(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５５６６）の生育をポリスチレンの存在下で行うことを特徴とするＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａの生育促進法。
【請求項２】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａの生育中にポリスチレンに物理的な力を加え、該ポリスチレン表面に保持されて増殖した菌体の少なくとも一部を積極的に剥離させる請求項１記載のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａの生育促進法。
【請求項３】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａをポリスチレンと共存させることを特徴とするバイオリアクター。
【請求項４】
ポリスチレン表面に保持されて増殖した菌体の少なくとも一部を積極的に剥離させる手段を有する請求項３記載のバイオリアクター。
【請求項５】
排水処理用である請求項３〜４のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項６】
排水が芳香族化合物を含有するものである請求項５記載のバイオリアクター。
【請求項７】
芳香族化合物がフェノールである請求項６記載のバイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明はリン、窒素等の栄養塩濃度が低い低栄養条件で生育し、芳香族化合物を含有する排水を分解することのできる低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａの生育促進法、該微生物を用いた芳香族化合物、例えばフェノール含有排水処理用バイオリアクター、および該バイオリアクターを用いた排水処理技術に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
自然環境は一般的に低栄養条件であると考えられており、また製油所や化学工場などの排水は、リンや窒素に乏しい低栄養排水であるので、通常知られている微生物は生育できないので、従来の環境浄化技術では、汚染環境に（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＮＨ4Ｃｌ、Ｎａ3ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4等の栄養塩類を添加し、微生物の活性を高める方法が行われている[（Ｄ．Ａ．Ｇｒａｖｅｓら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２８，Ｐ８１３（１９９１）:原山  重明、「地球をまもる小さな生き物たち」、技報堂出版、Ｐ１０９（１９９５）:西村  実、土と微生物、Ｎｏ４６、Ｐ１９（１９９５）：Ｃ．Ｈ．Ｎｅｌｓｏｎら、「Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐ１２５（１９９４）]。
【０００３】
また排水処理においても、微生物の生育と活性を保つために炭素：リン：窒素の割合を制御することが必要であると考えられている。炭素：リン：窒素の割合を制御するためには、排水に栄養塩を添加する方法が一般的である[「廃水処理技術指導書」、石油連盟、Ｐ１２９（１９７５）:「公害防止の技術と法規」、財団法人産業公害防止協会、Ｐ２１５（１９９２）]。
さらに特開平６−５００４９５では汚染環境に栄養塩を効率よく持続的に与えるための方法が記されており、また特開平７−５０７２０８ではリン酸エステルを添加することにより、栄養物質の供給と同時に汚染物質を乳化させる方法が記されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように自然環境は一般的に低栄養条件であると考えられており、また製油所や化学工場などの排水もリンや窒素に乏しい低栄養排水である。この様な条件では通常知られている微生物は生育できないので、環境浄化や低栄養排水の処理には栄養塩類を添加して微生物の活性を高めることが必要である。
しかし汚染環境や排水に添加する栄養塩類は、環境浄化や排水処理にかかるコストの１つである。特に浄化しようとする汚染場所が広い範囲であったり、あるいは処理をしようとする排水量が多い場合には添加する栄養塩類にかかる費用は莫大なものとなる。
さらに過剰に添加した栄養塩類は、地下水の硝酸汚染や環境の富栄養化等の二次汚染の原因となるので、添加方法や添加量の制御は重要である。
【０００５】
すなわち、窒素源は、土壌微生物の作用により酸化されて硝酸体となる。したがって窒素源を過剰に与えると土壌や地下水中の硝酸イオン濃度が高くなる。硝酸イオンは、発ガン性が指摘されており、飲料水への混入が問題となっている［鶴巻  道二、「地下水汚染・土壌汚染の現状と浄化対策」、工業技術会、Ｐ９８（１９９３）］。
また、過剰に添加した栄養塩類、特にリンおよび窒素源が雨水や地下水によって河川や湖沼に流入すると環境の富栄養化を引き起こす。環境の富栄養化はアオコの異常発生や飲料水のカビ臭の原因となるため、生活排水中のリンや窒素を除去する方法が数多く提案されている[中村  和憲、「微生物の生態１７」、学会出版センター、Ｐ３１（１９９１）:深瀬  哲朗、「地球をまもる小さな生き物たち」、技報堂出版、Ｐ１３３（１９９５）]。
Ｐ．Ｍｏｒｇａｎらは土壌環境に栄養塩類を添加することが土着微生物の有機物質の分解活性を阻害することを指摘している［Ｗａｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．６，Ｐ６３（１９９０）］。
【０００６】
添加した栄養塩類による二次汚染を回避するには、栄養塩類をコントロールしながら添加することが必要である。しかしこの様な制御装置を排水処理設備に設置することは、設備をより高価なものとし、排水の処理コストを増大させる。
さらに汚染土壌や地下水等の汚染環境は解放系であるため、栄養塩類をコントロールしながら効率よく添加するには、何らかの方法で汚染環境を閉鎖する必要がある。しかし汚染環境を土木的方法によって閉鎖するには、多額な資金が必要であり、特に汚染環境が広い場合には技術的に困難である。したがって汚染環境において、添加した栄養塩類による二次汚染を防ぐことは事実上不可能と言わざるを得ない。
【０００７】
低栄養性微生物の存在は古くから知られており、多くの研究がなされている。これまで低栄養性微生物は生育条件の中の有機炭素量でのみ論じられており、有機炭素濃度が１から１５ｐｐｍ以下で生育可能な微生物が低栄養性微生物と称されて研究されている[（畝本  力、「特殊環境に生きる細菌の巧みなライフスタイル」、共立出版、Ｐ７（１９９３）:江口  充、「海洋微生物とバイオテクノロジー」、技報堂出版、Ｐ６８（１９９１）:諏訪  裕一ら、「微生物の分離法」、Ｒ＆Ｄプランニング、Ｐ５４５（１９９０）]。
しかしながら自然汚染環境あるいは製油所や化学工場の排水は、汚染物質である有機炭素の濃度が高く、その他のリン、窒素等の栄養塩濃度のみが低い状態にある。この様な有機炭素の濃度が高く、その他のリン、窒素等の栄養塩濃度のみが低い条件で生育し汚染物質を分解する微生物は、従来の低栄養性微生物の概念に当てはまらないものであり、これまでに報告がない。
【０００８】
本発明の目的は、栄養塩類を添加することなしに、低栄養条件で生育し、芳香族化合物を分解することのできる低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａの生育促進方法、該微生物を用いた芳香族化合物、例えばフェノール含有排水処理用バイオリアクター、および該バイオリアクターを用いた排水処理技術、例えば製油所や化学工場などのフェノール含有排水処理技術を提供することにある。
なお、本発明で言う低栄養条件とは、前記のように有機炭素の濃度が高く、例えば、１５ｐｐｍ以上で、かつリン、窒素等の栄養塩濃度が低い、例えば、リン５ｐｐｍ以下でかつ窒素５０ｐｐｍ以下のような条件を指す。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
普通の自然環境は低栄養状態と考えられているが、本発明者らは、微生物の生育に特に重要なリンと窒素に注目し、自然環境中のリンと窒素の濃度を測定した。その結果、土壌や地下水では次表１に示すように窒素濃度が約６０ｐｐｍ以下、リン濃度が約３ｐｐｍ以下である。海洋では更に栄養成分濃度は低く、窒素濃度が約１．０ｐｐｍ以下、リン濃度が約０．１ｐｐｍ以下である。
【００１０】
【表１】
0004112082.tif 000002
【００１１】
前記自然環境中のリンと窒素の濃度の測定値に基づき、本発明者らは目的とする有機炭素の濃度が高く、その他のリンと窒素の栄養塩濃度のみが低い条件で生育し、汚染物質を分解することのできる微生物を得るための培地は、リン濃度が約５ｐｐｍ以下で、かつ窒素濃度が約５０ｐｐｍ以下のものであることを見出し、この知見に基づき、低栄養条件下で芳香族化合物を分解する微生物としてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５５６６）を先に提案している。
【００１２】
さらに本発明者らは、栄養塩類を添加することなしに、低栄養状態の排水を効率よく処理するためには、低栄養性微生物は、菌体生育量が少ないため、菌体量を高めたバイオリアクターを構築する必要があると考え、低栄養条件である製油所や化学工場などの低栄養排水について低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａを用いたバイオリアクターについて菌体濃度を高めるため実験を多く行った。
【００１３】
すなわち、低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａを培養する際に、培養液にポリスチレン、テフロン、ポリプロピレン、デルリン、アルミナ、エポキシ樹脂、ナイロン、ポリエチレンの各種素材で作成したビーズを添加し、該微生物の生育量とフェノール分解量について検討した。その結果、培養液中にポリスチレンを添加することによって、低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａの生育とこれに伴うフェノールの分解活性が著しく向上することを見出し、本発明に到達することができた。
従って、本発明の特徴の第１は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ１Ａの生育を低栄養条件でポリエスチレンの共存下で行うことを特徴とするＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａの生育促進方法に関する。
【００１４】
培地にプラスチック製品を添加して微生物を生育させる研究は、本発明前に服部らの報告がある〔森崎久雄ら、界面と微生物、学会出版センター（１９８８）〕。服部らは、培養液にプラスチック製の陰イオン交換樹脂を添加して、微生物の生育至適ｐＨがイオン交換樹脂を添加しない場合と比べてアルカリ側に移動することを見い出した。そして、この現象は陰イオン交換樹脂の表面近傍における培養液のｐＨが陰イオン交換樹脂から遠くに存在する培養液のｐＨと異なることに起因するものと考察している。
しかしポリスチレンには、イオン交換能と言ったような特別な機能はなく、陰イオン交換樹脂の添加効果と本発明で使用するポリスチレンの作用とは、まったく異なるものである。
【００１５】
一方、菌体の固定化法については、従来より多く研究がなされており、アルギン酸、ポリビニールアルコール、κ−カラギーナン、ゲランガム、アガロース、セルロース、デキストラン等のゲル状物質に包括固定する方法や、ガラス、活性炭、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、木材、シリカゲル等の表面に吸着固定する方法を挙げることができる［扇元  敬司、「バイオテクノロジーテキストシリーズ  微生物学」、講談社、Ｐ１６８（１９９４）、相田  浩ら、「新版  応用微生物学ＩＩ」、朝倉書店、Ｐ１１６（１９９５）］。
【００１６】
また、フェノールの排水処理に於いてもＲｈｃｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌［Ｓ−Ｌ．Ｐａｉ外ら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈ．，５１，Ｐ３７（１９９５）］やＰｓｅｎｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ［渡辺一哉ら、水処理技術、３６，Ｐ７７（１９９４）、Ａ．Ｍｏｒｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３３，Ｐ２０６（１９９０）］等の細菌、Ｃａｎｄiｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ［Ｈ．Ｗｅｎｈｕａ外ら、Ｗａｔｅｒ  Ｔｒｅｎｔ，８，Ｐ１１９（１９９３）］やＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｉｎｏｖｉｒ［Ａ．Ｍｏｒｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３３，Ｐ２０６（１９９０）］等の酵母及び活性汚泥［Ｆ．Ｓ．Ｌａｋｈｗａｌａ  ら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉ．，８，Ｐ９（１９９２）］をアルギン酸やポリビニルアルコール等による包括法及び活性炭や粘土鉱物による吸着法にて固定化して用いる例が報告されている。
【００１７】
しかしながら、本発明における前記ポリスチレンの効果は、その効果からみて、担体としての菌体固定化のための効果のみではなく、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａ培養液中の浮遊菌体の量をも高める他の素材には見られない増殖触媒作用であると考えられる。
前記ポリスチレンの増殖触媒作用は、ポリスチレンが水に不溶なプラスチックであること、低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａがポリスチレン製のビーズを炭素源として利用できないこと、培養液中に加えるポリスチレン製のビーズの数に比例することより、ポリスチレンの表面積に依存するものと考えられる（実施例７，９）。
【００１８】
培養液中に加えるポリスチレンの形状は、ビーズ状のものに限られるものではなく、シート状、ハニカム状、パイプ状等の種々の形状のものを用いることができるが、前記のようにその表面積の大きいものが好ましい。さらにポリスチレンは、他のプラスチック、ガラス、シリカゲル、アルミナ、金属等の表面にポリスチレンをコーティングした形でも用いることができる。
【００１９】
さらに、本発明者らは培養液中に加えるポリスチレンの使用態様について検討した結果、ポリスチレンに物理的な力を加え、該ポリスチレン表面に保持されて増殖した菌体の少なくとも一部を積極的に剥離させ、浮遊菌体とすることにより、ポリスチレンの増殖作用が向上することを見出した。この増殖作用の向上の原因としては、図４に示すように、ポリスチレン表面から菌体剥離され、該剥離された浮遊菌体もフェノール分解活性を有する菌体であり、さらに菌体が剥離されたポリスチレン表面には、また菌体が形成されるので、リアクター全体としてはフェノール分解活性が向上する。
【００２０】
前記培養工程中にポリスチレン表面から増殖した菌体を剥離するためには、菌体剥離型リアクターを用いるのが好ましい。該菌体剥離型リアクターとしては、例えば菌体剥離型ーエアーリフト型リアクター、小型ジャー型リアクターおよびビーズインボール型リアクター等が挙げられる。
【００２１】
本発明のバイオリアクターに用いるポリスチレンは耐水性に優れた半永久的な材質であり、長期間使用することが可能である。長期間使用すれば、ポリスチレンそのものは廃棄物とならないので、総合的な観点からは環境負荷が少ない。
また、本発明で言うポリスチレンとは、スチレンの単独重合体のみを指すのではなく、本発明の意図する増殖触媒作用を奏する限り、スチレン以外に他のモノマー成分を含有するものであっても良い。
本発明のバイオリアクターに用いるポリスチレンは耐水性に優れた半永久的な材質であり、長期間使用することが可能である。長期間使用すれば、ポリスチレンそのものは廃棄物とならないので、総合的な観点からは環境負荷が少ない。
【００２２】
本発明で使用するＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａは、リン濃度５ｐｐｍ以下でかつ窒素濃度５０ｐｐｍ以下の培地を用いて、フェノール１０００ｐｐｍを炭素源とした条件で検索することによって得られた。
【００２３】
リン源は実質的に微生物がリン源として利用可能な物質であればなんでも良く、リン酸一アンモニウム、リン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸水素アンモニウムカリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム等の無機のリン酸塩およびこれらの塩の水和物、酵母エキス、肉汁エキス等のリンを含む天然物やリン酸エステル等の有機リン化合物等をあげることができる。
【００２４】
同様に窒素源も実質的に微生物が窒素源として利用可能な物質であればなんでも良く、硫酸アンモニウム、リン酸一アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウムカリウム、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩およびこれらの塩の水和物、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、尿素、アミノ酸、酵母エキス、肉汁エキス、ペプトン等の窒素を含む天然物やアミド化合物等の有機含窒素化合物等をあげることができる。
【００２５】
前記Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａは、リン５ｐｐｍ以下でかつ窒素５０ｐｐｍ以下と言う低栄養条件下で生育することができるので、栄養塩類を添加しない環境調和型の環境浄化や排水処理に応用することが可能である。ただし、該微生物がリン５ｐｐｍ以下でかつ窒素５０ｐｐｍ以下と言う低栄養条件下で生育することができると言う性質を有することは、該微生物がリン５ｐｐｍ以上あるいは窒素５０ｐｐｍ以上の条件で生育できないことを意味するのではなく、前記Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａは、低栄養条件下のみならず、高栄養条件下でも生育できる通性低栄養性微生物である。
【００２６】
【実施例】
実施例１
低リン濃度、低窒素濃度条件（自然環境）で生育するフェノール資化性菌の検索
（検索用培地の作成）
検索用培地として、下表２に示した培地（以下、Ｅ−培地）を１／１０に希釈したもの（１／１０Ｅ−培地：リン約５ｐｐｍ、窒素約５０ｐｐｍ）を用いた。これに、炭素源としてフェノール１，０００ｐｐｍを加えた。また、各培地のｐＨは７．０とした。
【００２７】
【表２】
0004112082.tif 000003
【００２８】
（分解菌の取得方法Ａ）
分離源としては、つくば市周辺の土壌約４８０種類を用い、以下の方法で微生物のみを抽出して培地に添加した。３００ｍｌ容の三角フラスコに滅菌水３０ｍｌを入れ、ここに土壌サンプル５ｇを加えた。これを１日回転振とうして、菌の抽出を行なった。抽出後、遠心分離（２，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）して土壌を沈澱させ、上清を濾紙、およびグラスフィルターにてろ過して、土壌微粒子を除いた。得られた菌液をニトロセルロースフィルター（０．２μｍ）でろ過して微生物を捕集した。このフィルターを適宜切断して培地に加え、検索を行なった。検索は以下の方法で行なった。３００ｍｌ容の三角フラスコに１／１０Ｅ−培地３０ｍｌを入れ、ここに上述のニトロセルロースフィルターを加え３０℃にて５日間振とう培養を行なった。生育の見られたものについては、１／１０Ｅ−培地８ｍｌを入れた内径２４ｍｍの大型試験管に１００μｌ植え継ぎ５日間培養した。これを２回繰り返し、菌の単離を行なった。
菌の単離には、前述の１／１０Ｅ−培地に１．２％のアガロース[ａｇａｒｏｓｅ（電気泳動用ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｅ  ｇｒａｄｅ）]を加えて作成した平板を用いた。これに、前述の培養液を適宜希釈して塗布し、３０℃にて５日間培養して、生育してきたコロニーを単離した。
【００２９】
実施例２
（実施例１で取得した分解菌の同定）
前記実施例１で得られたフェノール資化性菌１Ａ株はグラム陰性で、運動性を持ち、オキシダーゼ、カタラーゼ共に陽性であった。また、Ｏ−Ｆテストは酸化を示した。その他の各種生理試験の結果から、取得した菌株の１種類はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａであると同定された。下表に、フェノール資化性菌１Ａ株の特性を示す。
【００３０】
【表３】
0004112082.tif 000004
【００３１】
【表４】
0004112082.tif 000005
【００３２】
実施例３
実施例１で得られた分解菌による低リン濃度、低窒素濃度条件下のフェノールの分解
（分解方法）
１Ａ株を１／１０Ｅ−平板培地（フェノール１，０００ｐｐｍ）に植菌し、３０℃にて培養した。生育した菌体を１／１０Ｅ−培地２ｍｌを入れたプラスチックチューブ（フェノールがチューブに吸着しないことは確認済み）に植菌し、振とう培養機（ＭＢＳＳ−１０、丸菱）にて培養して、培養後のフェノールの分解量を、ガスクロマトグラフィーを用いて定量した。初発フェノール濃度は１００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍとし、それぞれ３、６日後にサンプリングを行った。ガスクロマトグラフィーの条件を以下に示す。
カラム（Ｃｏｌｕｍｎ）        ：ＵｎｉｓｏｌｅＦ−２００
注入温度（Ｉｎｊ．ｔｅｍｐ）  ：１８０℃
カラム温度（Ｃｏｌ．ｔｅｍｐ）：１５０℃
検出器  （Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）  ：ＦＩＤ
注入量  （ｉｎｊ．ｓｉｚｅ）  ：２μｌ
内部標準物質（ＩＳ）          ：ジエチレングリコール
分解試験の結果を下表５に示す。実験に供したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａ株は、フェノール分解能を有していた。
【００３３】
【表５】
0004112082.tif 000006
【００３４】
実施例４
（実施例１で得られた菌株と既存の菌株のフェノール分解能の比較実験）
供試菌株としては実施例１で得た分離株１Ａ株を用いた。また、比較のために、これまでにフェノール分解菌として報告されているＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）保存菌株も用いた。このＡＴＣＣ保存のフェノール分解菌は、下記の４株である。
・Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ            ＡＴＣＣ  １１１７２
・Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ  １４３４７
・Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｙｃｌｏｓｉｅｓ                ＡＴＣＣ  １４６３５
・Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉ            ＡＴＣＣ  ５１３４９
前記供試菌株を下表６に示す培地を１／１００に希釈した１／１００Ｆ−培地（リン約１ｐｐｍ、窒素約２０ｐｐｍ）、または１／１００Ｆ−培地のリン、窒素濃度をそれぞれ約５００ｐｐｍに高めた培地２ｍｌを入れたプラスチックチューブに植菌し、振とう培養機（ＭＢＳＳ−１０、丸菱）にて３０℃、４日間培養した。培養後のフェノールの分解量を、ガスクロマトグラフィーを用いて定量した。また、生育量は６６０ｎｍにおける吸光度（Ａ６６０）として測定した。
【００３５】
【表６】
0004112082.tif 000007
【００３６】
なお、表６中の微量金属（ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ）の組成は下表７の通りである。
【表７】
0004112082.tif 000008
【００３７】
（結果と考察）
分解試験の結果を下表８〜９に示した。表８に示すように、取得した分解菌は１／１００Ｆ−培地に良好に生育し、添加した１００ｐｐｍのフェノールはほとんどが４日以内に完全に分解されていた。また、培地中のリン、窒素濃度を高めても、生育、フェノール分解共に阻害は全く見られなかった。
一方、ＡＴＣＣ保存株の方は、全ての菌株が基本培地には全く生育が見られなかった。表中でフェノールのわずかな減少が見られるのは、植菌した菌体への吸着であると思われる。なお、培地中のリン、窒素濃度をそれぞれ５００ｐｐｍに高めた培地を用いた表９の場合にも、表８に示すように、フェノールの分解が観察された。この結果から、前記実施例１のフェノール分解菌は、これまでに知られているフェノール分解菌が全く生育できないような低リン低窒素条件下で生育し、良好なフェノール分解能を有する新規な菌であると考えられる。
【００３８】
【表８】
0004112082.tif 000009
【００３９】
【表９】
0004112082.tif 000010
【００４０】
実施例５
低リン濃度、低窒素濃度条件で生育するフェノール資化性菌を用いた各種芳香族化合物の分解
供試菌株としては実施例１で得た分離株１Ａを用いてフェノール、ベンゼン、トルエン、キシレン（異性体混合物）の資化性を確認した。基質である各種芳香族化合物の量は１００ｐｐｍとし、培地は１／１００Ｆ−培地を用い、３０℃で４日間培養行った。
その結果を下表１０に示す。
【００４１】
【表１０】
0004112082.tif 000011
前表の結果より、何れの基質（炭素源）も炭素源が無い場合より、微生物の生育が高いことが確認できた。
【００４２】
実施例６
低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａの固定化担体の材質を検討するため、ポリスチレン、テフロン、アルミナ、ナイロン、デルリン、ポリエチレン、エポキシ樹脂、ポリプロピレンを用いてψ６．３ｍｍのビーズを作成した。
種母培養した１Ａ株は他の培養実験と同様に滅菌水で懸濁し、５８０ｎｍ吸光度（Ａ５８０）で０．０１になるように植菌した。培地１ｍｌとビーズ４個をネジ付ガラス試験管に入れ、３０℃、６００ｒｐｍの回転振盪下で１日間培養を行い、フェノールの分解能を検討した。
結果は図１に示した。ナイロンとデルリンはフェノールの吸着或いは吸収量が高かったため、以降の実験には供しなかった。
培養時にはポリスチレンビーズを添加した時に、最もフェノールは速く分解された。他の材質ビーズはビーズ無添加（浮遊菌体）に比べフェノール分解を僅かしか促進せず、その程度にはほとんど差がなかった。
【００４３】
実施例７
１Ａ株の培養時にψ６．３ｍｍのポリスチレンビーズを試験管あたり１〜４個添加してポリスチレンビーズの添加個数とフェノール分解に対する影響を検討した。
種母培養した１Ａ株は他の培養実験と同様に滅菌水で懸濁し、Ａ５８０で０．０１になるように植菌した。培地１ｍｌとビーズ４個をネジ付きガラス試験管に入れ、３０℃、６００ｐｐｍの回転振盪下で１日間培養を行い、フェノールの分解能を検討した。
その結果を図２に示した。ポリスチレンビーズの添加個数が増加するに従い、浮遊菌体量も増加し、これに伴ってフェノール分解量も増加した。
【００４４】
実施例８
ポリスチレンビーズ（ψ６．３ｍｍ）を用いて図３に示すようなバイオリアクターを２台作成した。
１台にはポリスチレンビーズを３００個添加し、もう１台にはポリスチレンビーズを全然添加せずに両者を比較検討した。
培地は各々８００ｍｌ添加し、種母培養した１Ａ株は滅菌水に懸濁してＡ５８０で０．００１になるように植菌した。
培養は回転バネを２５０ｒｐｍで回転攪拌しながら２５℃で行った。反応は回分式で行った。
その結果、図３に示すようなポリスチレンビーズを添加したものは浮遊菌体量も増加し、これに伴ってフェノール分解能もポリスチレンビーズ無添加に比べ高かった。
【００４５】
実施例９
低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａの生育に及ぼすポリスチレンビーズの表面積の影響について検討した。
直径の異なるポリスチレンビーズ（ψ３．２ｍｍおよびψ６．３５ｍｍ）の０〜３５個を栄養系に添加して、その生育に及ぼす影響を検討した。培養は３０゜Ｃ、６００ｒｐｍで一日間行った。ポリスチレンビーズ表面に吸着している菌体はアルカリ加水分解してタンパク質量として測定した。
その結果を図５に示した。ポリスチレンビーズの大小に関わらず、浮遊菌体量と吸着菌体量は共にポリスチレンビーズの実面積に依存して増加した。また、浮遊菌体量は表面積３００ｍｍ２付近、吸着菌体量は表面積６００ｍｍ２付近で飽和に達した。前記結果より、低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａの生育促進効果はビーズの大小ではなくビーズの表面積に依存することが解る。
【００４６】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａ株の場合、乾燥菌体の約４５％がタンパク質であり、１細胞の乾燥重量は８．１×１０−８μｇである。また、図５に示したデータよりビーズの表面積に吸着している菌体量はタンパク質として０．０５μｇ／ｍｍ２と算出される。前記１Ａ株の設置面積を０．５×１．５μｍと仮定すると、１ｍｍ２に１．３×１０６ｃｅｌｌが吸着し得ることになり、この値は先に求めた１．３７×１０６ｃｅｌｌ／ｍｍ２にほぼ等しい。従って、ポリスチレンの表面積には１Ａ株がほぼ飽和に近い状態で吸着しているものと考えられる。
【００４７】
ポリスチレンビース表面に吸着した菌体量は、アルカリ加水分解した後にタンパク質量として測定した。培養後のポリスチレンビーズを超純水で１回洗い、０．１ＮのＮａＯＨを加えて８０℃で一晩加熱して菌体を加水分解した。加水分解後の溶液に含まれるタンバク質はローリー法によりウシ血清アルブミンを標準として定量した（Ｒ．Ｆ．Ｓｃｈｌｅｉｆら（川上正也ら監訳）、『分子生物学マニュアル』講談社サイエンティフック、ｐ９０（１９８３））
【００４８】
実施例１０
各種ビースの表面親水性と仕と低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａの生育に及ぽす影響
φ６．３〜６．４ｍｍのガラス、テフロン及びポリスチレン製の各種ビースを用いて表面親水性と１Ａ株の生育に及ぼす影響を検討した。培養は３０℃、６００ｒｐｍで１日間行った。各種ビーズの表面親水性はＭ−Ｏ、Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎらの方法に従いビース表面に滴下した水滴とビーズ表面の接触角より求め。親水性（ＷＡ値）は、
【数１】
ＷＡ＝ＹLV０（１＋ｃｏｓθ）
（θは接触角、ＹLV０は飽和蒸気内での水の表面張力であり、７２．８ｍＮｍ-1である）
で与えられる（Ｍ−Ｏ、Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎら、Ｅｎｖｉｒｏｎ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.、５６、ｐ３６４３(１９９０)）。
各種ビース表面に吸着した菌体量は、アルカリ加水分解した後にタンパク質量として測定した。
前記の実験結果と各種ビーズの親水性を下表１１に示した。テフロンビーズが最も疎水性であり、ガラスビースは親水性てあった。ポリスチレンビースの親水性はテフロンビースとガラスビースの中間の値を示した。
【００４９】
【表１１】
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前記１Ａ株はポリスチレンビースの表面に最も良く吸着し、テフロンビース表面に吸着した菌体量はポリスチレンビーズの約１／４であつた．またガラスビーズ表面には全く吸着を示さなかった。
【００５０】
実施例１１
小型ジャー型リアクターによるフェノール分解
本実施例は、図６に示すような菌体剥離型リアクターとして小型ジャー型リアクターを用いてフェノールを分解する実施例である。該小型ジャー型リアクターは、カルスター社製の動物細胞培養用フラスコ（５００ｍｌ、ダブルアーム付）を改造して作製した。主な改造点は、フラスコ内部にステンレス製カゴを設置し、ポリスチレンビーズ（住友ベークライト製ＥＬＩＳＡ(ＲＩＡ)用ボールＨ５００個）を添加出来るように、またリアクター内の水面が水平になるようにテフロン製のバッフルを設置し、さらに該攪拌羽根の軸にステンレス製の棒を２本取付、カゴの中のポリスチレンビーズに物理的な衝撃を与えられるようにした。このリアクターを用いて、浮遊菌体量とフェノール分解量を検討した。
培地はリン０．５ｐｐｍ、窒素５ｐｐｍおよびフェノール１００ｐｐｍを含むものを用い、また、培地の流加速度は３０ｍｌ／ｈｒ（Ｔ1/2＝１３．３ｈｒ）である。その結果を図７に示した。ステンレス製の棒を取付けることにより浮遊菌体量は著しく増大した。また、これに伴いフェノールもすべてが分解された。
【００５１】
実施例１２
エアーリフト型リアクターによるフェノール分解
本実施例では、エアーリフト型リアクターは、（株）丸菱バイオエンジ社製のＭＤＰ型５Ｌステンレス製の棒を装着したカゴを設置し、落下するポリスチレンビーズがステンレス製の棒に衝突するように改造したものを使用した。
前記菌体剥離型ーエアーリフト型リアクターの実容量は、４，０００ｍｌであり、該リアクターに２ＳＬ／ｍｉｎの通気量で通気し、コンプレッサーエアーをフィルターで除菌してこれを用いた。
【００５２】
本実施例ではポリスチレンビーズを添加しないものをコントロールとして、ポリスチレンビーズの添加しないものをコントロールとして、ポリスチレンビーズの添加効果とカゴの設置効果を比較検討した。培養は３０゜Ｃで４８時間の回分培養を行った。フェノールの初発濃度を１００ｐｐｍとし、培養２４時間後に更に１００ｐｐｍ相当量を添加した。
【００５３】
いずれのリアクターにおいても培養２４時間後には、初めに与えた１００ｐｐｍのフェノールは完全に分解されていた。１００ｐｐｍ相当のフェノールを添加した後（培養３０時間後）の結果を図８に示した。ポリスチレンビーズを添加することにより、浮遊菌体量が増加し、これに伴ってフェノール分解能も向上した。更に、ステンレス製の棒を装着したカゴを設置することにより、浮遊菌体量の増加とフェノール分解能の向上が観察された。
【００５４】
実施例１３
ビーズインボール型リアクターによるフェノール分解
本実施例は、菌体剥離型リアクターとしてビーズインボール型リアクター（出願と同時に提出した物件提出書）を用いてフェノールを分解する実施例である。本実施例では、プラスチック製の球形のカゴの中に約８０個のポリスチレンビーズを入れ、培地の攪拌によりカゴが回転することで中に収納されたポリスチレンビーズが互いにぶっかり合うようにした。培養は３０゜Ｃで２４時間の回分培養と２０ｍｌ／ｈ（Ｔ1/2＝２０ｈｒ）と連続培養を行った。
【００５５】
その結果は図９に示した。ジャー型リアクター菌体剥離型リアクターリアクターと同様にコントロール（ポリスチレンビーズ無添加）のリアクターに比べて浮遊菌体量の増加が確認され、フェノールの分解活性も向上した。
ビーズインボール型とエアーリフト型リアクターでも菌体剥離型リアクターとなったので、菌体を剥離させる力はさほど大きくなくてもよいことが理解される。
【００５６】
【効果】
栄養塩類を添加することなしに、低栄養条件で生育し、芳香族化合物を分解することのできる低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａの生育促進方法、該微生物を用いた芳香族化合物、例えばフェノール含有排水処理用バイオリアクター、および該バイオリアクターを用いた排水処理技術、例えば製油所や化学工場などのフェノール含有排水処理技術を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例６の結果を示す図である。
【図２】実施例７の結果を示す図である。
【図３】本発明で使用するバイオリアクターの概念図の１例である。
【図４】本発明の菌体剥離型リアクターの概念を説明した図である。
【図５】低栄養性微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  １Ａ株の生育に及ぼすポリスチレンピースの表面積の影響を説明した図である。（Ａ）浮遊菌体濃度（Ｂ）ビーズ表面への吸着タンパク室濃度
【図６】小型ジャー型リアクターの模式的断面図である。
【図７】小型ジャー型リアクターによるフェノール分解結果を示した図である。
【図８】菌体剥離型ーエアーリフト型リアクターによるによるフェノール分解結果を示した図である。
【図９】ピーズインーボル型リアクターによるフエノール分解結果を示した図である。
【符号の説明】
１  ポリスチレンビーズ保持用のカゴ
２  カゴ中に保持されたポリスチレンビーズ
３  バッフル（じゃま板）
４  攪拌羽根
５  回転軸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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