(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非耐熱性エンテロトキシンＢサブユニット（LTB）とコレラトキシンＢサブユニット（CTB）の間の雑種分子であるが、但し、成熟CTBのアミノ酸配列からなるアミノ酸配列中のアミノ酸残基が、上記免疫上成熟したCTBにLTB-特異的エピトープの特性を付与する成熟LTBの対応アミノ酸残基で置換されている、雑種分子。
【請求項２】
非耐熱性エンテロキシンＢサブユニット（LTB）とコレラトキシンＢサブユニット（CTB）の間の雑種分子であるが、但し、成熟LTBのアミノ酸配列からなるアミノ酸配列中のアミノ酸残基が、上記免疫上成熟したLTBにCTB-特異的エピトープの特性を付与する成熟CTBの対応アミノ酸残基で置換されている、雑種分子。
【請求項３】
アミノ酸配列が配列番号：７の配列：
0004081140.tif 000020
であり、１、94および95位のアミノ酸残基がLTBの対応アミノ酸残基で置換されている成熟CTBのアミノ酸配列からなる、請求項１記載の雑種分子。
【請求項４】
アミノ酸配列が配列番号：８の配列：
0004081140.tif 000021
であり、１−25位のアミノ酸残基がLTBの対応アミノ酸残基で置換されている成熟CTBのアミノ酸配列からなる、請求項１記載の雑種分子。
【請求項５】
請求項１−４の何れか１項記載の雑種分子をコードする構造遺伝子。
【請求項６】
請求項５記載の構造遺伝子を含むプラスミド。
【請求項７】
請求項１−４の何れか１項記載の雑種分子を含む免疫原性蛋白質。
【請求項８】
雑種分子と、原核細胞または真核細胞またはウイルスの免疫反応性アミノ酸配列の融合蛋白質である、請求項７記載の免疫原性蛋白質。
【請求項９】
免疫成分として請求項７または８記載の免疫原性蛋白質を免疫上有効な量含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
本発明は、非耐熱性エンテロトキシンＢサブユニット（LTB）とコレラトキシンＢサブユニット（CTB）の雑種分子に関する。そのような雑種分子からなり、細胞またはウイルスの免疫反応性アミノ酸配列を任意に融合する免疫原性蛋白質は、ワクチン中で、例えばエンテロトキシンにより誘導される、下痢に対する広い範囲のスペクトルのワクチン中で免疫原成分として使用してよい。
背景
コレラは依然として発展途上の国々における病気の重大な原因であり、毎年200,000人以上の死者をもたらすと推定されてきた。毒素原性大腸菌（ETEC）は、発展途上の世界およびそこへの旅行者の下痢における最も頻発の原因であり、年間百万以上の下痢のエピソードおよび百万の死の原因である。ETECの感染は動物の疾患の重大な原因でもある。コレラおよびETECの両者の感染に関して、効果的なワクチンについての大きな要求がある。
コレラおよびETECの両者の感染に関して、下痢の初期原因は、コレラトキシン（CT）およびETEC非耐熱性エンテロトキシン（LT）の場合、感染生物から腸へのエンテロトキシンの放出作用である。２つのトキシンは構造上並びに機能上密接に関連しており、各々は５つの同一のＢサブユニット（それぞれ、CTBまたはLTB）に囲まれた毒性Ａサブユニット（それぞれ、CTAまたはLTA）からなる（Spangler, 1992）。Ｂサブユニットのペンタマーは、腸内皮細胞表面上に存在するGM１ガングリオシドリセプターへのトキシンの結合に必要であり（Holmgren, 1981）、LTは構造上関連する乳蛋白質リセプターにも結合することができる（Holmgren and Fredman, et al., 1982）。
両蛋白質は少数のアミノ酸残基における内部の変化、例えばヒトと動物のETEC単離物の間および古来のEITまたはバイオタイプのコレラ株で変化を呈するかもしれないが、LTBとCTBは成熟蛋白質において85％のアミノ酸の保存を伴う高度の相同性を示し（図１）、そしてLTBとCTBペンタマーも構造上類似しているとの結晶構造解析の研究による証拠がある（Sixma and Pronk, et al., 1991, Sixma and Kalk, et al., 1993, Merritt and Sarfaty, et al., 1994）。抗体の大多数は集合するペンタマーの構造上の特徴に対して向けられてという事実にも拘わらず、２つの分子の間に高度の免疫交差反応性も有り、２つの分子間の構造上の類似性をさらに示唆する。
CTは、主にＢサブユニットに対する腸IgA応答を生じる効果的な口免疫原出有ることがわかった。さらに、CTBの経口投与のみで同様の応答を効果的に刺激することもわかり、そして特にヒトにおいて、CTBはアジュバントまたはホロトキシンの毒性作用の何れかの不在下で強力な免疫原になることがわかった。これらの応答は、ビブリオコレラによる誘発または自然の感染に対する相対的に短期間の（６−９カ月と計算される）防御並びにより長く永続する免疫記憶ではあるが、高レベルに関連する
0004081140.tif 000002
抗トキシン抗体は、細菌細胞関連抗原、例えばビブリオコレラ01（Svennerholm and Holmgren, 1976）または新規血清型0139（J. Holmgren, et al.，未公開）のリポポリサッカライド（LPS）に対する腸IgA抗体と共に防御作用において相乗的に作用するらしい。これらの発見に基づき、CTB並びにビブリオコレラ01の全死細胞からなる、コレラに対する経口ワクチンが開発され、数年間の防御を生じ（Clemens and Sack, et al., 1990）、現在は0139血清型の細胞も含むように修飾されている。
バングラデシュにおけるＢサブユニット-01全細胞ワクチンの大規模な実地試験は、コレラに対して観察された長期間の防御に加えて、CTB成分によるETEC感染に対しての顕著な短期間の交差防御（cross-protection）を示した（Clemens and Sack, et al., 1988（a））。コレラワクチンにより付与されるETECに対してのそのような防御は、モロッコへのフィンランド人の観光客の旅行の研究において引き続き確認された（Peltola and Siitonen, et al., 1991）。これに基づき、ETECに対するより広範囲のスペクトルのワクチンが開発されたが、該ワクチンは、CTBと、腸上皮に吸着して含まれる主要コロニー形成因子抗原を発現する死大腸菌を共に用いた
0004081140.tif 000003
該大腸菌株は、単独またはLTと共に耐熱性エンテロトキシン（STa）放出ETEC株に対して免疫を提供するために含まれた。
コレラとETECが地方特有なエリアにおいては、両者の感染に対する効果的な防御が可能な単一のワクチンを有することが望まれるはずである。これは、一部には、既に許可されたコレラワクチンのCTB成分により付与されるETECに対しての防御を増大させることにより達成できる。LTBおよびCTBは顕著な免疫交差反応性を示すが、CTB免疫された個々の血清からのLTの中和は、同じ血清がCTを中和するのと同じほどの効果がない
0004081140.tif 000004
結果として、LTまたはLTBに対する抗血清はCTよりもLTと共に用いた場合に高い力価で反応することが知られている（Svennerholm and Holmgren, et al., 1983）。したがって、LTB中のいくつかの中和エピトープはCTB中で不在であることができ、またはその逆も可能である。これは、さらに、LTB特異的中和抗体の同定により示唆される
0004081140.tif 000005
コレラワクチンおよびETECワクチン両者へのCTBの含有は、大量に、そして毒性CTAサブユニットの全不在で生産可能な、組換え蛋白質の過剰生産のための発現系の開発につながった（Sanchez and Holmgren, 1989, Lebens and Johansson, et al., 1993）。これは、外来ペプチド抗原を持つ蛋白質の生成のために根本的な、CTBの遺伝修飾の相対的に単純な方法の道も開く。
本発明は、本質的にCTBを残す蛋白質中にLTBエピトープが導入された雑種蛋白質をもたらすCTBコード構造遺伝子の部位特異的変異導入による修飾に基づき、それにより、免疫交差反応性を増加させるために交差反応性であり且つCTB特異的なエピトープに加えてLTB特異的エピトープを持つそのような雑種分子を生成する。そのような雑種CTB/LTB分子は、毒素原性の病気の予防または治療のための広いスペクトルのワクチンを提供するために開発された。
発明の説明
本発明は、一つの側面において、非耐熱性エンテロトキシンＢサブユニット（LTB）とコレラトキシンＢサブユニット（CTB）の雑種分子に向けられており、該分子は、成熟CTBのアミノ酸配列からなるアミノ酸を有し、LTB特異的エンテロトキシンの特性を免疫原上成熟したCTBに付与する成熟LTBの対応アミノ酸残基でそのようなアミノ酸が置換されているか、またはその逆である。即ち、上記雑種分子は成熟LTBのアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなってもよく、CTB特異的エンテロトキシンの特性を免疫原上成熟したLTBに付与する成熟CTBの対応アミノ酸残基でそのようなアミノ酸が置換されている。
好ましい態様において、本発明の上記雑種分子は成熟CTBのアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するが、但し、１、94および95位のアミノ酸残基がLTBの対応するアミノ酸で置換されている。
他の好ましい態様において、本発明の上記雑種分子は成熟CTBのアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するが、但し、１−25位のアミノ酸残基がLTBの対応するアミノ酸で置換されている。
成熟CTBおよび成熟LTBのアミノ酸配列は図１に示すが、アミノ酸＋１から開始する。対応する構造遺伝子は同じ図面に示される。
本発明の他の側面は、本発明による雑種分子をコードする構造遺伝子に向けられる。さらに本発明は、そのような構造遺伝子を含むプラスミドに向けられる。
本発明のさらなる側面は、本発明による雑種分子を含む免疫原蛋白質に向けられる。
本発明のこの側面の態様において、上記免疫原蛋白質は、本発明の上記雑種分子と、原核または真核細胞またはウイルスの免疫反応性アミノ酸配列の融合蛋白質である。
本発明の他の側面は、免疫学上効果的な量の本発明による免疫原性蛋白質を免疫成分として含むワクチンに向けられる。好ましくは、該ワクチンはエンテロトキシンにより誘導される病気、例えば下痢に向けられる。
本発明のＢサブユニット雑種は、免疫学上効果的な量の本発明による免疫原性蛋白質を個体（動物またはヒト）に投与することからなる、個体のエンテロトキシンにより誘導される病気の予防または治療方法において使用することを意図される。
図面の説明
図１．ヒトETEC単離物からのLTB（Leong, et al., 1985）とCTB（M. Lebens，非公開）の配列比較。アミノ酸の変化をもたらす違いに関して、LTBの対応位置の残基をDNA配列の上に示す。CTBアミノ酸配列の下の数は、成熟CTBおよびLTB蛋白質中のアミノ酸残基の位置を示す。
図２．CTB/LTB雑種コーディングプラスミド。両方のプラスミド中にて、ctxB由来の遺伝子をtacプロモーターから発現させる。ａ）pML-LCTBtacAは、pML-LCTBtac1（21）からのSacI/AccI断片がＬＴＢの最初の25アミノ酸をコードする合成オリゴヌクレオチドで置換された場合の遺伝子挿入により生じた。ctxB遺伝子の残りは変化させなかった。該プラスミドは、LTBシグナルペプチドおよびリボソーム結合配列を持つ。ｂ）pML-LCTBtacBは、唯一のEcoRI部位が導入されて94及び95位のアミノ酸がLTB中の同じ位置に対応するように変更されるように、PCR指示変異導入により導入された。該プラスミドは、CTBシグナル配列およびラムダのcIIリボソーム結合配列を持つ。変更された配列をボックス中に示した。配列は雑種遺伝子の関連領域のみを描写する。
図３．３つの免疫（群１、２および３）各々の後の、rCTB，rLTBまたはCTB/LTB雑種蛋白質LCTBA（Ａ）またはLCTBB（Ｂ）の何れかのip免疫に対するIgG抗体の応答。力価は２つのマウスの平均であり、材料と方法に記載されたGM1-ELISAにより測定した。
図４．rCTB，rLTBまたはCTB/LTB雑種蛋白質LCTBAまたはLCTBBの何れか３つの免疫後に得られたマウス血清中のCTB-およびLTB-反応性抗体の力価に対するCTB吸収の効果。
本発明の雑種CTB/LTBの調製
本発明の雑種CTB/LTB分子は、ペプチドおよび蛋白質を生成する当業界で公知のあらゆる方法、例えば遺伝子工学および／またはペプチド合成、例えばメリフィールド（Merrifield）により調製してよい。そのような分子の調製を例示するために、本発明の２つのCTB/LTB分子を下記のとおり調製した。
雑種CTB/LTB分子の生成
本発明において使用される２つの雑種トキシン遺伝子は、２つの異なるCTB発現ベクターから生成した。第一に、ctxB遺伝子中の便利な制限部位の間に合成オリゴヌクレオチドを挿入することにより修飾を達成し、第二に、以前に記載された
0004081140.tif 000006
完全なプラスミドのPCR増幅において特定のプライマーを用いることにより変異を生じさせた。その結果の２つのプラスミドは修飾されたctxB遺伝子を持つpML-LCTBtacAおよびpML-LCTBtacBであり、これらの配列はDNA配列決定により確認されて図２に示される。pML-LCTBtacAにより発現された雑種蛋白質LCTBAは最初の25アミノ酸においてLTBと同一であり、そのあとはCTBと同一であった。pML-LCTBtacBにより発現されてLCTBBと称するものは、１、94および95位においてLTBに相当するが他の点では古来の01ビブリオコレラ株395からの天然CTBと同一となるように変更された。
雑種蛋白質はビブリオコレラJS1569内で発現されて生育培地中で産物の蓄積をもたらし、ヘキサメタリン酸沈殿に続くHPLCにより精製できた。
該蛋白質は、SDS PAGEに基づけばLCTBAの場合に対照CTB蛋白質と同一らしかったが、LCTBBの場合に、特にモノマー形態においてはよりLTBらしく挙動した。
CTB/LTB雑種の抗原性分析
２つの雑種蛋白質は、各々の発現ベクターを持つビブリオコレラの生育培地から部分精製されて、さまざまな異なるアッセイに供されて、天然CTBとLTBに比してのそれらの抗原特性を測定した。
最初に異なる蛋白質の固定濃度を、GM1-ELISA中のCTB-またはLTB-特異的抗体で力価測定した。この方法は、GM1リセプターと異なる検出抗体の何れかまたは両者に関する親和性の差異を測定するはずであるが、しかし、これら異なる蛋白質はGM1に全く同じく結合すること、および差異はしたがって抗体特異的であることを我々は以前に示した（結果は示さず）。結果を表１に示す。モノクローナル抗体および吸収されたポリクローナル抗血清両者の範囲に関して得られた力価のプロフィールは雑種と天然蛋白質の間で変化しうることが観察できる。結果から、雑種蛋白質LCTBAは、モノクローナル抗体との反応性に基づいて認識されうるLTB-特異的エピトープ、とりわけLTB-特異的モノクローナル抗体LT33：８およびLT80：７により認識されるエピトープを獲得したことを示す。しかしながら、それはまだCTB特異的抗体CTWiと反応する。これは、ウエスタンブロットによっても証明された。
LCTBBの場合、用いられたモノクローナル抗体の何れもが雑種分子の抗原性における何の変化も示さなかった。これには２つの可能性のある説明がある。一つは、特定のエピトープに関する親和性を証明するために、分子中の相対的に小数の変化は抗体の大きな範囲でスクリーニングする必要があったことである。あるいは、GM1-ELISAに基づくアッセイは、GM1結合部位内に隠された分子領域の変化を検出しないのかもしれない。
交差反応性抗血清を生じる雑種蛋白質による免疫
LTB，CTBまたは異なる雑種分子の何れかによる免疫後、もたらされた血清は、LTBおよびCTBに対する全抗体のレベルに関して、続いてLTB特異的抗体のレベルに関して分析された。
図３は、３つの免疫後のCTBおよびLTBに対する抗体レベルを示す。最初の免疫の前に、試験された全部のマウスにおいて何れかのＢサブユニットに対する検出可能な力価はなかった。CTBおよび雑種蛋白質の両者の場合に、CTBに対する力価はLTBに対するよりも首尾一貫して高かった。LTBで免疫されたマウスの場合、状況は逆であった。CTBまたはLCTBB雑種分子で免疫されたマウスにおいては、第一および第二免疫後にCTBおよびLTBに対して得られた相対的力価の間に顕著な差異はなかった。両者の場合、CTB力価は明らかにLTBに対するより高かった。LCTBAで免疫されたマウスにおいては、しかしながら、LTBおよびCTBに対する力価のレベルは互いにより小さかった。これは、CTBおよびLCTBB免疫マウスに比した場合、抗LTB抗体レベルの上昇および抗CTB抗体レベルの低下によった。第三の免疫後は、雑種分子で免疫されたマウス両群において、抗CTB力価はCTBで免疫されたマウス中の力価と同様であったが、抗LTBレベルは高かった。
LTBまたはCTBに対する抗体力価に関する全血清の試験の場合、交差反応性抗体の存在により問題が曖昧になる。異なる血清において観察された差異がLTB特異的抗体のレベルの変化によったのか否かを決定するために、第三の免疫後に採られた血清をCTBセファロースに吸収させて、交差反応性並びにCTB特異的抗体の両者を除去した。次に、これらを抗CTBおよび抗LTB力価に関してアッセイした。結果を図４に示す。該処理により、効果的にすべての抗CTB抗体が血清から除去されることがわかる。CTBで免疫されたマウスの場合、完全な観察された抗LTBの力価は、吸収後に残る交差反応性抗体およびLTB非反応性抗体による。LCTBAおよびLCTBBの両者の場合、顕著な抗LTB力価が残るが、LTBで免疫されたマウスにおけるよりも高くはない。CTB分子に導入された変異はLTB特異的抗体を生じる免疫効果をもつことは明らかである。CTB分子に７つの置換を有したLTBBAの場合、たった３つを有するLCTBBよりも効果が大きいことも明らかである。
異なるＢサブユニット抗血清によるCTおよびLTの中和
LTまたはCTの何れかを中和する能力に関するインビトロアッセイにおいて、異なる抗血清を試験した。結果を表２に示す。アッセイに用いた条件下では、CTBおよびLTB抗血清はわずかに交差反応性であるにすぎない。LTB抗血清は、CTB抗血清がLTに対して顕著な効果を示す範囲においていかなる希釈においてもCTを中和しなかった。対照的に、雑種分子の何れかに対する抗血清はCTおよびLTの両者に対する顕著な中和活性を有した。CTBを用いた場合、抗血清のCT中和活性の完全な吸収後でさえ、まだ顕著なLT中和活性があった。これらの結果から、CTB分子内で作成された置換はLTBエピトープの中和を導入するが、同時にCT中和エピトープを残す事が示唆される。LCTBBで免疫されたマウスからの抗血清によりLTに対して証明された中和活性のレベルは、GM1 ELISAで試験されたとおり、わずかな低いレベルのLTB特異的抗体の存在にも拘わらず、LCTBA免疫マウスからの抗血清に関して見いだされたのとほぼ同じであることは重要である。これは、Ｂサブユニット構造の94および95位のアミノ酸は、リセプター結合部位近傍に位置するかもしれない強力な中和エピトープの一部を形成することを示唆する。
明細書の実験部分に示された結果の要約
示された研究は、CTBを必ず含む２つの雑種Ｂサブユニットトキシン分子の合成および分析を記載するが、但し、変異により特定のアミノ酸が変更されており、ヒトLTB内の対応位置に似せてある。２つの蛋白質は高いレベルで発現されること並びにCTBおよびLTB両者の本質的な特性を保持していることがわかった。両者はペンタマー内に組み立てられてGM1ガングリオシドに結合された。さらに、両分子は野生型CTBおよびLTBと同様に、交差反応性モノクローナル抗体LT39と反応し、そしてCTBまたはLTBの何れかに対する抗血清とも強く反応した。他のLTB-またはCTB-特異的モノクローナル抗体との反応においては、しかしながら、これらの異なる蛋白質の間で識別可能であったことから、該新規蛋白質蛋白質はほんとうに同じ分子上の各々の野生型蛋白質に特異的なエピトープを持つことが示唆される。これはさらに、該雑種蛋白質で免疫された動物から得た血清の交差反応性が増加したことを証明する免疫実験により示された。CHO細胞トキシン中和アッセイにおいて、該雑種分子に対する抗血清はCTBのみに対する抗血清よりも効果的にLTを中和し、そしてこの活性がCTBにより吸収されえなかったことが証明された。
本研究において使用された２つの雑種分子が、CTB分子の別の領域における変異効果を示すためにデザインされた。第一の構築物はCTBのアミノ末端が変更されており、第二はリセプター結合の基質特異性に包含されると考えられるカルボキシル末端に近接した位置において、２残基が変更された。LCTBBの１位におけるThr→Alaの変異は、本研究において研究されなかった。対照として使用された組換えCTBは以前に記載された発現系から生産され（Lebens and Johansson, et al., 1993）、そして免疫上の重要性を有さないことを我々が以前に示したこの変異も持つ（Lebens and Johansson, et al., 1993およびLebens and Holmgren，未公開データ）。
この結果から、CTBのアミノ末端におけるより広範囲な変更は、検出可能であるがLTB特異的GM1-ELISA力価の低い、成熟蛋白質の94および95位における２残基の変化に比較して、よりLTB特異的な抗体を生じることは明らかである（CTBセファロースにより吸収されないGM1-ELISA抗体力価により定義されるとおり）。考慮すべき関心は、したがって、CHO細胞中の２つの変異Ｂサブユニットに対する抗血清によるLT（およびCT）の中和が同様であるとの発見であった。このことは、第二の雑種により生じたLTB特異的抗体類の明らかに低い力価にも拘わらず、該抗体類が均等な中和効果を有することを暗示しており、このことから影響された該２つの残基は中和エピトープ内に存在することを示唆する。さらに、Ｂサブユニット分子上のそのような中和エピトープがひとつより多く存在することは明らかであるが、なぜなら、幾つかのCTB特異的中和エピトープが置換の結果として損失されるかもしれない可能性にも拘わらず、何れの変異もCTを中和する能力を失わないからである。
変異CTB分子の交差反応性は生じた特異的変化に帰するが、なぜなら、CHO細胞アッセイにおいてCT中和活性の完全な損失をもたらす、免疫吸収剤で除去されるCTB特異的並びに交差反応性抗体により影響されるLTB特異的抗体を生じたからである。しかしながら、LT中和活性は残った。
これらの研究から、CTBおよびLTB特異的中和エピトープの両者を含む雑種分子は生成可能であることが明らかである。さらに、最近記載されたCTBの過剰発現系は、これらの蛋白質が大量に生産されることを可能にする。即ち、そのような分子は両方の種類の下痢疾患に対する顕著な防御を付与するようにデザインされた別々のコレラおよびETECワクチンまたは単一の広範囲なスペクトルのワクチンの何れかに取り込まれて、今提供される。
材料と方法
バクテリア株およびプラスミド
本研究において、組換えCTB（rCTB）並びに組換えLTB（rLTB）および変異誘導体の生成のために使用されたバクテリア株は、01 EI Tまたはビブリオコレラ株JBK70（Kaper and Lockman, et al., 1984）、および01の古来ビブリオコレラ株JS1569（Lebens and Johansson, et al., 1993）であった。適切な組換えプラスミドを持つ株を、20％グリセロール含有培地中で−70℃において凍結保存した。培養液はアンピシリン100μg/mlを付加されたＬアガー上に各々の株をストリークすることにより再生した。
本研究において生じたプラスミドを図２に示す。
ＤＮＡ操作
プラスミドの調製を含むDNAの操作、制限酵素の使用、DNAの連結およびアガロースゲル電気泳動は、本質的には、Sambrook and Fritsch, et al.,（1989）に記載されたとおりの標準法に従った。制限酵素は製造者により供給されるバッファー中で使用した。連結またはPCRを用いた増幅によりプラスミドに挿入されるオリゴヌクレオチドは、イノバーゲン（Innovagen）AB、スエーデンから得た。
PCRを用いて、
0004081140.tif 000007
により記載された方法に従い、ctxB遺伝子を有するプラスミドに変異を導入した。DNA配列決定はアマーシャム（英国）から得たシクエナーゼバージョン2.0キットを用いて実施した。ＣＴＢおよびＬＴＢおよびそれらの変異誘導体の調製
粗精rCTBおよびその誘導体は、関連の発現プラスミドを持つ株ビブリオコレラJS1569から調製した。LTBは、発現プラスミドpMMB68を持つビブリオコレラ株JBK70から調製した（Sandqvist and Hirst, et al., 1987）。培養液は修飾シンケース（syncase）上で生育させ（Lebens and Johansson, et al., 1993）、そして培地液中に蓄積したCTBまたはLTBを、以前に記載されたヘキサメトリン酸沈殿により回収した（Lebens and Johansson, et al., 1993）。得られたＢサブユニットの濃度は、交差反応性モノクローナル抗体LT39を用いて、GM1-ELISA（Svenner holm and Holmgren, 1978）により測定した。
LTBおよびCTB誘導体をさらに精製するための方法は、HPLCを用いて開発した。ヘキサメトリン酸沈殿物は20mM Tris-HCl pH９中に懸濁した。その結果の懸濁物を次に10,000rpmにて３分間遠心分離して、Ｂサブユニットを含む上清を0.2ｍ滅菌フィルターで濾過した。HPLCは、ウオーター600マルチソルベントデリバリーシステム（ミリポア社、米国）上で、DEAE Mem-Sep HP1000カラム（ミリポア社、米国）を用いて実施した。Ｂサブユニットは、最初にpH９（20mM Tris-HCl）において結合させ、0.16M（LCTBAに関して）または0.18M（LCTBBに関して）酢酸ナトリウムによりpH８においてカラムから溶出した。
インビトロの抗原性および蛋白質の分析
ポリスチレンELISAプレートのウエルを100μlの0.3nmol/ml GM1ガングリオシドで６時間室温においてコートして、使用まで４℃に保った。コートされたプレートは最初にPBSを２回代えて洗浄して、リン酸バッファー塩、pH7.2（PBS）、0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）で30分間37℃においてブロックした。PBS、0.1％（w/v）BSA中の濃縮保存溶液を希釈することにより、各々のＢサブユニット調製物の25ng/ml溶液を得た。これら希釈されたサンプルの100mlアリコートを用いて１時間室温においてインキュベートすることにより、ブロックされたプレートをコートした。
次に、異なる抗体溶液をプレートの第一列に加え、５倍連続希釈により力価を測定した。Ｂサブユニットに結合した抗体は、次にホースラディッシュパーオキシダーゼ（HRP）に結合させた二次抗マウスまたは抗ウサギイムノグロブリンで検出した（Jackson，PA，米国）。１時間室温においてインキュベート後、以前に記載されたとおりに（Svennerholm and Holmgren, 1978）、発色基質ｏ-フェニレンジアミン（OPD）およびH2O2を含むクエン酸バッファー（pH4.5）中で抗体の結合を検出した。プレートは３回PBSにより洗浄し、その合間は0.05％ツイーンにより洗浄した。力価は、10分間の反応後に0.4以上のバックグラウンドの450nmにおける吸収を与える相互希釈（reciprocal dilution）として測定した。
SDS-ポリアクリルアミド電気泳動および解析された蛋白質のニトロセルロースへのエレクトロトランスファーは、製造者により薦められた条件下でバイオラッド（CA、米国）から得たミニプロティーン（mini protean）II装置を用いて実施した。
マウスの免疫
対のC57/ブラックマウスを、３回、CTB，LTBまたは変異CTB誘導体の何れかで腹腔内免疫した。初めから２つの用量は、フロイント不完全アジュバントを含む200ml中に加えられた10mgのＢサブユットを含み、そして10日おきに与えられた。３回目の用量である20mgのＢサブユニットは何のアジュバントも含まずに第２の投与から14日後に与えられた。初めの２投与の前にマウスを出血させて、第３投与の７日後に犠牲にして、その後分析のための血液を回収した。血清を調製して、使用までは−20℃に保存した。
血清の力価測定
免疫により得られた血清をGM1-ELISA（Svennerholm and Holmgren, 1978）により試験した。使用直前に、GM1でコートされたプレートを最初に２回PBSで洗浄して、PBS、0.1％BSAで37℃において30分間ブロックした。次に、プレートを２群に分けた。PBS、0.1％BSA中にCTBを0.5μg/ml含む溶液100μlを第一群のプレートのウエルに加え、そしてPBS、0.1％BSA中にLTBを0.5μg/ml含む溶液100μlを第二群のプレートのウエルに加えた。次に、これらのプレートを室温において１時間インキュベートして、PBS、0.05％ツイーンで３回洗浄した。PBS、0.1％BSA、0.05％ツイーンの100μl溶液を、次に、第一列を除くすべてのウエルに加えた。第一列のウエルには、PBS、0.1％BSA中1/1000希釈の血清の150mlアリコートを加えた。次に、これらを連続３倍希釈により力価測定して、１時間室温においてインキュベートした。PBS、0.05％ツイーンで３回洗浄した後、CTBおよびLTBに結合した抗体を、HRP結合抗マウスIgGとのインキュベーションによりアッセイした（Jackson，PA，米国）。発色基質はOPDであり、上記インビトロ抗原性測定におけるのと同じ様式で計算した。
ＣＴＢ抗体吸収
CTB-特異的抗体並びにLTBと交差反応するはずの抗体の両者を除去するため、血清をCTB-セファロースビーズで吸収させた。CTB-セファロースは、製造者の指示書に従い、臭化シアン活性化セファロース（ファルマシアAB、スエーデン）にCTBペンタマーを共有結合させることにより調製した。
血清は、最初にPBS中で１：10に希釈した。この希釈液100μlを、室温において間欠して１時間撹拌しながら、50μlのセファロースCTB-ビーズと共にミクロ遠心管中でインキュベートした。次に、これらをベンチトップミクロ遠心管中で9,000rpmにて２分間遠心分離して上清を回収した。この方法を繰り返した。吸収された血清は、上記GM1-ELISAによりCTBおよびLTBに対してアッセイした。
トキシン中和試験
さまざまなCTB誘導体およびLTBによるマウスへの第３免疫後に得られた血清は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞アッセイ（Guerrant and Brunton, et al., 1974）において、CTB-セファロースによる吸収前および後のCTまたはLTの毒性を阻害する能力に関して試験された。非吸収血清は最初に１：20に希釈した。その結果の血清の50mlアリコートは、次に、２分割してマイクロタイタープレート中で３倍希釈により連続希釈した。２分割ウエルの第一群には、１％BSAを含む50μlのHAM F12培地中の0.2ng CTを加え、そして第二群には同じ培地中のLT溶液を加えた。これらのプレートを１時間室温においてインキュベートしてから、F12 HAM培地中の２×105細胞/ml懸濁液100μlをすべてのウエルに加えた。10％CO2，５％Ｏ2雰囲気中で、１時間、37℃においてインキュベートを進行させた。これらの細胞をメタノールで固定して、ギムザ溶液（メルク）で染色した。光学顕微鏡によりこれらの細胞の損傷を観察した。それらをCTB-セファロースビーズで吸収させた後に同じ方法を血清に適用した。すべての実験は、２分割して実施した。
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配列表
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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