(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を出射するレーザ光源と、
標本上に前記レーザ光源からのレーザ光を集束する対物レンズと、
前記レーザ光源から前記対物レンズの瞳へ平行ビームとして入射するレーザ光の光束径を当該瞳を満たすように広げることにより、対物レンズの開口数で決定される回折限界サイズ相当のスポット径のレーザ光を前記標本に照射する第１の状態と、前記対物レンズの瞳へ平行ビームとして入射するレーザ光の光束径を当該瞳より十分小さくしてサイトメータとしての測定を行う第２の状態とに切換可能な光束径切換手段と、
第１の状態か第２の状態かに関わらず前記レーザ光源からのレーザ光で前記標本を走査する走査手段と、
前記標本からの光を共焦点検出器の光路と非共焦点検出用の光路とに切換可能な光路切換手段と、
前記標本からの光を検出する検出器とを備え、前記光束径切換手段により前記レーザ光を回折限界サイズ相当のスポット径で照射する第１の状態に切換えた場合に前記共焦点検出器の光路を選択することを特徴とした走査型サイトメータ。
【請求項２】
レーザ光を出射するレーザ光源と、
標本上に前記レーザ光源からのレーザ光を収束する対物レンズと、
前記レーザ光源から前記対物レンズの瞳へ平行ビームとして入射するレーザ光の光束径を切換えることにより、前記光束径が前記瞳を満たして前記標本上に集光するスポット径が対物レンズの開口数で決定される回折限界サイズ相当になる第１の状態と、前記光束径が前記瞳より十分に小さくして前記標本上に集光するスポット径が細胞サイズと同等になる第２の状態とに切換可能な光束切換手段と、
第１の状態か第２の状態かに関わらず前記レーザ光源からのレーザ光で前記標本を走査する走査手段と、
前記標本からの光を検出する検出器とを備え、
前記標本からの光を共焦点検出する手段と非共焦点検出する手段を切換えるようにし、前記第１の状態の時には前記共焦点検出する手段に切換えて光学的断面画像を取得し、前記第２の状態の時には前記非共焦点検出する手段に切換えて細胞測定を行うことを特徴とする走査型細胞測定装置。
【請求項３】
レーザ光を出射するレーザ光源と、
標本上に前記レーザ光源からのレーザ光を集束する対物レンズと、
前記レーザ光源から前記対物レンズの瞳へ平行ビームとして入射するレーザ光の光束径を当該瞳を満たすように広げることにより、対物レンズの開口数で決定される回折限界サイズ相当のスポット径のレーザ光を前記標本に照射する第１の状態と、前記対物レンズの瞳へ平行ビームとして入射するレーザ光の光束径を当該瞳より十分小さくしてサイトメータとしての測定を行う第２の状態とに切換可能な光束径切換手段と、
第１の状態か第２の状態かに関わらず前記レーザ光源からのレーザ光で標本を走査する走査手段と、
前記標本からの光を検出する検出器とを備え、
前記標本からの光を共焦点検出する手段と非共焦点検出する手段を切換えるようにし、
前記レーザ光を回折限界サイズ相当のスポット径で照射する第１の状態の時には前記共焦点検出する手段に切換えて光学的断面画像を取得し、走査型サイトメータの測定を行う第２の状態に切り換えた場合には前記非共焦点検出する手段に切換えることを特徴とする走査型サイトメータ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザ光で標本を二次元的に走査し、細胞を測定する走査型サイトメータに関する。
【０００２】
【従来の技術】
スライドグラス上の細胞集団をレーザ（レーザビーム）を収束させたスポットで走査し、該細胞集団の個々の細胞が発する蛍光を検出し、走査画像データを画像処理して個々の細胞データを抽出して測定する「生物標本の複数の光学的特性を測定する方法および装置」（「レーザ走査型サイトメータ（ＬＳＣ：Laser Scanning Cytometer）」）が、特開平３−２５５３６５に開示されている。
【０００３】
レーザ走査型サイトメータ（以下、「走査型サイトメータ」と呼称する）（ＬＳＣ）は、固定されたレーザ及び該レーザビームを収束させたスポットに対して、単離細胞浮遊液標本の細胞集団を、超音波振動で毎秒数万個の水滴に分断させてジェット水流としてレーザスポット上を流して通過させて、各細胞を測定するフローサイトメータとは異なり、スライドグラス上に静置された細胞集団に対して、レーザスポットを光学的および機械的に走査させて、各細胞を測定する点で、基本構成に差がある。しかし、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）は、蛍光色素で生化学的に標識された細胞集団に対してレーザスポットを照射・励起し、個々の細胞の発する蛍光を測光して高速に測定し、細胞集団の免疫学的特性、遺伝学的特性、細胞増殖性等を表す統計的なデータとして測定結果を提示することを目的としている点においては、フローサイトメータと同じである。
【０００４】
さらに走査型サイトメータ（ＬＳＣ）は、スライドグラス上の各細胞の座標位置を記録し、かつ、走査ステージによる座標位置の再現が可能である。これにより、統計データのうち特定の部分集合に相当する測光値を示した個々の細胞を顕微鏡視野内に移動させて顕微鏡観察することができる。すなわち、サイトメータ（ＬＳＣ）はフローサイトメータに比べて、顕微鏡観察像と細胞データとを対応付けることができるという点で優れている。細胞集団標本を測定した後に、個々の細胞を顕微鏡下へ順次位置再現して顕微形態観察する機能を、以下、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）の「リコール観察機能」と呼称する。
【０００５】
走査型サイトメータ（ＬＳＣ）の典型的な医学生物学的研究用途として、がん腫瘍の細胞周期解析が挙げられる。がん腫瘍においては特に「増殖性」という性質が重要になるが、これは細胞一個一個を顕微鏡観察しても何ら知見は得られるものでなく、腫瘍組織を構成する数百から数千個の細胞のうち、細胞分裂周期の安定期・ＤＮＡ合成期・分裂期に属する細胞個数比率によって統計的な数値指標として客観的に表現することができる。走査型サイトメータ（ＬＳＣ）は、このような統計的数値指標を提供する一方、細胞分裂周期内の特定の期（例えば、分裂中期）に属する細胞データを指定して個々の細胞を顕微鏡視野内に順次呼び出すリコール観察機能により、形態的な検討を顕微鏡下で行うことができる。
【０００６】
一方、蛍光標識した細胞構造を観察する装置として、共焦点レーザ走査型顕微鏡（以下、「ＣＬＳＭ：Conforcal Laser Scanning Microscope 」と呼称する）が近年普及してきている。ＣＬＳＭは、従来の蛍光顕微鏡に対し高解像に光学的切断面観察することができ、光軸（Ｚ）方向の移動手段および光軸（Ｚ）方向の光学的切断画像データ列を取得して三次元画像を構築し表示する画像処理手段と組み合わせて、細胞構造を立体的に観察し形態解析できるという特長を有する。
【０００７】
前述した走査型サイトメータ（ＬＳＣ）による細胞周期の解析事例において、特に細胞分裂期における前記・中期・後期における染色体の挙動を立体的に形態解析することは重要な用途であり、前述したＣＬＳＭのリコール観察機能との共用が期待されるところである。また、装置構成技術の観点から見た場合には、レーザの照射、二次元走査、蛍光検出、走査画像データの取り込みといった機能項目は、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）とＣＬＳＭとの間で共通していると言える。
【０００８】
一方、装置の目的と達成すべき性能の違いにより、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）とＣＬＳＭとの共通機能項目の仕様は異なっており、従来、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）の機能とＣＬＳＭとの機能を兼備した装置は提供されていない。
【０００９】
もし、ユーザが共用を必要とする場合には、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）に備えられている走査ステージと同じ物をＣＬＳＭに搭載し、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）とは別のシステムとしてリコール観察用にＣＬＳＭを使用することで、二つのシステム商品の併用としては実現の可能性がある。
【００１０】
しかしながら、ユーザは、顕微鏡、走査ステージ、レーザ光源、走査装置、蛍光検出器、画像取り込み用コンピュータなどの装置構成ユニットを二系統保有し使用せねばならなくなり、購入費用・維持費用などのコスト負担が増大し、実験室などで装置が占めるスペースが大きくなるという欠点がある。また、ユーザは、二つの装置を別々に操作しなければならず、使い勝手が悪いという不便を生じる。
【００１１】
このため、前述した医学生物学的用途における走査型サイトメータ（ＬＳＣ）とＣＬＳＭとの共用にはメリットがあるにも関わらず、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）とＣＬＳＭとの併用はほとんど行われていないのが実状である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術として走査型サイトメータ（ＬＳＣ）とＣＬＳＭの共用を謳ったものはないが、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）およびＣＬＳＭの先行出願に基いて、技術的な問題点を説明する。
【００１３】
特開平３−２５５３６５は、冒頭で述べたように走査型サイトメータ（ＬＳＣ）のアイディアを示したものである。ここでは、標本に照射し二次元走査するレーザのスポットサイズを「細胞サイズと同等（同じ桁の大きさ以内）」としているが、蛍光検出系に関しては共焦点系とも非共焦点系とも説明されていない。スポットサイズに関しては、細胞集団標本をより高速に走査するため、との説明が記されている。
【００１４】
一方、特開平７−２０９１８７によれば、測光用の走査と同時に形態観察用の「高分解能画像」を取得するため、共焦点検出開口（「結像位置に配置した開口」）として、大きさが異なる開口径を２個以上用意するとしている。この発明によれば、測光と同時に形態観察用の「高分解能画像」を予め取得するため、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）のリコール観察時には標本を位置再現せずに、取り込んだ「高分解能画像」を呼び出すだけでよい。
【００１５】
しかしなから、数千から数万個の細胞集団の「高分解能画像」を細胞集団標本の一個一個の細胞測定毎にデータとして保存しておくことは、膨大なデータ記憶容量を必要とする。このため、システム規模が増大してコストか上がると同時に、データの保存・呼び出し時間が長くなって、システムとしてのスループットが低下する。
【００１６】
また、「高分解能画像」を取得する場合には、光学的な焦点深度が浅くなることから、高分解能画像の取得時には、標本走査時の焦点ズレを補正するため、焦点合わせを繰り返し行わねばならなくなる。
【００１７】
さらに、光軸（Ｚ）方向の移動手段および光軸（Ｚ）方向の光学的切断画像データ列を取得して三次元画像を構築し表示する画像処理手段と組み合わせて、個々の細胞構造を立体的に観察し形態解析できるというＣＬＳＭの特長を生かそうとする場合、「高分解能画像」列の取得に、より一層の時間とデータ記憶容量が必要となる。
【００１８】
また、ここで達せられる「高分解能画像」は、スポットサイズの比較的大きな（「細胞サイズと同等」）測光用のレーザスポットを照射しながら、蛍光検出側の開口だけを小さくしているため、面内方向・光軸方向ともＣＬＳＭの理論的な分解能限界を達成することは不可能である。つまり、特開平７−２０９１８７で得られる「高分解能画像」は分解能・光学切断性能とも、ＣＬＳＭとしては不満足であり、前述した走査型サイトメータ（ＬＳＣ）とＣＬＳＭの共用用途での目的を果たすことができないという欠点がある。
本発明は、ユーザの装置費用の負担や占有面積の増大を抑えながら、ＣＬＳＭの機能を併せ持つ走査型サイトメータを提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明の走査型サイトメータは、レーザ光を出射するレーザ光源と、標本上に前記レーザ光源からのレーザ光を集束する対物レンズと、前記レーザ光源から前記対物レンズの瞳へ平行ビームとして入射するレーザ光の光束径を当該瞳を満たすように広げることにより、前記標本上に対物レンズの開口数で決定される回折限界サイズ相当のスポット径のレーザ光を照射する第１の状態と、前記対物レンズの瞳へ平行ビームとして入射するレーザ光の光束径を当該瞳より十分小さくしてサイトメータとしての測定を行う第２の状態とに切換可能な光束径切換手段と、第１の状態か第２の状態かに関わらず前記レーザ光源からのレーザ光で標本を走査する走査手段と、前記標本からの光を共焦点検出器の光路と非共焦点検出用の光路とに切換可能な光路切換手段と、前記標本からの光を検出する検出器とを備え、前記光束径切換手段により前記レーザ光を回折限界サイズ相当のスポット径で照射する第１の状態に切換えた場合に前記共焦点検出器の光路を選択する。
また本発明は、レーザ光を出射するレーザ光源と、標本上に前記レーザ光源からのレーザ光を収束する対物レンズと、前記レーザ光源から前記対物レンズの瞳へ平行ビームとして入射するレーザ光の光束径を切換えることにより、前記光束径が前記瞳を満たして前記標本上に集光するスポット径が対物レンズの開口数で決定される回折限界サイズ相当になる第１の状態と、前記光束径が前記瞳より十分に小さくして前記標本上に集光するスポット径が細胞サイズと同等になる第２の状態とに切換可能な光束切換手段と、第１の状態か第２の状態かに関わらず前記レーザ光源からのレーザ光で標本を走査する走査手段と、前記標本からの光を検出する検出器とを備え、前記標本からの光を共焦点検出する手段と非共焦点検出する手段を切換えるようにし、前記第１の状態の時には前記共焦点検出する手段に切換えて光学的断面画像を取得し、前記第２の状態の時には前記非共焦点検出する手段に切換えて細胞測定を行うことを特徴とする走査型細胞測定装置である。
また本発明は、レーザ光を出射するレーザ光源と、標本上に前記レーザ光源からのレーザ光を集束する対物レンズと、前記レーザ光源から前記対物レンズの瞳へ平行ビームとして入射するレーザ光の光束径を当該瞳を満たすように広げることにより、対物レンズの開口数で決定される回折限界サイズ相当のスポット径のレーザ光を前記標本に照射する第１の状態と、前記対物レンズの瞳へ平行ビームとして入射するレーザ光の光束径を当該瞳より十分小さくしてサイトメータとしての測定を行う第２の状態とに切換可能な光束径切換手段と、第１の状態か第２の状態かに関わらず前記レーザ光源からのレーザ光で標本を走査する走査手段と、前記標本からの光を検出する検出器とを備え、前記標本からの光を共焦点検出する手段と非共焦点検出する手段を切換えるようにし、前記レーザ光を回折限界サイズ相当のスポット径で照射する第１の状態の時には前記共焦点検出する手段に切換えて光学的断面画像を取得し、走査型サイトメータの測定を行う第２の状態に切り換えた場合には前記非共焦点検出する手段に切換えることを特徴とする走査型サイトメータである。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態による走査型サイトメータの構成を図１に示す。
走査型サイトメータ（ＬＳＣ）１０は、ＣＬＳＭの機能を備えており、ＬＳＣ測定とＣＬＳＭ測定のいずれかを選択的に行なえる。
【００２１】
同装置１０は、励起光を射出する励起光導入部１００と、励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラー１２と、励起光を二次元的に走査する光偏向器２０と、瞳投影レンズ３２と、対物レンズ３４と、蛍光検出部２００とを有している。
【００２２】
励起光導入部１００と蛍光検出部２００は、それぞれ、ＬＳＣ測定用の光学系とＣＬＳＭ測定用の光学系の二系統を備えている。
励起光導入部１００は、励起光としてのレーザ光束を射出するレーザ光源１０２と、ＬＳＣ測定のためのスポット投影レンズ１０４とを備えている。
【００２３】
さらに、励起光導入部１００は、ＣＬＳＭのために、ビームエクスパンダを構成する二枚の凸レンズ１１８と１２０と、光をビームエクスパンダに通過させるための四枚の光路折り曲げミラー１０６と１１４と１１６と１１０を備えている。
【００２４】
二枚の光路折り曲げミラー１０６と１１０は、それぞれ、レーザ光源１０２とスポット投影レンズ１０４の間、スポット投影レンズ１０４とダイクロイックミラー１２の間において、光路上に選択的に挿脱自在に配置される。つまり、二枚の光路折り曲げミラー１０６と１１０は、それぞれ、スライド機構１０８と１１２（光束径切換手段）によって、測定の種類に応じて、実線で示されるように光路中に挿入されたり、想像線で示されるように光路から外されるように構成されている。
【００２５】
光偏向器２０は、駆動方向が９０°異なる二枚のガルバノミラーを有しており、それぞれの反射面の方向を変えることで、光束を互いに直交するＸＹ方向に偏向可能に構成する。図には、説明の都合上、ガルバノミラーをひとつだけ図示する。
【００２６】
蛍光検出部２００は、ＬＳＣ測定のためのコレクタレンズ２０４と、蛍光を検出する光検出器たとえば光電子増倍管２０２を有している。
蛍光検出部２００は、ＣＬＳＭのために、蛍光を集光させる凸レンズ２１８と、その焦点位置に配置された共焦点ピンホール２２２と、共焦点ピンホール２２２を通過した蛍光を平行光束に変えるための凸レンズ２２０と、蛍光を共焦点ピンホール２２２に導くと共にその通過光を光電子増倍管２０２に導くための四枚の光路折り曲げミラー２０６と２１４と２１６と２１０を備えている。
【００２７】
二枚の光路折り曲げミラー２０６と２１０は、それぞれ、ダイクロイックミラー１２とコレクタレンズ２０４の間、コレクタレンズ２０４と光電子増倍管２０２の間において、光路上に選択的に挿脱自在に配置される。つまり、二枚の光路折り曲げミラー２０６と２１０は、それぞれ、スライド機構２０８と２１２（光路切換手段）によって、測定の種類に応じて、実線で示されるように光路中に挿入されたり、想像線で示されるように光路から外されるように構成される。
【００２８】
装置１０は、さらに、標本４０が載置されるステージ５０と、各部を制御するコントローラ６０と、必要な情報を入力するための外部入力装置６２と、測定結果等を表示するためのモニタ６４を有している。
【００２９】
ステージ５０は互いに直交する方向に移動可能な二つのテーブルを含み、載置された標本４０を互いに直交するＸＹ方向に移動させることができる。
コントローラ６０は、光偏向器２０、ステージ５０、四つのスライド機構１０８，１１２，２０８，２１２を制御すると共に、光電子増倍管２０２から得られる測定データを処理し、処理結果や必要な情報をモニタ６４に表示させる。
【００３０】
ＬＳＣ測定においては、四枚の光路折り曲げミラー１０６と１１０と２０６と２１０は、それぞれ四つのスライド機構１０８と１１２と２０８と２１２によって想像線で示される位置に移動され、共に光路から外される。
【００３１】
レーザ光源１０２から射出されたレーザは、スポット投影レンズ１０４を経て、ダイクロイックミラー１２で反射され、光偏向器２０、瞳投影レンズ３２を経て対物レンズ３４に入射し、標本４０面上に集光される。
【００３２】
レーザ光源１０２から射出されるレーザは、概ね平行光束であるが、厳密にはレーザ管内の光束から徐々に広がりながら進行する。スポット投影レンズ１０４は、この広がりを抑える弱い凸レンズであり、レーザ管内の光束を、標本４０面上に正しく結像させる。
【００３３】
従って、レーザは、対物レンズ３４の瞳の開口径よりも十分に小さい光束径をもって、対物レンズ３４の瞳位置に入射する。
ＬＳＣ測定では広範囲を走査するため、光偏向器２０は一方のガルバノミラー２２、例えば光束をＸ方向に走査するガルバノミラー２２のみを駆動し、これに対応して、標本４０をガルバノミラー２２による光束の走査方向に直交する方向（Ｙ方向）にステージ５０を移動させる。
【００３４】
このように、光偏向器２０による高速だが狭い範囲に限られるスポットの移動と、ステージ５０による低速だが広い範囲にわたる標本４０の移動とを組み合わせることにより、標本面に形成されるスポットは標本上の広い範囲にわたって走査される。
【００３５】
標本４０から発せられる蛍光は、対物レンズ３４で集められ、瞳投影レンズ３２、光偏向器２０を経た後、ダイクロイックミラー１２を透過し、コレクタレンズ２０４を経て、ヘッドオン型の光電子増倍管２０２に入射し、光電変換される。
【００３６】
光偏向器２０から光電子増倍管２０２へ向かう蛍光は、概ね平行光束であるが、厳密には標本が対物レンズに近づく方向にデフォーカスする場合には若干発散する。コレクタレンズ２０４は、これを収束に向かわせるための凸レンズであり、光電子増倍管２０２の受光面を光偏向器２０にほぼ結像関係に繋いでいる。対物レンズ３４の瞳面と光偏向器２０は瞳投影レンズ３２で結像関係に繋がれているので、対物レンズ３４の瞳面と光電子増倍管２０２の受光面は結像関係に繋がれている。これにより、瞳面測光によって受光面の光量分布が光偏向器２０による走査や標本の厚さや位置のバラツキによるデフォーカスに対しても、測光量は変化し難い。
【００３７】
標本４０からの蛍光は対物レンズ３４の瞳開口の全面から射出するため、コレクタレンズ２０４の開口径は、使用する対物レンズ３４の最大瞳径と、標本４０が対物レンズに近づく場合の最悪デフォーカス条件とを考慮して決定される。
【００３８】
光電子増倍管２０２の出力はコントローラ６０に入力される。コントローラ６０は、光電子増倍管２０２からの光電信号に基づく走査画像データを処理して標本内の各細胞の細胞内成分量を定量測光する。コントローラ６０は、さらに、標本内の各細胞の座標位置データを記録し、個々の細胞の測光値を統計的に解析し、特定の部分集合に属する個々の細胞の座標位置データに基づいて、ステージ５０により標本４０の位置を制御し、所望の細胞を顕微鏡視野内に再配置し、これにより装置１０はリコール観察機能を実現し得る。
【００３９】
ＣＬＳＭ測定においては、四枚の光路折り曲げミラー１０６と１１０と２０６と２１０を、それぞれ四つのスライド機構１０８と１１２と２０８と２１２によって実線で示される位置に移動し、共に光路上に配置させる。
【００４０】
レーザ光源１０２から射出されたレーザは、二枚の光路折り曲げミラー１０６と１１４で反射され、焦点距離の異なる二枚の凸レンズ１１８と１２０より成るビームエクスパンダを経て、二枚の光路折り曲げミラー１１６と１１０で反射された後、ダイクロイックミラー１２で反射され、光偏向器２０、瞳投影レンズ３２を経て対物レンズ３４に入射し、標本面４０上に集光される。
【００４１】
レーザ光は、ビームエクスパンダによって、光束径が凸レンズ１２０の焦点距離／凸レンズ１１８の焦点距離で決まる拡大倍率で拡大される。その結果、レーザは、対物レンズ３４の瞳の開口径よりも大きい光束径をもって、対物レンズ３４の瞳位置に入射する。
【００４２】
ＣＬＳＭ測定では、スポットは高い位置精度をもって移動されるため、標本４０上のスポットによる走査は、高速かつ高い位置制御性を持つ光偏向器２０の二つのガルバノミラーを用いて行なわれる。
【００４３】
標本４０から発せられる蛍光は、対物レンズ３４で集められ、瞳投影レンズ３２、光偏向器２０を経た後、ダイクロイックミラー１２を透過し、二枚の光路折り曲げミラー２０６と２１４で反射された後、凸レンズ２１８によって集光され、共焦点スポットを結ぶ。共焦点ピンホール２２２を通過した光は、凸レンズ２２０で概略コリメートされ、二枚の光路折り曲げミラー２１６と２１０で反射された後、ヘッドオン型の光電子増倍管２０２に入射し、光電変換される。
【００４４】
凸レンズ２１８は、回折限界径の共焦点スポットを結ぶように設計されている。また、共焦点ピンホール２２２は、コントローラ６０により、共焦点スポットサイズに適合して正確に配置されるように、位置調整およびターレット（図示せず）による開口サイズの選択が可能に構成されていることが好ましい。
【００４５】
一般に、ＣＬＳＭ測定はＬＳＣ測定に続いて行なわれる。例えば、ＬＳＣ測定で標本の全体的な傾向を把握した後、ユーザの気を引く部分に対してＣＬＳＭ測定が行なわれるのが一般的である。
【００４６】
前述したように、標本内の各細胞の座標位置データはＬＳＣ測定の際に既に取得されるため、ＣＬＳＭ測定では、コントローラ６０は、外部入力装置６２から入力された情報、例えば、ユーザが観察を希望する箇所に応じて、装置１０はステージ５０を移動させ、標本４０内の特定の細胞を光軸上に配置する。
【００４７】
ステージ５０は、好ましくは、標本４０を光軸方向つまりＺ方向に沿って移動させる機能を有しており、これにより装置１０は共焦点光学系の特長を活かした光学的断面画像を取得し得る。さらに装置１０は、コントローラ６０により標本４０のＺ方向位置を制御しつつ、光学的切断画像データ列を取得することにより、三次元画像を構築し得る。
【００４８】
これまでの説明から分かるように、装置１０は、励起光導入部１００と蛍光検出部２００の内部の光路折り曲げミラー１０６と１１０と２０６と２１０の位置を制御することにより、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）とＣＬＳＭの機能とが切り換えることができる。
【００４９】
この切り換えは、好ましくは、外部入力装置６２に専用のＧＵＩ(Graphical User Interface)を用意し、コントローラ６０でスライド機構１０８と１１２と２０８と２１２を制御するとともに、光偏向器２０とステージ５０を制御することにより行なわれる。これにより、ユーザは特に意識することなく、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）とＣＬＳＭの切り換えが行なえる。
【００５０】
従って、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）でのリコール観察時に、ＣＬＳＭによる高解像の３次元形態観察を適用ことができる。
本実施の形態では、レーザ光源１０２と光電子増倍管２０２をひとつずつ持つ装置を例に挙げたが、もちろん、本発明は、例えば、複数の蛍光試薬で多重染色した標本に対して、波長の異なる複数の蛍光を同時測定するために、一つまたは複数のレーザ光源と複数の光電子増倍管を備えた装置にも適用できる。
【００５１】
本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で行なわれるすべての実施を含む。例えば、本実施の形態のように一つのレーザ光源を用いる場合でも、光路を切り換えて夫々の光路で光束径を切り換えるようにする以外に、光路系を切り換える構成として、例えば、レーザ光源の光路上にアフォーカルズームを行なえるレンズを介し、光路上でレンズを移動させることで光束径を切換可能にしたり、焦点距離の異なるレンズを、例えばスライド機構に複数設け、本実施の形態で用いた光束径拡大光路中に所望の焦点距離のレンズを切り換えるようにすることで光束径を切換可能にすることもできる。
【００５２】
本発明は以下の各項に例示する実施を含む。
１．細胞集団標本上でレーザを顕微鏡対物レンズで集光して二次元走査し、該レーザによって励起された細胞からの蛍光を検出器で検出し、該検出器で検出した光電信号によって形成された走査画像データをコンピュータに取り込み、該走査画像データに対する画像処理によって該細胞集団標本内の各細胞の細胞内成分量を定量測光すると共に該細胞集団標本内の各細胞の座標位置データを記録し、個々の細胞の測光値を統計的に解析し、特定の部分集合に属する個々の細胞の該座標位置データをもとにステージを制御して顕微鏡視野内に各細胞を移動させて顕微鏡観察する走査型サイトメータにおいて、対物レンズの開口数で決定される回折限界サイズ相当のスポット径のレーザ光を標本に照射し二次元走査する手段およびこの二次元走査によって生じた蛍光を共焦点蛍光検出する手段を有することを特徴とする。
２．第１項記載の装置において、対物レンズの開口数で決定される回折限界サイズ相当のスポット径のレーザ光を標本に照射し二次元走査する手段およびこの二次元走査によって生じた蛍光を共焦点蛍光検出する手段、のうち、少なくとも一つの構成要素が少なくとも部分的に、該走査型サイトメータと共有されていることを特徴とする。
３．第２項記載の装置において、光軸（Ｚ）方向の移動手段および光軸（Ｚ）方向の光学的切断画像データ列を取得して三次元画像を構築し表示する画像処理手段を備えていることを特徴とする。
４．第２項記載の装置において、対物レンズの開口数で決定される回折限界サイズ相当のスポット径のレーザ光を標本に照射し二次元走査する手段のうち少なくともレーザと光偏向器が該走査型細胞測測定装置と共有されており、レーザの光束径変換手段を備えていることを特徴とする。
５．第２項記載の装置において、共焦点蛍光検出する手段のうち少なくとも蛍光検出器が該走査型サイトメータと共有されており、蛍光集光レンズ切換手段と共焦点ピンホール挿脱切換手段のうち少なくとも一方を備えていることを特徴とする。
６．第２項記載の装置において、対物レンズの開口数で決定される回折限界サイズ相当のスポット径のレーザ光を標本に照射し二次元走査する手段およびこの二次元走査によって生じた蛍光を共焦点蛍光検出する手段が、マルチピンホールディスクスキャナーと撮像素子により構成されていることを特徴とする。
【００５３】
【発明の効果】
本発明によれば、ユーザの経済的負担や占有面積の増大を抑えながら、ＣＬＳＭの機能を併せ持つ走査型サイトメータが提供される。これにより、走査型サイトメータ（ＬＳＣ）のリコール観察時にＣＬＳＭを適用することができ、より好ましい形態観察が行なえる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態による走査型サイトメータの構成を示している。
【符号の説明】
２０  光偏向器
３４  対物レンズ
１００  励起光導入部
１１８  凸レンズ
１２０  凸レンズ
２００  蛍光検出部
２０２  光電子増倍管
２１８  凸レンズ
２２２  共焦点ピンホール
【図１】
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