(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト完全型副甲状腺ホルモンをアッセイするためのキットであって、
ａ）  Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号４）からなるヒト完全型副甲状腺ホルモンの初期ペプチド配列に特異的な第１の抗体又は抗体断片であって、該初期ペプチド配列中の少なくとも４つのアミノ酸が該抗体又は抗体断片との反応部位の一部である、標識された第１の抗体又は抗体断片と、
ｂ）  前記ヒト完全型副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列３４から８４（配列番号３）を認識する第２の抗体又は抗体断片と
を含み、阻害性の非（１〜８４）副甲状腺ホルモン断片を検出することなく、生物学的サンプル中のヒト完全型副甲状腺ホルモン量を測定するキット。
【請求項２】
前記標識された第１の抗体又は抗体断片が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、あるいはそれらの断片である請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記標識が、化学発光剤、測色剤、エネルギー移動剤、酵素、蛍光剤、及び放射性同位元素からなる群から選択される請求項１又は２に記載のキット。
【請求項４】
前記第２の抗体又は抗体断片が固相支持体に吸着されている請求項１〜３のいずれかに記載のキット。
【請求項５】
前記固相支持体が、タンパク質結合表面、金属コロイド粒子、ラテックス粒子又はポリマービーズからなる群から選択される請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記ヒト完全型副甲状腺ホルモンが、前記第１の抗体又は抗体断片及び前記第２の抗体又は抗体断片に結合した後に、該第１の抗体又は抗体断片及び該第２の抗体又は抗体断片の結合部位以外の部位に特異的に結合する第３の抗体又は抗体断片であって、それにより沈殿塊を生成する第３の抗体又は抗体断片をさらに含む請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
ヒト完全型副甲状腺ホルモンをアッセイするためのキットであって、
ａ）  Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号４）からなるヒト完全型副甲状腺ホルモンの初期ペプチド配列に特異的な第１の抗体又は抗体断片であって、該初期ペプチド配列中の少なくとも４つのアミノ酸が該抗体又は抗体断片との反応部位の一部である、実質的に純粋な第１の抗体又は抗体断片と、
ｂ）前記ヒト完全型副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列３４から８４（配列番号３）を認識する、標識された第２の抗体又は抗体断片と
を含み、阻害性の非（１〜８４）副甲状腺ホルモン断片を検出することなく、生物学的サンプル中のヒト完全型副甲状腺ホルモン量を測定するキット。
【請求項８】
前記第１の抗体又は抗体断片が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、あるいはそれらの断片である請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記第１の抗体又は抗体断片が、固相支持体に吸着されている請求項７または８に記載のキット。
【請求項１０】
前記固相支持体が、タンパク質結合表面、金属コロイド粒子、ラテックス粒子又はポリマービーズからなる群から選択される請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記標識が、化学発光剤、測色剤、エネルギー移動剤、酵素、蛍光剤、及び放射性同位元素からなる群から選択される請求項７〜１０のいずれかに記載のキット。
【請求項１２】
ヒト完全型副甲状腺ホルモンが前記第１の抗体又は抗体断片及び前記第２の抗体又は抗体断片に結合した後に、該第１の抗体又は抗体断片及び該第２の抗体又は抗体断片の結合部位以外の部位に特異的に結合する第３の抗体又は抗体断片であって、それにより沈殿塊を生成する第３の抗体又は抗体断片をさらに含む請求項７〜１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１３】
ラット完全型副甲状腺ホルモンをアッセイするためのキットであって、
ａ）  Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号７）からなるラット完全型副甲状腺ホルモンの初期ペプチド配列に特異的な第１の抗体又は抗体断片であって、該初期ペプチド配列中の少なくとも４つのアミノ酸が該抗体又は抗体断片との反応部位の一部である、標識された第１の抗体又は抗体断片と、
ｂ）  前記ラット完全型副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列３４から８４（配列番号８）を認識する第２の抗体又は抗体断片と
を含み、阻害性の非（１〜８４）副甲状腺ホルモン断片を検出することなく、生物学的サンプル中のラット完全型副甲状腺ホルモン量を測定するキット。
【請求項１４】
ａ）  検査すべき人から得られたサンプルを、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号４）からなるヒト完全型副甲状腺ホルモンの初期ペプチド配列に特異的な抗体又は抗体断片であって、該初期ペプチド配列中の少なくとも４つのアミノ酸が前記抗体又は抗体断片との反応部位の一部である、抗体又は抗体断片と接触させるステップと、
ｂ）  該サンプルを、前記ヒト完全型副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列３４から８４（配列番号３）を認識する第２の抗体又は抗体断片とさらに接触させるステップと
を含み、該サンプルにおける阻害性の非（１〜８４）副甲状腺ホルモン断片を検出することなく、完全型副甲状腺ホルモン値のみをイムノアッセイ法を用いて決定する、実質的に正常な副甲状腺機能を有する人と副甲状腺機能亢進症の人とを識別するための分析方法。
【請求項１５】
ａ）  検査すべき人から得られたサンプルを、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号４）からなるヒト完全型副甲状腺ホルモンの初期ペプチド配列に特異的な抗体又は抗体断片であって、該初期ペプチド配列中の少なくとも４つのアミノ酸が前記抗体又は抗体断片との反応部位の一部である、抗体又は抗体断片と接触させるステップと、
ｂ）  該サンプルを、前記ヒト完全型副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列３４から８４（配列番号３）を認識する第２の抗体又は抗体断片とさらに接触させるステップと
を含み、該サンプルにおける阻害性の非（１〜８４）副甲状腺ホルモン断片を検出することなく、完全型副甲状腺ホルモン値のみをイムノアッセイ法を用いて決定する、副甲状腺機能亢進症の治療効果をモニタリングするための分析方法。
【請求項１６】
ａ）  検査すべき人から得られたサンプルを、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号４）からなるヒト完全型副甲状腺ホルモンの初期ペプチド配列に特異的な抗体又は抗体断片であって、該初期ペプチド配列中の少なくとも４つのアミノ酸が前記抗体又は抗体断片との反応部位の一部である、抗体又は抗体断片と接触させるステップと、
ｂ）  該サンプルを、前記ヒト完全型副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列３４から８４（配列番号３）を認識する第２の抗体又は抗体断片とさらに接触させるステップと、
を含み、該サンプルにおける阻害性の非（１〜８４）副甲状腺ホルモン断片を検出することなく、完全型副甲状腺ホルモン値のみをイムノアッセイ法を用いて決定する、正常な骨機能を有する人と副甲状腺関連の骨疾患を有する人とを識別するための分析方法。
【請求項１７】
ａ）  検査すべき人から得られたサンプルを、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号４）からなるヒト完全型副甲状腺ホルモンの初期ペプチド配列に特異的な抗体又は抗体断片であって、該初期ペプチド配列中の少なくとも４つのアミノ酸が前記抗体又は抗体断片との反応部位の一部である、抗体又は抗体断片と接触させるステップと、
ｂ）  該サンプルを、前記ヒト完全型副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列３４から８４（配列番号３）を認識する第２の抗体又は抗体断片とさらに接触させるステップと、
を含み、該サンプルにおける阻害性の非（１〜８４）副甲状腺ホルモン断片を検出することなく、完全型副甲状腺ホルモン値のみをイムノアッセイ法を用いて決定する、副甲状腺関連の骨疾患をモニタリングするための分析方法。
【請求項１８】
ａ）  試験すべきヒトから得られたサンプルを、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号４）からなるヒト完全型副甲状腺ホルモンの初期ペプチド配列に特異的な抗体又は抗体断片であって、該初期ペプチド配列中の少なくとも４つのアミノ酸が前記抗体又は抗体断片との反応部位の一部である、抗体又は抗体断片と接触させるステップと、該サンプルを、前記ヒト完全型副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列３４から８４（配列番号３）を認識する第２の抗体又は抗体断片とさらに接触させるステップとを含む、完全型副甲状腺ホルモン値を決定するステップと
ｂ）  該サンプルにおける総副甲状腺ホルモン値を、イムノアッセイを用いて決定するステップと、
ｃ）  該サンプルにおける完全型副甲状腺ホルモン値、副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値、及び総副甲状腺ホルモン値からなる群から選択されるパラメータの少なくとも２つを比較するステップと
を含み、
ステップｃ）において、副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値を選択する場合には、副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値を、完全型副甲状腺ホルモン値及び総副甲状腺ホルモン値から計算するステップをさらに含む、実質的に正常な副甲状腺機能を有する人と副甲状腺機能亢進症の人とを識別するための分析方法。
【請求項１９】
ａ）  試験すべきヒトから得られたサンプルを、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号４）からなるヒト完全型副甲状腺ホルモンの初期ペプチド配列に特異的な抗体又は抗体断片であって、該初期ペプチド配列中の少なくとも４つのアミノ酸が前記抗体又は抗体断片との反応部位の一部である、抗体又は抗体断片と接触させるステップと、該サンプルを、前記ヒト完全型副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列３４から８４（配列番号３）を認識する第２の抗体又は抗体断片とさらに接触させるステップとを含む、完全型副甲状腺ホルモン値を決定するステップと
ｂ）  該サンプルにおける総副甲状腺ホルモン値を、イムノアッセイを用いて決定するステップと、
ｃ）  該サンプルにおける完全型副甲状腺ホルモン値、副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値、及び総副甲状腺ホルモン値からなる群から選択されるパラメータの少なくとも２つを比較するステップと
を含み、
ステップｃ）において、副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値を選択する場合には、副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値を、完全型副甲状腺ホルモン値及び総副甲状腺ホルモン値から計算するステップをさらに含む、副甲状腺機能亢進症の治療効果をモニタリングするための分析方法。
【請求項２０】
ａ）  試験すべきヒトから得られたサンプルを、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号４）からなるヒト完全型副甲状腺ホルモンの初期ペプチド配列に特異的な抗体又は抗体断片であって、該初期ペプチド配列中の少なくとも４つのアミノ酸が前記抗体又は抗体断片との反応部位の一部である、抗体又は抗体断片と接触させるステップと、該サンプルを、前記ヒト完全型副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列３４から８４（配列番号３）を認識する第２の抗体又は抗体断片とさらに接触させるステップとを含む、完全型副甲状腺ホルモン値を決定するステップと
ｂ）  該サンプルにおける総副甲状腺ホルモン値を、イムノアッセイを用いて決定するステップと、
ｃ）  該サンプルにおける完全型副甲状腺ホルモン値、副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値、及び総副甲状腺ホルモン値からなる群から選択されるパラメータの少なくとも２つを比較するステップと
を含み、
ステップｃ）において、副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値を選択する場合には、副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値を、完全型副甲状腺ホルモン値及び総副甲状腺ホルモン値から計算するステップをさらに含む、正常な骨機能を有する人と副甲状腺関連の骨疾患を有する人とを識別するための分析方法。
【請求項２１】
ａ）  試験すべきヒトから得られたサンプルを、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号４）からなるヒト完全型副甲状腺ホルモンの初期ペプチド配列に特異的な抗体又は抗体断片であって、該初期ペプチド配列中の少なくとも４つのアミノ酸が前記抗体又は抗体断片との反応部位の一部である、抗体又は抗体断片と接触させるステップと、該サンプルを、前記ヒト完全型副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列３４から８４（配列番号３）を認識する第２の抗体又は抗体断片とさらに接触させるステップとを含む、完全型副甲状腺ホルモン値を決定するステップと
ｂ）  該サンプルにおける総副甲状腺ホルモン値を、イムノアッセイを用いて決定するステップと、
ｃ）  該サンプルにおける完全型副甲状腺ホルモン値、副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値、及び総副甲状腺ホルモン値からなる群から選択されるパラメータの少なくとも２つを比較するステップと
を含み、
ステップｃ）において、副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値を選択する場合には、副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値を、完全型副甲状腺ホルモン値及び総副甲状腺ホルモン値から計算するステップをさらに含む、副甲状腺関連の骨疾患をモニタリングするための分析方法。
【請求項２２】
前記サンプルが、血清、血漿、及び血液のサンプルからなる群から選択される請求項１４〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記完全型副甲状腺ホルモン値が、前記副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値と比較される請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記完全型副甲状腺ホルモン値が、前記総副甲状腺ホルモン値と比較される請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片値が、前記総副甲状腺ホルモン値と比較される請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記比較が比率または割合の形態である請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記完全型副甲状腺ホルモン値が、完全型副甲状腺ホルモンと副甲状腺ホルモン阻害性ペプチド断片とを識別する抗体を用いて決定される請求項１８〜２６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、副甲状腺機能亢進等の副甲状腺疾患の患者を、正常状態または非罹病状態と識別する、斬新な方法および装置に関する。生物学的試料中の完全型副甲状腺ホルモン（以下、ｗ−ＰＴＨと略す）すなわち非断片化ＰＴＨ１〜８４、ならびにＰＴＨ拮抗物質の役割を果たすことができる非ｗ−ＰＴＨペプチド断片を検出する。非ｗ−ＰＴＨペプチド断片の値と、ｗ−ＰＴＨの値と、またはこれらの値の組み合せとのいずれかの値を比較するか、またはこれらを独立に使用することにより、副甲状腺および骨関連の疾患状態を識別すること、ならびにこのような状態と正常な状態とを識別することが可能である。
【０００２】
［関連出願］
本願は、米国特許および商標庁に提出された非暫定実用特許出願、出願番号第０８／２３１，４２２号の一部係属出願である。
【０００３】
［背景技術］
カルシウムは、細胞透過性、骨および歯の形成、血液凝固、神経インパルスの伝達、および通常の筋収縮において非常に重要な役割を果たす。血中カルシウムイオン濃度は、カルシトロールおよびカルシトニンと共に、主として副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）により制御される。カルシウム取り込みおよび排泄は変化する可能性があるが、ＰＴＨは、フィードバック機構により細胞内および周囲の体液中における安定したカルシウム濃度の維持に役立つ。血清カルシウムが低下すると、副甲状腺はＰＴＨを分泌し、貯蔵カルシウムの放出に影響を及ぼす。血清カルシウムが上昇すると、ＰＴＨ分泌低下により、貯蔵カルシウム放出が阻害される。
【０００４】
完全型のヒトＰＴＨ（本技術分野ではｈＰＴＨと呼ばれることもあるが、本発明では、完全型ＰＴＨまたはｗ−ＰＴＨと呼ぶ）は、図１に示す通り、独特の８４アミノ酸ペプチド（配列番号１）である。このペプチドは、プロテインキナーゼＣ活性化に関与するドメイン（アミノ酸残基２８〜３４）ならびにアデニル酸サイクラーゼ活性化に関与するドメイン（アミノ酸残基１〜７）を含み、骨に対して同化作用を有することが研究で確認されている。しかし、腺内代謝または末梢代謝により生成される公算が高い様々な異化作用型の分解されたＰＴＨペプチドまたは断片化ＰＴＨペプチドが循環内に存在する。たとえば、ｗ−ＰＴＨは、アミノ酸３４と３５の間で切断されて、（１〜３４）ＰＴＨのＮ末端断片と（３５〜８４）ＰＴＨのＣ末端断片が生じ得る。同様に、アミノ酸３６と３７の間または３７と３８の間で切断が起こり得る。最近、ＰＴＨのＮ末端付近で切り取られた「非（１〜８４）ＰＴＨ」と呼ばれる大きなＰＴＨ断片が開示された。（Ｒ．ＬｅＰａｇｅ  ｅｔ  ａｌ，“Ａ  ｎｏｎ−（１−８４）  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＰＴＨ）  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ａｓｓａｙ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓａｍｐｌｅｓ”  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ（１９９８）；４４：８０５−８１０参照）。
【０００５】
ＰＴＨの正確な測定が臨床上必要性なことは、十分に証明されている。血清ＰＴＨレベルは、以下の疾患を有する患者にとって最も重要な指標の１つである。それらは、家族性低カルシウム尿症、高カルシウム尿症、多発性内分泌腺腫症Ｉ型およびＩＩ型、骨粗鬆症、パジェット骨疾患、副甲状腺の過形成および腺腫に起因する原発性副甲状腺機能亢進、偽副甲状腺機能低下、および続発性副甲状腺機能亢進を引き起こす恐れがある腎不全である。
【０００６】
ＰＴＨは、慢性腎不全患者の病気の経過において、ある役割を果たす。腎性骨ジストロフィー（ＲＯ）は、嚢胞性線維性骨炎（ＰＴＨ過剰に起因する）、骨軟化症非鉱化骨基質（ビタミンＤ不足に起因する）、骨格外石灰化／骨化（カルシウム代謝異常およびリン代謝異常に起因する）、および無力性骨疾患（ＰＴＨ抑制が一因である）を含む複雑な骨格疾患である。慢性腎不全患者は、ＲＯが発症する恐れがある。腎機能障害により血清リンが増加し（高リン血症）、腎による１，２５ジヒドロキシビタミンＤ（１，２５−Ｄ）産生が減少する。前者の結果として、胃腸のカルシウム吸収減少による続発性副甲状腺機能亢進、および血清リンの上昇に応答したＰＴＨ上昇による嚢胞性線維性骨炎が起こる。後者は、低カルシウム血症および骨軟化症を引き起こす。続発性副甲状腺機能亢進が発症すると、副甲状腺のカルシウム受容体およびビタミンＤ受容体の発現が減少するため、副甲状腺のそのホルモン調節物質に対する応答が低下する。血清カルシウムが低下する。ＲＯは、指の壊疽、骨痛、骨折、および筋の衰弱につながる。
【０００７】
人間において、生物学的に活性な循環しているＰＴＨレベルの測定が行われてきた。１つの重大な問題は、ＰＴＨが、通常は１０〜６５ｐｇ／ｍｌという低レベルで存在することである。極めて循環レベルが低いことに加えて、ＰＴＨが不均質性であることおよびその多くの循環断片があるという問題がある。多くの場合、イムノアッセイは、循環ＰＴＨ断片による実質的且つ有意な阻害に直面している。たとえば、幾つかの市販されているＰＴＨキットは、非（１〜８４）ＰＴＨ断片と、ほぼ１００％の交差反応を示す（ＬｅＰａｇｅの論文を参照）。
【０００８】
ＰＴＨイムノアッセイは長い年月をかけて変化してきた。１つのアプローチは、Ａｒｎｏｌｄ  Ｗ．Ｌｉｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第４，３６９，１３８号に記載の二重抗体沈降イムノアッセイである。第１の抗体は（６５〜８４）ＰＴＨ断片に対して高いアフィニティを有する。第１の抗体を含む試料に放射能標識した（６５〜８４）ＰＴＨペプチドを加え、内因性非標識ペプチドに関して競合させる。第１の抗体および放射能標識したＰＴＨ断片複合体に結合する第２の抗体を加え、それによって、沈殿を形成する。沈殿も上清も放射能を測定することができる。内因性レベルをそれから算出することができる。
【０００９】
ＰＴＨ断片の阻害をなくすために、Ｎｉｃｈｏｌ’ｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓａｎ  Ｊｕａｎ  Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＡｌｌｅｇｒｏ（登録商標）Ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨアッセイ等の、インタクトＰＴＨ（Ｉ−ＰＴＨ）用の放射免疫測定法（ＩＲＭＡ）が導入された。１つの方式では、捕捉抗体がｈＰＴＨのＣ末端部分に特異的に結合し、標識抗体が捕捉されたｈＰＴＨのＮ末端に特異的に結合する。別の方式では、２つのモノクローナル抗体が使用され、その両者がｈＰＴＨのＮ末端部分に付着する。残念ながら、これらのアッセイでは、ｗ−ＰＴＨペプチドと非ｗ−ＰＴＨペプチド断片が測定されるが、両者が識別されないため、問題がある。非ｗ−ＰＴＨ断片の内因性濃度がかなり大きい副甲状腺機能亢進患者および腎不全患者では、このように識別不可能であることが表面化している。
【００１０】
最近、研究者が、Ｎ末端ＰＴＨ断片に適した特異的結合アッセイを行った。（Ｇａｏ，Ｐｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  ｔｗｏ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ”，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ２４５（１９９６）３９−５９参照）。この免疫化学照度測定法は、２つのモノクローナル抗体を使用し、Ｎ末端の（１〜３４）ＰＴＨ断片を検出するが、中間部分のＰＴＨ断片またはＣ末端のＰＴＨ断片を検出しない。これらのアッセイのデザインにおける重要な因子は、Ｃ末端のＰＴＨ断片との反応を排除することである。
【００１１】
［発明の開示］
本発明は、副甲状腺疾患患者（たとえば、原発性副甲状腺機能亢進、続発性副甲状腺機能亢進、およびその時期）を、正常状態または非罹病状態と識別するため、治療中または治療後の副甲状腺の機能をモニタリングするため、すなわち、手術中および手術後の副甲状腺機能のモニタリングならびに治療、および副甲状腺関連の骨疾患および副甲状腺機能亢進症の治療効果のモニタリングを行うための斬新な方法および装置に関する。すなわち、生物学的な試料のｗ−ＰＴＨすなわち非断片化ＰＴＨ、ＰＴＨ拮抗物質の役割を果たすことができる非ｗ−ＰＴＨペプチド断片、またはこれら２つの値の組み合せのいずれかの少なくとも１つという、３つの異なるパラメータの、血清中または血中レベルを検出する。これらの値の間の関係、ならびに値そのものが、健常者と副甲状腺疾患の患者との間で著しく異なるため、２つの値を比較するか、上記３つの値の１つを独立に試験することにより、副甲状腺および骨関連の疾患状態を識別し、疾患状態と正常な状態とを識別することができる。
【００１２】
本発明は、（配列番号２［ＰＴＨ3〜84］）から（配列番号３［ＰＴＨ34〜84］）までの間のアミノ酸配列を有するペプチドである非ｗ−ＰＴＨペプチド断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、拮抗物質または阻害物質（ＰＩＮ）の役割をするという発見を含む（図１２参照）。換言すれば、ｗ−ＰＴＨのＰＴＨ受容体への結合およびその後の生物学的活性は、このＰＩＮペプチド断片の存在による影響を受ける。ＰＴＨ結合部位が遮断されるという点で、ＰＴＨまたはＰＴＨ類似体に関してＰＴＨ受容体を阻害することができる。ｗ−ＰＴＨ濃度とＰＩＮ濃度との関係はＰＴＨ関連疾患によって異なり、従って、これらの関係は疾患状態を示すものである。本発明は、ＰＩＮの拮抗物質性が明らかになったことを考慮すると同様に役に立つ副甲状腺関連の骨疾患、および結果として生じる骨損失または増加をモニタリングするための斬新な方法および装置に関する。ＰＩＮが増量することにより、ＰＴＨのカルシウム放出活性が阻害される。
【００１３】
ｗ−ＰＴＨを測定する際に、ＰＩＮを測定することは望ましくない。血清、血漿または血液等の試料中のｗ−ＰＴＨ量を測定する本発明の方法は、ＰＴＨペプチドＳＥＲ-ＶＡＬ−ＳＥＲ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＮ−ＬＥＵ−ＭＥＴ（配列番号４）に特異的な第１の抗体を使用するか抗体断片を使用するかによって異なってもよく、少なくとも４つのアミノ酸を認識する抗体が、従来のイムノアッセイ形式におけるシグナル抗体または捕捉抗体のいずれかとしての、ペプチドの抗体反応部分の一部である一般的な様式を含む。（他の種に存在する類似したペプチド、たとえば、第１のアミノ酸セリンがアラニンで置換されているラットペプチドを使用することもできる）。シグナル抗体または捕捉抗体のいずれかとして使用する場合、存在する全てのｗ−ＰＴＨに結合させるのに十分な抗体を加える。次に、第１の抗体を、存在するあらゆるｗ−ＰＴＨに結合させ、それによって複合体を形成させる。複合体を、好ましくはｗ−ＰＴＨのＣ末端にて、標識するために、第２の抗体および従来のイムノアッセイ標識、たとえば化学発光剤、測色剤、エネルギー移動剤、酵素、蛍光剤、および放射性同位元素を含む特異的結合標識が使用され、また、第１の抗体と実質的に同時に、あるいは第１の抗体に続いて、加えることができる。最終的に、従来の技術を使用して標識複合体の量を測定し、それによって、試料中のｗ−ＰＴＨレベルを算出する。シグナル抗体を使用する場合、第１の抗体は依然としてＮ末端にて付着するが、第２の抗体はＣ末端にて付着する補足抗体の役割を果たす。
【００１４】
ＰＩＮを測定する際に、ＰＩＮを直接測定することもでき、あるいは間接的に測定することもできる。最初にｗ−ＰＴＨを測定し、次いで総ＰＴＨを測定することにより、間接的測定を行うことができる。ｗ−ＰＴＨ値を総ＰＴＨ値から減算することにより、ＰＩＮ値が得られる。（本発明では、「総ＰＴＨ」は、ｗ−ＰＴＨ（天然の主たるＰＴＨ受容体結合作動物質）とＰＩＮ（天然の主たるＰＴＨ受容体結合拮抗物質）との和を指す。）総ＰＴＨアッセイは、配列番号４ではなく、ＰＴＨのＮ末端を検出することにより、ＰＩＮとｗ−ＰＴＨの両者を検出する。ＰＴＨのアミノ酸７〜３８を検出することにより、このアッセイは、両者を検出することができる。市販の総ＰＴＨ用アッセイは、Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｓａｎｔｅｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手できる。少なくとも４つのアミノ酸が、ペプチドの抗体反応部分の一部である、ＰＴＨのアミノ酸７〜３８を含むＰＴＨペプチドＬＥＵ−ＭＥＴ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−ＡＬＡ−ＳＥＲ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＡＲＧ−ＭＥＴ−ＧＬＮ−ＴＲＰ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＥＵ−ＧＬＮ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＰＨＥ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＧＬＹ（配列番号５）の一部（好ましくは、アミノ酸９〜３４）に特異的な抗体または抗体断片を使用することにより、総ＰＴＨの直接測定を行うことができる。このような抗体あるいは抗体断片を、シグナル抗体または捕捉抗体のいずれかとして、従来のイムノアッセイ形式で使用することができる。
【００１５】
副甲状腺疾患状態と正常な状態とを識別するため、または副甲状腺疾患状態の治療効果をモニタリングするために、ｗ−ＰＴＨ値、ＰＩＮ値、または総ＰＴＨ（ｗ−ＰＴＨとＰＩＮとの組み合せ）値の間の関係、換言すれば、ＰＩＮ値と総ＰＴＨ値、ＰＩＮ値とｗ−ＰＴＨ値、またはｗ−ＰＴＨ値と総ＰＴＨ値の間の関係を比較することができる。たとえば、ｗ−ＰＴＨと総ＰＴＨ、ＰＩＮと総ＰＴＨ、またはＰＩＮとｗ−ＰＴＨとの間の比率を使用することができる。（比較は、これらの全因子の神経回路網の形をとることさえ可能である。）選択される比較方法に関わらず、これらの値は、健常者と副甲状腺疾患患者との間で、また副甲状腺疾患の様々な時期の間で、有意に異なる。
【００１６】
あるいは、副甲状腺疾患状態と正常な状態を識別するか、ｗ−ＰＴＨ、ＰＩＮ、または総ＰＴＨ単独のいずれかの値を独立に試験することによって副甲状腺疾患状態に対する治療効果をモニタリングすることができる。
【００１７】
［本発明を実行するための最良の形態］
本発明を開示するにあたって、多数のよく似た、種依存的ＰＴＨ型が存在することを念頭に置かなければならない。ｈＰＴＨのアミノ酸配列を図１に示す。しかし、たとえば、ラットＰＴＨ、ウシＰＴＨ、またはブタＰＴＨの場合、ｈＰＴＨ配列のアミノ酸の幾つかに置換が見られる。本発明の場合、抗体または抗体断片を互換的に使用して、これらのＰＴＨを測定することができるが、ＰＴＨ測定が行われる種と一致する配列をもつＰＴＨに特異的な抗体を使用することが好ましい。
【００１８】
［ｗ−ＰＴＨイムノアッセイ］
本発明の好ましい態様は、図２および３に示す、しばしばサンドイッチアッセイと呼ばれる放射免疫測定法（ＩＲＭＡ）である。このようなアッセイ（１０）で使用される要素としては、固体支持体（１４）に付着させた捕捉抗体（１２）、およびそれに付着させた、標識（１８）を有するシグナル抗体（１６）を含む。図２に示す通り、一般に、Ｃ末端断片（２２）に特異的な捕捉抗体が選択され、標識抗体は、アデニル酸サイクラーゼ活性化用ドメイン（２４）を含むｗ−ＰＴＨ先端部分のペプチド配列に特異的である。しかし、図３に示す通り、これらの抗体の特異性を逆転させることも可能である。
【００１９】
あるいは、従来の沈降アッセイまたは比濁アッセイと同様、ｗ−ＰＴＨが溶液から沈降するか溶液中で識別される、イムノアッセイをデザインすることも可能である。たとえば、少なくとも３つの抗体を使用して、沈殿塊を形成することができる。先端部分を認識するｗ−ＰＴＨ抗体およびＣ末端抗体に加えて、ＰＴＨの中間部分に付着する、少なくとも３つの抗体を使用することができる。ｗ−ＰＴＨと少なくとも３つの抗体の複合塊は、従来の技法で測定できる標識沈殿塊を形成する。別の方法は、先端部分を認識するｗ−ＰＴＨ配列抗体をコロイド状固体支持体、たとえばラテックス粒子に結合することであろう。
【００２０】
さらに詳細には、クロラミンＴで酸化し、１ｍＣｉの１２５−Ｉ放射性同位元素と共に室温で２５秒間インキュベートし、メタ硫酸水素ナトリウムで還元することによって、アフィニティ精製ヤギ抗（１〜６）ＰＴＨ抗体の５０μｇをヨウ素化することにより、シグナル抗体を作製することができる（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．製，Ｓａｎｔｅｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）。ヨウ素化混合物を、ＰＤ−１０脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を通過させ、製造会社の説明書に従うことにより、標識されなかった１２５−Ｉ放射性同位元素を、１２５−Ｉヤギ抗（１〜６）ＰＴＨシグナル抗体と分離させる。脱塩カラムから回収した分画をガンマカウンターで測定し、１２５−Ｉヤギ抗（１〜６）抗体を示す分画をプールし、１００μｌ当たり約３００，０００ＤＰＭ（崩壊／分）に希釈する。この溶液が、ｗ−ＰＴＨ  ＩＲＭＡで使用されるトレーサー溶液である。
【００２１】
当業者に周知の受動吸収技法を使用して、アフィニティ精製ヤギ抗ＰＴＨ３９〜８４抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．製，Ｓａｎｔｅｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を、１２×７５ｍｍポリスチレン管（Ｎｕｎｃ社製，Ｄｅｎｍａｒｋ）に付着させることにより、捕捉抗体被覆試験管を作製する。この試験管を空にし、乾燥させ、固相抗体被覆試験管を作成する。
【００２２】
試料のｗ−ＰＴＨアッセイを実施するために、人間血清試料２００μｍを固相固体被覆試験管に加える。各管にトレーサー溶液（標識したヤギ抗（１〜６）シグナル抗体）１００μｌを加える。この管を、１７０ｒｐｍで振盪しながら、室温にて２０〜２２時間インキュベートする。この間に、｛固相ヤギ抗（３９〜８４）ＰＴＨ抗体｝と｛ｗ−ＰＴＨ｝と｛１２５−Ｉ−ヤギ免疫化学反応ヤギ抗（１〜６）抗体｝というサンドイッチを形成する免疫化学反応が起きる。このインキュベーション後、この試験管を蒸留水で洗浄する。ガンマカウンターを使用して、固相上の放射能（その量は存在するｗ−ＰＴＨの量に対応する）を測定する。試料中のｗ−ＰＴＨ濃度を確認するために、標準および対照からの結果ならびにコンピューターソフトウエアを使用して、試料に関する放射能データを従来の分析法で処理する。図４に、このようなアッセイ用の標準曲線を示す。
【００２３】
［先端部分のｗ−ＰＴＨ配列ペプチド］
上記アッセイにおけるシグナル抗体を作製するために、まず、ｈＰＴＨ（Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）、ラットＰＴＨ（Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）のいずれかに対応する合成ＰＴＨペプチド、または共通配列における少なくとも先端部分の４つのアミノ酸を作製する。選択されたペプチドは、アッセイを行う上で、２つの役割を果たすことができる。第１に、ポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を作製する特異的な材料である。第２に、所望のシグナル抗体または捕捉抗体を単離するためのアフィニティ精製法の材料である。
【００２４】
簡単に記載すると、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．製（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ）モデル４３１自動ペプチドシンセサイザーで、Ｆｍｏｃ（９−フルオロニルメトキシカルボニル）をαアミノ保護基として使用して、このようなペプチドを合成することができる。全てのアミノ酸および溶剤は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社から入手され、合成級のものである。合成に続いて、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に６．６７％のフェノール、４．４％（Ｖ／Ｖ）のチオアニソールおよび８．８％のエタンジオールを含む反応混合液を使用して、このペプチドを樹脂から分離し、側鎖を脱ブロックする。分離されたペプチドを沈降させ、冷ジエチルエーテルで数回洗浄する。次いで、これを水に溶解し、凍結乾燥する。粗ペプチドをアミノ酸分析装置（Ｗａｔｅｒｓ  ＰＩＣＯ−ＴＡＧ  Ｓｙｓｔｅｍ社製，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ）、およびＶＹＤＡＣ（ＴＭ）Ｃ８カラムと移動緩衝液として水中に０．１％のＴＦＡおよび０．１％のＴＦＡ中に９９．９％のアセトニトリルとを使用した逆相ＨＰＬＣに供する。適当なアミノ酸組成に加えて１つの主要なピークが存在することは、このペプチドが、さらなる使用に適する証拠と考えられる。
【００２５】
次いで、このようにして得られるペプチドを、製造会社からの説明書に従って、架橋アガロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎからの活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）に付着させる。先端部分のアミノ酸配列を認識するペプチド配列をビーズ上に準備し、ｗ−ＰＴＨイムノアッセイ用の先端部分の配列抗体を単離するための、ポリクローナル抗体血清源をアフィニティ精製することができる。
【００２６】
［先端部分のアミノ酸配列を認識するｗ−ＰＴＨ抗体］
アフィニティ精製抗（１〜６）ＰＴＨ抗体を作製するために、先ず、上述の選択された先端部分のＰＴＨ配列ペプチドを、ヤギに注入する免疫原として使用する。このペプチドは、注射用免疫原として単独で、一般に約５，０００〜１０，０００，０００の分子量をもつ非ＰＴＨペプチドに組み込んで、ｗ−ＰＴＨ完全配列の一部として、使用することができる。この免疫原を、同量のフロイント完全アジュバント（軽鉱油、Ａｒｌａｃｅｌデタージェント、および不活化結核菌の混合物である）と混合する。このようにして得られた混合物をホモジナイズして水／油乳剤を作製し、これを、抗体を作製するために動物（一般にヤギ）に注入する。免疫原用量は約５０〜４００μｇである。以後毎月、同用量の免疫原複合体をフロイント完全アジュバントを除いてヤギに毎月注入する。免疫後約３ヶ月後から、ヤギから毎月採血する。遠心分離により血液から赤血球を分離し、（１〜６）ＰＴＨ抗体が多い血清（抗血清）を分離する。
【００２７】
所望の（１〜６）ＰＴＨ抗体に対する抗血清を精製するために、分離カラムに、上述の先端部分のＰＴＨ配列ペプチド結合ビーズを充填し、０．１Ｍのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でカラムを洗浄し、平衡化する。（１〜６）ＰＴＨ特異性をもたない抗体を除去するために、抗血清をカラムに負荷し、０．０１ＭのＰＢＳで洗浄する。溶出液（０．１Ｍのグリシン塩化水素緩衝液、ｐＨ２．５）を、カラムを通過させることにより、結合した特異的ヤギ抗（１〜６）ＰＴＨポリクローナル抗体を、カラムの固相ＰＴＨ１〜６から溶出させる。当業者に周知の通り、１．０Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．５を加えるか、０．０１ＭのＰＢＳと緩衝液交換するかのいずれかによって、ポリクローナル抗体がカラムから出た後、溶出したポリクローナル抗体を中和する。このポリクローナル抗体を２〜８℃で保存する。
【００２８】
［ｗ−ＰＴＨアッセイと総ＰＴＨアッセイとの間の比較］
本発明のｗ−ＰＴＨ  ＩＲＭＡアッセイと、従来のインタクトＰＴＨすなわちＩ−ＰＴＨイムノアッセイ、Ａｌｌｅｇｒｏ  Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｉｎｔａｃｔ−ＰＴＨアッセイ（Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｓａｎ  Ｊｕａｎ  Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ社，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａにより市販および作製されている）とを、ＰＴＨ正常者と慢性尿毒症罹患者との両者で比較した。このＩ−ＰＴＨイムノアッセイは、ＰＩＮとＰＴＨの間で１００％交差反応性であるため、事実上、総ＰＴＨアッセイである（図１０参照）。
【００２９】
図５に、本発明のｗ−ＰＴＨ  ＩＲＭＡアッセイおよび上記Ｉ−ＰＴＨアッセイの両方で測定した健常者からの正常なヒト血清試料３４検体の結果を示す。各例で、ＩＲＭＡにより検出されるｗ−ＰＴＨレベルは、Ｉ−ＰＴＨアッセイで報告されるｗ−ＰＴＨレベルより低く、本ＩＲＭＡが、Ｉ−ＰＴＨアッセイで検出される阻害性の非（１〜８４）ＰＴＨ断片を検出しないことがわかる（図１１参照）。図１１は、このような阻害がいかにして発生するかを示す図である。本発明における、先端部分のＰＴＨペプチド配列に特異的でないＮ末端のＰＴＨに特異的なシグナル抗体を検出することができる。ｗ−ＰＴＨ（図６の上部）のみならず、ＰＩＮ、非（１〜８４）ＰＴＨ断片（図６の下部）も検出することができる。
【００３０】
慢性尿毒症患者１５７例のアッセイ結果の比較を図７に示す。ｗ−ＰＴＨ  ＩＲＭＡおよび上記Ｉ−ＰＴＨを使用して、これらの患者からの血清試料を測定した。各例で、ｗ−ＰＴＨレベルはＩ−ＰＴＨ値より低い。
【００３１】
［臨床使用］
１８８例を含む臨床状況で、本発明のｗ−ＰＴＨアッセイおよびＰＩＮアッセイを使用した。このグループには、健常な副甲状腺を有する３１例および連続して透析を受けている慢性尿毒症患者１５７例が含まれていた。各人の血液試料を採取し、Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．からのｗ−ＰＴＨアッセイ、ならびに総ＰＴＨ値を与えるＮｉｃｈｏｌｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのＩ−ＰＴＨアッセイを使用して測定した。
【００３２】
表１に、透析を受けている慢性尿毒症患者の、ｗ−ＰＴＨアッセイ、ＰＩＮアッセイおよび総ＰＴＨアッセイの結果を、個々に、また比較して示す。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
【表１（つづき）】
0004132677.tif 000003
【００３５】
【表１（つづき）】
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【００３６】
【表１（つづき）】
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【００３７】
【表１（つづき）】
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【００３８】
表２に、健常者のｗ−ＰＴＨアッセイ、ＰＩＮアッセイおよび総ＰＴＨアッセイの結果を、個々に、また比較して示す。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
明らかに、これらの２群の中央値における統計学的な有意差から、これらのアッセイを単独で使用することにより、あるいはそれぞれの値を比較することにより２つを識別できることが分かる。
【００４１】
【表３】
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【００４２】
本発明は、かなり多数の上記の好ましい特徴を組み込むことができることを、当業者は理解できるであろう。
【００４３】
本明細書に記載の全ての刊行物および未公開の特許出願を、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００４４】
現在、およびこの特許明細書から発行される特許の存続期間中、当業者に明白である、したがって本発明の精神および範囲の中である本発明のその他の実施形態は、本明細書に記載されていない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトｗ−ＰＴＨの線図である。
【図２】  本発明の抗体をトレーサーエレメントとして使用したｗ−ＰＴＨアッセイの線図である。
【図３】  本発明の抗体を捕捉エレメントとして使用したｗ−ＰＴＨアッセイの線図である。
【図４】  ｗ−ＰＴＨアッセイ用の標準曲線を示すグラフである。
【図５】  「正常な」ＰＴＨ値を有する健常者に関する従来のＩ−ＰＴＨアッセイと本発明のｗ−ＰＴＨアッセイとを比較するグラフである。
【図６】  従来のＩ−ＰＴＨアッセイにおける、ＰＩＮによる阻害を示す線図である。
【図７】  慢性尿毒症患者に関する、従来のＩ−ＰＴＨアッセイと本発明のｗ−ＰＴＨアッセイととを比較するグラフである。
【図８】  健常者、原発性副甲状腺機能亢進患者、および慢性尿毒症患者に関する、ｗ−ＰＴＨの分布を示すグラフである。
【図９】  受容体レベルで、いかにして、ＰＩＮがｗ−ＰＴＨの作用を遮断し、それによって、人間がｗ−ＰＴＨの生物学的作用に非感受性になるかを示す線図である。
【図１０】  本発明で使用する総ＰＴＨアッセイにおける、ｗ−ＰＴＨとＰＩＮの完全な交差反応性を示すグラフである。
【図１１】  本発明で使用するｗ−ＰＴＨアッセイが、いかにＰＩＮを検出しないかを示すグラフである。
【図１２】  ＰＩＮが、いかにｗ−ＰＴＨのｉｎ  ｖｉｖｏインヒビターであるかを示すグラフである。
【配列表】
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0004132677.tif 000012
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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