(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡で多軸観察を行うための偏向装置において、顕微鏡の対物レンズと顕微鏡の焦点面との間に偏向装置があり、試料が前記偏向装置と対物レンズの間に配置され、かつ照射軸と観察軸が共に対物レンズを通過する構成を有し、そして、ある場合には、一つ以上の光線で試料をいくつかの側から照射することが可能で、および／または一つ以上の光線で試料をいくつかの側から観察することが可能で、またある場合には、光の照射軸に対しある角度で試料を観察することが可能であることを特徴とする顕微鏡の多軸観察用偏光装置。
【請求項２】
顕微鏡の光軸に関して回転可能なことを特徴とする請求項１に記載の偏向装置。
【請求項３】
照射軸と観察軸の間の角度が約９０度をなしていることを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれかに記載の偏向装置。
【請求項４】
照射軸と観察軸の間の角度が可変であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の偏向装置。
【請求項５】
二つの光束光路が、顕微鏡の対物レンズの焦点で同一線上にあり、したがって光が正反対方向から到達するか、または正反対方向から観察可能となるように偏向されることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の偏向装置。
【請求項６】
光学要素が変更可能および／またはスライド可能であることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の偏向装置。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のいずれかによる偏向装置を具備した顕微鏡において、特に共焦点光走査型顕微鏡。
【請求項８】
蛍光顕微鏡であることを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡。
【請求項９】
顕微鏡が投光および／または反射光の観察目的のために設けられていることを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
本発明は、顕微鏡において試料を多軸検査するため、ある場合には、複数の方向から一つ以上の光束を試料に照射および／または試料を観察し、またある場合には、照射軸に対し一定の角度からその試料を観察することを可能にする多軸検査用偏光装置に関する。本発明による偏光装置は、従来の遠視野光走査型顕微鏡に取付可能で、顕微鏡の対物レンズとその焦点面の間に置かれる。この装置は、試料と対物レンズの自由作動距離の大きさの割合に調整される。
科学技術文献にて共焦点式顕微鏡が知られており、これによると光軸に沿っての解像度（軸解像度）が示され、明確に焦点深度の浅くなった画像を生じさせることができる。しかし、この顕微鏡の対物レンズは、全立体角の一部だけしか把握せず、そのため１点から全方向へ照射された光のほんの一部しか捕足することができないという問題点がある。このため実際の解像度は、少なくとも１／３程度に低下し、一般にその比率はさらに低下する。
軸方向の解像度を補足的に向上させるために、ドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４０４０４４１で、二重共焦点による光走査型顕微鏡が提案されているが、この顕微鏡では、物体面のもう一つの側に第２の対物レンズを使用するのが特徴である。そしてその場合、両対物レンズが、共通対象点を照射および／またはその点から出射する光を検出している。その対象物が対物レンズ経由で可干渉的に照射されると、光軸に沿った干渉のため観察ボリュームは減少する。この観察ボリュームの減少が、解像度の改善と同義である。
これ以外に、ドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３から光走査型顕微鏡が知られており、この方式では、少なくとも二つの対物レンズが、一つの物点を同時に照射および／またはそこから出射する光を集光して、少なくとも、二つの対物レンズの光軸が一致しないような方法で配置されている。さらに、２重共焦点光走査型顕微鏡の場合と同様に、一方の対物レンズを透過した光が、他の対物レンズの一つを透過した光と干渉するように、対象物および／または少なくとも一つの光検出器の所で可干渉的に重ねる方法で干渉可変手段を設けることができる。
特にドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３で知られている光走査型顕微鏡には、二つの対物レンズが設けられ、両者の光軸は互いに直交し、第１の対物レンズが試料の照明用に、第２の対物レンズが試料の観察用に使用されている。照明用に使用する対物レンズの光軸として定義される照射軸と、観察用に使用する対物レンズの光軸として定義される観察軸との両軸で構成する垂直構造により、解像度の改善が達成される。
高解像度は次のような方法で実現される。
すなわち、焦点領域での光の強度分布が照射の点像消去関数（以下ＰＶＦという）により記述される。焦点領域から反射する光の検出確率は、検出孔絞りを使用する場合、観察のＰＶＦで記述される。共焦点式顕微鏡のＰＶＦは、照射のＰＶＦと観察のＰＶＦとの積である。この関数が増大するほど、顕微鏡の解像度は悪くなる。照明軸と観察軸相互間の構造を直交に近づけることにより、照射軸に沿った照射ＰＶＦの広い範囲が、この観察軸に沿った観察ＰＶＦのわずかな範囲で補償されるので、三つのすべての空間軸に沿ってほぼ同程度によい解像度が得られる。
さらにドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３から知られているもう一つの光走査型顕微鏡の実施例によれば、三つの対物レンズが設置され、２個の対物レンズの光軸は互いに直交しており、一方、第３の対物レンズの光軸は、他の両対物レンズのいずれかの軸上にある。この場合、いずれか一つの対物レンズを透過した光は、他の二つの対物レンズのいずれかを透過した光と、対象物および／または一つの検出器の所で干渉するように可干渉的に重畳される。照明光を干渉させる場合、高解像度は次の方法で実現される。すなわち、照明光の光束が可干渉的である限り、照明光のＰＶＦは対向方向から到来する両照明光の光束により干渉縞を貫く照明光の光軸に沿って変調される。両照明光の部分光束が焦点で丁度ゼロ、または２1の整数倍である場合には、幾何学的焦点における干渉は具体的に有形で、照明光のＰＶＦは、空間的により強く限定された主極大と照明光の光軸に沿ったいくつかの副極大から構成されている。そしてこれらの副極大を抑制できない場合には、解像度は悪化するであろう。照明光のＰＶＦと観察光のＰＶＦとの積である共焦点のＰＶＦは、同様に照明光の光軸に沿った干渉により変調される。しかしながら、これらの副極大は、第３の対物レンズによる垂直方向からの観察により抑制されるので、共焦点のＰＶＦは軸上の拡張性を有し、これは基本的に照明光ＰＶＦの主極大の拡張性により決定される。これは高い解像度と同義である。
これ以外に、ドイツ特許願１９６２９７２５．７からは、二つの対物レンズを有する２重対物レンズシステムが知られているが、このうちに一つは照明光の焦光用として、他の一つは観察光の集光用として作用している。そしてこの場合第２の対物レンズの観察軸は、第１の対物レンズの照明軸に対してある一定の角度を有する。これによりドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３に記述されている光学的原理に従い、解像度の改善が達せられる。ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３に記述されている照明光と観察光の光路を完全分離する構造とは対照的に、特許願１９６２９７２５．７からの２重対物レンズシステムは、ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３に記述されている光学的原理を既存の顕微鏡に適用して実現可能にする。この場合、従来の光学式顕微鏡では一般的であった単一対物レンズは、２重対物レンズシステムに取って替わられる。
これとは対照的に、本発明では、ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３に記述されている光学的原理が、単一対物レンズのみを有する既存の光走査型顕微鏡に対して、どのようにして実現可能かという一つの方法が挙げられている。
本発明の根拠となる課題は、偏光装置を提案することにあり、その装置は、あ
る場合には、複数の側から一つ以上の光束を試料に照射し、および／または複数の側から一つ以上の光束で試料を観察し、またある場合には、照明軸に対し一定の角度からその試料の観察を可能にする。それによって、ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３に記述されている光学的原理に従い解像度ができる限り改善され、共焦点観察ボリュームは周知の比較可能な光走査型顕微鏡のそれよりも小さくなる。この課題は、１個の対物レンズを有する既存の光走査型顕微鏡に同偏光装置が取付られるように設計することである。
この課題を解決するためには、本発明は、平行化され、対物レンズへ入射する入射光の光束が、対物レンズの入射開口での入射角に従い焦点にある試料を別の方向（この方向が照明軸）から照射し、焦点から反射される光束は、方向（この方向が観察軸）に従い別の異なる反射角の平行光線として対物レンズから離れることになるような方法で、この偏光要素（鏡）を顕微鏡の対物レンズとその焦点面との間に配置する。
特にこの偏光要素は、達成しようとする高解像度を考慮して、照明軸と観察軸が互いに直交するように光路中に配置される。しかし、本発明の特長は、この角度が直角から大きく外れない限り十分に達成可能である。この偏光要素は、構造上特に偏光装置に組み込まれる。
本発明による偏光装置は、蛍光顕微鏡に取付可能である。また、この装置は、投光照明で機能する顕微鏡にも設置可能である。
使用される対物レンズとして重要なことは、カバーグラスの使用に対して補正されない、より高い開口数をもつ対物レンズである。そのとき試料は特に薄い毛細管の先端に準備される。カバーグラスの使用に対して補正されない対物レンズを使用する場合、カバーグラスはその対物レンズと本発明による偏光装置、または試料との間に挿入することができる。液浸媒体の使用を必要とする対物レンズを使用する場合には、対物レンズと試料の間の空間は、液浸媒体で満たすことができる。
利点としては偏光装置が顕微鏡のスライドテーブル上に設置されるスライドホルダー上にあることである。これにより、高速偏光装置はスライドテーブルを動かすことで調整することができる、試料の移動は、スライドテーブルに左右されない追加的な移動調整要素による。この移動調整要素では、焦点による試料の走査が３次元で可能となり、それにより試料を１次元以上の高解像度で撮影することができるようなスライドテーブルが重要となる。
本発明について、添付図に基づき下記により詳細に説明する。
図１：本発明による偏光装置で、特に他に優先した実施形式におけるビーム光路の概略図。この場合、試料はあるひとつの方向から照射され、観察は照射軸に対して直交方向から行うことができる。そしてこの場合、この方向は対物レンズの光軸を含む平面内にある。
図２：本発明による偏光装置で、特に好適な実施形式におけるビーム光路の概略図。この場合、試料は二つの正反対の方向から照射され、観察は照射軸に対して直交してに行うことができる。
図３：本発明による偏光装置で、特に好適な実施形式における光束の光路の概略図。この場合、試料はある一つの方向から照射され、観察は照射軸に対して直交方向から行うことができる。そしてこの場合、この交点は対物レンズの光軸が垂直に立っている平面内にある。
図１は、本発明による偏光装置の代表的な実施例を示し、この場合、照射軸と観察軸が互いに直交し、その交点は、対物レンズの光軸を含む１平面内にある。照光レンズ２７、２８、レンズ２３、および反射鏡２４を経由してくる光源３１からの照射光束の光路１は、３本の透過光、すなわち１本の中心光２と２本の周縁光３、４で示されている。照射光は、焦点距離６内の顕微鏡の対物レンズ５によりその焦点面内に焦点を結び、各光線２，３，および４は、もしビーム偏光装置がなければ、焦点面６上の点７で交差する。この光線の流れは部分的に細い実線で示されている。対物レンズ５と焦点面６との間に、対物レンズ５の光軸が垂直となる面に対して角度がα1およびα2となり、かつ光線の方向を変更する少なくとも二つの鏡面からなる、本発明による偏光装置８が設置された場合、光線２，３．および４は反射され、点９に集光する。中央の光線２は、照射軸を示している。
平行化された照射光が顕微鏡の開口１０へ入射（入射角β1）する場合、焦点面上６の仮想焦点７は、対物レンズ５の光軸上にはない。偏光装置８が焦点面６に対応する距離と傾斜角α1により、たとえば焦点９が対物レンズ５の光軸上に来るようにすることができる。
観察光の光路１１は、照射光の光路１に対して部分的に対称に構築可能である（点線で示してある）。照射光の焦点９から出射する中央の光束１２は、観察軸の状態も示し、一方、周縁光１３および１４は、本発明による偏光装置８へ当たり、そこで反射される。これらの光線は、対応する焦点面６と偏光装置との距離と顕微鏡の対物レンズ５に対して光束ビーム偏光装置８がなす傾斜角α2により平行光線となる。光束１２、１３、および１４は、入射角β2で対物レンズ５の出射開口を通過しレンズ２３、およびレンズ系２５、２６を経由してあらかじめ設けられているピンホール２９を有する検出器３０へ達する。偏光装置がなければ、光束１２、１３、および１４は、焦点面６上の点１５に集光するはずである。この光線の流れは図では細い点線で示してある。
都合良く構造は対称となり、α1とα2は同じ値を有する。α1とα2の角度がそれぞれ２２．５度の場合、照射軸と観察軸とを定義付ける中央光２と１２は、互いに直交する。
照射軸と観察軸が互いに直交するためには、焦点９は顕微鏡の対物レンズ５の光軸上にあってはならない。対物レンズの光軸上にあると、構造上対称性が失われる。対照的構造は、焦点距離９とビーム偏光装置８の鏡面との距離が大きいので、利点となる。
偏光装置８は、特に可動なので、照射光および観察光の両焦点は調整可能である。特長として、傾斜角α1とα2は可変である。
照射光と観察光が顕微鏡５の入射、または出射開口１０へ達するときの入射角は、それぞれβ1とβ2である。好都合にも、この両角度は等しい。照射光と観察光の流れは、一般の光走査型顕微鏡で光走査する場合の光束の光路に対応している。一般に、この型の顕微鏡では、照射光と観察光の光路は同じ流れである。本発明にしたがう偏光装置を適用する場合、両光束の分離は、たとえば適当な点光源と点検出器（図示になし）の移動により達成可能である。
検査すべき試料は、照射光と観察光の共焦点９に置かれる。１次元、２次元、あるいは３次元での試料の完全撮影は、試料の走査（物体走査）、または試料を通しての共焦点９による走査（光走査）のどちらかによって達成できる。物体走査が一つ以上の軸に沿って実行さる場合、試料はテーブル２１の上に置かれる。すなわち、ここではホルダー２１の上に置かれ、これにより試料を走査テーブル２２上へ都合良く任意に移動または回転することができる。光走査が行なう場合は、既存の顕微鏡の走査装置が、照射光と観察光の光路を、制御された条件の下に試料が照射光と観察光の焦点を動かすという周知の方法で動かす。物体走査と光走査は組み合わせることができる。
本発明によるこの実施例の偏光装置を通常の顕微鏡に装備することにより、ドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３に記述されている周知の光走査型顕微鏡の原理に従い、遠視野光学式顕微鏡で干渉を使用せずに得られる範囲では最高の解像度を有する撮影が可能となる。
図２は、本発明偏光装置の代表的な実施例を示す。この実施例では、試料は正反対の二つの方向から照射され、観察は照射光軸に対して直角の方向で行われる。この場合、解像度が改善される焦点範囲で照射光の干渉が利用される。
照射光１は、図１の場合と同様に通過する３本の光線２、３、および４で示されている。入射開口１０へ傾斜して入射する照射光（入射角β1）は、顕微鏡５の対物レンズにより焦点を結ぶ。光線２、３、および４は本発明による偏光装置８により反射され点９に集光する。第２の照射光１６は３本の破線１７、１８、および１９により示されている。この照射光はいずれにしても入射開口１０へ傾斜して入射し（入射角β3）、焦点面６上の仮想焦点２０へ焦点を結ぶ。これらの光線１７、１８、および１９は、本発明による偏光装置により反射され、偏光装置８と焦点面６間の適切な距離、および偏光装置８の適切な傾斜角α2により第１の光線９の照射焦点に焦点が結ばれる。
観察光の光路１１は、図１の場合と同様に点線で示されている。照射光の共焦点９から出射する光線１２、１３および１４は、この発明による偏光装置８により焦点面６の対応する距離に反射され、顕微鏡の対物レンズで平行光線となる。
都合良く構造は対称的となり、α1とα2は同じ値を有する。α1とα2の角度がそれぞれ４５度の場合、両照射軸を定義付ける中心光２と１７は、照射光焦点９で互いに向きが正反対で集光する。角度α2＝０°の場合には、図１に示した本発明の実施例の構造と一致する。
両照射光が顕微鏡対物レンズ５の入射開口１０へ入射する入射角は、β1およびβ3である。特にこの両角度の値は同じである。観察光は、反射角β2で対物レンズ５の開口１０を離れる。好都合にも、この角度の値は９０°である。両照射光の流れは、通常の走査型顕微鏡で光走査する場合の流れに相当する。本発明による偏光装置を適用する場合、両照射光の分離は、たとえば二重点照射光源、または顕微鏡内の共通照射光内にあるプリズムによって達成可能である。
照射と観察は、また入れ替え可能である。すなわち、両照射光の光路は、両観察光の光路としても使用可能であり、また観察光の光路は照射光の光路としても使用可能である。そしてその場合、試料は正反対の二つの方向から照射光に直角な方向で観察される。
検査すべき試料は、図１の場合と同様に、照射光と観察光の共焦点９に置かれる。１次元、２次元、あるいは３次元での試料の撮影は、主として一つ以上の軸に沿った物体走査により可能となる。
本発明によるこの実施例での偏光装置を通常の顕微鏡に装備することにより、ドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４０４０４４１、およびＤＥ−ＯＳ４３２６４７３に記述されている周知の光走査型顕微鏡の原理に従い、遠視野光学式顕微鏡で干渉を使用して得られる最高解像度による撮影が可能となる。
図３は、本発明による偏光装置の代表的な実施例を示し、この実施例では照射軸と観察軸は互いに直交している。そしてこの場合、その交点は、対物レンズの光軸と垂直を成している平面内にある。図は、実施例を上部から（対物レンズの光軸に沿って）見た場合（左）と側面（図１、２と同様）から見た場合を示しており、この場合、断面は、左方から見た図に点線で示した線ＡＢＣ沿って図示されている。
照射・観察光１および１１は、図１の場合と同様に図示されている。平行光線となった照射光（２、３、および４）は、対物レンズ５の入射開口１０に対し傾斜して入射する（入射角β１）。本発明による偏光装置８で照射光２、３、および４を偏光させることにより、対物レンズ５を経た光は、照射光焦点９に焦点を結ぶ。ここで偏光が生じ、中心光２は反射後対物レンズ５の光軸に対し垂直方向へ進む。
照射光焦点９から出ていく観察光１２、１３、および１４は、偏光装置８へ反射され対物レンズ５によって平行になる。観察光１２、１３、および１４の流れは照射光２、３、および４の流れに相当する。これにより観測が行われ、中心の観察光１２は、焦点９と偏光装置８への衝突の間、中心照射光１２に垂直に、そして対物レンズ５の光軸に対しても垂直に進む。この場合、照射軸と観察軸との交角は、角度ＣＡＢである。
観察光は、反射角β2で出射開口１０を通過して進む。この反射角β2は図１における実施例とは対照的に入射角β1を含む平面（点Ａと対物レンズの光軸の間に張られた平面）内にはなく、点Ｃと光軸との間に張られた平面内にある。
この特別な実施例では、角度α１およびα２は、同じ値を有し、同様に、角度β1およびβ2も同じ値である。
これらの特別な実施例は、偏光装置を拡張することにより３本か４本の光線が焦点９で集光するようにすることができる。そのために、α１またはα２だけ傾斜した偏光要素（鏡面）に対し一つ、または二つの傾斜した偏光要素を追加することができる。図２と図３の実施例の組み合わせにより、５本の光路が、共焦点９で集光するように導くことも可能である。その場合、光路は、照射光あるいは観察光の光路としてが利用される。
この特別の実施例における照射光と観察光としての流れも、また従来の光走査型顕微鏡で光走査する場合の光線の流れに相当している。光束の分離は、たとえば、点照射（図示なし）または点検出器（図示なし）の傾斜移動により行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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