(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの光で対物レンズの像位置、該像位置と共役な位置、又はそれらの近傍に配置される共焦点用ディスクを照明し、通過する光を前記対物レンズで標本上に結像して走査し、前記標本からの光を再び前記対物レンズを介して前記共焦点ディスク又はその近傍に結像させ、前記共焦点用ディスクを通過する光を再結像させ、前記標本の像を得る共焦点顕微鏡において、
前記共焦点用ディスクの面が光軸に対して略垂直方向に移動する移動手段と、
前記共焦点用ディスク上の所定領域を前記光軸上に位置させるよう前記移動手段を係止する係止手段と、
前記移動手段の移動に連動して前記光軸上に挿脱自在な減光手段と、
を具備したことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記共焦点用ディスク上に前記減光手段を設けたことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記移動手段に前記減光手段を設けたことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
光を透過する部分と遮蔽する部分とからなる所定のパターンが形成されたディスクを回転させ、前記パターンを透過した光を試料に対して走査し、前記試料の共焦点像を得る共焦点顕微鏡において、
前記ディスクは同心円状に分割された複数の領域を備え、前記複数の領域の少なくとも一つは、光を一様に透過する領域からなることを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項５】
前記ディスクに形成された前記パターンにおける光の透過率をＴとしたときに、前記光を一様に透過する領域の透過率は、
【数１】
0004112257.tif 000008
（ｑ＝１〜０．２）であることを特徴とする請求項５に記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、回転するディスクに形成されたピンホール等を透過した光を用いて共焦点画像を得る共焦点顕微鏡、例えば光を利用して試料の微小構造や３次元の形状を高速に観察・測定するために用いられるディスク走査型の共焦点顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（第１の従来の技術）
近年、リアルタイムで高い解像度の観察画像を得ることが可能なディスク回転型共焦点顕微鏡が製品化されている。この共焦点顕微鏡は、通常の顕微鏡光路中に、ピンホール等の光通過部を設けたディスクを挿入して回転させるもので、ピントのずれた面の画像を除去し、ピントの合った面の画像のみを抽出することができる。これにより、非常に高いコントラストを持つ共焦点画像を得ることができる。
【０００３】
このような共焦点顕微鏡は、その性質上、通常は高倍率観察時にさらに強調された像を得ることを目的として用いられる。一般的に像観察の前には、試料の位置合わせやピント合わせを行なう必要がある。しかし上記の共焦点顕微鏡では、ピントの合った面の像のみしか得られないため、位置合わせやピント合わせの作業が非常に行ないづらい。
【０００４】
そこで一般に共焦点顕微鏡では、特に位置合わせやピント合わせを行なう時のために、光路中から上記ディスクを退避させ、ディスクを透過しない非共焦点像も得られるようにしている。このディスクには、一般にピンホールが螺旋状に配されたＮｉｐｋｏｗディスクやピンホールがランダムに配置されたものや、ラインパターンの設けられたものが使用されるが、光源からの入射光に対して利用できる試料からの反射光は０．５〜１％と低くなるため、得られる共焦点像が非常に暗い。
【０００５】
これを改善するために、光源には水銀やキセノンを使用しているが、上記のようにディスクを退避させて非共焦点像を見たときに、非常に明るいため眩しく感じてしまう。このようなとき、水銀やキセノンの光源は調光ができないために、光量を絞って調整することができない。
【０００６】
この問題を解決するために、上記したような顕微鏡装置では、光路内に任意に挿脱できる例えばＮＤフィルタなどの減光手段や、２枚の偏光板を使用して一方の偏光板を回転させることによって光量を絞る機構を設置している。
【０００７】
また、実開平５−９６８１６号公報や特開平９−３２５２７９号公報には、上述したように光路中からディスクを退避させるのではなく、共焦点用、非共焦点用にそれぞれ光路を設け、ミラーやビームスプリッタを用いた分岐用の光学系部材を光路に挿脱することで、光路を選択的に分岐させて共焦点画像と非共焦点画像を切換えて得るようにしたものが記載されている。この構成では、共焦点用、非共焦点用にそれぞれ別の照明を用意するため、共焦点用照明に水銀、キセノンなどの高輝度の光源、非共焦点用照明にハロゲンなど低輝度の光源を使用すれば、非共焦点観察時に明るすぎて眩しく感じることはない。
【０００８】
また、特開２００１−９１８４２号公報には、実開平５−９６８１６号公報や特開平９−３２５２７９号公報と異なり、光学系部材を挿脱させるのではなく、偏光板と偏光ビームスプリッタを用いて、偏光板を回転させることで光路を選択的に分岐させて共焦点画像と非共焦点画像を切換えて得るようにしたものが記載されている。この公報に記載の構成は、R.Juckaitis,T.Wilsonらの“Efficient  rea1-time  confocal  microscopy  with  white  light  sources”,  Nature誌Vo1.383  0ct.1996  p804-806に記載されている技術を使った、いわゆるＴ．Ｗｉｌｓｏｎ型ディスクを用いたものである。このディスクを使用した時、入射光に対して利用できる反射光は２５〜５０％と高く、共焦点観察時においても明るい観察像が得られるため、ハロゲン光源を使用することができる。このため、非共焦点観察時においても明るすぎて眩しく感じることがない。
【０００９】
また、特開２００１−８３４２６号公報には、同じくＴ．Ｗｉｌｓｏｎ型ディスクを用いた共焦点顕微鏡装置において、光線が開口部を通過するように電気的に制御してディスクを停止させ、非共焦点像を得るようにしたものが記載されている。この構成においても、上記と同様のディスクを使用するために、非共焦点観察時においても明るすぎて眩しく感じることがない。
【００１０】
（第２の従来の技術）
従来の代表的なディスク走査型共焦点顕微鏡として、多数のピンホールを有するＮｉｐｋｏｗディスクを用いた共焦点顕微鏡が知られている。
【００１１】
図１１は、上記Ｎｉｐｋｏｗディスクを使用した共焦点顕微鏡の構成を示す図である。光源６０１から出射される光の光路上に、コンデンサーレンズ６０２、偏光板６０３、ＰＢＳ（偏向ビームスプリッター）６０４が配置されている。ＰＢＳ６０４の反射光路上に、Ｎｉｐｋｏｗディスク（回転ディスク）６０５、第１の結像レンズ６０７、１／４波長板６０８、対物レンズ６０９、及び図示しないステージに載置された試料６１０が配置されている。ＰＢＳ６０４の試料６１０に対する透過光路上には、第２の結像レンズ６１１とＣＣＤカメラ６１２が配置されている。ＣＣＤカメラ６１２の画像出力端子にはモニター６１３が接続されている。モニター６１３は、画像を表示する。
【００１２】
図１２は、Ｎｉｐｋｏｗディスクの構成を示す図である。Ｎｉｐｋｏｗディスク６０５は円盤状をなし、図１２に示すように、同心円により三つの領域Ａ、領域Ｂ、及び領域Ｃに区分されている。三つの領域Ａ、Ｂ、Ｃには多数のピンホールが螺旋状に設けられている。各領域Ａ、Ｂ、Ｃ間のピンホールの直径は異なり、領域Ａ、Ｂ、Ｃの順に小さくなっている。各ピンホールは、互いの間隔がピンホールの直径の十倍程度となるよう配設されている。
【００１３】
Ｎｉｐｋｏｗディスク６０５は、図示しない駆動機構によって、図１１の矢印Ａの方向（紙面に対して左右方向）に移動可能である。また、Ｎｉｐｋｏｗディスク６０５は、回転軸６０６を介して図示しないモータの軸に連結されており、前記モータの駆動により一定の回転速度で回転する。
【００１４】
次に、上記のような構成をなす共焦点顕微鏡の動作を説明する。
【００１５】
光源６０１から出射された光は、コンデンサーレンズ６０２、偏光板６０３を介し、ＰＢＳ６０４で一定の方向の偏光成分のみが反射され、一定の速度で回転するＮｉｐｋｏｗディスク６０５に入射される。Ｎｉｐｋｏｗディスク６０５のピンホールを通過した光は、第１の結像レンズ６０７を通り、１／４波長板６０８で円偏光になって、対物レンズ６０９によって結像され、試料６１０に入射される。
【００１６】
試料６１０から反射された光は、対物レンズ６０９を介し、再度、１／４波長板６０８にて入射時の偏光方向に対して直交する偏光方向になり、第１の結像レンズ６０７によりＮｉｐｋｏｗディスク６０５上に試料像が投影される。投影された試料像のうち焦点の合っている部分はピンホールを通過し、さらにＰＢＳ６０４を第２の結像レンズ６１１の方向に透過して、第２の結像レンズ６１１を介してＣＣＤカメラ６１２で撮像される。ＣＣＤカメラ６１２で撮像された共焦点画像は、モニター６１３に表示される。
【００１７】
適切な共焦点効果を得るためのピンホール径Ｒは、光の波長をλ、観察する試料６１０のディスク６０５上への投影倍率をＭ、対物レンズ６０９の開口数をＮＡとすると、
Ｒ＝ｋλＭ／ＮＡ
の関係で設定される。ｋは係数であり、ｋ＝０．５〜１程度が良く使われる。したがって、対物レンズ６０９を交換すると、ディスク６０５上への投影倍率Ｍと開口数ＮＡが変わってしまうため、共焦点観察をするためのピンホール直径Ｒも変える必要がある。
【００１８】
観察に要する倍率を変えるときには、対物レンズ６０９を交換する。倍率の大きい対物レンズを用いる場合、Ｎｉｐｋｏｗディスク６０５を図１１の矢印Ａの方向に移動させ、ピンホール径の大きい領域Ａを用いるようにする。このような共焦点顕微鏡では、焦点の合った像のみが観察される。
【００１９】
通常の観察を行うには、始めに焦点を合わせたり、観察位置を探したりする必要があるが、共焦点顕微鏡ではこの作業が非常にしにくい。そこで、一般に共焦点顕微鏡では、特に位置合わせやピント合わせを行なう時のために、図１１の矢印Ａの方向にディスク６０５を動かして、光路中からディスク６０５を退避させ、ディスク６０５を透過しない非共焦点像も得られるようにしている。
【００２０】
また、実開平５−９６８１６号公報や特開平９−３２５２７９号公報のように、ディスクを動かして退避させるのではなく、共焦点用、非共焦点用にそれぞれ光路を設け、ミラーやビームスプリッターを用いた分岐用の光学系部材を光路に挿脱し光路を切換えることで、共焦点像と明視野像を切換えて得るようにしたものが開示されている。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
（第１の従来の技術の課題）
以上のように、従来から共焦点像又は非共焦点像に任意に切換えて観察できる構成をなし、かつ非共焦点観察時に明るすぎて眩しく感じることがないように構成されているか、減光手段を光路上に挿脱することができる構成になっている共焦点顕微鏡が提案されてきた。
【００２２】
しかしながら、光路中から上記ディスクを退避させ、ディスクを透過しない非共焦点像も得られるようにしている構成では、ディスクを退避させる動作を行なったあと、また新たに減光手段を光路上に挿入したり、偏光板を回転させるといった動作をしなければならず、操作が非常に煩わしい。また、ディスクを退避させてから次の動作に移るまでの間、観察者は非常に眩しく不快感をおぼえる。
【００２３】
また、実開平５−９６８１６号公報や特開平９−３２５２７９号公報に記載されている構成では、共焦点用、非共焦点用の２つの光路が必要であり、さらに照明も２種類あるため、非常に大きなスペースが必要である。
【００２４】
また、特開２００１−９１８４２号公報に記載の構成では、同じく共焦点用、非共焦点用の２つの光路が必要であり、非常に大きなスペースが必要である。さらに、Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎ型ディスクを使用するため、ディスク内のラインパターン領域から得られる非共焦点成分を含む共焦点像と開口部から得られる非共焦点像の差分演算が必要であり、共焦点像を目視することができない。
【００２５】
また、特開２００１−８３４２６号公報に記載の構成では、同じくＴ．Ｗｉｌｓｏｎ型ディスクを使用するため、ディスク内のラインパターン領域から得られる非共焦点成分を含む共焦点像と開口部から得られる非共焦点像の差分演算が必要であり、共焦点像を目視することができなく、さらにディスク停止のための電気的な制御を行なうので、そのための回路が必要となり機構が複雑になる。
【００２６】
（第２の従来の技術の課題）
従来のディスク走査型共焦点顕微鏡には、以下に示すような問題点がある。
【００２７】
光路中からディスクを退避させ、ディスクを透過しない非共焦点像を得られるようにした構成では、ディスクが光路中に入った状態と退避した状態で、光の空気換算長が異なる。この種のディスクは、通常ＢＫ７などの光学ガラスからなり屈折率が１．５程度である。これに対して、ディスクを退避させると、光路中のディスクの厚み分は空気になってしまうので、屈折率が１になる。これにより、焦点が移動する現象が起こるため、明視野像の観察時と共焦点像の観察時とでは、ピントを合わせ直さなければならない。
【００２８】
また、実開平５−９６８１６号公報や特開平９−３２５２７９号公報に記載されている構成では、共焦点用、明視野用の二つの光路が必要であり、さらに照明も二種類あるため、装置スペースが大きくなり、二つの光路の光軸調整を行う必要がある。
【００２９】
本発明の第１の目的は、簡単な構成により良好な状態で観察を行なえる共焦点顕微鏡を提供することにある。
【００３０】
本発明の第２の目的は、共焦点像と明視野像の観察切換えを容易に行え、かつ切換え時に焦点の調整を必要としない共焦点顕微鏡を提供することにある。
【００３１】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決し目的を達成するために、本発明の共焦点顕微鏡は以下の如く構成されている。
【００３２】
（１）本発明の共焦点顕微鏡は、光源からの光で対物レンズの像位置、該像位置と共役な位置、又はそれらの近傍に配置される共焦点用ディスクを照明し、通過する光を前記対物レンズで標本上に結像して走査し、前記標本からの光を再び前記対物レンズを介して前記共焦点ディスク又はその近傍に結像させ、前記共焦点用ディスクを通過する光を再結像させ、前記標本の像を得る共焦点顕微鏡において、前記共焦点用ディスクの面が光軸に対して略垂直方向に移動する移動手段と、前記共焦点用ディスク上の所定領域を前記光軸上に位置させるよう前記移動手段を係止する係止手段と、前記移動手段の移動に連動して前記光軸上に挿脱自在な減光手段と、から構成されている。
【００３３】
（２）本発明の共焦点顕微鏡は上記（１）に記載の顕微鏡であり、かつ前記共焦点用ディスク上に前記減光手段を設けている。
【００３４】
（３）本発明の共焦点顕微鏡は上記（１）に記載の顕微鏡であり、かつ前記移動手段に前記減光手段を設けている。
【００３５】
（４）本発明の共焦点顕微鏡は、光を透過する部分と遮蔽する部分とからなる所定のパターンが形成されたディスクを回転させ、前記パターンを透過した光を試料に対して走査し、前記試料の共焦点像を得る共焦点顕微鏡において、前記ディスクは同心円状に分割された複数の領域を備え、前記複数の領域の少なくとも一つは、光を一様に透過する領域からなる。
【００３６】
（５）本発明の共焦点顕微鏡は上記（４）に記載の顕微鏡であり、かつ前記ディスクに形成された前記パターンにおける光の透過率をＴとしたときに、前記光を一様に透過する領域の透過率は、
【数２】
0004112257.tif 000002
（ｑ＝１〜０．２）である。
【００３７】
上記手段を講じた結果、それぞれ以下のような作用を奏する。
【００３８】
（１）本発明の共焦点顕微鏡によれば、ディスク上にパターンを持つ領域を複数設けることで、ディスクを光軸に対し略垂直方向に移動させるといった単純な動作のみで、条件に合った最良の状態で共焦点観察を行なえる。さらに、減光手段を光軸上に挿脱自在とすることで、共焦点観察時、非共焦点観察時とも、観察者が眩しく感じることがなくなる。これにより、他の光学部材の挿脱や、複数の光路を必要とせず、複雑な光学系や電気的な制御も不要であるため、大きなスペースが不要になり、顕微鏡全体をコンパクト且つ簡単な機構のみで構成でき、良好な状態で観察を行なえる。
【００３９】
（２）本発明の共焦点顕微鏡によれば、ディスクの挿脱と同時に減光手段が光軸上に挿脱されるので、減光手段の挿脱機構など新たな機構を必要とせず、機構を簡単にすることができる。
【００４０】
（３）本発明の共焦点顕微鏡によれば、減光手段を設けるためにディスクの径を大きくする必要がないため、さらにスペースが少なくて済み、顕微鏡全体をコンパクトに構成でき、良好な状態で観察を行なえる。
【００４１】
（４）本発明の共焦点顕微鏡によれば、明視野像の観察時には、ディスクのパターンが無く一様に光を透過する部分を通して観察をすることになり、共焦点像の観察時と明視野像の観察時とで、光を同じ素材上に通すことができる。
【００４２】
（５）本発明の共焦点顕微鏡によれば、明視野像の観察時に光が透過率
【数３】
0004112257.tif 000003
（ｑ＝１〜０．２）の領域を通ることになるので、共焦点像の観察時と比べて明るさがほぼ同じになる。
【００４３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
【００４４】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す図である。図１において、例えば水銀又はキセノンの光源１から出射した光は、コレクタレンズ２を介して平行光になり、ビームスプリッタ３に入射する。ビームスプリッタ３に入射した光は９０°曲げられ、ディスク５を照射する。ディスク５は、モータ４の軸４ａに嵌装されていて、モータ４の駆動により常時回転している。
【００４５】
図２の（ａ）は、ラインパターンディスク（共焦点用ディスク）であるディスク５の構成を示す図である。このディスク５には、図２の（ｂ）に示すような透過部５ｘと反射部５ｙをもつラインパターンが複数設けられており、透過部５ｘの幅は反射部５ｙの幅の約１／２０程度である。そしてディスク５は、透過部の幅が小さい領域５ａ、透過部の幅が大きい領域５ｂ、ラインパターンがなく例えばＮＤ６（６％の透過率をもつ減光部材）が設置されている領域５ｃの３つの領域を有している。なお、ディスク５は、対物レンズ１０の像位置、該像位置と共役な位置、又はそれらの近傍に配置されている。
【００４６】
なお、本実施の形態においては、図１に示すように、モータ４は、ディスク５の面が光軸１５に垂直な面に対して５°傾くよう、移動部材６に支持されている。モータ４とディスク５は、移動部材６の移動に伴い、図２に示す３つの領域５ａ、５ｂ、５ｃのうちの１つが光軸１５を通るよう、前記のように傾いた状態で３段階に移動する。移動部材６にはＶ溝６ａ、６ｂ、６ｃとレバー８が設けられ、図示しない顕微鏡本体には位置決め機構７が固定されている。移動部材６は、観察者がレバー８を操作することにより移動される。この移動に伴い、Ｖ溝６ａ、６ｂ、６ｃのいずれかが位置決め機構７に係合することで、３つの領域５ａ、５ｂ、５ｃの１つが光軸１５を通るよう、移動部材６が位置決めされる。
【００４７】
ディスク５に照射された光は、結像レンズ９を通り対物レンズ１０を介して試料１１を照射する。試料１１からの反射光は、対物レンズ１０を介し、結像レンズ９によりディスク５で結像し、このディスク５を通過することで形成される共焦点像は、ビームスプリッタ３を介して結像レンズ１２により結像し、接眼レンズ１３を介して観察者１４により観察される。
【００４８】
次に、上記のような構成をなす共焦点顕微鏡の動作を説明する。まず、例えば低い倍率の対物レンズを使用して共焦点観察をする場合、観察者はレバー８を持って移動部材６を移動させ、領域５ａに光軸１５が通るようにディスク５を位置決めする。この場合、Ｖ溝６ａに位置決め機構７が係合する。
【００４９】
また、例えば高い倍率の対物レンズを使用して共焦点観察をする場合、観察者はレバー８を持って移動部材６を移動させ、領域５ｂに光軸１５が通るようにディスク５を位置決めする。この場合、Ｖ溝６ｂに位置決め機構７が係合する。
【００５０】
次に、非共焦点観察をする場合、観察者はレバー８を持って移動部材６を移動させ、領域５ｃに光軸１５が通るようにディスク５を位置決めする。この場合、Ｖ溝６ｃに位置決め機構７が係合する。
【００５１】
これらのいずれかの動作の後、光源１から出射した光がコレクタレンズ２、ビームスプリッタ３を通ってディスク５を照射し、その後結像レンズ９を通って対物レンズ１０を介して試料１１を照射する。このとき、ディスク５は高速で回転しており、試料１１上では光が高速に走査される。試料１１からの反射光は、対物レンズ１０を通って結像レンズ９によりディスク５又はその近傍で結像し、ディスク５の領域を通過したことで形成される像が結像レンズ１２により再結像され、接眼レンズ１３を介して観察者１４により観察される。
【００５２】
以上のように本第１の実施の形態では、ディスク５のラインパターンが配置されたいずれかの領域５ａ、５ｂが、使用する対物レンズの倍率に応じて光軸１５上に位置するように移動部材６が移動するため、最良の状態で共焦点観察を行なえる。また、ラインパターンが配置されている領域により、光源１からの入射光に対して利用できる試料１１からの反射光は５％程度と低くなるため、水銀又はキセノン光源といった高輝度の光源を使用している。しかし、観察者が非共焦点観察をしようとしたとき、ディスク５のラインパターンのない領域５ｃにＮＤ６や２５といった減光部材が設置されているので、その領域５ｃが光軸１５上に位置するように移動部材６を移動すれば、観察者は眩しく感じずに共焦点観察を行なえる。
【００５３】
（第２の実施の形態）
本第２の実施の形態は、第１の実施の形態に対してディスク上のパターンのみが異なるので、ディスクのパターンについて図３の（ａ），（ｂ）を参照して説明し、他の部分については説明を省略する。
【００５４】
図３の（ａ）は、ラインパターンディスク（共焦点用ディスク）であるディスク２５の構成を示す図である。このディスク２５には、図３の（ｂ）に示すような透過部２５ｘと反射部２５ｙをもつラインパターンが複数設けられており、透過部２５ｘの幅は反射部２５ｙの約１／２０程度である。そしてディスク２５は、透過部の幅が小さく透過部に例えばＮＤ２５（２５％の透過率をもつ減光部材）が設置されている領域２５ａ、透過部の幅が大きい領域２５ｂ、ラインパターンがなく例えばＮＤ６が設置されている領域２５ｃの３つの領域を有している。
【００５５】
上記のような構成をなすディスク２５を備えた共焦点顕微鏡の動作は、第１の実施の形態と同様であるので説明を省略する。
【００５６】
例えば、使用する低倍率の対物レンズと高倍率の対物レンズの倍率の差が大きい場合、低倍率の対物レンズは高倍率の対物レンズに比べて瞳径が著しく大きい。このため、高倍率の対物レンズを使用して観察することに合わせて光源の種類や光量を設定すると、低倍率の対物レンズを使用して共焦点観察をしたときに眩しく感じる。
【００５７】
これに対して本第２の実施の形態では、第１の実施の形態と異なり、透過部の幅が小さい領域にも減光部材が設置されているので、低倍率の対物レンズを使用し透過部の幅の小さい領域２５ａを光軸上に位置させて観察したときに、観察者は眩しく感じることがない。
【００５８】
（第３の実施の形態）
本第３の実施の形態は、第１の実施の形態に対してディスク上の形状、パターンと、移動部材の形状のみが異なるので、それらの部分について図４、図５を参照して説明し、他の部分については説明を省略する。
【００５９】
図４の（ａ）は、移動部材３６とラインパターンディスク（共焦点用ディスク）であるディスク３５の構成を示す上面図である。このディスク３５には、図４の（ｂ）に示すような透過部３５ｘと反射部３５ｙをもつラインパターンが複数設けられており、透過部３５ｘの幅は反射部３５ｙの約１／２０程度である。そしてディスク３５は、透過部の幅が小さい領域３５ａと、透過部の幅が大きい領域３５ｂの２つの領域を有している。
【００６０】
図５は、移動部材３６とディスク３５の構成を示す側面図である。移動部材３６にはＶ溝３６ａ、３６ｂ、３６ｃと孔３６ｌ、３６ｍ、３６ｎが設けられている。移動部材３６の移動に伴い、Ｖ溝３６ａ、３６ｂ、３６ｃの１つが位置決め機構７に係合することで、それぞれ孔３６ｌ、３６ｍ、３６ｎが光軸１５を通るよう、移動部材３６が位置決めされる。また、各孔３６ｌ、３６ｍ、３６ｎの入り口には、それぞれ当て付け３６ｓ、３６ｔ、３６ｕが設置されている。そして孔３６ｌには、ＮＤ６からなる減光部材３０１が当て付け３６ｓに保持されて挿入されている。
【００６１】
上記のような構成をなす共焦点顕微鏡の動作は、低い倍率の対物レンズを使用して共焦点観察をする場合と、高い倍率の対物レンズを使用して共焦点観察をする場合は、第１の実施の形態と同様であるが、非共焦点観察をする場合は異なるので、その場合について以下に述べ、他の観察については説明を省略する。
【００６２】
非共焦点観察をする場合、観察者はレバー８を持って移動部材３６を移動させ、孔３６ｌに光軸１５が通るようにディスク３５を位置決めする。この場合、Ｖ溝３６ａに位置決め機構７が係合する。この動作を行なった後、第１の実施の形態と同様に、観察者１４は接眼レンズ１３を介して観察をする。
【００６３】
以上のように本第３の実施の形態では、ディスク３５のラインパターンが配置されたいずれかの領域３５ａ、３５ｂが、使用する対物レンズの倍率や観察法に応じて光軸１５上に位置するように移動部材６が移動するため、最良の状態で共焦点観察を行なえる。また、ディスク３５外の孔３６ｌに光軸１５が通るように位置決めすれば、孔３６ｌに減光部材３０１が設置されているので、第１の実施の形態と同様に、観察者は眩しく感じずに非共焦点観察を行なえる。また、例えば孔３６ｎにＮＤ２５からなる減光部材を挿入してもよく、この場合、第２の実施の形態と同様に、低倍率の対物レンズを使用したときに観察者が眩しく感じることはない。
【００６４】
上記実施の形態においては、減光手段としてＮＤ６、ＮＤ２５を設置したが、これらと異なる透過率の減光部材を各箇所に配置してもよい。また、上記実施の形態においては、ディスク又は移動部材に例えばＮＤ６を設置したが、光軸に対して垂直な方向へ移動し光軸上の任意の位置に挿脱可能なようＮＤ６を設置してもよい。また、上記実施の形態においては、ディスク上に２種類のラインパターンを配置したが、これは１種類でも３種類以上であってもよい。
【００６５】
また、上記実施の形態においては、観察者が接眼レンズを介して像を観察するようにしているが、ＣＣＤカメラなどの撮像手段で撮像、観察してもよい。また、上記実施の形態においては、光源から試料に照射させるためにビームスプリッタを設置したが、偏光ビームスプリッタを設置し、この偏光ビームスプリッタが光を入射、出射する３方向側に偏光板を配置するように構成してもよい。また、上記実施の形態においては、光源に水銀又はキセノンの光源を使用したが、ハロゲン等その他の光源であってもよい。
【００６６】
また、上記実施の形態においては、ラインパターンの設置されているディスクを使用したが、例えばＮｉｐｋｏｗディスクのようなピンホールが螺旋状に配置されているディスクを使用してもよい。また、上記実施の形態においては、ディスク面から反射した不要な光、いわゆるゴーストが観察者の視野内に戻ってこないよう、ディスク５の面を光軸１５に垂直な面に対して５°傾けた。この傾ける角度は５°に限らず、例えば０°であってもよいが、好ましくは０°〜５°の間が効果的である。また、上記実施の形態においては、移動部材の移動を観察者が手動で行なったが、電動で移動させるようにしてもよい。
【００６７】
（第４の実施の形態）
図６は、本発明の第４の実施の形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す図である。この共焦点顕微鏡では、セクショニング像観察を行う。図６において、例えば水銀又はキセノンの光源１０１から出射される光の光路上に、コンデンサーレンズ１０２、偏光板１０３、ＰＢＳ（偏光ビームスプリッター）１０４が配置されている。ＰＢＳ１０４の反射光路上には、ディスク１０５、第１の結像レンズ１０７、１／４波長板１０８、対物レンズ１０９、及び図示しないステージに載置された試料１１０が配置されている。ＰＢＳ１０４の試料１１０に対する透過光路上には、第２の結像レンズ１１１とＣＣＤカメラ１１２が配置されている。ＣＣＤカメラ１１２の画像出力端子にはモニター１１３が接続されている。モニター１１３は、画像を表示する。
【００６８】
図７は、ディスク１０５の構成を示す図である。ディスク１０５は円盤状をなし、光学ガラスの基板上に図７に示すようなパターンが形成されており、同心円により三つの領域Ａ’、領域Ｂ’、及び領域Ｃ’に区分されている。このうち最内周の領域Ａは、光が一様に透過するよう透明になっている。その他の領域Ｂ’及びＣ’には多数のピンホールが螺旋状に設けられている。各領域Ｂ’、Ｃ’間のピンホールの直径は異なり、領域Ｂ’、Ｃ’の順に大きくなっている。各ピンホールは、互いの間隔がピンホールの直径の４〜１０倍程度となるよう配設されている。なお、図７において網で示された部分は、遮蔽部である。
【００６９】
ディスク１０５は、図示しない駆動機構によって、図６の矢印ａ又は矢印ｂの方向（紙面に対して左右方向）に移動可能である。また、ディスク１０５は、回転軸１０６を介して図示しないモータの軸に連結されており、前記モータの駆動により一定の回転速度で回転する。
【００７０】
次に、上記のような構成をなす共焦点顕微鏡の動作を説明する。
【００７１】
光源１０１から出射された光は、コンデンサーレンズ１０２、偏光板１０３を介し、ＰＢＳ１０４で一定の方向の偏光成分のみが反射され、一定の速度で回転するディスク１０５に入射される。ディスク１０５のピンホールを通過した光は、第１の結像レンズ１０７を通り、１／４波長板１０８で円偏光になって、対物レンズ１０９によって結像され、試料１１０に入射される。
【００７２】
試料１１０から反射された光は、対物レンズ１０９を介し、再度、１／４波長板１０８にて入射時の偏光方向に対して直交する偏光方向になり、第１の結像レンズ１０７によりディスク１０５上に試料像が投影される。投影された試料像のうち焦点の合っている部分はピンホールを通過し、さらにＰＢＳ１０４を第２の結像レンズ１１１の方向に透過して、第２の結像レンズ１１１を介してＣＣＤカメラ１１２で撮像される。ＣＣＤカメラ１１２で撮像された共焦点画像は、モニター１１３に表示される。
【００７３】
適切な共焦点効果を得るためにピンホール径Ｒは、光の波長をλ、観察する試料１１０のディスク１０５上への投影倍率をＭ、対物レンズ１０９の開口数をＮＡとすると、
Ｒ＝ｋλＭ／ＮＡ
の関係で設定される。ｋは係数であり、ｋ＝０．５〜１程度が良く使われる。したがって、対物レンズ１０９を交換すると、ディスク１０５上への投影倍率Ｍと開口数ＮＡが変わってしまうため、共焦点観察をするためのピンホール直径Ｒも変える必要がある。
【００７４】
観察に要する倍率を変えたときには、対物レンズ１０９を交換する。このとき、上記のようにディスク１０５上のピンホール直径も変える必要がある。通常、対物レンズ１０９の倍率が大きくなるにつれて、ＮＡは大きくなることが多いが、倍率が大きくなる割合に対して、ＮＡの大きくなる割合は小さい。よって、倍率の大きい対物レンズ１０９を用いる場合、ディスク１０５を図６の矢印ａの方向に移動させ、ピンホール径の大きい領域Ｃ’を用いるようにする。
【００７５】
また、焦点を合わせたり、観察位置を探したりするために、明視野像（非共焦点像）の観察を行いたいときには、ディスク１０５を図６の矢印ｂの方向に移動させ、パターンが無い素通し（透明）の領域Ａ’を用いるようにする。このとき、ガラス基板で形成されているディスク１０５を光路が通ることになるため、光路長に変化が無く、共焦点像の観察時と明視野像の観察時とで焦点が移動しないことになる。
【００７６】
なお、明視野像の観察時は、ディスク１０５のパターンが無い部分を使用するので、必ずしもディスク１０５を回転させる必要は無い。しかし、ディスク１０５は像面にあり、静止しているとディスク５上に挨等がつき、非常に目立つ。このため明視野像の観察時は、ディスク１０５を回転させることが望ましい。
【００７７】
（第５の実施の形態）
図８は、本発明の第５の実施の形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す図である。例えば水銀又はキセノンの光源３００から出射される光の光路上に、コリメータレンズ３０２、励起フィルター３０３、ダイクロイックミラー３０４が配置されている。ダイクロイックミラー３０４の反射光路上には、ディスク３０５、第１の結像レンズ３０７、対物レンズ３０８、及び図示しないステージに載置された試料３０９が配置されている。ダイクロイックミラー３０４の試料３０９に対する透過光路上には、吸収フィルタ３１０、第２の結像レンズ３１１、及びＣＣＤカメラ３１２が配置されている。
【００７８】
ディスク３０５は、図示しない駆動機構によって、図８の矢印ａ又は矢印ｂの方向（紙面に対して左右方向）に、モータ３０６と共に移動可能である。また、ディスク３０５は、回転軸３０５１を介してモータ３０６の軸に連結されており、モータ３０６の駆動により一定の回転速度で回転する。
【００７９】
図９の（ａ）は、ディスク３０５の構成を示す全体図であり、図９の（ｂ）は、ディスク３０５の部分拡大図である。ディスク３０５は円盤状をなし、図９の（ａ）に示すように、同心円により領域Ａ”、Ｂ”に分けられている。領域Ａ”（パターン部）にはスリット状の透過部が等間隔に配置され、さらに直線パターンを複数配置した一定の幅Ｄの領域４０１が、他の部分と直交するように設けられている。図９の（ｂ）は、図９の（ａ）の領域Ａ”の一部を拡大した図である。領域Ａ”のパターンは、図９の（ｂ）に示すように、直線状の光が通過するスリット部分４０５と光を遮蔽する遮蔽部分４０４とが交互に並んで配置されている。遮蔽部分４０４のラインの幅は、スリット部分４０５の幅より広く、これらは例えば１９：１の比になっている。また、領域Ｂ”は一様な透過率で光を透過するＮＤフィルタとなっており、その透過率は、領域Ａ”の透過率がＴの場合は、
【数４】
0004112257.tif 000004
（ｑ＝１〜０．２）となっている。例えば上記のように領域Ｂ”の透過率Ｔは５％、すなわち０．０５である。ｑ＝０．８を選べば、ＮＤフィルタの透過率は、
【数５】
0004112257.tif 000005
であるので、約１８％の透過率のＮＤフィルタを領域Ｂ”に形成しておく。なお、ｑ＝０．２の場合、視野中の１／２５（４％）の範囲で焦点が合っており、ｑ＝１の場合、視野中の全て（１００％）の範囲で焦点が合っている状態にある。共焦点顕微鏡で観察されるほぼ全ての試料は、このｑ＝１〜０．２の範囲で観察可能である。なお、図９の（ａ），（ｂ）において白抜きで示された部分は、遮蔽部である。
【００８０】
次に、上記のような構成をなす共焦点顕微鏡の動作を説明する。
【００８１】
光源３００から出射された光は、コリメータレンズ３０２を通って、励起フィルター３０３で波長選択され、ダイクロイックミラー３０４に入射する。励起フィルター３０３は、図１０の（ａ）に示すような透過特性を有し、光源３００からの光から蛍光を励起する波長の光を選択的に透過し、その他の波長の光を遮断する。また、ダイクロイックミラー３０４は、図１０の（ｂ）に示すように、励起フィルター３０３を透過した波長の光を反射し、図１０の（ｃ）に示すように、試料３０９からの蛍光の波長を透過する特性を有している。また、後述する吸収フィルター３１０は、励起波長を遮断し蛍光波長を透過する、図１０の（ｃ）に示すような透過特性を有している。
【００８２】
これらの波長特性は、使用する蛍光色素により異なる。例えば、ＦＩＴＣを観察する場合は、励起最大波長が４９０ｎｍ、蛍光最大波長が５２０ｎｍである。このため、励起フィルター３０３は透過する光の波長が４６０〜４９０ｎｍであるもの、ダイクロイックミラー３０４は反射波長が４６０〜４９０ｎｍであるもの、ダイクロイックミラー３０４と吸収フィルターは透過する波長が５１０ｎｍであるものが多く使われる。
【００８３】
ダイクロイックミラー３０４で反射された励起光は、一定の速度で回転するディスク３０５に入射される。共焦点像を観察する場合は、直線状のパターンが形成されている図９の（ａ）の領域Ａ”が光路上に位置するようディスク５を移動させておく。このディスク３０５の直線状のスリット部分４０５を透過した光は、第１の結像レンズ３０７を通り、対物レンズ３０８によって結像され、試料３０９に入射される。
【００８４】
励起光により、試料３０９は蛍光発光する。試料３０９からの蛍光は、対物レンズ３０８を通り、第１の結像レンズ３０７を介してディスク３０５に入射し、ディスク３０５上で試料３０９の像が結像される。結像された像のうち、焦点の合っている成分は、ディスク３０５上のスリット部分４０５を通過し、蛍光波長の光がダイクロイックミラー３０４を透過する。吸収フィルター３１０でも、励起波長の光は遮断される。蛍光波長の光は吸収フィルター３１０を透過し、第２結像レンズ３１１を介してＣＣＤカメラ３１２に入射し、ＣＣＤカメラ３１２で試料蛍光像が結像される。
【００８５】
焦点を合わせたり、観察位置を探したりするために、明視野像(非共焦点像)の観察を行いたいときには、ディスク３０５を図８の矢印ａの方向に移動させ、パターンが無い一様な透過用の領域Ｂ”を用いるようにする。ここで、直線状のパターンの領域Ａ”から領域Ｂ”に切り替えたときに、領域Ｂ”が透過率がほぼ１００％である素通しのガラス基板であると、観察像が明るくなり過ぎてしまうため、何らかの手段で減光をする必要がある。共焦点像の観察時には、ディスク３０５の透過率がＴのとき、光源３００からの光のＴ倍の光が試料３０９に照射される。試料３０９からの蛍光は、ディスク３０５を通る。このとき焦点が合っていれば、９０％程度の蛍光を透過するが、焦点が合っていないと、非合焦の度合いに応じて透過する蛍光が減ることになる。数百μｍ以上非合焦であれば、蛍光もディスク３０５によりＴ倍になるが、通常顕微鏡で観察する試料の厚さは数μｍ〜数十μｍであるため、Ｔ倍も暗くはならない。
【００８６】
一様な透過用の領域Ｂ”の透過率を、
【数６】
0004112257.tif 000006
（ｑ＝１〜０．２）にすると、１００％の透過に対して、観察像の明るさはｑ２Ｔ倍になる。本実施の形態では、明視野像の明るさが０．１８２＝０．０３倍になり、共焦点像の明るさは合焦部分のみが０．０５倍であり非合焦像はこれより非常に暗くなっているので、明視野像と共焦点像の明るさはほぼ同じになると考えられる。
【００８７】
また、明視野像の観察時でも第４の実施の形態と同様に、ガラス基板で形成されているディスク３０５を光路が通ることになるため、光路長に変化が無く、共焦点像の観察時と比べて焦点は移動しない。
【００８８】
本第５の実施の形態では、ディスク３０５における直線状の透過部分の幅と遮蔽部分の幅との比を１：１９にしているが、この比はこれより小さくても大きくても良い。例えば、非常に暗い蛍光の場合は、非合焦成分が増えるが、前記比を１：５ほどにすると、像が明るくなる。また、非常に明るい蛍光の場合は１：５０ほどにすると、非合焦成分がほとんど無くなり、焦点の合った像のみのセクショニング画像が得られる。しかしこの場合、像は暗くなる。
【００８９】
また第４の実施の形態では、試料の反射像をピンホールが形成されたＮｉｐｋｏｗディスクで、第５の実施の形態では、蛍光試料を直線状のパターンを有するディスクで観察する例を示したが、ディスクのパターンは第４の実施の形態と第５の実施の形態とを入れ替えてもよい。
【００９０】
また、第５の実施の形態においても、ＮＤフィルタの部分を第４の実施の形態と同様に透明にして、焦点ずれがなくなる効果のみにしてもよい。さらに第５の実施の形態においても、第４の実施の形態と同様に、ディスクを同心円上の領域に分けて、異なったラインパターンを領域ごとに形成し、異なった対物レンズヘの対応を図ることも考えられる。この場合、一様に光を透過する領域を外側の同心円領域に配置してもよい。また、Ｚステージを追加して、試料と対物レンズとの距離を変化させ、次々に画像を取り込めば、３次元観察を行うことも可能である。
【００９１】
以上のように、第１，２，５の実施の形態ではディスクに減光手段を設けた共焦点顕微鏡について述べた。
【００９２】
なお、本発明は上記各実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。
【００９３】
【発明の効果】
本発明の共焦点顕微鏡によれば、ディスクの一部の領域を一定の透過率とし、明視野像の観察時にこの領域を通して観察を行なうよう構成したので、顕微鏡を非常に安価に作製でき、観察が容易になるばかりでなく、共焦点像と明視野像とを切り換えて観察をしても、焦点の移動が無くなる。また、ディスクの一定の透過率の領域にＮＤフィルタを形成し、その透過率を、パターン部分の透過率Ｔとしたときに、
【数７】
0004112257.tif 000007
（ｑ＝１〜０．２）とすることで、共焦点像と明視野像とを切り換えて観察したときに観察像の明るさがほぼ同じになり、光量を調節する必要が無くなる。
【００９４】
以上のように本発明によれば、簡単な構成により良好な状態で観察を行なえる共焦点顕微鏡を提供できる。
【００９５】
また本発明によれば、共焦点像と明視野像の観察切換えを容易に行え、かつ切換え時に焦点の調整を必要としない共焦点顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す図。
【図２】本発明の第１の実施の形態に係るディスクの構成を示す図。
【図３】本発明の第２の実施の形態に係るディスクの構成を示す図。
【図４】本発明の第３の実施の形態に係る移動部材とディスクの構成を示す上面図。
【図５】本発明の第３の実施の形態に係る移動部材とディスクの構成を示す側面図。
【図６】本発明の第４の実施の形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す図。
【図７】本発明の第４の実施の形態に係るディスクの構成を示す図。
【図８】本発明の第５の実施の形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す図。
【図９】本発明の第５の実施の形態に係るディスクの構成を示す図。
【図１０】本発明の第５の実施の形態に係る透過特性と反射特性を示す図。
【図１１】従来例に係る共焦点顕微鏡の構成を示す図。
【図１２】従来例に係るＮｉｐｋｏｗディスクの構成を示す図。
【符号の説明】
１…光源
２…コレクタレンズ
３…ビームスプリッタ
４…モータ
４ａ…軸
５…ディスク
６…移動部材
６ａ、６ｂ、６ｃ…Ｖ溝
７…位置決め機構
８…レバー
９…結像レンズ
１０…対物レンズ
１１…試料
１２…結像レンズ
１３…接眼レンズ
１４…観察者
１５…光軸
２５…ディスク
３５…ディスク
３６…移動部材
３６ａ、３６ｂ、３６ｃ…Ｖ溝
３６ｌ、３６ｍ、３６ｎ…孔
３０１…減光部材
３６ｓ、３６ｔ、３６ｕ…当て付け
１０１…光源
１０２…コンデンサーレンズ
１０３…偏光板
１０４…ＰＢＳ
１０５…ディスク
１０６…回転軸
１０７…第１の結像レンズ
１０８…１／４波長板
１０９…対物レンズ
１１０…試料
１１１…第２の結像レンズ
１１２…ＣＣＤカメラ
１１３…モニター
３００…光源
３０２…コリメータレンズ
３０３…励起フィルター
３０４…ダイクロイックミラー
３０５…ディスク
３０５１…回転軸
３０６…モータ
３０７…第１の結像レンズ
３０８…対物レンズ
３０９…試料
３１０…吸収フィルタ
３１１…第２の結像レンズ
３１２…ＣＣＤ
【図１】
0004112257.tif 000009
【図２】
0004112257.tif 000010
【図３】
0004112257.tif 000011
【図４】
0004112257.tif 000012
【図５】
0004112257.tif 000013
【図６】
0004112257.tif 000014
【図７】
0004112257.tif 000015
【図８】
0004112257.tif 000016
【図９】
0004112257.tif 000017
【図１０】
0004112257.tif 000018
【図１１】
0004112257.tif 000019
【図１２】
0004112257.tif 000020