核酸分子は少なくとも転写してｍＲＮＡを産生することが可能であるような発現可能な形態で存在する。
【００２２】
該標的遺伝子は、動物細胞にとって内因性である遺伝子、又はとりわけウイルス若しくは外来性の遺伝子配列などの外来性遺伝子でありうる。好ましくは、標的遺伝子はウイルスの遺伝子配列である。
【００２３】
本発明は真核性遺伝子発現の調節、特にヒト又は動物の遺伝子発現の調節、さらにより具体的には脊椎動物及び昆虫、水生動物などの無脊椎動物（例えば、魚、貝、軟体動物、カニ、ロブスター及びエビなどの甲殻類）、鳥類、並びにとりわけ哺乳類に由来する遺伝子の発現調節にとりわけ有用である。
【００２４】
適切な手法及び充分な数の形質転換細胞を用いて、多様な特性が選択可能である。このような特性には可視的な特性、病気耐性の特性、及び病原体耐性の特性が含まれるが、これらに限定されない。この調節効果は、例えば、がん遺伝子、転写因子、及び細胞の代謝に関与するポリペプチドをコードする他の遺伝子などの細胞の代謝、又は細胞の形質転換の原因となる内因性遺伝子を含む植物及び動物において発現する種々の遺伝子に適用可能である。
【００２５】
例えば、マウスの色素産生の改変は、マウスにおけるチロシナーゼ遺伝子の発現を標的化することにより遺伝子工学的に行うことができる。これは黒色マウスに色素欠乏症の新規な表現型を付与する。植物細胞又は動物細胞においてウイルス複製に必要な遺伝子を標的化することにより、ウイルスのレプリカーゼ、ポリメラーゼ、コートタンパク質、又は脱外被遺伝子、又はプロテアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列の多重コピーを含む遺伝子構築物をそれを発現する細胞に導入して、ウイルスに対する免疫性を前記細胞に付与することができる。
【００２６】
本発明の実施において、分散した核酸分子又は外来性の核酸分子は一般的に標的遺伝子配列に対して約８５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。しかし、相同性が高いほど標的遺伝子配列の発現をより効果的に調節するかも知れない。実質的に高い相同性、即ち約９０％以上の相同性が好ましく、さらにより好ましくは約９５％から完全な同一性であることが望ましい。
【００２７】
完全な相同性を必要としない、導入された分散した核酸分子又は外来性核酸分子の配列は、標的遺伝子の一次転写産物か又は標的遺伝子の完全にプロセシングされたｍＲＮＡのいずれかに関して全長である必要もない。全長より短い配列でも相同性が高ければ、より長いが相同性の低い配列に匹敵する。さらに、導入された配列はイントロン又はエキソンの同じパターンを有する必要はなく、そして非コード部分の相同性は同様に効果的である。通常、２０〜１００ヌクレオチドより大きな配列が使用されるべきであるが、約２００〜３００ヌクレオチドより大きな配列が好ましく、標的遺伝子の大きさに応じて、５００〜１０００ヌクレオチドより大きな配列が特に好ましい。
【００２８】
本発明の第二の側面は、合成遺伝子でトランスフェクション又は形質転換された原核生物又は真核生物の細胞、組織又は器官における標的遺伝子の発現を改変できる該合成遺伝子であって、該細胞、組織若しくは器官中で機能しうるプロモーター配列の制御下で機能しうるように配置された、標的遺伝子ヌクレオチド配列に実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはその誘導体、若しくはそれに相補的な配列の多重コピーを含む、分散した核酸分子又は外来性核酸分子を少なくとも含む合成遺伝子を提供する。
【００２９】
本発明の第三の側面は、合成遺伝子でトランスフェクション又は形質転換された原核生物又は真核生物の細胞、組織又は器官において標的遺伝子の発現を改変できる該合成遺伝子であって、該合成遺伝子が少なくとも多重構造遺伝子配列を含み、該構造遺伝子配列のそれぞれが標的遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはその誘導体若しくはそれに相補的な配列を含み、該多重構造遺伝子配列が該細胞、組織又は器官で機能しうる単独のプロモーター配列の制御下に機能しうるように配置されるものである合成遺伝子を提供する。
【００３０】
本発明の第四の側面は、合成遺伝子でトランスフェクション又は形質転換された原核生物又は真核生物の細胞、組織又は器官における標的遺伝子の発現を改変できる合成遺伝子であって、該合成遺伝子が少なくとも多重構造遺伝子配列を含み、該構造遺伝子配列のそれぞれが該細胞、組織又は器官で機能しうるプロモーター配列の制御下で機能しうるように配置され、該構造遺伝子配列のそれぞれが標的遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列、若しくはその誘導体、若しくはそれに相補的な配列を含むものである合成遺伝子を提供する。
【００３１】
本発明の第五の側面は、形質転換又はトランスフェクションされた細胞、組織又は器官における内因性遺伝子又は標的遺伝子の発現を改変できる遺伝子構築物であって、少なくとも本発明の合成遺伝子及び一つ以上の複製起点及び／又は選択可能なマーカー遺伝子配列を含む遺伝子構築物を提供する。
【００３２】
植物及び動物などの多細胞生物における多くの新規な特性、特に組織特異的な特性、又は器官特異的な特性、又は発生上で制御される特性を観察するためには、本明細書に記載される合成遺伝子及び遺伝子構築物を保持する形質転換された細胞を生物体へ再生させることが必要となる。当業者は、これが形質転換された植物細胞又は動物細胞、そのような細胞の集団、組織又は器官から完全な生物体を成長させることを意味することを承知しているであろう。単離された細胞及び組織から植物及び動物を再生させるための標準的方法は当業者に知られている。
【００３３】
こうして、本発明の第六の側面は、本明細書に記載される合成遺伝子及び遺伝子構築物を含む細胞、組織、器官又は生物を提供する。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は細胞、組織又は器官における標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。該方法は、標的遺伝子のｍＲＮＡ産物の翻訳を改変するのに充分な時間及び条件の下で、該ｍＲＮＡ産物の転写が必ずしも抑制又は低減されないことを条件として、該標的遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列若しくはその一領域若しくはそれに相補的なヌクレオチド配列の多重コピーを含む一つ以上の分散した核酸分子若しくは外来性核酸分子を該細胞、組織又は器官に導入する工程を少なくとも含む。
【００３５】
「多重コピー」とは、標的遺伝子の二つ以上のコピーが同方向又は異方向で同一の核酸分子上に密接な物理的関係で又は並列して存在すること、必要ならば各反復間で二次構造の形成を容易にするためにスタッファー（stuffer)断片又は遺伝子間領域により随意的に分離されていることを意味する。このスタッファー断片はヌクレオチド残基若しくはアミノ酸残基、炭水化物分子若しくはオリゴ糖分子、又は炭素原子、又はそれらのホモログ、類似体又は誘導体の任意の組み合わせを含みうるものであって、核酸分子に共有結合できるものである。
【００３６】
好ましい態様では、このスタッファー断片はヌクレオチドの配列若しくはそのホモログ、類似体又は誘導体を含む。
【００３７】
より好ましくは、このスタッファー断片は少なくとも約１０〜５０ヌクレオチドの長さ、さらにより好ましくは少なくとも約５０〜１００ヌクレオチドの長さ、さらに一層より好ましくは少なくとも約１００〜５００ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
分散した又は外来性の核酸分子がイントロン／エキソン・スプライシング連結配列を含むと、スタッファー断片は遺伝子の５’末端に近い方の構造遺伝子の３’スプライシング部位とその隣の下流単位の５’スプライシング部位との間に位置するイントロン配列として働きうる。または、分散した外来性の核酸分子の三つ以上の近接したヌクレオチド配列単位が翻訳されることが望まれる場合、当業者には明白なように、それらの間に位置するスタッファー断片は、スタッファー断片の両末端にイントロン／エキソン・スプライシング連結配列を持たない、枠内の翻訳停止コドンを含むべきでなく、又は各単位の５’末端には翻訳開始コドンの付加を含むべきでない。
【００３９】
好ましいスタッファー断片は、検出可能なマーカータンパク質又はその生物学的に活性な類似体及び誘導体、例えば、中でもルシフェラーゼ、β−ガラクツロナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ又は緑色蛍光タンパク質をコードするものである。スタッファー断片の追加は排除されない。
【００４０】
この態様によれば、検出可能なマーカー又はその類似体又は誘導体は、特異的に検出可能な表現型、好ましくは視覚的に検出可能な表現型を細胞、組織又は器官に付与できる能力のため、細胞等において本発明の合成遺伝子の発現を示すのに役立つ。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、「調節する」という用語は、本明細書に記載の発明方法を用いない遺伝子の発現と比較して、標的遺伝子の発現が量的に低減され、及び／又は遺伝子発現のタイミングが遅延し、及び／又は標的遺伝子の発現の発生上のパターン、又は組織特異的なパターン、又は細胞特異的なパターンが改変されることを意味すると解釈されるべきである。
【００４２】
本明細書に記載される本発明の範囲を制限することはないが、本発明は、真核生物、特に単子葉植物若しくは双子葉植物などの植物、又はヒト若しくは他の動物、さらにより具体的には脊椎動物及び昆虫、水生動物などの無脊椎動物（例えば、中でも、魚、貝、軟体動物、カニ、ロブスター、及びエビなどの甲殻類）、鳥類、又は哺乳類の特定の細胞、組織又は器官での標的遺伝子の発現の程度における抑制、遅延又は低減を含む遺伝子発現の調節に関する。
【００４３】
より好ましくは、標的遺伝子の発現は、細胞、組織又は器官に導入された分散した核酸分子又は外来性の核酸分子により完全に不活性化される。
【００４４】
如何なる理論又は作用様式にも拘束されるものではないが、本発明の実施に起因する標的遺伝子発現の低減又消滅は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の翻訳の低減又は遅延に帰することができ、あるいは内因性の宿主細胞系による標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の配列特異的分解の結果としての該ｍＲＮＡの翻訳の阻止に帰することができる。
【００４５】
最良の結果として、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物が通常翻訳される時若しくは段階の前か、又は標的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物が通常翻訳される時と同時のいずれかで、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の配列特異的な分解が生じることが特に好ましい。従って、導入された分散した核酸分子又は外来性核酸分子の発現を調節するために適切なプロモーター配列を選択することは、本発明の最適な実施を考慮する上で重要である。このため、導入された分散した核酸分子又は外来性核酸分子の発現を調節する際に強力な構成的プロモーター又は誘導可能なプロモーター系の使用がとくに好ましい。
【００４６】
本発明は、発現の低減であって、転写の低下によってもたらされる標的遺伝子の発現の低減をも明らかに包含する。ただし、転写の低減がそれが起きる唯一の機構ではなくそして転写の低減が定常状態のｍＲＮＡプールの翻訳の低減を少なくとも伴うことを条件とする。
【００４７】
該標的遺伝子は動物細胞にとって内因性の遺伝子配列であってもよく、またウイルス若しくは他の外来性病原性生物に由来し且つ細胞に入り込むことができそして感染後に細胞の装置を用いることができる遺伝子配列のような非内因性遺伝子配列であってもよい。
【００４８】
標的遺伝子が動物細胞にとって非内因性の遺伝子配列である場合、標的遺伝子はウイルス若しくは他の病原体の複製又は増殖に必須の機能をコードするものであることが好ましい。このような態様において、本発明は特に動物細胞のウイルス感染の予防処置及び治療処置、あるいは該病原体に対する耐性の付与若しくは刺激に特に有用である。
【００４９】
標的遺伝子は、植物又は動物の細胞、組織又は器官のウイルス病原体の一つ以上のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
【００５０】
例えば、動物及びヒトの場合、ウイルス病原体はレトロウイルス、例えば免疫不全ウイルスなどのレンチウイルス、ウシのエンテロウイルス（ＢＥＶ）又はシンドビス・アルファウイルスなどの一本鎖（＋）ＲＮＡウイルスでありうる。又は、標的遺伝子は、とりわけ、ウシのヘルペスウイルス又は単純ヘルペスウイルスＩ（ＨＳＶＩ）などの二本鎖ＤＮＡウイルスといった（ただしこれらに限定されない）動物の細胞、組織又は器官のウイルス病原体の一つ以上のヌクレオチド配列を含むことができる。
【００５１】
植物の場合、ウイルス病原体は、ポチウイルス、カリモウイルス、バドナウイルス、ジェミニウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、ブニアウイルス、トスポウイルス、テヌイウイルス、トンブスウイルス、ルテオウイルス、ソベモウイルス、ブロモウイルス、ククモウイルス、アイラウイルス、アルファモウイルス、タバモウイルス、トブラウイルス、ポテックスウイルス、及びクロステロウイルスが好ましく、中でもＣａＭＶ、ＳＣＳＶ、ＰＶＸ、ＰＶＹ、ＰＬＲＶ、及びＴＭＶが好ましいが、これらに限定されない。
【００５２】
特にウイルス病原体に関して、当業者は、ウイルスがコードする機能は宿主細胞によりコードされるポリペプチドによって「イントランス」に補完されうることを承知している。例えば、宿主細胞におけるウシのヘルペスウイルスゲノムの複製は、不活性化されたウイルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を補完することができる宿主細胞のＤＮＡポリメラーゼにより促進されうる。
【００５３】
従って、標的遺伝子が動物細胞にとって非内因性の遺伝子配列である場合、本発明のさらなる代替の態様は、ウイルスに特異的な遺伝子配列などの宿主細胞の機能によって補完され得ないウイルスポリペプチド又は外来性ポリペプチドをコードする標的遺伝子を提供する。本発明のこの態様の典型的な標的遺伝子には、中でも、ウイルスコートタンパク質、脱外被タンパク質、及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明の特に好ましい態様において、標的遺伝子はＢＥＶのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子又はそのホモログ、類似体若しくは誘導体、又はＰＶＹ・Ｎｉａプロテアーゼをコードする配列である。
【００５５】
標的遺伝子の発現が改変される細胞は、多細胞の植物又は動物、それらの細胞及び組織の培養物に由来する任意の細胞でありうる。好ましくは、該動物細胞は昆虫、爬虫類、両生類、鳥類、ヒト又は他の哺乳類に由来する。典型的な動物細胞には、とりわけ、胚性幹細胞、培養された皮膚繊維芽細胞、神経細胞、体細胞、造血幹細胞、Ｔ細胞、及び不死化細胞系統、例えばＣＯＳ、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、マウスＣ１２７、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＷＩ−３８、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）又はＭＤＢＫ細胞系統が含まれる。このような細胞及び細胞系統は当業者にとって容易に入手できる。従って、標的遺伝子の発現が改変された組織又は器官はこのような動物細胞を含む任意の組織又は器官であってもよい。
【００５６】
植物細胞は単子葉植物又は双子葉植物種又はそれらから誘導された細胞系統に由来するものであることが好ましい。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「分散した核酸分子」という用語は、核酸分子が導入される細胞、組織又は器官に起源を有する遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に同一な又は相補的なヌクレオチド配列の一つ以上の多重コピー、好ましくは縦列直列反復を含む核酸分子であって、組換え手段により動物の細胞、組織又は器官に導入され、一般に染色体外核酸として又は該遺伝子に遺伝的に連結しない組込まれた染色体核酸として存在するという意味で非内因性である核酸分子、を指すと解釈されるべきである。さらに具体的には、「分散した核酸分子」は、縦列に連結しないため、又は同じ染色体上で異なる染色体の位置を占めるため、又は異なる染色体上に局在するため、又はエピソーム、プラスミド、コスミド又はウイルス粒子として細胞に存在するため、物理的地図中で目的の標的遺伝子に連結しない染色体又は染色体外の核酸を含む。
【００５８】
「外来性核酸分子」とは、外来性の核酸分子が導入された生物と異なる生物の遺伝子配列に由来するヌクレオチド配列の一つ以上の多重コピー、好ましくは縦列直列反復を有する単離された核酸分子を意味する。この定義は、核酸分子が導入された分類学上の群と同一の最下位の分類学上の群（即ち同一集団）の異なる個体に由来する核酸分子、並びにウイルス病原体に由来する遺伝子のように核酸分子が導入された分類学上の群と異なる分類学上の群の異なる個体に由来する核酸分子を包含する。
【００５９】
従って、本発明の実施において、外来性核酸分子が作用する標的遺伝子は、形質転換又はイントログレッション（introgression)の技術を用いて、ある生物から他の生物へ導入された核酸分子であってもよい。本発明のこの態様の典型的な標的遺伝子には、クラゲのエクオリア・ビクトリアに由来する緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子（プラッシェルら、１９９２；国際特許公開番号ＷＯ９５／０７４６３）、チロシナーゼ遺伝子、特にネズミのチロシナーゼ遺伝子（ウォンら、１９８８）、ｌａｃＺ遺伝子のポリペプチド抑制因子をコードできる大腸菌のｌａｃＩ遺伝子、本明細書で例示されるブタのα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号Ｌ３６５３５）、及び本明細書で例示されるＰＶＹ及びＢＥＶの構造遺伝子、又はそれらの遺伝子のホモログ、類似体、若しくは誘導体、又はそれらに相補的なヌクレオチド配列が含まれる。
【００６０】
本発明はさらに、例えば、共発現した標的遺伝子のそれぞれに実質的に同一なヌクレオチド配列を含む分散した核酸分子又は外来性の核酸分子を用いて、特定の細胞で共発現する幾つかの標的遺伝子の発現を同時に標的化するために有用である。
【００６１】
「実質的に同一な」とは、本発明の導入された分散した核酸分子又は外来性核酸分子と標的遺伝子配列とが、標準的な細胞内条件下で両者間に塩基対の形成が可能となる程にヌクレオチド配列レベルで十分に同一であることを意味する。
【００６２】
本発明の分散した核酸分子又は外来性核酸分子における各反復のヌクレオチド配列と標的遺伝子配列の一部のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列レベルで少なくとも約８０〜８５％同一であることが好ましく、少なくとも約８５〜９０％同一であることがより好ましく、少なくとも約９０〜９５％同一であることがさらにより好ましく、ヌクレオチド配列レベルで少なくとも約９５〜９９％又は１００％同一であることがさらにより一層好ましい。
【００６３】
本発明は、本発明の分散した核酸分子又は外来性核酸分子における反復配列の正確な数によって制限されるわけではないが、本発明は細胞中で発現されるベき標的遺伝子配列の少なくとも二つのコピーを必要とすると理解されるべきである。
【００６４】
標的遺伝子配列の多重コピーは縦列逆反復配列及び／又は縦列直列反復配列として分散した核酸分子又は外来性核酸分子中に存在することが好ましい。このような配置はＧａｌｔ、ＢＥＶ又はＰＶＹの遺伝子領域を含み本明細書に記載される「テストプラスミド」により例示される。
【００６５】
細胞、組織又は器官に導入される分散した核酸分子又は外来性核酸分子はＲＮＡ又はＤＮＡを含むことが好ましい。
【００６６】
分散した核酸分子又は外来性核酸分子は標的遺伝子によってコードされるアミノ酸配列をコードできるヌクレオチド配列又は相補的なヌクレオチド配列を含むことが好ましい。これらの核酸分子は一つ以上のＡＴＧ又はＡＵＧの翻訳開始コドンを含むことがさらにより好ましい。
【００６７】
標的遺伝子の発現を調節する目的で分散した核酸分子又は外来性核酸分子を細胞、組織又は器官に導入するため、標準的な方法が用いられうる。例えば、核酸分子は裸のＤＮＡ又はＲＮＡとして導入されうるし、任意選択的にリポソーム内にカプセル化して、弱毒化されたウイルスとしてのウイルス粒子内に入れ、又はウイルス外被又は輸送タンパク質又は金などの不活性担体と結合させて又は組換えのウイルスベクター若しくは細菌ベクターとして又はとりわけ遺伝子構築物として導入されうる。
【００６８】
投与方法としては、とりわけ注射及び経口摂取（例えば、医薬用食品物質）が挙げられる。
【００６９】
本核酸分子は、腸の微生物叢に取り込まれうる細菌内での発現に適した細菌発現系を用いるなど生きている送達系によっても送達されうる。又は、ウイルスの発現系が使用され得る。この点で、ウイルス発現の一つの形態は、感染に効果的な量の生きているベクター（例えば、ウイルス又は細菌）が動物に供給される場合、一般的に噴霧、飼料又は水による生きているベクターの投与である。ウイルス発現系の他の形態は細胞に感染できるが細胞内で複製できない非複製性ウイルスベクターである。この非複製性ウイルスベクターは、一過性の発現用に本遺伝物質をヒト又は動物の患者に導入する手段を提供する。このようなベクターを投与する様式は生きているウイルスベクターと同様である。
【００７０】
本核酸分子を宿主細胞に送達するのに利用される担体、賦形剤及び／又は希釈剤はヒト又は獣医の適用に許容されるべきものである。このような担体、賦形剤及び／又は希釈剤は当業者に周知である。獣医学的使用に適切な担体及び／又は希釈剤には、任意の及び全ての溶媒、分散媒、水溶液、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が挙げられる。従来の媒体又は薬剤は活性成分との配合が禁忌であるものを除き、組成物でのその使用が意図される。補足の活性成分もこの組成物に組込まれ得る。
【００７１】
別の態様において、本発明は、細胞、組織又は器官における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、少なくとも以下の工程、すなわち
（ｉ）該標的遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列又はその一領域またはそれに相補的なヌクレオチド配列の多重コピーを含む一つ以上の分散した核酸分子又は外来性核酸分子を選択する工程、及び
（ii)   ｍＲＮＡ産物の転写が専ら抑制又は低減されるのではないという条件付きで、標的遺伝子のｍＲＮＡ産物の翻訳が改変されるのに充分な時間及び条件の下で、分散した核酸分子又は外来性核酸分子を細胞、組織又は器官に導入する工程、
を含む方法を提供する。
【００７２】
標的遺伝子の発現を標的化するのに適切なヌクレオチド配列を選択するため、幾つかのアプローチが用いられうる。一つの態様では、特性決定された遺伝子の特定の領域の多重コピーを、適切なプロモーターと機能しうるように連結させてクローニングし、標的遺伝子の発現を低減させる効果を検定する。または、遺伝子配列の多重コピーを含むショットガンライブラリーを作成し、標的遺伝子の発現を低減させるそれらの効果を検定する。後者のアプローチに伴う利点は、細胞の望ましくない表現型の発現における特定の標的遺伝子の重要性について何らの先行知識も有する必要がないことである。例えば、任意のウイルス遺伝子が宿主細胞の病因に果たす役割についての先行知識がなくとも、ウイルスのサブゲノム断片を含むショットガンライブラリーを使用して、動物宿主細胞にウイルスの免疫性を付与する能力を直接試験しうる。
【００７３】
本明細書で用いられるとき、「ショットガンライブラリー」という用語は、多様なヌクレオチド配列の一組である。この一組の各構成要素は、細胞宿主の維持及び／又は複製に適した適切なプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、又はウイルスベクター分子内に含まれていることが好ましい。「ショットガンライブラリー」という用語には、ヌクレオチド配列間の相違の程度が多大であるため該ヌクレオチド配列の由来する生物のゲノムの全配列が「一組」で存在する典型的なライブラリー、又は配列間の相違の程度がより少ない限定されたライブラリーが含まれる。「ショットガンライブラリー」という用語はさらに、ヌクレオチド配列がせん断により得られる、又は他のアプローチの中でも制限エンドヌクレアーゼを用いて例えばゲノムＤＮＡの部分的消化により得られる、ウイルス又は細胞のゲノム断片を含む無作為ヌクレオチド配列を包含する。さらに、「ショットガンライブラリー」には、多様な一組の各ヌクレオチド配列を含む細胞、ウイルス粒子及びバクテリオファージ粒子が含まれる。
【００７４】
本発明のこの態様の好ましいショットガンライブラリーは、植物又は動物のウイルス病原体に由来する一組の縦列反復ヌクレオチド配列を含む「典型的なライブラリー」である。
【００７５】
とくに好ましい本発明の態様において、ショットガンライブラリーは、多様な一組のアミノ酸配列をコードする多様な一組の縦列反復ヌクレオチド配列を含む細胞、ウイルス粒子又はバクテリオファージ粒子を含む。この多様な一組のヌクレオチド配列の構成要素は、細胞中で該縦列反復ヌクレオチド配列の発現を指示することのできるプロモーター配列の制御の下で機能可能なように配置される。
【００７６】
従って、縦列反復配列における各単位のヌクレオチド配列は少なくとも約１から２００の長さのヌクレオチドを含みうる。より大きな断片の使用、特にウイルス、植物又は動物のゲノムに由来する無作為にせん断された核酸の使用は、除外されない。
【００７７】
導入された核酸分子は発現可能な形態であることが好ましい。
【００７８】
「発現可能な形態」とは、本核酸分子が少なくとも転写レベルで細胞、組織、器官又は生物全体で発現しうるような配置で存在することを意味する（即ち、それは動物細胞中で発現し、少なくともｍＲＮＡ産物を生じ、該産物は任意的に翻訳可能であるか又は翻訳されて組換えのペプチド、オリゴペプチド又はポリペプチドの分子を生産する）。
【００７９】
例として、目的の細胞、組織又は器官内で分散した核酸分子又は外来性核酸分子を発現させるために、合成遺伝子又は該合成遺伝子を含む遺伝子構築物が作成される。この合成遺伝子はその中で発現を調節できるプロモーター配列と機能しうるように連結された上記記載のヌクレオチド配列を含む。こうして、本核酸分子は真核性の転写が起きるのに充分な一つ以上の調節要素と機能しうるように連結される。
【００８０】
従って、本発明のさらに別の態様は動物の細胞、組織又は器官における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、少なくとも以下の工程、すなわち
（ｉ）  標的遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列又はその一領域またはそれに相補的なヌクレオチド配列の多重コピー、好ましくはその縦列反復を含む一つ以上の分散した核酸分子又は外来性核酸分子を選択する工程、
（ii)   分散した核酸分子又は外来性核酸分子を含む合成遺伝子を作成する工程、
（iii)  該細胞、組織又は器官に該合成遺伝子を導入する工程、及び
（iv)   ｍＲＮＡ産物の転写が専ら抑制又は低減されるのではないという条件付きで、標的遺伝子のｍＲＮＡ産物の翻訳が改変されるのに充分な時間と条件の下で、該合成遺伝子を該細胞、組織又は器官中で発現させる工程、
を含む方法を提供する。
【００８１】
本明細書において「遺伝子（ｇｅｎｅ）」又は「遺伝子（ｇｅｎｅｓ）」に対する言及は最も広い文脈で解釈されるべきであり、
（ｉ）下記のものから成る古典的ゲノム遺伝子、すなわち、
転写及び／又は翻訳の調節配列及び／又はコード領域及び／又は非翻訳配列（即ちイントロン、５’−及び３’−の非翻訳配列）から構成される古典的なゲノム遺伝子、及び／又は
（ii) 該遺伝子のコード領域（即ちエキソン）及び５’−及び３’−の非翻訳配列に対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ、及び／又は
（iii)非翻訳配列及び／又は構造領域に発現特性を付与できる転写及び／又は翻訳の調節領域から成る異種のプロモーター配列をさらに任意に含むコード領域（即ちエキソン）に対応する該構造領域、
を含む。
【００８２】
「遺伝子」という用語は、機能的産物の全部又は一部、特にセンス若しくはアンチセンスのｍＲＮＡ産物、又はペプチド、オリゴペプチド若しくはポリペプチド又は生物活性タンパク質をコードする合成分子又は融合分子を記載するためにも使用される。
【００８３】
「合成遺伝子」という用語は、本明細書で先に定義されたように、構造遺伝子配列に機能的に連結させた少なくとも一つ以上の転写及び／又は翻訳の調節配列を含むことが好ましい非天然産の遺伝子を指す。
【００８４】
「構造遺伝子」という用語は、ｍＲＮＡを産生するために伝達されることができ且つ任意的にペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド又は生物活性タンパク質分子をコードするヌクレオチド配列を指すと解釈されるべきである。当業者は、例えば、ｍＲＮＡが機能的な翻訳開始シグナルを欠く場合、又はｍＲＮＡがアンチセンスｍＲＮＡである場合、全てのｍＲＮＡがペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳され得るわけではないことを承知している。本発明はペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド又は生物活性タンパク質をコードできないヌクレオチド配列を含む合成遺伝子を明らかに包含する。特に、本発明者らは、このような合成遺伝子が原核生物又は真核生物の細胞、組織又は器官における標的遺伝子の発現を改変するのに有利でありうることを見出した。
【００８５】
「構造遺伝子領域」という用語は、機能しうるように連結させたプロモーター配列の制御下に細胞、組織又は器官内で発現させる本明細書に記載の分散した核酸分子又は外来性核酸分子を含む合成遺伝子の部分を指す。構造遺伝子領域は単独のプロモーター配列又は多重のプロモーター配列の制御下で機能しうる一つ以上の分散した核酸分子及び／又は外来性核酸分子を含みうる。従って、合成遺伝子の構造遺伝子領域はアミノ酸配列をコードできるヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を含みうる。この点で、本発明の実施で使用される構造遺伝子領域は、アミノ酸配列をコードするが機能的な翻訳開始コドン及び／又は機能的な翻訳終始コドンを欠き、結果として完全なオープン・リーディング・フレームを含まないヌクレオチド配列を含んでもよい。この文脈において、「構造遺伝子領域」という用語は、該遺伝子を発現する真核細胞中で通常翻訳されない遺伝子の５’−上流又は３’−下流の配列といった非コードヌクレオチド配列にまでも拡張される。
【００８６】
従って、本発明の文脈において、構造遺伝子領域は、同一又は異なる遺伝子の二つ以上のオープン・リーディング・フレーム間の融合も含みうる。このような態様において、本発明は、一つの遺伝子の異なる非連続領域を標的化することにより該遺伝子の発現を調節するため、又は多重遺伝子ファミリーの異なる遺伝子などの幾つかの異なる遺伝子の発現を同時に調節するために使用されうる。動物細胞にとって非内因性であり且つ特にウイルス病原体に由来する二つ以上のヌクレオチド配列を含む融合核酸分子の場合、融合は、この幾つかの病原体における遺伝子の発現を標的化することにより該幾つかの病原体に対する同時免疫又は同時予防を付与するというさらなる利点を提供しうる。その代わりに又はそれに加えて、融合は、任意の病原体の一つ以上の遺伝子の発現を標的化することにより該病原体に対するより効果的な免疫を与えうる。
【００８７】
本発明のこの側面の特に好ましい構造遺伝子領域は、少なくとも一つの翻訳可能なオープン・リーディング・フレームを含むものであり、より好ましくはさらに該オープン・リーディング・フレームの５’端（必ずしも構造遺伝子領域の５’−末端とは限らないが）に位置する翻訳開始コドンを含む。この点で、構造遺伝子領域は少なくとも一つの翻訳可能なオープン・リーディング・フレーム及び／又はＡＵＧ若しくはＡＴＧの翻訳開始コドンを含み得るが、このような配列を含むことは、本発明が標的遺伝子の発現を調節するため導入された核酸分子の翻訳を生じさせる必要があることを示唆するものではない。いかなる理論又は作用様式にも拘束されるものではないが、本核酸分子に少なくとも一つの翻訳可能なオープン・リーディング・フレーム及び／又は翻訳開始コドンを含ませることは、そのｍＲＮＡ転写産物の安定性を増大するのに役立ちうるものであり、それにより、本発明の効率が改善される。
【００８８】
本発明の合成遺伝子に関与しうる構造遺伝子配列の最適な数は、該構造遺伝子配列のそれぞれの長さ、方向、及び互いの同一性の程度に応じてかなり変動する。例えば、当業者は、パリンドローム構造のヌクレオチド配列がインビボで本来不安定であることそしてこのような配列がインビボで組換えを起こす傾向があるため、逆反復ヌクレオチド配列を含む長い合成遺伝子を構築するには困難が伴うことを知っている。このような難点にも関わらず、本発明の合成遺伝子に含まれるべき構造遺伝子配列の最適な数は、過度の実験を行うことなく、リコンビナーゼ欠損の細胞系統を用い、組換え事象を除去又は最小限にするレベルまで反復配列の数を減らし、そして多重構造遺伝子配列の全長を許容される限界、好ましくは僅か５〜１０ｋｂ、より好ましくは僅か２〜５ｋｂ、さらにより好ましくは長さを僅か０．５〜２．０ｋｂに保つことにより、本発明の合成遺伝子を構築するような標準的手法に従い、当業者によって経験的に決定されうる。
【００８９】
構造遺伝子領域が二つ以上の分散した核酸分子又は外来性核酸分子を含む場合、本明細書では「多重構造遺伝子領域」または同様な用語を用いて言及する。明らかに、本発明は、好ましくは特定の構造遺伝子、分散した核酸分子又は外来性核酸分子、又はその断片の直列反復配列、逆反復配列又は分断されたパリンドローム配列を含む多重構造遺伝子領域の使用にまで拡張される。
【００９０】
本合成遺伝子の多重構造遺伝子単位内に含まれる分散した核酸分子又は外来性核酸分子のそれぞれは、同じ生物での異なる標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列を含みうる。ウイルス標的遺伝子の発現を改変することにより合成遺伝子が細胞、組織又は器官における病原体、とりわけウイルス病原体に対する防御を提供することを意図する場合、このような配置は特に有用でありうる。例えば、多重構造遺伝子が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎｉａプロテアーゼ、及びコートタンパク質を含むリストから選択される二つ以上の標的遺伝子又はウイルスの感染力、複製又は増殖にに必須な他の標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列（即ち、二つ以上の分散した核酸分子又は外来性核酸分子）を含みうる。しかし、この配置については、本合成遺伝子の多重構造遺伝子がプロモーター配列の制御下で発現するのとほぼ同じ時期に（又は後に）、実質的に同一の標的遺伝子（複数）が感染した細胞、組織又は器官内で正常に発現するように構造遺伝子単位が選択されることが好ましい。これは、ウイルス標的遺伝子が異なる感染段階で発現する場合、ウイルスの全生活環にわたって、多重構造遺伝子の発現を制御するプロモーターが細胞、組織又は器官における発現を行わせるように通常選択されることを意味する。
【００９１】
分散した核酸分子又は外来性核酸分子の各配列単位に関しては、多重構造遺伝子の個々の単位は相互に対して例えば、頭部から頭部、頭部から尾部、又は尾部から尾部の任意の方向で空間的に連結されうる、そしてこのような配置は全て本発明の範囲内にある。
【００９２】
真核細胞での発現のため、合成遺伝子は、本発明の核酸分子に加えて、一般にプロモーター及び任意選択的に分散した核酸分子又は外来性核酸分子の発現を促進するように設計された他の調節配列を含む。
【００９３】
本明細書における「プロモーター」に対する言及は、最も広い文脈で解釈されるべきであり、正確な転写の開始に必要とされるＴＡＴＡボックスを含み、ＣＣＡＡＴボックス配列及び発生上の及び／又は外部の刺激に応答して又は組織特異的な様式で遺伝子発現を変化させる付加的調節因子（即ち、上流の活性化配列、エンハンサー及びサイレンサー）を備えた又は備えない古典的なゲノム遺伝子の転写調節配列を含む。プロモーターは、必ずではないが通常、その発現を制御する構造遺伝子領域の上流又は５’に位置する。さらに、プロモーターを含む調節因子は通常、遺伝子の転写の開始部位の２ｋｂ内に位置する。
【００９４】
本文脈において、「プロモーター」という用語は細胞における核酸分子の発現を付与し、活性化し、又は強化する合成分子又は融合分子又は誘導体を記述するためにも使用される。
【００９５】
好ましいプロモーターは、センス分子の発現をさらに強化するために及び／又は該センス分子の空間的発現及び／又は時間的発現を改変するために一つ以上の特異的な調節因子のさらなるコピーを含みうる。例えば、銅誘導性を付与する調節因子はセンス分子を発現させる異種のプロモーター配列に隣接して配置されることにより、該分子の発現に銅誘導性を付与する。
【００９６】
プロモーター配列の調節的制御の下に分散した核酸分子又は外来性核酸分子を配置することは、その発現がそのプロモーター配列により制御されるように該分子を配置することを意味する。プロモーターは一般的にそれが制御する遺伝子の５’（上流）に位置する。異種のプロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築において、天然の環境でのプロモーターとそれが制御する遺伝子、即ちプロモーターが見出される遺伝子との間の距離とほぼ同じ遺伝子転写開始部位からの距離にプロモーターを配置することが一般的に好ましい。当分野で周知のように、プロモーター機能を喪失することなく、この距離のある程度の変動は許容される。同様に、その制御下に置かれるべき異種遺伝子に関する調節配列因子の好ましい配置は、天然環境、即ち該因子が見出される遺伝子のその配置により定められる。また、当分野で周知のように、この距離のある程度の変動も起こり得る。
【００９７】
本発明の合成遺伝子における使用に適したプロモーターの例としては、ウイルス、菌類、細菌、動物及び植物に由来するプロモーターであって、植物、動物、昆虫、菌類、酵母又は細菌の細胞で機能しうるプロモーターが挙げられる。このプロモーターは、構成的に構造遺伝子構成要素の発現を調節し、あるいは、発現が起こる細胞、組織又は器官に関して、又は発現が起こる発生段階に関して、又はとりわけ生理的ストレス、又は病原体、又は金属イオンなどの外部刺激に応答して異なって構造遺伝子構成要素の発現を調節しうる。
【００９８】
このプロモーターは、少なくとも標的遺伝子が発現する時間の間中、より好ましくは細胞、組織又は器官で標的遺伝子の検出可能な発現の開始直前にも、真核生物の細胞、組織又は器官で核酸分子の発現を調節できることが好ましい。
【００９９】
従って、強力な構成的プロモーターが又はウイルス感染若しくは標的遺伝子の発現の開始により誘導されうるプロモーターが本発明の目的には特に好ましい。
【０１００】
植物及び動物で機能しうるプロモーターは本発明の合成遺伝子の使用に特に好ましい。好ましいプロモーターの例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＳＣＳＶプロモーター、ＳＣＢＶプロモーター等が挙げられる。
【０１０１】
標的遺伝子の発現と同時に起きる又は標的遺伝子の発現に先行する高レベルな発現のための好ましい必要条件を考慮すると、プロモーター配列は、とりわけＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列又はＳＶ４０初期プロモーター配列、ＳＶ４０後期プロモーター配列、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、又はＳＣＢＶプロモーターなどの強力な構成的プロモーターであることが極めて望ましい。当業者は、具体的に記載されたもの以外の別のプロモーター配列にも容易に気付くはずである。
【０１０２】
本文脈において、「機能しうるように連結させた」又は「制御の下で機能しうる」又は同様な語は、構造遺伝子領域又は多重構造遺伝子領域の発現が細胞、組織、器官又は生物全体において空間的に連結させたプロモーター配列の制御の下にあることを意味すると解釈されるべきである。
【０１０３】
本発明の好ましい態様において、構造遺伝子領域（即ち、分散した核酸分子又は外来性核酸分子）又は多重構造遺伝子領域は、該遺伝子が転写される場合、翻訳されるなら、標的遺伝子又はその断片のポリペプチド産物をコードできるｍＲＮＡ産物が合成されるように、プロモーター配列に関してプロモーター方向に機能しうるように連結させて配置される。
【０１０４】
しかし、本発明はこのような配置の使用に制限されるわけではなく、本発明は明らかに、合成遺伝子及び遺伝的構築物の使用であって、少なくともそのｍＲＮＡ転写産物の一部が標的遺伝子又はその断片によってコードされるｍＲＮＡに相補的となるように、構造遺伝子領域又は多重構造遺伝子領域がプロモーター配列に関して「アンチセンス」方向に配置されるものである使用に拡張される。
【０１０５】
分散した核酸分子、外来性の核酸分子又は多重構造遺伝子領域は標的遺伝子の縦列直列配列反復配列及び／又は逆反復配列を含むことは明らかであるから、上述の立体配置のあらゆる組み合わせが本発明により包含される。
【０１０６】
本発明の別の態様において、構造遺伝子領域又は多重構造遺伝子領域は第一プロモーター配列及び第二プロモーター配列の両方に機能しうるように連結される。該二つのプロモーターは、構造遺伝子領域または多重構造遺伝子領域の少なくとも一つの単位が第一プロモーター配列に関して「センス」方向に置かれ、且つ第二プロモーター配列に関して「アンチセンス」方向に置かれるように、その遠位及び近位の末端に配置される。この態様によれば、第一プロモーターと第二プロモーターは、それらに結合する細胞転写因子に対する両者間の競合を防ぐために異なっていることも好ましい。この配置の利点は、細胞内での標的遺伝子の発現を低減させる際に、試験される各ヌクレオチド配列にとっての最適な方向を決定するために、第一プロモーターと第二プロモーターからの転写の影響が比較されうることである。
【０１０７】
合成遺伝子は、例えば転写終結配列など、効率的な転写のためのさらなる調節因子を含むことが好ましい。
【０１０８】
「ターミネーター」という用語は、転写の終結を知らせる転写単位の末端にあるＤＮＡ配列を指す。ターミネーターはポリアデニル化シグナルを含む３’−非翻訳ＤＮＡ配列であり、ポリアデニル化シグナルは一次転写産物の３’−末端にポリアデニレート配列の付加を促進させる。植物細胞内で活性なターミネーターが知られており、文献に記載されている。ターミネーターは細菌、真菌、ウイルス、動物及び／又は植物から単離しうるし又はデノボ合成しうる。
【０１０９】
プロモーター配列と同様に、ターミネーターは使用が意図される細胞、組織又は器官で機能しうる任意のターミネーター配列でありうる。
【０１１０】
本発明の合成遺伝子の使用に特に適切なターミネーターの例としては、中でも、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶ・ＴＫポリアデニル化シグナル、ＣＹＣ１ターミネーター、ＡＤＨターミネーター、ＳＰＡターミネーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子ターミネーター、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子のターミネーター、トウモロコシ由来のｚｅｉｎ遺伝子ターミネーター、ルビスコ小サブユニット（ＳＳＵ）遺伝子ターミネーター配列、サブクローバー・スタント・ウイルス（ＳＣＳＶ）遺伝子配列ターミネーター、任意のｒｈｏ非依存性大腸菌ターミネーター、又はＬａｃＺアルファターミネーターが挙げられる。
【０１１１】
特に好ましい態様において、このターミネーターは、動物の細胞、組織又は器官で機能しうるＳＶ４０ポリアデニル化シグナル又はＨＳＶ・ＴＫポリアデニル化シグナル、植物の細胞、組織又は器官で活性なオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）又はノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）のターミネーター、又は原核細胞で活性なｌａｃＺアルファターミネーターである。
【０１１２】
当業者は、本発明を実施する際に使用に適しうるさらなるターミネーター配列に気付くであろう。このような配列は過度の実験をすることなく容易に使用される。
【０１１３】
本明細書に記載される合成遺伝子又はそれを含む遺伝子構築物を細胞に導入する手段（即ち、トランスフェクション又は形質転換）は当業者に周知である。
【０１１４】
さらなる別の態様において、二つ以上の構造遺伝子領域又は多重構造遺伝子領域を含む遺伝子構築物が使用される。この構造遺伝子領域の各々はそれ自体のプロモーター配列の制御下で機能しうるように配置される。本明細書に記載される他の態様と同様に、各構造遺伝子領域の方向は標的遺伝子の発現に対する調節効果が最大になるよう変更されうる。
【０１１５】
この態様によれば、構造遺伝子単位の発現を制御するプロモーターは、細胞転写因子とＲＮＡポリメラーゼに対するそれらの間の競合を減少させるため異なるプロモーター配列であることが好ましい。好ましいプロモーターは先に言及したものから選択される。
【０１１６】
当業者は、別個のプロモーター配列からの発現を調節するため、前述したような各構造遺伝子の配置又は立体配置をどのように改変すべきかを知っている。
【０１１７ 】
前述の合成遺伝子は、例えば、それが発現する細胞、組織又は器官内で合成遺伝子の検出を容易にするため、検出可能なマーカー酵素をコードするマーカーヌクレオチド配列又はその機能的類似体又はその誘導体を含めることによりさらに改変できる。この態様にしたがって、マーカーヌクレオチド配列は、翻訳可能な型で存在し、例えば一つ以上の任意の構造遺伝子の翻訳産物との融合ポリペプチドとして、又は非融合ポリペプチドとして発現される。
【０１１８】
当業者は、本明細書に記載される合成遺伝子の作製方法、及び必要なときに所望の条件下で特定の細胞又は細胞のタイプでのそれを発現させるための必要条件を承知している。特に、本発明を実施するのに必要とされる遺伝子操作は本明細書に記載される遺伝子構築物またはその誘導体を大腸菌細胞などの原核細胞又は植物細胞又は動物細胞で増やすことを必要とすることは当業者に知られている。
【０１１９】
本発明の合成遺伝子は、とりわけ細胞、ウイルス粒子又はリポソームなどの適切な担体内に任意選択的に含まれる遺伝子構築物の形態の直鎖状ＤＮＡとして、改変することなく、適切な細胞、組織又は器官に導入されうる。遺伝子構築物を作成するため、本発明の合成遺伝子は、後に導入される宿主の細胞、組織又は器官内で維持及び／又は複製及び／又は発現できるバクテリオファージベクター、ウイルスベクター又はプラスミド、コスミド又は人工染色体ベクターなどの適切なベクター又はエピソーム分子に挿入される。
【０１２０】
従って、本発明のさらなる側面は、本明細書に記載の一つ以上の態様の合成遺伝子、及び一つ以上の複製起点及び／又は選択可能なマーカー遺伝子配列を少なくとも含む遺伝子構築物を提供する。
【０１２１】
遺伝子構築物は、ウイルス病原体に対する耐性特性を付与するほかに、真核細胞へ新規な遺伝的特性を導入するための該細胞の形質転換に特に適している。このようなさらなる新規な特性は、異なる遺伝子構築物中に、又は本明細書に記載の合成遺伝子を含む同じ遺伝子構築物上に導入されうる。当業者は、特に遺伝子操作及び組織培養の必要性の減少並びに費用効果の増大という点で、単独の遺伝子構築物にこのような付加的特性及び本明細書に記載の合成遺伝子をコードする遺伝子配列を含めることの大きな利点を認識するはずである。
【０１２２】
細菌での使用に適した複製起点又は選択可能なマーカー遺伝子は、真核細胞での発現又はそれへの導入、又は真核細胞のゲノムへの取り込みが意図される遺伝子構築物に含まれるこれらの遺伝子配列から物理的に分離されているのが通常である。
【０１２３】
特に好ましい態様においては、複製起点は細菌細胞で機能しうるものであって、ｐＵＣ又はＣｏｌＥ１の起点を含み、又は複製起点は真核生物の細胞、組織で機能しうるものであり、より好ましくは２ミクロン（２μｍ）の複製起点又はＳＶ４０の複製起点を含む。
【０１２４】
本明細書で使用されるとき、「選択可能なマーカー遺伝子」という用語は、本発明の遺伝子構築物又はその誘導体でトランスフェクション又は形質転換される細胞の同定及び／又は選択を容易にするために、それを発現する細胞に表現型を付与する任意の遺伝子を含む。
【０１２５】
本明細書で意図される適切な選択可能なマーカー遺伝子には、とりわけ、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐr ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃr ）、細菌性カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎr ）、ゼオシン耐性遺伝子（ゼオシンはブレオマイシン・ファミリーの薬物であり、インビトロゲン社の商標である）、抗生物質のオーレオバシディンＡに対する耐性を付与するＡＵＲＩ−Ｃ遺伝子、フォスフィノスリシン耐性遺伝子、ネオマイシン・フォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子が含まれる。
【０１２６】
選択可能なマーカー遺伝子はｎｐｔII遺伝子又はＫａｎr 遺伝子又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子であることが好ましい。
【０１２７】
当業者は本発明の実施に有用な他の選択可能マーカー遺伝子を承知しており、本発明は選択可能マーカー遺伝子の性質によって制限されるものではない。
【０１２８】
本発明は本質的に本明細書に記載の遺伝子構築物であって、原核生物又は真核生物における遺伝子構築物の維持及び／又は複製並びに／又は真核細胞又は真核生物のゲノムへの遺伝的構築物またはその一部の取り込みを目的とするさらなる遺伝子配列を含む遺伝子構築物全てに及ぶ。
【０１２９】
分散した又は外来の核酸分子と同様に、上記の標準的方法は、標的遺伝子の発現を調節する目的で合成遺伝子及び遺伝子構築物を細胞、組織又は器官に導入するために用いてもよく、例えば、リポソームに媒介されるトランスフェクション若しくは形質転換、弱毒化されたウイルス粒子若しくは細菌細胞による細胞の形質転換、細胞接合、当分野で周知の又はアウスベルら（１９９２年）により記載された形質転換又はトランスフェクションの手法が用いられる。
【０１３０】
植物の組織または細胞に組換えＤＮＡを導入するためのさらなる手段には、ＣａＣｌ2 及びその変形を用いる形質転換、特にハナハン（１９８３年）によって記載された方法、プロトプラストへの直接的なＤＮＡ取り込み（クレンスら，１９８２、パスズコヴスキーら，１９８４）、プロトプラストへのＰＥＧ媒介取り込み（アームストロングら，１９９０）、微小粒子銃撃、電気穿孔（フロムら，１９８５）、ＤＮＡのマイクロインジェクション（クロスウェイら，１９８６）、組織の外植片又は細胞の微小粒子銃撃（クリストウら、１９８８、サンフォード，１９８８）、核酸による組織の減圧浸入、又は植物の場合、アンら（１９８５年）、ヘレラ−エストレラら（１９８３ａ、１９８３ｂ、１９８５）により実質的に記述されたアグロバクテリウムから植物組織へのＴ−ＤＮＡ媒介性の導入が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３１】
細胞の微小粒子銃撃では、微小粒子が細胞に射ち込まれ形質転換細胞を生ずる。本発明を実施する際に、任意の適切な銃撃細胞形質転換方法及び装置が使用されうる。典型的な装置及び手法はストンプら（米国特許第５，１２２，４６６号）及びサンフォードとヴォルフ（米国特許第４，９４５，０５０号）により開示されている。銃撃性の形質転換手法を用いる場合、遺伝子構築物は形質転換される細胞中で複製できるプラスミドに組込まれうる。
【０１３２】
このような系での使用に適する微小粒子の例には１から５μｍの金の球が挙げられる。ＤＮＡ構築物は沈降などの任意の適切な技術により微小粒子に沈着されうる。
【０１３３】
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載の合成遺伝子及び遺伝子構築物は発現する細胞のゲノムへの組み込みに適合される。当業者は、宿主細胞のゲノムへの遺伝子配列又は遺伝子構築物の組み込みを達成するためにはある付加的な遺伝子配列が必要となることを承知している。植物の場合、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに由来する左側と右側の境界配列が一般に必要とされる。
【０１３４】
本発明は、本明細書に記載の合成遺伝子を含む単離された細胞、組織若しくは器官又は同遺伝子を含む遺伝子構築物にもさらに拡大される。さらに、本発明は、該細胞、組織及び器官に由来する再生された組織、器官及び生物体、並びにそれらの繁殖体及び子孫にも拡大される。
【０１３５】
例えば、植物はホルモンを含有する培地上で形質転換された植物の細胞、又は組織又は器官から再生しうる。再生された植物は、形質転換細胞と非形質転換細胞のキメラ、クローンの形質転換体（例えば、発現カセットを含むよう形質転換された全細胞）、形質転換された組織及び形質転換されていない組織の接木（例えば、柑橘種において形質転換されていない若枝に接木される形質転換された台木）などの多様な形態をとりうる。形質転換植物は、クローン繁殖又は古典的な育種技術などによる種々の方法により繁殖しうる。例えば、第一世代（即ちＴ１）の形質転換植物は同型接合の第二世代（Ｔ２）の形質転換植物をもたらすように自家受粉させてもよく、さらにＴ２植物は古典的な育種技術により繁殖させてもよい。
【０１３６】
さらに、本発明は以下の非限定的な実施例を参照することにより記述される。
【０１３７】
実施例１
ＣＭＶプロモーター配列及び／又はＳＶ４０Ｌプロモーター配列に連結させた
ＢＥＶポリメラーゼ遺伝子配列を含む遺伝子構築物
１．市販のプラスミド
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ＋）
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ＋）はストラタジーン社から購入でき、ＬａｃＺプロモーター配列及びｌａｃＺ−アルファ転写ターミネーターを含み、その中に構造遺伝子配列の挿入用に多重クローニング部位を備える。このプラスミドはＣｏｌＥ１とｆｌの複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子をさらに含む。
【０１３８】
プラスミドｐＳＶＬ
プラスミドｐＳＶＬはファルマシア社から購入でき、ＳＶ４０後期プロモーター配列の供給源として役立つ。ｐＳＶＬのヌクレオチド配列もゲンバンク受託番号Ｕ１３８６８として一般に入手できる。
【０１３９】
プラスミドｐＣＲ２．１
プラスミドｐＣＲ２．１はインビトロゲン社から購入でき、ＬａｃＺプロモーター配列及びｌａｃＺ−α転写ターミネーターを含み、それらの間に構造遺伝子配列の挿入用にクローニング部位を備えている。プラスミドｐＣＲ２．１は、ポリメラーゼ連鎖反応の間にＴａｑポリメラーゼによりしばしば合成されるＡ−オーバーハングにより核酸断片をクローニングするよう設計されている。この様式でクローニングされたＰＣＲ断片は両側に二つのＥｃｏＲＩ部位が隣接している。このプラスミドはＣｏｌＥ１とｆ１の複製起点並びにカナマイシン耐性及びアンピシリン耐性の遺伝子をさらに含む。
【０１４０】
プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＭＣＳ
プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＭＣＳ（図１；クローンテック社）は、野生型の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、プラッシェルら，１９９２、チャルフィーら，１９９４、イノウエとツジ，１９９４）をより明るい蛍光に最適化させた赤色シフトした変異体をコードするオープン・リーディング・フレームに機能しうるように連結させたＣＭＶ−ＩＥプロモーターを含む。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＭＣＳによってコードされたこの特定のＧＦＰ変異体はコルマックらにより開示された（１９９６年）。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＭＣＳは、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターとＧＦＰのオープン・リーディング・フレームとの間に位置するＢｇｌII部位とＢａｍＨＩ部位を含む多重クローニング部位及び多数の他の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む。多重クローニング部位にクローニングされた構造遺伝子は、機能的な翻訳開始部位を欠く場合、このような構造遺伝子の配列はタンパク質レベルで発現しない（即ち翻訳されない）けれども、転写レベルでは発現する。多重クローニング部位に挿入された機能的な翻訳開始部位を含む構造遺伝子配列は、ＧＦＰをコードする配列と共に枠をそろえてクローニングされる場合、ＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現する。このプラスミドは、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列から転写されたｍＲＮＡの３’末端の適切なプロセシングを指示するため、ＧＦＰのオープン・リーディング・フレームの下流にＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをさらに含む。このプラスミドは、動物細胞で機能するＳＶ４０の複製起点と、カナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８で形質転換細胞を選択するためのＴｎ５（図１のＫａｎ／ｎｅｏ）に由来するネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子及びＨＳＶチミジン・キナーゼ・ポリアデニル化シグナル（図１のＨＳＶ・ＴＫポリ（Ａ））に機能しうるように連結させたＳＶ４０初期プロモーター（図１のＳＶ４０・ＥＰ）を含むネオマイシン耐性遺伝子と、細菌細胞で機能するｐＵＣ１９の複製起点（図１のｐＵＣ・Ｏｒｉ）と、そして一本鎖ＤＮＡ生産のためのｆ１の複製起点（図１のｆ１・Ｏｒｉ）とをさらに含む。
【０１４１】
２．発現カセット
プラスミドｐＣＭＶ．ｃａｓｓ
プラスミドｐＣＭＶ．ｃａｓｓ（図２）は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列の制御下で構造遺伝子配列を発現させるための発現カセットである。プラスミドｐＣＭＶ．ｃａｓｓは以下のようにＧＦＰのオープン・リーディング・フレームを欠失させることによりｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＭＣＳから誘導した。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＭＣＳをＰｉｎＡＩとＮｏｔＩで消化し、ＰｆｕＩポリメラーゼを用いて平滑末端化した後、再連結した。構造遺伝子配列は、ＰｉｎＡＩ部位を欠くことを除いてｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＭＣＳの多重クローニング部位と同一である多重クローニング部位を用いてｐＣＭＶ．ｃａｓｓ中へクローニングする。
【０１４２】
プラスミドｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓ
プラスミドｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓ（図３）は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列とＳＶ４０後期プロモーター配列が同方向の転写を指示することができるように、合成のポリＡ部位と、ＳａｌＩ断片としてプラスミドｐＣＭＶ．ｃａｓｓ（図２）のＳａｌＩ部位にサブクローニングされたプラスミドｐＣＲ．ＳＶ４０Ｌ（図４）に由来するＳＶ４０Ｌ後期プロモーター配列とを含む。従って、ＳＶ４０プロモーター配列の５’末端のこの合成ポリ（Ａ）部位は、このプラスミドのＣＭＶ−ＩＥプロモーターから発現される構造遺伝子に対する転写ターミネーターとして用いられる。このプラスミドは、ＳＶ４０後期プロモーターと合成ポリ（Ａ）部位との間に存在する多重クローニング部位により該構造遺伝子の挿入を可能とする（図５）。この多重クローニング部位はＣＭＶ−ＩＥプロモーター及びＳＶ４０後期プロモーターの後方に位置し、ＢａｍＨＩ部位及びＢｇｌII部位を含む。
【０１４３】
プラスミドｐＣＭＶ．ＳＶ４０ＬＲ．ｃａｓｓ
プラスミドｐＣＭＶ．ＳＶ４０ＬＲ．ｃａｓｓは、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター又はＳＶ４０後期プロモーターが望みのままにセンス又はアンチセンスの方向で構造遺伝子又は多重構造遺伝子単位を転写しうるように、ＳａｌＩ断片としてプラスミドｐＣＭＶ．ｃａｓｓ（図２）のＳａｌＩ部位にサブクローニングされたプラスミドｐＣＲ．ＳＶ４０Ｌに由来するＳＶ４０Ｌ後期プロモーター配列を含む。多重クローニング部位は、このプラスミドにおいて反対方向のＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列とＳＶ４０後期プロモーター配列の間に位置し、構造遺伝子配列の導入を容易にする。このプラスミドから構造遺伝子配列を発現させるためには、このプラスミドで反対方向のＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列とＳＶ４０後期プロモーター配列との間に位置する転写終結配列はないので、３’末端に位置するそれ自身の転写終結配列が導入されなければならない。ｐＣＭＶ．ＳＶ４０ＬＲ．ｃａｓｓに導入される構造遺伝子配列又は多重構造遺伝子単位は下記のように５’と３’のポリアデニル化シグナルの両方を含むことが好ましい、即ち
（ｉ）構造遺伝子配列又は多重構造遺伝子単位がＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列からセンスの方向で及び／又はＳＶ４０後期プロモーターからアンチセンスの方向で発現される場合、５’ポリアデニル化シグナルはアンチセンスの方向にあり、３’ポリアデニル化シグナルはセンスの方向にあり、そして
（ii) 構造遺伝子配列又は多重構造遺伝子単位がＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列からアンチセンスの方向で及び／又はＳＶ４０後期プロモーターからセンスの方向で発現される場合、５’ポリアデニル化シグナルはセンスの方向にあり、３’ポリアデニル化シグナルはアンチセンスの方向にある。
【０１４４】
その代わり又はそれに加えて、適切な方向を向いたターミネーター配列は図４に示すようにＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０Ｌプロモーターの５’末端に位置しうる。
【０１４５】
又は、プラスミドｐＣＭＶ．ＳＶ４０ＬＲ．ｃａｓｓをさらに改変して、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター又はＳＶ４０プロモーターの配列のいずれかからセンス又はアンチセンスの方向でそれらの間に位置する任意の構造遺伝子の発現を促進するよう適切な方向でＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列とＳＶ４０プロモーター配列との間に位置する２つのポリアデニル化シグナルを含む誘導体プラスミドを作成する。本発明は明らかにこのような誘導体を包含する。
【０１４６】
又は、適切な方向を向いたターミネーターは、アンチセンス方向の２つのプロモーターのそれぞれが読み込まれれた後に転写終結が起こるように、ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０Ｌプロモーターの上流に配置することができよう。
【０１４７】
３．中間構築物
ｐＣＲ．Ｂｇｌ−ＧＦＰ−Ｂａｍプラスミド
ｐＣＲ．Ｂｇｌ−ＧＦＰ−Ｂａｍプラスミド（図５）は、ｌａｃＺプロモーターの制御下で機能しうるように配置されたｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＭＣＳプラスミド（図１）に由来するＧＦＰオープン・リーディング・フレームの内部領域を含む。このプラスミドを作成するために、ＧＦＰオープン・リーディング・フレームの領域を増幅プライマーのＢｇｌ−ＧＦＰ（配列番号：１）とＧＦＰ−Ｂａｍ（配列番号：２）とを用いてｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＭＣＳから増幅し、ｐＣＲ２．１プラスミドにクローニングした。ｐＣＲ．Ｂｇｌ−ＧＦＰ−Ｂａｍプラスミドにおける内部ＧＦＰをコードする領域は機能的な翻訳開始コドン及び終始コドンを欠く。
【０１４８】
ｐＢＳＩＩ（ＳＫ＋）．ＥＧＦＰプラスミド
ｐＢＳＩＩ（ＳＫ＋）．ＥＧＦＰプラスミド（図６）は、ｌａｃＺプロモーターの制御下で機能しうるように配置されたｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＭＣＳプラスミド（図１）に由来するＥＧＦＰオープン・リーディング・フレームを含む。このプラスミドを作成するために、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＭＣＳのＥＧＦＰコード領域をＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ断片として切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ＋）プラスミドのＮｏｔＩ／ＸｈｏＩクローニング部位にクローニングした。
【０１４９】
ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰプラスミド
ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰプラスミド（図７）はＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列の制御下でＥＧＦＰ構造遺伝子を発現できる。このプラスミドを作成するため、ｐＢＳＩＩ（ＳＫ＋）．ＥＧＦＰプラスミド由来のＥＧＦＰ配列をＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ断片として切り出し、ｐＣＭＶ．ｃａｓｓプラスミド（図２）のＢｇｌII／ＳａｃＩ部位にクローニングした。
【０１５０】
ｐＣＲ．ＳＶ４０Ｌプラスミド
ｐＣＲ．ＳＶ４０Ｌプラスミド（図８）はｐＣＲ２．１（ストラタジーン社）にクローニングされたｐＳＶＬプラスミド（ゲンバンク受託番号Ｕ１３８６８、ファルマシア社）に由来するＳＶ４０後期プロモーターを含む。このプラスミドを作成するため、ｐＣＭＶ．ｃａｓｓへの増幅されたＤＮＡ断片のサブクローニングを容易にするためのＳａｌＩクローニング部位を含むプライマーのＳＶ４０−１（配列番号：３）及びＳＶ４０−２（配列番号：４）を用いて、ＳＶ４０後期プロモーターを増幅した。このプライマーは５’末端に合成のポリ（Ａ）部位も含むため、増幅産物はＳＶ４０プロモーター配列の５’末端に合成のポリ（Ａ）部位を含む。
【０１５１】
ｐＣＲ．ＢＥＶ．１プラスミド
ＢＥＶのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする領域は、標準的な増幅条件の下でＢＥＶ−１（配列番号：５）とＢＥＶ−２（配列番号：６）と称するプライマーを用いて、同ポリメラーゼをコードする全長ｃＤＮＡクローンから１３８５ｂｐのＤＮＡ断片として増幅された。増幅されたＤＮＡはＢＥＶ−１プライマー配列に由来する５’−ＢｇｌII制限酵素部位及びＢＥＶ−２プライマー配列に由来する３’ＢａｍＨＩ制限酵素部位を含んでいた。さらに、ＢＥＶ−１プライマー配列は１５〜１７位に遺伝子工学的に導入された翻訳開始シグナル５’−ＡＴＧ−３’を含むため、増幅されたＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子はＢＥＶポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列とともに枠内に開始部位を含む。こうして、増幅されたＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子はＢＥＶポリメラーゼをコードする配列に対してすぐ上流に（即ち並置して）ＡＴＧ開始コドンを含む。増幅されたＤＮＡに翻訳終始コドンはない。このプラスミドは図９に示す。
【０１５２】
ｐＣＲ．ＢＥＶ．２プラスミド
完全なＢＥＶポリメラーゼをコードする領域はプライマーのＢＥＶ−１とＢＥＶ−３を用いて同ポリメラーゼをコードする全長のｃＤＮＡクローンから増幅された。プライマーＢＥＶ−３は５位から１０位までにＢａｍＨＩ制限酵素部位及び１１位から１３位に翻訳終止シグナルの補完物を含む。結果として、翻訳開始シグナルと翻訳終止シグナルとを含むオープン・リーディング・フレームがＢｇｌIIとＢａｍＨＩの制限部位の間に含められた。この増幅断片をｐＣＲ２．１（ストラタジーン社）にクローニングしてｐＣＲ２．ＢＥＶ．２プラスミド（図１０）を作成した。
【０１５３】
ｐＣＲ．ＢＥＶ．３プラスミド
翻訳できないＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子を、増幅プライマーのＢＥＶ−３（配列番号：７）とＢＥＶ−４（配列番号：８）とを用いて全長のＢＥＶポリメラーゼｃＤＮＡクローンから増幅した。プライマーＢＥＶ−４は５〜１０位のＢｇｌIIクローニング部位を含み、このＢｇｌII部位の下流の配列はＢＥＶポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に相同である。プライマーのＢＥＶ−３とＢＥＶ−４で増幅されたＤＮＡ産物には機能的なＡＴＧ開始コドンは存在しない。このＢＥＶポリメラーゼはポリタンパク質の一部として発現され、その結果、この遺伝子にＡＴＧ翻訳開始部位は存在しない。この増幅されたＤＮＡをプラスミドｐＣＲ２．１（ストラタジーン社）にクローニングしてｐＣＲ．ＢＥＶ．３プラスミド（図１１）を得た。
【０１５４】
ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．ＢＥＶ２プラスミド
ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．ＢＥＶ２プラスミド（図１２）は、ＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片としてのｐＣＲ．ＢＥＶ．２由来のＢＥＶポリメラーゼ配列をｐＣＭＶ．ＥＧＦＰのＢａｍＨＩ部位中へクローニングすることにより作成した。
【０１５５】
４．対照プラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．２プラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．２プラスミド（図１３）は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列の制御下でＢＥＶポリメラーゼの完全なオープン・リーディング・フレームを発現できる。ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．２を作成するために、ｐＣＲ．ＢＥＶ．２由来のＢＥＶポリメラーゼ配列を、ＢｇｌIIからＢａｍＨＩまでの断片としてセンス方向でＢｇｌII／ＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ｃａｓｓ（図２）中にサブクローニングした。
【０１５６】
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．３プラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．３プラスミド（図１４）は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列の制御の下でセンス方向で翻訳され得ないＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子を発現する。ｐＣＭＶ．ＢＥＶｎｔを作成するため、ｐＣＲ．ＢＥＶ．３由来のＢＥＶポリメラーゼ配列をＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片としてセンス方向でＢｇｌII／ＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ｃａｓｓ中にサブクローニングした（図２）。
【０１５７】
ｐＣＭＶ．ＶＥＢプラスミド
ｐＣＭＶ．ＶＥＢプラスミド（図１５）は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列の制御の下でアンチセンスのＢＥＶポリメラーゼのｍＲＮＡを発現する。ｐＣＭＶ．ＶＥＢプラスミドを作成するため、ｐＣＲ．ＢＥＶ．２由来のＢＥＶポリメラーゼ配列をＢｇｌIIからＢａｍＨＩまでの断片としてアンチセンス方向でＢｇｌII／ＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ｃａｓｓ（図２）中にサブクローニングした。
【０１５８】
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＧＦＰプラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＧＦＰプラスミド（図１６）は、ｐＣＲ．Ｂｇｌ−ＧＦＰ−Ｂａｍ由来のＧＦＰ断片をＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片として、ＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ＢＥＶ．２中にクローニングすることにより構築した。このプラスミドは幾つかの実験における対照として役立ち、そして中間構築物としても役立つ。
【０１５９】
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０−Ｌ．０プラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０−Ｌ．０プラスミド（図１７）は、ｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓプラスミドのＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列とＳＶ４０後期プロモーターの配列の間にセンス方向で挿入されたｐＣＲ．ＢＥＶ．２由来の翻訳可能なＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子を含む。ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０Ｌ−Ｏプラスミドを作成するため、ＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子をＢｇｌIIからＢａｍＨＩ断片としてＢｇｌIIで消化したｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓＤＮＡ中にサブクローニングした。
【０１６０】
ｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．ＢＥＶプラスミド
ｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．ＢＥＶプラスミド（図１８）は、ｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓプラスミドに存在する縦列のＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列とＳＶ４０後期プロモーター配列との下流にクローニングされたｐＣＲ．ＢＥＶ．２プラスミドに由来する翻訳可能なＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子を含む。ｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．ＢＥＶプラスミドを作成するため、ＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子をＢｇｌIIからＢａｍＨＩまでの断片としてセンス方向でＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓＤＮＡ中にサブクローニングした。
【０１６１】
ｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．ＶＥＢプラスミド
ｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．ＶＥＢプラスミド（図１９）は、ｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓプラスミドに存在する縦列のＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列とＳＶ４０後期プロモーター配列の下流にクローニングされたｐＣＲ．ＢＥＶ．２プラスミドに由来するアンチセンスのＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子を含む。ｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．ＶＥＢプラスミドを作成するため、ＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子をＢｇｌIIからＢａｍＨＩまでの断片としてアンチセンス方向でＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ＳＶ．４０Ｌ．ｃａｓｓＤＮＡ中にサブクローニングした。
【０１６２】
５．試験プラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ２プラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ２プラスミド（図２０）は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列の制御の下で完全なＢＥＶポリメラーゼのオープン・リーディング・フレームの直列反復を含む。少なくとも真核細胞では、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターのより近くに位置するオープン・リーディング・フレームは翻訳可能である。ｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ２を作成するために、ｐＣＲ．ＢＥＶ．２プラスミド由来のＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子をＢｇｌIIからＢａｍＨＩまでの断片としてセンス方向で既にその中に存在するＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子のすぐ下流にあるＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ＢＥＶ．２中にサブクローニングした。
【０１６３】
ｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ３プラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ３プラスミド（図２１）は、ＣＭＶ−１Ｅプロモーターの制御下でＢＥＶポリメラーゼの三つの完全なオープン・リーディング・フレームの直列反復を含む。ｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ３を作成するため、ｐＣＲ．ＢＥＶ．２由来のＢＥＶポリメラーゼ断片を、ＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片としてセンス方向で既にその中に存在するＢＥＶポリメラーゼ配列のすぐ下流にあるｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ２のＢａｍＨＩ部位中にクローニングした。
【０１６４】
ｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ４プラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ４プラスミド（図２２）は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの制御の下でＢＥＶポリメラーゼの四つの完全なオープン・リーディング・フレームの直列反復を含む。ｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ４を作成するため、ｐＣＲ．ＢＥＶ．２由来のＢＥＶポリメラーゼ断片を、ＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片として、センス方向で、既にその中に存在するＢＥＶポリメラーゼ配列のすぐ下流にあるｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ３のＢａｍＨＩ部位中にクローニングした。
【０１６５】
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０Ｌ．ＢＥＶプラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０Ｌ．ＢＥＶプラスミド（図２３）は、機能しうるように配置され且つそれぞれＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列とＳＶ４０後期プロモーター配列の制御の下にある二つのＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子を含む多重構造遺伝子単位を含む。ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０Ｌ．ＢＥＶプラスミドを作成するため、ｐＣＲ．ＢＥＶ．２に存在する翻訳可能なＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子を、ＢｇｌIIからＢａｍＨＩまでの断片としてセンス方向で、ＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０Ｌ−Ｏに存在するＳＶ４０後期プロモーター配列の後方にサブクローニングした。
【０１６６】
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０Ｌ．ＶＥＢプラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０Ｌ．ＶＥＢプラスミド（図２４）は、機能しうるように配置され且つそれぞれＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列とＳＶ４０後期プロモーター配列の制御の下にある二つのＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子を含む多重構造遺伝子単位を含む。ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０Ｌ．ＶＥＢプラスミドを作成するため、ｐＣＲ．ＢＥＶ．２に存在する翻訳可能なＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子を、、ＢｇｌIIからＢａｍＨＩまでの断片としてアンチセンス方向で、ＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０Ｌ−Ｏに存在するＳＶ４０後期プロモーター配列の後方にサブクローニングした。このプラスミドでは、ＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子はＣＭＶ−ＩＥプロモーターの制御の下でセンス方向で発現して翻訳可能なｍＲＮＡを産生する一方、このＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子はＳＶ４０プロモーターの制御の下でも発現してアンチセンスのｍＲＮＡ種を産生する。
【０１６７】
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＧＦＰ．ＶＥＢプラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＧＦＰ．ＶＥＢプラスミド（図２５）は、逆反復の各ＢＥＶ構造遺伝子配列間にＧＦＰオープン・リーディング・フレーム（スタッファー断片）の挿入によって分断されたＢＥＶ構造遺伝子の逆反復即ちパリンドロームを含む。ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＧＦＰ．ＶＥＢプラスミドを作成するため、ｐＣＲ．Ｂｇｌ−ＧＦＰ−Ｂａｍ由来のＧＦＰスタッファー断片を、まずＢｇｌIIからＢａｍＨＩまでの断片としてＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ＢＥＶ．２中にセンス方向でサブクローニングしてｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＧＦＰ中間プラスミドを得た。該ＢＥＶポリメラーゼをコードする配列と該ＧＦＰをコードする配列とは５’−ＢｇｌIIからＢａｍＨＩ−３’までの同じ断片内に含まれる。次に、ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．２由来のＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子を、ＢｇｌIIからＢａｍＨＩまでの断片としてアンチセンス方向で、ＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＧＦＰ中にクローニングした。ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＧＦＰ．ＶＥＢプラスミドのＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列により近いＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子は少なくとも真核細胞中で翻訳され得る。
【０１６８】
ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．ＢＥＶ２．ＰＦＧプラスミド
ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．ＢＥＶ２．ＰＦＧプラスミド（図２６）は、逆反復の各ＧＦＰ構造遺伝子の間にＢＥＶポリメラーゼ配列を挿入することにによって分断されたＧＦＰパリンドロームを含む。このプラスミドを作成するため、ｐＣＲ．Ｂｇｌ−ＧＦＰ−Ｂａｍ由来のＧＦＰ断片を、ＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片として、ＣＭＶプロモーターに関してアンチセンス方向で、ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．ＢＥＶ２のＢａｍＨＩ部位中にクローニングした。
【０１６９】
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０ＬＲプラスミド
ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０ＬＲプラスミド（図２７）は、機能しうるように配置され且つ反対方向のＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列とＳＶ４０後期プロモーター配列により別々に制御されている完全なＢＥＶポリメラーゼのオープン・リーディング・フレームを含む構造遺伝子を含み、それにより、全長のＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子の少なくとも両方の鎖に由来するＢＥＶポリメラーゼの転写産物を潜在的に生産可能である。ｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０ＬＲプラスミドを作成するために、ｐＣＲ．ＢＥＶ．２に存在する翻訳可能なＢＥＶポリメラーゼ構造遺伝子を、ＢｇｌIIからＢｍＨＩまでの断片として、ＢＥＶのオープン・リーディング・フレームがＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列に関してセンス方向に存在するように、ｐＣＭＶ．ＳＶ４０ＬＲ．ｃａｓｓの唯一つのＢｇｌII部位にサブクローニングした。
【０１７０】
当業者は、このクローニング戦略を用いて、ｐＣＲ．ＢＥＶ．２に由来するＢＥＶポリメラーゼ断片がＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列に関してアンチセンス方向に挿入されているプラスミドを作成することが可能であることを認めるはずである。本発明はこのような遺伝的構築物をも包含する。
【０１７１】
実施例２
ＣＭＶプロモーター配列及び／又はＳＶ４０Ｌプロモーター配列に機能しうる
ように連結されたブタのα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ
（Ｇａｌｔ）構造遺伝子の配列又は配列群を含む遺伝子構築物
１．市販のプラスミド
ｐｃＤＮＡ３プラスミド
ｐｃＤＮＡ３プラスミドは、インビトロゲン社から購入でき、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター及びＢＧＨｐＡ転写ターミネーターを含み、構造遺伝子配列を挿入するための多重クローニング部位を備えている。さらに、このプラスミドはＣｏｌＥ１とｆｌの複製起点及びネオマイシン耐性とアンピシリン耐性の遺伝子を含む。
【０１７２】
２．中間プラスミド
ｐｃＤＮＡ３．Ｇａｌｔプラスミド
ｐｃＤＮＡ３．Ｇａｌｔプラスミド（ブレサゲン社、南オーストラリア州、オーストラリア、図２８）はｐｃＤＮＡ３プラスミド（インビトロゲン社）であり、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列の制御の下で機能しうるブタのアルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇａｌｔ）遺伝子をコードするｃＤＮＡ配列を含むので、Ｇａｌｔが該プラスミドから発現され得る。ｐｃＤＮＡ３．Ｇａｌｔプラスミドを作成するために、ブタのアルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ断片としてｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＩクローニング部位中にクローニングした。このプラスミドはＣｏｌＥ１とｆ１の複製起点及びネオマイシンとアンピシリンの耐性遺伝子をさらに含む。
【０１７３】
３．対照プラスミド
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔプラスミド
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔプラスミド（図２９）はＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列の制御の下でＧａｌｔ構造遺伝子を発現することができる。ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔプラスミドを作成するため、ｐｃＤＮＡ３．Ｇａｌｔプラスミド由来のＧａｌｔ配列をＥｃｏＲＩ断片として切り出し、ｐＣＭＶ．ｃａｓｓプラスミド（図２）のＥｃｏＲＩ部位にセンス方向でクローニングした。
【０１７４】
ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．Ｇａｌｔプラスミド
ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．Ｇａｌｔプラスミド（図３０）はＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列の制御の下でＧａｌｔ融合ポリペプチドとしてＧａｌｔ構造遺伝子を発現できる。ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．Ｇａｌｔプラスミドを作成するため、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ（図２９）由来のＧａｌｔ配列をＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片として切り出し、ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰのＢａｍＨＩ部位中にクローニングした。
【０１７５】
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＧＦＰプラスミド
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＧＦＰプラスミド（図３１）は、Ｇａｌｔ・ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３由来のＥｃｏＲＩ断片としてセンス方向でＥｃｏＲＩで消化したｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ中にクローニングすることにより作成した。このプラスミドは対照としても中間構築物としても役立つ。
【０１７６】
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０Ｌ．Ｏプラスミド
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０Ｌ．Ｏプラスミド（図３２）は、ｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓに存在するＣＭＶプロモーターの下流にクローニングされたＧａｌｔ構造遺伝子を含む。このプラスミドを作成するため、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ由来のＧａｌｔ・ｃＤＮＡ断片を、ＢｇｌII／ＢａｍＨＩとしてＢｇｌIIで消化したｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓ中にセンス方向でクローニングした。
【０１７７】
ｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．ｔｌａＧプラスミド
ｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．ｔｌａＧプラスミド（図３３）は、ｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓに存在するＳＶ４０Ｌプロモーターの下流にアンチセンス方向でＧａｌｔ構造遺伝子クローンを含む。このプラスミドを作成するため、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ由来のＧａｌｔ・ｃＤＮＡ断片を、ＢｇｌII／ＢａｍＨＩとしてＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓ中にアンチセンス方向でクローニングした。
【０１７８】
ｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．Ｇａｌｔプラスミド
ｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．Ｇａｌｔプラスミド（図３４）は、ｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓに存在するＳＶ４０Ｌプロモーターの下流にクローニングされたＧａｌｔ構造遺伝子を含む。このプラスミドを作成するため、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ由来のＧａｌｔ・ｃＤＮＡ断片を、ＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片としてＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓ中にセンス方向でクローニングした。
【０１７９】
４．試験プラスミド
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔｘ２プラスミド
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔｘ２プラスミド（図３５）は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列の制御の下にＧａｌｔオープン・リーディング・フレームの直列反復を含む。少なくとも真核細胞において、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターのより近くに位置するオープン・リーディング・フレームは翻訳可能である。ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔｘ２を作成するため、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ由来のＧａｌｔ構造遺伝子を、ＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片として切り出し、ｐＣＭＶ．ＧａｌｔのＢａｍＨＩクローニング部位中にセンス方向でクローニングした。
【０１８０】
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔｘ４プラスミド
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔｘ４プラスミド（図３６）は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列の制御の下にＧａｌｔオープン・リーディング・フレームの四つの直列反復を含む。少なくとも真核細胞において、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターのより近くに位置するオープン・リーディング・フレームは翻訳可能である。ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔｘ４を作成するため、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔｘ２由来のＧａｌｔｘ２配列を、ＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片として切り出し、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔｘ２のＢａｍＨＩクローニング部位中にセンス方向でクローニングした。
【０１８１】
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０Ｌ．Ｇａｌｔプラスミド
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０Ｌ．Ｇａｌｔプラスミド（図３７）は、Ｇａｌｔの二つのセンスの転写産物を発現するよう設計される。すなわち、一方はＣＭＶプロモーターにより駆動されたものであり、他方はＳＶ４０Ｌプロモーターにより駆動されたものである。このプラスミドを作成するため、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ由来のＧａｌｔ・ｃＤＮＡ断片をＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片としてＢｇｌIIで消化したｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０．Ｇａｌｔ中にセンス方向でクローニングした。
【０１８２】
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０Ｌ．ｔｌａＧプラスミド
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０Ｌ．ｔｌａＧプラスミド（図３８）は、ＣＭＶプロモーターにより駆動されＧａｌｔのセンスの転写産物を発現し、かつ、ＳＶ４０Ｌプロモーターにより駆動されアンチセンスの転写産物を発現するように設計される。このプラスミドを作成するため、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ由来のＧａｌｔ・ｃＤＮＡ断片をＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片としてＢｇｌIIで消化したｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０．ｔｌａＧ中にセンス方向でクローニングした。
【０１８３】
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＧＦＰ．ｔｌａＧプラスミド
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＧＦＰ．ｔｌａＧプラスミド（図３９）は、逆反復の各Ｇａｌｔ構造遺伝子の間がＧＦＰ配列の挿入により分断されたＧａｌｔパリンドロームを含む。このプラスミドを作成するため、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ由来のＧａｌｔ・ｃＤＮＡを、ＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片として、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＧＦＰのＢａｍＨＩ部位にＣＭＶプロモーターに関してアンチセンス方向でクローニングした。
【０１８４】
ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．Ｇａｌｔ．ＰＦＧプラスミド
ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．Ｇａｌｔ．ＰＦＧプラスミド（図４０）は、逆反復の各ＧＦＰ構造遺伝子の間がＧａｌｔ配列の挿入により分断されたＧＦＰパリンドロームを含み、その発現はＣＭＶプロモーターにより駆動される。このプラスミドを作成するため、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ由来のＧａｌｔ配列を、ＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片としてＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ．ＥＧＦＰにセンス方向でクローニングして中間体のｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．Ｇａｌｔ（未表示）を作成し、その後、ｐＣＲ．Ｂｇｌ−ｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．Ｇａｌｔ由来のＧＦＰ配列をアンチセンス方向でさらにクローニングした。
【０１８５】
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０ＬＲプラスミド
ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０ＬＲプラスミド（図４１）は、ｐＣＭＶ．ＳＶ４０ＬＲ．ｃａｓｓ発現カセットにおいて反対方向のＣＭＶプロモーターとＳＶ４０Ｌプロモーターとの間にクローニングされたＧａｌＴ・ｃＤＮＡ配列を発現するように設計される。このプラスミドを作成するため、ｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ由来のＧａｌｔ配列をＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片としてＢｇｌIIで消化したｐＣＭＶ．ＳＶ４０ＬＲ．ｃａｓｓに３５Ｓプロモーターに関してセンス方向でクローニングした。
【０１８６】
実施例３
３５Ｓプロモーター配列及び／又はＳＣＢＶプロモーター配列に機能しうる
ように連結させたＰＶＹ・Ｎｉａ配列を含む遺伝子構築物
１．二元ベクター
ｐＡＲＴ２７プラスミド
ｐＡＲＴ２７プラスミドは二元ベクターであり、ｐＡＲＴ２７発現カセットに適合するよう特別に設計されている。これは、大腸菌とアグロバクテリウム・ツメファシエンスの両方の細菌の複製起点、細菌の選択用のスペクティノマイシン耐性遺伝子、アグロバクテリウムから植物細胞へのＤＮＡ転移用の左側及び右側のＴ−ＤＮＡ境界領域、及び形質転換した植物細胞を選択するためのカナマイシン耐性カセットを含む。カナマイシン耐性カセットは両Ｔ−ＤＮＡ境界領域の間に位置し、ｐＡＲＴ２７は、両Ｔ−ＤＮＡ境界領域の間にクローニングされるべきｐＡＲＴ７などのベクター中で調製された構築物のクローニングを可能とする唯一のＮｏｔＩ制限部位をも含む。ｐＡＲＴ２７の構築はグリーブ、エイ．ピー．（１９９２年）に記述されている。
【０１８７】
このベクターにＮｏｔＩ挿入物をクローニングする場合、二つの挿入方向が得られ得る。以下の実施例全てにおいて、前記ｐＡＲＴ７構築物における３５Ｓプロモーターの方向に関して同じ挿入方向を選択した。これは、異なる挿入方向をもつ異なる構築物の比較から生じうる実験上の人工産物を最小限にするために行った。
【０１８８】
２．市販のプラスミド
ｐＢＣ（ＫＳ−）プラスミド
ｐＢＣ（ＫＳ−）プラスミドはストラタジーン社から購入でき、構造遺伝子配列の挿入用の多重クローニング部位を備え、ＬａｃＺプロモーター配列及びｌａｃＺ−アルファ転写ターミネーターを含む。このプラスミドはＣｏｌＥ１とｆ１の複製起点及びクロラムフェニコール耐性遺伝子をさらに含む。
【０１８９】
ｐＳＰ７２プラスミド
ｐＳＰ７２プラスミドはプロメガ社から購入でき、構造遺伝子配列の挿入用の多重クローニング部位を含む。さらに、このプラスミドはＣｏｌＥ１の複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【０１９０】
３．発現カセット
ｐＡＲＴ７プラスミド
ｐＡＲＴ７プラスミドは３５Ｓプロモーターの後方にクローニングされた配列の発現を駆動するよう設計された発現カセットである。これはクローニングを助けるためのポリリンカー及びオクティピンシンターゼのターミネーター領域を含む。３５Ｓ発現カセットの両側は、唯一のＮｏｔＩ部位を含むｐＡＲＴ２７のような二元発現ベクターへのクローニングを行える二つのＮｏｔＩ制限部位が隣接している。この構築はグリーブ、エイ．ピー．（１９９２年）に記載され、地図は図４２に示す。
【０１９１】
ｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＳＣＢＶ．ｃａｓｓプラスミド
ｐ３５Ｓ．ＣＭＶ．ｃａｓｓプラスミドは、一つのプラスミド中にクローニングされる二つの異なる遺伝子配列を発現するよう設計された。このプラスミドを作成するため、ｎｏｓターミネーターとＳＣＢＶプロモーターに対応する配列をＰＣＲにより増幅した後、３５ＳプロモーターとＯＣＳとの間にあるｐＡＲＴ７のポリリンカーにクローニングした。
【０１９２】
得られるプラスミドは以下の因子の配列を有する。
３５Ｓプロモーター−ポリリンカー１−ＮＯＳターミネーター−ＳＣＢＶプロモーター−ポリリンカー２−ＯＣＳターミネーター。
【０１９３】
ポリリンカー１にクローニングされた配列の発現は３５Ｓプロモーターにより制御され、ポリリンカー２にクローニングされた配列の発現はＳＣＢＶプロモーターにより制御される。
【０１９４】
ＮＯＳターミネーター配列は下記の二つのオリゴヌクレオチドを用いてｐＡＨＣ２７プラスミド（クリステンセンとクエイル，１９９６年）から増幅した。
ＮＯＳ５’（前向きプライマー、配列番号：９）
５’−ＧＧＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＣＧＴＣＧＣＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣＣＧＡＴＣＧＴＴＣ−３’、及び
ＮＯＳ３’（逆向きプライマー、配列番号：１０）
５’−ＣＣＡＴＧＧＣＣＡＴＡＴＡＧＧＣＣＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣＡＴＡＧ−３’。
【０１９５】
ＮＯＳ５’の１から１７とＮＯＳ３’の１から１５のヌクレオチド残基は、さらなる制限部位を加えることによる構築物調製を補助するよう設計された付加的なヌクレオチドを表す。ＮＯＳ５’では、これらはＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＡａｔII及びＮｒｕＩ部位の最初の４塩基であり、ＮＯＳ３’では、これらはＮｃｏＩとＳｆｉＩ部位である。各オリゴヌクレオチドに対する残りの配列は、ｐＡＨＣ２７におけるＮＯＳ配列の５’末端と３’末端にそれぞれ相同である。
【０１９６】
ＳＣＢＶプロモーター配列は下記の二つのオリゴヌクレオチドを用いてｐＳｃＢＶ−２０プラスミド（トザファーら，１９９８年）から増幅した。
ＳＣＢＶ５’：５’−ＣＣＡＴＧＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＣＡＴＴＣＡＡＧ−３’（配列番号：１１）、及び
ＳＣＢＶ３’：５’−ＡＡＣＧＴＴＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＧ−３’（配列番号：１２）。
【０１９７】
ＳＣＢＶ５’の１から１７のヌクレオチド残基は構築物の調製を助けるよう設計されたＮｃｏＩとＳｆｉＩの制限部位をコードし、残りの配列はＳＣＭＶプロモーター領域の上流配列に相同である。ＳＣＢＶ３’の１から９のヌクレオチド残基は構築物の調製を助けるよう設計されたＰｓｐ１０４６１とＨｐａＩの制限部位をコードし、残りの配列はＳＣＢＶの転写開始部位近くにある配列の逆向きかつ相補的配列に相同である。
【０１９８】
ＰＣＲを用いてｐＳｃＢＶ−２０から増幅された配列及びｐＳｃＢＶ−２０をｐＣＲ２．１（インビトロゲン社）にクローニングして得られた配列は、それぞれｐＣＲ．ＮＯＳとｐＣＲ．ＳＣＢＶであった。ＳｍａＩ／ＳｆｉＩで切断したｐＣＲ．ＮＯＳとＳｆｉＩ／ＨｐａＩで切断したｐＣＲ．ＳＣＢＶをＳｍａＩで切断したｐＡＲＴ７に連結し、適切な方向をもつプラスミドを選択してｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＳＣＢＶ．ｃａｓｓと名づけた。この構築物の地図は図４３に示す。
【０１９９】
４．中間構築物
ｐＢＣ．ＰＶＹプラスミド
ＰＶＹゲノムの領域は鋳型としてＰＶＹに感染したタバコから単離された逆転写ＲＮＡを用いて標準的なプロトコルでＰＣＲにより増幅し、ｐＧＥＭ３（ストラタジーン社）プラスミド中にクローニングしてｐＧＥＭ．ＰＶＹを作成した。ＰＶＹ株Ｏ配列（受託番号Ｄ１２５３９、ゲンバンク）の１５３６〜２２７０位のＳａｌＩ／ＨｉｎｄIII 断片に対応するｐＧＥＭ．ＰＶＹ由来のＳａｌＩ／ｈｉｎｄIII 断片を次にｐＢＣプラスミド（ストラタジーン社）にサブクローニングしてｐＢＣ．ＰＶＹ（図４４）を作成した。
【０２００】
ｐＳＰ７２．ＰＶＹプラスミド
ｐＳＰ７２．ＰＶＹプラスミドは、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩで切断したｐＳＰ７２（プロメガ社）中にｐＢＣ．ＰＶＹ由来のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片を挿入することにより調製した。この構築物はＰＶＹ挿入物を挟んで両側にさらなる制限部位を含んでいる。これらの制限部位は後の操作を助けるために用いられた。この構築物の地図は図４５に示す。
【０２０１】
ＣｌａｐＢＣ．ＰＶＹプラスミド
Ｃｌａ・ｐＢＣ．ＰＶＹプラスミドは、ｐＳＰ７２．ＰＶＹ由来のＣｌａＩ／ＳａｌＩ断片をＣｌａＩ／ＳａｌＩで切断したｐＢＣ（ストラタジーン社）中に挿入することにより調製した。この構築物はＰＶＹ挿入物を挟んで両側にさらなる制限部位を含む。これらの制限部位は後の操作を助けるために用いられた。この構築物の地図は図４６に示す。
【０２０２】
ｐＢＣ．ＰＶＹｘ２プラスミド
ｐＢＣ．ＰＶＹｘ２プラスミドはｐＢＣ．ＰＶＹに由来するＰＶＹ配列の二つの直列の頭−尾反復を含む。このプラスミドはＡｃｃＩで切断したｐＢＣ．ＰＶＹ中にｐＳＰ７２．ＰＶＹ由来のＡｃｃＩ／ＣｌａＩ・ＰＶＹ断片をクローニングすることにより作成した。このプラスミドは図４７に示す。
【０２０３】
ｐＳＰ７２．ＰＶＹｘ２プラスミド
ｐＳＰ７２．ＰＶＹｘ２プラスミドはｐＢＣ．ＰＶＹに由来するＰＶＹ配列の二つの直列の頭−尾反復を含む。このプラスミドはＡｃｃＩで切断したｐＳＰ７２．ＰＶＹ中にｐＢｃ．ＰＶＹ由来のＡｃｃＩ／ＣｌａＩ・ＰＶＹ断片をクローニングすることにより作成した。このプラスミドは図４８に示す。
【０２０４】
ｐＢＣ．ＰＶＹｘ３プラスミド
ｐＢＣ．ＰＶＹｘ３プラスミドはｐＢＣ．ＰＶＹに由来するＰＶＹ配列の三つの直列の頭−尾反復を含む。このプラスミドはＡｃｃＩで切断したｐＢＣ．ＰＶＹｘ２中にｐＳＰ７２．ＰＶＹ由来のＡｃｃＩ／ＣｌａＩ・ＰＶＹ断片をクローニングすることにより調製した。このプラスミドは図４９に示す。
【０２０５】
ｐＢＣ．ＰＶＹｘ４プラスミド
ｐＢＣ．ＰＶＹｘ４プラスミドはｐＢＣ．ＰＶＹに由来するＰＶＹ配列の四つの直列の頭−尾反復を含む。このプラスミドはＡｃｃＩで切断したｐＢＣ．ＰＶＹｘ２中にＡｃｃＩ／ＣｌａＩ断片としてのｐＳＰ７２．ＰＶＹｘ２由来のＰＶＹ配列の直列反復をクローニングすることにより調製した。このプラスミドは図５０に示す。
【０２０６】
ｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶプラスミド
ＰＶＹ配列の直列のパリンドロームを作成する試みは全て失敗した。おそらくこのような配列の配置は広く使用されている大腸菌のクローニング宿主では不安定らしい。しかしながら、分断されたパリンドロームは安定であることが分かった。
【０２０７】
ＰＶＹ配列の分断されたパリンドロームを作成するために、約３６０ｂｐの「スタッファー」断片をＰＶＹ配列の下流のＣｌａ・ｐＢＶ．ＰＶＹ中に挿入した。このスタッファー断片はつぎのように作製した。
【０２０８】
４ｂのウイルス遺伝子を含むことが知られているレタス・ネクロッティック・イエローズ・ウイルス（ＬＮＹＶ）のゲノムＲＮＡ（ダイツゲンら，１９８９年）から調製されたｃＤＮＡライブラリーから当初得られたクローンを下記のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
ＬＮＹＶ１：５’−ＡＴＧＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡ−３’（配列番号：１３）、及び
ＬＮＹＶ２：５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＣＧＧＡＣＣＣＧＡＴＧ−３’（配列番号：１４）。
【０２０９】
これらのプライマーの最初の９ヌクレオチドはＢａｍＨＩ部位をコードし、残りのヌクレオチドはＬＮＹＶの４ｂの遺伝子配列に相同である。
【０２１０】
増幅後、この断片をｐＣＲ２．１（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。このＥｃｏＲＩ断片をＣｌａ・ｐＢＣ．ＰＶＹのＥｃｏＲＩ部位にクローニングして図５１に示すｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ中間プラスミドを作成した。
【０２１１】
ｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＰＶＹプラスミド
ｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＰＶＹプラスミドはＰＶＹ配列の分断された直列反復を含む。このプラスミドを作成するために、ＳｍａＩで消化したｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ中にｐＳＰ７２由来のＨｐａＩ／ＨｉｎｃII断片をクローニングし、センス方向をもつプラスミドを単離した。この構築物の地図は図５２に示す。
【０２１２】
ｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰΔプラスミド
ｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰΔプラスミドはＰＶＹ配列の部分的に分断されたパリンドロームを含む。パリンドロームの一方のアームはｐＢＣ．ＰＶＹ由来のＰＶＹ全配列を含み、他方のアームはｐＳＰ７２．ＰＶＹのＥｃｏＲＶ部位とＨｉｎｃII部位間の配列に対応する、ＰＶＹ由来の該配列の一部を含む。このプラスミドを作成するために、ｐＳＰ７２．ＰＶＹ由来のＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｃII断片を、ＳｍａＩで消化したｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ中にクローニングし、所望の方向をもつプラスミドを単離した。この構築物の地図は図５３に示す。
【０２１３】
ｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰプラスミド
ｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰプラスミドはＰＶＹ配列の分断されたパリンドロームを含む。このプラスミドを作成するために、ＳｍａＩで消化したｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ中にｐＳＰ７２．由来のＨｐａＩ／ＨｉｎｃII断片をクローニングし、アンチセンス方向をもつプラスミドを単離した。この構築物の地図は図５４に示す。
【０２１４】
５．対照プラスミド
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹプラスミド及びｐＡＲＴ２７．ＰＶＹプラスミド
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹプラスミド（図５５）は３５Ｓプロモーターにより駆動  されるＰＶＹ配列を発現するよう設計された。このプラスミドは、他の全ての構築物がそれと比較される、これらの実験での対照構築物として役立つ。このプラスミドを作成するため、ＣｌａＩで消化したｐＡＲＴ７中にＣｌａｐＢＣ．ＰＶＹ由来のＣｌａＩ／ＡｃｃＩ断片をクローニングし、ＰＶＹゲノムに関してセンスのＰＶＹ配列を発現することが予期されるプラスミドが選択された。３５Ｓプロモーター、ＰＶＹ配列及びＯＣＳターミネーターから成る配列をＮｏｔＩ断片として切り出し、ＮｏｔＩで消化したｐＡＲＴ２７中にクローニングし、所望の挿入方向を持つプラスミドを選択してｐＡＲＴ２７．ＰＶＹと名づけた。
【０２１５】
ｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ．Ｏプラスミド及びｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ．Ｏプラスミド
ｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ．Ｏプラスミド（図５６）を、トランスジェニック植物における１個のプラスミドからの多重構築物の共発現のための対照として役立つよう設計した。３５ＳプロモーターはＰＶＹのセンス配列を発現するよう設計し、一方、ＳＣＢＶプロモーターは空とした。このプラスミドを作成するため、Ｃｌａ・ｐＢＣ．ＰＶＹ由来のＰＶＹ断片を、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＳＣＢＶ．ｃａｓｓ中にクローニングしてｐ３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ＞Ｏを作成した。センスのＰＶＹ配列を駆動する３５Ｓプロモーター及びＮＯＳターミネーター、及びＳＣＢＶプロモーター、及びＯＣＳターミネーターから成る配列を、ＮｏｔＩ断片として切り出し、ｐＡＲＴ２７中にクローニングして所望の挿入方向を持つプラスミドを単離しｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ．Ｏと名づけた。
【０２１６】
ｐＡＲＴ７．３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＰＶＹプラスミド及びｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＰＶＹプラスミド
ｐＡＲＴ７．３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＰＶＹプラスミド（図５７）は、トランスジェニック植物における１個のプラスミドからの多重構築物の共発現のためのさらなる対照として作用するよう設計された。発現可能な配列は３５Ｓプロモーターの後方にはクローニングせず、一方、ＳＣＢＶプロモーターはＰＶＹのセンス断片の発現を駆動した。このプラスミドを作成するため、Ｃｌａ・ｐＢＣ．ＰＶＹ由来のＰＶＹ断片を、ＣｌａＩ断片として、ＣｌａＩで消化したｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＳＣＢＶ．ｃａｓｓ中にクローニングし、センス方向にＰＶＹ配列を含むプラスミドを単離してｐ３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＰＶＹと名付けた。３５Ｓプロモーター及びＮＯＳターミネーター、及びセンスのＰＶＹ配列を駆動するＳＣＢＶプロモーター及びＯＣＳターミネーターから成る配列をＮｏｔＩ断片として切り出し、ｐＡＲＴ２７中にクローニングし、所望の挿入方向を持つプラスミドを単離してｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＰＶＹと名づけた。
【０２１７】
ｐＡＲＴ７．３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰプラスミド及びｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰプラスミド
ｐＡＲＴ７．３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰプラスミド（図５８）を、トランスジェニック植物における１個のプラスミドからの多重構築物の共発現のためのさらなる対照として作用するよう設計した。発現可能な配列は３５Ｓプロモーターの後方にはクローニングせず、一方、ＳＣＢＶプロモーターはＰＶＹのアンチセンス断片の発現を駆動した。このプラスミドを作成するため、Ｃｌａ・ｐＢＣ．ＰＶＹ由来のＰＶＹ断片を、ＣｌａＩ断片として、ＣｌａＩで消化したｐ３５Ｓ．ＳＣＢＶ．ｃａｓｓ中にクローニングし、アンチセンス方向にＰＶＹ配列を含むプラスミドを単離し、ｐ３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰと名付けた。３５Ｓプロモーター及びＮＯＳターミネーター、及びセンスのＰＶＹ配列を駆動するＳＣＢＶプロモーター、及びＯＣＳターミネーターから成る配列を、ＮｏｔＩ断片として切り出し、ｐＡＲＴ２７中にクローニングし、所望の挿入方向を持つプラスミドを単離してｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰと名づけた。
【０２１８】
６．試験プラスミド
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ２プラスミド及びｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ２プラスミド
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ２プラスミド（図５９）は、トランスジェニック植物で３５Ｓプロモーターにより駆動されるＰＶＹ配列の直列反復を発現するよう設計された。このプラスミドを作成するため、ｐＢＣ．ＰＶＹｘ２由来の直列反復を、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＡＲＴ７中にクローニングした。３５Ｓプロモーター、ＰＶＹの直列反復、及びＯＣＳターミネーターから成る配列を、ｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ２からＮｏｔＩ断片として切り出し、ＮｏｔＩで消化したｐＡＲＴ２７中にクローニングし、所望の挿入方向を持つプラスミドを選択してｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ２と名づけた。
【０２１９】
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ３プラスミド及びｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ３プラスミド
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ３プラスミド（図６０）は、トランスジェニック植物で３５Ｓプロモーターにより駆動される三つのＰＶＹ配列の直列反復を発現するよう設計された。このプラスミドを作成するため、ｐＢＣ．ＰＶＹｘ３由来の直列反復を、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＡＲＴ７中にクローニングした。３５Ｓプロモーター、ＰＶＹの直列反復、及びＯＣＳターミネーターから成る配列を、ｐＡＲＴ．ＰＶＹｘ３からＮｏｔＩ断片として切り出し、ＮｏｔＩで消化したｐＡＲＴ２７中にクローニングし、所望の挿入方向を持つプラスミドを選択してｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ３と名づけた。
【０２２０】
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ４プラスミド及びｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ４プラスミド
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ４プラスミド（図６１）は、トランスジェニック植物で３５Ｓプロモーターにより駆動される四つのＰＶＹ配列の直列反復を発現するよう設計された。このプラスミドを作成するため、ｐＢＣ．ＰＶＹｘ４由来の直列反復を、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＡＲＴ７中にクローニングした。３５Ｓプロモーター、ＰＶＹの直列反復、及びＯＣＳターミネーターから成る配列を、ｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ３からＮｏｔＩ断片として切り出し、ＮｏｔＩで消化したｐＡＲＴ２７中にクローニングし、所望の挿入方向を持つプラスミドを選択してｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ３と名づけた。
【０２２１】
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＰＶＹプラスミド及びｐＡＲＴ２７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＰＶＹプラスミド
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＰＶＹプラスミド（図６２）は、トランスジェニック植物で３５Ｓプロモーターにより駆動される、ＰＶＹ配列の分断された直列反復を発現するよう設計された。この構築物は、ｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＰＶＹ由来のＰＶＹの分断された直列反復を、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ断片として、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡＲＴ７中にクローニングすることにより調製した。３５Ｓプロモーター、ＰＶＹ配列の分断された直列反復、及びＯＣＳターミネーターから成る配列を、ｐＡＲＴ７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＰＶＹからＮｏｔＩ断片として切り出し、ＮｏｔＩで消化したｐＡＲＴ２７中にクローニングし、所望の挿入方向を持つプラスミドを選択してｐＡＲＴ２７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＰＶＹと名づけた。
【０２２２】
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰΔプラスミド及びｐＡＲＴ２７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰΔプラスミド
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰΔプラスミド（図６３）は、トランスジェニック植物で３５Ｓプロモーターにより駆動されるＰＶＹ配列の部分的に分断されたパリンドロームを発現するよう設計された。この構築物は、ｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰΔ由来のＰＶＹ配列の部分的に分断されたパリンドロームを、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ断片として、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡＲＴ７中にクローニングすることにより調製した。３５Ｓプロモーター、ＰＶＹ配列の部分的に分断されたパリンドローム、及びＯＣＳターミネーターから成る配列を、ｐＡＲＴ７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰΔからＮｏｔＩ断片として切り出し、ＮｏｔＩで消化したｐＡＲＴ２７中にクローニングし、所望の挿入方向を持つプラスミドを選択してｐＡＲＴ２７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰΔと名づけた。
【０２２３】
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰプラスミド及びｐＡＲＴ２７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰプラスミド
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰプラスミド（図６４）は、トランスジェニック植物で３５Ｓプロモーターにより駆動されるＰＶＹ配列の分断されたパリンドロームを発現するよう設計された。この構築物は、ｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰΔ由来のＰＶＹ配列の分断されたパリンドロームを、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ断片として、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡＲＴ７中にクローニングすることにより調製した。３５Ｓプロモーター、ＰＶＹ配列の分断されたパリンドローム、及びＯＣＳターミネーターから成る配列を、ｐＡＲＴ７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰからＮｏｔＩ断片として切り出し、ｐＡＲＴ２７中にクローニングし、所望の挿入方向を持つプラスミドを選択してｐＡＲＴ２７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰと名づけた。
【０２２４】
ｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰプラスミド及びｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰプラスミド
ｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰプラスミド（図６５）は、トランスジェニック植物でセンス構築物とアンチセンス構築物を共発現するよう設計された。このプラスミドを作成するため、Ｃｌａ・ｐＢＣ．ＰＶＹ由来のＰＶＹ断片を、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐ３５Ｓ．ＳＣＢＶ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰ中にクローニングした。センスのＰＶＹ配列を駆動する３５Ｓプロモーター、及びＮＯＳターミネーター、及びアンチセンスのＰＶＹを駆動するＳＣＢＶプロモーター、及びＯＣＳターミネーターから成る配列を、ＮｏｔＩ断片として切り出し、ｐＡＲＴ２７にクローニングし、所望の挿入方向を持つプラスミドを単離してｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰと名づけた。
【０２２５】
ｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＰＶＹｘ３．ＳＣＢＶ．ＹＶＰｘ３プラスミド及びｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．ＰＶＹｘ３．ＳＣＢＶ．ＹＶＰｘ３プラスミド
ｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＰＶＹｘ３．ＳＣＢＶ．ＹＶＰｘ３プラスミド（図６６）は、トランスジェニック植物でＰＶＹのセンス反復とアンチセンス反復を共発現するよう設計された。このプラスミドを作成するため、ＣｌａｐＢＣ．ＰＶＹｘ３由来の三重直列ＰＶＹ反復を、ＣｌａＩ／ＡｃｃＩ断片として、ＣｌａＩで消化したｐ３５Ｓ．ＳＣＢＶ．ｃａｓｓ中にクローニングし、アンチセンス方向をもつプラスミドを単離することにより、中間体のｐＡＲＴ７．３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰｘ３を構築した。ｐ３５Ｓ．ＰＶＹｘ３．ＳＣＢＶ．ＹＶＰｘ３のため、Ｃｌａ・ｐＢＣ．ＰＶＹｘ３由来の三重直列ＰＶＹ反復を、ＫｐｎＩ／ＳｍａＩ断片として、ＫｐｎＩ／ＳｍａＩで消化したｐ３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰｘ３中にクローニングしてｐ３５Ｓ．ＰＶＹｘ３．ＳＣＢＶ．ＹＶＰｘ３を作成した。両方のプロモーターとターミネーター、及び直列のＰＶＹ反復を含む配列を、ＮｏｔＩ断片として単離し、ｐＡＲＴ２７中にクローニングした。適切な方向を持つプラスミドを選択してｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．ＰＶＹｘ３．ＳＣＢＶ．ＹＶＰｘ３と名づけた。
【０２２６】
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ３．ＬＮＹＶ．ＹＶＰｘ３プラスミド及びｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ３．ＬＮＹＶ．ＹＶＰｘ３プラスミド
ｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ３．ＬＮＹＶ．ＹＶＰｘ３プラスミド（図６７）は、分断されたパリンドロームとしてのＰＶＹ配列の三重反復を発現するよう設計された。このプラスミドを作成するため、ｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰ由来のＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰ断片を、ＡｃｃＩ／ＣｌａＩ断片として、ｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ２．ｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＰＶＹｘ３．ＬＮＹＶ．ＹＶＰｘ３プラスミド中にクローニングすることにより中間体のｐＡＲＴ７ｘ３．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶを構築し、この中間構築物に、ｐＢＣ．ＰＶＹｘ２由来のさらなるＰＶＹ直列反復を、ＡｃｃＩ／ＣｌａＩ断片として、ＣｌａＩで消化したｐＡＲＴ７ｘ３．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰ中にクローニングした。３５Ｓプロモーター，全ＰＶＹ配列、及びＯＣＳターミネーターを含むｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＰＶＹｘ３．ＬＮＹＶ．ＹＶＰｘ３由来の配列を、ＮｏｔＩ断片として切り出し、ＮｏｔＩで消化したｐＡＲＴ２７中にクローニングした。適切な方向を持つプラスミドを選択してｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．ＰＶＹｘ３．ＬＮＹＶ．ＹＶＰｘ３と名づけた。
【０２２７】
プラスミドｐＡＲＴ７．ＰＶＹマルチ及びプラスミドｐＡＲＴ２７．ＰＶＹマルチ
プラスミドｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＰＶＹマルチ（図６８）はトランスジェニック植物でより高いオーダーのＰＶＹ配列の直列反復領域を発現するよう設計された。ＰＶＹに由来する７２ｂｐのＰＶＹ・Ｎｉａ領域のより高いオーダーの直列反復は、以下の二つの一部相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより調製した。
ＰＶＹ１：
５’−ＴＡＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＴＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＴＴＴＣＧＧＣＡＴＴＴ−３’（配列番号：１５）、及び
ＰＶＹ２：
５’−ＴＴＣＴＧＣＣＡＡＴＴＡＡＡＧＧＴＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＡＡＴＧＣＣＧＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＣＣＡＣＡＧＡＡＡＴ−３’（配列番号：１６）。
【０２２８】
このオリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、加熱し、ゆっくり冷却して自己アニーリングさせ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、クレノウポリメラーゼで末端を充填し、ｐＣＲ２．１（インビトロゲン社）中にクローニングした。多重反復を含むプラスミドを単離し、この配列をＥｃｏＲＩ断片として、ＥｃｏＲＩで消化したｐＡＲＴ７中にセンス方向でクローニングして中間体のｐＡＲＴ７．ＰＶＹマルチを作成した。ｐＡＲＴ２７．ＰＶＹマルチを作成するため、３５Ｓプロモーター、ＰＶＹ配列、及びＯＣＳターミネーターをＮｏｔＩ断片として切り出し、ＮｏｔＩで消化したｐＡＲＴ２７中にクローニングした。適切な挿入方向をもつプラスミドを単離してｐＡＲＴ２７．ＰＶＹマルチと名付けた。
【０２２９】
実施例４
哺乳類におけるウイルス遺伝子の発現の不活性化
ウイルスの免疫系統は安定に形質転換した細胞系統でウイルス配列を発現することにより生じる。
【０２３０】
特に、このアプローチには溶菌ウイルスが用いられる。その理由は、細胞の溶解は非常に単純な篩を提供し、且つウイルス免疫を生じうる極めてまれな形質転換事象を直接選択することを可能とするからである。単純な一本鎖ＲＮＡウイルス（ウシ・エンテロウイルス−ＢＥＶ）又は複雑な二本鎖ＤＮＡウイルスのＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶＩ）に由来するサブゲノムの断片を適切なベクターにクローニングし、形質転換細胞中で発現させる。哺乳類の細胞系統は、強力なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ−ＩＥ）プロモーターにより駆動されるウイルスの配列を発現するよう設計された遺伝子構築物を用いて形質転換される。用いられる配列には特異的なウイルス複製酵素の遺伝子が含まれる。典型的なウイルス遺伝子を含む無作為な「ショットガン」ライブラリー、及びウイルス配列の発現を標的化するように導入された分散した核酸分子も用いられうる。
【０２３１】
ＢＥＶのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に由来するヌクレオチド配列などの、この手法で使用される例示的な遺伝子構築物を本明細書で提示する。
【０２３２】
ウイルスのポリメラーゼ構築物のため、多数（約１００）の形質転換した細胞系統を作成し、そして各ウイルスで感染させる。ショットガンライブラリーで形質転換した細胞に対して、非常に多数（数百）の形質転換系統が作成しそしてウイルス免疫について大規模にスクリーニングする。ウイルスを感染させた後、耐性のある細胞系統を選択し、そして免疫を付与する配列を決定するためにさらに分析する。
【０２３３】
耐性のある細胞系統は、哺乳類の系において導入されたヌクレオチド配列がウイルス遺伝子の発現を不活性化する能力があることを支持する。
【０２３４】
さらに、このような実験から得られる耐性系統は、観察される改変の分子的及び生化学的特性をより正確に規定するために使用される。
【０２３５】
実施例５
トランスジェニック植物におけるウイルス耐性の導入
アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＬＢＡ４４０４株を、三親交雑(tri-parental matings)を用いて、構築物のｐＡＲＴ２７．ＰＶＹ、ｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ２、ｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ３、ｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ４、ｐＡＲＴ２７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＰＶＹ、ｐＡＲＴ２７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰΔ、ｐＡＲＴ２７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰ、ｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ．Ｏ、ｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＰＶＹ、ｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．Ｏ. ＳＣＢＶ．ＹＶＰ、ｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰ、ｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．ＰＶＹｘ３．ＳＣＢＶ．ＹＶＰｘ３、ｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ３．ＬＮＹＶ．ＹＶＰｘ３、及びｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ１０でそれぞれ形質転換した。これらの株から得られるＤＮＡの微量調製物を調製し、ＮｏｔＩでの制限を試験し、これらが適切な二元ベクターを含むことを確認した。
【０２３６】
ニコチアナ・タバカム（Ｗ３８品種）を、標準的手法を用いてこれらのアグロバクテリウム株で形質転換した。形質転換したと推定される苗条を切り出しカナマイシンを含有する培地上に根付かせた。これらの条件の下で、本発明者らは、トランスジェニック苗条のみがカナマイシン平板上に根付くことを一貫して観察した。根付いた苗条は土壌に移し樹立させた。二から三週間後、少なくとも三枚の葉をもつ丈夫な植物を選択し、ＰＶＹに感染させた。
【０２３７】
ウイルスの接種材料は、予めウイルスに感染させたＷ３８タバコから調製した。すなわち、明白なウイルスの症状を示す約２ｇの葉材料を１００ｍＭの燐酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．５）の１０ｍｌ中でカルバランダム（carbarundum)と共に粉砕した。この接種材料を追加の燐酸Ｎａ緩衝液で２００ｍｌまで希釈した。各トランスジェニック植物に由来する二枚の葉をカルバランダムと共に散布した後、０．４ｍｌの接種材料を各葉にかけ、かなり激しく指で葉をこすった。この手法を用いて、非トランスジェニック対照植物の１００％がＰＶＹに感染した。
【０２３８】
ウイルス耐性及び免疫性を検定するため、トランスジェニック植物を症状の進行について監視する。ＰＶＹ株（ＰＶＹ−Ｄ、オーストラリアのＰＶＹ単離体）はＷ３８タバコに明白な症状を与え、葉脈が透き通る症状は接種された葉の上方の二枚の葉に容易に観察され、それに続き葉は均一のクロロ障害を示す。症状の進行は６週間にわたって監視した。
【０２３９】
ウイルスの症状の低減が示される場合、トランスジェニック株は耐性として記述した。そして、ウイルス症状の低減はクロロ障害を示す葉の減少として現れる。耐性は、植物でごく少数のウイルス病変しか観察されない非常に強い耐性から、植物成長の後期で見られる葉の症状の低減を示す弱い耐性までの範囲に及ぶ。
【０２４０】
ウイルスの症状の証拠を全く示さないトランスジェニック植物は免疫体（ｉｍｍｕｎｅ）として分類した。これらの植物が免疫体であることを確証するため、ウイルスを再接種したところ、ほとんどの植物が免疫体のままであり、症状を示した小数の植物は耐性として再分類した。
【０２４１】
得られた植物系統についてサザン・ブロットを行い、次世代の耐性を監視し、耐性／免疫が伝達できることを測定する。さらに、該系統を他のＰＶＹ株で感染させることによりウイルス耐性の範囲を観察し、宿主範囲の感受性が変化するかどうかを測定する。
【０２４２】
これらの実験から得られた結果を表２に記載する。これらのデータは、標的遺伝子配列の縦列反復を、パリンドローム又は直列反復配列として分断されたパリンドロームのいずれかで含む構築物がトランスジェニック植物にウイルス耐性及び／又は免疫を付与できることを示している。
【０２４３】
従って、このような逆方向及び／又は直列の反復配列はトランスジェニック植物でウイルスの標的遺伝子の発現を変化させる。
【０２４４】
直列及び逆方向の反復配列の使用を組み合わせた構築物、即ち、ｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．ＰＶＹｘ３．ＳＣＢＶ．ＹＶＰｘ３とｐＡＲＴ２７．ＰＶＹｘ３．ＬＮＹＶ．ＹＶＰｘ３も遺伝子発現を変化させるのに有用である。
【０２４５】
実施例６
動物細胞におけるＧａｌｔの不活性化
Ｇａｌｔの不活性化を検定するため、ブタのＰＫ２細胞を関連のある構築物で形質転換した。ＰＫ２細胞は構成的にＧａｌｔ酵素を発現し、Ｇａｌｔ酵素の活性により、これらの細胞の細胞表面上に発現するある範囲のタンパク質に種々のα−１，３−ガラクトシル基が付加される。細胞はリポフェクチンを用いて形質転換し、安定に形質転換した系統をゲネテシンを用いて選択した。
【０２４６】
最初の検定のように、Ｇａｌｔをコードするエピトープ、即ち細胞表面タンパク質を修飾するα−１，３−ガラクトシル部分が存在するか否かについて、細胞系統をレクチンＩＢ４を用いて探索した。ＩＢ４の結合はインサイチュ又はＦＡＣＳ選別のいずれかにより検定した。
【０２４７】
インサイチュ結合では、細胞を冷メタノールを用いて固体の支持体に５分間かけて固定し、細胞をＰＢＳ（燐酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、非特異的なＩＢ４の結合をＰＢＳ中１％ＢＳＡで１０分間ブロックした。固定した細胞を１％ＢＳＡのＰＢＳ中で室温で３０分間かけて２０μｇ／ｍｌのＩＢ４−ビオチン（シグマ社）を用いて探索し、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、１：２００のエキストラアビジン−ＦＩＴＣ（シグマ社）ＰＢＳ希釈液で３０分間探索した後、さらにＰＢＳで濯いだ。次に、ＰＫ２対照細胞の外表面が均一に緑色に染色される条件の下で、細胞を蛍光顕微鏡を用いて調べた。
【０２４８】
ＦＡＣＳ分析では、細胞をトリプシン処理後懸濁し、ＨＢＳＳ／ヘペス（２０ｍＭのヘペスを添加したハンクの緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で洗浄し、ＨＢＳＳ／ヘペス中で４℃で４５分間かけて１０μｇ／ｍｌのＩＢ４−ビオチン（シグマ社）で探索した。細胞をＨＢＳＳ／ヘペスで洗浄し、１：２００のエキストラアビジン−ＦＩＴＣ（シグマ社）ＨＢＳＳ／ヘペス希釈液で４℃で４５分間かけて探索し、ＦＡＣＳ選別の前に冷ＨＢＳＳ／ヘペスで濯いだ。
【０２４９】
このアプローチを用いて、形質転換した細胞系統をＧａｌｔの不活性化について検定し、構築物の効率の定量的評価を求める。さらに、Ｇａｌｔの不活性化を示す細胞系統を単離し、さらなる分子学的分析にかけ、遺伝子不活性化の機構を決定する。
【０２５０】
【表２】
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【０２５１】
参照文献
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【０２５２】
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５  クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ），エイ．エイチ．とクエイル (Ｑｕａｉｌ），ピー．エイチ．（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：２１３−２１８。
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【０２５４】
１０  フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：５８２４−５８２８、１９８５。
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【０２５５】
１３  ヘレラ−エステラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｅｌｌａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３０３：２０９−２１３、１９８３ａ。
１４  ヘレラ−エステラら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：９８７−９９５、１９８３ｂ。
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【０２５６】
１６  イノウエ（Ｉｎｏｕｙｅ），エス．とツジ（Ｔｓｕｊｉ），エフ．アイ．（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．３４１：２７７−２８０。
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１８  クレンス（Ｋｒｅｎｓ），エフ．エイ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：７２−７４、１９８２。
【０２５７】
１９  ウォン（Ｋｗｏｎ），ビー．エス．ら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５３：１３０１−１３０９。
２０  パルーバハドラ（Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ），エム．ら（１９９７）Ｃｅｌｌ９０：４７９−４９０。
２１  パスズコヴスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２、１９８４。
【０２５８】
２２  プラシェル（Ｐｒａｓｈｅｒ），ディー．シー．ら（１９９２）Ｇｅｎｅ１１１：２２９−２３３。
２３  サンフォード（Ｓａｎｆｏｒｄ），ジェイ．シー．ら、Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７−３７、１９８７。
【０２５９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１  ＭＣＳの図式的表示である。
【図２】  図２はプラスミドｐＣＭＶ．ｃａｓｓの図式的表示である。
【図３】  図３はプラスミドｐＣＭＶ．ＳＶ４０Ｌ．ｃａｓｓの図式的表示である。
【図４】  図４はプラスミドｐＣＭＶ．ＳＶ４０ＬＲ．ｃａｓｓの図式的表示である。
【図５】  図５はプラスミドｐＣＲ．Ｂｇｌ−ＧＦＰ−Ｂａｍの図式的表示である。
【図６】  図６はプラスミドｐＢＳＩＩ（ＳＫ＋）．ＥＧＦＰの図式的表示である。
【図７】  図７はプラスミドｐＣＭＶ．ＥＧＦＰの図式的表示である。
【図８】  図８はプラスミドｐＣＲ．ＳＶ４０Ｌの図式的表示である。
【図９】  図９はプラスミドｐＣＲ．ＢＥＶ．１の図式的表示である。
【図１０】  図１０はプラスミドｐＣＲ．ＢＥＶ．２の図式的表示である。
【図１１】  図１１はプラスミドｐＣＲ．ＢＥＶ．３の図式的表示である。
【図１２】  図１２はプラスミドｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．ＢＥＶ２の図式的表示である。
【図１３】  図１３はプラスミドｐＣＭＶ．ＢＥＶ２の図式的表示である。
【図１４】  図１４はプラスミドｐＣＭＶ．ＢＥＶ３の図式的表示である。
【図１５】  図１５はプラスミドｐＣＭＶ．ＶＥＢの図式的表示である。
【図１６】  図１６はプラスミドｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＧＦＰの図式的表示である。
【図１７】  図１７はプラスミドｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０Ｌ−Ｏの図式的表示である。
【図１８】  図１８はプラスミドｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．ＢＥＶの図式的表示である。
【図１９】  図１９はプラスミドｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．ＶＥＢの図式的表示である。
【図２０】  図２０はプラスミドｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ２の図式的表示である。
【図２１】  図２１はプラスミドｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ３の図式的表示である。
【図２２】  図２２はプラスミドｐＣＭＶ．ＢＥＶｘ４の図式的表示である。
【図２３】  図２３はプラスミドｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０Ｌ．ＢＥＶの図式的表示である。
【図２４】  図２４はプラスミドｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０Ｌ．ＶＥＢの図式的表示である。
【図２５】  図２５はプラスミドｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＧＦＰ．ＶＥＢの図式的表示である。
【図２６】  図２６はプラスミドｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．ＢＥＶ２．ＰＦＧの図式的表示である。
【図２７】  図２７はプラスミドｐＣＭＶ．ＢＥＶ．ＳＶ４０ＬＲの図式的表示である。
【図２８】  図２８はプラスミドｐＣＤＮＡ３．Ｇａｌｔの図式的表示である。
【図２９】  図２９はプラスミドｐＣＭＶ．Ｇａｌｔの図式的表示である。
【図３０】  図３０はプラスミドｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．Ｇａｌｔの図式的表示である。
【図３１】  図３１はプラスミドｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＧＦＰの図式的表示である。
【図３２】  図３２はプラスミドｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０Ｌ．Ｏの図式的表示である。
【図３３】  図３３はプラスミドｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０Ｌ．ｔｌａＧの図式的表示である。
【図３４】  図３４はプラスミドｐＣＭＶ．Ｏ．ＳＶ４０Ｌ．Ｇａｌｔの図式的表示である。
【図３５】  図３５はプラスミドｐＣＭＶ．Ｇａｌｔｘ２の図式的表示である。
【図３６】  図３６はプラスミドｐＣＭＶ．Ｇａｌｔｘ４の図式的表示である。
【図３７】  図３７はプラスミドｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０Ｌ．Ｇａｌｔの図式的表示である。
【図３８】  図３８はプラスミドｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０Ｌ．ｔｌａＧの図式的表示である。
【図３９】  図３９はプラスミドｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＧＦＰ．ｔｌａＧの図式的表示である。
【図４０】  図４０はプラスミドｐＣＭＶ．ＥＧＦＰ．Ｇａｌｔ．ＰＦＧの図式的表示である。
【図４１】  図４１はプラスミドｐＣＭＶ．Ｇａｌｔ．ＳＶ４０ＬＲの図式的表示である。
【図４２】  図４２はプラスミドｐＡＲＴ７の図式的表示である。
【図４３】  図４３はプラスミドｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＳＣＢＶ．ｃａｓｓの図式的表示である。
【図４４】  図４４はプラスミドｐＢＣ．ＰＶＹの図式的表示である。
【図４５】  図４５はプラスミドｐＳＰ７２．ＰＶＹの図式的表示である。
【図４６】  図４６はプラスミドｐＣｌａｐＢＣ．ＰＶＹの図式的表示である。
【図４７】  図４７はプラスミドｐＢＣ．ＰＶＹｘ２の図式的表示である。
【図４８】  図４８はプラスミドｐＳＰ７２．ＰＶＹｘ２の図式的表示である。
【図４９】  図４９はプラスミドｐＢＣ．ＰＶＹｘ３の図式的表示である。
【図５０】  図５０はプラスミドｐＢＣ．ＰＶＹｘ４の図式的表示である。
【図５１】  図５１はプラスミドｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶの図式的表示である。
【図５２】  図５２はプラスミドｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＰＶＹの図式的表示である。
【図５３】  図５３はプラスミドｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰΔの図式的表示である。
【図５４】  図５４はプラスミドｐＢＣ．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰの図式的表示である。
【図５５】  図５５はプラスミドｐＡＲＴ２７．ＰＶＹの図式的表示である。
【図５６】  図５６はプラスミドｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ．Ｏの図式的表示である。
【図５７】  図５７はプラスミドｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＰＶＹの図式的表示である。
【図５８】  図５８はプラスミドｐＡＲＴ２７．３５Ｓ．Ｏ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰの図式的表示である。
【図５９】  図５９はプラスミドｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ２の図式的表示である。
【図６０】  図６０はプラスミドｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ３の図式的表示である。
【図６１】  図６１はプラスミドｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ４の図式的表示である。
【図６２】  図６２はプラスミドｐＡＲＴ７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＰＶＹの図式的表示である。
【図６３】  図６３はプラスミドｐＡＲＴ７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰΔの図式的表示である。
【図６４】  図６４はプラスミドｐＡＲＴ７．ＰＶＹ．ＬＮＹＶ．ＹＶＰの図式的表示である。
【図６５】  図６５はプラスミドｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＰＶＹ．ＳＣＢＶ．ＹＶＰの図式的表示である。
【図６６】  図６６はプラスミドｐＡＲＴ７．３５Ｓ．ＰＶＹｘ３．ＳＣＢＶ．ＹＶＰｘ３の図式的表示である。
【図６７】  図６７はプラスミドｐＡＲＴ７．ＰＶＹｘ３．ＬＮＹＶ．ＹＶＰｘ３の図式的表示である。
【図６８】  図６８はプラスミドｐＡＲＴ７．ＰＶＹマルチの図式的表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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