(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラ属細菌のoriCをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成された２種のオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であって、その一方が配列番号１又は２に示される塩基配列
(5´)TTGTGTATAAGTACC(3´) （配列番号１）
(5´)ATAAGTACCCGTTT(3´) （配列番号２）
を含むオリゴヌクレオチドからなり、もう一方が、配列番号６に示される塩基配列
(5´)TTATTAGGATCGCGCCAGGC(3´) （配列番号６）
からなることを特徴とするプライマー対。
【請求項２】
前記一方のオリゴヌクレオチドが配列番号３、４又は５に示される塩基配列
(5´)TTGAGTTGTGTATAAGTACC(3´) （配列番号３）
(5´)TTGTGTATAAGTACCCGTTT(3´) （配列番号４）
(5´)ATAAGTACCCGTTTTGATCC(3´) （配列番号５）
からなる請求項１記載のプライマー対。
【請求項３】
検体に、請求項１又は２記載のプライマーを加え、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行うことを特徴とするサルモネラ属細菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サルモネラ属細菌の検出方法に関する。さらに詳しくは、特定の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応法（Polymerase Chain Reaction、以下ＰＣＲ法と省略する）を行い、増幅されたプライマーの伸長物を検出することによりサルモネラ属細菌を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
サルモネラ属細菌は病原性の腸内細菌の一つであり、中でも、腸炎菌(Salmonella enteritidis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)等の血清型のものは食中毒を引き起こす細菌として知られている。
【０００３】
サルモネラ属細菌による汚染を確認するためには、検査材料が患者の吐瀉物、糞便、又は食品等の抜き取り材料ある場合、一般に、増菌培養、分離培養を経て各種確認試験が行なわれている。この方法でサルモネラ属細菌による汚染を確認するまでには通常４日が必要であり、次いで当該汚染が、サルモネラ属細菌のどの血清型によるものであるかを特定するには、さらに時間が必要となっている。また、分離培養や確認試験においては、培地の微妙な色調変化を調べる必要もある。このため、サルモネラ属細菌による汚染の確認試験の操作は、煩雑で熟練を要するものとなっている。
【０００４】
これに対して、近年、より簡便で迅速なサルモネラ属細菌の検出方法として、オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡプローブ法あるいはハイブリダイゼーション法が試みられている。しかしながら、これらの方法では充分な検出感度と再現性を得ることが困難である。
【０００５】
また、FluitらはＰＣＲ法を使用し、そのプライマーとして、サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成した２種のオリゴヌクレオチドを使用することにより、サルモネラ属細菌の特定領域のオリゴヌクレオチドを増幅し、これを検出することを試みている(Rapid Detection of Salmonellae in Poultry with the Magnetic Immuno-Polymerase Chain Reaction Assay., Appl. Env. Microb., 59, No.5, 1342(1993))。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、Fluitらのサルモネラ属細菌の検出方法によると、雑菌としてシトロバクター（Citrobacter freundii）が存在する場合、サルモネラ属細菌の検出感度が落ちるという問題がある。なお、このシトロバクターは腸内細菌叢として存在し、サルモネラ症は引き起こさないが、サルモネラ属細菌に極めて類縁であり、サルモネラ属細菌との識別が困難な菌である。
【０００７】
本発明は、このような従来技術の課題に対し、ＰＣＲ法でサルモネラ属細菌を検出するための新規のプライマーを開発し、雑菌としてシトロバクターが存在してもサルモネラ属細菌を良好に検出できるようにすることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するため、本発明は、サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１又は２に示される塩基配列
(5´)TTGTGTATAAGTACC(3´)      （配列番号１）
(5´)ATAAGTACCCGTTT(3´)       （配列番号２）
を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供し、特に、配列番号３、４又は５に示される塩基配列
(5´)TTGAGTTGTGTATAAGTACC(3´)      （配列番号３）
(5´)TTGTGTATAAGTACCCGTTT(3´)      （配列番号４）
(5´)ATAAGTACCCGTTTTGATCC(3´)      （配列番号５）
を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００９】
また、サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成された２種のオリゴヌクレオチドからなるプライマーであって、その一方が上述のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とするプライマーを提供する。
【００１０】
さらに、そのようなプライマーを検体に加え、ＰＣＲ法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行うことを特徴とするサルモネラ属細菌の検出方法を提供する。
【００１１】
本発明のサルモネラ属細菌の検出方法では、ＰＣＲ法におけるプライマーとして、サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成された特定の塩基配列のオリゴヌクレオチドを使用する。
【００１２】
このプライマーは、Fluitらがサルモネラ属細菌の検出のためにＰＣＲ法で使用するプライマーと、サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とする点では共通であるが、その相補鎖側の配列が異なる。即ち、Fluitらのプライマーがシトロバクターの配列とほぼ一致する領域を有するのに対し、本発明のプライマーはシトロバクターの配列とは全く一致しないものとなっている。したがって、本発明のプライマーを使用すると、サルモネラ属細菌とシトロバクターとの共存下でサルモネラ属細菌が微量に存在する場合でも、サルモネラ属細菌を検出することが可能となる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明がサルモネラ属細菌の検出のために行うＰＣＲ法は、Saikiが開発したPolymerase Chain Reaction法（Science,230,1350(1985)）に基づくものである。
【００１５】
本発明では、ＰＣＲ法によりサルモネラ属細菌を検出するに際して使用するプライマーとして、特定の塩基配列を有する本発明のオリゴヌクレオチド、即ち、サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１又は２に示される塩基配列
(5´)TTGTGTATAAGTACC(3´)      （配列番号１）
(5´)ATAAGTACCCGTTT(3´)       （配列番号２）
を含むオリゴヌクレオチドを使用する。
【００１６】
これら配列番号１又は２又で示されるオリゴヌクレオチドの配列は、サルモネラ属細菌のoriC遺伝子の塩基配列とシトロバクターのoriC遺伝子の塩基配列とを詳細に解析した結果、シトロバクターのoriC遺伝子の塩基配列と完全に識別される領域を見出すことにより決定されたものである。これら配列番号１又は２に示される配列は、サルモネラ属細菌を検出するための公知のＰＣＲ法（Fluitら、Appl. Env. Microb., 59, No.5, 1342(1993)）で使用される、oriC遺伝子を標的とした１組のプライマー（正規鎖側プライマー及び相補鎖側プライマー）のうち、相補鎖側プライマーの配列が、シトロバクターのoriC遺伝子の塩基配列とほぼ一致する領域を有しているのと明確に区別される。したがって、これらの配列を有するオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法のプライマーとして使用することにより、シトロバクターの共存下でも、シトロバクターの非共存下と同様にサルモネラ属細菌を検出することが可能となる。特に、腸炎菌(Salmonella enteritidis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)等の血清型の菌を高感度で検出することが可能となる。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１又は２で示される塩基配列を含む限り、その5´末端側又は3´末端側が延長されていてもよく、連鎖する塩基数が１４〜４０のものが好ましい。例えば、好ましいオリゴヌクレオチドとして、配列番号３、４又は５に示される塩基配列
(5´)TTGAGTTGTGTATAAGTACC(3´)      （配列番号３）
(5´)TTGTGTATAAGTACCCGTTT(3´)      （配列番号４）
(5´)ATAAGTACCCGTTTTGATCC(3´)      （配列番号５）
を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
【００１８】
これに対し、連鎖する塩基数が少なすぎるとサルモネラ属細菌のoriC遺伝子以外の遺伝子と反応し、サルモネラ属細菌の検出の選択性が低下するので好ましくない。また、連鎖する塩基数が多すぎるとサルモネラ属細菌のoriC遺伝子との結合が不安定となりやすいので好ましくない。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１又は２で示される塩基配列を含む限り、オリゴヌクレオチドを構成するデオキシリボースや塩基について、その一部に他の分子が付加したり、その一部が他の分子で置換されるなどにより修飾されているものも含まれる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドには、サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法で増幅した後、そのオリゴヌクレオチドの検出を簡略化するため、プライマーとするオリゴヌクレオチドの3´末端を蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したものが含まれる。この他、3´末端にビオチンを結合し、アビジンと共有結合させたペルオキシダーゼを結合させ得るものや、デオキシリボース骨格間を結合しているリン酸の中の酸素をイオウ原子に置き換えることによりアンチセンス化したもの等が含まれる。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法でサルモネラ属細菌を検出する場合の１組のプライマーの一方として使用する場合に、これと組み合わせて使用するもう一方のプライマーとしては、正規鎖側プライマーとして公知のものを使用することができる。例えば、FluitらがＰＣＲ法でサルモネラ属細菌を検出する場合に使用した、配列番号６
(5´)TTATTAGGATCGCGCCAGGC(3´)      （配列番号６）
で示されるオリゴヌクレオチドからなる正規鎖側プライマー（Appl. Env. Microb., 59, No.5, 1342(1993)）等を使用することができる。
【００２１】
これら正規鎖側と相補鎖側の１組のプライマーを使用し、サルモネラ属細菌に特異的なオリゴヌクレオチドを増幅するＰＣＲ法自体は公知の方法に従うことができる。即ち、まず、検体を熱処理することにより検体中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖に分離し、これに１組のプライマーを作用させて、相補的な検体のオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズさせ、次に、ＤＮＡポリメラーゼと４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）との存在下でプライマーの下流の領域を選択的に合成する。そしてこの操作を２０〜４０サイクル程度繰り返すことにより、検体中の特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーの伸長物として増幅することができる。また、この増幅は、電気泳動、クロマトグラフィー等により確認することができ、これにより検体中のサルモネラ属細菌を容易にかつ確実に検出することが可能となる。
【００２２】
なお、このＰＣＲ法を適用する検体としては、患者の吐瀉物、糞便、又は食品等の抜き取り材料等をあげることができる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。
【００２４】
実施例１
（１）検体の調製
サルモネラ属細菌及びシトロバクターとして、表１中の縦の見出し欄に示したものを用い、それぞれ増菌用の平板培地に接種し、３５℃で一晩培養した。菌体を掻き取り、０．８５％食塩水に懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱することによりＤＮＡを抽出し、遠心分離した上澄液を検体とした。なお、この懸濁液中の菌濃度は１０7ＣＦＵ／ｍｌ程度であった。
【００２５】
（２）プライマーの合成
サルモネラ属細菌のoriC遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とする、相補鎖側プライマーとして、配列番号３、４又は５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをトリエステル法により合成した。また、正規鎖側プライマーとして、配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをトリエステル法により合成した。
【００２６】
（３）反応液の調製とＰＣＲ反応
検体液５μｌに１０倍に濃縮されている反応用バッファー５μｌ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑに付属のＢｕｆｆｅｒ）、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑに付属のｄＮＴＰ混合液）４μｌ、表１に示すように、正規鎖側プライマーとして配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（Appl. Env. Microb., 59, No.5, 1342(1993)のプライマー１）２０ｐｍｏｌ、相補鎖側プライマーとして、配列番号３、４又は５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ）０．２５μｌを加え、水で５０μｌとした。
【００２７】
熱変成（９４℃、１分）、アニーリング（５０℃、１分）、重合反応（７２℃、１分）からなる過程を１サイクルとし、これを３０サイクル繰り返し反応させた。
【００２８】
反応液中にヌクレオチド配列が増幅されたか否かを見るために、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウムによる染色を行った。即ち、電気泳動は３％のアガロースゲルを使用し、ＴＢＥバッファー中、１００ボルトで３０分行った。次いでゲルを取り出し、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液中に３０分浸漬して染色後、トランスイルミネーターで発色させ、ポラロイドカメラで撮影した。この場合、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流すことにより、相対比較によって、検出されたヌクレオチド配列断片の長さを算出した。
【００２９】
結果を表１に示す。表１中の＋は、プライマーの組合せが、配列番号６のオリゴヌクレオチドと配列番号３のオリゴヌクレオチドの場合１４０塩基対、配列番号６のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチドの場合１３５塩基対、配列番号６のオリゴヌクレオチドと配列番号５のオリゴヌクレオチドの場合１２９塩基対に相当する大きさの増幅物が観察されたことを示している。
【００３０】
【表１】
0004131047.tif 000002
【００３１】
表１の結果から、各プライマーの組合せとも、サルモネラ属細菌を正しく検出できることがわかる。
【００３２】
実施例２
実施例１の各プライマーの組合せで行ったＰＣＲ反応によるサルモネラ属細菌の検出結果が、サルモネラ属細菌に対し選択的であることを確認するため、臨床検査、食品衛生検査等において高頻度で現れる腸内細菌科のサルモネラ属以外の属の菌を表２に示すように選び、実施例１と同様にして各プライマーの組合せごとに特定の長さの塩基対が増幅された否かを調べた。
【００３３】
結果を表２に示す。表２中の−は、プライマーの組合せが、配列番号６のオリゴヌクレオチドと配列番号３のオリゴヌクレオチドの場合１４０塩基対、配列番号６のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチドの場合１３５塩基対、配列番号６のオリゴヌクレオチドと配列番号５のオリゴヌクレオチドの場合１２９塩基対に相当する大きさの増幅物が観察されなかったことを示している。
【００３４】
【表２】
0004131047.tif 000003
【００３５】
表２の結果から、各プライマーの組合せとも、サルモネラ属以外の細菌は検出できないことがわかる。
【００３６】
実施例３
検体中のサルモネラ属細菌の検出限界を調べるために、Salmonella Enteritidis 食品由来株を実施例１と同様に培養し、菌の懸濁液とした。これの１０倍希釈系列を調製し、これを沸騰水中で１０分間加熱することによりＤＮＡを抽出し、遠心分離し、その上澄液を検体とした。なお、加熱直前に希釈液の一部を取って菌数測定し、それぞれの菌濃度を算出した。これらの菌濃度を表３に示す。
【００３７】
検体液５μｌに、１０倍に濃縮されている反応用バッファー５μｌ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑに付属のＢｕｆｆｅｒ）、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａＴａｑに付属のｄＮＴＰ混合液）４μｌ、表３に示すように、正規鎖側プライマーとして配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（Appl. Env. Microb., 59, No.5, 1342(1993)のプライマー１）２０ｐｍｏｌ、相補鎖側プライマーとして、配列番号３、４又は５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、あるいは相補鎖側プライマーの比較例として、FluitらがＰＣＲ法でサルモネラ属細菌を検出する場合にプライマー２として使用した、配列番号７
(5´)AAAGAATAACCGTTGTTCAC(3´)      （配列番号７）
で示されるオリゴヌクレオチド（Appl. Env. Microb., 59, No.5, 1342(1993)）、２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ）０．２５μｌを加え、水で５０μｌとした。
【００３８】
菌濃度ごとに、かつ各プライマーの組合せごとに、実施例１と同様にして特定の長さの塩基対が増幅された否かを調べた。
【００３９】
結果を表３に示す。表３中の＋、−は、前述の表１、表２と同様に、配列番号６のオリゴヌクレオチドと配列番号３のオリゴヌクレオチドの場合１４０塩基対、配列番号６のオリゴヌクレオチドと配列番号４のオリゴヌクレオチドの場合１３５塩基対、配列番号６のオリゴヌクレオチドと配列番号５のオリゴヌクレオチドの場合１２９塩基対に相当する大きさの増幅物の観察の有無を示している。
【００４０】
【表３】
0004131047.tif 000004
【００４１】
表３の結果から、検体中にシトロバクターが存在しない場合のサルモネラ属細菌の検出限界は、相補鎖側プライマーとして、本発明の配列番号３、４又は５のオリゴヌクレオチドを使用した場合は、公知の配列番号７のオリゴヌクレオチドを使用した場合と同様にサルモネラ属細菌を１０3ＣＦＵ／ｍｌまで検出できることがわかる。
【００４２】
実施例４
通常の臨床検体や食品検体の場合、大量の雑菌が共存するので、雑菌の共存条件下でもサルモネラ属細菌を検出できることが必要である。そこで、前述の実施例３の操作において、各検体液中にサルモネラ属細菌と最も類縁であるシトロバクター（Citrobacter freundii）を６．１×１０7ＣＦＵ／ｍｌ共存させ、実施例３と同様にして特定の長さの塩基対が増幅されたか否かを調べた。結果を表４に示す。
【００４３】
【表４】
0004131047.tif 000005
【００４４】
表４の結果から、相補鎖側プライマーとして公知の配列番号７のオリゴヌクレオチドを使用した場合には、検体中にサルモネラ属細菌とシトロバクターが共存すると、前述の実施例３のシトロバクターが共存しない場合に比してサルモネラ属細菌の検出限界が劣るが、本発明の配列番号３、４又は５のオリゴヌクレオチドを使用した場合は、シトロバクターの共存下においても前述の実施例３の共存しない場合と同様にサルモネラ属細菌を１０3ＣＦＵ／ｍｌまで検出できることがわかる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、ＰＣＲ法でサルモネラ属細菌を検出するにあたり、新規なプライマーを使用するので、雑菌としてシトロバクターが存在してもサルモネラ属細菌を良好に検出することが可能となる。
【００４６】
【配列表】
0004131047.tif 000006
0004131047.tif 000007
0004131047.tif 000008
0004131047.tif 000009