(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｌ−２−メチルアミノプロピオフェノンに作用して、ｄ−プソイドエフェドリンを生成する作用を有し、且つ、以下の理化学的性質を有するアミノケトン不斉還元酵素であるタンパク質。
基質：ｌ−２−メチルアミノプロピオフェノン
至適ｐＨ：ｐＨ８．１
至適温度：５５℃
補酵素：ＮＡＤＰ
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した分子量：約２８５００
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、アミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質の塩。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸。
【請求項６】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸を含有するベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを保有する形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体において発現させて得られるタンパク質。
【請求項１１】
請求項９に記載の形質転換体を該形質転換体が増殖可能な培地中で培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた該形質転換体からアミノケトン不斉還元酵素を精製する精製工程と、
を含むアミノケトン不斉還元酵素の製造方法。
【請求項１２】
モルガネラ  モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、ミクロバクテリウム  アルボレッセンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ノカルディオイデス  シンプレックス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、ムコー  アンビグアス（Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ）、ムコー  ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコー  フラジリス（Ｍｕｃｏｒ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、アブシジア  リヒテイミ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉ）、アスペルジラス  アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルジラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルジラス  オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルジラス  キャンディダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓ）、アスペルジラス  フォエチダス  バー．アシダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ  ｖａｒ．  ａｃｉｄｕｓ）、ペニシリウム  オキサリカム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）、グリフォーラ  フロンドーサ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）、ユーロチウム  レペンズ（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ）、ガノデルマ  ルシダム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ）、ハイポクレア  ゼラチノーザ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）、ヘリコスチルム  ニグリカンズ（Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、バーチシリウム  ファンジコーラ  バ−．ファンジコーラ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｇｉｃｏｌａ  ｖａｒ．  ｆｕｎｇｉｃｏｌａ）、フサリウム  ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、トリチラチウム  オリーゼ（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、モルチエレラ  イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、アルミラリエラ  メレア（Ａｒｍｉｌｌａｒｉｅｌｌａ  ｍｅｌｌｅａ）、シリンドロカルポン  スクレロチゲナム（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）、クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アウレオバクテリウム  エステラロマチカム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、シュ−ドモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、マイコバクテリウム  スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム  ジエンホフェリ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｅｒｎｈｏｆｅｒｉ）、マイコバクテリウム  バカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ）、マイコバクテリウム  フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム  クロロフェノリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｍ）、スポロボロマイセス  サルモニカラー（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、スポロボロマイセス  コラリフォルミス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｒａｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、スポリディオボルス  ジョンソニイ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）およびペニシリウム  シアネウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｙａｎｅｕｍ）に属する微生物群から選ばれる少なくとも一つの微生物であり、且つ、ｌ−２−メチルアミノプロピオフェノンを還元しｄ−プソイドエフェドリンを生成する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた微生物から請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質を精製する精製工程と、
を含むアミノケトン不斉還元酵素の製造方法。
【請求項１３】
ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）に属し、且つ、ｌ−２−メチルアミノプロピオフェノンを還元しｄ−プソイドエフェドリンを生成する能力を有する微生物。
【請求項１４】
前記微生物がロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＭＡＫ−３４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５１号）である請求項１３に記載の微生物。
【請求項１５】
一般式（１）：
【化１】
0004136663.tif 000039
（式中、Ｘは同一または異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基およびスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ１は低級アルキル基を示し、Ｒ２，Ｒ３は同一または異なっていてもよく、水素原子および低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し、＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物またはその塩のエナンチオマー混合物に請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質またはその塩を作用させて一般式（２）：
【化２】
0004136663.tif 000040
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記と同じ）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめる光学活性アミノアルコールの製造方法。
【請求項１６】
一般式（１）：
【化３】
0004136663.tif 000041
（式中、Ｘは同一または異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基およびスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ１は低級アルキル基を示し、Ｒ２，Ｒ３は同一または異なっていてもよく、水素原子および低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し、＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物またはその塩のエナンチオマー混合物に、請求項９に記載の形質転換体、請求項１３に記載の微生物及び請求項１４に記載の微生物からなる群より選ばれるいずれか一つの微生物を作用させて一般式（２）：
【化４】
0004136663.tif 000042
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記と同じ）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめる光学活性アミノアルコールの製造方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の光学活性アミノアルコールの製造方法において、一般式（３）：
【化５】
0004136663.tif 000043
（上記式中Ａは、構造式（Ｙ）または（Ｚ）を表し、
【化６】
0004136663.tif 000044
（Ｒ４は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環又はＲ8と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表す。）、
【化７】
0004136663.tif 000045
（Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、若しくはＲ６又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ６は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ8と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環、Ｒ５またはＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ７は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）、
Ｒ８は水素原子、カルボキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ４と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格、Ｒ６と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環を表し、Ｒ９は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアシル基、Ｒ５またはＲ６と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ１０は水素原子または置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
で表される化合物、又はその製薬学的に許容される塩あるいは溶媒和物をさらに添加して光学活性アミノアルコールを生成させる光学活性アミノアルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アミノケトン不斉還元酵素、前記酵素をコードする核酸、前記酵素を産生する微生物及びこれらを用いた光学活性アミノアルコールの製造方法に関する。
背景技術
エフェドリンは古くから発汗、解熱、鎮咳などの目的に用いられてきたが、中でもｄ−プソイドエフェドリンは抗炎症作用を有することが知られている。また、ｌ−エフェドリンには血管収縮作用、血圧上昇作用または発汗などの薬理作用が知られており、交感神経興奮剤として医療に使用される。また、ｌ−エフェドリンは気管支喘息治療にも使用される。すなわち、光学活性なエフェドリンを含む光学活性β−アミノアルコールを製造する方法は、医薬またはその中間体を製造する過程において有用であり、効率的な製造方法が望まれている。
従来、所望の光学活性を有するβ−アミノアルコールの製造方法としては、ラセミ体のβ−アミノアルコールを得た後、光学分割あるいは不斉合成等によって特定の光学活性体を製造する方法が用いられていた。
しかし、ラセミ体のβ−アミノアルコールその分子内に２個の不斉炭素を有するため、特定の光学活性体を得るためには煩雑な工程を経なければならなかった。
例えば、Ｇｅｒ．（Ｅａｓｔ）１３６８３，Ａｕｇ，２７，１９５７によれば、β−アミノアルコールの一種である光学活性エフェドリンの場合、ベンズアルデヒドから酵母を利用した発酵によって得られた光学活性フェニルアセチルカルビノールにメチルアミンを還元縮合することにより、エリスロ−１−２−メチルアミノ−１−フェニル−１−プロパノール、すなわち、１−エフェドリンを製造することができると報告されていた。
また、プソイドエフェドリンを得る方法としては、さらに、１−エフェドリンから無水酢酸によってオキサゾリンを生成した後、加水分解し、スレオ体すなわちｄ−プソイドエフェドリンに反転することにより製造可能であることが報告されていた（米国特許第４２３７３０４号）。
上記のように１−フェニル−２−メチルアミノ−１−プロパノンから所望の光学活性を有するプソイドエフェドリンを製造するためには、いったん、光学活性なエリスロ体のエフェドリンを得た後、スレオ体に反転するという工程が必要となるため、工程数も長く煩雑となり、収率も低下するという問題があった。
さらに前記プソイドエフェドリンの製造においては、原料のケトン体の還元時にジアステレオマーが相当量副生する一方、ジアステレオマーの原料としての回収が困難であり、経済的にも不利であった。
一方、特開平８−９８６９７号公報記載の方法によれば、分子内に不斉炭素原子１個を有する２−アミノ−１−フェニルエタノール化合物から特定の微生物を用いて光学活性な２−アミノ−１−フェニルエタノール誘導体を製造することができるが、２個の不斉炭素原子を有するβ−アミノアルコールについては未だ効果的な製造法がないのが現状であった。
発明の開示
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、α−アミノケトン化合物またはその塩のエナンチオマー混合物から、所望の光学活性を有するβ−アミノアルコールを高収率且つ高選択的に製造可能な作用を有するアミノケトン不斉還元酵素を提供することを目的とする。また、アミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、前記核酸で形質転換せしめた形質転換体、前記形質転換体を用いる前記タンパク質の製造方法及び前記形質転換体又は前記タンパク質の用途を提供することを目的とする。さらに、α−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物から効率よく光学活性β−アミノアルコールを変換する新規微生物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、特定の微生物から精製されたアミノケトン不斉還元酵素を用いることにより、α−アミノケトン化合物またはその塩のエナンチオマー混合物の一方の鏡像異性体のみを還元し、対応するβ−アミノアルコールの４種の異性体のうち１種のみを選択的かつ高収率で製造することができることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明のタンパク質は、１−２−メチルアミノプロピオフェノンに作用して、ｄ−プソイドエフェドリンを生成する作用を有し、且つ、以下の理化学的性質を有するアミノケトン不斉還元酵素であることを特徴とするタンパク質である。
基質：１−２−メチルアミノプロピオフェノン
至適ｐＨ：ｐＨ８．１
至適温度：５５℃
補酵素：ＮＡＤＰ
分子量：約２８５００Ｄａホモテトラマー
また、本発明のタンパク質は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質である。
さらに、本発明のタンパク質は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、アミノケトン不斉還元活性を有することを特徴とするタンパク質あるいはそれらの部分ペプチドである。
ここで、前記タンパク質の塩、あるいは前記タンパク質の部分ペプチドの塩も本発明に包含される。
また、本発明の核酸は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸である。
また、本発明の核酸は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有することを特徴とする核酸である。
さらに、本発明の核酸は、配列表の配列番号２に記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸である。
ここで、本発明の核酸は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の一部からなることを特徴とする核酸であってもよい。
これらの核酸をプラスミド等に導入することにより、本発明のベクターを得ることができる。
また、前記ベクターを宿主に導入することにより、本発明の形質転換体を得ることができる。このような形質転換体を用いて製造したアミノケトン不斉還元酵素またはその部分ペプチドも本発明に包含される。
また、本発明のアミノケトン不斉還元酵素またはその部分ペプチドの製造方法は、前記の形質転換体を該形質転換体が増殖可能な培地中で培養する培養工程と、前記培養工程で得られた該形質転換体からアミノケトン不斉還元酵素またはその部分ペプチドを精製する精製工程と、を含むことを特徴とする方法である。
さらに、本発明のアミノケトン不斉還元酵素またはその部分ペプチドの製造方法は、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スヒンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属、ムコー（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アスペルジラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、グリフォーラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）属、ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属、ガノデルマ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）属、ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属、ヘリコスチルム（Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ）属、バーチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、トリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）属、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、アルミラリエラ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉｅｌｌａ）属、シリンドロカルポン（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、アウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、スポリディオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物群から選ばれる少なくとも一つの微生物であり、且つ、１−２−メチルアミノプロピオフェノンを還元しｄ−プソイドエフェドリンを生成する能力を有する微生物を培養する培養工程と、前記培養工程で得られた微生物からアミノケトン不斉還元酵素またはその部分ペプチドを精製する工程とを含むことを特徴とする方法である。
また、本発明の微生物は、ロドコッカス属Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓに属し、且つ、１−２−メチルアミノプロピオフェノンを還元しｄ−プソイドエフェドリンを生成する能力を有することを特徴とする微生物である。
中でも、前記微生物がロドコッカス  エリスロポリス  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＡＫ−３４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５１号）であることが好ましい。
また、本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法は、一般式（１）：
0004136663.tif 000002
（式中、Ｘは同一または異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基およびスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ１は低級アルキル基を示し、Ｒ２，Ｒ３は同一または異なっていてもよく、水素原子および低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し、＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物またはその塩のエナンチオマー混合物に前記のタンパク質またはその部分ペプチドあるいはそれらの塩を作用させて一般式（２）：
0004136663.tif 000003
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記と同じ）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめることを特徴とする光学活性アミノアルコールの製造方法である。
さらに、本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法は、一般式（１）：
0004136663.tif 000004
で表されるα−アミノケトン化合物またはその塩のエナンチオマー混合物に、前記形質転換体、ロドコッカス属に属する微生物及びロドコッカス（エリスロポリス）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＭＡＫ−３４からなる群より選ばれるいずれか一つの微生物を作用させて一般式（２）：
0004136663.tif 000005
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめることを特徴とする光学活性アミノアルコールの製造方法である。
前記光学活性アミノアルコールの製造方法においては、一般式（３）：
0004136663.tif 000006
（上記式中Ａは、構造式（Ｙ）または（Ｚ）を表し、
0004136663.tif 000007
（Ｒ４は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環又はＲ８と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表す。）、
0004136663.tif 000008
（Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、若しくはＲ６又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ６は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環、Ｒ５またはＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ７は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）、
Ｒ８は水素原子、カルボキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ４と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格、Ｒ６と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環を表し、Ｒ９は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアシル基、Ｒ５またはＲ６と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ１０は水素原子または置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
で表される化合物、又はその製薬学的に許容される塩あるいは溶媒和物をさらに添加して光学活性アミノアルコールを生成させることが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
なお、本明細書及び図面において、塩基及びアミノ酸等を略号で表示する場合は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また、アミノ酸に光学異性体が存在する場合は、特に断らないかぎりＬ−体を示す。
先ず、本発明のタンパク質について説明する。
本発明のタンパク質は、１−２−メチルアミノプロピオフェノンに作用して、ｄ−プソイドエフェドリンを生成する作用を有し、且つ、以下の理化学的性質を有するアミノケトン不斉還元酵素であることを特徴とするタンパク質である。
基質：１−２−メチルアミノプロピオフェノン
至適ｐＨ：ｐＨ８．１
至適温度：５５℃
補酵素：ＮＡＤＰ
分子量：約２８５００Ｄａホモテトラマー。
前記タンパク質は、１−２−メチルアミノプロピオフェノンに作用してｄ−プソイドエフェドリンを生成する作用を有するのみならず、１−２−ジメチルアミノプロピオフェノン、アミノアセトン、１−アミノ−２−ブタノンに対して還元活性を示す。また、１−アミノ−２−プロパノールに作用してアミノアセトンを生成する。
前述した理化学的性質以外の性質として、各種金属イオン又は阻害剤による影響について検討がなされており、α，α’−Ｄｉｐｙｒｉｄｙｌ、ｏ−Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎ、ＥＤＴＡにより阻害されることが確認されている。
前記タンパク質は、アミノケトン不斉還元活性を有する微生物を培養し、得られた菌体から精製することにより得られる。
前記培養の方法としては、使用する微生物が生育可能な条件であれば特に制限はなく公知の方法が使用でき、通常、炭素源、窒素源、その他養分を含む液体培地が使用される。培地の炭素源としては、上記微生物が利用可能であればいずれでも使用できる。具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン、デンプン、ソルビトール等の糖類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類およびその塩類、パラフィン等の炭化水素類、あるいはこれらの混合物等が使用できる。窒素源としては上記微生物が利用可能であればいずれでも使用できる。具体的には、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩；フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩；肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン等の無機または有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物等が使用できる。また、培地には、無機塩、微量金属塩、ビタミン類等の通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。また、必要に応じて、培地には、微生物の増殖を促進する物質、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質等を添加してもよい。
微生物の培養は、生育に適した条件下で行うことができる。具体的には培地のｐＨ３〜１０、好ましくは４〜９、温度０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で行うことができる。微生物の培養は、好気的または嫌気的条件下で行うことができる。培養時間は１０〜１５０時間が好ましいが、それぞれの微生物により適宜決められるべきである。
このようにして培養された微生物は、その培養液をろ過または遠心分離して菌体を得、その菌体を水又は緩衝液でよく洗浄する。洗浄した菌体は適量の緩衝液に懸濁し、菌体を破砕する。破砕の方法としては特に制限はないが、例えば、乳鉢、ダイノミル、フレンチプレス、超音波破砕機等の機械的破砕法が挙げられる。得られた菌体の破砕液中より、固形物をろ過または遠心分離によって除去して得られた無細胞抽出液中のアミノケトン不斉還元酵素は酵素単離の常法によって採取される。
このような酵素単離の方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法等の塩析；セファデックス等によるゲルろ過法；ジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基等を持つ担体等を用いたイオン交換クロマトグラフィー法；ブチル基、オクチル基、フェニル基等疎水性基を持つ担体等を用いた疎水性クロマトグラフィー法；色素ゲルクロマトグラフィー法；電気泳動法；透析；限外ろ過法；アフィニティ・クロマトグラフィー法；高速液体クロマトグラフィー法等により精製することができる。
さらに、前記酵素を固定化酵素として用いることもできる。このような方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、酵素又は酵素産生細胞を固定化したものが挙げられ、共有結合法や吸着法といった担体結合法、架橋法、包括法等により固定化できる。また、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート等の縮合剤を必要に応じて使用してもよい。また、他の固定化法としては、例えば、モノマーを重合反応でゲル化させて行うモノマー法；通常のモノマーよりも大きな分子を重合させるプレポリマー法；ポリマーをゲル化させて行うポリマー法；ポリアクリルアミドを用いた固定化；アルギン酸、コラーゲン、ゼラチン、寒天、κ−カラギーナン等の天然高分子を用いた固定化；光硬化性樹脂、ウレタンポリマー等の合成高分子を用いた固定化が挙げられる。
このようにして精製された酵素は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等）によって単一バンドが確認されれば精製が十分に行われたものと判断される。
また、前記アミノケトン不斉還元活性を有する微生物としては、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スヒンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属、ムコー（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アスペルジラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、グリフォーラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）属、ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属、ガノデルマ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）属、ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属、ヘリコスチルム（Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ）属、バーチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、トリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）属、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、アルミラリエラ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉｅｌｌａ）属、シリンドロカルポン（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、アウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、スポリディオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物群から選ばれる少なくとも一つの微生物であることが好ましく、より具体的には、モルガネラ  モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、ミクロバクテリウム  アルボレッセンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）、スヒンゴバクテリウム  マルチボラム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ）、ノカルディオイデス  シンプレックス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、ムコー  アンビグアス（Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ）、ムコー  ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコー  フラジリス（Ｍｕｃｏｒ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、アブシジア  リヒテイミ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉ）、アスペルジラス  アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルジラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルジラス  オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルジラス  キャンディダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓ）、アスペルジラス  オリーゼ  バー．オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｖａｒ．ｏｌｙｚａｅ）、アスペルジラス  フォエチダス  バー．アシダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ  ｖａｒ．ａｃｉｄｕｓ）、ペニシリウム  オキサリカム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）、グリフォーラ  フロンドーサ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）、ユーロチウム  レペンズ（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ）、ガノデルマ  ルシダム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ）、ハイポクレア  ゼラチノーザ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）、ヘリコスチルム  ニグリカンズ（Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ  ��ｉｇｒｉｃａｎｓ）、バーチシリウム  ファンジコーラ  バー．ファンジコーラ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｇｉｃｏｌａ  ｖａｒ．ｆｕｎｇｉｃｏｌａ）、フサリウム  ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、トリチラチウム  オリーゼ（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、モルチエレラ  イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、アルミラリエラ  メレア（Ａｒｍｉｌｌａｒｉｅｌｌａ  ｍｅｌｌｅａ）、シリンドロカルポン  スクレロチゲナム（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）、クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アウレオバクテリウム  エステラロマチカム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、マイコバクテリウム  スメダマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム  ジエンホフェリ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｅｒｎｈｏｆｅｒｉ）、マイコバクテリウム  バカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ）、マイコバクテリウム  フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム  フォルツィタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム  クロロフェノリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｍ）、スポロボロマイセス  サルモニカラー（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、スポロボロマイセス  コラリフォルミス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｒａｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、スポリディオボルス  ジョンソニイ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス  ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）が挙げられる。
前記微生物は、野生株、変種株、又は細胞融合若しくは遺伝子操作法等の手法によって誘導される組換え体等、いずれの株であってもよく、少なくとも一種を使用すればよい。
さらに、本発明にかかるアミノケトン不斉還元活性を有する微生物の一種であり、特に効果的なアミノケトン不斉還元活性を有する新規微生物としてロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＭＡＫ−３４株が挙げられる。ロドコッカス  エリスロポリス  ＭＡＫ−３４株は、本発明者らが自然界より分離した新規な微生物で、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５１として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にて平成１３年２月１５日に受託されている。
ロドコッカス  エリスロポリス  ＭＡＫ−３４株の菌学的性質は以下のとおりである。
分類学的性質
（１）形態的性質
細胞の形状：桿菌
細胞の大きさ：１．０×１．５〜２．０μｍ
特徴：Ｖ型形成
運動性：−
胞子：−。
（２）培養的性質
培養温度：３０℃
コロニー形態：円形、周辺侵食状、凸状、やや光沢あり、クリーム色
ゼラチンの液化：−。
（３）生理学的性質
グラム染色：＋
硝酸塩還元：−
クエン酸塩の利用：＋
ウレアーゼ：＋
オキシダーゼ：−
カタラーゼ：＋
酸素に対する態度：好気性
Ｏ／Ｆテスト：−
ピラジミダーゼ：−
ピロリドニルアリルアミダーゼ：−
アルカリフォスフォターゼ：＋
β−グルクロニダーゼ    ：−
β−ガラクトシダーゼ    ：−
α−グルコシダーゼ：＋
Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ：−
エスクリン（グルコシダーゼ）：＋
炭水化物の利用性
乳糖：−
麦芽糖：＋
マンノース：＋
安息香酸塩：＋
ブタン−２，３−ジオール：＋
シトラコン酸：−
Ｄ−マンデル酸：−
ＤＬ−ノルロイシン：＋
ピメリン酸：−
スペルミン：−。
（４）１６Ｓ  ｒＲＮＡの全塩基配列を解析し  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｅｑのデータベースと照合した。
当該株と近縁とされる菌株とその相違性
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ              ０．５６％
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ                  ０．７６％
Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ    ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ    ２．５４％
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ                      ２．９４％
以上の結果より、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓが相同率９９．４４％で最も近縁な菌群であるとの知見が得られた。
また、本発明のタンパク質は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、前記アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、アミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質である。
このような欠失、挿入、置換、付加を施す方法としては特に制限はなく、公知の方法が使用できる。例えば、日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、ｐ１０５（広瀬進）、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸１１１（組換えＤＮＡ技術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５４，ｐ．３５０  ＆  ｐ．３６７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００，ｐ．４５７  ＆  ｐ．４６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｊ．Ａ．Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅ”，Ｖｏｌ．３４，ｐ．３１５（１９８５）；Ｔ．Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ”，Ｖｏｌ．１３，ｐ．３３０５（１９８５）；Ｊ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．”，Ｖｏｌ．１３，ｐ．８７６５（１９８５）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”．Ｖｏｌ．１５５．ｐ．５６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ａ．Ｒ．Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅ”，Ｖｏｌ．４４，ｐ．１７７（１９８６）に記載の方法が挙げられる。具体的には、例えば、合成オリゴヌクレオチド等を利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、Ｋｕｎｋｅｌ法、ｄＮＴＰ［αＳ］法（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）法、亜硫酸や亜硝酸等を用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
また、多くのタンパク質には糖鎖が付加されている場合があり、アミノ酸を１若しくは複数置換することにより糖鎖の付加を調節することができる。従って、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、前記糖鎖の調節されたタンパク質も上述のアミノケトン不斉還元活性を有する限りは、本発明のタンパク質に包含される。
さらに得られた本発明のタンパク質は、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例えば、ペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ等の酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体に改変することができる。
また、遺伝子組換え法で製造する時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるいは生体外で天然のアミノケトン不斉還元酵素と実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。この場合、遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、こうした融合タンパク質はその融合部を利用してアフィニティクロマトグラフィー等で精製することも可能である。タンパク質の構造の修飾・改変等は、例えば日本生化学会編、「新生化学実験講座１、タンパク質ＶＩＩ、タンパク質工学」、東京化学同人（１９９３）を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができる。
さらに、本発明は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであってもよい。本発明は、天然のアミノケトン不斉還元酵素に特有なアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個等）欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個等）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個等）のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体も包含する。天然のアミノケトン不斉還元酵素の特徴であるドメイン構造を有しているものも包含されてよい。また、同質のアミノケトン不斉還元酵素活性を有するものも挙げられる。
天然のアミノケトン不斉還元酵素の特徴であるドメイン構造が維持されていれば、上記のごとき変異体は、全て本発明に包含される。また本発明の天然のアミノケトン不斉還元酵素と実質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さらに天然のアミノケトン不斉還元酵素と実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。こうした本発明のアミノケトン不斉還元酵素は、下記で説明するように分離・精製処理されることができる。一方では、こうして本発明は上記したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、そして天然の特性の全部あるいは一部を有するアミノケトン不斉還元酵素のポリペプチド、さらにその類縁体あるいは誘導体をコードするＤＮＡ配列も包含する。該アミノケトン不斉還元酵素の塩基配列は、修飾（例えば、付加、除去、置換等）されることもでき、そうした修飾されたものも包含されてよい。
次に、本発明の核酸について説明する。
本発明の核酸は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸である。
すなわち、一つのアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）は複数存在するため、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸は多数存在する。従って、このような核酸も本発明の核酸に包含される。ここで、「タンパク質をコードする」とは、ＤＮＡが２本鎖である場合には、相補２本鎖のいずれか一方がタンパク質をコードする塩基配列を有するものを含むことを意味するため、本発明の核酸には配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を直接コードする塩基配列からなる核酸若しくはその相補的な塩基配列からなる核酸も包含される。
また、本発明の核酸は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有することを特徴とする核酸である。
配列表の配列番号２に記載の塩基配列は、上述した微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、アミノケトン不斉還元酵素のアミノ酸配列に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により得られたＤＮＡの塩基配列である。
ここで、前記微生物からゲノムＤＮＡを抽出する方法としては特に制限はないが、例えば、培養して得られた微生物（例えば、ロドコッカス  エリスロポリス  ＭＡＫ−３４株）の菌体を破砕し、常法により染色体ＤＮＡを遠心分離後、ＲＮＡを分解除去し、除タンパク操作を行って、ＤＮＡを精製する。これらの操作については「植物バイオテクノロジー実験マニュアル：農村文化社、２５２頁」を参照できる。またロドコッカス属に属するアミノケトン不斉還元酵素産生能をもつ微生物であれば、ＤＮＡ源として好適に用いることができる。
また、前記ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマーの作製方法としては、公知の方法を用いることができ、アミノケトン不斉還元酵素のアミノ酸情報に基づいて合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製する。
例えば、上記の微生物であり、且つ、アミノケトン不斉還元酵素産生能を有する微生物から得られた精製アミノケトン不斉還元酵素のアミノ酸情報に基づいて合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製することができる。一般的には、アミノ酸配列を基に、デシェネレイテッド・プライマー等を作製する。プライマーの作製は、当該分野で公知の方法で行うことができ、例えばＤＮＡ自動合成装置を用い、フォスフォジエステル法、フォスフォトリエステル法、フォスフォアミダイト法等により合成できる。具体的には、ロドコッカス・エリスロポリスを栄養培地中で培養して得られた菌体からアミノケトン不斉還元酵素を精製し、必要に応じペプチド加水分解酵素等で断片化し、その酵素のアミノ酸配列の情報を収集する。こうして得られたアミノ酸配列の情報より、好ましい合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製する。このプライマーを用い、アミノケトン不斉還元酵素のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応は、当該分野で公知の方法、あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えばＲ．Ｓａｉｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３０，ｐｐ．１３５０（１９８５）；Ｒ．Ｓａｉｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９，ｐｐ．４８７（１９８８）；Ｈｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ等に記載された方法に従って行うことができる。反応は、例えば、市販のキットや試薬を利用して行うことが出来る。
得られた増幅ＤＮＡ断片をシークエンスし、精製酵素のアミノ酸配列と相同な配列を含むことを確認し、それをアイソトープで標識しプローブとしてその後の実験等に使用する。塩基配列の決定は、ダイデオキシ法、例えばＭ１３ダイデオキシ法等、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法等を用いて行うことができるが、市販のシークエンシングキット、例えばＴａｑダイプライマーサイクルシークエンシングキット等を用いたり、自動塩基配列決定装置、例えば蛍光ＤＮＡシーケンサー装置等を用いて行うことが出来る。プローブ等を放射性同位体等によって標識するには、市販の標識キット、例えばランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈａｉｍ）等を使用して行うことが出来る。
また、本発明のアミノケトン不斉還元酵素遺伝子は、例えば次の方法でクローニングできる。具体的には、遺伝子組換え技術は、例えばＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｔ．（１９８９）；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００  ＆  １０１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５３，１５４  ＆  １５５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）等に記載の方法あるいはこれら文献において引用された文献記載の方法、あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。それらの手法は、本発明の目的に合わせて公知の手法に独自の改変改良を加えたものであってもよい。
また、本発明の核酸は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸である。
ここで、本発明にかかる「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、二つのＤＮＡ断片がサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ）」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９８９））Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行うことを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．１×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。
さらに、本発明の核酸は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の一部からなることを特徴とする核酸である。
次に，本発明のベクターについて説明する。
本発明のベクターは、前述した核酸を含有することを特徴とするベクターである。
ここで、前記核酸を組込むプラスミドとしては遺伝子工学的に常用される宿主細胞（例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母、等の真核細胞宿主）中で前記核酸にコードされているタンパク質が発現できるプラスミドであればどのようなプラスミドでもよい。こうした配列内には、例えば選択した宿主細胞で発現するのに好適なコドンを導入することや、制限酵素部位を設けることも可能である。また、目的とする遺伝子の発現を容易にするための制御配列、促進配列等、目的とする遺伝子を結合するのに役立つリンカー、アダプター等、さらには抗生物質耐性等を制御したり、代謝を制御したりし、菌体の選別等に有用な配列等を含ませることが可能である。
前記プラスミドに含まれるプロモーターとしては、大腸菌を宿主とするプラスミドでは、例えば、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、λファージＰＬプロモーターが挙げられ、酵母を宿主とするプラスミドでは、例えば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０プロモーターが挙げられる。
また、大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＶＣ１１９、ｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＴＺ−１８Ｒ／−１８Ｕ、ｐＴＺ−１９Ｒ／−１９Ｕ、ｐＧＥＭ−３、ｐＧＥＭ−４、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ−４Ｚ、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられる。大腸菌での発現に適したプラスミドベクターとしては、ｐＡＳ、ｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＭＣ１４０３、ｐＭＣ９３１、ｐＫＣ３０等も挙げられる。
酵母を宿主とするプラスミドとしては、例えば、ＹＩｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型ベクター、ＹＣｐ型ベクター、ｐＧＰＤ−２が挙げられる。
宿主細胞としては、宿主細胞が大腸菌の場合、例えば、大腸菌Ｋ１２株に由来するものが挙げられ、具体的には、ＮＭ５３３  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｃ６００、ＤＨ１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９等が挙げられる。
本発明の遺伝子工学的手法においては、当該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆転写酵素、ＤＮＡ断片をクローン化するのに適した構造に修飾したりあるいは変換するための酵素であるＤＮＡ修飾・分解酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡリガーゼ等を用いることが出来る。制限酵素としては、例えば、Ｒ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．１３，ｒ１６５（１９８５）；Ｓ．Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ｐ．１０９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２に記載のものが挙げられる。逆転写酵素としては、例えば、マウスモロネイ白血病ウイルス（ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ；ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＡＭＶ）由来の逆転写酵素が挙げられ、特にはＲＮａｓｅＨ欠損体を好ましく用いることが出来る。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、その誘導体であるクレノウ・フラグメント、大腸菌ファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱菌ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼとしては、例えば、Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００，ｐ．９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）に記載の３’−ＯＨ末端にデオキシヌクレオチド（ｄＮＭＰ）を付加するＴｄＴａｓｅが挙げられる。
ＤＮＡ修飾・分解酵素としては、例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼが挙げられ、具体的には、例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、大腸菌ＤＮＡエキソヌクレアーゼＩ、大腸菌ＤＮＡエキソヌクレアーゼＩＩＩ、大腸菌ＤＮＡエキソヌクレアーゼＶＩＩ、λエキソヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅＩ、ヌクレアーゼＳ１、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）ヌクレアーゼが挙げられる。
ＤＮＡリガーゼとしては、例えば、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼが挙げられる。
ＤＮＡ遺伝子をクローニングしてＤＮＡライブラリーを構築するのに適したベクターとしては、例えば、プラスミド、λファージ、コスミド、Ｐ１ファージ、Ｆ因子、ＹＡＣが挙げられる。中でも、λファージ由来のベクターが好ましく、具体的には、例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＤＡＳＨＩＩ、λＦＩＸＩＩ、λＥＭＢＬ３、λＺＡＰＩＩＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられる。
本発明のベクターを前述したような宿主細胞に導入することにより、本発明のアミノケトン不斉還元酵素を産生可能な微生物又は動物細胞等の形質転換体が得られる。このような形質転換体も本発明に包含される。
前記形質転換の方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いて行うことができるが、例えば、適当な細胞壁溶解酵素を用いて調製したプロトプラスト化した細胞に、塩化カルシウム、ポリエチレングリコール等の存在下でＤＮＡを接触させる方法や、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法（例えば、Ｅ．Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，“ＥＭＢＯ  Ｊ”，Ｖｏ．ｌ，ｐｐ．８４１（１９８２））、マイクロインジェクション法、遺伝子銃により打ち込む方法が挙げられる。
また、前記形質転換体を用いることにより、本発明のタンパク質を組換えタンパク質として製造することが可能である。このような組換えタンパク質の製造方法も本発明に包含される。
また本発明のタンパク質が封入体として得られた場合には、可溶化処理、例えば、塩酸グアニジン、尿素等の変成剤、さらには必要に応じ、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等の還元剤存在下に処理して活性型酵素として精製することもできる。酵素としては酵素産生細胞をそのまま用いることが出来る。
前記組換えタンパク質の製造に用いられる形質転換体としては、例えばアミノケトン不斉還元酵素遺伝子を導入したベクター（ｐＫＫ２２３−３）を保有する大腸菌（ＪＭ１０９）ＭＡＫ−ＥＸ４１（ＢＰ−７４５２）が挙げられる。ＭＡＫ−ＥＸ４１は平成１３年２月１５日（原寄託日）から茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）の経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）にブタペスト条約に基づき寄託され、受託番号ＢＰ−７４５２として保管されている。
次に、本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法について説明する。
本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法は、一般式（１）：
0004136663.tif 000009
（式中、Ｘは同一または異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基およびスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ１は低級アルキル基を示し、Ｒ２，Ｒ３は同一または異なっていてもよく、水素原子および低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し、＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物またはその塩のエナンチオマー混合物に前記のタンパク質を作用させて一般式（２）：
0004136663.tif 000010
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記と同じ）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめることを特徴とする光学活性アミノアルコールの製造方法である。
先ず、本発明にかかる一般式（１）で表されるα−アミノケトンについて説明する。
前記一般式（１）で示されるα−アミノケトン化合物またはその塩のエナンチオマー混合物であり、式中、Ｘは同一または異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基およびスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し、ｎは０〜３の整数を示し、Ｒ１は低級アルキル基を示し、Ｒ２，Ｒ３は同一または異なっていてもよく、水素原子および低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し、＊は不斉炭素を示す構造を有するものである。
以下、前記α−アミノケトンに含まれる置換基Ｘについて説明する。前記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子などが挙げられる。
また、低級アルキル基としては炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。これらは、直鎖状または分枝状のいずれの構造を取っていてもよい。また、置換基として、フッ素原子や塩素原子などのハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アミノ基またはアルコキシ基などを有していてもよい。
保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基の保護基としては、水で処理して除去可能なもの、酸または弱塩基で除去可能なもの、水素添加にて除去可能なもの、ルイス酸触媒およびチオ尿素などで除去可能なものなどが挙げられ、前記保護基には、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいシリル基、アルコキシアルキル基、置換基を有していてもよい低級アルキル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基およびトリチル基などが含まれる。
なお、前記アシル基には、アセチル基、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基およびｐ−ニトロベンゾイル基などが含まれる。また、置換基として、ヒドロキシル基、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基およびハロゲン原子などを有していてもよい。前記シリル基には、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基およびトリアリールシリル基などが含まれる。また、置換基として、アルキル基、アリール基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、ニトロ基およびハロゲン原子などの置換基を有していてもよい。前記アルコキシアルキル基には、メトキシメチル基および２−メトキシエトキシメチル基などが含まれる。前記低級アルキル基には炭素数１〜６のアルキル基が含まれ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。これらは直鎖状または分枝状のいずれの構造を取っていてもよい。また、置換基として、フッ素原子や塩素原子などのハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アミノ基およびアルコキシ基などを有していてもよい。
また、前記Ｘはニトロ基またはスルホニル基でもよく、具体的にはメチルスルホニル基などが挙げられる。
さらに、前記Ｘの数ｎは０〜３の整数であり、好ましくは０である。
また、前記一般式（Ｉ）中のＲ１は低級アルキル基を示す。このような低級アルキル基としては炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。これらは直鎖状または分枝状のいずれの構造を取ってもよい。
Ｒ２、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基を示す。前記低級アルキル基には炭素数１〜６のアルキル基が含まれ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。これらは直鎖状または分枝状のいずれの構造を取ってもよい。
また、前記α−アミノケトン化合物の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩などの無機酸の塩、または、酢酸、クエン酸などの有機酸の塩が挙げられる。
前記α−アミノケトンは、対応する１−フェニルケトン誘導体のα炭素をハロゲン化、例えば、ブロム化後、ブロム基などのハロゲンをアミンに置換することによって容易に合成できる（Ｇｅｒ．（Ｅａｓｔ）１１，３３２，Ｍａｒ．１２，１９５６）。
さらに、本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法は、一般式（１）：
0004136663.tif 000011
で表されるα−アミノケトンに、前記形質転換体、ロドコッカス属に属する微生物及びロドコッカス（エリスロポリス）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＭＡＫ−３４からなる群より選ばれるいずれか一つの微生物を作用させて一般式（２）：
0004136663.tif 000012
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめることを特徴とする光学活性アミノアルコールの製造方法である。
また、本発明のタンパク質は上述したものである。
すなわち、本発明のタンパク質は、１−２−メチルアミノプロピオフェノンに作用して、ｄ−プソイドエフェドリンを生成する作用を有し、且つ、以下の理化学的性質を有するアミノケトン不斉還元酵素であることを特徴とするタンパク質である。
基質：１−２−メチルアミノプロピオフェノン
至適ｐＨ：ｐＨ８．１
至適温度：５５℃
補酵素：ＮＡＤＰ
分子量：約２８５００Ｄａのホモテトラマー
また、前記タンパク質は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、前記タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。
また、本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法においては、前記タンパク質に代えて、前記形質転換体、ロドコッカス属に属する微生物、ロドコッカス（エリスロポリス）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＭＡＫ−３４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５１号）を直接反応系の中に添加して光学活性アミノアルコールの製造を行ってもよい。
次に、本発明にかかる一般式（２）で表される光学活性アミノアルコールについて説明する。
前記一般式（２）におけるＸ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記一般式（１）と同様である。さらに所望の光学活性を有するβ−アミノアルコールとしては（１Ｓ，２Ｓ）アミノアルコールが挙げられる。
前記反応を行う際の反応条件としては、例えば、液体培地で振盪培養した形質転換菌を集菌し、得られた菌体にアミノケトン水溶液（０．１〜１０％濃度）を加え、ｐＨを６〜８に調整しながら温度１０〜４０℃で数時間から１日反応させればよい。反応終了後、菌体を分離し、反応液中の生成物を単離することにより、光学活性アミノアルコールを得ることができる。ここで、形質転換菌の処理菌体（乾燥菌体や固定化菌体等）や形質転換菌から得られた酵素、又は、固定化酵素等も同様にして行うことが可能である。
また、本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法においては、一般式（３）：
0004136663.tif 000013
（上記式中Ａは、構造式（Ｙ）または（Ｚ）を表し、
0004136663.tif 000014
（Ｒ４は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環又はＲ８と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表す。）、
0004136663.tif 000015
（Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、若しくはＲ６又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ６は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環、Ｒ５またはＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ７は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ８は水素原子、カルボキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ４と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格、Ｒ６と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環を表し、Ｒ９は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアシル基、Ｒ５またはＲ６と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ１０は水素原子または置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
で表される化合物、又はその製薬学的に許容される塩あるいは溶媒和物を反応系にさらに加えて反応を行うことにより、より効率的に光学活性アミノアルコールの製造を行うことが可能である。
前記一般式（３）において、炭素数１〜３のアルキル基としては、直鎖状、分枝状のいずれであってもよく、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基などが挙げられる。また、炭素数１〜６のアルキル基としては、直鎖状、分枝状のいずれであってもよく、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、Ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。炭素数５〜１０の炭化水素環としてはシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニルおよびシクロデカニルなどが挙げられる。
ヘテロ原子１〜３個を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格において、ヘテロ原子としては窒素原子、酸素原子、硫黄原子などが挙げられ、特に好ましくは窒素原子、酸素原子が挙げられ、５〜８員環のヘテロ環状骨格としてはピロリジン、ピペリジン、イミダゾリジン、ピペラジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオフェンおよびモルホリンなどが挙げられる。
また、炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基としてはメチルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、イソブチルオキシカルボニル基およびｔ−ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。アシル基としてはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ピバロイル基、ベンゾイル基およびバレリル基などが挙げられる。前記の炭素数１〜３または炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基またはアシル基が置換基を有する場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の数に限定されないが、置換基としては、例えばフッ素原子や塩素原子などのハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ基、ニトロ基およびアリール基などが挙げられる。さらに、製薬学的に許容される塩としては塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸の塩、酢酸、クエン酸などの有機酸の塩、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、アンモニアなどの無機塩基の塩およびトリエチルアミン、シクロヘキシルアミンなどの有機塩基の塩が挙げられる。
このような一般式（３）で表される化合物としては、例えば、１−アセチルアミノ−２−ヒドロキシプロパン、１−メチルアミノ−２−ヒドロキシプロパン、１−アミノ−２−オキソプロパン、１−アミノ−２−ヒドロキシシクロペンタン、１−アミノ−２，３−ジヒドロキシプロパン、Ｌ−トレオニン、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、１−アミノ−２−オキソシクロヘキサン、モルホリン、３−ヒドロキシピロリジン、３−ヒドロキシピペリジン、２−アミノメチル−テトラヒドロフラン、１−（２−ヒドロキシプロピル）アミノ−２−ヒドロキシプロパン、１−ｔ−ブチロキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシプロパン、２−アミノ−３−ヒドロキシブタン、ＤＬ−セリン、１−アミノ−２−ヒドロキシプロパン、１−アミノ−２−ヒドロキシブタン、１−アミノ−２−ヒドロキシシクロヘキサンが挙げられる。これらのうち、不斉炭素原子を有する化合物においては、特に記載がない限り、光学活性体であっても、ラセミ体であってもよい。
これら活性誘導剤を培地中に添加することにより、微生物の活性が誘導され、その後の光学活性なβ−アミノアルコールの生成は、無添加時に比べ効率よく進行する。活性誘導剤は各々単独で用いてもよく、または複数の誘導剤の混合物で用いてもよい。このような活性誘導剤の添加量は、培地に対し０．０１〜１０重量％が望ましい。
以上説明したように、天然のアミノケトン不斉還元酵素、例えば、ロドコッカスエリスロポリス由来の天然のアミノケトン不斉還元酵素またはそれと実質的に同等な活性を有するタンパク質をコードする遺伝子構造が明らかにされ、前記タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡで形質転換せしめた宿主細胞、該宿主細胞を用いるタンパク質の製造方法、さらにはそれらタンパク質及び宿主細胞を用いての光学活性アミノアルコールの製造等の用途において飛躍的な発展を期待でき、さらにアミノケトン不斉還元酵素そのものの改変により酵素活性の飛躍的な上昇を可能ならしめることが可能である。
実施例
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
（アミノケトン不斉還元酵素の精製）
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＡＫ−３４をグルコース１％、リン酸水素二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２％、ペプトン１．５％、塩化ナトリウム０．２％、酵母エキス０．１％の組成（ｐＨ７．０）を有する培地５ｍｌを含む試験管に植菌し、２８℃で３日間振とう培養したものを、上記組成を有する培地５００ｍｌに接種し、２８℃で３日間振とう培養した。この前培養液を、上記組成に１−アミノ−２−ヒドロキシプロパン０．１％を加えた培地５０１に接種し、２８℃で２日間培養した。
前記培養液を遠心分離機で処理し、湿菌体３７８５ｇを得た。この菌体１ｋｇにグリセロール１０％、塩化ニッケル１ｍＭ、ニコチン酸１ｍＭを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１０００ｍｌを加え、９０−１００分間超音波破砕後、超遠心分離（３３，０００ｒｐｍ、６０分間）により無細胞抽出液７５９ｍｌを得た。この無細胞抽出液を上記緩衝液に対して透析を行った。この酵素液７７０ｍｌをＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（５．６×２０ｃｍ）に負荷し、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０．１５→０．８Ｍ）で溶離した。溶出した酵素活性画分１７３ｍｌを上記緩衝液に対して透析を行った。この酵素液１７３ｍｌをＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  １０／１０カラム（１．０×１０ｃｍ）に負荷し、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０→０．６Ｍ）で溶離した。溶出した酵素活性画分２８ｍｌを、ニコチン酸を含まない上記緩衝液に対して透析を行った。この酵素液２８ｍｌをＨｉＴｒａｐ  Ｂｌｕｅ（１ｍｌ）に負荷し、１０％グリセロール、１ｍＭ塩化ニッケル、２ｍＭニコチン酸、１．０Ｍ塩化ナトリウム、０．０２４％ＮＡＤＰ＋を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）でカラムを洗浄して溶出した酵素活性画分８．７ｍｌを得た。得られた酵素液８．７ｍｌに硫酸アンモニウム１．２Ｍを加えたものをＰｈｅｎｙｌ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ＨＲ  ５／５（０．５×５ｃｍ）に負荷し、硫酸アンモニウムの直線濃度勾配（１．２→０Ｍ）で溶離した。溶出した酵素活性画分２．１２ｍｌをアミコンＹＭ１０で限外ろ過し、得られた酵素濃縮液１５０μｌをＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＨＲ  １０／３０（１．０×３０ｃｍ）に負荷し、グリセロール１０％、塩化ニッケル１ｍＭ、ニコチン酸１ｍＭ、塩化ナトリウム０．１５Ｍを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で溶離した。溶出した酵素活性画分１．４５ｍｌをグリセロール１０％、塩化ニッケル１ｍＭ、ニコチン酸１ｍＭを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析を行った結果、精製酵素２９３μｇを含む精製酵素液を得た。
このようにして精製されたアミノケトン不斉還元酵素の性質を以下に示す。
（１）基質特異性及び酵素活性：
１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０μｌ、１６ｍＭ  ＮＡＤＰ＋２５μｌ、精製酵素液２１５μｌを４３℃に保ち、１−アミノ−２−ヒドロキシプロパン１μｌを加えてアミノアセトンを生成させた。反応に伴うＮＡＤＰＨの増減を３４０ｎｍの波長の吸光度変化で測定した。酵素活性の測定は下記条件で１分間に１μｍｏｌの１−アミノ−２−ヒドロキシプロパンが酸化される酵素活性を１単位（Ｕ）とする。その結果、全活性は１２６ｍＵ、比活性は４３２ｍＵ／ｍｇ、活性収率は０．２２％であった。
同様にして、１−２−メチルアミノプロピオフェノン、１−２−ジメチルアミノプロピオフェノン、１−アミノ−２−ブタノンに作用することが確認された。
（２）分子量
ゲルろ過法を用いて測定した場合は約１０５，０００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて測定した場合は約２８，５００であった（図１）。このことから本酵素は分子量約２８，５００のサブユニット４個からなる四量体タンパクであると考えられた。
（３）至適ｐＨ
精製酵素液１０μＬ、水４２０μＬ、１Ｍトリス塩酸緩衝液２０μＬ、１６ｍＭ  ＮＡＤＰ＋水溶液５０μＬを混合し、４５℃にてインキュベートし、１−アミノ−２−プロパノール２μＬを加え反応させた。分光光度計で３４０ｎｍの吸光度の時間変化から活性を算出した（図２）。その結果、至適ｐＨは約８．１であった。
（４）至適温度
精製酵素液１０μＬ、水４２０μＬ、０．１ＭＰ  ＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）２０μＬ、１６ｍＭ  ＮＡＤＰ＋水溶液５０μＬを混合し、各種温度にてインキュベートし、１−アミノ−２−プロパノール２μＬを加え反応させた。分光光度計で３４０ｎｍの吸光度の時間変化から活性を算出した（図３）。その結果、至適温度は５５℃であった．
（５）阻害剤、金属イオンの影響：
１ｍＭ濃度のα，α’−ジピリジル、１ｍＭ濃度のｏ−フェナンスロリン、１ｍＭ濃度のＥＤＴＡによって、それぞれ酵素活性は阻害された。
実施例２
（アミノケトン不斉還元酵素遺伝子のクローニングと大腸菌での発現）
（１）精製酵素のアミノ酸部分配列決定
凍結乾燥したアミノケトン不斉還元酵素１ｎｍｏｌを（サブユニット分子量約２８，５００として）８Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）５０μｌに溶かし、３７℃で１時間変性させた。これに５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）５０μｌを添加して尿素濃度を４Ｍとした。１２ｎｍｏｌ／ｍｌのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬）０．５μｌ（０．００６ｎｍｏｌ、Ｅ／Ｓ＝１／１６７）を添加し、３０℃で６時間消化をおこなった。得られた消化ペプチドを逆相カラム（アマシャムファルマシアバイオテク）で分取し、ＡＢＩ社４７６Ａプロテインシークエンサーでアミノ酸配列の分析をおこなった。結果は以下の通りであった。
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前記ペプチドの分取条件を以下に示す。
システム：ＳＭＡＲＴｓｙｓｔｅｍ
カラム：μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＳＣ２．１／１０
流速：１００μｌ／ｍｉｎ
溶離液：Ａ，０．１％ＴＦＡ
Ｂ，０．１％ＴＦＡ／８０％ＣＨ３ＣＮ
溶出条件：０−１５ｍｉｎ（１００％Ａ）→１５−７５ｍｉｎ（１００％Ａ→１００％Ｂ）のグラジエント溶出
カラム温度：室温
検出波長：２１４ｎｍおよび２８０ｎｍ。
（２）ゲノムＤＮＡの作製
対数増殖期後期の菌体（ＭＡＫ−３４）を遠心分離機で集菌した。得られた菌体をＴＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２．５％シュクロース，ｐＨ８．０）に懸濁した。この懸濁液にＥＤＴＡ、Ｈ２Ｏ、ＬｙｓｏｚｙｍｅとＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを添加し３７℃で２．５時間ゆっくり撹拌した。これに、ＳＤＳ添加後、撹拌した溶菌サンプルをフェノール、フェノール／クロロホルム、クロロホルムで順次処理して除タンパク操作をおこなった。ここに、３Ｍ酢酸ナトリウム１／１０容、エタノール２．５倍容添加し、ＤＮＡをガラス棒に巻き付けた。これを、７０％、８０％、９０％のエタノールで順次洗浄し、風乾したＤＮＡをＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）に溶解し、ＲＮａｓｅＡ処理したサンプルをフェノール、フェノール／クロロホルム、クロロホルムで順次処理して除タンパク操作をおこなった。ここに、３Ｍ酢酸ナトリウム１／１０容、エタノール２．５倍容添加しＤＮＡを沈殿させた後、７０％エタノールで洗浄し、風乾後ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒに溶解しゲノムＤＮＡ溶液（３６ｎｇ／μ）を得た。
（３）アミノケトン不斉還元酵素遺伝子の増幅
アミノケトン不斉還元酵素の内部ペプチドのアミノ酸配列（配列番号３〜７）を基に、以下のような塩基配列を有する、Ｎ−末端アミノ酸配列のセンスストランドに対応するセンスプライマーＭＡＫ−Ｓｅｎｓｅ１（配列番号８）と、内部ペプチド配列のアンチセンスストランドに対応するアンチセンスプライマーＭＡＫ−Ａｎｔｉ１（配列番号９）をそれぞれ合成した。ＭＡＫ−Ｓｅｎｓｅ１及びＭＡＫ−Ａｎｔｉ１は、それぞれディジェネレイトプライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｒｉｍｅｒ）であり、塩基配列中、ｙはＴ又はＣを、ｓはＣ又はＧを、ｈはＴ又はＣ又はＡを、ｒはＡ又はＧを、ｍはＣ又はＡを、ｗはＡ又はＴを、ｎはＡ又はＣ又はＧ又はＴを、それぞれ表す。
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アミノケトン不斉還元酵素のゲノムＤＮＡを鋳型として下記の条件でＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ増幅は、例えばＲ．Ｓａｋａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３０，ｐｐ．１３５０（１９８５）；Ｒ．Ｓａｋａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９，ｐｐ．４８７（１９８８）；ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）などに記載された方法にしたがって行われた。ＰＣＲ増幅により、約０．６ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を得た。
以下にＰＣＲの条件を示す。
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また、温度条件は以下の通りである。
９４℃／４分
９４℃／１分、５０℃／１分、７２℃／１．５分：３５サイクル
７２℃／１０分。
得られた増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後アミノ酸配列に変換したところ、アミノケトン不斉還元酵素の内部ペプチドの部分アミノ酸配列と同じ箇所が見出された。
塩基配列を決定した際に塩基配列が不明であった領域の塩基配列の決定をするために、ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行った。ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲは、例えばＨ．Ｏｃｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１２０，ｐｐ．６２１（１９８８）などに記載された方法にしたがって行われた。
まず、ゲノムＤＮＡ溶液を制限酵素（ＢｇｌＩＩ）処理し、フェノールクロロホルム処理、エタノール沈殿によって得られた、ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）で処理してセルフライゲーションした。これを、フェノールクロロホルム処理、エタノール沈殿することによって得られた環状化ＤＮＡを鋳型として、塩基配列が既知の部分から設計したセンスプライマー（ＩＰＣＲ−Ｓ１）及びアンチセンスプライマー（ＩＰＣＲ−Ａ１）を使用して、下記の条件でＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ増幅により、約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を得た。
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以下にＰＣＲの条件を示す。
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また、ＰＣＲ時の温度条件を以下に示す。
９４℃／４分
９４℃／１分、６０℃／１分、７２℃／４分：３０サイクル
７２℃／１０分
得られた増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、先の塩基配列を含めて、７８０ｂｐからなるＯＲＦが確認された。これを、アミノ酸配列に変換した結果、アミノケトン不斉還元酵素遺伝子全長を含んでいることが判明した（配列番号１）。
（４）アミノケトン不斉還元酵素遺伝子の大腸菌での発現
上記で明らかとなったアミノケトン不斉還元酵素遺伝子の塩基配列をもとに、制限酵素サイトを付加したプライマーを設計した。以下にその配列を示す。
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これらのプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型として下記の条件でＰＣＲを行った。その結果、約０．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲの条件を以下に示す。
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以下にＰＣＲ時の温度条件を示す。
９４℃／４分
９４℃／１分、６０℃／１分、７２℃／１．５分：２５サイクル
７２℃／１０分
こうして得られたＰＣＲ産物は両端にそれぞれＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトを持つので、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した後、制限酵素（ＥｃｏＲ  Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ）処理した。これをアガロース電気泳動後、バンドの切り出しを行い、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ，Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製した。これを、制限酵素（ＥｃｏＲ  Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ）処理済みのプラスミドｐＫＫ２２３−３とライゲーション（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＴＡＫＡＲＡ）し、発現ベクターを構築した。次に当該ベクターを“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，１９８９，ｅｄ．ｂｙ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載された方法に従い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９のコンピテントセルにトランスフォーメーションし、形質転換をおこなった。なお、当該形質転換体は、アンピシリン耐性株をコロニーＰＣＲすることにより選択し、形質転換処理は、塩化カルシウム法に従った。
この組み換え大腸菌ＭＡＫ−ＥＸ４１をトリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、ＩＰＴＧ１ｍＭ、５００ｍＬで３７℃、１６時間振とう培養した。得られた菌体を水で洗浄後、超音波処理し不溶物を除去、粗酵素抽出液１０ｍＬを調製した。この粗酵素抽出液０．１ｍＬに２−メチルアミノ−１−フェニルプロパノン塩酸塩１ｍｇ、水、１Ｍトリス塩酸バッファｐＨ７．５  ０．０２ｍＬ、グルコース１０ｍｇ、グルコースデヒドロゲナーゼ０．１ｍｇ、ＮＡＤＰ＋０．１ｍｇを加え混合し１ｍＬの反応液とし３７℃、２４時間反応した。反応後、反応液から不溶物を除去し上清をＨＰＬＣ分析（μＢｏｎｄａｐａｋｐｈｅｎｙｌ  ウォーターズ社製、径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ、溶離液０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（アセトニトリル７％含有）、ｐＨ６．５、流速０．８ｍＬ／分、検出波長ＵＶ２２０ｎｍ）、に付した結果、０．５ｍｇのプソイドエフェドリンが生成したことを確認した。さらにＨＰＬＣ分析（スミキラルＡＧＰ、住化分析センター社製、径４ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、溶離液０．０３Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７、流速０．５ｍＬ／分、検出波長ＵＶ２２０ｎｍ）に付した結果、得られたプソイドエフェドリンは全てｄ−プソイドエフェドリンであることを確認した。
上記アミノケトン不斉還元酵素の遺伝子を導入したベクターを保有する大腸菌ＭＡＫ−ＥＸ４１は、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５２として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にて平成１３年２月１５日に受託されている。
実施例３
（ｄ−（１Ｓ，２Ｓ）プソイドエフェドリンの生成）
グルコース１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％を含む培地５ｍｌに表１に記載の各微生物を植菌し、３０℃、４８時間振盪培養を行った。培養液を遠心分離して菌体を得た後、試験管に入れ、これに０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌを加え懸濁した。これにｄｌ−２−メチルアミノ−プロピオフェノン塩酸塩１ｍｇを加え、３０℃で２４時間振盪し反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除き、上清をＨＰＬＣに付して、光学活性なプソイドエフェドリンを得た（μＢｏｎｄａｐａｋｐｈｅｎｙｌウォーターズ社製、径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ、溶離液０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（７％アセトニトリル含有）、ｐＨ５．０、流速０．８ｍｌ／分、検出光波長ＵＶ２２０ｎｍ）。
絶対配置及び光学純度はＨＰＬＣ（住化分析センター製カラムスミキラルＡＧＰ、径４ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、０．０３Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、流速０．５ｍｌ／分、検出光波長２２０ｎｍ）で測定した。その結果、表１及び表２に示すように、ｄ−プソイドエフェドリンのみが選択的に得られた。
生成したｄ−プソイドエフェドリンの光学純度および生成量は表１及び表２のとおりである。以下、生成量は、全て塩酸塩に換算した量を示す。
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実施例４
グルコース１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％を含む培地にモルガネラ  モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＩＦＯ  ３８４８を植菌し、３０℃で４８時間、好気的に振盪培養した。この培養液５ｍｌを遠心分離して菌体を得た後に風乾し、得られた乾燥菌体を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌに懸濁した。前記乾燥菌体懸濁液にグルコース５０ｍｇ、グルコースデヒドロゲナーゼ０．２ｍｇ、ＮＡＤＰ０．６ｍｇ、ＮＡＤ０．６ｍｇ、ｄｌ−２−メチルアミノ−プロピオフェノン塩酸塩１０ｍｇを加え、２８℃、３００ｒｐｍで往復振盪した。４８時間反応を行った後、反応液を上記実施例３と同様にＨＰＬＣによりプソイドエフェドリンの生成量および光学純度を測定した。
その結果、ｄ−プソイドエフェドリン塩酸塩が０．７９ｍｇ／ｍｌ生成し、その光学純度は１００％であった。
実施例５
（誘導剤添加による影響（１））
培地１（表３）に、１−アミノ−２−ヒドロキシプロパンを５ｇ／Ｌになるように加え試験管に５ｍＬ入れ、シリコン栓をしてオートクレーブで１２１℃、３０分間、滅菌した。この培地および誘導剤無添加の培地に、それぞれＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＡＫ−３４株を植菌し３０℃、４８時間、３００ｒｐｍで振とう培養を行った。培養液０．５ｍＬを１００００Ｇ、２０分間遠心分離し、上清を除くことによって得られた菌体に水を加え懸濁し均一の懸濁液とした。これに水、緩衝液、ｄｌ−２−メチルアミノ−プロピオフェノン塩酸塩１０ｍｇを加え、１ｍＬとし試験管に入れ、３０℃、１２時間、１５０ｒｐｍで振とうし反応を行った。反応終了後、遠心分離して菌体を除き、上清をＨＰＬＣに付してプソイドエフェドリン生成量を測定した。（ＨＰＬＣ条件：μＢｏｎｄａｐａｋｐｈｅｎｙｌ  ウォーターズ社製、径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ、溶離液０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（７％アセトニトリル含有）、ｐＨ６．５、流速０．８ｍＬ／分、検出波長ＵＶ２２０ｎｍ）
その結果、表４に示すように誘導剤を添加し培養した場合のプソイドエフェドリン生成量は、無添加の培養に比較し著しい増大を示した。
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実施例６
（誘導剤添加による影響（２））
実施例５の微生物に代えて表４に示す微生物および培地を使用した以外は実施例５と同様にして培養、反応を行った。菌体の分離は、遠心分離または培養液からのろ過（Ｎｏ．（３）並びにＮｏ．（６）から（１３））によって行った。その結果、表４に示すように、１−アミノ−２−ヒドロキシプロパンを添加し培養した場合のｄ−プソイドエフェドリン生成量は無添加の培養に比較し著しい増大を示した。
実施例７
（誘導剤添加による影響（３））
実施例５の１−アミノ−２−ヒドロキシプロパンを１−アミノ−２−ヒドロキシブタンに代えた以外は実施例５と同様にして培養、反応を行った。菌体の分離は、遠心分離または培養液からのろ過によって行った。その結果、表５に示すように、化合物を添加し培養した場合のプソイドエフェドリン生成量は無添加の培養に比較し著しい増大を示した。
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実施例８
（誘導剤添加による影響（４））
実施例５の１−アミノ−２−ヒドロキシプロパンを１−アミノ−２−ヒドロキシシクロヘキサンに代えた以外は実施例５と同様にして培養、反応を行った。菌体の分離は、遠心分離または培養液からのろ過によって行った。その結果、表６に示すように、化合物を添加し培養した場合のプソイドエフェドリン生成量は無添加の培養に比較し著しい増大を示した。
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実施例９
（誘導剤添加による影響（５））
サッカロース１．０％、コーンスティープリカー０．５％、リン酸２水素カリウム０．１％、リン酸水素２カリウム０．３％、ｐ−アミノ安息香酸０．０１％、各種誘導剤０．１％を含むｐＨ７．０の培地５ｍｌにロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＭＡＫ−３４を植菌し、３０℃、４８時間振盪培養を行った。培養液を遠心分離して菌体を得た後、試験管に入れ、これに０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍｌを加え懸濁した。これにｄｌ−２−メチルアミノプロピオフェノン塩酸塩１０ｍｇ、グルコース２０ｍｇを加え、３０℃で１６時間振盪し反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除き、上清をＨＰＬＣに付して、光学活性なプソイドエフェドリンを得た（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅｐｈｅｎｙｌ  Ｗａｔｅｒｓ社製、径４ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、溶離液０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（７％アセトニトリル含有、ｐＨ６．５）、流速０．８ｍｌ／分、検出波長２２０ｎｍ）。その生成量は表７に示したように誘導剤無添加の場合に比較し著しく高い値を示した。
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産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明のアミノケトン不斉還元酵素、タンパク質、核酸及び微生物によれば、α−アミノケトン化合物またはその塩のエナンチオマー混合物から、所望の光学活性を有するβ−アミノアルコールを高収率且つ高選択的に製造可能な作用を有するアミノケトン不斉還元酵素を提供することが可能となる。また、アミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、前記核酸で形質転換せしめた形質転換体、前記形質転換体を用いる前記タンパク質の製造方法及び前記形質転換体又は前記タンパク質の用途を提供することが可能となる。さらに、α−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物から効率よく光学活性β−アミノアルコールを変換する新規微生物を提供することが可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のアミノケトン不斉還元酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動写真である。
図２は、本発明のアミノケトン不斉還元酵素のｐＨ依存性を示したグラフである。
図３は、本発明のアミノケトン不斉還元酵素の温度依存性を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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