(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質を含む試料を酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用して酸性雰囲気下で保持させるリン酸化合物の保持工程と、保持されなかったアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖又は脂質を所望のカラムにて分離・精製し、所望の検出器で検出する工程と、次に前処理カラムに保持されたリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質をリン酸塩、リン酸或いはアルカリ性溶液を含む溶液により溶出させるリン酸化合物の溶出工程と、それらを所望のカラムにて分離・精製し、所望の検出器で検出するリン酸化合物の検出工程よりなることを特徴とするリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質の抽出分離を含むアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖又は脂質分析方法。
【請求項２】
リン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質又はそれらを含む試料をｐＨ２程度の酸性溶液を含む溶液で酸化チタンカラムを前処理カラムとする逆相系ＨＰＬＣカラムに供給し、試料マトリクスの中からリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質を選択的に保持させ、前処理カラムに保持されなかったアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を逆相系ＨＰＬＣカラムにて精製し、所望の検出器で検出する工程と、次に前処理カラムに保持されたリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質を５０ｍＭ以上のリン酸バッファーにより溶出させ、それらを逆相系ＨＰＬＣカラムと所望の検出器にて分離検出を行う工程よりなることを特徴とするリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質の抽出分離を含むアミノ酸、ペプチド又はタンパク質分析方法。
【請求項３】
リン酸化合物の保持工程に於いて、ｐＨ０．８以上の酸性溶液を含む溶液で酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用し、リン酸化合物の溶出工程に於いて５０ｍＭ以上のリン酸バッファー、０．２％以上のリン酸或いはｐＨ８．０以上のアルカリ性溶液を含む溶液を使用することを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖又は脂質分析方法。
【請求項４】
分離・精製に逆相系固相又は陰イオン交換固相を用い、所望の検出器のイオン化部がＭＡＬＤＩプレートであるＭＳとすることを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖又は脂質分析方法。
【請求項５】
リン酸化糖を含む試料を酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用して酸性雰囲気下で保持させるリン酸化合物の保持工程に於いて、ｐＨ０．８程度の酸性溶液を含む溶液で保持させ、非リン酸化合物の検出工程に於いて分離・精製に陰イオン交換カラムを使用し、リン酸化合物の溶出工程に於いて５０ｍＭ以上のリン酸バッファーにより溶出させ、リン酸化合物の検出工程に於いて分離・精製に陰イオン交換カラムを使用することを特徴とするリン酸化糖の抽出分離を含む糖分析方法。
【請求項６】
リン脂質を含む試料を酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用して酸性雰囲気下で保持させるリン酸化合物の保持工程に於いて、ｐＨ２．０程度の酸性溶液を含む溶液で保持させ、非リン酸化合物の検出工程に於いて分離・精製に逆相系カラム又は陰イオン交換カラムを使用し、リン酸化合物の溶出工程に於いて０．６％以上のリン酸を含む溶液により溶出させ、リン酸化合物の検出工程に於いて分離・精製に逆相系カラム又は陰イオン交換カラムを使用することを特徴とするリン脂質の抽出分離を含む脂質分析方法。
【請求項７】
リン酸化合物の溶出工程に於いて、５０ｍＭ以上のリン酸バッファー、０．２％以上のリン酸或いはｐＨ８．０以上のアルカリを含む溶液により溶出させることを特徴とする請求項２に記載のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質分析方法。
【請求項８】
所望数の溶媒をポンプに選択自在に接続すると共に、該ポンプはインジェクターを介してスイッチングバルブを連結する一方、スイッチングバルブには酸化チタンカラム及び逆相系ＨＰＬＣカラム又は陰イオン交換カラムを接続して、酸化チタンカラムを試料保持の前処理カラムに設定自在とし、逆相系ＨＰＬＣカラム又は陰イオン交換カラムに検出器を接続する一方、試料を酸化チタンカラムに保持し、他の部分を逆相系ＨＰＬＣカラムに流して保持する流路と、酸化チタンカラムに保持した部分を流し、逆相系ＨＰＬＣカラムに送る流路とをスイッチングバルブを介して形成することを特徴とするリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質の選択的抽出分離を含むアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖又は脂質分析装置。
【請求項９】
所望数の溶媒をポンプに選択自在に接続すると共に、該ポンプはインジェクターを介してスイッチングバルブを連結する一方、スイッチングバルブには、試料保持の酸化チタンカラム及び固相抽出カラムを接続して酸化チタンカラムを前処理カラムに設定自在とし、固相抽出カラムに検出器を接続する一方、試料を酸化チタンカラムに保持し、他の部分を固相抽出カラムに流して保持する流路と、酸化チタンカラムに保持した部分を流し、固相抽出カラムに送る流路とをスイッチングバルブを介して形成することを特徴とするリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質の選択的抽出分離を含むアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖又は脂質分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質等のリン酸化物の簡便な抽出若しくは分離方法及び装置に関するものである。
【０００２】
背景技術
リン酸化タンパク質は生体内で細胞内のシグナル伝達など重要な役割を担っており、細胞内シグナル伝達カスケードについて知見を得るにはリン酸化タンパク質解析技術は必須である。生体内でのシグナル伝達解析は学術分野のみならず医療、製薬、食品分野においても重要である。
【０００３】
シグナル伝達を含む細胞内の状態変化を探るため、近年登場したプロテオミクスにおいては、ある状態（例えば何か刺激が加わった状態）の細胞中の発現タンパク質を取りこぼすこと無く検出同定し、各タンパク質の存在量の変化、タンパク質の相互作用更に修飾やその他活性型の解析を行い、シグナル伝達を含む細胞内の状態変化を探ることを目指している。現在一般的な実験法として、分画したタンパク質をトリプシン等の消化酵素で加水分解し、生じたペプチドをＭＳ分析し、データベースを活用してタンパク質の同定、定量を行う。ただデータベースの充実化から、実験法自体がタンパク質を混合物のまま加水分解し、ＭＳ分析する方向へ変わりつつあり、ペプチド混合物の中からリン酸化ペプチドを検出・定量する技術が必要になる。本発明はこの必要を満たす手法となりうる。
【０００４】
現在実用化されているリン酸化タンパク質の分析法のうち、いくつかの方法について具体的に説明し、夫々の方法の問題点を挙げる。
【０００５】
リン酸化タンパク質検出法の１つに、二次元電気泳動とアルカリフォスファターゼ処理を組合わせ、フォスファターゼ処理により移動したスポットをリン酸化タンパク質とし、これを加水分解した後ＭＳ分析でリン酸化部位の決定とタンパク質のリン酸化の程度を解析する方法があるが、２種の電気泳動板を比べてスポットの移動を判断するのは時間と経験を要する作業である。
【０００６】
又、リン酸化アミノ酸残基を一部重水素置換されたビオチン残基へ化学変換し、ビオチン・アビジンアフィニティ、トリブシン消化、ＭＳ／ＭＳ分析によりリン酸化タンパク質の選択的濃縮や定量、タンパク質のリン酸化の程度を定量する方法があるが、リン酸基のビオチン残基への化学変換により、間接的な分析法となる。
【０００７】
又、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-time of flight）ＭＳやNanoelecrospray ＭＳでリン酸化ペプチド分析を行う場合の前処理として、リン酸基と金属イオンとの錯形成を利用したリン酸化ペプチドの濃縮法があるが、ペプチド中の1つのリン酸基を認識できない場合がある。又、ペプチド中にアスパラギン酸やグルタミン酸残基などがある場合、リン酸基が金属イオンと錯体を作る条件ではこれ等のアミノ酸も金属イオンと錯体を形成してしまうため、選択的濃縮が難しい。
【０００８】
ヒスチジン融合タンパク質とニッケル、鉄、鋼などのカラムの錯形成やＧＳＴ（glutathione-s-transferase）融合タンパク質とグルタチオン固定化カラムのアフィニティー等で目的とするリン酸化タンパク質を分離した後、タンパク質のリン酸化の程度を測る技術として、抗体を用いた免疫ブロッティングによるリン酸化アミノ酸残基の定量法があるが、抗体が種々のリン酸化アミノ酸に対して万能でないため、何種類かの抗体を使い分けたり、抗体の作製から実験を行う必要があるケースがあり、試行錯誤を要する。又予め同位体３２Ｐで含量を測定する方法があるが、タンパク質の標識に時間を要する上、タンパク質の３２Ｐ含量の測定では実験者が放射線を浴びる危険性がある。
【０００９】
リン酸化タンパク質の解析には以上のような方法が使われているが、特にプロテオミクスのような分野では多くの検体を処理しなければならず、解析の簡便迅速化、低コスト化が望まれている。一方、酸化チタン（ＴｉＯ２）はケモアフィテイー担体として、その実用性と応用範囲の広さが注目を浴びている。高い耐酸、耐アルカリ性に加えて、優れた構造認識機能があり、特にリン酸基に対して高い吸着選択性を示すことが明らかになっている。
【００１０】
したがって、本発明は、簡便且つ安全、迅速に更に低コストでリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質或いはリン酸化糖、リン酸化脂質等のリン酸化物の構造を壊すことのない選択的抽出若しくは分離、精製、検出する方法及びこれを使用する装置を提供することを目的としている。
【００１１】
発明の開示
簡便迅速にリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質等のリン酸化物を選択的に抽出又は分離することにより、学術、産業分野におけるリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質解析の速度の向上、必要な経費の低減、実験操作の煩雑さや危険性を軽減するため、第１に、リン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質を含む試料を酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用して酸性雰囲気下で保持させるリン酸化合物の保持工程と、保持されなかったアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖又は脂質を所望のカラムにて分離・精製し、所望の検出器で検出する工程と、次に前処理カラムに保持されたリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質をリン酸塩、リン酸或いはアルカリ性溶液を含む溶液により溶出させるリン酸化合物の溶出工程と、それらを所望のカラムにて分離・精製し、所望の検出器で検出するリン酸化合物の検出工程よりなることを特徴としている。
【００１２】
このことにより、簡単迅速にリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖、リン酸化脂質等のリン酸化物を選択的に抽出・分離することにより、学術、産業各分野におけるリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖、リン酸化脂質解析の速度の向上、実験操作の簡易化、危険性の防止等の効果をあげることが出来、産業上殊に食品、薬品工業に資する処大である。更には前処理カラムからの成分を廃棄することが出来る。その場合、該カラムからの溶出工程、当然検出工程をも省略でき、必要成分のみの工程とすることが出来、操作がより迅速簡易化できる。
【００１３】
第２に、リン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質又はそれらを含む試料をｐＨ２程度の酸性溶液を含む溶液で酸化チタンカラムを前処理カラムとする逆相系ＨＰＬＣカラムに供給し、試料マトリクスの中からリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質を選択的に保持させ、前処理カラムに保持されなかったアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を逆相系ＨＰＬＣカラムにて精製し、所望の検出器で検出する工程と、次に前処理カラムに保持されたリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質を５０ｍＭ以上のリン酸バッファーにより溶出させ、それらを逆相系ＨＰＬＣカラムと所望の検出器にて分離検出を行う工程よりなることを特徴としている。
【００１４】
このことにより、リン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質を含む試料をこの工程に乗せることにより、リン酸化アミノ酸等を試料中から選り分けることが出来る。即ち、この一連の工程により、目的成分のリン酸化アミノ酸等をチタニアカラムのプレカラムに選択保持し、他の成分を溶出させて逆相系ＨＰＬＣカラムに送り、検出等の操作を為し、次いで目的成分を溶出させ、逆相系ＨＰＬＣカラムに保持させて検出等を為すことにより、極めて簡単な操作で従来の夾雑物質の除去や溶出成分の分取、その他の複雑で面倒な操作を必要とせず、目的成分のリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質を抽出、分離、精製、定性、定量等を行うことが出来る。
【００１５】
第３にリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質を含む試料を酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用して酸性雰囲気下で保持させた後、リン酸化合物の溶出工程にて溶出された化合物を検出工程に移行せず、分取して利用することを特徴としている。このことにより、選択的に抽出されたリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質の検出工程を省き、より迅速にそれらを生化学実験のアッセイなどに用いることが出来る。
【００１６】
第４に、リン酸化合物の保持工程に於いて、ｐＨ０．８以上の酸性溶液を含む溶液で酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用し、リン酸化合物の溶出工程に於いて５０ｍＭ以上のリン酸バッファー、０．２％以上のリン酸或いはｐＨ８．０以上のアルカリ性溶液を含む溶液を使用することを特徴としている。
このことにより、簡便な操作と安価な試薬を用いることでリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質を選択的に抽出・分離できる。
【００１７】
第５に、分離・精製に逆相系固相又は陰イオン交換固相を用い、所望の検出器のイオン化部がＭＡＬＤＩプレートであるＭＳとすることを特徴としている。
このことにより、夾雑のマトリクスや塩が混ざった状態ではイオン化し難いリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質を、イオン化及びＭＳ測定し易い状態に出来る。
【００１８】
第６に、リン酸化糖を含む試料を酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用して酸性雰囲気下で保持させるリン酸化合物の保持工程に於いて、ｐＨ０．８程度の酸性溶液を含む溶液で保持させ、非リン酸化合物の検出工程に於いて分離・精製に陰イオン交換カラムを使用し、リン酸化合物の溶出工程に於いて５０ｍＭ以上のリン酸バッファーにより溶出させ、リン酸化合物の検出工程に於いて分離・精製に陰イオン交換カラムを使用することを特徴としている。
このことにより、簡便な操作と安価な試薬を用いることで抽出・分離したリン酸化糖を酸化チタンカラムと性質の異なるカラムを用いて分析して同定、更なる精製、定性又は定量できる。
【００１９】
第７に、リン脂質を含む試料を酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用して酸性雰囲気下で保持させるリン酸化合物の保持工程に於いて、ｐＨ２．０程度の酸性溶液を含む溶液で保持させ、非リン酸化合物の検出工程に於いて分離・精製に逆相系カラム又は陰イオン交換カラムを使用し、リン酸化合物の溶出工程に於いて０．６％以上のリン酸を含む溶液により溶出させ、リン酸化合物の検出工程に於いて分離・精製に逆相系カラム又は陰イオン交換カラムを使用することを特徴としている。
このことにより、簡便な操作と安価な試薬を用いることで、抽出・分離したリン脂質を酸化チタンと性質の異なるカラムを用いて分析して同定、更なる精製、定性又は定量できる。
【００２０】
第８に、リン酸化合物の溶出工程に於いて、５０ｍＭ以上のリン酸バッファー、０．２％以上のリン酸或いはｐＨ８．０以上のアルカリを含む溶液により溶出させることを特徴としている。
このことにより、簡便な操作と安価な試薬を用いることで、抽出・分離したリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質を酸化チタンカラムと性質の異なるカラムを用いて分析して同定、更なる精製、定性又は定量できる。
【００２１】
第９に、所望数の溶媒をポンプに選択自在に接続すると共に、該ポンプはインジェクターを介してスイッチングバルブを連結する一方、スイッチングバルブには酸化チタンカラム及び逆相系ＨＰＬＣカラム又は陰イオン交換カラムを接続して、酸化チタンカラムを試料保持の前処理カラムに設定自在とし、逆相系ＨＰＬＣカラム又は陰イオン交換カラムに検出器を接続する一方、試料を酸化チタンカラムに保持し、他の部分を逆相系ＨＰＬＣカラムに流して保持する流路と、酸化チタンカラムに保持した部分を流し、逆相系ＨＰＬＣカラムに送る流路とをスイッチングバルブを介して形成することを特徴としている。
このことにより、酸化チタンカラムに試料成分を通すことにより、目的成分のリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド等の選択的保持を行い、次いで目的成分以外を逆相系ＨＰＬＣカラムにて保持させ、続いて検出操作に移行させ、目的成分をバッファーにより溶出させ逆相系ＨＰＬＣカラムに保持させ、続いて検出、同定操作を行なうので、目的成分の存在量の変化等のプロテオミクスに於ける細胞内の状態変化に応答するタンパク質のリン酸化の程度の変化の追跡にも重要な装置となる。
【００２２】
第１０に、所望数の溶媒をポンプに選択自在に接続すると共に、該ポンプはインジェクターを介してスイッチングバルブを連結する一方、スイッチングバルブには、試料保持の酸化チタンカラム及び固相抽出カラムを接続して酸化チタンカラムを前処理カラムに設定自在とし、固相抽出カラムに検出器を接続する一方、試料を酸化チタンカラムに保持し、他の部分を固相抽出カラムに流して保持する流路と、酸化チタンカラムに保持した部分を流し、固相抽出カラムに送る流路とをスイッチングバルブを介して形成することを特徴としている。
このことにより、酸化チタンカラムに試料成分を通すことにより、目的成分のリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド等の選択的保持を行ない、次いで目的成分以外を固相カラムにて保持させ、続いて検出操作に移行させ、目的成分をバッファーにより溶出させ固相カラムに保持させ、続いて検出、同定操作を行なうので、目的成分の存在量の変化等のプロテオミクスに於ける細胞内の状態変化に応答するタンパク質のリン酸化の程度の変化の追跡にも重要な装置となる。
【００２３】
発明を実施する為の最良の形態
次に本発明を更に具体的に説明する。
本発明の1つは、酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）を用いた処理を逆相系ＨＰＬＣ分析の前処理とすることにより、リン酸化ペプチド、リン酸化アミノ酸、リン酸化タンパク質（以下リン酸化ペプチド等と云う）を選択的に保持させ、リン酸化されないペプチド、アミノ酸、タンパク質（以下ペプチド等と云う）は酸化チタンカラムを素通りさせ、逆相系ＨＰＬＣカラムの入口に保持濃縮させる。ここで該逆相系ＨＰＬＣカラムに保持されたリン酸化されていないペプチド等は溶離液を替えて溶出させ、連結する検出器、ＨＰＬＣ等の分析装置により検出、分析される。
【００２４】
次いで、逆相系ＨＰＬＣカラム内から有機溶媒を除くための水（トリフルオロ酢酸０．１％含有させることは推奨される。）を流す。そこで酸化チタンカラムからリン酸化ペプチド等を溶出させ、逆相系ＨＰＬＣカラムに保持させるため、前処理カラム及び逆相系ＨＰＬＣカラムにバッファーを流す。
【００２５】
このバッファーはｐＨが５．６〜７．０の０．１Ｍリン酸化バッファーを使用し、リン酸化ペプチド等を酸化チタンカラムから溶出させる溶媒に適する。又、バッファー中のリン酸濃度が高いとバッファーのｐＨが低くてもリン酸化ペプチド等を酸化チタンカラムから溶出できる。
【００２６】
次に図１により本発明の一実施装置を説明する。
溶媒１、溶媒２をポンプ３に選択自在に接続しておく。
ポンプ３は、インジェクター４を介してスイッチングバルブ５に連結してある。スイッチングバルブ５には酸化チタンカラム６を連接し、一方には逆相系ＨＰＬＣカラム７を連結し、該逆相系ＨＰＬＣカラム７にはＵＶ検出器８を接続してある。酸化チタンカラム６は充填剤の主成分をアナターゼ型酸化チタンを用いるのがよい。
【００２７】
検出器としては、高速液体クロマトグラフィーと接続可能であればよく、蛍光検出器、質量スペクトル検出器、電気化学検出器、示差屈折率検出器等が挙げられる。
【００２８】
アナターゼ型とルチル型の酸化チタンのＸ線結晶解析データを図２に示す。充填剤のＸ線結晶解析結果を図３に示す。
【００２９】
図２では、○印を付けたピークがアナターゼ型酸化チタンのピーク、印を付けないピークがルチル型酸化チタンのピークを表す。図３では、アナターゼ型の酸化チタンのピークが現れており、Titansphere（登録商標） TiO、充填剤の主成分がアナターゼ型であることを表している。
【００３０】
カラムの形態は球状チタニアゲルを充填したものが使用される。その粒子径は０．０１〜１０００μｍ、好ましくはＨＰＬＣの場合１〜１０μｍ、固相の場合５〜３００μｍの球状粒子がよい。又、０．１〜２０μｍの貫通孔を有する連続体が使用される。
【００３１】
＜実施例１＞
試料として以下を使用する。
アミノ酸１９残基の、配列が同じペプチド４種、分子量２０００前後：
（１）N末端から１１番目のスレオニン、１２番目のチロシンがリン酸化されたものと夾雑のペプチド
その一例を示すと、
YSK IEK IGE GT(p) Y(p) GVV YKG R MW:2307.46
（２）N末端から１１番目のスレオニンがリン酸化されたものと夾雑のリン酸化されていないペプチド
その一例を示すと、
YSK IEK IGE GT(p) Y GVV YKG R MW2227.46
（３）N末端から１２番目のチロシンがリン酸化されたもの
その一例を示すと、
YSK IEK IGE GTY(p) GVV YKG R MW2227.46
（４）リン酸化されていないもの
その一例を示すと、
YSK IEK IGE GTY GVV YKG R MW2147.46
及びヒトインシュリン受容体断片（アミノ酸12残基のペプチド）：
（５）TRD IY（p）E TDY YRK（リン酸型）
（６）TRD IYE TDY YRK
引用論文名
Deshimaru S.,Miyake Y.,Ohmiya T.,Tatsu Y.,Endo Y.,Yumoto N.,
And Toraya T.,”cDNA cloning,expressin,and catalytic properties of
Cdc25 phosphatase domain of the starfish Asterina pectinifera”J.
Biochem(2002), in press
をそれぞれ逆相系ＨＰＬＣカラム（製品名Inertsil（登録商標） WP300C8）、酸化チタンカラムをプレカラムとしたInertsil（登録商標） WP300C8で、トリフルオロ酢酸０．１％を含む水１００％からトリフルオロ酢酸０．１％を含むアセトニトリルの割合を４５％まで増やす条件でＨＰＬＣ分析した。用いたＨＰＬＣ分析システム概要を図１に、分析結果を図４〜９に示す。
【００３２】
図１では、酸化チタンカラムはTitansphere（登録商標） TiO（10 × 4.0 mm I.D.、ジーエルサイエンス 製）を、逆相系HPLCカラムはInertsil（登録商標） WP300 C8（150 × 4.6 mm I.D.、ジーエルサイエンス 製）を用いた。溶媒１はトリフルオロ酢酸を０．１％含む水、溶媒２はトリフルオロ酢酸を０．１％含むアセトニトリルを用いた。ＨＰＬＣシステムとして、ポンプHITACHI Pump L-7120、検出器HITACHI Diode Array Detector L-7455、データ処理機HITACHI SYSTEM MANAGER（以上、HITACHI製）、インジェクター RHEODYNE 8125（レオダイン社 製）、スイッチングバルブ SSC E1E010（センシュー科学 製）を用いた。Titansphere（登録商標） TiOを前処理カラムとして直結したInertsil（登録商標） WP300 C8を使うときは、スイッチングバルブの流路は白、Inertsil（登録商標） WP300 C8のみを使うときはスイッチングバルブの流路は黒とした。サンプルループ及び配管にはすべてピーク材を用いた。
【００３３】
図４は実施例１のペプチド（１）の分析データで、 図４では、Inertsil（登録商標） WP300C8を用いてのＨＰＬＣ分析によるデータａ上に何本か現れたピークのうち、主要なピークが、Titansphere（登録商標） TiOを前処理カラムとして直結したInertsil（登録商標） WP300C8を用いてのＨＰＬＣ分析によるデータｂ上にて消失している。
カラム：ａ．Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ．Titansphere TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：Ａ．水（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ｂ．アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ａ／Ｂ＝１００／０（０ｍｉｎ）→５５／４５（９０ｍｉｎ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（１）
【００３４】
図５は実施例１に示すペプチド（２）の分析データで、 図５では、Inertsil（登録商標） WP300C8を用いてのＨＰＬＣ分析によるデータａ上に現れた一本のピーク強度が、Titansphere TiOを前処理カラムとして直結したInertsil（登録商標） WP300C8を用いてのＨＰＬＣ分析によるデータｂ上にて減少している。
カラム：ａ．Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ．Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：Ａ．水（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ｂ．アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ａ／Ｂ＝１００／０（０ｍｉｎ）→５５／４５（９０ｍｉｎ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（２）
【００３５】
後日、ペプチド（２）を逆相系ＨＰＬＣカラムを用いたイオンペアクロマトグラフィー分析すると、２本のピークが検出された事から、ペプチド（２）は逆相系ＨＰＬＣカラムによるデータ上では一本のピークとして現れるが、リン酸化されておらず、極性が近いペプチドとの混合物であることがわかった。このことから、逆相系分析では困難なリン酸化ペプチドのリン酸化の程度の分析も可能であることがわかった。
【００３６】
図６は実施例１のペプチド（３）の分析データで、図６では、Inertsil（登録商標） WP300C8を用いてのHPLC分析によるデータａ上に現れた一本のピークが、Titansphere（登録商標） TiOを前処理カラムとして直結したInertsil（登録商標） WP300C8を用いてのHPLC分析によるデータｂ上にてほぼ１００％消失している。
カラム：ａ．Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ．Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：Ａ．水（０．１％トリフリオロ酢酸）
Ｂ．アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ａ／Ｂ＝１００／０（０ｍｉｎ）→５５／４５（９０ｍｉｎ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（３）
【００３７】
図７は実施例１のペプチド（４）の分析データで、図７では、Inertsil（登録商標） WP300C8を用いてのＨＰＬＣ分析によるデータａ上に現れた一本のピークは、Titansphere（登録商標） TiOを前処理カラムとして直結したInertsil（登録商標） WP300C8を用いてのＨＰＬＣ分析によるデータｂにて減少していない。
カラム：ａ．Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ．Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：Ａ．水（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ｂ．アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ａ／Ｂ＝１００／０（０ｍｉｎ）→５５／４５（９０ｍｉｎ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（４）
【００３８】
図８は実施例１のペプチド（５）の分析データで、図８では、Inertsil（登録商標） WP300C8を用いてのＨＰＬＣ分析によるデータａ上に現れた一本のピークが、Titansphere（登録商標） TiOを前処理カラムとして直結したInertsil（登録商標） WP300C8を用いてのＨＰＬＣ分析によるデータｂ上にてほぼ１００％消失している。
カラム：ａ．Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ．Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：Ａ．水（０．１％トリフリオロ酢酸）
Ｂ．アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ａ／Ｂ＝１００／０（０ｍｉｎ）→５５／４５（４５ｍｉｎ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（５）
【００３９】
図９は実施例１のペプチド（６）の分析データで、図９では、Inertsil（登録商標） WP300C8を用いてのＨＰＬＣ分析によるデータａ上に現れた一本のピークは、Titansphere TiOを前処理カラムとして直結したInertsil（登録商標） WP300C8を用いてのＨＰＬＣ分析によるデータｂ上にて減少していない。
カラム：ａ．Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ．Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：Ａ．水（０．１％トリフリオロ酢酸）
Ｂ．アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ａ／Ｂ＝１００／０（０ｍｉｎ）→５５／４５（４５ｍｉｎ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（６）
【００４０】
これらの結果から、酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）を逆相系ＨＰＬＣカラム（Inertsil（登録商標） WP300C8）のプレカラムとすることにより、Inertsil （登録商標）WP300C8を用いてのＨＰＬＣ分析によるデータ上でリン酸化ペプチドのピークが消失することと、リン酸化されていないペプチドのピーク強度は減少しないことがわかった。このことから、Inertsil（登録商標） WP300C8を用いてペプチドを分析する溶離液条件に含まれる比率の溶媒（トリフルオロ酢酸を０．１％含む水１００％の溶離液から、トリフルオロ酢酸を０．１％含む水５５％とトリフルオロ酢酸を０．１％含むアセトニトリル４５％の溶離液まで）では酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）によりリン酸化ペプチドを選択的に保持できることがわかった。
【００４１】
対象となるリン酸化ペプチドの分子量範囲は特に限定するものではなく、任意の分子量について可能である。後述する実施例７に示すカゼインのトリプシン消化物中には様々な分子量のペプチド断片が共存するが、そのような場合でもリン酸化ペプチドを選択的に抽出することが出来ている。このことから、酸化チタンによるリン酸化ペプチドの選択的抽出において対象となるペプチドの分子量は特に影響を与えないこと明らかである。
【００４２】
一般的にアミノ酸残基が２０残基以上のものがタンパク質として知られている。アミノ酸１９残基からなるペプチドについては後述する実施例６で示す様に選択的抽出が可能であった。このことから、アミノ酸残基が２０程度のタンパク質について抽出は充分に可能である。
【００４３】
酸化チタンによる選択的抽出はアミノ酸残基の数（分子量）によらないことがカゼインの酵素消化物の実施例から明らかである。又、低分子のリン酸化合物、例えばＡＭＰ（Adenosine Mono Phosphate）などの抽出についても酸化チタンが有効であることは広く知られており、同様に酸化チタンによるリン酸化アミノ酸の選択的抽出も可能であった。リン酸化アミノ酸の分析は、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質中のどのアミノ酸がリン酸化されているのかを同定する際に必要である。酸化チタンを用いたリン酸化部位同定法の一例を以下に挙げる。
【００４４】
１．リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質をある条件下でアミノ酸にまで加水分解する。
２．その混合物を酸化チタンカラムに流し、リン酸化アミノ酸を選択的に抽出する。
３．酸化チタンカラムからリン酸化アミノ酸を溶出し、質量分析計で検出する（タンパク質を構成しているアミノ酸の種類及びその分子量は既に知られているため、質量分析系で溶出してきたアミノ酸の分子量を測定すればそのアミノ酸が何であるか容易に同定できる。）。
【００４５】
リン酸化部位の同定は高次構造のみならず、機能解析における機能発現機構の解明などにおいても重要である。
【００４６】
＜実施例２＞ｐＨ８．０の０．２ Mリン酸バッファー（０．２ Mリン酸水素二ナトリウムと0.2 Mリン酸二水素ナトリウムで調整）を酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）に単一溶離液として流した状態で、ペプチド（５）を注入し、HPLC分析した。用いた分析システム概要を図１０に、分析結果を図１１に示す。
【００４７】
図１０では、酸化チタンカラムはTitansphere（登録商標） TiO（10×4.0mmI.D.、ジーエルサイエンス 製）を用いた。溶媒は各実験に応じた単一溶離液を用いた。カラムと溶媒以外のＨＰＬＣシステムは＜実施例１＞と同様とした。スイッチングバルブの流路は白とした。
【００４８】
図１１では、ペプチド（５）は０．４０分で溶出された。この結果から、ｐＨ８．０の０．２ Mリン酸バッファー（リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムで調整）がリン酸化ペプチドを酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）から溶出させる溶媒に適することが示唆された。
カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム／０．２Ｍリン酸二水素ナトリウム＝２０／１
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（５）
【００４９】
＜実施例３＞ｐＨ９．０の０．０５ Mリン酸水素二ナトリウムを酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）に単一溶離液として流した状態で、ペプチド（５）を注入し、HPLC分析した。用いた分析システムは＜実施例２＞と同様とした。分析結果を図１２に示す。
カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：０．０５Ｍリン酸水素二ナトリウム
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（５）
【００５０】
図１２では、ペプチド（５）は０．５０分で溶出された。この結果から、ｐＨ９．０の０．０５ Mリン酸水素二ナトリウムがリン酸化ペプチドを酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）から溶出させる溶媒に適することが示唆された。
【００５１】
＜実施例４＞酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）に
・０．０５ Mリン酸二水素カリウム１００％から０．０５ Mリン酸水素二カリウムの割合を１００％まで増やす条件
・０．１ Mリン酸二水素カリウム１００％ら０．１ Mリン酸水素二カリウムの割合を１００％まで増やす条件
・０．２ Mリン酸二水素カリウム１００％から０．２ Mリン酸水素二カリウムの割合を１００％まで増やす条件
で溶離液を流し、ペプチド（５）を注入し、それぞれの溶離液条件におけるペプチド（５）のＨＰＬＣ分析を行った。用いた分析システム概要を図１３に、分析結果を図１４〜１６に示す。
【００５２】
図１３では、酸化チタンカラムはTitansphere（登録商標） TiO（10×4.0mmI.D.、ジーエルサイエンス 製）を用いた。溶媒は０．０５ M、０．１ M、０．２ Mの3種のリン酸水素二カリウムと、０．０５ M、０．１ M、０．２ Mの3種のリン酸二水素カリウムを用いた。カラムと溶媒以外のＨＰＬＣシステムは＜実施例１＞と同様とした。スイッチングバルブの流路は白とした。
【００５３】
図１４では、リン酸水素二カリウムの割合が４５〜５０％でペプチド（５）はTitansphere （登録商標）TiOから溶出された。
カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：Ａ：０．０５Ｍリン酸水素二カリウム
Ｂ：０．０５Ｍリン酸二水素カリウム
Ａ／Ｂ＝０／１００（０ｍｉｎ）→１００／０（１０ｍｉｎ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ａ：ペプチド（５）
ｂ：無し
【００５４】
図１５では、リン酸水素二カリウムの割合が１３〜３０％でペプチド（５）はTitansphere（登録商標） TiOから溶出された。
カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：Ａ：０．１Ｍリン酸水素二カリウム
Ｂ：０．１Ｍリン酸二水素カリウム
Ａ／Ｂ＝０／１００（０ｍｉｎ）→１００／０（１０ｍｉｎ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ａ：ペプチド（５）
ｂ：無し
【００５５】
図１６では、リン酸水素二カリウムの割合が１３〜３０％でペプチド（５）はTitansphere（登録商標） TiOから溶出された。
カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：Ａ：０．２Ｍリン酸水素二カリウム
Ｂ：０．２Ｍリン酸二水素カリウム
Ａ／Ｂ＝０／１００（０ｍｉｎ）→１００／０（１０ｍｉｎ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ａ：ペプチド（５）
ｂ：無し
【００５６】
これらの結果から、バッファー中のリン酸濃度が高ければ、バッファーのｐＨが低くても、リン酸化ペプチドを酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）から溶出させられること、０．０５〜０．２ Mのリン酸バッファーが、リン酸化ペプチドを酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）から溶出させる溶媒に適することが示唆された。
【００５７】
＜実施例５＞ｐＨ５．６、５．９、６．５、７．０の4種の０．１Mリン酸バッファー（０．１Mリン酸水素二カリウムと０．１Mリン酸二水素カリウムで調整）をそれぞれ酸化チタンカラム（Titansphere （登録商標）TiO）に単一溶離液として流した状態で、ペプチド（１）〜（６）を注入し、それぞれのペプチドをＨＰＬＣ分析した。用いた分析システムは＜実施例２＞と同様とした。分析結果を図１７〜２４に示す。
【００５８】
図１７では、ペプチド（１）は１．３０ 分、ペプチド（２）は１．７５ 分、ペプチド（３）は２．２０ 分、ペプチド（４）は４．２５ 分で溶出された。
カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：０．１Ｍリン酸水素二カリウム／０．１Ｍリン酸二水素カリウム＝５／９５（ｐＨ５．６）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（１），（２），（３），（４）
【００５９】
図１８では、ペプチド（１）は０．７５ 分、ペプチド（２）は１．２０ 分、ペプチド（３）は１．３０ 分、ペプチド（４）は３．１５ 分で溶出された。
カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：０．１Ｍリン酸水素二カリウム／０．１Ｍリン酸二水素カリウム＝１０／９０（ｐＨ５．９）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（１），（２），（３），（４）
【００６０】
図１９では、ペプチド（１）は０．４０ 分、ペプチド（２）は０．７０ 分、ペプチド（３）は０．７０ 分、ペプチド（４）は１．７０ 分で溶出された。
カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：０．１Ｍリン酸水素二カリウム／０．１Ｍリン酸二水素カリウム＝３０／７０（ｐＨ６．５）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（１），（２），（３），（４）
【００６１】
図２０では、ペプチド（１）は０．４０ 分、ペプチド（２）は０．５５ 分、ペプチド（３）は０．５５ 分、ペプチド（４）は１．０５ 分で溶出された。
カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：０．１Ｍリン酸水素二カリウム／０．１Ｍリン酸二水素カリウム＝５８／４２（ｐＨ７．０）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（１），（２），（３），（４）
【００６２】
図２１では、ペプチド（５）は０．４５ 分、ペプチド（６）は０．６０ 分で溶出された。
カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：０．１Ｍリン酸水素二カリウム／０．１Ｍリン酸二水素カリウム＝５／９５（ｐＨ５．６）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（５），（６）
【００６３】
図２２では、ペプチド（５）は０．４０ 分、ペプチド（６）は０．５０ 分で溶出された。
カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：０．１Ｍリン酸水素二カリウム／０．１Ｍリン酸二水素カリウム＝１０／９０（ｐＨ５．９）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（５），（６）
【００６４】
図２３では、ペプチド（５）は０．３５ 分、ペプチド（６）は０．４５ 分で溶出された。
カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：０．１Ｍリン酸水素二カリウム／０．１Ｍリン酸二水素カリウム＝３０／７０（ｐＨ６．５）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（５），（６）
【００６５】
図２４では、ペプチド（５）は０．３５ 分、ペプチド（６）は０．４０ 分で溶出された。  カラム： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.)
溶離液：０．１Ｍリン酸水素二カリウム／０．１Ｍリン酸二水素カリウム＝５８／４２（ｐＨ７．０）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（５），（６）
【００６６】
これらの結果から、ｐＨが５．６〜７．０の０．１Mリン酸バッファーがリン酸化ペプチドを酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）から溶出させる溶媒に適することが示唆された。  また、０．１Mリン酸バッファーを酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）に溶離液として流した状態では、アミノ酸配列が同じペプチドに関してはバッファーのｐＨが低いほど溶出が遅く、また結合しているリン酸の数が多いほど早く溶出されるという事が分かった。
【００６７】
＜実施例６＞酸化チタンカラムをプレカラムとしたカラムスイッチングシステムを応用して、リン酸化ペプチドを選択的に抽出・分析する為の逆相系ＨＰＬＣシステムを構築し、ペプチド（１）〜（６）を用いて分析を行った。ＬＣシステム概要を図２５に示す。分析に用いた溶離液条件は表１に示す。 表１の溶離液条件によるベースラインを図２６に示す。ペプチド（１）〜（６）の分析結果を図２７〜３２に示す。
【表１】
0004187106.tif 000002
【００６８】
図２５では、酸化チタンカラムはTitansphere（登録商標） TiO（10 × 4.0 mm I.D.、ジーエルサイエンス 製）を、逆相系ＨＰＬＣカラムはInertsil（登録商標） WP300 C8（150×4.6 mm I.D.、ジーエルサイエンス 製）を用いた。溶媒はトリフルオロ酢酸０．１％を含む水、トリフルオロ酢酸０．１％を含むアセトニトリルと、ｐＨ７．０の０．１ Mリン酸バッファーを用いた。カラムと溶媒以外のＨＰＬＣシステムは＜実施例１＞と同様とした。Titansphere（登録商標） TiOをプレカラムとして直結したInertsil（登録商標） WP300 C8を使うときは、スイッチングバルブの流路は白、Inertsil（登録商標） WP300 C8のみを使うときはスイッチングバルブの流路は黒とした。
【００６９】
図２６では、先ずスイッチングバルブの流路を白にしておく。０分で注入されるサンプルのうち、リン酸化ペプチドをTitansphere（登録商標） TiOに保持し、Titansphere（登録商標） TiOを素通りするペプチドをInertsil （登録商標）WP300 C8に保持するために、０〜４．９分でTitansphere（登録商標） TiOとInertsil（登録商標） WP300 C8にトリフルオロ酢酸を０．１％含む水を流す。ここでInertsil（登録商標） WP300 C8に保持されたペプチドを溶出するため、スイッチングバルブの流路を黒にし、５〜２０分でInertsil（登録商標） WP300 C8にトリフルオロ酢酸を０．１％含むアセトニトリルの比率が４５％になる勾配をかける。Inertsil（登録商標） WP300 C8の洗浄のため、２０〜２５分でInertsil（登録商標） WP300 C8にトリフルオロ酢酸を０．１％含むアセトニトリルの比率が１００％になる勾配をかけ、さらに２５〜３０分でInertsil（登録商標） WP300 C8にトリフルオロ酢酸を０．１％含むアセトニトリルを流す。Inertsil （登録商標）WP300 C8内から有機溶媒を除くため、３０．１〜３９．９分でInertsil（登録商標） WP300 C8にトリフルオロ酢酸を０．１％含む水を流す。Titansphere（登録商標） TiOからリン酸化ペプチドを溶出し、Inertsil（登録商標） WP300 C8に保持するため、スイッチングバルブの流路を白にし、４０〜５９．９分でTitansphere（登録商標） TiOとInertsil（登録商標） WP300 C8にｐＨ７．０の０．１ Mリン酸バッファーを流す。Inertsil（登録商標） WP300 C8内からリン酸バッファーを除くため、スイッチングバルブの流路を黒にし、６０〜７０分でInertsil WP300 C8にトリフルオロ酢酸を０．１％含む水を流す。Inertsil（登録商標） WP300 C8に保持されたリン酸化ペプチドを溶出するため、７０〜８５分でInertsil（登録商標） WP300 C8にトリフルオロ酢酸を０．１％含むアセトニトリルの比率が４５％になる勾配をかける。Inertsil（登録商標） WP300 C8の洗浄のため、８５〜９０分でInertsil （登録商標）WP300 C8にトリフルオロ酢酸を０．１％含むアセトニトリルの比率が１００％になる勾配をかけ、さらに９０〜９５分でInertsil（登録商標） WP300 C8にトリフルオロ酢酸を０．１％含むアセトニトリルを流す。Inertsil （登録商標）WP300 C8内から有機溶媒を除くため、９５．１〜１０５分でInertsil（登録商標） WP300 C8にトリフルオロ酢酸を０．１％含む水を流す。
カラム：ａ：Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ：Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：表１参照
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：無し
【００７０】
図２７では、リン酸化ペプチド（１）は酸化チタンカラムに保持・溶出された後、逆相系ＨＰＬＣカラムに保持・溶出されている。
カラム：ａ：Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ：Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：表１参照
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（１）
【００７１】
図２８では、リン酸化ペプチド（２）は酸化チタンカラムに保持・溶出された後、逆相系ＨＰＬＣカラムに保持・溶出されている。
カラム：ａ：Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ：Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：表１参照
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（２）
【００７２】
図２９では、リン酸化ペプチド（３）は酸化チタンカラムに保持・溶出された後、逆相系ＨＰＬＣカラムに保持・溶出されている。
カラム：ａ：Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ：Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：表１参照
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（３）
【００７３】
図３０では、ペプチド（４）は酸化チタンカラムに保持されず、逆相系ＨＰＬＣカラムに保持・溶出されている。
カラム：ａ：Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ：Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：表１参照
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（４）
【００７４】
図３１では、リン酸化ペプチド（５）は酸化チタンカラムに保持・溶出された後、逆相系ＨＰＬＣカラムに保持・溶出されている。
カラム：ａ：Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ：Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：表１参照
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（５）
【００７５】
図３２では、ペプチド（６）は酸化チタンカラムに保持されず、逆相系ＨＰＬＣカラムに保持・溶出されている。
カラム：ａ：Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ：Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：表１参照
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ペプチド（６）
【００７６】
これらの結果から、構築したＨＰＬＣシステムを用いて、オンラインでリン酸化ペプチドを選択的に抽出・分析できることがわかった。
【００７７】
＜実施例７＞ミルク等に含まれるリン酸化タンパク質であるカゼインのトリプシン消化物をサンプルとして、それぞれ逆相系ＨＰＬＣカラム(Inertsil （登録商標）WP300C8)、酸化チタンカラム(Titansphere TiO)をプレカラムとしたInertsil（登録商標） WP300C8で、トリフルオロ酢酸０．１％を含む水１００％からトリフルオロ酢酸０．１％を含むアセト二トリルの割合を４５％まで増やす条件でＨＰＬＣ分析した。用いたＨＰＬＣ分析システムは＜実施例１＞と同様とした。
【００７８】
次に、酸化チタンカラム(Titansphere（登録商標） TiO)にトリフルオロ酢酸０．１％を含む水を単一溶媒として流した状態でカゼインのトリプシン消化物を注入した後、０．０５ M塩化リチウムを含む０．０５ Mホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）を流して酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）からペプチドを溶出し、これを分取した。分取に用いたＨＰＬＣシステム概要を図３３に示す。分取したペプチドを逆相系ＨＰＬＣカラム(Inertsil（登録商標） WP300C8)で、トリフルオロ酢酸０．１％を含む水１００％からトリフルオロ酢酸０．１％を含むアセトニトリルの割合を４５％まで増やす条件でＨＰＬＣ分析した。用いたＨＰＬＣ分析システムは＜実施例１＞と同様とした。またここまでの分析結果を図３４に示す。
カラム：ａとｃ：Inertsil （登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
ｂ： Titansphere（登録商標） TiO(10×4.0mmI.D.) →Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：Ａ：水（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ｂ：アセトニトル（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ａ／Ｂ＝１００／０（０ｍｉｎ）→５５／４５（９０ｍｉｎ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ａとｂ：カゼイントリプシン消化物
ｃ：酸化チタンカラムに保持・溶出されたカゼイントリプシン消化物中のペプチド
【００７９】
また分取したペプチドがリン酸化ペプチドであることを示すため以下の実験を行った。分取したペプチドを二つの容器に分け、一方を対照とし、一方をアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸処理した。それぞれを逆相系HPLCカラム(Inertsil（登録商標） WP300C8)で、トリフルオロ酢酸０．１％を含む水１００％からトリフルオロ酢酸０．１％を含むアセトニトリルの割合を４５％まで増やす条件でＨＰＬＣ分析し、２つのデータを比べ、アルカリフォスファターゼ処理によりピークがシフトしたことを確認した。用いたＨＰＬＣ分析システムは＜実施例１＞と同様とした。分析結果を図３５に示す。
カラム：ａとｂ：Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：Ａ：水（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ｂ：アセトニトル（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ａ／Ｂ＝１００／０（０ｍｉｎ）→５５／４５（９０ｍｉｎ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ａ：酸化チタンカラムに保持・溶出されたカゼイントリプシン消化物中のペプチド（アルカリフォスファターゼ処理の対照）
ｂ：ａのサンプルをアルカリフォスファターゼ処理したもの
【００８０】
更に分取したペプチドがリン酸化ペプチドであることを示すため、以下の実験を行った。カゼイントリプシン消化物を２つの容器に分け、一方を対照とし、一方をアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸処理した。夫々を逆相系ＨＰＬＣカラム(Inertsil（登録商標） WP300C8)で、トリフルオロ酢酸０．１％を含む水１００％からトリフルオロ酢酸０．１％を含むアセトニトリルの割合を４５％まで増やす条件でＨＰＬＣ分析し、２つのデータを比べ、アルカリフォスファターゼ処理により３つのピークがシフトしたことを確認した。用いたＨＰＬＣ分析システムは＜実施例１＞と同様とした。分析結果を図３６に示す。
カラム：ａとｂとｃ：Inertsil（登録商標）WP300 C8 (150×4.6mmI.D.)
溶離液：Ａ：水（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ｂ：アセトニトル（０．１％トリフルオロ酢酸）
Ａ／Ｂ＝１００／０（０ｍｉｎ）→５５／４５（９０ｍｉｎ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：ａ：カゼイントリプシン消化物（アルカリフォスファターゼ処理の対照）
ｂ：カゼイントリプシン消化物をアルカリフォスファターゼ処理したもの
ｃ：酸化チタンカラムに保持・溶出されたカゼイントリプシン消化物中のペプシド
【００８１】
図３３では、酸化チタンカラムはTitansphere（登録商標） TiO（10 x 4.6 mm I.D.、ジーエルサイエンス 製）を用いた。溶媒はトリフルオロ酢酸０．１％を含む水と、０．０５ M塩化リチウムを含む０．０５ Mホウ酸-水酸化ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）を用いた。ＨＰＬＣシステムとして、ポンプ３１にHITACHI Pump L-7120、ポンプ３２にHITACHI Pump L-7100、検出器HITACHI Diode Array Detector L-7455、データ処理機HITACHI SYSTEM MANAGER（以上、HITACHI製）、インジェクター RHEODYNE 8125（レオダイン社 製）、スイッチングバルブ SSC E1E010（センシュー科学社 製）を用いた。サンプルループ及び配管にはすべてピーク材を用いた。Titansphere（登録商標） TiOにトリフルオロ酢酸０．１％を含む水を単一溶媒として流すときには、スイッチングバルブの流路は白とし、０．０５Ｍリチウムクロライドを含む０．０５Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）を流してTitansphere（登録商標） TiOからペプチドを溶出し、これを分取するときにはスイッチングバルブの流路は黒とした。
【００８２】
図３４では、カゼインのトリプシン消化物のうち、Titansphere（登録商標） TiOをプレカラムとした場合では、矢印で示したピークの強度が減少した。また０．０５ M塩化リチウムを含む０．０５ Mホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）でTitansphere（登録商標） TiOから溶出されたペプチドは、強度が減少したピークと一致した。
【００８３】
図３５では、Titansphere（登録商標） TiOに保持・溶出されたカゼイントリプシン消化物中のペプチドのうち３つはアルカリフォスファターゼ処理によって疎水性が増し、そのピークがシフトしている。
【００８４】
図３６ではカゼイントリプシン消化物をアルカリフォスファターゼ処理したことでシフトしたピークは、Titansphere（登録商標） TiOに保持・溶出されたカゼイントリプシン消化物中のペプチドのピークと略一致している。
【００８５】
これらの結果から、カゼイントリプシン消化物中のペプチドのうち、リン酸化ペプチドと思われるペプチドは酸化チタンカラム（Titansphere（登録商標） TiO）に選択的に保持され、０．０５ M塩化リチウムを含む０．０５ Mホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）で溶出されたことがわかった。
【００８６】
＜実施例８＞酸化チタンを固相に用いた例として、以下のような形状のカラムが挙げられる。
ここで述べるカラムとは充填剤を詰める、内壁に固定相をコーティングする、内壁に化学結合基を導入する、もしくは腐食させるなどの処理を行い、カラムクロマトグラフィーで分離の場となり得る状態にしたクロマト管の事である。その形態は特に限定する物ではなく２つの開放口を有する容器であり内部に固相が充填もしくは保持され、溶液がその開放口の一方から入り固相を通り他の開放口から出るような構造を有していれば良い。したがって、一般的なＬＣカラムのみならず図３７乃至図４０に示すような固相抽出用カラムの形態でも良い。
【００８７】
（固相の形態の説明）
ここで述べる固相とはクロマトグラフィーにおける移動相に対する語であり、物質に対する親和性を有し、移動しない相のことである。その形態としては特に限定するものではなく、目的とする成分を含む溶液と酸化チタンが接触できれば良い。したがってその形態としては、酸化チタンからなる多孔質球状粒子、多孔質破砕状粒子、非多孔質球状粒子、非多孔質破砕状粒子、貫通孔を有する立体連続体、及び酸化チタンと他の金属酸化物との複合酸化物からなる多孔質球状粒子、多孔質破砕状粒子、非多孔質球状粒子、非多孔質破砕状粒子、貫通孔を有する立体連続体でも良く、また、酸化チタン以外の材質による多孔質球状粒子、多孔質破砕状粒子、非多孔質球状粒子、非多孔質破砕状粒子、貫通孔を有する立体連続体の溶液との接触面に酸化チタンをコーティングしたものでも良い。ここで述べる貫通孔を有する立体連続体とはある成分もしくは複数の成分からなり、ある一面から他の面へと貫通する空洞を有する立体であり、一例としてモノリス骨格が挙げられる。モノリス骨格とは、０．５〜５００μｍサイズの細孔（スルーポア）と、２〜５００ｎｍサイズの細孔（メソポア）を有する酸化チタン骨格、ポリマー骨格が絡み合った構造を持つ２重細孔構造の酸化チタンを形成して成るものである（例えば曽我直弘、中西和樹、水口博義；特開平１１−２８７７９１）。
【００８８】
（使用方法の説明）
例えば、トリプシン等の消化酵素によるタンパク質の加水分解物をトリフルオロ酢酸を0.1％含む水に溶かし、固相に注入あるいは吸引等の方法で接触させ、リン酸化ペプチドを選択的に保持させる。固相をトリフルオロ酢酸を0.1％含む水で、注入あるいは吸引等の方法で洗浄した後、pH ７．０の０．１Mリン酸バッファーを固相に注入あるいは吸引等の方法で接触させ、リン酸化ペプチドを溶出する（リン酸化ペプチドを固相に選択的に保持させる溶媒、固相を洗浄する溶媒、固相からリン酸化ペプチドを溶出する溶媒は上記の例に限定するものではなく、＜実施例１〜７＞で用いられた溶媒も含まれる。）。
【００８９】
溶出したリン酸化ペプチドは、逆相系の固相に保持させ、脱塩を行い、有機溶媒で溶出する。溶出したペプチドはＭＳ等の分析機器で定性・定量する。尚、脱塩操作のいらない溶媒で溶出した場合は、ＭＡＬＤＩプレートなどを使用して直接ＭＳ等で検出することも可能である。
【００９０】
尚、以下のようなタンパク質についても本法は充分適用可と思われる。
ＪＡＫ（Janus Kinase）ファミリープロテイン、ＳＴＡＴ（signalTransducer and activatior of transcription）ファミリープロテイン、ＴＧＦ−β（transforming growth factor β）ファミリープロテイン、Ｓｍａｄファミリープロテイン、その他リン酸化にて活性化或いは不活性化されるシグナル伝達因子。
【００９１】
次いで、リン酸化糖、リン脂質のいずれについても実験の結果、リン酸化合物と非リン酸化合物を酸性条件でチタニアカラムにアプライし、素通り分画を採取、各分析カラムで分析し、予め取っておいたリン酸化合物と非リン酸化合物の混合物のデータと比較することでリン酸化合物のみがチタニアカラムに保持されて素通りしていないことを確認した。
【００９２】
次に、リン酸化合物が保持された状態のチタニアカラムにリン酸塩を含む溶出溶媒を流し、この分画を採取、各分析カラムで分析し、上記と同様に混合物のデータと比較することでリン酸化合物が溶出されることが確認された。
【００９３】
先ず、糖についての実験では、単糖のグルコースにリン酸基が一つ付いたもの（２種類）とグルコースを比較した。始めに実施例１に於いて、リン酸化ペプチドを保持させた条件（ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ＝１／１０００ｐＨ２程度）で糖混合物をアプライしたが、リン酸化糖と非リン酸化糖の両方が素通りしてしまった。そこで、条件をＨＣＩ水溶液（ｐＨ０．８８）に変えたところ、リン酸化糖だけを保持させることが出来た。又、溶出は０．０５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．５程度）で可能であった。今回用いたリン酸化糖のｐＫ１は１．１１であることから、保持に用いる溶液がそれより下のｐＨでなければ選択的に保持することは出来ないと考える。この時、糖に付いたリン酸基は、解離が抑えられＯＨが二つになっているはずである。溶出条件は特にｐＨが７付近でなくとも可能、又ペプチドの実験の際用いたリン酸カリウムバッファーでなくとも良い可能性が示された。
【００９４】
リン酸化ペプチドはｐＨ７．０程度の２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩバッファーでは、ｐＨ２．０程度の０．１％ＴＦＡ水溶液を用いた場合に比べて保持されるペプチドの数が少なかった。又、リン酸化糖（ｐＫ１＝１．１１）はｐＨ２．０程度の０．１％ＴＦＡ水溶液では酸化チタンカラムに保持されなかったが、ｐＨ０．８程度のＨＣＩ水溶液で保持された。
【００９５】
これらのことからリン酸化化合物の保持については、リン酸化化合物のリン酸部分の解離を抑えた状態が必要である。
【００９６】
酸化チタンカラムからの溶出については、各実験から、溶出中のリン酸濃度とｐＨが上がるほど、溶出効果が早まる。
【００９７】
＜実施例９＞試料として下記を使用する。
（１）D(+)-グルコース  キシダ化学  000-34105
D(+)-Glucose FW:180.16 13.6mg/500μlH2Oを40μl
試料の一例、化学式を示す
【化１】
0004187106.tif 000003
（２）α-D-グルコース−１−リン酸  Sigma G7000
α-D-Glucose 1-phosphate Disodium Salt Hydrate FW:304.1
20.2mg/300μlH2Oを40μl
試料の一例化学式を示す
【化２】
0004187106.tif 000004
（３）D-グルコース−６−リン酸  Sigma G7250
D-Glucose 6-phosphate Diodiun Salt Hydrate FW:304.1
21.1mg/300μlH2Oを40μl
試料の一例化学式を示す
【化３】
0004187106.tif 000005
上記（１）〜（３）を混合
【００９８】
実験手順：
Titansphere（登録商標）ＴｉＯ（１０×４．０ｍｍＩ．Ｄ．）にＨＣｌ水溶液（ｐＨ０．８８）を流した状態で混合したサンプルのうち、４０μｌをアプライし、素通り画分を分取する。この画分を１とする。
【００９９】
溶媒を５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４に切換え、Titansphere（登録商標）ＴｉＯからの溶出画分を分取する。この画分を２〜５とする。（図４１は各分取画分の位置を示すクロマトグラム）
【０１００】
イオン交換モードのカラム、Asahipak（登録商標）ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅを用いて分取画分のクロマトグラムを取る。混合したサンプルのクロマトグラムと比較し、Titansphere（登録商標）ＴｉＯを用いることで今回サンプルとしたリン酸化糖を選択的に抽出できることを示す。
カラム：Titansphere（登録商標）ＴｉＯ（１０×４．０ｍｍＩ．Ｄ．）
溶離液：Ａ．希塩酸（ｐＨ０．８８）
Ｂ．５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ約４．０）
０〜３ｍｉｎ  Ａ／Ｂ＝１００／０
３．１〜１２ｍｉｎ  Ａ／Ｂ＝０／１００
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ  カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２６０ｎｍ
サンプル：調整した糖混合物（１）（２）（３）を４０μｌ
【０１０１】
図４２に於いて、標品混合物で確認されている２種のリン酸化糖が２〜５の画分に確認されているので、この分離方法がリン酸化糖の抽出分離に有効であることがわかる。
カラム：Asahipak（登録商標）ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ（２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
溶離液：５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ約４．０）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ  カラム温度：室温
検出：ＲＩ
サンプル：０．上記の調整した糖混合物を２５μｌ
１〜５．各分取画分５０μｌずつ
【０１０２】
尚、以下のような糖類関係物質についても本法は充分適用可能と思われる。
フルクトース６−リン酸、フルクトース１，６−ビスリン酸、Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンリン酸、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、Ｄ−リプロース−５−リン酸、Ｄ−キシルロース−５−リン酸、Ｄ−リボース−５−リン酸、Ｄ−セドヘプツロース−７−リン酸、Ｄ−エリトロース−４−リン酸、ホスホグリコール酸、Ｄ−リブロース−５−リン酸、Ｄ−リブロース−１，５−ビスリン酸、セドヘプツロース−１，７−ビスリン酸、ＡＤＰグルコース、ＵＤＰグルコース、ＵＤＰグルクロン酸、１−ホスホ−α−Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−キシルロース−５−リン酸、スクロース−６−リン酸。
【０１０３】
水溶性低分子リン酸化合物についても同様である。
Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グルコサミン６リン酸、ｓｎ−グリセロール３−リン酸、１，３−ビスホスホグリセリン酸、２，３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ｃＡＭＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、ピロリン酸。
【０１０４】
次に、脂質についての実験では、水溶性でないサンプルについても、有機溶媒にＴＦＡを添加しておけば選択的保持が起こるということと、有機溶媒にリン酸を添加しておけば、溶出可能ということが判明した。よって水溶性サンプルだけではなく、極性の低いリン酸化化合物についても選択的保持溶出の可能性を示せた。又、リン酸基が末端にあるものだけでなく、エステルであっても適用できる可能性を示せた。
【０１０５】
例えば、スフィンゴミエリン（化４）はエステルの形でリン酸が付いているが、実験の結果選択的保持が確認できた。又、Ｌ―α―ホスファチジルイノシトール（化５）、Ｌ―α―ホスファチジルエタノールアミン（化６）、Ｌ―α―ホスファチジルコリン（化７）、Ｌ―α―ホスファチジル−Ｌ−セリン（化８）、Ｌ―α―ホスファチジル−Ｌ−トレオニン（化９）、Ｌ―α―ホスファチジン酸（化１０）の分離分析が可能である。
【化４】
0004187106.tif 000006
【化５】
0004187106.tif 000007
【化６】
0004187106.tif 000008
【化７】
0004187106.tif 000009
【化８】
0004187106.tif 000010
【化９】
0004187106.tif 000011
【化１０】
0004187106.tif 000012
【０１０６】
＜実施例１０＞下記のサンプルを使用する
（１）D-erythro-スフィンゴシン  Wako 192-11161      D-erythro-Sphingosine FW:299.5  １．６ｍｇ／１０００μｌ  ＭｅＯＨを１００μｌ
【化１１】
0004187106.tif 000013
（２）スフィンゴシン−１−リン酸  Sigma S9666
Sphingosine 1-phosphate FW:379.5  １．０ｍｇ／１０００μｌ  ＭｅＯＨを１００μｌ
【化１２】
0004187106.tif 000014
上記（１）（２）を混合
【０１０７】
実験手順：
Titansphere（登録商標）ＴｉＯ（１０×４．０ｍｍＩ．Ｄ．）にＨ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）：ＭｅＯＨ＝３０：７０混合溶液を流した状態で、混合調整したサンプルのうち１６０μｌをアブライし、素通り画分を分取する。この画分を１、２とする。
溶媒をＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ：Ｈ３ＰＯ４＝３０：７０：５に切換え、Titansphere（登録商標）ＴｉＯからの溶出画分を分取する。この画分を３〜９とする。（図４３は各分取画分の位置を示すクロマトグラム）
カラム：Titansphere（登録商標）ＴｉＯ（１０×４．０ｍｍＩ．Ｄ．）
溶離液：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）：ＭｅＯＨ＝３０：７０
Ｂ：Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ：Ｈ３ＰＯ４＝３０：７０：５
０〜３．９ｍｉｎ  Ａ／Ｂ＝１００／０
４〜１８ｍｉｎ  Ａ／Ｂ＝０／１００
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ  カラム温度：２５℃
検出波長：ＵＶ２０５ｎｍ
サンプル：調整した脂質混合物を１６０μｌ
【０１０８】
Inertsil（登録商標）ＯＤＳ−３（１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）を用いて各分取画分のクロマトグラムを取る。混合調整したサンプルのクロマトグラムと比較し、Titansphere（登録商標）ＴｉＯを用いることで今回サンプルとしたリン脂質（Sphingosine 1-phosphate）を選択的に抽出できることを示す。
【０１０９】
図４４は各分取画分の比較クロマトグラムであり、その際の実験データを下記に示す。
カラム：Inertsil（登録商標）ＯＤＳ−３（１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
溶離液：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）
Ｂ：ＭｅＯＨ
０〜２ｍｉｎ  Ａ／Ｂ＝７０／３０
２〜１２ｍｉｎ  Ａ／Ｂ＝７０／３０→０／１００
１２〜１７ｍｉｎ  Ａ／Ｂ＝０／１００
１７．１〜２２ｍｉｎ  Ａ／Ｂ＝７０／３０
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ  カラム温度：２５℃
検出波長：ＵＶ２０５ｎｍ
サンプル：０．上記の調整した脂質混合物を１０μｌ
１〜１０．各分取画分２００μｌずつ
【０１１０】
図４５，４６，４７は上記の詳細クロマトグラムである。
これによりスフィンゴシン１リン酸の抽出が判然としていることが明示されている。
【０１１１】
＜実施例１１＞下記のサンプルを使用する
（１）D-erythro-スフィンゴシン  Wako 192-11161
D-erythro-Sphingosine FW:299.5
１．８ｍｇ／５００μｌ  ＭｅＯＨを４０μｌ
（２）スフィンゴミエリン  Sigma S9666
Sphingomyelin（脂肪酸残基側鎖のためＦＷ不足）
１．８ｍｇ／５００μｌ  ＭｅＯＨを４０μｌ
上記（１）（２）を混合
【０１１２】
実験手順：
Titansphere（登録商標）ＴｉＯ（１０×４．０ｍｍＩ．Ｄ．）にＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）：ＣＨ３ＣＮ：ＭｅＯＨ＝８：８２：１０混合溶液を流した状態で、混合調整したサンプルのうち５０μｌをアプライし、素通り画分を分取する。この画分を１、２とする。
【０１１３】
溶媒をＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ：ＭｅＯＨ：Ｈ３ＰＯ４＝８：８２：１０：０．６に切換え、Titansphere（登録商標）ＴｉＯからの溶出画分を分取する。この画分を３〜１０とする。（図４８は各分取画分の位置を示すクロマトグラム）
カラム：Titansphere（登録商標）ＴｉＯ（１０×４．０ｍｍＩ．Ｄ．）
溶離液：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）：ＣＨ３ＣＮ：ＭｅＯＨ＝８：８２：１０
Ｂ：Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ：ＭｅＯＨ：Ｈ３ＰＯ４＝８：８２：１０：０．６
０〜２．９ｍｉｎ  Ａ／Ｂ＝１００／０
３〜２０ｍｉｎ  Ａ／Ｂ＝０／１００
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ  カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２１０ｎｍ
サンプル：調整した脂質混合物を５０μｌ
【０１１４】
Inertsil（登録商標）ＮＨ２（１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）を用いて各分取画分のクロマトグラムを取る。混合調整したサンプルのクロマトグラムと比較し、Titansphere（登録商標）ＴｉＯを用いることで今回サンプルとしたリン脂質（スフィゴミエリン）を選択的に抽出できることを示す。
【０１１５】
図４９は各分取画分の比較クロマトグラムであり、その際の実験データを下記に示す。
カラム：Inertsil（登録商標）ＮＨ２（１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
溶離液：  Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ：ＭｅＯＨ＝８：８７：５
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ  カラム温度：室温
検出波長：ＵＶ２０５ｎｍ
サンプル：０．上記の調整した脂質混合物を溶離液で６６倍希釈したもの５０μｌ
１〜１０．各分取画分５０μｌずつ
【０１１６】
図５０，５１は上記の詳細クロマトグラムである。
これによりスフィンゴミエリンの抽出が判然としていることが明示されている。
【０１１７】
尚、以下のようなリン脂質関係物質についても本法は充分適用可と思われる。
グリセロリン脂質類（例えばホスファチジルイノシトール等）、スフィンゴリン脂質類、トリオースリン酸。
【０１１８】
又、以下のような生体代謝関連物質について、その物性から本法は充分適用可と思われる。
ＣｏＡ（補酵素Ａ）、アセチルＣｏＡ、スクシニルＣｏＡ、アシルＣｏＡ、ＮＡＤ（Ｐ）＋、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、ＦＡＤＨ２、ＦＡＤＨ。
【０１１９】
産業上の利用可能性
本発明請求項１によれば、リン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質を含む試料を酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用して酸性雰囲気下で保持させるリン酸化合物の保持工程と、保持されなかったアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖又は脂質を所望のカラムにて分離・精製し、所望の検出器で検出する工程と、次に前処理カラムに保持されたリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質をリン酸塩、リン酸或いはアルカリ性溶液を含む溶液により溶出させるリン酸化合物の溶出工程と、それらを所望のカラムにて分離・精製し、所望の検出器で検出するリン酸化合物の検出工程よりなるので、簡単迅速にリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖、リン酸化脂質等のリン酸化物を選択的に抽出・分離することにより、学術、産業各分野におけるリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖、リン酸化脂質解析の速度の向上、実験操作の簡易化、危険性の防止等の効果をあげることが出来、産業上殊に食品、薬品工業に資する処大である。更には前処理カラムからの成分を廃棄することが出来る。その場合、該カラムからの溶出工程、当然検出工程をも省略でき、必要成分のみの工程とすることが出来、操作がより迅速簡易化できる。
【０１２０】
本発明請求項２によれば、リン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質又はそれらを含む試料をｐＨ２程度の酸性溶液を含む溶液で酸化チタンカラムを前処理カラムとする逆相系ＨＰＬＣカラムに供給し、試料マトリクスの中からリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質を選択的に保持させ、前処理カラムに保持されなかったアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を逆相系ＨＰＬＣカラムにて精製し、所望の検出器で検出する工程と、次に前処理カラムに保持されたリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質を５０ｍＭ以上のリン酸バッファーにより溶出させ、それらを逆相系ＨＰＬＣカラムと所望の検出器にて分離検出を行う工程よりなるので、リン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド又はリン酸化タンパク質を含む試料をこの工程に乗せることにより、リン酸化アミノ酸等を試料中から選り分けることが出来る。即ち、この一連の工程により、目的成分のリン酸化アミノ酸等をチタニアカラムのプレカラムに選択保持し、他の成分を溶出させて逆相系ＨＰＬＣカラムに送り、検出等の操作を為し、次いで目的成分を溶出させ、逆相系ＨＰＬＣカラムに保持させて検出等を為すことにより、極めて簡単な操作で従来の夾雑物質の除去や溶出成分の分取、その他の複雑で面倒な操作を必要とせず、目的成分のリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質を抽出、分離、精製、定性、定量等を行うことが出来る。
【０１２１】
本発明請求項３によれば、リン酸化合物の保持工程に於いて、ｐＨ０．８以上の酸性溶液を含む溶液で酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用し、リン酸化合物の溶出工程に於いて５０ｍＭ以上のリン酸バッファー、０．２％以上のリン酸或いはｐＨ８．０以上のアルカリ性溶液を含む溶液を使用するので、簡便な操作と安価な試薬を用いることでリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質を選択的に抽出・分離できる。
【０１２２】
本発明請求項４によれば、分離・精製に逆相系固相又は陰イオン交換固相を用い、所望の検出器のイオン化部がＭＡＬＤＩプレートであるＭＳとするので、夾雑のマトリクスや塩が混ざった状態ではイオン化し難いリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化糖又はリン脂質を、イオン化及びＭＳ測定し易い状態に出来る。
【０１２３】
本発明請求項５によれば、リン酸化糖を含む試料を酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用して酸性雰囲気下で保持させるリン酸化合物の保持工程に於いて、ｐＨ０．８程度の酸性溶液を含む溶液で保持させ、非リン酸化合物の検出工程に於いて分離・精製に陰イオン交換カラムを使用し、リン酸化合物の溶出工程に於いて５０ｍＭ以上のリン酸バッファーにより溶出させ、リン酸化合物の検出工程に於いて分離・精製に陰イオン交換カラムを使用するので、簡便な操作と安価な試薬を用いることで抽出・分離したリン酸化糖を酸化チタンカラムと性質の異なるカラムを用いて分析して同定、更なる精製、定性又は定量できる。
【０１２４】
本発明請求項６によれば、リン脂質を含む試料を酸化チタンカラムを前処理カラムとして使用して酸性雰囲気下で保持させるリン酸化合物の保持工程に於いて、ｐＨ２．０程度の酸性溶液を含む溶液で保持させ、非リン酸化合物の検出工程に於いて分離・精製に逆相系カラム又は陰イオン交換カラムを使用し、リン酸化合物の溶出工程に於いて０．６％以上のリン酸を含む溶液により溶出させ、リン酸化合物の検出工程に於いて分離・精製に逆相系カラム又は陰イオン交換カラムを使用するので、簡便な操作と安価な試薬を用いることで、抽出・分離したリン脂質を酸化チタンと性質の異なるカラムを用いて分析して同定、更なる精製、定性又は定量できる。
【０１２５】
本発明請求項７によれば、リン酸化合物の溶出工程に於いて、５０ｍＭ以上のリン酸バッファー、０．２％以上のリン酸或いはｐＨ８．０以上のアルカリを含む溶液により溶出させることので、簡便な操作と安価な試薬を用いることで、抽出・分離したリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド、リン酸化タンパク質を酸化チタンカラムと性質の異なるカラムを用いて分析して同定、更なる精製、定性又は定量できる。
【０１２６】
本発明請求項８によれば、所望数の溶媒をポンプに選択自在に接続すると共に、該ポンプはインジェクターを介してスイッチングバルブを連結する一方、スイッチングバルブには酸化チタンカラム及び逆相系ＨＰＬＣカラム又は陰イオン交換カラムを接続して、酸化チタンカラムを試料保持の前処理カラムに設定自在とし、逆相系ＨＰＬＣカラム又は陰イオン交換カラムに検出器を接続する一方、試料を酸化チタンカラムに保持し、他の部分を逆相系ＨＰＬＣカラムに流して保持する流路と、酸化チタンカラムに保持した部分を流し、逆相系ＨＰＬＣカラムに送る流路とをスイッチングバルブを介して形成するので、酸化チタンカラムに試料成分を通すことにより、目的成分のリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド等の選択的保持を行い、次いで目的成分以外を逆相系ＨＰＬＣカラム又は陰イオン交換カラムにて保持させ、続いて検出操作に移行させ、目的成分をバッファーにより溶出させ逆相系ＨＰＬＣカラム又は陰イオン交換カラムに保持させ、続いて検出、同定操作を行なうので、目的成分の存在量の変化等のプロテオミクスに於ける細胞内の状態変化に応答するタンパク質の離散の程度の変化の追跡にも重要な装置である。
【０１２７】
本発明請求項９によれば、所望数の溶媒をポンプに選択自在に接続すると共に、該ポンプはインジェクターを介してスイッチングバルブを連結する一方、スイッチングバルブには、試料保持の酸化チタンカラム及び固相抽出カラムを接続して酸化チタンカラムを前処理カラムに設定自在とし、固相抽出カラムに検出器を接続する一方、試料を酸化チタンカラムに保持し、他の部分を固相抽出カラムに流して保持する流路と、酸化チタンカラムに保持した部分を流し、固相抽出カラムに送る流路とをスイッチングバルブを介して形成するので、酸化チタンカラムに試料成分を通すことにより、目的成分のリン酸化アミノ酸、リン酸化ペプチド等の選択的保持を行ない、次いで目的成分以外を固相カラムにて保持させ、続いて検出操作に移行させ、目的成分をバッファーにより溶出させ固相カラムに保持させ、続いて検出、同定操作を行なうので、目的成分の存在量の変化等のプロテオミクスに於ける細胞内の状態変化に応答するタンパク質の離散の程度の変化の追跡にも重要な装置である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明一実施装置の説明図である。
【図２】図２は、アナターゼ型及びルチル型酸化チタンのＸ線ピーク図である。
【図３】図３は、Titansphere（登録商標） TiO充填剤のＸ線ピーク図である。
【図４】図４は、ペプチド（１）のＨＰＬＣデータの比較図である。
【図５】図５は、ペプチド（２）のＨＰＬＣデータの比較図である。
【図６】図６は、ペプチド（３）のＨＰＬＣデータの比較図である。
【図７】図７は、ペプチド（４）のＨＰＬＣデータの比較図である。
【図８】図８は、ペプチド（５）のＨＰＬＣデータの比較図である。
【図９】図９であり、ペプチド（６）のＨＰＬＣデータの比較図である。
【図１０】図１０は、本発明他実施装置の説明図である。
【図１１】図１１は、ペプチド（５）の酸化チタンカラムからの溶出図である。
【図１２】図１２は、ペプチド（５）の酸化チタンカラムからの溶出図である。
【図１３】図１３は、酸化チタンからの溶出条件検討用装置の説明図である。
【図１４】図１４は、ペプチド（５）の酸化チタンカラムからの溶出図である。
【図１５】図１５は、ペプチド（５）の酸化チタンカラムからの溶出図である。
【図１６】図１６は、ペプチド（５）の酸化チタンカラムからの溶出図である。
【図１７】図１７は、リン酸バッファー（ｐＨ５．６）中のペプチド挙動図である。
【図１８】図１８は、リン酸バッファー（ｐＨ５．９）中のペプチド挙動図である。
【図１９】図１９は、リン酸バッファー（ｐＨ６．５）中のペプチド挙動図である。
【図２０】図２０は、リン酸バッファー（ｐＨ７．０）中のペプチド挙動図である。
【図２１】図２１は、リン酸バッファー（ｐＨ５．６）中のペプチド挙動図である。
【図２２】図２２は、リン酸バッファー（ｐＨ５．９）中のペプチド挙動図である。
【図２３】図２３は、リン酸バッファー（ｐＨ６．５）中のペプチド挙動図である。
【図２４】図２４は、リン酸バッファー（ｐＨ７．０）中のペプチド挙動図である。
【図２５】図２５は、リン酸化ペプチドの選択的分析用装置の説明図である。
【図２６】図２６は、選択的分析に用いた溶離液のベースライン測定図である。
【図２７】図２７は、リン酸化ペプチド（１）の選択的分析図である。
【図２８】図２８は、リン酸化ペプチド（２）の選択的分析図である。
【図２９】図２９は、リン酸化ペプチド（３）の選択的分析図である。
【図３０】図３０は、非リン酸化ペプチド（４）の選択的分析図である。
【図３１】図３１であり、リン酸化ペプチド（５）の選択的分析図である。
【図３２】図３２は、非リン酸化ペプチド（６）の選択的分析図である。
【図３３】図３３は、分取装置の説明図である。
【図３４】図３４は、カゼイントリプシン消化物のＨＰＬＣデータの比較図である。
【図３５】図３５は、ペプチドの疎水性側へのピークシフト図である。
【図３６】図３６は、カゼインのトリプシン消化物の疎水性側へのピークシフト図である。
【図３７】図３７は、シリンジバレル型カラムを示す斜視図である。
【図３８】図３８は、カートリッジ型カラムを示す斜視図である。
【図３９】図３９は、ピペットチップ型カラムを示す斜視図である。
【図４０】図４０は、ウエルプレートを示す斜視図である。
【図４１】図４１は、リン酸化糖を用いた分析実験の各分画分の位置を示すクロマトグラムである。
【図４２】図４２は、同上各分取画分のクロマトグラムである。
【図４３】図４３は、リン脂質を用いた分析実験の各分画分の位置を示すクロマトグラムである。
【図４４】図４４は、同上分取画分の比較クロマトグラムである。
【図４５】図４５は、同上分取画分の詳細クロマトグラムである。
【図４６】図４６は、同上分取画分の詳細クロマトグラムである。
【図４７】図４７は、同上分取画分の詳細クロマトグラムである。
【図４８】図４８は、他のリン脂質を用いた分析実験の各分画分の位置を示すクロマトグラムである。
【図４９】図４９は、同上分取画分の比較クロマトグラムである。
【図５０】図５０は、同上分取画分の詳細クロマトグラムである。
【図５１】図５１は、同上分取画分の詳細クロマトグラムである。
【図１】
0004187106.tif 000015
【図２】
0004187106.tif 000016
【図３】
0004187106.tif 000017
【図４】
0004187106.tif 000018
【図５】
0004187106.tif 000019
【図６】
0004187106.tif 000020
【図７】
0004187106.tif 000021
【図８】
0004187106.tif 000022
【図９】
0004187106.tif 000023
【図１０】
0004187106.tif 000024
【図１１】
0004187106.tif 000025
【図１２】
0004187106.tif 000026
【図１３】
0004187106.tif 000027
【図１４】
0004187106.tif 000028
【図１５】
0004187106.tif 000029
【図１６】
0004187106.tif 000030
【図１７】
0004187106.tif 000031
【図１８】
0004187106.tif 000032
【図１９】
0004187106.tif 000033
【図２０】
0004187106.tif 000034
【図２１】
0004187106.tif 000035
【図２２】
0004187106.tif 000036
【図２３】
0004187106.tif 000037
【図２４】
0004187106.tif 000038
【図２５】
0004187106.tif 000039
【図２６】
0004187106.tif 000040
【図２７】
0004187106.tif 000041
【図２８】
0004187106.tif 000042
【図２９】
0004187106.tif 000043
【図３０】
0004187106.tif 000044
【図３１】
0004187106.tif 000045
【図３２】
0004187106.tif 000046
【図３３】
0004187106.tif 000047
【図３４】
0004187106.tif 000048
【図３５】
0004187106.tif 000049
【図３６】
0004187106.tif 000050
【図３７】
0004187106.tif 000051
【図３８】
0004187106.tif 000052
【図３９】
0004187106.tif 000053
【図４０】
0004187106.tif 000054
【図４１】
0004187106.tif 000055
【図４２】
0004187106.tif 000056
【図４３】
0004187106.tif 000057
【図４４】
0004187106.tif 000058
【図４５】
0004187106.tif 000059
【図４６】
0004187106.tif 000060
【図４７】
0004187106.tif 000061
【図４８】
0004187106.tif 000062
【図４９】
0004187106.tif 000063
【図５０】
0004187106.tif 000064
【図５１】
0004187106.tif 000065