(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を促進または抑制する能力の検定方法であって、
（１）前記転写調節因子を発現するヒト、サル、ウシ、ウサギ、マウス、ラットまたはハムスター由来の哺乳動物細胞に被験物質を接触させる第一工程、及び
（２）前記第一工程後に、前記哺乳動物細胞において前記転写調節因子依存的−神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記被験物質が有する前記能力を評価する工程、
を有することを特徴とする検定方法。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列
【請求項２】
下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を促進または抑制する能力の検定方法であって、
（１）前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が導入されてなるヒト、サル、ウシ、ウサギ、マウス、ラットまたはハムスター由来の形質転換哺乳動物細胞に被験物質を接触させる第一工程、及び
（２）前記第一工程後に、前記形質転換哺乳動物細胞において前記転写調節因子依存的−神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記被験物質が有する前記能力を評価する工程、
を有することを特徴とする検定方法。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列。
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列
【請求項３】
前記マーカー蛋白質遺伝子が、Eph Aレセプター遺伝子又はRho GDP dissociation inhibitor遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載の検定方法。
【請求項４】
前記マーカー蛋白質遺伝子が、Eph Aレセプター遺伝子及びRho GDP dissociation inhibitor遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載の検定方法。
【請求項５】
被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における、マーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を比較することにより得られる差異に基づき前記被験物質が有する前記能力を評価することを特徴とする請求項１又は２記載の検定方法。
【請求項６】
異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が前記能力を有さない物質であることを特徴とする請求項５記載の検定方法。
【請求項７】
下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を促進または抑制する能力を有する物質の探索方法であって、請求項１又は２記載の検定方法により評価された前記能力に基づき前記能力を有する物質を選抜することを特徴とする探索方法。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列。
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経細胞可塑性を制御する能力の検定方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脳神経機能は多種多様な神経細胞が作る神経回路の上に成り立っている。この複雑かつ正確なネットワークは、神経軸索が標的細胞へ正確に誘導され、正しい標的細胞とシナプス結合することにより形成されている。この誘導・結合過程では、神経軸索の伸長の制御（促進、抑制、誘引、反発等）が行なわれている。
最近の研究結果から、通常の老化に伴なう認識能力低下は、神経細胞やシナプスが無くなるというよりもむしろ、神経の機能不全によるものであることがわかってきた。このような神経の機能不全は、神経細胞が有する２種の突起（神経樹状突起と神経軸索）の構造的な可塑性（リモデリング：以下、神経細胞可塑性と記すこともある。）が何らかの原因により正常な状態に維持できなくなるために生じていると考えられている。同様に、精神遅延、アルツハイマー病による認識能力不全等においても神経細胞可塑性の異常が病因の一つであると考えられている。
従って、神経細胞の可塑性を適正に制御することにより、老化による認識能力不全、精神遅延、アルツハイマー病による認識能力不全等を効果的に改善することが可能となる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、哺乳動物における神経細胞可塑性を制御するための薬剤の開発が求められており、かかる薬剤の有効成分として使用し得る物質を探索するために、神経細胞可塑性を制御する能力を検定する方法の開発が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、Ｅｐｈ  ＡレセプターやRho GDP dissociation inhibitor（又はRho GTPase inhibitor）等の神経細胞可塑性の制御への関与が報告されている蛋白質の発現を、ある種の転写調節因子が制御していることを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．下記のいずれかのアミノ酸配列（以下、本アミノ酸配列と記すこともある。）を有する転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を制御する能力の検定方法であって、
（１）前記転写調節因子を発現する哺乳動物細胞に被験物質を接触させる第一工程、及び
（２）前記第一工程後に、前記哺乳動物細胞において前記転写調節因子依存的−神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記被験物質が有する前記能力を評価する工程、
を有することを特徴とする検定方法（以下、本発明検定方法と記すこともある。）、
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列；
２．本アミノ酸配列を有する転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を制御する能力の検定方法であって、
（１）本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が導入されてなる形質転換哺乳動物細胞に被験物質を接触させる第一工程、及び
（２）前記第一工程後に、前記形質転換哺乳動物細胞において前記転写調節因子依存的−神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記被験物質が有する前記能力を評価する工程、
を有することを特徴とする検定方法；
３．前記マーカー蛋白質遺伝子が、Eph Aレセプター遺伝子又はRho GDP dissociation inhibitor遺伝子であることを特徴とする前項１又は２記載の検定方法；
４．前記マーカー蛋白質遺伝子が、Eph Aレセプター遺伝子及びRho GDP dissociation inhibitor遺伝子であることを特徴とする前項１又は２記載の検定方法；
５．被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における、マーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を比較することにより得られる差異に基づき前記被験物質が有する前記能力を評価することを特徴とする前項１又は２記載の検定方法。
６．異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が前記能力を有さない物質であることを特徴とする前項５記載の検定方法；
７．本アミノ酸配列を有する転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を制御する能力を有する物質の探索方法であって、前項１又は２記載の検定方法により評価された前記能力に基づき前記能力を有する物質を選抜することを特徴とする探索方法（以下、本発明探索方法と記すこともある。）；
８．前項７記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体に製剤化されてなることを特徴とする神経細胞可塑調節剤（以下、本発明神経細胞可塑調節剤と記すこともある。）；
９．哺乳動物細胞における神経細胞可塑性を制御するための、本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの使用；
１０．外来ＤＮＡを、哺乳動物細胞に、当該細胞で前記ＤＮＡが発現する位置に置かれるように提供することによって前記細胞における下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子依存的−神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現を制御するための、下記のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの外来ＤＮＡとしての使用；
等を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明でいう「下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子」（以下、本転写調節因子と記すこともある。）とは、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス（basic helix-loop-helix：以下、ｂＨＬＨと記す。）モチーフとＰＡＳドメイン（Per-Arnt-Simホモロジードメイン）とを有する蛋白質であって、ヘテロ二量体を形成して特定の塩基配列を有するＤＮＡに結合することにより転写調節因子として機能し、神経細胞可塑性の制御に関与する蛋白質である。
本発明でいう「下記のいずれかのアミノ酸配列（即ち、本アミノ酸配列）を有する転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性」とは、本アミノ酸配列を有する転写調節因子（即ち、本転写調節因子）が関与する神経細胞可塑性（plasticity）であって、本転写調節因子が係わる代謝過程や信号伝達等のカスケード反応が起こると制御を受ける。かかるカスケード反応のことを本発明では「前記（即ち、本アミノ酸配列を有する）転写調節因子依存的−神経細胞可塑化経路」と記載する。また、当該経路に含まれ発現調節を受けている蛋白質であって、本発明において神経細胞可塑性の目安として利用し得る蛋白質のことを「前記（即ち、本アミノ酸配列を有する）転写調節因子依存的−神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質」という。具体的には、例えば、Ｅｐｈ  Ａレセプター、Rho GDP dissociation inhibitor（又はRho GTPase inhibitor）等をあげることができる。
Ｅｐｈ  Ａレセプターは、チロシンキナーゼ型の細胞膜レセプターであり、脳の発生に関わっていることが広く知られている。最近、Ｅｐｈ  Ａレセプターが大人の脳、特に海馬で発現していることが示され、当該レセプターのアゴニストやアンタゴニストを海馬に投与したときのＬＴＰ（シナプス伝達効率の長期増強）や行動の変化の観察などのいくつかの研究から、当該レセプターがシナプス可塑性、学習と記憶に関わっている証拠が揃ってきた。また当該レセプターは、記憶の強化にも関与していることが観察されている。
Ｒｈｏは、細胞内シグナル伝達物質の一つであり、細胞増殖の制御、細胞接着の形成調節、アクチン細胞骨格の構造形成等に関わっていることが広く知られている蛋白質である。Ｒｈｏの活性化を制御する因子として、Rho GDP dissociation inhibitor（又はRho GTPase inhibitor）と呼ばれる制御因子（抑制的蛋白質）が存在している。Rho GDP dissociation inhibitorは、ＲｈｏのＧＤＰ結合型と複合体を形成し、ＲｈｏがＧＴＰ結合型（Ｒｈｏの活性型）になることを妨げ、よってＲｈｏの活性化（Rho GTPase活性）を阻害する。Rho GDP dissociation inhibitor は、上記のようにしてＲｈｏのＧＴＰase活性をコントロールすることにより神経細胞の可塑性を調節していると考えられている。
【０００６】
本発明検定方法において用いられる「下記のいずれかのアミノ酸配列（即ち、本アミノ酸配列）を有する転写調節因子（即ち、本転写調節因子）」には、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列（即ち、本アミノ酸配列）を有する蛋白質（ここで、配列番号１で示される本アミノ酸配列を有する蛋白質は、ヒト由来の本転写調節因子であり、配列番号２で示される本アミノ酸配列を有する蛋白質は、マウス由来の本転写調節因子であり、また、配列番号３で示される本アミノ酸配列を有する蛋白質は、ラット由来の本転写調節因子である。）、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質、配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質、配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質が含まれる。このような蛋白質は、SDS-PAGEでの分子量として、約８〜１０万程度の分子量であることが好ましい。
本転写調節因子のアミノ酸配列において認められる、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列との相違としては、アミノ酸の欠失、置換、修飾、付加等の変異をあげることができる。これらには、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって人為的に導入され得る変異に加えて、動物の系統、個体、器官、組織等の違いによるアミノ酸配列の相違などの天然に生ずる多型変異も含まれる。
【０００７】
本発明において「配列同一性」とは、２つの塩基配列又は２つのアミノ酸配列の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列又はアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、FASTA［Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，4, 2444-2448(1988)］、BLAST［Altschulら、Journal of Molecular Biology, 215, 403-410(1990)］、CLUSTAL W［Thompson,Higgins＆Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680(1994a)］等のプログラムを用いて相同性解析を行いアラインメントを作成することによって算出することができる。上記のプログラムは、例えば、DNA Data Bank of Japan［国立遺伝学研究所 生命情報・ＤＤＢＪ研究センター (Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan ;CIB/DDBJ)内で運営される国際ＤＮＡデータバンク］のホームページ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）等において、一般的に利用可能である。また、配列同一性は、Vector NTI、GENETYX-WIN Ver.5（ソフトウェア開発株式会社製）等の市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。
本発明におけるアミノ酸同一性は、例えば、９０％以上であることが好ましい。
【０００８】
また、上記の「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ」としては、例えば、高イオン濃度下[例えば、6XSSC（900mM塩化ナトリウム、90mMクエン酸ナトリウム）などが用いられる。]に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることによりDNA-DNAハイブリッドを形成し、低イオン濃度下[例えば、0.1 X SSC（15mM塩化ナトリウム、1.5mMクエン酸ナトリウム）などが用いられる。]に、65℃の温度条件で30分間洗浄した後でも該ハイブリッドが維持されうるＤＮＡをあげることができる。本転写調節因子の転写調節能は、例えば、後述のレポーター遺伝子を用いたアッセイ等に基づき評価することができる。
【０００９】
本転写調節因子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、本転写調節因子遺伝子と記す。）は、例えば、ヒト、マウス、ラットなどの動物の組織から、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory発行、1989年）等に記載の遺伝子工学的方法に準じて取得することができる。
具体的には、まず、ヒト、マウス、ラットなどの動物の組織由来の全RNAを調製する。例えば、脳の組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等の蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチオシアネート／CsCl法等の方法により全RNAを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばISOGEN（ニッポンジーン製）がある。得られた全RNAを鋳型としてオリゴdTプライマーをRNAのポリA配列にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖cDNAを合成する。次いで、合成された一本鎖cDNAを鋳型とし、かつ大腸菌RNaseHを用いてRNA鎖にニックとギャップを入れることにより得られるRNAをプライマーとして大腸菌のDNAポリメラーゼＩを用いて二本鎖のcDNAを合成する。更に、合成された二本鎖cDNAの両末端をT4 DNAポリメラーゼにより平滑化する。末端が平滑化された二本鎖cDNAは、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばcDNA合成システムプラス（アマシャムファルマシアバイオテク社製）やTimeSaver cDNA合成キット（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等があげられる。次に、得られた二本鎖cDNAを例えば、プラスミドpUC118やファージλgt10などのベクターとリガーゼを用いて連結することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。尚、ｃＤＮＡライブラリーとしては、市販のｃＤＮＡライブラリー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製やＣｌｏｎｔｅｃｈ社製等）を用いることも可能である。
また、ヒト、マウス、ラットなどの動物の組織片から、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory発行、1989年）や、村松正寶、”ラボマニュアル遺伝子工学”（丸善１９８８）等に記載される通常の方法に準じてゲノムＤＮＡを調製する。例えば試料が毛髪の場合には、毛髪２〜３本を滅菌水、次いでエタノールで洗浄した後、2〜3 mmの長さに切断し、これにBCL-Buffer［10mM Tris-HCl(pH7.5), 5 mM MgCl2, 0.32M Sucrose, 1 Triton X-100］200μｌを加え、さらにProteinaseKを最終濃度100μｌ/ml 、ＳＤＳを最終濃度0.5 （w/v）になるようにそれぞれ加え混合する。この混合物を70℃で1時間保温した後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡを得ることができる。また、試料が末梢血の場合は、DNA-Extraction kit(Stratagene社製)等を用いて該試料を処理することによりゲノムＤＮＡを得ることができる。得られたゲノムＤＮＡをλgt10などのベクターとリガーゼを用いて連結することによりゲノムＤＮＡライブラリーが得られる。尚、ゲノムＤＮＡライブラリーとしては、市販のゲノムＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製等）を用いることも可能である。
【００１０】
上記のようなcDNAライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーから、例えば、配列番号４、５、６又は３３（もしくは３４）のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）や、配列番号４、５、６又は３３（もしくは３４）のいずれかで示される塩基配列又は該塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、本転写調節因子遺伝子を取得することができる。
ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、例えば、約10塩基から約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号４、５、６又は３３（もしくは３４）のいずれかで示される塩基配列の５’非翻訳領域から選択した塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び、配列番号４、５、６又は３３（もしくは３４）のいずれかで示される塩基配列の３’非翻訳領域から選択した塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。具体的には、フォワードプライマーとしては、例えば、配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドや配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをあげることができる。また、リバースプライマーとしては、例えば、配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドや配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをあげることができる。PCRの条件としては、例えば、反応液50μl中に、LA-Taqポリメラーゼ用10倍濃緩衝液（宝酒造社製）5μl、2.5mM dNTP混合液（各2.5mMのdATP,dGTP,dCTP及びdTTPを含む。）５μl（dATP,dGTP,dCTP及びdTTP各々の終濃度が0.25mM）、20μMプライマー 各0.25〜1.25μl（終濃度が0.1〜0.5μM）、鋳型cDNA 0.1〜0.5μg、LA-Taqポリメラーゼ（宝酒造社製）1.25ユニットを含む組成の反応液にて、95℃で1分間次いで68℃で3分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行う等の条件が挙げられる。
【００１１】
ハイブリダイゼーション法に用いられるプローブとしては、例えば、配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３３で示される塩基配列の塩基番号１４１９〜６１６４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ等があげられる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、6×SSC（0.9M塩化ナトリウム、0.09Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1(w/v)フィコール400、0.1(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1(w/v)BSA）、0.5(w/v)SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNA存在下に、65℃で保温し、次いで１×SSC（0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDS存在下に、室温で15分間の保温を2回行い、さらに0.1×SSC（0.015M 塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDS存在下に、68℃で30分間保温する条件等をあげることができる。また、例えば、5xSSC、50mM HEPES pH7.0、10xデンハルト溶液及び20μg/ml変性サケ精子DNA存在下に65℃にて保温し、次いで2xSSC中で室温にて３０分間の保温を行い、さらに0.1xSSC中で６５℃にて４０分間の保温を２回行う条件をあげることもできる。
尚、本転写調節因子遺伝子は、例えば配列番号４、５、６又は３３（もしくは３４）のいずれかで示される塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al.,Nature,310,105,1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
【００１２】
このようにして得られた本転写調節因子遺伝子は、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年等に記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。具体的には例えば、TAクローニングキット（Invitrogen社）やpBluescriptII（Stratagene社）などの市販のプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。
得られた本転写調節因子遺伝子の塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,560,1977等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson,J.Mol.Biol.,94,441,1975、Sanger,F,& Nicklen and A.R.Coulson.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463,1977等に記載される）等により確認することができる。
本転写調節因子遺伝子の具体例としては、配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列、配列番号３３で示される塩基配列の塩基番号１４１９〜６１６４で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
本転写調節因子遺伝子は、当該ＤＮＡを外来ＤＮＡとして、哺乳動物細胞で発現する位置に置かれるように当該細胞に提供することによって、哺乳動物細胞における本転写調節因子依存的−神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現を調節するために利用することもできる。
【００１３】
本転写調節因子遺伝子を、該遺伝子が導入される宿主細胞において利用可能なベクター（以下、基本ベクターと記す。）、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーをもつベクターに、通常の遺伝子工学的手法に準じて組み込むことにより本転写調節因子遺伝子ベクターを構築することができる。
本転写調節因子遺伝子ベクターの構築に用いることができる基本ベクターとしては、具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合、例えばプラスミドpUC119(宝酒造社製)や、ファージミドpBluescriptII(Stratagene社製)等を上げることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合は、プラスミドpGBT9、pGAD424、pACT2(Clontech社製)などをあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合はpRc/RSV、pRc/CMV(Invitrogen社製)等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドpBPV(アマシャムファルマシアバイオテク社製)もしくはEBウイルスプラスミドpCEP4(Invitrogen社製)等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルスなどをあげることができ、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。バキュロウイルスやワクシニアウイルス等のウイルスに本転写調節因子遺伝子を組み込むには、使用しようとするウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するトランスファーベクターを用いることができる。このようなトランスファーベクターの具体的例としては、Pharmingen社から市販されているpVL1392,pVL1393(Smith,G.E.,Summers M.D.et al.:Mol.Cell.Biol.,3,2156-2165(1983))、pSFB5(Funahashi,S.et al.:J.Virol.,65,5584-5588(1991))などのプラスミドをあげることができる。本転写調節因子遺伝子を前記のようなトランスファーベクターに挿入し、該トランスファーベクターとウイルスのゲノムとを同時に宿主細胞に導入すると、トランスファーベクターとウイルスのゲノムとの間で相同組換えが起こり、本転写調節因子遺伝子がゲノム上にくみこまれたウイルスを得ることができる。ウイルスのゲノムとしては、Baculovirus,Adenovirus,Vacciniavirusなどのゲノムを用いることができる。
より具体的には、例えばバキュロウイルスに本転写調節因子遺伝子を組み込む場合、トランスファーベクターpVL1393,pVL1392等のマルチクローニング部位に本転写調節因子遺伝子を挿入した後、該トランスファーベクターのDNAとBaculovirus genome DNA(Baculogold;Pharmingen社製)とを昆虫細胞Sf21株（ATCCから入手可能）にリン酸カルシウム法等により導入し、得られた細胞を培養する。培養液から遠心分離等により、本転写調節因子遺伝子が挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を回収し、これをフェノール等で除蛋白処理することにより、本転写調節因子遺伝子を含有するウイルスのゲノムを得ることができる。さらに、該ウイルスのゲノムを、昆虫細胞Sf21株などのウイルス粒子形成能を有する宿主細胞にリン酸カルシウム法等により導入し、得られる細胞を培養することにより、本転写調節因子遺伝子を含有するウイルス粒子を増やすことができる。
一方、マウス白血病レトロウイルスなどの比較的小さなゲノムへは、トランスファーベクターを利用せずに、本転写調節因子遺伝子を直接組み込むこともできる。例えばウイルスベクタ-DC(X)（Eli Gilboa et al.,BioTechniques,4,504-512(1986)）などは、該ベクター上のクローニング部位に本転写調節因子遺伝子を組み込む。得られた本転写調節因子遺伝子の組込まれたウイルスベクターを、例えばAmpli-GPE（J.Virol.,66,3755(1992)）などのパッケージング細胞に導入することにより、本転写調節因子遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を得ることができる。
【００１４】
本転写調節因子遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のような基本ベクターに組み込むことにより、本転写調節因子遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な本転写調節因子遺伝子ベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、本転写調節因子遺伝子が導入される宿主細胞において、プロモーターの制御下に本転写調節因子遺伝子が発現されるように、該プロモーターと本転写調節因子遺伝子とを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター活性を示すＤＮＡをあげることができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（lacP）、トリプトファンオペロンのプロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモーター(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(galP)、tacプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげることができ、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミアンウイルス(SV40)の初期又は後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス(MMTV)プロモーター等をあげることができる。宿主細胞が出芽酵母である場合にはADH1プロモーター）などをあげることができる。
また、宿主細胞において機能するプロモーターをあらかじめ保有する基本ベクターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーターと本転写調節因子遺伝子とが機能可能な形で結合するように、該プロモーターの下流に本転写調節因子遺伝子を挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドpRc/RSV、pRc/CMV等は、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、該クローニング部位に本転写調節因子遺伝子を挿入し動物細胞へ導入することにより、本転写調節因子遺伝子を発現させることができる。これらのプラスミドにはあらかじめSV40の自律複製起点（ori）が組み込まれているため、oriを欠失したSV40ゲノムで形質転換された培養細胞、例えばCOS細胞等に該プラスミドを導入すると、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、結果として該プラスミドに組み込まれた本転写調節因子遺伝子を大量発現させることもできる。また前述の酵母用プラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、該プラスミド又はその誘導体のADH1プロモーターの下流に本転写調節因子遺伝子を挿入すれば、本転写調節因子遺伝子を例えばCG1945(Clontech社製)等の出芽酵母内で大量発現させることが可能な本転写調節因子遺伝子ベクターが構築できる。
【００１５】
構築された本転写調節因子遺伝子ベクターを宿主細胞に導入することにより、形質転換体を取得することができる。本転写調節因子遺伝子ベクターを宿主細胞へ導入する方法としては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合は、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラークローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、又はリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法に準じて前記細胞に導入することができる。酵母を宿主細胞とする場合は、例えばリチウム法を基にしたYeast transformation kit(Clontech社製)などを用いて導入することができる。
尚、ウイルスをベクターに用いる場合には、上述のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できるほか、本転写調節因子遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによっても、該ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入することができる。
【００１６】
当該形質転換体を選抜するには、例えば、本転写調節因子遺伝子ベクターと同時にマーカー遺伝子を宿主細胞へ導入し、マーカー遺伝子の性質に応じた方法で細胞を培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、本転写調節因子遺伝子ベクターが導入された宿主細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせなどをあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、該栄養素を含まない最少培地を用いて、本転写調節因子遺伝子ベクターが導入された細胞を培養すればよい。
本転写調節因子遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる形質転換体を取得するには、例えば、本転写調節因子遺伝子ベクターとマーカー遺伝子を有するベクターとを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これらを前述の方法で宿主細胞へ導入して該細胞を通常数週間培養し、導入されたマーカー遺伝子の発現を指標にして目的とする形質転換体を選抜し取得すればよい。また、例えば、上記のような選抜薬剤に対する耐性付与遺伝子をマーカー遺伝子として有する本転写調節因子遺伝子ベクターを前述の方法で宿主細胞に導入し、該細胞を選抜薬剤が添加された培地で数週間以上継代培養して、コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培養することにより、本転写調節因子遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる形質転換体を選抜し取得することもできる。導入された本転写調節因子遺伝子が宿主細胞の染色体に組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムＤＮＡから、導入された本転写調節因子遺伝子の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるＰＣＲや、導入された本転写調節因子遺伝子をプローブに用いるサザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、本転写調節因子遺伝子の存在を検出すればよい。かかる形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、実験毎の形質転換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を実施することが可能となる。
【００１７】
上述のようにして得られた形質転換体を培養することにより本転写調節因子を産生させることができる。
例えば、上記形質転換体が微生物である場合、該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができる。培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（旋回式振とう培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（JarFermenter）培養、タンク培養等）などが可能である。培養温度及び培地のｐＨは、微生物が生育する範囲から適宜選ぶことができ、例えば、約15℃〜約40℃の培養温度にて、約6〜約8の培地pHで培養するのが一般的である。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１日間〜約5日間である。温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型のプロモーターを有す
る発現ベクターを用いた場合には誘導時間は1日間以内が望ましく、通常数時間である。
また、上記形質転換体が哺乳類、昆虫類等の動物細胞である場合、該形質転換体は一般の培養細胞における通常の培養に使用される培地を用いて培養することができる。選抜薬剤を利用して当該形質転換体を作製した場合は、該選抜薬剤の存在下に培養するのが望ましい。哺乳類動物細胞の場合、例えば終濃度が10％(w/v)となるようFBSを添加したDMEM培地（ニッスイ社製等）を用いて37℃、5％CO2存在下等の条件で数日ごとに新しい培養液に交換しながら培養する。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えば0.25％(w/v)程度となるようトリプシンが添加されたPBS溶液を加えて個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養を続ける。昆虫類動物細胞の場合も同様に、例えば10％(v/v)FBS及び2％(w/v)Yeastlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培養液を用いて培養温度25℃から35℃で培養すればよい。この際、Sf21細胞などのシャーレからはがれやすい細胞の場合は、トリプシン液を用いずピペッテイングにより分散させ継代培養を行なうことができる。また、バキュロウイルス等のウイルスベクターを含む形質転換体の場合は、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅する前、例えばウイルス感染後72時間までとするのが好ましい。
上記形質転換体により産生された本転写調節因子の回収は、適宜、通常の単離、精製の方法を組み合わせて行うことができ、例えば、培養終了後、形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、集められた該細胞を通常のバッファーに懸濁した後、ポリトロン、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕し、破砕液を遠心分離して上清画分を回収することにより、本転写調節因子を含む画分を得ることができる。さらに、前記上清画分をイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマトグラフィーに供することにより、より精製された本転写調節因子を回収することもできる。また、本転写調節因子又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを、ＧＳＴとの融合蛋白質として産生させた場合には、グルタチオンセファロース（アマシャムファルマシア社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーで精製することができる。
このようにして製造された本転写調節因子は、例えば、本転写調節因子又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体を作製するための免疫抗原として用いることができ、また、本転写調節因子に結合する物質をスクリーニングするためのアッセイ等に用いることもできる。
【００１８】
上述のように製造された本転写調節因子を免疫抗原として、例えばマウス、ウサギ、ニワトリ等の動物を、Frederick M.Ausubel et al.著；Short Protocols in Molecular Biology 3nd Edition, John Wiley＆Sons,Inc 記載の免疫学的方法に準じて免疫感作することにより、本転写調節因子又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体を作製することができる。具体的には例えば、まず、抗原として用いる本転写調節因子と完全Freunds adjuvantとを混合してエマルジョン化する。得られたエマルジョンをウサギに皮下投与する。約４週間後に、不完全Freunds adjuvantと混合してエマルジョン化した抗原を投与する。必要に応じて、さらに２週間毎に同様に投与を行なう。採血して血清画分を調製し、本転写調節因子に対する抗体価を確認する。このようにして得られた本転写調節因子又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体価を有する血清画分を通常の硫安沈殿法等に準じて分画することにより、本転写調節因子又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを認識するIgGを得ることができる。
また、本転写調節因子の部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを化学合成し、これを免疫抗原として動物に投与することにより、本転写調節因子又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体を作製することもできる。免疫抗原として用いるポリペプチドのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列の中から、他の蛋白質のアミノ酸配列とのホモロジーがなるべく低くかつ免疫感作する動物種の有する本転写調節因子のアミノ酸配列とも相違の多いアミノ酸配列を選択する。選択されたアミノ酸配列からなる１０アミノ酸から１５アミノ酸程度の長さのポリペプチドを、通常の方法に準じて化学合成し、Limulus plyhemusのhemocyanin等のキャリアー蛋白質とMBS等により架橋した後、上記と同様にウサギ等の動物に免疫する。
このようにして本転写調節因子又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体を作製することができる。
【００１９】
本転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を制御する能力（以下、本神経細胞可塑性制御能力と記すこともある。）を検定するには、（１）本転写調節因子を発現する哺乳動物細胞に被験物質を接触させる第一工程、（２）前記第一工程後に、前記哺乳動物細胞において前記転写調節因子依存的−神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び、第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記被験物質が有する前記能力を評価する工程を有する検定方法（即ち、本発明検定方法）を用いることができる。この際に、例えば、被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における上記マーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値（第一の測定量、第二の測定量）を比較することにより差異を調べる。その結果、得られる差異（第一の測定量と第二の測定量との差）に基づき前記被験物質が有する本神経細胞可塑性制御能力を評価することにより当該能力の検定を行う。このようにして評価された本神経細胞可塑性制御能力に基づき本神経細胞可塑性制御能力を有する物質であることを確認することができる。
このように本転写調節因子は、前記転写調節因子依存的−神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を効果的に分析する方法に利用でき、物質が有する本神経細胞可塑性制御能力を検定するために利用される。
【００２０】
本発明検定方法において用いられる哺乳動物細胞は、組織から分離された細胞や、同一の機能・形態を持つ集団を形成している細胞や、哺乳動物の体内にある細胞であってもよい。場合によっては前記細胞の抽出系でもよい。当該細胞の由来としては、例えば哺乳動物等を挙げることができ、さらに具体的にはヒト、サル、ウシ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターなどを挙げることができる。
本発明検定方法の第一工程において、本転写調節因子を発現する哺乳動物細胞と接触させる被験物質の濃度としては、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、１μＭ〜５０μＭが好ましい。上記哺乳動物細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常１０分間以上２日間程度であり、好ましくは数時間〜1日間程度である。
上記哺乳動物細胞に被験物質を接触させる環境としては、当該哺乳動物細胞の生命活動を維持させるような環境が好ましく、例えば、当該哺乳動物細胞のエネルギー源が共存する環境をあげることができる。具体的には、培地中で第一工程が行なわれることが好都合である。
【００２１】
さらにまた本発明検定方法の第一工程は、例えば、哺乳動物細胞に本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が導入されてなる形質転換哺乳動物細胞（以下、本形質転換哺乳動物細胞と記すこともある。）に、被験物質を接触させる方法でもよい。
当該工程において、本形質転換哺乳動物細胞と接触させる被験物質の濃度は、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、１μＭ〜５０μＭが好ましい。本形質転換哺乳動物細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常１０分間以上２日間程度が好ましく、より好ましくは数時間から１日間程度が挙げられる。
【００２２】
前記本形質転換哺乳動物細胞は、以下のようにして調製することができる。
本転写調節因子遺伝子を、通常の遺伝子工学的手法を用いて、本転写調節因子遺伝子を導入する哺乳動物細胞において使用可能なベクターに発現可能な形でプロモーターと接続されるように挿入することにより、プラスミドを作製する。ここで用いられるプロモーターは、本転写調節因子遺伝子が導入される哺乳動物細胞で機能可能なものであればよく、例えば、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Raus Sarcoma Virusプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター等が挙げられる。尚、このようなプロモーターをマルチクローニング部位の上流に含む市販のベクターを利用してもよい。
次いで、上記プラスミドを選抜マーカー遺伝子とともに哺乳動物細胞へ導入する。哺乳動物細胞への導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気導入法、ＤＥＡＥデキストラン法、ミセル形成法等を挙げることができる。リン酸カルシウム法としてはGrimm, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10923-10927等に記載される方法、電気導入法及びＤＥＡＥデキストラン法としてはTing, A. T. et al., EMBO J., 15, 6189-6196等に記載される方法、ミセル形成法としてはHawkins, C. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13786-13790等に記載される方法を挙げることができる。ミセル形成法を用いる場合には、リポフェクトアミン（ギブコ製）やフュージーン（ベーリンガー製）等の市販の試薬を利用するとよい。
上記プラスミドの導入処理を施した哺乳動物細胞を、例えば、当該プラスミドとともに導入された選抜マーカー遺伝子を利用し、当該選抜マーカー遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、本形質転換哺乳動物細胞を選抜することができる。さらに選抜を続けて、本転写調節因子遺伝子が染色体に導入されてなる安定形質転換体となった本形質転換哺乳動物細胞を取得してもよい。導入された本転写調節因子遺伝子が哺乳動物細胞中に存在する染色体上に組込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、本転写調節因子遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いるＰＣＲや、本転写調節因子遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、ゲノムＤＮＡ中の本転写調節因子遺伝子の存在を検出・確認すればよい。
また、本形質転換哺乳動物細胞は、後述する形質転換非ヒト動物から通常の方法に準じて調製してもよい。
【００２３】
本発明検定方法において、本転写調節因子依存的−神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する方法としては、例えば、
（１）前記マーカー蛋白質の量を、当該マーカー蛋白質を特異的に認識する抗体を用いるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、酵素標識抗体測定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay; ELISA）、ウエスタンブロッティング等で測定する方法、
（２）前記マーカー蛋白質の量と相関関係を有する指標値として、当該マーカー蛋白質のｍＲＮＡの、前記哺乳動物細胞内での存在量を測定する方法、
（３）前記マーカー蛋白質とハイブリダイズして、当該マーカー蛋白質のｍＲＮＡの量を測定することのできるオリゴヌクレオチドが固定されているＤＮＡアレイ又はＤＮＡチップを用いて、当該マーカー蛋白質の発現量を測定する方法、
等をあげることができる。
上記（２）におけるｍＲＮＡの定量には、ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンハイブリダイゼーション等の通常の方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor  Laboratory press）等に記載されている方法）を用いればよい。
【００２４】
上記のようにして本発明検定方法により測定された、被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における、前記マーカー蛋白質遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の本神経細胞可塑性制御能力を評価する。このようにして被験物質が有する本神経細胞可塑性制御能力の検定を行うことができる。
本発明検定方法において、前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質を本神経細胞可塑性制御能力を有しない物質（例えば、溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等であってもよい。）としこれを基準として、他の被験物質が有する本神経細胞可塑性制御能力を評価してもよい。また、前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が有する本神経細胞可塑性制御能力を基準として、他の被験物質が有する本神経細胞可塑性制御能力を評価してもよい。
本転写調節因子と被験物質とを接触させた場合における上記マーカー蛋白質の発現量又はその量と相関関係を有する指標値（以下、測定値1と記す。）を、本転写調節因子と被験物質とを接触させなかった場合の上記マーカー蛋白質の発現量又はその量と相関関係を有する指標値（以下、測定値２と記す。）と比較することによって、該被験物質の本神経細胞可塑性制御能力を評価してもよい。例えば、本神経細胞可塑性制御能力を、前記測定値を用いて、下記の式に従って制御率として表すこともできる。
制御率（％）＝［（測定値１−測定値２）／測定値２］×100
【００２５】
本神経細胞可塑性制御能力を有する物質を探索するには、本発明検定方法により評価された本神経細胞可塑性制御能力に基づき本神経細胞可塑性制御能力を有する物質を選抜すればよい。
例えば、被験物質の本神経細胞可塑性制御能力を表わす制御率の絶対値が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、３０％以上を示す物質、より好ましくは５０％以上を示す物質を、本神経細胞可塑性制御能力を有する物質として選抜する。ここで当該制御率が正の場合には、促進的能力を有する物質として選抜され、一方、負の場合には、抑制的能力を有する物質として選抜される。
尚、当該物質は、本神経細胞可塑性制御能力を有する限り、低分子化合物、蛋白質（抗体を含む）又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
本発明探索方法によって選抜された物質は本神経細胞可塑性制御能力を有しており、神経細胞可塑調節剤（例えば、認識能力不全改善剤、精神遅延改善剤等の治療剤等）の有効成分として使用してもよい。
【００２６】
本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする神経細胞可塑調節剤（即ち、本発明神経細胞可塑調節剤）は、その有効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明神経細胞可塑調節剤は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、本発明神経細胞可塑調節剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の本発明神経細胞可塑調節剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、動脈硬化病態増悪因子分泌抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明神経細胞可塑調節剤の適用可能と考えられる疾患としては、老人による認識能力不全、精神遅延、アルツハイマー病による認識能力不全等の疾患をあげることができる。
【００２７】
本転写調節因子遺伝子は、当該遺伝子を外来遺伝子として、哺乳動物細胞に、当該細胞で発現する位置に置かれるように提供することによって、哺乳動物細胞における本転写調節因子依存的−神経細胞可塑化経路上に存在するマーカー蛋白質遺伝子の発現を促進するために利用することもできる。
哺乳動物細胞としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物由来の細胞を挙げることができる。当該細胞は、組織から分離された細胞や、同一の機能・形態を持つ集団を形成している細胞や、前記哺乳動物の体内にある細胞であってもよい。従って、哺乳動物がヒトである場合には、一般にいう遺伝子治療が施されたヒトの細胞から各種実験に使用されるような株化細胞までを意味し、また哺乳動物が非ヒト動物である場合には、一般にいう遺伝子治療が施された非ヒト動物の細胞から各種実験に使用されるようなモデル動物の細胞や株化細胞までを意味する。後者の場合には、ラット、マウス等を好ましい動物種として挙げることができる。さらに、哺乳動物細胞が精神遅延を伴う疾患又はアルツハイマー症に羅患していると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞である場合をより具体的な例としてあげることができる。
【００２８】
本転写調節因子遺伝子の調製は、上述と同等な方法に準じて行えばよい。また、高効率プロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター）の制御下に本転写調節因子遺伝子を発現させるインビボ転写系によって調製することもできる。調製された遺伝子を用いて後述のように形質転換細胞を調製することにより、当該遺伝子が哺乳動物細胞で発現する位置に置かれるように提供された形質転換細胞を得ることができる。
本発明発現促進方法において「発現する位置に置かれた」とは、ＤＮＡ分子が、その塩基配列からの転写及び翻訳を指向する（即ち、例えば、本転写調節因子をコードするＲＮＡおよび本転写調節因子の産生を促進するような）塩基配列と隣接した位置に置かれていることを意味する。
本転写調節因子の発現レベルは、本転写調節因子遺伝子が提供されていない細胞と比較して上記マーカー蛋白質遺伝子の発現を制御するために十分である量であればよい。この場合、本転写調節因子遺伝子は、本転写調節因子の全体をコードするＤＮＡであってもよいし、当該蛋白質の一部をコードするＤＮＡであってもよい。
上記の発現促進方法において、本転写調節因子遺伝子がゲノムに組み込まれるように哺乳動物細胞に提供することにより、上記マーカー蛋白質遺伝子の発現を制御してもよい。
【００２９】
上記の発現促進方法において、本転写調節因子遺伝子を哺乳動物細胞に導入するために用いられる遺伝子構築物（以下、本遺伝子構築物と記載することもある。）および移入送達手段には、当該遺伝子が導入される哺乳動物細胞に対して親和性を有する、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター又はその他のウイルスベクターを用いることができる。具体的には例えば、ミラー(Miller)，Human Gene Therapy 15〜14，1990;フリードマン(Friedman)，Science 244:1275〜1281，1989;エグリティス(Eglitis)およびアンダーソン(Anderson)，BioTechniques 6:608〜614，1988;トルストシェフ(Tolstoshev)およびアンダーソン(Anderson)，current opinion in Biotechnology 1;55〜61，1990;シャープ(Sharp)，The Lancet 337:1277〜1278，1991;コルネッタ(Cornetta)ら、Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311〜322，1987;アンダーソン(Anderson)，Science 22-:401〜409，1984;モーン(Moen)，Blood Cells 17:407〜416，1991;ミラー(Miller)ら、Biotechniques 7:980〜990，1989;Le Gai La Salleら、Science 259:988〜990，1993;およびジョンソン(Johnson)，Chest 107:77S〜83S，1995等に記載される公知のベクターをあげることができる。ローゼンバーグ(Rosenberg)ら、N．Engl．J．Med 323:370，1990;アンダーソン(Anderson)ら、米国特許第5,399,346号等に記載されるレトロウイルスベクターは特に開発が進んでおり、臨床の場でもすでに使用されている。
また、本発明ＤＮＡの移入送達手段としては、非ウイルス的手法を用いることもできる。例えば、フェルグナー(Felgner)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413，1987;オノ(Ono)ら、Neurosci．Lett．117:259，1990;ブライアム(Brigham)ら、Am．J．Med．Sci．298:278，1989;シュタウビンガー(Staubinger)ら、Meth．Enz．101:512，1983）、アシアロソヌコイド・ポリリジン抱合（ウー(Wu)ら、J．Biol．Chem．263:14621，1988;ウー(Wu)ら、J．Biol．Chem．264:16985，1989等に記載されるリポフェクション、ウォルフ(Wolff)ら、Science 247:1465，1990等に記載されるマイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法及びプロトプラスト融合法、リポソーム法等があげられる。
【００３０】
本遺伝子構築物において、本転写調節因子遺伝子は、当該ＤＮＡを構成的に発現させるようなプロモーターの制御下に置かれていてもよい。例えば、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Raus Sarcoma Virusプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター等が挙げられる。
また、本転写調節因子遺伝子は、当該遺伝子の発現を環境刺激により調節するようなプロモーターの制御下に置かれていてもよい。例えば、上記遺伝子は、化学的信号もしくは薬物刺激等の外来性の信号もしくは薬物の導入により活性化されるプロモーターを用いて発現させてもよい。
また、本転写調節因子遺伝子は、組織特異的もしくは細胞型特異的なプロモーターの制御下に置かれていてもよい。かかるプロモーターには、哺乳動物における組織または細胞に特異的な転写制御に関与するプロモーター要素（エンハンサー等）が含まれていてもよい。例えば、必要に応じて、本転写調節因子遺伝子を発現させるために、神経細胞におけるＤＮＡの発現を優先的に指向することが知られるエンハンサーを用いてもよい。また、本転写調節因子をコードするゲノムＤＮＡ（例えば配列番号３３または３４で示される塩基配列を有するＤＮＡ等）のクローンを本遺伝子構築物として用いる場合には、本転写調節因子遺伝子の元来の発現調節領域に含まれるコグネイト調節配列を介して本転写調節因子遺伝子を発現させることができ、必要に応じて、上記の任意のプロモーター又はプロモーター要素を付加して発現を制御することもできる。
尚、上記のようなプロモーターまたはプロモーター要素をマルチクローニング部位の上流に含む市販のベクターを利用することもできる。
【００３１】
上記の発現促進方法を遺伝子治療の手段として応用する場合には、本遺伝子構築物は、上記マーカー蛋白質遺伝子の異常発現が予想される部位に対して適用される（例えば、注入によって）ことがよい。また、上記マーカー蛋白質の異常発現等の現象が予想される部位の近傍の組織又は上記マーカー蛋白質の異常発現が起こると予想される細胞に供給される血管に対してそれを適用してもよい。また、本遺伝子構築物を適用しようとする哺乳動物にとって外因性又は内因性の培養可能な細胞に、本遺伝子構築物を導入し、次いで、導入された細胞を血清学的に標的組織に対して注入することもできる。
理想的には、かかる遺伝子治療の手法により、少なくとも非罹患細胞における正常な本転写調節因子の細胞内レベルと同等の本転写調節因子の発現量がもたらされるとよい。
【００３２】
以下に、一例として、哺乳動物が形質転換非ヒト動物である場合の上記発明についてより詳細に説明する。
形質転換非ヒト動物の作製における本転写調節因子遺伝子の導入法としては、例えば、マイクロインジェクション法、レトロウイルスを用いる方法、胚性未分化細胞（ＥＳ細胞）を用いる方法等を挙げることができる。このうち、マイクロインジェクション法が最も汎用されている。マイクロインジェクション法とは、マイクロマニピュレーターを用いて、顕微鏡下で受精卵の前核内部に上記ＤＮＡを含んだ溶液を注入する方法である。
まず、本転写調節因子遺伝子を受精卵に注入する。その際、当該遺伝子を高い確率で染色体へ組込むためには、当該遺伝子の単離に用いたベクター領域を可能な限り除去すること、ｍＲＮＡの不安定化に寄与するＡＵに富む領域を除くこと、直鎖状にすることが好ましい。また、当該遺伝子に対してイントロンを予め挿入しておくことが好ましく、当該イントロンとしては、例えば、β−グロビンイントロン等を挙げることができる。
受精卵は、目的に応じた系統の非ヒト動物から採取する。例えば、マウスの場合には、近交系のＣ５７ＢＬ／６マウスやＣ３Ｈマウス、あるいはＣ５７ＢＬ／６マウスと他系統のマウスとの交雑系（例えば、（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）Ｆ1等）、非近交系のＩＣＲマウスが挙げられる。受精卵は、通常、妊馬血清ゴナドトロピンとヒト絨毛性ゴナドトロピンとの両者の腹腔内投与により過剰排卵を誘発させた雌マウスと雄マウスとを交尾させた後、前記雌マウスから採取する。尚、採取した受精卵は培養用ドロップに入れ、ＣＯ2ガスインキュベーターで培養・維持することにより、上記遺伝子の注入操作まで保管することができる。
上記遺伝子の注入はマイクロマニピュレーターをセットした倒立顕微鏡下で行なう。用いられる受精卵としては、雄性前核が雌性前核より大きくなる頃から両前核が融合するまでの発達段階にあるものを用いるとよい。まず受精卵を固定し、当該受精卵の雄性前核内に当該遺伝子を含有するＤＮＡ溶液を注入する。当該ＤＮＡ溶液は必要に応じて複合体として調製する。複合体形成に用いられる物質としては、リポソーム、リン酸カルシウム、レトロウイルス等を挙げることができる。ＤＮＡ溶液の注入は雄性前核が膨らむことにより確認できる。遺伝子注入量としては、例えば、約２００〜約３，０００コピーの上記遺伝子を含む量を挙げることができる。
【００３３】
このようにして、本転写調節因子遺伝子が注入された受精卵は胚盤胞になるまで前記と同様にして培養した後、仮親の子宮に移植する。好ましくは当該ＤＮＡの注入操作後ただちに仮親の卵管に移植するとよい。仮親としては、精管切断手術を施した雄マウスと交尾させて偽妊娠状態にした雌マウスを用いるとよい。具体的には、まず当該雌マウス背側の腎臓付近の皮膚と筋層を切開して卵巣・卵管・子宮を引き出し、卵巣膜を破いて卵管口を探し出す。次いで当該ＤＮＡの注入操作後に生き残った受精卵を該卵管口から移入し、卵巣・卵管・子宮を腹腔内に戻した後、筋層を縫合し、皮膚をクリップでとめる。約２０日後に仔が生まれる。
得られた仔の体組織の一部、例えば尾の一部、を切り取り、当該部位から抽出されたＤＮＡのサザンブロッティング等により当該遺伝子の存在有無を確認する。このようにして、当該遺伝子が非ヒト動物に導入されたことを確認できる。あるいは他の方法、例えばＰＣＲなどの確認方法を利用してもよい。
【００３４】
本転写調節因子遺伝子治療剤の有効成分となる、本転写調節因子遺伝子は、前述の如く調製すればよい。また、例えば、当該遺伝子を含有する組換えベクター又は組換えウイルス等の形態で使用されることもある。このような形態には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連性ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、ポリオーマウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター及びワクシニアウイルスベクター等のウイルスベクターを利用することができる。さらに、アデノウイルスベクターを使用する場合には、例えばＱＵＡＮＴＵＭ社製のＡｄＥａｓｙ  Ｋｉｔを用い、本転写調節因子遺伝子をＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトに組み込み、得られた組換えベクターを直線化した後に、ｐＡｄＥａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒと共に大腸菌にトランスフォームし、相同組換え体ＤＮＡをヒト２９３Ａ細胞に組み込むことにより、本転写調節因子遺伝子を含有する組換えウイルスを産生させ、これを回収し、使用することもできる。また、ヒトサイトメガウイルスのプロモーター領域を有するプラスミドＤＮＡ等のような非ウイルス系のベクターを用いることもできる。本転写調節因子遺伝子を上記マーカー蛋白質の異常発現が予想される部位に直接注入する場合のように、非ウイルスベクターを用いて本転写調節因子遺伝子を局所的に送達するシステムにおいては、プラスミドＤＮＡの使用は極めて有益である。体外に取り出された細胞に本転写調節因子遺伝子を含有する組換えベクターを導入して体内に戻す方法、すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏ法を使えば、あらゆる既知の導入方法が利用可能である。例えば、ａ）直接注入、ｂ）リポソームを介する形質導入、ｃ）リン酸カルシウム法・エレクトロポレーション法・ＤＥＡＥ−デキストラン法による細胞トランスフェクション、ｄ）ポリブレンを介した送達、ｅ）プロトプラスト融合、ｆ）マイクロインジェクション、ｇ）ポリリシンを使った形質導入などによって、非ウイルスベクターを導入することができる。
【００３５】
本発明遺伝子治療剤は、その有効量を非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、非経口的に投与する方法としては、例えば、上述のような注射（皮下、静脈内等）等を挙げることができる。前記の適当な投与剤型は薬学的に許容される、例えば、水溶性溶剤、非水溶性溶剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、安定剤等の担体に本転写調節因子遺伝子（本発明ＤＮＡが組み込まれた組換えベクター、組換えウィルス、組換えプラスミド等の形態を含む）を配合することにより製造することができる。必要に応じて、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本脂肪蓄積抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は、患者細胞において本発明蛋白質が細胞内で有効に働くような濃度レベルをもたらす有効成分量を投与すればよい。１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００３６】
【実施例】
以下に本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（本転写調節因子遺伝子が含有されてなるベクターであるpGEM-mNXFの調製）
配列番号７で示される塩基配列（aagcacggag gaggaagccg ccggtgcgtc gggac）からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８で示される塩基配列（ggagagcggc tccacgtctt gatgacaata tgcca）からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれDNA合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル394）を用いて合成した。マウスBrain cDNAライブラリー（＃10655−017ギブコBRL社製）10 ngを鋳型として、かつ、前記ポリヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った。当該ＰＣＲにおいて、反応液５０μｌ当たり上記のポリヌクレオチド10pmolを添加し、LA-Taqポリメラーゼ（宝酒造社製）及び当該酵素を含むキットに添付されたバッファーを用いた。PCR反応液の保温は、PCRsystem9700（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、95℃1分間次いで68℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。
次いで、PCR反応液の全量を、低融点アガロースゲル電気泳動（アガロースL：ニッポンジーン）に供した。約2.5kbのＤＮＡの単一バンドを確認した後、当該DNAを回収した。回収されたＤＮＡの一部とダイターミネーターシークエンスキットFS（アプライドバイオシステムズ社製）とを用いてダイレクトシークエンス用のサンプルを調製し、これを、オートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製、モデル3700）を用いたダイレクト塩基配列解析に供した。
次に、上記のようにして回収されたDNA（約１μｇ）とpGEM T easyベクター（プロメガ社製）（10ng）とを混合し、この混合物にT4 DNAリガーゼを添加して反応させることにより、pGEM-mNXFを得た。得られたpGEM-mNXFの塩基配列をABIモデル3700型オートシークエンサーを用いてダイターミネーター法で決定した。決定された塩基配列を、前記のダイレクトシークエンスで得られた塩基配列と比較して、翻訳領域の塩基配列が完全に一致していることを確認した。
【００３７】
実施例２（pRC/RSV-mNXFsense及びpRC/RSV-mNXFantisenseの調製）
哺乳動物細胞内において本転写調節因子の全長を発現させるためのプラスミド（以下、本発現プラスミドと記すこともある。）を、以下のようにして作製した。
実施例１で得られたpGEM-mNXFは、市販のpGEMベクターのSp6プロモーターの下流にマウス由来の本転写調節因子をコードする翻訳領域の開始コドンが位置するように構築されていた。そこでこのpGEM-mNXF（1μg）を鋳型にして、かつ、配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチド（フォワードプライマー 5´-gggcgctgcagcccagccaccatgtaccgatccaccaaggg-3´）および配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチド（リバースプライマー 5´-aatctcggcgttgatctggt-3´）をプライマーとして、KODplusポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用いたPCRを行うことにより、本転写調節因子をコードする翻訳領域の開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）が導入され、さらにその上流にPstI制限酵素部位が導入された本転写調節因子の一部をコードするＤＮＡを得た。尚、PCRの反応は、95℃１分間次いで55℃３０秒間さらに72℃１分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。
このようにして得られたＤＮＡをPstIとBssHIIとで切断した後、低融点アガロースゲル電気泳動（NusieveGTGアガロース；FMCbio社製）に供することにより精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡを下記で用いるインサートＤＮＡとした。次に、pGEM-mNXFをPstIとBssHIIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡを低融点アガロースゲル電気泳動（AgaroseL；ニッポンジーン社製）に供し、前記ＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡ（0.1μｇ）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、マウス由来の本転写調節因子をコードする翻訳領域の開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）が導入されているプラスミドpGEM-mNXFコザックを作製した。
次に、プラスミドｐGEM-mNXFコザックをPstI、NotI及びScaIの３者で同時に切断した後、これを低融点アガロース電気泳動に供し、約2.5kbpのＤＮＡ（mNXFコザックPstI-NotI）を回収した。そして、回収されたＤＮＡをT4ポリメラーゼで平滑末端化し、得られたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。RSVプロモーターを保有するプラスミドpRC/RSV（Invitorgen社製）をHindIIIで切断した後T4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡをBAP処理し、これをベクターＤＮＡとした。このベクターＤＮＡ（0.1μg）に前記インサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、（ａ）コザック配列の下流にマウス由来の本転写調節因子をコードする翻訳領域が接続されてなるＤＮＡのセンス鎖がRSVプロモーターの制御下に発現するプラスミドであるpRC/RSV-mNXFsense、及び（ｂ）コザック配列の下流にマウス由来の本転写調節因子をコードする翻訳領域が接続されてなるＤＮＡのアンチセンス鎖がRSVプロモーターの制御下に発現するプラスミドであるpRC/RSV-mNXFantisenseを作製した。尚、作製されたプラスミドが所望の構造を有することを、ベクターＤＮＡとインサートＤＮＡとの境界領域の塩基配列を調べることにより確認した。
【００３８】
実施例3  （本転写調節因子によるEphA1の発現促進）
まず、約１ｘ１０7のSK-N-MC細胞（ATCC No.HTB10；大日本製薬より購入した）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬製）を用いて３７℃にて５％ＣＯ2存在下に、直径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養した。翌日、培養された細胞をトリプシン処理により分散し、FBSを含まないDMEM培地で２回洗浄した後、再度１ｘ１０7に細胞密度がなるようにFBSを含まないDMEM培地に分散した。この細胞分散液0.4ｍｌに、実施例２で作製された本発現プラスミド（（ａ）pRC/RSV-mNXFsense、又は（ｂ）pRC/RSV-mNXFantisense）10μｇを混合した後、この混合物をエレクトロポレーション用キュベットに移し、Geneパルサー（BIORAD社製）を用いたエレクトロポレーション法により200V、950μFの条件でトランスフェクションを行った。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に置換してさらに10ｃｍシャーレ内で約24時間培養した。培養後、シャーレ5枚の細胞を材料にして、市販のRNA精製及び放射能ラベル用市販キットである、Atlas Pure Total RNA Labeling system（K1038-1；クロンテック社製）を用いてDNAを含まないのtotalRNAを精製した。RNA収量は、（ａ）のプラスミド（即ち、pRC/RSV-mNXFsense）を用いた場合には23μｇであり、また（ｂ）のプラスミド（即ち、pRC/RSV-mNXFantisense）を用いた場合には26μｇであった。次に、得られたRNAを材料にして、上記キットに含まれる特異的プライマー及び逆転写酵素を用いて[α-P32] -dATP（アマシャムファルマシア社製）でそれぞれのRNAを放射能ラベルした。次に、放射ラベルされたＲＮＡ（以下、プローブと記す。）を上記キットを用いて精製した後、精製されたＲＮＡの1.3ｘ105DPM相当分を以下のハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーションは、種々の遺伝子がブロットされたナイロン膜を含むキット（Atlas ｃDNA Expression array-Neurobiology ；7736-1  クロンテック社製）及び該キットに付属のハイブリダイゼーションバッファーを用いて、（ａ）pRC/RSV-mNXFsense導入細胞由来のプローブまたは（ｂ）pRC/RSV-mNXFantisense導入細胞由来のプローブをそれぞれ添加し、同一条件のもとで１８時間行った。ハイブリダイゼーションの後、各ナイロン膜を２XSSC、1%SDSバッファーで洗浄（68℃、30分間）した。これを４回繰り返した後、更に0.1XSSC、0.5%SDSバッファーで洗浄（68℃、30分間）した。それぞれのナイロン膜をプラスチックラップに包み、IPプレート（富士フィルム社製）に7日間感光させたのち、イメージングアナライザー（BASstation；富士フィルム社製）でナイロン膜上の種々の遺伝子に対応するハイブリダイゼーションシグナルの強度の定量と比較を行った。
その結果、EphA1遺伝子について、（ａ）pRC/RSV-mNXFsense導入細胞由来のプローブとハイブリダイズさせたナイロン膜上のハイブリダイゼーションシグナルが、（ｂ）pRC/RSV-mNXFantisense導入細胞由来のプローブとハイブリダイズさせたナイロン膜上のハイブリダイゼーションシグナルよりも有意に強く検出された。このように本転写調節因子には、EphA1の発現を促進する能力が存在することが確認できた。
【００３９】
実施例４  （本転写調節因子によるRho GDP dissociation inhibitorの発現抑制）
まず、約１ｘ１０7のSK-N-MC細胞（ATCC No.HTB10；大日本製薬より購入した）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬製）を用いて３７℃にて５％ＣＯ2存在下に、直径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養した。翌日、培養された細胞をトリプシン処理により分散し、FBSを含まないDMEM培地で２回洗浄した後、再度１ｘ１０7に細胞密度がなるようにFBSを含まないDMEM培地に分散した。この細胞分散液0.4ｍｌに、実施例２で作製された本発現プラスミド（（ａ）pRC/RSV-mNXFsense、又は（ｂ）pRC/RSV-mNXFantisense）10μｇを混合した後、この混合物をエレクトロポレーション用キュベットに移し、Geneパルサー（BIORAD社製）を用いたエレクトロポレーション法により200V、950μFの条件でトランスフェクションを行った。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換してさらに10ｃｍシャーレ内で約24時間培養した。培養後、シャーレ5枚の細胞をそれぞれ材料にして、市販のRNA精製及び放射能ラベル用キットである、Atlas Pure Total RNA Labeling system（K1038-1；クロンテック社製）を用いてDNAfreeのtotalRNAを精製した。RNA収量は、（ａ）のプラスミド（即ち、pRC/RSV-mNXFsense）を用いた場合には23μｇであり、また（ｂ）のプラスミド（即ち、pRC/RSV-mNXFantisense）を用いた場合には26μｇであった。次に、得られたRNAを材料にして、上記キットに含まれる特異的プライマー及び逆転写酵素を用いて[α-P32] -dATP（アマシャムファルマシア社製）でそれぞれのRNAを放射能ラベルした。次に、放射能ラベルされたＲＮＡ（以下、プローブと記す。）を上記キットを用いて精製した後、精製されたＲＮＡの1.3ｘ105DPM相当分を以下のハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーションは、種々の遺伝子がブロットされたナイロン膜を含むキット（Atlas ｃDNA Expression array-Neurobiology ；7736-1  クロンテック社製）及び該キットに付属のハイブリダイゼーションバッファーを用いて、（ａ）pRC/RSV-mNXFsense導入細胞由来のプローブまたは（ｂ）pRC/RSV-mNXFantisense導入細胞由来のプローブをそれぞれ添加し、同一条件のもとで１８時間行った。ハイブリダイゼーションの後、各ナイロン膜を２XSSC、1%SDSバッファーで洗浄（68℃、30分間）した。これを４回繰り返した後、更に0.1XSSC、0.5%SDSバッファーで洗浄（68℃、30分間）した。それぞれのナイロン膜をプラスチックラップに包み、IPプレート（富士フィルム社製）に7日間感光させたのち、イメージングアナライザー（BASstation；富士フィルム社製）でナイロン膜上の種々の遺伝子に対応するハイブリダイゼーションシグナルの強度の定量と比較を行った。
その結果、Rho GDP dissociation inhibitor遺伝子について、（ａ）pRC/RSV-mNXFsense導入細胞由来のプローブとハイブリダイズさせたナイロン膜上のハイブリダイゼーションシグナルが、（ｂ）pRC/RSV-mNXFantisense導入細胞由来のプローブとハイブリダイズさせたナイロン膜上のハイブリダイゼーションシグナルよりも有意に弱く検出された。このように本転写調節因子には、Rho GDP dissociation inhibitorの発現を抑制する能力が存在することが確認できた。
【００４０】
実施例５  （本発明検定方法）
実施例２で調製されたpRC/RSV-mNXFsense導入細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬製）を用いて３７℃にて５％ＣＯ2存在下に、直径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養した。翌日、培養された細胞をトリプシン処理により分散し、FBSを含まないＤＭＥＭ培地で２回洗浄した後、再度DMEM培地に分散する。
次に、分散させた細胞を、（ａ）DMSOのみを添加した培養液、又は（ｂ）DMSOで種々の濃度に溶解した被験物質を添加した培養液、を予め加えておいた６穴プレートに１０6個／ウェルの割合で播種する。このプレート内で当該細胞を３７℃で約２４時間培養した後、プレートから培養液を除きPBS(-)で細胞を洗浄し、Isogen（ニッポンジーン社製）を用いてそれぞれの穴からtotal RNAを抽出する。
このようにして抽出されたtotal RNAを材料にして、oligodT（アマシャムファルマシア社製）及びReverse transcriptase（スーパースクリプトII、ギブコ社製等）を用いて一本鎖cDNAを作製する。次にこの一本鎖cDNAを鋳型としてLA-Taq（タカラ社製）、並びに、下記のフォワードプライマー（配列番号１３〜１７）と下記のリバースプライマー（配列番号１８〜２２）との組み合わせによりPCRを行なう。
＜フォワードプライマー例＞
5'-agtgaacagcaacagatact-3'  （配列番号１３）
5'-gcttcccgcgtccacgtgga-3'  （配列番号１４）
5'-gatgtgggcattcagctccg-3'  （配列番号１５）
5'-cagagcttcaccattcgaga-3'  （配列番号１６）
5'-gtggccctggtgtctgtccg-3'  （配列番号１７）
＜リバースプライマー例＞
5'-ctggcccgcgcgtggggcaa-3'  （配列番号１８）
5'-acacatgcttcgccactgcc-3'  （配列番号１９）
5'-taatggccgctctcacaggt-3'  （配列番号２０）
5'-agctgagtccctgaggcaga-3'  （配列番号２１）
5'-tgtgctgtgccctgacactg-3'  （配列番号２２）
PＣＲの条件は、９５℃にて１分間次いで６８℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクルである。このようにしてtotal RNA中に存在するＥｐｈＡ  １のｍＲＮＡの量を算出し、DMSOのみを添加した培養液を用いて培養された細胞から抽出されたtotalＲＮＡ中のＥｐｈＡ  １のｍＲＮＡの量と、種々の被験物質を添加した培養液を用いて培養された細胞から抽出されるＲＮＡ中のＥｐｈＡ  １のｍＲＮＡの量とを比較することにより、被験物質が有する、本転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を制御する能力を検定・評価する。その結果に基づき所望の物質を選抜する。
【００４１】
同様にして、下記のフォワードプライマー（配列番号２３〜２７）と下記のリバースプライマー（配列番号２８〜３２）との組み合わせによりPCRを行う。
＜フォワードプライマー例＞
5'-ttgcagcggagaacgaggag-3'  （配列番号２３）
5'-gatgagcactcggtcaacta-3'  （配列番号２４）
5'-gcatccaggagatccaggag-3'  （配列番号２５）
5'-ctggacaaggacgacgagag-3'  （配列番号２６）
5'-cctgcgaaagtacaaggagg-3'  （配列番号２７）
＜リバースプライマー例＞
5'-cctaccatgtagtcagtctt-3'  （配列番号２８）
5'-ggtcaggaactcgtactcct-3'  （配列番号２９）
5'-ttgggtgcctcctccacggg-3'  （配列番号３０）
5'-gcgggacttgatgctgtagc-3'  （配列番号３１）
5'-gtcttgtcgtcgtctgtgaa-3'  （配列番号３２）
このようにして、total RNA中のRho GDP dissociation inhibitorのｍＲＮＡの量を算出し、DMSOのみを添加した培養液を用いて培養された細胞から抽出されたtotalＲＮＡ中のRho GDP dissociation inhibitorのｍＲＮＡの量と、種々の被験物質を添加した培養液を用いて培養された細胞から抽出されたtotalＲＮＡ中のRho GDP dissociation inhibitorのｍＲＮＡの量とを比較することにより、被験物質が有する、本転写調節因子に依存的な神経細胞可塑性を制御する能力を検定・評価する。その結果に基づき所望の物質を選抜する。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、哺乳動物における神経細胞可塑性を制御するための薬剤の有効成分として使用し得る物質を探索するために使用される、神経細胞可塑性を制御する能力を検定する方法等が提供可能となった。
［配列表フリーテキスト］
配列番号7
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号8
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号9
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号10
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号11
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号12
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号13
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号14
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号15
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号16
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号17
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号18
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号19
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号20
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号21
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号22
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号23
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号24
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号25
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号26
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号27
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号28
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号29
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号30
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号31
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号32
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００４３】
【配列表】
0004161570.tif 000002
0004161570.tif 000003
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