(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量平均分子量が１０００〜２０万であるアルデヒド化α−グルカンの水溶液からなる第１液と、重量平均分子量が１０００〜２万であるポリ-L-リジンの水溶液からなる第２液とよりなり、
前記アルデヒド化α−グルカンは、デキストランまたはデキストリンを過ヨウ素酸または過ヨウ素酸塩で酸化して、無水グルコース・ユニットあたり０．１〜１．０個のアルデヒド基を導入したものであり、
前記の第１反応剤及び第２反応剤を混合した際には、ｐＨが５．０〜８．０となることを特徴とする医療用２反応剤型接着剤。
【請求項２】
前記ポリ-L-リジンが、微生物または酵素を用いて生産されたε-ポリ-L-リジンであることを特徴とする請求項１に記載の医療用２液反応型接着剤。
【請求項３】
前記の第１液及び第２液を混合した状態におけるアルデヒド基／アミノ基のモル比が０．２〜２．０であることを特徴とする請求項１または２に記載の医療用２液反応型接着剤。
【請求項４】
前記第２液には、クエン酸、コハク酸、グルタル酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、またはその他の多価のカルボン酸化合物、または、これらの少なくとも一つに対応する無水酸化合物が、１〜１０重量％添加されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の医療用２液反応型接着剤。
【請求項５】
前記アルデヒド化α−グルカンは、重量平均分子量が２０００〜１０万のデキストラン、またはデキストリンを酸化して、無水グルコース・ユニットあたり０．２〜０．９個のアルデヒド基を導入したものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の医療用２液反応型接着剤。
【請求項６】
前記の第１液及び第２液について、１０〜５０ＫＧｙの電子線を照射して滅菌したことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の医療用２液反応型接着剤。
【請求項７】
重量平均分子量が１０００〜２０万であるアルデヒド化α−グルカンの水溶液からなる第１液と、重量平均分子量が１０００〜２万のポリ-L-リジンよりなる第２液とを混合して得られる含水ゲル状の医療用樹脂であって、
前記アルデヒド化α−グルカンは、デキストランまたはデキストリンを過ヨウ素酸または過ヨウ素酸塩で酸化して、無水グルコース・ユニットあたり０．１〜１．０個のアルデヒド基を導入したものであり、
アルデヒド基／アミノ基の反応モル比が０．２〜２．０であり、
含水状態で保存されたならば、１日〜１カ月の間で任意に設定可能なゲル状態保持期間を経た後には、自己分解によってゾル状態に変化することを特徴とする自己分解性の医療用樹脂。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外科手術時その他における生体組織の接着、充填、及び癒着防止、及び止血などに用いられる医療用接着剤、並びに医療用樹脂に関する。特には、第１液と第２液とを混合することで反応して硬化し、一定期間経過後に、分解・流動化するものに関する。
【背景技術】
【０００２】
医療用、特には外科手術用の接着剤として、（１）シアノアクリレート系接着剤、及び（２）フィブリン糊（フィブリン・グルー）が主に使用されてきた。【０００３】
（１）シアノアクリレート系接着剤
元来、金属、プラスチック、ゴム、木材、セラミックスなどを瞬間的に接着する目的で工業用または家庭用に使用されてきた接着剤であるが、医療用としても1968年までに約10種類が開発されている。この種の接着剤では、シアノアクリレートモノマーが微量の水分を重合開始剤として重合・固化することを利用しており、重合・固化が速やかで、生体組織との接着力が高い。しかし、固化物が柔軟性に乏しく硬いために創傷治癒を妨げる場合があり、また、生体内で分解しにくいために被包化されて異物となりやすい。さらに、分解の過程でホルムアルデヒドが生成するため、細胞毒性や組織傷害性を示すとの報告もある。【０００４】
（２）フィブリン糊
フィブリノーゲンがトロンビンの働きによって不溶性のフィブリン塊を形成するという生体内での血液凝固機構を利用した接着剤である。フィブリン糊は、生体への適合性や利便性が高く、外科手術後の縫合部などからの出血を防止し、組織の接着・閉鎖を高める目的で汎用されている。しかし、この接着剤は接着力がかなり低いため、生成したフィブリン塊が組織から剥がれる場合がある。さらに、血液製剤であるためウイルス感染が懸念される。【０００５】
一方、近年、下記（３）〜（６）のような外科用の2液反応型接着剤が提案されている。【０００６】
（３）アルデヒド化デキストラン−高分子量キトサン（特許文献１）
アルデヒド化デキストランの１５重量％水溶液を第1液とし、高分子量キトサン（protasanTM UPCL213, FMC Biopolymers）の2重量％または4重量%の水溶液を第2液とする外科用の2液反応型接着剤が提案されている。ここでは、アルデヒド基／アミノ基のモル比は、少なくとも3であるとしており（唯一の独立クレーム１）、Table 2及びTable 1のデータによると、アルデヒド基／アミノ基のモル比を６以上（Table 2及び1からの計算値）とすることで、150秒以内での硬化を実現している。また、Table 3等によると、せん断接着力も充分な値であったとしており、Table 8によると、平均分子量が40万以上の高分子量のデキストランを用いた場合に、より優れた接着力が得られることを示している。【０００７】
さらには、明細書本文の最後のセクション（4. Stoppage of Liver Bleeding）の記載によると、アルデヒド基／アミノ基のモル比を約13.6とし（Table 3の"DA6"）、混合液比を１／１とした2液反応型接着剤が、ラット肝臓の止血剤として有効であったとしている。この接着剤の硬化時間は、Table 2によると約15秒である。【０００８】
また、Table 6及び7、及びその関連説明によると、キトサン水溶液に代えて、ポリ・ビニルアルコール・ビニルアミングラフト共重合体(PVALNH2)の20重量%水溶液を用いた場合にも、充分な接着力が得られたとしている。但し、用いた共重合体の分子量や組成は不明である。また、硬化時間も不明である。【０００９】
（４）ミセル形成性の末端アルデヒドポリマー−高分子量のポリアリルアミン（特許文献２）
末端アルデヒド基−（分子量5500のポリエチレングリコール鎖セグメント）−（分子量4000のポリ乳酸セグメント）、という構造をもつポリマーのミセル水溶液（pH 5.0）を第1液とし、高分子量（６万以上）のポリアリルアミンの水溶液を第2液とする、2液反応型の「動物組織用の接着剤」が開示されている。【００１０】
第2液として、ポリアリルアミン水溶液に代えて、ポリ-L-リジンの水溶液（表−３、及び、表−５のRUN13-14, 16）やキトサン水溶液（表−４）を使用可能であることが示されている。また、第1液として、酸化デンプンや酸化セルロースが使用可能であるとの言及がある（段落番号0031）。ところが、ポリ-L-リジンは、分子量3万の比較的分子量の低いものは採用できず、分子量70万といった高分子量のものを使用する必要があることが示されている（表−５のRUN13-14, 16）。また、第2液としてのポリ-L-リジン水溶液のpHを9.0以上とすべきことが示されている（表−３、及び、表−５のRUN12-16）。【００１１】
（５）アルデヒド化デンプン−コラーゲン（特許文献３）
アルデヒド化可溶性デンプン溶液の５％水溶液0.5mlを第1液とし、コラーゲンの１５％水溶液2mlを第2液としている（実施例３の第１文）。ここで、可溶性デンプンの分子量は、「１〜２０万ダルトンの範囲で可変」としている（実施例１）。コラーゲンの分子量の言及はないが、一般の場合と同様の約30万であると考えられる。この接着剤は、生体組織接着剤として使用可能で、癒着防止効果を有していたとされている（実施例３〜実施例６）。【００１２】
（６）ゼラチン−スクシンイミド化ポリ-L-グルタミン酸（特許文献４）
コラーゲンを熱変性させて得られるゼラチンを含む水溶液を第1液とし、スクシンイミド化ポリ-L-グルタミン酸を含む水溶液を第2液とする医療用接着剤が開示されている。【００１３】
他方、上記のような2液反応型のものの他、下記（７）〜（８）のような医療用接着剤も提案されている。【００１４】
（７）ゼラチン−ジカルボン酸無水物
ゼラチンとジカルボン酸無水物とを反応させることで、ゼラチンのアミノ基をカルボキシル基に変換させる接着剤が開示されている（特許文献５参照）。しかし、これらゼラチン系の医療用接着剤は、牛の「危険部位」由来であるためBSE等を発生させる恐れがあり、医療の現場から敬遠されている。【００１５】
（８）ウレタンプレポリマー
例えば、ポリオールとポリイソシアネートとの付加体からなる接着剤が開示されている（特許文献６参照）。しかし、この接着剤は、粘性が高いために取り扱いにくい、血液や体液が多い部位では接着しにくい等の欠点がある。
【特許文献１】WO 2003/035122 (AESCULAP AG & CO KG (DE), US2005/0002893 A-1 及びEP1438079 B1に対応)
【特許文献２】日本特開2005-21454「高分子ミセルを有効成分とする組織接着剤」西田 博、横山 昌幸
【特許文献３】WO98/15299（「マクロモレキュラ−ポリアルデヒドベ−スの接着剤組成物及びコラ−ゲンの架橋方法」、日本特許323871に対応）
【特許文献４】日本特開平9(1997)-103479「医用材料及びその製造法」
【特許文献５】日本特開平11(1999)-239610「生体組織接着性医用材料及びその製造法」
【特許文献６】日本特開2004-261590「医療用接着剤」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
フィブリン糊であると、硬化物の物性について、より柔軟にするといった適宜の変更や調整ができない他、生体内で分解する期間（一般に1〜3日）を引き延ばすこともできない。また、シアノアクリレート樹脂を用いた場合、生体内で完全に分解されて吸収されるのに要する期間は、かなり長く、1年以上を要するという報告もある。したがって、例えば１〜2週間で完全に分解されて吸収されるように設計することは、事実上不可能である。【００１７】
前述した、いずれの従来の医療用接着剤も、得られる硬化物は、生体内での分解ないし崩壊がある所定期間の経過後に速やかに進行するというものでなく、接着力等を維持する期間を充分にとると、不所望の樹脂層や樹脂成形物が、かなり長期にわたって残留するということがあり問題となっていた。また、疾病の種類や施術の種類によって、所望の保持期間ないし分解開始期間はそれぞれ異なるが、このような細かい要求に合わせて分解期間をコントロールするということは事実上不可能であった。【００１８】
設計崩壊時間を経過した後に速やかに崩壊する樹脂の設計を試みようとしても、生体内に用いられるものであることから高度の安全性が求められ、細胞毒性、組織傷害性あるいは発癌性などを有しないようにする必要があり、かなりの制約を受けることとなる。しかも、医療用接着剤に一般に求められる性質として、(1)生体という水分を含んだ被着体に対する高い接着性、(2)生体組織表面における常温常圧下での比較的速やかな固化反応性、及び、(3)創部が治癒するまでの間、皮膚、血管又は臓器などの被着体に密着しつつ、被着体の物理的な運動を阻害しない程度の柔軟性、などを満たす必要がある。【００１９】
本発明は、上記に鑑みなされたものであり、医療用接着剤に求められる一般的な性質を充分に満たしつつ、設計崩壊時間を経過した後に速やかに崩壊するとともに、該設計期間を比較的自由に調整・制御できる医療用接着剤及び医療用の含水ゲル状樹脂を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の医療用２液反応型接着剤は、重量平均分子量が１０００〜２０万であるアルデヒド化α−グルカンの水溶液からなる第１液と、アミノ基含有ユニットの連鎖よりなるアミノ基含有ポリマーの水溶液からなる第２液とよりなり、前記アミノ基含有ポリマーの重量平均分子量が１０００〜２万であって、前記の第１液及び第２液を混合した際には、ｐＨが５．０〜８．０となることを特徴とする。【００２１】
本発明の含水ゲル状の医療用樹脂は、重量平均分子量が１０００〜２０万であるアルデヒド化α−グルカンの水溶液からなる第１液と、アミノ基含有ユニットの連鎖よりなり重量平均分子量が１０００〜２万であるアミノ基含有ポリマーの水溶液からなる第２液とを混合して得られる含水ゲル状の医療用樹脂であって、アルデヒド基／アミノ基の反応モル比が０．２〜２．０であり、含水状態で保存されたならば、１日〜１カ月の間で任意に設定可能なゲル状態保持期間を経た後には、自己分解によってゾル状態に変化することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
設計崩壊時間を経過した後に速やかに崩壊するとともに、該設計期間を比較的自由に調整・制御できる。しかも、生体に対する毒性その他の悪影響がなく、生体組織等に対する接着力に優れ、固化後の含水ゲル状の樹脂層に柔軟性がある。また、固化反応に要する時間についても、所望の程度に、ある程度調整・制御することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
第１液をなすアルデヒド化α−グルカンは、α−グルカンを酸化してアルデヒド基を導入したものであって、重量平均分子量が１０００〜２０万の範囲内にあるものである。α−グルカンとは、グルコース同士が脱水縮合してα結合により結合した形の糖鎖であり、グルカンにおける糖残基（無水グルコース・ユニット）の分子量は162.14である。本発明で用いるα−グルカンには、デキストラン、デキストリン、及びプルランが含まれ、これらを混合して用いることもできる。でんぷんやアミロースも適度に分解すれば使用可能である。また、高分子量のプルラン製品も適度に分解して用いることができる。なお、アルデヒド基の導入は、一般的な過ヨウ素酸酸化法により行うことができ、無水グルコース・ユニットあたり、適当な自己分解性の付与等のためには、好ましくは０．１〜１．０個のアルデヒド基、より好ましくは０．２〜０．９個、さらに好ましくは０．３〜０．８個のアルデヒド基が導入される。第1液の保存安定性を高めるためには、アルデヒド化の程度が比較的低いのが良く、例えば、無水グルコース・ユニットあたり０．２〜０．４個のアルデヒド基が導入される。【００２４】
アルデヒド化α−グルカンの中でもアルデヒド化デキストラン及びアルデヒド化デキストリンが、接着剤性能の安定性などの理由で特に好ましい。アルデヒド化デキストランを得るのに用いるデキストランは、重量平均分子量が、好ましくは２０００〜２０万であり、より好ましくは２０００〜１０万である。例えば、Pharmacosmos A/Sにより市販されている、医療用グレードのDextran 40、Dextran 60、Dextran 70の他、T-DextranシリーズのDextran T10〜Dextran T2000を使用することができる。一方、アルデヒド化デキストリンを得るのに用いるデキストリンとしては、和光純薬により市販されているデキストリン等を用いることができる。デキストリンの重量平均分子量は、例えば１０００〜1万である。なお、アルデヒド化α−グルカンの最適分子量は、具体的な用途によって異なり、特定の分子量ないし分子量分布のものを選択することにより、自己分解により液化するまでの期間を、調整することができる。アルデヒド化α−グルカンの分子量が過度に大きい場合、自己分解による液化が過度に遅延してしまう。また、アルデヒド化α−グルカンの分子量が過度に小さい場合、ゲル化状態を維持する時間が短くなりすぎる。【００２５】
α−グルカンの重量平均分子量及び分子量分布は、一般的な水系のGPC（ゲル濾過クロマトグラフィー；正式にはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)）測定により、容易に求めることができる。具体的には、水溶性ポリマー架橋体(ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ ｇｅｌ  Ｇ３０００ＰＷ及びＧ５０００ＰＷ、ＴＳＫ  ｇｕａｒｄ  ｃｏｌｕｍｎ  ＰＷＨ）からなるGPC用カラムを４０℃に加温し、緩衝液（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４＋１０ｍＭＫ２ＨＰＯ４）を溶離液とする測定により求めることができる。【００２６】
第２液をなすアミノ基含有ポリマーは、アミノ基含有ユニットの連鎖よりなるもので、重量平均分子量が１０００〜２万、好ましくは１０００〜１万、より好ましくは１５００〜８０００である。また、好ましくは分子量３万以上の高分子量分画を実質上含まないものである。【００２７】
特に好ましいアミノ基含有ポリマーは、SDSゲル電気泳動により分子量を測定した場合に、実質上、１０００以上かつ３万未満の分子量分画のみから、より好ましくは１０００〜２．５万の分子量分画のみから、さらに好ましくは１０００〜２万の分子量分画のみからなる。ここで、「実質上」とは、重量分率が全体の５％以下である分子量分画ないし染色ドットパターンを無視するという意味とする。【００２８】
ポリリジンその他のアミノ含有ポリマーの分子量分布（重合度分布）及び平均分子量は、下記のいずれかの方法により、容易かつ高精度に求めることができる。【００２９】
（１）SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)
アトー(株)製の電気泳動装置及びデンシトグラフ（AE-6920V型）を用いて容易に測定することができる。このとき、標準タンパクマーカーを用いる。【００３０】
（２）イオン会合クロマトグラフィー：高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）のイオン会合クロマトグラフィー法によって逆相カラム（TSKgel ODS-80Ts）を用いて測定する。このとき、非水溶媒としてアセトニトリルを用いてグラジエントをかけながら測定する。【００３１】
（３）水系ＧＰＣ：ＧＰＣグレードの蒸留水にリン酸緩衝液及びアセトニトリルを添加した溶離液（5% Ammonium Biphosphate/ 3% Acetonitrile (pH = 4.0)）を用い、例えば上記水系ＧＰＣカラムを40℃に加温して測定を行うことができる。このとき、絶対分子量の測定のためには、低角度レーザー光散乱法との組み合わせ（GPC-LALLS）を用いることができる。【００３２】
第２液に用いるアミノ基含有ポリマーとしては、微生物または酵素を用いて生産された、分子量が１０００〜２万、特には１０００〜６０００のε-ポリ-L-リジンを、好ましいものとして挙げることであっても良い。しかし、α-ポリ-L-リジンであっても良い。また、適当な分子量及び分子量分布を有するならばキトサンオリゴマーないしは分解キトサンでも良い。場合によっては、ポリグリセリンまたはポリビニルアルコールに多数のアミノ基側鎖を導入したもの等であっても良い。【００３３】
ε-ポリ-L-リジンは、具体的には、例えば、次のようにして得られらるものを用いることができる。日本特許第3525190号または日本特許第3653766号に記載の菌株であるストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスを用いる。そして、グルコース５重量％、酵母エキス０．５重量％、硫酸アンモニウム１重量％、リン酸水素二カリウム０．０８重量％、リン酸二水素カリウム０．１３６重量％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５重量％、硫酸亜鉛・７水和物０．００４重量％、硫酸鉄・７水和物０．０３重量％、ｐＨ６．８に調整した培地にて培養し、得られた培養物からε−ポリリジンを分離・採取する。【００３４】
ポリリジンその他のアミノ基含有ポリマーの分子量が大きすぎるか、または、分子量の大きすぎる区画を過度に含むならば、自己分解により液化するまでの期間が過度に長くなる。【００３５】
所定の分子量範囲のアミノ基含有ポリマーは、部分的に、より高分子量または、より低分子量のアミノ基含有ポリマーでもって置き換えることが可能である。例えば、高分子量（例えば分子量２０万）のキトサンを、１０００〜２万の分子量分画のみからなるポリリジンに、等重量程度まで配合することができる。また、分子量が約５００〜１０００で多官能（水酸基の数が２〜８）のポリエチレングリコールに末端アミノ基を導入したアミノ化ポリエチレングリコール（PEG-NH2）を同様に配合することも可能である。この場合、ショ糖等を出発物質とした官能数の特に大きなものが、配合する上で好ましい。【００３６】
第２液には、pH調節剤としての酸または酸性塩等が添加される。このようにして、第１液と第2液とが混合された際には、pHが５．０〜８．０の範囲内の値、好ましくは５．５〜７．５の範囲内の値、より好ましくは６．５〜７．５の範囲内の値になるようにする。なお、第２液のpHは、好ましくは７．０〜９．０である。【００３７】
pH調節剤として、好ましくは、一価または多価のカルボン酸またはその無水物が添加される。このカルボン酸としては、天然に存在するカルボン酸である、酢酸、クエン酸、コハク酸、グルタル酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸などを好ましいものとして挙げることができる。このようなカルボン酸は、緩衝作用によりpH調節能が大きく、また、生体に無害である。しかし、pHが５．０〜８．０の適当な値となるならば、塩酸、硫酸などの無機酸または無機塩を用いることも可能であり、上記カルボン酸またはその無水物と併用することもできる。また、リン酸緩衝塩を用いることも可能である。【００３８】
pH調節剤としてのカルボン酸は、モノカルボン酸、ジカルボン酸、及びトリカルボン酸のいずれを選択するかによって、硬化後のゲル体が、含水条件下にて自己分解により液化するまでの期間を調整することができる。これは、多価カルボン酸を用いる場合に、ポリリジンその他のアミノ基含有ポリマーに擬似的な架橋を生成し、自己分解による液化を遅延させるためと考えられる。【００３９】
第１液及び第２液を混合した状態におけるアルデヒド基／アミノ基のモル比は、0.1以上3未満であり、好ましくは０．２〜２．０、より好ましくは０．５〜１．５である。アルデヒド基／アミノ基のモル比が1に近づくほど、残留するアルデヒド基またはアミノ基が少なくなり、毒性をさらに低下させる上で、有意義である。【００４０】
第１液におけるアルデヒド化α−グルカンの濃度は、通常5〜50重量％であり、好ましくは15〜25重量％である。一方、第2液におけるアミノ基含有ポリマーの濃度は、通常0.5〜60重量％であり、好ましくは5〜50重量％、より好ましくは5〜20重量％である。第1液または第2液の濃度が低すぎる硬化反応が不十分になるなどの問題があり、高すぎると接着剤液の粘度が高くなるため取り扱いにくくなる。【００４１】
第１液及び第２液は、放射線滅菌により容易に滅菌を行うことができ、好ましくは１０〜５０ＫＧｙの電子線、さらに好ましくは２０〜３０ＫＧｙの電子線を照射して滅菌を行う。このような滅菌処理は、硬化時間その他の接着剤の性能には、全く悪影響を及ぼさないように条件を設定して行うことができる。【００４２】
本発明の2液反応型接着剤を使用する際、第1液と第2液との混合及び塗布は種々の方法により行うことができる。例えば、第1及び第2の接着剤原液の一方を被着体表面に塗布し、続けてもう一方を塗布することで混合を行うことができる。また、第1液と第2液とが塗布装置の混合室中で混合された後に、ノズルから噴出してスプレー塗布を行うのであっても良く、また、アプリケーターのスリットから送り出されて塗布を行うのであっても良い。場合によっては、接着剤としての利用の他、ゲル状樹脂からなるシート等として、癒着防止などの目的で使用することも可能である。なお、第1液と第2液との混合比（体積比）は、通常0.5〜2.0、好ましくは約1.0（即ち、同量程度）に設定される。【００４３】
第1液と第2液とが混合されると、アルデヒド化α−グルカンのアルデヒド基と、アミノ基含有ポリマーのアミノ基との間でシッフ結合が形成され、これが架橋点となって網目構造を有するハイドロゲルが形成される。その結果、硬化が、混合から2〜150秒、好ましくは3〜100秒、より好ましくは5〜50秒の間に生じる。混合から硬化までの好ましい時間は、用途によって多少異なり、生体組織内にまで浸透して高度の接着力を発揮するためには、硬化時間が10秒以上、特には15秒以上であるのが好ましい。【００４４】
このような硬化反応により生成する含水ゲル状の硬化接着剤層、または含水ゲル状の樹脂は、設計液化期間を経たならば、自己分解によって液体状態に変化する。すなわち、生体内での酵素分解等を経ずとも、含水状態にあるならば、自然に分解を生じ液体状態（流動可能なゾル状態）に変換される。したがって、生体内にあっては、ある所定の期間を経過時に、速やかに吸収あるいは排泄されて消滅されるようにすることができる。設計分解期間は、数時間〜4カ月、通常は1日〜1カ月の範囲、特には2日〜2週間の範囲内で任意に設定される。【００４５】
これに対して、生体内で酵素分解のみによって分解吸収される既存の生体分解樹脂の場合には、分解期間にばらつきが大きく、必要な接着力保持期間を経た後に速やかに分解されるようにするのは困難であったのである。【００４６】
自己分解による分解期間は、アルデヒド化α−グルカン及び／またはアミノ基含有ポリマーの分子量ないしその分布の選択ないしは調整、多価カルボン酸の使用・不使用もしくは選択、及び、２液混合時のpHの調整などによって、任意に調整し、設定することができる。すなわち、分解され吸収される期間を、2液接着剤の構成の調整により、任意に設計しておくことができる。【００４７】
自己分解の機構は、明らかでないが、アルデヒド化α−グルカンのアルデヒド基が、アミノ基と結合してシッフ塩基を形成した場合、シッフ塩基に隣接するα−グルコシド結合が分解を受けやすくなったものと考えている。【００４８】
シッフ塩基生成反応を利用した接着剤が従来より用いられていたにも関わらず、自己分解性の接着剤が開発されなかった理由は、アルデヒド基含有ポリマー及びアミノ基含有ポリマーとして、高分子量のものが用いられ、特には、アミノ基含有ポリマーとして、必ず、数万以上の分子量のものが用いられていたためと考えられる。アミノ基含有ポリマーには分解が生じないため、アミノ基含有ポリマーに分子量の大きいものを用いた場合、アルデヒド化α−グルカンに分解が生じても、硬化物の崩壊は生じない。また、一方では、アミノ基含有ポリマーの分子量がたとえ比較的小さいものであっても、アルデヒド化α−グルカンの分子量が大きいと、1カ月以内に硬化物の自己崩壊が生じることもない。【００４９】
従来は、上記特許文献１〜３の記述に見られるように、高分子量のアルデヒド基含有ポリマーとして高分子量のものを用いることが、接着剤樹脂の性能上必要であるとの先入観が支配していたと考えられる。【００５０】
本発明の医療用接着剤及び医療用樹脂は、生体接着剤、組織充填剤、止血剤、血管塞栓剤、動脈瘤の封止剤、癒着防止材、及びドラッグデリバリーシステム（DDS）用担体として、好適に適用されうる。
【実施例】
【００５１】
１．過ヨウ素酸ナトリウムによるアルデヒド導入量の制御
重量平均分子量２０００００のデキストラン(和光純薬工業株式会社、Lot No.EWN0778)５ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解させた。次に、種々量の過ヨウ素酸ナトリウム(分子量２１３．８９)を添加し、４０℃で５時間撹拌しながら反応させた。そして、反応後の溶液を蒸留水で２４時間透析(分画分子量１４０００の透析膜使用)した後、凍結乾燥した。これにより、アルデヒド化デキストランが得られた。【００５２】
得られた各アルデヒド化デキストランについて、導入されたアルデヒド基の量を測定した。そして、デキストランの糖残基量（モル）に対する過ヨウ素酸ナトリウムの添加量（モル）とアルデヒド基の導入量（モル）との関係を求めた。結果を図１に示す。【００５３】
尚、アルデヒド基の導入量の測定は、酸化還元滴定法によって行った。具体的には、０．０５ｍｏｌ／ｌのヨウ素水溶液２０ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌのアルデヒド化デキストラン水溶液１０ｍｌ及び１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液２０ｍｌを、１００ｍｌマイヤーフラスコに入れ、２５℃で１５分間攪拌した。そして、６ｖ／ｖ％硫酸水溶液１５ｍｌを添加し、０．１ｍｏｌ／ｌのチオ硫酸ナトリウム水溶液にて滴定した。終点は反応系が無色透明化した時点とし、指示薬はでんぷん水溶液とした。【００５４】
図１に示すように、アルデヒド基の導入量は過ヨウ素酸ナトリウムの添加量に対して直線的に増加した。また、糖残基量に対する過ヨウ素酸ナトリウム量が０．０５〜１．０の場合には、アルデヒド基量は０．１〜２であった。よって、糖残基と等量の過ヨウ素酸ナトリウムを添加した場合には、糖残基当たり２ヶのアルデヒド基が導入されることとなり、効率的に酸化反応が進行することが分かった。【００５５】
２．硬化（固化）時間の測定
重量平均分子量４００００のデキストラン(和光純薬工業株式会社、Lot No.EWR5671、)２０ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解させた。次に、１０ｇまたは５ｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、５０℃で３時間撹拌しながら反応させた。そして、反応後の溶液を蒸留水で２４時間透析(分画分子量１４０００の透析膜使用)した後、凍結乾燥することで、アルデヒド化デキストランを得た。さらに、各アルデヒド化デキストランを蒸留水に溶解することにより、２０重量％水溶液を調製し、これらを２液反応型接着剤の第１液とした。【００５６】
次いで、2５重量％の≡-ポリリジン水溶液(分子量4000、チッソ株式会社、Lot No.2050506、フリーアミン)に酢酸１ｍｌ及び蒸留水１．５ｍｌを添加することにより、２０重量％の中性ポリリジン水溶液を調製した。また、両末端に１ヶずつのアミノ基を有する重量平均分子量３０００のポリエチレングリコールアミン(２官能ＰＥＧ−ＮＨ2、フリーアミン)を蒸留水に溶解することにより、３０及び５０重量％の水溶液(フリーアミン)を調製した。さらに、４分岐端にアミノ基を有する重量平均分子量５０００のポリエチレングリコールアミン(４官能ＰＥＧ−ＮＨ2、フリーアミン)を蒸留水に溶解することにより、５０重量％の水溶液を調製した。そして、これらのアミノ化合物水溶液をそれぞれ、２液反応型接着剤の第２液とした。【００５７】
続いて、２液反応型接着剤の第１液０．５ｍｌを直径１６ｍｍのガラス製試験管に採取し、直径４ｍｍ、長さ１０ｍｍの磁気攪拌子を入れて３７℃に加温し100rpmの速度で攪拌した。そして、予め３７℃に加温した第２液０．５ｍｌをマイクロピペットにて添加し、接着剤の硬化により攪拌子が停止するまでの時間をストップウォッチにて計測した。２液反応型接着剤の第１液における過ヨウ素酸ナトリウムの添加量が１０ｇである場合の結果を表１に、添加量が５ｇである場合の結果を表２に、それぞれ示す。表１及び２において２０重量％の中性ポリリジン水溶液との組み合わせのみが実施例の接着剤である（それぞれ実施例１及び実施例２）。第２液を、末端にアミノ基が導入されたポリエチレングリコールの溶液とする場合、ゲル状接着層の強度などが不充分であった他、１日から1〜２カ月での自己分解性を達成することができなかった。
【表１】
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【表２】
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【００５８】
表１及び表２に示すように、アミノ化合物が２官能ＰＥＧ−ＮＨ2である接着剤に比べて、これよりもアミノ基数の多い４官能ＰＥＧ−ＮＨ2の接着剤では、ゲル化時間が短かった。さらに、１残基あたり１ヶのアミノ基を有するポリリジンでは、ゲル化時間がより短かった。また、アミノ化合物の濃度が高い方が速く硬化した。さらに、過ヨウ素酸ナトリウムの添加量が１０ｇの接着剤では、５ｇの接着剤と比べてゲル化時間が半分程度になる傾向が見られた。これらの結果より、アルデヒド基の数、及びアミノ化合物の種類や濃度を変えることによって、硬化時間を制御できることが分かった。【００５９】
３．細胞毒性試験
分子量75000のデキストラン(和光純薬工業株式会社、Lot No.EWK3037)20gに5gの過ヨウ素酸ナトリウムを反応させて、セクション2の方法に従ってアルデヒド化デキストランを得た。この後、20重量％の水溶液を調製し、第1液とした。【００６０】
次いで、セクション2で用いた2５重量％のポリリジン水溶液１０ｍｌに無水こはく酸0.5ml及び蒸留水14.5ｍｌを添加することにより、1０重量％の中性ポリリジン水溶液を調製し、第2液とした（参考例３）。一方、３０重量％のホルムアルデヒド水溶液及び２５重量％のグルタルアルデヒド水溶液約０．５ｇを精秤し、それぞれ２５ｍｌ水溶液を調製した。得られた各々の水溶液を用いて、以下に示す方法に従って細胞毒性試験を実施した。【００６１】
細胞毒性試験は、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，２９，８２９−８３５（１９９５）に記された方法に従って、マウス樹立細胞株Ｌ９２９を用いて行った。具体的には、まず、１００0０ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した細胞懸濁液を０．１ｍｌずつ９６ウェル培養プレートに播種し、３７℃で３日間培養した。次に、上記の各種水溶液を培地で種々の濃度に希釈し、それらを０．１ｍｌずつ添加して、さらに２日間培養を続けた。続いて、１５０μg／ｍｌに調製したニュートラルレッドの培地溶液を０．１ｍｌずつ添加し、３７℃で３時間培養した。培養後、培地を除いて、１重量％グルタルアルデヒド水溶液で細を固定し、風乾した。次いで、１重量％酢酸を含む水／エタノール溶液（同体積混合物）を０．１ｍｌずつ添加し、生存細胞に取り込まれたニュートラルレッド分子を抽出した。そして、５４１ｎｍにおける吸光度を測定し、その測定値に基づいてＮＲ５０値を求めた。ＮＲ５０値は、細胞を５０％死滅させるのに必要な溶液濃度であり、この値が低いほど毒性が強いことを示す。【００６２】
表３に各種化合物のNR50値をまとめる。
【表３】
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【００６３】
表に示すように、アルデヒド化デキストランのＮＲ５０値は、>6000μｇ／ｍｌであり、その値はホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドと比較して、それぞれ1/3500、１／1500以下であり、同じアルデヒド化合物であるにもかかわらず、毒性は極めて軽微であることが分かった。一方、ポリリジンの毒性も極めて低く接着剤の各成分は安全性が極めて高いものと考えられる。【００６４】
４．ゴム手袋を用いた硬化物の柔軟性評価
セクション２で得られた２０重量％のアルデヒド化デキストラン水溶液（２０ｇのデキストランに対して１０ｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加）及び２０重量％の中性ポリリジン水溶液を、それぞれ第１及び第２液とした。すなわち、実施例１の２液接着剤を採用した。そして、これらの接着剤原液を専用ミキシングデバイスを用いて実験用ゴム手袋に約０．５ｍｌ(0.25+0.25ml)塗布し、薄く伸ばした。約１分間放置して硬化させた後、エアポンプを用いて手袋内に空気を入れ、硬化物を拡張させた。図２に、拡張前（ａ）及び拡張後（ｂ）の接着剤硬化物の状態を示す。図において、着色(青色1号、和光純薬株式会社、Lot No.KLN3789)されているものが接着剤硬化物ゲルである。【００６５】
図に示すように、空気の注入によって接着剤硬化物は直径で約３倍に拡張されたが、亀裂や破壊は認められなかった。この結果から、本実施例（実施例１）の接着剤は硬化後においても非常に柔軟であることが分かった。なお、写真やデータは省略するが、デキストランの分子量を４００００とした場合や、２０ｇのデキストランに対する過ヨウ素酸ナトリウムの添加量を３ｇまたは５ｇ等とした場合、またデキストリンを用いた場合にも、同様に柔軟で靭性のあるゲル状樹脂層が得られた。【００６６】
５．ウサギ皮膚を用いた接着力の評価
セクション4で得られた２０重量％のアルデヒド化デキストラン水溶液を第１液とした。また、セクション２で得られた２０重量％の中性ポリリジン水溶液、３０重量％及び５０重量％の２官能ＰＥＧ−ＮＨ2水溶液、並びに５０重量％の４官能ＰＥＧ−ＮＨ2水溶液を、第２液とした。第２液に２０重量％の中性ポリリジン水溶液を用いたものだけが実施例（実施例１）の接着剤である。【００６７】
脱脂した家兎背部皮膚（１×６ｃｍ）を用意し、その表面に２液接着剤の第１液及び第２液を約１０μlずつ順次塗布した（塗布面積１×１ｃｍ）。十分に混和した後、同じ大きさの家兎背部皮膚（接着剤原液未塗布）と貼り合わせ、２００ｇの荷重を掛けて５分間放置した。そして、直ちに引張試験機（オートグラフＡＧＳ−５ＫＮＧ、島津製）によって、皮膚が剥離するまで１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で剪断力を負荷し続け、剥離時の負荷荷重を接着強度とした。また、比較のために、フィブリン糊(「ボルヒール」、化学及血清療法研究所)についても同様に試験した。表４に結果を示す。
【表４】
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【００６８】
表４に見られるように、第２の接着剤原液として中性ポリリジン水溶液又は４官能ＰＥＧ−ＮＨ2水溶液を用いた場合、従来のフィブリン糊と比べて遙かに高い接着強度を示した。【００６９】
６．キトサン添加による硬化物の分解制御
セクション4で得られた２０重量％のアルデヒド化デキストラン水溶液を第１液とした。次に、重量平均分子量１０００００のキトサン(ヤエガキ発酵発酵技研株式会社、脱アセチル化度８０％)を5%酢酸水溶液に溶解することよって調製された５重量％のキトサン溶液とセクション4で得られた２０重量％の中性ポリリジン水溶液とを種々の体積比で混合させ、これらの混合溶液を第２液とした。すなわち、実施例１の接着剤につき、第２液を部分的にキトサン水溶液で置き換えた。【００７０】
続いて、１６ｍｍガラス試験管内に第１及び第２の接着剤原液を１ｍｌずつ入れて、それらを硬化させた後、３ｍｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を添加し封管した。そして、試験管を３７℃の乾燥機に入れ、接着剤が分解する様子を経時的に観察した。図３に、硬化後５日間経過時における接着剤の状態を示す。図３における試験管下の表記は、５重量％キトサン水溶液と２０重量％中性ポリリジン水溶液との体積比を表す。【００７１】
図３に示すように、キトサン含量が少ない場合（体積比０／1０、1／9）の実施例では、接着剤は５日間で完全に分解した。それに対し、キトサン含量が多くなると硬化物の残存量は多くなり、体積比５／５の接着剤では3週間を経ても分解は観察されなかった。このことから、アミノ化合物の種類や混合比により、接着剤の分解速度、ないしは含水状態で流動化するまでの期間を容易に制御できることが分かった。【００７２】
なお、以上の結果から見てとれるように、分子量１０万という比較的低分子量のキトサンを単独で用いて、２液接着剤の第２液とした場合に、本発明の自己分解性は全く見られない。すなわち、アミノ基含有ユニットの直鎖状重合体であっても、分子量が数万以下、特には２万以下の場合にのみ、本発明の効果が得られるであろうことが裏付けられる。【００７３】
７．接着剤硬化物の生体内での分解速度の評価
第1液には、セクション3で用いた分子量75000のアルデヒド化デキストラン水溶液(20重量%)を使用した。また、セクション3と同じ1０重量％の中性ポリリジン水溶液を調製し、第2液とした。すなわち実施例１の接着剤を採用した。接着剤硬化物の生体内での分解速度を評価するため、家兎(体重2.5〜3.0kg、雌)を用いて以下の実験を実施した。【００７４】
体重1kg当たり0.6mlのネンブタールを耳静脈から注射後、体重1kg当たり0.1mlのセラクタールを足筋肉内に注射する事により麻酔処置を施した。開腹後、φ10mmの大きさに穴を開けた濾紙(No.2)を肝臓表面に貼り付け、専用ミキシングデバイスを用いて2液を混合し、約1ml塗布した。硬化後に閉腹し、経時的に硬化物の分解状況を調べた。【００７５】
図4に接着剤硬化物の分解の様子を示した。埋入3日後から徐々に分解が起こり、4週間後には90%程度分解していることが確認できた。また、組織反応も組織切片像から特に懸念されるような悪影響も認められず、安全性も高いことが示された。さらに分解実験中、ウサギの食欲の低下等も特に認められず、接着剤の埋入による悪影響は何ら確認されなかった。【００７６】
８．クエン酸添加による硬化物の分解制御
セクション4で得られた２０重量％のアルデヒド化デキストラン水溶液を第１液とした。また、セクション2で用いた２５重量％の塩基性ポリリジン水溶液１０ｍｌに、酢酸とクエン酸を併せて１ｇになるように種々の比率で添加し、更に蒸留水１．５ｍｌを添加することにより、２０重量％の中性ポリリジン水溶液を調製し、第２液とした。すなわち、実施例１の2液接着剤と、参考例３（セクション３）の2液接着剤とを、８／２，６／４，４／６，及び２／８の各重量比で混合した形の実施例の接着剤を調製した。また、酢酸のみ（１０／０）を用いたもの（実施例１に同じ）、及び、クエン酸のみ（０／１０）を用いたもの（参考例３に同じ）を同様に調製し、比較した。【００７７】
続いて、セクション６に記した方法により接着剤硬化物の分解速度を評価した。その結果を図5にまとめた。図中の表記は酢酸とクエン酸の重量比を意味しており、最も左が酢酸のみ、右がクエン酸のみでpH調整した場合である。ポリリジン水溶液のpH調整に使用した酸種が酢酸のみの場合は、４日後には完全に分解したのに対し、クエン酸量が増すにつれて硬化物の分解は遅延され、クエン酸のみでpH調整した場合には、２週間経過しても元の形状を保持しており、完全分解には2ヶ月以上を要した。このことから、pH調整剤の種類や量により、接着剤硬化物の分解速度を容易に制御できることが示された。【００７８】
９．ポリリジンの熱処理による高分子量化と硬化物の分解速度への影響
分子量4000のε-ポリ-L-リジン粉末(チッソ株式会社、Lot No. 20211023F)を、180℃の真空乾燥(熱処理)に供した。得られた熱処理ε-ポリ-L-リジンの分子量を、ゲル電気泳動法により評価した。ここで、電気泳動用ゲルとしては15%SDSを用い、電気泳動液としてRunning buffer solution(ナカライテスク社、0.25mol/l-Tris、1.92mol/l-グリシン、10g/l-SDS)を用い、日本エイドー株式会社の装置を用いて50mAの電流で測定を行った。マーカーはペプチド分子量マーカー(第一化学薬品株式会社、Mw＝2,512〜16,950；Lot No.024RJZ)及びProtein Ladder(invitrogen、Mw=6,000〜181,800；Lot No.1283301A)を用い、染色液は、Coomassie brilliant blue(invitrogen、R-250)を用いた。その結果、図6の写真の様な泳動パターンが得られた。未処理系(処理時間0)では2.5〜6Kの間に主成分が認められ、チッソ株式会社のカタログ値分子量4000と一致していた。その他の成分は不連続であり、分子量4000の成分が会合したことによるものと考えられる。熱処理によりスポットは消失するが、分子量は顕著に増加し、処理時間1.5時間を越えると分子量マーカーの最大値182Kを越える成分が出現し、さらに時間とともに高分子量成分が増加した。【００７９】
得られた熱処理ポリリジン粉末を蒸留水に溶かし、10重量％とし、4重量％の酢酸を含有させ、第２液を調製した。【００８０】
第1液には、セクション3で用いた分子量75000のアルデヒド化デキストラン水溶液(20重量%)を使用した。第1液及び第2液を混合しセクション6に記載の方法に従い、接着剤硬化物の分解速度を評価した。その結果が図7に示されている。処理時間(分子量)とともに分解期間が長くなり、処理時間0では2日間で分解されるのに対し、処理時間1.5時間では２週間、さらに6時間処理した場合には1ヶ月以上の時間を要した。【００８１】
セクション8に記載したように、硬化物の分解期間はpH調整剤の選択（酢酸またはクエン酸など）により容易に遅延できるため、分子量が低い熱処理前のε-ポリ-L-リジンを用いる場合には分解の期間を早期から長期へと自由に調節出来るのに対し、長時間の熱処理後のポリリジンを用いた場合にはこの調節は困難になるものと考えられる。しかし、例えば１８０℃で０．５時間程度またはそれ以下の熱処理については、分解期間を調節するための処理として利用可能であると考えられる。【００８２】
セクション６における分子量１０万のキトサンの結果と考え合わせると、アルデヒド基含有ポリマーの分子量が数万以下であるのが、本発明の自己分解性を充分に発揮する上で必要であると判断することができる。【００８３】
１０．電子線滅菌の適用
第1液には、セクション3で用いた分子量75000のアルデヒド化デキストラン水溶液20%)を使用した。また、セクション3と同じ1０重量％の中性ポリリジン水溶液を調製し、第2液とした。【００８４】
各溶液は、0.2μmの孔径を有するシリンジフィルター(Dismic 25-AS020AS、Advantec製)を用いて濾過後、それぞれ5mlガラスアンプルに詰め、封管した。【００８５】
第1液及び第2液をセットとして、25℃で表5左端に示す条件で滅菌処理を実施した。滅菌処理後、セクション2に示した方法に従って硬化時間を調べ、滅菌処理の影響を調べた。その結果を表５にまとめる。
【表５】
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表より、ガンマ線照射により若干の硬化時間遅延が認められるが、電子線照射では逆に未処置より硬化時間が短くなった。従って、各成分の分子量低下や変性は起こっておらず、電子線照射法は本接着剤の滅菌方法としての適用可能性が高いと考えられる。【００８６】
１１．圧縮試験による接着剤硬化物の柔軟性評価
第1液には、セクション3で用いた分子量75000のアルデヒド化デキストラン水溶液(20重量%)を使用した。また、セクション3と同じ10重量%の中性ポリリジン水溶液を調製し第2液とした。これらを専用ミキシングデバイスを用いて混合し、細胞培養用24wellプレート(底面積2cm2)に2ml量流し込んだ。25℃で2分間後、引張試験機(島津製作所製ADS-5D)を用いて直径6.6mmの半球を10mm/minの速度で接着剤硬化物に押し付け、圧縮応力を測定することにより硬化物の柔軟性を評価した。なお、比較対象としてフィブリン糊(ボルヒール、化学及血清療法研究所)についても調べた。図8に応力-歪み曲線の結果を示す。【００８７】
図では硬化物への半球の貫入量(mm)に対して、その時の応力値(mN)がプロットされている。初期勾配はあまり差がないが、貫入量が1mm付近からフィブリン糊の場合は傾きが大きくなるのに対し、本接着剤はその半分程度の傾きであった。このことから、本接着剤の硬化物はフィブリン糊より柔軟であることが示された。【００８８】
なお、データは省略するが、本発明の接着剤は、２０ｇのデキストランに対して添加する過ヨウ素酸ナトリウムの量を３ｇ及び１０ｇとすることにより、圧縮試験による歪−尾応力曲線を変化させることができた。すなわち、α−グルカンのアルデヒド化の程度を変化させ、アルデヒド基／アミノ基のモル比を変化させることで、硬化時の架橋密度を自由に変化させ、硬化後のゲル状樹脂層の柔軟性を自由に調整することができる。【００８９】
１２．牛皮を用いた接着力の評価
第1液には、セクション3で用いた分子量75000のアルデヒド化デキストラン水溶液(20重量%)を使用した。また、セクション3と同じ1０重量％の中性ポリリジン水溶液を調製し、第2液とした。すなわち、参考例３の２液接着剤を採用した。接着剤の接着強度を調べるために牛皮を被着体として接着試験を実施した。牛皮(TRUSCO社のJT-5L、作業用床革袖長手袋)を1×5cmの短冊状に裁断し、1×1cmの接着面積で2枚の皮を接着させ、100gの荷重下で5分間静置硬化させた。得られた接着体はセクション11で用いた引張試験機で10mm/minの引張速度で剪断させ、剥離時の接着力を求めた(n=5)。なお、比較対象としてフィブリン糊(ボルヒール、化学及血清療法研究所)についても調べた。【００９０】
その結果、本接着剤の接着強度は2024±563gf/cm2、フィブリン糊のそれは519±136gf/cm2であった。平均値でフィブリン糊の4倍近い接着強度を示し、1kg/cm2以上を示す試料が多かったのに対し、フィブリン糊は硬化時間が短すぎ、接着体作製が困難であったため、バラツキも大きく、低い接着強度であった。なお、セクション２の方法により測定した硬化時間は、本接着剤で約１０秒であったのに対し、フィブリン糊では1秒以下であった。【００９１】
１３．消化器外科領域での使用例(肝臓での止血効果)
セクション4で得られた２０重量％のアルデヒド化デキストラン水溶液を第１液とした。また、セクション２で得られた２０重量％の中性ポリリジン水溶液、及び５０重量％の２官能ＰＥＧ−ＮＨ2水溶液(フリーアミン)をそれぞれ第２液とした。中性ポリリジン水溶液を第２液としたものは、実施例１（セクション２）の接着剤に相当する。【００９２】
犠牲死させた家兎の腹部を正中切開し、肝臓を露出させた。そして、手術用メスを用いて、肝臓に長さ約２ｃｍ、深さ約５ｍｍ程度の傷（切れ込み）をつけることによって、切開部から絶え間なく出血させた。続けて、専用ミキシングデバイスを用いて、第１及び第２の接着剤原液を等容量混合し、それを切開部に塗布した。【００９３】
その結果、第２液が中性ポリリジン水溶液である２液接着剤（実施例１）の場合には１０秒以内に、２官能ＰＥＧ−ＮＨ2水溶液の接着剤では３０秒以内に、確実な止血が確認された。図9には第2液としてポリリジン水溶液を用いた場合の止血前後の肝臓を示しており、効果的に止血が成されているのが分かる。また、接着剤の膜は、肝臓に強固に固定されていた。このことから、本実施例の接着剤は、消化器外科領域で止血剤としても優れた効果を発揮することが分かった。【００９４】
１４．心臓血管外科領域での使用例(癒着防止効果)
第1液には、セクション3で用いた分子量75000のアルデヒド化デキストラン水溶液20%)を使用した。また、セクション3と同じ1０重量％の中性ポリリジン水溶液を調製し、第2液とした。すなわち、参考例３（セクション３）に同一の２液接着剤を調製した。【００９５】
次いで、分子量7000のデキストリン(和光純薬工業株式会社、Lot No.EWQ7180)20gに5gの過ヨウ素酸ナトリウムを反応させて、セクション2の方法に従ってアルデヒド化デキストリンを得た。この後、20重量%水溶液を調製し、２液接着剤の第１液とした。また、セクション2で用いた25重量%のポリリジン水溶液10mlに無水酢酸0.5ml及び蒸留水14.5mlを添加することにより、10重量%の中性ポリリジン水溶液を調製し、２液接着剤の第２液とした。このようにして、デキストリンタイプの実施例の２液接着剤を得た。【００９６】
心臓血管外科領域での癒着防止効果を確認するため、ラットの心膜を切開し、左室表面をガーゼで100回擦過することにより癒着惹起環境を作製した。そこに各種組成に調製した接着剤を塗布し閉胸した。4週間後、開胸して癒着状況を5段階のスコアー(0, 1, 2, 3, 4の5段階、数字が大きいほど癒着傾向が高い)を設けて判定した(n=5)。なお、比較対象は臨床で癒着防止剤として使用されているフィブリン糊(ボルヒール、化学及血清療法研究所)を用いた。【００９７】
スコアーは未処置、フィブリン糊、参考例３（セクション３）の接着剤、デキストリンタイプの実施例の接着剤の順に、それぞれ、2.4±0.5、1.2±0.4、3.2±0.4、1.2±0.4であった。【００９８】
参考例３（セクション３）の接着剤、及び、デキストリンタイプの実施例の接着剤をセクション6に示した方法に従って硬化物の分解速度評価に供したところ、前者は約1ヶ月、後者は2〜3日という結果であった。このことから、デキストリンタイプの実施例の接着剤は分解速度が極めて早いことが示された。このことと、上記の結果とを併せて考えると、ゲルの分解が遅い場合(参考例３)は未処置より癒着がひどく、早い場合(デキストリンタイプの実施例)はフィブリン糊と同程度の癒着であり、早期に分解する接着剤を用いることにより心臓の癒着防止に高い効果を示すことが分かった。【００９９】
図10に手術から4週間を経た患部の組織切片像を示す(Masson-Trichrome染色)。図中の矢印で示した様に心表面に硬化物の残存が確認出来る。手術時には心表面にある心外膜をガーゼで擦過することにより傷を付け癒着惹起部位を作製している。この時には擦過により心外膜は殆ど剥がれているものと思われ、心筋組織が露出しその部位に塗布している。接着剤の周りを取り囲んでいる組織は後から出来た組織である。接着剤の塗布量は同じであるが、デキストリンタイプの実施例接着剤の場合は分解が早いため、参考例３の場合と比べて、残存している硬化物の量は非常に少なかった。このため、癒着も軽微であったと考えられる。以上のことから、本実施例の接着剤は、分解速度を容易に制御出来るため、心臓血管外科領域で癒着防止剤としても有効であることが示された。【０１００】
１５．心臓血管外科領域での使用例(止血効果)
分子量40000のデキストランを用い、セクション8で使用した20重量%のアルデヒドデキストラン水溶液を調製し、第1液とした。また、セクション8で用いた20重量%の中性ポリリジン水溶液を調製し、第2液とした(クエン酸含有量4%)。すなわち、参考例３（セクション３）に相当する２液接着剤を調製した。なお、参考例３の接着剤は分解が多少遅いことを除くと、各実施例の接着剤と同様の性質及び性能を示す。【０１０１】
心臓血管外科領域における止血効果を確認するために以下の実験を行った。【０１０２】
麻酔はエーテル雰囲気下に30秒程度放置後、気管内挿管してイソフルレンの吸入麻酔を行う方法により実施した。ラットの左室自由壁を縫合することにより血流を止め、19ゲージ針で穿刺して穿孔を作成した。一時的に縫合を緩めて拍動性に出血することを確認した後再び縫合して完全に血流を止めた。周囲の血液を除去し、19ゲージよりやや大きな穴を開けた紙を心臓に被せて、接着剤と血液が周囲に流出しないようにした。【０１０３】
インスリン注入用のシリンジを用いて穿孔部に接着剤を0.4ml塗布した。3分後ガーゼをのせ、出血した血液がガーゼに吸収されるようにし、縫合を3分間緩めた(ガーゼの重量をあらかじめ測定しておき、前後の重量差を出血量とした)。実験は、比較対象として、未処理とフィブリン糊(ベリプラスト、化学及血清療法研究所)についても実施した。なお、実験に使用したラットの数は未処置群、本接着剤群、フィブリン糊群の順に6、5、5である。【０１０４】
各出血量は未処理、本接着剤、フィブリン糊の順に1.1±0.5g、0.4±0.1g、0.9±0.5gであり、本接着剤はフィブリン糊と比べて有意に出血量は少なかった(p=0.02)。なお、出血のパターンはフィブリン糊では硬化物を突き破っての出血の他に硬化物周囲と組織との間隙からの出血が認められたに対し、本接着剤は後者のみでそれも少量であったことが、この出血量の差に至ったと考えられた。以上のことから、本接着剤は、心臓血管外科領域で止血剤としても有効であることが示された。【０１０５】
１６．呼吸器外科領域での使用例(肺の空気漏れ閉塞)
第1液には、セクション3で用いた分子量75000のアルデヒド化デキストラン水溶液(20重量%)を使用した。次いで、セクション3と同じ1０重量％の中性ポリリジン水溶液を調製し、第2液とした。すなわち、参考例３（セクション３）に相当する２液接着剤を調製した。【０１０６】
肺の空気漏れ閉塞の効果を確認するため、ビーグル犬を用いて以下の実験を行った。常法に従って麻酔、気管内挿管を経て開胸し、右肺に電気メスを用いて3×3cmの面積の胸膜欠損部位を作製した。患部に生理食塩水をかけて人工呼吸器の圧力を上げることにより空気漏れを確認した。その後、専用ミキシングデバイスを用いて患部に約2mlの接着剤を滴下して指塗り(10秒)し、2分後胸腔内を生理食塩水で満たしてリークテストを行った。比較対象としてフィブリン糊(ボルヒール、化学及血清療法研究所)を用い、フィブリノーゲン溶液を患部に滴下して指塗りし、スプレーキットを用いてその上から塗布した(rub&spray法)。フィブリン糊の場合は文献に従って塗布から5分後にリークテストを行った。【０１０７】
空気漏れが認められた圧力は本接着剤、ボルヒールの順にそれぞれ35.4±6.8、33.3±4.8cmH2Oであり、大きな差は認められなかった。しかし、空気漏れの仕方は両者で大きく異なり、フィブリン糊の場合はフィブリン塊全体が肺から剥離し、欠損部がむき出しになって漏れ始める(気泡は大きい)のに対し、本接着剤の場合、欠損部自身はしっかり保持されており、その周辺部位からピンホール程度の穴があき、極めて小さい気泡が確認されたにすぎなかった。図11は本接着剤塗布前後の肺表面を示しており、塗布により欠損部位が接着剤硬化物でコートされているのが分かる。術後の経過は本接着剤、フィブリン糊とも良好で再びリークする犬は認められなかった。この結果から、本接着剤は呼吸器外科領域で肺の空気漏れを塞栓する目的でも効果が高いことが示された。【０１０８】
１７．参考例１−末端アミノ基ポリエチレングリコール
セクション4で得られた２０重量％のアルデヒド化デキストラン水溶液（分子量４００００）を第１液とした。また、セクション２で得られた両末端に１ヶずつのアミノ基を有する重量平均分子量３０００のポリエチレングリコールアミン(２官能ＰＥＧ−ＮＨ2、フリーアミン)を蒸留水に溶解することにより、５０重量％の水溶液(フリーアミン)を調製し第２液とした。【０１０９】
続いて、セクション６に記載した方法に従って接着剤硬化物が分解する様子を経時的に観察した。その結果、３時間でに完全に液化した。第２液成分の２官能ＰＥＧ−ＮＨ2は分子量は３０００であるが両末端にしかアミノ基を持たないため、末端でしか反応は起こらず、架橋密度が極めて低くなるため速やかに分解したものと考えられる。【０１１０】
本セクションの結果、及びセクション２のポリエチレングリコールアミンの結果から、アミノ基含有ポリマーは、アミノ基含有ユニットの連鎖よりなるものでなければならないことが裏付けられる。【０１１１】
１８．参考例２−キトサンオリゴ糖
セクション4で得られた２０重量％のアルデヒド化デキストラン水溶液（分子量４００００）を第１液とした。また、低分子量キトサン粉末(「Y.H.キトサンオリゴ糖」、ヤエガキ発酵技研株式会社、Lot. ０００５２２、乳酸塩、２〜６糖の混合物であり平均分子量は７００)を蒸留水に溶解することにより、５０重量％の水溶液を調製し第２液とした。【０１１２】
続いて、参考例１と同様に反応させたが、７時間を経ても硬化しなかった。このため、試験管に第１液を１ｍｌ加え、第2液の代わりにY.H.キトサンオリゴ糖の粉末１００mgを添加し混和した。３０分後、硬化が確認され、３ｍｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を添加し封管後、接着剤硬化物が分解する様子を経時的に観察した。その結果、６時間で完全に液化した。Y.H.キトサンオリゴ糖は、糖1残基あたり1ヶのアミノ基を有するが、分子量が低すぎるため５０重量％ではゲルが形成されず、粉末を使用した場合でも効果的なゲル網目構造が形成されないため、速やかに分解・液化したものと考えている。【０１１３】
キトサンオリゴ糖の結果から、約1日またはそれ以上の適当な自己崩壊期間を達成するためには、アルデヒド基含有ユニットの鎖状重合体の分子量が１０００以上は必要であることが知られる。また、キトサンオリゴ糖の結果から、低分子量キトサンが、低分子量ポリリジン等と同様の挙動をとるであろうことを知ることができる。すなわち、セクション６のキトサン添加の結果と考え合わせると、アルデヒド基含有ユニット鎖状重合体の分子量が１０００〜２万であるときに、はじめて、本発明の特有の効果が得られることが知られる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】過ヨウ素酸ナトリウムの添加量とアルデヒド基の導入量との関係を示すグラフである。（セクション１）
【図２−１】接着剤をゴム手袋に塗布した後に手袋を拡張させたときの接着剤硬化物の様子を示す写真（１）である。（セクション4）
【図２−２】接着剤をゴム手袋に塗布した後に手袋を拡張させたときの接着剤硬化物の様子を示す写真（２）である。（セクション4）
【図３−１】キトサンを添加した接着剤硬化物の硬化後3週間までの分解の様子を示す写真（１）である。（セクション6）
【図３−２】キトサンを添加した接着剤硬化物の硬化後3週間までの分解の様子を示す写真（２）である。（セクション6）
【図３−３】キトサンを添加した接着剤硬化物の硬化後3週間までの分解の様子を示す写真（３）である。（セクション6）
【図４−１】接着剤硬化物が家兎肝臓上で分解されてゆく様子を示す写真（１）である。(セクション7)
【図４−２】接着剤硬化物が家兎肝臓上で分解されてゆく様子を示す写真（２）である。(セクション7)
【図４−３】接着剤硬化物が家兎肝臓上で分解されてゆく様子を示す写真（３）である。(セクション7)
【図４−４】接着剤硬化物が家兎肝臓上で分解されてゆく様子を示す写真（４）である。(セクション7)
【図４−５】接着剤硬化物が家兎肝臓上で分解されてゆく様子を示す写真（５）である。(セクション7)
【図５−１】酢酸及とクエン酸の混合物でpH調整したポリリジンを用いて調製した接着剤硬化物の分解の様子を示す写真（１）である。(セクション８)
【図５−２】酢酸及とクエン酸の混合物でpH調整したポリリジンを用いて調製した接着剤硬化物の分解の様子を示す写真（２）である。(セクション８)
【図５−３】酢酸及とクエン酸の混合物でpH調整したポリリジンを用いて調製した接着剤硬化物の分解の様子を示す写真（３）である。(セクション８)
【図５−４】酢酸及とクエン酸の混合物でpH調整したポリリジンを用いて調製した接着剤硬化物の分解の様子を示す写真（４）である。(セクション８)
【図５−５】酢酸及とクエン酸の混合物でpH調整したポリリジンを用いて調製した接着剤硬化物の分解の様子を示す写真（５）である。(セクション８)
【図５−６】酢酸及とクエン酸の混合物でpH調整したポリリジンを用いて調製した接着剤硬化物の分解の様子を示す写真（６）である。(セクション８)
【図６−１】熱処理したポリリジンの電気泳動パターン（１）である。(セクション９)
【図６−２】熱処理したポリリジンの電気泳動パターン（２）である。(セクション９)
【図７−１】熱処理したポリリジンを用いて調製した接着剤硬化物の経時的な分解の様子を示す写真（１）である。(セクション９)
【図７−２】熱処理したポリリジンを用いて調製した接着剤硬化物の経時的な分解の様子を示す写真（２）である。(セクション９)
【図７−３】熱処理したポリリジンを用いて調製した接着剤硬化物の経時的な分解の様子を示す写真（３）である。(セクション９)
【図７−４】熱処理したポリリジンを用いて調製した接着剤硬化物の経時的な分解の様子を示す写真（４）である。(セクション９)
【図７−５】熱処理したポリリジンを用いて調製した接着剤硬化物の経時的な分解の様子を示す写真（５）である。(セクション９)
【図７−６】熱処理したポリリジンを用いて調製した接着剤硬化物の経時的な分解の様子を示す写真（６）である。(セクション９)
【図８】接着剤硬化物の応力−ひずみ曲線を表している。(セクション11)
【図９−１】実施例の接着剤によるウサギ肝臓の止血の様子を示す写真（１）である。(セクション13)
【図９−２】実施例の接着剤によるウサギ肝臓の止血の様子を示す写真（２）である。(セクション13)
【図１０−１】癒着惹起部位に塗布して4週間後の患部の組織切片像（１）である。 (セクション14)
【図１０−２】癒着惹起部位に塗布して4週間後の患部の組織切片像（２）である。 (セクション14)
【図１１−１】人工的に作成した肺欠損部位からの空気漏れを、実施例の接着剤を用いて閉塞した状況を示す写真（１）である。(セクション16)
【図１１−２】人工的に作成した肺欠損部位からの空気漏れを、実施例の接着剤を用いて閉塞した状況を示す写真（２）である。(セクション16)
【図１】
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【図８】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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