(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式のビタミンＤ誘導体を製造する方法であって、
【化１】
0004187929.tif 000014
ＲはビタミンＤ２またはビタミンＤ３の２５−ヒドロキシ側鎖を表し、；
Ｙは水素またはヒドロキシを表し、；
Ａは、スペーサー基を介して結合され、タンパク質に高い親和性で結合できる官能基を表し、；
以下の工程；すなわち、
ａ）アセトニトリルのような適切な溶媒中、水素化カリウムと第３ブタノールの存在下でのビタミンＤの開始化合物の３−ヒドロキシ基のシアノエチル化；
ｂ）水素化リチウムの添加と、２５−ヒドロキシ基のリチウムアルコキシドへの変換と、引き続くニトリル基の水素化リチウムアルミニウムによる還元；
および
ｃ）スペーサー基を官能基Ａとともに、アミノプロピルエーテル側鎖に結合させる；
工程によることを特徴とする上記ビタミンＤ誘導体を製造する方法。
【請求項２】
官能基Ａがビオチン、ジゴキシゲニン、チロシン、ＦＩＴＣ置換チロシン、置換されたアミノ酸、特異的なアミノ酸およびペプチド配列、ＦＩＴＣ、タンパク質およびペプチド類、Ａタンパク質、Ｇタンパク質およびビタミンＤ誘導体から選択される
請求項１記載の方法。
【請求項３】
官能基Ａが２５−ヒドロキシビタミンＤまたは１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤである
請求項１記載の方法。
【請求項４】
機能性ビタミンＤ基が３β位において、エーテルブリッジを介してスペーサー基と結合している
請求項３記載の方法。
【請求項５】
工程ｃ）が、ビオチニル−Ｎ−ε−アミノカプロイル−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ＬＣ−ＢＨＮＳ）または活性化されたビオチニル化試薬によって行われる
請求項２記載の方法。
【請求項６】
スペーサー基はアミノカルボン酸基、アミノウンデシル酸基またはアミノポリエーテル基である
請求項１記載の方法。
【請求項７】
請求項１記載の前記方法の工程ａ）およびｂ）を特徴とする
３−アミノプロピルエーテル−２５−ヒドロキシまたは３−アミノプロピルエーテル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ中間体化合物を製造する方法。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに従って製造されたビタミンＤ誘導体の標準化された量の固体または溶液を含む、２５−ヒドロキシ−および１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ代謝物の検出用試薬セット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２５−ヒドロキシビタミンＤの誘導体の製造法と、当該製造法により製造した２５−ヒドロキシビタミンＤの誘導体を含む、試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤおよび１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ代謝物の検出用試薬セットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−ビタミンまたはカルシフェロールは、日光により触媒されて、それらのプロビタミンからステラン環のＢ環の開裂を通して生じる。それらの最も重要な代表物はビタミンＤ3（コレカルシフェロール）およびビタミンＤ2（エルゴカルシフェロール）であり、それらは側鎖がわずかに異なるだけであるが、知られている限りでは、それらは同様に代謝され、同じ生物学的作用を有する。プロビタミンＤ2は食物とともに摂取されなければならないのに対して、プロビタミンＤ3はヒトの生体内で生成され得る。索引によって、それ以上限定的に表されないように、ビタミンＤという用語は一般に、以下のすべてのビタミンＤの型を含む。皮膚で生成された、または食物とともに摂取されたビタミンＤは、血漿中でビタミンＤ結合または輸送タンパク質（ＤＢＰ）に結合され、肝臓に輸送され、そこで２５−ヒドロキシビタミンＤ（２５−ＯＨ−Ｄ）に代謝される。ビタミンＤ結合タンパク質ＤＢＰはＧｃ−グロブリンまたは「グループ特異的成分」（J. G. Haddad, J. Steriod Biochem. Molec. Biol. (1995) 53, 579-582）としても知られている。血清中の測定可能な２５−ヒドロキシビタミンＤの９５％を超えるものが、通常、２５−ヒドロキシビタミンＤ3である。２５−ヒドロキシビタミンＤ2は、人がビタミンＤ2の投薬を受けているとき、または、米国においてしばしば習慣であるように、食品がビタミンＤ2によって補充されているときにのみ、より大きい比率で見出される。
【０００３】
２５−ヒドロキシビタミンＤは血液循環中での主なビタミンＤ代謝物であり、その血清中での濃度は通常、ビタミンＤ状態、すなわち、ビタミンＤが生体にどの程度まで利用可能であるかを示す。必要であれば、２５−ヒドロキシビタミンＤは、大きい生物学的活性を有するホルモン様物質の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤに、腎臓において代謝される。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの定量は、どのくらいビタミンＤが活性型で存在するかを示す。
【０００４】
試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤの定量は、好適には、ビタミンＤ結合タンパク質の結合サイトからの放射性２５−ヒドロキシビタミンＤの置換に基づく、競合的タンパク質結合分析の原理に従って行われ、試料中に存在する２５−ヒドロキシビタミンＤが定量され得る。また、この数年にわたって、125Ｉ−標識ビタミンＤ誘導体およびビタミンＤ誘導体に対する抗体を用いるラジオイムノアッセイは、診断において確立されている。血清中の２５−ヒドロキシビタミンＤの通常レベルのデータは、研究室によって様々である。しかしながら、血清中の２５−ヒドロキシビタミンＤ濃度は、通常、５ｎｇ／ｍｌより大きく、８０ｎｇ／ｍｌより小さいことが一致している。競合的タンパク質結合分析は、２５−ヒドロキシビタミンＤと同じタンパク質の結合特性をもたなければならない放射性ビタミンＤ誘導体の使用を要求する。これはまた、生物学的活性１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤおよび他のビタミンＤ代謝物の競合的結合分析にも当てはまる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
欧州特許明細書０  ３１２  ３６０および０  ３６３  ２１１、およびTanabe他、J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1989, 1220-1221およびJ. Nutri. Sci. Vitaminol., 1991, 37, 139-147は、様々な125Ｉ−標識ヒドロキシ−およびジヒドロキシビタミンＤ誘導体、および結合の研究におけるそれらの使用を開示している。これらの誘導体は、それらは生産するのが問題であり、極端に不安定であるという不都合が難点となっている。光、放射線、プロトン、水素、酵素、フリーラジカルまたは遊離または結合型のヨウ素の存在は、ビタミンＤ結合タンパク質ＤＢＰまたは特異的抗体に対するビタミンＤ誘導体の配置および結合特性に大きな影響をもつ。特に、それらはステラン系のＡ環の回転を起こす、または触媒することができる。それにより、ビタミンＤ分子の３β−ヒドロキシ基はプソイド−１α位に回転され、それにより、５，６−トランス−ビタミンＤが得られる。ビタミンＤのいわゆるプソイド−１α−ヒドロキシ−アナログは、ビタミンＤと同様に代謝されるかもしれないが、しかしながら、それらは重要な点で異なる構造を有し、例えばＤＢＰ／Ｇｃ−グロブリンまたは抗ビタミンＤ抗体のようなビタミンＤ結合タンパク質と結合しなかったり、著しく、より弱く結合したりする。
【０００６】
【化２】
0004187929.tif 000002
【０００７】
上記の転位は一例として理解されるべきである。その他の化学反応および転位も起こる。同じことは3Ｈ−または14Ｃ−標識ビタミンＤ誘導体に当てはまる。これらのビタミンＤ誘導体は同様に、それらが信頼性のある結合試験を許容する程度に安定ではない。放射性標識は保管、輸送および廃棄のコストをさらに増加させ、一般に、健康や環境に対して不利である。さらに、125ヨウ素の半減期は比較的短い。一方、3Ｈ−および14Ｃ−標識ビタミンＤ誘導体を用いた競合的結合分析は、特別のシンチレーションカウンターを要求し、主に同じ問題により、装置に関して、より要求が多い。
【０００８】
Ray他はBiochemistry, 1991, 30, 4809-4813 で、ビタミンＤ3の多様な発色団との結合を開示している。しかしながら、色素標識された誘導体は血清中で安定でなく、さらに、特に光感受性が強いという事実とは別に、色素標識ビタミンＤ3誘導体に対する検出感度は、それらを天然のビタミンＤ代謝物の競合的結合分析に用いるには低すぎる。
【０００９】
本発明の目的は、競合的結合分析または、非常に一般的に、２５−ヒドロキシビタミンＤおよび１，２５−ジヒドロキシビタミンＤのようなビタミンＤ代謝物のイムノアッセイに用いることができる、入手可能なビタミンＤ誘導体の製造方法を開発することである。これは、以下のような性質とみなされる：まず、ビタミンＤ誘導体について、試料中の検出対象のビタミンＤ代謝物の濃度よりも高い検出感度が存在する、あるいは、検出感度がより低い濃度範囲にあること；第２に、誘導体が血清、血漿または尿中で、通常のプロトン性条件下で安定であり、血清酵素に対して安定であること；最後に、第３に、誘導体が光および保管に関して数週および数ヵ月にわたって十分に安定であること。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この目的は、次式を有するビタミンＤ誘導体の製造によって達成される。
【００１１】
【化３】
0004187929.tif 000003
【００１２】
ここで、
Ｏはエーテル基の酸素原子を表す；
Ｘは０．８から４．２ｎｍの長さで、好適にはＣ８−からＣ１２−基の置換された、または置換されていない炭化水素基を表し、それは、Ｓ、Ｏ、ＮまたはＰのような通常のヘテロ原子を有してもよく、特に最も好適なものはヘキサアミド−、オクタアミド−、またはデカアミド−アミドプロピルエーテルリンカー基；
Ｙは水素またはヒドロキシ基を表す；
Ａは抗体またはビタミンＤ結合タンパク質ＤＢＰのような結合タンパク質と高い親和性で結合する官能基；
ＲはビタミンＤ代謝物の側鎖、好適にはビタミンＤ2またはＤ3の側鎖、特に好適にはビタミンＤ2またはＤ3の２５−ヒドロキシル化された側鎖。
【００１３】
高い親和性は結合タンパク質、すなわち抗体またはＤＢＰと、抗原または官能基Ａとの間の解離定数（Ｋ）が１０8よりも大きいときに存在する。１０16より大きい解離定数は、多くの応用に有利である。好適な実施形態では、Ａはビオチン、ジゴキシゲニン、チロシン、置換されたチロシン、置換されたアミノ酸、特徴的なアミノ酸およびペプチド配列、ＦＩＴＣ、タンパク質および、Ａタンパク質およびＧタンパク質のようなタンパク質群、またはさらにビタミンＤ誘導体、特に最も好適には２５−ヒドロキシビタミンＤから選択される。
【００１４】
スペーサー基Ｘは好適には、置換された、および置換されていない０．８から４．２ｎｍ、好適には約１．２ｎｍの長さを有するＣ体から選択される。アミノカルボン酸、特にアミノウンデシル酸、ペプチドおよびケト基、または０．８から４．２ｎｍ、好適には約０．９から１．５ｎｍの長さを有する置換された、又は置換されていないアミノポリエーテル基が特に好適である。Ａ基と、ビタミンＤ基の結合または検出サイトとの間の、この分離は、結合タンパク質が各場合で考えられている結合サイトに結合でき、それにより、互いに妨害しないようにするために必要である。例えば、ビタミンＤ結合タンパク質ＤＢＰ（Ｇｃ−グロブリン）については、１９−メチレン基、適用可能であればＡ環の１−ヒドロキシ基、およびビタミンＤ側鎖が認識サイトに属し、結合ポケットに受容されることが考慮されるべきである。同様なことが、様々なビタミンＤ誘導体に対する特異的抗体にも当てはまる。もし、スペーサー基Ｘが短すぎれば、選択された官能基Ａに、ビタミンＤ結合タンパク質に加えて、さらに結合タンパク質が結合できない。好適な例としては、これは、機能性ビオチン基がビタミンＤ結合タンパク質の結合ポケット内に位置するとき、第２の結合タンパク質、例えばストレプトアビジンは、もう到達できないことを意味する。一方、スペーサー基Ｘが長すぎれば、分子の折り畳み（folding)が起こる可能性があり、それはまた、同時に起こる２つの結合パートナーの結合を妨害する。
【００１５】
さらに、本発明に従ったスペーサー基は、Ａ環の１８０°回転を明らかに活発に妨害することから、驚くほど立体的効果をもつ。この理論に限定されず、Ａ環のエーテル基の３β−酸素原子が、天然のヒドロキシ基に対応して水和しており、したがって、その他の電子的および立体的な効果とは別に、５，６−二重結合への攻撃を防止することが疑われる。さらに重要な観点は、本発明に従ったエーテル基は、血清または血漿中に常に存在するエステラーゼによって解離されないことである。
【００１６】
最も特に好適なものは、次式（ＩＩ）の25−ヒドロキシビタミンＤ3-3β-3'[6-N-（ビオチニル）ヘキサアミド]アミドプロピルエーテル、および１α−ヒドロキシ−およびビタミンＤ2類似体である。
【００１７】
【化４】
0004187929.tif 000004
【００１８】
さらに、好適なものは、第２の官能基としてビタミンＤ基を含む誘導体である。これらの誘導体の利点は、それらが系に対して異質な基および化合物を含まず、したがって、競合的結合分析の増加された感受性および信頼性を許し、また、それらが量的な検出において、ビタミンＤ結合タンパク質の第１および第２の結合での可能性のある結合異常を、補償するためである。特に好適なものは、以下の式（ＩＩＩ）の化合物である：
【００１９】
【化５】
0004187929.tif 000005
【００２０】
ここで、Ｒ、ＹおよびＸは、上記の（Ｉ）におけるように定義される。したがって、対称なビタミンＤ誘導体が特に好ましい。
【００２１】
本発明に従った25-ヒドロキシ−および１α,25-ジヒドロキシビタミンＤ誘導体は光、保管および血清に対して驚くほど安定であり、すべての競合的免疫診断法において、例えば、人または動物の医療および研究での慣例の診断的使用に、感受性が高く信頼性のある25-ヒドロキシ−および１α,25-ジヒドロキシビタミンＤのようなビタミンＤ代謝物の定量を許可する。
【００２２】
本発明に従って、式（Ｉ）をもつ化合物は、以下の工程を含む方法によって得られる：
ａ）アセトニトリルのような適切な溶媒中、水素化カリウムおよび第３ブタノールの存在下における、アクリロニトリルによるビタミンＤまたは25-ヒドロキシビタミンＤの3-ヒドロキシ基のシアノエチル化；
ｂ）その結果であるニトリル基の、水素化リチウムと水素化リチウムアルミニウムとの混合物によるアミンへの還元；  および
ｃ）官能基Ａと適切であれば、スペーサー基のアミンへの連結、例えば、ＬＣ−ＢＨＮＳのような活性なビオチニル化（biotinylation）試薬による化合物のビオチニル化、または、２つのアミノビタミンＤ基が一緒になっている、式（ＩＩＩ）と一致するビタミンＤ誘導体を、カルボジイミドによるセバシン酸のようなジカルボン酸との縮合によって得ること。
【００２３】
本発明に従った機能性ビタミンＤ誘導体の製造方法は、より短い反応時間でより高い収率を与える。従来の方法と異なり、すなわち、工程ａ）において水素化カリウムおよび第３ブタノールの存在下で3-ヒドロキシ基のシアノエチル化が行われる。この方法によって、シアノエチル化がビタミンＤの3-ヒドロキシ基でのみ行われ、ビタミンＤのその他のヒドロキシ基は反応から保護されることが達成される。反応は０〜２０℃で、好適には５〜８℃で、アセトニトリルのような中性溶媒中で行われる。
【００２４】
次の還元では、シアノエチルエーテルのニトリル基がアミンに定量的に還元され、それは、その後、例えば商業的に入手可能なビオチニル化試薬との反応によって、他の一つの官能基と比較的単純に連結できる。
【００２５】
本発明はさらに血清、血漿、尿および他の試料中の25-ヒドロキシ−および１α,25-ジヒドロキシビタミンＤの検出方法における、本発明に従った機能性ビタミンＤ誘導体の使用を含む。ここで、本発明に従った機能性ビタミンＤ複合物は媒介として用いられて、それにより、ビタミンＤ結合タンパク質と天然ビタミンＤ代謝物が結合サイトに対して競合しても、または、天然ビタミンＤへの競合的結合成分として、それ自身が用いられても、いずれでもよい。試験系での定量法は好適にはＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、ＬｉＡまたはＩＬＭＡ、ＦＩＡまたはＩＦＭＡであり、それらは固相技術と同様に液相で、手作業または自動試験装置に適合された方法で行われる。
【００２６】
25−ヒドロキシ−および１α,25-ジヒドロキシビタミンＤ誘導体を検出するための特に好適な方法は、以下の工程を含む：
ａ）担体（キャリヤー）をストレプトアビジンで被覆する
ｂ）１つまたは複数の多機能ビオチン−ビタミンＤ誘導体の添加、
ｃ）試料と、一定量のビタミンＤ結合タンパク質の添加、
ｄ）標識された抗ビタミンＤ結合タンパク質抗体を用いた、結合した結合タンパク質の検出。抗ビタミンＤ結合タンパク質抗体の標識は、直接的、例えば放射性標識か、または、例えば酵素または発色反応を触媒できるペルオキシダーゼのような活性酵素フラグメントによる間接的が可能である。
【００２７】
25−ヒドロキシ−および１α,25-ジヒドロキシビタミンＤ誘導体を検出するためのさらに好適な方法は、以下の工程を含む：
ａ）担体を抗ビタミンＤ結合タンパク質抗体で被覆する、
ｂ）ビタミンＤ結合タンパク質を加える、
ｃ）試料と一定量のビオチン−ビタミンＤ誘導体を加える、
ｄ）標識されたストレプトアビジンを用いて、結合した誘導体の量を検出する。ストレプトアビジンは好適にはペルオキシダーゼによって間接的に標識され、担体は好適には、例えば、マイクロ滴定（タイトレーション）プレートの反応バイアル壁、または高分子または磁気材料またはその両方の粒子、例えばプラスチックまたはセルロース微粒子である。
【００２８】
これらの方法は、徹底的な安全基準が要求されることなく、25−ヒドロキシ−および1,25−ジヒドロキシビタミンＤの非放射性の定量を可能にする。ここで提案されている競合的方法は、したがって、骨粗しょう症の予防の観点で、Ｄ−ビタミン欠乏症またはＤ−ビタミン過剰症が疑われる場合に、一般の診断用および研究における慣例的な検査に適している。
【００２９】
本発明のさらに別の観点は、25−ヒドロキシ−および1,25−ジヒドロキシビタミンＤのようなビタミンＤ代謝物を検出するためのキットであり、特に、本発明に従った機能性ビタミンＤ誘導体を含む。キットは、自由に選択されることができるビタミンＤ結合タンパク質（Ｇｃ−グロブリン）、抗ビタミンＤ結合タンパク質抗体、ストレプトアビジンおよび予備調製された、または予備調製されていないマイクロタイトレーションプレートおよび／または磁気または他の微粒子および他の試薬を含む。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明のさらに別の利点、特徴および実施形態は、以下の実施例および添付した図面に示される。
図１は、本発明に従った、二官能性25-OHビタミンＤ複合物を製造するための合成径路を表す。まず、25-OHビタミンＤはアセトニトリル、水素化カリウムおよび第３ブタノールの混合物中で、アクリロニトリルによってシアノエチル化される。塩基として作用する水素化カリウムの存在により、および、25−ヒドロキシ基での非特異的な反応を防ぐための第３ブタノールの存在により、ビタミンＤの3-ヒドロキシ基が選択的にシアノエチル化されることが達成される。25-OHビタミンＤ-3β−シアノエチルエーテルの収率は４０分の反応時間で、通常、約７４％となる。
【００３１】
従来の調製の後、25-OHビタミンＤ-3β−シアノエチルエーテルは水素化リチウムと混合され、25−ヒドロキシ基はリチウムアルコキシドに変換される。その後、ニトリルのＬｉＡｌＨ4による25-OH-ビタミン-D-3β-3'-アミノプロピルエーテルへの還元が続く。この工程は、副生成物が生成せず、定量的である。最後に必要であれば、ＬＣ−ＢＨＮＳ（ビオチニル-N-ε−アミノカプロイル−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル）のような活性なビオチニル化試薬によるビオチニル化が行われる。結果的なスペーサー基Ｘは、アミノカプロイル鎖に対応する約０．８から０．９ｎｍの長さを有する。
【００３２】
25-OH-ビタミン-D-3β-3'[6-N-（ビオチニル）ヘキサアミド〕アミドプロピルエーテルは温度に安定であり、水性のわずかに酸性の媒質中で、多ヶ月にわたって保管できる。化合物は、血清の酵素によって開裂されないため、血清、血漿および尿中の慣例的な診断的検査に理想的に適している。
【００３３】
図２は、25-OH-ビタミンＤ用の競合的ＥＬＩＳＡの概略図を表す。ここで、25-OH-ビタミンＤ複合物(25-OH-ビタミン-D-3β-3'[6-N-（ビオチニル）ヘキサアミド〕アミドプロピルエーテル）は、ストレプトアビジンを介して固相に結合されている。そのとき、液相では、ビタミンＤ結合タンパク質と標準または試料からの25-OH-ビタミンＤの25-OH-ビタミンＤ複合物への競合的結合が行われる。検出はペルオキシダーゼで標識された、ビタミンＤ結合タンパク質に対する抗体によって行われる。習熟した人は、例えばアルカリ性ホスファターゼまたはガラクトシダーゼ等の他のマーカー酵素もまた採用され得ることを知っている。
【００３４】
図３は、ビタミンＤ結合タンパク質が、まず、抗ビタミンＤ結合タンパク質抗体を介して固相に結合された競合的、非放射性ＥＬＩＳＡの概略図を示す。その後、液相で25-OH-ビタミンＤビオチンと、標準または試料からの25-OH-ビタミンＤとの競合的結合が行われる。検出のために、ペルオキシダーゼで標識されたストレプトアビジンが、それから用いられる。示された原理は、ビオチンのかわりに上記のような他のトレーサー基と他のマーカー酵素に、もちろん変更できる。
【００３５】
図４は、ビタミンＤ結合タンパク質が直接固相に結合された競合的ＥＬＩＳＡの概略図を示す。25-OH-ビタミンD3−ビオチンと、標準または試料からの25-OH-ビタミンD3との競合的結合は液相で行われ、ペルオキシダーゼで標識されたストレプトアビジンが定量に用いられる。
【００３６】
図５ＡからＣは、25-OH-または1,25−ジヒドロキシビタミンD3−ビオチンを用いた、図２に示された原理に従った競合的ＥＬＩＳＡの典型的な検量線を示す。結合したビタミンＤ結合タンパク質の量は、ペルオキシダーゼが結合した抗ビタミンＤ結合タンパク質抗体と、基質としてのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とを用いる、標準化された発色反応によって決定された。かわりの基質は、例えばＯＰＤ（1,2-フェニルジアミンＸ２ＨＣｌ）、ＡＢＴＳおよびその他でもよい。検量線には０、８、２０、５０、１２５および３１２nMol/lの濃度のビタミンＤ試料が用いられた。縦軸は４５０ｎｍにおける２回の測定の平均値としての光学濃度を示し、横軸は25-OH-または1,25−ジヒドロキシビタミンＤの濃度をnMol/lで示す。
【００３７】
図６は、25-OH-ビタミン-D3-ビオチンと、標準または試料からの25-OH-ビタミンＤとが液相で、ビタミンＤ結合タンパク質の結合サイトについて競合する、競合的タンパク質結合検定（ＣＰＢＡ）の概略図を表す。125Ｉ−標識ストレプトアビジンが定量に用いられる。
【００３８】
図７は、25-OH-ビタミン-D−ビオチンと、標準または試料からの25-OH-ビタミンＤとが液相で、抗ビタミンＤ抗体の結合サイトについて競合する、競合的ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の概略図を表す。125Ｉ−標識ストレプトアビジンが定量に用いられる。検出が、非放射性であるが発蛍光団または発光団によって標識されているストレプトアビジンによって行われる場合、いわゆるＬＩＡまたはＦＩＡアッセイが含まれる。
【００３９】
図８は、25-OH-ビタミンＤ−ＩＲＭＡの概略図を表す。まず、25-OH-ビタミン-D-ビオチンはストレプトアビジンを介して固相に結合される。複合物および標準または試料からの25-OH-ビタミン-D3へのビタミンＤ結合タンパク質の競合的結合は、それから液相で行われる。複合物に結合した結合タンパク質の量は、125Ｉ−標識抗体によって決定される。
【００４０】
図９は、ＩＲＭＡサンドイッチ法（免疫放射線検定法）の概略図である。この目的のため、抗ビタミンD3抗体は固相に結合される。ビタミンＤ結合タンパク質はそれからこれらに結合した。競合は次の段階で、25-OH-ビタミンＤ複合物と標準または試料からの25-OH-ビタミンＤとの間で起こる。結合した複合物の定量は125Ｉ−標識ストレプトアビジンによって行われる。
【００４１】
図１０は、さらに別のＩＲＭＡサンドイッチ法の概略図を表す。まず、ビタミンＤ3結合タンパク質は固相に結合される。それから、その上で、25-OH-ビタミンＤ3複合物と、標準または試料からの25-OH-ビタミンＤ3との間で競合的結合が行われる。結合した複合物の量は、125Ｉ−標識ストレプトアビジンによって決定される。
【００４２】
図１１は、微粒子を用いた競合的ＥＬＩＳＡの概略図を表す。ここで、25-OH-ビタミンＤ−ビオチンは、ストレプトアビジンを介して微粒子に結合される。25-OH-ビタミンＤ誘導体は、それからそこに結合される。ビタミンＤ結合タンパク質と、対象となっている試料は、それから液相に加えられる。結合タンパク質と、標準または試料からの25-OH-ビタミンＤ3は、複合物の結合サイトについて競合する。結合した成分は、それらが磁石によって微粒子を介して保持されて分離され、一方、結合していない物質と一緒の残りは、除去される。結合した結合タンパク質の量は、ビタミンＤ結合タンパク質に対する１次抗体と、ペルオキシダーゼで標識された２次抗体とを用いる２つの段階のプロセスで決定される。
【００４３】
図１２は、微粒子を用いる競合的ＥＬＩＳＡの概略図を表す。25-OH-ビタミン-D−ビオチンはストレプトアビジンを介して微粒子に結合される。それから、（標準または試料からの）25-OH-ビタミンＤ3とともに液体試料が、非飽和量の抗体と同様に、加えられる。複合物と天然ビタミンＤ3は、抗体の結合について競合する。結合した抗体の量は、微粒子の凝集によって行われる。これは、例えば比濁分析(nephelometric analysis)または比濁分析(turbimetric analysis)によって直接、決定されることが可能である。
【００４４】
図１３は、ビタミンＤ結合タンパク質が、例えば125ヨウ素によって放射性に、または、ルテニウム(II)トリス−（ビピリジン)-ＮＨＳ−エステルによって電気化学発光に、直接標識される競合的結合アッセイの概略を示す。標識はペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等のような酵素であってもよく、また、ＦＩＴＣであってもよい。
【００４５】
図１４は、透析患者から、および正常の患者からの血清中の1,25−ジヒドロキシビタミンＤ含量の違いを棒グラフに表す。
【００４６】
競合的ＥＬＩＳＡのような既知のタンパク質検出方法は、検出される化合物が結合タンパク質または複合物と、結合サイトについて競合するという原理に基づいている。そこで、結合した結合タンパク質または複合物の量は決定され、検量線に基づいて、検出される化合物の濃度が決定される。
【００４７】
図に示される試験の原理は、他のビタミンＤ誘導体に単純に移されることが可能である。１α,25-ジヒドロキシビタミンＤ2およびＤ3は、特に挙げられる。この場合、結合タンパク質またはレセプターまたは抗体は、１α,25-ジヒドロキシビタミンＤ類似体を特異的に認識するものが選択されなければならない。関連した二官能性１α,25-ジヒドロキシ誘導体は、25-OH-ビタミン-D-1α−ヒドロキシラーゼを用いた25-OH-ビタミンＤ-3β−シアノエチルエーテルの反応、アミンへの還元、および最終的に第２の官能基の付加によって、酵素的に得ることが可能である。さらに、ビタミンＤ2およびビタミンＤ3の誘導体はここで提案される。その合成は、実施例１に示す径路に従って行うことができる。
【００４８】
【実施例】
実施例１：25-OH-ビタミン(Vit.)-Ｄ3-3β-3'[6-N-(ビオチニル)−ヘキサアミド]アミドプロピルエーテル（４）の合成
すべての反応は、暗所の乾燥窒素雰囲気で行われた。中間生成物は−２０℃で保存された。ＨＰＬＣ用純度の溶媒が用いられた。25-OH-ビタミンＤ3は、ビオモル  ファインケミカリエン  ゲゼルシャフト  ミット  ベシュレンクテル  ハフツング,  ハンブルク（BIOMOL Feinchemikalien GmbH, Hamburg）から、ＬＣ−ＢＨＮＳ（長鎖ビオチニル-N-ε-アミノカプロイル−ヒドロキシスクシンイミドエステル）はシグマ（Sigma Chemie） から、および他のすべての試薬はフルカ,  ダルムシュタット（Fluka, Darmstadt） から得られた。質量分析（ＦＡＢ）はフィニガン（Finigan）-MAT-90を用いて、ＮＭＲ測定はブルカー（Bruker）-ARX-400(400MHz)またはブルカー（Bruker）-ARC-250F(250MHz)を用いて行われた。
【００４９】
(i)25-OH-ビタミンＤ3-3β−シアノエチルエーテル
（２）塩化メチレン(CH2Cl2)に溶解された５ｍｇの25-OH-ビタミンＤ3(12.5μMol)が、窒素で満たされたバイアルに移され、溶媒が蒸発させられた。固体残留物は１ｍｌのアセトニトリルに溶解され、第３ブタノールとアセトニトリル（9:1v/v)との混合物の１０滴、および１００μｌのアセトニトリル中の１３０μＭｏｌのアクリロニトリル（１０ｅｑ．）〔保存液：アセトニトリルで1mlに希釈された８６μｌのアクリロニトリル（1.3mMol)〕と混合された。透明な溶液が１５分間６℃で攪拌された。25μｌの第３ブタノール／アセトニトリル(9:1v/v)中の6.25μMolの水素化カリウム(0.5eq.)〔保存液：1mlの第３ブタノール／アセトニトリル(9:1v/v)中の10mgのＫＨ(250μMol)〕が加えられた。そこで生じる凝集は再び直ちに溶解した。混合物は６℃で攪拌された。メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）中の２０％ペトロールエーテルを用いた、個々の試料のシリカゲル上の繰り返された薄層クロマトグラフィー（ＤＣ）は、１０分後に最初の化合物の９０％がすでに反応したことを示した。15分後、約５滴の水と0.5mlのMTBEを用いて数滴の反応混合物が調製された。有機相の薄層クロマトグラフィーは、さらに析出物を示さなかった。４０分後、反応混合物の全体が水/MTBEで調製された。4mgの油状の生成物が得られた。
【００５０】
ＩＲ（ＮａＣｌ／ＣＨ2Ｃｌ2）：  3422        ＯＨ
2941, 2872  ＣＨ
2252        ニトリル
1105        エーテル
【００５１】
ＨＰＬＣ分析（３％  ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）は93%の生成物および7%の析出物を示した。したがって、4mgの生成物は74%の収率に対応する３．７ｍｇ（８．２μＭｏｌ）の標的化合物を含んだ。
【００５２】
(ii)25-OH-ビタミンＤ3-3β−3'アミノプロピルエーテル（３）
(i)からの3.75mg(8.3μMol)のニトリルが2mlのエーテルに溶解され、そこに、1mlのエーテルに溶解された125μＭｏｌの水素化リチウム(保存液:７mlのエーテル中の7mgの新しい微粉末化されたLiH)が加えられ、１時間、室温、窒素雰囲気で撹拌された。169μMolのＬｉＡｌＨ4が、1mlのエーテル中の懸濁液として(ベース：３mlのエーテル中の18mgの新しい微粉末化されたＬｉＡＬｉＡｌＨ4)加えられた。さらに１時間後、混合物は1mlの濃KOH、5mlのＨ2Ｏおよび4  X  20mlのMTBEと調製された。試料の、1:1MTBE/ペトロールエーテルを用いたシリカゲル上の薄層クロマトグラフィーは開始点のみを示した。ジオールはＲi0.27で、ニトリルはＲi0.4であった。得られた物質は、さらに分析および精製せずに、さらに処理された。
【００５３】
(iii)25-ヒドロキシビタミンＤ3-3β−3'[6-N-(ビオチニル）ヘキサアミド)アミドプロピルエーテル（４）
(ii)からの3mg(6.6μMol)の25-OH-ビタミンＤ3-3β−アミノプロピルエーテル（３）は、1mlのジメチルホルムアミド（DMF）に溶解された。それから、窒素雰囲気で、3mg(6.6μMol)のＬＣ−ＢＮＨＳと１μｌ(17.5μMol)のトリエチルアミンが加えられた。18時間の室温での撹拌が行われ、DMFが蒸発され、残留物がＣＨ2Ｃｌ2中の20%メタノール（MeOH）で予備精製された。そのように得られた12mg(>100%)の物質が、HPLC（条件:クナウアー  クロマシル（Knauer Kromasil）-100, ５μＭ, 250 X  4 mm, ＣＨ2Ｃｌ2中の10% MeOH, 1.5 ml/ 分, OD 265 nm, 7分間）によって精製された。収量は1.2 mg(1.5μMol)となった。これは25-OH-ビタミンＤ3に対して12%、ニトリル化合物に対して18%に相当する。
【００５４】
【表１】
0004187929.tif 000006
【００５５】
MS(Finigan MAT 90); (FAB): 5.9.97 および28.11.97の797 （ＭＨ+）; ＣＤＣｌ3／ＴＭＳ中、400MHzでの1Ｈ−ＮＭＲ(ブルカー（Bruker） ARX 400)。分析のデータは表１に示される。
【００５６】
実施例２:25-OH- ビタミン(Vit.)Ｄ3-3β-3'[6-N-（ビオチニル)ヘキサアミド）アミドプロピルエーテルの安定性
それぞれの場合で、20mgの精製された実施例１からの25-OH-Ｄ3-ビオチン化合物(25-OH-ビタミンＤ3-３β-3'[6-N-(ビオチニル)-ヘキサアミド]アミドプロピルエーテル)は、NMR試験管の中に入れられ、そこに1mlの溶媒が加えられた。溶媒は重水素クロロホルム：重水素アセトニトリル：Ｄ2Ｏの3:2:1の比の、pH値４から５の間の混合物であった。試料は、以下に示す条件下で200日間保存され、NMRスペクトルは通常の間隔で調べられた。
【００５７】
試料１：−２０℃で遮光された
試料２：＋４から６℃で遮光された
試料３：室温で遮光された
試料４：室温で強い光にさらした（窓の縁の上で）
【００５８】
試料１および２は全体の時間にわたって、NMRスペクトルに物質的な変化を何も示さなかった。HPLC分析は、試料１と２がプロトン性溶媒中で200日後であっても元のままであったことを確かにした。試料３は100日後、NMRスペクトルの最小限の変化を示した。HPLC分析は、78％より多い化合物は、まだ元のままであったことを示した。試料４は２ヵ月後に分解した。安定性の調査は、光が排除される場合、プロトン性溶媒中および冷却なしであっても、化合物が非常に安定であることを示す。
【００５９】
実施例３：25-ヒドロキシビタミンD-ELISA、25-ヒドロキシビタミンＤ3-３β−3'[6-N-(ビオチニル）-ヘキサアミド]アミドプロピルエーテル
検出は、図２に表される原理に従って行われた。この目的のため、25-OH-ビタミンD-３β−3'[6-N-(ビオチニル）ヘキサアミド]アミドプロピルエーテルはストレプトアビジンを介して固相に結合される必要があった。
【００６０】
(i) マイクロタイトレーションプレートをストレプトアビジンで被覆する
マイクロタイトレーションプレートのそれぞれのウェル内に、100ngのストレプトアビジンが入れられ、２００μｌの60nM  ＮａＨＣＯ3、pH9.6に溶解され、プレートは一夜、4℃でインキュベートされた。ウェル中のストレプトアビジン溶液は除去され、各ウェルが２００μｌの洗浄緩衝液(0.05% Tween-20を含むPBS, pH 7.4)により５回洗浄された。それから、２５０μｌのアッセイ緩衝液が各ウェル内に入れられた。アッセイ緩衝液には、5gのカゼインが100mlの0.1N NaOHに溶解され、pH7.4のPBSで1Lの容量に補充された。溶液は１時間煮沸され、容量は蒸留水で1リットルに補充され、pH値は7.4に合わされ、微生物の生育を防止するため0.1gのチメロサールが加えられた。マイクロタイトレーションプレートのウェルはアッセイ緩衝液と１時間室温でインキュベートされ、それからアッセイ緩衝液が除去され、各ウェルが各回２００μｌの洗浄緩衝液で５回洗浄された。
【００６１】
(ii)25-ヒドロキシビタミンＤ3-３β-3'[6-N-(ビオチニル）ヘキサアミド]アミドプロピルエーテルの結合
各ウェル内に１００μｌのビオチン−ビタミンD-溶液(100μlの洗浄緩衝液中の10ngの25-OH-ビタミンD-３β−3'[6-N-(ビオチニル)ヘキサアミド]アミドプロピルエーテル）が導入され、室温で１時間、暗所で振盪しながらインキュベートされた。それから、ビオチン-ビタミンD-溶液がウェルから除去され、各ウェルが各回２００μｌの洗浄緩衝液で５回洗浄された。液相で、標準または試料からの25-OH-ビタミンDの存在下で、ビタミンD結合タンパク質の競合的結合が行われた。
【００６２】
(iii)試料調製
５０μｌの血清が２００μｌの(予め−２０℃に冷却された)無水エタノール（エタノールabs)と1.5mlのエッペンドルフ反応ベッセル内でボルテックスにより混合され、−２０℃で２０分間、沈殿させた。試料はエッペンドルフテーブル遠心分離器の回転の最大速度で遠心分離され、結果物が取り出されてELISAに配置された。
【００６３】
通常、血漿または血清試料は約２週間、4℃で、安定であると考えることができる。より長い保存の場合は、それらが分析されるまで、それらは急速冷凍されなければならない。保存前に、尿試料は1N NaOH でpH値６から８の間に合わせられなければならない。それから、それらは４℃で約１４日間保存されてもよく、より長い保存の場合には、分析が実行されるまで、これらも急速冷凍されなければならない。
【００６４】
(iv)競合的結合
各場合に、ヤギ血清から単離された１００μｌのビタミンD結合タンパク質（3%(w/V)PEG6000を含むアッセイ緩衝液中で1:15000）が、10μlの標準、対照（コントロール）または試料（試料調製物からの10μlの結果物）と一緒にウェル中に入れられた。マイクロタイトレーションプレートは２４時間、４℃で暗所で振盪されながらインキュベートされた。それから、溶液がウェルから除去され、ウェルが各回２００μlの洗浄緩衝液で５回洗浄された。
【００６５】
(v) 競合的結合の検出
各場合に、１００μｌのウサギ抗ビタミンD結合タンパク質(3%(w/v)のPEG6000を有するアッセイ緩衝液中で1:10000に希釈された）がウェル中に導入され、暗所で振盪されながら、室温で１時間インキュベートされた。溶液がウェルから除去され、それぞれのウェルが５回、各回に２００μｌの洗浄緩衝液で洗浄された。定量は１００μｌの抗ウサギIgG-ペルオキシダーゼ(洗浄緩衝液中で1:20000に希釈された)を用いて行われた。
【００６６】
インキュベーションは１時間、室温で行われた。その後、抗体溶液が除去され、各ウェルが５回、各回に２００μｌの洗浄緩衝液で洗浄された。発色反応のため、１００μｌのテトラメチルベンジジン(TMB)基質溶液（使用の準備がされている、ノーヴュム  ディアグノスティカ  ゲゼルシャフト  ミット  ベシュレンクテル  ハフツング,  ディーツェンバッハ,  ドイツ（NOVUM Diagnostika GmbH, Dietsenbach, Germany）） がウェル内に導入された。30分後、ウェル当たり50μｌの２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4の添加により発色が停止された。光学濃度の測定が450nmで行われた。以下の表２および３は、マイクロタイトレーションプレートのピペットで分ける分類と、光学濃度の値を示す。
【００６７】
標準として、25-OH-ビタミンＤ3のアッセイ緩衝液中の以下の濃度:0、8、20、50、125および312nMol/L(図5Aの検量線参照)の溶液が用いられた。対照または試料として、Ｄ−ビタミン欠乏症をもつ患者からの４つの血清（試料番号２４、２０３、９６３、９６５）と、４つのランダムに選ばれた正常の血清（試料番号ＮＰ１８、ＮＰ２５、ＮＰ３４、ＮＰ３７−試験系３および４）が提供された。ビタミンＤ欠乏の血清については、さらに、3H-25-OH-ビタミンＤを補助とする競合的結合アッセイによって、２５−ＯＨ−ビタミンＤ濃度が決定された。さらに別の”対照”として、それぞれの25-OH-ビタミンＤの濃度が、製造元の情報または3H-25-OH-ビタミンＤを用いた競合的結合アッセイ（ＣＢＰＡ）といった、他の定量から既知である４つの溶液が提供された。
【００６８】
【表２】
0004187929.tif 000007
【００６９】
ＮＳＢ：非特異的結合緩衝液（ビタミンＤ結合タンパク質のないアッセイ緩衝液）
【００７０】
【表３】
0004187929.tif 000008
【００７１】
列１および２の平均値と既知の25-OH-ビタミンＤ濃度から、図５Ａに示す検量線が作成された。縦軸は、４５０ｎｍでの２回の測定の平均値としての光学濃度を示し、横軸は、25-OH-ビタミンＤの濃度をnMol/lで示す。結果は、表５にまとめられている。
【００７２】
実施例４：競合的パートナーとして3H-25-OH-ビタミンＤを用いた比較の結合分析
他の表示がなければ、すべての試薬、緩衝液および物質は上記の実施例３と同じであった。競合的結合パートナー（トレーサー）として、トリチウム標識25-OH-ビタミンＤ3が提供された。実施例３と異なり、測定試料は抽出によって（個々の値に）精製された。この目的のため、それぞれの場合に50μｌの試料〔非特異的アッセイ緩衝液ＮＳＢ、標準、コントロール、患者の試料（血漿、血清または尿）〕が１．５ｍｌの使い捨て反応容器内に導入され、２００μｌのアセトニトリルが加えられて混合され、容器壁は自由に遠心分離され、混合物は２０から３０分間、４℃でインキュベートされた。混合物は１７００×ｇで１０分間、遠心分離された。定量は、２つの値を用いた結果により行われた。
【００７３】
この目的のため、２５μｌの透明な結果物がガラス試験管に（またはザルシュテット,  ダルムシュタット（ Sarstedt, Darmstadt）のスペシャルＲＩＡコンテナー内に）移され、１０μｌのトレーサー（3H-25-OH-D）、３００μｌのアッセイ緩衝液および１００μｌの（ＮＳＢ内ではない）ビタミンＤ結合タンパク質が加えられた。試験管の内容物は混合され、１時間、４℃でインキュベートされ、結合していない放射性トレーサーを除去するため、１００μｌの活性化されたチャコール懸濁液（０．１％のＮａＮ3と、活性化されたチャコールを含むリン酸緩衝液）が加えられた。試験管の内容物は混合され、３から５分間、４℃でインキュベートされ、１０分間、１７００×ｇで遠心分離することにより活性チャコールがペレット化された。それから、それぞれの場合に４００μｌの結果物が、カウンター容器（７ｍｌ）に移され、アクアセーフ（Ａｑｕａｓａｆｅ）TM３００またはハイセーフ（ＨｉＳａｆｅ）TMＩＩＩのようなシンチレーター液２ｍｌの添加後、結果物に存在する放射能がカウントされた（ベータカウンターで２分）。検量線の作成後の、対照に対する測定値は表５に示される。
【００７４】
実施例３によるＥＬＩＳＡとの比較は、両方のアッセイ手順（ＥＬＩＳＡおよびＣＢＰＡ）について、血漿または血清中の25-OH-ビタミンＤについての通常の範囲が約２５−１２５ｎｍｏｌ／ｌである場合であることを示す。試験系の感度限界は、ＢO＋２ＳＤとして決定された。それは約２．５ｎｍｏｌ／ｌとなる。
【００７５】
交差反応：活性化されたチャコールで処理された血清に、25-OH-ビタミンＤ2（１２５ｎｍｏｌ／ｌ）、24,25-(OH)2-ビタミンＤ3（２５０ｎｍｏｌ／ｌ）および1,25-(OH)2−ビタミンＤ3（２５０ｎｍｏｌ／ｌ）が加えられた。25-OH-ビタミンＤ2は６０％まで交差反応し、24,25-(OH)2-ビタミンＤ3は１００％まで交差反応し、一方、1,25-(OH)2−ビタミンＤ3は交差反応性を何も示さなかった。本発明に従った多機能性25-OH-ビタミンＤ複合物についても、同様な結果が見出されているか、または期待されている。
【００７６】
再現性：２５−ジヒドロキシビタミンＤ3を含む試料の繰り返し測定（ｎ＝１１）において、以下の結果が得られた。同様なことは、本発明に従った多機能性２５−ＯＨ−ビタミンＤ複合物を補助とする測定にも当てはまる：
【００７７】
【表４】
0004187929.tif 000009
【００７８】
実施例３で述べた試料について、以下の２５−ＯＨ−ビタミンＤ濃度が、実施例３および４に従った方法により決定された。
【００７９】
【表５】
0004187929.tif 000010
【００８０】
製造業者によって示された値は、競合的結合アッセイにおいて決定された濃度よりも、一般に高かった。これは、供給された試料においては、かなりの部分の25-OH-ビタミンＤがすでに分解していたか、光の作用を通して変化していたことを示唆する。
【００８１】
実施例５：ＨＰＬＣによるＥＬＩＳＡ−定量の確認
そこで、様々な試料について２５−ＯＨ−ビタミンＤ濃度が、実施例３に従ったＥＬＩＳＡによって、および確認の目的でＨＰＬＣによって定量された。検量線には０、８、２０、５０、１２５および３１２ｎＭｏｌ／ｌのビタミンＤ3濃度を有する標準が用いられた。全ての試料および標準は２つの値で測定された。試料の25-OH-ビタミンＤ3濃度は、それから、２つの値の平均値からの検量線に基づいて決定された。
結果は以下の表６に示される。
【００８２】
【表６】
0004187929.tif 000011
【００８３】
実施例６：ＥＬＩＳＡ検出における２５−ヒドロキシビタミンＤ複合物の長期安定性
試薬が一時的に４から６℃、暗所で保存された場合、６０および１００日後に、本発明に従ったビオチン−２５−ＯＨ−ビタミンＤ複合物を用いたＥＬＩＳＡ検出が、時間の経過によりどの程度まで変化したか決定するため、検量線が、実施例３と同じ標準溶液および試薬を用いて繰り返された。以下の表は、３０分の発色（実施例３参照）後のそれぞれの光学濃度を示す。
【００８４】
【表７】
0004187929.tif 000012
【００８５】
それぞれの非特異的結合を示す、様々な検量線の値が図（図５Ｂ参照）に表される場合、相対的な垂直方向の位置を別として、検量線が同じ形状を持つことが容易に見られる。これは、ＥＬＩＳＡ試験の感度および特異性が、上記の期間にわたって変化しなかったことを示す。
【００８６】
実施例７：抗ビタミンＤ結合タンパク質を用いた25(OH)-ビタミンＤ3−ＥＬＩＳＡ−ＭＴＰ
試行（トライアル）は基本的に、実施例３のプロトコルおよび図４に表された原理に従って行われた。以下の緩衝液が用いられた：  ａ）洗浄緩衝液：ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ、ｂ）アッセイ緩衝液：５ｇのカゼインが１００ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨに溶解され、ｐＨ７．４、１ｌにＰＢＳで補充された。それから、３％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−６０００および０．１ｇのチメロサールTMが加えられた。すべてのインキュベーションが、暗所で振盪されながら行われた。
【００８７】
(i) マイクロタイトレーションプレートの被覆
それぞれの場合に、マイクロタイトレーションプレートのウェル内にｐＨ９．６の６０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3内の１００μｌのウサギ抗ビタミンＤ結合タンパク質が導入され、プレートが一夜４℃でインキュベートされた。溶液が除去され、各ウェルが２００μｌの洗浄緩衝液で５回、洗浄された。それから、各ウェルの中に２５０μｌのアッセイ緩衝液が導入され、プレートが１時間室温でインキュベートされた。アッセイ緩衝液が除去され、各ウェルが各回に２００μｌの洗浄緩衝液で５回、洗浄された。
【００８８】
(ii)試料調製
５０μｌの血清、血漿または標準が、１．５ｍｌのエッペンドルフ反応容器内で、２００μｌの（予め−２０℃に冷却された）無水エタノール（エタノールabs)と混合され、ボルテックスされ、その後２０分間、−２０℃で沈殿させた。試料は、エッペンドルフテーブル遠心分離器で最大回転で遠心分離された。結果物は採取され、ＥＬＩＳＡに用いられた。
【００８９】
(iii) ＥＬＩＳＡ
まず、それぞれの個別のウェル内に、アッセイ緩衝液で希釈された１００μｌのビタミンＤ結合タンパク質が導入され、１時間、室温でインキュベートされた。その後、プレートが外され、それぞれの個別のウェルが各回に２００μｌの洗浄緩衝液で５回、洗浄された。
【００９０】
その後、ウェル内に、アッセイ緩衝液で希釈された各回に１００μｌのビオチン−ビタミンＤが、１０μｌの標準、試料または対照と一緒に導入された。プレートは２４時間、４℃でインキュベートされた。溶液は再び除去され、それぞれのウェルが５回、各回に２００μｌの洗浄緩衝液で洗浄された。
【００９１】
３番目の段階として、それぞれの場合に洗浄緩衝液で１：１００００に希釈された、ペルオキシダーゼが結合されたストレプトアビジンの１００μｌがウェル内に導入され、４５分間、室温でインキュベートされた。プレートが外され、各ウェルが５回、各回に２００μｌの洗浄緩衝液で洗浄された。
【００９２】
発色反応のため、各ウェルに１００μｌのＴＭＢ−基質溶液が導入された。十分な発色後（３０分）、反応はウェル当たり５０μｌの２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4によって停止された。光学濃度の測定は４５０ｎｍで行われた。実施例３または表５と同じ結果と同様なものが得られた。
【００９３】
実施例８：２５−ヒドロキシビタミンＤおよび１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの検出用のテストパックまたは試薬セットの内容物：
テストパックの内容物またはテスト試薬およびそれらの調製：
標準、例えば、洗浄緩衝液中で使用準備されている０、８、２０、５０、１２５および３１２ｎｍｏｌ／ｌの濃度の２５−ＯＨ−ビタミンＤ標準の６個のバイアル。
【００９４】
例えば、ストレプトアビジンで被覆され、滅菌され包装され、予備洗浄されたマイクロタイトレーションプレート。
緩衝溶液、例えば洗浄緩衝液、ＮＳＢ−緩衝液およびアッセイ緩衝液、停止液。
対照、例えば、ヒト血清中の２５−ＯＨ−ビタミンＤ対照の２つのバイアル。対照１（３０ｎｍｏｌ  ２５−ＯＨ−Ｄ／Ｌ）、対照２（８０ｎＭｏｌ  ２５−ＯＨ−Ｄ／Ｌ）。
【００９５】
トレーサー、例えば、洗浄緩衝液（１００ｎｇ／ｍｌ）中のビオチン−ビタミンＤ（２５−ＯＨ−ビタミンＤ3−３β−３’[6-N-(ビオチニル)−ヘキサアミド]アミドプロピルエーテル]が入ったバイアル。
ビタミンＤ結合タンパク質、例えば、安定剤として０．１％ＮａＮ3を含むリン酸緩衝液中のヤギ血清由来結合タンパク質の入ったバイアル。
【００９６】
マーカー、例えば、洗浄緩衝液中の抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼのバイアル。
ＴＭＢ−発色剤溶液、例えば、洗浄緩衝液中の安定化されたテトラメチルベンジジン−発色剤溶液のバイアル。
【００９７】
実施例９：1,25-ジヒドロキシビタミンＤの定量用ＥＬＩＳＡ  1,25-ビタミンＤ3の検出が、1,25-ジヒドロキシビタミンＤ3−ビオチン化合物がトレーサーとして提供されたことを除き、図２に表された原理に従って行われた。競合において、標準または試料からの1,25-ジヒドロキシビタミンＤ3は、1,25-ジヒドロキシビタミンＤ結合タンパク質、モノクローナルマウス抗１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ抗体（B. Mawer他，Steroids, 1985, 46, 741-754）と一緒に、合わせられた。標準または試料からの1,25-ジヒドロキシビタミンＤ3、および固定化された1,25-ジヒドロキシビタミンＤ3−ビオチン化合物は、その後、抗体の結合サイトについて競合する。検出は、ペルオキシダーゼ標識抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＸ）によって行われる。
【００９８】
(i) マイクロタイトレーションプレートのストレプトアビジンによる被覆は、洗浄緩衝液が界面活性剤として０．１％のトリトンTM Ｘ−１００を含んだが、実施例３のように行われた。実施例３と異なり、マイクロタイトレーションプレートのウェルは、ストレプトアビジン溶液による処理後、洗浄緩衝液でさらに洗浄されなかったが、それぞれの場合に１時間、２５０μｌの水性ソルビトール溶液（カリオン（Kａｒｉｏｎ）TM  Ｆ  水中で１：４）で処理された。トレーサー（1,25-ジヒドロキシビタミンＤ−ビオチン）の結合は、各ウェルに２００μｌのトレーサー溶液（洗浄緩衝液中の２０ｎｇの1,25-ジヒドロキシビタミンＤ3-3β-3'[6-N-(ビオチニル)−ヘキサアミド)アミドプロピルエーテル)が導入されたことを除き、実施例３のように行われた。1,25-ジヒドロキシビタミンD-ビオチンは、第１段階の後、過剰の３−シアノエチル化1-OH-ビタミンＤ中間体化合物が分離されたことを除き、図１に図解されるように合成された。しかしながら、以下の中間体化合物の一つ、または混合された合成の後、特に1,25-ジヒドロキシビタミンＤ3-3β-3'[6-N-(ビオチニル）−ヘキサアミド〕アミドプロピルエーテルを、ＨＰＬＣによって望まれたように分離することもできる。
【００９９】
(ii)ヒト血清中で25-OH-ビタミンＤ3の1,25-ジヒドロキシビタミンＤ3に対する比は、通常、１０００：１の範囲にあるため、1,25-ジヒドロキシビタミンＤの定量は、吸収と組み合わせられた分配クロマトグラフィーによる試料の完全な調製を要求する。第１段階で、この目的のため、エクストレルート（Ｅｘｔｒｅｌｕｔ）TM  キーゼルグーア（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ）カラム（メルク、ダルムシュタット）が、それぞれ５００μｌのトリス緩衝液で平衡化され、その後、各場合に５００μｌの標準、対照または測定試料が２つずつカラムに加えられ、その後、試料はカラム内を１０分間流れることができる。ビタミンＤ化合物のエクストレルート（Ｅｘｔｒｅｌｕｔ）TMカラムからの分離は、各場合に３分の間隔で４回の１ｍｌジイソプロピルエーテルによって行われた。エクストレルートTMの抽出物は直接、シリカカートリッジ（メルク、ダルムシュタット）に移され、エクストレルートTMカラムは廃棄された。シリカカラムは２ｍｌのイソプロパノール／ヘキサン（4/96 v/v）で５回と、２ｍｌのイソプロパノール／ヘキサン（6/94 (v/v)）で３回、洗浄された。その後、1,25-ジヒドロキシビタミンＤはシリカカラムから２回の２ｍｌのイソプロパノール／ヘキサン（25/75 v/v）により溶出され、３７℃の窒素雰囲気で、または真空遠心分離で乾燥された。標準および調査試料は最終的に、各場合に２００μｌのマウス抗1,25-ジヒドロキシビタミンＤ抗体溶液（ＲＲＡアッセイ緩衝液中の１：１５００００：５０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  メルカプトエタノール、ｐＨ７．５）とともに、２０μｌのエタノールｐ．ａ．に合わせられ、ストレプトアビジンで処理されたマイクロタイトレーションプレートに１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ−ビオチントレーサーを加えるのと出来るだけ同時に、１時間、室温でプレインキュベートされた。
【０１００】
(iii) トレーサーで被覆されたマイクロタイトレーションプレートのウェルは、各回に３００μｌのトリトンTM洗浄緩衝液で、５回洗浄され、吸収紙の上に叩き出された。それから、プレインキュベーションからの２００μｌの抗体試料溶液がウェル内に移され、１時間、暗所で振盪されながら室温でインキュベートされた。ウェルからの溶液の除去後、それらは５回、各回に２００μｌの洗浄緩衝液で洗浄された。定量は、実施例３と類似して、２００μｌのウサギ抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ（洗浄緩衝液中で１：１００００）との１時間の室温でのインキュベーション、３００μｌの洗浄緩衝液を用いたウェルの５回の洗浄、２００μｌのＴＭＢ基質溶液（使用準備されたもの、ノーヴュム  ディアグノスティカ  ゲゼルシャフト  ミット  ベシュレンクテル  ハフツング,  ディーツエンバッハ（ＮＯＶＵＭ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ，Ｄｉｅｔｚｅｎｂａｃｈ））を用いた暗所での発色反応、１５分後の５０μｌの２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4の添加による発色反応の停止、および４５０ｎｍでの光の減衰の定量により行われた。
【０１０１】
以下の表８は、１１人の透析患者および６人の無作為に選択された正常の人々からの血清中の1,25- ジヒドロキシビタミンＤの定量の結果を示す。検量線の決定用または標準として、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤのアッセイ緩衝液中の以下の濃度：０、６．６、２０、６０および１８０ｐｇ／ｍｌの溶液が用いられた（図５Ｃの検量線参照）。
【０１０２】
【表８】
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【０１０３】
図１４は、透析および通常の患者に見られる値を棒グラフに再び表し、その値によれば透析患者の血清は平均で、顕著に少ない活性1,25-ジヒドロキシビタミンＤを含む。透析患者の値の大きな分散は、また、ビタミンＤ欠乏の典型的な結果に、よりよく対処するために、透析患者の血清中の活性1,25-ジヒドロキシビタミンＤの量をより綿密に監視する必要性を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に従った二官能性(bifunctional)ビタミンＤ誘導体の25-ヒドロキシビタミンD3-3β-3'[6-N-（ビオチニル）ヘキサアミド〕アミドプロピルエーテル）の合成径路図である。
【図２】  本発明に従った25-OH-ビタミンＤ複合物の補助による、25-OH-ビタミンＤの検出のための様々なＥＬＩＳＡを表す図である。
【図３】  本発明に従った25-OH-ビタミンＤ複合物の補助による、25-OH-ビタミンＤの検出のための様々なＥＬＩＳＡを表す図である。
【図４】  本発明に従った25-OH-ビタミンＤ複合物の補助による、25-OH-ビタミンＤの検出のための様々なＥＬＩＳＡを表す図である。
【図５】  図５Ａは図２による25-OH-ビタミンＤの競合的ＥＬＩＳＡの検量線である。
図５Ｂは図５Ａに従った、３、６０および１００日経過の25-OH-ビタミンＤビオチントレーサーを有するＥＬＩＳＡの検量線である。
図５Ｃは図２に類似する、1,25−ジヒドロキシビタミンＤの競合的ＥＬＩＳＡの検量線である。
【図６】  本発明に従った25-OH-ビタミンＤ複合物の補助による、25-OH-ビタミンＤの競合的ＲＩＡを表す図である。
【図７】  本発明に従った25-OH-ビタミンＤ複合物の補助による、25-OH-ビタミンＤの競合的ＲＩＡを表す図である。
【図８】  本発明に従った25-OH-ビタミンＤ複合物の補助による、25-OH-ビタミンＤの競合的放射性ＩＲＭＡを表す図である。
【図９】  本発明に従った25-OH-ビタミンＤ複合物の補助による、25-OH-ビタミンＤの競合的放射性ＩＲＭＡを表す図である。
【図１０】  本発明に従った25-OH-ビタミンＤ複合物の補助による、25-OH-ビタミンＤの競合的放射性ＩＲＭＡを表す図である。
【図１１】  微粒子を用いた競合的ＥＬＩＳＡを表す図である。
【図１２】  微粒子を用いた競合的ＥＬＩＳＡを表す図である。
【図１３】  本発明に従った25-OH-ビタミンＤ複合物および直接標識されたビタミンＤ結合タンパク質の補助による、25-OH-ビタミンＤの競合的結合アッセイを表す図である。
【図１４】  透析患者および正常の患者からの血清中の1,25-ジヒドロキシビタミンＤ含量の比較の棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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