(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物質と免疫学的に結合する物質を担持させたラテックス粒子、並びに、被測定物質判定部位が設けられた多孔性ストリップから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、被検液の展開経路上に、少なくとも１種の糖質が、上記ラテックス粒子１重量部に対して５０〜４，０００重量部担持されていることを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項２】
請求項１記載の免疫クロマトグラフィー装置であって、糖質が上記ラテックス粒子と共に多孔性マトリックス中に担持され、該多孔性マトリックスは上記多孔性ストリップと接触する状態で設置され、被検液添加後に毛管現象により上記ラテックス粒子が該多孔性マトリックス中から該多孔性ストリップ中へ移動可能とされていることを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項３】
糖質が単糖類、二糖類及びオリゴ糖からなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２記載の免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項４】
糖質がグルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース及びセロビオースからなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２記載の免疫クロマトグラフィー装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫クロマトグラフィー装置、特に糖質を担持させることにより判定結果の信頼性を向上させた免疫クロマトグラフィー装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、 抗原−抗体による特異的反応を利用して、検体中における特定の抗原または抗体を分析する免疫学的分析法が知られており、特に、免疫クロマトグラフィー装置を用いた方法（米国特許第４１６８１４６号、第４０９４８４７号、第４２３５６６０１号、第４３６１５３７号等）は、目視により簡便に被分析対象物質を検出することができるので広く利用されている。
【０００３】
これらの免疫クロマトグラフィー装置では、被測定物質と免疫学的に結合する物質を担持させる担体として、従来においては、 金コロイド粒子を用いたものが多かったが、近年、 反応の識別性や色の選択性の点からラテックス粒子を用いたものが主流になりつつある。
【０００４】
しかしながらラテックス粒子は、 金コロイド粒子等の他の担体に比べて一般に粒子径が大きく、 展開中に多孔性ストリップ内において、 目詰まりを起こし、 展開が阻害されるという問題があった。特に血清・血漿等を検体として用いた場合には、 目詰まりの度合が大きく、粒子が移動しないために、検出感度が低下する等の問題点があった。
【０００５】
上記問題点を解決するために、 多孔性ストリップの孔径を大きくして目詰まりの発生を抑える試みもなされているが、多孔性ストリップの孔径を大きくすると被検液の展開速度が増進し、検出感度が低下するなどの恐れがある。 また、血清・血漿等の検体を分析するのに際しては、 展開促進液や希釈液等を用いる方法も検討されているが、検体が希釈されるため測定感度が低下する等の問題点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記に問題点に鑑み、ラテックス粒子が展開中に目詰まりを起こすことのない免疫クロマトグラフィー装置を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、被測定物質と免疫学的に結合する物質を担持させたラテックス粒子、並びに、被測定物質判定部位が設けられた多孔性ストリップから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、被検液の展開経路上に、少なくとも１種の糖質が、上記ラテックス粒子１重量部に対して５０〜４，０００重量部担持されていることを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置である。
【０００８】
請求項２記載の発明は、 請求項１記載の免疫クロマトグラフィー装置であって、糖質が上記ラテックス粒子と共に多孔性マトリックス中に担持され、該多孔性マトリックスは上記多孔性ストリップと接触する状態で設置され、被検液添加後に毛管現象により上記ラテックス粒子が該多孔性マトリックス中から該多孔性ストリップ中へ移動可能とされていることを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置である。
【０００９】
請求項３記載の発明は、糖質が単糖類、二糖類及びオリゴ糖からなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２記載の免疫クロマトグラフィー装置である。
【００１０】
請求項４記載の発明は、 糖質がグルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース及びセロビオースからなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２記載の免疫クロマトグラフィー装置である。
【００１１】
以下、本発明である、被測定物質と免疫学的に結合する物質を担持させたラテックス粒子、並びに、被測定物質判定部位が設けられた多孔性ストリップから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、被検液の展開経路上に、少なくとも１種の糖質が、上記ラテックス粒子１重量部に対して５０〜４，０００重量部担持されていることを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置について説明する。
【００１２】
上記被測定物質と免疫学的に結合する物質を担持させたラテックス粒子は、例えば、 被測定対象物質が、抗原または抗体であれば、それに対応する抗体または抗原が担持されたラテックス粒子である。 担持の方法としては、 公知の物理結合法あるいは化学結合法（カルボジイミド法、 グルタルアルデヒド法等）を用いることができる。
【００１３】
上記ラテックス粒子としては特に限定されないが、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等の微粒子等が挙げられ、特にスチレン系のものが好ましい。
【００１４】
上記ラテックス粒子の色は、 多孔性ストリップと識別可能な色とされているのが好ましい。
【００１５】
上記ラテックス粒子の粒径は、特に限定されるものではないが、５０〜５０００ｎｍが好ましい。
【００１６】
また、上記ラテックス粒子には、 免疫学的に不活性な物質を担持させるブロッキング処理を行ってもよい。 免疫学的に不活性な物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、 牛血清アルブミン、オボアルブミン、ラクトアルブミン、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
【００１７】
上記被測定物質判定部位が設けられた多孔性ストリップの材質としては、一般的な免疫クロマトグラフィー装置に用いられる多孔質の展開用部材を用いることができ、例えば、ガラス繊維や不織布等の繊維状部材、濾紙あるいはニトロセルロース・ナイロン・ポリエチレン製の多孔性部材等を用いることができる。これらのなかでも特にニトロセルロース製の多孔性部材を用いるのが好ましい。
【００１８】
上記被測定物質判定部位は、被測定物質を介してラテックス粒子を捕捉できるように構成されるものであり、一般的に、被測定物質と免疫学的に結合する物質が固定化されたものである。
【００１９】
本発明においては、被検液の展開経路上に、少なくとも１種の糖質が、上記ラテックス粒子１重量部に対して５０〜４，０００重量部担持されていることを特徴とする。糖質が担持される場所は、被検液の展開経路上であれば特に限定されるものではないが、上記ラテックス粒子と共に多孔性マトリックス中に担持されるのがより好ましい。
【００２０】
上記多孔性マトリックスは、上記多孔性ストリップと接触する状態で設置されるものであり、被検液添加後、毛管現象により、ラテックス粒子が多孔性マトリックス中から多孔性ストリップ中へ移動できるように構成される。多孔性マトリックスの材質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ガラス繊維や不織布等の繊維状部材、濾紙あるいはニトロセルロース・ナイロンシ・ポリエチレン製の多孔性部材等を用いることができる。これらのなかでも特にガラス繊維や不織布を用いるのが好ましい。
【００２１】
本発明における糖質の担持量は、ラテックス粒子１重量部に対して５０〜４，０００重量部である。これは、糖質の担持量が、少なすぎるとラテックス粒子の目詰まり防止効果を発揮し得ないからである。なお、より好ましい糖質の担持量は、ラテックス粒子１重量部に対して１００〜１，２００重量部である。
【００２２】
上記糖質としては、多価アルコール・単糖類・二糖類・オリゴ糖等、一般的に糖質に分類される物質であればよいが、特に単糖類、二糖類及びオリゴ糖を用いるのが好ましい。なお、多価アルコール・単糖類・二糖類・オリゴ糖には、これらの修飾体も含まれるものとする。
【００２３】
上記多価アルコールとしては、例えば、ソルビトース、マンニトール等が挙げられる。
【００２４】
上記単糖類としては、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、エリスリトール等が挙げられる。
【００２５】
上記二糖類としては、例えば、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、セロビオース等が挙げられる。
【００２６】
上記オリゴ糖としては、例えば、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ポリデキストロース等が挙げられる。
【００２７】
上記糖質の中でも、特に、単糖類であるグルコース、フルクトース、マンノース、二糖類であるスクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、セロビオースから選ばれる少なくとも１種を用いるのがより好ましい。さらに、免疫クロマトグラフィー装置の製造時において加熱乾燥の工程がある場合には、トレハロースを用いるのがより好ましい。
【００２８】
上記糖質及び上記ラテックス粒子を多孔性マトリックス中に担持させる順序としては、特に限定されず、ラテックス粒子及び糖質を含有する水溶液を多孔性マトリックスに添加してもよいし、また、糖質を含有する水溶液を添加した後にラテックス粒子を含有する水溶液を添加しても、ラテックス粒子を含有する水溶液を添加した後に糖質を含有する水溶液を添加してよい。これらの水溶液を添加したあと、一般的には乾燥を行うが、その方法は特に限定されず、凍結乾燥、風乾、加熱乾燥、真空乾燥等のいずれをも用いることができる。
【００２９】
本発明の免疫クロマトグラフィー装置で分析を行う被検液としては、全血、血清、血漿等生体関連の試料ならば特に限定されないが、血清若しくは血漿であるのがより好ましい。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３１】
［実施例１］
１）免疫クロマトグラフィー装置の調製
ａ）ＨＢｓ抗原固定化多孔性ストリップの調製
Ｈｉ−ＦｌｏｗTMニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ：Millipore 社製）を幅５ｍｍ、長さ５０ｍｍに裁断し、その上端より３０ｍｍの部位に、２．０ｍｇ／ｍｌ濃度のＨＢｓ抗原を含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１μｌを円形状に塗布し、室温で２時間乾燥した。この後、牛血清アルブミン（ＤＩＦＣＯ社製）を１％（ｗ／ｖ）濃度で含有する１００ｍＭリン酸（ｐＨ７．５）に１時間浸漬し、ブロッキング処理を行った後、０．１％（ｗ／ｖ）のラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄して、室温で乾燥した。
【００３２】
ｂ）ＨＢｓ抗原感作ラテックス粒子の調製
青色着色ラテックス粒子分散液（カラーラテックスＣ−３００Ｂ、１０％（Ｗ／Ｖ）、粒子径３００ｎｍ、積水化学工業社製）１．０ｍｌに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）９ｍｌを加え、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。得られた沈渣に、０．５ｍｇ／ｍｌのＨＢｓ抗原を含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１ｍｌ加え、 十分混和して、 室温にて１時間攪拌した。 未反応のＨＢｓ抗原を除去するため、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行ない、 沈渣を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２．５ｍｌに懸濁させ、 再度遠心分離を行った。さらに１％（ｗ／ｖ）濃度の牛血清アルブミンを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２．５ｍｌに、沈渣を懸濁させ、 室温で１時間攪拌し、ブロッキング処理を行った。 その後、 １５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行ない、 牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）及びアジ化ナトリウム０．０１％（ｗ／ｖ）含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍｌに、上記沈渣を懸濁させ、冷蔵保存した。
【００３３】
ｃ）ラテックス粒子及び糖質の多孔性マトリックスへの担持
ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）及びスクロースを２０％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を調製し、 この液２０μｌを幅５ｍｍ、長さ１５ｍｍのガラス繊維フィルター（ＧＦＦ：Millipore 社製）に含漬させ、室温で乾燥させた。
【００３４】
ｄ）免疫クロマトグラフィー装置の調製
上記ａ）のＨＢｓ抗原を感作させたニトロセルロースメンブレンを５ｍｍ、長さ６０ｍｍの粘着基材に貼り、 下端に上記ｃ）のＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子等を含漬させたガラス繊維フィルターと５ｍｍ重なるようにして装着し、テープにて圧着して、免疫クロマトグラフィー装置を調製した。
【００３５】
２）検体の分析
上記免疫クロマトグラフィー装置のガラス繊維フィルターに、 ＨＢｓ抗体含有血清（２００ｎｇ／ｍｌ）を希釈した検体１００μｌを添加し、 青色のスポットが検出されるかどうかを判定した。 また、ガラス繊維フィルターと重なる部位のメンブレン上で、目詰まりして移動しない青色粒子を目視にて観察し、 目詰まりしないものを０、目詰まりが著しいものを５として６段階で評価して、目詰まり強度を算出した。 なお、目詰まり強度は３名の評価者による平均値を算出し、結果を表１に示した。
【００３６】
［実施例２］
上記１）ｃ）において、ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）及びスクロースを３０％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行った。
【００３７】
［実施例３］
上記１）ｃ）において、ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）及びスクロースを５０％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行った。
【００３８】
［実施例４］
上記１）ｃ）において、ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）及びスクロースを１００％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行った。
【００３９】
［実施例５］
上記１）ｃ）において、ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）及びトレハロースを２０％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行った。
【００４０】
［実施例６］
上記１）ｃ）において、ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）及びトレハロースを４０％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行った。
【００４１】
［実施例７］
上記１）ｃ）において、ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）及びトレハロースを８０％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行った。
【００４２】
［比較例１］
上記１）ｃ）において、ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）及びアジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行った。
【００４３】
［比較例２］
上記１）ｃ）において、ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）及びスクロースを４％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行った。
【００４４】
［比較例３］
上記１）ｃ）において、ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）及びスクロースを５００％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行った。
【００４５】
［比較例４］
上記１）ｃ）において、ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）及びトレハロースを４％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行った。
【００４６】
［比較例５］
上記１）ｃ）において、ＨＢｓ抗原を感作させた青色ラテックス粒子を０．１％（ｗ／ｖ）、牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）及びトレハロースを５００％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外、実施例１と同様にして行った。
【００４７】
【表１】
0004171135.tif 000002
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、ラテックス粒子を用いた免疫クロマトグラフィー装置において、ラテックス粒子が展開中に目詰まりを起こすのを防止することができ、検出感度を低下させることなく判定結果の信頼性を向上させることができる。