(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体を通し得る固相坦体を利用した生体関連物質の反応をリアルタイムで検査するための生体関連物質の検査方法であり、
固相坦体に生体関連物質を供給する供給工程と、
固相坦体上において生体関連物質の反応を起こさせる反応工程と、
生体関連物質の反応後に余剰の生体関連物質を排除する排除工程と、
固相坦体と反応した生体関連物質を光学的に観察する観察工程とを有し、
排除工程は、固相坦体を洗浄水中に浸す工程と、洗浄水に超音波振動を加える工程とを含んでいる、生体関連物質の検査方法。
【請求項２】
反応工程と排除工程と観察工程とが加湿雰囲気下で行なわれる、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
排除工程は更に、固相坦体の上側から洗浄水を除去する工程を含んでいる、請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
流体を通し得る固相坦体を利用した生体関連物質の反応をリアルタイムで検査するための生体関連物質の検査方法であり、
固相坦体に生体関連物質を供給する供給工程と、
固相坦体上において生体関連物質の反応を起こさせる反応工程と、
生体関連物質の反応後に余剰の生体関連物質を排除する排除工程と、
固相坦体と反応した生体関連物質を光学的に観察する観察工程とを有し、
排除工程は、固相坦体に気体を通過させる工程を含み、固相坦体に通過させられる気体が温度制御された微小液滴を含んでいる、生体関連物質の検査方法。
【請求項５】
反応工程と排除工程と観察工程とが加湿雰囲気下で行なわれる、請求項４に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体関連物質の検査方法、すなわち生体関連物質の反応による情報を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子解析技術が進み、ヒトを含む多くの生物における遺伝子配列が明らかにされつつある。また、解析された遺伝子産物と疾病の因果関係も少しずつ解明されつつある。
【０００３】
現在用いられている遺伝子検査方法は、生体試料から核酸を抽出する工程、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ法などと呼ばれる核酸増幅方法を用いて検査対象となるターゲット遺伝子を増幅する工程、核酸を放射性同位元素や蛍光分子等によって標識する工程、標識されたターゲット遺伝子の塩基配列またはその濃度を測定する工程から構成されている。
【０００４】
最近は、蛍光標識された核酸を複数のキャピラリーを用いることで高速に多数のサンプルを処理できるキャピラリ電気泳動装置が数多く用いられている。これにより、従来の電気泳動装置などを用いた方法に比べて三分の１から四分の１程度の時間で行えるようになった。
【０００５】
更に近年になって同時に複数の遺伝子を検査するためのＤＮＡチップを用いた検査方法が開発された。ＤＮＡチップは、ガラス基板の表面に多数のｃＤＮＡプローブを固定化するものや、半導体製造過程を応用してシリコン上の微小な領域に合成した多数のオリゴプローブを作製したものである。いずれもサンプル中のＤＮＡの塩基配列や発現量を、複数、同時に決定出来る。
【０００６】
ＤＮＡチップの応用によって、多くの遺伝子発現量や複数の突然変異の解析を行うことが可能となった。また、ＤＮＡチップを用いて得られたデータから、多くの遺伝子を複数のグループに分類したり（即ち、クラスタリング）、発生や分化に伴う遺伝子の変動に関する情報が得られている。こうして得られた遺伝子情報は、インターネットを通じて容易にアクセス出来るようなデータベースとして利用されている。
【０００７】
遺伝子の発現量の検査や突然変異の解析が電気泳動法やマイクロアレイ法を用いて行われている。しかしながら、電気泳動法は、検査に必要な時間が長く、また、一度に行える検査は少数に限られるという欠点を有している。
【０００８】
ＤＮＡチップを用いた遺伝子解析方法は、一度に多数の検査を行える反面、長い検査時間を必要とし、多くの検査工程を含んでおり、煩雑な操作を必要としている。そのため、再現性のよい分析結果を得られないという欠点を有している。
【０００９】
このような欠点を克服するために、ＤＮＡチップの担体に、微細加工プロセスを利用して作製された多孔性ガラスウエハーを用いる手法が開発された。このような多孔性ガラスウエハーをＤＮＡチップの担体に用いる手法は、例えば特表平９−５０４８６４号公報に開示されており、ＤＮＡチップと同様の検査を再現性が良く短時間で行なえる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
例えば、生体関連物質である遺伝子を検査する従来の多孔性ガラスウエハーをＤＮＡチップの担体に用いる手法では、液体の移動と温度制御を行う反応部分と、蛍光検出を行う測定部分とが別々であり、各種の装置構成が必要である。このため、各種の装置間の搬送に時間と手間を要するだけでなく、搬送時に温度変化が生じたり、搬送によりゴミが付着したりするなどの問題がある。測定結果の再現性を確保するために注意が必要と考えられる。
【００１１】
また、検査対象となる検体液中にもゴミなどが含まれている場合があり、正確な検査を行なう際の障害となっている。
【００１２】
なお、生体関連物質としてはタンパク質、細胞、組織等があり、前述の問題や障害は、これらを検査する方法が共通に抱えている課題である。
【００１３】
特に、臨床検査においては、遺伝子を短時間で高い精度で簡便に検査したいという要求が強く、これらのユーザーニーズに応えることが難しいと推測される。
【００１４】
本発明は、このような現状を考慮して成されたものであり、その目的は、生体関連物質を短時間で簡便にリアルタイムで正確に検査できる検査方法を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、流体を通し得る固相坦体を利用した生体関連物質の反応をリアルタイムで検査するための生体関連物質の検査方法であり、固相坦体に生体関連物質を供給する供給工程と、固相坦体上において生体関連物質の反応を起こさせる反応工程と、生体関連物質の反応後に余剰の生体関連物質を排除する排除工程と、固相坦体と反応した生体関連物質を光学的に観察する観察工程とを有している。
【００１６】
排除工程は、一例においては、固相坦体を洗浄水中に浸す工程と、洗浄水に超音波振動を加える工程を含んでいる。
【００１７】
排除工程は、別の一例においては、固相坦体に気体を通過させる工程を含み、固相坦体に通過させられる気体は、温度制御された微小液滴を含んでいる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００１９】
第一実施形態
本実施形態は、生体関連物質の検査方法の一例として、ＤＮＡマイクロアレイを利用した遺伝子検査に向けられている。しかし、本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを利用した遺伝子検査に限定されるものではなく、遺伝子以外の他の生体関連物質の検査、例えば、プロテオームアレイを利用したタンパク質の検査にも同様に適用できる。
【００２０】
本実施形態において実施される遺伝子検査の基本的な原理は、配列が既知の固定化された核酸プローブを用いて、試料中に含まれる特定の配列をもった核酸鎖を検出するというものである。例えば、基板に一本鎖核酸の試料を固定化し、次に蛍光物質等で標識した試料中に含まれる核酸に接触させる。試料中の核酸が核酸プローブと相捕的な配列を有していれば、試料中の核酸は、核酸プローブとハイブリダイズして二本鎖を形成し、基板上に固定される。従って、洗浄により未反応の核酸鎖を除去した後で、プローブに付された標識（ローダミン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５など）を蛍光検出することにより、プローブに対して相捕的な配列を有する標的核酸が検出される。
【００２１】
本実施形態において、ＤＮＡマイクロアレイを利用した遺伝子検査に使用する遺伝子検査装置１００の概略的な構成を図１に示す。
【００２２】
図１に示されるように、遺伝子検査装置１００は、ＤＮＡマイクロアレイを含む反応容器１０１を支持すると共にＤＮＡマイクロアレイの反応を促進するための反応ステージ１０３と、ＤＮＡマイクロアレイを光学的に観察するための顕微鏡１０２とを備えている。顕微鏡１０２はＸＹステージを有しており、反応ステージ１０３はＸＹステージの上に載置される。反応ステージ１０３は、例えば、顕微鏡１０２によって観察される視野を変更するために、ＸＹステージによって移動される。
【００２３】
遺伝子検査装置１００は更に、顕微鏡１０２によって得られるＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像を撮影するためのＣＣＤ（charge coupled device）カメラ１０４を備えている。ＣＣＤカメラ１０４は、検査精度向上のために、冷却型が好ましい。
【００２４】
遺伝子検査装置１００は更に、反応ステージ１０３を覆うためのフード１０６を有している。フード１０６は、顕微鏡的観察に不要な外乱光を遮断するため、温度環境の変動を防止するため、観察領域内へのゴミの侵入を防止するために設けられている。フード１０６は、反応ステージ１０３を出し入れするための出入口と、顕微鏡的観察を可能にする観察窓とを有している。
【００２５】
反応ステージ１０３は、ＸＹステージにより、反応容器１０１を設置する際にはフード１０６の外にせり出され、観察の際には、フード１０６の中に収容される。フード１０６の出入口は開閉扉を有しており、反応ステージ１０３の収容後、開閉扉が閉じられる。フード１０６の内部の環境は、その内部に設けられた温度調整器や湿度調整器によって一定に保たれてもよい。
【００２６】
図２に示されるように、反応容器１０１は、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを有する薄板形状のスライドチップ１０７と、これを上下から挟んで保持する上ハウジング１０８と下ハウジング１０９とを備えている。上ハウジング１０８と下ハウジング１０９は、好ましくは遮光性のある部材で構成され、より好ましくは暗黒色の部材で構成される。上ハウジング１０８と下ハウジング１０９は、ネジや接着剤などの締結手段によって互いに固定されて、スライドチップ１０７を保持している。
【００２７】
スライドチップ１０７の上下面に、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを取り囲むように（図示しない）Ｏリングを設け、後に供給される流体（核酸サンプルや洗浄液）が上ハウジング１０８と下ハウジング１０９の隙間から漏れるのを防止してもよい。
【００２８】
図３に示されるように、スライドチップ１０７は、例えば、セラミック製の多孔質部１１０と、多孔質部１１０を間に挟んで支持するための一対の支持板１１１とを備えている。一対の支持板１１１は、互いに対応する位置に、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを規定するための円形の開口部１１２を有している。つまり、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは、多孔質部１１０の上下に配置された一対の支持板１１１にそれぞれ形成された一対の開口部１１２を介して露出している多孔質部１１０の部分をいう。
【００２９】
多孔質部１１０は、好ましくは、その厚み方向に延びている多数の微細な多孔を有している。ここで、多孔質部１１０は、必ずしもこのような構造である必要はなく、流体を通しさえすれば、どのような構造であってもよい。多孔質部１１０の材質は、遺伝子のハイブリダイズ反応の際にさらされる温度と圧力において多孔質部１１０が壊れさえしなければ、どのような材質であってもよい。
【００３０】
また、多孔質部１１０の厚みを充分に薄くし、多孔質の穴径も充分に小さくすれば、所要量のサンプルや試薬を多数の多孔に分配して収容させることができる。従って、多孔質部１１０の表面の特定面積当たりに、所望量の液体を収容するのに必要な個数の多孔を作製し、その所定の面積に対してサンプルや試薬を供給すれば多孔質部１１０内で安定した分析を実行することができる。
【００３１】
図４に示されるように、上ハウジング１０８は、スライドチップ１０７のＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを露出させるためのテーパー形状の開口部１１３を有している。開口部１１３の内側の空間には、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａに供給される核酸サンプル１１４が貯められ得る。
【００３２】
下ハウジング１０９は、スライドチップ１０７のＤＮＡマイクロアレイ１１０ａに対応する位置に形成された、その底面が傾斜している凹部１１５と、凹部１１５の最下部から下ハウジング１０９の下面まで延びている廃液のための廃液孔１１６と、廃液孔１１６の途中から下ハウジング１０９の側面まで延びている、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａに供給される核酸サンプル１１４を貯め得る貯液孔１１７とを有している。
【００３３】
ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａには、例えば、インクジェット吐出原理を用いた液体分注装置により、核酸プローブ溶液の複数の液滴が吐出される。多孔質部１１０に吐出された核酸プローブ溶液の一つの液滴は、微細な多孔の内部に瞬時に吸引され、微小径の核酸プローブスポットが形成される。
【００３４】
図５に示されるように、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは、このように形成された多数の核酸プローブスポット１１８を有している。通常、一つの核酸プローブスポット１１８は、そこに含まれる多孔質部１１０の部分の微細な多孔の内壁に一種類の核酸プローブ１１８が固定されている。言い換えれば、その内壁に一種類の核酸プローブ１１８が固定されている微細な多孔を含む領域が一つの核酸プローブスポット１１８である。
【００３５】
通常、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａ内の異なる核酸プローブスポット１１８には異なる種類の核酸プローブ１１８が固定されているが、必要に応じて、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａ内の複数の核酸プローブスポット１１８に同じ核酸プローブ１１８が固定されていてもよい。また、多孔質部１１０の微細な多孔の内壁に表面処理を施し、流体への摩擦抵抗や核酸プローブ１１８等の試薬の吸着性が調節されてもよい。
【００３６】
スライドチップ１０７の大きさは、例えば、通常のスライドガラスの半分の大きさであり、約３７ｍｍ×約１２ｍｍ×約１ｍｍである。例えば、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは約４ｍｍの直径を有し、一つの核酸プローブスポット１１８は約１００μｍの直径を有し、一つのＤＮＡマイクロアレイ１１０ａの中に４００個の核酸プローブスポット１１８が２００μｍ間隔で配列されている。
【００３７】
一つの核酸プローブスポット１１８は、１００ないし１０００個、好ましくは１０００個の微細な多孔を有し、一つの多孔は０．０５μｍの直径、好ましくは０．２μｍ程度の直径を有している。
【００３８】
ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは、一種類の反応が実施される一つの反応単位に対応している。従来のＤＮＡチップは、スライドガラス表面にプローブを固定化して形成され、二次元的な広がりを持つ反応領域を有している。このようなＤＮＡチップとは異なり、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは、基板の表面における二次元的な広がりに加えて、基板のの厚み方向の広がりをも持つ三次元的な反応領域を有している。
【００３９】
核酸プローブ１１８は、一般的に、約１０ヌクレオチド以上約１００ヌクレオチド以下の核酸からなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであり、一般的にハイブリダイゼーションにより核酸を検出する際に使用される。
【００４０】
ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａに含まれる一つの核酸プローブスポット１１８は、前述したように複数の微細な多孔、つまり、微量な液体を収容し得る三次元的な空間を有している。一つの核酸プローブスポット１１８は、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを上方から見たときの平面内で占める非常に狭いが、多孔質部１１０の厚さ方向に延びている三次元的な空間を有しているので、一つの核酸プローブスポット１１８が実際に占めている面積は見た目よりも遙かに大きい。
【００４１】
例えば、核酸プローブスポット１１８毎に（固定する核酸プローブ１１８の種類を変更したり、表面処理を変更したりする等して）条件を変えることによって、小さなＤＮＡマイクロアレイ１１０ａの中で非常に多くの情報を充分な感度で得ることができる。
【００４２】
ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを用いた解析としては、例えば、被験者における癌遺伝子等の突然変異の有無の検出、被験者における遺伝子の発現解析、薬剤耐性遺伝子の発現解析、被験者における疾病関連または感受性遺伝子の遺伝子型決定、被験者における細胞内シグナル遺伝子の発現パターンの決定等、臨床的な治療学的および診断学的解析、並びに非臨床的な基礎研究においても種々の遺伝子解析等である。
【００４３】
ここに説明したスライドチップ１０７は一つのＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを有しているが、スライドチップ１０７は複数のＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを有していてもよい。このようなスライドチップ１０７においては、複数のＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは、それぞれ異なる検体の検査に利用されもよく、あるいは、同じ検体の異なる種類の解析に利用されてもよい。
【００４４】
図６と図７に示されるように、反応ステージ１０３は、反応容器１０１が載置されるベース部１２０と、ベース部１２０に対して開閉し得るカバー部１２３とを有している。ベース部１２０とカバー部１２３は、反応容器１０１を支持する支持機構を構成している。反応容器１０１は、ベース部１２０の上に載置され、その後にカバー部１２３が閉じられることにより、支持される。
【００４５】
カバー部１２３は、顕微鏡１０２によるＤＮＡマイクロアレイ１１０ａの観察を可能にする顕微鏡観察孔１２２と、顕微鏡観察孔１２２を塞いでいる光学的に透明な二枚のカバーガラス１２１とを有している。二枚のカバーガラス１２１は、間隔を置いて位置している。
【００４６】
ベース部１２０は、反応容器１０１の廃液孔１１６と流体的に連絡される排出用流路１１９と、排出用流路１１９と流体的に連絡した、ベース部１２０の側面で終端している廃液管１３４と、排出用流路１１９の途中に設けられた、排出用流路１１９を開閉するための電磁弁１２８とを有している。
【００４７】
排出用流路１１９は、反応容器１０１と対向する面で終端しており、その終端すなわち送液口の周りにはそれを取り囲む円形の溝が形成されており、その溝の中にはＯリング１３０が配置されている。排出用流路１１９は、反応ステージ１０３に支持された反応容器１０１の廃液孔１１６と、Ｏリング１３０によって液密に保たれて、流体的に連絡される。
【００４８】
反応ステージ１０３は更に、反応容器１０１に対して流体を移送するためのシリンジピストンポンプ部１２５を有している。シリンジピストンポンプ部１２５は、例えば、反応容器１０１内に供給された核酸サンプルを反応容器１０１内において移動させたり、あるいは、洗浄水を反応容器１０１内に供給したりする。
【００４９】
シリンジピストンポンプ部１２５は、反応容器１０１の貯液孔１１７と流体的に連絡される移送用流路１２４と、移送用流路１２４と流体的に連絡した、反応容器１０１内の流体を移送するためのシリンジピストンポンプ１３１と、移送用流路１２４の途中に設けられた、移送用流路１２４を開閉するための電磁弁１２７とを有している。
【００５０】
移送用流路１２４は、反応容器１０１と対向する面で終端しており、その終端すなわち送液口の周りにはそれを取り囲む円形の溝が形成されており、その溝の中にはＯリング１３０が配置されている。移送用流路１２４は、反応ステージ１０３に支持された反応容器１０１の貯液孔１１７と、Ｏリング１３０によって液密に保たれて、流体的に連絡される。
【００５１】
シリンジピストンポンプ１３１は、シリンジ１３８と、シリンジ１３８内を移動し得るピストン１２９と、シリンジ１３８とピストン１２９を液密に保つためのシール１３９とを有している。
【００５２】
シリンジピストンポンプ部１２５のピストン１２９は、例えば（図示しない）モーターユニットによって駆動される。言い換えれば、遺伝子検査装置１００は、図示されていないが、シリンジピストンポンプ部１２５のピストン１２９を駆動するためのモーターユニットを有している。モーターユニットは、例えば、ステッピングモータと、ステッピングモータの回転軸の運動を直線運動に変換するラックピニオン機構とで構成される。
【００５３】
シリンジピストンポンプ部１２５は更に、シリンジピストンポンプ１３１から延びている洗浄水用流路と、洗浄水用流路と流体的に連絡した、シリンジピストンポンプ部１２５の側面で終端している洗浄水配管１３２と、洗浄水用流路の途中に設けられた、洗浄水用流路を開閉するための電磁弁１２６とを有している。
【００５４】
図８に模式的に示されるように、シリンジピストンポンプ部１２５の洗浄水配管１３２は洗浄水タンク１３３と流体的に連絡され、ベース部１２０に設けられた廃液管１３４は、吸引ポンプ１３５を介して、廃液タンク１３６と流体的に連絡される。言い換えれば、遺伝子検査装置１００は、反応ステージ１０３のシリンジピストンポンプ部１２５と流体的に連絡した洗浄水タンク１３３と、反応ステージ１０３の排出用流路１１９と流体的に連絡した廃液タンク１３６とを更に有している。
【００５５】
反応ステージ１０３は更に、反応容器１０１内のＤＮＡマイクロアレイ１１０ａの温度を調整するための温度調整機構を有している。温度調整機構は、反応容器１０１の温度を上げるための加熱手段を有している。加熱手段は、例えば、図６と図７に示されるように、シリコンラバーヒーターやセラミックヒーターやペルチェ素子等の板状ヒーター１０５である。
【００５６】
板状ヒーター１０５は、ベース部１２０とカバー部１２３に埋め込まれており、好ましくは、反応ステージ１０３に支持されている反応容器１０１と面接触する。具体的には、図６と図７に示されるように、ベース部１２０に埋め込まれた板状ヒーター１０５は、これに載せられた反応容器１０１の下ハウジング１０９と面接触する。これにより、板状ヒーター１０５は反応容器１０１の温度を短時間で上昇させることができる。
【００５７】
温度調整機構は、好ましくは、反応容器１０１の温度を下げるための冷却手段を更に有している。冷却手段は、例えば、ベース部１２０とカバー部１２３に設けられた（図示しない）ペルチェ素子である。ペルチェ素子は、好ましくは、反応ステージ１０３に支持されている反応容器１０１と面接触する。
【００５８】
温度調整機構は、図示しない温度調整器によって駆動制御される。言い換えれば、遺伝子検査装置１００は、図示されていないが、温度調整機構を駆動制御するための温度調整器を有している。
【００５９】
温度調整機構は更に反応容器１０１の温度をモニターするための温度センサーを有していてもよい。この場合、温度調整器は、温度センサーからの情報に基づいて、加熱手段や冷却手段を駆動制御してよい。
【００６０】
遺伝子検査装置１００は更に、装置全体を制御する（図示しない）制御コンピューターを備えている。制御コンピューターは、反応ステージ１０３の位置を調整するためのＸＹステージ、シリンジピストンポンプ部１２５を駆動するためのモーターユニット、これらが設けられた流路を開閉するための複数の電磁弁、反応容器１０１から流体を排出させるための吸引ポンプ１３５、温度調整機構を駆動制御するための温度調整器などを制御する。
【００６１】
本実施形態における遺伝子検査は、図９に示されるフローに従って進められる。
【００６２】
すなわち、遺伝子検査においては、図９に示されるように、まず、ＤＮＡマイクロアレイ１０１の上に検体液である核酸サンプル１１４を滴下する。次に、ＤＮＡマイクロアレイ１０１のハイブリダイゼーション反応を起こさせる。その後、余剰の核酸サンプル１１４をＤＮＡマイクロアレイ１０１より排除する。最後に、顕微鏡１０２により、ＤＮＡマイクロアレイ１０１を蛍光観察する。
【００６３】
より好ましくは、上述した工程は、核酸サンプル１１４の滴下を除いて、すべて加湿雰囲気で行なわれる。つまり、遺伝子検査は、より好ましくは、図１０に示されるフローに従って進められる。
【００６４】
すなわち、より好適な遺伝子検査においては、図１０に示されるように、まず、ＤＮＡマイクロアレイ１０１の上に検体液である核酸サンプル１１４を滴下する。次に、ＤＮＡマイクロアレイ１０１のハイブリダイゼーション反応を加湿雰囲気下で起こさせる。その後、余剰の核酸サンプル１１４をＤＮＡマイクロアレイ１０１より加湿雰囲気下で排除する。最後に、顕微鏡１０２によりＤＮＡマイクロアレイ１０１を加湿雰囲気下で蛍光観察する。
【００６５】
以下、遺伝子検査装置１００における具体的な動作について説明する。
【００６６】
図６において、カバー部１２３が開かれた状態で、反応容器１０１が反応ステージ１０３のベース部１２０に載置される。その後、反応容器１０１の開口部１１３の中に核酸サンプル１１４が供給される。その後、カバー部１２３が閉じられる。
【００６７】
これにより、反応容器１０１の廃液孔１１６がベース部１２０に設けられた排出用流路１１９と流体的に連絡されると共に、反応容器１０１の貯液孔１１７がシリンジピストンポンプ部１２５に設けられた送液用流路と流体的に連絡される。なお、シリンジピストンポンプ部１２５の内部の全ての流路は、反応容器１０１を載置する前に、予め洗浄水１３７で満たされている。
【００６８】
カバー部１２３が閉じられた状態では、カバー部１２３に設けられた下側のカバーガラス１２１は、反応容器１０１の上ハウジング１０８と面接触する。これにより、反応容器１０１の上ハウジング１０８に形成された開口部１１３が密閉される。
【００６９】
これにより、フード１０６内の埃などの異物が、反応容器１０１の上ハウジング１０８の開口部１１３内に入り込むことが防止される。これにより、異物の混入による顕微鏡１０２によるＤＮＡマイクロアレイ１１０ａの誤検査を防止できる。
【００７０】
その後、ハイブリダイズ反応を起こさせるため、反応容器１０１内のＤＮＡマイクロアレイ１１０ａが温度制御される。つまり、四つのヒーター１０５により、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａと各液体が、ハイブリダイズ反応に適した温度に加温される。
【００７１】
反応容器１０１の開口部１１３はカバーガラス１２１によって密閉されているので、その内部は高湿度環境すなわち加湿雰囲気となる。これにより、核酸サンプル１１４は蒸発することがなく、核酸サンプル１１４の濃度は一定に保たれる。従って、不所望な核酸サンプル１１４の濃度変化は生じない。
【００７２】
また、反応容器１０１の開口部１１３は、密閉された空気を間に挟んで配置されている二枚のカバーガラス１２１を介して、外部環境と遮断されているので、外部環境との温度勾配が低減されている。これにより、温度制御中にカバーガラス１２１の面に結露が生じることが防止される。
【００７３】
続いて、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａ側の電磁弁１２７のみが開放され、図７に示されるように、シリンジピストンポンプ１３１のピストン１２９が紙面右側に移動される。これにより、核酸サンプル１１４は、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを通過し、下ハウジング１０９内の貯液孔１１７の中に移動する。
【００７４】
次に、図６に示されるように、ピストン１２９が紙面左側に移動される。これにより、核酸サンプル１１４は、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを通過し、再びＤＮＡマイクロアレイ１１０ａの上側すなわち開口部１１３の中に戻る。
【００７５】
この動作は繰り返し行なわれる。これにより、核酸サンプル１１４は、短時間の内に、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａ内の核酸プローブスポット１１８とハイブリダイズ反応を起こす。その結果、所定の核酸プローブスポット１１８だけが後の蛍光観察の際に蛍光を発し得る。
【００７６】
貯液孔１１７の容積は予め、シリンジピストンポンプ部１２５の内部に核酸サンプル１１４が到達しないように決められている。また、シリンジピストンポンプ１３１は、貯液孔１１７の容積に応じてピストン１２９の移動距離が制限されて駆動される。これにより、核酸サンプル１１４がシリンジピストンポンプ部１２５の中に侵入することがなく、別のＤＮＡマイクロアレイ１１０ａをセットした際のキャリーオーバーが発生することはない。
【００７７】
ハイブリダイズ反応の終了後、余剰の核酸サンプル１１４を排除するために、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａが洗浄水で洗浄される。ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａの洗浄は、以下の手順に従って行なわれる。
【００７８】
まず、図８において、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａ側の電磁弁１２７と吸引ポンプ１３５側の電磁弁１２８が閉じられ、洗浄水タンク１３３側の電磁弁１２６が開かれ、シリンジピストンポンプ１３１のピストン１２９が紙面右側に移動される。これにより、洗浄水タンク１３３の洗浄水１３７がシリンジ１３８内に吸引される。
【００７９】
次に、洗浄水タンク１３３側の電磁弁１２６が閉じられ、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａ側の電磁弁１２７が開かれ、ピストン１２９が紙面左側に移動される。これにより、洗浄水１３７が反応容器１０１の中に注入される。洗浄水１３７の注入は、洗浄水１３７がＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを通過して、その上に貯まるまで続けられる。その結果、例えば図６に示されたテーパー形状開口部１１３に洗浄水が貯まり、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは洗浄水中に浸される。
【００８０】
その後、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａ側の電磁弁１２７が閉じられ、吸引ポンプ１３５側の電磁弁１２８が開かれ、吸引ポンプ１３５が動作される。これにより、反応容器１０１の中の洗浄水１３７と余剰の核酸サンプル１１４が廃液タンク１３６に排出される。
【００８１】
その一連の操作の結果、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａが洗浄される。この洗浄は繰り返し行なわれてもよい。洗浄を繰り返し行なうことにより、余剰の核酸サンプル１１４がより確実に排除される。
【００８２】
洗浄の間、洗浄液１３７の流路途中に設けられた（図示しない）圧力センサーを利用して、洗浄液１３７の圧力が所定値をを越えないように、シリンジピストンポンプ１３１や吸引ポンプ１３５が制御されてもよい。
【００８３】
洗浄後、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは、顕微鏡１０２によって、蛍光観察される。
【００８４】
本実施形態においては、反応容器１０１内のＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを各種装置間で搬送させることなく蛍光観察されるので、遺伝子のハイブリダイズ反応をリアルタイムで観察できる。
【００８５】
くわえて、蛍光観察の前にＤＮＡマイクロアレイ１１０ａを洗浄して余剰の核酸サンプルを排除しているので、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａのバックグランドの自家蛍光が低減される。つまり、核酸プローブとハイブリダイズ反応を起こしたわけでなく、単にＤＮＡマイクロアレイ１１０ａに付着している核酸サンプルが原因でこれまで生じていた不所望な蛍光が完全に無くなる。これにより、核酸プローブスポットの蛍光強度のＳ／Ｎ比が向上され、微弱蛍光においても正確な検査を行なうことができる。
【００８６】
さらに、ハイブリダイズ反応が加湿雰囲気下で行なわれるので、核酸サンプルの蒸発がなく、従って核酸サンプルの濃度変化がないので、核酸サンプルの濃度変化に起因した検査精度の低下が防止される。
【００８７】
本実施形態は、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、様々な変更や修正が加えられてもよい。例えば、本実施形態では、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは洗浄水で洗浄されているが、水以外の他の液体で洗浄されてもよい。また、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは、気体たとえば空気で洗浄されてもよい。つまり、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは、これに気体を通過させることにより洗浄されてもよい。例えば、空気による洗浄は、電磁弁１２６を大気に開放された三方弁に変更することにより容易に実施され得る。
【００８８】
また、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは、温度制御された微小液滴を含む気体たとえば水蒸気で洗浄されてもよい。例えば、水蒸気による洗浄は、電磁弁１２６を三方弁に変更し、これに加湿蒸気タンクに接続することにより容易に実施され得る。ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは、これに水蒸気を通過させることにより洗浄される。水蒸気の温度は、ハイブリダイズ反応に適した温度よりも低いことが好ましい。
【００８９】
第二実施形態
本実施形態は、超音波を利用したＤＮＡマイクロアレイの洗浄に向けられている。
【００９０】
図１１に示されるように、ベース部１２０は、その上に載置された反応容器１０１の下ハウジング１０９と面接触する二枚の圧電素子１４０を備えている。圧電素子１４０は、例えば、１０ｍｍ×３０ｍｍ×１ｍｍの大きさを有している。圧電素子１４０は、例えば、厚み方向の分極処理が施されたチタン酸シリコン酸鉛（ＰＺＴ）の板と、その厚み方向の二面に蒸着された銀電極とで構成されている。
【００９１】
圧電素子１４０には、図示しない駆動回路からフレキシブルケーブルなどを用いて、１００Ｖｐ−ｐ程度の正弦波の交番電圧が印加される。圧電素子１４０に印加する交番電圧の周波数は、好ましくは、ステージ１０３の固有振動数に一致した周波数である。このような周波数の交番電圧の印加に対して、圧電素子１４０は強い超音波振動を発生する。
【００９２】
図１１に示されるように、ハイブリダイズ反応の終了後、シリンジピストンポンプ１３１により、洗浄水１３７がＤＮＡマイクロアレイ１１０ａの上まで送液される。このようにＤＮＡマイクロアレイ１１０ａの上まで洗浄水１３７が供給されている状態で、ベース部１２０に内蔵されている圧電素子１４０が正弦波の交番電圧で駆動され、圧電素子１４０は超音波振動を発生する。これにより、洗浄水が供給されている部分は超音波洗浄される。
【００９３】
その後、廃液用電磁弁１２８を開放し、他の電磁弁１２６と１２７を閉じ、吸引ポンプ１３５を動作させることにより、余剰の核酸サンプル１１４と洗浄水１３７は反応容器１０１から排除される。
【００９４】
本実施形態では、洗浄水による洗浄の際に超音波振動を加えることにより、その洗浄効果が更に向上される。従って、蛍光観察の前に余剰の核酸サンプルがより確実に排除される。その結果、不所望な自家蛍光が更に軽減され、核酸プローブスポットの蛍光強度のＳ／Ｎ比が更に向上され、より正確な検査を行なうことができる。
【００９５】
第三実施形態
本実施形態は、ＤＮＡマイクロアレイの上方からの洗浄水の供給と吸引に向けられている。
【００９６】
図１２と図１３に示されるように、検査装置は、洗浄水をＤＮＡマイクロアレイに上方からすなわち検査面側から供給する洗浄ノズル１４１を更に有している。洗浄ノズル１４１は、反応ステージ１０３のカバー部１２３が開かれた状態で、反応容器１０１の上ハウジング１０８と接触され、上ハウジング１０８に形成されたテーパー形状開口部１１３に洗浄液を供給する。図示しないが、洗浄ノズル１４１は別の搬送部材により支持されており、洗浄ノズル１４１には洗浄水タンク１３３の洗浄水１３７を送液するポンプが接続されている。
【００９７】
ハイブリダイズ反応の終了後、図１２に示されるように、カバー部１２３が開けられ、洗浄ノズル１４１が反応容器１０１の上ハウジング１０８と接触され、上ハウジング１０８に形成されたテーパー形状開口部１１３に洗浄液が供給される。
【００９８】
洗浄ノズル１４１から洗浄液が供給されている間、廃液用電磁弁１２８だけが開かれ、吸引ポンプ１３５が動作されている。これにより、洗浄水１３７が余剰の核酸サンプル１１４と共に反応容器１０１から排出される。
【００９９】
第二実施形態と同様に、ベース部１２０は洗浄効果を高める圧電素子１４０を備えており、この洗浄動作の間、圧電素子１４０による超音波洗浄が併用されてもよい。
【０１００】
その後、図１３に示されるように、シリンジピストンポンプ１３１より、洗浄水タンク１３３の洗浄水１３７をＤＮＡマイクロアレイ１１０ａに送りながら、洗浄ノズル１４１により洗浄水が吸引され除去される。これにより余剰の核酸サンプルが除去される。
【０１０１】
本実施形態では、洗浄動作の間、洗浄水が一方向に流されるので、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａは常に清浄な洗浄水で洗浄され続ける。これにより、洗浄時間が大幅に短縮される。また、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａの上方に位置する洗浄ノズルによって洗浄液が吸引されて除去されることにより、ＤＮＡマイクロアレイ１１０ａの上側すなわち検査面側に存在するゴミも一緒に除去される。
【０１０２】
その結果、核酸サンプル１１４はハイブリダイズ反応を起こした適正な核酸プローブスポットにのみ存在し、余剰の核酸サンプル１１４は殆ど存在しなくなる。これにより、不所望な自家蛍光が更に軽減され、蛍光観察のＳ／Ｎ比が更に向上される。従って、より正確な検査を行なうことができる。
【０１０３】
ＤＮＡマイクロアレイを洗浄するための物質は液体に限定されるものではない。つまり、洗浄ノズル１４１から供給される物質は、温度制御された微小液滴であってもよい。温度制御された微小液滴も、余剰の核酸サンプル１１４を効率よく除去し得る。好ましくは、ＤＮＡマイクロアレイを通過する際の圧力負荷を抑えるために、蒸気の液滴の大きさは、数μｍ程度以下の大きさであるとよい。また、洗浄ノズル１４１から供給される物質は、蒸気や空気であってもよい。
【０１０４】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施の形態を述べたが、本発明は、これらの実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【０１０５】
【発明の効果】
本発明によれば、光学的な観察の前に余剰の生体関連物質が排除されるので、生体関連物質を短時間で簡便にリアルタイムで正確に検査できる検査方法が提供される。本発明の検査方法によれば、反応部分の検体液の状態（濃度など）や、温度条件を変化させながら対象生体関連物質の反応程度をリアルタイムで測定することができる。従って、対象生体関連物質の発現の有無やその発現量を正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第一実施形態における遺伝子検査装置の概略的な斜視図であり、フード内に収容された反応ステージを示すために、フードを透かして描かれている。
【図２】図１に示された反応容器の分解斜視図である。
【図３】図３に示されたスライドチップの分解斜視図である。
【図４】図３に示された反応容器の側方縦断面図を示している。
【図５】ＤＮＡマイクロアレイに配列された多数の核酸プローブスポットを示している。
【図６】図１に示された反応ステージと反応容器の側方縦断面図であり、反応容器が設置された直後の、核酸サンプルがＤＮＡマイクロアレイの上に位置している状態を示している。
【図７】図１に示された反応ステージと反応容器の側方断面図であり、核酸サンプルが貯液孔に移動された状態を示している。
【図８】本発明の第一実施形態における遺伝子検査装置の流路を概略的に示している。
【図９】本実施形態における遺伝子検査のフローを示している。
【図１０】本実施形態におけるより好適な遺伝子検査のフローを示している。
【図１１】本発明の第二実施形態における反応ステージと反応容器の断面図であり、ベース部に設けられた圧電素子によりＤＮＡマイクロアレイが超音波洗浄されている状態を示している。
【図１２】本発明の第三実施形態における遺伝子検査装置における反応ステージと反応容器と洗浄ノズルの断面図であり、洗浄ノズルから洗浄水が供給されている状態を示している。
【図１３】本発明の第三実施形態における遺伝子検査装置における反応ステージと反応容器と洗浄ノズルの断面図であり、洗浄ノズルにより洗浄水が吸引されている状態を示している。
【符号の説明】
１００  遺伝子検査装置
１０１  反応容器
１０２  顕微鏡
１０３  反応ステージ
１０４  ＣＣＤカメラ
１０５  板状ヒーター
１０７  スライドチップ
１０８  上ハウジング
１０９  下ハウジング
１１０  多孔質部
１１０ａ  ＤＮＡマイクロアレイ
１１１  支持板
１１６  廃液孔
１１７  貯液孔
１１９  排出用流路
１２０  ベース部
１２３  カバー部
１２４  移送用流路
１２５  シリンジピストンポンプ部
１３１  シリンジピストンポンプ
１３３  洗浄水タンク
１３５  吸引ポンプ
１３６  廃液タンク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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