(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターカレーターが結合した、二本鎖核酸と一本鎖核酸とを含む混合物において、二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物、又は一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物を、該混合物に添加することによって、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減させることを特徴とする、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルの低減化方法：ただし、
１）前記インターカレーターはエチジウムブロマイド又はアクリジンオレンジで、前記化合物は次亜塩素酸ナトリウム又は水素化ホウ素ナトリウムであるか、
２）前記インターカレーターはエチジウムブロマイド又はアクリジンオレンジで、前記化合物はメチレンブルー、アクチノマイシンＤ、又はＳＹＢＲグリーン２であるか、
３）前記インターカレーターはＹＯ−ＰＲＯ−１で、前記化合物はメチレンブルーであるか、あるいは
４)前記インターカレーターはメチレンブルーで、前記化合物はアシッドオレンジ７である。
【請求項２】
以下の工程：
（a）核酸増幅反応によって核酸を増幅する工程、
（b）核酸増幅反応後の反応液にインターカレーターを添加する工程、
（c）請求項１に記載の方法によって、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減化する工程、
（d）反応液の蛍光強度を測定する工程、
を包含する核酸増幅産物の検出方法：ただし、（b）のインターカレーターは（c）のシグナル低減化工程で用いられるインターカレーターと同一のものである。
【請求項３】
以下の工程：
（a）インターカレーターの存在下、核酸増幅反応によって核酸を増幅する工程、
（b）請求項１に記載の方法によって、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減化する工程、
（c）反応液の蛍光強度を測定する工程
を包含する、核酸増幅産物の検出方法：ただし、（a）のインターカレーターは（b）のシグナル低減化工程で用いられるインターカレーターと同一のものである。
【請求項４】
以下の工程：
（a）インターカレーター、及び一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物、又は一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物の存在下、核酸増幅反応によって核酸を増幅する工程、
（b）反応液の蛍光強度を測定する工程
を包含する、核酸増幅産物の検出方法：ただし、
１）前記インターカレーターはエチジウムブロマイド又はアクリジンオレンジで、前記化合物は次亜塩素酸ナトリウム又は水素化ホウ素ナトリウムであるか、
２）前記インターカレーターはエチジウムブロマイド又はアクリジンオレンジで、前記化合物はメチレンブルー、アクチノマイシンＤ、又はＳＹＢＲグリーン２であるか、
３）前記インターカレーターはＹＯ−ＰＲＯ−１で、前記化合物はメチレンブルーであるか、あるいは
４)前記インターカレーターはメチレンブルーで、前記化合物はアシッドオレンジ７である。
【請求項５】
核酸増幅反応が、以下の工程：
（a）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の3'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3'末端方向に向かって順に第１の任意配列F1c、第2の任意配列F2c及び第3の任意配列F3cをそれぞれ選択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末端方向に向かって順に第4の任意配列R1、第5の任意配列R2及び第6の任意配列R3をそれぞれ選択する工程、
（b）前記F2cに対し相補的な配列F2及び該F2の5'側に前記F1cと同一の配列を含むプライマー、前記F3cに対し相補的な配列F3を含むプライマー、前記R2と同一の配列及び該配列の5'側に前記R1に対し相補的な配列R1cを含むプライマー、並びに前記R3と同一の配列を含むプライマーをそれぞれ調製する工程、
（c）前記ヌクレオチド鎖を鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ及び前記プライマーの存在下でDNA合成反応を行う工程、
を包含する、請求項２に記載の検出方法。
【請求項６】
核酸増幅反応が、以下の工程：
（a）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の3'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3'末端方向に向かって順に第１の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cをそれぞれ選択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末端方向に向かって順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2をそれぞれ選択する工程、
（b）前記F2cに対し相補的な配列F2及び該F2の5'側に前記F1cと同一の配列を含むプライマー、並びに前記R2と同一の配列及び該配列の5'側に前記R1に対し相補的な配列R1cを含むプライマーをそれぞれ調製する工程、
（c）前記ヌクレオチド鎖を増幅用鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ、前記プライマー及び融解温度調整剤の存在下でDNA合成反応を行う工程、
を包含する、請求項２に記載の検出方法。
【請求項７】
融解温度調整剤が、ベタイン又はトリメチルアミンN-オキシドである、請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
核酸増幅反応が、以下の工程：
（a）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の3'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3'末端方向に向かって順に第１の任意配列F1c、第2の任意配列F2c及び第3の任意配列F3cをそれぞれ選択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末端方向に向かって順に第4の任意配列R1、第5の任意配列R2及び第6の任意配列R3をそれぞれ選択する工程、
（b）前記F2cに対し相補的な配列F2及び該F2の5'側に前記F1cと同一の配列を含むプライマー、前記F3cに対し相補的な配列F3を含むプライマー、前記R2と同一の配列及び該配列の5'側に前記R1に対し相補的な配列R1cを含むプライマー、並びに前記R3と同一の配列を含むプライマーをそれぞれ調製する工程、
（c）前記ヌクレオチド鎖を鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ及び前記プライマーの存在下でDNA合成反応を行う工程、
を包含する、請求項３に記載の検出方法。
【請求項９】
核酸増幅反応が、以下の工程：
（a）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の3'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3'末端方向に向かって順に第１の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cをそれぞれ選択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末端方向に向かって順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2をそれぞれ選択する工程、
（b）前記F2cに対し相補的な配列F2及び該F2の5'側に前記F1cと同一の配列を含むプライマー、並びに前記R2と同一の配列及び該配列の5'側に前記R1に対し相補的な配列R1cを含むプライマーをそれぞれ調製する工程、
（c）前記ヌクレオチド鎖を増幅用鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ、前記プライマー及び融解温度調整剤の存在下でDNA合成反応を行う工程、
を包含する、請求項３に記載の検出方法。
【請求項１０】
融解温度調整剤が、ベタイン又はトリメチルアミンN-オキシドである、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
核酸増幅反応が、以下の工程：
（a）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の3'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3'末端方向に向かって順に第１の任意配列F1c、第2の任意配列F2c及び第3の任意配列F3cをそれぞれ選択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末端方向に向かって順に第4の任意配列R1、第5の任意配列R2及び第6の任意配列R3をそれぞれ選択する工程、
（b）前記F2cに対し相補的な配列F2及び該F2の5'側に前記F1cと同一の配列を含むプライマー、前記F3cに対し相補的な配列F3を含むプライマー、前記R2と同一の配列及び該配列の5'側に前記R1に対し相補的な配列R1cを含むプライマー、並びに前記R3と同一の配列を含むプライマーをそれぞれ調製する工程、
（c）前記ヌクレオチド鎖を鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ及び前記プライマーの存在下でDNA合成反応を行う工程、
を包含する、請求項４に記載の検出方法。
【請求項１２】
核酸増幅反応が、以下の工程：
（a）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の3'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3'末端方向に向かって順に第１の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cをそれぞれ選択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末端方向に向かって順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2をそれぞれ選択する工程、
（b）前記F2cに対し相補的な配列F2及び該F2の5'側に前記F1cと同一の配列を含むプライマー、並びに前記R2と同一の配列及び該配列の5'側に前記R1に対し相補的な配列R1cを含むプライマーをそれぞれ調製する工程、
（c）前記ヌクレオチド鎖を増幅用鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ、前記プライマー及び融解温度調整剤の存在下でDNA合成反応を行う工程、
を包含する、請求項４に記載の検出方法。
【請求項１３】
融解温度調整剤が、ベタイン又はトリメチルアミンN-オキシドである、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
インターカレーター、並びに二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物及び／又は一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物を構成要素として含む、二本鎖核酸検出用キット：ただし、
前記インターカレーターはエチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、メチレンブルー、及びＹＯ−ＰＲＯ−１から選ばれ、
前記二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物及び／又は一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物は、次亜塩素酸ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、メチレンブルー、アクチノマイシンＤ、ＳＹＢＲグリーン２、及びアシッドオレンジ７から選ばれる。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、インターカレーターによる二本鎖核酸の検出をより高感度に行うことを可能とする核酸検出方法に関する。
背景技術
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等の核酸増幅反応によって得られた増幅産物を検出する最も一般的な方法は、増幅反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド等の蛍光インターカレーターを結合させて特異的な蛍光を観察するというものである。他のＤＮＡが混在するおそれがなく、増幅産物の有無のみを知りたい場合には、電気泳動を省略して増幅反応後の溶液に蛍光インターカレーターを加えて蛍光を観察することも可能であるが、蛍光インターカレーターはプライマー等の一本鎖ＤＮＡにも結合し蛍光を発してしまうため、検出された蛍光シグナル中にはかなりの割合でバックグラウンドノイズが含まれていると考えられる。
ところで、最近、本発明者らは、ＰＣＲ法で不可欠とされる複雑な温度制御を必要としない新しい核酸増幅法である、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の開発に成功した［Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１２）：ｅ６３（２０００）；ＷＯ  ００／２８０８２］。ＬＡＭＰ法は、鋳型ポリヌクレオチド自身の３’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組合わせることによって等温での増幅反応を可能とした方法であり、この方法により核酸増幅反応の簡易性は飛躍的に向上した。
また、蛍光インターカレーターを用いた核酸増幅産物のリアルタイムモニタリングにおいて、ＰＣＲ法は温度サイクルに伴って核酸増幅産物が熱変性による解離と再会合を繰り返すため蛍光強度が大きく変動するが、ＬＡＭＰ法は等温で反応が進行するため蛍光強度の変動がなく、核酸増幅産物のリアルタイムモニタリングにより適している。しかし、ＬＡＭＰ法はＰＣＲ法に比べ、約１０倍量のプライマーを使用するため、ＬＡＭＰ法によって得られた核酸増幅産物を蛍光インターカレーターを用いて検出しようとした場合、混在する一本鎖プライマーによるバックグランドノイズが高く、増幅された二本鎖核酸のみを高感度に検出することは困難である。
本発明は、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減させることにより、インターカレーターによる二本鎖核酸の検出をより高感度行うことができる核酸検出方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、インターカレーターが結合した、二本鎖核酸と一本鎖核酸とを含む混合物において、二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物、又は一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物を添加することによって、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減化させることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、インターカレーター（例えば、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１）が結合した、二本鎖核酸と一本鎖核酸とを含む混合物において、二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物を、該混合物に添加することによって、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減させることを特徴とする、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルの低減化方法である。ここで、二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物としては、酸化剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、過マンガン酸カリウム）及び還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム）が挙げられる。
さらに、本発明は、インターカレーター（例えば、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１）が結合した、二本鎖核酸と一本鎖核酸とを含む混合物において、一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物を、該混合物に添加することによって、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減させることを特徴とする、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルの低減化方法である。ここで、一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物としては、該インターカレーターとは異なる第２のインターカレーター（例えば、メチレンブルー、アクチノマイシンＤ、ＳＹＢＲグリーン２、ＯｌｉＧｒｅｅｎ）が挙げられる。
さらに、本発明は、以下の工程：
（ａ）核酸増幅反応によって核酸を増幅する工程、
（ｂ）核酸増幅反応後の反応液にインターカレーターを添加する工程、
（ｃ）前記のいずれかの方法によって、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減化する工程、
（ｄ）反応液の蛍光強度を測定する工程
を包含する核酸増幅産物の検出方法である。
さらに、本発明は、以下の工程：
（ａ）インターカレーターの存在下、核酸増幅反応によって核酸を増幅する工程、
（ｂ）前記のいずれかの方法によって、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減化する工程、
（ｃ）反応液の蛍光強度を測定する工程
を包含する核酸増幅産物の検出方法である。
さらに、本発明は、以下の工程：
（ａ）インターカレーター、及び一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物の存在下、核酸増幅反応によって核酸を増幅する工程、
（ｂ）反応液の蛍光強度を測定する工程
を包含する核酸増幅産物の検出方法である。
前記核酸増幅反応は、以下の工程：
（ａ）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の３’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ、第２の任意配列Ｆ２ｃ及び第３の任意配列Ｆ３ｃをそれぞれ選択し、標的領域の５’末端から当該ヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって順に第４の任意配列Ｒ１、第５の任意配列Ｒ２及び第６の任意配列Ｒ３をそれぞれ選択する工程、
（ｂ）前記Ｆ２ｃに対し相補的な配列Ｆ２及び該Ｆ２の５’側に前記Ｆ１ｃと同一の配列を含むプライマー、前記Ｆ３ｃに対し相補的な配列Ｆ３を含むプライマー、前記Ｒ２と同一の配列及び該配列の５’側に前記Ｒ１に対し相補的な配列Ｒ１ｃを含むプライマー、並びに前記Ｒ３と同一の配列を含むプライマーをそれぞれ調製する工程、
（ｃ）前記ヌクレオチド鎖を鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ及び前記プライマーの存在下でＤＮＡ合成反応を行う工程、
を包含するものであり得る。
さらに、前記核酸増幅反応は、以下の工程：
（ａ）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の３’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃをそれぞれ選択し、標的領域の５’末端から当該ヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２をそれぞれ選択する工程、
（ｂ）前記Ｆ２ｃに対し相補的な配列Ｆ２及び該Ｆ２の５’側に前記Ｆ１ｃと同一の配列を含むプライマー、並びに前記Ｒ２と同一の配列及び該配列の５’側に前記Ｒ１に対し相補的な配列Ｒ１ｃを含むプライマーをそれぞれ調製する工程、
（ｃ）前記ヌクレオチド鎖を増幅用鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ、前記プライマー及び融解温度調整剤（例えば、ベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド）の存在下でＤＮＡ合成反応を行う工程、
を包含するものであり得る。
さらに、本発明は、インターカレーター（例えば、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１）、並びに二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物及び／又は一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物を構成要素として含む二本鎖核酸検出用キットである。ここで、二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物としては、酸化剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、過マンガン酸カリウム）及び還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム）が挙げられる。また、一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物としては、該インターカレーターとは異なる第２のインターカレーター（例えば、メチレンブルー、アクチノマイシンＤ、ＳＹＢＲグリーン２、ＯｌｉＧｒｅｅｎ）が挙げられる。
発明の開示
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、インターカレーターが結合した、二本鎖核酸と一本鎖核酸とを含む混合物において、二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物、又は一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物を添加することによって、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルの低減化を図り、二本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルをより高感度に検出することに基づく二本鎖核酸の検出方法である。
従って、この方法は、一本鎖核酸であるプライマーを利用する核酸増幅反応において、増幅反応中又は反応後に、当該反応系中に増幅された二本鎖核酸以外に著量のプライマーが残存している場合に、増幅産物を選択的に検出する場合に特に有用である。
本発明において、「インターカレーター」とは、ＤＮＡ塩基対のなす平面と平面の間に挿入（インターカレーション）する性質のある化合物、インターカレート剤を意味する。また、「シグナル」とは、核酸に結合したインターカレーターに由来する蛍光のように、特定の物質や特定の状態の目印となるものを意味する。
１．  核酸増幅反応
具体的には、本発明は一本鎖核酸であるプライマーを利用する核酸増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のほか、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特公平７−１１４７１８号公報等）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特許第２６５０１５９号）等により得られる増幅産物（二本鎖核酸）を検出する場合に有用である。特に、ＬＡＭＰ法においては、ＰＣＲ法よりも多量のプライマーを使用するため、増幅反応後に残存する一本鎖プライマーも多く、ＬＡＭＰ法による増幅産物を検出する場合、本発明の二本鎖核酸検出方法は極めて有用である。
ＬＡＭＰ法は増幅対象となる塩基配列の末端にループ構造を形成し、そこを起点としてポリメラーゼによる伸長反応が起きると同時に、ループ内の領域にハイブリダイズしたプライマーが、鎖置換反応により核酸鎖を伸長しながら先の伸長反応の産物を一本鎖に解離させていくというものである。生成した一本鎖核酸はその末端に自己相補性領域を持つため、末端にループを形成し新たな伸長反応が始まる。実際のＬＡＭＰ法では等温で進行するため、上に述べた反応は同時に並行して起こる。ＬＡＭＰ法の特徴としては、等温で進行する鎖置換型の反応であることのほかに、増幅産物の量が非常に多いことが挙げられる。これは、ポリメラーゼが失活する原因である熱変性の操作が含まれていないことも一因である。以下、ＬＡＭＰ法について説明する。
（１）ＬＡＭＰ法
以下、ＬＡＭＰ法の概要について説明する（図１及び図２）。ＬＡＭＰ法においては、まず増幅の対象となる鋳型ポリヌクレオチドを調製する。鋳型ポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の調製は、化学合成により、あるいは組織又は細胞等の生物学的材料から公知の方法を用いて行うことができる。この場合、増幅の標的領域の両側（標的領域の５’側及び３’側）には、適当な長さの配列（両側配列という）が存在するように鋳型ポリヌクレオチドを調製する（図１Ａ）。両側配列とは、当該標的領域の５’末端からポリヌクレオチド鎖の５’末端までの領域の配列、及び当該標的領域の３’末端からポリヌクレオチド鎖の３’末端までの領域の配列を意味する（図１Ａの両矢印（←→）部分）。両側配列の長さは、標的領域の５’側及び３’側のいずれの領域も、１０〜１０００塩基、好ましくは３０〜５００塩基である。
標的領域及び両側配列を含む鋳型ポリヌクレオチド鎖（図１Ａ）において、両側配列の中から任意に所定の領域を選択する。すなわち、標的領域の３’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ、第２の任意配列Ｆ２ｃ、及び第３の任意配列Ｆ３ｃをそれぞれ選択する（図１Ｂ）。同様に、標的領域の５’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって、順に第４の任意配列Ｒ１、第５の任意配列Ｒ２、及び第６の任意配列Ｒ３をそれぞれ選択する（図１Ｂ）。ここで、前記任意配列Ｆ１ｃと前記任意配列Ｒ１の選択に当たっては、Ｆ１ｃとＲ１との間の距離を０塩基、すなわち、隣接するように選択することや、Ｆ１ｃとＲ１とが一部重複するように選択することも可能である。上記第１〜第６の領域は、それぞれ、調製されたポリヌクレオチド鎖の配列に応じて任意に選択される。選択する個々の領域は、それぞれ、５〜１００塩基が好ましく、１０〜５０塩基がさらに好ましい。この塩基の長さを選択することにより、後述のプライマーがアニールしやすくなる。
また、各任意配列は、ＬＡＭＰ法により得られる増幅産物が分子間アニールではなく、図２ＬのようにＦ１ｃ配列とＦ１配列との間及びＲ１配列とＲ１ｃ配列との間で分子内アニールを優先的に生じ、末端ループ構造を形成するように選択することが好ましい。例えば、分子内アニールを優先的に生じさせるためには、任意配列の選択にあたって、Ｆ１ｃ配列とＦ２ｃ配列との間の距離及びＲ１配列とＲ１ｃ配列との間の距離を考慮することが重要である。具体的には、両者各配列が、０〜５００塩基、好ましくは０〜１００塩基、最も好ましくは１０〜７０塩基の距離を介して存在するように選択することが好ましい。ここで、数値はそれぞれ、Ｆ１ｃ配列及びＦ２ｃ配列自身並びにＲ１配列及びＲ２配列自身を含まない塩基数を示している。
次に、ＦＡプライマーと呼ばれるプライマーを設計及び合成しておいて、これをＦ２ｃにアニールさせる。「ＦＡプライマー」とは、Ｆ２ｃ領域に相補的な配列であるＦ２配列と、Ｆ１ｃと同一の配列（便宜上Ｆ１ｃともいう）とを含むものであって、例えば、Ｆ２の５’側に、Ｆ１ｃ配列の３’末端が連結した構造を有するものが挙げられる（図１Ｃ）。また、「アニール」とは、ヌクレオチド鎖が、ワトソン−クリックのモデルに基づく塩基対結合によって二本鎖構造を形成することをいう。ＦＡプライマーを鋳型ポリヌクレオチド鎖上のＦ２ｃ配列にアニールさせた後は、ＦＡプライマー中のＦ２を起点として、ＤＮＡ鎖合成を開始させる（図１Ｄ）。続いて、Ｆ３ｃに相補的な配列Ｆ３を含むプライマー（以下、Ｆ３プライマーともいう）を鋳型ポリヌクレオチド鎖のＦ３ｃ配列にアニールさせる（図１Ｄ）。そして、アニールさせたＦ３プライマーを起点として、鎖置換型ＤＮＡ合成を行わせる（図１Ｅ）。「鎖置換型ＤＮＡ合成」とは、プライマーを合成起点とする相補鎖合成反応の鋳型に他のポリヌクレオチドがすでにハイブリダイズして２本鎖構造となっているときに、そのポリヌクレオチドを鋳型から分離しながら相補鎖合成が進行する反応をいう。具体的には、ＦＡプライマーによって合成された鎖を、Ｆ３プライマーによって合成された鎖が置換するように合成が進む反応が挙げられる。これは、換言すれば、ＦＡプライマーによって合成された、鋳型ポリヌクレオチド鎖の相補鎖は、Ｆ３プライマーを起点として伸長した鎖によって剥離されるように置換することともいえる。
以上の合成反応によって、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の２種類のヌクレオチド鎖を得ることができる。
（ｉ）鋳型ポリヌクレオチド鎖中の配列「（３’）Ｆ３ｃ−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ−標的領域−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３（５’）」に対して相補的な配列「（５’）Ｆ３−Ｆ２−Ｆ１−標的領域−Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ３ｃ（３’）」を含むヌクレオチド鎖（図１Ｆ）
（ｉｉ）置換されて一本鎖となった（剥離された）ヌクレオチド鎖、すなわちその５’末端側にＦ１ｃと同一の配列を有する「（５’）Ｆ１ｃ−Ｆ２−Ｆ１−標的領域−Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ３ｃ（３’）」を含むヌクレオチド鎖（図１Ｇ）
ここで、上記（ｉｉ）のヌクレオチド鎖において、Ｆ１とＦ１ｃとは互いに相補的であるため、Ｆ１とＦ１ｃとの間の鎖内水素結合によって両者はハイブリダイズし、ヘアピンループが形成される（図１Ｇ）。そして、ヘアピンループ中にＦ２が含まれる。
次に、上記（ｉｉ）のヌクレオチド鎖のＲ２ｃ配列に、「ＲＡプライマー」と呼ばれるプライマーをアニールさせる。ＲＡプライマーは、Ｒ２配列の５’側に、Ｒ１配列に対して相補的な配列Ｒ１ｃの３’側が連結されている。そして、ＲＡプライマーを合成起点としてＤＮＡ鎖合成を開始させる（図１Ｈ）。ＲＡプライマーを合成起点として合成された伸長ＤＮＡがＦ１とＦ１ｃとの間で形成される相補鎖部分に達すると、図１Ｅに示す置換反応と同様にしてＦ１ｃの配列が当該伸長ＤＮＡによって置換される（図１Ｉ）。続いて鋳型ポリヌクレオチド鎖のＲ３ｃに、該配列に相補的な配列Ｒ３を含むプライマー（以下、Ｒ３プライマーともいう）をアニールさせる（図１Ｉ）。アニールさせたＲ３プライマーを起点として、鎖置換型のＤＮＡ合成を行わせる（図２Ｊ）。以上の合成反応によって、以下の（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の２種類のヌクレオチド鎖が合成される。
（ｉｉｉ）配列「（５’）Ｆ１ｃ−Ｆ２−Ｆ１−標的領域−Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ３ｃ（３’）」に対して相補的なヌクレオチド鎖「（３’）Ｆ１−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ−標的領域−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３（５’）」（図２Ｋ）
（ｉｖ）最も３’末端側にＦ１を、最も５’末端側にＲ１ｃを有するヌクレオチド鎖「（３’）Ｆ１−Ｆ２ｃ−Ｆ１−標的領域−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１ｃ（３’）」（図２Ｌ）
なお、上記（ｉｖ）の配列は、３’側に存在する配列Ｆ１とＦ１ｃとの間及び５’側に存在する配列Ｒ１とＲ１ｃとの間の鎖内水素結合によってヘアピンループを形成する（図２Ｌ）。
次に、前記（ｉｖ）ヌクレオチド鎖のうち３’側のヘアピンループ部分のＦ２ｃにＦＡプライマーのＦ２領域をアニールさせる（図２Ｍ）。また、鎖内水素結合によりアニールしているＦ１を合成起点としてＤＮＡ鎖合成を開始させる。図１Ｍにおいて、Ｆ１を起点として合成される伸長鎖は、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１ｃで形成されるヘアピンループを開いて５’末端まで到達する。一方、Ｆ２を起点として反応が進むと、「Ｆ１ｃ−標的領域−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１ｃ」で構成される鎖に対する相補鎖が合成される。このとき、Ｆ１、及びＦ１を起点として合成された鎖「Ｆ１−標的領域−Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ１」は、上記Ｆ２を起点とする合成によって置換される。これによって、一本鎖突出構造「−標的配列−Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ１」を有する二本鎖ＤＮＡが得られる。かかる一本鎖突出構造部は、一本鎖突出構造部分（「Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ１」）のＲ１ｃとＲ１との間で鎖内水素結合を形成することによってヘアピンループを形成する（図２Ｎ）。この構造物は、鎖内水素結合によりアニールしているＲ１を合成起点としてＤＮＡ鎖合成を開始させる（図２Ｎ）。以上の合成反応によって、以下の（ｖ）及び（ｖｉ）の２種類のヌクレオチド鎖を得る。
（ｖ）配列「（３’）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１ｃ−標的領域−Ｆ１−Ｆ２−Ｆ１ｃ−標的領域−Ｒ１−Ｒ２ｃ−Ｒ１ｃ−標的領域−Ｆ１−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ−標的領域−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１ｃ（５’）」（図２Ｏ）
（ｖｉ）最も３’末端側にＦ１ｃを、最も５’末端側にＲ１を有する配列「（３’）Ｆ１ｃ−Ｆ２−Ｆ１−標的領域−Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ１（３’）」（図２Ｐ）
上記（ｖ）及び（ｖｉ）のヌクレオチド鎖は、いずれも鎖内水素結合によって、（ｖ）についてはＲ２ｃ、並びに（ｖｉ）についてはＦ２及びＲ２ｃをループ部分とするヘアピンループを形成する。上記（ｖ）及び（ｖｉ）の２つの配列においてヘアピンループを形成しているＲ２ｃ部分にはＲＡプライマーがアニールし、該プライマーを起点とするＤＮＡ合成が開始し、標的配列を含むヌクレオチド鎖（（ｖｉ）の配列に対する相補鎖）の合成が進む。この相補鎖は図２Ｌに示す配列と同一であるので、以下、図２Ｌ〜Ｐの反応が繰り返される。一方、図１Ａからの反応も進行し得るので、これらの一連の合成反応が繰り返されて、ポリヌクレオチド鎖の増幅が進行する。
上記の増幅反応においては、ＦＡプライマー、ＲＡプライマー、Ｆ３プライマー及びＲ３プライマーの４種類のプライマーを用いて増幅反応を行うものであるが、Ｆ３プライマー及びＲ３プライマーを使用せずに、ＦＡプライマー及びＲＡプライマーの２種のプライマーのみを使用することによっても、等温下での増幅反応を起こさせることが可能である。なお、その場合には、反応系中にベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）等の融解温度（Ｔｍ）調整剤を共存させることが必要である。
（２）反応条件
ＬＡＭＰ法における反応は、鋳型となる１本鎖の核酸に対して、以下の成分を加え、ＦＡ及びＲＡを構成する塩基配列が相補的な塩基配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。インキュベート温度は５０〜７５℃、好ましくは５５〜７０℃であり、インキュベート時間は１分〜１０時間、好ましくは５分〜４時間である。
（ｉ）    ４種類のオリゴヌクレオチド（ＦＡ、ＲＡ、アウタープライマーＦ３及びアウタープライマーＲ３）
（ｉｉ）  鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼの基質となるヌクレオチド
なお、上記２つの態様のＬＡＭＰ法において使用するＦＡプライマー及びＲＡプライマーをインナープライマー、Ｆ３プライマー及びＲ３プライマーをアウタープライマーともいう。
アウタープライマーからのヌクレオチド鎖合成は、インナープライマーからのヌクレオチド鎖合成よりも後に開始される必要がある。これを達成する方法として、インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも高く設定する方法などが挙げられる。具体的には、インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも、２〜５０倍、好ましくは４〜２５倍高く設定することにより実施することができる。
また、上記鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ（鎖置換型ポリメラーゼともいう）としては、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）などが挙げられる。
この反応は、酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度（Ｔｍ）の調整剤等の共存下で行う。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨは使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて調整する。塩類としてはＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４等が挙げられ、酵素の活性維持と核酸の融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。更に融解温度（Ｔｍ）の調整剤には、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルグリシン）、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミドが利用される。融解温度（Ｔｍ）の調整剤を利用することによって、前記オリゴヌクレオチドのアニールを限られた温度条件の下で調整することができる。特に、ベタイン及びトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）は、そのｉｓｏｓｔａｂｉｌｉｚｅ作用によって鎖置換効率の向上にも有効である。ベタインは、反応液中０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍ程度の添加により、本発明の核酸増幅反応の促進作用を期待できる。これらの融解温度の調整剤は、融解温度を下げる方向に作用するので、塩濃度や反応温度等のその他の反応条件を考慮して、適切なストリンジェンシーと反応性を与える条件を経験的に設定する。
２．  一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減化する方法
インターカレーターが結合した、二本鎖核酸と一本鎖核酸とを含む混合物において、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減化する方法として、以下のような方法がある。
（１）二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物を添加する方法
（１）−１  酸化剤又は還元剤の利用
二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物を、インターカレーターが結合した、二本鎖核酸と一本鎖核酸とを含む混合物に添加することによって、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減化することが可能である。二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物としては、酸化剤又は還元剤が挙げられる。すなわち、インターカレーターを添加することによって染色した、二本鎖核酸と一本鎖核酸の混合溶液に、さらに酸化剤又は還元剤を添加し、適当な温度下で適当な時間保持する。これにより一本鎖核酸に結合したインターカレーターは、二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも、優先的に酸化又は還元され、一本鎖に結合したインターカレーター由来の蛍光強度が低減する。ここで、インターカレーターとしては、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１等が挙げられる。酸化剤としては、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）等が挙げられる。還元剤としては、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアン化水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）等が挙げられる。
この方法により、核酸増幅産物を検出する場合には、核酸増幅反応後に反応液にインターカレーターを添加し、さらに酸化剤又は還元剤を添加して蛍光強度を測定する方法が一般的であるが、核酸増幅反応前に予め反応液中にインターカレーターを添加し、該インターカレーター存在下で増幅反応を行い、反応後に酸化剤又は還元剤を添加して蛍光強度を測定することも可能である。
（１）−２  錯体形成化合物の利用
二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物として、インターカレーターと錯体形成する化合物を利用することもできる。すなわち、インターカレーターと前記錯体形成化合物を、二本鎖核酸と一本鎖核酸の混合溶液に添加し、適当な温度下で適当な時間保持する。すると、結合が弱い一本鎖核酸とインターカレーターとの結合は、二本鎖核酸とインターカレーターとの結合よりも、錯体形成反応によって優先的に阻害され、一本鎖に結合したインターカレーター由来の蛍光強度が低減する。ここで、インターカレーターと錯体形成化合物の組合せとしては、例えば、メチレンブルー（インターカレーター）とアシッドオレンジ７（錯体形成化合物）の組合せ等を挙げることができる。
この方法により、核酸増幅産物を検出する場合には、核酸増幅反応後に反応液にインターカレーターと錯体形成化合物を、同時にあるいは順に添加して、蛍光強度を測定する方法が一般的であるが、核酸増幅反応前に予め反応液中にインターカレーターを添加し、該インターカレーター存在下で増幅反応を行い、反応後に錯体形成化合物を添加して蛍光強度を測定することも可能である。
また、錯体形成による吸収スペクトルの違いを利用して、蛍光強度の代わりに吸光度を測定してもよい。つまり、インターカレーターとその錯体では吸収スペクトルが異なるため、錯体を形成していないインターカレーターのみを定量的に測定することができる。
（２）一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物を添加する方法
一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物を、インターカレーターが結合した、二本鎖核酸と一本鎖核酸とを含む混合物に添加することによって、一本鎖核酸に結合したインターカレーター由来のシグナルを低減化することが可能である。一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物としては、該インターカレーター（以下、「第１のインターカレーター」という。）とは異なる第２のインターカレーターが挙げられる。すなわち、第１のインターカレーターを添加することによって染色した、二本鎖核酸と一本鎖核酸の混合溶液に、さらに一本鎖核酸に対する結合力は第１のインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力は第１のインターカレーターよりも弱い、第１のインターカレーターとは異なる第２のインターカレーターを添加し、適当な温度下で適当な時間保持する。これにより一本鎖核酸に結合した第１のインターカレーターは、二本鎖核酸に結合した第１のインターカレーターよりも、優先的に第２のインターカレーターによって置換され、一本鎖に結合した第１のインターカレーター由来の蛍光強度が低減する。ここで、二本鎖核酸と一本鎖核酸とを含む混合物に、最初に添加する第１のインターカレーターとしては、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１等が挙げられる。また、一本鎖核酸に結合した第１のインターカレーターとの優先的置換のために添加される、第１のインターカレーターとは異なる第２のインターカレーターとしては、メチレンブルー、アクチノマイシンＤ、ＳＹＢＲグリーン２、ＯｌｉＧｒｅｅｎ等が挙げられる。
この方法により、核酸増幅産物を検出する場合には、核酸増幅反応後に反応液にインターカレーターを添加し、さらに該インターカレーターとは異なる第２のインターカレーターを添加して蛍光強度を測定する方法が一般的であるが、核酸増幅反応前に予め反応液中にインターカレーターを添加し、該インターカレーター存在下で増幅反応を行い、反応後に該インターカレーターとは異なる第２のインターカレーターを添加して蛍光強度を測定することも可能である。その他、核酸増幅反応前に予め反応液中に前記２種のインターカレーターを添加し、該２種のインターカレーター存在下で増幅反応を行い、反応後の蛍光強度を測定することも可能である。
３．  二本鎖核酸の検出
本発明においては、上記２の処理を施した後に、核酸に結合したインターカレーターから発せられる蛍光を蛍光光度計を用いて測定することにより二本鎖核酸を検出する。例えば、上記１の増幅反応により得られる増幅産物を検出する場合には、鋳型ＤＮＡを入れずに増幅反応を行った反応系（対照系▲１▼）、あるいはＤＮＡポリメラーゼを入れない反応系（対照系▲２▼）を対照として設定する。そして、前記対照系と、鋳型ＤＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼを入れ、通常通り増幅反応を行った系（試験系）について、上記２の処理を施した後、対照系と試験系との間の蛍光強度の差を調べることによって、増幅反応により反応液中に生成された増幅産物の有無を確認することができる。すなわち、試験系の蛍光強度が、対照系▲１▼の蛍光強度又は対照系▲２▼の蛍光強度より大きいとき、試験系中には増幅産物が検出されたと評価することができる。
蛍光強度の測定に使用可能な蛍光光度計としては、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ等が挙げられる。蛍光強度の測定に際して、励起波長及び測定波長は核酸の染色に使用したインターカレーターの種類に応じて適宜設定される。なお、本発明においては、増幅反応開始後の反応液に対して上記２の処理を施した後の蛍光強度を、経時的に測定することによって、反応時間により反応産物がどのように推移したか、そのモニタリングをすることができる。
４．  二本鎖核酸の検出用又はモニタリング用キット
上記３の核酸増幅産物の検出又はモニタリング方法は、実施に必要な試薬類を、パッケージングし、キットとして供給することが可能である。より具体的には、以下の構成要素を含むものが挙げられる。
〔キットの構成要素〕
（１）インターカレーター〔例えば、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１〕
（２）二本鎖核酸に結合したインターカレーターよりも一本鎖核酸に結合したインターカレーターと優先的に反応する化合物〔例えば、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）等の酸化剤、水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤〕
（３）一本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも強く、二本鎖核酸に対する結合力はインターカレーターよりも弱い化合物〔例えば、二本鎖核酸と一本鎖核酸の混合溶液に最初に添加したインターカレーターとは異なる第２のインターカレーター（例えば、メチレンブルー、アクチノマイシンＤ、ＳＹＢＲグリーン２、ＯｌｉＧｒｅｅｎ）〕
上記キットを、以下の構成要素を加えることによって、ＬＡＭＰ法に基づいた標的核酸増幅・検出用キットとすることも可能である。
〔追加可能な構成要素〕
（ａ）検出すべき核酸を構成するポリヌクレオチド鎖上の標的領域の３’末端から該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ、第２の任意配列Ｆ２ｃ、及び第３の任意配列Ｆ３ｃをそれぞれ選択し、標的領域の５’末端からポリ該ヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって順に第４の任意配列Ｒ１、第５の任意配列Ｒ２、及び第６の任意配列Ｒ３をそれぞれ選択した場合、前記Ｆ２ｃに対し相補的な配列Ｆ２及び該Ｆ２の５’側に前記Ｆ１ｃと同一の配列を含むプライマー、前記Ｆ３ｃに対し相補的な配列Ｆ３を含むプライマー、前記Ｒ２と同一の配列及び該配列の５’側に前記Ｒ１に対し相補的な配列Ｒ１ｃを含むプライマー並びに前記Ｒ３と同一の配列を含むプライマー
（ｂ）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ
（ｃ）相補鎖合成反応の基質となるヌクレオチド
上記構成要素は、使用するＬＡＭＰ法の態様に応じて変化し得る。すなわち、必要に応じて、上記構成要素から、任意配列Ｆ３ｃに対し相補的な配列Ｆ３を含むプライマー及び任意配列Ｒ３と同一の配列を含むプライマーを省略することが可能である。その場合、融解温度調整剤（例えば、ベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド等）を加えることが好ましい。また、必要に応じて、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な試薬類を加えてもよい。さらに、本発明の好ましい態様においては、１回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で供給することも可能である。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００１−１８３７１６号の明細書に記載された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕  エチジウムブロマイドによるＬＡＭＰ反応産物の検出に及ぼす酸化剤又は還元剤の効果
（１）ＬＡＭＰ反応による核酸の増幅
0004081435.tif 000002
上記反応液に、ＬＡＭＰ反応の鋳型としてＰＳＡ（前立腺特異抗原）ＤＮＡを６×１０−２０ｍｏｌ、さらに増幅産物検出のためにエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を０．５μｇ／ｍｌの濃度になるように添加して、６５℃で３０分間増幅反応を行った。なお、前記のように鋳型ＤＮＡを添加した反応液をポジティブ反応液、鋳型ＤＮＡを添加しなかった反応液をネガティブ反応液とした。本増幅反応においては、鋳型中に含まれる以下の配列（配列番号１）を目的ポリヌクレオチドとした。
0004081435.tif 000003
また、上記反応液中のインナープライマー（ＦＡプライマー及びＲＡプライマー）並びにアウタープライマー（Ｆ３プライマー及びＲ３プライマー）は、配列番号１に示す塩基配列に基づいて以下のように設計した。
〔インナープライマー〕
・ＦＡプライマー
0004081435.tif 000004
・ＲＡプライマー
0004081435.tif 000005
〔アウタープライマー〕
・Ｆ３プライマー
0004081435.tif 000006
・Ｒ３プライマー
0004081435.tif 000007
（２）酸化反応又は還元反応
増幅反応後の上記ポジティブ反応液及びネガティブ反応液に対して、以下のようにして酸化反応又は還元反応を行った。すなわち、酸化反応は、上記両反応液に次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）を２．８％の濃度になるように添加し、室温に２時間保持することにより行った。一方、還元反応は、両反応液に水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を４ｍＭの濃度に、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を０．４ｍＭの濃度になるように添加し、氷上に１０分間保持することにより行った。上記反応後、各反応液の蛍光強度を、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを用い、励起波長４８８ｎｍ、測定波長６０５ｎｍの条件下で測定した。
測定結果を図３に示した。酸化反応も還元反応も行わなかった反応液（図３中、ＥｔＢｒ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が３０１２、ネガティブ反応液の蛍光強度が２６９５と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は３１７であった。これに対して、次亜塩素酸ナトリウムによる酸化反応を行った反応液（図３中、ＥｔＢｒ＋ＮａＣｌＯ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が１７８４、ネガティブ反応液の蛍光強度が６４８と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は１１３６に達した。また、水素化ホウ素ナトリウムによる還元反応を行った反応液（図３中、ＥｔＢｒ＋ＮａＢＨ４）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が１０５１、ネガティブ反応液の蛍光強度が２１８と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は８３３に達した。
以上より、エチジウムブロマイド染色した増幅産物を酸化又は還元することによって、エチジウムブロマイドによる二本鎖核酸増幅産物の検出感度を向上させることが可能なことが判明した。
〔実施例２〕  アクリジンオレンジによるＬＡＭＰ反応産物の検出に及ぼす酸化剤又は還元剤の効果
実施例１に記載の核酸増幅反応において、エチジウムブロマイドの代わりにアクリジンオレンジを添加し、且つ測定波長を５７５ｎｍとした以外、実施例１と同一の実験条件で、ＬＡＭＰ反応産物の検出効率に及ぼす酸化剤又は還元剤の効果を調べた。測定結果を図４に示した。酸化反応も還元反応も行わなかった反応液（図４中、ＡＯ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が７０５３、ネガティブ反応液の蛍光強度が６１５５と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は８９８であった。これに対して、次亜塩素酸ナトリウムによる酸化反応を行った反応液（図４中、ＡＯ＋ＮａＣｌＯ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が５５２１、ネガティブ反応液の蛍光強度が２０１と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は５３２０に達した。また、水素化ホウ素ナトリウムによる還元反応を行った反応液（図４中、ＡＯ＋ＮａＢＨ４）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が６２１４、ネガティブ反応液の蛍光強度が５９６と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は５６１８に達した。
以上より、アクリジンオレンジ染色した増幅産物を酸化又は還元することによって、アクリジンオレンジによる二本鎖核酸増幅産物の検出感度を向上させることが可能なことが判明した。
〔実施例３〕  エチジウムブロマイドによるＬＡＭＰ反応産物の検出に及ぼすその他のインターカレーターの効果
実施例１に記載の核酸増幅反応において、エチジウムブロマイド以外に、第２のインターカレーターとして、メチレンブルーを２０μＭ、アクチノマイシンＤを１μｇ／ｍｌ、又はＳＹＢＲグリーン２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を１００，０００倍の希釈濃度になるように加え、それ以外は実施例１と同一の反応条件でＬＡＭＰ反応を行い、ＬＡＭＰ反応産物の検出効率に及ぼす前記各第２のインターカレーターの効果を調べた。測定結果を図５に示した。エチジウムブロマイド以外に第２のインターカレーターを添加しなかった反応液（図５中、ＥｔＢｒ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が３０８５、ネガティブ反応液の蛍光強度が２７０１と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は３８４であった。これに対して、メチレンブルーを添加した反応液（図５中、ＥｔＢｒ＋ＭＢ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が８６０、ネガティブ反応液の蛍光強度が１１６と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は７４４に達した。また、アクチノノマイシンＤを添加した反応液（図５中、ＥｔＢｒ＋ＡＤ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が３１５８、ネガティブ反応液の蛍光強度が２３２２と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は８３６に達した。さらに、ＳＹＢＲグリーン２を添加した反応液（図５中、ＥｔＢｒ＋ＳＹＢＲ−Ｇ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が２８２２、ネガティブ反応液の蛍光強度が２２６８と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は５５４に達した。
以上より、エチジウムブロマイド以外に第２のインターカレーターを共存させて、ＬＡＭＰ反応を行うことによって、エチジウムブロマイドによる二本鎖核酸増幅産物の検出感度を向上させることが可能なことが判明した。
〔実施例４〕  アクリジンオレンンジによるＬＡＭＰ反応産物の検出に及ぼすその他のインターカレーターの効果
実施例１に記載の核酸増幅反応において、実施例１に記載のエチジウムブロマイドの代わりにアクリジンオレンジを添加し、アクリジンオレンジ以外に、第２のインターカレーターとして、メチレンブルーを２０μＭ、アクチノマイシンＤを１μｇ／ｍｌ、又はＳＹＢＲグリーン２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を１００，０００倍の希釈濃度になるように加え、且つ測定波長を５７５ｎｍとし、それ以外は実施例１と同一の反応条件でＬＡＭＰ反応を行い、ＬＡＭＰ反応産物の検出効率に及ぼす前記各インターカレーターの効果を調べた。測定結果を図６に示した。アクリジンオレンジ以外に第２のインターカレーターを添加しなかった反応液（図６中、ＡＯ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が７１２１、ネガティブ反応液の蛍光強度が６１９５と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は９２６であった。これに対して、メチレンブルーを添加した反応液（図６中、ＡＯ＋ＭＢ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が３５００、ネガティブ反応液の蛍光強度が３５０と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は３１５０に達した。また、アクチノノマイシンＤを添加した反応液（図６中、ＡＯ＋ＡＤ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が７３６８、ネガティブ反応液の蛍光強度が４７６２と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は２６０６に達した。さらに、ＳＹＢＲグリーン２を添加した反応液（図６中、ＡＯ＋ＳＹＢＲ−Ｇ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が９４３５、ネガティブ反応液の蛍光強度が４７２１と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は４７１４に達した。
以上より、アクリジンオレンジ以外に第２のインターカレーターを共存させて、ＬＡＭＰ反応を行うことによって、アクリジンオレンジによる二本鎖核酸増幅産物の検出感度を向上させることが可能なことが判明した。
〔実施例５〕  ＹＯ−ＰＲＯ−１によるＬＡＭＰ反応産物の検出に及ぼすメチレンブルーの効果
実施例３に記載の核酸増幅反応において、エチジウムブロマイドの代わりにＹＯ−ＰＲＯ−１を１μｇ／ｍｌ、第２のインターカレーターとしてメチレンブルーを１０μＭの濃度になるように添加し、それ以外は実施例３と同一の反応条件でＬＡＭＰ反応を行い、ＹＯ−ＰＲＯ−１によるＬＡＭＰ反応産物の検出効率に及ぼすメチレンブルーの効果を調べた。蛍光強度は、増幅反応後の反応液２０μｌを用いて、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製ＰＯＬＡＲＩＯＮ）により、励起波長４８５ｎｍ、蛍光強度５３５ｎｍ、温度２５℃の条件下で測定した。測定結果を図７に示した。
メチレンブルーを添加しなかった反応液（図７中、ＹＯ−ＰＲＯ−１）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が３９１９４、ネガティブ反応液の蛍光強度が３４０４７と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は５１４７であった。これに対して、メチレンブルーを添加した反応液（図７中、ＹＯ−ＰＲＯ−１＋ＭＢ）では、ポジティブ反応液の蛍光強度が３３５９６、ネガティブ反応液の蛍光強度が１３５９２と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する蛍光強度の差は２０００４に達した。
以上より、ＹＯ−ＰＲＯ−１に第２のインターカレーターとしてメチレンブルーを共存させてＬＡＭＰ反応を行うことにより、ＹＯ−ＰＲＯ−１による二本鎖核酸増幅産物の検出感度を向上できることが判明した。
〔実施例６〕  メチレンブルーによるＬＡＭＰ反応産物の検出に及ぼす錯体形成化合物の効果
メチレンブルーとアシッドオレンジ７を水溶液中で混合すると錯体を形成する。錯体を形成するとメチレンブルー及びアシッドオレンジ７（ＡｄＯ）の吸収スペクトルはどちらも変化するため、錯体形成の有無は吸収スペクトルの測定から知ることができる。
そこで、メチレンブルー５００μＭ、又はメチレンブルーとＡｄＯ各５００μＭの混合液（メチレンブルーとＡｄＯは錯体を形成）をそれぞれＬＡＭＰ反応液に添加し、実施例１と同様に核酸増幅反応を行った。増幅反応後の反応液は、島津  ＵＶ−２２００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｔｏｍｅｔｅｒ（１０ｍｍセル使用）を用いて、測定波長６８０ｎｍにて吸光度を測定した。測定結果を図８に示した。ＡｄＯを添加しなかった反応液（図８中、ＭＢ）では、ポジティブ反応液の吸光度が０．７５、ネガティブ反応液の吸光度が０．７１と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する吸光度の差は０．０４であった。これに対して、ＡｄＯを添加した反応液（図８中、ＭＢ＋ＡｄＯ）では、ポジティブ反応液の吸光度が０．４６、ネガティブ反応液の吸光度が０．３８と、二本鎖核酸増幅産物の有無に起因する吸光度の差は０．０８であった。
これは、メチレンブルーのＤＮＡへの挿入反応をＡｄＯが制御した結果であるといえる。つまり、一本鎖ＤＮＡへのメチレンブルーの挿入は弱いのでＡｄＯによって阻害されるが、二本鎖ＤＮＡへのメチレンブルーの挿入は強いので、ＡｄＯでは阻害できず、メチレンブルーが錯体から遊離したものと思われる。
このことから、酸化反応や還元反応だけではなく、錯体形成反応によっても一本鎖核酸へのインターカレーターの結合を優先的に阻害し、二本鎖核酸増幅産物の検出感度を向上しうることが示唆された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明により、二本鎖核酸増幅産物の効率的な検出方法が提供される。特に本発明をＬＡＭＰ法による核酸増幅産物の検出に適用した場合には、ＰＣＲに比べて多量のプライマーを使用することに起因する一本鎖核酸由来のバックグラウンドノイズを効果的に低減することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
【配列表】
0004081435.tif 000008
0004081435.tif 000009
0004081435.tif 000010
【図面の簡単な説明】
図１は、ＬＡＭＰ法による増幅方法の概要を示す図である。
図２は、ＬＡＭＰ法による増幅方法の概要を示す図である。
図３は、エチジウムブロマイド存在下でＬＡＭＰ反応を行い、その後還元剤又は酸化剤を添加した場合の各反応液の蛍光強度を示した図である。
図４は、アクリジンオレンジ存在下でＬＡＭＰ反応を行い、その後還元剤又は酸化剤を添加した場合の各反応液の蛍光強度を示した図である。
図５は、エチジウムブロマイド以外に、もう１種類の第２のインターカレーターを添加してＬＡＭＰ反応を行った場合の各反応液の蛍光強度を示した図である。
図６は、アクリジンオレンジ以外に、もう１種類の第２のインターカレーターを添加してＬＡＭＰ反応を行った場合の各反応液の蛍光強度を示した図である。
図７は、ＹＯ−ＰＲＯ−１に、第２のインターカレーターとしてメチレンブルーを添加してＬＡＭＰ反応を行った場合の各反応液の蛍光強度を示した図である。
図８は、メチレンブルーとアシッドオレンジ７を添加してＬＡＭＰ反応を行った場合の各反応液の吸光度を示した図である。
【図１】
0004081435.tif 000011
【図２】
0004081435.tif 000012
【図３】
0004081435.tif 000013
【図４】
0004081435.tif 000014
【図５】
0004081435.tif 000015
【図６】
0004081435.tif 000016
【図７】
0004081435.tif 000017
【図８】
0004081435.tif 000018