(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵黄の脂質成分をエタノールで抽出して残るエタノールを含む脱脂卵黄残渣に所定量の塩類溶液を加えて抽出してエタノール濃度が5〜10(V/V)％の卵黄水溶性タンパク質溶液を調製し、該卵黄水溶性タンパク質溶液を陰イオン交換体カラムに接触させ、非吸着タンパク質を塩類溶液で洗浄除去した後、陰イオン交換体に吸着した卵黄抗体を塩類溶液で溶出回収することを特徴とする卵黄抗体の製造方法。
【請求項２】
卵黄が、抗原を免疫注射して過免疫状態にした産卵鶏から得られる当該抗原に対する特異的抗体を含有する卵黄である請求項１に記載の卵黄抗体の製造方法。
【請求項３】
脱脂卵黄残渣から卵黄水溶性タンパク質溶液を抽出する塩類溶液の濃度が0.03M〜0.1Mである請求項１に記載の卵黄抗体の製造方法。
【請求項４】
非吸着タンパク質を洗浄除去する塩類溶液の濃度が0.1M以下である請求項１に記載の卵黄抗体の製造方法。
【請求項５】
卵黄抗体を溶出回収する塩類溶液の濃度が0.15M以上である請求項１に記載の卵黄抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は鶏卵の卵黄に存在する卵黄抗体のワンステップ大量製造方法に関する。より詳しくは、産卵鶏が異物として認識するウイルス、微生物、タンパク質などを抗原として、産卵鶏を過免疫した後、その鶏卵卵黄から有機溶剤を用いて脂質を抽出して得られる脱脂卵黄残渣から卵黄抗体を高純度かつ高回収率で簡便に精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
卵黄に含まれる水溶性タンパク質として、α−リベチン、β−リベチン及びγ−リベチンが知られており、それぞれ、親鳥の血清アルブミン、α２−グリコプロテイン及びγ−グロブリン（卵黄抗体）と免疫学的に同等であることが証明されている。従って、γ―リベチンである卵黄抗体（以下、卵黄抗体という）は特異的抗体（ＩｇＹ）としての機能を有することから、機能性食品素材、機能性化粧品素材、医薬品及び研究用試薬としての応用が期待されている。
【０００３】
卵黄は、水分50％、脂質30％、タンパク質20％からなる複雑なエマルジョンであり、脂質のほとんどはタンパク質と結合したリポタンパク質として存在するため、卵黄抗体を精製する第一段階として、まず卵黄から脂質及びリポタンパク質を除去し、卵黄水溶性タンパク質溶液を調製する必要がある。脂質及びリポタンパク質の除去方法としては、例えば、有機溶媒、各種多糖類又はポリエチレングリコールを用いる方法等が報告されている（Polson, A. et al.,
Immunol. Commun. 9: 495‐514 (1980)、Jensenius, J. C.,
J. Immunol. Methods 46: 63‐68 (1981)、Hatta, H. et al.,
Agric. Biol. Chem. 54: 2531‐2535 (1990)、特開昭64‐38098号公報、Aulisio, C. G.,
Proc. Soc. Exp. Biol. 126: 312‐315 (1981)、Bade, H., J.
Immunol. Methods 72: 421‐426 (1984)）。
【０００４】
上記方法で得られた卵黄水溶性タンパク質溶液から卵黄抗体を精製する方法としてはいくつか知られているが、イオン交換クロマトグラフィー法と塩析法を組み合わせて行う方法が一般的である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来の方法では、卵黄抗体を高純度に精製するためには複数回（最低３回以上）の塩析操作が必要となり、非常に手間がかかり、また、卵黄抗体の回収率も低いという問題があった。
【０００６】
また、限界ろ過膜を用いて卵黄抗体を分離精製する方法も試みられているが、回収率が低く実用化には至ってない。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、有機溶剤による脱脂卵黄残渣から得られた有機溶媒を含有する卵黄水溶性タンパク質画分から卵黄抗体を簡便な操作で、しかも効率的に分離精製する方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、エタノールを含む脱脂卵黄残渣に所定量の塩類溶液を加えて、特定濃度のエタノールを含む卵黄水溶性タンパク質画分を得、該卵黄水溶性タンパク質画分をカラムクロマトグラフィーに供することにより、効率よく卵黄抗体を精製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明の卵黄抗体の製造方法は、卵黄の脂質成分をエタノールで抽出して残るエタノールを含む脱脂卵黄残渣に、塩類溶液を加えて抽出して得られるエタノール濃度が5〜10(V/V)％の卵黄水溶性タンパク質溶液を、陰イオン交換体カラムに接触させ、非吸着タンパク質を塩類溶液で洗浄除去した後、陰イオン交換体に吸着した卵黄抗体を塩類溶液で溶出回収することを特徴とする。
【００１０】
上記発明においては、卵黄が、抗原を免疫注射して過免疫状態にした産卵鶏から得られる当該抗原に対する特異的抗体を含有する卵黄を用いることが好ましい。
【００１１】
上記発明においては、脱脂卵黄残渣から卵黄水溶性タンパク質溶液を抽出する塩類溶液の濃度が０．０３Ｍ〜０．１Ｍであることが好ましい。
【００１２】
上記発明においては、非吸着タンパク質を洗浄除去する塩類溶液の濃度が0.1M以下であることが好ましい。
【００１３】
上記発明においては、卵黄抗体を溶出回収する塩類溶液の濃度が０．１５Ｍ以上であることが好ましい。
【００１４】
本発明によれば、鶏卵の卵黄に存在する卵黄抗体を高純度で大量に製造することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の卵黄抗体の製造方法について、各工程ごとに説明する。
【００１６】
（卵黄の脂質成分の除去）
まず、常法にしたがって卵黄粉末（あるいは生卵黄）をエタノールで脱脂して、脱脂卵黄粉末を調製する。脱脂に用いるエタノールの純度は、脂質を効率的に分離するために95(v/v)％以上が好ましく、99(v/v)％以上がより好ましい。
【００１７】
本発明において、原料として用いられる卵黄は、鳥類(鶏、七面鳥、アヒル等)の卵から調製したものであれば特に制限なく用いることができる。また、特定抗原(細菌、ウィルス、タンパク質、酵素、ホルモン、多糖類等)により人工的に免疫した鳥類の産卵した卵から調製されたのものであってもよい。
【００１８】
（卵黄水溶性タンパク質溶液の調製）
卵黄水溶性タンパク質溶液の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。
【００１９】
上記で得られたエタノールを含む脱脂卵黄に、得られる卵黄水溶性タンパク質溶液のエタノール濃度が5〜10(V/V)％となるように所定量（10〜20倍量）の塩類溶液を加えて、30分〜1時間撹拌して卵黄水溶性タンパク質を抽出した後、固液分離して卵黄水溶性タンパク質溶液を得る。
【００２１】
上記塩類溶液としては、例えばリン酸緩衝液、生理的条件リン酸緩衝液(PBS)、トリス緩衝液等を用いることもできるが、前記緩衝液に塩を添加したものを用いることが好ましい。なお、緩衝液のpHは6.0〜11.0が好ましく、7.0〜10.0がより好ましく、8.0が特に好ましい。
【００２３】
本発明に用いられる塩の種類は、NaCl、KCl、CaCl２、MgCl２、NaH２PO４、Na２HPO４、KH２PO４、K２HPO４、Na２SO４、K２SO４、(NH４)２SO４、及びMgSO４からなる群から選ばれた１種類以上のものを用いることが好ましい。特に、コストや味の点からNaClが好ましい。卵黄水溶性タンパク質画分を抽出する際の塩類溶液の塩濃度は０．０３〜０．１Ｍが好ましく、０．０４〜０．０８Ｍがより好ましく、０．０４〜０．０５Ｍが特に好ましい。塩を添加することにより、卵黄抗体をカラム精製する際、夾雑タンパク質を選択的に洗浄除去し、容易に卵黄抗体を溶出回収することができる。
【００２４】
卵黄水溶性タンパク質溶液がエタノールを含有することにより、卵黄抗体をカラム精製する際、夾雑タンパク質のほとんどが吸着せず洗浄除去され、容易に高純度の卵黄抗体を高回収率で溶出回収することができる。有機溶剤の濃度は、5〜10(v/v)％が好ましい。
【００２５】
（カラムクロマトグラフィー）
上記のようにして調製した卵黄水溶性タンパク質溶液を陰イオン交換体カラムクロマトグラフィーに供し、卵黄抗体を精製する。
【００２６】
すなわち、卵黄水溶性タンパク質溶液に含まれる卵黄抗体を陰イオン交換体カラムに吸着させた後、好ましくは塩濃度０．１Ｍ以下の溶液を流して非吸着の夾雑タンパク質を流出させる。そして、塩濃度０．１５Ｍ以上、より好ましくは塩濃度０．３Ｍの溶液を流してカラムに吸着した卵黄抗体を溶出させる。得られた溶出液には、主に卵黄抗体が含まれているが、若干のα−リベチンも含まれているため、常法により塩析操作を１回行うことにより、容易に卵黄抗体の純品を得ることができる。
【００２７】
本発明で用いられる陰イオン交換体の担体は特に限定されず、例えばセファロース、セファデックス、セルロースなどが挙げられる。
【００２８】
陰イオン交換体の担体に結合する解離基は特に限定されず、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、テトラメチルアンモニウム（ＱＡ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）などが挙げられる。  なお、上記卵黄水溶性タンパク質溶液は、カラムクロマトグラフィーに供する前にろ過等により清澄にしておくことが好ましい。また、ｐＨを調整してもよく、ｐＨ６．０〜１１．０が好ましく、ｐＨ７．０〜１０．０がより好ましく、ｐＨ８．０が特に好ましい。ｐＨの調製は、アルカリ側で緩衝能を有する緩衝液を用いて行うことが好ましく、例えばリン酸緩衝液を用いることができる。
【００２９】
【実施例】
以下に比較例、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
なお、実施例において卵黄抗体の活性回収率は、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定することにより行った。すなわち、抗原をコーティング（０．５μｇ／ウェル）した９６ウェルマイクロプレートに、各試料を添加して３７℃で２時間静置して抗原と卵黄抗体の反応を行った後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで充分洗浄した。
【００３１】
次いで、抗ニワトリＩｇＧ−アルカリフォスファターゼコンジュゲート（ザイメット社製）のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ希釈液を添加して、３７℃で１時間放置し、前記抗原と反応した特異的抗体と上記コンジュゲートとの反応を行った。
【００３２】
各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにて充分洗浄し、０．１％Ｐ−フェニルジソジウムホスフェート溶液（０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解）を基質として添加して、３７℃、３０分間酵素反応を行った後、２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加して反応を停止し、４０５ｎｍ波長での各ウェルの吸光度をプレートリーダーにより測定した。なお、対照としては試料の代わりにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いた。各試料あたり３ウェル用いた。
【００３３】
そして、各試料の示す吸光度の平均値から対照の吸光度を引き、それぞれの試料質量を乗じた値（総吸光度）を各試料の総抗体活性とし、卵黄粉末の総抗体活性を１００％として卵黄抗体の活性回収率を求めた。
【００３４】
また、以下の実施例において特異的抗体含有卵黄粉末（以下、単に卵黄粉末という）としては、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｖ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）を抗原として鶏の胸筋に免疫して得られた抗ＳＥ抗体が血中に産生された鶏より得られた卵（Ｄ．Ｔ．Ｆｒａｓｅｒら；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．，２６巻，３４７ページ，１９６２年）から、卵白を分離した卵黄を凍結乾燥法で粉末にしたものを出発原料とした。
【００３５】
実施例１（卵黄水溶性タンパク質溶液中の卵黄抗体活性回収率の検討）
卵黄粉末に３倍量のエタノールを添加し、室温で３０分〜１時間撹拌した後、ろ紙で濾過して脱脂卵黄部を回収した。得られた脱脂卵黄粉末（エタノールを含む）の質量に対して、１０倍量の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（０．０５ＭＮａＣｌ含有、ｐＨ８）を加え、室温で１時間撹拌した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、５℃）して、上清を回収し、卵黄水溶性タンパク質溶液（サンプル１）を調製した。
【００３６】
上記の脱脂操作をそれぞれ２、３、４回繰り返して調製した脱脂卵黄を用いて、同様にして卵黄水溶性タンパク質溶液（サンプル２〜４）を調製した。
【００３７】
一方、比較例としてλ−カラギナンを用いた方法（従来法）により、卵黄水溶性タンパク質溶液を調製した。すなわち、卵黄粉末を同量の脱イオン水で溶解し、その後３倍量の脱イオン水を添加してホモミキサーで均質化し卵黄液を調製した。次に卵黄の６倍量の脱イオン水にλ−カラギナン（卵黄重量の１％）を加えてホモミキサーで均質化した。このλ−カラギナン液に上記卵黄液をスパーテルで撹拌しながらゆっくり加え、細かい固まりが残る程度にかき混ぜ、室温で３０分間放置した。これを遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、５℃）し、沈殿（リポタンパク質）を除去した後、上清をろ紙で濾過して卵黄水溶性タンパク質溶液を得た（サンプル５）。得られた各卵黄水溶性タンパク質溶液の卵黄抗体活性回収率をＥＬＩＳＡ法により測定し、各卵黄水溶性タンパク質溶液の卵黄抗体の活性回収率を調べた。その結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
0004132832.tif 000002
【００３９】
表１から、エタノールを用いて脱脂した脱脂卵黄から調製したサンプル１〜４は、脱脂回数に関係なくλ−カラギナンを用いて調製したサンプル５に比べて卵黄抗体活性回収率が高く、卵黄抗体の活性を損失することなく効率よく抽出できることが分かる。
【００４０】
実施例２（カラムへの卵黄抗体の脱吸着条件の検討）
精製卵黄抗体凍結乾燥粉末を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、更にエタノール及び／又はＮａＣｌを添加して、下記表２に示す６種類のサンプルを調製してエタノール濃度及び塩濃度と卵黄抗体のカラムへの吸着性及びカラムからの溶出性について検討した。
【００４１】
【表２】
0004132832.tif 000003
【００４２】
なお、カラムクロマトグラフィーは以下の条件で行った。
カラム：モノＱカラム（ファルマルシア社製陰イオン交換体プレパックカラム）装置：ＦＰＬＣ  ファルマシア社製
検出：吸光度  ２８０ｎｍ
緩衝液：Ａ液：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）
Ｂ液：１ＭＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）
【００４３】
上記各サンプルをそれぞれカラムにアプライして、卵黄抗体をカラムに吸着させた後、上記の緩衝液を用いてＮａＣｌ濃度０〜０．５Ｍまでのグラジュエント溶出を行った。その結果を図１及び図２に示す。尚、図中の斜線は、グラジェント溶出の塩濃度を示す。
【００４４】
図１から、溶液中の塩濃度と卵黄抗体のカラム吸着性においては、０．１０Ｍ以下の塩濃度（サンプル６，７）であればグラジェント溶出前にピークが検出されないことから、カラム吸着性に全く影響を与えないことがわかる。一方、０．１５Ｍ以上の塩濃度（サンプル８，９）では、塩濃度がより高いサンプル９で、カラムに吸着されず素通りする卵黄抗体のピークが増加していることが分かる。
【００４５】
図２より、溶液中のエタノール濃度と卵黄抗体のカラム吸着性においては、エタノール含量が５（ｖ／ｖ）％（サンプル１０）では、卵黄抗体のカラム吸着性に全く影響を与えないが、エタノール含量が１０（ｖ／ｖ）％（サンプル１１）になるとカラムに吸着されずグラジェント溶出前に素通りする卵黄抗体がわずかに確認されることが分かる。また、塩とエタノールの相互作用による卵黄抗体のカラムへの吸着阻害はないことが分かる。
【００４６】
また、図１、２中のグラジェント塩濃度を示す斜線と卵黄抗体のピークの交点から示されるように、塩濃度０．３Ｍで卵黄抗体が溶出されることが分かる。
【００４７】
実施例３（抽出液中のエタノール濃度とカラム非吸着画分の洗浄性の検討）
実施例１と同様にして卵黄水溶性タンパク質溶液を調製した。すなわち、エタノールで３回脱脂して脱脂卵黄を得、残存したエタノールを含有させたままの脱脂卵黄から、０．０５ＭＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で抽出を行い、５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む卵黄水溶性タンパク質溶液（サンプル１２）を調製した。また、同様にして、１０（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む卵黄水溶性タンパク質溶液（サンプル１３）を調製した
【００４８】
また、上記の脱脂卵黄から、エタノールを完全除去した後、同様にしてエタノールを含まない卵黄水溶性タンパク質溶液（サンプル１４）を調製した。
【００４９】
上記の各サンプルを、０．０５ＭＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−カラム（商品名「ＦＰＬＣ」、ファルマルシア社製、以下単にカラムという）にそれぞれ供して、卵黄抗体をカラムに吸着させた後、ステップワイズ溶出法により、０．０５ＭＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに流し、非吸着画分を回収した。
【００５０】
そして、回収した非吸着画分をゲルろ過に供し、各タンパク含量を算出した。その結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
0004132832.tif 000004
【００５２】
表３から、エタノールを５％含むサンプル１２のカラム非吸着画分には、卵黄抗体が全く検出されず、全てカラムに吸着されていることが分かる。
【００５３】
一方、エタノールを１０％含むサンプル１３、エタノールを含まないサンプル１４のカラム非吸着画分には、卵黄抗体が検出され、完全にカラムに吸着されていないことが分かる。
【００５４】
更に、エタノールを含有するサンプル１２及びサンプル１３のカラム非吸着画分にはβ―リベチンが主に検出されていることから、エタノールを含有することにより、β−リベチンのカラムへの吸着が選択的に阻害されることが分かる。
【００５５】
実施例４（抽出液中の塩濃度とカラム非吸着画分の洗浄性の検討）
実施例１と同様にして卵黄水溶性タンパク質溶液を調製した。すなわち、エタノールで３回脱脂して脱脂卵黄を得、残存したエタノールを含有させたままの脱脂卵黄を、０．０５ＭＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で抽出を行い、５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む卵黄水溶性タンパク質溶液（サンプル１５）を調製した。
【００５６】
また、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、又は０．１５ＭＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、同様にして抽出を行い、それぞれ５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む卵黄水溶性タンパク質溶液（サンプル１６、１７）を調製した。
【００５７】
上記の各サンプルを、実施例３と同様にして、カラムクロマトグラフィーに供し、非吸着画分を回収して、ゲルろ過に供し、タンパク含量を算出した。その結果を表４に示す。
【００５８】
【表４】
0004132832.tif 000005
【００５９】
表４から、０．０５Ｍの塩を含有するサンプル１５のカラム非吸着画分には、卵黄抗体が全く検出されず、全てカラムに吸着されていることが分かる。
【００６０】
一方、塩を含まないサンプル１６、０．１５Ｍの塩を含有するサンプル１７のカラム非吸着画分には、γ−リベチンが検出され、完全にカラムに吸着されていないことが分かる。
【００６１】
実施例５（カラムに吸着した卵黄抗体の溶出）
上記のサンプル１２、１３、１４をそれぞれカラムクロマトグラフィーに供し、卵黄抗体をカラムに吸着させ、０．３ＭＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を、カラム容積に対して５倍量流して卵黄抗体を溶出してそれぞれ回収した。
【００６２】
そして、得られた各溶出液（カラム吸着タンパク質画分）を、ゲルろ過に供し、溶出液中の各タンパク含量を算出した結果を表５に示す。
【００６３】
【表５】
0004132832.tif 000006
【００６４】
表５から、エタノールを含むサンプル１２、１３の溶出液には、主に卵黄抗体が含まれていることが分かる。
【００６５】
一方、エタノールを含まないサンプル１４の溶出液の卵黄抗体含量は低く、また夾雑タンパク質が多いことから工程中に卵黄抗体が損失していることが分かる。
【００６６】
実施例６（従来の精製法との抗体活性回収率の比較）
上記のサンプル１２を、０．０５ＭＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で非吸着画分を洗浄し、その後０．３ＭＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）をカラム容積に対して５倍量流して卵黄抗体を溶出し、本発明カラム溶出液（サンプル１８）を回収した。
【００６７】
一方、イオン交換クロマトグラフィー法と塩析法を組み合わせて行う方法（従来法）により、上記のサンプル１２を、上記と同様にしてカラムクロマトグラフィーに供しカラムに吸着したタンパク質を溶出した。すなわち、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したカラムにサンプル１２を供し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で十分洗浄した後、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてカラムに吸着したタンパク質の溶出を行った。
【００６８】
そして、得られた溶出液に、１５％（Ｗ／Ｖ）となるように硫酸ナトリウムを溶解し、生じた塩析物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×１０分）で集めて回収した。この塩析物を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、同様の塩析操作を２回繰り返した。そして、最終塩析物を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液に対し透析して、透析液（サンプル１９）を得た。
【００６９】
また、限界ろ過膜（分画分子量１００ｋＤａ）（従来法）により、上記のサンプル１２を、分子量１８０ｋＤａの卵黄抗体と分子量９０ｋＤａのα−リベチン及び分子量４５ｋＤａのβ−リベチン、その他の低分子夾雑タンパク質を分離し、リテンテイトが５倍濃縮されたところで濃縮を終了し、この濃縮液（サンプル２０）を回収した。
【００７０】
サンプル１２の卵黄抗体活性を１００％として、本発明のカラム溶出液（サンプル１８）及びサンプル１９、２０の総抗体活性を測定した。
【００７１】
その結果、本発明法によるカラム溶出液（サンプル１８）の卵黄抗体活性回収率は９１．５％と高く、抽出液中のほぼ全ての卵黄抗体活性を回収することができることが分かった。
【００７２】
一方、サンプル１９の卵黄抗体活性回収率は７６．１％と低く、塩析操作を繰り返すことで、損失が生じていることが推察された。また、サンプル２０の卵黄抗体活性回収率も５３．４％と低く、限界ろ過膜による分離が不十分であることが推察された。
【００７３】
実施例７（精製前の出発原料からの卵黄抗体の活性回収率の比較）
出発原料である卵黄粉末の総抗体活性を１００％として、カラム溶出液（本発明）（サンプル１８）及びサンプル１９、サンプル２０の総抗体活性を測定し、各精製溶液における卵黄抗体活性回収率を求めた。その結果を表６示す。
【００７４】
【表６】
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【００７５】
表６から、本発明による卵黄抗体の精製画分であるカラム溶出液（サンプル１８）の卵黄抗体活性回収率は８０％以上と高く、無駄なく卵黄抗体を精製できることが分かる。
【００７６】
一方、従来法による卵黄抗体の精製画分であるサンプル１９及びサンプル２０の卵黄抗体活性回収率はそれぞれ６９．６％、４８．８％と低く、従来法では精製工程において卵黄抗体の損失あるいは変性による失活が生じていると推察された。
【００７７】
実施例８
特に限定するものではないが、本発明製造法から図３に示すようなワンステップカラム製造法にて工業的規模で卵黄抗体を精製することができる。
【００７８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、卵黄の脂質成分をエタノールにより抽出して残るエタノールを含む脱脂卵黄残渣から、特定の範囲内のエタノールを残存させる量の特定の範囲内の塩を含ませた緩衝液で卵黄水溶性タンパク質を抽出し、得られた卵黄水溶性タンパク質画分をそのまま陰イオン交換クロマトグラフィーに供することにより、ワンステップのカラム操作で選択的に卵黄抗体を主体とした画分を得ることができる。
【００７９】
したがって、卵黄乾燥粉末から卵黄抗体を精製するまでの各成分の分離操作を連続的に行うことができ、従来最大の課題であった卵黄水溶性タンパク質画分からの卵黄抗体の精製がワンステップで完了し、工業的規模で高純度の卵黄抗体を大量生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例２において、各サンプル溶液に含まれる塩濃度による卵黄抗体のカラムへの吸着性及びカラムからの溶出性の影響を示すカラムクロマトグラフィーの図である。
【図２】  実施例２において、各サンプル溶液に含まれる塩濃度及びエタノール濃度による卵黄抗体のカラムへの吸着性及びカラムからの溶出性の影響を示すカラムクロマトグラフィーの図である。
【図３】  実施例８において、本発明ワンステップ製造法の実際の工程を簡単に示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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