(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、特定の細胞を捕捉するフィルターに、該フィルターに液体を導入する導管と、該フィルターから液体を排出する導管が接続しており、該フィルターの上流に、期待するリンス量と同じ内容量に形成するか、或いは期待するリンス量のところに計量用の線を付けるか、または計量用の目盛りを付けて、一定量のリンス液を一旦貯留した後、そのリンス液を排出してフィルターにリンス液を導入するためのリンス液定量装置が配置されており、該リンス液定量装置にエア流通用アダプター及びアグリゲート除去用のメッシュを具備していることを特徴とするリンス液定量装置付細胞分離セット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞集団から特定の細胞を分離回収或いは除去する装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、全血輸血に代わって、全血から赤血球、血小板、白血球を選択的に取り出し、治療に必要な血球成分を輸血する成分輸血が行われるようになった。また最近では、白血病などの造血器腫瘍及び固形癌の化学療法における副作用である造血障害に対して、末梢血、骨髄、臍帯血の中の造血幹細胞を移植することが盛んに行われている。そのほとんどの場合、細胞は移植前まで凍結保存されるが、保存スペース、解凍時の破壊赤血球による副作用が問題となるため、通常凍結前に赤血球除去が行われている。
従来、血液から治療に必要な血球成分を分離する方法として、比重液（例えばファルマシア社製Ｆｉｃｏｌｌ）を用いる比重遠心法が採用されている。本法は比重液に原料細胞を重層させる際に液面を乱してはならない等、非常に熟練を要する煩雑な操作である。最近では、簡便法として、フィルター法が散見されるようになった。具体的には、特開昭５４−１１９０１６号公報、特開昭５７−１４５６６２号公報等で、血液中の回収必要細胞をフィルターに捕捉し、フィルター内に残存した除去対象細胞をリンス液で洗い流した後、フィルターに振動を与えながら回収液をフィルターに通液することにより回収必要細胞を回収する方法、また特開昭６０−１９３４６８号公報等で、血液中の除去対象細胞をフィルターに捕捉し、フィルター内に残存した回収必要細胞をリンス液で洗って回収する方法などが提案されている。前者の場合、フィルター内の除去対象細胞を除くリンス操作時、リンス量が少ないと除去対象細胞を十分除けず、リンス量が多いと回収必要細胞が濾材内部に押し込まれ回収率低下を招いてしまう。また後者の場合、フィルター内に残存する回収必要細胞を回収するリンス操作時、リンス量が少ないと回収必要細胞を十分回収できず、リンス量が多いと除去対象細胞が濾材から漏出して除去率低下を招く。そこで、一般には、電子天秤を用いた重量測定やポンプでの流量定量、或いはリンス液の減少量をリンスボトルの目盛りで計ることで適量のリンスを行っていた。しかし、前者の場合、作業が煩雑で、現場によっては、装置を置くスペースを確保できない、或いは装置がない等、実施するには難がある。また、後者の場合、リンスボトルの目盛りは最小でも５０ｍＬ刻みで、細胞分離や細胞除去で一般に行われているリンス量は数ｍＬから５０ｍＬ以下の為、正確さに欠け、性能低下を招く。
一方、小児向けに薬液を定量する装置付きの血液回路（テルモ社製テルフュージョン定量輸液セット、川澄化学工業社製定量筒付輸液セット）が販売されているが、特定の細胞を分離或いは除去するフィルターと組み合わせたものは現在までにない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、細胞分離或いは除去操作において、簡便な操作で、正確にリンス液を定量可能なリンス液定量装置付細胞分離セットを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、本発明を完成させたものである。即ち、本発明は少なくとも、特定の細胞を捕捉するフィルターに、該フィルターに液体を導入する導管と、該フィルターから液体を排出する導管が接続しており、該フィルターの上流に、期待するリンス量と同じ内容量に形成するか、或いは期待するリンス量のところに計量用の線を付けるか、または計量用の目盛りを付けて、一定量のリンス液を一旦貯留した後、そのリンス液を排出してフィルターにリンス液を導入するためのリンス液定量装置が配置されており、該リンス液定量装置にエア流通用アダプター及びアグリゲート除去用のメッシュを具備していることを特徴とするリンス液定量装置付細胞分離セットである。
本発明で言うフィルターとは、細胞集団中の特定の細胞を選択的に捕捉するが他の成分は捕捉し難いフィルターであり、濾材を容器に充填したものが挙げられる。濾材としては、水不溶性であればいかなる材質でも使用可能であるが、成形性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属があげられる。また、濾材の形状としては粒状、繊維塊、織布、不織布、平板、スポンジ状多孔質体等があげられるが、体積あたりの表面積が大きいという点で繊維塊、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ましい。また、これらの濾材はこのままでも用いられるが、必要に応じ、アミノ酸、ペプチド、糖タンパク（抗体、接着分子等のバイオリガンドを含む）といった、特定の細胞に親和性のあるリガンドを固定してもよい。また、フィルターに血小板通過性を付与する場合、例えば特公平６−５１０６０号公報で提案されているように、ヒドロキシエチルメタクリレートを主成分とする合成高分子等で濾材表面を改質してもよい。
【０００５】
本発明で言うフィルターに液体を導入する導管（以下上流側導管と呼ぶ）とは、細胞集団をフィルターに導入するためにフィルターの入り口側に接続された中空管であり、フィルターから液体を排出する導管（以下下流側導管と呼ぶ）とは、濾液をフィルターから排出するためにフィルターの出口側に接続された中空管である。細胞集団から回収必要細胞をフィルターに捕捉し、リンス液で除去対象細胞を洗い流した後、捕捉された回収必要細胞を回収液で回収する細胞分離操作で、細胞集団と同方向にフィルターに回収液を通液する場合、上流側導管を通る液体は細胞集団、リンス液、回収液であり、下流側導管を通る液体は細胞集団とリンス液の濾液及び回収細胞液である。一方、細胞集団と逆方向にフィルターに回収液を通液する場合、上流側導管を通る液体は細胞集団、リンス液、回収細胞液であり、下流側導管を通る液体は細胞集団とリンス液の濾液及び回収液である。また、細胞集団から除去対象細胞をフィルターに捕捉し、リンス液で回収必要細胞を洗い流す細胞除去操作の場合、上流側導管を通る液体は、細胞集団とリンス液であり、下流側導管を通る液体は細胞集団とリンス液の濾液である。また導管の途中に、細胞分離性能を最大限に発揮できるように、ローラークランプ、オリフィスチューブ等、細胞集団、リンス液の流速を制御する手段を具備していてもよい。
回収必要細胞と除去対象細胞を含む細胞集団の例としては、骨髄、末梢血、臍帯血或いはこれらを遠心分離等により粗分離したものが挙げられる。回収必要細胞と除去対象細胞の組み合わせの例をいくつか示す。回収必要細胞が白血球であり、除去対象細胞が赤血球、血小板の場合、白血球はフィルターに捕捉され、フィルター内に残存した赤血球、血小板をリンス液で洗い流し、回収液にてフィルターに捕捉された白血球が回収される。また、回収必要細胞がＴリンパ球であり、除去対象細胞が赤血球、血小板、顆粒球、単球、Ｂリンパ球の場合、Ｔリンパ球はフィルターに捕捉され、フィルター内に残存した赤血球、血小板、顆粒球、単球、Ｂリンパ球をリンス液で洗い流し、回収液にてフィルターに捕捉されたＴリンパ球が回収される。また、回収必要細胞がＣＤ３４陽性細胞であり、除去対象細胞が赤血球、血小板、ＣＤ３４陰性細胞である場合、ＣＤ３４陽性細胞はフィルターに捕捉され、フィルター内に残存した赤血球、血小板、ＣＤ３４陰性細胞をリンス液で洗い流し、回収液にてフィルターに捕捉されたＣＤ３４陽性細胞が回収される。また、回収必要細胞が赤血球、血小板であり、除去対象細胞が白血球の場合、白血球はフィルターに捕捉され、フィルターを通過した赤血球、血小板を回収し、更にフィルター内に残存した赤血球、血小板をリンス液で洗い流して回収する。また、回収必要細胞が赤血球であり、除去対象細胞が白血球、血小板の場合、白血球、血小板はフィルターに捕捉され、フィルターを通過した赤血球を回収し、更に、フィルター内に残存した赤血球をリンス液で洗い流して回収する。また、血小板製剤中の血小板が回収必要細胞で、白血球が除去対象細胞の場合、白血球はフィルターに捕捉され、フィルターを通過した血小板を回収し、更にフィルター内に残存した血小板をリンス液で洗い流して回収する。
【０００６】
本発明で言うリンス液定量装置とは、細胞集団をフィルターで濾過した後のリンス操作時、一定量のリンス液を計りとるためのもので、リンス液を一旦貯留した後、そのリンス液を排出し、フィルターにリンス液を導入してフィルター内の除去対象細胞或いは回収必要細胞を洗い流すことができるものである。
その好ましい例としてリンス液定量装置にエア流通用アダプターを具備したものが挙げられる。これは液体の貯留及び排出の操作を簡便に行うことができる。本発明で言うエア流通用アダプターとは、一般に用いられている混注用アダプター（ゴム栓）、クランプ付きの短いチューブの先端に除菌フィルターが接続されたもの等を言い、通常は閉じていて、リンス操作時に、前者の場合は除菌フィルターの付いた針等を刺すことにより、後者の場合はクランプ等を開くことにより、エアを装置内から排出してリンス液を装置内に貯留して定量したり、エアを装置内に導入して装置内のリンス液をフィルターに流したりできるアダプターである。
更に、リンス液定量装置の中に、血液中のアグリゲート除去用のメッシュを具備した場合、メッシュチャンバーとリンス液定量装置が兼用できるため、血液回路がシンプルになりより好ましい。ここで言うアグリゲート除去用のメッシュとは、血液中のマイクロアグリゲート及びマクロアグリゲート除去用に一般に用いられているものでよい。細胞による目詰まりを起こさず、アグリゲートを有効に除去するメッシュの規格として、１００〜４００メッシュ、３０〜２００μｍのオープニングが好ましい。
リンス液定量装置を期待するリンス量と同じ内容量にするか、或いはリンス液定量装置に期待するリンス量のところに線を付けておけば、簡便に一定量を計り取ることができる。その場合、リンス液定量装置の容器は、外観で液面がわかるような透明度を持つ材質が好ましい。また、リンス液定量装置の容器に計量用の目盛りを付けることにより、任意の量のリンス液を計量できる。
細胞分離操作において、細胞集団をフィルターに流す方向と同方向に回収液をフィルターに通液する場合、回収液をリンス液定量装置に貯留できるため、回収液の定量或いは計量も可能である。
本発明の最も基本的な様態を図１に示す。１はフィルターに液体を導入する導入口であり、２はその導管である。３はリンス液定量装置、４は特定の細胞を捕捉するフィルターである。５はフィルターから液体を排出する導管、６はその排出口で、７及び８で示すクランプを付属させることができる。
本発明における血液回路は、無菌的に操作するために閉鎖系になっていることが好ましい。例えば、細胞分離では、フィルターの上流側から下流側へ回収液を流す場合、図１の液体導入口１の上流側に細胞集団を貯留する手段とリンス液を貯留する手段と回収液を貯留する手段が接続され、液体排出口６の下流側にフィルターを通った濾液を回収する手段とフィルターを通った回収液を回収する手段が接続される。また、フィルターの下流側から上流側へ回収液を流す場合、回収液を貯留する手段とフィルターを通った回収液を回収する手段が入れ替わった態様となる。細胞除去の場合、図１の液体導入口１の上流側に細胞集団を貯留する手段とリンス液を貯留する手段が接続され、液体排出口６の下流側にフィルターを通った濾液を回収する手段が接続された態様となる。
【０００７】
【実施例】
以下、本発明の実施例を比較例と共に示すが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
ヒト臍帯全血から白血球を分離する場合の細胞分離セットを、図２を用いて例示する。
▲１▼血液回路
図２の９は血液バッグ、１０は生理食塩水ボトル、１１は血液導管、１２はリンス液導管、１３、１４、１６はクランプ、１５はＹ字管、１７、１９は三方活栓、１８は細胞回収バッグ、２０は回収液バッグ、２１はドレインバッグである。本回路では、フィルターの下流側から回収液をフィルターに通液して回収を行う。尚、リンス液定量装置３には、図３及び図４に示すエア流通用アダプター及びメッシュ付のものを使用した。メッシュは袋状になっており、細胞集団中のアグリゲートを除去する。図３の２２は液体導入口、２３はエア流通用アダプター、２４は容器本体、２５はメッシュ、２６は液体排出口である。この場合のリンス液定量装置は、リンス液が充満したところで１０ｃｍ3を定量できる容量のものを用いた。
▲２▼細胞分離フィルター
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦３０ｍｍ、横３０ｍｍ、高さ１２ｍｍ（有効濾過断面積９ｃｍ2、内容積１１ｃｍ3）で液体流出口と液体流入口を最長対角線上に持つポリカーボネート製容器の入口側から、第１層目に平均繊維径１２μｍ、目付１００ｇ／ｍ2のポリエステル不織布２５枚を、第２層目に平均繊維径２．３μｍ、目付６０ｇ／ｍ2のポリエステル不織布１２枚を、上容器と下容器の周辺で挟み込むように充填して容器入口側空間と出口側空間に分離した。尚、本細胞分離フィルター内に充填された不織布の空隙率は０．８１で、充填密度は、第１層目が０．２９ｇ／ｃｍ3、第２層目が０．２２ｇ／ｃｍ3であった。
また、該細胞分離フィルターに血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（モル比で９７：３）の１％エタノール溶液を該細胞分離フィルターの液体流入口から通液し、窒素ガスで余分なポリマー溶液をパージした後、６０℃で８時間以上真空乾燥機で乾燥させた。
▲３▼使用方法
三方活栓１７を細胞回収バッグ１８の方向が閉、三方活栓１９を回収液バッグ２０の方向が閉になるよう切り替え、クランプ１３、１６を開けて、ＣＰＤ加ヒト臍帯全血２０ｃｍ3を、落差（流速約５ｃｍ3／分）によりフィルター４に通液して白血球を捕捉し、濾液はドレインバッグ２１に回収する。続いて、クランプ１３、１６を閉じる。次にリンス液定量装置３のエア流通用アダプター２３に針を刺し、クランプ１４を開ければ装置内からエアが排出されて生理食塩水がリンス液定量装置３に導入される。リンス液が充満したところでクランプ１４を閉じる。次に、クランプ１６を開けると、リンス液定量装置３にエアが導入されてリンス液が装置から排出される。装置内が空になるまでフィルター４に生理食塩水を導入し、フィルター内に残存した赤血球、血小板を洗い流した後、三方活栓１７をリンス液定量装置３の方向が閉になるよう切り替える。その後、三方活栓１９をドレインバッグ２１の方向が閉になるよう切り替え、市販の１０％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字「デキストラン４０注」）にヒト血清アルブミンを３％になるように添加した液体が６０ｍＬ入った回収液バッグ２０を手で握りつぶしてフィルター４に通液し、細胞回収バッグ１８に回収する。
▲４▼結果
同一の血液で、計５回処理して再現性を見た結果、白血球回収率は７５±４％（７３％、７０％、７９％、７４％、７７％）、赤血球除去率は９２±２％（９５％、９４％、９０％、９０％、９１％）、血小板除去率は８６±２％（８３％、８７％、８６％、８６％、８７％）で、再現性の良いデータが得られた。この場合の白血球回収率、赤血球除去率、血小板除去率は以下の式より算出した。
白血球回収率（％）＝１００×（回収細胞液中白血球数／元白血球数）
赤血球除去率（％）＝１００−１００×（回収液細胞中赤血球数／元赤血球数）血小板除去率（％）＝１００−１００×（回収液細胞中血小板数／元血小板数）白血球数は、濾過前血液（回収細胞数）：チュルク液（武藤化学薬品）＝１：９で混和して核染色後、チュルク計算盤を用いて光学顕微鏡（オリンパス社製  ＢＨ−２）で検鏡してカウントした。赤血球、血小板は、自動血球計数装置（東亜医用電子社製Ｓｙｓｍｅｘ  Ｋ−４５００）でカウントした。
【０００８】
【比較例１】
ヒト臍帯全血から白血球を分離する際、リンス液定量装置を使用しない場合を例示する。
▲１▼血液回路
図２のリンス液定量装置３がない以外は、実施例１と同じ。
▲２▼細胞分離フィルター
実施例１と同じ。
▲３▼使用方法
リンス液量を、生理食塩水ボトル１０の目盛りの変化を目視で読みとって計量した以外は、実施例１と同じ。
▲４▼結果
実施例１と同様、同一の血液で、計５回処理して再現性を見た結果、白血球回収率は７０±１２％（５５％、７０％、８６％、７５％、６４％）、赤血球除去率は９１±８％（９９％、９３％、７９％、８７％、９７％）、血小板除去率は８４±８％（９１％、８６％、７１％、８２％、９０％）であった。生理食塩水ボトル１０の目盛りは５０ｍＬ刻みでリンス液１０ｍＬを読みとることが難しく、実施例１に比べかなり性能にばらつきが見られた。
【０００９】
【実施例２】
ヒト濃厚赤血球から白血球を分離する場合の細胞分離セットを例示する。
▲１▼血液回路
図１のリンス液定量装置３に図３及び図４の形状で、内容量が２５ｍＬのものを使用した。
▲２▼細胞分離フィルター
市販の白血球除去フィルター（旭メディカル社製セパセル（登録商標）Ｒ−２００（２））を使用した。
▲３▼使用方法
ＭＡＰ加濃厚赤血球８０ｃｍ3入りの血液バッグを液体導入口１に接続し、クランプ７、８を開けて、落差（流速約５ｃｍ3／分）によりフィルター４に通液して白血球、血小板を捕捉し、濾液は液体排出口から回収する。続いて、クランプ８を閉じ、血液バッグを切り離し、生理食塩水ボトルを液体導入口に接続する。次に、リンス液定量装置３のエア流通用アダプターに針を刺し、生理食塩水がリンス液定量装置に充満したところでクランプ７を閉じる。最後に、クランプ８を開け、リンス液定量装置３が空になるまでフィルター４に通液してフィルター内に残存する赤血球を回収する。
▲４▼結果
同一の血液で、計５回処理して再現性を見た結果、白血球除去率は３．３５±０．１０１ｏｇ（３．４９、３．３６、３．２８、３．４１、３．２３）、赤血球回収率は９８±１％（９８、９７、９９、９８、９９）、血小板除去率は９７±１％（９５、９６、９８、９６、９８％）で、再現性の良いデータが得られた。この場合の白血球除去率、赤血球除去率、血小板除去率は以下の式より算出した。
白血球除去率＝−１ｏｇ（元白血球数／ドレイン中白血球数）
赤血球回収率（％）＝１００×（ドレイン中赤血球数／元赤血球数）
血小板除去率（％）＝１００−１００×（ドレイン中血小板数／元血小板数）
元白血球数は、濾過前血液：チュルク液（武藤化学薬品）＝１：９で混和して核染色後、チュルク計算盤を用いて光学顕微鏡（オリンパス社製  ＢＨ−２）で検鏡してカウントした。また、ドレイン中の白血球数は、濾過後血液：溶血液（１．１５％シュウ酸アンモニウムのリン酸緩衝液）＝１：２で混和し、１０分放置。その後、０．０１％アクリジンオレンジ水溶液を１．１倍希釈で加えて核染色。ノイパウェル計算盤を用いて蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製ＭＩＣＲＯＰＨＯＴ−ＦＸＡ）で検鏡してカウントした。赤血球、血小板は、自動血球計数装置（東亜医用電子社製Ｓｙｓｍｅｘ  Ｋ−４５００）でカウントした。
【００１０】
【比較例２】
ヒト濃厚赤血球から白血球を除去する際、リンス液定量装置を使用しない場合を例示する。
▲１▼血液回路
図１のリンス液定量装置３がない以外は、実施例２と同じ。
▲２▼細胞分離フィルター
実施例２と同じ。
▲３▼使用方法
リンス液量を、生理食塩水ボトルの目盛りの変化を目視で読みとって計量した以外は、実施例２と同じ。
▲４▼結果
実施例２と同様、同一の血液で、計５回処理して再現性を見た結果、白血球除去率は３．２０±０．３１％（２．９６、３．３３、３．４３、３．５１、２．７９）、赤血球回収率は９７±３％（９９％、９８％、９３％、９４％、９９％）、血小板除去率は９５±３％（９７％、９５％、９１％、９２％、９８％）であった。生理食塩水ボトルの目盛りは５０ｍＬ刻みでリンス液１０ｍＬを読みとることが難しく、実施例２に比べかなり性能にばらつきが見られた。
【００１１】
表１に結果のまとめを示す。
0004107519.tif 000002
【００１２】
【発明の効果】
本発明のリンス液定量装置付血液回路では、電子天秤等を使用しないため飛躍的にリンス操作を簡便化できるだけでなく、正確なリンス液定量による除去対象細胞の除去及び回収必要細胞の回収が再現性良く行える。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明細胞分離セットの基本構成を示す模式図である。
【図２】本発明細胞分離セットの実施態様の１例を示す模式図である。
【図３】リンス液定量装置の１例を示す模式図である。
【図４】リンス液定量装置の１例を示す模式図である。
【符号の説明】
１  液体導入口
２  導管
３  リンス液定量装置
４  フィルター
５  導管
６  液体排出口
７  クランプ
８  クランプ
９  血液バッグ
１０  生理食塩水ボトル
１１  血液導管
１２  リンス液導管
１３  クランプ
１４  クランプ
１５  Ｙ字管
１６  クランプ
１７  三方活栓
１８  細胞回収バッグ
１９  三方活栓
２０  回収液バッグ
２１  ドレインバッグ
２２  液体導入口
２３  エア流通用アダプター
２４  容器本体
２５  メッシュ
２６  液体排出口
【図１】
0004107519.tif 000003
【図２】
0004107519.tif 000004
【図３】
0004107519.tif 000005
【図４】
0004107519.tif 000006