(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号がFERM P−18645である、メタン資化菌。
【請求項２】
請求項１記載のメタン資化菌を用いてメタンからメタノールを製造する方法において、
メタン資化菌を６０〜６５℃の温度下に置く状態と当該菌の生存至適温度（４８℃）±５℃の温度下に置く状態を繰り返すことによりメタンからメタノールを製造する方法。
【請求項３】
メタノール生成速度が最高速度の０〜８０％に低下した時点で、メタン資化菌の生存条件を一定時間緩和する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
メタン資化菌の還元力を生み出すエネルギー源として蟻酸を系内に添加することなしにメタンからメタノールを製造する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
メタン資化菌の生存を阻害しない濃度のメタノールの存在下で、メタンからメタノールを製造する請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、メタン資化菌を用いてメタンからメタノールを製造する方法及びこの方法に用いるメタン資化菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今後のエネルギー開発においては、エネルギーの安定供給と地球環境保全との双方を確保することが重要な課題である。環境保全の観点からは、よりクリーンなエネルギーへのシフト及びこのようなクリーンエネルギーを用いた動力技術の開発が求められる。
【０００３】
現在、石油が主なエネルギー源として用いられているが、石油は燃焼に伴い二酸化炭素排出量が多く、硫黄酸化物などの有害物を排出するという難点がある。また、石油の産出量は２０２０年以降減少すると見通されている。石油よりクリーンなエネルギー源であり、かつ安定供給可能な石油代替エネルギーとして、メタンが注目されている。
【０００４】
メタンは、メタノールひいてはジメチルエーテル等の液体燃料の製造原料として用いられる。メタンからのメタノール、ジメチルエーテル等の製造は、工業的には、COガス及びH2ガスの製造及びその後の高温・高圧下での多段階プロセスにより行われている。しかし、この方法は、高温・高圧を維持するために大規模な設備が必要であり、小規模のガス田では行い難い。また、高温・高圧を維持するためにコスト高になる。
【０００５】
一方、常温・常圧でメタンからメタノールを合成する方法として、メタノールをエネルギー源として利用できるメタン資化菌を利用する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
図１に示すように、メタン資化菌は、メタンモノオキシゲナーゼによりメタンを酸化してメタノールとし、メタノールデヒドロゲナーゼによりメタノールを酸化してホルムアルデヒドとする。さらにメタン資化菌は、一方ではホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼによりホルムアルデヒドを酸化して蟻酸とし、フォルミックアシッドデヒドロゲナーゼにより蟻酸を酸化して二酸化炭素とする課程で、エネルギー源である還元力を生み出す。メタン資化菌は、他方では、ホルムアルデヒドを炭素源として用い、幾つかの段階を経て最終的に細胞構築物とする。
【０００７】
この課程を通じて、メタンはエネルギー源及び炭素源として利用されてしまい、通常、中間生成物であるメタノールを効率よく得ることは困難である。このため、メタノールを酸化するメタノールデヒドロゲナーゼをシクロプロパノールを用いて阻害することにより、メタノールを効率よく回収することも提案されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、シクロプロパノールは高価かつ不安定な化合物であるため、工業的には使用し難い。
【０００８】
また、メタン資化菌を用いてメタンからメタノールを製造する方法では、合成されたメタノールによりメタン資化菌が被毒されるために合成メタノール濃度を一定以上に高くすることができないという難点もある。
【０００９】
このため、メタノールの沸点付近で生育するメタン資化菌が単離されており、このメタン資化菌を用いてメタノールを製造するにあたり合成されたメタノールが随時蒸発により系外へ排出されるようなシステムが提案されている。
【００１０】
また、メタン資化菌を用いたメタノールの製造において、メタンとメタノールとの変換効率を左右するのは、メタン資化菌のメタン酸化能力である。従来のメタン資化菌ではその能力が30μmol/min/g乾燥菌体程度であり（例えば、非特許文献１参照）、産業として利用するのには十分でない。
【００１１】
また、従来、メタン資化菌を用いたメタン・メタノール変換において、メタンの酸化のためのエネルギーとして、系内にギ酸が供給されていた（例えば、非特許文献１参照）。しかし、ギ酸は高価で毒性が高い化合物であるため、安価で安全なエネルギー源が求められている。
【００１２】
【特許文献１】
特開2000-166553号公報
【００１３】
【特許文献２】
特開平1−177716号公報
【００１４】
【非特許文献１】
Optimization of Methanol Biosynthesis by Methylosinus trichosporium OB3b, M. Takeguti et al, Applied Biochemistry and Biotechnology vol68,143-152 1997
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、メタン資化菌を用いて、効率よくメタンからメタノールを製造できる方法及びこの方法に用いるメタン資化菌を提供することを主目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
▲１▼  メタン資化菌を用いてメタンからメタノールを効率的に製造するためには、メタノールデヒドロゲナーゼ活性に対するメタンモノオキシゲナーゼ活性の比率が大きいことが必要である。しかし、この比率が大きいほど、メタノール生産に消費する還元力に対して生成する還元力の比率が小さくなり、最終的にはメタノール生産速度が低下してしまう。
【００１７】
メタン資化菌により、メタンからメタノールを効率的かつ継続的に生産させるには、所定条件下でのみメタノールデヒドロゲナーゼ活性に対するメタンモノオキシゲナーゼ活性の比率が増大するメタン資化菌を用いることが有効である。このようなメタン資化菌を用い、メタノールデヒドロゲナーゼ活性に対するメタンモノオキシゲナーゼ活性の比率が増大する条件下で高速でメタノールを生産させ、還元力の不足によりメタノールの生産速度が低下してきた時点で、メタノールデヒドロゲナーゼ活性に対するメタンモノオキシゲナーゼ活性の比率が小さくなる条件に一定期間切り替えて、還元力を補充する。この二つの条件を繰り返すことによりメタンからメタノールを効率的かつ継続的に生産することができる。
▲２▼  対数増殖期前半のメタン資化菌は、メタン酸化活性が非常に高い。従って、対数増殖期前半のメタン資化菌をその状態に保ちつつ、メタンからメタノールを生産させることにより、効率よくメタノールが得られる。対数増殖期に保つためには、所定条件下でのみメタノールデヒドロゲナーゼ活性に対するメタンモノオキシゲナーゼ活性が高くなるメタン資化菌を用い、メタン資化菌が増殖せず且つ生存できる程度にフォルムアルデヒドが生じるように生存条件を設定すればよい。
▲３▼  メタン資化菌によりメタンからメタノールを生産するにあたり、還元力を生み出すエネルギー源として蟻酸を系内に添加するのに代えて、メタン資化菌の生育を阻害しない範囲でメタノールを存在させることにより、メタン資化菌のメタン酸化活性を向上させることができる。
【００１８】
本発明は前記知見に基づき完成されたものであり、以下のメタン資化菌及びメタノールの製造方法を提供する。
項１．  過酷な条件下では温和な条件下に比べて、メタノールデヒドロゲナーゼ活性に対するメタンモノオキシゲナーゼ活性の比率が可逆的に高くなるメタン資化菌。
項２．  過酷な条件が高温の条件である項１に記載のメタン資化菌。
項３．  メチロカルダム属に属する項２に記載のメタン資化菌。
項４．  寄託番号がFERM P−18645である項３に記載のメタン資化菌。
項５．  項１〜４のいずれかに記載のメタン資化菌を過酷な条件下においた状態で、該メタン資化菌によりメタンからメタノールを製造する方法。
項６．  メタノール生成速度が最高速度の０〜８０％に低下した時点で、メタン資化菌の生存条件を一定時間緩和する項５に記載の方法。
項７．  対数増殖期前半のメタン資化菌を用いる項５又は６に記載の方法。
項８．  対数増殖期前半のメタン資化菌を用いて、メタンからメタノールを製造する方法。
項９．  メチロカルダム属に属するメタン資化菌を用いる項８に記載の方法。
項１０．  メタン資化菌の生存を阻害しない濃度のメタノールの存在下で、メタン資化菌を用いて、メタンからメタノールを製造する方法。
項１１．  メチロカルダム属に属するメタン資化菌を用いる項１０に記載の方法。
【００１９】
【発明の実施の形態】
（１）メタン資化菌
菌の性質
本発明のメタン資化菌は、過酷な条件下では温和な条件下に比べて、メタノールデヒドロゲナーゼ（以下、「MDH」という。）活性に対するメタンモノオキシゲナーゼ（以下、「MMO」という。）活性の比率（以下、「MMO／MDH比」という。）が可逆的に高くなるメタン資化菌である。これは、過酷な条件下でMMO活性が高くなるもの又はMDH活性が低くなるもののいずれであってもよい。また、温和な条件下でMMO活性がMDH活性より大きいメタン資化菌であっても、過酷な条件下でさらにMMO／MDH比が増大する菌であればよい。
【００２０】
本発明において、MMO／MDH比は、実施例に記載の方法により測定された値である。
【００２１】
過酷な条件としては、例えば高温条件、高pHまたは低pH条件、高塩濃度等の条件を例示できる。
【００２２】
また、温和な条件とは、メタン資化菌の生存至適条件を含む生存に適した条件であり、生存至適温度±10℃（好ましくは±5℃、より好ましくは±1℃）以内の温度、生存至適pH±２（好ましくは±1、より好ましくは±0.2）以内のpH、生存至適塩濃度±10g/l以内の塩濃度の条件が挙げられる。
【００２３】
本発明のメタン資化菌は、高温条件下でMMO／MDH比が可逆的に高くなる温度感受性細菌であることが好ましい。これは、メタノールの沸点が65℃であることから、メタン資化菌をこの沸点前後の環境中で生存させた状態でメタンからメタノールを生産させる場合には、メタノールを効率的に回収することができるからである。すなわち、液体培地中に液体状態で生産されたメタノールを液体培地から分離するのは困難であるが、雰囲気中に気体状態で生産されたメタノールは、冷却することにより簡単に液体として空気から分離することができるからである。
【００２４】
本発明のメタン資化菌が温度感受性細菌である場合には、過酷な高温条件として、通常30〜100℃程度、特に50〜70℃程度、さらに特に60〜65℃程度の温度条件が挙げられる。本発明のメタン資化菌は、この温度下で、MMO／MDH比が、通常１以上、特に５以上、さらに特に10以上であることが好ましい。
【００２５】
本発明のメタン資化菌がpH感受性細菌である場合には、過酷なpH条件として、通常７〜10程度、特に８〜９程度の高pH条件または通常４〜７程度、特に５〜６程度の低pH条件が挙げられる。本発明のメタン資化菌は、このpH下で、MMO／MDH比が、通常１以上、特に５以上、さらに特に10以上であることが好ましい。
【００２６】
本発明のメタン資化菌が塩濃度感受性細菌である場合には、過酷な塩濃度条件として、通常１〜100g/l程度、特に10〜50g/l程度の塩濃度条件が挙げられる。この塩濃度下で、MMO／MDH比が、通常１以上、特に５以上、さらに特に10以上であることが好ましい。
【００２７】
MMO／MDH比の上限は特に制限されず、温和な条件下に戻した場合にMMO／MDH比が、生存可能な程度に低下するのであれば、過酷な条件下ではどれだけ大きくてもよく、MDH活性が全く検出されなくても構わない。
細菌の入手方法
本発明のメタン資化菌は、温泉のような高温環境、高pH若しくは低pH環境、または海のような高塩濃度環境から、それぞれ分離することもできるが、変異剤処理によっても得ることができる。
【００２８】
このようなメタン資化菌は、生存至適条件より高い温度環境、高pH若しくは低pH環境、または高い塩濃度環境から採取した細菌の中から、例えば、生育不可能な条件下でもMMO活性を検出できる細菌を選択することにより得ることができる。このようなメタン資化菌は、図１に示すメタン資化経路において、メタノール生成後のMDH（メタノールデヒドロゲナーゼ）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはフォルミックアシッドデヒドロゲナーゼのいずれかの活性が著しく低下し、その結果、生育が困難になっていると考えられる。従って、この状態でMMO活性が検出される細菌の中には、MMO／MDH比が高い細菌が一定比率で含まれる。
【００２９】
なお、ＭＭＯ活性は、単離した菌体を一定濃度まで増殖させ、遠心分離等により回収した後に、密閉バイアル瓶内でリン酸バッファーに懸濁し、一定量のプロピレンを封入し、一定時間後にＭＭＯによりプロピレンが酸化されて生じたプロピレンオキサイドの量をガスクロマトグラフィで測定することにより検出することができる。
【００３０】
対象とするメタン資化菌がｓＭＭＯ（可溶性ＭＭＯ）を有している場合は、MMO活性は、ナフタレン及びジアニシヂンテトラゾダイズドを含む平板培地上にコロニーを形成させ、コロニーの周囲の紫斑の大きさを指標に検出することができる。この紫斑は、ナフタレンがMMOにより酸化されて生じるナフトールがジアニシヂンテトラゾダイズドと反応することによるものである。このナフタレンアッセイによるMMO活性の検出の際には、細菌の分離環境に応じて、コロニー形成時の培養温度を高くしたり、コロニー形成時に使用する平板培地のpHを高くまたは低くしたり、コロニー形成時に使用する平板培地の塩濃度を高くしたりすればよい。
【００３１】
また、本発明のメタン資化菌のうち温度感受性細菌は、従来公知のメタン資化菌をニトロソグアニジン等の変異剤で処理した後に、平板培地上に菌液を塗布し、例えば50〜60℃程度で培養してコロニーを形成させた後、平板培地上にナフタレン溶液を噴霧し、培養温度を例えば60〜65℃程度に上昇させて培養を続け、温度シフトにより周囲が赤変するコロニーを選択することによっても得ることができる。
【００３２】
従来公知のメタン資化菌としては、メチロコッカス（Methylococcus）属、メチロモナス（Methylomonas）属、メチロバクター（Methylobacter）属、メチロシスティス（Methylocystis）属、メチロサイナス（Methylosinus）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、メチロカルダム（Methylocaldum）属などの細菌を例示できる。
（２）第１のメタノール製造方法
基本的構成
本発明の第１のメタノール製造方法は、過酷な条件下では温和な条件下に比べてMMO／MDH比が可逆的に高くなるメタン資化菌をその過酷な条件下においた状態で、このメタン資化菌によりメタンからメタノールを製造する方法である。
【００３３】
第１の方法では、メタン資化菌を生存させた状態で保持する。メタノール製造反応中は、メタン資化菌は増殖してもよいが、メタノール回収効率の観点からは、できるだけ増殖しない方が好ましい。
MMO／MDH比の調節
本発明の第１の方法において、過酷な条件は使用するメタン資化菌によって異なる。過酷な条件は、当該メタン資化菌のMMO／MDH比が通常１以上、特に５以上、さらに特に10以上となる条件である。
【００３４】
過酷な条件が高温条件である場合には、このような高温条件は、使用菌株によっても異なるが、通常30〜100℃程度、特に50〜70℃程度、さらに特に60〜65℃程度とすることが好ましい。
【００３５】
過酷な条件が高pH条件である場合には、使用菌株によっても異なるが、このような高pH条件は、通常７〜10程度、特に８〜９程度とすることが好ましい。また、過酷な条件が低pH条件である場合には、使用菌株によっても異なるが、このような低pH条件は、通常４〜７程度、特に５〜６程度とすることが好ましい。
【００３６】
過酷な条件が高塩濃度条件である場合には、使用菌株によっても異なるが、このような高塩濃度条件は、通常１〜100g/l程度、特に10〜50g/l程度とすることが好ましい。
【００３７】
本発明の方法において、メタノール生産速度が、最高速度の通常０〜80％程度に低下した時点で、メタン資化菌の生存条件を緩和し、温和な条件下におくことが好ましい。これは、MMO／MDH比が高くなる条件下にメタン資化菌が長くおかれると、エネルギー源となる還元力が不足し、その結果メタンからメタノールの生成速度が低下するためである。
【００３８】
メタン資化菌を過酷な条件下に継続して生存させる期間は、菌株によっても異なるが、通常１〜48時間程度とすることが好ましい。
【００３９】
温度感受性細菌を用いる場合には、細菌の環境温度を通常５℃以上、特に10℃以上低下させることが好ましい。細菌の生存至適温度±１℃程度、特に生存至適温度程度に切り替えることがより好ましい。
【００４０】
また、pH感受性細菌を用いる場合には、細菌の環境pHを通常１以上、特に２以上、生存至適pHに近づけることが好ましい。細菌の生存至適pH±0.2程度、特に生存至適pH程度に切り替えることがより好ましい。
【００４１】
また、塩濃度感受性細菌を用いる場合には、細菌の環境塩濃度を通常10g/l以上、特に100g/l以上低下させることが好ましい。細菌の生存至適塩濃度±10g/l程度、特に生存至適塩濃度程度に切り替えることがより好ましい。
【００４２】
温和な条件下での継続生存期間は、メタノール生成速度が実用上十分に回復するまでの期間であればよく、特に制限されないが、通常1〜48時間程度、特に1〜24時間程度とすることが好ましい。
【００４３】
このような過酷な条件と温和な条件とを切り替えつつ繰り返すことにより、効率的かつ継続的にメタノールを製造することができる。
培地
本発明の方法において、メタン資化菌を生存させるための培地は、微生物の成育に通常必要とされる炭素、窒素、リン、硫黄、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄等の他、対象細菌に特有の増殖因子を含むものを用いることができ、合成培養液、天然培養液のいずれも用いることができる。但し、培養液中に炭素は含まれないことが好ましい。
【００４４】
pH感受性菌でない場合には、培地のpHは、中性付近に保つことが好ましいが、酸性側になってもよい場合もある。塩濃度感受性菌でない場合には、培地中の塩濃度は、通常５〜20g/l程度とすればよい。
【００４５】
また、培地は液体培地、平板培地のいずれであってもよい。この他、メタン資化菌を、吸水性の担体に培養液及びメタン資化菌を保持させた状態で生存させてもよい。特に、吸水性の担体に保持させた状態で生存させることが好ましい。
【００４６】
吸水性の担体としては、例えば、活性炭、グラファイト、多孔質焼成土壌（例えばイソライト）、ゼオライト、粘土、シリカ、木粉、ヤシガラ、寒天、海綿、セルロース、キトサン、各種合成高分子材料などを用いることができる。特に、活性炭、イソライトなどが好ましい。微生物の担持能力を大きくするために、担体は、比表面積の大きいものを用いることが好ましい。例えば、粉体状、粒状、繊維状、織布、不織布などの形状の担体を用いることができる。
【００４７】
担体、メタン資化菌及び液体培地からなる細菌生存環境の含水率は、通常50重量％以下、特に40重量％以下とすることが好ましい。含水率の下限は、メタン資化菌が生存できる範囲であればよいが、30重量％程度とすればよい。
【００４８】
また、担体、メタン資化菌及び液体培地からなる細菌生存環境に含まれる水の全量に対する担体中に吸収される水の割合については、特に制限はないが、細菌生存環境に含まれる水の50〜100重量％程度が担体中に吸収された状態になるように、担体の使用量を調整することが好ましい。
雰囲気・原料ガス
液体培地、平板培地または担体を取り巻く雰囲気中に含まれるメタンの比率は、通常１〜50容量％程度、特に10〜50容量％程度とすることが好ましい。メタン資化菌は偏性好気性菌であるため、通常、生育雰囲気にはメタンの他に酸素を含ませればよい。酸素の比率は、通常１〜50容量％程度、特に10〜50容量％程度とすることが好ましい。雰囲気中には、この他、メタン資化菌の生育を妨げない範囲で窒素、二酸化炭素などが含まれていてもよい。
【００４９】
メタンの採取源は特に限定されず、例えば天然ガス田から産出されるメタン、液化天然ガス中のメタン、都市ガス中のメタン、廃水等のメタン発酵により得られるメタン等を使用できる。
【００５０】
メタノールの生産方法は、バッチ式でも連続式でもよいが、連続式の方が効率的であることから好ましい。連続式の場合の原料ガスの流量は、特に制限されないが、担体に細菌を保持させる場合には、菌体1g当たりメタン100μmol／分程度の流量を越えると、未反応のメタンが生じるため、原料ガスを循環させることが好ましい。
対数増殖期前半のメタン資化菌
本発明方法において、対数増殖期前半のメタン資化菌を用いることが好ましく、これによりメタノール製造効率を向上させることができる。
【００５１】
対数増殖期前半のメタン資化菌は、適当な液体培地に接種したメタン資化菌を600nmにおける吸光度（OD600）が0.1〜１程度になるまで培養することにより得ることができる。OD600は特に0.2〜0.7程度、さらに特に0.3〜0.5程度とすることが好ましい。
【００５２】
培地の種類、培養雰囲気及び培養温度は特に限定されず、メタン資化菌が前記OD600の範囲にまで増殖する条件であればよい。
【００５３】
この方法では、対数増殖期前半のメタン資化菌を回収し、その状態を保ちつつメタンからメタノールを生産させればよい。対数増殖期前半の状態を維持するためには、回収したメタン資化菌を増殖させない又は殆ど増殖させないことが必要であるが、例えば以下の方法を採ればよい。
【００５４】
図１を参照して説明すると、メタン資化菌を通常の生育可能温度下におくと、CH3OHが酸化されて生じるHCHOの一部は、HCOOHを経てCO2にまで酸化され、その過程でエネルギー源となる還元力を生み出す。また、HCHOの残部は細胞構築物として利用されることにより細胞が増殖する。
【００５５】
これに対してメタン資化菌を通常の生育可能温度よりやや高温下におくと、CH3OH→HCHO→HCOOH→CO2の流れを担う各酵素の活性は阻害されないが、HCHOから細胞構築物への第一段階を担う酵素（ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ又は／及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）の活性が阻害される。この状態では、メタン資化菌は生存するが増殖しない状態になる。
【００５６】
従って、このような温度下でメタン資化菌を生存させることにより、対数増殖期前半の状態に保ちつつメタンからメタノールを製造できる。
【００５７】
なお、本発明のメタン資化菌に限らず、メタン資化菌であれば、同様にして対数増殖期前半の状態に保つことにより、効率よくメタンからメタノールを生産できる。
メタノールの回収方法
液体培地を用いてメタン資化菌を生存させる場合は、環境温度がメタノールの沸点(64.1℃)より高くても低くてもメタン資化菌により生産されるメタノールの一部は液体状態で培養液の中に溜まる。液体培地中のメタノール濃度が２重量％程度になるとメタノールがメタン資化菌の生存を阻害するため、その濃度に達するまでに液体培地を回収すればよい。液体培地からのメタノールの回収は、蒸留、膜分離又は吸着剤によるメタノール吸着等の公知の方法により行えばよい。
【００５８】
平板培地又は担体に保持させた液体培地を用いて気相リアクターにする場合は、環境温度に関わらず、メタン資化菌が生成したメタノールの一部は雰囲気中に溜まる。雰囲気中のメタノール濃度が10容量％程度になるとメタン資化菌の生存が阻害されるため、その濃度に達しないように、雰囲気ガスの供給量を調整すればよい。雰囲気ガスの供給量を多くすれば生成したメタノールの回収速度が高くなり、その分雰囲気中のメタノール濃度を減少させることができる。
【００５９】
回収されたガス中には、メタノールの他に、通常、未反応メタン、酸素、窒素、二酸化炭素及び水蒸気等が含まれている。このガスを冷却すれば、主にメタノールを含む画分を回収することができる。
（３）第２のメタノール製造方法
基本的構成
本発明の第２のメタノールの製造方法は、メタン資化菌の生存を阻害しない濃度のメタノールの存在下で、メタン資化菌を用いて、メタンからメタノールを製造する方法である。
【００６０】
第２の方法でも、メタン資化菌を生存させた状態で保持する。メタノール製造反応中は、メタン資化菌は増殖してもよいが、メタノール回収効率の観点からは、できるだけ増殖しない方が好ましい。
培地
メタン資化菌を生存させる培地については、第１の方法と同様である。すなわち、培地として液体培地又は平板培地のいずれも使用でき、さらに液体培地を用いる場合は吸水性の担体に保持させた状態で使用することもできる。
雰囲気・原料ガス
原料ガスである雰囲気については第１の方法と同様である。但し、気相リアクターとする場合のメタン濃度及び酸素濃度については、後述する。
メタノール濃度
液体培地を用いてメタン資化菌を生存させる場合は、当初の液体培地中のメタノール濃度を10〜10000ppm程度、特に100〜1000ppm程度にしてメタノール製造を開始すればよい。環境温度がメタノールの沸点(64.1℃)より高くても低くてもメタン資化菌により生産されるメタノールの一部は液体状態で培養液の中に溜まる。液体培地中のメタノール濃度が２重量％程度になるとメタノールがメタン資化菌の生存を阻害するため、その濃度に達するまでに液体培地を回収すればよい。メタノール濃度は、特に10〜10000ppm程度、さらに特に100〜1000ppm程度とするのが好ましい。液体培地からのメタノールの回収は、蒸留、膜分離又は吸着剤によるメタノール吸着等の公知の方法により行えばよい。
【００６１】
平板培地又は担体に保持させた液体培地を用いて気相リアクターにする場合は、気相中の当初メタノール濃度を10ppm〜10容量％程度、特に100ppm〜１容量％程度にすればよい。この場合は、雰囲気中の酸素濃度を１〜50容量％程度、特に10〜50容量％程度とすることが好ましく、残余をメタンとすればよい。或いは、雰囲気中のメタン濃度を１〜50容量％程度、特に10〜50容量％程度とし、酸素濃度を１〜50容量％程度、特に10〜50容量％程度として、メタノール濃度を高く設定する場合はその分供給メタン濃度を下げることも好ましい。
【００６２】
環境温度に関わらず、メタン資化菌が生成したメタノールの一部は雰囲気中に溜まる。雰囲気中のメタノール濃度が10容量％程度になるとメタン資化菌の生存が阻害されるため、その濃度に達しないように、雰囲気ガスの供給量を調整すればよい。特に10ppm〜10容量％程度、さらに特に100ppm〜１容量％程度、さらに特に1000ppm〜１容量％程度に調整することが好ましい。雰囲気ガスの供給量を多くすれば生成したメタノールの回収速度が高くなり、その分雰囲気中のメタノール濃度を減少させることができる。
【００６３】
回収されたガス中には、メタノールの他に、通常、未反応メタン、酸素、窒素、二酸化炭素及び水蒸気等が含まれている。このガスを冷却すれば、主にメタノールを含む画分を回収することができる。
メタン資化菌
メタン資化菌は従来公知のメタン資化菌を使用できる。特に、メチロカルダム属細菌が好ましい。また、前述した本発明のメタン資化菌を用いることもでき、この場合は、温度制御によりメタノール生産量を調節できるという利点がある。
環境温度
環境温度は、使用するメタン資化菌の最適温度とすればよい。本発明のメタン資化菌を用いる場合は、上記説明したように、過酷な条件と温和な条件とを繰り返しつつ反応を行えばよい。
（４）メタノールの用途
本発明の第１及び第２の方法により得られるメタノールは、例えばジメチルエーテル(DME)燃料合成原料等として利用できる。また、本発明方法により得られるメタン資化菌は、例えば動物飼料の補足物などの蛋白質源等として利用できる。
【００６４】
【実施例】
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（温度感受性メタン資化菌の分離）
兵庫県の温泉水を下記の表１に示す組成の培地で、50℃で１ヶ月培養した。培養液に含まれる細菌から、生育可能温度以上の温度でMMO活性が検出される細菌を採取した。
【００６５】
具体的には、50℃で培養した培養液から幾つもの細菌を単離し、それぞれ単一菌として液体培養後、遠心分離により菌体を回収した。
＜MMO／MDH比の測定方法＞
回収した菌体を10mMリン酸緩衝液（pH6.9）3mlに懸濁し、10ml容のバイアル瓶に入れてブチルゴム栓で密閉した。
【００６６】
ここに、プロピレンを3ml添加し、50℃で15分間後に生成するプロピレンオキサイドをガスクロマトグラフィで定量した。プロピレンオキサイドはMDHによっては酸化されないため、この場合のプロピレンオキサイド量はMMO活性に相当する。また、プロピレンに代えてメタン3mlを添加し、50℃で15分間後に生成するメタノールをガスクロマトグラフィで定量した。この場合に測定されるメタノール量は、MMOにより生成したメタノールが、MDHによりさらにホルムアルデヒドに変換された後の残存メタノール量であり、MMO活性とMDH活性との差に相当する。この二つの活性値から、50℃におけるMMO／MDH比を算出した。同様にして、60℃におけるプロピレンオキサイドの生成量の定量およびメタノールの生成量の定量を行い、60℃におけるMMO／MDH比を算出した。
【００６７】
このようにして、50℃におけるMMO／MDH比に対する60℃におけるMMO／MDH比の比率（60℃／50℃）が５以上の細菌を選別した。
【００６８】
得られたメタン資化菌は、50℃におけるMMO／MDH比が1、60℃におけるMMO／MDH比が10、50℃におけるMMO／MDH比に対する60℃におけるMMO／MDH比の比率（60℃／50℃）が10であった。また、60℃におけるMMO活性が50℃のときの90.7％、60℃におけるMDH活性が50℃のときの6.1％であった。このメタン資化菌は、増殖可能上限温度（コロニーが形成される最高温度）が54℃、増殖至適温度が50℃であった。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
このメタン資化菌の菌学的性質を以下に示す。
▲１▼細胞形態：多形性、すなわち球状（直径1.0〜1.2μm）又は桿状（1.0〜1.  2μm×2.0μm）
▲２▼コロニー形態：前記の表１に組成を示す培地に1.5％寒天を添加した平板培地に菌を塗布し、メタン：空気＝1:4の雰囲気下で培養した場合に、円形、全縁なめらか、凸状、光沢あり、粘性あり、褐色。
▲３▼16S rDNA及びメタンモノオキシゲナーゼ遺伝子の部分DNA配列が、メチロカルダム属に属する公知の２菌株の対応DNA配列（Arch Microbiol(1997)168:493-  503）と90％以上一致している。
【００７１】
以上の結果、本菌株は、メチロカルダム属に属するメタン資化性菌と同定された。本菌株をメチロカルダム属T−025株（Methylocaldum sp. T−025）と命名した。本菌株は、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号FERM P−18645として寄託されている（寄託日：平成１３年１１月２９日）。
実施例２（メタノールの生産）
メタン資化菌メチロカルダム属T−025株を表１に組成を示す液体培地中で、48℃で48時間培養した。培養液を遠心分離し、乾燥重量に換算して1gの菌体を5mlの同液体培地に懸濁し、この菌液を5gのイソライトに吸収させたものを容量10mlのガラス製カラムに充填した。次いで、カラムを60℃に保った状態で、このカラムにメタンを100μmol／分の流量で通した。これにより、90μmol／分の速度でメタノールが得られた。10時間後にメタノール生産速度が低下したため、温度を48℃に下げ、４時間にわたり同じ流量でメタンをカラムに通した。さらに、温度を60℃に上げたところ、再び90μmol／分の速度でメタノールが得られた。この60℃で10時間／48℃で４時間のサイクルを10サイクル繰り返した。10サイクル繰り返し後にもメタノールの生産速度は低下しなかった。
実施例３（菌体培養条件の検討）
表１に組成を示す無機塩培地300mlにメチロカルダム属T-025株を植菌し、メタン：空気＝1：4（容量比）の混合気体雰囲気下で、50℃で2日間培養した。
【００７２】
培養中に経時的に雰囲気中のメタン濃度と菌密度を測定した。メタン濃度はガスクロマトグラフィにより測定し、菌密度は600nmにおける吸光度を測定することより評価した。同時に菌体を少量サンプリングし、下記の方法でメタン酸化活性（MMO活性）を測定した。
＜メタン酸化活性の測定方法＞
バイアル瓶（10ml用）に2.5mlのリン酸バッファー、0.5mlのメタノール（終濃度100ppm）、乾燥重量で0.3mgの菌体を加えて密封した。気相にプロピレン1.5ｍｌを加え、バイアル瓶を50℃の湯浴に浸けて60分間反応させた。氷浴につけることによりメタン酸化反応を停止させた後、液相中のプロピレンオキサイドの濃度をガスクロマトグラフィにより測定した。ここでは、乾燥菌体1g当たりが１分間に生産するプロピレンオキサイドの濃度（μmol）をメタン酸化活性とした。
【００７３】
結果を図２に示す。図２から明らかなように、OD600＝0.3〜0.5の対数増殖期前半では、OD600＝0.7〜0.8の定常期に較べて、メタン酸化活性が２倍程度高い。
実施例４（エネルギーの供給方法の検討）
メタン資化菌を用いてメタン・メタノール変換を行う場合、メタンを酸化するためのエネルギー源として、従来蟻酸が使用されている。エネルギー源としてメタノールを使用する場合と蟻酸を使用する場合とで、メタン資化菌のメタン酸化活性を比較した。
【００７４】
表１に組成を示す液体培地にメチロカルダム属T-025株を接種し、メタン：空気（容量比）＝1:4の雰囲気中で50℃で24時間培養した後、遠心により対数増殖期の菌体を回収した。
【００７５】
得られた菌体を用いて、実施例３で説明した測定方法により、エネルギー源としてメタノールを使用してメタン酸化活性を測定した。また、メタノールに代えてエネルギー源として同量の蟻酸ナトリウムを用いてメタン酸化活性を測定した。結果を表２に示す。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
表２から明らかなように、ギ酸ナトリウムの代わりにメタノールを使用することにより、メタン酸化活性が２倍程度にまで向上することが分かる。
【００７８】
なお、非特許文献１には、メチロサイナス・トリコスポリウムOB3b株を用いて、常温下で、蟻酸をエネルギー源として、メタンからメタノールを製造した場合のこの菌株のメタン酸化活性は、30μmol/分/g乾燥菌体であることが記載されている。実施例４では、この従来方法の10倍以上のメタン酸化活性が得られた。
【００７９】
実施例３、４の結果から、対数増殖期前半のメタン資化菌を使用するとともに、エネルギー源としてメタノールをすることにより、従来方法の約４倍の効率でメタンからメタノールを生産できることが分かる。
【００８０】
【発明の効果】
本発明によると、メタン資化菌を用いて、効率よくメタンからメタノールを製造することができる。
【００８１】
さらにいえば、本発明のメタン資化菌は、高温等の過酷な条件下でのみ可逆的にMMO／MDH比が増大するため、本発明の第１のメタノール製造方法では、本発明のメタン資化菌をこのような過酷な条件下におくことにより、メタンからメタノールを効率良く生産することができる。また、このようにMDH活性に対してMMO活性が大きくなる条件下で長く生存させると、MMO活性に見合うだけの還元力が得られなくなり、MMOによるメタノールの生産速度が低下する。その際には、一定時間生存し易い穏和な条件に切り替えることにより、MMO活性に見合うだけのMDH活性が回復するため、メタノール生産を継続することができる。従って、このようなメタン資化菌を用いて、過酷な条件と穏和な条件とを繰り返すことにより、効率的かつ継続的にメタノールを製造することができる。
【００８２】
また、対数増殖期前半のメタン資化菌を使用することにより、一層効率よくメタンからメタノールを生産できる。
【００８３】
本発明の第２のメタノール製造方法によると、エネルギー源としてメタノールを使用することにより、効率よくメタンからメタノールを生産できる。
【００８４】
以上のように、本発明により、メタン資化菌を用いて効率よくメタノールを製造する方法が提供された。本発明方法では常温・常圧下でメタノールを製造できるため、従来の触媒合成法のような大規模な設備を要さない。従って、メタン生産規模の小さい中小ガス田や国内のメタン発酵施設で、メタンからメタノールを製造できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】メタン資化菌によるメタンの代謝を示す図である。
【図２】メタン資化菌の増殖とメタン酸化活性との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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