(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
0004163007.tif 000011
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Ｍは、水素原子又は対カチオンである。）
で示される化合物を有効成分として含む、癌転移抑制剤。
【請求項２】
一般式（Ｉ）においてＲが、−Ｃ１５Ｈ３１、−（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨＣ６Ｈ１３、又は−（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨＣ８Ｈ１７であることを特徴とする、請求項１に記載の癌転移抑制剤。
【請求項３】
癌細胞の浸潤を抑制することにより癌の転移を抑制する、請求項１又は２に記載の癌転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、カルバ環状ホスファチジン酸誘導体を有効成分として含む、癌転移抑制剤に関する。
背景技術
リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ、ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）は、生体膜を構成するリン脂質の中で最も単純な構造を持っており、ホスファチジン酸（ＰＡ）からグリセロールのｓｎ−１位あるいは２位の脂肪酸のどちらか一方が脱アシル化されたものである（図１）。通常の細胞において、全リン脂質中にしめるＬＰＡの割合は０．５％以下ときわめて少なく、１９８０年代までは単に、リン脂質生合成の中間体や分解産物としてしか認識されていなかった。しかし最近、ＬＰＡの様々な生理活性が示され（Ｍｏｏｌｅｎａａｒ，Ｗ．Ｈ．：Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５３，２３０−２３８（１９９９））、さらに、細胞膜上の複数の受容体の存在も明らかになって（Ｇｕｏ，Ｚ．，他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１４３６７−１４３７２（１９９６）；Ｈｅｃｈｔ，Ｊ．Ｈ．，他，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３５，１０７１−１０８３（１９９６）；Ａｎ，Ｓ．，他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，７９０６−７９１０（１９９８）；Ｂａｎｄｏｈ，Ｋ．，他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２７７７６−２７７８５（１９９９）；及びＩｍ，Ｄ−Ｓ．，他，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，７５３−７５９（２０００））、機能リン脂質として注目されるようになった。
ＬＰＡは、細胞種によって様々な作用を引き起こす事が知られる。細胞の増殖促進（ｖａｎ  Ｃｏｒｖｅｎ，Ｅ．Ｊ．，他，Ｃｅｌｌ  ５９，４５−５４（１９８９））や細胞死の抑制（Ｕｍａｎｓｋｙ，Ｓ．Ｒ．，他，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆ．４，６０８−６１６（１９９７））に加え、低分子量Ｇタンパク質の一つであるＲｈｏを介したシグナル伝達系の活性化によって、細胞骨格の変化を導き、繊維芽細胞におけるストレスファイバーの形成（Ｇｏｈｌａ，Ａ．，他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，４６５３−４６５９（１９９８））や、神経細胞における神経突起の退縮（Ｔｉｇｙｉ，Ｇ．，他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２１３６０−２１３６７（１９９２）；Ｊａｌｉｎｋ，Ｋ．，他，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒ．４，２４７−２５５（１９９３）；Ｊａｌｉｎｋ，Ｋ．，他，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２６，８０１−８１０（１９９４）；及びＴｉｇｙｉ，Ｇ．，他，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６６，５３７−５４８（１９９６））、癌細胞の浸潤（Ｉｍａｍｕｒａ，Ｆ．，他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９３，４９７−５０３（１９９３）；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｋ．Ｌ．，他，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４３，１７４９−１７６０（１９９８）；Ｓｔａｍ，Ｊ．Ｃ．，他，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７，４０６６−４０７４（１９９８））などを誘導する。
一方、１９９２年には、真性粘菌Ｐｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍの単相体ミクソアメーバから、真核細胞のＤＮＡ複製酵素であるＤＮＡポリメラーゼαの活性を抑え、動物培養細胞の増殖を抑制する脂溶性物質が見いだされ、単離・精製された（Ｍｕｒａｋａｍｉ−Ｍｕｒｏｆｕｓｈｉ，Ｋ．，他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２１５１２−２１５１７（１９９２））。この物質はグリセロール骨格のｓｎ−１位にシクロプロパンを含むヘキサデカン酸が結合し、２位と３位にリン酸が環状エステル結合した物質であることがわかり（図１）、Ｐｈｙｓａｒｕｍ由来のＬＰＡ様物質であることから、ＰＨＹＬＰＡと命名された。
ＰＨＹＬＰＡがｓｎ−１位に特徴的な脂肪酸を有することから、一般的な脂肪酸に置換した誘導体を化学合成し、その活性を検討した。その結果、程度に強弱こそあったが、いずれも細胞増殖を抑制することが示され、ＰＨＹＬＰＡの増殖抑制作用が、２位と３位の環状リン酸基によることが明らかになった。現在では、このような環状リン酸基を持つＬＰＡ類似体を総称して、環状ホスファチジン酸（ｃＰＡ、ｃｙｃｌｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）と呼んでいる（図１）。このｃＰＡは最近、ヒト血清中にアルブミンに結合した形で検出され（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，他，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６５，２１８５−２１９１（１９９９））、広く生物界に存在することが明らかになった。また、このとき分離された脂質画分中のｃＰＡは、パルミチン酸を脂肪酸として持つＰａｌ−ｃＰＡが主要成分であった。血清の他、ラットやブタの脳でもｃＰＡの存在が確認され、Ｔｉｇｙｉらはまた、ウサギの角膜損傷モデルにおいて、房水や涙腺液中に、ｃＰＡを含む一群のＬＰＡ類縁体を検出している（Ｌｉｌｉｏｍ，Ｋ．，他，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７４，Ｃ１０６５−Ｃ１０７４（１９９８））。
ｃＰＡは、ＬＰＡと同様な、または相反する様々な生理活性を示すことが明らかになっている。ＬＰＡが培養細胞の増殖を促進するのに対し、ｃＰＡは抑制作用を示す（Ｍｕｒａｋａｍｉ−Ｍｕｒｏｆｕｓｈｉ，Ｋ．，他，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．１８，３６３−３７０（１９９３））。この作用は可逆的であり、培地からｃＰＡを除くと、細胞は再び増殖を始める。増殖抑制作用の機構として、ふたつの可能性が示唆されている。
マウス繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）において、ｃＰＡが細胞内ｃＡＭＰ濃度を数分以内に上昇させることが見いだされている。細胞内のＣａ２＋濃度の上昇を妨げることによってこの現象は見られなくなり（Ｍｕｒａｋａｍｉ−Ｍｕｒｏｆｕｓｈｉ，Ｋ．，他，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．１８，３６３−３７０（１９９３））、ｃＰＡは細胞膜上の受容体を介してＣａ２＋依存的なアデニル酸シクラーゼを活性化している可能性が考えられる。細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇がＭＡＰキナーゼの活性化を抑制することが示されており（Ｈｏｒｄｉｊｋ，Ｐ．Ｌ．，他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３５３４−３５３８（１９９４）；及びＨｏｗｅ，Ｌ．Ｒ．，他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２０７１７−２０７２０（１９９３））、このことが、増殖阻害につながる可能性が示唆された。一方、ｃＰＡはその構造上、容易に細胞内に取り込まれると考えられる。この点に関し、ｓｎ−１位を蛍光標識したｃＰＡを合成し、細胞に添加した後にその挙動を観察することで、ｃＰＡが迅速に細胞内に移行し、細胞質中、核の周辺部に局在することが判明している。また、ｃＰＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞周期を制御するｃｄｃ２５ホスファターゼの活性を阻害することが見いだされており（小林哲幸・室伏きみ子：蛋白質  核酸  酵素  ４４，１１１８−１１２５（１９９９））、このことから、ｃＰＡが、細胞膜上の受容体を介さずに、細胞質内でｃｄｋ２キナーゼ複合体の活性化を直接抑制することで、細胞の増殖を阻害している可能性も考えられる。
また、血清を制限した培地で培養した繊維芽細胞では、ＬＰＡ、ｃＰＡ共に、細胞内のアクチン分子によるストレスファイバーの形成を誘導する（小林哲幸・室伏きみ子：蛋白質  核酸  酵素  ４４，１１１８−１１２５（１９９９））。この場合は、ｃＰＡもＬＰＡと同様に、細胞膜受容体への結合を介してＲｈｏを活性化することで、その作用を引き起こすと考えられる。
さらに、癌細胞の浸潤については、ＬＰＡの促進作用に対し、ｃＰＡは強い抑制活性を示す（Ｍｕｋａｉ，Ｍ．，他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１，９１８−９２２（１９９９））。
癌の転移は、腫瘍の悪性化を示す最も顕著な現象であり、複雑な過程を経て成立する。中でも浸潤は特徴的なステップであり、生体内で原発巣から遊離した癌細胞は、間質、血管内に浸潤して血流にのって運ばれ、血管外、さらに遠隔臓器へと浸潤し、そこで増殖して転移巣を作る。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこの現象を解析するために、明渡らは、ラット腹水肝癌細胞（ＡＨ−１３０）をラット腹腔に移植した際におこる腹膜浸潤をモデル化し、宿主正常細胞層を越えた癌細胞の移動を定量的に評価できる実験系を開発した（Ａｋｅｄｏ，Ｈ．，他，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６，２４１６−２４２２（１９８６））。通常、浸潤の研究には細胞外基質をコーティングした膜を通り抜けた癌細胞を観察する実験系が用いられるが、その方法に対してこの系は、ｉｎ  ｖｉｖｏをよく反映すると考えられている。この実験系に用いられるいくつかの癌細胞には、その浸潤に血清を必要とするものとしないものとがある。ＡＨ−１３０細胞の高浸潤性クローン（ＭＭ１）は、その浸潤に血清を必要とし、血清中の浸潤促進物質の検索の結果、少なくともそのうちの一つがＬＰＡであることが明らかになった（Ｉｍａｍｕｒａ，Ｆ．，他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９３，４９７−５０３（１９９３））。このことから、ＬＰＡ構造類似体であるｃＰＡの浸潤に対する影響を調べたところ、ＬＰＡとは全く逆に、浸潤を抑制することが見いだされた。いくつかの、ｓｎ−１位に異なる脂肪酸が結合した誘導体を合成し、その浸潤抑制活性を調べたところ、Ｐａｌ−ｃＰＡが最も強い浸潤抑制を示した。また、同じアッセイ系において、その浸潤に血清やＬＰＡを必要としないヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）の浸潤も、Ｐａｌ−ｃＰＡによって顕著に抑制された（Ｍｕｋａｉ，Ｍ．，他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１，９１８−９２２（１９９９））。
ＭＭ１細胞においても、Ｐａｌ−ｃＰＡの添加によって細胞内ｃＡＭＰ濃度は数分のうちに上昇し、ＬＰＡ共存下においてもこの効果は失われなかった（Ｍｕｋａｉ，Ｍ．，他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１，９１８−９２２（１９９９））。そこで細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させる試薬を添加したところ、ＬＰＡ誘導性の浸潤は抑制された。さらに、これらの試薬やＰａｌ−ｃＰＡの添加によって、ＬＰＡによるＲｈｏの活性が阻害されることが示された（Ｍｕｋａｉ，Ｍ．，他，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８４，６９−７３（２０００））。これらのことから、この癌細胞（ＭＭ１）においても、ｃＰＡは細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることによって、ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａ（Ａキナーゼ）の活性化を介してＲｈｏの活性を阻害し、浸潤を抑制する可能性が示唆された。しかしながら、カルバ環状ホスファチジン酸誘導体が癌細胞の浸潤抑制作用を有するかどうかについてはこれまで報告されていなかった。
発明の開示
本発明は、カルバ環状ホスファチジン酸誘導体について癌細胞の浸潤抑制作用を検討することにより、新規な癌転移抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、小林らにより確立された方法（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．，他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４，４０４７−４０５０（１９９３））によって化学合成された１１種類のｃＰＡ誘導体について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ系における血清・ＬＰＡ依存性の浸潤に対する影響を検討した（以下の実施例１）。その結果、Ｐａｌ−ｃＰＡよりも１０〜１００倍強い浸潤抑制活性を示すｃＰＡ誘導体を見いだし、これらについて、ＬＰＡ非依存性の浸潤に対する影響を調べた（以下の実施例２）。最後に、ｃＰＡ誘導体による浸潤抑制活性の作用機作について、検討を行った（以下の実施例３）。その結果、カルバ環状ホスファチジン酸誘導体が癌細胞浸潤抑制活性を有することを実証し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、一般式（Ｉ）：
0004163007.tif 000002
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Ｍは、水素原子又は対カチオンである。）
で示される化合物を有効成分として含む、癌転移抑制剤が提供される。
本発明の特に好ましい態様では、一般式（Ｉ）においてＲは、−Ｃ１５Ｈ３１、−（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨＣ６Ｈ１３、又は−（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨＣ８Ｈ１７である。
本発明の特に好ましい態様では、癌細胞の浸潤を抑制することにより癌の転移を抑制する癌転移抑制剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、治療的有効量の上記一般式（Ｉ）で示される化合物をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、癌の転移を抑制する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記一般式（Ｉ）で示される化合物の、癌転移抑制剤の製造における使用が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書で使用する略号の説明を以下に記載する。
Ａｒａ−        アラキン酸，２０：０
ＢＳＡ          ウシ血清アルブミン
Ｂｔ２ｃＡＭＰ  ジブチリルサイクリックＡＭＰ
ｃＡＭＰ        アデノシン３’，５’−サイクリックホスフェート
ＣＢＭ          カルバモイル
ｃＰＡ          サイクリックホスファチジン酸
ＣＴＸ          コレラ毒素
ＤＨＡ          ドコサヘキサエン酸
ＥＰＡ          エイコサペンタエノン酸（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ
ａｃｉｄ）
ＦＢＳ          胎児ウシ血清
ＩＢＭＸ        ３−イソブチル−１−メチルキサンチン
Ｌａｕ−        ラウリン酸，１２：０
ＬＰＡ          リソホスファチジン酸
ＭＥＭ          最小必須培地
Ｏｌｅ−        オレイン酸，１８：１
Ｐａｌ−        パルミチン酸，１６：０
ΔＰａｌ−      パルミトレイン酸，１６：１
ＰＢＳ          リン酸緩衝生理食塩水
ＴＣＡ          トリクロロ酢酸
本発明の癌転移抑制剤は、一般式（Ｉ）：
0004163007.tif 000003
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Ｍは、水素原子又は対カチオンである。）
で示されるカルバ環状ホスファチジン酸誘導体を有効成分として含む。
一般式（Ｉ）において、置換基Ｒが示す炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基などが挙げられる。
置換基Ｒが示す炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基の具体例としては、例えば、アリル基、ブテニル基、オクテニル基、デセニル基、ドデカジエニル基、ヘキサデカトリエニル基などが挙げられ、より具体的には、８−デセニル基、８−ウンデセニル基、８−ドデセニル基、８−トリデセニル基、８−テトラデセニル基、８−ペンタデセニル基、８−ヘキサデセニル基、８−ヘプタデセニル基、８−オクタデセニル基、８−イコセニル基、８−ドコセニル基、ヘプタデカ−８，１１−ジエニル基、ヘプタデカ−８，１１，１４−トリエニル基、ノナデカ−４，７，１０，１３−テトラエニル基、ノナデカ−４，７，１０，１３，１６−ペンタエニル基、ヘニコサ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサエニル基などが挙げられる。
置換基Ｒが示す炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基の具体例としては、例えば、８−デシニル基、８−ウンデシニル基、８−ドデシニル基、８−トリデシニル基、８−テトラデシニル基、８−ペンタデシニル基、８−ヘキサデシニル基、８−ヘプタデシニル基、８−オクタデシニル基、８−イコシニル基、８−ドコシニル基、ヘプタデカ−８，１１−ジイニル基などが挙げられる。
上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうるシクロアルカン環の具体例としては、例えば、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロオクタン環などが挙げられる。シクロアルカン環は、１個以上のヘテロ原子を含んでいてもよく、そのような例としては、例えば、オキシラン環、オキセタン環、テトラヒドロフラン環、Ｎ−メチルプロリジン環などが挙げられる。
上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうる芳香環の具体例としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、ピリジン環、フラン環、チオフェン環などが挙げられる。
従って、置換基Ｒがシクロアルカン環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、例えば、シクロプロピルメチル基、シクロヘキシルエチル基、８，９−メタノペンタデシル基などが挙げられる。
置換基Ｒが芳香環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、ベンジル基、フェネチル基、ｐ−ペンチルフェニルオクチル基などが挙げられる。
一般式（Ｉ）で示される環状ホスファチジン酸（ｃＰＡ）誘導体中のＭは、水素原子又は対カチオンである。Ｍが対カチオンである場合の例としては、例えば、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子、置換若しくは無置換アンモニウム基が挙げられる。アルカリ金属原子としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどが挙げられ、アルカリ土類金属原子としては、例えば、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。置換アンモニウム基としては、例えば、ブチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、テトラメチルアンモニウム基などが挙げられる。
本発明において有効成分として用いる一般式（Ｉ）で示される化合物は文献記載の方法（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．，他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４，４０４７−４０５０（１９９３）；並びに「日本薬学会  第２３回  反応と合成の進歩シンポジウム１９９７年１１月１７、１８日（熊本市民会館）環状ホスファチジン酸およびカルバ体誘導体の合成と生理作用、要旨集ページ１０１−１０４」）に準じて合成することができる。具体的な合成経路の一例を図６に示す。
図６においては、先ず、市販の（Ｒ）−ベンジルグリシジルエーテル（１）をＢＦ３・Ｅｔ２Ｏで活性化させ、メチルホスホン酸ジメチルエステルにｎ−ＢｕＬｉを作用させて得られるリチオ体を反応させることでアルコール（２）を得る。
得られたアルコールを、トルエン中で過剰のｐ−トルエンスルホン酸のピリジニウム塩を用いて８０℃で反応させることにより、環化体（３）を得る。この環化体を、水素雰囲気下で２０％Ｐｄ（ＯＨ）２−Ｃを用いて加水素分解し、脱ベンジル化を行う（４）。縮合剤として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を用いて、脂肪酸と反応させてカップリング体（５）を得る。次に、求核剤としてブロモトリメチルシランを用いて、メチル基だけを位置選択的に除去し、環状ホスホン酸（６）を得る。これをエーテルを用いて分液ロートに移しこみ、少量の０．０２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、分液操作を行い、ナトリウム塩（７）として目的化合物を抽出、精製する。
本発明は、新規な癌転移抑制剤に関する。
癌の転移は癌細胞の原発巣からの離脱に始まり、細胞外マトリックスの破壊、血管内への侵入、血管内皮細胞層を越えての浸潤、遠隔臓器での接着、増殖という多段階の過程をとる。これらの過程には種々の因子が関与しており、それらの阻害物質が新しい癌転移抑制剤として注目されている。中でも、浸潤は転移という現象の最も特徴的なステップであり、癌細胞の浸潤を抑制する物質の中から優れた制癌剤が開発される可能性は極めて高いと考えられる。本発明は、癌細胞の浸潤抑制剤として使用できる新規な癌転移抑制剤を提供するものである。
本発明における癌転移とは、癌細胞がある場所から他の臓器、器官等に移動・増殖すること、即ち、癌細胞が原発巣から離れた部位に移動して癌が形成されることを意味し、血行性及びリンパ行性の両方を含む。
本発明の癌転移抑制剤により転移を抑制するべき癌の種類は特には限定されず、良性腫瘍及び悪性腫瘍の全てを包含する。転移抑制される癌の具体例としては、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
癌はその種類により、転移しやすい臓器は少しずつ異なり、例えば、乳癌は肺、肝、骨、リンパ節に、胃癌では肝、肺、骨、副腎に、そして大腸癌では肝、肺、副腎などに高率に転移することが知られている。転移癌の例としては、転移性肝癌、転移性空腸癌、転移性骨腫瘍、転移性脳腫瘍、転移性肺腫瘍、皮膚転移癌、転移性肋骨腫瘍、転移性卵巣癌等がある。従って、本発明の癌転移抑制剤は、このような癌転移を抑制するために使用することができ、特に、術後の転移抑制剤として有用な薬剤である。また、本発明の癌転移抑制剤は、臨床的には癌再発抑制剤でもあり、患者の生存期間を延長し、生存率を高めることが期待される。
本発明の癌転移抑制剤は、既知の化学療法、外科的治療法、放射線療法、温熱療法や免疫療法などと組み合わせて用いることができる。特に、本発明の癌転移抑制剤は、既知の抗腫瘍剤および／または癌転移抑制物質との併用により、さらに癌転移抑制効果を高めることができる。本発明の癌転移抑制剤を併用することにより、投与すべき既知の抗腫瘍剤および／または癌転移抑制物質の量を減量することができ、これにより、これらの薬物により引き起こされる副作用（白血球減少、血小板減少、出血、貧血、食欲不振、悪心、嘔吐、口内炎、下痢、発疹、脱毛、皮膚の色素沈着、発熱、倦怠感、頭痛、肝機能障害、蛋白尿、浮腫、過敏症等）を低減することができる場合がある。
本発明の癌転移抑制剤は、１又は２以上の製剤学的に許容される製剤用添加物と有効成分である一般式（Ｉ）で示される化合物とを含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
本発明の癌転移抑制剤は、種々の形態で投与することができ、経口投与でも非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与など）でもよい。経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、本発明の薬剤の剤形はこれらに限定されることはない。さらに、公知の技術によって持続性製剤とすることもできる。
本発明の薬剤の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。
経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。
本発明の薬剤はヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の薬剤の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたりの有効成分の量として１μｇ／ｋｇから１，０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。上記投与量の薬剤は一日一回に投与してもよいし、数回（例えば、２〜４回程度）に分けて投与してもよい。
本出願の優先権主張の基礎となる出願である特願２００１−１５０６８５号の明細書に開示した内容は全て引用により本明細書に開示したものとする。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例
実施例１：ｃＰＡ誘導体の合成とそれらによる癌細胞浸潤抑制
（１−１）種々のｃＰＡ合成誘導体による癌細胞浸潤抑制
（Ａ）材料及び方法
ｃＰＡ誘導体の化学合成
１１種類のｃＰＡ合成誘導体は、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．，他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４，４０４７−４０５０（１９９３）に記載された方法に従って合成された。現在、２０種類のｃＰＡ誘導体が合成されている。そのうち、本研究で用いなかったｃＰＡ誘導体の浸潤抑制活性については、既に向井らによって調べられており、その結果、Ｐａｌ−ｃＰＡは約８５％、Ｏｌｅ−ｃＰＡは約６０％、ＰＨＹＬＰＡ、ΔＰａｌ−ｃＰＡ、Ｌａｕ−ｃＰＡ、Ａｒａ−ｃＰＡは５０％前後、ＬＰＡ誘導性の浸潤を抑制していた（Ｍｕｋａｉ，Ｍ．，他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１，９１８−９２２（１９９９））。今回用いたｃＰＡ誘導体の構造を、図２に示した。
細胞培養
３００ｇのオスのドンリューラット（日本生物材料）を無菌的に開腹し、それから得た腸間膜を、３７℃で１５分間、０．２５％トリプシン処理し、１５０μｍのステンレスメッシュで濾過、遠心して中皮細胞を回収した。２倍量のイーグルＭＥＭアミノ酸ビタミン培地（ニッスイ）を添加したイーグルＭＥＭ１（ニッスイ）に、１０％ＦＢＳを加えたメディウムで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。一週間培養してコンフルエントまで育った単層の中皮細胞を、浸潤アッセイに用いた。
ラット腹水肝癌細胞（ＡＨ−１３０）の高浸潤性クローンであるＭＭ１細胞は、向井らによって確立され（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：８１，９１８−９２２（１９９９））、中皮細胞と同様の条件下で培養した。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイは、明渡らにより開発された（Ａｋｅｄｏ，Ｈ．，他，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６，２４１６−２４２２（１９８６））。コンフルエントになるまで育てた中皮細胞層に、１０％ＦＢＳ、または２５μＭ  ＬＰＡ（ＳＩＧＭＡ）存在下で、ＭＭ１細胞を重層培養し、２５μＭ  ｃＰＡを添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２０時間培養したのち、１０％ホルマリンで固定して、位相差顕微鏡下で、浸潤したＭＭ１細胞のコロニーをカウントした（図３）。
ｃＰＡ及びＬＰＡは、０．１％ｆａｔｔｙ−ａｃｉｄ  ｆｒｅｅ  ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）を含むＰＢＳ中で氷冷して超音波処理し、エマルジョン化して、−２０℃に保存したものを使用した。
（Ｂ）結果及び考察
１１種類のｃＰＡ誘導体による癌細胞浸潤抑制
いくつかのｃＰＡ誘導体のうち、Ｐａｌ−ｃＰＡがＦＢＳ誘導性、ＬＰＡ誘導性のいずれの浸潤をも強く抑制することが明らかになっている（Ｍｕｋａｉ，Ｍ．，他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１，９１８−９２２（１９９９））。ｃＰＡの構造と、浸潤抑制の強さの関連を調べるために、Ｐａｌ−ｃＰＡを含む化学合成した１１種類のｃＰＡ誘導体の癌細胞浸潤への影響を調べた。
１０％ＦＢＳ存在下で浸潤アッセイを開始して２０時間後に細胞を固定し、浸潤したコロニーをカウントしたところ、Ｐａｌ−ｃＰＡ以外に５種類の２５μＭ  ｃＰＡ誘導体について、５０％を越える浸潤抑制が見られた（図４）。この５種類について、さらにＬＰＡ誘導性の浸潤に対する影響を調べた（図５）。その結果、グリセロール骨格１位に結合する脂肪酸種の違いによる浸潤抑制活性の差が見いだされた。ｓｎ−１位にＥＰＡを持つｃＰＡ−１２によって、ＦＢＳ誘導の浸潤は約７０％抑制されたが、ＬＰＡ誘導の浸潤は抑制されなかった。このことから、ＦＢＳ中には、ＬＰＡ以外の浸潤促進因子が含まれ、ｃＰＡ−１２はその因子に誘導される浸潤を抑制している可能性が考えられる。このことは、１０％ＦＢＳあるいは２５μＭ  ＬＰＡにより、ＭＭ１細胞の浸潤が同程度に誘導されるが、１０％ＦＢＳを含む培地中のＬＰＡ濃度はその１／１０程度である事とも一致する。さらには、ｃＰＡによる浸潤抑制作用が、その脂肪酸種によって特異性を付与されていることが示され、この構造−活性相関についてはさらに検討する必要があろう。また、環状リン酸基の開環を防ぐためにデザインされた、ｓｎ−３位のＯをＣに置き換えたｃａｒｂａ−ｃＰＡによって、強い浸潤抑制活性が観察された。
また、ＭＭ１細胞のみｃＰＡで前処理し、メディウムで洗ってからＬＰＡ存在下で中皮細胞に重層した場合にも、浸潤抑制活性は失われなかったこと、また、中皮細胞のみをｃＰＡで前処理し、洗浄後にＬＰＡ存在下でＭＭ１細胞を重層した場合に明らかな浸潤が見られたことから、ｃＰＡは中皮細胞ではなく、ＭＭ１細胞に影響していることが示された。
（１−２）Ｃａｒｂａ−ｃＰＡによる癌細胞浸潤抑制
（Ａ）材料及び方法
Ｃａｒｂａ−ｃＰＡの合成
Ｃａｒｂａ−ｃＰＡの合成法は、東京理科大学薬学部、小林進によって開発された。以下の文中の数字は、図６の図中の番号と一致する。
市販の（Ｒ）−ベンジルグリシジルエーテル（１）をＢＦ３・Ｅｔ２Ｏで活性化させ、メチルホスホン酸ジメチルエステルにｎ−ＢｕＬｉを作用させて得られるリチオ体を反応させることでアルコール（２）を得た。得られたアルコールを、トルエン中で過剰のｐ−トルエンスルホン酸のピリジニウム塩を用いて８０℃で反応させることにより、環化体（３）を得た。この環化体を、水素雰囲気下で２０％Ｐｄ（ＯＨ）２−Ｃを用いて加水素分解し、脱ベンジル化を行った（４）。縮合剤として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を用いて、脂肪酸と反応させてカップリング体（５）を得た。次に、求核剤としてブロモトリメチルシランを用いて、メチル基だけを位置選択的に除去し、環状ホスホン酸（６）を得た。これをエーテルを用いて分液ロートに移しこみ、少量の０．０２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、分液操作を行い、ナトリウム塩（７）として抽出、精製した。
低濃度のｃａｒｂａ−ｃＰＡを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ
ＭＭ１細胞に０．５μＭ、１μＭ、１０μＭのｃａｒｂａ−ｃＰＡを添加し、２５μＭ  ＬＰＡ存在下で１−１と同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイを行った。
ＭＭ１細胞の増殖に対するｃａｒｂａ−ｃＰＡの影響
１０％ＦＢＳを含むメディウムに、１２．５μＭ、２５μＭのｃＰＡを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間、７２時間培養したＭＭ１細胞の細胞数を、血球計算盤を用いてカウントした。
（Ｂ）結果及び考察
低濃度のｃａｒｂａ−ｃＰＡによる癌細胞浸潤抑制
脂肪酸種による抑制活性の差を見るために、低濃度のｃａｒｂａ−ｃＰＡを添加して浸潤アッセイを行った（図７）。
天然体ｃＰＡでは、ｓｎ−１位にパルミチン酸の結合したものが最も強く浸潤を抑制したが、ｃａｒｂａ−ｃＰＡでは、パルミチン酸が結合したｃＰＡ−１８よりも、オレイン酸の結合したｃＰＡ−１９、パルミトオレイン酸の結合したｃＰＡ−２０の方が、強い浸潤抑制活性を示した。
ＭＭ１細胞の増殖に対するｃａｒｂａ−ｃＰＡの影響
図８に示したように、ｓｎ−１位にパルミチン酸の結合したｃＰＡは、天然体（ｃＰＡ−５）もｃａｒｂａ体（ｃＰＡ−１８）もＭＭ１細胞の増殖には影響しなかった。一方、より強い浸潤抑制活性を示したｃａｒｂａ−Ｏｌｅ−ｃＰＡ（ｃＰＡ−１９）、ｃａｒｂａ−ΔＰａｌ−ｃＰＡ（ｃＰＡ−２０）は、増殖抑制作用をも示した。天然体でもＯｌｅ−ｃＰＡ、ΔＰａｌ−ｃＰＡがいずれも増殖抑制作用をもつ事が示されているが、これらの分子種の浸潤抑制作用は弱いことが、向井らにより報告されている（Ｍｕｋａｉ，Ｍ．，他，Ｉｎｔ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１，９１８−９２２（１９９９））。従って、脂肪酸の種類による細胞増殖への影響と、浸潤抑制作用とは、おそらく独立した現象であると考えられる。
実施例２：血清・ＬＰＡに依存しない癌細胞の浸潤に対するｃＰＡの効果
（Ａ）材料及び方法
細胞培養
ヒト繊維肉腫細胞であるＨＴ−１０８０細胞は、向井らにより確立され（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：８１，９１８−９２２（１９９９））、１／１００量の非必須アミノ酸溶液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を添加したイーグルＭＥＭ１（ニッスイ）に、１０％ＦＢＳを加えたメディウムで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ
ＨＴ−１０８０細胞を、０．０５％トリプシン処理によって回収し、無血清培地で洗浄後、血清・ＬＰＡ非存在下で第１章に示したのと同様なアッセイを行い、４時間後に細胞を固定し、浸潤した細胞をカウントした。
ＨＴ−１０８０細胞の培養上清を用いたＭＭ１細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ
ＨＴ−１０８０細胞のメディウムを無血清培地に換えて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２０時間培養した。このメディウムを回収し、遠心した上清を、培養上清として用いた。この上清を用いて、一度洗ったＭＭ１細胞を懸濁し、段落００４３と同様に浸潤アッセイを行った。
（Ｂ）結果及び考察
血清・ＬＰＡ非依存的な癌細胞浸潤に対するｃａｒｂａ−ｃＰＡの影響
ＨＴ−１０８０細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ系において、血清・ＬＰＡ非依存的に浸潤する。この現象もまた、Ｐａｌ−ｃＰＡによって抑制されることが見いだされている（Ｍｕｋａｉ，Ｍ．，他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１，９１８−９２２（１９９９））。この知見に基づいて、同じ脂肪酸を持つｃＰＡ−１８（ｃａｒｂａ−Ｐａｌ−ｃＰＡ）を用いて、この細胞の浸潤に対するｃａｒｂａ−ｃＰＡの影響を調べた。図９に示したように、ｃａｒｂａ−ｃＰＡはこの細胞においても、天然体と同程度か、またはそれ以上の強さの浸潤抑制活性を示した。
ＨＴ−１０８０細胞の培養上清がＭＭ１細胞の浸潤に与える影響
ＨＴ−１０８０細胞が自らＬＰＡを合成し、そのＬＰＡによって浸潤が誘導される可能性を考え、ＬＰＡ依存的に浸潤するＭＭ１細胞をＨＴ−１０８０細胞の培養上清で懸濁し、中皮細胞に重層して、浸潤が起こるか否かを検討した。ＨＴ−１０８０細胞の無血清培養上清で、１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＭＭ１細胞を懸濁し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイを行った結果を表１に示す。
その結果、ＭＭ１細胞の浸潤は促進されず（表１）、また、ＨＴ−１０８０細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ系に、２５μＭのＬＰＡを添加してみても、浸潤がより促進されることはなかった。これらのことから、ＨＴ−１０８０細胞の浸潤促進因子はＬＰＡとは別のものであることが示唆された。
0004163007.tif 000004
実施例３：ｃＰＡによる浸潤抑制のシグナル伝達系の解析
（Ａ）材料及び方法
細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させる試薬の、浸潤に対する影響
ｃＡＭＰ合成酵素であるアデニル酸シクラーゼを直接活性化するＦｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｗａｋｏ）、アデニル酸シクラーゼを活性化するＧタンパク質（Ｇｓ）の不活性化を妨げるコレラ毒素（ＣＴＸ、Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、膜透過性で、細胞内に入ってｃＡＭＰと同様の働きをするＢｔ２ｃＡＭＰ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）、ｃＡＭＰ分解酵素であるホスホジエステラーゼを阻害するイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ、３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）（ＳＩＧＭＡ）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ系に添加し、２５μＭ  ＬＰＡ存在下でＭＭ１細胞の浸潤に対する影響を調べた。
細胞内ｃＡＭＰの測定
無血清培地中のＭＭ１細胞を１ｍＭのＩＢＭＸで１０分間前処理した後、２５μＭのＬＰＡまたはｃＰＡ、ポジティブコントロールとして、浸潤を抑制することが確認された１０μＭのＦｏｒｓｋｏｌｉｎを添加し、一定時間後、１０％氷冷ＴＣＡを加えて反応を止めた。遠心した上清を、ｗａｔｅｒ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒで４回洗ってＴＣＡを除き、６０℃の窒素ガス流下で溶媒を全てとばし、得られたサンプル中のｃＡＭＰを、Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ［３Ｈ］ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて測定した。
（Ｂ）結果と考察
細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇が、癌細胞の浸潤に与える影響
細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇が、ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａの活性化を介して低分子量Ｇタンパク質の一つであるＲｈｏの活性を阻害することが知られている（Ｌａｕｄａｎｎａ，Ｃ．，他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２４１４１−２４１４４（１９９７）；及びＤｏｎｇ，Ｊ−Ｍ．，他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２２５５４−２２５６２（１９９８））。また、Ｐａｌ−ｃＰＡが、ＭＭ１細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇を導くことが報告されている（Ｍｕｋａｉ，Ｍ．，他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１，９１８−９２２（１９９９））。このことから、Ｒｈｏを介することが明らかになっているＬＰＡ誘導性の浸潤に対するｃＡＭＰの影響を調べた。
図１０に示したように、どの試薬によっても、癌細胞の浸潤は抑制された。このことから、このうちの一つ、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎをポジティブコントロールとして用い、ｃａｒｂａ−ｃＰＡ添加による細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を測定し、その浸潤抑制活性への関与を検討した。
Ｃａｒｂａ−ｃＰＡの、細胞内ｃＡＭＰ濃度に対する影響
図１１に示したように、ＦｏｒｓｋｏｌｉｎによるｃＡＭＰ濃度の上昇が測定できているにも関わらず、以前に報告されているような、Ｐａｌ−ｃＰＡの添加によるｃＡＭＰ濃度の早い上昇を確認することができなかった。また、ｃａｒｂａ−Ｐａｌ−ｃＰＡの添加によっても結果は同様だった。しかし、同じ細胞で、ＬＰＡによって浸潤は誘導され、Ｐａｌ−ｃＰＡによってその浸潤は抑制されることから、ｃＡＭＰを介さない、別の浸潤抑制機構の存在が示唆された。
（実施例１〜３のまとめ）
実施例１では、種々のｃＰＡ誘導体を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイを行った。最初に、血清誘導性の浸潤に対するｃＰＡの影響を調べたところ、図４に示したように、構造の違いによる浸潤抑制活性の差が見られた。このうち、２５μＭ添加することによって５０％を越える浸潤抑制を示す、Ｐａｌ−ｃＰＡを含む６種類のｃＰＡ誘導体について、ＬＰＡ誘導性の浸潤に対する影響を調べた（図５）。血清誘導性の浸潤を約７０％抑制した、ｓｎ−１位にＥＰＡを有するｃＰＡ−１２は、ＬＰＡ誘導性の浸潤を抑制しなかった。このことから、血清中にＬＰＡ以外の浸潤促進物質が存在する可能性が示唆された。さらに、環状リン酸基の開環を防ぐためにデザインされた、ｓｎ−３位のＯをＣに置き換えたｃａｒｂａ−ｃＰＡによる、浸潤抑制活性が見いだされた。この活性は非常に強く、天然体の１０〜１００倍ほどであった（図７）。
実施例２では、このｃａｒｂａ−ｃＰＡに注目し、浸潤に血清・ＬＰＡを必要としない癌細胞を用いて、その浸潤に対するｃａｒｂａ−ｃＰＡの効果を調べた。図９に示したように、ＬＰＡ非依存性の浸潤においても、ｃａｒｂａ−ｃＰＡによる、天然体ｃＰＡと同様な強い浸潤抑制活性がみられた。
さらに実施例３では、ｃａｒｂａ−ｃＰＡによる浸潤抑制の作用機作の解析を行った。ＬＰＡが低分子量タンパク質の一つであるＲｈｏの活性化を介して浸潤を促進すること、また、Ｐａｌ−ｃＰＡの添加によって細胞内ｃＡＭＰ濃度が上昇し、さらにＲｈｏの活性が抑制されることから、ｃａｒｂａ−ｃＰＡによっても細胞内ｃＡＭＰ濃度が上昇し、その結果として浸潤が抑制される可能性を考え、細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定を行った（図１１）。しかし、ポジティブコントロールであるＦｏｒｓｋｏｌｉｎによるｃＡＭＰ濃度の上昇が測定されているにもかかわらず、Ｐａｌ−ｃＰＡによるｃＡＭＰ濃度の上昇を確認することができなかった。さらに、ｃａｒｂａ−Ｐａｌ−ｃＰＡによってもｃＡＭＰ濃度の変化は見られなかった。Ｐａｌ−ｃＰＡについて、再現性がみられないことについては、ＭＭ１細胞が変化してしまった可能性が考えられる。しかし、この細胞においても血清・ＬＰＡによる浸潤誘導、さらにＰａｌ−ｃＰＡによる浸潤抑制は見られることから、ｃＡＭＰを介さない、別の浸潤抑制の系の存在が示唆された。
実施例４：Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ血行性肺転移モデルを用いたＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａの肺転移に対する環状ホスファチジン酸誘導体ｃＰＡ−１９及びｃＰＡ−２０の抑制作用
（試験材料及び方法）
１．被験物質、媒体及び陽性対照物質
被験物質としてｃＰＡ−１９及びｃＰＡ−２０を使用した。媒体として、Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｂｏｖｉｎｅ［ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｆｒｅｅ］（ＢＳＡ，Ｌｏｔ  Ｎｏ．８９Ｈ７６０４，Ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ）をＣａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳ（ｐＨ７．２）により溶解して調製した０．１ｗ／ｖ％  ＢＳＡ／ＰＢＳを使用した。調製後、フィルター（０．２２μｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濾過滅菌した。用時調製した。陽性対照物質としてｃＰＡ−５を使用した。
２．混合物調製法及び頻度
被験物質又は陽性対照物質に対して必要量の媒体を加え、超音波処理により溶解し、０．１６ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。さらに被験物質では０．１６ｍｇ／ｍＬ溶液を媒体により希釈し、０．０８及び０．０２ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。混合物質はいずれも用時調製した。
３．試験系及び試験系の環境条件
日本チャールス・リバー株式会社よりマウスを購入した。系統はＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊ、性別は雌、入荷動物数は６０匹、入荷時週齢は４週齢、体重範囲は１０．２〜１４．０ｇであった。試験系の環境条件は以下の通りである
温度：２３〜２６℃、湿度：５４〜６０℃、換気回数：１３回／時、照明：１２時間（午前７時〜午後７時）、飼料：固型飼料ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母工業株式会社）を高圧蒸気滅菌して自由に摂取させた。飲水：次亜塩素酸ナトリウムを添加した井戸水（残留塩素濃度約２ｐｐｍ）を給水瓶で自由に摂取させた。床敷：ホワイトフレーク（日本チャールス・リバー株式会社）を高圧蒸気滅菌して使用した。飼育ケージ及び交換頻度：高圧蒸気滅菌したポリカーボネイト製ケージ（Ｗ２１５×Ｈ１４０×Ｄ３２０ｍｍ）を使用し、床敷と同時に１週間に２回交換した。ケージ収容動物数：検疫馴化期間においては１ケージ当たり５匹、試験期間においては１ケージ当たり３匹収容した。洗浄及び消毒：飼育室の清掃を毎日行い、床を消毒液で清拭した。
４．試験方法
４．１  腫瘍細胞の名称
腫瘍細胞としてマウス悪性黒色腫Ｂ１６−Ｆ０を使用した。大日本製薬株式会社より購入した。
４．２  培養
培養は１０％Ｆｅｒａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ及びカナマイシン含有のダルベッコ変法イーグル培地を使用した。３７℃、５％ＣＯ２に設定したＣＯ２インキュベーター内で、９５％湿度条件下で静置培養した。腫瘍細胞がセミコンフルエントの状態に達した後、０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ混合液により細胞をハーベストした。培地を加えトリプシンの作用を停止させるとともにビペッティングを行い、細胞浮遊液を調製した。培養用培地により１／１０に希釈して、移植に十分な量となるまで継代した。
４．３  移植用腫瘍細胞浮遊液の調製
継代法と同じ手法により、細胞浮遊液を調製した。即ち、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないリン酸緩衝液［ＰＢＳ（−）］により細胞を洗浄した後、回収した細胞を１０ｍＬ  ＰＢＳ（−）に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液の細胞数を計測し、全細胞数とした。５０μＬの細胞懸濁液、１００μＬの０．４％トリパンブルー液及び１００μＬのＰＢＳ（−）を混合し、生細胞数を計測した。生細胞数及び全細胞数より細胞の生存率を算出した。これらの結果をもとに、生細胞数を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、移植用の腫瘍細胞浮遊液を調製した。
４．４  投与
被験物質投与日の体重を基に、層別連続無作為化法により下記の表２に示す８試験群に群分けした。
0004163007.tif 000005
以前の試験の結果より、被験物質及び陽性対照物質はＢ１６マウス悪性黒色腫の増殖抑制作を示さないことが判明している。よって媒体、被験物質又は陽性対照物質をＢ１６−Ｆ０細胞浮遊液と１：１の割合で混合し、この混合液を尾静脈内に投与した。移植細胞数は５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｂｏｄｙであった。被験物質の用量は０．００１，０．００４もしくは０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙであり、陽性対照物質の用量は０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙであった。
４．５  一般状態の観察及び体重測定
被験物質投与後１４日までを観察期間とした。この間に毎日生死の確認を行い、一般状態を観察した。週２回体重測定を行った。
４．６  剖検
被験物質投与後１４日に、イソフルラン麻酔下にて腹大静脈後部より採血を行った。放血致死後、胸腔内及び腹腔内の転移結節の有無を確認した。肺を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリン溶液にて固定後、肺転移結節数を実体顕微鏡下（倍率：１０倍）にて計測した。
４．７  病理組織学的検査
肺転移結節数を計測後、標本をパラフィン包埋し、薄切切片を作製した。これらの切片よりヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製したのち、左葉及び後葉の一定部位において、転移巣の数を計測し、大きさにより分類した。大きさは転移巣の長径において４０倍の対物レンズ径（０．６５ｍｍ）を基準として０．６５ｍｍ未満のものを小型とし、０．６５ｍｍ以上１．３０ｍｍ未満のものを大型として分類した。また、転移巣に対するリンパ球の浸潤の程度を定性的に確認した。
５．統計学的解析処理方法
各試験群の代表値は、平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）で表示した。平均値の差の検定は、転移結節数については媒体群とｃＰＡ−１９群との間、及び媒体群とｃＰＡ−２０群との間でＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）により行い、媒体群とｃＰＡ−５群との間でＳｔｕｄｅｎｔのＴ−検定により検定を行った。転移巣数については媒体群を対照として、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｔｅｓｔにより検定を行った。転移結節又は転移巣を有する個体数については媒体群を対照としてＦｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔ（Ｆｉｓｈｅｒの抽出可能性検定）により検定を行った。有意水準は１及び５％とした。
（結果）
１．一般状態
全試験群において、観察期間中の死亡例はみられなかった。また、一般状態に異常は認められなかった。
２．体重の推移（図１２、表３）
各試験群における体重の推移を図１２および表３に示す。
0004163007.tif 000006
被験物質投与日において、媒体群では１６．０±０．５ｇであった。ｃＰＡ−１９の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では、それぞれ１５．９±０．６，１５．９±０．６及び１５．９±０．６ｇであった。ｃＰＡ−２０の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では、それぞれ１５．９±０．６，１６．０±０．６及び１５．９±０．５ｇであった。ｃＰＡ−５群では１５．９±０．６ｇであった。被験物質投与後４日において、媒体群では１５．７±０．８ｇであった。ｃＰＡ−１９の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では、それぞれ１５．５±０．５，１６．０±０．５及び１５．４±０．５ｇであった。ｃＰＡ−２０の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では、それぞれ１５．５±０．３，１６．０±０．７及び１６．１±０．８ｇであった。ｃＰＡ−５群では１５．８±０．９ｇであった。被験物質投与後７日において、媒体群では１６．１±１．１ｇであった。ｃＰＡ−１９の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では、それぞれ１５．８±０．７，１６．１±０．６及び１５．９±０．５ｇであった。ｃＰＡ−２０の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では、それぞれ１６．１±０．６，１６．２±０．６及び１６．３±０．８ｇであった。ｃＰＡ−５群では１６．２±１．０ｇであった。被験物質投与後１１日において、媒体群では１６．９±１．２ｇであった。ｃＰＡ−１９の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では、それぞれ１６．５±１．０，１６．７±０．６及び１６．８±０．５ｇであった。ｃＰＡ−２０の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では、それぞれ１６．８±０．４，１６．９±０．７及び１７．０±０．９ｇであった。ｃＰＡ−５群では１７．０±０．８ｇであった。被験物質投与後１４日において、媒体群では１７．３±１．２ｇであった。ｃＰＡ−１９の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では、それぞれ１７．１±１．２，１７．６±０．９及び１７．０±０．４ｇであった。ｃＰＡ−２０の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では、それぞれ１７．４±０．６，１７．５±０．８及び１７．７±０．８ｇであった。ｃＰＡ−５群では１７．４±１．０ｇであった。各測定時点において、体重値を媒体群と比較したところ、ｃＰＡ−１９，ｃＰＡ−２０及びｃＰＡ−５群では有意差は認められなかった。また、各測定時点の体重値を被験物質投与日の体重値と比較したところ、被験物質投与後４日において媒体群、ｃＰＡ−１９の０．００１及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群、ｃＰＡ−２０の０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群及びｃＰＡ−５では一過性の体重減少が認められた。
３．肺転移結節（図１３、表４）
被験物質投与後１４日に摘出した、肺における転移結節数の結果を図１３および表４に示す。
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転移結節を有する個体数は媒体群では６例であった。ｃＰＡ−１９の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群ではそれぞれ６，６及び０例であった。ｃＰＡ−２０の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群ではそれぞれ６，２及び１例であった。ｃＰＡ−５群では６例であった。転移結節を有する個体数は、媒体群と比較してｃＰＡ−１９の０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群、ｃＰＡ−２０の０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では有意に減少した。
転移結節数は、媒体群では４９±２０（最少−最大：２８−８４、以下同じ）個であった。ｃＰＡ−１９群の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群ではそれぞれ５４±１２（３７−６６），４±２（２−６）及び０±０（０）個であった。ｃＰＡ−２０群の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群ではそれぞれ５８±４０（１７−１１２）、１±２（０−４）及び０±０（０−１）個であった。ｃＰＡ−５群では２１±１３（５−３８）個であった。肺転移結節数は、媒体群と比較してｃＰＡ−１９の０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群ｃＰＡ−２０の０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では有意に減少し、またｃＰＡ−５群においても有意に減少した。
４．剖検（表５）
剖検の結果を表５に示す。
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媒体群において胸腔内（１例）、腹腔内では脾臓（５例）、卵巣（２例）及び脂肪組織（２例）にて転移結節が認められた。ｃＰＡ−１９の０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において胸腔内（１例）、腹腔内では脾臓（１例）、卵巣（２例）、副腎（１例）、腎臓（２例）及び脂肪組織（１例）において転移結節が認められた。ｃＰＡ−１９の０．００４ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において胸腔内では転移結節は認められず、腹腔内では脾臓（１例）、副腎（１例）及び脂肪組織（１例）において転移結節が認められた。ｃＰＡ−１９の０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において胸腔内では転移結節は認められず、腹腔内では脾臓（１例）において転移結節が認められた。ｃＰＡ−２０の０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において、胸腔内（１例）、腹腔内では横隔膜（１例）、脾臓（１例）、卵巣（１例）、及び陰核腺傍（１例）において転移結節が認められた。ｃＰＡ−２０の０．００４ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において胸腔内では転移結節は認められず、腹腔内では脾臓（１例）において転移結節が認められた。ｃＰＡ−２０の０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において胸腔内では転移結節は認められず、腹腔内では脾臓（１例）において転移結節が認められた。ｃＰＡ−５群において胸腔内では転移結節は認められず、腹腔内では脾臓（３例）において転移結節が認められた。ｃＰＡ−１９群及びｃＰＡ−２０群において、用量の増加に伴い、胸腔内や腹腔内に転移結節を有する個体数が減少した。
５．病理組織学的検査（図１４、表６および表７）
病理組織学的検査の結果を図１４、表６および表７に示す。
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転移巣を有する個体数は媒体群では６例であった。ｃＰＡ−１９の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群ではそれぞれ６，２及び０例であった。ｃＰＡ−２０の０．００１，０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群ではそれぞれ４，１及び０例であった。ｃＰＡ−５群では５例であった。転移巣を有する個体数は、媒体群と比較してｃＰＡ−１９の０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群、ｃＰＡ−２０の０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では有意に減少した。
肺の転移巣数は、媒体群において小型の転移巣が１．３±１．５個、大型の転移巣が１．３±１．０個でありその合計は２．７±２．４個であった。ｃＰＡ−１９の０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において小型の転移巣が３．０±１．３個、大型の転移巣が０．７±０．８個でありその合計は３．７±１．８個であった。ｃＰＡ−１９の０．００４ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において小型の転移巣が０．３±０．５個であり大型の転移巣は認められなかった。ｃＰＡ−１９の０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群においては転移巣は認められなかった。ｃＰＡ−２０の０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において小型の転移巣が３．２±３．５個、大型の転移巣が１．２±１．３個でありその合計は４．３±４．６個であった。ｃＰＡ−２０の０．００４ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において小型の転移巣が０．２±０．４個であり大型の転移巣は認められなかった。ｃＰＡ−２０の０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群においては転移巣は認められなかった。ｃＰＡ−５群において小型の転移巣が１．２±０．８個、大型の転移巣が０．８±０．８個でありその合計は２．０±１．３個であった。媒体群と比較して、小型の転移巣はｃＰＡ−１９の０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群及びｃＰＡ−２０の０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において、大型の転移巣ではｃＰＡ−１９の０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群、ｃＰＡ−２０の０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において、またそれらの合計ではｃＰＡ−１９の０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群、ｃＰＡ−２０の０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群において、それぞれ有意に減少した。
転移巣に対するリンパ球の浸潤は媒体群では６例中１例に認められた。ｃＰＡ−１９の０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では６例中１例に転移巣に対するリンパ球の浸潤が認められ、０．００４ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群の２例では認められなかった。ｃＰＡ−２０の０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では４例中１例に転移巣に対するリンパ球の浸潤が認められ、０．００４ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群の１例では認められなかった。ｃＰＡ−５群では５例中２例に転移巣に対するリンパ球の浸潤が認められた。各試験群において、転移巣に対するリンパ球の浸潤の程度に差は認められなかった。
（考察）
癌転移の主要経路の１つである血行性転移は、癌細胞の原発巣からの離脱と周辺組織への浸潤から始まり、リンパ管や血管へ侵入し、色々な器官の毛細血管床での接着を経て、遠隔部位での増殖による転移巣の形成に至るまで複雑な反応カスケードから成り立っている。本実験で用いたＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ血行性肺転移モデルは、原発巣を遊離した癌細胞が脈管内に侵入した以降の過程を調べることが可能なモデルである（Ｐｏｓｔｅ  Ｇ．ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ  Ｉ．Ｊ．：Ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２８３：１３９−１４６（１９８０）；及び、がん転移研究会編［責任編集］入村達郎：がんの浸潤・転移研究マニュアル，株式会社金芳堂，ｐ．７−１１、京都（１９９４））。リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）はリゾリン脂質メディエーターの１つであり（小林哲幸，室伏きみ子：リゾリン脂質メディエーターとしてのリゾホスファチジン酸と環状ホスファチジン酸の存在，代謝及び生理機能，蛋白質  核酸  酵素  ４４：１１１８−１１２６（１９９９））、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤実験系において浸潤を強く誘導することが知られている（向井睦子，明渡均：リゾホスファチジン酸によるがん細胞浸潤の誘導と環状ホスファチジン酸による浸潤の抑制，蛋白質  核酸  酵素  ４４：１１２６−１１３１（１９９９）；Ｍｕｋａｉ  Ｍ．，Ｉｍａｍｕｒａ  Ｆ．，Ａｙａｋｉ  Ｍ．，Ｓｈｉｎｋａｉ  Ｋ．，Ｉｗａｓａｋｉ  Ｔ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ−Ｍｕｒｏｆｕｓｈｉ  Ｋ．，Ｍｕｒｏｆｕｓｈｉ  Ｈ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ．，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｈ．ａｎｄ  Ａｋｅｄｏ  Ｈ．：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｒｉｄｉｅ  ａｃｉｄ（ｃｙｃｌｉｃ  ＬＰＡ）．Ｉｎｔ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：９１８−９２２（１９９９））。このＬＰＡの構造類似体である環状ホスファチジン酸（ｃＰＡ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤実験系においてＬＰＡとは反対に浸潤を強く抑制することが知られている（小林哲幸，室伏きみ子：リゾリン脂質メディエーターとしてのリゾホスファチジン酸と環状ホスファチジン酸の存在，代謝及び生理機能，蛋白質  核酸  酵素  ４４：１１１８−１１２６（１９９９）。そこで今回、Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ血行性肺転移モデルを用いて、ｃＰＡ誘導体であるｃＰＡ−１９及びｃＰＡ−２０のマウス悪性黒色腫Ｂ１６−Ｆ０の肺転移に対する抑制作用を検討した。
体重の経時的推移において、ｃＰＡ−１９の０．００１及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群、ｃＰＡ−２０の０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では一過性の体重減少が認められた。これは媒体群やｃＰＡ−５群においても認められており、ｃＰＡ−１９の０．００４ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群及びｃＰＡ−２０の０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群では認められないことから、被験物質の作用によるものではないと考えられる。またその後順調な体重増加が認められたことから、ｃＰＡ−１９及びｃＰＡ−２０は体重の変化に対して影響を与えないと考えられる。また、肺におけるＢ１６−Ｆ０の転移結節数において、媒体群では十分な結節数が認められたことから、今回の試験系に問題はなかったと考えられる。ｃＰＡ−１９及びｃＰＡ−２０の両試験群において０．００４ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群は転移結節数を有意に減少させ、０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群ではほぼ完全に転移を抑制した。また肺組織内部の転移巣や肺以外の転移においても同様の結果が得られた。これはｃＰＡ−１９及びｃＰＡ−２０がＢ１６−Ｆ０の転移を抑制したためと考えられる。一方、ｃＰＡ−５群では有意な転移結節数の減少は認められたが、転移巣数を減少させる作用は認められなかった。
以上のことから、本実験モデルにおいてｃＰＡ−１９及びｃＰＡ−２０は０．００４及び０．００８ｍｇ／ｂｏｄｙの用量においてＢ１６−Ｆ０の肺転移を抑制する作用を示し、その作用はｃＰＡ−５より強いことが明らかとなった。
産業上の利用の可能性
癌の転移は、腫瘍の悪性化を示す最も顕著な現象であり、複雑な過程を経て成立する。なかでも癌細胞の浸潤は特徴的な段階である。本発明によりｃａｒｂａ−ｃＰＡが強い浸潤抑制活性を有することが判明し、新規な癌転移抑制剤を提供することが可能になった。本発明の癌転移抑制剤の利用は、癌治療へ大きく貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＬＰＡ、ＰＨＹＬＰＡ、及びｃＰＡの構造を示す図である。
図２は、化学合成されたｃＰＡ誘導体の構造を示す図である。
図３は、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ系を示す図である。
（ａ）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイの方法。コンフルエントな状態まで培養した単層正常細胞層に、癌細胞を重層培養し、一定時間後に細胞を固定し、位相差顕微鏡下で観察した。
（ｂ）浸潤した細胞の、位相差顕微鏡による観察像。矢印で示したものが浸潤した癌細胞（ＭＭ１）。
図４は、ＦＢＳで誘導した浸潤に対するｃＰＡ誘導体の効果を示す図である。１０％ＦＢＳ存在下で１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＭＭ１細胞に２５μＭのｃＰＡ誘導体を添加し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイを行った。ｃＰＡによる浸潤抑制作用を、コントロールに対する割合（％）で示した。
図５は、ＬＰＡで誘導した浸潤に対するｃＰＡ誘導体の効果を示す図である。２５μＭ  ＬＰＡ存在下で１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＭＭ１細胞に２５μＭのｃＰＡ誘導体を添加し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイを行った。ｃＰＡによる浸潤抑制作用を、コントロールに対する割合（％）で示した。
図６は、Ｃａｒｂａ−ｃＰＡの化学合成の経路を示す図である。図中の番号は、実施例１の（１−２）に記載した合成の説明中の数字に一致する。
図７は、ＬＰＡで誘導した浸潤に対するｃａｒｂａ−ｃＰＡの効果を示す図である。
２５μＭ  ＬＰＡ存在下で１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＭＭ１細胞に、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭのｃａｒｂａ−ｃＰＡを添加し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイを行った。ｃａｒｂａ−ｃＰＡによる浸潤抑制作用を、コントロールに対する割合（％）で示した。
図８は、ＭＭ１細胞の増殖に対するｃＰＡの効果を示す図である。
１０％ＦＢＳ存在下で１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＭＭ１細胞に１２．５μＭ、２５μＭのｃＰＡを添加して培養し、２４時間後、７２時間後の細胞数をカウントした。
図９は、ＨＴ−１０８０細胞の浸潤に対するｃＰＡの効果を示す図である。
血清・ＬＰＡ非存在下で２×１０５ｅｅｌｌｓ／ｍｌのＨＴ−１０８０細胞に、１０μＭのｃＰＡを添加し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイを行った。ｃＰＡによる浸潤抑制作用を、コントロールに対する割合（％）で示した。
図１０は、ＬＰＡで誘導した浸潤に対するｃＡＭＰ上昇試薬の効果を示す図である。
２５μＭ  ＬＰＡ存在下で１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＭＭ１細胞に、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させる試薬を図中に示した濃度で添加し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイを行った。それらによる浸潤抑制作用を、コントロールに対する割合（％）で示した。
図１１は、細胞内サイクリックＡＭＰに対するｃＰＡの効果を示す図である。
２５μＭ  ｃＰＡをＭＭ１細胞に添加して一定時間後に反応を止め、細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定した。
図１２は、Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ血行性肺転移モデルを用いたＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａの肺転移に対する環状ホスファチジン酸誘導体ｃＰＡ−１９及びｃＰＡ−２０の抑制作用を調べた実験における各試験群における体重の推移を示す。
図１３は、Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ血行性肺転移モデルを用いたＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａの肺転移に対する環状ホスファチジン酸誘導体ｃＰＡ−１９及びｃＰＡ−２０の抑制作用を調べた実験において肺における転移結節数の結果を示す。
図１４は、Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ血行性肺転移モデルを用いたＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａの肺転移に対する環状ホスファチジン酸誘導体ｃＰＡ−１９及びｃＰＡ−２０の抑制作用を調べた実験において病理組織学的検査の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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