(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄吸引懸濁物から複合骨移植片を調製するためのキットであって、以下：
（ａ）多孔性で、生体適合性で、移植可能な基材であって、血小板濃縮物を該基材に通過させることによって取得可能である血小板を、該基材の表面上に有する、基材；および
（ｂ）該基材を支持するための容器であって、該容器は、該基材を維持し該骨髄吸引懸濁物が流れることを可能にするように配置され、かつ、内部表面および２つの末端を有し、該末端は各々開口部を規定する、容器
備える、キット。
【請求項２】
前記血小板濃縮物が、抗凝固剤を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記血小板濃縮物が、単離された血小板濃縮物である、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか1項に記載のキットであって、結合組織前駆
細胞または血小板の表面上で発現された表面抗原に結合する抗体をさらに備え、ここで該当抗体が、該基材の接触可能な表面に結合している、キット。
【請求項５】
請求項４に記載のキットであって、ここで、前記抗体が、ＳＴＲＯ−１、ＳＨ−２、ＳＨ−３、ＳＨ−４、ＳＢ−１０、ＳＢ−２０およびアルカリホスファターゼに対する抗体からなる群より選択される、キット。
【請求項６】
前記基材が無菌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７】
さらに、
前記基材を通過する前記骨髄吸引懸濁物の流速を調節するための、前記容器の一方の末端に取り付け可能な流量調節器、
を備える、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８】
さらに
（ａ）前記骨髄吸引懸濁物を支持するためのリザーバ；および
（ｂ）該リザーバから前記容器への該骨髄吸引懸濁物の流れを調節するための該リザーバに取り付け可能な流量調節器、
を備える、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９】
さらに、
前記容器からの前記骨髄吸引懸濁物の流出物を受けるための流出物レシーバ、を備える
、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０】
前記基材が外部寸法を有し、そして該外部寸法と同一の外部寸法を有する固体物体の表面積よりも少なくとも５倍広い接触可能な総表面積を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
前記基材が、リン酸カルシウムまたは生体ガラスを含むセラミックから形成される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２】
前記基材が、コラーゲン、鉱化骨および脱鉱化骨からなる群より選択される材料から形成される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
前記基材が、ヒアルロン酸または合成生体高分子から形成される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
前記基材が、合成生体高分子から形成される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
前記基材が、ヒアルロン酸から形成される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
前記基材がその表面に結合した細胞接着分子を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
前記基材がその表面に結合した増殖因子を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８】
前記基材が４０μｍより大きな直径を有する孔または通路を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９】
前記容器がさらに、該容器内に前記基材を保持するための多孔性部材を備える、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
前記容器が生体適合性の材料から作製される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
以下：
（ａ）多孔性で、生体適合性で、移植可能な基材であって、その表面に血小板を有している、基材；
（ｂ）有核骨髄細胞の異種集団；および
（ｃ）結合組織の前駆細胞の富化集団、
を含む、複合骨髄移植片。
【請求項２２】
請求項２１に記載の複合骨髄移植片であって、前記基材が、その表面上に、血小板濃縮物を該基材に通過させることによって取得可能である血小板を有する、複合骨髄移植片。
【請求項２３】
前記血小板濃縮物が、抗凝固剤を含む、請求項２２に記載の複合骨髄移植片。
【請求項２４】
前記血小板濃縮物が、単離された血小板濃縮物である、請求項２２に記載の複合骨髄移植片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
骨移植は、骨折、偽関節を処置するため、および関節固定を誘導するために広範に使用される。被移植者の一部位から採取され、そして被移植者の別の部位に移植される自己海綿質骨（ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ  ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ  ｂｏｎｅ）は、現在最も効果的な骨移植片である。自己海綿質骨は、骨治癒応答の分布を支持する骨格を提供する。自己海綿質骨はまた、新しい軟骨または骨を形成する結合組織前駆細胞を提供する。しかし、自己骨の採取は、かなりの費用および病的状態（瘢痕、血液減少、疼痛、長期の手術およびリハビリテーション期間、ならびに感染の危険を含む）を生じる。さらに、いくつかの臨床設定において、移植部位の容量が、利用可能な自己移植片の容量を超過し得る。従って、自己移植片に対する代替物が、骨移植手順の病的状態および費用を低減させる試みにおいて開発されてきている。
【０００２】
セラミックス、生体高分子、処理した同種異系移植片骨、およびコラーゲンベースのマトリックスを含むいくつかの精製材料または合成材料が、自己移植片の代替物として役立てるために調査または開発されてきている。ＦＤＡは、含まれる骨の欠損における使用について珊瑚由来の多孔性合成ヒドロキシアパタイトセラミックを承認した。精製コラーゲン／セラミック複合材料もまた、急性長骨骨折における使用について承認されている。これらの材料は、被移植者からの自己移植片を採取する際に関与する病的状態を回避し、そして利用可能な自己移植片の限定された量に伴う問題を除去するが、合成材料の臨床的な有効性は一般に自己移植片よりも劣ったままである。
【０００３】
合成移植片材料はまた、骨髄細胞のための担体として使用されてきている。このような複合材料が骨格欠損部へと移植された場合、結合組織前駆細胞が骨格組織へと分化した。いくつかの場合、複合インプラントは、合成移植片材料を骨髄栓から得られた細胞懸濁物中に浸漬することにより作製される。しかし、軟骨、骨、および他の結合組織（例えば、脂肪、筋肉、および繊維状組織）へと分化する能力を有する結合組織前駆細胞は、極微量でしか骨髄中に存在しない。１ｍｌの骨髄中に存在するこのような細胞の数は、約１００細胞〜約２０，０００細胞と被験体ごとに広範に変化する。これは、平均して骨髄中の有核細胞２０，０００あたり約１細胞〜４０，０００あたり約１細胞を表す。従って、所定の容量の合成担体移植片材料が匹敵する容量の新鮮な骨髄中に浸漬することにより作製される複合プラントは、比較的少ない結合組織前駆細胞を含有する。
【０００４】
従って、複合インプラントにおける結合組織前駆細胞の相対濃度を増加させる技術が以前に開発されてきた。この技術は、組織培養ディッシュに骨髄細胞の懸濁物をプレートし、培養物中の結合組織前駆細胞の数が増大するまで選択培地中で１日以上この細胞を培養し、次いで組織培養ディッシュから細胞を剥離して、培養的に増殖させた結合組織前駆細胞の集団を含む懸濁物を提供することを含む。次いで、複合インプラントは、この培養的に増殖させた細胞の懸濁物中に合成セラミック担体を浸漬することにより作製される。不幸にも、複合インプラントを調製するこの方法は、非常に時間がかかる。さらに、この方法で使用した培養的に増殖させた細胞が、被移植者から得られた骨髄吸引物由来である場合、被移植者は複数の侵襲性手順（被移植者の骨髄を取り出す手順および後日複合インプラントを移植する手順）を受けなければならない。さらに、被移植者は１回より多くの麻酔に曝露され得る。
【０００５】
従って、手術中（すなわち、被移植者から骨髄が採取されるのと同時）に実施され得る複合骨髄移植片の新しい調製方法を有することが望ましい。結合組織前駆細胞の供給源として骨髄吸引物を使用し、そして結合組織前駆細胞の富化集団を含有する複合骨移植片の形成を生じる、複合骨髄移植片の手術中の調製方法が特に望ましい。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、移植可能な移植片、特に複合骨移植片の新しく、かつ改善された調製法を提供する。本明細書中以下で使用される用語「骨移植片」は、結合組織前駆細胞を含み、そしてそれゆえ軟骨または骨に分化し得る移植片をいう。本方法は、骨髄吸引懸濁物を提供する工程、および多孔性で生体適合性の移植可能な基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を通して骨髄吸引懸濁物を通過させて結合組織前駆細胞の富化集団を有する複合骨移植片を提供する工程を包含する。本方法は、好ましくは、被移植者からの骨髄吸引物を使用して手術中に実施されるので、移植片調製に必要とされる時間および費用、ならびに被移植者が手術室に入り、侵襲性手順を受けなければならない回数をも低減させる。本発明によって調製される改善された複合骨移植片は、結合組織前駆細胞の富化集団、および最初の骨髄吸引物中に見い出されるより多数の単位容量あたりの結合組織前駆細胞を含有する。
【０００７】
本発明はまた、本発明の方法に従って調製される複合骨髄移植片に関する。
【０００８】
本発明はまた、移植可能移植片、特に複合骨移植片を調製するための装置を含むキットを提供する。このキットは、多孔性の生体適合性基材、およびこの基材を保持し、そして細胞懸濁物、特に骨髄吸引懸濁物のこれらを通じる流れを可能にするように形成された容器を備える。好ましくは基材は無菌である。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、複合骨移植片を調製するための、新規でかつ改善された方法を提供する。本方法は、骨髄吸引物を、好ましくは抗凝固剤の存在下でドナーから採取して骨髄吸引懸濁物を提供する工程、および骨髄吸引懸濁物を多孔質で生体適合性の移植可能な基材に通過させる工程を包含する。好ましくは、基材は無菌である。好ましくは、本方法は、手術時に、好ましくは被移植者（ｇｒａｆｔｅｅ）由来の骨髄吸引物を用いて実施される。
【００１０】
本発明はまた、その表面上に血小板を有する移植可能な移植片を調製するための方法を提供する。この方法は、血小板の懸濁物を、多孔性で、生体適合性の、移植可能な基材に通過させる工程を包含する。適切な懸濁物としては、例えば、抗凝固剤を含む骨髄、単離された血小板濃縮物、および血液が挙げられる。
【００１１】
（骨髄吸引懸濁物の調製）
骨髄吸引物は、血漿、有核結合組織前駆細胞、他の有核造血細胞、有核内皮細胞、および混入した末梢血に由来する細胞（赤血球および血小板を含む）を含有する。骨髄吸引物はまた、末梢血を含むので、骨髄が抗凝固剤を含むシリンジ中に採取されることが好ましい。適切な抗凝固剤は、例えば、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、およびＥＤＴＡを含む。好ましくは、骨髄吸引物は、滅菌等張溶液と混合されて、約１０００万〜約３億の有核細胞／ｍｌ、好ましくは約２０００万〜約２億５０００万の有核細胞／ｍｌ、より好ましくは約５０００万〜約２億の有核細胞／ｍｌの範囲の濃度を提供する。適切な等張溶液は、例えば、等張緩衝化塩溶液（例えば、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよびリン酸緩衝化生理食塩水）、および組織培養培地（例えば、最少必須培地）を含む。本明細書中では、用語「骨髄吸引懸濁物」は、等張溶液と混合されていない骨髄吸引物、および等張溶液と混合されている骨髄吸引物をいう。
【００１２】
（基材）
基材は、生体適合性の移植可能な移植片材料から作製される。好ましくは、材料は、荷電した表面を有する。荷電した表面を有する生体適合性の移植可能な移植片材料の例としては、リン酸カルシウムを含むセラミックス（例えば、ヒドロキシアパタイトまたはリン酸３カルシウムのような）；および脱鉱化骨マトリックス；または鉱化骨マトリックスが挙げられる。他の適切な移植片材料としては、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリガラクト酸、ポリカプロラクトン、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリスルホン、ポリエチレンおよびポリプロピレンのような生体高分子が挙げられる。他の適切な移植片材料としては、ヒアルロン酸（これは、架橋を有して精製されても架橋を有さずに精製されてもよい）、生体ガラスおよびコラーゲンが挙げられる。
【００１３】
より好ましくは、細胞接着分子は、基材の表面に結合される。用語「細胞接着分子」は、集合的に、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、血管細胞接着分子（Ｖ−ＣＡＭ）、細胞間接着分子（Ｉ−ＣＡＭ）、テネイシン、トロンボスポンジン、オステオネクチン、オステオポンチン、骨シアロプロテインおよびコラーゲンをいう。
【００１４】
必要に応じて、基材は、その表面に結合した増殖因子を有する。本明細書において用いる場合、用語「増殖因子」は、他の細胞（特に結合組織前駆細胞）の増殖または分化を調節する任意の細胞産物を包含する。増殖因子は、以下を含むがこれらに限定されない：血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のアイソフォーム、線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子βのアイソフォーム、インスリン様増殖因子、および骨形態形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【００１５】
必要に応じて、基材は、その表面に結合した結合組織前駆幹細胞に親和性を有する抗体を有する。適切な抗体としては、例えば、ＳＴＲＯ−１、ＳＨ−２、ＳＨ−３、ＳＨ−４、ＳＢ−１０、ＳＢ−２０およびアルカリホスファターゼに対する抗体が挙げられる。このような抗体は、以下に記載されている：Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈら、ヒト骨髄由来間葉細胞上の細胞表面抗原は、モノクローナル抗体により検出される．Ｂｏｎｅ  １３：６９〜８０，１９９２ａ；Ｂｒｕｄｅｒ，Ｓら、ヒト前骨芽細胞上の細胞表面分化抗原の同定および特徴づけ．Ｔｒａｎｓ  Ｏｒｔｈｏ  Ｒｅｓ  Ｓｏｃ  ２１：５７４；１９９６；Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ，Ｓ．Ｅ．，ら．ヒト骨髄由来間葉細胞上の細胞表面抗原は、モノクローナル抗体により検出される．Ｂｏｎｅ  １３：６９〜８０，１９９２；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｋら、ヒト骨細胞および骨髄細胞の培養中のＳＴＲＯ−１抗原およびアルカリホスファターゼの同時発現．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １１（補遺）：Ｓ１４２；１９９６；Ｆｌｅｍｍｉｎｇ  ＪＥら、成人骨髄由来間質幹細胞に対するモノクローナル抗体は胚性ヒト皮膚における血管系の発生を認識する．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２１２：１１９〜１３２，１９９８およびＢｒｕｄｅｒ  ＳＰら、ヒト骨形成原細胞表面抗原と反応性のモノクローナル抗体．Ｂｏｎｅ  ２１（３）：２２５〜２３５、１９９７。
【００１６】
好ましくは、基材は、基材の接近可能な総表面積が、同じ外部寸法を有する固体物体よりも少なくとも５倍大きいように、十分な数の孔または通路を有する。従って、好ましい総表面積は、基材物質の粉末の塊、顆粒の塊、繊維の塊、または高多孔性ブロックを含む基材を用いることにより達成され得る。好ましくは、基材中の孔のサイズは、２０μｍより大きく、より好ましくは４０μｍより大きく、最も好ましくは１００μｍより大きい。
【００１７】
特に適切な移植片材料は、例えば、単離された鉱化海綿質骨切片、鉱化骨の粉末または顆粒、脱鉱化海綿質骨切片、脱鉱化骨の粉末または顆粒、グアニジン−ＨＣｌ抽出脱鉱化骨マトリックス、焼結皮質骨または焼結海綿質骨、商品名Ｉｎｔｅｒｐｏｒｅ  ５００またはＩｎｔｅｒｐｏｒｅ２００としてＩｎｔｅｒｐｏｒｅにより販売される珊瑚質ヒドロキシアパタイト、および顆粒状セラミックス（例えば、Ｚｉｍｍｅｒにより販売される骨移植片代替物Ｃｏｌｌａｇｒａｆｔ中に取り込まれる顆粒状セラミックス）、または繊維状スポンジ（例えば、Ｏｒｑｕｅｓｔによるコラーゲンにより作製される繊維状スポンジ）を含む。
【００１８】
（基材容器）
好ましくは、基材は、容器内で基材を保持し、そして液体および骨髄細胞が容器を通って流れるのを可能にするように形成された容器内に配置される。このことは、そのいずれかの末端に２つの開口部を有し、そして基材と開口部の１つとの間に配置された１つ以上の孔を有する部材を含む容器を用いて達成される。好ましくは、部材の孔は、骨髄吸引懸濁物の液体および細胞がそれを通じて流れ、そして容器内に基材を保持するのを可能にするのに十分なサイズの直径を有する。好ましくは、容器の長さは、容器の幅より長く、基材内での懸濁物の滞留時間を増加させる。
【００１９】
好ましくは、容器は、生体適合性で、そして発熱物質を含まない材料から作製される。適切な容器材料は、例えば、ガラス、プラスチック、または金属を含む。容器は、容器のいずれかの末端で開口部をブロックする、２つの液流制限物（ｆｌｕｉｄ  ｆｌｏｗ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｒ）を含み得るが、好ましくは液流調節物（ｆｌｕｉｄ  ｆｌｏｗ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）は、容器の少なくとも一端に取り付けられて、基材を通しての骨髄吸引懸濁物の流れを調節する。
【００２０】
（条件）
被験体に対して移植片の移植を可能にするために、基材は無菌でありそして基材を保持する容器の内部表面も無菌であることが好ましい。好ましくは、骨髄吸引懸濁物は、外力または重力により生じ得る静水圧の下で無菌の基材を通じて流れるのを可能にされる。好ましくは、基材を通しての懸濁物の線状溶出速度は、２ｍｍ／分と５００ｍｍ／分との間、より好ましくは５ｍｍ／分と２００ｍｍ／分との間、最も好ましくは１０ｍｍ／分と１００ｍｍ／分との間である。
【００２１】
必要に応じて、溶出液は、溶出液収集器中に無菌的に収集され、そして基材を通して１回以上再利用されて複合骨移植物中の結合組織前駆細胞の数を増加させる。
【００２２】
必要に応じて、最初の骨髄吸引懸濁物および任意の溶出液が基材を通って通過した後に、洗浄溶液を、基材を通して通過させる。好ましくは、洗浄溶液は、７．３〜７．５のｐＨ範囲を有する、無菌で等張な緩衝化溶液を含む。適切な洗浄溶液は、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液、および最少必須培地を含む。
【００２３】
必要に応じて、増殖因子または増殖因子を分泌するかまたは提示する（すなわち、その表面に発現する）さらなる細胞を、使用の前に（すなわち、骨髄吸引懸濁物が基材を通過する時点より前、その間、またはそれより後に）複合骨移植片に添加する。添加され得る増殖因子は、例えば、血小板由来増殖因子のアイソフォーム、線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨ関連ペプチド、および骨形態形成タンパク質を含む。好ましくは、増殖因子は、全ての以前の懸濁物および溶液を基材に通過させた後に、増殖因子を含む溶液を、基材に通過させることにより添加される。あるいは、増殖因子は、洗浄溶液中に取り込ませることにより添加される。増殖因子を分泌することおよび負に荷電された表面に接着することが公知の血小板は、抗凝固剤を含む血液または血小板濃縮物のような血小板の懸濁物を基材に通過させることにより移植片に添加される。
【００２４】
複合骨移植片の調製方法の以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、本発明を限定することを意図しない：
（実施例１）
複合骨移植片を調製するための本方法は、本方法を実施するための装置の好ましい実施態様を示す図１を参照することにより、さらに容易に理解され得る。本装置は、１０として一般的に示されるように、多孔性で生体適合性の移植可能な基材１２、基材１２を保持するための容器１４、骨髄吸引懸濁物を保持するためのレザーバー１６、第１の液流調節物１８、第２の液流調節物２０、および溶出液収集器２２を備える。複合骨移植片の調製の前に、この装置の全ての構成要素を滅菌する。
【００２５】
頂部２３の除去の後に、骨髄吸引懸濁物をレザーバー１６中に導入する。次いで、液流調節物１８を開いて、骨髄吸引懸濁物がレザーバー１６から流れ出て、容器１４の取り外し可能な頂部２４における開口部３０に入り、そして基材１２の上に流れるのを可能にする。
【００２６】
懸濁物が基材１２中に入ったとき、容器１４のチップ３４に取り付けられた液流調節物２０は開いて、骨髄吸引懸濁物が多孔性部材３２を通って、容器１４の開口部３６を通って、そして溶出液収集器２２に流入するのを可能にする。
【００２７】
次いで、レザーバー１６および取り外し可能な頂部２４を容器１４から外し、次 いで改善された複合骨髄移植片を容器１４から取り出す。基材１２、結合組織前駆細胞の富化集団、ならびに他の有核骨髄細胞の異種集団、血球、ならびに骨髄および血液に由来する接着性増殖因子および接着分子を含む、改善された複合骨移植片は、インプラントとしてまたはインビトロでの使用の用意ができている。
【００２８】
（実施例２）
直径１３ｍｍおよび厚さ５ｍｍの寸法の珊瑚質ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）の９つの円筒状ディスクを、Ｉｎｔｅｒｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手した。各ディスクを、ストップコックを取り付けた、垂直に取り付けた１０ｃｃシリンジバレルのチップに配置した。骨髄サンプルを、９人の自発的なヒト被験体の前腸骨稜から吸引により採取した。サンプルを、Ｌｅｅ−Ｌｏｋ骨髄吸引針、ならびに１ｍｌの正常生理食塩水および１０００ユニットのＳｏｄｉｕｍ−Ｈｅｐａｒｉｎを含有する１０ｃｃシリンジを用いて採取した。２ｍｌの骨髄を、各部位から吸引した。骨髄サンプルをα−ＭＥＭ中に懸濁して、１ｍｌあたり５０００万の有核細胞を含有する骨髄細胞の懸濁物を調製した。２ｍｌの骨髄細胞懸濁物をシリンジの頂部に導入し、そしてストップコックを調節して骨髄細胞懸濁物がディスクを通して２ｍｌ／分で溶出するのを可能にした。溶出液の各サンプルを、ディスクを通して３回再利用した。溶出液を収集した後、ディスクを、６ｍｌリン酸緩衝化生理食塩水で、２ｍｌ／分の溶出速度で洗浄し、緩く接着した細胞を除去した。
【００２９】
初めの懸濁物、溶出液、および洗浄液中の有核細胞の数を、血球計算板を用いて計数して、得られた複合骨移植片中に保持された有核細胞の数を決定した。得られた複合骨移植片中に保持された結合組織前駆体の数を決定するために、初めの懸濁物、溶出液、および洗浄液中の結合組織前駆体の数を、組織培養プラスチック上でのコロニー計数によりアッセイした。コロニー計数のために、最初の懸濁物、溶出液、および洗浄液からの５００，０００の有核細胞を、別々の直径３５ｍｍの組織培養ウェル中にプレーティングし、そしてデキサメタゾン（１０-8Ｍ）およびアスコルベート（５０ｍｇ／ｍｌ）を含有するα−ＭＥＭ中で９日間培養した。次いで、培養した細胞を、Ｎ’，Ｎ’，ジメチルナフトール  Ｍ−Ｘホスフェートを基質として、そしてＴｅｘａｓ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄを染料として用いてアルカリホスファターゼ活性について染色した。アルカリホスファターゼ活性は、骨芽細胞分化のマーカーである。従って、アルカリホスファターゼ活性について陽性に染色されるコロニーの数は、最初の懸濁物、溶出液、および洗浄液中に存在する結合組織前駆体の数を反映する。
【００３０】
各工程の後に基材上に保持された有核細胞および結合組織前駆細胞の数を、溶出液または洗浄液中に見出された有核細胞および結合前駆細胞の数を、初めの懸濁物中の有核細胞および結合組織前駆細胞の数から引くことにより計算した。９つの複合骨移植片中に保持された有核細胞および結合組織前駆細胞の平均数、ならびに複合骨移植片中に保持された有核細胞および結合組織前駆細胞のパーセンテージを、表１に示す。
【００３１】
（実施例３）
複合骨移植片を、骨髄サンプルを３人の異なる自発的なヒト被験体の前腸骨稜から採取したこと、および用いた基材がＬｉｆｅ  Ｎｅｔ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｂｅａｃｈ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手したヒト脱鉱化海綿質骨マトリックスの円筒状ディスクであったこと以外は、実施例２に記載されたように調製した。
【００３２】
複合移植片中に保持された有核細胞および結合組織前駆細胞の数を、実施例２に上記のように決定した。複合骨移植片中に保持された有核細胞および結合組織前駆細胞の平均数、ならびに複合骨移植片中に保持された有核細胞および結合組織前駆細胞のパーセンテージを、表１に示す。
【００３３】
【表１】
0004184603.tif 000002
【００３４】
表１に示すように、ヒドロキシアパタイトまたはヒト脱鉱化海綿質骨の基材で作製した複合移植片は、有意なパーセンテージの有核細胞（それぞれ、４７％および２４％）およびさらに大きなパーセンテージの結合組織前駆細胞（それぞれ、６６％および４４％）を、最初の懸濁物中に保持した。表１にまた示すように、海綿質骨または珊瑚質ヒドロキシアパタイトの基材を洗浄することにより、珊瑚質ＨＡ基材中に最初に保持された有核細胞の１６．２％（１０％〜３３％の範囲）および脱鉱化海綿質骨マトリックス基材中に保持された細胞の３９．４５％（３３〜８６％の範囲）が平均して除去された。
【００３５】
表１に示すように、ヒドロキシアパタイトまたはヒト脱鉱化海綿質骨のいずれかで作製された複合移植片は、他の骨髄由来有核細胞と比較して結合組織前駆細胞を選択的に保持した。この選択的保持は、保持された結合組織前駆細胞の％の、基材上に保持された有核細胞の％に対する比（＞１）により示される。従って、ヒドロキシアパタイトディスクまたはヒト脱鉱化海綿質骨ディスクのいずれかで調製された複合骨移植片は、結合前駆細胞の富化集団を含む。
【００３６】
最初の骨髄サンプル中に見出される濃度より上の結合組織前駆細胞の濃度は、保持された結合組織前駆細胞の数を、ディスクの容量（０．６３ｃｍ3）で割ることにより示される。表１で示すように、ＨＡディスクを含む複合骨髄移植片中に保持された結合組織前駆細胞の平均濃度は、最初の骨髄サンプル中の濃度より２．８倍大きかった。同様に、脱鉱化海綿質骨マトリックスを含む複合骨移植片中に保持された結合組織前駆細胞の平均濃度は、最初の骨髄サンプルにおいてよりも１．３倍大きかった。
【００３７】
（実施例４）
４５の複合骨移植片を、骨髄懸濁物中の有核細胞の濃度が９人のヒトドナーの各々で５００万、１０００万、２０００万、４０００万、および５０００万の細胞／ｍｌの間で変化したこと以外は、実施例２に記載のように調製した。得られた複合骨移植片の各々の上で保持された有核細胞および結合組織前駆細胞の数を、実施例２に記載されたように決定した。結果を図２ａおよび図２ｂに示す。
【００３８】
図２ａおよび図２ｂに示すように、複合骨移植片中に保持された有核細胞の数および結合組織前駆細胞の数は、ヒドロキシアパタイト基材を通過した骨髄細胞の数が増加するにつれて、本質的に線形の様式で増加した。このことは、骨髄由来細胞でのヒドロキシアパタイト基材の飽和が、基材に対する細胞の容量の評価された範囲では生じなかったことを示す。
【００３９】
（実施例５）
１５の複合骨移植片を、骨髄懸濁物中の有核細胞の濃度が、３人のヒトドナーの各々で５００、１０００、２０００、４０００、および５０００万の細胞／ｍｌの間で変化したこと以外は、実施例２に記載されたように脱鉱化海綿質骨マトリックスのディスクを用いて調製した。得られた複合骨移植片中に保持された有核細胞の数および結合組織前駆体コロニーの数を反映するデータを、図３ａおよび図３ｂに示す。
【００４０】
図３ａおよび図３ｂに示すように、複合骨移植片中に保持された有核細胞の数および結合組織前駆細胞の数は、脱鉱化海綿質骨マトリックス基材を通過した骨髄細胞の数が増加するにつれて、本質的に線形の様式で増加した。このことは、骨髄由来細胞での基材の飽和が、基材に対する細胞の容量の評価された範囲では生じなかったことを示す。
【００４１】
（実施例６）
複合骨移植片を、ローディングの後に６ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水で基材を洗浄しなかったこと以外は、実施例２に記載されたように、５００万の有核細胞／ｍｌを含有する骨髄懸濁物２ｃｃを用いて調製した。実施例２において洗浄されたのと同一の様式でローディングされた同一のディスクと比較して、非洗浄ディスクは、同数の結合組織前駆体（示した場合は１０００）およびより大きな数の骨髄由来有核細胞（洗浄した実施例においての１２０万に対して、２２０万）を保持していた。インビトロで２４日間の培養後、これらのさらなる細胞の存在は、結合組織前駆体のより大きな増殖および分化をもたらした。このことは、骨芽細胞分化のマーカーである、アルカリホスファターゼ活性を発現した細胞により覆われた、より大きな表面積により明示された。
【００４２】
（実施例７）
複合骨移植片を、骨髄懸濁物がヒドロキシアパタイトディスクを３回ではなく１回のみ再利用されたこと以外は、実施例２に記載されたように調製した。このことは、珊瑚質ヒドロキシアパタイトのディスクに付着したままである細胞および結合組織前駆体の数を低減させた。
【００４３】
（実施例８）
３つの複合骨移植片を、骨髄懸濁物中の有核細胞の濃度を、１ｍｌあたり１億から１億５０００万の有核細胞に増加させたこと以外は、実施例２に記載されたように調製した。ヒドロキシアパタイトディスクを通過した細胞の数のこの増加は、複合骨移植片中に保持された有核細胞および結合組織前駆細胞の数を、それぞれ、平均６６．８４％および５２．０％増加させた。これらの高細胞性懸濁物は、増加した粘度およびよりゆっくりな溶出流速を示した。
【００４４】
（実施例９）
ヘパリン処理したヒト骨髄サンプルを、選択的整形外科手順の間にインフォームドコンセントに基づいて、２ｃｃサンプルの吸引の繰り返しによって、前腸骨稜に沿った別個の部位から収集した。ヒト同種移植片骨マトリックス粉末の滅菌サンプル（４２５〜８５０ｍ直径、０．１ｍｌ容量）（Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を、１ｍｌのシリンジ中にロードした。スクリーンは、シリンジ中に粒子を保持した。骨髄細胞懸濁物のサンプルを、規定の濃度および流速で同種移植片粉末に通過させた。骨髄のサンプルを、細胞数およびＣＦＵ−Ｏについて、確立された技術を用いて、マトリックスに通す前および後でアッセイした。マトリックス中に保持された細胞およびＣＦＵ−Ｏの数を計算した。ＣＦＵ−Ｏ対有核細胞についての選択比もまた、計算した（保持されたＣＦＵ−Ｏ／ロードしたＣＦＵ−Ｏ、保持された細胞／ロードした細胞）。１．０よりも大きな選択比は、ＣＦＵ−Ｏが他の骨髄由来有核細胞に対して正に選択されたことを示す。
【００４５】
この結果は、脱鉱化同種移植片粉末に対する細胞およびＣＦＵ−Ｏ保持が、ロードした細胞の数が２５００万の細胞から２億の細胞へと増加するにつれて増加し、ここで飽和が生じたことを示した（流速３０ｍｍ／分）。飽和したマトリックスは、平均８０×１０6の有核細胞（２０〜１４０×１０6の範囲）および３８００のＣＦＵ−Ｏ（５００〜６６００の範囲）を保持した。３８，０００／ｍｌというＣＦＵ−Ｏのこの平均濃度は、最初の吸引物のＣＦＵ−Ｏの平均濃度より１９倍高かった。２５００万細胞というローディング密度での平均選択比は、２．４であったが、２億細胞というローディング密度では１．４まで低下した。このことは、ＣＦＵ−Ｏが、マトリックス表面に選択的に結合するようであるが、一旦マトリックス表面が細胞で飽和されると、マトリックスの間隙空間におけるさらなる細胞蓄積は、ずっと選択性が低いことを示す。１５ｍｍ／分〜６０ｍｍ／分の流速の比較は、保持される細胞またはＣＦＵ−Ｏの数に対するこの範囲の流速の影響が存在しないことを示した。マトリックスを通して３回までサンプルを再利用することは、細胞またはＣＦＵ−Ｏの保持を増加させなかった。本実施例に示すように、吸引によって収集されるヒトの骨髄由来骨芽前駆細胞は、手術中での使用（ｉｎｔｒａ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｕｓｅ）に適切な迅速な方法の使用により、同種移植片マトリックスにおいて１９倍濃縮され得る。
【００４６】
複合骨髄移植片を調製するこれらの方法は、代表的には、完了するまで６０分間も必要としなかった。従って、これらの方法は、骨髄ドナー／被移植者が手術室にいる間に実施され得る。従って、複合骨移植片を受けるために被移植者が侵襲的手順を経験しなければならない機会の数は、これらの方法を用いることにより低減され得る。
【００４７】
これらの方法に従って調製される改善された複合骨移植片は、生体適合性の移植可能な基材および結合組織前駆細胞の富化集団を含んでいた。本明細書中で用いる用語「結合組織前駆細胞の富化集団」は、全ての有核骨髄細胞と比較した場合の結合組織前駆細胞のパーセンテージが、最初の骨髄吸引物においてよりも複合骨髄移植片において大きいことを意味する。さらに、改善された複合骨髄移植片における結合組織前駆細胞の濃度は、最初の吸引物におけるこれらの細胞の濃度よりも約２倍大きかった。
【００４８】
改善された複合骨移植片はまた、結合組織前駆細胞以外の有核細胞（骨髄由来の内皮細胞および造血細胞を含む）の集団ならびに末梢血由来の血小板の集団を含んでいた。骨髄吸引懸濁物中の赤血球および液体血漿は、複合骨移植片中に選択的に保持されず、従って改善された複合骨移植片は、代表的には、５％未満の赤血球を最初の懸濁物中に含む。血漿中に存在するタンパク質および接着分子もまた、血漿中でのそれらの濃度および基材表面についての相対親和性の組合せ関数として基材の表面上に濃縮される。
【００４９】
改善された複合骨移植片は、骨髄吸引物ドナー中への、または免疫学的に適合性の宿主中への移植のために適切である。改善された複合骨移植片はまた、インビトロでの結合組織前駆細胞の増殖および分化に対する外因性のサイトカイン、ホルモン、および他の生物活性分子の効果を評価するために有用である。
【００５０】
移植可能移植片を調製する方法をある程度詳細に記載してきたが、種々の適応および改変が、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲から逸脱することなく行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明に従って複合骨移植片を調製するために使用される装置の、いくらか模式的な図である。
【図２ａ】  図２ａは、ヒドロキシアパタイト基材を含む複合骨移植片上に保持された有核細胞の数に対する、骨髄吸引懸濁物中の有核細胞の濃度を増大することの効果を示すグラフである。データは、同一の条件を用いた９例のヒト被験体からの結果をまとめている。
【図２ｂ】  図２ｂは、ヒドロキシアパタイト基材を含む複合骨移植片上に保持された結合組織前駆細胞の数に対する、骨髄吸引懸濁物中の有核細胞の濃度を増大すること効果を示すグラフである。データは、同一の条件を用いた９例のヒト被験体からの結果をまとめている。
【図３ａ】  図３ａは、脱鉱化（ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ）のヒト海綿質骨マトリックス基材を含む複合骨移植片上に保持された有核細胞の濃度に対する、骨髄吸引懸濁物中の有核細胞の濃度を増大することの効果を示すグラフである。
【図３ｂ】  図３ｂは、脱鉱化ヒト海綿質骨マトリックス基材を含む複合骨移植片上に保持された結合前駆細胞の数に対する、骨髄吸引懸濁物中の有核細胞の濃度を増大することの効果を示すグラフである。データは、同一の条件を用いた３例のヒト被験体からの結果をまとめている。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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