(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＡ、配列番号３に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＢ、配列番号７に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＣ、配列番号８に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＤ、配列番号９に示される塩基配列の遺伝子ｐａｐＡ、配列番号１０に示される塩基配列の遺伝子ｐａｐＭ、配列番号４に示される塩基配列の遺伝子ｓａｍＳ、配列番号５に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＡ、配列番号１１および配列番号１２に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＣ、配列番号１３および配列番号１４に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＤ、配列番号１５および配列番号１６に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＥ、および配列番号６に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＲ、ならびに
（ｂ）上記の（ａ）に記載の遺伝子の配列から遺伝暗号の縮重に起因して生じる配列の遺伝子、
から選択されることを特徴とするストレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＡ、配列番号３に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＢ、配列番号７に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＣ、配列番号８に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＤ、配列番号９に示される塩基配列の遺伝子ｐａｐＡ、配列番号１０に示される塩基配列の遺伝子ｐａｐＭ、配列番号４に示される塩基配列の遺伝子ｓａｍＳ、配列番号５に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＡ、配列番号１１および配列番号１２に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＣ、配列番号１３および配列番号１４に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＤ、配列番号１５および配列番号１６に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＥ、および配列番号６に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＲから選択されることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のストレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡを含んで成る組換えＤＮＡ。
【請求項４】
下記の制限酵素の切断位置を示す４種の図式でそれぞれ表されるコスミドｐＩＢＶ１、コスミドｐＩＢＶ２、コスミドｐＩＢＶ３またはコスミドｐＩＢＶ４を含んで成ることを特徴とする請求項３記載の組換えＤＮＡ。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【請求項５】
請求項１および２のいずれか１項に記載のＤＮＡ、あるいは請求項３および４のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡを含んで成ることを特徴とする自律的に複製でき、そして／または統合可能な発現ベクター。
【請求項６】
ＤＮＡが、下記の制限酵素の切断位置を示す図式でそれぞれ表される４種のコスミド、ならびに１８種のプラスミドであって、コスミドｐＩＢＶ１、コスミドｐＩＢＶ２、コスミドｐＩＢＶ３、コスミドｐＩＢＶ４、プラスミドｐＶＲＣ４０２、プラスミドｐＶＲＣ５０１、プラスミドｐＸＬ２０４５、プラスミドｐＶＲＣ１１０５、プラスミドｐＶＲＣ１１０６、プラスミドｐＶＲＣ１１０４、プラスミドｐＶＲＣ９００、プラスミドｐＶＲＣ１０００、プラスミドｐＶＲＣ５０９、プラスミドｐＶＲＣ９０３、プラスミドｐＶＲＣ４０９、プラスミドｐＶＲＣ５０５、プラスミドｐＶＲＣ７０１、プラスミドｐＶＲＣ７０２、プラスミドｐＶＲＣ５０８、プラスミドｐＶＲＣ４０４、プラスミドｐＶＲＣ５０７およびプラスミドｐＶＲＣ７０６から選択されることを特徴とする請求項５記載のベクター。
【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【請求項７】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡ、または請求項５および６のいずれか１項に記載のベクターを含有する組換え細胞。
【請求項８】
請求項７記載の組換え細胞を培養し、そして生産されたポリペプチドが回収されることを特徴とする、ストレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチドの生産方法。
【請求項９】
ストレプトグラミン生産を増幅させるための請求項１および２のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは請求項３および４のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡのストレプトグラミンを生産する細胞中での使用方法。
【請求項１０】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡ、または請求項５および６のいずれか１項に記載のベクターの1つ以上を、ストレプトグラミンまたはストレプトグラミンの前駆体を生産する細胞に導入し、次いで該細胞中で増幅させ、
該細胞をストレプトグラミン生産条件下で培養し、そして
生産されたストレプトグラミンを回収することを特徴とするストレプトグラミンの生産方法。
【請求項１１】
プリスチナマイシンまたはバージニアマイシンの生産である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ストレプトグラミンを生産する細胞について、配列番号２に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＡ、配列番号３に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＢ、配列番号７に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＣ、配列番号８に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＤ、配列番号９に示される塩基配列の遺伝子ｐａｐＡ、配列番号１０に示される塩基配列の遺伝子ｐａｐＭ、配列番号４に示される塩基配列の遺伝子ｓａｍＳ、配列番号５に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＡ、配列番号１１および配列番号１２に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＣ、配列番号１３および配列番号１４に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＤ、配列番号１５および配列番号１６に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＥ、および配列番号６に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＲから選択される少なくとも１つの生合成経路の遺伝子の突然変異がなされることを特徴とする、ストレプトグラミンの生合成段階でブロックされた細胞を調製する方法。
【請求項１３】
突然変異がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｓｉｔｕで、少なくとも１つの対象とする遺伝子中の塩基のサプレッション、置換、削除もしくは付加または遺伝子破壊により行われることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの遺伝的修飾を、配列番号２に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＡ、配列番号３に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＢ、配列番号７に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＣ、配列番号８に示される塩基配列の遺伝子ｓｎａＤ、配列番号９に示される塩基配列の遺伝子ｐａｐＡ、配列番号１０に示される塩基配列の遺伝子ｐａｐＭ、配列番号４に示される塩基配列の遺伝子ｓａｍＳ、配列番号５に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＡ、配列番号１１および配列番号１２に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＣ、配列番号１３および配列番号１４に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＤ、配列番号１５および配列番号１６に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＥ、および配列番号６に示される塩基配列の遺伝子ｓｎｂＲから選択されるストレプトグラミンの生合成に関与する遺伝子に保有することを特徴とする、ストレプトグラミンを生産する微生物の突然変異体。
【請求項１５】
ストレプトグラミンの生合成経路の段階でブロックされた細胞を請求項１２記載の方法により調製し、
該細胞を培養し、そして
蓄積された中間体を回収する、
ことを特徴とするストレプトグラミンの生合成の中間体の生産方法。
【請求項１６】
ストレプトグラミンの生合成経路の段階でブロックされた細胞を請求項１２記載の方法により調製し、
該細胞を培養し、そして
細胞により蓄積された中間体を培養培地から分離した後に適当なところで修飾する、
ことを特徴とするストレプトグラミンから誘導される分子の製造方法。
【請求項１７】
請求項１４記載の突然変異体に請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは請求項５および６のいずれか１項に記載のベクターを導入して、培養することを含んで成る、ストレプトグラミンの生産方法。
【請求項１８】
ハイブリッド抗生物質を生成するための請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは請求項５および６のいずれか１項に記載のベクターの該ハイブリッド抗生物質を生成する細胞中での使用方法。
【請求項１９】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現から生じるポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドＳｎａＡ、配列番号３に示されるアミノ酸配列のポリペプチドＳｎａＢ、配列番号７に示されるアミノ酸配列のポリペプチドＳｎａＣ、配列番号８に示されるアミノ酸配列のポリペプチドＳｎａＤ、配列番号９に示されるアミノ酸配列のポリペプチドＰａｐＡ、配列番号１０に示されるアミノ酸配列のポリペプチドＰａｐＭ、配列番号４に示されるアミノ酸配列のポリペプチドＳａｍＳ、配列番号５に示されるアミノ酸配列のポリペプチドＳｎｂＡ、配列番号１１および配列番号に示されるアミノ酸配列のポリペプチド１２ＳｎｂＣ、配列番号１３および配列番号１４に示されるアミノ酸配列のポリペプチドＳｎｂＤ、配列番号１５および配列番号に示されるアミノ酸配列のポリペプチド１６ＳｎｂＥおよび配列番号６に示されるアミノ酸配列のポリペプチドＳｎｂＲから選択されるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
本発明はストレプトグラミン（streptogramines）の生合成に関与する新規ポリペプチドに関し、同時にストレプトグラミンのＡおよびＢ成分の生合成に関する遺伝子の単離および同定、目的物の生産レベルが増大したこれら遺伝子の発現、ならびに新規抗生物質の合成またはストレプトグラミンからの誘導体を導くことができるブロックされた変異体の構築物に関する使用を含んで成る。
ストレプトグラミンは化学的に異なる２種類の分子型を組み合わせて構成されている抗生物質の均一な群を形成している。一方はポリ不飽和マクロラクトン（Ａ−群成分、それらの２つの構造例が第１図に表されている）、そして他方はデプシペプチド（Ｂ−群、それらの３つの構造例が第２図に表されている）である。この群は多くの抗生物質（表１および第３図を参照にされたい）を含んで成ることができ、それらの起源により様々な名前で知られている、例えばプリスチナマイシン（pristinamycines）、ミカマイシン（mikamycines）およびバージニアマイシン（virginiamycines）がある（概説としてCocito 1979、1983を参照にされたい）。
ＡおよびＢ成分は、別個の成分の１００倍にも達することができる相乗的な抗バクテリア活性を有し、そしてこれは各成分と比較して殺バクテリア性である（Cocito 1979）。この活性はブドウ球菌属および連鎖球菌属のようなグラム−陽性バクテリアに対してより特別に効果的である（Cocito 1979、Videau 1982）。このＡおよびＢ成分はリボゾームの５０Ｓサブユニットに結合することによりタンパク質合成を阻害する（Cocito 1979；概説にはDi Giambattistaら、1989を参照にされたい）。
ストレプトグラミンは表１に表すように多くのストレプトミセス属を含む放線菌類により主として生産される。加えて、ストレプトグラミンはバーナマイシンを合成するミクロモノスポーラ（Micromonospora）のような真核生物でも合成される。放線菌類はそれらが生産する大量の二次代謝産物（多くの抗生物質（ベータ−ラクタム、テトラサイクリン、マクロリッド、アミノグリコシド、ポリ酢酸等）、除草剤、抗ガン剤、抗菌剤、イムノモジュレーターおよび酵素阻害剤を含む）ゆえに重要な微生物群を構成している。現在、放線菌に関しては種々雑多な種類に属する抗生物質、ならびに染料（概説はChater 1990を参照にされたい）のような他の二次代謝産物に関連する生合成経路はすでに研究されている。このバクテリア群の重要な観点は同一の生合成経路に関与する遺伝子類、構造遺伝子類、および耐性遺伝子（１つまたは複数）、ならびに制御遺伝子（１つまたは複数）が天然に一緒に染色体上に群を成し、１００ｋｂ以上にもなることができるクラスターを構成している点である（Hopwoodら1986a、Hopwoodら1986b、Hallamら1988、Anzaiら1987、Ohnukiら1985）。今日までこの考察に反対するものは見いだされていない。このような構造的組織は、生合成遺伝子をクローニングするための戦略を開発するのに大変興味深い。要するに、種々の手法によりすでにクローン化された単一遺伝子から出発して、生合成、耐性または制御遺伝子を染色体に沿って歩き、そして生合成クラスターの遺伝子の組をこのように単離することが可能である。
ストレプトグラミンの各成分の生合成経路に関する我々の知識は未だ完全ではないが、各分子の種々の部分の起源は放射線活性標識により同定された（kingstonら、1983）。したがってＡ−型成分は、酢酸塩と例えばセリンおよびグリシンのような数個のアミノ酸との縮合に由来する２つの領域から成る。Ｂ−型成分に関しては、ペプチド鎖中に存在するすべてのアミノ酸が天然アミノ酸であることが示された（HookおよびVining、1973）。しかしこれらの経路に関与するペプチドは今日までその分子特性を決定するために十分な量で精製されてはおらず、生合成遺伝子も記載されていない。Ｂ−型成分の生合成段階は、２つの部分に分けることができる：
１）大環状の前駆体またはその類似体の合成：３−ヒドロキシピコリン酸、Ｌ−２−アミノ酪酸、ｐ−ジメルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−オキソ−Ｌ一ピペコリン酸、Ｌ−フェニルグリシン。
２）上記の前駆体、Ｌ−トレオニンおよびＬ−プロリンまたはその類似体から大環の形成、あるいはこれら前駆体の修飾またはペプチドＮ−メチル化。
現在まで可能なＢ−型成分の大環の前駆体の代謝起源が標識同位体を使用して決定されているだけである（Reedら1986、Molineroら1989、Reedら1989）。
本発明はストレプトグラミンの生合成に参加するポリペプチドの精製の結果であり、同様に生産物がストレプトグラミンの生合成に参加する遺伝子クローニングの結果である。ストレプトグラミンの生合成という用語は、制御遺伝子および生産微生物に耐性を付与する遺伝子を含んで成ると理解されている。したがって、本発明はこれらの代謝物の生産レベルを組換えＤＮＡ法により増大させることも可能である。本発明の別の利点は、この生合成の種々の段階でブロックされた変異体を構築することにより、各々２つの成分のための合成中間体を生産する可能性にある。これらの中間体は化学的、生化学的、酵素的または微生物的手段用にさらに修飾するための基質を提供することができる。同様に生合成遺伝子を単離することは、生産株間に遺伝子を移すことによって医薬的に有利な特性を持つハイブリッド抗生物質を製造することを可能にする（Hopwoodら、1985a、Hopwoodら、1985b、Hutchinsonら、1989）。本発明の別の利点はストレプトグラミン類として分類される代謝物の生合成経路のより良い知識を提供するという事実にある。要するに本発明は、ストレプトグラミンの生合成に参加する１つ以上のタンパク質が適当な発現信号の制御の元に発現されるようにバクテリアまたは真菌株を構築できる。そのような株は次に生物変換を行うために使用できる。これらの生物変換は細胞全体、あるいは該細胞の無細胞抽出物のいずれかを使用して行うことができる。これらの生物変換はストレプトグラミンを生合成経路の酵素で誘導体に転換させることができる。例えばプリスチナマイシンIIＢはこのようにプリスチナマイシンIIＡに転換できる。同様な理論を任意の生合成中間体に応用できる。
したがって本発明の第一の目的は、ストレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。
さらに詳細には、生産物がストレプトグラミンの生合成に参加する数個の遺伝子がストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）から単離された。この株から生産されたストレプトグラミンは通常、用語プリスチナマイシンと呼ばれているので（表１）、以下のプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子の場合には参考になることもあるだろう。しかし、得られた結果はすべてのストレプトグラミン応用にできることは明らかである。プリスチナマイシンＩおよびIIはそれぞれストレプトグラミンのＢおよびＡ成分に対応する。したがってプリスチナマイシンII一族およびプリスチナマイシンＩ一族の七分子は、以下ではそれぞれストレプトグラミンのＡおよびＢ成分と呼ぶ。
本発明は特にｓｎａＡ、ｓｎａＢ、ｓｎａＣ、ｓｎａＤ、ｐａｐＡ、ｐａｐＭ、ｓａｍＳ、ｓｎｂＡ、ｓｕｂＣ、ｓｎｂＤ、ｓｎｂＥおよびｓｎｂＲ遺伝子の単離および特性決定に関する。これらの遺伝子はエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のゲノムＤＮＡライブラリーから単離された。このライブラリーはエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分消化することにより得られた。平均４０−５０ｋｂの巨大ＤＮＡ断片を、コスミドｐＨＣ７９中にクローン化した（Hohn,B.,およびCollins,J.F.,1980）。インビトロのキャプシド化後、E.Coli HB101株（Boyerら、Roulland-Dussoix、1969）およびDH1株（Low,1968）をトランスフェクションした。エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のＤＮＡライブラリーはこのように異なる２つのE.Coli株から作成される。
ｓｎａＡ、ｓｎａＢおよびｓａｍＳ（初はＳｎａＣ遺伝子と呼ばれた）は、コスミドｐＩＢＶ１（第４図）上に存在する。ポリペプチドＳｎａＡおよびＳｎａＢに対応するｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子の生成物は、プリスチナマイシンのII成分の最終生合成段階に参加し（プリスチナマイシンIIＢのプリスチナマイシンIIＡへの転換）、Ｄ−プロリンの２，３−結合の酸化に対応する。これら２つのポリペプチドはプリスチナマイシンIIＡシンターゼの２つのサブユニットを構成し、その精製は本発明に記載される。ｓａｍＳ遺伝子の生成物は、ＡＴＰとメチオニンからＳＡＭ（メチル基供与体）の合成に参加すると考えられている。多くのストレプトグラミンのＡ成分は、実質的にＣ−４でメチル化され（第１図）、そしてこのメチルはメチオニンのメチルに由来すると記載され（Kingstonら、1983）、ＳＡＭとのメチル化反応を介しておそらく変化する。したがってｓａｍＳ遺伝子は、プリスチナマイシンの生合成経路に特異的であるＳＡＭシンターゼ（ＳａｍＳ；ＥＣ  ２．５．１．６）をコードすると考えられる。
ｓｎｂＡ、ｓｎｂＲ、ｐａｐＡおよびｐａｐＭ遺伝子はコスミドｐＩＢＶ２（第５図）上に存在する（第５図）。ｓｎｂＡ遺伝子は実施例５に表すような生化学的研究に基づき、プリスチナマイシンＩの生合成の第一段階に対応する。これは鎖の第一の酸、３−ヒドロキシピコリン酸のアデニル化による活性化を含んで成る。ｓｎｂＲはプリスチナマイシンＩ（またはおそらくプリスチナマイシンII）一族の分子を、合成後に細胞外に転移させることに参加し、これにより生産株の成分に対して耐性を付与する。ｐａｐＡ遺伝子は配列分析（実施例８．８）、ならびにこの遺伝子により分断される変異体の研究（実施例９．３）に基づいて、コリスメートからパラ−アミノフェニルアラニンの生合成に関する遺伝子に対応する。パラ−アミノフェニルアラニンは次にｐａｐＭ遺伝子の生産物（本発明により記載されるＮ−メチルトランスフェラーゼ）によりジメチル化され、パラ−ジメチルフェニルアラニンを形成し、これは次にプリスチナマイシンＩＡ中に取り込まれる。したがってｐａｐＡおよびｐａｐＭ遺伝子はプリスチナマイシンＩＡの１つの前駆対の合成に参加する。
ｓｎａＡ、ｓｎａＤ、ｓｎｂＣ、ｓｎｂＤおよびｓｎｂＥ遺伝子は、コスミドｐＩＢＶ３（第６図）に存在し、したがってこれはｓｎａＡ遺伝子がすでに存在するコスミドｐＩＢＶ１に隣接する。ｓｎａＤ遺伝子は配列分析（実施例８．９）、ならびにこの遺伝子により分断される変異体の研究（実施例９．５）に基づいて、プリスチナマイシンIIの生合成に関与するペプチドシンターゼをコードする。生産物が本発明に記載されているｓｎｂＣ遺伝子はプリスタマイシンＩＡのペプチド鎖中にトレオニンおよびアミノ酪酸残基を取り込むことに参加する。また生産物が本発明に記載されているｓｎｂＤ遺伝子は、プリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖中へのプロリンおよびパラ−ジメチルアミノフェニルアラニン残基の取り込みに関与する。これはまたこれら２つの残基間のペプチド結合のＮ−メチル化をも支配する。また最後に生産物が本発明に記載されているｓｎｂＥ遺伝子は、プリスチナマイシンＩＡの最後の２つの残基、すなわちフェニルグリシンおよび４−オキソピペコリン酸の取り込みに参加する。
ｓｎａＣ遺伝子はコスミドｐＩＢＶ４（第７図）に存在する。これは本発明中に記載されたＦＭＮレダクターゼとも言うＦＭＮ：ＮＡＤＨ酸化還元酵素をコードし、そしてＦＭＮおよびＮＡＤＨからＦＭＮＨ2でプリスチナマイシンIIＡシンターゼを供給する。したがってｓｎａＣ遺伝子はプリスチナマイシンIIＡの生合成の最終段階に参加する。
これらの種々の遺伝子はそれらのコスミド起源からサブクローン化され、それらの核酸配列が決定された。ｓｎａＡ、ｓｎａＢおよびｓａｍＳ遺伝子は６−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片中にサブクローン化され、その部分を配列決定した（配列番号１）。ｓｎｂＡ遺伝子は５．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌII断片中にサブクローン化され、その部分を配列決定した（配列番号５）。ｓｎｂＲ遺伝子は４．６ｋｂのＢｇｌII−ＢｇｌII断片中にサブクローン化され、その部分を配列決定した（配列番号６）。ｐａｐＡ遺伝子部分は３．４ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片中にサブクローン化され、その部分を配列決定した（配列番号９）。ｐａｐＭ遺伝子は４．１ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片中にサブクローン化され、その部分を配列決定した（配列番号１０）。ｓｎａＤ遺伝子部分は１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片中にサブクローン化され、その部分を配列決定した（配列番号８）。ｓｎｂＣ遺伝子部分は６．２ｋｂのＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ断片中にサブクローン化され、その２つの領域を配列決定した（配列番号１１および１２）。ｓｎｂＤ遺伝子部分は８．４ｋｂのＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ断片中にサブクローン化され、その２つの領域を配列決定した（配列番号１３および１４）。ｓｎｂＥ遺伝子部分は６．６ｋｂのＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ断片中にサブクローン化され、その２つの領域を配列決定した（配列番号１５および１６）。ｓｎａＣ遺伝子は４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片中にサブクローン化され、その領域を配列決定した（配列番号７）。
ｓｎａＡ、ｓｎａＢ、ｓｎａＤ、ｓａｍＳ、ｓｎｂＣ、ｓｎｂＤおよびｓｎｂＥ遺伝子の近接、一方同様にｓｎｂＡ、ｓｎｂＲ、ｐａｐＡおよびｐａｐＭの近接は、ストレプトグラミンのＡおよびＢ成分の生合成に関する遺伝子のクラスター局在性を付与する。さらに本発明で記載した４つのコスミドは、パルスフェールド電気泳動で大きさが２００ｋｂと推定される染色体の領域中一で緒に群を成し、これはストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）の全ゲノムの３％に等しい（７５００ｋｂ）（実施例１３）。したがって本発明で同定した遺伝子（ｓｎａＡ、ｓｎａＢ、ｓｎａＤ、ｓａｍＳ、ｓｎｂＣ、ｓｎｂＤおよびｓｎｂＥ；ｓｎｂＡ、ｓｎｂＲ、ｐａｐＡおよびｐａｐＭ；ｓｎａＣ）の周辺領域は、プリスチナマイシン生合成クラスターの他の遺伝子を含み、そしてこれらの遺伝子はストレプトグラミンの生合成用の他の遺伝子を局在させるために使用できることが明らかである。
好ましくは本発明の主題は以下から選択されるヌクレオチド配列である：
（ａ）ｓｎａＡ（配列番号２）、ｓｎａＢ（配列番号３）、ｓｎａＣ（配列番号７）、ｓｎａＤ（配列番号８）、ｐａｐＡ（配列番号９）、ｐａｐＭ（配列番号１０）、ｓａｍＳ（配列番号４）、ｓｎｂＡ（配列番号５）、ｓｎｂＣ（配列番号１１および１２）、ｓｎｂＤ（配列番号１３および１４）、ｓｎｂＥ（配列番号１５および１６）、ならびにｓｎｂＲ（配列番号６）遺伝子の全部または部分、
（ｂ）生合成クラスターを構成し、そしてストレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチドをコードする遺伝子（ａ）に隣接する配列、
（ｃ）遺伝子（ａ）または（ｂ）の全部または部分とハイブリダイズし、かつストレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチドをコードする配列、ならびに
（ｄ）配列（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に由来し、遺伝子コードの縮退を持つ配列。
さらに好ましくは本発明の主題は、ｓｎａＡ（配列番号２）、ｓｎａＢ（配列番号３）、ｓｎａＣ（配列番号７）、ｓｎａＤ（配列番号８）、ｐａｐＡ（配列番号９）、ｐａｐＭ（配列番号１０）、ｓａｍＳ（配列番号４）、ｓｎｂＡ（配列番号５）、ｓｎｂＣ（配列番号１１および１２）、ｓｎｂＤ（配列番号１３および１４）、ｓｎｂＥ（配列番号１５および１６）、ならびにｓｎｂＲ（配列番号６）遺伝子により表されるヌクレオチド配列である。
本発明の別の主題はストレプトグラミンの生合成に関する遺伝子を含んで成る任意の組換えＤＮＡ法に関する。さらに好ましくはこれは第４から７図に表されるコスミドｐＩＢＶ１、ｐＩＢＶ２、ｐＩＢＶ３またはｐＩＢＶ４の全部または部分、あるいはコスミドｐＩＢＶ１からｐＩＢＶ４とハイブリダイズする配列の全部または部分、あるいはこれら後者の断片を含んで成る組換えＤＮＡ法である。
本発明の好適な態様において、上記定義のヌクレオチド配列は発現ベクターの部分を形成し、それは自律的に複製または統合できる。
上述のように、本発明はさらに特別にはプリスチナマイシンの生合成のための遺伝子にて説明されるが、得られた結果をすべてのストレプトグラミンに応用することは明らかである。
より特別には本発明で開発されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）からのストレプトグラミンの生合成に関するタンパク質の精製または遺伝子のクローニングに関する技術は、ストレプトグラミンを生産する他の微生物にも応用できる（表１参照）。
したがってエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）からの酵素活性の精製により、ストレプトグラミンを生産する別の株からの同一活性を精製することも可能である。したがって本発明は生合成に参加するタンパク質を精製し、そして次にそれらのＮＨ2−末端配列を使用して対応する遺伝子をクローン化できるオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、任意の生産微生物からストレプトグラミンの生合成に関する遺伝子のクローニングすることに応用できる。次に染色体ウォーキング（chromosome walking）は全生合成クラスターを同定することを可能にする。
さらに本出願で同定した遺伝子から、ハイブリダイゼーションによりストレプトグラミンの生合成の遺伝子を別の生産微生物のＤＮＡから直接的にクローン化することも可能である。実質的にプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子は別のストレプトグラミンの遺伝子と強くハイブリダイズする。したがってストレプトグラミンの生合成に関する遺伝子は、プローブとしてｓｎａ、ｓｎｂまたはｐａｐ遺伝子を使用して、あるいは後者の断片、あるいは本発明に表すような他のｓｎａおよびｓｎｂ遺伝子を含有する遺伝子に隣接する断片をプローブとして使用してハイブリダイゼーションによりクローン化することが可能である。これは１）種々の微生物により生産されるストレプトグラミンは同一であり、同様な構造を持つ（第３図を参照のこと）、２）ストレプトグラミンの生合成に関する遺伝子はクラスター中に組織化されている、そして３）この生合成の原因となる酵素系はそれらの基質に対して絶対的な特異性を持っていない、という事実によるものである。
さらにストレプトグラミンの生合成に関与する遺伝子のクローニングは、縮退オリゴヌクレオチド（上記のｓｎａまたはｓｎｂ遺伝子の配列から調製された）、またはそれら遺伝子の断片、あるいはこれらの遺伝子に隣接する断片を使用しても行うことができる。したがって種々のストレプトグラミン生産株のＡおよびＢ成分の生合成のための遺伝子の中から好きなものを選ぶことが可能である。これらの株はストレプトミセス（Streptomyces）属に、そして他の属にも属することができる（表１を参照のこと）。加えて、使用する出発株のゲノムＤＮＡがストレプトミセス（Streptomyces）に観察されるものとは異なるＧ＋Ｃ組成を有するならば、使用するプローブは、ＤＮＡを単離するために所望する遺伝子の属または種に対して特異的なコドンの偏りで合成できる。
本発明の別の主題は上記定義のヌクレオチド配列の発現に由来するポリペプチドに関する。より詳細には本発明はポリペプチドＳｎａＡ（配列番号２）、ＳｎａＢ（配列番号３）、ＳｎａＣ（配列番号７）、ＳｎａＤ（配列番号８）、ＰａｐＡ（配列番号９）、ＰａＰＭ（配列番号１０）、ＳａｍＳ（配列番号４）、ＳｎｂＡ（配列番号５）、ＳｎｂＣ（配列番号１１および１２）、ＳｎｂＤ（配列番号１３および１４）、ＳｎｂＥ（配列番号１５および１６）、ならびにＳｎｂＲ（配列番号６）のすべてまたは部分、あるいはそれらの誘導体を含んで成るポリペプチドに関する。本発明に使用する意味において、誘導体という用語はペプチド配列の遺伝的および／または化学的性質の修飾により得られる任意の分子を表す。遺伝的および／または化学的性質の修飾とは１つ以上の残基の任意の突然変異、置換、削除、付加および／または修飾である。そのような誘導体はさまざまな目的のさめに作成でき、例えば特にペプチドのその基質（１つまたは複数）に対する親和性の増加、その生産レベルの向上、プロテアーゼに対する耐性の上昇、その活性の増大および／または改変、あるいは新規な生物的性質の付与などである。付加により生じる誘導体の中では、例えば一方の末端に結合した付加的な相同的部分を含有するキメラ性のポリペプチドを挙げることができる。誘導体という用語はまた本発明に記載されたポリペプチドに相同的であり、かつ他の細胞、特にストレプトグラミンを産する株からから生じるポリペプチドを含んで成る。
本発明の主題は、上記定義のヌクレオチド配列またはベクターを含有する任意の組換え細胞でもある。本発明の組換え細胞は真核または原核細胞のいずれでもよい。適当な真核細胞の中では、動物細胞、酵母または真菌を挙げることができる。特に酵母に関してはサッカロミセス（Saccharomyces）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、シュワンニオミセス（Schwanniomyces）またはハンセニューラ（Hansenula）属を挙げることができる。動物細胞に関しては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７細胞、アフリカツメガエルの卵等を挙げることができる。真菌の中でも特に挙げることができるのは、ミクロモノスポーラ（Micromonospora）、アスペルギルスssp.（Aspergillus ssp.）またはトリコダーマssp.（Trichoderma ssp.）である。原核細胞としては、以下のバクテリアを使用することが好ましい：特にアクチノミセス（Actinomyces）およびストレプトミセス（Streptomyces）、E.Coli（実施例１１）、バチルス（Bacillus）。好ましくは本発明の組換え細胞はストレプトグラミンを生産する細胞から選択される（表１を参照のこと）。本発明の組換え細胞は、外来ヌクレオチド配列を細胞中に導入しうる任意の方法により得ることができる。これは特に、形質転換法、電気穿孔法、接合法、プロトプラスト融合法、あるいは当業者に周知である他の任意の方法であることができる。
さらに本発明の主題はストレプトグラミンの生合成に関与するポリペプチドの生産法であり、それによれば上記定義の組換え細胞が培養され、そして生産されたポリペプチドが回収される。
また本発明の主題は上記定義の組換え細胞の使用であり、ストレプトグラミンの生合成に関与する少なくとも１つのポリペプチドを生物変換反応で発現する。特にこれらの細胞はストレプトグラミンを誘導形に転換させることができる。例えばプリスチナマイシンIIＢをこのようにしてプリスチナマイシンIIＡに転換できる。同じ理論を、任意の生合成中間体に応用できる。これらの細胞は有利な医薬的特性を有するハイブリッド抗生物質を製造することができる（Hopwoodら、1985a、Hopwoodら、1985b、Hutchinsonら、1989）。これらの生物変換は全細胞を使用するか、あるいは該細胞の無細胞抽出物を使用するいずれかで行うことができる。
本発明の別の主題は、上記定義のヌクレオチド配列をストレプトグラミンの生産を増幅させるために使用することに関する。また本発明はストレプトグラミンの生産法に関し、それによれば本発明の１つ以上のヌクレオチド配列が導入され、かつ／またはストレプトグラミン生産細胞（あるいはストレプトグラミンの有望な生産者）中で増幅され、該細胞をストレプトグラミンの生産条件下で培養し、生産されたストレプトグラミンを回収する。
生合成に関与する特定遺伝子の過剰発現は、生産株のストレプトグラミンＡおよび／またはＢ生産を増大させることができる。この過剰発現は数種の株で行うことができる：ストレプトグラミンＡ一族の分子のみを生産する株か、ストレプトグラミンＢ一族の分子のみを生産する株か、あるいはＡおよびＢ成分の両方を生産する株のいずれかである。これらの過剰発現は合成レベルの増大、すなわちＡおよび／またはＢ成分のErlenmeyer中での、または小さい培養槽中での、あるいは大規模な工業的培養槽中での生産性の増大をもたらすことができる。さらにＡおよび／またはＢ成分の生合成に関与する遺伝子の特異的な過剰発現は、株により生産されるＡおよびＢ成分の％を変化させることができ、したがってこれら分子間のより良い相乗効果を得ることができる。さらにストレプトグラミンを生産する微生物から単離した生合成遺伝子は、別の生産微生物中で生産を増幅するために使用できる。
本発明の別の主題は、ストレプトグラミンの生合成経路の段階でブロックされた細胞の調製法に関し、それによれば突然変異がストレプトグラミンを生産する細胞について少なくとも１つの生合成遺伝子で行われる。
好ましくは突然変異はin vitroまたはin situで、問題とする遺伝子の１つ以上の塩基のサプレッション、置換、削除および／または付加により行われるか、または遺伝子分断により行われる。
本発明の別の観点は、実質的にストレプトグラミン生合成の特定段階でブロックされた突然変異体の構築にある。その価値は一方では突然変異タンパク質の機能的研究にあり、他方では生合成中間体を生産する株の生産にある。これらの中間体は分離後に適当なところで、生産媒体に特定の成分を付加することにより、または中間体の基質として作用することにより中間体を修飾できるこのように突然変異した別の遺伝子を株に導入することにより修飾されることができる。これらの中間体はこのように化学的、生化学的、酵素および／または微生物手段により修飾されることができる。この意味において、エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株の突然変異体ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０５が構築された：エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０５は自殺プラスミドｐＶＲＣ５０５のｓｎａＡ遺伝子中で相同的統合により単離され、ｐＤＨ５およびｓａｎＡ遺伝子の内部断片から樽築された。以下の突然変異体も構築された：ＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲ；ＳＰ９２：：ｐＶＲ５０８；ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ４０４およびＳＰ９２：：ｐＶＲＣ１０００（実施例９）。
したがって本発明はまたストレプトグラミンの生合成中間体を調製する方法に関し、それによれば：
−ストレプトグラミンの生合成経路の段階でブロックされる細胞を上記のように調製し、
−該細胞を培養し、そして
−蓄積した中間体を回収する。
本発明はまたはストレプトグラミンから誘導される分子の調製法に関し、それによれば：
−ストレプトグラミンの生合成経路の段階でブロックされる細胞を上記のように調製し、
−該細胞を培養し、そして
−この細胞により蓄積した中間体を培養培地から分離した後、適当なところで修飾する。
本発明は以下の実施例で説明されるが、それらは説明のためであり、限定するものではないと考える。
図の一覧
第１図：ストレプトグラミンのＡ成分の構造。
第２図：ストレプトグラミンのＢ成分の構造。
第３図：ストレプトグラミンの構造の他の例。
第４図：コスミドｐＩＢＶ１の図解。
第５図：コスミドｐＩＢＶ２の図解。
第６図：コスミドｐＩＢＶ３の図解。
第７図：コスミドｐＩＢＶ４の図解。
第８図：プリスチナマイシンIIＡシンターゼにより触媒される反応。
第９図：３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼにより触媒される反応。
第１０図：ＳｎｂＣにより触媒される反応。
第１１図：ＳｎｂＤにより触媒される反応。
第１２図：ＳｎｂＥにより触媒される反応。
第１３図：ＳｎａＣにより触媒される反応。
第１４図：ＰａｐＭにより触媒される反応。
第１５図：プラスミドｐＶＲＣ４０２（Ａ）およびｐＶＲＣ５０１（Ｂ）の図解。
第１６図：プラスミドｐＸＬ２０４５の図解。
第１７図：プラスミドｐＶＲＣ１１０５の図解。
第１８図：プラスミドｐＶＲＣ１１０６の図解。
第１９図：プラスミドｐＶＲＣ１１０４の図解。
第２０図：プラスミドｐＶＲＣ９００の図解。
第２１図：プラスミドｐＶＲＣ１０００の図解。
第２２図：プラスミドｐＶＲＣ５０９の図解。
第２３図：プラスミドｐＶＲＣ９０３の図解。
第２４図：プラスミドｐＶＲＣ４０９の図解。
第２５図：プラスミドｐＶＲＣ５０５の図解。
第２６図：プラスミドｐＶＲＣ７０１の図解。
第２７図：プラスミドｐＶＲＣ７０２の図解。
第２８図：プラスミドｐＶＲＣ５０８の図解。
第２９図：プラスミドｐＶＲＣ４０４の図解。
第３０図：プラスミドｐＶＲＣ５０７の図解。
第３１図：プラスミドｐＶＲＣ７０６の図解。
第３２図：一般的マップ。
材料
Bio-Sil SEC 125および250カラム（バイオラッド：Bio-Rad）
MonoQ HR 5/5,10/10および16/10カラム（ファルマシア：Pharmacia）
PD-10カラム（ファルマシア）
Superose 6 HR 10/30カラム（ファルマシア）
Superdex 200 Hi-Load 16/60および75 HR 10/30カラム（ファルマシア）
Superose 12 prep gradeカラム（ファルマシア）
Vydac C4およびC18カラム（ザ セパレーショングループ：The Separation Group）
Nucleosil 5-C18カラム（マーシェリー-ナゲル：Macherey-Nagel）
Phenyl Superose HR 10/10カラム（ファルマシア）
TSK G2000 SWカラム（トーソー：Tosoh、日本）
Phenyl Sepharose（ファルマシア）
FMN-アガロース（シグマ：Sigma）
Q Sepharose Fast Flow（ファルマシア）
Sephadex G-25 Fine（ファルマシア）
Centricon 10または30（アミコン：Amicon）
Centriprep 10または30（アミコン）
Centrilutor（アミコン）
実施例１：ストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）SP92株の全DNAの単離
この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）SP92株のDNAをどのように精製できるかを説明する。
エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）SP92株は、エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）DS5647株（ATCC25486）由来のものである。
50mlのYEME培地（３４％シュクロース、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２５％グリシン（D.Hopwoodら、1985））を１０8のエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）SP92株の胞子とともに植菌し、カルチャーを30℃にて40時間、280rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
菌糸体を回収し、１５ｍｌの１０．３％シュクロースで洗浄する。約１ｇの菌糸体ペレットを３４％のシュクロースを補充した５ｍｌのＴＥに溶解し、そこに１ｍｌのリゾチームを５０ｍｇ／ｍｌ濃度（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液、ｐＨ８．０、および１ｍｌの０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０中）で加える。３０℃で３０−６０分間インキュベーションした後、混合物に０．８ｍｌの１０％サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）を加えて透明化する。２ｍｌの０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１０ｍｌのＴＥ、１８ｇのＣｓＣｌおよび１．２ｍｌのＥＴＢ（１０ｍｇ／ｍｌ濃度で）を次に加える。調製物を、２０℃にて５５，０００ｒｐｍで一晩超遠心する。
染色体ＤＮＡ（ＣｓＣｌ勾配中にバンド状態で存在する）をパスツールピペットで回収する。ＥＴＢをＴＥ緩衝液、５Ｍ  ＮａＣｌで飽和としたイソプロパノール溶液で数回洗浄して除去する。３容量のＴＥおよび４容量のイソプロパノールを加えることによりＤＮＡを沈殿させる。７０％エタノールで洗浄した後、ＤＮＡを適当容量のＴＥ中に溶解する。得られた全ＤＮＡ量は菌糸体グラムあたり２５０から５００μgの間である。
実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドＤＮＡの単離
この実施例ではＥ．ｃｏｌｉの組換え株からいかにしてＥ．ｃｏｌｉプラスミドＤＮＡを調製できるかを説明する。
２．１  Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドＤＮＡの大量調製
この実施例ではプラスミドＤＮＡの最大調製物をいかにしてＥ．ｃｏｌｉで生産させるかを説明する。
この調製は、１５０μl／ｍｌのアンピシリンを含有する５００ｍｌのＬＢ培養培地を使用して行う。抽出法はＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ（１９７９）およびＩｓｈ−ＨｏｒｏｗｉｃｓおよびＢｕｒｋｅ（１９８１）、ならびにManiatisら（１９８９）により記載された方法による。
この抽出後、プラスミドＤＮＡをManiatisら（１９８９）に記載されたＣｓＣｌ勾配を使用して精製する。プラスミドＤＮＡを次に３容量のＴＥおよび４容量のイソプロパノールを加えて沈殿させる。遠心後、ペレットを０．５−１ｍｌのＴＥに溶解する。
２．２  少量のＥ．ｃｏｌｉプラスミドＤＮＡの調製
この実施例ではプラスミドＤＮＡの微量調製物をいかにしてＥ．ｃｏｌｉで生産させるかを説明する。
この調製は、１５０μg／ｍｌのアンピシリンを含有する１．５ｍｌのＬＢ培養培地を使用して行う。方法はＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ（１９７９）により記載された方法による。
実施例３：Ｅ．ｃｏｌｉ中でのエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のゲノムライブラリーの構築およびハイブリダイゼーション用膜の調製
この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムＤＮＡライブラリーをいかにしてＥ．ｃｏｌｉで作成するかを説明する。
３．１  ゲノムＤＮＡ断片の調製
この実施例ではとのように高分子量ゲノムＤＮＡ断片が調製できるかを説明する。
実施例１に記載したように調製したＳＰ９２株の全ＤＮＡを、製造元で推薦する緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中のＳａｕ３Ａ（ニューイングランド  バイオラボズ：New England Biolabs、ビバリー、マサチューセッツ州、０１９１５−５５１０、米国）で部分消化する。高分子量ＤＮＡ断片を得るために使用した酵素量は、経験的に定めた。約０．０２５酵素単位を、１μｇの全ＤＮＡを３７℃にて２０分間で消化するために使用する。反応を次に６５℃で１５分間インキュベーションすることにより停止し、そして酵素を等容量のフェノール／クロロホルムを加えて除去する。遠心後、部分的に消化した全ＤＮＡを含有する上澄みを、最終的に０，３Ｍの酢酸ナトリウムおよび２．５容量のエタノールを加えて沈殿させる。
約１００μｇの全ＤＮＡがこのようにして消化され、そして大きさが３０−５０ｋｂＤＮＡ断片が１０−４０％のシュクロース勾配で単離される。それらの大きさは０．４％のアガロースゲル電気泳動で確認する。
３．２  コスミドｐＨＣ７９の調製
この実施例ではどのようにコスミドｐＨＣ７９をE.coliから調製するかを説明する。
コスミドｐＨＣ７９（Ｈｏｈｎ，Ｂ．およびＣｏｌｌｉｎｓ，１９８０）は、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｆ．ら、１９７７）の一部分、λのｃｒｏ−ｃII領域およびＣｈａｒｏｎ  ４Ａ（Ｂｌａｔｔｎｅｒ，Ｆ．Ｒ．ら、１９７７）のｃｏｓ配列を含有する領域を含んで成る。
コスミドの抽出は実施例２．１に記載されたように、E.coli  ＴＧ１株（Ｋ１２，Δ（ｌａｃ−ｐｒｏ）ｓｕｐＥ  ｔｈｉ ｈｓｄ  ＤＳ  Ｆ’ｔｒａＤ３６  ｐｒｏＡ+Ｂ+ ｌａｃＩｑ  ＬａｃＺ  ΔＭ１５，Ｇｉｂｓｏｎ，１９８４）から行った。
５００ｎｇのコスミドｐＨＣ７９を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、６ｍＭ  ＭｇＣｌ2、６ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含んで成る２０μlの緩衝液中のＢａｍＨＩ（ニューイングランド  バイオラボズ  ビバリー、マサチューセッツ州、０１９１５−５５１０、米国）で消化する。
３．３  ＤＮＡ断片およびコスミドの連結
この実施例では、Ｓａｕ３Ａ消化から派生するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２ゲノムをどのようにしてＢａｍＨＩ−直線化ベクターｐＨＣ７９に連結できるかを説明する。
約１５０ｎｇの上記のように直線化したコスミドを、エタノールで、実施例３．２に記載されたような３５０ｎｇのエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の全ＤＮＡ断片とともに沈殿させた。ペレットを１０μlの連結緩衝液（ライゲーションバッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ  ＤＴＴ、１Ｍｍ  ＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）に溶解し、そして０．５μlの濃度４００，０００単位／ｍｌのＴ４ＤＮＡ  リガーゼ（ニューイングランド  バイオラボズ  ビバリー、マサチューセッツ州、０１９１５−５５１０、米国））を加えた。インキュベーションは１５℃で一晩行った。
３．４  インビトロでのキャプシド化の実施
この実施例では３．３で構築されたコスミドがどのようにしてインビトロでキャプシド化されるのかを説明する。
連結後のハイブリッドコスミドのキャプシド化は、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  クローニング  システム、ラジョラ、カリフォルニア州、９２０３７、米国）で開発されたＧｉｇａｐａｃｋIIＧｏｌｄキットを使用して行った。
２×４μlの連結混合物（２×７０ｎｇのハイブリッドコスミドと同等）をインビトロで供給元により記載された方法に従いキャプシド化した。
３．５  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１株およびＨＢ１０１株のトランスフェクション
この実施例ではコスミドをどのようにＥ．ｃｏｌｉに導入するかを説明する。
２つのトランスフェクションを平行してＥ．ｃｏｌｉＤＨ１株（Ｆ- ｇｙｒＡ９６  ｒｅｃＡ１  ｒｅｌＡ１  ｅｎｄＡ１  ｔｈｉ−１  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４Ｌ−、Ｌｏｗ  １９６８）およびＨＢ１０１株（Ｆ- ｓｕｐＥ４４  ｈｓｄＳ２０（ｒＢ-ｍＢ-）ｒｅｃＡ１３ ａｒａ−１４ ｐｒｏＡ２  ｌａｃＹ１  ｇａｌＫ２  ｒｐｓＬ２０  ｘｙｌ−５  ｍｔｌ−１、ＢｏｙｅｒおよびＲｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ  １９６９）で行った。
細胞を以下の方法に従い調製した：１００−ｍｌのプレカルチャーを０．２％のマルトースおよび１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4を補充したＬＢ培地で４−５時間、ＯＤ600の値が０．８になるまで生成する。カルチャーを次に遠心し、そしてペレットを４０ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4に溶解し、そしてＯＤ600＝０．５まで同様の溶液で希釈する。このようにして調製した２００μlの細胞懸濁液を、１００μlのキャプシド化混合物と混合する。３７℃での接触２０分後、１ｍｌのＬＢを加え、全体を３７℃で１時間インキュベーションする。トランスフェクション体を次に１５０μg／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ固体培地で選択する。得られたトランスフェクション体の数は1μｇの組換えコスミドあたり約１０4である。
３．６  エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムＤＮＡライブラリーの保存
この実施例ではどのようにエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムＤＮＡライブラリーが保存されるかを説明する。
コスミドｐＨＣ７９中に挿入された断片の平均の大きさを確認した後、ＨＢ１０１およびＤＨ１で行ったトランスフェクション体から派生する各約１５００コロニーを、２００μlのＨｏｇｎｅｓｓ培地（８．８％グリセロール、３ｍＭ  酢酸ナトリウム、５５ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4、２６ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１５ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、１５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンを補充したＬＢ培地）を含有する９６ウェルのマイクロタイタープレートにサブクローン化する。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベーションし、そして次に−８０℃に保存する。
３．７  エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムライブラリーのハイブリダイゼーション膜の調製
この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２ゲノムライブラリーを構成するコロニーのＤＮＡがどのようにハイブリダイゼーション膜上に移されるかを説明する。
これらのハイブリダイゼーション膜は、以下の方法に従い２つの各ライブラリーについて２連で作成された：
各ライブラリーの１５のマイクロタイタープレートは、レプリカプレーターを使用して１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上にレプリカを取る。３７℃で一晩生育させた後、コロニーをＢｉｏｈｙｌｏｎ  Ｚ+膜（バイオプロープ  システム：Ｂｉｏｐｒｏｐｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）上に、以下の手法に従い移し取る：膜を適当な大きさに切り、そしてコロニーに１分間接触させておく。次に変性は、膜を０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液に５分間浸漬させることにより行い、続いて中和化は膜を３Ｍの酢酸ナトリウム溶液に５分間浸漬させることにより行う。ＤＮＡは膜をＵＶランプ下に５分間暴露することにより固定する。
実施例４
４．１  パルスフィールド電気泳動用の試料挿入物としての状態のエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株およびＳＰ９２由来の株の染色体ＤＮＡの調製
この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株およびＳＰ９２由来の株のＤＮＡを、どのようにしてパルスフィールド電気泳動のための挿入物の状態で調製するかを説明する。この調製は以下のようにして得られた菌糸体カルチャーから作成される：０．２５％のグリシンを含有する３０ｍｌのＹＥＭＥ培地を被検株の１０8の胞子とともに植菌し、そしてカルチャーを３０℃で４８時間、２５０ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒｓ中で２８０ｒｐｍに撹拌しながらインキュベーションする。菌糸体を次に１０分間の３８００ｒｐｍの遠心により回収し、１０％のシュクロースで２回洗浄する。菌糸体ペレットを次に５ｍｌの溶液Ｉ（２５０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、２０．６％シュクロース）に再懸濁する。このようにして得られた２００Ｍｌの菌糸体に、４００Ｍｌのリゾチーム溶液を５０ｍｇ／ｍｌの濃度（溶液Ｉ中）で、８００Ｍｌの１％ＬＭＰアガロース（２５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０．３％シュクロース中、４２℃に維持）とともに加える。混合物を４２℃に維持し、そして次に特別製のコーム（ｃｏｍｂｓ）のウェル中に注ぎ、これを粘着テープで密閉し、４℃で３０分間保つ。混合物を固体化し、そしてこのようにして３０−４０の挿入物を得、そしてウェルに含まれる挿入物を型から注意深く取り出した。
挿入物を始めに４℃で３０分間、２５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０．３％シュクロースを含有する溶液中ですすぐ。それらを次に５００ｍＭの  ＥＤＴＡ、１％ラウリルサルコシルおよび１ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫで５０℃にて２４時間２回、時々撹拌しながら浸漬する。挿入物を次に１ｍＭ  ＰＭＳＦを含有するＴＥ中で１時間、各洗浄ごとに溶液を交換しながら３回洗浄する。このようにして得られた挿入物を４℃で０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０中で、最長４ケ月保存する。
４．２  エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株およびＳＰ９２由来の株のＤＮＡ挿入物の消化およびパルスフィールド電気泳動用による分析
この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株およびＳＰ９２由来の株の染色体ＤＮＡ（実施例４．１に記載されたように調製されたもの）を、どのようにしてパルスフィールド電気泳動用に種々の制限酵素で切断するかを説明する：
４．２．１．挿入物の状態での染色体ＤＮＡの消化
挿入物を始めにＴＥ中で６回洗浄し、そして次に選択した制限酵素の緩衝液中に１時間、２回インキュベーションする。各挿入物を次に、１６０Ｍｌの制限酵素緩衝液および４０単位の酵素を含有するエッペンドルフ試験管のフタの部分に置く。全体をパラフィルムで覆い、そして緩衝液の蒸発を避けることができるようにエッペンドルフをパラフィルムに包んで密閉する。この試験管をインキュベーター中にて所望温度で一晩インキュベーションする。
４．２．２  消化ＤＮＡのパルスフィールド電気泳動による分析
この実験のためのパルスフィールド電気泳動法は、Ｃｈｕら（１９８６）により開発されたＣＨＥＦ（Ｃｌａｍｐｅｄ  Ｈｏｍｏｈｅｎｅｏｕｓ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｉｅｌｄ）系のものであり、これはそれぞれが１２０°に配向された２種類の均一な交互の電場を得、ならびにＤＮＡ分子については直線的な軌跡を得ることができる。使用した“パルサフォーシステム（Ｐｕｌｓａｆｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）”はファルマシア−ＬＫＢにより販売されている。
電気泳動的移動度のパラメーター（パルス時間および移動時間など）は、１０−２５００ｋｂの間の大きさの範囲のＤＮＡ断片について至適な分離が得られるように変更した。使用した３種の移動条件は次の通りである：２００−１７００ｋｂの大きさの巨大断片を分離するために、選択した移動条件はパルス時間が９０秒で４０時間：５０−４００ｋｂの大きさの断片を分離するために選択した移動条件はパルス時間が１０秒で２０時間：最後により小さい１０−２００ｋｂの大きさの断片を分離するために選択した移動条件はパルス時間が１０秒で２４時間である。これらの３種の移動条件については、電圧を１５０ボルトの定電圧であり、温度は１３℃に維持し、そして電気泳動ゲルは１．３％のアガロースを含有する。
エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株およびＳＰ９２由来の株の染色体ＤＮＡを含有する挿入物を、上記の制限酵素で消化し、そして２つの外科用の刃を使用して電気泳動ゲルのウェルに置く。使用した分子量マーカーはニューイングランドバイオラボ社で販売している”酵母染色体ＰＦＧマーカー”および“ラムダ  ラダーＰＦＧマーカー”である。移動は上記条件の１つで行い、そして次に４ｍｇ／ｍｌ濃度のＥＴＢ（エチジウムブロミド）浴で染色し、その後２０分間水中にて脱集落化する。ゲルの写真を取った後、ＤＮＡ断片をナイロン膜上に移し、そして実施例９．１に記載するように［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ−標識プローブとハイブリダイズさせる。
実施例５：ストレプトグラミンの生合成に関与する精製タンパク質をコードする遺伝子を持つコスミドの単離
この実施例では、プリスチナマイシンの生合成に参加し、かつそのＮＨ2−末端配列または内部配列が確立されている精製タンパク質から出発して、いかに上記のように作成されたゲノムライブラリーからこの同一タンパク質に関する構造遺伝子を持つコスミドを単離することができるか、あるいはコスミドが保持し、かつすでに配列決定されたこれらの遺伝子から対応する構造物遺伝子を同定できるかを説明する。
５．１  プリスチナマイシンIIＡシンターゼの２つのサブユニットの１つ、または両方の構造物遺伝子を持つコスミドｐＩＢＶ１およびｐＩＢＶ３の単離
５．１．１  プリスチナマイシンIIの最終合成段階に関与するタンパク質の１つの同定および精製：プリスチナマイシンIIＡシンターゼ
導入部にて述べたように、プリスチナマイシンIIＡの最終合成段階は、Ｄ−プロリンの２，３−結合のデヒドロプロリンへの酸化に対応する。この活性の原因であるタンパク質はこの実施例に説明されるように均一に精製された。
５．１．１．Ａ．プリスチナマイシンIIＡシンターゼ活性のアッセイ
この実施例では、未だ記載されず、かつプリスチナマイシンの生産期間中にのみ発現される注目すべき特質を有するプリスチナマイシンIIＡの生合成経路の活性アッセイを説明する。問題の酵素はプリスチナマイシンIIＡシンターゼであるが、これはプリスチナマイシンIIＢをプリスチナマイシンIIＡに、プリスチナマイシンIIＢのＤ−プロリン残基を２，３−デヒドロプロリン残基（第８図）に、分子酸素およびＦＭＮＨ2の存在下で酸化して転換する。このアッセイする酵素画分（０．００２−０．００５単位）を、２７℃で１時間、全容量が５００ｍｌの５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液  ｐＨ６．８（ＮＡＤＨ（５００μＭ）およびＦＭＮ（５μＭ）、プリスチナマイシンIIＢ（２０μＭ）および０．０２単位のＦＭＮ還元酵素（べーリンガーマンハイム：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する）中でインキュベーションする。
生成したプリスチナマイシンIIＡは、５００μlの０．１Ｎ塩酸および５００μlのアセトニトリルでインキュベーションを停止し、そして試料を５０００ｇで５分間遠心した後、ＨＰＬＣで分析する。１５０μlの遠心上澄みを１５−ｃｍのＮｕｃｌｅｏｓｉｌ  ５−Ｃ８カラムに注入し、３４％のアセトニトリルおよび６６％の０．１Ｍリン酸緩衝液  ＰＨ２．９の混合物で溶出する。プリスチナマイシンIIＡおよびIIＢはそれらの２０６ｎｍでのＵＶ吸収により検出される。
酵素活性の単位は、１時間あたり記載された条件下で１μｍｏｌのプリスチナマイシンIIＡを合成するために必要な酵素量と定義される。
５．１．１．Ｂ  エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２  プリスチナマイシンIIＡシンターゼの精製
この実施例では、プリスチナマイシンIIＡ生合成経路に参加するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製されるかを説明する。
上記実施例５．１．１．Ａに記載されたアッセイを使用して、以下に記載のようにプリスチナマイシンIIＡシンターゼの精製を凍結に注意し、そして必要に応じて連続的な工程間では活性画分を−３０℃に保存して行う。
０．１Ｍのリン酸緩衝液  ｐＨ７．２（１０容量／容量％のグリセロールを含有する）で洗浄したエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２カルチャー（プリスチナマイシンの生産初期段階で回収した）の１５０ｇの遠心ペレットを、４５０ｍｌの５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液  ｐＨ６．８（５ｍＭのＤＴＴおよび０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有）に溶解する。このように得られた懸濁液を２７℃で４５分間インキュベーションし、そして５０，０００ｇで１時間遠心する。このようにして集めた粗抽出物を硫酸アンモニウム沈殿により分画する。４０−５５飽和％の間で沈殿するタンパク質画分を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅで脱塩し、ｐＨ６．８の５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ  ＤＴＴ中で（１回の注入あたり１００ｍｇ）、ｍｏｎｏＱ  ＨＲ  １０／１０カラムに注入する。タンパク質は直線的なＫＣｌ勾配（０−０．５Ｍ）で溶出する。酵素活性を含む画分（実施例５．１．１．Ａに記載された試験のように検出）をプールし、そしてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０で２０ｍｌに濃縮する。２Ｍ硫酸アンモニウムを含有する１容量のｐＨ  ６．８  ５０ｍＭのｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ  ＤＴＴで希釈した後、タンパク質をＰｈｅｎｙｌ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ＨＲ  １０／１０カラムで、硫酸アンモニウムの減少的勾配（１．０Ｍ−０Ｍ）により溶出する。所望の活性を含有する最高の画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０で１ｍｌに濃縮し、そしてＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ  ２５０カラムに添加（１回の注入あたり２００μl）する。活性ピークを７７，０００付近の分子量でこの方法により検出する。活性を有する画分をＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５  カラム（ｐＨ６．８、５０ｍＭｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、ＤＴＴ  １ｍＭ）に注入し、ＫＣｌの勾配（０−０．５Ｍ）で溶出する。
この工程の後、酵素は純粋であり、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動では３５，０００および５０，０００と推定される分子量の２つのサブユニットが確認される。これらは２５−ｃｍ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ４カラムで、０．０７％のトリフオロ酢酸を含有する３０−５０％のアセトニトリル（水中）の直線勾配で分離される。
0004036467.tif 000002
５．１．２  タンパク質配列からのオリゴヌクレオチドの生成；
この実施例では実施例５．１．１．Ｂに記載されたプリスチナマイシンIIＡシンターゼの２つのサブユニットのＮＨ2−末端配列から出発して、どのようにオリゴヌクレオチドを合成できるかを説明する。プリスチナマイシンIIＡシンターゼの２つのサブユニットは、ＳｎａＡおよひＳｎａＢと呼ばれ、それぞれ実施例５．１．１．Ｂに記載された分子量５０，０００および３５，０００のポリペプチドに対応する。
タンパク質ＳｎａＡおよびＳｎａＢのＮＨ2−末端配列（プリスチナマイシンIIＡシンターゼのサブユニットに対応する）は、マイクロシークエンシングで導いた。これはエドマン分解法により、フェニルチオヒダントイン誘導体を同定するためにＨＰＬＣ装置に連結された全自動シークエンサー（アプライドバイオシステムズ  モデル  ４０７Ａ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行われる。約３０残基がそれぞれについて決定された。
タンパク質ＳｎａＡ：（配列番号２の２−２９残基を参照）
0004036467.tif 000003
タンパク質ＳｎａＢ：（配列番号３の２−３１残基を参照）
0004036467.tif 000004
さらに、これら２つのポリペプチドの内部配列は、ＳｎａＡおよびＳｎａＢのトリプシン消化および得られた断片のＶｙｄａｃ  Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムでの精製後、決定された。以下の内部配列が検出された：
タンパク質ＳｎａＡ：（配列番号２の３６５−３８４残基を参照）
0004036467.tif 000005
タンパク質ＳｎａＢ：（配列番号３の１２２−１３６残基を参照）
0004036467.tif 000006
タンパク質ＳｎａＡおよびＳｎａＢの内部断片の各配列について下線を引いた領域から、ならびにストレプトミセス（Streptomyces）（実施例８を参照）に特異的な遺伝子コドンの縮退に従い、以下のオリゴヌクレオチドの混合物をＢｉｏｓｅａｒｃｈ  ８６００の全自動合成機で合成した。それらを次にすでに記載された技術により精製（Ｓａｗａｄｏｇｏ  Ｍ．およびＶｏｎ  Ｄｙｋｅ  Ｍ．Ｗ．，１９９１）した。ｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子はそれぞれタンパク質ＳｎａＡおよびＳｎａＢの構造遺伝子を表す。
ＳｎａＡの内部配列の下線部分に対応する混合物：
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ＳｎａＢの内部配列の下線部分に対応する混合物：
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５．１．３合成オリゴヌクレオチド混合物の標識化およびＳＰ９２株のゲノムＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション
この実施例ではプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドがどのように放射活性的に標識でき、そして次にすでにエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムライブラリーのＤＮＡが移されている膜にハイブリダイズさせることができるかを説明する。
オリゴヌクレオチドの標識化は５’−末端位に、ＡＴＰの［γ−32Ｐ］リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで転移されることにより行う。この標識化Maniatisら（１９８９）により記載されたように行う。標識化の後、オリゴヌクレオチドを精製せずに使用する。
約２×５００ｎｇの各オリゴヌクレオチド混合物がこのように32Ｐで標識され、２つのライブラリーのそれぞれとハイブリダイズするために使用された。
各ライブラリーの膜のハイブリダイゼーションは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ、Ｊ．およびＷａｈｌ，Ｇ，（１９８４）およびＨａｍｅｓ．Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．（１９８５）に開発されたものに由来した手順に従って行う：１５枚の膜を５０℃にて３時間、以下のものを含有する４０ｍｌの溶液中でプレハイブリダイゼーションする：デンハーツ（×５）［デンハーツ（×１００）：２重量／容量％Ｆｉｃｏｌｌ、２重量／容量％ポリビニルピロリドン、２重量／容量％ＢＳＡ）］、ＳＳＣ（×５）［ＳＳＣ（×２０）：３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  ＮａＰＯ4  ｐＨ６．５、０．１％ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡ。］。
次にハイブリダイゼーションは５０℃にて一晩、２０ｍｌの同一溶液中で行い、そこに５００ｎｇの標識オリゴヌクレオチドを加える。
フィルターを次にＳＳＣ（×６）および０．５％ＳＤＳ溶液中で、室温にて３０分間２回洗浄し、そして次に経験的にしだいに高い温度（５０−６５℃）で洗浄する。これらの後者の洗浄温度は、オリゴヌクレオチド混合物とハイブリダイズするクローンの特異性を測定するために連続的なオートラジオグラフィー的暴露後に次第に上昇させる。
５．１．４  コスミドｐＩＢＶ１およびｐＩＢＶ３の単離、ならびにｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子を含有する領域の決定
この実施例はプリスチナマイシンの生合成の遺伝子を含有する実施例３に記載されたように構築されたコスミドをどのように単離することが可能であるかを説明する。
コスミドｐＩＢＶ１およびｐＩＢＶ３は、それぞれＨＢ１０１株中で生産されたライブラリーおよびＤＨ１株中で生産されたライブラリーに由来する２つのクローンから単離され、これはｐＩＢＶ１については両方のオリゴヌクレオチド混合物と同時にハイブリダイズし、そしてｐＩＢＶ３についてはタンパク質ＳｎａＡの内部配列に由来するオリゴヌクレオチド混合物とハイブリダイズした。
これらのコスミドを実施例２のように精製する。コスミドｐＩＢ１およびｐＩＢＶ３はそれぞれ、大きさがそれぞれ３０ｋｂおよび３４ｋｂと推定されるエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムＤＮＡ挿入物を含んでいる。マップ（第４および６図）は、製造元（ニューイングランドバイオラボズ、ビバリー、マサチューセッツ州、０１９１５−５５１０、米国）の手法に従い、種々の制限酵素で消化したものから確立した。
種々の制限酵素で消化したｐＩＢＶ１およびｐＩＢＶ３ＤＮＡとオリゴヌクレオチド混合物とのサザンハイブリダイゼーションにより、ｓｎａＡおよび／またはｓｎａＢ遺伝子を含有するコスミドの領域の同定が可能になった。
サザンハイブリダイゼーションはManiatisら（１９８９）により記載されたように行った。制限断片を０．８％アガロースゲルでの電気泳動により分離した後、ＤＮＡをＢｉｏｈｙｌｏｎ  Ｚ+膜（バイオプロープ  システム）上に移す。このようにして膜へ移されたＤＮＡとオリゴヌクレオチド混合物とのハイブリダイゼーションは実施例５．１．３に記載されたように行った。
これらのサザンハイブリダイゼーションにより、コスミドｐＩＢＶ１は実施例５．１．２で合成したプローブ（タンパク質ＳｎａＡおよびＳｎａＢ由来）に相同的な配列を含有する６−ｋｂのＢａｍＨＩ断片を所有し、同様にタンパク質ＳｎａＡから排他的に派生するプローブに相同的な配列を含有するＢａｍＨＩ断片内部の２．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を所有することを表すことができた。さらにコスミドｐＩＢＶ３から得たハイブリダイゼーション信号は、それがタンパク質ＳｎａＡから排他的に派生するプローブに相同的な配列を含有する２．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ断片のみを所有することを示した。
５．２  ３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼ（ｓｎｂＡ）に関する構造遺伝子を含有するコスミドｐＩＢＶ２の単離
この実施例では、どのようにしてプリスチナマイシンＩの生合成に関する少なくとも１つの遺伝子を含有する、実施例３のように構築されたコスミドが得られるかを説明する。
５．２．１  ３−ヒドロキシピコリン酸の活性化に関与するタンパク質の同定および精製
この実施例ではどのようにして３−ヒドロキシピコリン酸の活性化の原因であるタンパク質がエス．プリスチナエスピラリス（S．pristinaespiralis）ＳＰ９２から均一にまで精製できるかを説明する。
５．２．１Ａ  ３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼのアッセイ
この実施例ではプリスチナマイシンＩＡの生合成経路の活性のアッセイを説明する。これはこれまでに記載されたことがなく、そしてプリスチナマイシンの生産期間中のみに発現されるという注目すべき性質を有するものである。問題の酵素は３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼであるが、これはその遊離酸およびＡＴＰからＭｇＣｌ2存在下で３−ヒドロキシピコリン酸のアデニル酸塩の形成（第９図）を触媒する。
アッセイする酵素の画分（０．００２−０．０２０単位）を２７℃で１５分間、全２５０μl容量のｐＨ６．８  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  プロパン緩衝液、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０容量／容量％グリセロール中（３−ヒドロキシピコリン酸（１ｍＭ）、ＡＴＰ（２ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（５ｍＭ）および放射活性のリン原子の３２同位体で標識したピロリン酸四ナトリウム塩（２００μＭ）の存在下で）でインキュベーションする。
反応は７５％の０．１Ｍ  ピロリン酸四ナトリウム塩および２５％の１４％過塩素酸の混合物中の１０ｇ／ｌ濃度の１ｍｌの活性炭懸濁液を加えることにより停止する。撹拌後、活性炭を回収し、そして１ｍｌのピロリン酸／過塩素酸混合物で２回洗浄する。放射線活性な有機分子を次に１ｍｌの５０％メタノールおよび５０％のＮアンモニア溶液混合物で３回、１２ｍｌの水を含有する計数容器中に溶出する。放射線活性はシンチレーションカウンターを装備したＣｅｒｅｎｋｏｖ（ＰＡＣＫＡＲＤ  Ｍａｎａｘｉ  ＴｒｉＣａｒｂ  ４０００）により測定する。
酵素活性の単位は、上記条件下で１時間のタイムコース中に１μｍｏｌのピロリン酸塩がＡＴＰに取り込まれるのに必要な酵素量と定義される。
５．２．１．Ｂ  エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２  ３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの精製
この実施例では、プリスチナマイシンＩＡの生合成経路に参加するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製できるかを説明する。
上記実施例５．２．１．Ａに記載したアッセイを使用して、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの精製が以下に記載されるように行われる。活性画分を−７０℃に凍結し、そして必要に応じて連続的な工程の間では−３０℃に保存することに注意する。
プリスチナマイシン生産フェーズの初期段階で回収したエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のカルチャーの遠心ペレット２３４ｇ（１０容量／容量％のグリセロールを含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液  ｐＨ７．２で洗浄したもの）を、２３４ｍｌのｐＨ  ８．０  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（４ｍＭ  ＤＴＥ、１ｍＭ  ベンズアミジン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１５容量／容量％のグリセロールおよび０．６ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する）に溶解する。このように得られた懸濁液を２７℃にて３０分間インキュベーションし、そして５０，０００ｇで１時間遠心する。このようにして回収した粗抽出物（ｐＨ  ８．０  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４ｍＭ  ＤＴＥ，１ｍＭ  ベンズアミジン  １ｍＭ  ＰＭＳＦ、１５容量／容量％グリセロール中の）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗのカラム（８０ｍｌ）に注入する。タンパク質をＫＣｌの直線勾配（０−０．４Ｍ）で溶出する。酵素活性を含有する画分を、（実施例５．２．１．Ａに記載された試験法で検出）をプールし、２Ｍの硫酸アンモニウムを含有する１容量の  ｐＨ  ８．０  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭ  ベンズアミジン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１５容量／容量グリセロールで希釈する。次にタンパク質をＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのカラム（５０ｍｌ）でクロマトグラフィーを行い、ｐＨ  ８．０  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭ  ベンズアミジン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１５容量／容量グリセロール中での硫酸アンモニウムの減少勾配（１．０Ｍ−０Ｍ）により溶出する。４ｍＭ  ＤＴＥを添加した後、活性画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０で５ｍｌに濃縮し、そして次にＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅのカラム（１００ｍｌ）に添加する。所望の活性を含む画分をプールし、そしてｐＨ  ８．０  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４ｍＭ  ＤＴＥ、１ｍＭ  ベンズアミジン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１５容量／容量グリセロール（１回の注入あたり６ｍｇ）中にてＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５のカラムに注入し、ＫＣｌの直線的勾配（０−０．４Ｍ）で溶出する。活性画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０で１ｍｌに濃縮し、３容量のｐＨ  ６．８  ５０ｍＭ  Ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、４ｍＭ  ＤＴＥ、１ｍＭ  ベンズアミジン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１５容量／容量グリセロールで希釈し、そして後者の緩衝液中にてＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５のカラムに注入し（１回の注入あたり２ｍｇ）、そしてＫＣｌの直線的勾配（０−０．３Ｍ）で溶出する。所望のリガーゼを含有する最高の画分をプールし、そして次にｐＨ  ６．８  ２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、５０ｍＭ  硫酸ナトリウム中にてＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ  ２５０カラムに添加する。活性ピークをこの方法で分子量６０，０００あたりに検出する。
３−ヒドロキシピコリン酸の活性化活性を所有するタンパク質を今後ＳｎｂＡと命名する。
この段階の後、酵素は純粋であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動においてその分子量は約６７，０００と推定される。
0004036467.tif 000009
５．２．２．タンパク質配列からのオリゴヌクレオチドの精製：
この実施例ではタンパク質３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼのＮＨ2−末端および内部配列から出発して、どのようにオリゴヌクレオチドを合成できるかを説明する。
タンパク質ＳｎｂＡのＮＨ2−末端配列を、実施例５．１．２に記載したようにマイクロシークエンシングにより導いた。約２０残基がこのようにして同定された。
タンパク質ＳｎａＡの内部の約２０アミノ酸配列もトリプシン加水分解後に同定され、得られた断片の精製をＶｙｄａｃ  Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムで行った。
タンパク質３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰ  リガーゼのＮＨ2−末端
（配列番号５に関しては残基１−２１を参照のこと）
0004036467.tif 000010
タンパク質３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰ  リガーゼの内部配列
（配列番号５に関しては残基４４８−４６７を参照のこと）
0004036467.tif 000011
各配列の下線部から、ならびにストレプトミセス（Streptomyces）に特異的な遺伝子コードの縮退により（実施例８参照）、以下の混合オリゴヌクレオチドが合成された：
タンパク質３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰ  リガーゼのＮＨ2−末端配列の下線部に対応する混合物
0004036467.tif 000012
タンパク質３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰ  リガーゼの内部配列の下線部に対応する混合物
0004036467.tif 000013
５．２．３  合成オリゴヌクレオチドの標識およびエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション
この実施例ではプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを、どのように放射活性的に標識し、そしてエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のゲノムライブラリーのＤＮＡがすでに移された膜とハイブリダイズさせることができるかを説明する。
オリゴヌクレオチドの標識は、実施例５．１．３に記載したように５’−末端位にＡＴＰの［γ−32Ｐ］リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより転移させることにより行う。
約２×５００ｎｇの各混合オリゴヌクレオチドがこのように32Ｐで標識され、そしてそれぞれ２つのライブラリーをハイブリダイズさせるために使用された。
各ライブラリーの膜のハイブリダイゼーションは実施例５．１．３に記載されたように行われる。
５．２．４．コスミドｐＩＢＶ２の単離および３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼに関する構造遺伝子を含有する領域の決定
この実施例では、少なくとも１つの３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの構造遺伝子を含有する実施例３で構築されたコスミドをどのようにして得ることができるかを説明する。
コスミドｐＩＢＶ２を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１中で生産されたライブラリーのクローン（これは両方の混合オリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズする）から単離した。
このコスミドを実施例２に記載したように精製した。これは大きさが４７ｋｂと推定されるエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムＤＮＡ挿入物を含有する。マップ（第５図）は実施例５，１，４に記載したように種々の制限酵素の消化物から確立した。
種々の酵素で消化したｐＩＢＶ２  ＤＮＡと混合オリゴヌクレオチドとのサザンハイブリダイゼーションにより、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼに関する構造遺伝子を含有する領域を同定できた。サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションは実施例５．１．４に記載したように行った。
ハイブリダイゼーションの結果により、コスミドｐＩＢＶ２は実施例５．２．２で合成されたプローブに相同的な配列を含有する５．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｌII断片を保有した。
５．３  コスミドｐＩＢＶ３についてプリスチナマイシンＩシンターゼII（ＳｎｂＣ）に関する構造遺伝子部分の存在の実証
この実施例ではすでに単離された（実施例５．１）コスミドについて、プリスチナマイシンＩの生合成に関する遺伝子の存在をどのように同定することができるかを説明する。
５．３．１  トレオニンおよびアミノ酪酸残基のペプチド鎖プリスチナマイシンＩＡ中への取り込みに関与するプリスチナマイシンＩシンターゼIIの同定
この実施例はトレオニンおよびアミノ酪酸残基の、プリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖への取り込みの原因であるタンパク質が、エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２からどのように均一にまで精製できるかを説明する。
５．３．１．Ａ  プリスチナマイシンＩシンターゼIIの部分活性のアッセイ
この実施例ではプリスチナマイシンＩＡの生合成経路の活性のアッセイを説明する。これはこれまでに記載されたことがなく、そしてプリスチナマイシンの生産期間中のみに発現されるという注目すべき性質を有するものである。問題の活性はＡＴＰおよびＭｇＣｌ2の存在下で、トレオニンおよびアミノ酪酸残基の、プリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖への取り込みの原因であるペプチドシンターゼの部分活性である。
トレオニン：ＡＭＰリガーゼおよびアミノ酪酸：ＡＭＰリガーゼ活性は、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼについて５．２．１．Ａに記載されたものと同様に、ＡＴＰ−ピロリン酸変換の酵素試験で測定する。
酵素とトレオニンまたはアラニン（プリスチナマイシンＩＣで見いだされるアミノ酪酸の類似体）とのアミノアシル化反応は、ＡＴＰ−ピロリン酸変換に影響するかもしれない他の酵素（特にアミノアシル−ｔＲＮＡシンターゼ）からペプチドシンターゼを分別することができる。以下に記載した酵素とトリチウム−標識トレオニンとのアミノアシル化の試験はこの実施例に使用したものである。
アッセイする酵素画分（０．２−２単位）を２７℃で１５分間、全容量が２５０μlのｐＨ  ６．８  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０容量／容量％グリセロール（１μＣｉの［３−3Ｈ］−Ｌ−トレオニン（１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＡＴＰ（２ｍＭ）およびＭｇＣｌ2（５ｍＭ）の存在下）中でインキュベーションする。
反応を１５０μlの２５％トリクロロ酢酸溶液を加えて停止する。沈殿したタンパク質をマイクロフィルター上に回収し、４００μlの７％トリクロロ酢酸で３回洗浄し、その後４００μlのＮ水酸化ナトリウムで２回、計数容器（１ｍｌのＮ  ＨＣｌおよび１２ｍｌのシンチレーションカクテル（ベックマン  リーディゲル：Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｒｅａｄｙｇｅｌ）を含有する）中に溶出する。この容器に含まれる放射線活性をシンチレーションカウンター（ＰＡＣＫＡＲＤ  Ｍｉｎａｘｉ  ＴｒｉＣａｒｂ  ４０００）で測定する。これは所望のペプチドシンターゼに共有的に結合したトレオニンの量を表す。
酵素活性の単位は１ピコモルのトレオニンが、上記条件下で１５分間に共有的に結合するために要する酵素量と定義する。
５．３．１．Ｂ．プリスチナマイシンＩシンターゼIIの精製
この実験では、プリスチナマイシンＩＡの生合成経路に参加するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製できるかを説明する。
上記実施例５．３．１．Ａに記載した酸を使用して、トレオニンおよびアミノ酪酸残基のプリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖への取り込みの原因であるペプチドシンターゼの精製は以下に記載されるように行われる。４℃で操作し、活性画分は−７０℃に保存することに注意する。
プリスチナマイシン生産フェーズの初期段階で回収したエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のカルチャーの遠心ペレット１５０ｇを（１０容量／容量％のグリセロールを含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液  ｐＨ７．２で洗浄したもの）を、４５０ｍｌのｐＨ  ８．０  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（４ｍＭ  ＤＴＥ、１ｍＭ  ベンズアミジン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１５容量／容量％のグリセロールを含有する）に溶解する。このように得られた懸濁液を、５０００ｐｓｉの圧力に調整したフレンチプレスを使用して粉砕し、そして５０，０００ｇで１時間遠心する。このようにして回収した粗抽出物を、（ｐＨ  ８  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４ｍＭ  ＤＴＥ、２ｍＭ  ベンズアミジン、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、１ｍｇ／ｌ  Ｅ−６４、１５容量／容量％グリセロール中の）Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗのカラム（２００ｍｌ）に注入する。タンパク質をＫＣｌの直線勾配（０−０．６Ｍ）で溶出する。カラムから溶出した各画分を、その１−１０容量の１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ溶液で処理する。酵素活性を含む画分（実施例５．３．１．Ａに記載された試験法で検出）をプールし、そしてｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３０の限外濾過により２８ｍｌの最終容量に再濃縮する。この濃縮物を４−ｍｌのアリコートとしてＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｈｉ−Ｌｏａｄ  １６／６０浸透カラム（ｐＨ  ６．８  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ  ベンズアミジン、４ｍＭ  ＤＴＥ、０．２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＫＣｌ、２０容量／容量グリセロールで平衡化した）に注入する。アッセイ後、活性画分をプールし、そしてｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３０により１５ｍｌに再濃縮し、次にＰＤ−１０（ｐＨ  ８．０  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４ｍＭ  ＤＴＥ、２ｍＭ  ベンズアミジン、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、１ｍｇ／ｌ  Ｅ−６４、２０重量／重量％グリセロール中）で脱塩し、２部分にて、同一緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ  １０／１０カラムに添加し、そして同一緩衝液中の０．４Ｍ  ＫＣｌの直線的勾配で溶出する。所望の活性を含む画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３０そして次にＣｅｎｔｒｉｃｏｎ３０で１ｍｌの最終容量に再濃縮し、そして５部分にてＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＨＲ  １０／３０（ｐＨ  ６．８  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ  ベンズアミジン、４ｍＭ  ＤＴＥ、０．２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＫＣｌ、２０容量／容量グリセロール中）に注入する。活性ピークをこの方法で分子量４５０，０００あたりに検出する。
この段階の後、酵素は純粋であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動においてその分子量は約２４０，０００と推定される。このバンドはまたトリチル化トレオニンでのアミノアシル化により標識されたタンパク質のすべての放射線活性を含む。
この段階で、１００μＣｉ／ｍｌのトレオニン（１５ｃｉ／ｍｍｏｌ）の濃縮物を使用した酵素の最大活性は、３６７０単位／ｍｇにのぼる；また酵素は、Ｌ−アミノ酪酸またはＬ−アラニンでアデニル酸を形成できる；酵素とトリチル化アラニンとのアミノアシル化反応が見いだされ、そして２００μＣｉ／ｍｌの［２，３−3Ｈ］−Ｌ−アラニン（１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で１５分間の最大活性は２２９０ｐｍｏｌ／ｍｇである。
0004036467.tif 000014
５．３．２．タンパク質配列からのオリゴヌクレオチドの生産：
この実施例ではプリスチナマイシンＩシンターゼIIの内部配列から出発して、どのようにオリゴヌクレオチドを合成できるかを説明する。
プリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖中へトレオニンおよびアミノ酪酸残基を取り込む原因となるペプチドシンターゼの内部配列を、トリプシン加水分解の後、得られた断片をＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラムで精製した後、実施例５．１．２に記載したようにマイクロシークエンシングにより導き出した。
タンパク質プリスチナマイシンＩシンターゼIIの内部配列
（配列番号１２に関しては残基４９−６１を参照のこと）
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これらの配列の下線部領域から、ならびにストレプトミセス（Streptomyces）に特異的な遺伝子コードの縮退により（実施例８参照）、以下の混合オリゴヌクレオチドが合成された：
タンパク質プリスチナマイシンＩシンターゼIIの内部の配列１の下線部に対応する混合物
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タンパク質プリスチナマイシンＩシンターゼIIの内部配列２の下線部に対応する混合物
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５．３．３  合成オリゴヌクレオチド混合物の標識およびコスミドＰＩＢＶ３  ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション
この実施例ではプリスチナマイシンＩの生合成に関する遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを、どのように放射活性的に標識し、そしてコスミド  ｐＩＢＶ３  ＤＮＡがすでに移された膜とハイブリダイズさせることができるかを説明する。
オリゴヌクレオチドの標識は、実施例５．１．３に記載したように５’−末端位にＡＴＰの［γ−32Ｐ］リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより転移させることにより行う。
約５００ｎｇの混合オリゴヌクレオチドがこのように32Ｐで標識され、そして種々の酵素で消化したｐＩＢＶ３  ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのために使用された。これらのハイブリダイゼーションで、プリスチナマイシンＩシンターゼIIに関する構造遺伝子部分がコスミドＰＩＢＶ３に保持されていることを示すことができ、そしてこの遺伝子を含有する領域を同定することができる。サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションは実施例５．１．４に記載されたように行われる。
ハイブリダイゼーションの結果は、コスミドｐＩＢＶ３が実施例５．３．２で合成されたプローブに相同的な配列を含有する６．２−ｋｂのＳｐｈＩ断片を保持することを示すことができた。
５．４．コスミドｐＩＢＶ３について、プリスチナマイシンＩシンターゼIII（ＳｎｂＤ）に関する遺伝子部分の存在の実証
この実施例ではすでに単離された（実施例５．１）コスミドについて、プリスチナマイシンＩの生合成に関する遺伝子の存在をどのように同定することができるかを説明する。
５．４．１  プロリンおよびｐ−ジメチルアミノフェニルアラニン残基のプリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖中への取り込みに関与するプリスチナマイシンＩシンターゼIIIの同定
この実施例はプロリンおよびｐ−ジメチルアミノフェニルアラニン残基の、プリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖への取り込みの原因であるタンパク質が、どのようにエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２から均一にまで精製できるかを説明する。
５．４．１．Ａ  プリスチナマイシンＩシンターゼIIIの部分活性のアッセイ
この実施例ではプリスチナマイシンＩＡの生合成経路の活性のアッセイを説明する。これはこれまでに記載されたことがなく、そしてプリスチナマイシンの生産期間中のみに発現されるという注目すべき性質を有するものである。問題の活性はＳＡＭ、ＡＴＰおよびＭｇＣｌ2の存在下で、プロリンおよびパラ−ジメチルアミノフェニルアラニン残基の、プリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖への取り込みの原因であるペプチドシンターゼの部分活性である。
プロリン：ＡＭＰリガーゼおよびｐ−ジメチルアミノフェニルアラニン：ＡＭＰリガーゼ活性は、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼについて５．２．１．Ａに記載されたものと同様に、ＡＴＰ−ピロリン酸変換の酵素試験で測定する。
酵素とプロリンおよびｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンとのアミノアシル化反応は、ＡＴＰ−ピロリン酸変換を行うことができる他の酵素（特にアミノアシル−ｔＲＮＡシンターゼ）からペプチドシンターゼを分別することができる。同じく酵素でアシル化されたｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンのα−アミノ官能基のＮ−メチル化について応用する。したがって後者の試験のＮ−メチル化の特徴を、この実施例に使用する。
アッセイする酵素画分（０．２−２単位）を２７℃で１５分間、全容量が２５０μlのｐＨ  ６．８  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０容量／容量％グリセロール（１μＣｉの［メチル−3Ｈ］−ＳＡＭ（１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、パラ−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン（１ｍＭ）、ＡＴＰ（２ｍＭ）およびＭｇＣｌ2（５ｍＭ）の存在下）中でインキュベーションする。
反応を１５０μlの２５％トリクロロ酢酸溶液を加えて停止する。沈殿したタンパク質をマイクロフィルター上に回収し、４００μlの７％トリクロロ酢酸で３回洗浄し、その後４００μlのＮ水酸化ナトリウムで２回、計数容器（１ｍｌのＮ  ＨＣｌおよび１２ｍｌのシンチレーションカクテル（ベックマン  リーディゲル）を含有する）中に溶出する。この容器に含まれる放射線活性をシンチレーションカウンター（ＰＡＣＫＡＲＤ  Ｍｉｎａｘｉ  ＴｒｉＣａｒｂ  ４０００）で測定する。これは所望のペプチドシンターゼに共有的に結合したＮ−メチル化パラ−ジメチルアミノフェニルアラニンの量を表す。
酵素活性の単位は１ピコモルのＮ−メチル化ｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンが、上記条件下で１５分間に共有的に結合するために要する酵素量と定義する。
５．４．１．Ｂ．プリスチナマイシンＩシンターゼIIIの精製
この実験では、プリスチナマイシンＩＡの生合成経路に参加するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製できるかを説明する。
上記実施例５．４．１．Ａに記載したアッセイを使用して、プロリンおよびパラ−ジメチルアミノフェニルアラニン残基のプリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖への取り込みの原因であるペプチドシンターゼの精製は以下に記載されるように行われる。４℃で操作し、活性画分は−７０℃に保存することに注意する。
プリスチナマイシン生産フェーズの初期段階で回収したエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のカルチャーの遠心ペレット２５０ｇを（０．１Ｍのリン酸緩衝液  ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１０容量／容量％のグリセロールで洗浄したもの）を、７５０ｍｌのｐＨ  ８．０  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（４ｍＭ  ＤＴＥ、４ｍＭ  ベンズアミジン、０．２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１ｍＭ  Ｅ．ＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、２ｍｇ／ｌ  ＳＴＩ、２ｍｇ／ｌ  アプロチニン、１ｍｇ／ｌ  Ｅ−６４、２０容量／容量％のグリセロールを含有する）に溶解する。このように得られた懸濁液を、５０００ｐｓｉの圧力に調整したフレンチプレスを使用して粉砕し、そして５０，０００ｇで１時間遠心する。このようにして回収した粗抽出物を硫酸アンモニウム沈殿により分画する。０から３５％飽和硫酸アンモニウムの間に沈殿するタンパク質画分を破壊緩衝液中に再溶解し、そして平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ  ７５  Ｆｉｎｅで脱塩し、同じ緩衝液で溶出する。このようにして得られたタンパク質を、（ｐＨ  ８．０  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４ｍＭ  ＤＴＥ、２ｍＭ  ベンズアミジン、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、１ｍｇ／ｌ  Ｅ−６４、２０容量／容量％グリセロール中の）Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗのカラム（２００ｍｌ）に注入し、そしてＫＣｌの直線勾配（０−０．６Ｍ）で溶出する。カラムから溶出した各画分を、その１−１０容量の２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ベンズアミジン溶液で処理する。酵素活性を含む画分（実施例５．４．１．Ａに記載された試験法で検出）をプールし、そして８０％飽和の硫酸アンモニウムで沈殿させる。沈殿するタンパク質をｐＨ  ６．８  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ  ベンズアミジン、１ｍＭ  ＤＴＥ、０．２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２０容量／容量％グリセロールに再溶解し、５４−ｍｌアリコート部分を、同一緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｈｉ−Ｌｏａｄ  １６／６０浸透カラムに注入し、そして同一緩衝液で溶出する。アッセイ後、活性画分をプールし、そしてｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３０により３ｍｌに再濃縮し、次に２０ｍｌのｐＨ  ８．０  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４ｍＭ  ＤＴＥ、１ｍＭ  ベンズアミジン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２０容量／容量％グリセロールで再希釈し、２部分にて同一緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ  １０／１０カラムに添加し、そして同一緩衝液中の０．４Ｍ  ＫＣｌの直線的勾配で溶出する。所望の活性を含む最高画分をプールし、酵素活性の特性決定のための材料およびそのマイクロシークエンシングとして使用する。
この段階の後、酵素は純粋であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動においてその分子量は約２５０，０００と推定される。このバンドはまたトリチル化ＳＡＭおよびパラ−ジメチルアミノフェニルアラニンでのアミノアシル化により標識されたタンパク質のすべての放射線活性も含む。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＨＲ  １０／３０の浸透において、酵素の天然の分子量は７００，０００と推定される。
この段階で、この酵素はプロリンとアデニル酸塩を形成することもできる；トリチル化プロリンとの酵素のアミノアシル化反応が検出され、２００μＣｉ／ｍｌの［５−3Ｈ］−Ｌ−プロリン（３４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で１５分間の最大活性は、２４９０単位／ｍｇである。
0004036467.tif 000018
５．４．２．タンパク質配列からのオリゴヌクレオチドの生産
この実施例ではプリスチナマイシンＩシンターゼIIIの内部配列から出発して、どのようにオリゴヌクレオチドを合成できるかを説明する。
プリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖中へプロリンおよびパラ−ジメチルアミノフェニルアラニン残基を取り込む原因となるペプチドシンターゼの内部配列を、シアノーゲンブロミド処理および得られた断片をＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラムで精製した後、実施例５．１．２に記載したようにマイクロシークエンシングにより導き出した。
タンパク質プリスチナマイシンＩシンターゼIIIの内部配列
１（配列番号１３に関しては残基２−２０を参照のこと）
0004036467.tif 000019
この配列の下線部領域から、ならびにストレプトミセス（Streptomyces）に特異的な遺伝子コードの縮退により（実施例８参照）、以下の混合オリゴヌクレオチドが合成された：
タンパク質プリスチナマイシンＩシンターゼIIIの内部配列の下線部に対応する混合物
0004036467.tif 000020
５．４．３  合成オリゴヌクレオチド混合物の標識およびコスミド  ＰＩＢＶ３  ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション
この実施例ではプリスチナマイシンＩの生合成に関する遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを、どのように放射活性的に標識し、そしてコスミド  ｐＩＢＶ３  ＤＮＡがすでに移された膜とハイブリダイズさせることができるかを説明する。
オリゴヌクレオチドの標識は、実施例５．１．３に記載したように５’−末端位にＡＴＰの［γ−32Ｐ］リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより転移させることにより行う。
約５００ｎｇの混合オリゴヌクレオチドがこのように32Ｐで標識され、そして種々の酵素で消化したｐＩＢＶ３  ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのために使用された。これらのハイブリダイゼーションで、プリスチナマイシンＩシンターゼIIIに関する構造遺伝子部分がコスミドｐＩＢＶ３に保持されていることを示すことができ、そしてこの遺伝子を含有する領域を同定することができる。サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションは実施例５．１．４に記載されたように行われる。
ハイブリダイゼーションの結果では、コスミドｐＩＢＶ３が実施例５．４．２で合成されたプローブに相同的な配列を含有する８．４−ｋｂのＳｐｈＩ断片を保持することを示すことができた。
５．５  コスミドｐＩＢＶ３についてプリスチナマイシンＩシンターゼIV（ＳｎｂＥ）に関する構造遺伝子部分の存在の実証
この実施例ではすでに単離された（実施例５．１）コスミドについて、プリスチナマイシンＩの生合成に関する遺伝子の存在をどのように同定することができるかを説明する。
５．５．１  フェニルグリシン残基をプリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖中に取り込む原因となるペプチドシンターゼIIの同定（プリスチナマイシンＩシンターゼIVと言う）。
５．５．１．Ａ  フェニルグリシン残基をプリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖中に取り込む原因となるペプチドシンターゼ（プリスチナマイシンＩシンターゼIV）により保持される酵素活性のアッセイ
この実施例ではプリスチナマイシンＩＡの生合成経路の酵素活性のアッセイを説明する。これはこれまでに記載されたことがなく、そして野生型微生物中でのプリスチナマイシンの生産期間中のみに発現されるという注目すべき性質を有するものである。問題の活性はＡＴＰおよびＭｇＣｌ2の存在下で、Ｌ−フェニルグリシン残基を、ペプチド鎖（第１２図）へ取り込む原因となるペプチドシンターゼ（プリスチナマイシンＩシンターゼIV）の活性である。プリスチナマイシンＩシンターゼIVのフェニルグリシン：ＡＭＰリガーゼ活性は、インキュベーション緩衝液中Ｌ−フェニルグリシン（１ｍＭ）およびＫＣ１（５０ｍＭ）の存在下で、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼ活性について５．２．１．Ａに記載されたものと同様に、ＡＴＰ−ピロリン酸変換の酵素試験で測定する。
５．５．１．Ｂ．フェニルグリシン残基をプリスチナマイシンＩＡのペプチド鎖中に取り込む原因となるペプチドシンターゼ（プリスチナマイシンＩシンターゼIV）の精製
この実施例では、プリスチナマイシンＩＡの生合成経路に参加するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製できるかを説明する。上記実施例５．５．１．Ａに記載したアッセイを使用して、プリスチナマイシンＩシンターゼIVの精製は以下に記載されるように行われる。すべての操作を４℃で行う。活性を含む画分はすぐに凍結し−７０℃に保存する。
７０ｇの湿潤細胞（実施例５．２．１．Ｂに記載したように回収）を、２５０ｍｌの細胞溶解緩衝液（２５％のグリセロール、４ｍＭ  ＤＴＥ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍｇ／ｌ  Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ  ＳＴＩ、２ｍｇ／ｌ  α2−マクログロブリン、１ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、２ｍｇ／ｌアプロチニン、５ｍＭ  ベンズアミジン、０．６ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ  ８．０）に再懸濁する。このように得られた溶液を、４℃に１時間撹拌しながら保ち、そして次に５０，０００ｇで１時間遠心する。このようにして得られた上澄みを、溶解緩衝液中でＳｅｐｈｄｅｘ  Ｇ−２５のカラムに注入し、そして排除画分（各クロマトグラフィー操作に約２５０ｍｇのタンパク質を注入）をＭｏｎｏＱ  ＨＲ  １６／１０（ファルマシア）（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ  ８．０、４ｍＭ  ＤＴＥ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｌ  Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ  ＳＴＩ、２０％グリセロールで平衡化）に注入する。タンパク質をＫＣｌの直線勾配（０−０．６Ｍ）で溶出し、カラムからの溶出時に、各画分をその１−１０容量の２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で処理する。酵素活性を含む画分をプールし、そして画分３容量あたり１容量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ  ８．０、１５％のグリセロール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ベンズアミジン、４ｍＭ  ＤＴＴ、３．４Ｍ  硫酸アンモニウムと混合する。この溶液をＰｈｅｎｙｌ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ＨＲ  １０／１０（各クロマトグラフィー操作に１／５の溶液を注入）に注入し、そしてタンパク質を硫酸アンモニウムの減少的勾配（０．９−０Ｍ）で溶出する。活性を含有する画分をプールし、そして溶液をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３０で３５００μlに濃縮し、そして２部に分けてＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｈｉ−Ｌｏａｄ  １６／６０カラム（５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液  ｐＨ  ６．８、２０％グリセロール、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ベンズアミジン、１ｍＭ  ＥＤＴＡで平衡化および溶出）に注入する。活性画分を９容量の２５％グリセロール、４ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ベンズアミジンを含有する５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液  ｐＨ  ６．８で希釈し、同一緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５カラムに注入する。所望の活性を０−０．４Ｍ  ＫＣｌの直線的勾配で溶出し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で６３０μlに濃縮する。次に所望のタンパク質は、試料を８０℃で１０分間ＳＤＳ／メルカプトエタノール混合物で加熱することにより変性させた後、６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動で精製する。電気泳動およびクーマシーブルーでゲルを染色した後、タンパク質を含有するゲルのバンドを切り出し、そしてタンパク質をゲルからＣｅｎｔｒｉｌｕｔｏｒ中に電気溶出する。
注意：プリスチナマイシンＩシンターゼIVに対応するバンドはトリチル化（トリチル化フェニルグリシンとの共有結合：実施例５．５．２．を参照にされたい）したものとの比較により同定する。
この段階の後、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において酵素は純粋である。その分子量は約１７０，０００と推定される。
５．５．２．プリスチナマイシンＩシンターゼIVの、酵素に対する放射活性フェニルグリシンのチオエステル化による標識
フェニルグリシン：ＡＭＰリガーゼ活性を介してアデニル酸の状態で活性化した後、フェニルグリシンを伸長化中にペプチド鎖中に取り込まれる前に、フェニルグリシンを酵素の活性部位のチオール基に転移させる（ペプチド抗生物質の一般的な生合成過程では“チオテンプレート  メカニズム（ｔｈｉｏｔｅｍｐｌａｔｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）”という名前で知られている）。一般的に、アミノ酸ノ活性化に影響するタンパク質の放射線標識は、放射活性な状態のアミノ酸でチオエステル誘導体を調製することにより行うことができる。
例として、プリスチナマイシンＩシンターゼIVの標識化は、５０μｇのタンパク質（ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５クロマトグラフィーカラムからの溶出活性画分；上記実施例５．５．１．Ｂを参照のこと）を、２７℃で１時間１００μＣｉの（ＲＳ）−２−フェニル［２−3Ｈ］グリシン（１８Ｃｉ／ｍｍｏｌ；アマシャム：Ａｍｅｒｓｈａｍ）と、７０μlの５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液中  ｐＨ  ６．８（２０％グリセロール、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＡＴＰ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ベンズアミジン、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する）でインキュベーションすることにより行われる。変性（メルカプトエタノール無しでＳＤＳのみ）後、タンパク質を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、６％ゲル）で分離し、クーマシーブルーで視覚化する。タンパク質バンドの計数およびオートラジオグラフィー（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＭＰ；ゲルにアマシャムのＡｍｐｌｉｆｙを染み込ませた後のフルオログラフィー）による放射活性のプロフィールの分析では、分子量１７０，０００の単一放射活性バンドが現れる。
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５．５．３．プリスチナマイシンＩシンターゼIVが保持する他の活性
実施例５．５．２に記載されたようにフェニルグリシンの取り込みの原因であるペプチドシンターゼの精製により、分子量が１７０，０００の純粋なタンパク質が得られる。このタンパク質は試験した他のアミノ酸（特にピペコリン酸または４−オキソピペコリン酸）を活性化しない。このタンパク質の第２の調製は、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅの工程を排除して５．５．１．Ｂに記載されたように行われるが、別のエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２カルチャーから出発して、５．４．１Ｂに記載するようにフレンチプレスで調製された粗抽出物を、ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５の工程の溶出時のタンパク質として得、これは純度において同じ実施例５．５．１．Ｂに記載した工程で得られたタンパク質と同等であるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２５０，０００の分子量を有した。この新規調製物は、フェニルグリシンの活性化およびチオエステル化の能力があったが、加えて３−ヒドロキシピコリン酸について記載した５．２．１．Ａと同様に、変換試験においてＬ−ピペコリン酸（１ｍＭ）でＡＴＰ−ピロリン酸変換活性を有した。さらに、１７０，０００のタンパク質は、大変不純なタンパク質調製物であってもＬ−ピペコリン酸でＡＴＰ−ピロリン酸変換活性をもたない。エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２は天然には４−オキソピペコリン酸の代わりにピペコリン酸残基を有する少量のプリスチナマイシンＩＡ類似体を生産することに注目すべきである。したがって、このことはフェニルグリシンの取り込みの原因であるペプチドシンターゼ（プリスチナマイシンＩシンターゼIV）が以前の残基（おそらくピペコリン酸）も取り込むことを触媒することを実証するものである。２つの調製物においてプリスチナマイシンＩシンターゼIVについて得られた異なる分子量（１７０，０００および２５０，０００）は、初めの場合における部分的タンパク質開裂現象に起因し、Ｌ−ピペコリン酸の活性化活性の損失を導く。
５．５．４．  タンパク質配列からのオリゴヌクレオチドの生産
この実施例ではプリスチナマイシンＩシンターゼIVの内部配列から出発して、適当に選択したオリゴヌクレオチドを使用してどのように対応する遺伝子の試験を開始できるかを説明する。
１５アミノ酸のプリスチナマイシンＩシンターゼIVの内部配列は、精製タンパク質をシアノーゲンブロミド開裂し、そして得られた断片をＶｙｄａｃ  Ｃ１８ＨＰＬＣカラムで精製した後に同定した。
タンパク質プリスチナマイシンＩシンターゼIVの内部配列
（配列番号１６に関しては残基８２−９８を参照のこと）
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各これらの配列の下線部領域から、ならびにストレプトミセス（Streptomyces）に特異的な遺伝子コードの縮退により（実施例８参照）、以下の混合オリゴヌクレオチドが合成された：
混合はタンパク質プリスチナマイシンＩシンターゼIVの内部配列の下線部分に対応する：
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５．５．５  合成オリゴヌクレオチド混合物の標識およびコスミド  ｐＩＢＶ３  ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション
この実施例ではプリスチナマイシンＩの生合成に関する遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを、どのように放射活性的に標識し、そしてコスミド  ｐＩＢＶ３  ＤＮＡがすでに移された膜とハイブリダイズさせることができるかを説明する。
オリゴヌクレオチドの標識化は、実施例５．１．３に記載したように５’−末端位にＡＴＰの［γ−32Ｐ］リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより転移させることにより行う。
約５００ｎｇの混合オリゴヌクレオチドがこのように32Ｐで標識され、そして種々の酵素で消化したｐＩＢＶ３  ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのために使用された。これらのハイブリダイゼーションで、プリスチナマイシンＩシンターゼIIに関する構造遺伝子部分がコスミドｐＩＢＶ３に保持されていることを示すことができ、そしてこの遺伝子を含有する領域を同定することができる。サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションは実施例５．１．４に記載されたように行われる。
ハイブリダイゼーションの結果は、コスミドｐＩＢＶ３が実施例５．５．４で合成されたプローブに相同的な配列を含有する６．６−ｋｂのＳｐｈＩ断片を保持することを示すことができた。
５．６  ＦＭＮレダクターゼ（ｓｎａＣ）の構造遺伝子を含有するコスミドｐＩＢＶ４の単離
この実施例ではＰIIの生合成に関する少なくとも１つの遺伝子を含有する実施例３に記載されたように構築されたコスミドを、どのようにして得ることができるかを説明する。
５．６．１  プリスチナマイシンIIＡシンターゼに関連するＦＭＮレダクターゼの同定
この実施例ではＮＡＤＨによりＦＭＮを還元してＦＭＮＨ2（プリスチナマイシンIIＡシンターゼにより触媒される反応に必要である）形成の原因となるタンパク質が、どのようにエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２から均一にまで精製できるかを説明する。
５．６．１．Ａ．ＦＭＮレダクターゼ活性のアッセイ
この実施例ではプリスチナマイシンIIＡの生合成経路の活性のアッセイを説明する。これはこれまでに記載されたことがなく、そしてプリスチナマイシンの生産期間中のみに発現されるという注目すべき性質を有するものである。問題の酵素はＦＭＮレダクターゼであり、これはまたＮＡＤＨ：ＦＭＮオキシドレダクターゼとも呼ばれるが、ＮＡＤＨの存在下で、ＦＭＮからＦＭＮＨ2（第１３図）への還元を触媒する。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに特異的な、または特異的ではない同様な反応を触媒し、そして他の生合成経路に関連するＦＭＮレダクターゼはいたるところに記載されている（Ｄｕａｎｅら  １９７５、Ｊａｂｌｏｎｓｋｉら  １９７７、Ｗａｔａｎａｂｅら  １９８２）。
この活性を検出するために２つのアッセイを使用する：
第一は実施例５．１．１に記載したプリスチナマイシンIIＡシンターゼとのカップリングを基本とし、そして精製の第一段階に使用する。アッセイする酵素画分（０．００２−０．００５単位）を、実施例５．１．１に記載したように２７℃で１時間、全容量が５００μlの５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液  ｐＨ６．８（ＮＡＤＨ（５００μＭ）、ＦＭＮ（２μＭ）、プリスチナマイシンIIＢ（２０μＭ）および０．０１単位のプリスチナマイシンIIＡシンターゼを含有する）中でインキュベーションする。生成したプリスチナマイシンIIＡは、実施例５．１．１．Ａに記載したようにＨＰＬＣで分析する。
酵素活性の単位は、上記に記載された条件下で１分間に１μｍｏｌのプリスチナマイシンIIＡを合成するために必要な酵素量と定義される。
第二アッセイは分光光度的アッセイであり、少なくとも部分精製された画分にのみ使用することができる。アッセイする酵素画分（０．００６−０．０３０単位）を、２７℃で１３分間、全容量が３ｍｌの５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液  ｐＨ６．８（ＮＡＤＨ（５００μＭ）およびＦＭＮ（２μＭ）を含有する）中でインキュベーションする。インキュベーション７分後、酵素が存在しない参考曲線に対して、６つの吸光度を３４０ｎｍで、１−分間の間隔をおいて読む。μmｏｌ／分での活性は、６．２の定数（３４０ｎｍでの１ｍｏｌＮＡＤＨの吸光度）で１分間の吸光度の減少勾配を割り算することにより算出する。
酵素活性の単位は、上記に記載された条件下で１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨが消費されるのに要する酵素量と定義する。
５．６．１．Ｂ  エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２  ＦＭＮレダクターゼの精製
この実施例ではプリスチナマイシンIIＡの生合成経路に参加するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製できるかを説明する。
上記実施例５．６．１．Ａに記載したアッセイを使用して、ＦＭＮレダクターゼの精製は以下に記載するように行われ、凍結に注意し、そして活性画分は必要に応じて連続的工程の間では−３０℃に保存する。
プリスチナマイシン生産フェーズの初期段階で回収したエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のカルチャーの遠心ペレット５００ｇを（１０容量／容量％のグリセロールを含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液  ｐＨ７．２で洗浄したもの）を、１５００ｍｌの  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液  ｐＨ  ６．８（５ｍＭ  ＤＴＴ、１０容量／容量％のグリセロールおよび０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する）に溶解する。このように得られた懸濁液を２７℃で４５分間インキュベーションし、そして５０，０００ｇで１時間遠心する。このようにして回収した粗抽出物を硫酸アンモニウム沈殿により分画する。４０から７５％飽和硫酸アンモニウムの間に沈殿するタンパク質画分をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅで脱塩し、ｐＨ  ６．８  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０容量／容量％のグリセロール中にてＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗのカラム（３００ｍｌ）に注入する。活性タンパク質はカラムに保持されず、そしてそれらをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅで脱塩し、そして再度ｐＨ  ８．２  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０容量／容量％のグリセロール中にてＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗのカラム（３５ｍｌ）に注入し、ＫＣｌの直線勾配（０−０．５Ｍ）で溶出する。酵素活性を含有する画分（実施例５．６．１．Ａに記載された第一試験で検出）をプールし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅで脱塩し、そしてｐＨ  ８．２  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０容量／容量％のグリセロール中にてＭｏｎｏＱ  ＨＲ  １０／１０カラムに注入する。保持されたタンパク質を０．２Ｍ  ＫＣｌを添加した同一緩衝液で直接溶出する。これらを１ｍｌ容量で回収し、これを直ぐにＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＨＲ  １０／３０のカラムに注入し、ｐＨ  ６．８  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０重量／重量％のグリセロールで溶出する。所望の活性を含む画分（実施例５．６．１．Ａに記載されたような分光光度的試験によりこの段階で検出される）をプールし、そしてプールした全量を７ｍｌとする：この７ｍｌを８ｍｌのＦＭＮ−アガロースが充填されたカラムに添加する；カラムをｐＨ  ６．８  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０容量／容量％のグリセロールで洗浄し、そして次に１０μＭのＦＭＮを含む同一緩衝液で溶出する。活性画分をプールし、ＰＤ−１０カラムで脱塩し、ｐＨ  ８．２  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０容量／容量％のグリセロール中にてＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５カラムに注入し、ＫＣｌの直線勾配（０−０．２５Ｍ）で溶出する。
この段階の後、酵素は純粋である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動において単一で明瞭な広いバンドが見られ、その分子量は約２８，０００と推定されるが、一方Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ  １２５ゲル浸透クロマトグラフィーでは、分子量約３０，０００付近に対照的なピークを形成する。
シークエンシングのために、このタンパク質を２５−ｃｍのＶｙｄａｃ  Ｃ４カラムで脱塩し、そして０．０７％のトリフルオロ酢酸を含有する３０−７０％のアセトニトリル（水中）の直線勾配で溶出する。
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５．６．２  タンパク質配列からオリゴヌクレオチドの生成
この実施例ではタンパク質ＦＭＮレダクターゼのＮＨ2−末端配列および内部配列から出発して、どのようにオリゴヌクレオチドを合成できるかを説明する。
ＦＭＮレダクターゼのＮＨ2−末端配列は実施例５．１．２に記載されたようにマイクロシークエンシングで導き出した。約３０残基がこのように同定された。
（第４番目および第１１番目の残基から始まるＮＨ2−末端配列もシークエンシングした試料の中に見いだされた。）
１３および２１アミノ酸のＦＭＮレダクターゼの２つの内部配列がトリプシン加水分解および得られた断片のＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラムでの精製後に同定された。
タンパク質ＦＭＮレダクターゼのＮＨ2−末端配列
（配列番号７の２−２５残基を参照）
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タンパク質ＦＭＮレダクターゼの内部配列
（配列番号７の１０２−１２２残基を参照）
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各配列の下線領域、ならびにストレプトミセス（Streptomyces）（実施例８を参照）に特異的な遺伝子コドンの縮退に従い、以下のオリゴヌクレオチドの混合物を合成した。
タンパク質ＦＭＮレダクターゼのＮＨ2−末端配列に対応する混合物：
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タンパク質ＦＭＮレダクターゼの内部配列に対応する混合物：
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５．６．３．合成オリゴヌクレオチド混合物の標識化およびエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション
この実施例ではプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドがどのように放射活性的に標識でき、そして次にすでにエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムライブラリーのＤＮＡが移されている膜にハイブリダイズさせることができるかを説明する。
オリゴヌクレオチドの標識化は、実施例５．１．３に記載されたように５’−末端位に、ＡＴＰの［γ−32Ｐ］リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで転移させることにより行う。
約２×５００ｎｇの各オリゴヌクレオチド混合物がこのように32Ｐで標識され、２つのライブラリーのそれぞれとハイブリダイズするために使用された。
各ライブラリーの膜のハイブリダイゼーションは、実施例５．１．３に記載されたように行う。
５．６．４  コスミドｐＩＢＶ４の単離、ならびにＦＭＮレダクターゼに関する構造遺伝子（ｓｎａＣ）を含有する領域の決定
コスミドｐＩＢＶ４は、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株中で生産されたライブラリーのクローンから単離され、これは３つのすべてのオリゴヌクレオチドの混合物と同時にハイブリダイズした。
これらのコスミドを実施例２のように精製する。これは大きさが４８ｋｂと推定されるエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のゲノムＤＮＡ挿入物を含んでいる。マップ（第７図）は、実施例５．１．４に記載されたように、種々の制限酵素で消化したものから確立した。
種々の酵素で消化したｐＩＢＶ４  ＤＮＡとオリゴヌクレオチド混合物とのサザンハイブリダイゼーションにより、ｓｎａＣ領域（ＦＭＮレダクターゼの構造遺伝子）を含有する領域の同定が可能になった。サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションは実施例５．１．４に記載されたように行った。
これらのサザンハイブリダイゼーションにより、コスミドｐＩＢＶ４は実施例５．６．３で合成したプローブに相同的な配列を含有する４−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片を所有することを表すことができた。
５．７  コスミドｐＩＢＶ２についてｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル−Ｎ）−メチルトランスフェラーゼに関する構造遺伝子の存在の実証
この実施例では精製されたタンパク質から出発して、実施例６．７および７．８に記載されるようにすでに分析そして配列決定され、そして実施例１１に記載されるようにE.Coli中で発現された遺伝子の中から、どのように対応する構造遺伝子を同定できるかを説明する。
５．７．１  ｐ−アミノフェニルアラニンからｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンへのメチル化に関与するタンパク質の同定および精製
この実施例はｐ−アミノフェニルアラニンからｐ−ジメチルアミノフェニルアラニン［ｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル−Ｎ）−メチルトランスフェラーゼ］へのメチル化の原因であるタンパク質が、エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株からどのように均一にまで精製でき、そしてどのようにしてE.Coliの組換え株から純粋に得られるかを説明する。
５．７．１．Ａ  ｐ−アミノフェニルアラニンからｐ−メチルアミノフェニルアラニンへのメチル化活性、およびｐ−メチルアミノフェニルアラニンからｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンへのメチル化活性のアッセイ
この実施例ではプリスチナマイシンＩＡの成分であるｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンの生合成の２つの末端活性のアッセイを説明する。これらの活性はこれまでに記載されたことがなく、そしてプリスチナマイシンの生産期間中のみに発現されるという注目すべき性質を有するものである。それらはｐ−アミノフェニルアラニンからｐ−メチルアミノフェニルアラニンへのメチル化（メチル化１）であり、一方ｐ−メチルアミノフェニルアラニンからｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンへのメチル化（メチル化２）であり、これらの両方の活性はＳＡＭをメチル基供与体として利用する（第１４図）。
アッセイする酵素画分（１−２０単位）を２７℃で３０分間、全容量が２００μlのｐＨ  ６．８  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液（ＳＡＭ（２００μl）を含有し、その中のメチル基は炭素原子の１４同位体で放射標識されている（２Ｃｉ／ｍｏｌ））中で、メチル化１のアッセイにはｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（１ｍＭ）の存在下で、そしてメチル化２のアッセイにはｐ−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン（２．５ｍＭ）の存在下でインキュベーションする。
反応を１６μlの３７％塩酸溶液そして次に２０μlのヘプタンスルホン酸ナトリウムを２４０ｇ／ｌの濃度で加えて停止する。遠心後、１５０μlの上澄みを以下の勾配様式でＨＰＬＣシステムに注入する。
0004036467.tif 000029
カラムから溶出時に、酵素反応の基質および生成物を２５４ｎｍの吸収で定量する。この検出はＧＴ４００−Ｕ４固体シンチレーションセルを装備したＢｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ５０６型検出器により、ライン化された放射線化学検出に連結されている。これにより放射線活性メチル基が反応生成物に取り込まれるのを特異的に監視することができる。
メチル化１（メチル化２）に関する酵素活性の単位は１ｎｍｏｌのメチル基が、ｐ−アミノフェニルアラニン（ｐ−メチルアミノフェニルアラニン）に取り込まれるの必要な酵素量と定義する。
５．７．１．Ｂ．ｐ−アミノフェニルアラニンからｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンへのメチル化を触媒するＳＡＭ−依存性Ｎ−メチルトランスフェラーゼ［ｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル−Ｎ）−メチルトランスフェラーゼ］のエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２からの精製
この実験では、プリスチナマイシンＩＡの生合成経路に参加するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製できるかを説明する。
上記実施例５．７．１．Ａに記載したアッセイを使用して、ＳＡＭ−依存性Ｎ−メチルトランスフェラーゼの精製は以下に記載されるように行われる。凍結に注意し、必要に応じて活性画分は連続工程の間では−７０℃に保存する。
プリスチナマイシン生産フェーズの初期段階で回収したエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２カルチャーの遠心ペレット２４０ｇを（ｐＨ７．２  １００ｍＭ  リン酸緩衝液、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５Ｍ  ＫＣｌ、  １０容量／容量％のグリセロールで洗浄したもの）を、４８０ｍｌのｐＨ  ８．０  ０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（４ｍＭ  ＤＴＥ、５ｍＭ  ベンズアミジン、０．２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１００μｇ／ｌ  Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍｇ／ｌ  ＳＴＩ、２ｍｇ／ｌ  アプロチニン、２０容量／容量％のグリセロールおよび２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する）に溶解し、この緩衝液は＋４℃に維持する。このように得られた懸濁液を４℃で激しく撹拌する。３０分間撹拌した後、０．２ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を添加する。９０分間撹拌した後、抽出物を５０，０００ｇで１時間遠心する。上澄みを約１８０ｍｌの３分画に分割する。各々を５００ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅカラム（４ｍＭ  ＤＴＥ、５ｍＭ  ベンズアミジン、０．２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１００μｇ／ｌ  Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍｇ／ｌ  ＳＴＩ、２ｍｇ／ｌ  アプロチニン、２０容量／容量％  グリセロールを含有するｐＨ  ６．８  ２０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓ緩衝液で自然流速で平衡化した）のゲル浸透により脱塩する。溶出したタンパク質を次にＭｏｎｏＱ  ＨＲ  １６／１０カラムで流速６ｍｌ／分でクロマトグラフィーを行い（各サイクルについて４００ｍｇのタンパク質）、４ｍＭ  ＤＴＥ、２ｍＭ  ベンズアミジン、１００μｇ／ｌ  Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、２０容量／容量％  グリセロールを含有するｐＨ  ６．８  ２０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン緩衝液中で塩化ナトリウムの増加直線勾配（０−０．３Ｍ）で溶出する。カラムからの溶出時に、画分に４ｍＭ  ＤＴＥ、３０ｍＭ  ベンズアミジン、２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１００μｇ／ｌ  Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍｇ／ｌ  ＳＴＩ、１０ｍｇ／ｌ  アプロチニン、２０容量／容量％  グリセロールを含有する１０容量／容量％のｐＨ  ６．８  ２０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓ緩衝液を補充する。このような条件下で、両方のメチル化活性（１および２）が排除画分および第一溶出画分中に同様に検出される。これらの画分をプールし、そしてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０の限外濾過により濃縮する。この濃縮物を０．８５Ｍ  の硫酸アンモニウムとし、そして次にＰｈｅｎｙｌ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ＨＲ  １０／１０カラムで流速１ｍｌ／分でクロマトグラフィーを行い（各サイクルについて２０−８０ｍｇのタンパク質）、４ｍＭ  ＤＴＥ、２ｍＭ  ベンズアミジン、１００μｇ／ｌ  Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０容量／容量％  グリセロールを含有するｐＨ  ６．８  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓ緩衝液中で硫酸アンモニウムの減少直線勾配（０．８５−０Ｍ）で溶出する。カラムからの溶出時に、画分に４ｍＭ  ＤＴＥ、３０ｍ��  ベンズアミジン、２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１００μｇ／ｌ  Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍｇ／ｌ  ＳＴＩ、１０ｍｇ／ｌ  アプロチニン、１０容量／容量％  グリセロールを含有する１０容量／容量％のｐＨ  ６．８  ５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓ緩衝液を補充する。このような条件下で、両方のメチル化活性（１および２）が約０．１５Ｍの硫酸アンモニウムに対応する画分に同様に検出される。これらの画分をプールし、そしてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０の限外濾過により濃縮し、４ｍＭ  ＤＴＥ、２ｍＭ  ベンズアミジン、１００μｇ／ｌ  Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、２０容量／容量％  グリセロールを含有するｐＨ８．２（５℃で）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液中で平衡化したＰＤ−１０カラムで脱塩し、同一緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５カラムで流速１ｍｌ／分でクロマトグラフィーを行う（各サイクルについて１０ｍｇのタンパク質）。これらの条件下では２つの活性はカラムに保持されない。したがってカラムからの溶出時に、２つの活性を含有する排除画分に４ｍＭ  ＤＴＥ、３０ｍＭ  ベンズアミジン、２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１００μｇ／ｌ  Ｅ−６４、２ｍｇ／ｌ  ロイペプチン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２０容量／容量％  グリセロールを含有する１０容量／容量％のｐＨ  ８．２  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液を補充する。これらの画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０の限外濾過により濃縮し、そして次に３００×７．５ｍｍの１０μｍ  ＴＳＫ  Ｇ２０００ＳＷカラム（０．５ｍｌ／分の流速で４ｍＭ  ＤＴＥ、０．２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０容量／容量％  グリセロール、０．１５Ｍ  塩化ナトリウムを含有するｐＨ  ７．０  ５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液で平衡化した）でクロマトグラフィーを行う。この方法で分子量３０，０００付近に対応する保持時間で２つの活性が共に溶出する。この段階の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでかなりのタンパク質が視覚化される。それはおよそ３２，０００に位置する。
0004036467.tif 000030
５．７．１．Ｃ  エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の組換えタンパク質（ｐ−アミノフェニルアラニンのｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンへのメチル化を触媒するＳＡＭ−依存性Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を表す）のE.coli  ｐＶＲＣ７０６からの精製
この実験では、プリスチナマイシンＩＡの生合成経路に参加し、そしてｐａｐＭ遺伝子のクローニングによりE.coli中で発現されるエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の酵素がどのように精製できるかを説明する。
上記実施例５．７．１．Ａに記載したアッセイを使用して、我々は組換えE.coli：：ｐＶＲＣ７０６の粗抽出物がメチル化１およびメチル化２について強い活性を表すことを示したが、一方対照E.coli株（ｐＭＴＬ２３）ではどちらの活性も検出されないことを示した。次にｐ−アミノフェニルアラニンのｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンへのメチル化を触媒するＳＡＭ−依存性ｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル−Ｎ）−メチルトランスフェラーゼの精製を行った。
実施例５．７．１．Ｂに開示された条件と同じ条件下で、しかしクロマトグラフィー段階（ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５の精製段階）を排除して、ＴＳＫ２０００カラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで実施例５．７．１．Ｂで精製したタンパク質が持つ分子量と同一の分子量を有するタンパク質を均一に精製した。
0004036467.tif 000031
５．７．２  ｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル−Ｎ）−メチルトランスフェラーゼの構造遺伝子の同定
実施例５．７．１．Ｂで精製した３２，０００のタンパク質のＮＨ2−末端配列を実施例５．１．２に記載されたマイクロシークエンシングで決定した。１０残基がこのようにして決定された：
実施例５．７．１．Ｃで精製した３２，０００のタンパク質のＮＨ2−末端配列を実施例５．１．２に記載されたマイクロシークエンシングで決定した。１０残基がこのようにして決定された：
両方の場合において、同じ残基が見いだされ、そしてこの配列はｐａｐＭ遺伝子の配列から導かれたタンパク質配列の開始部分に正確に対応する（配列番号１０の２−１１残基を参照のこと）。したがって精製されたｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル−Ｎ）−メチルトランスフェラーゼはタンパク質ＰａｐＭである。
実施例６：実施例３のように調製されたコスミド中にクローン化され、かつ目的遺伝子を含有するＤＮＡ断片のサブクローニング
この実施例では実施例３で記載したように構築され、かつプリスチナマイシンIIまたはプリスチナマイシンＩの生合成に関連する遺伝子を含有するコスミドから出発して、どのようにこれらの遺伝子を含有するＤＮＡ断片をサブクローン化できるかを説明する。
これらのサブクローニングは同定された遺伝子の核酸配列を連続的に導き出すことをできるようにするために、ならびに以下の実施例で与えられる種々の構築物が実施できるようにするために行われた。
６．１  ３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼに関する構造遺伝子を含有する５．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇａｌII断片の単離
この実施例では、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼに関する構造遺伝子を含有するコスミドｐＩＢＶ２から出発して、どのようにしてより小さい大きさのこの遺伝子を含有するＤＮＡ断片をサブクローン化することができるかを説明する。
約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ２を、制限酵素ＢｇａｌIIおよびＥｃｏＲＩ（ニューイングランドバイオラボズ）で製造元で薦める条件下で連続的に切断した。このようにして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し、そして５．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇａｌII断片をManiatisら（１９８９）により記載されるように電気的溶出により単離した。
ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断した約１００ｎｇのｐＵＣ１９（ＶｉｅｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ  １９８２）を、２００ｎｇの５．５−ｋｂのＢｇａｌII−ＥｃｏＲＩ断片と実施例３．３に記載した条件下で連結した。
ＴＧ１株の形質転換および形質転換体を固体ＬＢ培地（１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含有する）でManiatisら（１９８９）に記載された方法により選択した後、所望の断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ４０２と命名した。この制限マップを第１５（Ａ）図に表す。これはハイブリダイゼーションにより（実施例５．２）、５．５−ｋｂのＢｇａｌII−ＥｃｏＲＩ断片がエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの構造遺伝子を含有することが示された。したがってプラスミドｐＶＲＣ４０２はエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの構造遺伝子を含有する。
６．２．コスミドｐＩＢＶ２由来の４．６−ｋｂのＢｇａｌII−ＢｇａｌII断片の単離
この実施例では、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの構造遺伝子に隣接する領域中にプチスチナマイシンＩの生合成に関与する他の遺伝子の存在を同定を目的として、どのようにより小さい大きさのＤＮＡ断片をサブクーン化することができるかを説明する。
上記のように種々のクローニング工程を行った。
約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ２を、制限酵素ＢｇａｌIIで切断した。このようにして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し、そして４．６−ｋｂのＢｇａｌII−ＢｇａｌII断片を電気的溶出により単離した。
ＢａｍＨＩで切断した約１００ｎｇのｐＵＣ１９を、２００ｎｇのＢｇａｌII−ＢｇａｌII断片と連結した。
実施例６．１に記載したようにＴＧ１株の形質転換後、所望の断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ５０１と命名した。この制限マップを第１５（Ｂ）図に表す。
６．３．  プチスチナマイシンIIＡシンターゼの２つのサブユニットに関する構造遺伝子を含有する６−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片の単離
この実施例ではコスミドｐＩＢＶ１から出発して、どのようにプチスチナマイシンIIＡシンターゼの２つのサブユニットに関する構造遺伝子を含有するより小さい大きさのＤＮＡ断片をサブクローン化することができるかを説明する。
上記のように種々のクローニング工程を行った。
約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ１を、ＢａｍＨＩで切断した。このようにして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し、そして６ｋｂのＢａｍＨＩ断片を電気的溶出により単離した。
ＢａｍＨで切断した約１００ｎｇのｐＢＫＳ-（ストラタジーン  クローニングシステム、ラジョラ  カリフォルニア州）を、２００ｎｇの６−ｋｂのＢａｍＨＩ断片と連結した。
ＴＧ１株の形質転換後、所望の断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＸＬ２０４５と命名した。この制限マップを第１６図に表す。実施例５．１のハイブリダイゼーションにより、６−ｋｂのＢａｍＨＩ断片はエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のプチスチナマイシンIIＡシンターゼの２つのサブユニットをコードするｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子を含有することが示された。したがってプラスミドｐＸＬ２０４５はエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のプチスチナマイシンIIＡシンターゼの２つのサブユニットをコードするｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子を含有する。
６．４．  プチスチナマイシンＩシンターゼIIに関する構造遺伝子一部分を含有する６．２−ｋｂのＳｐｈＩ断片の単離
この実施例ではコスミドｐＩＢＶ３から出発して、どのようにプチスチナマイシンＩシンターゼIIに関する構造遺伝子の一部分を含有するより小さい大きさのＤＮＡ断片をサブクローン化することができるかを説明する。
上記のように種々のクローニング工程を行った。
約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ３を、ＳｐｈＩで切断した。このようにして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し、そして６．２ｋｂのＳｐｈＩ断片をバイオ１０１−オーザイム（Ｂｉｏ１０１−Ｏｚｙｍｅ）社により販売されている“Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ”キット法により単離した。
ＳｐｈＩで切断した約１００ｎｇのｐＵＣ１９を、２００ｎｇの６．２−ｋｂのＳｐｈＩ断片と連結した。
ＴＧ１株の形質転換後、所望の断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ１１０５と命名した。この制限マップを第１７図に表す。
６．５  プチスチナマイシンＩシンターゼIIIに関する構造遺伝子の一部分を含有する８．４−ｋｂのＳｐｈＩ断片の単離
この実施例ではコスミドｐＩＢＶ３から出発して、どのようにプチスチナマイシンＩシンターゼIIIに関する構造遺伝子の一部分を含有するより小さい大きさのＤＮＡ断片をサブクローン化することができるかを説明する。
上記のように種々のクローニング工程を行った。
約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ３を、ＳｐｈＩで切断した。このようにして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し、そして８．４ｋｂのＳｐｈＩ断片をバイオ１０１−オーザイム社により販売されている“Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ”キット法により単離した。
ＳｐｈＩで切断した約１００ｎｇのｐＵＣ１９を、２００ｎｇの８．４−ｋｂのＳｐｈＩ断片と連結した。
ＴＧ１株の形質転換後、所望の断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ１１０６と命名した。この制限マップを第１８図に表す。
６．６．  プチスチナマイシンＩシンターゼIVに関する構造遺伝子の一部分を含有する６．６−ｋｂのＳｐｈＩ断片の単離
この実施例ではコスミドｐＩＢＶ３から出発して、どのようにプチスチナマイシンＩシンターゼIVに関する構造遺伝子の一部分を含有するより小さい大きさのＤＮＡ断片をサブクローン化することができるかを説明する。
上記のように種々のクローニング工程を行った。
約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ３を、ＳｐｈＩで切断した。このようにして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し、そして６．６ｋｂのＳｐｈＩ断片をバイオ１０１−オーザイム社により販売されている“Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ”キット法により単離した。
ＳｐｈＩで切断した約１００ｎｇのｐＵＣ１９を、２００ｎｇの６．６−ｋｂのＳｐｈＩ断片と連結した。
ＴＧ１株の形質転換後、所望の断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ１１０４と命名した。この制限マップを第１９図に表す。
６．７  コスミドｐＨＣ７９を含有し、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼ（プチスチナマイシンＩシンターゼＩ）の上流に位置する遺伝子を持つ１７−ｋｂのＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII断片の単離
この実施例では３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼに関する構造遺伝子を含有するコスミドｐＩＢＶ２から出発して、どのようにこのコスミドの大部分を削除し、かつ３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの上流に位置する部分のみを保持することができるかを説明する。
約２００ｎｇのコスミドｐＩＢＶ２を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した。この酵素を供給元の推薦により８５℃で３０分間変性させた。このようにして消化したコスミドｐＩＢＶ２をエタノールでManiatisら（１９８９）に記載されたように沈殿させ、５０μlの容量でそれ自身と再連結させた。
ＴＧ１株の形質転換および形質転換体を固体ＬＢ培地（１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた）でManiatisら（１９８９）に記載された方法により選択した後、コスミドｐＨＣ７９および３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼの上流に位置する部分（対応する全体は約１７ｋｂの大きさ）を含有するクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ９００と命名した。この制限マップを第２０図に表す。
６．８  コスミドｐＩＢＶ３に由来する１．４−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片の単離
この実施例ではＰIIＡシンターゼの巨大サブユニットをコードするｓｎａＡ遺伝子を含有するコスミドｐＩＢＶ３から出発して、上流に位置するＤＮＡ断片を研究し、そしてシークエンシングするためにどのようにしてそれをサブクーン化することができるかを説明する。
約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ３を連続的に制限酵素ＳｓｔＩおよびＢａｍＨＩで切断した。このようにして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルの電気泳動で分離し、そして１．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片をバイオ１０１−オーザイム社により販売されている“Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ”キット法により単離した。
ＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩで切断した約１００ｎｇのｐＤＨ５（Ｈｉｌｌｅｍａｎら  １９９１）を、２００ｎｇのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片と実施例３．３に記載した条件下で連結した。
ＴＧ１株の形質転換および形質転換体を固体ＬＢ培地（１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを加えた）でManiatisら（１９８９）に記載された方法により選択した後、所望する断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ１０００と命名した。この制限マップを第２１図に表す。
６．９．  ＦＭＮレダクターゼに関する構造遺伝子を含有する４−ｋｂのＢａｍＨ−ＢａｍＨ断片の単離
この実施例ではＦＭＮレダクターゼに関する構造遺伝子（ｓｎａＣ）を含有するコスミドｐＩＢＶ４から出発して、どのようにこの遺伝子を含有するより小さい大きさのＤＮＡ断片をサブクローン化することができるかを説明する。
上記のように種々のクローニング工程を行った。
約１０μｇのコスミドｐＩＢＶ４を種々の制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。このようにして得た制限断片を０．８％のアガロースゲルで分離し、そして４−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片を電気的溶出により単離した。
ＢａｍＨＩで切断した約１００ｎｇのｐＵＣ１９を、２００ｎｇの４−ｋｂのＢａｍＨ−ＢａｍＨＩ断片と連結した。
E.Coli DH5α株（supE44 DlacU169（f80lacZDM15）hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1）（Hanahan、1983）の形質転換および形質転換体を固体ＬＢ培地（１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを加えた）でManiatisら（１９８９）に記載された方法により選択した後、所望する断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ５０９と命名した。この制限マップを第２２図に表す。
実施例７：エス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子を含有する単離されたＤＮＡ断片の配列
この実施例では、一方ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のプリスチナマイシンＩ族のプリスチナマイシンの生合成に関与する遺伝子、他方では同プリスチナマイシンII族のプリスチナマイシンの生合成に関与する遺伝子を持つＤＮＡ断片のシークエンシングを説明する。
７．１．  ５−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片のシークエンシング
この実施例ではどのようにエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子を含有する断片のヌクレオチド配列を得ることができるかを説明する。
ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片は、実施例６．３に記載されたプラスミドｐＢＫＳ-中でクローン化され得られたプラスミドｐＸＬ２０４５の６−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片の一部である。この５−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ副断片（サブフラグメント：ｓｕｂｆｒａｇｍｅｎｔ）挿入物は、酵素的消化により得られ、そしてその後ファージＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９（Ｍｅｓｓｉｎｇら、１９８１）中に両方向でサブクローン化された。使用したサブクローニング部位は次のとおりである：ＥｃｏＲＩ、ＲｓｔＩ、ＰｓｔＩ、ＮｒｕＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｒｕＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ、そして第１６図に示す。
これらの種々の挿入物は，合成プライマーとしてユニバーサルプライマー（universal primer：Maniatisら1989）を、または合成され（実施例５）、かつシークエンシングする挿入物の２０ヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを使用してチェーン−ターミネーション反応法（chain-termination reaction method）によりシークエンシングされた。
これら種々の挿入物間の重複により、５３９２ｂｐから成るＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片の全ヌクレオチド配列が両鎖について確立できた（配列番号１）。
７．２．  ５．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇａII断片の１８７０ｂｐ領域のシークエンシング
この実施例ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のｓｎｂＡ遺伝子を含有する断片のヌクレオチド配列を得ることができるかを説明する。
シークエンシングされた１８７０ｂｐ領域は、実施例６（第１５（Ａ）図）に記載されたプラスミドｐＵＣ１９中でクローン化され得られたプラスミドｐＶＲＣ４０２の５．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇａII断片の一部である。この５．５−ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇａII挿入物の副断片挿入物は、酵素的消化により得られ、そしてその後ファージＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９中で両方向でサブクローン化された。サブクローニング部位は：ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIIIであり、そして第１５（ａ）図に示す。
これら種々の断片の重複により、１８７０ｂｐから成るＳａｕ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ領域の全配列（配列番号５）が確立できた。
７．３．  ４．６−ｋｂのＢｇａII−ＢｇａII断片の１８３０ｂｐ領域の配列
この実施例ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のｓｎｂＡ遺伝子を含有するヌクレオチドに隣接する断片のヌクレオチド配列を得ることができるかを説明する。
この配列はｐＶＲＣ５０１（実施例６）からの１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩおよび２．１ｋｂのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片（第１５（Ｂ））をベクターＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９中にサブクローン化することにより導かれた。このＰｓｔＩ部位はこの部位に重複するＳａｕ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ断片をサブクローニングすることにより妨害され、続いてシークエンシングされた。このようにして得られた１８３０ｂｐを（配列番号６）に示す。
７．４．  ６．２−ｋｂのＳｐｈＩ断片の２つの２２７ｂｐおよび２４７ｂｐ領域のシークエンシング
この実施例ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のプリスチナマイシンＩシンターゼII（ｓｎｂＣ）に関する構造遺伝子の一部を含有する断片のヌクレオチド配列をどのように得ることができるかを説明する。
配列決定される２２７および２４７ｂｐの領域は、実施例６．４（第１７図）に記載されるプラスミドｐＵＣ１９中にクローン化されプラスミドｐＶＲＣ１１０５を与えた６．２ｋｂのＳｐｈＩ断片の一部である。６．２−ｋｂのＳｐｈＩ挿入物の副断片は酵素開裂により得られ、そしてファージＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９に両方向でサブクローン化された。サブクローニング部位はＸｈｏＩ、ＰｓｔＩおよびＢｇａｌIIであり、第１７図に示す。２２７−ｂｐのＰｓｔＩ−ＢｇａｌII断片を完全にシークエンシングし、そして２４７ｂｐは９００−ｂｐＸｈｏＩ断片からシークエンシングした：これらの配列を配列番号１１および１２に表す。
７．５．  ８．４−ｋｂのＳｐｈＩ断片の２つの１９２ｂｐおよび４７４ｂｐ領域のシークエンシング
この実施例ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のプリスチナマイシンＩシンターゼIII（ｓｎｂＤ）に関する構造遺伝子の一部を含有する断片のヌクレオチド配列をどのように得ることができるかを説明する。
配列決定される１９２および４７４ｂｐの領域は、実施例６．５（第１８図）に記載されるプラスミドｐＵＣ１９中にクローン化されプラスミドｐＶＲＣ１１０６を与えた８．４ｋｂのＳｐｈＩ断片の一部である。８．４−ｋｂのＳｐｈＩ挿入物の副断片は酵素開裂により得られ、そしてファージＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９に両方向でサブクローン化された。サブクローニング部位はＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩおよびＢｇａｌIIであり、第１８図に示す。
１９２−ｂｐのＢｇａｌII−ＳｐｈＩおよび４７４ｂｐのＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片を完全にシークエンシングされ、これらの配列を配列番号１３および１４に表す。
７．６．  ６．６−ｋｂのＳｐｈＩ断片の２つの４８５ｂｐおよび２９１ｂｐ領域のシークエンシング
この実施例ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のプリスチナマイシンＩシンターゼIV（ｓｎｂＥ）に関する構造遺伝子の一部を含有する断片のヌクレオチド配列をどのように得ることができるかを説明する。
配列決定される２９１および４８５ｂｐの領域は、実施例６．６（第１９図）に記載されるプラスミドｐＵＣ１９中にクローン化されプラスミドｐＶＲＣ１１０４を与えた６．６ｋｂのＳｐｈＩ断片の一部である。６．６−ｋｂのＳｐｈＩ挿入物の副断片は酵素開裂により得られ、そしてファージＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９に両方向でサブクローン化された。サブクローニング部位はＸｈｏＩ、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩであり、第１９図に示す。４８５−ｂｐのＸｈｏＩ−ＳｐｈＩ断片は完全にシークエンシングされ、そして２９１ｂｐは１５００ｂｐのＰｓｔＩ断片からシークエンシングされ、これらの配列を配列番号１５および１６に表す。
７．７．  ｐＶＲＣ９００から単離された３．４−ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片中の６４５ｂｐ領域の配列
この実施例ではエス．プリスティナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のｓｎｂＡ遺伝子を含有ヌクレオチド配列の上流に位置する断片のヌクレオチド配列をどのように得ることができるかを説明する。
この配列を導くために、あらかじめ３．４−ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片を実施例６．７に記載されたベクターｐＶＲＣ９００からのベクターｐＵＣ１８中にサブクローン化した。種々のクローニング工程が６．１に記載されたように行われた：プラスミドｐＶＲＣ９００を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、そしてこれにより得られた断片を０．８％アガロースで分離した。３．４ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片を電気的溶出により精製し、制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＵＣ１８と連結した。ＴＧ１株の形質転換後、３．４−ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ９０３と命名した。この制限マップを第２３図に表す。
この６４５ｂｐの配列は次に、上記ｐＶＲＣ９０３からの１．４−ｋｂのＰｖｕII−ＥｃｏＲＩおよび０．９−ｋｂのＰｖｕII−ＥｃｏＲＩ断片（第２３図）をベクターＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９中にサブクローニングすることにより導かれた。これらのクローニングを行うために、ベクターＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９は始めに制限酵素ＢａｍＨＩで消化された；ＰｕｖII消化により遊離する末端に対応できる平滑末端を作成するために、遊離した粘着末端をManiatisら（１９８９）に記載された方法によりＤＮＡポリメラーゼＩの巨大断片（クレノー：ニューイングランドバイオラボ）で満たした；ベクターを次に制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。ＰｖｕII部位を２．２−ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片（ＰＶＲＣ９０３から単離した）で分断し、この部位を重複させる。これにより得られた６４５ｂｐの配列を配列番号９に示す。
７．８．  ｐＶＲＣ９００から単離された４．１−ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片中の１０５０ｂｐ領域の配列
この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のｓｎｂＡ遺伝子を含有するヌクレオチド配列の上流に位置する断片のヌクレオチド配列をどのように得ることができるかを説明する。
この配列を導くために、あらかじめ４．１−ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片を実施例６．７に記載されたベクターｐＶＲＣ９００由来のベクターｐＵＣ１９中にサブクローン化した。種々のクローニング工程が６．１に記載されたように行われた：プラスミドｐＶＲＣ９００を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、そしてこれにより得られた断片を０．８％アガロースゲルにより分離した。この４．１−ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片を電気溶出により精製し、そして制限酵素ＰｓｔＩで切断したｐＵＣ１９と連結した。ＴＧ１株中での形質転換後、４．１−ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ４０９と命名した。この制限マップを第２４図に表す。
この配列は次に、上記ｐＶＲＣ４０９からの０．７−ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩおよび１−ｋｂのＸｈｏＩ−ＳｔｕＩ断片（第２４図）をベクターＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９中にサブクローニングすることにより導かれた。配列内部のＸｈｏＩ部位はプラスミドｐＶＲＣ４０９から二本鎖シークエンシングにより横断された。これにより得られた１０５０ｂｐの配列を配列番号１０に示す。
７．９．  １．４−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片中の６４０ｂｐ領域の配列
この実施例ではＰIIＡシンターゼの２つのサブユニットをコードするエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のｓｎｂＡおよびｓｎａＢ遺伝子を含有ヌクレオチド配列に隣接する断片のヌクレオチド配列をどのように得ることができるかを説明する。
この配列はｐＶＲＣ１０００（実施例６．８）からの１．４−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片（第２１図）を、ベクターＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９中にサブクローニングすることにより導かれた（実施例７．１参照のこと）。得られた６４０ｂｐの配列を配列番号８に示す。
７．１０．  ４−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片中に存在する６９４ｂｐのＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ領域の配列
この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のｓｎａＣ遺伝子を含有する断片のヌクレオチド配列をどのように得ることができるかを説明する。
シークエンシングする６９４ｂｐの領域はプラスミドｐＵＣ１９中にクローン化され、実施例６．９に記載されたプラスミドｐＶＲＣ５０９を与える４−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨ断片の一部である。プラスミドｐＶＲＣ５０９を制限酵素ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで二重消化することにより得られ、そして５．６に記載される３つのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする６９４−ｂｐのＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片を、ファージＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９中にクローン化する。ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩサブクローニング部位を第２２図に示す。これにより得られた６９４−ｂｐの断片の配列を配列番号７に示す。
実施例８：読み取り枠の決定によるヌクレオチド配列の分析
この実施例では実施例７で明確にしたヌクレオチド配列中に存在する読み取り枠をどのように決定することができるか、そしてエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２のプチスチナマイシンＩおよびプリスチナマイシンIIの生合成に関与する遺伝子ならびにこれらの遺伝子によりコードされるポリペプチドをどのように同定できるかを説明する。
８．１  ５−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（ｐＸＬ２０４５）
この実施例では上記のように単離され、そして実施例６および７で配列決定された５−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片中に存在する読み取り枠をどのようにして決定できるかを説明する。
我々はストレプトミセス（Streptomyces）ＤＮＡが高い割合のＧおよびＣ塩基を有すると同時に、コーディング枠を構成するコドンの使用について強い偏向があるという事実（Bibbら、１９８４）を利用して、５−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片中に読み取り枠の存在を探した。すでに配列決定され、そしてBISANCEデータ−処理サーバー（data-processing server）から得られた１９６７３個のコドンを含むファイル中に正しく並べられているストレプトミセス（Streptomyces）遺伝子のコドンの使用に基づいてStadenおよびMcLachlan（１９８２）法により、コーディング枠の可能性が計算できるようになる（Dessenら、１９００）。
この方法により以下の表に示す４つの有望な読み取り枠が５−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片中に特性付けられることができた。それらをそれらのＢａｍＨＩから出発する位置に従い枠１−４と命名する。それぞれについて、塩基長、断片中の位置（ＢａｍＨＩ部位が１位に位置する）、ならびに対応するタンパク質の分子量（ｋＤａ）を表す。枠１  ３および４は同じ鎖によりコードされ、そして枠２は相補鎖である（第１６図）。
0004036467.tif 000032
−枠１および３はそれぞれ上記実施例５に記載されたように単離されたタンパク質ＳｎａＡ（配列番号２）およびＳｎａＢ（配列番号３）に対応し、その遺伝子のクローニングに関しては実施例６に詳細に記載されいる。実質的にＯＲＦｓ１および３の生産物のＮＨ2−末端配列は、切除されるアミノ末端メチオニンは別として、て実施例５．１．２に記載されたタンパク質ＳｎａＡおよびＳｎａＢに関して見いだされたＮＨ2−末端配列とそれぞれ同一である。さらに配列から算出された分子量は、実施例５に記載された見かけ上のＳＤＳ−ＰＡＧＥで推定されるものに相当する。
−読み取り枠４の生産物とＮＢＲＦバンクに含まれるタンパク質配列の比較により、種々の、特にE.Coli（Markhamら（１９８４）、ラット（Horikawaら、１９８９）、およびエス．セルビシエ（S.Cerevisiase）（Thomasら、１９８８）のＳ−アデノシルメチオニン（またはＳＡＭ）シンターゼとの相同性が明らかになる。Ｋａｎｅｈｉｓａ（１９８４）のアルゴリズムを使用してすべての配列について計算された相同性の値は、５１．８−５５．４％で変化する。
したがってこれらの配列比較は、読み取り枠４の生成物がプリスチナマイシンＩまたはIIの生合成に関与するＳＡＭシンターゼであることを実証することができる。この遺伝子をＳａｍＳ（配列番号４）と命名した。
ＳａｍＳ遺伝子のプリスチナマイシン生合成への関与は、この遺伝子を破壊する、実施例９．２に示すようなＳＰ９２突然変異体の構築により確かに実証される。
−読み取り枠２の生産物の配列とＧｅｎｐｒｏバンクに含まれるタンパク質配列の比較により、このタンパク質の内部配列が、アナバエナ（Anabaena）（BancroftおよびWolk、１９８９）の挿入配列（ＩＳ８９１）の第一読み取り枠の内部配列と３６％の相同性であることを明らかになる。この結果は読み取り枠２（ＯＲＦ４０１と命名された）が挿入配列に属し、したがってｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子間に位置した挿入配列あることを示唆している。
８．２  １８７０−ｂｐのＳａｕ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ断片（ｐＶＲＣ４０２１）
この実施例では上記のように単離され、そして実施例６および７に記載されたように配列決定された１８７０−ｋｂのＳａｕ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ断片中に存在する読み取り枠をどのように決定することができるかを説明する。
Ｓａｕ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ断片に関する読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。単一の完全な読み取り枠をこのように実証することができた。その特徴は次の通りである：この枠はＳａｕ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ断片の１０９位から１８５８位に伸び、これは分子量６１４００Ｄａを有する５８２アミノ酸のタンパク質をコードする１７４９塩基の枠に対応する。このタンパク質は上記実施例５に記載されたように精製されたタンパク質ＳｎｂＡに対応し、そしてその遺伝子のクローニングは実施例６に詳細に記載されている。実質的にＳａｕ３Ａ−Ｓａｕ３Ａ断片に存在するＯＲＦの生産物のＮＨ2−末端配列は、実施例５．２のタンパク質ＳｎｂＡに見いだされるＮＨ2−末端配列と同一である。配列から算出された６１４００Ｄａの分子量は、タンパク質ＳｎｂＡの分子量としＳＤＳ−ＰＡＧＥで推定される６７０００Ｄａ、および実施例５．２．１．Ｂに記載されているゲル浸透による６００００Ｄａに相当する。
したがってｓｎｂＡ遺伝子は、１分子の３−ヒドロキシピコリン酸と１分子のＡＴＰ：３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼからアシルアデニレート３−ヒドロキシピコリニル−ＡＭＰの形成を触媒する酵素をコードする（配列番号５）。
８．３  １８３０−ｂｐ  断片（ｐＶＲＣ５０１）
この実施例では上記のように３．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片から単離された１８３０−ｋｂの断片中に存在する読み取り枠をどのように決定することができるかを説明する。
１８３０−ｂｐ断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。単一の完全な読み取り枠をこのように実証することができた。その特徴は次の通りである：この枠の開始点はおそらくＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片から配列決定された１８３０ｂｐの領域の１０３位に位置し、そして１６８６で終了し、これは分子量約５４０００を有する５２８アミノ酸のタンパク質に対応する。
このタンパク質の配列をGeneproバンクに含まれる配列と比較すると、種々の代謝物、特に種々の微生物中でのテトラサイクリン（KhanおよびNovick、１９８３；Hoshinoら，１９８５）、エス．コエリコーラー（S.coelicolor）、アクチノローディン（actinorhodine:Fernandez-Morenoら、１９９１）およびメチレノマイシン（methylenomycin:NealおよびChater、１９８７ｂ）の転移機能を持つタンパク質との相同性が；明らかになる。
これらのデータにより、３．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片中に含有される読み取り枠の生成物は、プリスチナマイシンＩ（そしておそらくプリスチナマイシンII）を細胞外に運搬することができる転移タンパク質であることが指示される。このタンパク質はＳｎｂＲと命名され、そして遺伝子ｓｎｂＲに対応する（配列番号６）。
KyteおよびDoolittle（１９８２）の方法によるタンパク質ＳｎｂＲの疎水性プロフィールの分析は、その膜の局存性の確証となり、したがってその転移機能の確証となる。
８．４  １０５０−ｂｐ  断片（ｐＶＲＣ４０９）
この実施例では上記実施例７．８に記載のように配列決定されたｐＶＲＣ４０９由来の１０５０−ｋｂの断片中に存在する読み取り枠をどのように決定することができるかを説明する。
１０５０−ｂｐ断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。単一の完全な読み取り枠をこのように実証することができた。その特徴は次の通りである：この相は配列決定された部分の８４位から９６２位に拡がり、これは分子量３２０００Ｄａを有する２９２アミノ酸のタンパク質をコードする８７８塩基の枠に対応する。このタンパク質はタンパク質ＰａｐＭと命名された。これはさらに実施例５に記載されたようにエス．プリスチナエスピラリス（Ｓ．ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）ＳＰ９２株から精製された。配列から算出されたタンパク質の３２０００Ｄａの分子量は、実施例５のようなＳＤＳ−ＰＡＧＥで推定される見かけ上の分子量３２０００と同一である。さらにこのタンパク質のＮＨ2−末端配列は実施例５から導かれるように、１０５０ｂｐの配列（配列番号１０）の読み取り枠での分析から同定されたタンパク質ＰａｐＭのＮＨ2−末端配列とよく対応する。
８．５  ２２０−ｂｐおよび２４７−ｂｐ断片（ｐＶＲＣ１１０５）
この実施例では上記実施例６および７に記載のように配列決定されたｐＶＲＣ１１０５からの２２７−ｂｐおよび２４７−ｂｐ断片中に存在する読み取り枠をどのように決定することができるかを説明する。
これら２つの断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。両方の場合において断片の全長にわたって不完全な読み取り枠を実証することができた。
９００−ｂｐのＸｈｏＩ断片から単離された２４７−ｂｐ断片について同定された読み取り枠から得た配列は実施例５に記載されたように精製されたタンパクＳｎｂＣの内部配列の１つを含む。
ｐＶＲＣ１１０５から単離された２２７−ｂｐおよび２４７−ｂｐ断片について同定された読み取り枠の生成物とGeneproバンクに含まれる配列と比較すると、それらはペプチドシンターゼと相同的であることが明らかになる。２２７−ｂｐ断片から導かれた断片の１つは、アクレモニウム クリソゲニウム（Acremonium chrysogenum）（α−アミノアジピル）システイニルバリンシンターゼと２４．５％の相同性を表す（Gutierrezら、１９９１）。２４７−ｂｐ断片から導かれた断片、バチルス  グラミシジンＳシンターゼII（Horiら、１９９１）と３４．９％の相同性を、そしてアクレモニウム クリソゲニウム（Acremonium chrysogenum）（α−アミノアジピル）システイニルバリンシンターゼと２８％の相同性を表す（Gutierrezら、１９９１）。
これにより、実施例５．１で単離されたコスミドｐＩＢＶ３は、まさに実施例５．３に記載したプリスチナマイシンＩシンターゼIIの構造遺伝子の一部を含み、これをＳｎｂＣと命名する（配列番号１１および１２）。
８．６  １９２−ｂｐおよび４７４−ｂｐ断片（ｐＶＲＣ１１０６）
この実施例では上記実施例６および７に記載されたｐＶＲＣ１１０６からの１９２−ｂｐおよび４７４−ｂｐ断片中に存在する読み取り枠をどのように決定することができるかを説明する。
これら２つの断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。ｐＶＲＣ１１０６から単離された１９２−ｂｐ断片についても不完全な読み取り枠を実証することができた。その特徴は次の通りである：この枠はＢｇａｌIIの方向に配列決定された部分の２９位から始まる。停止コドンは同定されず、これはこの読み取り枠が終了しないことを指示している。
１９２−ｂｐのＢｇａｌII−ＳｐｈＩ断片に関する読み取り枠から得られた配列は、実施例５に記載されたように精製されたタンパク質ＳｎｂＤの内部配列を含み、実際これはタンパク質のＮＨ2−末端配列であることを証明する。
４７４−ｂｐのＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ断片全長に関して不完全な読み取り枠が実証できた。
ｐＶＲＣ１１０６から単離された４７４−ｂｐ断片について同定された読み取り枠の生成物とＧｅｎｅｐｒｏバンクの配列とを比較すると、このタンパク質がペプチドシンターゼと３０−４０％の相同性を表すことが明らかとなり、例えばバチルス  グラミシジンＳシンターゼII（ＨｏｒｉＤ、１９９１）と３９．４％の相同性を、そしてアクレモニウム クリソゲニウム（Acremonium chrysogenum）（α−アミノアジピル）システイニルバリンシンターゼと３４％の相同性を表す（Gutierrezら、１９９１）。
このことは実施例５．１で単離されたコスミドｐＩＢＶ３が、まさに実施例５．４に記載したプリスチナマイシンＩシンターゼIIIの構造遺伝子の一部を含み、これをＳｎｂＤと命名する（配列番号１３および１４）。
８．７  ２９１−ｂｐおよび４８５−ｂｐ断片（ｐＶＲＣ１１０４）
この実施例では上記実施例６および７に記載されたｐＶＲＣ１１０４からの２９１−ｂｐおよび４８５−ｂｐ断片中に存在する読み取り枠をどのように決定することができるかを説明する。
これら２つの断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。両方の場合において断片の全長にわたって不完全な読み取り枠を実証することができた。
１４５０−ｂｐ  ＰｓｔＩ断片から単離された２９１−ｂｐについて同定された読み取り枠から得た配列は実施例５に記載されたように精製されたタンパクＳｎｂＥの内部配列を含む。
ｐＶＲＣ１１０４から単離された４８５−ｂｐのＸｈｏＩ−ＳｐｈＩ断片について同定された読み取り枠の生成物とGeneproバンクに含まれる配列と比較すると、それらはペプチドシンターゼと相同的であることがあきらかになる。例えばバチルス  グラミシジンＳシンターゼII（Horiら、１９９１）と３４．７％の相同性を、そしてアクレモニウム クリソゲニウム（Acremonium chrysogenum）（α−アミノアジピル）システイニルバリンシンターゼと３６．２％の相同性を表す（Gutierrezら、１９９１）。
これにより、実施例５．１で単離されたコスミドｐＩＢＶ３は、まさに実施例５．５に記載したプリスチナマイシンＩシンターゼIVの構造遺伝子の一部を含み、これをＳｎｂＥと命名する（配列番号１５および１６）。
８．８  ６４５−ｂｐ断片（ｐＶＲＣ９０３）
この実施例では上記実施例６．７に記載されたプラスミドｐＶＲＣ９０３から上記のように配列決定された６４５−ｂｐ断片中に存在する読み取り枠をどのように決定することができるかを説明する。
この６４５−ｂｐ断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。このように不完全な読み取り枠を実証することができた。その特徴は次のとおりである。この枠には翻訳開始について２つの可能性があり、それは配列決定された部分の６１位のＧＴＧおよび７０位のＧＴＧである（１２４位に位置するＡＴＧは後に記載する配列相同性のために考慮しない）。シャイン−ダルガーノ領域の存在の見込ではこれらのどのコドンが開始に対応するかを区別することができない。停止コドンは同定されないので、これはこの読み取り枠が終了しないことを指示する。このようにして同定された遺伝子をｐａｐＡと呼び、そしてタンパク質はタンパク質ＰａｐＡと呼ぶ（配列番号９）。
ｐＶＲＣ９００から単離された３．４−ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片について同定された読み取り枠の生成物とＧｅｎｅｐｒｏバンクに含まれる配列と比較すると、それらはｐ−アミノベンゾエートシンターゼおよびアントラニレートシンターゼ型のタンパク質の第II成分と相同的であることかき明らかになる。それらはそれぞれ種々の微生物のｐ−アミノ安息香酸（葉酸前駆体）の合成およびアントラニル酸（トリプトファン前駆体）の合成に関与する。それは特にアゾスピリウム（Azospirillum）のタンパク質ＴｒｐＧと４８％相同的（Zimmer W.,Aparicio C.,およびElmerich c.Mol Gen.Genet.（１９９１）２２９：４１−５１）であり、そしてクレブシーラ プノウモニエ（Klebsilla pneumoniae）のタンパク質ＰａｂＡと４７％の相同的である（KaplanJ.B.,Merkel W.K.およびNichols B.P.J.Mol.Biol.（１９８５）１８３：３２７−３４０）。タンパク質ＴｒｐＧおよびＰａｂＡはコリスミ酸のアミノ基転移に関与するグルタミナーゼ活性を持つ。実証された相同性はタンパク質ＰａｐＡもクロスミックアシッドのアミノ基転移活性に関与するかもしれないことを表す傾向がある。コリスミ酸はストレプトミセス（Streptomyces）により導かれる抗生物質であるクロラムフェニコールの合成で推定されるｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンの前駆体（プリスチナマイシンＩの成分）と考えられる（Sharka B.,Westlake D.W.S.およびVining L.C.（１９７０）Chem Zvesti ２４、６６−７２）。
タンパク質ＰａｐＡの役割はｐａｐＡ遺伝子でのＳＰ９２株の突然変異体の分析により引き続き（実施例９．３）示されるであろう。
８．９  １．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片（ｐＶＲＣ１０００）
この実施例では上記実施例６．８および７．９に記載されたように単離そして配列決定された１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片中に存在する読み取り枠をどのように決定することができるかを説明する。
１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片中に存在する６４０ｂｐの配列決定領域に関する調査は、実施例８．１のように行われた。このように単一の完全な読み取り枠が実証できた。翻訳開始および停止コドンが実証できなかったことは、配列決定した６４０ｂｐの領域はおそらくさらに大きな読み取り枠の内部であろうことを指示し、これはｓｎａＤと命名する（配列番号８）。
６４０ｂｐ領域でコードされるタンパク質配列とＧｅｎｅｐｒｏおよびＮＢＲＦバンクに含まれるタンパク質配列と比較すると、このタンパク質がビー．ブレビス（B.brevis）グラミシジン  シンターゼＩ（Horiら、１９８９）、ビー．ブレビス（B.brevis）チオシジンシンターゼＩ（Weckermannら、１９８８）、およびアクレモニウム クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）ＡＣＶシンターゼ（Gutierrezら、１９９１）のようなペプチドシンターゼの内部部分と２０−２５％相同的であることが明らかとなる。
これらのデータは６４０ｄｐ領域に部分的にコードされるタンパク質が、おそらくプリスチナマイシンIIのペプチド部分の生合成に関与するペプチドシンターゼであることを示している。実質的にプリスチナマイシンＩの生合成に関与するすべてのペプチドシンターゼは、他のエス．プリスチナエスピラリス（S.Pristinaespiralis）染色体の領域ですに同定されている（実施例５．２．５．３、５．４および５．５）。
８．１０  ６９４−ｂｐ断片（ｐＶＲＣ５０９）
この実施例では上記実施例６および７に記載されたｐＶＲＣ５０９から上記のように配列決定された６９４−ｂｐ断片中に存在する読み取り枠をどのように決定することができるかを説明する。
この６９４−ｂｐ断片の読み取り枠に関する調査は、上記のように行われた。このように不完全な読み取り枠を実証することができた。その特徴は次のとおりである。この枠は配列決定された領域の２１０位から始まる。停止コドンは同定されないので、これはこの読み取り枠が終了しないことを指示する。したがって対応するタンパク質の分子量は算出できず、実施例５．６で記載したＳＤＳ−ＰＡＧＥで推定されるＦＭＮレダクターゼの見かけ上の分子量２８，０００とも比較てきない。一方このように６９４−ｂｐの配列の読み取り枠の分析により同定されたタンパク質のＮＨ2−末端は、実施例５に記載したように精製されたタンパク質ＳｎａＣのＮＨ2−末端と同一である。同様に、実施例５．６に記載したＦＭＮレダクターゼの２つの内部タンパク質が、配列決定した部分から導かれた。これはコスミドｐＩＢ４から単離された遺伝子がまさに実施例５．６に記載したタンパク質ＦＭＮレダクターゼに対応することを確証するものであり、これをＳｎａＣ（配列番号７）と命名する。
コスミドｐＩＢＶ１からｐＩＢＶ２が持つエス．プリスチナエスピラリス（S.Pristinaespiralis）のＤＮＡ断片は、プリスチナマイシンIIおよびプリスチナマイシンＩの生合成に関与する数個の遺伝子の存在を実証した。ｓｎａＡ、ｓｎａＢおよびｓａｍＳ遺伝子はプリスチナマイシンII、プリスチナマイシンIIＡシンターゼおよびおそらくＳＡＭシンターゼの生合成に参加する酵素をコードし、そしてプラスミドｐＩＢＶ１にクローン化された巨大ＤＮＡ断片上に物理的に一緒に群を成す。同様にｓｎｂＡ、ｓｎｂＲ、ｐａｐＡ、およびｐａｐＭ遺伝子（これらはプリスチナマイシンＩ、３−ヒドロキシピコリン酸：ＡＭＰリガーゼ（ＳｎｂＡ）の生合成に参加するタンパク質、おそらくプリスチナマイシンＩの転移の原因であるＳｎｂＲタンパク質、コリスミックアシッドからｐ−アミノフェニルアラニンの生合成に関与するタンパク質Ｐａｐａ、およびｐ−アミノフェニルアラニン（フェニル−Ｎ）−メチルトランスフェラーゼ（ＰａｐＭ）をコードする）は、コスミドｐＩＢＶ２中にクローン化された巨大ＤＮＡ上に一緒に群を成す。同様にｓｎａＡおよびｓｎａＤ遺伝子（これらはプリスチナマイシンIIの生合成に参加するタンパク質、ＳｎａＤはおそらくペプチドシンターゼであるタンパク質をコードする）、ならびにｓｎｂＣ、ｓｎｂＤおよびｓｎｂＥ遺伝子（これらはその６つの別個のアミノ酸からプリスチナマイシンＩのペプチド鎖の形成に関与する３つのペプチドシンターゼＳｎｂＣ、ＳｎｂＤおよびｓｎｂＥをコードする）はコスミドｐＩＢＶ３中にクローン化された巨大ＤＮＡ上に一緒に群を成す。これらの結果はプリスチナマイシンIIの生合成に関与する遺伝子、ならびにプリスチナマイシンＩの生合成に関与する遺伝子が一緒に群を成しているという仮定を確証するものであり、そして調査した領域の上流および下流の染色体を歩くことにより、これらの生合成に関与する他の遺伝子のクローニングの可能性を与える。
さらに様々な株で生産されるストレプトグラミン（表１参照のこと）の全ＤＮＡとｓｎａＡ、ｓｎａＢ、ｓｎａＣ、ｓｎａＤ、ｓａｍＳ、ｓｎｂＡ、ｓｎｂＲ、ｓｎｂＣ、ｓｎｂＤ、ｓｎｂＥ、ｐａｐＡおよびｐａｐＭ遺伝子とをハイブリダイゼーションさせることにより、または染色体ウォーキングにより同定された遺伝子、あるいはこれらの遺伝子の断片とハイブリダイゼーションさせることによりストレプトグラミンを生産する他の微生物で同じ機能に対応する遺伝子を単離することが可能である。これはプリスチナマイシンについて行われたものと同様な研究法により、種々のストレプトグラミンの生合成に関与するすべての遺伝子を単離することを可能にする。
実施例９：遺伝子破壊によるＤＮＡ断片の遺伝的研究
この実施例では、生産株由来の株を構築し、そしてこれらの遺伝子を破壊して突然変異させ、さらにそのような突然変異体の表現型を分析することによりストレプトグラミンの生合成について遺伝子の関与をどのように実証できるかを説明する。この実施例ではさらに唯一の、または他のストレプトグラミンのＡおよびＢ成分を生産している株、あるいはＳＰ９２株とは異なる割合でＡおよびＢ成分を生産している株をどのように得るかを説明する。
９．１  ｓｎａＡ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体の構築
この実施例ではｓｎａＡ遺伝子の破壊により、もはやプリスチナマイシンIIＡを生産せず、対照的にプリスチナマイシンIIＢを生産するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株をどのように構築できるかを説明する。
この突然変異体はＳｎａＡの機能を確認し、そして実質的に改変されることができるプリスチナマイシンIIの中間体の生産を与えることを目的として構築された。
その構造はE.coli中のみで複製できるが、ストレプトミセス（Streptomyces）中で発現する耐性マーカーを持つ自殺プラスミドを使用して行った。このベクターはｐＤＨ５であるが、Hillemanら（１９９１）により開発された。
９．１．１．  プラスミドｐＶＲＣ５０５の構築
この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２中では複製せず、そして単一相同的組換えによりｓｎａＡ遺伝子を破壊するために使用できるプラスミドをどのように構築できるかを説明する。
プラスミドｐＶＲＣ５０５は、実施例６．３に記載されるプラスミドｐＸＬ２０４５から、ｓｎａＡ遺伝子が破壊されたＳＰ９２染色体突然変異体を生成するために構築された。
ｐＸＬ２０４５中にクローン化された６−ｋｂのＢａｍＨＩ断片（第１６図）を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断した。このように得られた断片を１％アガロースゲルで分離した後、ｓｎａＡ遺伝子の５’末端を含有する０．７−ｋｂの断片を単離し、そしてGeneclen（バイオ１０１、ラジョラ、カリフォルニア州）で精製した。
ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ二重消化により直線化された１００ｎｇのベクターｐＤＨ５を、実施例３．３に記載するように１００ｎｇの０．７ｋｂ断片と連結した。所望の断片を持つクローンをＴＧ１株による形質転換後に単離した。この組み換えプラスミドをｐＶＲＣ５０５と命名した。プラスミドｐＶＲＣ５０５は実施例２．１．に記載されたように調製した。その制限マップを第２５図に示す。
９．１．２．  相同的組み換えによりｓｎａＡ遺伝子が破壊されたＳＰ９２突然変異体の単離
この実施例ではｓｎａＡ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）の突然変異体をどのように構築できるかを説明する。
突然変異体は自殺プラスミドｐＶＲＣ５０５でＳＰ９２株を形質転換して単離した。
プロトプラストの調製およびその形質転換は、Hopwoodら（１９８５）に記載されているように行った。
ＳＰ９２株をＹＥＭＥ培地、３４％シュクロース、５ｍＭ  ＭｇＣl2、０．２５％グリシンで３０℃にて４０時間培養した。菌糸体をリゾチームの存在下でプロトプラストに転換し、そして５×１μｇのｐＶＲＣ５０５をプロトプラストの形質転換に使用した（ＰＥＧを使用する方法による）。Ｒ２ＹＥ培地（D.Hopwoodら  １９８５）でのプロトプラストの一晩の再生後、組み換え体を２．６μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有する３ｍｌのＳＮＡ培地（D.Hopwoodら、１９８５）を上層させて選択した。
実施した５つの形質転換の中で、３つのチオストレプトン−耐性クローンが単離された。これは１μｇのＤＮＡあたり１より低い組み換え効率である。これらの組み換え体はＳＰ９２株の染色体が持つｓｎａＡ遺伝子と自殺プラスミドｐＶＲＣ５０５の０．７ｋｂ断片との間の単一相同的組み換えの結果である。ｐＶＲＣ５０５中に挿入されたより小さい断片（０．７−ｋｂ）は低い組み換え効率を説明している。
組み換え体の胞子を４００μｇ／ｍｌのチオストレプトンを補充したＲ２ＹＥ培地にまいて生育させ、そして再度同一培地にまいて単離コロニーを得た。
プラスミドｐＶＲＣ５０５の統合位置を確認するために、数種の組み換えクローンの全ＤＮＡ（これは適当な制限酵素で消化した）の種々のサザンブロットが作成され、そしてManiatisら（１９８９）に記載されたように［α−32Ｐ］−ｄＣＴＰでランダムプライミングにより標識（ランダムプライムド  ＤＮＡ  標識キット、ベーリンガーマンハイム、仏国：Random Primed labeling kit,Boehringer Mannheim,France）した後、連続的にプローブとして使用したベクターｐＤＨ５および０．７−ｋｂ断片とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの結果では組み換え体クローンのゲノム中にベクターｐＤＨ５の大きさのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩバンドの出現が示され、これは後者とハイブリダイズし、同様にさらに両方のプローブとハイブリダイズするＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩハンドの出現が示される。これらの突然変異体の１つはＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０５と命名された。この突然変異体は単一相同的組み換えによるｓｎａＡ遺伝子中のプラスミドｐＶＲＣ５０５の統合によく対応する。
９．１．３  突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０５によるプリスチナマイシンの生産
この実施例ではプラスミドｐＶＲＣ５０５の統合によりｓｎａＡ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体が、もはやプチスチナマイシンIIＡを生産せず、一方プチスチナマイシンIIＢを生産し続けることをどのように測定するかを説明する。
突然変異体ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０５、同様に対照としてＳＰ９２株を液体生産培地で培養した。発酵は以下のように行われた：０．５ｍｌの上記株の胞子の懸濁液を、滅菌条件下で３００−ｍｌのエーレンマイヤー中の４０ｍｌの植菌培地に加える。植菌培地は１０ｇ／ｌのコーンスティープ、１５ｇ／ｌのシュクロース、１０ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、３ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよび１．２５ｇ／ｌのＣａＣＯ3から成る。炭酸カルシウムを導入する前にｐＨを６．９に水酸化ナトリウムで調整する。エーレンマイヤーは２７℃で４４時間、３２５ｒｐｍの速度で回転スターラーで撹拌する。４４時間経過後、上記カルチャー２．５ｍｌを滅菌条件下で、３００−ｍｌのエーレンマイヤー中の３０ｍｌの生産培地に加える。生産培地は２５ｇ／ｌの大豆粉、７．５ｇ／ｌの澱粉、２２．５ｇ／ｌのグルコース、３．５ｇ／ｌの補充酵母、０．５ｇ／ｌの硫酸亜鉛および６ｇ／ｌの炭酸カルシウムから成る。炭酸カルシウムを導入する前にｐＨを６．０に塩酸で調整する。エーレンマイヤーは２７℃で２４、２８および３２時間撹拌する。各時間で、１０ｇの果膠が均質なエーレンマイヤー中で計られ、これに６２．５％のアセトニトリルおよび３７．５％の０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4溶液（Ｈ3ＰＯ4でｐＨを３．０に調整）から成る２０ｍｌの移動相（そしてこれはプリスチナマイシンの抽出を可能にする）を加える。スターラーで室温にて２０分間撹拌（３２５ｒｐｍ）した後、全体を濾紙により濾過し、そしてプリスチナマイシンを実施例５．１．１．Ａに記載するようにＨＰＬＣにてアッセイする。
結果は、実施した発酵条件下で突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０５は対照であるＳＰ９２と同等量のプリスチナマイシンＩを生産し、これは試験した３回の場合でそうであった。対照的に対照は約７０％のプリスチナマイシンIIＡおよび３０％のプリスチナマイシンIIＢを、２４、２８および３２時間の発酵で生産し、突然変異体ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０５はプリスチナマイシンIIＢを１００％、これらと同時に生産し、その量はＳＰ９２株が生産したプリスチナマイシンIIＡ＋プリスチナマイシンIIＢの総和に等しかった。したがって突然変異体はまさにプリスチナマイシンIIの生合成段階（これは中間体プリスチナマイシンIIＢのＤ−プロリンの２，３結合の酸化に対応する）でブロックされた。したがってこの突然変異体はプリスチナマイシンIIＢを蓄積する。これはプリスチナマイシンIIＢからプリスチナマイシンIIＡへの転換におけるＳｎａＡの機能的関与をよく表している。
この実施例は生合成に関するクローン化遺伝子から出発して、プリスチナマイシンの生合成段階で突然変異した株を構築できることを示している。これはプリスチナマイシンIIに関しても示されたが、ストレプトグラミンの種々の成分に関して応用することにより、同じ結果がプリスチナマイシンＩについても得ることができる。種々の中間体を生産する株はこのように得ることができる。これら株は化学的、生化学的、酵素的などの修飾（１つまたは複数）により新規分子を生産するために使用できる。１つ、または他のストレプトグラミンの成分の生合成経路の初期段階でのブロックにより、唯一の、または他の成分を生産するようにされた突然変異株も導くことができる。
９．２  ｓａｍＳ遺伝子が分断されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体の構築
この実施例ではｓａｍＳ遺伝子の破壊により、野生型のＳＰ９２株に比較して３５％低いＰＩＡ、および１０倍多いＰＩＢ（その化学構造を第２図に示す）を生産するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株をどのように構築できるかを説明する。この突然変異体はｓａｍＳ遺伝子にコードされるタンパク質に関して推定されるＳＡＭシンターゼ機能を確証し、そして野生型ＳＰ９２株よりも多いＰＩＢを合成する株を得ることを目的として構築された。
９．２．１．  プラスミドｐＶＲＣ７０２の構築
プラスミドｐＸＬ２０４５（実施例６．３に記載される）から、３．２−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を酵素的開裂により単離し、そして１％のアガロースゲルの電気泳動の後Genecleanキット法で精製した（実施例６．８参照）。この断片はｓｎａＢ遺伝子およびｓａｍＳ遺伝子（第１６図）を持つ。この断片を次に以下の方法によりプラスミドｐＵＣ１８中にクローン化した：５０ｎｇのｐＵＣ１８を酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを使用する二重消化により直線化し、そしてＴＳ  ＤＮＡリガーゼ（バルオラボズ）の存在下で３００ｎｇの３．２−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片と連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１株のコンピテント細胞をこの連結混合物で形質転換した後、この３．２−ｋｂの挿入物を有するプラスミドｐＵＣ１８を持つ組換えクローンを単離でき、そしてこれをｐＶＲＣ７０１と命名した（第２６図）。
プラスミドｐＶＲＣ７０２は、のｓａｍＳ遺伝子（第２７図）の中央に位置する２つのＳｓｔＩ部位の間に、アムラマイシンおよびゲニチシンに対する耐性をコードするａｍＲ遺伝子を持つカセットを導入することによりプラスミドｐＶＲＣ７０１から派生する。このために、ＱａｍＲカセットを持つ２．２−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨ断片が最初にプラスミドｐＨＰ４５０ＱａｍＲ（J.L. Pernodet、Laboratoire de Genetiqe d'Oesayに与えられている）から、上記と同様な手法を使用してＢａｍＨＩ消化により単離された。２００ｎｇのこの断片を、酵素ＢａｍＨＩで直線化した５０ｎｇのプラスミドｐＵＣ１３１８（ＫａｙおよびＭａｃｐｈｅｒｓｏｎ、１９８７）と連結し、そしてこの連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１株のコンピテント細胞に導入した。ＱａｍＲカセットを含有するプラスミドｐＵＣ１３１８を有する組換えゾーンから、酵素Ｓｓｔ１を使用する部分開裂によりＱａｍＲカセットを含有する５０ｎｇの２．２−ｋｂのＳｓｔ１−Ｓｓｔ１断片を再単離することができ、そしてこの断片を３０ｎｇのＳｓｔ１（第２６図）で切断したプラスミドＰＶＲＣ７０１と連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞で形質転換した後、プラスミドＰＶＲＣ７０２を得、その構造を第２７図に表す。
これにより得たプラスミドｐＶＲＣ７０２を上記実施例２．１に記載したように大量に調製した。
９．２．２．ｓａｍＳ：：ＱａｍＲ染色体遺伝子を有する株の構築
この株はエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）のプロトプラストを１μｇの自殺プラスミドｐＶＲＣ７０２（これはストレプトミセス（Streptomyces）細胞中では複製できない）で形質転換することにより得られた。プロトプラストの調製法およびその形質転換法は、上記（実施例９．１）と同じである。実施例１０．１に関しては抗生物質の選択について変更しただけである。本場合には３０℃でＲ２ＹＥ培地で１８時間再生した後、組換えプロトプラストを５０μｇ／ｍｌのゲニチシン（シグマ化学社）存在下で選択した。すなわち３８３μｇ／ｍｌのゲニチシンを含有する３ｍｌのＳＡＮを各Ｒ２ＹＥ培地の皿に上層した。
このように５００個のゲニチシン−耐性クローンを単離することができ、これは染色体とプラスミドｓａｍＳとの間の単一相同的組換え後のプラスミドｐＶＲＣ７０２の染色体への統合か（単一交差の場合）、あるいは二重相同的組換え後の染色体ｓａｍＳ遺伝子とプラスミドｓａｍＳ：：ＱａｍＲプラスミド遺伝子の交換の結果（二重交差の場合）のいずれかの結果でありうる。この２つの適例において、ＱａｍＲカセットは株の染色体上に転移され、そして世代にわたって安定なａｍＲ耐性を付与する。
組換えクローンをプレートにまき、そして最終的に５０μｇ／ｍｌのゲニチシンを含有するＨＴ７培地で生育させ、そしてコロニーハイブリダイゼーション法により単離する。実施例９．１に記載されるように、ｐＶＲＣ７０２および対応するｐＵＣ１８に由来する２．７ｋｂのＢａｍＨ１−ＥｃｏＲＩ断片から得た第一プローブでのクローンのハイブリダイゼーション、ならびにＱａｍＲカセットを持つ２．２−ｋｂのＢａｍＨ１断片に対応する第２プローブでのハイブリダイゼーションは、単一交差（両方のプローブとハイブリダイズする）を二重交差（第２プローブとのみハイブリダイズする）から区別することを可能にする。これにより選択される二重交差から生じる３つのクローンを、プレートにまいて、そして終濃度が５０ｍｇ／ｍｌのゲニチシンを含有るすＹＶＤ培地で生育させ、そして胞子のストックを得た。
３つの二重組換え体のゲノム構造を確認するために、これらのクローンを酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した染色体ＤＮＡの様々なサザンブロットを作成し、そして以下の３つのプローブとハイブリダイズさせた：ｐＶＲＣ７０２の２．２−ｋｂのＢａｍＨＩ断片から得たＱａｍＲカセットに対応するプローブ、ｐＶＲＣ７０１の２．７−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片から得たｐＵＣ１８に対応するプローブ、そして最後にｓｎａＢ遺伝子を持ち、かつｓａｍＳの始まりであるｐＶＲＣ７０１の１．３−ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ断片から得たプローブ。これらのハイブリダイゼーションにより試験した３つのクローンがまさに、ＱａｍＲカセットにより妨害された突然変異ｓａｍＳ遺伝子により完全な染色体ｓａｍＳ遺伝子置換を可能にする二重相同的組換えの結果であることを確証することができる。
これら３つのうちの１つの突然変異クローンをＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲと命名した。
９．２．３．突然変異株ｓａｍＳ：：ＱａｍＲ株によるプリスチナマイシンの生産
この実施例では破壊されたｓａｍＳ遺伝子を持つ突然変異体ＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲが野生型のＳＰ９２株に比較して３５％低いプリスチナマイシンIＡ、および１０倍多いプリスチナマイシンＩＢを生産することをどのように測定するかを説明する。
突然変異体ＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲならびに対照ＳＰ９２株は液体培地で培養し、そしてそれらの生産物のプリスチナマイシンIIおよプリスチナマイシンＩを実施例９．１に記載したようにアッセイした。
結果は、実施した発酵条件下で突然変異体ＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲは対照であるＳＰ９２と同等量のプリスチナマイシンIIを生産し、これは試験した３回の場合でそうである。対照的に突然変異体ＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲは対照株よりも約３５％低いプリスチナマイシンＩＡおよび１０倍多いプリスチナマイシンＩＢを、試験した３回のすべてについて生産する。したがってプリスチナマイシンのＩＢ形は突然変異体ＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲが生産する全プリスチナマイシンＩ型の集合の２０％を表し、一方対照株はＰＩＢを１％のオーダーで生産するのみである。プリスチナマイシンのＩＢ形がＩＡ形と異なる点は、プリスチナマイシンＩＡの第５番残基がｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンの代わりにりｐ−メチルアミノフェニルアラニンである点である。突然変異体ＳＰ９２ｓａｍＳ：：ＱａｍＲがより多くのプリスチナマイシンＩＢを生産し、そしてより少ないプリスチナマイシンＩＢを生産するという事実は、ｓａｍＳ遺伝子の破壊がプリスチナマイシンＩの第５残基のメチル化の程度を減少させ、したがってｓａｍＳ遺伝子はおそらくメチル基供与体、ＳＡＭの生合成に関与し、すなわちそれはＳＡＭシンターゼをコードする。
９．３  ｐａｐＡ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体の構築
この実施例ではｐａｐＡ遺伝子の破壊により、もはやＰＩを生産しないエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株をどのように構築できるかを説明する。この突然変異体はｐａｐＡタンパク質の機能を確認することを目的として構築された。その構築は実施例９．１に記載したように自殺プラスミドｐＤＨ５を使用して行われた。
９．３．１．  プラスミドｐＶＲＣ５０８の構築
この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２中では複製せず、そして単一相同的組換えによりｐａｐＡ遺伝子を破壊するために使用できるプラスミドをどのように構築できるかを説明する。
プラスミドｐＶＲＣ５０８は実施例７．７に記載されるプラスミドＰＶＲＣ９０３から、ｐａｐＡ遺伝子が破壊されたＳＰ９２染色体突然変異体を作成するように構築された。
実施例７．７において、ｐａｐＡ遺伝子のシークエンシングを目的として１．４−ｋｂ  ＰｖｕII−ＥｃｏＲＩ断片のＭ１３ｍｐ１８（プラスミドｐＶＲＣ９０３から）へのクローニングが記載された（この断片はベクターｐＶＲＣ９００中に存在する１．４ｋｂのＰｖｕII−ＸｈｏＩ断片に対応する、第２３図）。
Ｍ１３ｍｐ１８中のこの構築物を、制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩで消化した。ベクターＭ１３ｍｐ１８およびｐａｐＡ遺伝子を含有する１．４−ｋｂ断片を０．８％のアガロースゲルで分離後、後者の断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎ（バイオ１０１  ラ  ジョラ  カリフォルニア）により単離、そして精製した。ｐａｐＡ遺伝子中の断片の位置を第２３図に表す。
制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩを使用した二重消化により直線化した１００ｎｇのベクターｐＤＨ５を、実施例３．３に記載されたように２００ｎｇの１．４−ｋｂの断片と連結した。所望の断片を持つクローンをＴＧ１株での形質転換後、単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ５０８と命名した。プラスミドｐＶＲＣ５０８は実施例２．１に記載されたように調製した。その制限マップを第２８図に表す。
９．３．２．  相同的組み換えによりｐａｐＡ遺伝子が破壊されたＳＰ９２突然変異体の単離
この実施例ではｐａｐＡ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）の突然変異体をどのように構築できるかを説明する。この突然変異体は自殺プラスミドｐＶＲＣ５０８によるＳＰ９２株の形質転換により単離した。プロトプラストの調製およびその形質転換は、実施例９．１に記載されているように行った。ＳＰ９２のプロトプラストを形質転換した後、組み換え体を２．６ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するで３ｍｌのＳＮＡ培地を上層させて選択した。１μｇのプラスミドｐＶＲＣ５０８で５回実施した５回の形質転換の中で、１０個のチオストレプトン−耐性クローンが単離された。これは１μｇのＤＮＡあたり約２の組み換え効率である。これらの組み換え体はＳＰ９２株の染色体が持つｐａｐＡ遺伝子と１．４ｋｂの自殺プラスミドｐＶＲＣ５０８の断片との間の単一相同的組み換えの結果である。
組み換え体の胞子を４００μｇ／ｍｌのチオストレプトンを補充したＲ２ＹＥ培地にまいて生育させ、そして再度同一培地にまいて単離コロニーを得ることにより単離した。
プラスミドｐＶＲＣ５０８の統合位置を確認するために、数種の組み換えクローンの全ＤＮＡ（上記のように精製した）の種々のサザンブロットが作成され、そしてManiatisら（１９８９）に記載されたように［α−32Ｐ］−ｄＣＴＰでランダムプライミングにより標識した後、連続的にプローブとして使用したベクターｐＤＨ５および１．４−ｋｂ断片とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの結果では制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した（１．４−ｋｂの断片の周辺を含む部位）の組み換え体クローンのゲノム中から６．８−ｋｂのＥｃｏＲＩバンドが消失し、そして対照のＳＰ９２株と比較してにさらに１．４−ｋｂ断片とハイブリダイズする２．４ｋｂのもの、および他のｐＤＨ５および１．４−ｋｂ断片の両方とハイブリダイズする１０．５ｋｂのものの出現が示される。制限酵素ＰｓｔＩによる組換えクローンの消化では対照のＳＰ９２株と比較してにさらに１．４−ｋｂ断片とハイブリダイズする１．０ｋｂ、ならびに他のｐＤＨ５および１．４−ｋｂ断片の両方とハイブリダイズする５．１ｋｂの出現が示される。これらの中の１つをＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０８と命名した。
９．３．３  突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８によるプリスチナマイシンの生産
この実施例ではプラスミドｐＶＲＣ５０８の統合によりｐａｐＡ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体が、もはやＰＩを生産しないことをどのように測定するかを説明する。
突然変異体ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０８、同様に対照としてＳＰ９２株を液体生産培地で培養した。発酵およびプリスチナマイシンＩおよびIIのアッセイは実施例９．１に記載されたように行った。
結果は、実施した発酵条件下で対照ＳＰ９２株は標準的な量のプリスチナマイシンＩを生産したが、突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８は微量のＩ型プリスチナマイシンも発酵果膠中に検出されなかった。さらに突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８によるプリスチナマイシンIIの生産はＳＰ９２対照と等しかった。突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８はプリスチナマイシンIIのみを生産するようにされた。これらの結果はｐａｐＡ遺伝子がプリスチナマイシンＩの生合成に関与することを明らかに表している。
突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８中で行われる破壊の有極性が無いことを確認するために、後者をｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンの存在下で発酵させた。突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８は上記のように発酵させ、さらに１００ｍｇ／ｍｌのｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンを発酵１７時間後に加えた。このような相補性の条件下で、突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８はＳＰ９２株が生産するプリスチナマイシンＩと等量のプリスチナマイシンＩを生産した。プリスチナマイシンIIの生産は両方の株で等量である。これにより突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ５０８のｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンの生合成に参加する遺伝子（ｐａｐＡ遺伝子）がまさに破壊されているので、プリスチナマイシンを生産しないことが結論できる。この突然変異体のｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンの相補性は、プリスチナマイシンＩを生産する能力を再保有し、この突然変異が他のプリスチナマイシンＩ前駆体、またはこれらの前駆体の縮合に対して極性効果を持たないことを証明する。
この実施例では生合成に関与するクローン化遺伝子から出発して、プリスチナマイシン（特にプリスチナマイシンＩ）の生合成段階で突然変異した株が構築できることを示す。またこの実施例は、この研究法により、特にプリスチナマイシンIIを生産するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）株を、特にプリスチナマイシンＩを生産する株に拡張することにより構築できることを示す。この研究法はまた、トレプトグラミンを生産する放線菌類の他の株にも使用することができる。
９．４  ｓｎｂＡ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体の構築
この実施例ではｓｎｂＡ遺伝子の破壊により、もはやプリスチナマイシンＩを生産しないエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株をどのように構築できるかを説明する。この突然変異体はＳｎｂＡタンパク質の機能を確認することを目的として構築された。その構築は実施例９．１に記載したように自殺プラスミドｐＤＨ５を使用して行われた。
９．４．１．  プラスミドｐＶＲＣ４０４の構築
この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２中では複製せず、そして単一相同的組換えによりｓｎｂＡ遺伝子を破壊するために使用できるプラスミドをどのように構築できるかを説明する。
プラスミドｐＶＲＣ４０４は実施例６．２に記載されるプラスミドｐＶＲＣ４０２から、ｓｎｂＡ遺伝子が破壊されたＳＰ９２染色体突然変異体を作成するように構築された。プラスミドｐＶＲＣ４０２を制限酵素ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄIIIで消化する。このような断片を０．８％のアガロースゲル電気泳動で分離後、ｓｎｂＡ遺伝子の内部を含有する１１７０−ｂｐの断片をGeneclean（バイオ１０１、ラ  ジョラ  カリフォルニア州）で単離そして精製した。ｓｎｂＡ遺伝子中の断片の位置は第１５図に示す。
ＳｍａＩ消化により直線化された１００ｎｇのベクターｐＤＨ５を実施例３．３に記載された２００ｎｇの１１７３−ｂｐ断片と連結した。所望の断片を持つクローンをＴＧ１株の形質転換後に単離した。組換えプラスミドをｐＶＲＣ４０４と命名した。プラスミドｐＶＲＣ４０４を実施例２．１に記載されるように調製した。その制限マップを第２９図に示す。
９．４．２．相同的組み換えによりｓｎｂＡ遺伝子が破壊されたＳＰ９２突然変異体の単離
この実施例ではｓｎｂＡ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰの突然変異体をどのように構築できるかを説明する。
この突然変異体は自殺プラスミドｐＶＲＣ４０４によるＳＰ９２株の形質転換により単離した。プロトプラストの調製およびその形質転換は、実施例９．１に記載されているように行った。ＳＰ９２のプロトプラストを形質転換した後、組み換え体を２．６ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するで３ｍｌのＳＮＡ培地を上層させて選択した。１μｇのプラスミドｐＶＲＣ４０４で５回実施した５回の形質転換の中で、約３０個のチオストレプトン−耐性クローンが単離された。これは１μｇのＤＮＡあたり約５の組み換え効率である。これらの組み換え体はＳＰ９２株の染色体が持つｓｎｂＡ遺伝子と１１７０ｂｐの自殺プラスミドｐＶＲＣ４０４の断片との間の単一相同的組み換えによる統合の結果である。組み換え体の胞子を４００ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを補充したＲ２ＹＥ培地にまいて生育させ、そして再度同一培地にまいて単離コロニーを得た。プラスミドｐＶＲＣ４０４の統合位置を確認するために、数種の組み換えクローンの全ＤＮＡ（上記のように精製した）の種々のサザンブロットが作成され、そしてManiatisら（１９８９）に記載されたように［α−32Ｐ］−ｄＣＴＰでランダムプライミングにより標識した後、連続的にプローブとして使用したベクターｐＤＨ５および１１７０−ｂｐ断片とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの結果では制限酵素ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した組み換え体クローンのゲノム中から、対照のＳＰ９２株（ベクターｐＤＨ５＋１．１７ｋｂ）と比較してにさらにｐＤＨ５および１１７０ｂｐ断片の両方とハイブリダイズする４．７−ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIIIバンドの出現が示される。制限酵素Ｐｆ１ＭＩ（１１７０−ｂｐのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII断片を含む部位）による組換えクローンの消化では、３．１−ｋｂのＰｆ１ＭＩ−Ｐｆ１ＭＩバンドが消失し、そして両方のプローブにハイブリダイズする８．８ｋｂのバンドの出現が示される。これらの結果は分析したクローンのゲノム構造は、まさにｐＶＲＣ４０４と染色体ｓｎｂＡ遺伝子間の単一相同的組換え後起こったものと思われる。これらの中の１つをＳＰ９２：：ｐＶＲＣ４０４と命名した。
９．４．３  突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ４０４によるプリスチナマイシンの生産
この実施例ではプラスミドｐＶＲＣ５０８の統合によりｓｎｂＡ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体が、もはやＰＩを生産しないことをどのように測定するかを説明する。
突然変異体ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ４０４、同様に対照としてＳＰ９２株を液体生産培地で培養した。発酵およびプリスチナマイシンＩおよびIIのアッセイは実施例９．１に記載されたように行った。結果は、実施した発酵条件下で対照ＳＰ９２株は標準的な量のプリスチナマイシンＩを生産したが、突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ４０４は微量のＩ型プリスチナマイシンも発酵果膠中に検出されなかった。さらに突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ４０４によるプリスチナマイシンIIの生産はＳＰ９２対照と等しかった。突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ４０４はプリスチナマイシンIIのみを生産するようにされた。これらの結果は、実施例５．２の精製中に示されたようにｓｎｂＡ遺伝子がプリスチナマイシンＩの生合成に関与するタンパク質ＳｎｂＡをコードすることを明らかに表している。
この実施例では前記条件と同様に生合成に関与するクローン化遺伝子から出発して、プリスチナマイシン（特にプリスチナマイシンＩ）の生合成段階で突然変異した株が構築できることを示す。またこの実施例は以下の実施例９．５に記載するように、この研究法により、特にプリスチナマイシンIIを生産するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）株を、プリスチナマイシンＩを特に生産する株に拡張することにより構築できることを示す。同様な研究法もまた、ストレプトグラミンを生産する放線菌類の他の株にも使用することができる。
９．５  おそらくプリスチナマイシンIIの生合成に関与するペプチドシンターゼをコードするｓｎａＤ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体の構築
この実施例ではおそらくプリスチナマイシンIIの生合成に関与するペプチドシンターゼをコードするｓｎｂＡ遺伝子の破壊により、もはやプリスチナマイシンIIを生産しないエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２株をどのように構築できるかを説明する。この突然変異体はｓｎａＤ遺伝子の機能を確認し、そしてプリスチナマイシンＩのみを生産するようにされたＳＰ９２株由来の株を得ることを目的として構築された。
その構築は実施例６．８に記載したように、E.coli中でのみ複製でき、そしてストレプトミセス（Streptomyces）中で発現する耐性マーカーを持つ自殺プラスミドｐＤＨ５由来のプラスミドＰＶＲＣ１０００を使用して行われた（実施例９．１を参照のこと）。
９．５．１．  プラスミドｐＶＲＣ１０００の構築
この実施例ではエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２中では複製せず、そして単一相同的組換えによりｓｎａＤ遺伝子を破壊するために使用できるプラスミドをどのように構築できるかを説明する。ｓｎａＤ遺伝子の一部を持つプラスミドｐＶＲＣ１０００構造は実施例６．８に記載される。
９．５．２．相同的組み換えによりｓｎａＤ遺伝子が破壊されたＳＰ９２突然変異体の単離
この実施例ではｓｎａＤ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体をどのように構築されたかを説明する。この突然変異体はＳＰ９２を自殺プラスミドｐＶＲＣ１０００で形質転換株して単離した。プロトプラストの調製およびその形質転換は、実施例９．１に記載されているように行った。１ｍｇのｐＶＲＣ１０００で行った５回の形質転換の中で約１５００個のチオストレプトン−耐性クローンを単離した。これは１μｇのＤＮＡあたり約３７５の組み換え効率である。これらの組み換え体はＳＰ９２株の染色体が持つｓｎａＤ遺伝子と自殺プラスミドｐＶＲＣ１０００の１．５ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片との間の単一相同的組み換えの結果である。約２０個の組換え体が４００μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含有するＲ２ＹＥ培地上でサブクローン化され、そしてこれら組換え体の胞子を再度４００μｇ／ｍｌのチオストレプトンを補充したＲ２ＹＥ培地にまいて生育させることにより単離した。
プラスミドｐＶＲＣ１０００の統合位置を確認するために、上記のように精製した７種の組み換えクローンの全ＤＮＡの種々のサザンブロットが作成され、そして実施例９．１に記載されたように［α−32Ｐ］−ｄＣＴＰで標識した後、連続的にプローブとして使用したベクターｐＤＨ５および１．５ｋｂの断片とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの結果では７個の組換えクローンで、これら２つのプローブハイブリダイズする１３．８−ｋｂのＥｃｏＲＩバンドおよび約１７−ｋｂのＢａｌIIバンド、ならびに１．２ｋｂのＢａｍＨ−ＳｓｔＩプローブとハイブリダイズする３．７ｋｂのＥｃｏＲＩバンドの出現を示す。これらの中の１つをＳＰ９２：：ｐＶＲＣ１０００と命名し、これは単一相同的組換えによりｓｎａＤ遺伝子中にプラスミドｐＶＲＣ１０００が統合されていることによく対応する。
９．５．３  突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ１０００によるプリスチナマイシンの生産
この実施例ではプラスミドｐＶＲＣ１０００の統合によりｓｎａＤ遺伝子が破壊されたエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）ＳＰ９２の突然変異体が、もはやプリスチナマイシンIIを生産しないがプリスチナマイシンＩのみを生産することをどのように測定するかを説明する。突然変異体ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ１０００、同様に対照としてＳＰ９２株を液体生産培地で培養し、そしてプリスチナマイシンIIおよびＩの生産を実施例９．１に記載したようにアッセイした。
結果は、実施した発酵条件下で、そして試験したすべての場合で、突然変異体ＳＰ９２：ｐＶＲＣ１０００は０ｍｇ／ｍｌのプリスチナマイシンIIを生産し、そしてプリスチナマイシンＩの生産量はＳＰ９２対照と等しかった。したがって突然変異体はプリスチナマイシンIIの生合成段階でまさにブロックされ、これはｓｎａＤ遺伝子がプリスチナマイシンIIの生合成に関与する酵素をコードし、そしてそれはまさしくペプチドシンターゼであろうことを示す。
これらの結果は、前記実施例のように生合成に関与するクローン化遺伝子から出発して、プリスチナマイシン（特にプリスチナマイシンII）の生合成段階で突然変異した株が構築できることを示す。またこの実施例はこの研究法により、特にプリスチナマイシンＩを生産するエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）株を、特にプリスチナマイシンIIを生産する株に拡張することにより構築できることを示す。同様な研究法もまた、ストレプトグラミンを生産する放線菌類の他の株にも使用することができる。
実施例１０：ＳＰ９２の非生産突然変異株の相補性
この実施例ではプリスチナマイシンの生合成に関する遺伝子をどのように発現できるかを説明する。この発現はより特別にはＳＰ９２：：ＳＰ１２０から派生した突然変異体中のコスミドｐＩＢＶ１により保持されるｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子に関して実施された。この突然変異体はプリスチナマイシンIIＡの生産しない。これはプリスチナマイシンII：プリスチナマイシンIIＢの生合成経路の最終中間体を蓄積する。
１０．１  ｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子のシャトルベクターｐＩＪ９０３中へのクローニング
この実施例ではｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子を含有するコスミドｐＩＶＢ１の副断片が、どのようにイー．コリー（E.coli）およびストレプトミセス（Streptomyces）の両方で複製できるベクター中にクローン化できるかを説明する。
ベクターｐＩＪ９０３（Lydiate D. J.ら、１９８５）はコピー数が低い（細胞あたり１−３個）シャトルベクターであり、これはｐＢＲ３２２の複製起源の結果としてイー．コリーE.coli中で、そしてＳＣＰ２+の複製起源の結果としてストレプトミセス（streptomyces）中で、それらの両方の中で複製でる。アンピシリン耐性遺伝子によりＥ．ｃｏｌｉ中での選択が可能であり、そしてチオストレプトン耐性遺伝子によりストレプトミセス（streptomyces）中での選択が可能である。
コスミドｐＩＢＶを制限酵素ＳｓｔＩで消化した。ｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子を含有する大きな７．６ｋｂのＤＮＡ断片を０．８％のアガロースゲル電気泳動および電気溶出により単離した。５００ｎｇの断片を、ＳｓｔＩで直線化した１００ｎｇのベクターｐＵＣ１８１３（kayおよびMcPherson、１９８７）と連結した。
E.Coli  ＤＨ５α株（supE44 ΔlacU169（f80lacZΔMl5）hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1）での形質転換、および形質転換体を固体ＬＢ培地（１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含有する）で選択した後、７．６−ｋｂ断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ５０６と命名した。この組換えプラスミドの調製は実施例２．１に記載されているように行った。
ベクターｐＩＪ９０３へのクローニングはＨｉｎｄIII部位で行われた。プラスミドｐＶＲＣ５０６をＨｉｎｄIIIで切断し、そしてｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子を含有する７．６ｋｂの断片を０．８％のアガロースゲル電気泳動および電気溶出により単離した。５００ｎｇの断片を、ＨｉｎｄIIIで直線化した５００ｎｇのベクターｐＩＪ９０３と連結した。
E.Coli  ＤＨ５α株での形質転換、および形質転換体を固体ＬＢ培地（１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する）で選択した後、７．６−ｋｂ断片を持つクローンを単離した。この組換えプラスミドをｐＶＲＣ５０７と命名した。この組換えプラスミドの調製は実施例２．１に記載されているように行った。そのマップを第３０図に示す。
１０．２  ｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子の突然変異体ＳＰ１２０中での発現
この実施例では対応する構造遺伝子を持つプラスミドをエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）中に導入することにより、どのようにしてその株の中でタンパク質ＳｎａＡおよびＳｎａＢを生産できるかを説明する。ｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子の発現は突然変異体ＳＰ１２０株を５００ｎｇのプラスミドｐＶＲＣ５０７で形質転換させた後行った。ＳＰ１２０のプロトプラストの形質転換およびチオストレプトンでの形質転換体の選択は実施例９．２．１に記載されているように行った。
多くの形質転換体をこのようにして得、そしてその中の３個を液体培地での生産のため選択した。プラスミドｐＩＪ９０３を持つＳＰ１２０株を対照として選択した。発酵および生合成産物の抽出は、実施例９．１．３に記載されているように行った。
結果は実施した発酵条件下で、対照（プラスミドｐＩＪ９０３を持つＳＰ１２０）が１００％のＰIIＢおよび０％のＰIIＡを、２４、２８および３２時間の発酵で生産するのに対して、プラスミドｐＶＲＣ５０７で形質転換したＳＰ１２０株の３つのクローンは同じ時間で約８５−８０％のプリスチナマイシンIIＢ、そして１５−２０％の時プリスチナマイシンIIＡを生産し、その総和は対照株（プラスミドｐＩＪ９０３を持つＳＰ１２０）のプリスチナマイシンIIＢの生産量に等しい。ｐＶＲＣ５０７を持つクローンはまさにプリスチナマイシンIIの生合成段階が部分的に相補され、これは中間体プリスチナマイシンIIＢのＤ−プロリンの２，３−結合の酸化に対応する。これはプリスチナマイシンIIＡシンターゼ活性の酵素活性により実施例５．１．１．Ａに記載されるように、ｐＶＲＣ５０７を持つＳＰ１２０、およびｐＩＪ９０３を持つＳＰ１２０株について確認された。一方ｐＩＪ９０３を持つ対照株ＳＰ１２０は、プリスチナマイシンIIＡシンターゼ活性を表さず、ｐＶＲＣ５０７を持つＳＰ１２０株がＰIIＡシンターゼ活性を表す。
この実施例ではストレプトグラミンの生合成に関する遺伝子を発現することができることを示す。発現はよりより詳細にプリスチナマイシンIIＡシンターゼをコードする遺伝子に関して調査されたが、他のプリスチナマイシンIIおよびプリスチナマイシンＩの生合成に関する遺伝子、ならびに種々のストレプトグラミンの成分の生合成に関与する遺伝子もこのように発現できる。この発現は実施例１０の場合のように、突然変異株で行ってもよいが、ストレプトグラミンの生産量レベルを上昇させるために生産株中で行ってもよい。発現は種々のコピー数（低いまたは高い）を持つベクター中、または統合的ベクター中に遺伝子をクローニングすることにより、あるいはこれらの遺伝子のデレギュレーション（deregulation）により、あるいはこれらの遺伝子を相同的なまたは異種のプロモーター（強い、または特別に制御されたプロモーター）の制御下でクローニングすることによりモデファイすることができる。ストレプトグラミンの生合成に関する種々の遺伝子の発現は、ハイブリッド抗生物質を生成するために適当な発現ベクターを使用して異種株中で行ってもよい。
実施例１１：E.coli中でのエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）のｐａｐＭ遺伝子の発現
この実施例は、エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）遺伝子にコードされるタンパク質を同定し、精製し、そして調査するために、どのようにしてこの遺伝子をE.coli中で発現できるかを説明する。
１１．１  プラスミドｐＶＲＣ７０６の構築
E.coli中でのｐａｐＭ遺伝子の発現は、この遺伝子をE.coliのｌａｃＺ遺伝子のプロモーターの下流およびリボゾーム結合部位に配置することにより得る。
実施例７．８に記載したように、１．７−ｋｂのＭｌｕＩ−ＳｔｕＩ断片をプラスミドｐＶＲＣ４０９から単離し、そしてＢａｍＨＩで切断され、そして続いてクレノー酵素（Maniatisら、１９８９）で満たされたプラスミドｐＭＴ１２３（Chambersら、１９８８）中にＭｌｕＩ部位でクローン化し、第３１図に示すプラスミドｐＶＲＣ７０６を得た。ＭｌｕＩ部位でのクローニングは、プラスミドｐＭＴＬ２３のｌａｃＺ遺伝子にコードされるβ−ガラクトシダーゼの最初の３２アミノ酸とｐａｐＭのすぐ上流の遺伝子の最後の１１アミノ酸の間のフレイム内融合（in-frame fusion）を可能にする。これによりｐａｐＭ遺伝子とこの上流遺伝子の間（実施例７．８に示されるヌクレオチド配列の下）に存在することを表す翻訳結合（translation coupling）が保存される。したがってｌａｃＺとｐａｐＭの上流の遺伝子との間のハイブリッド遺伝子の発現、ならびにｐａｐＭ遺伝子の発現が、ｌａｃＺ遺伝子の発現シグナルの制御下にある。
１１．２  E.coli  ＤＨ５ａ株中でのｐａｐＭ遺伝子生産物の発現
プラスミドｐＶＲＣ７０６およびｐＭＴＬ２３は形質転換によりE.coli  ＤＨ５ａ株中に導入され、そしてそれらの遺伝子の発現がｌａｃＺ遺伝子のプロモーターがすでに記載されたように（Maniatisら、１９８９）誘導される条件下で調査された。プラスミドｐＶＲＣ７０６または他の対照プラスミドｐＭＴＬ２３を持つE.coli株は５００ｍｌのＬＢ富栄養培地（１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む）中で培養され、ｌａｃＺ遺伝子のプロモーターの誘導を可能にした。これらのカルチャーを６００ｎｍの光学密度が１の領域に達した時、試料として採取し、そしてタンパク質抽出物を以下に記載するように調製した。
１１．３  E.coli中で発現したｐａｍＭ遺伝子産物の活性アッセイ
ｐａｐＭ遺伝子によりコードされるタンパク質に対応する活性を、プラスミドｐＶＲＣ７０６またはプラスミドｐＭＴＬ２３を持つE.coliカルチャーから調製された２つの抽出物についてアッセイする実施例５．７）。E.coli：：ｐＶＲＣ７０６株からの抽出調製物は、ｐ−アミノフェニルアラニンのｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンへのメチル化を触媒し、その活性は２３５単位／ｍｇであり、一方対照E.coli：：ｐＭＴＬ２３株の抽出物中の活性は無い（実施例５．７．１．Ｃを参照のこと）。これらの結果はE.coli中でのエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）のｐａｐＭ遺伝子の発現が可能であることを指示し、そして対応するタンパク質はまさに、ｐ−アミノフェニルアラニンをｐ−ジメチルアミノフェニルアラニンへのメチル化を触媒するタンパク質であることが指示される。この実施例は抗生物質の前駆体あるいはさらに天然またはハイブリッド抗生物質を生産するために、異質株（例えばE.coliのような、しかし他の微生物中でも）中で、適当な発現ベクターを使用してストレプトグラミンの生合成に関する遺伝子を発現させることができることを示す。
実施例１２：種々のストレプトミセス（Streptomyces）中のストレプトグラミンの生合成に関与する遺伝子の相同性の実証
この実施例では全ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより、ストレプトグラミンを生産する種々のストレプトミセス（Streptomyces）株について、ストレプトグラミンの生合成に関与する種々の遺伝子間に存在する相同性を、どのように実証することが可能であるかを説明する。
１２．１  ストレプトグラミンを生産する種々のストレプトミセス（Streptomyces）の全ＤＮＡの抽出
この実施例ではストレプトグラミンを生産する種々の株のＤＮＡがどのように精製できるかを説明する。これらのストレプトミセス（Streptomyces）株は表１に記載された中から選択された：
ストレプトミセス ロイデンシス（Streptomyces loidensis）
ストレプトミセス オリバセウス（Streptomyces olivaceus）
ストレプトミセス オステログリセウス（Streptomyces osteogriseus）
ストレプトミセス バージニエ（Streptomyces virginiae）
ストレプトグラミンを生産しない株：
ストレプトミセス ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）を陰性対照として選択した。
ＹＥＭＥ培地中のカルチャーから種々の全ＤＮＡの抽出を、実施例１に記載されるように行った。
１２．２  ストレプトグラミン生産株の全ＤＮＡと、プリスチナマイシンの生合成に関与し、エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）ＳＰ９２株から単離された遺伝子のＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーション
この実施例は前記実施例に記載されたプリスチナマイシンの生合成に関与し、ＳＰ９２株から単離された遺伝子から出発して、ストレプトグラミン生産株の全ＤＮＡのハイブリダイゼーションによりどのように相同的遺伝子が実証できるかを説明する。
プローブとして使用したＤＮＡ断片は：
実施例６．５に記載されたｐＶＲＣ１１０６から単離された３．９−ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片、その制限マップは第１８図に示される。
この断片はプリスチナマイシンＩシンターゼIIをコードする遺伝子の一部を含む。
実施例６．３に記載されたプラスミドｐＸＬ２０４５から単離された６−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片、その制限マップは第１６図に示される。この断片はＰIIＡシンターゼの２つのサブユニットに関する構造遺伝子を含む。
４種のストレプトグラミン生産株の全ＤＮＡ、エス．ハイグロスコピカス（S.hygroscopicus）株そしてまたＳＰ９２株を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した。このようにして得られたＤＮＡ断片を０．７％アガロースゲルで分離し、そしてManiatisら（１９８９）により記載されるようにＤＮＡをナイロン膜に移した。３．６ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片および６−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片の標識化を、実施例９．２．１に記載したようにランダムプライミングによる標識化により行った。膜のハイブリダイゼーションをホルムアミドの存在下で４２℃でManiatisら（１９８９）に記載されたように行った。ハイブリダイゼーション後の膜の洗浄を５０および６０℃で、１０倍に希釈ＳＳＣしおよび０．１％ＳＤＳ（Maniatisら、１９８９）を含有する溶液中で行った。
以下の結果がこれらのハイブリダイゼーションで実証された：
エス．ハイグロスコピカス（S.hygroscopicus）株は使用した２つのプローブとのハイブリダイゼーションを示さなかった。
エス．オステオグリセウス（S.osteogriseus）、エス．オリバセウス（S.olivaceus）、エス．ロイデンシス（S.loidensis）およびエス．バージニエ（S.virginiae）の全ＤＮＡ（ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した）はすべてＳＰ９２株の全ＤＮＡについて観察されたものに匹敵するハイブリダイゼーションシグナルの強さを使用した両方のプローブについて表す。
エス．バージニエ（S.virginiae）の全ＤＮＡ（ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した）は使用した両方のプローブとシグナルを示すが、しかしその強さはＳＰ９２で観察されたものよりも弱い。
この実施例は前記実施例のように、ストレプトグラミンを生産する種々のストレプトミセス（Streptomyces）がエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）ＳＰ９２株中から単離された遺伝子であり、そしてプリスチナマイシンの生合成に関与する遺伝子とハイブリダイズすることを示す。これらのハイブリダイゼーションはしたがってＳＰ９２株のストレプトグラミンの生合成に関与する遺伝子と、ストレプトグラミンの生合成に関与する遺伝子または他のストレプトグラミン生産株との間に相同性が存在することを実証する。
したがってこの実施例はＳＰ９２から単離され、そしてストレプトグラミンの生合成に関与する遺伝子から出発して、ハイブリダイゼーションおよびクローニングにより、他のストレプトグラミン生産株に存在する相同的遺伝子を単離することができることを示す。
実施例１３：プリスチナマイシンＩおよびプリスチナマイシンIIの生合成に関与する種々のエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）ＳＰ９２遺伝子の物理的結合の調査
この実施例ではプリスチナマイシンＩおよびIIの生合成に関与する種々のエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）ＳＰ９２遺伝子の物理的結合がどのように調査できるかを説明する。この実施例ではすべてのこれらの遺伝子が染色体上にクラスター状態で一緒に群を成していることを示し、したがってすでに同定された遺伝子から染色体ウォーキングによりプリスチナマイシンＩおよびIIの生合成に関与する他の遺伝子をできることを示すことを目的として行われた。このような研究法はストレプトグラミンの生合成に関与する遺伝子に関しても考えられる。
１３．１  パスルフィールド電気泳動のために使用する制限酵素
エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）ＳＰ９２ゲノムはＧおよびＣに７０％−７５％かたよっているヌクレオチド配列から成る。このゲノムを少数の巨大な断片に切断するために、ＡＴが豊富な配列を認識するＡｓｅＩ（ＡＴ／ＴＡＡＴ）およびＳｓｐＩ（ＡＡＴ／ＡＴＴ）のような、しかしＨｉｎｄIII（Ａ／ＡＧＣＴＴ）、ＥｃｏＲＩ（Ｇ／ＡＡＴＴＣ、ＮｄｅＩ（ＣＡ／ＴＡＴＧ）およびＣｌａＩ（ＡＴ／ＣＧＡＴ）を使用した。
１３．２．パスルフィールド電気泳動に使用するプリスチナエスピラリス株
プリスチナマイシンＩおよびプリスチナマイシンIIの生合成に関与する遺伝子の物理的結合をパスルフィールド電気泳動により研究するために、数種の株の染色体ＤＮＡを使用した。実施例４．１に記載するように、エス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）ＳＰ９２株の染色体ＤＮＡ、および実施例９．１および９．４に構造が記載されるＳＰ９２株から派生した株の染色体ＤＮＡの試料挿入物を調製した。これらはｓｎａＡ遺伝子がプラスミドｐＶＲＣ５０５の統合により破壊されたＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０５株（実施例９．１）およびｓｎｂＡ遺伝子がプラスミドｐＶＲＣ４０４の統合により破壊されたＳＰ９２：ｐＶＲＣ４０４株（実施例９．４）である。後者の２つの株は、染色体ＤＮＡをめったに切断しないプラスミドｐＶＲＣ５０５およびｐＶＲＣ４０４中のＡｓｅＩ、ＳｓｐＩ、ＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩおよびＣｌａＩ部位の存在を利用することにより正確に染色体上にｓｎａＡおよびｓｎａＢ遺伝子を位置ずけることができるので、この調査に加えられた。
１３．３パスルフィールド電気泳動で単離された断片のハイブリダイゼーションに使用するＤＮＡプローブ
実施例９．１に記載したように、放射標識プローブを得るために、種々のＤＮＡ断片を使用し、これを上記３種の染色体ＤＮＡ試料挿入物を酵素的開裂し、そしてパスルフィールド電気泳動で分離した後の断片とハイブリダイズさせた。プローブは次のとおり：ｓｎａＢおよびｓａｍＳ遺伝子を持つプラスミドｐＶＲＣ７０１から単離した３．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（実施例９．２参照）、ｓｎａＤ遺伝子の一部を持つプラスミドｐＶＲＣ１０００から単離した１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片（実施例６．８参照）、ｓｎｂＡ遺伝子を持つプラスミドｐＶＲＣ４０２から単離した１．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII断片（実施例６．１参照）、ｐａｐＡ遺伝子を持つプラスミドｐＶＲＣ９００から単離した２．４ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片（実施例６．７参照）、およびｓｎａＣ遺伝子を持つプラスミドｐＶＲＣ５０９から単離した１．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片（実施例６．９参照）。
１３．４プリスチナマイシンＩおよびIIの生合成に関与する種々の遺伝子の染色体上の位置、およびそれらの物理的結合の調査
上述の６つの酵素を使用する単一消化、または二重消化で切断したエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）ＳＰ９２株、ＳＰ９２：：ｐＶＲＣ４０４およびＳＰ９２：：ｐＶＲＣ５０５の染色体ＤＮＡの、上記の様々なプローブとのハイブリダイゼーションにより第３２図に示す一般的マップが導かれる：プリスチナマイシンＰＩおよびＰIIの生合成に関与する遺伝子の翻訳位置および方向とともに主要部位の位置を指示した。したがって同定された遺伝子を含有する３つの染色体領域（すなわちｓｎｂＡ、ｓｎｂＲ、ｐａｐＡおよびｐａｐＭ遺伝子（コスミドｐＩＢＶ２、実施例５．２））、（ｓｎａＡ、ｓｎａＢ、ｓａｍＳ、ｓｎａＤ、ｓｎｂＣ、ｓｎｂＤおよびｓｎｂＥ遺伝子（コスミドｐＩＢＶ１および３、実施例５．１）、（そして最後にｓｎａＣ遺伝子（コスミドｐＩＢＶ４、実施例５．６））を分割する距離を計算できる。例えばｓｎａＡおよびｓｎｂＡ遺伝子間の距離は、約１６０−１７０ｋｂである。これはすでに同定された遺伝子はすべてエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespilalis）株の２００ｋｂのみに含まれることを示し、これは全ゲノム長の３％より少ないものに等しく、パルスフィールド電気泳動法で７５００ｋｂと推定できた。
これらの結果はプリスチナマイシンＩおよびIIの生合成に関与する遺伝子が染色体上にクラスター状態で一緒に群を成すことを示し、したがってすでに同定された遺伝子の染色体ウォーキングにより、プリスチナマイシンＩおよびプリスチナマイシンIIの生合成に関与する他の遺伝子を単離できることを示す。さらに一般的に、任意のストレプトグラミンの生合成に関与する遺伝子から染色体ウォーキングによりこの生合成に関与する他の遺伝子を同定することも可能である。
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使用した略号：
ＤＮＡ：    デオキシリボ核酸
ＡＭＰ：    アデノシン5′-1リン酸
ＡＴＰ：    アデノシン5′-3リン酸
ＥＴＢ：    エチジウムブロシド
bis-tris：  （ビス［2-ヒドロキシルエチル］イミノトリス［ヒドロキシルメチル］-メタン）
bis-tris プロパン：（1,3-ビス［トリス（ヒドロキシメチル）-メチルアミノ］プロパン）
ＢＳＡ：    ウシ血清アルブミン
ＨＰＬＣ    高性能液体クロマトグラフイー
ＯＤ：      光学密度
ＤＴＥ：    ジチオエリスリトール
ＤＴＴ：    ジチオスレイトール
Ｅ６４：    トランス-エポキシスクシンル-L-ロイシルアミノ-（4-グアニジノ）ブタン
ＥＤＴＡ：  エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＴＡ：  エチレングリコールビス（β-アミノエチル）四酢酸
ＦＭＮ：    フラビン  モノヌクレオチド
ＦＭＮＨ2：  還元型フラビンモノヌクレオチド
Ｈepes：    （Ｎ-［2-ヒドロキシエチル］ピペラジン-N′-［2-エタンスルホン酸］）
ＩＰＴＧ：  イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド
kＤa：      キロダルトン
kb：        キロベース
ＬＢ：      ルリア  ブロス（E. coli用の富栄養培地）
ＮＡＤ：    ニコチンアミド  ジヌクレオチド
ＮＡＤＨ：  還元型ニコチンアミド  ジヌクレオチド
ＰＡＧＥ：  ポリアクリルアミド  ゲル  電気泳動
bp：        塩基対
ＰＭＳＦ：  フエニルメチルスルホニル  フルオリド
ＰＰi：     ピロリン酸塩
rpm：       毎秒回転数
Ａ．Ｓ．：  硫酸アンモニウム
ＳＡＭ：    S-アデノシルメチオニン
ＳＤＳ：    ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＴＩ：    大豆トリプシン  インヒビター
ＴＥ：      10mM Tris-Hcl,１mM EDTAを含む緩衝液，pH7.5
Ｔris：     2-アミノ-2-ヒドロキシルメチル-1,3-プロパンジオール
ＵＶ：      紫外線
Ｘgal：     5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル  b-D-ガラクトシド
ＹＥＭＥ：  酵母抽出物-麦芽抽出物培地（ストレプトミセス（Streptomyces）の富栄養成長培地）
ＰＥＧ：    ポリエチレン  グリコール
ＬＭＰ：    低融点
ＭＷ：      分子量
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0004036467.tif 000036
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配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人
（Ａ）氏名：ローヌ−プーラン  ローラー  エス．エー．
（Ｂ）通り：レイモンド  アロン  アベニュー２０
（Ｃ）市：アントニー
（Ｅ）国：仏国
（Ｆ）郵便番号：９２１６５
（ii）発明の名称：ストレプトグラミンの生合成に関するポリペプチド、これらポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその使用
（iii）配列の数：１６
（iv）コンピューター読み取り先：
（Ａ）媒体：テープ
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ
（Ｃ）実行システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン  リリース＃１．０、バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）
（２）配列番号１に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：５３９２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：ストレプトミセス  プリスチナエスピラリス
（xi）配列の記載：配列番号１
0004036467.tif 000039
0004036467.tif 000040
0004036467.tif 000041
（２）配列番号２に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２６９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：ストレプトミセス  プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．１２６９
（xi）配列の記載：配列番号２
0004036467.tif 000042
0004036467.tif 000043
0004036467.tif 000044
（２）配列番号３に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：８３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：ストレプトミセス  プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．８３４
（xi）配列の記載：配列番号３
0004036467.tif 000045
0004036467.tif 000046
（２）配列番号４に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２０９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：ストレプトミセス  プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．１２０９
（xi）配列の記載：配列番号４
0004036467.tif 000047
0004036467.tif 000048
（２）配列番号５に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１８７９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：ストレプトミセス  プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１１０．．１８５８
（xi）配列の記載：配列番号５
0004036467.tif 000049
0004036467.tif 000050
0004036467.tif 000051
（２）配列番号６に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１８３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：ストレプトミセス  プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１０３．．１６８９
（xi）配列の記載：配列番号６：
0004036467.tif 000052
0004036467.tif 000053
0004036467.tif 000054
（２）配列番号７に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：６９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：エス．プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：２１２．．６９５
（Ｄ）他の情報：／生産物＝“ＳｎａＣ  遺伝子”
（xi）配列の記載：配列番号７：
0004036467.tif 000055
（２）配列番号８に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：６４０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：エス．プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．６４０
（Ｄ）他の情報：／生産物＝“ＳｎａＤ  遺伝子”
（xi）配列の記載：配列番号８：
0004036467.tif 000056
（２）配列番号９に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：６４５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：エス．プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：６１．．６４５
（Ｄ）他の情報：／生産物＝“ｐａｐＡ  遺伝子”
（xi）配列の記載：配列番号９：
0004036467.tif 000057
（２）配列番号１０に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１０５２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：エス．プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：８４．．９６２
（Ｄ）他の情報：／生産物＝“ｐａｐＭ  遺伝子”
（xi）配列の記載：配列番号１０：
0004036467.tif 000058
0004036467.tif 000059
（２）配列番号１１に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：２２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：エス．プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３．．２２７
（Ｄ）他の情報：／生産物＝“ＳｎｂＣ遺伝子の一部”
（xi）配列の記載：配列番号１１：
0004036467.tif 000060
（２）配列番号１２に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：２４７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：エス．プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．２４７
（Ｄ）他の情報：／生産物＝“ＳｎｂＣ遺伝子の一部”
（xi）配列の記載：配列番号１２：
0004036467.tif 000061
（２）配列番号１３に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１９２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：エス．プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３．．１９２
（Ｄ）他の情報：／生産物＝“ＳｎｂＤ遺伝子の一部”
（xi）配列の記載：配列番号１３：
0004036467.tif 000062
（２）配列番号１４に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：４７４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：エス．プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．４７４
（Ｄ）他の情報：／生産物＝“ＳｎｂＤ遺伝子の一部”
（xi）配列の記載：配列番号１４：
0004036467.tif 000063
（２）配列番号１５に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：４８５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：エス．プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３．．４８５
（Ｄ）他の情報：／生産物＝“ＳｎｂＥ遺伝子の一部”
（xi）配列の記載：配列番号１５
0004036467.tif 000064
（２）配列番号１６に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：２９１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：無し
（iii）アンチセンス：無し
（iv）起源
（Ａ）微生物：エス．プリスチナエスピラリス
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．２９１
（Ｄ）他の情報：／生産物＝“ＳｎｂＥ遺伝子の一部”
（xi）配列の記載：配列番号１６：
0004036467.tif 000065
【図１】
0004036467.tif 000092
【図２】
0004036467.tif 000093
【図３】
0004036467.tif 000094
【図４】
0004036467.tif 000095
【図５】
0004036467.tif 000096
【図６】
0004036467.tif 000097
【図７】
0004036467.tif 000098
【図８】
0004036467.tif 000099
【図９】
0004036467.tif 000100
【図１０】
0004036467.tif 000101
【図１１】
0004036467.tif 000102
【図１２】
0004036467.tif 000103
【図１３】
0004036467.tif 000104
【図１４】
0004036467.tif 000105
【図１５（Ａ）】
0004036467.tif 000106
【図１５（Ｂ）】
0004036467.tif 000107
【図１６】
0004036467.tif 000108
【図１７】
0004036467.tif 000109
【図１８】
0004036467.tif 000110
【図１９】
0004036467.tif 000111
【図２０】
0004036467.tif 000112
【図２１】
0004036467.tif 000113
0004036467.tif 000114
【図２３】
0004036467.tif 000115
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
0004036467.tif 000119
【図２８】
0004036467.tif 000120
【図２９】
0004036467.tif 000121
【図３０】
0004036467.tif 000122
【図３１】
0004036467.tif 000123
【図３２】
0004036467.tif 000124