(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−セリン分解能を欠失し、かつＬ−セリンアナログに耐性を有することによりＬ−セリン生産能を有し、かつ、ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子及びホスホセリントランスアミナーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めることによってホスホセリンホスファターゼ活性及びホスホセリントランスアミナーゼ活性の両方が増強されたコリネ型細菌を培地に培養し、培地中にＬ−セリンを蓄積させ、培地中から当該Ｌ−セリンを回収することを特徴とする、発酵法によるＬ−セリンの製造法。
【請求項２】
前記コリネ型細菌が、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列または同配列に１または複数のアミノ酸置換、付加または欠失が生じたアミノ酸配列を有するＤ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列の３２５番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したものをコードする遺伝子が導入されたコリネ型細菌である、請求項１に記載のＬ−セリンの製造法。
【請求項３】
他のアミノ酸残基がリジン残基である請求項２に記載のＬ−セリンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬品・化学品・化粧品分野で使用されるアミノ酸混合物を製造するために用いられるＬ−セリンの製造法、同製造法を構成するコリネ型細菌に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の発酵法によるＬ−セリンの製造法としては、グリシン及び糖からＬ−セリンに変換できる菌株を使用して、３０ｇ／Ｌのグリシンを有する培地で最高１４ｇ／ＬのＬ−セリンを製造したという報告がある。この方法におけるグリシンからＬ−セリンへの変換収率は４６％に相当する（Ｋｕｂｏｔａ  Ｋ．    Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９，７〜１２，１９８５）。また、グリシンとメタノールからＬ−セリンに変換できる菌株を使用して、１００ｇ／Ｌのグリシンから５３ｇ／ＬのＬ−セリンが生産できる（Ｔ．Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．７９，Ｎｏ．２，１８１−１８３．１９９５）。また、ノカルディア属細菌を使用する方法では、セリンハイドロキサメイトやアザセリン等の耐性菌を育種することによりＬ−セリン生産能が改善されることが知られている（特公昭５７−１２３５号）。しかし、これらの方法はＬ−セリンの前駆体であるグリシンを使用しなければならず、操作が煩雑でコスト的にも不利であった。
【０００３】
Ｌ−セリンを糖より直接発酵でき、かつ培地にＬ−セリンの前駆体を添加する必要のない菌株として、Ｄ−セリン、α−メチル−セリン、ｏ−メチルセリン、イソセリン、セリンハイドロキサメイト、３−クロロアラニンに耐性なコリネバクテリウム  グルタミカムが知られているが、そのＬ−セリン蓄積は０．８ｇ／Ｌと極めて低いものであり（農芸化学会誌、第４８巻、第３号、ｐ２０１−２０８，１９７４）、工業的にＬ−セリンの直接発酵を行うには更なる菌株改良が望まれた。
【０００４】
一方、コリネ型細菌において、菌体内で自律増殖可能でかつ、薬剤耐性マーカー遺伝子を有するベクタープラスミド（米国特許第４５１４５０２号参照）、遺伝子の菌体への導入方法（特開平２−２０７７９１号等）が開示されており、これらの技術を用いたＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシン生産菌育成の可能性が開示されている（米国特許第４４５２８９０号、及び米国特許第４４４２２０８号参照）。また、Ｌ−リジン生産菌育成に関しても、ベクタープラスミドにＬ−リジン生合成に関与する遺伝子を組み込み、菌体内で増幅させる技術（特開昭５６−１６０９９７号などがある）が知られている。
【０００５】
エシェリヒア  コリではＬ−セリン生合成に関与する酵素のうち、野生型ではフィードバック阻害を受ける酵素について、フィードバック阻害が解除された変異を有する酵素遺伝子を導入してＬ−セリン生産性を向上させた例も知られている（特許２５８４４０９号）。このような遺伝子として具体的には、３−ＰＧＤＨ遺伝子（以下、３−ＰＧＤＨタンパクをコードする遺伝子を「ｓｅｒＡ」ともいう。）が知られている。
【０００６】
また、コリネ型細菌においては３−ＰＧＤＨ遺伝子の増幅がＬ−トリプトファン生産性に影響を与える例が知られている（特開平３−７５９１号）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、糖をＬ−セリンに変換する微生物を提供し、同微生物が有するＬ−セリンへの変換能を利用して培養液中にＬ−セリンを蓄積させる方法を提供することであり、すなわち、工業的に実施するのに有利なＬ−セリンの製造方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の課題を解決すべくＬ−セリンの製造法について鋭意研究を重ねた結果、Ｌ−セリン生産能を有するコリネ型細菌、好ましくはＬ−セリン分解能を欠失した同細菌またはＬ−セリンアナログに耐性を示す変異株において、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の一方又は両方が増強された株を採取し、同株を用いてＬ−セリン発酵を行い培養液中のＬ−セリン蓄積が飛躍的に向上することを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、Ｌ−セリン生産能を有し、かつ、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の少なくとも一方が増強されたコリネ型細菌である。
【００１０】
さらに本発明は、ホスホセリンホスファターゼ活性及びホスホセリントランスアミナーゼ活性の両方が増強された同コリネ型細菌；Ｌ−セリン分解能を欠失したことによりＬ−セリン生産能を有する同コリネ型細菌；Ｌ−セリンアナログに耐性を有することによりＬ−セリン生産能を有する同コリネ型細菌；前記ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の増強が、前記コリネ型細菌細胞内のホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子又はホスホセリントランスアミナーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めることによるものである同コリネ型細菌；および、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除されたＤ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入された同コリネ型細菌である。
さらに本発明は、前記コリネ型細菌を培地に培養し、培地中にＬ−セリンを蓄積させ、培地中から当該Ｌ−セリンを回収することを特徴とするＬ−セリンの製造法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明においてコリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版５９９頁（１９７４）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であり、コリネバクテリウム属細菌、および従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌、さらにコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属及びミクロバクテリウム属細菌を含む。
【００１２】
本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−セリン生産能を有し、かつ、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性が増強されたコリネ型細菌である。このようなコリネ型細菌は、例えばＬ−セリン生産能を有するコリネ型細菌細胞内のホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子（以下、「ｓｅｒＢ」ともいう）又はホスホセリントランスアミナーゼをコードする遺伝子（以下、「ｓｅｒＣ」ともいう）のコピー数を高めることによって得られる。
また、本発明のコリネ型細菌は、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性が増強されたコリネ型細菌に、Ｌ−セリン生産能を付与することによっても取得することができる。
【００１３】
Ｌ−セリン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−セリン解能を欠失したコリネ型細菌、Ｌ−セリンアナログに耐性なコリネ型細菌、またはＬ−セリン解能を欠失しかつ、Ｌ−セリンアナログに耐性なコリネ型細菌が挙げられる。
本発明においてＬ−セリンアナログとしては、アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンが挙げられる。
【００１４】
Ｌ−セリンアナログに耐性を有しＬ−セリン生産能を有するコリネ型細菌、さらに好ましくは同細菌のうちＬ−セリン分解能を欠失しているコリネ型細菌は、野生型あるいはＬ−セリン生産能を有するコリネ型細菌を親株として人工的に変異、誘導される。
【００１５】
Ｌ−セリンアナログに耐性を有しＬ−セリン分解能を欠失しＬ−セリン生産能を有するコリネ型細菌の採取は、例えば次のようにして行うことができる。すなわち親株としてブレビバクテリウム  フラバム  ＡＴＣＣ１４０６７を通常の方法で変異処理（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンへの接触等）に付して、Ｌ−セリン分解能を欠失した変異株を得、さらにこの変異株を親株としてＬ−セリンアナログ、例えばアザセリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン耐性菌を採取する。また、親株からＬ−セリンアナログに対する耐性菌を取得した後に、Ｌ−セリン分解能を欠失した変異株を得てもよい。このような方法により得られた変異株の中にＬ−セリンを高濃度で蓄積する菌株が得られる。
Ｌ−セリンアナログに対する耐性菌は、後述する変異型ｓｅｒＡを親株またはＬ−セリン分解能を欠失した変異株に導入することによっても、得られうる。
【００１６】
Ｌ−セリンアナログに耐性とは、Ｌ−セリンアナログを含有する培地において野生株よりも速い生育を示す性質をいう。
具体的には例えば、アザセリン耐性とは、アザセリンを含有する培地において野生株よりも速い生育を示す性質をいうが、例えば、０．２５ｇ／Ｌのアザセリンを含有する固体培地上で、３０℃、４〜５日でコロニーを形成できる株はアザセリン耐性を有する。
【００１７】
同様にβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン耐性とは、β−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンを含有する培地において野生株よりも速い生育を示す性質をいうが、例えば、０．２５ｇ／Ｌのβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンを含有する固体培地上で、３０℃、４〜５日でコロニーを形成できる株はβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン耐性を有する。
【００１８】
次に、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の増強について説明する。
ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の増強は、ｓｅｒＢ又はｓｅｒＣを、それぞれ発現可能な形態でコリネ型細菌に導入することによって行うことができる。これは、各々の酵素をコードする各々の遺伝子を別々のプロモーターにより強制発現させる手法でも、あるいは、一つのプロモーターの制御下で両遺伝子を強制発現させることでも可能である。また、これらの遺伝子がプラスミド上にある場合でも、あるいは、染色体上に存在する場合であっても、これらの遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強化することによって、又は翻訳効率を改善することによって、発現を強化してもよい。あるいは、染色体上の遺伝子数を増幅することによっても酵素活性を増強することができる。更に、比活性を上昇させた改変酵素をコードするように変化させたホスホセリンホスファターゼ又はホスホセリントランスアミナーゼをコードする遺伝子を用いることによって、これらの酵素活性の増強は達成される。
【００１９】
コリネ型細菌にｓｅｒＢ又はｓｅｒＣを導入するには、ｓｅｒＢ又はｓｅｒＣを含むＤＮＡ断片を、コリネ型細菌で機能するベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをＬ−セリン生産能を有するコリネ型細菌宿主に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のｓｅｒＢ又はｓｅｒＣのコピー数が上昇する結果、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性が増幅される。また、コリネ型細菌に、ｓｅｒＢ及びｓｅｒＣの両方を含む組み換えＤＮＡを導入すれば、又はｓｅｒＢを含む組み換えＤＮＡ及びｓｅｒＣを含む組み換えＤＮＡの両ＤＮＡを導入すれば、ホスホセリンホスファターゼ活性及びホスホセリントランスアミナーゼ活性がともに増幅される。
【００２０】
ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣともに塩基配列は公知であり（ｓｅｒＢ：ＧｅｎＢａｎｋ；Ｘ０３０４６  Ｍ３０７８４、ｓｅｒＣ：ＧｅｎＢａｎｋ；Ｄ９０７２８）、それらの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリ又はブレビバクテリウム  フラバム等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により、これらの微生物のｓｅｒＢ遺伝子又はｓｅｒＣ遺伝子を取得することが可能である。このようなプライマーとして、配列表配列番号１５〜１８に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【００２１】
ｓｅｒＢ遺伝子又はｓｅｒＣ遺伝子を、エシェリヒア  コリ及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組み換えＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア  コリ細胞に導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア  コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自律複製可能なものが好ましく、例えば  ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０等が挙げられる。
ｓｅｒＢ遺伝子及びｓｅｒＣ遺伝子を、それぞれ別個のベクターに搭載してコリネ型細菌に導入する場合は、異なるマーカー遺伝子を有する２つのベクターを用いることが好ましい。
【００２２】
組み換えＤＮＡの調製はトランスポゾン（ＷＯ０２／０２６２７国際公開パンフレット、ＷＯ９３／１８１５１国際公開パンフレット、欧州特許公開０４４５３８５号、特開平６−４６８６７号、Ｖｅｒｔｅｓ，  Ａ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １１，  ７３９−７４６  （１９９４）、Ｂｏｎａｍｙ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １４，  ５７１−５８１  （１９９４）、Ｖｅｒｔｅｓ，  Ａ．  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２４５，  ３９７−４０５  （１９９４）、Ｊａｇａｒ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １２６，  １−６  （１９９５）、特開平７−１０７９７６号、特開平７−３２７６８０号等）やファージベクター、染色体組み換え（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｐｒｅｓｓ（１９７２）；Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２，１１９６（１９８５））等を利用することによっても行うことができる。
【００２３】
また、これらのベクターにコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断片を挿入すると、エシェリヒア  コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。なお、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の寄託番号をかっこ内に示した。
【００２４】
ｐＨＣ４        エシェリヒア  コリＡＪ１２６１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５３２）
ｐＡＪ６５５    エシェリヒア  コリＡＪ１１８８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６）
コリネバクテリウム  グルタミカムＳＲ８２０１（ＡＴＣＣ３９１３５）
ｐＡＪ１８４４  エシェリヒア  コリＡＪ１１８８３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３７）
コリネバクテリウム  グルタミカムＳＲ８２０２（ＡＴＣＣ３９１３６）
ｐＡＪ６１１    エシェリヒア  コリＡＪ１１８８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３８）
ｐＡＪ３１４８  コリネバクテリウム  グルタミカムＳＲ８２０３（ＡＴＣＣ３９１３７）
ｐＡＪ４４０    バチルス  ズブチリスＡＪ１１９０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４０）
【００２５】
これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００２６】
エシェリヒア  コリにプラスミドを導入して形質転換するには  Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６８，３２６，  １９７９）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．，Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等により行うことができる。
【００２７】
コリネ型細菌にプラスミドを導入して形質転換するには、電気パルス法（杉本ら、特開平２−２０７７９１号  公報）によって行うことができる。
【００２８】
上記ＤＮＡを導入するコリネ型細菌の例としては、例えば次のような野生株が挙げられる。
コリネバクテリウム  アセトアシドフィルム    ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム  アセトグルタミカム      ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム  カルナエ                ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム  グルタミカム            ＡＴＣＣ１３０３２
（ブレビバクテリウム  ディバリカタム）      ＡＴＣＣ１４０２０
（ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム）ＡＴＣＣ１３８６９
（コリネバクテリウム  リリウム）            ＡＴＣＣ１５９９０
（ブレビバクテリウム  フラバム）            ＡＴＣＣ１４０６７
コリネバクテリウム  メラセコーラ            ＡＴＣＣ１７９６５
ブレビバクテリウム  サッカロリティクム      ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム  インマリオフィルム      ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム  ロゼウム                ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム  チオゲニタリス          ＡＴＣＣ１９２４０
ミクロバクテリウム  アンモニアフィラム      ＡＴＣＣ１５３５４
コリネバクテリウム  サーモアミノゲネス      ＡＪ１２３４０
（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９）
【００２９】
ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の増幅は、ｓｅｒＢ遺伝子又はｓｅｒＣ遺伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上にｓｅｒＢ遺伝子又はｓｅｒＣ遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、ｓｅｒＢ遺伝子又はｓｅｒＢ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のｓｅｒＢ遺伝子又はｓｅｒＣ遺伝子のコピー数が上昇する結果、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性が増幅される。
【００３０】
ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、ｓｅｒＢ遺伝子又はｓｅｒＣ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、ｓｅｒＢ遺伝子又はｓｅｒＣ遺伝子の発現が強化されることによってホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性が増幅される。
【００３１】
本発明のコリネ型細菌の好ましい態様は、Ｌ−セリン生産能を有し、かつ、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性が増強されたコリネ型細菌において、さらにＬ−セリンによるフィードバック阻害が解除されたＤ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（以下、「３−ＰＧＤＨ」ともいう）をコードする遺伝子が導入された菌株である。
【００３２】
３−ＰＧＤＨは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を補酵素として、３−ホスホグリセレートが３−ホスホヒドロキシピルビン酸に酸化される反応を触媒する。
【００３３】
野生型のコリネ型細菌由来の３−ＰＧＤＨはＬ−セリンによるフィードバック阻害を受け、１０ｍＭのＬ−セリン存在下ではその活性がほぼ完全に阻害される。Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除された３−ＰＧＤＨとは、１０ｍＭのＬ−セリン存在下でもＬ−セリン非存在下における活性の２０％以上、好ましくは４０％以上、さらに好ましくは９０％以上の活性を有する３−ＰＧＤＨをいう。後述の実施例に示されるブレビバクテリウム  フラバムＡＪ１３３２７由来の３−ＰＧＤＨは８０ｍＭのＬ−セリン存在下で活性をほぼ１００％維持しており、最も好ましい３−ＰＧＤＨの一つである。
Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除された３−ＰＧＤＨをコードする遺伝子は、Ｌ−セリンアナログに耐性なコリネ型細菌、例えば後述の実施例で得られたブレビバクテリウム  フラバムのアザセリン耐性株ＡＪ１３３２７の染色体ＤＮＡから調製することができる。
【００３４】
野生型のコリネ型細菌由来の３−ＰＧＤＨ（以下、これをコードするＤＮＡを「野生型ｓｅｒＡ」ともいう）は配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列を有する。Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除された３−ＰＧＤＨ（以下、これをコードするＤＮＡを「変異型ｓｅｒＡ」ともいう）として具体的には、配列表配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、または同配列に１または複数のアミノ酸置換、付加または欠失が生じたアミノ酸配列を有するＤ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列の３２５番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したことを特徴とするＤ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼが挙げられる。同他のアミノ酸残基として最も好ましいものはリジン残基である。
【００３５】
コリネ型細菌からｓｅｒＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離するには、例えば、斎藤、三浦の方法（Ｈ．Ｓａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｋ．Ｍｉｕｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，  ７２，６１９，（１９６３））等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；  Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ  ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ５，１８５（１９８９）参照）により、ｓｅｒＡ遺伝子を増幅することによって行うことができる。例えば、配列表配列番号１１のＯＲＦ（１７２〜１７０５）を含むＤＮＡ断片を増幅できるよう、配列表の１番目の塩基からＡＴＧ直前の塩基の範囲から任意に２０〜３０塩基を選択してプライマーの一つとする。また、終始コドン直下流の塩基から配列表の最後の塩基に至る範囲から任意に２０〜３０塩基を選択してプライマーのもう一つとする。
【００３６】
上記のようにして３−ＰＧＤＨ野生株からｓｅｒＡを単離すれば野生型ｓｅｒＡが得られ、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除された３−ＰＧＤＨを保持する変異株（３−ＰＧＤＨ変異株）からｓｅｒＡを単離すれば変異型ｓｅｒＡが得られる。具体的には、野生型ｓｅｒＡは配列表の配列番号１１に記載される配列を有し、変異型ｓｅｒＡは配列番号１３に記載される配列を有する。
変異型ｓｅｒＡをコリネ型細菌に導入するには、前記ｓｅｒＢ又はｓｅｒＣの導入と同様にして、変異型ｓｅｒＡを含む組み換えベクターでコリネ型細菌を形質転換すればよい。変異型ｓｅｒＡは、多コピーで導入することが好ましい。変異型ｓｅｒＡとｓｅｒＢ又はｓｅｒＣは、単一のベクターにそれぞれ搭載してもよいし、別個の２種類又は３種類のベクターにそれぞれ搭載してもよい。
【００３７】
本発明の菌株を用いてＬ−セリンを生産するには次のような方法が用いられる。使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が使用される。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、さらには酢酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類、グリセリン等も使用される。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、ペプトン等のペプチド類等が使用される。無機イオンとしてはリン酸イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン等が適宜添加される。また本発明の微生物にアミノ酸等の要求性物質がある場合には、その要求物質を添加しなければならない。
【００３８】
微生物の培養は通常ｐＨ５〜８、温度２５〜４０℃の範囲で好気的条件下で行われる。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。
【００３９】
発酵液からＬ−セリンを採取するには、例えば菌体を分離除去し、イオン交換樹脂処理あるいは濃縮冷却晶析法、膜分離法、その他公知の方法を組み合わせることにより行われる。不純物を除くためには常法の活性炭吸着法及び再結晶法を用いて精製してもよい。
【００４０】
【実施例】
【００４１】
（実施例１）Ｌ−セリン生産菌ブレビバクテリウム  フラバムＡＪ１３３２４およびＡＪ１３３２７の構築
ブレビバクテリウム  フラバムＡＪ１３３２４およびＡＪ１３３２７は野生型株ブレビバクテリウム  フラバム  ＡＴＣＣ  １４０６７から得られたＬ−セリンの分解能が欠失したブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３７７から構築された。
【００４２】
変異株を得るためには、ブイヨン培地（魚肉エキス１ｇ、ポリペプトン１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、食塩０．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．０に調整した培地）で一昼夜増殖させた菌体を、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し（１ｍｌ当たり１０9−１０10個の菌体を含む）、これに２００μｇ／ｍｌ濃度となるようにＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を加えて３０℃で３０分間保持した。このようにしてＮＧ処理した菌体を同緩衝液で十分洗浄した。
【００４３】
ＮＧ処理した菌体からＬ−セリン分解能のない菌株を選択するためには、洗浄したブレビバクテリウム  フラバム  ＡＴＣＣ  １４０６７のＮＧ菌体をブイヨン寒天培地に塗布し、３０℃、２４時間培養してコロニーを形成させた。次にブイヨン寒天培地のコロニーを原版にして、最少培地と選択用最少培地にレプリカを行い、最少培地で生育し選択用最少培地で生育しない菌株を探した。最少培地は純水１Ｌ当たりグルコース２０ｇ、硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．４ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸マンガン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００μｇ、寒天２．０ｇを含有する培地で、選択用最少培地は、純粋１Ｌ当たり硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．４ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸マンガン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００μｇ、Ｌ−セリン０．５ｇ、寒天２．０ｇを含有する培地であった。このような方法で得られた変異株の中には、Ｌ−セリンの分解能がない菌株が多く見いだされ、その１株としてブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３７７を取得した。
【００４４】
ブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３７７を親株にして、ＮＧ処理した菌株からアザセリン耐性株を選択するため、洗浄したブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３７７のＮＧ処理菌体を選択用最少培地に接種した。選択用最少培地は純水１Ｌ当たりグルコース２０ｇ、硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．４ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸マンガン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００μｇ、アザセリン２５０ｍｇを含有する培地である。ＮＧ処理変異株を同培地上で３０℃で５〜１０日間培養した。このようにして得られた菌液をブイヨン寒天培地に塗布し、３０℃、２４時間培養しコロニーを形成させた。コロニーを形成する株の中からアザセリンに耐性な菌株を取得した。得られた変異株の中には、高収率で著量のＬ−セリンを蓄積する菌株が多く見いだされ、それらよりブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３２４およびＡＪ１３３２７の２株を取得した。本菌株らは０．２５ｇ／Ｌのアザセリン存在下で生育可能であることを確認した。
【００４５】
（実施例２）新規Ｌ−セリン生産菌ブレビバクテリウム  フラバムＡＪ１３３２５の構築
ブレビバクテリウム  フラバムＡＪ１３３２５は野生型株ブレビバクテリウム
フラバム  ＡＴＣＣ  １４０６７から得られたＬ−セリンの分解能が欠失したブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３７７から構築された。
【００４６】
ブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３７７を親株にして、ＮＧ処理した菌株からβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン耐性株を選択するため、洗浄したブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３７７のＮＧ処理菌体を選択用最少培地に接種した。選択用最少培地は純水１Ｌ当たりグルコース２０ｇ、硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．４ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸マンガン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００μｇ、β−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン２５０ｍｇを含有する培地である。ＮＧ処理変異株を同培地上で３０℃で５〜１０日間培養した。このようにして得られた菌液をブイヨン寒天培地に塗布し、３０℃、２４時間培養しコロニーを形成させた。コロニーを形成する株の中からβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性な菌株を取得した。得られた変異株の中には、高収率で著量のＬ−セリンを蓄積する菌株が多く見いだされ、その１株としてブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３２５を取得した。本菌株は０．２５ｇ／Ｌのβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン存在下で生育可能であることを確認した。
【００４７】
（実施例３）Ｌ−セリン生産菌ブレビバクテリウム  フラバムＡＪ１３３２４、ＡＪ１３３２５およびＡＪ１３３２７によるＬ−セリンの生産
ブレビバクテリウム  フラバムＡＪ１３３２４、ＡＪ１３３２５およびＡＪ１３３２７をブイヨン寒天培地で３０℃、２４時間培養し、次いで表１の組成の発酵培地２０ｍｌを含有する５００ｍｌ振とうフラスコに白金耳で接種した。対照として親株であるブレビバクテリウム  フラバム  ＡＴＣＣ１４０６７およびＡＪ１３３７７を同様に接種した。培地は水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整後１１５℃、１５分間オートクレーブ殺菌した。殺菌冷却後、１８０℃、３時間乾熱殺菌した炭酸カルシウム５ｇ／Ｌ添加した。
【００４８】
【表１】
0004066543.tif 000002
【００４９】
生産物であるＬ−セリンの測定は、高速液体クロマトグラフィー（日立Ｌ−８５００アミノ酸分析装置）によって行った。その結果、ブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３２４、ＡＪ１３３２５およびＡＪ１３３２７はＬ−セリンをそれぞれ１５．２ｇ／Ｌ、１４．３ｇ／Ｌ、１５．４ｇ／Ｌ  培地中に蓄積した。一方、対照として培養したブレビバクテリウム  フラバム  ＡＴＣＣ１４０６７およびＡＪ１３３７７のＬ−セリン蓄積量はそれぞれ０ｇ／Ｌ、５．０ｇ／Ｌであった。
【００５０】
ブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３２４の培養液は遠心分離後、定法によりカチオン交換樹脂による脱塩処理を行い、その後カチオン交換樹脂及びアニオン交換樹脂によるクロマト分離を用いて副生物を除き、晶析処理による精製を行い、９９％以上の純度のＬ−セリン結晶をブロスからの収率５５％で得た。
【００５１】
（実施例４）３−ＰＧＤＨ活性の測定
ブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３２４、ＡＪ１３３２５およびＡＪ１３３２７をブイヨン寒天培地で３０℃、２４時間培養し、次いで表２の組成の接種用培地５０ｍｌを含有する５００ｍｌ振とうフラスコの中に白金耳で接種した。対照として親株であるブレビバクテリウム  フラバム  ＡＴＣＣ１４０６７、ＡＪ１３３７７を同様に接種した。接種用培地は水酸化ナトリウムでｐＨ５．５に調整し、１１５℃、１５分間オートクレーブ殺菌した後使用した。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
各菌株を培養した培養液から菌体を回収した後、生理食塩水で２度洗浄し、２ｍＭのジチオスレイトールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー  ｐＨ７．０で懸濁した。氷冷後、超音波破砕機で菌体を破砕し、破砕液を超遠心分離機にかけた。超遠心は４５，０００ｒｐｍで１時間行い、粗酵素液を得た。
【００５４】
３−ＰＧＤＨの酵素活性測定はＳａｌａｃｈ  Ｈ．Ｊ．らの方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖ９，２１６−２２０，１９６６）に従った。
【００５５】
あらかじめ２５℃に暖めておいた０．０１５Ｍ  ＮＡＤ  ０．４ｍｌ、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ９  ＮａＯＨ）０．１２ｍｌ、０．０５Ｍ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ｐＨ６  ＫＯＨ）０．１ｍｌ、１Ｍ  Ｈｙｄｒａｄｉｎｅ（ｐＨ９Ａｃｅｔａｔｅ）０．５ｍｌ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９  ＨＣｌ）０．６ｍｌ、適当な濃度のＬ−セリン（０〜４０ｍＭ）を加え、水を加えて２．３ｍｌに調整し、その後粗酵素液を０．２ｍｌ加え、５分間保温し、０．１Ｍ  ３−ＰＧＡ（３−ホスホグリセリン酸二ナトリウム塩、ｐＨ７  ＮａＯＨ）を０．５ｍｌ加え、撹拌後３４０ｎｍの吸光度を３０秒間測定した。反応は２５℃で行った。
【００５６】
活性の測定には日立Ｕ−２０００Ａ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用した。
【００５７】
図１に測定結果を示す。野生株であるＡＴＣＣ１４０６７に比べＡＪ１３３７７はＬ−セリンに対する感受性が緩和されていた。ＡＪ１３３２４では更に感受性が緩和されており、ＡＪ１３３２５もほぼ同等であった。ＡＪ１３３２７では感受性が大幅に緩和され８０ｍＭのＬ−セリン存在下でも阻害は完全に解除されていた。
【００５８】
Ｌ−セリンによる３−ＰＧＤＨの阻害の解除についてはエシェリヒア  コリの例（トサ（Ｔｏｓａ）及びピッツア（Ｐｉｚｅｒ）、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０６：９７２〜９８２（１９７１）、又は特表平６−５１０９１１）があるが、これほど高濃度のＬ−セリンの存在下で阻害が完全解除されている例はない。
【００５９】
（実施例５）コリネ型細菌由来の野生型及び変異型ｓｅｒＡのクローニング
実施例４で示されたように、ＡＪ１３３２７ではＬ−セリンによるフィードバック阻害が完全に解除されていた。そこで、ＡＴＣＣ１４０６７由来の野生型、及びＡＪ１３３２７由来の変異型３−ＰＧＤＨをコードするｓｅｒＡ遺伝子をクローニングして、変異点を明らかにし、また３−ＰＧＤＨの増幅効果を確認することとした。
【００６０】
ブレビバクテリウム  フラバムの染色体よりＰＣＲ法を用いてｓｅｒＡを増幅するためには対応するプライマーを作製しなければならない。ブレビバクテリウムのｓｅｒＡ遺伝子のクローニング及び塩基配列については報告されていないため、コリネバクテリウム由来のｓｅｒＡの配列を利用することとした。コリネバクテリウム由来のｓｅｒＡ断片がクローニングされている菌株コリネバクテリウム  グルタミカム  Ｋ８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２４４４、特開平３−７５９１号公報参照）からＷｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用してプラスミド  ｐＤＴＳ９９０１を抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）製）でｓｅｒＡを含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。
【００６１】
遺伝子断片のクローン化用ベクターとしては、新規に構築したコリネ型細菌用クローニングベクターｐＶＫ７を用いた。ｐＶＫ７は、以下のようにして、エシェリヒア  コリ用ベクターであるｐＨＳＧ２９９（Ｋｍｒ；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ６１，  ６３−７４，  （１９８７）、特開平１０−２１５８８３号参照）にブレビバクテリウム  ラクトファーメンタムのクリプティックプラスミドであるｐＡＭ３３０を結合することによって構築した。ｐＨＳＧ２９９を一箇所切断酵素であるＡｖａＩＩ（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したのち、ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したｐＡＭ３３０と接続した。ｐＨＳＧ２９９に対するｐＡＭ３３０の挿入方向により、生成した２種類のプラスミドをｐＶＫ６、ｐＶＫ７と命名し、ｐＶＫ７を以下の実験に用いた。ｐＶＫ７は、エシェリヒア  コリ及びブレビバクテリウム  ラクトファーメンタムの細胞中で自律複製可能であり、かつ、ｐＨＳＧ２９９由来のマルチプルクローニングサイトとｌａｃＺ’を保持している。ｐＶＫ６及びｐＶＫ７の構築の過程を図２に示す。
【００６２】
構築したシャトルベクターｐＶＫ７にｓｅｒＡを含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を接続した。ｐＤＴＳ９９０１を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）製）にて切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩにて切断したｐＶＫ７と接続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行った。
【００６３】
シークエンス反応にはＰＣＲ  サーマルサイクラー  ＭＰ型（宝酒造（株）製）を用い、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を使用した。ＤＮＡプライマーとしてはＭ１３（−２１）、ＲＶプライマー（宝酒造（株）製）を使用した。得られた配列を配列表の配列番号１に示す。この配列によってコードされ得るアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００６４】
決定した塩基配列に基づいてプライマーを合成し、ブレビバクテリウム  フラバム変異株ＡＪ１３３２７の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりｓｅｒＡを増幅した。ここで遺伝子増幅に用いるために合成したＮ末側のＤＮＡプライマーの配列を配列表の配列番号３に、Ｃ末側を配列番号４に示す。
【００６５】
ブレビバクテリウム  フラバムの染色体ＤＮＡの調製にはＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．製）を使用し、調製方法は添付のプロトコールに従った。
【００６６】
ＰＣＲ反応にはＰＣＲ  サーマルサイクラー  ＭＰ型（宝酒造（株）製）を用い、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（宝酒造（株）製）を使用した。
【００６７】
ＰＣＲ産物はＯｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して直接プラスミドｐＣＲ２．１ベクターにライゲーションして、ＩＮＶαＦ’のＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌを用いて形質転換を行い、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌおよびカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーをつり上げ、単コロニー分離して、形質転換株を得た。
【００６８】
形質転換株からプラスミドを抽出し、ＰＣＲ法によりｓｅｒＡ断片の挿入が確認できたものについては制限酵素ＥｃｏＲＩ処理を行いシャトルベクター  ｐＶＫ７につなぎかえた。これの塩基配列を決定したところＣ末端側には完全長の配列が含まれていないと考えられた。得られた配列は配列表の配列番号１３の、５’側はさらに２７７塩基上流、３’側は１１３４番目の塩基までにあたる。
【００６９】
ｓｅｒＡ遺伝子全長を含む断片を取得するため、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を使用し、添付のプロトコールに従ってブレビバクテリウム  フラバムＡＪ１３３２７の染色体ＤＮＡから欠損部分のクローニングを行った。
【００７０】
まず、調製した染色体ＤＮＡを各種制限酵素で完全消化し、ライゲーション反応によりこれらにそれぞれ対応する制限酵素サイトを持つカセットを連結した。カセットプライマー（Ｃ１）（配列表配列番号５）と、ＤＮＡ上の既知領域に相補的なプライマー（Ｓ１）（配列表配列番号６）を用いて１回目のＰＣＲを行った。反応液の一部を用いて、内側のプライマーＣ２（配列表配列番号７）とＳ２（配列表配列番号８）で２回目のＰＣＲを行い、目的のＤＮＡのみを増幅させた。
【００７１】
制限酵素としてＥｃｏＲＩ（宝酒造（株）製）を使用した際に目的ＤＮＡの増幅が確認され、このＰＣＲ産物の塩基配列を直接決定した。得られた塩基配列に基づきＣ末側をコードするプライマーを作製し、野生型としてブレビバクテリウム  フラバム  ＡＴＣＣ１４０６７、変異型としてＡＪ１３３２７からｓｅｒＡ全長を含む断片の取得を行った。ここで使用したＮ末側のＤＮＡプライマーの配列を配列表の配列番号９に、作製したＣ末側のＤＮＡプライマーの配列を配列表の配列番号１０に示す。
【００７２】
得られた野生型ｓｅｒＡ及び変異型ｓｅｒＡ全長を含む遺伝子断片をＯｒｉｇｉｎａｌＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ＥｃｏＲＩ切断したシャトルベクターｐＶＫ７に接続した。各遺伝子断片を搭載したプラスミドを各々作製し、塩基配列の決定を行った。野生型の配列を配列表の配列番号１１に、変異型の配列を配列表の配列番号１３に示す。これらの配列によってコードされ得るアミノ酸配列を配列番号１２及び１４にそれぞれ示す。決定したこれらの塩基配列を比較したところ変異型ｓｅｒＡでは１０８７番目のＧがＡに変異しており、この結果アミノ酸配列では３２５番目のグルタミン酸がリジンに変化していることが確認された。
【００７３】
（実施例６）３−ＰＧＤＨ遺伝子を含むプラスミドのブレビバクテリウム  フラバムへの導入
野生型ｓｅｒＡ又は変異型ｓｅｒＡを搭載したプラスミドをブレビバクテリウム  フラバム  ＡＪ１３３７７にそれぞれ導入した。プラスミドの導入の方法は、電気パルス法（杉本ら、特開平２−２０７７９１号公報）によった。形質転換体の選択は２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む完全培地にて行った。
【００７４】
（実施例７）形質転換体によるＬ−セリンの生産
野生型ｓｅｒＡ又は変異型ｓｅｒＡ全長を含む遺伝子断片を搭載したプラスミドが導入された形質転換体をそれぞれ実施例３に従い５００ｍｌ振とうフラスコを用いて培養し、生産物であるＬ−セリンの測定を行った。対照として宿主であるＡＪ１３３７７株についても同様に培養を行った。
野生型ｓｅｒＡを導入した形質転換体ではＬ−セリン生産能に影響は認められなかったが、変異型ｓｅｒＡを導入した形質転換体ではＬ−セリン生産能の向上が確認された（表３）。
【００７５】
ブレビバクテリウム  フラバムＡＪ１３３７７は、平成９年１０月１５日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４７１が付与され、平成１０年１１月２０日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５７６が付与されている。
また、変異型ｓｅｒＡを含むプラスミドをブレビバクテリウム  フラバムＡＴＣＣ１４０６７に保持させた。同プラスミド保持株は、ブレビバクテリウム  フラバムＡＪ１３３７８と命名されて、平成９年１０月１５日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４７２が付与され、平成１０年１１月２０日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５７７が付与されている。
【００７６】
（実施例８）ブレビバクテリウム  フラバムＬ−セリン生産菌におけるｓｅｒＢ及び／又はｓｅｒＣの増幅
（１）ｓｅｒＢ又はｓｅｒＣを発現するプラスミドの構築
ｓｅｒＢを発現するプラスミドｐＳＢ及びｓｅｒＣを発現するプラスミドｐＳＣを、図３及び図４に示すようにして構築した。
【００７７】
ｓｅｒＢ遺伝子については、既知である塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ；Ｘ０３０４６，Ｍ３０７８４）を基にプライマーを作製（Ｎ末側配列表の配列番号１５、Ｃ末側を配列番号１６に示す）し、また、ｓｅｒＣ遺伝子の取得については、既知である塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ；Ｄ９０７２８）を基にプライマーを作製（Ｎ末側配列表の配列番号１７、Ｃ末側を配列番号１８に示す）して、エシェリヒア・コリＪＭ１０９の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ｓｅｒＢをコードするＯＲＦを含む遺伝子断片（１１９７ｂｐ）、及びｓｅｒＣをコードするＯＲＦを含む遺伝子断片（１３８０ｂｐ）を取得した。
配列番号１５及び１６に示す塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ；Ｘ０３０４６，Ｍ３０７８４の配列中の塩基番号１１９７〜１１７５、１〜２３にそれぞれ対応し、配列番号１７及び１８に示す塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ；Ｄ９０７２８の配列中の塩基番号１３２０５〜１３２２７、１４５８４〜１４５６２にそれぞれ対応する。
【００７８】
ｓｅｒＢ断片は平滑末端化した後、高コピー型ベクターであるｐＨＳＧ３９９のＳｍａＩ部位に挿入し、ｐ３９９Ｂを得た。このプラスミドをコリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能にするために、ｐＨＭ１５１９由来の複製開始起点を保持するｐＢＫ４から複製開始起点（以下、「Ｂｒｅｖ．−ｏｒｉ」と記す）を切り出し、ｐ３９９Ｂに挿入し、ｐＳＢを得た（図３）。ｐＢＫ４は、以下のようにして作製した。Ｂｒｅｖ．−ｏｒｉを含むプラスミドｐＨＣ４を、同プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＡＪ１２６１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５３２）より調製し、ＫｐｎＩ（宝酒造（株）製）及びＢａｍＨＩ（宝酒造（株）製）で切断し、Ｂｒｅｖ．−ｏｒｉ断片を抽出した後、末端を平滑化した。末端の平滑化は、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行った。その後、リン酸化済みＢａｍＨＩリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、ＢａｍＨＩにて再切断後に、同じくＢａｍＨＩにて切断したｐＨＳＧ２９８に接続し、ｐＢＫ４を得た。ｐＢＫ４は、ＢａｍＨＩによりＢｒｅｖ．−ｏｒｉ断片を切り出すことができる。
【００７９】
また、ｓｅｒＣ断片をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）のＳｒｆＩ部位に挿入し、ｐＳｃｒｉｐｔ−ｓｅｒＣを得た。得られたプラスミドのＳａｃＩ部位にＰｓｔＩリンカーを挿入した後、ｓｅｒＣ断片をＰｓｔＩで切り出し、ｐＨＳＧ３９９のＰｓｔＩ部位に挿入し、ｐ３９９Ｃを得た。ｐＨＭ１５１９由来の複製開始起点を保持するｐＢＫ４から複製開始起点を切り出し、ｐ３９９Ｃに挿入し、ｐＳＣを得た（図４）。
【００８０】
（２）ｓｅｒＢ及びｓｅｒＣを発現するプラスミドの構築
次に、ｓｅｒＢ及びｓｅｒＣを発現するプラスミドｐＢＣ８及びｐＢＣ１４を作製した（図５）。前記ｐＳｃｒｉｐｔ−ｓｅｒＣのｓｅｒＣ断片の外側に存在するＳａｃＩ部位にＰｓｔＩリンカーを挿入してＰｓｔＩ部位を導入した。このプラスミドをＰｓｔＩ処理してｓｅｒＣ断片を切り出し、ｓｅｒＢ搭載プラスミドｐＳＢのＰｓｔＩ部位に挿入した。塩基配列の確認を行い、ｓｅｒＣ断片がｌａｃＺに対して逆方向に挿入されたプラスミドをｐＢＣ８、順方向に挿入されたプラスミドをｐＢＣ１４とした。
【００８１】
（３）ｓｅｒＢ及びｓｅｒＣ増幅株によるＬ−セリンの生産
上記で作製したプラスミドｐＳＢ、ｐＳＣ及びｐＢＣ８を用いて、それぞれブレビバクテリウム  フラバムの野生株ＡＴＣＣ１４０６７を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドを抽出してＬ−セリン生産能を有するブレビバクテリウム  フラバムＡＪ１３３７７及びＡＪ１３３２７を形質転換した。また、ｐＢＣ８を保持するＡＪ１３３７７及びＡＪ１３３２７を、ブレビバクテリウム  フラバムＡＪ１３３７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４７２）が保持する変異型ｓｅｒＡを搭載したプラスミドで形質転換した。
【００８２】
上記の各形質転換株を１０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む寒天培地で培養し、形成したコロニーについて実施例３と同様に培養して、培地中に蓄積されたＬ−セリンの量を測定した。尚、変異型ｓｅｒＡを搭載したプラスミドを保持する形質転換株は、培地に２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加して培養した。結果を表３に示す。
【００８３】
【表３】
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【００８４】
上記のように、ｓｅｒＢまたはｓｅｒＣの増幅によって、Ｌ−セリン蓄積量が増加した。また、ｓｅｒＢ及びｓｅｒＣの両遺伝子を増幅することによって、Ｌ−セリン蓄積量はさらに増加した。さらに、変異型ｓｅｒＡ遺伝子を併せて増幅すると、一層Ｌ−セリン蓄積量が増加した。尚、ｐＢＣ８の代わりにｐＢＣ１４を用いても、同様の結果が得られた。
【００８５】
本実施例では、各遺伝子を増幅するＬ−セリン生産能を有するコリネ型細菌宿主として、ブレビバクテリウム  フラバムのＬ−セリン分解能欠失株（ＡＪ１３３７７）、またはＬ−セリン分解能を欠失したアザセリン耐性株（ＡＪ１３３２７）を用いたが、他のアザセリン耐性株（ＡＪ１３３２４）またはＬ−セリン分解能を欠失したβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン耐性株（ＡＪ１３３２５）を用いてもよい。
【００８６】
【発明の効果】
本発明により、糖からＬ−セリンを生成するコリネ型細菌が提供される。同コリネ型細菌は、工業的に有利なＬ−セリンの製造法に利用することができる。
【００８７】
【配列表】
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【００８８】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
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【００９９】
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【０１００】
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【０１０１】
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【０１０２】
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【０１０３】
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【０１０４】
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【０１０５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】各種株由来の３−ＰＧＤＨのＬ−セリンによるフィードバック阻害の様子を示す。横軸は、酵素液中に存在するＬ−セリンの濃度を示す。縦軸は、Ｌ−セリンが存在しない時の３−ＰＧＤＨ活性に対する、Ｌ−セリンが存在するときの３−ＰＧＤＨ活性を百分率で示す。◆はＡＴＣＣ１４０６７株由来の３−ＰＧＤＨがＬ−セリンによって受けるフィードバック阻害の様子を示す。■はＡＪ１３３７７株由来の３−ＰＧＤＨがＬ−セリンによって受けるフィードバック阻害の様子を示す。▲はＡＪ１３３２４株由来の３−ＰＧＤＨがＬ−セリンによって受けるフィードバック阻害の様子を示す。×はＡＪ１３３２５株由来の３−ＰＧＤＨがＬ−セリンによって受けるフィードバック阻害の様子を示す。＊はＡＪ１３３２７株由来の３−ＰＧＤＨのがＬ−セリンによって受けるフィードバック阻害の様子を示す。
【図２】プラスミドｐＶＫ７およびｐＶＫ６の構築図。
【図３】ｓｅｒＢが搭載されたプラスミドｐＳＢの構築図。
【図４】ｓｅｒＣが搭載されたプラスミドｐＳＣの構築図。
【図５】ｓｅｒＢ及びｓｅｒＣが搭載されたプラスミドｐＢＣ８及びｐＢＣ１４の構築図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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