(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本を照明する光源と、
前記光源からの照明光を偏向するとともに、この偏向角度を変更可能にしたスキャナと、
前記スキャナで偏向される照明光の光路に配置され、前記標本の像を投影する対物レンズと、
前記スキャナと前記対物レンズとの間に配置され、前記スキャナで偏向された照明光を前記対物レンズを介して前記標本上に集光させる第１の投影レンズと、
前記スキャナと前記対物レンズとの間に配置され、前記スキャナで偏向された照明光を前記対物レンズの瞳面上に集光させる第２の投影レンズと、
を具備し、前記第１および第２の投影レンズを選択的に前記光路に挿入可能にしたことを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記第１および第２の投影レンズを収納したユニット構成のレンズ収納手段を有し、
該レンズ収納手段を前記スキャナと前記対物レンズとの間の光路に挿脱可能にしたことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記スキャナは、前記第２の投影レンズが前記光路に挿入された状態で、前記照明光の偏向角度の可変を所定角度で停止可能にしたことを特徴とする請求項１または２記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
標本を照明する光源と、
前記光源からの照明光を偏向するとともに、この偏向角度を変更可能にしたスキャナと、
前記スキャナで偏向される照明光の光路に配置され、前記標本の像を投影する対物レンズと、
前記スキャナと前記対物レンズとの間に配置され、前記スキャナで偏向された照明光を前記対物レンズを介して前記標本上に集光させる第１の状態と前記照明光を前記対物レンズの瞳面上に集光させる第２の状態を切換可能なレンズ手段とを具備し、
前記スキャナは前記第２の状態のときに対物像面と共役であることを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項５】
前記レンズ手段が前記第１の状態のときに前記標本からの光を受光する第１の受光素子と、
前記レンズ手段が前記第２の状態のときに前記標本からの光を受光する第２の受光素子と、
前記第２の状態のときに前記標本からの光を前記第２の受光素子へ導くダイクロイックミラーとを備え、
前記第１の状態のときに前記標本からの光を前記第１の受光素子で受光してＬＳＭ画像を取得し、前記第２の状態のときに前記標本からの光を前記第２の受光素子で受光してエバネッセント蛍光画像を取得するようにしたことを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記第２の状態において、前記スキャナの偏向角度の停止位置を変化させることによりエバネッセント光のしみだし深さを可変することを特徴とする請求項５記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記第２の状態において、前記スキャナの偏向角度を変化させることにより前記対物レンズの瞳面上の集光位置を可変することを特徴とする請求項４〜６記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
前記第２の状態において、前記対物レンズの種類に応じて前記スキャナの偏向角度の停止位置を可変することを特徴とする請求項５記載の顕微鏡装置。
【請求項９】
前記第２の投影レンズが挿入されているとき、前記スキャナは対物像面と共役であることを特徴とする請求項１〜３記載の顕微鏡装置。
【請求項１０】
標本を照明する光源と、
前記光源からの照明光を偏向するとともに、この偏向角度を変更可能にしたスキャナと、
前記スキャナで偏向される照明光の光路に配置され、前記標本の像を投影する対物レンズとを備え、前記対物レンズによって集光される前記照明光を前記スキャナによって走査することにより前記標本の走査画像を形成する顕微鏡装置において、
前記スキャナと前記対物レンズとの間に配置され、前記照明光を前記対物レンズの瞳面上に集光させるとともに前記スキャナと対物像面を共役関係にする投影レンズを具備し、
前記スキャナで偏向された前記照明光を前記投影レンズを介して前記対物レンズの瞳面の周辺に集光させることによって、前記標本のエバネッセント照明を可能にしたことを特徴とする顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザ顕微鏡によるコンフォーカル画像（ＬＳＭ画像）と蛍光顕微鏡によるエバネッセント蛍光画像を選択的に取得可能な顕微鏡装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
最近、生体細胞の機能解析が盛んに行われるようになっている。これら細胞の機能解析の中で、特に、細胞膜の機能を観察するために、細胞膜およびその近傍からのエバネッセント蛍光画像を取得する蛍光顕微鏡が注目されるようになっている。
【０００３】
この種の蛍光顕微鏡は、光源にレーザ光を使用することが多く、このため、最近では、レーザ顕微鏡によるコンフォーカル画像（ＬＳＭ画像）と、蛍光顕微鏡によるエバネッセント蛍光画像を選択的に取得可能な顕微鏡装置が考えられている。
【０００４】
図３は、走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示すもので、レーザ光源１から発せられるレーザ光を集光レンズ２で光ファイバ３の入射端に集光し、光ファイバ３を通って出射端より出射される光をコリメートレンズ４で平行光に変換し、ダイクロイックミラー５を透過してスキャナ６に入射する。そして、瞳投影レンズ７によりスキャナ６を対物レンズ９の射出瞳面９ａに投影するとともに、スキャナ６で偏向されたレーザ光を結像レンズ８、対物レンズ９を通してステージ１０に載置された標本１１上に集光してＸＹ方向にスキャンさせ、標本１１からの光を上述と逆の光路を通してダイクロイックミラー５に入射し、ここで反射させて吸収フィルタ１２、ピンホール結像レンズ１３、ピンホール１４および集光レンズ１５を介してフォトマル１６で受光することによりＬＳＭ画像を取得するようになっている。
【０００５】
一方、図４は、蛍光顕微鏡の概略構成を示すもので、レーザ光源１から発せられるレーザ光を集光レンズ２で光ファイバ３の入射端に集光し、光ファイバ３を通って出射端より出射される光束をエバネッセント投光管１７まで導光し、このエバネッセント投光管１７内部のコリメートレンズ１８で平行光に変換した後、対物像投影レンズ１９によりダイクロイックミラー２０を介して対物レンズ９の瞳位置９ａに集光させる。そして、光ファイバ３の出射端を図示矢印方向に移動させることで、射出瞳面９ａ上でのレーザ光の集光位置を対物レンズ９の瞳中心から周辺までの範囲で移動させ、レーザ光の集光位置が対物レンズ９の瞳の中心付近にあるときは、レーザ光が光軸とほぼ平行に標本１１を照明して通常の蛍光観察を可能とし、また、レーザ光の集光位置が対物レンズ９の瞳の周辺にあるときは、レーザ光が光軸に対して斜めから標本１１を照明することでエバネッセント蛍光観察を可能にしている。この場合、標本１１は細胞などの上にカバーガラスを貼り付けた状態になっており、レーザ光の集光位置が対物レンズ９の瞳の周辺に集光されると、細胞とカバーガラスの境界面で全反射が起きる臨界角以上の角度で照明がなされ、この全反射した際に境界面で細胞側に１００ｎｍ〜２００ｎｍ程度しみでる照明光を利用して細胞のエバネッセント蛍光観察が行われる。そして、エバネッセント照明された蛍光観察像は結像レンズ２１を介して接眼レンズ２２やＣＣＤ２３により観察される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、ＬＳＭ画像とエバネッセント蛍光画像を選択的に取得するために、これら走査型レーザ顕微鏡と蛍光顕微鏡のそれぞれの構成を各別に用意したのでは、構成が複雑になるばかりか、操作も面倒になり、さらに、装置全体が大型となって大きな設置スペースが必要となるなど経済的に不利になる欠点がある。
【０００７】
一方、特開平６−２７３８５号公報には、光源からの光を標本上の対物レンズを介して集光して標本をスポット照明する第１の光路と、光源からの光を対物レンズの瞳面付近に集光して標本の視野を大きな光束径で照明する第２の光路を選択的に切換え可能にした顕微鏡が開示されている。
【０００８】
ところが、上述したレーザ顕微鏡によるＬＳＭ画像と蛍光顕微鏡によるエバネッセント蛍光画像を取得するための動作を行わせた場合、スキャンユニット内部で第１および第２の光路を切換えるようになるため、光路切換えのための光学素子が多数必要となり、それだけ構成が複雑になるとともに、そのための内部スペースの確保も必要となって顕微鏡自身が大型化するなどの問題が生じる。
【０００９】
そこで、特願２００１ー２１４３７３号明細書に開示されるように、レーザ光を対物レンズの瞳位置に集光させる集光レンズと、レーザ光に対して平行に所定距離オフセットさせ、対物レンズの中心からオフセットさせた位置にレーザ光を入射させるための透明な平行平面板をレーザ光の光路に挿脱可能に設け、これら集光レンズと平行平面板を光路から外した状態では、通常のレーザ顕微鏡としてＬＳＭ画像の取得を可能とし、一方、集光レンズと平行平面板を光路上に挿入した状態では、平行平面板を回転させ対物レンズの瞳面上でレーザ光の集光位置を変更することにより、エバネッセント照明によるエバネッセント蛍光画像の取得を可能として、ＬＳＭ画像とエバネッセント蛍光画像を選択的に取得できるようにしたものが考えられている。
【００１０】
しかしながら、このように構成したものは、エバネッセント蛍光観察を行うため対物レンズの瞳面上でレーザ光をスキャンするスキャナとして、専用の平行平面板を用意しなければならないばかりか、この平行平面板を精度よく回転駆動するための駆動手段も必要となるため、その分構成が複雑となり、価格的にも高価になるという問題が生じる。
【００１１】
そこで、さらにＬＳＭ画像を取得するために用いられるスキャナを利用できないものか考えられるが、特願２００１−２１４３７３号明細書のものでは、エバネッセント蛍光観察の状態で、スキャナよりレーザ光源側の光路にエバネッセント蛍光観察のための集光レンズが挿入されるだけで、スキャナを対物像面に投影することができないので、レーザ光の集光点をシフトさせるため、僅かにスキャナを動かしてレーザ光をスキャンさせると、視野の周辺で、いわゆるケラレが発生してしまい適切なエバネッセント照明ができない。
【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、簡単な構成で、しかも確実にＬＳＭ画像とエバネッセント蛍光画像を選択的に取得可能にした顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、標本を照明する光源と、前記光源からの照明光を偏向するとともに、この偏向角度を変更可能にしたスキャナと、前記スキャナで偏向される照明光の光路に配置され、前記標本の像を投影する対物レンズと、前記スキャナと前記対物レンズとの間に配置され、前記スキャナで偏向された照明光を前記対物レンズを介して前記標本上に集光させる第１の投影レンズと、前記スキャナと前記対物レンズとの間に配置され、前記スキャナで偏向された照明光を前記対物レンズの瞳面上に集光させる第２の投影レンズと、を具備し、前記第１および第２の投影レンズを選択的に前記光路に挿入可能にしたことを特徴としている。
【００１４】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記第１および第２の投影レンズを収納したユニット構成のレンズ収納手段を有し、該レンズ収納手段を前記スキャナと前記対物レンズとの間の光路に挿脱可能にしたことを特徴としている。
【００１５】
請求項３記載の発明は、請求項１または２記載の発明において、前記スキャナは、前記第２の投影レンズが前記光路に挿入された状態で、前記照明光の偏向角度の可変を所定角度で停止可能にしたことを特徴としている。
【００１６】
この結果、本発明によれば、レンズ切換え手段により、ＬＳＭ画像の観察の場合は、第１の投影レンズを光路上に切換えてスキャナで偏向される照明光を標本上に集光させ、エバネッセント蛍光観察の場合は、第２の投影レンズを光路上に切換えてスキャナで偏向される照明光を対物レンズの瞳面上に集光させるようにしたので、簡単な構成で、しかも確実にＬＳＭ画像とエバネッセント蛍光画像を選択的に取得することができる。
【００１７】
また、本発明によれば、レンズ収納手段は、光路に対して挿脱可能なユニット構成になっているので、従来用いられている走査型レーザ顕微鏡を僅かに改造してレンズ切換え手段を装着できる構成とするだけで、適用することができる。
【００１８】
さらに、本発明によれば、スキャナの偏向角度の停止位置を決定するだけで、エバネッセント蛍光観察の際のエバネッセント照明の調節を行うことができる。
また請求項４記載の発明は、標本を照明する光源と、前記光源からの照明光を偏向するとともに、この偏向角度を変更可能にしたスキャナと、前記スキャナで偏向される照明光の光路に配置され、前記標本の像を投影する対物レンズと、前記スキャナと前記対物レンズとの間に配置され、前記スキャナで偏向された照明光を前記対物レンズを介して前記標本上に集光させる第１の状態と前記照明光を前記対物レンズの瞳面上に集光させる第２の状態を切換可能なレンズ手段とを具備し、前記スキャナは前記第２の状態のときに対物像面と共役であることを特徴としている。
請求項５の発明は、請求項４記載の発明において、前記レンズ手段が前記第１の状態のときに前記標本からの光を受光する第１の受光素子と、前記レンズ手段が前記第２の状態のときに前記標本からの光を受光する第２の受光素子と、前記第２の状態のときに前記標本からの光を前記第２の受光素子へ導くダイクロイックミラーとを備え、前記第１の状態のときに前記標本からの光を前記第１の受光素子で受光してＬＳＭ画像を取得し、前記第２の状態のときに前記標本からの光を前記第２の受光素子で受光してエバネッセント蛍光画像を取得するようにしたことを特徴としている。
請求項６の発明は、請求項５記載の発明において、前記第２の状態において前記スキャナの偏向角度の停止位置を変化させることによりエバネッセント光のしみだし深さを可変することを特徴としている。
請求項７の発明は、請求項４〜６記載の発明において、前記第２の状態において前記スキャナの偏向角度を変化させることにより前記対物レンズの瞳面上の集光位置を可変することを特徴としている。
請求項８の発明は、請求項５記載の発明において、前記第２の状態において前記対物レンズの種類に応じて前記スキャナの偏向角度の停止位置を可変することを特徴としている。
請求項９の発明は、請求項１〜３記載の発明において、前記第２の投影レンズが挿入されているとき、前記スキャナは対物像面と共役であることを特徴としている。
請求項１０の発明は、標本を照明する光源と、前記光源からの照明光を偏向するとともに、この偏向角度を変更可能にしたスキャナと、前記スキャナで偏向される照明光の光路に配置され、前記標本の像を投影する対物レンズとを備え、前記対物レンズによって集光される前記照明光を前記スキャナによって走査することにより前記標本の走査画像を形成する顕微鏡装置において、前記スキャナと前記対物レンズとの間に配置され、前記照明光を前記対物レンズの瞳面上に集光させるとともに前記スキャナと対物像面を共役関係にする投影レンズを具備し、前記スキャナで偏向された前記照明光を前記投影レンズを介して前記対物レンズの瞳面の周辺に集光させることによって、前記標本のエバネッセント照明を可能にしたことを特徴としている。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の一実施の形態を図面に従い説明する。
【００２０】
図１は、本発明が適用される正立型の顕微鏡装置の概略構成を示している。
【００２１】
図において、３１はレーザ光源で、このレーザ光源１から発せられるレーザ光の光路上には、集光レンズ３２を介して光ファイバ３３の入射端が配置され、集光レンズ３２により集光されたレーザ光が入射される。
【００２２】
光ファイバ３３の出射端には、スキャンユニット３４が配置されている。スキャンユニット３４は、光ファイバ３３内に導出され出射端から出射される光束の光路上に沿ってコリメートレンズ３５、ダイクロイックミラー３６およびスキャナ３７が配置され、光ファイバ３３から入射されるレーザ光をコリメートレンズ３５で平行光に変換し、ダイクロイックミラー３６を透過してスキャナ３７に入射するようにしている。スキャナ３７は、レーザ光源１からのレーザ光を偏向するとともに、この偏向角度を変更可能にしている。この場合、スキャナ３７は、ミラーを回転させるようなタイプのものが用いられ、軸３７ａを中心に回転可能に支持され、レーザ光を直線方向(例えばＸ方向)にのみ偏向（スキャン）するようになっている。
【００２３】
スキャンユニット３４のダイクロイックミラー３６は、標本４７側からの蛍光を反射するもので、反射光路上には、吸収フィルタ３８、ピンホール結像レンズ３９、ピンホール４０、集光レンズ４１および受光素子としてのフォトマル４２が配置されている。
【００２４】
スキャナ３７で偏向されるレーザ光の光路上には、結像レンズ４３、対物レンズ４４および顕微鏡本体４５のステージ４６上の標本４７が配置されている。
【００２５】
顕微鏡本体４５には、対物像を偏向させる鏡筒４９と、鏡筒４９で偏向された対物像を目視で観察する接眼レンズ４８が設けられている。
【００２６】
スキャナ３７と対物レンズ４４との間の光路には、レンズ収納手段としてレンズ収納ユニット５１が配置されている。このレンズ収納ユニット５１は、第１の投影レンズとしての瞳投影レンズ５２、第２の投影レンズとしての対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂおよびダイクロイックミラー５４を収納したユニット構成をなすもので、これら瞳投影レンズ５２、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂおよびダイクロイックミラー５４を図示しないレンズ切換え手段により選択的に光路上に切換え可能にしている。
【００２７】
この場合、瞳投影レンズ５２は、ＬＳＭ画像を取得する際に光路上に挿入されるもので、スキャナ３７で偏向されたレーザ光を結像レンズ４３、対物レンズ４４を介して標本４７上に集光させるとともに、スキャナ３７を対物レンズ４４の射出瞳面４４ａに投影させるようにしている。ここで、スキャナ３７を対物レンズ４４の射出瞳面４４ａと共役の位置に設定しているのは、レーザ光をスキャンした場合に視野の周辺で、いわゆるケラレが発生するのを防止するためである。
【００２８】
対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂは、エバネッセント蛍光画像を取得する際に光路上に挿入されるもので、スキャナ３７で偏向されて平行に出射されたレーザ光を結像レンズ４３を介して対物レンズ４４の射出瞳面４４ａ上に集光させるとともに、スキャナ３７を対物像面５０へ投影させるようにしている。ここで、スキャナ３７を対物像面５０と共役の位置に設定しているのは、ＬＳＭ画像を観察する場合に瞳投影レンズ５２によりスキャナ３７を対物レンズ４４の射出瞳面４４ａに投影しているのと同じで、こうすることで、レーザ光を偏向した場合の視野の周辺での、いわゆるケラレの発生を防止している。また、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂは、ケプラータイプのアフォーカルコンバータに近いもので、これら対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂの間に対物レンズ４４の瞳の中間像４４ｂを結像する内焦点式のものが用いられ、対物レンズ４４の射出瞳面４４ａを無限遠に投影するとともに、スキャナ３７を対物像面５０へ投影するなどの働きを小さなスペースで可能にしている。
【００２９】
ダイクロイックミラー５４は、波長選択的に励起光となるレーザ光を透過するとともに、標本４７から発せられる蛍光のみを反射するような特性を有するもので、この反射した蛍光を吸収フィルタ５６を通してＣＣＤ５５に入射させるようにしている。また、ダイクロイックミラー５４は、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂと一体に構成され、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂとともに光路に挿脱されるようにしている。
【００３０】
なお、これら瞳投影レンズ５２と、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂおよびダイクロイックミラー５４の光路に対する具体的な切換え手段は図示していないが、例えば、スライダーによるスライド切換え機構やターレットによる回転切換え手段など公知のレンズ切換え手段を用いることができる。
【００３１】
また、このように構成されたレンズ収納ユニット５１は、スキャナ３７と対物レンズ４４との間の光路に対して挿脱可能な構成になっている。
【００３２】
このような構成において、まず、ＬＳＭ画像の観察を行う場合を説明する。
【００３３】
この場合、スキャナ３７と対物レンズ４４との間の光路に、レンズ収納ユニット５１を挿入するとともに、図示しない切換え手段により瞳投影レンズ５２を光路上に挿入する。図面では、光路上に挿入された瞳投影レンズ５２と光路から外された対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂおよびダイクロイックミラー５４をそれぞれ破線で表わしている。
【００３４】
レーザ光源３１より発せられる平行のレーザ光は、集光レンズ３２により光ファイバ３３の入射端面に集光され、この光ファイバ３３内を導光され出射端に達する。そして、光ファイバ３３の出射端から出射されたレーザ光は、コリメートレンズ３５により平行光にもどされ、ダイクロイックミラー３６を透過してスキャナ３７に導かれる。
【００３５】
この状態で、スキャナ３７は、光軸が折り返される点である軸３７ａを中心に回転され、コリメートレンズ３５からのレーザ光は、標本４７に向けて偏向される。ここで、スキャナ３７により偏向されるレーザ光は、図示実線が光軸に平行に偏向された時の光線の状態、図示破線が光軸に対してある角度を持って偏向された時の光線の状態を表している。
【００３６】
スキャナ３７で偏向されたレーザ光は、瞳投影レンズ５２、結像レンズ４３、対物レンズ４４を介して標本４７上に集光される。
【００３７】
この場合、スキャナ３７は、瞳投影レンズ５２により結像レンズ４３を介して対物レンズ４４の射出瞳面４４ａに投影され、対物レンズ４４の射出瞳面４４ａと共役な位置に設定されている。
【００３８】
このようにして、スキャナ３７で偏向されたレーザ光は、標本４７上に集光されるとともに、スキャナ３７での偏向角度に応じたスキャンがなされる。
【００３９】
一方、標本４７上に集光されたレーザ光により励起され、標本４７から発せられた蛍光は、対物レンズ４４、結像レンズ４３、瞳投影レンズ５２、スキャナ３７と上述したのと逆の光路をたどり、ダイクロイックミラー３６に入射する。そして、このダイクロイックミラー３６により反射されて、吸収フィルタ３８を透過し、ピンホール結像レンズ３９により標本４７の像がピンホール４０上に結像される。
【００４０】
この場合、吸収フィルタ３８は、励起光となるレーザ光をカットし標本４７から発せられる観察に必要な蛍光の波長のみを透過するものが用いられている。また、ピンホール４０は、標本４７へのフォーカス面以外の画像成分をカットするようにしている。
【００４１】
これにより、ピンホール４０を通過した蛍光は、集光レンズ４１を介してフォトマル４２により受光され電気信号に変換される。そして、図示していないが、フォトマルの電気信号から画像を構成するための電気回路やソフトウェアなどの処理により画像として生成されてモニタ上に映し出され、ＬＳＭ画像として観察可能となる。
【００４２】
次に、エバネッセント蛍光観察を行う場合を説明する。
【００４３】
この場合、図示しない切換え手段を用いて、瞳投影レンズ５２を光路から外し、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂおよびダイクロイックミラー５４を光路に挿入する。図面では、光路に挿入された対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂ、ダイクロイックミラー５４と、光路から外された瞳投影レンズ５２をそれぞれ実線で表わしている。
【００４４】
この場合も、レーザ光源３１から出射されたレーザ光は、光ファイバ３３を介してコリメートレンズ３５に入射される。次に、コリメートレンズ３５で平行光束にされたレーザ光は、ダイクロイックミラー３６を透過する。
【００４５】
なお、エバネッセント蛍光観察の場合、ダイクロイックミラー３６は、不要なので、明るさのロスを減らしたければ、光路から外すようにしてもよい。
【００４６】
ダイクロイックミラー３６を透過したレーザ光は、スキャナ３７に導かれ、このスキャナ３７で標本４７側へ向けて偏向される。
【００４７】
スキャナ３７は、ＬＳＭ画像の観察の場合と同様に偏向角度が可変となっており、ここでも図示実線が光軸に平行に偏向された時の光線の状態、図示破線が光軸に対してある角度を持って偏向された時の光線の状態を表している。
【００４８】
ただし、エバネッセント蛍光観察の場合は、ＬＳＭ画像の観察の場合と異なり像面をスキャンして画像構築を行う必要がないので、スキャナ３７は、レーザ光の偏向角度の可変を所定角度の状態で停止される。
【００４９】
スキャナ３７で偏向されたレーザ光は、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂ、ダイクロイックミラー５４、結像レンズ４３を介して対物レンズ４４の射出瞳面４４ａ上に集光される。
【００５０】
この場合、スキャナ３７は、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂにより対物像面５０へ投影され、対物像面５０と共役な位置に設定されている。
【００５１】
これにより、対物レンズ４４の射出瞳面４４ａ上に集光されるレーザ光は、スキャナ３７を回転させて偏向角度を変えるのみで、対物レンズ４４の瞳中心から周辺までの範囲で移動することができる。
【００５２】
この場合、図２に示すように、対物レンズ４４の射出瞳面４４ａ上に集光されるレーザ光が対物レンズ４４の瞳中心付近のａ〜ｂの範囲にあるときは、レーザ光は、対物レンズ４４を介して光軸に平行に標本４７を照明して通常の蛍光観察が可能となる。また、レーザ光が対物レンズ４４の瞳周辺のｂ〜ｃの範囲にあるときは、レーザ光は、対物レンズ４４を介して標本４７を光軸に対して斜めに照明し、その角度が上述したように臨界角を超えることで、エバネッセント照明となってエバネッセント蛍光観察が可能となる。
【００５３】
この場合、標本４７は、細胞などの上にカバーガラスが貼り付けられた状態になっており、このためカバーガラスの屈折率によってエバネッセント照明になる臨界角は異なり、また、臨界角以上の角度でも、その角度によって細胞とカバーガラスの境界面から細胞側へしみでるエバネッセント光のしみだし深さも異なってくる。このしみだし深さは、標本４７の、どの程度の深さまで観察したいかということであり、検鏡者の目的によっても異なる。
【００５４】
このようにして、標本４７の条件や、観察したい深さによって、標本４７に照射されるレーザ光の角度は異なってくる。この場合、対物レンズ４４の射出瞳面４４ａに集光されるレーザ光は、瞳の周辺に移動するにしたがって光軸に対する標本４７への照射角度が大きくなるので、標本４７の観察したい深さによって対物レンズ４４の射出瞳面４４ａでの集光位置が異なってくる。また、光軸に対する標本４７への照射角度が同じであっても、対物レンズ４４の種類によっても射出瞳面４４ａでのレーザ光の集光位置も異なる。そこで、検鏡者は、これらのことを加味しながら、用途に応じてスキャナ３７の偏向角度を最適な角度に設定してエバネッセント蛍光観察を行うことになる。
【００５５】
一方、エバネッセント照明により標本４７から発光した蛍光は、対物レンズ４４、結像レンズ４３を介してダイクロイックミラー５４に入射し、このダイクロイックミラー５４よりＣＣＤ５５へ向けて反射され、吸収フィルタ５６を介してＣＣＤ５５の受光面でもある対物像面５０へ投影される。
【００５６】
この場合、吸収フィルタ５６は、励起光となるレーザ光をカットし標本４７から発する観察に必要な蛍光の波長のみを透過するものが用いられている。
【００５７】
これにより、ＣＣＤ５５で撮像された対物像は、図示しないモニタ上に映し出され、エバネッセント蛍光画像として観察可能となる。
【００５８】
従って、このようにすれば、スキャナ３７と対物レンズ４４との間の光路に瞳投影レンズ５２と対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂを収容するレンズ収納ユニット５１を配置し、ＬＳＭ画像の観察の場合は、瞳投影レンズ５２を光路上に切換え、スキャナ３７で偏向されたレーザ光を標本４７上に集光させるとともに、スキャナ３７を対物レンズ４４の射出瞳面４４ａに投影させ、一方、エバネッセント蛍光観察の場合は、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂを光路上に切換え、スキャナ３７で偏向されたレーザ光を対物レンズ４４の射出瞳面４４ａ上に集光させるとともに、スキャナ３７を対物像面５０へ投影させるようにしたので、従来のスキャンユニット内部でＬＳＭ画像と蛍光顕微鏡によるエバネッセント蛍光画像を取得するため２つの光路を切換えるようにしたものと比べ、光路切換えのための光学素子が必要でなくなり、構成を簡単にできるとともに、無駄な内部スペースを排除でき、顕微鏡自身の小型化も実現できる。また、共通のスキャナ３７によりＬＳＭ画像とエバネッセント蛍光画像を選択的に取得できるので、従来のエバネッセント蛍光観察を行うため専用の平行平面板と、この平行平面板を精度よく回転駆動するための駆動手段を用意する必要のあるものと比べ、構成が簡単で、価格的にも安価にできる。
【００５９】
また、スキャナ３７と対物レンズ４４との間の光路に配置されるレンズ収納ユニット５１は、光路に対して挿脱可能なユニット構成になっているので、従来用いられている走査型レーザ顕微鏡を僅かに改造してレンズ収納ユニット５１を装着できる構成とするだけで、実現可能である。
【００６０】
さらに、ＬＳＭ画像の観察の場合は、瞳投影レンズ５２によりスキャナ３７を対物レンズ４４の射出瞳面４４ａに投影させ、エバネッセント蛍光観察の場合は、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂによりスキャナ３７を対物像面５０へ投影できるので、レーザ光をスキャンした場合に視野周辺でのケラレの発生を防止でき、適切な照明を行うことができる。
【００６１】
さらにまた、スキャナ３７は、ＬＳＭ画像の観察では、レーザ光を所定角度の範囲で繰り返して偏向させるように使用され、エバネッセント蛍光観察では、所定の偏向角度の状態で停止して使用されるようになっており、これら動作の切換えはスキャナ３７の図示しない駆動手段を制御するだけで簡単に得られるので、ＬＳＭ画像の観察とエバネッセント蛍光観察の切換えを簡単に行うことができ、また、エバネッセント蛍光観察の際のエバネッセント照明の調節も、スキャナ３７の偏向角度の停止位置を調整するだけで簡単に行うことができる。
【００６２】
さらにまた、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂとダイクロイックミラー５４は、一体に構成され、瞳投影レンズ５２と選択的に光路上に切換えられるようになっているので、ＬＳＭ画像の観察とエバネッセント蛍光観察をワンタッチ操作で切換えることができる。
【００６３】
さらにまた、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂは、ケプラータイプのアフォーカルコンバータに近いもので、これら対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂの間に対物レンズ４４の瞳の中間像４４ｂを結像する内焦点式のものが用いられるので、対物レンズ４４の射出瞳面４４ａを無限遠に投影するとともに、スキャナ３７を対物像面５０へ投影するなどの働きを小さなスペースで実現できる。
【００６４】
さらにまた、スキャナ３７としてミラーを回転させるタイプのものを用いることで、対物レンズ４４の射出瞳面４４ａでのレーザ光の集光位置を大きく移動させることができるので、通常の蛍光観察からエバネッセント観察までを簡単に調整することができる。
【００６５】
なお、上述した実施の形態では、スキャナ３７は、１個のみ設け、直線方向へ偏向(スキャン)する場合を示したが、２個設けて２次元的(ＸＹ方向)なスキャンを行うようにしてもよい。また、上述した実施の形態では、瞳投影レンズ５２と対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂを光路に対して交互に挿脱することで切換えを行うようにしたが、レンズ間隔を変更したり、どちらかのレンズの一部だけを挿脱するなどの他の手段を用いてレーザ光の集光位置を変更するようにしてもよい。さらに、上述した実施の形態では、対物像投影レンズ５３ａ、５３ｂとダイクロイックミラー５４を一体構成として同時に光路から挿脱するようにしているが、必ずしも同時に挿脱する必要はなく、また、ダイクロイックミラー５４は、結像レンズ４３と対物レンズ４４の間に配置してもよい。この場合は、エバネッセント蛍光像を結像させるために、ダイクロイックミラー５４で反射させた後に別途結像レンズを設けるようにすればよい。さらに、ダイクロイックミラー３６、５４は、観察光路側を反射面にして配置されているが、これらダイクロイックミラー３６、５４の反射面の面精度の影響による像の劣化を少なくするためには、それぞれフォトマル４２側とレーザ光源３１側およびＣＣＤ５５側とレーザ光源３１側を逆の配置にしてもよい。さらに、対物レンズ４４として結像レンズ４３を用いない有限対物レンズとしてもよい。さらに、上述した実施の形態は、例えば、ｃａｇｅｄ試薬解除装置や、ある１点の蛍光を強制的に退色させるＦＲＡＰなどに応用することもできる。さらに、上述した実施の形態では、一貫して正立型顕微鏡を例に説明したが、同様の構成で倒立型顕微鏡に適用することもできる。
【００６６】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【００６７】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００６８】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、簡単な構成で、しかも確実にＬＳＭ画像とエバネッセント蛍光画像を選択的に取得可能にした顕微鏡装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】一実施の形態のエバネッセント蛍光観察を説明するための図。
【図３】従来の走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。
【図４】従来の蛍光顕微鏡の概略構成を示す図
【符号の説明】
３１…レーザ光源
３２…集光レンズ
３３…光ファイバ
３４…スキャンユニット
３５…コリメートレンズ
３６…ダイクロイックミラー
３７…スキャナ
３７ａ…軸
３８…吸収フィルタ
３９…ピンホール結像レンズ
４０…ピンホール
４１…集光レンズ
４２…フォトマル
４３…結像レンズ
４４…対物レンズ
４４ａ…射出瞳面
４４ｂ…中間像
４５…顕微鏡本体
４６…ステージ
４７…標本
４８…接眼レンズ
４９…鏡筒
５０…対物像面
５１…レンズ収納ユニット
５２…瞳投影レンズ
５３ａ．５３ｂ…対物像投影レンズ
５４…ダイクロイックミラー
５５…ＣＣＤ
５６…吸収フィルタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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