(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動植物の生体外に取出した細胞群の懸濁液、又は、ヒトを除く動植物の生体そのもののいずれか一方の細胞が含まれる系に電界を作用させて、細胞を系内で移動させ、細胞膜に変化を生じさせ、或は、細胞内組成の変化を促進する細胞処理方法であって、前記細胞を含有する系に対向させて電磁コイルを配し、該電磁コイルに対して、電流上昇期の電流波形と電流下降期の電流波形が時系列的に非対称となるようなパルス通電を行って、プラス側とマイナス側が非対称の極性を有するパルス電圧を前記細胞が含まれる系内に誘起させることを特徴とする細胞処理方法。
【請求項２】
前記細胞が含まれる系内に誘起させるパルス電圧における、プラス側ピーク電圧，マイナス側ピーク電圧相互間の比率を３〜10とする、請求項１記載の細胞処理方法。
【請求項３】
前記誘導コイルへのパルス通電を極性を切換えながら行って、前記細胞が含まれる系内に誘起させるパルス電圧の極性が上記切換えに伴って切換わるようにする、請求項１又は２に記載の細胞処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動植物の品種改良，生育促進などの目的で動植物の細胞を変成させる処理を、ヒトを除く動植物の生体そのもの、あるいはヒトを含む動植物の生体外に取出した細胞群の懸濁液（以下これらを包括して「細胞含有系」と云う）に対する通電操作によって行う処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動植物の品種改良などのための手段として、伝統的な交配に加えて、近年は、異種間細胞融合あるいは細胞への他種遺伝子導入といった、細胞そのものに処理を加える細胞処理（細胞操作）が盛んになってきている。上記細胞処理は、通常、細胞含有系に対して通電操作を加える形で行われる。
【０００３】
細胞融合は、細胞含有系に対して先ず高周波通電を行い、細胞を系内で誘電泳動させて、細胞が数珠つなぎ状に密接配列した状態（パールチェーン）を生じさせ、次いで上記系に対して高電圧パルス通電を行って、細胞同志が接触している部位の細胞膜を一過的に破壊して窓状に開口させるという一連の通電操作を経て行われる。しかして、上記操作の後、隣り合った細胞の開口部のいわば窓枠同志が結合する形で細胞膜が修復されて、２つ以上の細胞が一体化（融合）するものである。よって、系内に複数種の細胞が存在すれば、異種間の細胞融合が起ることになる。
【０００４】
遺伝子導入の場合は、細胞含有系に対していきなり高電圧パルス通電を行って細胞膜の一部を一過的に破壊して開口部ないしは弱体化部分を生じさせ（エレクトロポレーション）、細胞内外間の流通ないしは透過を容易にする。又、上記開口部等を通じての他種ＤＮＡなどの荷電物質の出入りは、細胞含有系への直流通電による電気泳動ないしは電気滲透によって促進される。上記開口部等も、その後自己修復される。エレクトロポレーションを経由する上記処理は、細胞内生成物質の抽出にも有用である。
【０００５】
細胞融合，遺伝子導入といった細胞処理のための通電操作は、細胞含有系の系内又は系外に電極対を配し、これに電圧をかけて細胞含有系内に電界を形成する電場誘導法によって行われてきた。ついては、上記通電操作を動植物の生体そのものに適用する場合、上記電極対の配置を、▲１▼生体の表面に電極を密着させるか、▲２▼生体の表面から針状ないしは刃物状の電極を生体内の所望部位に刺し入れるか、あるいは、▲３▼切開手術によって生体内の所望部位を一旦露呈させて電極を配置するかのいずれかの形態で行うことになる。しかして▲１▼の形態では、電極から紡錘状に広がる形で電束が形成されるため、所望部位に集中した電界形成が行いにくゝ、云いかえれば、所望条件の電界を所望部位に形成しようとすると、他の部位、特に表皮（皮膚など）に対して上記所望条件を上回り且つ本来は不要な通電負荷をもたらすことになる。又、▲２▼あるいは▲３▼の形態では、所望部位への集中的な電界形成は行いやすくなるものの、生体は前記▲１▼の形態よりも更に大きな侵襲を受けることになる。即ち、生体機能の常態からの偏倚を生じさせることなく細胞処理を施し、このあと生育実験を続けること自体が難題であって、適用を試みうる対象が極く限られたものになるという事情にあった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、前記高電圧パルス通電等のための電界形成を、電極を使用せずに行い、電極の使用に由来する上記限界を克復することができる細胞処理方法の提供を課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決すべくなされた本発明細胞処理方法は、動植物の生体外に取出した細胞群の懸濁液、又は、ヒトを除く動植物の生体そのもののいずれか一方の細胞が含まれる系に電界を作用させて、細胞を系内で移動させ、細胞膜に変化を生じさせ、或は、細胞内組成の変化を促進する細胞処理方法であって、前記細胞を含有する系に対向させて電磁コイルを配し、該電磁コイルに対して、電流上昇期の電流波形と電流下降期の電流波形が時系列的に非対称となるようなパルス通電を行って、プラス側とマイナス側が非対称の極性を有するパルス電圧を前記細胞が含まれる系内に誘起させることを特徴とするものである。
【０００８】
即ち、本発明は、細胞処理のための通電操作を、電極に代えて電磁コイルを用いる電磁誘導法により系内に電界を形成して行うようにし、且つ、パルス通電に要求される通電極性を有する形でこれを行えるようにしたものであり、前記電極の使用に由来する限界が克復されるところとなって、前記本発明の課題が解決される。因に、電磁誘導法によって負荷に誘導される電圧は通常は交流であって、正負両側に概ね均等な振巾を有する、即ち、極性を有しないものである。
【０００９】
電磁誘導法は、通電したい対象物の近くに電磁コイルを配し、該コイルに通電することによって対象物への通電が行えるものであるから、電極の配置を全く要しない。即ち、(イ)前述のような生体への侵襲を伴わずに、又、(ロ)所望部位よりもむしろそれ以外の部位に強い作用が及ぶこともなしに細胞処理が実施でき、更には、(ハ)電磁コイルの形状や配置の工夫などによって、所望部位を狙った磁束形成ひいては電束形成さえも可能となるものである。
【００１０】
本発明における電磁コイルへの通電、即ち、電流上昇期の電流波形と電流下降期の電流波形が時系列的に非対称となるようなパルス通電（以下「非対称通電」という）とは、たとえば、(イ)電流値が急激に立上がり、緩慢に低下するような通電、あるいは、(ロ)電流値が緩慢に立上がり、急激に低下するような通電を指している。なお、上記電流値が立上がる上昇期と低下する下降期の間に、電流値が殆ど変化しない保持期間が存在するような通電態様も、本発明に適合する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明における、細胞含有系への電磁コイルの配設例を図１に示す。図１の例では、細胞含有系として他種ＤＮＡを注射により導入したマウスの生体１を充て、電磁コイルとしては、８の字状のマルチターンコイル２を用いてこれをＤＮＡ導入部位の体表面に配設している。生体１とコイル２の間隔は、小さい方が系内への磁場形成を効率よく行えるので、たとえば、電気絶縁シート（厚さ0.1〜２mm程度の布材やプラスチックシートなど）をスペーサー代りに介在させて生体１にコイルを密接させた状態を、機械的支持手段を援用して保持するようにするとよい。なお、細胞含有系としては、非導電性の容器や管路中に収容ないしは流送中の細胞群懸濁液なども当然ながら対象としうる。又、上記コイル２を８の字状のものとし、対面形式で配置したのは、巻線が重畳する2aの部分に対向する部位の生体内に磁束を集中させて、この部位に集中的に電界を生じさせるためであるが、本発明に用いる電磁コイルの形状及び配置形式としては、上記形態に限らず、生体を取囲むようにソレノイドコイル（螺旋筒状）を配して生体全体に磁束を形成させるなど、目的に応じて他の形態を適宜採用してよい。
【００１２】
次に、本発明における、電磁コイルへのパルス通電の仕方について説明する。図２は前記非対称通電を行うための出力回路例を示したものであって、３は直流電源、４はＯＮ／ＯＦＦスイッチ、５はフライホイールダイオード、６は減衰率調整用抵抗（抵抗値R1）、７，7’は出力端子である。誘導コイル２のインダクタンスはＬ，抵抗値はR2であるとする。なお、スイッチ４は、たとえば、スイチッチグトランジスターと、所望の時系列モードでＹＥＳ／ＮＯ信号を出力することのできるタイマーとによって構成できるが、この構成に限らず、要は所望の時系列モードでＯＮ／ＯＦＦ動作が行える機構であればよい。
【００１３】
図２の回路において、スイッチ４に、図３(a)に示すようなＯＮ／ＯＦＦ動作をさせることにより、コイル２は図３(b)に示すような、電流上昇期の波形と下降期の波形が時系列的に非対称なパルス電流が流れて、コイルを対向させた細胞含有系内には、図３(c)のような極性を有する（プラス側とマイナス側が非対称の）パルス電圧が誘起される。
【００１４】
ここで、直流電源の電圧Ｅが大きいほど図３(b)の電流上昇期の立上りの急峻度（図中のθ1の正接即ちtanθ1）が大となり、ひいては図３(c)のプラス側のピーク電圧の大きさ｜Ep1｜が大となる。一方、減衰率調整用抵抗６とコイル２の内部抵抗の和Ｒ＝R1＋R2（抵抗６を省略してダイオード５を直結した状態で最小値R2となる）と、コイル２のインダクタンスＬの比Ｒ／Ｌが大きいほど図３(b)の電流下降期の減衰の急峻度（例えば、図中のθ2の正接即ちtanθ2＝電流半減期迄の平均勾配で表せる）が大となり、ひいては図３(c)のマイナス側のピーク電圧の大きさ｜Ep2｜が大となる。図３(c)の誘起電圧の極性は、上記｜Ep1｜と ｜Ep2｜の比あるいは差によって表されるので、直流入力電圧Ｅを大きくし、減衰率調整用抵抗の抵抗値R1を小さくするほど、誘起電圧の極性が顕著になる。
【００１５】
上記誘起電圧の極性の度合は、｜Ep1｜／｜Eｐ2｜比率にして３〜10程度に設定することが望ましい。これは、上記比率が３以上のときに誘起パルス電圧における直流バイアスレベル（｜Ep1｜−｜Ep2｜）／２がマイナス側のピークレベル｜Ep2｜以上となって極性の効果が現われやすくなり、比率が大きいほど本発明の目的に沿うが、一方、｜Ep1｜／｜Ep2｜比率を大にするために前記コイル電流下降期の波形の急峻度tanθ2（図３参照。以下も）を小さくする（ゆるやかに減衰させる）ことが必要となり、その分、前記スイチッチ４にＯＦＦ動作をさせる時間を長くとる必要性が生じてＯＮ動作の時間比率すなわち誘起パルス電圧の出現サイクルが制約されることから｜Ep1｜／｜Ep2｜比率を10を超えるレベルには設定しにくいためである。
【００１６】
上記｜Ep1｜／｜Ep2｜比率の好適化は、前述の通り、直流入力電圧Ｅ及び減衰率調整用抵抗の抵抗値R1を調整することによって行える。又、図３(a)に示したスイッチ４のＯＮ／ＯＦＦ動作モードについては、前記｜Ep1｜／｜Ep2｜比率を好適化するために図中のＯＮ動作時間t1及びＯＦＦ動作時間t2、更にはその比率t1／t2が制約される面があり、加えて個々の細胞処理試行において誘起パルス電圧の出現サイクル等を実験的に最適化する必要性もあることから、基本的には各細胞処理試行毎に選定されるべきものである。
【００１７】
なお、上記説明では｜Ep1｜（プラス側）が｜Ep2｜（マイナス側）よりも大である例を挙げたが、これは説明上の便宜的な設定であり、実際には通電対象である細胞含有系内の主たる通電方向を所望の方向にできるよう、コイルを含めた回路の接続極性を設定すればよい。あるいは、前記｜Ep1｜／｜Ep2｜比率の好適範囲として、前記３〜10の他に、Ep2の方が大きいケースに対応した0.1〜0.3（３〜10の逆数）を付加えてもよい。
【００１８】
以上の通り、図２に例示した出力回路によって電磁コイルに通電することにより、対象とする細胞含有系内に極性を有する高電圧パルス通電を行うことができ、前記細胞融合、あるいは遺伝子導入のためのエレクトロポレーション，電気泳動などが行えることになる。上記パルス通電の様相を確認するために、図４に示す等価モデル回路により通電実験を行ったところ、図５に示す結果が得られた。図４において、８は細胞含有系に見たてた等価抵抗（１ｋΩ）、９は細胞含有系に対する電磁誘導作用を等価的に再現するための２次コイルである。又、図５の(イ)はコイル２に流れたパルス電流の波形、図５の(ロ)は等価抵抗８の両端で計測されたパルス電圧の波形である。図５に見る通り、コイル２への非対称パルス通電によって｜Ep1｜／｜Ep2｜＝５：１のパルス電圧が誘起されている。因に、図６(イ)に示すようにコイル２に時系列的に対称な通常のパルス通電を行った場合には、図６(ロ)に示す極性のない通常の交流パルスが誘起されている。
【００１９】
上述のように、細胞融合，エレクトロポレーション等のための高電圧パルス通電は、極性を持ったパルス電圧を対象系内に発生させて行うが、同じ極性で通電を続けると、系内で電気分解が起り系内の組成変化や該変化に伴って生成したガス等の副生物により、系そのものに異変を来たして処理の遂行に支障をきたす。又、この問題は、通電の極性を適宜切替えながら通電することによって回避できることが知られている。しかして、本発明においては、たとえば、図７に示す回路を図８(a)▲１▼〜▲４▼のように動作させてコイルに図８(b)に例示した電流モードでパルス通電することにより、図８(c)のように上記極性が順次切換わるパルス電圧を誘起させることができる。
【００２０】
細胞融合のための通電操作の一つである、前記パールチェーン形成のための高周波通電（高周波交流通電）も、上記本発明範囲内の極性切換え通電によって実施可能である。但し、上記高周波通電は、通常の高周波発振器の出力を電磁コイル２に入力して行うこともできるので、情況に応じていずれかの手段を選定すればよい。
【００２１】
なお、本発明細胞処理方法における、通電操作以外の諸操作は、従来の細胞処理方法に準じた手法で行われてよい。
【００２２】
【発明の効果】
本発明は、上述のように、動植物の生体外に取出した細胞群の懸濁液、又は、ヒトを除く動植物の生体そのもののいずれか一方の細胞が含まれる系への高圧パルス通電等によって細胞融合や遺伝子導入を行う細胞処理方法において、通電のための電界形成を、電場誘導法ではなく電磁誘導法によって行い、且つ、電磁誘導法でありながら、極性を有する電界が形成されるようにしたものである。即ち、電極を用いない細胞処理が可能となったものであり、従来の細胞処理方法における、電極の存在に由来する限界（生体そのものには適用しにくい等）が克復された。
【００２３】
細胞処理は、動植物の品種改良等の手段として、伝統的な交配などの手段にとって変りつゝある。本発明によって細胞処理の適用範囲が大巾に拡げられ、ヒトを除く動植物の生体そのものへの適用も可能になったことは、今後の畜産，農業，更には薬物製造事業等に、大きく貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞含有系への電磁コイルの配設例を示す図。
【図２】非対称通電を行うための出力回路の一例を示すブロック図。
【図３】図２の出力回路における動作と出力を示す波形で、(a)はスイッチ４の動作タイミング波形を、(b)はコイルに流れる電流波形を、(c)は細胞含有系内に誘起されるパルス電圧波形を、それぞれ示す波形図。
【図４】図２の出力回路の等価モデル回路の一例を示すブロック図。
【図５】図４に示す回路のコイル２に流れたパルス電流と等価抵抗８で計測されたパルス電圧の波形図。
【図６】通常のパルス通電により得られる波形図。
【図７】非対称通電を行う出力回路の他の例のブロック図。
【図８】図７の出力回路の動作と出力を示す波形で、(a)は動作タイミングの波形を、(b)はパルス通電の波形を、(c)は誘起されるパルス電圧の波形を、それぞれ示す波形図。
【符号の説明】
１        生体
２        電磁コイル
３        回路
４，4’   入力端子
６        ２次コイル
５        スイッチ
７，7’   出力端子
８        抵抗素子
【図１】
0004187060.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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