(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列を含有することを特徴とするプラスミド。
【請求項２】
１．８ｋｂの塩基対からなり、配列番号１で示される塩基配列を含有することを特徴とするニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属）に属するアンモニア酸化細菌に由来するプラスミド。
【請求項３】
配列番号２で示される塩基配列を含有することを特徴とするプラスミド。
【請求項４】
１．９ｋｂの塩基対からなり、配列番号２で示される塩基配列を含有することを特徴とするニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属）に属するアンモニア酸化細菌に由来するプラスミド。
【請求項５】
配列番号１で示される塩基配列又は配列番号２で示される塩基配列と、選択マーカー遺伝子とを含有することを特徴とするキメラプラスミド。
【請求項６】
アンモニア酸化細菌及び大腸菌の細胞内で複製可能であることを特徴とする請求項５記載のキメラプラスミド。
【請求項７】
請求項６に記載のプラスミドが少なくとも一つ宿主生物であるアンモニア酸化細菌又は大腸菌に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項８】
アンモニア酸化細菌がニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属）であることを特徴とする請求項７に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンモニア酸化細菌由来のプラスミド及びその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
化学的独立栄養細菌であるアンモニア酸化細菌は、アンモニアを亜硝酸に酸化する生体反応によってのみその生命活動に必要なエネルギーを獲得する微生物である。アンモニア酸化細菌は、自然界における窒素循環に重要な役割を果たしている。加えて、活性汚泥法などによるし尿排水、生活排水及び産業排水等の生物処理において、窒素除去の主要反応である硝化過程の媒介微生物としても重要である。近年、水域の富栄養化防止の観点から、先述の排水の生物処理における窒素除去効率の向上が求められる傾向にあり、アンモニア酸化細菌の機能が注目されている。ところが、アンモニア酸化細菌は、一般の好気性従属栄養微生物のように有機物を酸化分解してエネルギーを得ることができないため、アンモニアの酸化及び増殖の速度が非常に遅い。加えて、アンモニア酸化細菌は、様々な有機化学物質・金属元素等による生育阻害を受けやすいため、排水の生物処理において流入原排水中に有害成分が混入した場合、窒素除去率の低下が起こりやすい。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
アンモニア酸化細菌の上記のような弱点を克服するための一手段として、遺伝子組換え技術を用いることができると考えられる。すなわち、アンモニア酸化細菌の染色体に存在するアンモニア酸化に関与する酵素の遺伝子の機能を高めるために適当な外来遺伝子断片をアンモニア酸化細菌に導入して発現させたり、アンモニア酸化細菌にとって有害な物質に対する解毒作用を示す酵素の遺伝子をアンモニア酸化細菌に導入し発現させたりする手段である。しかしながら、従来は、アンモニア酸化細菌を宿主生物とするベクター系が確立されていないため、このような遺伝子組換え操作を行うことができなかった。そこで、アンモニア酸化細菌を宿主生物とするベクター系の開発が強く望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
このような状況下で、本発明者らは鋭意検討した結果、アンモニア酸化細菌の細胞内で複製しうるプラスミドを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１）配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴とするプラスミド（以下、本発明プラスミドＳと記す。）、
２）約１．８ｋｂの塩基対からなり、図１に示される制限酵素地図で表されることを特徴とするプラスミド、
３）配列番号２で示される塩基配列を有することを特徴とするプラスミド（以下、本発明プラスミドＬと記す。）、
４）約１．９ｋｂの塩基対からなり、図２に示される制限酵素地図で表されることを特徴とするプラスミド、
５）配列番号１で示される塩基配列及び配列番号２で示される塩基配列の少なくとも１部を有し、選択マーカー遺伝子を含有することを特徴とするプラスミド、
６）アンモニア酸化細菌及び大腸菌の細胞内で複製可能であることを特徴とする前項５記載のプラスミド、
７）約７．６ｋｂの塩基対からなり、図３に示される制限酵素地図で表されることを特徴とするプラスミド、
８）前項１ないし７に記載のプラスミドが少なくとも一つ宿主生物に導入されてなることを特徴とする形質転換体、
９）水溶液中のアンモニウムイオンの検出方法であって、生物発光に関与するタンパク質をコードする発光生物由来の遺伝子が挿入された前項１〜７記載のプラスミドがアンモニア酸化細菌に導入されてなる形質転換体を、被検水溶液および生物発光の基質に同時に接触させ、前記形質転換体の生物発光を測定することを特徴とする方法、
１０）硝化阻害物質の代謝分解酵素をコードする遺伝子が挿入された前項１〜７記載のプラスミドをアンモニア酸化細菌に導入して形質転換体を取得することを特徴とする硝化阻害物質抵抗性アンモニア酸化細菌の作製方法、
１１）アンモニア酸化に関与する酵素をコードする遺伝子が挿入された前項１〜７記載のプラスミドをアンモニア酸化細菌に導入して形質転換体を取得することを特徴とするアンモニア酸化細菌のアンモニア酸化能増強方法、
を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、さらに詳細に本発明を説明する。
本発明プラスミドＳ及びＬは、ニトロソモナス（Nitrosomonas）属に属するアンモニア酸化細菌から得られうるプラスミドである。具体的には、本発明プラスミドＳとしては、例えば、1823塩基対からなり、その全塩基配列が配列番号１で示される塩基配列であるプラスミド（pAYS）をあげることができ、また本発明プラスミドＬとしては、例えば、1910塩基対からなり、その全塩基配列が配列番号２で示される塩基配列であるプラスミド（pAYL）をあげることができる。
【０００６】
本発明プラスミドＳまたはＬは、例えば、J.Sambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー・クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、１９８９年、等に記載の通常の遺伝子工学的手法において用いられるプラスミドの調製方法により調製することができる。具体的には、まず本発明プラスミドＳまたはＬを含有するNitrosomonas属に属するアンモニア酸化細菌を培養し、得られた菌体からプラスミドを抽出する。ここで、Nitrosomonas属に属するアンモニア酸化細菌を培養する方法としては、通常のアンモニア酸化細菌の培養方法を用いることができる。培地には、例えば、アンモニア源として、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等、無機塩として、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄等の硫酸塩、リン酸塩、塩化物及び有機塩等を用いることができる。具体的には、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム七水和物、塩化カルシウム二水和物、炭酸カルシウム、硫酸第一鉄七水和物、エチレンジアミン四酢酸鉄三水和物などをあげることができる。また、その他の無機元素として、銅、コバルト、モリブデン、マンガン、亜鉛等の硫酸塩及び塩化物等を微量加えることもできる。具体的には、例えば、硫酸銅五水和物、塩化コバルト六水和物、モリブデン酸ナトリウム二水和物、塩化マンガン四水和物、硫酸マンガン四水和物、硫酸亜鉛七水和物などをあげることができる。また、アンモニア酸化細菌の増殖に伴って培地中のアンモニアが亜硝酸に酸化されるため、時間の経過とともに培養液のｐＨが低下する。その場合、培養液のｐＨの低下を抑制するために、アンモニア酸化細菌の生育に無害な緩衝作用を有する化学物質をあらかじめ培地中に加えることもできる。加えることができる化学物質としては、例えば、ＨＥＰＥＳ（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸）等があげられる。
【０００７】
培養は、通常の絶対好気性細菌の培養方法に準じて行われる。液体培養、すなわち試験管振とう培養、往復式振とう培養、回転式振とう培養、ジャーファーメンター培養等はいずれも可能である。培養温度は、アンモニア酸化細菌が生育する範囲で適宜変更でき、例えば約20℃〜約35℃、好ましくは約25℃〜約30℃の範囲である。培地のｐＨは、中性からわずかにアルカリ性が適性領域であり、例えば約７〜約８が好ましい。必要に応じて、ｐＨを適性領域に保つために、例えば約５重量％〜約10重量％の炭酸ナトリウム、１規定度程度の水酸化ナトリウム等のアルカリ性物質溶液を適宜滴下することもできる。培養時間は、種々の条件によって異なるが、通常約5日間〜約20日間が好ましい。該微生物は、一般に増殖が遅く菌体収量も低いため、肉眼での観察または濁度計などによる培養液の濁度測定等によって増殖を確認することは困難である。したがって、イオンクロマトグラフィーなどを使用して、培養液の亜硝酸の生成を検出することにより増殖を検出することが望ましい。固体培養においては培地の固化剤として、精製された多糖類、例えばゲランガム（和光純薬株式会社製）等を使用することが好ましい。一般に広く使用される寒天は不純物を含有している場合があるため、これを使用すると該微生物のコロニーが形成しないか、形成してもごく小さいので菌体の取り扱いが困難である。このようにして培養された該微生物菌体を遠心分離によって回収し、例えば、H.C.Birnboim & J.Doly, Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)等に記載されるアルカリ−ＳＤＳ法等の通常の細菌からのプラスミド抽出法に準じて本発明プラスミドＳまたはＬを得ることができる。
【０００８】
プラスミドの構造決定は、通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を用いることができる。すなわち、本発明プラスミドＳまたはＬの各種制限酵素消化断片を大腸菌を宿主生物とするプラスミドベクターに挿入し、大腸菌を形質転換した後、該プラスミドベクターのＤＮＡを抽出し、これを市販の塩基配列決定装置（シーケンサー）に供する。決定された塩基配列は市販のパーソナルコンピュータ用の遺伝子解析ソフトウェアなどを使用すれば、制限酵素地図の作成や既往の核酸塩基配列データとの比較検討などを行うことができる。さらに、上記の比較検討方法に準じて、例えば、プラスミド間で相同性の高い領域を見出し、その領域を形質転換用ベクターの構築に利用することもできる。プラスミド間で相同性の高い領域として、例えば、本発明プラスミドＳであるpAYSおよび本発明プラスミドＬであるpAYLの塩基配列を比較検討した場合、pAYSでは配列番号１における第1152番の部位から第1413番の部位までの262塩基対の領域と、pAYLでは配列番号２における第1340番の部位から第1600番の部位までの261塩基対の領域をあげることができる。
【０００９】
本発明プラスミドＳまたはＬを含有するNitrosomonas属に属するアンモニア酸化細菌としては、例えば、活性汚泥中から後述の実施例１に記載される方法により分離されたNitrosomonas sp. ENI-11と命名されたアンモニア酸化細菌があり、現在、ブタペスト条約に従い工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-5774（受理日 平成8年12月18日）として寄託されている。なお、 Nitrosomonas sp. ENI-11株の菌学的性質は以下の通りである。
（ａ）形態
細胞の形及び大きさ
形        ：桿状（短桿菌）
大きさ    ：０．５μｍ 〜０．７μｍ  ×  １．０μｍ 〜１．４μｍ
グラム染色      ：陰性
運動性の有無    ：無
（ｂ）生育状態
アンモニアから亜硝酸の生成          ：＋
亜硝酸から硝酸の生成                ：−
ＣＧＹ培地等栄養培地における増殖    ：−
酸素要求性          ：絶対好気性
最適生育温度範囲    ：２８℃〜３２℃
最適生育ｐＨ範囲    ：７．５〜８．０
（ｃ）その他の性質
ＧＣ含量    ：５０％
以上の諸性質をバージーの細菌分類書（Bergy's Manual of Systematic Bacteriology）［1984年版］により検索した結果、本発明者らは、本菌株をニトロソモナス（Nitrosomonas）属に属するとするのが適当であると判断した。
【００１０】
本発明プラスミドＳが有する配列番号１で示される塩基配列及び本発明プラスミドＬが有する配列番号２で示される塩基配列の少なくとも１部と、選択マーカー遺伝子断片を有するキメラプラスミド（以下、本発明キメラプラスミドと記す。）を作製することができる。本発明キメラプラスミドとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列及び選択マーカー遺伝子を含有するプラスミド、配列番号２で示される塩基配列及び選択マーカー遺伝子を含有するプラスミド、配列番号１で示される塩基配列、配列番号２で示される塩基配列及び選択マーカー遺伝子を含有するプラスミド等をあげることができる。具体的には、例えば、約7.6kbの塩基対からなり、図３に示される制限酵素地図で表されるプラスミドをあげることができる。
【００１１】
本発明キメラプラスミドの含有する選択マーカー遺伝子とは、該プラスミドが宿主生物内に存在していることを検出可能とするマーカーとして機能しうる遺伝子を意味し、例えば、該プラスミドが導入された宿主生物を非導入宿主生物から選別するために利用できる。選択マーカー遺伝子としては、本発明キメラプラスミドを導入しようとする宿主生物で選択マーカーとして機能可能な遺伝子であれば特に問題はなく、例えば、宿主生物に薬剤耐性を付与する遺伝子や、宿主生物の栄養要求性を相補する遺伝子等を用いることができる。具体的には、例えば、市販の各種ベクター由来のカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子又はクロラムフェニコール耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子、トリプトファン要求性相補遺伝子、ヒスチジン要求性相補遺伝子等のアミノ酸要求性相補遺伝子、ウラシル要求性相補遺伝子等の核酸要求性相補遺伝子等をあげることができる。尚、２種類以上の宿主生物に導入するための本発明キメラプラスミドには、それぞれの宿主生物で選択マーカーとして機能する２種類以上の遺伝子が同一プラスミド上に含まれていてもよいし、いずれの宿主生物においても選択マーカーとして機能する１種の遺伝子が含まれていてもよい。また、例えば、２種の本発明キメラプラスミドを１つの宿主生物に同時に導入する場合には、導入に用いる２種の該キメラプラスミドにそれぞれ異なる選択マーカー遺伝子が含まれていると、形質転換体の選別に便利である。
【００１２】
本発明キメラプラスミドは、通常の遺伝子工学的手法に準じて作製することができる。例えば、配列番号１で示される塩基配列又は配列番号２で示される塩基配列、及び選択マーカー遺伝子を含有するプラスミドを作製するには、本発明プラスミドＳ又は本発明プラスミドＬ、及び上述の選択マーカー遺伝子を含む大腸菌ベクターを適当な制限酵素で切断した後ライゲーションにより連結し、得られた構築物で大腸菌を形質転換した後、該大腸菌からプラスミドＤＮＡを抽出すればよい。また、例えば、配列番号１で示される塩基配列、配列番号２で示される塩基配列及び選択マーカー遺伝子を含有するプラスミドを作製するには、本発明プラスミドＳ、本発明プラスミドＬ及び選択マーカー遺伝子を含む大腸菌ベクターを適当な制限酵素で切断した後ライゲーションにより三者を連結し、得られた構築物で大腸菌を形質転換した後、該大腸菌からプラスミドＤＮＡを抽出すればよい。選択マーカー遺伝子を含む大腸菌用ベクターには、例えば、市販の大腸菌用プラスミドベクターを用いることができる。
【００１３】
本発明プラスミドＳ、Ｌ、又は本発明キメラプラスミドを通常の遺伝子工学的手法に準じて宿主生物に導入することにより、形質転換体を作製することができる。具体的には、例えば、本発明プラスミドＳ、Ｌ、又は本発明キメラプラスミドをN.G.Hommes, L.A.Sayavedra-Soto, D.J.Arp, Journal of Bacteriology, 178, 3710-3714 (1996)等に記載されるエレクトロポーレーション法により、Nitrosomonas europaeaに代表されるアンモニア酸化細菌に導入し、形質転換体を作製することができる。複数種の上記プラスミドを同時にアンモニア酸化細菌に導入することにより、形質転換体を作製してもよい。また、本発明キメラプラスミドをD.Hanahan, Journal of Molecular Biology, 166, 557-580 (1983) 等に記載される塩化カルシウム処理法により大腸菌に導入し、形質転換体を作製することもできる。
【００１４】
本発明キメラプラスミドをベクターとして使用し、これに外来遺伝子を組み込んで宿主生物であるアンモニア酸化細菌に導入することにより、本来アンモニア酸化細菌が有しない形質を発現させることができる。例えば、本発明キメラプラスミドに、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）等の発光細菌の生物発光に関する蛋白質をコードする遺伝子群、例えばDevine,J.H., Countryman,C. and Baldwin,T.O., Biochemistry 27, 837-842 (1988)等に記載のluxオペロン等の遺伝子断片を挿入してプラスミドを構築する。このようにして得られるプラスミドを用いてNitrosomonas europaea等のアンモニア酸化細菌を形質転換することにより、形質転換体に生物発光の形質を発現させることができる。
このようにして得られた形質転換体を水試料に接触させることにより、該水試料中のアンモニウムイオンを検出及び定量することができる。形質転換体は浮遊培養によって増殖したものをそのまま用いても良いし、あるいは、須藤隆一編著「微生物固定化法による排水処理」産業用水調査会発行（1988）等に記載の包括固定化等の微生物の保持固定化技術によって適当な支持体に固着保持したもの（以下、固定化菌体という）を用いてもよい。いずれの場合も、形質転換体が本来有するアンモニア酸化作用によってアンモニウムイオンから生成されるプロトン（H+）を基質として菌体内の電子伝達系酵素群が機能し、該形質転換体に導入されたlux遺伝子群が発現して産生される酵素（ルシフェラーゼ）が前記電子伝達系と共役して機能し基質に作用することにより発光反応がおこる。その際の光量または発光強度をルミノメータのような光検出器を使用して測定することにより、アンモニウムイオンの検出及び定量化が可能となる。また、水試料中にアンモニウムイオンが前記形質転換体の生物発光により検出できる程度に存在する場合において、アンモニア酸化細菌の硝化機能を阻害する化学物質（以下、硝化阻害物質という）が該水試料中に混在する場合は、硝化阻害物質濃度に応じて上記形質転換体の発光反応が抑制される。従って、あらかじめ硝化阻害物質を含まないことがわかっている水試料を対照として、対照及び被検試料をそれぞれ上記形質転換体の培養液または固定化菌体と接触させ、該形質転換体の生物発光を測定し対照と被検試料の測定値を比較することにより、試料中の硝化阻害物質を検出及び定量することもできる。具体例として、下水、産業排水等の生物処理（活性汚泥法、生物膜法など）における原排水の硝化阻害物質検査などがあげられる。
上記形質転換体をM.Hikuma, T.Kubo, T.Yasuda, Analytical Chemistry, 52, 1020-1024 (1980)等に記載される方法などによってプローブ様に固定化し、光ファイバケーブル等で前記のルミノメータ等に接続することでアンモニウムイオンのセンサーを作製することもできる。このようなセンサーを用いて被検水試料中のアンモニウムイオン濃度を検出することにより、被検水試料を採取することなく、例えば流水系においても、アンモニア測定及び／または硝化阻害物質測定を行うことができる。例えば、活性汚泥排水処理槽の前段に備えられる調整槽に流入する排水中の硝化阻害物質を上記形質転換体を利用して検知し、得られる値に応じて、流入バルブの閉止、有害物質含有排水の待避ピットへの貯留等の指令信号を発する排水監視システムを構築することができる。
【００１５】
本発明キメラプラスミドに硝化阻害物質の分解または無害化を行う酵素遺伝子群の断片を挿入し、Nitrosomonas europaea等のアンモニア酸化細菌を形質転換することにより、形質転換体に硝化阻害物質に対する抵抗性を付与することができる。硝化阻害物質の例は、C.Bedardら、Microbiological Reviews, 53, 68-84 (1989)、D.J.W.Blumら、Research Journal of Water Pollution Control Federation, 63, 198-207 (1991)等に記載されている。それらのうち、既に微生物による分解または無害化作用に係る酵素がそれをコードする遺伝子レベルまで解明されている物質の例としてシアニド、フェノール、トルエン、キシレン、クレゾール、アニリンなどがあげられる。これらの硝化阻害物質を分解または無害化する酵素遺伝子、例えば、T.Nakazawa, S.Inouye and A.Nakazawa, Plasmids in Bacteria, 415, Plenum Publishing (1985)等に記載されるキシレン分解遺伝子xylオペロンなどを単独もしくは複数組み合わせて本発明キメラプラスミドに挿入し、得られるプラスミドを用いてアンモニア酸化細菌を形質転換する。このようにして得られる形質転換体は、それぞれの硝化阻害物質に対する抵抗性を獲得する。例えば、上記の硝化阻害物質を含みうる産業排水等の生物的処理プロセスにおいて、前記形質転換体の培養液または菌体（包括固定化等の加工を施したものを含む）を活性汚泥排水処理槽に適当量投入することにより、排水処理槽中の硝化阻害物質を分解・無毒化し、排水処理槽における活性汚泥の硝化機能の低下を抑制し、処理水に対する窒素除去性能を安定化することができる。
【００１６】
本発明キメラプラスミドにアンモニアモノオキシゲナーゼ（amo）及びヒドロキシルアミンオキシドレダクターゼ（hao）等のアンモニア酸化に関与する酵素の遺伝子群の断片を挿入し、Nitrosomonas europaea等のアンモニア酸化細菌を形質転換し、宿主生物のamo及びhao遺伝子のコピー数を増大することより、宿主生物のアンモニア酸化能力を増強することができる。具体的には、本発明キメラプラスミドにNitrosomonas sp. ENI-11その他のアンモニア酸化細菌のamo及びhao遺伝子を挿入し、アンモニア酸化細菌（例えばNitrosomonas sp. ENI-11）を形質転換する。このようにして得られた形質転換体は、染色体上にamo遺伝子２コピー、hao遺伝子３コピーを有する通常のアンモニア酸化細菌に比較して、それぞれの遺伝子のコピー数が増加しているため、これらが発現することにより、高いアンモニア酸化活性を示しうる。該形質転換体を培養するリアクタを構築し、該リアクタに高濃度のアンモニア態窒素分を含む生活排水・し尿排水または産業排水等を基質として供することにより、前記排水の硝化を促進させることができる。該リアクタにおいては、形質転換体は浮遊培養によって増殖させたものを使用しても良いし、あるいは、あらかじめ増殖させたものを固定化菌体として使用しても良い。該リアクタにより処理された排水を、嫌気工程を有する通常の活性汚泥排水処理プロセス等に導き硝酸化若しくは脱窒反応に供することより、処理水における窒素濃度を低減することができる。また、上記形質転換体の培養液または菌体（包括固定化等の加工を施したものを含む）を通常の活性汚泥排水処理槽に適当量投入することにより該排水処理槽における硝化を促進し、処理水質における窒素濃度を低減することもできる。
【００１７】
【実施例】
次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【００１８】
実施例１（菌体分離例）
化学工場の活性汚泥を採取し、該活性汚泥乾燥重量10mgを硫酸アンモニウム0.2重量％、リン酸二水素カリウム0.05重量％、硫酸マグネシウム七水和物0.005重量％、塩化カルシウム二水和物0.0004重量％、エチレンジアミン四酢酸鉄三水和物0.00001重量％からなり1規定度の水酸化ナトリウム溶液でｐＨを８に調整した培地（以下、ＡＬ培地と記す。）100mLに加えて、シリコン栓をした500mLの三角フラスコで１分間あたり約120回転の速度で回転式振とう培養した。培養温度は30℃に保った。培養開始後４日目から１〜２日毎に培地のｐＨをｐＨ計で測定し、かつ培地中のアンモニウム及び亜硝酸イオン濃度をイオンクロマトグラフィーで定量した。ｐＨが７未満となる毎に１規定度の水酸化ナトリウム溶液でｐＨを８に調整した。このような操作を繰り返し、培養１０日目には培地の亜硝酸イオンの濃度が50mg／Lを越えたので、培養液の一部を新鮮なＡＬ培地に移植した（移植量は新鮮な培地体積に対して10分の１量とした。）。以後、同様の培養及び移植操作を４回繰り返したのち、硫酸アンモニウム0.2重量％、炭酸水素ナトリウム0.05重量％、リン酸一水素カリウム0.05重量％、硫酸マグネシウム七水和物0.005重量％、塩化カルシウム二水和物0.0005重量％、エチレンジアミン四酢酸鉄三水和物0.0005重量％、硫酸マンガン四水和物0.0002重量％、硫酸銅0.00001重量％、硫酸亜鉛七水和物0.00001重量％、モリブデン酸ナトリウム二水和物0.000005重量％、塩化コバルト六水和物0.0000001重量％からなり50mMのＨＥＰＥＳ緩衝溶液でｐＨを８に調整した培地（以下、改変アレキサンダー培地と記す。）に植え継いでさらに４世代培養した。このようにして、十分アンモニア酸化細菌が集積されたと見なせる段階で平板培養を行った。すなわち、液体培地（改変アレキサンダー培地）と同組成の培地液を1重量％のゲランガムで固化した平板培地に培養液の一部を生理食塩水で希釈して塗り広げ、30℃に保った。約10日経過ごろより形成しはじめた微生物の集落を白金線で釣菌し、再び液体培養にうつすことでNitrosomonas sp. ENI-11株を得た。
【００１９】
実施例２（菌体培養例）
改変アレキサンダー培地300mLをシリコン栓をした2000mLの三角フラスコに入れ、あらかじめ同組成の培地で培養したNitrosomonas sp. ENI-11株培養液を5〜50mL加えた。これを28℃で５日間、１分間あたり約120〜約160ストロークの速さで回転式振とう培養することにより、菌体培養液を得た。
【００２０】
実施例３（プラスミド抽出例）
上記菌体培養液を10000rpmで10分間遠心分離することによって菌体を回収した後、回収された菌体を0.1mLのＴＥ溶液（10mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、ｐＨ８、1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）に懸濁し、1.5mL容量のマイクロ遠沈管（エッペンドルフチューブ）に移した。これに0.4規定度の水酸化ナトリウム溶液と2重量％のドデシル硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ0.1mLずつ加え、ゆるやかにふり混ぜて氷上に5分間静置した。さらに3Mの酢酸カリウム溶液（ｐＨ5.2）を0.15mL加え、ゆるやかにふり混ぜて氷上に5分間静置した。このマイクロ遠沈管を15000rpmで5分間遠心分離後、上澄み液を別のマイクロ遠沈管に移した。0.45mLのＴＥ溶液飽和フェノール／クロロホルム（体積比１／１）を添加してゆるやかに反転しながら攪拌した。次に、マイクロ遠沈管を15000rpmで5分間遠心分離後、上澄み液を別のマイクロ遠沈管に移し、ＴＥ溶液飽和フェノール／クロロホルム（体積比１／１）を0.45mL加え、５分間ゆるやかに反転しながら攪拌した。さらにマイクロ遠沈管を15000rpmで5分間遠心分離後、上澄み液を別のマイクロ遠沈管に移し、99.5％のエタノールを0.9mL加え氷上に10分間置いた。このマイクロ遠沈管を15000rpmで5分間遠心分離後、上澄み液を廃棄し、沈殿を70％のエタノールで洗浄した。沈殿（プラスミドＤＮＡ）を真空乾燥した後、0.015mLのＴＥ溶液に溶解した。このようにしてプラスミドＤＮＡを取得した。
【００２１】
実施例４（プラスミドのクローニングとＤＮＡ塩基配列決定例）
実施例３で得られたプラスミドＤＮＡを、宝酒造社製またはベーリンガーマンハイム社製の制限酵素EcoRI、BamHI、SacI、SphI、BalI、KpnIそれぞれ単独または２種類を同時に用いて、完全消化の場合は１時間、部分消化の場合は10秒間、37℃で加温処理した。制限酵素処理後の溶液を1.0％のアガロースゲルで100Vで電気泳動し、各制限酵素消化ＤＮＡ断片を分離した。ゲルを0.5mg／Lの臭化エチジウム溶液に15分間浸漬してから紫外線照射器を用いてＤＮＡ断片を検出した。目的のＤＮＡ断片を含むゲルの部分をカミソリで切り出し、BIO101社製のGENE CLEAN II KITを使ってＤＮＡ断片をゲルから分離精製した。次に、各制限酵素消化ＤＮＡ断片を東洋紡績社のLigation highキットを用いて、pUC118、pUC119（宝酒造社製）、pBluescriptIISK（STRATAGENE社製）の大腸菌の各クローニング用ベクタープラスミドに連結した。処理条件は、16℃、30分とした。各制限酵素消化ＤＮＡ断片を連結したクローニング用ベクタープラスミドを用いて、大腸菌宿主MV1184株を塩化カルシウム処理によるコンピテントセル法によって形質転換した。クローニング用ベクタープラスミドに目的のＤＮＡ断片が挿入されたことを確認するためには、形質転換株を寒天平板培養して得られる、β-ガラクトシダーゼ活性の欠如による白色コロニーの形成をもって判別する手法を用いた。白色コロニーを通常の大腸菌の培養方法に準じて一晩培養した後、各制限酵素消化ＤＮＡ断片を連結したクローニング用ベクタープラスミドを抽出して、制限酵素処理及び電気泳動によって挿入断片を確認した。挿入断片の塩基配列決定は、ファルマシアバイオテク社製のALFred DNA Sequencerを用いて行った。また、決定された挿入断片の塩基配列に基づき、宝酒造社製のDNASIS V2.0遺伝子解析ソフトウェアを使用することによりプラスミドの制限酵素地図を作成した（図１及び図２）。さらに、塩基配列が決定された２種のプラスミド（pAYSおよびpAYLとそれぞれ命名した。）の塩基配列を比較したところ、pAYSでは配列番号１における第1151番の部位から第1412番の部位までの262塩基対の領域と、pAYLでは配列番号２における第1339番の部位から第1599番の部位までの261塩基対の領域が相同性が高かった。
【００２２】
実施例５（本発明キメラプラスミドの構築）
実施例４で塩基配列が決定されたプラスミドpAYL及びプラスミドpUC119（宝酒造社製）をそれぞれ制限酵素KpnI（宝酒造社製）で切断した後、両者を東洋紡績社のLigation highキットを用いて連結した。ライゲーション処理条件は、16℃、30分とした。該ライゲーション反応混液を用いて、宿主生物である大腸菌MV1184株を塩化カルシウム処理によるコンピテントセル法によって形質転換した。クローニング用ベクタープラスミドpUC119に目的とするプラスミドpAYLのＤＮＡ断片が挿入されたことを確認するためには、形質転換株を寒天平板培養して得られる、β-ガラクトシダーゼ活性の欠如による白色コロニーの形成をもって判別する手法を用いた。白色コロニーを通常の大腸菌の培養方法に準じて一晩培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出して、制限酵素処理及び電気泳動によって挿入断片を確認した。このようにして得られたプラスミド（pUC119Lと命名した。）を、制限酵素SacI及びBamHI（宝酒造社製）で切断し、制限酵素処理後の溶液を1.0％のアガロースゲルで100Vで電気泳動し、制限酵素消化ＤＮＡ断片を分離した。ゲルを0.5mg／Lの臭化エチジウム溶液に15分間浸漬してから紫外線照射器を用いてＤＮＡ断片を検出した。プラスミドpAYLを含有するＤＮＡ断片（約1.9kb、DNA断片Lと命名した。）を含むゲルの部分をカミソリで切り出し、フナコシ社製のGENE CLEAN II KITを使って該ＤＮＡ断片をゲルから分離精製した。
次に、実施例４で塩基配列が決定されたプラスミドpAYS及びプラスミドpBluescriptIIKS+（東洋紡績社製）をそれぞれ制限酵素EcoRV（宝酒造社製）で切断した後、両者を東洋紡績社のLigation highキットを用いて連結した。ライゲーション処理条件は、16℃、30分とした。該ライゲーション反応混液を用いて、宿主生物である大腸菌MV1184株を塩化カルシウム処理によるコンピテントセル法によって形質転換した。クローニング用ベクタープラスミドpBluescriptIIKS+に目的とするプラスミドpAYSのＤＮＡ断片が挿入されたことを確認するためには、形質転換株を寒天平板培養して得られる、β-ガラクトシダーゼ活性の欠如による白色コロニーの形成をもって判別する手法を用いた。白色コロニーを通常の大腸菌の培養方法に準じて一晩培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出して、制限酵素処理及び電気泳動によって挿入断片を確認した。このようにして得られたプラスミド（pBS-Sと命名した。）を、制限酵素XhoI及びBamHI（宝酒造社製）で切断し、上記pUC119Lの場合と同様の操作で、プラスミドpAYSを含有するＤＮＡ断片（約1.8kb、ＤＮＡ断片Sと命名した。）を分離精製した。
さらに、カナマイシン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドpCRII（INVITROGEN社製）を制限酵素SacI及びXhoI（宝酒造社製）で切断し、上記pUC119Lの場合と同様の操作で、プラスミドpCRIIを含有するＤＮＡ断片（約3.9kb、ＤＮＡ断片Cと命名した。）を分離精製した。
得られたＤＮＡ断片L、ＤＮＡ断片S及びＤＮＡ断片C（いずれも約0.5μg）を混合して三者を東洋紡績社のLigation highキットを用いて連結した。ライゲーション処理条件は、16℃、30分とした。該ライゲーション反応混液を用いて、宿主生物である大腸菌MV1184株を塩化カルシウム処理によるコンピテントセル法によって形質転換し、形質転換処理した大腸菌をアンピシリン（100mg/L）を含む寒天平板で培養することにより、形質転換体を選抜した。形質転換体のコロニーを通常の大腸菌の培養方法に準じて一晩培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出して、制限酵素処理及び電気泳動によってプラスミドの構造を確認した。ＤＮＡ断片L、ＤＮＡ断片S及びＤＮＡ断片Cが連結された構造を有するプラスミド（図３）をキメラプラスミドpAY3と命名した。
【００２３】
実施例６（本発明キメラプラスミドを用いたアンモニア酸化細菌の形質転換例１）
本発明キメラプラスミドをベクターとして、Nitrosomonas属に属するアンモニア酸化細菌ENI-11株の形質転換を行う。実施例４で得られたpAYSの制限酵素EcoRV部位（配列番号１における第991番の部位）に、カナマイシン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドpCRII（INVITROGEN社製）のEcoRV消化ＤＮＡ断片（大きさ3932塩基対）を前述のLigation highキットを用いて連結したもの、及び実施例４で得られたpAYLの制限酵素KpnI部位（配列番号２における第1515番の部位）に、カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドpHSG298（宝酒造社製）のKpnI消化ＤＮＡ断片（大きさ2676塩基対）を前述のLigation highキットを用いて連結したものをそれぞれ調製する（以下、それぞれpAYSキメラプラスミド及びpAYLキメラプラスミドと記す。）。宿主生物であるアンモニア酸化細菌ENI-11株を実施例２に準じて培地1000mLを用いて３８〜４０時間振とう培養した後、遠心分離によって菌体を回収し、これを滅菌水にて３回洗浄した後、滅菌水0.4mLに懸濁する。これにpAYSキメラプラスミド及びpAYLキメラプラスミドのＤＮＡ各1μgを含むＴＥ溶液0.01mLを加え、2mmギャップのキュベットに全量移す。次に、ＢＴＸ社製のエレクトロポーレーション装置Electro Cell Manipulator 600を使用して、キュベットに電圧を負荷する。電圧負荷の条件は、電圧1.2kV/mm、キャパシタンス50μF、抵抗値720Ωとする。エレクトロポーレーション操作を行った該菌体懸濁液をキュベットから全量取り出し、100mLの改変アレキサンダー培地をいれた坂口フラスコに移して、24時間振とう培養する。この培養液10mLを、カナマイシン10mg/Lを含有する新しい改変アレキサンダー培地100mLに移し替え、振とう培養する。７日間の培養により、肉眼で認識できる程度（600nmの吸光度が約0.1）に微生物が増殖した時点で、10万倍〜1000万倍に希釈して、カナマイシン10mg/Lを含有する改変アレキサンダー平板培地に塗末する。28℃のインキュベータで10日間培養することにより、形質転換体コロニーが得られる。コロニーの形成率から、pAYSキメラプラスミド及びpAYLキメラプラスミドの形質転換効率を求める。
【００２４】
実施例７（本発明キメラプラスミドを用いたアンモニア酸化細菌の形質転換例２）
本発明キメラプラスミドをベクターとして、Nitrosomonas属に属するアンモニア酸化細菌ENI-11株の形質転換を行った。宿主生物であるアンモニア酸化細菌ENI-11株を実施例２に準じて1000mL液体培養した後、遠心分離によって菌体を回収し、これを滅菌水にて３回洗浄した後、滅菌水0.4mLに懸濁した。これに実施例５で得られたキメラプラスミドpAY3のＤＮＡ1μgのＴＥ溶液0.01mLを加え、2mmギャップのキュベットに全量移した。次に、ＢＴＸ社製のエレクトロポーレーション装置Electro Cell Manipulator 600を使用して、キュベットに電圧を負荷した。電圧負荷の条件は、電圧1.2kV/mm、キャパシタス50μF、抵抗値720Ωとした。エレクトロポーレーション操作を行った該菌体懸濁液をキュベットから全量取り出し、100mLの改変アレキサンダー培地をいれた坂口フラスコに移して、24時間振とう培養した。この培養液10mLを、カナマイシン10mg/Lを含有する新しい改変アレキサンダー培地100mLに移し替え、振とう培養した。７日間の培養により、肉眼で認識できる程度（600nmの吸光度が約0.1）に微生物が増殖した時点で、10万倍〜1000万倍に希釈して、カナマイシン10mg/Lを含有する改変アレキサンダー平板培地に塗末した。28℃のインキュベータで10日間培養することにより、形質転換体コロニーが得られた。コロニーの形成率から計算すると、キメラプラスミドpAY3の形質転換効率は、およそ100-1000／μg DNAであった。このようにして得られた形質転換体をカナマイシン10mg/Lを含有する改変アレキサンダー培地で培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出して、制限酵素処理及び電気泳動によってプラスミドの構造を分析したところ、キメラプラスミドpAY3の制限酵素地図から計算される大きさのＤＮＡ断片が検出され、形質転換体からキメラプラスミドpAY3が回収されたことが確認できた。さらに、該形質転換体から回収されたキメラプラスミドpAY3のＤＮＡを用いて宿主生物である大腸菌MV1184株を塩化カルシウム処理によるコンピテントセル法によって形質転換し、形質転換処理した大腸菌をアンピシリン（100mg/L）を含む寒天平板で培養することにより、形質転換体を選抜した。得られた大腸菌形質転換体のコロニーを通常の大腸菌の培養方法に準じて一晩培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出して、制限酵素処理及び電気泳動によってプラスミドの構造を分析した。その結果、キメラプラスミドpAY3の制限酵素地図から計算される大きさのＤＮＡ断片が検出され、大腸菌形質転換体からのキメラプラスミドpAY3の回収が確認された。以上のことから、キメラプラスミドpAY3がシャトルベクターとして機能することが判明した。
【００２５】
【発明の効果】
本発明により、アンモニア酸化細菌における遺伝子操作を実施するための形質転換用ベクター等を提供することができた。
【００２６】
【配列表】
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【００２７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpAYSの制限酵素地図を示す図である。図中太線で表した部分は、プラスミドpAYLとの相同性が高い領域である。
【図２】プラスミドpAYLの制限酵素地図を示す図である。図中太線で表した部分は、プラスミドpAYSとの相同性が高い領域である。
【図３】キメラプラスミドpAY3の制限酵素地図を示す図である。図中Kmはカナマイシン耐性遺伝子、Ampはアンピシリン耐性遺伝子、oriは大腸菌の複製開始点を示す。
【図４】キメラプラスミドpAY3の構築手順を示す図である。図中Kmはカナマイシン耐性遺伝子、Ampはアンピシリン耐性遺伝子、oriは大腸菌の複製開始点を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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