(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オンコスタチンＭ受容体遺伝子が破壊された、オンコスタチンＭ受容体遺伝子欠損動物（ヒトを除く）から成る肝障害モデル動物作出用動物に肝臓毒を投与して肝障害を誘発した肝障害モデル動物。
【請求項２】
前記動物がマウスである請求項１記載の肝障害モデル動物。
【請求項３】
破壊されたオンコスタチンＭ受容体遺伝子がホモ接合となっている請求項１又は２記載の肝障害モデル動物。
【請求項４】
インターロイキン−６遺伝子がさらに破壊されている請求項１ないし３のいずれか１項に記載の肝障害モデル動物。
【請求項５】
破壊されたインターロイキン−６遺伝子がホモ接合となっている請求項４記載の肝障害モデル動物。
【請求項６】
肝障害に対する薬物評価、肝再生促進因子の探索又は肝細胞移植評価用である請求項１ないし５いずれか１項に記載の肝障害モデル動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オンコスタチンＭ受容体遺伝子欠損動物及びその肝障害モデル動物作出用としての用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、肝疾患治療薬等の探索や、肝細胞又は肝幹細胞移植の評価のための肝疾患モデル動物としては、正常なマウスやラットに四塩化炭素やD-ガラクトサミン等の肝臓毒を投与したものが広く用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、肝臓は極めて回復力に富む臓器であり、肝臓毒を１回投与された動物の肝臓も、速やかに回復して元の状態に戻る。例えば、四塩化炭素をマウスに投与した場合、中心性壊死や、細胞の破壊を示す血中GPT活性が、投与４８時間後にピークを迎え、その後急速に回復し、投与７２時間後には血中GPT活性が正常レベルにまで回復する。従って、このような肝障害モデル動物を用いた場合には、薬効を発揮するまでに時間がかかる薬剤の探索や評価を行うことが困難であり、また、肝臓は、薬剤を投与しなくても急速に回復していくので、薬効を正確に評価するためには適していない。もし、肝臓毒を投与した後の肝臓の回復が正常な動物よりも遅れる動物がいれば、肝疾患治療薬等の探索や、肝細胞又は肝幹細胞移植の評価のための肝疾患モデルとしてより好ましい。
【０００４】
従って、本発明の目的は、肝臓毒を投与した後の肝臓の回復が正常な動物よりも遅れる動物を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、オンコスタチンＭ受容体遺伝子を破壊したマウスに肝臓毒を投与すると、正常なマウスに比べ、誘発される肝障害が広範囲かつ持続的で、回復が遅れることを見出し、さらに、このようなマウスが従来の肝疾患モデルよりも肝疾患モデルとして有利であることに想到し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、オンコスタチンＭ受容体遺伝子が破壊された、オンコスタチンＭ受容体遺伝子欠損動物（ヒトを除く）から成る肝障害モデル動物作出用動物に肝臓毒を投与して肝障害を誘発した肝障害モデル動物を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明の動物は、オンコスタチンＭ受容体（以下、「OSMR」と言うことがある）遺伝子が破壊されたものである。破壊するOSMR遺伝子は、OSMRα遺伝子でも同受容体β遺伝子でもよい。また、動物種も限定されず、いかなる種でもよいが（ただし、ヒトを除く）、胚性幹細胞(ES)細胞の入手容易性等の観点からマウスが好ましい。また、破壊されたOSMR遺伝子がホモ接合となっている動物が好ましい。以下、破壊されたOSMR遺伝子がホモ接合になっている動物を「OSMR -/-」のように記載することがある。ここで、「−」は正常な遺伝子を有さないことを意味し、正常な遺伝子を有する場合は「＋」で表す。従って、野生型は「OSMR +/+」、正常OSMR遺伝子と破壊されたOSMR遺伝子のヘテロ接合は、「OSMR
+/-」と表記することがある。
【０００８】
OSMR遺伝子に加え、さらにインターロイキン−６（以下、「IL-6」と言うことがある）遺伝子が破壊された動物では、肝臓毒により肝疾患を誘発した後の肝臓の回復がさらに遅れるので、肝疾患モデルとしてさらに好ましい。IL-6遺伝子についても、破壊されたIL-6遺伝子がホモ接合になっている動物が好ましい（OSMR遺伝子の場合と同様、「IL-6 -/-」のように表記することがある）。
【０００９】
OSMR遺伝子自体は周知であり、その塩基配列も決定されている（GenBank Accession No.AB015978）。また、遺伝子ターゲティング法を用いたノックアウトマウスの作出方法も周知であり、確立されているので、OSMR遺伝子欠損マウスの作出自体は、常法に基づいて行うことができる。例えば、下記実施例において詳述するように、次のようにして作出することができる。すなわち、ゲノム上のOSMRタンパク質をコードする遺伝子部分に、外来のLacZ及びネオマイシン耐性遺伝子を挿入してOSMR遺伝子を破壊したターゲティング・ベクターを作製する。これをマウスES細胞にエレクトロポレーション法等によって導入し、相同組み換えを起こしたES細胞をクローニングする。このES細胞をマウスの胚盤胞(blastocyst)内にマイクロインジェクションした後、仮親の子宮内に戻すことでキメラマウスを出産させる。このキメラマウスを野生型マウスと交配し、生まれたマウスの中から、一対の染色体のうち片方のOSMR遺伝子が破壊されたマウスを得る。これらのマウス同士を交配することで、染色体上で完全にOSMR遺伝子が欠損した（OSMR -/-）ノックアウトマウスを作製することができる。
【００１０】
また、IL-6遺伝子を破壊したノックアウトマウス（IL-6 -/-)は、周知である（例えば、Cressman, D.E. et al. (1996) Nature 274: 1379-1383; Kovalovich, K. et al., (2000) Hepatology 31: 149-159）ので、周知のIL-6ノックアウトマウスと、上記方法により作出されるOSMRノックアウトマウスとの交配を繰り返すことで両方の遺伝子が破壊されたマウスを作製することができる。
【００１１】
下記実施例において具体的に示されるように、OMSR遺伝子欠損動物は、四塩化炭素等の肝臓毒を投与することにより誘発される肝障害が、正常動物に比較してより長期間に亘って持続し、障害も広範囲である。従って、OMSR遺伝子欠損動物は、肝障害モデル動物の作出用動物として適している。
【００１２】
肝障害モデル動物は、上記動物に対し、従来と同様に、肝障害を誘発する肝臓毒を投与することにより容易に得ることができる。肝障害を誘発するための肝臓毒としては、従来より広く用いられている四塩化炭素やＤ−ガラクトサミン等の公知の肝臓毒のいずれをも用いることができ、その投与量も従来と同様でよい。四塩化炭素を用いる場合、例えば、濃度２０〜３０％程度の四塩化炭素溶液を、４〜８μＬ／ｇ体重程度投与することにより効果的に肝障害を誘発することができる。
【００１３】
下記実施例において、具体的に示されるように、四塩化炭素投与後、野生型マウスでは、四塩化炭素投与48時間において、中心性壊死、血清GOT, GPT活性が最大となり、それ以降回復に向かっていることが示された。一方、OSMR -/- マウスでは壊死の範囲が非常に広くに渡っており、また72時間においても改善されず、持続的な肝障害が観察された。また、TIMPの発現誘導が著しく阻害されていることに起因する、細胞外マトリックスの再構築の障害も認められた。これらの結果はOSMが生体内において、肝障害の軽減化、組織修復を促進する活性を持っていることを示唆する。野生型マウスよりも、広範囲かつ持続的な肝障害が誘発され、容易に慢性化することが予想されるOSMR-/-マウス、およびIL-6/OSMR -/-マウスは、通常のマウスやラットを用いた肝障害モデル動物よりも、より薬物の薬効を評価する系として適している。また、OSMRのシグナルの下流、すなわちOSMRにより誘導される遺伝子の中に、抗肝炎の薬剤ターゲットが含まれることを意味しており、このマウスを用いることによって新規ターゲット遺伝子の同定、それらターゲットの発現や活性を制御する薬剤のスクリーニングなども可能になる可能性がある。
【００１４】
また、人工肝臓の構築や、肝臓移植に替わる治療法として期待されている肝細胞移植、肝幹細胞移植を考えた場合、採取した成熟肝細胞や肝幹細胞を生体外で増やす必要がある。肝再生という現象からも分かるとおり、肝細胞は生体内においては、高い増殖力をもつ細胞であり、肝細胞に対する増殖因子としてはHGFやEGFが知られている。しかしながら、残念なことに、現段階においては、これらの増殖因子をもってしても肝細胞を生体外で増やすことは出来ていない。この事は、肝再生における肝細胞の増殖機構が十分にわかっていない事が原因である。本発明により、OSMR -/-マウス、およびIL-6/OSMR -/- マウスは肝障害後の残存肝細胞の増殖が著しく阻害されていることがわかった。これらマウスを利用して肝細胞増殖機構、肝細胞増殖促進因子の探索が可能であり、そこから得られるであろう成果は、上記の臨床応用にも有用となるはすである。
【００１５】
さらに、ドナー不足が深刻な肝臓移植に替わる次世代の医療として肝細胞移植や肝幹細胞移植が期待されている。これら細胞移植の評価は、個体への移植実験が必須である。成体の肝臓は非常に再生力に富んだ臓器であり、通常の肝切除術や四塩化炭素などの肝臓毒による肝障害においては、残存肝の成熟肝細胞の速やかな増殖により、平均して約1.7回の分裂で元の体積に戻るとされており、移植したドナー細胞が生着し十分に増殖するだけのキャパシテイーがない。従来、ラットにおいては、レトロシンなどのアルキル化剤を投与し、レシピエントの肝細胞の増殖を阻害するような前処理を施すことが行われているが、この前処理には１ヶ月程度の時間が必要であり不便であった。本発明によって、OSMR -/- マウス、およびIL-6/OSMR -/- マウスは、障害後の肝細胞の増殖が著しく阻害されていることが明らかになった。この結果から、これらマウスは上記のような前処理を施すことなく、細胞移植のレシピエントマウスとして利用することが可能であると考えられる。
【００１６】
このように、OSMR遺伝子欠損動物に肝臓毒を投与して肝障害を誘発した動物は、肝障害モデル動物として有用であり、特に、肝障害に対する薬物評価、肝再生促進因子の探索又は肝細胞移植評価に有用である。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１８】
材料と方法
(1)  OSMR, IL-6/OSMR ノックアウトマウスの作製
ゲノム上のOSMRβタンパク質をコードする遺伝子の開始メチオニン（図１のaにおいて「ATG」と記載）直下に、外来遺伝子であるLacZ (GenBank Accession No.V00296)およびネオマイシン耐性遺伝子(Neo)（GenBank Accession No.E00425)を挿入してOSMR遺伝子を破壊したターゲティング・ベクターを作製した。ターゲティング・ベクターは、図１のbに示す構造を有しており、野生型OSMRβ遺伝子のHindIII/BglII断片をApaI及びSacIIで切断し、この部分にLacZ及びNeoを挿入した。このターゲティング・ベクターは、LacZ/Neoの上流及び下流に、それぞれ1．5kbと６kbのマウスゲノム配列と相同な領域を有する。
【００１９】
このターゲティング・ベクターを、常法に基づきマウスES細胞にエレクトロポレーション法によって導入し，G418添加培地でネオマイシン耐性遺伝子を有するクローをまず選択した。次に、得られたクローンからゲノムDNAを調整し、Hind III もしくはEco RVの制限酵素で消化した後、生じる断片の変化をサザンブロット法及びＰＣＲで解析することにより、目的の位置に相同組み換えを起こしたES細胞をクローニングした。なお、サザンブロットに用いたプローブの位置は、図１のａに白抜きの四角形で示してある。また、サザンブロットの結果は、図１のｄに示されている。また、ＰＣＲには、２種類のプライマーペアを用いた。用いたプライマーペアの位置をそれぞれ、図１のａ及び図１のcに黒い矢印で示す。正常遺伝子では、図１のａに示されるように364 bpの領域が増幅され、破壊された遺伝子では図１のcに示されるように750 bpの領域が増幅される。サザンブロット及びＰＣＲ産物を電気泳動した結果が図１のd及びeに示されている。
【００２０】
このES細胞をブラストシスト・インジェクション法によりマウスのブラストシスト内にマイクロインジェクションした後、それを仮親の子宮内に戻すことで、体細胞が部分的に導入ES細胞に由来するキメラマウスを出産させた。続いて、このキメラマウスを野生型マウスと交配し、生まれたマウスの中から、全体細胞において２対の染色体のうち１つのOSMR遺伝子が破壊されたマウスを得た。これらのマウス同士を交配することで、染色体上で完全にOSMR遺伝子が欠損したノックアウトマウスを作製した。また、このOSMRノックアウトマウスとIL-6ノックアウトマウスの交配を繰り返すことで、両方の遺伝子が破壊されたマウスを作製した。得られたマウスのOSMR遺伝子又はOSMR/IL-6遺伝子が破壊されていることは、上記と同様なサザンブロット法および新生児肺におけるノーザンブロット法により確認した。なお、ノーザンブロット法に用いたプローブは、OSMR遺伝子のコーディング領域に含まれる1218 bpをＰＣＲで増幅したものを使用した(5'-プライマー： atccaaaggctccgcaggac; 3'-プライマー： agcgtgcatctggagttgtg)。
【００２１】
(2)  四塩化炭素による急性肝障害
実験には10週齢から12週齢の野生型マウス（C57/BL6）、OSMR -/-、およびIL-6/OSMR -/-の雄を使用した。25% 四塩化炭素溶液（オリーブオイルで希釈）を6 μL/g (体重)で腹腔内投与した。各群２から３匹のマウスを四塩化炭素投与後、0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 60, 72, 96, 120時間後にネンブタール麻酔下、腹部大静脈より採血した後、頚椎脱きゅうにて屠殺した。次いで肝臓を摘出し組織化学、免疫組織化学、遺伝子発現解析に使用した。
【００２２】
(3)  血清肝障害マーカーの測定
血清GOT活性およびGTP活性の測定は、GOT-UVテストワコー、GPT-UVテストワコー（和光純薬工業）を用い、キット添付のプロトコルに従い測定した。
【００２３】
(4)  組織化学および、免疫組織化学
クリオスタットを用いて、7 μmの肝臓凍結切片を作製し、4 %パラホルムアルデヒド、またはアセトンで固定した。組織化学はヘマトキシリン・エオジン染色を行い、増殖細胞核抗原 (PCNA)に対する免疫染色は、抗PCNA抗体（ラットIgG）、ビオチン化抗ラットIgG, ストレプトアビジンHRPをそれぞれ反応させ、DABを基質とした反応によって染色を行った
【００２４】
(5)  ノザンブロットによる遺伝子発現解析
採取した肝臓からTrizol試薬（ニッポンジーン）を用いてRNAを抽出した。1レーンあたり10マイクログラムの全RNAを、ホルムアルデヒド変性ゲルにて電気泳動したのち、ナイロン膜に転写した後、DIGラベルしたcDNAプローブを用いてハイブリダイズを行った。バンドの検出は、CDP-starを基質とした化学発光により行った。
【００２５】
(6)  ゼラチンザイモグラフィー解析
1レーン当たり80マイクログラムの肝臓抽出液を、非還元化、0.1%ゼラチンを含む8% SDS-PAGEで分離した後、ゲルを2.5% Triton X-100（登録商標）で洗浄し（30分X 2）、反応液（50 mM Tris-HCl (pH7.5)/150 mM NaCl/10 mM CaCl2）中で、37℃で24時間反応させた後、CBB染色を行い、次いで脱色処理をおこなった（メタノール30／酢酸10／水 60）。In situ ゼラチンザイモグラフィーはゼラチン膜をコートしたポリエステルフィルム（富士フィルム）上に肝臓新鮮凍結切片を張り付け、37℃で3時間反応させた後、Biebrich Scarletによって染色を行った。顕微鏡で観察した。
【００２６】
結果
(1)  OSMR-/-マウス、IL-6/OSMR -/-マウスにおける急性肝障害の悪化
マウスに四塩化炭素を単回投与すると、肝のチトクロームP-450によって四塩化炭素からフリーラジカルが生じ、これによって肝小葉中心部の肝細胞が障害されて、まず肝細胞の細胞膜透過性が増大し、GPTやGOTといった肝特異的酵素の血中への漏えいが起き、それに続きいわゆる中心性壊死が引き起こされる (Recknagel, R. et al., (1989) Pharmacol. Thr. 43: 139-154)。顕微鏡観察の結果、OSMR-/-マウスでは四塩化炭素投与後、広範囲にわたる肝細胞壊死が観察され、投与72時間後においても持続していた。またOSMR-/-マウスの肝臓では四塩化炭素投与により、顕著な脂肪滴の蓄積が観察され、この事からもより強い障害が起きていることが示された。同様にIL-6/OSMR -/-マウスでは、投与後84時間においても顕著な肝細胞壊死が観察された。肝障害マーカーである血清GOT、およびGPT活性は、投与後48時間までの上昇率は野生型、OSMR-/-ともに同様の推移を示したが、それ以降、野生型マウスではGPT, GOT両活性ともに急速に減衰していくのに対して、OSMR-/-マウスでは明らかな回復の遅延が観察され、特にGOT活性については、72時間までほぼピーク値を保っていた（図２、図３）。なお、図２及び図３中、「WT」は野生型マウス、「KO」はOSMR-/-マウスについての結果を示す。
【００２７】
(2)  OSMR-/-マウス、IL-6/OSMR -/-マウスにおける肝再生の遅延
肝障害により肝実質が失われると、失われた肝組織を修復すべく肝細胞の増殖のスイッチが入り、肝再生がスタートする。四塩化炭素投与48時間における肝細胞の増殖を抗増殖核抗体を用いた免疫染色で調べた結果、OSMR-/-マウスでは、野生型マウスの約20%の肝細胞にしか増殖シグナルが入っておらず、非常に強く肝再生が抑制されていた（図４）。細胞周期制御タンパク質であるサイクリン- D, - A, - B, - Eの遺伝子発現の誘導も、OSMR-/-マウスでは発現時期が遅れており、かつ発現レベルも低く抑えられていた。IL-6/OSMR -/-マウスでは抑制がさらに強まり、調べたサイクリン遺伝子の発現誘導は検出限界以下であった 。
【００２８】
(3)  OSMR-/-マウス、IL-6/OSMR -/-マウスにおける細胞外マトリックス再構築の障害
肝再生過程において、肝臓がその構造を再構築する際には、細胞の増殖とあわせて、細胞外マトリックスの再構築がおこなわれる。事実、肝再生の初期に細胞外マトリックス分解酵素として知られるマトリックスメタロプロテアーゼ群 (MMPs)の発現が誘導され、続いてその阻害分子（TIMPs）が発現誘導されることが知られている。これらMMPsとTIMPsのバランスが崩れると、細胞外マトリックスの再構築のバランスが崩れ、ひいては肝繊維化などの病態をもたらすと考えられている。肝障害時のMMPs (特にゼラチナーゼ群)とTIMPs の発現を、ゼラチンザイモグラフィーとノザンブロットにより解析した結果、OSMR -/-マウスでは肝障害後のTIMP-1, 2の遺伝子発現が著しく抑制されており、そのことと対応してに、ゼラチナーゼ（特にMMP9）の活性が、野生型マウスと比べて強く、かつ持続していた。In situゼラチンザイモグラフィーにおいても、OSMR-/- マウスでは、より広い範囲で組織破壊がみられた。IL-6/OSMR -/-マウスにおいては、OSMR -/-マウスと比べて、より悪化しているかどうかは、現段階でははっきりしないが、野生型と比べると、明らかに高いゼラチナーゼ活性を維持していた。肝障害後の組織修復過程のバランスが崩れた両マウスは、野生型マウスよりも容易に慢性肝炎、肝硬変へと移行することが予想される。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、OSMR遺伝子欠損動物から成る肝障害モデル動物作出用動物から作出される肝障害モデル動物が初めて提供された。肝障害モデル動物作出用動物は、肝臓毒を投与して肝障害を誘発すると、誘発された肝障害の回復が正常動物よりも有意に遅れ、また、障害も広範囲でより悪化している。従って、肝障害モデル動物作出用動物に肝臓毒を投与して肝障害を誘発した動物は、肝障害モデル動物として有用であり、特に、肝障害に対する薬物評価、肝再生促進因子の探索又は肝細胞移植評価に威力を発揮するものと考えられる。
【００３０】
【配列表】
0004107838.tif 000002
【００３１】
0004107838.tif 000003
【００３２】
0004107838.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】図１のａは野生型OSMRβ遺伝子の制限酵素地図、翻訳開始コドンの位置、サザンブロット法に用いたプローブの位置、並びにＰＣＲに用いたプライマー及び増幅領域の位置と増幅領域のサイズを示す図である。図１のbは、構築したターゲティング・ベクターの構造を示す図である。図１のcは、図1のbに示すターゲティング・ベクターと相同組換えが起きた、破壊されたOSMRβ遺伝子の構造並びにＰＣＲに用いたプライマー及び増幅領域の位置と増幅領域のサイズを示す図である。図１のdは、サザンブロットの結果を遺伝子型と共に示す図である。図１のeは、ＰＣＲ産物を電気泳動した結果を遺伝子型と共に示す図である。
【図２】四塩化炭素を投与した野生型マウス及びノックアウトマウス(OSMR-/-)における、四塩化炭素投与後の時間と血中GPT活性との関係を示す図である。
【図３】四塩化炭素を投与した野生型マウス及びノックアウトマウス(OSMR-/-)における、四塩化炭素投与後の時間と血中GOT活性との関係を示す図である。
【図４】四塩化炭素を投与した野生型マウス及びノックアウトマウス(OSMR-/-)における、四塩化炭素投与後の時間と増殖細胞核抗原陽性細胞数との関係を示す図である。
【図１】
0004107838.tif 000005
【図２】
0004107838.tif 000006
【図３】
0004107838.tif 000007
【図４】
0004107838.tif 000008