(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるオキサゾリン誘導体に、ウシ睾丸由来ヒアルロニダーゼ又は羊睾丸由来ヒアルロニダーゼからなるヒアルロン酸分解酵素を作用せしめることを特徴とするヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の製造法。
【化１】
0004036755.tif 000010
（上式中Ｒは水素、アルキル基、置換されたアルキル基、フェニル基、又は置換されたフェニル基を表す。）
【請求項２】
前記一般式（Ｉ）で表されるオキサゾリン誘導体が２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウム−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）］−α−Ｄ−グルコピラノ−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンであることを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の製造法。
【請求項３】
前記２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウム−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）］−α−Ｄ−グルコピラノ−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンにヒアルロン酸分解酵素を作用せしめるにあたり、ｐＨを５〜１０に調整することを特徴とする請求項１又は２に記載のヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、ヒアルロン酸分解酵素を利用したヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の酵素的製造法に関する。更に詳しくは、ヒアルロン酸分解酵素であるほ乳類由来のヒアルロニダーゼを触媒とし、ヒアロビウロネートオキサゾリン誘導体をモノマー基質として酵素的に重合させてヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体を製造する方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンの二糖が直鎖状に交互に結合した枝分かれのない高分子多糖である。ヒアルロン酸は動物のあらゆる結合組織に存在し、その分子量は数万から数百万とされている。ヒアルロン酸の特徴は高保湿性、高粘弾性、高潤滑性を示すことであり、それらの特徴を生かして、化粧品に保湿剤として配合されたり、各種関節症治療用注射剤、眼科手術補助剤等の医療分野においてもその有用性が幅広く認められている。
【０００３】
ヒアルロン酸の実用的な製造法としては、ヒアルロン酸が多量に含まれている鶏冠、臍帯等からの抽出法の他に、乳酸菌の一種であるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属による発酵法が知られている。これら生体内でのヒアルロン酸の生合成に関与する酵素については遺伝子レベル及び酵素レベルで研究結果から、ＵＤＰ−ＧｌｃＡ（ウリジン５’−二リン酸−グルクロン酸）とＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ウリジン５’−二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン）の２つの糖ヌクレオチドを前駆体としてヒアルロン酸合成酵素によりヒアルロン酸が合成されることが明らかになっている。
【０００４】
一方、本発明においても使用されているヒアルロン酸分解酵素を用いたヒアルロン酸の合成例としては、ヒアルロン酸分解酵素が有する糖転移活性を応用してピリジルアミノ化−ヒアルロン酸六糖を受容体とし、供与体としての分子量８０万のヒアルロン酸を共存させた反応系からピリジルアミノ化−ヒアルロン酸オリゴマー混合物が微量生成することが報告されている（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０，３７４１（１９９５））。オリゴマー混合物中にはピリジルアミノ化−ヒアルロン酸八糖（分子量約０．１６万）から最高ピリジルアミノ化−ヒアルロン酸二二糖（分子量約０．４４万）までが微量ながらも検知されている。
【０００５】
しかしながら、従来のヒアルロン酸の製造である鶏冠抽出法あるいは発酵法に替わりうる酵素化学的合成手法の開発は幾多の試行の結果においても、これまで達成されていないという課題があった。
【０００６】
本発明者らは、実用レベルにおいても有用性の高いヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の新規な製造法の開発について鋭意研究を重ねた結果、予想外のことに、ヒアルロン酸分解酵素を用いた酵素化学的手法によるヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の新規な製造法を初めて見出した。
更に詳しくは、本発明者らは酵素化学的手法によるヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の製造研究において、本来ヒアルロン酸を分解する酵素として知られているヒアルロニダーゼを酵素重合触媒とし、ヒアロビウロネートオキサゾリン誘導体をモノマー基質とした場合に、モノマー基質が酵素的に重合されて高分子量のヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体が収率よく生成することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
【発明の開示】
即ち、本発明は、（１）下記一般式（Ｉ）で表されるオキサゾリン誘導体に、ウシ睾丸由来ヒアルロニダーゼ又は羊睾丸由来ヒアルロニダーゼからなるヒアルロン酸分解酵素を作用せしめることを特徴とするヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の製造法、
【０００８】
【化２】
0004036755.tif 000002
（上式中Ｒは水素、アルキル基、置換されたアルキル基、フェニル基、又は置換されたフェニル基を表す。）
（２）前記一般式（Ｉ）で表されるオキサゾリン誘導体が２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウム−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）］−α−Ｄ−グルコピラノ−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンであることを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の製造法。
（３）前記２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウム−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）］−α−Ｄ−グルコピラノ−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンにヒアルロン酸分解酵素を作用せしめるにあたり、ｐＨを５〜１０に調整することを特徴とする（１）又は（２）に記載のヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の製造法である。
【０００９】
【発明を実施するための最良の形態】
以下、さらに詳しく本発明を説明する。
本発明で使用する基質モノマーの一つであるヒアロビウロネートオキサゾリン誘導体（８）を例に挙げ、合成の手順を以下に記す。また、図１に合成スキームを示す。
すなわち、メチル（臭化２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）ウロネート（１）を糖供与体、ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−４，６−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド（２）を糖受容体として用い、ジクロロメタン中、トリフルオロメタンスルホン酸銀−１，１，３，３−テトラメチル尿素を活性化剤としてアルゴン雰囲気下−４０℃で反応を開始し、３０分後から徐々に室温に戻した後、２２時間室温で反応させることによりベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−４，６−Ｏ−イソプロピリデン−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−グルコピラノシド（３）を合成した。得られた３を脱水メタノール中、水素雰囲気下で１０％パラジウム炭素を触媒とする接触水素還元によりベンジル基並びにイソプロピリデン基の脱保護を行い、２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−グルコピラノース（４）を得た。続いて脱水ピリジン中、無水酢酸を作用させ、すべての水酸基をアセチル基にて保護することにより２−アセトアミド−４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−グルコピラノシルアセテート（５）を得た。続いて１，２−ジクロロエタン中、アルゴン雰囲気下、５０℃にて７時間、５にトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルを作用させ、その後氷冷下、トリエチルアミンを作用させることで２−メチル［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−｛メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート｝−α−Ｄ−グルコピラノ−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（６）を得た。得られた６を脱水メタノール中、ナトリウムメトキシドを作用させてすべてのアセチル基を脱保護し、反応溶液を減圧濃縮後、乾固させて２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（７）を得た。
【００１０】
これを炭酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ１０．６）中で３０分撹拌することでメチルエステルを脱保護し、目的とする基質モノマーである２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウムβ−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）］−α−Ｄ−グルコピラノ−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（８）を得る。
【００１１】
かくして得られたヒアロビウロネートオキサゾリン誘導体は重合触媒としてのヒアルロン酸分解酵素の基質モノマーとして好適に使用される。酵素反応時の基質モノマー濃度は実用面から０．１重量％以上、好ましくは１重量％以上で用いられる。
【００１２】
反応ｐＨは酵素の反応性と基質モノマーの安定性を考慮し、５〜１０望ましくは６．５〜９．５が好適に採用される。反応温度は５℃〜６０℃で、通常は２０℃〜４０℃が用いられる。
【００１３】
使用するヒアルロン酸分解酵素としては、エンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）に分類されるウシ睾丸由来又は羊睾丸由来ヒアルロニダーゼであり、該酵素は適当な担体に固定化した固定化酵素の形態で使用することも可能である。バッチ反応あるいは連続反応形式いずれも採用される。
【００１４】
反応は水溶媒あるいは水溶媒にメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール等のアルコール類、グリセリン、ポリエチレングリコール等のポリオール類、ジメルスルフォキシド、ジメチルフォルムアミド、酢酸エチル、ジオキサン、反応に悪影響を及ぼさない各種無機塩類又はｐＨ緩衝剤等を適宜添加した条件下でも進行する。
【００１５】
基質モノマーとしては、２−メチル−ヒアロビウロネートオキサゾリン誘導体（８）に限定されることはなく、ヒアルロニダーゼによる重合反応が進行するヒアロビウロネートオキサゾリン基本構造を有しておれば本発明に含まれる。
例えば、前記一般式（Ｉ）のＲで水素あるいはメチルのかわりにエチル、プロピル、ブチル等のアルキル基あるいはフェニル基、ハロゲン置換アルキル基、ハロゲン置換フェニル基等が使用可能である。
【００１６】
また、基質モノマーは、フリーの酸、ナトリウム，カリウム等の金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩等の形であれば特に限定されない。生成したヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体は基質モノマーのグルクロン酸の塩の形態に依存し、フリーな酸あるいはナトリウム，カリウム等の金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩などの形態が含まれる。
【００１７】
上記条件下でバッチ反応を開始した場合、条件によって一概に規定できないが、数時間〜数日で反応は完了する。反応終了後、反応液を遠心分離、限外濾過、精密濾過、各種吸着カラム、溶媒沈殿及びクロマト分離などの公知精製手段を組み合わせることで高純度のヒアルロン酸を単離精製することが出来る。かくして得られたヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体は化粧品、医薬品あるいは医用材料として幅広く利用できる。
【００１８】
以下に本発明の詳細な内容について実施例で説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−４，６−Ｏ−イソプロピリデン−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−グルコピラノシド（３）の合成
遮光二口ナスフラスコ中に、ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−４，６−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド（１．０６７ｇ，３．０４ｍｍｏｌ）をとり、ジクロロメタン（３０ｍｌ）を加え溶解させた。これにトリフルオロメタンスルホン酸銀（１．１６ｇ，４．５１ｍｍｏｌ）と粉末ＭＳ４Ａを加えた。その溶液をアルゴン雰囲気下、撹拌しながら−４０℃に冷却し、続いてメチル（臭化２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−グルコピラノシド）ウロネート（１．７０ｇ，４．２８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解させた溶液及び１，１，３，３−テトラメチル尿素（０．５ｍｌ，４．１７ｍｍｏｌ）を滴下した。その後３０分間−４０℃で撹拌し、続いて徐々に室温に戻した後２２時間撹拌した。ＴＬＣによる反応終了の確認後、反応溶液をセライト（Ｎｏ．５４５）濾過することにより不溶物を除去し、濾液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１回）、冷却飽和食塩水（３回）で分液洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで一晩乾燥した。この後、硫酸マグネシウムをガラスフィルターで除去し、この濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出混合溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝１：２，１：１，２：１）にて精製させ、展開後の溶媒を減圧乾燥した。これをさらにＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＬＨ−２０サイズ排除カラムクロマトグラフィー（溶離液：メタノール）にて単離精製し、展開後の溶媒を減圧乾燥することで、ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−４，６−Ｏ−イソプロピリデン−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−グルコピラノシド（５８３ｍｇ，０．８７３ｍｍｏｌ，２９％）を得た。
【００１９】
ＮＭＲのスペクトラムの帰属は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）：７．３４−７．２６（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），５．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ２，Ｎ−Ｈ＝７．１５Ｈｚ，ＮＨ），５．２４−５．１５（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−１，Ｈ−４’），４．９５（１Ｈ，ｔ，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝８．０９Ｈｚ，Ｈ−２’），４．８６−４．８３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１’，ＣＨ２Ｐｈ），４．５５−４．４９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｐｈ，Ｈ−３），３．９６−３．９２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−６），３．８１−３．７１（５Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−４，ＣＨ３Ｏ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ），３．３８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），３．０４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２），２．０９−２．００（１２Ｈ，ｍ，Ａｃ），１．５８（３Ｈ，ｓ，（ＣＨ３）２Ｃ），１．４１（３Ｈ，ｓ，（ＣＨ３）２Ｃ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）：１７０．３５−１６９．４８（ＣＨ３ＣＯ），１６７．２９（Ｃ−６’），１３６．６１−１２８．０６（ａｒｏｍａｔｉｃ），９９．６４（Ｃ−１’），９９．４２（（ＣＨ３）２Ｃ），９８．５９（Ｃ−１），７７．００（Ｃ−３），７３．８７（Ｃ−４），７２．６６（Ｃ−５’），７２．３４（Ｃ−３’），７１．７１，７１．６５（Ｃ−２’，ＣＨ２Ｐｈ），６９．４７（Ｃ−４’），６６．５１（Ｃ−５），６２．０８（Ｃ−６），５８．３９（Ｃ−２），５２．８５（ＣＨ３Ｏ），２９．０８（（ＣＨ３）２Ｃ），２３．５９（ＮＨＣＯＣＨ３），２０．７５−２０．４９（ＯＣＯＣＨ３），１８．５１（（ＣＨ３）２Ｃ）
【００２０】
実施例２
２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−グルコピラノース（４）の合成
ナスフラスコ中で、ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−４，６−Ｏ−イソプロピリデン−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−グルコピラノシド（４８８ｍｇ，０．７３１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン−メタノール（１：１，ｖ／ｖ）混合溶媒（１８０ｍｌ）に溶解させ、これに１０％パラジウム炭素（１９０ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で７２時間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認後、セライト濾過でパラジウム炭素を除去し、濾液を減圧濃縮した。これをジイソプロピルエーテルにより再沈殿し減圧乾燥することで２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−グルコピラノース（３８３ｍｇ，０．７１３ｍｍｏｌ，９８％）を得た。
【００２１】
ＮＭＲのスペクトラムの帰属は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ（ｐｐｍ）：５．２９（１Ｈ，ｔ，Ｊ２’，３’＝Ｊ３’，４’＝９．３２Ｈｚ，Ｈ−３’），５．１０（１Ｈ，ｔ，Ｊ３’，４’＝Ｊ４’，５’＝９．７１Ｈｚ，Ｈ−４’），４．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝３．４９Ｈｚ，Ｈ−１α），４．９５（１Ｈ，ｔ，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝８．６８Ｈｚ，Ｈ−２’），４．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ１’，２’＝７．９８Ｈｚ，Ｈ−１’），４．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ４’，５’＝９．９６Ｈｚ，Ｈ−５’），３．９８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２α），３．８４−３．７７（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３α，Ｈ−６α，Ｈ−５α），３．７２（３Ｈ，ｓ，ＣＨ２Ｏ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ），３．７１−３．６８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６α），３．４５（１Ｈ，ｔ，Ｊ３’，４’＝Ｊ４’，５’＝９．１８Ｈｚ，Ｈ−４α），２．０４−１．９５（１２Ｈ，ｍ，Ａｃ）
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ（ｐｐｍ）：１７５−１７１（ＣＨ３ＣＯ），１６８．８３（Ｃ−６’）１０１．０１（Ｃ−１’），９２．３４（Ｃ−１α），８１．９４（Ｃ−３α），７３．０７（Ｃ−３’），７２．４２，７２．２５，７２．００（Ｃ−５α，Ｃ−２’，Ｃ−５’），７０．４２（Ｃ−４’），６９．９８（Ｃ−４α），６２．５９（Ｃ−６α），５３．７３，５３．６３（Ｃ−２α，ＣＨ３Ｏ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ），２３．１４（ＮＨＣＯＣＨ３），２０．８６−２０．７６（ＯＣＯＣＨ３）
【００２２】
実施例３
２−アセトアミド−４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−グルコピラノシルアセテート（５）の合成
二口ナスフラスコ中で２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−グルコピラノース（４４７ｍｇ，０．８３２ｍｍｏｌ）を４−ジメチルアミノピリジン（１３．６ｍｇ，０．１１１ｍｍｏｌ）を溶解させたピリジン（１０ｍｌ）に溶解させ、乾燥雰囲気下、無水酢酸（５ｍｌ，５３．０ｍｍｏｌ）を滴下し、０℃で６時間撹拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、反応溶液を減圧濃縮し、残渣をクロロホルムで希釈し、０．１Ｍ塩酸（１回）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１回）、飽和食塩水（３回）で分液洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで一晩乾燥した。続いて硫酸マグネシウムをガラスフィルターで濾去し、濾液を減圧濃縮し、これを酢酸エチルに溶解させ、ジイソプロピルエーテルにより再沈殿し減圧乾燥することで４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−グルコピラノシルアセテート（５４３ｍｇ，０．８１８ｍｍｏｌ，９８％）を得た。
【００２３】
ＮＭＲのスペクトラムの帰属は、以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）：６．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝３．６３Ｈｚ，Ｈ−１α），５．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ２，Ｎ−Ｈ＝９．７４Ｈｚ，ＮＨ），５．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ２’，３’＝Ｊ３’，４’＝９．３４Ｈｚ，Ｈ−３’），５．１６−５．０６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−４α），４．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝８．５２Ｈｚ，Ｈ−２’），４．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ１’２’＝７．７９Ｈｚ，Ｈ−１’），４．５５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２α），４．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−６α），４．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−６α），４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ４’，５’＝１０．００Ｈｚ，Ｈ−５’），３．９７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５α），３．９４（１Ｈ，ｔ，Ｊ２，３＝Ｊ３，４＝９．８１Ｈｚ，Ｈ−３α），３．７５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３Ｏ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ），２．２０−２．０１（２１Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＯ  ｏｆ  ａｃｅｔａｔｅ  ａｎｄ  ａｃｅｔａｍｉｄｅ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）：１７０．８２−１６８．６７（ＣＨ３ＣＯ），１６７．００（Ｃ−６’），１００．３９（Ｃ−１’），９１．３４（Ｃ−１α），７６．４２（Ｃ−３α），７２．６０（Ｃ−５’），７１．８４（Ｃ−３’），７１．５７（Ｃ−２’），６９．８７（Ｃ−５α），６９．５４（Ｃ−４’），６７．６３（Ｃ−４α），６１．６９（Ｃ−６α），５２．８８（ＣＨ３Ｏ），５１．１２（Ｃ−２α），２３．４２（ＮＨＣＯＣＨ３），２１．０４−２０．４８（ＯＣＯＣＨ３）
【００２４】
実施例４
２−メチル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（６）の合成
二口ナスフラスコ中で、アルゴン雰囲気下、２−アセトアミド−４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−Ｄ−グルコピラノシルアセテート（３４３ｍｇ，０．５１７ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン（１２０ｍｌ）に溶解させ、１，２−ジクロロエタン（０．５ｍｌ）で希釈したトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０．１４ｍｌ，０．８４３ｍｍｏｌ）を滴下し、５０℃で７時間反応させた。ＴＬＣで反応終了を確認した後、氷冷下でトリエチルアミン（０．１２ｍｌ，０．８８９ｍｍｏｌ）を滴下し、その後室温で３０分間撹拌することで反応を停止させた。続いて反応溶液を減圧濃縮し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出混合溶媒：クロロホルム／メタノール＝２０：１，１５：１，１０：１）にて精製させ、展開後の溶媒を減圧濃縮させ、得られた無色油状物を減圧乾固させた。これをさらにＳｅｐｈａｄｅｘ
ＬＨ−２０サイズ排除カラムクロマトグラフィー（溶離液：メタノール）に供し、展開後の溶媒をエバポレートにより濃縮し減圧乾燥することで、無色アモルファス状の２−メチル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（３１１ｍｇ，０．５１５ｍｍｏｌ）を定量的に得た。
【００２５】
分析データは、以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）：５．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝６．６９Ｈｚ，Ｈ−１），５．３０−５．１９（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−４’，Ｈ−４），５．００（１Ｈ，ｔ，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝８．３１Ｈｚ，Ｈ−２’），４．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ１’，２’＝７．２４Ｈｚ，Ｈ−１’），４．１８−４．１５（３Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−６，Ｈ−５’），４．１３（１Ｈ，ｓ，Ｈ−３），４．０６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２），３．７５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３Ｏ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ），３．６１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），２．１２−２．０２（１８Ｈ，ｍ，Ａｃ  ａｎｄ  ＣＨ３Ｃ  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）：１７０．８１−１６９．１８（ＯＣＯＣＨ３），１６７．０８−１６６．５９（ＣＨ３Ｃ  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ，Ｃ−６’），１００．７７（Ｃ−１’），９９．７０（Ｃ−１），７８．３７（Ｃ−３），７２．２８（Ｃ−５’），７２．１７（Ｃ−３’），７１．１４（Ｃ−２’），６９．１１（Ｃ−４’），６７．７５（Ｃ−４），４７．４１（Ｃ−５），６５．５２（Ｃ−２），６３．５６（Ｃ−６），５２．８１（ＣＨ３Ｏ），２０．９３−２０．５０（ＯＣＯＣＨ３），１４．０５（ＣＨ３Ｃ  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｓｉｏｎ  ＦＡＢ  Ｍａｓｓ
計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝６０４．１８７８ｍ／ｚ（Ｃ２５Ｈ３４ＮＯ１６）
測定値：６０４．１８５１ｍ／ｚ（−４．５ｐｐｍ）
【００２６】
実施例５
２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウムβ−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）］−α−Ｄ−グルコピラノ−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（８）の合成
二口ナスフラスコ中で、アルゴン雰囲気下、２−メチル［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（メチル２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（７２．４ｍｇ，０．１２０ｍｍｏｌ）をメタノール（５．０ｍｌ）に溶解させ、０．１Ｍナトリウムメトキシド−メタノール溶液（０．３ｍｌ，０．０３００ｍｍｏｌ）を氷冷下、ゆっくりと滴下し、続いて室温で３０分間撹拌した。ＴＬＣで反応終了を確認した後、反応溶液をエバポレートにより濃縮し、減圧乾固させた。これを５０ｍＭ炭酸緩衝溶液（１．０８０ｍｌ，ｐＨ１０．６）に溶解させ、室温で３０分間撹拌することで、２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウムβ−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンを得た。
【００２７】
分析データは、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，５０ｍＭ炭酸緩衝重水溶液（ｐＨ１０．６）：δ（ｐｐｍ）：６．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝７．１４Ｈｚ，Ｈ−１），４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ１’，２’＝７．３６Ｈｚ，Ｈ−１’），５．３０−５．１９（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−４’，Ｈ−４），５．００（１Ｈ，ｔ，Ｊ１’，２’＝Ｊ２’，３’＝８．３１Ｈｚ，Ｈ−２’），４．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ１’，２’＝７．３６Ｈｚ，Ｈ−１’），４．２６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２），４．１０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−３），３．８２−３．７１（３Ｈ，ｍ，Ｈ−４，Ｈ−６，Ｈ−５’），３．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ５，６＝６．３１Ｈｚ，Ｊ６，６＝１２．２９Ｈｚ，Ｈ−６），３．４９−３．４７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−４’），３．３３−３．２６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−２’），２．０２（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３Ｃ  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ）
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，５０ｍＭ炭酸緩衝重水溶液（ｐＨ１０．６）：δ（ｐｐｍ）：１７５．９７（Ｃ−６’），１６８．５２（ＣＨ３Ｃ  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ），１０１．８４（Ｃ−１’），１００．３９（Ｃ−１），７９．１９（Ｃ−３），７５．９９（Ｃ−５’），７５．４７（Ｃ−３’），７２．８６（Ｃ−２’），７２．３３（Ｃ−５），７１．８５（Ｃ−４’），６７．７９（Ｃ−４），６４．１４（Ｃ−２），６１．６１（Ｃ−６），１３．１５（ＣＨ３Ｃ  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｓｉｏｎ  ＦＡＢ  Ｍａｓｓ
計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４０２．１０１２ｍ／ｚ（Ｃ２５Ｈ３４ＮＯ１６）
測定値：４０２．１０１４ｍ／ｚ（＋０．５ｐｐｍ）
【００２８】
実施例６
酵素触媒重合によるヒアルロン酸の合成
重水炭酸緩衝溶液（１．０８０ｍｌ）に基質モノマーである実施例５で得た２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウムβ−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（４８．２ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）が溶解している溶液をＤＣｌ重水溶液（１．０ｍｏｌ／ｌ、０．５ｍｏｌ／ｌ、０．１ｍｏｌ／ｌ）によりｐＨを７．１に調整した。この溶液を３６０μｌづつＮＭＲサンプル管に移し（Ｅｎｔｒｙ１〜３）、３０℃における経時変化を１Ｈ  ＮＭＲにより測定した。Ｅｎｔｒｙ１には重水（４０μｌ）、Ｅｎｔｒｙ２にはＢｏｖｉｎｅ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（１．６ｍｇ）（ＳＩＧＭＡ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．７７Ｈ７０６５，３３０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を重水（４０μｌ）に溶解させた溶液、Ｅｎｔｒｙ３にはＯｖｉｎｅ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（１．６ｍｇ）（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｌｏｔ  Ｎｏ．９３０３Ｂ，５６０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を重水（４０μｌ）に溶解させた溶液を加え、よく撹拌した後、再び３０℃における経時変化を１Ｈ  ＮＭＲにより測定した。基質モノマー濃度の経時変化はアセトアミド基のメチルプロトンを内部標準とし、その積分値とオキサゾリンモノマーの還元末端１位プロトンの積分値の比を求めることにより算出した。
その結果を以下の表１及び図２に示す。
【００２９】
【表１】
0004036755.tif 000003
【００３０】
上記表１及び図２に示す結果からＢｏｖｉｎｅ及びＯｖｉｎｅ  Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅを添加した系では添加していない系と比較して有意にモノマー消費が促進されていることが明らかとなり、ヒアルロビウロネートオキサゾリン誘導体が両酵素により認識され、オキサゾリン環の開環反応が起こっていることが明らかとなった。
【００３１】
Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅを添加した系（Ｅｎｔｒｙ２、３）で、モノマー消費が完結したことを確認した後、重合溶液を９０℃の湯浴に３分間浸し、酵素を失活させることで反応を停止した。この溶液にＴＨＦ（５．０ｍｌ）を加え、析出した沈殿物を遠心分離により分離させ、これを減圧乾燥させることで生成物を得た。得られた生成物は蒸留水に溶解させ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ−１０）にて精製し、展開後の溶媒を凍結乾燥することで生成物を得た。得られた生成物は１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ、ＧＰＣ測定により分析を行った。図３に１Ｈ  ＮＭＲスペクトル、図４に１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル、表２にＧＰＣ測定による結果を示す。なお、ＮＭＲ管はＳＨＩＧＥＭＩ社製水溶液用対称形ミクロ試験管ＢＭＳ−００５Ｂを用いた。１Ｈ  ＮＭＲ測定はサンプル約５．０ｍｇを重水（２００μｌ）に溶解させ、２５℃にて測定を行なった。１３Ｃ  ＮＭＲ測定は生成物約５．０ｍｇ、重水（１００μｌ）の濃度で４０℃にて測定を行なった。内部標準物質にはアセトン（２μｌ）を用い、１Ｈ  ＮＭＲでは２．２２５ｐｐｍ、１３Ｃ  ＮＭＲでは３１．０７ｐｐｍに補正した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，Ａｃｅｔｏｎｅ）：δ（ｐｐｍ）：４．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝７．４８Ｈｚ，Ｈ−１），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ１’，２’＝６．９６Ｈｚ，Ｈ−１’），３．９２−３．７０（６Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−２，Ｈ−６，Ｈ−４’，Ｈ−３，Ｈ−５’），３．５８−３．５０（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−４，Ｈ−５），３．３４（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２’），２．０２（３Ｈ，ｓ，ＮＨＣＯＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，Ａｃｅｔｏｎｅ）：δ（ｐｐｍ）：１７５．７０（Ｃ−６’），１７４．５３（ＮＨＣＯＣＨ３），１０３．８９（Ｃ−１’），１０１．３４（Ｃ−１），８３．４３（Ｃ−３），８０．７９（Ｃ−４’），７６．９８（Ｃ−５’），７６．２５（Ｃ−５），７４．４６（Ｃ−３’），７３．３１（Ｃ−２’），６９．３３（Ｃ−４），６１．４３（Ｃ−６），５５．１１（Ｃ−２），２３．３１（ＮＨＣＯＣＨ３）
ＧＰＣ測定の標準物質はヒアルロン酸ナトリウム塩（Ｍｎ＝８００、２０００、４０００、Ｍｖ＝５００００＊、１０００００＊）を用いた。測定条件は以下に示す。
｛液体クロマトグラフ条件｝
検出器：示差検出計
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｏｈｐａｋ  ＳＢ−８０３ＨＱ
ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｏｈｐａｋ  ＳＢ−Ｇ
カラム温度：４０℃
移動相：０．１Ｍ硝酸ナトリウム
流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：２０μｌ
＊Ｍｖ＝５００００、１０００００のヒアルロン酸ナトリウム塩についてはＧＰＣ測定によりそのＭｎを算出した。
【００３２】
【表２】
0004036755.tif 000004
【００３３】
実施例７
酵素触媒重合挙動の追跡
炭酸緩衝溶液（２．０ｍｌ）に基質モノマーである実施例５で得た２−メチル−［１，２−ジデオキシ−３−Ｏ−（ソディウムβ−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（８４．４ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）が溶解している溶液をＨＣｌ水溶液（１．０ｍｏｌ／ｌ、０．５ｍｏｌ／ｌ、０．１ｍｏｌ／ｌ）によりｐＨを７．１（Ｅｎｔｒｙ１，２）、８．０（Ｅｎｔｒｙ３，４）、９．０（Ｅｎｔｒｙ５，６）に調整し、それぞれ６３０μｌづつエッペンドルフチューブに移した。これをさらに２１０μｌづつエッペンドルフチューブに移し、それぞれＢｏｖｉｎｅ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（０．９ｍｇ）を蒸留水（１０μｌ）に溶解させた溶液（Ｅｎｔｒｙ１，３，５）、Ｏｖｉｎｅ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（０．９ｍｇ）を重水（１０μｌ）に溶解させた溶液（Ｅｎｔｒｙ２，４，６）を加え、３０℃で反応を開始した。各Ｅｎｔｒｙとも反応開始より０、３、６、９、１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０時間後に反応溶液２０μｌを採取し、これを蒸留水４０μｌで希釈した溶液をＧＰＣ分析に供した。
その結果を表３と表４及び図５に示す。
【００３４】
【表３】
0004036755.tif 000005
【００３５】
【表４】
0004036755.tif 000006
【００３６】
実施例８
ベンジル２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成
遮光二口フラスコ中で、メチル（２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミデート）ウロネート（５０２ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）とベンジル２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２００ｍｇ，０．５２２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３．００ｍｌ）に溶解させ、活性化したモレキュラーシーブス４Ａ（ＭＳ４Ａ；３６０ｍｇ）を加えた後、アルゴン雰囲気下−２０℃でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ；１８８μｌ，０．９３９ｍｍｏｌ）を徐々に加え、４０分撹拌した。反応終了後、−２０℃でトリエチルアミン（０．２００ｍｌ，１．４８ｍｍｏｌ）を加えた後、セライト濾過により不溶物を除去した。続いて濾液をクロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順に洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、続いてセライト濾過により不溶物を除去した。ろ液を減圧濃縮し、得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル５／１−３／１）、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０サイズ排除クロマトグラフィーにて精製し、白色粉末状のベンジル２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−グルコピラノシド（１１７ｍｇ，０．１６７ｍｍｏｌ，３２％）を得た。
【００３７】
分析データは、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）；７．４３−７．３１（１０Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），５．５２（１Ｈ，ｓ，ＣＨＰｈ），５．２１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，Ｈ−３’），５．１６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，Ｈ−４’），５．０４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，Ｈ−２’），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５５Ｈｚ，ＣＨ２Ｐｈ），４．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，Ｈ−１’），４．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０５Ｈｚ，ＣＨ２Ｐｈ），４．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，Ｈ−１），４．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０２，１０．５４Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．８４−３．７７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６ｂ，Ｈ−５’），３．７２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．０４Ｈｚ，Ｈ−４），３．６２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，Ｈ−３），３．５８（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），３．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０３，９．５３Ｈｚ，Ｈ−２），３．３６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５．０２，９．５４Ｈｚ，Ｈ−５），２．０６（３Ｈ，ｓ，Ａｃ），２．００（３Ｈ，ｓ，Ａｃ），１．９８（３Ｈ，ｓ，Ａｃ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ
計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝６９９．６７ｍ／ｚ（Ｃ３３Ｈ３７Ｎ３Ｏ１４）
測定値：７００ｍ／ｚ
【００３８】
実施例９
ベンジル２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成
ナスフラスコ中で、ベンジル２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−グルコピラノシド（１９９ｍｇ，０．２８５ｍｍｏｌ）を９０％酢酸水溶液（５．００ｍｌ）に溶解させ、７０℃で３時間反応させることによりベンジリデン基を脱保護した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、セライト濾過により不溶物を除去した。濾液を減圧濃縮した後、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル１／１−１／４）にて精製し、白色粉末状のベンジル２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−グルコピラノシド（１０７ｍｇ，０．１７５ｍｍｏｌ，６１％）を得た。
【００３９】
分析データは、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）；７．３８−７．２７（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ），５．３０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５３Ｈｚ，Ｈ−３’），５．２０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５４Ｈｚ，Ｈ−４’），５．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０３，９．５３Ｈｚ，Ｈ−２’），４．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０５Ｈｚ，ＣＨ２Ｐｈ），４．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０５Ｈｚ，ＣＨ２Ｐｈ），４．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，Ｈ−１’），４．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，Ｈ−１），４．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０４Ｈｚ，Ｈ−５’），３．９７−３．９１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ），３．９０（１Ｈ，ｓ，４−ＯＨ），３．８１−３．７４（４Ｈ，ｍ，Ｈ−６ｂ，ＣＯＯＣＨ３），３．５６（１Ｈ，ｂｔ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，Ｈ−４），３．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０３，９．５４Ｈｚ，Ｈ−２），３．３０−３．２７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），３．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，Ｈ−３），２．０９（３Ｈ，ｓ，Ａｃ），２．０４（３Ｈ，ｓ，Ａｃ），２．０３（３Ｈ，ｓ，Ａｃ），１．９８（１Ｈ，ｂｔ，Ｊ＝６．７８Ｈｚ，６−ＯＨ）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ
計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝６１１．５６ｍ／ｚ（Ｃ２６Ｈ３３Ｎ３Ｏ１４）
測定値：６１２ｍ／ｚ
【００４０】
実施例１０
４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−２−プロパンアミド−Ｄ−グルコピラノシルアセテートの合成
二口ナスフラスコ中で、ベンジル２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−グルコピラノシド（１０１ｍｇ，０．１６５ｍｍｏｌ）をメタノール（６．００ｍｌ）に溶解させ、２０％水酸化パラジウム活性炭（１００ｍｇ）を加えて水素雰囲気下、２７時間接触水素還元することによりベンジル基の脱保護及びアジド基のアミノ基への変換を行った。反応終了後、セライト濾過により不溶物を除去し、セライトベッドをメタノール（１２．０ｍｌ）で洗浄した。濾液にトリエチルアミン（０．１００ｍｌ，０．７４１ｍｍｏｌ）を加え、乾燥雰囲気下、０℃で塩化プロピオニル（２２．０μｌ，０．２５２ｍｍｏｌ）を加え３時間反応させた。反応終了後、ピリジン（４．００ｍｌ）を加え減圧濃縮することでメタノールを除去し、続いて無水酢酸（３．００ｍｌ，３１．５ｍｍｏｌ）を加え０℃で１時間、続いて室温で８時間撹拌した。反応終了後、反応溶液に氷水を加え過剰量の無水酢酸を分解し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出し、１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順に分液洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、セライト濾過により不溶物を除去後、濾液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル１／１−０／１）にて精製し無色油状物の４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−２−プロパンアミド−Ｄ−グルコピラノシルアセテート（５４．０ｍｇ，０．０７９０ｍｍｏｌ，４８％，α／β＝７３／２７）を得た。
【００４１】
分析データは、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ  ｆｏｒ  α  ｆｏｒｍ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）；６．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０２Ｈｚ，Ｈ−１），５．２５−５．０２（４Ｈ，ｍ，ＮＨ，Ｈ−４，Ｈ−３’，Ｈ−４’），４．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５３，９．５４Ｈｚ，Ｈ−２’），４．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，Ｈ−１’），４．５７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝４．０２，１０．０４，１０．２９Ｈｚ，Ｈ−２），４．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．０２，１２．５５Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．０７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６ｂ），４．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０４Ｈｚ，Ｈ−５’），３．９８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），３．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０４Ｈｚ，Ｈ−３），３．７５（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），２．２２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ３），２．２０−２．００（１８Ｈ，ｍ，Ａｃ），１．２６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ３）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ
計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝６７７．６１ｍ／ｚ（Ｃ２８Ｈ３９ＮＯ１８）
測定値：６７８ｍ／ｚ
【００４２】
実施例１１
２−エチル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンの合成
二口フラスコを用いアルゴン雰囲気下、１，２−ジクロロエタン（３．００ｍｌ）中、４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−２−プロパンアミド−Ｄ−グルコピラノシルアセテート（５４．０ｍｇ，０．０７９０ｍｍｏｌ）に５０℃でＴＭＳＯＴｆ（２０．０μｌ，０．１２０ｍｍｏｌ）を作用させた。４．５時間後、反応終了を確認し、０℃に冷却してトリエチルアミン（４０．０μｌ，０．３００ｍｍｏｌ）を加えた。続いて反応溶液を減圧濃縮し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／メタノール４０／１）、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０サイズ排除クロマトグラフィーにて精製し、無色油状物の２−エチル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート］−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（２７．０ｍｇ，０．０４４０ｍｍｏｌ，５５％）を得た。
【００４３】
ＮＭＲのスペクトラムの帰属は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）；５．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５２Ｈｚ，Ｈ−１），５．３０−５．１８（３Ｈ，ｍ，Ｈ−４，Ｈ−３’，Ｈ−４’），５．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，Ｈ−２’），４．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０４Ｈｚ，Ｈ−１’），４．１８−４．１０（４Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ，Ｈ−５’），４．０８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２），３．７５（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），３．６０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），２．３９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ３），２．１１−２．０１（１８Ｈ，ｍ，Ａｃ），１．２３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ３）
【００４４】
実施例１２
２−エチル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソディウムβ−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンの合成
二口フラスコ中で、アルゴン雰囲気下、２−エチル−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（５４．０ｍｇ，０．０７９０ｍｍｏｌ）をメタノール（２．００ｍｌ）に溶解させ、室温でナトリウムメトキシドのメタノール溶液（１０８μｌ，０．０１０８ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌することによりアセチル基を脱保護した。この溶液を減圧濃縮し、続いて５０ｍＭ炭酸緩衝溶液（１５０μｌ，ｐＨ１０．６）に溶解させ３０分撹拌することによりメチルエステルを加水分解した。この溶液を減圧濃縮することにより無色油状物の２−エチル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソディウムβ−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンを得た。
【００４５】
ＮＭＲのスペクトラムの帰属は、以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ（ｐｐｍ）；６．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，Ｈ−１），４．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，Ｈ−１’），４．４０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２），４．２４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），３．９６−３．８３（３Ｈ，ｍ，Ｈ−４，Ｈ−６ａ，Ｈ−５’），３．７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０２，１２．０５Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．７０−３．６０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−４’），３．５０−３．４０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−２’），２．５０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ３），１．２６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ３）
実施例１３
４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−２−（２−メチルプロパンアミド）−Ｄ−グルコピラノシルアセテートの合成
二口ナスフラスコ中で、ベンジル２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−β−Ｄ−グルコピラノシド（１０７ｍｇ，０．１７５ｍｍｏｌ）をメタノール（６．００ｍｌ）に溶解させ、２０％水酸化パラジウム活性炭（１００ｍｇ）を加えて水素雰囲気下、２４時間接触水素還元することによりベンジル基の脱保護及びアジド基のアミノ基への変換を行った。反応終了後、不溶物をセライト濾過により除去し、セライトベッドをメタノール（１２．０ｍｌ）で洗浄した。濾液にトリエチルアミン（０．１００ｍｌ，０．７４１ｍｍｏｌ）を加え、乾燥雰囲気下、０℃で塩化イソブチリル（２８．０μｌ，０．２６５ｍｍｏｌ）を加え、０℃で３時間撹拌した。反応終了後、ピリジン（４．００ｍｌ）を加え減圧濃縮することによりメタノールを除去し、無水酢酸（３．００ｍｌ，３１．５ｍｍｏｌ）を加え０℃で１時間、続いて室温で９時間反応させた。反応終了後、氷水を加えて過剰量の無水酢酸を分解させ、続いて減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出し、１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順に分液洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、セライト濾過により不溶物を除去後、濾液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１／１−０／１）にて精製し、無色油状物の４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−２−（２−メチルプロパンアミド）−Ｄ−グルコピラノシルアセテート（５３．０ｍｇ，０．０７７０ｍｍｏｌ，４４％，α／β＝８８／１２）を得た。
【００４６】
分析データは、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ  ｆｏｒ  α  ｆｏｒｍ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）；６．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５２Ｈｚ，Ｈ−１），５．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５３Ｈｚ，ＮＨ），５．２１−５．１０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，４’），５．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５４，１０．０４Ｈｚ，Ｈ−４），４．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５３，９．０３Ｈｚ，Ｈ−２’），４．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，Ｈ−１’），４．５２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．５２，９．５３，１０．０４Ｈｚ，Ｈ−２），４．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．５２，１２．５５Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０１，１２．５５Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０４Ｈｚ，Ｈ−５’），３．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０４，１０．０４Ｈｚ，Ｈ−３），３．７６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），３．７５（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），２．３８（Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝６．５３，７．０３Ｈｚ，−ＣＨ（ＣＨ３）２），２．２０−２．００（１８Ｈ，ｍ，Ａｃ），１．１９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，−ＣＨ（ＣＨ３）２），１．１５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ，−ＣＨ（ＣＨ３）２）
Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＡＢ  ＭＳ
計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝６９１．６４ｍ／ｚ（Ｃ２９Ｈ４１ＮＯ１８）
測定値：６９２ｍ／ｚ
【００４７】
実施例１４
２−（２−メチルエチル）−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−オキサゾリンの合成
二口フラスコを用いアルゴン雰囲気下、１，２−ジクロロエタン（３．００ｍｌ）中、４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−２−（２−メチルプロパンアミド）−Ｄ−グルコピラノシルアセテート（５１．２ｍｇ，０．０７４０ｍｍｏｌ）に、１，２−ジクロロエタン（３．００ｍｌ）中、５０℃でＴＭＳＯＴｆ（２３．０μｌ，０．１２５ｍｍｏｌ）を作用させた。３時間後、反応終了を確認し、０℃に冷却してトリエチルアミン（４０．０μｌ，０．２９６ｍｍｏｌ）を加えた。続いて反応溶液を減圧濃縮し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／メタノール４０／１）、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ
ＬＨ−２０サイズ排除クロマトグラフィーにて精製し、無色油状物の２−（２−メチルエチル）−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−オキサゾリン（２６．４ｍｇ，０．０４１７ｍｍｏｌ，５６％）を得た。
【００４８】
ＮＭＲのスペクトラムの帰属は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ（ｐｐｍ）；５．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，Ｈ−１），５．３０−５．１８（３Ｈ，ｍ，Ｈ−４，Ｈ−３’，Ｈ−４’），５．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０３，９．０３Ｈｚ，Ｈ−２’），４．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，Ｈ−１’），４．２０−４．０８（５Ｈ，ｍ，Ｈ−２，３，６，５’），３．７５（３Ｈ，ｓ，ＣＯＯＣＨ３），３．５９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），２．６６（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝６．５３，７．０３Ｈｚ，−ＣＨ（ＣＨ３）２），２．１０（３Ｈ，ｓ，Ａｃ），２．０７（３Ｈ，ｓ，Ａｃ），２．０４（３Ｈ，ｓ，Ａｃ），２．０３（３Ｈ，ｓ，Ａｃ），２．０２（３Ｈ，ｓ，Ａｃ），１．２４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ，−ＣＨ（ＣＨ３）２），１．２３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，−ＣＨ（ＣＨ３）２）
実施例１５
２−（２−メチルエチル）−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソディウムβ−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−オキサゾリンの合成
二口フラスコ中で、アルゴン雰囲気下、２−（２−メチルエチル）−［４，６−ジ−Ｏ−アセチル−１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−オキサゾリン（２６．４ｍｇ，０．０４１７ｍｍｏｌ）をメタノール（２．００ｍｌ）に溶解させ、室温でナトリウムメトキシドのメタノール溶液（１０４μｌ，０．０１０４ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌することによりアセチル基を脱保護した。この溶液を減圧濃縮し、続いて５０ｍＭ炭酸緩衝溶液（３００μｌ，ｐＨ１０．６）に溶解させ１時間撹拌することによりメチルエステルを加水分解した。この溶液を減圧濃縮することにより無色油状物の２−（２−メチルエチル）−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソディウムβ−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−オキサゾリンを得た。
【００４９】
ＮＭＲのスペクトラムの帰属は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ（ｐｐｍ）；６．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，Ｈ−１），４．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，Ｈ−１’），４．４０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２），４．２４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），３．９６−３．８３（３Ｈ，ｍ，Ｈ−４，６，５’），３．７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０２，１２．０５Ｈｚ，Ｈ−６），３．７０−３．６０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，４’），３．５０−３．４０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５，２’），２．５０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ３），１．２６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ３）
【００５０】
実施例１６
酵素触媒重合によるヒアルロン酸誘導体の合成
重水炭酸緩衝溶液（３００μｌ）に基質モノマーである実施例１２で得た２−エチル−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソディウムβ−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（基質モノマーＡとする，１８ｍｇ，０．０４４ｍｍｏｌ）が溶解している溶液をＤＣｌ重水溶液（１．０Ｍ，０．５Ｍ，０．１Ｍ）によりｐＨを７．１に調整した。この溶液を１６０μｌずつＮＭＲサンプル管に移した。（Ｅｎｔｒｙ１，２）Ｅｎｔｒｙ１には重水（５０．０μｌ）、Ｅｎｔｒｙ２にはＯｖｉｎｅ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（０．９ｍｇ）（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｌｏｔ  Ｎｏ．９３０３Ｂ，５６０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を重水（５０．０μｌ）に溶解させた溶液を加え、よく撹拌した後、３０℃における経時変化を１Ｈ  ＮＭＲにより測定した。基質モノマー濃度の経時変化はオキサゾリンの２位エチル基のメチルプロトンを内部標準とし、その積分値とオキサゾリンモノマーの還元末端１位プロトンの積分値の比を求めることにより算出した。その結果を表５及び図６に示す。
別の基質モノマーである実施例１５で得た２−（２−メチルエチル）−［１，２−ジ−デオキシ−３−Ｏ−（ソディウムβ−Ｄ−グルコピラノシルウロネート）−α−Ｄ−グルコピラノ］−［２，１−ｄ］−オキサゾリン（基質モノマーＢとする，１８ｍｇ，０．０４２ｍｍｏｌ）を用いて同様の実験を行った。その結果を表６に示す。
【００５１】
【表５】
0004036755.tif 000007
【００５２】
【表６】
0004036755.tif 000008
【００５３】
上記表５，図６及び表６に示す結果から、Ｏｖｉｎｅ  Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅを添加した系では添加していない系と比較して有意に基質モノマーＡ及びＢの消費が促進されていることが明らかとなり、基質モノマーＡ及びＢが両酵素により認識され、オキサゾリン環の開環反応が起こっていることが明らかとなった。
【００５４】
Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅを添加した系（Ｅｎｔｒｙ２）で、モノマー消費が完結したことを確認した後、重合溶液を９０℃の湯浴に３分間浸し、酵素を失活させることで反応を停止した。この溶液をＧＰＣ分析に供し、ピーク面積から重合生成物の収率を求めた。次に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ−１０）にて精製し、展開後の溶媒を凍結乾燥することで生成物を得た。得られた生成物は１Ｈ  ＮＭＲ、ＧＰＣ測定により分析を行った。図７に基質モノマーＡを用いた場合に得られたプロパンアミド誘導体の１Ｈ
ＮＭＲスペクトル、表７にプロパンアミド誘導体（基質モノマーＡからの生成物）と２−メチルプロパンアミド誘導体（基質モノマーＢからの生成物）のＧＰＣ測定による結果を示す。ＧＰＣ測定は、実施例６に記載の標準物質及び測定条件にて行った。
【００５５】
ＮＭＲのスペクトラムの帰属は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ（ｐｐｍ）；４．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ，Ｈ−１），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，Ｈ−１’），３．９３−３．７１（６Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈ−６，Ｈ−４’，Ｈ−５’），３．８７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２），３．５７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３’），３．５３−３．５０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４，５），３．３７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２’），２．３１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ３），１．１２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ３）
【００５６】
【表７】
0004036755.tif 000009
【００５７】
【産業上の利用可能性】
本発明の酵素化学的ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の製造法は従来より工業的に用いられてきた鶏冠抽出法や、発酵法に比較して、簡便な合成法であり且つ反応液からの生成物の単離精製が容易なヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の製造法を提供するものである。採取されたヒアルロン酸は化粧品、医薬品および医療用等の材料として工業的に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】合成スキームを示す。
【図２】反応液中モノマー基質の経時変化を示す。
【図３】生成ヒアルロン酸の１Ｈ  ＮＭＲスペクトラムを示す。
【図４】生成ヒアルロン酸の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトラムを示す。
【図５】ウシ睾丸ヒアルロニダーゼの場合と羊睾丸ヒアルロニダーゼの場合のｐＨの影響を示す。
【図６】反応液中モノマー基質Ａの経時変化を示す。
【図７】生成プロパンアミド誘導体の１Ｈ  ＮＭＲスペクトラムを示す。
【図１】
0004036755.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0004036755.tif 000015
【図６】
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【図７】
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