(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マラチオンを加水分解できる酵素をコードする単離されたDNA分子であって、
i)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、または配列番号１４に示されたヌクレオチド配列；
ii)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、または配列番号１４に示された配列において、１個または数個のヌクレオチドの欠失、置換、または付加を有するヌクレオチド配列；あるいは
iii)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、または配列番号１４に示されたヌクレオチド配列に対して高い厳重さの条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列
を含み、
前記DNA分子によってコードされる前記酵素が、配列番号１０の２５１位に対応する位置で、Leu,Ser,Ala,Ile,Val,Thr,Cys,Met及びGlyより成る群から選択されたアミノ酸を含む、単離されたDNA分子。
【請求項２】
配列番号１０の２５１位に対応する位置でLeuまたはSerを含む、請求項１に記載の単離されたDNA分子。
【請求項３】
配列番号１０のアミノ酸配列、または、２５１位のTrpがSerに置換されている配列番号１３のアミノ酸配列を有する酵素をコードする単離されたDNA分子。
【請求項４】
マラチオンを加水分解できる酵素を発現するトランスフォームされた細胞であって、請求項１から３のいずれか一項に記載のDNA分子を用いてトランスフォームされた細胞。
【請求項５】
原核生物細胞または昆虫細胞である請求項４に記載のトランスフォームされた細胞。
【請求項６】
マラチオンを加水分解できる酵素であって、請求項４または５に記載の細胞によって生産される酵素。
【請求項７】
マラチオンを加水分解できる単離された酵素であって、配列番号１０に示されたアミノ酸配列、または配列番号１０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、または付加を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１０の２５１位に対応する位置で、Leu,Ser,Ala,Ile,Val,Thr,Cys,Met及びGlyより成る群から選択されたアミノ酸を少なくとも含む、単離された酵素。
【請求項８】
配列番号１０の２５１位に対応する位置でLeuまたはSerを含む、請求項７に記載の単離された酵素。
【請求項９】
サンプルまたは物質における混ざったマラチオン残留物の濃度を除去または減少する方法であって、請求項１から３のいずれか一項に記載のDNA分子によってコードされる酵素と前記サンプルまたは物質を接触させることを含む方法。
【請求項１０】
サンプルまたは物質における混ざったマラチオン残留物の濃度を除去または減少する方法であって、請求項４または５に記載の細胞と前記サンプルまたは物質を接触させることを含む方法。
【請求項１１】
サンプルまたは物質における混ざったマラチオン残留物の濃度を除去または減少する方法であって、請求項６から８のいずれか一項に記載の酵素と前記サンプルまたは物質を接触させることを含む方法。
【請求項１２】
マラチオンを加水分解できる酵素を生産する方法であって、プロモーター配列と実施可能にリンクした請求項１から３のいずれか一項に記載のDNA分子を用いてホスト細胞をトランスフォームし、前記DNA配列の発現を許容するコンディションの下で前記トランスフォームされた細胞を培養し、そして生産された酵素を回収することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般的に以下の構造を持つ有機リン酸類(OP)殺虫剤の特異的なクラスを能率的に加水分解できるマラチオンカルボキシルエステラーゼと呼ばれる酵素(及び該酵素をコードする核酸配列)に関する。
0004112617.tif 000002
(例えば、マラチオン、フェントエート(phenthoate))
0004112617.tif 000003
(例えば、マラオキソン(malaoxon)、フェントエートオキソン(phenthoate oxon))Xにはチオン型有機リン酸類に対する一つ以上のカルボキシルエステル基が含まれるが、オキソン型有機リン酸類に対するものは含まれない。
有機リン酸類の残留物が、環境及び一定範囲の必需品に混ざることは望まれない。特に感受性の範囲としては、家庭向きの給水及び土、様々な食料及び繊維製品の輸出における許容されるレベルでの上述の残留物、家畜へ混ざることが含まれる。それゆえ生物学的改善のストラテジーが、これらの殺虫剤の残留物を除去または減少するために必要とされる。一つの提案されるストラテジーには、該殺虫剤残留物を固定または分解できる酵素の使用が含まれる。該酵素は例えば、混ざった水が通過できるバイオリアクターにおいて;混ざった牧草及び給水内への流出に関する問題を減少するために、動物を殺虫剤に浸して洗う工程において;または残留物レベルを減少し時間を節約するために、果物または動物生産物の収穫後の害虫駆除後の溶液の洗浄において用いられるであろう。農薬残留物を分解するための適した酵素には、エステラーゼが含まれる。エステラーゼは農薬残留物に比較的特異的で、急速な割合で該残留物を加水分解することが望ましい。
MCE酵素はL.cuprina、RM及びder-Lの異なるマラチオン耐性株から精製されている(Whyard S.,Russell R.J.及びWalker V.K.,Biochemical Genetics 32:9,1994;Whyard S.及びWalker V.K.,Pesticide Biochemistry and Physiology 50:198,1994)。それは11.0±0.4μmのマラチオンに対するKm及び775±28nmolマラチオン/分/mgのVmaxを持つ60.5kDaの単量体である。それはまたマラチオンに対する高ターンオーバーレートを持つ(kcat=46min-1)。
有用な量のMCE酵素の生産を可能にするために、本発明はPCR及びクローニング法を用いてL.cuprina(RM-8)のマラチオン耐性株から推定のMCE遺伝子をクローニングしようとした。
L.cuprinaにおけるMCE遺伝子は、第IV染色体のE3遺伝子から0.7マップユニット内の位置に、古典的な遺伝学的方法を用いてマッピングされている。Drosophila melanogasterにおけるMCEの考え得るホモローグ、Mceは、主要なα-カルボキシルエステラーゼ,EST9及びL.cuprina E3のオーソローグ(orthologue),EST23の付近で第III染色体の右腕にマッピングされている(Spackman M.E.,Oakeshott J.G.,Smyth K-A.,Medveczky K.M.,及びRussell R.J.,Biochemical Genetics,32:39,1994)。
L.cuprinaからMCE遺伝子をクローニングする目的のため、MCEホモローグをクローニングするためにD.melanogasterに対して有用な豊富な分子遺伝学的方法を使用し、L.cuprina遺伝子自身を単離するためにこれらのクローンをプローブとして使用することを決めた。
要約すると、L.cuprinaゲノム及びcDNAから5のエステラーゼアンプリコンを単離した。クラスター特異的プライマーを用いたPCRによって得られた5のL.cuprinaアンプリコンのうち4は、相当するDrosophila遺伝子に対するホモローグに基づいて、LcαE7,LcαE8,LcαE9,及びLcαE10と名付けられた。第5のLc#53には、いかなるDrosophila遺伝子との同一性もないことに基づいて、自信を持って名前を与えることができなかった。
MCE特異的活性は、胸部または腹部よりもむしろ成虫の頭部で最も高い(Smyth,K-M.,Walker,V.K.,Russell,R.J.,及びOakeshott,J.G.Pesticide Biochemistry and Physiology,54:48,1996)。これに基づいて、LcαE7,LcαE8及びLcαE10は全てMCE候補であった。Parker,A.P.,Russell,R.J.,Delves,A.C.及びOakeshott,J.G.の以前の生理学的研究(Pesticide Biochemistry and Physiology 41:305,1991)によって、E3(LcαE7)酵素が成虫の頭部に存在することが示されている。さらに、クラスター特異的プライマーを用いたPCRで、頭部のcDNAライブラリーからこれらの遺伝子を増幅することが可能であったことより、LcαE8及びLcαE10遺伝子もまた頭部で発現されている。PCRでは幼虫の脂肪体または成虫の頭部のいずれにおいても、LcαE9及びLc＃53を検出できず、D.melanogaster αE9ホモローグのノーザン分析により、この遺伝子は胚でのみ発現されていることが示された。それゆえLcαE9及びLc＃53は、E3及びMCEをコードする遺伝子の候補としては外された。
この分類に基づき及びLcαE7がL.cuprinaにおけるジアジノン/パラチオンOP耐性に含まれるE3酵素をコードすることが知られていたという事実(PCT/AU95/00016:”Enzyme based bioremediation”)及びマラチオン耐性とジアジノン/パラチオン耐性は別の遺伝子にコードされていると考えられるという事実のため、LcαE8及びLcαE10遺伝子が主要なMCE候補として最初に選択された。
本発明はMCE酵素をコードするのはLcαE7の変異体であるという驚くべき発見をなした。この遺伝子はin vitroで発現され、その産物はMCE活性をもつことを示した。発現された産物は環境のカルボキシルエステルまたはジメチル一般的OPの分解での使用のため処方され得る。
したがって第一の面として本発明は、カルボキシルエステル有機リン酸類及びジメチル-オキソン有機リン酸類より成る群から選択された少なくとも一つの有機リン酸類を加水分解できる酵素をコードする単離されたDNA分子、LcαE7とのホモロジーが少なくとも60%、好ましくは少なくとも80%およびより好ましくは少なくとも95%である核酸配列を含む単離されたDNA分子で、該DNA分子によってコードされるタンパク質は251位のTrpがLeu,Ser,Ala,Ile,Val,Thr,Cys,Met及びGlyより成る群から選択されたアミノ酸で置換されている点でE3とは異なるという特徴を持つ単離されたDNA分子にある。
本発明の好ましい実施態様として、単離されたDNA分子は図1に示された配列を持ち、または該DNA分子によってコードされるタンパク質は251位のTrpがLeu,Ser,Ala,Ile,Val,Thr,Cys,Met及びGlyより成る群から選択されたアミノ酸で置換されている点でE3とは異なるという条件付きで、それらにハイブリダイズする配列を持つ。
本発明の好ましい実施態様として、251位のTrpはLeuまたはSerで置換されている。
上述したように、本発明は図1に示された配列とハイブリダイズする核酸分子を含む。好ましくは該ハイブリダイゼーションは低い及び高い厳重さのコンディションで、またはその間で生ずる。一般的な用語として、低い厳重さのコンディションとは約65℃の環境温度で3×SSCとして定義され、高い厳重さのコンディションとは約65℃で0.1×SSCとして定義される。SSCとは0.15MNaCl,0.015Mクエン酸三ナトリウムのバッファーの略語である。3×SSCとはSSCより3倍強いことであり、以下同様である。
第二の面として、本発明は図1に示されたRM-8Conのアミノ酸配列、または251位のTrpがSerで置換されている図3に示されたMdαE7のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする単離されたDNA分子にある。
MCEコード配列のホモローグは、他の昆虫のゲノムにも存在するであろうし、および特に双翅目の他の種のゲノムにも存在するであろう。それゆえ本発明はこれらのホモローグにも拡張されることが理解される。この例は、Musca MCEに関して以下に示された結果によって提供される。
本発明の単離されたDNA分子は、適した発現ベクター内にクローン化され、続いて酵素の発現のため原核生物または真核生物ホスト細胞内にトランスフェクトされる。特に適した系として、バキュロウイルスベクター及び昆虫細胞系が含まれる。
第三の面として、本発明はカルボキシルエステル有機リン酸類及びジメチル-オキソン有機リン酸類より成る群から選択された少なくとも一つの有機リン酸類を加水分解できる酵素、またはそれらの酵素学的に活性なタンパク質生産法にあり、該方法はコントロール配列と実施可能にリンクした本発明の第一の面のDNA分子でホスト細胞をトランスフォームし、該DNA分子の発現を許容するコンディションの下で該トランスフォームされたホスト細胞を培養し、及び生産された酵素またはそれらの酵素学的に活性なタンパク質を回収することを含む。
生物学的改善試薬として本質的に該酵素を使用する代わりとして、生物学的改善試薬は該酵素をコードするDNAでトランスフォームされた生物であることも視野に含まれる。該構成において、該酵素を発現するようにトランスフォームされた該生物は生物学的改善試薬として用いられるであろう。
本発明はさらに、本発明にしたがって単離されたDNA分子によってコードされるエステラーゼの使用を含む、サンプルまたは物質に混ざったカルボキシルエステルまたはジメチル-オキソン型有機リン酸類殺虫剤残留物の濃度の除去法または減少法に関する。
本発明の性質をより明白に理解するために、以下の実施例及び図面を参考として好ましい形態が記述されているであろう。
図1はLcαE7(E3)の感受性クローン(Lc743)を参考として、3のマラチオン耐性クローン(RM8A-C)及びそれらのコンセンサス(RM8con)の複数の核酸配列を示す。点印はLc743感受性クローンと同一であることを示す。罫線の下は並べられた核酸配列であり、罫線の上はLc743の推定されるアミノ酸配列であり、Lc7RM8conで見出される一つの置換がすぐ下に太字で示されている。核酸は予想される翻訳の開始から数値が打たれており、アミノ酸は予想される開始メチオニンから数値が打たれている。Lc743 5’及びLc743 3’プライマー配列には下線が引かれている。
図2はLucilia cuprina Lc743クローン由来のLcαE7(E3)タンパク質(PCT/AU95/00016”Enzyme Based Bioremediation”)と比較したMusca domesticaのRutgers株由来の予想されるMdαE7タンパク質のアミノ酸配列を示す。配列比較により、同じ長さ、570残基タンパク質の間で75%の同一性及び86%の相同性が示される。矢印は配列の251位の保存されたトリプトファン残基を示す。
図3はRutgers株MdαE7遺伝子の配列をコードする1710bp核酸を示す。予想される570タンパク質配列もまた示されている。
図4はPCR Ankara株MdαE7アンプリコンのアミノ酸配列及びRM-8マラチオン耐性LcαE7タンパク質の相当する領域を示す。マラチオン耐性に示される構造的ミューテーション(MdαE7に対するセリン及びLcαE7に対するロイシン)は、251位の残基で矢印で示されている。
Lucilia cuprinaのマラチオン耐性株由来のMCE遺伝子のクローニング及びシークエンシング
カルボキシルエステラーゼ活性における2の型の変化は、より高等な双翅目におけるOP殺虫剤に対する耐性に関連している。変化の一つの型はジアジノン及びパラチオンのようなOPに対する耐性を引き起こし、一方で残りのものはマラチオンのようなOPに対する耐性を引き起こし、それらは化学物質をOPと定義するリン酸トリエステル部分に加えて一つ以上のカルボキシルエステル基を持つ(上記参照)。
2の変化の型はMusca domesticaのOP耐性株において最初に記述された。両方において増大したOPの分解は、減少したアリエステラーゼ活性に関連し、そこで「アリエステラーゼ」なる語はカルボキシルエステル、メチル酪酸または同様の分子の加水分解に主に寄与する酵素をいう(Oppenoorth F.J.,Entomology Experimental and Applied,2:304,1959;Oppenoorth F.J.及びvan Asperen,K.,Entomology Experimental and Applied 4:311,1961)。これは「ミュータントアリエステラーゼ仮説」の定式化を導き、それは同時に全てのOPのオキソン型に共通のリン酸エステル結合を加水分解でき、特定のカルボキシルエステル物質に向けた活性を減少する特異的なカルボキシルエステラーゼにおけるミューテーションのため各型の耐性が生ずることを提案する(Oppenoorth,F.J.及びvan Asperen,K.,Science 132:298,1960)。
両型の変化は約2-30倍の範囲で多様なOP(マラチオンを除く)に対する耐性因子を生じた(Bell,J.D.及びBusvine,J.R.,Entomology Experimental and Applied,10:263,1967)。しかしながら、マラチオン耐性M.domestica株はまた例外的にマラチオンに対する高耐性(一般的に>100倍)をも示した。この高耐性はリン酸エステル結合の加水分解(OP加水分解活性)に加えてマラチオンにおけるカルボキシルエステル結合の切断(すなわちMCE活性)と関連した。MCE活性はin vivo及びin vitroでの主要な分解産物を説明した(Townsent,M.G.及びBusvine,J.R.,Entomology Experimental and Applied 12:243,1969)。
2の型の耐性間のまたはそれらとアリエステラーゼ間の組換えはM.domestica株において全く観察されなかった(Nguy,V.D.及びBusvine,J.R.,World Health Organisation 22:531,1960)。これは、それらがOP加水分解及びMCE活性の面では明白に区別される一方で、それにもかかわらず2の型の耐性は同じカルボキシルエステラーゼ/アリエステラーゼ遺伝子/酵素系での対立遺伝子変化であろうことを示唆する(Oppenoorth,F.J.及びWelling,W.,in Insecticide Biochemistry and Pharmacology,Wilkinson,C.F.編,Plenum Press,New York and London,pp.507-551,1976)。
マラチオン耐性表現型はまたクロバエ類、Chrysomya putoriaでも記述されており、それは高MCE活性及び低アリエステラーゼ活性と関連する点でM.domesticaのマラチオン耐性表現型と同様である(Busvine,J.R.,Bell,J.D.及びGuneidy,A.M.,Bulletin of Entomological Research 54:589,1963;Bell,J.D.及びBusvine,J.R.,Entomology Experimental and Applied 10:263,1967;Townsent,M.G.及びBusvine,J.R.,Entomology Experimental and Applied 12:243,1969)。二種におけるマラチオン耐性表現型の類似性に対するさらなる証拠は、マラチオンを助け補強するOP化合物のスペクトルによって示される。特異的には一連の対称の一分子中に3個の置換基を有するリン化合物において、最高の共同薬(例えばトリフェニルリン酸)は両種で共通であった(Bell,J.D.及びBusvine,J.R.,Entomology Experimental and Applied 10:263,1967)。しかしながらC.putoriaにおけるジアジノン/パラチオン型耐性についてはほとんど知られていない。
これらのハエは感受性のハエより急速にパラオキソンを加水分解し(Hughes,P.B.及びDevonshire,A.L.,Pesticide Biochemistry and Physiology 18:289,1982)、そして耐性は減少したカルボキシルエステラーゼ活性と関連するので、ミュータントアリエステラーゼ仮説はまたL.cuprinaにおけるジアジノン/パラチオン耐性を説明するために引き合いに出された。この場合耐性ハエ由来のエステラーゼアイソザイムE3は、ポリアクリルアミド電気泳動後に検出されなかった(「非染色」)(PAGE;Hughes,P.B.及びRaftos,D.A.,Bulletin of Entomological Research 75:535,1985)。E3変化と耐性の間の因果関係に対する証拠は、L.cuprinaのE3染色、OP感受性ミュータントのEMSミュータジェネシス及びOP耐性ミュータントに対する選択によって得られた;回収された全ての耐性ミュータントはE3非染色PAGE表現型を持った(McKenzie,J.A.,Parker,A.G.及びYen,J.L.,Genetics 130:613,1992)。
M.domesticaのマラチオン耐性株と同様に、マラチオンに対して耐性であるL.cuprinaの株はマラチオンに対する大変高耐性力価を示し、増大されたMCE活性を示す。またM.domesticaと共通して、マラチオン耐性L.cuprinaは一般的にジアジノン/パラチオン耐性を示さず、逆もまた然りである。しかしながらM.domesticaにおける状況との一つの相違点として、2の耐性表現型をコードするローカスはいくつかの実験においてたとえ近接してリンクしていても一般的に分離可能であるようであることが存在する(Smyth,K-A.,Russell,R.J.及びOakeshott,J.G.,Biochemical Genetics 32:437,1994;Smyth,K-A.,Walker,V.K.,Russell,R.J.及びOakeshott,J.G.,Pesticide Biochemistry and Physiology 54:48,1996)。
OP耐性に関与する遺伝子を含むエステラーゼ遺伝子クラスターは、L.cuprinaから単離されている(Newcomb,R.D.,East,P.D.,Russell,R.J.及びOakeshott,J.G.Insect Molecular Biology 5:211,1996)。これらの遺伝子の一つ、LcαE7は、エステラーゼE3をコードし(Newcomb,R.D.,Campbell,P.M.,Russell,R.J.及びOakeshott,J.G.Insect Biochemistry and Molecular Biology,印刷中)、L.cuprinaにおけるジアジノン/パラチオン耐性を与える活性部位における構造的ミューテーションをコードする。これらのデータは以前の特許出願PCT/AU95/00016:”Enzyme based bioremediation”に記述されており、この開示は参考としてここで取り込まれる。
以下で我々はL.cuprinaのマラチオン耐性株からのLcαE7遺伝子のクローニング及びシークエンシングを記述する。我々はエステラーゼE3の本対立遺伝子がL.cuprinaにおけるマラチオン耐性に必須のMCE遺伝子であるという分子遺伝学的証拠を提供する。
a) LcαE7のマラチオン耐性対立遺伝子のクローニング
RT-PCR(逆転写PCR)アプローチを第IV染色体に対して同一であるL.cuprina(RM-8)のマラチオン耐性株からLcαE7のcDNA対立遺伝子をクローン化するために用いた。
RM-8株由来の成虫を収集の前3日間成長させ、-70℃で貯蔵した。Chigwin等の修飾されたプロトコールを用いてRNAを調製した(Chigwin,J.M.,Przybyla,A.E.,Mac Donald,R.J.& Rutter,W.J.,1979,Biochemistry 18,5294)。約100の成虫をSorvall Omnimix blenderを用いてD溶液(4Mグアニジンチオシアン酸,25mMクエン酸ナトリウム,pH7.0,0.5%サルコシル,0.1Mβ-メルカプトエタノール)の15ml中に完全に均質化した。結果として生じた均質物を、ガラス綿及び10mMNa-EDTA,pH8において形成された5mlの4.8MCsClを上部に層状にした6mlを通して、SW41超遠心チューブにおいて濾過した。これらを15℃で16時間SW41ローターで35,000rpmで遠心した。上清を除去し、RNAペレットを400μlのDEPC処理H2Oに再懸濁した。RNAを800μlのエタノールと10μlの4MNaClを添加することによって沈殿させ、-20℃のエタノールの下で貯蔵した。使用の前にRNAペレットを75%エタノールで洗い、風乾した後DEPC処理H2Oに再懸濁した。
オリゴdTセルロース上のアフィニティークロマトグラフィー(Pharmacia;Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,及びManiatis,T.,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA)を用いてポリA+RNAを500μgの全RNAから調製した。結果として生じたmRNA(1-5μg)を再び沈殿させ、20μlのDEPC処理H2Oで洗浄して再懸濁した。オリゴdTプライマーcDNAを、20μlの容量反応で製品の説明書にしたがって、逆転写酵素(SuperscriptII,BRL)を用いて1μgのmRNAから作製した。200ngのcDNAを、LcαE7遺伝子のコード領域の5’(Lc7435’:5’atgaatttcaacgttagtttgatggea3’)及び相補的な3’(Lc743 3’:5’ctaaaataaatctctatgtttttcaaac3’)末端からデザインされたプライマーを用いた2のPCR反応のそれぞれにおけるテンプレートとして使用した。反応にはTaqDNAポリメラーゼ(BRL)を用い、100pmolの各プライマー、0.2mMの各dNTP,10mTris-HCl,pH8.3,50mMKCl,0.002%Tween20(v/v),0.5mMMgCl2及び200ngのテンプレートが含まれた。2滴の鉱油を各50μlの反応物に層状にした。6ユニットのTaq酵素を95℃で5分の「ホットスタート」の後加え、97℃で35秒、60℃で1分及び72℃で2分の40サイクルが後に引き続いた。72℃で8分の最終サイクルが含まれた。1.7kbの主要産物をゲル精製し、一般的なクローニング法を用いてpBSK-(Stratagene)またはpGEM-T(Promega)プラスミドベクターのEcoRV切断部位内にクローン化した(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,及びManiatis,T.,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA)。
b) LcαE7のマラチオン耐性対立遺伝子のシークエンシング
方法:
シークエンシングのための3のクローン(RM8-Aから-C)を選択し、それら全ては独立のPCR反応に由来した。一連の12の21マーシーフェンシングプライマー(以下に示された配列)を存在するLcαE7配列からデザインした:
0004112617.tif 000004
これらを50pmolのプライマーを反応に対して用い、96℃で3分の「ホットスタート」を含みそして30サイクルで各シークエンシング反応を完成させることを除いて、Corbett Researchキャピラリーサーマルサイクラーで25μlのキャピラリーチューブにおいて製品の説明書にしたがって実施された色素−ターミネーターシークエンシング反応(ABI)に用いた。色素プライマー反応もまたABIプロトコールにしたがってABI M13前方向及び後方法プライマーを用いて、全てのクローンで実施した。シークエンシング反応は製品の説明書にしたがってABI 370A自動シークエンシングマシーンでの電気泳動によって解読した。両ストランドで実施されたこれによって、全配列決定がなされた。
結果:
図1はLcαE7の感受性クローン(Lc743)を参考として比較した3の耐性クローン(RM8 A−C)の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。マラチオン耐性LcαE7対立遺伝子のコンセンサス配列が決定された(RM-8con)。耐性クローン間の差異はTaqポリメラーゼによって取り込まれた誤差であると推定された。
マラチオン耐性RM-8コンセンサス配列(RM-8con)のものとの感受性配列(Lc743)の比較は、たった一つの置換部位の差異、すなわちアミノ酸251位でのTrpからLeuへの置換(核酸752位)を示した。同一のアミノ酸はT.californica AChEの三次元モデルで強調されており、それはLeuミューテーションが活性部位Serから6.5オングストロームである活性部位の谷間のベースで位置を定められていることを示していた。
c) 様々なLcαE7対立遺伝子由来の752位の核酸を取り巻く領域のシークエンシング
マラチオン耐性を与えるエステラーゼの構造的ミューテーションは、分子の活性部位領域で生じると期待されるであろう。それゆえLcαE7での核酸752位でのTrpからLeuへのミューテーションは、マラチオン耐性ミューテーションに対する最適な候補である。
本発明者は第IV染色体に対して均質で、既知のマロチオン耐性性質を持つL.cuprinaの全部で14の株を確立した。これらの系をプローブとしてLcαE7遺伝子を用いたゲノムDNAのRFLP分析に基づいて7のクラスに分けた。それゆえ核酸752位は全範囲のクラスで調べられた。
方法:
いくつかのクラスで代表的な株由来のLcαE7対立遺伝子の完全なcDNA配列を入手した。例えばRM-8由来のLcαE7の配列が図1に示されている。さらに2より多いクラスを代表するLS2及びLlandillo103株由来のLcαE7cDNA配列が、特許出願PCT/AU95/00016(”Enzyme based bioremediation”)に記述されている。第四のクラスを代表するGunning107株の完全なLcαE7cDNA配列は、J.Trott,B.Agr.Sc Thesis,1995に記述されている。
残りの3のクラスを代表するLBB101、Llandillo104及びHampton Hill6.2株における核酸752位の領域でのLcαE7の配列を得るために、PCRアプローチをとった。ゲノムDNAをDavis,L.G.,Dibner,M.D.,及びBatley,J.F.,(1986.Basis Mathods in Molecular Biology,Elsevier Science Publ.Co.,New York,Section 5.3)の方法を用いて卵から、またはC-TAB法(Crozier,Y.C.,Koulianos,S.& Crozier,R.H.,1991,Experientia 47,9668-969)を用いて成虫のハエから調製した。それから1μgのサンプルを、100pmolのプライマー7F1及び7R4を用いたPCR反応におけるテンプレートとして用いた。また反応物中には0.2mMの各dNTP,10mMTris-HCl,pH8.3,50mMKCl,1.5mMMgCl2が含まれる。2滴の鉱油を50μlの各反応物中に層状にした。2.5ユニットのTaqポリメラーゼを97℃で3分の「ホットスタート」の後加え、一方55℃でアニーリング温度を維持した。72℃での最初の伸長を2分維持した。これに97℃で35秒、55℃で1分そして72℃で1分の34サイクルが引き続いた。72℃で9分の最終伸長が含まれた。約1kbの単一の生成物が生産された。これを製品の説明書にしたがってQIA高速回転カラム(Qiagen)を用いてシークエンシングのため精製した。500ngのテンプレートを上述したような7F7(5’:5’tgctgcctctacccactacat3’)及び7R7(3’:5’cctgtggcttggctttcataa3’)プライマーを用いた色素-ターミネーターシークエンシング反応において用いた。
結果:
アッセイされた7のクラスにおいて、全ての5のマラチオン感受性株(LS2,LBB101,Llandillo104,Gunning107及びLlandillo103)は核酸752位でGを持っており、一方両マラチオン耐性株(Hampton Hill6.2及びRM-8)はこの位置でTを持っており、アミノ酸251位でTrpからLeuの置換を引き起こしている(表2)。異なる第IV染色体を持つ2のマラチオン耐性株における同じ構造的ミューテーションの存在は、該ミューテーションが耐性のため必須であることを強く示唆する。
0004112617.tif 000005
d) Musca domesticaのマラチオン耐性株由来のオーソローガスなαE7遺伝子のクローニングとシークエンシング
上述したように、ジアジノン/パラチオン及びマラチオンエステラーゼ介在性OP耐性型は、L.cuprina,M.domestica及びC.putoriaの間で多くの強い共通性を示し、そしておそらくオーソローガスな遺伝子における機能的に同等なミューテーションによって引き起こされる。それゆえイエバエ、M.domesticaからオーソローガスな遺伝子をクローン化し、核酸752位の周辺の領域を、マラチオン耐性Musca株におけるマラチオン耐性ミューテーションの存在のため調べた。
PCR反応:
コンセンサス一般的α-エステラーゼプライマーをD.melanogaster(Robin,C.Russell,R.J.,Medveczky,K.M.及びOakeshott,R.J.,Journal of Molecular Evolution 43:241,1996)及びL.cuprina(Newcomb,R.D.,Campbell,P.M.,Russell,R.J.及びOakeshott,J.G.Insect Biochemistry and Molecular Biology,印刷中)のα-エステラーゼ遺伝子の複数のアミノ酸配列の保存された領域に対してデザインし、M.domestica由来の相同なαE7遺伝子配列の回収のためPCR増幅実験において用いた。
ゲノムDNAをLifton法(Bender,W.,Spierer,P.及びHogness,D.S.,Journal of Molecular Biology 168:17,1989)を用いて、Rutgers OP耐性イエバエ株の成虫メスから調製した(Plapp,F.W.Jr.,Tate,L.G.及びHodgson,E.1976.Pestic.Biochem.Physiol.6:175-182)。Rutgers株ゲノムDNAを50μlの増幅反応においてテンプレートとして用いた:
0004112617.tif 000006
プライマー:
Md1(35マー)
0004112617.tif 000007
L.cuprina αE7における58-69残基に相当する
Md2(32マー)
0004112617.tif 000008
L.cuprina αE7における92-82残基に相当する
注意:IUBコードは混合された位置に対して用いられる;I＝イノシン。
0004112617.tif 000009
PCR増幅物のクローニングとシークエンシング:
540bp主要産物をアガロースゲルから溶出し、QIAGEN QIA高速PCR精製キットを用いて精製し、標準的な方法(Sambrook,J.,Fritsch.E.F.及びManiatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA,1989)を用いてpGEM-Tプラスミドベクター(PROMEGA)内にクローン化した。クローン化されたインサートの末端を、Applied Biosystems Model 370A自動化DNAシークエンサーにおいて、商業的に入手可能なT7とSP6プライマー及びTaqFS色素-ターミネーター法(ABI)を用いてシークエンシングした。翻訳されたアミノ酸配列を、GCGコンピューターパッケージ(Devereux,J.,GCG配列分析ソフトウェアーパッケージバージョン6.0、Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wisconsin,USA,1989)由来のPILEUPを用いて予想されるα-エステラーゼタンパク質配列に対して並べた;D.melanogaster及びL.cuprina由来の既知のα-エステラーゼ遺伝子の配列に対して同一であることが全て証明された。クローン化された534bp増幅物は、L.cuprinaのαE7の予想されるタンパク質配列の等しい135アミノ酸に対して76%の同一性を示した。
M.Domesticaからの完全なαE7遺伝子の単離:
M.domesticaのRutgers株のλDASH(Stratagene)ゲノムライブラリー(Koener,J.F.,Carino,F.A.及びFeyereisen,R.,Insect Biochemistry and Molecular Biology 23:439,1993)をαE7のフルレングスゲノムクローンのためにスクリーニングした。およそ300,000プラークを上述した32Pラベル534bp増幅物を用いて突き止めた。一般的な方法(Sambrook,J.,Fritsch.E.F.及びManiatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA,1989)を用いたライブラリースクリーニングを、高く厳しい条件で(50%ホルムアミド,5×SSC,3×Denhard’s,0.5%SDS及び10μg/mlサケ精子DNA、45℃で)で実施し、最後に高く厳しい条件で洗浄(0.1%SSC,0.1%SDS、65℃で)を含んだ。制限地図は、17.5kbのゲノム挿入物と共に単一のλDASHクローンがαE7遺伝子を含むことを示した。4.5kbHindIII断片をpBSK-ベクター(Stratagene)内にサブクローン化し、上述したような色素-ターミネーター自動シークエンシング法を用いて特性指摘した。一連の13のシークエンシングプライマーをデザインし、フルレングスゲノム配列を解釈するために用いた:
0004112617.tif 000010
1710bpまたは570アミノ酸の予想されるコード配列は、L.cuprina由来のαE7タンパク質の同等なフルレングス570残基に対して大変高い75%の同一性及び85%の相同性を示した(図2及び3)。プローブとして534bpαE7PCR増幅物を用いたRutgers株由来のゲノムDNA、及びEcoR I、HindIII、Sal I切断DNAの、標準的な方法(Sambrook,J.,Fritsch.E.F.及びManiatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA,1989)にしたがったサザンハイブリダイゼーション分析により、HindIIIに対する単一の4.5kbのハイブリダイジングバンド、単一の6.0kbのSal Iバンド、そして1.5kbと0.8kbの2のEcoR Iバンドが示された。該分析により、ラムダゲノムクローンのシークエンシング及びマッピングデータから解釈される制限パターンが確認された。他の異常型のハイブリダイゼーションパターンは、αE7が単一コピー遺伝子として存在する高い蓋然性を示すように生じなかった。
M.domesticの推定されるαE7マラチオン耐性対立遺伝子の特性指摘:
高マラチオン耐性Ankara株(Sisli,M.N.,Bosgelmez,A.,Kocak,O.,及びPorsuk,H.1983.Mikrobiyol Bul.17:49-46)の単一の成虫メス由来のゲノムDNA抽出物(Bender,W.,Spierer,P.及びHogness,D.S.,Journal of Molecular Biology 168:17,1989)を、推定のマラチオン耐性対立遺伝子の配列特性指摘のため用いた。一連のPCR反応をαE7遺伝子の対立遺伝子変異体の特性指摘のために単一ハエゲノムDNAを用いて実施した。特異的なイエバエAE7.5及びAE7.6プライマーペアと共に、上述のコンディションを用いたPCR増幅により、およそ760bpの単一の増幅物が生産された。この増幅物は、L.cuprinaにおけるマラチオン耐性に関連したアミノ酸残基251でのTrpからLeuへのミューテーションの部位を含む、翻訳された配列の96-304残基に対してコードする酵素の触媒部位において含まれる高く保存された領域を包含する(図4)。9の個々のハエ由来のPCR増幅物のクローニング及びシークエンシング(前に記述した)により、Ankara株はαE7遺伝子の2の対立遺伝子変異体に分離されることが示された:一つはアミノ酸251位でTrp残基を持ち、一方でもう一つはこの同じ位置でSerを持つ。この置換はL.cuprinaにおけるマラチオン耐性に含まれるTrpからLeuへの置換と同義である。ロイシンとセリンの両者は活性部位内のかさばったトリプトファン残基と置換し、それゆえ我々はこの変化がカルボキシエステル及びOPに向けられた酵素の速度論的性質における観察された変化を説明することを提案する。同様な方式で、かさばったTrp残基のAla,Ile,Gly,Val,Thr,Cys及びMetのような他のより小さい残基での置換が同様な効果を持つことが考えられる。Lucilia及びMuscaの両者のマラチオン耐性株におけるこれらの同様な活性部位でのミューテーションの発見は、これらのミューテーションがこれらの種におけるマラチオン耐性に必須であるという我々の結論をさらに支持する。
LcαE7の感受性及びマラチオン耐性対立遺伝子の発現された産物の加水分解活性
以下に我々は様々なカルボキシルエステル及びOPに対するLcαE7の感受性及びマラチオン耐性対立遺伝子の発現された産物の活性を記述する。該結果はLcαE7遺伝子における核酸752位でのミューテーションの結果として、L.cuprinaにおけるマラチオン耐性に対する考え得る機構を示唆する。
a) in vitro発現
LcαE7のOP感受性対立遺伝子(クローンLc743)のin vitro発現が、特許出願PCT/AU95/00016(”Enzyme based bioremediation”)に記述されている。
マラチオン耐性LcαE7フルレングスcDNAを、ポリヘドリンプロモーターのバキュロウイルストランスファーベクター、Bacpac6(Clonetech)3’内にクローン化した。King及びPossee(The Baculovirus Expression System:A Laboratory Guide,Chapman & Hall,London,1992)にしたがってDOTAP(Boehringer Mannheim)を用いたリポフェクト法を用いて、トランスフェクションを実施した。制限酵素BSU36I(Promega)を用いた切断によって直線化した200ngのBacpac6バキュロウイルスDNA(Clonetech)と共に結果として生じた構築物のそれぞれの1μgのDNAを、室温で10分ポリスチレン含有物中において15％DOTAP(Boehringer Mannheim)を含むHBS(hepes buffered saline)の溶液中でインキュベートした。それから1.5mlのGrace’s培地(King及びPossee,The Baculovirus Expression System:A Laboratory Guide,Chapman & Hall,London,1992)における104Sf9(Spodoptera frugiperda)細胞を用いて以前に2時間前接種された6穴組織培養プレートの単一のウェルにトランスフェクトするために該溶液を用いた。12時間後、該培地を10％胎児ウシ血清を含む3mlのGrace’s培地を用いて置換した。構築物プラスDOTAP、直線化ウイルスプラスDOTAP、及びDOTAPのみのコントロールを、トランスフェクションを用いて平行に実施した。該トランスフェクション物を感染後4-5日で回収し、細胞を500gで5分の遠心分離によって単離した。結果として生じた細胞ペレットの均等物をすぐに氷上で貯蔵し、0.5％TritonX-100を含む10mMイミダゾール-HClバッファー,pH7.0に再懸濁した。これらの細胞抽出物における最終タンパク質濃度は、5から40mg/mlの間であった。細胞抽出物の均等物を酵素アッセイの前に-70℃で貯蔵した。
b) マラチオン加水分解
方法:
Whyard,S.,Russell,R.J.及びWalker,V.K.Biochemical Genetics 32:9(1994)によって修飾されたようなZiegler,R.,Whyard,S.,Downe,A.E.R.,Wyatt,G.R.及びWalker,V.K.,Pesticide Biochemistry and Physiology,28:279(1987)の仕切り法を用いてMCE活性をアッセイした。細胞抽出物を10mMイミダゾール-HCl,pH7.0において300倍に希釈し、150μlの均等物をマイクロヒュージチューブに三重に置いた。[14C]-マラチオン[Amersham;103mCi/mmole,280nCi,コハク酸部分の両メチレン炭素でラベルし、非ラベルマラチオン(99％;Riedel-de-Haen Ag.,Seelze,Germany)の添加によって15mM(または速度論実験に対しては375μM-15mM)に調節した]を含む1μlのエタノールの添加によって反応を開始した。アッセイ混合物を25℃で10分インキュベートし、それから300μlの希釈バッファーを加え、そして非分解マラチオンを600μlのクロロホルムを用いて3回抽出した。300μlの水相におけるマラチオンのカルボン酸の濃度を液体シンチレーションによって測定した。細胞上清におけるタンパク質濃度を、スタンダードとしてウシ血清アルブミンを用いたBradford,M.,Analytical Biochemistry 72:248(1976)の方法によって、Biorad Protein Assay Kitを用いて測定した。ボイルした酵素コントロールを通常のように実施した。非組換えバキュロウイルスを用いて感染された細胞の抽出物の特異的MCE活性は、LcαE7のOP感受性またはマラチオン耐性対立遺伝子をコードするバキュロウイルスを用いて感染された細胞のものより、少なくとも700倍低かった。LcαE7の対立遺伝子のためではないこのわずかなMCE活性は、大変少量のソース及び誤差のためであると考えられ、引き続いて無視された。
結果:
2.5から100μMの間のマラチオンの最初の濃度を用いて、LcαE7のマラチオン耐性及び感受性対立遺伝子によってコードされるMCEは、Michaelis-Menten速度論に適したフィットを示した。Km及びVmaxを両酵素に対して計算した。それからKcatをVmax及びそれら各自の細胞抽出物におけるLcαE7産物のモル濃度から計算した。細胞抽出物における感受性LcαE7産物のモル濃度は、Newcomb,R.D.,Campbell,P.M.Russell,R.J.及びOakeshott,J.G.,Insect Biochemistry and Molecular Biology(印刷中)に以前に記述されたようにパラオキソンを用いた滴定によって測定された。LcαE7のマラチオン耐性対立遺伝子の産物のモル濃度は、リン酸トリフェニル(TPP;1から10×10-8M)をパラオキソンの代わりに用いた点を除いて同様に計算された。コントロール実験において、TPP(8×10-8M)を基質マラチオンの添加前15,30または45分で三重に細胞抽出物と共にプレインキュベートした。各プレインキュベーション時間で残余のMCE活性の間で有意な差異は存在せず、これは第一にTPPによるMCEの阻害が完成してしまったこと、そして第二にTPPはMCEによってターンオーバーされないことを示した。
LcαE7のマラチオン耐性及び感受性対立遺伝子の産物に対するマラチオン加水分解の速度論的パラメーターは以下の通りである:
0004112617.tif 000011
マラチオン耐性産物に対するKm及びKcatは、マラチオン耐性のハエから精製されたMCE酵素に対して測定されたものと程よく一致した(それぞれ11±0.4μM及び分当たり46±2:Whyard,S.及びWalker,V.K.,Pesticide Biochemistry and Physiology,50:198,1994)。
c) TPPに対するMCE活性の感受性
TPPによる阻害の高感受性は、M.domestica,C.putoria及びL.cuprinaにおけるマラチオン耐性と関連したMCE活性の明白な性質であり、これらの種の耐性株におけるTPPによるマラチオンの潜在的な共同薬性に一致する(Shono,T.,Applied and Entomological Zoology 18:407,1983;Bell,J.D.及びBusvine,J.R.,Entomology Experimental and Applied 10:263,1967;Townsent,M.G.及びBusvine,J.R.,Entomology Experimental and Applied 12:243,1969;Hughes,P.B.,Green,P.E.及びReichmann,K.G.,Journal of Economic Entomology 77:1400,1984;Smyth,K-A.,Walker,V.K.,Russell,R.J.及びOakeshott,J.G.,Pesticide Biochemistry and Physiology,54:48,1996)。LcαE7のマラチオン耐性対立遺伝子によってコードされるMCE活性は、10-7M以下の濃度での酵素の化学量論的阻害によって示されるように、TPPによって阻害される可能性がある(上記参照)。
d) α-ナフチル酢酸加水分解
方法:
マラチオン耐性及び感受性LcαE7対立遺伝子の発現された産物を含む細胞抽出物、及びα-ナフチル酢酸(α-NA)の間の反応の最初の割合を、記録式分光光度計及びMastrapaolo及びYournoの方法(Analytical Biochemistry 115:188,1981)を用いて25℃で測定した。10μlの2-メトキシエタノールに溶解された6-200μMα-NAを、石英キュベット内の0.1MTris-HCl,pH8.0(980μl)に加えた。α-ナフチル酢酸は水中でゆっくりと加水分解され、そのためバックグランドの割合は10μlの希釈された細胞抽出物の添加によって酵素反応を開始する前に記録された。コントロール反応を非感染細胞及びBacpac6感染細胞の両者の抽出物を用いて実施した。これらのコントロールは極めてわずかな酵素的加水分解のみを示した。
結果:
6から200μMのα-NAの最初の濃度を用いて、LcαE7のマラチオン耐性及び感受性対立遺伝子によってコードされる酵素は、Michaelis-Menten速度論に適したフィットを示した。Km及びVmaxを両酵素に対して計算した。それからKcatをVmax及びそれら各自の細胞抽出物におけるLcαE7産物のモル濃度(上記測定された)から計算した。
0004112617.tif 000012
マラチオン耐性産物に対するKm及びKcatは、マラチオン耐性のハエから精製されたMCE酵素に対して測定されたものと程よく一致した(167±14μM及び分当たり2063:Whyard,S.及びWalker,V.K.,Pesticide Biochemistry and Physiology,50:198,1994)。
e) α-ナフチル酪酸加水分解
方法:
α-NAの代わりに、6-200μMα-ナフチル酪酸(α-NB)を用いたことを除いて、α-NA加水分解に対して上述したように実施した。
結果:
6から200μMのα-NBの最初の濃度を用いて、LcαE7のマラチオン耐性及び感受性対立遺伝子によってコードされる酵素は、Michaelis-Menten速度論に適したフィットを示した。Km及びVmaxを両酵素に対して計算した。それからKcatをVmax及びそれら各自の細胞抽出物におけるLcαE7産物のモル濃度(上記測定された)から計算した。
0004112617.tif 000013
マラチオン耐性産物に対するKm及びKcatは、マラチオン耐性のハエから精製されたMCE酵素に対して測定されたものと程よく一致した(39±4μM及び分当たり3700:Whyard,S.及びWalker,V.K.,Pesticide Biochemistry and Physiology,50:198,1994)。
f) 一般的OP加水分解
M.domesticaにおいては、パラチオン/ジアジノン耐性のハエは、2のメトキシ基(「ジメチルOP])よりむしろリン原子に付着した2のエトキシ基を持つOP(「ジエチルOP」)に対して、より大きい耐性力価を一般的に示すように、OP間で交差耐性のパターンが存在する(Bell,J.D.及びBusvine,J.R.,Entomology Experimental and Applied 10:263,1967)。逆のパターン(すなわちジメチルOPに対してより大きい耐性)は、M.domestica及びC.putoriaのマラチオン耐性株に対して観察される(Bell,J.D.及びBusvine,J.R.,Entomology Experimental and Applied 10:263,1967;Townsend,M.G.及びBusvine,J.R.,Entomology Experimental and Applied 12:243,1969)。このジメチルOP選択性は、マラチオン類似体(カルボキシルエステル基を持つ)及び一般的OP(カルボキシルエステル基を持たない)の両者に対して適用される。これらの研究により、マラチオン型耐性と密接に関連した一般的OP加水分解活性が存在し、そしてOP加水分解はジメチルOPに対して選択性を示すことが示唆される。
該ジメチル/ジエチルOP交差耐性パターンがL.cuprinaにおいて生じるかどうかを測定する印刷されたデータは不十分にしか存在しない。ここで我々は第一に該交差耐性パターンが存在することを、第二にLcαE7のマラチオン耐性対立遺伝子によってコードされる酵素はカルボキシルエステル基を欠くOPに対して加水分解活性をもつことを調べる。
方法:
i) 毒理学
以下の有機リン酸類化合物を用いた:ジアジノン(O,O-ジエチルO-2-イソプロピル-6-メチルピリミジン-4-イル ホスホロチオエート,91％,Mallinckrodt)、パラチオン-メチル(O,O-ジメチルO-4-ニトロフェニル ホスホロチオエート,97.0％,Bayer)、パラチオン(O,O-ジエチルO-4-ニトロフェニル ホスホロチオエート,99％,Pestanalグレード,Riedel-de-Haen)、フェンチオン(fenthion)(O,O-ジメチルO-[3-メチル-4-(メチルチオ)フェニル]ホスホロチオエート,98.8％,Bayer)、フェンチオン-エチル(O,O-ジエチルO-[3-メチル-4-(メチルチオ)フェニル]ホスホロチオエート,Dr.G.Levotからの贈呈)、ジクロルボス(2,2-ジクロロビニルジメチルホスフェート,99％,Chem Service)、ジエチル-ジクロルボス(2,2-ジクロロビニルジエチルホスフェート,Dr.J.Desmarchelierからの贈呈)、ジ-イソプロピル-ジクロルボス(2,2-ジクロロビニルジ-イソプロピルホスフェート,Dr.J.Desmarchelierからの贈呈)、マラチオン(S-1,2-ビス(エトキシカルボニル)エチルO,O-ジメチル ホスホロジチオエート,テクニカルグレード、Nufarm)、イソプロピルマラチオン(S-1,2-ビス(エトキシカルボニル)エチルO,O-ジ-イソプロピル ホスホロジチオエート,Dr.J.Desmarchelierからの贈呈)。
成虫メスのL.cuprinaにおけるOPの毒理学を、0.7μlのジオクチルフタレートにおいて小盾板にOPを適用することによって孵化後3または4日で測定した(Busvine,J.R.,Bell,J.D.及びGuneidy,A.M.,Bulletin of Entomologyical Research 54:589,1963;;Townsend,M.G.及びBusvine,J.R.,Entomology Experimental and Applied 12:243,1969)。各OPを、50％モル濃度(LD50)を引き起こす投与量にわたって各少なくとも5の異なる濃度で少なくとも20のハエに適用した。コントロールグループはOPを含まない溶媒で処理された。モル濃度を24時間後測定した。Probit Or LOgit(POLO-PC)コンピュータープログラム(LeOra Software,1987)を用いて、データをプロビットカーブにフィットした。このプログラムは<5％であった天然のモル濃度に対して正確である。統計値g(「潜在的見積もりに対する有意性の指標」)は常に、LD50の95％信頼限界に対して0.5より小さかった。
ii) クロルフェンビンホス(Chlorfenvinphos)加水分解アッセイ:
酵素サンプルを最終容量50μlに0.1Mイミダゾール-HClバッファー,pH7.0(「イミダゾールバッファー」)に希釈した。エタノール中の7.5mMストック溶液から0.5μlの(14C-エチル)-クロルフェンビンホス(CVP,306.5MBq/mmole,Internationale Isotope Munchen)の添加によって反応を開始した。該反応物を30℃でインキュベートし、300μlのジクロロメタンの添加によって停止させ、引き続き150μlの水を勢いのあるボルテックス攪拌によって混ぜた。相を分離するために該反応物を遠心分離し、150μlの上部の水相をCVPの加水分解によって生産された14C-ジエチルリン酸の量を測定するためにシンチレーションカウントのため取り出した。熱した酵素を用いたインキュベーションも、CVPの非酵素的加水分解に対するコントロールとするために実施した。
結果:
I) 毒理学:
10のOPのLD50をWoodside5.2株(LcαE7のマラチオン耐性対立遺伝子に対して同種)及びLlandillo103株(LcαE7のパラチオン/ジアジノン耐性対立遺伝子に対して同種)に対して測定した。耐性力価を計算するためにOP感受性LS2株に対してLD50もまた測定した(表8)。Woodside5.2ハエはジメチルOP、パラチオン-メチル、フェンチオン及びジクロルボスの方が、それらのジエチル類似体、パラチオン、フェンチオン-エチル及びエチルジクロルボスに対するものより約2から5倍大きい耐性力価を示した。逆にLlandillo103ハエはジエチルOP、パラチオン、及びエチルジクロルボスの方が、それらのジメチル類似体、パラチオン-メチル、及びジクロルボスに対するものより約2倍大きい耐性力価を示した。しかしながらフェンチオン及びフェンチオン-エチルに対するLlandillo103ハエの耐性力価の間には有意な差異が存在しなかった。
4のジエチルOPの間では、Llandillo103ハエはWoodside5.2ハエより(同様の耐性力価を持つフェンチオン-エチルを除いて;表8)高い耐性力価を持つ。対照的に、Woodside5.2ハエは4のジメチルOPのそれぞれに対してLlandillo103より高い耐性力価を持つ。それゆえ両株は、ジメチルOPまたはジエチルOPのいずれかに対する偏向を持つにもかかわらず、同様な有効性の一般的OP耐性を示す。
ジクロルボスまたはマラチオンのジ-イソプロピル類似体に対する3倍より大きい耐性を示す耐性株は両者で存在しなかった(表8)。
M.domestica由来の比較可能なデータは、7の試験化合物に対して入手可能である。各場合において耐性力価は平行な耐性型を示す2の種の株において同様である(表8)。
0004112617.tif 000014
ii) 全ハエホモジェネート及び発現されたLcαE7遺伝子産物のクロルフェンビンホス加水分解活性:
L.cuprinaのマラチオン耐性(株はRM-8,60NE1.1,4.2,Beverly6.2,Hampton Hill6.1,Hampton Hill6.2,Woodside5.2,RopRmal1,M22.2 6.3,M27.1 4.1)、ジアジノン耐性(Gunning107,Inverell22,Q4,RM2.6,Llandillo103,Sunbury5.2)及び感受性(LBB101,Llandillo104,LS2)株の全ハエホモジェネートを、CVP,一般的OP(すなわちマラチオン型OPではない)のエステラーゼ介在性加水分解に対して試験した。全ての10のマラチオン耐性株は3の感受性株(0.5-1.0pmol/分/mg)よりも大きいCVP加水分解活性を示したが(1.5-3.0pmol/分/mg)、6のジアジノン耐性株(8.2-30.0pmon/分/mg)よりは小さかった。
マラチオン耐性LcαE7対立遺伝子の発現された産物をCVP加水分解活性に対して試験した。75μMCVPのターンオーバーは約1.2hour-1であり、それはジアジノン耐性(RM2-6)LcαE7遺伝子産物のものよりおよそ50倍小さいが、CVP活性が検出できないOP感受性(LS2)遺伝子産物のものよりははるかに大きかった。[LcαE7のRM2-6及びLS2対立遺伝子の遺伝子産物のCVP加水分解活性は、特許出願PCT/AU95/00016:”Enzyme based bioremediation”に記述されている]
g) 結論
1. 我々はM.domestica及びC.putoriaのOP耐性株のパターンと類似するL.cuprinaの株の間のOP交差耐性のジエチルパターンに対するジメチルパターンを発見した。2のOP耐性型はジメチルまたはジエチルOP選択性にもかかわらず、ほとんどのOP(マラチオンは除く)の間で等しく効力があり一般的である。
2. LcαE7のOP感受性対立遺伝子(O)、マラチオン耐性対立遺伝子(1.2hour-1)及びジアジノン/パラチオン耐性対立遺伝子(〜1min-1)によってコードされるジエチルOP加水分解活性は、L.cuprina株のOP感受性(低)、マラチオン耐性(中)及びジアジノン/パラチオン耐性(局)のホモジェネートにおけるジエチルOP加水分解活性と同様である。
3. 1及び2の指摘を共に考えて、我々は一般的OP交差耐性のジエチルパターンに対するジメチルパターンは、αE7遺伝子の2の択一的なOP耐性対立遺伝子によってコードされる一般的OP加水分解活性の基質特異性を反映していることを提案する。それゆえ我々は、L.cuprina及びM.domestica由来のαE7遺伝子のマラチオン耐性対立遺伝子の産物が、ジアジノン/パラチオン耐性αE7対立遺伝子がジエチルOPに対するものと同じくらい生物学的改善に対して好ましい速度論を持ったジメチルOP加水分解を示すであろうことを期待する。
4. αE7遺伝子のマラチオン耐性対立遺伝子の産物の増大されたMCE活性は、ハエをマラチオンの100倍以上大きい投与量でも生存することを引き起こす。MCE活性は2の点において増大されている。第一に、それは感受性対立遺伝子のものよりマラチオン分解に対する好ましい速度論を持つ(Kcat/Kmは6倍大きい)。第二に、それは一般的OP加水分解活性を持っている。後者は、酵素がOP殺虫剤の「活性化」または「P=O」形態によってリン酸化/阻害後にそのMCE活性を回復することを可能にするので、耐性及び生物学的改善の両者に対して重要である。P=O OPは昆虫の代謝系で生産されるので昆虫内に存在する。生物学的改善に対して、OP加水分解は2の理由で必要とされる:第一に、主要な残留物である一般的OPを加水分解するため、そして第二に、酵素によるマラチオン加水分解は’P=O’OPでの少量残留物の存在が継続するであろうことを確実にするために必要とされる。
L.cuprinaにおけるマラチオン及びジアジノン/パラチオン耐性表現型の対立性
L.cuprinaにおけるマラチオン耐性はLcαE7(エステラーゼE3)、ジアジノン/パラチオン型OPに対する耐性に関与するものと同じ遺伝子の活性部位における構造的ミューテーションによって与えられることは、上記分子遺伝学的及び生化学的データから明白である。しかしながら2の古典的遺伝学的研究によって、L.cuprinaにおけるマラチオン耐性表現型とジアジノン耐性表現型の間で少量の推定される組換えが検出されており、それは両者が非常に近接してリンクしているが分離できる遺伝子であることを示唆するであろう(Raftos,D.A.及びHughes,P.B.,Journal of Economic Entomology 77:553,1986;Smyth,K-A,Russell,R.J.及びOakeshott,J.G.,Biochemical Genetics 32:437,1994)。
Smyth等(1994)の研究によって生産された5の仮定的な組換え体の3由来の凍結抽出物の入手により、著者はPCR法を用いて予想される表現型に対して直接的にそれらを試験することが可能であった。この特定の研究において、ジアジノン耐性オス(Q4株)をマラチオン耐性メス(RM-8株)と交配させ、F1のメスをQ4のオスと戻し交配させた。子孫をE3非染色及びジアジノンとマラチオンの両者に対する耐性の表示として高MCE表現型について記録した。高MCE/E3非染色表現型を示す5の仮定的な組換え個体を、692の戻し交配子孫から回収した;おそらくマラチオンとジアジノンの両者に感受性であろう逆の低MCE/E3染色表現型を持つ個体は全く回収されなかった。
方法:
ジアジノン耐性ミューテーション(137位でGlyからAspへの置換)及びマラチオン耐性ミューテーション(251位でTrpからLeuへの置換)を取り巻くLcαE7遺伝子の領域を、それぞれ7F1/7R2プライマーセット及び7F7/7R4プライマーセットを用いて、Smyth等(1994)の研究由来の3の入手可能な抽出物のそれぞれから増幅した。PCRコンディション及びプライマー(7F7を除く)は、55℃のアニーリング温度及びTaqDNAポリメラーゼの製品によって提供されたバッファー(BRL;0.2mMの各dNTP,20mMTris-HCl,pH8.4,50mMKCl,1.5mMMgCl2)を用いる点を除き、上述したようなものである。7F7プライマーは以下の配列:5’tgctgcctctacccactacat3’をもち、Lc743配列におけるその5’位置は核酸660である(図１参照)。
7F7/7R4プライマーセットによって生産されるLcαE7の330nt断片は、Q4及びRM-8対立遺伝子のそれぞれに対して特異的なRFLP多形を含む:核酸752位でのNco I切断部位はQ4対立遺伝子を特徴付け(この多形はマラチオン耐性に必須なTrpからLeuへのミューテーションの部位である)、一方796位のBgl I部位はRM-8対立遺伝子を特徴付ける。それゆえそれぞれの抽出物におけるQ4及びRM-8対立遺伝子を同定するために、PCR産物を標準的な方法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,及びManiatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA,1989)を用いて、それぞれの酵素を用いて直接的に切断し、該産物をアガロースゲル電気泳動によってサイズ分離した。コントロールはQ4及びRM-8ゲノムDNAから生産されたPCR産物を含んだ。
該一般的なRFLP多形は7F1/7R2プライマーセットによって増幅された326nt断片に含まれていなかった(この断片は核酸360位に68ntのイントロンを含む)。しかしながら3の核酸多形がQ4及びRM-8断片を区別する:Q4配列における345位でのTからC及び410位でのGからAである(後者の置換はジアジノン/パラチオン耐性に必須である)。それゆえPCR産物は標準的な方法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,及びManiatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA,1989)を用いて、pGEM-Tベクター(Promega)内にクローン化され、個々のクローンを上述したように、商業的に入手可能なSP6及びT7プライマーそして色素ターミネーター法を用いてシークエンスした。
結果:
Nco IまたはBgl Iを用いた7F7/7R4プライマーセットによって生産されたPCR産物の切断により、全ての3の抽出物においてRM-8の染色体のみの存在が明らかとなった(すなわちPCR産物はBgl Iでのみ切断可能でNco Iでは不可能であり、一方コントロールQ4ゲノムDNAの産物はNco Iを用いて容易に切断された;データは示していない)。奇妙にもQ4対立遺伝子は、F1子孫が交配工程においてQ4と戻し交配されたという事実にもかかわらず、いかなる抽出物からも増幅されなかった。
第一の抽出物由来の3のクローンのうち2が、そして第二の抽出物由来の2のクローンのうち2が、303位及び345位でのQ4対立遺伝子の多形特徴を、そして410位でのRM-8の多形特徴を含んだ。これに対して第一の抽出物由来の第三のクローン、及び第三の抽出物由来の単一のクローンは、RM-8の全ての3の多形特徴を含んだ。再言すると、Q4染色体から完全に生産された断片はクローン化DNAの間で全く見出されなかった。
結論:
1. Q4対立遺伝子はF1子孫がQ4に対して戻し交配され、それゆえQ4の第IV染色体の少なくとも1コピーが含まれていると期待されるであろうという事実にもかかわらず、いかなる抽出物からも増幅されなかった。
2. もしマラチオン耐性ミュータントがLcαE7とは別の遺伝子上に位置していたならば、Q4対立遺伝子と同種の子孫が期待されるであろう。該子孫は全く見出されなかった。
3. もしE3及びMCEが別の遺伝子であれば期待されるであろう、低MCE/E3染色(おそらくマラチオン及びパラチオンの両者に対して感受性である)子孫は全く回収されなかった。
4. 少なくとも2の抽出物は、核酸410位でGlyからAspへのミューテーションに対するLcαE7遺伝子5’の領域のどこかでQ4/RM-8組換え体である第IV染色体を含んだ。この第IV染色体及び結果として生じたキメラタンパク質のMCE活性/PAGE表現型を持つハエの起源は未知である。
5. 推定されるE3/MCE組換え体は子孫を交配する間の単純な逆の組換え現象の結果であった;それゆえそれらはE3及びMCE遺伝子が別の遺伝子である証明を構成しない。
L.cuprinaにおけるマラチオン耐性が、LcαE7(E3)遺伝子、ジアジノン/パラチオン型OPに耐性を与えるためにミューテートした同じ遺伝子における構造的ミューテーションの結果であることは、本発明より明らかである。換言すると、以前の古典的遺伝学的研究が示したように、MCE及びE3遺伝子はおそらく対立遺伝子であり、0.7マップまでは離れていない。2の耐性ミューテーションの対立性は、マラチオン型OP耐性とジアジノン/パラチオン型OP耐性の間にネガティブな関連性が存在するというSmyth,K-A,Russell,R.J.及びOakeshott,J.G.(Biochemical Genetics 32:437,1994)の観察を説明する。それゆえ集団内のマラチオン型耐性の存在は、ウジの発生に対抗するためのジエチルOPの使用を示唆し、一方でジアジノン/パラチオン型耐性対立遺伝子の存在は、ジメチルOPの使用を示唆するであろう。
本発明の方法によって生産されたMCE酵素は、E3酵素(特許:Enzyme Based Bioremediation)が一般的OP加水分解に対するin vitroアッセイを発展するために用いられているのと全く同様の方法で、機能的なin vitroアッセイを発展するために用いられるであろう。共に使用すれば、該アッセイはE3様酵素による耐性の問題に打ち勝つであろう択一的OPに対するスクリーニングの範囲を提供する。
たくさんの変異形及び/または修飾が広く記述された本発明の精神または範囲から離れることなく、特異的な実施態様に示されたように本発明に対してなされるであろうことは、当業者にとって察知されるであろう。それゆえ本実施態様は説明として全ての面において考えられるべきで、制限のためと考えられるべきではない。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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