(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
【化１】
0004187441.tif 000014
の化合物、またはその製薬学的に許容し得る塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物を含有する、製薬学的使用のための調整物。
【請求項３】
腫瘍脈管構造を選択的に標的とし、そして破壊することに使用するための、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
腫瘍細胞と請求項１に記載の化合物の有効量とを接触させることによる、インビトロでチューブリン重合を阻害する方法。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物と製薬学的に許容しうるキャリアーとを含んでなる製薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
チューブリンは、近年、固形腫瘍の治療のための新しい薬物設計におけるもっとも魅力的な治療上の標的の一つである。1c  数種の命名をもつ、コンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ−４）プロドラッグおよびドラスタチン１０の成功見込みとともに、ビンクリスチンおよびタキソールの予告された成功は、がん治療のためのこれらの抗有糸分裂剤の臨床上の効能を堅固たるものとして確立した。
【０００２】
固形腫瘍がんの治療に対する積極的な化学療法戦略は、チューブリンとの直接結合性相互作用をとおしてそれらの効果を仲介する構築上新規な、そして生物学的により強力な抗腫瘍、抗有糸分裂剤の開発に依存することが続いている。強力な細胞毒性と抗腫瘍活性を例証する種々の臨床的に有望な化合物は、それらの主要な作用様式をチューブリン重合の有効な阻害をとおして達成することが知られている。1  この種の化合物は、偏在するタンパク質チューブリンへの最初の相互作用（結合）を経て、これが、順に、細胞の維持と分裂のために必須な成分である微小管へと重合するチューブリンの能力を阻止する。2  細胞周期の中期の間、核膜は破壊され、そしてタンパク質チューブリンは中心体（また、微小管形成中心とも呼ばれる）を形成することができ、そしてチューブリンの重合と脱重合をとおして、分裂する染色体が分離される。近年、もっとも認識され、臨床的に有用なこの種の抗有糸分裂、抗腫瘍剤のメンバーは、タキソール4とともにビンブラスチンおよびビンクリスチン3である。さらに、天然の生産物、リゾキシン5、コンブレタスタチンＡ−４およびＡ−２6、クラシンＡ1、ポドフィロトキシン7、エポチロンＡおよびＢ8、ドラスタチン１０9およびウェルウィスタチン10（数種の命名をもつ）ならびにフェンスタチン11、２−スチリルキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（ＳＱＯ）12を含むある種の合成類似体、およびシス−およびトランス−スチルベンの高酸素化誘導体13およびジヒドロスチルベンはすべて、チューブリンとの結合相互作用をとおしてそれらの細胞傷害性活性を仲介することが知られている。この結合部位相互作用の正確な性質は多くは不明のままであり、そして一連の化合物間で明確に異なる。光親和性標識および他の結合部位解明技術は、チューブリン上の数種のキー結合部位を同定した：コルヒチン部位、ビンカアルカロイド部位、およびタクソールが結合する重合微小管上の部位。1a，14
発明の概要
本研究の重要な基本的および本質的態様は、チューブリンの両αおよびβサブユニットの「小分子」結合ドメインの、分子レベルにおける詳細な理解を必要とする。α、βチューブリンヘテロ二量体の３次構造は、電子結晶学として知られる技術を用いて３．７Åの解像度において、Ｄｏｗｎｉｎｇおよび共同研究者らによって本年初期に報告された。15  この輝かしい業績は、この構造の解明に対向された１０年間の研究を最高点に達せしめ、そして光親和性および化学的親和性標識のような技術をとおして、小分子結合部位、例えばコルヒチン部位の同定を可能にするに違いない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ３−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−２−（４’−メトキシフェニル）−６−メトキシベンゾ［ｂ］チオフェンを具体的に説明する。
【図２】  ２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−（４’−メトキシフェニル）−６−メトキシベンゾ［ｂ］フランを具体的に説明する。
【図３】  ベンゾ［ｂ］チオフェンフェノール（ＢＢＴ−ＯＨ）を具体的に説明する。
【図４】  ベンゾ［ｂ］チオフェンプロドラッグ（ＢＢＴ−Ｐ）を具体的に説明する。
【図５】  ベンゾ［ｂ］チオフェンプロドラッグ（ＢＢＴ−Ｐ）についてのイン・ビボ生物学的データを具体的に説明する。
【図６】  フェニルインドール誘導体製造のための合成過程を具体的に説明する。
【図７】  ２−フェニルインドール（芳香族領域）化合物３１についてのＣＯＳＹ  ＮＭＲを具体的に説明する。
【図８】  アリール移動なしの環化異性体（その形成についての証拠はない）を具体的に説明する。
【図９】  ワンポット反応における２−フェニルインドール３１の製造を具体的に説明する。
【図１０】  インドールに基づく類似体の製造についての設計された合成過程を具体的に説明する。
【図１１】  インドールに基づく類似体の製造を具体的に説明する。
【図１２】  インドールに基づくジナトリウムプロドラッグ塩の合成を具体的に説明する。
【図１３】  インドールに基づくジナトリウムプロドラッグのその他の合成を具体的に説明する。
【図１４】  インドールに基づくジナトリウムプロドラッグのその他の合成を具体的に説明する。
【図１５】  インドールに基づくホスホルアミデートプロドラッグの合成を具体的に説明する。
【図１６】  インドールに基づくジナトリウムプロドラッグ塩のその他の合成を具体的に説明する。
【図１７Ａ】  コンブレタスタチンＡ−４プロドラッグを具体的に説明する。
【図１７Ｂ】  ホスホルアミデート類似体１０を具体的に説明する。
【図１８】  ホスホルアミデート１０の合成を具体的に説明する。
【図１９】  ホスホルアミデート合成のために使用されるモデル系を具体的に説明する。
【図２０】  （Ｚ）−３’−ニトロコンブレタスタチン類似体７Ｂからのホスホルアミデート１０の合成を具体的に説明する。
【図２１】  置換４−メトキシインドールアミンおよび／またはフェノールを具体的に説明する。
【図２２】  置換４−メトキシインドールホスフェートエステル部分およびホスホルアミデートを具体的に説明する。
【図２３】  さらなる置換４−メトキシインドールホスフェートエステル部分およびホスホルアミデートを具体的に説明する。
【図２４】  置換６−メトキシインドールアミンおよび／またはフェノールを具体的に説明する。
【図２５】  置換６−メトキシインドールホスフェートエステル部分およびホスホルアミデートを具体的に説明する。
【図２６】  置換６−メトキシインドールホスフェートエステル部分およびホスホルアミデートを具体的に説明する。
【図２７】  置換４−メトキシ−３−アリールインドールアミンおよび／またはフェノールを具体的に説明する。
【図２８】  置換４−メトキシ−３−アリールインドールホスフェート部分およびホスホルアミデートを具体的に説明する。
【図２９】  さらなる置換４−メトキシ−３−アリールインドールホスフェート部分およびホスホルアミデートを具体的に説明する。
【図３０】  ２−（４’−メトキシフェニル）−３−（３”，４”，５”−トリメトキシベンゾイル）−４−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図３１】  ２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−（４”−メトキシフェニル）−６−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図３２】  ２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−（４”−メトキシフェニル）−４−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図３３】  ジナトリウム２−（３’−ホスホルアミデート−４’−メトキシフェニル）−３−（３”，４”，５”−トリメトキシベンゾイル）−６−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図３４】  ２−（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシフェニル）−３−（３”，４”，５”−トリメトキシベンゾイル）−４−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図３５】  ２−（３’−アミノ−４’−メトキシフェニル）−３−（３”，４”，５”−トリメトキシベンゾイル）−４−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図３６】  ジナトリウム２−［（４’−メトキシフェニル）−３’−Ｏ−ホスフェート］−３−（３”，４”，５”−トリメトキシベンゾイル）−４−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図３７】  ２−（３’−ジエチルホスホルアミデート−４’−メトキシフェニル）−３−（３”，４”，５”−トリメトキシベンゾイル）−４−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図３８】  ジナトリウム２−（３’−ホスホルアミデート−４’−メトキシフェニル）−３−（３”，４”，５”−トリメトキシベンゾイル）−４−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図３９】  ２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−（３”−ヒドロキシ−４”−メトキシフェニル）−６−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図４０】  ２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−（３”−アミノ−４”−メトキシフェニル）−６−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図４１】  ジナトリウム２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−［（４”−メトキシフェニル−３”−Ｏ−ホスフェート）−６−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図４２】  ２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−［（４”−メトキシフェニル−３”−ジエチルホスホルアミデート）］−６−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図４３】  ジナトリウム２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−［（４”−メトキシフェニル−３”−ホスホルアミデート）−６−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図４４】  ２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−（３”−ヒドロキシ−４”−メトキシフェニル）−４−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図４５】  ２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−（３”−アミノ−４”−メトキシフェニル）−４−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図４６】  ジナトリウム２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−［（４”−メトキシフェニル−３”−Ｏ−ホスフェート）−４−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図４７】  ２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−［（４”−メトキシフェニル−３”−ジエチルホスホルアミデート）］−４−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図４８】  ジナトリウム２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−［（４”−メトキシフェニル−３”−ホスホルアミデート）−４−メトキシインドールを具体的に説明する。
【図４９】  コンブレタスタチンＡ−４の置換３−ホスホルアミデート誘導体を具体的に説明する。
【図５０】  ジナトリウム（Ｚ）−１−［（４’−メトキシフェニル）−３’−ホスホルアミデート］−２−（３”，４”，５”−トリメトキシフェニル）エテンを具体的に説明する。
【図５１】  コンブレタスタチンＡ−４の置換３−ホスホルアミデート塩を具体的に説明する。
発明の詳細な記述
本発明者らは、新規な抗有糸分裂剤の発見が、適当に置換された形態（すなわち、フェノール性部分など）において、チューブリン結合のために必須と考えられる構造的特徴（アリールアルコキシ基、ある種のハロゲン置換など）により適当に改変された、エストロゲン受容体（ＥＲ）と相互作用する分子鋳型（スカホールド）の妥当な組み合わせ物から生じることを示唆する作業仮説を開発した。メトキシアリール官能基は、ある種の類似体におけるコルヒチン結合部位において相互作用を増強するために特に重要であると考えられる。16  ＥＲ分子鋳型に関するこの仮説の定式化において、本発明者らの最初の設計および合成努力は、ラロキシフェン、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．17によって開発された選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）であるラロキシフェンにならって作成されたベンゾ［ｂ］チオフェンリガンドに集中した。最初の研究は、非常に活性なベンゾ［ｂ］チオフェンに基づく抗チューブリン剤の製造をもたらした。18-21  本仮説のさらなる支持において、最近の研究は、構造的に改変されたエストラジオール同族体（例えば、２−メトキシエストラジオール）としてのある種のエストロゲン受容体（ＥＲ）結合化合物が、チューブリンと相互作用し、そしてチューブリン重合を阻害することを示した。22  もちろん、エストラジオールは、多分ヒトにおけるもっとも重要なエストロゲンであり、そしてこの化合物にメトキシアリールモチーフの付加が、それをチューブリンと相互作用性にさせるということは興味あることであり、そして有益である。また、２−メトキシエストラジオールがエストラジオールの自然の哺乳類代謝物であり、そして特に妊娠中に顕著である細胞成長調節的役割を演じるということは注目されるべきである。
伝統的なエストロゲン受容体（ＥＲ）結合化合物の分子骨格が、コルヒチンおよびコンブレタスタチンＡ−４の回想される構造モチーフにより改変されて、チューブリン重合のインヒビターを生成できるという設計前提は、新規な抗有糸分裂剤のベンゾ［ｂ］チオフェンおよびベンゾ［ｂ］フラン類によって確認された。18-21  各シリーズの先導化合物（図１および２）は、種々のヒトのがん細胞系統に対する顕著な生物学的活性を例証した。例えば、３，４，５−トリメトキシベンゾ［ｂ］チオフェン（図１）は、強い細胞毒性とチューブリン重合の阻害を例証した。ＮＣＩ６０細胞系統パネル23において、この化合物は平均パネルＧＩ50＝２．６３ｘ１０-7Ｍを生じる（表Ｉ参照）。
３−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−２−（４’−メトキシフェニル）−６−メトキシベンゾ［ｂ］チオフェンによるチューブリン重合の阻害。コンブレタスタチンＡ−４を用いる１．１μＭ薬物の同じアッセイによる最大チューブリン集合速度の５０％阻害は０．７３μＭの値を示す。
３−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−２−（４’−メトキシフェニル）−６−メトキシベンゾ［ｂ］チオフェンによるヒトのがん細胞系統研究（イン・ビトロ）。
表Ｉ．  ２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−（４’−メトキシフェニル）−６−メトキシベンゾ［ｂ］フランによるチューブリン重合の阻害。ＩＣ５０＝２．１ｐＭ（４ｐＭにおいて全くフラット）。
２−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−３−（４’−
メトキシフェニル）−６−メトキシベンゾ［ｂ］フランによる
ヒトのがん細胞系統研究（イン・ビトロ）。
【表１】0004187441.tif 000002
さらに、３，４，５−トリメトキシベンゾ［ｂ］チオフェン化合物（図３）のフェノール性誘導体は、宣言された細胞傷害性を有し、そしてチューブリン重合の顕著な阻害を例証し36、そしてこの化合物のプロドラッグ・ジナトリウムホスフェート塩型（図４）は、血管ターゲティングおよび破壊（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）剤（これは、チューブリン結合（薬物のフェノール型）36，37および続くチューブリン重合の阻害の成分を含む）としてイン・ビトロおよびイン・ビボの細胞傷害性を例証する。
最初のイン・ビボ研究は、非常に励みになるものである（図５参照）。メスのｓｃｉｄマウスが、ＭＨＥＣ接種（１ｘ１０-6／マウス）の１週間後、ＣＡ−４Ｐおよびベンゾ［ｂ］チオフェンホスフェートプロドラッグを４００ｍｇ／ｋｇにおいて単一用量ｉｐで投与された（すなわち、ＣＡ−４ＰのＭＤＴ）。研究は、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒｓ  Ｒｏｎａｌｄ  Ｗ．Ｐｅｒｏ  ａｎｄ  Ｋｌａｕｓ  Ｅｄｖａｒｄｓｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎとの共同研究により実施された（註：ＰｂＴプロドラッグ２０は、ＢＢＴ−Ｐと呼ばれる同じ化合物である）。
これらの有望な研究結果に基づいて、インドールに基づく抗有糸分裂剤の設計における関心が起き、そして合成経路（スキーム１−４，図３Ａ−Ｄ参照）が、ベンゾ［ｂ］チオフェン誘導体の合成にしたがって設計された。
構造的にコンブレタスタチンＡ−４に関係する、本明細書に記述される若干の新規なインドールに基づくリガンドは、また、抗血管形成活性を伴うさらなる生物学的機構を介して機能できるという可能性が明らかに存在する。明白なことは、発達する腫瘍細胞への血流を選択的に途絶させる能力は、がんに対する絶えざる骨の折れる戦いにおいて可能性のある突破口である。ある種のフェニルインドールは、チューブリン重合の阻害に関して注目された。27
インドールに基づくリガンド３３の典型的な合成は図６、９および１１において示される。第２級アミン３０は、塩基性条件（エタノール性水酸化カリウム）下０℃におけるｍ−アニシジンおよび２−ブロモ−４−メトキシアセトフェノンの処理によって作成された。アミン３０のＰＰＡとの処理は、２種の位置異性体の形成をもたらした。これらの異性体は、ＥｔＯＡｃ，ＣＨ2Ｃｌ2およびＥｔＯＨ中では乏しい溶解度をもつ。インドール３１はアセトン中での粉砕によって（インドール３２から）精製された。この異性体の構造はＮＭＲ解析によって確認された。ＣＯＳＹ  ＮＭＲは、プロトン間のカップリング関係を詳細に研究するために実施された。リガンド３１の芳香族領域についての拡大されたＣＯＳＹスペクトルが図５に示される。このＣＯＳＹ  ＮＭＲスペクトルは、各々が二重線として現れるＨaおよびＨb間に強いカップリングを示す。Ｈcは、小二重線中に窒素に結合されたプロトンとカップリングした。Ｈdは、Ｈeによってのみ対応する二重線にカップリングされたが、Ｈeは、オルトカップリング（Ｈd）およびメタカップリング（Ｈf）の両方によって二重線パターンの二重線にカップリングされた。Ｈfは、Ｈdによって二重線にカップルされた。２−フェニルインドール３１形成のさらなる証拠は、窒素を含有する環におけるプロトンＨcの化学シフトである。コンピューターモデリング（ＣｈｅｍＤｒａｗ  Ｕｌｔｒａ４．５）により、理論的化学シフト値６．４ｐｐｍがプロトンＨc（３位における）について予測され、これは、６．６ｐｐｍにおける実際のＮＭＲスペクトルにおいて示されるピークに一致する。プロトンが２位に存在する場合では（図８）、化学シフトは７．０３ｐｐｍであると予測され、これは、得られたスペクトルにおけるいずれのピークにも一致しない。これらの研究に集合的に基づき、異性体３１の形成が確認され、そしてメトキシフェニル系の移動が明らかにされた。他の異性体（インドール３２）は、アセトンに可溶であり、そして純粋な形態で得ることははるかに困難である（図６参照）。
あるいはまた、その他の合成方法が、所望の２−フェニルインドールの製造に適用することができる。１９８４年には、Ａｎｇｅｒｅｒと共同研究者は、内分泌障害の治療のための新しい治療剤開発への経路としてワン・ポット反応系列における２−フェニルインドールの合成（図９）を報告している。25
この操作（図９）にしたがって、２種のアリールレギオ異性体が良好な収量で得られた。ＥｔＯＨ中での再結晶化は、白色結晶性物質としての所望の異性体、２−フェニルインドール３１を生成した。
インドールに基づく類似体３３を合成するために、フリーデル・クラフトのアシル化反応が、ルイス酸ＡｌＣｌ3の存在下で塩化３，４，５−トリメトキシベンゾイルによりインドール３１を処理することによって実施された（図１０）。反応は、通常条件下では働かず、そして出発材料のみが生成後に得られた。反応温度を増大するか、または他のルイス酸、例えばＴｉＣｌ4を用いることによって反応条件を改変する試みは、同様に無駄であった。出発材料があらゆる場合において回収された。この結果に関する１つの可能な説明は、窒素原子（孤立電子対と酸性プロトンを含有する）がアシル化過程を壊すかもしれないという事実である。この解析にしたがって、フリーデル・クラフトのアシル化段階の前に、グリニャール試薬（臭化エチルマグネシウム）が使用されてこの窒素が保護された。なおも、出発材料のみが反応後に得られた。したがって、新規な合成アプローチがこの研究に持ち込まれた。
１９７７年には、Ｉｎｉｏｎと共同研究者は、種々のアミノアルコキシ−４−ベンゾイル−３−インドールの合成を報告した。26  ベンゾエートインドール生成物は、加熱（１３０−１５０℃）しつつ適当な塩化ベンゾイルによりインドールを処理することによって製造された。ＨＣｌがこれらの条件下で発生した。類似の合成アプローチが、所望のトリメトキシベンゾエートインドールリガンド３３の合成において使用された（図１１）。
前駆物質、インドール３１は、塩化トリメトキシベンゾイルとともに混合された。両試薬が固体であるので、高沸点の溶媒が必要であった。１，２−ジクロロベンゼンが、１８０℃の沸点をもつのでこの場合に選ばれた。これらの条件下で、インドール３３が、フラッシュカラムクロマトグラフィーおよび再結晶化による精製に続いて中等の収量で得られた。ＮＭＲ分光法は、インドール３３の構造が図１１において指示された構造であることを示唆している。
ベンゾ［ｂ］チオフェンおよびベンゾフラン類似体を用いて得られた有望な結果に基づいて、ホスフェート塩の製造が図１２−１４において詳述され、類似体の製造が図１５−１６において詳述され、そして類似のインドールに基づくホスフェートプロドラッグ塩およびホスホルアミデート誘導体の製造が図２１−５１に詳述される。
インドールに基づく抗有糸分裂剤に関するこの特許出願において記述されるホスフェートエステルプロドラッグに加えて、本発明者らは、また、コンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ−４）の窒素類似体のホスホラスに基づくプロドラッグが、選択的な腫瘍血管系破壊剤として治療上有利であるということを発見した。これ
【外１】
0004187441.tif 000003
るホスホルアミデート誘導体および関連ホスフェートジアニオンである。本発明者らは、２種の特定の化合物および数種の明白な類似体を記述しているが、３−アミノ−コンブレタスタチンＡ−４構造から組み立てられ、そして腫瘍血管系の選択的な破壊のためのプロドラッグとして類似の機能を示すであろう種々の他の置換体ホスホラス結合の設計が存在することは、いずれの当業者にも明らかである。
近年、コンブレタスタチンＣＡ−４が、また抗血管形成活性を例証することが示された24ので、さらなる意義は、コルヒチン部位に結合する新規な薬物に与えられる。がん化学療法の明らかになりつつある領域は、発達中の腫瘍の新しい微細血管形成を破壊する抗血管形成薬物ならびに健全な細胞を生存させたまま腫瘍細胞の血管を選択的に標的とする血管ターゲティングおよび破壊剤の両方の開発に集中している。コンブレタスタチンＣＡ−４Ｐプロドラッグ（図１７Ａ）は、この血管ターゲティングを表す既知の世界的化合物の比較的小さいコレクション中からの先導的な新規候補の１つである。１９７０年代に南アフリカにおけるヤナギ（ｗｉｌｌｏｗ）の木（コンブレタム・カッフルム（ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｃａｆｆｒｕｍ）からＰｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｒ．Ｐｅｔｔｉｔ（Ａｒｉｚｏｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって発見されたこの化合物は、近年、ＯＸｉＧＥＮＥ，Ｉｎｃ．によって後援され、そして実施許諾された第１相臨床評価を受けつつある。
コンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ−４）は、β−チューブリン上のコルヒチン部位に結合するチューブリン重合の強力なインヒビターである。興味あることに、ＣＡ−４それ自体は腫瘍血管系の破壊を例証しないが、ＣＡ−４プロドラッグは、腫瘍血管系破壊に関して非常に活性がある。プロドラッグのホスフェートエステル部分が、亢進した血管形成の部位において選択的に脱リン酸化（多分、内皮アルカリホスファターゼの作用を介して）を受けて強力なＣＡ−４自体を現し、これがチューブリン重合の阻害をとおして腫瘍細胞を破壊することは非常にあり得ることである。腫瘍細胞は多産の血管形成部位を表し、そしてアルカリホスファターゼは腫瘍血管を裏張りする内皮細胞において高い濃度で存在すると考えられるので、脱リン酸化事象は、腫瘍細胞において選択的に起きる。この亢進した血管形成の必要性は、健全な細胞については必要ではない。したがって、この二重様式の反応性プロフィルは、健全な細胞以上に選択的に腫瘍細胞を標的とするためには、明らかに重要である。これは、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｒｏｎａｌｄ  Ｐｅｒｏ（ＯＸｉＧＥＮＥ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｕｎｄ）によって提出された提案であり、これに対する種々の強い証拠が得られた。
コンブレタスタチンＡ−４の３’−窒素類似体について得られた良好かつ有望な生物学的結果に一部基づいて、ホスホルアミデート類似体が、新規なコンブレタスタチンＡ−４窒素プロドラッグとして製造された（図１７Ｂ）。
下記のホスホルアミデート１０は、関係のないアリールアミンについてのＴａｙｌｏｒおよび共同研究者によって報告された操作にしたがって得られた。28  アリールアミン７Ｂの無水エーテル中ジエチルクロロホスファイトによる処理、続くｍ−ＣＰＢＡによる酸化が、中等度の収量においてホスホルアミデート１０を生成した（図１８）。
ホスホルアミデート類似体１０のの合成における従来の試みは、Ｂｉｌｈａ  ａｎｄ  Ｌａｒｉｓａ  Ｓｈｅｉｈｅｔによって報告された方法を利用した。29この方法は、ホスホルアミデート中間体を提供するが、これは、ビフィリック（ｂｉｐｈｉｌｉｃ）試薬としてジエチルクロロホスファイトを用いる、対応するアリールアミンへのニトロアリール化合物の還元から単離できる。（Ｚ）−ニトロコンブレタスタチン類似体７Ｂは、ホスホルアミデートプロドラッグ１０の合成のための効果的な出発材料と考えられた。また、この反応は、モデル系として（Ｚ）−１−（３’，４’，５’−トリメトキシフェニル）−２−（４”−ニトロフェニル）エテン（既に報告された他のコンブレタスタチン含有類似体と類似の方法において合成される）を用いて試みられた（図１９）。いずれの場合でも、ホスホルアミデート生成物は観察されなかった。スチルベン系における強力な電子供与置換基としてのメトキシ基の存在が反応には好ましくないと考えられる（図２０）。
ホスホルアミデート（例えば１０）およびそれらの関連する塩（−ＮＨＰＯ3-2２Ｎａ+）を製造するために使用できる種々の他の合成方法があることはホスホルアミデート化学のホスフェートの技術に熟達したいずれの者にとっても明白であろう。
表ＩＩ．30  ホスホルアミデート類似体１０のイン・ビトロヒトがん細胞系統研究．ＧＩ50，ＴＧＩおよびＬＣ50はμｇ／ｍｌにおける濃度として報告される  ＮＤ＝決定不能
【表２】0004187441.tif 000004
生物学的評価（イン・ビトロ）は、ホスホルアミデートプロドラッグ１０が、対応するアミン８よりも効果が低いことを示唆する（表ＩＩ）。Ｐｅｔｔｉｔおよび共同研究者は、本来の化合物に比較してコンブレタスタチンＡ−４およびフェンスタチンのホスフェートプロドラッグについて、イン・ビトロの生物学的活性における同じような喪失を報告した（表ＩＩＩ）。31  これらの結果は、大きいホスホラス基と結合部位認識に対するその立体的障害とによって説明することがでる。事実、Ｐｅｔｔｉｔおよび共同研究者は、コンブレタスタチンプロドラッグによるチューブリン重合の阻害がないが、フェンスタチンプロドラッグについてはフェンスタチンに比較して４０％の活性が存在することを報告した。チューブリン重合の阻害のＩＣ50値は、ＣＡ−４について１．２±０．１μＭ、ＣＡ−４プロドラッグについて＞８０μＭ、フェンスタチンについて１．０±０．２μＭおよびフェンスタチンプロドラッグについて２１±３μＭである；類似の結果は、アミノ−ＣＡ−４  ８およびホスホルアミデート１０について期待される。31  アミノ−ＣＡ−４  ８についてのＩＣ50は１．２±０．０２μＭであり、そしてホスホルアミデート１０はいかなる活性もほとんどもたない。32
表ＩＩＩ．  アミン−ＣＡ−４  ８、アミン−ＣＡ−４プロドラッグ１０、フェンスタチン、フェンスタチンプロドラッグおよびコンブレタスタチンＡ−４プロドラッグについてのヒトがん細胞系統に対する比較ＧＩ50値。ＧＩ50は、μｇ／ｍｌにおける濃度として報告される  ＮＤ＝決定不能a  ＤＲ．Ｇｅｏｒｇｅ  Ｒ．Ｐｅｔｔｉｔと共同して得られたデータ。30b  フェンスタチンホスフェートの合成から得られたデータ。
【表３】0004187441.tif 000005
イン・ビボ系に関しては、ホスホルアミデート類似体１０は、アミン８よりも可溶性の化合物を提供するので、それによってその生物学的利用性を増大することができる。イン・ビボの生物学的条件下で、Ｐ−Ｎ結合は、血清ホスファターゼによって切断されてアミンを遊離するが、これはコンブレタスタチンと類似の方式でチューブリン重合を阻害できる。
抗血管形成
腫瘍の成長は、細胞分裂の間に要求されるすべての代謝産物を提供できる血管の生成に依存している。抗血管形成化合物の開発は、固形腫瘍の治療において特に有用であるが、その理由は、これらの化合物が、健全な細胞を生存状態で残しつつ腫瘍細胞の血管系を選択的に破壊する強い能力をもっているからである。コンブレタスタチンＡ−４プロドラッグは、薬物の小用量が腫瘍血管系に対して毒性があるので抗血管形成活性を例証した。34  増強された細胞毒性は、がん性細胞の腫瘍血管系に係わる内皮細胞に対して観察されたが、同じ時点で、腫瘍自体から離れて位置している他の内皮細胞に対しては効果をもたないことが報告された。34，35  血管の発達が固形腫瘍の生存と増殖のためには決定的であるので、がん治療のための抗血管形成薬物としてのコンブレタスタチンＡ−４プロドラッグの作用機構が研究されつつある。抗血管形成に関する１つの提案されたメカニズムは、壊死に代わる細胞のアポトーシス（細胞の自殺）の誘導を必要とする。内皮細胞のアポトーシスを誘導するための、構造的に類似の化合物とともに、新規なホスホルアミデート１０の能力の評価は、近い将来において着手されるであろう。
ホスホルアミデート類似体の合成
（Ｚ）−１−（３’−ジエチルホスホルアミデート−４’−メトキシフェニル）−２−（３”，４”，５”−トリメトキシフェニル）エテン１０
ジエチルクロロホスファイト（０．１０３ｇ，０．６６ｍｍｏｌ）を、無水ジエチルエーテル（２．５ｍｌ）に溶解し、そして−７８℃まで冷却した。ジイソプロピルエチルアミン（０．１８７ｇ，１．４５ｍｍｏｌ）を、Ｅｔ2Ｏ（１．０ｍｌ）に溶解し、そして注射器によって反応混合液に２分間にわたって徐々に添加した。アミノ−スチルベン８を、Ｅｔ2Ｏ（１．０ｍｌ）に溶解し、そして注射器によって反応混合液に徐々に添加した。反応混合液を窒素下−７８℃で２時間撹拌し、続いて室温で１時間撹拌した。混合液を濾過し、そして溶媒を減圧下で除去した。黄色オイルを得て、乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（５ｍｌ）中に溶解した。オイルを−４０℃に冷却し、そしてＣＨ2Ｃｌ2（５ｍｌ）中ｍ−ＣＰＢＡ（０．１９３ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）溶液を添加した。それを室温で１時間以上撹拌した。この時間後、反応混合液を−４０℃に冷却し、そして焼結ガラスロートをとおして濾過した。液は、反応を止めるために、亜硫酸ナトリウム（５％）（２０ｍｌ）上に激しく撹拌しながら収集した。生成物は、ＣＨ2Ｃｌ2で抽出して単離し、そしてＮａＨＣＯ3飽和溶液で洗浄した。得られた黄色オイルをＭｇＳＯ4上で乾燥した。フラッシュクロマトグラフィー（７０／３０，ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）による精製で黄色オイルとしてのホスホルアミデート１０（０．１３０ｇ，０．２９ｍｍｏｌ、４４％）を得た。
1H-NMR(CDCl3,360MHz)δ7.12(d,J=1.9Hz,IH,ArH),6.88(dd,J=8.4Hz,2.0Hz,IH,ArH),6.72(dd,J=8.4Hz,1.7,IH,ArH),6.49(s,2H,ArH),6.51(d,J=12.1Hz,IH,vinyl CH),6.41(d,J=12.1Hz,IH,vinyl CH),5.67(d,J=10.0Hz,NH),4.02(m,4H,CH2),3.83(s,3H,OCH3),3.83(s,3H,OC3),3.68(s,6H,OCH3),1,25(t,6H,J=7.1Hz,CH3).
13C-NMR(CDCl3,90MHz)δ152.7,146.7,146.6,137.0,132.7,130.3,129.7,129.1,129.0,122.0,117.0,109.9,106.0,62.8,60.7,55.7,16.1.
31P-NMR(CDCl3,145MHz)δ0.84.
HRMS(EI)M+ C22H30NO7Pについての計算値 451.1760,実測値 451.1765.
実施例１
インドールに基づく抗チューブリン剤の合成
２−フェニルインドール３１の製造
方法Ｉ（２段階）：
ｒｔにおいてＥｔＯＨ（１８ｍｌ）およびＨ2Ｏ（９ｍｌ）中ＫＯＨ（０．９２６ｇ，１６．５ｍｍｏｌ）の十分な撹拌溶液に、注射器によってｍ−アニシジン（２．１９２ｇ，１７．８０ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、溶液を０℃で撹拌した。１０分後、２−ブロモ−４−メトキシアセトフェノン（０．０９ｇ，１７．８０ｍｍｏｌ）溶液を、４０分間かけて添加ロートによって滴下した。０℃〜ｒｔにおいて２０時間後、水を添加した。生成物を抽出（ＩＨ  ＨＣｌ，ＮａＨＣＯ3，食塩水、ＭｇＳＯ4）によって単離した。生成物を再結晶化（５０：５０  ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって精製して、黄色固体として第２級アミン３０（２．４６ｇ，９．０７ｍｍｏｌ，５２％）を得た。
1H NMR(CDCl3):δ7.98(2H,D,J=8.9Hz),7.12(IH,t,J8.1Hz),6.97(2H,d,J8.9Hz),6.30(3H,m),4.54(2H,s),3.88(3H,s),3.79(3H,s).
ポリリン酸（ＰＰＡ）を丸底フラスコに加え、そして激しく撹拌しながら温度を８０℃まで上げた。このフラスコに先のアミン３０（４．０ｇ，１４．７４ｍｍｏｌ）３０分間かけて６回に分けて添加した。８０℃〜９０℃において２時間後、水を添加した。生成物を抽出（ＥｔＯＡｃ，ＮａＨＣＯ3，食塩水、ＭｇＳＯ4）によって単離した。再結晶化（アセトン）による精製で、淡黄色固体としてインドール３１（０．５４４ｇ，２．１５ｍｍｏｌ，１５％）を得た。
1H NMR(CDCl3):δ11.24(IH,br,s),7.72(2H,d,J8.82Hz),7.36(IH,d,J=8.57Hz),7.00(2H,d,J=8.84Hz),6.85(IH,d,J=2.07Hz),6.66(IH,d,J=1.66Hz),6.63(IH,dd,J8.59,2.28Hz),3.78(3H,s),3.77(3H,s).
13C NMR(CDCl3):δ158.15,155.22,137.44,136.33,125.60,124.93,122.82,120.04,114.07,109.00,96.97,94.01,54.93,54.88.
方法２（１段階）：
ｍ−アニシジン（１．５６ｍｌ，２０．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアニリン（３．５ｍｌ）の沸騰混合液に、２−ブロモ−４−メトキシアセトフェノン（ＥｔＯＡｃ中１．３７ｇ，６．００ｍｍｏｌ）を、注射器によって徐々に添加した。添加後、混合液を１７０℃で１時間維持した。反応混合液を室温まで冷却し、そして暗色固体を形成した。ＨＣｌ（２Ｎ）とともにＥｔＯＡｃを添加した。水層をＥｔＯＡｃで数回抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、そしてＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒を減圧下で除去して、暗褐色固体を得た。ＥｔＯＨ中での再結晶化による精製で、白色結晶状物質としてインドール３１をを得た。
1H NMR(CDCl3):δ11.24(IH,br,s),7.72(2H,d,J8.82Hz),7.36(IH,d,J8.57Hz),7.00(2H,d,J=8.84Hz),6.85(IH,d,J=2.07Hz),6.66(IH,d,J=1.66Hz),6.63(IH,dd,J8.59,2.28Hz),3.78(3H,s),3.77(3H,s).
13C NMR(CDCl3):δ158.15,155.22,137.44,136.33,125.60,124.93,122.82,120.04,114.07,109.00,96.97,94.01,54.93,54.88.
融点：208-229.5℃
HRMS(El)M+ CH16NO2についての計算値 253.3035,実測値 253.1060.
トリメトキシベンゾエート２−フェニルインドール３３の製造
ｏ−ジクロロベンゼン（１０ｍｌ）中インドール３１（０．５０２ｇ，１．９８ｍｍｏｌ）の十分な撹拌溶液に、塩化トリメトキシベンゾイル（０．６９２ｇ，３．００ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合液１２時間加熱還流した。溶媒を減圧蒸留によって除去した。室温まで冷却後、暗色固体が形成され、これをクロロホルム中に溶解し、そして溶出液としてクロロホルムによるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。回収された混合液を再びカラムクロマトグラフィー（５０：５０  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、黄色オイル状ゲルとしてトリメトキシベンジルインドール３３（０．７４４ｇ，１．６６ｍｍｏｌ，８４％）を得た。エタノールおよびヘキサンの混合液から再結晶化によって淡黄緑色結晶を得た。
1H NMR(CDCl3):δ8.63(IH,br,s),7.88(IH,d,J=9.39Hz),7.24(2H,d,J=8.78Hz),6.95(2H,s),6.90(2H,m),6.71(2H,d,J=8.79Hz),3.86(3H,s),3.80(3H,s),3.73(3H,s),3.68(6H,s);
13C NMR(CDCl3):δ192.23,159.73,157.06,152.42,142.85,141.01,136.41,134.65,130.16,124.28,122.94,122.17,113.67,112.46,111.52,107.24,94.54,60.78,55.92,55.54,55.14.
融点：153-155℃
分析：C26H25NO6についての計算値:C,69.79;H,5.63;H,3.13.実測値:C,69.61;H,5.63;N,3.01.
実施例２
チューブリン重合の阻害アッセイ
チューブリン重合についてのＩＣ50値を、Ｂａｉらによって記述された操作にしたがって決定した。精製されたチューブリンは、Ｈａｍｅｌ  ａｎｄ  Ｌｉｎにおいて記述されたようにウシ脳細胞から得られた。種々の量のインヒビターが、精製チューブリンとともに３７℃で１５分間プレインキュベートされた。インキュベート後、反応液を冷却し、そしてＧＴＰを添加してチューブリン重合を誘導した。次いで、重合が、Ｇｉｆｏｒｄ分光光度計において３５０ｎｍでモニターされた。最終反応混合液（０．２５ｍｌ）は、チューブリン１．５ｍｇ／ｍｌ、微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）０．６ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍＭＧＴＰ、０．５ｍＭＭｇＣｌ2、４％ＤＭＳＯおよび０．１Ｍ４−モルホリンエタンスルホネートバッファー（ＭＥＳ，ｐＨ６．４）を含有した。ＩＣ50は、インヒビター不在下で起きる阻害量に関してチューブリン重合を５０％阻害するのに必要なインヒビター量である。３−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−２−（４’−メトキシフェニル）−６−メトキシインドールについて決定されたＩＣ50は０．５−１．５μＭであった。
実施例３
Ｐ３８８白血病細胞を用いる細胞毒性アッセイ
新規に製造された化合物の１種が、以下およびＭｏｎｋｓらにおいて記述されるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの操作に類似するアッセイ系を用いて、Ｐ３８８白血病細胞に対する細胞毒性について評価された。３−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−２−（４’−メトキシフェニル）−６−メトキシインドールのＥＤ５０値（細胞増殖の５０％を阻害するのに必要な有効用量として定義される）は、０．０１３３μｇ／ｍｌであることが見い出された。
実施例４
他のがん細胞系統に対する増殖阻害活性
３−（３’，４’，５’−トリメトキシベンゾイル）−２−（４’−メトキシフェニル）−６−メトキシインドールが、膵臓、卵巣、ＣＮＳ、肺−ＮＳＣ、結腸および前立腺系を含む、数種のヒトがん細胞系統に対する増殖阻害活性に関して評価された。使用されたアッセイは、Ｍｏｎｋｓらによって記述されている。簡単に言えば、特定の細胞タイプおよび期待される標的細胞濃度にしたがって希釈された細胞懸濁液（細胞増殖特性に基づいて１ウェル当たり５，０００−４０，０００細胞）が、９６穴ミクロタイタープレートにピペット（１００μｌ）によって添加された。接種細胞は、安定化のために３７℃で２４−２８時間プレインキュベーションさせた。インヒビター化合物とのインキュベーションは、５％ＣＯ2雰囲気および１００％湿度下で４８時間継続させた。細胞増殖の決定は、細胞のインサイチュー固定と、それに続く細胞高分子の塩基性アミノ酸に結合するタンパク質結合染料、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）による染色によって行われた。可溶化された染色が分光光度計によって測定された。これらのアッセイの結果が表１において示される。ＧＩ50は、腫瘍細胞増殖を５０％阻害するのに必要な用量として定義される。
表ＩＶ．  選ばれたヒトがん細胞系統に対するインドールリガンドの活性（イン・ビトロ）
【表４】0004187441.tif 000006
治療効力をもつインドールおよびインドール含有化合物は、長い間知られていた。本明細書に記述されるインドール化合物に関して真にユニークなことは、これらの化合物が、擬アリール−アリールｐｉスタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）相互作用が起きるように適当な分子コンホメーションにおいて配列されたコルヒチンおよびコンブレタスタチンＡ−４を想起させる３，４，５−トリメトキシアリールモチーフを組み入れている最初の（本発明者の知識の及ぶ限りでは）インドールに基づくリガンドであるという事実である。適当なセントロイド間の（ｃｅｎｔｒｏｉｄ−ｔｏ−ｃｅｎｔｒｏｉｄ）距離（約４．７Å）をもつそのようなアリール−アリール相互作用が、β−チューブリン上のコルヒチン部位への増強される結合親和力のために必須であるということが本発明者らの主張である。最終的に細胞毒性現象としてそれ自体を表現するチューブリン重合の阻害をもたらすのがこの結合である。擬ｐｉ−ｐｉスタッキングを受けることができる類似の分子コンホメーションをもたらす方式で、インドール分子骨格の周囲にトリメトキシアリールおよびトリメトキシアロイル基を付加する種々の方法があることは、当該技術分野において熟達したいかなる実施者にとっても直ちに明らかであろう。さらに、トリメトキシアリールモチーフは増強されるチューブリン結合のためには最適であるように見えるけれども、いずれか三置換パターンまたは二置換（１種類のアルコキシ部分による）および一置換（種々のアルコキシ部分による）として、あるいは３つの異なる種類のアルコキシ部分をもつアルコキシ置換体（例えばエトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、アリルオキシなど）のその他の組み合わせが、また良好なチューブリン結合特性をもつことも、また非常に可能性がある。また、アリールアルコキシ基をもつ代わりに、単純にアリール−アルキルおよびアリール−アルケニル部分を置換することもまた可能であり、そしてなお増強された細胞毒性プロフィルを維持することが考えられる。フェノール性基は、また、これらの前記インドールリガンドへの活性をもつであろう。これらの改変されたインドール−リガンドのいずれの合成も、当該技術分野における熟達したいずれの者にとって非常に率直であろうし、そしてその都度、最初の出発材料の異なる選択を必要とするだけであろう。これらの代替リガンドを作成するために、同じ合成スキーム（図６，９，１１，１２−１６）、またはわずかな改変のみをもつ類似のスキームが用いられる。ベンゾ［ｂ］チオフェンリガンドによる従来の研究において、本発明者らは、カルボニル基が酸素と置換されて、チューブリンに対して同じかまたは類似の生物学的効力を維持する新規な化合物が生成できることを例証した。同様にして、前記インドールリガンドにおけるカルボニル基の置換は、酸素原子（エーテル結合）と置換されて、チューブリンに対して良好な活性をもつことが予測される新規な誘導体を生成するであろう。この化合物は、ベンゾ［ｂ］チオフェン化合物について本発明者らによって記述された求核試薬としてトリメトキシフェノール性アニオンを利用するさらなる脱離反応によって製造することができる。アリール  アリール環の間の他の結��原子はが同様に考えられる。
本明細書に開示され、そして特許請求される組成物および方法のすべては、本開示に照らして過度の実験なしに作成され、そして実施することができる。本発明の組成物および方法は好適な実施態様に関して記述されたが、種々の改変が、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、組成物および／または方法に対して、そしてここに記述される方法の段階または段階の配列において適用できることは、当業者にとって明らかである。より具体的には、両化学的および生理学的に関連するある種の薬剤が、同じかまたは類似の結果が達成されつつ、本明細書に記述された薬剤を置換できることは明らかである。当業者にとって明白なそのような類似の置換物および改変物のすべては、付随する請求項によって定義される本発明の精神、範囲および概念内にはいると考えられる。
【表５】0004187441.tif 000007
【表６】0004187441.tif 000008
【表７】0004187441.tif 000009
【表８】0004187441.tif 000010
【表９】0004187441.tif 000011
【表１０】0004187441.tif 000012
【表１１】0004187441.tif 000013
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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