(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンモニアと酸素を同時に供給する好気性培養において、空気、酸素またはそれらの混合気体を散気管の先に取りつけた焼結金属膜を用いて培養槽に分散供給し、同時にアンモニアまたはアンモニアと空気の混合ガスを前記散気管とは別の散気管から培養槽に分散、供給することを特徴とする好気的培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本願発明は、好気的な有用物質の発酵生産において、焼結金属膜を用いて酸素供給を行なうことにより、好気性培養の生産性を高める方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
発酵工業では多く好気的培養が行われており、通気撹拌により酸素供給を行っている。従来の培養槽では培養槽内に設置された通気ラインから供給された空気を撹拌翼によって微細化する通気撹拌によって菌体への酸素供給を行なっていた。しかしながら、この方法では菌体濃度が高くなった場合や、菌体の有用物質の生産速度が高い等、菌体による酸素消費量が大きい場合には、酸素供給が足りなくなるという問題が生じてきた。
【０００３】
そこで、培養液への酸素供給を高めるため、供給気体として空気ではなく酸素を用いる検討がなされてきた。しかしながら、酸素発生用の設備およびその保守が必要であること、酸素を供給しても従来の通気撹拌では十分に培養液へ酸素供給できず、空気と比較して酸素濃度の高い排気となるという問題があった。
【０００４】
また、通気撹拌槽において供給空気を微細化することを目的として、撹拌動力を増加させることにより酸素供給性能を上昇させることができるが、撹拌動力をある程度以上上昇させるとキャビテーションが生じるなど、供給された動力を効率良く酸素供給に用いることができていない。
【０００５】
その他、酸素供給を向上させるために、通気・内圧をあげる方法もあるが、圧力が高いと菌体の代謝に影響を与えるほか、コンプレッサーの能力を増強する必要があることなど大きな投資が必要であるという問題点があった。
【０００６】
また、微細気泡ポンプ（たとえば特開平６−１９３６００、特開平６−３３０８８８など）や、静止型ミキサー（たとえば特開平５−１５７５３など）、微細気泡ノズル等（特開平９−２０１５２０など）液体を循環させることによって酸素供給を向上させる装置は実用化されているが、培養槽で液体を循環させると循環ラインにおける洗浄が不充分になり雑菌汚染の原因となることや、工業レベルの培養では循環量が多量となり、循環用ポンプとして大きな設備が必要となる問題点がある。また、内部設置型の静止型ミキサーやノズルであっても、混合部がラインによって閉塞されるため、洗浄不良による雑菌汚染が生じる等の問題点があった。
【０００７】
また、焼結金属エレメントを用いる培養方法（特開昭６１−５６０７０）では、空気、酸素富化空気、あるいは酸素ガスを、焼結金属エレメントを用いて微細な気泡として培養槽に分散供給すると、大幅な酸素供給性能の向上は観察されるものの、通常使用の通気ラインの代わりに焼結金属エレメントを用いて通気しても、培養中に膜に固形物が付着し、圧力損失の増大から通気を続けることが出来ないという問題点があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
一般に窒素源供給用、およびｐＨ調整用のアンモニアガスは、撹拌翼による効果的な分散を目的として通常の好気性培養では酸素または空気等と混合され通気用の散気管を経て培養槽内に供給される（たとえば、Malcolm V Bartow, Chemical Engineering, July, 70(1999)、Daniel I.C. Wang et.al, Fermentation and Enzyme Technology, 230(1979)、高橋穣二編,バイオインダストリーの装置と機器, 10, バイオインダストリー協会(1987)）。雑菌汚染および、ｐＨの不均一化を避けること、およびアンモニアガスは溶解度が高く、非使用時に培養液が逆流する可能性があることから、アンモニアガスのみを通気用散気管以外から供給する例は非常に少ない。しかしながら、通常の好気性培養方法で使用される散気管を焼結金属エレメントに変更して好気的培養を実施し、アンモニアを供給すると、膜表面が粗であることにより固形物が付着し通気による圧力損失が上昇するという問題が生じ、現状のコンプレッサー吐出圧では引き続き通気することができず、培養中盤に膜の使用を中止せざるを得なくなってしまうことを本願発明者らは初めて見出した。
【０００９】
したがって、本願発明は、現状の通気撹拌槽に散気管として焼結金属膜を設置することにより、酸素供給速度を６０％以上向上させることができ、かつアンモニアを同時に供給することが可能であり、しかも、膜の閉塞、雑菌混入の問題もなく、培養運転できる培養装置および培養方法を開発することにある。本願発明者らは、膜の閉塞の原因について検討した結果、アンモニアの供給によって膜外側表面に固形物が付着して焼結金属膜を閉塞させてしまうことが原因であることをつきとめた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
そこで本願発明者は、焼結金属膜を用いた高酸素供給培養を連続的に行なうため、アンモニアは酸素または空気等を供給する散気管とは別の散気管から供給し、焼結金属膜の閉塞を回避することにより本願発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本願発明は、アンモニアと酸素を同時に供給する好気性培養において、空気、酸素またはそれらの混合気体を散気管の先に取りつけた焼結金属膜を用いて培養槽に分散供給し、同時にアンモニアまたはアンモニアと空気の混合ガスを前記散気管とは別の散気管から分散、供給することを特徴とする好気的培養方法に関するものである。
【００１２】
さらに望ましくはアンモニアガス未使用時の培養液の逆流を防止するため散気管からは微量の空気を常時供給することを特徴とする好気的培養方法に関するものである。
【００１３】
膜の細孔径と空気の供給線速は、微細気泡型のエアレーターと同じく細孔径１〜２０μｍ、通気線速０．０４〜０．１１ｍ／Ｈｒ（特開昭６１−５６０７０等）が適するが、好ましくは細孔径５μｍ程度、通気線速０．０４ｍ／ｓが望ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本願発明の対象となる好気性培養として、アミノ酸発酵、核酸発酵、酵母培養、カビ培養等が挙げられる。アミノ酸発酵の例として、グルタミン酸、リジン、アルギニン発酵等、核酸発酵の例として、イノシン、グアノシン発酵等がある。また、培養条件は常法に従って行えばよい。
【００１５】
また、発酵槽内に供給されたアンモニアガスを効率的に分散させるには、剪断力の大きい下段翼の下部からアンモニアガスを供給することが望ましい。
焼結金属膜を通して供給する空気の通気量は、要求される酸素量に依存するが、全体の通気量の１０％〜８０％ととし、残りの空気は既存の散気管からアンモニアとともに供給する。一例を下表に示す。
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【００１６】
本願発明に用いた燒結金属膜は粒子径分布の一様な金属粉末を加圧成形、燒結することによって作られている。このため、高分子膜やセラミック膜と比較して耐熱性や強度の面で優れており、石油精製や化学工業におけるフィルターとして多く用いられている。
【００１７】
本願発明に用いる燒結金属膜の材質は、ニッケル、ステンレス、インコネル、チタン等を選択することが出来るが、膜の材質による酸素供給性能の差は見られず、機械的強度、耐薬品性、耐熱衝撃性、価格の面からステンレス製の膜が好ましい。
【００１８】
好気性培養に用いる気体は通常空気を用いるが、より高い酸素供給能力が必要な場合には酸素発生装置等により、酸素濃度の高い空気、純酸素等を用いてももちろんよい。
【００１９】
本願発明に用いる焼結膜金属を用いた好気的培養の高酸素要求培養を実施するための培養装置の一例として、膜を設置した培養装置を図１に示し、以下に説明する。
【００２０】
図１は、以下に記載した実施例を行った際の培養装置の縦断面図である。培養槽１内には、培養液２１が満たされ、下部には既存の散気管用空気供給管２が設けられ、一方上部には培養槽１内で生じた泡沫３を槽外に排出する排気管４が設けられている。ｐＨ調整用のアンモニアは管１４を通して供給される。アンモニアの逆流を防止するため、アンモニア用配管１４と焼結金属膜１８への配管１９との間に逆止弁１７を設置する。金属焼結膜１８の設置場所は、膜が完全に液没して、できるだけ下方に設置することが望ましい。管１５からは圧縮空気が既存の散気管２と焼結金属膜への散気管１９へと供給される。殺菌用の蒸気管１６は既存の散気管２と焼結金属膜の散気管１９とに連結されている。排気管４はサイクロン５に連結され、サイクロン５は還流液管１１を介して培養槽に連結している。また、排気管１０は、サイクロン７に連結されておりサイクロン７と培養槽は還流管１２を介して連結している。なお、還流液管１１と還流管１２は連結していてももちろん良い。６は排気管、８は撹拌羽根、９は撹拌モーター、１３は消泡材添加管、２０は添加糖供給管である。
【００２１】
培養槽１の下部より吹き込まれた空気は撹拌羽根によって剪断され、微細化される。一方、焼結金属膜から供給された空気は微細化された状態で培養液に供給される。培養途中、菌体の代謝、あるいはアミノ酸等の生成によりｐＨが下がる場合にはアンモニアを通常の通気ラインから供給し、撹拌羽根によって剪断することによってｐＨ調整を行なう。
【００２２】
本願発明の培養装置を用いて酸素供給を行なうことにより、菌体による酸素要求量を満たすことができ、雑菌混入の問題点もなく運転でき、高菌体条件で培養を行なうことにより有用成分の生産性を大幅に上げることができる。以下、実施例により本願発明を具体的に説明する。
【００２３】
【実施例】
実施例１
グルタミン酸の生産菌であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)ＡＴＣＣ１３８６９を用いて、図１の培養装置（培養槽の全容量は３１０ｋＬ。）によりグルタミン酸発酵を以下のように行った。糖濃度８０ｇ／Ｌの糖蜜１４０ｋＬに表１の組成になるよう添加物を添加し培地を調整した。これに予め同じ培地組成で培養したBrevibacterium lactofermentum  ＡＴＣＣ１３８６９を約１０ｋＬ接種し、３１．５℃にてｐＨをアンモニアガスにて７．５に保ちつつ、通気撹拌下培養した。発酵槽内圧は０．５ｋｇｆ／ｃｍ２Ｇとした。培養中培地中の糖濃度が３％を切った時、糖濃度３５０ｇ／Ｌの濃度の糖蜜を少量ずつ添加し糖濃度を２〜４％に調節しつつ培養した。培地中の溶存酸素濃度が１．６ｐｐｍを切った際には糖の添加を中止し、溶存酸素濃度が１．６ｐｐｍ以上を保つように制御した。また、培養途中所定の菌量に達した時点で界面活性剤トウイーン６０を培地に対し０．６％になるように添加した。消泡剤としてはＰＰＧ系（ポリプロピレン・グリコール  ＡＺ２０Ｒ（日本油脂（株）））を用いた。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
ＳＵＳ３１６Ｌ製の焼結金属膜を取りつけた培養装置を用いて培養を行った。通気配分が既存ライン：焼結金属膜ライン＝２：８になるようにコントロール弁にて制御した。培養開始直後から菌体による酸素要求量が上昇し、開始後５時間目に溶存酸素濃度が急激に減少した。これにあわせ、ｐＨ制御のためのアンモニアが、既存ラインから供給された。約１０時間程度に初めに添加した糖を消費し、糖濃度が３％以下になったため糖の添加を開始した。約１２時間程度に菌体の酸素消費量が最大値を示し、その後徐々に減少する傾向が見られた。培養時間２４時間後、培養液量が培養槽の７６〜８０％になった時点で培養終了とした。培養中、添加糖の速度が追いつかず、溶存酸素濃度は常に３ｐｐｍ以上を示した。最終の培養液量は２４０ｋＬに達し、８６ｇ／Ｌのグルタミン酸を得た。途中発泡により系外に泡が出る現象も見られたが、既存の消泡方法により抑泡でき、培養排気口に設置されているサイクロンから培養液が溢れることなく運転ができた。さらに、撹拌翼による供給気体への剪断が必要でなく、撹拌動力は既存方法の約６０％で運転することができた。
【００２６】
比較例１
実施例１と比較する為、図２に示したように、焼結金属膜を取り付けていない培養装置を用いて培養を行った。通気は全て既存ラインから供給された。実施例１と同様の培養条件でBrevibacterium lactofermentum  ＡＴＣＣ１３８６９の培養を行い、糖蜜も同じ濃度のものを使い培養した。実施例１と同様に、培養開始後５時間目程から溶存酸素が急激に減少した。培養１０時間程度に糖の添加を開始した。溶存酸素濃度を１．６ｐｐｍに制御するため、糖の添加速度は実施例よりも低くなった。約１２時間程度に酸素消費量が最大になるもその値は実施例の６０％であった。培養時間４０時間後、培養液量が培養槽の７８％になった時点で培養終了とした。最終の培養液量は２４０ＫＬに達し、８４ｇ／Ｌのグルタミン酸を得た。
【００２７】
表２に実施例１と比較例１の結果をまとめて示した。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
【発明の効果】
本願発明によって、実生産用培養槽で収率を落とすことなく、生産性を大幅に向上させることができる。培養時間を短縮して運転でき、雑菌が発生するといったこともなく運転できる。これにより、単位時間における目的物質の生産量を増やすことができ、生産性を上げることができる等のメリットを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本願発明の培養装置図である。
【図２】比較例１の培養装置である。
【符号の説明】
１      培養槽
２      既存散気管空気供給管
３      泡沫
４      排気管
５      サイクロン
６      排気管
７      サイクロン
８      撹拌翼
９      撹拌モーター
１０    排気管
１１    還流液管
１２    還流液管
１３    消泡剤添加管
１４    アンモニア供給管
１５    空気供給管
１６    蒸気供給管
１７    逆止弁
１８    焼結金属膜
１９    焼結金属膜用空気供給管
２０    添加糖供給管
【図１】
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【図２】
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