(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程：
ａ）核酸を含有する試料中の所定のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイゼーションすることができる核酸プローブの溶液中でハイブリダイゼーションを実施し、前記プローブは検出成分と第一捕捉成分とを含んでなり、
ｂ）ハイブリダイゼーションしないヌクレオチド配列を分解する酵素を使用して、前記試料中のハイブリダイゼーションしないヌクレオチド配列を分解し、
ｃ）前記プローブの前記第一捕捉成分と相互作用する第二捕捉成分でコーティングされた固体支持体と、工程ｂ）を経て得られたハイブリッドとを接触させることによって、前記ハイブリッドを捕捉し、
ｄ）前記ハイブリッド、または変性後に前記ハイブリッドから生じたプローブを前記検出成分により検出することからなることを特徴とする核酸検出法。
【請求項２】
工程ａ）において、ＲＮＡプローブを使用し、そして工程ｂ）において、ＲＮアーゼを使用して酵素分解を実施することを特徴とする、請求項１に記載のメッセンジャーＲＮＡ検出法。
【請求項３】
前記プローブの前記第一捕捉成分が前記プローブに共有結合した第一生物学的分子から成り、前記固体支持体の前記第二捕捉成分が前記固体支持体に結合した第二生物学的分子から成り、前記第二生物学的分子が前記第一分子と相互作用し、非共有結合することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
所定の遺伝子から発現されたｍＲＮＡを検出するために、前記遺伝子のクローン化ｃＤＮＡ断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られたＲＮＡプローブを使用することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
核酸に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られたＲＮＡプローブを使用し、１の前記ＲＮＡプローブは、前記検出成分および前記第一捕捉成分へのカップリングにより修飾されたヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブが１００〜１０００ヌクレオチドを含有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブが２５０〜５００ヌクレオチドを含有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）後、ハイブリダイゼーションしない核酸の分解産物を除去することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
１の前記プローブが生物学的分子から成る前記検出成分および前記第一捕捉成分で修飾されたヌクレオチドを１５％以下で含有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
１の前記プローブが生物学的分子から成る前記検出成分および前記第一捕捉成分で修飾されたヌクレオチドを１０％以下で含有することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出成分および前記第一捕捉成分を所定のヌクレオチド上で置換するとき、前記置換ヌクレオチド以外のヌクレオチドにおいて一本鎖核酸を切断する酵素を工程ｂ）において用いることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出成分および前記第一捕捉成分をウリジンヌクレオチド上で置換し、そして工程ｂ）の酵素がＲＮアーゼＴ1であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一および第二の捕捉分子がビオチン／ストレプトアビジン系を構成することを特徴とする、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一捕捉分子がジゴキシゲニン（ＤＩＧ）であり、そして前記第二捕捉分子が抗ジゴキシゲニン抗体であることを特徴とする、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出成分が１成分として直接的に検出可能な放射性または蛍光性成分であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出成分が間接的に検出可能な成分であり、前記成分が直接的に検出可能な成分を含有する他の分子と非共有結合で反応することができる生物学的分子から成ることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記間接的に検出可能な成分がビオチン、フルオレセインおよびジゴキシゲニンから選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一捕捉成分がビオチン、フルオレセインおよびジゴキシゲニンから選択されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出成分がジゴキシゲニンであり、かつ前記第一捕捉成分がビオチンであるか、または、前記検出成分がビオチンであり、かつ前記第一捕捉成分がジゴキシゲニンであることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
１の前記プローブが、ビオチン分子で置換されたヌクレオチドを２〜５％で含有すると共に、ジゴキシゲニン分子で置換されたヌクレオチドを２〜５％で含有することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
１の前記プローブが、ビオチン分子で置換されたヌクレオチドを２〜５％で含有すると共に、ジゴキシゲニン分子で置換されたヌクレオチドを２〜３％で含有することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
１の前記プローブが、ビオチン分子で置換されたヌクレオチドを３〜４％で含有する共に、ジゴキシゲニン分子で置換されたヌクレオチドを２〜５％で含有することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
１の前記プローブが、ビオチン分子で置換されたヌクレオチドを３〜４％で含有すると共に、ジゴキシゲニン分子で置換されたヌクレオチドを２〜３％で含有することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の検出法を使用する、病理に関係する核酸を検出する検出方法。
【請求項２５】
前記検出成分及び第一捕捉成分を有する核酸プローブと、前記第一捕捉成分に特異的に結合可能な第二捕捉成分でコーティングされた固体支持体と、を備え、
前記第一捕捉成分と第二捕捉成分とは、リガンド-レセプター系又は抗原-抗体系を構築し、前記第一及び第二捕捉成分と前記検出成分とは、異なる分子である請求項１〜２４のいずれか一項に記載された方法の実施用キット。
【請求項２６】
１００以上のヌクレオチドを有することを特徴とする請求項２５に記載の実施用キット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、特異的捕捉および検出を可能とするヌクレオチドプローブを用いた核酸検出法に関する。本発明は、標的ヌクレオチド配列に対して相補的な一本鎖リボヌクレオチドプローブを使用して、核酸の大規模な特異的検出の自動化を可能とする。前記プローブにより適当な表面上の捕捉および急速かつ感受性に富む検出の双方が可能となる。
主要なゲノムの配列決定および分析プログラムの結果、生物学的は新しい時代、すなわち、改良された現存技術の集約によるデータの大量の獲得という時代に直面している。５〜１０年の間において、いくつかのモデルの生物のゲノム、ならびにヒトのゲノムは完全に配列決定される。ヒトのゲノムによりコードされる多数の遺伝子は５０，０００〜１００，０００であると計算されるので、コーディング領域（ｃＤＮＡ）およびまた調節領域（プロモーター）の数千の配列を列挙し、分析し、そしてデータベースの中に組込まなくてはならず、数百の組織または細胞におけるそれらの発現プロフィールを確立しなくてはならない。
遺伝子の発現プロフィールは、特定の細胞において発現される対応する比較的豊富なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を研究することにある（例えば、異なる組織に属するか、または発育、特に病理、の種々段階、薬剤による誘導、およびその他）。それゆえ、遺伝子の発現プロフィールはｍＲＮＡの特異的かつ感受性の検出を必要とする。
特異的ｍＲＮＡの株を２つのタイプのアプローチ、増幅技術に基づくものおよびハイブリダイゼーション技術に基づくもの、により実施することができる。
増幅技術、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応）は、それを実施するために必要な多数のオリゴヌクレオチドの合成（５０，０００の異なる遺伝子について、最小数は１０，０００のオリゴヌクレオチドであろう）に費用がかかり、ｍＲＮＡの発現プロフィールの計画された大規模な研究においては適用が制限されているように思われる。
標的核酸の精製（固相ハイブリダイゼーション後の検出を必要とする）および固定化を回避するために、Dunn A.R.and Hassell J.A.（1977,CelI,12、23-36）により最初に記載された「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション技術が開発された。この技術は、同一標的核酸に対して向けられた２つの非オーバーラッププローブの存在に基づく。第一プローブを固体状表面上に固定化し、標的の捕捉を可能とする。第二プローブはその配列の中にトレーサーを有し、標的の検出を可能とする。この技術は本質的に増幅産物の検出に使用される。実際には、使用するプローブは小さく（２０〜２５ヌクレオチド）そして、長いプローブと異なり、それらは強いハイブリダイゼーション構造遺伝子を発生することができない。各プローブは異なることがあるハイブリダイゼーション温度を必要とするので、この技術は多数の標的の同時検出のためには不適当である。
第二技術は、増幅を含まず、それゆえ、大きい感度を必要とするハイブリダイゼーション技術に基づく。特異的ハイブリダイゼーションを検出するために使用できるいくつかのフォーマットが存在する：液相ハイブリダイゼーション；固相ハイブリダイゼーション；組織または細胞本体についてのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。すべての場合において、プローブは相補的核酸配列とハイブリダイゼーションすることができる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。異なる核酸のハイブリダイゼーション反応の反応速度論はよく知られており（Britten et al.,1974,Methods Enzymol.,29,p.363;Kohme et al.,1977,Biochemistry 16,pp.5329-5341）、ハイブリダイゼーション速度ならびに標的プローブの安定性に関係するプロモーターの知識により、最良のシグナル／バックグラウンド比を得るための最適条件を決定することができる。
液相ハイブリダイゼーションは非常に効率よく、最も速いハイブリダイゼーションを与えるという利点を有する。しかしながら、ハイブリダイゼーションしたプローブから遊離プローブを分離することが困難である。固体状表面（例えば、ニトロセルロース、ナイロン）上の標的（またはプローブ）の固定化を含む固相ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションしないプローブの分離の観点から実施が容易である。しかしながら、溶液中のハイブリダイゼーションに比較して、ハイブリダイゼーション速度は７〜１０倍低い。最後に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは細胞または組織の中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡ配列の顕微鏡検査を可能とすると同時にそれらの局在化を保存する。この方法は細胞学または組織学の研究所に適する。
ＲＮＡ検出の特定の場合において、いわゆる「ノザンブロット」固相技術は医学的分析および基本研究の双方において使用される、最も広く使用されているハイブリダイゼーション法を構成する。ノザンブロッティングは、メッセンジャーの大きさについて、それゆえ標的の同一性について、の情報を提供することができる唯一の方法であるが、感度が低くかつ自動化が困難であるので、大規模の分析には考慮されない。同様な理由で、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術は同様にＲＮＡの発現プロフィールの大規模研究には不適当であろう。
溶液中のハイブリダイゼーションに基づくＲＮＡの検出法の中で、ヌクレアーゼ保護技術は非常に感受性でありかつ特異的方法であるという利点を有する。この技術において、一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡの放射性プローブは標的ＲＮＡを含有するＲＮＡ調製物を使用してハイブリダイゼーションされる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションしない核酸（ハイブリダイゼーションしないプローブおよび調製物のＲＮＡの双方）を一本鎖核酸に対して特異的なヌクレアーゼ（一般に、ＲＮＡプローブについてＲＮアーゼＡおよびＴ１、そしてＲＮＡまたはＤＮＡプローブについてヌクレアーゼＳ１）の作用により分解する。プローブとその相補的ＲＮＡ標的とのハイブリダイゼーションはヌクレアーゼによる分解からプローブを「保護」し、そして二本鎖分子を生じ、前記分子の長さはプローブ−標的の相補性により定められる。
他方において、標的以外のＲＮＡとプローブとの非特異的ハイブリダイゼーションは、特異的ハイブリダイゼーションから発生するものよりも短い二本鎖分子を生ずる。それゆえ、特異的および非特異的の２つの型の産物は大きさに従い区別することができ、最も有用な通常の分析はポリアクリルアミドゲルの電気泳動である。クロマトグラフィー分離による分析の別の技術は、ＷＯ９５／１１３１１６号明細書において提案されている。
ヌクレアーゼ保護技術は感受性および特異的であるという利点を有するが、電気泳動またはクロマトグラフィーの分離から成る分析法は、この方法の自動化および多数の試料の使用と不適合性である。
本発明は、完全に自動化できると同時に感受性、特異的、再現性である方法により、多数の試料を同時に取り扱うことを可能とするフォーマットにおいて、核酸、特にＲＮＡ、の特異的検出を可能とするように設計される。
本発明の他の目的は、全体のＲＮＡからｍＲＮＡを特異的に検出できる方法を提供することである。
本発明は、核酸とヌクレオチドプローブとの溶液中のハイブリダイゼーション法の使用に基づき、前記ヌクレオチドプローブはその配列により生ずる認識の特異性に加えて、２つの異なる機能を達成できる修飾を有する。第一機能は、固体支持体に対して、プローブ−標的のハイブリッド、または前もって変性されたプローブ−標的のハイブリッドから生じたプローブを接触させることにある。プローブの第二機能は、放射性または非放射性検出法により特異的検出を可能とすることにある。
一般に、本発明は、下記の工程を含む方法である：
（１）所定のＲＮＡまたはＤＮＡと特異的にハイブリダイゼーションする二重標識化核酸プローブを使用する液相中のハイブリダイゼーション。
（２）ハイブリダイゼーションしないヌクレオチド配列のヌクレアーゼによる分解。
（３）プローブの修飾による、形成したハイブリッドの固体支持体上の特定捕捉によるハイブリッドの分離。
（４）前述の修飾の結果として、またはプローブ上に存在する他の修飾による、ハイブリッドの検出。
さらに詳しくは、本発明の主題は、下記の工程：
ａ）核酸を含有する試料中の所定のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイゼーションすることができる核酸プローブ、特に１００以上のヌクレオチドを有する核酸プローブ、のハイブリダイゼーションを溶液中で実施し、前記プローブは検出成分と第一捕捉成分とを含んでなり、
ｂ）ハイブリダイゼーションしないヌクレオチド配列を分解する酵素を使用して、前記試料中のハイブリダイゼーションしないヌクレオチド配列を分解し、
ｃ）前記プローブの前記第一捕捉成分と相互作用する第二捕捉成分でコーティングされた固体支持体と、工程ｂ）を経て得られたハイブリッドを接触させることによって、前記ハイブリッドを捕捉し、そしてｄ）前記ハイブリッド、または変性後に前記ハイブリッドから発生するプローブを前記検出成分により検出する、ことを含むことを特徴とする核酸検出法である。
大きいプローブ、特に１００以上のヌクレオチドを有するプローブを使用すると、ハイブリダイゼーションの特異性をより大きくし、かつプローブの検出および捕捉のために十分な修飾を導入することができると同時にハイブリダイゼーションの安定性が保存される。
特に、プローブは１００〜１０００ヌクレオチド、好ましくは２５０〜５００ヌクレオチドを含有する。
本発明の１つの面によれば、ヌクレアーゼとのインキュベーション後、オリゴヌクレオチド（１００より少ない塩基）を除去する１またはそれ以上の技術、例えば、分別沈降、膜を通す濾過、ゲル濾過（排除クロマトグラフィー）または核酸、特にハイブリダイゼーションしないプローブ、の分解産物からの標的−プローブのハイブリッドの分離を可能とする任意の他の技術を使用する。
一般に、２つの異なるヌクレオチドの修飾により、プローブの２つの機能は達成される。しかしながら、同一修飾を捕捉および検出に使用することができることに注意すべきである。
本発明によれば、プローブは捕捉を実施し、次いで十分な検出を実施するために十分な量の検出成分および捕捉成分を含んでなる。しかしながら、工程ａ）のハイブリダイゼーションおよび工程ｂ）のハイブリッドと適合性とするために、前記検出成分および前記第一捕捉成分の量を最適化する。
二機能的プローブの中へ修飾されたヌクレオチドを導入すると、修飾に近接する対合に関して、特異的プローブを不安定化させることを考慮に入れるべきである。実際には、本発明を例示する下記の実施例から理解されるように、プローブの修飾の量が大き過ぎると、ハイブリダイゼーションは十分に安定ではないので、工程ｂ）において使用する酵素によりハイブリッドが分解されるようになることさえある。
好ましくは、検出成分および第一捕捉成分がプローブを構築するヌクレオチド上で置換された生物学的分子であるとき、プローブは１５％以下、好ましくは１０％以下の前記検出成分および前記第一捕捉成分で修飾されたヌクレオチドを含有すべきである。また、これらの量は検出成分および捕捉成分を構築する分子の大きさに依存することが理解される。立体障害性が大き過ぎる場合、ハイブリダイゼーションの安定性は低下するであろう。
本発明によるヌクレオチドプローブはＤＮＡプローブ、好ましくはＲＮＡプローブである。ＲＮＡプローブはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得ることができ、そしてＤＮＡプローブを越えたいくつかの利点を有する。ＲＮＡプローブは一本鎖の形態で一直線で存在するので、変性を必要としない。そのうえ、ＤＮＡプローブの場合におけるように相補的鎖との妨害は存在しない。したがって、ＲＮＡプローブはＤＮＡプローブを使用して得られたものよりもいっそう安定なハイブリッドをそれらの標的と形成する。
好都合には、所定の遺伝子から発現されたｍＲＮＡを検出するために、前記遺伝子のクローン化ｃＤＮＡ断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られたプローブを使用する。
好都合には、ヌクレオチド（それらのあるものは前記検出成分および／または前記捕捉成分へのカップリングにより修飾されている）を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られたＲＮＡプローブを使用する。
多数の修飾をＲＮＡポリメラーゼＳＰ６、Ｔ３およびＴ７により転写されたＲＮＡの中に組込むことができる。例えば、ビオチン基（例えば、ビオチン−ＵＴＰおよびＤＩＧ−ＵＴＰ）またはフルオレセイン基（例えば、Ｆ１−１１−ＵＴＰ、Ｆ１−１２−ＵＴＰ）を含有するリボヌクレオチドが存在し、これらはＲＮＡポリメラーゼＳＰ６、Ｔ３およびＴ７により触媒されるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応においてＵＴＰを置換することができる。さらに、他の型の修飾を当業者に知られている技術に従いリボヌクレオチドの中に組込むことができる。
二機能的プローブと標的ＲＮＡを含有する調製物とのハイブリダイゼーション後、特異的プローブ−標的のハイブリッドの分解を生じない条件下に、ハイブリダイゼーションしないプローブを分解しなくてはならない。また、ハイブリダイゼーションしないプローブを除去する方法を選択する場合、特定のシグナルの一部分を損失しないように、プローブ−標的のハイブリッドの中に一本鎖領域が存在する可能性について考慮しなくてはならない。一本鎖核酸と特異的にハイブリダイゼーションする能力を有する酵素が存在する。なかでも、下記のものを列挙することができる：ヌクレアーゼＳ１、ヤエナリヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼＶＩＩ（これらは配列の特異性をもたない）、およびＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＣＬ３、ＲＮアーゼＰｈｙＭ、ＲＮアーゼＴ１またはＲＮアーゼＵ２（これらはあるヌクレオチドの上流および／または下流のみを切断する）。一本鎖領に対して特異的でありかつプローブの中に組込まれた修飾されたヌクレオチドに対して特異的でないヌクレオチド分解酵素の１またはそれ以上の使用は、本発明の一部分を形成する。例えば、リボソームがＵＴＰに結合した修飾を含有する場合、プローブ−標的のハイブリッド中の修飾ＵＴＰの回りの切断の可能性を減少するために、ＲＮアーゼＴ１（これはＧの３’側で切断する）および／またはＲＮアーゼＣＬ３（これはＣの３’側で切断する）および／またはＲＮアーゼＵ２（ＣれはＡの３’側で切断する）を使用することが好ましい。
好都合には、ｍＲＮＡを検出するとき、工程ａ）において、ＲＮＡプローブを使用し、そして工程ｂ）において、ＲＮアーゼを使用して酵素的分解を実施する。
検出成分および第一捕捉成分を所定のヌクレオチド上で置換するとき、工程ｂ）において、前記置換されたヌクレオチド以外のヌクレオチドにおいて一本鎖核酸とカップリングする酵素を使用することが好ましい。
特に、検出成分および第一捕捉成分をウリジン（Ｕｒｉｄｉｎｅ）ヌクレオチド上で置換し、そして工程ｂ）の酵素はＲＮアーゼＴ1である。
捕捉基は固相へのプローブの特異的結合を可能とする。
１つの態様において、前記プローブの第一捕捉成分はプローブに共有結合した第一生物学的分子から成り、そして固体支持体の第二捕捉成分は固体支持体に結合した第二生物学的分子から成り、第二生物学的分子は第一生物学的分子と相互作用しかつそれに結合する。
第一生物学的分子および第二生物学的分子がビオチン／ストレプトアビジン系または抗原／抗体系を構築するか、またはなおさらに特に、第一捕捉成分および第二捕捉成分がジゴキシゲニン（ＤＩＧ）および抗ＤＩＧ抗体またはフルオレセインおよび抗フルオレセイン抗体；より一般に、任意のリガンド−レセプターまたはハプテン−抗体系であることができる、態様を特に列挙することができる。
本発明によれば、プローブ−標的のハイブリッドの核酸、または前もって変性されたプローブ−標的のハイブリッドから発生するプローブの捕捉は固体状表面上で起こる。この表面は好ましくはマイクロプレートであるが、それに限定されない。捕捉はプラズマ共鳴検出器の表面上で起こすことができる（Surfaceplasma resonance Fisher et al.,1994,Curr.of Biotech,5,389-395）。選択した表面は、プローブ中に存在する捕捉基に対して高いアフィニティーを有する分子の固定化の結果として、プローブの特異的結合を可能とする。
検出基はプローブの特異的証明を可能とする。例えば、ビオチンはストレプトアビジンによるか、または酵素にカップリングされた抗ビオチン抗体により認識されることができ、ＤＩＧは酵素にカップリングされた抗ＤＩＧ抗体により認識されることができるか、またはフルオレセインは酵素にカップリングされた抗フルオレセイン抗体により認識されることができる。検出は、また、プローブ中の放射性ヌクレオチドの存在により仲介されることができる。
プローブの検出成分は直接的または間接的に検出可能である成分である。実際に、「検出成分」は直接的または間接的に、すなわち、後者の場合において、他の分子および／または固体粒子とのカップリングまたは共有結合により結合後に、検出できる分子を意味すると理解される。「直接的結合」は、特に、前記分子それ自体が検出可能な成分、例えば、放射性または蛍光性成分を含有する場合、または前記分子が基質を使用して検出できる酵素にカップリングされているか、または前記分子が蛍光性分子にカップリングされている場合を意味する。「間接的結合」は、特に、前記分子が生物学的分子であり、前記分子が直接的に検出可能な成分、例えば、放射性または蛍光性原子、酵素または蛍光性分子をそれ自体が含有する他の生物学的分子と非共有結合の相互作用または共有結合のカップリングにより物理化学的に反応できる場合を意味する。
間接的に検出可能な成分は、直接的に検出可能な成分、例えば、酵素を含有する他の生物学的分子と非共有結合的に反応できる生物学的分子から成ることができる。ストレプトアビジン／ビオチン系または抗原／抗体系を特に列挙することができる。特に、間接的に検出可能な成分はビオチン、フルオレセインおよびＤＩＧから選択される。
放射性検出の場合において、プローブ中の放射性ヌクレオチドの存在は、例えば、マイクロプレートに適当な放射能の検出器中で計数することによって判別することができる。非放射性検出において、プローブ中にこの目的で組込まれた検出基は、酵素に結合された特異的リガンド／抗体を使用し、次いで基質とのインキュベーションにより認識可能である。したがって、ビオチンはストレプトアビジンによるか、または酵素にカップリングされた抗ビオチン抗体により認識可能であり、ＤＩＧは酵素にカップリングされた抗ＤＩＧ抗体により認識可能であるか、またはフルオレセインは酵素にカップリングされた抗フルオレセイン抗体により認識可能である。非放射性検出のために使用される酵素は、なかでも、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼであることができる。これらの酵素のために、多数の比色、蛍光性または化学発光性基質が存在する。酵素活性の測定は、マイクロプレートに適当な比色計、蛍光計または化学発光計を使用する自動的読みにより実施することができる。
また、選択した捕捉表面がプラズマ共鳴バイオセンサーのそれである場合、プローブ中の検出基の存在は特異的リガンド／抗体との相互作用の直接的測定により決定することができる。
捕捉成分および検出成分がヌクレオチド上で置換された生物学的分子であるとき、特にウリジン、ビオチン、フルオレセインまたはジゴキシゲニンを検出成分および／または捕捉成分として列挙することができる。特に、検出成分はジゴキシゲニンおよび／またはビオチンであり、そして第一捕捉成分はビオチンおよびジゴキシゲニンから選択される。１つの態様において、前記第一捕捉成分はビオチンまたはジゴキシゲニンであり、そしてこれらの修飾を担持するヌクレオチドはウリジンであり、そして前記検出成分はＤＩＧまたはビオチンである。
好ましくは、検出基はＤＩＧであり、複合体はアルカリ性ホスファターゼにカップリングされた抗ＤＩＧ抗体であり、そして基質は化学発光性の検出を可能とする。
下記の詳細な説明の実施例に例示されている１つの態様において、プローブは２〜５％、特に３〜４％のビオチンから成る前記検出成分へのカップリングにより修飾されたヌクレオチドと、２〜５％、特に２〜３％のジゴキシゲニン分子から成る前記第一捕捉成分へのカップリングにより修飾されたヌクレオチドとを含有する。
本発明の主題は、また、本発明による検出法を使用する、病理に関係する核酸の検出方法である。
本発明の主題は、また、検出成分および前記第一捕捉成分を担持する大きい核酸プローブ、特に１００以上のヌクレオチドを有する前記プローブと、前記第二捕捉成分でコーティングされた固体支持体とを含有することを特徴とする、本発明の検出法を実施するために有用なキットである。
本発明の他の特徴および利点は、下記の説明および実施例に照らして、第１図〜第１０図を参照すると、明らかとなるであろう。
第１Ａ図は１ｆｍｏｌの（３２ａＰ）ＣＴＰ標識化ビオチン−ＤＩＧリボプローブの結合についての結果を描写し、そしてプレートに対するすぐれた結合に必要なリボプローブ中の組込みのために導入されたビオチンの百分率の決定を可能とする。変動する比率のビオチン−ＵＴＰ（５、１０、１５、２５、１００％）および固定された量のＤＩＧ−ＵＴＰ（１０％）を使用する逆転写により、研究したリボプローブを得る。リボプローブの検出は放射能の測定により実施される。
第１Ｂ図は、抗ＤＩＧ抗体を使用する３００ａｍｏｌのリボプローブの検出を描写する。研究したリボプローブは、変動する百分率のビオチン−ＵＴＰ（５、１０、１５、２５％）および１０％のＤＩＧ−ＵＴＰから形成する。
第２Ａ図は、高い比活性（２×１０5ｃｐｍ／ｆｍｏｌ）を有する（α−32Ｐ）ＣＴＰ標識化ビオチン−ＵＴＰ（２５および１００％）リボプローブの結合を示す。これは結合の感度をいっそう正確に決定可能とする。リボプローブは２．５から０．０１ｆｍｏｌへの倍加希釈を行う。
第２Ｂ図は、アルカリ性ホスファターゼにカップリングされた抗ＤＩＧ抗体を使用し、次いで蛍光の測定により、リボプローブ中のＤＩＧの百分率の関数として、ビオチン−ＤＩＧリボプローブの検出の結果を示す。
第３Ａ図は、（α−32Ｐ）ＣＴＰ標識化相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションしたリボプローブ（ビオチン−ＵＴＰ）の捕捉を描写する。これは二本鎖形態のリボプローブの結合の研究を可能とする。研究したリボプローブは、変動する百分率のビオチン−ＵＴＰ（５、１５、２５、３５％）から調製される。ハイブリッドを２から０．０１５ｆｍｏｌに倍加希釈する。放射能の測定により、ハイブリッドの検出を実施する。これらの曲線は、すぐれた結合を得るのためのリボプローブ（二本鎖の形態）中のビオチン−ＵＴＰの最適量を示す。
第３Ｂ図は、（α−32Ｐ）ＣＴＰ標識化ヌクレオチド配列（３５％のＤＩＧ−ＵＴＰ）とハイブリダイゼーションしたリボプローブ（５、１５、２５、３５％のビオチン−ＵＴＰ）の捕捉を描写する。これは二本鎖形態のリボプローブの結合の研究を可能とする。ハイブリッドの検出は、放射能の測定により実行される。
第４図は、抗ＤＩＧ抗体を使用する検出シグナルの大きさへのＤＩＧ−ＵＴＰの百分率の影響を示す。研究したプローブは、１５％のビオチン−ＵＴＰおよび（５、１５、２０、２５％のＤＩＧ−ＵＴＰ）から成る。
第５図は、ヌクレオチド保護の機能的試験におけるＤＩＧ−ＵＴＰリボプローブの使用を示す。
研究したリボプローブはＤＩＧ−ＵＴＰ（０、５、１５、２５および３５％）から成る。それらを（α−32Ｐ）ＣＴＰで放射性標識化する。
各リボプローブを１０μｇの酵母ＲＮＡ（＋）の存在において相補的リボヌクレオチド配列（１０または１ｎｇ）とハイブリダイゼーションさせる。ＲＮアーゼＴ１で消化しない対照（−）および相補的プローブを含まないＲＮアーゼ対照（０）を各プローブについて実行した。
第６図は、ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを描写し、そして未修飾の同一放射性標識化リボプローブと比較した、１５％のビオチン−ＵＴＰおよび１０％のＤＩＧ−ＵＴＰから成る放射性標識化リボプローブを使用する、検出の感度を示す。
１ｆｍｏｌ（４５，０００ｃｐｍ）において使用した２つの放射性標識化リボプローブを、１０μｇの酵母ＲＮＡ（＋）の存在において、減少する量の非放射性相補的リボヌクレオチド配列（１０4〜１０3ｐｇの１０倍の連続希釈に付した）とともに配置した。ＲＮアーゼＴ１で消化しない対照（−）および相補的プローブを含まないＲＮアーゼ対照（０）を各プローブについて実行した。ゲル上で可視のバンドは、ＲＮアーゼＴ１で消化するとき分解しなかった（ハイブリッドの形態であるので）リボプローブに相当する。
第７図は、ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを描写する。それは、１５％のビオチン−ＵＴＰおよび１０％のＤＩＧ−ＵＴＰから成り、（α−32Ｐ）ＣＴＰで放射性標識化したリボプローブ（マウスβ−アクチン遺伝子のメッセンジャーの２５０ヌクレオチドに対して相補的）リボプローブを使用する、異なるヒトおよびラットの細胞におけるβ−アクチン遺伝子のメッセンジャーの検出を示す。試験した異なる細胞または組織の順序は下記の通りである：脳（ラット）、腎（ラット）、肝（ラット）、Ｊｕｒｋａｔ（ヒト）、ＨｅｐＧ２（ヒト）、Ｈ４ＩＩ（ラット）、胎盤（ヒト）、酵母、ＨｅＩａ（ヒト）。各試料について、ＲＮアーゼＴ１を含まないリボプローブの対照（−）およびβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡの検出（＋）を実施した。酵母を使用して、反応の特異性の対照を実施する。
第８図は、１５％のビオチン−ＵＴＰおよび１０％のＤＩＧ−ＵＴＰから成り、（α−32Ｐ）ＣＴＰ（３×１０4ｃｍｐ／ｆｍｏｌ）で放射性標識化したリボプローブを使用する、β−アクチンメッセンジャーのプレート上の検出（リボヌクレアーゼＴ１により消化から保護した後）を描写する。
ウェルを切断し、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＬＳ６０００ＩＣカウンターで放射能を計数した後、リボプローブの存在の検出を実施する。１０μｇ、５μｇおよび１μｇの異なる組織から抽出された合計のＲＮＡ中で、β−アクチンｍＲＮＡを試験する（凡例を参照のこと）。
第９図は、（α−32Ｐ）ＣＴＰ（５×１０4ｃｐｍ／ｆｍｏｌ）で放射性標識化したリボプローブ（１５％のビオチン−ＵＴＰ、１０％のＤＩＧ−ＵＴＰ）を使用する、普通ではないメッセンジャー、すなわち、ＨＮＦ１（肝核因子１）のメッセンジャーのプレート上の検出を描写する。試験した試料は、腎、肝、胎盤および酵母から発生した、１０、５および１μｇのｔＲＮＡに相当する。
第１０図は、１５％のビオチンおよび１０％のＤＩＧ−ＵＴＰから成るリボプローブを使用する、β−アクチンメッセンジャーのプレート上の検出を描写する。
アルカリ性ホスファターゼにカップリングされた抗ＤＩＧ抗体を使用して、リボプローブの検出を実施する。
実施例において、修飾されたヌクレオチドＵＴＰ−ビオチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｒｅｆ．１３８８９０８）およびＵＴＰ−ＤＩＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｒｅｆ．１２０９２５６）を含んでなる、ＮＴＰと表示するヌクレオチドモノマーからの転写により得られた、修飾されたリボプローブを使用する。
リボプローブがｎ％のビオチン−ＵＴＰまたはＤＩＧ−ＵＴＰから得られると記載するとき、これは転写に使用された修飾および未修飾のＵＴＰの合計量に関するビオチン−ＵＴＰの百分率がｎ％であることを意味する。これはほぼｎ／４％の得られたリボプローブ中の対応する修飾されたヌクレオチドの百分率に相当する。
実施例１は、ビオチン−ＵＴＰおよびＤＩＧ−ＵＴＰリボプローブの二機能的面を示す。実施例２は、リボヌクレアーゼによる消化からの保護の試験に関して、修飾の程度の重要性を強調する。実施例３は、遺伝子の発現を検出する方法として、本発明の応用を例示する。
実施例１：マイクロプレート上のビオチン−ＵＴＰおよびＤＩＧ−ＵＴＰから成るリボプローブの捕捉および検出の証明
ヒトゲノムの配列決定に関する目的で、ＤＮＡ配列決定方法の自動化に関してかなりの努力が費やされてきた。しかしながら、遺伝子の発現を分析する従来の方法は絶えず増加するメッセンジャーの検出に適していない。したがって、メッセンジャーＲＮＡを検出する新規な方法は自動化の可能性にあり、そして大きい系列の試料の研究に特に適する、固体支持体、例えば、マイクロプレート上で実施することができなくてはならない。他方においてその捕捉を可能とする機能的部分を有し、そして特異的認識の性質を有するリボプローブの使用は、メッセンジャーＲＮＡの検出に非常に適することが理解される。提供された実施例において、捕捉をビオチンにより実施し、そして検出をＤＩＧにより実施する。
１．リボプローブの使用の一般的原理
遺伝子の一部分に相当するＤＮＡセグメントをバクテリオファージ（Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６）、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの直ぐ下流のクローニング部位に、アンチセンスＲＮＡの産生に導く向きで挿入する。次いで、組換えプラスミドを制限酵素でインサートの３’側において切断する。次いで、修飾されたリボヌクレオチドを含んでなるリボヌクレオチド、例えば、ビオチン−ＵＴＰおよびＤＩＧ−ＵＴＰの存在において、線状化されたプラスミドを転写する。過剰のこの二重標識化ＲＮＡを溶液中で試験すべきｍＲＮＡとハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーションは標準的ストリンジェント条件下にＴ＝４０〜５０℃において一夜（１６時間）８０％のホルムアミド、０．４ＭＮａＣｌ緩衝液中でｐＨ７〜８において実施する。次いで、一本鎖ＲＮＡ、例えば、ＲＮアーゼＣＬ３、Ｔ１、ＰｈｙＭ、Ｕ２またはＡに対して特異的なリボヌクレアーゼを使用する消化により、ハイブリダイゼーションプローブを排除する。ｍＲＮＡ：リボプローブ（ビオチン−ＤＩＧ）ハイブリッド中の第一修飾、例えば、ビオチン−ＵＴＰの存在により、その表面がストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート上に前記ハイブリッドを捕捉することができる。他の修飾、例えば、ＤＩＧの存在により、ハイブリッドを検出し、そしてアルカリ性ホスファターゼにカップリングされた抗ＤＩＧ抗体を使用するＥＬＩＳＡ法により定量することができる。そのうえ、また、（α−32Ｐ）ＣＴＰの存在において転写を実施して、プレートへの適用後にハイブリッド（ｍＲＮＡ：リボプローブ）を検出しかつ定量することができる。
２．モデル系：ＨＮＦ１（肝核因子１）
ラットＨＮＦ１をコードするｃＤＮＡの４９０ｂｐのＰｖｕＩＩ断片（９９２−１４８２、Ｃｈｏｕａｒｄ ｅｔ ａｌ．、１９９０、ＮＡＲ １８、５８５３−５８６３）をベクターｐＢＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｍａＩ部位においてサブクローニングする。ＥｃｏＲＩで切断してベクターを線状化し、次いでＴ３ＲＮＡポリメラーゼを使用して転写を実施することによって、アンチセンスリボプローブを得る。ベクターをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、次いでＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用する転写することによって、センスリボプローブを合成する。
３．リボプローブの合成
Ｔ７またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを使用する各転写反応を下記の条件下に実施する：ＤＥＰＣ Ｈ２０適量２０μｌ；４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；６ｍＭのＭｇＣｌ2；２ｍＭのスペルミジン；５ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのＤＴＴ；１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（画分Ｖ、Ｓｉｇｍａ）；５００μＭのＣＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ；変化する量のＵＴＰ、ビオチン−ＵＴＰおよびＤＩＧ−ＵＴＰ、修飾の所望の百分率に依存する（例えば、１５％のビオチンおよび１０％のＤＩＧリボプローブを得るためには：７５μＭのビオチン−ＵＴＰ；５０μＭのＤＩＧ−ＵＴＰ、３７５μＭのＵＴＰ）；１Ｕ／ｍｌのリボヌクレアーゼインヒビター；４０ＵのＴ７またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ；１μｇの消化後に適当な制限エンドヌクレアーゼ（ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）で線状化されたプラスミドＤＮＡ。この混合物を３７℃において２時間インキュベートする。転写が完結したとき、１μｌ（１単位）のＤＮアーゼＲＱ１（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加により、プラスミドＤＮＡを消化する。この反応を３７℃において１５分間インキュベートする。バイオスピン（Ｂｉｏｓｐｉｎ）３０排除クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏｒａｄ）を通過させることによって、組込まれなかったリボヌクレオチドを除去する。
リボプローブの合成を定量するか、またはハイブリッド（ｍＲＮＡ：リボプローブ）の存在を放射線的に決定するために、所望の比活性に依存して１〜７μｌの（ａ３２Ｐ）ＣＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｌ；２０ｍＣｉ／ｍｌ）を使用して転写を実施する。変性条件下に５％のアクリルアミド電気泳動ゲル上の移動により、リボプローブの量を測定する。
４．マイクロプレート上のリボプローブの捕捉
ストレプトアビジン（Ｂｏｅｈｒｎｇｅｒ １６０２８５３）に結合したマイクロプレートのウェルを、１×ＰＢＳ緩衝液中で希釈した１００μｌのハイブリッド；１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で３７℃において１時間カバーする。次いでプレートを洗浄緩衝液：０．１ＭのＮａＣｌ；０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；０．１％のツイーン２０；３ｍＭのＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５で５回洗浄する。次いで、１００μｌ（７０ｍＵ）のアルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｎｇｅｒ）にカップリングされた抗ＤＩＧ抗体を添加し、１％のＢＳＡを含有する洗浄緩衝液中で３７℃において１時間インキュベートする。
５．マイクロプレート上のリボプローブの検出
プローブの修飾に依存して、検出は非放射性（蛍光性またはルミネセンス）または放射性であることができる。
５．１．蛍光の検出
０．１Ｍのジエタノールアミン、ｐＨ９．８中の０．４ｍｇ／ｍｌの濃度の１００μｌの４−メチルウムベリフェリルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を使用して、反応を実施する。インキュベーションを室温において一夜実施する。フルオロメーター（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）により３６５ｎｍの励起波長および４５０ｎｍの放射波長において、蛍光の測定を実施する。
５．２．ルミネセンスの検出
０．１Ｍのジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８中で１／１０に希釈したサファイアー（Ｓａｐｐｈｉｒｅ）エンハンサー（Ｔｒｏｐｉｘ）の存在において１／５９に希釈した１００μｌのＡＭＰＰＤ基質（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用して、反応を実施する。２０分後に室温においてマイクロ・ベータ・トリルックス（Ｍｉｃｒｏ Ｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ）ルミノメーター（Ｗａｌｌａｃ）により、ルミネセンスの測定を実施する。
５．３．放射能の検出 これは放射性標識化リボプローブの使用を含む。各ウェルを切り出した後、３ｍｌのシンチレーション流体と接触させる。ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＬＳ６０００ＩＣカウンターにより、放射能の測定を実施する。
６．結果
ビオチン−ＵＴＰはリボプローブ中に組込まれ、これによりビオチン−ＵＴＰをマイクロプレート上に前もって固定化されたストレプトアビジンにより特異的に捕捉することができる。
すべてのプレート結合研究のために、その配列の中にビオチン−ＵＴＰを含まない放射性標識化リボプローブを特異性の対照として使用した。
６．１．一本鎖リボプローブの捕捉の程度に対するビオチンの百分率の影響
第１Ａ図に示すように、一本鎖リボプローブ（ビオチン−ＵＴＰ、（α−32ｐ）ＣＴＰ）の捕捉はリボプローブ中に組込まれたビオチンの量と相関する。５％のビオチンを使用して、最小の結合が得られた。次いで、直線的に２５％のビオチンまで増加し、プラトーに到達する。放射能の測定により、検出を実施した。
１００％のビオチン−ＵＴＰを含有するリボプローブを使用するとき、最大の捕捉の程度は８０％である。
また、非放射性検出系により、捕捉の程度に対するビオチン−ＵＴＰの百分率の影響を判別することができる。しかしながら、リボプローブの中にＤＩＧ−ＵＴＰを組込むことが必要である。第１Ｂ図はこのような検出系を示す。上記結果と一致して、捕捉の程度はビオチン−ＵＴＰの百分率とともに増加する。
６．２．異なる検出系の感度の限界値
異なる型の検出を放射性的または非放射性的に使用することができる。
（α−32Ｐ）ＵＴＰまたは（α−32Ｐ）ＣＴＰで放射性標識化したリボヌクレオチドの組込み後、放射性検出を実施する。
特異的リガンド（ビオチンのためのストレプトアビジン）または酵素（アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ）とカップリングされた特異的抗体（抗ビオチン、抗ＤＩＧ、抗フルオレセイン）から成る複合体を使用して検出された、修飾されたヌクレオチド、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはフルオレセインの組込みの結果として、非放射性検出が可能である。蛍光性生成物またはルミネセンスの生成物の出現を測定することによって、可視化を実施する。
下記において、放射性ヌクレオチド（α−32Ｐ）ＣＴＰの組込みによるか、またはＤＩＧ−ＵＴＰの組込みおよび引き続く蛍光または化学発光の測定により、検出を実施する。
放射性検出の場合において、最大の可能な感度を得るために、高い比活性（２×１０5ｃｐｍ／ｆｍｏｌ）を有するリボプローブを使用した。第３Ａ図は、プレート上で１ａｔｔａｍｏｌｅまでのリボプローブを検出できることを示す。
非放射性検出のために、放射性検出におけるように、感度の限界値は検出に使用する修飾されたヌクレオチド（ＤＩＧ−ＵＴＰ）の組込みレベルに依存する。
例えば、第２Ｂ図はシグナルの強度がリボプローブの中に存在するＤＩＧ−ＵＴＰの百分率とともに増加することを示す：２５％のＤＩＧ−ＵＴＰから成るプローブ５％のＤＩＧ−ＵＴＰを有するプローブの強度の２．５倍で検出される。
検出の最大に相当するＤＩＧ−ＵＴＰの組込み（３５％のＤＩＧ−ＵＴＰ）の条件下に、検出の限界値はフルオレセインにおいて１０ａｔｔａｍｏｌｅであり、そしてルミネセンスにおいて５ａｔｔａｍｏｌｅである。
これらの結果が示すように、異なる系（放射性または非放射性）を使用して、マイクロプレート上に捕捉されたリボプローブを検出することができる。すべての場合において、検出の限界値はプローブの修飾のレベルに依存する。
６．３．二本鎖ＲＮＡ分子の捕捉および検出
マイクロプレート上の一本鎖ＲＮＡ分子を捕捉しかつ検出することが可能であることが確認された後、二本鎖分子の捕捉の可能性を研究した。実際には、試料中の所定のｍＲＮＡの存在はリボプローブとのハイブリダイゼーションにより確認される。形成されたハイブリッドをリボヌクレアーゼによる消化から保護するが、一本鎖分子を消化により除去する。それゆえ、ハイブリッド分子の検出はｍＲＮＡの存在を開示する特徴である。研究した二本鎖分子は異なる百分率の修飾を含有する。
第３Ａ図は、（α−32Ｐ）ＣＴＰ標識化相補的リボヌクレオチド配列を有するハイブリッドを形成した後における、リボプローブ（５、１５、２５、３５％のビオチン−ＵＴＰ）の結合の研究を示す。プレート上のハイブリッドの挙動をモニターできるようにするために、相補的鎖のみを放射性標識化することに注意すべきである。
ハイブリッドの最適な結合は１５〜２５％のビオチン−ＵＴＰにおいて起こることが明らかである。
一本鎖リボプローブについてのように、ハイブリッドを適切に結合するためには５％のビオチン−ＵＴＰは不十分である。
第３Ｂ図は、（５、１５、２５、３５％）のビオチン−ＵＴＰおよび３５％のＤＩＧ−ＵＴＰから成るハイブリッドの捕捉に対するビオチン−ＵＴＰの程度の影響を示す。
ビオチン−ＵＴＰ、ＤＩＧ−ＵＴＰハイブリッドの最大の捕捉は、１５％のビオチン−ＵＴＰを使用して得られる。
これらの結果は上記において得られた結果を確証する。そのうえ、３５％のビオチン−ＵＴＰを含有するプローブは非常に低いレベルのハイブリッドの結合を生ずる。多分、３５％のＤＩＧ−ＵＴＰの存在において得られた二重らせんの安定性が低いためであろう。この結果が証明するように、リボプローブの過度の修飾はハイブリッドを不安定化し、それ自体非常に低いレベルの捕捉を表す。
また、アルカリ性ホスファターゼにカップリングされた抗ＤＩＧ抗体を使用し、次いで蛍光を測定することによって、二本鎖ＲＮＡ分子を検出することができる（結果は示されていない）。
例えば、第４図は１５％のビオチン−ＵＴＰを含有するリボプローブが、また、１５％のＤＩＧ−ＵＴＰを含有するとき、ハイブリッドの最適な検出が達成されることを証明する。
これらの結果は、一本鎖および二本鎖の双方の形態における、１５％のビオチン−ＵＴＰを含有するリボプローブの非常にすぐれた結合を示す。
得られた結果は、ビオチン−ＵＴＰ、ＤＩＧ−ＵＴＰリボプローブ（一本鎖および二本鎖の形態）がマイクロプレートに結合し、そして検出される可能性を有することを示す。捕捉および検出の双方の性質を有するこれらのリボプローブは、自動化可能であるメッセンジャーＲＮＡの検出に非常に適合することが理解される。しかしながら、一本鎖および二本鎖の分子の間の異なるプレート結合挙動が観察された。一本鎖分子について、捕捉の程度はリボプローブ中に組込まれるビオチン−ＵＴＰの量に直接的に関係づけられる。これに対して、二本鎖分子について、捕捉の程度は、１５％のビオチン−ＵＴＰから成るリボプローブ使用するとき、到達する最適値を通り過ぎる。したがって、二本鎖分子について、結合の程度はハイブリッドの中に含有されるビオチンの量に直接的に相関しないが、ハイブリッドの安定性および修飾の百分率の結果である。これは二本鎖分子の結合の最適化を実行する必要性を意味する。
実施例２：一本鎖に対して特異的なリボヌクレアーゼによる分解に対する安定性に関するリボプローブ中の修飾されたヌクレオチドの組込みの効果
実施例１は、過度の比率の修飾が二本鎖ＲＮＡの不安定化を生ずることを示す。それゆえ、リボヌクレアーゼによる消化からの保護の試験に関して、このような修飾の結果を決定することが必須である。そのうえ、この試験において、ハイブリッドの２本の鎖の対合が非常に安定でなくてはならない。なぜなら、不対合はリボヌクレアーゼにより切断および特異的シグナルの損失を生ずるからである。他方において、修飾はウリジン上に位置するので、このヌクレオチドにおいて切断するリボヌクレアーゼは他のヌクレオチドの後で切断するリボヌクレアーゼよりも耐性が低いからであろう。
異なる型のリボヌクレアーゼは商業的に入手可能である（Ｃ１３、Ｔ１、Ａ、ＰｈｙＭ、Ｕ２）。それらは一本鎖の形態のＲＮＡ分子のみを分解し、二本鎖分子を無傷の状態で残すという共通の特徴を有する。これらの酵素はそれらの切断部位の特異性において異なる。
伝統的に、リボヌクレアーゼＡおよびＴ１の混合物を使用して、リボヌクレアーゼの保護試験を実施する。しかしながら、ウリジン、シチジンおよびチミジン残基の後に切断するリボヌクレアーゼＡは、グアノシンの後においてのみ切断するリボヌクレアーゼＴ１よりも実用性が低いことが確認された（示されていない）。これにより、リボヌクレアーゼＡを試験から排除し、そして特異的シグナル（二本鎖分子）の保存と非特異的（一本鎖の）シグナルの分解との間のよりすぐれた妥協を与えるリボヌクレアーゼＴ１を保持することが可能である。マイクロプレート上の可視化の間における高いバックグラウンドの存在を回避するために、ハイブリダイゼーションしないプローブを完全に消化することが必要である。
１．プローブの合成
ＨＮＦ１プローブおよび抗プローブの合成を実施例１におけるように実施した。
２．ハイブリダイゼーション
１ｆｍｏｌの異なる修飾（ビオチンおよび／またはＤＩＧ）を含有するＨＮＦ１アンチセンスプローブを、１０μｇの酵母ｔＲＮＡの存在において、１０および１ｎｇのセンス相補的配列をハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション緩衝液は、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４；１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０；０．４ＭのＮａＣｌ；８０％の脱イオンホルムアミドから成る。この混合物を９３℃において４分間変性した後、ハイブリダイゼーションを４３℃において１６時間実施する。
３．ＲＮアーゼＴ１による消化からの保護
ＲＮアーゼＴ１を使用する消化をハイブリダイゼーション後に実施して、ハイブリダイゼーションしないリボプローブおよびｍＲＮＡを分解する。
３００μｌの消化緩衝液：３００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ７．５；２０ＵのＲＮアーゼＴ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を添加することによって、ＲＮアーゼＴ１を使用する消化を実施する。ハイブリダイゼーションしないＲＮＡの消化を３７℃において３０分間実施する。次いで、２０μｌの１０％のＳＤＳ溶液および１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテイナーゼＫ溶液を使用して、ＲＮアーゼＴ１を不活性化する。この混合物を３７℃において３０分間インキュベートする。ハイブリッドを４００ｐｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合物（Ａｍｅｓｃｏ）で抽出する。１２，０００ｒｐｍにおいて５分間遠心した後、上相を新鮮な管に移す。２００μｌの４Ｍの酢酸アンモニウムおよび７５０μｌの無水エタノールの存在下に−２０℃において３０分間、ハイブリッドを沈降させる。
ハイブリッドの分析のプロトコールに依存して、ペレットを下記の中に取る：
− １０μｌの８０％のホルムアミド；０．１％のキシレンシアノール；０．１％のブロモフェノールブルー；２ｍＭのＥＤＴＡを含んでなる負荷溶液。次いで、ペレットをアクリルアミドゲル上で変性条件下に分析する、または
− １００μｌの捕捉緩衝液：１×ＰＢＳ；１％のウシ血清アルブミン。試料を引き続いてストレプトアビジン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）でコーティングされたマイクロプレートに結合した後、分析する。
４．ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上の分析
試料を９３℃に４分間加熱して変性した後、５％のポリアクリルアミド；１×ＴＢＥを含有する７Ｍの尿素を含有する変性ゲル中で４０〜４５Ｖ／ｃｍにおいて電気泳動的に移動させる。
オートラジオグラフィーにより、放射能を検出する。既知大きさの放射性標識化ＤＮＡ断片の移動との比較により、リボプローブに対応するバンドの大きさを決定する。
５．結果
上記試験によりリボプローブの捕捉（ビオチン）または検出（ＤＩＧ）の修飾がヌクレアーゼ保護試験と適合するかどうかを決定した。使用した試験はＲＮアーゼＴ１により消化からの保護、および引き続く変性条件下の電気泳動ゲル上の伝統的分析である。ＨＮＦ１リボプローブの大きさは５００ヌクレオチドである。
ビオチン−ＵＴＰ（３５％および１００％）リボプローブ（結果は示されていない）およびＤＩＧ−ＵＴＰ（５、１５、２０および３５％）リボプローブ（結果は第５図に描写されている）を試験した。
修飾の百分率がより高いほど、リボヌクレアーゼ保護試験におけるリボプローブの有用性はより低いことが明らかである。したがって、３５％のビオチン−ＵＴＰおよび３５％のＤＩＧ−ＵＴＰから成るリボプローブを使用することは不可能である。なぜなら、多分これらの修飾がハイブリッドの中に生ずる歪みの結果として、リボヌクレアーゼによる分解のために特異的シグナルが完全に喪失されるからである。同様に、１００％のＵＴＰ修飾は、修飾（ビオチン−ＵＴＰ、ＤＩＧ−ＵＴＰ）に無関係に、許容されない。
リボプローブ中に組込まれるＤＩＧ−ＵＴＰの百分率の関数として、ハイブリッドの分解の繊細な分析により、修飾の程度が増加すると、感度が漸進的に減少することが示される。特異的シグナルを有意に喪失させないＤＩＧ−ＵＴＰ修飾の最大の限界値は、１０％のＤＩＧ−ＵＴＰを含有するプローブを使用して得られる（第５図）。
第６図は、リボプローブ（１５％のビオチン−ＵＴＰ、１０％のＤＩＧ−ＵＴＰ）と未修飾の同一リボプローブとの間の感度の比較研究を示す。使用した試験はＲＮアーゼＴ１による消化からの保護、および引き続く変性条件下の電気泳動ゲル上の伝統的分析である。この実験において、双方の放射性標識化リボプローブは４×１０4ｃｐｍ／ｆｍｏｌの比活性を有する。リボプローブ（１５％のビオチン−ＵＴＰ、１０％のＤＩＧ−ＵＴＰ）は、未修飾リボプローブと同様に、１００ｐｇの相補的配列を検出することができるが、シグナルは更に弱い。
これらの結果が示すように、捕捉修飾としてビオチンを使用しそして検出においてＤＩＧを使用する場合において、１５％のビオチンおよび１０％のＤＩＧは標的ＲＮＡのすぐれた検出のために適するように見える。他の修飾では、最適化を実施することが必要であろう。
実施例３：マイクロプレート上のβ−アクチンまたはＨＮＦ１遺伝子のメッセンジャーを検出するリボプローブ（１５％のビオチン−ＵＴＰ、１０％のＤＩＧ−ＵＴＰ）の使用
ＨＮＦ１リボプローブの合成、捕捉および検出を実施例１におけるように実施した。
１．β−アクチンプローブの合成
マウスβ−アクチンをコードするｃＤＮＡの２５０ｂｐの断片（５８２−８３１）を、ベクターｐＢＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＫｓｐＩ／ＸｂａＩ部位においてクローニングする。ＨｉｎｄＩＩＩでベクターを線状化し、次いでＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写することによって、β−アクチンリボプローブが得られる。
２．全体のＲＮＡの抽出
１０7細胞または１０〜１００ｍｇの組織から２ｍｌのＲＮＡｚｏｌ Ｂ（Ｂｉｏｔｅｘ）を使用して、全体のＲＮＡを単離する。組織はＲＮＡｚｏｌ Ｂの中に突き刺して凍結しなくてはならず、そして均質化を「ワーリングブレンダー」ミル中で３０〜６０秒間実施した後、組織を融解するか、そうでなければＲＮＡをＲＮアーゼで消化する。次いで０．２ｍｌのクロロホルムをホモジネートに添加する。混合し、氷の中に５分間放置した後、この溶液を１２，０００ｇ、４℃において１５分間遠心する。水性相を除去し、等しい体積のイソプロパノールを添加する。この混合物を−２０℃において３０分間沈降させる。１２，０００ｇ、４℃において１５分間遠心した後、ペレットを７０％のアルコールで洗浄する。全体のＲＮＡをＤＥＰＣ水中に再懸濁させる。２８０ｎｍにおいて光学密度を測定することによって、試料の濃度を測定する。調製物の品質を０．８％のアガロースゲル上で確認する。
３．ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に必要な全体のＲＮＡの量は、探求するヌクレオチド配列の濃度および放射性標識化リボプローブの比活性に依存する。高い比活性（＞１０9ｃｐｍ／μｇ）を有するリボプローブでは、１０μｇの全体のＲＮＡは通常１〜５コピー／細胞のを残すで存在するｍＲＮＡの検出を可能とするために十分である。
０．１体積の３Ｍの酢酸ナトリウム溶液ｐＨ５．２および２．５体積の冷いエタノールを添加することによって、分析すべき全体のＲＮＡ（１０μｇ）を沈降させる。この溶液を−２０℃において３０分間放置する。１２，０００ｒｐｍ、４℃において１５分間遠心することによって、ｔＲＮＡを回収する。次いでペレットを７０％のエタノール溶液で洗浄し、再遠心する。エタノールの除去後、ペレットを乾燥する。次いでｔＲＮＡを２０ｍｌの下記の成分を含有するハイブリダイゼーション緩衝液中に溶解する：４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４；１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０；０．４ＭのＮａＣｌ；８０％の脱イオンホルムアミド。次いで、放射性標識化またはその他の方法で標識化した、１ｆｍｏｌのビオチン−ＤＩＧリボプローブを添加する。この溶液をピペットで数回撹拌して、ペレットを完全に可溶化する。この混合物を９３℃において４分間インキュベートして変性する。次いで、管をハイブリダイゼーション温度に調節した水浴の中に急速に移す。ほとんどの場合において、ＲＮＡを４５〜５０℃において１６時間ハイブリダイゼーションさせるとき、満足すべき結果が得られる。
４．結果
第７図は、マウスβ−アクチンメッセンジャーに対して相補的な配列に相当するリボプローブ（１５％のビオチン−ＵＴＰ）１０％のＤＩＧ−ＵＴＰ、（α−32Ｐ）ＣＴＰ）の使用を示す。リボプローブの大きさは２５０塩基対である。
リボプローブ（１５％のビオチン−ＵＴＰ、１０％のＤＩＧ−ＵＴＰ、（α−32P）ＣＴＰ）は、１０μｇの全体のＲＮＡ中のβ−アクチンメッセンジャーを検出することができた。使用した試験はＲＮアーゼＴ１による消化からの保護、および引き続く変性条件下のアガロースゲル電気泳動による分析である。リボプローブの大きさの完全性は、放射性標識化マーカーの存在の結果として決定される。
リボプローブは試験したすべての試料において保護されることが理解される（第７図中の矢印を参照のこと）。しかしながら、ヒトの試料について、ＲＮアーゼＴ１切断部位に関する人間とマウスとの間のβ−アクチン遺伝子の配列の差が存在するために、より小さい大きさの第二バンドの存在（矢印）に注意すべきである。β−アクチンメッセンジャーは試験したすべての細胞において可視化された。検出の特異性は、β−アクチンを発現しない、酵母により与えられる。
これが証明するように、リボプローブ（１５％のビオチン−ＵＴＰ、１０％のＤＩＧ−ＵＴＰ）はｍＲＮＡの中に位置する相補的配列と正しく対合する。それゆえ、それをＲＮアーゼＴ１による消化からの保護の機能的試験において使用することができる。
第８図は、ＲＮアーゼＴ１による消化からの保護、および引き続くマイクロプレート上の捕捉後における放射能の検出において得られた結果を示す。同一量のβ−アクチンリボプローブ（１５％のビオチン−ＵＴＰ、１０％のＤＩＧ−ＵＴＰ）、１ｆｍｏｌ（４×１０4ｃｐｍ）をゲルおよびプレート上の検出のために使用した。ポリアクリルアミド電気泳動ゲルを使用する分析におけるように、リボプローブ（１５％のビオチン−ＵＴＰ、１０％のＤＩＧ−ＵＴＰ、（α−32Ｐ）ＣＴＰ）は、１μｇの全体のＲＮＡから出発してβ−アクチンメッセンジャーの存在を検出することができる。陰性の反応の対照として使用した酵母は、β−アクチンを発現する細胞からの５および１０μｇのｔＲＮＡを使用して得られた１８００〜４０００ｃｐｍに比較して、非常に低いバックグラウンド（２５０ｃｐｍ）を与える。非常に弱い（４００〜６８０ｃｐｍ）が、シグナルは１μｇのｔＲＮＡで陽性に止まる。
第９図は、弱く発現されたメッセンジャーに対して向げられたリボプローブ（５００ヌクレオチド）を使用して得られた結果を示す。使用したプローブは、１５％のビオチン−ＵＴＰおよび１０％のＤＩＧ−ＵＴＰを含有し、（α−32Ｐ）ＣＴＰ（５×１０5ｃｐｍ／ｆｍｏｌ）で放射性標識化されている。ＨＮＦ１を発現する２つの細胞（腎および肝）に関係づけられる放射能の測定は、ＨＮＦ１を発現しない試料（胎盤および酵母）に関係づけられる放射能よりも有意に高い。この結果は、弱く発現されたｍＲＮＡのリボプローブ（ビオチン−ＵＴＰ、ＤＩＧ−ＵＴＰ）による検出の可能性を証明する。
しかしながら、自動化を完全に可能するために、このマイクロプレート上の分析法は放射能の使用を省略しなくてはならない。
第１０図は、β−アクチンリボプローブ（１５％のビオチン−ＵＴＰ、１０％のＤＩＧ−ＵＴＰ）を使用し、抗ＤＩＧ抗体を使用するマイクロプレート上の検出およびルミネセンスによる読みにより得られた結果を示す。
試験した細胞は、Ｊｕｒｋａｔ、胎盤、脳、酵母の細胞である。
Ｊｕｒｋａｔ細胞から、０．５μｇのｔＲＮＡ中のβ−アクチンメッセンジャーを検出することができた。胎盤および脳細胞について、β−アクチンメッセンジャーは２μｇのｔＲＮＡにおいて証明された。これらの結果は、検出法の非常にすぐれた感度を示す。
放射能を使用するときのように、リボプローブは１０、５、２または０．５μｇの全体のＲＮＡから出発してβ−アクチンメッセンジャーを検出することができる。
蛍光の検出を使用して、同様な結果が得られる（示さず）。
これらの試験が示すように、リボプローブ（ビオチン−ＵＴＰ、ＤＩＧ−ＵＴＰ）は、それらのヌクレオチド配列を介する認識の特異性を保持すると同時に、プレートに結合し、特異性を検出することができる。ヌクレアーゼ保護の試験におけるそれらの使用は、それらが修飾される程度の調節を必要とする。
ヌクレアーゼ保護技術はしばしばｍＲＮＡの検出および定量の研究において使用されるが、それにもかかわらず、大規模試料の分析に不適当である。ヌクレアーゼ保護実験の産物は通常ポリアクリルアミドゲル上で変性条件下に分析されるので、リボプローブ（ビオチン−ＵＴＰ、ＤＩＧ−ＵＴＰ）用いたマイクロプレート上のメッセンジャーＲＮＡを検出する可能性により、非常に大きい分析手段が構築され、ヌクレアーゼ保護技術が多くの研究に使用可能となる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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