(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物が存在するか存在しないかを分析するサンプルを保持する容器と、
微生物の増殖を保持する前記容器内の増殖培地と、
前記増殖培地から分離し、微生物の増殖のために変化する前記容器内の気体成分の濃度の変化に応答し、それによりサンプル中に微生物が存在するか存在しないかを示すことができる前記容器内のセンサと、
この装置の使用中に気体の通過を可能にする、前記容器の壁面内の気体透過性膜と、
前記気体透過性膜と隣接して配置された取り外し可能な気体不透過性シールとを含む、微生物を検出する装置。
【請求項２】
前記気体成分が、サンプル中に存在する微生物の代謝生成物である請求の範囲第１項に記載の装置。
【請求項３】
前記センサが、サンプル中の微生物の前記気体代謝生成物によるｐＨ変化に感能性である請求の範囲第２項に記載の装置。
【請求項４】
代謝生成物が二酸化炭素であり、前記センサが二酸化炭素の増加に感能性である請求の範囲第２項に記載の装置。
【請求項５】
前記センサが容器の一部の内部表面に取り付けられており、および容器の前記部分が実質的に透明である請求の範囲第１項に記載の装置。
【請求項６】
前記気体透過性膜が、容器内にサンプルを含むための疎水性バリヤである請求の範囲第１項に記載の装置。
【請求項７】
前記気体透過性膜が、５ないし約３０ｐｓｉの圧力に耐えるように構成される請求の範囲第６項に記載の装置。
【請求項８】
前記気体透過性膜が、１５ｐｓｉまたはそれを越える圧力に耐えるように構成される請求の範囲第６項に記載の装置。
【請求項９】
前記気体透過性膜が、２５ｐｓｉまたはそれを越える圧力に耐えるように構成される請求の範囲第８項に記載の装置。
【請求項１０】
前記気体透過性膜が、シリコーン、ポリプロピレン、アクリル共重合体、フッ素化エチレンプロピレン、低密度ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、およびポリメチルペンテンから選択した一つまたは複数の材料で形成される請求の範囲第１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記気体透過性膜を覆う密封性かつ気体不透過性の取り外し可能シールをさらに含む、請求の範囲第６項に記載の装置。
【請求項１２】
前記取り外し可能シールがプラスチックで被覆されたアルミニウムからなる請求の範囲第１１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記気体透過性膜が０．２ミクロンまたはそれより小さい孔サイズを有する、請求の範囲第１１項に記載の装置。
【請求項１４】
圧力下にある時に気体透過性膜の支持を提供するために、気体透過性膜の内部またはその付近に補強手段を備える請求の範囲第７項に記載の装置。
【請求項１５】
圧力下にある時に気体透過性膜の支持を提供するために、気体透過性膜の内部またはその付近に補強手段を備える請求の範囲第１１項に記載の装置。
【請求項１６】
前記気体透過性膜がポリテトラフルオロエチレンからなり、前記補強手段が前記気体透過性膜内部にあるポリプロピレン製の支持グリッドである請求の範囲第１４項に記載の装置。
【請求項１７】
前記補強手段が、気体透過性膜の両側に配置された二つの支持グリッドを含む請求の範囲第１５項に記載の装置。
【請求項１８】
気体透過性膜の周囲に隣接して配置されたＯリングをさらに含む、請求の範囲第１４項に記載の装置。
【請求項１９】
前記容器がボトルであり、前記気体透過性膜および気体不透過性シールがボトルキャップ内部に配置されボトルと適合する請求の範囲第１１項に記載の装置。
【請求項２０】
前記容器がボトルであり、前記気体透過性膜および気体不透過性シールがボトルキャップ内部に配置されボトルと適合し、前記補強手段が、ボトルキャップ内部に配置された前記気体透過性膜の位置と隣接した複数の開口をボトルキャップに含む請求の範囲第１５項に記載の装置。
【請求項２１】
前記気体透過性膜およびボトルキャップの開口の配列がＣ字型である請求の範囲第２０項に記載の装置。
【請求項２２】
前記センサがボトルキャップの内部に配置される請求の範囲第２０項に記載の装置。
【請求項２３】
前記センサがボトルの底部の内部に配置される請求の範囲第２０項に記載の装置。
【請求項２４】
前記気体透過性膜が、二酸化炭素より酸素に対する気体透過性が高い請求の範囲第１項に記載の装置。
【請求項２５】
前記気体透過性膜がポリメチレンペンテンからなる請求の範囲第２４項に記載の装置。
【請求項２６】
装置内の微生物の増殖を援助する流体媒体をさらに含む、請求の範囲第１項に記載の装置。
【請求項２７】
前記容器内に不活性気体をさらに含む、請求の範囲第１項に記載の装置。
【請求項２８】
前記気体が窒素および／またはＣＯ2である請求の範囲第２７項に記載の装置。
【請求項２９】
請求項１に記載の装置を用意する段階と、
装置から気体不透過性シールを除去する段階と、
被験サンプルを装置に加える段階と、
装置を所定温度でインキュベートする段階と、
インキュベート中に装置を振とうする段階であって、装置の気体透過性膜により流体媒体およびサンプルの装置外側への通過が制限され、同時に酸素の装置内への通過が可能である段階と、
装置内のセンサの任意の変化を検出し、装置内に微生物が存在するか存在しないかを決定する段階と
を含む、微生物が存在するか存在しないかということに関してサンプルを分析する方法。
【請求項３０】
装置内の流体媒体およびサンプルが気体透過性膜から漏れることなくこれを洗う程度に、装置を振とうする請求の範囲第２９項に記載の方法。
【請求項３１】
微生物が被験サンプル中に存在する場合には、前記微生物が増殖のために前記流体媒体を利用すること、および前記微生物が増殖することにより前記装置内で圧力となる気体の代謝生成物が生じ、前記気体透過性膜が装置内で生じた前記圧力に耐えるように構成される請求の範囲第３０項に記載の方法。
【請求項３２】
前記気体透過性膜が、５ないし３０ｐｓｉの圧力に耐えることができる請求の範囲第３１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記気体透過性膜が、少なくとも１５ｐｓｉの圧力に耐えることができる請求の範囲第３１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記気体透過性膜が、少なくとも２５ｐｓｉの圧力に耐えることができる請求の範囲第３１項に記載の方法。
【請求項３５】
振とうする間、垂直姿勢と倒立姿勢の間で前後に装置を揺り動かす請求の範囲第３０項に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験サンプルが血液サンプル、無菌体液サンプル、または食物サンプルである請求の範囲第２９項に記載の方法。
【請求項３７】
微生物が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、またはＭ．ｌｕｔｅｕｓである請求の範囲第３６項に記載の方法。
【請求項３８】
微生物がミコバクテリアである請求の範囲第３６項に記載の方法。
【請求項３９】
インキュベートする段階および振とうする段階の間、前記気体透過性膜を介して前記装置内に入ることができる酸素の方が、前記気体透過性膜を介して前記装置から外に出ることができる二酸化炭素より多い請求の範囲第２９項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願のクロスリファレンス
本特許出願は、１９９５年３月２４日出願の特許出願第０８／４１０３７４号の一部継続出願である。本特許出願はまた、すべて参照により本明細書の一部となるＴｕｒｎｅｒ他の米国特許出願第５２１７８７６号（１９９３年６月８日発行）、Ｃａｌａｎｄｒａ他の米国特許出願第５０９４９５５号（１９９２年３月１０日発行）、Ｔｈｏｒｐｅ他の米国特許出願第５３１４８５５号（１９９４年５月２４日発行）、ＤｉＧｕｉｓｅｐｐｉ他の米国特許出願第５１６４７９６号（１９９２年１１月１７日発行）、およびＴｕｒｎｅｒ他の米国特許出願第４９４５０６０号（１９９０年７月３１日発行）に関連する。
本発明は、増殖培地および密封した容器を使用して、試料を調製し、容器に加えた後で、容器内に侵入することなしに、試料のｐＨ、気体生成物（ＣＯ2、ＮＨ2、Ｈ2Ｓなど）または揮発性酸生成物の変化を検出／監視する方法およびデバイスを提供する。他の利点として、その上に取外し可能な気体不透過性シールを有する気体透過性膜が容器の壁に備えられる。検出すべき微生物が嫌気生物である場合、気体不透過性シールは適所に残される。検出すべき微生物が好気生物である場合、容器内に酸素が通過できるように、気体不透過性シールは除去される。好ましい実施形態では、気体透過性膜は、容器内の高い正または負の圧力に耐えられ、また容器内への酸素の通過を可能にし、かつ容器外への二酸化炭素の通過が少なくとも一部制限されるように構成される。（例えば、容器内の培地中に）容器内の気体、揮発性酸および／またはｐＨの濃度の差のために変化するセンサが備えられる。
発明の背景
従来、臨床試料中の微生物の存在は、栄養物の存在中で試料を培養し、ある時間期間後、試料の変化または試料上の雰囲気の変化から微生物の活動を検出することによって決定された。例えば、Ａｈｎｅｌｌ他の米国特許第４１８２６５６号では、炭素１３によりラベルされた発酵性基質からなる培地を有する容器内に試料を配置する。容器を密封し、試料を生物活動に対して伝導性の状況においた後、試料上の気体雰囲気中の炭素１３と炭素１２の比率を決定し、最初の比率と比較する。米国特許第４１５２２１３号では、容器内の気体の存在を監視し、試料上の雰囲気中の酸素の量の減少を検出することによって、密封された容器内で試料中の酸素を消費する細菌の存在を決定する。米国特許第４０７３６９１号は、ある時間期間後、試料上の気体雰囲気の特性の変化を測定することによって培地を含む密封された容器内で、細菌を含む生物活性物質の存在を決定する方法を提供する。気体雰囲気中のＣＯ2の変化の非侵襲性検出の方法は、１９８４年４月４日発行のＥＰＯ特許出願８３１０８４６８．６号に開示されているＳｕｐｐｍａｎ他によって教示されている。上記その他の特許出願に記載されている方法および装置はすべて、培養後に気体雰囲気の変化を測定するために放射測定方法または密封された容器の侵襲を必要とするか、または赤外光を通す特別な材料を必要とする。
試料、特に血液培養中の微生物の存在を測定する他の知られている方法には、温度、ｐＨ、混濁、色、生物発光、インピーダンスの微小な変化を測定する方法がある。一般に、これらの方法では、細菌代謝生成物を検出することによって微生物の存在または増殖を決定する。また、継代培養および／または染色によって微生物の存在を評価する。これらの方法のうち、インピーダンス測定、放射測定および赤外分光測定のみは、臨床試料の自動処理の可能性を与える。また、これらの手順では、インピーダンス測定および赤外測定を除いて、液体試料または試料上の気体雰囲気に関する測定を行うために容器内に侵入する必要がある。
これらの方法は、汚染の可能性の他に、決定を行うたびに試料上の雰囲気の構成要素を変更する可能性をもたらし、長時間短い時間間隔にわたって連続的または繰り返し測定を行うことができない。これは、生物の増殖速度が生物および元の試料中の生物の数によって異なり、したがって雰囲気または流体試料中の検出可能な変化がいつ現れるかが予測できないので大きな欠点である。関連問題では、生物の増殖を液体試料中のｐＨの変化によって決定する場合、様々な代謝生成物が試料のｐＨに様々な影響を及ぼす。例えば、アンモニアの生成はｐＨを上昇させ、ＣＯ2の生成はそれを低下させる。様々な生物の様々な増殖速度は、ある時点ではｐＨの増大をもたらし、他の時点では減少をもたらし、これは、ｐＨを広く離間した間隔をおいて測定した場合、検出されない。全血液試料中のｐＨ測定によって変化を検出する場合、特にｐＨ決定の手段が指示染料である場合、他のエラー源は、染料の外観が血液細胞の存在によって影響を受けるか、または不明瞭になる。比色指示薬は、試料の性質によって引き起こされるエラーが染料の外観に影響を及ぼすのを防ぐことができる場合のみ有効に使用することができる。
生物活性物質が好気生物である場合、生物活動が起こるように容器内の十分な酸素を保証するシステムを備えなければならない。容器に酸素を供給する一つの方法は、容器の製造時に、培地を含む容器内の雰囲気に酸素を加えることである。その場合、容器の使用者が試料を容器に加えたとき、酸素がすでに容器内に存在する。（しかしながら、この方法の問題は、予め加えられた酸素および培地を含むそのような容器の貯蔵寿命が短いことである）。
微生物が好気生物である場合、容器に酸素を供給する他の方法は、生物の培養時に容器を「スパイク」することである。しばしば、培養中に酸素が容器内に自由に流れ込むように容器上のストッパに針またはカニューレを刺す。しかしながら、この方法の一つの問題は、余分のステップ、容器に針を刺すユーザの技術、また試料汚染または針による使用者への傷害の危険を伴うことである。また、培養方法が、培地をよりよく酸素化する振とうを含む場合、液体培地が針を介して容器の外に漏れないように注意しなければならない。また、穴の空いた容器は、容器の外からの二酸化炭素の通過を制御することができない（容器内の二酸化炭素の変化は、特定の微生物の存在を示すために望ましい）。
発明の概要
本発明は、気体透過性膜を有する滅菌した透明な容器内で無菌増殖培地を用いて試料を培養することによって、血液やその他の体液など、臨床試料中の微生物の存在を検出するデバイスおよび方法に関する。微生物の存在は、容器の内表面に取り付けられた使い捨てセンサを使用して、試料のｐＨの変化、または容器内の気体（例えば、ＣＯ2）または揮発性酸の生成を検出するか、または測定することによって決定される。本発明によれば、非侵襲性手段によって、大きい濃度の赤血球など、妨害材料の存在中でも微生物を検出することができる。
本発明では、容器を好気生物の培養に使用する場合、気体不透過性シールが気体透過性膜から除去される。そうではなく、シールが適所に残される場合、容器を嫌気生物の培養に使用することができる。気体透過性膜は、酸素が容器内を通過でき、好ましくは高い正または負の圧力に耐えられ、かつ容器外への二酸化炭素の通過を十分な程度まで制限し、また容器のオートクレーブおよび振とう中でも、容器の外への液体培地の通過を十分に制限する。
【図面の簡単な説明】
図面は、以下の図面から構成される。
第１図−血液培養機器
この図面は、（１）容器、（２）センサ、（３）培地、（４）光源、（５）光検出器、および（６）電流源、（７）電流電圧変換器、（８）低域通過フィルタを含む関連する電子回路を有する検出器アセンブリである機器の機能部分の全体的な外観を示す。
一実施形態では、各検出器アセンブリは、さら穴内のフォトダイオード、および光が観察すべき表面に当たるだけでなく、検出器自体にも直接当たるように配置された一つまたは複数のＬＥＤから構成される。この実施形態の電子回路は、検出器からの信号を調整する増幅器およびフィルタ、使用できる信号を選択するマルチプレクサ、および照明器用の定電流源を含む。
動作に際して、デバイス全体を培養機器内の攪拌器上に配置する。それにより微生物の増殖に適した環境を提供し、室内光を光検出器から除外する。
第２図−ｐＨ感度
様々な色付きのボトルを用いて機器を主観的にテストし、さらに、ｐＨ感受膜ボトルを用いて機器をテストした。この図面は、５．８から８．２までのｐＨ範囲にわたる様々な緩衝剤を用いてセンサを平衡させた後の異なる七つの検出器の平均電圧出力を示す。詳細な研究によれば、本システムは、ｐＨ６．０から７．５までの範囲にわたって０．１ｐＨ単位の変化を容易に識別することができることが示された。
第３図−微生物の増殖によるｐＨおよび雰囲気の変化
機器を使用して、ｐＨの変化ならびに気体または揮発性生成物によって微生物の増殖を検出した。この図面は、細菌Ｅ．ｃｏｌｉの増殖によって生じるｐＨおよびＣＯ2の変化を示す。
第４図−様々な微生物の検出
ほとんどすべての生物は、代謝の過程において気体または揮発性酸を放出する。したがって、このシステムを使用すれば、非常に広い範囲の微生物の増殖を検出することができる。この図面は、Ｅ．ｃｏｌｉ、グラム陰性菌、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ，グラム陽性菌、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，グラム陰性非発酵菌、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ，嫌気性菌、およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、酵母の増殖中に発生した気体（ＣＯ2）または揮発性酸の検出を示す。単位は、検定の始めのＣＯ2の濃度に基づく培地中の相対気体濃度を示す。試料容器および培地が室温（約２０°）であり、容器および試料は検定中に３７°でインキュベートされる。ＣＯ2は、温度が上昇するにつれて液体中のＣＯ2の溶解度が低下するために、最初の２〜４時間の間、液体試料および培地上の空間中に放出される。試料の導入および機器への配置の前に容器および培地をより高い温度に維持しなければ、一般に最初の２〜４時間以内に最小ＣＯ2濃度を通過するまで微生物の存在の信頼できる指示を測定することはできない。
第５Ａ〜第５Ｄ図
第５Ａ〜第５Ｄ図は、センサをその中に有するボトルのストッパ内のキャビティ内に配置されている透過性膜の一実施形態を示す図である。
第６図
第６図は、特定の透過性膜および支持グリッドを有するストッパの断面図である。
第７Ａ図および第７Ｂ図
第７Ａ図は、透過性膜用の支持グリッドの正面図であり、第７Ｂ図は、膜サポートの拡大図である。
第８Ａ図〜第８Ｃ図
第８Ａ図〜第８Ｃ図は、Ｏリングによって成形された膜を保持する膜支持グリッドの図である。
第９図
第９図は、センサおよび透過性膜をその中に有する本発明の培養ボトルの断面図である。
第１０Ａ図および第１０Ｂ図
第１０Ａ図は、ボトルキャップの中心にボトル開口を有する培養ボトルを示す図であり、第１０Ｂ図では、ボトルアクセス開口が中心からずれている。
第１１図
第１１図は、センサ、ならびに気体透過性膜および取外し可能な不透過性シールをその中に有する本発明の培養ボトルを示す図である。
第１２Ａ図〜第１２Ｃ図
第１２Ａ図〜第１２Ｃ図は、培養ボトルのキャップ内の気体透過性膜の追加の実施形態を示す図である。
第１３Ａ図および第１３Ｂ図
第１３Ａ図および第１３Ｂ図は、グリッドおよび透過性膜がＣ字形である本発明の一実施形態を示す図である。
第１４図
第１４図は、透過性膜用の培養ボトルキャップおよび保持リングの特定の特徴の断面図である。
第１５Ａ図および第１５Ｂ図
第１５Ａ図および第１５Ｂ図は、透過性膜用の保持リングの追加の実施形態の断面図である。
第１６図
第１６図は、培養ボトル全体の図である。
好ましい実施形態の説明
本発明の装置およびデバイスは、微生物によって生成された代謝生成物の増加を測定することによって、血液やその他の体液など臨床試料中、および非臨床試料中の微生物の存在を検出する非侵襲性手段を提供する。試料は、いくつかの微生物代謝生成物の生成を増大させる特別に調製された培地に加えられる。これらの微生物代謝生成物は、培養容器の底部または容器の密封手段内に配置された独自の使い捨てセンサによって検出される。センサは、取付け媒体または支持媒体と呼ばれる固体成分または膜、およびその上またはその中に固定された指示媒体を含む。センサは、指示媒体が外側から見えるように、容器を密封するために使用される密封手段内に、容器の内表面に対して同一平面に配置されるか、または密封手段に取り付けられる。センサは、細胞、タンパク質、その他の固体またはその他の不透明な成分または有色の成分がセンサと容器表面との間に入るのを防ぐために、容器に固定することもできる。いくつかの実施形態では、センサは、気体分子を通過させかつイオンを通過させない膜または固体層によって試料およびその増殖培地から分離される。
本発明の一実施形態は、透明であるか、または透明なセクションを有するキャップまたはフタなど密封手段を含む。センサは、透明なキャップまたはキャップの透明なセクションの近くに配置されるか、またはキャップの一部をなす。容器を密封するためにキャップを使用した場合、透明な密封手段を介して指示薬の変化を読み取る。この実施形態に対して考えられる利点は、これが容器を大規模で製造する最も経済的な方法になることである。
密封手段はまた、カプセル化指示ミセルを含むポリマーなどの材料から製造することができる。材料が微生物の代謝生成物に対して透過性であり、かつ指示薬の変化が密封手段の表面上で見える限り、容器または密封手段内の透明なセクションは不要である。
ミリメートル当たり１生物程度しか含まない血液など体液の試料中の微生物は、本発明を使用して検出することができる。そのような試料は、生物の個体数が臨界レベルに達し、代謝生成物の増大が測定できるまで、最高７日間の培養を必要とする。いくつかのタイプの生物の１０6ＣＦＵ／ｍリットルの濃度は、ｐＨまたはＣＯ2の測定できる変化をもたらすことが分かった。すべての生物は、１０7〜１０8ＣＦＵ／ｍリットルの濃度において測定できる結果を示した。
センサは、以下の点において有用である。１）微生物代謝生成物は、試料上の雰囲気中ではなく培養ボトルの液相中で測定される。２）独自の使い捨てセンサは、ボトルの内表面またはクロージャまたは密封手段に固定されるか、またはクロージャまたは密封手段の外側から取り付けられるので、ボトルの完全性を損なうことなしにボトルの透明な壁または密封手段の外側から測定を行うことができる。３）視覚検査によって、または反射率によって測定する機器を用いて、外部測定を行うことができる。４）試料中の不透明または有色の成分は、変化を検出するセンサの能力またはそれらの変化の測定を妨害しない。５）センサ内の小さい体積中、すなわちポリマーエマルション中または膜上で指示薬分子の高い濃度が維持され、したがって色の変化が容易に観測できる。
複雑な微生物培地を構成する栄養成分は、微生物によって使用される代謝経路に影響を及ぼす。使用できる栄養物に依存する比率で有機酸、塩基および様々な気体が発生する。これらの生成物はまた、微生物の種ごとに異なる。液体培地内にこれらの生成物が存在すると、そのｐＨが変化する。本発明において使用するセンサは、環境内のｐＨ変化に応答して、測定できる変化をもたらすｐＨ感能指示薬を含む。ｐＨセンサを気体透過性、イオン不透過性膜によって覆う実施形態では、ＣＯ2など指示薬のｐＨに影響を及ぼす気体の存在が測定される。したがって、液体培地のｐＨの変化か、または培地中に溶解した気体の測定によって微生物の増殖を検出することができる。どちらの指示も、微生物によって生成された気体代謝生成物によってもたらされる。二酸化炭素は、たいていの生物によって生成される一般的な代謝生成物であり、したがって微生物の増殖の検出用に好ましい代謝生成物である。
ＣＯ2センサおよびｐＨセンサは、ｐＨ指示薬として有用な分子種、および取付け／支持媒体の二つの共通の成分を共有する。ｐＨ指示薬は、支持媒体に共有的かまたは非共有的に取り付けることができる。あるいは、指示薬は、硬化する前にポリマーマトリックス内で乳化させるなど、ポリマーマトリックス内でカプセル化することができる。ｐＨセンサとして実施するために、指示薬は、液体培地と接触しなければならない。ＣＯ2センサは、第三の構成要素、すなわち指示薬膜を試料および増殖培地から完全に分離する半透過性物質を有する。半透過性層は、別個の膜であるか、あるいは、試料および増殖培地に隣接する硬化したポリマーは、一体半透過性膜を形成する。これらのセンサは、適切な透明な容器または透明な密封手段内に接着剤によって固定される。これらのセンサはまた、密封手段の一部をなすか、またはその場で硬化したポリマーマトリックス内で乳化した指示薬として密封手段に固定されるか、または容器内に固定される。これらのセンサはまた、微生物の代謝生成物または試料を含む増殖培地をセンサに接触させる方法が提供される限り、容器の外側に配置することもできる。
様々な異なる蛍光ｐＨ指示薬および可視ｐＨ指示薬がｐＨセンサまたはＣＯ2センサ内の活性分子種として使用できる。一般に、指示薬の選択に関する唯一の制限は、指示薬が、既存の前面蛍光または反射技法によって容易に検出できる容認可能なダイナミックｐＨレンジおよび波長変化を有する要件である。
本発明による培地のｐＨ変化を検出するセンサは、約５．０から約８．０のｐＨ範囲にわたって蛍光強度または可視色の変化を示すことが好ましい。
ＣＯ2センサ用の指示薬は、ＣＯ2の濃度の変化を検出するために、好ましくは約ｐＨ１３から約５、最も好ましくは約ｐＨ１３から約９の蛍光強度または可視色の変化を示さなければならない。
いくつかのｐＨ指示薬分子のみ、支持媒体に共有的にかまたは非共有的に結合し、それらのｐＨ指示特性を保持することができる。キサンテン基、フェノールフタレイン基およびフェノールスルホンフタレイン基に属する指示薬は有用である。これらの例としては、フルオレセイン、クマリン、フェノールフタレイン、チモールフタレイン、ブロモチモールブルー、チモールブルー、キシレノールブルー、アルファナフトールベンゼンがある。
取付け／支持媒体は、有機反応を使用して、ｐＨ指示薬をそれに共有的に取り付けることができるセルロースなどの物質である。正または負のゼータ電位を有するナイロン膜など、イオン支持材料を使用すれば、ｐＨ指示薬の非共有取付けを行うことができる。使用できる他のイオン支持材料は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）樹脂やＤＥＡＥセルロースなど、正または負に荷電したイオン樹脂である。指示薬膜を微生物増殖培地に直接接触させる場合、タンパク質を用いて支持材料を事前処理する必要がある。
ｐＨ指示薬センサは、微生物増殖培地のｐＨ環境によるｐＨの変化を直接検出する。しかしながら、これらのセンサは、シリコーン、ラテックス、テフロン、または気体を選択的に拡散させかつイオンを通過させる能力を特徴とする様々なプラスチックなど、選択的半透過性成分または膜でこれらのセンサを覆うことによって、液体増殖培地内で気体（例えば、二酸化炭素、アンモニア）に選択的に反応するように製造することができる。ポリマーマトリックス内でカプセル化された指示薬を含むセンサの場合、マトリックスを形成するポリマーは、気体を通過させかつイオンを通過させない半透過性バリヤの働きをする。
一実施形態では、ＣＯ2センサは、四つの構成要素から構成される。第一の構成要素は、６から１０までのｐＨ範囲において反応する可視または蛍光ｐＨ指示薬である。これらの基準を満足する指示薬の例は、ブロモチモールブルー、チモールブルー、キシレノールブルー、フェノールフタレイン、クマリン、フルオレセインである。第二の構成要素は、選択したｐＨ指示薬によってＣＯ2を検出するために最適なｐＨ環境を維持する水酸化ナトリウムまたは同等の塩基である。第三の構成要素は、硬化していないポリマー内で乳化した指示薬溶液の液滴を生成することができるグリセロールまたは同等の乳化剤である。第四の構成要素は、指示薬に適した環境を維持するシリコーンなど硬化していないポリマーである。気体に対して透過性でありかつイオンに対して透過性でなく、また滅菌を施したときにこれらの特性が変化しない限り、それ自体の化学特性または物理特性か、またはその硬化の要件から、指示薬の化学活性に影響を及ぼさないどんなポリマーも使用できる。また、充分な他のシリコーンポリマーは、高温、触媒活性、または紫外線加硫によって硬化させたものである。四つの構成要素からエマルションを調製し、ポリマーを硬化させて、ｐＨ指示薬の液滴のまわりに液体微生物増殖培地からのＣＯ2およびその他の気体を選択的に拡散させ、したがって指示薬の測定できる変化をもたらす半透過性マトリックスを形成する。センサを鋳型内などで別個に調製し、硬化させ、次いでシリコーン接着剤など適切な接着剤を用いて、培養ボトルに取り付ける。あるいは、かつ好ましくは、センサをボトルの底部に形成し、その場で硬化させる。硬化の後、オートクレーブなどによって、センサを有するボトルを滅菌する。従来、増殖培地は、オートクレーブの前にボトル内に導入され、またそのプロセスによって滅菌される。
好気微生物を培養する場合、培養ボトル内に酸素を供給する必要がある。現在、自動、半自動、いくつかの手動培養ボトルは、例えば穴あけ装置（例えば、穴あけスパイクまたは針）の挿入および除去、キャップの緩めおよび／または交換、またはボトルからの気体の機械的引抜きおよびボトルへの強制気体復帰によって、何らかの形で一時的に通気される。いくつかの非攪拌手動システムは、テストの期間中適所にある導入された通気装置を使用する。
しかしながら、本発明では、培養ボトル内への周囲の雰囲気を通過させ、かつ培地および試料がボトルの外に漏れるのを防ぐ選択的疎水性バリヤが提供される。本発明の透過性バリヤは、汚染生物など汚染物がボトル内に入るのを防ぐとともに、二酸化炭素がボトルの外に通過するのを抑止することが好ましい。透過性膜／疎水性バリヤ用に好ましい材料には、シリコーン、ポリプロピレン、フッ素化エチレンプロピレン、低密度ポリエチレン、Ｐｏｒｅｘ、ポリテトラフルオロエチレン、ポリメチルペンテンなど、選択的バリヤとしての膜および材料がある（ポリメチルペンテンは、無視できるＣＯ2透過性、および高いＯ2透過性、すなわち２７０（ｃｃ−ｍ）秒−ｃｍ2−ｃｍＨｇ×１０-10を有する）。酸素に対して十分透過性であり、好ましくは膜がボトルの外への二酸化炭素の通過を抑止し、材料がオートクレーブ可能であり、圧力下で漏れに耐えられるものであれば、他の透過性膜も使用できる。以下で論じるように、十分な剛性のない材料は、透過性膜と一体の支持構造を形成するか、または透過性膜を支持手段の上または間に配置することによって強化することができる。
本発明のいくつかの実施形態では、透過性膜を支持材料に固定するために接着剤が使用される。Ｅｌｍｅｒｓ  Ｓｔｉｘ−Ａｌｌなどの接着剤を使用すれば、Ｐｏｒｅｘプラグをストッパ内で確実に密封することができる。Ａｄｃａｒｅ接着剤は、溶接密閉を実施するのに十分でないが、気体に対して透過性であり、膜をサンドイッチ状の構成でＰｏｒｅｘプラグに接着するために使用することができる。
培養用にボトルを使用する前に酸素が培養ボトル内に通過するのを防ぐために、気体透過性膜を覆う溶接密閉を実施する。不透過性シールは、ボトル調製、ガス抜き、オートクレーブ、および保管の間、透過性膜を覆い、溶接密閉する。シールは、培地ボトルの培養中に気体の交換の交換を可能にするために（微生物が好気性であれば）ボトル接種時に除去される。透過性膜がその中に配置される材料に依存するが、プラスチックで被覆されたアルミニウムが一般に適切である。
さらに、気体透過性膜に関して、気体が膜上に移動する間、培地が周囲の生物によって汚染されるのを防ぐために、０．２ミクロンまたはそれ以下の孔サイズが望ましい。気体透過性膜を適所に固定する支持システムが必要であり、また内圧および真空効果に備えてオートクレーブ処理のために、必要な場合、同じまたは別個の支持構造が気体透過性膜を支持しなければならない。内部ポリプロピレン支持グリッドを有するＰＴＦＥは、気体透過性膜として使用するために特に有効である。
本発明の一実施形態を第５Ａ図から第５Ｄ図に示す。第５Ａ図に示されるようなストッパ１０は、第５Ｂ図に示される内部キャビティ１２を備えている。フィルタ１４がストッパのキャビティ内に配置され、取外し可能な気体不透過性シール１６がフィルタ１４に隣接して配置される（第５Ｃ図参照）。第５Ｄ図に示すように、取外し可能な不透過性シール１６を取り外したとき、ストッパ１０は、気体透過性膜１４を介して気体に対して透過性になる。気体透過性膜１４は、例えば、Ｐｏｒｅｘフィルタである。
第６図に示すように、本発明のストッパの異なる実施形態では、その間に気体透過性膜２２を有する二つのサポート２０、２１上に気体不透過性シール１６が備えられる。第７Ａ図および第７Ｂ図を見れば最も良く分かるように、上部サポート２０ならびに下部サポート２１内に支持グリッド２５が備えられる。二つのサポート２０、２１を互いに嵌合させたとき、気体透過性膜２２は、それらの間で確実に保持される。第８Ａ図から第８Ｃ図を見れば分かるように、気体透過性膜用のサポートの他の実施形態では、サポート２０とサポート２１の間に保持された膜２８は、液体を培養ボトルの外に通過させる膜の不透過性が改善されるように「Ｏリング」シール２９を用いて成形される。もちろん、サポートおよびそれらの間の膜は、ストッパ内に備えられ、同様にストッパも、本発明のセンサを有する培養ボトル内に備えられる。
本発明の他の実施形態では、気体透過性膜はストッパ内に備えられるのではなく、培養ボトルの上部にストッパに隣接して備えられる。第９図を見れば分かるように、気体透過性膜３１は、箔シール３２など、取外し可能な気体不透過性シールの下に備えられる。２０ｍｍストッパなど、ストッパ２３、ならびに金属シール３４および押上げ蓋３５が備えられる。ボトル３６は、上述のように、その底部に配置されたセンサ３７および膜３８を有するプラスチックボトルである。第１０Ａ図を見れば分かるように、１２ｍｍストッパなどのストッパ３３は、ボトル３６上のプラスチックキャップ３０の中心位置に配置される。また、第１０Ｂ図を見れば分かるように、ストッパは、キャップの中心からずれて備えられる。
第１１図に示されるように、膜３１の上には、箔シール３２が配置される。シール３２は、プラスチックで被覆されたアルミニウムである。もちろん、十分な不透過性および培養時のボトルからの取外しの容易さを有する材料である限り、取外し可能なシール用の他の材料が考えられる。第１１図を見れば分かるように、シールの把持および取外しが容易なように、ボトルに接着されないタブ３９がシール３２の一部として備えられる。
第１２Ａ図から第１２Ｃ図に示されるように、本発明の他の実施形態では、グリッド４０がボトルキャップ自体の中に形成される。一実施形態では、複数の穴４１がボトルキャップ中に形成される。第１２Ｂ図および第１２Ｃ図を見れば分かるように、Ｐｏｒｅｘの層４３が気体透過性膜４５に隣接して配置され、保持リング４２によって適所に保持される。このアセンブリは、第１２Ｂ図に示されるように、ボトルキャップのグリッド４０の下に配置される。
グリッドは、複数の穴４１が中心ストッパ３３のまわりでＣ字形になっている第１３Ａ図および第１３Ｂ図に示されるグリッド４７などである。このようにすると、グリッドの下に配置された気体透過性膜４８の表面領域が増大する。
本発明の培養ボトルは、多数の方法で製造することができる。好ましい実施形態では、培養ボトルおよび培養ボトルキャップは、別々に製造され、次いで上部をボトル上に接着することなどによって互いに連続的に接着される。ボトル上部とボトルを接着する他の方法は、ボトル上部とボトルを互いに回転させて、発生した摩擦がプラスチックを溶解し、これが再凝固し、それにより上部とボトルが溶接されるスピン溶接である。
第１４図を見れば分かるように、ボトルキャップ５９は、それぞれ異なる外直径を有する外表面５０、５１、５２を備えている。表面５２は、ボトルの外側円周表面と同一平面になるような寸法のものである。最小の外直径を有する表面である表面５０は、ボトル内に正確に嵌合し、したがって、表面５０によって画定されたボトルの内直径および外直径は、実質上同じである。表面５１は、ボトルの内直径よりも大きい外直径を有する。したがって、スピン溶接中、ボトルの内直径よりも大きい直径を有する表面５１は、ボトルキャップが回転し、ボトル内に押し込まれたときに高度の摩擦を発生する。このようにして、ボトルキャップとボトルは、互いに固く接着される。また、第１４図に示されるように、膜５８は、保持リングおよび膜のまわりの流体の流れに対する不透過性が改善されるように突出部５６を有する保持リング５４によって適所に保持される。
ボトルキャップをボトルに接着する他の方法は、超音波溶接である。気体透過性膜を適所に保持する保持リングは、超音波溶接によっても接着することができる。第１５Ａ図および第１５Ｂ図を見れば分かるように、断面が示されている保持リング５４は、環状ピーク６０を備えている。超音波エネルギーをピーク６０の真下の点６５のところに当てた場合、保持リング５４が適所に溶接される。第１５Ｂ図を見れば分かるように、ボトルの振とう中に液体が保持リング内に捕獲される可能性を小さくするために、傾斜した内表面６６を備えることができる。
第１６図に示されるように、センサ３７が培養ボトルの底部に配置され、膜５８が保持リング５４によって適所に保持される。また、表面５１の溶解のためにキャップとボトルのスピン溶接中に発生する余分の溶融プラスチック用の環状リセス７０が示されている（第１４図参照）。環状リセス７０のために、溶融プラスチックは、ボトルキャップまたはボトルの外表面へ流れない。
本発明の一実施形態におけるセンサの二酸化炭素またはｐＨに対する応答性のために、気体透過性膜は、（ボトルから出る）二酸化炭素よりも（ボトルに入る）酸素に対する透過性が高いことが望ましい。二酸化炭素に対して少なくとも部分的に不透過性の膜によれば、センサの感度がより高くなる。ただし、二酸化炭素よりも酸素に対する透過性が高い膜は、本発明には不要である。最初、ボトルからの二酸化炭素の自由な流れを可能にし、かつ（例えば、微生物の存在が示されるように）その中のセンサを変更するためにボトル内に二酸化炭素を必要とする培養ボトルは使用できないと考えていたが、驚いたことに、センサは、ボトル内の二酸化炭素用のある種の「シンク」の働きをし、したがって気体透過性膜がボトルの一部になっている場合でもセンサが微生物の存在を適切に示すことを発見した。
血液ガス変化による透過性（表１）
ボトルを準備し、１００％窒素を封入した。代表的なボトルは、ヒートシールを除去することにより開封し、回転シェーカ上で室温で１時間振とうする。この時間周期の最後に血液ガス機器上でｐＯ2を測定し、読みを透過膜のない対照ボトル、および２０ないし３０ｍｍＨｇの所定のｐＯ2（１００％窒素を封入したボトルを表す事前試験で見られた）と比較した。対照基準値と比較したこれらのボトルのｐＯ2の増加は、その材料の酸素に対する１時間以内の透過性を示す。
オートクレーブ性（表１）
選択した試験材料は、１２１℃、１５ｐｓｉで１２分間、高速排出でオートクレーブ処理する。その後、各材料を溶解や変形などの視覚的な変化に関して検査した。
圧力の許容範囲（表１）
ストッパは、記述した試験材料でヒートシールなしで作成され、その後、水を含むボトルの上にクリンプシールされる。６０ｃｃのシリンジに１６ｇの針を取り付け、プランジャを５０ｃｃのマークまで引き、針をストッパ内に挿入する。続いて、材料を通して漏れが生じるまで、プランジャに圧力を加える。漏れが生じた時点で、５０からプランジャの位置を引いて必要な圧力量を決定する。
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増殖実行による透過性（表２）
代表的なボトルに接種する。ボトルは上記に記述したように準備する。続いて代表的なボトルにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＭ．ｌｕｔｅｕｓを接種するが、試験材料あたり二つのボトルにして標準的な増殖実行プロトコルを使用する。陰性対照ボトルは窒素中に５％の二酸化炭素を含む雰囲気で準備する。これらのボトルは一時的に通気されず、透過膜を備えない。正制御ボトルは同様に準備するが通気される、または標準的な好気性アダルトボトルである。接種済みのボトルをＢＴＡ中に３日間放置し、その後各読みをグラフにした。各グラフの比較から、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓが最も良く、増殖を抑制しない速度でのボトル中への酸素の通過を示すことが判明した。また、これは二酸化炭素の生成量が低い微生物であるので、二酸化炭素の拡散の影響を観察することができる。
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ヒートシールの透過性（表３）
穴あけパンチを使用して、標準的なＴｏｍｐｋｉｎｓストッパに穴を開ける。試験ヒートシール材料は、穴を覆うように密封される。ボトルを４０ｍｌの媒体で充填し、ヒートシールしたストッパで覆い、１００％窒素を封入し、１２１℃、１５ｐｓｉで１２分間オートクレーブした。少なくとも２４時間の平衡状態の後、代表的なボトルのｐＯ2を、ＮＯＶＡ  ＳＴＡＴ３上で標準的なプロトコルを使用して測定する。残りのボトルはある時間周期の間室温で保持し、ヒートシールが酸素をボトルに漏入させたかどうかを決定する。除芯ストッパのない対照ボトルの最初のｐＯ2と、保持時間の後の最終的なｐＯ2とを比較して、その材料が酸素に対して透過性であるかどうかを決定する。
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いくつかの方法を使用して本発明の培養ボトルを作成することができるが、一つの方法では、気体透過性膜材料を、ヒートシールによりボトルキャップに取り付ける。その後、この透過性材料を覆うようにボトルの外側に、取り外し可能シールを取り付ける。キャップはボトル上の適所に溶接する。別のポートでセンサを加え、熱硬化させる。その後で、媒体をボトルに加え、ボトルの上部空き高を取り除き、適当な混合気体で置き換える。その後、残りの減圧を適用することができる。ストッパをシールに合わせて固定し、その後、組み立てたボトルをオートクレーブする。
オートクレーブの間、ボトル内部の圧力は１５ｐｓｉを越える可能性がある。そのため、本発明の一つの実施形態のように、気体透過性膜構造は、気体不透過性の取り外し可能シールと同様に、５ないし３０ｐｓｉを越える圧力に耐えるように構成する。気体透過性膜構造および取り外し可能シールは、少なくとも１５ｐｓｉの圧力に耐えられることが好ましい。また、微生物の増殖による圧力が２５ｐｓｉに達する可能性があるので、気体透過性膜構造および取り外し可能シールは１５ないし２５ｐｓｉの圧力に耐えられるようにそれぞれ構成し、好ましい一つの実施形態では、この膜およびシールは２５ｐｓｉまたはそれを越える圧力に耐えるように構成する。オートクレーブの後、ボトルを冷却し、その後で包装および輸送のために標識付けすることができる。
ボトルを使用する一つの方法では、真空容器アダプタに固定された管状材料を備えた蝶形針を使用するなどして、血液サンプルを患者から採取する。ストッパを付けたポートの頂部の汚染を除去し、アダプタをこのポートの上を滑らせる。続いて、ボトルは適量のサンプルを排出する。接種した後、ボトルを識別し、培養の準備ができる。ボトルを好気性の培養に使用する場合には、取り外し可能シールを除去して気体透過性膜を露出させ、それにより酸素がボトルの中に自由に通過することができるようにする。Ｏｒｇａｎｏｎ  ＴｅｋｎｉｋａのＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ機器などの自動培養機器の中に、ボトルを配置することができる。ボトルは、３５ないし３７℃の温度で保温される。
いくつかの培養方法では、培養中に培養ボトルを振とうすることが望ましい。本発明の培養ボトルは、気体透過性膜が培養ボトル中への酸素の自由な通過を可能にしながら同時に流体がボトルから流出することを制限するので、培養中に振とうすることに特に適している。実際に、本発明が、活発に振とうすること、および培養物を垂直姿勢と倒立姿勢の間で振とうすることに特に適していることが分かっている。従来技術によるスパイクボトルでは漏れが生じ、このように振とうする、または揺り動かすことはできない。
本発明の原理、好ましい実施形態、および操作様式について前述の明細書に記述した。しかし、本明細書において保護されるよう意図された発明は、開示した特定の形態が制限的なものではなく例示的なものと見なすべきであるので、これらに限定されるよう強制されるものではない。本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、当業者は変形および変更を加えることができる。例えば、センサおよび透過性膜はともに、開示した以外の、培養ボトルの他の部分に設けることもできる。例えば、透過性膜をボトルの側壁に配置し、センサをボトルキャップ内部に配置することもできる。また、複数のセンサまたは膜を備えることもできる。さらに、その他の支持グリッドの配列、ならびに透過性膜のサイズおよび形状もまた、本発明の範囲内である。もちろん、透過性膜および不透過性の取り外し可能シールのその他の材料もまた、本発明の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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