(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子と相互作用を有し、ビニル基およびアリル基より選択される重合可能な官能基を有する有機分子と架橋性モノマーを、前記標的分子の共存下で重合させて得られる有機重合体から、前記標的分子を遊離除去させることにより前記標的分子の分子形状構造に対応する孔が形成された多孔体としてのポリマーであって、前記標的分子と前記ポリマーとが相互作用したときに前記ポリマーの光学的特性変化が生じる事を特徴とする情報発信型分子認識高分子。
【請求項２】
前記有機分子がホスト分子であり、標的分子がゲスト分子であって、ホスト−ゲスト分子の複合体を形成したときに分子の光学的特性が変化する物質である請求項１記載の情報発信型分子認識高分子。
【請求項３】
前記有機分子が、ポルフィリン類、シクロデキストリン類、クラウンエーテル類、カリックスアレーン類、スフェランド類およびクリプタンド類からなる群より選択される請求項２記載の情報発信型分子認識高分子。
【請求項４】
前記光学的特性変化が、吸光度、蛍光、りん光、散乱光、旋光からなる群より選ばれる光学的パラメータの変化である請求項１〜３の何れか１項に記載の情報発信型分子認識高分子。
【請求項５】
標的分子と相互作用を有し、ビニル基およびアリル基より選択される重合可能な官能基を有する有機分子と架橋性モノマーを、前記標的分子の共存下で重合させて得られる有機重合体から、前記標的分子を遊離除去させることにより前記標的分子の分子形状構造に対応する孔が形成された多孔体としてのポリマーであって、標的分子と前記ポリマーとが相互作用したときに前記ポリマーの光学的特性変化が生じる情報発信型分子認識高分子を、標的分子を含む試料と混合し、その混合物の光学的特性変化を測定することを特徴とする情報発信型分子認識高分子の使用方法。
【請求項６】
前記光学的特性変化が、吸光度、蛍光、りん光、散乱光、旋光からなる群より選ばれる光学的パラメータの変化である請求項５記載の情報発信型分子認識高分子の使用方法。
【請求項７】
標的分子と相互作用を有し、ビニル基およびアリル基より選択される重合可能な官能基を有する有機分子と架橋性モノマーを、前記標的分子の共存下で重合させて得られる有機重合体から、前記標的分子を遊離除去させて得ることを特徴とする情報発信型分子認識高分子の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特異的結合を利用した物質の測定において、例えば、酵素基質反応あるいは抗原抗体反応などの利用による物質の測定に代わる、標的分子と特異的結合部位を有する分子認識物質（ポリマー）を利用した情報発信型分子認識高分子およびその調製方法ならびに利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内では、優れた分子認識能によって、極めて特異性が高く、かつ高選択的に化学反応が進行している。例えば酵素は、構造のわずかに異なる一連の化合物の中から特定物質を厳密に分子認識し、その特定物質の中の特定の位置のみに化学反応を行わせ、目的生成物を選択的に生成している。このような、生体内の巧妙な分子認識を模倣し、種々のバイオセンサー素子が開発されている。
【０００３】
これらのバイオセンサー素子は、例えば、酵素基質反応を利用した素子の場合、高い基質選択性が得られる。さらに、抗原抗体反応を利用したセンサー素子も開発されており、抗体の特徴である非常に高い特異性により、測定試料中に微量に含まれる物質の検出に広く利用されている。
【０００４】
一方、生体内の特異的な反応を人工的な手法で模倣する試みがなされている。近年、モレキュラーインプリンティング法という技術が開発され、天然の抗体を模倣した人工の分子認識物質が容易に調製できるようになった（Ｗｕｆｆ，Ｇ．：Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３４，１８１２−１８３２（１９９５））。このモレキュラーインプリンティング法で得られる分子認識物質は、標的分子と該標的分子と相互作用を有する重合可能な有機分子（機能性モノマー）、および該標的分子と前記機能性モノマーとを共に架橋反応により重合させることができる架橋性モノマーとの共存下で重合させて得られた有機重合体から、前記標的分子を遊離除去させて得られる、前記標的分子の分子形状構造を多孔体として有する特徴をもつ。この人工の分子認識物質（人工抗体）の製造方法と使用に関しては既に特表平８−５０６３２０号で開示されている。そこにはこの人工抗体の利用に関する記述も見られ、イムノアッセイ、特に、ラジオイムノアッセイによる検出法が記載されている。
【０００５】
その方法は、既知量の標識された標的分子と試料中の未知量の標的分子とを、競合的に人工の分子認識物質（ポリマー）と反応させて、上清中の遊離の標識された標的分子または、ポリマーに結合した標識された標的分子のいずれか一方を測定するアッセイ方法である。
【０００６】
さらに、このモレキュラーインプリンティングポリマーを利用したアッセイ法として、特開平８−１５１６０号では、かび臭物質の検出として、水晶振動子の周波数変化あるいは、表面プラズモン共鳴を利用した光の共鳴角変化の利用による検出法を用いた方法が開示されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のバイオセンサー素子は、酵素基質反応を利用した素子の場合、酵素反応に基づく高い基質選択性が得られるが、酵素をセンサー上に固定化させるための特殊な固定化技術を必要とする。また、酵素は、生物由来の物質であるため、安定性に欠けることから、その取り扱いが慎重にならざるを得ず、長期保存できないものが大半である。
【０００８】
さらに、抗原抗体反応を利用したセンサー素子では、高い特異性が得られるものの、酵素同様、生物由来の物質を用いて試薬が構成されていることから、その試薬の取扱は大変注意を払う必要がある。また、特異抗体などを得るためには、抗血清からの煩雑な精製工程を行う必要がある。このように抗体の利用は取扱いが煩雑で、高価につくなどの問題点が考えられる。また、保存による安定性が悪く、長期保存した場合、性能が劣化するという問題もある。
【０００９】
そこで近年、上記課題の解決のためにモレキュラーインプリンティング法による、天然の抗体を模倣した高分子ポリマーによる人工の分子認識物質を利用したアッセイ又はセンサに関する方法が開示されている。
【００１０】
特表平８−５０６３２０号では、測定対象となる標的分子に標識を付けた試薬と標的分子との競合的バインディングアッセイ法が開示されている。しかし、この方法では別に標識を付した試薬の調製が必須であり、このための試薬構成が複雑となる。さらに標的分子の検出のために遊離の標識分子と、人工抗体と結合した標識・標的分子複合体とを分離して計測する必要があり、検出操作も煩雑となるなどの問題が生じる。
【００１１】
次に、特開平８−１５１６０号で開示されている方法では、水晶振動子上あるいは、金属薄膜上にモレキュラーインプリントポリマーを層状に固定化させる必要が生じ、そのための特殊なポリマー合成技術が必要となり、また、検出に関しては、水晶振動子あるいは、表面プラズモン共鳴装置といった高価で特殊な専用装置を必要とするといった問題が生じる。特に表面プラズモン共鳴装置を利用した場合、薄膜近傍のエバネッセント波という極めて特殊な光学パラメータを使用するため、装置が非常に高価になるという問題がある。
【００１２】
本発明は、長期保存が可能であり、さらに特殊な装置を必要とせず、簡便に測定対象とする標的分子の検出を可能とする分子認識物質及びその調製方法を提供することを目的とする。またそれを用いた標的分子の検出方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
これらの問題点を解決するため鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、モレキュラーインプリント法で得られる分子認識ポリマー（モレキュラーインプリンティングポリマー（ＭＩＰ））が物理的に安定であること、また、ある分子が標的分子と結合するとその分子の光学的特性が変化することに着目し、このような光学的特性を有する分子をあらかじめＭＩＰ内に取り込むことによって、容易に標的分子の検出ができることを見出した。
【００１４】
すなわち本発明の情報発信型分子認識高分子は、標的分子と相互作用を有し、ビニル基およびアリル基より選択される重合可能な官能基を有する有機分子と架橋性モノマーを、前記標的分子の共存下で重合させて得られる有機重合体から、前記標的分子を遊離除去させることにより前記標的分子の分子形状構造に対応する孔が形成された多孔体としてのポリマーであって、前記標的分子と前記ポリマーとが相互作用したときに前記ポリマーの光学的特性変化が生じる事を特徴とする。
【００１５】
また、本発明の情報発信型分子認識高分子の使用方法は、標的分子と相互作用を有し、ビニル基およびアリル基より選択される重合可能な官能基を有する有機分子と架橋性モノマーを、前記標的分子の共存下で重合させて得られる有機重合体から、前記標的分子を遊離除去させることにより前記標的分子の分子形状構造に対応する孔が形成された多孔体としてのポリマーであって、標的分子と前記ポリマーとが相互作用したときに前記ポリマーの光学的特性変化が生じる情報発信型分子認識高分子を、標的分子を含む試料と混合し、その混合物の光学的特性変化を測定することを特徴とする。
【００１６】
さらに、本発明の情報発信型分子認識高分子の調製方法は、標的分子と相互作用を有し、ビニル基およびアリル基より選択される重合可能な官能基を有する有機分子と架橋性モノマーを、前記標的分子の共存下で重合させて得られる有機重合体から、前記標的分子を遊離除去させて得ることを特徴とする。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明でいう相互作用とは、イオン結合（静電的相互作用）、共有結合、配位結合、金属結合、分子間結合（水素結合、ファンデルワールス力）が挙げられる。
【００１８】
ところで、アビジンとビオチンの関係のように、ある特定の分子間で特異的に結合する反応物質が知られており、ホスト・ゲスト化学として研究されている。これは、抗原抗体反応、酵素反応あるいはリガンド−レセプター反応のような生物体で起こる反応を離れて、一方の分子が他方の分子を認識すると考え、一個の有機反応として扱い、それぞれの分子を一個の機能性物質として扱う化学領域である。
【００１９】
このような機能性物質は種々のものがあるが、溶液中のある異なる分子間では、特異的な結合が起こると、それら分子の光学的特性が変化することは、これまでに知られているところである。例えば、ピレン修飾γ−シクロデキストリンとコール酸との結合によって蛍光強度の増強が認められることや、２本鎖核酸とエチジウムブロマイドとの結合によって、蛍光波長が長波長側にシフトすることが知られている。これは、異なる分子間の特異結合によって、結合前後で分子の電子状態が変化するためと考えられる。また、クリプタントとＡＴＰが複合体を形成したときにＡＴＰのアデニン残基とホストのアクリジン残基が重なってπ電子相互作用を誘起し、アクリジン残基の発光強度が増大するといったことも知られている。
【００２０】
なお、光学的特性変化とは、吸光度、蛍光、りん光、散乱光、旋光などの光学的パラメータの変化を意味する。また、最大吸収波長や蛍光波長のシフトなども本発明の光学的特性変化に含まれる。
【００２１】
本発明の情報発信型分子認識高分子を調製するには、機能性モノマーとして、標的分子と相互作用したときに光学的特性が変化する有機分子を使用する。このような分子としては、ポルフィリン類、シクロデキストリン類、クラウンエーテル類、カリックスアレーン類、スフェランド類及びクリプタンド類などが挙げられる。築部  浩編著：分子認識化学−超分子へのアプローチ−  三共出版（１９９７）には、種々の化合物が記載されている。これらの分子（ホスト分子）は、特異的に結合する分子（ゲスト分子）と結合すると、光学的特性が変化する。
【００２２】
なお、これらの分子を重合させるには、その分子中にビニル基やアリル基などのような重合可能な官能基が必要であるが、ポルフィリンのように重合可能な官能基がその分子中にない場合には、適当な方法で重合可能な官能基を導入して誘導体化すればよい。例えばポルフィリンでは、メタクリロイルクロライドと反応させることによってビニル基を導入することができる。
【００２３】
重合に際しては、架橋性モノマーを使用することができる。ＭＩＰを調製するのに使用できるものであれば特に制限はないが、例えばエチレングリコールジメタクリレートが好適に用いられる。
【００２４】
ＭＩＰを調製するには、標的分子（ゲスト分子）、標的分子と特異的に結合する機能性モノマー（ホスト分子）、及び架橋性モノマーの混合物に、例えば２，２−アゾビス（２，４−ジメチル−バレロニトリル）のような適当な重合開始剤を添加して重合を開始する。重合方法は公知の手段にしたがって行うことができる。重合後、適当な溶媒を用いて洗浄することにより標的分子を除去する。
【００２５】
例えばポルフィリン誘導体とエチレングリコールジメタクリレートを使い、例えば、核酸誘導体である９−エチルアデニン分子と、その周りに集めたモノマー（ポルフィリン誘導体とエチレングリコールジメタクリレート）とをそのまま重合させた後、９−エチルアデニンを除去すると、９−エチルアデニンの立体的分子構造を記憶させたＭＩＰを作製することができる。作製したＭＩＰは、標的分子である９−エチルアデニン分子と特異的な結合能を有しており、その結合によって、例えば、濃度に応じて最大吸収波長のシフトがみられる。
【００２６】
従って、調製したＭＩＰと未知試料を混合した溶液の最大吸収波長を測定することで、標的物質を検出できる。
【００２７】
【実施例】
実施例１：ポルフィリン誘導体の製造
まず、インプリントポリマーで使用するポルフィリン誘導体を以下の工程により製造した。
【００２８】
１．ポルフィリンの合成
プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）３００ｍｌ、ｐ−イソプロピルベンズアルデヒド（ｐ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）４．２０ｇ、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）１．１６ｇ、ピロール（ｐｙｒｒｏｌｅ）２．７ｍｌを混合し、１５０℃の油浴上で、２時間還流後、室温で冷却した。酸性溶媒を減圧蒸留により除去後、適量のクロロホルムを添加した。反応液に炭酸水素ナトリウム溶液を少量づづ添加し、中和させた。反応液をクロロホルムで抽出、硫酸ナトリウムで乾燥後、フロリジール（和光純薬工業（株））を添加し、乾固させた。反応液をカラムクロマトグラフィー（吸着剤  フロリジール、展開溶媒  ジクロロメタン）、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒  ３：１  クロロホルム：石油エーテル、およびクロロホルム）で精製した。上記クロマトグラフィー操作を数回繰り返し、５−（４−ヒドロキシフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−イソプロピルフェニル）ポルフィリン（５−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−１０，１５，２０−ｔｒｉｓ（４−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）を得た。
【００２９】
ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム）：Ｒｆ＝０．０７３〜０．２４４
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：σ−２．７７（２Ｈ，ｓ，ＮＨ），１．５２−１．５４（１８Ｈ，ｍ，Ｐｒ−Ｍｅ），３．１７−３．３１（３Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｐｒ−Ｈ），７．１７−７．２０（２Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４ＯＨ），７．５７−７．５９（６Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４Ｐｒ），８．０５−８．０７（２Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４ＯＨ），８．１０−８．１３（６Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４Ｐｒ），８．８６（８Ｈ，ｓ，β−Ｈ）
【００３０】
２．ポルフィリンの亜鉛錯体化
５−（４−ヒドロキシフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−イソプロピルフェニル）ポルフィリン（５−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−１０，１５，２０−ｔｒｉｓ（４−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）１１８ｍｇをクロロホルム２０ｍｌに添加、還流後、酢酸亜鉛６５０ｍｇを含む飽和メタノール溶液５ｍｌを滴下し、３時間還流した。反応溶液を蒸留水で洗浄後、有機層を抽出、硫酸ナトリウムで乾燥させた。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  １９：１  クロロホルム：酢酸エチル）および吸光度測定で確認した。
【００３１】
0004036961.tif 000002
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：σ１．５２−１．５４（１８Ｈ，ｍ，Ｐｒ−Ｍｅ），３．１５−３．２４（３Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｐｒ−Ｈ），７．１０−７．１４（２Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４ＯＨ），７．５１−７．５４（６Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４ｐｒ），７．９９−８．００（２Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４ＯＨ），８．０２−８．０７（６Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４ｐｒ），８．９０（８Ｈ，ｓ，β−Ｈ）
【００３２】
３．ポルフィリン亜鉛錯体の誘導体化
ポルフィリン亜鉛錯体５５８．０ｍｇとトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）４５４．５μｌとをジエチルエーテル溶液３０ｍｌに添加した。この溶液中に、メタクリロイルクロライド（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）３１８．９μｌを含むジエチルエーテル溶液３０ｍｌを滴下し、８時間攪拌した。反応液を蒸留水で洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮した。分種ＴＬＣ（吸着剤：シリカゲル、展開溶媒：クロロホルム）により精製し、生成物（ポルフィリン亜鉛錯体の誘導体）５１５．０ｍｇを得た。
【００３３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：σ１．５１−１．５５（１８Ｈ，ｍ，Ｐｒ−Ｍｅ），２．４２（３Ｈ，ｓ，Ｃ６Ｈ４ＯＣＯ−ＣＨ３），３．２１−３．３０（３Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｐｒ−Ｈ），６．５３−６．８９（２Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４ＯＣＯＣ＝ＣＨ２），７．４１−７．４３（２Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４−Ｏ），７．５７−７．６０（６Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４Ｐｒ），８．２３−８．２４（２Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４−Ｏ），８．１０−８．１３（６Ｈ，ｄ，Ｃ６Ｈ４Ｐｒ），８．９８（８Ｈ，ｓ，β−Ｈ）
【００３４】
実施例２：ＭＩＰの製造
実施例１で製造した、ポルフィリン亜鉛錯体の誘導体２４６ｍｇ、９−エチルアデニン４９ｍｇ、エチレングリコールジメタクリレート２．８１ｇ、２，２−アゾビス（２，４−ジメチル−バレロニトリル）１５ｍｇをそれぞれクロロホルム７．５ｍｌに添加した。混合液をガラスの試験管に移し替え、５分間、窒素ガスで置換し、蓋をした後、４５℃の水浴中で、１３時間熱重合した。固化したポリマーを粉砕し、ふるいにかけて粒径を３２〜１０６μｍにそろえ、メタノールで洗浄し、標的分子である９−エチルアデニンを除去した。
【００３５】
実施例３：分光学的評価
実施例２で製造した、９−エチルアデニンインプリントポリマー１ｍｇを、０μＭ，１μＭ，１０μＭ，１００μＭ，１ｍＭ，１０ｍＭ，１００ｍＭの９−エチルアデニン溶液５ｍｌ中に添加してインキュベーションし、分光光度計により可視吸収スペクトルの測定を行った。
【００３６】
９−エチルアデニンの濃度上昇に従い、最大吸収波長の長波長側へのシフトが認められた。従って、吸収波長を求めることで、９−エチルアデニンの定量が可能であることが確認された。
【００３７】
【発明の効果】
本発明による情報発信型分子認識高分子（ポリマー）は、化学物質、例えば、９−エチルアデニンと結合することで、ポリマーの光学的特性、例えば最大吸収波長が濃度に応じて変化し、標的化学物質を検出することができる。本発明による情報発信型分子認識高分子を種々のオプティカルセンサーなどに応用することにより、簡便、高感度に標的物質の検出が可能となる。
【００３８】
本発明によると、特表平８−５０６３２０号で開示されているような、測定対象となる標的分子に標識を付けるといった、煩雑な操作が不必要になる。本発明で使用する光学的パラメータは、吸光度、蛍光など、汎用性の高いパラメータで良く、特別な標識物質もしくは高価な専用装置を必要としない。また、この光学的パラメータ変化が、可視領域で起こる場合、目視による検出、定量が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の情報発信型分子認識高分子の製造方法（モレキュラーインプリンティング法）の概略図である。
【図２】本発明の実施例１の反応式を示した図である。
【図３】本発明の実施例３の測定結果を示した図である。
【図１】
0004036961.tif 000003
【図２】
0004036961.tif 000004
【図３】
0004036961.tif 000005