(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブルクホルデリア・セパシアＪＣＭ２８００株又はＪＣＭ２８０１株を培地に培養し、同培地又は／及び前記微生物菌体から以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質、
（Ａ）配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２又は４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
を精製することを特徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項２】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２又は４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２又は４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項３記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１又は３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１又は３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース脱水素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項３又は４に記載のＤＮＡ若しくは請求項５記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物としてグルコース脱水素酵素を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項８】
配列番号１又は３の塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチドをプローブとして、微生物の染色体ＤＮＡのハイブリダイゼーションを行い、前記ポリヌクレオチドと相同性を有する配列の有無を検出することを特徴とする、グルコース脱水素酵素を保持する微生物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なグルコース脱水素酵素、同酵素をコードするＤＮＡ、同酵素をコードするＤＮＡを含有する組換えベクター、同組換えベクターで形質転換された形質転換体、及び前記形質転換体又は非形質転換微生物を用いたグルコース脱水素酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特定の基質に対して特異的に反応する酵素を用いたバイオセンサの開発は、産業の分野を問わず盛んに行われている。その中でも特にバイオセンサの１つであるグルコースセンサは、主に医療分野で測定方法やその方法を利用した装置の開発が盛んに行われている。例えばグルコースセンサは、1962年にＣｌａｒｋとＬｙｏｎｓによってグルコースオキシダーゼと酸素電極を組み合わせたバイオセンサーの報告（L.c.Clark,J.and Lyonas,C."Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery."Ann,n.y.Acad.Sci.105:20-45）が最初にされて以来、約40年ほどの歴史を有している。
【０００３】
このように、グルコースセンサに、酵素としてグルコースオキシダーゼが採用されてからの歴史は長い。なぜならグルコースオキシダーゼは、グルコースに対する基質特異性が高く、熱安定性に優れており、更に酵素の量産化が可能であり、生産コストが他の酵素と比べて安価である、からである。基質特異性が高いということは、酵素がグルコース以外の糖とは反応しないため、測定値に誤差を生じることなく、正確な測定が行なえるという利点に通じる。また、熱安定性に優れているということは、酵素が熱により変性し酵素活性が失活するという問題を防止することができ、長期間正確な測定が行えるという利点に通じる。
【０００４】
しかし、グルコースオキシダーゼは、上記の様なメリットを有している反面、例えば溶存酸素の影響を受け、測定結果に影響があるという問題も有している。
一方、グルコースオキシダーゼ以外には、グルコース脱水素酵素（以下、「グルコースデヒドロゲナーゼ」又は「GDH」ともいう）を利用したグルコースセンサの開発も行われてきた。そして、酵素も、微生物から発見されている。例えば、バチルス（Bacillus）属由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.47）及びクリプトコッカス（Cryptococcus）属由来グルコースデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.119）が知られている。
前者のグルコースデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.47）は、β−Ｄ−グルコース＋NAD(P)+ →Ｄ−δ−グルコノラクトン＋NAD(P)H＋H+の反応を触媒する酵素であり、後者のグルコースデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.119）は、Ｄ−グルコース＋NADP+ →Ｄ−δ−グルコノラクトン＋NADPH＋H+の反応を触媒する酵素であり、前述した微生物由来のグルコースデヒドロゲナーゼは、既に市販もされている。
これらグルコースデヒドロゲナーゼは、測定サンプルの溶存酸素の影響を受けないという利点を有する。このことは、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酸素量が多く要求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、測定結果に誤差を及ぼさずに正確に測定することができるという利点に通じる。
【０００５】
しかし、従来に見られるグルコースデヒドロゲナーゼは、溶存酸素の影響を受けない一方、熱安定性が悪く、基質特異性がグルコースオキシダーゼよりも劣るという問題点を有しており、センサに採用される酵素として、グルコースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼの両欠点を補う酵素の提供が望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、熱安定性に優れ、安価に生産でき、測定サンプルの溶存酸素の影響を受けないグルコースデヒドロゲナーゼが、ブルクホルデリア属の微生物（ブルクホルデリア・セパシア KS1株）によって生産されていることを見出している（特願２０００−３３２０８５号、特願２０００−３５７１０２号、特願２００１−２７８６８３２号、ＰＣＴ／ＪＰ０１／０９５５６）。
【０００７】
本発明は、ブルクホルデリア・セパシア KS1株以外のブルクホルデリア細菌に由来する新規なGDH及びそれをコードする遺伝子、並びにそれらの利用法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ブルクホルデリア・セパシア KS1株以外のブルクホルデリア細菌菌株から、GDHをコードする遺伝子を取得することに成功し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ブルクホルデリア・セパシアＪＣＭ２８００株又はＪＣＭ２８０１株を培地に培養し、同培地又は／及び前記微生物菌体から以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質、
（Ａ）配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２又は４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
を精製することを特徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。
（２）以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２又は４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（３）以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２又は４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（３）に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１又は３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１又は３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース脱水素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）（３）又は（４）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（６）（３）又は（４）に記載のＤＮＡ若しくは（５）の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（７）（６）に記載の形質転換体を培養して、前記ＤＮＡの発現産物としてグルコース脱水素酵素を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素の製造方法。
（８）配列番号１又は３の塩基配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチドをプローブとして、微生物の染色体ＤＮＡのハイブリダイゼーションを行い、前記ポリヌクレオチドと相同性を有する配列の有無を検出することを特徴とする、グルコース脱水素酵素を保持する微生物のスクリーニング方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、理化学研究所微生物系統保存施設（Japan Collection of Microorganisms, JCM）に保存されているブルクホルデリア・セパシアJCM2800株およびJCM2801株から、GDH遺伝子を検索し、単離した。これらの菌株は、同保存施設から入手することができる。
【００１１】
＜１＞本発明のグルコース脱水素酵素
本発明のGDHは、ブルクホルデリア・セパシアJCM2800株又はJCM2801株を培地に培養し、同培地又は／及び前記微生物菌体からGDHを採取することにより、製造することができる。前記培地としては、適当な栄養培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類、グルコース或はこれらを含む物質などを含む培地が挙げられる。
炭素源としては、資化できるものはいずれの物質も利用でき、例えば、Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビソース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、デンプン、各種ペプトン類などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、各種ペプトン類、各種肉エキス類、コーンスティープリカー、アミノ酸溶液、アンモニウム塩など有機、無機の窒素化合物又はこれらを含有した物質が利用できる。無機塩としては、各種リン酸塩、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムなどの塩類が使用される。また必要に応じて菌の生育或は酵素生産に必要な各種の無機物や有機物、例えばシリコーン油、ゴマ油、各種界面活性剤などの消泡剤やビタミン類を培地に添加することができる。
【００１２】
培養の形態は、液体培養でも固体培養でもよいが、通常は液体培養が好適である。
こうして得られた培養物の培地中又は／及び菌体中から本発明酵素を得ることが出来る。菌体中にある酵素は、菌体を破砕あるいは溶解することによって、菌体抽出液として得られる。
【００１３】
培養生成物中あるいは菌体抽出液中のGDHは、イオン交換体、ゲル濾過担体、ハイドロフォービック（疎水性）担体などを用いたクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって精製することができる。
【００１４】
本酵素の活性は、公知のGDHの活性測定と同様の方法で測定することができる。具体的には、例えば次のようにして測定することができる。594μMの１−メトキシフェナジンメトサルフェート(mPMS)および5.94μMの2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)を含む10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に、酵素試料および基質としてグルコースを基質として加え、37℃でインキュベートする。分光光度計を用いてDCIPの600nmにおける吸光度変化を追跡し、当該吸光度の減少速度を酵素反応速度とする。
【００１５】
尚、本発明者らは、ブルクホルデリア・セパシア KS1株が産生するGDHは、αサブユニット、βサブユニット、及びγサブユニットを含む多量体タンパク質であることを確認している。これらのサブユニットのうち、αサブユニットは単独でもGDH活性を示す。
【００１６】
ブルクホルデリア・セパシア KS1株が産生するGDHは、以下の理化学的性質を示す。
１．作用：グルコースの脱水素反応を触媒する。
２．還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａと分子量約43ｋＤaを示すサブユニットからなる。
３．ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株）製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、分子量約３８０ｋＤaを示す。
４．至適反応温度：４５℃付近 （Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
【００１７】
また、αサブユニット単独では、以下の理化学的性質を示す。
１’．グルコース脱水素酵素活性を有する。
２’．還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａを示す。
３’．至適反応温度：７５℃付近 （Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
【００１８】
後述するように、ブルクホルデリア・セパシアJCM2800株又はJCM2801株から、KS1株のGDHαサブユニットをコードする遺伝子と相同性の高い遺伝子が単離された。したがって、JCM2800株又はJCM2801株は、KS1株と類似した性質のGDHを産生すること、同GDHはKS1株の産生するGDHと同様に、多量体構造をとること、及び、αサブユニット単独でGDH活性を示すことが強く示唆される。
【００１９】
JCM2800株及びJCM2801株の産生するGDHαサブユニットは、各々配列番号２及び４に示すアミノ酸配列を有する。尚、これらのサブユニットは、GDH活性を有する限り、配列番号２又は４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、配列番号２及び４には、配列番号１及び３の塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を示してあるが、Ｎ末端のメチオニン残基は、翻訳後に脱落している可能性がある。本発明において「１又は複数」とは、１〜１０個、好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。
【００２０】
上記本発明のGDHαサブユニットは、例えば、後述する本発明のＤＮＡによってコードされる。
【００２１】
＜２＞本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、例えばブルクホルデリア・セパシアJCM2800株又はJCM2801株から取得することができる。本発明のＤＮＡは、本発明を完成する過程においては、ブルクホルデリア・セパシアJCM2800株又はJCM2801株の染色体ＤＮＡから単離された。本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号１及び３に示す塩基配列を有するプライマーを用い、ブルクホルデリア・セパシア、例えばJCM2800株又はJCM2801株の染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRによって、取得することができる。また、本発明によりその塩基配列及び同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が明らかとなったので、これらの配列に基づいて化学合成することによっても取得することができる。また。前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブ又はプライマーとするハイブリダイゼーション又はＰＣＲによって、ブルクホルデリア・セパシアJCM2800株又はJCM2801株の染色体ＤＮＡから取得することもできる。本発明のＤＮＡは、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものの他、配列番号２又は４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、GDH活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。
【００２２】
本発明のＤＮＡとしては、具体的には、配列番号１又は３の塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また本発明のＤＮＡは、配列番号１又は３の塩基配列又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、GDH活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ストリンジェントな条件としては、７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件、具体的には、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃が挙げられる。
【００２３】
本発明のＤＮＡ又は同ＤＮＡを含む組換えベクターを保持する形質転換体を培養して、同ＤＮＡの発現産物としてGDHを産生させ、これを菌体又は培養液から採取することにより、GDHを製造することができる。その際、本発明のＤＮＡは、αサブユニットをコードするＤＮＡであってもよいが、さらにγサブユニットをαサブユニットとともに発現させることによって、発現効率を高めることができる。γサブユニット及びαサブユニットを連続してコードするＤＮＡ断片は、配列番号７及び８に示す塩基配列を有するプライマーを用いたPCRによって、取得することができる。
【００２４】
GDHを産生させる微生物としては、大腸菌をはじめとする腸内細菌群、シュードモナス属やグルコノバクター属などのグラム陰性細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌をはじめとするグラム陽性細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌が挙げられるが、これらに限られず、異種タンパク質生産に適した宿主微生物であれば用いることができる。
【００２５】
一度選択されたGDH遺伝子を保有する組換えベクターより、微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、GDH遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やPCR法によりGDH遺伝子であるDNAを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる微生物の形質転換は、例えばエシェリヒア属細菌ではカルシウム処理によるコンピテントセル法、バチルス属細菌ではプロトプラスト法、酵母ではＫＵ法やＫＵＲ法、糸状菌ではマイクロマニュピレーション法等の方法によって行うことができる。また、エレクトロポーレーション法も広く用いることができる。
【００２６】
宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするDNAを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとGDH活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつGDHを生成する微生物を選択すればよい。
形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００２７】
培養温度は菌が生育し、GDHを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは20〜42℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、GDHが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は12〜72時間程度である。培地のpHは菌が発育し、GDHを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはpH6.0〜9.0程度の範囲である。
【００２８】
培養物中のGDHを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、GDHが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、GDH含有溶液と微生物菌体と分離した後に利用される。GDHが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、EDTA等のキレート剤及び界面活性剤を添加してGDHを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００２９】
上記のようにして得られたGDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって精製を行うことにより、精製されたGDHを得ることができる。
【００３０】
カラムクロマイトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（SDS-PAGE）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましいが、γサブユニットが含まれていても良い。
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。
また、後記実施例に示すαサブユニットのアミノ酸配列と同様にしてβサブユニットのアミノ酸配列を決定し、βサブユニットをコードするＤＮＡを単離することができる。また、得られたＤＮＡを用いて、βサブユニットを製造することができる。さらに、αサブユニットをコードするＤＮＡ及びβサブユニットをコードするＤＮＡを用いて、多量体酵素を製造することもできる。
【００３１】
本発明のGDH又はそれを保持する形質転換体又は非形質転換微生物（ブルクホルデリア・セパシアJCM2800株又はJCM2801株）は、グルコースセンサの酵素電極として用いることができる。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のGDHを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のグルコース脱水素酵素をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００３２】
グルコースの濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の酵素を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコースの濃度を計算することができる。
【００３３】
また、本発明のGDHは、グルコース等の糖類アッセイキットの構成要素とすることができる。典型的には、キットは、本発明のGDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作成のためのグルコースなどの標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う酵素は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【００３５】
【参考例１】
ブルクホルデリア・セパシアKS1株を、培養液１Ｌ中に以下の成分を含む培地７Lで、３４℃、８時間、培養した。
【００３６】
ポリペプトン              １０ｇ
酵母抽出液                  １ｇ
NaCl                        ５ｇ
KH2PO4                      ２ｇ
グルコース                  ５ｇ
Einol（ABLE Co.東京  日本） ０．１４ｇ
Ｔｏｔａｌ、蒸留水          １Ｌ
ｐＨ調製                    ７．２
【００３７】
本培養液７Lを４℃、１０分間、９，０００×ｇで遠心分離し、約６０ｇの菌体を得た。
６０ｇの菌体を１０mＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．０）に分散し、フレンチプレス（大竹製作所  東京  日本）で１，５００Kg/cm2の圧力差を加えて、菌体膜を破壊した。細胞抽出液を８，０００×ｇで１０分間、遠心分離し、細胞固形物を除いた。さらに、その上清を、４℃で６９，８００×ｇで９０分間、超遠心し、沈殿物としての膜フラクション、約８ｇを得た。
【００３８】
膜フラクションを、最終濃度でTriton−X１００が１％になるように、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で再分散した。そして、４℃、一晩、ゆっくり攪拌した。超遠心後（４℃、６９，８００ｇ、９０分間）、可溶化膜フラクションを、４℃で、１５０００×ｇで１５分間、再遠心し、上清を得た。
【００３９】
その可溶化膜フラクションに、同量の０．２％Triton−X１００を含む１０mＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。透析後、その溶液を、０．２％Triton−X１００を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で等量化されたＤＥＡＥ-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラム（22mmＩＤ×20ｃｍ  東ソー  東京日本）に供給した。タンパク質を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中のNaClの濃度が０〜0.15Mになるように、直線的グラジエントで溶出した。その流速は5ml／ｍｉｎで行った。GDHは約７５mMのNaCl濃度で溶出された。GDH活性をもつフラクションを集め、０．２％Triton−X１００を含む１０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐH８．０  ４℃）で一夜、透析した。
【００４０】
さらに透析調製酵素液を、DEAE-５PWカラム（８．０mmＩＤ×７．５cm  東ソー、東京、日本）に通した。そのカラムは予め、０．２％Triton−X１００を含む１０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化されている。タンパク質を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中のNaClの濃度が０〜１００ｍMになるように、直線的グラジエントで溶出した。その流速は１ml／ｍｉｎで行った。GDH活性のあるフラクションが約２０mMのNaCl濃度で溶出した。GDH活性をもつフラクションを集め、０．２％ Triton−X100を含む１０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で、一夜、脱塩し、精製酵素を得た。
GDHの活性測定は、以下の方法に従い行った。
電子受容体として、2,6−ジクロルフェノルインドフェノル（ＤＣＩＰ）及びフェナンジメトサルフェート（ＰＭＳ）を用いた。反応はポリエチレンチューブ内で所定の温度で実施した。0.75mMＰＭＳと0.75mMＤＣＩＰ含有25mMトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ8.0  20μlに酵素溶液5μlを添加した。この混合液を１分間事前定温放置した。2Ｍグルコース1μl（最終濃度：77mM）の添加により反応を開始させ、２分間定温放置した。次に氷冷蒸留水100μlまたは7.5M尿素120μlを添加して試料を冷却した。超微量計測用セル（100μl）及びこれを用いて計測できる分光光度計（ＵＶ160、島津製作所、京都、日本）を用いて、グルコースの脱水素化に基づく、電子受容体の還元反応を追跡した。すなわちＤＣＩＰ還元にもとづく退色を、ＤＣＩＰの吸収波長である600ｎｍを時間とともに計測した。ＤＣＩＰのモル吸光係数（22.23mM×cmー1）を用いた。酵素１単位（U）は標準検定条件下で１分ごとに１μＭグルコースを酸化する量と定義した。タンパク濃度はローリー法で測定した。
【００４１】
上記精製酵素について、酵素学的性質を調べた結果を以下に示す。
１．作用：グルコースの脱水素反応を触媒する。
２．還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａと分子量約43ｋＤaを示すサブユニットからなる。
３．ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー（株）製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、分子量約３８０ｋＤaを示す。
４．至適反応温度：４５℃付近（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。尚、７５℃付近にも活性ピークを有する。
【００４２】
また、上記生成酵素を70℃で30分間、熱処理することによって、分子量６０ｋＤａの単一ポリペプチド（αサブユニット）が得られる。このポリペプチドについて、酵素学的性質を調べた結果を以下に示す。
１’．グルコース脱水素酵素活性を有する。
２’．還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分子量約６０ｋＤａを示す。
３’．至適反応温度：７５℃付近 （Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）。
【００４３】
【実施例１】
ブルクホルデリア・セパシア JCM2800株又はJCM2801株からのGDH遺伝子の単離
（１）ブルクホルデリア・セパシアJCM2800株及びJCM2801株からの染色体ＤＮＡの調製
ブルクホルデリア・セパシアJCM2800株及びJCM2801株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、これらの菌株をTL液体倍地（ポリペプトン １０g、酵母抽出液 １g、NaCl ５g、KH2PO4  ２g、グルコース ５g；１L、pH 7.2）を用いて、34℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離機により回収した。これらの菌体を10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5% SDS、100μg/mlのプロテイナーゼKを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収した。これに終濃度0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体DNAを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、70%エタノールで洗浄した後、適当量のTEバッファーに溶解させ、染色体DNA溶液とした。
【００４４】
（２）PCRによるGDH遺伝子の増幅
ブルクホルデリア・セパシアKS1株のGDHを構成するαサブユニットの遺伝子の塩基配列に基づいて、コード領域の前後２０塩基からなる以下の塩基配列を有する１組のヌクレオチドプライマーを用いて、（１）で得た染色体ＤＮＡを鋳型とするPCR反応により増幅を行った。
【００４５】
（フォワード）
5'-ATGGCCGATACCGATACGCA-3'（配列番号５）
（リバース)
5'-TCAGACTTCCTTCTTCAGCG-3'（配列番号６）
【００４６】
PCR反応により増幅された塩基配列を常法により解析したところ、ブルクホルデリア・セパシアJCM2800株由来の増幅断片は、配列番号１に示される塩基配列を有し、ブルクホルデリア・セパシアJCM2801株由来の増幅断片から、配列番号３に示される塩基配列を有することが、それぞれ確認された。
【００４７】
配列番号１及び３の塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を、配列番号２及び４に示す。
【００４８】
ブルクホルデリア・セパシアKS1株、JCM2800株、JCM2801株のGDHを構成するαサブユニットの相同性を比較したところ、表１に示す結果が得られた。
【００４９】
【表１】
0004036667.tif 000002
【００５０】
この結果から、ブルクホルデリア属が生産するGDHと類似の酵素をスクリーニングする際に、配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列のうち、任意の長さでポリヌクレオチドプローブを作製し、これを用いて染色体DNAをスクリーニングすることが可能であることが判明した。
【００５１】
（３）GDHの製造
ブルクホルデリア・セパシアKS1株の生産するGDHは、GDH活性を示すαサブユニットのコード領域の上流に、αサブユニットの生産に関係するγサブユニットの存在が明らかになったことから（ＰＣＴ／ＪＰ０１／０９５５６)、γサブユニットの塩基配列を上流域に持ち、JCM2800株またはJCM2801株のαサブユニットの構造遺伝子が連続するポリシストロン構造の遺伝子を含む組換えベクターを作製し、同ベクターを導入した形質転換体を構築した。
【００５２】
先ずベクターに挿入する遺伝子を以下のように調製した。
γサブユニットの構造遺伝子と、JCM2800株またはJCM2801株のGDHの構造遺伝子が連続するゲノム断片を、JCM2800株またはJCM2801株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、所望の制限酵素部位を含むように、PCR反応により増幅した。PCR反応には次の１組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
【００５３】
（フォワード）
5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACACT-3'（配列番号７）
（リバース）
5'-CCCAAGCTTCAGACTTCCTTCTTCAGCG-3'（配列番号８）
【００５４】
このPCRにより増幅された遺伝子の5'末端をNcoI、3'末端をHindIIIで消化した後、ベクターpTrc99A（Pharmacia社）のクローニング部位である、NcoI/HindIII部位に挿入した。得られたプラスミドをpTrc99A/γ+ JCM2800またはpTrc99A/γ+ JCM2801と命名した。
【００５５】
前記プラスミドにより、エシェリヒア・コリＤＨ５αＭＣＲ株を形質転換し、アンピシリン５０μg/mlを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーを採取し、それを更に前述した方法により培養を行って、培養生成物のGDH活性を測定したところ、GDH活性が確認することができた。
【００５６】
【発明の効果】
本発明により、ブルクホルデリア・セパシアJCM2800株またはJCM2801株から、GDH及びそれをコードするＤＮＡが提供される。同ＤＮＡを導入した組換え体を用いて、GDHを工業的に量産することが可能となった。
【００５７】
【配列表】
0004036667.tif 000003
0004036667.tif 000004
【００５８】
0004036667.tif 000005
0004036667.tif 000006
0004036667.tif 000007
0004036667.tif 000008
【００５９】
0004036667.tif 000009
0004036667.tif 000010
0004036667.tif 000011
【００６０】
0004036667.tif 000012
0004036667.tif 000013
0004036667.tif 000014
0004036667.tif 000015
【００６１】
0004036667.tif 000016
0004036667.tif 000017
0004036667.tif 000018
【００６２】
0004036667.tif 000019
【００６３】
0004036667.tif 000020
【００６４】
0004036667.tif 000021
【００６５】
0004036667.tif 000022