(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二枚貝類に由来し、下記の特性を有するセルラーゼ。
（ａ）作用：本酵素は、セルロースを分解して低分子化セルロース及びセロオリゴ糖を生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素は、セルロースに作用する。
（ｃ）分子量：４５ｋＤａ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）至適温度：３０〜３５℃
（ｅ）熱安定性：３０℃以下で安定である。
（ｆ）至適ｐＨ：ｐＨ５．０〜７．０
（ｇ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１に記載の配列を有する。
【請求項２】
ホタテガイの胃と中腸腺及び／又は胃と中腸腺の滲出液に緩衝液又は抽出液を注入することによりセルラーゼを抽出し、セルラーゼを回収することを特徴とする請求項１に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法により回収したセルラーゼを冷水に加え、得られたセルラーゼ液に吸着剤を加えて攪拌することによりセルラーゼを当該吸着剤に吸着させた後、緩衝液を加えてセルラーゼを吸着剤から溶出させることを特徴とする請求項１に記載のセルラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二枚貝類に由来する新規なセルラーゼ及び当該セルラーゼを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セルラーゼとは、セルロースを低分子化セルロース、セロオリゴ糖、ブドウ糖（β−Ｄ−グルコース）にまで分解する酵素の総称であり、セロオリゴ糖などの機能性オリゴ糖の生産のほか、食品、飼料、工業材料の生産、ひいてはセルロースのバイオマスエネルギー化等に有用な酵素である。
このような広い用途を有するセルラーゼが工業的に利用されている主要なものは、現状では糸状菌由来のセルラーゼである。
【０００３】
ホタテガイのように微細藻類を主食としている二枚貝類（軟体動物二枚貝類）の消化液等には、かなり強いセルラーゼ活性が認められる。
しかしながら、原料の軟体動物が高価であることや、資源的に大量に得るのが難しいことなどの問題があって、現在のところ産業レベルでの利用は実現していない。
【０００４】
ところで、北海道においては、ホタテガイやカキ等の二枚貝類などの養殖に伴う不可食部分（貝殻、内臓）が、年間約３０万トン廃棄されている。近年では、その処理コストや廃棄場所の問題が水産加工業の経営を圧迫する原因となっており、環境への影響も社会問題化している。
そのため、これらの廃棄物から高付加価値成分を生産することにより、廃棄物を有価資源化しようという試みが各方面でなされている。
【０００５】
ホタテガイを例にとると、廃棄される内臓（廃棄内臓）等の利用可能量は、年間数千トンから１万トン程度はあると思われ、セルラーゼの製造に際して、この廃棄内臓等を出発材料とすることができれば、部分精製品としてもかなりの量のセルラーゼが得られると考えられる。例えば、１０ｇの内臓から１ｍｇ程度のセルラーゼが得られるとすると、単純計算で廃棄内臓１万トンから１トン程度のセルラーゼが得られることが期待される。
【０００６】
前記したように、二枚貝類などの軟体動物にセルラーゼが含まれていることは知られているが、これまでは当該酵素の精製が不十分であり、したがって酵素の諸性質については詳細な検討がなされていなかった。また、二枚貝類から上記セルラーゼを効率良く製造する方法についても十分に検討されていなかったため、産業上有効利用することができなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、二枚貝類由来のセルラーゼの諸特性を解明し、これらの養殖に伴なう廃棄内臓等の有価資源化の実現に供することを目的とするものである。
また、本発明は、二枚貝類から、上記セルラーゼを用途に応じた純度で、簡易な操作で、かつ短時間に効率良く製造する方法を開発し、廃棄内臓等の有価資源化の一層の促進を図ること目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため、二枚貝類のセルラーゼを抽出、精製して、その基本的諸性質を鋭意検討した。その結果、二枚貝類由来のセルラーゼは、基質特異性、至適温度、熱安定性、ｐＨ依存性等の点において、従来知られている微生物（細菌、真菌、糸状菌）由来のセルラーゼとは異なる基本的性質を持つことを見出した。また、二枚貝類のセルラーゼを抽出、精製する方法について検討する過程で、セルラーゼを効率良く製造するための製造方法をも見出した。本発明は、係る知見に基づくものである。
【０００９】
請求項１に係る本発明は、二枚貝類に由来し、下記の特性を有するセルラーゼである。
（ａ）作用：本酵素は、セルロースを分解して低分子化セルロース及びセロオリゴ糖をを生成する。
（ｂ）基質特異性：本酵素は、セルロースに作用する。
（ｃ）分子量：４５ｋＤａ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）至適温度：３０〜３５℃
（ｅ）熱安定性：３０℃以下で安定である。
（ｆ）至適ｐＨ：ｐＨ５．０〜７．０
（ｇ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１に記載の配列を有する。
【００１０】
請求項２に係る本発明は、ホタテガイの胃と中腸腺及び／又は胃と中腸腺の滲出液に緩衝液又は抽出液を注入することによりセルラーゼを抽出し、セルラーゼを回収することを特徴とする請求項１に記載のセルラーゼの製造方法である。
【００１１】
請求項３に係る本発明は、請求項２に記載の方法により回収したセルラーゼを冷水に加え、得られたセルラーゼ液に吸着剤を加えて攪拌することによりセルラーゼを当該吸着剤に吸着させた後、緩衝液を加えてセルラーゼを吸着剤から溶出させることを特徴とする請求項１に記載のセルラーゼの製造方法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳しく説明する。
請求項１に係る本発明のセルラーゼは、二枚貝類に由来する酵素である。
二枚貝類としては、例えばホタテガイ、アカザラガイ（アズマニシキガイ）、ウバガイ（ホッキガイ）、マガキ、ムラサキイガイ、アカガイ、アサリ、ハマグリ等が挙げられる。
これらの内、養殖に伴なう廃棄内臓等を原料として容易に入手できる点で、ホタテガイ等が好ましい。
本発明のセルラーゼは、これらの二枚貝類の内臓や内臓滲出液、特に消化器系の内臓組織やその滲出液に多く分布し、中でもホタテガイの胃部から中腸腺にかけての内蔵組織、並びに胃及び中腸腺からの滲出液等に豊富に分布している。
【００１３】
請求項１に係る本発明のセルラーゼは、以下に示す特性を有している。
【００１４】
（ａ）作用：本酵素は、セルロースを分解して低分子化セルロース及びセロオリゴ糖を生成する。
すなわち、請求項１に係る本発明のセルラーゼは、セルラーゼとしての活性を有する。ここで、セルラーゼとは、▲１▼非晶性セルロースをエンド型で切断するエンドβ−グルカナーゼ（ＥＧ、ＣＭＣａｓｅ（カルボキシメチルセルラーゼ））としてのセルラーゼ〔cellulase，EC.3.2.1.4〕、▲２▼セルロースの非還元末端に作用し、セロビオースを精製するエキソβ−グルカナーゼ（セロビオハイドラーゼ（ＣＢＨ）、アビセラーゼ）としてのセルロース１，４−β−グルコシダーゼ〔glucan 1,4-glucosidase，EC 3.2.1.91〕；▲３▼セロビオースを分解してブドウ糖を生成するβ−グルコシダーゼ（セロビアーゼ）〔β-glucosidase，EC 3.2.1.21〕の総称であり、請求項１に係る本発明のセルラーゼは、これらの３つの酵素活性のうち▲１▼に相当する。なお、本酵素によりセルロースを分解して生成したセロオリゴ糖にβ−グルコシダーゼを作用させると、ブドウ糖（β−Ｄ−グルコース）が生成する。
【００１５】
（ｂ）基質特異性：本酵素は、セルロースに作用する。
（ｃ）分子量：４５ｋＤａ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｄ）至適温度：３０〜３５℃
（ｅ）熱安定性：３０℃以下で安定である。
（ｆ）至適ｐＨ：ｐＨ５．０〜７．０
（ｇ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１に記載の配列を有する。
【００１６】
請求項１に係る本発明のセルラーゼの製造は、一般的な手法に従えば良いが、例えば請求項２に示した如く、二枚貝類の内臓及び／又は内臓滲出液からセルラーゼを含む抽出液を得た後、これをそのまま回収する方法などがある。さらに、回収したセルラーゼ含有液を精製する方法としては、請求項３に示した方法は、簡便で、しかも短時間に処理できるので好ましい方法である。
【００１７】
次に、請求項２に記載のセルラーゼの製造方法について説明する。
二枚貝類の内臓及び／又は内臓滲出液を原料とするセルラーゼの製造は、基本的に穏やかな条件下で実施すべきである。二枚貝類からセルラーゼを含む抽出液を得る場合に、ワーリングブレンダーを用いた従来のホモジェナイズによる抽出法を行うと、得られるセルラーゼ活性が著しく低下するので好ましくない。しかし、セルラーゼの用途などを考慮して従来法を採用することもできる。
【００１８】
本発明では、貝殻に付着した状態の二枚貝類の内臓の適当な部分に切り込みを入れ、この部分から内臓内に緩衝液又は抽出液を静かに注入して内臓各部や内臓滲出液と接触させるか、もしくは貝殻から切除した後の二枚貝類の内臓や内臓滲出液に直接緩衝液又は抽出液を加えることによって、セルラーゼを洗い出すように抽出する。この抽出操作を、必要に応じて数回（２〜５回）繰り返すと、目的とするセルラーゼを含有する抽出液を効率よく回収することができる。
この方法によれば、抽出に際して脂質や色素成分などの不純物の溶出量を低減させることができ、高いセルラーゼ活性を示す抽出液が得られる。
【００１９】
ここで、セルラーゼの抽出に使用する緩衝液又は抽出液としては、例えば５〜１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１〜５ｍＭ  炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．５）、１０〜２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）などの中性ないし弱アルカリ性に緩衝能を持つ緩衝液であれば使用可能である。いずれも、４〜１０℃程度に冷却して使用する。
【００２０】
このようにして得た粗セルラーゼ抽出液からセルラーゼの精製を行う場合、粗セルラーゼ抽出液を冷蒸留水で１０倍に希釈し、イオン交換樹脂を加えてバッチ吸着し、これをカラムに充填してから溶出するというイオン交換クロマトグラフィーを行っても良いが、この方法はフラクションコレクターを必要とすること、試料分取のために数多くの試験管を必要とすること、クロマトグラフィーに１２時間程度を要する等の時間と手間がかかるという問題点がある。
そこで、請求項３に係る本発明の方法では、上記した方法によって回収したセルラーゼを含む抽出液を冷水で希釈して得た粗セルラーゼ液、通常は４〜１０℃程度の冷水で７〜１５倍、好ましくは８〜１２倍程度に希釈した粗セルラーゼ液に、吸着剤を加えて穏やかに攪拌することにより、セルラーゼを当該吸着剤に吸着させる。
このとき用いる吸着剤としては、イオン交換樹脂の場合、陽イオン交換タイプのイオン交換樹脂、好ましくはCM-Toyopearl（東ソー社製）、SP-Toyopearl（東ソー社製）などがある。イオン交換樹脂を加えて５〜２０分間、好ましくは８〜１５分間攪拌することによって、当該樹脂にセルラーゼをバッチ吸着させることができる。イオン交換樹脂以外の吸着剤としては、例えばハイドロキシルアパタイト（和光純薬製）などを使用することができる。
【００２１】
セルラーゼを当該吸着剤に吸着させた後、中性ｐＨに調整した、イオン強度０．１〜０．１５のNaCl、KCl 、Na２HPO４  などの溶離液又は緩衝液を加えて懸濁することによって、セルラーゼを吸着剤から溶出させる。この場合、セルラーゼを吸着剤から溶出させる前に、デカンテーションや吸引ろ過等によって吸着剤を回収し、非吸着画分をイオン強度０．０１程度の緩衝液で洗浄、除去することが望ましい。
なお、吸着剤からのセルラーゼの溶出は、直線濃度勾配で行うと、より高純度のセルラーゼを得ることができる。
次いで、ろ過、遠心分離などの固−液分離手段によりセルラーゼを溶出液中に回収する。
この方法によれば、比較的高純度（通常３０〜５０％程度）のセルラーゼを１〜３時間という短時間で大量に製造することができる。例えば、ホタテガイ（体重２００〜３００ｇ）の場合、１個体から１〜５ｍｇ程度のセルラーゼ得ることができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが本発明はこれらによって制限されるものではない。
なお、実施例を示す前に、活性の測定法など本実施例で用いた基本的分析方法について述べる。
【００２３】
（１）セルラーゼ活性の測定および検出方法
（１−１）生成還元糖の定量によるセルラーゼ活性の測定
セルラーゼ活性測定には、基本的には以下の組成の反応混液を用いた。
１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
０．５％  カルボキシメチルセルロース（中粘度ＣＭＣ、ＩＣＮ製）
種々の量のセルラーゼ（測定対象の試料）
【００２４】
反応液量は１ｍｌとし、反応温度は３０℃、反応温度は３０分とした。反応停止は１００℃で５分間の加熱によった。生成した還元糖（還元末端）はＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法により定量した。セルラーゼ１単位（ｕｎｉｔ）は、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量と定義した。
【００２５】
（１−２）ザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の検出
セルラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した後、ゲルをシャーレに移し５０ｍｌの１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）と２５％  イソプロパノールを含む溶液により４℃で３０分間、穏やかに振盪しながら洗浄した。この操作を３回繰り返した後、さらに１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で３回洗浄することにより酵素を再生させた。
【００２６】
一方、１５ｃｍのガラスシャーレに０．１％のＣＭＣと１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む２％の寒天ゲルを作成しておき、ここに上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の洗浄ゲルを重層した。これを３７℃で３時間インキュベートすることにより、洗浄ゲル中の再生セルラーゼと寒天ゲル中のＣＭＣとを反応させた。反応後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、０．１％  クマシブリリアントブルーの５０％  メタノール溶液で染色し、一方の寒天ゲルは、０．１％  コンゴーレッド水溶液で染色した。セルラーゼ活性はコンゴーレッド非染色部として検出した。
【００２７】
（２）タンパク質濃度、総タンパク質量の測定
タンパク質濃度は、高濃度（ｍｇ／ｍｌオーダー）の場合は、Ｂｉｕｒｅｔ法で、低濃度（μｇ／ｍｌオーダー）の場合は、Ｌｏｗｒｙ法で定量した。
また、総タンパク質量は、試料のタンパク質濃度に試料の体積を乗ずることによって算出した。
【００２８】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｐｏｒｚｉｏ＆Ｐｅａｒｓｏｎの方法に従い、０．１％ＳＤＳ−１０％ゲルと０．１％ＳＤＳ−１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８．６）を用いて行った。
【００２９】
実施例１（ホタテガイ・セルラーゼの調製）
ホタテガイ（Patinopecten yessoensis)を用いて、以下の手順でホタテガイ・セルラーゼを抽出・精製した。
（１）ホタテガイ・セルラーゼの分布
ホタテガイの消化器官は、図１に示すように、口に当たる唇弁に始まり、胃、中腸腺を経て生殖腺内部の腸管を通り、貝柱外側の直腸から肛門に至る。そこで、まずホタテガイ・セルラーゼの内臓組織中の分布について調べた。
即ち、試料として貝殻長約１２ｃｍ、体重１８０ｇのホタテガイ（３年貝）を解体し、唇弁、胃＋中腸腺（胃と中腸腺は組織的に融合しており、分離できない。）腸管及び直腸に切除した。各内臓組織をそれぞれ５０ｍｌのビーカーに取り、氷冷下で３０分間、１０ｍｌの駒込ピペットで１分間に２０回程度の吸引−吐出を行うことにより、可溶性成分を抽出した。抽出後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上清を、各内臓組織の酵素液とした。
【００３０】
なお、ホタテガイ解体の際、胃＋中腸腺及び直腸のそれぞれからの滲出液もそれぞれ胃＋中腸線滲出液、直腸滲出液として回収した。
これらの各内臓組織の酵素液及び各消化液試料について、総タンパク質量とセルラーゼ活性を測定した。
【００３１】
図２に、ホタテガイの各内臓組織及び各滲出液の総タンパク質量とセルラーゼ活性を示す。なお、図２中、黒色は総タンパク質量を、白色はセルラーゼ活性（全活性、ｕｎｉｔｓ）を示す。
図２によれば、胃＋中腸腺の酵素液と胃＋中腸腺の滲出液に高い酵素活性が認めらることが明らかとなった。
【００３２】
また、胃＋中腸腺の滲出液について、ザイモグラフィーを行い、セルラーゼ活性の検出を行った。ザイモグラフィーの結果を図３に示す。
図３から明らかな通り、ホタテガイ・セルラーゼの主成分の分子サイズは、約４５ｋＤａであることが示された。
【００３３】
（２）ホタテガイ・セルラーゼの調製
▲１▼ホタテガイ・セルラーゼ（粗酵素）の抽出
前項の結果から、セルラーゼは、胃＋中腸腺とその滲出液に多く含まれていることが分かったので、ホタテガイ・セルラーゼの調製には、これらを出発原料として用いることにした。
なお、予備実験の結果、抽出の際にＰｏｔｔｅｒ型ホモジェナイザーやワーリングブレンダーなどにより組織を強くホモジェナイズすると、酵素活性が著しく低下することを認めた。そこで、抽出は、できるだけ穏やかに行うように留意した。
【００３４】
即ち、ホタテガイ（３年貝）２０個体を解体し、貝柱を貝殻に残したまま、外套膜及び内臓を貝殻からはずした。ここから、胃＋中腸腺部分をハサミで切り取り、それをビーカー中に移した。このようにして、約２００ｇの胃＋中腸腺を得た。次いで、胃＋中腸腺に対し、４倍量の抽出液（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０），０．２％  ＮａＮ３，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、ハサミで胃＋中腸腺を概ね４〜６片に切断し、ガラス棒で穏やかに攪拌しながら、氷冷下で３０分間ホタテガイ・セルラーゼ（粗酵素）を抽出した。
【００３５】
この抽出液を、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を得た。この上清のタンパク質濃度は、約１．７８ｍｇ／ｍｌで容量は９９２ｍｌであった。その結果、１，７６６ｍｇの粗酵素が得られた。また、上記全タンパク質量（ｍｇ）のほか、この上清、すなわち粗酵素のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）及び全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）及び収率（％）を、第１表に示す。
【００３６】
この粗酵素試料について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとザイモグラフィーを行った結果、ホタテガイ・セルラーゼ活性は、分子サイズ６６ｋＤａと４５ｋＤａの位置に検出され、活性の高さから、４５ｋＤａの成分がホタテガイ・セルラーゼの成分であることが分かった。
【００３７】
▲２▼ホタテガイ・セルラーゼのCM−Toyopearl カラムクロマトグラフィーによる精製
上記▲１▼で抽出したホタテガイ・セルラーゼ（粗酵素）の抽出液を、以下の手順でCM−Toyopearl カラムクロマトグラフィーにより精製した。
なお、▲１▼で抽出した粗酵素抽出液には、抽出の際に貝殻中からの海水が若干混入しており、イオン強度がやや高く、セルラーゼのCM−Toyopearl への吸着が悪いことが分かった。そこで、酵素抽出液を冷蒸留水で１０倍に希釈することによりイオン強度を下げた。
【００３８】
次いで、この粗酵素希釈液に、あらかじめ１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化したCM−Toyopearl ６５０Ｍ（東ソー（株）製）をベッド体積で５０ｍｌ加え、４℃で１０分間穏やかに攪拌することによりセルラーゼを担体に吸着させた。静置して担体を沈澱させ、デカンテーションで上清を概ね除去した後、担体を１００ｍｌの１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で再度懸濁して２．０ｃｍ×１５ｃｍのガラスカラムに充填した。このカラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）１００ｍｌで洗浄した後、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌの直線濃度勾配によりタンパク質を溶出した。
各フラクションの吸光度（２８０ｎｍ）とセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ））の測定結果を図４に示す。なお、図４中、○は吸光度を示し、●は比活性を示す。
【００３９】
図４から明らかなように、セルラーゼは、２つのピーク画分、即ちフラクション番号２１〜２３、２５〜２８の２画分に溶出していることが分かった。これらについては、以降それぞれを、ＳＣ−Ｉ画分、ＳＣ−II画分と呼ぶこととする。
【００４０】
一方、図４中でａ〜ｉで示した画分については、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥとザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の分析に供した。ザイモグラフィーの結果を図５に示す。
【００４１】
図５の結果によれば、ホタテガイ・セルラーゼの主成分である分子サイズ４５ｋＤａの活性成分は、ＳＣ−Ｉ画分に含まれることが分かったので、この画分について、さらにハイドロキシアパタイト・カラムクロマトグラフィーで精製することとした。
【００４２】
ＳＣ−Ｉ画分の総タンパク質量は、７．６８ｍｇであった。また、上記全タンパク質量（ｍｇ）のほか、このＳＣ−Ｉ画分のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）及び全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）及び収率（％）の測定値を、第１表に示す。
なお、ＳＣ−II画分も十分なセルラーゼ活性を持っているので、精製品が必要でない場合は、これらの画分もホタテガイ・セルラーゼとして使用可能である。
【００４３】
▲３▼ホタテガイ・セルラーゼのハイドロキシアパタイト・カラムクロマトグラフィーによる精製
上記▲２▼において、CM−Toyopearl カラムクロマトグラフィーにより得たＳＣ−Ｉ画分（フラクション番号２１〜２３、総タンパク質量７．６８ｍｇ）を、１０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．０）で平衡化したハイドロキシアパタイト（和光純薬工業（株）製、カラムクロマトグラフ高流速タイプ）カラム（１．５×２０ｃｍ）に供した。ここで、緩衝液をリン酸ナトリウムからリン酸カリウムに変換したが、その理由は、ハイドロキシアパタイト・カラムからのタンパク質の溶出に用いる高濃度のリン酸塩の溶解度が、リン酸ナトリウムよりもリン酸カリウムの方が高く、低温下の操作でも析出し難いためである。
【００４４】
ハイドロキシアパタイトに吸着したタンパク質は、１０〜３００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）の直線濃度勾配により溶出した。溶出液は１フラクションあたり５ｍｌ分取した。
各フラクションの吸光度（２８０ｎｍ）とセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ））の測定結果を図６に示す。なお、図６中、○は吸光度を示し、●は比活性を示す。
【００４５】
図６から明らかなように、ハイドロキシアパタイト・カラムクロマトグラフィーの結果、セルラーゼの比活性は、フラクション番号３６〜３８付近にほぼ単一のピークとして溶出することが分かった。
また、図６のａ〜ｉで示した各画分については、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーによるセルラーゼ活性の分析に供した。ザイモグラフィーの結果を図７に示す。
【００４６】
図７の結果によれば、フラクション３６〜３８に相当するｂ〜ｃ画分の場合には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４５ｋＤａ付近にほぼ単一のバンドが確認され、ザイモグラフィーにより、この成分がセルラーゼ本体であることが確認された。
この精製セルラーゼ（４５ｋＤａ）〔ＳｃＨｙｄ〕の総タンパク質量は、０．７９ｍｇであった。また、この精製セルラーゼ（４５ｋＤａ成分）の上記全タンパク質量（ｍｇ）のほか、カルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）及び全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）及び収率（％）を第１表に示す。
【００４７】
【表１】
0004050060.tif 000002
0004050060.tif 000003
【００４８】
以上、ホタテガイの胃＋中腸腺を出発材料として、分子量サイズ４５ｋＤａのホタテガイ・セルラーゼを精製することに成功した。この精製過程は、第１表に示す通りであり、分子量サイズ４５ｋＤａの精製セルラーゼは、粗酵素から約８９倍に精製されたことが分かる。
一方、活性収率は４％であるが、残りの活性の多くは、前記▲２▼のCM−ToyopearlカラムクロマトグラフィーにおいてＳＣ−Ｉの非回収部分に残存している。従って、この画分は部分精製セルラーゼとして利用可能である。
【００４９】
実施例２（ホタテガイ・セルラーゼの基本的な性質）
実施例１で精製した分子量サイズ４５ｋＤａの精製セルラーゼの基本的な酵素特性を調べた。以下の実施例２において、市販の糸状菌セルラーゼ（Trichoderma viride起源、和光純薬工業（株）製）からCM−Toyopearlカラムクロマトグラフィーで精製した、２３．５ｋＤａセルラーゼ成分を比較対照とした。
【００５０】
（１）セルラーゼ活性の温度依存性（至適温度）
実施例１で得た分子量サイズ４５ｋＤａの精製セルラーゼ（以下、ＳｃＨｙｄという。）及びTrichoderma viride由来の分子量サイズ２３．５ｋＤａのセルラーゼ（以下、Ｔｒｉ−２３．５という。）のセルラーゼ活性の温度依存性を測定した。
【００５１】
酵素液を除く反応混液（０．９５ｍｌ）を、１０〜７０℃の各温度（ＳｃＨｙｄは１０〜５０℃、Ｔｒｉ−２３．５は２０〜７０℃）で、１０分間プレインキュベートした後、各反応混液にいずれかのセルラーゼを０．０５ｍｌ加えて反応を開始し、それぞれの温度で３０分間保持した後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止した。生じた還元糖はＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法で定量し、セルラーゼ活性を算出した。
なお、Ｔｒｉ−２３．５の至適ｐＨは、酸性側（ｐＨ５．０）にあるので、反応混液のｐＨはリン酸ナトリウムでｐＨ５．０とした。
結果を図８に示す。なお、図８の上段は比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）の温度依存性を、下段は相対的活性（％）の温度依存性を示し、○はＳｃＨｙｄの結果を、△はＴｒｉ−２３．５の結果を示す。
【００５２】
図８に示すように、３５℃においてＴｒｉ−２３．５の比活性が約１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｇであるのに対し、ＳｃＨｙｄは約３．４ｕｎｉｔｓ／ｍｇであったことから、ＳｃＨｙｄの比活性は、Ｔｒｉ−２３．５に比べ測定した温度範囲で約２倍高いことが明らかとなった。
また、ＳｃＨｙｄの至適温度は、３０〜３５℃付近にあり、Ｔｒｉ−２３．５の至適温度である約５０℃よりも１５〜２０℃低かった。これらの結果から、ホタテガイ・セルラーゼがTrichoderma viride由来のセルラーゼに比べて、より低温で高活性を示すことが示された。
【００５３】
（２）セルラーゼ活性の熱安定性
次に、ＳｃＨｙｄ及びＴｒｉ−２３．５のセルラーゼ活性の熱安定性を測定した。
１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に、各酵素を０．１５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、２０〜７０℃の各温度で３０分間インキュベートした後、氷冷した。これら加熱処理酵素の０．０５ｍｌを、あらかじめ３０℃に保温してある０．９５ｍｌの反応混液に加え、同温度で３０分間反応させた。
相対的活性の結果を図９に示す。なお、図９中、○はＳｃＨｙｄの結果を、△はＴｒｉ−２３．５の結果を示す。
【００５４】
図９によれば、ＳｃＨｙｄの活性は、加熱温度が３０℃まではほとんど変化しないが、３５℃以上になると急激に失活することが分かる。一方、比較対照のＴｒｉ−２３．５の活性は、５０℃まではほとんど失活しないが、６０℃では従来の報告通りほぼ完全に失われた。
このことから、ホタテガイ・セルラーゼの熱安定性は、Trichoderma viride由来のセルラーゼよりも約２０℃低いことが明らかとなった。
【００５５】
（３）セルラーゼ活性のｐＨ依存性
従来知られているセルラーゼの至適ｐＨは、多くの場合酸性側にある。そこで、ホタテガイ・セルラーゼのｐＨ依存性をTrichoderma viride由来のセルラーゼと比較すべく、ＳｃＨｙｄ及びＴｒｉ−２３．５のセルラーゼ活性のｐＨ依存性を測定した。
即ち、酢酸ナトリウム（ｐＨ２．０〜５．０）、リン酸ナトリウム（ｐＨ５．０〜９．０）又はグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０〜１０．０）で反応混液のｐＨを変えて、温度３０℃における各ｐＨにおけるセルラーゼ活性を調べた。
図１０に結果を示す。なお、図１０の上段は比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を、下段は相対的活性（％）を示し、○はＳｃＨｙｄの結果を、△はＴｒｉ−２３．５の結果を示す。
【００５６】
図１０に示すように、ＳｃＨｙｄは、ｐＨ６．１で最大活性を示し、ｐＨ５．０〜７．０にかけて最大の７０％以上の活性値を示したことから、ホタテガイ・セルラーゼは弱酸性から中性付近に至適ｐＨを有することが明らかとなった。
一方、比較対照に用いたＴｒｉ−２３．５の至適ｐＨは、これまで報告されている通り、ｐＨ５．０付近であった。
このことから、ホタテガイ・セルラーゼの至適ｐＨは、弱酸性から中性付近にあり、Trichoderma viride由来のセルラーゼを始めとする他の糸状菌セルラーゼの至適ｐＨが酸性側にあるのとは明らかに異なるｐＨ特性を持つ酵素であることが分かった。
従って、ホタテガイ・セルラーゼは既知のセルラーゼの使用可能なｐＨ範囲を広げるという点で有用性が高いと考えられる。
【００５７】
（４）ＳｃＨｙｄの部分アミノ酸配列の解読
ホタテガイ・セルラーゼのうち、完全精製した４５ｋＤａの成分（ＳｃＨｙｄ）の部分アミノ酸配列を分析し、これまでに一次構造が明らかにされているセルラーゼのアミノ酸配列との差異を若干ながら検討した。
まず、ＳｃＨｙｄについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした。そして、そのＮ末端のアミノ酸配列を、パーキンエルマー−ＡＢＩ社製の４７３Ａ型プロテインシークエンサーで分析した。その結果、ＳｃＨｙｄのＮ末端８残基の配列は、配列表の配列番号１に示される通りであることが明らかとなった。
【００５８】
ＳｃＨｙｄのＮ末端の配列と相同性のある配列をＦＡＳＴＡプログラム（ＤＤＢＪを利用）により検索した。図１１には、ＳｃＨｙｄのＮ末端の配列及びシロイヌナズナの第３染色体にコードされている未同定タンパク質（Accession No. AC020580）のアミノ酸配列との比較を示す。図１１から明らかなとおり、ＳｃＨｙｄのＮ末端の配列は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の第３染色体にコードされている未同定タンパク質（Accession No. AC020580）のアミノ酸配列（３７０〜３７６塩基部分）と、高い相同性を示すことが分かった。
【００５９】
実施例３（ホタテガイ・セルラーゼの調製）
ホタテガイ（３年貝、貝殻を含めた体重約２５０ｇ）の貝柱筋をナイフで切断することにより開殻した後、ハサミで唇弁から胃及び中腸腺方向に向かって切開した。それにより、滲出した消化液をビーカーに受けた。さらに、切開部に駒込ピペットを使って５ｍｌの１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を吹き込み、洗浄液をビーカー中に受けた。この操作はさらに２回繰り返した。
【００６０】
１０個体分についてこの操作を行い、得られた粗酵素液を合わせた後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。得られた上清のタンパク質濃度は、約１．２ｍｇ／ｍｌで、体積は１６１ｍｌであった。従って、総タンパク質量は、１９３．２ｍｇであった。総タンパク質量のほか、粗酵素液のカルボキシメチルセルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）、収率（％）を第２表に示した。
【００６１】
この粗酵素液に５００ｍｌの冷蒸留水を加え、さらにベッド体積で２０ｍｌの１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化したCM−Toyopearlを直接加えた。５分間静かに懸濁することにより、セルラーゼをCM−Toyopearlに吸着させ、グラスフィルターろ過により、CM−Toyopearlを集めた。
これを、１００ｍｌのビーカーに取り、ここに１０ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＣｌ−１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を加えて静かに攪拌し、セルラーゼを溶出した。次いで、グラスフィルターでろ過し、ろ液を集めた。
この担体からのセルラーゼ溶出操作は、もう一回行い、これらの溶出液を合一した。この溶出液の全タンパク質量（ｍｇ）、セルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）、収率（％）を第２表に示した。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
第２表に示すように、本発明の方法により、比活性が１．０７ｕｎｉｔｓ／ｍｇで、精製度が粗酵素の４．９倍の純度２０％程度のホタテガイ・セルラーゼを、１〜３時間で３３％の収率で大量に（ホタテガイ（貝殻を含めた体重約２５０ｇ）の場合、１個体から１〜２ｍｇ）得られることが分かった。
このセルラーゼの比活性は、従来のようにワーリングブレンダー等を用いたホモジェナイズ抽出や、先に貝殻から消化器官を切除する方法で精製したものと比較して、脂質や色素成分などの混入がなく、高い精製率のものであった。なお、CM−Toyopearlからの溶出を直線濃度勾配にすれば、より高純度のセルラーゼを得ることができる。
【００６４】
比較例１
ホタテガイ（３年貝、貝殻を含めた体重約２５０ｇ）の１０個体分の中腸線をワーリングブレンダーでホモジェナイズし、遠心分離（１０，０００×ｇ）により得た上清を粗酵素とした。これを硫安分画して得た画分（４０〜７０％飽和画分）及びゲルろ過によって脱塩した画分（脱塩画分）の全タンパク質量（ｍｇ）、セルラーゼ活性（比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、全活性（ｕｎｉｔｓ））、精製度（ｆｏｌｄ）及び収率（％）を第３表に示した。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
【発明の効果】
請求項１に係る本発明のセルラーゼは、比較的低温で高活性を示し、至適ｐＨが弱酸性から中性付近にあり、しかも比活性値が糸状菌のセルラーゼより高いことから、新規なセルラーゼであることが明らかである。特に、至適ｐＨの範囲が広いことから、従来のセルラーゼよりも広範な利用が期待できる。
さらに、本発明に係るセルラーゼは、二枚貝類に由来し、その給源を養殖及び水産加工の際に廃棄される廃棄内臓に求めることができる。そのため、従来の糸状菌由来のセルラーゼと比較して低コストで、かつ大量に生産することが可能である。
【００６７】
請求項１に係る本発明のセルラーゼは、地球上に最も大量に存在する多糖であるセルロースの糖化利用、セロビオース、セロトリオースなどのセロオリゴ糖の生産、飼料効率を高めるための飼料添加、製紙工業における脱墨や脱色の促進、洗剤等の用途に広く利用できると共に、本発明は養殖及び水産加工に伴なう廃棄内臓の有価資源化の実現に供するものである。
【００６８】
また、請求項２に係る本発明の方法により、不純物である脂質や色素成分などの溶出量を最低限に抑え、活性の低下が抑制された上記請求項１に係る本発明のセルラーゼを製造することができる。そして、本発明の方法は、加熱や激しい撹拌などの操作を必要としないので操作が簡便である。また、本発明によれば、抽出後に硫安分画を行わなくても、従来の抽出後に硫安分画を行って得られるセルラーゼ標品と同程度か、それ以上の純度のセルラーゼを得ることができるので、操作工程を省略できる上に、短時間で所望のセルラーゼを製造できる。
【００６９】
そして、請求項３に係る本発明の製造方法によれば、従来の製造方法と比較して、簡便な操作で高純度のセルラーゼを、短時間で得ることができる。
それ故、請求項２及び３に係る本発明の製造方法は、上記優れた性質を有し、産業上の利用性も高い請求項１に係る本発明のセルラーゼの効率的な製造方法として極めて有用である。
【００７０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ホタテガイの解剖図を示す図である。
【図２】  ホタテガイの内臓組織及び滲出液におけるセルラーゼの分布を示す図である。
【符号の説明】
黒色は総タンパク質量を、白色はセルラーゼ活性を示し、棒グラフの上の数値は比活性を示す。
【図３】  胃＋中腸腺滲出液のザイモグラフィーの結果を示す図である。
【図４】  CM-Toyopearlクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図５】  CM-Toyopearlクロマトグラフィーの結果得られた各画分についてのザイモグラフィーの結果を示す図である。
【図６】  ＳＣ−Ｉ画分についてハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィーを行った結果を示す図である。
【符号の説明】
図４及び６中、○は吸光度を、●は比活性を示す。
【図７】  ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィーの結果得られた各画分についてのザイモグラフィーの結果を示す図である。
【図８】  セルラーゼ活性の温度依存性（至適温度）を示す図である。
【図９】  セルラーゼ活性の熱安定性を示す図である。
【図１０】  セルラーゼ活性のｐＨ依存性を示す図である。
【図１１】  ＳｃＨｙｄのＮ末端アミノ酸配列とシロイヌナズナのアミノ酸配列との比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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