(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
0004069987.tif 000043
で示される化合物。
【請求項２】
安定なジオキセタンから光を発生させる方法であって、
（ａ）式
0004069987.tif 000044
で示される安定なジオキセタン、及び
ジオキセタン上のＰＯ3Ｎａ2基を除去して、不安定なオキシド中間体ジオキセタン化合物を形成し、この化合物が分解して光を発生させることができる試薬を、光を発生させるべき環境に用意し；ならびに
（ｂ）安定な１，２−ジオキセタンを試薬と反応させて、ジオキセタンからＰＯ3Ｎａ2基を取り除き、光を発生させる
ことを含む方法。
【請求項３】
安定なジオキセタンから光を発生させる方法であって、
（ａ）式
0004069987.tif 000045
（ここで、ＰＯ3Ｎａ2基は、試薬及びジオキセタンを試薬と反応させることによって発する光量を、エンハンサーの非存在下で発する光量に比べて増大させるエンハンサー物質によって取り除くことができる）
で示される安定なジオキセタンを水溶液中に含む試薬組成物を、光を発生させるべき環境に用意し；
（ｂ）ジオキセタンとの反応のための酵素及び他の化学薬剤からなる群より選択される試薬を用意し；ならびに
（ｃ）安定な１，２−ジオキセタンを試薬と反応させて、ジオキセタンからＰＯ3Ｎａ2基を取り除き、光を発生させる
ことを含む方法。
【請求項４】
エンハンサーが、ポリビニルベンジルトリアルキルホスホニウム基含有ポリマー及び式
0004069987.tif 000046
（式中、各Ｒは、独立して、炭素原子１〜２０個を含むアルキル基及びアラルキル基から選択され、Ｙはアニオンである）
で示される二カチオン界面活性剤からなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
（１）発明の分野
本発明は、酵素をはじめとする化学的試薬によって誘発されると光を発することができる化学発光１，２−ジオキセタン化合物に関する。特に、本発明は、ジオキセタン環上にハロアルコキシ基がさらに置換している安定なアリール基置換１，２−ジオキセタン類であって、保護基の除去によって不安定なジオキセタン化合物を生成し、分解すると、光と、２種のカルボニル化合物とを生成する安定なアリール基置換１，２−ジオキセタン類に関する。
（２）関連技術の説明
ａ．化学誘発性ジオキセタン類
文献に見られる最初の例は、２，３−ジアリール−１，４−ジオキセンから誘導されるヒドロキシ置換ジオキセタンに関して記載されている［A.P. Schaap and S. Gagnon, J. Amer. Chem. Soc., 104, 3504（1982）］。しかし、ヒドロキシ置換ジオキセタン及びジアリール−１，４−ジオキセン類から誘導されるジオキセタン類の他の例は比較的不安定であり、２５℃でわずか数時間の半減期しか有しない。さらに、これらの非安定化ジオキセタン類は、いずれも生物学的検定の水性緩衝剤に使用される成分である少量のアミン類［T. Wilson, Int. Rev. Sci.: Chem., Ser. Two, 9, 265（1976）］及び金属イオン［T. Wilson, M.E. Landis, A.L. Baumstark, and P.D. Bartlett, J. Amer. Chem. Soc., 95, 4765（1973）; P.D. Bartlett, A.L. Baumstark, and M.E. Landis, J. Amer. Chem. Soc., 96, 5557（1974）］によって破壊される。
アダマンチルで安定化されたジオキセタン類の化学誘発の例は、最初、米国特許出願（A. P. Schaap、１９８６年７月１７日出願の特許出願第８８７，１３９号）及び文献［A.P. Schaap, T.S. Chen, R.S. Handley, R. DeSilva, and B.P. Giri, Tetrahedron Lett., 1155（1987）］に報告された。ジオキセタン類は、何年もの熱的半減期を示すが、必要に応じて誘発されると、効率的な化学発光を起こすことができる。また、トリアルキルシリル及びアセチルで保護されたフェノール基で置換された、弱い化学発光を起こすベンゾフラニルジオキセタン類が報告されている［W. Adam, R. Fell, M.H. Schulz, Tetrahedron, 49（11）, 2227-38（1993）; W. Adam, M.H. Schulz, Chem. Ber., 125, 2455-61（1992）］。
ｂ．酵素誘発性ジオキセタン類
酵素によって誘発されると化学発光分解を起こすことができるジオキセタン類が米国特許出願（A. P. Schaap、特許出願第８８７，１３９号）及び一連の文献［A P. Schaap, R.S. Handley, and B.P. Giri, Tetrahedron Lett., 935（1987）; A.P. Schaap, M.D. Sandison, and R.S. Handley, Tetrahedron Lett., 1159（1987）及びA.P. Schaap, photochem. Photobiol., 47S, 50S（1988）］に開示されている。保護されたアリールオキシド置換基を有する安定性の高いアダマンチル置換ジオキセタン類は、水性緩衝剤中での酵素の作用によって誘発されると、電子供与性の強いアリールオキシドアニオンを与え、それがジオキセタンの分解速度を劇的に増大させ、光を放ちながら分解する。その結果、保護された形態のジオキセタンの低速の熱分解から生じる光度を数オーダ上回る大きさの光度の化学発光が放出される。Schaapの米国特許第５，０６８，３３９号明細書は、共有結合した発蛍光体基を有する酵素誘発性ジオキセタン類を開示している。これらのジオキセタン類の分解の結果、発蛍光体への分子内エネルギー移動を介して高められ、赤にシフトされる化学発光が生じる。Edwardsの米国特許第４，９５２，７０７号明細書は、アダマンチル基及び２，５−又は２，７−二置換ナフチル基を有する酵素誘発性ジオキセタン類を開示している。米国特許第５，１１２，９６０号、第５，２２０，００５号、第５，３２６，８８２号及びBronsteinのＰＣＴ出願（８８−００６９５）明細書は、塩素、臭素、カルボキシル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及びメチレン基をはじめとする種々の基で置換されたアダマンチル基を有する誘発性ジオキセタン類を開示している。ある出版物［M. Ryan, J.C. Huang, O.H. Griffith, J.F. Keana, J.J. Volwerk, Anal. Biochem., 214（2）, 548-56（1993）］は、酵素ホスホリパーゼによって誘発されるホスホジエステル置換ジオキセタンを開示している。Urdeaの米国特許第５，１３２，２０４号明細書は、化学発光分解を誘発するため、結合した２個の保護基を順次に取り除くための２種の異なる酵素を要するジオキセタン類を開示している。Hacesの米国特許第５，２４８，６１８号明細書は、酵素的又は化学的に誘発されると第一の保護基を取り除いて中間体を生成し、この中間体が自発的に分子内反応を受けて第二の保護基を分断して、化学発光分解を誘発するジオキセタン類を開示している。
ｃ．界面活性剤の存在下でのジオキセタン類からの化学発光の増強
アンモニウム界面活性剤及び発蛍光体を含む水溶性物質の存在下における安定な１，２−ジオキセタンの酵素誘発分解による化学発光の増強が報告されている［A.P. Schaap, H. Akhavan and L.J. Romano, Clin. Chem., 35（9）, 1863（1989）］。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）及び５−（Ｎ−テトラデカノイル）アミノフルオレセインからなる蛍光ミセルが、中間ヒドロキシ置換ジオキセタンを捕らえ、ミセルの疎水性環境での励起状態エステルのアニオン形態からフルオレセイン化合物への効率的なエネルギー移動のおかげで、化学発光量子収量の４００倍の増大をもたらす。
Schaapの米国特許第４，９５９，１８２号及び第５，００４，５６５号明細書は、第四アンモニウム界面活性剤ＣＴＡＢ及び発蛍光体の存在下での安定なジオキセタン類の化学的及び酵素的誘発による化学発光の増強のさらなる例を記載している。ＣＴＡＢ及び上述のフルオレセイン界面活性剤もしくは１−ヘキサデシル−６−ヒドロキシベンゾチアザミドから形成される蛍光ミセルは、ヒドロキシ及びアセトキシで置換されたジオキセタン類の塩基誘発分解からの化学発光を増強させる。また、ＣＴＡＢそのものがホスフェート置換ジオキセタンの化学発光を増強できるということが報告された。
Voytaの米国特許第５，１４５，７７２号明細書は、ペンダント第四アンモニウム基を有するポリマーの、単独での、又はフルオレセインと混合した状態での存在下での、１，２−ジオキセタン類から酵素的に生成される化学発光の増強を開示している。化学発光を増強すると報告されている他の物質には、球状タンパク質、たとえばウシアルブビン及び第四アンモニウム界面活性剤がある。他のカチオンポリマー化合物は、化学発光増強剤としては穏やかな効果をもつものであった。非イオンポリマー化合物は一般に効果がなく、唯一のアニオンポリマーは発光を有意に減らした。１９９３年９月２２日に公開されたAkhavan-Taftiの欧州特許公開第９２１１３４４８．２号公報は、蛍光エネルギー受容体が共有結合したポリビニルホスホニウム塩及びポリビニルホスホニウム塩の存在下での１，２−ジオキセタン類から酵素的に起こる化学発光の増強を開示している。１９９３年６月２４日に出願されたAkhavan-Taftiの米国同時係属出願第０８／０８２，０９１号明細書は、二カチオンホスホニウム塩の存在下での１，２−ジオキセタン類から酵素的に起こる化学発光の増強を開示している。
酵素誘発性ジオキセタン類は、今や、マーカ酵素のための基質として、イムノアッセイ、遺伝子発現研究、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、ＤＮＡ配列決定及び感染病原体の核酸セグメントの識別をはじめとする数多くの用途に広く使用されている。これらの化合物がますます使用されているにもかかわらず、検定方法に使用するための誘発性ジオキセタン類の性質をいっそう改善する必要性が存在する。誘発されると、より速く最大光度に達する誘発性ジオキセタン類が望ましい。本発明は、そのようなジオキセタン類を追求する。
目的
本発明の目的は、室温で長期間にわたり熱的かつ加水分解的に安定である、ジオキセタン環上でハロアルコキシ基によってさらに置換されている新規で安定なアリール基置換１，２−ジオキセタン類を提供することである。また、本発明の目的は、誘発されると、化学発光を起こしながら分解することができる、ジオキセタン環上でハロアルコキシ基によってさらに置換されている安定なアリール基置換１，２−ジオキセタン類を提供することである。本発明の目的は、酵素をはじめとする化学的試薬によって誘発されると、化学発光を起こすことができる、ジオキセタン環上でハロアルコキシ基によってさらに置換されている安定なアリール基置換１，２−ジオキセタンを含む方法及び組成物を提供することである。さらには、本発明の目的は、発光反応が起こることができる疎水性環境を提供する物質を用意することにより、化学発光を増強する方法及び組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、ジオキセタンと近接した状態に維持される蛍光化合物へのエネルギー移動によって化学発光を増強する方法及び組成物を提供することである。本発明のジオキセタン化合物は、優れた発光能力を有し、酵素の検出、イムノアッセイならびに周知の方法による酵素結合核酸、抗体、ハプテン及び抗原の検出に使用されるとき、有意な利点を提供する。
図面
図１は、ジオキセタン５［４−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−４−（３−ホスホリルオキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ−［３．３．１．１3,7］デカン］二ナトリウム塩］及び種々の量のエンハンサーを含有する試薬１００μLを、３７℃で、１．１２×１０-17moLのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の添加によって誘発することによって発せられる化学発光の光度の時間的変動状態を示すグラフである。試薬は、１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ−ｎ−ブチル−ホスホニウムメチル）ベンゼンジクロリド（エンハンサーＡ）を０．１、０．２５、０．５又は１mg/mL含有する、０．２M ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中ジオキセタン５の０．３３mM溶液からなる。
図２は、ジオキセタン５及び種々の量のエンハンサーを含有する試薬１００μLを、３７℃で、１．１２×１０-17moLのＡＰの添加によって誘発することによって発せられる化学発光の光度の時間的変動状態の比較を示すグラフである。試薬は、ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド／ポリビニルベンジルトリオクチルホスホニウムクロリド共重合体（トリブチル基：トリオクチル基を３：１の比率で含有）エンハンサーＢ（調製方法は、１９９３年９月２２日公開の欧州特許出願第５６１，０３３号明細書に記載）を０．０１、０．０２５、０．１又は０．５mg/mL含有する、０．２M ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中ジオキセタン５の０．３３mM溶液からなる。
図３は、ジオキセタン２（LUMIGEN PPD, Lumigen, Inc., Southfield, MI）又は５のいずれかを含有する増強試薬１００μLを、３７℃で、１．１２×１０-17moLのＡＰの添加によって誘発することによって発せられる化学発光の光度の時間的変動状態の比較を示すグラフである。試薬は、１）エンハンサー１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベンゼンジクロリドを１．０mg/mL含有する、０．２M ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中ジオキセタン２の０．３３mM溶液と、２）同エンハンサーを０．１mg/mL含有する、０．２M ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中ジオキセタン５の０．３３mM溶液とからなる。本発明のジオキセタン５の使用は、ジオキセタン２に比較して、これらの条件の下で、より強い化学発光を有利に提供するだけでなく、最大光度に達するまでの遅延を短縮する。
図４は、ジオキセタン２又は５のいずれかを含有する増強試薬のもう一つの対１００μLを、３７℃で、１．１２×１０-17moLのＡＰの添加によって誘発することによって発せられる化学発光の光度の時間的変動状態の比較を示すグラフである。試薬は、１）エンハンサーＢを０．５mg/mL含有する、０．２M ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中ジオキセタン２の０．３３mM溶液と、２）同エンハンサーを０．２５mg/mL含有する、０．２M ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中ジオキセタン５の０．３３mM溶液とからなる。本発明のジオキセタン５の使用は、最初の１５分以内により高い光度を達成し、これは検定に有利である。
図５は、ジオキセタン５を含有する試薬１００μLを３７℃で誘発することによって発せられる最大化学発光光度をＡＰの量に相関させるグラフである。化学発光は、３．３６×１０-16moL〜３．３６×１０-21moLの酵素を含有するＡＰ溶液３μLを、１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ−ｎ−ブチル−ホスホニウムメチル）ベンゼンジクロリド１．０mg/mLを含有する、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（０．２M、pH９．６）中ジオキセタン５の０．３３mM溶液１００μLに添加することにより、３７℃で開始した。項Ｓ−Ｂは、ＡＰの存在下での相対光単位（ＲＬＵ）での化学発光信号（Ｓ）を、ＡＰの非存在下でのバックグラウンド化学発光（Ｂ）に関して修正したものを示す。グラフは、アルカリホスファターゼ検出の直線性を示す。計算した検出限界（バックグラウンドの標準偏差の倍）は、これらの条件の下で、１．４×１０-21moL、すなわちアルカリホスファターゼ分子１，０００個未満であることが測定された。
図６は、膜上のアルカリホスファターゼを化学発光によって検出する実験から得られたＸ線フィルムのデジタル走査画像である。１．１×１０-15〜１．１×１０-18moLを含有するアルカリホスファターゼ水溶液を同一のナイロン膜（Micron Separations Inc., Westboro, MA）に適用した。膜を、５分間空気乾燥させ、０．８８mMのＭｇＣｌ及び０．３３mMのジオキセタン２もしくは０．３３mMのジオキセタン５のいずれかを含有する、０．２M ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中エンハンサーＡ１mg/mLを含有する試薬に短時間浸漬した。膜を透明なプラスチックシートの間に配置し、Ｘ線フィルム（Kodak X-OMAT AR, Rochester, NY）にさらした。２種の試薬の比較において、本発明のジオキセタン５を使用して発せられた光が、より鮮明な画像及びより高い検出感度をもたらした。
好ましい実施態様の説明
本発明は、酵素をはじめとする化学的試薬によって誘発されると化学発光を起こすことができる安定な１，２−ジオキセタン類に関する。本発明を実施するのに有用な安定なジオキセタン類は、次式で示すことができる。
0004069987.tif 000002
式中、Ｒ1は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される少なくとも１個のハロゲンをさらに含む、炭素原子１〜８個を含むハロアルキル基であり、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、ヘテロ原子によって置換されていてもよいし非置換でもよく、ジオキセタンに安定性を提供する有機基であり、Ｒ2は、さらなる置換基を含むことができる、アリール基、ビアリール基、ヘテロアリール基、縮合多環式アリール基及び縮合多環式ヘテロアリール基から選択され、Ｘは、酵素及び他の化学物質からなる群より選択される試薬によって除去されると、不安定なオキシド中間体ジオキセタン化合物を形成し、この化合物が分解し、電子エネルギーを放出して、以下の反応式１に示すように、光と、２種のカルボニル含有化合物とを生成することができる保護基である。
0004069987.tif 000003
一つの実施態様では、基Ｒ3及びＲ4が一緒になって環式又は多環式の有機基Ｒ5を形成する。この基は、ジオキセタン環にスピロ縮合しており、炭素原子６〜３０個を含み、さらなる置換基を含むことができ、熱安定性を提供する。
0004069987.tif 000004
基Ｒ5は、より好ましくは、多環式基、好ましくはアダマンチル基又は、ハロゲン、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、カルボニル基、カルボキシル基、フェニル基、置換フェニル基、アミノ基及びアミノアルキル基から選択される１個以上の置換基Ｒ6が共有結合している置換アダマンチル基である。
0004069987.tif 000005
もう一つの好ましい実施態様では、基Ｒ2はフェニル基又はナフチル基である。Ｒ2は、以下に示すようにＯＸ基がジオキセタン環基に対してメタの配置にあるフェニル基であることが特に好ましい。フェニル環は、ハロゲン、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基及びアルキルアミノ基から独立して選択されるさらなる環置換基Ｒ7を含むことができる。いくつかの代表的な構造は、たとえば以下のものである。
0004069987.tif 000006
もう一つの好ましい実施態様では、基Ｒ1は、１個以上のフッ素原子又は塩素原子を含むモノ−、ジ−又はポリハロアルキル基である。ハロゲン原子は、アルキル中、ハロゲン原子がハロアルコキシ基の酸素原子から炭素原子２個を超えないだけ離れているように位置していることが特に好ましい。
ジオキセタン化合物の好ましい分類は次式によって例示される。
0004069987.tif 000007
式中、Ｙは、フッ素原子及び塩素原子から選択されるハロゲンであり、ｍは１〜３の整数であり、Ｘは、酵素をはじめとする化学的試薬によって除去されると、アリールオキシド置換ジオキセタンを形成することができる基である。
ＯＸ基は、ヒドロキシル基、ＯＯＣＲ8（ここで、Ｒ8は、いずれもヘテロ原子を含むことができる、炭素原子２〜２０個を含むアルキル基又はアリール基である）、トリアルキルシリルオキシ基、トリアリールシリルオキシ基、アリールジアルキルシリルオキシ基、ＯＰＯ3-2塩、ＯＳＯ3-塩、β−Ｄ−ガラクトシドキシ基及びβ−Ｄ−グルクロニジルオキシ基から選択することができる。
本発明の安定な１，２−ジオキセタン化合物は、室温で長期間、通常は１年以上の半減期を有するが、試薬によって誘発されると急速に分解することができ、そのときの半減期は、ジオキセタンがおかれる微細環境に依存して、数秒から数分の範囲である。ジオキセタン環上でハロアルコキシ基によってさらに置換されている安定なアリール基置換１，２−ジオキセタン類は、誘発されると、保護基Ｘを除去して、不安定なオキシド中間体ジオキセタン化合物を形成し、その化合物が分解し、電子エネルギーを放出して光及び２種のカルボニル含有化合物を形成するという予想外の性質を提供する。本発明のジオキセタン化合物は、誘発されると、従来技術の化合物よりも急速な化学発光分解を起こすが、それにもかかわらず、保護された状態では高い程度の熱安定性及び加水分解安定性を維持する。このような特性の組み合わせは、酵素誘発性ジオキセタン類を使用する検定の用途での利点を与える。急速な化学発光分解は、より速い発光を可能にし、検定時間の短縮をもたらす。また、ブロッティング用途でも、より速い発光の開始により、より高い光度が得られる。既存のジオキセタン化学発光理論には、本発明の急速な化学発光速度を十分に説明づけたものも、予測したものもない。
本発明はさらに、酵素及び他の化学物質をはじめとする試薬によって誘発されると、エンハンサー物質の存在下で化学発光を起こすことができるハロアルキル置換１，２−ジオキセタン類を含有する組成物に関する。エンハンサーとは、化学発光反応を誘発することによって発する光量を、エンハンサーの非存在下で発する量よりも増大させる物質である。本発明を実施するのに使用するのに適した、参考までに本明細書に含めるエンハンサーには、（１）Schaapの米国特許第４，９５９，１８２号及び第５，００４，６５６号明細書に記載されている、単独で、又は蛍光補助界面活性剤と混合した状態で、水溶液中でミセルを形成する第四アンモニウム塩界面活性剤、（２）Voytaの米国特許第５，１４５，７７２号明細書に記載されている、ポリマー性第四アンモニウム塩界面活性剤、（３）ポリマー性ホスホニウム塩界面活性剤、特に、１９９３年９月２２日に公開された、Akhavan-Taftiの欧州特許出願第９２１１３４４８．２号明細書に記載されているポリビニルベンジルトリアルキルホスホニウム含有ホモポリマー及びコポリマー、（４）１９９３年７月２４日に出願された米国特許出願第０８／０８２，０９１号明細書に記載されている、式
Ｂ- +Ｒ3ＡＣＨ2−Ｌｉｎｋ−ＣＨ2ＡＲ3+  Ｂ-
（式中、ＡはＰ原子又はＮ原子であり、Ｌｉｎｋは、置換及び非置換のアリール基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基からなる群より選択される、炭素原子２個以上を含む有機スペーサ基であり、Ｌｉｎｋはヘテロ原子を含むことができ、Ｒは、炭素原子１〜２０個を含む低級アルキル又はアラルキルから選択され、Ｂはハロゲンのアニオンである）
で示される二カチオンホスホニウム又はアンモニウム塩界面活性剤がある。ハロアルキル置換１，２−ジオキセタン類、上述のエンハンサー及びさらには蛍光エネルギー受容体を含む組成物もまた、本発明の範囲内である。増強の程度は、使用するエンハンサーの濃度に依存する。エンハンサー濃度が約０．００１％〜約１０％の範囲であるとき、化学発光の光度の増幅が起こる。エンハンサーは、好ましくは、約０．０１％〜約０．５％の濃度で使用する。特定のホスフェート保護されたハロアルコキシ置換１，２−ジオキセタン類を特定のエンハンサーと組み合わせたものが、ホスファターゼ酵素と反応すると、光を急速に高効率で発生させるのに効果的な試薬を提供するということがわかった。最大の光度及び発光効率に達する速度の点での、これらの組み合わせの予想外の利点は、他の既知のジオキセタン−エンハンサー系の挙動とは比較にならない。これらの利点は、詳細な説明の実施例を考慮することによっていっそう明白になるであろう。
本発明は、光を発生させる方法であって、式
0004069987.tif 000008
（式中、Ｒ1は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される少なくとも１個のハロゲンをさらに含む、炭素原子１〜８個を含むハロアルキル基であり、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、ジオキセタンに安定性を提供する有機基であり、ヘテロ原子によって置換されていてもよいし非置換でもよい。Ｘは、酵素及び他の化学的試薬からなる群より選択される試薬によって除去されると、不安定なオキシド中間体ジオキセタン化合物を形成し、この化合物が分解し、電子エネルギーを放出して、光と、式
0004069987.tif 000009
で示される２種のカルボニル含有化合物とを生成することができる基である）
で示される安定な１，２−ジオキセタン類を用意する工程と、
前記ジオキセタン類を前記試薬と反応させて光を発生させる工程を含む方法に関する。
さらに、本発明は、酵素及び他の化学薬剤から選択される試薬によって誘発される安定な１，２−ジオキセタン類から、溶液中又は固体支持体上で化学発光を生じさせる方法に関する。本発明はまた、酵素及び他の化学薬剤を化学発光反応によって検出する改良された方法に関する。
Ｘ基を除去する試薬が酵素であるとき、それは、別の分子に対するコンジュゲート（複合体）、特に、ハプテン、抗原、抗体、受容体、タンパク質、核酸及びオリゴヌクレオチドから選択される特異的結合対のメンバーに対する複合体として使用することができる。さらには、酵素又は複合体は、固体、たとえば、化学発光反応を実施するためのビーズ、チューブ、マイクロプレートウェル又は膜の表面に付着させることもできる。もう一つの実施態様では、Ｘ基を除去する試薬は、化学物質、たとえば双極性非プロトン性溶剤中の求核性化合物、フッ化物塩又は塩基性塩であってもよい。
本発明はまた、試薬が酵素及び他の化学薬剤から選択される検定において、本発明のジオキセタンの化学発光分解を誘発することができる試薬の存在又は量を検出する方法に関する。本発明は、たとえばレポータ遺伝子検定におけるように、試料中の酵素の存在又は量を検出するのに使用することができる。本発明はまた、検出される物質の酵素複合体、検出される物質の類似体の酵素複合体又は検出される物質に特異的に結合する物質の酵素複合体を用いることによって検出又は定量される物質の検定にも利用することができる。たとえば、本発明は、ホスファターゼ酵素の検出、イムノアッセイ、たとえば、分析対象物、分析対象物類似体、分析対象物に対する抗体、ビオチンとアビジン、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン又はフルオロセインと抗フルオレセインによって例示される特異的結合対のメンバーにレポータ遺伝子を結合させてもよいＥＬＩＳＡもしくは競合イムノアッセイのようなサンドイッチ検定における、ハプテン、抗原及び抗体の検出のための方法及び組成物に関する。本発明の使用によって検出することができる酵素はまた、当該技術に公知の方法、たとえばタンパク質検出のウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡプロフィール決定、ＤＮＡフィンガープリント法および酵素結合ＤＮＡもしくはＲＮＡプローブの検出のための核酸ハイブリダイゼーションベースの検定に使用することもできる。後者のタイプの検定では、酵素標識核酸プローブを、対象の相補的配列、たとえば感染病原体の検出のためにはバクテリアＤＮＡ又はウイルスＲＮＡもしくはＤＮＡと、又は遺伝子疾患又はガンに関連するＤＮＡ配列とハイブリダイズさせる。検定における酵素的検出反応によって発する光の検出は、ルミノメータ、Ｘ線フィルム、カメラおよび写真フィルム又はＣＣＤカメラを使用して容易に実行することができる。
もう一つの実施態様では、フッ素化アルコキシ基を有する本発明のジオキセタン類を、対応するビニルエーテル先駆物質の光酸素化によって調製する。フッ素化アルコキシ置換ビニルエーテル類は、米国特許第４，９６２，１９２号および第４，９８３，７７９号明細書に開示されている方法により、ケトンとフッ素化アルキルエステルとの還元カップリングによって調製することができる。驚くべきことに、強い還元条件の下では、後者のエステル類のカップリングは、ハロゲン化エステル類は還元的開裂を受けやすいにもかかわらず、反応式４に示すように進行して、予想されるビニルエーテルを形成する。
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したがって、本発明は、次式で示されるビニルエーテル化合物をさらに含む。
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式中、ｍは１〜３の整数であり、ＯＸ基は、ヒドロキシル基、Ｏ-Ｍ+（ここで、Ｍは、アルカリ金属イオン、第四アンモニウムイオン及び第四ホスホニウムイオンから選択される）、ＯＯＣＲ8（ここで、Ｒ8は、いずれもヘテロ原子を含むことができる、炭素原子２〜２０個を含むアルキル基又はアリール基である）、トリアルキルシリルオキシ基、トリアリールシリルオキシ基、アリールジアルキルシリルオキシ基、ＯＰＯ3-2塩、ＯＳＯ3-塩、β−Ｄ−ガラクトシドキシ基およびβ−Ｄ−グルクロニジルオキシ基から選択することができる。
さらに別の実施態様では、フッ素化アルコキシ基を有する本発明のジオキセタン類は、ジオキセタン上のＯＸ基１個を別のＯＸ基で置換して、別のジオキセタンを生成することによって調製される（ここで、ＯＸ基は上記に定義したとおりである）。このような置換の一例を以下の反応式５に示す。
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実施例
ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＡＰ）をBiozyme社（San Diego, CA）から入手した。他の試薬は、Aldrich Chemical社（Milwaukee）から入手した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、Varian Gemini 300分光計でＤ2Ｏ又はＣＤＣｌ3溶液で得た。化学発光光度及び速度測定は、Turner Designs社製（Sunnyvale, CA）のルミノメータTD−20ｅモデル、Luminoskan社製（Helsinki, Finland）のルミノメータ、発明者の実験室で作製したＣＣＤカメラルミノメータ又は発明者の実験室で作製した、電気的に加熱される試料ブロックと、光ファイバ及び関連の集光光学系と、光電子倍増管とからなるルミノメータのいずれかを使用して実施した。市販のルミノメータで分析する試料の温度制御は、計器に接続した循環槽によって達成した。Turner社のルミノメータでの定量的な光度の測定は、中性フィルタにより、検出器の１０4線形範囲以上に拡大させた。計器それぞれからのデータ収集は、Apple Macintosh社のSE/30コンピュータにより、LUMISOFTデータ縮小プログラム（Lumigen）を使用して制御した。
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実施例１  ジオキセタン１及び２の合成
４−メトキシ−４−（３−ヒドロキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］−デカン］１
米国特許第５，００４，５６５号明細書に記載の方法により、［（３−ヒドロキシフェニル）メトキシメチレン］トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン（調製方法は米国特許第４，９６２，１９２号及び第４，９８３，７７９号明細書に記載）をジオキセタンに転換した。ジオキセタン２は、LUMIGEN PPD（Lumigen, Inc., Southfield, MI）として市販されているものであった。
実施例２  ジオキセタン３の合成
（ａ）２，２，２−トリフルオロエチル  ３−ヒドロキシベンゾエートの合成
Ｈ2ＳＯ4６mLを含む、トリフルオロエタノール１５０mL中のメチル  ３−ヒドロキシベンゾエート２０ｇの溶液を３．５時間還流した。Ｈ2ＳＯ4をさらに６mL加え、還流を一夜継続した。冷却した溶液を氷６００ｇに注加し、用心しながら中和した。水を酢酸エチル（約１．５L）で抽出した。酢酸エチル溶液を乾燥させ、蒸発させると、油状物が得られた。これを、ヘキサン中１０％酢酸エチルを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量１９．７ｇ
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（ｂ）２，２，２−トリフルオロエチル  ３−tert−ブチルジメチルシリルオキシベンゾエートの合成
ＤＭＦ３mL中のtert−ブチルジメチルシリルクロリド１．８２ｇ（１．２当量）及びイミダゾール０．８２ｇ（１．２当量）の溶液をアルゴン下に１５分間攪拌した。ＤＭＦ７mL中（ａ）のエステル（２．２２ｇ、１０mmoL）を加え、得られた溶液を一夜攪拌した。この溶液を水１２５mLに注加し、ヘキサンで抽出した。ヘキサンを乾燥させ、蒸発させると、油状物が残った。これを、シリカ上、ヘキサン中１０％酢酸エチルを用いてクロマトグラフィーに付した。収量３．１８ｇ
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（ｃ）［（３−tert−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−（２，２，２−トリフルオロエチル）メチレン］トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカンの合成
三つ口フラスコをアルゴンでパージし、無水ＴＨＦ２００mLを充填した。フラスコを氷槽中で冷却し、三塩化チタン（２０．２５ｇ、０．１３１moL）を攪拌しながら加えた。水素化リチウムアルミニウム（ＬＡＨ）（２．３６ｇ、０．０６６moL）を少しずつ加えると、短い発熱反応を生じた。すべてのＬＡＨを加えたのち、冷却槽を取り除き、トリエチルアミン（１８．３mL、０．１３１moL）を加えた。黒色の混合物をアルゴン下に１００分間還流させたのち、１５分間冷却した。乾燥ＴＨＦ３０mL中のアダマンタノン（５．９２ｇ、３９mmoL）及び２，２，２−トリフルオロエチル−３−tert−ブチルジメチルシリルオキシベンゾエート（４．３９ｇ、１３mmoL）の溶液を１０分間滴下した。ヘキサン中の２０％酢酸エチルを用いるＴＬＣによって反応の進行を監視した。粗反応混合物をヘキサンで希釈し、デカンテーションした。全部で約１Lのヘキサンを使用して残渣を数回洗浄した。合わせたヘキサン溶液をろ過し、蒸発させると、油状物が残った。これを、シリカ上、ヘキサン中１．５％酢酸エチルで溶離させるカラムクロマトグラフィーによって精製すると、アルケン３．５ｇが得られた。
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（ｄ）［（３−ヒドロキシフェニル）−（２，２，２−トリフルオロエチル）メチレン］トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカンの合成
シリル基で保護されたアルケン（３．５ｇ、７．７mmoL）を、乾燥ＴＨＦ４０mL中のフッ化テトラブチルアンモニウム２．４４ｇ（１当量）との反応によって脱保護した。１時間攪拌したのち、溶液を蒸発させ、残渣を水１５０mLに注加した。水溶液を酢酸エチル１５０mLずつで３回で抽出した。合わせた有機溶液を乾燥させ、蒸発させ、残渣を、ヘキサン中１．５〜１０％酢酸エチルを使用してクロマトグラフィーに付した。残留するtert−ブチルジメチルシラノールを減圧下に５０℃で除去した。脱保護されたアルケン１．２５ｇが得られた。
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（ｅ）４−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−４−（３−ヒドロキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］（３）の合成
ポリマー結合ローズベンガルを使用して、ＣＨ2Ｃｌ2２０mL中アルケン（５１mg）を−７８℃で９０分間光酸素化した。ＴＬＣは、アルケンの完全な消費及びプレート加熱時に青緑の光を発する新たな物質の形成、ならびにジオキセタン分解生成物を示した。増感剤をろ別し、溶剤を蒸発させ、粗生成物を、ヘキサン中１０％酢酸エチルを使用してクロマトグラフィーに付すと、ジオキセタン２４mgが得られた。
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実施例３  ジオキセタン４の合成
４−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−４−（３−ビス（シアノエチル）ホスホリルオキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］
（ａ）ＣＨ2Ｃｌ2１０mL中のＰＯＣｌ3（１．０mL、３．３当量）の溶液をアルゴン下に配置し、０℃に冷却した。無水ピリジン（２．６mL、１０当量）を加え、溶液を１０分間攪拌して冷却した。ＣＨ2Ｃｌ2１０mL中ジオキセタン３（１．２ｇ、１当量）及びピリジン（２．０mL、８当量）を滴下した。ＴＬＣは、ジオキセタンが１時間で完全に転換することを示した。揮発性成分を減圧下に除去し、得られた黄色の固体をアルゴン下に配置した。
（ｂ）前段からの固体をＣＨ2Ｃｌ2１５mLに溶解し、シアノエタノール０．９０mL（４当量）を加え、続いてピリジン３．０mLを加えた。一夜攪拌したのち、溶液を濃縮し、再びＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。水で抽出し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させると、黄色の油状物が残った。これを、シリカ上、ヘキサン中の５０〜１００％酢酸エチルを用いるクロマトグラフィーによってさらに精製すると、ビス（シアノエチル）ホスフェートジオキセタン４が無色の油状物として得られた。
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実施例４  ジオキセタン５の合成（方法１）
４−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−４−（３−ホスホリルオキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］、二ナトリウム塩
（ａ）［（３−ビス（シアノエチル）ホスホリルオキシフェニル）−（２，２，２−トリフルオロエチル）メチレン］トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカンの合成
乾燥ＣＨ2Ｃｌ2３mL中のピリジン（１．１mL）を氷槽中で冷却した。ＣＨ2Ｃｌ2３．５mL中のＰＯＣｌ3（０．４mL、４．３mmoL）を滴下し、溶液を１５分間攪拌した。ＣＨ2Ｃｌ2５mL及びピリジン０．５mL中、実施例２（ｄ）のアルケン（４５０mg、１．３３mmoL）を加え、反応を室温に暖めた。１．５時間後、ＴＬＣが反応は不完全であることを示したため、さらなるＰＯＣｌ3（０．１mL）及びピリジン（０．３mL）を加えた。１時間後、反応は完了したものと判断した。溶液を蒸発乾固させ、ＣＨ2Ｃｌ2１０mL、２−シアノエタノール０．２７mL（４mmoL）及びピリジン１．１mLの溶液を加えた。７２時間後、溶液を蒸発させ、残渣をＣＨ2Ｃｌ2７５mLで希釈した。この溶液をＮａＣｌ飽和溶液で抽出し、ＮａＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させた。粗生成物を、ヘキサン中５０〜１００％酢酸エチルを使用してクロマトグラフィーによって精製すると、生成物２８９mgが得られた。
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（ｂ）［（３−ホスホリルオキシフェニル）−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）メチレン］トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン、二ナトリウム塩の合成
アセトン１５mL中のビス（シアノエチル）ホスフェートアルケン（３７４mg、０．７１mmoL）を、水１mL中のＮａＯＨ５７mg（２当量）の溶液とともに一夜攪拌した。沈殿した生成物をろ過によって捕集し、アセトンで洗浄すると、生成物２７２mgが得られた。さらなるＮａＯＨ（１０mg）をろ液に加え、攪拌を１日続けた。２回目の生成物がわずかに沈殿しており、それを捕集した。
0004069987.tif 000021
（ｃ）４−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−４−（３−ホスホリルオキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］、二ナトリウム塩の合成
メチレンブルーを使用して、Ｄ2Ｏ１０mL中のアルケン（２７２mg）を０℃で９０分間光酸素化した。ＮＭＲは、ジオキセタンへの完全な転換を示した。このようにして生成したジオキセタンは、ホスファターゼ酵素との反応用の水溶液の調製にそのままで使用することができる。
実施例５  ジオキセタン５の合成（方法２）
（ａ）メタノール２０mLに溶解したビス（シアノエチル）ホスフェートジオキセタン４（０．３３６７ｇ、０．６１mmoL）を、タイプＩの水（Lumigen）２mL中の炭酸ナトリウム０．２６９ｇ（４．２当量）とともに一夜攪拌した。ＴＬＣが不完全な転換を示したため、タイプＩの水１mL中炭酸ナトリウム０．１２８３ｇ及びメタノール１０mLをさらに加え、攪拌をさらに１日継続した。ＣＨ2Ｃｌ2中３０％メタノールを使用するＴＬＣは、シアノエチル基をほぼ完全に除去したことを示した。減圧下に溶剤を蒸発させると、わずかに黄色の固体が得られた。メタノールに２回溶解し、ろ過し、メタノールを蒸発させることにより、固体から不純物を除去した。
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実施例６  ジオキセタン６の合成
４−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−４−（３−アセトキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］
ＣＨ2Ｃｌ2１５mL中のジオキセタン３（７８．２mg）の溶液をアルゴン下に配置した。乾燥ピリジン（４０μL、２．３当量）を加え、その５分後、塩化アセチル１６．６μL（１．１当量）を加えた。２時間後、ＴＬＣが、プレート加熱時に青緑の光を発する新たな物質を示したことにより、反応は完了したものと判断した。揮発性物質を減圧下に除去すると、黄色の油状物が残った。これを、ＣＨ2Ｃｌ2を溶離剤として使用する分取ＴＬＣによって精製した。無色の油状物（４４mg）が得られた。
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実施例７  ジオキセタン７の合成
４−（２，２−ジフルオロエトキシ）−４−（３−ヒドロキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］
（ａ）２，２−ジフルオロエチル  ３−ヒドロキシベンゾエートの合成
Ｈ2ＳＯ4２滴を含む、２，２−ジフルオロエタノール４mL（６２mmoL）中３−ヒドロキシ安息香酸２．１９ｇ（１５．９mmoL）の溶液を３日間還流させた。冷却した溶液を酢酸エチル７５mLに注加した。ＮａＨＣＯ3飽和水溶液を用いて、中性状態まで酢酸エチルを抽出した。酢酸エチル溶液をＮａＣｌ飽和水溶液で抽出し、乾燥させ、減圧下に蒸発させると、無色の油状物２．８２ｇ得られた。
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（ｂ）２，２−ジフルオロエチル  ３−tert−ブチルジメチルシリルオキシベンゾエートの合成
ＤＭＦ５mL中のtert−ブチルジメチルシリルクロリド２．３１ｇ（１．１当量）及びイミダゾール１．０４ｇ（１．１当量）の溶液をアルゴン下に１５分間攪拌した。ＤＭＦ５mL中、段階（ａ）のエステル（２．８２ｇ、１３．９mmoL）を加え、得られた溶液を一夜攪拌した。溶液をＤＭＦ５０mLで希釈し、ヘキサンで抽出し（１０×７５mL）、合わせたヘキサン溶液を水洗した（２×２００mL）。ヘキサンを乾燥させ、蒸発させると、シリル化エステル３．５８ｇが残った。
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（ｃ）［（３−tert−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−（２，２−ジフルオロエトキシ）メチレン］トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカンの合成
三つ口フラスコをアルゴンでパージし、無水ＴＨＦ６０mLを充填した。攪拌しながら三塩化チタン（１２．１９ｇ、７９mmoL）を加え、フラスコを氷槽中で冷却した。水素化リチウムアルミニウム（１．４２ｇ、３９．５mmoL）を少しずつ加えると、短い発熱反応を生じた。すべてのＬＡＨを加えたのち、冷却槽を取り除き、トリエチルアミン（１１mL、７９mmoL）を加えた。黒色の混合物をアルゴン下に１４０分間還流させたのち、加熱を停止した。乾燥ＴＨＦ１０mL中アダマンタノン（３．５６ｇ、２３．７mmoL）及び２，２−ジフルオロエチル  ３−tert−ブチルジメチルシリルオキシベンゾエート（２．５０ｇ、７．９mmoL）の溶液を５分間滴下した。ヘキサン中の２５％酢酸エチルでのＴＬＣによって反応の進行を観察した。２０分後、混合物をヘキサンで希釈し、デカンテーションした。残渣をヘキサンで洗浄し（７×１００mL）、合わせたヘキサン溶液をろ過し、蒸発させると、油状物が残った。これを、シリカゲル上、ヘキサン中の５％酢酸エチルで溶離させるカラムクロマトグラフィーによって精製した。アルケンとアダマンチリデンアダマンタンとの混合物３．１ｇを含有する画分を捕集した。この混合物を次の段階に用いた。
（ｄ）［（２，２−ジフルオロエトキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）メチレン］トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン
不純なシリル基保護アルケン（３．１ｇ）を、乾燥ＴＨＦ２０mL中のフッ化テトラブチルアンモニウム２．２５ｇとの反応によって脱保護した。４５分間攪拌したのち、溶液を水５０mLに注加した。水溶液を酢酸エチルで抽出した（３×７５mL）。合わせた有機溶液を乾燥させ、蒸発させると、油状物が残った。これを、シリカゲル上、ヘキサン中の３％酢酸エチルで溶離させるカラムクロマトグラフィーによって精製した。残留tert−ブチルジメチルシラノールを減圧下に４５℃で除去した。脱保護されたアルケン１．００ｇが得られた。
0004069987.tif 000026
（ｅ）４−（２，２−ジフルオロエトキシ）−４−（３−ヒドロキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］の合成
ポリマー結合ローズベンガルを使用して、ＣＨ2Ｃｌ2１２mL中アルケン（３０mg）を−７８℃で３０分間光酸素化した。ＴＬＣは、アルケンの完全な消費及びプレート加熱時に青緑の光を発する新たな物質の形成、ならびにジオキセタン分解生成物を示した。増感剤をろ別し、溶剤を蒸発させ、粗生成物を、ヘキサン中３０％酢酸エチルを使用してクロマトグラフィーに付した。ジオキセタン２４mgが得られた。
0004069987.tif 000027
光酸素化を繰り返すと、アルケンが１０分で完全に転換されることがわかった。
実施例８  ジオキセタン８の合成
４−（２′−フルオロエトキシ）−４−（３−ヒドロキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］
（ａ）２−フルオロエチル  ３−ヒドロキシベンゾエートの合成
Ｈ2ＳＯ4３滴を含む、２−フルオロエタノール１１mL中の３−ヒドロキシ安息香酸１２．９３ｇ（９３．７mmoL）の溶液を１６時間還流させた。冷却した溶液を蒸発させ、白色の固体を酢酸エチルに溶解した。ＮａＨＣＯ3及びＮａ2ＣＯ3の水溶液を用いて、中和状態まで酢酸エチルを抽出した。酢酸エチル溶液を乾燥させ、減圧下に蒸発させると、薄黄色の油状物１３．７ｇが晶出した。
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（ｂ）２−フルオロエチル  ３−tert−ブチルジメチルシリルオキシベンゾエートの合成
ＤＭＦ２０mL中のtert−ブチルジメチルシリルクロリド２．７３ｇ（１．１当量）及びイミダゾール１．２４ｇ（１．１当量）の溶液をアルゴン下に１５分間攪拌した。ＤＭＦ２０mL中のエステル（３．０４ｇ、１６．５mmoL）を加え、得られた溶液を一夜攪拌した。tert−ブチルジメチルシリルクロリド０．２５ｇ及びイミダゾール０．１１ｇをさらに加え、攪拌を３０分間継続した。溶液をヘキサンで抽出し（７×１００mL）、合わせたヘキサン溶液を水洗した（３×１００mL）。ヘキサンを乾燥させ、蒸発させると、シリル化エステル４．１ｇが残った。
0004069987.tif 000029
（ｃ）［（３−tert−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）−（２−フルオロエトキシ）メチレン］トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン
三つ口フラスコをアルゴンでパージし、無水ＴＨＦ６０mLを充填した。攪拌しながら三塩化チタン（８．３８ｇ、０．０５４moL）を加え、フラスコを氷槽中で冷却した。水素化リチウムアルミニウム（０．９８ｇ、０．０２７moL）を少しずつ加えると、短い発熱反応を生じた。すべてのＬＡＨを加えたのち、冷却槽を取り除き、トリエチルアミン（７．６mL、０．０５４moL）を加えた。黒色の混合物をアルゴン下に１４０分間還流させたのち、加熱を停止した。乾燥ＴＨＦ２０mL中のアダマンタノン（２．４５ｇ、１６．３mmoL）及び２−フルオロエチル  ３−tert−ブチルジメチルシリルオキシベンゾエート（１．０ｇ、３．３５mmoL）の溶液を５分間滴下した。ヘキサン中２０％酢酸エチルでのＴＬＣによって反応の進行を観察した。２５分後、混合物をヘキサンで希釈し、デカンテーションした。全部で約４５０mLのヘキサンを使用して残渣を数回洗浄した。合わせたヘキサン溶液をろ過し、蒸発させると、油状物が残った。これを、シリカゲル上、ヘキサン中３％酢酸エチルで溶離させるカラムクロマトグラフィーによって精製すると、アダマンチリデン−アダマンタンをいくらか含むアルケン１．６８ｇが得られた。
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（ｄ）［（２−フルオロエトキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）−メチレン］トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカンの合成
不純なシリル基保護アルケン（１．６８ｇ）を、乾燥ＴＨＦ７５mL中のフッ化テトラブチルアンモニウム１．２７ｇとの反応によって脱保護した。１．５時間攪拌したのち、溶液を蒸発させ、残渣を水１２５mLに注加した。水溶液を酢酸エチル１００mLずつで２回抽出した。合わせた有機溶液を乾燥させ、蒸発させ、残渣を、ヘキサン中１．５〜１０％酢酸エチルを使用してクロマトグラフィーに付した。残留tert−ブチルジメチルシラノールを減圧下に５０℃で除去した。脱保護されたアルケン０．５５ｇが晶出した。
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（ｅ）４−（２−フルオロエトキシ）−４−（３−ヒドロキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］の合成
ポリマー結合ローズベンガルを使用して、ＣＨ2Ｃｌ2２０mL中のアルケン（５０mg）を−７８℃で４０分間光酸素化した。ＴＬＣは、アルケンの完全な消費及びプレート加熱時に青緑の光を発する新たな物質の形成を示した。増感剤をろ別し、溶剤を蒸発させた。生成物を、ヘキサン中２０％酢酸エチルを使用する分取ＴＬＣによって精製すると、ジオキセタン３２mgが得られた。
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実施例９  ジオキセタン９の合成
４−（２′−クロロエトキシ）−４−（３−ヒドロキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］
（ａ）２−クロロエチル  ３−ヒドロキシベンゾエートの合成
Ｈ2ＳＯ4１．５mLを含む、２−クロロエタノール１２０mL中の３−ヒドロキシ安息香酸１４ｇ（１０１mmoL）の溶液を４時間還流させた。冷却した溶液を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した（２×２００mL）。ＮａＨＣＯ3水溶液及びＮａＣｌ飽和溶液を用いて酢酸エチルを抽出した。酢酸エチル溶液を乾燥させ、減圧下に蒸発させると、少量の２−クロロエタノールを含有する生成物２０．９２ｇが得られた。
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（ｂ）２−クロロエチル  ３−tert−ブチルジメチルシリルオキシベンゾエートの合成
ＤＭＦ８５mL中のtert−ブチルジメチルシリルクロリド２３．５８ｇ（１５６mmoL）及び段階（ａ）のエステル（２０．９２ｇ）の溶液をアルゴン下に１５分間攪拌した。イミダゾール（１４．２ｇ、２０８mmoL）を加え、得られた溶液を一夜攪拌した。この溶液を水２００mLに注加し、エーテルで抽出した（５×１００mL）。合わせたエーテル溶液を乾燥させ、蒸発させると、橙色の油状物が残った。このシリル化エステルを、ヘキサン中３％酢酸エチルを使用するカラムクトマトグラフィーによって精製すると、少量のtert−ブチルジメチルシラノールを含有する無色の油状物として生成物２６．７ｇが得られた。
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（ｃ）［（２−クロロエトキシ）−（３−tert−ブチルジメチルシリルオキシフェニル）メチレン］トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカンの合成
三つ口フラスコをアルゴンでパージし、無水ＴＨＦ１５０mLを充填した。攪拌しながら三塩化チタン（５５．４ｇ、３５９mmoL）を加え、フラスコを氷槽中で冷却した。水素化リチウムアルミニウム（６．８２ｇ、１８０mmoL）を少しずつ加えると、短い発熱反応を生じた。黒色の混合物を乾燥ＴＨＦ１５０mLで希釈した。すべてのＬＡＨを加えたのち、冷却槽を取り除き、トリエチルアミン（５０．１mL、３５９mmoL）を加えた。黒色の混合物をアルゴン下に２時間還流させたのち、加熱を停止した。乾燥ＴＨＦ１５０mL中アダマンタノン（１６．１９ｇ、１０８mmoL）及び２−クロロエチル  ３−tert−ブチルジメチルシリルオキシベンゾエート（１１．３１ｇ、３５．９mmoL）の溶液を１時間滴下した。ヘキサン中２０％酢酸エチルでのＴＬＣによって反応の進行を観察した。３０分後、混合物を冷却し、アルゴン下に一夜放置した。混合物をヘキサン９００mLで希釈し、ろ紙に通してろ過した。ヘキサン３００mLずつを２回使用して残渣を洗浄した。合わせたヘキサン溶液をろ過し、蒸発させると、油状物が残った。これを、シリカゲル上、ヘキサン中５％酢酸エチルで溶離させるカラムクロマトグラフィーによって部分的に精製すると、アダマンチリデンアダマンタンをいくらか含むアルケン１３．２８ｇが得られた。
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（ｄ）［（２−クロロエトキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）メチレン］トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカンの合成
未処理のシリル保護アルケン（３．１３ｇ）を、乾燥ＴＨＦ５０mL中のフッ化テトラブチルアンモニウム２．４２ｇとの反応によって脱保護した。１５分間攪拌したのち、溶液を蒸発させ、残渣を水７０mLに注加した。水溶液を酢酸エチル１００mLずつで３回抽出した。合わせた有機溶液を乾燥させ、蒸発させ、残渣を、ヘキサン中２５％酢酸エチルを使用してクロマトグラフィーに付した。残留するtert−ブチルジメチルシラノールを減圧下に除去した。脱保護されたアルケン１．３２ｇが油状物として得られた。
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（ｅ）４−（２−クロロエトキシ）−４−（３−ヒドロキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］の合成
小型の光酸素化装置に、ビニルエーテル６１mg（０．１９mmoL）、ポリマー結合ローズベンガル１００mg及びＭｇＳＯ4上で乾燥させたＣＨ2Ｃｌ2８mLを充填した。次に、酸素気泡を中に通しながら、得られた溶液を−７８℃に冷却した。数分後、反応溶液を１，０００Wのナトリウムランプで３０分間照射した。ヘキサン中２０％酢酸エチルを使用するＴＬＣは、プレート加熱時に光を発する新たな物質への転換及び分解生成物を示した。増感剤をろ別し、溶剤を蒸発させ、物質を、シリカ上、ヘキサン中２０％酢酸エチルを使用するクロマトグラフィーによって精製すると、少量のアダマンタノンを含むジオキセタン４０mgが得られた。
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実施例１０  １−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベンゼンジクロリド、エンハンサーＡの合成
（ａ）トルエン（５０mL）中のトリ−ｎ−ブチルホスフィン（７ｇ、３４．６mmoL）の混合物を、アルゴン下に、トルエン（２００mL）中α，α′−ジクロロ−ｐ−キシレン（１２．１ｇ、６９．２mmoL、２当量）の混合物に滴下した。反応混合物をアルゴン下に室温で１２時間攪拌すると、４−（クロロメチル）ベンジル−トリ−ｎ−ブチルホスホニウムクロリドが溶液から晶出した。結晶をろ過し、トルエン及びヘキサンで洗浄し、空気乾燥させた。
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（ｂ）室温でアルゴン下のＤＭＦ中の４−（クロロメチル）ベンジル−トリ−ｎ−ブチルホスホニウムクロリド（３ｇ、７．９mmoL）の混合物にトリ−ｎ−オクチルホスフィン（４．３９ｇ、１２mmoL）を加えた。反応混合物を数日間攪拌したのち、ＴＬＣ検査は、反応が完了していることを示した。減圧下にＤＭＦを除去し、残渣をヘキサン及びトルエンで数回洗浄したのち、乾燥させると、１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウムメチル）ベンゼンジクロリドが白色結晶として得られた。
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実施例１１  化学発光光度−速度変動状態の比較
ＡＰとの反応によって生じる最大化学発光光度が９５％に達するのに要する時間における、ホスフェートジオキセタン５を含有する組成物によって得られる検出速度での改善を、ジオキセタン２と比較して表２に示す。ジオキセタン２、４−メトキシ−４−（３−ホスホリルオキシ−フェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］、二ナトリウム塩（LUMIGEN PPD, Lumigen, Inc.）又は５のいずれかを含有する３種の異なる試薬組成物を、ＡＰと３７℃で反応させた。組成物Ａは、１−（トリ−ｎ−オクチルホスホニウムメチル）−４−（トリ−ｎ−ブチルホスホニウム−メチル）ベンゼンジクロリド（エンハンサーＡ）を１．０mg/mL含む、０．２M ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中０．３３mMジオキセタンからなるものであった。１００μL部を３．３６×１０-16moLの酵素と反応させた。組成物Ｂは、ポリビニルベンジル−トリブチルホスホニウムクロリド−ｃｏ−ポリビニルベンジルトリオクチル−ホスホニウムクロリド（トリブチル基：トリクオチル基を３：１の比率で含む）（調製方法は、１９９３年９月２２日に公開された欧州特許第５６１，０３３号公報に記載されている）（エンハンサーＢ）を０．５mg/mL含む、０．２M ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中０．３３mMジオキセタンからなるものであった。１００μL部を３．３６×１０-16moLの酵素と反応させた。組成物Ｃは、０．２M ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中０．３３mMジオキセタンからなるものであった。５００μL部を１．１２×１０-15moLの酵素と反応させた。
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さらには、ジオキセタン２を含む組成物に比べて、ジオキセタン５を含む組成物Ａの方がより高いプラトー光度が達成された。
実施例１２  ジオキセタン５を用いた場合の化学発光光度及び速度に対するエンハンサーＡの濃度の影響
ジオキセタン５のアルカルホスファターゼ誘発化学発光反応に使用するエンハンサーＡの最適量を見いだすため、濃度依存性の実験を行った。０．８８mMのＭｇ+2及び１、０．５、０．２５又は０．１mg/mLのエンハンサーＡを含有する０．２M ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中ジオキセタン５の溶液を調製した。アリコート（１００μL）を３７℃で平衡にし、１．１２×１０-17モルのアルカリホスファターゼと反応させた。図１の時間に対する相対光単位（ＲＬＵ）の光度のグラフは、予想外にも、エンハンサーの量を減らすにつれて高まるプラトー光度と、エンハンサーの量を減らすにつれて遅くなる立上りを示した。ジオキセタン２を用いる同様の実験は、エンハンサーの量が減るにつれ、最大光度に達するまでの立上り時間は減るが、０．１mg/mL〜３mg/mLのエンハンサーのすべての濃度で立上り時間が１時間以上であることを示した。
実施例１３  ジオキセタン５を用いた場合の化学発光光度及び速度に対するエンハンサーＢの濃度の影響
ジオキセタン５のアルカルホスファターゼ誘発化学発光反応に使用するエンハンサーＢの最適量を見いだすため、濃度依存性の実験を行った。０．８８mM  Ｍｇ+2及び０．５、０．２５、０．１、０．０５又は０．０２５mg/mLのエンハンサーＢを含有する０．２M ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中ジオキセタン５の溶液を調製した。アリコート（１００μL）を３７℃で平衡にし、１．１２×１０-17モルのアルカリホスファターゼと反応させた。図２の時間に対する光度のグラフは、予想外にも、エンハンサーの量を０．５mg/mLから０．０１mg/mLに減らすと、立上りがより遅くなることを示した。ジオキセタン２を用いる同様の実験は、エンハンサーの量を３mg/mLから０．１mg/mLに減らしても、最大光度に達するまでの立上り時間は１時間又はそれ以上でほぼ一定であることを示した。図２に示す結果は、ジオキセタン５とともに使用した場合のエンハンサーＢの濃度の異例な効果を示した。発光に関して平坦なプラトーを提供する点での速度は、高いエンハンサー濃度及び低いエンハンサー濃度で好ましい挙動を示した。
実施例１４  ジオキセタン２又は５を含有する最適化溶液の化学発光光度及び速度の比較
図３は、０．３３mMのジオキセタン２及び１mg/mLのエンハンサーＡを含有する組成物と、０．３３mMの本発明のジオキセタン５及び０．１mg/mLのエンハンサーＡを含有する組成物の２種の組成物の３７℃での経時変化及び相対発光光度を示した。１．１２×１０-17モルのＡＰをジオキセタン溶液１００μLに加えることにより、発光を開始した。本発明のジオキセタン５を含有する試薬は、非常に高い最大光度に、より速くプラトーに達した。図４に、０．３３mMのジオキセタン２及び０．５mg/mLのエンハンサーＢを含有する組成物と、０．３３mMの本発明のジオキセタン５及び０．２５mg/mLのエンハンサーＢを含有する組成物の２種の組成物の３７℃での経時変化及び相対発光光度を示した。１．１２×１０-17モルのＡＰをジオキセタン溶液１００μLに加えることにより、発光を開始した。本発明のジオキセタン５を含有する試薬は、最初の１５分間でより高い光度に達した。これはイムノアッセイには有利である。
実施例１５  ジオキセタン５を用いるアルカリホスファターゼ検出の直線性及び感度
ジオキセタン５を含有する本発明の試薬組成物を使用するアルカリホスファターゼ検出の直線性を測定した。９６ウェル式マイクロプレートの４８個のウェルそれぞれに、０．８８mMのＭｇ+2及び１．０mg/mLのエンハンサーＡを含む、０．２M ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中ジオキセタン５の０．３３mM溶液５０μLを加えた。プレートを３７℃でインキュベートし、３．３６×１０-16moL〜３．３６×１０-21moLの間の酵素を含有するＡＰ溶液３μLの添加によって化学発光を開始した。１０分後に光度を計測した。図５に、アルカリホスファターゼ検出の直線性を示した。項Ｓ−Ｂは、ＡＰの存在におけるＲＬＵ単位の化学発光信号（Ｓ）をＡＰの非存在におけるバックグラウンド化学発光（Ｂ）に関して修正したものを示す。計算された検出限界（バックグラウンドの標準偏差の２倍）は、これらの条件では、１．２５×１０-21moL、すなわち、アルカリホスファターゼ分子１，０００個未満であると測定された。
実施例１６  ヒドロキシジオキセタン類の塩基誘発分解速度の比較
０．８８mMのＭｇ+2及び１．０mg/mLのエンハンサーＡを含む、０．２M ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中ジオキセタン１及び３の化学発光の一次壊変をルミノメータ中３７℃で測定した。０．８８mMのＭｇ+2及び１．０mg/mLのエンハンサーＡを含む、０．２M ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中ジオキセタン１及び３の化学発光壊変半減期（ｔ1/2）は、同じ緩衝液溶液中のアルカリホスファターゼで誘発されたジオキセタン２及び５の分解の最大光度（Ｉmax）に達するのに要する時間と相関していた。したがって、ホスフェートで保護されたジオキセタンに対するヒドロキシジオキセタン同族体の発光壊変半減期を、対応するホスフェートジオキセタンのホスフェート誘発の場合の発光の増大速度を予測するのに利用することができる。特に、ジオキセタン１よりも短いｔ1/2を示すヒドロキシジオキセタン類は、対応するホスフェートジオキセタン類がより速くＩmaxに達することを示唆した。さらに、他のヒドロキシジオキセタン類（７〜９）を同じ条件の下で調べた。モノクロロ−ジオキセタン（９）だけがジオキセタン１よりも短い半減期を示した。
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実施例１７  化学発光における量子収量の比較
０．８８mM  Ｍｇ+2を含む、０．２M ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中エンハンサーＡ１mg/mL又は０．１mg/mLを含む配合物において、ジオキセタン２及び５の相対的な化学発光における量子収量を測定した。３．３６×１０-13moLのアルカリホスファターゼの添加により、各試薬の１００μLアリコートを完全に脱ホスホリル化した。発光が終わるまでの全発光量（相対光単位（ＲＬＵ））を積分した。また、０．８８mM  Ｍｇ+2を含む、０．７５M ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）を使用する、エンハンサーなしの配合物の５００μL部を用いて同様の比較を行った。ジオキセタン５はジオキセタン２よりも多量の光を発した。
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実施例１８  ハロアルコキシジオキセタン類のフッ化物誘発化学発光
精製ジオキセタン３及び６〜９それぞれの部分を、ＤＭＳＯ中の０．１M フッ化テトラブチルアンモニウムの溶液と別個に混合して、暗い部屋で目に見える青緑色の短い閃光を生じさせた。化学発光は数分間持続した。このようにして生じる発光はまた、シリカゲルＴＬＣプレート上に付着したジオキセタンによって起こすこともできた。
実施例１９  膜上のアルカリホスファターゼの化学発光の検出
ブロッティング膜表面上の酵素の化学発光の検出用の本発明の組成物の利点を以下の実施例で実証した。１．１fmoL〜１．１amoLを含有するアルカリホスファターゼ水溶液を同一のナイロン膜（Micron Separations Inc., Westboro, MA）に被着させた。膜を５分間空気乾燥させ、０．８８mMのＭｇＣｌ2及び０．３３mMのジオキセタン２又はジオキセタン５を含む、０．２M ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（pH９．６）中エンハンサーＡ１mg/mLを含有する試薬に短期間浸漬した。膜を透明なプラスチックシートの間に配置し、Ｘ線フィルム（Kodak X-OMAT AR, Rochester, NY）にさらした。図６に、２種の試薬の比較において、ジオキセタン５を使用して発生させた光が、より鮮明な画像及びより高い検出感度を与えたことを示した。これらの結果は、ジオキセタン５の性能の改善をウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、ＤＮＡフィンガープリント法及び他のブロッティングでの用途に予想した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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