(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１で表されるDNA配列において、１若しくは２の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１で表されるDNA配列と95〜100％の相同性を有するDNA配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１のDNA配列と95〜100％の相同性を有するDNA配列からなり、かつキクの１以上の組織において安定発現可能なプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１ないし４に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかを有する発現ベクター。
【請求項６】
請求項１ないし４に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチドと構造遺伝子とからなるキメラ遺伝子。
【請求項７】
請求項１ないし４に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または請求項６のキメラ遺伝子を有する植物細胞。ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物細胞は除く。
【請求項８】
請求項１ないし４に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または請求項６に記載のキメラ遺伝子を有する植物個体。ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物個体は除く。
【請求項９】
請求項１ないし４に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または請求項６に記載のキメラ遺伝子を有するキク植物細胞またはキク植物体。ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有するキク植物細胞またはキク植物体は除く。
【請求項１０】
配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号２で表されるDNA配列において、１若しくは２の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号２で表されるDNA配列と95〜100％の相同性を有するDNA配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号２のDNA配列と95〜100％の相同性を有するDNA配列からなり、かつキクの１以上の組織において安定発現可能なプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１０ないし１３に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１０ないし１３に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチドと構造遺伝子からなるキメラ遺伝子。
【請求項１６】
請求項1０ないし１３に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または請求項１５に記載のキメラ遺伝子を有する植物細胞。ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物細胞は除く。
【請求項１７】
請求項1０ないし１３に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または請求項１５に記載のキメラ遺伝子を有する植物個体。ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物個体は除く。
【請求項１８】
請求項1０ないし１３に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または請求項１５に記載のキメラ遺伝子を有するキク植物細胞またはキク植物体。ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有するキク植物細胞またはキク植物体は除く。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物において転写活性を有するDNA配列、すなわちプロモーターとして機能するポリヌクレオチドおよびその利用に関する。
【０００２】
本明細書においては、下記用語を以下のように定義する。
「ポリヌクレオチド」には、１本鎖ＤＮＡ、当該１本鎖ＤＮＡの相補鎖である１本鎖ＤＮＡ、両者が水素結合した２本鎖ＤＮＡ、及びこれらＤＮＡの転写産物であるＲＮＡも含まれる。
「１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列」とは、元のDNA配列のうち、１個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列および、複数の塩基、好ましくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されているが、実質的に同等の機能を有するDNA配列をいう。すなわち、これら１または複数の塩基の欠失、置換、付加によってプロモーターの機能に実質的な変化のないもの、およびプロモーターの機能が減少するものも含む。例えば５'−上流から欠失変異を取った場合に、転写活性が変化しないか、または、転写活性が減少するプロモーターを含む意味である。なお、５'−上流から欠失変異を作成することは当業者に周知の技術である。シスエレメントとしての機能を有しないスペーサー領域の欠失、置換、付加は実質的にプロモーター活性を変化させない場合が多く、かかるスペーサー領域が欠失、置換または付加されたＤＮＡ配列も上記用語に含まれる。また、機能を有するシスエレメントを欠失させ、プロモーター活性を減少させるか、あるいは、組織特異性を減少させるものも含まれる。これらの条件を満たす限り、「複数の塩基」とは２塩基から数百塩基までを含むものとする。プロモーター活性を上昇させ、あるいは、組織特異性を変化させるような実質的に機能を変化させる欠失、置換、付加は含まれない。
【０００３】
「ストリンジェントな条件」とは、本明細書中では、95〜100％の相同性を有するDNAがハイブリダイズする条件をいう。例えば2XSSC, 65℃、16〜20時間もしくは0.5Mチャーチリン酸バッファー、1ｍM EDTA、7％ SDS、65℃、16〜20時間等の条件が用いられるが、これらに限られない。
「プロモーター」とは、遺伝子からRNAを転写する活性を有するDNAを言う。本発明においては、主として植物において転写活性を有するプロモーターを意味するが、これに限定されず、機能する限り動物、細菌、酵母、カビ等で使用される場合も含まれる。
「発現ベクター」とは、プロモーターの下流にクローニング用の制限酵素部位を挿入したプラスミドベクターをいう。Tiプラスミド由来のベクターも含まれる。制限酵素部位の下流にポリA付加信号を連結する場合が多い。
「植物細胞」とは、本発明にかかるプロモーターが転写活性を発揮する植物細胞を意味するが、常に転写活性を発揮する必要は無く、いずれかの組織に分化した場合にのみ転写活性を発揮する場合の植物細胞も含まれる。
「キク」とは、本発明にかかるプロモーターがその転写活性を発揮するキク植物細胞およびキク植物体を意味するが、全ての組織において転写活性を発揮するという意味ではなく、一部の組織で転写活性を発揮するキクも含まれる。
「形質転換によらないポリヌクレオチド」とは、その生物がもともと有しているゲノムのポリヌクレオチドを意味する。本発明のプロモーターをもともと有している生物に本発明のプロモーターを連結したキメラ遺伝子を導入した場合には、その導入したプロモーターは「形質転換によらないポリヌクレオチド」ではない。
【０００４】
【従来の技術】
近年の植物分子生物学の発展に伴い、遺伝子のセンスRNA、アンチセンスRNA、2本鎖RNAあるいはリボザイムRNAを植物細胞内で発現させ、病虫害抵抗性、除草剤耐性、ストレス耐性、有用物質生産、新規な花色、新規な形態等の有用形質を備えた植物新品種を分子育種することが可能となってきた。即ち、植物で発現可能なプロモーターの3'-側に目的の遺伝子断片をセンス方向もしくはアンチセンス方向にまたは2本鎖RNAを形成できるように連結し、あるいはリボザイムRNAを転写できるように連結してキメラ遺伝子を作成し、これらをベクターを用い、あるいは直接、植物細胞の染色体に導入することにより、その目的形質の遺伝子を発現または抑制するというものである。かかる手法を応用することにより、例えば、Bacillus thuringensis由来の殺虫性ＢＴ毒素遺伝子のセンスRNAを発現する虫害抵抗性植物（D.A.Fischhoff等、Bio/Technology、vol.232:738、1987）や、トマト果実の登熟に関するポリガラクツロナーゼ遺伝子のアンチセンスRNAを発現する日持ち良好なトマト（C.J.Smith等、Nature、vol.334:724、1988）等が作出されている。
【０００５】
このような形質転換植物に導入される遺伝子のプロモーターとしては、多くの場合、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）の35Ｓプロモーター（以下単に35Ｓプロモーターという）が用いられている。この35Ｓプロモーターは、多くの双子葉植物で遺伝子からRNAを強力に転写する働きを有し、多くの組織で強く発現することから形質転換植物において最も広く使われている。しかしながら、35Ｓプロモーターには以下のような問題がある。1) 単子葉植物においてはそれほど発現が強力でない。2) 単子葉、双子葉を問わず、多くの植物で後代を取ると、発現が見られなくなる個体が出現する。3) 35Ｓプロモーターには高頻度に組換えを引き起こす配列が含まれており（A.  KohliらPlant J 1999 Mar;17(6):591-601）、プロモーター配列自体の染色体上における安定性に問題がある。したがって、これらの問題点を解決できるプロモーターが望まれていた。
【０００６】
キクについても、上記と同様の理由から、35Ｓプロモーターを用いて外来遺伝子の発現が試みられてきた。ところが、キクにおいては、35Sプロモーターを用いた場合、外来遺伝子を発現する個体は得られにくく、また発現が見られる個体が得られたとしてもその発現レベルは低く、しかも成長するにつれて発現が弱くなり、最終的には発現が見られなくなることが知られている（Y. TakatsuらPlant Biotechnology, 2000, 17 (3), 241-245）。すなわち、35Ｓプロモーターはキクにおいて外来遺伝子を発現させる場合の安定性に問題があり、キクにおいて効率良く安定発現できるプロモーターが望まれていた。また、35Ｓプロモーターはキクにおいて発現が見られる場合でも非常に弱い発現しか見られないことから、高発現できるプロモーターも望まれていた。
【０００７】
キクにおいて外来遺伝子の発現が不安定となる現象の原因については未だ解明されていないが、メチル化により35Ｓプロモーターが不活性化されることが原因の１つではないかと推測されている。すなわち、キクは多くの場合、６倍体等の高い倍数性を持つため染色体DNAの大部分がメチル化されており、35Ｓプロモーターもメチル化されることにより不活性化される可能性が考えられる。実際、35Sプロモーターによる遺伝子発現が抑制（サイレンシング）されたキク形質転換体に脱メチル化剤であるアザシチジンを添加すると、発現が回復する場合があることから、メチル化が関与している可能性が高い。なお、サイレンシングには、転写の抑制と転写後の抑制があるが、ここでは転写の抑制を意味する。メチル化によるサイレンシングはキクに限らず他の植物においても問題となっている。したがって、メチル化等によるサイレンシングを受けずに植物において安定発現可能なプロモーターも望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安定的に遺伝子を発現させることができるプロモーター、特に植物体、より好ましくはキクにおいて、いずれかの組織で安定的に遺伝子を発現させるプロモーター、およびその利用方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
キクの内在性遺伝子は上述のようなサイレンシングを受けずに正常に発現することから、キクの内在性の遺伝子のプロモーターを利用して、キクにおける外来遺伝子を発現させることにより、メチル化等によるサイレンシングを回避して、安定的に高発現できる可能性がある。
【００１０】
そこで、以下のようにして、キク由来の強いプロモーターを検索し、クローン化した。リュウノウギクの葉からCTAB-Li法（島本功、佐々木卓治監修  新版植物のPCR実験プロトコール60-62頁、秀潤社1997）を用いて全RNAを抽出し、cDNAライブラリーを構築した。このcDNAライブラリーについて約100クローンのプラスミドを調製し、EST（expressed sequence tag）解析を行い、出現頻度の高い遺伝子（クロロフィルa/b結合蛋白質遺伝子、以下cabという）のEST配列および多数の組織で発現すると考えられる遺伝子（tublin）のESTを配列を見いだした。これらのEST配列に基づき、プライマーを合成し、TAIL-PCR法により、その上流域のプロモーターをクローン化した。既知配列との比較から、翻訳開始コドンを推定し、この翻訳開始コドンの１塩基上流からプロモーターを含む上流領域までの配列をクローン化するために、5'-上流側プライマーの5'-上流側に制限酵素Hind III切断部位、3'-下流側プライマーの5'-上流（プロモーターから見れば3'-下流側）にBam HI切断部位と開始コドンのアンチセンス（CAT）とを付加するようにデザインしたプライマーを用いて、プロモーター及び5'-非翻訳領域をPCRにより増幅した。得られたプロモーターと5'-非翻訳領域を含むPCR断片を制限酵素で切断し、イントロンの入ったβ−グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子に連結し、キクに形質転換後8ヶ月目〜10ヶ月目にGUS活性測定を行った。その結果、リュウノウギクより単離したcabプロモーターが形質転換キク植物体の葉において長期間（少なくとも8ヶ月間）安定的に高発現できることを見出した。
【００１１】
tublin遺伝子のプロモーターについても同様にレポーター遺伝子であるGUS遺伝子に連結し、キクに形質転換して安定性、プロモーターの強度を検討した。その結果、tublinプロモーターについては、葉における安定発現は観察されなかったが、花弁において高頻度に発現が観察された。
一方、35Sプロモーターについては、葉における安定発現は認められなかったことから、キク由来のプロモーターである、cabプロモーターおよびtublinプロモーターについては、葉および花弁でそれぞれ組織特異的に安定発現することが証明された。tublinプロモーターについては、葉由来のESTを基にプライマーをデザインし、TAIL-PCR法によりクローン化したわけであるが、予想に反し、葉では安定発現できず、花弁でのみ安定発現が認められた。
【００１２】
このことは、ある植物の組織で発現している遺伝子のプロモーターをクローン化して、同じ植物種に形質転換したとしても、必ずしも予想される組織で安定に発現するとは限らないことを意味する。つまり、その植物自身のプロモーターを利用するという戦略は当業者が容易に考えつくものであるが、その効果は必ずしも予想通りにはならず、予測できない有利な効果を奏する場合もある。実際、この戦略によっては、葉で安定発現できるプロモーターが得られるものと予想されたが、かかる特性を有するcabプロモーターのみならず、葉では安定発現できないプロモーター（tublinプロモーター）も同様に得られた。そして、どのプロモーターがどの組織で安定発現できるかは当業者は必ずしも予測できない。何故なら、tublin遺伝子はノザン解析のコントロールとしても使われるもので、多くの組織で普遍的に発現すると考えられている。このように多くの組織で発現すると言うことは、組織特異的なサイレンシングを受けず、安定的に発現できる機構が備わっているものと考えられる。しかし、このtublinプロモーターを用いた場合には、キクの葉における安定発現は難しかった。また、cabプロモーターは高発現するプロモーターとして知られているが、かかる高発現プロモーターはある閾値を超える発現量を示した場合、サイレンシング（転写後のサイレンシング）を受けやすいと考えられているため、安定発現は通常期待し難いと考えられる。しかし、予想に反し、かかる高発現プロモーターが安定発現を示した。これらは発明者らの予想外のことであった。したがって、このことから、宿主植物自身のプロモーターを用いる場合でも組織によっては安定発現できる場合とできない場合があり、その判断は当業者の予測できる範囲を超えていると考えられる。以上より、本発明にかかるcabプロモーターおよびtublinプロモーターは当業者の予想できない有利な効果を奏するものである。
【００１３】
即ち、本発明の上記課題はこのcabプロモーターおよびtublinプロモーター、具体的には、配列番号１および配列番号２に示すDNA配列を有するポリヌクレオチドにより解決される。
【００１４】
本発明のプロモーターとしては、配列番号１または２で表されるDNA配列を有するポリヌクレオチドであれば制限なく使用できる。また、このDNA断片とストリンジェントな条件（例えば、2XSSC, 65℃、16時間〜20時間）でハイブリダイズするDNA断片でプロモーター活性を有するものも、本発明において使用できる。本発明で得られたcabプロモーター、tublinプロモーターについてGenBank DatabaseにおいてBlast検索したところでは、類似する配列は認められなかった。cab ESTについては類似性が認められ、アミノ酸レベルでは、Lactuca Sativaのcabタンパク質と局所的には74%の相同性を示した。したがって、このESTをcabのESTと同定した。tublin ESTのアミノ酸部分についてはチコリのtublinのアミノ酸配列とN末端50アミノ酸が完全に一致したことからtublinと同定した。
【００１５】
かかるcabプロモーターまたはtublinプロモーターとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、その由来を問わない。他の植物、例えばキク科の他の植物より定法（CTAB法等）を用いて単離したDNAを用いることもできるが、これらに限られず、いかなる生物種のDNAでもよい。また化学合成したDNAを用いることもできる。
【００１６】
すなわち、本発明は、
（１）  配列番号１で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
（２）  配列番号１で表されるDNA配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
（３）  配列番号１で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
（４）  配列番号１のDNA配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキクの１以上の組織において安定発現可能なプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
に関する。
【００１７】
（５）  前記（１）ないし（４）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかを有する発現ベクター、
（６）  前記（１）ないし（４）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチドと構造遺伝子とからなるキメラ遺伝子、
（７）  前記（１）ないし（４）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または前記（６のキメラ遺伝子を有する植物細胞、ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物細胞は除く、
（８）  前記（１）ないし（４）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または前記（６）に記載のキメラ遺伝子を有する植物個体、ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物個体は除く、
（９）  前記（１）ないし（４）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または前記（６）に記載のキメラ遺伝子を有するキク植物細胞またはキク植物体、ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有するキク植物細胞またはキク植物体は除く、
に関する。
【００１８】
（１０）  配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
（１１）  配列番号２で表されるDNA配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
（１２）  配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
（１３）  配列番号２のDNA配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキクの１以上の組織において安定発現可能なプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、
に関する。
【００１９】
また、本発明は、
（１４）  前記（１０）ないし（１３）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチドを有する発現ベクター、
（１５）  前記（１０）ないし（１３）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチドと構造遺伝子からなるキメラ遺伝子、
（１６）  前記（１０）ないし（１３）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または前記（１５）に記載のキメラ遺伝子を有する植物細胞、ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物細胞は除く、
（１７）  前記（１０）ないし（１３）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または前記（１５）に記載のキメラ遺伝子を有する植物個体、ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有する植物個体は除く、
（１８）  前記（１０）ないし（１３）に記載のポリヌクレオチドのうち、いずれかのポリヌクレオチド、または前記（１５）に記載のキメラ遺伝子を有するキク植物細胞またはキク植物体、ただし、形質転換によらないポリヌクレオチドを有するキク植物細胞またはキク植物体は除く、
に関する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明のプロモーターにより制御すべき遺伝子は、プロモーターの3'-側の下流領域に連結する。そのため、プロモーターの3'-下流側に適当な制限酵素切断部位を挿入した発現ベクターを構築する。望ましくは、制限酵素切断部位の下流にポリA付加信号を含む、転写終結領域を連結する。所望により、適当な選択マーカー遺伝子を連結する。例えば、実施例1および図1に示す、pIGcab1, pIGtub13においては、BamHIとSacIにより、イントロン付GUS遺伝子を切り出すことができ、代わりに任意の遺伝子が挿入可能になっている。植物における選択マーカーとしては、特に限定されないが、カナマイシン、ハイグロマイシン等が利用可能となっている。必要な場合には、適当なエンハンサーをプロモーターの上流域に連結、またはイントロン内に挿入することによりプロモーター活性を上昇させることができる。発現を安定させたい場合、インシュレーターやMatrix Attatchment Region等が利用できる。また、プロモーターと翻訳開始コドンの間に翻訳のエンハンサーを挿入することにより、翻訳効率を上昇させることも可能である。さらに、ＡＴＧ翻訳開始コドンの下流の、このコドンと制御すべき構造遺伝子との間に、構造遺伝子の第一イントロンを含む一部を連結することで、発現効率をさらに向上させることができる場合もある。
【００２１】
本発明において、植物細胞への遺伝子導入は、上記のようにしてプロモーターとこれによりその転写を制御すべき遺伝子とを連結してベクターを作成し、このベクターを用い、定法により行うことができる。即ち、ベクターとしてTiプラスミド由来のベクターを用いる場合には、植物に感染する細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（以下、Ａ．ツメファシエンスと略す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネシス等を媒介として植物細胞への遺伝子導入を行うことができる。また、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、リポソーム融合法、遺伝子銃、カルシウムカーバイドウィスカー法等の物理的・化学的手法により、直接的に植物細胞への遺伝子導入を行うこともできる（K. Lindsey: Transgenic Plant Research, Harwood academic publishers: p.1-33 (1998)）がこれらの方法に限られない。
【００２２】
更に、これらの方法等により遺伝子が導入された植物細胞からは、その植物の種類等に応じた適当な条件下で培養することにより、植物体を再分化させることもできる。また、茎頂に導入することにより、あるいはInPlanta形質転換法を用いることにより、再分化技術を用いることなく、形質転換植物を得ることもできる。このようにして得られた植物細胞・植物体は、本発明のプロモーターによりその転写が制御された遺伝子が導入されている植物細胞であり、植物体である。
【００２３】
本発明のcabプロモーターおよびtublinプロモーターは、下記の実施例で用いたβ−グルクロニダーゼ遺伝子のみならず、他の様々なタンパク質をコードする遺伝子、アンチセンス遺伝子、２本鎖RNA又はリボザイムRNA等の発現を制御することができる。従って、本発明においては、プロモーターの下流に連結させる遺伝子としては、目的に応じて、以下のものが考えられるがこれらに限られない。農業的に優れた形質を付与する遺伝子としては、例えば、耐病性、耐虫性、耐ウイルス性、除草剤抵抗性、抗生物質抵抗性、細菌抵抗性、カビ抵抗性、ストレス耐性、花色関連遺伝子、形態形成に関与する遺伝子、生理活性物質の生合成系遺伝子、有用物質生産遺伝子等がある。医薬品や農薬産業等において有用な物質の生産に関与する遺伝子としては、ワクチン遺伝子、抗体遺伝子、医薬原料生産遺伝子、除虫菊成分等の殺虫物質生合成系遺伝子等が挙げられる。化学工業等において有用な物質の生産に関与する遺伝子としては、例えば、油脂の生合成系遺伝子、工業用酵素遺伝子等が考えられる。研究目的に使用される遺伝子として、遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子（転写因子遺伝子等）、レポーター遺伝子等が考えられる。これらは自然界の生物からクローン化した遺伝子、化学合成遺伝子、あるいはそれらの組み合わせやそれらの改変遺伝子でも良い。また、導入する遺伝子の数も１個に限らず複数でもよい。
【００２４】
また、本発明のプロモーターを使用することのできる植物の種類も特に限定されない。前記植物としては、キクが好ましいが、キク以外でも、例えば、タバコを始め、イネ、トウモロコシ、シロイヌナズナ、ペチュニア、ダイズ、サツマイモ等の草本植物、あるいは、ヤマナラシ、ポプラ、アカシア、スギ、マツ、ユーカリ、ゴム等の木本植物にも本発明のプロモーターを使用することができるが、これらの植物に限られない。
【００２５】
【実施例】
以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］プロモーター活性測定用ベクターの構築
プロモーター活性の測定に用いたpIG101HmBは以下のようにして構築した。まず、pBI101Hm（Akama, K. et al. Plant Cell Rep., 12: 7-11. (1992)）をBamHIで部分分解し、クレノウ酵素で末端をfill inし、そのまま連結し、形質転換した。出現したコロニーを培養し、プラスミドを調製して、制限酵素の切断パターンを調べることにより、pBI101Hmのハイグロマイシン遺伝子の下流のBamHIサイトが欠失したプラスミドを得、これをpBI101HmBと名付けた。次にpBI101HmBをSacIで切断後、フェノール／クロロフォルム抽出を行い、エタノール沈殿後、BamHIで切断し、ゲル電気泳動により分画してベクター側の長いDNA断片をゲルから回収した。ゲル回収にはPrepA Gene DNA Purification Kit (BioRad社製)を用いた。次に、pIG121Hm（Y. Hiei et al. Plant J.  6, 271-282 (1994)）をSacIとBamHIで同様にして切断し、イントロン-GUS遺伝子を含むBamHI-SacI断片をアガロースゲルから回収した。この、pBI101HmBのBamHI-SacIの長い断片と、イントロン-GUS遺伝子を含むBamHI-SacI断片を連結し、pBI101HmBのGUS遺伝子部分をpIG121Hmのイントロン-GUS遺伝子と置き換えたプラスミドを構築し、pIG101HmBと名付けた。
【００２６】
［実施例2］キクRNAの調製
キク全RNAの調製は以下のようにして行った（島本功、佐々木卓治監修  新版植物のPCR実験プロトコール60-62頁、秀潤社1997）。圃場で栽培したリュウノウギクの葉1グラムを乳鉢、乳棒を用いて液体窒素中で細かくなるまで粉砕し、2ＸCTAB溶液（80℃）10mlと混合し、65℃で10分間保温した。等量のクロロフォルム／イソアミルアルコール（24：1）を加え、5分間攪拌し、遠心分離（3500回転、室温）後、水層（上層）を回収した。クロロフォルム／イソアミルアルコール抽出を中間層が出なくなるまで繰り返し行い、水層を回収し、1/4倍量の10M塩化リチウム液を加え、少なくとも2時間-20℃に放置した。15000回転、10分間、4℃で遠心し、上清を捨て、沈殿を回収した。沈殿を1mlのTE緩衝液に溶解し、15000回転、10分間、4℃で遠心し、上清を回収した。上清に等量のTE飽和フェノール（pH9.0）を加えて攪拌し、15000回転、10分間、4℃で遠心し、水層を回収した。水層に等量のフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（25：24：1）を加え攪拌し、15000回転、10分間、4℃で遠心し、水層を回収した。この操作を2回繰り返した。水層に等量のクロロフォルム／イソアミルアルコール（24：1）を加え攪拌し、15000回転、10分間、4℃で遠心し、水層を回収した。水層に1/4倍量の10M塩化リチウム液を加え、少なくとも2時間-20℃に放置した。15000回転、10分間、4℃で遠心し、沈殿を回収した。沈殿を70%エタノールで洗浄し、乾燥後、RNaseフリーの滅菌水30μlに溶解した。
【００２７】
ポリARNAの調製はFAST Track mRNA Isolation Kit（InVitrogen社製）を用いて行った。方法はキットに添付のマニュアルに従って行った。このmRNAを用いて、Gibco BRL社製のSuperScriptcDNA合成キットを用いてcDNAを合成し、pBluescript II KS (-)（StrataGene社製）のEcoRV部位にクローン化した。得られたコロニー105クローンについてそれぞれアンピシリン50μg/mlを含むLB培地で終夜培養し、クラボウ社のプラスミド抽出装置PI-100Σを用いてプラスミドを抽出した。これらのプラスミドについてBigDye cycle sequencing Kit（Applied BioSystems社製）を用いて反応させ、ABI PRISM 310シーケンサーを用いてDNA配列を決定した。
【００２８】
その結果、もっともEST出現頻度が高かったcabとノザン解析のポジティブコントロールに使用されるβ-tublinの2遺伝子を選択し、これらのDNA配列を元にTAIL-PCRのプライマーを合成した。
【００２９】
キクからの全DNAの抽出はCTAB法を用いて定法により行った。
【００３０】
TAIL-PCRの方法については、島本功、佐々木卓治監修、新版植物のPCR実験プロトコール、秀潤社刊、1997年、p83〜p89にしたがって行った。任意プライマーについては、同p85の図2のB：任意プライマー、1：5'-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3'、2：5'-GTNCGA(G/C)(A/T)CANA(A/T)GTT-3'、3：5'-(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3'を用いた。遺伝子特異的プライマーとしては、cab遺伝子については、配列番号3: 5'-CCGTACCATGGGCTTCCTGAT-3'、配列番号4: 5'-AACTCTTCCATTTCCGAGAAGCT-3'、配列番号5: 5'-GAGCCATGGTTGAAGAAGCCARR-3'を用いた。TAIL-PCRの結果、任意プライマー1、2、3の全ての区で約3kbの明瞭なバンドが増幅された。そこで、TAIL-PCR産物をpBluescript II KS (-)のEcoRV部位にクローン化し、得られた組換えプラスミドのDNA配列を決定した。その結果、任意プライマー3を用いて得られたクローンNo.19が遺伝子特異的プライマーである配列番号5の配列を含み、かつ、その上流のcabのDNA配列と一致し、さらに、上流の末端側に任意プライマー3の配列が存在した。そこで、このクローンNo.19をcabのプロモーターを含む上流領域と同定した。
【００３１】
次にこのNo.19の配列を元に、翻訳開始コドン（ATG）のすぐ上流からプロモーターを含む領域を増幅させ、レポーター遺伝子（β-グルクロニダーゼ遺伝子：GUS遺伝子）に連結するために、以下のプライマーを合成した。配列番号6: 5'-AAAGCTTTATATCTTCATCTCTCATGGCTA-3'、配列番号7: 5'-AGGATCCATTTGTTGAAATTGGTTGGAAGA-3'  これらのプライマーを用いて以下の条件でTAIL-PCRを行った。94℃2分→（94℃30秒→50℃±10℃1分→72℃2分）Ｘ5サイクル→（94℃30秒→55℃±10℃1分→72℃3分）Ｘ30サイクル→72℃7分30秒→4℃。このPCR反応により得られた約1.8kbの断片をInVitrogen社のTOPO TA cloning Kitを用いてクローン化し、出現したコロニーを培養後、プラスミドを調製してEcoRI切断により1.9kbの断片が挿入されていることを確認した。このプラスミドをHindIII, BamHIで切断したところ、0.9kb, 1.0kbの2本のバンドが観察された。この2本のバンドをまとめてゲルから回収し、pIG101HmBのHindIII、BamHI間に連結した。このプラスミドをpIGcab1と名付けた（図１）。
【００３２】
Tublinプロモーターについても同様に以下のプライマーを合成し、TAIL-PCRによりクローン化した。すなわち、1st PCR primer配列番号8: 5'-CTCCACTCGCTTCGTTGTAGTAGACATTGA-3'、 2nd PCR primer配列番号9: 5'-GATGCGTTCTAGCTGGAGTTCTGAGTCT-3'、 3rd PCR primer配列番号10: 5'-GGAAGTGAAGGATTTCTCTCATTTTTGGTT-3'をこの順にTAIL-PCRを行った。TAIL-PCRの方法は、上述の方法のままではバンドが多数出現したので、3rd PCR以外は上記と同様であるが、3rd PCRについては、2nd PCR産物を10倍希釈したものを1μl用い、全体で100μl の容量で（94℃2分→44℃1分→72℃3分）X20サイクル→72℃5分→4℃のサイクルで通常のPCRを行った。得られたPCR産物をフェノール／クロロフォルム抽出し、プラスミドpBluescript KS(-)のEcoRV切断物と連結し大腸菌に形質転換した。得られたクローンについて、DNA配列を両鎖について確認後、上記と同様に上流側にHindIII部位、翻訳開始コドン直前にBamHI部位の付加されたプライマー配列番号11: 5'-AAAGCTTCGAGAGAGAAGAACAAACAAA-3'配列番号12: 5'-AGGATCCATTTTTGGTTTTGGTTAGTGTGT-3'を合成して再度PCRを行い、TAクローニングを行った。制限酵素によるスクリーニングで得られたクローンのプラスミドをHindIII、BamHIで切断後、プロモーターを含む断片をゲルより回収し、pIG121HmBのHindIII, BamHI間に挿入することにより、pIGtub13を作成した。プロモーター領域のDNA配列はこのTAクローニングのクローンを用い、両鎖についてABI3100シーケンサーを用いて、BigDye Cycle Sequence法によって決定し、DNASISにより連結した。Cabプロモーターについても同様にしてDNA配列を決定した。cabプロモーターについては翻訳開始コドンから上流300塩基のAT含有率が約80％と非常に高い価を示した。このことからCpG配列のメチル化によるサイレンシングを回避できる可能性がある。tublinプロモーターについては翻訳開始コドンから上流300塩基のAT含有率は約60％であった。
【００３３】
次いで、pIGcab1, pIGtub13をアグロバクテリウム法により、キク（Dendranthema grandiflorum (Ramat.) Kitamura, 品種 セイマリン）に導入した。即ち、pIGcab1, pIGtub13をエレクトロポレーション法によりＡ．ツメファシエンスＥＨＡ１０５に導入した（１０％グリセロール中、電気パルスとして２５００Ｖ、２５μＦを付与。バイオラッド社製 GENE PULSERII を使用。）後、このＡ．ツメファシエンスをカナマイシン５０ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地（トリプトン１％、食塩０．５％、酵母エキス０．５％）で２８℃、２日間培養することにより選抜し、これをカナマイシン５０ｍｇ／ｌを含むLB培地で終夜液体培養したものを無菌培養したキクの葉に感染させた。
【００３４】
キクの形質転換は以下の手順で行った。キク品種‘セイマリン’の無菌植物の葉を5mm角程度に切り外植片とした。この外植片（葉切片）をアグロバクテリウム懸濁液に約３０分つけた後、余分な菌液をろ紙で除いて共存培養培地（ムラシゲ・スクーグ基本培地（以下、ＭＳと略す。）、３％しょ糖、０．８％寒天、２mg/lナフタレン酢酸、１mg/lベンジルアデニン、1g/l カザミノ酸、100μM/l アセトシリンゴン）に葉の裏側を上向きにして置き、22℃・暗黒下で２日間共存培養した。共存培養終了時には、外植片をカルベニシリン 300mg/l、Tween 20 １％を含む10mM硫酸マグネシウム溶液中で、25℃１時間振とうして除菌した。次に、外植片を、選抜培地Ａ（ＭＳ、３％しょ糖、０．８％寒天、２mg/lナフタレン酢酸、１mg/lベンジルアデニン、300mg/l カルベニシリン、25mg/l  パロモマイシン）に移し、20℃、低照度（7μmol/s/m2）で培養した。２週間後、新しい選抜培地Ａに移し、さらに２週間後、選抜培地Ｂ（ＭＳ、３％しょ糖、０．８％寒天、0.02mg/lナフタレン酢酸、１mg/lベンジルアデニン、10.0mg/l ジベレリン酸、300mg/l カルベニシリン、25mg/lパロモマイシン）に移した。次いで、２週間ごとに新しい選抜培地Ｂに移し、シュートが2-3mm長になった時点でシュートをかきとり伸長培地（無機塩濃度が1/2のMS、300mg/lカルベニシリン）に移した。さらに、伸長培地上で伸長したシュートの葉を5mm角に切り選抜培地Ａで培養して抗生物質抵抗性を確認した。
【００３５】
得られたpIGcab1あるいは pIGtub13導入キク植物、即ちキクcabプロモーター-GUS融合遺伝子あるいはキクtublinプロモーター-GUS融合遺伝子を有するキクについて、Jefferson et al. （EMBO J. 1987, 6, 3901 - 3907）の方法に基づき、GUS遺伝子の発現試験を行った。定量的分析には、培養器内で育成した再分化から約８ヶ月経過した形質転換体の展開葉から打ち抜いた直径約7 mmの葉片を材料とし、4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) を基質として用いた。葉片をすりつぶして得た抽出液を、50 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）、10 mM メルカプトエタノール、10 mM EDTA、0.1 % N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、0.1 % Triton X-100、20 % メタノール、1 mM MUGの反応液中で37℃、30分間処理した。処理後、反応液中に存在する4-methylumbelliferone (4-MU)の量を分光蛍光光度計によって定量的に測定した。GUS活性は、葉片抽出液中のタンパク質1 mg当りに生成された4-MUの量（pmol 4-MU/min/ mg protein）で表した。なお、タンパク質の濃度は、Protein assay kit（Bio-Rad Laboratories, California, USA）を用いて定量した。花弁については再分化から１２ないし１８ヶ月後の温室植物体の舌状花の花弁部分を用いて上記と同様の方法でGUS活性を測定した。また、組織化学的分析には、培養器内で育成した再分化から約8ヶ月経過した形質転換体の全体を材料とし、5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- glucuronic acid (X-GLUC)を基質として用いた。植物材料を、100 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）、0.5 mM フェロシアン化カリウム、0.5 mM フェリシアン化カリウム、10 mM EDTA、0.1 % Triton X-100、20 % メタノール、1 mM X-GLUCの反応液に浸漬し、37℃条件下に16時間置いた。反応処理後、７０％エタノール溶液に浸して葉緑素を脱色しGUS活性を示す濃青色の部分の分布を調査した。定量的分析の結果、キク形質転換体の葉において、キクcabプロモーターは35Sプロモーター及びキクtublinプロモーターに比べて強いGUS発現の個体が多く、形質転換体中に占めるGUS活性を有する個体の割合も高いことが示された（表１）。すなわち、その機能は、これが本来プロモーターとして作用する構造遺伝子とは全く異なるGUS構造遺伝子のプロモーターとして用いた場合でも、発揮されることが示された。
【００３６】
植物体全体についてGUS染色による組織化学的分析を行った結果、35Sプロモーター／GUS（表１の≧100の個体）は葉の葉脈のみ薄く染色され、tublinプロモーター／GUS（表１の≧100の個体）は葉の葉脈のみが濃く染色され、cabプロモーター／GUS（表１の≧1000の個体）は葉の全体が濃く染色された。このことからcabプロモーターは葉の全体で強く発現するが、tublinプロモーターは葉脈でのみ強く発現し、35Sプロモーターは葉脈で弱く発現し、他の組織ではほとんど発現しないと考えられた。
【００３７】
【表１】
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なお、表中のＧＵＳ活性レベルは、pmol 4MU/min/mg proteinで示した。
【００３８】
【表２】
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なお、表中のＧＵＳ活性レベルは、pmol 4MU/min/mg proteinで示した。
【００３９】
以上の結果より、本発明のプロモーター、即ち、キクcabプロモーターとして単離された配列番号１に示すDNA配列を有するポリヌクレオチドは、キク形質転換体の葉において、これが本来プロモーターとして作用する構造遺伝子とは全く異なる構造遺伝子に対しても、発現を促進できることが明らかとなった。また、tublinプロモーターについても、キク形質転換体の葉においては活性がほとんど検出されなかったが（表1）、花弁においては中程度の活性が認められた（表２）。このことはtublinプロモーターについても、本来の構造遺伝子以外の遺伝子についても活性を有することを意味している。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のcabプロモーター、即ち、配列番号１に示すDNA配列を有するポリヌクレオチドは、キク形質転換体において、その制御下に置かれた構造遺伝子を少なくとも8ヶ月間以上、葉において安定的かつ強力に発現させる能力を有する。つまり、このプロモーターを使用することにより、キクにおいてサイレンシングを回避して外来遺伝子を長期間安定に高発現させることが可能となる。しかも、このプロモーターは、使用できる構造遺伝子の種類を問わない。
【００４１】
従って、目的に応じて適切なDNA配列を選択し、これを本発明のプロモーターの制御下に置いてベクターを作成し、このベクターを用いてキクの形質転換を行えば、キクにおいてそのDNA配列由来のRNAを安定的かつ強力に発現させることができるので、目的とする形質を付与することが可能である。
【００４２】
本発明で得られたcabプロモーターは、キク植物体において35Sプロモーターに比べ、約10倍程度強い発現を示す。タバコ、ペチュニアにおいては、35Sプロモーターがcabプロモーターよりも3〜10倍程度高い活性を示すが、キクにおいては、キクcabプロモーターは逆に35Sプロモーターよりも10倍程度高い活性を示した。このことは発明者らが全く予想できなかった有利な効果である。
【００４３】
また、35Sプロモーターはキクにおいては、幼植物においては発現が見られる場合があるものの、成長するにつれて発現が弱くなり、最終的に発現が見られなくなる。これに対し、cabプロモーターはキク形質転換体が成長後も約8ヶ月にわたって、安定的に強い発現を維持していた。tublinプロモーターについても長期間栽培後の花弁において高頻度に発現が見られた。
【００４４】
キク由来プロモーターがキクにおいて安定発現することは容易推考とも考えられる。しかし、本発明時と同時期にクローン化したキク由来のtublinプロモーターについては、葉においては安定発現は認められなかった。tublinプロモーターは多くの組織で普遍的に発現するプロモーターであることから、ノザン解析においてコントロールとして使われるものである。かかる多くの組織で安定的に発現しているプロモーターはその近傍に発現を抑制する配列を持たず、ほとんどの組織で安定発現するものと期待される。しかしながら、tublinプロモーターについては葉における安定発現は見られず、花弁においてのみ発現が観察された。
【００４５】
これに対し、cabプロモーターは光誘導性の組織特異的な高発現プロモーターであることから、安定的に発現するとは必ずしも予想できないものである。高発現プロモーターはサイレンシングが起きやすいからである。しかしながら、cabプロモーターについては葉において安定発現が認められた。このことは、当業者の予想できる範囲を超えており、予想外の効果と言える。
【００４６】
さらにcabプロモーターは約80%のアデニン・チミン含量（AT含量）を有していたが、これは非常に高いAT含量であり、このような高いAT含量のプロモーターが存在することは当業者の予想外であると考えられる。AT含量が高いということは、メチル化を受けるシトシンおよびグアニンが少ないことを意味し、そのためにメチル化の影響を受けにくいのではないか、とも考えられる。したがって、かかるAT含量の高い配列が安定高発現に寄与している可能性があるが、もしそうであれば、この点についても当業者の予想外の効果と考えられる。tublinプロモーターについてはかかる高いAT含量は認められなかったが、それにもかかわらず、花弁においては長期間栽培後も発現を示した。この点についても予想外の効果であった。
【００４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  pIGcab1、pIGtub13のT-領域の構造を示す。
B:BamHI, E:EcoRI, H:HindIII, S:SalI, Sc:SacI, pnos:ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、tnos:ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター、BR：右境界配列、BL：左境界配列、NPTII：ネオマイシン・フォスフォトランスフェラーゼII、cab：クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーター、tub：tublin遺伝子プロモーター、GUS：β-グルクロニダーゼ遺伝子、35S：カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、HPT：ハイグロマイシン・フォスフォトランスフェラーゼ
【図１】
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