(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性を有する基板上に、リード部および検出部が直列になるように導電性インキを用いて連続的に印刷し、次いで導電性微粉末を未乾燥の検出部に付着させ、次いでリード部および検出部を乾燥させ、次いで導電性微粉末に核酸を電気的に固定化させることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【請求項２】
絶縁性を有する基板上に、リード部を導電性インキを用いて印刷して乾燥し、次いで検出部を導電性インキを用いてリード部と直列になるように印刷し、次いで導電性微粉末を未乾燥の検出部に付着させ、次いで検出部を乾燥させ、次いで導電性微粉末に核酸を電気的に固定化させることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【請求項３】
導電性微粉末が、金属またはグラファイトからなるものである請求項１〜２のいずれかに記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【請求項４】
基板上に複数列のリード部および検出部を形成する請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、電気化学的にＤＮＡやＲＮＡを検出する方法において用いることができるＤＮＡマイクロアレイの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、遺伝子構造を大量に効率的に解析するための解析ユニットとしてＤＮＡマイクロアレイがある（ＤＮＡチップともいう）。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイとして、プローブＤＮＡを電極型センサに適用する方法がある（特開平９−２８８０８０参照）。すなわち、出力端子を備えた電極であって、プローブＤＮＡが固定された電極と試料ＤＮＡとを反応させ、反応後の電極の電流を測定することにより、プローブＤＮＡと試料ＤＮＡとで形成されるハイブリッドＤＮＡの存在を検出あるいはハイブリッドＤＮＡの量を測定する方法である。すなわち、導電性物質で修飾されたプローブＤＮＡが結合した電極を、試料ＤＮＡを含む検体溶液に導入することにより、プローブＤＮＡと相補的な配列を有する試料ＤＮＡがハイブリダイズし、ハイブリッドＤＮＡが形成される。このハイブリダイゼーションは、インターカレーターの存在下で行なう。インターカレーターは、ハイブリッドＤＮＡの層間に侵入し、一種の電荷移動錯体を形成する。ハイブリッドを形成しない場合、つまり一本鎖のままであれば、インターカレーションは起こらない。インターカレーションにより、電極に流れる電流量が変化する。この電流は、ハイブリダイズにより形成された二本鎖ＤＮＡにインターカレートしたインターカレーターの酸化、還元によるものである。二本鎖ＤＮＡの形成の程度はインターカレートの程度として検出することができる。したがって、電極に流れる電流量を検出および／または測定することにより、ハイブリッドＤＮＡの存在が検出され、あるいはハイブリッドＤＮＡの量が測定される。このような電気化学的検出方式に用いるＤＮＡマイクロアレイは、ＥＣＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｒｒａｙ）チップともいう。
【０００４】
電気化学的検出方式に用いるＤＮＡマイクロアレイの電極としては、蒸着法で形成されたアレー状に配置された多数の微細な金電極上に、それぞれ異なる種類の合成オリゴＤＮＡを共有結合させたものがある（特開２０００−５０９３１参照）。各金電極に異なる種類の合成オリゴＤＮＡを供給する手段としては、フォトリソグラフィー法を利用した方法や、ディスペンサーで反応性物質を滴下する方法がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記ＤＮＡマイクロアレイの基板上には、数百〜数万個の電極を形成していることが多い。このような場合、フォトリソグラフィー法を利用して核酸を固定するには、多数のマスク処理が必要となるという問題がある。また、ディスペンサー法を利用して核酸を固定するには、ペン先を洗浄することによる核酸濃度の不均一性が生じるといった問題や、基板上に形成された微細な電極との高精度な位置合わせが必要となるという問題がある。
【０００６】
したがって、この発明は、上記のような問題点を解消し、フォトリソグラフィー法やディスペンサー法を用いずに製造することができるＤＮＡマイクロアレイの製造方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、以上の目的を達成するために、つぎのように構成した。
【０００８】
つまり、この発明のＤＮＡマイクロアレイは、絶縁性を有する基板上に、リード部および検出部が直列になるように導電性インキを用いて連続的に印刷し、次いで導電性微粉末を未乾燥の検出部に付着させ、次いでリード部および検出部を乾燥させ、次いで導電性微粉末に核酸を電気的に固定化させるように構成した。
【０００９】
また、絶縁性を有する基板上に、リード部を導電性インキを用いて印刷して乾燥し、次いで検出部を導電性インキを用いてリード部と直列になるように印刷し、次いで導電性微粉末を未乾燥の検出部に付着させ、次いで検出部を乾燥させ、次いで導電性微粉末に核酸を電気的に固定化させるように構成してもよい。
【００１１】
また、上記の発明において、導電性微粉末が、金属またはグラファイトからなるように構成してもよい。
【００１２】
また、上記の発明において、基板上に複数列のリード部および検出部を形成するように構成してもよい。
【００１３】
【発明の実施の形態】
図面を参照しながらこの発明の実施の形態について詳しく説明する。
【００１４】
図１は、この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法によって得ることができるＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。図２〜４は、この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す断面図である。図５は、この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す模式図である。図６〜９は、この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す断面図である。図１０は、この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法によって得ることができるＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。図１１は、この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す平面図である。図１２は、この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法によって得ることができるＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。図１３は、この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法によって得ることができるＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す平面図である。図中、１はＤＮＡマイクロアレイ、２は基板、３はリード部、４は検出部、５は導電性微粉末、６は核酸、７はマスキングである。
【００１５】
この発明のＤＮＡマイクロアレイ１の製造方法は、絶縁性を有する基板２上に、リード部３および検出部４が直列になるように導電性インキを用いて連続的に印刷し、次いで導電性微粉末５を未乾燥の検出部４に付着させ、次いでリード部３および検出部４を乾燥させ、次いで導電性微粉末５に核酸６を電気的に固定化させる方法である。なお、この発明でいうＤＮＡマイクロアレイ１とは、ＤＮＡの検出だけでなく、ＲＮＡの検出を行うものも含む。
【００１６】
まず、絶縁性を有する基板２上に、リード部３および検出部４が直列になるように導電性インキを用いて連続的に印刷する（図２参照）。
【００１７】
基板２としては、絶縁性を有し、導電性インキが印刷可能なものであればよく、たとえば、紙類、ポリエチレン樹脂、エチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリイソブチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリ酢酸ビニル樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリビニルアセタール樹脂、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル樹脂、ポリスチレン樹脂、アセタール樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリアミド樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド樹脂、ポリスルホン樹脂などの有機材料や、ガラス、アルミナなどの無機材料などを使用することができる。ＤＮＡマイクロアレイ１において、リード部３および検出部４が形成された基板２が複数枚積層される多層構成にする場合は、各基板２の厚さを数十μｍ程度と薄いものにすると、ＤＮＡマイクロアレイ１をより小型化することができ、ＤＮＡマイクロアレイ１に接触させるべき試料の量が少なくなるので好適である。
【００１８】
導電性インキは、導電性フィラー、バインダー、溶剤から少なくとも構成される。導電性フィラーとしては、導電性に優れた物質である銅粉、金粉、黒鉛、カーボンブラック、炭素繊維、ニッケル粉などを用いることができる。なお、銀粉は試料溶液中に溶出するなどマイグレーションが生じるおそれがあるため、他の物質をフィラーとして用いるのが好ましい。バインダーとしては、エポキシ系樹脂、アルキド系樹脂、アクリル系樹脂、ポリウレタン系樹脂、メラミン系樹脂、フェノール系樹脂、塩化ビニル−酢酸ビニル共重合体系樹脂などを用いることができる。溶剤としては、バインダーとして用いる樹脂を溶解するものを用いるとよい。また、必要に応じて、分散剤、滑剤、カップリング剤などの添加剤を加えてもよい。
【００１９】
導電性インキに要求される特性としては、導電性、印刷適正、乾燥性が挙げられる。導電性が小さいと検出信号が小さくなり、ノイズの影響が大きくなるので正しい検出結果を得るのが困難になる。この発明においては、導電性は、リード部３の長さなどにより適宜精度よく検出できる範囲であればよく、ばらつきの少ない安定した検出信号を取り出すには１５００Ω／ｃｍ２以下であるのが好ましい。
【００２０】
導電性インキの印刷方法としては、たとえば、スクリーン印刷法、グラビア印刷法、オフセット印刷法、インクジェット印刷法など、通常の印刷法を用いることができる。印刷方法は、導電性インキの種類や、リード部３および検出部４のパターン形状などに応じて適宜選択すればよい。
【００２１】
リード部３は、導電性インキの印刷によって形成される。リード部３は、電流量を測定する機器に接続する端子と検出部４との間を、所望の抵抗値を有する回路によって接続されるように形成する。
【００２２】
検出部４は、導電性インキの印刷によって形成される。リード部３と検出部４とは、導電性インキの印刷によって、リード部３および検出部４が直列になるように連続したパターンとして１回の印刷工程で連続して印刷して形成することができる。検出部４としては、所望の抵抗値を有するとともに、導電性微粉末５が確実に固着することが必要である。すなわち、導電性微粉末５が確実に検出部４の表面に固着できるようにするため、印刷された検出部４の導電性インキ膜厚と、付着される導電性微粉末５の粒径を、適宜選択するとよい。また、試料に含まれる複数種類の核酸６を同時に検出させる場合には、複数の検出部４を同一の基板２上に形成することになるため、検出部４を微細に形成することによって集積度を高めることができる。
【００２３】
次いで、導電性微粉末５を未乾燥の検出部４に付着させる（図３参照）。
【００２４】
導電性微粉末５としては、導電性を有し、核酸６を固定化することができるものを用いる。たとえば、金、グラシーカーボン、炭素などからなる微粉末を用いることができる。導電性微粉末５の形状や大きさとしては、検出能力や再現性の点から印刷された導電性インキ上に一面に形成されるものであればよく、たとえば、球状、板状、針状など種々の形状のものを用いることができる。特に、形状が球状であると、検出部４に均一に付着させることができるので好ましい。
【００２５】
基板２上に検出部４として印刷された導電性インキが乾燥するまでの間に、導電性微粉末５を、検出部４の上に付着させる。
【００２６】
導電性微粉末５を付着させる方法としては、印刷された導電性インキである検出部４の表面上に、導電性微粉末５を積層させることができる方法であればよい。たとえば、印刷された導電性インキの上方から導電性微粉末５を自然散布する方法、導電性微粉末５を吹き付ける方法、基板２と導電性微粉末５の双方を帯電させ、静電気を利用して吸着させる方法、大量の導電性微粉末５中に基板２をくぐらせる方法などがある。このような工程の後、余分な導電性微粉末５をエアーガンなどで除去し、検出部４の表面にのみ導電性微粉末５を付着させることができる（図４参照）。また、導電性微粉末５の散布等の際に、導電性微粉末５がリード部３に付着しないようにするため、リード部３をマスキング用治具などで覆うようにしてもよい。
【００２７】
次いでリード部３および検出部４を乾燥させる。
【００２８】
リード部３および検出部４を構成する導電性インキを、加熱などの手段で乾燥させ、導電性微粉末５を検出部４に完全に固着させ剥離しないようにする。導電性インキを乾燥させることにより、リード部３および検出部４を実用的な抵抗値にするとともに、導電性微粉末５との密着をより強固にすることができる。
【００２９】
次いで、導電性微粉末５に核酸６を電気的に固定化させる。なお、本発明でいう核酸６とは、ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片をいう。
【００３０】
核酸６を電気的に固定化させるには、次のような方法がある（図５参照）。すなわち、まず、酢酸緩衝液（ｐＨ５）に検出部４を挿入し、電位を＋１．５Ｖ（ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ）で１分間印加し、検出部４に付着した導電性微粉末５表面の活性化処理を行う。次いで、核酸６３０ｐｐｍを含む０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７に検出部４を挿入し、３分間電位を＋０．５Ｖに保って導電微粉末上に核酸６を固定化する。次いで、０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７に検出部４を挿入し、すすぎ洗いした後５５℃３０分間の条件にてオーブンで乾燥する。
【００３１】
以上のようにしてＤＮＡマイクロアレイ１を得ることができる（図１参照）。
【００３２】
また、次のような方法でＤＮＡマイクロアレイ１を得るようにしてもよい。
【００３３】
まず、絶縁性を有する基板２上に、リード部３を導電性インキを用いて印刷して乾燥する（図６参照）。リード部３が印刷された後にリード部３の導電性インキを乾燥させ、検出部４の印刷に備えるようにする。
【００３４】
次いで、検出部４を、導電性インキを用いてリード部３と直列になるように印刷する（図７参照）。検出部４のパターンは、リード部３と部分的に重複するように形成することによって、検出部４とリード部３との導通を図ることができる。
【００３５】
次いで、導電性微粉末５を未乾燥の検出部４に付着させる（図８参照）。この際、リード部３を構成する導電性インキはすでに乾燥しているため、マスキングなどの処理を行わなくても導電性微粉末５は検出部４にのみ付着する。
【００３６】
次いで、検出部４を乾燥させ、余分な導電性微粉末５をエアーガンなどで除去する（図９参照）。
【００３７】
次いで、次いで導電性微粉末５に核酸６を電気的に固定化させる（図５参照）ことにより、ＤＮＡマイクロアレイ１を得ることができる（図１０参照）。
【００３８】
また、次のような方法でＤＮＡマイクロアレイ１を得るようにしてもよい。
【００３９】
まず、絶縁性を有する基板２上に、リード部３および検出部４が直列になるように導電性インキを用いて連続的に印刷する（図２参照）。
【００４０】
次いで、リード部３および検出部４を乾燥させる。
【００４１】
次いで、検出部４が露出するようにリード部３をマスキング７する（図１１参照）。
【００４２】
次いで、検出部４に核酸６を電気的に固定化させる（図５参照）ことにより、ＤＮＡマイクロアレイ１を得ることができる（図１２参照）。
【００４３】
また、ＤＮＡマイクロアレイ１は、複数列のリード部３および検出部４を有し、各検出部４に異なる種類の核酸６が付着されたものであってもよい（図１３参照）。各検出部４ごとに個別に電位を印加することによって、各検出部４に異なる種類の核酸６を固定化させることができる。
【００４４】
また、この発明のＤＮＡマイクロアレイ１は、リード部３および検出部４が形成された基板２が複数枚積層される多層構成とすることができる。このように構成することにより、検出部４の集積度を高めることができ、少量の試料によって検出を行うことが可能になる。
【００４５】
この発明のＤＮＡマイクロアレイ１は、いわゆる電気化学的検出方式に用いることができるものである。電気化学的検出方式は、大掛かりな検出装置を必要とせず即時的に判定することができ、また蛍光検出方式よりも感度がはるかに高い方式である。
【００４６】
本願発明のように電気化学的にハイブリダイズを検出するインターカレーターとしては、フェロセン化合物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯体、金属フェナンスリン錯体、ビオローゲン化合物などが挙げられる。ハイブリダイズの検出は、インターカレーター自身がハイブリダイス部以外の電極表面に付着する場合があるのであらかじめハイブリダイズさせずに電極表面だけに付着するインターカレーター量をブランク値として測定する必要がある。次いでハイブリダイズさせブランクと同様の操作で電流電位曲線を測定する。得られた電流電位曲線からブランクを差し引いて補正すればハイブリダイズ部に使用されたインターカレーター量を算出することができる。
【００４７】
この発明のＤＮＡマイクロアレイ１は、検出部４を対極と共に試料溶液に浸漬させることによって検出を行うことができる。また、対極と共に並べ、検出部４に試料溶液を滴下することによって検出を行うことができる。
【００４８】
【実施例】
（実施例１）  厚さ２５０μｍ、大きさ１０ｍｍ×４０ｍｍのポリエチレンテレフタレートフィルムを基板とし、その上に導電性インキ（十条ケミカル株式会社製カーボンペーストインキＣＨ−１）をスクリーン印刷にて５ｍｍ角の検出部と５ｍｍ×３０ｍｍのリード部とがそれぞれ直列になるよう印刷し、次いで粒子径が揃うよう乳鉢で十分すりつぶした導電性微粉末（株式会社内藤商店製）の中に検出部のみを浸漬した。
【００４９】
次いで、基板をオーブンで７０℃、２時間の乾燥処理を行い、さらに余分な導電性微粉末をエアーガンで除去した。
【００５０】
次いで、酢酸緩衝液（ｐＨ５）に上記基板の検出部が十分浸漬する様挿入し、電位を＋１．５Ｖ（ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ）１分間印加した。次いで、ポリグアニル酸カリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製ＰＯＬＹＧＵＡＮＹＬＩＣＡＣＩＤ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ）を０．２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）で３０ｐｐｍになるよう調整した液中に上記作製した基板の検出部を挿入し、＋０．５Ｖ（ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ）に保って３分間印加し、導電性微粉末上に核酸を固定化してＤＮＡマイクロアレイを得た。
【００５１】
このようにして得たＤＮＡマイクロアレイを、０．２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）液中に挿入し、電位を＋０．１Ｖより＋１．３Ｖまで走査し酸化還元電位を測定したところ０．９Ｖ付近にグアニンのピークが確認された。
【００５２】
（実施例２）  実施例１と同様の基板上に、導電性インキ（十条ケミカル株式会社製カーボンペーストインキＣＨ−１）をスクリーン印刷にて５ｍｍ×３０ｍｍのリード部を印刷し、オーブンで７０℃２時間乾燥した。
【００５３】
次いで、同様に５ｍｍ角の大きさの検出部を実施例１と同様に印刷した後、実施例１と同様の導電性微粉末を基板上方より散布した。
【００５４】
次いで、余分な導電性微粉末をエアーガンで除去した後、オーブンで７０℃、２時間乾燥した。
【００５５】
次いで、実施例１と同様にして基板上の導電性微粉末に核酸を固定化し、ＤＮＡマイクロアレイを得た。
【００５６】
このようにして得たＤＮＡマイクロアレイについて、実施例１と同様にして酸化還元電位を測定したところ、グアニンのピークが確認された。
【００５７】
（実施例３）  実施例１と同様の基板上に、実施例１と同様にして検出部とリード部とがそれぞれ直列になるよう印刷し、この基板をオーブンで７０℃、２時間の乾燥処理を行った。
【００５８】
次いで、アクリル系樹脂インキ（十条ケミカル株式会社製）を用いて検出部およびリード部の端部のみが露出するよう、スクリーン印刷にて７ｍｍ×１５ｍｍの大きさで印刷してリード部のマスキングを行った。次いで、実施例１と同様にして検出部に核酸を固定化し、ＤＮＡマイクロアレイを得た。
【００５９】
このようにして得たＤＮＡマイクロアレイについて、実施例１と同様にして酸化還元電位を測定したところ、グアニンのピークが確認された。
【００６０】
【発明の効果】
この発明は、前記した構成からなるので、次のような効果を有する。
【００６１】
この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、絶縁性を有する基板上に、リード部および検出部が直列になるように導電性インキを用いて連続的に印刷し、次いで導電性微粉末を未乾燥の検出部に付着させ、次いでリード部および検出部を乾燥させ、次いで導電性微粉末に核酸を電気的に固定化させるように構成されているので、フォトリソグラフィー法やディスペンサー法を用いずにＤＮＡマイクロアレイを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法によって得ることができるＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。
【図２】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す断面図である。
【図３】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す断面図である。
【図４】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す断面図である。
【図５】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す模式図である。
【図６】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す断面図である。
【図７】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す断面図である。
【図８】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す断面図である。
【図９】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す断面図である。
【図１０】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法によって得ることができるＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。
【図１１】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一工程を示す平面図である。
【図１２】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法によって得ることができるＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。
【図１３】この発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法によって得ることができるＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す平面図である。
【符号の説明】
１  ＤＮＡマイクロアレイ
２  基板
３  リード部
４  検出部
５  導電性微粉末
６  核酸
７  マスキング
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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