(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ老化を抑制する活性を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１であり、かつ老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつ老化を抑制する活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）または（ｂ）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項３】
ＤＮＡが、配列番号６、７および８で表されるＤＮＡ配列から選ばれるＤＮＡ配列を有するＤＮＡ、または該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである、請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２または３記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１記載のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項６】
請求項５記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７】
ハイブリドーマが、ＫＭ１９０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９８３）、ＫＭ２０７０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１９６）、ＫＭ２０７６（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１９７）、ＫＭ２１０５（Ｆ４ＥＲＭ ＢＰ−６１９８）、ＫＭ２１１６（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１９９）、ＫＭ２１１９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２００）から選ばれる、請求項６記載のハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項５記載の抗体を用いる、請求項１記載のポリペプチドの免疫学的定量法。
【請求項９】
請求項４記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
【請求項１０】
形質転換体が、Escherichia coli ENKM101（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６５）、Escherichia coli ENKM112（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８４）、Escherichia coli ENKM103（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９４２）、Escherichia coli ENKH106（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６７）およびEscherichia coli XL1-Blue/pRYHH02（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１９３）から選ばれる形質転換体である、請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項４記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該組換え体ＤＮＡのコードする老化抑制ポリペプチドを該培養中に生成蓄積させ、該培養液より該ポリペプチドを採取することを特徴とする老化抑制ポリペプチドの製造法。
【請求項１２】
配列番号３で表されるポリペプチドをコードする遺伝子を導入することにより早期老化様症状を改善することを特徴とする家畜の改良法。
【請求項１３】
請求項１記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させる工程、請求項５記載の抗体を用いて該細胞により発現された請求項１記載のポリペプチドの量を定量する工程、被検試料を添加しない系と比較して該ポリペプチドの量を増加させることのできた化合物を同定する工程を含むことを特徴とする、請求項１記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増強させる化合物のスクリーニング法。
【請求項１４】
請求項１記載のポリペプチドの量を請求項５記載の抗体を用いて定量することを特徴とする、請求項１３記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
発現の増強を、請求項１記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ量を測定することにより検出することを特徴とする、請求項１３記載のスクリーニング法。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞と被検試料とを接触させる工程、該細胞における請求項１に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物を定量する工程、被検試料を添加しない系と比較して該転写産物の量を増加させることのできた化合物を同定する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増強させる化合物のスクリーニング法。
【請求項１７】
請求項１記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写を制御する領域の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含むプラスミドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させる工程、該形質転換体における請求項１に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物を定量する工程、被検試料を添加しない系と比較して該転写産物の量を増加させることのできた化合物を同定する工程を含むことを特徴とする、請求項１記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増強させる化合物のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、動物の老化を抑制する新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドを認識する抗体、本発明のポリペプチドに対するリガンド、本発明のポリペプチドとリガンドとの特異的な結合を阻害する化合物、本発明の老化抑制ポリペプチドをコードする老化抑制遺伝子の発現を増加させる化合物に関する。
背景技術
老化現象は、通常加齢に伴い進行する個体の機能的、外見的変化における、個体の劣化を意味し、老化に伴い種々の成人病の発症頻度が増加することが知られている。従って老化を何等かの形で制御できる薬剤は成人病の治療薬、予防薬、また、機能的、外見的劣化に対する保護薬、予防薬となることが期待される。これまで科学的に該効果の証明されている薬剤は全く知られていない。
個体の老化に関する遺伝子レベルの研究は世界的に見てもまだ開始されたばかりであり、個体の老化に関する分子遺伝学的情報はこれまで皆無であった。しかし、遺伝的早期老化症は数種類知られており、代表的なものにウェルナー症候群、ハッチンソン・ギルフォード症候群（プロゲリア）、ダウン症候群、ターナー症候群、ルイ・バール症候群、ロスモンド・トムソン症候群等々がある（藤本大三郎編：老化のメカニズムと制御、アイピーシー1993年）。
ウェルナー症候群に関しては原因遺伝子の同定がなされている〔Science,272,258（1996）〕。ウェルナー症候群の原因遺伝子はヘリカーゼと考えられており、ウェルナー症候群の患者の遺伝子には種々の変異が認められている。該患者においては、該遺伝子変異により正常なヘリカーゼ蛋白質が産生されず、その機能が発現されないことにより早期老化症状を示すものと考えられている。
以上のことから老化に関与する遺伝子が存在し、該遺伝子が変異を受けることにより、老化が促進されるとの考えが示された。他の遺伝的早期老化症にも原因遺伝子が存在するため、老化には複数の遺伝子が関与していると考えられている。
老化に関与する遺伝子の機能が失われて早老症状が発症するなら、該遺伝子機能を補う、即ち、該遺伝子のコードする蛋白質産物を投与する、あるいは遺伝子治療的に発現させるという治療法が有用と考えられる。更に、遺伝的早老症以外の老化においても、老化を制御することができれば、老化と密接に関連して現れる種々の成人病の治療、予防に用いることができると考えられる。
本発明の遺伝子はヒトウェルナー症候群原因遺伝子とは異なるものである。
発明の開示
老化に伴い発生頻度の増加する、成人病の治療、予防、診断、老化に伴う機能的、外見的劣化に対する保護、予防、診断、および、早期老化症の治療、診断等はこれまで対応策が知られていない。本発明は、これらの対応策に対し有用である。
本発明は、ヒトを含む動物の老化を抑制する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有する早期老化症治療薬、成人病治療薬もしくは老化抑制薬、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する早期老化症治療薬、成人病治療薬もしくは老化抑制薬、該ＤＮＡを用いる家畜の改良法、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体を含む形質転換体、該形質転換体を用いた本発明のポリペプチドの生産法、該ポリペプチドを認識する抗体、該抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法もしくは老化診断法、本発明のポリペプチドに対するリガンドの探索方法、該リガンド、本発明のポリペプチドとリガンドとの特異的な結合を阻害する化合物のスクリーニング方法、および、該スクリーニング方法により得られた化合物に関する。
本発明のポリペプチドは下記工程１〜７より製造できる。
（工程１）
公知のヒトエロンゲーションファクター−１アルファプロモーター（ＥＦ１アルファプロモーター）にＮａ+／Ｈ+逆輸送体を連結した外来遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（特開平５−２６８８５６）等のトランスジェニックマウスを用い、該マウスのホモ個体中より顕著な早期老化様症状を示すマウス個体を見出す。以下、トランスジェニックマウスに導入したマーカーとなる外来遺伝子を導入遺伝子と呼ぶ。導入遺伝子はマウス中に導入したことが検出できる遺伝子であればいずれも用いることができる。
早期老化様症状を示すマウスとしては、寿命の短縮、若年での動脈硬化、骨粗鬆症、腺組織の萎縮、神経細胞の減少等の症状を高発するマウスをあげることができ、具体的には、第１８回日本分子生物学会年会（鍋島ら、２Ｋ−０２、１９９５年）で報告された早期老化様症状を示すマウス個体をあげることができる。
該早期老化様症状を示すマウス個体は、以下に示す観察結果を示す特性を有する。
［観察例１］外見的観察：老化マウスのホモ体（８から９週齢）は、体長約４ｃｍで、同週齢の野生型マウス（約６ｃｍ）と比較してかなり小さい。また、胴の長さに対し、頭部の比率が大きい。老化マウス（８週齢、雄）では体躯が矮小であるものの、体毛のつや、四肢の爪等に異常は認められない。行動も正常である。
寿命については、
１）  生後３週間前後から成長が停止し、徐々に活動性が低下する。
２）  寿命の短縮：平均寿命はオスが８．０±０．９週（ｎ＝１３）、メスが９．３±０．９週（ｎ＝１３）であり、生後１５週までに全例が死亡するという早期老化症状を特徴とする。
以下８週令前後のホモのオス、メスそれぞれ５匹ずつ、およびそれらの同腹兄弟の野生型マウスのオス、メスそれぞれ４匹ずつを解剖して肉眼的観察の後、常法に従い（渡辺慶一、中根一穂編、酵素抗体法、学際企画、１９９２年  改訂３版）ホルマリン固定、パラフィン包埋、薄切し、ＨＥ染色を施して病理観察を行った。（以下観察例１２まで同一の手法で観察を行った。）
［観察例２］下垂体の病理観察：好酸性細胞の減少が認められた。下垂体の好酸性細胞は成長ホルモン（Growth Hormone：ＧＨ）またはプロラクチン（Prolactin：ＰＲＬ）を産生する細胞であるが、それらの数が減少している。高齢者ではＧＨ分泌の低下が知られている。
［観察例３］性腺の病理観察：性腺が著明に萎縮しており、不妊であることを見出した。オスでは、精巣が肉眼的に著明に萎縮している。精細管の径は野生型の約1/3程度にまで萎縮し、精子成熟がパキテン期精母細胞までしか進んでおらず、精子が全く認められない。メスでは、卵巣・子宮がやはり肉眼的にも著明に萎縮している。卵子成熟が一次卵胞までしか進んでおらず、二次卵胞や黄体は認められない。
［観察例４］顎下腺の病理観察：正常なオスでは線状部に大量の好酸性顆粒を有しているが、ホモ体では線状部の細胞は丈が低く、好酸性顆粒もほとんど認められない。
［観察例５］腎臓の病理観察：小動脈壁を始め尿細管上皮、ボウマン嚢壁などに石灰沈着が認められる。ボウマン嚢壁は扁平上皮である。
［観察例６］血管系の病理観察：まずホモ個体では動脈硬化が顕著であった。胸部大動脈の径が不整で高度の中膜石灰化が存在し、内膜肥厚も認められた。このような中膜石灰化と内膜肥厚を主体とする動脈硬化は腎動脈などの中血管や実質臓器内の小血管に至るまで認められた。特に腎実質内の血管中膜石灰化は顕著であったが、糸球体・尿細管はほぼ正常であった。沈着物が確かにＣａ2+であることはKossa染色で確認した。大動脈中膜石灰化は高齢者によく認められる所見である。
［観察例７］肺組織の病理観察：肺胞壁の破壊をともなう肺胞構造の破壊が顕著であった。肺胞壁に石灰沈着が認められる。
［観察例８］軟部組織・軟骨の観察：気管粘膜固有層、胃粘膜固有層・粘膜筋板、肺胞上皮に石灰沈着が認められた。胃底腺細胞および粘膜下結合組織、筋層に石灰沈着が認められた。胃粘膜の石灰化は長期飼育のラット・マウスで認められる所見と類似している。また、心臓の僧帽弁輪石灰化を認める個体もあった。僧帽弁輪石灰化は高齢者に特徴的な所見である。また、関節軟骨、気管軟骨、肋軟骨にも石灰沈着が認められた。これら硝子軟骨の石灰化は高齢者によく認められる所見である。
［観察例９］骨組織病理観察およびＸ腺観察：大腿骨遠位端の骨幹端の骨密度の上昇、骨端軟骨の肥厚が認められる。関節軟骨では軟骨細胞への不正な石灰沈着像が認められる。大腿骨、脛骨のX線所見ではX線透過度が亢進しており、骨塩密度の低下がうかがわれる。実際骨塩密度を測定すると骨幹部・脛骨遠位端・大腿骨近位端では野生型に比べ最高約半分にまで低下している。組織学的にも皮質骨が著しく低下している。ただし、脛骨近位端と大腿骨遠位端の骨幹端では例外的に一次海綿骨が増生しており、この部分でのみ骨塩密度が逆に上昇している。
［観察例１０］小脳の病理観察：小脳神経細胞層のプルキンエ細胞数の減少および孤在性壊死・軸索の膨化が認められた。小脳においては老化に伴いプルキンエ細胞が減少し、それに伴い軸索突起は膨化することが知られている。
［観察例１１］肝臓の病理観察：好酸性に染色されるグリコーゲン顆粒がほとんど認められない。肝細胞の細胞質は正常と比較するとやや小さい。
［観察例１２］胸腺の病理観察：胸腺が著明に萎縮しており、肉眼的には確認できない個体もあった。
（工程２）
早期老化様症状を示すマウス個体より導入遺伝子により破壊、不活化された染色体部分を単離、解析し、その染色体領域に存在するＤＮＡをクローン化する。
（工程３）
該ＤＮＡの正常マウス各組織における発現状態を確認し、早期老化症状を示すマウス個体ではほとんど発現の認められないような、早期老化症状の原因遺伝子（以下、老化抑制遺伝子と呼ぶ）を決定する。
（工程４）
更に、該マウス老化抑制遺伝子に高いホモロジーを有する遺伝子をヒト等のｃＤＮＡライブラリーよりクローン化し、ヒト等における老化抑制遺伝子を決定する。
（工程５）
マウス、ヒト等の老化抑制遺伝子を遺伝子組換え技術における常法により大腸菌、昆虫細胞、哺乳類細胞等で発現させ、該遺伝子のコードするポリペプチドを生産・蓄積させる。
（工程６）
該蓄積させたポリペプチドを常法により精製し、該ポリペプチドを免疫原として用い、該ポリペプチドに対する抗体をラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ウマ、ウシ、サル等を用いて取得する。
（工程７）
該抗体が大腸菌、昆虫細胞、哺乳類細胞等を用い生産・蓄積させた該ポリペプチドを認識することを確認する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであり、例えば、配列番号１、２、３、４および５で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列番号１、２、３、４および５で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列のうち一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつ老化を抑制する活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、または該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをあげることができる。
該ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A laboratory manual）、第２版〔サンブルック（Sambrook）、フリッチ（Fritsch）、マニアチス（Maniatis）編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年刊（以下、モレキュラー・クローニング 第２版と略す）〕等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１、２、３、４および５で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドとして、上記ＤＮＡの有する塩基配列の一部の塩基配列と同じ塩基配列または相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、例えば、配列番号６〜１０から選ばれるＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜60残基、好ましくは10〜50残基の塩基配列と同じ塩基配列または相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレイチドの誘導体をあげることができる。
本発明のポリペプチドとして、上述のＤＮＡによりコードされるポリペプチドをあげることができ、具体的には、配列番号１、２、３、４および５で表せられるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは配列番号１、２、３、４および５で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列のうち一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつ老化を抑制する活性を有するペプチド等をあげることができる。
ポリペプチドのアミノ酸配列のうち一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつ老化を抑制する活性を有するペプチドは、Nucleic Acids Research,10,6487（1982）、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409（1982）、Proc.Natl.Acad.Scl.,USA,81,5662（1984）、Science,224,1431（1984）、PCT WO85／00817（1985）、Nature,316,601（1985）、Gene,34,315（1985）、Nucleic Acids Research,13,4431（1985）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）,８章Mutagenesis of Cloned ＤＮＡ,John Wiley & Sons,Inc.（1989）等に記載の方法に準じて調製することができる。
本発明の抗体は、上述のポリペプチドを認識する抗体をあげることができる。
本発明のリガンドは、本発明のポリペプチドと特異的に結合する分子のことを意味し、本発明のポリペプチドと特異的に結合する分子であればいずれも本発明のリガンドとして用いることができる。
以下に、本発明の老化を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの製造法を示す。
１）遺伝子導入部位に隣接するマウス染色体ＤＮＡのクローニング
（i）導入遺伝子の検出
トランスジェニックマウスにおいては導入遺伝子は多コピー組み込まれるが、通常それらは染色体ＤＮＡ上の一カ所にタンデム（tandem）につながって挿入される。
上述の早期老化様症状を示すマウスにおいても導入遺伝子の挿入部位が一箇所であることを確認するために、導入遺伝子を切断しない制限酵素（ＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩなど）で野生型、ヘテロ体、ホモ体それぞれの肝臓から調製した染色体ＤＮＡを消化し、導入遺伝子全長をプローブとしてサザンブロティングを行う。
サザンブロティングを行い、ヘテロ体、ホモ体で単一のシグナルが検出されることを確認することにより、導入遺伝子がマウス染色体上一箇所にのみ挿入されていることがわかる。
また、導入遺伝子をプローブとした蛍光in situハイブリダイゼーション法（Fluorescence in situ hybridization：ＦＩＳＨ）により確認することもできる。
（ii）遺伝子導入部位に隣接するマウス染色体ＤＮＡのクローニングは以下のようにして行うことができる。
トランスジェニックマウスへの導入遺伝子にｐＵＣ等のプラスミド・ベクターが含まれている場合には、プラスミド・レスキュー法を用いることができる。
即ち、ホモ体の染色体ＤＮＡを該プラスミドベクターを切断しない任意の制限酵素で消化した上で自己環状化させた後に大腸菌に形質転換すると、プラスミド・ベクター由来の薬剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子等）をもつプラスミドを含んで自己環状化したものが入った大腸菌だけが選択培地でコロニーを形成する。該大腸菌より得られるプラスミドは導入遺伝子そのもの、および該遺伝子に隣接するマウス染色体ＤＮＡの断片を含む可能性がある。
レスキューされてきたプラスミドに含まれているマウス染色体ＤＮＡ部分の断片をプローブとして、上述のサザンブロティングで用いたときの膜と同様の膜を用いてサザンブロティングを行い、導入遺伝子に隣接する部分がマウス染色体ＤＮＡの断片由来のものであることを確認する。即ち、野生型のマウスでは野生型対立遺伝子（wild allele；以下、wild alleleを＋で表記することもある）のみ、ホモ体では変異型対立遺伝子（mutant allele；以下、mutant alleleをpgで表記することもある）のみ、ヘテロ体では両方の対立遺伝子（allele）由来のシグナルが認められることを確認する。
レスキュー法以外に、通常の染色体ＤＮＡクローン化法も用いることができる。即ち、染色体ＤＮＡを制限酵素で消化し、該切断断片を通常のプラスミドベクターまたはファージベクターを用いてクローニングし、ライブラリーを作成する。導入遺伝子断片をプローブとして用い、上述のレスキュー法で用いた方法と同様の方法により、該ライブラリーをスクリーニングすることにより、遺伝子導入部位に隣接するマウス染色体ＤＮＡのクローニングを行うことができる。
２）マウス由来の老化抑制遺伝子のクローニング
染色体ＤＮＡクローン化法あるいはレスキュー法で取得したプラスミドに含まれているマウス染色体ＤＮＡ部分の断片をプローブとして用い、野生型のマウス・ゲノミック・ライブラリー（Stratagene,mouse genomic library,λFIXII）を添付のマニュアルに従ってスクリーニングし、プローブとハイブリダイズするファージ・クローンを取得する。
老化抑制遺伝子を同定するため、染色体ＤＮＡクローン化法あるいはレスキュー法で取得したプラスミドに含まれているマウス染色体ＤＮＡ部分を中心として、常法に従って塩基配列を順次決定する。
塩基配列において、CpG islandには遺伝子の第１エクソンや第２エクソンが存在する場合が多いことが知られているので（Bruce Albertsら、Molecular Biology of the Cell中村桂子、松原謙一監訳、教育社、昭和６０年４月２５日）、塩基配列決定時にCpG island領域を特定し、染色体ＤＮＡクローン化法あるいはレスキュー法で取得したプラスミドに含まれているマウス染色体ＤＮＡ部分を、CpG island領域を含むように、適切な制限酵素、例えばＳａｃII等で切断する。
CpG island領域が認められない場合には、エクソントラッピング法〔例えばエクソントラッピングシステム（GIBCO BRL）〕により、あるいは塩基配列をもとにエクソン部分を予測するコンピューターソフト（例えばＨＥＸＯＮ：インターネット上Human Genome Center,Baylor College of Medicin、Houston、TXの遺伝子構造解析のサイトであるhttp://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/gene-finder/gf.htmlで利用可能）でエクソン部分を予測し、制限酵素によりエクソンを含むと考えられるＤＮＡ断片を単離することが可能である。
該ＤＮＡ断片が老化抑制遺伝子に関与することを以下の方法により確認することができる。
該ＤＮＡ断片を、例えばメガプライムＤＮＡラベリングキット（Amersham社製）等を使用してα-［32P]-dCTPで標識する。
該標識ＤＮＡをプローブとして、マウス心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓のpoly（A）+RNAフィルター〔Mouse Multiple Tissue Northern Blotsのフィルター（Clontech）〕を用いて、Hybond N+のマニュアルの条件に従いノーザン・ハイブリダイゼーション（Northern hybridization）を行う。
該ノーザン・ハイブリダイゼーションにより、バンドの得られた組織を特定する。
野生型、ホモ個体およびヘテロ個体のマウスより、上記で特定された組織を取り出し、該組織よりQuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia）等を用いてpoly（A）+ＲＮＡを調製する。
各マウス組織より得られた該ＲＮＡを電気泳動した後、Hybond N+フィルターへ常法によりトランスファーし、上記標識ＤＮＡ断片をプローブとして上記と同様にノーザン・ハイブリダイゼーションを行う。
該ノーザン・ハイブリダイゼーションにより得られたバンドより、野生型およびヘテロ個体と比較し、ホモ個体において発現の異なることを確認する。発現の異なる例として、バンドが検出されず全く発現していないもの等をあげることができる。該確認により、該制限酵素切断ＤＮＡ断片が老化抑制遺伝子に関与することを確認できる。
次に、上記で特定された組織を野生型マウスより取り出し、該組織より常法によりcＤＮＡライブラリーを作成する。例えば、野生型マウスの腎臓poly（A）+RNAよりcＤＮＡ Synthesis System（GIBCO BRL）を用いてcＤＮＡを合成し、その両端にEcoRI-NotI-SalI adaptor（SuperScript Choice System for cＤＮＡ Synthesis;GIBCO BRL社製）を付加した後、クローニングベクターλZAP II〔λZAP II Cloning Kit（STRATAGENE社製）〕のＥｃｏＲＩ部位に挿入することによりcＤＮＡライブラリーを作製することができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作成するための、クローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミッドベクター等いずれでも使用でき、具体的には、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies,5,58（1992）〕、pBluescript II SK（+）〔Nucleic Acids Research,17,9494（1989）〕、λZAP II（ストラタジーン社製）、λgt10、λgt11〔DNA Cloning,A Practical Approach,1,49（1985）〕、λTriplEx（クローンテック社製）、λExCell（ファルマシア社製）、pT7T318U（ファルマシア社製）、pcD2〔H.Okayama and P.Berg;Mol.Cell.Biol.,3,280（1983）〕等をあげることができる。
宿主微生物としては、大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。好適には、Escherichia coli XL1-Blue等をあげることができる。
具体的には、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli XL1-Blue MRF’〔ストラタジーン社製、Strategies,5,81（1992）〕、Escherichia coli C600〔R.K.Appleyard;Genetics,39,440（1954）〕、Escherichia coli Y1088〔R.A.Young and R.W.Davis;Science,222,778（1983）〕、Escherichia coli Y1090〔R.A.Young and R.W.Davis;Science,222,778（1983）〕、Escherichia coli NM522〔J.A.Gough and N.E.Murray;J.Mol.Biol.,166,1（1983）〕、Escherichia coli K802〔W.B.Wood;J.Mol.Biol.,16,118（1966）〕、Escherichia coli JM105〔L.J.Reha-Krantz;Gene,38, 275（1985）〕、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000等が用いられる。
cＤＮＡライブラリーの作成例としては、例えば、野生型マウスの腎臓poly（A）+RNAよりcＤＮＡ合成システム（cＤＮＡ Synthesis System;GIBCO BRL社製）を用いてcＤＮＡを合成し、その両端にEcoRI-NotI-SalI adaptor（SuperScript Choice System for cＤＮＡ Synthesis;GIBCO BRL社製）を付加した後、クローニングベクターλZAP II（λZAP II Cloning Kit;STRATAGENE社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入して作成されたcＤＮＡライブラリーをあげることができる。
上記標識ＤＮＡ断片をプローブとして用い、常法により、コロニーあるいはプラーク・ハイブリダイゼーションを行い、該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。
該スクリーニングにより取得されたクローン（形質転換体）より、老化抑制遺伝子を常法により単離し、遺伝子配列を常法、例えば、サンガー（Sanger）らのジデオキシ法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74,5463（1977）〕等により決定する。塩基配列の分析は、塩基配列自動分析装置、例えば、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（Sequencer）等を用いて行うことができる。
このようにして決定された老化抑制遺伝子配列として、例えば、配列番号８に示された配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。該ＤＮＡを有するプラスミドｐＮＫＭ１０１を含有する大腸菌ＥＮＫＭ１０１は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６５として、平成８年１２月５日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）に寄託されている。
また決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で化学合成することによって上記で取得されたＤＮＡを調製することもできる。
ＤＮＡ合成機としては、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等をあげることができる。以下においても、配列決定された本発明のＤＮＡを同様の手法によりＤＮＡ合成機で合成することができる。
また、配列番号６〜１０記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡの有する塩基配列中の連続した１０〜５０塩基と同じ配列を有するＤＮＡをセンスプライマー、該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをアンチセンスプライマーとして用い、該ＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とする本発明のＤＮＡを調製することができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとしては、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記オリゴヌクレオチドが好ましい。
上記で取得された老化抑制遺伝子のコードするポリペプチドとして、例えば、配列番号３に示された配列を有するポリペプチドをあげることができる。
３）マウス由来分泌型老化抑制遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
上記２）または下記４）において取得される老化抑制遺伝子を用いて、マウス由来の分泌型老化抑制遺伝子を取得することができる。具体的には以下の方法により取得することができる。
ヒト腎臓ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡより得られた配列番号２に示されるアミノ酸配列の、配列番号１と異なる５３５番目から５４９番目のアミノ酸配列を参考に、本配列と相同性を示すアミノ酸配列をコードする合成ＤＮＡをプライマーとして用い、５’ＲＡＣＥ法によりマウス腎臓由来ｃＤＮＡライブラリーよりスクリーニングを行う。得られたｃＤＮＡ断片は、上述の場合と同様に遺伝子を単離し、塩基配列を決定する。
該塩基配列が配列番号２と相同性の高いものを目的とするマウス由来分泌型老化抑制遺伝子としてあげることができる。例えば配列番号９に示された配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。また、遺伝子のコードするポリペプチドとしては、例えば配列番号４に示された配列を有するポリペプチドをあげることができる。
該ＤＮＡを含むプラスミドｐＮＫＭ１１２を含有する大腸菌ＥＮＫＭ１１２は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１８４として平成９年１１月２８日付けで、工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）に寄託されている。
４）ヒト由来の老化抑制遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
（i）上記で取得されるマウス由来の老化抑制遺伝子を用い、以下に示す方法により、他の動物由来、例えばヒト由来の老化抑制遺伝子を取得することができる。
上記で取得されるマウス由来の老化抑制遺伝子を含むＤＮＡ断片を、例えばメガプライムＤＮＡラベリングキット（Amersham社製）等を使用してα-［32P］-dCTPで標識する。
目的とする動物の組織、例えば、ヒト腎臓あるいはヒト海馬組織等より、上述マウスの場合と同様の方法によりｃＤＮＡライブラリーを作成する。
上記標識ＤＮＡ断片をプローブとして用い、コロニーあるいはプラーク・ハイブリダイゼーションを行い、該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。
該スクリーニングにより取得されたクローン（形質転換体）より、上述マウスの場合と同様に、遺伝子を単離し、塩基配列を決定する。
該塩基配列がマウス老化抑制遺伝子の塩基配列と相同性の高いものを、目的とする動物の老化抑制遺伝子としてあげることができる。
該遺伝子配列として、例えば、ヒト腎臓に由来する配列番号６あるいは７に示された配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。該ＤＮＡを有するプラスミドｐＮＫＭ１０３を含有する大腸菌ＥＮＫＭ１０３およびプラスミドｐＮＫＨ１０６を含有する大腸菌ＥＮＫＨ１０６は、それぞれ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９４２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７６７として、平成９年５月１５日付けおよび平成８年１２月５日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）に寄託されている。
（ii）上記のようにして得られる動物由来の老化抑制遺伝子を用い、以下に示す方法により、該動物の他の組織由来あるいは他の動物由来の老化抑制遺伝子ｃＤＮＡを取得することができる。
上記で取得される老化抑制遺伝子を含むＤＮＡ断片を、例えばメガプライムＤＮＡラベリングキット（Amersham社製）等を使用してα-［３２P］-dCTPで標識し、プローブとする。または適当なプライマーセットを用いて目的とする動物の組織、例えば、ヒト膵臓等由来のＲＮＡやｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてPCR反応を行い、増幅されるＤＮＡ断片を上記のようにアイソトープ標識するか、例えばDIG DNA labeling kit（ベーリンガー・マンハイム社製）などを用いてジゴキシゲニン（DIG）等で標識し、プローブとする。プライマーセットとして具体的に好適には、例えば配列番号１９および配列番号２０で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡ等をあげることができる。
上記標識ＤＮＡ断片をプローブとして用い、目的とする動物の組織、例えば、ヒト膵臓等のｃＤＮＡライブラリーに対してコロニーあるいはプラーク・ハイブリダイゼーションを行い、該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。
該スクリーニングにより取得されたクローン（形質転換体）より、上述マウス、ヒトの場合と同様に、遺伝子を単離し、塩基配列を決定する。
該塩基配列がマウスまたはヒト老化抑制遺伝子の塩基配列と相同性の高いものを、目的とする動物の老化抑制遺伝子と相同な遺伝子としてあげることができる。
該遺伝子配列として、例えば、ヒト膵臓に由来する配列番号１０に示された配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。該ＤＮＡを有するプラスミドｐＲＹＨＨ０２を含有する大腸菌XL1-Blue/pRYHH02は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１９３として、平成９年１２月４日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）に寄託されている。
５）老化抑制ポリペプチドの生産
上記のようにして得られる老化抑制遺伝子を宿主細胞中で発現させるためには、まず、老化抑制遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいはＤＮＡ分解酵素類で、老化抑制ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中プロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。例えば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する原核生物、クルイベロミセス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株や動物細胞宿主等をあげることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、老化抑制遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、老化抑制遺伝子発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、老化抑制遺伝子、転写終結配列、より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（Pharmacia社製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agricultural Biological Chemistry,48,669（1984）〕、pLSA1〔Agric.Biol.Chem.,53,277（1989）〕、pGEL1〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306（1985）〕、pBluescript II SK（-）（Stratagene社製）、pGEX（Pharmacia社製）、pET-3（Novagen社製）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp x ２）、tacプロモーター、letIプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好ましい。
本発明の老化抑制遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium ammmoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110（1972）〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、またはGene,17,107（1982）やMolecular & General Genetics,168,111（1979）に記載の方法等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods.Enzymol.,194,182（1990〕、スフェロプラスト法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929（1978）〕、酢酸リチウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、153,163（1983）〕、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929（1978）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979;Cytotechnology,3,133,（1990）〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＣＤＭ８〔Nature,329,840,（1987）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３〔J.Biochem.,101,1307（1987）〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法〔Cytotechnology,3,133（1990）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84,7413（1987）〕、virology,52,456（1973）に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ・ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーサプルメント1-３８（1987-1997）、Bio/Technology,6,47（1988）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃIII（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（W.H.Freeman and Company）、ニューヨーク（New York）、（1992）〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413（1987）〕等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング  第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
老化抑制遺伝子を組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に老化抑制ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より老化抑制ポリペプチドを採取することにより、老化抑制ポリペプチドを製造することができる。
本発明の老化抑制ポリペプチド製造用形質転換体を培地する培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の老化抑制ポリペプチド製造用形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519（1967）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Science,122,501（1952）〕、ＤＭＥＭ培地〔Virology,8,396（1959）〕、１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73,1（1950）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔Pharmingen社製〕、Sf-900 II SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもJRH Biosciences社製〕、Grace’s Insect Medium〔Grace,T.C.C.,Nature,195,788（1962）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
老化抑制ポリペプチド製造用形質転換体の培養物から、本発明の老化抑制ポリペプチドを単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドあるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、上記方法により発現させたポリペプチドを、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易（米国Advanced chemTech社製）、パーキンエルマージャバン（米国Perkin-Elmer社製）、ファルマシアバイオテク（スウューデンPharmacia Biotech社製）、アロカ（米国Protein Technology Instrument社製）、クラボウ（米国Synthecell-Vega社製）、日本パーセプティブ・リミテッド（米国PerSeptive社製）、島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
６）老化抑制ポリペプチドを認識する抗体の生産
（i）ポリクローナル抗体の作製
上述４）または５）で取得した老化抑制ポリペプチド全長または部分断片精製標品（抗原）を、５０〜１００μｇ／匹程、ウサギ、ヤギまたは３〜２０週令のラット、マウスもしくはハムスターの皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund’s Adjuvant）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに投与する。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ELISA法）：医学書院刊1976年、Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lavoratory（1988）〕などで確認する。
免疫に用いた抗原に対し、該血清が充分な抗体価を示したウサギ、ヤギ、マウス、ラットまたはハムスターより血清を取得し、該血清より、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析法、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲルろ過カラム等を用いたクロマト法等の常法を用いて精製抗体を取得する。
（ii）モノクローナル抗体の作製
（a）抗体産性細胞の調製
免疫に用いた老化抑制部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（b）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。たとえば、8-アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）〔Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.,81,1（1978）〕、〔Europ.J.Immunol.,6,511（1976）〕、SP2/0-Ag14（SP-2）〔Nature,276,269（1978）〕、P3-X63-Ag8653（653）〔J.Immunol.,123,1548（1979）〕、P3-X63-Ag8（X63）〔Nature,256,495（1975）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０-5Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０7個以上用いる。
（c）ハイブリドーマの作製
（a）で取得した抗体産生細胞と（b）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム １．８３ｇ、リン酸一カリウム ０．２１ｇ、食塩 ７．６５ｇ、蒸留水 １リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０8抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０-4Ｍ）、チミジン（１．５×１０-5Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０-7Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Antibodies,ALaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratory,Chapter 14（1988）〕等に述べられている酵素免疫測定法により、老化抑制部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた老化抑制部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（d）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、老化抑制ポリペプチドに特異的に反応するものを抗老化抑制ポリペプチドモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
当該ハイブリドーマ株の具体例として、ハイブリドーマＫＭ１９０２株をあげることができる。ハイブリドーマＫＭ１９０２株は、平成９年６月１７日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９８３として寄託されている。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗老化抑制ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（d）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（c）で取得した抗老化抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０6細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清を、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析法、カプリル酸沈殿法〔Antibodies,A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,（1988）〕、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはセルロファインGSL2000（生化学工業社製）を用いたカラムクロマト法等を用いて、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体として使用する。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体ダイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
７）モノクローナル抗体を用いた免疫細胞染色
付着細胞を用いて免疫細胞染色を行う場合には、予め下記の処理をすることにより、培養フラスコより剥がした細胞を用いることが好ましい。
即ち、培養付着細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、０．０５％ トリプシン、０．０２％ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）を含むＰＢＳ緩衝液３ｍｌを加え、余分な溶液を除いた後、３７℃、５分間インキュベートすることによりフラスコより細胞を剥がす（以下、この操作をトリプシン−ＥＤＴＡ処理と呼ぶ）。
浮遊細胞については培養細胞をそのまま用いることができる。
免疫細胞染色を行う細胞を免疫細胞染色用緩衝液（１％ ＢＳＡ、０．０２％ ＥＤＴＡ、０．０５％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）等に懸濁し、１〜２０×１０5個ずつ丸底９６穴プレートに分注する。
該プレートに、（ｃ）で取得した抗老化抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清、（ｄ）で取得した精製モノクローナル抗体、もしくは該モノクローナル抗体を公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊1985年）でビオチン標識した抗体を０．１〜５０μｇ／ｍｌの濃度になるように免疫細胞染色用緩衝液あるいは１０％動物血清を含む免疫細胞染色用緩衝液を用いて希釈したものを２０〜５００μｌ／穴となるように分注し、氷冷下で３０分間放置する。
上記において、（ｃ）で取得した抗老化抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清または（ｄ）で取得した精製モノクローナル抗体を用いた場合には、上記プレートに免疫細胞染色用緩衝液を添加し、細胞を洗浄後、ＦＩＴＣあるいはフィコエリスリン等の蛍光色素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体あるいは抗ラットイムノグロブリン抗体を０．１〜５０μｇ／ｍｌ程度の濃度で含む免疫細胞染色用緩衝液を５０〜５００μｌ／穴ほど分注し、氷冷下で３０分間遮光して放置する。
ビオチン標識した該モノクローナル抗体を用いた場合には、上記プレートにストレプトアビジンを５０〜５００μｌ／穴ほど分注し、氷冷下で３０分間遮光して放置する。
両ケースとも、放置後、プレートに免疫細胞染色用緩衝液を添加し、細胞を良く洗浄し、セルソーターにより解析する。
８）老化抑制ポリペプチドの免疫沈降
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞あるいは昆虫細胞をシャーレ等の培養容器中で培養する。
該培養容器にＰＢＳを添加し、細胞を洗浄する。
該培養容器に氷冷した１％ Triton X100、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌからなる緩衝液（以後、緩衝液１と呼ぶ）等の細胞膜を可溶化する緩衝液を１００〜５００μｌ添加し、氷上で３０分間静置した後、５分間隔でゆっくり振動させ、可溶化処理する。
なお、培養上清より試料を調製する際には、上清を限外濾過膜や凍結乾燥等の方法にて濃縮後、その試料を用いて以下同様の方法で免疫沈降反応を行う。
上記可溶化処理液を１．５ｍｌ用遠心チューブに回収し、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。
得られた上清に、上記で用いた緩衝液で平衡化させたプロテインＧ−セファロースもしくはプロテインＡ−セファロースを１０〜５０μｌ添加し、４℃で１時間以上振盪した後、５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を回収する。
該上清に、（ｃ）で取得した抗老化抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清または（ｄ）で取得した精製モノクローナル抗体を０．０１〜５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、４℃で１時間以上振盪する。
該振盪液にプロテインＧーセファロースもしくはプロテインＡーセファロースを１０〜５０μｌ添加し、４℃で１時間以上振盪後、５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。
得られた沈殿画分に２００μｌの上記の細胞膜を可溶化する緩衝液を添加し、沈殿を懸濁させる。同様の操作を３度以上繰り返し、沈殿画分を洗浄する。
該沈殿にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファーを添加し、ヒートブロックを用いて加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、得られたゲル中のポリペプチドをＰＶＤＦ膜等へ転写し、本発明の抗老化抑制部分断片ペプチドポリクローナル抗体等を用いたウエスタンブロッティング法等により老化抑制ポリペプチドを検出する。
なお、検出された老化抑制ポリペプチドをＰＶＤＦ膜より切り出すことにより、該タンパク質を精製することができる。精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法に準じて行うことができる。
９）マウス由来の老化抑制遺伝子を用いた、早期老化様症状を示すマウスから該症状の改善されたマウスの取得（老化抑制遺伝子の導入により早期老化症状が改善され、治療に有効であることの証明）
上記で取得した老化抑制遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスを作成するために、マウスに導入・発現させるための老化抑制遺伝子を含むＤＮＡ（以下、導入老化抑制ＤＮＡと呼ぶ）を構築する。該導入老化抑制ＤＮＡを野生型マウスの受精卵の雄性前核に注入し、偽妊娠を誘発させておいた雌マウスに移植する。
生まれてきた老化抑制遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウス（＋/＋）を早期老化様症状を示すマウスから得られたヘテロ個体（pg/＋）と交配し、老化抑制遺伝子を発現し、pg/＋を示すマウスを取得する。
該マウス同士、あるいは該マウスとpg/＋を示すマウスとを交配し、老化抑制遺伝子を発現し、pg/pgを示すマウスを取得する。
該マウスが早期老化様症状を示さなくなっていることを確認することにより、上記で取得した老化抑制遺伝子が治療に有効であることを確認する。
例えば、以下に示す方法により、早期老化様症状を示すマウスから該症状の改善されたマウスを取得することができる。
（i）導入老化抑制ＤＮＡの構築
導入老化抑制ＤＮＡはプロモーター、老化抑制遺伝子およびSV40 early splicing region & poly adenylation signalのカセット（以下、SV40カセットと略す）より構成されていることが好ましい。
プロモーターとしてはマウス中で発現させることのできるものであればいずれも用いることができるが、強いプロモーターを用いることが好ましく、例えば、human elongation factor １α〔ｐＥＦ３２１ＣＡＴ（Kim DW et al.Gene,91,217,1990）のＨｉｎｄIII処理断片（5’UTRの1st exonと2nd exonの一部を含む２．５ｋｂのプロモーター部分〕等をあげることができる。
老化抑制遺伝子としては、上記２）で取得した遺伝子であればいずれも用いることができ、具体的には配列番号３記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをあげることができる。
ＳＶ４０カセットはClontechから市販の発現ベクターｐＭＡＭｎｅｏの塩基番号1551-2427を利用することができる。
常法により、プロモーター、老化抑制遺伝子、ＳＶ４０カセットの順になるように連結し、適当な制限酵素、例えばＮｏｔＩ等で切断し、約５００コピー／ｍｌの濃度となるようにＰＢＳ緩衝液に溶解し導入用老化抑制ＤＮＡとして使用する。
（ii）トランスジェニックマウスの作成
トランスジェニックマウスは通常のマイクロインジェクション（microinjection）法で作成することができる（発生工学実験マニュアル−トランスジェニックマウスの作り方  野村達次監修  勝木元也編  講談社サイエンティフィック、1987）。
具体的には、C57BL/6とC3HのF1（BCF1）のメス（8-16週令）に７単位のセロトロピン（帝国臓器社製）を腹腔内投与する。その４８時間後に７単位のゴナドトロピン（帝国臓器社製）を腹腔内投与し、C3Hのオスと交配する。
翌日、交尾したメスの卵管膨大部より受精卵を採取する。正立顕微鏡下でマイクロマニピュレータ（成茂社製）を用いて、ＤＮＡ液を該受精卵の雄性前核に注入する。
前日に精管結紮オス（ICR）と交配し、偽妊娠を誘発しておいたメス（ICR、8-16週令）の卵管に、該受精卵を移植する。
移植後２０日目に誕生した子マウスの尾を４〜５週令になった時点で切断し、染色体ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを用いて以下のようにして遺伝子型を解析する。
（iii）遺伝子型の解析
上記で得られたマウスの尾にリシス緩衝液〔lysis buffer；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、Proteinase Ｋ（SIGMA社製）０．１５ｍｇ／ｍｌ、Pronase Ｅ（SIGMA社製）１ｍｇ／ｍｌを含む緩衝液〕２ｍｌを加え、５０℃で一晩放置する。
該緩衝液を等量のフェノールで抽出し、その上清１ｍｌをＰＣＲの鋳型として用いる。
ＰＣＲのプライマーとしては以下の５種類のプライマーを作製し、混合して用いる。
２）で取得した老化抑制遺伝子由来の塩基配列であり、ゲノミックＤＮＡではその配列の中にイントロンが挿入されている領域に相当する所より、２種類のプライマーを（プライマー１、２）、変異型対立遺伝子および野生型対立遺伝子に共通に存在する領域（プライマー３）、変異型対立遺伝子のみに存在する領域（プライマー４）、野生型対立遺伝子のみに存在する領域（プライマー５）より各々１種類ずつのプライマーを作製する。
プライマー１、２としては、例えば、配列番号２５または２６で示された配列を有するＤＮＡをあげることができる。
プライマー３としては、例えば、配列番号２７で示された配列を有するＤＮＡをあげることができる。
プライマー４としては、例えば、配列番号２８で示された配列を有するＤＮＡをあげることができる。
プライマー５としては、例えば、配列番号２９で示された配列を有するＤＮＡをあげることができる。
マウスに２）で取得した老化抑制遺伝子が存在すれば、プライマー１および２により、ＰＣＲで増幅される断片が生成され、ホモ個体（pg/pg）ではプライマー３および４により増幅される断片が、野生型（＋/＋）ではプライマー３および５により増幅される断片が、ヘテロ個体（pg/＋）プライマー３および４、プライマー３および５により増幅される２断片が生成されることにより、マウスの遺伝子型を解析することができる。
ＰＣＲは常法により行うことができる。具体的には、５０μｌの系〔１ｘ ＬＡ ＰＣＲ緩衝液II（Mg plus）、ｄＮＴＰ混合液 各成分各々４００ｍＭ、プライマー各々０．２ｍＭ、TaKaRa LATaq ２．５Ｕ〕で、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480およびＬＡ ＰＣＲキット（宝酒造社製）を用い、９４℃で１．５分間加熱後、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１．５分間の工程を１サイクルとして３０サイクル行い、更に７２℃で１０分間加熱する。
（iV）トランスジェニックマウスとpg/＋を示すマウスとの交配
（ii）で取得したトランスジェニックマウスとpg/＋を示すマウスとを交配することにより得られた子マウスの遺伝子型を（iii）記載の方法により解析し、老化抑制遺伝子を発現し、pg/pgを示すマウスが早期老化様症状を示さなくなっていることを確認する。
１０）マウス由来の老化抑制遺伝子を含む組換えアデノウイルスを用いた、早期老化症状を示すマウスから該症状の改善されたマウスの取得
上記で取得した老化抑制遺伝子をマウスに導入、発現させるために、老化抑制遺伝子を含む組換えアデノウイルスを構築し、該組換えウイルスを早期老化症状を示すマウスに投与し、該マウスが早期老化症状を示さなくなっていることを確認することにより、上記で取得した老化抑制遺伝子が治療に有効であることを確認する。
例えば、以下に示す方法により、早期老化症状を示すマウスから該症状の改善されたマウスを取得することができる。
（i）老化抑制遺伝子を含む組換えコスミドの構築
導入老化抑制遺伝子ＤＮＡはプロモーター、老化抑制遺伝子、およびスプライシング領域、およびポリＡ付加シグナルを含み、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢおよびＥ３を欠失した５型アデノウイルスゲノムＤＮＡを含むことが好ましい。
老化抑制遺伝子を除く各構成要素が含まれたコスミドとしてpAxCAwt〔Nucl.Acids.Res.,23,3816（1995）〕等があげられる。
老化抑制遺伝子としては上記２）で取得した遺伝子であればいずれも用いることができ、具体的には配列番号３記載のアミノ酸をコードするＤＮＡをあげることができる。
常法により、コスミドを適当な制限酵素、たとえばＳｗａＩ等で切断し、老化抑制遺伝子を接続することにより組換えコスミドを作製する。
（ii）老化抑制遺伝子を含む組換えアデノウイルスの作製
組換えウイルスの作製は既に報告のある三宅らの方法〔Proc.Natl Acad.Sci.USA,93,1320（1996）〕で作製することが出来る。
具体的には（i）で作製した老化抑制遺伝子を含む組換えコスミドと例えばＥｃｏＴ２２Ｉにより切断されたＥ３、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂを欠損した５型アデノウイルスAd5dIXＤＮＡ〔J.Virology,54,711（1985）〕とを混合し、例えばリン酸カルシウム法（特開平2-227075）を用いてＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子を含む細胞株、例えばヒト胎児腎由来２９３細胞に導入する。細胞内でコスミドとアデノウイルスＤＮＡの組換えが生じれば、組換えアデノウイルスが生成し、細胞の死滅がおこるため、該細胞の死滅を指標に老化抑制遺伝子を含む組換えアデノウイルスの生成を確認する。死滅した細胞を回収し、例えば凍結融解を繰り返し行ったり、細胞破砕機を使用することにより細胞を破壊することにより老化抑制遺伝子を含む組換えアデノウイルス溶液を得る。
さらに、得られた組換えウイルスは、そのＤＮＡを常法により抽出し、制限酵素、例えばＸｈｏＩで切断することによりその構造の確認ができる。
（iii）組換えアデノウイルスの精製
得られた組換えウイルスは例えば鐘ヶ江らの方法〔Jpn.J.Med.Sci.Biol.,47,157（1994）〕に従い２回の塩化セシウム密度勾配により精製し、１０％グリセロールを含むＰＢＳ、１０％グリセロールを含むＨＥＰＥＳ−ＭｇＣｌ2、１０％グリセロールを含むＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡ等の溶液で懸濁後、−８０℃に保存し、適宜使用することができる。
（iv）老化抑制遺伝子を含む組換えアデノウイルスの早期老化様症状を示すマウスへの投与
このようにして得られた組換えウイルスを１０8から１０10プラークフォーミングユニット（ＰＦＵ）、を早期老化様症状を示すマウス好ましくは３〜４週齢程度のものの尾静脈に投与し、投与後の経過において、早期老化様症状が解消されたかを確認する。
１１）本発明の老化抑制ポリペプチドと特異的に結合するリガンドの検索および同定
本発明の老化抑制ポリペプチドと被験試料を接触することによりリガンドを探索、同定することができる。
被験試料として、例えば、哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物などを用いることができる。
例えば、尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物などを適当な希釈、濃縮、分画等を行って、本発明の老化抑制ポリペプチドに接触させ、細胞刺激活性などを指標にさらに分画することにより、最終的に単一のリガンドを単離することができる。
具体的には本来本老化抑制遺伝子を発現していない細胞と、該細胞に本老化抑制遺伝子を導入発現させた細胞の両細胞に被験試料を接触させ、例えば、細胞内カルシウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等の細胞内情報伝達分子濃度の変化、細胞内蛋白質のリン酸化、初期転写因子遺伝子の発現変化、細胞膜電位の変化、細胞内ｐＨの変化、細胞外情報伝達分子の遊離、細胞の形態変化等、種々の細胞刺激活性を両細胞において測定し、両細胞における差異を詳細に比較、解析することにより、リガンドを探索し、同定することができる。
合成化合物、天然に存在するまたは人工的に合成された蛋白質、糖質、脂質およびそれらの修飾体、誘導体を、放射能等により標識し、該標識化合物の、本老化抑制ポリペプチド発現細胞、該細胞膜画分、もしくはマイクロタイタープレート等へ固層化した本発明の老化抑制ポリペプチドへの、結合量を測定することにより、本発明のリガンドであるかの同定が可能である。
また、本発明の老化抑制ポリペプチドまたはその部分改変体や部分ペプチドをBIAcore（Pharmacia Biotech社製）のセンサーチップに共有結合させ被験試料を接触させるという公知の方法〔Nature,368,558（1994）〕により、リガンドを探索し、同定することができる。
更に、標識した本老化抑制遺伝子ポリペプチドまたは非標識の該ポリペプチドと該ポリペプチドに対する標識抗体を用いて、該ポリペプチドと特異的に会合するリガンドを以下の方法で探索し、同定することが可能である。
即ち、尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物などを適当な分画を行った後、ポリアクリルアミド電気泳動、アガロース電気泳動、二次元電気泳動、などの電気泳動や、ＨＰＬＣ等のカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の手法によりさらに分画し、本老化抑制遺伝子を発現している個体と発現していない個体、または本老化抑制遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞等の間における差異を詳細に比較、解析することにより、本老化抑制遺伝子の発現と特異的に相関して認められる（または消失する）バンドやスポット、ピークを特定する。
該バンド、スポット、ピークより、ブロッティングの手法を用いて、ゲルまたは薄層プレートからニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜等の支持体に写し取った後、標識した本老化抑制遺伝子ポリペプチドまたは非標識の該ポリペプチドと該ポリペプチドに対する標識抗体を用いて、該ポリペプチドと特異的に結合するバンド、スポットを探索し、該バンド、スポットよりリガンドを抽出し、同定することができる。
１２）本発明の老化抑制ポリペプチドと本発明のリガンドとの特異的結合を阻害する化合物の探索および同定
本発明の老化抑制ポリペプチドと本発明のリガンドを接触させた場合と本老化抑制ポリペプチド、本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行うことにより、被験試料から、本老化抑制ポリペプチドとリガンドとの特異的結合を阻害する化合物（例えば蛋白質、ペプチド、糖質、脂質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、生体成分など）をスクリーニングすることができる。該スクリーニングにより得られる化合物には、リガンドの老化抑制ポリペプチドへの特異的結合を阻害し、老化抑制ポリペプチドの有する活性を阻害する活性を有する化合物（アンタゴニスト）、および、特異的結合を阻害するが、リガンドと同様の機能を有するまたは代替する活性を有する化合物（アゴニスト）が含まれる。
被験試料として、合成化合物、天然に存在するまたは人工的に合成された蛋白質、糖質、脂質およびそれらの修飾体、誘導体などの他に、例えば、哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物、さらに発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等をあげることができる。
該化合物のスクリーニング方法として、例えば、以下の方法をあげることができる。
本老化抑制遺伝子を導入発現させた細胞もしくは本来本老化抑制遺伝子を発現している細胞に本発明のリガンド単独、または本発明のリガンドと被験試料を接触させ、例えば、細胞内カルシウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等の細胞内情報伝達分子濃度の変化、細胞内蛋白質のリン酸化、初期転写因子遺伝子の発現変化、細胞膜電位の変化、細胞内ｐＨの変化、細胞外情報伝達分子の遊離、細胞の形態変化等、種々の細胞刺激活性をリガンド単独の場合と、リガンドと被験試料を接触させた場合とで比較することにより、本発明の老化抑制遺伝子ポリペプチドと本発明のリガンドの特異的結合を阻害する化合物を探索し、同定する方法をあげることができる。
また本発明のリガンドを放射能等によって標識し、該標識リガンドの本発明の老化抑制ポリペプチド発現細胞、該細胞膜画分またはマイクロタイタープレート等へ固層化した本発明の老化抑制ポリペプチドへの結合量を該標識を利用して測定し、リガンド単独の場合と、リガンドと被験試料を接触させた場合とで比較することにより、本老化抑制遺伝子ポリペプチドとリガンドとの結合を阻害する化合物を探索し、同定することができる。
１３）本発明の老化抑制ポリペプチドと本発明のリガンドが結合した結果誘導される化合物の探索および同定
本発明のポリペプチドを発現させた細胞と該ポリペプチドを発現しない細胞のそれぞれに本発明のリガンドを接触させた場合と接触させない場合で、その培養上清、細胞、細胞質画分、細胞膜画分等についてポリアクリルアミド電気泳動、アガロース電気泳動、二次元電気泳動、などの電気泳動や、ＨＰＬＣ等のカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等を行い、各成分を分画し、各成分について比較を行うことにより、リガンドを接触させた場合に特異的、また該ポリペプチド発現に相関して特異的に現れる、または消失するバンド、スポット、ピーク等を同定し、該バンド、スポット、ピークより目的とする分子を取得することができる。
また、本発明のポリペプチドを発現している個体では該ポリペプチドとリガンドとの特異的結合が恒常的に生じていると考えられ、発現していない個体（具体的に好適な例としては本特許記載の早期老化マウス）ではこの相互作用が生じないと考えられる。従って正常のマウスと本特許記載の早期老化マウスの種々の臓器、組織、体液、血液、尿等を適当な分画を行った後、ポリアクリルアミド電気泳動、アガロース電気泳動、二次元電気泳動、などの電気泳動や、ＨＰＬＣ等のカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の手法により分画し、比較を行うことにより、両者で異なる挙動を示すバンド、スポット、ピーク等を探索し、該バンド、スポット、ピークより分子を回収し、該バンド、スポット、ピークより目的とする化合物を同定することができる。
１４）本発明の老化抑制ポリペプチドの発現を増強させる化合物（以下、発現増強化合物と略す）の探索および同定
（i）本発明の老化抑制ポリペプチドを認識する抗体を用いた探索および同定
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現する細胞を被験試料と接触させた後、本発明の老化抑制ポリペプチドを認識する抗体を用いることにより、その細胞中、細胞培養上清中に存在する発現増強化合物を探索、同定することができる。本発明の老化抑制ポリペプチドを発現する細胞として、例えば、マウス腎臓由来尿細管細胞をあげることができ、濃度勾配法、浸透圧耐性分離法、尿細管分離法等の公知の方法〔腎と透析,臨時増刊号,588（1991）〕を用いて調製したものを用いることができる。
被験試料として、合成化合物、天然に存在するまたは人工的に合成されたタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、糖質、脂質およびそれらの修飾体、誘導体などの他に、例えば、哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物、さらに発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等をあげることができるが、それらに限定されない。
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現する細胞を、例えば該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現した老化抑制ポリペプチド含量を、上記６）記載のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用い、上記７）記載の方法に準じて定量する。
被験試料を添加しない系と比較し、老化抑制ポリペプチド含量を増加させることのできた被験試料を探索することにより、発現増強化合物を同定することができる。
（ii）本発明の老化抑制遺伝子の転写産物の定量系を利用した探索および同定
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現する細胞を被験試料と接触させた後、本発明の老化抑制遺伝子の転写産物を定量することにより発現増強化合物を探索、同定することができる。
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現する細胞および被験試料として、上記（i）記載のものを用いることができる。
本発明の老化抑制ポリペプチドを発現する細胞を、例えば該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現した老化抑制遺伝子の転写産物の量を、通常のノーザンブロットハイブリダイゼーション法、ＲＮＡのドットブロットハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法などを用い定量することができる。
ハイブリダイゼーション法等に用いることのできるプローブおよびＲＴ−ＰＣＲ法等に用いることのできるプライマーとして、本発明の老化抑制遺伝子断片をあげることができ、具体的には配列番号６、７、８、９および１０記載のＤＮＡ配列から選ばれる配列を有するＤＮＡ断片を好適に用いることができる。
被験試料を添加しない系と比較し、本発明の老化抑制遺伝子の転写産物含量を増加させることのできた被験試料を探索することにより、発現増強化合物を同定することができる。
（iii）レポーター遺伝子を利用した探索および同定
本発明の老化抑制ポリペプチドをコードする遺伝子の転写を制御する領域（以下、転写制御領域と略す）の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含むプラスミドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させた後、レポーター遺伝子によりコードされたポリペプチドの発現量を定量することにより発現増強化合物を探索、同定することができる。
転写制御領域としては、後述の実施例２に記載されているホモ体において欠失の認められている、老化抑制遺伝子の上流約６ｋｂのところに存在する約８ｋｂの領域をあげることができる。また、該領域を適当な制限酵素を用い、適切な長さに切断した断片を転写制御領域として用いることができる。
レポーター遺伝子としては、該遺伝子の翻訳産物が細胞内で安定であり、該翻訳産物の存在量が容易に定量できるものであればいかなるものでも用いることができ、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β-ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、グリーンフルオレッセントプロテイン（ＧＦＰ）等をあげることができる。
被験試料として、上記（i）記載のものを用いることができる。
転写制御領域の下流に常法によりレポーター遺伝子を連結し、作製したプラスミドを用い、常法により宿主細胞を形質転換する。
該形質転換体を、例えば該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現したレポーター遺伝子の転写産物の量を、該転写産物に適した方法で検出、定量する。
検出、定量法として、ＣＡＴの場合には、例えば、モレキュラー・クローニング 第２版，１６章，６０頁に記載の方法を、β−ｇａｌの場合には、例えば、モレキュラー・クローニング 第２版，１６章，６６頁に記載の方法を、ｌｕｃの場合には、例えば、実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ４遺伝子導入と発現・解析法,81（1994）に記載の方法を、ＧＦＰの場合には、例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,4653（1997）記載の方法等をあげることができる。
被験試料を添加しない系と比較し、本発明の老化抑制遺伝子の転写産物含量を増加させることのできた被験試料を探索することにより、発現増強化合物を同定することができる。
１５）本発明のオリゴヌクレオチドの調製
本発明のＤＮＡおよび該ＤＮＡ断片を用いて、常法あるいはＤＮＡ合成機により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した１０〜５０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができ、具体的には、配列番号６〜１０記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡの有する塩基配列中の連続した１０〜５０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができる。
上記オリゴヌクレオチドを本発明のオリゴヌクレオチドとしてあげることができるが、更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとしてあげることができる。該誘導体ＤＮＡとしては、ＤＮＡ中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine）で置換された誘導体ＤＮＡ、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体ＤＮＡ、あるいはＤＮＡ中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体ＤＮＡ等をあげることができる〔細胞工学,16,1463（1997）〕。
１６）老化抑制ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドを認識する抗体、本発明のオリゴヌクレオチド、本発明のリガンドおよび発現増強化合物の利用
（i）本発明の抗老化抑制ポリペプチド抗体を用いることにより、血液、臓器の一部、細胞等のサンプルでの老化抑制ポリペプチドの検出、定量を行うことができる。具体的に好適な手法としてはマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法などがあげられ、また病理組織切片を用いた免疫組織染色にも利用できる。従って該抗体は老化抑制ポリペプチド発現の低下に伴う早期老化症や種々の成人病の発生の可能性の診断に有用である。同様に該ペプチドを対象とした研究における研究用試薬としても有用である。
（ii）本発明の老化抑制ポリペプチドの全長または部分断片を生体に投与することにより老化の抑制が可能である。従って老化の進行に密接に関連して生ずる種々の成人病、例えば動脈硬化、高血圧、骨粗鬆症等の治療薬、予防薬として有用である。また老化の抑制にもとずく寿命の延長の効果にも有用である。
（iii）本発明の老化抑制遺伝子をレトロウィルス、アデノウィルス等のウィルスベクターやその他のベクターに組み込み、遺伝子治療の方法により治療に用いることができる。
（iV）本発明の老化抑制遺伝子あるいはオリゴヌクレオチドを用いて、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、該遺伝子の発現量を測定し、老化、成人病を診断するとともに、該老化抑制遺伝子あるいはオリゴヌクレオチドを老化抑制、成人病発症抑制に利用することができる。また、該老化抑制遺伝子の先天的な欠損により、老化が促進され、成人病を生じやすくなった個体を、該老化抑制遺伝子あるいはオリゴヌクレオチドを用いサザンブロットハイブリダイゼーションやＰＣＲ法により検出し、該検出された個体の核酸配列情報を基に遺伝子診断を行うことができる。更に該老化抑制遺伝子あるいはオリゴヌクレオチドは遺伝子研究用試薬としても極めて有用である。
（V）更に、本発明により提供される、目的とする家畜動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ等、由来の老化抑制遺伝子産物を相応する動物に投与するか、または該遺伝子を遺伝子治療的に適当なウィルス等のベクターを用いて個体で発現させることにより、目的とする家畜の寿命を延長し、また老化を抑制することが可能である。これにより長期に渡り状態の良い飼育と、乳や卵や産子の長期に渡る採取が可能となる。もしくは受精卵に該遺伝子を導入し、体中全ての細胞の染色体に該遺伝子を挿入し、発現させる、いわゆるトランスジェニック動物を作製することにより、同様の効果が期待でき、畜産分野でも育種の面から有用性が高いと考えられる。
また該遺伝子を含むベクターを用い胚性幹細胞（embryonic stem cell）において染色体上の老化抑制遺伝子を公知の相同組換えの手法〔例えば、Nature,326,6110,295（1987）、Cell,51,3,503（1987）等〕により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成することができる〔例えば、Nature,350,6315,243（1991）〕。このようにして作成した胚性幹細胞クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞（blastcyst）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作成することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の老化抑制遺伝子に任意の変異を有する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、ホモ個体を得ることができる。
このようにして動物個体において、老化抑制遺伝子の任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば老化抑制遺伝子の翻訳領域中への塩基置換、欠失、挿入等の変異を導入することにより、その産物の活性を変化させることができる。またその発現制御領域への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織特異性等を改変させることも可能である。さらにCre-loxP系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。このような例としては脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例〔Cell,87,7,1317（1996）〕やCreを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例〔Science,278,5335,（1997）〕が知られている。従って本発明の老化抑制遺伝子についてもこのように任意の時期や組織で発現を制御できる、または任意の挿入、欠失、置換をその翻訳領域や、発現制御領域に有する動物個体を作成することが可能である。このような動物は任意の時期、任意の程度または任意の部位で、老化と老化に伴って生ずる成人病等の種々の疾患の症状を誘導することができる。従って老化や成人病等の種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその治療薬、予防薬、また機能性食品、健康食品等の評価用モデルとして非常に有用である。
（Vi）本発明の本老化抑制ポリペプチドは、該ポリペプチドに特異的に結合するリガンドを探索し、決定するための試薬として有用である。
（Vii）本発明の老化抑制ポリペプチドと本発明のリガンドとを用いて、該ポリペプチドとリガンドの特異的結合を阻害する化合物の探索および同定に用いることができる。
（Viii）本発明の老化抑制ポリペプチドと本発明のリガンドを利用し、該ポリペプチドとリガンドが結合した結果誘導される分子を探索、同定することができる。
（iX）本発明のリガンド、本発明の老化抑制ポリペプチドと本発明のリガンドとの特異的結合を阻害する化合物、本発明のポリペプチドとリガンドが結合した結果誘導される分子は、本老化抑制遺伝子ポリペプチドの老化抑制機能を代替もしくは補助すると考えられ、これら分子を含む薬剤は早期老化症治療薬、成人病治療薬、老化抑制薬として有用である。
（X）早期老化症治療薬、成人病治療薬、老化抑制薬として有用である本発明の老化抑制ポリペプチドをコードする老化抑制遺伝子の発現を増加させる化合物（発現増強化合物）は、老化抑制ポリペプチド同様、老化の抑制、成人病の治療、予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
図面中で用いた符号の説明は以下の通りである。
bp：塩基対（base pairs）
kb：キロ塩基対（kilobase pairs）
IFN-γ：インターフェロンγ遺伝子
Amp、ApまたはApr：pBR322由来アンピシリン耐性遺伝子
rop+：ｒｏｐ遺伝子
PletI：ｌｅｔＩプロモーター
Ptrp：ｔｒｐプロモーター
PSE：シミアン・ウィルス（simian virus）40（SV40）初期遺伝子プロモーター
PMO：モロニーマウス白血病ウィルスのロングターミナルリピート（long terminal repeat：LTR）プロモーター
Hyg：ハイグロマイシン耐性遺伝子
G418r：G418耐性遺伝子
dhfr：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
P1：pBR322由来P1プロモーター
Ptk：ヘルペス・シンプレックス・ウイルス（Herpes simlpex virus；HSV）チミジンキナーゼ（tk）遺伝子のプロモーター
Sp.βG：ラビットβグロビン遺伝子スプライシングシグナル
A.βG：ラビットβグロビン遺伝子ポリＡ付加シグナル
A.SE：シミアン・ウィルス（simian virus）40（SV40）初期遺伝子ポリＡ付加シグナル
Atk：ヘルペス・シンプレックス・ウイルス（Herpes simplex virus；HSV）チミジンキナーゼ（tk）遺伝子のポリＡ付加シグナル
以下、図面を簡単に説明する。
第１図は、導入遺伝子全長をプローブとした染色体サザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示した電気泳動の図である。レーン１はホモ個体、レーン２はヘテロ個体、レーン３は野生型マウス由来のものである。
第２図は、導入遺伝子と実際にレスキューされてきたプラスミドの制限酵素地図を示した図である。
第３図は、レスキューされたプラスミドに含まれる染色体断片をプローブとした染色体サザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示した電気泳動の図である。レーン１はホモ個体、レーン２はヘテロ個体、レーン３は野生型マウス由来のものである。
第４図は、導入遺伝子が挿入されていた近傍の染色体ＤＮＡを有するファージクローンの制限酵素地図を示した図である。
第５図は、ＳａｃＩＩ  ４５０ｂｐをプローブとしたマウス各臓器poly（A）+RNAに対するノーザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示した電気泳動の図である。
第６図は、野生型、ヘテロ個体、ホモ個体（早期老化様症状を示すマウス）、および出生時（０Ｗ）から７週（７Ｗ）までの各時期の野生型マウスのそれぞれの腎臓より調製したpoly（A）+RNAおよびプローブとしてＳａｃＩＩ  ４５０ｂｐを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示した電気泳動の図である。
第７図は、ヒト全長（上）、ヒト分泌型（中）、マウス全長（下）の老化抑制ポリペプチドのｃＤＮＡおよび該ｃＤＮＡコードされている蛋白質の簡単な模式図である。
第８図は、プラスミドｐＮＫＭ１０１の制限酵素地図を示した図である。長い矢印はマウス由来の老化抑制遺伝子および転写の方向を表す。
第９図は、プラスミドｐＮＫＭ１１２の制限酵素地図を示した図である。長い矢印はマウス由来の分泌型老化抑制遺伝子および転写の方向を表す。
第１０図は、マウス各臓器ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲによるマウス分泌型老化抑制遺伝子の発現の検討結果を示した電気泳動の図である。
第１１図は、プラスミドｐＮＫＭ１０３の制限酵素地図を示した図である。長い矢印はヒト由来の老化抑制遺伝子および転写の方向を表す。
第１２図は、プラスミドｐＮＫＨ１０６の制限酵素地図を示した図である。長い矢印はヒト由来分泌型の老化抑制遺伝子および転写の方向を表す。
第１３図は、プラスミドｐＳｕｐｅｘの構築過程を示した図である。
第１４図は、プラスミドｐＹＴ１０２の構築過程を示した図である。
第１５図は、ｐＹＴ１０２を保有する大腸菌により生産された、老化抑制ポリペプチド断片を確認したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の図である。レーン１はＩＡＡ無添加時の、レーン２はＩＡＡ添加時のｐＹＴ１０２を保有する大腸菌NY49による老化抑制ポリペプチド断片の生産を示している。
第１６図は、老化抑制ポリペプチド断片に対するポリクローナル抗体を用いた、ウェスタンブロット法による大腸菌での老化抑制ポリペプチド断片の発現を確認した、電気泳動の図である。
第１７図は、ｐＡＧＥ２１０の構築過程を示した図である。
第１８図は、ｐＹＴ１０３の構築過程を示した図である。
第１９図は、老化抑制ポリペプチド断片に対するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法による動物細胞での老化抑制ポリペプチド全長の発現を確認した、電気泳動の図である。レーン１はCHO dhfr-細胞（宿主のみのコントロール）、レーン２はCHO dhfr-/pYT103 MTX増幅細胞を用いた時の結果を示す。
第２０図は、ｐＡＳ１０４の構築過程を示した図である。
第２１図は、昆虫細胞での老化抑制ポリペプチド全長の発現を確認した、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の図である。レーン１は分子量マーカーであり、レーン２はＳｆ９細胞、レーン３は老化抑制ポリペプチド発現ウィルス感染Ｓｆ９細胞を用いたときの結果を示す。
第２２図は、老化抑制ポリペプチド断片に対するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法による昆虫細胞での老化抑制ポリペプチド全長の発現を確認した電気泳動の図である。レーン１はＳｆ９細胞、レーン２は老化抑制ポリペプチド発現ウィルス感染Ｓｆ９細胞を用いたときの結果を示す。
第２３図は、プラスミドｐＹＳ１１０の構築過程を示した図である。
第２４図は、老化抑制ポリペプチド断片に対するモノクローナル抗体ＫＭ１９０２を用いたウエスタンブロット法によるＣＨＯ細胞（CHOdhfr-）での老化抑制ポリペプチド全長の発現を確認した電気泳動の図である。レーン１はＣＨＯ細胞、レーン２はヒト由来老化抑制ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞（CHOdhfr-/pYS110）、レーン３はマウス由来老化抑制ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞（CHOdhfr-/pYT103）によるウエスタン反応の結果を示す。
第２５図は、プラスミドｐＹＳ１１１の構築過程を示した図である。
第２６図は、老化抑制ポリペプチド断片に対するモノクローナル抗体ＫＭ１９０２を用いたウエスタンブロット法によるＣＨＯ細胞（CHOdhfr-）でのヒト由来分泌型老化抑制ポリペプチド全長の発現を確認した電気泳動の図である。レーン１はＣＨＯ細胞、レーン２はヒト由来分泌型老化抑制ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞（CHOdhfr-/pYS111）によるウエスタン反応の結果を示す。
第２７図は、プラスミドｐＹＳ１５０の構築過程を示した図である。
第２８図は、老化抑制ポリペプチド断片に対するモノクローナル抗体ＫＭ１９０２を用いたウエスタンブロット法による昆虫細胞でのヒト由来分泌型老化抑制ポリペプチド全長の発現を確認した電気泳動の図である。ヒト由来分泌型老化抑制ポリペプチド発現ウイルス感染Ｓｆ２１細胞を用いたときの結果を示す。
第２９図は、プラスミドｐＹＳ１１２の構築過程を示した図である。
第３０図は、老化抑制ポリペプチド断片に対するモノクローナル抗体ＫＭ１９０２を用いた免疫沈降法によるＣＨＯ細胞（CHOdhfr-）でのマウス由来分泌型老化抑制ポリペプチド全長の発現を確認した電気泳動の図である。レーン１はＣＨＯ細胞、レーン２はマウス由来分泌型老化抑制ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞（CHOdhfr-/pYS112）によるウエスタン反応の結果を示す。
第３１図は、プラスミドｐＹＳ１５１の構築過程を示した図である。
第３２図は、老化抑制ポリペプチド断片に対するモノクローナル抗体ＫＭ１９０２を用いた免疫沈降法による昆虫細胞でのマウス由来分泌型老化抑制ポリペプチド全長の発現を確認した電気泳動の図である。レーン１はＳｆ２１細胞、レーン２はマウス由来分泌型老化抑制ポリペプチド発現ウイルス感染Ｓｆ２１細胞を用いたときの結果を示す。
第３３図は、フローサイトメーターによるモノクローナル抗体ＫＭ１９０２の反応性の解析を表した図である。（Ａ）にＣＨＯ細胞（CHOdhfr-）にモノクローナル抗体ＫＭ１９０２を添加した時と添加しない時での比較結果を、（Ｂ）に老化抑制ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞（CHOdhfr-/pYT103）にモノクローナル抗体ＫＭ１９０２を添加した時と添加しない時での比較結果を示す。
第３４図は、老化抑制ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞（CHOdhfr-/pYT103）を用いたモノクローナル抗体ＫＭ１９０２による免疫沈降結果を表したウエスタンブロッティングの図である。レーン１に老化抑制ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞（CHOdhfr-/pYT103）を用いたモノクローナル抗体ＫＭ１９０２による免疫沈降結果を、レーン２に老化抑制ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞（CHOdhfr-/pYT103）を用い、モノクローナル抗体ＫＭ１９０２を添加することなく免疫沈降を行った結果を示す。
第３５図は、プラスミドｐＥＦＳＡの構築過程を示した図である。
第３６図は、プラスミドｐＲＥＳの構築過程を示した図である。
第３７図は、マウス老化抑制遺伝子を含む組換えアデノウイルスを投与した際の結果を示す。Ａは野生型、無投与、Ｂは野生型、ウイルス投与、Ｃはホモ個体（早期老化様症状を示すマウス）、ウイルス投与、Ｄはホモ個体（早期老化様症状を示すマウス）、無投与。
第３８図は、プラスミドｐＹＳ２０１の構築過程を示した図である。
第３９図は、ｐＹＳ２０１を保有する大腸菌により生産されたヒト由来老化抑制ポリペプチドＮ末端領域（ペプチドＳＵＨＮ）のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の図である。
第４０図は、プラスミドｐＹＳ２０２の構築過程を示した図である。
第４１図は、ｐＹＳ２０２を保有する大腸菌により生産されたヒト由来老化抑制ポリペプチドＣ末端領域（ペプチドＳＵＨＣ）のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の図である。
第４２図は、ＫＭ２０７６を用いたマウス組織およびマウス膜型完全長発現ＣＨＯ細胞抽出液のウェスタンブロットハイブリダイゼーションの結果を示した電気泳動の図である。マウス腎、肝の膜画分と細胞質画分、およびマウス膜型完全長発現ＣＨＯ細胞の抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分離した。
ＫＭ２０７６でウェスタンブロットを行い、化学発光試薬によるＸ線フィルムへの感光により検出した。
第４３図は、ＫＭ２１１９、ＫＭ２１１６を用いたマウス組織およびマウス膜型完全長発現ＣＨＯ細胞の抽出液のウェスタンブロットハイブリダイゼーションの結果を示した電気泳動の図である。マウス腎、肝の膜画分と細胞質画分、およびマウス膜型完全長発現ＣＨＯ細胞の抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分離した。ＫＭ２１１９またはＫＭ２１１６でウェスタンブロットを行い、化学発光試薬によるＸ線フイルムへの感光により検出した。
第４４図は、マウス膜型完全長発現ＣＨＯ細胞より細胞抽出液を調整し、ＫＭ２０７６、ＫＭ２１１９およびProtein G-Sepharose 4FFを用いて免疫沈降した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、ウェスタンブロットを行った、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションの結果を示した電気泳動の図である。
第４５図は、ヒト分泌型発現ＣＨＯ細胞の培養上清をＫＭ２０７６およびProtein G-Sepharose 4FFを用いて免疫沈降した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、ＫＭ２０７６を用いたウェスタンブロットを行ったときの、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションの結果を示した電気泳動の図である。レーン１はヒト分泌型発現ＣＨＯ細胞の培養上清をＫＭ２０７６およびProtein G-Sepharose 4FFを用いて免疫沈降させたもので、レーン２は血清フリー培地をＫＭ２０７６を用いて免疫沈降させたもので、レーン３はヒト分泌型発現ＣＨＯ細胞の培養上清をＮＲＩｇＧを用いて免疫沈降させたものである。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例を示す。遺伝子操作的手法は特に断らない限り公知のモレキュラー・クローニング 第２版に記載されている方法により行った。
実施例１：遺伝子導入部位に隣接するマウス染色体ＤＮＡのクローニング
（１）導入遺伝子の検出
ヒト エロンゲーションファクター１αプロモーター（ＥＦ１アルファプロモーター）にＮａ+／Ｈ+逆輸送体を連結した外来遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（特開平５−２６８８５６）を作成し、得られたヘテロ個体を掛け合わせ早期老化様症状を示すホモ個体を取得した。該ホモ個体中より顕著な早期老化様症状を示したマウス個体〔第１８回日本分子生物学会年会（鍋島ら、２Ｋ−０２、１９９５年）〕、および該ホモ個体を取得するために用いたヘテロ個体をを以後の実験に用いた。
上記ヘテロ個体、ホモ個体および野生型のマウス、それぞれの肝臓より染色体ＤＮＡを調製した。該染色体ＤＮＡ各々１０μｇづつをＥｃｏＲＶまたはＸｂａＩで完全に消化した。
該消化ＤＮＡ断片各々を、０．８％アガロースゲル電気泳動にかけた後、Hybond N+フィルター（Amersham社製）にブロッティングした。
トランスジェニックマウス作製に用いたプラスミドｐＥＦＮａＨ（特開平５−２６８８５６）をメガプライムＤＮＡラベリングキット（Amersham社製）を使用してα-［32P］-dCTPで標識し、該標識プラスミドをプローブとして用い、Hybond N+フィルターの添付マニュアルに従って、上記ブロッティングしたHybond N+フィルターとハイブリダイゼーションを行った。
結果を第１図に示す。ヘテロ個体、ホモ個体では約１５０ｋｂ付近に単一のバンドが検出されたことより、導入遺伝子はマウス染色体上一カ所にのみ挿入されていると考えられた。該結果は導入遺伝子をプローブとしたＦＩＳＨでも確認することができた。即ち、第６染色体長腕のテロメア（6G2-3）に単一のシグナルを検出した。
（２）遺伝子導入部位に隣接するマウス染色体ＤＮＡのクローニング
（１）記載のホモ個体マウスの染色体ＤＮＡ１０μｇをＥｃｏＲＩまたはＫｐｎＩで完全に消化し、ＤＮＡ Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で１６℃、３０分間結合反応を行った。
該反応液１０μｌを用いて、大腸菌XL1-BlueMRF’（Epicurian Coli,STRATAGENE社製）をトランスフォームし、３７℃で１８時間培養後、得られたコロニーよりプラスミドを回収した。
上記において、染色体をＥｃｏＲＩで消化した場合にはＥ５０、Ｅ７０の２種類のプラスミドが、ＫｐｎＩで消化した場合にはＫ８プラスミドが、マウス・ゲノミックＤＮＡの断片を含むプラスミドとして、レスキューされた。
導入遺伝子と実際にレスキューされてきたプラスミドの制限酵素地図を第２図に示す。３種のプラスミドいずれも導入遺伝子とは異なるＤＮＡ断片を含んでおり、これらＤＮＡ断片は導入遺伝子に隣接する染色体断片であると考えられた。
次にレスキューされたプラスミドＥ５０に含まれているマウス染色体ＤＮＡ部分のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ断片を調製した後（１）と同様の方法により放射標識し、これをプローブとして、（１）で用いたフィルターのデハイブリダイズしたものを用いてサザンブロッティング（Southern blotting）を行った。
結果を第３図に示す。野生型マウスでは野生型対立遺伝子（wild allele）のみ、ホモ個体では変異型対立遺伝子（mutant allele）のみ、ヘテロ個体では両方の対立遺伝子（allele）由来のバンドが認められ、レスキューされたプラスミドに含まれる染色体由来ＤＮＡ断片が導入遺伝子に隣接している部分であることを確認した。
実施例２：マウス老化抑制遺伝子のクローニング
実施例１の（２）のプローブを用い、野生型のマウス・ゲノミック・ライブラリー（Stratagene社製,mouse genomic library,λFIXII）を添付のマニュアルに従ってスクリーニングし、プローブとハイブリダイズする３つの独立したファージ・クローン（E8.5,E2.6,E11.1）を得た（第４図）。
実施例１の（２）でホモ個体からレスキューされたゲノミックＤＮＡと比較すると、ホモ個体における老化抑制遺伝子内の領域には約８ｋｂにわたる欠失が存在していた（第４図）。
該領域から転写される遺伝子を同定するため、欠失部分を中心として塩基配列をLi-Cor社model4000Lシークエンサー（以下同じ）により順次決定したところ、欠失部分から約６ｋｂ離れたところにCpG islandが存在することが明らかとなった。
該欠失部分からＳａｃＩＩにより４５０ｂｐの断片を切り出して実施例１の（１）と同様の方法で標識し、これをプローブとしてマウス心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓のpoly（A）+RNAフィルター〔Mouse Multiple Tissue Northern Blotsのフィルター（Clontech）〕を用いて、Hybond N+のマニュアルの条件に従いノーザン・ハイブリダイゼーションを行った。
結果を第５図に示す。腎臓において約５．３ｋｂのバンドが認められ、該４５０ｂｐのＳａｃＩＩ切断断片にエクソンが含まれていることを確認した。
野生型、ホモ個体、ヘテロ個体のマウス腎臓よりQuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia社製）を用いてそれぞれpoly（A）+RNAを調製し、その５μｇを０．８％アガロースゲル電気泳動にかけた後、Hybond N+フィルター（Amersham社製）へトランスファーした。
上記４５０ｂｐのＳａｃＩＩ切断断片をプローブとして、上記と同様にノーザン・ハイブリダイゼーションを行った。
結果を第６図に示す。野生型、ヘテロ個体ではバンドが認められ、老化抑制遺伝子の発現が確認されたが、ホモ個体ではバンドが検出されず、該遺伝子が全く発現されていないことが明らかとなった。
同様に、出生後各時期においてマウス腎臓からpoly（A）+RNAを調製し、上記４５０ｂｐのＳａｃＩＩ切断断片をプローブとしてノーザン・ハイブリダイゼーションを行った。第６図に示したように、生後１、２週間では、老化抑制遺伝子はほとんど発現せず、新生児期から徐々に発現量が増え、生後３、４週間目に発現が強くなる傾向があった。
実施例３：マウス老化抑制遺伝子ｃＤＮＡのクローン化
野生型マウスの腎臓のpoly（A）+RNAよりｃＤＮＡ合成システム（cDNA Synthesis System、GIBCO BRL社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、その両端にEcoRI-NotI-SalI adaptor（SuperScript Choice System for cDNA Synthesis;GIBCO BRL社製）を付加した後、クローニングベクターλZAP II（λZAP II Cloning Kit、STRATAGENE社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、in vitro packaging（Stratagene社製Gigapack II Gold）をすることによりｃＤＮＡライブラリーを作製した。
実施例２の４５０ｂｐのＳａｃＩＩ切断断片をプローブとして用い、該ｃＤＮＡライブラリー５ｘ１０5クローンについてプラークハイブリダイゼーションを行った。該ハイブリダイゼーションにおいて、フィルターを、２倍濃度のＳＳＰＥ〔１倍濃度のＳＳＰＥの組成は、１８０ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム、１ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）よりなる（ｐＨ７．４）〕、０．１％ＳＤＳよりなる緩衝液中で６５℃、１０分間浸漬する条件で２回、１倍濃度のＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中で６５℃、１５分間浸漬する条件で１回、０．２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中で６５℃、１０分間浸漬する条件で２回洗浄した。
該ハイブリダイゼーションにより、ハイブリダイズする４０個の独立したクローンが得られた。該クローンより、in vivoイクサイション（excision）によりプラスミドを回収し、制限酵素解析、塩基配列決定を行った。
該塩基配列の決定により、プラスミドｐＮＫＭ１０１には、配列番号８に記載された、約５ｋｂのｃＤＮＡが含まれ、該ｃＤＮＡには３，０４２ｂｐのオープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦと略す）が存在することが分かった。該ＯＲＦには、配列番号３に記載された、Ｎ末端に３５アミノ酸からなるシグナル・シークエンスとＣ末端に１９アミノ酸からなる膜貫通領域を有する１０１４アミノ酸残基よりなる新規の蛋白質がコードされていた（第７図）。ｐＮＫＭ１０１の構造を第８図に示す。
実施例４：マウス由来分泌型老化抑制遺伝子の単離
マウスゲノミックＤＮＡを含むライブラリー（Bacterial artificial chromosome,ＢＡＣ）からマウス老化抑制遺伝子のゲノム領域を含むクローンを単離するため、実施例３で得られたマウス老化抑制遺伝子ｃＤＮＡのうち、配列番号１１と配列番号１２で示される２ヶ所の領域の配列をプライマーにして用い、マウス染色体ＤＮＡを鋳型としたときに、ＰＣＲ法により１２７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されることを確認した。
ＰＣＲ反応は、PERKIN ELMER社製のDNA Thermal Cycler 480を用い、９４℃で１分間、５６℃で１分間、７２℃で１分間の工程を１サイクルとして、３０サイクル行った。
平均して１００ｋｂのマウス染色体ＤＮＡを含むＢＡＣライブラリー（Research Genetics社製）より、上述のプライマーおよび増幅条件を用いてＰＣＲ法により１２７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されるＢＡＣクローンを選択した。
得られたＢＡＣクローン１０μｇの試料を５０μｌの緩衝液Ｂに添加後、３単位のＳａｕ３ＡＩを加えて、３７℃で１０分間反応させた。
該反応液を用いてフェノール−クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を約５μｇ回収した。
コスミドベクターｐＷＥ１５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）は、５μｇを３０μｌの緩衝液Ｃに添加後、３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で２時間反応させた。該反応液を用いてフェノール−クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を約２μｇ回収した。
上記Ｓａｕ３ＡＩ処理ＢＡＣクローン断片１μｇとＢａｍＨＩ処理ｐＷＥ１５断片１００ｎｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、該溶液にＴ４ＤＮＡリガーゼを１単位加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。該反応液をGigapackIIGold Extract（Stratagene社製）を用いてin vitro packaging処理を行い、コスミドライブラリーを作製した。
該ライブラリーより上述のＢＡＣクローン選択時のプライマーおよび増幅条件を用い、ＰＣＲ法により１２７ｂｐ断片が増幅されるクローンを得た。
後述実施例５で取得されたヒト由来分泌型老化抑制ポリペプチドのＣ末端に相当する塩基配列と、コスミドにサブクローン化されているマウス老化抑制遺伝子の相当領域のＤＮＡ配列を比較した結果、ヒト由来分泌型老化抑制ポリペプチド配列番号２の５３５アミノ酸から５４９アミノ酸までのポリペプチド配列と相同性を示す配列をコードするＤＮＡ配列が見出された。
Mouse Kidney Marathon Ready cDNA kit（Clontech社製）を鋳型とし、配列番号１３で示すライブラリー由来アダプタープライマーと、配列番号１４で示す上述のマウス由来のヒト分泌型老化抑制ポリペプチドＣ末側相同領域に相当するプライマーを添加後、ＰＣＲ法による遺伝子増幅を行った。
ＰＣＲ反応は、PERKIN ELMER社製のDNA Thermal Cycler 480を用い、９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を１サイクルとして、３０サイクル行った。
得られた反応物をアガロースゲル電気泳動で解析したところ、約２ｋｂの増幅断片が認められ、該断片をｐＣＲ２．１ベクター（Invitrogen社製）に挿入した。
塩基配列を決定したところ、配列番号９に記載された配列が得られたことより、本ｃＤＮＡは１６５０ｂｐよりなる、５５０アミノ酸残基をコードするＯＲＦを含む、マウス分泌型老化抑制遺伝子であることがわかった。
本遺伝子はさらに配列番号１５と配列番号１６で示される合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い、遺伝子の両端にＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ切断部位を付加した後、プラスミドベクターｐＵＣ１１８のＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ切断部位に挿入し、ｐＮＫＭ１１２を作製した。（第９図）
該遺伝子のマウス組織での発現を調べるため、配列番号１７と配列番号１８に示すプライマーを用い、各種臓器からQuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia社製）を用いて調製したｐｏｌｙ（Ａ）+ｍＲＮＡ ５００ｎｇを鋳型としてTakaRa RNA LA PCR kit（AMV）Ver.1.1（宝酒造社製）を用いて、ランダム９ｍｅｒをプライマーにして逆転写反応を行った後、LA-TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応は、PERKIN ELMER社製のDNA Thermal Cycler 480を用い、９４℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を１サイクルとして、３０サイクル行った。
得られた反応物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果を第１０図に示す。腎臓、脳、脳下垂体、卵巣、精巣、膵臓で発現が確認された。
実施例５：ヒト老化抑制遺伝子ｃＤＮＡのクローン化
（１）ヒト腎臓由来の老化抑制遺伝子の取得
ヒト腎臓poly（A）+RNA（Clontech社製）を用い、実施例３と同様にヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーを構築した。該ライブラリー約１００万クローンについて、実施例２のマウスｃＤＮＡ中５’端アダプター由来のＮｏｔＩ部位とｃＤＮＡ中に存在するＮｏｔＩ部位で切り出される４．２ｋｂ断片をプローブとして用い、実施例３と同様の方法でプラークハイブリダイゼーションを行った。
該ハイブリダイゼーションにより、強くハイブリダイズする６個の独立したクローンが得られた。該クローンより、in vivoイクサイションによりプラスミドを回収し、制限酵素解析、塩基配列決定を行った。
該塩基配列の決定により、２クローンから得られたプラスミドには、配列番号６に記載された、全体に渡ってマウスの配列と高い相同性を示す、約３．２ｋｂのｃＤＮＡが含まれ、該ｃＤＮＡには3,036ｂｐからなる、配列番号１に記載された１，０１２アミノ酸残基をコードする、ＯＲＦが存在することが分かった。
該アミノ酸配列はマウスと８６％の高い相同性を有することからヒトホモログ（human homologue）であると結論された（第７図）。
該ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＮＫＭ１０３の構造を第１１図に示す。
残り４クローンから得られたプラスミドには、配列番号７に記載された、約３．４ｋｂのｃＤＮＡが含まれ、該ｃＤＮＡには１，６４７ｂｐからなる、配列番号２に記載されたポリペプチドをコードする、ＯＲＦが存在することが分かった。
配列番号１に記載されたポリペプチドと比較し、配列番号２に記載されたポリペプチドにはＣ末端付近の膜貫通領域が含まれないため、該ポリペプチドは分泌蛋白質であると考えられる（第７図）。
該ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＮＫＨ１０６の構造を第１２図に示す。
（２）ヒト膵臓由来の老化抑制遺伝子
ヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリー（Clontech社製）のファージ液１μｌ（１ｘ１０８個のファージを含む）を鋳型として、配列番号１９に示した１０μＭのセンスプライマー（RYHH-02-5′）、１０μＭの配列番号２０に示したアンチセンスプライマー（RYHH-02-3′-2）の各々１μｌと、１０×ＰＣＲ用緩衝液（酵素に添付してあるものを使用）４μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ３．２μｌを混合してサーマルサイクラーにセットした。９７℃で５分間反応させた後、氷上５分間急冷し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製、５単位／μｌ）０．５μｌを混合後、９５℃で６０秒間、６５℃で１分間、７２℃で１分間からなる工程を１サイクルとして３０サイクルのＰＣＲを行いアガロースゲル電気泳動を用いて確認したところ、約４００ｂｐのバンドの増幅が見られた。
この０．２ｋｂの増幅断片をアガロースゲルから精製し、pT7Blue T-vector（ノバジェン社）にＤＮＡライゲーションキット ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて、組み込んだ。方法はキットの指示に従った。この溶液で大腸菌XL1-Blue株を形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。該形質転換株からプラスミド抽出機ＰＩ−１００（クラボウ社製）を用いてプラスミドを回収し、２クローンの塩基配列をＤＮＡシークエンサー３７７〔パーキン・エルマー社製〕を用いて決定したところ、老化抑制遺伝子と相同性を示す配列を有するｐＴ７−０２を見出した。
このプラスミドｐＴ７−０２の挿入断片をDIG DNA labeling kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いてジゴキシゲニン（DIG）標識し、プローブとした。標識の方法はキットの指示に従った。
ヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリーを、１枚につき約２×１０５プラークが出現するように直径１５ｃｍのプレート５枚に培養し、ナイロンメンブレンフィルターHybond N+〔アマシャム（Amersham）社製〕にブロッティングした。ベーリンガー・マンハイム社のプロトコール（DIG Luminescent Ditection Kit for Nucleic Acids）に従って、DNAの変性、固定化、プローブとのハイブリダイズ、フィルターの洗浄を行った。ハイブリダイズ溶液は５ｘＳＳＣ、１％ Blocking solution〔DIG Luminescent Ditection Kit for Nucleic Acids（ベーリンガー・マンハイム社製）〕、0.1％ Sacrcosyl、0.02％ ＳＤＳを含むものを用い、６８℃で一晩行った。また、洗浄は振とうしながら、０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中室温で１０分間を２回行った後、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中で６８℃で１５分間を２回行った後、抗ＤＩＧ抗体を用いたＤＩＧ検出キット（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いてポジティブプラークを検出した。該プラークを寒天培地ごとくりぬいてＳＭ緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．００８Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）５００μｌに入れ、室温、一晩ファージを緩衝液中に溶出させた。この緩衝液１μｌを鋳型にして上記と同様のＰＣＲを行い、０．４ｋｂの断片が増幅することにより確かに目的のｃＤＮＡを含んでいることを確認した後、該ポジティブクローンよりＥｃｏＲＩにより約３．５ｋｂの挿入配列を切り出し、pBluescript SKII＋のＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。該形質転換株からプラスミド抽出機ＰＩ−１００（クラボウ社製）を用いてプラスミドを回収し、１クローンの塩基配列をＤＮＡシークエンサー３７７〔パーキン・エルマー社製〕を用いて決定したところ、配列番号１０記載の塩基配列を含むプラスミドｐＲＹＨＨ０２を見出した。該遺伝子には配列番号５記載の１０１５アミノ酸の蛋白をコードしうるＯＲＦが存在する事が明らかになった。この塩基配列から予測しうるアミノ酸配列は、全域にわたって老化抑制遺伝子と約４５％の相同性を示したことから、該遺伝子が老化抑制遺伝子ファミリーのひとつである事が明らかになった。
また配列番号１０記載のアミノ酸配列に対し、Ｎ末端より１００アミノ酸を対象に、シグナル配列切断部位予測ソフトであるSignalP ver1.2〔Protein Enginerring,10,1（1997）〕およびSPScan（Genetics Computer Group、Inc.）を用いて解析を行った。その結果、両ソフトの予測するシグナル配列切断位置は、２３番目のGlyと２４番目のPheの間ということで一致した。従って本ポリペプチドではアミノ酸配列の１番目から２３番目までがシグナル配列を形成し、２４番目以降が成熟型ペプチドであると結論された。
実施例６：大腸菌によるマウス老化抑制ポリペプチド部分断片の発現用プラスミドｐＹＴ１０２の構築
大腸菌によるマウス老化抑制ポリペプチド部分断片の発現は、以下に示す大腸菌用発現ベクターｐＳｕｐｅｘにマウス老化抑制ポリペプチド断片をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を挿入してｐＹＴ１０２を作製し、ｐＹＴ１０２を大腸菌に導入することにより行った。
ｐＳｕｐｅｘの作製は、第１３図に示すとおり既に報告のあるｐＧＨＡ２（特開昭６０−２２１０９１）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９）、ｐＧＫＡ２（特開昭６０−２２１０９１）を組み合わせることにより以下に記載する５段階の工程を経て作製した。
（工程１）プラスミドｐＴｅｒｍ４の構築
３μｇのプラスミドｐＧＨＡ２を３０μｌの１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ 塩化ナトリウムおよび１ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液（以下、トリスＡ緩衝液と略す）に添加後、該緩衝液に１０単位のＨｉｎｄIIIを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡを３０μｌの１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウムおよび１ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液（以下、トリスＢ緩衝液と略す）に添加後、該緩衝液に１０単位のＰｓｔＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、ｌｅｔＩプロモーターを含む約０．９４ｋｂのｐＧＨＡ２のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIII処理断片を約０．３μｇ回収した。
３μｇのプラスミドｐＴｅｒｍ２を３０μｌのトリスＡ緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＨｉｎｄIIIを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液よりエタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡを３０μｌのトリスＢ緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＰｓｔＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、複製開始領域、翻訳終始コドンを含む約１．１ｋｂのｐＴｅｒｍ２のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIII処理断片を約０．８μｇ回収した。
上述のｐＧＨＡ２のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIII処理断片１００ｎｇおよびｐＴｅｒｍ２のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIII処理断片５０ｎｇを２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶解後、該溶解液にＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、以下同様）１００単位を加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第１３図に示したプラスミドｐＴｅｒｍ４を得た。
（工程２）プラスミドｐＧＢＺ２の構築
３μｇのｐＧＫＡ２を３０μｌの１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、７０ｍＭ 塩化マグネシウム、１５０ｍＭ 塩化カリウム、０．０１％ ウシ血清アルブミンおよび７ｍＭ ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、トリスＣ緩衝液と略す）に添加後、該緩衝液に１０単位のＮｒｕＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ｐＧＫＡ２のＮｒｕＩ処理断片を回収した。
ＢｇｌＩＩリンカー（5’-pCAGATCTG-3’）を合成し、該リンカー５０ｎｇおよび上記ｐＧＫＡ２のＮｒｕＩ処理断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解後、該溶解液にＴ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第１３図に示したプラスミドｐＧＢＺ２を得た。
（工程３）プラスミドｐＴｅｒｍ５の構築
３μｇのプラスミドｐＴｅｒｍ４を３０μｌのトリスＢ緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＰｓｔＩと１０単位のＢｇｌＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、ｌｅｔＩプロモーターと翻訳終止コドンを含む１．１５ｋｂのｐＴｅｒｍ４のＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩ処理断片を約０．８μｇ回収した。
３μｇのプラスミドｐＧＢＺ２を３０μｌのトリスＢ緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＰｓｔＩとＢｇｌＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、複製開始点、アンピシリン耐性遺伝子およびｒｏｐ遺伝子を含む約２．６３ｋｂのｐＧＢＺ２のＰｓｔＩとＢｇｌＩＩ処理断片を約０．３μｇ回収した。
上述のｐＴｅｒｍ４のＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩ処理断片１００ｎｇおよびｐＧＢＺ２のＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩの処理断片５０ｎｇを２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶解後、該溶解液にＴ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第１３図に示したプラスミドｐＴｅｒｍ５を得た。
（工程４）プラスミドｐＴｅｒｍ６の構築
３μｇのプラスミドｐＴｅｒｍ５を３０μｌのトリスＣ緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＮｒｕＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡを３０μｌのトリスＡ緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＣｌａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、複製開始点、アンピシリン耐性遺伝子、ｌｅｔＩプロモーターおよびｒｏｐ遺伝子を含む約３．７ｋｂのｐＴｅｒｍ５のＮｒｕＩ／ＣｌａＩ処理断片を約０．３μｇ回収した。
配列番号２１および２２に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡそれぞれ１μｇを１０μｌの蒸留水に溶解し、９５℃で５分間加熱した後、３０分間かけて室温まで冷却しアニーリングを行った（以下、合成ＤＮＡ−１と呼ぶ）。
上述のｐＴｅｒｍ５のＮｒｕＩ／ＣｌａＩ処理断片５０ｎｇおよび５０ｎｇの合成ＤＮＡ−１をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを１００単位加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第１３図に示したプラスミドｐＴｅｒｍ６を得た。
（工程５）プラスミドｐＳｕｐｅｘの構築
３μｇのプラスミドｐＴｅｒｍ６を３０μｌの５０ｍＭ 酢酸カリウム、２０ｍＭ トリス−酢酸塩（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ 酢酸マグネシウムおよび１ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＮｓｉＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液を用い、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡを３０μｌのトリスＡ緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＨｉｎｄIIIを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、複製開始点、アンピシリン耐性遺伝子、ｌｅｔＩプロモーターおよびｒｏｐ遺伝子を含む約３．７ｋｂのｐＴｅｒｍ６のＮｓｉＩ／ＨｉｎｄIII処理断片を約０．３μｇ回収した。
配列番号２３および２４に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡそれぞれ１μｇを１０μｌの蒸留水に溶解し、９５℃で５分間加熱した後、３０分間かけて室温まで冷却しアニーリングを行った（以下、合成ＤＮＡ−２と呼ぶ）。
上述のｐＴｅｒｍ６のＮｓｉＩ／ＨｉｎｄIII処理断片５０ｎｇおよび５０ｎｇの合成ＤＮＡ−２をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第１３図に示したプラスミドｐＳｕｐｅｘを得た。
（工程６）プラスミドｐＹＴ１０２の構築
実施例３で取得したｐＮＫＭ１０１を３μｇ、３０μｌの５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウムおよび１ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＥｃｏ４７IIIを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡを３０μｌの１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウムおよび１ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、配列番号３に示した老化抑制ポリペプチドのＡｌａ35からＴｙｒ267のアミノ酸残基を含む断片をコードするＤＮＡを含む約０．７ｋｂのｐＮＫＭ１０１のＥｃｏ４７III／ＫｐｎＩ処理断片（第１４図）を約０．３μｇ回収した。
工程５で得られた大腸菌用発現ベクターｐＳｕｐｅｘを３μｇ、３０μｌのトリスＡ緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＳｔｕＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡを３０μｌの１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウムおよび１ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、約３．８ｋｂのｐＳｕｐｅｘのＳｔｕＩ／ＫｐｎＩ処理断片を約０．３μｇ回収した。
上述のｐＮＫＭ１０１のＥｃｏ４７III／ＫｐｎＩ処理断片５０ｎｇおよびｐＳｕｐｅｘのＳｔｕＩ／ＫｐｎＩ処理断片１００ｎｇを２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１００単位を加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第１４図に示したプラスミドｐＹＴ１０２を得た。
実施例７：大腸菌での老化抑制部分断片ポリペプチドの発現
実施例６で取得したｐＹＴ１０２を大腸菌ＮＹ４９株に導入した。該菌株を７５μｇ／ｍｌ アンピシリンおよび２ｍｇ／ｍｌ カザミノ酸を添加した４００ｍｌのＭ９最少培地（Molecular Cloning,A laboratory manualに記載の培地）中で、３７℃、２時間培養後、５０μｇ／ｍｌのインドールアクリル酸を添加し、更に、３７℃で１８時間培養した。
該培養液４００ｍｌを３，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離し、大腸菌を含む沈殿を７ｍｌの緩衝液１〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウムからなる緩衝液〕中に懸濁し、超音波処理することにより菌体を破壊する。
該処理液を１０，０００ ｘ ｇで３０分間遠心分離し、得られた沈殿をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー〔６ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、５％ ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液〕に溶解した。該溶液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、該ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。結果を第１５図に示す。分子量約２７ｋＤの老化抑制部分断片ポリペプチドの生産が確認された。該電気泳動において、分子量マーカーとしてphosphorylase b（97,400）、牛血清アルブミン（66,200）、ovalbumin（45,000）、carbonic anhydrase（31,000）、soybean trypsin inhibitor（21,500）、lysozyme（14,400）を用いた。
実施例８：マウス老化抑制部分断片ポリペプチドと反応する抗マウス老化抑制ポリペプチド抗体の生産
（１）実施例７で大腸菌を宿主として発現されたマウス老化抑制部分断片ポリペプチドを、２ｍｍ厚のゲルを用い、還元条件で常法によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画した。
該ゲルを０．１％クマシーブリリアントブルー水溶液で染色後、水で脱色して老化抑制部分断片ポリペプチドに相当する約２７ｋＤのバンドを切り出した。
該ゲルを磨り潰し、０．１％ＳＤＳ−ＰＢＳを用いて、老化抑制ポリペプチド部分断片を４℃で一晩抽出した後、回収した。蛋白濃度は、ＢＳＡを蛋白濃度測定用スタンダードとして用い、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことにより求めた。
（２）（１）で取得した老化抑制部分断片ポリペプチドを用いて、常法に従ってラットを免疫した。
即ち、初回のみアジュバント（水酸化アルミニウムゲル２ｍｇ、百日せきワクチン１ｘ１０9ｃｅｌｌｓ／匹）を加え５０μｇ／匹の濃度で老化抑制部分断片ポリペプチドを腹腔内へ投与し、初回より２週間目、３週間目に老化抑制部分断片ポリペプチドのみを腹腔内へ投与した。
最終免疫の３日後に部分採血し、以下に述べるＥＬＩＳＡ法により血中抗体価の測定を行った。
〔ＥＬＩＳＡ法〕
上述の老化抑制部分断片ポリペプチドをＰＢＳ緩衝液〔リン酸水素二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸二水素カリウム０．２１ｇおよび塩化ナトリウム７．６５ｇを蒸留水に溶かし１リットルとした緩衝液、ｐＨ７．２〕で１０μｇ／ｍｌの濃度に調製した。該調製液を９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に５０μｌ／穴ほど分注し、４℃で一晩放置した。
該プレートをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと略す）を１００〜２００μｌ／穴分注し、室温１〜２時間または、４℃で１〜２晩放置した。放置後、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、該プレートをＰＢＳ緩衝液でよく洗浄した。
該プレートに、採取した抗血清をＢＳＡ−ＰＢＳで希釈後、２０〜１００μｌ／穴づつ加え、室温で２時間放置した。
放置後、該プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（以下、ＰＢＳ-0.05Ｔｗｅｅｎと略す）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリンもしくはペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン（ＤＡＫＯ社製）を５０〜１００μｌ／穴づつ添加し、室温で１時間放置した。
放置後、該プレートをＰＢＳ−0.05Ｔｗｅｅｎで洗浄し、該プレートにＡＢＴＳ基質液〔２、２-アジノビス（３-エチルベンゾチアゾール-６-スルホン酸）アンモニウム５５０ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１リットルに溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１μｌ／ｍｌを加えた溶液〕を用いて発色させ、ＯＤ415nmの吸光度を測定した（ＮＪ２００１；日本インターメッド社）。
（３）ウェスタンブロットにより、該血清が上述のマウス老化抑制部分断片ポリペプチドと反応することを確認した。
実施例７に記載された方法に準じて、老化抑制部分断片ポリペプチド断片の発現が確認された大腸菌の菌体蛋白質をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画した。
該ゲルに分画された蛋白質をセミドライブロット法により転写膜（Immobilon Transfer Membranes,Millipore社製）に転写した。転写は、１００％ メタノールに２０秒、１０ｍＭ ＣＡＰＳ（３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸）、１０％ メタノールおよび０．０３％ＳＤＳを含む溶液に（ｐＨ１１．０）３０分以上浸した転写膜を使用し、２ｍＡ／ｃｍ2定電流の条件で２時間行った。
該転写膜を、２００ｍｌのＢＳＡ−ＰＢＳ中で１時間振盪させた後、ＰＢＳ緩衝液で一度洗浄した。
該転写膜およびＰＢＳ緩衝液で１／２５００に希釈したラットより採取した血清２ｍｌをビニールバッグに入れてシールし、４℃で一晩ゆっくりと振盪させた。
該転写膜を２度ＰＢＳ−0.05Ｔｗｅｅｎに５分間浸漬し、洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液で５分間浸漬し、洗浄した。
該転写膜およびＰＢＳ緩衝液に溶解させた０．５ｍｇ／ｍｌのパーオキシダーゼ標識された抗ラットＩｇＧ抗体（anti-rat immunoglobulin,Amersham社製）３ｍｌをビニールバッグに入れ、シールをした後、室温で１時間振盪させた。
振盪後、該転写膜を２度ＰＢＳ−0.05Ｔｗｅｅｎに５分間浸漬し、洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液に５分間浸漬し、洗浄した。
発光法（ECL Western blotting detection reagents,Amersham社製）により、ラット血清中の抗体と交叉の見られる、該転写膜上の蛋白質の検出を行った。
結果を第１６図に示す。
実施例７で得られた約２７ｋＤのバンドと同一の位置にバンドが検出され、実施例８（２）で採取したラット血清中の抗体が抗原であるマウス老化抑制ポリペプチド断片を認識し、ウェスタンブロット法に使用可能であることが示された。
以下、該ラット血清中の抗体を抗老化抑制ポリペプチド抗体と呼ぶ。
実施例９：抗老化抑制ポリペプチドモノクローナル抗体の作製
（１）抗体産生細胞の調製
実施例８（２）で取得した、血清が十分な抗体価を示したラット３匹より脾臓を摘出した。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てた。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いた。
（２）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン培地で継代しておいた、８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を正常培地で培養し、細胞融合用の骨髄腫細胞として用いた。細胞融合には２×１０7個以上の細胞を使用した。
（３）ハイブリドーマの作製
（１）で取得した抗体産生細胞と（２）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てた。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０8抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加した。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製した。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てた。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地１００ｍｌ中に懸濁した。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養した。
培養後、培養上清の一部をとり実施例８（２）に述べた酵素免疫測定法に準じて、大腸菌により生産した老化抑制部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマ約１、０００株を選択した。
該ハイブリドーマを用いて、１回目はＨＴ培地、２回目は正常培地を使用した限界希釈法によるクローニングを行い、抗老化抑制ポリペプチド抗体を生産するハイブリドーマＫＭ１９０２株を取得した。
ハイブリドーマＫＭ１９０２株の産生するモノクローナル抗体ＫＭ１９０２の抗体クラスがＩｇＧ２ａであることを、サブタイプタイピングキットを用いた酵素免疫測定法により決定した。
（４）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令のヌード雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に、（３）で取得したハイブリドーマ株を５〜２０×１０6細胞／匹を腹腔内に注射することにより、１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化した。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去した。
得られた上清を、カプリル酸沈殿法〔Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1988）〕を用いて精製することにより、ＩｇＧを取得し、精製モノクローナル抗体として用いた。
実施例１０：動物細胞でのマウス老化抑制ポリペプチドの発現用プラスミドｐＹＴ１０３の構築
（工程１）動物細胞用発現ベクターｐＡＧＥ２１０構築（第１７図）
動物細胞用発現ベクターｐＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１）およびｐＡＧＥ１４８（特開平６−２０５６９４）を用いて、動物細胞用発現ベクターｐＡＧＥ２１０の構築を以下のように行った。
ｐＡＧＥ２０７もしくはｐＡＧＥ１４８を３μｇ、３０μｌのトリスＡ緩衝液に溶解後、該溶解液に１０単位のＣｌａＩおよびＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、ｐＡＧＥ２０７よりＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（以下、ＰSEという）、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子（以下、ＡPという）を含む４．７ｋｂのｐＡＧＥ２０７のＣｌａＩ／ＫｐｎＩ処理断片を約０．５μｇ、ｐＡＧＥ１４８よりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒという）を含む約４．３ｋｂのｐＡＧＥ１４８のＣｌａＩ／ＫｐｎＩ処理断片を約０．５μｇ回収した。
上述のｐＡＧＥ２０７のＣｌａＩ／ＫｐｎＩ処理断片５０ｎｇおよびｐＡＧＥ１４８のＣｌａＩ／ＫｐｎＩ処理断片５０ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを２００単位加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第１７図に示したプラスミドｐＡＧＥ２１０を得た。
（工程２）
工程１で取得したｐＡＧＥ２１０のＸｂａＩ断片と実施例６（工程６）記載のｐＮＫＭ１０１の老化抑制ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＸｂａＩ断片とを連結することにより、マウス老化抑制ポリペプチド発現ベクターｐＹＴ１０３の構築を以下のように行った（第１８図）。
３μｇのｐＡＧＥ２１０を３０μｌのトリスＡ緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＸｂａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡを５０μｌの１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）緩衝液に溶解後、該溶解液に１単位のアルカリフォスファターゼを加えて３７℃で１時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、該抽出液からｐＡＧＥ２１０のＸｂａＩ−脱リン酸処理断片を約０．５μｇ回収した。
３μｇのｐＮＫＭ１０１を、０．０１％のＢＳＡを添加したトリスＡ緩衝液３０μｌに添加後、該緩衝液に１０単位のＸｂａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液をアガロース電気泳動により分画後、３．２ｋｂのｐＮＫＭ１０１のＸｂａＩ処理断片を約０．３μｇ回収した。
該ｐＮＫＭ１０１のＸｂａＩ処理断片５０ｎｇと上記ｐＡＧＥ２１０のＸｂａＩ−脱リン酸処理断片３００ｎｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、該溶液にＴ４ＤＮＡリガーゼを１単位加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第１８図に示したプラスミドｐＹＴ１０３を得た。
実施例１１：動物細胞におけるマウス老化抑制ポリペプチドの発現
動物細胞へのプラスミドの導入は、宮地らの方法に従い、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology,3,133（1990）〕を用いて行った。
実施例１０（工程２）で得られたｐＹＴ１０３を、dhfr遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞〔Proc.Natl.Acad.Sci.,77,4216（1980）〕４×１０6個あたり４μｇ導入後、１０ｍｌのMEMα2000-dFCS（5）〔ｄＦＣＳを５％、７．５％ ＮａＨＣＯ3を１／４０量、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液（ギブコ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）を０．５％含むMEMα２０００培地（ギブコ社製）〕に懸濁し、１０ｃｍプレート（イワキガラス社製）に入れた。
３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター中で２４時間培養した後、ハイグロマイシン（GIBCO社製）を０．３ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。
該培養により生育してきた形質転換株がコンフルエントになった状態で、該形質転換株の細胞を回収した。
該細胞をハイグロマイシンを０．３ｍｇ／ｍｌ、メソトレキセート（以下、ＭＴＸと略記する）を５０ｎＭ含むMEMα2000-dFCS（5）培地に１〜２×１０5細胞／ｍｌになるように懸濁し、Ｆ７５フラスコ（グライナー社製）に２ｍｌ分注した後、３７℃のＣＯ2インキュベーター中で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性クローンを誘導した。
該クローンを、ハイグロマイシンを０．３ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを１００ｎＭ含むMEMα2000-dFCS（5）培地に１〜２×１０5細胞／ｍｌになるように懸濁し、Ｆ７５フラスコに２ｍｌ分注後、３７℃のＣＯ2インキュベーター中で１〜２週間培養して、１００ｎＭ ＭＴＸ耐性クローンを誘導した。
該クローンを、ハイグロマイシンを０．３ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５００ｎＭ含むMEMα2000-dFCS（5）培地に１〜２×１０5細胞／ｍｌになるように懸濁し、Ｆ７５フラスコに２ｍｌ分注した後、３７℃のＣＯ2インキュベーター中で１〜２週間培養して、５００ｎＭ ＭＴＸ耐性クローンを誘導した。
該５００ｎＭ ＭＴＸ耐性クローンを、ＭＴＸを５００ｎＭ含むMEMα2000-dFCS（5）培地に１〜２×１０5細胞／ｍｌになるように懸濁し、Ｆ７５フラスコに１５ｍｌ分注した後、３７℃のＣＯ2インキュベーター中で５〜７日間培養し、耐性クローンが８０〜１００％コンフルエントになった時点でＣＨＯ細胞用無血清培地CHO-S-SFMII培地（ギブコ社製）１５ｍｌと交換し、さらに３日培養した。
培養により得られた細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ処理し、１０ｍｌ MEMα2000培地に懸濁した。
該懸濁液を１，５００ ｘ ｇで５分間遠心分離し、細胞を集めた。
該細胞に７ｍｌのＰＢＳ緩衝液を加え、洗浄した後、１，５００ ｘ ｇで５分間遠心分離することにより、細胞を集めた。
該細胞は−２０℃で保存することが可能で、必要に応じて解凍して使用することができる。
実施例８（３）と同様の方法により、該細胞の全蛋白質（１レーン当たり１ｘ１０5細胞）を用いてウェスタンブロットを行った。
結果を第１９図に示す。抗老化抑制ポリペプチド抗体と交叉するバンドが確認され、老化抑制ポリペプチドが動物細胞を用いて著量発現されることがわかった。
また、マウス膜結合型老化抑制ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列をタンパク質化学の常法に従って決定した。
即ち、コンフルエントとなるまで生育させた１０ｃｍシャーレ２０枚分の実施例１０に記載された老化抑制ポリペプチドを発現したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ dhfr-/pYT103）より、後述の実施例２５に記載の免疫沈降法で精製した約１４０ｋＤａ老化抑制ポリペプチドを気相プロテインシーケンサー（ＰＰＳＱ−１０、島津製作所）を用いてメーカー推奨の方法によりＮ末端９アミノ酸残基の配列を解析した。
該解析の結果、配列番号３に記載のアミノ酸配列のＮ末端３６残基目からの９アミノ酸残基の配列と一致した。
実施例１２：昆虫細胞による老化抑制ポリペプチド発現用組み換えウィルスの作製
昆虫細胞による蛋白質の生産には目的遺伝子を組み込んだ組み換えウィルスの作製が必要であるが、その作製には（工程１）トランスファーベクターと呼ばれる目的蛋白質をコードするＤＮＡを特殊なプラスミドに組み込む工程と（工程２）野生型ウィルスとトランスファーベクターを昆虫細胞にコトランスフェクションし、相同組み換えにより組み換えウィルスを取得する工程が必要である。
該工程を行うために、ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキット（製品番号PM-21001K）を用いて、該キットのマニュアルに従い以下の手順で行った。
（工程１）トランスファーベクターの作製（第２０図）
３μｇのｐＮＫＭ１０１を、３０μｌの０．０１％ ウシ血清アルブミンおよび０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加したトリスＢ緩衝液（以下、トリスＤ緩衝液と呼ぶ）に添加後、該緩衝液に１０単位のＮｏｔＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡに、３０μｌの１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、０．０１％ ウシ血清アルブミンおよび１ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液（以下、トリスＥ緩衝液と呼ぶ）を添加後、１０単位のＸｂａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、マウス老化抑制ポリペプチド断片をコードするＤＮＡを含む、約３．２ｋｂのｐＮＫＭ１０１のＮｏｔＩ−ＸｂａＩ処理断片を約０．３μｇ回収した。
ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットに含まれるプラスミドｐＶＬ１３９２を３μｇ、トリスＤ緩衝液に添加後、１０単位のＮｏｔＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡを回収した。該ＤＮＡに３０μｌのトリスＥ緩衝液を添加後、該緩衝液に１０単位のＸｂａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、約９．６ｋｂのｐＶＬ１３９２のＮｏｔＩ−ＸｂａＩ処理断片を約０．９μｇ回収した。
該ｐＶＬ１３９２のＮｏｔＩ−ＸｂａＩ処理断片２００ｎｇと上記ｐＮＫＭ１０１のＮｏｔＩ−ＸｂａＩ処理断片５０ｎｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、プラスミドｐＡＳ１０４を得た（第２０図）。
（工程２）組み換えウィルスの作製
ＴＭＮ−ＦＨインセクトメディウム（ファーミンジェン社製）を用いて培養した昆虫細胞Ｓｆ９（ファーミンジェン社製）に、線状バキュロウィルスＤＮＡ〔バキュロゴールド・バキュロウィルスＤＮＡ（BaculoGold baculovirus ＤＮＡ）、ファーミンジェン社製〕および上記プラスミドｐＡＳ１０４をリポフェクション法により導入すること〔蛋白質核酸酵素、37,2701（1992）〕により、以下のようにして、組み換えバキュロウィルスを作製した。
１μｇのｐＡＳ１０４および２０ｎｇの線状バキュロウィルスＤＮＡを１２μｌの蒸留水に溶解後、リポフェクチン６μｌおよび蒸留水６μｌとを混和したものを添加し、室温で１５分間放置した。
Ｓｆ９細胞１ｘ１０6個を２ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地（Gibco社製）に懸濁し、直径３５ｍｍの細胞培養用プラスチックシャーレに入れた後、上記のプラスミドＤＮＡ、線状バキュロウィルスＤＮＡおよびリポフェクチン混和溶液全量を添加し、２７℃で３日間培養した。
該培養液より、組み換えウィルスを含む培養上清１ｍｌを採取した。該培養上清を取得したシャーレには新たにＳｆ９００−ＩＩ培地１ｍｌを加え、更に２７℃で３日間培養し、同様にして、組み換えウィルスを含む培養上清を更に１．５ｍｌ取得した。
実施例１３：昆虫細胞におけるマウス老化抑制ポリペプチドの発現
（工程１）組み換えウィルスの増殖
Ｓｆ９細胞２ｘ１０7個を１０ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地に懸濁し、１７５ｃｍ2フラスコ（グライナー社製）に入れ、室温で１時間放置して細胞をフラスコに付着させた。
放置後、上清を除き、該フラスコに１５ｍｌのＴＭＮ−ＦＨインセクトメディウムおよび実施例１２で取得した組み換えウィルスを含む培養上清１ｍｌを添加し、２７℃で３日間培養した。
培養後、上清を１，５００ ｘ ｇで１０分間遠心分離することにより、Ｓｆ９細胞の除かれた、組み換えウィルス溶液を得た。
該組み換えウィルス溶液のウィルスの力価を以下の方法で算定した〔ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキット・マニュアル〕。
Ｓｆ９細胞６ ｘ １０6個を４ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地に懸濁し、直径６０ｍｍの細胞培養用プラスチックシャーレに入れ、室温で１時間放置して細胞をシャーレに付着させた。
放置後、上清を除き、該シャーレにＳｆ９００−ＩＩ培地４００μｌおよびＳｆ９００−ＩＩ培地で１０，０００倍に希釈した上記組み換えウィルス溶液を添加し、室温で１時間放置した。
放置後、培地を除き５ｍｌの１％低融点アガロース〔アガープラーク・アガロース（Agarplaque Agarose）、ファーミンジェン社製〕を含む培地〔滅菌した１ｍｌの５％アガープラークプラス・アガロース水溶液と４ｍｌのＴＭＮ−ＦＨインセクトメディウムを混和し、４２℃に保温したもの〕を該シャーレに流し込み、室温で１５分間放置した。
放置後、乾燥を防ぐためビニルテープをシャーレにまき、密閉可能なプラスチック製容器に該シャーレを入れ、２７℃で６日間培養した。
該シャーレに０．０１％ニュートラルレッドを含むＰＢＳ緩衝液１ｍｌを加えさらに１日培養した後、出現したプラークの数を数えた。
以上の操作より該組み換えウィルス溶液は約１×１０8プラークフォーミングユニット（ＰＦＵ）／ｍｌのウィルスを含んでいることがわかった。
（工程２）昆虫細胞による老化抑制ポリペプチドの発現
ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットに添付されているマニュアルに従い以下の手順によりマウス老化抑制ポリペプチドの発現を行った。
Ｓｆ９細胞６ｘ１０6個を２２５ｃｍ2フラスコ（グライナー社製）に１０％ＦＣＳを含むグレイスズ・インセクト・メディウム（Grace’s Insect Medium、ギブコ社製）４５ｍｌに懸濁し、２７℃で３〜４日間培養した。
培養後、培養上清を除き、該フラスコに新たに３０ｍｌの１０％ＦＣＳを含むグレイスズ・インセクト・メディウムおよび（工程１）で取得したｐＡＳ１０４由来の組み換えウィルスを約１×１０8ＰＦＵ／ｍｌの濃度で含む溶液を１ｍｌ添加し、２７℃で１日間培養した。
培養後、上清を除き、該フラスコに新たにＳｆ９００−ＩＩ培地４５ｍｌを加え２〜３日間培養した。
培養後、上清を１，５００ ｘ ｇで５分間遠心分離することにより除き、得られた細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理により剥がした。
得られた細胞画分を、１０ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地に懸濁後、１，５００ ｘ ｇで５分間遠心分離することにより細胞を集めた。
該細胞画分に７ｍｌのＰＢＳ緩衝液を添加し、洗浄した後、１，５００ ｘ ｇで５分間遠心分離することにより細胞を集めた。
該細胞は−２０℃で保存することが可能で、必要に応じて、解凍して使用した。
（工程３）発現の確認
実施例７と同様の方法により、工程２で取得した細胞の全蛋白質（１レーン当たり１ｘ１０5細胞）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
結果を第２１図に示す。１２０ｋＤ近辺の特異的なバンドが確認された。
また、実施例８（３）と同様の方法により、工程２で取得した細胞の全蛋白質（１レーン当たり１ｘ１０5細胞）を用いて、ウェスタンブロットを行った。
結果を第２２図に示す。ウェスタンブロットにおいても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同一の位置に、抗老化抑制ポリペプチド抗体と交叉する特異的なバンドが確認された。
以上のことより、昆虫細胞を用いて、抗老化抑制ポリペプチド抗体と交叉する老化抑制ポリペプチドを著量発現されることが可能であることがわかった。
また、該昆虫細胞より実施例８（１）の方法に準じて老化抑制ポリペプチドを取得した。
実施例１４：動物細胞でのヒト膜結合型老化抑制ポリペプチドの発現用プラスミドｐＹＳ１１０の構築
実施例１０（工程１）で取得したｐＡＧＥ２１０の（ＫｐｎＩ平滑末端化処理）−ＢａｍＨＩ断片と実施例５記載のｐＮＫＭ１０３のヒト膜結合型老化抑制ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ断片とを連結することにより、ヒト膜結合型老化抑制ポリペプチド発現ベクターｐＹＳ１１０の構築を以下のように行った（第２３図）。
５μｇのｐＡＧＥ２１０を３０μｌの１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液に添加後、該緩衝液に２０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で２時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を約３μｇ回収した。該ＤＮＡをDNA blunting kit（宝酒造社製）により平滑末端化処理を行った後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、５０μｌの２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ 塩酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ 塩化カリウム緩衝液に溶解後、該溶解液に２０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃２時間反応させた。
該反応液はアガロースゲル電気泳動により分画後９．０ｋｂのｐＡＧＥ２１０のＢａｍＨＩ−（ＫｐｎＩ平滑末端化処理）断片をゲルより切り出し、ガラスパウダー法〔Gene Clean II（Bio101社製）〕により精製し、約１μｇ回収した。
１０μｇのｐＮＫＭ１０３を、５０μｌの２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ 塩酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ 塩化カリウム緩衝液に添加後、該緩衝液に３０単位のＢａｍＨＩと３０単位のＨｐａＩ加えて３７℃で２時間反応させた。
該反応液をアガロース電気泳動により分画後、３．２ｋｂのｐＮＫＭ１０３のＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ処理断片を約０．５μｇ回収した。
該ｐＮＫＭ１０３のＢａｍ−ＨｐａＩ処理断片１００ｎｇと上記ｐＡＧＥ２１０のＢａｍＨＩ−（ＫｐｎＩ平滑末端化処理）断片１００ｎｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、該溶液にＴ４ＤＮＡリガーゼを１単位加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第２３図に示したプラスミドｐＹＳ１１０を得た。
実施例１５：動物細胞におけるヒト膜結合型老化抑制ポリペプチドの発現
動物細胞へのプラスミドの導入は、宮地らの方法に従い、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology,3,133（1990）〕を用いて行った。
実施例１４で得られたｐＹＳ１１０を、dhfr遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞〔Proc.Natl.Acad.Sci.,77,4216(1980）〕４×１０6個あたり４μｇ導入後、１０ｍｌのMEMa2000-dFCS（5）〔ｄＦＣＳを５％、７．５％ ＮａＨＣＯ3を１／４０量、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液（ギブコ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）を０．５％含むＭＥＭａ２０００培地（ギブコ社製）〕に懸濁し、１０ｃｍプレート（イワキガラス社製）に入れた。以後の操作は実施例１１と同様に行い、５００ｎＭ ＭＴＸ耐性クローンを誘導した。
該５００ｎＭ ＭＴＸ耐性クローンを、ＭＴＸを５００ｎＭ含むMEMa2000-dFCS（5）培地に１〜２×１０5細胞／ｍｌになるように懸濁し、Ｆ７５フラスコに１５ｍｌ分注した後、３７℃のＣＯ2インキュベーター中で５〜７日間培養し、耐性クローンが８０〜１００％コンフルエントになった時点で培養を終了し、該培養液を除き、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により細胞を取得した。
得られた細胞を、１０ｍｌ MEMa2000培地に懸濁後、該懸濁液を１，５００ ｘ ｇで５分間遠心することにより細胞を集めた。
該細胞に７ｍｌのＰＢＳ緩衝液を加え、洗浄した後、１，５００ ｘ ｇで５分間遠心分離することにより、細胞を集めた。
該細胞は−２０℃で保存することが可能で、必要に応じて解凍して使用することができる。
実施例８（３）と同様の方法により、該細胞の全蛋白質（１レーン当たり１ｘ１０5細胞）を用いてウェスタンブロットを行った。ただし、一次抗体には、実施例９に記載したモノクローナル抗体ＫＭ１９０２を使用した。
結果を第２４図に示す。抗老化抑制ポリペプチド抗体と交叉するバンドが確認され、ヒト膜結合型老化抑制ポリペプチドが動物細胞を用いて著量発現されることがわかった。
また、ヒト膜結合型老化抑制ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列をタンパク質化学の常法に従って決定した。
即ち、コンフルエントとなるまで生育させた１０ｃｍシャーレ２０枚分の実施例１４に記載されたヒト膜結合型老化抑制ポリペプチドを発現したＣＨＯ細胞（ＣＨＯdhfr-/pYS110）より、免疫沈降法で精製した約１４０ｋＤａヒト膜結合型老化抑制ポリペプチドを２-メルカプトエタノール還元下でＳＤＳ-ＰＡＧＥを行った後、P.Matsudairaの方法〔J.B.C.,262,10035（1987）〕に従いＰＶＤＦ膜（ProBlott、PERKIN ELMER社製）へ電気的に転写した。
該転写した膜をクマジーブルー染色し、本実施例で示したウェスタンブロッティングで陽性の１４０ｋＤａ付近のバンドを切り出し、気相プロテインシーケンサー（ＰＰＳＱ−１０、島津製作所）を用いてメーカー推奨の方法によりＮ末端１０アミノ酸残基の配列を解析した。
該解析の結果、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端３４残基目からの１０アミノ酸残基の配列と一致した。
また、該動物細胞より実施例８（１）の方法に準じてヒト膜結合型老化抑制ポリペプチドを取得した。
実施例１６：動物細胞でのヒト分泌型老化抑制ポリペプチドの発現用プラスミドｐＹＳ１１１の構築
実施例１０（工程１）で取得したｐＡＧＥ２１０のＢａｍＨＩ−（ＫｐｎＩ平滑末端化）断片と実施例５記載のｐＮＫＨ１０６の老化抑制ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＭｓｃＩ断片とを連結することにより、ヒト分泌型老化抑制ポリペプチド発現ベクターｐＹＳ１１１の構築を以下のように行った（第２５図）。
５μｇのｐＡＧＥ２１０を３０μｌの１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウムおよび１ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液に添加後、該緩衝液に２０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で２時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を約３μｇ回収した。
該ＤＮＡをDNA blunting kit（宝酒造社製）により平滑末端化処理を行った後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、５０μｌの２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ 塩酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ 塩化カリウム緩衝液に溶解後、該溶解液に２０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃２時間反応させた。該反応液はアガロースゲル電気泳動により分画後９．０ｋｂのｐＡＧＥ２１０のＢａｍＨＩ−（ＫｐｎＩ平滑末端化）断片をゲルより切り出しガラスパウダー法により精製し、約１μｇ回収した。
１０μｇのｐＮＫＨ１０６を、５０μｌの２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ 塩酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ 塩化カリウム緩衝液に溶解後、該緩衝液に３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃２時間反応させた。
該反応液を用い、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った後、５０μｌの５０ｍＭ 酢酸カリウム、２０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ緩衝液に溶解後、３０単位のＭｓｃＩ加えて３７℃で２時間反応させた。
該反応液をアガロース電気泳動により分画後、１．９ｋｂのｐＮＫＨ１０６のＢａｍＨＩ−ＭｓｃＩ処理断片を約０．５μｇ回収した。
該ｐＮＫＨ１０６のＢａｍＨＩ−ＭｓｃＩ処理断片１００ｎｇと上記ｐＡＧＥ２１０のＢａｍＨＩ−（ＫｐｎＩ平滑末端化）断片１００ｎｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、該溶液にＴ４ＤＮＡリガーゼを１単位加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第２５図に示したプラスミドｐＹＳ１１１を得た。
実施例１７：動物細胞におけるヒト分泌型老化抑制ポリペプチドの発現
動物細胞へのプラスミドの導入は、宮地らの方法に従い、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology,3,133（1990）〕を用いて行った。
実施例１６で得られたｐＹＳ１１１を、dhfr遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞〔Proc.Natl.Acad.Sci.,77,4216（1980）〕４×１０6個あたり４μｇ導入後、１０ｍｌのMEMa2000-dFCS（5）〔ｄＦＣＳを５％、７．５％ ＮａＨＣＯ3を１／４０量、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液（ギブコ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）を０．５％含むＭＥＭａ２０００培地（ギブコ社製）〕に懸濁し、１０ｃｍプレート（イワキガラス社製）に入れた。
以後の操作は実施例１１と同様に行い、５００ｎＭ ＭＴＸ耐性クローンを誘導した。
該５００ｎＭ ＭＴＸ耐性クローンを、ＭＴＸを５００ｎＭ含むMEMa2000-dFCS（5）培地に１〜２×１０5細胞／ｍｌになるように懸濁し、Ｆ７５フラスコに１５ｍｌ分注した後、３７℃のＣＯ2インキュベーター中で５〜７日間培養し、耐性クローンが８０〜１００％コンフルエントになった時点でＣＨＯ細胞用無血清培地CHO-S-SFMII培地（ギブコ社製）１５ｍｌと交換し、さらに３日培養した。
培養終了後、該培養液０．５ｍｌにアセトン１．５ｍｌを添加し、２０℃で３０分間静置した。試料は−１０℃、１５，０００ ｘ ｇ、１０分間の条件で遠心分離し、沈殿画分を取得した後、該沈殿画分に２ｍｌの７０％エタノールを添加し、４℃で５分間遠心処理を行った。
得られた沈殿はその後乾燥させ、培養上清のアセトン濃縮試料を得た。
上記培養上清は−２０℃で保存することが可能で、必要に応じて解凍して使用することができる。
上記アセトン濃縮試料を用い、ウェスタンブロットにより産物の解析を行った。
結果を第２６図に示す。
抗老化抑制ポリペプチド抗体と交叉するバンドが確認され、ヒト分泌型老化抑制ポリペプチドが動物細胞を用いて著量発現されることがわかった。
また、培養上清３００ｍｌより免疫沈降法により濃縮したヒト分泌型老化抑制ポリペプチドを実施例１５記載の方法により、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端３４残基目から９アミノ酸残基の配列と一致した。
また、該動物細胞培養上清より実施例８（１）の方法に準じてヒト分泌型老化抑制ポリペプチドを取得した。
実施例１８：昆虫細胞によるヒト分泌型老化抑制ポリペプチド発現用組み換えウィルスの作製
昆虫細胞によるヒト分泌型老化抑制ポリペプチド発現用組み換えウィルスの作製は実施例１２に記載する方法に準じて調製した。
具体的には１０μｇのｐＮＫＨ１０６を、５０μｌの２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ 塩酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ 塩化カリウム緩衝液に溶解後、該緩衝液に３０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃２時間反応させた。反応液はフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿後、５０μｌの５０ｍＭ 酢酸カリウム、２０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ緩衝液に溶解後、３０単位のＭｓｃＩ加えて３７℃で２時間反応させた。
該反応液をアガロースゲル電気泳動により分画後、１．９ｋｂのｐＮＫＨ１０６のＢａｍＨＩ−ＭｓｃＩ断片をゲルより切り出しガラスパウダー法により精製し、約０．５μｇ回収した。
ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットに含まれるプラスミドｐＶＬ１３９３を５μｇ、５０μｌのトリスＢ緩衝液に添加後、３０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡをDNA blunting kit（宝酒造社製）により平滑末端化処理を行った後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、５０μｌの２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ 塩酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ 塩化カリウム緩衝液に溶解後、該溶解液に２０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃２時間反応させた。
該反応液をアガロースゲル電気泳動により分画後、９．６ｋｂのｐＶＬ１３９３の（ＥｃｏＲＩ平滑末端処理）−ＢａｍＨＩ断片をゲルより切り出し、ガラスパウダー法により精製し、約１μｇ回収した。
該ｐＶＬ１３９３の（ＥｃｏＲＩ平滑末端処理）−ＢａｍＨＩ断片２００ｎｇと上記ｐＮＫＨ１０６のＢａｍＨＩ−ＭｓｃＩ処理断片５０ｎｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、プラスミドｐＹＳ１５０を得た（第２７図）。
組み換えウィルスの作製は１μｇのｐＹＳ１５０を使用し、２０ｎｇの線状バキュロウィルスとともにリポフェクチン法でＳｆ２１細胞に導入し、２７℃で３日間培養した。該倍溶液より組み換えウイルスを含む培養上清１．０ｍｌを採取した。
実施例１９：昆虫細胞におけるヒト分泌型老化抑制ポリペプチドの発現
（工程１）組み換えウィルスの増殖
Ｓｆ２１細胞２ｘ１０7個を１０ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地に懸濁し、１７５ｃｍ2フラスコ（グライナー社製）に入れ、室温で１時間放置して細胞をフラスコに付着させた。放置後、上清を除き、該フラスコに１５ｍｌのＴＭＮ−ＦＨインセクトメディウムおよび実施例１７で取得した組み換えウィルスを含む培養上清１ｍｌを添加し、２７℃で３日間培養した。
培養後、上清を１，５００ ｘ ｇで１０分間遠心分離することにより、Ｓｆ２１細胞の除かれた、組み換えウィルス溶液を得た。
該組み換えウィルス溶液のウィルスの力価は実施例１３記載の方法で算定し、組み換えウィルス溶液は約２×１０8プラーク フォーミング ユニット（ＰＦＵ）／ｍｌのウィルスを含んでいることがわかった。
（工程２）昆虫細胞による老化抑制ポリペプチドの発現
ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットに添付されているマニュアルに従い以下の手順によりマウス老化抑制ポリペプチドの発現を行った。
Ｓｆ２１細胞６ ｘ １０6個を２２５ｃｍ2フラスコ（グライナー社製）に１０％ＦＣＳを含むグレイスズ・インセクト・メディウム（Grace’s Insect Medium、ギブコ社製）４５ｍｌに懸濁し、２７℃で３〜４日間培養した。
培養後、培養上清を除き、該フラスコに新たに３０ｍｌの１０％ＦＣＳを含むグレイスズ・インセクト・メディウムおよび（工程１）で取得したｐＳＹ１５０由来の組み換えウィルスを約２×１０8ＰＦＵ／ｍｌの濃度で含む溶液を０．５ｍｌ添加し、２７℃で１日間培養した。
培養後、上清を除き、該フラスコに新たにＳｆ９００−ＩＩ培地４５ｍｌを加え２〜３日間培養した。
培養後、１，５００ ｘ ｇで５分間遠心分離することにより培養上清を得た。該培養上清は−２０℃で保存することが可能で、必要に応じて、解凍して使用した。
（工程３）発現の確認
実施例１７と同様の方法により、培養上清０．５ｍｌを使用し、アセトンによる濃縮を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動後ウェスタンブロットを行った。
結果を第２８図に示す。ウェスタンブロットにおいて、抗老化抑制ポリペプチド抗体と交叉する特異的なバンドが確認された。
以上のことより、昆虫細胞を用いて、抗老化抑制ポリペプチド抗体と交叉するヒト分泌型老化抑制ポリペプチドを著量発現されることが可能であることがわかった。
また、該昆虫細胞培養上清より実施例８（１）の方法に準じてヒト分泌型老化抑制ポリペプチドを取得した。
実施例２０：動物細胞でのマウス分泌型老化抑制ポリペプチドの発現用プラスミドｐＹS１１２の構築
実施例１０（工程１）で取得したｐＡＧＥ２１０ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片と実施例４記載のｐＮＫＭ１１２の老化抑制ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片とを連結することにより、マウス分泌型老化抑制ポリペプチド発現ベクターｐＹＳ１１２の構築を以下のように行った（第２９図）。
５μｇのｐＡＧＥ２１０を３０μｌの２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ塩酸マグネシウム、１ｍＭＤＴＴ、１００ｍＭ塩化カリウム緩衝液に溶解後、該溶解液に２０単位のＢａｍＨＩと２０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加えて３７℃２時間反応させた。
該反応液はアガロースゲル電気泳動により分画後９．０ｋｂのｐＡＧＥ２１０のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をゲルより切り出し、ガラスパウダー法により精製し、約１μｇ回収した。
１０μｇのｐＮＫＭ１１２を、５０μｌの２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ 塩酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ 塩化カリウム緩衝液に溶解後、該溶解液に３０単位のＢａｍＨＩと３０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加えて３７℃２時間反応させた。
該反応液をアガロースゲル電気泳動により分画後、１．６ｋｂのｐＮＫＭ１１２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ処理断片を約０．５μｇ回収した。
該ｐＮＫＭ１１２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ処理断片１００ｎｇと上記ｐＡＧＥ２１０のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片１００ｎｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、該溶液にＴ４ＤＮＡリガーゼを１単位加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、第２９図に示したプラスミドｐＹＳ１１２を得た。
実施例２１：動物細胞におけるマウス分泌型老化抑制ポリペプチドの発現
動物細胞へのプラスミドの導入は、宮地らの方法に従い、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology,3,133（1990）〕を用いて行った。
実施例２０で得られたｐＹＳ１１２を、dhfr遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞〔Proc.Natl.Acad.Sci.,77,4216（1980）〕４×１０6個あたり４μｇ導入後、１０ｍｌのMEMa2000-dFCS（5）〔ｄＦＣＳを５％、７．５％ ＮａＨＣＯ3を１／４０量、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液（ギブコ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）を０．５％含むＭＥＭａ２０００培地（ギブコ社製）〕に懸濁し、１０ｃｍプレート（イワキガラス社製）に入れた。
以後の操作は実施例１１と同様に行い、５００ｎＭ ＭＴＸ耐性クローンを誘導した。
該５００ｎＭ ＭＴＸ耐性クローンを、ＭＴＸを５００ｎＭ含むMEMa2000-dFCS（5）培地に１〜２×１０5細胞／ｍｌになるように懸濁し、Ｆ７５フラスコに１５ｍｌ分注した後、３７℃のＣＯ2インキュベーター中で５〜７日間培養し、耐性クローンが８０〜１００％コンフルエントになった時点でＣＨＯ細胞用無血清培地CHO-S-SFMII培地（ギブコ社製）１５ｍｌと交換し、さらに３日培養した。
該培養上清は−２０℃で保存することが可能で、必要に応じて解凍して使用することができる。
該培養上清１ｍｌを用い、後述実施例２５記載の免疫沈降法により産物の濃縮を行った後、ウエスタン法により産物の解析を行った。
結果を第３０図に示す。抗老化抑制ポリペプチド抗体と交叉するバンドが確認され、マウス分泌型老化抑制ポリペプチドが動物細胞を用いて著量発現されることがわかった。
該動物細胞培養上清４５ｍｌより免疫沈降法により濃縮したマウス分泌型老化抑制ポリペプチドを実施例１５記載の方法により、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列は、配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端３６残基目から１３アミノ酸残基の配列と一致した。
また、該動物細胞培養上清より実施例８（１）の方法に準じてマウス分泌型老化抑制ポリペプチドを取得した。
実施例２２：昆虫細胞によるマウス分泌型老化抑制ポリペプチド発現用組み換えウィルスの作製
昆虫細胞によるマウス分泌型老化抑制ポリペプチド発現用組み換えウィルスの作製は実施例１２に記載する方法に準じて調製した。
具体的には１０μｇのｐＮＫＭ１１２の老化抑制ポリペプチドをコードするＤＮＡを、５０μｌの２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ 塩酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ 塩化カリウム緩衝液に溶解後、該溶解液に３０単位のＨｉｎｄＩＩＩを加えて３７℃２時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡをDNA blunting kit（宝酒造社製）により平滑末端化処理を行った後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、５０μｌの２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ 塩酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ 塩化カリウム緩衝液に溶解後、該溶解液に２０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃２時間反応させた。
該反応液をアガロース電気泳動により分画後、１．６ｋｂのｐＮＫＭ１１２の（ＨｉｎｄＩＩＩ平滑末端処理）−ＢａｍＨＩ断片をゲルより切り出しガラスパウダー法により精製し、約０．５μｇ回収した。
ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットに含まれるプラスミドｐＶＬ１３９２を５μｇ、５０μｌのトリスＢ緩衝液に添加後、３０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡをDNA blunting kit（宝酒造社製）により平滑末端化処理を行った後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、５０μｌの２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ 塩酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ 塩化カリウム緩衝液に溶解後、該溶解液に２０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃２時間反応させた。
該反応液はアガロースゲル電気泳動により分画後９．６ｋｂのｐＶＬ１３９３の（ＥｃｏＲＩ平滑末端処理）−ＢａｍＨＩ断片をゲルより切り出し、ガラスパウダー法により精製し、約１μｇ回収した。
該ｐＶＬ１３９２の（ＥｃｏＲＩ平滑末端処理）−ＢａｍＨＩ断片１００ｎｇと上記ｐＮＫＭ１１２の（ＨｉｎｄＩＩＩ平滑末端処理）−ＢａｍＨＩ断片１００ｎｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、プラスミドｐＹＳ１５１を得た（第３１図）。
組み換えウィルスの作製は１μｇのｐＹＳ１５１を使用し、２０ｎｇの線状バキュロウィルスとともにリポフェクチン法でＳｆ２１細胞に導入し、２７℃で３日間培養した。該倍溶液より組み換えウイルスを含む培養上清１．０ｍｌを採取した。
実施例２３：昆虫細胞におけるマウス分泌型老化抑制ポリペプチドの発現
（工程１）組み換えウィルスの増殖
Ｓｆ２１細胞２ｘ１０7個を１０ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地に懸濁し、１７５ｃｍ2フラスコ（グライナー社製）に入れ、室温で１時間放置して細胞をフラスコに付着させた。
放置後、上清を除き、該フラスコに１５ｍｌのＴＭＮ−ＦＨインセクトメディウムおよび実施例２２で取得した組み換えウィルスを含む培養上清１ｍｌを添加し、２７℃で３日間培養した。
培養後、上清を１，５００ ｘ ｇで１０分間遠心分離することにより、Ｓｆ２１細胞の除かれた、組み換えウィルス溶液を得た。
該組み換えウィルス溶液のウィルスの力価は実施例１３記載の方法で算定し、組み換えウィルス溶液は約１×１０8プラーク フォーミング ユニット（ＰＦＵ）／ｍｌのウィルスを含んでいることがわかった。
（工程２）昆虫細胞によるマウス分泌型老化抑制ポリペプチドの発現
ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキットに添付されているマニュアルに従い以下の手順によりマウス老化抑制ポリペプチドの発現を行った。
Ｓｆ２１細胞６ｘ１０6個を２２５ｃｍ2フラスコ（グライナー社製）に１０％ＦＣＳを含むグレイスズ・インセクト・メディウム（Grace’s Insect Medium、ギブコ社製）４５ｍｌに懸濁し、２７℃で３〜４日間培養した。
培養後、培養上清を除き、該フラスコに新たに３０ｍｌの１０％ＦＣＳを含むグレイスズ・インセクト・メディウムおよび（工程１）で取得したｐＳＹ１５１由来の組み換えウィルスを約１×１０8ＰＦＵ／ｍｌの濃度で含む溶液を１ｍｌ添加し、２７℃で１日間培養した。
培養後、上清を除き、該フラスコに新たにＳｆ９００−ＩＩ培地４５ｍｌを加え２〜３日間培養した。
培養後、１，５００ ｘ ｇで５分間遠心分離することにより培養上清を得た。該培養上清は−２０℃で保存することが可能で、必要に応じて、解凍して使用した。
（工程３）発現の確認
実施例２１と同様の方法により、培養上清１ｍｌを使用し、免疫沈降を行った後、産物の解析をウエスタン法により行った。
結果を第３２図に示す。
ウエスタン法において、抗老化抑制ポリペプチド抗体と交叉する特異的なバンドが確認された。
以上のことより、昆虫細胞を用いて、抗老化抑制ポリペプチド抗体と交叉するマウス分泌型老化抑制ポリペプチドを著量発現されることが可能であることがわかった。
また、該昆虫細胞培養上清より実施例８（１）の方法に準じてマウス分泌型老化抑制ポリペプチドを取得した。
実施例２４：モノクローナル抗体を用いた免疫細胞染色
実施例１１で作製した老化抑制ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯdhfr-/pYT103）を免疫細胞染色用緩衝液に５×１０6個／ｍｌとなるように懸濁し、丸底９６穴プレートに１００μｌ／穴ほど分注した。
対照として、実施例１１において宿主として用いたＣＨＯ細胞（ＣＨＯdhfr-）を同様に操作した。
該プレートを４℃、３５０ｘｇで１分間遠心分離後、上清を除いた。
実施例９（３）で取得した抗老化抑制ポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＫＭ１９０２株の培養上清５ｍｌをMabTrapGII（ファルマシアバイオテク社製）を用い２０倍濃縮し、上記プレートに５０μｌ／穴ほど添加し、４℃で３０分間放置した。
放置後、該プレートに免疫細胞染色用緩衝液を２００μｌ／穴ほど添加し、４℃、３５０ｘｇで１分間遠心分離後、上清を除き細胞の洗浄を行った。
該洗浄操作をさらに２回行った後、該プレートに、染色バッファーで３０倍希釈したＦＩＴＣ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（和光純薬社製）を含む免疫細胞染色用緩衝液を５０μｌ／穴ほど添加し、氷冷下で３０分間遮光して放置した。放置後、上記と同様の洗浄操作を３回行い、フローサイトメーター（コールター社製）を用いて解析を行った。
結果を第３３図に示す。
モノクローナル抗体ＫＭ１９０２はＣＨＯ細胞には反応せず、老化抑制ポリペプチド発現ＣＨＯ細胞を特異的に認識した。
実施例２５：老化抑制ポリペプチドの免疫沈降
免疫沈降用老化抑制ポリペプチドの試料として、実施例１１に記載した老化抑制ポリペプチドを発現したＣＨＯ細胞（ＣＨＯdhfr-/pYT103）を用いた。
コンフルエントとなるまでＣＨＯ細胞を生育させた６ｃｍシャーレにＰＢＳを添加し、ＣＨＯ細胞を一回洗浄した。
該シャーレに氷冷した緩衝液１を３６０μｌ添加し、氷上で３０分間静置した後、５分間隔でゆっくり振動させ、可溶化処理した。
該処理液を１．５ｍｌ用遠心チューブに回収し、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。
得られた上清に、緩衝液１で平衡化したプロテインＧーセファロース（５０％ｖ／ｖ）２５μｌを添加し、４℃で１時間振盪した後、５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を回収した。
該上清に、実施例９（４）で取得した精製モノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、４℃、１時間振盪した。
該振盪液にプロテインＧーセファロース（５０％ｖ／ｖ）２５μｌを添加し、４℃、１時間振盪後、５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。
得られた沈殿画分に２００μｌの緩衝液１を添加し、沈殿を懸濁させた。同様の操作を３度繰り返し、沈殿画分を洗浄した。
該沈殿にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー［６ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％２−メルカプトエタノールからなる緩衝液］１５μｌを添加し、ヒートブロックを用いて加熱した後、市販のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用グラジエントゲル（アトー社製）を用いて電気泳動を行った。電気泳動終了後、得られたゲル中のポリペプチドをＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。
該ＰＶＤＦ膜を用い、実施例８に準じた方法により、抗老化抑制部分断片ペプチドポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、約１４０ｋＤａの位置に老化抑制ポリペプチドを検出した。
結果を第３４図に示した。
モノクローナル抗体ＫＭ１９０２は老化抑制ポリペプチドを免疫沈降した。
実施例２６：マウス由来の老化抑制遺伝子を用いた、早期老化様症状を示すマウスから該症状の改善されたマウスの取得
（１）導入老化抑制ＤＮＡの構築
プロモータを含有するＤＮＡ断片として、ヒト エロンゲーションファクター１αのプロモータを含有するｐＥＦ３２１ＣＡＴ〔Gene,91,217（1990）〕のＨｉｎｄIII断片を利用した。該２．５ｋｂのＨｉｎｄIII断片には、ヒト エロンゲーションファクター１αの5’非翻訳領域の第１エクソンと第２エクソンの一部、プロモータ、5’末端側におけるＨｉｎｄIIIリンカーおよび3’末端側におけるＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIリンカーが存在する。
該ＨｉｎｄIII断片の下流に老化抑制遺伝子を含有するｐＮＫＭ１０１のＮｏｔＩ断片（４．２ｋｂ）およびSV40 early splicing region & polyadenylation signalのカセット〔プラスミドpMAMneo（Clontech）の塩基番号1551-2427〕を連結して導入老化抑制ＤＮＡとして用いた。
該導入老化抑制ＤＮＡの造成法を第３５図及び第３６図に示した。
具体的には、
（i）pEF321CATをＨｉｎｄIIIで切断し、得られた２．５ｋｂのＨｉｎｄIII断片をDNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い末端平滑化した。該平滑化断片に、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いＸｂａＩリンカー（宝酒造社製、4693P）を付加後、ＸｂａＩで切断し、ＸｂａＩ切断断片を取得した。
（ii）pMAMneo（Clontech社製）をＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで切断し、得られたｐｏｌｙＡカセットを含有する８７０ｂｐのＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ断片をpBluescriptIISK（-）（STRATAGENE社製）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングした。
サブクローニング後、ＢａｍＨＩで切断し、ＸｈｏＩリンカー（宝酒造社製、4694P）を付加し、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、ｐｏｌｙＡカセット（両端がＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIの末端となる）を切り出した。
（iii）（ii）で得られたｐｏｌｙＡカセットをpBluescriptIISK（-）のＨｉｎｄIII／ＸｈｏＩ部位にサブクローニングし、ｐｏｌｙＡカセットを含むプラスミドを取得した。
（iV）（iii）で得られたプラスミドのＸｂａＩ部位に（i）で得られたＸｂａＩ切断断片をサブクローニングした。得られたプラスミドを以下、ｐＥＦＳＡと呼ぶ。
（V）ｐＮＫＭ１０１をＮｏｔＩで切断し、得られた４．２ｋｂのＮｏｔＩ断片を平滑末端化後、pBluescriptIISK（-）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングした。
サブクローニング後、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、４．２ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII断片を切り出した。
（Vi）（V）で得られた断片をｐＥＦＳＡのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII部位にサブクローニングし、プラスミドｐＲＥＳを得た。
該ｐＲＥＳをＮｏｔＩで切断し、線状化した後、５．７ｎｇ／ｍｌ（約５００コピー／ｍｌ）の濃度となるようにＰＢＳに溶解してマイクロインジェクション用ＤＮＡ液として用いた。
（２）トランスジェニックマウスの作成
トランスジェニックマウスは通常のマイクロインジェクション法で作成した（発生工学実験マニュアル−トランスジェニックマウスの作り方  野村達次監修  勝木元也編  講談社サイエンティフィック  1987）。
具体的には、
（i）Ｃ５７ＢＬ／６とＣ３ＨのＦ１（ＢＣＦ１）のメス（８〜１６週令）に７単位のセロトロピン（帝国臓器社製）を腹腔内投与した。投与４８時間後に７単位のゴナドトロピン（帝国臓器社製）を腹腔内投与し、Ｃ３Ｈのオスと交配した。
（ii）翌日、交尾したメスの卵管膨大部より受精卵を採取した。正立顕微鏡下でマイクロマニピュレータ（成茂社製）を用いて、（１）で調製したマイクロインジェクション用DNA液を受精卵の雄性前核に注入した。
（iii）（i）を行う前日に精管結紮オス（ＩＣＲ）と交配し、偽妊娠を誘発しておいたメス（ＩＣＲ、８〜１６週令）の卵管に、（ii）で調製した受精卵を移植した。
（iV）移植後２０日目に誕生した子マウスの尾を４〜５週令になった時点で切断し、染色体ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを用いて以下（３）に記載の方法で遺伝子型を解析した。
（３）遺伝子型の解析
（i）上記で取得したマウスの尾にリシス緩衝液２ｍｌを加え、５０℃で一晩放置した。
（ii）（i）の放置液に等量のフェノールを添加し、フェノール抽出を行い、その上清１ｍｌをＰＣＲの鋳型として用いた。
ＰＣＲのプライマーとして、配列番号２５〜２９に示される５種類のＤＮＡを用いた。
配列番号２５および２６に示された塩基配列を有するＤＮＡはｐＮＫＭ１０１のｃＤＮＡ部分の塩基配列から合成したもので、該ｃＤＮＡが存在すれば３３９ｂｐの断片が増幅される。染色体由来のＤＮＡでは両プライマー間にイントロンが存在するため、染色体ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片は増幅されない。
配列番号２７に示された塩基配列を有するＤＮＡは変異型対立遺伝子（ｐｇ）および野生型対立遺伝子（＋）に共通に存在する部分、配列番号２８に示された塩基配列を有するＤＮＡは変異型対立遺伝子にのみ存在する部分、配列番号２９に示された塩基配列を有するＤＮＡは野生型対立遺伝子にのみ存在する部分から合成した。
従って、ｐｇ／ｐｇでは配列番号２７に示された塩基配列を有するＤＮＡと配列番号２８に示された塩基配列を有するＤＮＡの間で増幅される９２０ｂｐの断片が、＋／＋では配列番号２７に示された塩基配列を有するＤＮＡと配列番号２９に示された塩基配列を有するＤＮＡの間で増幅される４５８ｂｐの断片が、ｐｇ／＋ではその両方が生じる。
LA PCRキット（宝酒造社製）を用い、全５０μｌの系〔１ｘ ＬＡ ＰＣＲ緩衝液II（Mg plus）、ｄＮＴＰの各成分各々４００ｍＭを含む混合液、プライマー各々０．２ｍＭ、TaKaRa LATaq ２．５Ｕ〕、下記条件下で、ＰＣＲを行った。
即ち、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480を用い、９４℃で１．５分間加熱後、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１．５分間の工程を１サイクルとして３０サイクル行い、更に７２℃で１０分間加熱した。
（４）トランスジェニックマウスとｐｇ／＋を示すマウスとの交配
（２）で取得した子マウス１６１匹を（３）の方法でスクリーニングしたところ、３７匹が老化抑制遺伝子を有するトランスジェニックマウスであった。
該トランスジェニックマウスをｐｇ／＋を示すマウスと交配し、Ｆ１においてｐｇ／＋の遺伝子型で老化抑制遺伝子を有するトランスジェニックマウスを得た。
該Ｆ１に導老化抑制遺伝子を伝達できたものは３１系統あった。
老化抑制遺伝子をもつｐｇ／＋同士、またはｐｇ／＋と老化抑制遺伝子をもつｐｇ／＋を交配し、Ｆ２において３系統の老化抑制遺伝子をもつｐｇ／ｐｇを取得した。
結果を第１および２表に示した。
0004112627.tif 000002
0004112627.tif 000003
早期老化様症状を示していたｐｇ／ｐｇマウスが老化抑制遺伝子を有することにより該症状を示さなくなることが確認された。
従って該遺伝子が早期老化マウスでの早老症状の原因遺伝子であることが明らかになるとともに、早期老化様症状を示す個体において該遺伝子を発現させることにより、早期老化症状が抑制されることが示された。
実施例２７：マウス由来の老化抑制遺伝子を含む組換えアデノウイルスを用いた早期老化様症状を示すマウスから該症状の改善されたマウスの取得
マウス由来老化抑制遺伝子を含む組換えアデノウイルスの作製は基本的には三宅らの方法〔Proc.Natl Acad.Sci.USA.,93,1320（1996）〕に従った。
具体的にはマウス由来老化抑制遺伝子を含むプラスミドｐＮＫＭ１０１をＮｏｔＩおよびＸｂａＩで切断し、得られた該遺伝子含む３．１ｋｂ断片をDNA Blunting kit（宝酒造社製）により、両末端を平滑化した。
該断片３μｇとＥ３、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ領域を欠失した５型アデノウイルスゲノムおよびサイトメガロウイルスエンハンサー、チキンβアクチンプロモーターのキメラプロモーター（ＣＡＧプロモーター）を含むコスミドｐＡｘＣＡｗｔ〔鐘ヶ江らNucl.Acids.Res.,23,3816（1995）〕のＳｗａＩ断片１μｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、該溶液にＴ４ＤＮＡリガーゼを１単位加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該リガーゼ反応液およびGigapack II XL Packaging Extract（Stratagene社製）を用いてin vitro packagingを行い、得られたファージを大腸菌DH5αへ感染させ、組換えコスミドを取得した。
なお、組換えコスミドでのマウス由来老化抑制遺伝子のプロモーターに対する方向の確認は、コスミドをＢａｍＨＩで切断後、１．６ｋｂの断片を検出することにより行った。
このようにして得られたコスミド８μｇとＥｃｏＴ２２Ｉにより切断されたＥ３、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂを欠損した５型アデノウイルスAd5dIXＤＮＡ〔J.Virology.,54,711（1985）〕１μｇとを混合し、CellPhect Transfection Kit（Pharmacia Biotech社製）を用い、６ｃｍシャーレにリン酸カルシウム法で、２９３細胞へトランスフェクションを行った。
以後は鐘ヶ江らの方法〔バイオマニュアルシリーズ,4,43-58，羊出社（1994）〕に従い組換えウイルスを取得した。
該組換えウイルスを、鐘ヶ江らの方法〔Jpn.J.Med.Sci.Biol.,47,157（1994）〕に従い２回の塩化セシウム密度勾配により精製し、１０％グリセロールを含むＰＢＳで懸濁後、−８０℃に保存し適宜使用した。
該組換えウイルス溶液のウイルスの力価は鐘ヶ江らの方法〔Jpn.J.Med.Sci.Biol.,47,157（1994）〕に従い算定したところ、１ｘ１０10ｐｆｕ／ｍｌのウイルスを含んでいることがわかった。
このようにして得られた組換えウイルス５ｘ１０8ｐｆｕを３から４週齢の早期老化様症状を示すマウスの尾静脈に接種し、その経過を観察した。
結果を第３７図に示した。
該ウイルスを接種したマウスにおいて、体重増加、延命が認められ、早期老化様症状の解消がみられた。
実施例２８：大腸菌によるヒト老化抑制ポリペプチドＮ末端領域発現用プラスミドｐＹＳ２０１の構築
実施例６で作製したｐＳｕｐｅｘの（ＫｐｎＩ平滑末端化処理）−ＥｃｏＲＶ断片と実施例５記載のｐＮＫＭ１０３のヒト由来老化抑制ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＳａｃＩＩの６２３ｂｐ断片とを連結することにより、ヒト老化抑制ポリペプチドＮ末端領域発現ベクターｐＹＳ２０１の構築を以下のように行った（第３８図）。
実施例５で取得したｐＮＫＭ１０３を１０μｇ、３０μｌの３３ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、６６ｍＭ 酢酸カリウム、０．０１％ ＢＳＡおよび０．５ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液に添加後、該緩衝液に２０単位のＳａｃIIを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収し、DNA blunting kit（宝酒造社製）により平滑末端化処理を行った。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、配列番号１に示した老化抑制ポリペプチドのＧｌｙ55からＰｒｏ261のアミノ酸残基を含む断片をコードするＤＮＡを含む約０．６ｋｂのｐＮＫＭ１０３の平滑化処理ＳａｃＩＩ断片を約０．３μｇ回収した。
実施例６、工程５で得られた大腸菌用発現ベクターｐＳｕｐｅｘを３μｇ、３０μｌのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウムおよび１ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収し、DNA blunting kit（宝酒造社製）により平滑末端化処理を行った。
さらにフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、該ＤＮＡを３０μｌの５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウムおよび１ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液に添加後、該緩衝液に１０単位のＥｃｏＲＶを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、約３．８ｋｂのｐＳｕｐｅｘの（平滑化処理ＫｐｎＩ）−ＥｃｏＲＶ処理断片を約２μｇ回収した。
得られた断片を４４μｌのＨ2０に溶解させた後、５μｌの０．５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ユニットのアルカリフォスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を添加し、３７℃で３０分間静置した。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収した。
上述のｐＮＫＭ１０３の平滑化処理ＳａｃＩＩ断片５０ｎｇおよびｐＳｕｐｅｘのアルカリフォスファターゼ処理を行った（平滑化処理ＫｐｎＩ）−ＥｃｏＲＶ処理断片１００ｎｇを２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１００単位を加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、プラスミドｐＹＳ２０１を得た（第３８図）。
実施例２９：大腸菌でのヒト由来老化抑制ポリペプチドＮ末端領域の発現
実施例２８で取得したｐＹＳ２０１を大腸菌ＮＹ４９株に導入した。該菌株を実施例７記載の方法と同様にしてヒト由来老化抑制ポリペプチドＮ末端領域の発現を行った。
即ち、７５μｇ／ｍｌ アンピシリンおよび２ｍｇ／ｍｌ カザミノ酸を添加した４００ｍｌのＭ９最少培地（Molecular Cloning,A laboratory manualに記載の培地）中で、上記菌株を３７℃、２時間培養後、５０μｇ／ｍｌのインドールアクリル酸を添加し、更に、３７℃で１８時間培養した。
得られた培養液４００ｍｌを３，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離し、大腸菌を含む沈殿を７ｍｌの緩衝液１〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウムからなる緩衝液〕中に懸濁し、超音波処理することにより菌体を破壊した。
該処理液を１０，０００ ｘ ｇで３０分間遠心分離し、得られた沈殿をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー〔６ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、５％ ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液〕に溶解した。
該溶液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分画し、該ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。
結果を第３９図に示す。
分子量約２６ｋＤのヒト由来老化抑制ポリペプチドＮ末端領域（以下、ペプチドＳＵＨＮと呼ぶ）の生産が確認された。該電気泳動において、分子量マーカーとしてphosphorylase b（94,000）、牛血清アルブミン（67,000）、ovalbumin（43,000）、carbonic anhydrase（30,000）、soybean trypsin inhibitor（20,000）、lysozyme（14,400）を用いた。
実施例３０：ヒト老化抑制ポリペプチドＣ末端領域発現ベクターｐＹＳ２０２の構築
実施例２８で作製したｐＳｕｐｅｘの（ＫｐｎＩ平滑末端化処理）−ＥｃｏＲＶ断片と実施例５記載のｐＮＫＭ１０３のヒト由来老化抑制ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＫｐｎＩ−ＡｐａＩの４６７ｂｐ断片とを連結することにより、ヒト老化抑制ポリペプチドＣ末端領域発現ベクターｐＹＳ２０２の構築を以下のように行った（第４０図）。
実施例５で取得したｐＮＫＭ１０３を１０μｇ、３０μｌの１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウムおよび１ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液に添加後、該緩衝液に２０単位のＡｐａIとＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。
該反応液を用いて、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ断片を回収し、DNA blunting kit（宝酒造社製）により平滑末端化処理を行った。
該反応液中の上記処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分画し、配列番号１に示した老化抑制ポリペプチドのＰｈｅ801からＰｒｏ954のアミノ酸残基を含む断片をコードするＤＮＡを含む約０．５ｋｂのｐＮＫＭ１０３の平滑化処理ＡｐａI−ＫｐｎＩ断片を約０．３μｇ回収した。
上述のｐＮＫＭ１０３の平滑化処理ＡｐａI−ＫｐｎＩ断片５０ｎｇおよび実施例２８記載のｐＳｕｐｅｘのアルカリフォスファターゼ処理を行った（平滑化処理ＫｐｎＩ）−ＥｃｏＲＶ処理断片１００ｎｇを２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１００単位を加え、１６℃で１８時間結合反応を行った。
該反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、プラスミドｐＹＳ２０２を得た（第４０図）。
実施例３１：大腸菌でのヒト由来老化抑制ポリペプチドＣ末端領域の発現
実施例３０で取得したｐＹＳ２０２を大腸菌ＮＹ４９株に導入した。該菌株を実施例７記載の方法と同様にしてヒト由来老化抑制部分断片ポリペプチドＣ末端領域の発現を行った。
即ち、７５μｇ／ｍｌ アンピシリンおよび２ｍｇ／ｍｌ カザミノ酸を添加した４００ｍｌのＭ９最少培地中で、上記菌株を３７℃、２時間培養後、５０μｇ／ｍｌのインドールアクリル酸を添加し、更に、３７℃で１８時間培養した。
得られた培養液４００ｍｌを３，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離し、大腸菌を含む沈殿を７ｍｌの緩衝液１中に懸濁し、超音波処理することにより菌体を破壊した。
該処理液を１０，０００ ｘ ｇで３０分間遠心分離し、得られた沈殿をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファーに溶解した。該溶液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、該ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。
結果を第４１図に示す。
分子量１８ｋＤのヒト由来老化抑制ポリペプチドＣ末端領域（以下、ペプチドＳＵＨＣと呼ぶ）の生産が確認された。該電気泳動において、実施例２９で用いた分子量マーカーと同じものを用いた。
実施例３２：ヒト老化抑制ポリペプチド部分断片と反応するモノクローナル抗体の生産
実施例２９および実施例３１で大腸菌を宿主として生産されたペプチドＳＵＨＮおよびペプチドＳＵＨＣを実施例８と同様に精製した。
精製されたペプチドＳＵＨＮおよびペプチドＳＵＨＣの分子量はそれぞれ約２６ｋＤ、約１８ｋＤであった。
実施例８に記載の方法に準じラットを免疫し、実施例９と同様にモノクローナル抗体を作成した。
第３表に作成されたモノクローナル抗体の一覧を示す。
ハイブリドーマＫＭ２０７０株、ＫＭ２０７６株、ＫＭ２１０５株、ＫＭ２１１６株、ＫＭ２１１９株は、それぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−６１９６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１９７、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１９８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１９９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２００、として、平成９年１２月９日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）に寄託されている。
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実施例３３：ヒト老化抑制ポリペプチド部分断片と反応するモノクローナル抗体を用いる老化抑制ポリペプチドの検出
（１）ＣＨＯ発現マウス完全長タンパクおよびマウス組織のウェスタンブロット
野生型ICRマウスの腎、肝、ホモ型ICRマウス（老化マウス）の腎、肝を、ホモゲナイズ用緩衝液〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）、０．２５Ｍ Ｓｕｃｒｏｓｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ 2-mercaptoethanol〕中で粉砕し、超遠心分離（100,000 x g、４℃、１時間）を行い、膜画分（沈殿）と細胞質画分（上清）に分けて回収した。
得られた膜画分を溶解用緩衝液〔１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ〕に溶解させた。また、実施例１１に示したマウス膜型完全長発現ＣＨＯ細胞をＰＢＳで洗浄後、溶解用緩衝液で可溶化した。各組織の膜画分と細胞質画分（２０μｇ）およびマウス膜型完全長発現ＣＨＯ細胞セルライセイト（２μｇ）、およびマウス膜型完全長発現ＣＨＯ細胞の培養上清（１５μｌ）を用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲルからＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。
転写後、５％スキムミルクを含むPBS-Tween中で20分間ブロッキングを行い、ＫＭ２０７６、ＫＭ２１１６、ＫＭ２１１９の各ハイブリドーマ培養上清とそれぞれ室温１時間反応させた。PBS-Tweenで１時間洗浄後、第２抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（アマシャム社、４０００倍希釈）を室温で３０分反応させた。
反応後、PBS-Tweenで１時間洗浄後、ECLウェスタンブロッティング検出試薬（アマシャム社）を反応させ、Ｘ線フィルムに感光させ、バンドを検出した。
結果を第４２図および第４３図に示した。
ＫＭ２０７６は腎膜画分において野生型特異的に約１３０ｋＤａのバンドを認識した。この約１３０ｋＤａのバンドは、アミノ酸配列より推定される分子量に近いこと、およびＣＨＯ細胞で発現されたマウス膜型完全長タンパクの大きさとほぼ一致することから、膜型完全長タンパクであると考えられる。また、ＫＭ２０７６はマウス膜型完全長発現ＣＨＯ細胞の培養上清中に約７０ｋＤａのバンドを認識した。
ＫＭ２１１９は腎膜画分において野生型特異的に約１３０ｋＤａの膜型完全長のバンドと約６０ｋＤａのバンドを認識した。約６０ｋＤａのバンドは、ＫＭ２０７６（ヒトＮ末認識抗体）では検出されずＫＭ２１１９（ヒトＣ末認識抗体）でのみ検出されることから、完全長タンパクのＮ末側が切断されて残ったＣ末側断片であると考えられる。そして、ＫＭ２０７６が認識したマウス膜型完全長発現ＣＨＯ細胞の培養上清中の約７０ｋＤａのバンドは、Ｎ末側の切断断片であると思われる。またＫＭ２１１９は、腎および肝の細胞質画分に野生型・ホモ型ともに反応する非特異な約６６ｋＤａのバンドを認識した。一方、ＫＭ２１１６は、腎膜画分に野生型特異的に完全長タンパクを認識したが、約７０ｋＤａの非特異的なバンドも検出した。
（２）ＣＨＯ発現マウス完全長タンパクおよびＣＨＯ発現ヒト分泌型タンパクの免疫沈降
実施例１１に示したマウス膜型完全長タンパク発現ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ細胞を、溶解用緩衝液〔１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ〕で可溶化した。この溶液を２００μｌに免疫沈降用緩衝液〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ〕８００μｌを加えて全量を１ｍｌとし、Protein G-Sepharose 4FF（ファルマシア社）２５μｌを添加して４℃で１時間反応させた。遠心分離（１００００ ｘ ｇ、４℃、５分）により上清を回収し、KM2076またはＫＭ２１１９精製抗体１μｇを添加して４℃で１時間反応させた。更にProtein G-sepharose 4FFを２５μｌ添加して４℃で１時間反応させた。また実施例１７に示したヒト分泌型タンパク発現ＣＨＯ細胞の培養上清１ｍｌをProteinG-sepharoseにＫＭ２０７６をあらかじめ結合させておいたものと、同様に４℃で１時間反応させた。これらの反応物を免疫沈降用緩衝液で洗浄した後、遠心分離（10,000 x g、４℃、５分）により沈殿物を回収し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後ゲルからＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。５％スキムミルクを含むPBS-Tween中で２０分間ブロッキングを行い、ＫＭ２０７６、ＫＭ２１１９を用いてウェスタンブロットを行った。その結果、第４４図で示すように、ＫＭ２０７６を用いた免疫沈降により膜型完全長タンパクが回収され、ＫＭ２１１９を用いた免疫沈降では膜型完全長タンパクとＣ末側断片タンパクが回収された。第４５図で示すように、ヒト分泌型タンパクもＫＭ２０７６を用いた免疫沈降により同様に回収された。
（３）ヒト組織切片を用いた免疫組織染色
ヒト腎２検体、ヒト肝２検体のホルマリン固定パラフィン包埋組織を４ｍｍに薄切し、スライドガラス上に固定した。キシレンで脱パラフィン後、アルコールー水で段階的に親水化し、さらに１％過酸化水素水を含むメタノール中で１５分処理し、内在性ペルオキシダーゼをブロックした。切片をPBSで洗浄後、希釈した正常ウマ血清中で２０分ブロッキングし、ＫＭ２０７０、ＫＭ２１１６（１０ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ室温３０分反応させた。よく洗浄した後、第二抗体として、ビオチン標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ベクター社、２００倍希釈）を室温で３０分反応させ、洗浄した後、ＡＢＣリエージェント（ベクター社製）を室温で３０分反応させた。PBSで洗浄後、ジアミノベンチジン基質溶液〔ジアミノベンチジン５０ｍｇを１５０ｍｌの０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ＰＨ７．２）に溶解後、濾過し、過酸化水素５０ｍｌを加えた〕中で約１分発色させ、氷冷中で反応を停止させた。ヘマトキシレンにて核染色し、アルコールー水およびキシレンで脱水後、エンテランニューで封入し、顕鏡した。その結果、第４表に示すように、ＫＭ２０７０はヒト腎の腎尿細管および血管平滑筋に反応したが、ＫＭ２１１６はヒト腎の遠位尿細管に特異的に反応した。ヒト肝については、ＫＭ２０７０、ＫＭ２１１６ともに、肝細胞に反応した。ＫＭ２１１６によるウエスタンブロッティングで、野生型ＩＣＲマウスの腎の膜画分に検出され、ホモ型マウス（老化マウス）の腎の膜画分には検出されないバンドがある第４３図ことからも、ＫＭ２１１６がヒトの病理切片の解析に有用であることが示された。
（４）マウス組織切片を用いた免疫組織染色
野生型ＩＣＲマウスの腎、肝それぞれ２検体、ホモ型ＩＣＲマウス（老化マウス）の腎、肝それぞれ２検体のホルマリン固定パラフィン包埋組織を４ｍｍに薄切し、スライドガラス上に固定した。ＫＭ２０７０、ＫＭ２１０５（１０ｍｇ／ｍｌ）について、（１）のＫＭ２０７０、ＫＭ２１１６と同様に免疫組織染色を行った。その結果、第４表に示すように、ＫＭ２０７０、ＫＭ２１０５は、野生型特異的に腎尿細管に反応した。しかし、ＫＭ２０７０は、野生型・ホモ型ともに血管平滑筋に反応した。さらに、ＫＭ２０７０、ＫＭ２１０５は、野生型・ホモ型両方の肝細胞に反応した。
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産業上の利用可能性
本発明によれば、老化を抑制する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有する早期老化症治療薬、成人病治療薬もしくは老化抑制薬、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する早期老化症治療薬、成人病治療薬もしくは老化抑制薬、該ＤＮＡを用いる家畜の改良法、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体を含む形質転換体、該形質転換体を用いた本発明のポリペプチドの生産法、該ポリペプチドを認識する抗体、該抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法もしくは老化診断法、本発明のポリペプチドに対するリガンドの探索方法、該リガンド、本発明のポリペプチドとリガンドとの特異的な結合を阻害する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法により得られた化合物、本発明の老化抑制ポリペプチドをコードする老化抑制遺伝子の発現を増加させる化合物のスクリーニング方法、および、該スクリーニング方法により得られた化合物を提供することができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：1,012
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源：
生物名：ヒト
臓器：腎臓
配列
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配列番号：２
配列の長さ：549
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名：ヒト
臓器：腎臓
配列
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配列番号：３
配列の長さ：1,014
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名：マウス
臓器：腎臓
配列
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配列番号：４
配列の長さ：550
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名：マウス
臓器：腎臓
配列
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配列番号：５
配列の長さ：1,015
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名：ヒト
臓器：膵臓
配列
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配列番号：６
配列の長さ：3,163
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源：
生物名：ヒト
臓器：腎臓
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：9..3047
特徴を決定した方法：E
配列
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配列番号：７
配列の長さ：3,435
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源：
生物名：ヒト
臓器：腎臓
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：9..1655
特徴を決定した方法：E
配列
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配列番号：８
配列の長さ：5,032
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源：
生物名：マウス
臓器：腎臓
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：19..3060
特徴を決定した方法：E
配列
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配列番号：９
配列の長さ：1650
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源：
生物名：マウス
臓器：腎臓
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..1650
特徴を決定した方法：E
配列
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配列番号：１０
配列の長さ：3460
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源：
生物名：ヒト
臓器：膵臓
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：60..3107
特徴を決定した方法：E
配列
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配列番号：１１
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列：
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配列番号：１２
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列：
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配列番号：１３
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列：
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配列番号：１４
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列：
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配列番号：１５
配列の長さ：34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列：
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配列番号：１６
配列の長さ：34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列：
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配列番号：１７
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列：
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配列番号：１８
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列：
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配列番号：１９
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列：
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配列番号：２０
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列：
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配列番号：２１
配列の長さ：43
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列：
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配列番号：２２
配列の長さ：41
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：２３
配列の長さ：44
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：２４
配列の長さ：36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
起源：合成DNA
配列
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配列番号：２５
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：２６
配列の長さ：25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：２７
配列の長さ：19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：２８
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：２９
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0004112627.tif 000089
【図６】
0004112627.tif 000090
【図７】
0004112627.tif 000091
【図８】
0004112627.tif 000092
【図９】
0004112627.tif 000093
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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