(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類の白子あるいは酵母由来の核酸及び／又はその構成成分を有効成分として含有する、タイトジャンクション形成促進能を有する、腸管粘膜細胞間からのアレルゲン物質透過抑制剤。
【請求項２】
核酸構成成分がヌクレオチド及び／又はヌクレオシドである、請求項１記載のアレルゲン物質透過抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸及び／又はその構成成分を有効成分として含有するタイトジャンクション形成促進剤に関する。本発明は、有効成分である核酸及び／又はその構成成分によって、消化管粘膜細胞間のタイトジャンクション形成を促進し、体内にアレルゲンが侵入することを予防する。本発明はその効果から、アレルギーの予防などに有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、アレルギー性疾患の罹患率が高くなり、患者の増加とともにアレルギーが社会問題にまで発展している。特に、乳児から小児期に多い食物アレルギーは、アトピー性皮膚炎や小児喘息などの疾患が重症になることもあり、多くの関心が寄せられている。食物アレルギー発症の、メカニズムは様々だが、乳児の場合は主として未発達な消化管粘膜から、アレルゲンが体内に侵入するために起こると考えられている。こうした食物アレルギーを予防、或いは治療するためには、アレルゲンを摂取しない食事制限が最も一般的に行われているが、こうしたアレルギーの原因となる食事成分には、卵や牛乳などの良質な蛋白質が多く、成長期にこうした食事制限を行った場合、栄養失調で正常な発育が妨げられることが明らかとなっている。従って、通常の食生活の中でアレルギーの発症を未然に防ぐことが望まれており、アレルゲンとなる蛋白質をあらかじめ予備消化した蛋白質加水分解物か、もしくは蛋白質の構成成分であるアミノ酸を組み合わせて栄養組成物を製造する方法が実用化されている。しかしながら、こうした蛋白質加水分解物やアミノ酸組成物は苦味が強く、味覚の点が問題となっており、予防用の一般食品には受け入れられにくい。そこで、味を良くするために蛋白質の予備消化率を低くすると、アレルゲンの分解が不十分となり、アレルギーを予防することが充分に期待できない。
【０００３】
一方、こうしたアレルゲンの分解や低減とは異なる方法で、アレルギーの発症を予防するには、アレルゲンを体内へ侵入させてしまう消化管自体を改良する方法が考えられる。例えば、粘膜上皮細胞の隙間からアレルゲンが通過することを防ぐことが、アレルギー予防の手段の一つとして考えられる。このような作用をもつ成分としては、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）などが知られている。ＥＧＦは、消化管粘膜細胞の成長を促進することにより細胞の成熟化を促し、細胞間隙を狭めることによりアレルゲンの透過を防ぐことが考えられるが、このようなサイトカインは動物の生体内に微量しか存在しない成分であり、工業的に生産するには遺伝子組み換え技術や動物細胞培養技術などを利用しなければならない。さらに、このような技術で生産した成分を食品に利用するには、安全性などの理由で解決しなければならない問題点が多いのが現状である。又、通常、腸管粘膜の上皮細胞間は、タイトジャンクションと呼ばれる部分で密に接合しており、アレルゲンの透過抑制の他イオンの選択等が行なわれている。しかし、未熟な乳児や粘膜が障害を受けた場合、タイトジャンクションが完全には形成されず、アレルゲン等が細胞間隙を透過して体内に侵入しやすくなると言われている。これに対し、ガングリオシドがタイトジャンクションの形成を促進することにより、アレルギーを予防すること（特願平６−２７１７７５号）が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは上述の状況に鑑み、消化管粘膜の細胞間のタイトジャンクション形成を促進することによって、消化管粘膜からのアレルゲン透過を抑制しアレルギーを予防する物質を食品中に広く求め鋭意探索の結果、核酸及び／又はその構成成分にその効果があることを見出した。よって本発明は、消化管粘膜細胞間隙のタイトジャンクション形成を促進することにより、アレルゲンの消化管透過を抑制し体内へのアレルゲンの侵入を防ぐ、核酸及び／又はその構成成分を有効成分として含有するタイトジャンクション形成促進剤を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、核酸及び／又はその構成成分を有効成分として含有するタイトジャンクション形成促進剤に関する。本発明でいう核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／又はリボ核酸（ＲＮＡ）、及びその構成単位であるヌクレオチド及び／又はヌクレオシドを指す。核酸は基本的にあらゆる細胞の核に存在するので、その由来は特に限定されないが、食品として利用されるものを由来とする核酸が好ましく、特に魚類の白子あるいは酵母などが好ましい。又、これらを酵素及び／又は化学的に分解した分解物でも良い。例えば、魚の白子より核酸を抽出するには、白子をすりつぶし水に懸濁させ、これにプロテアーゼを作用させ分解し、適当な溶媒を用いて遠心分離を数回行い、沈殿を回収することにより得られる。又、酵母から核酸を抽出するには、酵母を培養し菌体を遠心分離して回収・洗浄し、得られた菌体を適当な溶媒に分散し加熱・遠心分離を行い、上清を回収することにより得られる。これらの抽出された核酸を、さらに酵素的（特に好ましくはヌクレアーゼ）又は化学的（特に好ましくは水酸化カリウム溶液）に分解し、ｐＨを調整し、限外濾過により透過液を得、これを乾燥することによりヌクレオチド分画物が得られる。得られたヌクレオチド分画物にさらに酵素（特に好ましくはアルカリフォスファターゼ）を作用させインキュベーションを行い、これを限外濾過し透過液を得、透過液を乾燥することによりヌクレオシドが得られる。さらに、市販されているヌクレオチド及び／又はヌクレオシドを利用しても良い。
【０００６】
このようにして得られた核酸及び／又はその構成成分を摂取する際に、その摂取形態は特に限定されないが、例えばそのままを粉末状、液状として摂取することのほか、その成分を含む錠剤、液剤、散剤、顆粒剤として、或いは脂質、蛋白質、糖類、ビタミン、アミノ酸等を配合した栄養組成物に配合し摂取してもよい。この時の蛋白質としては、カゼイン、乳清蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）、乳清蛋白質分離物（ＷＰＩ）、αs-カゼイン、β−カゼイン、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリン等の乳蛋白質、乳蛋白質分画物、卵蛋白質或いは大豆蛋白質や小麦蛋白質等の植物蛋白質、更にはこれらの蛋白質を酸や酵素で処理し、ペプチド或いは遊離アミノ酸の形態で配合してもよい。遊離アミノ酸は、窒素源としての他に、特定の生理作用を付与するために用いることもでき、このようなアミノ酸としてタウリン、シスチン、システイン、アルギニン、グルタミン等を挙げることができる。これらの蛋白質やペプチド或いは遊離アミノ酸は、固形分当たり５〜３０重量％配合することが好ましい。糖質としては、デンプン、可溶性多糖類、デキストリン、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ブドウ糖や6'- ガラクトシルラクトース、フラクトオリゴ糖、ラクチュロースなどのオリゴ糖或いは人工甘味料等を挙げることができ、これらの糖類の中からいずれか１種以上用いる。糖質の配合量は、固形分当たり４０〜８０重量％配合されることが好ましい。脂質としては、乳脂肪、ラード、牛脂及び魚油等の動物性油脂、大豆油、菜種油、コーン油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、サフラワー油、エゴマ油、アマニ油、月見草油、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）及び綿実油等の植物性油脂、更にはこれらの分別油、水添油、エステル交換油のいずれか１種以上を用い、固形分当たり４０重量％以下配合されることが好ましい。ビタミン類として、ビタミンＡ、Ｂ類、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ類、葉酸、パントテン酸、β−カロチン、ニコチン酸アミド等を挙げることができ、固形分当たり１０mg〜５ｇ重量％配合することが好ましい。又、ミネラル類として、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、銅、亜鉛、ヨウ素、マンガン、セレン等が挙げられ、固形分当たり１mg〜５g 重量％配合されることが好ましい。これらの成分を適宜配合して製造された栄養組成物は、健康食品或いは医薬用栄養組成物として、ヒト、特に乳幼児に対して投与される。
【０００７】
【実施例】
以下に実施例を示すことによって本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【０００８】
【実施例１】
魚の白子からの核酸の抽出方法
サケの白子をすりつぶし水に懸濁させた後、ｐＨを塩酸で４に調整した。この懸濁液にプロテアーゼ（プロテアーゼＭ、天野製薬社）を０．１％添加し、４５℃で４時間攪拌して蛋白質を分解した。蛋白質分解物に過塩素酸を０．２Ｎとなるように添加し、１５分間氷中で静置した後、５００×ｇ、０℃で１０分間遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を３回繰り返し、目的とする魚の白子由来核酸抽出物を得た。
【０００９】
【実施例２】
酵母からの核酸の抽出方法
酵母を３０℃で培養した後、菌体を遠心分離で回収し、冷水で充分洗浄した。得られた菌体を５％食塩水中に分散し、９０℃で３時間加熱し、３０００×ｇ、２０分間遠心分離を行った。分離した上清を回収し、目的とする酵母由来核酸抽出物を得た。
【００１０】
【実施例３】
ヌクレオチドの製造方法・１
実施例１及び２の方法で得られた核酸抽出物をｐＨ５．５の酢酸緩衝液に溶解し、核酸抽出物１ｇあたり２万単位のヌクレアーゼ（シグマ社）を加え、３７℃、２時間反応させた。得られた分解物溶液を、水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した後９０℃で５分間加熱し、さらに限外濾過（分画分子量５万）を行い透過液を得た。得られた透過液を凍結乾燥し、目的とするヌクレオチド分画物を得た。
【００１１】
【実施例４】
ヌクレオチドの製造方法・２
実施例２で得られた核酸抽出物を０．３Ｎ水酸化カリウム溶液に溶解し、３７℃で２時間インキュベーションを行った。これを０．３Ｎ塩酸でｐＨ７に調整した後、限外濾過（分画分子量５万）を行い、透過液を回収した。得られた透過液を凍結乾燥し、目的とするヌクレオチド分画物を得た。
【００１２】
【実施例５】
ヌクレオシドの製造方法
実施例３で得られたヌクレオチドをｐＨ７．５のリン酸緩衝液に溶解し、アルカリフォファターゼ（シグマ社）をヌクレオチド１ｇ当たり１万単位添加し、３７℃、２時間インキュベーションを行った。これを９０℃で５分間加熱し酵素を失活させた後、限外濾過（分画分子量５万）を行い、透過液を回収した。得られた透過液を凍結乾燥し、目的とするヌクレオシド分画物を得た。
【００１３】
【参考例】
核酸配合栄養組成物の調製
実施例２で得られた酵母核酸抽出物３０ｇ、ホエー蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）１．１ｋｇ、ソーダカゼイン０．８ｋｇ、乳糖５．５ｋｇを温湯に溶解し、さらに１００ｇのビタミン類（ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、ナイアシン、葉酸、パントテン酸）と、１００ｇのミネラル類（クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、硫酸銅、硫酸亜鉛）を添加し、溶解した。これに脂溶性ビタミン類（ビタンミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ）を混合したサフラワー油２．７ｋｇを添加して均質化した後噴霧乾燥し、核酸配合栄養組成物１０ｋｇを得た。
【００１４】
【実施例７】
タイトジャンクション形成試験
タイトジャンクションの形成試験は、Hashimoto らの方法(Biosci. Biotech. Biochem., Vol.58, p1345(1994))に従って行った。即ち、培地中濃度が10μg/mlとなるように、ヌクレオチド及びヌクレオシドを無血清培地（Cosmedium 001 、コスモバイオ社）に添加し、ヌクレオチド培地及びヌクレオシド培地を作成した。これらの培地及び10％仔ウシ血清（ＦＣＳ）添加培地、無添加Cosmedium 001 培地を用いて、24穴マイクロタイタープレートにMillicell-CM（ 0.4μm ／0.6 cm2 、ミリポア社）を設置し、膜表面をコラーゲン処理した後、ヒト消化管上皮細胞株Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ３７）を培養した。培養開始日（０日目）と培養１０日後に、電気抵抗測定器（Millicell-ERS 、ミリポア社）を用いて、Ｃａｃｏ−２の単層培養層の上面と下面間の電気抵抗値を測定した。結果を表１に示す。
【００１５】
【表１】
0004050799.tif 000002
【００１６】
この結果、ヌクレオチド添加培地及びヌクレオシド添加培地では、10％ＦＣＳ添加培地と同様に電気抵抗値が上昇したが、無添加培地では変化がなかった。通常、この電気抵抗値が１００〜２００Ω・cm2 以上になるとタイトジャンクションが形成されたと言われており、即ち、ヌクレオチド及びヌクレオシドの添加によって、Ｃａｃｏ−２の細胞間にタイトジャンクションが形成されたと考えられ、このことより腸管粘膜細胞間からのアレルゲン物質透過を抑制する効果が示唆された。
【００１７】
【実施例８】
アレルゲン侵入阻止効果試験
Wistar系ラット（４日齢）を核酸投与群（25匹）、ヌクレオチド投与群（25匹）、ヌクレオシド投与群（25匹）、及び対照群（５匹）に分け、ラット乳に近似させた組成の人工乳で哺育した。核酸投与群、ヌクレオチド投与群、及びヌクレオシド投与群には、４〜２０日目に各々２μg/ml〜２mg/ml の濃度の核酸溶液、ヌクレオチド溶液、或いはヌクレオシド溶液を、マイクロピペットで50μl を毎日経口投与した。この時、核酸溶液は、実施例２で得られた核酸抽出物を水に溶解し、所定の濃度に調製した。又、ヌクレオチド溶液は、５’−シチジル酸二ナトリウム、５’−ウリジル酸二ナトリウム、５’−アデニル酸二ナトリウム、５’−グアニル酸二ナトリウム、５’−イノシン酸二ナトリウム（武田薬品社）を10:1:1:1:1の重量比で混合したヌクレオチド混合物を水に溶かして調製した。又、ヌクレオシド溶液は、実施例５で得られたヌクレオシド分画物を水に溶解し、所定の濃度に調製した。投与２１日後に、10mg/ml のβ−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）溶液を100 μl 経口投与し、その２時間後及び１０日後に採血した。得られた２時間後の血液を用いて、血中β−Ｌｇ量を測定した。即ち、β−Ｌｇ溶液とフロイト完全アジュバンド（ＤＩＦＣＯ社）を混合して乳化させ、３ヶ月齢のウサギ（白色和種、雄）の皮下３ヵ所に注射し免疫し、それを採血することにより抗β−Ｌｇ抗血清を得、この抗血清を一次抗体として、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＰＯ）を標識した二次抗体とのサンドイッチＥＬＩＳＡ法で血中β−Ｌｇ量を測定した。又、１０日後の血液を用いて、抗β−Ｌｇ  ＩｇＥ量を測定した。即ち、β−ＬｇとＰＯを標識した抗ラットＩｇＥ抗体（ノルディック社）によるＥＬＩＳＡ法により、抗β−Ｌｇ  ＩｇＥ量を測定した。それぞれの結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】
0004050799.tif 000003
【００１９】
この結果より、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド各投与群において、β−Ｌｇ量及び抗β−Ｌｇ  ＩｇＥ量が対照群と比較して顕著に低下していることが確認された。即ちこれは、核酸、ヌクレオチド、又はヌクレオシドを摂取することにより、腸管細胞間にタイトジャンクションが形成され、これによりアレルゲンが腸管細胞間を透過することが抑制されていることを示す。
【００２０】
【発明の効果】
よって本発明により、核酸及び／又はその構成成分を有効成分とするタイトジャンクション形成促進剤が提供される。本発明は、アレルギーの予防などに有用である。