(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ法で増幅された濃度未知の核酸物質由来の蛍光シグナルを検出するのに有用な蛍光計であって、
少なくとも一方がレベルの異なる複数の強度を示す第一光源及び第二光源であって前記第一光源の最高強度レベルが前記第二光源の最低強度レベルよりも低い第一光源及び第二光源と、
前記第一光源及び前記第二光源からの輻射線が、それぞれ空間内の一点で交差する第一経路上及び第二経路上に発せられるように、前記光源を互いに直交するように搭載する手段と、
前記一点に配置され、反射する光量の２倍以上の光を透過するように構成されているシングルビームスプリッターと、
蛍光を発する可能性のある試料を含有する試験容器を前記第二経路を横切るように配置するための手段と、
前記第二経路を横切るように配置された蛍光シグナル検出器であって、前記試験容器が存在する場合には前記試験容器が前記蛍光シグナル検出器と前記ビームスプリッターとの間に配置される蛍光シグナル検出器と、
前記第一経路を横切るように配置された基準検出器と、
それぞれ強度の異なる光源に最低強度から最高強度へと順に電力を供給するための電源と、及び
前記シグナル検出器がしきい値よりも高いシグナルを検出した場合に、前記第二光源が発する輻射線がまだ最高強度に達していない場合であっても、前記電源を停止するための開閉手段とを含んで成る蛍光計。
【請求項２】
ＰＣＲ法で増幅された濃度未知の核酸物質由来の蛍光シグナルを検出するための方法であって、
（ａ）容器に入っている前記物質にレベルの低い第一フラッシュ光を当て、前記物質の蛍光をＰＭＴ検出器で検出する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で検出された蛍光が所定のしきい値を下回る場合には、前記第一フラッシュ光のレベルよりも高い第二レベルのフラッシュ光を前記容器に当て、前記物質の蛍光をＰＭＴ検出器で検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出された蛍光が所定のしきい値を下回る場合には、それぞれ前回のレベルよりも高い増加したレベルのフラッシュ光を前記容器に当て、前記物質の蛍光をＰＭＴ検出器で検出する工程と、及び
（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）のいずれかにおいて、前記しきい値シグナルを上回る蛍光シグナルを検出した場合には、前記ＰＭＴ検出器を露光過度から守るように前記容器のフラッシュ露光を停止する工程とを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フラッシュ蛍光計及び方法、特にＰＣＲ法で増幅された核酸物質の検出に有用なものに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、多少なりとも予測可能で変動幅が最小である光量を測定するためにＰＭＴ検出器を使用した蛍光計が提供されている。このようなＰＭＴを使用するいずれの検出器も、露光量が検出限界の上限を超えないように注意しなければならない。というのは、そのような注意をしないと、ＰＭＴが（ａ）「回復」するのに時間がかかりすぎたり、（ｂ）永久にダメージを受けたりするからである。しかしながら、当該光量が、大幅に変動することが予測されない場合や、一定出力で発光する光源による場合には、ＰＭＴが危険にさらされることはない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
実際にＰＭＴ検出器を危険にさらす使用現場が存在する。均質系ＰＣＲ法は、出力が標的ＤＮＡの複製濃度の関数となり、ひいては出発濃度の関数となる蛍光マーカーを利用する場合が多い。その結果、検出時点でのマーカー濃度の変動幅が１００倍以上になる場合もある。すなわち、蛍光団濃度が一定のフラッシュランプ強度について予測される値よりもはるかに高くなる場合で使用される恐れがあり、その場合、ＰＭＴは「盲目的」となる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、フラッシュ照明装置の光出力を非常に低いレベルから開始してＰＭＴが特定範囲内での蛍光の検出を記録するまで段階的に強度を増加させる蛍光計及び方法を開発した。この記録時点でフラッシュランプの出力増加を停止するので、ＰＭＴが過負荷を受ける危険がない。
【０００５】
より具体的には、本発明の第一の側面によると、ＰＣＲ法で増幅された濃度未知の核酸物質由来の蛍光シグナルを検出するのに有用な蛍光計であって、
少なくとも一方がレベルの異なる複数の強度を示す第一光源及び第二光源であって前記第一光源の最高強度レベルが前記第二光源の最低強度レベルよりも低い第一光源及び第二光源と、
前記第一光源及び前記第二光源からの輻射線が、それぞれ空間内の一点で交差する第一経路上及び第二経路上に発せられるように、前記光源を互いに直交するように搭載する手段と、
前記一点に配置され、反射する光量の２倍以上の光を透過するように構成されているシングルビームスプリッターと、
蛍光を発する可能性のある試料を含有する試験容器を前記第二経路を横切るように配置するための手段と、
前記第二経路を横切るように配置された蛍光シグナル検出器であって、前記試験容器が存在する場合には前記試験容器が前記蛍光シグナル検出器と前記ビームスプリッターとの間に配置される蛍光シグナル検出器と、
前記第一経路を横切るように配置された基準検出器と、
それぞれ強度の異なる光源に最低強度から最高強度へと順に電力を供給するための電源と、及び
前記シグナル検出器がしきい値よりも高いシグナルを検出した場合に、前記第二光源が発する輻射線がまだ最高強度に達していない場合であっても、前記電源を停止するための開閉手段とを含んで成る蛍光計が提供される。
【０００６】
本発明の別の側面によると、ＰＣＲ法で増幅された濃度未知の核酸物質由来の蛍光シグナルを検出するための方法であって、
（ａ）容器に入っている前記物質にレベルの低い第一フラッシュ光を当て、前記物質の蛍光をＰＭＴ検出器で検出する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で検出された蛍光が所定のしきい値を下回る場合には、前記第一フラッシュ光のレベルよりも高い第二レベルのフラッシュ光を前記容器に当て、前記物質の蛍光をＰＭＴ検出器で検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出された蛍光が所定のしきい値を下回る場合には、それぞれ前回のレベルよりも高い増加したレベルのフラッシュ光を前記容器に当て、前記物質の蛍光をＰＭＴ検出器で検出する工程と、及び
（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）のいずれかにおいて、前記しきい値シグナルを上回る蛍光シグナルを検出した場合には、前記ＰＭＴ検出器を露光過度から守るように前記容器のフラッシュ露光を停止する工程とを含んで成る方法が提供される。
【０００７】
実施態様
以下の説明は、増幅された核酸物質から得られる蛍光を検出するため、特定の試験容器を、特定期間にかけて、具体的には最大で４段階のエネルギーレベルまでサイクル運転するフラッシュ蛍光計と共に使用する好ましい実施態様に関するものである。さらに、本発明は、使用する試験容器の種類、フラッシュサイクルにおいて採用する期間及びエネルギーレベル、異なるフラッシュエネルギーレベルの数、又は検出する蛍光源とは無関係に有用である。
【０００８】
本発明により、低出力フラッシュランプ照明装置１２と高出力フラッシュランプ照明装置１４を有する蛍光計１０を構築する。各照明装置は、最初は（そのランプの）低エネルギーレベルでフラッシュし、次いでより高いレベルでフラッシュするように電力供給されている。当該レベルを低く保ち且つ徐々に蓄積させるため、ランプ１２を最初にその２段階のレベルでフラッシュし、次いで必要があればランプ１４をその低い方のレベルでフラッシュし、その後必要があればその高い方のレベルでフラッシュする。その結果、ランプ１２は最初に低いエネルギーレベルでフラッシュし、次いで中間のエネルギーレベルでフラッシュし、次いで必要があればランプ１４は高いレベルでフラッシュし、その後非常に高いレベルでフラッシュすることになるが、すべて１．５秒の読みサイクルの範囲内である。
【０００９】
実際にフラッシュに使用されるエネルギーレベルは、もちろん試験容器内で予測される蛍光団標的の量に依存する。当該レベルは当業者であれば周知の事項である。典型的には、各フラッシュを４μ秒間行う場合、当該エネルギーレベルは０．０１〜１０ジュールの範囲にある。
【００１０】
当該蛍光計の運転を４種及び４種のみの異なるエネルギーレベルで行わなければならない理由がないことは容易に理解できる。ランプは、全体で６種の場合に、各々が、例えば３種のレベルで運転されるように設けること、或いは一つを２種のレベルとし、一つを１種又は３種のレベルとすることもできる。いずれも、試験容器内に存在すべき蛍光団のレベルに必要とされることが予測される段階化(staging) に依存する。
【００１１】
ランプ１２及び１４は、図示したように、交差する２本の各経路に沿って、互いに直交する輻射線を発するように適当な手段によって搭載される。
蛍光計の残部は、当該光路の交差点に配置された９０／１０ビームスプリッター２０と、ソース基準ダイオード検出器２２と、励起フィルター２４と、蛍光団マーカーの付いた試料を含有する試験容器２６と、エミッションフィルター２８と、光電増倍管（ＰＭＴ）検出器３０と、検出器３０を周囲光から防護する必要がある時にいつでも閉鎖するシャッター３２とを含む。フィルター２４の表面は、どちらのランプから来る光の経路とも交わるように容器２６を配置する手段として作用する。
【００１２】
電源４０（図２）を使用してランプに４種類のレベルで電力を供給するが、これは常用の各種装置によって実施することができる。例えば、二つの高電圧電源４２、４４をそれぞれステッパースイッチ５２、５４に独立に接続し、電圧分割抵抗器４８により、電源４２又は４４の出力電圧のすべて又は対応する一部分を提供する。これらは、順に、それぞれスイッチ６０、６２を介してフラッシュランプ１２及び１４へ接続される。コンデンサーＣ１及びＣ２は並列に配線され、Ｃ２はＣ１の１０倍の値を示す。例えば、Ｃ１は１マイクロファラドであって０．０１Ｊ〜０．１Ｊの出力を与えることができ、その場合、Ｃ２は１０マイクロファラドであってランプ１４に０．１Ｊ〜１．０Ｊの出力を与える。スイッチ６０、６２は、スイッチ５２、５４と共に、ここでは７０で図示した蛍光計用のマイクロプロセッサで制御され、ランプは適当な順序で発光し、試料容器２６から十分なシグナルが検出器３０によって検出された時点で遮断される。
均質系ＰＣＲ法に有用で検出可能な蛍光団については、例えば、Nature Biotechnology (Vol. 14, March 1996, p. 264, pp. 303-306) に記載されている。
【００１３】
【発明の効果】
本発明の有利な特徴は、ＰＭＴにより蛍光を検出するために広範囲のフラッシュエネルギーを試料容器に当てても、ＰＭＴが露光過度になり盲目化する危険性のないフラッシュ蛍光計が提供されることにある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明により構成された蛍光計の部分分解図である。
【図２】当該蛍光計への電力供給を制御するための回路の概略図である。
【符号の説明】
１０…蛍光計
１２…低出力フラッシュランプ照明装置
１４…高出力フラッシュランプ照明装置
２０…ビームスプリッター
２２…基準ダイオード検出器
２４…励起フィルター
２６…試験容器
２８…エミッションフィルター
３０…光電増倍管（ＰＭＴ）検出器
３２…シャッター
４０…電源
４２，４４…高電圧電源
４８…電圧分割抵抗器
５２，５４…ステッパースイッチ
６０，６２…スイッチ
Ｃ１，Ｃ２…コンデンサー
【図１】
0004188455.tif 000002
【図２】
0004188455.tif 000003