(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ酵素活性を有する蛋白質でああって、以下のいずれかの特徴を有する蛋白質。
(a)配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する。
(b)配列番号２で示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ酵素活性を有する。
(c)配列番号１で示される塩基配列によってコードされる。
(d)配列番号１で示される塩基配列において縮重コドンを含む縮重異性体によってコードされる。
【請求項２】
請求項１に記載された蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載された遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項２に記載された遺伝子が導入された細胞。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、植物の中の脂肪酸の合成に関与する合成酵素のアミノ酸配列およびそれに関係するＤＮＡの構造、すなわち特定のアミノ酸配列を有する脂肪酸合成酵素タンパク質およびそれをコードする遺伝子に関するものである。そのような遺伝子および適切な調節配列（調節遺伝子）を挿入したキメラ遺伝子を用いて細胞の形質転換を行い、細胞中の飽和および不飽和脂肪酸の量を制御することができる。
背景技術
脂肪酸合成酵素に関しては２つの型のあることが知られており、動物や酵母の酵素は、多種類の酵素全体が一つの機能を持つ複合体として結び付いている脂肪酸合成酵素複合体（FAS）であるのに対し（I型）、高等植物細胞および原核生物の酵素は、個々の酵素が生体外では独立してバラバラになるもの（II型）である。II型の酵素による脂肪酸合成には可溶性のタンパク質であるアシルキャリアプロテイン（ACP）を必要とし、脂肪酸はアシル−ACPとして合成される。この合成系の最終産物は、パルミトイル−ACPである。パルミトイル−ACPは更にステアロイル−ACPに鎖長が伸長された後、可溶性の脂肪酸不飽和化酵素（ステアロイル−ACP不飽和化酵素）によって不飽和化を受け、オレオイル−ACPに変換される。パルミチン酸とオレイン酸は極性脂質に取り込まれた後、更に後者は不飽和化される（J. Ohlrogge and J.Browse（1995）Lipid Biosynthesis. The Plant Cell 7,p957-970）。
パルミトイル−ACPからステアロイル−ACPへの鎖長伸長酵素は、パルミトイル−ACPとマロニル−ACPとNADPHからステアロイル−ACPを作る（J.Ohlrogge and J. Browse（1995）Lipid Biosynthesis. The Plant Cell 7,p957-970）。これらの反応はパルミトイル−チオエステルとＣ２単位の、縮合物の還元、脱水、再還元によるステアロイル−チオエステルの生成までの一連の酵素反応の概要全体を説明したものである。
植物における脂質の生合成は非常に良く研究されてきた（Browse et.al.,Annu.Rev.Plant Physiol.Mol.Biol.（1991）42:467-506）。これらの研究から、植物細胞においてパルミチン酸からステアリン酸の生成は、β−ケトアシル−ACPシンテターゼII酵素（KASII）によって触媒される反応であることが明らかになっている。しかし、上記文献においては、KASII酵素およびその遺伝子のいずれについても単離されておらず、それらの配列も不明である。
またKASのアイソザイムは植物の葉緑体では３種類知られており、KASII以外の２種類のアイソザイムについては、KASIIIはアシル鎖の合成の開始を触媒し、KASIはアシル鎖の炭素数１６のパルミトイル−ACPまでの伸長反応を触媒する。植物の脂質合成に関係する酵素の突然変異体がシロイヌナズナから多数分離されており、特に不飽和化反応を行なう酵素については詳細に分析されている。KASIIについても報告があり、変異体はfab1と命名されている。この変異体ではKASII酵素活性が６５％に低下し、その結果パルミチン酸含量が葉では７％、根では３％増加していた（Wu et. al., Plant Physiol.（1994）106: 143-150）。
KASII酵素の完全精製について、およびその精製酵素の限定分解ペプチドのアミノ酸配列に基づいて遺伝子がトウゴマ（Ricinus communis；特表平6-500234号公報）およびタイズ（Glycine max；特表平7-501446号公報）からクローニングされている。上記公報において、これらの遺伝子を用いた形質転換による脂肪酸の変化については、トウゴマの遺伝子を大腸菌で発現させた場合、炭素数１６の脂肪酸含量は、約２０％減って全脂肪酸含量の３０％強になり、一方、タイズの遺伝子をカノーラに導入した場合、その種子のパルミチン酸は０．８％減少し、タバコに導入した場合、その葉ではパルミチン酸は約２％の減少であった。なお、不思議なことにトウゴマとダイズの両者の遺伝子の間には明確な相同性を示す配列は見つかっていない。
ところで、生体膜を構成する膜脂質は、主に脂質に結合している脂肪酸の不飽和度によって相転移温度が変化し、その結果、生物の低温耐性も変化する事が知られている。膜脂質の不飽和度を上げるためには、例えば脂肪酸の転移酵素（PCT/JP 92/00024（PCT/WO 92/13082））、脂肪酸の不飽和化酵素（PCT/JP 94/02288（PCT/WO 95/18222））などが有効とされている。
発明の開示
本発明は上記事情に鑑み、植物細胞あるいは微生物細胞中の飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸の含量を調節もしくは制御することを可能とする酵素活性を有するタンパク質の遺伝子およびその発現産物としての酵素タンパク質を提供することを目的とする。
脂肪酸合成に関与する酵素活性が低下して細胞の脂質中のパルミチン酸含量が増加し、逆に酵素活性が増加して炭素数１８以上の脂肪酸含量が増えるような酵素活性を有するタンパク質が存在すれば、例えば酵素活性の増加によりこの炭素数１８以上の脂肪酸含量の増加の結果おそらく脂質中の不飽和脂肪酸含量が増加すると考えられる。
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ラン藻（Anacystis nidulans）からβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII（KASII）酵素をコードする遺伝子を単離することに成功し、さらに当該遺伝子を大腸菌に導入することによってKASII生産能が付与され、それにより鎖長が伸長された脂肪酸が増加することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有しかつKASII酵素活性を有するタンパク質に関するものである。
また、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有しかつKASII酵素活性を有するタンパク質をコードするKASII酵素遺伝子にも関する。
更に、本発明は、上記遺伝子を含む組換えベクターおよび上記遺伝子が導入された細胞に関するものである。
【図面の簡単な説明】
第図１は、配列表２（アミノ酸３文字表記）に対応するアミノ酸１文字表記によるアミノ酸配列を示す。
第図２は、大麦（SWISS-PROTデータベースでのアクセッション番号はP23902）KASI酵素のアミノ酸とトウゴマ（GENBANKアクセッション番号L13241）KASIIのDNA配列から予想されるアミノ酸配列の比較図である。
第図３は、本発明におけるAnacystis nidulans由来のKASII酵素（図ではKASIIと記す）とSynechocystis sp. strain PCC6803のfabFまたはJ（コードsll 1069）のアミノ酸配列（Fabと記す）の比較図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
KASII酵素活性タンパク質およびその遺伝子
本発明のKASII酵素活性を有するタンパク質は、配列番号２（図１のアミノ酸配列（１文字表記）に対応）で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有するものであり、また、本発明のKASII酵素活性タンパク質遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有する上記酵素タンパク質をコードするものであることは前記したところである。本発明でいう「KASII酵素活性を有するタンパク質」または「KASII酵素活性タンパク質」とは、脂肪酸（特にパルミチン酸）の鎖長を伸長したより高級な脂肪酸（特にステアリン酸）を生成する酸素活性を有するタンパク質を意味するものである。
このようなKASII酵素活性タンパク質としては、自然界に存在する適切な遺伝子の産物を用いることができる他に、これらタンパク質のアミノ酸配列の一部が変化した変異遺伝子産物であっても、上記KASII酵素活性を保持している限り、本発明に用いることができる。KASII酵素活性タンパク質遺伝子の産物の例としては、微生物であるラン藻（配列番号２）由来のKASII酵素が代表例としてあげられる。
本発明において「実質的に同一なアミノ酸配列」とは、上記のような変異体の配列も包含されることを意味するものであり、典型的には配列番号２で示されるラン藻由来の酵素タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２、図１）、または該配列においても１もしくは複数、好ましくは１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたものである。
従って、本発明において「実質的に同一なアミノ酸配列…をコードする遺伝子」という場合の「実質的」という用語は、自然界に存在する上記に定義したKASII酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の遺伝子だけでなく、上記のような変異型のKASII酵素活性タンパク質をコードするＤＮＡ配列の遺伝子をも包含することを示し、典型的には配列番号２で示されるアミノ酸配列、または該配列において１もしくは複数、好ましくは１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されるものであるアミノ酸をコードするＤＮＡ配列の遺伝子である。また一般に、ＤＮＡ鎖が、あるアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする場合、一つのアミノ酸に対応する遺伝コード（コドン）が複数個存在し（縮重異性体）、本発明のKASII酵素活性タンパク質をコードするＤＮＡ鎖においても、任意の遺伝コードを用いることができることは言うまでもない。
本発明の遺伝子によりコードされるKASII酵素活性タンパク質は、前記のごとく本来植物および微生物に存在する脂肪酸合成の鎖長伸長酵素の機能を有しており、更に具体的な機能において脂肪酸（特にパルミチン酸）の鎖長を伸長したより高級な脂肪酸（特にステアリン酸）を生成する酵素活性を有するものである。本発明タンパク質の典型例はラン藻由来のものであるが、このラン藻由来のKASII酵素の化学構造は大腸菌および大麦のKASI遺伝子のコードするタンパク質と局所的に類似していおり、また、前出のKASIIに関する特許出願公表のうちトウゴマ由来の酵素とも局所的に類似している。本発明によるKASII酵素活性タンパク質は、前述のように配列番号２で示されるアミノ酸配列またはその配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有し、かつ脂肪酸（特にパルミチン酸）の鎖長を伸長したより高級な脂肪酸（特にステアリン酸）を生成する活性の著しく高い酵素活性を有するものである。
本発明タンパク質をコードする遺伝子を取得する一つの手段は、核酸合成の方法に従ってその鎖長の少くとも１部を化学合成することであるが、結合アミノ酸の数を考えれば、この化学合成法よりも天然素材、特に細菌であるラン藻から単離したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、この遺伝子のライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法によりこれを取得する方法が好ましいといえる。
KASII酵素遺伝子は、例えば、以下のようにして得ることができる。
まず、高等植物または微生物、特にラン藻より公知の方法により酵素を精製し、これをペプチダーゼにより断片化し、その断片のアミノ酸配列を決定する。次に、アミノ酸配列を決定した断片化ペプチドに対応するオリゴヌクレオチドを合成する。これとは別に、植物又は微生物から全RNAを抽出し、このRNAに相補的なDNA（cDNA）を合成する。このcDNAをファージλgtl1のような適当なベクターにつなぎ、cDNAライブラリーを作成する。ここで当該遺伝子の選抜方法としては、通常公知の方法、例えば抗体によるプラークハイブリダイゼーション法、若しくはコロニーハイブリダイゼーション法等の免疫学的方法、又はヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法等を用いることができる。
また、既知のKASII酵素またはこれに関連した他のアイソザイムの共通配列をもとに、目的とする配列の両端に位置する短いDNA配列に対応するプライマーを設計し、全体の配列を決定するのに使った材料から得たDNAを鋳型としてPCRを行うことにより、目的とする配列を得ることもできる。この場合、KAS遺伝子のアイソザイムを区別するために、例えば、その遺伝子を大腸菌で発現させることにより活性を同定することができる。
このようにして選抜したクローンにおける本発明遺伝子の塩基配列の決定および確認は、通常公知の方法を用いて行なうことができる。例えば、Ｍ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Sambrook et. al., Molecular Cloning, 2nd edition（1989））により行なう事ができる。
上記のようにして塩基配列が決定された本遺伝子は、通常公知の手段、例えばホスファイト法を用いた市販のＤＮＡシンセサイザーで合成することも可能である。
また、ＤＮＡ鎖またはその断片を発現させてそれがコードするタンパク質もしくはポリペプチドを産生させるためには、そのアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列（コーディング領域）以外に、発現調節配列が必要である。従って、本発明ＤＮＡ鎖は、このような発現調節配列を含むＤＮＡ配列をも包含する物である。この発現調節領域の中で、特に高等植物で発現させるために重要なのがコーディング領域の上流のプロモーター配列（たとえばカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモータ由来）、および下流のポリＡ付加シグナル（たとえばノパリン合成酵素のターミネーター由来）である。取得したＤＮＡが高等植物のゲノム遺伝子である場合には、ＤＮＡ配列に発現調節領域が含まれていれば、それをそのまま用いることもできる。
KASII酵素活性タンパク質遺伝子の用途
本発明は、上述のＤＮＡ鎖またはその断片を含有する組換えベクターおよびこの遺伝子を導入した細胞にも関するものであることは前記したところである。
組換えベクターは上述のＤＮＡ鎖またはその断片をベクターに連結した物であり、ベクターとしてはプラスミド（たとえばｐＥＴ１７ｂ）、ファージ（たとえばλZAPII）等公知の物が使用できる。
この組換えベクターＤＮＡを上記したような適当な植物、あるいは微生物細胞に導入して発現させる事により、宿主においてKASII酵素を生産することができる。
なお、細胞としては、微生物細胞、植物細胞のいずれでもよく、生物の種類も問わないが、微生物細胞としては大腸菌等があげられ、また植物細胞としてはタバコ等の低温感受性植物等である。植物への遺伝子の導入方法としては、通常公知の方法、例えば「Plant Molecular Biology Manual, Second Edition; S.G.Gelvin, and R.A. Schilperoort eds, Kluwer Academic Publishers, 1995」記載の方法を用いて行なう事ができる。その例としては、生物的方法であるウイルスを用いる方法、アグロバクテリウムを用いる方法等、物理化学的方法であるエレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法等が挙げられる。
また、KASII酵素は植物体では葉緑体の包膜に存在するタンパクである事から、葉緑体への転移ペプチドをコードするＤＮＡ鎖をKASII酵素の上流に付けておく必要がある。その例としては、エンドウのリブロース−１、５−２リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット遺伝子を当該転移ペプチドをコードする遺伝子として用いる事ができる。
本発明のKASII酵素活性タンパク質、代表的にはラン藻Anacystis nidulans由来のKASII酵素活性タンパク質（アミノ酸配列番号２）をコードする遺伝子（ラン藻由来の遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号１）は、形質転換による植物、微生物の脂質組成の改良、特に炭素数１６および１８の脂肪酸の量比の制御に有用である。
本発明のKASII酵素タンパク質が、外来タンパク質として生体内で発現することにより、脂肪酸の鎖長が炭素数１６（パルチミン酸）から１８（ステアリン酸）に伸長され、ステアリン酸は生体内で不飽和化されて、不飽和脂肪酸含量が増加する。不飽和脂肪酸が増加した植物では、低温耐性が増加すると考えられ（PCT/WO 92/13082、PCT/WO 95/18222）、また不飽和脂肪酸が増加した微生物（酵母、大腸菌等）では培養のストレスに対する耐性の増加が期待される。
実施例
以下実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１  A. nidulans由来のDNAの調整およびDNAライブラリーの作成
A. nidulans（カタログNo. IAM M-6：東京大学分子細胞学研究所より入手可能）を、Shawの成書Plant Molecular Biology ２７９ページ（IRL PRESS 1988）に従って作成した約１００ｍｌのBG-11培地で培養した。２５℃、１０００ｌｕｘの蛍光灯下で毎分１２０回振とうし、十分菌を成育させた。菌体を室温で５０００ｇで１０分間遠心分離することにより回収した。
ＤＮＡを単離するため、沈殿した菌体を５０ｍｌの５０mM Tris Cl（pH8.0），１mM EDTA（Ａ液）に懸濁し、再度遠心分離することにより洗浄した。次に、１５ｍｌの５０mM Tris Cl（pH8.0），２０mM EDTA，５０mM NaCl，０．２５M sucroseの液（Ｂ液）中で再度懸濁し、Ｂ液に溶解した４０ｍｇのリゾチーム（シグマ社）を加え、３７℃でゆっくり振とうした。１時間後、１５ｍｇのプロテナーゼＫと最終濃度１％のＳＤＳを加え３７℃で１晩ゆっくり振とうした。翌日、NaCl04を１Ｍ濃度にし、２０ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加え、１０分間ゆっくり振とうし、遠心分離により水層を回収した。クロロホルム／イソアミルアルコール抽出をもう一度繰り返した後、５０ｍｌのエタノールを加え、ＤＮＡをガラス棒に巻き付けて回収した。このＤＮＡを２０ｍｌのＡ液に溶かし、NaClを０．１Mにし、ＲＮａｓｅを５０mg/ml濃度加え、３７℃で１時間反応させた。次に、Ａ液で飽和した等量のフェノールで２回抽出した。水層中のＤＮＡをエタノールを加える事により回収し、７０％エタノールで洗浄した後、１ｍｌのＡ液に溶かしＤＮＡ液とした。
得られたＤＮＡからゲノムＤＮＡライブラリーを作成するため約１００μｇのＤＮＡをSau 3A Iで部分消化した後、Sambrookらの成書に従って、ショ糖密度勾配下での超遠心分離により約９から２３kbのＤＮＡを回収した。これをBam HIとHind IIIで切断したλDASH II（Stratagene社キット）にクローニングした。
実施例２  ラン藻Anacystis nidulansからのKASII酵素類似遺伝子のクローニング
大麦のKASI酵素およびトウゴマのKASII酵素を比較して、その両者と間で相同性が高い領域に注目して、幾つかの短いDNA鎖を合成した（図２）。その中で、以下に示す組合わせで行った反応で、予想される大きさに一致する明瞭なバンドが観察された。
0004112014.tif 000002
このうち、配列番号４がアミノ酸配列EEVNYINAに対応するセンスプライマーで、配列番号３がアミノ酸配列NSFGFGGに対応するアンチセンス鎖をコードしているプラーマーである。センスおよびアンチセンスのプライマーを使いＰＣＲ反応を行なった。反応条件は、１００μｌの反応液中でプライマーを各２０μM、A. nidulans由来ＤＮＡを１μｇ入れ、GeneAmpTM PCR反応キット（宝酒造）を用いて行なった。反応プログラムは、９５℃（１分）５０℃（１分）７２℃（２分）を１サイクルとして、３５サイクル行なった。但し、１サイクル目のみ、９５℃反応を３分に延長し、５０℃の反応を３７℃に変更した。反応終了後、１００μｌのクロロホルムで抽出し水層を回収し、次いで１００μｌのエーテルでクロロホルムを除去して得た水層から、１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動により分析した。
その結果、予想される大きさと同じ大きさ（約330bp）のＤＮＡが検出された。このＤＮＡ断片をpCRIIベクター（Invitrogen社）にクローニングした。ＤＮＡの塩基配列は、蛍光シーケンサーを用いたダイデオキシ法（Applied Biosystem社製）により決定した。このＤＮＡをMultiprime DNA labelling Kit（Amersham社）を用いて32P-dCTPで標識しプローブを作成し、以下のハイブリダーゼーションの実験に用いた。
DNAライブラリーのファージを大腸菌Ｐ２３９２に感染させ、ＮＺＹＭ培地をいれた直径約１５cmのシャーレ上に約１万個のプラークを形成させた後、ナイロンメンブレンに転写させた。ハイブリダイゼーションは、サンブルック（Sambrook）らの著書（Molecular Cloning; Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に従って行なった。その条件は５×SSC（１×SSCは0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム），１０mM EDTA，１０×Denhardtの液（50×Denhardtの液はFicoll（Type400, Pharmacia社），polyvinylpyrrolidone,bovine serum albumin（fraction V, Sigma社）を各10g／l），および２５０μg/mlサケ精子DNAから成る液中で６０℃、１６時間とした。その後、メンブレンを５×SSC，０．１% SDS液中４５℃、１５分２回洗い、オートラジオグラフィーを取った。１０個の陽性クローンを純化後、ファージＤＮＡを得た。幾つかの制限酵素で切断し、アガロースゲルで電気泳動後、常法に従ってナイロンメンブレンへサザンブロッティングした。このメンブレンを上記のプラークハイブリダイゼーションと同じ条件でハイブリダイゼーションを行ない、ハイブリの強度およびＤＮＡ断片長の比較を行なった。その結果、そのうちの２クローン（λＢ、Ｆ）が強度および断片長いずれの点からも十分と考えられたので、更に幾つかの制限酵素で切断しサザンハイブリダイゼーションを行なった。その結果、Sal Iで切断した時、約５kbpのハイブリする断片が検出されたので、それをpUC１９（宝酒造社）のSal Iサイトにサブクローニングした（夫々pB，pFと呼ぶ）。それぞれのクローンを更に詳細に制限酵素によるマッピングを行なった所、pBとpFは同一のＤＮＡと判断されたので、後者について常法に従って制限酵素によるデリーションプラスミドを作成し、ハイブリダイズするＤＮＡ断片の周辺約２kbpについて、ＤＮＡ鎖の塩基配列を蛍光シーケンサーで決定を行なった（配列番号１）。そこには１２５１ｂｐからなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）があり、４１７残基のアミノ酸配列が推定された（配列番号２）。このアミノ酸配列の相同性をデータベースに登録されているタンパク質と比較すると、脂肪酸合成酵素と有意のホモロジーを示した。特に、かずさDNA研究所の作成したSynechocystis sp. strain PCC6803についての全ゲノム配列中のfabFまたはJ（データベースDDBJアクセッション番号D90905、PID;g1652389）とされているタンパクと最大の７４％のホモロジーを示した（図３）。他のタンパクでは、トウゴマ由来のKASII遺伝子、大麦由来のKASI遺伝子と４３〜４６％、また、大腸菌由来のKASIと３５％のホモロジーを示した。しかし、遺伝子のホモロジーからは、本ＯＲＦの機能が、KASI、IIまたはIIIのいずれに相当するのか判別できなかった。
実施例３  Anacystis nidulans由来のKASII類似遺伝子の大腸菌での活性測定
上記の遺伝子の機能を特定するために、大腸菌での発現を試みた。まず、ＯＲＦの前後の余分なＤＮＡ配列を除くため、Ｎ末側はＤＮＡ合成（Applied Biosystem社）によりスタートコドン（ＡＴＧ）の５’側にNde Iサイトを導入し、一方ＯＲＦの直後にHind IIIサイトを導入したものを作成した。
0004112014.tif 000003
両者の合成ＤＮＡをプライマーとして、pFを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ反応を行なった。反応条件は反応条件は、パーキンエルマー社のマニュアルに従い、９４℃（１分）、６０℃（１分）、７２℃（２分）を１サイクルとする反応を３０回繰り返した。この反応産物をNdeIおよびHindIIIで切断した後、同じ制限酵素のセットで予め切断したpET17bで大腸菌DH5株、次にそれをBL21（DE3）pLysS株（Novagen）にクローニングした。
後者の大腸菌株への組換え体を、１００μg/mlのアンピシリン、および３０μg/mlのクロラムフェニコールを加えた７５ｍｌのＬＢ培地で培養液の濁度が、波長６００ｎｍで０、５０Ｄになるまで培養（３２℃）を行なった。その後、最終濃度０．４mMのＩＰＴＧを加え、更に培養を２時間継続した。培養液から１０、０００Ｘｇ、１０分間の遠心分離で大腸菌を回収し、菌体を５０mM Tris HCl（pH7.4）で洗い、−２０℃で凍結した。この菌体を２０mM TrisHCl（pH8.0），２０mM dithiothreithol，１０mM MgCl2および１μg/mlDNaseIからなる溶液で氷中で融解させた。その後、100,000×g、４℃で１時間遠心分離し、上清のタンパク液を、１０〜２０％ポリアクリルアミド濃度購買のスラブゲル上でＳＤＳ電気泳動後、クマジーブリリアントブルーで染色した。その結果、Anacystis nidulans由来のタンパク質は分子量約５０ｋＤａのタンパク質として検出された。
この大腸菌の脂肪酸組成については、上記の様に培養した菌体から脂肪酸をメチルエステルとして回収し、分析した。メチル化は脂質約５ｍｇを無水メタノール性５％塩酸１ｍｌと共に封管中で沸騰水中で４時間加熱し、放冷した後、脂肪酸メチルエステルをヘキサンで抽出する。メチル化した脂肪酸エステルの分析は水素炎イオン化検出器を用いて、キャピラリーカラム（ポリエステル液相；１０％  ＥＧＳＳ−Ｘ、１７５℃）で行なった。スタンダードのメチル化脂肪酸の相対保持時間との対比により脂肪酸を決定した。結果を下の表に示す。
0004112014.tif 000004
その結果、炭素数１６の脂肪酸（16:0と16:1）が減少し、逆に炭素数１８の脂肪酸（18:0と18:1）の割合が、大幅に増加したことが判明した。
産業上の利用可能性
本発明により、Anacystis nidulans由来のKASII酵素に代表されるβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ鎖が提供された。本発明の酵素タンパク質をコードする遺伝子は上述のように、脂肪酸（特にＣ１６のパルミチン酸）をより高級な脂肪酸（特にＣ１８ステアリン酸）へ変換する活性が著しく高いKASII酵素の遺伝子であり、形質転換による植物の脂質の改良、微生物の脂質の改良、特に炭素数１６と１８の脂肪酸量の比率の調整もしくは不飽和脂肪酸含量の増加に有用である。
配列表
出願人氏名：麒麟麦酒株式会社
発明の名称：β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ酵素およびそれをコードする遺伝子
整理番号：１１３７０２−４３２
出願日：平成１０年１月２０日
配列の数：６
配列番号：１
配列の長さ：１２５１
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源：
生物名：Anacystis nidulans
株名：IAM M-6
配列
0004112014.tif 000005
配列番号：２
配列の長さ：４１７
配列の型：タンパク質
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源：
生物名：Anacustis nidulans
株名：IAM M-6
特徴を表わす記号：CDS
特徴を決定した方法：P
配列
0004112014.tif 000006
0004112014.tif 000007
0004112014.tif 000008
配列番号：３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0004112014.tif 000009
配列番号：４
配列の長さ：２３
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0004112014.tif 000010
配列番号：５
配列の長さ：２６
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0004112014.tif 000011
配列番号：６
配列の長さ：２７
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0004112014.tif 000012
【図１】
0004112014.tif 000013
【図２】
0004112014.tif 000014
【図３】
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