(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
極性官能基を有する高分子が、粒子径が０．５〜１００ｎｍの半導体ナノ粒子の表面に物理的及び／又は化学的に接合している発光性微粒子であって、前記極性官能基を有する高分子は免疫反応不活性タンパク質であることを特徴とする発光性微粒子。
【請求項２】
免疫反応不活性タンパク質は、アルブミン、ミオグロビン又はカゼインであることを特徴とする請求項１記載の発光性微粒子。
【請求項３】
請求項１又は２記載の発光性微粒子と、前記発光性微粒子に吸着又は結合した分子認識物質からなることを特徴とする分子認識発光性微粒子。
【請求項４】
免疫反応不活性タンパク質がアルブミンであって、発光性微粒子と分子認識物質とが、ビオチンとアビジンとを介して結合していることを特徴とする請求項３記載の分子認識発光性微粒子。
【請求項５】
請求項３又は４記載の分子認識発光性微粒子を用いることを特徴とする標的物質の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体関連物質、環境関連物質等の標的物質の高感度測定法に用いる分子認識発光性マーカー物質として好適であり、高塩又は酸性溶液をはじめ、生物溶媒で分散安定性に優れる発光性微粒子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体内に含まれるタンパク質、ウイルス、核酸等の生体関連物質や、ダイオキシン、金属イオン等の環境関連物質を高感度に測定する方法として、分子認識物質を蛍光体等のマーカー物質に結合した分子認識体を用いる方法が多用されている。しかし、従来用いられていた蛍光体等のマーカー物質は、発光効率が低く感度の点で必ずしも満足できず、また、一定の波長の光しか発することができないことから、一時に複数の検体を検出する等の複雑な測定に用いることは困難であった。
【０００３】
近年、マーカー物質となる分子認識発光性微粒子として、半導体超微粒子（以下、半導体ナノ粒子ともいう）が注目されている。半導体ナノ粒子はバルク結晶における励起子ボーア半径と同等の粒子径を有する半導体の超微粒子（超微結晶）であり、量子閉じ込め効果の発現によって光学スペクトル、すなわち吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを粒子径によって調節することが可能である。すなわち、粒子径によって異なる波長の光を発し得る。
【０００４】
半導体ナノ粒子は、通常、粒径が０．５〜１００ｎｍ、好ましくは０．５〜５０ｎｍ、より好ましくは１〜１０ｎｍである超微粒子である。またこの半導体ナノ粒子の種類としては、例えば、ＣｕＣｌ等のＩ−ＶＩＩ族化合物半導体、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ等のＩＩ−ＶＩ族、ＩｎＡｓ等のＩＩＩ−Ｖ族化合物半導体、ＩＶ族半導体等の半導体結晶等が挙げられる。このような半導体ナノ粒子はコロイド化学的合成法により合成され、その表面は一般に界面活性剤及び／又は表面修飾剤で被覆され、安定化されている。
【０００５】
高い量子効率を有し、かつ、粒子径分布が狭い半導体ナノ粒子を得るための合成法は限定されており、これらの方法によれば得られるナノ粒子の表面は疎水性となる場合が多い。しかし、表面が疎水性では、標的となるタンパク質、ウイルス、核酸等の生体関連物質との反応性が低下し高い感度で検出することが困難となる。また、半導体ナノ粒子は、ファンデルワールス力により粒子同士が凝集しやすく、測定中にも凝集が起こってしまうことから、凝集が起こる前に測定を終了しなくてはならないという問題もあった。
【０００６】
そこで、生体内へ導入して用いる場合には半導体ナノ粒子の表面を親水化すると同時に、半導体ナノ粒子同士が凝集することを防ぐ必要があった。半導体ナノ粒子表面の親水化としては、例えば、ＷＯ００／１７６５６「ＷＡＴＥＲ−ＳＯＬＵＢＬＥ  ＴＨＩＯＬ−ＣＡＰＰＥＤ  ＮＡＮＯＣＲＹＳＴＡＬＳ」に記載されているような方法が報告されている。この方法は、半導体ナノ粒子の表面にカルボキシル基等の極性を有する官能基をグラフトすることにより、官能基の有するイオンの電荷同士の反発により粒子の凝集を防ぐというものである。
【０００７】
しかしながら、この方法では試験条件を厳密にコントロールできるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験であっても長期間の分散性は不安定であり、更に、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、高塩濃度の生体内であることから、生体内に存在するイオンによって粒子表面にグラフトされた官能基の電荷が打ち消されてしまい、凝集を防ぐことはできなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、生体関連物質、環境関連物質等の標的物質の高感度測定法に用いる分子認識発光性微粒子のマーカー物質として好適であり、高塩又は酸性溶液をはじめ、生物溶媒で分散安定性に優れる発光性微粒子を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、極性官能基を有する高分子が表面に物理的及び／又は化学的に接合している半導体ナノ粒子からなる発光性微粒子である。
以下に本発明を詳述する。
【００１０】
本発明の発光性微粒子は、極性官能基を有する高分子が表面に物理的及び／又は化学的に接合していることを特徴とする半導体ナノ粒子からなる。
上記半導体ナノ粒子としては特に限定されず、例えば、ＣｕＣｌ等のＩ−ＶＩＩ族化合物半導体、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ等のＩＩ−ＶＩ族、ＩｎＡｓ等のＩＩＩ−Ｖ族化合物半導体、ＩＶ族半導体等の半導体結晶、ＴｉＯ２等の金属酸化物、フタロシアニン、アゾ化合物等の有機化合物からなるもの、またはそれらの複合材料等が挙げられる。かかる複合材料としては、例えば、ＣｄＳをコア−ＣｄＳｅをシェル、ＣｄＳｅをコア−ＣｄＳをシェル、ＣｄＳをコア−ＺｎＳをシェル、ＣｄＳｅをコア−ＺｎＳをシェル、ＣｄＳｅのナノ結晶をコア−ＺｎＳをシェル、ＣｄＳｅのナノ結晶をコア−ＺｎＳｅをシェル、Ｓｉをコア−ＳｉＯ２をシェルとするコア−シェル構造を有するもの等が挙げられる。
【００１１】
なお、上記半導体ナノ粒子としては、本発明の目的を損なわない範囲であれば、表面を化学的又は物理的に修飾されたものであってもよく、また、界面活性剤、分散安定剤又は酸化防止剤等の添加剤を加えたものであってもよい。このような半導体ナノ粒子は、コロイド化学的な方法、例えば、逆ミセル法（Ｌｉａｎｏｓ，  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．，  １２５，  ２９９  （１９８６））やホットソープ法（Ｐｅｎｇ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１９，  ７０１９  （１９９７））等によって合成することができる。
【００１２】
上記半導体ナノ粒子の粒子径の好ましい下限は０．５ｎｍ、上限は１００ｎｍである。０．５ｎｍ未満であると原子又は分子そのものとなってしまい、１００ｎｍを超えると、バルクの性質となってしまうことがある。より好ましい下限は０．５ｎｍ、上限は５０ｎｍ、更に好ましい下限は１ｎｍ、上限は１０ｎｍである。上記半導体ナノ粒子の形状としては特に限定されず、例えば、球状、棒状、板状、薄膜状、繊維状、チューブ状等が挙げられる。なかでも球状が好ましい。
【００１３】
本発明の発光性微粒子では、上記半導体ナノ粒子の表面に極性官能基を有する高分子が物理的及び／又は化学的に接合している。極性官能基を有する高分子を物理的及び／又は化学的に接合させることにより、高分子の有する極性官能基同士の電気的な反発により粒子の凝集を防ぐことができる。
上記極性官能基を有する高分子は、酸性条件下及び／又は塩基性条件下でイオン化する官能基を有することが好ましい。一般に生体内は、部位により酸性条件にも塩基性条件にもなり得るが、酸性条件下でイオン化する官能基と塩基性条件下でイオン化する官能基とを両方同時に有することにより、酸性条件下でも塩基性条件下でも表面の極性官能基がイオン化し得るので、静電反発力により粒子の凝集を防ぐことができる。かかる官能基としては、例えば、カルボキシル基、スルホニル基、リン酸基、アンモニウム基等が挙げられる。
更に、生体内での測定に供することから、上記極性官能基を有する高分子としては天然物であることが好ましい。
【００１４】
このような種々の要件を満たしうる高分子としては特にタンパク質が好適である。タンパク質と半導体ナノ粒子とを結合させることにより、本発明の発光性微粒子は生体内でも安定した分散安定性を示すとともに、該タンパク質の本来有する機能をも発現することができ、生体内の生体関連物質、環境関連物質等の標的物質の測定に利用することができる。例えば、タンパク質として、細胞膜透過性を有するタンパク質を用いれば、細胞を破壊することなく細胞内に存在する標的物質の分析にも用いることができる。
また、上記タンパク質としては免疫反応不活性タンパク質であることが好ましい。免疫反応不活性タンパク質であれば、生体内に用いても、生体の免疫機構によって排除されることなく測定を行うことができる。
【００１５】
かかるタンパク質としては、具体的には例えば、アルブミン、ミオグロビン、カゼイン等が挙げられる。なかでもアルブミンは、後述の分子認識物質との結合の面でも優れており好適である。
【００１６】
上記半導体ナノ粒子と上記極性官能基を有する高分子とは、物理的及び／又は化学的に接合されている。上記結合の態様としては特に限定されず、化学吸着、物理吸着、配位、水素結合、イオン結合、共有結合等が挙げられる。結合の安定性から、結合力の強い結合様式により結合されていることが好ましい。
なお、本発明の目的を損なわない範囲で、直接的接合のほかに間接的接合、すなわち該半導体ナノ粒子表面と該高分子との間に接合を媒介する他の有機分子が存在していてもよい。
また、上記極性官能基を有する高分子は、上記半導体ナノ粒子表面を取り囲むようにして複数結合していることが好ましい。極性官能基を有する高分子の半導体ナノ粒子表面の被覆率が高まることにより、本発明の発光性微粒子の分散安定性がより向上する。
【００１７】
本発明の発光性微粒子を作製する方法としては特に限定されず、例えば、上記半導体ナノ粒子を、アルブミン溶液に浸漬する方法等が挙げられる。この方法により、半導体ナノ粒子の表面にアルブミンが物理吸着される。
【００１８】
本発明の発光性微粒子は、表面に物理的及び／又は化学的に極性官能基を有する高分子が接合していることから、高分子の有する極性官能基同士の電気的反発により粒子の凝集を防ぐことができる。特に極性官能基を有する高分子としてタンパク質を用いる場合には、生体内でも安定した分散状態を保ち、かつ、細胞膜を通過して細胞を破壊することなく細胞内に侵入させること等が可能となる。
また、本発明の発光性微粒子は、半導体ナノ粒子を用いることから、励起光照射によって高輝度の蛍光（フォトルミネッセンス）を発し、微量成分の高感度測定に好適に用いることができる。また、粒子径の異なる半導体ナノ粒子からなる本発明の発光性微粒子を目的に応じて使い分けることにより、発光スペクトルを任意に調節・設計可能であり、より精密な測定への応用を図ることができる。
【００１９】
本発明の発光性微粒子に分子認識物質を吸着及び／又は結合してなる分子認識発光性微粒子は、生体関連物質、環境関連物質等の標的物質の高感度測定法に好適に用いることができる。
かかる分子認識発光性微粒子もまた、本発明の１つである。
【００２０】
上記分子認識物質とは、標的物質に特異的に反応するものであれば特に限定されないが抗原、抗体等のタンパク質、ＤＮＡ、シクロデキストリン、クラウンエーテル等の環状化合物等が挙げられる。
【００２１】
本発明の分子認識発光性微粒子を作製する方法としては特に限定されず、例えば、物理的吸着法や化学的結合法等が挙げられる。例えば、分子認識物質がタンパク質である場合には、発光性微粒子をアミノシラン誘導体等で処理することにより、直接又は縮合試薬により、タンパク質のアミノ基と発光性微粒子が結合される。また、分子認識物質がＤＮＡのＰＣＲ産物である場合には、発光性微粒子をポリＬ−リシンでコートすることにより静電気的に結合可能である。分子認識物質がオリゴヌクレオチドである場合には、予めアルキルアミノアシランでコートした発光性微粒子を光感受性保護基を有するリンカーで保護し、光照射による脱保護、合成の繰り返しによりオリゴヌクレオチド鎖を合成する方法が挙げられる
【００２２】
また、本発明の発光性微粒子に用いる極性官能基を有する高分子としてアルブミンを用いる場合には、ビオチンとアビジンとを用いて本発明の分子認識発光性微粒子を作製する方法が好適である。
すなわち、ビオチンはアルブミンとの結合性に優れることから、本発明の発光性微粒子が極性官能基を有する高分子としてアルブミンを用いている場合には、そのアルブミン上に容易にビオチンを結合させることができる。一方、ビオチンは、分子認識物質として用いられる抗原、抗体等のタンパク質やＤＮＡ等にも容易に結合させることができる。
表面にビオチンを有する本発明の発光性微粒子と、表面にビオチンを有する抗原、抗体等のタンパク質やＤＮＡ等の分子認識物質とは、アビジンを介して容易に結合することができる。
このように、本発明の発光性微粒子に用いる極性官能基を有する高分子としてアルブミンを用い、ビオチンとアビジンとを介して発光性微粒子と分子認識物質とが結合した分子認識発光性微粒子（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｌｂｕｍｉｎ−Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔs：以下、ＡＢＡ−ＱＤsともいう）は、作製が容易であり応用範囲が広く好適である。
かかる本発明の分子認識発光性微粒子の１実施態様を図１及び図２に示した。
【００２３】
本発明の分子認識発光性微粒子は、分子認識物質を選択することにより種々の生体関連物質、環境関連物質等を標的物質することができる。本発明の分子認識発光性微粒子による測定対象となる標的物質としては、抗体又はレセプターを作製できるものであれば特に限定されず、例えば、抗原・抗体や異常型プリオン等のタンパク質、ダイオキシン類等の内分泌撹乱物質、エイズウイルス等のウイルス、ペプチド、核酸、金属イオン等が挙げられる。
【００２４】
本発明の分子認識発光性微粒子は、本発明の発光性微粒子からなることにより分散安定性に極めて優れる。このため、ＥＬＩＳＡ法によるタンパク質の検出や、免疫スクリーニング法、ハイブリッド形成法によるＤＮＡ、ＲＮＡの検出等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に用いると、凝集が起こりにくく、長時間安定した試験を行うことができる。
また、生体内での分散安定性に優れることから、生体内における標的物質を高感度に測定することができ、薬物や生体成分の追尾、薬物の作用機構の解析等のｉｎ  ｖｉｖｏ試験にも応用することができる。
更に、アフィニティクロマトグラフィーの担体等に用いることにより、標的物質の分離や濃縮にも応用できる。
本発明の分子認識発光性微粒子を用いる標的物質の検出キットもまた、本発明の１つである。
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２５】
（実施例１）
１１−メルカプトウンデカン酸ナトリウム塩表面修飾発光性微粒子（ＭＵＡ−ＱＤ）１ｍｇとウシ血清アルブミン（シグマ社製：ＢＳＡ）１０ｍｇとを予め０．１ｍＬの蒸留水に溶解し、０．１Ｍ２−［Ｎ−モルフォリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー（ｐＨ４．８）３．４ｍＬを加えて充分に混合した。
次いで、蒸留水で溶解した１０ｍｇ／ｍＬ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ピアス社製、ＥＤＣ）溶液０．５ｍＬを加え、室温2時間撹拌しながら反応させた。未反応のＢＳＡは反応液をマイクロコンＹＭ−１００（ミリポア社製）で１５０００ｘｇで5分間遠心することで除去した。遠心後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）で２回洗浄した後、０．５ｍＬのＰＢＳバッファーで溶解することにより、半導体素子の表面にウシ血清アルブミンが接合した発光性微粒子（ＢＳＡ結合ＭＵＡ−ＱＤ）を得た。
【００２６】
得られたＢＳＡ結合ＭＵＡ−ＱＤを０、０．２５、０．５、１、２、４Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）で溶解し、室温で３日間静置した。
充分に撹拌した後、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）で作製した０．５％アガロースゲルで１３５Ｖ、５０分間電気泳動を行った。対照としてＡＢＳが接合していないＭＵＡ−ＱＤについても同様にして電気泳動を行った。
得られた電気泳動像を図３に示した。
図３より、ＢＳＡ結合ＭＵＡ−ＱＤでは、４Ｍの塩化ナトリウムで処理してもブロードな電気泳動像が観察され、充分に分散していることがわかった。一方、ＭＵＡ−ＱＤでは０．２５Ｍの塩化ナトリウム処理でも全く泳動されず、凝集していることがわかった。
【００２７】
また、ＢＳＡ結合ＭＵＡ−ＱＤとＭＵＡ−ＱＤとを１０ｍＭＭＥＳバッファー（ｐＨ４．０及びｐＨ５．５）及び１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で溶解し、室温で１２時間静置した。
充分に撹拌した後、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で作製した０．５％アガロースゲルで１３５Ｖ、５０分間電気泳動を行った。
得られた電気泳動像を図４に示した。
図４より、ＢＳＡ結合ＭＵＡ−ＱＤでは、ｐＨ４であってもpH７．４の場合と同様の移動度を示したことから、酸性下でも充分に分散していることがわかった。一方、ＭＵＡ−ＱＤでは、ｐＨ５．５では泳動されるもののｐＨ７．４の場合に比べて移動度が劣り若干の凝集が認められ、更にｐＨ４では完全に凝集していることがわかった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、生体関連物質、環境関連物質等の標的物質の高感度測定法に用いる分子認識発光性微粒子のマーカー物質として好適であり、特に生体内での分散安定性に優れる発光性微粒子を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の分子認識発光性微粒子の１実施態様を示す模式図である。
【図２】本発明の分子認識発光性微粒子の１実施態様を示す模式図である。
【図３】実施例で作製したＢＳＡ結合ＭＵＡ−ＱＤとＭＵＡ−ＱＤとを異なる濃度の塩化ナトリウムで処理した後の電気泳動像である。
【図４】実施例で作製したＢＳＡ結合ＭＵＡ−ＱＤとＭＵＡ−ＱＤとを異なるｐＨで処理した後の電気泳動像である。
【符号の説明】
１  発光性微粒子
２  半導体ナノ粒子
３  アルブミン
４  ビオチン
５  アビジン
６  分子認識物質（オリゴＤＮＡ）
７  分子認識物質（ＩｇＧ抗体）
【図１】
0004107873.tif 000002
【図２】
0004107873.tif 000003
【図３】
0004107873.tif 000004
【図４】
0004107873.tif 000005