(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジフテリアトキシンもしくはジフテリアトキシンと交差反応性を示すＣＲＭ蛋白質の製造方法において、
プラスミドｐＮＧ２中に存在する複製開始点および選択性マーカーを含んでなるプラスミドｐＮＧ２−２２にジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質をコードする遺伝子を挿入したプラスミドを用いて、ジフテリアC7株（Corynebacterium diphtheria C7）の微生物の形質転換を行い、そして
該微生物による該遺伝子の発現に十分な条件下で上記トキシンもしくは蛋白質を発現させる、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
プラスミドｐＮＧ２中に存在する複製開始点および多重クローニング部位に連結している選択性マーカーを含んでなるプラスミドｐＮＧ２−２２にジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質をコードする遺伝子が挿入されたプラスミド。
【請求項３】
請求項２のプラスミドで形質転換されているジフテリア菌Ｃ７株（Corynebacterium diphtheria C7）の微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【背景】
ＣＲＭ１９７蛋白質は無毒な形態のジフテリアトキシンであるが、これをジフテリアトキシンから免疫学的に区別することは不可能である。毒素産生性を示すコリネファージβのニトロソグアニジン変異誘発で作り出される毒素産生性を示さないファージβ１９７tox-に感染させたジフテリア菌（Corynebacterium diphteriae）が、ＣＲＭ１９７を産生する（Uchida, T.他、 1971、 Nature New Biology 233:8-11）。このＣＲＭ１９７蛋白質の分子量は該ジフテリアトキシンと同じであるが、構造遺伝子内の１つの塩基が変化していることで（グアニンからアデニンへ）それとは異なっている。このように１つの塩基が変化していることが、成熟蛋白質内のアミノ酸置換（グリシンがグルタミン酸に置き換わっている）の原因になっており、それによってジフテリアトキシンの毒性がなくなっている。このＣＲＭ１９７蛋白質は、糖類のための安全で有効なＴ細胞依存担体であり、現在これは、インフルエンザ菌型ｂオリゴ糖ＣＲＭ１９７接合体ワクチン内で用いられている（HibTiter商標；Lederle Praxis Biologicals、 Rochester、 N.Y.）。
【０００２】
ワクチンで用いるに適した有意量でＣＲＭ１９７蛋白質を製造することは、蛋白質量が低いことが原因で妨げられてきた。毒素産生性を示さないコリネファージβ１９７の二重溶原菌（Rappuoli, R.、 1983、 Applied Env. Microbio. 46:560-564；R. Rappuoliに発行された米国特許第4,925,792号、およびRappuoli, R.、1983、 J. Bacteriol. 153:1202-1210）を用いてＣＲＭ蛋白質の産生を助長する技術が開発された。Rappuoliは、二重溶原菌（double lysogen）を用いることによって、単溶原菌（single lysogen）よりも３倍高い収率に及ぶＣＲＭ１９７収率を報告している。単溶原菌によるＣＲＭ１９７の産生レベルは適当であるが、ＣＲＭ１９７蛋白質が用いらているワクチン類の製造にとっては経済的に満足されるものではない。
【０００３】
コリネファージβの多重溶原菌（multiple lysogen）をジフテリア菌に導入するのは、ＣＲＭ１９７蛋白質、ジフテリアトキシン、またはジフテリアトキシンと交差反応性を示す他のＣＲＭ蛋白質を過剰生産し得る株を同定するにとって労力を必要とするスクリーニング方法である。加うるに、この方法の能力は、標準的組換え技術が用いられている蛋白質発現操作に限定されている。従って、コリネファージβを用いることなく遺伝子のコピー数を増大させるか、或はコリネファージβに溶原性を示す株からの上記蛋白質産生レベルを増大させることにより、ジフテリアトキシンおよびＣＲＭ蛋白質を有意量で生じさせ得る方法を開発することは有益である。
【０００４】
【発明の要約】
本発明は、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキシン、およびジフテリアトキシン遺伝子から誘導される他のＣＲＭ蛋白質、をコード化する遺伝子を操作して導入するための新規な方法およびプラスミド系、並びにこれらの手段で形質転換された微生物に関する。毒素産生性を示さないベータファージ由来ＣＲＭ１９７のための遺伝子とプラスミドｐＮＧ２−２２を結合させる、ｐＰＸ３５１１と表示する特に好適なＤＮＡプラスミドを記述する。この新規なプラスミド系は、多重溶原菌を用いることなくＣＲＭ１９７蛋白質を高レベルで発現し得る株に、ジフテリア菌株を形質転換させ得る。本発明は、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキシン、およびこのジフテリアトキシン遺伝子から誘導される他のＣＲＭ蛋白質の、蛋白質発現を増大させる精密な手段を提供するものである。プロモーターの力を増大させるか、或は鉄調節由来プロモーターを除去することにより、遺伝子発現を操作することも可能である。好適な態様において、このプラスミド系を用いることで、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキシン、またはこのジフテリアトキシン遺伝子から誘導される他のＣＲＭ蛋白質、との遺伝的融合として、他の蛋白質を発現させることができる。ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキシン、またはこのジフテリア遺伝子から誘導される他のＣＲＭ蛋白質由来の、調節およびプロセシング配列を用いて、コリネバクテリウム種内で外来蛋白質を発現させることができる。
【０００５】
【発明の詳細な記述】
本発明は、ジフテリアトキシン、ＣＲＭ１９７、およびジフテリアトキシン遺伝子から誘導される他のＣＲＭ蛋白質を、ワクチン類内で用いるか或は運用できるに適当な量でこれらの蛋白質を必要としている他の用途で用いるに充分な量で産生させる新規な方法およびプラスミド系に関する。このプラスミド系は、ジフテリアトキシン遺伝子もしくはＣＲＭ遺伝子をコリネバクテリウム種の中に導入してそれらのコピー数を増大させるに有効性を示す手段を提供する。このプラスミドは、それ自身の複製機能と共にそれ自身の独立したエピソームを有しており、従って、このプラスミドは、ジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ遺伝子の余分なコピーを宿主菌株（これらは、このような組み込みの能力を有していないか、或は以前にはファージβ１９７tox-に感染しなかった）の中に導入することができる。例えば、本発明のプラスミドを有するコリネバクテリウム種が産生するＣＲＭ１９７蛋白質レベルは、コリネファージβ１９７tox-に感染させたジフテリア菌の多重溶原菌が発現するＣＲＭ１９７蛋白質収率より良好でないにしても匹敵している。
【０００６】
本発明の高レベル産生プラスミドは、ジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質をコード化する遺伝子（それのプロモーターおよび調節シグナル配列を含む）；コリネバクテリウム属の複製開始点（その結果として得られるプラスミドがコリネバクテリウム種の中に導入され得るように）；並びに任意に多重クローニング部位に連結していてもよい、選択性マーカー；を含んでいる。このプラスミドを用い、ジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ遺伝子の発現を容易にするに充分な条件下で、コリネバクテリウム種の微生物、特にジフテリア菌の形質転換を行う。適切な増殖条件は、その宿主有機体に応じて本分野の技術者に容易に明らかであろう。例えば、コリネバクテリウム種を用いてＣＲＭ１９７、ジフテリアトキシンまたは他のＣＲＭ蛋白質を最適に産生させるには、この微生物を、低鉄もしくは脱鉄（deferated）媒体の中に維持する必要がある。
【０００７】
このプラスミドは、ジフテリアトキシンか或はこのジフテリアトキシン遺伝子から誘導されるＣＲＭ蛋白質、をコード化する遺伝子を含んでいる。ＣＲＭ蛋白質、即ち本発明のプラスミド構築物内で用いられ得る、ジフテリアトキシンと免疫学的交差反応を示す交差反応材料（Cross-Reacting Materials）の例には、これに限定されるものではないが、ＣＲＭ１９７、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ３０、ＣＲＭ２２８およびＣＲＭ１７６が含まれる。このＣＲＭ１９７蛋白質をコード化する遺伝子はジフテリアトキシン（ＤＴ）から誘導され、この後者の配列は、Greenfield他によって報告された（Greenfield, L.他、 1983、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 80:6853-6857）。このＤＴ遺伝子とＣＲＭ１９７遺伝子との間の違いは、構造遺伝子内の塩基の１つが変化している点である。これらのＣＲＭ遺伝子のいくつかに関するヌクレオチド配列が、Uchida, T.他（J. Biol. Chem.、 248:3838-3844、 1975）によって報告されている。このＣＲＭ遺伝子全体（それの調節シグナル配列を含む）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で製造され得る。他の増幅技術もしくは合成技術を用いても、このＣＲＭ１９７遺伝子もしくは他のＣＲＭ遺伝子を生じさせ得る。
【０００８】
ジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質をコード化する遺伝子上の調節シグナル遺伝子は、この蛋白質がその培地内に分泌されることを可能にしている。従って、この分泌された蛋白質は、その培地から回収された後、通常技術、例えば塩沈澱およびカラムクロマトグラフィーなどで精製され得る。
【０００９】
該多重クローニング部位は、好適にはｐＵＣ１８から誘導されるが、他の給源から誘導される多重クローニング部位、例えばpBluescriptもしくは他の合成多重クローニング部位も用いられ得る。また、この多重クローニング部位は、このプラスミドの作用性を干渉しないで全て除去され得る。どちらの場合も、このプラスミドの中に選択性マーカーを組み込む。この選択性マーカーとしては如何なる抗生物質耐性マーカーも用いられ、例えばこれに限定されるものではないが、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、カナマイシン耐性マーカーなどが用いられ得る。このコリネバクター（corynebacter）がその選択抗生物質に対して示す感受性を最初に試験する。これらの発現させた蛋白質をヒト用途で用いることを意図している場合クロラムフェニコールが好適である、と言うのは、クロラムフェニコールは上記目的に関してＦＤＡ（the Food and Drug Administration）に認可されているからである。プラスミド選択に関する他の方法、例えば重金属耐性もしくは栄養要求なども、抗生物質耐性マーカーに対する代替として用いられ得る。
【００１０】
本発明の高産生プラスミド類の構築で有効な複製開始点は、コリネバクテリウム種から誘導されるものである。ｐＰＸ３５１１に関して選択した複製開始点はジフテリア菌から誘導される。実施例セクションを参照のこと。他のコリネバクター複製開始点も用いられ得る。
【００１１】
好適な態様において、ジフテリア菌株Ｃ７を形質転換してＣＲＭ１９７蛋白質を高レベルで産生する菌株を生じさせ得る、ｐＰＸ３５１１と表示する新規な組換え型ＤＮＡプラスミドを用いることで、ＣＲＭ１９７蛋白質の高レベル発現を達成する。図１に示すプラスミドｐＰＸ３５１１には、ジフテリアトキシンから誘導されるＣＲＭ１９７遺伝子が含まれている。（Greenfield, L.他、 1983、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 80:6853-6857）。このプラスミドの残りの部分は親プラスミドｐＮＧ２−２２から誘導され、この中に該ＣＲＭ１９７遺伝子を挿入する。
【００１２】
プラスミドｐＰＸ３５１１は、最初にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてジフテリア菌由来ＣＲＭ１９７遺伝子を増幅させることを経由して作り出される。次に、このＣＲＭ１９７遺伝子を、選択性マーカーを含んでいるジフテリア菌プラスミド、例えばｐＮＧ２（Schiller, J.他、 1980、 Antimicrobial Agents and Chemotherapy 18:814-821）およびｐＮＧ２−２２（Serwold-Davis, T.M.他、 1990、 FEM Microbiol. Lett. 66:119-124）にクローン化する。これらのプラスミドの両方共、幅広い宿主域を有しており、今まで試験した全てのコリネフォーム（coryneforms）において低コピー数（５−１０コピー／細胞）で複製し得る。
【００１３】
親プラスミドｐＮＧ２は天然に存在しているジフテリア菌プラスミドであり、これは最初エリスロマイシン耐性臨床菌株から単離されたものであった。ｐＮＧ２に関する複製開始点は、２．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩフラグメント上に含まれている。この複製開始点を用いて、ｐＮＧ２−２２（Serwold-Davis, T.M.他、上記）およびｐＣＭ２．６（Schmit、 1991、 Infect. Immun. 59:1899-1904）と表示するクロラムフェニコール耐性ベクターを作り出した。
【００１４】
次に、エレクトロポレーションにより、その得られるｐＰＸ３５１１プラスミドを用いてジフテリア菌株Ｃ７の形質転換を行うことで、この細菌は、ファージβ１９７tox-存在なしでもＣＲＭ１９７を産生し得るようになる。他の形質転換技術、例えば公知の物理的および化学的手段も用いられ得る（Serwold-Davis他、上記）。このｐＰＸ３５１１を用いたエレクトロ形質転換技術を、また、ジフテリア菌Ｃ７（β１９７）tox-単溶原菌を用いて実施することによって、このＣＲＭ１９７蛋白質の産生レベルを上昇させる。この形質転換体が発現するＣＲＭ１９７蛋白質レベルは、単溶原菌であるジフテリア菌Ｃ７（β１９７）tox-（ATCC番号5328）および二重溶原菌であるジフテリア菌Ｃ７（β１９７）tox-Ｍ１（ATCC番号39255）［これはｐＰＸ３５１１プラスミドを有していない］による発現レベルに匹敵している。プラスミドｐＰＸ３５１１をジフテリア菌株Ｃ７に移入すると、その形質転換体は、ジフテリア菌の二重溶原菌株に匹敵するレベルでＣＲＭ１９７を発現し得ることが観察される。
【００１５】
本発明の他の態様において、この新規なプラスミドベクターを修飾して、種々の能力を有する１組のプラスミドベクターを作り出す。例えば部位特異的変異誘発を用いて、ＣＲＭ１９７内の単一塩基変化を修復することができ、その結果として、この新規なプラスミドはジフテリアトキシンを発現するようになる。このクローン化したＣＲＭ１９７遺伝子配列に他の変化を生じさせて、他の公知ジフテリアトキシンＣＲＭ蛋白質、例えばＣＲＭ４５、ＣＲＭ３０、ＣＲＭ２２８およびＣＲＭ１７６などを発現させるようにすることができる（Uchida, T.他、1973、J. Biol. Chem.、 248:3838-3844）。
【００１６】
組換えＤＮＡ技術を用い、ＣＲＭ１９７または他の同様にクローン化したジフテリアトキシンもしくはＣＲＭの遺伝子が有するジフテリアトキシン調節配列もしくはプロセシング配列に変化を生じさせることにより、更にこれらの蛋白質の産生量を上昇させ得る。例えば、ｔｏｘプロモーター領域を修飾して、そのプロモーターから鉄調節を取り除くことができる。
【００１７】
別の態様において、このプラスミドベクター系を修飾して、該ＣＲＭ１９７遺伝子または同様にクローン化したジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ遺伝子が有するアミノ末端に制限酵素クローニング部位を導入することができる。次に、これらのクローニング部位に他の蛋白質由来ＤＮＡ配列をクローン化することにより、該ＣＲＭ１９７蛋白質または同様にクローン化したジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質とのアミノ末端融合物として他の組換え型蛋白質もしくは抗原を、このプラスミドベクターが共発現するようにすることができ、ここで、これらの全てはそのｔｏｘプロモーターおよびシグナル配列の支配下にある。加うるにか或は別法として、該ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキシンまたは同様にクローン化されたＣＲＭ、が有するカルボキシ末端部分にクローニング部位を挿入することによって、カルボキシ末端融合物として他の蛋白質を発現させることも可能である。このＣＲＭ１９７調節シグナル配列が存在していることにより、その得られる融合蛋白質はその培養培地内に分泌される。また、他の蛋白質を分泌形態として培養培地内に発現させる手段として用いるに必要とされているのは、そのＣＲＭ１９７の調節シグナル配列のみである。
【００１８】
本発明の産生プラスミドで有効性を示す適切な蛋白質および抗原には、粒子状抗原、例えば細菌、ウイルス、寄生虫または菌・カビから誘導されるもの、並びに細胞および可溶抗原の微細成分、例えば蛋白質、ペプチド類、ホルモン類および糖蛋白質などが含まれる。特に興味の持たれる抗原はウイルス、菌・カビ、寄生虫もしくは細菌の抗原、アレルゲン、自己免疫関連抗原もしくは腫瘍関連抗原である。これらの抗原は天然源から入手可能であるか、或はこれらは組換えＤＮＡ技術または他の人工手段で製造され得る。
【００１９】
興味の持たれる細菌抗原の中には、ヒトの細菌病原体に関連している抗原があり、これらには、これに限定されるものではないが、例えば分類分け可能（typable）および分類分け不可能な（nontypable）インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、大腸菌（Escherichia coli）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、カタル球菌（Branhamella catarrhalis）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎かん菌（Klebsiella pneumoniae）および破傷風菌（Clostridium tetani）が含まれる。いくつかの特定的細菌抗原には、細菌の表面および外側膜蛋白質（例えば、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌またはカタル球菌由来）および細菌の表面蛋白質（例えば、化膿連鎖球菌由来Ｍ蛋白質または肺炎連鎖球菌由来の３７キロダルトン表面蛋白質）が含まれる。
【００２０】
病原性ウイルス由来のウイルス抗原には、これに限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（Ｉ型およびＩＩ型）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型）、ＲＳウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａおよび非Ｂ肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（Ｉ型およびＩＩ型）、シトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、風疹ウイルス、はしかウイルス、水痘ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルスおよび黄熱病ウイルスが含まれる。
【００２１】
これらの病原性ウイルスのいくつかの特定ウイルス抗原には、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）のＦ蛋白質（特に、表題が「ＲＳウイルス：ワクチンおよび診断アッセイ」であるParadiso, P.他の国際公開第89/02935号明細書の中に記述されているＦペプチド283-315を含んでいる抗原）およびＮおよびＧ蛋白質、ロタウイルスのＶＰ４（以前はＶＰ３として知られていた）、ＶＰ６およびＶＰ７、ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ糖蛋白質、Ｂ型肝炎の表面およびプレサーフェス（presurface）抗原、並びにヘルペス糖蛋白質ＢおよびＤが含まれる。
【００２２】
菌・カビの抗原は、これに限定されるものではないが、カンジダ（Candida）種[特にアルビカンス（albicans）］、クリプトコックス（Cryptococcus）種［特にネオフォルマンス（neoformans）］、ブラストミセス（Blastomyces）種［例えばデルマティティディス（dermatitidis）］、ヒストプラスマ（Histoplasma）種［特にカプスラーツム（capsulatum）］、コクシジオイデス（Coccidioides）種［特にイミティス（immitis）］、パラコクシジオイデス（Paracoccidioides）種［特にブラジルパラコクシジオイデス（brasiliensis）］およびアスペルギルス（Aspergillus）種を含む菌・カビから誘導される抗原であってもよい。寄生虫抗原の例には、これに限定されるものではないが、プラスモディム（Plasmodium）種、アイメリア（Eimeria）種、住血吸虫（Schistosoma）種、トリパノソーマ（Trypanosoma）種、バベシア（Babesia）種、リーシュマニア（Leishmania）種、クリプトスポリジア（Cryptosporidia）種、トキソプラスマ（Toxoplasma）種およびニューモシスティス（Pneumocystis）種から誘導されるものが含まれる。
【００２３】
以下に示す非制限的実施例を用いて本発明のさらなる説明を行う。
【００２４】
【実施例】
実施例１：構築物
細菌株
全てのクローニング操作において大腸菌ＤＨ５α（ＢＲＬ、Gaithersburg、 MD）を用いる。ＣＲＭ１９７蛋白質発現研究におけるプラスミドの宿主および対照の両方として、毒素産生性を示さず溶原性を示さないジフテリア菌Ｃ７（−）tox-株、毒素産生性を示さない単溶原ジフテリア菌Ｃ７（β１９７）tox-株（ATCC番号5328）を用いる。ＣＲＭ１９７蛋白質発現実験における対照として、毒素産生性を示さない二重溶原ジフテリア菌Ｃ７（β１９７）tox-株（ATCC番号39255）を用いる。
【００２５】
培養培地および条件
大腸菌株ＤＨ５αを３７℃の超最適ブロス（ＳＯＢ）寒天培地上およびＳＯＢ液内で常規通り増殖させる（Sambrook, J.他著「分子クローニング：実験室マニュアル」（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、 1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor、 NY）。ジフテリア菌Ｃ７株をＳＯＣ寒天培地（Sambrook, J.上記）および液内で常規通り培養する。エレクトロポレーションを行った細胞を平面培養する場合、ＥＴ浸透寒天培地（Best, G.R.およびM.L. Britz、 1986、 Appl. Microbiol. Biotech.、 23:288-293）を用いる。ＣＲＭ１９７の発現を伴う実験では、脱鉄ＣＹ培地（Rappuoli, R.他、 1983、 J. Bacteriol.、 153:1202）を用いる。クロラムフェニコールを、大腸菌ＤＨ５αでは３４μｇ／ｍＬ添加しそしてプラスミドｐＰＸ３５１１を含んでいるジフテリア菌Ｃ７株では２μｇ／ｍＬ添加する。
【００２６】
ＣＲＭ１９７遺伝子のクローニング
公開されているジフテリアトキシン配列（Greenfield, L.他、 1983、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6853-6857）を基準にしたオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、ジフテリア菌Ｃ７（β１９７）tox-単溶原菌ＤＮＡ由来の遺伝子配列をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅させることによって、ＣＲＭ１９７遺伝子のクローニングを行う。１つのプライマーがその機能遺伝子の開始点にＳａｌＩ／ＨｉｎｃＩＩ制限部位を作り出しそしてもう１つのプライマーがその構造遺伝子の遺伝子終止コドンの後ろにＸｂａＩ部位を作り出すように、上記プライマーの設計を行う。これらのもしくは同様なプライマーを用いて、このＣＲＭ１９７遺伝子か、ジフテリアトキシン遺伝子か、或はコリネファージβがコード化するジフテリアトキシン遺伝子に類似した何らかのＣＲＭ遺伝子の、増幅およびクローニングを行う。
【００２７】
このＣＲＭ１９７のＰＣＲ産物をＨｉｎｃＩＩおよびＸｂａＩで消化させた後、ＳｍａＩ／ＸｂａＩで消化させたｐＮＧ２−２２（大腸菌およびコリネバクテリウム種の両方の中で複製する能力を有する幅広い宿主域のクロラムフェニコール耐性ベクター）に結合させる。この連結反応を用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、そしてこのＣＲＭ１９７遺伝子の存在に関する制限分析により、組換え型コロニーのスクリーニングを行う。このＣＲＭ１９７遺伝子に対する何らかの変化を検査するための重なりプライマーを用いて、１つの単離物であるｐＰＸ３５１１の配列決定を行う。Applied Biosystems 380BＤＮＡシンセサイザーを用いて、ＰＣＲおよび配列決定で用いるオリゴヌクレオチドプライマー類の合成を行う。Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを用いてＰＣＲを行う。Applied Biosystems Sequencer 373Aを用いて配列決定を行う。その得られるプラスミド（ｐＰＸ３５１１）を、エレクトロポレーションにより、その毒素産生性を示さず溶原性を示さないジフテリア菌Ｃ７（−）tox-株および毒素産生性を示さないジフテリア菌Ｃ７（β197）tox-株（ATCC番号5328）に転移させる。
【００２８】
ジフテリア菌Ｃ７のエレクトロポレーション
Tween-80を０．２％補ったＳＯＣ培地を用いる以外は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）およびブレビバクテリウ・ラクトフェルメンツム（Brevibacterium lactofermentum）の形質転換を行う目的で開発されたプロトコル（Hayes, J.A.およびM.L. Britz、 1989、 FEMS Microbiol. Lett. 61:329-334）を用いたエレクトロポレーションにより、プラスミドｐＰＸ３５１１のＤＮＡを用いてジフテリア菌Ｃ７の形質転換を行う。エレクトロポレーションでは、Power PlusおよびOptimizor Graphic Pulse Analyzerが備わっているBTX Transfector 100、および間隙が１ｍｍのキュベットを用いる。プラスミドレスキューおよび制限分析により、その形質転換したジフテリア菌Ｃ７株内にプラスミドｐＰＸ３５１１が存在していることを確かめる。
【００２９】
実施例２：発現
定量的ＣＲＭ197発現研究
同様な条件下でジフテリア菌Ｃ７株を増殖させた後、その培養上澄み液内のＣＲＭ１９７量を比較することにより、ＣＲＭ１９７産生の比較を行う。これらの菌株の定量的比較では、４ｍＬの一晩培養物を脱鉄ＣＹ培地で希釈してＯＤ600＝０．１になるようにし（２５０ｍＬの三角フラスコ内の最終体積３０ｍＬ）、そして３７℃で２０時間振とうして増殖させる。ｐＰＸ３５１１を含んでいる菌株を、抗生物質選択の有り無し両方で増殖させる（２μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）。インキュベートした後、これらの培養物を遠心分離にかけることで細胞を除去し、そしてこの培養物の上澄み液２０μＬを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上で泳動させる。このゲルをクーマシー染色した後、Hoefer Scientific GS 370 Analysis Packageが備わっているBio-Rad Model 1650透過率／反射率走査濃度計（Transmittance/Reflectance Scanning Densitometer）を用いて定量比較を行う。このゲルのイムノブロッティングを行いそしてＣＲＭ１９７に対するモノクローナルを用いて検査することにより、組換え型ＣＲＭ１９７蛋白質と溶原性β１９７tox-のＣＲＭ１９７蛋白質が示す抗原特性の比較を行う。ｐＰＸ３５１１が産生するＣＲＭ１９７は、溶原性菌株が産生するＣＲＭ１９７と抗原的に同じである。
【００３０】
プラスミドｐＰＸ３５１１の安定性実験
抗生物質選択無しプラスミド保持の指示としてクロラムフェニコール耐性の持続を用いることにより、プラスミドｐＰＸ３５１１が示す安定性を試験する。細胞凝集を防止する目的でTween-80を０．１％補ったＳＯＣブロス内で１８時間（１４−１７世代）、３７℃で、ジフテリア菌Ｃ７（β１９７）tox-ｐＰＸ３５１１の培養物を増殖させる。次に、コロニーの数を数える目的で、これらの培養物をＳＯＣ寒天上で平面培養した後、次世代のために１／１０希釈する。これらのＳＯＣ寒天プレートを、クロラムフェニコールが２μｇ／ｍＬ入っているＳＯＣ寒天上でレプリカ平板培養した後、クロラムフェニコール耐性を維持しているコロニーのパーセントを計算する。６０世代に及んでこの方法を繰り返す。
【００３１】
実施例３：生物学的結果
クーマシー染色したゲルの濃度測定を用いた、異なるジフテリア菌Ｃ７株によるＣＲＭ１９７産生の定量的比較（図２）により、ｐＰＸ３５１１はその単溶原菌よりも約２倍多い量でＣＲＭ１９７を産生し、そしてその二重溶原菌と同様に多量産生することが示された（表１）。このプラスミドｐＰＸ３５１１が６０世代に渡って安定であることは、図３に示されている。
【００３２】
0004144813.tif 000002
生物学的寄託
ブタペスト条約の規定の下で、プラスミドｐＰＸ３５１１を1993年2月12日付けでthe American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ)、 12301 Parklawn Drive、 Rockville、 Maryland 20852に寄託し、ＡＴＣＣ取得番号75415と指定された。この寄託材料の公共利用に対する全ての制限は、本出願に対して特許が与えられた時点で最終的に取り除かれる。この寄託は、この寄託日から少なくとも３０年間か或はこの特許の有効期間か或はこの生物材料のサンプル提供に関する最も新しい要求日から５年間のいずれか長い方の期間に渡って、公共寄託所に維持される。この寄託物の活力がなくなるか或は複製能力がなくなる場合それを交換するものとする。
【００３３】
本分野の技術者は、常規実験を用いるのみで、本明細書で特定的に記述した本発明の特定態様に対する数多くの相当物を認識するか或は確かめることができるであろう。上記相当物を請求の範囲内に包含させることを意図している。
【００３４】
本発明の特徴および態様は以下のとうりである。
【００３５】
１．ジフテリアトキシンと交差反応性を示すジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質の製造方法において、ａ）ジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質をコード化する遺伝子、ｂ）コリネバクテリウム属の複製開始点、およびｃ）選択性マーカー、を含んでいるプラスミドを用いて、コリネバクテリウム種微生物の形質転換を行い、そして該微生物による該遺伝子の発現に充分な条件下で上記トキシンもしくは蛋白質を発現させる、ことを含む方法。
【００３６】
２．該形質転換方法がエレクトロポレーションによるものである第１項の方法。
【００３７】
３．該微生物がジフテリア菌である第１項の方法。
【００３８】
４．該ジフテリア菌株が株Ｃ７である第３項の方法。
【００３９】
５．該ＣＲＭ遺伝子がＣＲＭ１９７、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ３０、ＣＲＭ２２８およびＣＲＭ１７６から成る群から選択される第１項の方法。
【００４０】
６．該複製開始点がコリネバクテリウム属プラスミドｐＮＧ２から誘導される第１項の方法。
【００４１】
７．ａ）ジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質をコード化する遺伝子、
ｂ）コリネバクテリウム属の複製開始点、および
ｃ）任意に多重クローニング部位に連結している、選択性マーカー、
を含んでいる、宿主内でジフテリアトキシンと交差反応性を示すジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質を発現させるためのプラスミド。
【００４２】
８．該蛋白質をコード化する遺伝子が、作用を示す様式で、１種以上の蛋白質、ペプチド類またはそれらのエピトープ類をコード化するヌクレオチド配列に連結している第７項のプラスミド。
【００４３】
９．プラスミドｐＰＸ３５１１、ＡＴＣＣ取得番号７５４１５。
【００４４】
１０．第７項のプラスミドで形質転換されているコリネバクテリウム種の微生物。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＲＭ１９７のための遺伝子、クロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）マーカーを含んでいる大腸菌クローニングベクターｐＵＣ１８から誘導される多重クローニング部位、およびプラスミドｐＮＧ２−２２（Serwold-Davis, T.M.他、 1990、 FEM Microbiol. Lett. 66:119-124）から誘導される複製開始点、を含んでいる、ｐＰＸ３５１１と表示する組換え型ＤＮＡプラスミドの略図である。
【図２】異なるジフテリア菌株Ｃ７からのＣＲＭ１９７（６１．８キロダルトン）産生を示す１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果を示す図に代わる写真である。レーンＡ：高分子量の標準（ＢＲＬ、２００−１４．３キロダルトン）；レーンＢ：単溶原菌Ｃ７（β１９７）tox-；レーンＣ：二重溶原菌Ｃ７（β１９７）tox-；レーンＤ：クロラムフェニコール（Ｃｍ２）（２μｇ／ｍＬ）なしで増殖させたｐＰＸ３５１１を有する非溶原性Ｃ７（−）tox-；レーンＥ：クロラムフェニコール（２μｇ／ｍＬ）有りで増殖させたｐＰＸ３５１１を有する非溶原性Ｃ７（−）tox-；レーンＦ：クロラムフェニコール（２μｇ／ｍＬ）なしで増殖させたｐＰＸ３５１１を有する単溶原菌Ｃ７（β１９７）tox-；レーンＧ：クロラムフェニコール（２μｇ／ｍＬ）有りで増殖させた単溶原菌Ｃ７（β１９７）tox-。
【図３】抗生物質選択なしで、プラスミド保持の指示としてクロラムフェニコール耐性を用いた、ジフテリア菌Ｃ７（β１９７）tox-内におけるプラスミドｐＰＸ３５１１の安定性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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