(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性の基板、前記基板上に設けられた測定極と対極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素と電子メディエータを含む反応層、前記電極系と前記反応層とを含む試料液供給路、試料供給部、および前記試料供給部と試料液供給路との間に設けられた、血球を濾過するフィルタを具備し、前記フィルタで血球を濾過された血漿が毛管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバイオセンサであって、前記フィルタは、その一次側の断面積が前記試料液供給路の開口部の断面積より大きく、かつ前記試料液供給路の開口部に位置する二次側の断面積より大きいことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記試料液供給路の断面積は、試料液供給路の開口部の断面積と等しいかそれより小さい請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記フィルタは、その二次側の断面積が前記試料液供給路の開口部の断面積と等しいかそれより大きい請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記フィルタは、三次元的に連なる空隙部を有する多孔体からなり、この多孔体は毛管作用により血液を前記試料供給部側から試料液供給路側へ移動させるが、血漿と血球との流通抵抗の差により血球を濾過する作用を有する請求項１〜３のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記フィルタの試料供給部から試料液供給路までの領域において、フィルタの表面を一回り囲む空隙部を有する請求項１〜４のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記フィルタの二次側の先端が電極と非接触である請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記試料液供給路が、前記基板とこれに組み合わされたカバー部材との間に形成された請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記カバー部材の少なくとも前記フィルタおよび試料液供給路を覆う部分が透明である請求項７記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記カバー部材に界面活性剤が担持または固定化されている請求項７記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、試料中の特定成分について、迅速、高精度、かつ簡便に定量することができるバイオセンサ、特にコレステロールセンサに関する。
【０００２】
背景技術
従来のバイオセンサの一例として、グルコースセンサについて説明する。
グルコースの定量方法としては、グルコースオキシダーゼと酸素電極または過酸化水素電極とを組み合せた方式が一般に知られている。グルコースオキシダーゼは、酸素を電子メディエータとして基質であるβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに選択的に酸化する。この反応にともない酸素は過酸化水素に還元される。このときの酸素消費量を酸素電極によって測定するか、または過酸化水素の生成量を白金電極等を用いた過酸化水素電極によって測定することにより、グルコースの定量が行われる。
【０００３】
しかし、上記の方法では、測定対象によっては溶存酸素濃度の影響を大きく受け、また酸素のない条件下では測定が不可能となる。そこで、酸素を電子メディエータとして用いず、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体などの金属錯体や有機化合物を電子メディエータとして用いるタイプのグルコースセンサが開発されている（特開平２−０６２９５２号公報）。
【０００４】
このバイオセンサは、絶縁性の基板上にスクリーン印刷等の方法で測定極、対極および参照極からなる電極系を形成し、この電極系上に、親水性高分子と酸化還元酵素および電子メディエータを含む酵素反応層を形成したものである。この酵素反応層には、必要に応じて緩衝剤が加えられる。
【０００５】
このバイオセンサの酵素反応層上に、基質を含む試料液を滴下すると、酵素反応層が溶解して、酵素と基質が反応し、前記反応に伴い電子メディエータが還元される。酵素反応終了後、この還元された電子メディエータを電気化学的に酸化する酸化電流値から試料液中の基質濃度を求めることができる。
このタイプのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子メディエータの還元体を電極で酸化し、その酸化電流値からグルコース濃度を求めることができる。
【０００６】
このようなバイオセンサは、測定対象物質を基質とする酵素を用いることで、様々な物質に対する測定が原理的には可能である。例えば、酸化還元酵素にコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼおよびコレステロールエステラーゼを用いれば、各種医療機関で診断指針に用いられる血清中コレステロール値を測定することができる。
【０００７】
コレステロールエステラーゼの酵素反応の進行は非常に遅いので、適切な界面活性剤を添加することにより、コレステロールエステラーゼの活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮することができる。
しかし、反応系に界面活性剤が含まれることから、界面活性剤が血球に悪影響を及ぼすため、全血による測定は不可能であった。
【０００８】
上記のように、血液中のコレステロール値を測定する場合、反応系に界面活性剤が含まれていることから、界面活性剤が血液中の赤血球に悪影響を及ぼす。それが原因となり、グルコースセンサのように全血そのものを測定することが不可能となっていた。そこで、赤血球をろ過した血漿のみを迅速にセンサに供給するために、試料液供給路の開口部付近にろ過部を設ける提案がなされている。しかし、ろ過した血漿がセンサ内に流入する速度が遅く、一定ではないことから、応答値がばらつき、また血漿がセンサ内に入る際しばしば気泡が生じ、測定不可能となっていた。
【０００９】
本発明は、上記のような不都合をなくし、血球を濾過された血漿が迅速に電極系に達するように改良したバイオセンサを提供することを目的とする。
本発明は、高精度で応答性が優れ、全血を測定対象とするコレステロールセンサを提供することをも目的とする。
【００１０】
発明の開示
本発明のバイオセンサは、絶縁性の基板、前記基板上に設けられた測定極と対極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素と電子メディエータを含む反応層、前記電極系と前記反応層とを含む試料液供給路、試料供給部、および前記試料供給部と試料液供給路との間に設けられた、血球を濾過するフィルタを具備し、前記フィルタで血球を濾過された血漿が毛管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバイオセンサであって、前記フィルタは、その一次側の断面積が前記試料液供給路の開口部の断面積より大きいことを特徴とする。
【００１１】
ここに用いるフィルタは、三次元的に連なる空隙部を有する多孔体からなり、この多孔体は毛管作用により血液を前記試料供給部側から試料液供給路側へ移動させるが、血漿と血球との流通抵抗の差により血球を濾過する作用を有する。このフィルタには、ガラス繊維、セルロース、パルプなどの好ましくは親水性の繊維からなる不織布、濾紙、その他の多孔質体が用いられる。
前記フィルタは、その一次側の断面積が前記試料液供給路の開口部に位置する二次側の断面積と同じかそれより大きいのが好ましい。
【００１２】
発明を実施するための最良の形態
上記のように、本発明は、妨害物質である血球を、フィルタにより除去し、速やかにセンサの電極系へ血漿を流入させるようにしたものである。すなわち、電極系および反応層を含む試料液供給路と試料供給部との間に、血球を濾過する作用を有し、一次側の断面積が前記試料液供給路の開口部の断面積より大きいフィルタを設け、これによってフィルタで血球を濾過された血漿が毛管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるようにするものである。
【００１３】
本発明の好ましい実施の形態において、試料液供給路は、前記基板とこれに組み合わされたカバー部材との間に形成される。
本発明の他の好ましい実施の形態において、前記カバー部材の少なくとも前記フィルタおよび試料液供給路を覆う部分は透明である。
血球を分離された血漿を速やかに電極系へ導入させるには、さらに次のいずれかの条件を満たすことが好ましい。
【００１４】
１）試料液供給路の断面積は、試料液供給路の開口部の断面積と等しいかそれより小さい。
２）フィルタは、その電極側の端部の断面積が、試料液を導入する側、すなわち一次側の断面積と同じかそれよりも小さくなっている。
３）フィルタは、その膨張が妨げられないように、支持体に保持されている。
【００１５】
つまり、フィルタの試料供給部に面する一次側から、試料液供給路の終端に開口する空気孔側にかけて、試料液が流れる部分のセンサ内中空部およびフィルタの断面積が徐々に小さくなっている構造が最も好ましい。
フィルタの電極側先端の断面積が小さい例として、フィルタ全体の形状が凸型、円錐、台形などであるものがある。
【００１６】
フィルタ先端の断面積が小さいとは、フィルタの電極側先端部分を支持している部分が試料液供給路にかけて狭くなっていることである。
妨害物質である血球を完全に除去するためには、試料液が、フィルタを必ず通過するように、フィルタはその試料供給部から試料液供給路までの領域の範囲において、フィルタ支持部と非接触の箇所、すなわちフィルタの表面を一回りする空隙部が１箇所以上あることが好ましい。これがないと、フィルタを通過せずフィルタ支持部を伝わった血球が電極系へ流入する可能性がある。
【００１７】
また、フィルタの二次側の断面積が一次側の断面積より小さい場合と、フィルタの一次側から二次側までの断面積が同じ場合とを比較すると、前者は血球分離位置がより一次側である。そして、後者では、血球分離位置がより二次側であるため、試料液供給路内に血球が混入する場合がある。
これらの構成や形状により、試料液中の妨害物質を除去し、速やかにセンサ内に血漿を流入させることが可能である。
【００１８】
フィルタの電極側先端と電極の位置関係については、フィルタは電極とは非接触であることが好ましい。
ろ過部と電極式バイオセンサの接続位置は、通常、試料液供給路の開口部側に位置するのがよいが、省スペース化として、空気孔側に位置していてもよい。この場合は、試料液供給路の開口部が空気孔の役割をする。
【００１９】
カバーおよびスペーサなどのフィルタ支持部は、透明であることが好ましい。なぜなら、フィルタにより試料液がろ過される工程、およびろ過された試料液が毛細管現象によって試料液供給路の内部に吸引される工程を目視できることにより、ろ過が成功してるかどうかを確認することができるからである。
電子メディエータとしては、フェリシアン化カリウムの他、コレステロールオキシダーゼなどの酸化還元酵素との電子伝達能を有するレドックス化合物から選択して用いることができる。
【００２０】
用いる酸化還元酵素は、測定対象物質を基質とする酵素であり、グルコースを測定対象とするセンサでは、グルコースオキシダーゼを用いる。診断指針に用いられる血清中のコレステロール値を測定するには、コレステロールの酸化反応を触媒する酵素コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼとコレステロールエステルをコレステロールに変化させる過程を触媒する酵素コレステロールエステラーゼを用いる。コレステロールエステラーゼの酵素反応の進行は非常に遅いので、適切な界面活性剤を添加することにより、コレステロールエステラーゼの活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮することができる。これらは、センサ内の電極系上またはその近傍の位置に配置する。電極系を設けた基板に組み合わされて基板との間に電極系に試料液を供給する試料液供給路を形成するカバー部材を有するセンサでは、前記試料液供給路に露出する部分や試料液供給路の開口部などに設けることができる。いずれの位置であっても、導入された試料液によって反応試薬層が容易に溶解して電極系に到達できることが好ましい。電極を保護し、形成される反応層の剥離を抑制するために、電極系上に接して親水性高分子層が形成されることが好ましい。また、電極系以外でも、反応層を形成する際の下地として親水性高分子層が形成されるか、最下層の反応層に親水性高分子が含まれることが好ましい。
【００２１】
電子メディエータを含む層は、溶解性を高めるために、界面活性剤と分離することが好ましい。また、保存安定性のために、コレステロールの酸化反応を触媒する酵素コレステロールエステラーゼと分離することが好ましい。
血糖値を測定するバイオセンサでは、試料液が反応層へ導入されるのを容易にするため、電極系上に形成された層などを被覆するように、脂質を含む層を形成する例がある（たとえば特開平２−０６２９５２号公報）。本発明のコレステロールを測定するバイオセンサでは、界面活性剤が含まれ、これが脂質と同様の役割も果たすため、脂質層はなくてもよい。
【００２２】
親水性高分子としては、水溶性セルロース誘導体、特にエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースの他、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、ポリアクリル酸およびその塩、デンプンおよびその誘導体、無水マレイン酸の重合体およびその塩、ポリアクリルアミド、メタクリレート樹脂、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレートなどを用いることができる。
【００２３】
界面活性剤には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ポリエチレングリコールモノドデシルエーテル、コール酸ナトリウム、ドデシル−β−マルトシド、ジュークロースモノラウレート、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミドおよびポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルから選択することができる。
【００２４】
脂質としては、使用する場合、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質で、両親媒性脂質が好適に用いられる。
酸化電流の測定方法としては、測定極と対極のみの二電極方式と、参照極を加えた三電極方式があり、三電極方式の方がより正確な測定が可能である。
【００２５】
以下、具体的な実施の形態により本発明を詳細に説明する。
図１は一実施の形態に係るバイオセンサの縦断面図、図２はその反応層、スペーサおよびカバーを除いた平面図、図３は反応層およびフィルタを除いたバイオセンサの分解斜視図である。
【００２６】
１はポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板を示す。この基板１は、左半分１ａは厚みが薄く、右半分１ｂは左半分の約２倍の厚みを有する。厚みの薄い方の部分１ａには、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷してリード２、３および電極系の下地を形成してある。基板１上には、さらに樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを印刷することにより、測定極４と対極５を含む電極系を形成している。また、特定の領域に絶縁性ペーストを印刷することにより絶縁層６を形成してある。絶縁層６は、測定極４および対極５の露出部分の面積を一定とし、かつリード２および３を部分的に覆っている。基板１の厚みの厚い部分１ｂには、上面に開口する凹部７および８が設けられている。
【００２７】
前記の基板１に組み合わせるスペーサ１１は、基板１の絶縁層６をほぼ覆う大きさの平板部１１ａと、基板の部分１ｂの周縁部を覆って基板１上に後述するフィルタを収容する空間部を形成するための、高さの高い略Ｕ字部１１ｂとからなる。Ｕ字状部１１ｂは、左端部１６には順次高さが低くなるようにテーパをつけて、平板部１１ａに連なる部分は平板部と同じ高さになるようにしている。Ｕ字状部１１ｂは、さらに、基板１の凹部７と８との間の仕切部９に対応する部分の上方に、フィルタを押さえる押さえ部１９を有する。平板部１１ａは、上下に貫通し、Ｕ字状部側に開放したスリット１２を有する。
【００２８】
カバー２１は、それぞれスペーサ１１の平板部１１ａおよび部分１１ｂを覆う部分２１ａおよび２１ｂを有し、部分２１ｂには、スペーサのテーパ部１６に対応させて傾斜した部分２６を有する。カバー２１は、さらに基板１のスリット１２の終端に連通する空気孔２２、および、凹部８と、スペーサ１１の押さえ部１９の右方の開放部１８とに連通する透孔２８を有する。
【００２９】
基板１上および／またはカバー１１側に反応試薬層を形成し、さらに基板１上にフィルタ２０をセットして、スペーサ１１およびカバー２１を基板１に組み合わせることによって、図１に示すようなバイオセンサが作成される。図１において、１０は電極系を示す。フィルタ２０は、後端の上下が基板１の仕切部９とカバー２１の押さえ部１９によって、また前端部が基板１の試料液供給路の開口部に連なる部分とカバー２１の傾斜部２６によってそれぞれ挟まれて固定される。そして、フィルタ２０は、その先端がスペーサ１１のスリット１２の部分に形成された試料液供給路内に臨んでいる。
【００３０】
このように固定されたフィルタ２０は、基板１の凹部７上に位置する部分は、その周囲が一回り分基板やカバー部材に接触していない。このように、フィルタ２０の一部がフィルタ支持部と非接触の箇所、すなわちフィルタを一回りする空隙部があることにより、フィルタを通過せずにフィルタ支持部を伝わって血球が電極系へ流入するのを阻止することができる。
【００３１】
図１及び図２において、Ｆ１はフィルタ２０の一次側の断面積を表し、Ｆ２はフィルタ２０の試料液供給路の開口部に位置する二次側の断面積を表す。また、Ｓ１は試料液供給路の開口部の断面積を表し、Ｓ２は試料液供給路の断面積を表す。
本発明においては、Ｓ１＜Ｆ１とする。これによって血球を濾過された血漿が迅速に電極系に達する。好ましくはＳ２≦Ｆ１である。より好ましくはＦ２≦Ｆ１である。
【００３２】
このセンサを用いて血液中のコレステロール値を測定するには、試料の血液をカバー２１の透孔２８の部分から基板１の凹部８上に供給する。ここに供給された血液は、フィルタ２０の端部からその内へ浸透する。フィルタ２０内では、血球の浸透速度は液体成分である血漿より遅いので、血漿がフィルタの電極系側の端部から浸み出す。そしてこの浸みだした血漿は、酵素等からなり、電極系を覆う位置またはその直上のカバー裏面に担持された反応試薬を溶解しながら電極系近傍から、さらに空気孔２２の部分までの試料液供給路全体を満たす。試料液供給路全体が液体で満たされると、フィルタ２０内の液体の流動も停止し、その時点で、血球はフィルタ２０の電極系側の端部に到達せず、その位置に留め置かれる。従って、フィルタ２０は、血漿が試料液供給路全体を満たすだけの量が通過してなお血球がフィルタの二次側に達しない程度に、血漿と血球との流通抵抗の差があるように設計される。本発明のフィルタは、平均孔径約１〜７μｍ程度のデプスフィルタが好適である。
【００３３】
このような、血球濾過の過程を経て、血漿により溶解された反応試薬層と血漿中の測定成分、コレステロールセンサであればコレステロール、との化学反応が生じ、一定時間経過後、電極反応により電流値を測定し、血漿中の成分を定量することができる。図４は、試料液供給路の電極系近傍における反応試薬層の配置の例を示す。基板１の電極系上には、親水性高分子のカルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（以下単にＣＭＣで表す）の層３０、および反応試薬の例えば電子メディエータを含む層３１ａが形成してある。また、カバー２１にスペーサ１１を組み合わせたカバー部材の裏面には、試料液供給路に露出する面に、界面活性剤の層３２と酸化還元酵素を含む反応試薬層３１ｂが形成されている。
【００３４】
図５、６および７は、センサの変形例を略図で示している。
図５は、試料供給部の異なる例を示している。図５（ａ）は、図１のように、試料供給部８が試料液を受容するような凹部で構成されている。図５（ｂ）は、フィルタ２０の端部上面が露出し、そこに試料液を添加するようにした試料供給部８を有する例である。図５（ｃ）は、フィルタ２０の一次側端面および端部上面が露出している。従って、基板１上の試料供給部８のみでなく、フィルタ２０の端部上面へ試料を添加してもよい。
【００３５】
図６は、フィルタの種々の形状を示す平面図である。図６（ａ）は、一次側から二次側まで同じ幅のフィルタの例である。図６（ｂ）は、一次側から二次側に順次幅が狭くなるようにテーパを付したもので、略台形である。図６（ｃ）は、一次側の幅が二次側幅より広くなるように途中で幅を変えた例である。
【００３６】
図７は、フィルタの断面形状が異なる例を示す。図７（ａ）ないし（ｃ）は、一次側の断面を二次側の断面より大きくなるようにテーパを付したものである。図７（ｄ）および（ｅ）は、一次側および二次側とも同じ断面となるようにしたものである。
【００３７】
上記図１および図５〜７に示すように、試料液供給路を構成するスリット１２の液が流通する方向に垂直な断面積は、いずれもフィルタ２０の断面積に比べて小さくしてある。そして、フィルタ２０は、その全体がほぼ均一な密度を有するものとしてある。このように本発明は、試料液供給路の断面積Ｓ２をフィルタ２０の一次側の断面積Ｆ１より小さくすることにより、フィルタで血球を濾過された血漿が毛管現象によって試料液供給路内に迅速に吸引されるようにするものである。フィルタ先端の断面積を小さくすることにより、速やかにセンサ内に血漿を流入させることが可能となる。
【００３８】
図５に示す試料供給部と、図６に示すフィルタの平面形状および／または図７に示すフィルタの断面形状とを組み合わせた場合でも、速やかに血漿を試料供給路内に流入させることができるようになる。
図示のような構造のバイオセンサでは、フィルタの一次側の幅は５ｍｍ以下、厚さは２ｍｍ以下が好ましい。試料液供給路の開口部の幅は２ｍｍ以下、厚さは２００μｍ以下が好ましい。
図８は、本発明のさらに他の実施形態に係るバイオセンサの縦断面図、図９はその試薬層を除いた分解斜視図である。
【００３９】
絶縁性基板３１上には、図１の場合と同様にして、リード３２および３３、それぞれのリードに接続された作用極３４および対極３５、ならびに絶縁層３６が形成されている。この基板３１上には、複数のスペーサ４１、４３、４５、４７および４９、ならびにカバー５２が組み合わされ、スペーサ４３とカバー５２との間には、透孔４６、４８および５０の部分にフィルタ５１がセットされている。カバー５２の透孔５３が試料供給部を構成し、スペーサ４１および４３に設けられた透孔４２および４４が試料液供給路を構成している。スペーサ４５および４９の透孔４６および５０は、その径をフィルタ５１の径より大きくしているので、フィルタ５１の周囲には、５５および５６で表すように、フィルタ５１を囲む空隙部が形成される。スペーサ４７は、フィルタ５１の外周と部分的に接し、フィルタを位置決めする役割をしている。スペーサ４１は、前記の試料液供給路の終端部側を大気に開放するための一対の空気孔５４を有する。かくして試料供給部となる透孔５３から電極系に至るフィルタ５１および試料液供給路には毛管現象により試料液が導入され、フィルタ５１で濾過された血漿が電極系に到達すると、試料液の移動は停止するようになる。
【００４０】
ここで、フィルタ５１を囲む空隙部５５および５６の高さを定めるスペーサ４９および４５の厚みは１００μｍ以上であることが好ましい。スペーサ４１は、その透孔４２の部分が試料液と試薬との反応の場を提供するものであり、スペーサ４１の厚みは２００μｍ以下が好ましい。
この例では、電極系上に、ＣＭＣ層６１および電子メディエータ層６２が形成され、スペーサ４３の裏面に酵素と界面活性剤を含む層６３が形成されている。
【００４１】
図１０は、前記のように、カバー側に設けた試料供給部から電極系に向けて、試料液を重力方向に供給するセンサにおけるフィルタの形状の例を示す。図１０（ａ）は、図８のように、一次側および二次側が同じ断面をもつフィルタ５１を用いる例である。図１０（ｂ）は、二次側の断面積を一次側の断面積より小さくした例である。
以下、本発明の実施例を説明する。
【００４２】
実施例１
図１〜４の構成を有するコレステロールセンサで、反応層３１ａが電子メディエータを含み、反応層３１ｂがコレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、および界面活性剤を含み、層３２が界面活性剤からなる。このセンサの作製手順を以下に示す。
【００４３】
まず、基板１の電極系上に、カルボキシルメチルセルロースのナトリウム塩の０．５ｗｔ％水溶液を５μｌ滴下し、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させることによりＣＭＣ層３０を形成した。次に、フェリシアン化カリウム水溶液４μｌ（フェリシアン化カリウム７０ｍＭ相当）をＣＭＣ層３０上に滴下し、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させることにより、フェリシアン化カリウムを含む反応層３１ａを形成した。
【００４４】
界面活性剤であるポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）の２ｗｔ％エタノール溶液を、カバーとスペーサを組合せたカバー部材のスリットにより形成される凹部に２μｌ滴下し、室温で３分間乾燥させることにより界面活性剤層３２を形成した。前記スリットの幅は２ｍｍ、長さ４．５ｍｍであり、スペーサの厚みは１００μｍである。
【００４５】
ノカルジア由来のコレステロールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．６、以下ＣｈＯＤと略す）とシュードモナス由来のコレステロールエステラーゼ（ＥＣ．３．１．１．１３、以下ＣｈＥと略す）を溶解した水溶液に、界面活性剤であるポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した。この混合水溶液を、界面活性剤層３２上に１.５μｌ滴下し、−１９６℃の液体窒素にて凍結後、梨型フラスコ内に収納して凍結乾燥器中で一晩乾燥させることにより、４８０ユニット（Ｕ）／ｍｌのコレステロールオキシダーゼ、１２００Ｕ／ｍｌのコレステロールエステラーゼおよび２ｗｔ％の界面活性剤を含む反応層３１ｂを形成した。
【００４６】
こうして作製したセンサの基板１上に、上辺２ｍｍ、下辺４ｍｍ、高さ３ｍｍの台形に打ち抜いた厚さ６００μｍ、平均孔径２．３μｍのガラス繊維濾紙を、作用極に接触しないように、図２のように設置した。
この後、前記のカバー部材を基板に接着することにより、図１のコレステロールセンサを作製した。
【００４７】
比較例１
図１１および図１２に示すように、フィルタ２０’の寸法を幅２ｍｍ、長さ２７ｍｍ、厚さ１００μｍとした他は実施例１と同様のコレステロールセンサを組み立てた。
【００４８】
実施例１および比較例１のコレステロールセンサＡおよびＢに、試料液として全血２０μｌを試料液導入口となるカバー２１の透孔２８より基板１の凹部８上に導入し、３分後に対極を基準にして測定極にアノード方向へ＋０．５Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。その結果を図１３に示す。実施例１および比較例１のセンサのフィルタの見掛けの体積は、いずれも約５．４ｍｍ3である。
図から明らかなように、本発明のセンサによれば、コレステロール濃度と応答値との間に良好な直線性が得られる。
【００４９】
産業上の利用の可能性
本発明によれば、妨害物質である血球を、フィルタにより除去し、しかも迅速に電極系へ供給することができ、応答特性の優れた電気化学的バイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の一実施の形態に係るバイオセンサの縦断面図である。
【図２】  同センサの反応層、スペーサおよびカバーを除いた平面図である。
【図３】  同センサの分解斜視図である。
【図４】  同センサの要部の拡大断面図である。
【図５】  センサの試料供給部の構成例を示す縦断面略図である。
【図６】  センサのフィルタの変形例を示す平面略図である。
【図７】  センサのフィルタの変形例を示す縦断面略図である。
【図８】  本発明の他の実施の形態に係るセンサの縦断面図である。
【図９】  同センサの分解斜視図である。
【図１０】  センサのフィルタの変形例を示す縦断面略図である。
【図１１】  比較例のセンサの縦断面図である。
【図１２】  同センサの平面図である。
【図１３】  本発明の実施例および比較例のコレステロールセンサの応答特性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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