(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）非定型株由来の天然のＨｉｎ４７タンパク質に対する類似体タンパク質であって、
（１）前記天然のＨｉｎ４７タンパク質は、各インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）非定型株中において、翻訳されたプレタンパク質よりシグナルペプチド部が除去された、分子量約４７ｋＤａの成熟型タンパク質であり、該分子量約４７ｋＤａの成熟型タンパク質のアミノ酸配列は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）非定型株ＳＢ３３由来の配列番号：２に記載される完全長のアミノ酸配列中、２７位〜４６３位の部分アミノ酸配列を含んでなり、
（２）該類似体タンパク質は、
（ａ）前記配列番号：２に記載される完全長のアミノ酸配列中の、２７位〜４６３位の部分アミノ酸配列のＮ末の２７位に相当するアミノ酸を１位とする番号付けにおいて、
前記天然のＨｉｎ４７タンパク質が保持しているセリンプロテアーゼ型のプロテアーゼ活性に関与する三つのアミノ酸；Ｓｅｒ−１９７、Ｈｉｓ−９１またはＡｓｐ−１２１の部位において、
Ｓｅｒ−１９７を、Ａｌａ、Ｃｙｓ、またはＴｈｒで置換する；
Ｈｉｓ−９１を、ＡｌａまたはＡｒｇで置換する；
Ａｓｐ−１２１を、Ａｌａで置換する；
からなるアミノ酸置換の群から選択される、１つ以上のアミノ酸の置換による変異を有している；
あるいは、
（ｂ）前記Ｓｅｒ−１９７、Ｈｉｓ−９１またはＡｓｐ−１２１の部位における変異に加えて、更に、
前記配列番号：２に記載される完全長のアミノ酸配列中の、２７位〜４６３位の部分アミノ酸配列のＮ末の２７位に相当するアミノ酸を１位とする番号付けにおいて、
下記の９５位のＧｌｕ、１１９位のＬｅｕ、２４５位のＧｌｙ、２９９位のＡｌａ、３４６位のＳｅｒ、４１５位のＧｌｕ、または４２９位のＡｓｐの７つの部位において、
９５位のＧｌｕを、Ｇｌｙで置換する；
１１９位のＬｅｕを、Ｇｌｎで置換する；
２４５位のＧｌｙを、Ｃｙｓで置換する；
２９９位のＡｌａを、Ｇｌｙで置換する；
３４６位のＳｅｒを、Ｇｌｙで置換する；
４１５位のＧｌｕを、Ｌｙｓで置換する；
４２９位のＡｓｐを、Ａｓｎで置換する；
からなるアミノ酸置換の群から選択される、７つ以下のアミノ酸の置換による変異を有しており；
かつ、
該類似体タンパク質のプロテアーゼ活性は、少なくとも、前記配列番号：２に記載される完全長のアミノ酸配列中、２７位〜４６３位の部分アミノ酸配列を有する天然のＨｉｎ４７タンパク質のプロテアーゼ活性に対して、約１０％まで低下されており、また、
該類似体タンパク質は、もとの天然のＨｉｎ４７タンパク質が保持する免疫原性を有している
ことを特徴とするＨｉｎ４７タンパク質類似体。
【請求項２】
前記配列番号：２に記載される完全長のアミノ酸配列中、２７位〜４６３位の部分アミノ酸配列に相当する、成熟型の前記天然Ｈｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列を、該Ｎ末の２７位を１位とする番号付けにおいて、
前記置換される少なくとも１個のアミノ酸は、前記天然Ｈｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列中の、Ｓｅｒ−１９７、Ｈｉｓ−９１またはＡｓｐ−１２１から選択される請求項１に記載の類似体。
【請求項３】
前記置換される少なくとも１個のアミノ酸は、Ｓｅｒ−１９７であり、該Ｓｅｒ−１９７は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、またはＴｈｒで置換される請求項２に記載の類似体。
【請求項４】
該Ｓｅｒ−１９７が、Ａｌａで置換される請求項３に記載の類似体。
【請求項５】
上記置換される少なくとも１個のアミノ酸は、Ｈｉｓ−９１であり、該Ｈｉｓ−９１が、ＡｌａまたはＡｒｇで置換される請求項２に記載の類似体。
【請求項６】
上記置換される少なくとも１個のアミノ酸は、Ａｓｐ−１２１であり、該Ａｓｐ−１２１がＡｌａで置換される請求項２に記載の類似体。
【請求項７】
上記のプロテアーゼ活性に関与する三つのアミノ酸；Ｓｅｒ−１９７、Ｈｉｓ−９１またはＡｓｐ−１２１において、複数のアミノ酸が置換される請求項１〜６のいずれか１項に記載の類似体。
【請求項８】
置換される前記複数のアミノ酸は、Ｈｉｓ−９１およびＳｅｒ−１９７、またはＨｉｓ−９１、Ａｓｐ−１２１およびＳｅｒ−１９７であり、
個々にＡｌａにより置換されている請求項７に記載の類似体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の類似体がポリペプチド、タンパク質またはポリサッカリドと連結されているキメラ分子。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨｉｎ４７タンパク質類似体をコードする塩基配列を含んでなる、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）非定型株由来の野生型ｈｉｎ４７遺伝子に対する変異体からなる分離・精製された核酸分子。
【請求項１１】
前記野生型ｈｉｎ４７遺伝子中、プロテアーゼ活性に関与するアミノ酸をコードする、少なくとも１個のコドンを置換する、部位特異的変異誘発を行うことで、前記変異体ｈｉｎ４７遺伝子とされている請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記変異体ｈｉｎ４７遺伝子は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）非定型株由来の前記野生型ｈｉｎ４７遺伝子の部位特異的変異誘発により作製されている請求項１０または１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
上記請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の核酸分子が挿入されるプラスミド・ベクターからなる、宿主の形質転換に使用される組み換えプラスミド。
【請求項１４】
配列番号：２に記載される完全長のアミノ酸配列中の、２７位〜４６３位の部分アミノ酸配列のＮ末の２７位に相当するアミノ酸を１位とする番号付けにおいて、
該部分アミノ酸配列中、Ｓｅｒ−１９７がＡｌａへと置換されてなる変異アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸分子が挿入されるプラスミド・ベクターであり、
該組み換えプラスミド・ベクターは、米国微生物寄託機関（ＡＴＣＣ）に承認番号７５８４５として、ブタペスト条約による寄託がなされているプラスミドＤＳ−１０１１−１−１（ｐＴ７／Ｈｉｎ４７＊）である、組み換えプラスミド。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の組み換えプラスミドを含む形質転換細胞。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載される分離・精製したＨｉｎ４７タンパク質類似体の作製方法であり、該Ｈｉｎ４７タンパク質類似体のプロテアーゼ活性は、少なくとも、前記配列番号：２に記載される完全長のアミノ酸配列中、２７位〜４６３位の部分アミノ酸配列を有する天然Ｈｉｎ４７タンパク質のプロテアーゼ活性の約１０％まで低下させられており、下記の工程からなる方法：
該天然Ｈｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列中より、そのプロテアーゼ活性に関与する少なくとも１個のアミノ酸残基を特定すること、
特定された前記の少なくとも１個のアミノ酸をコードするコドンを置換してなる変異体ｈｉｎ４７遺伝子を作製するため、該天然Ｈｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列をコードするｈｉｎ４７遺伝子に、前記コドンの置換を起こす部位特異的変異誘発を行うこと、
形質転換細胞を作製するため、細胞中に該変異体ｈｉｎ４７遺伝子を導入すること、および
該Ｈｉｎ４７タンパク質類似体を生産するため、前記形質転換細胞を培養すること。
【請求項１７】
前記変異体ｈｉｎ４７遺伝子の導入により、該変異体ｈｉｎ４７遺伝子がＴ７プロモータの制御を受けている形質転換細胞を作製し、前記形質転換細胞の増殖ならびに前記Ｔ７プロモータによる該Ｈｉｎ４７タンパク質類似体の発現は、誘発濃度のラクトース中にて培養させることで行われる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記変異体ｈｉｎ４７遺伝子の導入が、請求項１４に記載される米国微生物寄託機関（ＡＴＣＣ）に承認番号７５８４５として、ブタペスト条約による寄託がなされているプラスミドＤＳ−１０１１−１−１（ｐＴ７／Ｈｉｎ４７＊）による細胞の形質転換により行われる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｈｉｎ４７タンパク質類似体を含む顆粒画分を保持する生育した形質転換細胞を調製する培養工程に加え、
前記顆粒画分と上清を作製するため、前記培養した形質転換細胞を破砕すること、
該Ｈｉｎ４７タンパク質類似体を含む溶液を得るため、前記顆粒画分を可溶化すること、
細胞残破片を除き、前記溶液から該Ｈｉｎ４７タンパク質類似体をクロマトグラフィーを用いて精製すること、および
精製された該Ｈｉｎ４７タンパク質類似体を分離することからなる請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
免疫効果を有する量の請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨｉｎ４７タンパク質類似体、または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の核酸分子を含む免疫原組成物。
【請求項２１】
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）非定型株由来の天然のＨｉｎ４７タンパク質または宿主内で該天然のＨｉｎ４７タンパク質と特異的に反応する抗体の産生を誘起するタンパク質を産生する細菌病原体が引き起こす病気を防御するため、宿主へのインビボ投与用のワクチンとして調製され、
Ｈｉｓ−９１またはＳｅｒ−１９７を、Ａｌａで置換する改変がなされているＨｉｎ４７タンパク質類似体を、免疫原として含んでなる請求項２０に記載の免疫原組成物。
【請求項２２】
前記細菌病原体は、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌種である請求項２１に記載の免疫原組成物。
【請求項２３】
該ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌種は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）である請求項２２に記載の免疫原組成物。
【請求項２４】
少なくとも１個の他の免疫原性または免疫刺激物質を更に含む請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項２５】
（ａ）該Ｈｉｎ４７タンパク質類似体と、それと特異的に反応する検体中に存在するいずれかの抗体とからなる複合体を形成させるため、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨｉｎ４７タンパク質類似体と検体を接触させること、および
（ｂ）該複合体の形成を同定すること、
上記の手順を含む、検体中のＨｉｎ４７タンパク質と特異的に反応する抗体の存在を検定する方法。
【請求項２６】
（ａ）Ｈｉｎ４７タンパク質と特異的に反応する抗体を産生するため、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の免疫原組成物を用いて、非ヒト対象を免疫すること、
（ｂ）前記Ｈｉｎ４７タンパク質に特異的な抗体と、検体中に存在するいずれかのＨｉｎ４７タンパク質とからなる複合体を形成させるため、該抗体と検体を接触させること、および
（ｃ）該複合体の形成を同定すること、
上記の手順を含む、検体中のＨｉｎ４７タンパク質の存在を検定する方法。
【請求項２７】
（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨｉｎ４７タンパク質類似体、
（ｂ）検体中に存在する抗体と、前記類似体とからなる複合体を形成させるため、検体に該類似体を接触させるための手段、および
（ｃ）該複合体の形成を同定するための手段、
上記の手段を含む、Ｈｉｎ４７タンパク質と特異的に反応する、検体中の抗体の存在を検定するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は免疫学の分野の、特に、Haemophilus属の菌種から生産される免疫原および抗原に関する。
関連出願のリファレンス
本出願は１９９４年８月２６日申請の米国特許出願番号０８／２９６、１４９の一部継続出願であり、これ自体は１９９４年７月２１日申請の米国特許出願番号０８／２７８、０９１の一部継続出願である。
発明の背景
Haemophilus influenzae（ヘモフィルス属インフルエンザ菌）は、ヒトに、髄膜炎、喉頭蓋炎、肺炎、中耳炎などの種々の病気を発症させる微生物である。H.influenzae菌のｂ型（Ｈｉｂ）は、５才以下の小児における細菌性髄膜炎の主な原因菌である。この病気の防御抗体は微生物の夾膜多糖から誘導して生産するが、その場合、精製した燐酸ポリリボシル・リボトール（ＰＲＰ）を抗原に使って製造したワクチンが開発されている。このワクチンの免疫効果は成人では９０％であり、生後２４カ月の小児では２４％以上であるが、生後２４カ月以下の小児には免疫効果はない（Zangwill et al,1994）。（リファレンスは本申請の最後に示した参考文献リストに示してあり、そのリストの中の各参考文献はそれ自体で完結された形になっており内容が分かるので、それ以上の別の文献を必要としないようになっている。）他の多糖タンパク由来の抗原と同様に、このＰＲＰではＴ−ヘルパ細胞の増殖はなく、再免疫が二次免疫応答や記憶細胞の増加を誘発するようなことはない。ＰＲＰ多糖と蛋白質キャリアーが接合されることで、ワクチンにＴー細胞からの独立特性が付与され、実質的に、ＰＲＰ抗原に対する免疫応答力が強化されることになる。最近では、４種類のＰＲＰーキャリア・接合ワクチンが入手可能である。これらのワクチンはいずれも、Haemophilus influenzae菌のｂ型・夾膜多糖がジフテリア類毒素、破傷風類毒素、または、Neisseria meningtidis（髄膜炎菌）外層膜タンパク質と接合したものをベースにしている。これらのHaemophilus influenzae菌ｂ型接合ワクチンは細菌性髄膜炎の発症を劇的に減少させることに成功している（Schoendorf et al, 1994）。
Haemophilus influenzae菌の血清型はａからｆまでの６種類があり、その夾膜多糖の種類により識別する。最近のHaemophilus菌由来接合型ワクチンは、他の侵襲型のタイプ分けが可能な菌株（ａおよびｃ型）に対し防御力がない。もっと重要なことは、これらのワクチンが、産後の敗血症、新生児の敗血症、肺炎、中耳炎の通常の原因菌であるタイプ分けが不可能な菌株（ＮＴＨｉ）に対しての防御力がないことである。中耳炎は低年齢の小児がかかる最もありふれた病気であり、すべての小児の約７０％が７才までに少なくとも一回はこの病気を経験する。この中耳炎が慢性化すると小児の聴覚障害、言語障害、知覚障害の原因となる。この中耳炎の原因の約５０％はStreptococcus pneumoniae（肺炎連鎖球菌）による感染、約３０％がHaemophilus influenzae（ヘモフィルス属インフルエンザ菌）のタイプ分けが不可能な菌株が原因であり、残り約２０％はMoraxella（Branhamella）catarrhalis菌による感染が原因である。米国だけでも、中耳炎の治療費は年間１０億から２０億ドルに上り、抗生物質、扁桃摘出やアデノイド切除、鼓膜切開手術の費用に使われているのである。H.influenzae菌が関係する病気に対する普遍的な防御法として、特に、２才から６才までの小児、その他のハイリスク群を守る方法として、保存的で、非対応、非夾膜型のH.influenzae菌由来の免疫原の供給が待たれていたところである。H.influenzaeのタイプ分けが不可能な菌株は高齢者や、特に、呼吸器系の感染を受け易いヒトにおける肺炎の重要な病原菌でもある。このように、H.influenzae菌由来の抗原に対する需要があり、それが供給されれば、H.influenzae菌の多くの血清型に対しての防御能のある免疫薬剤の成分として利用できることになるのである。１９９２年７月９日公開のＰＴＣ出願ＷＯ・９２／１０９３６（レファレンスとして当該申請書にも掲載）には、このH.influenzae菌から得られた分子量４７、０００の外層膜タンパク質について触れており、アドヘシンであるとして報告されており、Ｈｉｎ４７と命名され、H.influenzae菌からの単離体で、免疫学的には、このH.influenzaeはタイプ分け不可能な菌とｂ型との中間に位置するとしている。遺伝子コーディングされたＨｉｎ４７におけるアミノ酸の配列とヌクレオチドの塩基配列は、１９９２年５月２６日から３０日まで米国ニューオリンズで開催された全米微生物学会で発表されている。これらの配列については、１９９４年１月６日に公開されたＰＣＴ申請ＷＯ・９４／００１４９にも発表されており、本申請書でもレファレンスとして掲載している。
このＨｉｎ４７タンパク質はHaemophilus influenzae菌株由来のタンパク質のひとつとして分類され、アドヘシンであると報告されているので、Haemophilus influenzae菌が原因で発症した病気やＨｉｎ４７を産生するようなその他の細菌性病原体が原因となっている病気の診断やワクチンとして利用できるし、さらに、Ｈｉｎ４７に特異的に反応する抗体の産生を誘起できるタンパク質として利用できるのである。
このＨｉｎ４７タンパク質を抗原として、抗ーＨｉｎ４７抗体を産生を誘起させるタンパク質として診断で使用する場合には、デメリットもある。つまり、これは、本申請者が予期せずして偶然に発見したことであるが、このＨｉｎ４７にはプロテアーゼ活性があり、そのために、Ｈｉｎ４７内で自己消化が起こり、その中に混入している他の抗原のタンパク質分解を起こすことである。そこで、抗原として使用できるようにするために、あるいは、ワクチンのような免疫剤や他の免疫原のキャリアーとして、あるいは、診断薬の生産用として使用できるようにするためには、このタンパク質分解活性を減少させたＨｉｎ４７タンパク質類似体を合成し供給することが望まれる（ここでは、このＨｉｎ４７タンパク質類似体を突然変異体または誘導体と呼ぶ場合もある）。
発明の要約
本発明の目的は、プロテアーゼ活性を低下させたHaemophilus菌由来のＨｉｎ４７タンパク質類似体を供給することである。
本発明の態様の一つは、分離・精製したHaemophilus菌由来のＨｉｎ４７タンパク質類似体を供給することであり、その類似体のプロテアーゼの活性を自然界に存在する天然のＨｉｎ４７の活性の約１０％にまで低下させたものである。このＨｉｎ４７類似体は、本質的に、天然のＨｉｎ４７タンパク質と同じ免疫原性を持っていることが望ましい。本発明で供給する類似体は、天然のＨｉｎ４７を化学的、生化学的方法または遺伝子修飾を加えることで合成・生産する。
本発明の実施例では、遺伝子修飾により合成させる場合に、そのプロテアーゼ活性を低下させるために、プロテアーゼ活性を起こさせている天然Ｈｉｎ４７の中の少なくとも一個のアミノ酸を除去するか、または、別のアミノ酸で置換する。さらに、このプロテアーゼ活性を低下させるための別の方法として、少なくとも１個のアミノ酸を天然のＨｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列に挿入する。除去されるか、または、置換される少なくとも一個のアミノ酸は、天然Ｈｉｎ４７の中にあるアミノ酸１９５から２０１までの中の一つが選択されるが、特に、セリンー１９７が除去されるか、別のアミノ酸であるアラニン、システイン、トレオニンで置換される。さらに、除去されるか、または、置換される少なくとも一個のアミノ酸として、Ｈｉｓー９１があり、これは除去するか、アラニン、シンン、アルギニンで置換する。除去されるか、または、置換される少なくとも一個のアミノ酸として、Ａｓｐー１２１があり、これは除去するか、アラニンで置換する。さらに、別の方法として、天然Ｈｉｎ４７分子の中の複数のアミノ酸を除去または置換させることでも生産できる。複数のアミノ酸として、Ｈｉｓー９１およびセリンー１９７があり、これらを除去するか、Ａｌａー９１およびＡｌａー１９７で置換することによって、Ｈｉｎ４７類似体タンパク質であるＨ９１Ａ／Ｓ１９７Ａを合成・生産できる。さらに、複数のアミノ酸として、Ｈｉｓー９１、Ａｓｐー１２１、Ｓｅｒー１９７があり、これらも除去するか、Ａｌａー１２１およびＡｌａー１９７で置換することによって、Ｈｉｎ４７類似体タンパク質であるＨ９１Ａ／Ｄ１２１Ａ／Ｓ１９７Ａを合成・生産できる。この発明で供給されるＨｉｎ４７類似体のうちのいくつかについて、その特性要約を表３に示した。Ｈｉｎ４７の突然変異体であるＤ１２１Ｅだけには、実質的なプロテアーゼ活性が残っていることを示している。
本発明の別の態様として、分離精製した核酸分子を供給する。この核酸分子は、Haemophilus influenza Hin 47タンパク質をコーディングするHaemophilus influenza hin 47の突然変異遺伝子から成っており、そのプロテアーゼ活性は天然Ｈｉｎ４７タンパク質の１０％以下に低下したものになっている。この突然変異hin47遺伝子は上記のＨｉｎ４７類似体のいずれの型のタンパク質もコードする。この突然変異遺伝子は野生型hin47遺伝子の部位特異的突然変異誘発により産生されることが望ましい。この核酸分子は、宿主の形質転換に使用される組み換えプラスミドに挿入される。ここで使用されるプラスミドはＤＳー１０１１ー１ー１であり、これは１９９４年７月２７日付けでメリーランドのロックビルにある米国微生物寄託機関に承認番号７５８４５として寄託されている。本発明は、そのような形質転換細胞に組み込まれる組み換えプラスミドも供給するものである。
本発明の別の態様として、プロテアーゼ活性が天然Ｈｉｎ４７タンパク質の１０％まで低下した活性低下型のHaemophilus influenzae菌由来Ｈｉｎ４７タンパク質類似体の生産方法を提供する。その方法には、プロテアーゼ活性を起こさせている天然Ｈｉｎ４７タンパク質中の少なくとも一個のアミノ酸残基を同定すること、少なくとも一個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を除去または置換させ、さらに、突然変異体のhin47遺伝子を産生させるために、突然変異遺伝子hin47の部位特異的突然変異誘発を起こさせること、その突然変異遺伝子hin47を細胞に取り込み、細胞に形質転換をおこさせ、それを増殖させることで、目的とするＨｉｎ類似体タンパク質を産生させる方法を含む。ここで選択される少なくとも一個のアミノ酸は、Ｈｉｎ４７類似体に関して上記で同定されたアミノ酸のうちのいずれかである。
突然変異遺伝子hin47の細胞への取り込みにより細胞の形質転換が起こさせることが望ましい。形質転換細胞の中では突然変異遺伝子hin47は、Ｔ７プロモータの制御を受けるが、その形質転換細胞の増殖と、Ｔ７プロモーターによるＨｉｎ４７類似体の発現誘発は、誘発濃度に調製したラクトース培地での培養によることが望ましい。さらに、細胞の形質転換のための突然変異遺伝子hin47の細胞への取り込みは、組み換えプラスミドＤＳー１０１１ー１ー１（ここでは、これをプラスミドpT7／hin47と呼ぶ。）を使用することが望ましい。
さらに、発明の態様として、本発明は分離・精製したＨｉｎ４７類似体を供給する方法を提供する。その方法にはＨｉｎ４７類似体を合成させるための上記の各手順を実施することを含む。その手順として、Ｈｉｎ４７類似体を含む顆粒画分から成る増殖させた形質転換細胞を、その上澄み液とその顆粒画分とを分離するためにその細胞を破壊すること、さらに、Ｈｉｎ４７類似体を含むる顆粒画分を溶解させ、その溶液をクロマトグラフィーを使って溶液部分を細胞砕片部分から分離して、Ｈｉｎ４７を精製すること、さらに精製したそのＨｉｎ４７類似体を分離することが含まれる。
この発明で供給されるタンパク質活性低下型のＨｉｎ４７の類似体は、免疫原性組成における抗原として、別の免疫原のキャリアーとして、あるいは、診断薬の原料として有用である。同様に本発明で供給される核酸分子も、診断用プローブとして、あるいは、広く免疫分野の診断道具として有用である。
発明のさらに別の態様として、本発明は、免疫効果を発揮できるだけの量のＨｉｎ４７類似体、または、Ｈｉｎ４７類似体をコードする遺伝子を含む核酸分子から成る免疫原性組成物質を供給する。この免疫原性組成物質は、ヒトを含む宿主に対するインビボ投与用のワクチンとして調製できる。このワクチンは、Ｈｉｎ４７を産生する、または、Ｈｉｎ４７に特異的に反応する宿主内抗体の産生を誘起できるタンパク質を産生するような細菌性病原体が原因で発症した病気に対しての防御手段として使える。この細菌性病原体として、Haemophilus influenzae菌のようなHaemophilus菌種がある。本発明の免疫原性組成物質には、アジュバントのような、少なくも一個の別の免疫原性物質または免疫刺激物質から成る。さらに追加の実施例として、本発明のＨｉｎ４７類似体をコードする遺伝子から成る核酸分子は、ポックスウイルス、Salmonella（サルモネラ）、ポリオウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスまたはＢＣＧのような生存ベクターに含まれている。
本発明には、ヒトを含む宿主に免疫応答を起こさせる方法も含まれる。その方法として、本発明の免疫原性組成物質を、免疫効果の期待できる量をこの宿主に接種することを含む。
上述したように、このＨｉｎ４７類似体は診断領域でも使用可能である。従って、発明の追加態様として、検体中にＨｉｎ４７に特異的に反応する抗体が存在しているかどうかを検査する方法を提供する。その方法には下記の手順を含む。
（ａ）検体を、実質的に天然のＨｉｎ４７タンパク質と同じ免疫原性を持つＨｉｎ４７類似体と接触させ、その結果、Ｈｉｎ４７類似体と、検体中に存在しＨｉｎ４７と特異的に反応する抗体との複合物質を産生させること、および
（ｂ）この複合物質の産生を確認すること。
本発明は検体中にＨｉｎ４７が存在するかどうか検出する方法を含む。その方法は下記の手順から成る。
（ａ）本発明での免疫原性組成物質で被検対象を免疫感作してＨｉｎ４７タンパク質に特異的に反応する抗体を産生させること、
（ｂ）被検対象をこの抗体と接触させる、その結果、被検対象に存在するＨｉｎ４７と抗体に特異的に反応するＨｉｎ４７から成る複合物質を産生させること、
（ｃ）この複合物質の産生を確認すること。
この発明には診断キットの供給を含む。これは検体中に、Ｈｉｎ４７に特異的に反応する抗体があるかどうかを診断するもので、下記の物質と方法を含む。
（ａ）本発明で供給される天然のＨｉｎ４７タンパク質と本質的に同じ免疫原性を有するＨｉｎ４７類似体であること、
（ｂ）この類似体と検体中に含まれる抗体との複合物質を産生できるように、この類似体を被検対象と接触させる方法、および、
（ｃ）その複合物質の産生を確認する方法。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドであるＪＢー１０３１ー１ー１４およびＪＢー１０６８ー２ー２の制限酵素地図と塩基配列分析のための構造図である。
図２は、H.influenzae菌株由来ＳＢ３３から生産したＨｉｎ４７の完全なヌクレオチド塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）とアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）および、部分的ヌクレトチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）と部分的アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）である。後者はＡＳＭ会議で発表された資料を本発明者がコピーしたものである。
図３は、H.influenzae Hin47（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、E.coli（大腸菌）株のhtrA（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、Salmonella typhimurium（ネズミチフス菌）株のhtrA（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のアミノ酸配列を比較したものである。
図４は、既知のプロテアーゼを有するＨｉｎ４７のアミノ酸残基の５７から２５６までの配列（ＳＥＱＩＤ  ＮＯＳ：７から１６）である。コードは下記の通り。ＴＯＮ：ラットのトニン、ＰＫＡＡＢ：カリクレイン、ＰＴＮ：トリプシン、ＣＨＡＡ：キモトリプシン、ＥＳＴ：エラスターゼ、ＲＰ２Ａ：ラットのマスト細胞プロテアーゼ、ＳＧＴ：Streptomyces griseus（ストレプトミセス・グリセウス）トリプトシン、ＳＧＢＥ：Streptomyces griseusプロテナーゼＡ、ＳＧＡ：Streptomyces girseusプロテナーゼＢ、ＡＬＰ：L.enzymogenesアルファー・リシン・プロテナーゼ、hin47：Ｈｉｎ４７の５７ー２５６。アスタリスク（＊）は、構造上の保存部位を示す。触媒三つ組残基はそで章マーク（≠）で示す。’ｃｏｎ’は哺乳類プロテアーゼの共通配列部位を示す。
図５はプラスミドであるＤＳー１０１１ー１ー１およびＤＳー１０４８ー２の制限酵素地図で、これは、E.coli（大腸菌）から生産したＨｉｎ４７類似体であり、プラスミド・ＤＳー１０１１ー１ー１（プラスミド  pT7/Hin47*）のための構成スキームである。
図６は、E.coliから生産したＨｉｎ４７類似体の精製工程を示したもので、本発明の実施例の一つであり、精製品のゲル分析でもある。
図７は、天然Ｈｉｎ４７と本発明のＨｉｎ４７類似体のベータ・カゼインに対するプロテアーゼ活性を示したものである。
図８は、天然Ｈｉｎ４７と本発明のＨｉｎ４７類似体の温度を変化させた場合の安定性を比較したものである。
図９は、天然のＨｉｎ４７と本発明のＨｉｎ４７類似体による、H.influenzae由来組み換えタンパク質の酵素分解を示したものである。
図１０は、マウスにおける、天然のＨｉｎ４７と本発明のＨｉｎ４７類似体の免疫原性を比較したものである。
図１１は、H.influenzae菌株由来ＳＢ３３から生産されたＨｉｎ４７タンパク質とＳＢ１２から生産されたＨｉｎ４７タンパク質の、それぞれのアミノ酸配列の比較である。
図１２はE.coliから生産されたＨｉｎ４７類似体であるＨ９１Ａの精製工程を示したものである。
発明の一般的説明
Ｈｉｎ４７遺伝子を持つすべてのHaemophilus菌株は、精製・分離した核酸分子（ＤＮＡ分子の形）の供給に利用されており、この分子は、本発明の典型的な実施例で示したように、Ｈｉｎ４７をコードする部分を含んだ遺伝子である。このような菌株は、臨床現場や米国微生物寄託機関のような細菌収集機関から入手可能である。このような菌として、H.influenzae菌やＨｉｎ４７・フラグメントやその類似体と特異的に反応する抗体を作り出すことのできるタンパク質を産生するその他の細菌株がある。
Haemophilus菌のうち使える菌株は次の通りである。
Haemophilus菌ｂ型株ＭｉｎｎＡ
Haemophilus菌ｂ型株Ｅａｇａｎ
Haemophilus菌非定型株ＳＢ３３
Haemophilus菌非定型株ＳＢ１２
Haemophilus菌非定型株ＰＡＫ１２０８５
図１には、プラスミドであるＪＢー１０３１ー１ー１４、および、ＪＢー１０６８ー２ー２の制限酵素地図を示してあるが、これらのプラスミドには、Haemophilus菌非定型株ＳＢ３３から生産されるＨｉｎ４７蛋白質をコードする部分が挿入される。Ｈｉｎ４７遺伝子のヌクレトチド配列はすでに決定されており、図２には、Ｈｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列を示している。図３には、H.influenzae菌由来のＨｉｎ４７のアミノ酸配列とE.coli（大腸菌）株由来のhtrAタンパク質のセリン・プロテアーゼ・htrA、Salmonella typhimurium（ネズミチフス菌）株由来のhtrAタンパク質のアミノ酸配列を示してある。本発明者が予期せず発見したことであるが、このアミノ配列が存在することで、天然Ｈｉｎ４７では細菌性セリンプロテアーゼとして作用し、これがプロテアーゼ活性を起こしているのである。この天然Ｈｉｎ４７は、以前にはアドヒシンであると報告されていたものである。このプロテアーゼ活性があるために、天然Ｈｉｎ４７を予防接種用の免疫原、あるいは、診断用の抗原として使用しようとする場合に大きな障害となるのである。図３のアミノ酸配列の分析から、htrAタンパク質と天然Ｈｉｎ４７には、成熟タンパク質のアミノ酸残基１９５と２０１の間にＧＮＳＧＧＡＬの配列が含まれることが判明した。セリン・プロテアーゼの活性部位のコンセンサス配列はＧＤＳＧＧＰＫ（ＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ：１８）（Brenner,1988）であり、活性残基はセリンである。このように、Ｈｉｎ４７のセリンー１９７に突然変異を誘起させると、プロテアーゼ活性が低下したＨｉｎ４７類似体が合成される。これは、本発明の実施例として示してある。別の実施例ではセリンー１９７をアラニンで置換した。Ｈｉｎ４７のアミノ酸残基５７から２５６は既知のプロテアーゼであり、これは触媒三つ組残基を取り巻いている先端の相同体からは識別された活性中心残基と一列に並んでいるのである。セリンプロテアーゼには標準ナンバリング・システムが確立されており、それによれば、触媒三つ組残基はそれぞれＨｉｓー５７、Ａｓｐー１０２、Ｓｅｒー１９５と番号付けがなされる。これらがそれぞれ、残基Ｈｉｓー９１、残基Ａｓｐー１２１、Ｓｅｒー１９７に対応している。図４には、１０個の構造がすでに決定されているセリンプロテアーゼ（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：７から１６）の構造配列が示されているが、図の通り、相同残基が３次元的に同じ位置に列をなしている。Ｈｉｎ４７の疎水性コア内にある多数残基は、活性中心の廻りの残基と同様に、Ｈｉｎ４７のプロテアーゼの機能アミノ酸を識別できるような位置で合理的に列をなしているのである。天然Ｈｉｎ４７内でタンパク質のプロテアーゼ活性を起こさせているその他のアミノ酸残基としては、Ｈｉｓー９１とＡｓｐー１２１がある。実施例では、活性を低下させるために、このＨｉｓー９１をアラニン、リスニンまたはアルギニンで置換する。別の実施例では、同様に、Ａｓｐー１２１をアラニンまたはグルタミン酸で置換する。さらに、追加の実施例では、セリンー１９７をアラニン、セリン、またはトレオニンで置換する。ここでは、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７の類似体を供給する方法として、Ｈｉｎ４７のタンパク質内の特別なアミノ酸を置換することを例示���ているが、本発明で示したプロテアーゼ活性の発見、Ｈｉｎ４７の発現方法、その精製方法を応用することにより、少なくとも一個のアミノ酸を除去または置換した別のＨｉｎ４７類似体、あるいは、少なくとも一個の追加アミノ酸をＨｉｎ４７タンパク質に取り込んだ別の類似体の生産も可能であることは明かである。本申請および実施例において、プロテアーゼ活性を特に低下させるためには、Ｈｉｎ４７タンパク質内の数個のアミノ酸を同時に変換することが望ましいことも示している。数個のアミノ酸としては、Ｈｉｓー９１とＳｅｒー１９７があり、これらを除去するかアラニンで置換して活性を低下させる。別の実施例では、これらの複数のアミノ酸として、Ｈｉｓー９１、Ａｓｐー１２１、Ｓｅｒー１９７があり、これらは除去するかアラニンで置換することを示している。従って、本発明では、一個または複数のアミノ酸を除去または別のアミノ酸で置換する方法、あるいは追加のアミノ酸を導入する方法で、プロテアーゼ活性を低下させたＨｉｎ４７タンパク質類似体を供給できることを示している。
上記で述べた通り、Ｈｉｎ４７には、大腸菌由来のhtrAタンパク質またはS.typhimurium由来のhtrAタンパク質との相同性があり、これらのタンパク質は両方ともストレス応答タンパク質であり、共にセリンプロテアーゼ活性を持つ。大腸菌由来のhtrAタンパク質は、大腸菌を４３．５℃で増殖させることで産生誘導が可能である（レファレンス１３参照）。本発明では、この大腸菌由来のhtrAタンパク質は、６％のエタノール溶液内での増殖でも産生誘導が可能であることを示した。Ｈｉｎ４７も、６％のエタノール溶液内での増殖で産生の誘導可能であり、さらに、誘導される産生量は減少するが、温度を４３．５℃まで低下させて増殖させても産生誘導可能であり、そのことは以下で詳述する。このＨｉｎ４７タンパク質の発現の分析を進める中で、このタンパク質とＬｔｒＡとの間には関係があるという証拠が明確になってきた。hin47遺伝子は、タイプ分けできないH.influenzae菌株ＳＢ１２をＰＣＲ増殖することでそのクローンが得られる。図１１では、H.influenzae菌株ＳＢ１２由来のＨｉｎ４７タンパク質とH.influenzae菌株ＳＢ３３由来のＨｉｎ４７タンパク質におけるアミノ酸配列の比較をしている。この比較で分かることは、この両方のタンパク質のアミノ酸配列がほとんど同じであるということである。
図５にはプラスミドであるＤＳー１０１１ー１ー１とＤＳー１０４８ー２を示してあり、これらを使用して、大腸菌内でセリンー１９７をアラニンで置換するとＨｉｎ４７類似体が発現する。
図６は、Ｈｉｎ４７類似体を大腸菌の顆粒画分から精製する方法を示した流れ図である。
図７は、セリンー１９７をアラニンで置換して得られたＨｉｎ４７類似体の、ベータカゼインに対するプロテアーゼ活性の低下の状態を示したもので、これにより、この類似体のプレテアーゼ活性は、天然のＨｉｎ４７タンパク質の１０％以下であることが分かる。このように、本発明の実施例では、本発明が、プロテアーゼ活性が天然のＨｉｎ４７タンパク質の１０％以下であるＨｉｎ４７類似体を供給し、このようなＨｉｎ４７類似体は、アミノ酸のセリンー１９７をアラニンで置換して生産できることを示している。
図８には、本発明で供給されるＨｉｎ４７類似体の熱安定性の向上に関する分析が図示されている。本発明の実施例として、熱安定性が向上したＨｉｎ４７類似体が供給されており、そのようなＨｉｎ４７類似体はアミノ酸であるセリンー１９７をアラニンで置換して生産したものである。
図９は、非Hin47のHaemophilus菌由来抗原が、Ｈｉｎ４７およびＨｉｎ４７類似体によってタンパク分解される状態を図示している。本発明の別の実施例には、このＨｉｎ４７によるタンパク質分解を起こさない別のＨｉｎ４７類似体を示し、これは、そのアミノ酸セリンー１９７がアラニンで置換されたものである。
図１０と表１には、マウスにおける、修飾を加えてない天然のＨｉｎ４７と本発明にかかるプロテアーゼ活性低下型Ｈｉｎ４７類似体との免疫原性比較が図示されている。天然Ｈｉｎ４７タンパク質と本発明のＨｉｎ４７類似体Ｓ１９７Ａの免疫原性は似ている。実施例では、プロテアーゼ活性低下型で、しかも、その免疫原性が天然のＨｉｎ４７と実質的に同じであるＨｉｎ４７類似体が示されている。このＨｉｎ４７類似体では、アミノ酸であるセリンー１９７がアラニンで置換されたものである。
表２と表３には、幼少ラットの菌血症モデルおよび免疫感作させたチンチラネコの中耳炎モデルにおける、プロテアーゼ活性低下型Ｈｉｎ４７類似体のＨｉｂに対する免疫防御能が示されている。このＨｉｎ４７類似体では、アミノ酸Ｈｉｓー９１が除去されるかアラニン、リシン、アルジニンで置換され、Ａｓｐー１２１が除去されるかアラニンまたはグルタミン酸で置換され、セリンー１９７がアラニン、システイン、トレオニンで置換されるか、あるいは、これらの組み合わせの置換で合成されたものである。
本発明の別の態様として、Haemophilus菌、または、その他の細菌性病原菌に対する防御用のワクチンを供給する。ここで言う病原体は、Ｈｉｎ４７タンパク質、または、Ｈｉｎ４７を認識できる抗体を誘発するようなタンパク質を産生する細菌のことである。ここでのワクチンは、免疫・防御能力のあるＨｉｎ４７類似体を使ったもので、免疫原性的効果の期待できる量を使用し、または、Ｈｉｎ４７をコードする塩基配列を持つ核酸分子、および、生理的に受け入れ可能な、これらの物質のキャリアーから構成されるワクチンである。本発明で供給されるこの類似体は、Ｈｉｎ４７に関係のない抗原決定基に対する接合ワクチンを作る際には、ハプテン、多糖類、または、ペプチドのキャリア・タンパクとして使用できる。
後述する申請内容からも明かなように、本発明はプラスミドおよびＨｉｎ４７類似体合成用の細菌の新規株も提供する。
Haemophilus influenzae菌由来で、しかも、天然のものに較べてそのプロテアーゼ活性の低いタンパク質Ｈｉｎ４７をコードする精製・分離ＤＮＡは、核酸プローブとして、Haemophilus菌株のインビトロまたはインビボでの同定手段として有用である。本発明により供給される遺伝子ＤＮＡ分子によりコードされたＨｉｎ４７類似体は、それを抗原に使うことで診断薬として、あるいは、抗Ｈｉｎ４７抗体を産生させる抗原として有用である。さらに、Haemophilus菌株やＨｉｎ４７と特異的に認識する抗体の産生を誘起できるタンパク質を産生するその他の細菌性病原菌が原因で発症する病気に対するワクチン生産用の抗原としても使えるし、Haemophilus菌あるいはそれに類するその他の細菌の感染症の診断に使用可能である。
本発明の追加実施例では、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７類似体が、被包性菌などの病原菌防御用のキメラ分子や接合ワクチン（複合糖質を含む）を合成する際のキャリア分子として使用できることを示している。例えば、本発明で供給される複合型糖質は、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）やＰＲＰのような多糖類抗原を持つ細菌が原因となる病気や感染症の防御用の免疫感作に使用できる。これらの細菌性病原菌としては、Haemophilus influenza、Streptococcus pneumonia、Escherichia coli、Neisseria meningitidis、Salmonella typhi（チフス菌）、Streptococcus mutans、Cryptococcus neoformans、Klebsiella、Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）、Pseudomonas aeruginosa（緑膿菌）がある。特殊抗原をＨｉｎ４７類似体に接合させることが可能であり、そのような接合の方法は、本発明の申請者が作製したＰＴＣ申請書・ＷＯ・９４／１２６４１にすでに記載しているが、ここではレファレンスとして掲載している。
別の実施例では、このＨｉｎ４７類似体は、ガン細胞の異常多糖類に対する免疫感作をする場合や、化学療法剤または生体活性剤に接合可能な抗ガン抗体を作製する際に、キャリアとして利用できることを示している。
本発明で供給されるＨｉｎ４７類似体は、H.influenzae菌由来のタンパク質であるので、これを調合した薬剤では、H.influenzae菌が原因で発症する病気の予防と診断に使える。本発明者は、このＨｉｎ４７類似体が、生きたH.influenzae菌ｂ型株に対する防御免疫応答を引き出すことができることを発見した。従って、本発明はワクチンにも利用可能であることが明かである。さらに、本発明には、Ｈｉｎ４７類似体をコードする遺伝子のヌクレトチド配列を示している。これらのＤＮＡセグメントは、組み換えＤＮＡ技術を利用することで、ＰＲＰやリポオリゴ多糖類（ＬＯＳ）のような、H.influenzae抗原とは本質的に関連のない免疫原を供給する際にも使用できる。Ｈｉｎ４７類似体タンパク質は、E.coli、Haemophilus、Bacillus（バシラス）、Bordetella（ボルデテラ）菌、酵母、バキュロウイルス、ポックッスウイルス、ワクシニアウイルスの増殖媒体を適当な発現システムとして使用することでその産生を誘起させることが可能である。本発明は、実質的には、分離・精製された純粋なＨｉｎ４７類似体を合成する新規技術を提供するものである。
本発明での実施例が、Haemophilus菌の感染症や、Ｈｉｎ４７と特異的に反応する抗体の産生を誘発できるタンパク質を産生するその他の細菌性病原菌の感染症の治療や診断、予防接種に適用できることは、本分野の技術に熟練した者には明白なことである。そのような使用法に関して下記に詳述する。
１．ワクチンおよびその使用法
ワクチン生産用の免疫原性誘発物質として上記のＨｉｎ４７類似体を使用できる。ワクチンは接種対象者の免疫応答を引き出し、抗Ｈｉｎ４７抗体を含む、食菌性または殺菌性の抗体を産生させるためのものである。ワクチンを投与された者が、H.Haemophilus菌や、Ｈｉｎ４７と特異的に反応する抗体の産生を誘起するタンパク質を産生するようなその他の細菌の攻撃を受けた時には、この抗体が侵入細菌に結合してそれを不活性化させる。食菌性または殺菌性の抗Ｈｉｎ４７抗体は別の機序でも防御作用を発揮する。
ワクチンを含むこれらの免疫感作物質は、注射液や液体溶液として、あるいはエマルションとして調製が可能である。Ｈｉｎ４７類似体に、薬学的な意味で許容できる限度内で賦形剤を混ぜて使うことも可能である。そのような賦形剤としては、水、食塩、デキストローズ、グリセロール、エタノール、および、それらを組み合わせてものがある。この免疫原性物質やワクチンには、その効果を強化するために湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または、アジュバントのような付帯物質を添加してもよい。アジュバント効果を完全なものするために、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムを使用できるが、通常の場合には０．０５から０．１％のリン酸緩衝食塩溶液を使用する。免疫原性物質およびワクチンは、非経口で、皮下注射または、筋肉注射で投与する。本発明にかかる免疫原性物質は、投与した粘膜表面で免疫応答が起こるように調製することも可能である。この免疫原性物質は、経鼻または経口（胃内）ルートで粘膜表面への投与が可能である。坐薬や経口薬剤の方法でこれを投与することが望ましい。坐薬の場合には、そのバインダーおよびキャリアーとしてはポリアルカリン・グリコールまたはトリグリセリドが使用できる。経口薬剤として使う場合には、賦形剤を使用するが、この賦形剤としては、サッカリン、炭酸セルロース、炭酸マグネシウムを使用する。この免疫原性物質の剤形としては、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性調剤、粉末のいずれに可能であり、このＨｉｎ４７類似体の含有濃度も１から９５％まで調節できる。この免疫原性物質製剤およびワクチンは、その投与量を調節して、治療用、予防・防御用、免疫原としての使い分けが可能である。その投与量は投与対象者の個人状況により異なり、抗体の産生を誘起する個人の免疫機能の状態、必要な場合には、細胞性免疫応答の能力によって調製する。投与の際の有効成分の期待される正確な量については医者の判断に委ねられている。しかし、適切な投与量については、この分野の熟練専門家が決定する必要があり、Ｈｉｎ４７類似体の投与量としては、マイクログラムのオーダーとなるであろう。適切な初回投与量もその後の投与予定量により変動し、追加免疫抗原量も多様である。さらに、どの経路で投与するかによっても投与量は変わるし、宿主の大きさによってもその量は変動する。
本発明にかかる免疫原物質製剤に含む抗原の濃度は一般的には１から９５％である。ワクチンが、一種類のみの病原菌由来の抗原を含む場合には、そのワクチンは１価ワクチンと呼ばれる。他方、数種類の病原菌由来の抗原を含むワクチンは混合ワクチンと呼ばれ、それも本発明に供給するワクチンである。混合ワクチンの場合には、種々の病原菌由来の抗原、同じ病原菌であってもその菌株が異種のものから生産した抗原あるいは種々の病原菌の組み合わされた菌からの抗原を含む。
本発明のＨｉｎ４７類似体をコードする核酸分子は、直接に免疫感作に使える。例えば、この遺伝子ＤＮＡを直接に免疫感作対象に投与するか、遺伝子免疫感作の場合にはＤＮＡを直接に注射する方法もある。さらに、サルモネラ、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスのような生きたベクターに遺伝子を運搬させることで免疫感作させる方法もある。異種抗原を免疫システムに運ぶのに使用する生きたベクターに関しては、O’Hagan（1992）の報告があり、遺伝子感作の目的で検体にＤＮＡを直接に挿入する方法についてはUlmerらが報告している（1993）。
２．イムノアッセイ（免疫検定法）
本発明のＨｉｎ４７類似体は、抗Ｈｉｎ４７抗体の産生を誘起するための免疫原として、さらに、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ：エリザ、ＲＩＡ：ラジオイムノアッセイ、その他の非酵素連結抗原結合検定または抗Haemophilus抗体、抗Ｈｉｎ４７抗体の探知技術として知られている方法を含む）における抗原としても有用である。エリザ法では、Ｈｉｎ４７類似体を、特別に選別された表面、例えば、ポリスチレン製のマイクロティタ板の壁面のようなタンパク質を付着させることのできる表面に固定する。不完全に吸収されたＨｉｎ４７類似体を除去するために洗浄をした後、検体に対して抗原抗体反応的には中立であることで知られるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液のような非特異的タンパク質をその選択表面に結合させる。こうすることで、固定表面に非特異的吸収部位をブロックできることになり、表面に抗血清の非特異的に結合する原因と背景を少なくすることができる。
次に、この固定表面に、臨床的意味のある、または生物学的意味のある物質から成るサンプルを接触させ、免疫複合物質（抗原／抗体）の形成を促進させる方法で検体を試験する方法もある。この方法には、ＢＳＡ溶液、ウシ・ガンマ・グロブリン（ＢＧＧ）、リン酸緩衝食塩（ＰＢＳ）／トウイーンのような希釈剤でサンプルを希釈することも含まれる。その後、このサンプルを温度２５℃から３７℃で２ー４時間培養する。培養の後、サンプルが付着している表面を洗浄して非免疫複合物質を除去する。この洗浄には、ＰＢＳ／トウイーンまたはホウ酸バッファーのような溶液で洗浄することも含む。試験サンプルと結合したＨｉｎ４７類似体との間に特異的免疫複合物質を生成させた後、洗浄して、その免疫複合物質を、最初の抗体に対する特異性をもつ二番目の抗体に接触させることで、免疫複合物質の産生の時期、量を決定することができる。仮に試験サンプルがヒト由来のものであれば、二番目の抗体はヒト免疫グロビリン（一般には、ＩｇＧ）に対して特異性を持つ抗体である。検出方法として、この二番目の抗体には、適当な色素産生物質と一緒に培養した時に色を発生する酵素活性のような活性を持たせることができる。ここで発生した色の度合いをスペクトル分光光度計を使用して測定することで定量分析が可能となる。
３．ハイブリッド形成プローブとして塩基配列を使用
本発明の核酸分子はhin47類似体遺伝子としての塩基配列を持っており、そのために、Haemophilus菌株およぼその他のＨｉｎ４７を特異的に認識する抗体を産生することのできるタンパク質を作り出す細菌からhin47類似体遺伝子をクローニングすることも可能である。
この核酸分子は、本発明のＨｉｎ４７類似体をコードする塩基配列を持つので、別のhin47遺伝子と相補的な長さの複合分子を選択的に形成させるのに使用できる。
別のhin遺伝子を探索するためにプローブの選択性に幅を持たせたい場合には、ハイブリッド形成条件の設定を多様に変化させることが可能である。この選択性を高めたい場合には、複合物質を形成させる場合に、比較的に厳しい条件を採用する、例えば、塩化ナトリウムの量を低くし、かつ、高温の状態にする、具体的には、Ｎａｃｌ量を０．０２Ｍから０．１５Ｍにして、温度を５０から７０℃のような高温条件にする。場合によっては、ハイブリッド形成条件をもっと緩やかなもの、例えば、塩化ナトリウム量を０．１５から０．９Ｍにして、温度を２０から５５℃の条件にする必要があるような場合もある。ハイブリッド複合物質を不安定化させる場合には、ホルムアルデヒドの添加量を増量してハイブリッド形成条件をもっと厳しいものにすることも可能である。このように、ハイブリッド形成条件を自由に調節でき、望む結果に合わせて広く条件選択ができるというメリットがある。
臨床診断用の実施例では、本発明のhin47遺伝子をコードする核酸分子は、ハイブリッド形成の際に、ラベリング法のような適当な方法と組み合わせて使えることを示している。例えば、放射線、酵素、アビジンやビオチンのようなリガンドなどの多様なレベル指示法が知られており、これらはいずれも探知信号を発生させることができるものである。本発明の別の診断用実施例は、放射線標識に代わりに、ウレアーゼ、リン酸アルカリン、ペルオキシダーゼのような酵素標識が使用できることを示している。酵素標識の場合には、hin47遺伝子の塩基配列が含有されているサンプルの特別なハイブリッド形成を確認する際に、人間の目で見える方法として、または、分光光度計で見たような方法を提供するものとして、比色指示物質が知られている。
本発明のhin47遺伝子から成る核酸分子は、溶液ハイブリッド形成を行う場合や個体相を使う実施例において、そのプローブとして有用である。個体相を使用した実施例には、浸出液、体液（例えば、血清、羊水、中耳浸出液、唾液、気管支肺胞洗浄液）または、組織のような臨床サンプルから取ったテストＤＮＡ（またはＲＮＡ）は、選択マトリックスや表面に吸収され付着することが示されている。その後、固定された一本鎖核酸は、本発明のhin47遺伝子の核酸配列から成る選択プローブで、望む条件下で、特別なハイブリッド形成を起こすことになる。この選択条件というのは、Ｇ＋Ｃの内容、目標核酸の型、核酸の起源、ハイブリッド形成プローブなどに応じて要求される特別な基準に基礎を置いた特別な環境に依存する。非特異的に結合しているプローブ分子を除去するためのハイブリッド形成の表面の洗浄に続いて起こる特別のハイブリッド形成は、標識を使用することで検出できるし、その形成量の定量でさえも可能である。
４．プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７の類似体をコードする遺伝子の発現
宿主との適合性のある菌株から生産された、レプリコン配列と制御配列を含んでいるベクターが、Ｈｉｎ４７類似体遺伝子の発現に使用できる（本発明では発現システムを使用する）。元来、ベクターというのは、形質転換細胞内で表現型選択をさせる標識配列部分と複製部分を細胞内に運搬するものである。例えば、大腸菌は、アンピシリンとテトラサイクリンに耐性のある遺伝子を含むプラスミドｐＢＲ３２２を使用して、細胞の形質転換が可能で、ｐＢＲ３２２は形質転換細胞の同定の簡便な手段でもある。プラスミドｐＢＲ３２２、その他の細菌性プラスミド、ファージはプロモータを含むか、含むように修飾されており、このプロモーターは、宿主が自らのタンパク質を産生する場合にも使用される。
さらに、宿主との適合性があり、レプリコン配列と制御配列を含んでいるファージ・ベクターは、宿主との関係では形質転換ベクターとしても使用できる。例えば、ラムダＧＥＭー１１ファージは、組み換えファージベクターを作製する際に使用でき、この組み換えファージベクター（例えば、E.coli LE392）は、宿主の形質転換用にも使える。
組み換えＤＮＡ技術で普通に使用されているプロモーターとしては、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース・プロモータ・システム（Chang et al,1979;Goedel et al,1980）、Ｔ７・プロモータ・システム（米国特許４、９５２、４９６）のような細菌性プロモーターなどがある。これらの核酸の塩基配列は詳しく解明されており、この分野の熟練技術者であれば、これらを機能的にプラスミドベクターに結合可能である。
どのようなプロモータを選択するかは、どのような結果を希望しているかに依る。Ｈｉｎ４７類似体の発現に適した宿主としては、E.coli Bacillus菌株，Haemophilus Bordetella菌株，酵母、哺乳類の細胞などがあり、この類似体発現にはバキュロウイルス発現システムも使用できる。
本発明では、Ｈｉｎ４７類似体の生産には組み換え法が望ましいとしている。このタンパク質の発現のために特に好ましい宿主としては、ＬＰＳを持ってない、つまり、エンドトキシンのないグラム陽性菌が挙げられる。例として、Bacillus菌株があり、これは特に、非発熱性のＨｉｎ４７類似体の作製に有用である。
生物寄託
Ｈｉｎ４７類似体をコードするタンパク質を含むプラスミドであるＤＳー１０１１ー１ー１（pT7/Hin47*）は、この一部継続出願に先だって、ブダペスト条約により、承認番号７５８４５として、１９９４年７月２７日に米国、メリーランド、ロックビルにある米国微生物寄託機関に寄託されている。このに寄託されたプラスミドのサンプルは、当該米国特許申請に基づく特許付与があり次第、一般に公開されることになっている。本発明およびクレームは、この寄託されているプラスミドに限定されるのでなく、それは発明の例示のひとつにすぎない。この申請の中で記載している類似体または同等の抗原をコードする遺伝子が挿入される同等または類似の如何なるプラスミドも本発明の範囲内に入るものである。
実施例
一般的に記述された上記の開示は本発明を説明するものである。下記に示す実施例を参照することでより完全な理解が得られる。ここで示す実施例は単に例示であって、本発明がそれらに限定されるものではない。周囲の状況で適当と判断された場合には、形態を変更したり、同等物で置き換える場合もある。特別な用語が使用される場合があるが、それは本発明を記載するために使用されたもので、限定的な意味合いを付与するものではない。
この開示の中で使用されているが、明示的には記載されてない分子遺伝学、タンパク質生化学、免疫学分野の方法も、それらは関連文献で十分に説明され明白であり、本発明に関連する分野の熟練者の技術の範囲内にあるものである。
実施例１
この実施例は、タイプ分けできないH.influenzae菌株ＳＢ３３から作製したhin47遺伝子のクローンを示したものである。
染色体ＤＮＡをH.influenzae菌株ＳＢ３３から調製して、ＥＭＢＬ３ライブラリを作製し、hin47遺伝子の５’末端に特異的に反応する標識オリゴヌクレオチド・プローブでスクリーニングしている。ハークニス（Harkness et al, 1992））らの方法に従って、タイプ分け出来ないH.influenzae菌株ＳＢ３３をムーラーヒントン（Mueller-Hinton）寒天で、または、流体培養基で増殖させた。染色体ＤＮＡは、次のような方法で作製した。即ち、５０ml培養液から細胞をペレットで取り、ソルバール（Sorvall）型ＲＣ−３Ｂ遠心分離機を使用して、５０００rpmの回転速度で１５分から２０分間、温度４℃で遠心分離を行った。分離した細胞をＴＥ溶液１０ml中で再懸濁させた後、プロナーゼを加えて５００μｇｍｌ-1とし、さらに１％ＳＤＳを加えた。透明な溶解産物が得られるまでサンプルを３７℃で培養した。この溶解産物を、静かに一回、トリス飽和フェノール（ｐＨ７．４）で抽出させ、さらに、もう一回、トリス飽和フェノール／クロロフォルム（１：１）で抽出し、さらにもう一度クロロフォルムで抽出した。最終の液体相を１Ｍ塩化ナトリウムを使用して２４時間、４℃で分離透析し、其の後、ＴＥで２４時間分離透析した。
ＥＭＢＬ３ライブラリのＳａｕ３Ａを使用して、ＳＢ３３染色体ＤＮＡの部分消化させて調製し、其の後、ＴＮＥ（20Mmトリス／塩酸，5mM塩化ナトリウム，1mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸，pH8.0）の中で１０から３０％スクロース勾配でサイズ分別するか、または、分離用ゲル電気泳動を行った。長さが５KD以上のＤＮＡフラグメントを含む画分については、それをプールさせ沈澱させ、ＥＭＢＬ３（プロメガ）のＢａｍＨと連結させた。この連結混合物質は包装キットであるギガパックＩＩを使用して包装してE.coli ＬＥ３９２細胞の上に置いた。このライブラリは、増幅させた後、クロロフォルム存在下４℃で保存した。プラークはニトロセルロースで濾過し、32p標識のオリゴヌクレオチド・プローブ（３０２６．ＳＬ）でハイブリダイゼーションを実施した。オリゴヌクレオチドの塩基配列はＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＴＡＡＡＴＡＧＴＡＴＴＧＣＡＣＴＴＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）であり、これはＮ末端アミノ酸配列ＭＫＫＴＲＦＶＬＮＳＩＡＬＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）と対応している。ファージＤＮＡをプラークから調製し、挿入ＤＮＡをSal Iで酵素消化で切断して、Sal Iで酵素消化されたＰＵＣＢ−ＢｇＸｂのクローンを作製した。プラスミドＪＢー１０３１ー１ー１４およびＪＢー１０６８ー２ー２（図１）をさらに分析するために選択した。
実施例２
この実施例は、hin47遺伝子およびＮＴＨｉ株ＳＢ３３から生産したＨｉｎ４７タンパク質のキャラクタリゼーションおよび塩基配列分析を示したものである。
クローンＪＢー１０３１ー１ー１４およびＪＢー１０６８ー２ー２の制限酵素地図での分析およびサザンブロット法によれは、4.7kb BamH I/BamH Iまたは2.7kb BamH I/Pst I ＤＮＡフラグメント上にhin47遺伝子があることになる。クローンＪＢー１０６８ー２ー２から得られた4.7kb BamH I/BamH IフラグメントはプラスミドＤＳー７５５ー１を産生するｐＵＣＢ／ＢｇＸｂにクローン化される。ＤＳー７５５ー１の3.1kb BamH IからXba IフラグメントはプラスミドＪＢー１１６５ー１ー１を産生するｐＵＣ１８にクローン化され、このｐＵＣ１８には制限部位があり、Erase-a-base（Promega）手順に利用できるようになっている（図１）。この技術によれば、挿入ＤＮＡの切断を増やすことで連続的にクローンを生産できる。この結果、生産されたクローンはプライマーを使用して急速にその塩基配列が決定されることになる。
プラスミドＪＢー１１６５ー１由来のＤＮＡは、BamH IおよびSac Iで消化され、次に、Erase-a-baseキットでexoII消化される。切断されたプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分析し、代表的プラスミドを塩基配列分析のために選択する。
配列決定のためのプラスミドＤＮＡを、ホルムス／クイグレー法（Holmes and Quigley, 1981）による修飾法で調製した。その修飾法を簡単に述べれば、５０ｍｌ培養液から取った細胞を１０ｍｌのＳＴＥＴ（８％スクロース、５％トリトン  Ｘー１００、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  トリス／塩酸、ｐＨ８．０）中で再懸濁させ、リゾチームを添加し、その混合液を２分間沸騰させる。そのサンプルを遠心分離機ソルバルＲＣ５Ｂで、１４、０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する、其の後、その上澄み液を同量のイソプロパノールで沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、純粋のエタノールで洗浄して、風乾した。細胞ペレットを０．９ｍｌのＴＥ中で再懸濁させ、５ｍｇ・ｍｌ-1ＲＮＡｓｅＡを２０μｌを添加した。その後、この混合物質を３７℃で１５分培養した。１．５Ｍ・ＮａＣＬ／３０％ＰＥＣを５００μｌ添加した後、その混合物質を３０分間氷上培養し、エッペンドルフ（Eppendorf）遠心分離機で１０分間遠心分離をしてＤＮＡをペレットで取り出した。この細胞ペレットを４００μｌのＴＥ中で懸濁させ、トリス飽和フェノール（ｐＨ７．４）で３回、トリス飽和フェノール／クロロフォルム（１：１）で２回、クロロフォルムで２回抽出を行った。３Ｍ・酢酸アセトンを４０μｌおよび１ｍｌのエタノールを添加してＤＮＡを沈澱させ、その後、７０％エタノールで洗浄し、蒸留水中で再懸濁をさせた。
ＤＮＡサンプルの塩基配列は、ＡＢＩ・モデル３７０Ａ・ＤＮＡシークエンサー、および、ダイ・ターミネーター化学法で行った。hin47遺伝子コーディング鎖の塩基配列の決定のために、クローンの集合セットと共に、ユニバーサル逆プライマーを使用した。約２５塩基のオリゴヌクレオチド・プライマーを非コーディング鎖の塩基配列を確認する目的で使用した。ＳＢ３３・hin47遺伝子のヌクレオチド塩基配列とＨｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列を図２に示した。このＨｉｎ４７タンパク質のヌクレオチド塩基配列とＮ末端アミノ酸配列については、１９９２年５月２６日から３０日までニューオリンズで開催された米国微生物学会で発表したが、これを図２の下方に示した。ＳＢ３３・Ｈｉｎ４７タンパク質のアミノ酸末端配列と、本発明にかかるタンパク質の配列は同一であり、このクローン遺伝子がhin47としての同一性を示している。
実施例３
この実施例ではＨｉｎ４７タンパク質のセリンプロテアーゼ活性の発見について示している。
上記の実施例で決定されたＨｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列を、遺伝子バンクに登録されているすべてのタンパク質と比較した。上述した通り、Ｈｉｎ４７タンパク質はＰＣＴ申請書ＷＯ９４／００１４９、ＷＯ９２／１１３６７、ＷＯ９２／１０９３６に記載されており、Haemophilusのアドヘシン分子であることが示されている。本発明における驚くべき、かつ、予期せぬ発見は、Ｈｉｎ４７タンパク質は、セリンプロテアーゼ・E.coli  htrA、S.typhimurium htrA、および、その他のプロテアーゼとの相同性（５５％）のある重要なアミノ酸を持っているということである。このようなアミノ酸配列相同性については図３と図４に示している。
さらに、Ｈｉｎ４７タンパク質は、ペファブロック（Pefablock）のような、セリン・プロテアーゼ阻害剤の存在がなければ自己消化を起こすことも発見した。
実施例４
本実施例は、部位特異的突然変異誘発による突然変異体hin47遺伝子の産生経過を示したものである。上記で述べた通り、H.influenzae Hin47、E.coli htrA、S.Typhimuriumはいずれもセリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼの活性中心のコンセンサス配列はＧＤＳＧＧＰＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）であり、セリンが活性残基である。htrAタンパク質はいずれもＧＮＳＧＧＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）の配列であり、H.influenzae Hin47には、成熟タンパク質の残基１９５と２０１の間には同一の配列がある。このように、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７類似体が産生される場合には、このセリン残基１９７が部位特異的突然変異誘発の位置として選ばれることになる。
オリゴヌクレトチド・ＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）が産生され、これは１９７位置のセリン残基をアラニンに変換されたものである。hin47遺伝子をクローニングしてＭ１３ｍｐ１８とし、これにクローンＤＳー９８１ー３を産生させ、アメリカ・インビトロ・部位特異的突然変異誘発キットを用いて突然変異を誘発させた。塩基配列分析により、クローンＤＳー９９１ー８が確認され、セリンー１９７からアラニンへの突然変異が起こっていた。この突然変異体hin47遺伝子を「hin47*」と呼ぶことにした。適当なオリゴヌクレオチドを使用して、１９７位置のセリン残基はシステイン（突然変異体Ｓ１９７Ｃ）とトレオニン（突然変異体Ｓ１９７Ｔ）に変換させた。
さらに、図４で示した通り、Ｈｉｎ４７のアミノ酸配列と他のプロテアーゼを比較したところ、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７類似体を産生するには、アミノ酸Ｈｉｓ−９１とＡｓｐー１２１の突然変異誘発が適当であることが判明した。上記で述べたと同様の突然変異誘発法により、これらのアミノ酸Ｈｉｓ−９１とＡｓｐー１２１を除去するか、または、別のアミノ酸で置換させた。このようなアミノ酸の置換としては、アミン酸Ｈｉｓー９１をアラニン（突然変異体Ｈ９１Ａ）とアルギニン（突然変異体Ｄ１２１Ａ）で、アミノ酸Ａｓｐー１２１をアラニン（突然変異体Ｈ９１Ａ）とグルタミン酸（突然変異体Ｄ１２１Ｅ）で置換した。このような、突然変異誘発のオリゴヌクレオチドは下記の通り。
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別の突然変異を誘発するために対応するオリゴヌクレトチドを使用した。多数の突然変異体が誘発され、Ｈｉｓー９１とセリンー１９７がアラニンで置換され（突然変異体Ｈ９１Ａ／Ｓ１９７Ａ）、Ｈｉｓー９１、Ａｌｐー１２１、Ｓｅｒー１９７はすべてアラニンで置換された（突然変異体Ｈ９１Ａ／Ｄ１２１Ａ／Ｓ１９７Ａ）。Hin47*原料に関する前述の実施例で述べたように、プロテアーゼ活性の減退を確認するために、これらの追加で生産した突然変異体の抽出・精製・試験を行った。
多くのセリンプロテアーゼは不活性（チモーゲンのように）の状態で分泌されており、活性中心を見るのに切開が必要であった。成熟天然Ｈｉｎ４７タンパク質のＮ末端の塩基配列を分析した結果、ＫＦＦＦＧ  ＤＲＦＡＷＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）の位置でプレタンパク質の細胞分裂が起こっていることが判明した。活性プロテアーゼ分子を産生する分子の細胞分裂を阻止するアミノ酸を修飾することにより、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７類似体を発現させることができるのである。
実施例５
本実施例は、Ｓｅｒー１９７がアラニンで置換されたＨｉｎ４７類似体を発現させるのに使用する大腸菌プラスミドの構造を示したものである。
プラスミドであるＤＳー９９１ー８由来の突然変異体hin47*遺伝子のｐＴー７発現ベクターのクローニングを行いプラスミドＤＳー１０１１ー１ー１を産生させた（図５）。大腸菌株ＢＬ２１／ＤＥ３を形質転換させて大腸菌株ＤＳー１０１８ー３ー１を作製するが、これによりＳｅｒー１９７がアラニンで置換されたＨｉｎ４７類似体を発現された。
テトラサイクリン・セレクションを利用するために、hin47*遺伝子をクローニングしてｐＢＲ３２８とした。BglII/BamH Iフラグメントの作製のために、プラスミドＤＳー１０１１ー１ー１由来のBgl II/Cla IT7/hin47遺伝子フラグメントをクローニングすることでpEVvrf1（Young and Davis, 1985）を生産するが、これは、さらにBamH Iで消化されるpUC-4K（Pharamacia）にクローン化できる。産生されたクローンＤＳー１０３４ー３を酵素EcoR Iで消化させ、T7/hin47*遺伝子フラグメントをクローニングしてpBR328とし、プラスミドＤＳー１０４８とＤＳー１０６７ー２を作製する。プラスミドＤＮＡを大腸菌株ＢＬ２１／ＤＥ３に導入すると、ＤＳー１０７１ー１ー１とＤＳー１０７１ー３ー１が生成され、これがＳｅｒー１９７がアラニンで置換されたＨｉｎ４７類似体を発現させる。
実施例６
この実施例では、Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の発現状態について示している。
ＤＳー１０１８ー３ー１、ＤＳー１０７１ー１ー１、ＤＳー１０７１ー３ー１をＮＺＣＹＭ＋３％デキストロース＋抗生物質（２５μｇ・ｍｌ-1のアムピシリンまたは１０μｇ・ｍｌ-1）の混合培養基で、３７℃で振り混ぜながら１昼夜培養して増殖させた。この一昼夜培養液を１：４０に希釈し、音波処理を行った後、同じ培養基に入れ、振り混ぜながら、吸光度が約０．３になるまで培養した。Ｔ７プロモーターからの発現を誘起させるために、１０％ラクトースの１０分の１容積分を添加した。ソルバル（Sorvall）ＲＣ−３Ｂ遠心分離機を用いて、培養液を５０００ｒｐｍ回転で、１０分間、温度４℃で遠心分離した後、４時間して細胞サンプルを取り出した。
実施例７
この実施例ではＨｉｎ４７タンパク質の抽出、精製を示している。Ｈｉｎ４７は大腸菌において溶解性タンパク質として発現される。実施例６で調製した２５０ｍｌ培養液から取り出した細胞ペレットを、５０ｍＭトリス塩酸４０ｍｌ（ｐＨ８．０）内で再懸濁させ、音波処理で破壊した。この抽出物を２０、０００ｘｇで遠心分離した。ここで取り出した上澄み液の９５％以上が溶解性のＨｉｎ４７タンパク質であり、これは保管した。ここで発生した分画を「Ｈｉｎ４７・抽出液」と呼ぶことにした。
さらに、このＨｉｎ４７・抽出液をＤＥＡＥ・モデル・セファセル・カラム（Sephacel column）を使用して精製した。４０ｍｌのＨｉｎ４７・抽出液を２０ｍｌ型ＤＥＡＥ・モデル・セファセル・カラム（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０）に注入した。Ｈｉｎ４７はこの条件下でカラムに付着した。さらに、このカラムを、１００ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８・０）、２０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１００ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で順次洗浄した。Ｈｉｎ４７を４０ｍＭ塩化ナトリウム含有の５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で希釈した。ＢＣＡタンパク質検定法で分画内のＨｉｎ４７を定量した。達成されたＨｉｎ４７の純度をＳＤＳ−ＰＡＧ分析法で測定した。Ｈｉｎ４７を含む分画を組み合わせた状態で、−２０℃で保管した。
顆粒分画として生産された突然変異体の殆どを占める野生型Ｈｉｎ４７タンパク質と同程度の溶解性があるタンパク質は、突然変異体であるＨ９１Ａだけであった。
実施例８
この実施例は、Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７の抽出と精製プロセスを示している。
Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７は大腸菌の顆粒分画中に発現された。２５０ｍｌ培養液から取り出した細胞ペレット（実施例６で調製したもの）を４０ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で再懸濁し、音波処理（３ｘ１０分、７０％効率サイクル）で破壊した。抽出液を２０、０００ｘｇで遠心分離し、取り出した細胞ペレットを保管した。その細胞ペレットを４０ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸、０．５％トリトン・Ｘー１００、１０ｍＭ・ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で再抽出した。懸濁液を音波処理（１０分、７０％効率サイクル）を行った。抽出液を３００ｘｇで５分間遠心分離を行った。ここで取り出した上澄み液を２０、０００ｘｇで３０分間遠心分離をして、発生した細胞ペレットを保管した。その細胞ペレットを５０ｍＭトリス塩酸、０．５％トリトン・Ｘー１００、１０ｍＭ・ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で再抽出した。懸濁液を８Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）と混合した。５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を使用して、混合液内の尿素の濃度を２Ｍに調製した。Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７はこの条件で完全に溶解した。この溶液の最終量は２０ｍｌであった。この分画を「Ｈｉｎ４７類似体ー抽出液」と呼んだ。Ｈｉｎ４７類似体ー抽出液をＤＥＡＥ・モデル・セファセル・カラムで精製した。２０ｍｌのＨｉｎ４７・類似体ー抽出液を１０ｍｌ型ＤＥＡＥ・モデル・セファセル・カラム（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０）に注入した。Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体は、この条件でカラムに付着した。さらに、このカラムを５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８・０）で洗浄し、Ｈｉｎ４７類似体を３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で希釈した。この分画中にあるＨｉｎ４７類似体の量をＢＣＡタンパク質検定法で測定した。Ｈｉｎ４７類似体の純度をＳＤＳ−ＰＡＧ分析法で測定した（図６）。Ｈｉｎ４７を含む分画を組み合わせて−２０℃で保管した。
実施例９
この実施例では、Ｈｉｎ４７とＳｅｒー１９７をアラニンで置換して合成されたＨｉｎ４７類似体のプロテアーゼ活性を示している。
Ｈｉｎ４７とＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の酵素活性を、基質としてベータ・カゼインを使用して分析した（図７）。この反応混合物には、５μｇのベータ・カゼインと、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体のいずれかを含む。反応を３７℃で２時間進行させ、その後、ＳＤＳーサンプル緩衝液を添加し、直ちに１００℃で５分間熱することで停止した。アリクオット（部分サンプル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図７で示されているように、Ｈｉｎ４７によるベーター・カゼインの消化は、２時間後には明白であり（パネルＡ、行１）、その消化の程度はＨｉｎ４７類似体を含む画分よりも強く（パネルＡ、行２）、しかも、外因性のタンパク質は関与してない（パネルＡ、行３）。これらの混合物の中のＨｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の存在は、Ｈｉｎ４７に対するモノクローナル抗体を使用したイムノブロット法により確認された（図７、パネルＣ、行１、２）。
４℃および−２０℃という条件下での、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の自己消化の分析を通して、Ｈｉｎ４７およびＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体での活性を比較した。そのために、精製したＨｉｎ４７またはその類似体を４℃か−２０℃のいずれかの温度で２０日間保存した。保存後、ゼロ日目、１０日目、２０日目にアリクオットを取り出し、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の熱安定性を、Ｈｉｎ４７モノクローナル抗体を使用したイムノブロット法で分析した（図８）。４℃か−２０℃のいずれかの温度で２０日間保存した場合に、Ｈｉｎ４７よりもＨｉｎ４７類似体のほうが熱的に安定であった。
Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体のプロテアーゼ活性をさらに詳しく試験するために、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の８０ーｋＤａ・H.influenzae組み換え抗原を崩壊させる能力を測定した。Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の、他の抗原に対する酵素分解作用を測定するために混合抗原試験を行った。本試験では、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体（４７ｋＤａ）と区別するため、８０ーｋＤａ・H.influenzae組み換え抗原（ＴＢＰ１）を選択した。５種類の混合物質は下記のように調製した。８０ーｋＤａタンパク質のみ、８０ーｋＤａタンパク質＋Ｈｉｎ４７、８０ーｋＤａタンパク質＋Ｈｉｎ４７類似体、Ｈｉｎ４７のみ、Ｈｉｎ４７類似体のみ。混合物質における各タンパク質の量はいずれも５μｇであった。混合物質は４℃で４週間保存した。保存後、ゼロ日目、７日目、１４日目、２８日目ににアリクオットを取り出しＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った（図９）。１週間後に、この８０ーｋＤａタンパク質とＨｉｎ４７の両方が大きく崩壊した（２、４行）。これとは対照的に、８０ーｋＤａタンパク質とＨｉｎ４７類似体を組み合わせた混合物では、１週間後にも元のままであり、４週間後に僅かに崩壊を示しただけであった（行３）。
他のＨｉｎ４７類似体のプロテアーゼ活性について、リプンシカら（Lipinska et al）が提唱した方法で、ベータ・カゼインの酵素消化反応を利用して評価を行い、その結果を表３に示した。一個の突然変異体（Ｄ１２１Ｅ）だけにセリンプロテアーゼ活性を保持していることが観察された。
実施例１０
この実施例は、マウスにおけるＨｉｎ４７とＨｉｎ４７類似体の免疫原性の比較を示している。
図１０は、Ｈｉｎ４７とＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の免疫原性に関する比較試験結果を示してある。１群あたり５匹のBalb/cマウスで構成される群を５群用意して、１回あたり１μｇのＨｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体のいずれかを、ＡＬＰＯ4（１投与量あたり１．５ｍｇ）の存在下で、１日目、２９日目、４３日目に１日３回皮下に注射した。注射後、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目に採血をして（これは、それぞれ、血液標本１、２、３、４として表示されている）、ＥＩＡ法により、抗Ｈｉｎ４７・抗体の力価を分析した。マウス血清における抗Ｈｉｎ４７・抗体は、パネツティ（Panezutti et al, 1993）らの方法で測定した。マイクロタイター・ウエルに１μｇのＨｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体のいずれかを、コーテングして室温で１６時間放置した。プレートはＰＢＳ内で０．１％ウシ血清アルブミンを入れブロックした。マウス血清を段階希釈してウエルに添加した後、室温で１時間培養した。ペルオキシダーゼと接合したヤギ・抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体をアフィニテー精製したＦ（ａｂ’）2フラグメントを第二の抗体として使用した。テトラメチルベンジデン（ＴＭＢ・Ｈ2Ｏ2）を使用して反応を進行させ、フロー・マルテスカン（Mutiskan）・ＭＣＣ・マイクロプレート・リーダーで、波長４５０ｎｍ（基準の波長は５４０ｎｍを使用）での吸光度を測定した。抗血清の反応力価を希釈度の相関として定義したが、これは注射をしてない血清サンプルの２倍の吸光度を示した。図１０から分かるように、マウスでは、Ｈｉｎ４７とＨｉｎ４７類似体の両方とも、Ｈｉｎ４７または突然変異体がＥＩＡ法での抗原として使用できるかどうかとは関係なく、相当なＩｇＧ力価を示した。
Ｈ９１ＡＨｉｎ４７類似体を使用した免疫原性研究も行った。この類似体はＳ１９７ＡＨｉｎ４７類似体と同等の免疫応答を示すことが分かった。
Ｈｉｎ４７またはＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体に対する免疫応答をさらに試験するために、マウス血清での抗Ｈｉｎ４７・ＩｇＧのサブクラスを測定した。マイクロタイター・ウエルに１μｇの精製したＨｉｎ４７または類似体のいずれかをコーテングした。免疫原性比較研究のために用意したマウス血清最終サンプルをプールして、ＥＩＡ法により試験した。このＥＩＡ試験では、抗原として、ペルオキシダーゼと結合させたラット・抗マウス・ＩｇＧ、ＩｇＧ2a、ＩｇＧ2b、およびペルオキシダーゼと結合させたウサギ・抗マウスＩｇＧ3を使用した。交差反応を避けるために、精製した抗体サブクラスを使用して、各抱合体の希釈液を測定した。上記で述べた方法で、反応力価を測定した。表１で示したように、マウスにおいて、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体のいずれかにより誘導されたＩｇＧサブクラスは、同一であり、このことはＨｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体が個体抗原としてＥＩＡ法に使えるかどうかとは関係がない。マウス血清の両グループのうち、顕著なＩｇＧ応答を示したのはＩｇＧ１・イソタイプであった。従って、Ｈｉｎ４７類似体は、実質的に天然タンパク質と同じ免疫原性を示したことになる。
実施例１１
本実施例は、Ｈｉｎ４７またＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の免疫防御能を示している。
幼若ラットの菌血症モデルにおける、Ｈｉｎ４７・特異的抗血清の、H.influenzae菌ｂ株由来ＭｉｎｎＡに対する防御能から、Ｈｉｎ４７またはＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の免疫防御能を分析した。表２にはこの結果を示してある。０．１ｍｌのウサギ・抗Ｈｉｎ４７類似体・抗血清または同等の採血前血清のいずれかを、日齢６日のウイスター幼若ラット群の頚部に近い背部皮下に接種した。さらに、これらの群に、２４時間後に７００cfuの増殖させたばかりの新鮮なＨｉｂ株ＭｉｎｎＡを腹腔内投与した。２０時間後に、腹腔内投与されたラットから採血をして、チョコレート寒天プレートに移し培養した。２４時間後には細菌コロニーのカウントができた。表２に示したように、抗Ｈｉｎ４７類似体・抗血清を接種した群の９匹のうち３匹には、その血液中に菌血症は認められなかった。Ｈｉｎ４７類似体・抗血清（１１％）を接種した群の中で、採血前血清を接種したマウスに較べて、血液からの菌の回収量が高かったのは１匹だけであった。これとは対照的に、採血前血清を接種された９匹のマウス全部において菌が回収された。採血前血清を接種した９匹のうち４匹（４４％）において、血液中の細菌の数（５００ー１０００）のレベルが高かった。
幼若ラットの菌血症モデルを、抗Ｈｉｎ４７・血清または抗Ｈｉｎ４７・突然変異体・抗血清の、H.influenzae・タイプｂ株感染が原因で発症した菌血症に対する防御能を評価するために使用した。この幼若ラット１０匹のうち６匹において、これらの血清は野生型Ｈｉｎ４７、Ｈ９１Ａ・Ｈｉｎ４７、Ｓ１９７Ａ・Ｈｉｎ４７類似体に対する防御能を示した。
実施例１２
本実施例は、ストレス負荷の条件下でのＨｉｎ４７合成の誘導を示している。
H.influenzae株Eaganをヘミン（２μｇ・ｍｌ-1）とＮＡＤ（２μｇ・ｍｌ-1）を含んだＢＨＩ液体培養基内で３７℃で、Ａ590=0.3の条件で増殖させた。このサンプル・アリクオットを取り出して、３７℃、４２℃、４３．５℃で、または、６％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、または、０．３塩化ナトリウムの存在下で増殖させた。大腸菌株ＪＭ１０９を、ＹＴ培養基内で３７℃で、Ａ590=0.3の条件下で増殖させ、上記と同じ方法でアリクオットを取り出した。サンプルを０分、２０分、４０分、６０分、９０分後に収集して、ＯＤ法およびＳＤＳ−ＰＧＥ／ウエスタンブロット法で分析した。H.influenzae・Hin47とE.coli・htrAを認識するモルモット抗血清を、ウエスタンブロット法分析に使った。４３．５℃で増殖させた時に、大量のE.coli・htrA・タンパク質が合成され、H.influenzae・Hin47・タンパク質は少量しか認められなかった。６％エタノールを含む培地で増殖させることで、E.coli・htrA・タンパク質とH.influenzae・Hin47・タンパク質の両方の合成が誘導された。塩の含有が多いと、このタンパク質のいずれか一方の合成が弱くなった。これらの結果は、Ｈｉｎ４７がストレス応答タンパク質であり、類似の条件で、E.coli・htrA・タンパク質の合成が誘導されることを示している。
実施例１３
本実施例は、Ｈ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質の精製を示している。
この溶解性のＨ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質を、実施例７での野生型Ｈｉｎ４７タンパク質の場合と同じ方法に、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラムを追加した方法で精製した。ＨＡＰカラムには１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を入れ、ＤＥＡＥカラムをセットした。Ｈ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質がＨＡＰカラムに付着した。汚濁タンパク質は１７５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄して除去した。３００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出したＨ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質を−２０℃で保存した。
実施例１４
本実施例はチンチラネコの中耳炎モデルにおけるＨｉｎ４７およびＨｉｎ４７突然変異体の防御能を示したものである。
野生型のＨｉｎ４７、Ｈ９１Ａ・Ｈｉｎ４７、Ｓ１９７Ａ・Ｈｉｎ４７による能動免疫化が引き起こす防御能の評価のために、チンチラネコの中耳炎モデルを使用した。
ＡＩＰＯ４と抱合しているＨｉｎ４７（Ｈ９１Ａ）またはＨｉｎ４７突然変異体（Ｓ１９７Ａ）を、一回投与量で３０μｇ、１日目、２８日目、４２日目にチンチラネコの筋肉内に１日３回接種した。５６日目にこのチンチラネコに、５０ー１０００ＣＦＵ（コロニー形成単位）の細菌・ビルレントＮＴＨｉ株ＳＢ１２を接種した。鼓膜切開と耳鏡検査でモニターした後、接種後４日目に中耳浸出液を取り出しチョコレート寒天培地で培養した。２４時間後に細菌コロニーをカウントした。野生型のＨｉｎ４７およびＨ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質はこの実験動物の５０％に防御能を与えるが、Ｓ１９７Ａ・Ｈｉｎ４７には防御能はない。
開示内容の要約
本発明は、プロテアーゼ活性を天然のＨｉｎ４７タンパク質の約１０％まで低下させた新規のH.influenzae菌由来Ｈｉｎ４７タンパク質類似体および、このＨｉｎ４７タンパク質をコーデングする分離・精製ＤＮＡを供給するものである。本発明の範囲内でのタンパク質修飾が可能である。
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配列表
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：塩基対２８９４個
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｉｉ）分子の型
（xi）配列の名称：配列番号１
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0004184430.tif 000007
（２）配列番号２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ：４６３アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（xi）配列の名称：配列番号２
0004184430.tif 000008
0004184430.tif 000009
（２）配列番号３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：塩基対４１個
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号３
0004184430.tif 000010
（２）配列番号４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸３７個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号４
0004184430.tif 000011
（２）配列番号５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸４７２個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号５
0004184430.tif 000012
0004184430.tif 000013
（２）配列番号６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸４７５個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号６
0004184430.tif 000014
0004184430.tif 000015
（２）配列番号７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２２８個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号７
0004184430.tif 000016
（２）配列番号８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２３２個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号８
0004184430.tif 000017
（２）配列番号９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２２３個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号９
0004184430.tif 000018
（２）配列番号１０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２２８個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１０
0004184430.tif 000019
（２）配列番号１１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２４０個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１１
0004184430.tif 000020
（２）配列番号１２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２２４個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１２
0004184430.tif 000021
（２）配列番号１３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸２２３個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
0004184430.tif 000022
（２）配列番号１４の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸１８５個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１４
0004184430.tif 000023
（２）配列番号１５の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸１８１個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１５
0004184430.tif 000024
（２）配列番号１６の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸１９８個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１６
0004184430.tif 000025
（２）配列番号１７の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸７個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１７
0004184430.tif 000026
（２）配列番号１８の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸７個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１８
0004184430.tif 000027
（２）配列番号１９の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸１４個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号１９
0004184430.tif 000028
（２）配列番号２０の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：塩基対２２個
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号２０
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（２）配列番号２１の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：塩基対２１個
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号２１
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（２）配列番号２２の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：塩基対２１個
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号２２
0004184430.tif 000031
（２）配列番号２３の情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ：アミノ酸１１個
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の状態：単鎖
（Ｄ）形態：直線
（ｘｉ）配列の名称：配列番号２３
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
0004184430.tif 000037
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
0004184430.tif 000048
【図５Ａ】
0004184430.tif 000049
【図５Ｂ】
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【図６】
0004184430.tif 000051
【図７】
0004184430.tif 000052
【図８】
0004184430.tif 000053
【図９】
0004184430.tif 000054
【図１０】
0004184430.tif 000055
【図１１Ａ】
0004184430.tif 000056
【図１１Ｂ】
0004184430.tif 000057
【図１２】
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