(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の３８６番目のＡから１４８０番目のＣで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドの、動脈硬化、リュウマチ、加齢黄斑変性症、血管新生が関連する糖尿病性網膜症または癌のマーカーとしての使用。
【請求項２】
配列番号１の１番目のＣから１４８０番目のＣで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液を用いて６５℃で洗浄してハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつDNA合成阻害または細胞遊走阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、動脈硬化、リュウマチ、加齢黄斑変性症、血管新生が関連する糖尿病性網膜症または癌のマーカーとしての使用。
【請求項３】
配列番号１の１番目のＣから１４８０番目のＣで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドの、動脈硬化、リュウマチ、加齢黄斑変性症、血管新生が関連する糖尿病性網膜症または癌のマーカーとしての使用。
【請求項４】
配列番号１の１番目のＣから５４８１番目のＣで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドの、動脈硬化、リュウマチ、加齢黄斑変性症、血管新生が関連する糖尿病性網膜症または癌のマーカーとしての使用。
【請求項５】
ヒト由来の試料から請求の範囲１から４のいずれかに記載のマーカー を検出することを特徴とする、動脈硬化、リュウマチ、加齢黄斑変性症、血管新生が関連する糖尿病性網膜症または癌の検出方法。
【請求項６】
下記の工程を含む、配列番号１の３８６番目のＡから１４８０番目のＣで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその連続した２０個以上の塩基配列からなる断片を用いることを特徴とする、請求の範囲１から４のいずれかに記載のマーカーが関連する動脈硬化、リュウマチ、加齢黄斑変性症、血管新生が関連する糖尿病性網膜症または癌の検出方法、
（ａ）該ポリヌクレオチドと試料を接触させる工程、および
（ｂ）該ポリヌクレオチドと結合するポリヌクレオチドを検出する工程。
【請求項７】
下記の工程を含む、配列番号１の３８６番目のＡから１４８０番目のＣで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドの連続した２０個以上の塩基配列からなる断片を用いることを特徴とする、請求の範囲１から４のいずれかに記載のマーカーが関連する動脈硬化、リュウマチ、加齢黄斑変性症、血管新生が関連する糖尿病性網膜症または癌の検出方法、
（ａ）試料からｃＤＮＡを調製する工程、および
（ｂ）該ポリヌクレオチド断片によりｃＤＮＡを増幅し、検出する工程。
【請求項８】
請求の範囲５から７のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲１から４のいずれかに記載のマーカーが関連する動脈硬化、リュウマチ、加齢黄斑変性症、血管新生が関連する糖尿病性網膜症または癌の診断用キット。
【請求項９】
下記の工程を含む、請求の範囲１から４のいずれかに記載のマーカーの発現調節物質であって、動脈硬化、リュウマチ、加齢黄斑変性症、血管新生が関連する糖尿病性網膜症、または癌の治療剤に用いることを特徴とする物質のスクリーニング方法、
（ａ）請求の範囲１から４のいずれかに記載のマーカーを発現しうる細胞と被検物質を接触させる工程、および
（ｂ）該マーカーの発現量の増加を、請求の範囲６または７のいずれかに記載の方法を用いて検出する工程。
【請求項１０】
請求の範囲９に記載の方法を用いることを特徴とする、請求の範囲１から４のいずれかに記載のマーカーの発現調節物質のスクリーニング用キット。
【請求項１１】
配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とするＤＮＡ合成阻害剤。
【請求項１２】
配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする細胞遊走活性阻害剤。
【請求項１３】
請求の範囲１１に記載のＤＮＡ合成阻害剤、請求の範囲１２に記載の細胞遊走活性阻害剤、配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むヒト遺伝子治療用発現ベクター、および配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択される少なくとも１つを含む、動脈硬化、リュウマチ、加齢黄斑変性症、血管新生が関連する糖尿病性網膜症または癌の治療用医薬組成物。
【請求項１４】
請求の範囲１３に記載の医薬組成物を製造するための配列番号１で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌のマーカーとなるポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。また、本発明はそれらの疾患の治療に関する。
背景技術
ダブルアダプター法を利用してヒトゲノムのショットガンライブラリーが構築され、そのＤＮＡライブラリーよりＥＳＴクローンであるＡＦ０５５０２１（配列番号３）のヌクレオチド配列が決定された（ＡＮＬＩＴＩＣＡＬ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２３６，１０７−１１３（１９９６）．）。次いで、ＡＦ０５５０２１の完全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）が決定され、ＫＩＡＡ１０３６と命名された（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６（３）１９７−２０５（１９９９）．）。ＫＩＡＡ１０３６のポリペプチド（配列番号２）は、３６５個のアミノ酸からなるポリペプチドであるが、その機能は未だ解明されていない。
生体内において細胞が生存するためには、血液より供給される酸素および栄養素が必要であり、増殖の盛んな組織においては血管新生も盛んである。血管新生は、生理的に組織の再生に関与しているばかりでなく、病理的に細胞増殖の盛んな疾患にも関与していることが知られている。該疾患としては、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌などが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ，４０７，２４９（２０００）．）。さらに、悪性新生物細胞の増殖時に血管新生が見られることから、癌による血管新生のモデルとして血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）で処理したヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）が報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５，５２９６−５３０１（１９９５）．）。
前記に記載の種々の疾患に関与する遺伝子の研究がこれまで行われてきているが、その発症機構は完全には解明されておらず、未知の遺伝子の関与しうる可能性が考えられている。この様な状況の下、上記疾患の発症に関わる新規遺伝子の同定および同遺伝子を用いた疾患の診断方法が待望されていた。
発明の開示
本発明者らは、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの発現が卵巣癌および大腸癌組織中で増加しているしていることを見出し、該ペプチドが癌のマーカーとして有用であることを確認した。更に研究を進めた結果、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドが新規な血管新生マーカーであり、血管新生が関連する血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患、癌などの種々の疾患のマーカー、治療薬などとして有用であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号１の３８６番目のＡから１４８０番目のＣで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその断片を含む、血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌のマーカー；
（２）配列番号１の１番目のＣから１４８０番目のＣで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその断片からなる、血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌マーカー；
（３）配列番号１の１番目のＣから１４８０番目のＣで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその断片からなる、（１）記載のマーカー；
（４）配列番号１の１番目のＣから５４８１番目のＣで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその断片からなる、（１）記載のマーカー；
（５）配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその断片を含む、血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌のマーカー；
（６）配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加から選択される変異を有するポリペプチドまたはその断片からなる、血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌のマーカー；
（７）配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその断片からなる、（５）記載のマーカー；
（８）ヒト由来の試料から（１）から（７）のいずれかに記載のマーカーを検出する方法；
（９）下記の工程を含む、配列番号１の３８６番目のＡから１４８０番目のＣで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその断片を用いることを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載のマーカーの検出または定量方法、
（ａ）該ポリヌクレオチドと試料を接触させる工程、および
（ｂ）該ポリヌクレオチドと結合するポリヌクレオチドを検出する工程；
（１０）下記の工程を含む、配列番号１の３８６番目のＡから１４８０番目のＣで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその断片を用いることを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載のマーカーの検出または定量方法、
（ａ）試料からｃＤＮＡを調製する工程、および
（ｂ）該ポリヌクレオチド断片によりｃＤＮＡを増幅し、検出する工程；
（１１）下記の工程を含む、配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその断片を認識する抗体を用いることを特徴とする、（５）から（７）のいずれかに記載のマーカーの検出または定量方法、
（ａ）該抗体と試料を接触させる工程、および、
（ｂ）該抗体と結合するポリペプチドを検出する工程；
（１２）（９）から（１１）のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、（１）から（７）のいずれかに記載のマーカーが関連する疾患の検出方法；
（１３）疾患が血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌である（１２）に記載の検出方法；
（１４）（９）から（１１）のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、（１）から（７）のいずれかに記載のマーカーが関連する疾患の診断用キット；
（１５）疾患が血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌である（１４）に記載の診断用キット；
（１６）下記の工程を含む、（５）から（７）のいずれかに記載のマーカーの結合物質のスクリーニング方法、
（ａ）（５）から（７）のいずれかに記載のマーカーと被検物質とを接触させる工程、および
（ｂ）該マーカーと被検物質との結合を検出する工程；
（１７）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその断片を含むことを特徴とする、（１６）に記載の結合物質のスクリーニング用キット；
（１８）下記の工程を含む、（５）から（７）のいずれかに記載のマーカーと該マーカーに結合する物質との結合を調節する結合活性調節物質のスクリーニング方法、
（ａ）被検物質の存在下または非存在下、（５）から（７）のいずれかに記載のマーカーと該マーカーの結合物質を接触させる工程、および
（ｂ）該マーカーと該結合物質の結合活性を、被検物質の存在下と非存在下で比較する工程；
（１９）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその断片を含むことを特徴とする、（１８）に記載の結合活性調節物質のスクリーニング用キット；
（２０）下記の工程を含む、（１）から（７）のいずれかに記載のマーカーの発現調節物質のスクリーニング方法；
（ａ）（１）から（７）のいずれかに記載のマーカーを発現しうる細胞と被検物質を接触させる工程、および
（ｂ）該マーカーの発現量の変化を、（９）から（１１）のいずれかに記載の方法を用いて検出する工程；
（２１）（２０）に記載の方法を用いることを特徴とする、（１）から（７）のいずれかにのマーカーの発現調節物質のスクリーニング用キット；
（２２）配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその断片を含むことを特徴とするＤＮＡ合成阻害剤；
（２３）配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその断片を含むことを特徴とする細胞遊走活性阻害剤；
（２４）（２２）に記載のＤＮＡ合成阻害剤、（２３）に記載の細胞遊走活性阻害剤、配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその断片、配列番号１に記載の塩基配列またはその一部からなるポリヌクレオチドを含むヒト遺伝子治療用発現ベクター、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその断片、および該ポリペプチドに対する抗体からなる群から選択される少なくとも１つを含む医薬組成物；
（２５）血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌の治療剤である（２４）に記載の医薬組成物；
（２６）（２４）または（２５）に記載の医薬組成物を投与することを特徴とする血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌の治療方法；
（２７）（２４）または（２５）に記載の医薬組成物を製造するための配列番号１で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの使用；
を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明のマーカーとなるＫＩＡＡ１０３６のポリヌクレオチドの調製、ポリペプチドの調製、組換えベクター、形質転換体、製造方法、抗体、ポリペプチドの検出方法、ｍＲＮＡの検出方法、血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌の検出法、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌の診断用キット、治療剤、治療方法について説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫細胞、酵母および大腸菌での組換えポリペプチドの生産技術、分子生物学的手法、発現したポリペプチドの分離精製法、分析法および免疫学的手法が採用される。
本発明のマーカーは、「配列番号１の３８６番目のＡから１４８０番目のＣで表わされる塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはその断片」であり、ＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチド配列である。また、本発明のマーカーには、「配列番号１の１番目のＣから５４８１番目のＣで表わされる塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはその断片」、「本発明マーカーとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその断片」も包含される。以下、本発明のマーカーとなるポリヌクレオチドをポリヌクレオチドＡと言う。
本明細書において、「血管新生」とは、既存の血管から新たに血管が形成される現象を意味する。「血管新生」が関連する疾患としては、「血管性疾患」、「炎症性疾患」、「眼内血管新生性疾患」、「生殖器官系疾患」、「中枢神経系疾患」、「癌」などが例示される。
「血管性疾患」としては、動脈硬化、高血圧、狭心症、閉塞性動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞、糖尿病性血管障害、血管奇形などが例示される。「炎症性疾患」としては、肝炎、肺炎、糸球体腎炎、甲状腺炎、骨髄炎、滑膜炎、骨破壊、軟骨破壊、リウマチ、喘息、サルコイドーシス、クロウ−深瀬症候群、パンヌス、アレルギー性浮腫、潰瘍、腹水、腹膜硬化、組織癒着などが例示される。「眼内血管新生性疾患」としては、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性などが例示される。「生殖器官系疾患」としては、子宮機能不全、胎盤機能不全、卵巣機能過亢進、濾胞性嚢胞などが例示される。「中枢神経系疾患」としては、網膜症、脳卒中、血管性痴呆、アルツハイマー病などが例示される。「癌」としては、固形癌、血管腫、血管内皮腫、肉腫、カポシ肉腫および造血器腫瘍などの種々の悪性新生物が例示され、卵巣癌および大腸癌などが包含され、さらにこれら癌の転移をも包含する。
ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドＡの断片をプローブとして、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）などに記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）のみのからなる配列は除外される。「ポリヌクレオチドの断片」とは、配列番号１に記載の塩基配列中の連続した５個以上の塩基配列であって、例えば、５個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、５０個、１００個、５００個、１０００個などからなる塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本明細書において「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。そのようなポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上、好ましくは、８０％以上、更に好ましくは、９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。ここで、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０）．）の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。
本発明のマーカーは、「配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片」であり、ＫＩＡＡ１０３６のポリペプチド配列である。また、それらの塩も包含され、「塩」としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、または酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが用いられる。「ポリペプチドの断片」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の連続した５個以上のアミノ酸残基であって、例えば、５個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、５０個、１００個などからなるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明のマーカーは、「配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加から選択される変異を有するポリペプチドまたはその断片」も包含する。以下、本発明のマーカーとなりうるポリペプチドをポリペプチドＢと言う。
１若しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘発法などにより欠失、置換または付加することができる程度の数のアミノ酸であり、５０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１０個以下のアミノ酸残基を意味している。さらに、ポリペプチドＢは、欠失、置換または付加によっても、血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌のマーカーとしての機能を有するポリペプチドであり、配列番号２表わされるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の相同性を有するポリペプチドを挙げることができる。
本明細書において、「マーカー」とは、生体試料から血管新生およびそれに関連する各種疾患、例えば、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌などを検出するに使用される物質でり、ポリヌクレオチドＡおよびポリペプチドＢを包含する。ある種のｍＲＮＡまたはタンパク質が、疾患においてその発現が増加または減少する場合に、「マーカー」となりえ、例えば、配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表されるアミノ酸配列を有するＫＩＡＡ１０３６ポリペプチド、配列番号１の３８６番目のＡから１４８０番目のＣで表される塩基配列からなるＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチド、それに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドおよびそれらの一部が挙げられる。
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。
「抗体」とは、当該分野で通常使用される意味で用いられ、抗体の全部またはその断片、誘導体、結合体、修飾体なども包含される。好ましくは、ポリペプチドＢまたはその断片を認識する抗体であり、より好ましくは、該ポリペプチドを特異的に認識する抗体であり、さらに好ましくは単一特異的に認識する抗体である。そのような抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。
本発明のマーカーの「検出または定量」は、免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法でおよび分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法を用いて達成することができる。
マーカーがポリペプチドＢである場合、そのような方法として、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法が挙げられる。
ポリペプチドＢまたはその断片に対する抗体を用いて、血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌を検出または定量することができる。本発明のマーカーは、前記疾患のマーカーとなり得ることから、該抗体を用いた疾患の検出または定量方法は、前述のポリペプチドの検出または定量と同様に、適切な免疫学的測定方法を含む方法により達成することができる。
本発明は、ポリペプチドＢまたはその断片に対する抗体を含むことを特徴とする血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌の診断用キットに関する。このキットは、少なくともポリペプチドＢまたはその断片に対する抗体および標準試薬としてポリペプチドＢを含む。ポリペプチドＢは血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌のマーカーであるから、前述の免疫学的測定方法による検出または定量方法に基づき、免疫学的に測定することができる。
また、マーカーがｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドである場合、そのような方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法、またはＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法が挙げられる。
ポリヌクレオチドＡまたはその断片をプローブあるいはプライマーとして用いてｍＲＮＡを検出または定量することができる。
本発明のマーカーは、前記疾患のマーカーとなり得ることから、該プローブまたはプライマーを用いた疾患の検出または定量方法は、前述のポリヌクレオチドの検出または定量と同様に、適切な分子生物学的測定方法を含む方法により達成することができる。
ここで、プローブまたはプライマーとは、配列番号１に記載の塩基配列中の連続した塩基で、例えば、５個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個などからなる塩基配列であり、同一配列のオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよびその誘導体オリゴヌクレオチドも包含される。誘導体オリゴヌクレオチドとしては、例えば、オリゴヌクレオチド中のりん酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合またはＮ３’−Ｐ５’ホスホアミダイト結合などに変換された誘導体オリゴヌクレオチド、リボースとりん酸ジエステル結合がペプチド結合に変換された誘導オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピオニルウラシルまたはＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピオニルシトシンまたはフェノキサジン修飾シトシンなど置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースまたは２’−メトキシエトキシリボースなどで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどを挙げることができる。その様なポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子マーカー、ＰＣＲ用のプライマー、ハイブリダイゼーション用のプローブとして有用である。
本発明は、ポリペプチドＢをコードするポリヌクレオチドの一部または全部および標準試薬として該ポリヌクレオチドを含む、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌の診断用キットに関する。このキットは、少なくともポリヌクレオチドＡまたはその断片に対するプローブまたはプライマーおよび標準試薬としてポリヌクレオチドＡを含む。ポリヌクレオチドＡは、血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌のマーカーとなり得ることから、前述の分子生物学的測定方法による検出または定量方法に基づき、分子生物学的に測定することができる。
ポリヌクレオチドＡを用いて、ＤＮＡの転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制することができる。ポリヌクレオチドＡと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドＡとハイブリダイズするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドＡの塩基配列中の連続した５から６０個の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよび誘導体オリゴヌクレオチドなどを適宜調製し、当該分野で周知なアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術を用いて、このポリペプチドのＤＮＡの転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法を提供することができる。
本発明は、本発明のマーカーの「結合物質のスクリーニング方法」に関する。「結合物質」とは本発明のマーカーに結合する任意の物質であり、このような結合物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、受容体および抗体などのポリペプチドが挙げられる。「結合物質のスクリーニング方法」は、当技術分野で公知となっている技術を適宜適応することにより行うことができ、バイオアッセイおよび結合アッセイなどが例示される。
本発明の「結合物質のスクリーニング用キット」には、少なくとも本発明のマーカーが含まれる。このキットを用いて、結合物質を生化学的手法によりスクリーニングすることができる。
本発明はさらに、「結合活性調節物質のスクリーニング方法」に関する。「結合活性調節」とは、本発明のマーカーとそれに対する結合物質との結合活性を増強あるいは減少させることを意味し、「結合活性」は、Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）により評価される。「結合活性調節物質」とは、本発明のマーカーとそれに対する結合物質との結合活性を増強あるいは減少させる物質であり、アゴニストやアンタゴニストが例示される。このような物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどが挙げられる。「結合活性調節物質のスクリーニング方法」は当該分野で公知となっている技術を適宜適応することにより達成することができる。本発明のスクリーニング方法により結合活性調節物質をスクリーニングすることができ、そのような方法としては、バイオアッセイおよび結合アッセイなどが例示される。
本発明の「結合活性調節物質のスクリーニングキット」には、少なくとも本発明のマーカーが含まれてる。本発明のキットを用いて、結合活性調節物質を生化学的手法によりスクリーニングすることができる。
また、本発明は、「発現調節物質のスクリーニング方法」に関する。発現量とは、目的の細胞などにおいて、本発明のマーカーが発現される量を意味する。発現量は、ポリペプチドＢに対する抗体を用いた、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、免疫組織染色法方法などの免疫学的測定方法などを含む適切な方法で測定することまたはポリヌクレオチドＡに対するｍＲＮＡを測定する方法、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法で測定することにより評価することができる。「発現調節」とは、上記の免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のマーカーのタンパク質またはｍＲＮＡレベルでの発現量を増加または減少させることを意味する。「発現調節物質」とは上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される、本発明のマーカーのタンパク質またはｍＲＮＡレベルでの発現量を増加または減少させる物質であり、このような物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどが例示される。「発現調節物質のスクリーニング方法」は当該分野で公知となっている技術を適宜適応することにより達成することができる。本発明のスクリーニング方法により発現調節物質をスクリーニングすることができ、そのような方法としては、バイオアッセイおよび結合アッセイなどが例示される。
本発明の「発現調節物質のスクリーニングキット」には少なくとも本発明のマーカーが含まれてる。本発明のキットを用いて、発現調節物質をスクリーニング方法に基づき、発現調節物質を生化学的手法によりスクリーニングすることができる。
ポリペプチドＢが血管内皮細胞のＤＮＡ合成および遊走活性を抑制することから、ポリヌクレオチドＡ、該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、ポリペプチドＢまたは／および該ポリペプチドに対する抗体はＤＮＡ合成阻害剤または／および細胞遊走活性阻害剤となり得る。よって、本発明はＤＮＡ合成阻害剤ならび細胞遊走阻害剤も提供する。
本発明の「医薬組成物」とは、少なくとも、ポリペプチドＢ、該ポリペプチドに対する抗体、ポリヌクレオチドＡ、該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、ＤＮＡ合成阻害剤、細胞遊走活性阻害剤、結合物質、結合活性調節物質および発現調節物質から選択される少なくとも１つを含有していればよく、特定の疾患、例えば、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌などの治療剤に用いることができる。このような物質としては、例えば、低分子物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの物質が挙げられる。好ましくは、配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその断片である。また、本発明の医薬組成物は、「遺伝子治療用発現ベクター」も包含する。「遺伝子治療用発現ベクター」とは、ポリヌクレオチドＡの全部または一部を組み込んだ発現ベクターで、細胞・組織に導入することにより正常な遺伝子を細胞に補ったり、遺伝子の欠陥を修復・修正したり、遺伝子の発現調節したりすることができるベクターである。そのようなベクターは、複製能を欠いたウイルスの配列の一部または全部を治療用遺伝子と置き換えたものなどが用いられる。よって、本発明はそれら疾患に対する治療剤や治療方法も提供する。
「治療方法」とは、前述の医薬組成物を投与することにより特定疾患、例えば、血管新生に関連する疾患である、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌など疾患を治療する方法である。以下、詳細に説明する。
（１）ＫＩＡＡ１０３６のポリヌクレオチドの取得
ヒト脳、心臓、骨格筋、ひ臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、これら組織由来のヒト正常細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞またはヒト卵巣癌あるいはヒト大腸癌より、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）などに記載された方法、あるいは市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（ストラタジーン社製）などを用いる方法が挙げられる。
該方法により取得されるｃＤＮＡとして、例えば、配列番号２で表されるポリペプチドをコードするＤＮＡなどを挙げることができ、具体的には、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡなどを挙げることができる。配列番号１のＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、後述の実施例に記載したプラスミドをあげることができる。
得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み発現プラスミドを構築し、該発現ベクターを適した宿主に導入することにより形質転換体を得ることができる。該発現ベクターとしては、該ｃＤＮＡを組み込んで動物細胞で発現できるベクターであればいずれでもよく、そのようなベクターとしてｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ（インビトロジェン社製）、ｐＨＭ６、ｐＨＢ６（ロシュダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−１１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１９、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２），１３３−１４０（１９９０）．；特開平３−２２９７９）、ｐＡＧＥ１０３（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１（５），１３０７−１３１０（１９８７）．）、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８（３０），２２７８２−２２７８７（１９９３）．）、ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平５−３３６９６３）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）などを用いることができる。
ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターは、目的とするｃＤＮＡを選択可能な動物細胞に導入し、形質転換細胞を取得する。該発現ベクターの宿主への導入方法としてはＤＮＡを導入する方法であればいずれの方法も用いることができる。宿主が動物細胞である場合、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２），１３３−１４０（１９９０）．）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．；Ｖｉｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）．）に記載の方法が例示される。
宿主としては発現ベクターに対応する適当な細胞または組織を用いることが可能で、例えば、動物細胞などが挙げられる。宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞のＮａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４３２）およびそのサブラインＮａｍａｌｗａＫＪＭ−１、ＨＣＴ−１５（ヒト大腸癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２２５）、サル由来株細胞のＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）およびＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）などが例示されるが、好ましくは、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＮａｍａｌｗａＫＪＭ−１細胞およびＨＣＴ−１５細胞を用いる。
本発明の形質転換体は、当該分野において周知慣用の常法により培養する。形質転換した宿主に適した培地を用いて行うことができ、培養に使用される培地としては液体培地が適当である。具体的には、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）．）、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）．）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）．）、ＹＴ培地、ＢＥＭ培地などが用いられる。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＩＭ培地などにウシ胎児血清（ＦＣＳ）を適量添加したものなどが用いられる。必要により発現ベクターのプロモーターの転写活性を高めるために、転写活性を促進する物質を含んでいてもよく、例えば、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシン（ＩＰＴＧ）などを用いることができる。
培地には形質転換体が生育するのに必要な栄養素、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン類、ホルモン類、血清、好ましくは、ＦＣＳ、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが含有されており、その様な培地であればどのような組成の培地でも用いることができ、市販されている培地も用いることができる。培養はｐＨ６．０〜８．０、２５〜４０℃、５％  ＣＯ２存在下などの条件で行う。
得られた形質転換細胞を常法により培養する。具体的には、以下の形質転換体の培養方法により培養することができる。形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）．）、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）．）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）．）、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）．）またはこれらの培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）などを添加した培地などが用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
以上のようにして、ヒト脳、心臓、骨格筋、ひ臓、腎臓、肝臓、肺、胎盤、これら組織由来のヒト正常細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞またはヒト卵巣癌あるいはヒト大腸癌より、血管新生マーカーであるＫＩＡＡ１０３６をコードするＤＮＡを取得することができる。
また、アミノ酸配列に基づいて、ＫＩＡＡ１０３６をコードするＤＮＡを化学合成することによってもＤＮＡを調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２などを用いて行うことができる。
さらに、後述のオリゴヌクレオチドをセンスプライマー（配列番号４）およびアンチセンスプライマー（配列番号５）として用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とするＤＮＡを調製することができる。
（２）ＫＩＡＡ１０３６のポリペプチドの製造
ＫＩＡＡ１０３６は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）などに記載された方法などを用い、例えば、以下の方法により、ＫＩＡＡ１０３６のポリヌクレオチドを宿主細胞中で発現させ、製造することができる。
ＫＩＡＡ１０３６のポリペプチドをコードする全長ＤＮＡを基にして、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該ポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは該ポリペプチドの生産率を向上させるうえで有用である。該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡ（組換えベクター）を作製する。該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ＫＩＡＡ１０３６のポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、ＫＩＡＡ１０３６のポリペプチド遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
（ｉ）原核生物を宿主として用いる場合
ＫＩＡＡ１０３６の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＫＩＡＡ１０３６、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（ロシュダイアグノスティックス社製）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃａｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）．）、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃａｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３，２７７（１９８９）．）、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）．）、ｐＥＧ４００（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，２３９２（１９９０）．）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−６７９８）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）などを例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージなどに由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離、例えば、６〜１８塩基に調節したプラスミドを用いることが好ましい。ＫＩＡＡ１０３６のポリヌクレオチドの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などの原核生物が挙げられ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属としてＥ．ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ株、ＤＨ１株、ＭＣ１０００株、ＫＹ３２７６株、Ｗ１４８５株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｎｏ．４９株、Ｗ３１１０株、ＮＹ４９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株およびＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株などが、Ｓｅｒｒａｔｉａ属として、Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ株、Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ株、Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ株などが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属として、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株などが、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｂ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ株、Ｂ．Ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６８）株、Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６６）株などが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３０３２）株、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６７）株、Ｃ．ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８６９）株、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８７０）株などが、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｍ．ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１５３５４）株などが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属として、Ｓ．ｍｅｐｈｉｔｉｃａ株などが例示される。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）．）、りん酸カルシウム法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）．）、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）．やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）．に記載の方法などがあげられる。
（ｉｉ）酵母を宿主として用いる場合
宿主として酵母を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ：３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ：３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ：３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などが挙げられる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいずれのものでもよく、例えば、ＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＨＯ５（酸性フォスファターゼ）プロモーター、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＧＡＬ１（ガラキトースキナーゼ）プロモーター、ＧＡＬ１０（ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ）プロモーター、ＭＦα１（αフェロモン）プロモーター、ＣＵＰ１（メタロチオネイン）プロモーターなどが挙げられる。
宿主としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ｐｏｍｂｅ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｔ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ種、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ種およびＰｉｃｈｉａ属、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ種などが挙げられる。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４，１８２（１９９０）．）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）．）、酢酸リチウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）．およびＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）．）記載の方法などが挙げられる。
（ｉｉｉ）動物細胞を宿主として用いる場合
宿主として動物細胞を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）、ｐＡＧＥ１０３（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）．）、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（ｐＡＭｏＰＲＳＡ）（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）．）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０５）などを用いることができる。
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｌｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ＨＳＰプロモーター、ＳＲαプロモーターおよびメタロチオネインのプロモーターなどを挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、Ｎａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４３２）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）およびＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）、マウス由来株細胞のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）およびＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）、サル由来株細胞のＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）およびＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）、ラット由来株細胞のＰＣ４２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）およびＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）などを例示することができる。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）．）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．、Ｖｉｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）．）。
（ｉｖ）植物細胞を宿主として用いる場合
宿主として植物細胞または植物個体を用いる場合、公知の方法（組織培養，２０（１９９４）．、組織培養，２１（１９９５）．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５、４５（１９９７）．）に準じてポリペプチドを生産することができる。発現ベクターとしては、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクターなどを挙げることができる。遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーターなどを挙げることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１などを挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
宿主としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻などの植物細胞が例示される。
組換えベクターの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）などを挙げることができる。
（ｖ）昆虫細胞を宿主として用いる場合
宿主として昆虫細胞を用いる場合、トランスファーベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（インビトロジェン社製）などが、感染用ウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するバキュロウイルス（Ｖａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡｃＭＮＰＶ）Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡなどが挙げられる。昆虫細胞の形質転換の方法は、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９２）（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）．などに記載の方法が用いられる。
昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含むトランスファーベクターおよび昆虫細胞への感染用のバキュロウイルスＤＮＡを添加し、組換えにより作製された目的遺伝子を発現するウイルスが昆虫細胞に感染することによりポリペプチドを発現することができる。
宿主に用いる昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）由来株細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（イラクサキンウワバ）由来株細胞などが挙げられ、具体的には、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来細胞としては、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７１１、卵巣細胞）、Ｓｆ２１（卵巣細胞）などが、Ｔ．ｎｉ由来細胞株としては、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（卵細胞、インビトロジェン社製）などが例示される。
組換えベクターの導入方法としては、宿主に導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｃｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．）などを挙げることができる。また、動物細胞と同様に、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）なども用いることができる。
（ｖｉ）培養方法
本発明のＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する形質転換体が、大腸菌、酵母、動物細胞あるいは植物細胞などの細胞の場合、各種宿主に適した通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを産生・蓄積させ、形質転換体または培養液より該ポリペプチドを回収することにより、該ポリペプチドを製造することができる。形質転換体が、動物個体または植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って飼育または栽培し、該ポリペプチドを産生・蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを回収することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
宿主が動物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードするＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを該動物中に産生・蓄積させ、該動物個体中から該ポリペプチドを回収することにより、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを製造することができる。動物個体中の産生・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、唾液、卵などを挙げることができる。
宿主が植物個体の場合、例えば、本発明のＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードするＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを該植物個体中に産生・蓄積させ、植物個体中から該ポリペプチドを回収することにより、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを製造することができる。
宿主が大腸菌などの原核生物または酵母などの真核生物である場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する形質転換体を培地中で培養し、該組換え体ＤＮＡのコードするＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを培養液に産生・蓄積させ、該培養液から該ポリペプチドを回収することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明のＫＩＡＡ１０３６の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母などの真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
形質転換体が大腸菌などの原核生物あるいは酵母などの真核生物である場合、得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、バクトトリプトン、イーストエクストラクトおよび塩化ナトリウムを含むＹＴ培地が好ましい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物などを用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地などを用いることができる。
ＫＩＡＡ１０３６のポリペプチド製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）．）、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）．）、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）．）、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）．）またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）などを添加した培地などが用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％  ＣＯ２存在下などの条件で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
形質転換体が昆虫細胞である場合、培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  ＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）．）などを用いることができる。
（ｖｉｉ）製造方法
ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドは、形質転換体を培養し、培養液からＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを単離・精製することにより製造することができる。ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの単離・精製方法は、当該分野において周知慣用の常法により行うことができ、例えば、酵素の単離・精製方法やＳａｎｄｌｅｒらの糖転移酵素の精製方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８）を用いることができる。
ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドが溶解性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記のように形質転換体を培養した培養液を、例えば、遠心分離などの方法で細胞または菌体と培地に分離する。ＫＩＡＡ０３６ポリペプチドが宿主細胞内に存在する場合、採取した細胞または菌体をＳＴＥ溶液などの適当な緩衝液で洗浄した後、超音波、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミルなどで細胞または菌体を破砕し、遠心分離やろ過により無細胞溶液として得ることができる。
ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの分離・精製に用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれていてもよく、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）などを含んでいてもよい。
得られた粗精製物に含まれる目的タンパク質の分離・精製方法は自体公知の各種分離・精製方法を組合わせて行うことができる。これらの公知の方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫酸アンモウニウムなどによる塩析法、透析法、有機溶媒による沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロースクロマトグラフィー、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などのリジンを用いた陰イオンクロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）などのリジンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、ブチルセファロースなどの疎水性クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や等電点電気泳動法などの各種電気泳動などが例示される。アフィニティークロマトグラフィーは、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドに対する抗体を用いることによっても行うことができる。
ＫＩＡＡ０３６ポリペプチドが不溶性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記同様に細胞または菌体を分離し、適当な方法により破砕後、該ポリペプチドを含む分画を回収する。回収した試料は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）などの界面活性剤などの可溶化剤で可溶化する。該可溶化液は、可溶化剤を含まないか殆ど含まれない濃度にまで希釈または透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の分離・精製方法により精製標品を得ることができる。
また、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる（山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）．）。融合タンパク質に使用する付加タンパク質としてはプロテインＡ、ＦＬＡＧなどが例示される（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）．、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４，１２８８（１９９０）．、特開平５−３３６９６３、特開平６−８２３０２１）。プロテインＡを使用する場合、ＫＩＡＡ０３６ポリペプチドとプロテインＡの融合タンパク質を生産し、イムノグロブリンＧを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。ＦＬＡＧペプチドを使用する場合、ＫＩＡＡ０３６ポリペプチドととＦＬＡＧの融合タンパク質を生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。
ＫＩＡＡ０３６ポリペプチドは、公知の方法に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてを生産することができる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４（１９９５）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１０，１６６−１６８（１９９１）．）。
ＫＩＡＡ０３６ポリペプチドは、そのアミノ酸配列を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法や市販されているペプチド合成機器、例えば、ＡＰＥＸ３９６（アドバンストケムテック社製）、４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳ３（プロテインテクノロジーズ社製）、９０５０（パーセプティブ社製）、ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）などのペプチド合成機器をにより化学合成することができる。
ＫＩＡＡ０３６ポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば、遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。本発明のポリペプチドのコルジン活性は、公知の測定法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５８，９８９３−９８９８（１９８３）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６２，１５６４９−１５６５８（１９８７）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，５８−６５（１９９８）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，４３３−４４０（１９９８）．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，１２７７０−１２７７８（１９９８）．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２７０，６３０−６４６（１９８９）．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２７４，１４−２５（１９８９）．、特開平６−１８１７５９）に準じて測定することができる。
（３）変異型ポリペプチドの作製方法
ＫＩＡＡ０３６ポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）．、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）．、ＷＯ  ８５／００８１７、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）．などに記載の方法に準じて調製することができる。
（４）ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを認識する抗体の作製
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
ＫＩＡＡ０３６ポリペプチドの全長、その部分ペプチドもしくはその部分ペプチド含むポリペプチドを抗原として哺乳動物に投与することで抗体を作製することができる。抗原は、それ自体でもよいが、担体、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）や牛チログロブリン（ＢＴＧ）などに結合したものを用いてもよい。また、抗原による免疫反応を高めるために、例えば、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）および不完全アジュバント（ＩＦＡ）を投与してもよい。免疫に用いられる哺乳動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ハムスターなどを用いることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、レーンらの方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））などに従って作製することができる。
哺乳動物に抗原を１回目の投与後、１〜２週間毎に３〜１０回投与することで免疫された哺乳動物を得て、それらの哺乳動物から血清を採取し、精製することで作製できる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。該抗原の投与量は１回当たり動物１匹に対し、５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、適当な担体に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、遺伝子工学的手法やペプチド合成機で合成することができる。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）などに記載の方法で確認することができる。
免疫された哺乳動物から採血し、抗体価を測定する。十分な抗体価が得られるまでに免疫された時点で採血し、血清を調製することによりポリクローナル抗体を得ることができる。ポリクローナル抗体の分離、精製方法としては、遠心分離、硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡカラム、Ｇ−カラムあるいはゲル濾過カラムなどの各種クロマトグラフィーを単独または組み合わせることで行うことができる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
モノクローナル抗体は、（ｉ）で十分な抗体価が得られたのち、それらの哺乳動物から脾臓またはリンパ節を採取し、それらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。骨髄種細胞としては、マウスまたはラットから樹立した細胞株を用いる。細胞融合の方法は既知の方法で行うことができ、例えば、ケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）．）に従って作製することができる。
ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチド、その部分ペプチドもしくはその部分ペプチドを含むポリペプチドを投与して、十分な抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、抗体産生細胞として脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈殿画分の脾細胞をＴｒｉｓ−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから由来の株化細胞を使用し、そのような細胞として、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１株（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１（１９７８）．、Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）．）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４株（以下、ＳＰ−２と略す）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６、２６９（１９７８）．）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３株（以下、６５３と略す）（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）．）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（以下、Ｘ６３と略す）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）．）などが用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地（１５μｇ／ｍｌ８−アザグアニンを含む正常培地（１．５ｍＭ  グルタミン、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌ  ジェンタマイシンおよび１０％  ＦＣＳ（ＣＳＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地））で継代し、細胞融合を行う３〜４日前に正常培地で培養する。細胞融合には、そのようにして調製した細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で調製した抗体産生細胞と（ｂ）で調製した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（１リットル当たり；１．８３ｇリン酸二ナトリウム、０．２１ｇリン酸一カリウム、７．６５ｇＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄し、骨髄腫細胞の細胞数に対し抗体産生細胞５〜１０倍になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に対し抗体産生細胞１０８当たり、ポリエチレングリコール溶液（２ｇポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、２ｍｌ  ＭＥＭ培地、０．７ｍｌ  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））を０．２〜１ｍｌを３７℃で攪拌しながら添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。ＭＥＭ培地で全量を５０ｍｌになるように調製し、９００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。沈殿分画にＨＡＴ培地（正常培地、１０−４Ｍ  ヒポキサンチン、１．５×１０−５Ｍ  チミジンおよび４×１０−７Ｍ  アミノプテリンを含む）１００ｍｌを添加し、ゆるやかにほぐし懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートの各穴に１００μｌ穴ずつ分注し、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で７〜１４日間培養する。酵素免疫測定法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））などに記載の方法で、培養上清に産生された抗体のうち、ＫＩＡＡ０３６ポリペプチドに特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
（５）ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの免疫学的検出方法
ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの免疫学的検出方法としては、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドに対する抗体を直接または間接的に酵素、蛍光物質、放射性同位体、ラテックスなどに結合した標識体を用いることにより該ポリペプチドまたはその部分ペプチドを測定する方法が挙げられる。そのような測定方法として、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素標識により検出するＥＬＩＳＡ法や化学発光法、ルミノールやＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光標識を検出するＦＩＴＣ法、１２５Ｉなどの放射性同位体標識を検出するＲＩＡ法、ラテックスに結合したラテックス凝集法などが例示される。
また、そのような測定方法として、ウェスタンブロット法および免疫組織染色なども例示される。
さらに、そのような測定方法を用いることによりＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドまたはその部分ペプチドを定量することもできる。
免疫学的検出方法に使用する抗体は固相支持体に固定されていても良く、結合したポリペプチドを、レポーター基を有する２次抗体または試薬を用いて検出することもできる。また、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドをレポーター基で標識し、抗体および試料と共に反応させた後、固定抗体と結合させられる、競合法によっても検出できる。試料のＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドによる同標識ポリペプチドと抗体との結合を阻害する程度は、試料の固定抗体との反応性により示され、試料中のＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの濃度を算出することができる。固相支持体としては、抗体が付着しできる、当業者に公知の任意の物質であれば何れのものでもよく、例えば、マイクロタイタープレート、ニトロセルロース膜などのメンブレン、ビーズ、ディスク、例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックスまたはポリスチレンまたはポリ塩化ビニルなどの可塑性物質が挙げられる。磁性粒子または繊維光学センサー（ＵＳ  ５３５９６８１など）も用いることが可能である。抗体の支持体への固相方法は、当該分野に公知の方法を用いることができる。本明細書において、「固相」とは、吸着などの物理的方法または抗体と支持体上の官能基との共有結合による化学的方法による固定を意味する。抗体と支持体上の官能基は直接結合しても良いが、架橋剤などを介して結合してもよい。
物理的方法による固定は、適切な緩衝液中で適宜希釈した抗体を支持体、好ましくは、マイクロタイタープレートまたはメンブレンと適切な時間の間接触させることにより達成され得る。接触時間は、温度により変化するが、代表的には、約１時間と１日の間である。ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルなどのプラスチック製のマイクロタイタープレートの各ウェルに約１０ｎｇから約１μｇ、好ましくは、約１００〜２００ｎｇの抗体を添加し抗体を固定する。
化学的方法による固定は、支持体と抗体の官能基、例えば、水酸基またはアミノ基の両方に反応する二官能性試薬と支持体を反応させることにより達成され得る。例えば、抗体は、適切なポリマーコートを有する支持体に、ベンゾキノンを用いるかまたは支持体上のアルデヒド基と結合パートナー上のアミンおよび活性水素との縮合により、共有結合することで固相することができる。このような手法は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９１）Ａ１２〜Ａ１３を参照して行うことができる。
抗体を固相した支持体は他のポリペプチドの物理的吸着を阻害するために当業者に公知の方法で、適切なブロッキング剤、例えば、ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ  ２０（シグマアルドリッチ社製）などにより処理をおこなう。
抗体固相支持体と試料を反応させ、本発明のポリペプチドと抗体を結合させる。試料は、適切な希釈液、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）などで適宜希釈してもよい。試料と抗体の反応時間は、癌を有する個体から得られた試料中の本発明のポリペプチドの存在を検出するに十分な時間で、好ましくは、結合ポリペプチドおよび非結合ポリペプチドとの間の平衡に達成する結合レベルの少なくとも９５％の結合レベルに達成する時間である。平衡に達成する時間は、経時的に結合レベルを測定することにより容易に決定することができる。結合ポリペプチド以外は適切な緩衝液、例えば、ＰＢＳ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む）などで固相支持体を洗浄することにより除去することができる。標識された２次抗体と固相支持体を反応させる。標識としては、好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性同位体、発色物質、蛍光物質などが用いられる。抗体と標識との結合は、当業者に公知の方法により行うことができる。２次抗体は、固相抗体と本発明のポリペプチドとの複合体に結合するのに十分な時間反応を行う。適切な時間は、結合レベルを経時的に測定することにより容易に決定することができる。非結合２次抗体は適切な緩衝液、例えば、ＰＢＳ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む）などで固相支持体を洗浄することにより除去することができる。２次抗体の標識を検出する方法は、標識の種類によって異なる。標識として放射性同位体を用いる場合、シンチレーションカウンターやオートラジオグラフィーによる検出が用いれる。標識として色素、発色物質および蛍光物質などを用いる場合、分光光度計による検出が用いられる。標識として酵素を用いる場合、それに対する基質を添加し、一定時間反応後における生成物を分光光度計などで検出する。標識と２次抗体は直接結合されていても良いが、アビジン−ビオチンなどにより間接的に結合したものを用いてもよい。その場合、一方を２次抗体に結合し、他方を標識することにより検出することが可能となる。
また、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドはフロースルー試験またはストリップ試験で検出することができる。抗体をニトロセルロース膜などのメンブランに固定したものに、フロースルー試験においては、試料を添加し、試料がメンブレンを通過すると、ポリペプチドが固相抗体に結合して免疫複合体を形成し、標識２次抗体を含む溶液がメンブレンを通過すると該免疫複合体に結合する。ストリップ試験においては、試料を添加し、試料が標識抗体を含む領域を通過すると、ポリペプチドが標識抗体と結合して免疫複合体を形成し、固相抗体を含む領域を通過すると該免疫複合体が結合し、固相抗体領域で検出される２次抗体の量が、癌の有無を示す。検出部位での標識は、視覚で確認でき、確認できない場合は陰性であることが示される。メンブレンに固相される抗体の量は、好ましくは、約２５ｎｇ〜約１μｇであり、より好ましくは約５０ｎｇ〜約１μｇである。
（６）ｍＲＮＡの定量方法
ＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドより調製したオリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡを定量することでＫＩＡＡ０３６ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を定量することができる。
正常あるいは疾患モデル動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどでｍＲＮＡを定量する場合、必要によって抗癌剤などの薬剤などを投与し、一定時間経過後に、血液、脳、胃、腎臓などの臓器または組織を単離し、細胞を調製する。得られた細胞から当該分野で周知慣用の常法によりｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンブロットハイブリダイゼーション法などでｍＲＮＡを定量・解析することができる。
ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドもしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体からのｍＲＮＡを定量する場合も、該形質転換体から当該分野で周知慣用の常法によりｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンブロットハイブリダイゼーション法などでｍＲＮＡを定量・解析することができる。
（７）遺伝子構造の同定
現在、多くの機能未知のヒト染色体遺伝子の配列がデータベースに登録されている。したがって、ＫＩＡＡ０３６ポリヌクレオチド配列と、データベースに登録されているヒト染色体遺伝子の配列とを比較することにより、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドをコードするヒト染色体遺伝子を同定し、該遺伝子の構造を明らかにできる可能性がある。ｃＤＮＡの配列と一致する染色体遺伝子配列が登録されていれば、ｃＤＮＡの配列と染色体遺伝子の配列を比較することにより、本発明のポリペプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域、エクソンおよびイントロン構造をスクリーニングすることができる。ＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドをプローブとして、当該分野において周知慣用の常法（東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）．）を用いて、該遺伝子のプロモーター領域を取得することができる。プロモーター領域としては、哺乳動物細胞においてＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するすべてのプロモーター領域が挙げられる。
（８）疾患の検出方法
ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドは、血管新生モデルで発現が増加していることから血管新生が関連する疾患、例えば、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌などの診断に利用することができる。さらに、該ポリペプチドの発現が卵巣癌および大腸癌組織中で増加しているしていることを見出し、それらの癌の診断に利用することができる。患者における癌の存在または非存在は、生物学的試料、例えば、患者から取得した癌または正常組織生検、切除組織、血液、リンパ節、血清、尿または他の組織、これらのホモジェネートまたは抽出物などから本発明のポリペプチドまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドを特異的に検出し、その発現量を健常者または正常組織と比較することにより決定することができる。
疾患の検出方法としては、該ポリペプチドの免疫学的検出方法または分子生物学的検出方法などが例示される。
該ポリペプチドの免疫学的検出方法として、該ポリペプチドと反応する異なるエピトープを認識する２種類の抗体のうち一方を直接または間接的に酵素で標識したものを用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法や１２５Ｉなどの放射性同位体で標識した該ポリペプチドとそれを認識する抗体を用いる競合ＲＩＡ法などを挙げることができる。
分子生物学的検出方法として、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などが例示され、ＰＣＲは、患者由来の生物学的試料から単離されたｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡを増幅するために使用することができる。ＰＣＲに使用するプライマーは、配列番号１記載のＤＮＡ配列に基づいて化学的に合成することができる。好ましくは、配列番号４に記載のオリゴヌクレオチド配列５’−ＧＴＴＣＡＧＧＡＣＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧＣ−３’で表わされるＰＲＩＭＥＲ１および配列番号５に記載のオリゴヌクレオチド配列５’−ＧＴＣＡＡＴＡＣＴＧＡＴＧＧＡＣＴＴＧＣ−３’で表わされるＰＲＩＭＥＲ２を用いる。ＰＣＲによって増幅されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動により分離され、そして当業者に周知の方法に従って可視化され得る。通常、同じ個体由来の癌組織および非癌組織からなる適合する組織の対または異なる個体由来の癌組織および非癌組織からなる適合しない組織の対から試料を調製しＰＣＲを行う。ＰＣＲによる増幅反応は、好ましくは、２桁にわたるいくつかのｃＤＮＡの希釈において行われる。癌サンプルのいくつかの希釈において、同じ希釈の非癌サンプルと比較して、２倍以上の発現の増加は、陽性と考えられる。
癌の存在または非存在は、正常者試料と患者試料において検出した本発明のマーカーを測定し、比較することによって達成され得る。一般的に、非癌組織から確立された癌を有さない患者由来の試料から得られるマーカーの平均値をカットオフ値とし、試料からのマーカー検出値とカットオフ値を比較する。一般的に、検出値がカットオフ値に標準偏差の三倍値を加えた値を越える場合、その試料は癌について陽性と考えられる。また、カットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｅｎｅ  １０６−１０７，（１９８５）．（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ）の方法に従うＲｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐａｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅを用いて決定される。
（９）診断用キット
ＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドは、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いた血管新生が関連する疾患、例えば、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または卵巣癌、大腸癌などの癌の診断に利用することが可能である。また、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドに対する抗体を用いて免疫学的手法によっても血管新生が関連する疾患、例えば、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または卵巣癌および大腸癌などの癌の診断を行なうことができる。従って、ポリヌクレオチドを用いた診断の場合には、キット中には標識されたＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドが含まれる。また、抗体を用いた診断の場合には、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドに対する抗体の他に、標準抗原としてＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドが含まれる。更にキット中には標準曲線が含まれていてもよい。
（１０）ｍＲＮＡの翻訳抑制方法
ＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドを投与することにより、ＫＩＡＡ０３６ポリペプチドの生産を抑制することができる。即ち、ＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドを用いて、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写の抑制、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の抑制を行うことが可能である。
（１１）結合物質のスクリーニング方法
本発明のマーカーに対する結合物質を探索またはスクリーニングするための試薬として有用である。すなわち、本発明のマーカーと被検物質とを接触させることを特徴とする該マーカーに対する結合物質のスクリーニング方法を提供する。被検物質としては、例えば、天然または化学的に合成された化学物質、タンパク質、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなどの哺乳動物の組織抽出物、細胞培養物などが用いられる。これらの被検物質を本発明のマーカーと共に添加し、血管内皮細胞のＤＮＡ合成活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。
具体的には、本発明の結合物質のスクリーニング方法は、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドもしくはその部分ペプチドを用いるか、組換え型ポリペプチドの発現系を構築し、該発現系を用いた結合アッセイ系を用いるか、またはＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドに結合して細胞刺激活性、例えば、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）の取込みによるＤＮＡ合成を促進する活性または抑制する活性、細胞遊走活性などを測定するか、血管内皮細胞の管腔形成を顕微鏡などで視覚的に測定する方法などが例示される。
まず、結合物質のスクリーニング方法に用いるポリペプチドとしては、ポリペプチドＢを含有するものであれば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量発現させたポリペプチドが適している。ポリペプチドＢを製造するには、前述の発現方法が用いられるが、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部分をコードするＤＮＡ断片には、通常、相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したポリペプチドの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６７，１９５５５〜１９５５９（１９９２）．に記載の方法に従って行うことができる。
したがって、本発明の結合物質スクリーニング方法において、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドもしくはその部分ペプチドを含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したポリペプチドもしくはその部分ペプチドであってもよいし、該ポリペプチドを含有する細胞またはその細胞上清を用いてもよい。本発明の結合物質のスクリーニング方法において、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを含有する細胞を用いる場合、該細胞をアガロースゲルなどに固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを含有する細胞としては、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドに対する結合物質をスクリーニングするためには、適当なポリペプチド画分と、標識した被験物質が必要である。ポリペプチド画分としては、天然型のポリペプチド画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ポリペプチド画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識した被験物質としては、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓなどで標識したものが例示される。
具体的には、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドに対する結合物質のスクリーニング方法を行なうには、まず、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニング方法に適したバッファーに懸濁することによりポリペプチド標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ６〜８のリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などのリガンドとポリペプチドとの結合を阻害しない緩衝液であればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各種タンパク質を緩衝液に加えるもよい。さらに、プロテアーゼによるリセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１〜１０ｍｌの該ポリペプチド溶液に、一定量、好ましくは、５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍの３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓなどで標識した被験物質を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の試験物質を加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、好ましくは４℃から３７℃で、２０分から２４時間、好ましくは３０分から３時間で行なう。反応後、ガラス繊維濾紙などで濾過し、適量の同緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターあるいはγ−カウンターで計測する。全結合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験物質を本発明のマーカーに対する結合物質として選択することができる。
本発明のマーカーに対する結合物質をスクリーニングするためには、該ポリペプチドを介する細胞刺激活性、例えば、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）の取込みによるＤＮＡ合成を促進する活性または抑制する活性、細胞遊走活性などを公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。また、血管内皮細胞の管腔形成を顕微鏡などで視覚的に測定する方法により測定することもできる。具体的には、まず、ポリペプチドを含有する細胞をマルチウェルプレートなどに培養する。結合物質のスクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当な緩衝液に交換し、被験物質などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。
（１２）結合物質スクリーニング用キット
本発明のマーカーに結合する結合物質スクリーニング用キットは、ポリペプチドＢ、該ポリペプチドを含有する細胞、または該ポリペプチドを含有する細胞上清画分などを含有するものである。本発明の結合物質スクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
（ｉ）結合物質スクリーニング用試薬
スクリーニング溶液および洗浄溶液としてＨａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製）に０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社製）を加えたものを孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存したものまたは用時調製したもの。
（ａ）本発明のポリペプチドを発現させたＣＯＳ−７細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃で２日間培養したもの。
（ｂ）標識被検物質
市販の３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓなどで標識した被検物質した溶液を４℃あるいは−２０℃にて保存し、測定用緩衝液にて１μＭに希釈するして用時調製する。水に難溶性を示す被検物質については、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、メタノールなどに溶解する。
（ｃ）非標識被検物質
標識物質と同じものを１００〜１０００倍濃度で調製したもの。
（ｉｉ）測定法
（ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のポリペプチド発現ＣＯＳ−７細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ｂ）標識被検物質を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を測定ためには非標識被検物質を５μｌ加える。
（ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄溶液で３回洗浄する。細胞に結合した標識被検物質を０．２Ｍ  ＮａＯＨ（１％  ＳＤＳを含む）で溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマンコールター社製）を用いて放射活性を測定する。
（１３）結合活性調節物質のスクリーニング方法
本発明のマーカーは、該マーカーに対する結合活性調節物質を探索またはスクリーニングするための試薬として有用である。該マーカーと結合物質との結合活性調節物質、すなわち、結合性を変化させる物質のスクリーニング方法としては、本発明のマーカーを発現する組換え体発現系を構築し、バイオアッセイ系または結合アッセイ系を用いることによって、結合物質と本発明のマーカーとの結合性を変化させる物質、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物などを効率よくスクリーニングすることができる。このような物質には、（ａ）結合物質と本発明のマーカーとの結合を介する細胞刺激活性、例えば、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）の取込みによるＤＮＡ合成を促進する活性または抑制する活性、細胞遊走活性などを促進する活性または抑制する活性などの増強あるいは減少させる物質、（ｂ）結合物質と本発明のマーカーとの結合力を増強する物質あるいは減少させる物質が挙げられる。
すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のマーカーと結合物質を接触させた場合および（ｉｉ）本発明のマーカーと結合物質および被検物質とを接触させた場合の結合物質の結合量を比較することを特徴とする結合物質と本発明のマーカーとの結合活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明の結合活性調節物質のスクリーニング方法は、（ｉ）および（ｉｉ）の場合において、該マーカーと結合物質との結合量を、例えば、細胞刺激活性などを測定することにより比較することを特徴とする。
本発明の結合活性調節物質のスクリーニング方法として、具体的には、（ａ）標識した結合物質をＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに接触させた場合、および、標識結合物質および被検物質を接触させた場合における、該ポリペプチドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質とＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質をスクリーニング方法、（ｂ）ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどを含有する細胞または細胞培養液と標識結合物質を接触させた場合および標識結合物質および被検物質を接触せた場合における、該細胞または細胞培養液における該ポリペプチドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質と本発明のポリペプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング方法、（ｃ）ＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって細胞培養液に分泌したポリペプチドなどと標識結合物質を接触させた場合および標識結合物質および被検物質を接触させた場合における、該ポリペプチドなどに対する標識結合物質の結合量を測定し、比較することを特徴とする結合物質とＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどとの結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング方法などが挙げられる。
（１４）結合活性調節物質のスクリーニング用キット
ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドと結合物質の結合性を変化させる結合活性調節物質のスクリーニング用キットは、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチド、該ポリペプチドを含有する細胞または細胞培養液を含有するものなどである。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
（ｉ）結合活性調節物質のスクリーニング用試薬
スクリーニング用溶液および洗浄用溶液としてＨａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社製）を加えたものを孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌したものを、４℃で保存したものまたは用時調製したもの。
（ａ）ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチド
ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを発現させたＣＯＳ−７細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％  ＣＯ２、で２日間培養したもの。
（ｂ）標識被検物質
市販の３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓなどで標識した被検物質した溶液を４℃あるいは−２０℃にて保存し、測定用緩衝液にて１μＭに希釈するして用時調製する。水に難溶性を示す被検物質については、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、メタノールなどに溶解する。
（ｃ）非標識被検物質
標識物質と同じものを１００〜１０００倍濃度で調製したもの。
（ｉｉ）測定法
（ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養したＫＩＡＡ１０３６ポリペプチド発現ＣＯＳ−７細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ｂ）標識被検物質を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を測定ためには非標識被検物質を５μｌ加える。
（ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄溶液で３回洗浄する。細胞に結合した標識被検物質を０．２Ｍ  ＮａＯＨ（１％  ＳＤＳを含む）で溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマンコールター社製）を用いて放射活性を測定する。
（１５）発現調節物質のスクリーニング方法
ポリヌクレオチドＡ、ポリペプチドＢ、該ポリペプチドに対する抗体は、本発明のマーカーに対する発現調節物質を探索またはスクリーニングするための試薬として有用である。
すなわち、本発明の発現調節物質スクリーニング方法は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物の血液、特定の臓器、臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ｉｉ）形質転換体などに含まれるＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量あるいはタンパク質量を測定することにより、本発明のマーカーの発現調節物質のスクリーニングを行うことができる。
（１６）発現調節物質のスクリーニング用キット
ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの発現調節物質またはその塩のスクリーニング用キットは、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＳを含有する細胞、または該ポリペプチドを含有する細胞培養液を含有するものなどである。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
（１７）免疫学的定量方法に基づくスクリーニング用キット
ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの定量方法としては、液相中で該ポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２６Ｉなどの放射性同位体で標識したＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドとそれを特異的に認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法などが例示される。従って、抗体を用いた診断の場合には、本発明の抗体の他に、標準抗原としてＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドが含まれる。更にキット中には標準曲線が含まれていてもよい。
（１８）分子生物学的定量方法に基づくスクリーニング用キット
ＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドあるいは該ポリヌクレオチドから調製したオリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量をｍＲＮＡレベルで定量することができる。
具体的には、（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどに対して、薬剤、例えば、抗癌剤などなどを投与し、一定時間経過した後、血液、特定の臓器、例えば、脳、腎臓、大腸、卵巣など、あるいは臓器から単離した組織または細胞を得る。得られた細胞に含まれる本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡは、例えば、当該分野において周知の抽出方法によりｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎＰＣＲなどの手法を用いることにより定量、または周知のノーザンブロット法により解析することもできる、または（ｉｉ）ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドもしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれるＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
また、ポリヌクレオチドを用いた診断の場合には、キット中には標識されたＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドが含まれる。
（１９）医薬組成物
ポリヌクレオチドＡ、該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、ポリペプチドＢ、それに対する抗体ならびにポリヌクレオチドＡを含む遺伝子治療用ベクターなどの物質から選択される少なくとも１つを含有する医薬組成物は、治療剤として該物質単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。ＫＩＡＡ１０３６が血管内皮細胞のＤＮＡ合成を抑制すること、細胞遊走活性を抑制することからＤＮＡ合成阻害剤および細胞遊走活性阻害剤も包含される。また、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質およびその塩も包含される。そのような物質としては、具体的には、（ａ）結合物質とＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドとの結合を介する細胞刺激活性、例えば、ＤＮＡ合成活性、血管内皮細胞遊走活性、血管内皮細胞の管腔形成を増強あるいは減少させる物質、（ｂ）結合物質とＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドとの結合活性を増強あるいは減少させる物質、あるいは（ｃ）ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの発現量を増強あるいは減少させる物質である。該物質としては、低分子化合物、ペプチド、タンパク、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよいく、天然物質または非天然物質の何れでもよい。ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに対するアゴニストは、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性と同様の作用を有しているので、該結合物質活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに対するアンタゴニストは、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を抑制することができるので、該結合物質活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。結合物質とＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドとの結合力を増強する物質は、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。結合物質とＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドとの結合力を減少させる物質は、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。また、ＫＩＡＡ１０３６を発現する遺伝子治療用発現ベクターも含まれる。ＫＩＡＡ１０３６が血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌のマーカーとなり得ることから、それらの疾患に関連していることが示唆され、それらの疾患のに対する遺伝子治療に有用である。遺伝子治療用発現ベクターはＫＩＡＡ１０３６のポリヌクレオチドの一部または全部を組込んだ発現ベクターで、細胞や組織に導入することにより先天的、後天的を問わず、何れの疾患に対してその原因となる異常を遺伝子レベルで正常化することであり、正常な遺伝子を細胞に補ったり、遺伝子の欠陥を修復・修正したり、遺伝子の発現を調節することができるベクターである。
（２０）治療剤
ポリペプチドＢ、該ポリペプチド対する抗体、ポリヌクレオチドＡ、該ポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド、結合物質、結合調節物質、発現調節物質、ＤＮＡ合成阻害剤、細胞遊走活性阻害剤または遺伝子治療用ベクターを含有する医薬組成物は、治療薬として該物質単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などが挙げられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば、乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などが挙げられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該物質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該物質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製する。担体として具体的には、乳糖、グリセリンなどが例示される。該物質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質またはその塩とは、結合物質、結合活性調節物質、発現調節物質、ＤＮＡ合成阻害剤および細胞遊走活性阻害剤であり、具体的には、（ａ）結合物質とポリペプチドＢとの結合を介する細胞刺激活性、例えば、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）の取込みによるＤＮＡ合成を促進する活性または抑制する活性、細胞遊走活性などを促進する活性または抑制する活性などを増強あるいは減少させる物質、（ｂ）結合物質とポリペプチドＢとの結合活性を増強あるいは減少させる物質、あるいは（ｃ）本発明のマーカーの発現量を増強あるいは減少させる物質である。
該物質としては、低分子化合物、ペプチド、タンパク、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよいく、天然物質または非天然物質の何れでもよい。ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに対するアゴニストは、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性と同様の作用を有しているので、該結合物質活性に応じて安全で低毒性な医薬組成物として有用である。ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに対するアンタゴニストは、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を抑制することができるので、該結合物質活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。結合物質とＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドとの結合力を増強する物質は、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。結合物質とＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドとの結合力を減少させる物質は、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドなどに対する結合物質が有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。また、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの発現量を変化させる物質を含有する各種疾病の治療剤ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドは前述のとおり、例えば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。従って、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドまたはその部分ペプチドの発現量を変化させる発現調節物質は、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの機能不全に関連する疾患の治療剤として用いることができる。該物質をＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの機能不全に関連する疾患の治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該物質は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該物質を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖や補助薬を含むＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなどの等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール、プロピレングリコールやポリエチレングリコールなどのアルコール類、ポリソルベート８０やＨＣＯ−５０など非イオン性界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなどの安定剤、ベンジルアルコール、フェノールなどの保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
（２１）治療方法
前述の医薬組成物が血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌の治療剤となり得ることから、該医薬組成物を適宜・適切な方法で投与することにより、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または癌などの疾患を治療する方法が提供される。そのような方法としては、前述の医薬組成物を、治療に際して最も効果的な投与方法を使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与を挙げることができる。
前述で調製された治療剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどの哺乳動物に対して投与することができる。予防または治療剤の１回の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば体重６０ｋｇの高血圧症患者においては、一般に一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇであり、非経口的に投与、例えば、注射剤の場合は、例えば体重６０ｋｇの高血圧症患者においては、一般に一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与する。他の動物の場合も、体重ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。投与量または投与回数は目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
実施例
以下実施例は、例示のために提供され、本発明を何ら限定するものではない。遺伝子操作的手法として、特に断らない限りＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｐｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）．に記載された方法を用いた。
実施例１
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）刺激によりヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において発現亢進される遺伝子の同定
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞であるＥｎｄｏｃｅｌｌ  ＨＵＶＥＣ（クラボウ社製）を３本解凍したものを、１０％  ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＥＢＭ培地（三光純薬社製）を分注したコラーゲン・コート培養皿（ＩＷＡＫＩ社製）１６枚に播種し、３７℃で３日間培養を行った後、同培地を交換し、さらに２日間培養を行った。顕鏡にて培養皿が細胞でほぼコンフルエントになったことを確認し、培地を１％  ＦＣＳを含むＭ１９９培地（ニッスイ社製）に交換し、２４時間培養した。ＶＥＧＦ処理区は１％  ＦＣＳを含むＭ１９９培地に１ｎＭ  ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加した培地に、ＶＥＧＦ未処理区（対照区）はｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ１６５を含まない同培地に交換して３７℃で培養を行い、０時間、０．５時間、２時間、６時間、１２時間および２４時間の各時間に細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）で全ＲＮＡを調製し、オリゴｄＴセルロースカラムにてｍＲＮＡを調製した。このｍＲＮＡをＩｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社のＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ受託解析によりＬｉｆｅＡｒｒａｙｈｕｍａｎＵｎｉＧＥＮＥ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社）を用いて解析を行った。
その結果、ヒト遺伝子６３９３種類について、各時間におけるＶＥＧＦ未処理区に対する処理区の割合により遺伝子の発現量を算出した。これらの遺伝子の内、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ０５５０２１の機能未知遺伝子がＶＥＧＦ処理により経時的に発現量が増大し、２４時間後において処理区は未処理区の３．８倍の発現量を示した。ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースにおけるＡＦ０５５０２１遺伝子の配列情報からはタンパク質翻訳領域が不明であったため、同遺伝子の塩基配列をＡｓｓＥＳＴ（メイズ社製）データベースで検索し、ＥＳＴクラスターのコンセンサス配列を得た。さらに、このコンセンサス配列を基にＡｓｓＥＳＴをＢｌａｓｔｘで検索することにより、同配列がコードし得るアミノ酸の相同性検索を行ったところ、機能未知のＫＩＡＡ１０３６のポリペプチド（配列番号２）と完全に一致した。また、機能朱知のＡＫ０２２５６７のポリペプチドと５８％の相同性を有していた（第１図）。ＮＣＢＩデータベースにおけるＫＩＡＡ１０３６遺伝子およびＡＫ０２２５６７遺伝子は転写開始コドンから始まるそれぞれ３６５個および２９０個のアミノ酸残基に相当するタンパク質翻訳領域を有しており、ほぼ完全長ｃＤＮＡであると考えられる。ＡＫ０２２５６７のポリペプチドは既に分泌タンパク質として国際公開（ＷＯ９９／３８８１）されているが、ＫＩＡＡ１０３６もアミノ酸配列の相同性が５８％であることから考えて分泌タンパク質であると予測される。
実施例２
ヒト正常組織におけるＫＩＡＡ１０３６の発現
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞からＫＩＡＡ１０３６遺伝子のクローニングを試みた。ＮＣＢＩデータベースよりＫＩＡＡ１０３６遺伝子の３’非翻訳領域の核酸配列を基にＰＣＲ用プライマーとしてオリゴヌクレオチド２種類を合成した。
0004112374.tif 000002
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞であるＨＵＶＥＣからＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ（キアゲン社製）を用い、添付のマニュアルに従って全ＲＮＡを調製した。得られた全ＲＮＡ１０μｇをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（インビトロジェン社製）を用いて一本鎖ｃＤＮＡ断片を調製した。得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりＰｒｉｍｅｒ１（配列番号４）およびＰｒｉｍｅｒ２（配列番号５）を用い遺伝子断片の増幅を行った。
一本鎖ｃＤＮＡ５０分の一量に、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造社製）１．２５ユニット、Ｐｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ２を各１μＭ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑに添付のＰＣＲ反応用バッファー（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）を５μｌおよびｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅを最終濃度で２００μＭになるよう添加し、蒸留水で全量を５０μｌとしＰＣＲ用試料を調製した。９４℃で３分間を１回、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルを３０回、７２℃で５分間を１回でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応により増幅されたｃＤＮＡ断片をアガロース電気泳動により分画し、７５０ｂｐのｃＤＮＡ断片（配列番号６）を回収した。得られたｃＤＮＡ断片を制限酵素ＡｐａＩ、ＨｉｎｃＩＩおよびＰｓｔＩで消化し、アガロース電気泳動により分画されるｃＤＮＡ断片の大きさを測定することにより、回収したｃＤＮＡ断片が目的物であることを確認した。Ｐｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ２で増幅されたｃＤＮＡ断片５０ｎｇをＲｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、添付のマニュアルに従って、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍ  ｍｏｌ、１０  ｍＣｉ／ｍｌ）（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて３２Ｐ標識した。この３２Ｐ標識したｃＤＮＡ断片をプローブに用いノーザンブロット解析を行った。
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮＴＭ）Ｂｌｏｔｓ  Ｈｕｍａｎ  １２−Ｌａｎｅ  ＭＴＮ  Ｂｌｏｔ（クロンテック社製）のナイロン膜をＧＭＣバッファー（０．５Ｍ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．２、１％  ウシ血清アルブミン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７％  ＳＤＳを含む）に浸し、６５℃で１時間、予備ハイブリダイゼーションを行ったのち、３２Ｐ標識プローブを添加したＧＭＣバッファーにナイロン膜を浸し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のナイロン膜を２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で室温にて５分間、１×ＳＳＣ（０．２％  ＳＤＳ含む）で５０℃で３０分間、０．５×ＳＳＣ（０．２％  ＳＤＳを含む）で５０℃で３０分間順次洗浄を行った後、風乾した。次いで、このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フィルム社製）とともにイメージングプレートカセット（富士写真フィルム社製）に装着しオートラジオグラフィを行った後、イメージアナライザーＦＬＡ３０００（富士写真フィルム社製）で画像解析を行った。
その結果、脳、心臓、骨格筋、ひ臓、腎臓、肝臓、小腸および胎盤において約６ｋｂの大きさのシグナルが検出され、特に脳および胎盤において強い発現が観察された。
実施例３
ヒト臍帯静脈内皮細胞におけるＫＩＡＡ１０３６の発現
実施例１で示したように、ＶＥＧＦ処理したＨＵＶＥＣにおけるＫＩＡＡ１０３６遺伝子の発現はＤＮＡチップを用いたＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ受託解析により見出されたものであるため、当該遺伝子をプローブとしてＶＥＧＦ処理したＨＵＶＥＣより調製した全ＲＮＡを用いたノーザンブロット解析によって、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ解析結果の検証を行った。
実施例１と同様に、１％  ＦＣＳを含むＭ１９９培地に１ｎＭ  ｈｕｍａｎＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加した培地でヒト臍帯静脈内皮細胞であるＥｎｄｏｃｅｌｌ  ＨＵＶＥＣ（クラボウ社製）の培養を行った。培養後、０、０．５、１、２、６、１２および２４時間目に細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ（キアゲン社製）を用いて添付のマニュアルに従って全ＲＮＡを調製した。
各ＲＮＡサンプル５μｇを電気泳動後、ナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ−ＸＬ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に転写した。該ナイロン膜をＧＭＣバッファーに浸し、６５℃で１時間、予備ハイブリダイゼーションを行った後、実施例２と同様の３２Ｐ標識プローブを添加したＧＭＣバッファーにナイロン膜を浸し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のナイロン膜を２×ＳＳＣで室温にて５分間、１×ＳＳＣ（０．２％  ＳＤＳを含む）で５０℃で３０分間、０．５×ＳＳＣ（０．２％  ＳＤＳを含む）で５０℃で３０分間順次洗浄を行った後、風乾した。次いで、このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フィルム社製）とともにイメージングプレートカセット（富士写真フィルム社製）に装着しオートラジオグラフィを行った後、イメージアナライザーＦＬＡ３０００（富士写真フィルム社製）で画像解析を行った。
次に、沸騰水浴中に同ナイロン膜を浸すことによってプローブをデハイブリダイズさせ、実施例２と同様にして３２Ｐ標識したヒトβ−アクチンｃＤＮＡ断片をプローブとしてノーザンブロット解析を行った。各時間におけるβ−アクチン遺伝子のシグナル強度に対するＫＩＡＡ１０３６遺伝子のシグナル強度を算出し、未処理区でのシグナル強度による補正を行いＶＥＧＦ処理区におけるＫＩＡＡ１０３６の発現量比を算出した。
その結果、ＶＥＧＦ添加後０．５から２時間では発現抑制が見られたが、２４時間では３．２倍という高い遺伝子発現誘導が見られ、ＤＮＡチップでの結果が再現された（第２図）。
実施例４
ヒト癌組織におけるＫＩＡＡ１０３６の発現
ヒト由来各種臓器の正常組織および癌組織における当該遺伝子の発現量の違いについて解析を行った。
同一患者における胸部、子宮、結腸、胃、卵巣、肺、腎臓、直腸、子宮頸、小腸、前立腺の腫瘍組織と正常組織から合成したｃＤＮＡを固相したナイロン膜であるＭａｔｃｈｅｄ  Ｔｕｍｏｒ／Ｎｏｒｍａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ（クロンテック社製）を、実施例２と同様の３２Ｐ標識プローブを添加したＧＭＣバッファーに浸し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のナイロン膜を２×ＳＳＣで室温にて５分間、１×ＳＳＣ（０．２％  ＳＤＳを含む）で５０℃で３０分間、０．５×ＳＳＣ（０．２％  ＳＤＳ含む）で５０℃で３０分間順次洗浄を行った後、風乾した。次いで、このナイロン膜をイメージングプレート（富士写真フィルム社製）とともにイメージングプレートカセット（富士写真フィルム社製）に装着しオートラジオグラフィーを行った後、イメージアナライザーＦＬＡ３０００（富士写真フィルム社製）で画像解析を行った。
実施例３同様に該ナイロン膜をでハイブリダイズ後、３２Ｐ標識したβ−アクチン遺伝子をプローブとしてシグナル強度を測定した。各臓器におけるβ−アクチン遺伝子に対するＫＩＡＡ１０３６のシグナル強度の割合を算出し、同一患者の正常組織に対する癌組織の割合を求め、当該遺伝子の各種癌組織における発現量の変化を解析した。
その結果、卵巣癌患者４人および大腸癌患者１１人の全員で癌組織におけるＫＩＡＡ１０３６遺伝子の発現の増加が観察された（第３図）。
実施例５
ＫＩＡＡ１０３６のＣＯＳ細胞での発現
配列番号２の１位のＭｅｔから３６５位のＶａｌで表わされるＫＩＡＡ１０３６アミノ酸配列のカルボキシ末端に３×ＦＬＡＧ配列を付加したポリペプチドをコードするｃＤＮＡを動物細胞発現用ベクターに挿入しＣＯＳ細胞で発現させる。
ＫＩＡＡ１０３６をコードする配列番号１の３８６番目のＡから１４８０番目のＣで表わされる塩基配列を動物発現用ベクターｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１３およびｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４（シグマアルドリッチ社製）のＮｏｔＩ／ＸｂａＩ部位に挿入することによりＫＩＡＡ１０３６のカルボキシ末端に３×ＦＬＡＧを付加したポリペプチドを発現するプラスミドｐＦＬＡＧ１３−１０３６およびｐＦＬＡＧ１４−１０３６を構築した。
ｐＦＬＡＧ１３−１０３６およびｐＦＬＡＧ１４−１０３６の宿主としてＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞））を、形質転換にはＦｕＧＥＮＥ６試薬（ロシュダイアグノスティックス社製）を用い、添付のマニュアルに従って操作した。
１０％  ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を分注した６０ｍｍのディッシュに、ＣＯＳ−７細胞を５×１０５細胞／ウェルになるよう添加し、３７℃で１６時間培養を行った。培地交換後、該細胞に２μｇのｐＦＬＡＧ１３−１０３６および１０μｌのＦｕＧＥＮＥ６を添加し、４８時間培養を行った。ｐＦＬＡＧ１４−１０３６および対照区としてＫＩＡＡ１０３６ｃＤＮＡを挿入していないｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４についても同様に操作して形質転換体を作出し、培養を行った。
ＦＬＡＧ融合ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの発現はＬａｅｍｌｉの方法に従いウェスタンブロット法で解析を行った。
各種形質転換ＣＯＳ−７細胞の培養上清１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した後、ニトロセルロースメンブランキット（テフコ社製）付属ののニトロセルロースメンブランに電気的に転写した。該ニトロセルロースメンブランをブロッキング溶液（ＴＢＳ、ｐＨ７．６；５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含む）に浸し、室温で１時間振とう反応を行った後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識（シグマアルドリッチ社製）を添加したＴＢＳ（ｐＨ７．６；５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含む）溶液中に浸し、室温で１時間静置した後、該ニトロセルロース膜を洗浄液（ＴＢＳ、ｐＨ７．６０．０５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含む）で１０分間の洗浄を３回行った。該ニトロセルロース膜とＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅａｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を室温で反応させ、直ちに該ニトロセルロース膜およびＸ線フィルムＸ−ＯＭＡＴ  ＡＲ（コダック社製）をＸ−オマット  カセッテ（コダック社製）に装着し数分間露光した。
その結果、ｐＦＬＡＧ１３−１０３６およびｐＦＬＡＧ１４−１０３６で形質転換したＣＯＳ細胞の培養上清においては共に約５０ｋＤａの予測される大きさのバンドが検出されたが、対照区ではバンドは検出されなかった。従って、ＫＩＡＡ１０３６遺伝子は発現可能なＫＩＡＡ１０３６タンパク質をコードしており、ＫＩＡＡ１０３６が動物細胞において分泌タンパク質であることが確認された。
実施例６
ＫＩＡＡ１０３６タンパク質のバキュロウイルスでの発現
バキュロウイルスでの発現にはＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用いて、添付のマニュアルに従って操作を行った。
実施例５で作製したＣ末端に３×ＦＬＡＧ付加したＫＩＡＡ１０３６をコードするｃＤＮＡ断片を、ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＦａｓｔＢａｃ１のＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入し、昆虫細胞発現用プラスミドｐＦＡＳＴＢａｃ１０３６を構築した。該組換えプラスミドをＭａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ１０Ｂａｃ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓに導入し、バキュロウイルスゲノム（ｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡ）へ転移することにより組換えｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡを構築した。該組換えｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡをＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を用いてＳｆ９（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７１１、卵巣細胞）細胞に導入し、組換えバキュロウイルスを得た。該バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞培養液０．５ｍｌを１．５×１０６個／ｍｌ濃度血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または悪性新生物でＳｆ９細胞培養液５０ｍｌに添加し、２８℃で９６時間培養を行った。該細胞培養液を遠心分離し沈殿画分に形質転換体を得た。
ＫＩＡＡ１０３６ＦＬＡＧの発現は実施例５と同様にウェスタンブロット法により確認した。
回収した形質転換細胞を５ｍｌ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４で１回洗浄した。洗浄後の細胞に５ｍｌ  Ｌｙｓｉｓ溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  Ａｍｉｄｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  ｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｒｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、０．１％  ＮＰ−４０を含む）に懸濁し、氷中にてＭＩＣＲＯＣＯＮ（ＨＥＡＲＴ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製）にて超音波処理１５秒間を４回行った後、１４，５００×ｇで２０分間遠心分離し、得られた上清画分に等量のＬｙｓｉｓ溶液を添加したものを粗タンパク質溶液とした。
粗タンパク質溶液１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した後、ニトロセルロースメンブランキット（テフコ社製）付属ののニトロセルロースメンブランに電気的に転写した。該ニトロセルロースメンブランをブロッキング溶液（ＴＢＳ、ｐＨ７．６；５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含む）に浸し、室温で１時間振とう反応を行った後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識（シグマアルドリッチ社製）を添加したＴＢＳ、ｐＨ７．６（５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含む）溶液中に浸し、室温で１時間静置した後、該ニトロセルロース膜を洗浄液（ＴＢＳ、ｐＨ７．４；０．０５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含む）で１０分間の洗浄を３回行った。該ナイロン膜とＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅａｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を室温で反応させ、直ちに該ニトロセルロース膜およびＸ線フィルムハイパーフィルムＥＣＬ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）をＸ−オマット  カセッテ（コダック社製）に装着し数分間露光した。
ＫＩＡＡ１０３６ＦＬＡＧタンパク質を抗ＦＬＡＧ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
ＦＬＡＧタンパク質精製用アフィニティーカラムＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２−Ａｇａｒｏｓｅ（シグマアルドリッチ社製）をＴＢＳ、ｐＨ７．４（０．１％  ＮＰ−４０を含む）で平衡化した後、粗タンパク質溶液を添加しＦＬＡＧタンパク質の分画を行った。分画後のカラムをＴＢＳ、ｐＨ７．４（０．１％  ＮＰ−４０を含む）で洗浄し、Ｇｌｙ−ＨＣｌ、ｐＨ３．５（０．１％  ＮＰ−４０を含む）で１ｍｌ／画分となるよう溶出した。各分画に２０μｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を添加することにより中和しアフィニティー精製画分とした。
粗タンパク質画分およびアフィニティー精製画分の各１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した後、該ゲルをＢｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（バイオラッド社製）により銀染色した。
その結果、約５０ｋＤａの予測される大きさのバンドが検出された。
さらに、該精製画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分画後ＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）に電気的に転写しＢｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（バイオラッド社製）により染色したバンドを切り取り、そのままアミノ酸シークエンサーＰｒｏｃｉｓｅＭｏｄｅ１４９１（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いてポリペプチドのアミノ末端部分の配列を解析した。
その結果、配列番号２で表わされる、アミノ酸配列の第２位のＰｒｏから第１０位のＧｌｙに一致するアミノ酸配列であったことから、発現しているタンパク質がＫＩＡＡ１０３６であることが確認された。
実施例７
ＫＩＡＡ１０３６による血管内皮細胞のＤＮＡ合成に対する阻害効果
ＫＩＡＡ１０３６タンパク質の血管内皮細胞の増殖に対する効果を調べるために、ＫＩＡＡ１０３６タンパク質存在下（処理区）および非存在下（対照区）におけるＶＥＧＦ処理ＨＵＶＥＣ細胞でのＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）の取込みを測定した。ＫＩＡＡ１０３６タンパク質としては実施例６でバキュロウィルス発現系で発現させた、アフィニティークロマトグラフィーで精製したタンパク質を用いた。また、ＢｒｄＵの細胞への取込みは、細胞増殖ＥＬＩＳＡ，ＢｒｄＵ化学発光キットを用い、添付のマニュアルに従って操作した。
ヒト血管内皮細胞であるＥｎｄｏｃｅｌｌ  ＨＵＶＥＣ（クラボウ社製）を、５％  ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＭ１９９培地（ニッスイ社製）を分注したコラーゲン・コート培養皿（ＩＷＡＫＩ社製）に３０００細胞／皿となるよう分注し、３７℃で２４時間培養を行った。該培養細胞にＶＥＧＦ処理区は１％  ＦＣＳを含むＭ１９９培地に１ｎＭ  ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＫＩＡＡ１０３６タンパク質が０、１ｎＭまたは１０ｎＭとなるよう調製した培地を、ＶＥＧＦ未処理区（対照区）はｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ１６５を含まずＫＩＡＡ１０３６タンパク質が０、１ｎＭまたは１０ｎＭとなるよう調製した同培地に交換した後、ＢｒｄＵ標識液を０．０２ｍｌ／ウェル添加し、３７℃で１２時間培養を行った。該培養細胞を室温で１時間放置し固定化を行った後、ＰＯＤ標識抗ＢｒｄＵ抗体溶液０．１ｍｌ／ウェルを添加し、室温で１時間放置した。該細胞をウォッシング・バッファーで５分間で３回の洗浄を行った後、発色基質０．１ｍｌ／ウェルを添加し３分間振盪反応させ１０分以内にＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ  ＪＮＲ（ＡＴＴＯ社製）で５秒間の瞬時蛍光を測定した。
その結果、ＶＥＧＦはＨＵＶＥＣ細胞のＤＮＡ合成を促進したが、ＫＩＡＡ１０３６タンパク質は用量依存的にその作用を抑制した（第４図）。
実施例８
ＫＩＡＡ１０３６タンパク質による血管内皮細胞の遊走に対する阻害効果
ＫＩＡＡ１０３６タンパク質の血管内皮細胞の遊走に対する効果を改変Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ法により検討した。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（コーニングコースター社製）のＬｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒにＶＥＧＦ処理区（試験区）には０．２５ｎＭ  ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＫＩＡＡ１０３６タンパク質が１ｎＭまたは１０ｎＭとなるよう調製したＭ１９９培地を、ＶＥＧＦ無処理区（対照区）にはＫＩＡＡ１０３６タンパク質が１ｎＭまたは１０ｎＭとなるよう調製したＭ１９９培地をそれぞれ６００μｌ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、Ｕｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒはＭ１９９培地（５％  ＦＣＳを含む）で１６時間培養したＥｎｄｏｃｅｌｌ  ＨＵＶＥＣ（クラボウ社製）を４×１０４個／ｗｅｌｌを分注し、３７℃で４時間培養を行った。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌのフィルターをディフクイック固定液（国際試薬社製）にて固定した後、ディフクイック染色液（国際試薬社製）にて染色した。フィルターのＵｐｐｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ側を拭いた後、下方に移動した細胞数を計測することによりＬｏｗｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ培地成分中の細胞遊走能を測定した。
その結果、ＶＥＧＦはＨＵＶＥＣ細胞の遊走を促進したが、ＫＩＡＡ１０３６タンパク質はその作用を有意に抑制した（第５図）。
実施例９
ＫＩＡＡ１０３６タンパク質による血管内皮細胞の管腔形成に対する阻害効果
ＫＩＡＡ１０３６タンパク質による血管内皮細胞の管腔形成に対する効果を調べるために、ＫＩＡＡ１０３６タンパク質存在下（処理区）および非存在下（対照区）におけるＨＵＶＥＣ細胞の管腔形成を観察した。
氷上で冷却した６穴マイクロプレートに１穴当たり１ｍｌのマトリゲル（ベクトンディッキンソンバイオサイエンシズ社製）を分注し、３７℃で１時間静置しゲル化させた。ＥＢＭ培地（１０％  ＦＣＳを含む）中で浮遊させたＥｎｄｏｃｅｌｌ  ＨＵＶＥＣ（クラボウ社製）から、ＫＩＡＡ１０３６処理区（試験区）として実施例６で調製したＫＩＡＡ１０３６タンパク質を最終濃度で１ｎＭおよび１０ｎＭ添加したもの、未処理区（対照区）としてＫＩＡＡ１０３６を添加しないものを調製し、ゲル化したマトリゲルに細胞が５×１０４個／穴となるよう分注した後、３７℃で９時間培養した。試験区および対照区におけるＨＵＶＥＣのネットワーク形成を倒立顕微鏡で観察した。
その結果、ＫＩＡＡ１０３６タンパク質はネットワーク形成を著明に抑制しており、管腔形成を阻害することが明らかとなった。
産業上の利用の可能性
ＫＩＡＡ１０３６のｍＲＮＡの検出方法、ＫＩＡＡ１０３６のポリペプチドの検出方法、血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患または悪性新生物のマーカー、診断用キット、および治療剤が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ＫＩＡＡ１０３６とＡＫ０２２５６７のアミノ酸配列を比較した模式図である。
Ｑｕｅｒｙ：６１４はＫＩＡＡ１０３６のアミノ酸配列を、Ｓｂｊｃｔ：１はＡＫ０２２５６７のアミノ酸配列を示している。
第２図は、ノーザンブロット法によるヒト臍帯静脈内皮細胞におけるＫＩＡＡ１０３６の発現量を表わしている。
１ｎＭ  ＶＥＧＦを０、０．５、２、６、１２、２４時間処理したヒト臍帯静脈内皮細胞から全ＲＮＡを調製し、β−アクチン遺伝子のシグナル強度に対するＫＩＡＡ１０３６遺伝子のシグナル強度を算出した。対照区（未処理）でのシグナル強度を１とした場合の相対的な発現量を示している。
ＶＥＧＦ添加後０．５〜２時間では発現抑制が見られたが、添加後２４時間では３．２倍の高遺伝子発現誘導が見られた。
第３図は、ドット・ブロット法によるヒト癌組織におけるＫＩＡＡ１０３６の発現量を表わしている。
ヒト卵巣癌または大腸癌患者由来組織および各癌組織に対応した同一患者の正常組織に由来するｃＤＮＡを固相したナイロン膜を用い、β−アクチン遺伝子のシグナル強度に対するＫＩＡＡ１０３６遺伝子のシグナル強度を算出した。各癌組織でのシグナル強度について、同一患者の正常組織に対する割合を求め、当該遺伝子の各種癌組織における発現量の変化を解析した。その結果、４人の卵巣癌患者全員および１１人の大腸癌患者全員の癌組織においてＫＩＡＡ１０３６遺伝子の発現増加が観察された。
第４図は、血管内皮細胞に対するＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの細胞増殖抑制効果を示している。
ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取込みによるＤＮＡ合成を指標してヒト血管内皮細胞における細胞増殖を定量した。ヒト血管内皮細胞をＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドが最終濃度でそれぞれ０、１、１０ｎＭとなるよう調製したＭ１９９培地に分取し、ＢｒｄＵ試薬を添加した後、１２時間培養を行い、細胞に取込まれたＢｒｄＵ量を測定した（レーン１〜３）。１ｎＭ  ＶＥＧＦを添加したＭ１９９培地を用いて同様の操作を行い、細胞に取込まれたＢｒｄＵ量を測定した（レーン４〜６）。
その結果、ＶＥＧＦの有無にかかわらず、添加したＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの濃度に依存して細胞のＤＮＡ合成の減少が観察された。
第５図は、血管内皮細胞に対するＫＩＡＡ１０３６の遊走活性抑制効果を示している。
フィルターで仕切られた培養装置の下層にＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドを最終濃度でそれぞれ０、１、１０ｎＭとなるよう調製したＭ１９９培地を、上層に血管内皮細胞を分取し４時間培養を行い、フィルターに付着した細胞数を計測した（レーン１〜３）。０．２５ｎＭ  ＶＥＧＦを添加したＭ１９９培地を用いて同様の操作を行い、フィルターに付着した細胞数を計測した（レーン４〜６）。
その結果、ＶＥＧＦの有無にかかわらず、添加したＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドの濃度に依存して細胞の遊走活性阻害が観察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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