(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
0004171178.tif 000032
（Ｉ）              
で表される４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン、下記式（ＩＩ）〜（Ｖ）：
【化２】
0004171178.tif 000033
（ＩＩ）              、
【化３】
0004171178.tif 000034
（ＩＩＩ）              、
【化４】
0004171178.tif 000035
（ＩＶ）              、
【化５】
0004171178.tif 000036
（Ｖ）              
で表される４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オンの誘導体、４−ヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン及び下記式（ＶＩ）〜（ＶＩＩ）：
【化６】
0004171178.tif 000037
（ＶＩ）                、
【化７】
0004171178.tif 000038
（ＶＩＩ）            
で表される４−ヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オンの誘導体から選択される化合物を有効成分として含有することを特徴とする、肝炎、重症肝炎、肝硬変及び肝内胆汁うっ帯、創傷、老人痴呆症、末梢神経障害、頭部外傷変性疾患、成長障害疾患、坐骨神経障害又は筋萎縮性側索硬化症の治療剤又は予防剤。
【請求項２】
式（Ｉ）で表される４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン、式（ＩＩ）〜（Ｖ）で表される４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オンの誘導体、４−ヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン及び式（ＶＩ）〜（ＶＩＩ）で表される４−ヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オンの誘導体から選択される化合物を有効成分として含有することを特徴とする肝細胞増殖因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子から選択される成長因子産生増強剤及び／又はインターロイキン−１２産生増強剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は細胞成長因子の産生増強を要する疾患に有効な医薬、製剤又は飲食品に関する。
発明の背景
成長因子は微量で細胞の成長・増殖を促進する一群の物質であり、増殖因子とも呼ばれ、細胞の増殖・伸長・肥大・分化等の制御を行っている。成長因子の生理機能としては、成長促進作用、インスリン様作用、同化作用、骨形成作用、細胞増殖促進作用、神経栄養因子様作用、エリスロポエチン様作用、子宮内発育促進作用、腎血流増加・腎細胞保護作用、免疫増強作用等が知られており、成長ホルモン不応症、糖尿病、異化状態の改善、骨粗しょう症、組織修復を必要とする疾患、神経変性疾患、貧血、子宮内発育不全、腎不全、免疫不全症等の疾患への適応が期待されている。
成長因子の疾患への適応は、通常は成長因子を外部より投与する方法で行われるが、成長因子を大量に得ることは困難である。またペプチド性成長因子は遺伝子操作により調製することが可能であるが、得られた成長因子は感受性が低い場合が多く、そのため大量投与を必要とし、その結果として大量投与による、発熱や食欲不振等を始めとする様々な副作用を伴うことが知られている。
部分肝切除を受けた肝臓は、速やかに再生し、もとのサイズになる。この肝再生因子の本体は、長年不明であったが、劇症肝炎患者の血漿中に肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｏ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）が見出され、その患者血漿から、単離、精製された［Ｇｏｈｄａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．，８８：４１４―４１９（１９８８）］。さらに、ヒトＨＧＦのｃＤＮＡもクローニングされ、ＨＧＦの１次構造も明らかにされた［Ｍｉｙａｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ，，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６３：９６７−９７３（１９８９）］。また、細胞の運動性を亢進させるｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＦ）および、腫瘍細胞障害因子であるｔｕｍｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＣＦ）とＨＧＦが同一物質であることも明らかになった［Ｗｅｉｄｎｅｒ，Ｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７００１−７００５（１９９１）；Ｓｈｉｍａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８０：１１５１−１１５８（１９９１）］。
ＨＧＦは肝細胞だけでなく胆管上皮細胞、腎尿細管上皮細胞、胃粘膜細胞など多くの上皮細胞の増殖を促進させる。また、上皮細胞の運動性の亢進や血管新生、上皮細胞の管腔形成で見られるような形態形成を誘導し、ＨＧＦは極めて多彩な生理活性を示す多機能活性物質である。つまり、ＨＧＦは様々な臓器において、その臓器の障害を修復する際の上皮細胞の増殖を促進し、運動性の亢進や血管新生などの形態形成の誘導等を行う。
ＨＧＦは肝細胞増殖作用、タンパク合成促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎障害の予防作用などを示す。これらのことからも、ＨＧＦは重症肝炎、肝硬変および肝内胆汁うっ滞の治療薬として期待されている。しかしながら、ＨＧＦそのものを治療薬として実用化するには至っていない。さらに、遺伝子治療でＨＧＦの遺伝子を導入する方法も試みられているが、不必要な時期、場所で作用することによる副作用により、これも、実用化には遠い。
ヒトの知的機能、記憶、感情、行動などの精神活動の維持には神経細胞が主要な役割を担っている。これら精神活動の基になっている神経細胞の分化、生存、機能発現には、それぞれの神経細胞に特異的な神経性栄養因子が必要であると考えられるが、推定の域をでない。唯一、存在および機能が明らかにされているのは、神経成長因子（以下ＮＧＦと略す）である。ＮＧＦは前脳基底部の大細胞性コリン作動性神経細胞の神経性栄養因子であることから、アルツハイマー型痴呆症との関連が注目されている〔ファルマシア，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２，１４７−１５１（１９８６）；老年精神医学，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．６，７５１−７５８（１９８６）〕。
アルツハイマー型痴呆症とは発育障害、巣症状、下肢の強直拘攣、てんかん様発作などの臨床を伴い、老人性プラーク、アルツハイマー原線維変化などの症理学的所見を見る疾患であり、老人性痴呆の一病型である。近年の高齢化社会で増加の傾向が見られ、重大な社会的関心が払われているが、これといった症状の改善法、治療法が見つかっていない。
アルツハイマー型痴呆症患者の脳には、マイネルト基底核を中心とする前脳基底部に顕著な変性、コリンアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）活性の著しい低下が認められている〔Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３：７７（１９８０）〕。１９８５年にラット脳を用いた研究で、ＮＧＦが脳のこの部位での神経性栄養因子であることが明らかにされ〔ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：１３８９（１９８５）〕、ＮＧＦと本疾患との関連が注目された。またハンチントン舞踏疾患者の脳の線条体では、ＧＡＢＡ作動性神経細胞の脱落と共にコリン作動性神経細胞の脱落が著しく、ＮＧＦが線条体の内在性コリン作動性神経細胞にも作用することが明らかにされ〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１３４１（１９８６）〕、本疾患がＮＧＦと関連している可能性が指摘されている。さらにまた、各種の神経疾患のモデルとなり得るラットなどの動物でＮＧＦの効果が研究され、ラットでは神経細胞の変性が顕著になる以前にＮＧＦを脳内投与すれば、変性を食い止めることができ、ＣＡＴ活性の低下も防げることが報告されている〔Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，６：２１５５（１９８６）；Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，，２９３：３０５（１９８５）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：２１４（１９８６）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：９２３１（１９８６）〕。また末梢の交感神経支配組織および脳でＮＧＦが生合成されていること、とのＮＧＦの生合成に末梢組織あるいは脳組織の間質細胞である線維芽細胞あるいはアストログリア細胞が各々重要な役割を担っていることが証明されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：１２５９（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１３６：５７（１９８６）〕。また、この線維芽細胞やアストログリア細胞の産生するＮＧＦの抗原性、分子量、等重点、生物活性は、従来よく研究されていた顎下腺ＮＧＦと同一であることが明らかにされている。また線維芽細胞（Ｌ−Ｍ細胞）およびアストログリア細胞の培養液に種々の神経伝達物質を加えると、カテコーラミン（ノルエピネフリン、エピネフリン、ドーパミン）がＮＧＦ合成促進効果を示すことが見出されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１：６０３９（１９８６）；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０８：２５８（１９８６）〕。
このように、ＮＧＦが神経性栄養因子として作用する部位が変性するこれらの神経疾患において、ＮＧＦは変性を食い止める治療薬として用いることができるのではないかと期待される。また脳血管障害、脳腫瘍、脳尖、頭部外傷変性疾患、麻酔薬物中毒など脳神経細胞が一旦変性に陥れば、生涯回復することがなく、その結果、知的機能低下、記憶障害のみならず、感情障害、行動異常など様々な障害を引き起こすが、神経線維には可塑性があり、損傷を受けると、その付近の健常な線維から発芽が起こり、障害されたシナプスに変わって新しいシナプスが形成されるので、この時ＮＧＦが神経機能の修復再生を促す治療剤として用いることができるのではないかと期待される。
しかしながら、ＮＧＦを各種神経疾患の治療に応用しようとした場合、ＮＧＦはＮＧＦを必要とする神経細胞の極く近傍に達していなければならないし、中枢神経疾患の場合も脳細胞の患部にＮＧＦを送り届けなければならないが、血管系を通してＮＧＦを脳内に送り込むことはできない。なぜならば、脳内の血管内皮細胞は、互いに密着結合で結合しており（脳血液関門という）、水、ガス、脂溶性物質以外の物質の血液から脳組織への移行は制限を受けているからであり、高分子物質である蛋白質（ＮＧＦも含む）はまったく脳血液関門を通ることが出来ないからである。このＮＧＦを直接脳内に外科的手法を用いて投入することは、現在の技術をもってしても危険が大き過ぎる。
成長因子の適応疾患を治療又は予防するためには、成長因子を投与する代わりに成長因子を生体内で誘導する方法があり、この場合は成長因子の投与に起因する異常な副作用を伴うことなく、安全に疾患の治療又は予防が可能になる。
例えばＨＧＦを外から投与するのではなく、生体内で任意に誘導できるのであれば、肝炎、肝硬変、肝内胆汁うっ滞等のＨＧＦ発現増強を必要とする疾患の治療及び予防に有効である。
また脳内のＮＧＦ産生細胞にＮＧＦを誘導させる物質を到達させることにより、インビトロで得られた成果を治療薬として応用することができる。
発明の目的
本発明の目的は天然物由来の、安全性の高い成長因子産生増強能及び／又はインターロイキン−１２産生増強能を有する化合物を提供し、成長因子産生増強を要する疾患の治療又は予防に有用な医薬や飲食品を提供することにある。
発明の要旨
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は下記式（Ｉ）で表される４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン、４−ヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン及びそれらの誘導体から選択される化合物を有効成分として含有することを特徴とする成長因子産生増強を要する疾患及び／又はインターロイキン−１２産生増強を要する疾患の治療剤又は予防剤に関する。
0004171178.tif 000002
本発明の第２の発明は、式（Ｉ）で表される４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン、４−ヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン及びそれらの誘導体から選択される化合物を有効成分として含有することを特徴とする成長因子産生増強剤及び／又はインターロイキン−１２産生増強剤に関する。
本発明の第３の発明は、式（Ｉ）で表される４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン含有物、４−ヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン含有物、４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン誘導体含有物、及び４−ヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン誘導体含有物から選択されるものを含有、希釈及び／又は添加してなる成長因子産生増強用及び／又はインターロイキン−１２産生増強用食品、又は成長因子産生増強用及び／又はインターロイキン−１２産生増強用飲料に関する。
本発明者らは、式（Ｉ）で表される４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン、４−ヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン及びそれらの誘導体から選択される化合物が成長因子産生増強作用及び／又はインターロイキン−１２産生増強作用を有し、成長因子の産生増強、インターロイキン−１２の産生増強に有用であることを見出し、本発明を完成した。
発明の詳細な説明
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明で使用する４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（以下、単にシクロペンテノンと称する）の製造方法はいかなる方法でも良く、化学合成法〔カーボハイドレートリサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．）、第２４７巻、第２１７〜２２２頁（１９９３）、ヘルベチカ  キミカ  アクタ（Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ）、第５５巻、第２８３８〜２８４４頁（１９７２）〕で合成しても良く、またウロン酸、ウロン酸誘導体、ウロン酸及び／又はウロン酸誘導体を含有する糖化合物、ウロン酸及び／又はウロン酸誘導体を含有する糖化合物含有物から選択される少なくとも１種の物の加熱処理物中に生成するシクロペンテノン、その精製物を使用することもでき、本発明ではシクロペンテノンを含有するこれらの加熱処理物、その部分精製物及び精製物が使用できる。なおこれらはＷＯ９８／１３３２８号公報に記載され、該公報記載の内容は参考としてここに組入れる。
またシクロペンテノン含有物とは特に限定はないが、シクロペンテノンを含有する上記加熱処理物、その部分精製物が本発明の第３の発明において特に好適に使用することができる。
本発明において４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン誘導体（以下、単にシクロペンテノン誘導体と称す）とはシクロペンテノンの誘導体であって、成長因子産生増強能及び／又はインターロイキン−１２産生増強能を有するものであれば限定はないが、下記式（ＩＩ）〜（Ｖ）で表されるシクロペンテノン誘導体が例示される。
本発明で使用する４−ヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（以下、単に４ＨＣＰと称する）の製造方法はいかなる方法でもよく、化学合成法で調製しても良い。その公知の合成法としては、タナカ（Ｔａｎａｋａ，Ｔ．）らの方法〔テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、第３２巻、第１７１３頁（１９７６）〕、ナラ（Ｎａｒａ，Ｍ．）らの方法〔テトラヘドロン、第３６巻、第３１６１頁（１９８０）〕、及びジル（Ｇｉｌｌ，Ｍ．）らの方法〔オーストラリアン  ジャーナル  オブ  ケミストリー（Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．）、第３４巻、第２５８７頁（１９８１）］が挙げられる。これらの方法は合成段階が多く複雑であり、収率も低く、効率の良い製造方法ではない。４−シクロペンテン−１，３−ジオンを塩化セリウム（ＩＩＩ）及び水素化ホウ素ナトリウムで還元することによって、１段階で、高収率で４ＨＣＰが得られる。
またペントース、ペントース誘導体、ペントースを含有する化合物、及びペントース誘導体を含有する化合物から選択される少なくとも１種の物の加熱処理物中に生成する４ＨＣＰ、その精製物を使用することもでき、本発明では４ＨＣＰを含有するこれらの加熱処理物、その部分精製物及び精製物が使用できる。なおこれらはＷＯ９９／３６３８３号公報に記載され、該明細書記載の内容は参考としてここに組入れる。
また４ＨＣＰ含有物とは特に限定はないが、４ＨＣＰを含有する上記加熱処理物、その部分精製物が本発明の第３の発明において特に好適に使用することができる。
また４ＨＣＰ誘導体とは４ＨＣＰの誘導体であって、成長因子産生増強能及び／又はインターロイキン−１２産生増強能を有するものであれば限定はないが、下記式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）で表されるその誘導体が例示される。またペントース、ペントース誘導体、ペントースを含有する化合物、及びペントース誘導体を含有する化合物から選択される少なくとも１種の物の加熱処理物中に生成する４−（９−アデニニル）−２−シクロペンテン−１−オン（以下、４ＡＣＰと称す）、４−（９−グアニニル）−２−シクロペンテン−１−オン（以下、４ＧＣＰと称す）、それらの精製物を使用することもでき、本発明では４ＡＣＰ及び／又は４ＧＣＰを含有するこれらの加熱処理物、その部分精製物及び精製物が使用できる。
なお本発明はこれらのシクロペンテノン誘導体含有物、４ＨＣＰ誘導体含有物も使用できる。またシクロペンテノン、シクロペンテノン誘導体、４ＨＣＰ、４ＨＣＰ誘導体のそれぞれの光学活性体若しくはそれらの塩を使用することができる。
0004171178.tif 000003
（式中、５員環内の点線で示した結合子は当該５員環が、二重結合を有するシクロペンテン環、或いはそれが飽和されたシクロペンタン環のいずれでもよいことを意味する。そして、シクロペンテン環の場合、Ｘ１はＯＨ、Ｙ１は＝Ｏ、Ｚ１はＨであり、他方シクロペンタン環の場合、Ｘ１は＝Ｏ、Ｙ１はＯＨ、Ｚ１はＯＨである。またＷ１はＳＨ基含有化合物からＳＨ基を除いた残基である）
0004171178.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２は同じであっても異なっても良く、水素、脂肪族基、芳香族基又は芳香脂肪族基である）
0004171178.tif 000005
（式中、Ｒ３、Ｒ４は同じであっても異なっても良く、水素、脂肪族基、芳香族基又は芳香脂肪族基である。但し、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈの場合を除く）
0004171178.tif 000006
［式中、５員環内の点線で示した結合子は、当該５員環が、二重結合を有するシクロペンテン環、或いはそれが飽和されたシクロペンタン環のいずれでもよいことを意味する。そして、シクロペンテン環の場合、Ｘ２はＯＲ５、Ｙ２は＝Ｏ、Ｚ２はＨであり、他方シクロペンタン環の場合、Ｘ２は＝Ｏ、Ｙ２はＯＲ６、Ｚ２はＯＲ７であり、Ｒ５はＲ８、又は−（ＣＯ）−Ｒ９、Ｒ６はＨ、Ｒ１０、又は−（ＣＯ）−Ｒ１１、Ｒ８はＩＩ、Ｒ１２、又は−（ＣＯ）−Ｒ１３（Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は同じであっても異なってもよく、脂肪族基、芳香族基、又は芳香脂肪族基であり、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１３はＨでもよい）を意味する。但しＲ６＝Ｒ７＝Ｈを除く。またＷ２はＳＨ基含有化合物からＳＨ基を除いた残基である］
0004171178.tif 000007
（式中、Ｒ１４は脂肪族基、芳香族基、又は芳香脂肪族基であり、ｎは０又は１である。但し、ｎ＝０でＲ１４がＨの場合を除く）
0004171178.tif 000008
（式中、Ｗ３はＳＨ基含有化合物からＳＨを除いた残基である）
式（ＩＩ）で表されるシクロペンテノン誘導体についてはＷＯ９８／３９２９１号公報に詳細に記載されており、当該誘導体はシクロペンテノンとＳＨ基含有化合物、例えばシステイン、グルタチオン等とを反応させることにより得ることができる。またシクロペンテノン含有物にＳＨ基含有化合物を添加することによって、当該シクロペンテノン誘導体含有物を得ることができる。当該誘導体の例としては下記式（ＶＩＩＩ）〜（ＸＩ）で表される化合物がある。なお以下、式（ＶＩＩＩ）で表される化合物を単にＧＭと称す。
0004171178.tif 000009
0004171178.tif 000010
式（ＩＩＩ）で表されるシクロペンテノン誘導体についてはＷＯ９８／４０３４６号公報、ＰＣＴ／ＪＰ９９／０４３２３号明細書に詳細に記載されており、シクロペンテノンと脂肪族基、芳香族基又は芳香脂肪族基を有するカルボン酸及び／又はその反応性誘導体とを、同時又は順次反応させることにより得ることができる。当該シクロペンテノン誘導体としては、ジアセチルシクロペンテノン、ジベンゾイルシクロペンテノン、ジヘキサノイルシクロペンテノン、ジミリストイルシクロペンテノン、ジオクタノイルシクロペンテノン、ジ−３−オクテノイルシクロペンテノン、ジブチリルシクロペンテノン、ジデカノイルシクロペンテノン、ジバレリルシクロペンテノン、ジプロピオニルシクロペンテノン、ジ−２−ヘキセノイルシクロペンテノン、ジイソブチリルシクロペンテノン、ジメトキシアセチルシクロペンテノン、メトキシフマリルシクロペンテノン、メトキシマレイルシクロペンテノン等が例示される。下記式（ＸＩＩ）にジプロピオニルシクロペンテノンの構造を示す。また下記式（ＸＩＩＩ）にジベンゾイルシクロペンテノンの構造を示す。
0004171178.tif 000011
0004171178.tif 000012
式（ＩＶ）で表されるシクロペンテノン誘導体についてはＷＯ９９／００３４９号公報に詳細に記載されており、シクロペンテノンと脂肪族基、芳香族基又は芳香脂肪族基を有するアルコール及び／又はその反応性誘導体とを、同時又は順次反応させることにより得ることができる。当該シクロペンテノン誘導体としては４−ベンジルシクロペンテノンエーテル、５−ベンジルシクロペンテノンエーテル、４，５−ジベンジルシクロペンテノンエーテル、４−ｔ−ブチルシクロペンテノンエーテル、５−ｔ−ブチルシクロペンテノンエーテル、４，５−ジ−ｔ−ブチルシクロペンテノンエーテルが例示される。５−ベンジルシクロペンテノンエーテルの構造を下記式（ＸＩＶ）に、４，５−ジ−ｔ−ブチルシクロペンテノンエーテルの構造を下記式（ＸＶ）に示す。
0004171178.tif 000013
式（Ｖ）で表されるシクロペンテノン誘導体についてはＰＣＴ／ＪＰ９９／０４３２４号明細書に詳細に記載されており、式（ＩＩＩ）で表される化合物又は式（ＩＶ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物、例えばシステイン、グルタチオン等とを反応させることにより得ることができる。当該シクロペンテノン誘導体含有物を得ることができる。当該誘導体の例としては下記式（ＸＶＩ）、（ＸＶＩＩ）でそれぞれ表される化合物がある。
0004171178.tif 000014
式（ＶＩ）で表される４ＨＣＰ誘導体は、４ＨＣＰと脂肪族基、芳香族基又は芳香脂肪族基を有するカルボン酸及び／又はその反応性誘導体とを反応させること、又は４ＨＣＰと脂肪族基、芳香族基又は芳香脂肪族基を有するアルコール及び／又はその反応性誘導体と反応させることにより得ることができる。
式（ＶＩＩ）で表される４ＨＣＰ誘導体はＷＯ９９／３６３８３号公報に記載のように、４ＨＣＰとＳＨ基含有化合物、例えばシステイン、グルタチオン等とを反応させることにより得ることができる。また４ＨＣＰ含有物にＳＨ基含有化合物を添加することによって、当該４ＨＣＰ誘導体含有物を得ることができる。当該誘導体の例としては下記式（ＸＶＩＩＩ）で表される化合物がある。
0004171178.tif 000015
本発明における産生増強を要する成長因子とは細胞の成長を促進する活性を有していれば特に限定はないが、ＨＧＦ、ＮＧＦ、上皮成長因子、ミルク由来成長因子、線維芽細胞成長因子、脳由来線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板塩基性タンパク、結合組織活性化ペプチド、インスリン様増殖因子、コロニー形成刺激因子、エリスロポエチン、スロンボポエチン、Ｔ細胞成長因子、インターロイキン類（例えば、インターロイキン２、３、４、５、７、９、１１、１５）、Ｂ細胞成長因子、軟骨由来因子、軟骨由来成長因子、骨由来成長因子、骨格成長因子、内皮細胞成長因子、内皮細胞由来成長因子、眼由来成長因子、精巣由来成長因子、セルトリ細胞由来成長因子、乳腺刺激因子、脊髄由来成長因子、マクロファージ由来成長因子、リサイクル間葉成長因子、形質転換増殖因子−α、形質転換増殖因子−β、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子、アンフィレグリン、ＳＤＧＦ、ベータセルリン、エピレグリン、ニューレグリン１、２、３、血管内皮増殖因子、ニューロトロフィン、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、ＮＴ−６、ＮＴ−７、グリア細胞株由来神経栄養因子、幹細胞因子、ミッドカイン、プレイオトロフィン、Ｅｐｈｒｉｎ、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、アクチビン、腫瘍壊死因子、インターフェロン類等が例示される。
ＨＧＦは肝細胞増殖作用、タンパク合成促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎障害の予防作用などを示す。またＨＧＦのｍＲＮＡは脳、腎臓、肺等でも合成されており、肝実質細胞、腎細尿管細胞、表皮細胞等にも増殖活性がある、中胚葉性細胞成長因子である。従って、肝細胞増殖因子の産生を増強することにより、肝炎、重症肝炎、肝硬変および肝内胆汁うっ滞、慢性腎炎、肺炎、創傷の治療又は予防を行うことができる。
ＮＧＦは神経細胞の生存や機能を維持したり、ＮＧＦの濃度勾配に従って神経細胞を伸長させたりする内因性の成長因子であり、ＮＧＦの産生を増強することにより、アルツハイマー病等の老人痴呆症や末梢神経障害、脳血管障害、脳腫瘍、脳尖、頭部外傷変性疾患、麻酔薬物中毒などによる神経機能の修復再生を要する疾患の治療又は予防を行うことができる。
インスリン様増殖因子は種々の細胞に多彩な生理作用を有し、インスリン様増殖因子の産生を増強することによって、ＩＩ−型糖尿病（インスリン非依存性）や成長障害疾患（小人症）の治療又は予防を行うことができる。またインスリン様増殖因子は坐骨神経障害において坐骨神経の再生を促進することから、筋萎縮性側索硬化症の治療又は予防を行うことができる。
なおシクロペンテノン、シクロペンテノン誘導体、４ＨＣＰ及び４ＨＣＰ誘導体はインターロイキン−１２産生増強能を示し、シクロペンテノン、シクロペンテノン誘導体、４ＨＣＰ及び４ＨＣＰ誘導体から選択される化合物を有効成分とするインターロイキン−１２産生増強剤が提供される。当該製剤はそれ自体公知の方法により、製剤化することができ、インターロイキン−１２産生増強を要する疾患の治療剤又は予防剤として使用することができる。
インターフェロンγ（ＩＦＮγ）はＴ細胞（Ｔｈ１）のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）が抗原呈示細胞（ＡＰＣ）等により刺激されたとき産生されるが、その際、さらにＡＰＣから産生されるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）によって産生が誘導される。つまり、ＩＬ−１２産生を増強することにより、ＩＦＮγの産生を誘導し、誘導されたＩＦＮγはウイルス、真菌感染、および癌疾患等において細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ等の細胞性免疫を活性化させ、生体防御能の増強に働く。一方、アレルギー疾患において発症の原因とされているＴｈ２の活性化を抑制することにより、喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎等の治療および予防に有効と考えられている。
更に、シクロペンテノン、シクロペンテノン誘導体、４ＨＣＰ及び４ＨＣＰ誘導体は筋肉増強作用を有し、これらの化合物、該化合物含有物を有効成分として筋肉増強剤が提供できる。当該化合物含有物としては、特に限定はないが、例えばペントースを含有する化合物であるＤＮＡを加熱処理することによって得られる４ＨＣＰを高含有するＤＮＡ加熱処理物を使用することができる。
なお筋肉増強作用については、坐骨神経を圧挫し、萎縮した筋肉が機能面と量で回復する程度を評価することができる。このモデル実験での障害からの回復は神経の再生によるところが大きいと報告されている。ビタミンＢ１やＢ１２には鶏胎知覚神経節や脊髄の組織培養実験において神経繊維の伸びを著明に促進し、坐骨神経圧挫モデルにおいてもヒラメ筋などの有意な筋肉量の回復効果が報告されている（Ｆｏｌｉａ  ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊａｐｏｎ，７４：７２１―７３４（１９７８））。
しかしながら当該ＤＮＡ加熱処理物が上記のようなモデル実験において有効であることは報告されておらず、さらにインスリン様増殖因子や、ＨＧＦやＮＧＦの産生を増強したり、筋肉の増強や機能の回復する効果については報告されていない。すなわち本発明者らが見出した様に、当該ＤＮＡ加熱処理物はインスリン様増殖因子や、ＨＧＦやＮＧＦの産生を増強することから、筋萎縮性側索硬化症だけではなく、インスリン様増殖因子が必要とされる成長障害、骨粗しょう症、糖尿病、腎不全等の治療や予防に使用することができる。
シクロペンテノン、シクロペンテノン誘導体、４ＨＣＰ及び４ＨＣＰ誘導体から選択される化合物は成長因子産生増強能及び／又はインターロイキン−１２産生増強能を有し、これらの化合物を有効成分として成長因子産生増強を要する疾患及び／又はインターロイキン−１２産生増強を要する疾患の治療剤又は予防剤を製造することができる。また当該化合物を有効成分として筋肉増強剤を製造することができる。
治療剤又は予防剤としては、シクロペンテノン、シクロペンテノン誘導体、４ＨＣＰ及び４ＨＣＰ誘導体から選択される化合物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すればよい。一般的には、当該組成物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。
当該治療剤又は予防剤は、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。
医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。
一方、非経口剤の場合は、常法に従い当該治療剤又は予防剤の有効成分であるシクロペンテノン、シクロペンテノン誘導体、４ＨＣＰ及び４ＨＣＰ誘導体から選択される化合物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製される。
本発明の治療剤又は予防剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮肉等に投与することができ、外用剤には座剤等も包含される。
治療剤又は予防剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
本発明のシクロペンテノン、シクロペンテノン誘導体、４ＨＣＰ及び４ＨＣＰ誘導体から選択される化合物を有効成分として含有する成長因子産生増強剤及びインターロイキン−１２産生増強剤は、上記の治療剤又は予防剤に準じ製造、投与することができる。当該成長因子産生増強剤及びインターロイキン−１２産生増強剤は成長因子の増強方法に使用することができ、成長因子の機能研究や、成長因子に関連する医薬のスクリーニングに有用である。
本発明の成長因子産生増強剤としては、特に限定はないがＨＧＦ産生増強剤、ＮＧＦ産生増強剤、ｈ−ＩＧＦ産生増強剤等が例示され、ＨＧＦ産生増強、ＮＧＦ産生増強、ｈ−ＩＧＦ産生増強を要する疾患の治療剤又は予防剤として使用することができる。
本発明のＨＧＦ産生増強剤の有効成分としては、シクロペンテノン、シクロペンテノン誘導体、４ＨＣＰ及び４ＨＣＰ誘導体から選択される化合物を使用すれば良く限定はないが、シクロペンテン環を有する化合物を使用することが好適である。またＨＧＦ遺伝子の転写を誘導し、ＨＧＦの産生を増強するサイトカイン類、プロスタグランジン類、例えばＩＬ−１、プロスタグランジンＥ１、Ｅ２等から選択される物質を本発明のＨＧＦ産生増強剤に含有させても良い。更に好適には、本発明のＨＧＦ産生増強剤がＨＧＦ遺伝子の転写を誘導するように作用するのであれば、本発明のＨＧＦ産生増強剤に、ＨＧＦ遺伝子のｍＲＮＡの翻訳以降のステップを促進してＨＧＦの産生を増強する作用のある物質を含有させることによって、ＨＧＦ産生が相乗的に増強されるＨＧＦ産生増強剤が提供される。当該相乗効果を発現させる物質としては、ＨＧＦ遺伝子のｍＲＮＡの翻訳以降のステップを促進してＨＧＦの産生を増強する作用のある物質であればよく、特に限定はないが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、フコイダン等の硫酸化多糖及びこれらの分解物が例示される。また、ＨＧＦ産生増強作用を有する生姜等由来のショウガオール、ジンジャーオール、ウコン等由来のクルクミン等、又はこれらの含有物等を本発明のＨＧＦ産生増強剤に含有させても良い。更に、本発明の成長因子産生増強剤及び／又はインターロイキン−１２産生増強剤を任意の飲食品に添加して、日常的に摂取しても良い。
本発明のシクロペンテノン、シクロペンテノン誘導体、４ＨＣＰ及び４ＨＣＰ誘導体から選択される化合物を有効成分として含有する筋肉増強剤は、上記の治療剤又は予防剤に準じ製造、投与することができる。
シクロペンテノン含有物、シクロペンテノン誘導体含有物、４ＨＣＰ含有物及び４ＨＣＰ誘導体含有物から選択されるものを有効成分として含有、希釈及び／又は添加してなる成長因子産生増強用及び／又はインターロイキン−１２産生増強用食品、又は成長因子産生増強用及び／又はインターロイキン−１２産生増強用飲料の製造法は、特に限定はないが、調理、加工及び一般に用いられている食品又は飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品又は飲料に有効量の生理作用を有するシクロペンテノン含有物、シクロペンテノン誘導体含有物、４ＨＣＰ含有物及び４ＨＣＰ誘導体含有物から選択されるものが含有されていれば良く、成長因子産生増強作用及び／又はインターロイキン−１２産生増強作用を有する機能性食品又は飲料とすることができる。
またシクロペンテノン含有物、シクロペンテノン誘導体含有物、４ＨＣＰ含有物及び４ＨＣＰ誘導体含有物から選択されるものを有効成分として含有、希釈及び／又は添加してなる筋肉増強用食品又は筋肉増強用飲料の製造法は、特に限定はないが、調理、加工及び一般に用いられている食品又は飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品又は飲料に有効量の生理作用を有するシクロペンテノン含有物、シクロペンテノン誘導体含有物、４ＨＣＰ含有物及び４ＨＣＰ誘導体含有物から選択されるものが含有されていれば良く、筋肉増強作用を有する機能性食品又は飲料とすることができる。
本発明で使用するシクロペンテノン、シクロペンテノン誘導体、４ＨＣＰ及び４ＨＣＰ誘導体はその生理活性の有効量の投与を行っても毒性は認められない。またそれらの含有物も毒性は認められない。
例えば経口投与の場合、シクロペンテノン、ＧＭ、４ＨＣＰ、ジプロピオニルシクロペンテノン、ジヘキサノイルシクロペンテノン、ジ−２−ヘキセノイルシクロペンテノン、ジイソブチルシクロペンテノン、ジベンゾイルシクロペンテノン、４−ｔ−ブチルシクロペンテノンエーテル、４，５−ジ−ｔ−ブチルシクロペンテノンエーテル若しくはこれらの光学活性体又はそれらの塩のいずれかを１００ｍｇ／ｋｇでマウスに単回投与しても死亡例は認められない。
実施例
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、実施例における％は重量％を意味する。
参考例１
（１）１０ｇのＤ−グルクロン酸（シグマ社製  Ｇ  ５２６９）を１リットルの水に溶解し、１２１℃で４時間加熱した後約１０ｍｌになるまで減圧下濃縮した。これに酢酸ブチル：酢酸：水＝３：２：２混合液の上層４０ｍｌを加えて混合後、遠心によって得た上清を減圧下約１０ｍｌまで濃縮した。
上記抽出液をカラムクロマトグラフィー用シリカゲルＢＷ−３００ＳＰ（２×２８ｃｍ、富士シリシア化学社製）にアプライし、酢酸ブチル：酢酸：水＝３：２：２の上層を溶離液としてコンプレッサーで０．２ｋｇ／ｃｍ２に加圧し、毎分５ｍｌの流速で分離を行った。１画分当り１０ｍｌになるようにフラクショネーションを行い、各画分の一部をとって薄層クロマトグラフィーで分析したところ６１番から８０番までの画分に高純度のシクロペンテノンが含まれていた。これらの画分を集めて減圧下濃縮した後４０ｍｌのクロロホルムで抽出し、抽出液を減圧下濃縮することによって１００ｍｇのシクロペンテノンを得た。
この画分をパルパックタイプＳカラム（宝酒造社製）を用いた順相ＨＰＬＣで分離し、２１５ｎｍの紫外部吸収で検出したところ、純度は９８％であった。
（２）シクロペンテノン３０ｍｇ、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）  １６ｍｇ、トリエチルアミン  ６６ｍｇ及び無水プロピオン酸（東京化成工業社製Ｐ０５１３）８６ｍｇを５．９ｍｌのジクロロメタンに溶解し、氷冷下１時間反応させた。この反応液をクロロホルム：メタノール＝２００：１を展開溶媒としたシリカゲル薄層クロマトグラフィーによって展開し、Ｒｆ＝０．５〜０．６の部分のシリカゲルを薄層から掻き取り、クロロホルムで抽出することによって３１ｍｇのジプロピオニルシクロペンテノンを得た。
得られたジプロピオニルシクロペンテノンの核磁気共鳴による構造解析結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ
δ７．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２−３＝６．２７Ｈｚ，Ｊ３−４＝２．１５Ｈｚ，Ｈ−３）、６．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２−３＝６．２７Ｈｚ，Ｊ３−４＝１．４９Ｈｚ，Ｈ−２）、５．９１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ４−５＝２．９７Ｈｚ，Ｈ−５）、２．４６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．０１，７．５９Ｈｚ）、２．４２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．０１，７．５９Ｈｚ）、１．１８（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５９，７．５９Ｈｚ）
（３）シクロペンテノンの１Ｍ水溶液１００μｌと２００ｍＭグルタチオン（還元型：ナカライテスク社販売：１７０−１０）水溶液（ｐＨ３．０）５００μｌを混合し、６０℃で５時間反応させた。この反応液を０．５μｍコスモナイスフィルター（ナカライテスク社製）でろ過し、以下の条件でＨＰＬＣで分離した。
0004171178.tif 000016
上記反応液２００μｌをＨＰＬＣにかけ、保持時間３５．７分、３６．１分のピークを分取し、それぞれ減圧下濃縮乾固し、乾固物５．５ｍｇを得た。
この乾固物の構造を解析した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル、質量スペクトル（ＭＳ）を測定した。その結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ
δ２．０９（２Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），２．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．０，２０．０Ｈｚ，５−Ｈ），２．４４（２Ｈ，ｍ，４’−Ｈ），２．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，１４．０，１’−Ｈ），２．８５又は２．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０，６．０Ｈｚ，５−Ｈ），２．９２又は２．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．０，５．５Ｈｚ，１’−Ｈ），３．８６（２Ｈ，Ｓ，９’−Ｈ），３．９５（２Ｈ，ｍ，４−Ｈ，６’−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｍ，２’−Ｈ），６．４７又は６．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，３−Ｈ）
試料は０．１Ｎ  ＤＣｌ重水溶液に溶解し、ＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。
１３Ｃ−ＮＭＲ
δ２６．３（５’−Ｃ），３１．７（４’−Ｃ），３１．９又は３２．１（１’−Ｃ），３９．３（４−Ｃ），４１．９（９’−Ｃ），４２．２又は４２．３（５−Ｃ），５３．３（６’−Ｃ），５４．１（２’−Ｃ），１３３．５（３−Ｃ），１５４．４（２−Ｃ），１７３付近（３’−Ｃ，７’−Ｃ，８’−Ｃ，１０’−Ｃ），２０５．８（１−Ｃ）
試料は０．１Ｎ  ＤＣｌ重水溶液に溶解し、ジオキサンの化学シフト値を６７．４ｐｐｍとして表した。
なお、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲのピークの帰属の番号は下記式（ＸＩＸ）のとおりである。
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ＦＡＢ−ＭＳ
ｍ／ｚ  ４０４（Ｍ＋Ｈ）＋，４２６（Ｍ＋Ｎａ）＋
グリセロールをマトリックスに用いた。
ＵＶ  λｍａｘ  ２５１ｎｍ（水）
ＩＲ  νＫＢｒ  ｍａｘ  ｃｍ−１  ２９４９，１７１０，１６６０，１５３９，１４０４，１２０３
拡散反射法によって行った。
以上の結果から、乾固物はＧＭ、すなわち２−ヒドロキシ−４−グルタチオン−Ｓ−イル−２−シクロペンテン−１−オン（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓ−ｙ１−２−ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｅｎ−１−ｏｎｅ）であった。
（４）５Ｗ／Ｖ％  ＤＮＡ・Ｎａ（株式会社ニチロ製）水溶液のｐＨは６．５であった。これに希ＨＣｌを加えて、ｐＨを５．５に調整後、ヒートブロックにて、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０及び１２０℃で３時間加熱処理をした。
加熱処理液の上清中の４ＨＣＰの濃度を、薄層クロマトグラフィー法で測定した。
すなわち、薄層クロマトグラフィー用シリカゲルプレート（ＭＥＲＣＫ社製）に、上記加熱処理物の上清及び２、４、６、８、１０及び１２ｍＭの４ＨＣＰ水溶液を、１μｌずつスポットし、クロロホルム：メタノール＝４：１の混合液で展開した。オルシノール硫酸呈色試液で赤色に呈色させた後、プレートの画像をｐｈｏｔｏ／Ａｎａｌｙｓｔ  Ａｒｃｈｉｖｅｒ（Ｆｏｔｏｄｙｎｅ  ｉｎｃ．）で撮り込み、１−ＤＢａｓｉｃ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）でスポットの強度を数値化して、４ＨＣＰの検量線より各試料の濃度を求めた。
結果を図１に示す。すなわち図１は加熱温度と４ＨＣＰ生成量の関係を示す図であり、縦軸は４ＨＣＰ生成量（ｍＭ）、横軸は加熱温度（℃）を示す。図に示すように４ＨＣＰの生成量は、加熱献度が高くなるにつれて増加した。
（５）５Ｗ／Ｖ％  ＤＮＡ・Ｎａ（株式会社ニチロ製）水溶液に希ＨＣｌを加えて、ｐＨを５．５に調整後、オートクレーヴにて、１２０℃で０、１、３、５及び９時間加熱処理をした。
加熱処理液の上清中の４ＨＣＰの濃度を、参考例１−（４）に記載の方法で測定した。
結果を図２に示す。すなわち図２は加熱時間と４ＨＣＰ生成量の関係を示す図であり、縦軸は４ＨＣＰ生成量（ｍＭ）、横軸は加熱時間（時間）を示す。図に示すように４ＨＣＰ生成量は、加熱３時間でピークに達した。
（６）５Ｗ／Ｖ％  ＤＮＡ・Ｎａ（株式会社ニチロ製）水溶液に希ＨＣｌを加えてｐＨを４．０、５．０、５．５、６．０に調整したもの、及び希ＮａＯＨを加えてｐＨを７．０に調整したものを、オートクレーヴにて、１２０℃で３時間加熱処理をした。
加熱処理物の上清中の４ＨＣＰの濃度を、参考例１−（４）に記載の方法で測定した。
結果を図３に示す。すなわち図３はｐＨと４ＨＣＰ生成量の関係を示す図であり、縦軸は４ＨＣＰ生成量（ｍＭ）、横軸はｐＨを示す。図に示すよう４ＨＣＰ生成量は、ｐＨ５付近をピークに増加した。
（７）５Ｗ／Ｖ％  ＤＮＡ・Ｎａ（株式会社ニチロ製）水溶液に希ＨＣｌを加えて、ｐＨを５．５に調整後、ヒートブロックにて、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０及び１２０℃で３時間加熱処理をした。
加熱処理物の上清を逆相ＨＰＬＣ法にて分析した。分析条件は以下のとおりである。
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２５分に溶出される４ＧＣＰ及び３３分に溶出される４ＡＣＰのピーク面積を求め、各検量線より、各試料の濃度を求めた。
結果を図４及び図５に示す。すなわち図４は加熱温度と４ＡＣＰ生成量の関係を示す図であり、縦軸は４ＡＣＰ生成量（ｍＭ）、横軸は加熱温度（℃）を示す。図５は加熱温度と４ＧＣＰ生成量の関係を示す図であり、縦軸は４ＧＣＰ生成量（ｍＭ）、横軸は加熱温度（℃）を示す。
図４、図５に示すように４ＡＣＰ及び４ＧＣＰは３時間加熱時１００℃より生成が認められ、その生成量は加熱温度が高くなる程増加した。
（８）５Ｗ／Ｖ％  ＤＮＡ・Ｎａ（株式会社ニチロ製）水溶液に希ＨＣｌを加えて、ｐＨを５．５に調整後、オートクレーヴにて、１２０℃で０、１、３、５及び９時間加熱処理をした。
加熱処理物の上清中の４ＡＣＰ及び４ＧＣＰの濃度を、参考例１−（７）に記載の方法で測定した。
結果を図６及び図７に示す。すなわち図６は加熱時間と４ＡＣＰ生成量の関係を示す図であり、縦軸は４ＡＣＰ生成量（ｍＭ）、横軸は加熱時間（時間）を示す。図７は加熱時間と４ＧＣＰ生成量の関係を示す図であり、縦軸は４ＧＣＰ生成量（ｍＭ）、横軸は加熱時間（時間）を示す。
図６、図７に示すように４ＡＣＰ及び４ＧＣＰは、共に３時間でピークに達し、その後減少した。
（９）５Ｗ／Ｖ％  ＤＮＡ・Ｎａ（株式会社ニチロ製）水溶液に希ＨＣｌを加えてｐＨを４．０、５．０、５．５、６．０に調整したもの、及び希ＮａＯＨを加えてｐＨを７．０に調整したものを、オートクレーヴにて、１２０℃で３時間加熱処理をした。
加熱処理物の上清中の４ＡＣＰ及び４ＧＣＰの濃度を、参考例１−（７）に記載の方法で測定した。
結果を図８及び図９に示す。すなわち図８はｐＨと４ＡＣＰ生成量の関係を示す図であり、縦軸は４ＡＣＰ生成量（ｍＭ）、横軸はｐＨを示す。図９はｐＨと４ＧＣＰ生成量の関係を示す図であり、縦軸は４ＧＣＰ生成量（ｍＭ）、横軸はｐＨを示す。
図８、図９に示すように４ＡＣＰ及び４ＧＣＰは、共にｐＨ５付近をピークに増加した。
（１０）０．１Ｍ  ２−デオキシ−Ｄ−リボース（シグマ社製）水溶液を、１２１℃で０．５、１、２、４、１５時間加熱処理した。
加熱処理物の上清を逆相ＨＰＬＣ法にて分析した。分析条件は以下のとおりである。
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７分に溶出される４，５−ジヒドロキシ−２−ペンテナールのピーク面積を求め、検量線より、各試料の濃度を求めた。
結果を図１０に示す。すなわち図１０は加熱時間と４，５−ジヒドロキシ−２−ペンテナールの生成量の関係を示す図であり、縦軸は４，５−ジヒドロキシ−２−ペンテナール生成量（ｍＭ）、横軸は加熱時間（時間）を示す。図１０に示すように、５時間の加熱で４，５−ジヒドロキシ−２−ペンテナールの生成量はプラトーに達した。
実施例１
ラット繊維芽Ｌ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１．２）を０．５％のバクトペプトン（ギブコ社製）を含むＭ１９９培地（ギブコ社製）で１．０×１０５細胞／ｍｌに懸濁し２４穴プレートに１ｍｌずつまき無菌的に培養した。２日間培養後、培地をとり除き、０．５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＭ１９９培地に置き換えた。これにシクロペンテノン（終濃度１〜２５μＭ）、４ＨＣＰ（アルドリッチ社製）（終濃度１２．５μＭ）、ジプロピオニルシクロペンテノン（終濃度３．１〜９．４μＭ）を添加し、２４時間培養した。
培養終了後、培養液中の神経成長因子の濃度をエンザイムイムノアッセイ法（ＮＧＦ  Ｅｍａｘ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：プロメガ社製）にて測定した。結果、シクロペンテノン、４ＨＣＰ、ジプロピオニルシクロペンテノンは濃度依存的にＬ−Ｍ細胞の神経成長因子産生を増強した。結果を表１〜表４に示す。
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さらに、これら以外のシクロペンテノン誘導体も同様にＬ−Ｍ細胞の神経成長因子産生を増強した。
実施例２
１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地（バイオウィッタカー社製）に懸濁したＭＲＣ−５細胞（ＣＣＬ１７１、大日本製薬社製）５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養後に１％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、試料を添加し、さらに２４時間培養した後、培地を回収し、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＨｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いて、培地中のＨＧＦの量を測定した。ＨＧＦの生産量は、ネガティブコントロールを１００％として表した。なお、ネガティブコントロールのＨＧＦの生産量は、７．２ｎｇ／ｍｌであった。上記の試料は、それぞれ最終濃度が、シクロペンテノンは、２０、４０、１６０μＭ、ＧＭは、２０、４０、８０、１６０μＭ  ジプロピオニルシクロペンテノンは、３２、６４μＭになるように添加した。ネガティブコントロールとして、試料と同量の蒸留水を添加した。ポジティブコントロールとして、プロスタグランジンＥ１を、０．０１、０．１、１、１０μＭになるように添加した。
その結果、シクロペンテノン及びその誘導体を添加した細胞群は全て、蒸留水添加のネガティブコントロールより有意にＨＧＦの生産量が増加していた。さらに、ポジティブコントロールのプロスタグランジンＥ１添加よりも顕著にＨＧＦの生産量が増加していた。このことより、シクロペンテノン及びその誘導体には、これまでＨＧＦの増強が確認されているプロスタグランジンより高いＨＧＦの生産を増強する活性があることが示された。シクロペンテノン、ＧＭ及びジプロピオニルシクロペンテノンを添加した結果をそれぞれ表５、表６、表７に示す。
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実施例３
（１）ヒト新生児包皮上皮細胞株であるＨｓ６８細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３５）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ギブコＢＲＬ社製）を含むＤ−ＭＥＭ培地（バイオウィッタカー社製）にて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で細胞が培養器に飽和になるまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（バイオウィッタカー社製）で細胞を３×１０５個／ｍｌとなるように上記培地に懸濁し、９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに２００μｌずつ分注した。培養５日後、ほぼ細胞が培養器に飽和になった時点で培地を捨て、４０、１００又は２００μＭの４ＨＣＰを含有する培地を加えた。９６時間のタイムコースを取って、２４時間ずつ経時的に培養上清を回収し、Ｈｓ６８細胞におけるヒトインスリン様増殖因子−１（ｈ−ＩＧＦ−１）産生増強に対する４ＨＣＰの影響をｈ−ＩＧＦ−１のＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔ（ダイアグノスティックス  システム  ラボ  社製）を用いて測定した。その結果を表８に示した。
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表８に示すように、Ｈｓ６８細胞において、１００μＭ以上の４ＨＣＰを添加した場合には、ｈ−ＩＧＦ産生増強活性は２４時間目に最大となり、それから経時的に減少した。
（２）Ｈｓ６８細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養器に飽和になるまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で細胞を３×１０５個／ｍｌとなるように上記培地に懸濁し、９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに２００μｌずつ分注した。培養５〜７日後、ほぼ細胞が培養器に飽和になった時点で培地を捨て、０、２．５、５、１０、又は２０μＭのシクロペンテノン、又はＧＭを含有する上記培地を加えた。
４８時間のタイムコースを取って、１、３、６、１２、２４、４８時間で、経時的に培養上清を回収し、Ｈｓ６８細胞におけるｈ−ＩＧＦ−１産生（発現増強）に対するシクロペンテノン又はＧＭの影響をｈ−ＩＧＦ−１のＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔを用いて測定した。
その結果、Ｈｓ６８細胞において、１０〜２０μＭのＧＭを添加した場合は、添加後３時間からｈ−ＩＧＦ−１が産生され、６時間後には無添加の対照と比べ、約２倍量のｈ−ＩＧＦ−１が産生された。
また１０〜２０μＭのシクロペンテノンを添加した場合は、添加後１時間から６時間にかけて、ｈ−ＩＧＦ−１の産生が認められた。
（３）Ｈｓ６８細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養器に飽和になるまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で細胞を３×１０５個／ｍｌとなるように上記培地に懸濁し、９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに２００μｌずつ分注した。培養５〜７日後、ほぼ細胞が培養器に飽和になった時点で培地を捨て、０、２５、５０、１００、又は２００μＭの４ＨＣＰ、式（ＸＶＩＩＩ）で表される化合物（４ＨＣＰ−ＧＳＨ）、又はグルタチオン（ＧＳＨ）を含有する上記培地を加えた。４８時間のタイムコースを取って、１、３、６、１２、２４、４８時間で、経時的に培養上清を回収し、Ｈｓ６８細胞におけるｈ−ＩＧＦ−１産生（発現増強）に対する影響をｈ−ＩＧＦ−１のＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔを用いて測定した。
その結果、Ｈｓ６８細胞において、２５〜２００μＭの４ＨＣＰを添加した場合は、早くも１時間目からｈ−ＩＧＦ−１産生が最大となって、それから経時的に減少した。また、４８時間目においてｈ−ＩＧＦ−１発現は１００μＭ以上の４ＨＣＰで処理した細胞で観察された。式（ＸＶＩＩＩ）で表される化合物は、１００〜２００μＭの濃度で、濃度依存的なｈ−ＩＧＦ−１増強活性が確認された。これらの結果をそれぞれ表９及び表１０に示す。なお、培養時間が１０〜３０分のときも有意なｈ−ＩＧＦ−１産生増強が認められた。一方、グルタチオン単独を添加した培地には有意なｈ−ＩＧＦ−１増強活性が認められなかった。
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実施例４
５週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラットを用い、坐骨神経の圧挫により後肢筋の萎縮モデルを作製した。圧挫の２週間後に後肢腓腹筋を摘出して筋重量を測定し、圧挫肢側の筋重量を正常肢側に対する割合で表した。
１０Ｗ／Ｖ％  ＤＮＡ・Ｎａ（株式会社ニチロ製）水溶液に希ＨＣｌを加えてｐＨを５に調整したものを、オートクレーヴにて、１２０℃で３時間加熱処理し、ＤＮＡ加熱処理物を調製した。
調製したＤＮＡ加熱物の１０倍水希釈液（４ＨＣＰとして約１１ｍｇ／ｋｇ／日）および１００倍水希釈液（４ＨＣＰとして約１ｍｇ／ｋｇ／日）を調製し、圧挫の３日前から飲水中より摂取させた（Ｎ＝９〜１０）。対照群には水道水を与えた（Ｎ＝１０）。
その結果を表１１に示す。表中の数字は、平均値±標準誤差を表す。表中の＊は対照群と比較して５％以下の危険率で有意な差を有することを意味する。
対照群では圧挫によって顕著な筋萎縮が惹起され、圧挫２週間後においてもほとんど回復は見られなかった。これに対し、ＤＮＡ加熱物飲水投与群では用量依存的に筋重量の回復を促進し、ＤＮＡ加熱物の１０倍希釈液飲水群では有意な筋肉増量効果により対照群での筋萎縮状態を改善した。
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実施例５
（１）注射剤
生理食塩液にシクロペンテノン又はＧＭを１％濃度で加え、注射剤を作製した。
（２）錠剤
ジプロピオニルシクロペンテノン又は４ＨＣＰの１００ｍｇと微結晶性セルロースの適量とを含有する錠剤を調製し、糖衣を施し、各錠剤を作製した。
参考例６
ｄｄＹマウス（メス、５週齢、体重約２５ｇ）は日本エスエルシーより購入し、１週間の予備飼育の後、実験に用いた。マウスの腹腔内に１×１０６ｃｅｌｌｓのエーリッヒがん細胞を接種し、接種１日後に１０ｍｇ／ｋｇのシクロペンテノンを腹腔内投与した。癌細胞接種から８日または１２日後にマウスを断頭、放血死させ、対照群の腹水貯留量と同量（２ｍｌ）の１％牛血清アルブミン（シグマ社製）を含んだＰＢＳ（−）（日水製薬社製）をマウスの腹腔内に注入し、よくマッサージした後、回収した。対照群では腹水を直接回収した。回収した腹水および腹腔洗浄液は２０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後、上清を回収してインターロイキン−１２量をマウスインターロイキン−１２測定用ＥＬＩＳＡキット（エンドジェン社製）を用いて定量した。
がん細胞接種８日後、および１２日後の各マウスの腹腔内インターロイキン−１２量を表１２に示す。がん細胞接種８日後の対照群では３例のマウス全てで検出限界以下であったのに対し、シクロペンテノン投与群では、各マウスにおいて、シクロペンテノンのインターロイキン−１２の産生増強活性が認められ、局所のＴ細胞およびＮＫ／ＬＡＫ細胞が活性化された状態にあることが示された。また、がん細胞接種１２日後においてもシクロペンテノン投与群では腹腔内にインターロイキンが確認され、免疫賦活による抗腫瘍効果が発現されていた。またシクロペンテノン誘導体も、同様に、インターロイキン−１２産生増強活性を示した。
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産業上の利用の可能性
本発明により成長因子産生増強活性及び／又はインターロイキン−１２産生増強活性を示す化合物を有効成分として含有する成長因子産生増強を要する疾患及び／又はインターロイキン−１２産生増強を要する疾患に有効な医薬が提供される。該医薬は、生体内におけるＨＧＦ産生増強活性、ＮＧＦ産生増強活性、ｈ−ＩＧＦ産生増強活性、インターロイキン−１２産生増強活性等を有し、肝炎、アルツハイマー症、糖尿病、がん等のこれらの成長因子の産生増強を要する疾患及び／又はインターロイキン−１２産生増強を要する疾患の治療剤又は予防剤として有用である。
更に、成長因子産生増強能及び／又はインターロイキン−１２産生増強能を有するシクロペンテノン含有物、シクロペンテノン誘導体含有物、４ＨＣＰ含有物、４ＨＣＰ誘導体含有物から選択されるものを用いて飲食品を製造することが可能になり、日常の飲食品として摂取することにより、成長因子の産生増強を要する疾患及び／又はインターロイキン−１２産生増強を要する疾患の症状改善等が可能となる。
従って、シクロペンテノン含有物、シクロペンテノン誘導体含有物、４ＨＣＰ含有物、４ＨＣＰ誘導体含有物から選択されるものを有効成分とする機能性飲食品は、その成長因子産生増強作用及び／又はインターロイキン−１２産生増強作用により、生体の恒常性の維持に有用な機能性飲食品である。
また、成長因子の産生増強剤及び／又はインターロイキン−１２産生増強剤も提供され、当該増強剤は成長因子の機能研究、成長因子に関連する疾病用医薬のスクリーニングに有用である。
更に筋肉増強剤も提供され、神経圧迫に起因する疾患の治療にも有用である。
【図面の簡単な説明】
図１：加熱温度と４ＨＣＰ生成量の関係を示す図である。
図２：加熱時間と４ＨＣＰ生成量の関係を示す図である。
図３：ｐＨと４ＨＣＰ生成量の関係を示す図である。
図４：加熱温度と４ＡＣＰ生成量の関係を示す図である。
図５：加熱温度と４ＧＣＰ生成量の関係を示す図である。
図６：加熱時間と４ＡＣＰ生成量の関係を示す図である。
図７：加熱時間と４ＧＣＰ生成量の関係を示す図である。
図８：ｐＨと４ＡＣＰ生成量の関係を示す図である。
図９：ｐＨと４ＧＣＰ生成量の関係を示す図である。
図１０：加熱時間と４，５−ジヒドロキシ−２−ペンテナール生成量の関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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