(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体細胞からサイクリン依存性キナーゼ／サイクリン複合体を測定するための試料を調製し、
該試料の存在下、サイクリン依存性キナーゼの基質となる基質蛋白質とアデノシン５'−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）を反応させて、該基質蛋白質のセリンまたはスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、
導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質または標識酵素を結合させることによって該基質蛋白質を標識し、
該基質蛋白質を標識した標識蛍光物質からの蛍光量を測定するか、または該基質蛋白質を標識した標識酵素に、該標識酵素との反応によって光学的に検出可能な物質が生じるような基質を作用させて、生じた生成物の量を光学的に測定し、
予め作製した検量線をもとにサイクリン依存性キナーゼの活性値を蛍光量または生じた生成物の量から算出することからなる細胞周期調節因子の活性の測定法。
【請求項２】
該複合体のサイクリン依存性キナーゼが、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６から選択される請求項１に記載の測定法。
【請求項３】
該標識蛍光物質が、蛍光色素である請求項１に記載の測定法。
【請求項４】
該蛍光色素が、ＦＩＴＣである請求項３に記載の測定法。
【請求項５】
該標識酵素が、ペルオキシダーゼである請求項１に記載の測定法。
【請求項６】
該複合体のサイクリン依存性キナーゼがＣＤＫ１またはＣＤＫ２であり、該基質蛋白質がヒストンＨ１である請求項１〜５のいずれか一つに記載の測定法。
【請求項７】
該複合体のサイクリン依存性キナーゼがＣＤＫ４またはＣＤＫ６であり、該基質蛋白質が、システイン残基をアラニンに置換したＲｂである請求項１〜５のいずれか一つに記載の測定法。
【請求項８】
前記生体細胞が、癌の患者から採取された組織サンプルに含まれる細胞である請求項１〜７のいずれか一つに記載の測定法。
【請求項９】
癌が、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、食道癌、前立腺癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮癌、脳腫瘍、骨肉種または骨髄腫瘍である請求項８記載の測定法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一つに記載の測定法に使用される、生体細胞を可溶化するための細胞可溶化用液と、サイクリン依存性キナーゼに対する抗体と、サイクリン依存性キナーゼの基質と、ＡＴＰ−γＳと、モノチオリン酸基の硫黄原子に結合可能な標識蛍光物質または標識酵素との組み合わせからなる試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は放射性物質を用いることのない細胞周期調節因子の活性の測定法と該測定法に使用される試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞増殖は生命維持上、生物の基本的かつ重要な特徴の一つである。細胞増殖は、１つの細胞が２つの娘細胞に分裂することにより行われるが、体細胞分裂の場合、細胞の成長、ＤＮＡの複製、染色体の分配、細胞の分裂などからなる複数の連続反応により、細胞分裂が起こっている。この連続反応の一連過程は細胞周期と呼ばれる。細胞周期は、真核細胞の場合、４つの時期に分けられる。すなわち、ＤＮＡ複製が起こるＳ期、細胞の分裂が起こるＭ期、Ｍ期と次のＳ期までの間の間隙であるＧ１期およびＳ期と次のＭ期までの間の間隙であるＧ２期からなる。Ｇ１期は細胞が増殖へのシグナルを受け、ＤＮＡ複製の準備や細胞の分裂に必要な代謝、成長のための時期であり、Ｇ２期は分裂に入る準備のための時期と考えられている。また、Ｇ１期には哺乳類細胞ではＲ点（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）、酵母ではＳＴＡＲＴと呼ばれる移行点が実験的に想定されている。一般に細胞は外界からの増殖シグナルを受けて増殖する。これらのシグナルを細胞はＧ１期で受け取り、細胞周期を進行させるが、Ｇ１期のある点を過ぎると細胞は増殖シグナルがなくなっても、増殖を停止することなくＳ→Ｇ２→Ｍ→Ｇ１と細胞周期を進行させる。この点がＲ点またはＳＴＡＲＴであり、いわば細胞が増殖方向に進行することを決定する時期であるといえる。さらに、細胞は細胞周期を逸脱し、成長も増殖もしない休止期（Ｇ０期）に入ることができる。
実験的にはこのような細胞は適当なシグナルを与えればＧ１期に戻り、成長と分裂を再び誘導することができる。多細胞生物体を構成する多くの非成長性、非増殖性の細胞はＧ０期にあると考えられている。
【０００３】
細胞内にあって、細胞周期調節因子は主に２つ存在する。１つは、正の調節因子であるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と呼ばれるリン酸化酵素群であり、もう一つは負の調節因子であるＣＤＫ阻害因子（ＣＤＫＩ）である。ＣＤＫは、通常細胞内では不活性型単体として細胞質に存在し、ＣＤＫ自体がリン酸化等の活性化を受けて細胞内の核内に移動する。核内では、ＣＤＫは核内に存在するサイクリン分子と結合してＣＤＫとサイクリンの複合体（以下、活性型ＣＤＫと称する）となり、細胞周期の様々な段階において、細胞周期の進行を正に調節する。一方、ＣＤＫＩはＣＤＫと結合することにより、すなわちＣＤＫＩが活性型ＣＤＫまたはＣＤＫ単体と結合することによりＣＤＫを不活性とし、細胞周期活性を負に調節する。
【０００４】
ＣＤＫは、現在、ＣＤＫ１、２、３、４、５、６および７のタイプが知られ、それぞれ結合するサイクリンが異なる。すなわち、ＣＤＫ１はサイクリンＡまたはＢと、ＣＤＫ２はサイクリンＡまたはＥと、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６はサイクリンＤ１、Ｄ２またはＤ３と結合して活性型となる。活性型ＣＤＫは、それぞれ特異的な細胞周期の段階を制御する。細胞周期制御にかかわるＣＤＫと、機能的に結合するサイクリンおよびこれら活性型ＣＤＫが機能する段階を以下の表１に示す。
【０００５】
【表１】
0004036655.tif 000002
【０００６】
このように、異なる種類のＣＤＫが活性化されることにより細胞周期が調節され、細胞増殖を調節している。活性型ＣＤＫは基質蛋白質のセリンまたはスレオニン残基をリン酸化する酵素である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応系においては、活性型ＣＤＫ１および２はヒストンＨ１を、活性型ＣＤＫ４および６はＲｂ（網膜芽細胞腫蛋白質、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を基質として良好に反応を行う。しかし、実際の細胞周期制御における各活性型ＣＤＫの生理的基質は、その一つがＲｂであると考えられているが、これ以外に基質が存在するかどうかは未だ不明である。
【０００７】
上記のように、ＣＤＫおよびサイクリンは密接に関連しあって細胞周期を調節しているが、食道癌ではサイクリンＤ１遺伝子の増幅が多くの症例において認められ、胃癌や大腸癌ではサイクリンＤ１遺伝子の発現亢進が多くの症例において示されている。一方、サイクリンＥの遺伝子の増幅は胃癌や大腸癌で認められているが、食道癌では認められていない。胃および大腸でのサイクリンＥの過剰発現は、腺腫および腺癌の場合に有意に高頻度であり、深部への侵潤、ステージの進行、転移などの悪性度と有意な相関を示す。また、ＣＤＫ１の発現およびキナーゼ活性は、正常粘膜組織においてと比較して大部分の胃癌および大腸癌において著しく亢進している。従って、サイクリン遺伝子の発現の亢進と、種々の癌の進行度や悪性度と相関していることが知られている（安井  弥、Ｓｙｓｍｅｘ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｗｅｂ．，１〜１０頁，  ｖｏｌ．１，  ２０００）。
【０００８】
以上のことから、それぞれの種類のＣＤＫの活性を測定すると、細胞周期の制御に関連した疾患の種類や悪性度の良い指標となり得ることが期待される。すなわち、Ｒ点でＣＤＫ２の発現が低下し細胞周期を停止させて細胞分裂が調節されるが、ＣＤＫ２の発現が高まっていることはＲ点における細胞周期の停止不能、例えば癌のような疾患の状態を意味すると予想される。また、ＣＤＫ４または６の発現が高まっていると、ＣＤＫ４または６と特異的に結合するサイクリンＤ１遺伝子の発現亢進が見られる胃癌または大腸癌が予想され、癌の種類を決定することが可能であると考えられる。
【０００９】
通常、ＣＤＫの活性は放射性同位体を用いて測定される。詳細には、抗ＣＤＫ抗体を用い細胞溶解液から免疫沈降法により抽出された活性の不明なＣＤＫ存在下に、基質蛋白質のセリンまたはスレオニン残基に、32Ｐ標識したアデノシン５’−Ｏ−（３−トリホスフェート）（ＡＴＰ）を作用させて、32Ｐ標識したＡＴＰ由来のモノリン酸基を導入し、基質蛋白質に取り込まれた32Ｐ量をオートラジオグラフィーまたはシンチレーションカウンターで検出することによりリン酸化された基質蛋白質の量が測定され、その基質蛋白質の量からＣＤＫの活性が算出される。
上記の方法は、32Ｐという放射性物質を使用するため、取り扱いや廃液処理等には注意が必要である。
【００１０】
【解決しようとする課題】
従って、放射性物質を使用せずに鋭敏に細胞周期調節因子を測定する方法および該方法に使用される試薬を見出すことが、所望されていた。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、生体細胞からサイクリン依存性キナーゼ／サイクリン複合体を測定するための試料を調製し、該試料の存在下、サイクリン依存性キナーゼの基質となる基質蛋白質とアデノシン５'−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）を反応させて、該基質蛋白質のセリンまたはスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質または標識酵素を結合させることによって該基質蛋白質を標識し、該基質蛋白質を標識した標識蛍光物質からの蛍光量を測定するか、または該基質蛋白質を標識した標識酵素に、該標識酵素との反応によって光学的に検出可能な物質が生じるような基質を作用させて、生じた生成物の量を光学的に測定し、予め作製した検量線をもとにサイクリン依存性キナーゼの活性値を蛍光量または生じた生成物の量から算出することを特徴とする細胞周期調節因子の活性の測定法を提供するものである。
さらに、本発明は、上記の測定法に使用される、生体細胞を可溶化するための細胞可溶化用液と、サイクリン依存性キナーゼに対する抗体と、サイクリン依存性キナーゼの基質と、ＡＴＰ−γＳと、モノチオリン酸基の硫黄原子に結合可能な標識蛍光物質または標識酵素との組み合わせからなる試薬を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の方法を実施するには、まず試料が調製される。
本発明においてサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）／サイクリン複合体を含有する試料とは、１種類または複数種類のＣＤＫ／サイクリン複合体を含有するものであってもよいが、１種類のＣＤＫ／サイクリン複合体を含有するものが好ましい。
本発明の方法で用いる生体細胞から調製されたＣＤＫ／サイクリン複合体（以下、活性型ＣＤＫと略す）を含有する試料は、生体細胞の可溶化およびその可溶化液からの測定目的の活性型ＣＤＫを含む試料の単離により調製される。
本発明で用いられるＣＤＫとは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６およびＣＤＫ７が挙げられる。
【００１３】
（１）細胞の可溶化
試料は、組織サンプル（バイオプシーサンプルや外科切除サンプル等）のようなヒトを含む動物由来の生体細胞から調製される。試料はＣＤＫ／サイクリン複合体の有無を試験するためのものであり、試料中に存在する場合にはその活性の度合いも測定されるものである。生体細胞中、単体ＣＤＫは細胞質に存在し、サイクリンは核内に存在する。単体ＣＤＫが核内に移行して核中でサイクリンと結合して活性型ＣＤＫとなる。したがって、活性型ＣＤＫを含む試料を調製するには、生体細胞を可溶化させることにより、単体ＣＤＫはサイクリンと結合させる必要がある。
生体細胞を可溶化させるために、生体細胞はその細胞膜および核膜を化学的または物理的処理に付して、破壊することにより行うことができる。具体的には、例えば界面活性剤、蛋白質分解酵素阻害剤および脱リン酸化酵素阻害剤を含有する緩衝液中、ワーリングブレンダー、シリンジで吸引排出するか、または超音波処理に付すことが好ましい。
【００１４】
界面活性剤は、細胞膜や核膜を破壊して細胞内物質を取り出すために用いられる。ただし、活性型ＣＤＫを分解させない程度の界面活性を有するものが用いられる。その例としては、ノニデットＰ−４０、トリトンＸ−１００、デオキシコール酸、ＣＨＡＰＳが挙げられる。界面活性剤濃度は、１ｗ／ｖ％以下が好ましい。
【００１５】
蛋白質分解酵素阻害剤は、細胞膜や核膜が破壊された細胞内物質が混在するときに蛋白質であるＣＤＫやサイクリン分子が破壊されるのを防ぐために用いられる。その例は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡのようなメタロプロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦ、トリプシンインヒビター、キモトリプシンのようなセリンプロテアーゼ阻害剤および／またはヨードアセトアミド、Ｅ−６４のようなシステインプロテアーゼ阻害剤の混合物や、シグマ社から市販のプロテアーゼ阻害剤カクテルのようなそれら蛋白質分解酵素阻害剤の予め混合された市販品が挙げられる。
【００１６】
脱リン酸化酵素阻害剤は、蛋白質である活性型ＣＤＫ自体のリン酸基が水解されて活性が変動するのを防ぐために用いられる。その例として、セリン／スレオニン脱リン酸化酵素阻害剤としてはフッ化ナトリウムが、チロシン脱リン酸化酵素阻害剤としてはオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ3ＶＯ4）が挙げられる。
【００１７】
細胞可溶化液は、遠心分離やフィルターを用いたろ過などに付され、不溶物が除去される。次に、活性型ＣＤＫを含む試料を調製するにあたり、処理された生体細胞の可溶化液中の全蛋白質量を当業者に公知の方法に従って測定しておくのが望ましい。全蛋白質量は、例えば、ＤＣ蛋白質キット等を用いて、ウシＩｇＧを標準として測定される。
【００１８】
（２）測定目的の活性型ＣＤＫを含む試料の単離
活性測定用の目的の活性型ＣＤＫを含む試料は、そのようにして得られた細胞可溶化液から調製される。
活性型ＣＤＫを含む試料の調製法には、例えば、免疫沈降法がある。
免疫沈降法によれば、目的の各種ＣＤＫ１〜７のいずれか一つに特異性を有する抗ＣＤＫ抗体が用いられる。
【００１９】
より詳細には、所定量の蛋白質を含む細胞可溶化液に、測定目的の活性型ＣＤＫに対応する抗ＣＤＫ抗体と、その抗ＣＤＫ抗体を捕捉するための材料としてプロテインＡ、プロテインＧまたは抗ウサギＩｇＧ抗体をコートしたセファロースビーズの懸濁液（ビーズ含量４〜６ｖ／ｖ％）を０〜１０℃で１〜２時間反応させる。これらビーズは不溶性なので、ビーズに結合した該抗ＣＤＫ抗体とＣＤＫの複合体は不溶性となり沈降する。
【００２０】
なお、免疫沈降法によると、細胞可溶化液中のＣＤＫ群（ＣＤＫ単体、活性型ＣＤＫ、活性型ＣＤＫとＣＤＫＩの複合体、およびＣＤＫとＣＤＫＩの複合体を意味する）がすべて捕捉されるので、活性型ＣＤＫと共にＣＤＫ単体、活性型ＣＤＫとＣＤＫＩの複合体、およびＣＤＫとＣＤＫＩの複合体のような不活性型ＣＤＫも調製する試料に含まれる。しかし、不活性型ＣＤＫはＡＴＰ−γＳ存在下に基質蛋白質のモノチオリン酸化に関与しないので、不活性型ＣＤＫを含む活性型ＣＤＫの活性測定用試料を用いて本発明の方法を実施しても、不活性型ＣＤＫの活性は測定されず、活性型ＣＤＫの活性のみが測定されることとなる。
【００２１】
次いで、沈降した活性型ＣＤＫと抗ＣＤＫ抗体との複合体と結合したビーズを洗浄する。ビーズを洗浄する洗浄用緩衝液には、後に活性型ＣＤＫの基質となる基質蛋白質と活性型ＣＤＫとにＡＴＰ−γＳが作用するためにマグネシウムとコンプレックスを形成する必要があるので、塩化マグネシウム、およびタンパクの高次構造の安定化のために必要な酵素の安定化剤として例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む。さらに、アルブミンや、少量の界面活性剤などを含まれてもよい。
【００２２】
その後、測定目的の活性型ＣＤＫを含有する試料を用いて、その活性を測定する。本発明による方法は、活性型ＣＤＫ存在下に基質蛋白質のセリンまたはスレオニン残基をモノチオリン酸化することと、そのチオリン酸基を標識してその標識を測定することからなる。なお、本発明の方法においては、ビーズに結合したＣＤＫ抗体と結合した状態の活性型ＣＤＫ抗体を、活性型ＣＤＫとして用いて行ってもよい。
【００２３】
（ｉ）活性型ＣＤＫ存在下に、ＣＤＫの基質である基質蛋白質とアデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）を反応させて、該基質蛋白質のセリンまたはスレオニン残基にＡＴＰ−γＳ由来のモノチオリン酸基を導入すること。
通常、活性型ＣＤＫは、以下の式に示すように、基質蛋白質のセリンまたはスレオニン残基にＡＴＰを作用させてＡＴＰ由来のモノリン酸基を導入されるが、本発明の方法においては、ＡＴＰの代わりにＡＴＰ−γＳを用いて、モノリン酸基の代わりにモノチオリン酸基を基質蛋白質のセリンまたはスレオニン残基に導入されるものである。
【００２４】
モノチオリン酸化するには、該基質蛋白質０．１〜１ｍｇ／ｍｌを含むｐＨ６．５〜８．５、好ましくは７．４の溶液に、２５〜４０℃、好ましくは３７℃の温度で、該基質蛋白質１当量に対して１０〜１００当量のＡＴＰ−γＳを、活性型ＣＤＫの存在下で、５分間〜１時間、好ましくは１０分間反応させることにより行う。
測定試料には測定目的の活性型ＣＤＫのみならず、上述のように不活性型も含まれているが、活性型ＣＤＫのみがチオリン酸基導入反応を触媒するので、本発明の方法には不活性型は関与しない。
【００２５】
【化１】
0004036655.tif 000003
基質蛋白質としては、活性型ＣＤＫ１およびＣＤＫ２に対してはヒストンＨ１、活性型ＣＤＫ４およびＣＤＫ６に対してはＲｂ（網膜芽細胞腫蛋白質、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。
【００２６】
なお、本発明において、元来分子内にシステイン残基を含む基質蛋白質、例えばＲｂについては、その残基をアラニンなどのチオール基を含まないアミノ酸残基に置換した基質蛋白質が用いられる。これは、活性型ＣＤＫの作用によりＡＴＰ−γＳ由来のチオリン酸基が導入された基質蛋白質のチオリン酸の硫黄原子を標識蛍光物質または標識酵素で標識する際に、基質蛋白質内に元来存在するシステイン残基のチオール基が同時に標識されて測定誤差が生じないようにするためである。
【００２７】
元来分子内にシステイン残基を含む基質蛋白質について、その残基をアラニンなどのチオール残基を含まないアミノ酸残基に置換した基質蛋白質を製造する方法としては、ＰＣＲ法、部位点突然変異法による基質蛋白質遺伝子の修飾およびその遺伝子の発現が挙げられる。具体的には、例えば、Ｒｂのようなシステイン残基を含む基質蛋白質には、オリゴヌクレオチドプライマーＲｂ−１（５'−ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＣＡＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＴＣＣ−３'（配列番号１））、Ｒｂ−２（５'ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＣＡＴ  ＣＴＧＡＴＴ  ＴＡＴ−３'（配列番号２））、Ｒｂ−３（５'−ＡＴＧ  ＧＴＡ  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＴＧ−３'（配列番号３））およびＲｂ−７（５'−ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＡＴＴ−３'（配列番号４））を用いてクローニングすることにより得られる組換えベクターから発現して得られる、システイン残基をコードするヌクレオチドをアラニン残基をコードするヌクレオチドに置換した組換えＤＮＡを発現させてシステイン残基をアラニン残基に置換した基質蛋白質を製造する。
【００２８】
（ｉｉ）該基質蛋白質の標識およびその標識の量の測定
導入されたチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質または標識酵素を結合させることによって該基質蛋白質を標識するには、チオリン酸基が導入された該基質蛋白質０．１〜１ｍｇ／ｍｌを含むｐＨ７．５〜９．０、好ましくは８．５の溶液に、該基質蛋白質１当量に対して１０〜１００当量の、チオール基と反応する官能基を持つ標識蛍光物質または標識酵素を１０分〜２時間反応させることにより行う。反応は、遊離のチオール、例えばβ−ＭＥ（β−メルカプトエタノール）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）が添加されて停止される。
【００２９】
標識蛍光物質で標識した該基質蛋白質の場合、該標識蛍光物質からの蛍光量を測定し、予め作製したチオリン酸基を導入した既知量の基質蛋白質と蛍光量との検量線に、得られた蛍光量をあてはめることにより該基質蛋白質の量を算出する。その該基質蛋白質の量を、試料中に含まれる活性型ＣＤＫの活性値とする。または、標識酵素で標識した該基質蛋白質の場合、該基質蛋白質を標識した標識酵素に、該標識酵素との反応によって光学的に検出可能な物質が生じるような基質を作用させて、生じた生成物の量を光学的に測定し、前記と同様に予め作製した検量線に得られた測定値をあてはめることにより試料中に含まれる活性型ＣＤＫの活性値を算出する。ここで、光学的に検出可能な物質とは、蛍光や吸光度等を測定することによってその存在を検出できるような物質をいう。
【００３０】
チオリン酸基の硫黄原子に結合可能な標識蛍光物質としては、フルオレセイン、クマリン、エオシン、フェナントロリン、ピレン、ローダミンなどが挙げられる。そのうち、フルオレセインが好ましい。これらの標識蛍光物質によりチオリン酸基の硫黄原子と結合するためには、チオール基と反応する官能基を持つ標識蛍光物質、例えばアルキルハライド、マレイミド、アジリジン部位を有する標識蛍光物質が使用される。
【００３１】
チオール基と反応する官能基を持つ標識蛍光物質としては、ヨードアセチル−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、５−（ブロモメチル）フルオレセイン、フルオレセイン−５−マレイミド、５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ）、６−ヨードアセトアミドフルオレセイン（６−ＩＡＦ）、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリン、エオシン−５−ヨードアセトアミド、エオシン−５−マレイミド、エオシン−５−ヨードアセトアミド、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ブロモアセトアミド、１−ピレンブチリルクロリド、Ｎ−（１−ピレンエチル）ヨードアセトアミド、Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセトアミド（ＰＭＩＡ  アミド）、１−ピレンメチルヨードアセテート（ＰＭＩＡ  エステル）、ローダミンレッドＣ２マレンイミドなどが挙げられる。このうち、ヨードアセチル−ＦＩＴＣが好ましい。
【００３２】
また、チオリン酸基の硫黄原子と反応する官能基を有するビオチン、例えばヨードアセチルビオチンと反応させた後に、ビオチンとアビジンの親和性を利用してアビジンに標識蛍光物質が共有結合した分子を反応させて、チオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質を導入してもよい。
チオリン酸基の硫黄原子に標識酵素を導入する方法としては、ヨードアセチルビオチンを硫黄原子に導入し、その後該ビオチン分子に親和性を持つアビジン分子に酵素が共有結合した分子を反応させることによる方法がある。酵素としては、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼが挙げられる。そのうち、ペルオキシダーゼが好ましい。
【００３３】
標識された該基質蛋白質の量の測定方法としては、標識蛍光物質からの蛍光量を測定するか、または標識酵素で標識された該基質蛋白質に、該標識酵素との反応によって光学的に検出可能な物質が生じるような基質を作用させて、生じた生成物を光学的に測定する方法がある。
具体的には、標識蛍光物質を用いる場合、標識蛍光物質をある特定の波長で励起させて、蛍光画像解析装置で検出する。照射する光の波長は標識蛍光物質によって異なるが、具体的には、標識蛍光物質が、フルオレセインであるときは４８８ｎｍの波長を照射して励起させる。
【００３４】
標識酵素を用いる場合、標識酵素で標識された該基質蛋白質に、該標識酵素との反応によって蛍光物質が生じるような基質を加えて、該標識酵素との反応を起こさせて蛍光物質を生成させ、その蛍光物質を特定の蛍光波長で励起させて、蛍光を検出する。標識酵素との反応により蛍光物質を生成する物質には、標識酵素がペルオキシダーゼであるときには、蛍光物質を生成するＥＣＬ−プラスが挙げられる。なお、基質は使用する標識酵素に合わせて適宜選択することができる。
【００３５】
標識蛍光物質または反応によって生成した蛍光物質の量を測定し、予め作製した検量線にあてはめて、活性型ＣＤＫの活性値が算出される。標識された基質蛋白質の反応液は、該標識された基質蛋白質の標識蛍光物質の蛍光量または、標識酵素との反応によって生じた発光物質の蛍光量が検量線範囲に入る程度まで希釈する必要がある。具体的には、例えば、反応液は、１００〜５００倍に希釈する。希釈剤としては、ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）、水、塩化ナトリウム水溶液等が用いられる。塩化ナトリウム水溶液の場合は、塩化ナトリウムの濃度が１００〜５００ｍＭの範囲が好ましい。希釈した場合には、活性型ＣＤＫの活性を算出する際に希釈倍率も考慮に入れる。得られた活性型ＣＤＫの活性値は、調製した試料の全蛋白質量から取り出した所定量の蛋白質中に含まれる量である。
【００３６】
予め作製する検量線は、チオール基を導入した既知量の基質蛋白質を用いて作製されるのが望ましいが、その他、標識蛍光物質または標識酵素との反応に対する挙動が、チオール基を導入した基質蛋白質と同様であることが知られているビオチン化アクチン等が代わりに用いられてもよい。その際、活性型ＣＤＫの活性値は、ビオチン化アクチン等の量から換算される必要がある。
また、本発明は、本発明の方法により測定したＣＤＫ活性の結果により、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、食道癌、前立腺癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮癌、脳腫瘍、骨肉種または骨髄腫瘍のような癌疾患を診断する方法を提供する。
【００３７】
【実施例】
方法例１（活性型ＣＤＫ１の測定の場合；ヒストンＨ１を基質とし、ペルオキシダーゼ標識を使った例）
第１工程：
０．１ｗ／ｖ％ＮＰ４０（界面活性剤ノニデットＰ−４０）、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４，  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムおよび１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテール（シグマ、ＳＩＧＭＡ社）を含む溶解緩衝液中で、１ｘ１０７細胞／５ｍｌの溶解緩衝液という条件下にＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞）細胞を、氷浴中で２３Ｇ針をつけた５ｍｌのシリンジで１０回吸引排出を繰り返し、細胞溶解液を調製した。不溶物を１５０００ｒｐｍで５分間４℃で遠心除去した。上澄み中に含まれる全蛋白質量をＤＣ蛋白質キット（バイオ−ラッド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、ウシＩｇＧを標準として測定した。
【００３８】
第２工程：
１．５ｍｌ用量のエッペンドルフチューブに、５００μｌの溶解緩衝液中に溶解物の全蛋白質量が１０μｇとなる量を加え、サンプルを調製した。サンプルに、１０μｌのポリクローナル抗ＣＤＫ抗体（サンタクルツバイオテクノロジー、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を加えた。そのサンプルに、６０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズ（最終的には３０μｌの封入されたビーズ）の１：１（セファロースビーズ：溶解緩衝液）スラリーを加えた。サンプルを、１時間４℃で連続的に回転させてインキュベートした。サンプル中のビーズを１ｍｌの溶解緩衝液で２回洗浄した。そのビーズを、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４，１０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）、１ｍＭのＤＴＴを含むキナーゼ緩衝液１ｍｌで１度洗浄した。ビーズを１５μｌのキナーゼ緩衝液中に再懸濁させた。
【００３９】
第３工程：
懸濁液に、ヒストンＨ１溶液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４中の０．１ｍｇ／ｍｌの溶液）を１０μｌ加えた。その懸濁液にＡＴＰ−γＳ溶液（１０ｍＭ水溶液）を１０μｌ加えた。懸濁液を１０分間３７℃で連続的に振とうしながらインキュベートした。１００００ｒｐｍで１０秒間ビーズを遠心し、沈殿させた。３０μｌの上澄み液を集めた。上澄み液に、ヨードアセチルビオチンとチオリン酸の結合反応の至適条件がｐＨ８．５であるため、１５０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよびｐＨ９．２，５ｍＭのＥＤＴＡを含む結合用緩衝液２５μｌを加えた。上澄み液に、４０ｍＭ  ＰＥＯ−ヨードアセチルビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社）溶液（２０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０）を２０μｌ加えた。上澄み液を９０分間暗所室温でインキュベートした。ヨードアセチルビオチンとの反応を、７．５μｌのβ−ＭＥ（β−メルカプトエタノール）を加えて停止させた。反応液を、ＴＢＳ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）で希釈した。
【００４０】
第４工程
希釈した反応液の５０μｌをスロットブロッター（Ｓｌｏｔ  Ｂｌｏｔｔｅｒ）を用いてＰＶＤＦメンブレン上に添加し吸引した。メンブレンを５０ｍｌのＴＢＳ−Ｔ（０．０５ｗ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液）で１度洗浄した。メンブレンがアビジン−ペルオキシダーゼと反応しないように、予めメンブレンの疎水性部分をＢＳＡによりブロックする。具体的には、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ中で３ｗ／ｖ％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Ｂｏｖｉｎｅ  ＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ）で３０分間室温でブロックした。メンブレンをアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ社）（ＴＢＳ−Ｔで５００００倍希釈）で１０分間室温で反応させた。メンブレンを５０ｍｌのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＥＣＬ−プラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）をメンブレンに５分間反応させた；溶液の調製は、製造者の指示に従った。メンブレンを２００ｍｌの水で洗浄して反応を停止させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で蛍光のバンドを視覚化し、定量した。
【００４１】
方法例２（活性型ＣＤＫ１の測定の場合；ヒストンＨ１を基質とし、ＦＩＴＣ標識を使った例）
上記第４工程において、アビジン−ペルオキシダーゼの代わりにアビジン−ＦＩＴＣを使用し、ＥＣＬ−プラスを反応させない以外は方法例１と同様に操作した。
【００４２】
方法例３（活性型ＣＤＫ２の測定の場合；ヒストンＨ１を基質とし、ＦＩＴＣ標識を使った例）
第１工程
エッペンドルフチューブ（容量１．５ｍｌ）中に１０ｍｇから５０ｍｇの湿重量を持つ組織を入れ、方法例１の第１工程中に記載の溶解緩衝液を８００μｌ加え、ペッスルで磨り潰した。この際のペッスルは、押し付け力５ｋｇで９０度の回転を左右に行う基礎運動を合計１０回繰り返した。ガラスウール（重量約０．１ｇ）を充填し、先端に０．４５μｍポアサイズを持つディスクフィルター（ミリポア社）を装備した注射筒（容量１ｍｌ）に、得られた粗可溶化液を通すことより、不溶物及び脂質を取り除いた細胞可溶化液を調製した。上澄み中に含まれる全蛋白質量をＤＣ蛋白質キット（バイオ−ラッド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、ウシＩｇＧを標準として測定した。
【００４３】
第２工程
方法例１の第２工程と同様に操作した。
【００４４】
第３工程
懸濁液に、ヒストンＨ１溶液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中の０．１ｍｇ／ｍｌの溶液）を１０μｌ加えた。その懸濁液にＡＴＰ−γＳ溶液（１０ｍＭ水溶液）を１０μｌ加えた。懸濁液を９０分間３７℃で連続的に振盪させながらインキュベートした。１０００ｒｐｍで１０秒間ビーズを遠心し、沈殿させ、３０μｌの上澄み液を集めた。上澄み液１８μｌに１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む結合緩衝液１５μｌを加えた。さらに、５ｍＭ  ヨードアセチルフルオロセイン（Ｐｉｅｒｃｅ社）溶液（５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０及び５０％ジメチルスルフォオキシド）を１０μｌ加えた後、９０分間暗所室温でインキュベートした。ヨードアセトアミドフルオロセインの反応を４３μｌのβ―ＭＥを加えて停止させた。反応液を、ＴＢＳ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で５倍から１０倍に希釈した。
【００４５】
第４工程
希釈した反応液の５０μｌをスロットブロッターを用いてＰＶＤＦメンブレン上に添加し吸引した。メンブレンを５０ｍＭのＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ｗ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液）で振盪しながら１０分間３回洗浄した。その後、メンブレンを２００ｍｌの水で洗浄し、乾燥させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で蛍光のバンドを視覚化し、イメージアナライザーにより数値化した。
【００４６】
方法例４（活性型ＣＤＫ２の測定の場合；ヒストンＨ１を基質とし、ＦＩＴＣ標識を使った例）
第１工程
Ｋ５６２細胞株を用い、方法例１の第１工程を同様に操作した。
第２工程
５００μｌの溶解緩衝液中、Ｋ５６２細胞可溶化物の全蛋白量が、０、２５、５０、１００および２００μｇ／ｍｌの濃度系列の試料を調製し、５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに注入した。それぞれのサンプルに、１０μｌのポリクロナール抗ＣＤＫ２抗体（２００μｇ／ｍｌ、サンタクルズバイオテクノロジー、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を加えた。そのサンプルに、４０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズの１：１（セファロースビーズ：溶解緩衝液）スラリーを加えた。サンプルを、１時間４℃で連続的に回転させてインキュベートした。サンプル中のビーズを１ｍｌの溶解緩衝液で２回洗浄した。そのビーズを、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  塩化ナトリウムで１回洗浄し、さらに、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で１回洗浄した。
【００４７】
第３工程
ビーズに、ヒストンＨ１を含むリン酸化反応溶液（４０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１８ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、６μｇ／ｔｅｓｔ  ヒストンＨ１）を５０μｌ加えた。懸濁液を９０分間３７℃で連続的に振盪させながらインキュベートした。１０００ｒｐｍで１０秒間ビーズを遠心し、沈殿させ、３６μｌの上澄み液を集めた。上澄み液３６μｌに１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む結合緩衝液３０μｌを加えた。さらに、３５ｍＭ  ＰＥＯ−ヨードアセチルビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社）溶液（５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０）を２０μｌ加えた後、９０分間暗所室温でインキュベートした。その後、等量（８６μｌ）の０．５％  β―ＭＥを加え、反応を停止した。反応液を、ＴＢＳ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで５倍から１０倍に希釈した。
【００４８】
第４工程
希釈した反応液の５０μｌをスロットブロッターを用いてＰＶＤＦメンブレン上に添加し吸引した。得られたメンブレンを１ｗ／ｖ％のＢＳＡで３０分間ブロックし、ＴＢＳで５分間洗浄した。次にアビジン−ＦＩＴＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社）（ＴＢＳで５００倍希釈）溶液中で３７℃、６０分間反応した。反応後、メンブレンをＴＢＳで３回、水で１回洗浄し、乾燥させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で蛍光のバンドを視覚化し、測定した。
【００４９】
製造例１（Ｒｂ（網膜芽細胞腫蛋白質）のシステイン残基をアラニン残基で置換した蛋白質をコードする組換えベクターおよびそのベクターを発現したタンパクの製造）
（１）発現プラスミドの構築
まず、ヒトＲｂをコードするｃＤＮＡをヒト胎盤のｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社）よりクローニングした。
Ｃｙｓ８５３をＡｌａに単一変異させた、ヒトのＲｂのＣ−末端部分（Ｌｅｕ７６９からＬｙｓ９２８）を発現するプラスミドを構築するためには、２工程のＰＣＲを、ヒトＲｂ  ｃＤＮＡの全長を含むｐＪ３Ωベクターで、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。
【００５０】
１．第１のＰＣＲ
まず、ヒトＲｂタンパクのＬｅｕ７６９からＡｓｐ９２１に相当する領域を増幅し、同時に、Ｃｙｓ８５３をＡｌａに変換するために、４種類のプライマーを用いて２段階ＰＣＲを行った。用いたプライマーは、両端のプライマーＲｂ−１（５'−ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＣＡＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＴＣＣ−３'（配列番号１）、ＢａｍＨＩ部位（下線部）を導入）およびＲｂ−７（５'−ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＡＴＴ−３'（配列番号４）、ＥｃｏＲＩ部位（下線部）を導入）に加えて、８５３位をＡｌａコドン（ＡＧＣ）に変換したプライマーＲｂ−２（５'−ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＡＧＣＴＡＣ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＴＡＴ−３'（配列番号２）、点変異コドンを下線で示した）とその相補的プライマーＲｂ−３  （５'−ＡＴＧ  ＧＴＡＧＣＴ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＴＧ−３'（配列番号３））である。ヒトＲｂ全長ｃＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＲｂ−１／Ｒｂ−２とプライマーセットＲｂ−３／Ｒｂ−７によりそれぞれ以下の反応条件下にＰＣＲを行ってＰＣＲフラグメント１および２をそれぞれ得た。ＰＣＲフラグメント１および２は、プライマーＲｂ−２とＲｂ−３に対応する領域で相補的である。
【００５１】
反応液組成(ヌクレオチド2305-2565に相当するフラグメント１用)
pJ3 W-Rb                250 ng
Taq DNA ポリメラーゼ (TaKaRa Ex Taq, 宝酒造)                 0.03 U
TaKaRa Ex Taq 用緩衝液(宝酒造)
MgCl2 (宝酒造)                 2 mM
dNTPs (宝酒造)                 250 mM
プライマー Rb-1                1 mM
プライマー Rb-2                1 mM
合計                50mL
【００５２】
反応液組成(ヌクレオチド2551-2763に相当するフラグメント２用)
pJ3 W-Rb                250 ng
Taq DNA ポリメラーゼ (TaKaRa Ex Taq, 宝酒造)                 0.03 U
TaKaRa Ex Taq用緩衝液 (宝酒造)
MgCl2 (宝酒造)                 2 mM
dNTPs (宝酒造)                 250 mM
プライマー Rb-3                1 mM
プライマー Rb-7                1 mM
合計                50mL
【００５３】
反応温度
95℃, 5 分、
94℃, 30秒、55℃, 1分、72℃, 1分(15 サイクル)、
72℃, 2分。
【００５４】
２．突出部の処理
ＰＣＲ産物のＡ−３’突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を以下の反応条件を用いてクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理した。
反応液組成
ＰＣＲフラグメント１および２
クレノウフラグメント(宝酒造)        0.07 U
クレノウフラグメント用緩衝液(宝酒造)
dNTPs (宝酒造)        250 mM
反応温度
37℃, 1時間
【００５５】
３．第２のＰＣＲ
それらのＰＣＲ産物の混合物を鋳型として、両端のプライマーセットＲｂ−１／Ｒｂ−７により以下の反応条件下にＰＣＲを行い、Ｃｙｓ８５３Ａｌａを持つＬｅｕ７６９からＡｓｐ９２１に相当する４７０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
反応液組成
クレノウ処理されたPCR フラグメント1および2
Taq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa Ex Taq, 宝酒造)                 0.03 U
TaKaRa Ex Taq用緩衝液 (宝酒造)
MgCl2 (宝酒造)                 2 mM
dNTPs (宝酒造)                  250 mM
プライマーRb-1                1 mM
プライマーRb-7                1 mM
合計                50 mL
反応温度
95℃, 5分、
94℃, 30秒、55℃, 1分、72℃, 1分(15サイクル)、
72℃, 2分。
【００５６】
４．ｐＭｅｌＢａｃＡへのクローニング
Ｎ末端に分泌シグナルを付加したＲｂタンパクを発現するために、前工程３．で増幅された４７０ｂｐのＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ消化した後、ｐＭｅｌＢａｃＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位に挿入した。得られたプラスミドを、ｐＭｅｌＢａｃＡ−Ｒｂとした。
【００５７】
５．ＰＣＲ
得られたプラスミドを鋳型として、プライマーＲｂ−９（５'−ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＴＡＧ  ＴＣＡ−３'（配列番号５）、ＥｃｏＲＩ部位（下線部）を導入）とＲｂ−５（５'−ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧＴＣＡ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＡＴＴ−３'（配列番号６）、ＸｈｏＩ部位（下線部）を導入）を用いて以下の反応条件下にＰＣＲを行い、分泌シグナルを付加した５４０ｂｐＤＮＡ断片を増幅した。
反応液組成
pMelBacA-Rb 250 ng
Taq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa Ex Taq, 宝酒造)         0.03 U
TaKaRa Ex Taq用緩衝液 (宝酒造)
MgCl2 (宝酒造)         2 mM
dNTPs (宝酒造)         250 mM
プライマーRb-9        1 mM
プライマーRb-5        1 mM
合計        50 mL
反応温度
94℃, 5分、
94℃, 30 秒、55℃, 1分、72℃, 1分(25 サイクル)、
72℃, 2分。
【００５８】
６．ｐＦａｓｔＢａｃ１へのクローニング
前工程５．で増幅された、分泌シグナルを含む５４０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ消化した後、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）のＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位に挿入した。
【００５９】
（２）Bac-To-Bac Baculovirus 発現システム(Lifetech社)による組み換えウイルスの単離
添付プロトコールに従い、前工程６で得られた発現プラスミドを基に、組み換えウイルスを単離した。
【００６０】
（３）発現
前工程（２）で調製した組み換えウイルス液を、ＭＯＩ＝１０の条件で昆虫細胞  （Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（登録商標）  ｃｅｌｌ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に感染させ、Ｃｙｓ８５３Ａｌａを含むＬｅｕ７６９からＡｓｐ９２１に相当する領域を発現させた。発現タンパクが培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ４０５，ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に分泌されることを、抗ヒトＲｂポリクローナル抗体［Ｒｂ（Ｃ−１５），Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社］を用いたウエスタン・ブロット法により確認し、感染５日後に培地を収穫した。
【００６１】
（４）発現タンパクの精製
全工程（３）で得たＲｂ組み換えタンパクを含む培地を、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）により５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換した後、０〜１Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配を用いるＣＭ−５ｐｗカラム（ＴＯＳＯＨ社）によりタンパクを溶出した。約０．３Ｍ  ＮａＣｌでＲｂ組み換えタンパクが溶出されることを、抗ヒトＲｂポリクローナル抗体［Ｒｂ（Ｃ−１５），Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社］を用いたウエスタン・ブロット法により確認した。
得られた蛋白質は、ＣＤＫ４またはＣＤＫ６の測定を行う場合に、方法１において第３工程の基質蛋白質であるヒストンＨ１の代わりに用いる。
【００６２】
方法例5（活性型ＣＤＫ４の測定の場合；製造例１で製造した組換えヒトＲｂを基質とし、ＦＩＴＣ標識を使った例）
第１工程
方法例３の第１工程と同様に操作した。
第２工程
１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに、５００μｌの溶解緩衝液中にＫ５６２細胞可溶化物の全蛋白量が０、５０、１００、１２５、２５０μｇとなる量を加え、サンプルを調製した。それぞれのサンプルに、１０μｌのポリクロナール抗ＣＤＫ４抗体（２００μｇ／ｍｌ、サンタクルズバイオテクノロジー、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を加えた。そのサンプルに、４０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズの１：１（セファロースビーズ：溶解緩衝液）スラリーを加えた。サンプルを、１時間４℃で連続的に回転させてインキュベートした。サンプル中のビーズを１ｍｌの溶解緩衝液で２回洗浄した。そのビーズを、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  塩化ナトリウムで１回洗浄し、さらに、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で１回洗浄した。
【００６３】
第３工程
ビーズに、製造例１で製造した組換えヒトＲｂ蛋白質を含むリン酸化反応溶液（４０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２００ｍＭ塩化マグネシウム、３．３ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、２０μｌ組換えヒトＲｂ蛋白質溶液：５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０）を５０μｌ加えた。懸濁液を９０分間３７℃で連続的に振盪させながらインキュベートした。１０００ｒｐｍで１０秒間ビーズを遠心し、沈殿させ、３６μｌの上澄み液を集めた。上澄み液３６μｌに１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む結合緩衝液３０μｌを加えた。
さらに、５０ｍＭ  ＰＥＯ−ヨードアセチルビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社）溶液（５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０）を２０μｌ加えた後、９０分間暗所室温でインキュベートした。その後、等量（８６μｌ）のＳＤＳ−サンプルローディング緩衝液（０．１２５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ，１０％β―ＭＥ，２５％グリセリン、ブロモフェノールブルー）を加え、５分間１００℃で処理した。
【００６４】
第４工程
第３工程で準備したサンプルを２０μｌ／レーンの条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（第一化学薬品、プレキャストゲル、４−２０％グラジエント、１０ｍｍ×１０ｍｍ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件は、第一化学薬品の指示に従った（６０ｍＡ、４０分）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲル内に展開された蛋白質は電気的にＰＶＤＦメンブレンに転写された（１０Ｖ、３０分、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法）。得られたメンブレンを４ｗ／ｖ％のＢＳＡで３０分間ブロックし、ＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。次にアビジンＦＩＴＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社）（ＴＢＳ−Ｔで１０００倍希釈）溶液中で３７℃、３０分間反応した。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで２回、水で１回洗浄し、乾燥させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で蛍光のバンドを視覚化し、測定した。
【００６５】
活性型ＣＤＫ１活性の測定
１．ビオチン化アクチン（ＢＡ）を標準物質とした検量線作成
ＢＡ濃度０〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度系列の試料を調製し、各５０μｌをスロットに注入する。スロット中の試料は方法例１の第４工程の処理を行う。ＢＡはペルオキシダーゼで標識されているので第４工程においてＥＣＬ−プラス（蛍光基質）から蛍光物質を生成する。各ＢＡ濃度の試料の蛍光物質の蛍光量を測定し、その蛍光量をカウント（ＣＮＴ）値で表示する。ＢＡ濃度を横軸に、ＣＮＴ値を縦軸にとり、データをプロットし、方法例１の反応条件下での検量線を作成する。得られた検量線は図１に示す。
【００６６】
同様に、方法例２についても、スロット中の試料に方法例１の第４工程の処理を行い、上述のようにして方法例２の反応条件下での検量線を作成する。得られた検量線は図２に示す。
【００６７】
２．活性型ＣＤＫ１の活性値の算出
方法例１および２のそれぞれについて、抗ＣＤＫ抗体を添加しない以外は方法例１に従って処理した試料をブランク試料として調製する。そのブランク試料の蛍光量を測定し、得られたＣＮＴ値をそれぞれの方法例に対応する上記で作成した検量線を用いてＢＡ濃度に換算する。得られたＢＡ濃度を以下の式に代入して活性型ＣＤＫ１の活性値を算出する。
式１：｛（試料のＢＡ換算濃度）−（ブランク試料のＢＡ換算濃度）｝×（試料の希釈倍率）＝（活性型ＣＤＫ１の活性値）
【００６８】
なお、作成した検量線がシグモイド曲線ではない、直線であるとき（例えば、方法例２）は、（試料のＣＮＴ値）−（ブランク試料のＣＮＴ値）を算出し、その差を検量線を用いてＢＡ濃度に換算し、得られたＢＡ濃度を以下の式に代入して活性型ＣＤＫの活性値を算出してもよい。
式２：（試料とブランク試料のＣＮＴ値の差のＢＡ換算濃度）×（試料の希釈倍率）＝（活性型ＣＤＫ１の活性値）
【００６９】
実施例１（方法例１に従い処理した試料の活性型ＣＤＫ１の活性値の測定）
方法例１に従い抗ＣＤＫ１抗体を用い希釈倍率４５０倍で調製した試料の蛍光量を、前述のようにして測定した。試料１は増殖期にあるＨｅＬａ細胞を、試料２は増殖停止期にあるＨｅＬａ細胞を用いて調製した。検量線が図１に示されたようにシグモイド曲線であったので式１を用いて、すなわちブランク試料を上述のように作成し、その蛍光量を測定して、先に測定した試料の蛍光量から活性型ＣＤＫ１の活性値を算出した。その結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
0004036655.tif 000004
【００７１】
実施例２（方法例２に従い処理した試料の活性型ＣＤＫ１の活性値測定）
方法例２に従い抗ＣＤＫ１抗体を用い希釈倍率１００倍で調製した試料の蛍光量を、前述のようにして測定した。検量線は図２に示されたように直線であったので、式１または式２のいずれを用いても、活性型ＣＤＫ１の量は算出可能であることが判明した。
【００７２】
活性型ＣＤＫ２活性の測定
実施例３（方法例３に従い処理した試料の活性型ＣＤＫ２の活性測定）
試料３は、方法例３に従い抗ＣＤＫ２抗体を用いて調製した。対照として、試料４を抗ＣＤＫ２抗体を用いずに方法例３に従い調製し、試料５を第２工程中の抗ＣＤＫ２抗体の代わりに非特異的ＩｇＧ抗体を添加する以外は方法３に従い調製した。試料３〜５の蛍光バンドを図３に示す。また、それらのバンドの蛍光量は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で数値化した。得られた蛍光量は、表３に示す。
【００７３】
【表３】
0004036655.tif 000005
【００７４】
上記の結果から、非特異的ＩｇＧ抗体を抗ＣＤＫ２抗体の代わりに添加した場合（試料５）に非特異的反応が見られず、従って活性型ＣＤＫ２の活性値が本発明の方法により測定可能であることが示された。
【００７５】
実施例４（方法例４に従い処理した試料の活性型ＣＤＫ２の活性値測定）
１．Ｋ５６２細胞株（前骨髄性白血病）を標準物質とした検量線作成
方法例４に従い作成した０〜２００μｇ／ｍｌの濃度系列の試料から得られた蛍光量を測定し、その蛍光量をＣＮＴ値で表示した。Ｋ５６２細胞株の濃度を横軸に、ＣＮＴ値を縦軸にとり、データをプロットし、検量線を作成した。得られた検量線は、図４に示す。
【００７６】
２．活性型ＣＤＫ２の活性値の算出
Ｋ５６２細胞可溶化物の試料の代わりに未知試料を用いる以外は方法例４に従って、検体として調製する。その検体の蛍光量を測定し、得られたＣＮＴ値を上記で作成した検量線を用いて、Ｋ５６２細胞可溶化物のＣＤＫ２活性値に換算して活性値を算出する。
【００７７】
活性型ＣＤＫ４活性の測定
実施例５（方法例５に従い処理した試料の活性型ＣＤＫ４の活性測定）
試料６は、方法例５に従い抗ＣＤＫ４抗体を用いて調製した。対照として、試料７を抗ＣＤＫ４抗体を用いない以外は方法例５に従い調製した。試料６および７の蛍光バンドを図５に示す。
【００７８】
ＣＤＫ特異的阻害剤を用いて活性型ＣＤＫ２測定値がＣＤＫ２の活性に特異的であることを証明する例
実施例６（活性型ＣＤＫ２測定の場合）
第１工程：
Ｋ５６２細胞株（前骨髄性白血病）を用い、方法例１の第１工程を同様に操作した。
第２工程：
１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに、５００μｌの溶解緩衝液中にＫ５６２細胞可溶化物の全蛋白量が２５０μｇとなる量を加え、サンプルを調整した。サンプルに、１０μｌのポリクロナール抗ＣＤＫ２抗体（２００μｇ／ｍｌ、サンタクルズバイオテクノロジー、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を加えた。そのサンプルに、４０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズの１：１（セファロースビーズ：溶解緩衝液）スラリーを加えた。サンプルを、１時間４℃で連続的に回転させてインキュベートした。サンプル中のビーズを１ｍｌの溶解緩衝液で２回洗浄した。そのビーズを、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  塩化ナトリウムで１回洗浄し、さらに、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で１回洗浄した。
【００７９】
第３工程
ＣＤＫ阻害剤として、ＣＤＫ１および２活性の阻害剤であるブチロラクトン（Ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ  Ｉ、カールバイオキム、Calbiochem社）ならびにＣＤＫ２の阻害を含む広い阻害スペクトラムを持つスタウロスポリン（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ、カールバイオキム、Calbiochem社）を用いた。ビーズに、ヒストンＨ１及びＣＤＫ阻害剤（終濃度０，１、１０、３０，１００μＭのブチロラクトン又は終濃度０，０．３、１、１０，３０μＭのスタウロスポリン）を含むリン酸化反応溶液（４０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１８ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、６μｇ／テストのヒストンＨ１）を５０μｌ加えた。懸濁液を９０分間３７℃で連続的に振盪させながらインキュベートした。１０００ｒｐｍで１０秒間ビーズを遠心し、沈殿させ、３６μｌの上澄み液を集めた。上澄み液３６μｌに１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む結合緩衝液３０μｌを加えた。さらに、５０ｍＭ  ＰＥＯ−ヨードアセチルビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社）溶液（５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０）を２０μｌ加えた後、９０分間暗所室温でインキュベートした。その後、等量（８６μｌ）のＳＤＳ−サンプルローディング緩衝液（０．１２５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％  ＳＤＳ，  １０％  β―ＭＥ，  ２５％グリセリン、ブロモフェノールブルー）を加え、５分間１００℃で処理した。
【００８０】
第４工程
第３工程で準備したサンプルを２０μｌ／レーンの条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（第一化学薬品、プレキャストゲル、４−２０％グラジエント、１０ｍｍｘ  １０ｍｍ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件は、第一化学薬品の指示に従った（６０ｍＡ、４０分）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲル内に展開された蛋白質は電気的にＰＶＤＦメンブレンに転写された（１０Ｖ，  ３０分、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法）。得られたメンブレンを４ｗ／ｖ％のＢＳＡで３０分間ブロックし、ＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。次にアビジンＦＩＴＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社）（ＴＢＳ−Ｔで１０００倍希釈）溶液中で３７℃、３０分間反応した。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで２回、Ｈ２Ｏで１回洗浄し、乾燥させた。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で蛍光のバンドを視覚化し、測定した。
【００８１】
得られた視覚化された蛍光バンドをイメージアナライザーにより数値化し、グラフ化したものを図６に示す。ｎｏｎｅはＣＤＫ阻害剤を添加しないで上記工程を実施したもの、ＤＭＳＯはＣＤＫ阻害剤の溶剤（ジメチルスルホキシド）のみを添加して上記工程を実施したもの、ＩＰ（−）はＣＤＫ２抗体を入れずに上記工程を実施したものである。図６に示すように、ＣＤＫ２の活性は、両阻害剤の分量依存的に阻害された。この結果より、測定された活性値はＣＤＫ２に特異的な値であることが証明された。
【００８２】
【発明の効果】
上記から示されたように、本発明の方法は、放射性物質を用いずに、細胞周期調節因子の活性を鋭敏に高感度に測定することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において得られるビオチン化アクチンの量（ｎｇ／スロット）と、蛍光量（カウント）との関係を示す検量線である。
【図２】実施例２において得られるビオチン化アクチンの量（ｎｇ／スロット）と、蛍光量（カウント）との関係を示す検量線である。
【図３】実施例３において得られる蛍光バンドを示す図である。
【図４】活性型ＣＤＫ２の測定のための検量線である。
【図５】実施例５において得られる蛍光バンドを示す図である。
【図６】実施例６において得られるグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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